JP5334136B2 - 電気化学分子認識プローブ及びそれを用いた分子認識センサ並びにそれらを用いた電気化学的検出方法 - Google Patents
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Description
目的とする分子に特有な特徴がない場合には、特徴のある分子団等によりラベル化し、ラベルを目印に目的の分子を検出する。また、その目的とする分子へのラベル化が困難な場合には、その分子を特異的に認識する分子認識試薬を用い、分子認識試薬側に特徴を持たせることで目的の分子を検出することが多い。特に、測定対象が多数の場合には後者の方法を用いることが多い。
現在、例えばゲノム解析における核酸の検出においては、測定対象となる核酸(ターゲット核酸)そのものに蛍光団を直接ラベル化し、チップや基板上に固定した相補的配列を有する核酸(プローブ核酸)との配列特異的なハイブリッド形成の後、蛍光発光を直接検出することでターゲット核酸を同定している。
しかし、多種類の核酸を測定対象とする場合、こういったラベル化作業を全ての核酸に対して行うのは大変煩雑であり、ラベル化フリーの核酸検出法が望まれている。このような状況は、多くのタンパク質やペプチドを取り扱わねばならないプロテオーム解析やメタボローム解析でも同様である。
本発明者らは従来、蛍光分光法に代わるより簡便な手法について研究してきた。その過程で、電気化学に基づく手法は、低エネルギーで安価で小規模な装置で検出が可能なため、簡便な検出を可能とすることを示してきた。特に、生体内での遺伝子やタンパク質の働きにおける正常時からのずれを指標とした診断技術であるトキシコゲノミクスやファーマコゲノミクスなど患者の病態予測や治療法の選択を可能とする技術が、研究所レベルの研究から臨床レベルの診断へと応用の幅を広げようとしている昨今では、簡便な診断ツールの必要性はますます増加している。
[1]電気化学活性団と、前記電気化学活性団の電気化学活性を抑制する活性抑制団と、目的物質を特異的に分子認識するレセプター領域と、分子認識の結果立体構造を変化させる構造変化領域とを備え、分子認識前は前記電気化学活性団が前記活性抑制団により活性を抑制され、分子認識後は活性を取り戻すことを特徴とする分子認識プローブ。
[2]前記レセプター領域が、前記構造変化領域を兼ねていることを特徴とする前記[1]の分子認識プローブ。
[3]固体表面上に固定するためのアンカー領域を備えたことを特徴とする前記[1]又は[2]の分子認識プローブ。
[4]前記電気化学活性団が、メタロセン又はその誘導体であることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかの分子認識プローブ。
[5]前記活性抑制団が前記電気化学活性団を内包していることを特徴とする前記[1]〜[4]のいずれかの分子認識プローブ。
[6]前記活性抑制団が、シクロデキストリン又はカリックスアレン或いはこれらの誘導体であることを特徴とする前記[5]の分子認識プローブ。
[7]前記[1]〜[6]のいずれか1つの分子認識プローブを固体表面に固定化することで作製した分子認識センサ。
[8]目的物質を含有する溶液と、前記[1]〜[6]のいずれかの分子認識プローブを接触させて、該分子認識プローブから発生される、分子認識前後の電気化学信号の変化を検出することを特徴とする電気化学的検出方法。
[9]前記電気化学信号の変化が、電流値の増減又は電圧値の増減であることを特徴とする前記[8]の電気化学的検出方法。
[10]目的物質を含有する溶液と、前記[7]に記載の分子認識センサを接触させて、該分子認識センサから発生される、分子認識前後の電気化学信号の変化を検出することを特徴とする電気化学的検出方法。
[11]前記電気化学信号の変化が、電流値の増減又は電圧値の増減であることを特徴とする前記[10]の電気化学的検出方法。
本発明の分子認識プローブは、目的物質を特異的に分子認識するレセプターが、分子認識の結果立体構造を変化させる分子領域を兼ね備えていても良い。
また、本発明の分子認識センサは、この分子認識プローブを電極表面に固定して構成したセンサである。
図中、Eは、電気化学活性団を表し、Qは、該電気化学活性団の電気化学活性を抑制する活性抑制団を表しており、これらの図では、EとQの間に存在するレセプターの一例として核酸を用いた例を示している。本例においては、レセプターである核酸は、分子認識の結果立体構造を変化させる分子領域を兼ねている。
この際、分子認識プローブはバルク測定溶液中で電気化学信号を発生し、分子認識センサは電極表面上で電気化学信号を発生する。最終的には、どちらの場合も電極を用いて電気化学信号を測定する。
前記分子認識プローブは、分子認識前の状態では、電気化学活性団と活性抑制団とを互いに近傍に位置させるため、両者が内包錯体や電荷移動錯体などを形成することで、比較的弱い力により結び付いている状態が望ましい。また同様の目的のため、例えばレセプター領域として核酸を用いている場合には、図6に示すようなステム構造を形成していても良い。
図3は、レセプターが分子認識に伴ってその立体構造が変化して酸化還元電位がシフトすることにより電流値が増大することを模式的に示す図である。
また、本発明において、前記構造変化領域としては、核酸、タンパク質、ペプチド、イオノフォア等が挙げられる。
これらに用いられる核酸としては、具体的には、DNA、RNA、PNA(Peptide Nucleic Acid、ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)が挙げられる。
さらに、前記レセプター領域が、前記構造変化領域を兼ねるものであってもよい。
例えば、前記活性抑制団として、前記電気化学活性団を内包するものが用いられる。この場合、電気化学活性団は、分子認識前は、活性抑制団に内包されているために、その活性が抑制されているが、分子認識後は、レセプター領域が分子認識に伴ってその立体構造が変化する結果、電気化学活性団が活性抑制団に内包されない構造に変化し、その活性が取り戻される。このような活性抑制団としては、シクロデキストリン、又はカリックスアレン、或いはそれらの誘導体が挙げられる。
また、前記電気化学活性団が酸化還元酵素の場合において、前記活性抑制団はその阻害剤であってもよく、この場合、分子認識前は、酸化還元酵素の酵素活性が阻害されているが、分子認識後は、レセプター領域が分子認識に伴ってその立体構造が変化して、阻害剤の影響を受けなくなり、酵素活性が取り戻される。このような活性抑制団としては、イミダゾール、又はトリアゾール、或いはそれらの誘導体が挙げられる。
この場合、分子認識するレセプター及び/又は構造変化領域に対して、電気化学活性団及び/又は活性抑制団を離して位置させることができる。その結果、電気化学活性団及び/又は活性抑制団は、レセプター及び/又は構造変化領域からの立体障害をより受けにくくなり、電気化学活性団及び活性抑制団の効果を充分に生かして、本発明のプローブを構成することが可能となる。
該リンカー領域としては、置換されていても良い、好ましくは炭素数が5以上の直鎖アルキレン基を有し、さらにグリコール基・エーテル基・チオエーテル基・アミド基・イミド基・マレイミド基・エステル基やリン酸エステルの構造を1つ以上繰り返してなる構造も有しても良く、任意の環構造や硫黄、窒素、酸素等の炭素以外の原子を有していても良く、単結合・二重結合・三重結合を有していても良い。
このようなアンカー領域としては、電極材料である金属と共有結合することが可能なものが用いられ、具体的には、チオール類、チオエーテル類、チオエステル類、リポ酸誘導体、システイン誘導体およびその他の硫黄化合物等が挙げられる。
また、前記アンカー領域として、他の電極材料である金属酸化物と共有結合することが可能なものが用いられ、具体的には、シラン類が挙げられる。
さらに、前記アンカー領域が、抗原抗体反応、His−Tag、核酸のハイブリッド形成、ビオチン−アビジン結合およびその他の結合形成により固体表面上に固定できるものが好ましい。
図5は、それにアンカーの一例を付加したものである。
本発明において、目的物質を含有する溶液と分子認識プローブ又は分子認識センサを接触させる方法は、特に限定されないが、例えば、本発明の分子認識プローブを用いる場合には、目的物質と分子認識プローブを含有する溶液を入れた容器内に電極を挿入するか、或いは、電極を形成した基板上に、目的物質を含有する溶液に分子認識プローブを混合した液を滴下する方法等があげられる。また、本発明の分子認識センサを用いる場合には、目的物質を含有する溶液を入れた容器内に該センサを挿入するか、或いは、該センサを有する基板上に、目的物質を含有する溶液を滴下する方法等があげられる。
(1)試薬
フェロセンを修飾したジチオール化DNA(分子1)はDNA合成機により作製したものを株式会社ファスマックより購入した。分子1の構造式は、Fc-C6-(C3)2-GCA ACC TTC CCT ATT ACT CCA C-(C3)3-(CH2)3-SS-(CH2)3OH(ここで、Fc:フェロセン、C6およびC3はそれぞれ炭素鎖6および3のリンカーを表す)と表される。図7aにこの分子の構造式を示した。この分子のジチオール基をチオール基に変換することでβ−シクロデキストリンと結合可能にした。
プローブに対するターゲットとして、フルマッチDNA(配列:5’-GTG GAG TAA TAG GGA AGG TTG C-3’)、ミスマッチDNA(配列:(dT)22)及び一塩基変異DNA(配列:5’-GTG GAG TAA TAC GGA AGG TTG C-3’)をオペロンバイオテクノロジー社から購入し、これらを100μM水溶液に調製してストックした。3A−アミノ−3A−デオキシ−(2AS,3AS)−β−シクロデキストリンは東京化成株式会社より購入し、N−(6−マレイミドカプロイロキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩は株式会社同仁化学研究所(熊本)より購入した。他の試薬は全て入手できる最も高品質のものを使用した。水溶液には全てMilli−Q水システム(Millipore社、Bedford,MA)を使用して調製した超純水(抵抗値>18.2MΩcm)を用いた。
カーボンくし形電極(電極幅10μm、電極間隔5μm、電極長さ2mm、対本数65、BAS株式会社、東京)を使用した。参照電極は、銀塩化銀ペーストを塗布し、120℃で5分間加熱することで形成した。電気化学測定は全て、ALS−730C電気化学測定装置(BAS社)を用いて25℃で行った。サイクリックボルタモグラムはデュアルモードにて4電極法で行った。電位は0Vから0.6Vまで挿引し、再び0Vまで挿引した。挿引速度は10mV/sとした。
1ODの分子1水溶液の50μLおよび1Mジチオスレイトールを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)の5μLを混合し、37℃で1時間静置した。その後150μLの水を加え水で平衡化したNAP−5カラム(GEヘルスケアライフサイエンス株式会社、東京)上に展開し、水を展開溶媒として500μLずつ分画した。これら画分を吸光光度計により吸光測定し、260nmの吸光度が最も大きい画分を以降の合成に用いた。得られた分子の構造式はFc-C6-(C3)2-GCA ACC TTC CCT ATT ACT CCA C-(C3)3-(CH2)3-SH(分子2)であり、この分子のモル吸光係数ε=2.29×10−5M−1cm−1を用いて濃度を計算すると7.51μM(500μL)だった。図7bにこの分子の構造式を示した。
0.01M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)と100μMプローブ水溶液とを3:1の体積比で混合し、25μMプローブおよび7.5mM塩化ナトリウムを含む75mMリン酸緩衝液を調製した。カーボンくし形電極を用いて挿引速度10mV/s、0〜0.6V(銀塩化銀電極に対して)間でこの溶液5μLの電気化学測定を行ったところ、プローブに修飾したフェロセンの電子移動反応に起因するS字型の電流−電位曲線を得た。ここで、バックグラウンドとして7.5mM塩化ナトリウムを含む75mMリン酸緩衝液の電流−電位曲線を差し引いた。0〜0.3V間では電流値はほぼ0であったが、0.3V付近から急激な電流値の増加が観測され、0.4V付近でほぼ18nAの定電流であった(図8a)。この曲線の変曲点における電位を微分により算出すると0.363Vであった(図8b)。以降同様に、電流−電位曲線の変化をこの変曲点電位にて追うこととした。
Claims (11)
- 電気化学活性団と、前記電気化学活性団の電気化学活性を抑制する活性抑制団と、目的物質を特異的に分子認識するレセプター領域と、分子認識の結果立体構造を変化させる構造変化領域とを備え、分子認識前は前記電気化学活性団が前記活性抑制団により活性を抑制され、分子認識後は活性を取り戻すことを特徴とする分子認識プローブ。
- 前記レセプター領域が、前記構造変化領域を兼ねていることを特徴とする請求項1に記載の分子認識プローブ。
- 固体表面上に固定するためのアンカー領域を備えたことを特徴とする請求項1又は2に記載の分子認識プローブ。
- 前記電気化学活性団が、メタロセン又はその誘導体であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の分子認識プローブ。
- 前記活性抑制団が、前記電気化学活性団を内包することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の分子認識プローブ。
- 前記活性抑制団が、シクロデキストリン又はカリックスアレン或いはこれらの誘導体であることを特徴とする請求項5に記載の分子認識プローブ。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の分子認識プローブを固体表面に固定化することで作製した電気化学センサ。
- 目的物質を含有する溶液と、請求項1〜6のいずれか1項に記載の分子認識プローブを接触させて、該分子認識プローブから発生される、分子認識前後の電気化学信号の変化を検出することを特徴とする電気化学的検出方法。
- 前記電気化学信号の変化が、電流値の増減又は電圧値の増減であることを特徴とする請求項8に記載の電気化学的検出方法。
- 目的物質を含有する溶液と、請求項7に記載の分子認識センサを接触させて、該分子認識センサから発生される、分子認識前後の電気化学信号の変化を検出することを特徴とする電気化学的検出方法。
- 前記電気化学信号の変化が、電流値の増減又は電圧値の増減であることを特徴とする請求項10に記載の電気化学的検出方法。
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