JP2002243696A - 微量タンパク質の高感度分析方法 - Google Patents
微量タンパク質の高感度分析方法Info
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- JP2002243696A JP2002243696A JP2001036225A JP2001036225A JP2002243696A JP 2002243696 A JP2002243696 A JP 2002243696A JP 2001036225 A JP2001036225 A JP 2001036225A JP 2001036225 A JP2001036225 A JP 2001036225A JP 2002243696 A JP2002243696 A JP 2002243696A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 分析時間を短縮し、微量タンパク質の高感度
分析を可能として、ベッドサイド等での患者の負担の少
ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能とする。 【解決手段】 酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビ
ーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基
板上に対局並びに参照電極とともに形成した、間隔を置
いて互いに歯を挟み込んで対向させ、各々が独立した電
位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電
極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性と
して検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能
とする。
分析を可能として、ベッドサイド等での患者の負担の少
ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能とする。 【解決手段】 酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビ
ーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基
板上に対局並びに参照電極とともに形成した、間隔を置
いて互いに歯を挟み込んで対向させ、各々が独立した電
位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電
極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性と
して検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能
とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、微量タン
パク質の高感度分析方法に関するものである。さらに詳
しくは、この出願の発明は、分析時間を短縮し、分析感
度を著しく高めることができ、ベッドサイド等での患者
の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能
とする、新しい酵素標識免疫分析方法に関するものであ
る。
パク質の高感度分析方法に関するものである。さらに詳
しくは、この出願の発明は、分析時間を短縮し、分析感
度を著しく高めることができ、ベッドサイド等での患者
の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能
とする、新しい酵素標識免疫分析方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】従来より、肝臓ガン、大腸ガン、前立腺
ガン等の診断においては腫瘍マーカーと呼ばれる各々の
ガンに特有なタンパク質の血中濃度の変化を観察するこ
とが行われている。また、感染症の場合にも、各々の抗
体タンパク質が体液中に増えることから、このようなタ
ンパク質の濃度変化が診断において有用な情報として取
扱われている。
ガン等の診断においては腫瘍マーカーと呼ばれる各々の
ガンに特有なタンパク質の血中濃度の変化を観察するこ
とが行われている。また、感染症の場合にも、各々の抗
体タンパク質が体液中に増えることから、このようなタ
ンパク質の濃度変化が診断において有用な情報として取
扱われている。
【０００３】たとえば、このように有益な生体情報を与
えるタンパク質の分析については、従来より、微量のタ
ンパク質の定量分析法として、酵素標識免疫分析法（Ｅ
ＬＩＳＡ）が知られている。この方法では、分析の対象
としてのタンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識とし
て結合し、抗原タンパク質の濃度に対応して濃度変化す
る標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の
生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原と
してのタンパク質の濃度を求めている。
えるタンパク質の分析については、従来より、微量のタ
ンパク質の定量分析法として、酵素標識免疫分析法（Ｅ
ＬＩＳＡ）が知られている。この方法では、分析の対象
としてのタンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識とし
て結合し、抗原タンパク質の濃度に対応して濃度変化す
る標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の
生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原と
してのタンパク質の濃度を求めている。
【０００４】また、従来より、タンパク質の定量分析方
法としては、前記の酵素標識免疫分析法以外にも各種の
ものが知られているが、生体情報を与えるタンパク質
は、通常、その濃度がｐｇ／ｍＬオーダーからμｇ／ｍ
Ｌ程度までと低濃度であることから、どうしてもその分
析には複雑で面倒な操作や、大型の装置と、長時間が必
要とされる場合が多い。
法としては、前記の酵素標識免疫分析法以外にも各種の
ものが知られているが、生体情報を与えるタンパク質
は、通常、その濃度がｐｇ／ｍＬオーダーからμｇ／ｍ
Ｌ程度までと低濃度であることから、どうしてもその分
析には複雑で面倒な操作や、大型の装置と、長時間が必
要とされる場合が多い。
【０００５】実際、たとえば、現状での臨床検査による
腫瘍マーカーの速度測定は、デスクトップ装置での長時
間にわたる測定が必要とされている。このため、酵素標
識免疫分析法をはじめとする従来の方法によっては、腫
瘍マーカーや前記の感染症についてのタンパク質測定の
場合だけでなく、今後その臨床的ニーズがさらに高まる
ことが予想される、心筋梗塞や脳卒中での血液凝固に関
連するタンパク質の分析の場合のように、ベッドサイド
等での患者の負担の少ない場所での小型装置による、簡
便で高感度、かつ、迅速な分析測定が必要とされる状況
には対応することが困難であった。
腫瘍マーカーの速度測定は、デスクトップ装置での長時
間にわたる測定が必要とされている。このため、酵素標
識免疫分析法をはじめとする従来の方法によっては、腫
瘍マーカーや前記の感染症についてのタンパク質測定の
場合だけでなく、今後その臨床的ニーズがさらに高まる
ことが予想される、心筋梗塞や脳卒中での血液凝固に関
連するタンパク質の分析の場合のように、ベッドサイド
等での患者の負担の少ない場所での小型装置による、簡
便で高感度、かつ、迅速な分析測定が必要とされる状況
には対応することが困難であった。
【０００６】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の従来技術の問題点を解消し、分析時間を短縮し、分析
感度を高めることができ、ベッドサイド等での患者の負
担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析をも可能と
する、改善された新しい微量タンパク質の高感度分析方
法を提供することを課題としている。
の従来技術の問題点を解消し、分析時間を短縮し、分析
感度を高めることができ、ベッドサイド等での患者の負
担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析をも可能と
する、改善された新しい微量タンパク質の高感度分析方
法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、酵素標識免疫
抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質によ
る酵素標識免疫反応を、基板上に対極並びに参照電極と
ともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挾み込んで対
向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として
機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の
濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によって
タンパク質濃度を判別可能とすることを特徴とする微量
タンパク質の高感度分析方法を提供する。
の課題を解決するものとして、第１には、酵素標識免疫
抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質によ
る酵素標識免疫反応を、基板上に対極並びに参照電極と
ともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挾み込んで対
向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として
機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の
濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によって
タンパク質濃度を判別可能とすることを特徴とする微量
タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００８】また、この出願の発明は、第２には、超常
磁性ビーズの径は、２０μｍ以下であることを特徴とす
る上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供し、第
３には、一対の櫛型電極における互いに挾み込んだ歯の
対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビー
ズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴とする
上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
磁性ビーズの径は、２０μｍ以下であることを特徴とす
る上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供し、第
３には、一対の櫛型電極における互いに挾み込んだ歯の
対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビー
ズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴とする
上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００９】さらに具体的にも、この出願の発明は、第
４には、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極
微量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量すること
を特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供す
る。
４には、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極
微量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量すること
を特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供す
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いて説明する。
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いて説明する。
【００１１】この出願の発明の方法では、前記のとおり
の酵素標識免疫分析法が前提とされている。すなわち、
従来と同様に、分析対象タンパク質を抗原とする抗体に
酵素を標識として結合しておき、抗原濃度に対応して温
度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、
生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによっ
て抗原濃度を求めることになる。このような方法とし
て、たとえばサンドイッチ法が周知である。
の酵素標識免疫分析法が前提とされている。すなわち、
従来と同様に、分析対象タンパク質を抗原とする抗体に
酵素を標識として結合しておき、抗原濃度に対応して温
度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、
生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによっ
て抗原濃度を求めることになる。このような方法とし
て、たとえばサンドイッチ法が周知である。
【００１２】そしてこのような抗原−抗体の酵素標識免
疫反応について、この出願の発明では、酵素標識免疫抗
体を固定した超常磁性ビーズが用いられる。
疫反応について、この出願の発明では、酵素標識免疫抗
体を固定した超常磁性ビーズが用いられる。
【００１３】酵素標識免疫分析法では免疫抗体を固体表
面に固定したり、抗原−抗体反応を進行させるのに一晩
程度インキュベーションすることが多いが、このインキ
ュベーションを短縮する方法として超常磁性微粒子を内
部に含む有機ポリマー球形粒子コロイドを用いる方法が
知られている。このような方法のための粒子コロイドが
市販されていることから、この出願の発明においては、
このものを、前記の酵素標識免疫抗体を固定した超常磁
性ビーズとして使用することができる。ここで「超常磁
性」とは磁場が印加された場合のみに磁性を有すること
として定義される。
面に固定したり、抗原−抗体反応を進行させるのに一晩
程度インキュベーションすることが多いが、このインキ
ュベーションを短縮する方法として超常磁性微粒子を内
部に含む有機ポリマー球形粒子コロイドを用いる方法が
知られている。このような方法のための粒子コロイドが
市販されていることから、この出願の発明においては、
このものを、前記の酵素標識免疫抗体を固定した超常磁
性ビーズとして使用することができる。ここで「超常磁
性」とは磁場が印加された場合のみに磁性を有すること
として定義される。
【００１４】一方、微小の櫛型電極は、微量の生成物を
分析電気化学の手法で高感度に測定する方法に有効であ
ることが知られているものであるが、この出願の発明の
ように、免疫反応による分析に利用することはこれまで
ほとんど考えられていない。分析のためのこの微小櫛型
電極は、その構造として、二個の櫛型電極が互いに歯を
挟み込んでμｍオーダーの狭い対向間隔で配列され、二
個がそれぞれ独立した電位を与え得る作用電極として機
能する構造を持つことを特徴としている。このような構
造は、石英等の適宜な基板上に、対極(counter electro
de, CE)並びに参照電極(reference electrode, RE)とと
もに、半導体や電子デバイスにおける微細加工技術によ
って形成可能とされる。
分析電気化学の手法で高感度に測定する方法に有効であ
ることが知られているものであるが、この出願の発明の
ように、免疫反応による分析に利用することはこれまで
ほとんど考えられていない。分析のためのこの微小櫛型
電極は、その構造として、二個の櫛型電極が互いに歯を
挟み込んでμｍオーダーの狭い対向間隔で配列され、二
個がそれぞれ独立した電位を与え得る作用電極として機
能する構造を持つことを特徴としている。このような構
造は、石英等の適宜な基板上に、対極(counter electro
de, CE)並びに参照電極(reference electrode, RE)とと
もに、半導体や電子デバイスにおける微細加工技術によ
って形成可能とされる。
【００１５】この出願の発明においては、抗原タンパク
質と抗体との免疫反応にともなう標識酵素と基質との反
応により発生する対向する微小電極間の電位差から、タ
ンパク質の濃度を電流値として検出する。
質と抗体との免疫反応にともなう標識酵素と基質との反
応により発生する対向する微小電極間の電位差から、タ
ンパク質の濃度を電流値として検出する。
【００１６】この発明の櫛型電極には、前記のとおりの
抗原としてのタンパク質を付着させた超常磁性ビーズ
（微粒子の集合としてのコロイド）を接触させればよ
い。
抗原としてのタンパク質を付着させた超常磁性ビーズ
（微粒子の集合としてのコロイド）を接触させればよ
い。
【００１７】櫛型電極との関係で、磁性ビーズ、つまり
超常磁性ビーズを用いることを特徴とするこの出願の発
明方法についてさらに説明すると、磁石により磁場を働
かせて超常磁性ビーズを電極に引き寄せることによっ
て、超常磁性ビーズ表面に固定化された酵素（標識とし
て免疫抗体に結合させてある酵素）が生成する反応物が
迅速かつ高濃度で電極に到達する。
超常磁性ビーズを用いることを特徴とするこの出願の発
明方法についてさらに説明すると、磁石により磁場を働
かせて超常磁性ビーズを電極に引き寄せることによっ
て、超常磁性ビーズ表面に固定化された酵素（標識とし
て免疫抗体に結合させてある酵素）が生成する反応物が
迅速かつ高濃度で電極に到達する。
【００１８】この場合、基質と超常磁性ビーズ、反応性
生物を含む溶液が基板表面を覆い、櫛形電極の上部は、
雲のように超常磁性ビーズコロイドにより覆われる。た
とえば、後述の実施例では、基板の下に小さな永久磁石
（２〜４ｍｍφ×１０ｍｍ長さ、表面磁束密度３５００
ガウス程度）を置いて超常磁性ビーズコロイドを電極に
引き寄せている。
生物を含む溶液が基板表面を覆い、櫛形電極の上部は、
雲のように超常磁性ビーズコロイドにより覆われる。た
とえば、後述の実施例では、基板の下に小さな永久磁石
（２〜４ｍｍφ×１０ｍｍ長さ、表面磁束密度３５００
ガウス程度）を置いて超常磁性ビーズコロイドを電極に
引き寄せている。
【００１９】この発明の超常磁性ビーズは、抗体を固定
化したり、抗体に抗原を結合させる度に洗浄する。普通
のビーズの場合、ビーズは、洗浄液と溶液の全体に広が
ってしまい希釈状態になるが、超常磁性ビーズの場合は
洗浄・攪拌したあと、ビーズを磁石で引き寄せることが
できる。ビーズを含まない部分の液は不要であるから廃
棄して、超常磁性ビーズが濃縮されたコロイドを使うこ
とができる。重力による自然沈下などより迅速に洗浄→
廃液＝再濃縮できることが大きな特徴である。
化したり、抗体に抗原を結合させる度に洗浄する。普通
のビーズの場合、ビーズは、洗浄液と溶液の全体に広が
ってしまい希釈状態になるが、超常磁性ビーズの場合は
洗浄・攪拌したあと、ビーズを磁石で引き寄せることが
できる。ビーズを含まない部分の液は不要であるから廃
棄して、超常磁性ビーズが濃縮されたコロイドを使うこ
とができる。重力による自然沈下などより迅速に洗浄→
廃液＝再濃縮できることが大きな特徴である。
【００２０】測定分析における電気化学的分析法には種
々のものが知られており、たとえばアンペロメトリー法
や、微分パルスボルタンメトリー法などがあるが、たと
えぱ短時間測定には、アンペロメトリー法が適してい
る。この出願の発明では、高感度と迅速性を両立させる
ことができるが、このためには、分析のための櫛型電極
を備えたチップの設計と抗体の選択について次のことが
考慮される。
々のものが知られており、たとえばアンペロメトリー法
や、微分パルスボルタンメトリー法などがあるが、たと
えぱ短時間測定には、アンペロメトリー法が適してい
る。この出願の発明では、高感度と迅速性を両立させる
ことができるが、このためには、分析のための櫛型電極
を備えたチップの設計と抗体の選択について次のことが
考慮される。
【００２１】１）電気化学的検出器を利用する酵素標識
免疫分析法では、標識酵素による酵素反応で生成する反
応生成物Ｐの生成量ｎｐ（ｔ）と、電極表面における生
成物Ｐの濃度Ｃｐ（ｔ）が比例することを前提にしてい
る｛ｔは時間を表す｝。
免疫分析法では、標識酵素による酵素反応で生成する反
応生成物Ｐの生成量ｎｐ（ｔ）と、電極表面における生
成物Ｐの濃度Ｃｐ（ｔ）が比例することを前提にしてい
る｛ｔは時間を表す｝。
【００２２】２）１０秒以内、望ましくは数秒程度の迅
速測定をするためには、生成物が電極に到達する時間遅
れが０．１秒程度以下であることが望ましい。（時間遅
れ／測定時間）比が誤差を決めるからである。
速測定をするためには、生成物が電極に到達する時間遅
れが０．１秒程度以下であることが望ましい。（時間遅
れ／測定時間）比が誤差を決めるからである。
【００２３】３）電気化学的検出器を利用する酵素標識
免疫分析法でよく用いられる酵素反応生成物の代表的化
合物がパラアミノフェノール（ＰＡＰ、分子量１０９）
である。この程度の小さな分子量の化合物では水溶液中
の拡散速度Ｄは１０-5ｃｍ2ｔのオーダーである。拡散
時間を０．１ｓ以下とすると、拡散距離ＬはＬ＝（Ｄ・
ｔ）1/2＝１０-3ｃｍ＝１０μｍ以下であることが必要
である。
免疫分析法でよく用いられる酵素反応生成物の代表的化
合物がパラアミノフェノール（ＰＡＰ、分子量１０９）
である。この程度の小さな分子量の化合物では水溶液中
の拡散速度Ｄは１０-5ｃｍ2ｔのオーダーである。拡散
時間を０．１ｓ以下とすると、拡散距離ＬはＬ＝（Ｄ・
ｔ）1/2＝１０-3ｃｍ＝１０μｍ以下であることが必要
である。
【００２４】４）単分散に近い、狭い粒度分布幅を持つ
球形の超常磁性ビーズを使うことが望ましい。
球形の超常磁性ビーズを使うことが望ましい。
【００２５】ビーズ表面の酵素の作用で生成する生成物
が密着した電極に到達する平均所要時間は、拡散距離が
ビーズの半径に等しくなる程度の時間である。上記３）
のことから、ビーズの半径は１０μｍ以下であることが
時間遅れが０．１秒以下になるための必要条件である。
また、単分散の球は空隙率が大きく、その空隙を生成物
分子が拡散しやすい。微小櫛型電極のアノードとカソー
ドの間のredoxサイクルが起りやすい。これは高感度に
なるための必要条件を充たす。
が密着した電極に到達する平均所要時間は、拡散距離が
ビーズの半径に等しくなる程度の時間である。上記３）
のことから、ビーズの半径は１０μｍ以下であることが
時間遅れが０．１秒以下になるための必要条件である。
また、単分散の球は空隙率が大きく、その空隙を生成物
分子が拡散しやすい。微小櫛型電極のアノードとカソー
ドの間のredoxサイクルが起りやすい。これは高感度に
なるための必要条件を充たす。
【００２６】５）感度の向上という目的からすると、微
小櫛型電極から１０μｍ程度以内の領域に、できるだけ
高密度に酵素標識抗体が存在することが望ましい。この
ために、発明者は抗体分子ＩｇＧから余分なタンパク質
を取り除いたＦ（ａｂ1）2を使って良い結果を得てい
る。
小櫛型電極から１０μｍ程度以内の領域に、できるだけ
高密度に酵素標識抗体が存在することが望ましい。この
ために、発明者は抗体分子ＩｇＧから余分なタンパク質
を取り除いたＦ（ａｂ1）2を使って良い結果を得てい
る。
【００２７】６）電極から離れた所にある標識酵素によ
る生成物は、電極に到達する比率が小さく、残りは電極
から離れた空間に拡散していく。上記１）〜５）のよう
に、電極から１０μｍ以内の距離に高い密度で酵素標識
抗体を集めることで高い感度が得られる。
る生成物は、電極に到達する比率が小さく、残りは電極
から離れた空間に拡散していく。上記１）〜５）のよう
に、電極から１０μｍ以内の距離に高い密度で酵素標識
抗体を集めることで高い感度が得られる。
【００２８】この出願の発明においては、以上のことか
ら、超常磁性ビーズの径は２０μｍ（つまり半径１０μ
ｍ）以下とすることを具体的に好ましい形態として提供
する。そして、さらには、櫛型電極の対向する歯の間の
間隔は、前記の超常磁性ビーズの径と同等、もしくはそ
れ以下とすることも好ましい形態としている。たとえ
ば、好適には、超常磁性ビーズの径を３μｍ以下とし、
前記電極の対向間隔もこれ以下として、かつ超常磁性ビ
ーズの径よりも小さくすることである。
ら、超常磁性ビーズの径は２０μｍ（つまり半径１０μ
ｍ）以下とすることを具体的に好ましい形態として提供
する。そして、さらには、櫛型電極の対向する歯の間の
間隔は、前記の超常磁性ビーズの径と同等、もしくはそ
れ以下とすることも好ましい形態としている。たとえ
ば、好適には、超常磁性ビーズの径を３μｍ以下とし、
前記電極の対向間隔もこれ以下として、かつ超常磁性ビ
ーズの径よりも小さくすることである。
【００２９】たとえば以上のような形態において、この
出願の発明では、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／
ｍＬの極微量タンパク質を、１０秒以内の応答速度で定
量する方法も具体的に提供される。
出願の発明では、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／
ｍＬの極微量タンパク質を、１０秒以内の応答速度で定
量する方法も具体的に提供される。
【００３０】この方法は、肝臓ガンの腫瘍マーカー（Ａ
ＦＰ）検出に必要な目標性能に適している。ＡＦＰの分
子量は約６８，０００であるから、１ｎｇ／ｍＬは１５
ｐｍｏｌ／Ｌに相当する。
ＦＰ）検出に必要な目標性能に適している。ＡＦＰの分
子量は約６８，０００であるから、１ｎｇ／ｍＬは１５
ｐｍｏｌ／Ｌに相当する。
【００３１】そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく
発明の実施の形態について説明する。もちろん、以下の
例によって発明が限定されることはない。
発明の実施の形態について説明する。もちろん、以下の
例によって発明が限定されることはない。
【００３２】
【実施例】１．櫛型電極作成 石英基板上にＥＢ露光装置（ＥＬＳ７７００）で櫛型パ
タニングを行った。現像処理後、下地にＣｒ、その上に
Ｐｔを真空蒸着した。図１にその平面図を示したよう
に、リフトオフしたＰｔパタンにリード線（Ｗ１）（Ｗ
２）、参照電極（ＲＥ）、対電極（ＣＥ）、絶縁部を作
成した。参照電極になる部分に銀メッキを施した後、塩
化銀メッキ処理を行いＡｇ／ＡｇＣｌにして櫛型白金電
極（Ｗ）を作成した。
タニングを行った。現像処理後、下地にＣｒ、その上に
Ｐｔを真空蒸着した。図１にその平面図を示したよう
に、リフトオフしたＰｔパタンにリード線（Ｗ１）（Ｗ
２）、参照電極（ＲＥ）、対電極（ＣＥ）、絶縁部を作
成した。参照電極になる部分に銀メッキを施した後、塩
化銀メッキ処理を行いＡｇ／ＡｇＣｌにして櫛型白金電
極（Ｗ）を作成した。
【００３３】Ｐｔ櫛型電極の幅は３μｍ、歯の対向間隔
は２μｍとした。 ２．磁性ビーズ上への抗体の固定化 粒径２．８±０．２μｍの磁性ビーズ(Dynal社，dynabe
ads（登録商標）：M270Amine)に抗原−抗体をサンドイ
ッチ法により固定した。固定化する際、磁石で攪拌する
ことと温度を調節することで免疫反応時間の短縮を図っ
た。
は２μｍとした。 ２．磁性ビーズ上への抗体の固定化 粒径２．８±０．２μｍの磁性ビーズ(Dynal社，dynabe
ads（登録商標）：M270Amine)に抗原−抗体をサンドイ
ッチ法により固定した。固定化する際、磁石で攪拌する
ことと温度を調節することで免疫反応時間の短縮を図っ
た。
【００３４】なお、測定対象にはＡＦＰ（α−fetoprot
ein、癌マーカー蛋白質）を使用した。 ３．アンペロメトリー法による測定 デュアルポテンショスタットＡＬＳ８３２ａを使用し、
アンペロメトリー法で電流値を測定した。
ein、癌マーカー蛋白質）を使用した。 ３．アンペロメトリー法による測定 デュアルポテンショスタットＡＬＳ８３２ａを使用し、
アンペロメトリー法で電流値を測定した。
【００３５】電極電位のコントロールには多機能のポテ
ンショスタットである電気化学ワークステーションを使
い、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。標識酵素
による反応生成物を電気化学的に検出するとき、生成物
によって最適電位が異なるが、実施例ではパラアミノフ
ェノールが生成する基質を選んでいる。この場合、櫛型
電極の一方の歯を作用電極Ｉとして＋０．４Ｖを印加し
てアノード酸化を行わせ、櫛型電極の他方の歯を−０．
１Ｖに設定し、カソード還元を行わせた。 ４．結 果 図２は、前記の磁性ビーズに濃度の異なる抗原タンパク
質と抗体を付着させて電流を測定した結果を時間との関
係で例示したものである。この図２より、ＡＦＰ濃度と
電流との比例関係が確認される。
ンショスタットである電気化学ワークステーションを使
い、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。標識酵素
による反応生成物を電気化学的に検出するとき、生成物
によって最適電位が異なるが、実施例ではパラアミノフ
ェノールが生成する基質を選んでいる。この場合、櫛型
電極の一方の歯を作用電極Ｉとして＋０．４Ｖを印加し
てアノード酸化を行わせ、櫛型電極の他方の歯を−０．
１Ｖに設定し、カソード還元を行わせた。 ４．結 果 図２は、前記の磁性ビーズに濃度の異なる抗原タンパク
質と抗体を付着させて電流を測定した結果を時間との関
係で例示したものである。この図２より、ＡＦＰ濃度と
電流との比例関係が確認される。
【００３６】また、図３は、ＡＦＰ濃度と電流との関係
を初期時間の観点で示したものである。１０ｎｇ／ｍＬ
以下の濃度でも電流値との比例関係が得られ、１０秒以
下でも比例関係が確認できた。
を初期時間の観点で示したものである。１０ｎｇ／ｍＬ
以下の濃度でも電流値との比例関係が得られ、１０秒以
下でも比例関係が確認できた。
【００３７】また、ＡＦＰ高濃度領域での阻害が生起し
ないことも確認された。
ないことも確認された。
【００３８】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、分析時間を短縮し、微量タンパク質の高
感度分析が可能となり、ベッドサイド等での患者の負担
の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析が可能とな
る。
発明によって、分析時間を短縮し、微量タンパク質の高
感度分析が可能となり、ベッドサイド等での患者の負担
の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析が可能とな
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月１日（２００１．５．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例を示した平面図である。
【図２】実施例としての時間と電流値との関係をＡＦＰ
濃度について例示した図である。
濃度について例示した図である。
【図３】ＡＦＰ濃度と電流との関係を初期時間の観点で
例示した図である。
例示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５７
Claims (4)
- 【請求項１】 酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビ
ーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基
板上に対極並びに参照電極とともに形成した、間隔を置
いて互いに歯を挾み込んで対向させ、各々が独立した電
位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電
極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性と
して検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能
とすることを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方
法。 - 【請求項２】 超常磁性ビーズの径は、２０μｍ以下で
あることを特徴とする請求項１の微量タンパク質の高感
度分析方法。 - 【請求項３】 一対の櫛型電極における互いに挾み込ん
だ歯の対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁
性ビーズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴
とする請求項１または２の微量タンパク質の高感度分析
方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの方法であ
って、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微
量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量することを
特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法。
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|---|---|---|---|
| JP2001036225A JP3693578B2 (ja) | 2001-02-13 | 2001-02-13 | 微量タンパク質の高感度分析方法 |
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| JP2001036225A JP3693578B2 (ja) | 2001-02-13 | 2001-02-13 | 微量タンパク質の高感度分析方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002243696A true JP2002243696A (ja) | 2002-08-28 |
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|---|---|---|---|
| JP2001036225A Expired - Fee Related JP3693578B2 (ja) | 2001-02-13 | 2001-02-13 | 微量タンパク質の高感度分析方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3693578B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011158736A1 (ja) * | 2010-06-15 | 2011-12-22 | 株式会社マイクロブラッドサイエンス | 電荷測定による発電酵素を用いた迅速高感度分子検出定量法、および該方法に用いるための検出部並びに装置 |
| JP2012242249A (ja) * | 2011-05-20 | 2012-12-10 | Oji Keisoku Kiki Kk | 電気化学測定用電極素子 |
Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPH09257793A (ja) * | 1996-03-27 | 1997-10-03 | Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan | 免疫反応測定用抗体とこれを用いた電気化学的測定方 法 |
| JPH11502617A (ja) * | 1995-03-10 | 1999-03-02 | メソ スケール テクノロジーズ，エルエルシー | 多重アレイの多重特異的な電気化学発光試験 |
| JP2004503758A (ja) * | 2000-06-14 | 2004-02-05 | ボード・オブ・リージェンツ，ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム | 誘電性に設計された微粒子 |
| JP2004525345A (ja) * | 2000-11-29 | 2004-08-19 | コミッサリア タ レネルジー アトミーク | 磁力によって支持体に固定化されている生物学的又は化学的プローブの固定マイクロアレイ |
-
2001
- 2001-02-13 JP JP2001036225A patent/JP3693578B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP2012242249A (ja) * | 2011-05-20 | 2012-12-10 | Oji Keisoku Kiki Kk | 電気化学測定用電極素子 |
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|---|---|
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