JP2022535185A - 電極を使用しないナノポアによる分析物の検出 - Google Patents

電極を使用しないナノポアによる分析物の検出 Download PDF

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Abstract

本発明は、化学勾配によって駆動されるナノポアを通じたイオン流の光学的測定に基づいて分析物を同定するための無電極の系、およびそのような系を用いて分析物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、異なる分析物を同時に同定するための無電極のナノポアアレイ、そのようなアレイを用いて異なる分析物を同定するための方法、およびそのようなアレイを製造する方法を提供する。【選択図】図１４

Description

本発明は、タンパク質ナノポアを用いて分析物を同定するための方法に関する。
天然の膜通過輸送は様々な膜輸送タンパク質の補助を受ける［１］。輸送される、小イオン［２］、水［３］、糖［４］、さらには遺伝物質［５］などの溶質は、様々な細胞活性の制御を行う上で極めて重要なものである。詳細な輸送機構は異なるが［６］、チャネル移行時の単一分子の識別情報を報告できたことは、バイオミミクリアプローチとしての、ナノポアシーケンシングの根幹となる基盤を形成している［７、８］。報告されているように、平面脂質膜［９］、液滴界面二重層（ｄｒｏｐｌｅｔ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｂｉｌａｙｅｒ）（ＤＩＢ）［１０］、ヒドロゲル界面二重層［１１］、合成固体膜［１２］、ガラス製ナノピペット［１３］、または細胞膜［１４］から、ナノポアセンシングが行われている。しかし、１９９６年の最初の登場［９］から、電気生理学から取り入れられたコアとなる機構は変わっていない。
電気生理学的現象の中で、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極対は、膜貫通電位を印加し、Ｃｌ－と荷電した分析物の持続的なエレクトロマイグレーションを駆動する働きをする。また、単一分子同定では、イオン電流変動を記録する働きもする（図１ａ）。電極が無い場合、ナノポアを横断するイオンの活発な熱拡散が双方向に存在するものの、電気的中性の法則により、正味のイオンフローと電解質含有空間全体の電場は厳密にゼロとなる（図１ｂ）［１５］。
電気生理学的測定は、十分と言える時間分解能（約１０μ秒）および振幅分解能（＜０．１ｐＡ）を実現し［１６］、単一チャネル記録をベースとした応用のニーズを満たしているが、スループットの点で不利である［１７］。ナノポアシーケンシングや薬物スクリーニングは至急必要とされているが、１００万チャネルからの同時読み取りを、デバイスのコストやサイズ面での犠牲を伴わずに実現するには至っていない［１７、１８］。このような差し迫った必要性から刺激を受け、バイオミミクリからさらに獲得される可能性がある、高スループットなチャネル記録のための、簡略化された戦略を再考することとなった。
細菌ファージＴ４は、宿主細胞と相互作用する際、チャネルタンパク質を通じてそのゲノムＤＮＡを注入する［１９］。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）のα溶血素（α－ＨＬ）は、挿入されたチャネルを通じた栄養分の受動的漏出により、標的細胞の溶血をもたらす［２０］。これらの自然進化によって獲得された自発的な分子輸送から、外部の電子素子が分子輸送に必ずしも必要ではないことに思い至った。いかにして電気的接続なしでナノポアセンシングシグナルを取得できるかは、未だに難題である。
近年の光シグナルチャネル記録（ｏＳＣＲ）の発展［２１～２５］から、代替となる戦略が示され、それは、液滴界面二重層（ＤＩＢ）に埋め込まれた個々のナノポアを通じたＣａ２＋流を光学的にモニタリングするというものである（図１ｃ）［２１、２３］。ｏＳＣＲはハイスループット測定において有利であるが、ナノポアを通じた持続的なＣａ２＋流を電気泳動的に駆動するために、まだ電極対が用いられていた［２３］。電極を水性液滴に手動で挿入するには、繊細な顕微操作技能が必要であり、二重層崩壊のリスクを高める可能性があり［２３］、これが、学術研究や産業利用での幅広い利用の妨げとなっていた。
本発明は、化学勾配によって駆動されるナノポアを通じたイオン流の光学的測定に基づいて分析物を同定するための系を提供する。本発明はまた、分析物を同定するためにそのような系を使用する方法を提供し、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡなどの小分子またはＤＮＡを同定する方法が挙げられる。
本発明の一つの態様では、分析物を同定するための無電極の系であって、
（ａ）第一水溶液を中に含有し、上記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメント；
（ｂ）第二水溶液を中に含有し、上記第二水溶液は上記蛍光レポーター分子に特異的に結合する上記イオン種を含む、第二コンパートメント；および
（ｃ）第一コンパートメントと第二コンパートメントとを隔てる膜；
を含み、
上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとがナノポアにより接続されるように、上記第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の膜には少なくとも１つのナノポアが挿入されており；
上記イオン種を、上記ナノポアを通じて上記第二コンパートメントから上記第一コンパートメントへ拡散させることができる、上記イオン種の化学勾配が、上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に存在する、
系が提供される。
いくつかの実施形態では、上記膜は固体膜である。
いくつかの実施形態では、上記膜は半透膜である。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高く；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しく；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなり；好ましくは、上記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなる二重層である。
いくつかの実施形態では、上記両親媒性分子は脂質である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記第一コンパートメントは水性液滴によって供給される。
いくつかの実施形態では、上記第二コンパートメントはヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、上記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、上記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む。
いくつかの実施形態では、上記ナノポアはタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアは、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである。
いくつかの実施形態では、上記イオン種は、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記蛍光レポーター分子は、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液は、塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度は０．０１～６．７６Ｍである。
いくつかの実施形態では、上記第一水溶液は、キレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、上記キレート化剤は上記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、上記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである。
いくつかの実施形態では、上記系は、照明用の光源と、蛍光を検出するための光センサとをさらに含み；好ましくは、上記光源はレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンライト、キセノンライトであり；好ましくは、上記光センサはＣＣＤ、ｓＣＭＯＳセンサ、または光ダイオードであり；より好ましくは、上記光センサはＥＭＣＣＤまたはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）である。
いくつかの実施形態では、上記系は、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、広視野蛍光顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法のためのデバイスをさらに含む。
いくつかの実施形態では、上記第一水溶液または上記第二水溶液が上記分析物を含む。
いくつかの実施形態では、上記分析物は小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記分析物は化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、上記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである。
本発明の別の態様において、分析物を同定する方法であって、
（ａ）上記分析物が上記第一コンパートメント中または上記第二コンパートメント中に供給された、上記のいずれか１つの系を準備する工程；
（ｂ）上記蛍光レポーター分子を励起可能な光を、上記ナノポアの近位の上記第一コンパートメント内の領域に当てる工程；
（ｃ）上記蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを測定し上記分析物を同定する工程、
を含む方法が提供される。
本発明の別の態様において、無電極の系を製造する方法であって、
第一水溶液を中に含有し、上記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメントを準備すること；
第二水溶液を中に含有し、上記第二水溶液は上記蛍光レポーター分子に特異的に結合する上記イオン種を含む、第二コンパートメントを準備すること；
ナノポアが挿入された半透膜が上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとを接触させること；
を含み、
上記第一水溶液または上記第二水溶液中にタンパク質ナノポアが供給される、
方法が提供される。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高く；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しく；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなり；好ましくは、上記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなる二重層である。
いくつかの実施形態では、上記両親媒性分子は脂質である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記第一コンパートメントは水性液滴によって供給される。
いくつかの実施形態では、上記第二コンパートメントはヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、上記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、上記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む。
いくつかの実施形態では、上記ナノポアはタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアは、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである。
いくつかの実施形態では、上記イオン種は、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記蛍光レポーター分子は、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液は、塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む。
いくつかの実施形態では、上記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度は０．０１～６．７６Ｍである。
いくつかの実施形態では、上記第一水溶液は、キレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、上記キレート化剤は上記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、上記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである。
いくつかの実施形態では、上記第一水溶液または上記第二水溶液中に分析物が供給される。
いくつかの実施形態では、上記分析物は小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記分析物は化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、上記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである。
本発明の別の態様において、複数の分析物を同定するための無電極のナノポアアレイであって、複数の系を並列に含み、各系が、
（ａ）第一水溶液を中に含有し、上記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメント；
（ｂ）第二水溶液を中に含有し、上記第二水溶液は上記蛍光レポーター分子に特異的に結合する上記イオン種を含む、第二コンパートメント；および
（ｃ）第一コンパートメントと第二コンパートメントとを隔てる膜；
を含み、
各系において上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとがナノポアにより接続されるように、各系において、上記第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の膜には少なくとも１つのナノポアが挿入されており；
上記イオン種を上記ナノポアを通じて上記第二コンパートメントから上記第一コンパートメントへ拡散させることができる、上記イオン種の化学勾配が、各系の上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に存在し；
測定された蛍光が各系において識別可能であるように、上記複数の系が配置されている、
ナノポアアレイが提供される。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメント系との間の上記膜は固体膜である。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間の上記膜は半透膜である。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高く；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しく；あるいは、上記第二水溶液のモル浸透圧濃度が上記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、上記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が上記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなり；好ましくは、上記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなる二重層である。
いくつかの実施形態では、上記両親媒性分子は脂質である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記複数の系の上記第一コンパートメントのそれぞれは互いに隔てられている。
いくつかの実施形態では、各系の上記第一コンパートメントは水性液滴によって供給される。
いくつかの実施形態では、上記複数の系の上記第二コンパートメントは単一のコンパートメントである。
いくつかの実施形態では、各系の上記第二コンパートメントはヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、上記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む。
いくつかの実施形態では、上記複数の系の上記第二コンパートメントは単一ヒドロゲル層によって供給される。
いくつかの実施形態では、各系において、上記ナノポアはタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアは、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各系において、上記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである。
いくつかの実施形態では、各系において、上記イオン種は、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各系において、上記蛍光レポーター分子は、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第二水溶液は、塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度は０．０１～６．７６Ｍである。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第一水溶液は、キレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、上記キレート化剤は上記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、上記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである。
いくつかの実施形態では、上記アレイは、照明用の光源と、蛍光を検出するための光センサとをさらに含み；好ましくは、上記光源はレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンライト、キセノンライトであり；好ましくは、上記光センサはＣＣＤ、ｓＣＭＯＳセンサ、または光ダイオードであり；より好ましくは、上記光センサはＥＭＣＣＤまたはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）である。
いくつかの実施形態では、上記アレイは、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、広視野蛍光顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法のためのデバイスをさらに含む。
いくつかの実施形態では、各系において、上記第一水溶液または上記第二水溶液が上記分析物を含む。
いくつかの実施形態では、各系において、上記分析物は小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、各系において、上記分析物は化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、上記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、異なる分析物が各種系へと物理的に分離される。
いくつかの実施形態では、上記ナノポアアレイにおける上記系の密度は１０～１０００個／ｍｍ２である。
いくつかの実施形態では、上記複数の系によって与えられる総面積は１～１００ｍｍ２である。
いくつかの実施形態では、上記複数の系の数は４～１，０００，０００個であり；好ましくは、上記複数の系の数は１０～１０００個である。
本発明の別の態様において、複数の分析物を同定するための多重法であって、
（ａ）２種以上の分析物が上記ナノポアアレイの各種系に供給される、上記のいずれか１つのナノポアアレイを準備すること；
（ｂ）上記第一コンパートメントのそれぞれに含有される上記蛍光レポーター分子を励起可能な光シグナルを、上記ナノポアの近位の上記複数の第一コンパートメント内の領域に当てること；
（ｃ）各系に含有される上記蛍光レポーター分子からの複数の蛍光シグナルを測定し、上記複数の分析物を同定すること、
を含む、方法が提供される。
本発明の別の態様において、無電極のナノポアアレイを製造する方法であって、
タンパク質ナノポアと、分析物と、イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子とを含む第一水溶液をそれぞれが含む、複数の水性液滴を準備すること；
上記イオン種を含むヒドロゲル層を準備すること；
半透膜が上記水性液滴のそれぞれとヒドロゲル層との間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で上記複数の水性液滴と上記ヒドロゲル層とを接触させること、
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴（ａｑｕｅｏｕｓ ｄｒｏｐｌｅｔｄ）のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、上記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度よりも高く；あるいは、上記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴のモル浸透圧濃度と等しいか、または、上記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、上記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、上記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなり；好ましくは、上記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、上記半透膜は両親媒性分子からなる二重層である。
いくつかの実施形態では、上記両親媒性分子は脂質である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；好ましくは、上記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む。
いくつかの実施形態では、各系において、上記ナノポアはタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記タンパク質ナノポアは、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層中の上記イオン種は、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記蛍光レポーター分子は、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層は、塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層中の塩化カルシウムの濃度は０．０１～６．７６Ｍである。
いくつかの実施形態では、各水性液滴は、キレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、上記キレート化剤は上記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、上記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記分析物は小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記分析物は化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、上記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、異なる分析物が各種系に供給される。
いくつかの実施形態では、上記水性液滴の数は４～１，０００，０００個であり；好ましくは、上記水性液滴の数は１０～１０００個である。
別の態様において、本発明は、光学的な分析物の分析を行うための、上記の系の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、光学的な分析物の分析を行うための、上記のナノポアアレイの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、ナノポアアレイを形成させるためのキットであって、
アガロースと、緩衝剤と、蛍光レポーター分子に特異的に結合し蛍光を放出させることが可能なイオン種と、を含む充填用ヒドロゲル；
キレート化剤と、上記イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な上記蛍光レポーター分子と、緩衝剤と、を含む水溶液であって；上記キレート化剤は上記イオン種に結合することが可能である、水溶液；
両親媒性分子を含有する疎水性媒体；
固体支持体、
を含む、キットを提供する。
いくつかの実施形態では、上記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が上記水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、上記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が上記水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、上記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が上記水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、上記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が上記水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、上記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が上記水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、上記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が上記水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、上記両親媒性分子は脂質である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記脂質は、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記水溶液はタンパク質ナノポアも含む。
いくつかの実施形態では、上記ナノポアはタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアは、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層中の上記イオン種は、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、各水性液滴中の上記蛍光レポーター分子は、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である。
いくつかの実施形態では、上記充填用ヒドロゲルは、塩化カルシウムを含むことで、上記イオン種としてＣａ２＋を供給する。
いくつかの実施形態では、上記ヒドロゲル層中の塩化カルシウムの濃度は０．０１～６．７６Ｍであり；好ましくは、上記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度は０．１５Ｍ～６Ｍである。
いくつかの実施形態では、上記充填用ヒドロゲルは２．５％アガロース、１．５Ｍ ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含む。
いくつかの実施形態では、上記水溶液はＫＣｌも含む。
いくつかの実施形態では、上記水溶液は１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、両親媒性分子を含有する上記疎水性媒体は、乾燥ＤＰＨＰＣ脂質膜５ｍｇをヘキサデカンおよびシリコーン油の１：１体積比の混合物２ｍＬ中に溶解させて含む脂質油であってもよい。
いくつかの実施形態では、上記キットは塗布用ヒドロゲルも含む。好ましくは、上記塗布用ヒドロゲルは０．７５％（ｗ／ｖ）のアガロースを水に含むものであってもよい。
図１は、ＤｉｆｆｕｓｉＯｐｔｏＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙと、ＴｒｉＭ－β－ＣＤセンシングにおけるその適用を示している。（ａ～ｄ）各種測定プラットフォームにおけるナノポアを通じたイオン輸送の模式図。（ａ）電気生理学的記録の際、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極対を介して膜電位差を適用すると、ナノポアを通じたＣｌ－の電気泳動的挙動が観察される。（ｂ）電極がない場合、ナノポアを横断するイオンの熱運動が双方向に存在するが、電気的中性の法則に従って、正味のイオン輸送流は生じていないはずである。（ｃ）ｏＳＣＲでは、方向性を持ったＣａ２＋の動きが、ナノポアを通じて電気泳動的に駆動され、Ｃａ２＋濃度の急勾配を確立する。ｃｉｓ側でＦｌｕｏ－８と結合すると、ポア近傍のＦｌｕｏ－８／Ｃａ２＋複合体が強い蛍光を発する。（ｄ）ＤｉｆｆｕｓｉＯｐｔｏＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙでは、イオンの熱運動により、穏やかなＣａ２＋濃度勾配がポア近傍に確立され得る。Ｆｌｕｏ－８と結合すると、ｃよりも弱い蛍光が放出されることが予想される。（ｅ）ポア周囲のＦｌｕｏ－８／Ｃａ２＋複合体の空間分布の横断面図。点線の箱：ナノポア付近の極近傍領域の拡大図。（ｆ）上段左：コンピューターシミュレーションから得られた対応する画像結果。上段右：シミュレーションされた蛍光強度プロファイルはガウス分布に従っている。下段左：単一のＷＴ α－ＨＬナノポアのＤＯＰ記録から取得された代表的なフレーム。下段右：対応する蛍光強度プロファイルもガウス分布に従っている。スケールバー：４μｍ。（ｇ）無電極ｏＳＣＲの場合の、α－ＨＬナノポアによるＴｒｉＭ－β－ＣＤ（７５ｍＭ）の単一分子センシング。スケールバー：４μｍ。（ｈ）ＴｒｉＭ－β－ＣＤ濃度に対する平均イベント間間隔の逆数（１／τｏｎ）および平均滞留時間の逆数（１／τｏｆｆ）のプロット。各条件について３つの独立した実験（Ｎ＝３）から平均値および標準偏差を得る。（ｉ）それぞれ、＋２０ｍＶでのＤＯＰおよび電気生理学的記録から得られたτｏｆｆ結果およびＦＰ結果の統計。ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、上記のＤＯＰ記録を実施した。膜の両側に１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、電気生理学的記録を実施した。ＴｒｉＭ－β－ＣＤを７５ｍＭの最終濃度でｃｉｓ側に加えた。 図２は、ＦＥＭモデルの形状を示している。電解質液で満たされた１０μｍ半径の球が１０ｎｍ厚の半透膜で２つのチャンバ（ｃｉｓ：上側、ｔｒａｎｓ：下側）に分割されている。イオンではなく液体の膜を横切る通過のみが許される。膜の中央に、各種直径（２ｎｍ～８ｎｍ）の、単一のナノスケールの円柱状の開口部が配置され、２チャンバ間の液体およびイオン輸送のための唯一の通路として働く。ＫＣｌ濃度を変えて（１Ｍ～２．５Ｍ）ｃｉｓ側の境界条件を設定し、ＣａＣｌ２濃度を変えて（０．５Ｍ～１．５Ｍ）ｔｒａｎｓ側の境界条件を設定した。本明細書中の全てのＦＥＭシミュレーションはこの形状を用いて実施された。 図３は、構成の模式図を示している。（ａ）無電極ｏＳＣＲ構成の横断面図。脂質／油環境（ヘキサデカン／シリコーン油の１：１体積比混合物中２．５ｍｇ／ｍｌのＤＰＨＰＣ）中に浸漬された場合、水性液滴とアガロース基体とが接触の際に液滴界面二重層（ＤＩＢ）を自発的に形成する［２１］。水性液滴は、１Ｍ～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、および生体ナノポアから構成される。アガロース基体は、０．５～１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、および２．５％（ｖ／ｗ）低融点アガロースから構成される。生体ナノポアは、液滴中に事前に溶解させたものであり、ＤＩＢに自発的に挿入され、Ｃａ２＋を液滴中へ熱力学的に拡散させる。輸送されたＣａ２＋は、液滴中のＦｌｕｏ－８と直ちに結合し、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法によるイメージングの際にポア近傍に蛍光を放出する。（ｂ）ＤＩＢの明視野像。ＤＩＢの境界は明視野像から目視で分解可能である。 図４は、シクロデキストリン結合キネティクスを示している。（ａ～ｅ）それぞれ＋２０ｍＶ、＋４０ｍＶ、＋６０ｍＶ、＋８０ｍＶ、および＋１００ｍＶの印加電圧を用いた場合の、代表的な電流トレース。トリメチル－β－シクロデキストリン（ＴｒｉＭ－β－ＣＤ）を最終濃度４ｍＭでｃｉｓに加えた。印加電圧が増加すると、イベント検出頻度は規則的に減少する。これは、ナノポア内に逆向きの電気浸透流が存在している可能性があり、これにより、ＴｒｉＭ－β－ＣＤがポアと結合する確率が減少したことを示している。（ｆ）印加電圧の関数としての１／τｏｎのプロット。１／τｏｎの統計は、３つの独立した一連の電気生理学的記録（Ｎ＝３）に基づいて行い、各条件の期間を９０秒とした。膜の両側に１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、電気生理学的記録を実施した。ＷＴ α－ＨＬナノポアをｃｉｓに加えた。 図５は、ｏＳＣＲの際のシグナルおよびバックグラウンドの定義を示している。（ａ）ナノポアの無電極ｏＳＣＲから直接得られた代表的な画像フレーム。（ｂ）ａの２Ｄガウシアンフィッティング
Figure 2022535185000002
 の結果。ピーク（ｘｃ、ｙｃ）の中央、ピーク振幅（Ａ＋ｚ０）、および半値全幅（ＦＷＨＭ）などのパラメータはフィッティング結果から抽出することができる（方法を参照）。（ｃ）ＦＷＨＭに従ったシグナルおよびバックグラウンドの定義。簡潔には、直径２ＦＷＨＭの円内の総ピクセル値をシグナルと定義する。直径３ＦＷＨＭ～４ＦＷＨＭの間の外環内の総ピクセル値をバックグラウンドと定義する。示された画像加工はＭＡＴＬＡＢを用いて自動化している。
図６は、蛍光トレース正規化の実例を示している。レーザーからの電力変動、焦点面のずれ、またはナノポアの運動が起こり得るため、生の蛍光時間トレースには低周波変動がいくらか確認される。しかし、これらの変動は標準的なトレース較正によって減弱させることができた。（ａ）蛍光強度の較正。無電極ｏＳＣＲベースのＴｒｉＭ－β－ＣＤセンシングに対応する試料トレースを実例として使用した（図１）。カスタムＬａｂＶＩＥＷプログラムを用いて、生の蛍光時間トレース（シグナルおよびバックグラウンド）を別々に抽出した。無電極ｏＳＣＲの際のシグナルおよびバックグラウンドの定義については図１０を参照されたい。トレース較正は式Ｆｃａｌ＝（Ｆｓｉｇ－Ｆｂｋｇ）／Ｆｂｋｇを従って行う。Ｆｃａｌ、Ｆｓｉｇ、およびＦｂｋｇはそれぞれ、較正後の蛍光強度、生の蛍光シグナル、および生の蛍光バックグラウンドを表す。生の蛍光時間トレースにおいて確認された低周波変動は正規化後に最小限となった。（ｂ）正規化後の蛍光時間トレース。定量分析では、開口ポア状態に対応する蛍光の振幅を１となるようにさらに正規化する。 図７は、移行イベントの統計を示している。（ａ）α－ＨＬポアを通じたＴｒｉＭ－β－ＣＤ移行を示す代表的な蛍光トレース。イベント滞留時間（ｔｏｆｆ）およびイベント間間隔（ｔｏｎ）はトレース内に標識した通りに定義した。（ｂ）滞留時間（ｔｏｆｆ）のヒストグラム。黒線はヒストグラムデータの単一指数フィットである。時定数τｏｆｆをこれらのフィッティング結果から得た。（ｃ）封鎖レベル（％Ｆｂ）のヒストグラム。ピーク値ｘｃは封鎖率平均値ＦＰと定義される。（ｄ）イベント間間隔（ｔｏｎ）のヒストグラム。黒線はヒストグラムデータの単一指数フィットである。時定数τｏｎをこれらのフィッティング結果から得た。 図８は、ＤＯＰ記録の際の浸透調整に伴うセンシング性能の増強を示している。（ａ）異なる電解質組み合わせを用いたＤＯＰ記録から取得された蛍光トレース。ＤＯＰ記録はα－ＨＬナノポアを用いて実施した。ＴｒｉＭ－β－ＣＤを最終濃度１５ｍＭでｃｉｓに加えた。ｃｉｓとｔｒａｎｓとの間に確立された浸透勾配が大きくなるほど、イベント間隔τｏｎは減少している。（ｂ）ｃｉｓにおけるＫＣｌ濃度の関数としての浸透圧および１／τｏｎのプロット。３つの一連の独立した実験（Ｎ＝３）から平均値および標準偏差を得る。（ｃ）ｃｉｓに異なるＫＣｌ濃度を用いた場合の蛍光イメージング結果のＳＢＲ解析。上段パネルはＤＯＰ記録から取得された代表的な画像を示している。各画像は、左から右に、ｃｉｓにおける［ＫＣｌ］がそれぞれ１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、および２．５ＭであるＤＯＰ記録によって取得された。ｃｉｓにおけるＫＣｌ濃度が増加すると、ＳＢＲの値は減少している。５つの独立した実験（Ｎ＝５）から平均値および標準偏差を得る。ｃｉｓにおいては１Ｍ～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、（ａ）～（ｃ）の実験を行った。（ｄ）ｃｉｓにおけるＫＣｌ濃度の関数としてのシミュレートされた蛍光強度のプロット。上段パネルはシミュレーションからの蛍光強度の対応する２Ｄプロファイルを示しており、ｃの無電極ｏＳＣＲから取得された結果と似ている。シミュレーションは、ｃｉｓには１Ｍ～２．５Ｍ ＫＣｌを、ｔｒａｎｓには０．７５Ｍ ＣａＣｌ２を用いて実施した。（ｅ）シミュレーション空間内のＦｌｕｏ－８の空間分布の横断面図。シミュレーションの境界条件は、ｃｉｓにおいては１．０Ｍ ＫＣｌ、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２と設定した。ｃｉｓからｔｒａｎｓへの持続的な浸透圧流によって、ＤＩＢ近傍のＦｌｕｏ－８分布に濃縮が起こる。 図９は、ＴｒｉＭ－β－ＣＤセンシングの際のベースライン比較を示している。（ａ）ｃｉｓに２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１５ｍＭ ＴｒｉＭ－β－ＣＤ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）、ｔｒａｎｓに０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）を用いて取得された、ＤＯＰ記録からの代表的な蛍光トレース。（ｂ）ｃｉｓに１Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１５ｍＭ ＴｒｉＭ－β－ＣＤ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）、ｔｒａｎｓに０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）を用いて取得された、ＤＯＰ記録からの代表的な蛍光トレース。ａおよびｂの両方のトレースは、α－ＨＬナノポアを用いて記録を行った。ｃｉｓからｔｒａｎｓへの浸透圧流が存在する場合、熱雑音の低減が確認されたが、これはＤＯＰ記録からの蛍光強度の増強の結果である。 図１０は、Ｆｌｕｏ－８分布のＦＥＭモデリングを示している。ｃｉｓに加えられたＦｌｕｏ－８Ｈは、細胞不透過性分子（ＡＡＴバイオクエスト社（ＡＡＴ ｂｉｏｑｕｅｓｔ））である。膜を挟んだ水の浸透圧流によって、ＤＩＢのｃｉｓ側周辺にＦｌｕｏ－８の濃縮が生じる。この現象が、ｃｉｓの電解質モル浸透圧濃度をｔｒａｎｓのそれよりも低く設定した場合のナノポア蛍光のＳＢＲ増強に寄与しているはずである。Ｆｌｕｏ－８濃度はＦＥＭモデリングを用いてシミュレーションした（方法）。全てのシミュレーションにおいて、ｃｉｓ境界上のＫＣｌ、ＥＤＴＡ、およびＦｌｕｏ－８の濃度は、それぞれ０．５～１．５Ｍ、４００μＭ、および４０μＭとなるように設定した。ｔｒａｎｓ境界上のＣａＣｌ２の濃度は０．７５Ｍに一定に維持した。シミュレーション空間の境界に対し設定されたこれらのシミュレーションパラメータは、ナノポアから遠位の電解質緩衝液の定常状態を表す。（ａ）ｃｉｓ境界上のＫＣｌ濃度が０．５Ｍである場合のＦｌｕｏ－８の３Ｄ分布の横断面図。この状況ではｃｉｓからｔｒａｎｓへの強い浸透圧流が存在し、これが膜付近のＦｌｕｏ－８の濃縮をもたらす。（ｂ）ｃｉｓ境界上のＫＣｌ濃度が１Ｍである場合のＦｌｕｏ－８の３Ｄ分布の横断面図。Ｆｌｕｏ－８の濃縮の減少が認められる。（ｃ）ｃｉｓ境界上のＫＣｌ濃度が１．５Ｍである場合のＦｌｕｏ－８の３Ｄ分布の横断面図。この条件ではｔｒａｎｓからｃｉｓに弱い浸透圧流が存在し、これにより膜付近のＦｌｕｏ－８濃度が減少することとなる。 図１１は、ＤＯＰ記録の際のＣａ２＋流を増加させた場合のＳＢＲの増強を示している。（ａ）ＤＯＰ記録から取得された、イメージング結果（上段パネル）および対応する２Ｄガウシアンフィッティング（下段パネル）。モル浸透圧濃度が等張を保つようにｃｉｓのＫＣｌ濃度を適宜調整した場合、ｔｒａｎｓのＣａＣｌ２濃度は増加した。蛍光スポットは、ＷＴ α－ＨＬナノポアを通じたＣａ２＋流に対応しているが、Ｃａ２＋流の増加に伴い明るさが増している。スケールバー：４μｍ。（ｂ）異なる電解質モル浸透圧濃度を用いた場合の蛍光イメージングシグナルのＦＷＨＭおよびＳＢＲ（Ｎ＝１２）。（ｃ）代表的な蛍光トレースとして、ＤＯＰ記録によって取得された、ＷＴ α－ＨＬナノポアを通じてのＰＥＧ１５００移行シグナルが示されている。ＰＥＧ１５００をアガロース基体中に添加し、最終濃度を２０ｍＭとした。ＤＯＰ記録の際、ｃｉｓの２．２５Ｍ ＫＣｌ緩衝液とｔｒａｎｓの１．５Ｍ ＣａＣｌ２緩衝液との組み合わせを使用した。（ｄ）それぞれ直径２ｎｍ、４ｎｍ、６ｎｍ、および８ｎｍの４つの異なる孔径の場合に示された、重量モル浸透圧濃度の関数としてのシミュレートされた総蛍光強度。電解質濃度を等張に保つことで、この実例では浸透に関する議論を回避した。（ｅ）左：α－ＨＬおよびＣｌｙＡ－ＲＲの同時のＤＯＰイメージング。チャネルコンダクタンスがより大きいために、ＣｌｙＡ－ＲＲは同一視野のＷＴ α－ＨＬと比較してより大きくより明るいスポットに見える。右：それぞれ位置１および位置２と標識された、垂直線に沿った蛍光強度プロファイル。蛍光強度プロファイルはガウス分布でフィッティングしている。スケールバー：５μｍ。（ｆ）ＷＴ α－ＨＬおよびＣｌｙＡ－ＲＲの蛍光イメージングシグナルのＦＷＨＭおよびＳＢＲ（Ｎ＝５）。ｅ、ｆに示されたＤＯＰ記録は、ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて実施した。（ｇ）直径６ｎｍの相当円筒ポアを通じた浸透流のシミュレーション。ポア形状が広いほど、生じる浸透流が大きくなる。 図１２は、ＣｌｙＡ－ＲＲの調製および特性評価を示している。（ａ）ブルーネイティブゲル電気泳動（４～１５％ポリアクリルアミド勾配ゲル）を用いて特性評価された十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲ。レーンＭ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓタンパク質スタンダード（バイオラド社）；レーン１：原核生物発現を用いて作製されたＣｌｙＡ－ＲＲ（方法）。レーン２：ＤＤＭを添加し最終濃度０．２５％（ｗ／ｖ）とした後のＣｌｙＡ－ＲＲ。ゲルから、ＤＤＭの添加前に単量体が自己組織化していたことが示されたが、十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲを安定化するために、ＤＤＭを用いた製造を継続して利用する。（ｂ）電気生理学的記録の際に確認された、持続的なＣｌｙＡ－ＲＲ膜挿入。測定は＋５０ｍＶの定電圧で実施した。十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアをｃｉｓに添加した。（ｃ）ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの代表的なＩ－Ｖ曲線。（ｄ）＋１００ｍＶの印加電圧を用いた場合のＣｌｙＡ－ＲＲの開口ポア電流ヒストグラム。曲線は１７６１．４２８ｐＡを中心とした。２０の独立した一連の電気生理学的記録（Ｎ＝２０）に基づいて、開口ポア電流の統計を取った。示した測定（ｂ～ｄ）は全て、膜の両側に１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて実施された。 図１３は、ポア内の浸透圧流のＦＥＭモデリングを示している。これらのシミュレーションは、ｃｉｓに１Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８を、ｔｒａｎｓに１．５Ｍ ＣａＣｌ２を用い、孔径を変化させて実施した。（ａ）孔径に対するポア中心の流速のプロット。（ｂ）～（ｄ）異なるサイズのポア内のシミュレートされた浸透圧流の横断面図。シミュレーションから、孔径が大きくなるほど、顕著な流速の増加が生じる。 図１４は、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じてのｄｓＤＮＡ移行を示している。（ａ）ＤＯＰ記録の際のＣｌｙＡ－ＲＲを通じてのｄｓＤＮＡ移行の模式図。（ｂ）ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのＤＯＰイメージングおよび対応する蛍光トレース。液滴へのｄｓＤＮＡの添加は無しである。（ｃ）ｄｓＤＮＡを最終濃度２μＭで液滴に添加した場合の、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのＤＯＰイメージングおよび対応する蛍光トレース。連続的に深部に長期滞留する蛍光封鎖がはっきりと認められた。スケールバー：５μｍ。（ｄ）それぞれ＋６ｍＶ、＋４ｍＶ、および＋２ｍＶにおけるＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡ移行の電気生理学的記録。電圧が＋２ｍＶと低い場合でも、ｄｓＤＮＡ移行イベントに対応する電流封鎖が認められた。（ｅ）ｄｓＤＮＡ移行イベントにおける滞留時間のヒストグラム。ＥＭ－ＣＣＤの取得時間に制限があるため（３０ミリ秒）、高速のｄｓＤＮＡ移行は完全には分解することができない。ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、上記のＤＯＰ記録を実施した。ｃｉｓには１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を、ｔｒａｎｓには１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、電気生理学的記録を実施した。ｄｓＤＮＡをｃｉｓに最終濃度２μＭで加えた。ＤＯＰ記録からのデータ（オリーブ色で示される）はフレームレート３０ミリ秒で取得した。電気生理学的トレース（黒色で示される）はサンプリング速度２５ｋＨｚで記録し、１ｋＨｚの低域フィルターにかけた。 図１５は、ＣｌｙＡを通じたｄｓＤＮＡ移行の統計を示している。（ａ）ｄｓＤＮＡがＣｌｙＡ－ＲＲポアを通じて移行する場合の封鎖レベル（％Ｆｂ）の代表的なヒストグラム。ＦＰ値は０．６１０±０．１３８（中心値±ＦＷＨＭ）である。（ｂ）～（ｄ）＋２ｍＶ（ｂ）、＋４ｍＶ（ｃ）、および＋６ｍＶ（ｄ）において、ｄｓＤＮＡがＣｌｙＡ－ＲＲポアを通じて移行する場合の封鎖レベル（％Ｉｂ）の代表的なヒストグラム。ＩＰ値はそれぞれ０．７８６±０．２２４、０．６０５±０．４６０、および０．６１１±０．３５７である。光学的および電気的な封鎖レベルは本質的に同じである。ｃｉｓには１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を、ｔｒａｎｓには１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、無電極ｏＳＣＲおよび電気生理学的記録の両方を実施した。２ｍＭの７８ｂｐ ｄｓＤＮＡをｃｉｓに加えた。 図１６は、小型化チップにおける多重ＤＯＰ記録を示している。（ａ）指先サイズのＤＯＰ記録用デバイス。（ｂ）ＤＯＰ記録の際のチップ構成。この構成のＤＩＢは、４７３ｎｍレーザーを用いて励起し、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法を用いてイメージングした（方法）。（ｃ）同一ＤＩＢ中のＷＴ α－ＨＬナノポアおよびＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの同時イメージング。２種類のナノポアは蛍光スポットの大きさおよび強度から容易に識別が可能である（黄色の破線の円：ＷＴ α－ＨＬ、赤色の破線の円：ＣｌｙＡ－ＲＲ）。（ｄ）多重無電極ｏＳＣＲ用のミニＤＩＢアレイの模式図。（ｅ）ミニＤＩＢアレイの明視野像。（ｆ）ミニＤＩＢに挿入されたＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのフレーム。ＤＩＢの直径は約４０μｍである。ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。 図１７は、α－ＨＬナノポアを用いた無電極ｓｓＤＮＡセンシングを示している。（ａ）α－ＨＬナノポアからの代表的なＤＯＰ取得結果および抽出された蛍光トレース。液滴へのｓｓＤＮＡの添加は無しである。（ｂ）オリゴマーｓｓＤＮＡが５０μＭの最終濃度で液滴に添加された場合の、α－ＨＬナノポアからの代表的なＤＯＰ取得結果および抽出された蛍光トレース。連続的な短期滞留型の蛍光封鎖が一貫して明確に認められた。Ａ、Ｂにおけるスケールバー：５μｍ。（ｃ）抵抗性イベントからの封鎖レベル（％Ｆｂ）の統計。％Ｆの平均値は０．２８９±０．１７５（中心値±ＦＷＨＭ）である。ｃｉｓにおいては３Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、示されたＤＯＰ記録を実施した。このアッセイで使用されたＤＮＡ配列：５’－ＧＡＴＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡ－３’。 図１８は、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを用いた無電極ｓｓＤＮＡセンシングを示している。（ａ）ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのＤＯＰイメージングおよび対応する蛍光トレース。液滴へのｓｓＤＮＡの添加は無しである。（ｂ）ｓｓＤＮＡ－ａ（７８ｎｔ）を最終濃度２μＭで液滴に添加した場合の、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのＤＯＰイメージングおよび対応する蛍光トレース。連続的に深部に長期滞留する蛍光封鎖がはっきりと認められた。画像挿入図におけるスケールバー：５μｍ。（ｃ）ポリＡ７８を５０μＭの最終濃度で液滴に添加した場合の、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのＤＯＰイメージングおよび対応する蛍光トレース。連続的に浅部に短期滞留する蛍光封鎖がはっきりと認められた。スケールバー：５μｍ。（ｄ）ｓｓＤＮＡ－ａがＣｌｙＡ－ＲＲナノポアと相互作用した場合の封鎖レベル（％Ｆｂ）の代表的なヒストグラム。％Ｆの平均値は０．５８３±０．０１４（中心値±ＦＷＨＭ）である。（ｅ）ポリＡ７８がＣｌｙＡ－ＲＲナノポアと相互作用した場合の封鎖レベル（％Ｆｂ）の代表的なヒストグラム。％Ｆの平均値は０．７８０±０．００６（中心値±ＦＷＨＭ）である。ｃｉｓにおいては２．２５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＯＰ記録を実施した。 図１９は、ＰＭＭＡ製測定デバイスを示している。ＰＭＭＡ製デバイスは以前に報告された通りに作製されている［参考文献］。（Ａ）実験で使用されたＤＩＢデバイスの底面図。スケール単位：ｍｍ。（Ｂ）実験で使用されたＤＩＢデバイスの正面図。スケール単位：ｍｍ。緑色で標識された経路を沿って、溶融ゲルをデバイスに注入することができる。（Ｃ）ＤＩＢデバイスの３Ｄモデル。溶融アガロース用のゲル入口穴およびゲル出口穴を図示する。出口側の追加穴は、充填中に気泡を逃す働きをする。４個の独立した液滴ウェルは並列測定用に設計されている。スケールバー：２ｍｍ。（Ｄ）作製されたデバイスの写真。この構成のＤＩＢは、４７３ｎｍレーザーを用いて励起し、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）を用いてイメージングした。スケールバー：１０ｍｍ。
本発明は、全ての電気的接続を取り除くことでｏＳＣＲから簡略化された、ＤｉｆｆｕｓｉＯｐｔｏＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（ＤＯＰ）に基づくものであり、ナノポアセンサを通じた、Ｃａ２＋のその指示薬であるＦｌｕｏ－８色素との拡散を介した結合から生じた蛍光放出を、光学的にモニタリングするものである（図１ｄ）。その後、小分子、高分子、および生体高分子の直接的な検知が、直接的な蛍光の読み取りから実証された。電極を配置する必要性をなくすことで、ＤＯＰは、１回の使用にかかるコストが＄１未満の、アクセス性が高く生体適合性の材料を用いた、数千個のナノポアからの並列測定を可能にする。よって、ナノテクノロジーセンサを備えた使い捨てチップを用いて、新しいコンセプトの臨床診断が開発される可能性がある。コスト面、設備面、および技能面から技術上の障害が低減されるため、どの研究者でも、ほとんどトレーニングをすることなく、ナノポア測定を簡単に実施することが可能となる。ハイスループットな薬物スクリーニングや、イオンチャネルの基礎研究など、様々な研究分野が、このように恩恵を受ける可能性がある。
本発明は、化学勾配によって駆動されるポアを通じたイオン流の光学的測定に基づいて分析物を同定するための無電極の系を提供する。本発明はまた、分析物を同定するためにそのような系を使用する方法を提供し、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡなどの小分子またはＤＮＡを同定する方法が挙げられる。
無電極の系は、膜によって隔てられた２つのコンパートメントを含み、第一コンパートメントは蛍光レポーター分子を含有する第一水溶液を保持し、第二コンパートメントは遊離状態のイオン種を含有する第二水溶液を保持する。イオン種に結合する際、蛍光レポーター分子は光センサで識別可能な特定の蛍光放出を行う。第一コンパートメントと第二コンパートメントとがナノポアにより接続されるように、第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の膜は少なくとも１つのナノポアを有する。イオン種が、化学勾配を原動力として、第二コンパートメントから第一コンパートメントへと膜のナノポアを通過し、第一コンパートメント内の蛍光レポーター分子に結合し、レポーター分子から蛍光が発せられる。イオン種の通過はナノポアに限局されるため、これは、蛍光がナノポアの近位の領域に存在する結果となる。ポア近位の領域の蛍光シグナルの強度は、イオン種の第一コンパートメントへの流動速度に依存する。これで、蛍光レポーター分子の蛍光放出が検出可能となる。ナノポアがナノポアを通過中の分析物によって封鎖または部分的に封鎖された場合、ナノポアを通じたイオン種の移行が妨害され、これはナノポア近傍の蛍光の減少として測定され、ポアを通じたイオン種の妨害なしの流動により生じた蛍光と比較される。分析物が異なると、分析物の大きさや形状などに依存して、ナノポアを横切るイオン種の移行の妨害の程度も異なり、蛍光の減少の程度が異なる結果となる。ポアの封鎖または部分的封鎖による蛍光の減少は、ポアを通じたイオン移行がどの程度妨害されているかと相関しており、これは、分析物の特性に関する情報を反映するものである。ナノポア近位領域の蛍光減少の大きさを利用することで、ナノポアを通過中の封鎖を行っている分析物を同定することができる。蛍光減少の大きさは、イベント滞留時間（ｅｖｅｎｔ ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）およびパーセント封鎖深度（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｄｅｐｔｈ）によって特徴付けることができる。
分析物は第一コンパートメントに加えることもできるし、第二コンパートメントに加えることもできる。分析物は、ナノポアを通じて、例えば化学勾配を原動力として、第一コンパートメントから第二コンパートメントへ、または第二コンパートメントから第一コンパートメントへと通過し、当該ナノポアを封鎖または部分的に封鎖し、蛍光を減少させる。
分析物を同定する方法であって、
（ａ）第一コンパートメントまたは第二コンパートメントに分析物を含む本発明の系を準備すること；
（ｂ）上記蛍光レポーター分子を励起可能な光を、上記ナノポアの近位の上記第一コンパートメント内の領域に当てること；
（ｃ）上記蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを測定し上記分析物を同定すること、
を含む、方法。
イオン種は蛍光レポーター分子と併せて選択され、別の分子の特定の蛍光放出を引き起こす任意のイオン種であってよい。このようなイオン種は当業者に周知である。いくつかの実施形態では、イオン種としては、Ａｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、および／またはＺｎ２＋が挙げられるが、これらに限定はされない。イオン種は１種のイオン種であってもよいし、あるいは、２種以上のイオン種の組み合わせであってもよい。
用語「蛍光レポーター分子」は、上記で挙げられたものなどのイオン種に結合する際に、光センサによって識別可能な特定の蛍光放出を行う任意の分子としてよい。このような蛍光レポーター分子は当業者に周知である。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター分子は、それぞれカルシウムイオン、ナトリウムイオン、または亜鉛蛍光をキレート化できる、小分子などの分子である、カルシウム蛍光プローブ、ナトリウム蛍光プローブ、または亜鉛蛍光プローブであってもよい。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター分子としては、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、またはＢＡＰＴＡ（１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸）が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター分子としては、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、ＺＩＮＱＵＩＮなどが挙げられるが、これらに限定はされない。イオン種は１種の蛍光レポーター分子であってもよいし、あるいは、２種以上の蛍光レポーター分子の組み合わせであってもよい。蛍光レポーター分子は、二重層非透過性などの、膜非透過性であってもよい。
本発明の系および方法において、使用されるイオン種は、使用される蛍光レポーター分子に結合できて、当該蛍光レポーター分子が特定の蛍光放出を行うことができるようなものとすべきである。いくつかの実施形態では、イオン種はＣａ２＋であり、蛍光レポーター分子はＦｌｕｏ－８またはＣａｌ－５２０などのカルシウム蛍光プローブである。
第一コンパートメントはその中に第一水溶液を含有してもよい。第二コンパートメントはその中に第二水溶液を含有してもよい。第一コンパートメントは第一水溶液で完全に満たされていてもよい。第一コンパートメントは第一水溶液で完全には満たされていなくてもよく、第一コンパートメントには第一水溶液のほかに、いくらかの空間または他の基体が存在していてもよい。少なくとも、第一コンパートメントの膜に対しごく近位の部分は第一水溶液で満たされる。第二コンパートメントは第二水溶液で完全に満たされていてもよい。第二コンパートメントは第二水溶液で完全には満たされていなくてもよく、第一コンパートメントには第二水溶液のほかに、いくらかの空間または他の基体が存在していてもよい。少なくとも、第二コンパートメントの膜に対しごく近位の部分は第二水溶液で満たされる。第一コンパートメントと第二コンパートメントは、独立して、任意の形態や任意の形状としてもよい。第一コンパートメントおよび第二コンパートメントの形態や形状は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第一コンパートメントおよび／または第二コンパートメントは、境界層を有していてもよいし、有していなくてもよい。第一コンパートメントおよび第二コンパートメントの境界層は各々、固定であっても可変であってもよい。いくつかの実施形態では、第一コンパートメントは水性液滴によって供給されてもよい。いくつかの実施形態では、第二コンパートメントはヒドロゲル層によって供給されてもよい。
第一水溶液は蛍光レポーター分子を含む。第二水溶液はイオン種を含む。第二水溶液は、カルシウム塩などの、イオン種を供給する塩を含んでもよい。第一水溶液および第二水溶液は、独立して、他の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。第一水溶液は、蛍光レポーター分子と結合し蛍光放出を引き起こすことが可能なイオン種を含んでいなくてもよい。第二水溶液は、イオン種に結合し蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含んでいなくてもよい。
第一水溶液は、第二水溶液中の塩と異なっていてもよい塩を含んでいてもよい。第一水溶液中のイオンは、蛍光レポーター分子に結合して蛍光を放出させるものとすべきではない。第一水溶液中の塩は、蛍光レポーター分子に結合して蛍光を放出させることがない任意の塩としてもよい。いくつかの実施形態では、第一水溶液は塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、第一水溶液は塩化カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第二水溶液は塩化カルシウムを含む。第一水溶液中の塩化カリウムの濃度は約０～３．４Ｍとしてもよい。いくつかの実施形態では、塩化カリウムの濃度は３Ｍ以下である。いくつかの実施形態では、塩化カリウムの濃度は０．７５Ｍ以下、１．０Ｍ以下、１．５Ｍ以下、２．２５Ｍ以下、または２．５Ｍ以下である。第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度は約０．０１～６．７６Ｍとしてもよい。いくつかの実施形態では、塩化カルシウムの濃度は、０．１５Ｍ以上、０．５Ｍ以上、０．７５Ｍ以上、１Ｍ以上、１．５Ｍ以上、２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上である。いくつかの実施形態では、塩化カルシウムの濃度は６Ｍ以下である。
イオン種の濃度を増加させた場合、膜を横切るイオン種の化学勾配が増大して、ナノポアを通じたイオン種の流動がより多く生じることで、センシングシグナルを改善し得ることが、本発明者らにより発見される。しかし、塩濃度は電解質の水中の最大溶解度によっても制限を受ける（例えば、２０℃で、ＣａＣｌ２：６．７６７Ｍ）。いくつかの実施形態では、第一水溶液は、上記イオン（Ｃａ２＋など）の競合的結合を行うためのキレート化剤をさらに含んでいてもよく、これにより、競合的結合によってナノポアの中心から離れた場合に蛍光が減弱することとなる。キレート化剤の例としては、ＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、第一水溶液または第二水溶液は、ｐＨを調節するための緩衝剤を含んでいてもよく、例えば、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、および／またはリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔ）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第一水溶液は、塩化カリウム緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）およびＫＣＬ）を含んでいてもよく、第二水溶液は、塩化カルシウム緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）およびＣａＣｌ２）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第一水溶液は、１．０Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；２．２５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；または２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第二水溶液は、０．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；１Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；または１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい。他の理由で、例えば、タンパク質を安定化させるために、結合成分を調節するために、モル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度を調節するために、および／または、蛍光プローブを活性化するために、塩を第一水溶液または第二水溶液に含ませてもよい。
第一水溶液が分析物を含んでもよい。分析物は、膜のナノポアを通じて、第一コンパートメントから第二コンパートメントに、化学勾配を原動力として通過し、当該ナノポアを封鎖または部分的に封鎖し、蛍光性レポート分子からの蛍光を減少させる。分析物は第二水溶液に含ませてもよく、分析物は、膜のナノポアを通じて、第二コンパートメントから第一コンパートメントに、化学勾配を原動力として通過し、当該ナノポアを封鎖または部分的に封鎖し、蛍光性レポート分子からの蛍光を減少させる。
いくつかの場合では、第一コンパートメントは水性液滴によって供給されてもよい。水性液滴は、第一水溶液を含むものまたはそれからなるものとしてもよい。いくつかの場合では、第二コンパートメントは、アガロース基体を含むヒドロゲル層などの、ヒドロゲル層によって供給されてもよい。ヒドロゲルは第二水溶液を含んでいてもよい。水分子を選択的に透過させる、両親媒性分子を含む疎水性媒体中で接触させた場合、水性液滴およびヒドロゲル層は、当該両親媒性分子からなる液滴界面二重層（ＤＩＢ）を自発的に形成し得る。タンパク質ナノポアは水性液滴またはヒドロゲル中に供給されてもよく、これにより、タンパク質ナノポアをＤＩＢの形成中にＤＩＢに自発的に挿入させることができる。水性液滴が分析物を含んでもよい。
ヒドロゲル層の基体は、親水性ポリマーを含むものまたはそれからなるものとしてもよい。ヒドロゲル層の基体は、実質的に透明な親水性ポリマーを含むものまたはそれからなるものとしてもよい。ヒドロゲル層の基体は、アガロースを含むものまたはそれからなるものとしてもよい。他のヒドロゲル材も好適である場合があり、例えば、ポリアクリルアミド、架橋ポリエチレングリコール、またはニトロセルロースなどである。ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）アガロースを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル層は、５％（ｗ／ｖ）未満のアガロース、４％（ｗ／ｖ）未満のアガロース、または約３％（ｗ／ｖ）のアガロースを含んでいてもよい。ヒドロゲルは、１％（ｗ／ｖ）超のアガロース、２％（ｗ／ｖ）超のアガロースを含んでいてもよい。ヒドロゲルは、約２％～約４％のアガロースを含んでいてもよい。ヒドロゲルは、約２．５％（ｗ／ｖ）～約３．５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含んでいてもよい。ヒドロゲル層が分析物を含んでいてもよい。
第一コンパートメントと第二コンパートメントとを隔てる膜は、ナノポアを支持することが可能な任意の材料としてもよい。膜は天然膜、合成膜、または人工膜としてもよい。膜は固体膜としてもよい。膜は、固体の基体を含むものとしても、固体の基体からなるものとしてもよく、固体の基体としては、ＳｉＮｘ、ガラス、二酸化ケイ素、二硫化モリブデン、グラフェン、酸化アルミニウム、またはＣＮＴ（カーボンナノチューブ）などである。
膜は半透膜としてもよい。半透膜は水分子を選択的に透過させるものである。イオン種、蛍光レポーター分子、分析物などは半透膜を透過できず、その結果、それらの通過はナノポアに限定されることとなる。このような半透膜およびその製造法は当業者に周知である。半透膜は、水分子を選択的に透過させる、両親媒性分子を含むもの、または両親媒性分子からなるものとしてもよい。
半透膜は、両親媒性分子を含むもの、または両親媒性分子からなるものとしてもよい。両親媒性分子は、脂質またはポリマーとしてもよく、例えばブロックコポリマーとしてもよい。膜は、単層または二重層としてよく、例えば、両親媒性分子を含むものまたは両親媒性分子からなるものであってもよい単層または二重層としてもよい。例としては、ブロックコポリマーなどのポリマーを含むまたはそれからなる単層、および脂質を含むまたはそれからなる二重層が挙げられる。二重層は脂質二重層としてもよい。二重層は人工二重層としてもよく、例えば非天然二重層としてもよい。二重層は細胞二重層としてはならない。二重層はパッチクランプ細胞二重層としてはならない。二重層を得るための方法が複数存在することは、当業者には理解される。二重層は、例えば国際公開第２００９０２４７７５号において与えられたように、液滴ヒドロゲル二重層（ｄｒｏｐｌｅｔ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｂｉｌａｙｅｒ）（ＤＨＢ）法によって供給されてもよく、上記国際公開の内容は参照によって本明細書に援用されたものとする。
いくつかの実施形態では、半透膜は、脂質またはブロックコポリマーなどの両親媒性分子を含有する疎水性媒体中に、第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の相互作用によって、得てもよい。いくつかの実施形態では、半透膜は、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中に第一コンパートメントおよび第二コンパートメントを浸漬し、当該両親媒性分子が半透膜を形成するように当該第一コンパートメントと当該第二コンパートメントとを接触させることによって、得てもよい。その結果、上記両親媒性分子からなる半透膜が、上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に自発的に形成することとなる。いくつかの実施形態では、タンパク質ナノポアは第一コンパートメントまたは第二コンパートメントに供給されてもよく、両親媒性分子からなる膜が自発的に形成する際に、当該タンパク質ナノポアを二重層に自発的に挿入させてもよい。いくつかの実施形態では、半透膜は、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中に、いずれかがタンパク質ナノポアを有する第一コンパートメントおよび第二コンパートメントを浸漬することで、得てもよい。結果として、上記両親媒性分子からなる半透膜が、上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に自発的に形成することとなり、上記タンパク質ナノポアを二重層に自発的に挿入させることができる。
いくつかの実施形態では、二重層は、単層の両親媒性分子を有する第一コンパートメントを、単層の両親媒性分子を有する第二コンパートメントと接触させて、二重層を自発的に形成させることで、得てもよい。いくつかの実施形態では、二重層は、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中に、いずれかがタンパク質ナノポアを有する第一コンパートメントおよび第二コンパートメントを浸漬することで、第一コンパートメントおよび第二コンパートメントの表面上に単層の両親媒性分子を形成させ、単層の両親媒性分子が二重層を形成するように第一コンパートメントと第二コンパートメントとを接触させることで、得てもよい。結果として、上記両親媒性分子からなる二重層が上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に自発的に形成することとなり、上記タンパク質ナノポアを当該二重層に自発的に挿入させることができる。
よって、本発明の一つの態様では、上記系を製造する方法であって、
第一水溶液を中に含有し、当該第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメントを準備すること；
第二水溶液を中に含有し、当該第二水溶液は上記蛍光レポーター分子に特異的に結合する上記イオン種を含む、第二コンパートメントを準備すること；
ナノポアが挿入された半透膜が上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとを接触させること；
を含み、
上記第一水溶液または上記第二水溶液中にタンパク質ナノポアが供給され、
上記両親媒性分子からなる半透膜が上記第一コンパートメントと上記第二コンパートメントとの間に自発的に形成することとなり、上記タンパク質ナノポアを当該半透膜に自発的に挿入させることができる、
方法が提供される。
ここで記載されている、第一コンパートメント、第二コンパートメント、蛍光レポーター分子、イオン種、タンパク質ナノポア、半透膜、二重層、疎水性媒体、両親媒性分子、分析物などの特徴は、本明細書との関連において記載された通りである。
本発明において、分析物は、半透膜が形成する前に第一水溶液または第二水溶液に供給されてもよい。分析物はまた、半透膜が形成した後の、且つ検出が始まる前に、第一水溶液または第二水溶液に添加されてもよい。
いくつかの実施形態では、両親媒性分子は、水分子を選択的に透過させるものとしてもよい。本発明のいずれかの方法で使用される両親媒性分子は、ポリマー分子または脂質分子としてもよく、特に、界面活性剤分子を用いてもよい。脂質分子は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールを含む群から選択されるものとしてもよい。上記脂質としては、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；および１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物を含む群のいずれか；またはこれらの混合物を含んでいてもよい。
上記ポリマーは、半透膜を形成可能なブロックコポリマーとしてもよく、例えばトリブロックコポリマーとしてもよく、例えば、Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．およびＡｈｍｅｄ，Ｆ．、Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、８巻、頁３２３－３４１（２００６年）；Ｎａｒｄｉｎ，Ｃ．、Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，Ｍ．、およびＭｅｉｅｒ，Ｗ．、Ｇｉａｎｔ ｆｒｅｅ－ｓｔａｎｄｉｎｇ ＡＢＡ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１６巻、頁７７０８－７７１２（２０００年）；Ｍｅｉｅｒ，Ｗ．、Ｎａｒｄｉｎ，Ｃ．、およびＷｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，Ｍ．、Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ （ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ） ＡＢＡ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３９巻、頁４５９９－４６０２（２０００）、またはＣＮ１０４９３６６８２Ｂで提供されたようなものとしてもよく；これらは、参照によって本明細書に援用されたものとする。１つの実施形態では、上記トリブロックコポリマーは、ポリ（２－メチルオキサゾリン）－ブロック－ポリ（ジメチルシロキサン）－ブロック－ポリ（２－メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ）またはポリ（２－メチルオキサゾリン）－ブロック－ポリ（エチレン）－ブロック－ポリ（２－メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＥ－ＰＭＯＸＡ）である。
疎水性媒体は油を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、疎水性媒体は油としてもよい。両親媒性分子を含む疎水性媒体は、油中脂質（ｌｉｐｉｄ－ｉｎ－ｏｉｌ）を含むものまたはそれからなるものとしてもよい。上記油は炭化水素としてもよく、上記炭化水素は分岐状であっても非分岐状であってもよく、置換であっても非置換であってもよい。例えば、上記炭化水素は５～２０個の炭素原子を有するものとしてもよく、より好ましくは、１０～１７個の炭素原子を有するものである。好適な油としては、ヘキサデカン、デカン、ペンタン、もしくはスクアレンなどのアルカンまたはアルケン、またはフッ素化油、またはシリコーン系油、または四塩化炭素；またはこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記油は、Ｃ１０～Ｃ１７ｎ－アルカンなどのｎアルカンであり、例えばｎ－ヘキサデカン（Ｃ１６）などである。いくつかの実施形態では、疎水性媒体は、油としてもよく、例えば、ヘキサデカンおよびシリコーン油 混合物などである。いくつかの実施形態では、上記油は、ヘキサデカンおよびシリコーン油ＡＲ２０（シグマ・アルドリッチ社）の１：１（ｖ：ｖ）混合物を含んでいてもよい。
他の二重層形成法も代わりに利用可能である。例えば、二重層は、当業者に公知の以下の技術のいずれか１つによって得てもよく、パッチクランプ法、例えば光学的パッチクランプ法；黒膜（ｂｌａｃｋ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ：ＢＬＭ）；別名ＢＬＭ塗装（ｐａｉｎｔｅｄ ＢＬＭ）；支持脂質二重膜（Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ：ＳＬＢ）；およびテザード二重層脂質膜（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ｔ－ＢＬＭ）が含まれる。二重層は国際公開第２００８１０２１２１号に従って開口部に形成させてもよく、上記国際公開の内容は参照によって本明細書に援用される。二重層は国際公開第２０１４０６４４４４号に従って液滴間の界面に形成させてもよく、上記国際公開の内容は参照によって本明細書に援用される。
本発明において、用語「ナノポア」とは、その最狭点に開口部を有するチャネルであって、当該開口部が分析物の通過を可能とする直径を有するものを指す。ナノポアは、分析物によるチャネルの封鎖が、蛍光シグナルなどの特定のシグナルにおける変化によって検出可能であるのに十分な狭さを有する。
膜のナノポアは、系の意図される用途に応じて大きさを変えることができるが、本発明で使用されるイオン種のイオン通過が可能であるほど十分に大きなものでなければならない。また好ましくは、ナノポアは蛍光レポーター分子の通過を妨げるほど十分に小さなものである。ナノポアは分析物の通過が可能であるほど十分に大きなものとしてもよい。
膜が固体膜であるか半透膜であるかに関わらず、ナノポアは、固体ナノポア、ＤＮＡナノポアまたはタンパク質ナノポアとしてもよい。ナノポアは天然のもの、例えば生物由来のものとしてもよいし、あるいは、ナノポアは合成のものとしてもよい。ナノポアは組み換え生成されたものとしてもよい。ナノポアは、タンパク質ナノポア（ナノポア形成タンパク質と称することもある）などの生体分子としてもよい。場合によっては、ナノポアは、タンパク質ナノポアまたはナノポア形成タンパク質と称される場合があるタンパク質によって、形成されてもよい。本発明で使用されるタンパク質ナノポアは、自発的な開閉活性は持たないことが好ましく、且つ／あるいは、分析物が存在していない場合に開き続けていることが好ましい。本発明で使用されるタンパク質ナノポアは任意のものとしてもよい。タンパク質ナノポアまたはナノポア形成タンパク質の例としては、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、またはこれらのバリアントが挙げられる。いくつかの実施形態では、１または複数のナノポアがＣｌｙＡ－ＲＲ［４２］である。ＣｌｙＡ－ＲＲは、ＣｌｙＡの変異体（Ｄ６４Ｒ／Ｃ８７Ａ／Ｌ９９Ｑ／Ｅ１０３Ｇ／Ｓ１１０Ｒ／Ｆ１６６Ｙ／Ｉ２０３Ｖ／Ｃ２８５Ｓ／Ｋ２９４Ｒ／Ｈ３０７Ｙ）である。生体分子ナノポアの他の例としては、ＤＮＡ自己集合によって形成されたナノポアが挙げられる。また、本発明で使用できるナノポアは、カリウムチャネルまたはナトリウムチャネルなどの、イオンチャネルとしてもよい。
本発明において、用語「α－ＨＬ」とは、α溶血と称される場合もあり、野生型α溶血素、変異型α溶血素、野生型α溶血素のパラログまたはホモログ溶血素、および、変異型α溶血素のパラログまたはホモログ溶血からなる群から選択されるものとしてもよい。いくつかの実施形態では、α溶血素は、野生型α溶血素としてもよい。本発明で使用されてもよいα溶血素は、ナノポアを形成可能なものであるべきである。いくつかの実施形態では、α－ＨＬは七量体である。
本発明において、用語「ＣｌｙＡ」とは、野生型ＣｌｙＡ、変異型ＣｌｙＡ、野生型ＣｌｙＡのパラログまたはホモログＣｌｙＡ、および変異型ＣｌｙＡのパラログまたはホモログＣｌｙＡからなる群から選択されるものとしてもよい。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡは、野生型α溶血素としてもよい。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡは、変異型ＣｌｙＡとしてもよい。好ましい変異型ＣｌｙＡはＣｌｙＡ－ＲＲである。本発明で使用されてもよいＣｌｙＡは、ナノポアを形成可能なものであるべきである。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡまたはＣｌｙＡ－ＲＲは十二量体である。
タンパク質ナノポアの配列、例えばα－ＨＬおよびＣｌｙＡまたはこれらの変異体の配列は、当業者に既知である。タンパク質ナノポア、例えばα－ＨＬまたはＣｌｙＡまたはこれらの変異体、の作製法は当業者に既知であり、例えば、原核生物発現と、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーによる簡易精製とにより作製できる。タンパク質ナノポアは、いくつかのタンパク質単量体の自己集合によって形成でき、例えば、十二量体ＣｌｙＡ、十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲ、または七量体α－ＨＬなどである。いくつかの例では、タンパク質ナノポアは半透膜に自己集合することができる。
ナノポアは、固体ナノポアとしてもよく、例えば、窒化ケイ素またはグラフェンなどの合成材料を含むものなどである。固体ナノポアは、典型的には、合成膜（ＳｉＮｘまたはＳｉＯ２など）に形成されたナノメートルサイズの孔である。固体ナノポアは、収束イオンまたは電子ビームで作製することができ、細孔の大きさを調整することができる。ナノポアは、合成材料にポア形成タンパク質セットを含むハイブリッドナノポアとしてもよい。
膜にナノポアを形成する方法は当業者に周知のものであり、例えば、半透膜が形成された後または半透膜の形成中に半透膜にナノポア分子を加えることによる方法である。いくつかの実施形態では、タンパク質ナノポアは、第一コンパートメントまたは第二コンパートメントに供給されてもよく、両親媒性分子からなる膜が自発的に形成する際に、当該タンパク質ナノポアを半透膜に自発的に挿入させてもよい。
分析物は特定の分子に限定されず、ナノポアを通過時にナノポアを封鎖または部分的に封鎖できる任意の分子としてもよい。分析物としては小分子、高分子、または生体高分子を挙げることができ、これらに限定はされない。小分子は、分子量が低くサイズが小さい分子またはイオンであって、ナノポアの孔径よりもはるかに小さく、ナノポアを容易に通過するものを意味する。小分子としては、化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、またはヌクレオチドを挙げることができ、これらに限定はされない。高分子は非常に大きな分子を意味し、典型的には、数千個またはそれより多くの原子から構成される。高分子としては、核酸、タンパク質、炭水化物、もしくは脂質などの生体高分子；脂質もしくは大環状分子などの巨大な非重合体分子；または合成高分子を挙げることができるが、これらに限定はされない。高分子の一例としては生体高分子があり、例えば、ポリペプチド、多糖類、またはポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含む）またはＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡを含む）が挙げられるが、これらに限定はされない。ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡなどのＤＮＡの長さは、１０～１０００ｎｔとしてもよい。ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡなどのＤＮＡの長さは、１５ｎｔ超、２０ｎｔ超、３０ｎｔ超、４０ｎｔ超、５０ｎｔ超、６０ｎｔ超、７０ｎｔ超、８０ｎｔ超、９０ｎｔ超、または１００ｎｔ超としてもよい。ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡなどのＤＮＡの長さは、５００ｎｔ未満、４０００ｎｔ未満、３００ｎｔ未満、２００ｎｔ未満としてもよい。ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡなどのＲＮＡの長さは、１５ｎｔ超、２０ｎｔ超、３０ｎｔ超、４０ｎｔ超、５０ｎｔ超、６０ｎｔ超、７０ｎｔ超、８０ｎｔ超、９０ｎｔ超、または１００ｎｔ超としてもよい。ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡなどのＲＮＡの長さは、５００ｎｔ未満、４０００ｎｔ未満、３００ｎｔ未満、２００ｎｔ未満としてもよい。
分析物は、第一水溶液中または第二水溶液中に入れてもよい。分析物は、第一水溶液または第二水溶液を作製時に第一水溶液または第二水溶液に含めてもよく、すなわち、分析物は、他の所望の成分と一緒に、第一水溶液または第二水溶液に配合されてもよい。分析物は、系の準備ができてから、検査が開始されるときに、第一水溶液または第二水溶液に加えてもよい。
本発明において、用語「同定」とは、識別情報、例えば、分析物の種類の検出もしくは解析、または、分析物の構造情報、例えば、ポリマーの構造、もしくは、ポリヌクレオチドの一次構造もしくは二次構造などのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの構造の取得を包含する。
ナノポアを通過中の封鎖分析物はナノポア近位領域の蛍光減少の大きさによって同定することができる。本発明の開示に伴い、蛍光減少の大きさに基づいて分析物を同定する方法が当業者に知られることとなるが、これは、例えば、イベント滞留時間およびパーセント封鎖深度によって特徴付けることができる。イベント滞留時間は分析物がナノポアを占有している残留時間である。パーセント封鎖深度はＩｂ／Ｉｏと定義され、ここでＩｂおよびＩｏはそれぞれ、絶対封鎖電流（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｃｕｒｒｅｎｔ）および開口ポア電流（ｏｐｅｎ ｐｏｒｅ ｃｕｒｒｅｎｔ）を意味する。例えば、イオン流の妨害により生じる蛍光放出を測定し、同一試験条件下での基準物質の蛍光放出と比較することで、当該分析物と当該基準とが同一であるかどうかを判定できる。蛍光放出のイベント滞留時間および／またはパーセント封鎖深度を比較項目とすることができる。
蛍光検出は膜および膜領域の顕微鏡観察または分光測定を含んでいてもよい。蛍光検出は、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、広視野蛍光顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法の使用を含んでいてもよい。蛍光検出は、例えば、徳永ら（２００８年、Ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｃｌｉｎｅｄ ｔｈｉｎ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｃｅｌｌｓ．、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、５巻、頁１５９－１６１）により提供されたような、薄層斜光照明法（ＨｉＬｏ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の使用を含んでいてもよい。蛍光検出は、他の微小角入射照明法の使用を含んでいてもよい。膜と膜内のナノポアのすぐ周囲の膜領域における蛍光シグナル／放出を検出するために、任意の好適な蛍光検出手段を用いてもよい。蛍光検出は、表面プラズモン共鳴法の使用を含んでいてもよい。蛍光検出は、ＳＴＥＤ、ＧＳＤ、ＲＥＳＯＬＦＴ、もしくはＳＳＩＭを含む確定的超解像微鏡法；もしくはＳＯＦＩを含む確率的超解像などの超解像顕微鏡法、または、ＳＰＤＭ、ＳＰＤＭｐｈｙｍｏｄ、ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭ、もしくはｄＳＴＯＲＭなどの単一分子局在化法（ＳＭＬＭ）の使用を含んでいてもよい。蛍光検出は、落射蛍光顕微法、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＬＳＭ）、または全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法の使用を含んでいてもよい。蛍光検出は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の使用を含んでいてもよい。共焦点ＬＳＭもしくは二光子ＬＳＭによって、またはＴＩＲＦ顕微鏡法を用いて取得できる画像の蛍光強度における変動の空間相関関数を算出するのに、画像相関分光法（ＩＣＳ）を用いもよい。蛍光検出法は、参照によりその内容が本明細書に援用される、Ａｎａ Ｊ．Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｅｚ、Ｐｅｔｒａ Ｓｃｈｗｉｌｌｅ．、Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１７９８巻（２０１０年）頁７６６－７７６に記載されているものとしてもよい。
蛍光レポーター分子からの蛍光放出の検出は、光源および光センサが必要なものであってもよい。光源および光センサは同じデバイスに搭載してもよいし、あるいは別々のデバイスに搭載してもよい。光源は、イオン種の存在下で蛍光レポーター分子を励起可能な波長または波長範囲の光を供給可能なものとすべきであり、光センサは、イオン種の存在下で蛍光レポーター分子によって放出された波長または波長範囲の光を検出可能なものとすべきである。
よって、いくつかの実施形態では、上記系は、ナノポア近位の膜領域を照射可能な光源を含む。いくつかの実施形態では、光源は特定範囲の波長内の光を供給する。いくつかの実施形態では、光源は、レーザー、ＬＥＤ、ハロゲンライト、またはキセノンライトとしてもよい。蛍光レポーター分子を光源で照明する方法は当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、上記系は、ナノポア近位の膜領域内の光シグナルを検出可能な光センサを含む。光センサは、低光量光（すなわち蛍光）に対し感度のある感光デバイスとしてもよく、例えば電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、電子増倍ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）、ｓＣＭＯＳセンサ、または光ダイオードなどであり、光ダイオードはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。高速感光デバイスが好ましい。好ましくは、光センサはＥＭＣＣＤまたはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）である。
光センサはまた、顕微鏡イメージングシステム、光電子増倍管、または上記の蛍光検出技術を利用して蛍光を検出できる光センサとしてもよい。いくつかの実施形態では、ナノポア近位の膜領域における光シグナルを検出および／または記録するために、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）などの全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）イメージングシステムを用いてもよい。いくつかの実施形態では、ナノポア近位の膜領域における光シグナルを検出および／または記録するために、広視野蛍光イメージングシステムまたは共焦点イメージングシステムを用いてもよい。光センサにより蛍光レポーター分子からの蛍光放出を検出する方法は当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、光センサおよび光センサは単一デバイスとしてもよい。いくつかの蛍光検出デバイスを照明に用いてもよい。例えば、ＴＩＲＦＭは照明とイメージングの両方に用いることができる。
本発明者らは、第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の浸透圧流が、ナノポアによる分析物の蛍光検出のさらなる改善のために有利であることを発見した。第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間のモル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度差は、膜に挿入された生体ナノポアを通じた、イオンおよび分析物を運ぶ定方向水流を駆動し得る。結果として、この非対称性の導入により分析物の移行効率の増強が達成されるはずである。さらに、第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の浸透圧流によって蛍光シグナルが増幅され得る。第二水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）が第一水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）よりも高い場合、蛍光レポーター分子は半透膜に対し非透過性であるという事実から、膜を横切る浸透圧水流によって、第一コンパートメントの膜周辺に蛍光レポーター分子が濃縮し、その結果蛍光強度が増強することとなる。
よって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、第一水溶液および第二水溶液が等張を維持する環境、または第二水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）が第一水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）よりも低い環境において実施できるが、いくつかの実施形態では、第二水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）は、第一水溶液のモル浸透圧濃度（または重量モル浸透圧濃度）よりも高くても低くてもよい。
モル浸透圧濃度および重量モル浸透圧濃度は共に、オスモル単位で定義される。オスモルは、化学溶液の浸透圧に寄与する化合物のモル数、すなわち、半透膜を横切る濃度勾配など、２つの側面を横切る濃度勾配から生じる静水圧を記述する、測定の単位である。モル浸透圧濃度は、溶液の体積当たりの溶質のオスモル数と定義される。一般的には、モル浸透圧濃度はｏｓｍｏｌ／Ｌ単位で表現される。重量モル浸透圧濃度は非常に似たものであるが、１キログラムの純水溶媒当たりの溶質のオスモル数と定義され、一般的にはｏｓｍｏｌ／ｋｇ単位で表現される。例えば、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの溶液は２ｏｓｍｏｌ／Ｌのモル浸透圧濃度に相当する。ＮａＣｌ塩粒子は水中で完全に解離し、２つの別々の粒子、Ｎａ＋イオンとＣｌ－イオンになる。よって、ＮａＣｌの各モルは溶液中では１モルのＮａ＋と１モルのＣｌ－という２オスモルとなる。同様に、１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２の溶液は、３ｏｓｍｏｌ／Ｌ（Ｃａ２＋および２Ｃｌ－）の溶液を与える。溶液のモル浸透圧濃度または重量モル浸透圧濃度を求める方法は当業者に公知である。
第二水溶液のモル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度は、イオン種の濃度を増加させることにより、または第一水溶液のモル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度を増加させることができる他の溶質をさらに添加することにより、増加させてもよい。イオン種の濃度を増加させることでセンシングシグナルを改善できたため、好ましくは、第二水溶液のモル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度は、イオン種の濃度を増加させることで増加させる。第一水溶液のモル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度は、浸透圧に寄与し得る溶質の濃度を減少させることにより減少させてもよいし、あるいは第一水溶液に塩を含めなくてもよい。いくつかの実施形態では、第二水溶液のモル浸透圧濃度は、第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも、少なくとも０．０１ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．０５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．１ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．２ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．３ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．４ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．６ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．７ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．８ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも０．９ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも２．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも２．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも３．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも３．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも４．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも４．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも５．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも５．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも６．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも６．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも７．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも７．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも８．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも８．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも９．０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも９．５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１０ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１１ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１２ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１３ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１４ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１５ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１６ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１７ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１８ｏｓｍｏｌ／Ｌ、少なくとも１９ｏｓｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも２０ｏｓｍｏｌ／Ｌ高い。いくつかの実施形態では、第二水溶液の重量モル浸透圧濃度は、第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも、少なくとも０．０１ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．１ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．２ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．３ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．４ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．６ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．７ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．８ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも０．９ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも２．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも２．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも３．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも３．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも４．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも４．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも５．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも５．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも６．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも６．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも７．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも７．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも８．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも８．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも９．０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも９．５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１１ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１２ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１３ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１４ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１５ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１６ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１７ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１８ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも１９ｏｓｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも２０ｏｓｍｏｌ／ｋｇ高い。
蛍光レポーター分子から放出された蛍光を測定することにより、本発明は、高価な電極を並べる必要なく、多数のナノポアを通じた流動を同時に記録することを可能にする。測定された蛍光は、各ナノポアごとに複数の蛍光トレースに分離でき、ナノポアアレイなどのハイスループットスクリーニングを必要とする状況に適用できる。
本発明の別の態様では、無電極のナノポアアレイが提供される。ナノポアアレイは複数の本発明の系を並列に含み、各系は上記の通りである。ナノポアアレイを用いることで、複数の分析物を同時に同定することができる。本発明のナノポアアレイは電極なしで用いることができるため、デバイスのサイズを小さくし、コストを節約できる。
上記の複数の系は、測定された蛍光が各系において識別可能であるように配置される。これらの複数の系の少なくとも一部は、各系を独立して用いてその中の分析物を検出できるように、且つ、測定された蛍光が各系において識別可能であるように、互いに隔てられている。いくつかの実施形態では、上記複数の系の少なくとも第一コンパートメントは互いに隔てられている。いくつかの実施形態では、上記複数の系の第二コンパートメントは互いに隔てられているか、互いに隔てられていない。上記複数の系は同じであっても異なっていてもよい。
ナノポアアレイにおける系の密度は、最大１０／ｍｍ２、最大５０／ｍｍ２、最大１００／ｍｍ２、最大２００／ｍｍ２、最大３００／ｍｍ２、最大４００／ｍｍ２、最大５００／ｍｍ２、最大６００／ｍｍ２、最大７００／ｍｍ２、最大８００／ｍｍ２、最大９００／ｍｍ２、最大１０００／ｍｍ２、またはそれ以上としてもよい。
上記複数の系によって与えられる総面積は、最大１ｍｍ２、最大２ｍｍ２、最大５ｍｍ２、最大１０ｍｍ２、最大１５ｍｍ２、最大２０ｍｍ２、最大２５ｍｍ２、最大３０ｍｍ２、最大３５ｍｍ２、最大４０ｍｍ２、最大４５ｍｍ２、最大５０ｍｍ２、最大５５ｍｍ２、最大６０ｍｍ２、最大６５ｍｍ２、最大７０ｍｍ２、最大７５ｍｍ２、最大８０ｍｍ２、最大８５ｍｍ２、最大９０ｍｍ２、最大９５ｍｍ２、または最大１００ｍｍ２、またはそれ以上としてもよい。
複数の分析物が種々の系に物理的に分離されるように、複数の分析物を上記アレイの２つ以上の系、またはそれぞれの系に、供給することができる。複数の分析物は同じであっても異なっていてもよく、あるいは、部分的に同じであっても部分的に異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、複数の分析物のうち少なくとも２つは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、同じ分析物を上記アレイの２つ以上の系、またはそれぞれの系に供給してもよい。いくつかの実施形態では、異なる分析物を上記アレイの２つ以上の系、またはそれぞれの系に供給してもよい。いくつかの実施形態では、異なる分析物がそれぞれ異なる系に供給されてもよい。複数の分析物が異なるナノポアを同時に通過すると、それぞれのナノポアに近位の領域の蛍光が減少することとなり、各ナノポアごとに複数の蛍光トレースに分離できるため、各分析物を同定することが可能となる。
このようなナノポアアレイは、複数の分析物を同定する多重法であって、
（ａ）複数の分析物を含み、２種以上の分析物がナノポアアレイの各種系に供給される、本発明のナノポアアレイを準備すること；
（ｂ）第一コンパートメントのそれぞれに含有される蛍光レポーター分子を励起可能な光を、ナノポア近位の複数の第一コンパートメント内の領域に当てること；
（ｃ）第一コンパートメントのそれぞれに含有される蛍光レポーター分子からの複数の蛍光シグナルを測定し、複数の分析物を同定すること、
を含む多重法で用いることができる。
ここで記載されている、第一コンパートメント、第二コンパートメント、蛍光レポーター分子、イオン種、タンパク質ナノポア、膜、二重層、疎水性媒体、両親媒性分子、分析物などの特徴は、本明細書との関連において記載された通りである。
ナノポアアレイにおいて、異なる系は、同じまたは異なる蛍光レポーター分子と、異なるイオン種とを含んでいてもよい。検出の便宜のために、好ましくは、異なる系は同じ蛍光レポーター分子と異なるイオン種とを含む。
ナノポアアレイにおいて、異なる系は、同じまたは異なるナノポアを含んでいてもよい。検出の便宜のために、好ましくは、異なる系は同じナノポアを含む。
いくつかの実施形態では、異なる系の第一コンパートメントは互いに分離されており、異なる系の第二コンパートメントは互いに分離されていない。いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、水分子を選択的に透過させる両親媒性分子を含む疎水性媒体中で複数の第一コンパートメントと第二コンパートメントとを接触させることにより得てもよく、ここで、各第一コンパートメントはその中にタンパク質ナノポアを少なくとも含む。両親媒性分子からなる半透膜が第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間に自発的に形成することとなり、タンパク質ナノポアを半透膜に自発的に挿入させることができる。いくつかの実施形態では、各第一コンパートメントは、タンパク質ナノポアと、蛍光性レポート分子と、所望により分析物をその中に含み、異なる分析物は各種油中水型コンパートメント中へと物理的に分離され得る。
いくつかの実施形態では、各系の第一コンパートメントは水性液滴によって得られ、各系の第二コンパートメントは、アガロース基体を含むヒドロゲル層などのヒドロゲル層によって得られる。いくつかの実施形態では、複数の系の第二コンパートメントは単一ヒドロゲル層によって得られる。いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、水分子を選択的に透過させる両親媒性分子を含む疎水性媒体中で複数の水性液滴とヒドロゲル層を接触させることで得てもよく、ここで、各水性液滴はタンパク質ナノポア、蛍光性レポート分子、および分析物を含み、異なる分析物は各種油中水滴へと物理的に分離され得る。両親媒性分子からなる半透膜が各水性液滴とヒドロゲル層との間に自発的に形成することとなり、タンパク質ナノポアを半透膜に自発的に挿入させることができる。
本発明の別の態様において、ナノポアアレイを製造する方法であって、
タンパク質ナノポアと、分析物と、イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子とをそれぞれが含む、複数の水性液滴を準備すること；
イオン種を含むヒドロゲル層を準備すること；
半透膜が水性液滴のそれぞれとヒドロゲル層との間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で複数の水性液滴とヒドロゲル層とを接触させること、
を含む方法が提供される。
各水性液滴の体積は、１００ｐＬ未満、９０ｐＬ未満、８０ｐＬ未満、７０ｐＬ未満、６０ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、４０ｐＬ未満としてもよく、例えば、約３０ｐＬとしてもよい。液滴－ヒドロゲルアレイの密度は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも５０個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも１００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも２００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも３００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも４００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも５００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも６００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも７００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも８００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも９００個の液滴、１ｍｍ２当たり少なくとも１０００個の液滴としてもよく、例えば、マイクロフルイディクスからの補助を受けることで形成できる高秩序液滴－ヒドロゲルアレイなどである。
本発明の１つのナノポアアレイでは、水性液滴の数は、４～１，０００，０００個としてもよい。いくつかの実施形態では、水性液滴の数は、１０個超、１００個超、または１０００個超である。いくつかの実施形態では、水性液滴の数は、１００，０００個未満、１０，０００個未満、または１０００個未満である。
上記の単一系または方法用に記載された光源、光センサ、および記録デバイスは、本発明のナノポアアレイに用いることができる。当業者に公知のように、電子増倍ＣＣＤカメラ（ｉｘｏｎ３、アンドール社（Ａｎｄｏｒ））により、２５００個超に及ぶポアが同時に記録されてもよい。
モル浸透圧濃度／重量モル浸透圧濃度差による蛍光シグナルの増幅は、本発明の多重系および多重法の場合にも適用できる。
本発明の別の態様において、ナノポアアレイを形成するためのキットであって、
アガロースと、緩衝剤と、蛍光レポーター分子に特異的に結合し蛍光を放出させることが可能なイオン種と、を含む充填用ヒドロゲル；
キレート化剤と、イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子と、緩衝剤と、を含む水溶液であって；キレート化剤はイオン種に結合することが可能である、水溶液；
両親媒性分子を含有する疎水性媒体；
固体支持体、
を含むキットが提供される。
固体支持体は、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中でヒドロゲルと水溶液の液滴とを接触させて、ヒドロゲルと水溶液の液滴との間に両親媒性分子からなる半透膜を形成するのに好適な任意の構造を有していてもよい。固体支持体は、ＰＭＭＡ製またはガラス製としてもよい。固体支持体は、図１９に示されるような構造を有するＰＭＭＡ製測定デバイスとしてもよい。図３および図１９に示されているように、ＰＭＭＡ製測定デバイスは、中央の凹領域に４つの独立した液滴ウェルと、充填用ヒドロゲルを充填するためのゲル入口と、排出用の出口と、ヒドロゲルを支持するためのカバーガラスとを有していてもよい。カバーガラスは、酸素プラズマ処理カバーガラスとしてもよい。ＰＭＭＡは、ポリメチルメタクリレートメタクリル酸（ｐｏｌｙ ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）としても知られている。
キットは、水にアガロースを含んだ、塗布用ヒドロゲルを含んでいてもよい。ナノポアアレイを形成させるため、カバーガラスを、溶解した塗布用ヒドロゲルでスピンコートし、ゲル入口を通じて溶解した充填用ヒドロゲルを充填することによりＰＭＭＡ製測定デバイスに貼り付けてもよい。次いで、カバーガラスを、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中に浸漬してもよい。タンパク質ナノポアおよび分析物を含む水性液滴をピペット操作で疎水性媒体へと移し、インキュベーションを行ってもよい。液滴およびアガロースヒドロゲルを疎水性媒体中で接触させてもよく、ＤＩＢ形態のナノポアアレイが自発的に形成し得る。
いくつかの実施形態では、充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い。
いくつかの実施形態では、蛍光レポーター分子はＦｌｕｏ－８としてもよく、イオン種はＣａ２＋としてもよい。
充填用ヒドロゲルまたは水溶液はまた、タンパク質ナノポアを含んでいてもよい。
水溶液は、ＫＣｌまたはＮａＣｌなどの塩を含んでいてもよい。
ここで記載されている、蛍光レポーター分子、イオン種、タンパク質ナノポア、疎水性媒体、両親媒性分子、キレート化剤、分析物などの特徴は、本明細書との関連において記載された通りである。
いくつかの実施形態では、塗布用ヒドロゲルは０．７５％（ｗ／ｖ）のアガロースを水に含むものであってもよい。
いくつかの実施形態では、充填用ヒドロゲルは２．５％アガロース、１．５Ｍ ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、上記水溶液は１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、両親媒性分子を含有する疎水性媒体は、乾燥ＤＰＨＰＣ脂質膜５ｍｇをヘキサデカンおよびシリコーン油の１：１体積比の混合物２ｍＬ中に溶解させて含む脂質油であってもよい。別の態様において、本発明は、上記製造法によって形成されるナノポアアレイを提供する。
別の態様において、本発明は、光学的な分析物の分析を行うための、上記の系または上記のナノポアアレイの使用を提供する。
特に記載がない限り、系および方法の特徴の大部分は、異なる系および異なる方法で共通であり、例えば、第一コンパートメントおよび第二コンパートメント、第一水溶液および第二水溶液、膜、ナノポア、蛍光レポーター分子、並びに／またはイオン種、並びにそれらを形成させる方法、それらを使用する方法などの特徴である。例えば、ナノポアアレイにおける、第一コンパートメントおよび第二コンパートメント、第一水溶液および第二水溶液、膜、ナノポア、蛍光レポーター分子、並びに／またはイオン種、並びにそれらを形成させる方法、それらを使用する方法などの特徴は、特に記載がないか不可能でない限り、上記の単一系において記載された通りのものとしてもよい。
本発明において、溶液中の成分について言及する場合、「第一水溶液中」および「第一コンパートメント中」は、同義的に使用されている場合があり、「第二水溶液中」および「第二コンパートメント中」は同義的に使用されている場合がある。
本明細書に記載の実施形態は、下記の詳細な説明、例、および特許請求の範囲、並びにそれらの前後の説明を参照することによって、より容易に理解することができる。本明細書に記載の実施形態が特定の使用、方法、および／または生成物に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語が、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことを理解されたい。
さらに、下記の説明は、現在知られている最良の態様の様々な実施形態の教示を可能にするものとして提供される。関連技術分野の当業者であれば、本開示の有益な結果を得ながら、説明された態様に多くの変更を加えることができることを認識するであろう。また、本発明の所望の利点のいくつかは、他の特徴を利用することなく、様々な実施形態の特徴のいくつかを選択することによって得られることも、明らかであろう。よって、当業者には、本明細書に記載された様々な実施形態に対し、多くの変更および適合が可能であり、特定の状況では望ましい可能性さえあり、本開示の一部であることが認識される。すなわち、以下の説明は、本明細書に記載された実施形態の原理の例示として提供されており、それを限定するものではない。
本願の全体を通じて、用語「約」は、値を求めるために使用しているシステムまたは方法において、その値が誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。用語「約」と一緒に使用される数値と絡めて論じられる任意の実施形態において、用語「約」は省略できることが特に企図されている。
本明細書の全体を通じて、単数形の表現には、特に記載がない限り、それらの複数形の概念が包含されることを理解すべきである。よって、例えば、単数形の冠詞（英語では 「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）には、特に記載がない限り、複数形の概念が包含されることを理解すべきである。
また、本明細書で使用される場合という用語は、特に記載がない限り、当該技術分野において通常使用される定義を有することを理解すべきである。全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に使用するものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、本明細書（定義を含む）が優先される。
本明細書で参照された、全ての特許および刊行物（係る特許および刊行物内で開示されている全ての配列を含む）は、参照により明示的に援用される。
実施例１：ＤＯＰによるトリメチル－β－シクロデキストリンの単一分子センシング：概念実証
図１ｄによれば、ＤＯＰ記録の基本的な構成は、ナノポアが挿入された半透膜によって隔てられた非対称性の電解質緩衝液を含む。ＫＣｌ、Ｆｌｕｏ－８、およびＥＤＴＡで満たされたコンパートメントをｃｉｓ側と定義する。それに対し、ＣａＣｌ２で満たされたコンパートメントをｔｒａｎｓサイドと定義する。生体ナノポアは、ｃｉｓとｔｒａｎｓとの間の唯一の伝導路を形成するものであり、化学勾配によって駆動されるチャネル輸送を通じた熱力学的拡散によりＣａ２＋とＦｌｕｏ－８の結合を促進する。ＦｌｕｏＣａは、Ｃａ２＋とＦｌｕｏ－８の結合形態であり、各ナノポアの周囲に蛍光を発して、センサが開口状態であることを報告する。
理論的には、ポアソン・ネルンスト・プランク・ストークス（ＰＮＰＳ）モデル［２６］から適合させて、有限要素法（ＦＥＭ）シミュレーションを確立した（方法、図２）。実験操作を模倣するため、試薬濃度の各種組み合わせなどのシミュレーションパラメータは、各種境界条件を設定することにより、調整することができた。試みとして、ｃｉｓの境界条件を１．５Ｍ ＫＣｌ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、４００μＭ ＥＤＴＡ、ｔｒａｎｓの境界条件を０．７５Ｍ ＣａＣｌ２と設定し、円柱状のチャネル形状を直径２ｎｍとして、シミュレーションを実施した。結果から、ＦｌｕｏＣａの濃度勾配がナノポアの真上に確立された（図１ｅ）。ＦｌｕｏＣａからの同時放出によって、強力な蛍光強度コンストラクトがナノポア上部に期待される。強度プロファイルは、ＴＩＲＦイメージングの模倣として作成され（方法）、半値全幅（ＦＷＨＭ）が２．６７０μｍのガウス分布に従う（図１ｆ上段）。
実験的に、水性液滴と１００ｎｍ厚ヒドロゲルシートとの間に液滴界面二重層（ＤＩＢ）を確立した（図３）。水性液滴は、１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）から構成させた。ヒドロゲルシートは、０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２．５％（ｖ／ｗ）低融点アガロースから構成させた。水性液滴中に入れられたＷＴ α－ＨＬ（α－ＨＬ）はＤＩＢ中に自発的に挿入されるものであるが、ＴＩＲＦイメージングの際には明るい蛍光スポットとして現れた（図１ｆ下段）。ＴＩＲＦイメージングから得られた代表的なフレームの蛍光強度プロファイルは、ＦＷＨＭが２．５８３μｍのガウス分布におおよそ従っており（図１ｆ下段）、シミュレーションのもとの似ている。
トリメチル－β－シクロデキストリン（ＴｒｉＭ－β－ＣＤ）は、ＷＴ α－ＨＬナノポアの拘束と相互作用し、電気生理学的記録時に、長く残留する深部でのポア封鎖イベントを生じる［２７～２９］。このような観察のし易さにより、ＴｒｉＭ－β－ＣＤを代表的な小分子分析物とし、ＤＯＰを用いた単一分子センシングの概念実証を行うことが可能となる。ＤＯＰ記録の際に安定な分析物濃度を維持するため、ＴｒｉＭ－β－ＣＤを７５ｍＭの最終濃度でｃｉｓに加えた。ｃｉｓからのＴｒｉＭ－β－ＣＤ結合も、対応する電気生理学的測定により検証された（図４）。ＤＯＰ記録の際、ＴｒｉＭ－β－ＣＤとα－ＨＬが確率的に結合することで、チャネルを通じたＣａ２＋流が制限され、α－ＨＬナノポアの開口状態（Ｆｏ）と封鎖状態（Ｆｂ）との間に識別性の高い画像コントラストが生じる（図１ｇ）。連続的に記録された一連の画像から抽出された（方法、図５）、対応する蛍光トレースから、逐次的なポア封鎖が確認された（図１ｇ）。異なる試行間で定量的な比較を行うため、全ての蛍光トレースは、較正および正規化してから解析を行った（図６）。
正規化された蛍光トレースから、単一分子センシングイベントを、イベント滞留時間（ｔｏｆｆ）、イベント間期間（ｔｏｎ）、およびパーセント封鎖深度（％Ｆｂ）によって特性評価した。ｔｏｆｆおよびｔｏｎのヒストグラムは指数分布を示しており、それぞれの平均時定数τｏｆｆおよびτｏｎによってフィッティングおよび特徴付けを行うことができた（図７）。ｃｉｓ中のＴｒｉＭ－β－ＣＤ濃度を変えると、滞留時間の逆数（１／τｏｆｆ）は一定であるが、イベント間隔の逆数（１／τｏｎ）はｃｉｓ中のＴｒｉＭ－β－ＣＤ濃度と直線的に相関している（図１ｈ、表１）。
Figure 2022535185000003
ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。ＴｒｉＭ－β－ＣＤをｃｉｓに加えた。３回の独立した測定を実施して、統計を取った。
ＤＯＰ記録から、平均τｏｆｆ値０．３４７±０．０６７秒と平均ＦＰ値０．０７８±０．０１０が記録された。ここで、ＦＰは平均封鎖深度と定義され、ＤＯＰ記録の各試行からの％Ｆｂ値から得られた（図７）。一方、＋２０ｍＶ電位バイアスにより得られた対応する電気生理の結果からは、τｏｆｆ値０．３８６±０．３９２秒およびＩＰ値０．０６５±０．００２が得られた。ここで、ＩＰは電気生理学的記録の各試行からの平均封鎖深度と定義される。各測定条件について３回の独立した試行を実施し、統計を取った。この結果の類似により、ＤＯＰによる単一分子センシングの実行可能性が確認された（図１ｉ）。
実証されてはいないが、糖［３０、３１］、イオン［３２］、ヌクレオチド［３３］、神経伝達物質［３４］、アミノ酸［３５］などの他の小分子の単一分子センシングも、原理的にはＤＯＰ記録で同様に行うことができ、スループットの面で利点がある。分析物の捕捉は電気化学的勾配ではなく化学勾配によって駆動されるため、分析物の電荷はＤＯＰ記録には重要ではない。しかし、蛍光放出の強さおよび分析物の結合効率を、電気生理学のものに匹敵するように、さらに改善することができた。
実施例２：指向性浸透によるＤＯＰセンシングの強化
通例の電気生理学的記録に際し、適用された電気化学的勾配は、イオンおよび分析物などの荷電粒子の持続的な流れを駆動する上で、重大な意味を持つ。直感的には、電極を用いず分析物の流れをナノポアセンサーに指向させるには、他の形態の非対称性を導入する必要がある。
ＤＩＢは、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤｐｈＰＣ）脂質から構成される自己組織化膜であり、イオンではなく水分子を選択的に透過させる［３６、３７］。ＤＩＢを挟んでモル浸透圧濃度濃度（Ｃ（溶質）＝ｉＭ（溶質））差が存在する場合、Δπ＝（Ｃ（溶質、ｃｉｓ）＝Ｃ（溶質、ｔｒａｎｓ））ＲＴに従って浸透圧が確立される。式中、ｉは各溶質分子からの解離イオンの数を表す無次元のファントホッフ指数であり、Ｍ（溶質）は溶質のモル濃度であり、Ｒは理想気体定数であり、Ｔはケルビン温度である。ここで、浸透圧の正の方向はｃｉｓからｔｒａｎｓと定義される（理解を容易にするための定義であり、ｃｉｓ側の浸透圧がｔｒａｎｓよりも高い場合もある）。この浸透圧が後に、膜に挿入された生体ナノポアを通じた水、イオン、および分析物の定方向流の原動力となる［２２］。結果として、この非対称性の導入により分析物の移行効率の増強が達成されるはずである。
この仮説を実験で検証するために、ＤＩＢ（図３）において、ｃｉｓのＫＣｌ濃度を変化させ（１．０～２．５Ｍ）、ｔｒａｎｓのＣａＣｌ２濃度は一定に保ち（０．７５Ｍ）、一連のＤＯＰ記録を実施した。試みとして、α－ＨＬとＴｒｉＭ－β－ＣＤをそれぞれモデルセンサと分析物として再度選択し、ｃｉｓ中のＴｒｉＭ－β－ＣＤ濃度をｃｉｓ中で１５ｍＭに固定した。代表的なＤＯＰ記録から、ｃｉｓ中のＫＣｌ濃度を２．５Ｍから１．０Ｍに減少させた場合に、ＴｒｉＭ－β－ＣＤの捕獲率の増強が蛍光トレースの時間延長から確認された（図３）。独立した測定からイベントごとに１／τｏｎ値を評価することにより、浸透圧の減少に応じて１／τｏｎの規則的な減少が確認され（図８、表２）、これは、定方向の浸透圧流の助けにより、より高いイベント検出率が確認されたことを意味している。
Figure 2022535185000004
ｃｉｓにおいては１～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。１５ｍＭ ＴｒｉＭ－β－ＣＤをｃｉｓに加えた。３回の独立した測定を実施して、統計を取った。
ｃｉｓからｔｒａｎｓへの浸透圧流が存在する場合のＤＯＰ記録から、蛍光画像コントラストに顕著な改善が見られることも分かった。この現象は、ＫＣｌ濃度がより低い測定条件を用いた場合の蛍光トレースにおける熱雑音の減少から、気付くことができた（図８ａ、図９）。ここで、蛍光トレースから確認された高い熱雑音は、イメージングの際の光子数の減少の結果である。
さらに、ＤＯＰ記録から得られる蛍光強度を浸透によって調整できた（図８ｃ、表３）理由を調べるため、ｃｉｓには１～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を、ｔｒａｎｓには０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、種々の一連の実験を実施した。分析物結合からの干渉を避けるため、ＴｒｉＭ－β－ＣＤは省いた。蛍光の明るさを評価する際の不均等なＴＩＲＦ照明またはレーザー出力の変動からの干渉を避けるため、シグナル・バックグラウンド比（ＳＢＲ）値を導入して、ＤＯＰ記録の異なる試行を定量的に比較した（方法）。代表的な画像フレームと対応するＳＢＲ値から、ｃｉｓからｔｒａｎｓへより大きな浸透圧を導入した際、蛍光スポットの明るさが明らかに増強された。各条件について５つの独立した測定を行い、統計を取った（図８ｃ）。
Figure 2022535185000005
ｃｉｓにおいては１～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．７５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。５回の独立した測定を実施して、統計を取った。
この現象は、ｃｉｓの境界条件を１～２．５Ｍ ＫＣｌ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、４００μＭ ＥＤＴＡ、ｔｒａｎｓの境界条件を０．７５Ｍ ＣａＣｌ２と設定して実行した、対応するＦＥＭシミュレーションからも確認することができた（図８ｄ）。シミュレーション空間内のＦｌｕｏ－８分布をプロットすることにより、ｃｉｓからｔｒａｎｓへの定方向の浸透圧流が存在する場合に、濃縮されたＦｌｕｏ－８分布が膜のｃｉｓ側付近に確立されたことがはっきりと分かる。これは、脂質膜に対し不透過性のＦｌｕｏ－８が浸透圧流を介して濃縮され、その結果蛍光強度が増強されたことにより起こったことである（図１０）。
実施例３：Ｃａ ２＋ 流の拡大によるＳＢＲのさらなる最適化
しかしながら、浸透によるＦｌｕｏ－８濃縮は膜が半透性を有していない固体ナノポアデバイスでは起こらないはずである。代わりに、ナノポアを通じたＣａ２＋流をより多く導入することで、ＤＯＰ記録からのＳＢＲを改善することができた。この戦略に即した即座の解決法は、ｔｒａｎｓの［ＣａＣｌ２］を増加させることであり、これにより、膜を挟んだ［Ｃａ２＋］の化学勾配が直接生じることとなる。この仮説を検証するため、ｔｒａｎｓのＣａＣｌ２濃度を徐々に上方調節することで、一連のＤＯＰ記録を実施した。浸透からの干渉を回避するため、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓのモル浸透圧濃度が常に等張を保つように、ｃｉｓのＫＣｌ濃度を適宜調整した。
実験的に、ｃｉｓにおいては０．７５Ｍ、１．５Ｍ、または２．２５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては０．５Ｍ、１Ｍ、または１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。ｔｒａｎｓの［ＣａＣｌ２］を高くした電解質緩衝液の組み合わせを用いて取得された場合、代表的な画像フレームは、蛍光スポットサイズの規則的な拡大を示している（図１１ａ）。対応する２Ｄガウシアンフィッティングは（図１１ａ）、フィッティング振幅に従って色分けされたものであり、これらの条件で取得された蛍光強度をより簡単に比較できる。これらの電解質の組み合わせを用いて取得されたＤＯＰ記録からＳＢＲおよびＦＷＨＭを定量的に測定し、図１１ｂに示した。この図から、膜の両側のモル浸透圧濃度を上方調節すると、ＦＷＨＭおよびＳＢＲは共に（表４）増加する。各条件について１２の独立した測定を行い、統計を取った。
Figure 2022535185000006
ｃｉｓにおいてはＫＣｌ（０．７５Ｍ、１．５Ｍ、および２．２５Ｍ）、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいてはＣａＣｌ２（０．５Ｍ、１Ｍ、および１．５Ｍ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。１２回の独立した測定を実施して、統計を取った。
ＰＥＧは、中性ｐＨの緩衝液中に溶解された場合に電気的に中性の高分子であるが、電気生理学的記録の際にα－ＨＬナノポアを通じて移動することが示されている［３８］。測定時の電解質緩衝液の塩濃度が高いほど、捕獲率が増強され、イベント滞留時間が延長されることが報告された［３９］。実例として、ＰＥＧ１５００を、ＤＯＰによる高分子の単一分子センシングのモデル分析物として選択した。
実験的に、ｃｉｓにおいては２．２５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、２０ｍＭ ＰＥＧ１５００、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。ｃｉｓに２０ｍＭ ＰＥＧ１５００を添加すると、抽出された蛍光トレースから、多数の釘様の移行イベントが即座に現れた（図１１ｃ）。これらのポア移行の特徴と、報告された電気生理学的データとの類似により、ＴｒｉＭ－β－ＣＤを用いて示された場合と同様に、ＤＯＰ記録でＰＥＧ１５００を検知できることが確認された。
しかし、通常、分析物の溶解性は高塩濃度の電解質緩衝液中では減少する［３９］。さらに、塩濃度は電解質の水への最大溶解度によっても制限を受ける（ＣａＣｌ２：６．７６７Ｍ、ＫＣｌ：３．４０８Ｍ、２０℃）。この制限に達することなくより多くのＣａ２＋流をもたらすために、ＤＯＰ記録の際に、開口部がより大きいナノポアセンサを導入することができたが、この確認は対応するＦＥＭ研究で行われる（方法、図１１ｄ）。報告された結晶解析結果によれば、ＣｌｙＡナノポアの制限は、直径３．８ｎｍの測定値を取り、α－ＨＬの直径の２．７倍である［４０］。チャネル開口部が大きいことから、ｄｓＤＮＡなどの巨大生体高分子や低分子タンパク質を検知するために、ＣｌｙＡおよびそのバリアントが開発された［４０～４４］。ＣｌｙＡ－ＲＲは、電荷を最適化された変異体であると報告され、電気生理学的記録の際にｄｓＤＮＡを効率的に移行させることができたものであるが［４２］、これをＤＯＰ記録用に選択した（方法、図１２）。実証はされていないが、ｐｈｉ２９コネクタータンパク質［４５］や固体ナノポア［２４、２５］も、重要な候補である。
試みとして、ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。浸透圧（図８）、ＣａＣｌ２濃度（図１１）、およびポア移動性［２２］を考慮して、１．５Ｍ ＫＣｌ（ｃｉｓ）／１．５Ｍ ＣａＣｌ２（ｔｒａｎｓ）の電解質組み合わせを選んだ。ＤＯＰ記録の際にチャネル開口部が異なるナノポア同士の定量比較を行うために、同一ＤＩＢからの同時測定用に十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアおよび七量体α－ＨＬナノポアの両方を液滴中に配置した。
挿入されると、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアは巨大で眩しい蛍光スポットに見え、一方、α－ＨＬナノポアはサイズが小さく、強度も薄暗く見える（図１１ｅ）。ＣｌｙＡ－ＲＲを用いたＤＯＰ記録から得られたＦＷＨＭおよびＳＢＲは、α－ＨＬによるそれよりも明らかに優れており、膜を横断するより多くのＣａ２＋流が導入される（図１１ｆ、表５）。５回の独立した測定を実施して、統計を取った。
Figure 2022535185000007
ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。ポアはｃｉｓに加えた。５回の独立した測定を実施して、統計を取った。
ＳＢＲの改善のほかに、ＦＥＭシミュレーションからも予測されるように、ＣｌｙＡのより大きな開口部は浸透圧流の増強にも寄与し、ＤＮＡ移行の原動力となるように働く場合がある（図１１ｇおよび図１３）。ＤＮＡ移行の際の電気泳動力を相殺するために多大な努力がなされてきたが［４６］、移行の際にコイル状のＤＮＡを効率的に解く電気泳動力は［９］、ＤＮＡセンシングの際に不可欠なものと考えられた。しかし、ｄｓＤＮＡの長期残留性の長さ［４７］とＣｌｙＡナノポアの開口部の広さは、ｄｓＤＮＡ移行のエントロピー障壁を低減させる可能性がある［４８］。さらに、ＣｌｙＡの巨大な玄関は、ＤＯＰ記録の際にｄｓＤＮＡのセンシングシグナルを報告するために、部分的移行の形態でｄｓＤＮＡを収容する役割を果たす可能性もある。
実施例４：ＣｌｙＡナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの移行
実験的に、ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、２ｍＭ ｄｓＤＮＡ（７８ｂｐ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した（図１４ａ）。ＤＩＢの両側のモル浸透圧濃度を、ｃｉｓからｔｒａｎｓへの持続的な浸透圧を確立するように設計した。７８ｂｐから構成されるｄｓＤＮＡ（表６）を、所望により２μＭの最終濃度で水性液滴に溶解させた。
Figure 2022535185000008
注：ｄｓＤＮＡを形成させるため、相補的ｓｓＤＮＡ（７８ｎｔ ｓｓＤＮＡ－ａおよびｂ）（配列番号１および２）を１．５Ｍ ＫＣｌ緩衝液（１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））中に溶解し、ＰＣＲサーマルサイクラー（ＡＢＩ２７２０）上で、９５℃まで加熱し、室温（２５℃）まで徐々に冷却（－５℃／分）した。
液滴中にｄｓＤＮＡが添加されていない場合、ＣｌｙＡナノポアからの代表的な蛍光トレースは、安定的に開口しており、自発的なゲーティング活性はないように見える（図１４ｂ）。ｄｓＤＮＡを液滴中に添加すると、ＤＯＰ記録中に連続的な蛍光封鎖が自発的に表れる（図１４ｃ）。ＤＯＰ記録から確認された封鎖は、０．６２５±０．０１４の平均ＦＰと、２．５３８±０．８４９の平均τｏｆｆを示した（Ｎ＝３）。これらの結果は、電気化学的勾配を適用することなく、ＣｌｙＡ－ＲＲとのｄｓＤＮＡ相互作用が生じていたことを示唆している。長期の滞留時間は、測定中の電気泳動力を取り除いたためか、あるいは、ＣｌｙＡの巨大な玄関構造内にｄｓＤＮＡがトラップされたためである可能性がある。
通例の電気生理学的記録によりこの現象をさらに検証するため、ｃｉｓに１．５Ｍ ＫＣｌ １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）を、ｔｒａｎｓに１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）を用いて、平面脂質膜を確立した。７８ｂｐ ｄｓＤＮＡを２μＭの最終濃度でｃｉｓに添加した。ＤＯＰ記録の模倣として極端に低い電位を印加し、膜電位差は厳密にゼロであった。図１４ｄは、それぞれ＋６ｍＶ、＋４ｍＶ、または＋２ｍＶの膜電位差で記録された代表的な電気生理学的トレースを示している。ＤＯＰ記録から確認されたものと同様の移行イベントがモニターされ、ｄｓＤＮＡがＣｌｙＡと相互作用し、電極無しで光学的にモニターされた場合に検出可能なセンシングシグナルを生成し得るという仮説が確証された。ＩＰ値は、＋６ｍＶでは０．６１１±０．３５７、＋４ｍＶでは０．６０５±０．４６０、＋２ｍＶでは０．７８６±０．２２４であり、ＤＯＰ記録から確認された封鎖と定性的にも一致していた（図１５、表７）。電気生理学的記録の際、滞留時間は１ミリ秒から１０５ミリ秒まで広く分布したが、ＤＯＰ記録からの取得帯域は制限があるため、３０ミリ秒以下の高速のイベントは光学的に検出できない（図１４ｄ）。
Figure 2022535185000009
ｃｉｓにおいては１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ｔｒａｎｓにおいては１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて、ＤＩＢを確立した。２μＭのｄｓＤＮＡをｃｉｓに添加した。３回の独立した測定を実施して、統計を取った。
ナノポアを通じたｓｓＤＮＡ移行をさらに検証するため、α－ＨＬナノポアを用いた無電極２０ｎｔ ｓｓＤＮＡセンシングを実施する。結果を図１７に示す。ｓｓＤＮＡが通過することのみを許し、ｄｓＤＮＡは通過させない、αＨＬ ＷＴナノポアを使用する。このナノポアは比較的小さいため、高濃度の５０μｍｏｌ／Ｌ ｓｓＤＮＡを使用する。パーセント封鎖深度は、２０ｎｔ ｓｓＤＮＡがα－ＨＬナノポアを通過できることを示している。
ＣｌｙＡ－ＲＲを用いた無電極７８ｎｔ ｓｓＤＮＡセンシングを別に実施し、結果を図１８に示す。ＣｌｙＡ－ＲＲはより大きな開口部を有し、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの両方を通過させる。ｓｓＤＮＡの場合、ｓｓＤＮＡはナノポアを通過する際に完全な直線状ではない場合があるため、蛍光放出の特徴はｓｓＤＮＡの配列および二次構造に大きく影響される。７８ｎｔ ｓｓＤＮＡ－ａとポリＡ７８は、非常に異なる蛍光放出特徴を示した。ポリＡ７８は一様に浅いパーセント封鎖深度を有する。７８ｎｔ ｓｓＤＮＡ－ａは別々のパーセント封鎖深度および長期のイベント滞留時間を有する。ｓｓＤＮＡはＤＯＰで検知可能であることが分かる。
実施例５：指先サイズのデバイスを用いた多重ＤＯＰ記録および将来の展望
電極配置の必要性を取り除くことにより、ＤＯＰは、低コスト（１＄未満）且つハイスループットという利点を保持しながら、デバイスサイズをはるかによりコンパクトにすることを可能にする。この構成は、交差汚染が厳しく防止されるべきである臨床診断用の使い捨てナノポアチップを製造する上で好適である。概念実証として、小型化したデバイス（１０ｍｍ×１０ｍｍ×１ｍｍ）を、嵩のあるポリメチルメタクリレートメタクリル酸（ｐｏｌｙ ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＭＭＡ）から製造した（図１６ａ、図２）。照明とイメージングの両方に使用するＴＩＲＦ対物レンズの真上にチップを配置することで、ＤＯＰ記録を実施することができた。実例として、α－ＨＬおよびＣｌｙＡからのＤＯＰ記録をこの小型化デバイスを用いて実施したところ、α－ＨＬおよびＣｌｙＡを両方視覚的にモニターすることができた（図１６ｃ）。
しかし、単一ＤＩＢからのＤＯＰ測定は、ポアおよび分析物の１つの組み合わせでは制限を受けた。電極を設置する必要性を取り除くことで、ＤＯＰは、極めて単純な構成とはるかに小さくなった測定体積とを有する、異なるＤＩＢからの多重記録を可能にし、この場合、異なる分析物を種々の油中水コンパートメント中に物理的に分離することができた。
概念実証として、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを含有する微小滴（約３０ｐＬ）を作製し、脂質油液で満たされた測定リザーバにピペット操作で加えた（図１６ｄ）。サイズの点で単分散はしていないが、多数の独立したＤＩＢが自発的に形成し、その後極めて容易にＤＯＰ記録を行うことができた（図１６ｅ）。直径約４０μｍのＤＩＢにおいて、単一の挿入ＣｌｙＡナノポアが明るい蛍光スポットとして明白に確認され（図１６ｆ）、液滴中のＥＤＴＡがＣａ２＋結合により枯渇するまで約１０分間継続した。これは、マイクロフルイディクス構成からの助けにより形成させることができた高秩序ＤＩＢアレイなどにおける、１ｍｍ２当たり１０３個の独立したＤＩＢという有効な測定密度と一致している［４９］。しかし、この高い測定密度は、エレクトロニクスの組み込みによる複雑性から、ｏＳＣＲや電気生理学では容易には達成できなかった。
無電極であることの利点はあるが、ＤｉｆｆｕｓｉＯｐｔｏＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙは制限がないわけではない。蛍光イメージング技術として、ＤＯＰの時間分解能は、全視野（１３５μｍ×１３５μｍ）で記録された場合、通常約１０ミリ秒／フレームに限定される。量を減らした画像ピクセルから蛍光を読み取ることで、取得速度を一気に増強することができた。高秩序ナノポアアレイからのアドレス性の向上により、スピニングディスク型共焦点イメージングによる高速ＤＯＰ記録の実施が可能となった［５０］。電場がない場合、ＤＯＰの際の検出限界（ＬＯＤ）は、通常、電気生理学やｏＳＣＲからの検出限界（～ｎＭまで）よりも高かった（～μＭ）。しかし、電極設置を省くことで、必要とされる測定体積がはるかに小さくなる（約３０ｐＬまで）ことが補償され、絶対的なサンプルコストが実際に削減されている。
結論
要約すると、要約すると、天然の受動的チャネル輸送からヒントを得たＤｉｆｆｕｓｉＯｐｔｏＰｈｙｓｉｏｌｇｙを、ナノポアセンシングプラットフォームとして使用する方法を実証した。ＤＯＰ記録時の蛍光放出は、Ｃａ２＋とＦｌｕｏ－８の受動拡散とそれに続く結合によって引き起こされたものであるが、その蛍光強度は、実証されたように、様々な単一分子センシング適用に役立つのに十分な強さである。電解質やチャネルサイズからの最適化を組み合わせたことで、この技術は、センシング性能を従来の電気生理学的記録やｏＳＣＲと同等に維持したまま、ハイスループットなナノポア測定を可能としている。全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法で実証されたが、ＤＯＰは、原理的には、共焦点顕微鏡法や落射蛍光顕微鏡法などのあらゆる蛍光プラットフォームに柔軟に適用できる。電極を設置するスペースを必要としないため、ＤＯＰの測定体積はさらに約３０ｐＬまで減少し、これはこれまでに報告された中で最も少ない記録であり、存在量が極めて少ない分析物の測定に適している可能性がある。また、微小液滴アレイを用いたＤＯＰ記録により、油中水型分離からシンプルに確立されていた、独立したコンパートメントからの多重測定が可能となる。ナノテクノロジーセンサをチップとして組み込んでいるが、エレクトロニクスを省くことで、デバイスのコストとサイズが大幅に削減された。この方式は、使い捨てのナノポアチップを様々な用途に使用する将来の臨床応用のヒントになり得る。
方法
材料
ヘキサデカン、シリコーン油ＡＲ２０、ペンタン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｇｅｎａｐｏｌ Ｘ－８０、およびＰＥＧ１５００はシグマ・アルドリッチ社から入手した。塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、および塩化ナトリウムはアラジン社（Ａｌａｄｄｉｎ）から入手した。ジオキサン非含有イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ドデシルβ－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）、硫酸カナマイシン、トリメチルアミンメタン（Ｔｒｉｓ）、およびイミダゾールはソーラーバイオ社（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）から入手した。低融点アガロースおよびワイドレンジＤＮＡラダー（２０～５００ｂｐ）はタカラ社（Ｔａｋａｒａ）から入手した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓタンパク質マーカーおよび４～１５％ポリアクリルアミドゲルはバイオラド社から入手した。エタノールおよびアセトンはシノファーム社（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ）から入手した。Ｆｌｕｏ－８Ｈナトリウム塩（Ｆｌｕｏ－８）はＡＡＴバイオクエスト社（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）から入手した。１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）はアヴァンティ・ポーラ・リピッド社（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）から入手した。４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）はシャンハイ・ユェンイー・バイオテクノロジー社（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｕａｎｙｅ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）はバイオメド社（ＢｉｏＭｅｄ）から入手した。トリメチル－β－シクロデキストリンは東京化成工業社（上海）から入手した。ＬＢブロスおよびＬＢ寒天はホープバイオ社（Ｈｏｐｅｂｉｏ）から入手した。上記全ての物品は届いたままの状態で使用した。
ＫＣｌ緩衝液（１～２．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））およびＣａＣｌ２緩衝液（０．５～１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））をメンブレンフィルターでろ過した（０．２μｍセルロースアセテート、ナルゲン社（Ｎａｌｇｅｎｅ））。簡単にするため、特に記載がない限り、１～２．５Ｍ ＫＣｌ緩衝液は１～２．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を表し、０．５～１．５Ｍ ＣａＣｌ２緩衝液は０．５～１．５Ｍ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を表す。ＫＣｌ緩衝液はＣｈｅｌｅｘ１００樹脂（バイオラド社）で使用前に一晩処理し、混入二価イオンを除去した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製したＤＮＡ（表６）はデオキシリボヌクレアーゼ／ＲＮａｓｅ非含有水に溶解してから使用した。ｄｓＤＮＡを形成させるため、相補的ｓｓＤＮＡを１．５Ｍ ＫＣｌ緩衝液（１．５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））中にさらに溶解し、ＰＣＲサーマルサイクラー（ＡＢＩ２７２０）上で、９５℃まで加熱し、室温（２５℃）まで徐々に冷却（－５℃／分）した。
本明細書において使用されたタンパク質ナノポアはα－ＨＬ ＷＴおよびＣｌｙＡ－ＲＲであり（図７）、これらは大腸菌において発現させ、公開されたプロトコル［２２、４２］に基づいて精製した。
ＣｌｙＡ－ＲＲ調製
単量体ＣｌｙＡ－ＲＲ（Ｄ６４Ｒ／Ｃ８７Ａ／Ｌ９９Ｑ／Ｅ１０３Ｇ／Ｓ１１０Ｒ／Ｆ１６６Ｙ／Ｉ２０３Ｖ／Ｃ２８５Ｓ／Ｋ２９４Ｒ／Ｈ３０７Ｙ）タンパク質をコードする遺伝子をカスタム合成し、ｐＥＴ３０ａ（＋）プラスミド（ジェンスクリプト社（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）、ニュージャージー）に構築した。後のクロマトグラフィー精製用に上記タンパク質のＣ末端にヘキサ－ヒスチジンタグを導入した。プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天板中で１８時間培養した。単一コロニーを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地に播種し、ＯＤ６００が４．０に達するまで３７℃でインキュベートした。イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭに達するように上記ＬＢ培地に添加することで、タンパク質発現を誘導した。培地をさらに、１５℃で１６時間振盪した（２００ｒｐｍ）。その後、細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、２０分）で回収した。ペレットを回収し、可溶化液緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、超音波処理（１５分）で溶解し、遠心（１４，０００ｒｐｍ、４℃、４０分）して無傷細胞を除去した。シリンジフィルターによる濾過後、上清をニッケルアフィニティーカラム（ＨｉｓＴｒａｐＴＭ ＨＰ、ＧＥヘルスケア社）にロードした。洗浄用緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で上記カラムを洗浄した後、３種類の洗浄用緩衝液（緩衝液Ｂ：５００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；緩衝液Ｃ：５００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０％グリセロール、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；緩衝液Ｄ：５００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて標的タンパク質を順に溶出させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動（図１２）を用いてＣｌｙＡ－ＲＲ単量体を含有する溶出画分を確認し、２７０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、１０％グリセロール、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ１００、ｐＨ８．０の緩衝液中、－８０℃で保存した。
以前の研究［４２］に従って、０．２５％（ｗ／ｖ）β－ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）を添加することで、ポアのオリゴマー化を促進した。２５℃で１５分間インキュベートした後、ポアオリゴマー化の結果を、４～１５％ポリアクリルアミドゲルを用いたブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ－ＰＡＧＥ、バイオラド社）（図１２）によって特性評価した。ゲルから、単量体がＤＤＭ添加前にオリゴマーへと自己組織化していたことが示された。しかし、以前の研究［４２］に厳密に従うために、フォローアップ測定にはＤＤＭ添加によるＣｌｙＡ－ＲＲ十二量体を引き続き使用した。ここで、十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲに対応するバンドをゲルから切り出し、０．２％ＤＤＭおよび１０ｍＭＥＤＴＡを添加した１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に３時間浸した。ゲルから拡散した十二量体タンパク質を含有している上清を、遠心分離（２０，０００ｇ、４℃、２０分）で回収した。回収された十二量体ＣｌｙＡ－ＲＲタンパク質は、その後の実験にすぐに使用するか、最長１４日間４℃で保存した。
ＤＩＢ形成
液滴／ヒドロゲル二重層の作製方法に関する詳細な説明は、以前に報告されたものである［１０］。簡潔に説明すると、酸素プラズマ処理カバーガラス（２４ｍｍ×４０ｍｍ）を、２００μＬ溶融アガロース（０．７５％ｗ／ｖ、ＭｉｌｉＱ水中）でスピンコートした（３０００ｒｐｍ、３０秒）。デバイス内のマイクロ流体チャネルを溶融アガロース（２．５％ｗ／ｖ、ＣａＣｌ２緩衝液中）で満たすことにより、カバーガラスをＰＭＭＡデバイスに貼り付けた［１０］。ヘキサデカンおよびシリコーン油の１：１体積比混合物２ｍＬ中に乾燥ＤＰＨＰＣ脂質膜５ｍｇを溶解させることにより脂質／油液を調製した。脂質－油液中に浸漬させると、脂質単層がアガロースコートカバーガラス上に形成された。水性液滴の調製において、タンパク質ナノポアや他の分析物は、１Ｍ～２．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０から構成される緩衝水溶液に添加することができた。各種体積の水性液滴を脂質／油液にピペットで加え、インキュベーションを行った。５分後、水－油界面に自己組織化脂質単層を形成させることができた。この液滴とアガロース基体を脂質／油液中で接触させると、安定な二重層（ＤＩＢ）を自発的に形成させることができた。
ＴＩＲＦイメージングおよび光学的記録
ＤＩＢは６０×油浸ＴＩＲＦ対物レンズ（ＮＡ＝１．４９、Ｐｌａｎ Ａｐｏ、ニコン社）を搭載した倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ、ニコン社）を用いてイメージングした。４７３ｎｍダイオード励起固体（Ｄｉｏｄｅ Ｐｕｍｐｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ）（ＤＰＳＳ）レーザー（１００ｍＷ、チャンチュン・ニュー・インダストリーズ・オプトエレクトロニクス・テクノロジー社（Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｎｅｗ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で蛍光を励起した。電子倍増ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ３ ８９７、アンドール社（Ａｎｄｏｒ））を用いて画像を取得した。露光時間は３～３０ミリ秒に設定した。最大視野は１３５μｍ×１３５μｍとした。
電気的記録
電気生理学的記録を以前に報告されたように実施した８。電気生理学的トレースを２５ｋＨｚサンプリング速度で取得し、１ｋＨｚの低域フィルターにかけ（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ、モレキュラーデバイス社）、Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ａデジタイザ（モレキュラーデバイス社）を用いてデジタル化し記録した。その後のデータ解析はＣｌａｍｐｆｉｔ １０．７（モレキュラーデバイス社）を用いて行った。
有限要素モデリング（ＦＥＭ）シミュレーション
Ｃａ２＋とカルシウム指示薬であるＦｌｕｏ－８色素との結合はポア近傍に蛍光放出を生じる。過剰なＣａ２＋は、ＥＤＴＡと結合し、蛍光バックグラウンドを低減させる。これら２つの完了（ｃｏｍｐｌｅｔｉｖｅ）反応は式（１、２）のように記述することができ、式中、αおよびβはそれぞれ正方向結合速度および逆方向結合速度を意味する。
Figure 2022535185000010
ポアソン－ネルンスト－プランク－ストークス（ＰＮＰＳ）モデル［２４、２６］を用いたＦＥＭにより、光学的単一チャネル記録（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）（ｏＳＣＲ）をシミュレートすることができた。ネルンスト－プランク－ストークスの式を式（３）に記載する。
Figure 2022535185000011
無電極ｏＳＣＲの場合、電位Ｖは、シミュレーション空間内で一定となるように設定される。従って、式（３）は（式（４））に単純化され、イオンの動きは受動拡散、化学反応、およびフルイディック流量によってのみ駆動される。
Figure 2022535185000012
ここで、［ｃｉ］は各種イオン種の濃度を表す。Ｒｉは化学反応項を表し、ｕは液体速度を表す。遊離Ｃａ２＋は式（１、２）に記載のようにＦｌｕｏ－８またはＥＤＴＡと結合することができた。
各種イオンの場合で、式（４）をさらに拡張し、式（５～１０）に記載されるような対応する脚注によりイオンの識別情報を注釈付けする。ここで、ＦｌｕｏＣａおよびＥＤＴＡＣａは、Ｆｌｕｏ－８とＣａ２＋の結合形態およびＥＤＴＡとＣａ２＋の結合形態を表す。
Figure 2022535185000013
標準的なＰＮＰＳモデルの静電ポテンシャルは式（１１）で表されるポアソン方程式によって制御される。
Figure 2022535185000014
しかし、無電極ｏＳＣＲでは、電位Ｖはシミュレーション空間内で一定であるため、上記式は式（１２）のように単純化される。
Figure 2022535185000015
シミュレーションパラメータは主に文献［２６］から取得する。ここで、Ｄは拡散係数である（ＤＦｌｕｏ＝ＤＦｌｕｏＣａ＝１５μｍ２ｓ－１、Ｄｋ＝Ｄｃｌ＝ＤＣａ＝ＤＥＤＴＡ＝ＤＥＤＴＡＣａ＝２００μｍ２ｓ－１）。ｚは電荷数（ｚＣａ＝＋２、ｚｋ＝＋１、ｚｃｌ＝－１）である。Ｆはファラデー定数である。ｋｂはボルツマン定数である。Ｔは電圧である。αは正方向結合速度（αＥ＝５μＭ－１ｓ－１、αＦ＝１５０ｓ－１）である。βは逆方向結合速度（βＥ＝０．７５μＭ－１ｓ－１、βＦ＝４５０ｓ－１）である。脚注ＥおよびＦはそれぞれＥＤＴＡおよびＦｌｕｏ－８を表す。εは水の比誘電率である。ＫＣｌ濃度を変えて（０．５Ｍ～２．５Ｍ）ｃｉｓ側の境界条件を設定し、０．７５Ｍ ＣａＣｌ２としてｔｒａｎｓ側の境界条件を設定する。
各種シミュレーション条件のイオンの定常分布を、ＣＯＭＳＯＬ５．３ａで数値的に解く。簡潔に説明すると、軸対称のシミュレーション形状を、イオンではなく液体の通過のみが許される半透膜によって隔てられた２つの半球状空間と定義する（図２）。この２つの半球は、それぞれｃｉｓ側およびｔｒａｎｓ側と表され、膜上の円柱状ナノポアによって接続されており、液体およびイオンの自由な通過が共に許される。
ＴＩＲＦモードで照明した場合、励起強度はｚ方向に指数関数的に減衰する。投影されたｘ－ｙ平面における蛍光強度をシミュレートするために、式（１３）を用い、式中、γはｚ方向のエバネッセント光の減衰定数である。
Figure 2022535185000016
一方、総蛍光強度は式（１４）に従って推定する。
Figure 2022535185000017
２Ｄガウシアンフィッティング
無電極ｏＳＣＲにおいて、明るい点として現れる蛍光強度プロファイルを、式（１５）に従って２Ｄガウス分布にフィットさせた。
Figure 2022535185000018
ここで、ｆ（ｘ、ｙ）はｘ－ｙ平面におけるフィットされた蛍光強度を表す。Ｚ０は基準レベルを表し、Ａはフィッティング振幅を表し、ｘｃおよびｙｃはフィッティングの重心を表す。σｘおよびσｙはそれぞれｘ方向およびｙ方向の分布の標準偏差を表す。
この関数により、追跡されたスポットのサブピクセル解像度での位置特定が可能になる。２次元ガウス関数の全幅半値（ｆｕｌｌ ｗｉｄｔｈ ｈａｌｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）（ＦＷＨＭ）は、半分の高さにおける幅を表しており、スポットサイズの評価に利用できる。ここで、ＭＡＴＬＡＢのｃｆｔｏｏｌモジュールを用いて２Ｄガウシアンフィッティングを行う（図５）。ＦＷＨＭは式（１６）から導いた。
Figure 2022535185000019
直径２ＦＷＨＭの円の中にあるピクセルをシグナルと定義し、直径３ＦＷＨＭの円と４ＦＷＨＭの円の間の円環の中にあるピクセルをバックグラウンドと定義した（図５）。
シグナル・バックグラウンド比（ＳＢＲ）評価
ＤＯＰ記録の異なる試行からＤＯＰ記録の性能を定量的に評価するためにＳＢＲ値を導入した。ＳＢＲ値は以下の通りに算出する。
Figure 2022535185000020
ここで，ピーク（ｓｉｇ）は，２Ｄガウシアンフィッティングで得られたシグナルのピーク振幅（Ａ＋ｚ０）である（図５）。平均値（ｂｋｇ）はバックグラウンド（ｚ０）の平均ピクセル強度である。ｓｔｄ（ｂｋｇ）はバックグラウンドのピクセル強度の標準偏差である。シグナルおよびバックグラウンドの定義は図５に示されている。
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Claims (106)

  1. 分析物を同定するための無電極の系であって、
    （ａ）第一水溶液を中に含有し、前記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメント；
    （ｂ）第二水溶液を中に含有し、前記第二水溶液は前記蛍光レポーター分子に特異的に結合する前記イオン種を含む、第二コンパートメント；および
    （ｃ）第一コンパートメントと第二コンパートメントとを隔てる膜；
    を含み、
    前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとがナノポアにより接続されるように、前記第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の膜には少なくとも１つのナノポアが挿入されており；
    前記イオン種を、前記ナノポアを通じて前記第二コンパートメントから前記第一コンパートメントへ拡散させることができる、前記イオン種の化学勾配が、前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとの間に存在する、
    系。
  2. 前記膜が固体膜である、請求項１に記載の系。
  3. 前記膜が半透膜である、請求項１に記載の系。
  4. 前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い、請求項３に記載の系。
  5. 前記半透膜が両親媒性分子からなり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである、請求項３または請求項４に記載の系。
  6. 前記半透膜が両親媒性分子からなる二重層であり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質である、請求項３または請求項４に記載の系。
  7. 前記脂質が、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である、請求項６に記載の系。
  8. 前記脂質が、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である、請求項６に記載の系。
  9. 前記第一コンパートメントが水性液滴によって供給される、請求項１～８のいずれか一項に記載の系。
  10. 前記第二コンパートメントがヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、前記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、前記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の系。
  11. 前記ナノポアがタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の系。
  12. 前記タンパク質ナノポアが、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数であり；好ましくは、前記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである、請求項１１に記載の系。
  13. 前記イオン種がＡｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の系。
  14. 前記蛍光レポーター分子がＦｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の系。
  15. 前記第二水溶液が塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の系。
  16. 前記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度が０．０１～６．７６Ｍである、請求項１５に記載の系。
  17. 前記第一水溶液がキレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、前記キレート化剤は前記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、前記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の系。
  18. 照明用の光源と、蛍光を検出するための光センサとをさらに含み；好ましくは、前記光源はレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンライト、キセノンライトであり；好ましくは、前記光センサはＣＣＤ、ｓＣＭＯＳセンサ、光ダイオードであり；より好ましくは、前記光センサはＥＭＣＣＤまたはアバランシェフォトダイオードである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の系。
  19. 全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、広視野蛍光顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法のためのデバイスをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の系。
  20. 前記第一水溶液または前記第二水溶液が前記分析物を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の系。
  21. 前記分析物が小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される、請求項２０に記載の系。
  22. 前記分析物が化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、前記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである、請求項２０に記載の系。
  23. 分析物を同定する方法であって、
    （ａ）前記分析物が前記第一コンパートメント中または前記第二コンパートメント中に供給された、請求項１～２２のいずれか一項に記載の系を準備する工程；
    （ｂ）前記蛍光レポーター分子を励起可能な光を、前記ナノポアの近位の前記第一コンパートメント内の領域に当てる工程；
    （ｃ）前記蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを測定し前記分析物を同定する工程、
    を含む、方法。
  24. 無電極の系を製造する方法であって、
    （ａ）第一水溶液を中に含有し、前記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメントを準備すること；
    （ｂ）第二水溶液を中に含有し、前記第二水溶液は前記蛍光レポーター分子に特異的に結合する前記イオン種を含む、第二コンパートメントを準備すること；
    （ｃ）ナノポアが挿入された半透膜が前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとの間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとを接触させること；
    を含み、
    前記第一水溶液または前記第二水溶液中にタンパク質ナノポアが供給される、
    方法。
  25. 前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記半透膜が両親媒性分子からなり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである、請求項２４または請求項２５に記載の系。
  27. 前記脂質が、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記脂質が、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記第一コンパートメントが水性液滴によって供給される、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第二コンパートメントがヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、前記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、前記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む、請求項２～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ナノポアがタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択され、前記タンパク質ナノポアはα－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びにイオンチャネルからなる群から選択される１または複数である、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記タンパク質ナノポアが、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数であり；好ましくは、前記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記イオン種がＡｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記蛍光レポーター分子がＦｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記第二水溶液が塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度が０．０１～６．７６Ｍである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第一水溶液がキレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、前記キレート化剤は前記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、前記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 複数の分析物を同定するための無電極のナノポアアレイであって、
    複数の系を並列に含み、各系が、
    （ａ）第一水溶液を中に含有し、前記第一水溶液はイオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子を含む、第一コンパートメント；
    （ｂ）第二水溶液を中に含有し、前記第二水溶液は前記蛍光レポーター分子に特異的に結合する前記イオン種を含む、第二コンパートメント；および
    （ｃ）第一コンパートメントと第二コンパートメントとを隔てる膜；
    を含み、
    各系において前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとがナノポアにより接続されるように、各系において、前記第一コンパートメントと第二コンパートメントとの間の膜には少なくとも１つのナノポアが挿入されており；
    前記イオン種を、前記ナノポアを通じて前記第二コンパートメントから前記第一コンパートメントへ拡散させることができる、前記イオン種の化学勾配が、各系の前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとの間に存在し；
    測定された蛍光が各系において識別可能であるように、前記複数の系が配置されている、
    ナノポアアレイ。
  39. 各系において、前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメント系との間の前記膜が固体膜である、請求項３８に記載のナノポアアレイ。
  40. 各系において、前記第一コンパートメントと前記第二コンパートメントとの間の前記膜が半透膜である、請求項３８に記載のナノポアアレイ。
  41. 各系において、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、前記第二水溶液のモル浸透圧濃度が前記第一水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、前記第二水溶液の重量モル浸透圧濃度が前記第一水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い、請求項４０に記載のナノポアアレイ。
  42. 前記半透膜が両親媒性分子からなり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである、請求項４０または請求項４１に記載のナノポアアレイ。
  43. 前記半透膜が両親媒性分子からなる二重層であり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質である、請求項４０または請求項４１に記載のナノポアアレイ。
  44. 前記脂質が、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である、請求項４３に記載のナノポアアレイ。
  45. 前記脂質が、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である、請求項４３に記載のナノポアアレイ。
  46. 前記複数の系の前記第一コンパートメントそれぞれが互いに隔てられている、請求項３８～４５のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  47. 各系の前記第一コンパートメントが水性液滴によって供給される、請求項４６に記載のナノポアアレイ。
  48. 前記複数の系の前記第二コンパートメントが単一のコンパートメントである、請求項３８～４６のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  49. 各系の前記第二コンパートメントがヒドロゲル層によって供給され；好ましくは、前記ヒドロゲル層は０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；より好ましくは、前記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む、請求項４８に記載のナノポアアレイ。
  50. 前記複数の系の前記第二コンパートメントそれぞれが単一ヒドロゲル層によって供給される、請求項４９に記載のナノポアアレイ。
  51. 各系において、前記ナノポアがタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される、請求項３８～５０のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  52. 前記タンパク質ナノポアが、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数であり；好ましくは、前記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである、請求項５１に記載のナノポアアレイ。
  53. 各系において、前記イオン種がＡｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である、請求項３８～５２のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  54. 前記蛍光レポーター分子がＦｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である、請求項３８～５３のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  55. 各系において、前記第二水溶液が塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む、請求項３８～５４のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  56. 各系において、前記第二水溶液中の塩化カルシウムの濃度が０．０１～６．７６Ｍである、請求項５５に記載のナノポアアレイ。
  57. 各系において、前記第一水溶液がキレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、前記キレート化剤は前記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、前記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである、請求項３８～５６のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  58. 照明用の光源と、蛍光を検出するための光センサとをさらに含み；好ましくは、前記光源はレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンライト、キセノンライトであり；好ましくは、前記光センサはＣＣＤ、ｓＣＭＯＳセンサ、光ダイオードであり；より好ましくは、前記光センサはＥＭＣＣＤまたはアバランシェフォトダイオードである、請求項３８～５７のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  59. 全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、広視野蛍光顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法のためのデバイスをさらに含む、請求項５８に記載のナノポアアレイ。
  60. 各系において、前記第一水溶液または前記第二水溶液が前記分析物を含む、請求項３８～５９のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  61. 各系において、前記分析物が小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される、請求項６０に記載のナノポアアレイ。
  62. 各系において、前記分析物が化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、前記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである、請求項６０に記載のナノポアアレイ。
  63. 異なる分析物が各種系へと物理的に分離される、請求項６０～６２のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  64. 前記ナノポアアレイにおける前記系の密度が１０～１０００個／ｍｍ２である、請求項３８～６３のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  65. 前記複数の系によって与えられる総面積が１～１００ｍｍ２である、請求項３８～６４のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  66. 複数の分析物を同定するための多重法であって、
    （ａ）２種以上の分析物が前記ナノポアアレイの各種系に供給される、請求項３８～６５のいずれか一項に記載のナノポアアレイを準備すること；
    （ｂ）前記第一コンパートメントのそれぞれに含有される前記蛍光レポーター分子を励起可能な光シグナルを、前記ナノポアの近位の前記複数の第一コンパートメント内の領域に当てること；
    （ｃ）各系に含有される前記蛍光レポーター分子からの複数の蛍光シグナルを測定し、前記複数の分析物を同定すること、
    を含む、方法。
  67. 無電極のナノポアアレイを製造する方法であって、
    （ａ）タンパク質ナノポアと、分析物と、イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な蛍光レポーター分子とを含む第一水溶液をそれぞれが含む、複数の水性液滴を準備すること；
    （ｂ）前記イオン種を含むヒドロゲル層を準備すること；
    （ｃ）半透膜が前記水性液滴のそれぞれとヒドロゲル層との間に形成されるように、両親媒性分子を含有する疎水性媒体中で前記複数の水性液滴と前記ヒドロゲル層とを接触させること、
    を含む、方法。
  68. 前記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴（ａｑｕｅｏｕｓ ｄｒｏｐｌｅｔｄ）のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、前記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、前記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴のモル浸透圧濃度と等しいか、または、前記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、前記ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が各水性液滴のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、前記ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が各水性液滴の重量モル浸透圧濃度よりも低い、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記半透膜が両親媒性分子からなり；好ましくは、前記両親媒性分子は脂質またはトリブロックコポリマーである、請求項６７または請求項６８に記載の系。
  70. 前記脂質が、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記脂質が、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記ヒドロゲル層が０．１～２０％（ｗ／ｖ）のアガロースを含み；好ましくは、前記ヒドロゲル層は２～５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ナノポアがタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 各水性液滴中の前記タンパク質ナノポアが、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数であり；好ましくは、各水性液滴中の前記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ヒドロゲル層中の前記イオン種がＡｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 各水性液滴中の前記蛍光レポーター分子がＦｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ヒドロゲル層が塩化カルシウムと、所望により緩衝剤とを含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ヒドロゲル層中の塩化カルシウムの濃度が０．０１～６．７６Ｍである、請求項７７に記載の方法。
  79. 各水性液滴がキレート化剤と、所望により緩衝剤とを含み、前記キレート化剤は前記イオン種に結合することができるものであり；好ましくは、前記キレート化剤はＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＣＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＨＥＤＴＡ、またはＤＥＧである、請求項６７～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 各水性液滴中の前記分析物が小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 各水性液滴中の前記分析物が化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、前記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。
  82. 異なる分析物が各種系に供給される、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記水性液滴の数が４～１，０００，０００個であり；好ましくは、前記水性液滴の数は１０～１０００個である、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 光学的な分析物の分析を行うための、請求項１～２２に記載の系の使用。
  85. 光学的な分析物の分析を行うための、請求項３８～６５に記載のナノポアアレイの使用。
  86. 分析物が前記第一水溶液または前記第二水溶液中に供給される、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記分析物が小分子、高分子、および生体高分子からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記分析物が化合物、薬剤、糖、イオン、神経伝達物質、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドからなる群から選択され；好ましくは、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり；より好ましくは、前記ＤＮＡはｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり；より好ましくは、前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｔＲＮＡである、請求項８６に記載の系。
  89. 前記複数の系の数が４～１，０００，０００個であり；好ましくは、前記複数の系の数は１０～１０００個である、請求項３８～６５のいずれか一項に記載のナノポアアレイ。
  90. ナノポアアレイを形成させるためのキットであって、
    アガロースと、緩衝剤と、蛍光レポーター分子に特異的に結合し蛍光を放出させることが可能なイオン種と、を含む充填用ヒドロゲル；
    キレート化剤と、前記イオン種に結合した際に蛍光を発することが可能な前記蛍光レポーター分子と、緩衝剤と、を含む水溶液であって；前記キレート化剤は前記イオン種に結合することが可能である、水溶液；
    両親媒性分子を含有する疎水性媒体；
    固体支持体、
    を含む、キット。
  91. 前記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が前記水溶液のモル浸透圧濃度よりも高いか、または、前記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が前記水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも高い；あるいは、前記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が前記水溶液のモル浸透圧濃度と等しいか、または、前記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が前記水溶液の重量モル浸透圧濃度と等しい；あるいは、前記充填用ヒドロゲルのモル浸透圧濃度が前記水溶液のモル浸透圧濃度よりも低いか、または、前記充填用ヒドロゲルの重量モル浸透圧濃度が前記水溶液の重量モル浸透圧濃度よりも低い、請求項９０に記載のキット。
  92. 前記両親媒性分子が脂質またはトリブロックコポリマーである、請求項９０または請求項９１に記載のキット。
  93. 前記脂質が、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド、リン脂質、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）、およびコレステロールからなる群から選択される１または複数である、請求項９２に記載のキット。
  94. 前記脂質が、モノオレイン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ グリセロ－Ｓ－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン；１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＥ／ＰＯＰＧ）混合物；およびこれらの混合物からなる群から選択される１または複数である、請求項９２に記載のキット。
  95. 前記水溶液がタンパク質ナノポアも含む、請求項９０～９４のいずれか一項に記載のキット。
  96. 前記ナノポアがタンパク質ナノポア、ＤＮＡナノポア、または固体ナノポアからなる群から選択される、請求項９５に記載のキット。
  97. 前記タンパク質ナノポアが、α－ＨＬ、ＣｌｙＡ、Ｐｈｉ２９コネクタータンパク質、エロリジン、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＦｒａＣ、ＨｌｙＡ、ＳｈｅＡ、ｓｐ１、およびこれらのバリアント；並びに、イオンチャネルからなる群から選択される１または複数であり；好ましくは、前記タンパク質ナノポアはＣｌｙＡ－ＲＲまたはα－ＨＬである、請求項９６に記載のキット。
  98. 前記ヒドロゲル層中の前記イオン種がＡｇ＋、Ａｇ２＋、Ａｌ３＋、Ａｓ３＋、Ａｕ＋、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｃｌ－、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ｈ＋、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｉｎ３＋、Ｋ＋、Ｌａ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｏ３＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、ＯＨ－、Ｐｂ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ２＋、Ｐｔ４＋、Ｒｕ３＋、Ｓｂ３＋、Ｓｃ３＋、Ｓｎ２＋、Ｓｒ２＋、Ｔｂ３＋、Ｔｌ＋、およびＺｎ２＋からなる群から選択される１または複数である、請求項９０～９７のいずれか一項に記載のキット。
  99. 各水性液滴中の前記蛍光レポーター分子がＦｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｌｕｏ－８、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｃａｌ－５２０、カルシウム特異的アミノポリカルボン酸、ＢＡＰＴＡ、ＳＢＦＩ、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ ＮａＴＲＩＵＭ Ｇｒｅｅｎ－２、Ｔｈａｌｌｏｓ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２、Ａｓａｎｔｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－３、ＰＢＦＩ、Ｆｌｕｏ－２ Ｍｇ、Ｆｕｒａ－２ Ｍｇ、Ｉｎｄｏ－１ Ｍｇ、Ａｓａｎｔｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＳＰＱ、ＭＱＡＥ、ＴＳＱ、ＴＦＬ－Ｚｎ、およびＺＩＮＱＵＩＮからなる群から選択される１または複数である、請求項９０～９８のいずれか一項に記載のキット。
  100. 前記充填用ヒドロゲルが塩化カルシウムを含むことで、前記イオン種としてＣａ２＋を供給する、請求項９０～９９のいずれか一項に記載のキット。
  101. 前記ヒドロゲル層中の塩化カルシウムの濃度が０．０１～６．７６Ｍである、請求項１００に記載のキット。
  102. 前記充填用ヒドロゲルが２．５％アガロース、１．５Ｍ ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含む、請求項９０～１０１のいずれか一項に記載のキット。
  103. 前記水溶液がＫＣｌも含む、請求項９０～１０２のいずれか一項に記載のキット。
  104. 前記水溶液が１．５Ｍ ＫＣｌ、４００μＭ ＥＤＴＡ、４０μＭ Ｆｌｕｏ－８、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含んでいてもよい、請求項１０３に記載のキット。
  105. 両親媒性分子を含有する前記疎水性媒体が、乾燥ＤＰＨＰＣ脂質膜５ｍｇをヘキサデカンおよびシリコーン油の１：１体積比の混合物２ｍＬ中に溶解させて含む脂質油であってもよい、請求項９０～１０４のいずれか一項に記載のキット。
  106. アガロースを水に含有する塗布用ヒドロゲルも含み；好ましくは、前記塗布用ヒドロゲルは０．７５％（ｗ／ｖ）のアガロースを水に含有していてもよい、請求項９０～１０５のいずれか一項に記載のキット。
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