JPWO2009157219A1 - Ｄｎａコンジュゲートを利用した核酸の電気化学的検出法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡの固定化等を必要としない、より簡便で、かつ精度の高い遺伝子検出技術を提供すること。【解決手段】本発明は、シクロデキストリン等のホスト化合物を一端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチドを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡコンジュゲートを利用した核酸の電気化学的検出法に関する。

以前に本発明者はDNA末端にFcを修飾したコンジュゲートを合成し、これを用いて電気化学検出器を備えたHPLCを利用した超高感度遺伝子検出法を提案している（非特許文献１：S. Takenaka, Y. Uto, H. Kondo, T. Ihara, M. Takagi, Anal. Biochem., 1994, vol. 218, pp. 436-443; 非特許文献２：T. Ihara, Y. Maruo, S. Takenaka, M. Takagi, Nucleic Acids Res., 1996, vol. 24, pp. 4273-4280）。さらに同コンジュゲートと電極固定化DNAとを利用した遺伝子センサーも世界に先駆けて発表している（非特許文献３：T. Ihara, M. Nakayama, M. Murata, K. Nakano, M. Maeda, Chem. Commun., 1997, vol. 1997, pp. 1609-1610; 非特許文献４：M. Nakayama, T. Ihara, K. Nakano, M. Maeda, Talanta, 2002, vol. 56, pp. 857-866）。これらの研究に続いて世界中で遺伝子の電気化学的検出法が提案されたが、いずれもハイブリダイゼーションによりその電気化学的シグナルは変化しないためにターゲットDNAの一部を固相単体上に固定化した系を利用しており、検出する前にフリー、あるいは非特異的に結合したコンジュゲートを充分に洗浄、除去する必要があった。

DNAがハイブリダイズすることでシグナルが変化する系として、Fc-DNAコンジュゲートを電極上に固定化したものが報告されている（例えば、非特許文献５：C. E. Immoos, S. J. Lee, M. W. Grinstaff, J. Am. Chem. Soc., 2004, vol. 126, pp. 10814-10815）。これは、ターゲットDNAとのハイブリダイゼーションにより電極上に固定化されたコンジュゲートの構造が変化し（hairpin → duplex）、それに伴ってFcと電極との距離が変化することを利用して電流値を変化させる仕組みに基づいている。しかしながら、やはりこの系もDNAの固定化を必要とする。

本発明者らの研究を含め（例えば、非特許文献６：S. Takenaka, T. Ihara, M. Hamano, M. Takagi, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, vol. 1990, pp. 1271-1273）、DNAとの結合により電気化学的シグナルが変化する小分子はこれまでにも幾つか知られている。しかしながら、インターカレータなどのこれら小分子は塩基配列認識能がほとんどないために、現在必要とされている一塩基レベルの個人差（SNP）を見分ける目的で使用することは困難であった。
S. Takenaka, Y. Uto, H. Kondo, T. Ihara, M. Takagi, Anal. Biochem., 1994, vol. 218, pp. 436-443 T. Ihara, Y. Maruo, S. Takenaka, M. Takagi, Nucleic Acids Res., 1996, vol. 24, pp. 4273-4280 T. Ihara, M. Nakayama, M. Murata, K. Nakano, M. Maeda, Chem. Commun., 1997, vol. 1997, pp. 1609-1610 M. Nakayama, T. Ihara, K. Nakano, M. Maeda, Talanta, 2002, vol. 56, pp. 857-866 C. E. Immoos, S. J. Lee, M. W. Grinstaff, J. Am. Chem. Soc., 2004, vol. 126, pp. 10814-10815 S. Takenaka, T. Ihara, M. Takagi, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, pp. 1485-1487

このような状況下、ＤＮＡの固定化等を必要としない、より簡便で、かつ精度の高い遺伝子検出技術が求められている。

本発明は、以下の修飾オリゴヌクレオチド、電気化学的遺伝子検出用キット、および電気化学的遺伝子検出方法を提供する。

（１）ホスト化合物を一端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチド。
（２）上記ホスト化合物が５’末端に結合している、上記（１）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（３）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（１）または（２）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（４）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（１）または（２）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（５）上記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。

（６）ホスト化合物を５’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチド、および
レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチド
を含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
上記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、上記所望の部位の３’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
（７）ホスト化合物を３’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチド、および
レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチド
を含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
上記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、上記所望の部位の５’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
（８）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（６）または（７）に記載のキット。
（９）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（６）または（７）に記載のキット。
（１０）上記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、上記（６）〜（９）のいずれかに記載のキット。
（１１）上記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、上記（１０）に記載のキット。
（１２）上記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（６）〜（１１）のいずれかに記載のキット。

（１３）ホスト化合物を５’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチドおよびレポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
上記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
上記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、上記ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、上記所望の部位の３’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
（１４）ホスト化合物を３’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチドおよびレポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
上記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
上記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、上記ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、上記所望の部位の５’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
（１５）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（１３）または（１４）に記載の方法。
（１６）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（１３）または（１４）に記載の方法。
（１７）上記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）上記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、上記（１７）に記載の方法。
（１９）上記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（１３）〜（１８）のいずれかに記載の方法。

（２０）ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、修飾オリゴヌクレオチド。
（２１）ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、修飾オリゴヌクレオチド。
（２２）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（２０）または（２１）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（２３）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（２０）または（２１）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（２４）上記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（２５）上記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、上記（２４）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（２６）電気化学的モレキュラービーコンである、上記（２０）〜（２５）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（２７）上記オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（２０）〜（２６）に記載の修飾オリゴヌクレオチド。

（２８）ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
上記修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
（２９）ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを含む電気化学的遺伝子検出用キットであって、
上記修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
（３０）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（２８）または（２９）に記載のキット。
（３１）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（２８）または（２９）に記載のキット。
（３２）上記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、上記（２８）〜（３１）のいずれかに記載のキット。
（３３）上記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、上記（３２）に記載のキット。
（３４）上記オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（２８）〜（３３）に記載のキット。

（３５）ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
上記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
（３６）ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
上記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
上記レポーター分子は、上記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
（３７）上記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、上記（３５）または（３６）に記載の方法。
（３８）上記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、上記（３５）または（３６）に記載の方法。
（３９）上記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、上記（３５）〜（３８）のいずれかに記載の方法。
（４０）上記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、上記（３９）に記載の方法。
（４１）上記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、上記（３５）〜（４０）のいずれかに記載の方法。

ターゲットとの結合に際して、その光学的性質を変えるプローブは多く知られているが、均一溶液中でその電気化学的性質をコントロールして、遺伝子検出に利用した例は従来にはない。本発明のＤＮＡコンジュゲート（例えば、一実施形態としてのβ−シクロデキストリン（本明細書中、「βＣｙＤ」と略記することがある。）修飾ＤＮＡコンジュゲート）は、均一溶液中でその電気化学的性質をコントロールして遺伝子検出に利用され得る。

本発明によれば、コンジュゲートのＤＮＡの塩基配列を適当に選んでやることでβＣｙＤをテンプレートＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）上の望む位置に配置することができる。このＤＮＡコンジュゲートに加えて、βＣｙＤに包接される性質を持つ比較的疎水性の高いレポーター分子（発信号分子）を修飾したＤＮＡコンジュゲートを調製する。これら２つのコンジュゲートのＤＮＡの塩基配列を同じテンプレートＤＮＡの隣り合うサイトにそれぞれ相補的となるように構成し、これらコンジュゲートをそのサイトにハイブリダイズさせてタンデム二本鎖を形成させることで、レポーター分子とβＣｙＤがテンプレート上で対峙するように配置することができる。レポーター分子としては、βＣｙＤに包接されることでそのシグナルが変化するような分子なら任意のものが使用できる。このようなＤＮＡコンジュゲートは遺伝子解析に利用することができる。また、１つのＤＮＡの両端にβＣｙＤとレポーター分子とをそれぞれ修飾したＤＮＡコンジュゲートも同様に遺伝子解析に利用することができる。

複数の異なるコンジュゲート（第一および第二の修飾オリゴヌクレオチド）の協同作業による本発明の遺伝子検出方法の一実施形態においては、タンデム二本鎖複合体の中でＦｃがβＣｙＤに包接され、バルクから遮蔽されることでその電子移動速度が著しく低下することを利用している（図４）。電気化学法においてβＣｙＤは蛍光法における消光剤に相当する機能を持つために、分光学的手法において用いられているシステムを電気化学法を利用したものに移行させることが可能である。たとえば、両末端に蛍光物質と消光物質を修飾したＤＮＡはモレキュラービーコン（ＭＢ）としてよく知られているが、本発明の一実施形態として蛍光物質と消光物質の代わりにＦｃとβＣｙＤにより両端を修飾したＤＮＡコンジュゲートは、ヘアピン型から二本鎖への構造変化に伴い、その電流値が増加するタイプの電気化学的モレキュラービーコン（ＥＣＭＢ）として利用することができる（図６）。

本発明により、高感度な電気化学的遺伝子検出法、それに用いる修飾オリゴヌクレオチド、およびキットが提供される。本発明の電気化学的遺伝子検出法によれば、従来のインターカレータなどの小分子を用いた方法では困難であった一塩基レベルの個人差（SNP）を見分けることが可能である。

本発明の方法は、従来のFc-DNAコンジュゲートを用いる方法では必要であったオリゴヌクレオチドの固相への固定化が必要ではない点で有利である。本発明の電気化学的方法は、安価であり、用途に合わせて小型化が可能であるという利点がある。本発明は、バイオテクノロジー分野の中の特に遺伝子検出・解析技術において、その基礎技術として有用である。

また、本発明の遺伝子検出法では、レポーター分子としてＦｃの他に一般的な色素、蛍光性分子なども用いることが可能であり、該検出法は汎用性に優れた手法である。

１．本発明の修飾オリゴヌクレオチド
フェロセン（Ｆｃ）は、電気化学的に活性な分子としてよく知られているが、そのサイズはβ−シクロデキストリン（βＣｙＤ）の空孔によくフィットし、包接錯体を形成する。βＣｙＤとＦｃを末端にそれぞれ修飾した２種類のＤＮＡコンジュゲートを合成し、それらに相補的なＤＮＡを足場としてこの包接反応を制御することによって、包接に伴う電気化学的シグナルの変化を遺伝子検出に利用することができる。

本発明の典型的な実施形態においては、ターゲットＤＮＡの隣り合うサイトに相補的な２つのＤＮＡの３’、５’末端にそれぞれＦｃとβＣｙＤを修飾した２種類のＤＮＡコンジュゲート、３’Ｆｃ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と５’ＣｙＤ−ＯＤＮをプローブとして合成する。これらのコンジュゲートは、ターゲットと混合した場合、修飾部位が互いに向かい合うようにターゲットＤＮＡとタンデム二本鎖を形成し、向かい合ったＦｃとβＣｙＤは包接錯体を形成し（図４）、包接に伴うＦｃからの電気化学的シグナルの変化が検出されうる。本発明は、このような原理に基づく遺伝子検出法に関するものである。

したがって、本発明は、１つの実施形態において、β−シクロデキストリンを一端に結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）修飾オリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、β−シクロデキストリンはこのオリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。このオリゴヌクレオチドの塩基配列は、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に相補的であるように構成される。但し、この相補性は完全（１００％）である必要はなく、上記所望の部位に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的であればよいから、相補性の程度は目的に応じて適宜調節してよい。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性の程度は、ハイブリダイズする際の温度、塩濃度等によっても変化する（または調節しうる）ことは当業者に周知である。特異性を高めるには比較的低い塩濃度および／または高温の条件（例：約０．０２ｍｏｌ／ｌ〜約０．１５ｍｏｌ／ｌの塩濃度および約５０℃〜約７０℃の温度）でハイブリダイズしうる程度の相補性が求められる。

上記オリゴヌクレオチドは、糖部がリボースからなるオリゴリボヌクレオチドまたは糖部がデオキシリボースからなるオリゴデオキシリボヌクレオチドでありうるが、好ましくは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの長さの下限は、約２ヌクレオチド、好ましくは３ヌクレオチド、より好ましくは４ヌクレオチド、さらに好ましくは５ヌクレオチド、なおさらに好ましくは６ヌクレオチド、そして最も好ましくは７ヌクレオチドであるかまたはそれより大きく、上限は、約１００ヌクレオチド、好ましくは約８０ヌクレオチド、より好ましくは約６０ヌクレオチド、さらに好ましくは約４０ヌクレオチド、なおさらに好ましくは約３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは約２０ヌクレオチドであるかまたはそれより小さい。典型的には、上記オリゴヌクレオチドの長さは、約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドであるが、これに限定されない。本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、自動合成機などを使用して所望の長さおよび塩基配列を有するものを合成することができる。

上記の修飾オリゴヌクレオチド（第一の修飾オリゴヌクレオチド）は、レポーター分子を一端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチドとともに、遺伝子の電気化学的検出のために使用することができる。第二の修飾オリゴヌクレオチドは、第一の修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするターゲットポリヌクレオチド上の上記所望の部位に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含む。

βＣｙＤが第一のオリゴヌクレオチドの５’末端に結合されている場合には、レポーター分子は第二のポリペプチドの３’末端に結合され、第二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするターゲットポリヌクレオチド上の上記所望の部位の３’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含むように構成される。βＣｙＤが第一のオリゴヌクレオチドの３’末端に結合されている場合には、レポーター分子は第二のポリペプチドの５’末端に結合され、第二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするターゲットポリヌクレオチド上の上記所望の部位の５’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含むように構成される。このように構成することで、第一の修飾オリゴヌクレオチドと第二の修飾オリゴヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズした際に、βＣｙＤとレポーター分子とが互いに対峙するように配置することができる。

βＣｙＤと対峙した上記レポーター分子は、β−シクロデキストリンと包接錯体を形成し得る。包接錯体が形成されるとレポーター分子の電気化学的シグナルが遮蔽され、減弱する。このシグナル強度の変化を検出することによって、ターゲットポリヌクレオチドと本発明の修飾オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを確認することができる。

ここで、「包接錯体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、クラスレート化合物（ｃｌａｔｈｒａｔｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ともいい、分子錯体の一種であり、一方の化学種が１〜３次元の分子規模の空間をつくり、その空間に寸法と形状が適合することを第一要件として他方の化学種が取り込まれる（包接される）ことによって生じる化合物のことをいう（大木他編 「化学大事典」 第１版 東京化学同人 １９８９）。空間を提供する化学種をホスト、包接される化学種をゲストという。本発明において使用される包接錯体の典型例は、ホストとしてβ−シクロデキストリン、ゲストとしてフェロセンからなる。しかしながら、本発明において使用しうる包接錯体の組み合わせはこれに限定されるものではなく、包接錯体の形成の前後で検出されるゲスト化合物の電気化学的シグナルが変化するものであればよい。

レポーター分子（本発明におけるゲスト化合物）は、β−シクロデキストリンその他のホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化するものならば特に限定されない。本発明において使用されるレポーター分子の例としては、フェロセン等の電気化学活性なメタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、これらの誘導体等の電気化学活性な小分子が挙げられる。

本発明で使用されるホスト化合物としては、レポーター分子が包接されうる空間を提供できるものであって、レポーター分子を取り込んだ場合にその電気化学的活性を遮蔽しうるものであれば特に限定されない。本発明において使用されるホスト化合物の例としては、シクロデキストリン（ＣｙＤ）（例えば、β−シクロデキストリン（βＣｙＤ）、α−シクロデキストリン（αＣｙＤ）、γ−シクロデキストリン（γＣｙＤ）等）またはこれらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、キューカービチュリル類などが挙げられる。なお、カリックスアレーン類、シクロファン類、キューカービチュリル類には、カリックスアレーンおよびその誘導体、シクロファン類およびその誘導体、キューカービチュリルおよびその誘導体がそれぞれ含まれるものとする。

上記の電気化学活性なゲスト化合物とホスト化合物との好適な組合せ例としては、ＣｙＤ−フェロセン（Ｄ． Ｒ． ｖａｎ Ｓｔａｖｅｒｅｎ， Ｎ． Ｍｅｔｚｌｅｒ−Ｎｏｌｔｅ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， １０４， ５９３１−５９８５ （２００４））、ＣｙＤ−メタロセン（Ｆ． Ｈａｐｉｏｔ， Ｓ． Ｔｉｌｌｏｙ， Ｅ． Ｍｏｎｆｌｉｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， １０６， ７６７−７８１ （２００６））、ＣｙＤ−アントラキノン（Ｘ． −Ｊ． Ｄａｎｇ， Ｊ． Ｔｏｎｇ， Ｈ． −Ｌ． Ｌｉ， Ｊ． Ｉｎｃｌ． Ｐｈｅｎｏｍ．， ２４， ２７５−２８６ （１９９６））、キューカービチュリル−フェロセン（Ｄ． Ｓｏｂｒａｎｓｉｎｇｈ， Ａ． Ｅ． Ｋａｉｆｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２００５， ５０７１−５０７３）、ＣｙＤ−フラビン、ＣｙＤ−フラーレンなど多くの例が挙げられる。なお、ＣｙＤ一般については、“Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”， Ｈ． Ｄｏｄｚｉｕｋ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ （２００６）に詳説されている。

オリゴヌクレオチドの一端に上記ホスト化合物が結合した本発明のホスト化合物修飾オリゴヌクレオチドは、末端に第一級アミノ基またはチオール基を化学修飾したオリゴヌクレオチドと活性化したホスト化合物とのカップリング、または、ホスト化合物誘導体を基体とするアミダイト試薬を用いたDNA合成によって作製することができる。

レポーター分子（ゲスト化合物）を一端に結合したオリゴヌクレオチドは、末端に第一級アミノ基またはチオール基を化学修飾したオリゴヌクレオチドと活性化したレポーター分子とのカップリング、またはレポーター分子を基体とするアミダイト試薬を用いたDNA合成によって作製することができる。

ターゲットポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子検出方法において、検出対象となるポリヌクレオチド（例：標的遺伝子）のことをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうるが、好ましくは、ＤＮＡである。

本発明は、さらに別の実施形態において、１つのオリゴヌクレオチドの両端にβ−シクロデキストリンとレポーター分子とをそれぞれ結合した修飾オリゴヌクレオチドを提供する。β−シクロデキストリンが５’末端に結合される場合には、レポーター分子は３’末端に結合され、β−シクロデキストリンが３’に結合される場合には、レポーター遺伝子は５’末端に結合される。オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含むように構成される。上記レポーター分子は、β−シクロデキストリンと包接錯体を形成し得、β−シクロデキストリンに包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する。なお、この実施形態においても、β−シクロデキストリン以外に、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、キューカービチュリル類などのホスト化合物が用いられうる。また、レポーター分子としては、フェロセン等を含むメタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、これらの誘導体等の電気化学活性な小分子が用いられうる。

このように構成された修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズしていないときは、両端のβＣｙＤとレポーター分子とが包接錯体を形成し、ヘアピン状の形態（ステム・ループ構造）をとる。ターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズする際には、ループ構造が解かれて伸長した形態をとる。この形態の修飾オリゴヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズしたときには、レポーター分子からの電気化学的シグナルの増大が検出される。例えば、両末端に蛍光物質と消光物質を修飾したＤＮＡはモレキュラービーコン（ＭＢ）としてよく知られているが、本発明の一実施形態として蛍光物質と消光物質の代わりにＦｃとβＣｙＤを修飾したＤＮＡコンジュゲートは、ヘアピン型から二本鎖への構造変化に伴い、その電流値が増加するタイプの電気化学的モレキュラービーコン（ＥＣＭＢ）として利用することができる（図６）。

２．本発明の修飾オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子検出方法
本発明は、さらに別の実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを用いた電気化学的遺伝子検出法を提供する。本発明の電気化学的遺伝子検出方法は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、およびその後のレポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程を含む。

ターゲットポリヌクレオチドと本発明の修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションをすると、レポーター分子（ゲスト化合物）がβ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、キューカービチュリル類などのホスト化合物と包接錯体を形成してレポーター分子の電気化学的シグナルが減弱されるか、またはモレキュラービーコンタイプの修飾オリゴヌクレオチドの場合には反対にレポーター分子の電気化学的遮蔽が解除されてシグナルが増大する。

本発明の遺伝子検出法においては、ターゲットポリヌクレオチドを含有する試料溶液と上記第一および第二の修飾オリゴヌクレオチドとを混合した際の、この電気化学的シグナルの変化を検出することによって、ターゲットポリヌクレオチドの存在を検出することができる。レポーター分子が発する電気化学的シグナルは、例えば、βＣｙＤ修飾オリゴヌクレオチドとレポーター分子修飾オリゴヌクレオチドの混合溶液を、作用電極、対電極、および参照電極からなる３電極方式の電解セルに入れ、これにターゲットを添加した後に、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）、スクエアウェーブボルタンメトリー（ＳＷＶ）などの各種ボルタンメトリーにより観察する。または、フロー式の電気化学検出器内に先の試料を導入することでより高感度に測定することができる。また、ターゲットポリヌクレオチドを含有する試料の例には、細胞抽出液をＰＣＲで増幅した試料等が含まれるが、これに限定されない。
３．本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む遺伝子検出用キット

本発明は、さらなる実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む、電気化学的遺伝子検出用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の電気化学的遺伝子検出法を実施するために用いることができる。本発明のキットは、必要に応じて、使用方法を記載した説明書、容器、ラベルなどを含んでいても良い。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されない。

［実施例１］３’Ｆｃ−ＯＤＮおよび５’ＣｙＤ−ＯＤＮの調製
フェロセンカルボン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、フェロセンカルボン酸の活性エステルとした。緩衝液とＤＭＳＯ混合溶媒中、３’末端に第一級アミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを大過剰のフェロセンカルボン酸の活性エステルとカップリングさせることで３’Ｆｃ−ＯＤＮを得た。ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで同定した。

β−シクロデキストリンの第一級水酸基のうちの一つをトシル化し、次いでこれをチオール基に変換した。チオール基はさらにアルドリチオールで活性化した。５’末端にチオール基を導入したオリゴヌクレオチドと先の活性化β−シクロデキストリンとをカップリングして５’ＣｙＤ−ＯＤＮを得た。ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで同定した。

図１ＡおよびＢは、それぞれ、Ａ）３’Ｆｃ−ＯＤＮ、およびＢ）５’ＣｙＤ−ＯＤＮの構造を示す。図１Ａは、１５量体ＤＮＡの３’末端にＦｃを修飾したもの、図１Ｂは、７量体の５’末端にβＣｙＤを修飾したものを示す。両コンジュゲートはターゲットＤＮＡの隣り合うサイトに相補的である。両コンジュゲートの塩基配列はターゲットとのタンデム二本鎖を形成した際に修飾分子を互いに内側に向けるように設計されている。

［実施例２］ターゲットＤＮＡとのタンデム二本鎖の溶融実験
実施例１で作製したタンデム二本鎖を用いて融解実験を行った。

（手順）
５’ＣｙＤ−ＯＤＮ、３’Ｆｃ−ＯＤＮ、およびターゲットＤＮＡを１μＭとなるように緩衝溶液（１０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解し、３者からなるタンデム二本鎖（３’Ｆｃ−ＯＤＮ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ）を形成させた。０℃から溶液の温度をゆっくりと上昇させ（０．２℃／ｍｉｎ以下）ながら、２６０ ｎｍの吸光度を測定した。

非線形最小二乗法により、融解曲線を二状態モデルを仮定した理論式にフィッティングして種々の熱力学的パラメータ（Ｋ、ΔＧ、ΔＨ、ΔＳ）を得た。

（結果）
その結果、融解過程で最初に解離する５’ＣｙＤ−ＯＤＮの融解温度は隣接するＤＮＡがＦｃを持たない未修飾のときに比べて２０℃近く上昇していることがわかった。図２は、タンデム二本鎖の融解挙動を示す図である。低温側の融解が８量体の５’ＣｙＤ−ＯＤＮ、高温側が１５量体の未修飾ＤＮＡまたは３’Ｆｃ−ＯＤＮの融解を示している。隣接する１５量体の末端に何も修飾されていない場合（点線）の融解温度は１８．７℃であり、Ｆｃが修飾されているとき（実線）には３７．４℃であった。この著しい安定化は両コンジュゲート末端でＦｃがβＣｙＤに包接されて複合体が熱的に安定化した結果と考えられる。これはΔＧ_２９８にして３ ｋｃａｌ／ｍｏｌ程度の安定化（結合定数にして約２６０倍の増大）に相当し、二本鎖上でＦｃがβＣｙＤに包接されていることが示唆された。

［実施例３］電気化学的シグナルの測定
（手順）
リン酸緩衝液中（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．５Ｍ ＫＣｌ）での電気化学測定を行った。作用電極、および対極として金、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。３’Ｆｃ−ＯＤＮのみ、３’Ｆｃ−ＯＤＮ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮ、３’Ｆｃ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ、およびタンデム二本鎖３’Ｆｃ−ＯＤＮ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔについて測定した。

（結果）
電気化学測定を行った結果、タンデム二本鎖形成に伴ってＦｃの酸化電流が著しく減少することがわかった。図３は、ＤＮＡ複合体のサイクリックボルタモグラムである。３’Ｆｃ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ、３’Ｆｃ−ＯＤＮ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮ系の電流値は３’Ｆｃ−ＯＤＮのみのときとほとんど変わらなかった。タンデム二本鎖（３’Ｆｃ−ＯＤＮ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ）が形成し、ｔａｒｇｅｔ上でＦｃとβＣｙＤが接したときにだけ電流が著しく抑制された。

このことから、タンデム二本鎖複合体上でβＣｙＤに包接されることによりＦｃが電極から遮蔽され、その電子移動が抑制されたものと考えられる。タンデム二本鎖複合体上でβＣｙＤにＦｃが包接される様子を模式的に表したのが図４である。図４は、３’Ｆｃ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮのタンデム二本鎖の可能な構造の一つを示す。ＦｃはβＣｙＤ内に包接され外界から遮蔽されることでその電極との電子移動反応が著しく抑制される。電気化学法においてβＣｙＤには蛍光法における消光分子に相当する機能が期待できる。

以上の結果から、ＤＮＡをテンプレートとしたハイブリダイゼーションに基づくβＣｙＤとの相互作用はＦｃの電気化学的シグナルを変化させるための汎用の基礎技術となり得ることがわかった。

［実施例４］本発明の修飾オリゴヌクレオチドの遺伝子解析への応用（その１）
実施例３の結果を踏まえて、TPMT遺伝子（チオプリンメチルトランスフェラーゼ：薬剤の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子。ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）塩基の種類により抗ガン剤メルカプトプリンの投与量を決める）のホットスポットを含む遺伝子配列を化学合成し、遺伝子解析への応用可能性を検討した。

（手順）
まず、ＴＰＭＴ遺伝子のＳＮＰサイトにそれぞれ４種類の塩基を提示した４つのターゲットについて先と同様の融解実験を行った。ここで利用した二本鎖に関しては野生型であるＣをもつターゲットとの間に形成する二本鎖の融解温度は約５０℃、それ以外のＡ、Ｔ、Ｇを含む変異型ターゲットの場合の融解温度は約２５℃であった。よって、ＳＮＰ解析はこの中間の温度である３５℃で行った。グラッシーカーボンを作用電極、白金ワイヤーを対極、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照電極として用いて、リン酸緩衝液中（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．５Ｍ ＫＣｌ）でスクエアウェープボルタンメトリーを行った。

（結果）
その結果、変異型Ｇ、Ｔ、Ａの場合には大きな電流を示したが、野生型であるＣの場合にだけこの電流値が著しく低下した（図５）。図５は、複合体のスクエアウェーブボンタンメトリーを示す。テンプレートＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）が３’Ｆｃ−ＯＤＮに完全に相補的な場合（Ｇ−Ｃ）には安定に二本鎖を形成するためにβＣｙＤへの包接の影響で電子移動が著しく抑制されているが。一塩基が置換されたＤＮＡをテンプレートとすると包接が完全に進行しないために大きな電流値を示した。

［実施例５］本発明の修飾オリゴヌクレオチドの遺伝子解析への応用（その２）
図６は、（Ａ）従来のモレキュラービーコン（ＭＢ）と（Ｂ）本発明の電気化学的モレキュラービーコン（ＥＣＭＢ）の動作原理を示す図である。本発明では、ＦｃとβＣｙＤが両末端に修飾されたオリゴヌクレオチドは通常末端の相補的な数量体がステムを形成してヘアピン構造をとり、その際ＦｃはβＣｙＤに包接されてその電気化学活性を抑制される。ターゲットが添加されるとヘアピン構造が解消し、ターゲットとの二本鎖を形成する。これに伴ってＦｃはむき出しになり、本来の電気化学活性を取り戻す。すなわち、電気化学法においてβＣｙＤは従来の蛍光法における消光剤と同等の役割を果たすユニットとして用いることができる。

電気化学法は分光学的手法と比較すると高感度であり、使用する機器も安価であり、用途に合わせて小型化が可能である。本発明は、そのような電気化学的方法に基づく新たな遺伝子検出方法を提供するものであり、バイオテクノロジー分野の中の特に遺伝子検出・解析技術において、その基礎技術として有用である。

ＤＮＡコンジュゲート（Ａ）３’Ｆｃ−ＯＤＮ、および（Ｂ）５’ＣｙＤ−ＯＤＮの構造を示す。 タンデム二本鎖の融解挙動を示す。 ＤＮＡ複合体のサイクリックボルタモグラムである。 ３’Ｆｃ−ＯＤＮ／ｔａｒｇｅｔ／５’ＣｙＤ−ＯＤＮのタンデム二本鎖の可能な構造の一つを示す。 複合体のスクエアウェーブボンタンメトリーを示す。 （Ａ）従来のモレキュラービーコン（ＭＢ）、および（Ｂ）本発明の電気化学的モレキュラービーコン（ＥＣＭＢ）の動作原理を示す図である。

Claims (41)

1. ホスト化合物を一端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチド。
2. 前記ホスト化合物が５’末端に結合している、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
3. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
4. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
5. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
6. ホスト化合物を５’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチド、および
   レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチド
   を含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
   前記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
   前記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、前記所望の部位の３’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
   前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
7. ホスト化合物を３’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチド、および
   レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチド
   を含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
   前記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
   前記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、前記所望の部位の５’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
   前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
8. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項６または７に記載のキット。
9. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項６または７に記載のキット。
10. 前記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、請求項６〜９のいずれかに記載のキット。
11. 前記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、請求項１０に記載のキット。
12. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項６〜１１のいずれかに記載のキット。
13. ホスト化合物を５’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチドおよびレポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
    前記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
    を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
    前記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、前記ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、前記所望の部位の３’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
14. ホスト化合物を３’末端に結合した第一の修飾オリゴヌクレオチドおよびレポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した第二の修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
    前記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
    を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
    前記第一の修飾オリゴヌクレオチドは、前記ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記第二の修飾オリゴヌクレオチドは、前記所望の部位の５’末端側に隣接する部位の塩基配列に対して特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接された場合に、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
15. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項１３または１４に記載の方法。
17. 前記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
20. ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、修飾オリゴヌクレオチド。
21. ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドであって、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、修飾オリゴヌクレオチド。
22. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項２０または２１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
23. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項２０または２１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
24. 前記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド。
25. 前記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、請求項２４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
26. 電気化学的モレキュラービーコンである、請求項２０〜２５に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
27. 前記オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項２０〜２６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
28. ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを含む、電気化学的遺伝子検出用キットであって、
    前記修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
29. ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを含む電気化学的遺伝子検出用キットであって、
    前記修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出用キット。
30. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項２８または２９に記載のキット。
31. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項２８または２９に記載のキット。
32. 前記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、請求項２８〜３１のいずれかに記載のキット。
33. 前記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、請求項３２に記載のキット。
34. 前記オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項２８〜３３に記載のキット。
35. ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、ホスト化合物を５’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を３’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
    前記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
    を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
36. ターゲットポリヌクレオチドの所望の部位の塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる程度に相補的な塩基配列を含み、ホスト化合物を３’末端に、レポーター分子（ゲスト化合物）を５’末端に結合した修飾オリゴヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液と混合する工程、ならびに
    前記レポーター分子の電気化学的シグナルの変化を検出する工程、
    を含む、電気化学的遺伝子検出法であって、
    前記レポーター分子は、前記ホスト化合物と包接錯体を形成し得、該ホスト化合物に包接されている場合と包接されていない場合とで、その電気化学的シグナルが変化する、電気化学的遺伝子検出法。
37. 前記ホスト化合物が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体、カリックスアレーン類、シクロファン類、またはキューカービチュリル類のいずれかである、請求項３５または３６に記載の方法。
38. 前記ホスト化合物が、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項３５または３６に記載の方法。
39. 前記レポーター分子が、メタロセン、金属錯体、アントラキノン、ビオローゲン、メチレンブルー、フラビン、フラーレン、ドーノマイシン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される電気化学活性な小分子である、請求項３５〜３８のいずれかに記載の方法。
40. 前記メタロセンが、フェロセンまたはその誘導体である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項３５〜４０のいずれかに記載の方法。