KR20150126476A

KR20150126476A - 전기화학적 활성을 나타내는 나노입자를 이용한 당화혈색소 측정용 바이오센서

Info

Publication number: KR20150126476A
Application number: KR1020140053376A
Authority: KR
Inventors: 신재호; 심승은; 이정봉; 윤종해
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2015-11-12
Also published as: KR101721572B1

Abstract

본 발명은 전기화학적으로 활성을 나타내는 나노입자를 사용하여 다양한 보론산 유도체를 고정시킨 금 전극을 이용해 보론산과 당화혈색소 간의 반응에 의한 가리움 효과로부터 당화혈색소의 비율을 측정하는 전기화학적 센서를 제공한다. 본 발명에 의한 센서는 보론산 유도체를 사용하여 보론산을 자기조립막의 형성 방법으로 전극에 고정시킨 후 여기에 당화혈색소를 결합시키는 비교적 단순한 과정에 의해 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있다. 상기 센서는 염기성 조건에서 바람직하게 작동하며, 보론산 고정을 위해 사용된 보론산 유도체의 종류에 따라 최적의 작동 성능을 나타내는 pH 가 존재한다.

Description

전기화학적 활성을 나타내는 나노입자를 이용한 당화혈색소 측정용 바이오센서{Biosensors for Glycosylated Hemoglobin using electrochemically active nano particles}

본 발명은 전기화학적으로 활성을 나타내는 나노입자를 사용하여 다양한 보론산 유도체를 고정화한 금 전극을 이용해 보론산과 당화혈색소간의 반응에 의한 가리움 효과로 당화혈색소의 비율을 측정하는 전기화학적 센서에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 분비량이 적거나 비정상적 작동으로 인해 체내에 흡수된 포도당을 제대로 사용하지 못하는 부적절한 탄수화물 대사로 인하여 발생하며, 혈액 내에 과다한 혈당이 존재하여 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다. 이는 크게 세가지로 분류되며, 제1형 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병으로, 이자 세포의 자가면역반응에 의하여 인슐린을 합성하거나 분비하는 기능을 상실하는 타입이다. 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로, 인슐린에 대한 체내 저항성 또는 부적절한 인슐린 분비 등에 의해 발병한다. 그 외에 임신 중 발생할 수 있는 임신성 당뇨가 있다.

당뇨병을 진단하는 방법으로 여러 가지가 있지만, 이중 혈중 포도당 즉 혈당수치는 식이 및 신체 활동 상태 등의 여러 요인들에 의한 생리적인 변화가 크기 때문에 공복 상태에서 채혈하거나 당부하를 해야하는 단점이 있다. 이를 보완하기 위하여 장기간의 혈당 조절 추이 파악이 가능한 당화혈색소 검사를 추가적으로 실시한다.

당화혈색소 (Glycosylated Hemoglobin, Hemoglobin A_1C, HbA_1C)는 헤모글로빈과 글루코오스 (포도당)가 결합한 형태로, 적혈구 내의 헤모글로빈이 장시간 높은 혈중 글루코오스 상태에 노출되면 단백질 (헤모글로빈)의 β-사슬 말단의 아미노기에 당잔기 (글루코오스)가 비효소적인 반응으로 결합하는 당화 과정이 일어나며 이는 매우 점진적이고 비가역적인 반응이다 (도 1 참조).

혈색소의 농도는 사람마다 다르기 때문에 전체 혈색소의 농도에 대한 당화혈색소의 농도로 정의되는 %HbA_1C로 진단한다.

%HbA_1C=C_HbA1c/C_Hb

%HbA_1C는 혈중 평균 혈당 수치에 비례한다. 당화혈색소 측정의 장점은 2-3 개월간의 평균혈당을 의미하여 환자의 상태 파악에 용이하고 비교적 단기 편차에 영향을 받지 않으며, 공복 및 당부하가 불필요하다는 점에 있다. 2001년 미국 내분비학회에서는 6.5%를 참고치로 제시하였고, 1999년 국제당뇨협회 (International Diabetes Federation, IDF)에서도 동일하게 당화혈색소 6.5%를 참고치로 제시하였다.

혈액 내의 당화혈색소를 측정하기 위한 다양한 측정법으로는 면역분석법 (immunoassay) (Metus, P.; Ruzzante, N.; Bonvicini, P.; Meneghetti, M.; Zaninotto, M.; Plebani, M. J. Clin. Lab. Anal. 1999, 13, 5-8), 이온교환 크로마토그래피법 (ion-exchange chromatography) (Eckerbom, S.; Bergqvist, Y.; Jeppsson, J. O. Ann. Clin. Biochem. 1994, 31, 355-360), 보로네이트 친화력 크로마토그래피법 (boronate affinity chromatography) (Frantzen, F.; Grimsrud, K.; Heggli, D. E.; Faaren, A. L.; Lovli, T.; Sundrehagen, E. Clin. Chem. 1997, 43, 2390-2396), 전기영동법 (electrophoresis) (Jenkins, M.; Ratnaike, S. Clin. Chem. Lab. Med. 2003, 41, 747-754), 형광분석법 (fluorescence) (Yang, W.; Yan, J.; Springsteen, G.; Deeter, S.; Wang, B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1019-1022), 표면 플라즈몬 공명법 (surface plasmon resonance) (Lee, M.; Kim, T. I.; Kim, K. H.; Choi, M. S.; Choi, H. J.; Koh, K. Anal. Biochem. 2002, 310, 163-170) 등이 있다. 이러한 방법들은 대부분 크로마토그래피를 이용한 분리에 기반을 두며, 그 외 방법들은 항체 혹은 상업적으로 사용 불가능한 보론산 유도체를 필요로 한다. 또한 값비싼 장비를 요구하고 장비들을 다루는데 어려움이 있으며 시간소모가 크다는 단점이 존재한다.

그에 비해 전기화학 분석법 (electrochemical methods)은 상대적으로 낮은 비용으로 측정이 가능하므로 경제적이고, 장비가 간단하며, 소형화가 용이하고, 정밀한 측정값을 얻을 수 있다는 장점이 있다. 당화혈색소 측정을 위한 전기화학 분석법의 구체적인 예로서, 임피던스 측정법 (impedance spectroscopy) (Park, J. Y.; Chang, B. Y.; Nam, H.; Park, S. M. Anal. Chem. 2008, 80, 8035-8044)은 금 전극 표면에 싸이오펜-3-보론산 (Thiophene-3-boronic acid)을 이용하여 자기조립단층막을 형성시켜 보론산과 당화혈색소간의 결합을 이용하며, 당화혈색소의 농도가 높을수록 전극 표면의 임피던스가 증가하는 것을 이용하여 당화혈색소의 농도를 측정한다. 또 다른 예로서, 전위차법 (potentiometry) (Liu, H.; Crooks, R. M. Anal. Chem. 2013, 85, 1834-1839)은 페닐보론산 (phenylboronic acid)과 당화혈색소 및 알리자린 레드 S (ARS)의 다이올 (diol) 그룹간의 결합을 이용한다. ARS는 산화환원 지시약으로 사용되는 것으로, 페닐보론산과 결합시 전위를 음의 방향으로 이동시키고 당화혈색소가 존재할 경우에는 ARS와 경쟁하여 전위를 양의 방향으로 이동시키는데 이러한 전위의 이동을 이용하여 당화혈색소의 농도를 측정한다. 또한, 전류법 (amperometry) (Kim, D. M.; Shim, Y. B. Anal. Chem. 2013, 85, 6536-6543)은 아미노페닐보론산 (aminophenylboronic acid)을 당화혈색소와 결합시킨 후, 당화혈색소내의 철에 의한 과산화수소의 환원을 촉매화하여 전기화학적 신호를 얻는다.

한편 전극에 직접 보론산을 고정하여 표식자 없이 당화혈색소를 측정하는 기술로 US 2010-0089774에는 4-페닐비닐보론산 (4-phenyl-vinyl-boronic acid)을 카본페이스트와 혼합하여 제조한 전극을 통해 변화하는 전압을 측정하여 당화혈색소의 비율을 측정하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 보론산을 카본페이스트와 혼합하여 전극을 제조하는 경우 보론산의 첨가량이 많게 되면 카본페이스트 전극을 제조하기 어렵기 때문에 보론산을 소량 첨가해야 하는데, 이는 고농도의 당화혈색소 측정시 재현성이 떨어진다는 문제점이 있다. 또한 카본페이스트 전극을 가지고 생체시료를 측정할 경우 공존 물질에 영향을 받기 쉽다는 문제점이 있다.

본 발명은 전기화학적 분석 방법으로 당화혈색소의 농도를 검출하는 수단을 제시하고자 한다. 특히 본 발명에서는 준비과정이 간단하면서도 민감도가 높고, 전문적으로 숙련된 측정자 없이도 측정할 수 있는 전기화학적 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 작업전극, 및 상기 작업전극 위에 형성된 보론산 유도체의 자기조립막을 포함하고, 상기 자기조립막은 당화혈색소와 결합하며, 결합된 당화혈색소의 농도에 따른 전기화학적 활성을 갖는 나노입자에 의한 전기화학적 신호로부터 당화혈색소의 농도를 측정하는 바이오센서를 제공한다.

바람직하게, 상기 나노입자는 당화혈색소 농도에 따라 작업전극에 대한 접근성이 달라진다.

바람직하게, 상기 나노입자는 전자에 의해서 산화 또는 환원을 일으킨다.

바람직하게, 상기 작업전극은 금 (Au) 전극이다.

바람직하게, 상기 보론산 유도체는 싸이올 (thiol), 싸이오펜 (thiophene) 및 아민 (amine)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1의 치환기를 갖는 보론산이다.

바람직하게, 상기 보론산 유도체는 T3BA (싸이오펜-3-보론산, Thiophene-3-boronic acid), p-MPBA (p-머캅토페닐보론산, p-Mercaptophenylboronic acid), m-MPBA (m-머캅토페닐보론산, m-Mercaptophenylboronic acid), m-APBA (m-아미노페닐보론산, m-Aminophenylboronic acid) 및 TPBA (4-(2H-테트라졸-5-일)페닐보론산, 4-(2H-Tetrazol-5-yl)phenylboronic acid)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1 이상이다.

바람직하게, 상기 나노입자는 음전하성 실리카 나노입자이다.

바람직하게, 상기 나노입자는 테트라에틸 오르소실리케이트 (TEOS) 또는 테트라메틸 오르소실리케이트 (TMOS)를 스토버 (Stober)방법을 이용해 합성된 실리카 나노입자 또는 훈증된 (fumed) 실리카 나노입자에 페로센이 도입된 것이다.

바람직하게, 상기 나노입자의 사이즈는 130 nm 이상의 것이다.

바람직하게, 상기 바이오센서의 작동 pH는 7.0 내지 9.7 범위이다.

바람직하게, 전기화학적 신호를 얻는 방법은 순환전압전류법 (cyclic voltammetry), 네모파전압전류법 (square wave voltammetry), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 또는 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)이다.

바람직하게, 전기화학적 신호를 얻는 방법에 사용되는 전극계는 작업전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성되는 제3전극계 또는 작업전극 및 기준전극으로 구성되는 제2전극계이다.

본 발명은 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 당화혈색소의 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 개발에 도입하여 표지자가 필요없는 비표지 방식 (label-free)으로 센서를 제공함으로써, 측정하고자하는 당화혈색소에 형광물질이나 다양한 기능성 분자를 부착하는 등의 전처리 과정이 없어 측정 대상을 있는 그대로 측정하는 것이 가능하고, 시스템의 단순화가 가능하며 빠른 시간 내에 분석할 수 있다.

본 발명에 의한 센서는 보론산 유도체를 자기조립막 형성 방법으로 전극에 고정시킨 후 여기에 당화혈색소를 결합시키는 비교적 단순한 과정에 의해 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명은 효소 (enzyme), 항체 (antibody), 그리고 압타머 (aptamer) 등에 비해 상대적으로 가격이 저렴하고 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 보론산 유도체들을 이용하여 당화혈색소에 반응하는 센서를 구성하기 때문에 경제적이고 효율적이다.

도 1은 헤모글로빈과 글루코오스의 결합으로부터 당화혈색소가 만들어지는 반응을 도시한 것이다.
도 2는 당화혈색소와 보론산의 반응을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명 센서에서 작업전극의 준비과정을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명 센서의 개념도이다.
도 5는 본 발명 센서의 감응 원리를 도시한 것이다.
도 6은 실시예 1 내지 5에서 준비된 센서의 pH 8.5에서의 성능을 평가한 결과이다.
도 7은 실시예 1에서 준비된 센서의 pH에 따른 성능을 평가한 결과이다.
도 8은 실시예 2에서 준비된 센서의 pH에 따른 성능을 평가한 결과이다.
도 9는 실시예 3에서 준비된 센서의 pH에 따른 성능을 평가한 결과이다.
도 10은 실시예 1 내지 3에서 준비된 센서의 각각의 최적 작동 pH에서 당화혈색소의 농도에 따라 얻어진 전압전류도이다.

본 발명은 전기화학적으로 활성을 나타내는 나노입자를 사용하여 다양한 보론산 또는 보론산 유도체를 고정시킨 금 전극을 이용해 보론산과 당화혈색소 간의 반응에 의한 가리움 효과로 당화혈색소의 비율을 측정하는 전기화학적 센서를 제공한다.

용어 '보론산 유도체'는 보론산을 작업전극 위에 고정시키기 위한 수단으로 사용되는 것이므로, 이하에서는 보론산 또는 보론산 유도체가 동시에 또는 동일한 의미로 기재될 수 있다. 또한 상술한 바와 같이 본 발명의 센서는 전체 혈색소의 농도에 대한 당화혈색소의 농도로 정의되는 %HbA_1C를 측정하는 것이기 때문에 '당화혈색소의 농도'는 '당화혈색소의 비율'이라는 용어와 병행하여 사용될 수 있다.

상기 센서에서는 작업전극 위에 고정된 보론산 또는 보론산 유도체와 결합하는 당화혈색소의 농도에 따라 작업전극에 대한 전기화학적 활성을 갖는 나노입자의 접근성이 달라진다. 이에 따라 나노입자에 의한 산화-환원 전류가 다르게 나타나고, 이로부터 당화혈색소의 농도를 측정하는 것이다. 따라서 상기 센서에서는 당화혈색소 농도에 따른 가리움 효과에 의해 전기화학적 신호의 차이가 나는 것을 이용하지만, 나아가 추가적으로는 전기화학적 활성을 갖는 나노입자의 크기를 조절하는 것으로 작업전극 위에 고정된 보론산 유도체와 결합한 당화혈색소에 대한 나노입자의 접근성을 다르게 함으로써 당화혈색소의 농도 격간의 신호차이를 증폭시킬 수 있다.

보론산 (boronic acid) (하기 화학식 1)은 하나의 알킬 또는 아릴 그룹이 치환된 붕산으로 1,2- 또는 1,3-다이올 그룹을 포함하는 화합물과의 가역적인 공유결합을 통해 보론산 에스터 (하기 화학식 2) 또는 보로네이트 에스터 (하기 화학식 3)를 형성한다. 따라서, 본 발명은 다이올 그룹을 가지는 단당류나 당화 단백질 및 아미노산을 인지하고 반응하여 에스터를 형성할 수 있는 보론산을 이용하여 당화혈색소의 검출을 위한 센서를 제안한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

보론산과 다이올의 반응은 pH 의존적인 반응이다. 산성 조건에서는 하기와 같이 보론산 에스터의 산소와 수소이온이 결합하면서 에스터가 깨진다.

중성 조건에서는 보론산 에스터가 보론산에 비해 더 강한 루이스 산이기 때문에 하기 식에서 역반응이 정반응에 비해 활발하게 진행된다.

따라서 염기성 조건에서 하기와 같은 반응이 유리하게 진행될 수 있다.

그러므로 본 발명에서는 센서의 작동 pH를 염기성 조건으로 제안한다. 도 2는 염기성 조건에서 글루코오스 그룹을 가지는 당화혈색소와 보론산의 반응을 도시한 것이다. 구체적으로 본 발명에서 제공하는 보론산 유도체는 7.0 내지 9.7의 pH 범위에서 당화혈색소의 농도간 구별이 가능하고 더 좋은 직선성과 더 작은 표준편차를 나타내는 것이 확인된다. 또한 보론산 유도체의 종류에 따라 최적의 작동 성능을 나타내는 pH 가 존재한다.

본 발명의 센서에서는 보론산을 작업전극 위에 고정시키기 위하여 전극 위에 자기조립단층막 (self-assembled monolayer) (이하 '자기조립막'이라고도 함)을 형성한다. 상기 작업전극은 바람직하게 금 (Au) 전극으로 금 디스크 전극 (disk electrode), 금 증착법 (sputter)에 의한 전극 또는 스크린 프린팅 전극 (screen printing electrode)일 수 있다. 또한 보론산의 자기조립막을 형성하기 위하여 R그룹에 황 (S) 혹은 질소 (N) 원자를 포함하여 금 전극과 자기조립단층막을 형성할 수 있는 보론산의 유도체를 사용하는데, 실시예로서 싸이올 (thiol), 싸이오펜 (thiophene) 및 아민 (amine)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1의 치환기를 갖는 것을 사용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 사용하는 보론산 유도체는 T3BA (싸이오펜-3-보론산, Thiophene-3-boronic acid) (하기 화학식 4), p-MPBA (p-머캅토페닐보론산, p-Mercaptophenylboronic acid) (하기 화학식 5), m-MPBA (m-머캅토페닐보론산, m-Mercaptophenylboronic acid) (하기 화학식 6), m-APBA (m-아미노페닐보론산, m-Aminophenylboronic acid) (하기 화학식 7) 및 TPBA (4-(2H-테트라졸-5-일)페닐보론산, 4-(2H-Tetrazol-5-yl)phenylboronic acid) (하기 화학식 8)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1 이상의 것이다.

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

도 3은 본 발명의 일 실시예로서 센서에서 사용되는 작업전극의 준비 과정을 도시한 것이다. 우선 보론산의 자기조립막 형성을 위해 보론산 유도체를 메탄올 (methanol) 등의 용매에 녹인 후 전극에 배양한다. 자기조립막 형성 후에는 증류수를 이용하여 전극을 세척한다. 다음으로 당화혈색소와 자기조립막을 결합시키기 위해 당화혈색소를 완충용액으로 희석한 후 전극에 배양하고, 완충용액과 증류수를 이용하여 전극을 세척한다.

본 발명에서는 상기와 같이 보론산-당화혈색소 결합물질이 고정된 전극을 작업전극으로 사용하고 이에 기준전극과 보조전극을 더하여 구성되는 제3전극계 또는 작업전극 및 기준전극으로 구성되는 제2전극계의 전기화학적 센서를 구성한다. 완성된 센서에서는 전기화학적 활성을 갖는 나노입자를 이용하여 당화혈색소 비율에 따른 산화-환원 전류를 얻는다. 전기화학적 활성을 갖는 나노입자는 전극에 대하여 산화-환원 매개체 역할을 하는 전도성 (conductivity) 나노입자와 나노입자 겉표면 또는 나노입자 내부에 전기화학적 활성을 갖는 물질을 도입하는 방법으로 나뉠 수 있다.

전기화학적 신호를 얻는 방법은 순환전압전류법 (cyclic voltammetry), 네모파전압전류법 (square wave voltammetry), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)일 수 있다.

도 4는 본 발명 센서의 개념도로서, 금 전극에 보론산 유도체를 고정시킨 후, 이와 특이적으로 결합하는 당화혈색소의 상호작용을 이용하여 전기화학적 활성물질에 의한 전극과의 전자전달을 측정함으로써 당화혈색소의 정량을 시도하는 것이다.

도 5는 상기 센서에서 감응 원리를 나타낸 것으로, 보론산과 결합된 당화혈색소의 비율이 높을수록 나노입자는 크기가 큰 당화혈색소에 의한 가리움 효과로 인해 산화-환원 반응이 용이하지 않아 신호가 감소한다. 이러한 가리움 효과로 인한 당화혈색소의 비율 증가에 따른 신호 감소 정도를 측정함으로써 간접적으로 당화혈색소의 비율을 결정할 수 있다.

따라서 본 발명 바이오센서의 검정곡선은 당화혈색소가 저농도일수록 전극과 나노입자간의 산화-환원이 수월해지므로 전기화학적 신호가 증가하게 되는 반비례 곡선을 갖는다. 또한 보론산-당화혈색소 결합물질은 음전하를 띄게 되므로 본 발명에서는 음전하를 띠는 전기화학적으로 활성을 갖는 나노입자를 이용하는 것이 나노입자와 보론산-당화혈색소 결합물질 간의 반발력을 증대시킴으로써 농도간의 전기화학적 신호 차이를 증가시켜 농도 간 구별을 향상시킬 수 있으므로 유리하다.

바람직하게 본 발명에서 사용하는 나노입자는 음전하성 실리카 나노입자로서 일 실시예로, 테트라에틸 오르소실리케이트 (TEOS) 또는 테트라메틸 오르소실리케이트 (TMOS)를 스토버 (Stober)방법을 이용해 합성된 실리카 나노입자 또는 훈증된 (fumed) 실리카 나노입자에 페로센이 도입된 것이다. 이러한 나노입자에 대해서는 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나, 등록특허 제10-1321082호의 실시예에 기재된 방법에 따라 합성된 것을 사용할 수 있다.

또한 당화혈색소에 의한 가리움 효과를 위해 나노입자의 크기는 130 nm 이상의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 나노입자의 크기가 너무 작을 경우 당화혈색소의 농도에 상관없이 전기화학적 활성물질이 전극에 도달하여 전자전달을 하여 농도에 의한 신호차이를 얻을 수 없다. 그러므로 일정 이상의 크기를 갖는 나노입자를 사용하여 당화혈색소 농도에 따른 신호를 측정한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 해석되는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.

<실시예 1>

센서의 준비

작업전극으로 BASi사의 금 디스크 전극 (Model MF-2014) (n=6)을 사용하였다. 지름 0.05 μm와 1 μm의 알루미나 가루를 이용해 큰 입자에서부터 작은 입자순으로 Microcloth (Buehler) 패드에서 연마하였다. 그런다음 에탄올 하에서 초음파 처리 (sonication)하였다. 그리고 1 M 황산 용액 중에서 순환 전압전류법 (cyclic voltammetry)을 이용하여 세척한 후 증류수를 이용하여 세척하였다.

상기 준비된 작업전극에 보론산 자기조립막을 형성하기 위해 10 mM의 보론산 유도체 T3BA (싸이오펜-3-보론산, Thiophene-3-boronic acid)를 메탄올 (methanol)에 녹인 후 3시간 동안 전극에 배양하였다. 자기조립막 형성 후에는 증류수를 이용하여 전극을 세척하는 것으로 작업전극을 준비했다.

또한 3전극계 센서를 구성하기 위해 기준전극으로 CH Instrumets사의 Ag/AgCl 바이코 기준전극 (Model MF-2052)을, 보조전극으로 BASi사의 백금 와이어 (Model MW-1033)를 준비하였다.

<실시예 2 내지 5>

상기 실시예 1에서 보론산 유도체 T3BA를 대신하여 p-MPBA (p-머캅토페닐보론산, p-Mercaptophenylboronic acid), m-MPBA (m-머캅토페닐보론산, m-Mercaptophenylboronic acid), m-APBA (m-아미노페닐보론산, m-Aminophenylboronic acid) 및 TPBA (4-(2H-테트라졸-5-일)페닐보론산, 4-(2H-Tetrazol-5-yl)phenylboronic acid)을 사용하는 것을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 준비하였다.

<평가예 1>

상기 실시예에서 준비된 센서들의 성능을 평가하기 위해 실시예 1 내지 5의 작업전극들에 대하여 pH 8.5 완충용액 (10 mM 4-ethylmorpholine-HCl (20 mM NaCl, 50 mM KCl))으로 10배 희석한 당화혈색소 (Bio rad사의 liquichek diabetes control levels 1, 2, and 3: 각각 %HbA_1C =5.15%, 9.75%, 13.75% 농도의 것)를 30분 동안 전극에 배양한 후, 완충용액과 증류수를 이용하여 전극을 세척하였다.

이렇게 준비된 작업전극과 상기 준비된 기준전극 및 보조전극으로 3전극계를 구성한 다음, 전기화학적 활성을 갖는 실리카 나노입자 (등록특허 제10-1321082호의 실시예 1 및 2에 기재된 방법으로부터 제조된 것을 사용함)의 용액 (10 mM 4-ethylmorpholine-HCl 완충용액 (20 mM NaCl, 50 mM KCl, pH 8.5) 내에서 초음파분쇄기로 완전히 분산된 상태의 것; 2 mg/mL의 농도) 내에서, 전기화학 측정장비인 CH Instruments사의 electrochemical alayzer (Model 760D)를 이용하여, 네모파전압전류법 (square wave voltammetry) (측정 전위 영역: 0.0 - 0.7 V (vs. Ag/AgCl))을 시행하였다.

결과를 도 6에 나타내었다. 실시예 1 내지 3으로부터 준비된 센서의 경우 3개 농도 당화혈색소 모두에서 완벽한 신호 구분이 나타난 것을 확인할 수 있다.

<평가예 2 내지 4>

실시예 1 내지 3의 센서에 대하여 당화혈색소의 배양 pH를 변화시키면서 센서의 성능을 평가하였다. 10 mM 4-ethylmorpholine-HCl (20 mM NaCl, 50 mM KCl) (pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5)과 10 mM ethanolamine-HCl (20 mM NaCl, 50 mM KCl) (pH 9.2, 9.7)의 완충용액을 사용하였다.

결과를 도 7 내지 9 및 하기 표 1 내지 3에 각각 나타내었다.

pH	기울기	R ²
7.0	0.0158	0.9198
7.5	-	-
8.0	0.0211	0.9998
8.5	0.0191	0.9999
9.2	0.0271	0.9464

(R²값이 0.9 미만일 경우 기울기와 R²값은 '-'로 표시함)

pH	기울기	R ²
7.0	-	-
7.5	0.0184	0.9831
8.0	0.0202	0.9431
8.5	0.0335	0.9496
9.2	0.0455	0.9916
9.7	-	-

(R²값이 0.9 미만일 경우 기울기와 R²값은 '-'로 표시함)

pH	기울기	R ²
7.0	-	-
7.5	0.0332	0.9069
8.0	0.0517	0.9991
8.5	0.0495	0.9353
9.2	-	-

(R²값이 0.9 미만일 경우 기울기와 R²값은 '-'로 표시함)

상기 결과에서 각각의 센서는 자기조립막을 형성하기 위해 사용된 보론산 유도체의 종류에 따라 센서의 바람직한 감응을 보이는 작동 pH가 다르게 나타났다. 즉, 실시예 1의 센서는 pH 8.0~9.2의 완충용액 조건에서, 실시예 2의 센서는 pH 7.5~9.2의 완충용액 조건에서, 실시예 3의 센서는 pH 7.5~8.5의 완충용액 조건에서 당화혈색소의 농도 증가에 따른 신호의 감소를 보였다.

한편, 상기 결과에서 얻은 각 센서들의 최적화된 작동 pH 조건, 즉 실시예 1 및 3은 pH 8.0에서, 실시예 2의 센서는 pH 9.2에서 당화혈색소의 비율에 따른 전압전류도를 얻었다. 도 10에 나타내었다.

상기 결과로부터 보론산 유도체 T3BA, p-MPBA, 및 m-MPBA를 이용한 센서가 모두 염기성 조건에서 당화혈색소의 농도간 구별이 가능하며, 보론산 유도체의 종류에 따라 더 좋은 직선성과 더 작은 표준편차를 나타내는 pH 조건이 존재함을 확인하였다.

Claims

작업전극, 및 상기 작업전극 위에 형성된 보론산 유도체의 자기조립막을 포함하고, 상기 자기조립막은 당화혈색소와 결합하며, 결합된 당화혈색소의 농도에 따른 전기화학적 활성을 갖는 나노입자에 의한 전기화학적 신호로부터 당화혈색소의 농도를 측정하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 나노입자는 당화혈색소 농도에 따라 작업전극에 대한 접근성이 달라지는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 나노입자는 전자에 의해서 산화 또는 환원을 일으키는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 작업전극은 금 (Au) 전극인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 보론산 유도체는 싸이올 (thiol), 싸이오펜 (thiophene) 및 아민 (amine)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1의 치환기를 갖는 보론산인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 보론산 유도체는 T3BA (싸이오펜-3-보론산, Thiophene-3-boronic acid), p-MPBA (p-머캅토페닐보론산, p-Mercaptophenylboronic acid), m-MPBA (m-머캅토페닐보론산, m-Mercaptophenylboronic acid), m-APBA (m-아미노페닐보론산, m-Aminophenylboronic acid) 및 TPBA (4-(2H-테트라졸-5-일)페닐보론산, 4-(2H-Tetrazol-5yl)phenylboronic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 나노입자는 음전하성 실리카 나노입자인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 나노입자는 테트라에틸 오르소실리케이트 (TEOS) 또는 테트라메틸 오르소실리케이트 (TMOS)를 스토버 (Stober)방법을 이용해 합성된 실리카 나노입자 또는 훈증된 (fumed) 실리카 나노입자에 페로센이 도입된 것임을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 나노입자의 사이즈는 130 nm 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 바이오센서의 작동 pH는 7.0 내지 9.7 범위인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
전기화학적 신호를 얻는 방법은 순환전압전류법 (cyclic voltammetry), 네모파전압전류법 (square wave voltammetry), 정상펄스전압전류법 (normal pulse voltammetry), 또는 펄스차이전압전류법 (differential pulse voltammetry)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
전기화학적 신호를 얻는 방법에 사용되는 전극계는 작업전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성되는 제3전극계 또는 작업전극 및 기준전극으로 구성되는 제2전극계인 것을 특징으로 하는 바이오센서.