CN113574388A - 不使用电极的纳米孔单分子分析物检测 - Google Patents

Abstract

一种用于识别分析物的无电极的系统，该系统基于对由化学梯度驱动的通过纳米孔的离子流动的光学测量，以及一种通过使用该系统用于识别分析物的方法。一种用于平行识别不同分析物的无电极的纳米孔阵列、一种通过使用该阵列识别不同分析物的方法以及一种生产该阵列的方法。

Description

不使用电极的纳米孔单分子分析物检测

技术领域

本发明涉及一种使用蛋白质纳米孔识别分析物的方法。

背景技术

自然跨膜转运由不同的膜转运蛋白辅助[l]。转运的溶质，诸如小离子[2]、水[3]、糖[4]或甚至遗传物质[5]等，对于调节不同的细胞活动至关重要。尽管详细的转运机制各不相同[6]，但在通道移位过程中可以报告单分子身份这一事实构成了纳米孔测序作为仿生方法的基本基础[7,8]。据报道，已从平面脂质膜[9]、液滴界面双层(DIB)[10]、水凝胶界面双层[11]、合成固态膜[12]、玻璃纳米移液管[13]或细胞膜[14]进行纳米孔传感。然而，改编自电生理学的核心设置自1996年[9]首次出现以来一直保持不变。

在电生理学过程中，Ag/AgCl电极对用于施加跨膜电位，从而驱动Cl^-和带电分析物的持续电迁移。它还用于记录用于单分子识别的离子电流波动(图1a)。在无电极的情况下，尽管离子穿过纳米孔的振动热扩散在两个方向上都存在，但由于电中性规则，整个含电解质空间内的离子净流量和电场严格为零(图1b)[15]。

电生理测量提供了相当好的时间(～10μs)和幅度分辨率(<0.1pA)[16]，满足基于单通道记录的应用的需求，但具有通量方面的不足[17]。尽管在纳米孔测序和药物筛选中迫切需要，但无法在不牺牲成本或装置尺寸的情况下实现100万个通道的同时读取[17,18]。因此，这种迫切需求促使我们重新思考一种简化的高通量通道记录策略，这可能进一步从仿生学中获得。

当宿主细胞保持完整时，细菌噬菌体T4通过通道蛋白注入其基因组DNA[19]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)α-溶血素(α-HL)导致靶细胞溶血是由于营养物质通过插入的通道的被动泄漏[20]。这些从自然进化中获得的自发分子转运提醒我们，外部电子器件对于分子转运并不是必不可少的。剩下的挑战是如何在没有电连接的情况下获取纳米孔传感信号。

光学单通道记录(oSCR)的最新进展[21-25]展示了一种替代策略，该策略光学监测通过嵌入液滴界面双层(DIB)的单个纳米孔的Ca²⁺流动(图1c)[21,23]。尽管oSCR在高通量测量中具有优势，但仍利用一对电极以电泳方式驱动Ca²⁺通过纳米孔的持续流动[23]。手动将电极插入水性液滴中，这需要精细的显微操作技能，并可能导致双层破裂的高风险[23]，阻碍其在学术研究和工业应用中的广泛应用。

发明内容

本发明提供了用于识别分析物的系统，该系统基于对由化学梯度驱动的通过纳米孔的离子流动的光学测量。本发明还提供了使用该系统识别分析物的方法，包括识别小分子或DNA(诸如dsDNA或ssDNA)的方法。

在本发明的一个方面，提供了一种用于识别分析物的无电极的系统，所述系统包括：

(a)第一隔室(compartment)，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质(ionic species)结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的离子物质；和

(c)膜，其分隔所述第一隔室和所述第二隔室；

其中所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜具有至少一个插入的纳米孔，使得所述第一隔室和所述第二隔室通过所述纳米孔连接；

其中在所述第一隔室和所述第二隔室之间存在所述离子物质的化学梯度，其可以驱动所述离子物质通过所述纳米孔从所述第二隔室扩散到第一隔室。

在一些实施方式中，所述膜是固体膜。

在一些实施方式中，所述膜是半透膜。

在一些实施方式中，所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度(osmolarity)高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度(osmolality)高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

在一些实施方式中，所述半透膜是由两亲分子组成的双层

在一些实施方式中，所述两亲分子是脂质。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂(prenollipids)、糖脂质(saccharolipids)、聚酮、磷脂、糖脂(glycolipids)和胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

在一些实施方式中，所述第一隔室由水性液滴提供。

在一些实施方式中，所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

在一些实施方式中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素(aerolysine)、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道。

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

在一些实施方式中，所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru^{3 +}、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

在一些实施方式中，所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUMGreen-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante PotassiumGreen-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1Mg、AsanteMagnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

在一些实施方式中，所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

在一些实施方式中，所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

在一些实施方式中，所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

在一些实施方式中，所述系统进一步包括用于照明的光源和用于检测荧光的光传感器；优选地，所述光源是激光、LED、卤素灯、氙气灯；优选地，所述光传感器是CCD、sCMOS传感器、光电二极管；更优选地，所述光传感器是EMCCD或雪崩光电二极管(APD)。

在一些实施方式中，所述系统进一步包括用于全内反射荧光(TIRF)、宽视场荧光显微术或共焦显微术的装置。

在一些实施方式中，所述第一水溶液或所述第二水溶液包括所述分析物。

在一些实施方式中，所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

在一些实施方式中，所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

在本发明的另一方面，提供了一种识别分析物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供上述系统中的任一个，其中在所述第一隔室或所述第二隔室中提供所述分析物；

(b)将能够激发所述荧光报告分子的光施加到所述第一隔室中邻近所述纳米孔的区域；

(c)测量来自所述荧光报告分子的荧光信号以识别所述分析物。

在本发明的另一方面，提供了一种生产无电极的系统的方法，包括：

提供第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

提供第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的离子物质；

将所述第一隔室和所述第二隔室在含有两亲分子的疏水介质中放在一起，使得在所述第一隔室和所述第二隔室之间形成具有插入的纳米孔的半透膜；

其中在所述第一水溶液或所述第二水溶液中提供蛋白质纳米孔。

在一些实施方式中，所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

在一些实施方式中，所述半透膜是由两亲分子组成的双层。

在一些实施方式中，所述两亲分子是脂质。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

在一些实施方式中，所述第一隔室由水性液滴提供。

在一些实施方式中，所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

在一些实施方式中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道。

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

在一些实施方式中，所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru^{3 +}、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

在一些实施方式中，所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUMGreen-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante PotassiumGreen-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1Mg、AsanteMagnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

在一些实施方式中，所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

在一些实施方式中，所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

在一些实施方式中，所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

在一些实施方式中，分析物在所述第一水溶液或所述第二水溶液中提供。

在一些实施方式中，所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

在一些实施方式中，所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

在本发明的另一方面，提供了一种用于识别多种分析物的无电极的纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包括平行的多个系统并且每个系统包括：

(a)第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的离子物质；和

(c)膜，其分隔所述第一隔室和所述第二隔室；

其中在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜具有至少一个插入的纳米孔，使得所述第一隔室和所述第二隔室通过每个系统中的纳米孔连接；

其中在每个系统中，在所述第一隔室和所述第二隔室之间存在所述离子物质的化学梯度，其可以驱动所述离子物质通过所述纳米孔从所述第二隔室扩散到第一隔室；

其中所述多个系统被配置成使得可以区分每个系统的测量荧光。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室系统之间的所述膜是固体膜。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜是半透膜。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

在一些实施方式中，所述半透膜是由两亲分子组成的双层。

在一些实施方式中，所述两亲分子是脂质。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

在一些实施方式中，所述多个系统的所述第一隔室彼此分开。

在一些实施方式中，每个系统的所述第一隔室由水性液滴提供。

在一些实施方式中，所述多个系统的所述第二隔室是单个隔室。

在一些实施方式中，每个系统的所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

在一些实施方式中，所述多个系统的所述第二隔室由单个水凝胶层提供。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

在一些实施方式中，在每个系统中，其中所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、AsantePotassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

在一些实施方式中，所述阵列进一步包括用于照明的光源和用于检测荧光的光传感器；优选地，所述光源是激光、LED、卤素灯、氙气灯；优选地，所述光传感器是CCD、sCMOS传感器、光电二极管；更优选地，所述光传感器是EMCCD或雪崩光电二极管(APD)。

在一些实施方式中，所述阵列进一步包括用于全内反射荧光(TIRF)、宽视场荧光显微术或共焦显微术的装置。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述第一水溶液或所述第二水溶液包括所述分析物。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

在一些实施方式中，不同的分析物被物理上分开到各种系统中。

在一些实施方式中，所述纳米孔阵列中所述系统的密度为10-1000个/mm²，

在一些实施方式中，由所述多个系统提供的总面积为1-100mm²。

在一些实施方式中，所述多个系统的数量为4-1,000,000个；优选地，所述多个系统的数量为10-1000个。

在本发明的另一方面，提供了一种用于识别多种分析物的多重方法，所述方法包括：

(a)提供上述纳米孔阵列中的任一种，其中在所述纳米孔阵列的各种系统中提供两种或更多种分析物；

(b)将能够激发所述第一隔室中各自包含的所述荧光报告分子的光信号施加到多个第一隔室中邻近所述纳米孔的区域；

(c)测量来自每个系统中包含的所述荧光报告分子的多个荧光信号以识别多种分析物。

在本发明的另一方面，提供了一种生产无电极的纳米孔阵列的方法，所述方法包括：

提供多个水性液滴，其中所述水性液滴各自包括第一水溶液，所述第一水溶液包括蛋白质纳米孔、分析物和当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

提供水凝胶层，其中所述水凝胶层包括所述离子物质；

将所述多个水性液滴和所述水凝胶层在包括两亲分子的疏水介质中放在一起，使得在所述水性液滴和所述水凝胶层之间各自形成半透膜。

在一些实施方式中，所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度高于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度高于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度；或者所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度等于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度等于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度；或者所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度低于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度低于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

在一些实施方式中，所述半透膜是由两亲分子组成的双层。

在一些实施方式中，所述两亲分子是脂质。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

在一些实施方式中，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

在一些实施方式中，在每个系统中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

在一些实施方式中，所述水凝胶层中的所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、AsantePotassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

在一些实施方式中，所述水凝胶层包括氯化钙和任选的缓冲剂。

在一些实施方式中，所述水凝胶层中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

在一些实施方式中，每个水性液滴包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

在一些实施方式中，不同的分析物在各种系统中提供。

在一些实施方式中，所述水性液滴的数量为4-1,000,000个；优选地，所述水性液滴的数量为10-1000个。

在另一方面，本发明提供了上述系统用于光学分析物分析的用途。

在另一方面，本发明提供了上述纳米孔阵列用于光学分析物分析的用途。

在另一方面，本发明提供了一种用于形成纳米孔阵列的试剂盒，所述试剂盒包含：

填充性水凝胶，其包括琼脂糖、缓冲剂和能够与荧光报告分子特异性结合以使其发射荧光的离子物质；

水溶液，其包括螯合剂、当与所述离子物质结合时能够发射荧光的所述荧光报告分子、和缓冲剂；其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；

疏水介质，其含有两亲分子；

固体支持物。

在一些实施方式中，所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度低于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度低于水溶液的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，所述两亲分子是脂质。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

在一些实施方式中，所述水溶液还包括蛋白质纳米孔。

在一些实施方式中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道

在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

在一些实施方式中，所述水凝胶层中的所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

在一些实施方式中，每个水性液滴中的所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、AsantePotassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

在一些实施方式中，所述填充性水凝胶包括氯化钙以提供Ca²⁺作为所述离子物质。

在一些实施方式中，所述水凝胶层中氯化钙的浓度为0.01-6.76M；优选地，所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.15M-6M。

在一些实施方式中，所述填充性水凝胶包括2.5％琼脂糖、1.5M CaCl₂和10mMHEPES，pH 7.0。

在一些实施方式中，所述水溶液还包括KCl。

在一些实施方式中，所述水溶液可以包括1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0。

在一些实施方式中，含有两亲性分子的所述疏水介质可以是脂质油，其包括溶解在体积比为1:1的2mL十六烷和硅油混合物中的5mg DPHPC脂质的干膜。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括包被水凝胶，所述包被水凝胶包括在水中的琼脂糖；优选地，所述包被水凝胶可以包括在水中的0.75％(w/v)琼脂糖。

附图说明

图1显示了DiffusiOptoPhysiology及其在TriM-β-CD传感中的应用。a-d，不同测量平台中通过纳米孔的离子转运示意图。a，在电生理记录过程中，当通过一对Ag/AgCl电极施加跨膜电位时，观察到Cl^-通过纳米孔的电泳运动。b，在无电极的情况下，虽然离子穿过纳米孔的热运动存在两个方向，但根据电中性规则，不应发生离子转运的净流量。c，在oSCRs过程中，Ca²⁺的定向运动，其被电泳驱动通过纳米孔，构建陡Ca²⁺浓度梯度。在cis侧与Fluo-8结合后，孔附近的Fluo-8/Ca²⁺复合物发射强荧光。d，在DiffusiOptoPhysiology过程中，由于离子的热运动，可在孔附近建立缓Ca²⁺浓度梯度。与Fluo-8结合后，预期荧光发射比c弱。e，孔周围Fluo-8/Ca²⁺复合物空间分布的横截面图。虚线框：近纳米孔的紧邻区域的放大视图。f，左上图：计算机模拟的相应图像结果。右上图：模拟的荧光强度分布遵循Gaussian分布。左下图：从单个WTα-HL纳米孔的DOP记录中获取的代表性帧。右下图：相应的荧光强度分布也遵循Gaussian分布。标尺：4μm。g，在无电极oSCR过程中使用α-HL纳米孔的TriM-β-CD(75mM)的单分子传感。标尺，4μm。h，平均事件间间隔(1/τ_on)和平均停留时间(1/τ_off)的倒数相对于TriM-β-CD浓度的图。平均值和标准差来自每个条件的三个独立实验(N＝3)。i，分别从DOP和+20mV的电生理记录获得的τ_off和F_P结果的统计数据。以上显示的DOP记录在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧)的条件下进行。电生理记录在1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0条件下在膜两侧进行。TriM-β-CD以75mM终浓度加入cis侧。

图2显示了FEM模型的几何结构。半径为10μm、充满电解质溶液的球体被10nm厚的半透膜分隔成两室(cis：上，trans：下)。仅允许液体而不是离子穿过膜。在膜的中心，置入具有不同直径(2nm-8nm)的单个纳米级圆柱形孔隙，它是两个室之间液体和离子转运的唯一通道。cis侧的边界条件被设置为具有不同的KCl浓度(1M至2.5M)，而trans侧的边界条件被设置为具有不同的CaCl₂浓度(0.5M至1.5M)。本文中的所有FEM模拟均使用这种几何结构进行。

图3显示了设置的示意图。a，无电极oSCR设置的横截面图。当浸入脂质/油环境(在体积比为1:1的十六烷/硅油混合物中的2.5mg/ml DPHPC)中时，水性液滴和琼脂糖基质在一起时自发形成液滴界面双层(DIB)[21]。水性液滴由1M-2.5M KCl、400μM EDTA、40μMFluo-8、10mM HEPES(pH 7.0)组成并具有生物纳米孔。琼脂糖基质由0.5-1.5M CaCl₂、10mMHEPES、pH 7.0和2.5％(v/w)低熔点琼脂糖组成。先前溶解在液滴中的生物纳米孔自发插入DIB并实现Ca²⁺热力学扩散到液滴中。转运的Ca²⁺立即与液滴中的Fluo-8结合，当通过全内反射荧光(TIRF)显微镜成像时，在孔周围产生荧光发射。b，DIB的明场图像。DIB的边界可以从明场图像中直观地分辨出。

图4显示了环糊精结合动力学。a-e，分别使用+20、+40、+60、+80和+100mV施加电位的代表性电流迹线。向cis侧加入三甲基-β-环糊精(TriM-β-CD)，终浓度为4mM。当施加的电位增加时，事件检测频率系统地降低。这表明纳米孔中可能存在相反的电渗流，这降低了TriM-β-CD与孔结合的可能性。f，1/τ_on作为施加电压的函数的图。1/τ_on的统计基于三组独立的电生理记录(N＝3)，每个条件的持续时间为90s。电生理记录在1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0条件下在膜两侧进行。将WTα-HL加入cis侧。

图5显示了oSCR过程中信号和背景的定义。a，直接从无电极oSCR获取的纳米孔的代表性图像帧。b，a的2D Gaussia拟合

结果。可以从拟合结果中得出参数诸如峰中心(x_c,y_c)、峰幅度(A+z₀)和半高全宽(FWHM)(参见方法)。c，根据FWHM定义信号和背景。简而言之，将直径为2FWHM的圆圈内的总像素值定义为信号。直径3FWHM和4FWHM之间的外环内的总像素值定义为背景。显示的图像处理使用MATLAB自动进行。

图6显示了荧光迹线归一化的演示。由于激光可能产生功率波动、焦平面漂移或纳米孔运动，有时在原始荧光时间迹线中观察到低频波动。然而，这些波动可以通过标准迹线校正来减少。a，荧光强度的校正。将对应于基于无电极oSCR的TriM-β-CD传感的样品迹线用作演示(图1)。使用自定义LabVIEW程序分别提取原始荧光时间迹线(信号和背景)。有关无电极oSCR过程中信号和背景的定义，参见图10。迹线校正按照等式F_cal＝(F_sig-F_bkg)/F_bkg进行。F_cal、F_sig和F_bkg分别代表校正后的荧光强度、原始荧光信号和原始荧光背景。归一化后，原始荧光时间迹线中观察到的低频波动被最小化。b，归一化的荧光时间迹线。对于定量分析，对应于开放孔状态的荧光幅度进一步归一化为1。

图7显示了移位事件的统计。a，显示TriM-β-CD移位通过α-HL孔的代表性荧光迹线。以迹线中的标记定义事件停留时间(t_off)和事件间间隔(t_on)。b，停留时间(t_off)的直方图。黑线是直方图数据的单指数拟合。时间常数τ_off从拟合结果得出。c，阻断水平(％F_b)的直方图。以平均百分比阻断值F_P定义峰值x_c。d，事件间间隔(t_on)的直方图。黑线是直方图数据的单指数拟合。时间常数τ_on从拟合结果得出。

图8显示了在DOP记录过程中通过调整渗透增强的传感性能。a，从使用不同电解质组合的DOP记录获得的荧光迹线。DOP记录使用α-HL纳米孔进行。将TriM-β-CD加入cis侧，终浓度为15mM。当在cis侧和trans侧之间建立更大的渗透梯度时，事件间间隔τ_on减小。b，渗透压和1/τ_on作为cis侧中KCl浓度的函数的图。平均值和标准差来自三组独立实验(N＝3)。c，cis侧中不同KCl浓度下的荧光成像结果的SBR分析。上图显示了从DOP记录获取的代表性图像。从左到右的图像通过DOP记录获得，cis侧中[KCl]分别为1.0、1.5、2.0和2.5M。当cis侧中KCl浓度增加时，SBR的值降低。平均值和标准差来自五个独立实验(N＝5)。a-c中的实验在1M-2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH7.0(trans侧中)的条件下进行。d，模拟荧光强度作为cis侧中KCl浓度的函数的图。上图显示了模拟中相应的荧光强度2D轮廓(profile)，类似于c中从无电极oSCR获得的结果。模拟在1M-2.5M KCl(cis侧中)和0.75M CaCl₂(trans侧中)的条件下进行。e，模拟空间中Fluo-8空间分布的横截面图。模拟的边界条件设置为1.0M KCl(cis侧中)和0.75MCaCl₂(trans侧中)。从cis侧到trans侧的持续渗透流导致了Fluo-8在DIB附近的富集分布。

图9显示了TriM-β-CD传感过程中的基线比较。a，来自DOP记录的代表性荧光迹线，在2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、15mM TriM-β-CD、10mM HEPES，pH＝7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES(pH＝7.0)(trans侧中)的条件下获得。b，来自DOP记录的代表性荧光迹线，在1M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、15mM TriM-β-CD、10mM HEPES(pH＝7.0)(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH＝7.0(trans侧中)的条件下获得。a和b中的迹线均使用α-HL纳米孔记录。当从cis侧到trans侧的渗透流存在时，观察到热噪声减少，这是DOP记录荧光强度增强的结果。

图10显示了Fluo-8分布的FEM建模。置入cis侧的Fluo-8H是细胞不可渗透分子(AAT bioquest)。水穿过膜的渗透流导致Fluo-8在DIB的cis侧周围富集。当cis侧中的电解质容量渗透摩尔浓度被设置为低于trans侧时，这种现象应该有助于增强纳米孔荧光的SBR。Fluo-8浓度使用FEM建模(方法)进行模拟。对于所有模拟，cis侧边界上KCl、EDTA和Fluo-8的浓度分别被设置为0.5-1.5M、400μM和40μM。trans侧边界上CaCl₂浓度保持恒定在0.75M。这些模拟参数在模拟空间的边界上设置，代表远离纳米孔的电解质缓冲液的稳态。a，cis侧边界上KCl浓度为0.5M时，Fluo-8的3D分布的横截面图。在这种情况下，存在从cis侧到trans侧的强渗透流，导致Fluo-8在膜附近富集。b，cis侧边界上KCl浓度为1M时，Fluo-8的3D分布的横截面视图。观察到Fluo-8的富集减少。c，cis侧边界上KCl浓度为1.5M时，Fluo-8的3D分布的横截面视图。在这种情况下，存在从trans侧到cis侧的弱渗透流，导致膜附近的Fluo-8浓度降低。

图11显示了在DOP记录过程中随Ca²⁺通量增加而增强的SBR。a，从DOP记录中获取的成像结果(上图)和相应的2D Gaussian拟合(下图)。当cis侧中KCl浓度相应地调整时，trans侧中CaCl₂浓度增加，从而使容量渗透摩尔浓度保持等渗。荧光点对应于通过WTα-HL纳米孔的Ca²⁺流动，其随Ca²⁺流动的增加而变得更亮。标尺，4μm。b，在不同电解质容量渗透摩尔浓度(N＝12)条件下的荧光成像信号的FWHM和SBR。c，代表性荧光迹线显示了PEG1500通过WTα-HL纳米孔的移位信号，如通过DOP记录获得。将PEG1500加入琼脂糖基质中，达到终浓度为20mM。在DOP记录过程中使用cis侧中2.25M KCl缓冲液和trans侧中1.5M CaCl₂缓冲液的组合。d，作为重量渗透摩尔浓度函数的模拟总荧光强度，显示了直径分别为2nm、4nm、6nm和8nm的四种不同孔径。电解质浓度保持等渗以避免在本演示中讨论渗透。e，左图：α-HL和ClyA-RR的同时DOP成像。由于通道电导较大，与WTα-HL在同一视野中相比，ClyA-RR显示为了更大且更亮的点。右图：沿分别由位置1和2标记的垂直线的荧光强度曲线。荧光强度曲线符合Gaussian分布。标尺，5μm。f，WTα-HL和ClyA-RR(N＝5)荧光成像信号的FWHM和SBR。在e、f中显示的DOP记录在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下进行。g，通过直径为6nm的虚拟圆柱孔的模拟渗透流。更宽的孔几何形状产生更大的渗透流。

图12显示了ClyA-RR的制备和表征。a，十二聚体ClyA-RR使用蓝色天然凝胶电泳(4-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶)进行表征。泳道M：precision plus蛋白质标准品(Bio-Rad)；泳道1：使用原核表达(方法)制备的ClyA-RR。泳道2：加入DDM后的ClyA-RR，达到终浓度0.25％(w/v)。凝胶显示单体在加入DDM之前已自组装，但我们仍使用DDM进行生产以稳定十二聚体ClyA-RR。b，在电生理记录过程中观察到的连续ClyA-RR膜插入。测量在+50mV恒定电压下进行。十二聚体ClyA-RR纳米孔在cis侧加入。c，ClyA-RR纳米孔的代表性I-V曲线。d，ClyA-RR的开放孔电流直方图，施加+100mV电位。电流集中在1761.428pA。开放孔电流的统计基于20组独立的电生理记录(N＝20)。所有显示的测量(b-d)均在膜两侧在1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的条件下进行。

图13显示了孔中渗透流的FEM建模。模拟在1M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8(cis侧中)和1.5M CaCl₂(trans侧中)的条件下使用不同的孔径进行。a，孔中心的流速相对孔直径的图。b-d，不同尺寸孔内模拟渗透流的横截面图。从模拟可知，较大的孔径导致流速显著增加。

图14显示了通过ClyA-RR纳米孔的dsDNA移位。a，DOP记录过程中通过ClyA-RR的dsDNA移位示意图。b，ClyA-RR纳米孔的DOP成像和相应的荧光迹线。液滴中未加入dsDNA。c，当dsDNA以2μM终浓度加入液滴中时ClyA-RR纳米孔的DOP成像以及相应的荧光迹线。清楚地观察到连续的深且长的驻留荧光阻断。标尺：5μm。d，通过ClyA-RR纳米孔的dsDNA移位分别在+6mV、+4mV和+2mV的电生理记录。在电压低至+2mV的情况下，仍可观察到与dsDNA移位事件相对应的电流阻断。e，dsDNA移位事件的停留时间直方图。由于EM-CCD的采集时间有限(30ms)，无法完全解析快速dsDNA移位。上述DOP记录在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下进行。电生理记录在1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5MCaCl₂、10mM HEPES，pH7.0(trans侧中)的条件下进行。dsDNA以2μM的终浓度加入cis侧。DOP记录的数据(以橄榄色显示)以30ms的帧速率获取。电生理迹线(以黑色显示)以25kHz的采样速率和1kHz的低通滤波记录。

图15显示了通过ClyA的dsDNA移位的统计。a，当dsDNA移位通过ClyA-RR孔时阻断水平(％F_b)的代表性直方图。F_P值为0.610±0.138(中心值±FWHM)。b-d，当dsDNA在+2mV(b)、+4mV(c)和+6mV(d)下移位通过ClyA-RR孔时，阻断水平(％I_b)的代表性直方图。I_P值分别为0.786±0.224、0.605±0.460和0.611±0.357。光阻断水平和电阻断水平基本相同。无电极oSCR和电生理记录均在1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mMHEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下进行。2mM 78bp dsDNA在cis侧加入。

图16显示了微型芯片中的多重DOP记录。a，用于DOP记录的指尖大小的装置。b，DOP记录过程中的芯片设置。设置中的DIB使用473nm激光激发，并使用全内反射荧光(TIRF)显微术(方法)成像。c，在相同的DIB中进行WTα-HL和ClyA-RR纳米孔同时成像。两种类型的纳米孔可以通过荧光点的大小和强度轻松区分(黄色虚线圆圈：WTα-HL，红色虚线圆圈：ClyA-RR)。d，用于多重无电极oSCR的微型DIB阵列的示意图。e，mini-DIB阵列的明场图像。f，插入微型DIB中的ClyA-RR纳米孔的帧。DIB的直径为～40μm。DIB在1.5M KCl、400μM EDTA、40μMFluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。

图17显示了使用α-HL纳米孔的无电极ssDNA传感。(a)α-HL纳米孔的代表性DOP采集结果和得出的荧光迹线。液滴中未加入ssDNA。(b)当寡聚ssDNA以50μM终浓度加入液滴中时，α-HL纳米孔的代表性DOP采集结果和得出的荧光迹线。持续且清楚地观察到连续的短驻留荧光阻断。A、B中的标尺：5μm。(c)电阻事件的阻断水平(％F_b)的统计。％F的平均值为0.289±0.175(中心值±FWHM)。显示的DOP记录在3M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mMHEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下进行。本测定中使用的DNA序列：5'-GATAGTGAGCCAAATTTAAA-3'。

图18显示了使用ClyA-RR纳米孔的无电极ssDNA传感。(a)ClyA-RR纳米孔的DOP成像和相应的荧光迹线。液滴中未加入ssDNA。(b)当ssDNA-a(78nt)以2μM终浓度加入液滴中时，ClyA-RR纳米孔的DOP成像和相应的荧光迹线。清楚地观察到连续的深且长的驻留荧光阻断。图像插图中的标尺：5μm。(c)当ploy A₇₈以50μM终浓度加入液滴中时，ClyA-RR纳米孔的DOP成像和相应的荧光迹线。清楚地观察到连续的浅且短的驻留荧光阻断。标尺：5μm。(d)当ssDNA-a与ClyA-RR纳米孔相互作用时，阻断水平(％F_b)的代表性直方图。％F的平均值为0.583±0.014(中心值±FWHM)。(e)当poly A₇₈与ClyA-RR纳米孔相互作用时，阻断水平(％F_b)的代表性直方图。％F的平均值为0.780±0.006(中心值±FWHM)。DOP记录在2.25M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH7.0(trans侧中)的条件下进行。

图19显示了PMMA测量装置。PMMA装置的制造如之前[ref]所报道。(A)实验中使用的DIB装置的底视图。标尺：mm。(B)实验中使用的DIB装置的前视图。标尺：mm。熔融凝胶可以沿绿色标记的路线注入装置。(C)DIB装置的3D模型。显示了熔融琼脂糖的凝胶入口和出口孔。出口侧的额外孔有助于在填充过程中排出气泡。4个独立的液滴槽设计用于平行测量。标尺：2mm。(D)准备好的装置的照片。设置中的DIB使用473nm激光激发，并使用全内反射荧光(TIRF)成像。标尺：10mm。

具体实施方式

本发明基于DiffusiOptoPhysiology(DOP)，其通过省去所有电连接而简化了oSCR，光学监测由Ca²⁺与其指示染料Fluo-8通过纳米孔传感器的扩散结合引起的荧光发射(图1d)。随后通过直接荧光读取证明了对小分子、大分子和生物大分子的直接传感。通过省去对电极配置的需求，DOP能够从成千上万个具有高度可接近性和生物相容性材料的纳米孔进行平行测量，单次使用成本＜$1。因此，可以使用配备纳米技术传感器的一次性芯片开发新概念的临床诊断。因成本、设施和技能而减少的技术障碍使任何几乎未受过培训的研究人员都能轻松进行纳米孔测量。不同的研究领域，诸如高通量药物筛选或离子通道的基础研究，可能因此受益。

本发明提供了一种用于识别分析物的无电极的系统，该系统基于由化学梯度驱动的通过孔的离子流动的光学测量。本发明还提供了使用该系统用于识别分析物的方法，包括识别小分子或DNA(诸如dsDNA或ssDNA)的方法。

无电极的系统包括由膜分隔的两个隔室：第一隔室容纳含有荧光报告分子的第一水溶液，第二隔室容纳含有游离离子物质的第二水溶液。当与离子物质结合时，荧光报告分子产生特定的荧光发射，其可以通过光传感器进行区分。第一隔室和第二隔室之间的膜具有至少一个纳米孔，使得第一隔室和第二隔室通过纳米孔连接。离子物质由化学梯度的驱动穿过膜中的纳米孔从第二隔室进入第一隔室，并与第一隔室中的荧光报告分子结合，导致报告分子发射荧光。由于离子物质的通道仅限于纳米孔，这在邻近纳米孔的区域产生荧光。邻近孔的区域中荧光信号的强度取决于离子物质进入第一隔室的流量(the rate offlux)。然后，可以检测荧光报告分子的荧光发射。当纳米孔被穿过纳米孔的分析物阻断或部分阻断时，离子物质通过纳米孔的传输受阻，这被测量为与离子物质不受阻碍地流过孔所产生的荧光相比，纳米孔附近的荧光减少。取决于分析物的大小、形状等，不同分析物在不同程度上阻碍离子物质传输穿过纳米孔，导致不同程度的荧光降低。由于孔的阻断或部分阻断而导致的荧光降低与离子通过孔的传输受到阻碍的程度相关，这反过来又反映了有关分析物性质的信息。邻近纳米孔的区域的荧光降低幅度可用于识别穿过纳米孔的阻断分析物。荧光减少的幅度可以通过事件停留时间和百分比阻断深度进行表征。

分析物可以被加入第一隔室或第二隔室。分析物例如由化学梯度驱动穿过纳米孔，从第一隔室进入第二隔室或从第二隔室进入第一隔室并阻断或部分阻断纳米孔，导致荧光降低。

识别分析物的方法包括：

(a)提供本发明的系统，其在第一隔室或第二隔室中包括分析物；

(b)将能够激发荧光报告分子的光施加到第一隔室中邻近纳米孔的区域；

(c)测量来自荧光报告分子的荧光信号以识别分析物。

离子物质与荧光报告分子结合选择并且可以是引起另一分子的特定荧光发射的任何离子物质。此类离子物质是本领域技术人员公知的。在一些实施方式中，离子物质包括但不限于Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy^{3 +}、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt^{2 +}、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和/或Zn²⁺。离子物质可以是一种离子物质或者两种或更多种离子物质的组合。

术语“荧光报告分子”可以是产生特定荧光发射的任何分子，当与如上所示的离子物质结合时，该荧光发射可以通过光传感器区分。此类荧光报告分子是本领域技术人员公知的。在一些实施方式中，荧光报告分子可以是钙荧光探针、钠荧光探针或锌荧光探针，其是分子，诸如可以分别螯合钙离子、钠离子或锌荧光的小分子。在一些实施方式中，荧光报告分子包括但不限于Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸或BAPTA(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)。在一些实施方式中，荧光报告分子包括但不限于SBFI、Asante NaTRIUMGreen-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn、ZINQUIN等。离子物质可以是一种类型的荧光报告分子或者两种或更多种类型的荧光报告分子的组合。荧光报告分子可以是膜不可渗透的，诸如双层不可渗透的。

在本发明的系统和方法中，使用的离子物质应该能够与使用的荧光报告分子结合，使得荧光报告分子可以产生特定的荧光发射。在一些实施方式中，离子物质是Ca²⁺并且荧光报告分子是钙荧光探针，例如Fluo-8或Cal-520。

在第一隔室中可以具有第一水溶液。在第二隔室中可以具有第二水溶液。第一隔室可以完全填充第一水溶液。第一隔室可以未完全填充第一水溶液，并且除了第一隔室中的第一水溶液之外，可以存在一些空间或其他基质。至少第一隔室中紧邻膜的部分填充第一水溶液。第二隔室可以完全填充第二水溶液。第二隔室可以未完全填充第二水溶液，并且除了第一隔室中的第二水溶液之外，可能存在一些空间或其他基质。至少第二隔室中紧邻膜的部分填充第二水溶液。第一隔室和第二隔室可以独立地为任何形式或任何形状。第一隔室和第二隔室的形式或形状可以相同或不同。在一些实施方式中，第一隔室和/或第二隔室可以具有或可以不具有边界层。第一隔室和第二隔室的边界层各自可以是固定的或可变的。在一些实施方式中，第一隔室可以由水性液滴提供。在一些实施方式中，第二隔室可以由水凝胶层提供。

第一水溶液包括荧光报告分子。第二水溶液包括离子物质。第二水溶液可以包括盐以提供离子物质，诸如钙盐。第一水溶液和第二水溶液可以独立地包括或不包括其他成分。第一水溶液可以不包括能够结合荧光报告分子以引起荧光发射的离子物质。第二水溶液可以不包括能够结合离子物质并发射荧光的荧光报告分子。

第一水溶液可以包括与第二水溶液中的盐不同的盐。第一水溶液中的离子不应与荧光报告分子结合以使其发射荧光。第一水溶液中的盐可以是不与荧光报告分子结合以使其发射荧光的任何盐。在一些实施方式中，第一水溶液包括氯化钠。在一些实施方式中，第一水溶液包括氯化钾。在一些实施方式中，第二水溶液包括氯化钙。第一水溶液中氯化钾的浓度可以为约0-3.4M。在一些实施方式中，氯化钾的浓度小于或等于3M。在一些实施方式中，氯化钾的浓度小于或等于0.75M、小于或等于1.0M、小于或等于1.5M，小于或等于2.25M、或者小于或等于2.5M。第二水溶液中氯化钙的浓度可以为约0.01-6.76M。在一些实施方式中，氯化钙的浓度大于或等于0.15M、大于或等于0.5M、大于或等于0.75M、大于或等于1M、或者大于或等于1.5M、大于或等于2M、大于或等于3M、大于或等于4M、大于或等于5M、大于或等于6M。在一些实施方式中，氯化钙的浓度小于或等于6M，

发明人发现，增加离子物质的浓度可以通过提高离子物质的跨膜化学梯度，从而导致更多离子物质流过纳米孔来改善传感信号。然而，盐浓度也受到电解质在水中的最大溶解度的限制(例如，CaCl₂：6.767M，20℃)。在一些实施方式中，第一水溶液可以进一步包括用于离子(诸如Ca²⁺)的竞争性结合的螯合剂，由此当由于竞争性结合而远离纳米孔的中心时荧光减弱。螯合剂的实例包括但不限于EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。在一些实施方式中，第一水溶液或第二水溶液可以包括缓冲剂以控制pH，例如，Bis-tris、Tris、Hepes、磷酸钠和/或磷酸钾。在一些实施方式中，第一水溶液可以包括氯化钾缓冲液(例如10mM HEPES，pH 7.0和KCL)并且第二水溶液可以包括氯化钙缓冲液(例如，10mM HEPES，pH 7.0和CaCl₂)。在一些实施方式中，第一水溶液可以包括1.0M KCl、400μM EDTA、10mM HEPES，pH 7.0；1.5M KCl、400μM EDTA、10mMHEPES，pH 7.0；2.25M KCl、400μM EDTA、10mM HEPES，pH 7.0；或2.5M KCl、400μM EDTA、10mM HEPES，pH 7.0；或2.5M KCl、400μM EDTA、10mM HEPES，pH 7.0。在一些实施方式中，第二水溶液可以包括0.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0；0.75M CaCl₂，10mM HEPES，pH 7.0；1MCaCl₂，10mM HEPES，pH 7.0；或1.5M CaCl₂，10mM HEPES，pH 7.0。出于其他原因，在第一水溶液或第二水溶液中可以包括盐，例如，以稳定蛋白质、控制结合组分、控制容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度和/或激活荧光探针。

第一水溶液可以包括分析物。分析物由化学梯度的驱动穿过膜中的纳米孔从第一隔室进入第二隔室，并阻断或部分阻断纳米孔，导致来自荧光报告分子的荧光降低。在第二水溶液中还可以包括分析物，其中分析物由化学梯度的驱动穿过膜中的纳米孔从第二隔室进入第一隔室，并阻断或部分阻断纳米孔，导致来自荧光报告分子的荧光降低。

在一些情况下，第一隔室可以由水性液滴提供。水性液滴可以包括第一水溶液或由其组成。在一些情况下，第二隔室可以由水凝胶层提供，诸如包括琼脂糖基质的水凝胶层。水凝胶可以包括第二水溶液。当将水性液滴和水凝胶层在包括对水分子可选择性渗透的两亲分子的疏水介质中放在一起时，二者可以自发形成由两亲分子组成的液滴界面双层(DIB)。蛋白质纳米孔可以在水性液滴或水凝胶中提供，使得蛋白质纳米孔可以在DIB形成时自发插入DIB中。水性液滴还可以包括分析物。

水凝胶层的基质可以包括亲水性聚合物或由其组成。水凝胶层的基质可以包括基本上透明的亲水聚合物或由其组成。水凝胶层的基质可以包括琼脂糖或由其组成。其他水凝胶材料可能是合适的，诸如聚丙烯酰胺、交联聚乙二醇或硝基纤维素。水凝胶层可以包括0.1-20％(w/v)琼脂糖。在一些实施方式中，水凝胶层可以包括小于5％(w/v)的琼脂糖、小于4％(w/v)的琼脂糖、或约3％(w/v)的琼脂糖。水凝胶可以包括大于1％(w/v)的琼脂糖、大于2％(w/v)的琼脂糖。水凝胶可以包括约2％至约4％的琼脂糖。水凝胶可以包括约2.5％(w/v)至约3.5％(w/v)的琼脂糖。水凝胶层可以包括分析物。

分隔第一隔室和第二隔室的膜可以是能够支撑纳米孔的任何材料。膜可以是天然膜、合成膜或人造膜。膜可以是固体膜。膜可以包括固体基质或由其组成，诸如SiNx、玻璃、二氧化硅、二硫化钼、石墨烯、氧化铝或CNT(碳纳米管)。

膜可以是半透膜。半透膜可选择性渗透水分子。离子物质、荧光报告分子、分析物等对半透膜是不可渗透的，因此，它们的通过仅限于纳米孔。此类半透膜及其生产方法是本领域技术人员公知的。半透膜可以包括可选择性渗透水分子的两亲分子或由其组成。

半透膜可以由两亲分子组成。两亲分子可以是脂质或聚合物，诸如嵌段共聚物。膜可以是单层或双层，例如，其可以包括两亲分子或由其组成。实例包括单层，该单层包括聚合物或由其组成，诸如嵌段共聚物，以及双层，该双层包括脂质或由其组成。双层可以是脂质双层。双层可以是人造的，例如非天然的。双层可以不是细胞双层。双层可以不是细胞的膜片钳双层。本领域技术人员将理解存在多种提供双层的方法。双层可以通过液滴水凝胶双层(DHB)方法提供，例如如WO2009024775中提供的，其内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，半透膜可以通过在含有两亲分子(诸如脂质或嵌段共聚物)的疏水介质中的第一隔室-第二隔室相互作用来提供。在一些实施方式中，半透膜可以通过将第一隔室和第二隔室浸入含有两亲分子的疏水介质中，并将第一隔室和第二隔室放在一起使得两亲分子形成半透膜来提供。结果，由两亲分子组成的半透膜将在第一隔室和第二隔室之间自发形成。在一些实施方式中，可以在第一隔室或第二隔室中提供蛋白质纳米孔，当由两亲分子组成的膜自发形成时，蛋白质纳米孔可以自发插入双层中。在一些实施方式中，半透膜可以通过将第一隔室和第二隔室(它们中的任一者中具有蛋白质纳米孔)浸入含有两亲分子的疏水介质中来提供。结果，由两亲分子组成的半透膜将在第一隔室和第二隔室之间自发形成，并且蛋白质纳米孔可以自发插入双层中。

在一些实施方式中，可以通过使具有两亲分子单层的第一隔室与具有两亲分子单层的第二隔室接触以自发形成双层来提供双层。在一些实施方式中，双层可以通过以下提供：将第一隔室和第二隔室(它们中的任一者中具有蛋白质纳米孔)浸入含有两亲分子的疏水介质中，从而在第一隔室和第二隔室的表面上形成两亲分子的单层，然后将第一隔室和第二隔室放在一起，使得两亲分子的单层形成双层。结果，由两亲分子组成的双层将在第一隔室和第二隔室之间自发形成，并且蛋白质纳米孔可以自发插入到双层中。

因此，在本发明的一个方面，提供了一种生产上述系统的方法，包括：

提供第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

提供第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括与所述荧光报告分子特异性结合的离子物质；

将所述第一隔室和所述第二隔室在含有两亲分子的疏水介质中放在一起，使得在所述第一隔室和所述第二隔室之间形成具有插入的纳米孔的半透膜；

其中在所述第一水溶液或所述第二水溶液中提供蛋白质纳米孔

其中由两亲分子组成的半透膜将在第一隔室和第二隔室之间自发形成，并且蛋白质纳米孔可以自发插入半透膜中；

第一隔室、第二隔室、荧光报告分子、离子物质、蛋白质纳米孔、半透膜、双层、疏水介质、两亲分子、分析物和本文提到的其他特征如在本说明书的上下文中所述。

在本发明中，可以在半透膜形成之前在第一水溶液或第二水溶液中提供分析物。还可以在半透膜形成之后和检测开始之前将分析物加入第一水溶液或第二水溶液中。

在一些实施方式中，两亲分子可以选择性地渗透水分子。在本发明的任何方法中使用的两亲分子可以是聚合物或脂质分子，特别地，可以使用表面活性剂分子。脂质分子可以选自包括脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇的组。脂质是包括以下的组中的任一种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

聚合物可以是能够形成半透膜的嵌段共聚物，例如三嵌段共聚物，例如如Discher,D.E.&Ahmed,F.Polymersomes.Annu.Rev.Biomed.Eng.8,323-341(2006)；Nardin,C.,Winterhalter,M.&Meier,W.Giant free-standing ABA triblockcopolymermembranes.Langmuir 16,7708–7712(2000)；Meier,W.,Nardin,C.&Winterhalter,M.Reconstitution of channel proteins in(polymerized)ABA triblockcopolymer membranes.Angew.Chem.Int.Ed.39,4599–4602(2000)或CN104936682B中所提供；其通过引用并入本文。在一个实施方式中，三嵌段共聚物是聚(2-甲基恶唑啉)-嵌段-聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基恶唑啉)(PMOXA-PDMS-PMOXA)或聚(2-甲基恶唑啉)-嵌段-聚(乙烯)-嵌段-聚(2-甲基恶唑啉)(PMOXA-PE-PMOXA)。

疏水介质可以包括油。在一些实施方式中，疏水介质可以是油。包括两亲分子的疏水介质可以包括油包脂质(lipid-in-oil)或由其组成。油可以是烃，其可以是支链的或无支链的，并且可以是取代的或未取代的。例如，烃可以具有5至20个碳原子，更优选10至17个碳原子。合适的油包括烷烃或烯烃，诸如十六烷、癸烷、戊烷或角鲨烯，或氟化油，或硅氧烷基油，或四氯化碳；或其混合物。在一些实施方式中，油是正烷烃，诸如C10至C17正烷烃，例如正十六烷(C16)。在一些实施方式中，疏水介质可以是油，例如，十六烷和硅油的混合物。在一些实施方式中，油可以包括十六烷和硅油AR20(Sigma-Aldrich)的1:1(v:v)混合物。

可选地，可以使用其他双层形成方法。例如，可以通过本领域技术人员已知的以下技术中的任何一种来提供双层：膜片钳，例如光学膜片钳；黑脂质膜(BLM)；也称为涂BLM(painted BLM)；支持脂质双层(SLB)；和系留双层脂质膜(t-BLM)。双层可以根据WO2008102121(其内容通过引用并入本文)穿过孔隙形成。双层可以根据WO2014064444(其内容通过引用并入本文)在液滴与液滴的界面处形成。

在本发明中，术语“纳米孔”是指在其最窄点处具有开口的通道，其具有允许分析物通过开口的直径。纳米孔足够窄，以至于可以通过特定信号(例如荧光信号)的变化来检测分析物对通道的阻断。

膜中的纳米孔的尺寸可以根据系统的预期应用而变化，但必须足够大以允许本发明中使用的离子物质的离子通过。优选地，纳米孔也足够小以防止荧光报告分子通过。纳米孔可以足够大以允许分析物通过。

无论膜是固体膜还是半透膜，纳米孔可以是固体纳米孔、DNA纳米孔的蛋白质纳米孔。纳米孔可以是天然的，例如源自生物有机体，或者纳米孔可以是合成的。纳米孔可以重组产生。纳米孔可以是生物分子，诸如蛋白质纳米孔(也可以称为形成纳米孔的蛋白质)。在一些情况下，纳米孔可由蛋白质形成，蛋白质可被称为蛋白质纳米孔或纳米孔形成蛋白质。本发明中使用的蛋白质纳米孔优选不具有自发门控活性和/或优选在分析物不存在时保持开放。本发明中使用的蛋白质纳米孔可以是任何一种。蛋白质纳米孔或纳米孔形成蛋白质的实例包括α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1或其变体。在一些实施方式中，一个或更多个纳米孔是ClyA-RR[42]。ClyA-RR是ClyA的突变体(D64R/C87A/L99Q/E103G/S110R/F166Y/I203V/C285S/K294R/H307Y)。生物分子纳米孔的其他实例包括通过DNA自组装形成的纳米孔。可用于本发明的纳米孔还可以是离子通道，诸如钾通道或钠通道等。

在本发明中，术语“α-HL”也可称为α-溶血素，可以选自由以下组成的组：野生型α-溶血素、突变α-溶血素、野生型α-溶血素旁系同源物或同系物溶血素、和突变α-溶血素旁系同源物(paralog)或同源物(homolog)溶血素。在一些实施方式中，α-溶血素可以是野生型α-溶血素。可用于本发明的α-溶血素应能够形成纳米孔。在一些实施方式中，α-HL是七聚体。

在本发明中，术语“ClyA”可以选自由以下组成的组：野生型ClyA、突变ClyA、野生型ClyA旁系同源物或同源物ClyA、和突变ClyA旁系同源物或同源物ClyA。在一些实施方式中，ClyA可以是野生型α-溶血素。在一些实施方式中，ClyA可以是突变的ClyA。优选的突变ClyA是ClyA-RR。可用于本发明的ClyA应该能够形成纳米孔。在一些实施方式中，ClyA或ClyA-RR是十二聚体。

蛋白质纳米孔(例如α-HL和ClyA或其突变体)的序列是本领域技术人员已知的。蛋白质纳米孔(例如α-HL或ClyA或其突变体)的制备方法是本领域技术人员已知的，例如可以通过原核表达制备，并易于通过凝胶电泳或色谱法纯化。蛋白质纳米孔可以通过几种蛋白质单体的自组装形成，例如十二聚体ClyA、十二聚体ClyA-RR或七聚体α-HL。在一些情况下，蛋白质纳米孔可以自组装进半透膜。

纳米孔可以是固态纳米孔，例如包括合成材料，诸如氮化硅或石墨烯。固态纳米孔通常是在合成膜(诸如SiNx或SiO₂)中形成的纳米级孔。固态纳米孔可以通过聚焦离子或电子束生产，从而可以调整孔的大小。纳米孔可以是包括在合成材料中形成的成孔蛋白质的杂合纳米孔。

在膜中形成纳米孔的方法是本领域技术人员公知的，例如通过在半透膜形成之后或在半透膜形成过程中将纳米孔分子加入半透膜中。在一些实施方式中，可以在第一隔室或第二隔室中提供蛋白质纳米孔，当由两亲分子组成的膜自发形成时，蛋白质纳米孔可以自发插入半透膜中。

分析物不限于特定分子并且可以是在穿过纳米孔时能够阻断或部分阻断纳米孔的任何分子。分析物可以包括但不限于小分子、大分子或生物大分子。小分子是指分子量低、尺寸小的分子或离子，其比纳米孔的孔径小很多并且容易通过纳米孔。小分子可以包括但不限于化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸或核苷酸。大分子是指非常大的分子，通常由数千个或更多原子组成。大分子可以包括但不限于生物聚合物，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物或脂质；大的非聚合分子，诸如脂质或大环；或合成的大分子。大分子的实例是生物大分子，其包括但不限于多肽、多糖或多核苷酸，例如，DNA(包括ssDNA或dsDNA)或RNA(；包括miRNA、siRNA或tRNA)。DNA(诸如ssDNA或dsDNA)的长度可以是10-1000nt。DNA(诸如ssDNA或dsDNA)的长度可以大于15nt、大于20nt、大于30nt、大于40nt、大于50nt、大于60nt、大于70nt、大于80nt、大于90nt或大于100nt。DNA(诸如ssDNA或dsDNA)的长度可以小于500nt、小于4000nt、小于300nt、小于200nt。RNA(诸如miRNA、siRNA或tRNA)的长度可以大于15nt、大于20nt、大于30nt、大于40nt、大于50nt、大于60nt、大于70nt、大于80nt、大于90nt或大于100nt。RNA(诸如miRNA、siRNA或tRNA)的长度可以小于500nt、小于4000nt、小于300nt、小于200nt。

分析物可置于第一水溶液或第二水溶液中。在配制第一水溶液或第二水溶液时，在第一水溶液或第二水溶液中可以包括分析物，即，分析物可以与其他预期成分一起配制到第一水溶液或第二水溶液中。可以在系统准备好之后和开始检测时将分析物加入第一水溶液或第二水溶液中。

在本发明中，术语“识别”包括检测或分析身份，例如分析物的类型或获得分析物的结构信息，例如聚合物的结构，或多核苷酸或多肽的结构，诸如多核苷酸的一级结构或二级结构。

穿过纳米孔的阻断性分析物可以通过邻近纳米孔的区域中荧光降低的幅度来识别。根据本发明的公开内容，本领域技术人员知道如何基于荧光降低的幅度来识别分析物，例如，其可以通过事件停留时间和百分比阻断深度进行表征。事件停留时间是分析物占据纳米孔的滞留时间。百分比阻断深度定义为I_b/I_o，其中I_b和I_o分别代表绝对阻断电流和开放孔电流。例如，可以测量由离子流动受阻引起的荧光发射，并与相同检测条件下的参比物质的荧光发射进行比较，以确定分析物和参比物是否相同。事件停留时间和/或荧光发射的百分比阻断深度可以是比较项。

荧光检测可以包括膜和膜区域的显微术或光谱学。荧光检测可以包括使用全内反射荧光(TIRF)、宽视场荧光显微术或共聚焦显微术。荧光检测可以包括使用HiLo显微术，例如由Tokunaga et al(2008.Highly inclined thin illumination enables clearsingle-molecule imaging in cells.Nat Meth 5,159-161)所提供的。荧光检测可以包括使用其他掠入射照明技术。可以使用任何合适的荧光检测手段来检测紧邻膜和膜中纳米孔的膜区域中的荧光信号/发射。荧光检测可以包括使用表面等离子体共振。荧光检测可以包括使用超分辨率显微镜，例如确定性超分辨率(deterministic super-resolution)，包括STED、GSD、RESOLFT或SSIM；或随机超分辨率(stochastical super-resolution)，包括SOFI，或单分子定位方法(SMLM)，诸如SPDM、SPDMphymod、PALM、FPALM、STORM或dSTORM。荧光检测可以包括使用落射荧光显微术(epifluorescence microscopy)、共聚焦激光扫描显微术(LSM)或全内反射荧光(TIRF)显微术。荧光检测可以包括使用荧光相关光谱法(FCS)。图像相关光谱(ICS)可用于计算图像荧光强度波动的空间相关函数，该函数可通过共焦或双光子LSM或TIRF显微术获得。荧光检测技术可以在Ana J.Garcia-Saez,PetraSchwille.Surface analysis of membrane dynamics Biochimica et Biophysica Acta1798(2010)766-776中描述，其内容通过引用并入。

检测来自荧光报告分子的荧光发射可能需要光源和光传感器。光源和光传感器可以包含在同一装置中或分开的装置中。光源应该能够提供能够在离子物质存在的情况下激发荧光报告分子的波长或波长范围的光，并且光传感器应该能够检测在离子物质存在下由荧光报告分子发射的波长或波长范围的光。

因此，在一些实施方式中，系统包括能够照亮邻近纳米孔的膜区域的光源。在一些实施方式中，光源提供特定波长范围内的光。在一些实施方式中，光源可以是激光器、LED、卤素灯或氙气灯。本领域技术人员已知如何使用光源照射荧光报告分子。

在一些实施方式中，系统包括能够检测邻近纳米孔的膜区域中的光信号的光传感器。光传感器可以是对弱光(即荧光)敏感的光敏器件，例如电荷耦合器件(CCD)、电子倍增CCD(EMCCD)、sCMOS传感器或光电二极管，诸如雪崩光电二极管(APD)。优选快速光敏器件。优选地，光传感器是EMCCD或雪崩光电二极管(APD)。

光传感器也可以是显微成像系统、光电倍增管、或可以使用上述荧光检测技术检测荧光的光传感器。在一些实施方式中，全内反射荧光(TIRF)成像系统，诸如全内反射荧光显微术(TIRFM)可用于检测和/或记录邻近纳米孔的膜区域中的光学信号。在一些实施方式中，可以使用宽视场荧光成像系统或共焦成像系统来检测和/或记录邻近纳米孔的膜区域中的光学信号。本领域技术人员已知如何使用光传感器检测来自荧光报告分子的荧光发射。

在一些实施方式中，光传感器和光传感器可以是单个装置。一些荧光检测装置也可用于照明。例如，TIRFM可用于照明和成像。

发明人发现第一隔室和第二隔室之间的渗透流有利于进一步改进纳米孔对分析物的荧光检测。第一隔室和第二隔室之间的容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度差异可以驱动携带离子和分析物的水的定向流动通过插入膜中的生物纳米孔。因此，通过引入的这种不对称性，应该可以提高分析物的移位效率。此外，荧光信号可以通过第一隔室和第二隔室之间的渗透流放大。当第二水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)高于第一水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)时，由于荧光报告分子对半透膜是不可渗透的，水跨膜的渗透流导致第一隔室中膜周围的荧光报告分子富集，因此荧光强度增强。

因此，尽管在一些实施方式中，本发明的方法可以在以下环境中实施：其中第一水溶液和第二水溶液保持等渗或其中第二水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)低于第一水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)，在一些实施方式中，第二水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)可以高于或低于第一水溶液的容量渗透摩尔浓度(或重量渗透摩尔浓度)。

容量渗透摩尔浓度和重量渗透摩尔浓度均根据渗透摩尔(osmole)定义。渗透摩尔是一种测量单位，它描述了对化学溶液渗透压(即由跨表面两侧(诸如跨半渗透膜)的浓度梯度产生的静水压)有贡献的化合物的摩尔数。容量渗透摩尔浓度定义为每体积溶液中溶质的渗透摩尔数。它通常以osmol/L表示。重量渗透摩尔浓度非常相似，但它的定义是每千克纯溶剂中溶质的渗透摩尔数，通常以osmol/kg表示。例如，1mol/L NaCl溶液对应的容量渗透摩尔浓度为2osmol/L。NaCl盐颗粒在水中完全离解，成为两个单独的颗粒：Na⁺离子和Cl^-离子。因此，每摩尔NaCl在溶液中变成两摩尔，一摩尔Na⁺和一摩尔Cl^-。类似地，1mol/LCaCl₂的溶液产生3osmol/L(Ca²⁺和2Cl^-)的溶液。本领域技术人员熟知如何确定溶液的容量渗透摩尔浓度或重量渗透摩尔浓度。

可以通过增加离子物质的浓度或通过另外加入可以增加第一水溶液中的容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度的其他溶质来增加第二水溶液的容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度。优选地，通过增加离子物质的浓度来增加第二水溶液的容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度，因为增加离子物质的浓度可以改善传感信号。第一水溶液的容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度可以通过降低可有助于渗透压的溶质浓度或甚至在第一水溶液中不含盐来降低。在一些实施方式中，第二水溶液的容量渗透摩尔浓度比第一水溶液的容量渗透摩尔浓度高至少0.01osmol/L、至少0.05osmol/L、至少0.1osmol/L、至少0.2osmol/L、至少0.3osmol/L、至少0.4osmol/L、至少0.5osmol/L、至少0.6osmol/L、至少0.7osmol/L、至少0.8osmol/L、至少0.9osmol/L、至少1.0osmol/L、至少1.5osmol/L、至少2.0osmol/L、至少2.5osmol/L、至少3.0osmol/L、至少3.5osmol/L、至少4.0osmol/L、至少4.5osmol/L、至少5.0osmol/L、至少5.5osmol/L、至少6.0osmol/L、至少6.5osmol/L、至少7.0osmol/L、至少7.5osmol/L、至少8.0osmol/L、至少8.5osmol/L、至少9.0osmol/L、至少9.5osmol/L、至少10osmol/L、至少11osmol/L、至少12osmol/L、至少13osmol/L、至少14osmol/L、至少15osmol/L、至少16osmol/L、至少17osmol/L、至少18osmol/L、至少19osmol/L、或至少20osmol/L。在一些实施方式中，第二水溶液的重量渗透摩尔浓度比于第一水溶液的重量渗透摩尔浓度高至少0.01osmol/kg、至少0.05osmol/kg、至少0.1osmol/kg、至少0.2osmol/kg、至少0.3osmol/kg、至少0.4osmol/kg、至少0.5osmol/kg、至少0.6osmol/kg、至少0.7osmol/kg、至少0.8osmol/kg、至少0.9osmol/kg、至少1.0osmol/kg、至少1.5osmol/kg、至少2.0osmol/kg、至少2.5osmol/kg、至少3.0osmol/kg、至少3.5osmol/kg、至少4.0osmol/kg、至少4.5osmol/kg、至少5.0osmol/kg、至少5.5osmol/kg、至少6.0osmol/kg、至少6.5osmol/kg、至少7.0osmol/kg、至少7.5osmol/kg、至少8.0osmol/kg、至少8.5osmol/kg、至少9.0osmol/kg、至少9.5osmol/kg、至少10osmol/kg、至少11osmol/kg、至少12osmol/kg、至少13osmol/kg、至少14osmol/kg、至少15osmol/kg、至少16osmol/kg、至少17osmol/kg、至少18osmol/kg、至少19osmol/kg、或至少20osmol/kg。

通过测量从荧光报告分子发射的荧光，本发明能够记录通过许多平行纳米孔的流动，而无需昂贵的电极阵列。测量的荧光可以分离成每个纳米孔的多个荧光迹线，可以应用于需要高通量筛选的情况，诸如纳米孔阵列。

在本发明的另一方面，提供了一种无电极的纳米孔阵列。纳米孔阵列包括平行的多个本发明系统，每个系统如上所述。纳米孔阵列可用于平行识别多种分析物。本发明的纳米孔阵列在无电极的情况即可使用，从而减小了器件的尺寸并节约了成本。

多个系统被配置成使得可以区分每个系统的测量荧光。这些多个系统的至少一部分彼此分离，使得每个系统可以独立地用于检测其中的分析物并且可以区分每个系统的测量荧光。在一些实施方式中，多个系统的至少第一隔室彼此分离。在一些实施方式中，多个系统的第二隔室彼此分离或不分离。多个系统可以相同也可以不同。

纳米孔阵列中系统的密度可以高达10个/mm²、高达50个/mm²、高达100个/mm²、高达200个/mm²、高达300个/mm²、高达400个/mm²、高达500个/mm²、高达600个/mm²、up to700个/mm²、高达800个/mm²、高达900个/mm²、高达1000个/mm²或更高。

多个系统提供的总面积可以是高达1mm²、高达2mm²、高达5mm²、高达10mm²、高达15mm²、高达20mm²、高达25mm²、高达30mm²、高达35mm²、高达40mm²、高达45mm²、高达50mm²、高达55mm²、高达60mm²、高达65mm²、高达70mm²、高达75mm²、高达80mm²、高达85mm²、高达90mm²、高达95mm²、或高达100mm²或更高。

可以在阵列的两个或更多个或每个系统中提供多种分析物，从而将多种分析物物理分离到各种系统中。多种分析物可以相同或不同，或者可以部分相同或部分不同。在一些实施方式中，多种分析物中的至少两种可以不同。在一些实施方式中，可以在阵列的两个或更多个或每个系统中提供相同的分析物。在一些实施方式中，可以在阵列的两个或更多个或每个系统中提供不同的分析物。在一些实施方式中，可以分别在不同的系统中提供不同的分析物。多种分析物平行通过不同的纳米孔，导致邻近每个纳米孔的区域的荧光降低，每个纳米孔可以分离成多个荧光迹线，从而确定每个分析物的身份。

此类纳米孔阵列可用于识别多种分析物的多重方法，该方法包括：

(a)提供包括多种分析物的本发明的纳米孔阵列，其中在纳米孔阵列的各种系统中提供两种或更多种分析物；

(b)将能够激发包含在每个第一隔室中的荧光报告分子的光施加到多个第一隔室中邻近纳米孔的区域；

(c)测量来自每个第一隔室中包含的荧光报告分子的多个荧光信号以识别多个分析物。

第一隔室、第二隔室、荧光报告分子、离子物质、蛋白质纳米孔、膜、双层、疏水介质、两亲分子、分析物和本文提及的其他特征如本说明书上下文中所述。

在纳米孔阵列中，不同的系统可以包括相同或不同的荧光报告分子和不同的离子物质。为了便于检测，优选地，不同系统包括相同的荧光报告分子和不同的离子物质。

在纳米孔阵列中，不同的系统可以包括相同或不同的纳米孔。为了便于检测，优选地，不同系统包括相同的纳米孔。

在一些实施方式中，不同系统的第一隔室彼此分离并且不同系统的第二隔室彼此不分离。在一些实施方式中，纳米孔阵列可以通过将多个第一隔室与所述第二隔室一起放在包括可选择性渗透水分子的两亲分子的疏水介质中来提供，其中在每个第一隔室中至少包括蛋白质纳米孔。由两亲分子组成的半透膜将在第一隔室和第二隔室之间各自自发形成，并且蛋白质纳米孔可以自发插入半透膜。在一些实施方式中，每个第一隔室包括蛋白质纳米孔、荧光报告分子和任选其中的分析物，其中不同的分析物可以被物理分离到各种油包水隔室中。

在一些实施方式中，每个系统的第一隔室由水性液滴提供，每个系统的第二隔室由水凝胶层(例如包括琼脂糖基质的水凝胶层)提供。在一些实施方式中，多个系统的第二隔室可以由单层水凝胶层提供。在一些实施方式中，纳米孔阵列可以通过将多个水性液滴与所述水凝胶层在包括对水分子选择性渗透的两亲分子的疏水介质中放在一起来提供，其中每个水性液滴包括蛋白质纳米孔、荧光报告分子和分析物，其中不同的分析物可以物理分离进各种油包水液滴。由两亲分子组成的半透膜将在每个水性液滴和水凝胶层之间自发形成，并且蛋白质纳米孔可以自发插入半透膜。

根据本发明的另一方面，提供了一种生产纳米孔阵列的方法，包括：

提供多个水性液滴，其中水性液滴各自包括蛋白质纳米孔、分析物和当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

提供水凝胶层，其中水凝胶层包括离子物质；

将所述多个水性液滴和所述水凝胶层在含有两亲分子的疏水介质中放在一起，从而在水性液滴和水凝胶层之间各自形成半透膜。

每个水性液滴的体积可以为小于100pL、小于90pL、小于80pL、小于70pL、小于60pL、小于50pL、小于40pL，例如，约30pL。液滴-水凝胶阵列的密度可以为至少10液滴/mm²、至少50液滴/mm²、至少100液滴/mm²、至少200液滴/mm²、至少300液滴/mm²、至少400液滴/mm²、至少500液滴/mm²、至少600液滴/mm²、至少700液滴/mm²、至少800液滴/mm²、至少900液滴/mm²、至少1000液滴/mm²，诸如可以在微流体技术的帮助下形成的高度有序的液滴-水凝胶阵列。

在本发明的一个纳米孔阵列中，水性液滴的数量可以是4-1,000,000个。在一些实施方式中，水性液滴的数量大于10个、大于100个或大于1000个。在一些实施方式中，水性液滴的数量小于100,000个、小于10,000个或大于1000个。

对于上述单个系统或方法所描述的光源、光传感器和记录装置可用于本发明的纳米孔阵列中。如本领域技术人员所知，使用电子倍增CCD相机(ixon3，Andor)可以同时记录高达和超过2500个孔。

通过容量渗透摩尔浓度/重量渗透摩尔浓度差异放大荧光信号也适用于本发明的多重系统和多重方法的情况。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于形成纳米孔阵列的试剂盒，所述试剂盒包含：

填充性水凝胶(filling hydrogel)，其包括琼脂糖、缓冲剂和能够与荧光报告分子特异性结合以使其发射荧光的离子物质；

水溶液，其包括螯合剂、当与所述离子物质结合时能够发射荧光的所述荧光报告分子、和缓冲剂；其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；

疏水介质，其含有两亲分子；

固体支持物。

固体支持物可以具有任何适合于将水凝胶和水溶液液滴在含有两亲分子的疏水介质中放在一起并从而在水凝胶和水溶液液滴之间形成由两亲分子组成的半透膜的结构。固体支持物可以由PMMA或玻璃制成。固体支持物可以是具有如图19所示结构的PMMA测量装置。如图3和图19所示，PMMA测量装置可以在中央凹陷区域具有四个独立的液滴槽、用于填充填充性水凝胶的凝胶入口、用于排气的出口和用于支撑水凝胶的盖片(coverslip)。盖片可以是氧等离子体处理过的盖片。PMMA被称为聚甲基丙烯酸甲酯甲基丙烯酸。

试剂盒还可以包含包被水凝胶，其包括在水中的琼脂糖。为了形成纳米孔阵列，盖片可以旋涂有熔融包被水凝胶，并通过凝胶入口填充熔融填充性水凝胶而粘在PMMA测量装置上。然后将盖片浸入含有两亲分子的疏水介质中。可以将带有蛋白质纳米孔和分析物的水性液滴移液至疏水介质中进行孵育。可以将液滴和琼脂糖水凝胶在疏水介质中放在一起，DIB形式的纳米孔阵列可以自发形成。

在一些实施方式中，所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度低于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度低于水溶液的重量渗透摩尔浓度。

在一些实施方式中，荧光报告分子可以是fluo-8并且离子物质可以是Ca²⁺。

填充性水凝胶或水溶液还可以包括蛋白质纳米孔。

水溶液还可以包括盐，诸如KCl或NaCl。

此处提及的荧光报告分子、离子物质、蛋白质纳米孔、疏水介质、两亲分子、螯合剂、分析物和其他特征如本说明书的上下文中所述。

在一些实施方式中，包被水凝胶可以包括在水中的0.75％(w/v)琼脂糖。

在一些实施方式中，填充性水凝胶可以包括2.5％琼脂糖、1.5M CaCl₂和10mMHEPES，pH 7.0。

在一些实施方式中，水溶液可以包括1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mMHEPES，pH 7.0。

在一些实施方式中，含有两亲分子的疏水介质可以是脂质油，其包括溶解在体积比为1:1的十六烷和硅油的2mL混合物中的5mg DPHPC脂质的干膜(dried film)。在另一方面，本发明提供了通过上述生产方法形成的纳米孔阵列。

在另一方面，本发明提供了上述系统或上述纳米孔阵列用于光学分析物分析的用途。

除非另有说明，否则系统和方法的大部分特征在不同系统和不同方法中是相同的，诸如第一和第二隔室、第一和第二水溶液、膜、纳米孔、荧光报告分子和/或离子物质的特征，以及它们是如何形成的、如何使用它们等。除非另有说明或不可能，否则纳米孔阵列中的例如，第一和第二隔室、第一和第二水溶液、膜、纳米孔、荧光报告分子和/或离子物质的特征，以及它们是如何形成的、如何使用它们等可以如以上单个系统中所述。

在本发明中，当提及溶液中的组分时，“在第一水溶液中”和“在第一隔室中”可以互换使用，并且“在第二水溶液中”和“在第二隔室中”可以互换使用

通过参考以下具体实施方式、实施例和权利要求以及它们之前和之后的描述，可以更容易地理解这里描述的实施方式。应当理解，本文描述的实施方式不限于特定的用途、方法和/或产品。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，并不旨在进行限制。

此外，提供以下描述作为各种实施方式以能够以其最佳的、目前已知的方面进行教导。相关领域的技术人员将认识到，可以对所描述的方面进行许多改变，同时仍获得本公开内容的有益结果。还将显而易见的是通过选择各种实施方式的一些特征而不利用其他特征可以获得本发明的一些期望的益处。因此，本领域技术人员将认识到，对本文所述的各种实施方式的许多修改和改编是可能的，并且在某些情况下甚至是合乎需要的并且是本公开内容的一部分。因此，提供以下描述作为对本文所述的实施方式的原理的说明而不是对其进行限制。

在本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的系统或方法的标准差或标准误。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施方式中，特别考虑可以省略术语“约”。

在整个本说明书中应当理解，除非另有说明，否则单数形式的表达包括它们的复数的概念。因此，除非另有说明，否则例如应当理解单数冠词(例如，英语中的“a”、“an”、“the”)包括复数形式的概念。

还应理解，除非另有说明，否则本文所用术语具有本领域中通常使用的定义。因此，除非另有定义，所有科学和技术术语与本发明所属领域的技术人员通常使用的含义相同。如有矛盾，以本说明书(包括定义)为准。

本文公开的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列，均通过引用明确并入本文。

实施例

实施例1

DOP对三甲基-β-环糊精的单分子传感：概念论证的证明

根据图1d，DOP记录的基本配置包括由带有插入纳米孔的半透膜分隔的不对称电解质缓冲液。填充KCl、Fluo-8和EDTA的隔室被定义为cis侧。而填充CaCl₂的隔室被定义为trans侧。生物纳米孔形成cis侧和trans侧之间的唯一传导路径，通过通道转运的热力学扩散促进Ca²⁺和Fluo-8的结合，这是由化学梯度驱动的。FluoCa是Ca²⁺和Fluo-8的结合形式，在每个纳米孔周围发射荧光以报告传感器的开放状态。

理论上，构建有限元法(FEM)模拟，该方法改编自Poisson-Nernst-Planck-Stokes(PNPS)模型[26](方法，图2)。为了模拟实验操作，可以通过设置不同的边界条件来调整模拟参数，诸如试剂浓度的不同组合。尝试性地，通过将cis侧的边界条件设置为1.5M KCl、40μM Fluo-8、400μM EDTA，将trans侧的边界条件设置为0.75MCaCl₂以及直径为2nm的圆柱形通道几何形状来进行模拟。根据结果，在纳米孔正上方构建FluoCa的浓度梯度(图1e)。由于FluoCa同时发射的结果，预期在纳米孔的顶部有强荧光强度对比。作为TIRF成像(方法)的模拟生成的强度轮廓遵循Gaussian分布，半高全宽(FWHM)为2.670μm(图1f上图)。

实验上，在水性液滴和100nm厚的水凝胶片之间构建了液滴界面双层(DIB)(图3)。水性液滴由1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0组成。水凝胶片由0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0和2.5％(v/w)低熔点琼脂糖组成。置于水性液滴中的WTα-HL(α-HL)自发插入DIB并在TIRF成像期间显示为明亮的荧光点(图1f下图)。来自TIRF成像的代表性帧的荧光强度轮廓遵循近似Gaussian分布，FWHM为2.583μm(图1f下图)，类似于从模拟得到的。

三甲基-β-环糊精(TriM-β-CD)与WTα-HL纳米孔的限制部位(restriction)相互作用，在电生理记录过程中产生长驻留和深孔阻断事件[27-29]。这种易于观察的特性使TriM-β-CD成为具有代表性的小分子分析物，用于使用DOP进行单分子传感的概念论证。为了在DOP记录过程中保持稳定的分析物浓度，以75mM终浓度向cis侧加入TriM-β-CD。来自cis侧的TriM-β-CD结合也通过相应的电生理学测量得到验证(图4)。在DOP记录过程中，TriM-β-CD与α-HL的随机结合导致通过通道的Ca²⁺流动受限，从而在α-HL纳米孔的开放(Fo)和阻断状态(Fb)之间产生高度可区分的图像对比度(图1g)。从相应的荧光迹线(图1g)中观察到连续的孔阻断，这些迹线从连续记录的图像系列中得出(方法，图5)。为了在不同试验之间进行定量比较，在分析之前对所有荧光迹线进行校正和归一化(图6)。

从归一化的荧光迹线，单分子传感事件的特点通过事件停留时间(t_off)、事件间持续时间(t_on)和百分比阻断深度(％F_b)来表征。t_off和t_on的直方图显示了指数分布，可以分别用它们的平均时间常数τ_off和τ_on拟合和表征(图7)。通过改变cis侧中TriM-β-CD浓度，停留时间的倒数(1/τ_off)保持不变，而事件间间隔的倒数(1/τ_on)与cis侧中TriM-β-CD浓度线性相关(图1h，表1)。

表1.使用不同[TriM-β-CD]的TriM-β-CD的1/τ_on和1/τ_off。

DIB在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。将TriM-β-CD加入cis侧。进行三次独立测量以形成统计数据。

从DOP记录中，记录的平均τ_off值为0.347±0.067s和平均F_P值为0.078±0.010。此处，F_P被定义为平均阻断深度，其从每次DOP记录试验的％F_b值得出(图7)。而在+20mV电位偏倚下获得的相应电生理结果产生的τ_off值为0.386±0.392s和I_P值为0.065±0.002。此处，I_P被定义为每次电生理记录试验的平均阻断深度。对每个测量条件进行三个独立试验以形成统计数据。因此，该结果的相似性证实了DOP单分子传感的可行性(图1i)。

虽然未经证明，但其他小分子(诸如糖[30,31]、离子[32]、核苷酸[33]、神经递质[34]、氨基酸[35]等)的单分子传感原则上可以通过DOP记录类似地执行，并另外具有通量优势。由于分析物捕获是由化学梯度而不是电化学梯度驱动的，因此分析物的电荷对于DOP记录并不重要。然而，荧光发射强度和分析物结合效率可以进一步提高以比得上电生理学。

实施例2

通过定向渗透增强DOP传感

在常规电生理记录过程中，应用的电化学梯度对于驱动带电粒子(诸如离子和分析物)的持续流动至关重要。直观地说，为了在不使用电极的情况下驱动分析物定向流入纳米孔传感器，必须引入其他形式的不对称性。

DIB是由1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DphPC)脂质组成的自组装膜，可选择性渗透水分子而不是离子[36,37]。当跨DIB存在容量渗透摩尔浓度差异(C_solute＝iM_solute)时，根据Δπ＝(C_solute,cis-C_solute,trans)RT构建渗透压，其中i是无量纲van't Hoff指数，表示每个溶质分子中离解离子的数量，M_solute是溶质的摩尔浓度，R是理想气体常数，T是开尔文温度。此处，渗透压的正向被定义为从cis侧到trans侧(这是一个易于理解的定义，尽管可能是cis侧的渗透压高于trans侧)。该渗透压随后驱动水、离子和分析物定向流动穿过插入膜中的生物纳米孔[22]。因此，通过引入的这种不对称性，应该可以提高分析物的移位效率。

为了在实验上验证该假设，在DIB中进行一系列DOP记录(图3)，在cis侧中具有不同的KCl浓度(1.0-2.5M)，而trans侧中的CaCl₂浓度保持恒定(0.75M)。尝试性地再次选择α-HL和TriM-β-CD作为模型传感器和分析物，其中cis侧中TriM-β-CD的浓度固定为15mM。从代表性的DOP记录中，当cis侧中的KCl浓度从2.5M降低到1.0M时，从时间延长的荧光迹线中观察到TriM-β-CD的捕获率增强(图3)。通过评价来自独立测量的事件的1/τ_on值，观察到1/τ_on随渗透压的降低而系统性降低(图8，表2)，这表示在定向渗透流的帮助下观察到更高事件检测率。

表2.使用cis侧中不同[KCl]的TriM-β-CD的1/τ_on。

DIB在1-2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。将15mM TriM-β-CD加入cis侧。进行三次独立测量以形成统计数据。

还发现当存在从cis侧到trans侧的渗透流时，从DOP记录中观察到显著改善的荧光图像对比度。这种现象可以从在较低KCl浓度的测量条件下荧光迹线中热噪声降低中注意到(图8a，图9)。此处，从荧光迹线观察到的高热噪声是成像过程中光子计数降低的结果。

为了进一步研究DOP记录的荧光强度可以通过渗透进行调节的原因(图8c，表3)，在1-2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下进行了一组不同的实验。为避免分析物结合的干扰，省去TriM-β-CD。为了在评价荧光亮度时避免不均匀的TIRF照明或激光功率波动的干扰，引入信号背景比(SBR)值来定量比较不同的DOP记录试验(方法)。从代表性图像帧和相应的SBR值可知，当引入从cis侧到trans侧的较大渗透压时，荧光点的亮度明显增强。每个条件都包括五个独立的测量值以形成统计数据(图8c)。

表3.使用不同[KCl]的FWHM和SBR

DIB在1-2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和0.75M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。进行五次独立测量以形成统计数据。

这种现象也可以从相应的FEM模拟中观察到，该模拟通过将cis侧的边界条件设置为1-2.5M KCl、40μM Fluo-8、400μM EDTA和trans侧的边界条件设置为0.75M CaCl₂进行(图8d)。通过在模拟空间内绘制Fluo-8分布，可以清楚地发现，当存在从cis侧到trans侧的定向渗透流时，在膜的cis侧附近构建集中的Fluo-8分布。这是因为Fluo-8对脂质膜是不可渗透的，通过渗透流富集，因此荧光强度增强(图10)。

实施例3

使用放大的Ca²⁺流动进一步优化SBR

然而，通过渗透富集Fluo-8不应该发生在膜不具有半透性特征的固态纳米孔装置中。可选地，可以通过纳米孔引入更多Ca²⁺通量来改进DOP记录的SBR。遵循此策略的直接解决方案是增加trans侧中的[Ca²⁺]，其直接提高跨膜[Ca²⁺]的化学梯度。为了证实这一假设，通过逐渐上调trans侧中的CaCl₂浓度进行一系列DOP记录。为避免渗透作用的干扰，cis侧中的KCl浓度相应调整，使cis侧和trans侧的渗透压浓度始终保持等渗。

实验上，DIB在0.75M、1.5M或2.25M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)以及0.5M、1M或1.5M CaCl₂，10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。代表性图像帧显示了当使用trans侧中的[CaCl₂]较高的电解质缓冲液的组合获得时，荧光点尺寸系统地增大(图11a)。相应的2D Gaussian拟合(图11a)根据拟合幅度进行颜色编码，对这些条件下获得的荧光强度进行了更直接的比较。图11b示出了使用这些电解质组合获得的DOP记录中SBR和FWHM的定量测量，由此当膜两侧的摩尔渗透压浓度上调时，FWHM和SBR(表4)增加。每个条件包括12次独立测量值以形成统计数据。

表4.使用不同[CaCl₂]的FWHM和SBR

DIB在KCl(0.75M、1.5M和2.25M)、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和CaCl₂(0.5M、1M和1.5M)、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。进行12次独立测量以形成统计数据。

PEG是一种大分子，当溶解在中性pH值的缓冲液中时呈电中性，已被证明在电生理记录过程中通过α-HL纳米孔移位[38]。据报道，当使用更高盐浓度的电解质缓冲液进行测量时，捕获率提高，事件停留时间延长[39]。作为示范，PEG 1500被选为DOP单分子检测大分子的模型分析物。

实验上，DIB在2.25M KCl、10mM HEPES、400μM EDTA、40μM Fluo-8、20mM PEG1500、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7(trans侧中)的条件下构建。向cis侧加入20mM PEG 1500，从得出的荧光迹线中立即出现大量尖峰移位事件(图11c)。这些孔移位特征与报告的电生理数据的相似性证实PEG1500可以通过DOP记录传感，类似于TriM-β-CD所证明的。

然而，在高盐浓度的电解质缓冲液中，分析物的溶解度通常降低[39]。此外，盐浓度还受电解质在水中的最大溶解度的限制(CaCl₂：6.767M，KCl：3.408M，20℃)。为了带来更多的Ca²⁺流动，而不达到此限制，可以在DOP记录过程中引入具有更大孔径的纳米孔传感器，这已通过相应的FEM研究(方法，图11d)得到证实。根据报道的晶体学结果，直径为3.8nm的ClyA纳米孔的限制部位是α-HL直径的2.7倍[40]。ClyA及其变体得益于其大通道开放而被开发用于传感大生物大分子，诸如dsDNA或小蛋白质[40-44]。据报道，ClyA-RR是电荷优化的突变体，可以在电生理记录过程中有效地移位dsDNA [42]，被选择用于DOP记录(方法，图12)。虽然未被证明，phi29连接蛋白[45]或固态纳米孔[24,25]也是很好的候选者。

尝试性地，DIB在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。考虑到渗透压(图8)、CaCl₂浓度(图11)和孔隙迁移率[22]，选择1.5M KCl(cis)/1.5M CaCl₂(trans)的电解质组合。为了在DOP记录过程中与不同通道开口的纳米孔进行定量比较，将十二聚体ClyA-RR纳米孔和七聚体α-HL纳米孔置入液滴中，以从相同DIB同时测量。

插入时，ClyA-RR纳米孔显示为巨大且耀眼的荧光点，而α-HL纳米孔尺寸较小且强度较暗(图11e)。随引入更多的跨膜Ca²⁺流动，从使用ClyA-RR的DOP记录得出的FWHM和SBR明显优于从使用α-HL得出的FWHM和SBR(图11f，表5)。进行五次独立测量以形成统计数据。

表5.αHL和ClyA-RR纳米孔的FWHM和SBR

DIB在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5MCaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。将孔加入cis侧。进行五次独立测量以形成统计数据。

除了改进SBR外，ClyA的较大孔径也有助于增强渗透流，如FEM模拟所预测，这可能有助于为DNA移位提供驱动力(图11g和图13)。尽管在DNA移位过程中已经付出了大量努力来抵消电泳力[46]，但在DNA传感过程中，电泳力在移位过程中有效解开卷曲的DNA[9]，仍被认为是必不可少的。然而，dsDNA的长的持久长度(persisitence length)[47]和ClyA纳米孔的大开口可能降低dsDNA移位的熵屏障[48]。此外，ClyA的大前庭(vestibule)也可以以部分移位的形式容纳dsDNA，以在DOP记录过程中报告dsDNA的传感信号。

实施例4

dsDNA和ssDNA通过ClyA纳米孔的移位

实验上，DIB在1.5M KCl、10mM HEPES、400μM EDTA、40μM Fluo-8、2mM dsDNA(78bp)、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建(图14a)。DIB两侧的摩尔渗透压浓度旨在构建从cis侧到trans侧的持续渗透压。dsDNA由78bp组成(表6)，可选择地地溶解在水性液滴中，终浓度为2μM。

表6.核酸缩写和序列

注：为了形成dsDNA，将互补ssDNA(78nt ssDNA-a和b)溶解在1.5M KCl缓冲液(1.5M KCl，10mM HEPES，pH 7.0)中，在PCR热循环仪(ABI 2720)上加热至95℃并逐渐冷却(-5℃/min)至室温(25℃)。

在液滴中未加入任何dsDNA的情况下，来自ClyA纳米孔的代表性荧光迹线表现为稳定开放(open)，不具有自发门控活性(图14b)。当在液滴中加入dsDNA时，在DOP记录过程中自发出现连续的荧光阻断(图14c)。观察到的来自DOP记录的阻断显示平均F_P为0.625±0.014，并且平均τ_off为2.538±0.849s(N＝3)。这些结果表明dsDNA与ClyA-RR的相互作用在没有施加电化学梯度的情况下发生。较长的滞留时间可能是由于测量过程中没有电泳力或可能是由于dsDNA被困在ClyA的大前庭结构中。

为了通过常规电生理记录进一步验证这种现象，平面脂质膜在1.5M KCl 10mMHEPES，pH＝7.0(cis侧中)和1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH＝7.0(trans侧中)的条件下构建。将78bp dsDNA加入cis侧，终浓度为2μM。施加极低电压作为跨膜电位严格为零的DOP记录的模拟。图14d显示了分别在+6mV、+4mV或+2mV跨膜电位下记录的代表性电生理学迹线。监测从DOP记录中观察到的类似移位事件，这证实了我们的假设，即在没有电极的情况下进行光学监测时，dsDNA可以与ClyA相互作用并产生可检测的传感信号。I_P值在+6mV下为0.611±0.357，在+4mV下为0.605±0.460，在+2mV下为0.786±0.224，也与从DOP记录中观察到的阻断定性一致(图15，表7)。在电生理记录过程中，停留时间广泛分布在1至10⁵ms，而由于DOP记录的采集带宽有限，无法通过光学方式检测到低于30ms的快速事件(图14d)。

表7.dsDNA移位的阻断水平。

DIB在1.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0(cis侧中)和1.5MCaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0(trans侧中)的条件下构建。将2μM dsDNA加入cis侧。进行三次独立测量以形成统计数据。

为了进一步验证ssDNA通过纳米孔的移位，使用α-HL纳米孔进行无电极20-ntssDNA传感。结果如图17所示。使用仅允许ssDNA通过但不允许dsDNA通过的αHL WT纳米孔。由于该纳米孔相对较小，因此使用高浓度50μmol/L ssDNA。百分比阻断深度表明20-ntssDNA能够通过α-HL纳米孔。

进行另一种使用ClyA-RR的无电极78-nt ssDNA传感，结果如图18所示。ClyA-RR具有更大的孔径并允许ssDNA和dsDNA通过。对于ssDNA，由于ssDNA在通过纳米孔时可能不是完全直的，因此ssDNA的序列和二级结构显著影响荧光发射特性。78-nt ssDNA-a和poly A₇₈表现出非常不同的荧光发射特性。Poly A₇₈具有均匀且较浅的百分比阻断深度。78-ntssDNA-a具有不同百分比的阻断深度和较长的事件停留时间。表明ssDNA可以通过DOP传感。

实施例5

使用指尖大小的装置进行多重DOP记录和未来前景

通过省去电极配置的需要，DOP使装置尺寸更紧凑，同时仍保留低成本(<1$)和高通量的优势。该配置适用于生产一次性纳米孔芯片用于交叉污染应严格禁止的临床诊断。作为概念证明，小型化装置(10mm×10mm×1mm)由本体聚甲基丙烯酸甲酯甲基丙烯酸(PMMA)制成(图16a，图2)。DOP记录可以通过将芯片直接置于TIRF物镜上方进行，该物镜用于照明和成像。作为示范，使用这种小型化装置从α-HL和ClyA进行DOP记录，其中α-HL和ClyA都可以进行视觉监测(图16c)。

然而，来自单个DIB的DOP测量限于孔和分析物的一种组合。通过省去容纳电极的需要，DOP能够以极其简单的配置和大大减少的测量体积从不同的DIB进行多重记录，其中不同的分析物可以在物理上被分离到各种油包水隔室中。

作为概念证明，产生含有ClyA-RR纳米孔的微滴(～30pL)并将其移液至填充有脂质油溶液的测量储液器中(图16d)。尽管在大小上不是单分散的，但许多独立的DIB可以自发形成，以非常轻松地进行后续DOP记录(图16e)。在直径约为40μm的DIB中，明确观察到单个插入的ClyA纳米孔作为明亮的荧光点(图16f)，在液滴中的EDTA因Ca²⁺结合而耗竭之前持续～10分钟。这对应于10³个独立DIB/mm²的有效测量密度，诸如可以在微流体装置的帮助下形成的高度有序的DIB阵列[49]。然而，由于电子集成的复杂性，oSCR或电生理学无法轻松实现这种高测量密度。

尽管具有无电极的优势，但DiffusiOptoPhysiology并非没有限制。作为一种荧光成像技术，在全视场(135μm×135μm)中记录时，DOP的时间分辨率通常限于每帧～10ms。从减少的图像像素中读取荧光可以立即提高采集速度。随着高度有序的纳米孔阵列的可寻址性得到改善，高速DOP记录可以通过旋转磁盘共聚焦成像进行[50]。在没有电场的情况下，DOP期间的检测限(LOD)通常高于电生理学或oSCR的检测限(～μM)(低至～nM)。然而，由于不用容纳电极，所补偿的是需要更小的测量体积(低至～30pL)，这实际上降低了样品绝对成本。

结论

总之，我们已经证明了如何从自然被动通道转运中获得灵感将DiffusiOptoPhysiolgy用作纳米孔传感平台。虽然DOP记录过程中的荧光发射是由被动扩散以及随后Ca²⁺和Fluo-8的结合触发的，但如所证明的，荧光强度足以满足各种单分子传感应用的需求。在结合电解质和通道尺寸的优化后，该技术可实现高通量纳米孔测量，同时传感性能仍可与传统电生理记录或oSCR相媲美。尽管使用全内反射荧光(TIRF)显微术进行了证明，但DOP原则上可以灵活使用任何荧光平台，诸如共聚焦或落射荧光显微术。无需空间以容纳电极，DOP的测量体积进一步减少到～30pL，这是有史以来报告的最低记录，可能适用于测量丰度极低的分析物。使用微滴阵列记录DOP还可以从独立隔室进行多重测量，这些隔室从油包水分离简单构建。虽然拥有集成纳米技术传感器作为芯片，但省去电子器件显著降低了成本和装置的尺寸。因此，该方案可启示在各种应用中使用一次性纳米孔芯片的未来临床应用。

方法

材料

十六烷、硅油AR20、戊烷、乙二胺四乙酸(EDTA)、Triton X-100、Genapol X-80和PEG1500来自Sigma-Aldrich。氯化钾、氯化钙、氯化镁和氯化钠来自Aladdin。不含二恶烷的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、十二烷基β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)、硫酸卡那霉素、三甲胺甲烷(Tris)和咪唑来自Solarbio。低熔点琼脂糖和宽范围DNA ladder(20-500bp)来自Takara。Precision plus蛋白质标志物和4-15％聚丙烯酰胺凝胶来自Bio-Rad。乙醇和丙酮来自Sinopharm。Fluo-8H钠盐(Fluo-8)来自AAT Bioquest。1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPhPC)来自Avanti Polar Lipids。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)购自Shanghai Yuanye Bio-Technology。大肠杆菌菌株BL21(DE3)来自BioMed。三甲基-β-环糊精来自Tokyo chemical industry(Shanghai)。LB肉汤和LB琼脂来自Hopebio。以上列出的所有物品均按原样使用。

KCl缓冲液(1-2.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0)和CaCl₂缓冲液(0.5-1.5MCaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0)经过膜过滤(0.2μm醋酸纤维素，Nalgene)。为简单起见，如果没有另外说明，否则1-2.5M KCl缓冲液代表1-2.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0。0.5-1.5M CaCl₂缓冲液代表0.5-1.5M CaCl₂、10mM HEPES，pH 7.0。KCl缓冲液在使用前用Chelex 100树脂(Bio-Rad)处理过夜，以去除污染的二价离子。

使用前，将高效液相色谱(HPLC)纯化的DNA(表6)溶解在不含DNase/RNase的水中。为了形成dsDNA，互补ssDNA进一步溶解在1.5M KCl缓冲液(1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0)中，在PCR热循环仪(ABI 2720)上加热至95℃并逐渐冷却(-5℃/min)至室温(25℃)。

本文中使用的蛋白质纳米孔是α-HL WT和ClyA-RR(图7)，它们在大肠杆菌中表达并根据已发表的方案进行纯化[22,42]。

ClyA-RR制备

定制合成编码单体ClyA-RR(D64R/C87A/L99Q/E103G/S110R/F166Y/I203V/C285S/K294R/H307Y)蛋白的基因并构建在pET 30a(+)质粒(Genescript,New Jersey)中。在蛋白质的c端引入六组氨酸标签，用于后续的层析纯化。将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上培养18小时。将单菌落接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下培养至OD₆₀₀达到4.0。通过将异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入LB培养基中以达到1mM终浓度以诱导蛋白质表达。将培养基在15℃下进一步振荡(200rpm)16小时。然后通过离心(4000rpm，4℃，20min)收获细胞。收集沉淀并重悬在裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris·HCl、10％甘油，pH 8.0)中，超声裂解(15min)并离心(14,000rpm，4℃，40min)以去除完整的细胞。注射器过滤后，将上清液加载到镍亲和柱(HisTrapTM HP，GE Healthcare)上。用洗涤缓冲液A(150mM NaCl、50mM Tris·HCl、10％甘油、20mM咪唑，pH 8.0)洗涤柱后，使用三种洗涤缓冲液(缓冲液B：500mM NaCl、15mM Tris·HCl、10％甘油、300mM咪唑，pH8.0；缓冲液C：500mM NaCl、15mM Tris·HCl、10％甘油、50mM咪唑，pH 8.0；缓冲液D：500mM NaCl、15mM Tris·HCl、10％甘油、20mM咪唑，pH 8.0)洗脱目标蛋白质。含有ClyA-RR单体的洗脱部分使用SDS-PAGE凝胶电泳(图12)测定并在-80℃下储存在270mM NaCl、50mM Tris-HCl、10％甘油、0.2％Triton 100，pH 8.0缓冲液中。

根据先前的研究[42]，加入0.25％(w/v)β-十二烷基麦芽糖苷(DDM)以促进孔低聚化。在25℃下孵育15min后，孔低聚化的结果通过使用4-15％聚丙烯酰胺凝胶的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE，Bio-Rad)表征(图12)。凝胶显示单体在加入DDM之前已经自组装成低聚物。然而，为了严格遵循先前的研究[42]，加入DDM的ClyA-RR十二聚体仍用于后续测量。此处，将对应于十二聚体ClyA-RR的条带从凝胶上切下并浸泡在150mM NaCl、15mMTris·HCl，pH 7.5(补充有0.2％DDM和10mM EDTA)中3小时。通过离心(20,000g，4℃，20min)收集含有从凝胶中扩散出的十二聚体蛋白的上清液。收集的十二聚体ClyA-RR蛋白立即用于后续实验，或在4℃下储存长达14天。

DIB形成

先前报道了有关如何创建液滴/水凝胶双层的详细描述[10]。简而言之，用200μL熔融琼脂糖(0.75％w/v，在Mili Q水中)旋涂(3000rpm，30s)经氧等离子体处理的盖片(24mm×40mm)。通过用熔融琼脂糖(2.5％w/v，在CaCl₂缓冲液中)填充装置内的微流体通道，将盖片固定在PMMA装置上[10]。通过将5mg DPHPC脂质的干膜溶解在体积比为1:1的2mL十六烷和硅油的混合物中，制备脂质/油溶液。当浸入脂质-油溶液中时，在涂有琼脂糖的玻璃盖片上形成脂单层。在制备水性液滴时，可以将蛋白质纳米孔和其他分析物加入由1M-2.5M KCl、400μM EDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0组成的水性缓冲液中。将不同体积的水性液滴移液至脂质/油溶液中孵育。5min后，可以在水-油界面形成自组装脂质单层。当将该液滴和琼脂糖基质在脂质/油溶液中放在一起时，可以自发形成稳定的双层(DIB)。

TIRF成像和光学记录

使用配有60倍油浸TIRF物镜(NA＝1.49，Plan Apo，Nikon)的倒置显微镜(EclipseTi-U，Nikon)对DIB成像。用473nm二极管泵浦固态(DPSS)激光器(100mW，Changchun NewIndustries Optoelectronics Technology)激发荧光。图像使用电子倍增CCD相机(iXon3897,Andor)获得。曝光时间设置为3-30ms。最大视场为135μm×135μm。

电学记录

按照先前报道8进行电生理记录。电生理迹线以25kHz采样率采集，以1kHz低通滤波(Axopatch 200B，Molecular Devices)，使用Digidata 1550A数字化仪(MolecularDevices)进行数字化和记录。随后的数据分析使用Clampfit 10.7(Molecular Devices)进行。

有限元建模(FEM)模拟

Ca²⁺与钙指示剂染料Fluo-8结合导致孔附近的荧光发射。过量Ca²⁺与EDTA结合，导致荧光背景降低。这两个完全反应可以以等式(1,2)进行描述，其中α和β分别代表正向和反向结合率。

光学单通道记录(oSCR)可以使用Poisson-Nernst-Planck-Stokes(PNPS)模型通过FEM进行模拟[24,26]，其中Nernst-Planck-Stokes等式在等式(3)中描述。

在无电极oSCR的情况下，电位V在模拟空间内设置为恒定。因此，等式(3)被进一步简化(等式(4))，其中离子的运动仅由被动扩散、化学反应和流体流动驱动。

其中，[c_i]代表不同离子物质的浓度。R_i代表化学反应项(chemical reactionterm)，u代表流体速度。游离Ca²⁺可以与Fluo-8或EDTA结合，如等式(1,2)中所描述。

对于不同的离子，等式(4)进一步扩展，其中离子的身份由相应的脚注注释，如等式(5-10)所述。其中，FluoCa和EDTACa分别代表Fluo-8和EDTA与Ca²⁺的结合形式。

标准PNPS模型中的静电位由Poisson等式控制，如等式(11)所述：

然而，在无电极oSCR过程中，电位V在模拟空间内是恒定的，因此等式简化为等式(12)：

z_Ca[Ca²⁺]+z_k[K⁺]+z_Cl[Cl^-]＝0 (12)

模拟参数主要获自文献[26]。其中D是扩散常数(D_Fluo＝D_FluoCa＝15μm² s^-1,D_k＝D_cl＝D_Ca＝D_EDTA＝D_EDTACa＝200μm² s^-1)。z是电荷数(z_Ca＝+2,z_k＝+1,z_cl＝-1)。F是Faraday常数。k_b是Boltzmann常数。T是温度(300k)。V是电位。α为正向结合速率(α_E＝5μM^-1s^-1,α_F＝150s^-1)。β为反向结合速率(β_E＝0.75μM^-1s^-1,β_F＝450s^-1)。脚注_E和_F分别代表EDTA和Fluo-8。ε是水的介电常数介电常数。cis侧的边界条件设置为不同的KCl浓度(0.5M至2.5M)，而trans侧的边界条件设置为0.75M CaCl₂。

Comsol 5.3a对不同模拟条件下离子的稳态分布进行了数值解析。简而言之，轴对称模拟几何被定义为由半透膜分隔的两个半球空间，其中半透膜仅允许液体而不是离子通过(图2)。分别代表cis侧和trans侧的两个半球通过膜上的圆柱形纳米孔连接，其中允许液体和离子自由通过。

在TIRF模式下照明时，激发强度在z方向呈指数衰减。为了模拟投影x-y平面中的荧光强度，使用等式(13)，其中γ是z方向上的消逝波衰减常数：

而总荧光强度根据等式(14)估计：

F_Total＝∫∫F(x,y)dxdy (14)

2DGaussian拟合

在无电极oSCR过程中，显示为亮点的荧光强度轮廓符合等式(15)的2D Gaussian分布：

其中，f(x,y)代表x-y平面中拟合的荧光强度。z₀代表基础水平，“A”代表拟合幅度，x_c和y_c代表拟合的质心。σ_x和σ_y分别代表x和y方向分布的标准差。

此函数允许对具有亚像素分辨率的跟踪点进行位置定位。2DGaussian函数的全宽半幅(FWHM)描述了其半高处的宽度，可用于评价光点大小。其中使用MATLAB中的cftool模块进行2DGaussian拟合(图5)。FWHM由等式(16)得出：

我们将直径为2FWHM的圆圈中的像素定义为信号，将直径为3FWHM和4FWHM的圆圈之间圆环中的像素定义为背景(图5)。

信号背景比(SBR)评价

引入SBR值是为了从不同的DOP记录试验中定量评价DOP记录的性能。SBR值计算如下：

其中，peak(sig)是从2D Gaussian拟合(图5)获得的信号的峰值幅度(A+z₀)。mean(bkg)是背景(z₀)的平均像素强度。std(bkg)是背景像素强度的标准差。信号和背景的定义如图5所示。

参考文献

1.André,B.An overview of membrane transport proteins in Saccharomycescerevisiae.Yeast 11,1575-1611(1995).

2.Gouaux,E.&MacKinnon,R.Principles of selective ion transport inchannels and pumps.Science 310,1461-1465(2005).

3.Nielsen,S.et al.Specialized membrane domains for water transport inglial cells:high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4in ratbrain.Journal of Neuroscience 17,171-180(1997).

4.Wood,I.S.&Trayhurn,P.Glucose transporters(GLUT and SGLT):expandedfamilies of sugar transport proteins.British Journal of Nutrition 89,3-9(2003).

5.Choi,K.H.et al.Insight into DNA and protein transport in double-stranded DNA viruses:the structure of bacteriophage N4.Journal of molecularbiology 378,726-736(2008).

6.Bressloff,P.C.&Newby,J.M.Stochastic models of intracellulartransport.Rev Mod Phys 85,135-196(2013).

7.Deamer,D.,Akeson,M.&Branton,D.Three decades of nanoporesequencing.Nat Biotechnol 34,518-524(2016).

8.Huang,S.Nanopore-based sensing devices and applications to genomesequencing:a brief history and the missing pieces.Chin.Sci.Bull.59,4918-4928(2014).

9.Kasianowicz,J.J.,Brandin,E.,Branton,D.&Deamer,D.W.Characterizationof individual polynucleotide molecules using a membrane channel.P Natl AcadSci USA 93,13770-13773(1996).

10.Bayley,H.et al.Droplet interface bilayers.Mol Biosyst 4,1191-1208(2008).

11.Sapra,K.T.&Bayley,H.Lipid-coated hydrogel shapes as components ofelectrical circuits and mechanical devices.Sci Rep-Uk 2,848(2012).

12.Li,J.et al.Ion-beam sculpting at nanometre length scales.Nature412,166-169(2001).

13.Zhang,B.et al.Bench-top method for fabricating glass-sealednanodisk electrodes,glass nanopore electrodes,and glass nanopore membranes ofcontrolled size.Anal Chem 79,4778-4787(2007).

14.Geng,J.et al.Stochastic transport through carbon nanotubes inlipid bilayers and live cell membranes.Nature 514,612(2014).

15.Chou,L.Y.,Ming,K.&Chan,W.C.Strategies for the intracellulardelivery of nanoparticles.Chemical Society Reviews 40,233-245(2011).

16.Barry,R.J.,Clarke,A.R.&Johnstone,S.J.A review of electrophysiologyin attention-deficit/hyperactivity disorder:I.Qualitative and quantitativeelectroencephalography.Clinical neurophysiology 114,171-183(2003).

17.Dunlop,J.,Bowlby,M.,Peri,R.,Vasilyev,D.&Arias,R.High-throughputelectrophysiology:an emerging paradigm for ion-channel screening andphysiology.Nat Rev Drug Discov 7,358-368(2008).

18.Jain,M.et al.Nanopore sequencing and assembly of a human genomewith ultra-long reads.Nat Biotechnol 36,338-+(2018).

19.Letellier,L.,

L.,Bonhivers,M.&Boulanger,P.Phage DNAtransport across membranes.Research in microbiology 150,499-505(1999).

20.Song,L.et al.Structure of staphylococcalα-hemolysin,a heptamerictransmembrane pore.Science 274,1859-1865(1996).

21.Huang,S.,Romero-Ruiz,M.,Castell,O.K.,Bayley,H.&Wallace,M.I.High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array.Nat Nano 10,986-U996(2015).

22.Wang,Y.Q.et al.Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of BiologicalNanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing.Acs Appl Mater Inter 10,7788-7797(2018).

23.Heron,A.J.,Thompson,J.R.,Cronin,B.,Bayley,H.&Wallace,M.I.Simultaneous measurement of ionic current and fluorescence from singleprotein pores.J.Am.Chem.Soc 131,1652-1653(2009).

24.Anderson,B.N.et al.Probing solid-state nanopores with light forthe detection of unlabeled analytes.Acs Nano 8,11836-11845(2014).

25.Ivankin,A.et al.Label-Free Optical Detection of BiomolecularTranslocation through Nanopore Arrays.Biophys J 108,331a-331a(2015).

26.Shuai,J.&Parker,I.Optical single-channel recording by imaging Ca2+flux through individual ion channels:theoretical considerations and limits toresolution.Cell Calcium 37,283-299(2005).

27.Gu,L.Q.,Braha,O.,Conlan,S.,Cheley,S.&Bayley,H.Stochastic sensingof organic analytes by a pore-forming protein containing a molecularadapter.Nature 398,686-690(1999).

28.Gu,L.Q.,Cheley,S.&Bayley,H.Capture of a single molecule in ananocavity.Science 291,636-640(2001).

29.Kang,X.F.,Cheley,S.,Guan,X.Y.&Bayley,H.Stochastic detection ofenantiomers.J Am Chem Soc 128,10684-10685(2006).

30.Bayley,H.&Cremer,P.S.Stochastic sensors inspired by biology.Nature413,226(2001).

31.Fennouri,A.et al.Kinetics of enzymatic degradation of highmolecular weight polysaccharides through a nanopore:experiments and data-modeling.Anal Chem 85,8488-8492(2013).

32.Braha,O.et al.Simultaneous stochastic sensing of divalent metalions.Nat Biotechnol 18,1005(2000).

33.Clarke,J.et al.Continuous base identification for single-moleculenanopore DNA sequencing.Nat Nanotechnol 4,265(2009).

34.Boersma,A.J.,Brain,K.L.&Bayley,H.Real-time stochastic detection ofmultiple neurotransmitters with a protein nanopore.Acs Nano 6,5304-5308(2012).

35.Boersma,A.J.&Bayley,H.Continuous stochastic detection of aminoacid enantiomers with a protein nanopore.Angewandte Chemie 124,9744-9747(2012).

36.Sacerdote,M.&Szostak,J.Semipermeable lipid bilayers exhibitdiastereoselectivity favoring ribose.Proceedings of the National Academy ofSciences 102,6004-6008(2005).

37.Raghunathan,A.&Aluru,N.Molecular understanding of osmosis insemipermeable membranes.Phys Rev Lett 97,024501(2006).

38.Robertson,J.W.et al.Single-molecule mass spectrometry in solutionusing a solitary nanopore.Proceedings of the National Academy of Sciences104,8207-8211(2007).

39.Rodrigues,C.G.,Machado,D.C.,Chevtchenko,S.F.&Krasilnikov,O.V.Mechanism of KCl enhancement in detection of nonionic polymers bynanopore sensors.Biophys J 95,5186-5192(2008).

40.Soskine,M.et al.An engineered ClyA nanopore detects folded targetproteins by selective external association and pore entry.Nano letters 12,4895-4900(2012).

41.Biesemans,A.,Soskine,M.&Maglia,G.A Protein Rotaxane Controls theTranslocation of Proteins Across a ClyA Nanopore.Nano letters 15,6076-6081(2015).

42.Franceschini,L.,Brouns,T.,Willems,K.,Carlon,E.&Maglia,G.DNATranslocation through Nanopores at Physiological Ionic Strengths RequiresPrecise Nanoscale Engineering.Acs Nano 10,8394-8402(2016).

43.Franceschini,L.,Soskine,M.,Biesemans,A.&Maglia,G.A nanoporemachine promotes the vectorial transport of DNA across membranes.Naturecommunications 4,2415(2013).

44.Soskine,M.,Biesemans,A.&Maglia,G.Single-Molecule AnalyteRecognition with ClyA Nanopores Equipped with Internal ProteinAdaptors.Journal of the American Chemical Society 137,5793-5797(2015).

45.Wendell,D.et al.Translocation of double-stranded DNA throughmembrane-adapted phi29 motor protein nanopores.Nat Nanotechnol 4,765(2009).

46.Manrao,E.A.Reading DNA at single-nucleotide resolution with amutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase.Nature Biotechnol.30,349-353(2012).

47.Tinland,B.,Pluen,A.,Sturm,J.&Weill,G.Persistence length of single-stranded DNA.Macromolecules 30,5763-5765(1997).

48.Nomidis,S.K.,Hooyberghs,J.,Maglia,G.&Carlon,E.DNA capture into theClyA nanopore:diffusion-limited versus reaction-limited processes.Journal ofPhysics:Condensed Matter(2018).

49.Chen,Z.T.et al.Centrifugal micro-channel array droplet generationfor highly parallel digital PCR.Lab Chip 17,235-240(2017).

50.Nakano,A.Spinning-disk confocal microscopy—a cutting-edge toolfor imaging of membrane traffic.Cell structure and function 27,349-355(2002).

Claims (106)

1.一种用于识别分析物的无电极的系统，所述系统包括：

(a)第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的所述离子物质；和

(c)膜，其分隔所述第一隔室和所述第二隔室；

其中所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜具有至少一个插入的纳米孔，使得所述第一隔室和所述第二隔室通过所述纳米孔连接；

其中在所述第一隔室和所述第二隔室之间存在所述离子物质的化学梯度，其可以驱动所述离子物质通过所述纳米孔从所述第二隔室扩散到第一隔室。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述膜是固体膜。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述膜是半透膜。

4.根据权利要求3所述的系统，其中所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

5.根据权利要求3或4所述的系统，其中所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

6.根据权利要求3或4所述的系统，其中所述半透膜是由两亲分子组成的双层；优选地，所述两亲分子是脂质。

7.根据权利要求6所述的系统，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

8.根据权利要求6所述的系统，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中所述第一隔室由水性液滴提供。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，其中所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

12.根据权利要求11所述的系统，其中所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道；优选地，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr^{3 +}、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统，其中所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、CalciumGreen-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUMGreen-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

16.根据权利要求15所述的系统，其中所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的系统，其中所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括用于照明的光源和用于检测荧光的光传感器；优选地，所述光源是激光、LED、卤素灯、氙气灯；优选地，所述光传感器是CCD、sCMOS传感器、光电二极管；更优选地，所述光传感器是EMCCD或雪崩光电二极管。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括用于全内反射荧光(TIRF)、宽视场荧光显微术或共焦显微术的装置。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的系统，其中所述第一水溶液或所述第二水溶液包括所述分析物。

21.根据权利要求20所述的系统，其中所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

22.根据权利要求20所述的系统，其中所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

23.一种识别分析物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求1-22中任一项所述的系统，其中在所述第一隔室或所述第二隔室中提供所述分析物；

(b)将能够激发所述荧光报告分子的光施加到所述第一隔室中邻近所述纳米孔的区域；

(c)测量来自所述荧光报告分子的荧光信号以识别所述分析物。

24.一种生产无电极的系统的方法，包括：

(a)提供第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)提供第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的所述离子物质；

(c)将所述第一隔室和所述第二隔室在含有两亲分子的疏水介质中放在一起，使得在所述第一隔室和所述第二隔室之间形成具有插入的纳米孔的半透膜；

其中在所述第一水溶液或所述第二水溶液中提供蛋白质纳米孔。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

26.根据权利要求24或25所述的系统，其中所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述第一隔室由水性液滴提供。

30.根据权利要求2-29中任一项所述的方法，其中所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道；优选地，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

33.根据权利要求24-32中任一项所述的方法，其中所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr^{3 +}、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

34.根据权利要求24-33中任一项所述的方法，其中所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、CalciumGreen-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUMGreen-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

35.根据权利要求24-34中任一项所述的方法，其中所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

38.一种用于识别多种分析物的无电极的纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包括平行的多个系统并且每个系统包括：

(a)第一隔室，在所述第一隔室中具有第一水溶液，其中所述第一水溶液包括当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)第二隔室，在所述第二隔室中具有第二水溶液，其中所述第二水溶液包括特异性结合所述荧光报告分子的所述离子物质；和

(c)膜，其分隔所述第一隔室和所述第二隔室；

其中在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜具有至少一个插入的纳米孔，使得所述第一隔室和所述第二隔室通过每个系统中的所述纳米孔连接；

其中在每个系统中，在所述第一隔室和所述第二隔室之间存在所述离子物质的化学梯度，其可以驱动所述离子物质通过所述纳米孔从所述第二隔室扩散到第一隔室；

其中所述多个系统被配置成使得可以区分每个系统的测量荧光。

39.根据权利要求38所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室系统之间的所述膜是固体膜。

40.根据权利要求38所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第一隔室和所述第二隔室之间的所述膜是半透膜。

41.根据权利要求40所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度高于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度等于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述第二水溶液的容量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述第二水溶液的重量渗透摩尔浓度低于所述第一水溶液的重量渗透摩尔浓度。

42.根据权利要求40或41所述的纳米孔阵列，其中所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

43.根据权利要求40或41所述的纳米孔阵列，其中所述半透膜是由两亲分子组成的双层；优选地，所述两亲分子是脂质。

44.根据权利要求43所述的纳米孔阵列，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

45.根据权利要求43所述的纳米孔阵列，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

46.根据权利要求38-45中任一项所述的纳米孔阵列，其中所述多个系统的所述第一隔室彼此分开。

47.根据权利要求46所述的纳米孔阵列，其中每个系统的所述第一隔室由水性液滴提供。

48.根据权利要求38-46中任一项所述的纳米孔阵列，其中所述多个系统的所述第二隔室是单个隔室。

49.根据权利要求48所述的纳米孔阵列，其中每个系统的所述第二隔室由水凝胶层提供；优选地，所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；更优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

50.根据权利要求49所述的纳米孔阵列，其中所述多个系统的所述第二隔室由单个水凝胶层提供。

51.根据权利要求38-50中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

52.根据权利要求51所述的纳米孔阵列，其中所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道；优选地，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

53.根据权利要求38-52中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

54.根据权利要求38-53中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、Asante Potassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

55.根据权利要求38-54中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第二水溶液包括氯化钙和任选的缓冲剂。

56.根据权利要求55所述的纳米孔阵列，其中在每个体系中，所述第二水溶液中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

57.根据权利要求38-56中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第一水溶液包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

58.根据权利要求38-57中任一项所述的纳米孔阵列，其中所述阵列进一步包括用于照明的光源和用于检测荧光的光传感器；优选地，所述光源是激光、LED、卤素灯、氙气灯；优选地，所述光传感器是CCD、sCMOS传感器、光电二极管；更优选地，所述光传感器是EMCCD或雪崩光电二极管。

59.根据权利要求58所述的纳米孔阵列，其中所述阵列进一步包括用于全内反射荧光(TIRF)、宽视场荧光显微术或共焦显微术的装置。

60.根据权利要求38-59中任一项所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述第一水溶液或所述第二水溶液包括所述分析物。

61.根据权利要求60所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

62.根据权利要求60所述的纳米孔阵列，其中在每个系统中，所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

63.根据权利要求60-62中任一项所述的纳米孔阵列，其中不同的分析物被物理上分开到各种系统中。

64.根据权利要求38-63中任一项所述的纳米孔阵列，其中所述纳米孔阵列中所述系统的密度为10-1000个/mm²，

65.根据权利要求38-64中任一项所述的纳米孔阵列，其中由所述多个系统提供的总面积为1-100mm²。

66.一种用于识别多种分析物的多重方法，所述方法包括：

(a)提供根据权利要求38-65中任一项所述的纳米孔阵列，其中在所述纳米孔阵列的各种系统中提供两种或更多种分析物；

(b)将能够激发所述第一隔室中各自包含的所述荧光报告分子的光信号施加到多个第一隔室中邻近所述纳米孔的区域；

(c)测量来自每个系统中包含的所述荧光报告分子的多个荧光信号以识别所述多种分析物。

67.一种生产无电极的纳米孔阵列的方法，包括：

(a)提供多个水性液滴，其中所述水性液滴各自包括第一水溶液，所述第一水溶液包括蛋白质纳米孔、分析物和当与离子物质结合时能够发射荧光的荧光报告分子；

(b)提供水凝胶层，其中所述水凝胶层包括所述离子物质；

(c)将所述多个水性液滴和所述水凝胶层在包括两亲分子的疏水介质中放在一起，使得在所述水性液滴和所述水凝胶层之间各自形成半透膜。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度高于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度高于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度；或者所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度等于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度等于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度；或者所述水凝胶的容量渗透摩尔浓度低于每个水性液滴的容量渗透摩尔浓度或所述水凝胶的重量渗透摩尔浓度低于每个水性液滴的重量渗透摩尔浓度。

69.根据权利要求67或68所述的系统，其中所述半透膜由两亲分子组成；优选地，所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

71.根据权利要求69所述的方法，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中所述水凝胶层包括0.1-20％(w/v)琼脂糖；优选地，所述水凝胶层包括2-5％(w/v)琼脂糖。

73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

74.根据权利要求73所述的方法，其中每个水性液滴中的所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道；优选地，每个水性液滴中的所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述水凝胶层中的所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

76.根据权利要求67-75中任一项所述的方法，其中每个水性液滴中的所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、AsantePotassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

77.根据权利要求67-76中任一项所述的方法，其中所述水凝胶层包括氯化钙和任选的缓冲剂。

78.根据权利要求77所述的方法纳米孔阵列，其中所述水凝胶层中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

79.根据权利要求67-78中任一项所述的方法，其中每个水性液滴包括螯合剂和任选的缓冲剂，其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；优选地，所述螯合剂是EDTA、BAPTA、EGTA、CyDTA、DTPA、EDDP、HIDA、IDA、NTA、NTPO、TTHA、CA、TA、GA、HEDTA或DEG。

80.根据权利要求67-79中任一项所述的方法，其中每个水性液滴中的所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

81.根据权利要求67-79中任一项所述的方法，其中每个水性液滴中的所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

82.根据权利要求67-81中任一项所述的方法，其中不同的分析物在各种系统中提供。

83.根据权利要求67-82中任一项所述的方法，其中所述水性液滴的数量为4-1,000,000个；优选地，所述水性液滴的数量为10-1000个。

84.根据权利要求1-22所述的系统用于光学分析物分析的用途。

85.根据权利要求38-65所述的纳米孔阵列用于光学分析物分析的用途。

86.根据权利要求24-37中任一项所述的方法，其中所述分析物在所述第一水溶液或所述第二水溶液中提供。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述分析物选自由小分子、大分子和生物大分子组成的组。

88.根据权利要求86所述的系统，其中所述分析物选自由以下组成的组：化合物、药物、糖、离子、神经递质、氨基酸、核苷酸、聚合物、多肽、多糖和多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或RNA；更优选地，所述DNA是dsDNA或ssDNA；更优选地，所述RNA是miRNA、siRNA或tRNA。

89.根据权利要求38-65中任一项所述的纳米孔阵列，其中所述多个系统的数量为4-1,000,000个；优选地，所述多个系统的数量为10-1000个。

90.提供了一种用于形成纳米孔阵列的试剂盒，所述试剂盒包含：

填充性水凝胶，其包括琼脂糖、缓冲剂和能够与荧光报告分子特异性结合以使其发射荧光的离子物质；

水溶液，其包括螯合剂、当与所述离子物质结合时能够发射荧光的所述荧光报告分子、和缓冲剂；其中所述螯合剂能够与所述离子物质结合；

疏水介质，其含有两亲分子；

固体支持物。

91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度高于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度等于所述水溶液的重量渗透摩尔浓度；或者所述填充性水凝胶的容量渗透摩尔浓度低于所述水溶液的容量渗透摩尔浓度或所述填充性水凝胶的重量渗透摩尔浓度低于水溶液的重量渗透摩尔浓度。

92.根据权利要求90或91的试剂盒，其中所述两亲分子是脂质或三嵌段共聚物。

93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、异戊烯醇脂、糖脂质、聚酮、磷脂、糖脂和胆固醇。

94.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述脂质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：单油酸甘油酯；1,2-二油酰基-sn-甘油基-S-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPhPC)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；l-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺；l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPE/POPG)混合物；及其混合物。

95.根据权利要求90-94中任一项所述的试剂盒，其中所述水溶液还包括蛋白质纳米孔。

96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述纳米孔选自由蛋白质纳米孔、DNA纳米孔或固体纳米孔组成的组。

97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述蛋白质纳米孔是选自由以下组成的组中的一种或更多种：α-HL、ClyA、Phi29连接蛋白、气单胞菌溶素、MspA、OmpF、OmpG、FraC、HlyA、SheA、sp1及其变体；和离子通道；优选地，所述蛋白质纳米孔是ClyA-RR或α-HL。

98.根据权利要求90-97中任一项所述的试剂盒，其中所述水凝胶层中的所述离子物质是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Ag⁺、Ag²⁺、Al³⁺、As³⁺、Au⁺、Ba²⁺、Bi³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ce^{3 +}、Ce⁴⁺、Cl^-、Co²⁺、Cr³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Fe2⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、H⁺、Hg⁺、Hg²⁺、In³⁺、K⁺、La³⁺、Mg²⁺、Mn^{2 +}、Mo³⁺、Na⁺、Ni²⁺、OH^-、Pb²⁺、Pd²⁺、Pt²⁺、Pt⁴⁺、Ru³⁺、Sb³⁺、Sc³⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Tb³⁺、Tl⁺和Zn²⁺。

99.根据权利要求90-98中任一项所述的试剂盒，其中每个水性液滴中的所述荧光报告分子是选自由以下组成的组中的一种或更多种：Fura-2、Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、DCFH、DHR、SNARF、Cal-520、钙特异性氨基多羧酸、BAPTA、SBFI、Asante NaTRIUM Green-1、Asante NaTRIUM Green-2、Thallos钾离子通道试剂、AsantePotassium Green-1、Asante Potassium Green-2、Asante Potassium Green-3、PBFI、Fluo-2 Mg、Fura-2 Mg、Indo-1 Mg、Asante Magnesium Green、SPQ、MQAE、TSQ、TFL-Zn和ZINQUIN。

100.根据权利要求90-99中任一项所述的试剂盒，其中所述填充性水凝胶包括氯化钙以提供Ca²⁺作为所述离子物质。

101.根据权利要求100所述的试剂盒，其中所述水凝胶层中氯化钙的浓度为0.01-6.76M。

102.根据权利要求90-101中任一项所述的试剂盒，其中所述填充性水凝胶包括2.5％琼脂糖、1.5M CaCl₂和10mM HEPES，pH 7.0。

103.根据权利要求90-102中任一项所述的试剂盒，其中所述水溶液还包括KCl。

104.根据权利要求103所述的试剂盒，其中所述水溶液可以包括1.5M KCl、400μMEDTA、40μM Fluo-8、10mM HEPES，pH 7.0。

105.根据权利要求90-104中任一项所述的试剂盒，其中含有两亲性分子的所述疏水介质可以是脂质油，其包括溶解在体积比为1:1的2mL十六烷和硅油混合物中的5mg DPHPC脂质的干膜。

106.根据权利要求90-105中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括包被水凝胶，所述包被水凝胶包括在水中的琼脂糖；优选地，所述包被水凝胶可以包括在水中的0.75％(w/v)琼脂糖。

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