JP2009139114A - 免疫測定用電気化学センサー - Google Patents

Abstract

【課題】ディスポーザブルなタイプで、小スケールで迅速・簡便に酵素活性を精度よく測定することが可能である、抗体が電極上に固定化されてなる電気化学センサーを提供する。
【解決手段】金属電極上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子を介して抗体が共有結合により固定化されてなり、該固定化された抗体に対する抗原が作用することにより生ずる電気化学的なシグナルの変動、例えば酸化もしくは還元電流を検出することを特徴とする電気化学センサー。
【選択図】 なし

Description

本発明は、電気化学的な方法によりイムノアッセイを行うための電気化学センサーに関する。より詳細には、金属電極の表面に、抗体を共有結合により固定化されてなる電気化学センサーに関する。

固定化された抗体を電極と組み合わせ、電気的信号として物質を定量する免疫センサーは、抗原抗体反応により電極上で生ずる化学物質の消費や生成を、電極で電流値や電位値の変化として測定する。電気化学的な手法を用いた免疫センサーは、古くから報告があり、不溶性担体に抗原もしくは抗体が固定化され免疫反応のサインドイッチを形成して酵素反応を行う際に、電極を挿入して測定する方法が報告されている（特許文献１）。その他にも、予め微小電圧が印加された試薬を用いて、免疫凝集反応を検出する方法（特許文献２）、脂質薄膜の電気伝導度の変化量から免疫反応を検出する方法（特許文献３）など多くのものが例示される。検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングによる方法は有利といえる。

上記のように、免疫センサーについては、既に多数の報告がなされているが、高精度化と安定性に関しては、依然として課題が残っており、現在も多くの研究開発が続けられている。また、近年では特にＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）への電気化学測定の適用も広がっていることから（特許文献４）、コンパクトで扱いやすく、ディスポーザブルなものが求められるようになっている。したがって、電極の小型化も重要な課題の一つとなっている。

抗体の固定化様式としては、物理的な吸着による方法（特許文献５）、ＩｇＧ抗体に特異的に結合性を有するプロテインＡを表面に導入して固定化する方法（特許文献６）、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシドを介する方法（特許文献７）などが挙げられるが、必ずしも満足いくような性質のものは得られていない。
抗体の安定化、固定化効率、反応性などの点において、必ずしも有用とはいえない。

一方、少ないサンプル量で迅速に測定を行うために、電極の微小化に関しても様々な報告がある。これらに関しても、多くの試みが知られているが、例えば、マイクロ流路を組み合わせた測定システム（特許文献８）や、絶縁基板上に導電性材料をパターニングすることで形成された使い捨てが可能なプレナー型電極（特許文献９）などが報告されている。しかしながら、これらの電極やシステムを応用した測定系としては、まだ有効に活用できているとは言い難く、必ずしも十分なレベルに達していないのが実情である。

特開平５−７２２０５号公報 特開平１０−７３５９５号公報 特開２００２−１７４６１３号公報 特開２００６−２２７０９６号公報 特表２００４−５２７７６９号公報 特許第２９２２０４０号公報 特開平９−２５７７９３号公報 特開２００７−２４７４２号公報 特開２００７−２７８９８１号公報

本発明の課題は、ディスポーザブルなタイプの、小スケールで迅速・簡便にイムノアッセイを精度よく行うことが可能である、抗体が電極に固定化されてなる電気化学センサーを提供することにある。

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。

（１）金属電極上に親水性高分子を介して抗体が共有結合により固定化されてなり、該固定化された抗体に対する抗原の結合を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学センサー。
（２）金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする（１）の電気化学センサー。
（３）金属電極が円形であることを特徴とする（１）又は（２）の電気化学センサー。
（４）金属電極の半径が２ｍｍ以下であることを特徴とする（３）の電気化学センサー。
（５）親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの電気化学センサー。
（６）固定化された抗体に対する抗原の結合を検出するに際して、酵素で標識された該抗原に結合する抗体を作用させた後、該標識酵素の基質を作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの電気化学センサー。

本発明における方法を用いることにより、微量サンプルを用いたイムノアッセイを簡便に行うことが可能である。ディスポーザブルな使用が可能であり取り扱いやすい点でも有利である。また、精度よく安定したイムノアッセイに有用なものとして期待される。

本発明は、電気化学センサーに関するものであり、金属電極上に親水性高分子を介して抗体が共有結合により固定化されてなり、かつ該固定化抗体に対する抗原の反応を電気化学的に検出することを特徴とするものである。電気化学的に検出される方法は、特に限定されるものではないが、例えば、抗原および酵素標識された二次抗体を作用させ、標識抗体に対する基質を反応させることによる、酸化もしくは還元反応により生じる電流の変化をアンペロメトリーにより測定する方法が挙げられる。

ここで、電気化学測定の方法は特に限定されないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることができる。一般的なテスターを用いてもよい。測定システムとしては、二電極であっても三電極系であってもよい。本発明においては、作用電極には白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属を用いることを特徴とする。なかでも、金が特に好ましい。参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。

ところで、チオール基は金属と特異的に反応して、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成することが知られている。作用電極に金属を用いると、この原理を適用して、容易に表面に官能基を導入することが可能になる。こうして、抗体の電極表面への固定化が可能になる。この固定化方法では、抗体の固定化密度をコントロールしやすくなり、再現性の点で有利になる。金属電極は、このように容易にＳＡＭ形成を行うことができる点で扱いやすいというメリットがある。

本発明においては、金属電極上において、特に親水性高分子を介して抗体が共有結合により固定化されていることを特徴とする。このような構成を有することで、抗体の安定性が向上するだけでなく、抗原との反応性も向上することができる。したがって、精度の高いイムノアッセイを実現することができるものである。

本発明において、親水性高分子とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはＰＥＧである。

こうした親水性高分子を介した形で、酵素を固定化するには、例えばＰＥＧを用いるのであれば、官能基等で修飾されたＰＥＧ誘導体を用いることが可能である。特に金属電極を用いる場合、チオール基を末端に有するＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。更には、蛋白質の一種である抗体をカップリングすることが可能であるような官能基を他方のＰＥＧ末端に有することがより好ましい。該官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、スクシンミド基などが挙げられるが、特にスクシンミド基であることが特に好ましい。すなわち、チオール基とスクシンミド基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用いると、１ステップで金属電極表面にスクシンミド基を導入することができる。また、チオール基とカルボキシル基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用い、水溶性カルボジミドを用いた縮合反応による固定化を行ってもよい。また、これらの場合のＰＥＧ架橋剤におけるエチレングリコールの繰り返しは、３〜２５程度の長さであることが好ましい。

また、チオール基の場合、安定性が比較的劣るため、チオール基が保護されてなる架橋財、好ましくはＰＥＧ誘導体からなる架橋剤を簡単な化学的処理を行うことにより、チオール基を要時調製により形成させて、金属電極の表面処理を施してもよい。具体的には、Ｓ−アセチル基を末端に有する化合物が挙げられる。これを脱アセチル処理を施すことによりチオール基を形成することができる。より好ましくは、Ｓ−アセチル基とともにスクシンミド基も併せ持ったＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。

本発明において、金属電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものがより好ましい。

本発明において、金属電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられるが、円形であることが、固定化する抗体溶液のマウントのしやすさの点から特に好ましい。また、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。抗体溶液の容量としては１〜５μｌ程度で十分であり、２−３μｌ程度の量で行うのがより好ましい。抗体溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。

本発明において、用いられる固定化用の抗体は特に限定されるものではなく、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体のいずれを用いてもよい。また、抗体の抗原結合部位を有するフラグメントや一本鎖抗体を用いることも可能である。

本発明における実施態様の一つとして、例えば、固定化された抗体に結合する抗原を作用させた後、酵素標識された二次抗体を作用させ、該標識酵素に対する基質を反応させる、いわゆるサンドイッチアッセイ系が例示される。標識酵素の種類としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。

免疫反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。

抗原抗体反応による電極間の電子移動を仲介するためのメディエーターを用いることも効果的である。適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、電子対として、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。その他にも、オスミウムやルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、抗体自体の安定性を損なったり、あるいは活性を失活させてしまう可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ＰＥＧのような親水性高分子で修飾されたものを用いてもよい。またメディ−ターについても種々の官能基による修飾体を用いて、酵素とともに金属電極上に固定化させて用いてもよい。

抗原抗体反応は、所望の容量の反応溶液中に、抗体が固定化された電極と所望の量のメディエーターを加えて混合された状態において、固定化抗体に結合性のある抗原を含有する試料溶液を所定量加え、更に酵素標識された二次抗体および標識酵素に対する基質を作用させると同時に測定を開始する。抗原抗体反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化をシグナルとして測定することが好ましい。測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、抗体に対する抗原を成分として含有する化含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行う方が好ましい。マイクロ流路デバイス等を用いた微量解析に展開することも可能である。

以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

（実施例１）
図１（Ａ）に示すような、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に、２ｍＭ ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌ（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＴ−００１２Ｃ；式（Ｉ）を参照）溶液（エタノール：水／１：９９容量比）２μＬをマウント（図１（Ｂ）参照）して、湿潤環境下、室温で２時間静置して、スクシンミド基表面を形成させた。ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌはＰＥＧ末端にチオール基とスクシンミド基とを併せ持ったＰＥＧ誘導体である。電極を水及びエタノールで十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗ヒトＩｇＥ抗体（以下、ａｎｔｉ−ＩｇＥとも示す；ａｂｃａｍ製ａｂ９２３３）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で３時間静置して、固定化反応を行った。金表面に導入されたスクシンミド基と抗体蛋白質に有するアミノ基とが反応することにより固定化することができる。

この電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、２ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥＰＡ−２０Ｈ（日本油脂製）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で１時間静置して、未反応のスクシンミド基のブロッキングを行った。ＭＥＰＡ−２０Ｈは、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体であり、分子量は２，０００である。

上記の電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、１００もしくは１０ｎｇ／ｍｌ濃度でヒトＩｇＥ溶液（ヤマサ製）（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、３７℃で１時間静置して、抗原抗体反応を行った。ブランクとしてＰＢＳをマウントして、同様の実験を行った。更に、この電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（以下、ＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ＩｇＥとも示す；ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ製）の１０倍希釈液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で１時間静置して、サンドイッチ系を形成させた。

上記のように調製された電極を、５ｍＭ濃度のＦｅｒｒｏｃｅｎｙｌ ＰＥＧ（１１−Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｕｎｄｅｃｙｌ ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｅｔｈｅｒ）（同仁化学製）のＰＢＳ溶液（以下、ＰＥＧ−フェロセン溶液という。）６０μＬ中に入れて、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。

上記のＰＥＧ−フェロセン溶液中に、過酸化水素を添加して、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図２に、本測定の概念を示した。ポテンショ／ガルバノスタットの電位は０ボルトに設定して測定を行った。過酸化水素はＰＢＳで希釈して、所望の濃度のものを用いた。

更に、１０ｍＭ 過酸化水素溶液（ＰＢＳ溶液）に８μｌずつインジェクションを行い、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図３に測定の結果を示した。過酸化水素をインジェクションした場合、作用させたＩｇＥの濃度が高くなるほど、還元電流の値が大きくなる様子が確認された。ブランクにおいては、電流値がほとんど変化していない。このように、本発明の電気化学センサーを用いて、抗原抗体反応を精度よくモニターすることが可能になった。

（実施例２）
式（ＩＩ）に示すようなＳＡＴ（ＰＥＯ）４（Ｐｉｅｒｃｅ製）の２５０ｍＭストック液（ＤＭＳＯ溶解液）をＰＢＳで２５０倍希釈したＡ液と、ヒドロキシルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ製）の０．５Ｍ溶液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳに溶解）であるＢ液を調製し、Ａ液とＢ液を４：１の容量比になるように混合して、室温で２時間反応させて、脱アセチル処理を行いチオール基末端とした。この反応液をＤＥＰ Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で２時間静置して、スクシンミド基表面を形成させた。その後は、実施例１と同様にして、ペルオキシダーゼの固定化及びブロッキング処理を行い、電極の作製を行った。

上記のように調製された電極を、実施例１の場合と同様に、５ｍＭ濃度のＰＥＧ−フェロセン溶液（ＰＢＳ溶液）６０μＬ中に入れて、過酸化水素を加えた際の還元電流の測定を行った。実施例１と同様に、１ｍＭ 過酸化水素、１０ｍＭ 過酸化水素、１００ｍＭ 過酸化水素の順に８μｌずつインジェクションを行い、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図４に測定の結果を示した。

この場合も、過酸化水素をインジェクションした場合、作用させたＩｇＥの濃度が高くなるほど、還元電流の値が大きくなる様子が確認された。ブランクにおいては、電流値がほとんど変化していない。また、過酸化水素の濃度が高くなるほど、還元電流の値が大きくなる様子が確認された。こうして、本発明の電気化学センサーを用いて、抗原抗体反応を精度よくモニターすることが可能になった。

本発明を利用することにより、小スケールの電極センサーによる微量サンプルを用いた電気化学的なイムノアッセイを、精度よく行うことが可能である。またディスポーザブルな使用態様も可能であることから、簡便で取り扱いやすく、医療検査、環境因子の分析、食品分野等における品質管理など幅広い産業分野における応用展開が期待される。

（Ａ）実施例で用いた電極の写真を示す図である。（Ｂ）実施例において、金電極上に溶液をマウントした状態を示す写真である。 本発明における測定原理を示す図である。 実施例１において、アンペロメトリーを行った結果を示す図である。 実施例２において、アンペロメトリーを行った結果を示す図である。

Claims (6)

1. 金属電極上に親水性高分子を介して抗体が共有結合により固定化されてなり、該固定化された抗体に対する抗原の結合を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学センサー。
2. 金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする請求項１に記載の電気化学センサー。
3. 金属電極が円形であることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気化学センサー。
4. 金属電極の半径が２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項３に記載の電気化学センサー。
5. 親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の電気化学センサー。
6. 固定化された抗体に対する抗原の結合を検出するに際して、酵素で標識された該抗原に結合する抗体を作用させた後、該標識酵素の基質を作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の電気化学センサー。