CN107082792A - 纳米孔的制备方法和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于使用核苷酸类似物和使标签从并入的核苷酸类似物易位通过纳米孔来对核酸测序的系统和方法。在各方面，本发明涉及用于使用标签分子和对从并入所述分子释放的标签易位通过纳米孔进行检测来对核酸测序的组合物、方法和系统。

Description

纳米孔的制备方法和其用途
交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请第61/781,353号、2012年6月20日提交的美国临时申请第61/662,330号、2012年6月20日提交的美国临时申请第61/662,329号、2012年6月20日提交的美国临时申请第61/662,334号和2012年4月9日提交的美国临时申请第61/621,981号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦赞助的研究的声明
本发明在政府支持下在由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号HG005109下进行。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术
核酸测序是测定核酸的核酸基体的工艺。所述序列信息可以有助于诊断和/或治疗受试者。举例来说，受试者的核酸序列可以用来鉴别、诊断和可能开发对于遗传疾病的治疗。作为另一实例，对于病原体的研究可以导致对于传染疾病的治疗。
可获得可以用来对核酸测序的方法。然而，所述方法是昂贵的，并且在一段时间内并且在一定精确性下可能不会提供序列信息，所述时间和精确性可能为诊断和/或治疗受试者所必需。
发明内容
涉及单链核酸分子通过纳米孔的核酸测序方法可能具有不充足的灵敏度。包含核酸分子的核酸碱基(例如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸嘧啶(T)和/或尿嘧啶(U))可能不提供与彼此充分不同的信号。具体来说，嘌呤(即A和G)具有彼此类似的大小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不充分不同的信号。此外，嘧啶(即C、T和U)具有彼此类似的大小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不充分不同的信号。本文中认识到对于改进用于核酸分子鉴别和核酸测序的方法的需要。
本发明的一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法，所述方法包含：(a)提供包含可个别寻址的纳米孔的芯片，其中所述多个可个别寻址的纳米孔的可个别寻址的纳米孔在与电极相邻安置的膜中包含纳米孔，其中所述纳米孔与核酸聚合酶连接，并且其中每个可个别寻址的纳米孔适于检测在加标签的核苷酸聚合后从所述加标签的核苷酸释放的标签；(b)引导所述核酸分子以与所述纳米孔相邻或接近；(c)借助于所述聚合酶，使核苷酸沿着所述核酸分子聚合以产生与所述核酸分子的至少一部分互补的链，其中在聚合期间，标签从所述核苷酸的个别核苷酸释放，并且其中所述释放的标签流动通过或接近所述纳米孔；和(d)借助于所述电极检测所述标签，其中所述标签在从所述个别核苷酸释放之后进行检测。在一些实施例中，(d)的所述检测进一步包含鉴别所述标签。在一些情况下，所述方法进一步包含使所述鉴别的标签与一类所述个别核苷酸相关联。在一些情况下，所述方法进一步包含借助于计算机处理器、基于在聚合期间检测的所述标签的评估来产生所述核酸分子的核酸序列。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)使核酸发夹连接到双链核酸分子的一端上；(b)使所述双链核酸分子与发夹解离以形成单链核酸模板；(c)使用加标签的核苷酸延伸与所述单链核酸模板杂交的引物，其中与个别核苷酸相关联的标签在延伸后释放；和(d)借助于纳米孔检测所述释放的标签，由此测定双链核酸分子的核酸序列。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核苷酸释放的所述标签通过所述纳米孔。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核苷酸释放的所述标签到与所述纳米孔相邻的位置。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)使加标签的核苷酸以第一速率聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放；和(b)通过使所述标签以第二速率通过纳米孔来检测所述释放的标签，其中所述第二速率大于或等于所述第一速率。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)使加标签的核苷酸聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放；和(b)借助于纳米孔检测所述释放的标签。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核苷酸释放的所述标签通过所述纳米孔。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核苷酸释放的所述标签到与所述纳米孔相邻的位置。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测核苷酸向核酸分子中的并入，其中所述核酸分子不通过所述纳米孔。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测个别核苷酸并入事件的副产物。
一种用于对核酸分子测序的方法，其包含以大于4σ的精确性区别个别核苷酸并入事件。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)提供纳米孔阵列，其中所述阵列中的个别纳米孔与核酸聚合酶结合；和(b)用所述聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中个别加标签的核苷酸包含标签，并且其中所述标签被释放并且借助于所述纳米孔进行检测。
本发明的另一方面提供一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于包含纳米孔阵列的芯片中的纳米孔进行检测的标签。
本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的系统，其包含：(a)包含可个别寻址的纳米孔的芯片，其中所述多个可个别寻址的纳米孔的可个别寻址的纳米孔在与电极相邻安置的膜中包含至少一个纳米孔，其中每个可个别寻址的纳米孔适于帮助检测在于与所述核酸分子互补的核酸链中并入加标签的核苷酸后从所述加标签的核苷酸释放的标签；和(b)与所述可个别寻址的纳米孔耦接的计算机处理器，其中所述计算机处理器被程序化以帮助基于从所述多个可个别寻址的纳米孔接收的电信号来表征所述核酸分子的核酸序列，其中个别电信号与在于与所述核酸分子互补的核酸链中并入加标签的核苷酸之后从所述加标签的核苷酸释放的标签相关联。
本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法，所述方法包含以每mm2至少约500个位点的密度提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中在聚合后标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。在一些情况下，所述方法进一步包含引导借助于处理器、基于所述检测的标签来产生所述核酸分子的核酸序列。
本发明的另一方面提供一种电导测量系统(conductance measurement system)，其包含：(a)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障(physical barrier)间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(b)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(c)用于测量所述电场的变化的构件；(d)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(e)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶。
本发明的另一方面提供一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反。
本发明的另一方面提供一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物或尿嘧啶或其衍生物，并且其中每种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签。
在一些情况下，所述组合物进一步包含第五类型的化合物，其在所述碱基方面和在所述标签方面不同于所述四种类型的化合物中的每一者，其中如果所述第四类型的化合物的所述碱基是胸嘧啶或其衍生物，那么所述第五类型的化合物的碱基是尿嘧啶或其衍生物，或其中如果所述第四类型的化合物的所述碱基是尿嘧啶或其衍生物，那么所述第五类型的化合物的所述碱基是胸嘧啶或其衍生物。
本发明的另一方面提供一种用于确定化合物的身份的方法，其包含：(a)使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；和(b)记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化，其中所述电场的所述变化是所述化合物、所述电解质与所述孔隙之间的相互作用的结果，并且指示所述化合物的大小、电荷和组成，由此使得所述变化与预定值之间相关以确定所述化合物的身份。在一些情况下，所述方法进一步包含在步骤(a)之前用磷酸酶处理所述化合物的步骤。
本发明的另一方面提供一种用于确定化合物是标签还是所述标签的前体的方法，其包含：(a)使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(b)记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化；和(c)将所述电场的所述变化与对应于所述标签和所述标签的所述前体的预定值比较，由此确定所述化合物是所述标签还是其所述前体。在一些情况下，所述方法进一步包含在步骤(a)中调节所述电场的电流偏置的步骤。
本发明的另一方面提供一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：(a)使所述单链DNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物，并且其中每种的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签，其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和(c)对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
本发明的另一方面提供一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：(a)使所述单链DNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制条件为(1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类型，和(2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类型，其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和(c)对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基反复进行步骤(a)和(b)，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
本发明的另一方面提供一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：(a)使所述单链RNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是尿嘧啶或其衍生物，并且其中每种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签，其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链RNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和(c)对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
本发明的另一方面提供一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：(a)使所述单链RNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制条件为(1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类型，和(2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类型，其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和(c)对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基反复进行步骤(a)和(b)，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
本发明的另一方面提供一种电导测量系统，其包含：(a)间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障；(b)所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙；(c)在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物；(d)所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电解质溶液；(e)所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特征；和(f)测量所述离子电流的构件和将其时间过程记录为时间序列的构件，所述时间序列包括所述至少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时间段。在一些情况下，所述标签在所述孔隙中的滞留时间大于测量所述离子电流的所述构件的离子电流带宽和电流散弹噪声的限度。
本发明的另一方面提供一种将电导时间序列的片段划定为与不受阻塞的孔隙电导水平统计一致的区域和降低的电导的脉冲以及降低的电导的个别脉冲内的统计稳定片段的方法，所述电导时间序列用包含以下的电导测量系统产生：间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障；所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙；在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物；所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电解质溶液；所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特征；和测量所述离子电流的构件和记录所述电导时间序列的构件，所述时间序列包括所述至少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时间段；划定电导时间序列的片段的所述方法选自由以下组成的群组：(a)对从所述原始电导时间序列估计的连续密度隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)的最大似然状态序列(maximum likelihood statesequence)进行维特比解码(Viterbi decoding)；(b)经由与偏离开放孔隙电导水平的差幅的阈值比较来划定降低的电导的脉冲的区域；和(c)通过估计每一片段的离子电流水平的集中趋势或通过一起测量集中趋势和片段持续时间来表征降低的电导的脉冲的构件，片段集中趋势的量度选自由以下组成的群组：(i)作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一GMM的高斯分量(Gaussian component)的平均参数；(ii)算术平均值；(iii)截尾平均值(trimmed mean)；(iv)中值；和(v)样品位置的最大后验概率(Maximum A Posteriori)估计量或样品位置的最大似然估计量(maximum likelihoodestimator)。
在一些情况下，所述方法进一步包含以下至少一者：(a)基于电导片段的集中趋势的所述量度对第二高斯混合模型(Gaussian Mixture Model)进行最大似然估计；(b)借助于插值寻峰，和使所述电导时间序列的片段的集中趋势的估计的经验概率密度平滑，和对插值函数的导数求根；和(c)定位多峰分布估计量的模式的另一构件。
本发明的另一方面提供一种用于测定溶液中的化合物的至少一个参数的方法，其包含以下步骤：将第一流体放置于第一储槽中；将第二流体放置于第二储槽中；所述第一和所述第二流体中的至少一者包含至少一种化合物，其中所述化合物是加标签的核苷酸或从加标签的核苷酸裂解的标签；所述第一储槽中的所述第一流体用电阻屏障与所述第二储槽中的所述第二流体间隔开；所述电阻屏障包含至少一个孔隙；用所述第一与所述第二流体之间的电势使离子电流通过所述第一流体、所述至少一个孔隙和所述第二流体；测量通过所述至少一个孔隙的所述离子电流和所述离子电流的变化的持续时间；所述离子电流的所述测量进行一段时间，以足以测量由所述化合物与所述至少一个孔隙相互作用而引起的所述离子电流的降低；和通过数学分析在所述时间段内所述离子电流的所述变化和所述离子电流的所述变化的所述持续时间，来测定所述化合物的至少一个参数；所述数学分析包含至少一个选自由以下组成的群组的步骤：(a)作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一GMM的高斯分量的平均参数；(b)事件平均值抽取；(c)最大似然事件状态指定；(d)阈值检测和平均；(e)滑动窗分析；(f)算术平均值；(g)截尾平均值；(h)中值；和(i)样品位置的最大后验概率估计量或样品位置的最大似然估计量。
本发明的另一方面提供一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。
本发明的其它方面和优势将根据以下详细描述而变得为本领域技术人员显而易见，其中仅展示和描述本发明的说明性实施例。应意识到，本发明能够具有其它和不同实施例，并且其若干细节能够在各个明显的方面具有修改，其都不脱离本发明。因此，应将图式和实施方式视为本质上说明性的而非限制性的。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公开和专利申请都以引用的方式并入本文中，引用的程度使每个个别公开或专利申请都经特定并且个别指示从而以引用的方式并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。将参考阐述其中利用本发明原理的说明性实施例和其附图的以下详细描述来获得对本发明特征和优势的更佳理解：
图1示意性地展示方法的步骤。
图2A、2B和2C展示纳米孔检测器的实例，其中图2A的纳米孔安置在电极上，图2B的纳米孔插入孔上的膜中，并且图2C的纳米孔在突出电极上。
图3展示一种用于核酸测序的方法。
图4展示因标签通过纳米孔而产生的信号的一实例。
图5展示纳米孔检测器的阵列。
图6展示与核苷酸的磷酸酯连接的标签分子的一实例。
图7展示替代性标签位置的实例。
图8展示加标签的核苷酸的一实例。
图9展示可检测的标签-聚磷酸酯和可检测的标签。
图10展示一种用于制备模板链的方法。
图11展示包含纳米孔的例示性芯片装配。
图12展示例示性测试芯片电池阵列配置。
图13展示例示性电池模拟电路。
图14A和14B展示超紧凑电路的实例。
图15展示合成香豆素-PEG-dG4P核苷酸类似物的一实例。
图16通过MALDI-TOF MS展示释放的标签的表征的一实例；如MALDI-TOF-MS分析所展示，通过酸水解产生香豆素-PEG16-NH2(蓝色)的香豆素-PEG16-dG4P、产生香豆素-PEG20-NH2(绿色)的香豆素-PEG20-dG4P、产生香豆素-PEG24-NH2(橙色)的香豆素-PEG24-dG4P和产生香豆素-PEG36-NH2(红色)的香豆素-PEG36-dG4P而产生的香豆素-PEG-NH2标签与在用碱性磷酸酶处理之后聚合酶延伸反应中所产生的相应释放的标签相同；展示四个单独地获得的MS光谱的合成图像；展示香豆素-PEG-NH2标签的结构。
图17展示在单分子检测水平下区别蛋白质纳米孔中的释放的标签的一实例；将通过酸水解衍生自四种相当核苷酸的四种香豆素-PEGn-NH2化合物(n＝16、20、24和36)汇集并且稀释于4M KCl、10mM Tris，pH 7.2中以便进行纳米孔测量；(左)时间序列数据指示，当这些PEG标签进入单一α-溶血素离子通道时，其造成具有其大小特征的电流阻塞；右，由个别分子造成的平均电流阻塞的直方图展示具有10kHz测量带宽的基线分辨率；顶部的有色条表示数据的6σ分布(对于可以表示四种DNA核苷酸中的每一者的四种PEG标签中的每一者，假定高斯分布)，这表明此图中通过使用A、C、G和T名称表示的单一碱基可以按比300,000个事件分之1更佳的精确性进行区别，当具有四种不同长度PEG的四种不同核苷酸用于DNA测序时，这可能出现。
图18展示被配置成控制测序仪的计算机系统。
图19展示电池电流读数的直方图。
图20展示4种不同标签的以皮安培为单位测量的电流相较于以秒为单位测量的时间的图。
图21展示自组装于脂质双层中以形成离子通道的α--溶血素蛋白质，并且核酸拉伸通过其(上)，产生相应电子签名(下)(韦库特尔(Vercoutere)等人2001和迪默(Deamer)等人2002)。
图22展示核苷酸脱氧核糖核苷酸腺苷三磷酸酯、脱氧核糖核苷酸鸟苷三磷酸酯、脱氧核糖核苷酸胞嘧啶三磷酸酯和脱氧核糖核苷酸胸苷三磷酸酯的结构。
图23展示四种磷酸酯加标签的核苷-5'-聚磷酸酯的结构。
图24展示磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯的合成。
图25展示磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯的合成。
图26展示末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯的合成。
图27展示a)寡核苷酸-3'与5'-磷酸酯连接，b)寡核苷酸-5'与5'-磷酸酯连接，c)在聚合酶反应之后的可检测部分。
图28(A)展示碱基修饰的核苷-5'-三磷酸酯的合成。
图28(B)展示碱基修饰的核苷-5'-三磷酸酯通过TCEP的裂解。
图29展示3'-O修饰的核苷-5'-三磷酸酯的合成；(A)3'-O-2-硝基苯甲基连接的dNTP；(B)3'-O-叠氮基甲基连接的dNTP；(C)在聚合酶延伸和TCEP裂解之后的可检测部分；和(D)在聚合酶延伸和UV裂解之后的可检测部分。
图30展示使用磷酸酯修饰的核苷酸类似物的DNA延伸反应。
图31展示使用碱基加标签的核苷酸类似物的DNA延伸反应。
图32展示使用2'或3'-OH标记的核苷酸类似物的DNA延伸反应。
图33展示通过纳米孔用修饰的核苷酸进行DNA测序的示意图，具体来说适用于涉及同时添加所有4种核苷酸和聚合酶以接触单一模板分子的单分子实时测序。
图34展示具有可能连接子和标签的磷酸酯、碱基、2'和3'修饰的核苷磷酸酯；碱基＝腺嘌呤、鸟嘌呤、胸嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶5-甲基C、7-脱氮-A、7-脱氮-G或其衍生物；R1和R2＝H、OH、F、NH2、N3或OR'；n＝1-5；A＝O、S、CH2、CHF、CFF、NH；Z＝O、S、BH3；X＝使磷酸酯或2'-O或3'-O或碱基与可检测部分连接的连接子并且可以含有O、N或S、P原子(连接子还可以直接或间接是可检测部分，例如氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、不同长度和分子量的PEG、有机或无机染料、荧光和荧光基因染料、药物、寡核苷酸、质量标签、化学发光标签，并且可以含有正或负电荷)；Y＝标签或可检测部分，例如具有一或多个环的脂肪族或有机芳香族化合物、染料、蛋白质、碳水化合物、不同长度和分子量的PEG、药物、寡核苷酸、质量标签、荧光标签、化学发光标签，并且可以含有正或负电荷。
图35展示PEG-磷酸酯标记的核苷酸的结构和具有不同反应性基团以与官能团反应的可能PEG的实例。
图36展示末端磷酸酯上的反应性基团的非限制性特定实例，其还可以通过适当变化而与核苷碱基部分连接，并且基团与所述基团可以反应以形成标签。
图37展示用于通过合成进行大规模平行DNA测序的纳米孔阵列的示意图。
图38展示PEG—磷酸酯标记的核苷酸的合成。
图39展示通过并入PEG-磷酸酯标记的核苷酸类似物(dG4P-PEG)产生的DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱；光谱中所示的单一产物指示dG4P-PEG24和dG4P-PEG37以接近100％的效率并入。
图40展示α-溶血素纳米孔在含有49、37、24或16个环氧乙烷单体的PEG存在下在+40mV施加的电势下的相对阻塞深度分布；容易鉴别四种物质。
图41展示(A)混合聚(乙二醇)(PEG)单元通过单一纳米孔的分离度和质量分布；和(B)根据碱基线分离度选择4种不同PEG单元作为4种碱基A、C、G和T的标签；还展示直链和支链PEG的结构。
图42展示带电PEG-三磷酸酯的合成(电荷可以基于需求进行调节)。
图43展示磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯的合成。
图44展示磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯的合成。
图45展示末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯的合成。
图46展示CMOS集成纳米孔测量平台：(A)八通道CMOS前置放大器芯片的显微照片，与具有集成顺侧电极的一个放大器通道的图像；(B)展示具有固态纳米孔的二芯片集成的图；(C)展示芯片的截面和在一芯片实施例中纳米孔如何直接蚀刻到芯片中的图；包装用独立的孔在顺侧上进行；和3.5nm直径的纳米孔的TEM图像。
图47展示CMOS集成纳米孔电子装置的电性能：(A)在CF＝0.15pF，1MHz 4极贝塞尔滤波器(Bessel filter)，fs＝4MS/s情况下的输入参考基线电流噪声谱。还展示整体电池模式中的Axopatch 200B在β＝1,100kHz4极贝塞尔滤波器，fs＝250kS/s情况下的测量开放前级探头；(B)通过Axopatch 200B测量的连接有纳米孔的新放大器与相同纳米孔相比的本底噪声。
图48展示纳米孔附近的聚合酶的系栓；孔有助于限制扩散；L表示归因于扩散和电泳的分子运动相等所处的距孔隙开口的临界距离。
图49展示标签标记的核苷-5'-聚磷酸酯的合成。
图50展示3'-O封端的PEG-核苷酸的合成。
图51展示通过PEG-核苷酸合成和纳米孔检测来测序(固定于珠子上的相同DNA分子的许多拷贝并且一次添加一种PEG-核苷酸)；使用与所有四种核苷酸连接的相同PEG；一次添加一种PEG-核苷酸，如果并入正确的核苷酸，那么每个循环读取至少一种碱基。
图52展示通过3'-O封端的PEG-核苷酸合成和纳米孔检测来测序(固定于珠子上的相同DNA分子的许多拷贝并且同时添加所有四种3'-O封端的PEG-核苷酸)；一起添加所有四种3'封端的不同大小的PEG连接的核苷酸(3'封端的dNTP-PEG)；基于释放的PEG的阻塞信号检测并入的核苷酸；3'封端基团通过TECP处理来去除，并且继续循环以便正确地对包括均聚区的模板测序。
图53展示用以进行测序工艺的微孔的大规模平行高密度阵列的示意图。每个孔可以固定不同DNA模板和纳米孔装置。
图54展示四种香豆素-PEG-dG4P分子的结构。
图55通过MALDI-TOF MS展示四种香豆素-PEGn-dG4P核苷酸(n＝16、20、24、36)的表征；除了全长产物峰和相关盐峰之外，在每个光谱中的左侧存在第二主峰(香豆素-PEGn-NH2)，代表聚磷酸酯与氨基庚烷连接子之间的N-P键归因于用于MALDI-TOF MS分析的基质的酸性性质的裂解。
图56展示用于SBS反应的模板-环路-引物的结构；“模板链”中的C允许通过聚合酶添加dGMP到“引物链”并且从香豆素-PEG-dG4P核苷酸释放香豆素-PEG-三磷酸酯标签。
图57展示两种产生香豆素-PEGn-NH2标签的方法；用10％乙酸直接处理核苷酸类似物(香豆素-PEGn-dG4P，n＝16、20、24、36)(上)产生香豆素-PEG-NH2标签，其与在用碱性磷酸酶处理之后的聚合酶释放的标签(右下)相同；香豆素-PEG-NH2标签(左下)然后在单分子水平下通过纳米孔电流阻塞签名进行表征。
图58展示用四种香豆素-PEG-dG4P核苷酸获得的延伸产物的MALDI-TOF MS测量；模板-环路引物(其中模板在下一位置处含有C)连同四种PEG-标签修饰的核苷酸之一一起用于聚合酶反应；在每种情况下，2'-dGMP并入到DNA中，产生单碱基引物延伸产物。
具体实施方式
虽然已经在本文中展示和描述了本发明的各种实施例，但本领域技术人员应明白，所述实施例仅作为实例而提供。本领域技术人员可以在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，可以采用本文中所述的本发明的实施例的各种替代方案。
如本文中所用，术语“纳米孔”一般来说是指在膜中形成或以其它方式提供的孔隙、通道或通路。纳米孔可以由膜中的分子(例如蛋白质)界定。膜可以是有机膜，例如脂质双层，或合成膜，例如由聚合材料形成的膜。纳米孔可以与感测电路相邻或接近安置，所述感测电路例如互补金属-氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。纳米孔的特征宽度或直径可以近似是0.1纳米(nm)到约1000nm。一些纳米孔是蛋白质。α溶血素是蛋白质纳米孔的一实例。
如本文中所用，术语“核酸”一般来说是指包含一或多个核酸亚单元的分子。核酸可以包括一或多个选自以下的亚单元：腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可以是单链或双链的。
冠词“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”是非限制性的。举例来说，“所述方法”包括所述短语的含义的最广泛定义，其可以是多于一种方法。
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或尿嘧啶的“衍生物”包括7-脱氮-嘌呤和5-甲基嘧啶。其它实例包括7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤和5-甲基-胞嘧啶。
如本文中所用，“烷基”包括具有规定数目的碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未被取代或被取代的。因此，如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn定义为包括在直链或支链排列中具有1、2……n-1或n个碳的基团。举例来说，“C1-C5烷基”定义为包括在直链或支链排列中具有1、2、3、4或5个碳的基团，并且具体地说包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。
如本文中所用，“烯基”是指直链或支链的、含有至少1个碳碳双键的非芳香族烃基，并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳双键，并且可以是未被取代或被取代的。举例来说，“C2-C5烯基”意指具有2、3、4或5个碳原子和分别至多1、2、3或4个碳-碳双键的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指直链或支链的含有至少1个碳碳三键的烃基，并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳三键，并且可以是未被取代或被取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4或5个碳原子和至多2个碳-碳三键的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。
术语“被取代的”是指其中含于其中的与氢原子的至少一个键由与非氢或非碳原子的键置换的如上文所述的官能团，例如烷基或烃基，其条件是维持正常价数并且所述取代产生稳定化合物。被取代的基团还包括其中与碳或氢原子的一或多个键由与杂原子的一或多个键(包括双或三键)置换的基团。取代基的非限制性实例包括上文所描述的官能团，和例如N例如以便形成-CN。
应理解，本发明的化合物上的取代基和取代模式可以由本领域的普通技术人员选择，以便提供化学上稳定的并且可以容易使用例如下文阐述的方法从可容易获得的起始物质合成的化合物。如果取代基本身被多于一个基团取代，那么应理解，这些多个基团可以在同一碳上或在不同碳上，只要产生稳定结构即可。
在选择本发明的化合物时，本领域的普通技术人员将认识到，各个取代基(即R1、R2等)应与化学结构连接的原理一致地进行选择。
在本文中描绘的化合物结构中，氢原子除在核糖和脱氧核糖上外一般来说未加以展示。然而，应理解，充足氢原子存在于所表示的碳原子上以满足八隅规则。
如本文中所用，并且除非另外说明，否则以下术语中的每一者应具有所阐述的定义：A：腺嘌呤；C：胞嘧啶；DNA：脱氧核糖核酸；G：鸟嘌呤；RNA：核糖核酸；T：胸嘧啶；U：尿嘧啶；dNPP：脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯；和rNPP：核糖核苷酸聚磷酸酯。
核酸可以包括任何核酸分子，包括(但不限于)DNA、RNA和其杂交体或变异体。核酸可以是单链或双链的。在一实施例中，形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。这些碱基的衍生物例示于PCR系统、试剂和消费品(PCR Systems,Reagentsand Consumables)(珀金埃尔默(Perkin Elmer)目录1996-1997，罗氏分子系统公司(RocheMolecular Systems,Inc.),布兰斯堡(Branchburg),新泽西州(New Jersey),美国(USA))中，其全部以引用的方式并入本文中。
核苷酸聚磷酸酯，例如脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯(“dNPP”)或核糖核苷酸聚磷酸酯(“rNPP”)，是包含多个(即三、四、五、六个或更多个)以线性方式与其5'糖碳原子键结的磷酸酯的核苷酸。核苷酸聚磷酸酯类似物是如本文中所定义的这种脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯或这种核糖核苷酸聚磷酸酯的类似物，与其不同之处在于在规定位置处有标签与其连接。所述类似物可通过在适当核酸聚合条件下与适当核酸聚合酶接触而并入到引物或核酸延伸链(例如DNA延伸链)中。
在一实施例中，dNPP是三磷酸脱氧核苷酸。
如本文中所用，四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸分别包括4、5或6个通过磷酸二酯键接合的核酸单体残基，其中游离端残基可以是核苷酸或核苷。在一实施例中，游离端残基是核苷并且其它残基是核苷酸。
“固体衬底”应意指固相中所存在的、核酸可以附着的任何合适媒介。非限制性实例包括芯片、孔、珠子、纳米孔结构和柱子。在一非限制性实施例中，固体衬底可以存在于溶液、包括电解质水溶液中。
“杂交”应意指基于充分理解的序列互补性原理使一种单链核酸退火为另一核酸(例如引物)。在一实施例中，另一核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度以及互补性程度。这些参数对于杂交的作用描述于例如萨姆布鲁克J(Sambrook J),弗里奇EF(Fritsch EF),马尼亚迪斯T.(Maniatis T.),分子克隆实验指南(Molecular cloning:a laboratory manual),冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),纽约(New York)(1989)中。如本文中所用，引物序列或DNA延伸产物与另一核酸的杂交应意指退火充足，以使得引物或DNA延伸产物分别可通过与能够与其形成磷酸二酯键的可用核苷酸或核苷酸类似物产生磷酸二酯键而延伸。
如本文中所用，除非另外规定，否则“不同于”另一碱基或所列举的碱基清单的碱基应意指所述碱基具有与另一碱基或其它碱基不同的结构。举例来说，“不同于”腺嘌呤、胸嘧啶和胞嘧啶的碱基可以包括鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。
如本文中所用，“引物”(引物序列)是具有适当长度(例如约18-24个碱基)的、短的通常化学合成的寡核苷酸，其足以与标靶DNA(例如单链DNA)杂交并且在合适条件下允许添加核苷酸残基到其上或寡核苷酸或多核苷酸由其合成。在一实施例中，引物是DNA引物，即由脱氧核糖核苷酸残基组成或基本上由脱氧核糖核苷酸残基组成的引物。引物被设计成具有是所述引物杂交的模板/标靶DNA的区的反向互补序列的序列。核苷酸残基通过形成磷酸二酯键向引物的3'端的添加产生DNA延伸产物。核苷酸残基通过形成磷酸二酯键向DNA延伸产物的3'端的添加产生另一DNA延伸产物。
用于核酸鉴别和测序的方法和系统
本文中描述用于使用纳米孔对核酸测序的方法、装置和系统。所述方法可以精确检测个别核苷酸并入事件，例如在将核苷酸并入到与模板互补的生长链中后。酶(例如DNA聚合酶)可以并入核苷酸以使多核苷酸链生长，其中所添加的核苷酸与相应模板核酸链互补，所述核酸链与生长链杂交(例如聚合酶链式反应(PCR))。这些核苷酸并入事件使标签从核苷酸释放，所述标签通过纳米孔并且被检测。以此方式，可以鉴别并入的碱基(即A、C、G、T或U)，因为独特标签从每种类型的核苷酸释放(即A、C、G、T或U)。
核苷酸并入事件可以实时(即在其发生时)并且借助于纳米孔进行检测。在一些情况下，与纳米孔连接或接近的酶(例如DNA聚合酶)可以有助于核酸分子流动通过纳米孔或与纳米孔相邻。核苷酸并入事件或并入多种核苷酸可以释放一或多种标签分子(本文中也称“标签”)，其可以在标签流动通过纳米孔或与纳米孔相邻流动时通过纳米孔进行检测。在一些情况下，与纳米孔连接或接近的酶可以帮助检测在并入一或多种核苷酸后释放的标签或其它副产物。
本文中描述的方法可以是单分子方法。也就是说，所检测的信号由单一分子产生(即单核苷酸并入)并且不由多种克隆分子产生。所述方法可能不需要DNA扩增。
核苷酸并入事件可以从包含多种核苷酸(例如三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP，其中N是腺苷(A)、胞苷(C)、胸苷(T)、鸟苷(G)或尿苷(U)))的混合物发生。核苷酸并入事件未必从包含单一类型的核苷酸(例如dATP)的溶液发生。核苷酸并入事件未必从多种核苷酸(例如dATP，随后dCTP，随后dGTP，随后dTTP，随后dATP)的交替溶液发生。
DNA测序是生物学基础技术。已经开发数种分析方法来在单分子水平下使用化学或物理显微技术检测DNA或RNA(珀金斯(Perkins)等人1994，里夫(Rief)等人1999，史密斯(Smith)等人1996和韦库特尔等人2001)。
在过去几年中，已经探索依赖于检测当核苷酸通过聚合酶并入到DNA链中时释放的氢离子(H+)的离子感测技术(例如离子通道)(罗斯伯格(Rothberg)等人2011)来检测个别DNA或RNA链(卡西亚诺维奇(Kasianowicz)2003和2004，钱德勒(Chandler)等人2004，迪默等人2002，别尔苏科夫(Berzukov)等人2001和亨利克森(Henrickson)等人2000)。
在一些情况下，α--溶血素通道(由细菌分泌的外毒素)可以用以在单分子水平下检测核酸(卡西亚诺维奇等人1996)。α--溶血素蛋白质是自组装于脂质双层膜中以形成具有2.6nm直径孔室和1.5nm直径限制性孔口(孔隙的最窄点)的七聚孔隙的单体多肽(梅勒(Meller)等人2000，阿克松(Akeson)等人1999和迪默等人2002)。纳米孔的限制性孔口允许直链单链而非双链核酸分子(直径约2.0nm)通过。在离子盐水溶液(例如KCl)中，当施加穿过膜的适当电压时，由α--溶血素通道形成的孔隙传导足够强并且稳定的离子电流。聚阴离子核酸由施加的电场驱动通过孔隙，因此阻塞或降低可以以其它方式不受阻的离子电流。此通过工艺产生电子签名(图21)(韦库特尔等人2001和迪默等人2002)。特定核酸分子当进入并且通过纳米孔时产生将其与其它核酸分子区别的特征签名。阻塞的持续时间与核酸的长度成正比，并且信号强度与核苷酸的空间和电子性质，即四种碱基(A、C、G和T)的身份相关。因此，通过单通道记录技术基于特征参数(例如易位电流、易位持续时间和其在图中的相应分布)获得特定事件图(其是易位时间相较于阻塞电流的图)，并且将其用以区别聚核苷酸的长度和组成(梅勒等人2000)。
还已经显示，具有共价连接的接合体的蛋白质纳米孔可以按高精确性精确鉴别未标记的核苷5'-单磷酸酯(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)(克拉克(Clarke)等人2009)。举例来说，氨基环糊精接合体已经成功地共价连接于α-溶血素孔隙内。当dNMP被捕获并且驱动通过脂质双层膜中的孔隙时，通过孔隙的离子电流降低到四个水平之一，所述水平各自代表四种dNMP(A、G、C或T)之一。此外，罗伯森(Robertson)等人(2007)近来已经展现，当聚(乙二醇)(PEG)分子进入单一α-溶血素孔隙时，其产生不同质量依赖性电导状态与特征平均滞留时间。基于电导的质谱明显地分辨乙二醇的重复单元，并且滞留时间随PEG的质量而增加。
尽管当前纳米孔方法展示了作为DNA检测方法的前景，但尚未达到精确碱基到碱基测序的更苛刻目标。
用于对核酸测序的方法可以包括获取具有待测序的核酸的生物样品，从生物样品提取或以其它方式分离核酸样品，和在一些情况下制备核酸样品以用于测序。
图1示意性地展示一种用于对核酸样品测序的方法。所述方法包含从生物样品(例如组织样品、流体样品)分离核酸分子，和制备核酸样品以用于测序。在一些情况下，核酸样品从细胞提取。用于提取核酸的一些例示性技术是使用溶菌酶、声处理、萃取、高压或其任何组合。在一些情况下，核酸是无细胞核酸并且不需要从细胞提取。
在一些情况下，核酸样品可以通过涉及从核酸样品去除蛋白质、细胞壁碎片和其它组分的工艺来制备以用于测序。存在许多可用于实现此的商业产品，例如核酸纯化柱(spin column)。还可以使用乙醇沉淀和离心。
核酸样品可以分割(或破裂)成多个片段，这可以有助于例如借助于以阵列形式包括多个纳米孔的装置进行核酸测序。然而，使待测序的核酸分子破裂可能不是必需的。
在一些情况下，测定长序列(即“鸟枪测序”法可能不是所需的)。可以测定任何合适长度的核酸序列。举例来说，可以对至少约400、约500、约600、约700、约800、约800、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000或约100000个和类似数目的碱基进行测序。在一些情况下，对至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000个和类似数目的碱基进行测序。在一些情况下，所测序的碱基是连续的。在一些情况下，核酸样品可以在测序之前进行分割。
纳米孔测序和分子检测
本文中提供用于借助于纳米孔对核酸分子测序的系统和方法。纳米孔可以形成或以其它方式包埋于与感测电路(例如集成电路)的感测电极相邻安置的膜中。集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在一些实例中，集成电路是场效应晶体管或互补金属-氧化物半导体(CMOS)。感测电路可以位于具有纳米孔的芯片或其它装置中，或芯片或装置外，例如芯片外配置中。半导体可以是任何半导体，包括(但不限于)IV族(例如硅)和III-V族半导体(例如砷化镓)。
在一些情况下，在核酸或标签流动通过纳米孔时，感测电路检测与核酸或标签相关的电信号。核酸可以是较大链的亚单元。标签可以是核苷酸并入事件的副产物。检测的信号可以收集并且存储于存储器位置中，并且稍后用以构筑核酸的序列。所收集的信号可以经处理以解释所检测的信号的任何异常(例如错误)。
图2展示如可以根据美国专利申请公开第2011/0193570号中所述的方法制备的具有温度控制的纳米孔检测器(或传感器)的一实例，所述公开全部以引用的方式并入本文中。参考图2A，纳米孔检测器包含与导电溶液(例如盐溶液)207接触的顶部电极201。底部导电电极202与纳米孔206靠近、相邻或接近，所述纳米孔插入膜205中。在一些情况下，底部导电电极202包埋于半导体203中，其中电路包埋于半导体衬底204中。半导体203的表面可以被处理成疏水性的。所检测的样品通过纳米孔206中的孔隙。半导体芯片传感器放置于包装208中，并且此又处于温度控制元件209附近。温度控制元件209可以是热电加热和/或冷却装置(例如匹尔特装置(Peltier device))。多个纳米孔检测器可以形成纳米孔阵列。
参考图2B，其中类似标号表示类似元件，膜205可以安置在孔210上，其中传感器202形成孔的表面的一部分。图2C展示其中电极202从被处理的半导体表面203突出的一实例。
在一些实例中，膜205在底部导电电极202上并且不在半导体203上形成。在这种情况下，膜205可以与底部导电电极202形成耦合相互作用。然而，在一些情况下，膜205在底部导电电极202和半导体203上形成。作为一替代方案，膜205可以在半导体203上并且不在底部导电电极202上形成，但可以在底部导电电极202上延伸。
用纳米孔间接测序
纳米孔可以用以任选地通过电检测对核酸分子间接测序。间接测序可以是其中聚合核酸分子(例如DNA或RNA)不通过纳米孔的任何方法。核酸分子可以至少部分位于纳米孔的孔室中，但不位于纳米孔的孔隙(即最窄部分)中。核酸分子可以在距纳米孔任何合适距离内和/或与其接近地通过，任选地在一个距离内，以使得从核苷酸并入事件释放的标签在纳米孔中被检测到。
核苷酸并入事件的副产物可以通过纳米孔进行检测。“核苷酸并入事件”是将核苷酸并入到生长多核苷酸链中。副产物可以与既定类型核苷酸的并入相关。核苷酸并入事件一般来说由酶(例如DNA聚合酶)催化，并且使用与模板分子的碱基对相互作用来在可用核苷酸之中进行选择以在每个位置处并入。
在一些情况下，副产物通过纳米孔和/或在纳米孔中产生可检测的信号。所释放的标签分子是副产物的一实例。在一些情况下，副产物是质子(即pH变化)。在其它情况下，副产物是磷酸酯(例如在核苷酸并入事件期间释放的磷酸酯)。举例来说，不同类型的核苷酸中的每一者可以包含不同数目的磷酸酯，并且所释放的磷酸酯的检测使得可确定所并入的核苷酸的身份。
所述方法的一实例描绘于图3中。此处，核酸链300穿越或接近(但不如301处的箭头所指示般通过)纳米孔302地通过。酶303(例如DNA聚合酶)通过一次并入一种核苷酸、使用第一核酸分子作为模板300使生长核酸链304延伸(即酶催化核苷酸并入事件)。
酶303可以与纳米孔302连接。用于使酶与纳米孔连接的合适方法包括交联，例如形成分子内二硫键。纳米孔和酶还可以是由单一多肽链编码的融合蛋白。用于制造融合蛋白的方法可以包括使酶的编码序列与纳米孔的编码序列同框并且相邻地融合(在中间不具有终止密码子)，和从单一启动子表达此融合序列。在一些情况下，磷酸酶也与纳米孔连接。
在一些情况下，DNA聚合酶是9°N聚合酶或其变异体、大肠杆菌DNA聚合酶I、噬菌体T4 DNA聚合酶、测序酶、Taq DNA聚合酶、9°N聚合酶(exo-)A485L/Y409V或Phi29 DNA聚合酶(DNA聚合酶)。
对标签分子纳米孔测序
核酸样品可以使用加标签的核苷酸或核苷酸类似物来测序。在一些实例中，一种用于对核酸分子测序的方法包含(a)使加标签的核苷酸聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放，和(b)借助于纳米孔检测所述释放的标签。
在一些情况下，所述方法进一步包含引导从个别核苷酸释放的标签通过纳米孔。所释放的标签可以通过任何合适技术、在一些情况下借助于酶(或分子马达)来引导。或者，所释放的标签可以在不使用酶的情况下引导通过纳米孔。举例来说，标签可以如本文中所述由穿过纳米孔的电压差来引导。
继续参考图3，酶从与标签分子(指示305处的空心圆)连接的核苷酸(指示305处的实心圆)的集合中抽取。每种类型的核苷酸与不同标签分子连接，以使得当标签被释放并且通过纳米孔306时，其可以基于纳米孔中产生的信号而彼此区分。
图4展示由不同标签所产生的如其通过纳米孔进行检测的不同信号的一实例。检测到四个不同信号强度(401、402、403和404)。这些可以对应于四种不同标签。举例来说，呈现给纳米孔和/或通过并入腺苷(A)释放的标签可以产生具有振幅401的信号。呈现给纳米孔和/或通过并入胞嘧啶(C)释放的标签可以产生具有更高振幅403的信号；呈现给纳米孔和/或通过并入鸟嘌呤(G)释放的标签可以产生具有甚至更高振幅404的信号；并且呈现给纳米孔和/或通过并入胸嘧啶(T)释放的标签可以产生具有又更高振幅402的信号。在一些情况下，信号在检测之间可以返回到基线水平405。
核苷酸并入事件的速率一般来说与在核苷酸并入事件期间释放的标签分子通过纳米孔和/或由纳米孔检测的速率相比更慢(或相等)。一般来说，核苷酸并入事件的速率不大于在核苷酸并入事件期间释放的标签分子通过纳米孔和/或由纳米孔检测的速率(即，否则的话核苷酸并入事件无法精确检测和/或处于正确序列)。
用于测序的纳米孔的阵列
图5显示，多种核酸分子可以在纳米孔检测器的阵列上进行测序。此处，每个纳米孔位置(例如501)包含任选地与聚合酶和/或磷酸酶连接的纳米孔。一般来说如本文中别处所述在每个阵列位置处还存在传感器。
在一些实例中，提供与核酸聚合酶连接的纳米孔的阵列，并且用聚合酶使加标签的核苷酸聚合。在聚合期间，标签被释放并且通过纳米孔进行检测。纳米孔的阵列可以具有任何合适数目的纳米孔。在一些情况下，阵列包含约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约10000、约15000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、约200000、约400000、约600000、约800000、约1000000个和类似数目的纳米孔。在一些情况下，阵列包含至少200、至少400、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000、至少200000、至少400000、至少600000、至少800000、至少1000000个和类似数目的纳米孔。纳米孔可以是可个别寻址的。在一些情况下，阵列可以按每mm2至少约500、600、700、800、900、1000、10,000、100,000或1,000,000个可个别寻址的纳米孔的密度包括可个别寻址的纳米孔。
在一些情况下，单一标签在并入单一核苷酸后被释放并且通过纳米孔进行检测。在其它情况下，多种标签在并入多种核苷酸后被释放。与纳米孔相邻的纳米孔传感器可以检测个别释放的标签或多种释放的标签。可以对一或多个与多种释放的标签相关的信号进行检测和处理以产生平均信号。
标签可以通过传感器作为时间的函数检测。随时间检测的标签可以用以例如借助于计算机系统(参看例如图18)测定核酸样品的核酸序列，所述计算机系统被程序化以记录传感器数据并且从数据产生序列信息。
测序精确性
本文中提供的方法可以精确区别个别核苷酸并入事件(例如单分子事件)。所述方法可以单遍地精确区别个别核苷酸并入事件，即不必对既定核酸分子再测序。
一种用于核酸测序的方法包含以大于约4σ的精确性区别个别核苷酸并入事件。在一些情况下，核苷酸并入事件借助于纳米孔进行检测。与核苷酸相关联的标签可以在并入后释放，并且标签通过纳米孔。不同标签可以与每种类型的核苷酸相关联和/或从其释放(例如A、C、T、G)，并且在其通过纳米孔时进行检测。错误包括(但不限于)(a)未能检测标签，(b)错鉴别标签，(c)在不存在标签时检测到标签，(d)以不正确的顺序检测标签(例如两种标签以第一顺序释放，但通过彼此并且以第二顺序检测)，(e)尚未从核苷酸释放的标签被检测为被释放，或其任何组合。在一些实施例中，区别个别核苷酸并入事件的精确性是100％减错误发生的比率(即错误率)。
区别个别核苷酸并入事件的精确性是任何合适的百分比。区别个别核苷酸并入事件的精确性可以是约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.9％、约99.99％、约99.999％、约99.9999％等。在一些情况下，区别个别核苷酸并入事件的精确性是至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.999％、至少99.9999％等。在一些情况下区别个别核苷酸并入事件的精确性以西格玛(σ)单位报道。西格玛是一种统计变量，其有时在企业管理和制造策略中用以报道错误率，例如无缺陷产品的百分比。此处，西格玛值可以根据如下关系与精确性可互换地使用：4σ是99.38％精确性，5σ是99.977％精确性，并且6σ是99.99966％精确性。
根据本文中所述的方法区别个别核苷酸并入事件可以用以精确测定核酸序列。在一些情况下，核酸(例如DNA和RNA)的核酸序列的测定包括错误。例示性错误包括(但不限于)缺失(未能检测核酸)、插入(在无一者真实存在时检测到核酸)和取代(检测不正确的核酸)。核酸测序的精确性可以通过以下方式来测定：使所测量的核酸序列与真实核酸序列对齐(例如根据生物信息学技术)，并且测定是缺失、插入和/或取代的核酸位置的百分比。错误是缺失、插入和取代的任何组合。精确性在0％到100％范围内，其中100％是完全正确地测定核酸的序列。类似地，错误率是100％-精确性并且在0％到100％范围内，其中0％错误率是完全正确地测定核酸的序列。
如根据本文中所述的方法和/或使用本文中所述的装置进行的核酸测序的精确性是高的。精确性是任何合适地高的值。在一些情况下，精确性是约95％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、约99.9％、约99.99％、约99.999％、约99.9999％等。在一些情况下，精确性是至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.999％、至少99.9999％等。在一些情况下，精确性在约95％与99.9999％之间、约97％与99.9999％之间、约99％与99.9999％之间、约99.5％与99.9999％之间、约99.9％与99.9999％之间等。
高精确性可以通过进行多个道次而达到(即例如通过使核酸通过或接近纳米孔地通过并且对核酸分子的核酸碱基测序而对核酸分子测序多次)。可以将多个道次的数据组合(例如将第一道次中的缺失、插入和/或取代使用其它重复的道次的数据来校正)。所述方法以极少的道次(也称为读数，测序覆盖的多重性)提供高精确性。道次数目是任何合适数目，并且不需要是整数。在一些实施例中，对核酸分子测序1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、16次、18次、20次、25次、30次、35次、40次、45次、50次等。在一些实施例中，对核酸分子测序至多1次、至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多12次、至多14次、至多16次、至多18次、至多20次、至多25次、至多30次、至多35次、至多40次、至多45次、至多50次等。在一些实施例中，对核酸分子测序约1次与10次之间、约1次与5次之间、约1次与3次之间等。精确性水平可以通过组合从至多20个道次收集的数据来达到。在一些实施例中，精确性水平通过组合从至多10个道次收集的数据来达到。在一些实施例中，精确性水平通过组合从至多5个道次收集的数据来达到。在一些情况下，精确性水平在单一道次中达到。
错误率是任何合适低的比率。在一些情况下，错误率是约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.1％、约0.01％、约0.001％、约0.0001％等。在一些情况下，错误率是至多10％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、至多0.5％、至多0.1％、至多0.01％、至多0.001％、至多0.0001％等。在一些情况下，错误率在10％与0.0001％之间、3％与0.0001％之间、1％与0.0001％之间、0.01％与0.0001％之间等。
模板制备
所述方法可以涉及通过以下方式来对模板核酸链测序：添加加标签的核苷酸到与模板链互补的链，和检测纳米孔中释放的标签分子。
图10展示一种用于制备核酸模板的方法。在此情况下，待测序的核酸分子是双链的并且包含有义链1001和反义链1002。核酸发夹1003可以连接到有义链的3'端和反义链的5'端上。
核酸分子的链可以解离以形成包含有义链1004、发夹1005和反义链1006的单链模板分子。此单链核酸可以如本文中所述进行测序。
在一些情况下，用于制备核酸模板的本发明方法允许在单一测序操作中对有义链和反义链测序。这可以产生两个冗余数据集(即对每个核酸碱基对位置测序两次)，与对初始双链核酸分子的仅一个链测序相比，其可以导致更精确地测定序列。
装置装配
图11是可以用以如本文中所述对核酸测序和/或检测标签分子的纳米孔装置100(或传感器)的示意图。含有纳米孔的脂质双层可以通过电阻和电容来表征。纳米孔装置100包括形成于导电固体衬底106的脂质双层相容表面104上的脂质双层102，其中脂质双层相容表面104可以通过脂质双层不相容表面105隔离并且导电固体衬底106可以通过绝缘材料107电隔离，并且其中脂质双层102可以由形成于脂质双层不相容表面105上的非晶脂质103围绕。脂质双层102可以包埋有单一纳米孔结构108，其纳米孔110足够大以使所表征的标签分子和/或小离子(例如Na+、K+、Ca2+、Cl-”)在脂质双层102的两侧之间通过。水分子层114可以吸附在脂质双层相容表面104上并且夹在脂质双层102与脂质双层相容表面104之间。吸附在亲水性脂质双层相容表面104上的水性膜114可以促进脂质分子的排序并且有助于在脂质双层相容表面104上形成脂质双层。含有核酸分子112和加标签的核苷酸的溶液的样品腔室116可以提供于脂质双层102上。溶液可以是含有电解质并且缓冲到最优离子浓度并且维持在最优pH下以保持纳米孔110开放的水溶液。装置包括一对与可变电压源120耦接的电极118(包括负节点118a和正节点118b)，以便提供穿过脂质双层的电刺激(例如电压偏置)并且感测脂质双层的电特性(例如电阻、电容和离子电流)。正电极118b的表面是或形成脂质双层相容表面104的一部分。导电固体衬底106可以与电极118之一耦接或形成其一部分。装置100还可以包括电路122，以便控制电刺激并且加工所检测的信号。在一些实施例中，可变电压源120包括为电路122的一部分。电路122可以包括放大器、积分器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其它组件。电路122可以是集成于硅衬底128内的集成电路并且可以进一步与计算机处理器124耦接，所述计算机处理器与存储器126耦接。
脂质双层相容表面104可以由适用于离子转导和气体形成的各种材料形成以有助于脂质双层形成。在一些实施例中，可以使用导电或半导电亲水性材料，因为其可以允许更佳地检测脂质双层电特性的变化。例示性材料包括Ag-AgCl、Au、Pt或掺杂硅或其它半导体材料。在一些情况下，电极不是牺牲电极。
脂质双层不相容表面105可以由不适用于脂质双层形成的各种材料形成并且其典型地是疏水性的。在一些实施例中，非导电疏水性材料是优选的，因为其除了使脂质双层区域彼此间隔之外还使脂质双层区域电绝缘。例示性脂质双层不相容材料包括例如氮化硅(例如Si3N4)和铁氟龙(Teflon)。
在一实例中，图11的纳米孔装置100是α溶血素(aHL)纳米孔装置，其具有单一α溶血素(aHL)蛋白质108包埋于二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层102中，所述脂质双层形成于涂布在铝材料106上的脂质双层相容Pt表面104上。脂质双层相容Pt表面104通过脂质双层不相容氮化硅表面105而隔离，并且铝材料106通过氮化硅材料107而电绝缘。铝106与集成于硅衬底128中的电路122耦接。位于芯片上或从盖板128向下延伸的银-氯化银电极接触含有核酸分子的水溶液。
aHL纳米孔是七种个别肽的组装。aHL纳米孔的入口或孔室的直径是约26埃，这足够宽以容纳dsDNA分子的一部分。aHL纳米孔从孔室开始首先变宽并且然后变窄到直径是约15埃的筒管，其足够宽以允许单一ssDNA分子(或释放的标签分子)通过但宽度不够允许dsDNA分子通过。
除了DPhPC之外，纳米孔装置的脂质双层可以由基于各种考虑因素所选择的各种其它合适两亲材料组装，所述考虑因素例如所用的纳米孔类型、所表征的分子类型以及所形成的脂质双层的各种物理、化学和/或电特性(例如所形成的脂质双层的稳定性和渗透性、电阻和电容)。例示性两亲材料包括各种磷脂，例如棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)和二油酰基-磷脂酰甲酯(DOPME)、二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂。
除了上文所示的aHL纳米孔之外，纳米孔可以是各种其它类型的纳米孔。实例包括γ-溶血素、杀白细胞素、蜂毒肽以及各种其它天然存在、被修饰的天然和合成纳米孔。合适的纳米孔可以基于分析物分子的各种特征进行选择，所述特征例如分析物分子相对于纳米孔的孔隙大小的大小。举例来说，aHL纳米孔具有约15埃的限制性孔隙大小。
高阵列密度
纳米孔检测器的阵列可以具有高密度的离散位点。举例来说，每单位面积多个位点(即密度)允许构筑便携式的、低成本的或具有其它有利特征的较小装置。包含纳米孔和感测电路的多个位点可以允许一次对多个核酸分子测序。这种系统可以增加对核酸样品测序的产量和/或降低其成本。
核酸样品可以使用具有具备包含离散位点的表面的衬底的传感器(或检测器)来测序，每个个别位点具有纳米孔、与纳米孔连接的聚合酶和任选地至少一种磷酸酶以及与纳米孔相邻的感测电路。系统可以进一步包含与衬底流体连通的流动槽，所述流动槽适于传递一或多种试剂到所述衬底。
表面包含任何合适密度的离散位点(例如适用于在既定时间量中或针对既定成本对核酸样品测序的密度)。表面的离散位点密度可以是每1mm2大于或等于约500个位点。在一些实施例中，表面的离散位点密度是每1mm2约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点。在一些情况下，表面的离散位点密度是每1mm2至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000或至少500000个位点。
电流测量
基于纳米孔的测序芯片可以并入以阵列形式配置的多个自主地操作或可个别寻址的电池。纳米孔装置可以包括可个别寻址的纳米孔的阵列。每个可个别寻址的纳米孔可以包括可个别寻址的电极。举例来说，一百万个电池的阵列可以由1000行电池×1000列电池构筑。此阵列可以通过例如当在核苷酸并入事件后释放的标签通过纳米孔时测量电导差而使得能够对核酸分子平行测序。此外，此电路实施例使得孔隙-分子复合物的电导特征可测定，这在区别特定标签方面可能价值极高。
在一些情况下，电流可以在施加的电压下测量。为了实现此，可以向电极施加所要电势，并且随后可以在整个测量中维持施加的电势。在一实施例中，出于此目的，可以如本文中所述使用运算放大积分器拓扑。积分器借助于电容反馈维持电极处的电压电势。积分器电路可以提供出色的线性、电池与电池匹配和偏移特征。运算放大积分器典型地需要大的尺寸以便获得所需性能。本文中描述更紧凑的积分器拓扑。
在一些情况下，可以向腔室施加电压电势“V液体”，其向芯片上的所有电池提供共用电势(例如350mV)。积分器电路可以将电极(其电学上是积分电容器的顶板)初始化为大于共用液体电势的电势。举例来说，450mV下的偏置可以得到正100mV的电极与液体之间电势。此正电压电势可以导致电流从电极流动到液体腔室接触点。在此情况下，载体是：(a)K+离子，其从双层的电极(反)侧流动通过孔隙到双层的液体储槽(顺)侧；和(b)反侧上的氯(Cl-)离子，其根据以下电化学反应与银电极反应：Ag+Cl-→AgCl+e-。
在一些情况下，K+从封闭电池中流出(从双层的反侧到顺侧)，而Cl-转化为氯化银。双层的电极侧可以由于电流而变得脱盐。在一些情况下，银/氯化银液体海绵状材料或基质可以充当储槽以在电腔室接触点处发生的逆反应中供应Cl-离子以完成电路。
在一些情况下，电子最终流动到积分电容器的顶侧上，这产生所测量的电流。电化学反应将银转化为氯化银，并且电流将继续流动，仅要存在待转化的可用银即可。在一些情况下，银的有限供应导致电流依赖性电极寿命。在一些实施例中，使用未耗尽的电极材料(例如铂)。
电池电路
电池电路的一实例展示于图14B中。将施加的电压Va施加到MOSFET电流传送器门1401前的运算放大器1400。此处还展示电极1402以及核酸和/或标签的通过装置检测的电阻1403。
施加的电压Va可以驱动电流传送器门1401。电极上的所得电压则是Va-Vt，其中Vt是MOSFET的阈值电压。在一些情况下，这导致有限控制向电极施加的实际电压，因为MOSFET阈值电压可以因工艺、电压、温度并且甚至在芯片内的各装置之间大大变化。此Vt变化在低电流水平下可能更大，其中亚阈值泄漏效应可以开始起作用。因此，为了提供对施加的电压的更佳控制，可以将运算放大器以跟随器反馈配置与电流传送器装置一起使用。这确保，向电极施加的电压是Va，与MOSFET阈值电压的变化无关。
电池电路的另一实例展示于图13中，并且包括积分器、比较器和数字逻辑以移入控制位并且同时移出比较器输出的状态。电池电路可以适于用于本文中提供的系统和方法。B0到B1线可以从移位寄存器中出来。模拟信号由组内的所有电池共用，而数字线从电池到电池可以是菊链式的。
电池数字逻辑包含5位数据移位寄存器(DSR)、5位平行负载寄存器(PLR)、控制逻辑和模拟积分器电路。使用LIN信号，将移到DSR中的控制数据平行负载到PLR中。这些5位控制数字“先断后通”时序逻辑，其控制电池的切换。另外，数字逻辑具有置位复位(SR)闩锁以记录比较器输出的切换。
所述架构提供与个别电池电流成正比的可变取样速率。与较低电流相比，较高电流每秒可以产生更多样品。电流测量的分辨率与所测量的电流相关。小电流与大电流相比可以按更精细分辨率测量，这可以是优于固定分辨率测量系统的益处。存在允许用户通过改变积分器的电压摆动来调节取样速率的模拟输入。可能可以增加取样速率以便分析生物学上快速的过程或减缓取样速率(并且由此增益精确度)以便分析生物学上缓慢的过程。
将积分器的输出初始化为电压LVB(低电压偏置)并且积分达到电压CMP。每当积分器输出在这两个水平之间摆动时，产生一样品。因此，电流越大，积分器输出摆动越快并且因此取样速率越快。类似地，如果CMP电压降低，那么产生新样品所需的积分器输出摆动减小并且因此取样速率增加。因此，简单地减小LVB与CMP之间的电压差提供了增加取样速率的机制。
基于纳米孔的测序芯片可以并入以阵列形式配置的多个自主地操作或可个别寻址的电池。举例来说，一百万个电池的阵列可以由1000行电池×1000列电池构筑。此阵列使得能够通过例如当在核苷酸并入事件后释放的标签通过纳米孔进行检测时测量电导差而对核酸分子平行测序。此外，此电路实施例使得孔隙-分子复合物的电导特征可测定，这在区别标签方面可能是有价值的。
集成纳米孔/双层电子电池结构可以施加适当电压以便进行电流测量。举例来说，可能需要(a)控制电极电压电势并且(b)同时监测电极电流以便恰当地运行。
此外，可能需要彼此独立地控制电池。可能需要独立控制电池以便管理可以处于不同物理状态的多个电池。精确控制向电极施加的分段线性电压波形刺激可以用以在电池的各物理状态之间转换。
为了减小电路大小和复杂性，提供逻辑以施加两个单独的电压可能足够了。这允许对电池进行两个独立分组并且施加相应状态转换刺激。状态转换实质上是随机的，发生概率相对低。因此，可能非常适用的是能够确证适当控制电压并且随后进行测量以确定是否已经发生所要状态转换。举例来说，可以向电池施加适当电压并且然后测量电流以确定是否已经形成双层。电池分成两组：(a)已经具有双层形式并且不再需要施加电压的电池。这些电池可以被施加以0V偏置以便实现空操作(NOP)，也就是说保持相同状态；和(b)并未形成双层的电池。这些电池将再次被施加以双层形成电压。
可以通过将容许施加电压约束到两个并且反复使电池分批地在各物理状态之间转换来实现实质性简化和电路大小减小。举例来说，可以通过约束容许施加电压实现至少1.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100倍的减小。
使用紧凑型测量电路的本发明另一实施例展示于图14A中。在一些情况下，紧凑型测量电路可以用以获得本文中所述的高阵列密度。此电路还被设计成向电极施加电压而同时测量低水平电流。
电池充当超紧凑积分器(UCI)并且此处描述基本操作。电池通过Electrod-Sense(ELSNS)连接与电化学活性电极(例如AgCl)电连接。NMOS晶体管M11起两个独立作用：(1)充当源极跟随器以向ELSNS节点施加电压，由(Vg1--Vt1)给出；并且(2)充当电流输送器以使电子从电容器C1移动到ELSNS节点(并且反之亦然)。
在一些情况下，可以向ELSNS电极施加受控电压电势，并且此电势可以简单地通过改变电极源极跟随器M11的门上的电压而改变。此外，将来自M11源极销的任何电流直接并且精确传播到M11漏极销，其中其可以积聚在电容器C0上。因此，M11和C0一起充当超紧凑积分器。此积分器可以用以通过测量积分到电容器上的电压的变化、根据以下来测定从电极流出/流入到电极的电流：I*t＝C*V，其中I是电流，t是时间，C是电容，并且V是电压变化。
在一些情况下，电压变化在固定时间间隔t(例如每1ms)下进行测量。
晶体管M2可以配置为源极跟随器以便缓冲电容器电压并且提供积分电压的低阻抗代表。此防止电荷共用改变电容器上的电压。
晶体管M3可以用作行接入装置，模拟电压输出AOUT以与许多其它电池共用的列形式连接。启用列连接的AOUT信号的仅单一行，以便测量单一电池的电压。
在一替代性实施例中，晶体管M3可以通过将晶体管M2的漏极与行可选择的“转换轨道”连接而被省略。
晶体管M4可以用以使电池复位到预定起始电压，电压从所述起始电压开始积分。举例来说，向RST和RV两者施加高电压(实例：到VDD＝1.8V)将拉动电容器达到(VDD--Vt5)的充电前值。确切起始值可以在电池与电池间(由于M4和M2的Vt变化)以及由于复位切换热噪声(sqrt(KTC)噪声)而在测量与测量间变化。因此，相关双取样(CDS)技术用以测量积分器起始电压和终止电压以测定积分时期期间的实际电压变化。
还请注意，晶体管M4的漏极可以与受控电压RV(复位电压)连接。在正常操作中，此可以驱动为VDD，然而其还可以驱动为低电压。如果M4的“漏极”实际上驱动到地，那么电流可以逆转(即电流可以从电极通过M1和M4流动到电路中，并且源极和漏极的概念可以调换)。在一些情况下，当以此模式操作电路时，向电极施加的负电压(相对于液体参考)受此RV电压控制(假定Vg1和Vg5至少是大于RV的阈值)。因此，RV上的地电压可以用以向电极施加负电压(例如以实现电穿孔或双层形成)。
模/数转换器(ADC，未展示)在复位之后立即并且在积分时期(执行CDS测量)之后再次测量AOUT电压以便测定在固定时间段期间积分的电流。并且ADC可以根据列或用于每个列的单独晶体管以模拟多路复用器形式建构，以在多个列之间共用单一ADC。此列多路复用器因素可以取决于噪声、精确性和产量的需求而变化。
在任何既定时间，每个电池可以处于四种不同物理状态之一：(1)对液体短路，(2)双层形成，(3)双层+孔隙，(4)双层+孔隙+核酸和/或标签分子。
在一些情况下，施加电压以使电池在各状态之间移动。NOP操作用以保持电池处于特定所要状态，而用施加的电势刺激其它电池以从一种状态移动到另一状态。
这可以通过具有两个(或更多个)可以向M1源极跟随器的门电压施加的不同电压来实现，所述门电压间接用以相对于液体电势控制向电极施加的电压。因此，晶体管M5用以施加电压A，而晶体管M6用以施加电压B。因此，M5和M6一起充当模拟多路复用器，SELA或SELB被驱动得很高以选择电压。
因为每个电池可以处于可能的不同状态并且因为SELA和SELB是互补的，所以可以在每个电池中使用存储器元件以在电压A或B之间选择。此存储器元件可以是在每个循环时刷新的动态元件(电容器)或简单模拟-闩锁存储器元件(交叉耦合的反相器)。
运算放大器测试芯片结构
在一些实例中，测试芯片包括264个传感器的阵列，其以每组66个传感器电池的四个单独群组(也称为组)布置。每个群组又分成三“列”，每列具有22个传感器“电池”。“电池”名称是适当的，考虑到在阵列中的264个传感器中的每一者上方形成理想地由双脂质层和插入的纳米孔组成的虚拟电池(但装置可以在仅一部分传感器电池如此填充的情况下成功地操作)。
存在单一模拟I/O垫，其向安装到模具表面的导电圆柱内所含的液体施加电压电势。此“液体”电势施加到孔隙的顶侧并且为检测器阵列中的所有电池共用。孔隙的底侧具有暴露电极并且每个传感器电池可以向其电极施加不同底侧电势。然后测量顶部液体连接与孔隙的底侧上的每个电池的电极连接之间的电流。传感器电池测量如由在孔隙内通过的标签分子调节的穿过孔隙的电流。
在一些情况下，五位控制每个传感器电池的模式。继续参考图12，阵列中的264个电池中的每一者可以个别地控制。向一组66个电池单独地施加值。一组中66个电池中的每一者的模式通过使330(66×5位/电池)个数字值连续移位到数据移位寄存器(DSR)中来控制。使用KIN(时钟)和DIN(dat in)销使这些值移位到阵列中，对于每个群组的66个电池使用单独销对。
因此，330个时钟用以使330位移位到DSR移位寄存器中。当确证相应LIN<i>(负载输入)很高时，与此移位寄存器平行负载第二330位平行负载寄存器(PLR)。在与平行负载PLR相同的时间，将电池的状态值负载到DSR中。
完整操作可以由以下组成：330个时钟以使330数据位移位到DSR中，确证LIN信号很高的单一时钟周期，接着是330个时钟周期以读取从DSR中移位出的捕获的状态数据。使操作管线化，以便新的330位可以移位到DSR中，而同时330位从阵列中被读取出。因此，在50MHz时钟频率下，读取的周期时间是331/50MHz＝6.62μs。
加标签的核苷酸
在一些情况下，加标签的核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。标签可以与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在一些情况下，标签不是荧光团。标签可以通过其电荷、形状、大小或其任何组合而可检测。例示性标签包括各种聚合物。每种类型的核苷酸(即A、C、G、T)一般来说包含独特标签。
标签可以位于核苷酸上的任何合适位置上。图6提供加标签的核苷酸的一实例。此处，R1一般来说是OH并且R2是H(即对于DNA)或OH(即对于RNA)，但其它修饰是可接受的。在图6中，X是任何合适连接子。在一些情况下，连接子是可裂解的。连接子的实例包括(但不限于)O、NH、S或CH2。适用于位置Z的化学基团的实例包括O、S或BH3。碱基是适用于并入到核酸中的任何碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或其衍生物。在一些情况下，通用碱基也是可接受的。
磷酸酯的数目(n)是任何合适的整数值(例如多个磷酸酯以使得核苷酸可以并入到核酸分子中)。在一些情况下，所有类型的加标签的核苷酸都具有相同数目的磷酸酯，但这不是必需的。在一些应用中，对于每种类型的核苷酸存在不同标签并且磷酸酯的数目未必用以区别各种标签。然而，在一些情况下，多于一种类型的核苷酸(例如A、C、T、G或U)具有相同标签分子，并且区别一种核苷酸与另一核苷酸的能力至少部分通过磷酸酯的数目测定(各种类型的核苷酸具有不同n值)。在各种实施例中，n的值是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
下文描述合适的标签。在一些情况下，标签的电荷相对于化合物的其余部分上的电荷正负相反。当连接标签时，整体化合物上的电荷可以是中性的。标签的释放可以产生两种分子，带电的标签和带电的核苷酸。带电的标签通过纳米孔并且在一些情况下进行检测。
合适加标签的核苷酸的更多实例展示于图7中。标签可以与糖分子、碱基分子或其任何组合连接。参考图7，Y是标签并且X是可裂解连接子。此外，R1(如果存在的话)一般来说是OH、-OCH2N3或-O-2-硝基苯甲基，并且R2(如果存在的话)一般来说是H。此外，Z一般来说是O、S或BH3，并且n是包括1、2、3或4的任何整数。在一些情况下，A是O、S、CH2、CHF、CFF或NH。
继续参考图7，每种dNPP类似物上的碱基的类型一般来说不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，并且每种dNPP类似物上的标签的类型一般来说不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的标签的类型。合适的碱基包括(但不限于)腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或其每一者的衍生物。在一些情况下，碱基是7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶之一。
在R1是-O-CH2N3的情况下，所述方法任选地进一步包含处理并入的dNPP类似物以便去除-CH2N3并且产生与3'位连接的OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
在R1是-O-2-硝基苯甲基的情况下，所述方法任选地进一步包含处理并入的核苷酸类似物以便去除-2-硝基苯甲基并且产生与3'位连接的OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
例示性标签
标签可以是能够在纳米孔中检测的任何化学基团或分子。在一些情况下，标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
还预期，标签进一步包含适当数目的赖氨酸或精氨酸以平衡化合物中磷酸酯的数目。
在一些情况下，标签是聚合物。聚乙二醇(PEG)是聚合物的一实例并且具有如下结构：
可以使用任何数目的乙二醇单元(W)。在一些情况下，W是0与100之间的整数。在一些情况下，乙二醇单元的数目对于每种类型的核苷酸来说是不同的。在一实施例中，四种类型的核苷酸包含具有16、20、24或36个乙二醇单元的标签。在一些情况下，标签进一步包含另一可鉴别部分，例如基于香豆素的染料。
在一些情况下，标签包含多个PEG链。在一实例中，标签具有如下结构：
其中R是NH2、OH、COOH、CHO、SH或N3，并且W是0到100的整数。
在一些情况下，标签选自分子(dCp)m、(dGp)m、(dAp)m和(dTp)m。图8展示与核苷酸连接的这些分子。此处，‘m’独立地是0到100的整数，并且其中当m是0时，dNPP的末端磷酸酯与结构的左手侧上所展示的核苷的3'O原子直接键结。在一些情况下，n的值对于每种类型的碱基来说是不同的。
在一些情况下，标签是被取代或未被取代的烃基，例如烷基、烯基、炔基，并且质量是3000道尔顿或更小。
如本文中所用，术语“烷基”包括具有规定数目的碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未被取代或被取代的。如本文中所用，“烯基”是指直链或支链的、含有至少1个碳碳双键的非芳香族烃基，并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳双键，并且可以是未被取代或被取代的。术语“炔基”是指直链或支链的含有至少1个碳碳三键的烃基，并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳三键，并且可以是未被取代或被取代的。术语“被取代的”是指其中含于其中的与氢原子的至少一个键由与非氢或非碳原子的键置换的如上文所述的官能团，例如烷基或烃基，其条件是维持正常价数并且所述取代产生稳定化合物。被取代的基团还包括其中与碳或氢原子的一或多个键由与杂原子的一或多个键(包括双或三键)置换的基团。
加标签的核苷酸的非限制性实例包括具有以下结构的化合物：
其中‘R’是被取代或未被取代的至多3000道尔顿的烃基，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
加标签的核苷酸的其它非限制性实例包括具有以下结构的化合物：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
加标签的核苷酸的其它非限制性实例包括具有以下结构的化合物：
加标签的核苷酸的其它非限制性实例包括具有以下结构的化合物：
其中m是1-50的整数，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
用于连接标签的方法
可以使用任何适用于连接标签的方法。在一实例中，标签可以通过以下方式与末端磷酸酯连接：(a)使核苷酸三磷酸酯与二环己基碳化二亚胺/二甲基甲酰胺在允许产生环三偏磷酸酯的条件下接触；(b)使由步骤a)产生的产物与亲核试剂接触以便形成-OH或-NH2官能化的化合物；和(c)使步骤b)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成核苷酸三磷酸酯类似物。
在一些情况下，亲核试剂是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R'S-R-OH、R'S-R-NH2或
在一些情况下，所述方法包含在步骤b)中，使由步骤a)产生的产物与具有以下结构的化合物接触：
和随后或同时使产物与NH4OH接触以便形成具有以下结构的化合物：
步骤b)的产物然后可以与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成具有以下结构的核苷酸三磷酸酯类似物：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
释放标签
标签可以按任何方式释放。在一些情况下，标签与聚磷酸酯(例如图6)连接并且核苷酸向核酸分子中的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯。并入可以由至少一种任选地与纳米孔连接的聚合酶催化。在一些情况下，至少一种磷酸酶也与孔隙连接。磷酸酶可以使标签从聚磷酸酯裂解以释放标签。在一些情况下，磷酸酶被定位成使得在聚合酶反应中由聚合酶制造的焦磷酸酯在进入孔隙之前与磷酸酶相互作用。
在一些情况下，标签不与聚磷酸酯连接(参看例如图7)。在这些情况下，标签通过可裂解连接子(X)连接。用于制造可裂解地封端和/或可裂解地连接的核苷酸类似物的方法公开于美国专利第6,664,079号中，所述专利以全部引用的方式并入本文中。
连接子可以是任何合适连接子并且以任何合适方式裂解。连接子可以是可光裂解的。在一实施例中，UV光用以使可光化学裂解的连接子和部分光化学裂解。在一实施例中，可光裂解的连接子是2-硝基苯甲基部分。
-CH2N3基团可以用TCEP(三(2-羧乙基)膦)处理以便使其从dNPP类似物或rNPP类似物的3'O原子去除，由此产生3'OH基团。
检测标签
标签可以在其从核苷酸释放之后流动通过纳米孔。在一些情况下，施加电压以拉动标签通过纳米孔。至少约85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％或至少99.99％的所释放的标签可以易位通过纳米孔。
在所述方法的一些情况下，聚合酶从包含多种不同碱基(例如A、C、G、T和/或U)的加标签的核苷酸的集合中抽取。还可能反复使聚合酶与各种类型加标签的碱基接触。在此情况下，可能不需要每种类型的核苷酸具有独特碱基，但在一些情况下，在不同碱基类型之间循环给工艺增添了成本和复杂性，然而此实施例涵盖于本发明中。
图9显示，向核酸分子中并入加标签的核苷酸(例如使用聚合酶以使引物碱基对延伸到模板)释放了可检测的标签-聚磷酸酯。在一些情况下，标签-聚磷酸酯在其通过纳米孔时进行检测。甚至可能基于包含聚磷酸酯的磷酸酯的数目区别核苷酸(例如甚至当标签相同时)。然而，每种类型的核苷酸一般来说具有独特标签。
参考图9，标签-聚磷酸酯化合物可以在使标签通过纳米孔并且测量离子电流之前用磷酸酶(例如碱性磷酸酶)进行处理。
标签可以(至少部分)由于其电荷而在纳米孔中检测。在一些情况下，标签化合物是交替地带电的化合物，其具有第一净电荷，并且在化学、物理或生物反应之后具有不同的第二净电荷。在某一情况下，标签上的电荷的量级与化合物的其余部分上的电荷的量级相同。在一实施例中，标签具有正电荷并且标签的去除改变化合物的电荷。
在一些情况下，在标签通过纳米孔时，可能产生电子变化。在一些情况下，电子变化是电流振幅的变化、纳米孔的电导的变化或其任何组合。
纳米孔可以是生物或合成的。还预期，孔隙是蛋白质的，例如其中孔隙是α溶血素蛋白质。合成纳米孔的一实例是固态孔隙或石墨烯。
在一些情况下，聚合酶和/或磷酸酶与纳米孔连接。融合蛋白或二硫交联是用于与蛋白质纳米孔连接的方法的实例。在固态纳米孔的情况下，与靠近纳米孔的表面的连接可以经由生物素-抗生蛋白链菌素键联进行。在一实例中，DNA聚合酶经由被经氨基官能化的烷硫醇自组装单层修饰的金表面与固体表面连接，其中氨基被修饰为NHS酯以便与DNA聚合酶上的氨基连接。
本发明的一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法。在一些实施例中，所述计算机处理器在接近所述芯片的工作站。在一些情况下，标签通过纳米孔。在一些实施例中，标签与纳米孔相邻地通过。在一些实施例中，聚合的速率小于标签通过纳米孔或与纳米孔相邻地通过的速率。在一些情况下，所述电极适于供应穿过所述膜的电刺激。芯片可以具有例如美国专利第8,324,914号公开的特征和性质，所述专利以全部引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，如穿过所述膜测量，所述膜的电容大于约5fF/μm2。在一些情况下，如穿过所述膜测量，所述膜的电阻大于或等于约500MΩ。在一些实施例中，所述膜的穿过所述膜的电阻小于或等于约1GΩ。在一些情况下，所述电阻借助于与所述膜相邻安置的相对电极测量。在一些实施例中，所述电阻借助于与所述膜相邻安置的相对电极测量。
在一些情况下，每个可个别寻址的纳米孔适于调节分子流动。在一些情况下，所述可个别寻址的纳米孔适于在其所述标签的分子流动通过所述纳米孔或与所述纳米孔相邻流动后检测所述标签。在一些情况下，所述电极是可个别寻址的。在一些情况下，所述电极与集成电路耦接，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。
在一些情况下，所述集成电路包含逻辑控制器。在一些情况下，所述电极是集成电路的一部分，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。
在一些情况下，所述膜是脂质双层。在一些情况下，所述膜是二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层。在一些情况下，纳米孔是α-溶血素纳米孔。在一些情况下，所述膜展现(i)穿过所述膜是大于约5fF/μm2的电容或小于或等于约1GΩ的电阻，或(ii)穿过所述膜是大于约5fF/μm2的电容和小于或等于约1GΩ的电阻。在一些情况下，所述膜与膜相容表面相邻安置。在一些情况下，所述多个可个别寻址的纳米孔的密度每mm2至少约500、600、700、800、900、1000、10,000、100,000或1,000,000个可个别寻址的纳米孔。
在一些情况下，每种类型的核苷酸包含独特标签。在一些情况下，标签最初与个别核苷酸的5'-磷酸酯连接。在一些情况下，使引物退火到单链核酸模板上的特定位置。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测核苷酸向核酸分子中的并入，其中所述核酸分子不通过所述纳米孔。在一些情况下，与核苷酸相关联的标签在并入后释放，并且其中在释放之后标签通过纳米孔。
在一些情况下，核苷酸并入事件以至少4σ的精确性检测。在一些情况下，核苷酸并入事件以至少5σ的精确性检测。在一些情况下，核苷酸并入事件以至少6σ的精确性检测。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测个别核苷酸并入事件的副产物。在一些情况下，核苷酸不通过所述纳米孔直接检测。在一些情况下，核苷酸并入事件的副产物是在所述个别核苷酸并入事件后释放的标签分子。在一些情况下，标签分子通过纳米孔。一种用于对核酸分子测序的方法，其包含以大于4σ的精确性区别个别核苷酸并入事件。在一些情况下，精确性大于5σ。在一些情况下，精确性大于6σ。在一些情况下，核苷酸并入事件借助于纳米孔进行检测。在一些情况下，所述纳米孔是可个别寻址的纳米孔。在一些情况下，所述纳米孔在与电极相邻安置的膜中。在一些情况下，所述电极在密度是每mm2至少约500个电极的电极阵列中。在一些情况下，所述个别核苷酸并入事件包含在与所述核酸分子互补的核酸链中并入核苷酸，其中所述核苷酸包含在于所述核酸链中并入所述核苷酸后释放的标签，并且其中所述标签在从所述核苷酸释放之后通过所述纳米孔或与所述纳米孔相邻地通过。在一些情况下，所述标签在从所述核苷酸释放之后借助于所述电极进行检测。
本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)提供纳米孔阵列，其中所述阵列中的个别纳米孔与核酸聚合酶结合；和(b)用所述聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中个别加标签的核苷酸包含标签，并且其中所述标签被释放并且借助于所述纳米孔进行检测。在一些情况下，标签在释放之后与纳米孔相邻地通过。在一些情况下，标签在释放之后通过纳米孔。在一些情况下，聚合的速率小于标签通过纳米孔的速率。在一些情况下，纳米孔是可个别寻址的。
本发明的另一方面提供一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于包含纳米孔阵列的芯片中的纳米孔进行检测的标签。在一些情况下，标签与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在一些情况下，标签不是荧光团。在一些情况下，标签可通过其电荷、形状、大小或其任何组合而检测。
本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的系统。在一些情况下，所述电极适于供应穿过所述膜的电刺激。在一些情况下，如穿过所述膜测量，所述膜的电容大于约5fF/μm2。在一些情况下，如穿过所述膜测量，所述膜的电阻大于或等于约500MΩ。在一些情况下，所述膜的穿过所述膜的电阻小于或等于约1GΩ。在一些情况下，所述电阻如通过与所述膜相邻安置的相对电极测量。在一些情况下，每个可个别寻址的纳米孔适于调节分子流动。在一些情况下，每个可个别寻址的纳米孔适于借助于向所述纳米孔施加的电刺激来调节分子流动。在一些情况下，所述计算机处理器在接近所述芯片的工作站。在一些情况下，所述计算机处理器包含于所述芯片中。在一些情况下，所述可个别寻址的纳米孔适于在其所述标签的分子流动通过所述纳米孔或与所述纳米孔相邻流动后检测所述标签。在一些情况下，所述电极是可个别寻址的。在一些情况下，所述电极与集成电路耦接，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。在一些情况下，所述集成电路包含逻辑控制器。在一些情况下，所述电极是集成电路的一部分，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。
在一些情况下，所述膜是脂质双层。在一些情况下，纳米孔是α-溶血素纳米孔。在一些情况下，膜是二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质双层。在一些情况下，所述膜与膜相容表面相邻安置。在一些情况下，所述多个可个别寻址的纳米孔的密度是每mm2至少约500个可个别寻址的纳米孔。在一些情况下，所述密度是每mm2至少约1000个可个别寻址的纳米孔。
本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法，所述方法包含以每mm2至少约500个位点的密度提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中在聚合后标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。在一些情况下，所述方法进一步包含引导借助于处理器、基于所述检测的标签来产生所述核酸分子的核酸序列。在一些情况下，标签通过纳米孔。在一些情况下，标签与纳米孔相邻地通过。在一些情况下，聚合的速率小于标签通过纳米孔或与纳米孔相邻地通过的速率。
用于标签测序的方法和系统
本发明的另一方面提供一种电导测量系统，其包含由物理屏障间隔开的具有第一和第二电解质溶液的第一与第二隔室，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙。系统可以进一步包括用于施加穿过屏障的电场的构件、用于测量电场的变化的构件、至少一种与孔隙连接的聚合酶和一或多种与孔隙连接的磷酸酶。
在系统的一实施例中，孔隙的直径是约1到10nm。在另一实施例中，聚合酶和磷酸酶与孔隙共价连接。在另一实施例中，与聚合酶相比更多磷酸酶与孔隙连接。
在系统的一个实施例中，磷酸酶被定位成使得在聚合酶反应中由聚合酶制造的聚磷酸酯在进入孔隙之前与磷酸酶相互作用。
在另一实施例中，磷酸酶与聚磷酸酯之间的相互作用的速率与聚合酶制造聚磷酸酯的速率相比更快或相等。
在另一实施例中，第一和第二隔室中的每一者具有电荷。还预期，孔隙的内部具有负电荷。
在系统的另一实施例中，孔隙是生物或合成的。还预期，孔隙是蛋白质的，例如其中孔隙是α溶血素蛋白质。
在系统的另一实施例中，孔隙是固态孔隙或石墨烯。
还预期，系统包含各自具有实质上相同特征的孔隙的阵列，或不同直径的孔隙的阵列，或其中施加穿过屏障的不同电场的孔隙的阵列。
还预期，电导测量系统与CMOS电子装置集成，或孔隙或孔隙的阵列如图46中所示直接集成到CMOS模具中。
一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反。
在化合物的一个实施例中，标签上的电荷的量级与化合物的其余部分上的电荷的量级相同。
在化合物的另一实施例中，标签包含多个乙二醇单元，优选地16、20、24或36个乙二醇单元。
在化合物的另一实施例中，标签进一步包含另一可鉴别部分，例如基于香豆素的染料。
在一个实施例中，标签具有正电荷。在另一实施例中，标签的去除改变化合物的电荷。
还预期，标签进一步包含适当数目的赖氨酸或精氨酸以平衡化合物中磷酸酯的数目。
一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物或尿嘧啶或其衍生物，并且其中每种类型的化合物上的标签不同于其它三种类型的化合物中的每一者上的标签。
虽然已经在本文中展示和描述了本发明的各种实施例，但本领域技术人员应明白，所述实施例仅作为实例而提供。本领域技术人员可以在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，可以采用本文中所述的本发明的实施例的各种替代方案。
一种用于核酸测序的方法，所述方法包含提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。
在一个实施例中，标签通过纳米孔。在另一实施例中，聚合的速率与标签通过纳米孔的速率相比更慢。
一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)使加标签的核苷酸以第一速率聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放；和(b)通过使所释放的标签以第二速率通过纳米孔来检测其，其中第二速率与第一速率相比更快或相等。
在一个实施例中，每种类型的核苷酸包含独特标签。在另一实施例中，标签最初与个别核苷酸的5'-磷酸酯连接。
一种用于核酸测序的方法，所述方法包含：(a)使加标签的核苷酸聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放；和(b)借助于纳米孔检测所述释放的标签。
在一个实施例中，所述方法进一步包含引导从个别核苷酸释放的标签通过纳米孔。在另一实施例中，每种类型的核苷酸包含独特标签。在另一实施例中，标签最初与个别核苷酸的5'-磷酸酯连接。
一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测核苷酸向核酸分子中的并入，其中所述核酸分子不通过纳米孔。
在一个实施例中，与核苷酸相关联的标签在并入后释放并且标签通过纳米孔。在另一实施例中，核苷酸并入事件以至少4σ的精确性检测。
一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测个别核苷酸并入事件的副产物。
在一个实施例中，核苷酸不直接检测。在另一实施例中，核苷酸并入事件的副产物是释放的标签分子。在另一实施例中，标签分子通过纳米孔。
一种用于核酸测序的方法，其包含以大于4σ、5σ或6σ的精确性区别个别核苷酸并入事件。
在一个实施例中，核苷酸并入事件借助于纳米孔进行检测。在另一实施例中，与核苷酸相关联的标签在并入后释放并且标签通过纳米孔。
一种用于核酸测序的方法，所述方法包含提供与核酸聚合酶连接的纳米孔的阵列，和用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中标签被释放并且通过纳米孔进行检测。
在一个实施例中，标签通过纳米孔。在另一实施例中，聚合的速率与标签通过纳米孔的速率相比更慢。
一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。
在一个实施例中，标签与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在另一实施例中，标签不是荧光团。在另一实施例中，标签可通过其电荷、形状、大小或其任何组合而检测。
一种用于确定化合物的身份的方法，其包含：(a)使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(b)记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化，其中所述电场的所述变化是所述化合物、所述电解质与所述孔隙之间的相互作用的结果，并且指示所述化合物的大小、电荷和组成，由此使得所述变化与预定值之间相关以确定所述化合物的身份。
在一个实施例中，所述方法进一步包含在步骤(a)之前用磷酸酶处理化合物的步骤。
一种用于确定化合物是标签还是所述标签的前体的方法，其包含：(a)使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化；和将所述电场的所述变化与对应于所述标签和所述标签的所述前体的预定值比较，由此确定所述化合物是所述标签还是其所述前体。
在一个实施例中，所述方法进一步包含在步骤(a)中调节电场的电流偏置的步骤。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：
(a)使所述单链DNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物，并且其中每种的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签，其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；
(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：
(a)使所述单链DNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，
其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，
其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制条件为(1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类型，和(2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类型，
其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，
其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；
(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基反复进行步骤(a)和(b)，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：
(a)使所述单链RNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是尿嘧啶或其衍生物，并且其中每种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签，
其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链RNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，
其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，
其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；
(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含：
(a)使所述单链RNA与包含以下的电导测量系统接触：(i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(ii)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(iii)用于测量所述电场的变化的构件；(iv)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(v)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，
其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链DNA的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，
其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制条件为(1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类型，和(2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类型，
其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯，
其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标签；
(b)通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤(a)易位通过所述孔隙中产生的由所述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成步骤(a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基反复进行步骤(a)和(b)，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
在所述方法的一个实施例中，与聚合酶相比更多磷酸酶与孔隙连接。在一实施例中，单链DNA或RNA通过使双链DNA或RNA变性而获得，以适用者为准。在另一实施例中，相同单链DNA或RNA的多个拷贝固定于珠子上。还预期，单链DNA或RNA的核苷酸序列使用相同单链DNA或RNA的多个拷贝来测定。
在另一实施例中，在每个反复的步骤(b)之后进行洗涤步骤以去除未并入的化合物以免与单链DNA或RNA接触。在另一实施例中，在每个反复的步骤(b)之后预期一个步骤以确定与标签连接的另一可鉴别部分的身份。
在所述方法的一个实施例中，至少85％、90％、95％或99％的所释放的标签易位通过纳米孔。
在一个实施例中，化合物进一步包含可逆终止子，任选地所述方法进一步包含在每个反复的步骤(b)之后去除可逆终止子的步骤，其中可逆终止子通过生物手段、化学手段、物理手段或通过光照射而去除。
在另一实施例中，孔隙的内部的电荷相对于标签或有标签与其连接的聚磷酸酯的电荷正负相反。
在另一实施例中，电导测量系统的第一和第二隔室中的每一者具有电荷，任选地第一与第二隔室的电荷极性相反。还预期，第一和第二隔室的电荷是可调节的。
在另一实施例中，在步骤(b)中标签易位通过孔隙的速率基于标签的电荷以及第一和第二隔室的电荷来测定。
在另一实施例中，第一和第二隔室中的每一者的电荷使得在步骤(b)中标签以与在步骤(a)中标签或有标签与其连接的聚磷酸酯被释放的速率相比更快或相等的速率易位通过孔隙。
一种电导测量系统，其包含：
间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障；
所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙；
在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物；
所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电解质溶液；
所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特征；和
测量所述离子电流的构件和将其时间过程记录为时间序列的构件，所述时间序列包括所述至少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时间段。
在系统的一个实施例中，所述标签在所述孔隙中的滞留时间大于测量所述离子电流的所述构件的离子电流带宽和电流散弹噪声的限度。
一种将电导时间序列的片段划定为与不受阻塞的孔隙电导水平统计一致的区域和降低的电导的脉冲以及降低的电导的个别脉冲内的统计稳定片段的方法，所述电导时间序列用包含以下的电导测量系统产生：
间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障；
所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙；
在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物；
所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电解质溶液；
所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特征；和
测量所述离子电流的构件和记录所述电导时间序列的构件，所述时间序列包括所述至少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时间段；
划定电导时间序列的片段的所述方法选自由以下组成的群组：
(a)对从所述原始电导时间序列估计的连续密度隐马尔可夫模型的最大似然状态序列进行维特比解码；
(b)经由与偏离开放孔隙电导水平的差幅的阈值比较来划定降低的电导的脉冲的区域；和
(c)通过估计每一片段的离子电流水平的集中趋势或通过一起测量集中趋势和片段持续时间来表征降低的电导的脉冲的构件，片段集中趋势的量度选自由以下组成的群组：(i)作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一GMM的高斯分量的平均参数；(ii)算术平均值；(iii)截尾平均值；(iv)中值；和(v)样品位置的最大后验概率估计量或样品位置的最大似然估计量。
在另一实施例中，所述方法进一步包含以下至少一者：(a)基于电导片段的集中趋势的所述量度对第二高斯混合模型进行最大似然估计；(b)借助于插值寻峰，和使所述电导时间序列的片段的集中趋势的估计的经验概率密度平滑，和对插值函数的导数求根；和(c)定位多峰分布估计量的模式的另一构件。
一种用于测定溶液中的化合物的至少一个参数的方法，其包含以下步骤：
将第一流体放置于第一储槽中；
将第二流体放置于第二储槽中；所述第一和所述第二流体中的至少一者包含至少一种化合物，其中所述化合物是加标签的核苷酸或从加标签的核苷酸裂解的标签；所述第一储槽中的所述第一流体用电阻屏障与所述第二储槽中的所述第二流体间隔开；所述电阻屏障包含至少一个孔隙；
用所述第一与所述第二流体之间的电势使离子电流通过所述第一流体、所述至少一个孔隙和所述第二流体；
测量通过所述至少一个孔隙的所述离子电流和所述离子电流的变化的持续时间；所述离子电流的所述测量进行一段时间，以足以测量由所述化合物与所述至少一个孔隙相互作用而引起的所述离子电流的降低；和
和通过数学分析在所述时间段内所述离子电流的所述变化和所述离子电流的所述变化的所述持续时间，来测定所述化合物的至少一个参数；所述数学分析包含至少一个选自由以下组成的群组的步骤：(a)作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一GMM的高斯分量的平均参数；(b)事件平均值抽取；(c)最大似然事件状态指定；(d)阈值检测和平均；(e)滑动窗分析；(f)算术平均值；(g)截尾平均值；(h)中值；和(i)样品位置的最大后验概率估计量或样品位置的最大似然估计量。
在所述方法的一个实施例中，化合物在测量离子电流的降低之前用磷酸酶进行处理。在另一实施例中，化合物是交替地带电的化合物，其具有第一净电荷，并且在化学、物理或生物反应之后具有不同的第二净电荷。
在另一实施例中，数学分析选自由以下组成的群组：GMM、阈值检测和平均以及滑动窗分析。
在另一实施例中，至少一个参数选自由以下组成的群组：化合物的浓度、大小、电荷和组成。
预期，所述方法的一实施例包含校准电导测量系统的步骤。
在一个实施例中，所述方法的精确性大于4σ、5σ或6σ。
一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。
在一个实施例中，标签与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在另一实施例中，标签不是荧光团。在另一实施例中，标签可通过其电荷、形状、大小或其任何组合而检测。
在电导测量系统的一个实施例中，第一与第二电解质溶液相同。
在所述方法的一个实施例中，第一与第二电解质溶液相同。
一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。
在一个实施例中，标签与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在另一实施例中，标签不是荧光团。在另一实施例中，标签可通过其电荷、形状、大小或其任何组合而检测。
一种用于核酸测序的方法，所述方法包含提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸聚合，其中标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链DNA(其中单链DNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物)与DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯(dNPP)类似物(其中的至少一者可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸中的每一者杂交)接触，如果dNPP类似物之一与单链DNA的在单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化dNPP类似物之一并入到引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中四种dNPP类似物中的每一者具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或尿嘧啶或这些碱基中的一或多者的衍生物，其中R1是OH，其中R2是H，其中X是O、NH、S或CH2，其中n是1、2、3或4，其中Z是O、S或BH3，并且
其限制条件为(i)每种dNPP类似物上的碱基的类型不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种dNPP类似物的n值不同于其它三种dNPP类似物中的每一者的n值，或四种dNPP类似物中的每一者的n值相同并且每种dNPP类似物上的标签的类型不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的标签的类型，其中dNPP类似物的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯；和
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(a)易位通过纳米孔中所产生的由有标签与其连接的聚磷酸酯引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种dNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的DNA延伸产物，其中电子变化对于每个n值或对于每种不同类型的标签不同，以适用者为准，由此允许鉴别单链DNA中与并入的dNPP类似物互补的核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，其中在每个反复的步骤(b)中，鉴别哪种dNPP类似物已经并入到步骤(a)中的DNA延伸产物中，其中dNPP类似物位于单链DNA的与DNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'。由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链DNA(其中单链DNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物)与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯(dNPP)类似物(其可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸杂交)接触，如果dNPP类似物与单链DNA的在单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化dNPP类似物并入到引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中dNPP类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中R1是-OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2是H，其中X是O、NH、S或CH2，其中n是1、2、3或4，其中Z是O、S或BH3，并且
其中如果不并入dNPP类似物，那么反复重复接触不同dNPP类似物直到并入dNPP类似物，其限制条件为(i)每种dNPP类似物上的碱基的类型不同于其它dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种dNPP类似物的n值不同于其它dNPP类似物中的每一者的n值，或dNPP类似物中的每一者的n值相同并且每种dNPP类似物上的标签的类型不同于其它dNPP类似物中的每一者上的标签的类型，其中dNPP类似物的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯；
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(a)易位通过纳米孔中所产生的由有标签与其连接的聚磷酸酯引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种dNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的DNA延伸产物，其中电子变化对于每个n值或对于每种不同类型的标签不同，以适用者为准，由此允许鉴别单链DNA中与并入的dNPP类似物互补的核苷酸残基；
(c)对于所测序的单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(a)和(b)，其中在每个反复的步骤(a)中，如果dNPP类似物与单链DNA的在单链DNA的与DNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么将dNPP类似物并入到DNA延伸产物中，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链DNA(其中单链DNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物)与DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯(dNPP)类似物(其中的至少一者可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸中的每一者杂交)接触，如果dNPP类似物之一与单链DNA的在单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化dNPP类似物之一并入到引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中四种dNPP类似物中的每一者具有选自以下的结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或这些碱基中的一或多者的衍生物，其中Y是标签，其中R1(如果存在的话)是OH，其中R2(如果存在的话)是H，其中X是可裂解连接子，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中A是O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且
其限制条件为(i)每种dNPP类似物上的碱基的类型不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种dNPP类似物上的标签的类型不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的标签的类型；
(b)使标签从在步骤(a)中并入的dNPP类似物裂解；
(c)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(b)易位通过纳米孔中由裂解的标签引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种dNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的DNA延伸产物，其中电子变化对于每种不同类型的标签不同，由此允许鉴别单链DNA中与并入的dNPP类似物互补的核苷酸残基；和
(d)对于所测序的单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)和(c)，其中在每个反复的步骤(c)中，鉴别哪种dNPP类似物已经并入到步骤(a)中的DNA延伸产物中在单链DNA的与DNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链DNA(其中单链DNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物)与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸聚磷酸酯(dNPP)类似物(其可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸杂交)接触，如果dNPP类似物与单链DNA的在单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化dNPP类似物并入到引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物，其中dNPP类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中Y是标签，并且其中R1(如果存在的话)是OH、-OCH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2(如果存在的话)是H，其中X是可裂解连接子，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中A是O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且
其中如果不并入dNPP类似物，那么反复重复接触不同dNPP类似物直到并入dNPP类似物，
其限制条件为(i)每种dNPP类似物上的碱基的类型不同于其它dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种dNPP类似物上的标签的类型不同于其它dNPP类似物中的每一者上的标签的类型；
(b)使标签从在步骤(a)中并入的dNPP类似物裂解；和
(c)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(b)易位通过纳米孔中由裂解的标签引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种dNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的DNA延伸产物，其中电子变化对于每种类型的标签不同，由此允许鉴别单链DNA中与并入的dNPP类似物互补的核苷酸残基；
(d)对于所测序的单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(a)到(c)，其中在每个反复的步骤(a)中，如果dNPP类似物与单链DNA的在单链DNA的与DNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么将dNPP类似物并入到DNA延伸产物中，由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
在一些情况下，加标签的核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。标签可以与核苷酸的5'-磷酸酯连接。在一些情况下，标签不是荧光团。标签可以通过其电荷、形状、大小或其任何组合而可检测。例示性标签包括各种聚合物。每种类型的核苷酸(即A、C、G、T)一般来说包含独特标签。
标签可以位于核苷酸上的任何合适位置上。图34提供加标签的核苷酸的一些非限制性实例。在第一图中，R1一般来说是OH并且R2是H(即对于DNA)或OH(即对于RNA)，但其它修饰是可接受的。在图34中，X是任何合适连接子。在一些情况下，连接子是可裂解的。连接子的实例包括(但不限于)O、NH、S或CH2。适用于位置Z的化学基团的实例包括O、S或BH3。碱基是适用于并入到核酸中的任何碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或其衍生物。在一些情况下，通用碱基也是可接受的。
磷酸酯的数目(n)是任何合适的整数值(例如多个磷酸酯以使得核苷酸可以并入到核酸分子中)。在一些情况下，所有类型的加标签的核苷酸都具有相同数目的磷酸酯，但这不是必需的。在一些应用中，对于每种类型的核苷酸存在不同标签并且磷酸酯的数目未必用以区别各种标签。然而，在一些情况下，多于一种类型的核苷酸(例如A、C、T、G或U)具有相同标签分子，并且区别一种核苷酸与另一核苷酸的能力至少部分通过磷酸酯的数目测定(各种类型的核苷酸具有不同n值)。在各种实施例中，n的值是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
下文描述合适的标签。在一些情况下，标签的电荷相对于化合物的其余部分上的电荷正负相反。当连接标签时，整体化合物上的电荷可以是中性的。标签的释放可以产生两种分子，带电的标签和带电的核苷酸。带电的标签通过纳米孔并且在一些情况下进行检测。
合适的加标签的核苷酸的其它实例也展示于图34中。如第二到第四图中所示，标签还可以与糖分子、碱基分子或其任何组合连接。参考图34，Y是标签并且X是可裂解连接子。此外，R1(如果存在的话)一般来说是OH、-OCH2N3或-O-2-硝基苯甲基，并且R2(如果存在的话)一般来说是H。此外，Z一般来说是O、S或BH3，并且n是包括1、2、3或4的任何整数。在一些情况下，A是O、S、CH2、CHF、CFF或NH。
继续参考图34，每种dNPP类似物上的碱基的类型一般来说不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，并且每种dNPP类似物上的标签的类型一般来说不同于其它三种dNPP类似物中的每一者上的标签的类型。合适的碱基包括(但不限于)腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或其每一者的衍生物。在一些情况下，碱基是7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶之一。
在R1是-O-CH2N3的情况下，所述方法任选地进一步包含处理并入的dNPP类似物以便去除-CH2N3并且产生与3'位连接的-OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
在R1是-O-2-硝基苯甲基的情况下，所述方法任选地进一步包含处理并入的核苷酸类似物以便去除-2-硝基苯甲基并且产生与3'位连接的-OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
标签可以是能够在纳米孔中检测的任何化学基团或分子。在所述方法的一实施例中，标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、染料、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、荧光染料、化学发光化合物、氨基酸、肽、碳水化合物、核苷酸单磷酸酯、核苷酸二磷酸酯、脂肪族酸、芳香族酸、醇、未被取代或被一或多个卤素取代的硫醇、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在所述方法的一实施例中，碱基选自由以下组成的群组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。
在一实施例中，所述方法进一步在每个反复的步骤(b)之后包含洗涤步骤以去除未并入的dNPP类似物以免与单链DNA接触。
在一实施例中，所述方法进一步在每个反复的步骤(c)之后包含洗涤步骤以去除未并入的dNPP类似物以免与单链DNA接触。
在所述方法的一实施例中，单链DNA、电解质溶液和膜中的纳米孔位于单一容器内。
在所述方法的其中R1是-O-CH2N3的一实施例中，所述方法任选地进一步包含处理并入的dNPP类似物以便去除-CH2N3并且产生与3'位连接的-OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
在所述方法的其中R1是-O-2-硝基苯甲基的一实施例中，所述方法任选地进一步包含处理并入的核苷酸类似物以便去除-2-硝基苯甲基并且产生与3'位连接的-OH基团，由此允许并入另一dNPP类似物。
在所述方法的一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中Z是O、S或BH3，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
在所述方法的一实施例中，标签是单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸的碱基是与dNPP类似物的碱基相同类型的碱基。
在所述方法的一实施例中，标签选自以下：
其中在每个结构中，n独立地是1、2、3或4，并且m独立地是0到100的整数，并且其中当m是0时，dNPP的末端磷酸酯与结构的左手侧上展示的核苷的3'O原子直接键结，并且其中n的值对于每种类型的碱基来说是不同的。
在所述方法的一实施例中，m是0到50的整数。在所述方法的一实施例中，m是0到10的整数。
提供加标签的核苷酸的各种非限制性实例。在所述方法的一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
其中R是被取代或未被取代的至多3000道尔顿的烃基，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
在所述方法的一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
在所述方法的一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
在所述方法的一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
其中m是1-50的整数，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
在所述方法的一实施例中，电子变化是电流振幅的变化。
在所述方法的一实施例中，电子变化是纳米孔的电导的变化。
在所述方法的一实施例中，纳米孔是生物的。在所述方法的一实施例中，纳米孔是蛋白质的。在所述方法的一实施例中，纳米孔包含α溶血素。在所述方法的一实施例中，纳米孔是石墨烯。在所述方法的一实施例中，纳米孔是固态纳米孔。在所述方法的一实施例中，纳米孔在固态膜中。
在所述方法的一实施例中，单链DNA、引物或DNA聚合酶与固体表面连接。
在所述方法的另一实施例中，纳米孔是纳米孔阵列的一部分。
可以使用任何适用于连接标签的方法。在一实例中，标签可以通过以下方式与末端磷酸酯连接：(a)使核苷酸三磷酸酯与二环己基碳化二亚胺/二甲基甲酰胺在允许产生环三偏磷酸酯的条件下接触；(b)使由步骤a)产生的产物与亲核试剂接触以便形成-OH或-NH2官能化的化合物；和(c)使步骤b)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成核苷酸三磷酸酯类似物。
在一些情况下，亲核试剂是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R'S-R-OH、R'S-R-NH2或
在一些情况下，所述方法包含在步骤b)中，使由步骤a)产生的产物与具有以下结构的化合物接触：
和随后或同时使产物与NH4OH接触以便形成具有以下结构的化合物：
步骤b)的产物然后可以与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成具有以下结构的核苷酸三磷酸酯类似物：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
具体来说是一种用于制造核苷酸三磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸三磷酸酯类似物与核苷酸三磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：(a)使核苷酸三磷酸酯与二环己基碳化二亚胺/二甲基甲酰胺在允许产生环三偏磷酸酯的条件下接触；和(b)使由步骤a)产生的产物与有羟基或氨基与其连接的标签在允许亲核性打开环三偏磷酸酯的条件下接触以使标签与末端磷酸酯键结，由此形成核苷酸三磷酸酯类似物。
一种用于制造核苷酸三磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸三磷酸酯类似物与核苷酸三磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：(a)使核苷酸三磷酸酯与二环己基碳化二亚胺/二甲基甲酰胺在允许产生环三偏磷酸酯的条件下接触；(b)使由步骤a)产生的产物与亲核试剂接触以便形成-OH或-NH2官能化的化合物；和(c)使步骤b)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成核苷酸三磷酸酯类似物。
在本发明方法的一实施例中，亲核试剂是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R'S-R-OH、R'S-R-NH2或
在一实施例中，本发明方法包含在步骤b)中使由步骤a)产生的产物与以下接触：具有以下结构的化合物：
和随后NH4OH，以便形成具有以下结构的化合物：
和使步骤b)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下反应，由此形成具有以下结构的核苷酸三磷酸酯类似物：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
一种用于制造核苷酸四磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸四磷酸酯类似物与核苷酸四磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；和
(b)使由步骤a)产生的产物与有单磷酸酯基与其连接的标签在允许形成核苷酸四磷酸酯类似物的条件下接触。
一种用于制造核苷酸四磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸四磷酸酯类似物与核苷酸四磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；
(b)使由步骤a)产生的产物与磷酸在允许形成核苷酸四磷酸酯的条件下接触；
(c)使核苷酸四磷酸酯与1)羰基二咪唑/二甲基甲酰胺；2)亲核试剂；和然后3)NH4OH接触，以便形成-OH或-NH2官能化的化合物；和
(d)使步骤c)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下接触，由此形成核苷酸四磷酸酯类似物。
在本发明方法的一实施例中，亲核试剂是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R'S-R-OH、R'S-R-NH2或
在一实施例中，本发明方法包含在步骤b)中使核苷酸四磷酸酯与1)羰基二咪唑/二甲基甲酰胺；2)一种具有以下结构的化合物：和然后3)NH4OH接触，以便形成一种具有以下结构的化合物：
和使步骤b)的产物与有-COR基团与其连接的标签在允许标签与末端磷酸酯间接键结的条件下接触，由此形成具有以下结构的核苷酸三磷酸酯类似物：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
一种用于制造核苷酸四磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸四磷酸酯类似物与核苷酸四磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
(b)使由步骤a)产生的产物与磷酸在允许形成核苷酸四磷酸酯的条件下接触；和
(c)使核苷酸四磷酸酯与羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和有羟基或氨基与其连接的标签接触，以便形成具有以下结构的化合物：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
一种用于制造核苷酸五磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸五磷酸酯类似物与核苷酸五磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；和
(b)使由步骤a)产生的产物与有焦磷酸酯基与其连接的标签在允许形成核苷酸五磷酸酯类似物的条件下接触。
一种用于制造核苷酸五磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸五磷酸酯类似物与核苷酸五磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；
(b)使由步骤a)产生的产物与焦磷酸酯基在允许形成核苷酸五磷酸酯的条件下接触；和
(c)使核苷酸五磷酸酯与羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和有羟基或氨基与其连接的标签接触，以便形成核苷酸五磷酸酯类似物。
一种用于制造核苷酸六磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸六磷酸酯类似物与核苷酸六磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；和
(b)使由步骤a)产生的产物与有三磷酸酯基与其连接的标签在允许形成核苷酸六磷酸酯类似物的条件下接触。
一种用于制造核苷酸六磷酸酯类似物的方法，其中核苷酸六磷酸酯类似物与核苷酸六磷酸酯不同之处在于有标签与其末端磷酸酯连接，所述方法包含：
(a)使核苷酸三磷酸酯与1,1'-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允许形成以下结构的条件下接触：
其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶；
(b)使由步骤a)产生的产物与三磷酸酯基在允许形成核苷酸六磷酸酯的条件下接触；和
(c)使核苷酸六磷酸酯与羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和有羟基或氨基与其连接的标签接触，以便形成核苷酸六磷酸酯类似物。
一种具有以下结构的化合物：
其中标签是乙二醇、氨基酸、碳水化合物、染料、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且其中n是1、2、3或4。
在一实施例中，R2是H。在一实施例中，R2是OH。
在一些情况下，标签选自分子(dCp)m、(dGp)m、(dAp)m和(dTp)m。图27(a)展示与核苷酸连接的这些分子的一些实例。举例来说，一种具有以下结构的化合物：
其中在每个结构中，n独立地是1、2、3或4，并且m独立地是0到100的整数，并且其中当m是0时，dNTP的末端磷酸酯与结构的左手侧上展示的核苷的3'O原子直接键结，其中R1是-OH或-O-CH2N3，并且R2是H或OH。在一些情况下，n的值对于每种类型的碱基来说是不同的。
在一实施例中，m是0到50。在一实施例中，m是0到10。在一实施例中，R1是-OH。在一实施例中，R2是-H。在一实施例中，R2是-OH。
一种具有以下结构的化合物：
其中m是0到100的整数，并且其中化合物包含单一类型的碱基，并且其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物。
在一实施例中，m是0到50。在一实施例中，m是0到10。
在一实施例中，化合物具有以下结构：
其中m是0到100的整数。
一种具有以下结构的化合物：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
一种具有以下结构的化合物：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且R是被取代或未被取代的至多3000道尔顿的烃基。
一种具有以下结构的化合物：
一种具有以下结构的化合物：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且m是1-50的整数。
一种具有以下结构的化合物：
其中n是1或2并且碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
一种具有以下结构的化合物：
其中R1是-OH或-O-CH2N3，并且R2是H或OH。
一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链RNA(其中单链RNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链RNA有与其一部分杂交的引物)与RNA聚合酶和四种核糖核苷酸聚磷酸酯(rNPP)类似物(其中的至少一者可以与所测序的RNA中的A、U、G或C核苷酸中的每一者杂交)接触，如果rNPP类似物之一与单链RNA的在单链RNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许RNA聚合酶催化rNPP类似物之一并入到引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，其中四种rNPP类似物中的每一者具有以下结构：
其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶或尿嘧啶或这些碱基中的一或多者的衍生物，其中R1是OH，其中R2是OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中n是1、2、3或4，其中Z是O、S或BH3，并且其限制条件为(i)每种rNPP类似物上的碱基的类型不同于其它三种rNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种rNPP类似物的n值不同于其它三种rNPP类似物中的每一者的n值，或四种rNPP类似物中的每一者的n值相同并且每种rNPP类似物上的标签的类型不同于其它三种rNPP类似物中的每一者上的标签的类型，其中rNPP类似物的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯；和
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(a)易位通过纳米孔中所产生的由有标签与其连接的聚磷酸酯引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种rNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的RNA延伸产物，其中电子变化对于每个n值或对于每种不同类型的标签不同，以适用者为准，由此允许鉴别单链RNA中与并入的rNPP类似物互补的核苷酸残基；和
(c)对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(b)，其中在每个反复的步骤(b)中，鉴别哪种rNPP类似物已经并入到步骤(a)中的RNA延伸产物中，其中rNPP类似物位于单链RNA的与RNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
一种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)使单链RNA(其中单链RNA在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中单链RNA有与其一部分杂交的引物)与RNA聚合酶和核糖核苷酸聚磷酸酯(rNPP)类似物(其可以与所测序的RNA中的A、U、G或C核苷酸杂交)接触，如果rNPP类似物与单链RNA的在单链RNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许RNA聚合酶催化rNPP类似物并入到引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物，其中rNPP类似物具有以下结构：
其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中R1是-OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2是-OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中n是1、2、3或4，其中Z是O、S或BH3，并且其中如果不并入rNPP类似物，那么反复重复接触不同rNPP类似物直到并入rNPP类似物，其限制条件为(i)每种rNPP类似物上的碱基的类型不同于其它rNPP类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种rNPP类似物的n值不同于其它rNPP类似物中的每一者的n值，或rNPP类似物中的每一者的n值相同并且每种rNPP类似物上的标签的类型不同于三种rNPP类似物中的每一者上的标签的类型，其中rNPP类似物的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯；
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量步骤(a)易位通过纳米孔中所产生的由有标签与其连接的聚磷酸酯引起的穿过纳米孔的电子变化，来鉴别哪种rNPP类似物已经并入到引物中以形成步骤(a)中的RNA延伸产物，其中电子变化对于每个n值或对于每种类型的标签不同，以适用者为准，由此允许鉴别单链RNA中与并入的rNPP类似物互补的核苷酸残基；
(c)对于所测序的单链RNA的每种核苷酸残基重复进行步骤(a)和(b)，其中在每个反复的步骤(a)中，如果rNPP类似物与单链RNA的在单链RNA的与RNA延伸产物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么将rNPP类似物并入到RNA延伸产物中，由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
在一实施例中，dNPP类似物具有以下结构：
其中n是1或2并且碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮嘌呤或5-甲基嘧啶。
在一实施例中，生物纳米孔与CMOS电子装置集成。在另一实施例中，固态纳米孔与CMOS电子装置集成。
在一实施例中，与固体表面的连接经由生物素-抗生蛋白链菌素键联进行。在另一实施例中，DNA聚合酶经由被经氨基官能化的烷基硫醇自组装单层修饰的金表面与固体表面连接，其中氨基被修饰为NHS酯以便与DNA聚合酶上的氨基连接。
在一个实施例中，dNPP类似物是末端磷酸酯加标签的核苷-聚磷酸酯。在另一实施例中，每种类型的dNPP类似物具有聚乙二醇标签，其与其它三种类型的dNPP类似物中的每一者的聚乙二醇标签大小不同。
在一些情况下，标签是聚合物。聚乙二醇(PEG)是聚合物的一实例。在一个实施例中，标签具有如下结构：
其中W是0与100之间的整数。可以使用任何数目的乙二醇单元(W)。在一些情况下，W是0与100之间的整数。在一些情况下，乙二醇单元的数目对于每种类型的核苷酸来说是不同的。在一实施例中，四种类型的核苷酸包含具有16、20、24或36个乙二醇单元的标签。在一些情况下，标签进一步包含另一可鉴别部分，例如基于香豆素的染料。
在一些情况下，标签包含多个PEG链。所述标签的一实例具有如下结构：
其中R是NH2、OH、COOH、CHO、SH或N3，并且W是0到100的整数。
一种组合物，其包含至少四种聚磷酸脱氧核苷酸(dNPP)类似物，其各自具有选自权利要求74和75中所阐述的结构的结构，其中四种dNPP类似物中的每一者包含的碱基的类型不同于其它三种dNPP类似物的碱基的类型。
在一个实施例中，四种dNPP类似物中的每一者的聚乙二醇标签与其它三种dNPP类似物中的每一者的聚乙二醇标签大小不同。
在一实施例中，加标签的核苷聚磷酸酯上的净电荷是中性的。在另一实施例中，释放的标签具有正电荷。
在一个实施例中，所述方法进一步包含在步骤b)之后用碱性磷酸酶处理的步骤，其中碱性磷酸酶使释放的标签-焦磷酸酯上的游离磷酸酯基水解。
在一个实施例中，单链DNA的多个拷贝固定于珠子上。
一种如图51中所示用于测定相同单链DNA分子的多个拷贝的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)用DNA聚合酶和相继四种加标签的脱氧核糖核苷酸类似物中的每一者(其可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸杂交)处理单链DNA(在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中DNA具有与其一部分杂交的引物)，如果类似物与所测序的DNA的在所测序的单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化类似物并入到引物的延伸产物的末端上的条件下，其中如果不并入类似物，那么反复重复接触不同类似物直到并入类似物，其限制条件为(i)每种类似物上的碱基的类型不同于其它类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种类似物上的标签的类型不同于其它类似物中的每一者上的标签的类型，其中类似物的并入导致释放标签；
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量由与类似物连接的标签产生的穿过纳米孔的电变化，来鉴别已经并入到步骤(a)中的延伸产物中的类似物；和
(c)重复进行步骤(a)和(b)，由此获得单链DNA的核苷酸序列。
一种如图52中所示用于测定相同单链DNA分子的多个拷贝的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)用DNA聚合酶和四种3'封端的脱氧核糖核苷酸类似物(其中的至少一者可以与所测序的DNA中的A、T、G或C核苷酸中的每一者杂交)处理单链DNA(在电解质溶液中接触膜中的纳米孔并且其中DNA具有与其一部分杂交的引物)，如果类似物与所测序的DNA的在所测序的单链DNA的与引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在允许DNA聚合酶催化类似物并入到引物的延伸产物的末端上的条件下，其中每种类似物包含可逆终止子，其限制条件为(i)每种类似物上的碱基的类型不同于其它三种类似物中的每一者上的碱基的类型，和(ii)每种类似物上的标签不同于其它三种类似物中的每一者上的标签，其中类似物的并入导致释放标签；
(b)通过施加穿过膜的电压并且测量由与类似物连接的标签产生的穿过纳米孔的电变化，来鉴别已经并入到步骤(a)中的延伸产物中的类似物；
(c)从已经并入到步骤(a)中的延伸产物中的类似物去除可逆终止子；和
(d)重复进行步骤(b)和(c)，由此获得单链DNA的核苷酸序列。
在一个实施例中，纳米孔如图46中所示直接集成到CMOS模具中。
预期，纳米孔具有负电荷，或者电荷与标签或有标签与其连接的聚磷酸酯的电荷正负相反。
在一个实施例中，核苷酸类似物通过聚合酶并入的速率与标签或有标签与其连接的聚磷酸酯易位通过纳米孔的速率相比更小或者相同。
本发明进一步包含在步骤(a)之前从双链DNA或RNA获得待测序的单链DNA或RNA。
在一个实施例中，聚合酶与纳米孔连接。
预期，标签可基于大小、长度、形状、质量、电荷或其任何组合进行检测。
预期，电导测量系统的各种实施例还适用于用于测定核苷酸序列的方法，并且反之亦然。
本发明还提供一种化合物，其具有本申请的图式和/或方案中阐述的化合物中的任一者的结构。
本发明还提供一种dNPP类似物，其包含具有本申请的图式和/或方案中阐述的标签中的任一者的结构的标签。
在一实施例中，标签是被取代或未被取代的烃基，例如烷基、烯基、炔基，并且质量是3000道尔顿或更小。
在一实施例中，单链DNA、RNA、引物或探针经由1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应结合到固体衬底。在一实施例中，DNA、RNA、引物或探针经由聚乙二醇分子结合到固体衬底。在一实施例中，DNA、RNA、引物或探针是炔烃标记的。在一实施例中，DNA、RNA、引物或探针经由聚乙二醇分子结合到固体衬底，并且固体衬底是叠氮化物官能化的。在一实施例中，DNA、RNA、引物或探针经由叠氮基键联、炔基键联或生物素-抗生蛋白链菌素相互作用固定于固体衬底上。核酸的固定描述于DNA在芯片上的固定II(Immobilization of DNA onChips II),克莉丝汀维特曼(Christine Wittmann)编(2005),斯普林格出版社(SpringerVerlag),柏林(Berlin)中，所述文献特此以引用的方式并入。在一实施例中，DNA是单链DNA。在一实施例中，RNA是单链RNA。
在一实施例中，固体衬底呈芯片、珠子、孔、毛细管、载玻片、晶片、滤纸、纤维、多孔介质、多孔纳米管或柱子形式。本发明还提供本发明方法，其中固体衬底是金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃或金刚石。本发明还提供本发明方法，其中固体衬底是多孔非金属物质，金属或金属的组合与所述物质连接或浸渍。固体表面可以呈不同形式，包括芯片、珠子、管子、基质、纳米管的非限制性实例。固体表面可以由为DNA微阵列共用的材料制成，包括玻璃或尼龙的非限制性实例。固体表面，例如珠子/微珠子，又可以固定到另一固体表面，例如芯片。
在一实施例中，核酸样品、DNA、RNA、引物或探针在表面上或容器中的离散隔室、孔或凹口中间隔开。
本发明还提供本发明方法，其中核酸样品、DNA、RNA、引物或探针的约1000个或更少个拷贝结合到固体表面。本发明还提供本发明，其中核酸样品、DNA、RNA、引物或探针的2×107、1×107、1×106或1×104个或更少个拷贝结合到固体表面。
在一实施例中，固定的核酸样品、DNA、RNA、引物或探针以高密度固定。本发明还提供本发明，其中核酸样品、DNA、RNA、引物或探针的超过或至多1×107、1×108、1×109个拷贝结合到固体衬底。
在一实施例中，DNA聚合酶是9°N聚合酶或其变异体、大肠杆菌DNA聚合酶I、噬菌体T4 DNA聚合酶、测序酶、Taq DNA聚合酶或9°N聚合酶(exo-)A485L/Y409V。
在本文中所述的方法或组合物的一实施例中，DNA是单链的。在本文中所述的方法或组合物的一实施例中，RNA是单链Phi29或其变异体。
在所述用于RNA测序的方法的一实施例中，聚合酶是RNA聚合酶、反转录酶或用于RNA聚合的适当聚合酶。
连接子可以是可光裂解的。在一实施例中，UV光用以使可光化学裂解的连接子和部分光化学裂解。在一实施例中，可光裂解的连接子是2-硝基苯甲基部分。
-CH2N3基团可以用TCEP(三(2-羧乙基)膦)处理以便使其从dNPP类似物或rNPP类似物的3'O原子去除，由此产生3'OH基团。
标签可以按任何方式释放。在一些情况下，标签与聚磷酸酯(例如图34)连接并且核苷酸向核酸分子中的并入导致释放有标签与其连接的聚磷酸酯。并入可以由至少一种任选地与纳米孔连接的聚合酶催化。在一些情况下，至少一种磷酸酶也与孔隙连接。磷酸酶可以使标签从聚磷酸酯裂解以释放标签。在一些情况下，磷酸酶被定位成使得在聚合酶反应中由聚合酶制造的焦磷酸酯在进入孔隙之前与磷酸酶相互作用。
在一些情况下，标签不与聚磷酸酯连接(参看例如图34)。在这些情况下，标签通过可裂解连接子(X)连接。用于制造可裂解地封端和/或可裂解地连接的核苷酸类似物的方法公开于美国专利第6,664,079号中，所述专利特此以引用的方式并入。
连接子可以是任何合适连接子并且以任何合适方式裂解。举例来说，连接子可以是可光裂解的。在一实施例中，不损伤DNA的光用以使可光化学裂解的连接子和部分光化学裂解。在一实施例中，可光裂解的连接子是2-硝基苯甲基部分。在另一实施例中，-CH2N3基团可以用TCEP(三(2-羧乙基)膦)处理以便使其从dNPP类似物或rNPP类似物的3'O原子去除，由此产生3'OH基团。
“核苷酸残基”是呈在并入到多核苷酸中并且由此变成多核苷酸的单体之后所存在的状态的单一核苷酸。因此，核苷酸残基是多核苷酸(例如DNA)的核苷酸单体，其通过磷酸二酯键在其糖的3'位处结合到多核苷酸的相邻核苷酸单体并且通过其磷酸酯基结合到第二相邻核苷酸单体，例外之处是：(i)3'端核苷酸残基仅通过磷酸二酯键从其磷酸酯基结合到多核苷酸的一个相邻核苷酸单体，和(ii)5'端核苷酸残基仅通过磷酸二酯键从其糖的3'位结合到多核苷酸的一个相邻核苷酸单体。
由于充分理解的碱基配对规则，通过测量标签易位通过纳米孔的独特电信号以及由此并入的dNPP类似物(或rNPP类似物)的身份来确定并入到引物或DNA延伸产物(或RNA延伸产物)中的dNPP类似物(或rNPP类似物)的(碱基的)身份允许鉴别单链多核苷酸中的互补核苷酸残基，引物或DNA延伸产物(或RNA延伸产物)与所述互补核苷酸残基杂交。因此，如果并入的dNPP类似物包含腺嘌呤、胸嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链DNA中的互补核苷酸残基分别鉴别为胸嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。嘌呤腺嘌呤(A)与嘧啶胸嘧啶(T)配对。嘧啶胞嘧啶(C)与嘌呤鸟嘌呤(G)配对。类似地，关于RNA，如果并入的rNPP类似物包含腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，那么单链RNA中的互补核苷酸残基分别鉴别为尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。
dNPP或rNPP类似物向寡核苷酸或多核苷酸(例如引物或DNA延伸链)中的并入分别意指在多核苷酸的3'端核苷酸残基的3'碳原子与dNPP类似物或rNPP类似物的5'碳原子之间形成磷酸二酯键。
如本文中所用，除非另外规定，否则(例如核苷酸聚磷酸酯类似物的)碱基不同于参考分子(例如另一核苷酸聚磷酸酯类似物)的碱基的类型意指碱基具有与其它/参考碱基不同的化学结构。举例来说，不同于腺嘌呤的碱基可以包括鸟嘌呤碱基、尿嘧啶碱基、胞嘧啶碱基和胸嘧啶碱基。举例来说，不同于腺嘌呤、胸嘧啶和胞嘧啶的碱基可以包括鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。
如本文中所用，除非另外规定，否则(例如核苷酸聚磷酸酯类似物的)标签不同于参考分子(例如另一核苷酸聚磷酸酯类似物)的标签的类型意指标签具有与其它/参考标签的化学结构不同的化学结构。
标签可以在其从核苷酸释放之后流动通过纳米孔。在一些情况下，施加电压以拉动标签通过纳米孔。至少约85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％或至少99.99％的所释放的标签可以易位通过纳米孔。
在所述方法的一些情况下，聚合酶从包含多种不同碱基(例如A、C、G、T和/或U)的加标签的核苷酸的集合中抽取。还可能反复使聚合酶与各种类型加标签的碱基接触。在此情况下，可能不需要每种类型的核苷酸具有独特碱基，但在一些情况下，在不同碱基类型之间循环给工艺增添了成本和复杂性，然而此实施例涵盖于本发明中。
图9显示，向核酸分子中并入加标签的核苷酸(例如使用聚合酶以使引物碱基对延伸到模板)释放了可检测的标签-聚磷酸酯。在一些情况下，标签-聚磷酸酯在其通过纳米孔时进行检测。甚至可能基于包含聚磷酸酯的磷酸酯的数目区别核苷酸(例如甚至当标签相同时)。然而，每种类型的核苷酸一般来说具有独特标签。
参考图28，标签-聚磷酸酯化合物可以在使标签通过纳米孔并且测量离子电流之前用磷酸酶(例如碱性磷酸酶)进行处理。
标签可以(至少部分)由于其电荷而在纳米孔中检测。在一些情况下，标签化合物是交替地带电的化合物，其具有第一净电荷，并且在化学、物理或生物反应之后具有不同的第二净电荷。在某一情况下，标签上的电荷的量级与化合物的其余部分上的电荷的量级相同。在一实施例中，标签具有正电荷并且标签的去除改变化合物的电荷。
在一些情况下，在标签通过纳米孔时，可能产生电子变化。在一些情况下，电子变化是电流振幅的变化、纳米孔的电导的变化或其任何组合。
如本文中所用，“纳米孔”一般来说是指在屏障/膜中形成或以其它方式提供的孔隙、通道或通路。“纳米孔”包括例如包含以下的结构：(a)由物理屏障间隔开的第一与第二隔室，所述屏障具有至少一个直径是例如约1到10nm的孔隙，和(b)用于施加穿过屏障的电场的构件，以便带电分子(例如DNA、核苷酸、核苷酸类似物或标签)可以从第一隔室通过孔隙到第二隔室。纳米孔理想地进一步包含用于测量分子通过其屏障的电子签名的构件。纳米孔屏障可以部分是合成或天然存在的。屏障/膜可以是有机膜，例如脂质双层，或合成膜，例如由聚合材料形成的膜。屏障可以包括例如其中具有α-溶血素的脂质双层、寡聚蛋白质通道(例如孔蛋白和合成肽)等。屏障还可以包括具有一或多个合适大小的孔洞的无机板。纳米孔可以与感测电路相邻或接近安置，所述感测电路例如互补金属-氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。纳米孔的特征宽度或直径可以近似是0.1纳米(nm)到约1000nm。纳米孔可以是生物或合成的。还预期，孔隙是蛋白质的，α溶血素是蛋白质纳米孔的一实例。合成纳米孔的一实例是固态孔隙或石墨烯。本文中，纳米孔屏障中的“纳米孔”、“纳米孔屏障”和“孔隙”有时等效地使用。
在一些情况下，聚合酶和/或磷酸酶与纳米孔连接。融合蛋白或二硫交联是用于与蛋白质纳米孔连接的方法的实例。在固态纳米孔的情况下，与靠近纳米孔的表面的连接可以经由生物素-抗生蛋白链菌素键联进行。在一实例中，DNA聚合酶经由被经氨基官能化的烷硫醇自组装单层修饰的金表面与固体表面连接，其中氨基被修饰为NHS酯以便与DNA聚合酶上的氨基连接。
本文中描述用于使用纳米孔对核酸测序的方法、装置和系统。所述方法可以精确检测个别核苷酸并入事件，例如在将核苷酸并入到与模板互补的生长链中后。酶(例如DNA聚合酶)可以并入核苷酸以使多核苷酸链生长，其中所添加的核苷酸与相应模板核酸链互补，所述核酸链与生长链杂交(例如聚合酶链式反应(PCR))。这些核苷酸并入事件使标签从核苷酸释放，所述标签通过纳米孔并且被检测。以此方式，可以鉴别并入的碱基(即A、C、G、T或U)，因为独特标签从每种类型的核苷酸释放(即A、C、G、T或U)。
核苷酸并入事件可以实时(即在其发生时)并且借助于纳米孔进行检测。在一些情况下，与纳米孔连接或接近纳米孔的酶(例如DNA聚合酶)可能有助于核酸分子流动通过纳米孔。核苷酸并入事件或并入多种核苷酸可以释放一或多种标签分子(本文中也称“标签”)，其可以在标签流动通过纳米孔时通过纳米孔进行检测。在一些情况下，与纳米孔连接或接近的酶可以帮助检测在并入一或多种核苷酸后释放的标签或其它副产物。
本文中描述的方法可以是单分子方法。也就是说，所检测的信号由单一分子产生(即单核苷酸并入)并且不由多种克隆分子产生。所述方法可能不需要DNA扩增。
核苷酸并入事件可以从包含多种核苷酸(例如三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP，其中N是腺苷(A)、胞苷(C)、胸苷(T)、鸟苷(G)或尿苷(U)))的混合物发生。核苷酸并入事件未必从包含单一类型的核苷酸(例如dATP)的溶液发生。核苷酸并入事件未必从多种核苷酸(例如dATP，随后dCTP，随后dGTP，随后dTTP，随后dATP)的交替溶液发生。
本发明的纳米孔装置和系统可以与其它纳米孔装置组合或由其它纳米孔装置修改，所述其它纳米孔装置例如美国专利第7,005,264 B2号、第7,846,738号、第6,617,113号、第6,746,594号、第6,673,615号、第6,627,067号、第6,464,842号、第6,362,002号、第6,267,872号、第6,015,714号、第5,795,782号以及美国公开第2004/0121525号、第2003/0104428号和第2003/0104428号中描述的纳米孔装置，所述文献中的每一者以全部引用的方式并入本文中。
在本文中所公开的分子和方法的一实施例中，标签通过可裂解的化学连接子与分子的其余部分连接。
在一实施例中，纳米孔在固态膜中。在一实施例中，膜是氮化硅膜。在一实施例中，纳米孔是生物孔。在一实施例中，孔隙是蛋白质的。在一实施例中，孔隙是α-溶血素孔隙。在一实施例中，孔隙是石墨烯孔隙。
在一实施例中，DNA、RNA或单链核酸位于膜的定位纳米孔的一侧上并且膜位于导电电解质溶液中。
在提供值的范围时，除非上下文另外明确规定，否则应理解，除非上下文另外明确规定否则在那个范围的上限与下限之间的值的每个中介整数和值的每个中介整数的每个十分位以及那个所述范围中的任何其它所述或中介值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所述范围包括界限值中的一或两者的情况下，排除所包括的界限值中的任(i)一者或(ii)两者的范围也包括于本发明中。
本文中所描述的各种元件的所有组合在本发明的范围内。本文中所描述的各种元件的所有子组合也在本发明的范围内。
用于对核酸测序的方法可以包括获取具有待测序的核酸的生物样品，从生物样品提取或以其它方式分离核酸样品，和在一些情况下制备核酸样品以用于测序。
本文中提供用于借助于纳米孔对核酸分子测序的系统和方法。纳米孔可以形成或以其它方式包埋于与感测电路(例如场效应晶体管或互补金属-氧化物半导体(CMOS))相邻安置的膜中。在一些情况下，在核酸或标签流动通过纳米孔时，感测电路检测与核酸或标签相关的电信号。核酸可以是较大链的亚单元。标签可以是核苷酸并入事件或加标签的核酸与纳米孔或与纳米孔相邻的物质(例如使标签从核酸裂解的酶)之间的其它相互作用的副产物。
核苷酸并入事件的副产物可以通过纳米孔进行检测。“核苷酸并入事件”是将核苷酸并入到生长多核苷酸链中。副产物可以与既定类型核苷酸的并入相关。核苷酸并入事件一般来说由酶(例如DNA聚合酶)催化，并且使用与模板分子的碱基对相互作用来在可用核苷酸之中进行选择以在每个位置处并入。
在一些情况下，DNA聚合酶是9°N聚合酶或其变异体、大肠杆菌DNA聚合酶I、噬菌体T4 DNA聚合酶、测序酶、Taq DNA聚合酶、9°N聚合酶(exo-)A485L/Y409V或Phi29 DNA聚合酶(DNA聚合酶)。
核酸样品可以使用加标签的核苷酸或核苷酸类似物来测序。在一些实例中，一种用于对核酸分子测序的方法包含(a)使加标签的核苷酸聚合，其中与个别核苷酸相关联的标签在聚合后释放，和(b)借助于纳米孔检测所述释放的标签。
核苷酸并入事件的速率一般来说与在核苷酸并入事件期间释放的标签分子通过纳米孔和/或由纳米孔检测的速率相比更慢(或相等)。一般来说，核苷酸并入事件的速率不大于在核苷酸并入事件期间释放的标签分子通过纳米孔和/或由纳米孔检测的速率(即，否则的话核苷酸并入事件无法精确检测和/或处于正确序列)。
在一些情况下，单一标签在并入单一核苷酸后被释放并且通过纳米孔进行检测。在其它情况下，多种标签在并入多种核苷酸后被释放。与纳米孔相邻的纳米孔传感器可以检测个别释放的标签或多种释放的标签。可以对一或多个与多种释放的标签相关的信号进行检测和处理以产生平均信号。
本文中提供的方法可以精确区别个别核苷酸并入事件(例如单分子事件)。所述方法可以单遍地精确区别个别核苷酸并入事件，即不必对既定核酸分子再测序。
一种用于核酸测序的方法包含以大于约4σ的精确性区别个别核苷酸并入事件。在一些情况下，核苷酸并入事件借助于纳米孔进行检测。与核苷酸相关联的标签可以在并入后释放，并且标签通过纳米孔。不同标签可以与每种类型的核苷酸相关联和/或从其释放(例如A、C、T、G)，并且在其通过纳米孔时进行检测。错误包括(但不限于)(a)未能检测标签，(b)错鉴别标签，(c)在不存在标签时检测到标签，(d)以不正确的顺序检测标签(例如两种标签以第一顺序释放，但通过彼此并且以第二顺序检测)，(e)尚未从核苷酸释放的标签被检测为被释放，或其任何组合。在一些实施例中，区别个别核苷酸并入事件的精确性是100％减错误发生的比率(即错误率)。
区别个别核苷酸并入事件的精确性是任何合适的百分比。在一些情况下区别个别核苷酸并入事件的精确性以西格玛(σ)单位报道。西格玛是一种统计变量，其有时在企业管理和制造策略中用以报道错误率，例如无缺陷产品的百分比。此处，西格玛值可以根据如下关系与精确性可互换地使用：4σ是99.38％精确性，5σ是99.977％精确性，并且6σ是99.99966％精确性。
所述方法可以涉及通过以下方式来对模板核酸链测序：添加加标签的核苷酸到与模板链互补的链，和检测纳米孔中释放的标签分子。本文中所公开的方法可以与其它测序方法组合，所述其它测序方法例如美国专利第5,470,724号中所述的测序方法，所述专利以全部引用的方式并入本文中。
参考以下实验细节将更好地理解本发明，但本领域的技术人员将容易了解，详述的特定实验仅为说明如在之前的权利要求中更充分描述的本发明。
本发明的另一方面提供一种电导测量系统，其包含：(a)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(b)用于施加穿过所述屏障的电场的构件；(c)用于测量所述电场的变化的构件；(d)至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和(e)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶。
在一些情况下，孔隙的直径是约1到10nm。在一些情况下，聚合酶和磷酸酶与孔隙共价连接。在一些情况下，与聚合酶相比更多磷酸酶与孔隙连接。在一些情况下，磷酸酶被定位成使得在聚合酶反应中由聚合酶制造的聚磷酸酯在进入孔隙之前与磷酸酶相互作用。在一些情况下，磷酸酶与聚磷酸酯之间的相互作用的速率与聚合酶制造聚磷酸酯的速率相比更快或相等。
在一些情况下，第一和第二隔室中的每一者具有电荷。在一些情况下，孔隙的内部具有负电荷。在一些情况下，孔隙是生物或合成的。在一些情况下，孔隙是蛋白质的。在一些情况下，孔隙是α溶血素蛋白质。在一些情况下，孔隙是固态孔隙。在一些情况下，孔隙由石墨烯形成。
在一些情况下，电导测量系统进一步包含各自具有实质上相同特征的孔隙的阵列。在一些情况下，电导测量系统进一步包含不同直径的孔隙的阵列。在一些情况下，电导测量系统进一步包含孔隙的阵列，其中孔隙被配置成施加不同的穿过屏障的电场。
在一些情况下，电导测量系统与CMOS电子装置集成。在一些情况下，孔隙或孔隙的阵列如图46中所示直接集成到CMOS模具中。
本发明的另一方面提供一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反。
在一些情况下，标签上的电荷的量级与化合物的其余部分上的电荷的量级相同。在一些情况下，标签包含多个乙二醇单元。在一些情况下，标签包含16、20、24或36个乙二醇单元。在一些情况下，标签包含另一可鉴别部分。在一些情况下，另一可鉴别部分是基于香豆素的染料。在一些情况下，标签具有正电荷。在一些情况下，标签的去除改变化合物的电荷。在一些情况下，标签进一步包含适当数目的赖氨酸或精氨酸以平衡磷酸酯的数目。
本发明的另一方面提供一种用于测定单链DNA或RNA的核苷酸序列的方法。在一些情况下，与聚合酶相比更多磷酸酶与孔隙连接。在一些情况下，单链DNA或RNA通过使双链DNA或RNA变性而获得，以适用者为准。在一些情况下，相同单链DNA或RNA的多个拷贝固定于珠子上。在一些情况下，单链DNA或RNA的核苷酸序列使用相同单链DNA或RNA的多个拷贝来测定。在一些情况下，所述方法进一步在每个反复的步骤(b)之后包含洗涤步骤以去除未并入的化合物以免与单链DNA或RNA接触。在一些情况下，所述方法进一步在每个反复的步骤(b)之后包含确定与标签连接的另一可鉴别部分的身份的步骤。在一些情况下，至少85-99％的所释放的标签易位通过孔隙。在一些情况下，化合物进一步包含可逆终止子。在一些情况下，所述方法进一步在每个反复的步骤(b)之后包含去除可逆终止子的步骤。在一些情况下，可逆终止子通过生物手段、化学手段、物理手段或通过光照射而去除。在一些情况下，孔隙的内部的电荷相对于标签或有标签与其连接的聚磷酸酯的电荷正负相反。在一些情况下，电导测量系统的第一和第二隔室中的每一者具有电荷。在一些情况下，第一与第二隔室的电荷极性相反。在一些情况下，第一和第二隔室的电荷是可调节的。在一些情况下，在步骤(b)中标签易位通过孔隙的速率基于标签的电荷以及第一和第二隔室的电荷来测定。在一些情况下，第一和第二隔室中的每一者的电荷使得在步骤(b)中标签以与在步骤(a)中标签或有标签与其连接的聚磷酸酯被释放的速率相比更快或相等的速率易位通过孔隙。
本发明的另一方面提供一种用于测定溶液中的化合物的至少一个参数的方法。在一些情况下，化合物在测量离子电流的降低之前用磷酸酶进行处理。在一些情况下，化合物是交替地带电的化合物，其具有第一净电荷，并且在化学、物理或生物反应之后具有不同的第二净电荷。在一些情况下，数学分析选自由以下组成的群组：GMM、阈值检测和平均以及滑动窗分析。在一些情况下，至少一个参数选自由以下组成的群组：化合物的浓度、大小、电荷和组成。
在一些情况下，所述方法进一步包含校准电导测量系统的步骤。在一些情况下，精确性大于4σ。在一些情况下，精确性大于5σ。在一些情况下，精确性大于6σ。
各方面描述涉及第一和第二电解质溶液和/或第一和第二流体的方法和电导测量系统。在一些情况下，第一与第二电解质溶液相同。在一些情况下，第一流体与第二流体相同。
纳米孔检测和标签
本文中所公开的本发明涉及用于使用纳米孔对DNA(或RNA，加以必要修正)单分子分析的被修饰的核苷酸。可以在核苷酸的各个位置(即末端磷酸酯、碱基和/或2'或3'-OH)处进行修饰以形成核苷酸类似物。在模板-引物复合物上的聚合酶延伸反应之后，所释放的标签连接的焦磷酸酯通过纳米孔，并且监测所得电流阻塞以确定所添加的核苷酸碱基。如果修饰或标签在核苷酸的碱基部分或糖部分的2'/3'-OH处，那么在通过DNA/RNA聚合酶并入之后，连接子-标签通过化学或光化学手段从碱基/糖裂解，并且释放的连接子-标签通过纳米孔以鉴别所添加的核苷酸。
设计并且合成携载不同数目的磷酸酯基作为连接子并且被与核苷酸的末端磷酸酯连接的标签修饰的核苷-5'-聚磷酸酯。在模板-引物延伸反应中通过DNA/RNA聚合酶并入之后，所释放的标签连接的聚磷酸酯(二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯等)可以使用纳米孔进行检测以产生序列数据。任选地，所释放的标签-聚磷酸酯还可以用碱性磷酸酶进行处理以提供游离标签。使用对于每种核苷酸碱基来说不同并且具有特异性的四种不同标签，可以测定模板DNA或RNA的序列。
提供携载不同数目的磷酸酯基或标签以便合成被修饰的核苷酸的核苷酸，其是聚合酶反应中的有效底物。所释放的标签连接的聚磷酸酯使用纳米孔进行检测以确定用于设计并且修饰核苷酸以获得不同阻塞信号的条件。
还提供携载在核苷酸碱基部分和/或糖部分的2'/3'-OH处连接的连接子-标签的核苷酸，以用于DNA聚合酶反应以产生连接子-标签标记的单碱基DNA延伸产物。这些核苷酸对于常用的DNA/RNA聚合酶来说是良好底物。在延伸的DNA产物处连接的连接子-标签通过化学或光化学手段而裂解以产生准备好使用被修饰的核苷酸进一步延伸的引物。所释放的连接子-标签通过纳米孔并且基于关于标签的大小、形状和电荷的差异来鉴别以产生序列数据。
如本文中所公开，这些分子工具有助于使用纳米孔以单碱基分辨率进行单分子测序。
此处公开纳米孔方法的数种改进：1)精确并且明显地区别构成核酸分子的四种碱基(A、C、G和T)；2)增强并且区分检测信号的强度；3)开发一种用于辨别并且处理产生的电子阻塞信号的有效方法；4)控制核酸易位通过孔隙的速率，例如减缓标签的移动以改进碱基与碱基间区别的能力；和5)设计并且制造新的并且更有效的用于区分DNA中的四种不同核苷酸的合成纳米孔。
四种核苷酸的结构展示于图22中。A和G是嘌呤，而C和T是嘧啶。A和G的整体分子大小非常类似，而C和T的大小类似。纳米孔已经显示能够区分嘌呤与嘧啶(阿克松等人1999和梅勒等人2000)，但不能够区别个别嘌呤A与G或个别嘧啶C与T。
先前研究已经展示核苷-5'-三磷酸酯的修饰包括引入更多磷酸酯基以产生四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯，将染料直接引入到末端磷酸酯，或使连接子在末端磷酸酯与染料之间连接(库马尔(Kumar)等人,2006和2008)。四磷酸酯和五磷酸酯是更佳的DNA聚合酶底物，并且已经开发染料标记的六磷酸核苷酸(库马尔等人2005；苏德(Sood)等人2005；艾德(Eid)等人2009)。
本文中公开核苷酸类似物，其被设计成通过在末端磷酸酯部分处修饰核苷酸增强每种核苷酸的区别。合成核苷-5'-聚磷酸酯，并且不同标签(例如不同长度/质量的聚(乙二醇)(PEG)、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸、染料或有机/无机分子)与末端磷酸酯基连接。在聚合酶延伸反应之后，产生标签连接的聚磷酸酯部分(图9)，并且当标签连接的聚磷酸酯部分通过纳米孔时，产生对于每种碱基特定的不同信号。这些修饰由于四种核苷酸(A、G、C和T)之间的释放的加标签的聚磷酸酯单元的大小、质量或电荷差异增加而增强了通过纳米孔区别碱基。
DNA易位通过纳米孔的速率由于所释放的标签连接的聚磷酸酯的膨松性而降低，但标签易位通过纳米孔的速率不需要降低，只要标签可以被区分即可。因此，碱基与碱基测序所需的精确性和可靠性变得可实现。优化纳米孔测序中的其它分析参数，例如多核苷酸的浓度、施加的电压的量级、溶液的温度和pH值以便针对DNA链的检测和分析得到最精确并且可靠的结果。
单分子测序方法提供了得到单倍型用于遗传研究和允许对mRNA直接测序的可能性。在用于解码DNA或RNA分子的序列的可能单分子方法中的是使用生物或合成纳米孔作为个别DNA碱基的检测器。
现有合成测序(SBS)方法使用可裂解荧光核苷酸可逆终止子(CF-NRT)(郭(Guo)等人2010)。SBS方法是基于能够在聚合酶反应期间每种核苷酸加成之后暂停并且使用特定荧光团以在4种碱基中进行区别。然而，SBS用于单分子测序的主要限制是需要昂贵荧光检测器和快速成像软件。本文中所公开的方法和工艺利用SBS的优势，尤其其高精确性，还利用作为离子电流阻抗检测器的纳米孔的速度和灵敏度。
虽然大量研究已经探究使DNA穿过纳米孔，希望在每种碱基通过时由于其对于离子电流的可变作用而区别其，但这非常难以实现，是由于传输速度和围绕的碱基的作用，所述碱基可以对通过孔隙的离子和相对离子贡献其自身作用(蒂姆普(Timp)等人2010)。在蛋白质孔隙的腔中使用环糊精或其它环形结构帮助提供棘轮机构以减缓转换时间(阿斯蒂(Astier)等人2006)，但在每种用于测序的碱基通过时绝对地辨识其的能力仍是一种挑战。使用核酸外切酶以一次允许一种核苷酸穿过孔隙的替代性策略已经引起单碱基区别(克拉克等人2009)。然而，仍难以针对不同长度的DNA和核苷酸控制核酸外切酶的反应时间以及所释放的离子以此方法达到孔隙的速度。
聚合酶反应本身展示高持续合成能力和稳定碱基并入速率。实际上，聚合酶反应已经用以控制DNA链通过纳米孔的移动以用于进行直接碱基区别(本纳(Benner)等人2007，考克罗夫特(Cockroft)等人2008，赫特(Hurt)等人2009)。在聚合酶反应期间，释放焦磷酸酯(PPi)部分。因此，如果对于四种核苷酸中的每一者使不同标签与三磷酸酯连接，那么这些标签可以在其被释放并且通过适当纳米孔以便进行DNA序列测定时进行区别。这些相对小的焦磷酸酯类似物或具有其它带正电荷的基团的等效分子可以极快速地到达孔隙。核苷酸通过聚合酶并入的速率是每秒约1000个核苷酸，即每碱基添加一毫秒，而输送通过纳米孔的速率是每微秒1个分子。因此，通过适当射流技术和工程化，我们的方法既不存在对DNA测序的散相问题，也不难以解码均聚物拉伸。已经显示，可以通过聚乙二醇对于阻塞纳米孔中的电流的作用来在少至一或两个碳单元不同的大范围聚乙二醇中进行辨别(赖纳(Reiner)等人2010，罗伯森等人2007)，分辨率基本上等效于通过质谱仪获得的分辨率。因此，如下文所描述，不同长度的PEG链与dATP、dCTP、dGTP和dTTP的末端磷酸酯连接。在聚合酶反应期间并入每种核苷酸时，具体来说加标签的磷酸酯基释放到纳米孔中，产生不同电流阻塞信号，以指示哪种核苷酸被并入。测序速度极快速，仅受聚合酶反应的速率限制。作为用于给核苷酸加标签的一替代性方法，还利用不同磷酸酯链长度(例如三磷酸酯、四磷酸酯和五磷酸酯)。
另外，还使用在制造的更佳控制和灵活性方面具有优势的固态纳米孔，因此确保快速向量输送加标签的聚磷酸酯但不输送核苷酸前体或DNA朝向和通过纳米孔或纳米通道。为了实现这个，并入两个重要的设计特征。第一，合成具有整体中性电荷的前体(加标签的核苷酸聚磷酸酯)，而裂解的加标签的磷酸酯具有整体正电荷。通过利用吸引正离子的电流，纳米孔仅需要辨别四种替代性释放的加标签的分子。前体和产物上的差异性电荷通过以下方式来实现：向标签中并入多个赖氨酸或精氨酸(带正电荷)，恰好平衡磷酸酯(带负电荷)的数目。在向生长引物中并入α-磷酸酯之后，在释放的产物中与磷酸酯相比多一个赖氨酸。任选地，碱性磷酸酶可以用以使所有磷酸酯裂解以产生具有较强正电荷的PEG标签。第二，为了确保释放的磷酸酯紧密地移动通过最接近的孔隙，DNA聚合酶例如经由生物素-抗生蛋白链菌素键联而固定到孔隙的入口。在DNA链穿过聚合酶时，所释放的加标签的产物仅须扩散相同短距离以到达纳米孔。
还重要的是，认识到生物电子转导机制优于光学方法的优势。对于单分子光学转导技术，来自单一荧光团的信号典型地在高短噪声级下是<2500个光子/秒(对应于约50fA的检测的电流水平)，需要复杂光学装置以尝试收集每个发射的光子，使得难以将平台按比例调整到较高密度。合成反应必须减缓到1Hz以使得充足积分时间可用于这些弱的有噪声的光信号。对光学技术的挑战已经开启了生物电子检测方法的可能性，所述方法具有显著更高的信号水平(典型地高超过三个数量级)，允许可能通过适当共设计转导器、检测器和放大器而进行高带宽检测。纳米孔的信号水平可以是α-溶血素的高达100pA(卡西亚诺维奇等人1996)，MspA的300pA(达灵顿(Derrington)等人2010)，和固态纳米孔的4nA以上(瓦努努(Wanunu)等人2010)。
已经作大量努力来开发纳米孔技术作为生物电子转导机制(本纳等人2007，迪默等人2002，卡西亚诺维奇等人1996，布瑞腾(Branton)2008，布瑞腾等人2008，陈(Chen)2004，格肖(Gershow)等人2007，尼利(Nealy)2007，马蒂西克(Matysiak)等人2006)。此电子传感器的两种必需属性给予其以单分子灵敏度。第一是孔隙本身中的电荷灵敏度的非常局限的(纳米级)几何形状。孔隙的直径可以是2-3nm，并且归因于电解质电荷，筛选测量的电流对于距孔隙超过几纳米的电荷源非常不灵敏。第二，纳米孔传感器通过生物聚合物所具有的相对缓慢移动的电荷对于较高迁移率盐离子的附近浓度的作用来提供增益。然而，纳米孔受孔隙的电荷灵敏区域中的相对短时间生物分子消耗的限制极大。此通过使用标签直接寻址，这可以经优化以产生高信号水平和较久易位事件。同时，利用这些孔隙的CMOS共积分以显著改进用于在纳米孔装置中检测的噪声限制性带宽。固态和生物孔隙都由此平台支持。此固态积分以及相关联的微射流技术还独特地使得能够将此设计按比例扩大为具有集成电子装置的大阵列以用于检测。
计算机系统
本发明的核酸测序系统和方法可以借助于计算机系统进行调节。图18展示系统1800，其包含与核酸测序系统1802耦接的计算机系统1801。计算机系统1801可以是一服务器或多个服务器。计算机系统1801可以被程序化以调节样品制备和处理以及通过测序系统1802进行核酸测序。测序系统1802可以是如本文中别处所述的基于纳米孔的测序仪(或检测器)。
计算机系统可以被程序化以实施本发明的方法。计算机系统1801包括中央处理单元(CPU，本文中还称“处理器”)1805，其可以实单核或多核处理器或多个用于平行处理的处理器。计算机系统1801还包括存储器1810(例如随机存取存储器、只读存储器、快闪存储器)、电子存储单元1815(例如硬盘)、用于与一或多个其它系统通信的通信接口1820(例如网络适配器)和外围装置1825(例如高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示器适配器)。存储器1810、存储单元1815、接口1820和外围装置1825通过通信总线(实线)(例如母板)与CPU 1805通信。存储单元1815可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1801可以借助于通信接口1820与计算机网络(“网络”)可操作地耦接。网络可以是因特网、因特网和/或外联网、或与因特网通信的内联网和/或外联网。网络可以包括一或多个计算机服务器，这使得能够分布式计算。
本发明的方法可以藉助于存储于计算机系统1801的电子存储位置上(例如存储器1810或电子存储单元1815上)的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)来建构。在使用期间，代码可以由处理器1805执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1815检索并且存储于存储器1810上以供处理器1805存取。在一些情形下，可以排除电子存储单元1815，并且机器可执行指令存储于存储器1810上。
代码可以预先汇集并且被配置以用于具有适于执行代码的处理器的机器，或可以在运行时间期间汇集。代码可以按编程语言供应，所述编程语言可以经选择以使得代码能够以预先汇集或当时汇集的方式执行。
计算机系统1801可以适于存储用户预置文件信息，例如姓名、物理地址、电子邮件地址、电话号码、即时通讯(IM)控点、教育信息、工作信息、社交喜好和/或厌恶以及可能与所述用户或其它用户相关的其它信息。所述预置文件信息可以存储于计算机系统1801的存储单元1815上。
本文中提供的系统和方法的各方面(例如计算机系统1801)可以实施于程序化。所述技术的各个方面可以被认为是典型地呈一类机器可读媒体上携载或实施的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储于电子存储单元，例如存储器(例如ROM、RAM)或硬盘上。“存储”型媒体可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关联的模块(例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等)，其可以在软件程序化的任何时间提供非暂时性存储。所有或部分软件有时可以通过因特网或各种其它电信网络通信。所述通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器负载到另一计算机或处理器中，例如从管理服务器或主机负载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以带有软件元件的另一类媒体包括光波、电波和电磁波，例如穿过本地装置之间的物理接口、通过有线并且光学的固定网络以及在各种空中链路上使用。携载所述波的物理元件(例如有线或无线链路、光学链路等)也可以视为带有软件的媒体。如本文中所用，除非限制为非暂时性、有形“存储”媒体，否则例如计算机或机器“可读媒体”的术语是指参与向处理器提供执行指令的任何媒体。
因此，机器可读媒体(例如计算机可执行代码)可以呈许多形式，包括(但不限于)有形存储媒体、载波媒体或物理传输媒体。非易失性存储媒体包括例如光盘或磁盘，例如任何计算机等中的存储装置中的任一者，例如可以用以实施图中所示的数据库等。易失性存储媒体包括动态存储器，例如这种计算机平台的主存储器。有形传输媒体包括同轴电缆；铜线和光纤，包括计算机系统内包含总线的电线。载波传输媒体可以呈电信号或电磁信号或声波或光波形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。计算机可读媒体的常见形式因此包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其它磁性媒体、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学媒体、穿孔卡纸带、具有孔洞模式的任何其它物理存储媒体、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒、输送数据或指令的载波、输送这种载波的电缆或链路、或计算机可以读取到程式化代码和/或数据的任何其它媒体。这些形式的计算机可读媒体中的多者可以参与将一或多个指令的一或多个序列携载到处理器以便执行。
本文中提供的系统和方法可以与其它系统和方法组合或由其它系统和方法修改，所述其它系统和方法例如PCT专利公开第WO/2012/083249号中所述的系统和方法，所述申请以全部引用的方式并入本文中。
实例
实例1
I.设计并且合成被修饰的核苷酸
使用有不同大小的标签或基团与核苷酸的末端磷酸酯连接的各种磷酸酯连接的核苷酸，来测定加标签的聚磷酸酯的膨松性对于由纳米孔产生的电子阻塞信号的作用。四种磷酸酯加标签的核苷-5'-聚磷酸酯的结构展示于图23中。首先，合成一系列核苷-5'-三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯和六磷酸酯。在这些核苷酸中，末端磷酸酯与连接子连接，不同标签(例如不同长度和质量的乙二醇或增加所释放的聚磷酸酯的膨松性或电荷的其它分子)通过所述连接子连接。通过纳米孔测试这些核苷酸，以确定与末端磷酸酯连接的哪些标签或庞大基团与不同碱基之间的电子阻塞信号的更显著差异相关。
1)末端磷酸酯修饰的核苷-聚磷酸酯
a.末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯
如图24中所示，末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯可以通过以下方式来合成：使相应dNTP与DCC/DMF反应以得到环三偏磷酸酯，可以用适当亲核试剂使所述环三偏磷酸酯打开以得到标签或连接子连接的核苷-5'-三磷酸酯。这可以用于模板-引物延伸反应中，并且所释放的标签连接的焦磷酸酯可以使用纳米孔进行读取。或者，与磷酸酯连接的连接子可以与标签-NHS酯反应以提供替代性标签连接的核苷-5'-三磷酸酯。
b.末端磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯
为了合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯，首先使相应三磷酸酯与CDI在DMF中反应以活化末端磷酸酯基，然后使所述末端磷酸酯基与磷酸或标签-单磷酸酯反应以得到四磷酸酯(图25)。四磷酸酯上的末端磷酸酯可以用CDI进一步活化，接着与适当亲核试剂反应，以提供连接子连接的四磷酸酯，其可以进一步用以连接不同质量、长度或体积的标签，例如m-dPEG-NHS酯，也展示于图25中。
c.末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯和六磷酸酯
末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯和六磷酸酯的合成按照如图26中所示的相同原理。其可以通过与磷酸、焦磷酸酯或标签连接的磷酸酯反应而由活性三磷酸酯或四磷酸酯制备。或者，连接子可以与五磷酸酯或六磷酸酯连接，接着与活性NHS酯反应。
d.寡核苷酸-标签连接的核苷-聚磷酸酯
当前用于纳米孔测序的方法(例如在碱基通过纳米孔时识别其并且登记允许识别核碱基的输送速度或速率)存在多个问题。DNA以1-5μs的速率通过α-溶血素纳米孔，这对于单分子测序实验来说太快以致无法记录。已经通过多种蛋白质工程化策略(包括使用分子刹车(短共价连接的寡核苷酸))而在解决这些问题方面取得一些进展(贝利H.(Bayley,H.)2006)。
如本文中所公开，短寡核苷酸可以通过活性末端磷酸酯与寡核苷酸的3'-OH或5'-OH的反应而与核苷聚磷酸酯的末端磷酸酯连接。或者，寡核苷酸的3'或5'-磷酸酯可以用CDI或咪唑/DCC活化并且与核苷-5'-聚磷酸酯反应。寡核苷酸连接的核苷磷酸酯(寡核苷酸-3'与5'-磷酸酯；寡核苷酸-5'与5'-磷酸酯)的结构分别展示于图27(a)和27(b)中。借助于通过纳米孔监测的聚合酶反应副产物展示于图27(c)中。
聚合酶反应副产物迁移通过纳米孔的速率可以通过使不同长度的寡核苷酸与不同核苷-5'-聚磷酸酯连接来控制。举例来说，如果核苷dA连接有1或2个寡核苷酸-dA单元，那么dT可以具有3个寡核苷酸-dT单元，dC可以具有4个寡核苷酸-dC单元，并且dG可以具有5个寡核苷酸-dG单元。每种核苷酸的寡核苷酸的数目的不同组合可以用以控制纳米孔中的输送和滞留时间。
纳米孔中的输送和滞留时间还可以通过添加不同数目的磷酸酯基到核苷酸来控制。因此，电荷和质量对于每种核苷酸聚磷酸酯来说可以不同。
连接子标签结构的实例
末端磷酸酯或核苷碱基部分上的反应性基团以及可以与反应性基团反应的基团的特定实例提供于表1中。可以与所述基团反应的反应性基团可以存在于连接子或标签上。
表1
在此包括可以通过纳米孔检测的标签，但其决不限于化合物的这些群组。本领域技术人员可以改变官能团以得到合适标签。
标签包括具有一或多个4-8元环的脂肪族、芳香族、芳基、杂芳基化合物并且可以任选地被卤基、羟基、氨基、硝基、烷氧基、氰基、烷基、芳基、杂芳基、酸、醛、叠氮基、烯基、炔基或其它基团取代。其包括聚乙二醇(PEG)、碳水化合物、氨基酸、肽、荧光、荧光基因(非荧光，但在去除保护基之后变为荧光)、显色(无色，但在去除保护基之后变为有色)染料、化学发光化合物、核苷、核苷-单磷酸酯、二磷酸酯或聚磷酸酯、寡核苷酸、芳基、杂芳基或脂肪族化合物。一些实例给出于图35中。
PEG-磷酸酯标记的核苷酸的结构和具有不同反应性基团以与官能团反应的可能PEG的一些实例例示于图36中。
此处提供可以用以与核苷酸的末端磷酸酯或碱基部分连接的染料或化合物的一些其它实例。其决不是可以使用的仅有的化合物。此处将其作为实例列举，并且本领域技术人员可以容易地得到可以与核苷酸连接并且通过纳米孔检测的合适连接子-标签。
合适标签的其它实例是：
荧光染料：黄嘌呤染料、氟硼二吡咯染料、花青染料。化学发光化合物：1,2-二氧杂环丁烷化合物(特洛匹克斯公司(Tropix Inc.),贝德福(Bedford),马萨诸塞州(MA))。氨基酸与肽：天然存在或被修饰的氨基酸和其聚合物。碳水化合物：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等。NMP与NDP：核苷-单磷酸、核苷-二磷酸酯。脂肪族或芳香族酸、醇、硫醇被卤素、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其它此类基团取代。
2)碱基修饰的核苷-5'-三磷酸酯
合成用于通过合成进行DNA测序(SBS)的多种核苷酸可逆终止子(NRT)，其中可裂解连接子使荧光染料与核苷酸碱基连接，并且将核苷酸的3'-OH用小可逆终止基团封端(居(Ju)等人2006，郭等人2008和2010)。使用这些NRT，使DNA合成在每个位置处可逆地停止。在记录来自并入的碱基的荧光信号之后，去除所并入的核苷酸的可裂解部分，并且重复所述循环。
还可以将相同类型的核苷酸用于纳米孔DNA测序。如图28(A)中所示，可以合成3'-OH处的小封端基团和在通过可裂解连接子连接的碱基处连接的标签。在聚合酶延伸反应之后，使3'-O-封端基团以及标签从碱基裂解，并且所释放的标签可以用以通过纳米孔并且监测阻塞信号。可以使用四种不同标签(例如不同长度和分子量的聚乙二醇(PEG)，如图28(A)中所示)，一种标签用于四种碱基中的每一者，因此区分阻塞信号。
或者，不使用3'-O-封端基团，因为已经展示庞大基团或核苷酸碱基可以防止DNA聚合酶一次添加多于一种核苷酸(哈里斯(Harris)等人2008)。如图28(B)中所示，庞大dNMP通过可裂解连接子引入。因此，不同dNMP根据初始dNTP通过连接子引入。举例来说，通过dTTP核苷酸，引入dTMP(对于dATP，引入dAMP；对于dGTP，引入dGMP；并且对于dCTP，引入dCMP)。在聚合酶并入和通过TCEP裂解之后，产生被修饰的dNMP，其通过纳米孔通道并且通过适当方法进行检测。
3)2'或3'-OH修饰的核苷-5'-三磷酸酯
可以进行所有四种3'修饰的核苷-5'-三磷酸酯的合成(郭等人2008，李(Li)等人2003，赛欧(Seo)等人2004)。3'-O-2-硝基苯甲基和3'-O-叠氮基甲基连接的dNTP(分别图29A和29B)是DNA聚合酶的良好底物。在测序反应中通过DNA/RNA聚合酶并入之后，这些3'-O加标签的核苷酸在单碱基延伸之后由于3'-OH处的封端基团而终止合成。进一步延伸仅在封端基团从3'-O位置裂解之后是可能的。3'-O-2-硝基苯甲基可以通过UV光高效裂解，并且2'-O-叠氮基甲基通过用TCEP处理而产生游离OH基团以便进一步延伸。经由通过纳米孔并且记录信号来监测来自反应的裂解的产物(图29C或29D)的电子阻塞。合成四种不同被取代的硝基苯甲基保护的dNTP以及四种不同叠氮基甲基取代的dNTP，一种dNTP用于DNA的四种碱基中的每一者。
II.使用被修饰的核苷酸进行DNA延伸
1)磷酸酯加标签的核苷酸
上文所述的末端磷酸酯加标签的核苷聚磷酸酯用于聚合酶反应中以产生延伸产物。如图30中所示，在聚合酶反应之后，获得磷酸酯加标签的核苷酸的释放的副产物标签-聚磷酸酯，并且延伸的DNA不含任何修饰。所释放的标签-聚磷酸酯然后通过单通道记录技术用于工程化的纳米孔中以便进行测序分析。还可以用碱性磷酸酶处理所释放的标签-聚磷酸酯，以提供也可以检测的游离标签。对于四种核苷酸(A、T、G和C)使用四种不同标签以产生质量、电荷或体积不同的四种不同加标签的聚磷酸酯，可以测定DNA的序列。
2)具有可裂解连接子的碱基加标签的核苷酸
合成用于通过合成进行DNA测序(SBS)以及单分子测序的碱基加标签的核苷酸三磷酸酯(郭等人2008和2010)。在嘧啶(C和T)的5位和7-脱氮嘌呤(G和A)的7位处添加大庞大基团可以阻止在DNA聚合酶反应中添加多于一种核苷酸。合成具有可裂解连接子、庞大基团和不同电荷与核苷酸碱基连接的被修饰的核苷酸。被修饰的核苷酸还可以在核苷酸的3'-OH处具有小封端基团。这些被修饰的核苷酸用于聚合酶延伸反应中。如图31中所示，在用适当核苷酸延伸之后，通过化学或光化学手段使连接子和标签从核苷酸碱基并且如果封端的话从糖3'-O裂解，并且所释放的连接子-标签通过单通道记录技术用于工程化的纳米孔中以便进行测序分析。
3)具有可裂解连接子的2'或3'加标签的核苷酸
连接子和标签还可以与核苷酸的2'或3'-OH连接。在聚合酶延伸反应之后，通过化学、光化学或酶促反应使连接子-标签从延伸产物裂解，以释放游离3'-OH以便进一步延伸。如图32中所示，所释放的连接子-标签然后通过单通道记录技术用于工程化的纳米孔中以便进行测序分析。
III.使用纳米孔的DNA测序研究
按照图30-32中所示的策略来评估使用纳米孔的DNA测序中不同核苷酸的区别。为了验证纳米孔区别DNA中的四种不同连接子-标签的能力，进行如图33中所示的一系列实验。DNA/RNA聚合酶可以结合到纳米孔，并且与引物一起添加待测序的模板。DNA模板或引物还可以固定于纳米孔的顶部上并且接着随后在添加DNA聚合酶后形成模板-引物复合物。向此模板-引物复合物中一起或依序添加四种不同地加标签的核苷酸。在聚合酶催化的正确核苷酸并入之后，所添加的核苷酸释放标签连接的聚磷酸酯(在末端磷酸酯标记的核苷酸的情况下)，其然后通过纳米孔以产生待记录并且用以鉴别所添加的碱基的电信号。任选地，所释放的标签-聚磷酸酯还可以用碱性磷酸酶处理以提供游离标签，其还可以借助于通过纳米孔进行检测。每种标签由于大小、质量或电荷的差异而产生不同电子阻塞签名。在碱基修饰的或2'/3'修饰的核苷酸的情况下，在DNA/RNA聚合酶延伸之后，通过化学、光化学或酶促手段使标签从延伸引物裂解，并且监测所释放的标签的电子签名。标签的形状、大小、质量、电荷或其它性质可以根据需求而调节。
如本文中所公开，核苷酸中的每一者(图34)以及不同身份的核苷酸之间的转换的信号是突出的并且对其进行表征。对事件图上的阻塞签名的量级和持续时间进行分析，并且将其与已知图相比。因此，通过对DNA的构筑嵌段进行这些合理化学设计和修饰，优化纳米孔的使用以在单分子水平下以单碱基分辨率解密DNA序列。
为了实施用于DNA测序的此新颖策略，纳米孔的阵列可以如图37中所示构筑于平坦表面上以进行大规模平行DNA测序。纳米孔的阵列还可以构筑于硅芯片或其它此类表面上。纳米孔可以由蛋白质构筑于脂质双层或其它此类层中(α-溶血素孔隙、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegnatis)孔蛋白A，MspA)(达灵顿等人2010)，或其可以是在氮化硅、氧化硅或金属氧化物中制造的合成固态纳米孔(斯多姆(Storm)等人2005；瓦努努等人2008)，或是固态孔隙与α-溶血素之间的混成物(霍尔(Hall)等人2010)。
图37展示用于通过合成进行大规模平行DNA测序的纳米孔阵列的示意图。纳米孔可以在每种DNA/RNA聚合酶催化的核苷酸加成副产物(与磷酸酯或碱基和/或糖部分的2'、3'-OH连接的标签)通过纳米孔时感测其。不同标签的电性质将基于其在纳米孔中的阻塞性质而区别碱基。图37中所示的纳米孔的阵列可以各自读取相同序列或不同序列。增加读取每个序列的次数将导致所得序列数据的品质更佳。
实例2
I.合成PEG标记的脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(dG4P-PEG)：
根据图38合成PEG标记的脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(dG4P-PEG)。首先，2'-脱氧鸟苷三磷酸酯(dGTP)与CDI在DMF中反应以活化末端磷酸酯基，然后使所述末端磷酸酯基与磷酸二丁铵反应以得到四磷酸酯。此四磷酸酯上的末端磷酸酯用EDAC在0.1M咪唑缓冲液中进一步活化，接着与二氨基庚烷反应，以提供氨基连接的四磷酸酯，其进一步与mPEG-NHS酯反应，以提供所需的四种PEG-dG4P。在聚合酶并入之后，所释放的PEG上的净电荷是-3(PEG-NH-三磷酸酯)。
II.在单碱基延伸反应中测试被修饰的核苷酸.
如表II中所示通过MALDI-TOF质谱法来表征dG4P-PEG。
dG4P-PEG是引物延伸中DNA聚合酶的极佳底物。DNA延伸产物的MALDI-TOF质谱展示于图39中。
实例3
通过纳米孔对用以标记核苷酸的Peg进行单分子检测
聚(乙二醇)是微弱地结合阳离子的非电解质聚合物(例如其以约2M的Kd结合K+离子)。因此，聚合物上的净电荷取决于移动阳离子浓度并且取决于与其化学连接的其它部分的存在。已经证实，单一α-溶血素纳米孔可以按比单体分辨率更佳(即比44g/mol更佳)的分辨率容易地区别不同地尺寸化的PEG聚合物(赖纳等人2010；罗伯森等人2007)。那种区别水平称为可能，是因为聚合物由于体积排除(孔隙电导随聚合物大小增加而降低)并且通过结合移动阳离子(其否则可以自由流动通过孔隙)而降低孔隙的电导(赖纳等人2010)。另外，聚合物在孔隙中的滞留时间对于聚合物的电荷非常灵敏，其对于PEG来说，与聚合物的长度成比例调整。纳米孔应该能够区别与其它部分化学连接的不同地尺寸化的PEG。用于标记核苷酸的PEG(PEG 16、24、37和49)在纳米孔上进行测试并且如图40中所示在单分子水平下产生不同电子阻塞签名。
为了研究不同地加标签的聚磷酸酯的膨松性对于纳米孔中产生的电子阻塞信号的作用，合成各种磷酸酯连接的核苷酸，其有不同大小的聚乙二醇(PEG)标签与核苷酸的末端磷酸酯连接。首先，如图23中所示，合成一系列核苷-5'-三磷酸酯、四磷酸酯和五磷酸酯，其中末端磷酸酯经由连接子连接，不同标签(例如不同长度和质量的PEG或用以增加所释放的聚磷酸酯的分子大小或调节电荷的其它分子)可以与所述连接子连接。然后在与通过纳米孔检测结合的聚合酶反应中测试这些核苷酸，以在不同碱基中观察与末端磷酸酯连接的哪些标签或庞大基团产生更显著的电子阻塞信号差异。
I.通过不同纳米孔阻塞信号筛检并且选择4种PEG标签
近来，已经显示，当聚乙二醇(PEG)分子进入单一α-溶血素孔隙时，其引发不同质量依赖性电导状态与特征平均滞留时间(罗伯森等人2007)。图41A显示，基于电导的质谱明显地分辨乙二醇重复单元，并且滞留时间随PEG的质量而增加。
I.a测试PEG的纳米孔阻塞签名.
如实例2中所述，选择不同长度和分子量的PEG(可从量子生物设计有限公司(Quanta Biodesign Ltd)或其它供应商商购)，并且监测纳米孔阻塞信号。如图41A中所示，28-48个乙二醇单元的PEG由纳米孔明显地区别出。因此，选择呈现非常不同的纳米孔阻塞信号的具有宽范围的乙二醇单元的PEG作为标签以标记核苷酸A、C、G和T。实例展示于图41B中。还评估作为标签的支链PEG，因为其可以按更直接的方式用正电荷修饰。一些直链和支链PEG的结构展示于图41的底部。
I.b设计并且合成I.a中选择的磷酸酯标记的PEG
在纳米孔测序中，纳米孔中的电流阻塞信号由在聚合酶反应期间释放的PEG-磷酸酯产生。因此，设计并且合成具有带正电荷的连接子的磷酸酯标记的PEG，并且用有机(例如α-溶血素)和合成(固相)纳米孔测试这些分子以评估其电流阻塞信号。如图42中所示将所选择的PEG转化为其三磷酸酯。举例来说，Fmoc保护的氨基-丁醇可以通过以下方式转化为相应三磷酸酯：在一锅反应中，首先与氧氯化磷反应，接着与焦磷酸三丁铵反应。纯化之后的三磷酸酯用DCC/DMF或CDI/DMF活化以提供活性三磷酸酯，其与PEG的OH基团反应以产生PEG-三磷酸酯。相同方案适用于直链以及支链PEG。在纳米孔中测试这些PEG磷酸酯以优化产生不同电流阻塞信号的条件。
通过标准肽合成策略合成聚氨基酸(聚赖氨酸、聚精氨酸、间杂的聚赖氨酸)连接子；如果插入与聚磷酸酯链的酯键，那么应该可能使用碱性磷酸酶以使其裂解，对于纳米孔询问产生更强的正标签。正电荷还可以并入到PEG链中。
I.c设计并且合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯的库.
设计并且合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯、四磷酸酯和五磷酸酯。在聚合酶反应中测试这些分子并且选择最优者用于纳米孔检测。具有多种标签(包括小或大聚赖氨酸、氨基酸、例如能量转移染料的多种带负或正电荷的染料以及乙二醇单元)的末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯、四磷酸酯和五磷酸酯已经被展示可由DNA聚合酶接受为用于引物延伸的极佳底物(库马尔等人2006和2008；苏德等人2005；和艾德等人2009)。
I.c.1设计并且合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯.
如图43中所示，末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯通过以下方式来合成：使相应dNTP与DCC/DMF反应以产生环三偏磷酸酯，可以用亲核试剂使所述环三偏磷酸酯打开以产生标签或连接子连接的核苷-5'-三磷酸酯。另外，与磷酸酯连接的连接子可以与PEG-NHS酯反应，以提供替代性PEG连接的核苷-5'-三磷酸酯。所得末端磷酸酯加标签的核苷-5'-三磷酸酯用于模板-引物延伸反应中，并且所释放的标签连接的焦磷酸酯通过其特定纳米孔电流阻塞参数进行检测和区分。
I.c.2设计并且合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯.
如图44中所示，为了合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-四磷酸酯，首先使相应三磷酸酯与CDI在DMF中反应以活化末端磷酸酯基，然后使所述末端磷酸酯基与磷酸或标签-单磷酸酯反应以得到四磷酸酯。四磷酸酯上的末端磷酸酯可以用EDAC在0.1M咪唑缓冲液中进一步活化，接着与适当亲核试剂反应，以提供连接子连接的四磷酸酯，其可以用以连接不同质量、长度或电荷的标签，例如m-PEG-NHS酯。在此情况下四种三甲基赖氨酸用以中和四种磷酸酯的电荷。在聚合酶并入之后，所释放的PEG上的净电荷是+1，或如果用碱性磷酸酶处理，那么是+4，这可以通过纳米孔进行检测。
I.c.3设计并且合成末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯.
末端磷酸酯加标签的核苷-5'-五磷酸酯的合成按照如图45中所示的相同原理。其可以通过与磷酸、焦磷酸酯或标签连接的磷酸酯反应而由活性三磷酸酯或四磷酸酯制备。或者，连接子可以与五磷酸酯连接，接着与活性NHS酯反应。
上文所述的端磷酸酯加标签的核苷聚磷酸酯用于聚合酶反应中以产生延伸产物。按照图30中所示的方案，在聚合酶延伸中评估末端磷酸酯加标签的核苷聚磷酸酯的性能。首先进行单碱基延伸反应并且通过MALDI-TOF质谱法表征DNA延伸产物以评估并入效率。在确定优化反应条件之后，将模板固定于磁性珠子上，并且重复单碱基延伸反应，之后将所释放的聚磷酸酯-标签从溶液中分离以便使用单一纳米孔检测。连续进行此反应以评估所有4种核苷酸(A、C、G和T)以及其通过纳米孔检测的相应释放的标签。与聚磷酸酯-标签核苷酸的连续聚合酶反应以及通过纳米孔对所释放的聚磷酸酯-标签的明确区别确立了方法的可行性。
如图30中所示，在聚合酶反应之后，获得磷酸酯加标签的核苷酸的释放的副产物(标签-聚磷酸酯)，并且延伸的DNA链不含任何修饰。这是有利的，因为生长DNA链上剩余的任何疤痕都可能会因增加核苷酸加成、最终终止进一步DNA合成而影响其由聚合酶辨识的能力。在纳米孔中分析所释放的标签连接的聚磷酸酯以评估测序灵敏度和精确性。在初始实验中，在运行SBS反应之前测试标签的阻塞信号。如果对于四种核苷酸使用不同标签以产生质量、电荷或体积不同的四种不同加标签的聚磷酸酯并且产生4个不同阻塞信号，那么可以测定DNA序列。
II.通过蛋白质纳米孔检测释放的加标签的磷酸酯
使用单一α-溶血素纳米孔来检测经由多磷酸酯连接子与核苷酸连接的PEG以及在核苷酸/核糖部分已经通过DNA聚合酶反应裂解之后的相同聚合物。四种不同DNA碱基中的每一者与具有独特长度的PEG聚合物连接。因此，鉴别通过聚合酶从PEG去除的每种碱基。因为未反应的核苷酸不能与释放的加标签的聚磷酸酯分离，尤其在实时情况下，所以利用所述方法的对于分子电荷的极端灵敏度来区别所释放的反应产物与起始物质。使用圆锥形玻璃支撑物测量单一α-溶血素电导(怀特(White)等人,2006和2007)，所述支撑物允许在100kHZ和约4pA RMS噪声下进行数据采集。测量加标签的核苷酸和加标签的产物在广泛范围的跨膜电势内的阻塞深度和滞留时间分布，以确定用于核苷酸区别的最优条件并且将我们对PEG-纳米孔相互作用的当前理论理解(罗伯森等人2007)延伸到具有固定电荷的分子。表征和理论理解允许明确鉴别通过聚合酶并入到聚核苷酸中的核苷酸。因此，通过对DNA的构筑嵌段进行这些合理化学设计和修饰，优化纳米孔的使用以在蛋白质或合成纳米孔中在单分子水平下以单碱基分辨率解密DNA。
实例4
制造单一固态纳米孔用于单分子测序
从蛋白质纳米孔转换为固态纳米孔使得高密度纳米孔阵列的制造变得可能，产生高产量单分子电子DNA测序仪的关键步骤。此处，开发集成的单固态纳米孔平台以基于从蛋白质纳米孔获得的了解在聚合酶反应中表征加标签的核苷酸。
集成的纳米孔平台.
开发专门的集成的低噪声CMOS电子装置，其当与固态纳米孔集成时提供优于采用外部电生理学放大器(例如Axopatch 200B)的“标准”测量技术的显著性能优势。这些优势来自在定制集成放大器设计中采用电容(而非电阻)反馈。在DC伺服环路中用低噪声电流源操作去除DC电流，其是此和其它生物电子接口的特征。与共积分相关联的降低的放大器输入电容和降低的寄生电容改进高频率下的噪声性能，对于固态孔隙实现接近1MHz的带宽。所述高暂态分辨率当与开发的标签组合时将提供高灵活性以使此平台具有高灵敏度和实时性能。
如图46中所示在二芯片或一芯片配置中使用此CMOS集成的纳米孔(CNP)集成电路。在前一情况下，如图46B中所示将孔隙与CNP一起封装。在后一情况下，如图46C中所示将孔隙直接制造到CNP中，射流技术在芯片的任一侧上。在两种情况下，与放大器的输入连接的顺电极直接集成于CNP的表面上。一芯片配置具有可容易以额外制造复杂性为代价按比例调整到多路复用的平台的优势。后处理制造的CMOS小片(其在一侧上不大于5mm)的能力是在过去五年中建立的独特能力(黄(Huang)等人2011，雷(Lei)等人2008，和莱文(Levine)等人2009)。此方法完全利用现有铸造工艺流程而不需要新工艺开发。
一芯片制造方法通过调适标准固态纳米孔制造技术来进行(罗森斯坦(Rosenstein)等人2011)。在模具的为传感器保留的区域中，已经封闭所有金属，留下一堆厚的交替玻璃填充和氮化硅罩盖层。使用电感耦合CHF3等离子体蚀刻大部分介质堆叠。在模具的背面上沉积并且图案化PECVD Si3N4蚀刻遮罩之后，使用各向异性氢氧化钾蚀刻在硅衬底中制造局部开口。然后在缓冲氢氟酸中使用短浸渍以将单一50nm层的氮化硅从初始介质堆叠分离为悬置的膜。最终，用高分辨率投射式电子显微镜将纳米孔钻探到这些氮化物膜中。
此系统的测量噪声与Axopatch 200B的相当配置的基线噪声的测量一起展示于图47A中。对于由Axopatch支持的最高带宽(B＝100kHz)，与Axopatch的9pARMS相比，集成放大器具有3.2pARMS的本底噪声。在对于集成放大器表征的最高带宽(B＝1MHz)下，与通过在其支持的范围以外外推Axopatch应答而模型化的247pARMS相比之下，噪声级是27pARMS(约低十倍的噪声)。作为一个比较点，对于1nA信号，在1μs中仅输送约6250个离子通过孔隙。集成放大器的27pAVRMS的输入参考噪声级允许在此时间间隔中分辨少至150个离子。
还重要的是注意，在CMOS芯片上与安装在机架上的Axopatch放大器相比仅消耗0.2mm2的面积的集成放大器的情况下获得此优越电性能，证实了创新电子装置的重要性。当纳米孔与放大器输入连接时，引入1/f噪声和膜电容使噪声谱升高到开放前级探头基线以上。图47b展示在此情况下的典型噪声谱，证实对于100kHz和1MHz的带宽分别仅10pARMS和163pARMS的本底噪声。展示相同纳米孔在Axopatch情况下的至多100kHz的测量比较。在100kHz下，CNP的输入参考噪声功率存在超过二倍的降低。如果Axopatch可以在较高带宽下测量，那么在1MHz下噪声功率差异可以是六倍。
此平台还允许集成生物纳米孔，提供更多灵活性。在脂质膜(典型地1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC))中产生生物纳米孔，所述脂质膜在二液电池之间的铁氟龙膜中的孔洞上形成。表面必须亲水性足够大以使膜从单层囊泡形成。监测电池的两个腔室之间的电导，同时添加膜蛋白质到电池之一，当检测到并入时立即对其冲洗。用以制造纳米孔的膜还可以用作脂质双层的固体支撑物以向膜中钻探更大的孔洞，脂质双层在所述膜上形成(克拉克等人2009；本纳等人,2007；侯(Hou)等人,2009；和王(Wang)等人2011)。平坦双层脂质膜(BLM)已经通过具有纳米图案化孔洞(直径约100nm)的图案化固体支撑物上的不同蛋白质通道以及通过自组装单层组装将其直接系栓于金上而工程化(阿克塞尔罗德(Axelrod)等人,1976，布尔特曼(Bultmann)等人1991，杜塔(Dutta)等人2010，詹金斯(Jenkins)等人2001，纳姆(Nam)等人2006，帕尔格罗斯德曼热(Palegrosdemange)等人1991，沈(Shen)等人2009，斯里尼瓦桑(Srinivasan)等人2001，杨(Yang)等人2003，殷(Yin)等人2005)。此外，已经显示，在纳米图案化衬底上以4μm2/s的扩散系数形成连续BLM；SAM-金组装上形成的BLM产生0.8μm2/s的系数。两者都属于代表良好形成的BLM的0.1-10μm2/s理想扩散范围内(阿克塞尔罗德等人1976，布尔特曼等人1991)。这些BLM的电表征指示具有1.4GW-mm2电阻的高阻抗膜，使得适于进一步电分析膜中形成的生物纳米孔(奥利佛(Oliver)等人1994，史(Shi)等人2000，维尔曼(Wiehelman)1988)。
将聚合酶固定到纳米孔支承表面
聚合酶的大小是约5nm×5nm。一个聚合酶定位得靠近每个纳米孔的入口。对于固态纳米孔为了实现此，需要(1)表面上的独特位置在CMOS制造期间被官能团修饰以结合聚合酶；(2)位点足够小，使得仅可以结合一个聚合酶分子；(3)其相隔足够远，使得所释放的加标签的聚磷酸酯不太可能扩散到附近通道；和(4)交联剂柔性足够大，使得酶功能完整。聚合酶系栓通过以下方式来实现：组合图案化连接点与在孵育期间使用适当浓度的聚合酶溶液，以便连接至多一个酶分子。
建立用于聚合酶的适当系栓点通过采用固态纳米孔的现有制造方法来实现。典型地，为了最大化转导信号，通过以下方式产生这些孔隙：使用电子光束光刻使支撑的Si3N4膜变薄以界定窗口，随后用等离子体蚀刻(例如SF6)使所述窗口变薄。然后在变薄的区域中使用电子光束剥蚀来钻探纳米孔。由此窗口产生的孔(图48)产生一个天然位置以系栓聚合酶，保证紧密接近纳米孔入口。在蚀刻变薄的窗口之前，可以用连接材料的内埋式外延层扩充初始膜。当蚀刻窗口时，这可以变为聚合酶连接的选择性侧壁区域。连接材料包括二氧化硅或金。然而，对于二氧化硅可能具有有限选择性，因为在适当条件下氧化物也可以在氮化硅表面上形成。
原则上，在二氧化硅表面的情况下，可以使用生物素-抗生蛋白链菌素键联(克拉其(Korlach)等人2008和2010)，在二氧化硅贴片上利用生物素化PEG分子，并且在抗生蛋白链菌素存在下孵育生物素末端标记的聚合酶。用聚乙烯基膦酸使表面的其余部分钝化。由于以上提及的问题，优选的是改为用经氨基官能化的烷基硫醇自组装单层(SAM)修饰金表面(洛夫(Love)等人2005)。其可以容易修饰为NHS酯以便与聚合酶上的氨基连接。通过椭圆对称术或原子力显微术测定层的厚度和均匀性。
开发具有带正电荷的连接子的5'修饰的核苷酸
产生一种系统，其用于使所释放的标签朝孔隙快速扩散而前体核苷酸和DNA被孔隙排斥。使加标签的核苷酸工程化，以便在并入到DNA中之后，从核苷释放的标签具有累计正电荷，而完整标签-核苷酸保持中性。如果根据方法通道带负电荷，那么这允许具体来说通过检测通道对所释放的标签有效地门控(瓦努努等人2007)。因为反应混合物中所存在的不是标签的所有其它游离分子(引物、未反应的核苷酸、模板)都带负电荷，所以仅携载正电荷的释放的标签吸引到通道中，增加检测的特异性并且减少噪声。可以在不同标签上使用不同数目的带电基团，取决于特定核苷酸碱基。因此，标签的累计电荷与其大小一起可以用于进行碱基区别。在并入并且释放标签之后，如果聚磷酸酯被认为掩蔽正电荷，那么其可以使用二级反应(例如固定于孔隙中的第二下游位点处的碱性磷酸酶)来去除。带正电荷的标签可以被门控到带负电荷的通道中以便检测和识别。
扩散和漂移
此测序系统的关键方面是通过相邻纳米孔可靠并且适时捕获每种核苷酸的释放的标签。条件必须被工程化成使得标签快速并且以正确顺序捕获。另外，应该使未并入的标签的捕获率最小化，并且相邻通道的干扰应该是可忽略的。在孔隙入口处产生孔(如图48中所示)帮助此方法，其还取决于聚合酶与纳米孔开口的紧密接近性。纳米孔捕获过程的分析一般来说考虑围绕孔隙的径向对称过程。几何形状指示，在不存在电场下，分子倾向于扩散得较远离孔隙，对抗静电吸引力。在电压梯度下，存在归因于扩散与电泳的分子运动相等所处的临界距离L(格肖等人2007)。此临界距离是离子电流(I)和电解质电导率(σ)以及分析物分子的扩散常数(D)和迁移率(μ)的函数，捕获是统计过程，但在距离L处捕获约50％的分子。此似然性对于更短距离来说增加，并且对于d<L/3超过90％。在此过程期间，分子典型地以约的时间标度捕获。通过使聚合酶位于纳米孔的L/3内，捕获几乎所有分子。还确保，t捕获比聚合酶并入速率显著更快，以按正确顺序捕获碱基。
25单元PEG分子于水中的扩散系数的近似值是D＝3e-10m2/s(岛田(Shimada)等人2005)，其数量级与类似长度ssDNA片段相同(恩科多(Nkodo)等人2001)。假定能斯特-爱因斯坦(Nernst-Einstein)关系的有效性(但对于聚合物来说这不始终正确)，迁移率可以估计为扩散常数和净电荷(Q)的函数，关于这些估计，则在1M KCl中在I＝5nA下，参看下表。
+1e +4e
50％捕获 2.1nm 5.8nm
90％捕获 0.7nm 1.9nm
t捕获 7.1ns 114ns
实例5
制造固态纳米孔的阵列
除了改进的性能之外，仅通过集成电子装置即可能产生大规模平行纳米孔阵列。这涉及图46C中所示的一芯片拓扑，其中纳米孔直接集成到CMOS模具中，射流技术在芯片的任一侧上。用于集成多个孔隙的方法也展示于图46C中。在此情况下，SU-8光阻的孔用以将个别纳米孔彼此隔离。这是类似于罗斯伯格等人2011中的方法的方法。然而，在罗斯伯格等人的方法中，孔仍可以保持由芯片上方的溶液储槽“连接”。在本发明情况下，因为在顺储槽之间需要电隔离，所以如图46C中所示PDMS盖用以密封孔以便在引入试剂之后测量。64个固态纳米集成到同一5mm×5mm模具上。电流集成放大器设计(其可能必须在每个孔隙位点处复制)仅是250μm×150μm，但必须留下额外空间以便制造孔隙本身。随着进一步开发制造技术以减小芯片面积，这可以容易按比例调整到16×16电极的阵列。
实例6
使用磷酸酯加标签的核苷酸和纳米孔检测进行焦磷酸测序
焦磷酸测序是合成测序(SBS)方法，其依赖于对当核苷酸在聚合酶反应中并入到生长DNA链中时释放的焦磷酸酯的检测(罗纳吉(Ronaghi)等人1998)。在此方法中，与酶、底物和常见聚合酶反应组分的混合物一起依序添加四种dNTP中的每一者。如果所添加的核苷酸与模板上的第一可用碱基互补，那么核苷酸将并入并且焦磷酸酯将释放。通过酶级联，所释放的焦磷酸酯转化为ATP，并且然后通过萤火虫荧光素酶转成可见光信号。另一方面，如果所添加的核苷酸不并入，那么将不产生光并且核苷酸将简单地通过酶腺苷三磷酸双磷酸酶降解。焦磷酸测序已经成功地应用于单核苷酸多态性(SNP)检测和DNA测序。开发一种商业测序平台，其中个别微珠子上组合焦磷酸测序与DNA模板扩增以进行高产量DNA测序(马古利斯(Margulies)等人2005)。然而，固有地难以进行焦磷酸测序以测定模板的均聚区(例如一串连续几个T)中并入的核苷酸的数目。除此之外，焦磷酸测序存在仍需要改进的其它方面。举例来说，四种核苷酸中的每一者必须单独地进行添加和检测。当对长DNA模板测序时，未降解的核苷酸和其它组分的积聚也可能会降低方法精确性。
这是修改的焦磷酸测序方法，其依赖于对在聚合酶反应期间释放的标签或标签-磷酸酯的检测。在此方法中，在聚合酶催化的反应中在模板-引物复合物上使用磷酸酯加标签的核苷酸。在并入加标签的核苷酸后，磷酸酯-标签部分被释放，其可以借助于通过纳米孔进行检测。可以在每种核苷酸上使用相同标签或可以使用不同分子量和长度的标签(例如PEG)。已经显示，当通过溶血素纳米孔时，不同长度和质量的聚乙二醇(PEG)可以在单分子灵敏度下分辨(罗伯森等人2009)。
α--溶血素通道可以用以在单分子水平下检测核酸(卡西亚诺维奇等人1996)。所述单体多肽自组装于脂质双层中以形成具有1.5nm直径限制性孔口的七聚孔隙。在离子盐水溶液中，当施加穿过膜的适当电压时，由α--溶血素通道形成的孔隙传导强并且稳定的离子电流。纳米孔的限制性孔口允许直链单链但不允许双链核酸分子(直径约2.0nm)通过。聚阴离子核酸由施加的电场驱动通过孔隙，这阻塞或降低离子电流。此通过产生独特电子签名。因此，将通过单通道记录技术基于特征参数(例如易位电流、易位持续时间和其在图中的相应分布)获得特定事件图(其是易位时间相较于阻塞电流的图)，并且将其用以区别聚核苷酸的长度和组成。选择四种PEG标签(已经显示其在纳米孔中产生不同电流阻塞信号)以与四种核苷酸(A、C、G、T)在末端磷酸酯处结合。这些新颖核苷酸类似物用于聚合酶反应中并且如图33中所示使用纳米孔以检测所释放的标签以便解码所并入的碱基。
此方法存在几个优势：
1)避免使用许多不同酶(节约成本和复杂性)。
2)依序添加单标签连接的核苷聚磷酸酯，或所有四种核苷酸有不同标签与每种核苷酸连接。
3)使用PEG作为可以通过纳米孔在单一单元分辨率下检测的标签。
4)在标签通过纳米孔时进行实时单分子检测测序。
5)大规模平行测序、低成本以及高产量。
如图33中所示，DNA聚合酶固定于纳米孔，并且模板-引物与PEG加标签的核苷酸一起被添加。在并入正确PEG加标签的核苷酸后，所释放的PEG-磷酸酯通过纳米孔并且测量电子阻塞信号。不同长度的PEG具有不同阻塞信号，因此，4种不同PEG可以用于4种不同核苷酸。
可以一次添加一种核苷酸，如果添加正确核苷酸，那么给出不同阻塞信号。然而，如果核苷酸与模板核酸碱基不互补，那么其将不被并入并且因此检测不到信号。以大规模平行方式，可以构筑用以进行生物化学过程的微米/纳米孔的高密度阵列。每个微米/纳米孔固定不同DNA模板和纳米孔装置。所释放的PEG在单分子灵敏度下检测。
用于合成标签标记的核苷-5'-聚磷酸酯的通用方法展示于图49中。末端磷酸酯标记的核苷-5'-三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯可以以相应核苷-5'-三磷酸酯(NTP)为起始物质而合成。因此，三磷酸酯首先用DCC/DMF活化，其可以与标签-亲核试剂直接反应以给出标签连接的NTP或其可以与连接子亲核试剂(标签-NHS或适当活性标签可以与其反应)反应以提供标签-连接子连接的NTP。为了合成标签连接的核苷四磷酸酯(N4P)或五磷酸酯(N5P)，活性三磷酸酯首先分别与磷酸或焦磷酸酯反应以得到四磷酸酯和五磷酸酯，其可以与连接子亲核试剂反应，接着与适当活性标签反应。
PEG标记的核苷酸的合成在上文中在实例2和3中论述。PEG标记的核苷酸基于三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯的使用而具有-3、-4、-5或-6个电荷。在聚合酶催化的引物延伸反应之后，所释放的PEG-标签上的净电荷将比起始PEG-核苷酸少一(-1)，这足以通过纳米孔离子阻塞信号进行区别(未反应的PEG-核苷酸还比所释放的PEG-磷酸酯更庞大，因此具有不同离子阻塞信号)。或者，如果碱性磷酸酶存在于反应混合物中，那么所释放的PEG将是中性的(游离磷酸酯基通过碱性磷酸酶而水解)。还可以如下文所示使得所释放的PEG-标签带正电荷，以便其可以容易通过纳米孔进行检测。类似地，还可以使其带很多负电荷。
合成带正电荷的标签连接的核苷-聚磷酸酯：
如图44中所示合成带正电荷的标签连接的核苷-聚磷酸酯。首先，带正电荷的三甲基-(赖氨酸)n--甘氨酸氨基酸(K((Me)3)n-Gly)与PEG-NHS酯反应，并且然后活化以形成PEG-K((Me)3)n-Gly-NHS酯。此活性酯如图38和44中所示与氨基封端的核苷-聚磷酸酯反应。核苷-四磷酸酯上的净电荷是中性的，但在聚合酶并入之后，所释放的PEG具有+1正电荷，并且如果添加碱性磷酸酶到反应混合物中，那么所释放的PEG上的净电荷是+4。因此，所释放的标签可以借助于通过纳米孔而容易分离并且鉴别。
合成3'封端的PEG连接的核苷-聚磷酸酯以便通过合成与纳米孔检测测序.
3'封端的核苷-聚磷酸酯的合成基本上按照如关于标签连接的核苷-聚磷酸酯所展示的相同途径，但起始核苷-5'-三磷酸酯是3'-O封端的dNTP。如图50中所示，3'-O-叠氮基甲基-dNTP(6)首先与CDI或DCC/DMF反应，接着与磷酸(四磷酸酯)或焦磷酸酯(五磷酸酯)反应。这在用适当亲核试剂纯化之后反应，以提供氨基封端的磷酸酯，其然后与适当PEG-NHS酯(中性、带正电荷或带负电荷)反应，以提供所需的3'O封端-PEG连接的核苷-聚磷酸酯。
PEG-核苷酸和纳米孔检测的测序方案(DNA分子的许多拷贝固定于珠子上，并且依序一次添加一种PEG-核苷酸)。
如图51中所示，DNA分子固定于珠子上。因此，每个珠子具有相同DNA分子的许多拷贝。珠子添加到与纳米孔连接的微米/纳米孔。DNA通过与纳米孔连接或与PEG连接的核苷酸一起添加到微米/纳米孔的DNA聚合酶而形成复合物。可以一次添加一种核苷酸，如果添加正确核苷酸，那么所述核苷酸被并入并且释放PEG-标签，其当通过纳米孔时提供不同阻塞信号。然而，如果核苷酸与模板核酸碱基不互补，那么其将不被并入并且因此检测不到信号。在此情况下，可以在所有四种核苷酸上使用相同长度和分子量的PEG，或必要时还可以使用四种不同PEG。因此，核酸碱基的添加可以容易通过纳米孔阻塞信号在单分子灵敏度下检测。
通过3'-O封端的PEG-核苷酸合成和纳米孔检测来测序(DNA分子的许多拷贝固定于珠子上，并且同时添加所有四种3'-O封端的PEG-核苷酸)。
可以使用此方法对DNA的均聚区正确测序。因此，如果核苷酸的3'-OH基团由可逆部分封端，那么DNA合成将在添加仅一种核苷酸之后停止。合成可以在去除封端基团以产生游离3'-OH基团之后继续。如图52中所示，可以添加所有四种不同大小的PEG连接的3'-O-叠氮基甲基-核苷酸到反应微米/纳米孔中，并且每当并入正确核苷酸时，所释放的PEG-标签借助于通过纳米孔来读取并且检测离子信号。因为3'-OH基团被封端，所以一次仅添加一种核苷酸。此3'-O封端的基团可以通过TECP处理而裂解并且因此游离OH基团准备好进一步核苷酸并入。通过重复的核苷酸加成和裂解，可以正确并且容易地对均聚区测序。
使用纳米孔大规模平行焦磷酸测序：
如图53中所示，以大规模平行方式，可以构筑用以进行生物化学过程的微米孔的高密度阵列。每个微米/纳米孔固定不同DNA模板和纳米孔装置。所释放的PEG在单分子灵敏度下检测。
实验概述：
1)不同大小、长度、分子量、电荷的任何标签与核苷酸的末端磷酸酯连接，其可以在聚合酶并入之后通过纳米孔进行检测。
2)标签与三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯连接。
3)电子检测
4)DNA分子的群组与珠子或固体表面连接，以及单分子检测灵敏度(高密度和高灵敏度)。
5)通过使用标签连接的3'-O封端的核苷酸容易对均聚区测序。
6)每个循环添加一种标签-核苷酸。
7)一起添加所有四种可逆地加标签的核苷酸以便对均聚区测序。
8)高灵敏度、精确性和速度。
9)大规模平行测序。
实例7
使用纳米孔进行的溶液中单分子质量/大小光谱测定
方法
无溶剂的平坦脂质双层膜在25μm厚的铁氟龙隔板(其分隔两个相同铁氟龙腔室)中的约70μm直径孔洞上由二植烷酰基磷脂酰胆碱(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；阿凡提极性脂质(Avanti Polar Lipids),阿拉巴斯特(Alabaster),阿拉巴马州(Ala.))在戊烷(J.T.贝克(J.T.Baker),菲利普斯堡(Phillipsburg),新泽西州(N.J.))中形成。孔洞用1:400体积/体积的十六烷(奥德里奇(Aldrich),圣路易斯(St.Louis),密苏里州(Mo.))于戊烷中的溶液预处理。两个腔室都含有4M KCl(马林克罗特(Mallinckrodt),巴黎(Paris),肯塔基州(Ky.))、5mM 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris；施瓦茨/曼生物技术(Schwarz/Mann Biotech),克利夫兰(Cleveland),俄亥俄州(Ohio))，用浓柠檬酸(福鲁卡(Fluka),布克斯(Buchs),瑞士(Switzerland))调节到pH 7.5。
单通道通过在隔板的一侧上添加约0.25μgα-溶血素(利斯特生物实验室(ListBiological Laboratories),坎贝尔(Campbell),加利福尼亚州(Calif.))到溶液中而形成。在单通道形成之后，第一腔室用新鲜缓冲液快速冲洗以防止进一步通道并入。除非另外规定，否则在-40mV的施加的电势下获得数据，两个Ag/AgCl电极通过维克(Vycor)盐桥(3MKCl)与散状电解质分隔。使用Axopatch 200B膜片钳放大器(分子装置(MolecularDevices),森尼维耳(Sunnyvale),加利福尼亚州)测量电流，并且在10kHz下用四极贝塞尔滤波器滤波，随后在50kHz下数字化。
α-溶血素毒素可以形成具有不同电导水平和门控性质的至少两种构象。此处仅使用较高电导构象，其在±50mV之间具有3.75nS的近似电阻电导(数据未展示)。添加PEG(多分散PEG 1500；福鲁卡；或单分散PEG 1294；保利普雷(Polypure),奥斯陆(Oslo),挪威(Norway))到第二腔室中，从12mg/ml于电解质中的储备溶液到0.045mg/ml的最终浓度。
用Voyager DE-STR(波尔塞普提夫生物系统(PerSeptive Biosystems),弗雷明汉(Framingham),马萨诸塞州(Mass.))通过使用反射器模式获得PEG样品的MALDI-TOF质谱。通过用来自氮激光器的脉冲UV光(337nm)产生解吸附/离子化。仪器通过使用设定在600ns下的提取延迟时间在25kV下以正离子模式操作。从100次撷取平均最终光谱，同时使激光在样品表面上移动，激光功率设定得稍高于每个光谱的外形的阈值。样品由1％wt/wt PEG的蒸馏水溶液制备。基质溶液是1:1乙腈:水，用添加有0.1％氟乙酸(马西森(Matheson),乔利矣特(Joliet),伊利诺斯州(Ill.))的全反式视黄酸(西格玛(Sigma),圣路易斯,密苏里州)使其饱和。样品和基质1:1混合到2μl的总体积，随后进行干燥。
讨论
在不存在分析物下，充分界定由DC电势引起的离子电流。离子电流中的固有噪声可能部分由离子在纳米孔中的布朗运动(Brownian motion)和电阻屏障电容引起。分析物(例如聚(乙二醇))的添加导致电导有界限分明的瞬时降低。每个脉冲可以对应于单一PEG分子于纳米孔中的存在。对于多分散PEG-1500样品(平均分子量约1500g/mol)，电流降低涵盖仅约50皮安的范围。
非电解质聚合物在其分配到脂质双层膜中的单独纳米孔中时导致离子电流有界限分明的降低。通过由无聚合物溶液浸润的α-溶血素通道的离子电流是静态的。多分散PEG(Mr＝1,500g/mol)的添加产生持续电流降低的电导脉冲。
单一纳米孔区分具有不同分子质量的聚合物。由多分散(Mr＝1,500)与单分散(M＝1,294g/mol，n＝29)PEG引起的电导状态之间的差异显而易见。对于多分散和单分散PEG样品，时间序列数据分别含有约500和约700个事件。离子电流的全点直方图反映两种聚合物样品的不同性质。从>105个降低的电导脉冲事件计算每种样品的离子电流直方图。靠近单分散PEG时间序列中的零点的历时长久的小离子电流降低的电导脉冲最可能由PEG样品中的杂质产生。这些事件历时长久但数目极少。
质量或大小光谱的校准可以通过数种技术来实现。举例来说，使用标准大小的分析物重复基于电导的实验允许分配多分散样品的PEG 1294g/mol峰，指示为多分散样品数据。基于电导的直方图中的邻近峰由单一乙二醇单元(即CH2—CH2-O)不同的PEG分子产生。相同多分散PEG样品的基于电导的大小分布与MALDI-TOF质谱的比较展示此方法的精确性。
实例8
使用加标签的聚磷酸核苷酸和纳米孔进行单分子测序
非常需要对单DNA和RNA分子精确测序以用于个体化用药。本文中描述新颖基于纳米孔的合成测序(SBS)策略，其在单分子水平下精确区分最初与每种核苷酸的5'-磷酸酯连接的四种不同大小的标签。在每种核苷酸在聚合酶反应期间并入到生长DNA链中时，其标签通过加标签的核苷酸的α-磷酸酯与前一核苷酸的3'-OH基团之间的磷酸二酯键形成而释放。所释放的标签以其被释放的顺序进入纳米孔，并且归因于其大小、形状和电荷而实现独特离子电流阻塞签名，由此在单分子水平下以单碱基分辨率电子地测定DNA序列。作为一非限制性实例，四种不同长度的PEG-香豆素标签与2'-脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯的末端磷酸酯连接。观测到这些被修饰的核苷酸在聚合酶反应期间的有效并入，并且四种标签之间的比6σ更佳的标签区别基于不同标签降低纳米孔离子电流的程度。此处所述的结合与阵列格式中的纳米孔共价连接的聚合酶的分子方法得到单分子基于纳米孔的SBS平台。
方法
合成香豆素-PEG-dG4P核苷酸类似物
所有核苷酸都通过在150×4.6mm柱(苏佩克(Supelco))上逆相HPLC来纯化，流动相：A，8.6mM Et3N/100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇于水中(pH 8.1)；B，甲醇。如下进行洗脱：100％A等度经10分钟，接着是0-50％B的线性梯度经20分钟，并且然后是50％B等度再经30分钟。
A.合成香豆素-PEGn-dG4P：
如图15中的方案中所示，香豆素-PEGn-dG4P的合成涉及三个步骤。
A.1合成2'-脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(dG4P)：
首先，以2'-dGTP为起始物质来进行2'-dG4P的合成。使300微摩尔2'-dGTP(三乙铵盐)通过使用含1.5mmol(5当量)三丁胺的无水吡啶(5ml)转化为三丁铵盐。将所得溶液浓缩到干燥，并且与5ml无水DMF(×2)共蒸发。将dGTP(三丁铵盐)溶解于5ml无水DMF中，并且添加1.5mmol 1,1-羰基二咪唑。搅拌反应物6小时，之后添加12μl甲醇，并且继续搅拌30分钟。向此溶液中添加1.5mmol磷酸(三丁铵盐，于DMF中)，并且在室温下搅拌反应混合物过夜。
将反应混合物用水稀释，并且在Sephadex-A25柱上使用0.1M到1M TEAB梯度(pH7.5)纯化。dG4P在梯度的末端洗脱。将适当的洗脱份合并，并且通过逆相HPLC进一步纯化，以提供175μmol纯四磷酸酯(dG4P)。31P-NMR:δ,-10.7(d,1P,α-P),-11.32(d,1P,δ-P),-23.23(dd,2P,β,γ-P)；ESI-MS(负离子模式)：计算值587.2；实验值585.9(M-2)。
A.2合成dG4P-庚基-NH2：
向含80μmol dG4P的2ml水和3.5ml 0.2M 1-甲基咪唑-HCl(pH 6)中添加154mgEDAC和260mg二氨基庚烷。用浓HCl将所得溶液的pH调节到6，并且在室温下搅拌过夜。将此溶液用水稀释，并且通过Sephadex-A25离子交换色谱法接着逆相HPLC纯化，以得到约20μmol dG4P-NH2。此由ESI-MS数据(负离子模式)证实：计算值699.1；实验值(698.1,M-1)。
B.合成香豆素-PEG-酸和NHS酯：
可商购的氨基-dPEG-酸(氨基-d(PEG)16、20、24、36-酸；量子生物设计)与6-甲氧基香豆素-NHS酯反应，以提供相应香豆素-(PEG)n-酸。将氨基-PEG-酸(1当量)溶解于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 8.6)中，接着添加含香豆素-NHS(1当量)的DMF，并且搅拌反应混合物过夜。将香豆素-PEG-酸通过硅胶色谱法使用CH2Cl2-MeOH(5-15％)混合物纯化，并且合并适当洗脱份。通过1H NMR和MALDI-TOF MS分析来分析这些化合物。
MALDI-TOF MS数据：
香豆素-PEG16-酸 香豆素-PEG20-酸 香豆素-PEG24-酸 香豆素-PEG36-酸
预期的MW 996 1,172 1,348 1,877
观测的MW* 1,016 1,192 1,368 1,899
*观测的值归因于钠盐的存在的差异。
使香豆素-PEG-酸通过与1.5当量碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)和2当量三乙胺在无水DMF中反应2小时而转化为相应NHS酯。将所得NHS酯(其在硅胶板上稍高于酸地流动)通过硅胶色谱法使用CH2Cl2-MeOH(5-15％)混合物纯化，并且用于下一步骤。
C.香豆素-PEGn-dG4P：
将来自以上步骤A的dG4P-庚基-NH2溶解于0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 8.6)中，并且向此搅拌溶液中添加香豆素-PEG-NHS化合物之一(于DMF中)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，并且然后在硅胶滤筒(含15-25％MeOH的CH2Cl2以去除未反应的香豆素-酸或-NHS，和然后6:4:1异丙醇/NH4OH/H2O)上纯化。将其通过逆相HPLC进一步纯化两次以提供纯香豆素-PEG-dG4P。通过在MALDI-TOF MS上分析来证实结构。香豆素-PEG16-dG4P：滞留时间31.7分钟；香豆素-PEG20-dG4P：滞留时间32.2分钟；香豆素-PEG24-dG4P：滞留时间33.0分钟；香豆素-PEG36-dG4P：滞留时间34.3分钟。
MALDI-TOF MS数据：
使用香豆素-PEGn-dG4P的DNA聚合酶延伸反应：
使用环路的模板-引物(5'-GATCGCGCCGCGCCTTGGCGCGGCGC-3'，M.W.7966)进行延伸反应，其中模板上的下一互补碱基是C，使得通过单个G延伸(图56)。在65℃下在GeneAmpPCR系统9700热循环仪(应用生物系统(Applied Biosystems))中在20μl由以下组成的反应物中进行每个延伸反应25分钟：3μM环路的模板-引物、1×Therminatorγ缓冲液(50mMKCl、20mM Tris-HCl、5mM MgSO4、0.02％IGEPAL CA-630(在25℃下pH 9.2))、2单位的TherminatorγDNA聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))和15μM香豆素-PEG-dG4P核苷酸之一。将DNA延伸产物用乙醇沉淀，通过C18 ZipTip柱(密理博(Millipore))纯化，并且通过MALDI-TOF MS使用ABI Voyager仪器来表征。如图58中所示，获得四种相同产物(预期的分子量8,295)。
重复每种香豆素-PEGn-dG4P的聚合酶延伸反应，并且将产物(香豆素-PEGn-三磷酸酯，图57)用碱性磷酸酶(1U，在37℃下15分钟)处理，以产生香豆素-PEGn-NH2标签。将其萃取到二氯甲烷中并且通过MALDI-TOF-MS分析来表征。
香豆素-PEG-dG4P的酸水解(图57)：
添加乙酸到香豆素-PEG-dG4P核苷酸中到10％的最终浓度，并且剧烈震荡溶液过夜以确保δ磷酸酯与庚胺之间的N-P键水解。将溶液使用CentriVap干燥，并且再悬浮于适当体积的水中。收集1μl等分试样以进行MALDI-TOF质谱表征，并且使用NanoDrop ND-1000分光光度计在260nm和350nm下测量第二等分试样。
如通过MALDI-TOF MS测量，所得香豆素-PEG-胺化合物是预期的大小(参看图16和下表)。
纳米孔测量：
膜和通道形成
将单α-溶血素通道插入到无溶剂的平坦脂质双层膜(BLM)中(蒙塔尔(Montal)等人,1972)，所述膜如先前所述在25μm厚铁氟龙隔板(其间隔开两个电解质溶液孔)中的约80μm直径孔洞上制造。(赖纳等人2010)在整个实验中使用4M KCl、10mM Tris，用柠檬酸滴定到pH 7.2。膜通过以下方式形成：首先用1％v/v十六烷/戊烷润湿隔板。使含10mg/mL二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhyPC)的戊烷在空气-电解质溶液界面处扩散，溶液水平面远低于铁氟龙隔板中的孔洞。在10分钟之后，溶液水平面自发地升高到高于孔洞以形成膜。将约0.5μL的0.5mg/mLα-溶血素注射到与膜紧密相邻的溶液中，并且观测离子电流直到单通道插入到膜中。然后将顺腔室内含物与无蛋白质的电解质溶液交换，以维持单通道。
添加香豆素-PEGn-NH2分子(n＝16、20、24和36)到孔隙的反侧(定义为通道的β-筒管侧)到每种组分0.4μmol/L与1μmol/L之间的最终浓度。在固定电势(-40mV)下记录两个匹配的Ag/AgCl(3M KCl)之间的离子电流约15分钟，以获得充足计数统计。在4极贝塞尔滤波器的情况下在10kHz下记录数据，在50kHz下重复取样。
数据分析
如先前所述用在LabVIEW(国家仪器(National Instruments))中编写的内部程序离线分析数据。(罗得里格斯(Rodrigues)等人2008)简单来说，基于在5σ的开放状态下电流噪声下设定的简单阈值算法用事件检测器定位阻塞。当检测事件时，丢弃上升时间和下降时间(分别约60μs和20μs)中的点。从剩余点计算平均阻塞深度，并且从0.8ms开放通道数据的平均值计算开放通道电流，与阈值间隔开0.2ms。将数据以平均值的比率(<i>/<i开放>)形式报道，并且纳米孔光谱计算为这些值的直方图。
讨论
在1996年，卡西亚诺维奇等人(卡西亚诺维奇等人1996)首先证实了α-溶血素(αHL)通道可用于在单分子层面检测核酸。αHL通道具有1.5nm直径限制性孔口(桑(Song)等人1996；别兹鲁科夫(Bezrukov)等人1996；克拉西尔尼科夫(Krasilnikov)2002；卡西亚诺维奇1995)和其电压依赖性门控可以受控制，使得孔保持无限开放，(卡西亚诺维奇1995)，这使其成为基于纳米孔的检测和区别的理想候选物。个别单链聚阴离子核酸利用外加电场驱动通过孔，且多核苷酸引起孔电导率界限分明的瞬时降低。(卡西亚诺维奇等人1996；韦库特尔等人2001；迪默等人2002；卡西亚诺维奇2004)由于孔中多核苷酸的滞留时间与RNA或DNA轮廓长度成比例，故表明纳米孔可能能够在四种碱基可彼此区分时以自动收报机纸条方式测序DNA。(卡西亚诺维奇等人1996)朝着所述目的，(卡西亚诺维奇1996；卡西亚诺维奇等人2008；卡西亚诺维奇等人2002)孔中具有共价连接的接合体的αHL通道用于鉴别未标记的核苷-5'-单磷酸酯(克拉克等人2009)然而，基于这种概念测序DNA的完整核酸外切酶纳米孔系统尚未有记载。
尽管纳米孔能在单分子层面检测和表征DNA的一些物理性质，但尚未实现通过使单链DNA通过纳米孔进行准确碱基到碱基测序的更苛刻目标。牛津纳米孔技术近来宣布能够以4％的差错率以3碱基分辨率实现纳米孔中的链测序。(AGBT会议，2012)另一组报导用纳米孔进行的单碱基分辨率链测序，但已困难地正确测定均聚物序列。(曼拉奥等人2012)
天然αHL通道具有高分辨率分子区别的固有能力。举例来说，可在水性H+与D+离子之间进行区分，(卡西亚诺维奇等人1995)和罗伯森等人(2007)近来证实通道可以在单体层面容易地分离聚(乙二醇)(PEG)分子。在后者研究中，从由个别PEG分子引起的平均电流估计的分子量或大小谱容易地分辨乙二醇重复单元。另外，聚合物在孔中的平均滞留时间随着PEG质量增加。(罗伯森等人2007；赖纳等人2010)基于这些观察结果和DNA聚合酶可以将在5'-末端磷酸酯基处具有广泛修饰的核苷酸类似物识别为有效底物的事实，(库马尔2005，库马尔2006，库马尔2008；苏德等人2005；艾德等人2009)，发展了一种新颖单分子DNA测序方法，其可通过检测和区别所释放的副产物(例如来自DNA聚合酶反应的不同长度PEG标签，图9)而非核苷酸本身来鉴别个别碱基。
在这种方法中，在聚合酶反应中在磷酸二酯键形成期间，并入的核苷酸中的α-β磷酸酯键裂解释放标签。每一碱基用不同标签的四碱基反应序列的实例展示在图30中。各自具有邻接于一个孔入口的共价连接聚合酶的所述纳米孔(其中一者以图形方式展示在图33中)的阵列允许单分子合成测序(SBS)。每一核苷酸的加入通过所释放的标签对纳米孔电导率的作用来测定。
这种基于5'-磷酸酯标签的SBS系统相较于通过纳米孔测序链提供优点，所述优点在于通过孔的运送速度不再成问题，因为聚合酶延伸和释放速率与通过孔的标记运送时间相比较慢。这还可消除链测序方法固有的定相问题。描述了使用具有四种不同长度PEG和香豆素部分的5'-磷酸酯连接的标签合成和有效并入核苷酸。证实了在单分子层面α-溶血素孔中所释放的标签的四种截然不同的电流阻塞图案，确定了单分子电子SBS方法的可行性。
PEG标记的核苷酸的设计、合成和表征
根据图15中展示的普遍的合成流程合成四种5'-磷酸酯标记的2'-脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(图54)(详情参看上文方法)。首先，将2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸酯(dGTP)转化成2'-脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(dG4P)，并接着将二氨基庚烷连接基团加入到四磷酸酯的末端磷酸酯中，以便连接不同长度PEG标签。在另一组反应中，使6-甲氧基-香豆素N-羟基丁二酰亚胺基酯与具有16、20、24或36乙二醇单元的四种氨基-PEG-COOH分子中的一者反应，产生香豆素-PEGn-COOH分子，其随后转化成相应NHS-酯。这些与dG4P-庚胺(dG4P-NH2)反应以产生四种最终核苷酸类似物，简称为香豆素-PEGn-dG4P(图54)。香豆素部分用于追踪中间物和最终核苷酸类似物的纯化。预期分子的合成通过MALDI-TOF质谱证实(图55)。
香豆素-PEG-dG4P核苷酸用于使用DNA聚合酶的Therminatorγ变异体的聚合酶延伸反应。设计引物-环-模板，其中下一个互补碱基是C，使得dGMP能够加入DNA引物(图56)。香豆素-PEG-三磷酸酯在反应期间释放(图57)。MALDI-TOF-MS证实了，四种dG4P类似物中的每一者确实以100％并入效率给出正确的延伸产物，如由在8,290道尔顿下的峰的外形所示(图58)。在7,966道尔顿下的引物峰不存在表明反应基本上进行到完成。
所有并入均代表香豆素-PEG-dG4P类似物，而非潜在残余dGTP或dG4P，因为分子在HPLC系统中纯化两次，所述HPLC系统以两种化合物之间差10分钟以上的滞留时间有效分离这些分子。为了进一步排除这一可能性，经纯化的香豆素-PEG-dG4P类似物用碱性磷酸酶处理，所述碱性磷酸酶可以将任何污染性三磷酸酯或四磷酸酯降解成游离核苷，且在延伸反应中使用所得HPLC再纯化的香豆素-PEG-核苷酸。重要的是，延伸的链含有无任何修饰的天然核苷酸，允许SBS在延伸长度上继续。
从聚合酶反应释放的标签是香豆素-PEG-三磷酸酯(香豆素-PEG-P3，图57)。为了减少电荷对标签的复杂性，所释放的标签用碱性磷酸酶处理，得到香豆素-PEG-NH2标签，分析其的纳米孔电流阻塞作用。在进一步发展基于纳米孔的SBS系统中，所释放的香豆素-PEG-P3用碱性磷酸酶处理，其如同聚合酶，可以是连接于纳米孔的一个入口，从而产生香豆素-PEG NH2标签，或优化条件以便使用纳米孔来直接检测所释放的带电标签。在本研究中，为了获得大量物质以便通过MALDI-TOF MS和蛋白质纳米孔测试，预期的所释放的标签(香豆素-PEG-NH2)的合成型式是通过酸水解四种香豆素-PEG-核苷酸类似物以裂解聚磷酸酯与庚胺部分之间的P-N键来产生的(图57)。
实例9
通过MALDI-TOF MS表征释放的标签
在HPLC纯化之后，通过MALDI-TOF-MS分析证实了预期的香豆素-PEG-NH2分子(图16)。MALDI-TOF-MS结果指示通过酸水解产生的香豆素-PEG-NH2标签与在碱性磷酸酶处理之后在聚合酶反应期间产生的释放的标签相同。
参考图16，通过得到香豆素-PEG16-NH2的香豆素-PEG16-dG4P、得到香豆素-PEG20-NH2的香豆素-PEG20-dG4P、得到香豆素-PEG24-NH2的香豆素-PEG24-dG4P和得到香豆素-PEG36-NH2的香豆素-PEG36-dG4P的酸水解产生的香豆素-PEG-NH2标签与在用碱性磷酸酶处理之后在聚合酶延伸反应中产生的相应释放的标签相同，如通过MALDI-TOF-MS分析所示。展示了四个单独获得的MS光谱的合成图像。下文展示香豆素-PEG-NH2标签的结构。
实例10
在单分子下区别蛋白质纳米孔中的释放的标签
参考图17，将通过酸水解衍生自四种相当核苷酸的四种香豆素-PEGn-NH2化合物(n＝16、20、24和36)汇集并且稀释于4M KCl、10mM Tris，pH 7.2中以便进行纳米孔测量。左边的时间序列数据指示，当这些PEG标签进入单一α-溶血素离子通道时，其造成具有其大小特征的电流阻塞。右边的展示由个别分子造成的平均电流阻塞的直方图展示具有10kHz测量带宽的基线分辨率。顶部的有色条表示数据的6σ分布(对于可以表示四种DNA核苷酸中的每一者的四种PEG标签中的每一者，假定高斯分布)，这表明此图中通过使用A、C、G和T名称表示的单一碱基可以按比300,000个事件分之1更佳的精确性进行区别，当具有四种不同长度PEG的四种不同核苷酸用于DNA测序时，这可能出现。
为展现电子单分子SBS方法，测试四种释放的香豆素-PEGn-NH2对αHL纳米孔的电流阻塞作用(图17)。阻塞事件直方图的相对频率分布(<i>/<i开放>)展示四种香豆素-PEGn-NH2标签的四个分离很好并且独特的峰(在图17中右下方从左到右分别是n＝36、24、20和16)。
为了突出峰的宽分离，并且为可以通过由具体核苷酸释放的PEG得到的独特阻塞信号来实现对所述核苷酸的检测提供明显证据，用单个高斯函数拟合所述峰并且展示对应6σ误差分布(在图17中右下方的顶部有色矩形)。用孔隙表征单独应用的香豆素-PEG-NH2分子(数据未展示)，其证实此图中所示的PEG相关峰的一致性。
如此处所描述，单个αHL离子通道可以基于单分子的大小对所述分子进行分离，并且容易地分辨PEG的混合物，达到比单个单体单元大小更佳(即<44g/mol)的程度。此高分辨率源自PEG聚合物、电解质(移动阳离子)与沿αHL通道腔排列的氨基酸侧链之间的相互作用。这些相互作用允许孔隙用作对被分析物的大小、电荷和化学性质具有特异性的纳米级传感器。
此处，这类分析扩展到在任一末端具有不同化学基团的PEG。在图17中顶部和左下的单通道离子电流记录一次一种地说明由四种不同尺寸化的香豆素-PEGn-NH2分子造成的阻塞。如同未被修饰的PEG，电流阻塞中的每一者都是单峰(即用高斯分布和界限分明的平均值很好地描述)。
为了在四种碱基(A、C、G和T)之间精确区别以便进行纳米孔测序，需要采用以下策略中的一或多者：1)增强并且区分检测信号的强度；2)开发一种用于辨别并且处理产生的电子阻塞信号的有效方法；3)控制核酸易位通过孔隙的速率，例如减缓用于链测序的DNA移动；以及4)设计并且制造新的并且更有效的合成纳米孔。如此处所展现，将分辨个别碱基的问题转变为在四种独特标签之间进行区别的问题基本上解决前三个问题。
此处展现一种通过对四种核苷酸的末端磷酸部分进行修饰来增强对其的区别的新颖方法。库马尔等人首先报导对核苷-5'-三磷酸酯的改质，其通过引入更多磷酸酯基以产生四磷酸酯和五磷酸酯并且将染料直接引入到末端磷酸酯，或使连接子在末端磷酸酯与染料之间连接来进行。(库马尔等人2006,2008)展示四磷酸酯和五磷酸酯是更佳的DNA聚合酶底物，并且荧光团标记的磷酸酯核苷酸已经广泛用于DNA测序。(库马尔等人2005；苏德等人2005；艾德等人2009；西姆斯(Sims)等人2011)
示意性地展示在图33中的单分子纳米孔SBS系统描绘紧密接近纳米孔入口结合的DNA聚合酶和待测序的模板与引物一起被添加。向此模板-引物复合物中一起添加四种不同地加标签的核苷酸。在聚合酶催化正确核苷酸并入之后，释放标签连接的聚磷酸酯并且穿过纳米孔以产生电流阻塞信号，进而鉴别所添加的碱基。每种标签由于不同大小、质量或电荷而产生不同电子阻塞签名。
可以进一步调节标签的物理和化学特性以优化捕获效率和测量精确性。举例来说，在聚磷酸酯与PEG之间插入由四个赖氨酸或精氨酸组成的带正电连接子产生具有中性电荷的前驱体并且释放具有净正电荷的标签。使用适当的电势量级和正负号，通过孔隙输送所释放的标签，而非核苷酸底物。
底物与产物的进一步区别可以通过在每个纳米孔的轮缘处邻接于聚合酶掺杂若干共价连接的碱性磷酸酶分子来达成，这确保标签上的正电荷甚至更高。重要的是以恰当顺序维持聚合酶反应中释放的每一个标签。因此，因为两种酶的类似周转速率，每一个聚合酶分子需要若干磷酸酶。
尽管使用所有这些防护，但一些未反应得核苷酸可以进入孔隙。因此，在裂解的标签和未反应的核苷酸之间的区别能力至关重要；其应容易地因其明显大小和电荷差异而区分，这是纳米孔系统的固有能力。
本文所描述的方法可以应用于蛋白质纳米孔(例如αHL、耻垢分枝杆菌孔蛋白A)(达灵顿等人2010)或固态纳米孔。(高劳伊(Garaj)等人2010；霍尔等人2010；莫禅特(Merchant)等人2010；施奈德(Schneider)等人2010；斯多姆等人2005；瓦努努等人2008年)这些策略提供适合于检测标签库的具有不同特性的纳米孔。为了实施用于DNA测序的此新颖策略，可以在平坦表面上构筑大量纳米孔37以促进大规模平行DNA测序。
总之，展现在用于聚合酶反应的核苷酸底物上具有新颖可释放标签优点的基于SBS和纳米孔的单分子DNA测序平台。此类平台能够长时间精确读数并且以极高处理量进行电子单分子DNA测序。
实例11
合成香豆素-PEG-dG4P核苷酸类似物
所有核苷酸都通过在150×4.6mm柱(苏佩克(Supelco))上逆相HPLC来纯化，流动相：A，8.6mM Et3N/100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇于水中(pH 8.1)；B，甲醇。如下进行洗脱：100％A等度经10分钟，接着是0-50％B的线性梯度经20分钟，并且然后是50％B等度再经30分钟。
合成香豆素-PEGn-dG4P：
如图15中的方案中所示，香豆素-PEGn-dG4P的合成涉及三个步骤。
A.1合成2'-脱氧鸟苷-5'-四磷酸酯(dG4P)：
首先，以2'-dGTP为起始物质来进行2'-dG4P的合成。使300微摩尔2'-dGTP(三乙铵盐)通过使用含1.5mmol(5当量)三丁胺的无水吡啶(5ml)转化为三丁铵盐。将所得溶液浓缩到干燥，并且与5ml无水DMF(×2)共蒸发。将dGTP(三丁铵盐)溶解于5ml无水DMF中，并且添加1.5mmol 1,1-羰基二咪唑。搅拌反应物6小时，之后添加12μl甲醇，并且继续搅拌30分钟。向此溶液中添加1.5mmol磷酸(三丁铵盐，于DMF中)，并且在室温下搅拌反应混合物过夜。
将反应混合物用水稀释，并且在Sephadex-A25柱上使用0.1M到1M TEAB梯度(pH7.5)纯化。dG4P在梯度的末端洗脱。将适当的洗脱份合并，并且通过逆相HPLC进一步纯化，以提供175μmol纯四磷酸酯(dG4P)。31P-NMR:δ,-10.7(d,1P,α-P),-11.32(d,1P,δ-P),-23.23(dd,2P,β,γ-P)；ESI-MS(负离子模式)：计算值587.2；实验值585.9(M-2)。
A.2合成dG4P-庚基-NH2：
向含80μmol dG4P的2ml水和3.5ml 0.2M 1-甲基咪唑-HCl(pH 6)中添加154mgEDAC和260mg二氨基庚烷。用浓HCl将所得溶液的pH调节到6，并且在室温下搅拌过夜。将此溶液用水稀释，并且通过Sephadex-A25离子交换色谱法接着逆相HPLC纯化，以得到约20μmol dG4P-NH2。此由ESI-MS数据(负离子模式)证实：计算值699.1；实验值(698.1，M-1)。
B)合成香豆素-PEG-酸和NHS酯：
可商购的氨基-dPEG-酸(氨基-d(PEG)16、20、24、36-酸；量子生物设计)与6-甲氧基香豆素-NHS酯反应，以提供相应香豆素-(PEG)n-酸。将氨基-PEG-酸(1当量)溶解于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 8.6)中，接着添加含香豆素-NHS(1当量)的DMF，并且搅拌反应混合物过夜。将香豆素-PEG-酸通过硅胶色谱法使用CH2Cl2-MeOH(5-15％)混合物纯化，并且合并适当洗脱份。通过1H NMR和MALDI-TOF MS分析来分析这些化合物。
MALDI-TOF MS数据：
香豆素-PEG16-酸 香豆素-PEG20-酸 香豆素-PEG24-酸 香豆素-PEG36-酸
预期的MW 996 1,172 1,348 1,877
观测的MW* 1,016 1,192 1,368 1,899
*观测的值归因于钠盐的存在的差异。
使香豆素-PEG-酸通过与1.5当量碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)和2当量三乙胺在无水DMF中反应2小时而转化为相应NHS酯。将所得NHS酯(其在硅胶板上稍高于酸地流动)通过硅胶色谱法使用CH2Cl2-MeOH(5-15％)混合物纯化，并且用于下一步骤。
C)香豆素-PEGn-dG4P：
将来自以上步骤A的dG4P-庚基-NH2溶解于0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 8.6)中，并且向此搅拌溶液中添加香豆素-PEG-NHS化合物之一(于DMF中)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，并且然后在硅胶滤筒(含15-25％MeOH的CH2Cl2以去除未反应的香豆素-酸或-NHS，和然后6:4:1异丙醇/NH4OH/H2O)上纯化。将其通过逆相HPLC进一步纯化两次以提供纯香豆素-PEG-dG4P。通过在MALDI-TOF MS上分析来证实结构。香豆素-PEG16-dG4P：滞留时间31.7分钟；香豆素-PEG20-dG4P：滞留时间32.2分钟；香豆素-PEG24-dG4P：滞留时间33.0分钟；香豆素-PEG36-dG4P：滞留时间34.3分钟。
MALDI-TOF MS数据：
实例12
通过MALDI-TOF MS表征释放的标签
在HPLC纯化之后，通过MALDI-TOF-MS分析证实了预期的香豆素-PEG-NH2分子(图16)。MALDI-TOF-MS结果指示通过酸水解产生的香豆素-PEG-NH2标签与在碱性磷酸酶处理之后在聚合酶反应期间产生的释放的标签相同。
参考图16，通过得到香豆素-PEG16-NH2的香豆素-PEG16-dG4P、得到香豆素-PEG20-NH2的香豆素-PEG20-dG4P、得到香豆素-PEG24-NH2的香豆素-PEG24-dG4P和得到香豆素-PEG36-NH2的香豆素-PEG36-dG4P的酸水解产生的香豆素-PEG-NH2标签与在用碱性磷酸酶处理之后在聚合酶延伸反应中产生的相应释放的标签相同，如通过MALDI-TOF-MS分析所示。展示了四个单独获得的MS光谱的合成图像。右边展示香豆素-PEG-NH2标签的结构。
实例13
在单分子下区别蛋白质纳米孔中的释放的标签
参考图17，将通过酸水解衍生自四种相当核苷酸的四种香豆素-PEGn-NH2化合物(n＝16、20、24和36)汇集并且稀释于4M KCl、10mM Tris，pH 7.2中以便进行纳米孔测量。左边的时间序列数据指示，当这些PEG标签进入单一α-溶血素离子通道时，其造成具有其大小特征的电流阻塞。右边的展示由个别分子造成的平均电流阻塞的直方图展示具有10kHz测量带宽的基线分辨率。顶部的有色条表示数据的6σ分布(对于可以表示四种DNA核苷酸中的每一者的四种PEG标签中的每一者，假定高斯分布)，这表明此图中通过使用A、C、G和T名称表示的单一碱基可以按比300,000个事件分之1更佳的精确性进行区别，当具有四种不同长度PEG的四种不同核苷酸用于DNA测序时，这可能出现。
为展现电子单分子SBS方法，测试四种释放的香豆素-PEGn-NH2对αHL纳米孔的电流阻塞作用(图17)。阻塞事件直方图的相对频率分布(<i>/<i开放>)展示四种香豆素-PEGn-NH2标签的四个分离很好并且独特的峰(在图17中右下方从左到右分别是n＝36、24、20和16)。
为了突出峰的宽分离，并且为可以通过由具体核苷酸释放的PEG得到的独特阻塞信号来实现对所述核苷酸的检测提供明显证据，用单个高斯函数拟合所述峰并且展示对应6σ误差分布(在图17中右下方的顶部有色矩形)。用孔隙表征单独应用的香豆素-PEG-NH2分子(数据未展示)，其证实此图中所示的PEG相关峰的一致性。
如此处所描述，单个αHL离子通道可以基于单分子的大小对所述分子进行分离，并且容易地分辨PEG的混合物，达到比单个单体单元大小更佳(即<44g/mol)的程度。此高分辨率源自PEG聚合物、电解质(移动阳离子)与沿αHL通道腔排列的氨基酸侧链之间的相互作用。这些相互作用允许孔隙用作对被分析物的大小、电荷和化学性质具有特异性的纳米级传感器。
此处，这类分析扩展到在任一末端具有不同化学基团的PEG。在图17中顶部和左下的单通道离子电流记录一次一种地说明由四种不同尺寸化的香豆素-PEGn-NH2分子造成的阻塞。如同未被修饰的PEG，电流阻塞中的每一者都是单峰(即用高斯分布和界限分明的平均值很好地描述)。
实例14
标签的检测
装置用于检测4种不同标签分子的4种独特电流水平。如图19中所见，标签中的每一者可以与其他三种中的任一者进行区别(即直方图显示在图解中以对应标签标记的四个独特峰)。
每种标签分子都是长度为约30个碱基、在3'端生物素化并且链中2个区域可能被修饰的的均聚物“T”。在每种30个碱基长的分子中，被修饰的区域是：从3'端开始碱基位置11、12和13以及位置17、18和19。如此处所使用的，“x”是无碱基位点(没有基质)并且“T”是胸腺嘧啶。四种标签是：
(a)具有序列抗生蛋白链菌素-生物素-10T-xxx-3T-xxx-11T的假标签XXX-XXX
(b)具有序列抗生蛋白链菌素-生物素-10T-TTT-3T-xxx-11T的假标签TTT-XXX
(c)具有序列抗生蛋白链菌素-生物素-30T的30T标签
(d)具有序列抗生蛋白链菌素-生物素-10T-TTT-3T-T-IfluorT-T-11T的假标签iFluorT，其中位置18处的T由荧光素标记。
结果是针对从溶液中捕获多个分子的阵列中的一个孔隙随时间的变化。检测条件是1M KCl，用20mM HEPES缓冲，在室温下pH 7.5。每个分子在施加电压的同时被捕获和保持在孔隙中。将施加电压增加到+160mV，捕获新的分子，将电压降低到0V以下并且加标签的分子掉出孔隙。然后重复循环。四种不同标签分子同时处于样品混合物中。
如图20所示，曲线图的横轴是时间(以秒为单位测量)对比纵轴上的电流(以皮安(pA)为单位测量)。未展示所施加电压的波形。所施加电压的波形从0V以下开始并且快速增加到+160mV，并且在此处保持约2.3秒。然后使电压逐渐下降到0V以下。电流读数与施加电压相仿，其中所捕获分子的电流在施加电压为+160mV的同时是平坦的并且然后随着电压逐渐下降而逐渐下降。
如图19中所示，在施加160mV期间所见的清晰条带在直方图中变为连接或稍微模糊，这是因为也绘制了在逐渐下降期间的电流。尽管如此，每种标签分子都可见独特的可重复捕获的条带。
根据前文应理解，虽然已经展示和描述了具体实施例，但可以对其进行各种修改并且所述修改涵盖于本文中。也不希望本发明受说明书内提供的特定实例限制。虽然已经参考上述说明书描述本发明，但本文中的优选实施例的描述和说明并不打算以限制意义理解。此外，应理解，本发明的所有方面都不限于本文中阐述的特定描绘、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。本发明的实施例的形式和细节的各种修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。因此预期，本发明也应涵盖任何所述修改、变型和等效物。预期，以上权利要求界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
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39.居J.(Ju,J.),金D.H.(Kim,D.H.),毕L.(Bi,L.),孟Q.(Meng,Q.),毕X.(Bi,X.),李Z.(Li,Z.),李X.(Li,X.),马尔玛M.S.(Marma,M.S.),顺迪S.(Shundi,S.),吴J.(Wu,J.),爱德华兹J.R.(Edwards,J.R.),罗穆A.(Romu,A.)和图罗N.J.(Turro,N.J.)使用可裂解荧光核苷酸可逆终止子的四色DNA合成测序(Four-color DNA sequencing bysynthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators).美国国家科学院院刊2006,103(52),19635-19640。
40.卡西亚诺维奇J.J.和别兹鲁科夫S.M.(Bezrukov,S.M.)来自pH依赖性电流波动的频谱分析的α-毒素离子通道的质子化动力学(Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent currentfluctuations).生物物理学杂志(Biophys J)69,94-105(1995)。
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42.卡西亚诺维奇J.J.,亨利克森S.E.(Henrickson,S.E.),维塔尔H.H.(Weetall,H.H.)和罗伯森B.(Robertson,B.)使用纳米规模孔的同步多分析物检测(Simultaneousmultianalyte detection with a nanometer-scale pore).分析化学(Anal Chem)73,2268-72(2001)。
43.卡西亚诺维奇J.J.等人DNA穿过纳米孔的物理学和应用于同步多分析物传感(Physics of DNA threading through a nanometer pore and applications tosimultaneous multianalyte sensing).约束聚合物的结构和动力学(Structure andDynamics of Confined Polymers),卡西亚诺维奇J.J.,克勒迈尔M.S.Z.(Kellemayer,M.S.Z.)和迪默D.W.(Deamer,D.W.)编,Nato科学系列(Nato Science Series),克卢沃学术出版社(Kluwer Academic Publishers),荷兰(The Netherlands)87,141-64(2002)。
44.卡西亚诺维奇J.J.纳米规模孔隙：DNA表征和分析物检测的潜在应用(Nanometer-scale pores:potential applications for DNA characterization andanalyte detection).疾病标记(Disease Markers)2003,18,185-191。
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46.克拉其J.(Korlach,J.)等人零模式波导纳米结构中单个DNA聚合酶分子的靶向固定的选择性铝钝化(Selective aluminum passivation for targetedimmobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguidenanostructures).美国国家科学院院刊105,1176-81(2008)。
47.克拉其J.(Korlach,J.)等人来自单个聚合酶分子的实时DNA测序(Real-timeDNA sequencing from single polymerase molecules).酶学方法(Methods Enzymol)472,431-55(2010)。
48.克拉西尔尼科夫O.V.(Krasilnikov,O.V.)用中性聚合物确定通道大小(Sizing channels with neutral polymers).约束聚合物的结构和动力学,卡西亚诺维奇J.J.,克勒迈尔M.S.Z.和迪默D.W.编,Nato科学系列,克卢沃学术出版社,荷兰87,97-116(2002)。
49.库马尔S(Kumar,S)和苏德A.(Sood,A.)标记的核苷聚磷酸酯(LabeledNucleoside Polyphosphates).美国专利7,041,812(2006)。
50.库马尔S.(Kumar,S.),麦克杜格尔M.(McDougall,M.),苏德A.(Sood,A.),纳尔逊J.(Nelson,J.),富勒C.(Fuller,C.),麦克林J.(Macklin,J.)和米齐斯P.(Mitsis,P.)具有新连接子的末端磷酸盐标记的核苷酸(Terminal-Phosphate-Labeled Nucleotideswith New Linkers).美国专利7,393,640(2008)。
51.库马尔S.,苏德A.,韦格纳J.(Wegener,J.),芬P.(Finn,P.),楠帕利S.(Nampalli,S.),纳尔逊J.,谢卡尔A.(Sekher,A.),米齐斯P.,麦克林J.(Macklin,J.)和富勒C.W.(Fuller,C.W.)末端磷酸酯标记的核苷酸：合成、应用和连接子对通过DNA聚合酶并入的作用(Terminal Phosphate Labeled Nucleotides:Synthesis,Applications andLinker effect on incorporation by DNA Polymerases).核苷、核苷酸和核酸(Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids)(2005)24(5-7),401-408。
52.李S.E.(Lee S.E.),西多罗夫A.(Sidorov A.),古兰T.(Gourlain T.),米涅N.(Mignet N.),索普S.J.(Thorpe S.J.),布瑞泽尔J.A.(Brazier J.A.),迪克曼M.J.(Dickman M.J.),霍恩比D.P.(Hornby D.P.),格拉斯比J.A.(Grasby,J.A.)和威廉姆斯D.M.(Williams,D.M.)增强核酸的催化组库：连接子长度和刚性的系统研究(Enhancingthe catalytic repertoire of nucleic acids:a systematic study of linker lengthand rigidity).核酸研究(Nucleic Acids Research)2001,29(7),1565-1573。
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97.瓦努努M.(Wanunu,M.)等人使用薄纳米孔传感器的探针特异性微RNA的快速电子检测(Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thinnanopore sensors).自然·纳米技术5,807-14(2010)。
98.怀特R.J.(White,R.J.)等人分离脂质双层膜和玻璃负载物的水层的离子导电性(Ionic conductivity of the aqueous layer separating a lipid bilayermembrane and a glass support).朗缪尔22,10777-83(2006)。
99.怀特R.J.等人使用玻璃纳米孔膜的单离子通道记录(Single ion-channelrecordings using glass nanopore membranes).美国化学会志129,11766-75(2007)。
100.维尔曼K.(Wiehelman,K.)双金鸡纳酸蛋白质分析的研究：鉴别负责形成颜色的基团(Investigation of the bicinchoninic acid protein assay:identificationof the groups responsible for color formation).分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)175(1988)。
101.杨T.L.(Yang,T.L.),巴雷什尼科娃O.K.(Baryshnikova,O.K.),毛H.B.(Mao,H.B.),荷登M.A.(Holden,M.A.)和克里默P.S.(Cremer,P.S.)研究流体支撑磷脂膜上的二价抗体结合：半抗原密度的作用(Investigations of bivalent antibody binding onfluid-supported phospholipid membranes:The effect of hapten density).美国化学学会杂志125,4779-4784(2003)。
102.殷P.(Yin,P.)具有小跨膜肽离子通道的系栓双层膜传感器-近来发展、未来研究和潜在应用(Tethered Bilayer Membrane Sensors with Small TransmembranePeptide Ion Channels-Recent Developments,Future Research and PotentialApplications).平面脂质双层和脂质体的进展(Advances in Planar Lipid Bilayersand Liposomes),第2卷(奥塔瓦-莱曼诺瓦A.(Ottova-Leitmannova,A.)编)49-76(学术出版社(Academic Press),2005)。
103.韦库特尔W.(Vercoutere,W.),文特斯-希尔特S.(Winters-Hilt,S.),奥而森H.(Olsen,H.),迪默D.(Deamer,D.),豪斯勒D.(Haussler,D.)和阿克松M.(Akeson,M.)使用离子通道以单核苷酸分辨率在个别DNA发夹分子中快速辨别(Rapid discriminationamong individual DNA hairpin molecules at single-nucleotide resolution usingan ion channel).自然·生物技术2001,19,248-252。
序列表
<110> 纽约哥伦比亚大学理事会
由商务部长代表的美国政府
静月·居
希尔·库玛尔
传娟·陶
民辰·钱
詹姆斯·J·拉索
约翰·J·卡希恩沃维奇
约瑟夫·W·F·罗伯森
<120> 纳米孔的制备方法和其用途
<130> 0575/84043-A-PCT/JPW/VA
<140> PCT/US2013/035635
<141> 2013-04-08
<150> 61/781,353
<151> 2013-03-14
<150> 61/662,330
<151> 2012-06-20
<150> 61/662,329
<151> 2012-06-20
<150> 61/662,334
<151> 2012-06-20
<150> 61/621,981
<151> 2012-04-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer
<400> 1
gatcgcgccg cgccttggcg cggcgc 26

Claims (15)

1.一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中n是1、2、3或4，并且其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述标签上的所述电荷的量级与所述化合物的所述其余部分上的所述电荷的量级相同。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述标签包含多个乙二醇单元。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的化合物，其中所述标签包含16、20、24或36个乙二醇单元。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的化合物，其中所述标签包含另一可鉴别部分。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述另一可鉴别部分是基于香豆素的染料。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的化合物，其中所述标签具有正电荷。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的化合物，其中所述标签的去除改变所述化合物的电荷。
9.根据权利要求1到7中任一项所述的化合物，其中所述标签进一步包含适当数目的赖氨酸或精氨酸以平衡磷酸酯的数目。
10.一种组合物，其包含四种不同的化合物，各种具有以下结构：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合，其中R1是OH，其中R2是H或OH，其中X是O、NH、S或CH2，其中Z是O、S或BH3，其中n是1、2、3或4，其中所述标签的电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一此类化合物的碱基是腺嘌呤或其类似物，第二此类化合物的碱基是鸟嘌呤或其类似物，第三此类化合物的碱基是胞嘧啶或其类似物，并且第四此类化合物的碱基是胸嘧啶或其类似物或尿嘧啶或其类似物，并且其中每种此类不同的的化合物上的标签不同于所述三种其它此类不同的化合物中的每一者上的标签。
11.根据权利要求10所述的组合物，其进一步包含第五不同的化合物，其在所述碱基方面和在所述标签方面不同于所述四种其它不同的化合物中的每一者，其中如果所述第四此类化合物的所述碱基是胸嘧啶或其类似物，那么第五此类化合物的碱基是尿嘧啶或其类似物，或其中如果所述第四此类不同的化合物的所述碱基是尿嘧啶或其类似物，那么此类第五化合物的所述碱基是胸嘧啶或其类似物。
12.一种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借助于纳米孔进行检测的标签。
13.根据权利要求12所述的核苷酸，其中所述标签与所述核苷酸的5'-磷酸酯连接。
14.根据权利要求12所述的核苷酸，其中所述标签不是荧光团。
15.根据权利要求12所述的核苷酸，其中所述标签可通过其电荷、形状、大小或其任何组合而检测。
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