CN115877018A - 一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及激素检测领域，具体涉及一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用。一方面，本发明提供了一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用，所述孔蛋白为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1。另一方面，本发明还提供了一种检测样本中去氢表雄酮硫酸酯的非诊断方法。

Description

一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及激素检测领域，具体涉及一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用。

背景技术

去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是一种由肾上腺分泌的类固醇激素(甾体激素)。去氢表雄酮是雌激素、孕酮和睾酮的前体，在人体内能够转变成雌激素和雄激素。血液中，去氢表雄酮大部分以硫酸结合物(DHEA-S，去氢表雄酮硫酸酯)的形式存在。

据报道，DHEA-S浓度与内分泌失调、雌雄激素分泌不和谐、性能力降低、衰老、骨质疏松症、乳腺癌、心血管疾病、肌肉量减少、脂肪含量增加、阿尔兹海默症等多种疾病有关。因此，DHEA常作为药品和保健品来发挥抗衰老、维持心血管健康、降低血脂、降低血压、提升免疫系统功能、增强骨骼、使皮肤光滑细致、增强记忆力、增加活力等功效。此外，DHEA-S还可以作为指示肾上腺合成雄激素功能的标志物。

DHEA-S的临床意义重大。目前常用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、化学发光免疫分析技术(CLIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析DHEA-S。但液相色谱串联质谱法受仪器昂贵、测定周期较长、分析技术较难掌握、检测用试剂需自配等限制。而主要原理是利用待测物抗原与抗体的特异反应，通过酶与底物或荧光标记等方法产生可供检测的化学反应来进行定量测定的免疫分析法，检测结果不稳定，易受到外部因素(例如温度)干扰，受样本类型(仅限于血液)、专属性稍差、试剂盒昂贵等限制。

发明内容

一方面，本发明提供了一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用，其特征在于，所述孔蛋白位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道，待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯被加入到所述第一介质，向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后，所述去氢表雄酮硫酸酯与所述孔蛋白相互作用，进而所述孔蛋白检测所述去氢表雄酮硫酸酯，所述孔蛋白为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1。

在一个实施方案中，所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1包括野生型地热嗜氢杆菌的钾离子通道1和/或地热嗜氢杆菌的钾离子通道1变体。

在一个实施方案中，所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述待测样本来源于已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者。

在一个实施方案中，所述试剂盒用于确定所述待测样本中所述去氢表雄酮硫酸酯的存在。

在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于确定所述去氢表雄酮硫酸酯的浓度或浓度范围的参照标准。

在一个实施方案中，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。

在一个实施方案中，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于健康受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。

另一方面，本发明还提供了一种检测样本中去氢表雄酮硫酸酯的非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将所述样本加入纳米孔系统，所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述纳米孔为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1纳米孔；所述样本被加入到所述第一介质；

S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯与所述纳米孔相互作用并产生电信号；

S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯。

在一个实施方案中，所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1包括野生型地热嗜氢杆菌的钾离子通道1和/或地热嗜氢杆菌的钾离子通道1变体。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用，所述孔蛋白为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1。本发明的试剂盒至少具有以下优点：

(a)对去氢表雄酮硫酸酯的针对性检测：在众多纳米孔中，去氢表雄酮硫酸酯仅能使地热嗜氢杆菌的钾离子通道1“阻塞”而产生特异性电信号(参见图7，图9-11)。因此，本发明提供的试剂盒能够针对性地检测待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯。

(b)检测所需的时间短：目前的医院急诊报告时间大约为30min，而基于本发明提供的试剂盒，仅需要大约5min的时间，即可实现快速检测待测样本的去氢表雄酮硫酸酯存在和/或判断待测样本的去氢表雄酮硫酸酯浓度或浓度范围。这在一定程度上保证了检测结果的实时性和避免了现有技术中因耗费的检验时间较长而导致的检测结果的延迟及受试者承担的风险的增加。

(c)检测所需样本量少：基于本发明提供的试剂盒，仅需要大约2–20μL样本量，即可实现快速检测待测样本的去氢表雄酮硫酸酯。因此，本发明提供的试剂盒仅需要采集受试者的少量样本(例如，以皮肤采血来代替静脉采血)，特别适用于一段时间内连续、多次检测受试者的去氢表雄酮硫酸酯浓度的情况(例如，去氢表雄酮硫酸酯水平异常的6-13岁儿童、治疗绝经的妇女等)。

(d)便于实际使用：临床实践中，去氢表雄酮硫酸酯的检测主要由LC/MS、HPLC及电化学发光等设备进行，这些设备费用高、体积大，对于操作人员的技术要求较高，难以满足患者POCT检测的需求。本发明提供的试剂盒对操作人员没有特定要求，且可以与适用于POCT检测的小型化便携式设备联用(例如便携式纳米孔装置)。这在一定程度上满足了临床应用上的较大需求的同时，还方便在基层医疗结构、家庭、医院等多种应用场景中使用。本发明提供的试剂盒为保证接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者所使用的去氢表雄酮类激素的剂量适当、能达到预期效果等方面提供了便利。

如本文所使用，“去氢表雄酮类激素”是指受试者服用(例如通过口服、吸入等给药途径)后能够在受试者体内至少部分地以去氢表雄酮硫酸酯(DHEA-S)存在的激素，例如去氢表雄酮、去氢表雄酮硫酸酯。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为PC1蛋白的侧视图和俯视图；

图2为PC1蛋白的电生理特性测试——单个纳米孔通道嵌入电流图；

图3为PC1蛋白的电生理特性测试——单个纳米孔道的Ramp曲线测试图；

图4为PC1蛋白的单分子传感测试——检测硫酸庆大霉素的实验结果图；

图5为PC1纳米孔检测硫酸庆大霉素的滞留时间分布与阻塞电流分布；

图6为PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯装置示意图；

图7为PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯——PC1纳米孔在+50mV下的基线电流(上)以及加入去氢表雄酮硫酸酯后的电流信号(下)；

图8为PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯的阻塞电流信号特征——阻塞信号中的阻塞电流分布图(上)以及阻塞信号中的阻塞时间分布图(下)；

图9为SC1孔检测去氢表雄酮硫酸酯结果图；

图10为PaMscS纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯结果图；

图11为MscCG纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯结果图；

图12为不同浓度的去氢表雄酮硫酸酯加入后，PC1孔的电流信号示意图；

图13为来源于不同样本的去氢表雄酮硫酸酯加入后，PC1孔的电流信号示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

纳米孔

本发明所使用的纳米孔是地热嗜氢杆菌(Geothermobacter hydrogeniphilus)的钾离子通道1(Potassium channel 1)(简称PC1)或其变体。所述变体(也可以理解为“突变体”)可以是由生物体(例如地热嗜氢杆菌)表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。本领域技术人员可以根据实际情况，对上述PC1进行修饰(例如，任何的突变、截短、融合、化学修饰等)，来获得相应PC1变体，且修饰手段都是本领域公知的。

分析物

所述分析物是荷电物质。如果分析物带有净电荷则它是荷电的。所述分析物可以荷负电也可以荷正电。如果分析物带有净负电荷则它是荷负电的。如果分析物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的分析物应为尺寸小于或等于所述纳米孔孔径的物质，例如药物分子。

在本发明的一个实施方案中，所述分析物可以为药物分子。药物分子可以是一种化合物。更具体地，“药物分子”可以是具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如，低于800、700、600、500、400、300或200g/mol)。作为优选，所述药物分子可以是氨基糖苷类抗生素。

在本发明的一个实施方案中，所述分析物可以为类固醇激素，优选为去氢表雄酮硫酸酯。

纳米孔系统

“纳米孔系统”包括具有纳米级尺寸的孔(简称为“纳米孔”)、绝缘膜、第一介质和第二介质。在本发明的一个实施方案中，所述具有纳米级尺寸的孔为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1(PC1)。所述具有纳米级尺寸的孔允许所述分析物从所述绝缘膜的一侧易位到另一侧。

在本发明的一个实施方案中，所述具有纳米级尺寸的孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜(也可以理解为，所述纳米级尺寸的孔和所述绝缘膜的复合体)将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述具有纳米级尺寸的孔的孔道提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道；向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力后，位于所述第一介质的分析物与所述PC1纳米孔相互作用以形成电流(即电信号)。在本发明中，“第一介质”是指所述分析物被加入所述纳米孔系统时位于的介质；“第二介质”则是指被所述绝缘膜分隔开的两部分介质中，“第一介质”的另一侧。在本发明中，驱动力是指通过电势、电渗流、浓度梯度等方式驱动分析物与所述纳米孔相互作用的力。

所述第一介质和所述第二介质可以相同或不同，并且所述第一介质和所述第二介质可以包括电导液。所述电导液为碱金属卤化物水溶液，具体为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaCl)。在本发明一个实施例中，所述第一介质和所述第二介质含有的电导液的浓度是不同的，换句话说，所述第一介质和所述第二介质中电导液的浓度存在差值，进而使得所述绝缘膜两侧的渗透压存在差值。所述第一介质和/或所述第二介质还可以包括缓冲液，例如HEPES。所述第一介质和/或所述第二介质的浓度范围可以是30mM-3M。

绝缘膜是指具有搭载纳米孔并阻塞非纳米孔通过的离子电流的能力的膜。所述绝缘膜可以包括磷脂膜和/或高分子膜。示例性的磷脂膜包括DPHPC、DOPC、E.coli lipid，示例性的高分子膜包括三嵌段共聚物高分子膜。

在本发明的一个具体实施例中，所述纳米孔系统包括两个电解液室，其被绝缘膜分隔开而形成反式(-trans)隔室和顺式(-cis)隔室，所述PC1纳米孔的孔嵌入绝缘膜中，绝缘膜上只有所述PC1纳米孔来连通上述两个电解液室。当向上述两个电解液室施加电势时，电解液室中溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过所述纳米孔。

所述纳米孔和分析物之间的相互作用

所述分析物可与所述纳米孔在所述绝缘膜两侧的任一侧接触。所述分析物可以与所述绝缘膜两侧中的任一侧相接触，使得所述分析物穿过所述纳米孔的通道以到达所述绝缘膜的另一侧。在这种情况下，所述分析物在其经由所述孔的通道穿过所述绝缘膜时，与所述纳米孔相互作用。或者，所述分析物可与所述绝缘膜的侧面接触，所述绝缘膜的侧面可使所述分析物与所述纳米孔相互作用，使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。所述分析物可以以任何方式并在任何位点与所述纳米孔相互作用。所述分析物还可以撞击到所述纳米孔，与所述纳米孔相互作用，使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。

在所述分析物与所述纳米孔相互作用的过程中，所述分析物会以该分析物特异性的方式影响流过所述纳米孔的电流，即流经所述纳米孔的电流对特定分析物是特征性的。可进行对照实验以测定特定分析物对流过所述纳米孔的电流的效应，然后以鉴定样本中的特定分析物或测定样本中是否存在特定分析物。更具体地，可以根据通过检测分析物所获得的电流模式与在相同的条件下使用已知的分析物获得的已知的电流模式进行比较，以鉴定分析物的存在与否、浓度或与已知的电流模式的偏离程度等。

本发明的纳米孔系统还可以包括一个或多个测量流过所述纳米孔的电流的测量装置，例如膜片钳放大器或数据采集设备。

样本

所述分析物可存在于任何合适的样本中。本发明通常在已知含有或怀疑含有所述分析物的样本上进行。本发明可以在含有一种或多种种类未知的分析物的样本上进行。或者，本发明可以确认所述一种或多种已知存在或预计存在于所述样本中的分析物的种类。

所述样本可以是生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。本发明还可以在获自或提取自任何病毒的样本上在体外进行。优选地，所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本，例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类，也可以源自其他哺乳动物。所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本，例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。

所述样本在分析之前可以不经过处理，例如直接在全血中检测所述分析物。所述样本在分析之前也可以经过处理，例如通过离心、过滤、稀释、沉淀、富集或其他本领域已知的物理手段或化学手段。

在本发明的一个实施方案中，所述样本为全血样本。

检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒

本发明还提供了一种检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒。试剂盒是指一组包装好的相关组分，通常是一种或多种化合物或组合物。在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒包括地热嗜氢杆菌的钾离子通道1(PC1)、一种或多种电导液、绝缘膜或能够生成绝缘膜的物质。所述试剂盒还可以包括缓冲液(例如HEPES)。所述电导液为碱金属卤化物水溶液，具体可以为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaCl)。所述电导液的浓度范围可以是30mM-3M。所述能够生成绝缘膜的物质可以是脂质或三嵌段共聚物。

在一个具体实施方案中，所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道，待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯被加入到所述第一介质，向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后，所述去氢表雄酮硫酸酯与所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1相互作用，进而所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测所述去氢表雄酮硫酸酯。所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1包括野生型地热嗜氢杆菌的钾离子通道1和/或地热嗜氢杆菌的钾离子通道1变体。所述试剂盒可以用于确定所述待测样本中所述去氢表雄酮硫酸酯的存在。

在一个实施方案中，所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。

在一个具体实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于确定所述去氢表雄酮硫酸酯的浓度或浓度范围的参照标准。地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的去氢表雄酮硫酸酯浓度越高，所产生的信号频率越高。将地热嗜氢杆菌的钾离子通道1(PC1)检测的“待测样本”中的去氢表雄酮硫酸酯的电信号(更具体地，信号频率)与“参照样本”的电信号进行比较，通过分析经PC1检测的“待测样本”与“参照样本”的电信号之间的差异和偏离程度，进而预估“待测样本”中的去氢表雄酮硫酸酯的浓度(例如大于、小于、近似于“参照样本”中去氢表雄酮硫酸酯的浓度)。待测样本和参照样本的样本类型应该相同。待测样本的来源可以与参照样本不同，也可以相同。

在本发明的一个实施方案中，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于健康受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。当待测样本和参照样本来源于相同受试者时(例如，参照样本来源于该受试者去氢表雄酮硫酸酯的激素水平正常时的样本，更具体地，例如参照样本为该受试者绝经前的样本，待测样本为该受试者处于需要预防和/或治疗绝经时期的样本)，所获得的预估结果更为准确。在本发明的另一个实施方案中，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。当待测样本和参照样本来源于相同受试者时(例如，该已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者按医生综合评估后规定的剂量服用去氢表雄酮类激素且处于相对健康的状态，即参照样本中的去氢表雄酮硫酸酯的水平为该受试者应该保持的水平)，所获得的预估结果更为准确。因此，通过分析经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的“待测样本”与“参照样本”的电信号之间的差异和偏离程度，还可以判断该受试者的实际去氢表雄酮硫酸酯的激素水平与应保持的去氢表雄酮硫酸酯的激素水平之间的差异(例如偏高、偏低或正常)。

本发明提供的试剂盒在实际应用中所需样本量少(大约2–20μL)、检测时间短(大约5min)，并能够实现对去氢表雄酮硫酸酯的特异性检测(例如定性和定量)。

检测样本中去氢表雄酮硫酸酯的非诊断方法

另一方面，本发明还提供了一种检测样本中去氢表雄酮硫酸酯的非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将所述样本加入纳米孔系统，所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述纳米孔为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1纳米孔；所述样本被加入到所述第一介质；S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯与所述纳米孔相互作用并产生电信号；

S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯。

在一个实施方案中，所述样本可以是生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。优选地，所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本，例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类，也可以源自其他哺乳动物。在另一个实施方案中，所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本，例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。

实施例一

实验条件：

缓冲液：-Cis：1M CsCl，10mM Hepes，pH7.5；-Trans：1M CsCl，10mM Hepes，pH7.5

嵌孔电压：+200～+300mV

记录电压：+50mV

磷脂膜：E.coli

检测装置：Warner竖直样品槽

PC1孔蛋白的电生理特性测试

本实施例评估了PC1孔蛋白的电生理特性。PC1孔蛋白是地热嗜氢杆菌(Geothermobacter hydrogeniphilus)的钾离子通道1(Potassium channel 1)，氨基酸序列为：MTLKPHSQPAPRPEAAAIRHRLHTIIFEADTPAGKLFDLGLIFSILLSVLVVMLDSVGPLHADYGGLFLRIEWGFTILFSVEYLLRLLCIGRPLKYAVSFFGIVDLLSILPTYLSLLLPGSQYLLTIRILRILRIFRVLKLAQYVGEANHLVRALRASRRKIIVFLFAVATMVVIFGSLIYLVEGPEAGFTNLFEAYYYAIVTLSTVGYGDIIPITPLGKAISCFIMILGYGIIAVPTGIVSVELAQTRKLEVSTQSCPECSAEGHDSDAAFCKYCGAQL(SEQ ID NO:1)。图1显示了PC1孔蛋白的结构，PC1孔蛋白为由四聚体组成的跨膜通道蛋白，其中单个亚基由280个氨基酸残基组成，共构成九个阿尔法螺旋。

图2显示了单个PC1蛋白插入到绝缘膜的电流轨迹。单通道记录的电流轨迹表明，PC1蛋白可以稳定地插入绝缘膜。

图3显示了PC1蛋白的Ramp曲线，这表明PC1蛋白在-150mV至150mV电压内无高电压门控。

实施例二

实验条件：

缓冲液：-Cis：1M CsCl，10mM Hepes，pH7.5；-Trans：1M CsCl，

10mM Hepes，pH7.5

嵌孔电压：+200～+300mV

记录电压：+50mV

磷脂膜：E.coli

检测装置：Warner竖直样品槽

本实施例尝试利用PC1来检测硫酸庆大霉素，以评估其单分子传感能力。电流信号轨迹图如图4所示(上图为PC1纳米孔在-50mV下通道电流背景，下图为PC1纳米孔在-50mV下检测庆大霉素的电流背景)。PC1纳米孔检测庆大霉素的滞留时间分布与阻塞电流分布如图5所示。上述实验结果表明硫酸庆大霉素能够阻塞PC1纳米孔，PC1纳米孔具备检测小分子药物的能力。

实施例三

实验条件：

缓冲液：-Cis：1M CsCl，10mM Hepes，pH7.5；-Trans：1M CsCl，

10mM Hepes，pH7.5

嵌孔电压：+200～+300mV

记录电压：+50mV

磷脂膜：E.coli

检测装置：Warner竖直样品槽

PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯

本实施例尝试利用PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯。PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯的装置示意图如图6所示。

图7上图显示了PC1纳米孔背景信号分布特征(即加入去氢表雄酮硫酸酯前)，图7下图显示了PC1纳米孔加入去氢表雄酮硫酸酯后的特征信号分布特征。图8上图显示了PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯的阻塞信号中的阻塞电流分布，图8下图显示了PC1纳米孔检测去氢表雄酮硫酸酯的阻塞时间分布。上述实验结果表明PC1纳米孔具备检测去氢表雄酮硫酸酯的能力。

实施例四

本实施例尝试利用同为离子通道的SC1孔来检测去氢表雄酮硫酸酯，其中SC1孔是α-变形菌HIMB114(alpha proteobacterium HIMB114)的钠离子通道(Sodium channel 1)，氨基酸序列为：MTPFFSSLKDNRIFQFTVVSIIILNAVLIGATTYELDPLFLETIHLLDYGITIFFVIEILIRFIGEKQKADFFKSGWNIFDTVIVAISLIPIPNNSSFLVLRLLRIFRVLRLISVIPELKQIIEAILESVRRVFFVSLLLFIILYIYATMGAILFGNDDPSRWGDLGISLITLFQVLTLSSWETVMLPMQEIYWWSWVYFFSFIIICGITILNLVIAILVDVVIQKKL(SEQ ID NO:2)。

图9(上图：SC1孔背景信号，测试条件为200mM KCl，电压为+50mV，绝缘膜为大肠杆菌磷脂膜；下图：SC1孔cis端加入终浓度为1mM去氢表雄酮硫酸酯的电流信号，无响应信号)显示去氢表雄酮硫酸酯不能使SC1孔阻塞(产生信号)，即SC1孔不具备检测去氢表雄酮硫酸酯的能力。

除此之外，发明人还使用了其他通道蛋白，例如为机械力敏感性通道蛋白的PaMscS(铜绿假单胞菌的小电导机械力敏感性通道蛋白)和MscCG(谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白)来检测去氢表雄酮硫酸酯。如图10、图11所示，实验结果表明，去氢表雄酮硫酸酯不能使PaMscS和MscCG阻塞，即PaMscS和MscCG都不具备检测去氢表雄酮硫酸酯的能力。上述实验的电导液条件均为30-300mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.5。

PaMscS的氨基酸序列为：MELNYDRLVQQTESWLPIVLEYSGKVALALLTLAIGWWLINTLTGRVGGLLARRSVDRTLQGFVGSLVSIVLKILLVVSVASMIGIQTTSFVAAIGAAGLAIGLALQGSLANFAGGVLILLFRPFKVGDWIEAQGVAGTVDSILIFHTVLRSGDNKRIIVPNGALSNGTVTNYSAEPVRKVIFDVGIDYDADLKNAQNILLAMADDPRVLKDPAPVAVVSNLGESAITLSLRVWVKNADYWDVMFMFNEKARDALGKEGIGIPFPQRVVKVVQGAMAD(SEQ ID NO:3)

MscCG的氨基酸序列为：MRIIKRRVESAADADTTKNQLAFAGVGVYIAQIVAFFMLAVSAMQAFGFSLAGAAIPATIASAAIGLGAQSIVADFLAGFFILTEKQFGVGDWVRFEGNGIVVEGTVIEITMRATKIRTIAQETVIIPNSTAKVCINNSNNWSRAVVVIPIPMLGSENITDVIARSEAATRRALGQEKIAPEILGELDVHPATEVTPPTVVGMPWMVTMRFLVQVTAGNQWLVERAIRTEIISEFWEEYGSATTTSGTLIDSLHVEHEEPKTSLIDASPQALKEPKPEAAATVASLAASSNDDADNADASVINAGNPEKELDSDVLEQELSSEEPEETAKPDHSLRGFFRTDYYPNRWQKILSFGGRVRMSTSLLLGALLLLSLFKVMTVEPSENWQNSSGWLSPSTATSTAVTTSETSAPVSTPSMTVPTTVEETPTMESNVETQQETSTPATATPQRADTIEPTEEATSQEETTASQTQSPAVEAPTAVQETVAPTSTP(SEQ ID NO:4)

实施例五

一种利用PC1孔预估或确定去氢表雄酮硫酸酯的浓度或浓度范围的方法

如图12的示意图所示，PC1孔检测不同浓度的含去氢表雄酮硫酸酯的样本所产生的信号频率不同，换句话说，PC1孔检测的去氢表雄酮硫酸酯浓度越高，所产生的信号频率越高。基于此，可以通过将PC1孔检测的“待测样本”中的去氢表雄酮硫酸酯的电信号(更具体地，信号频率)与“参照样本”的电信号进行比较，通过分析经PC1孔检测的“待测样本”与“参照样本”的电信号之间的差异和偏离程度，进而预估“待测样本”中的去氢表雄酮硫酸酯的浓度(例如大于、小于、近似于“参照样本”中去氢表雄酮硫酸酯的浓度)。

如图13的示意图所示，通过将PC1孔检测待测样本得到的电信号与“健康人信号”(即将“健康人信号”视为参照标准，该样本视为参照样本)对比，预估待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯的浓度大于、小于、近似于“参照样本”中去氢表雄酮硫酸酯的浓度，进而判断受试者的去氢表雄酮硫酸酯的激素水平(偏高、偏低、正常)。待测样本和参照样本的样本类型应该相同。

上述“健康人信号”不仅可以来源于健康受试者(即去氢表雄酮硫酸酯的激素水平正常的受试者)，还可以来源于接受去氢表雄酮类激素治疗(去氢表雄酮类激素在血液中以去氢表雄酮硫酸酯形式存在)的受试者。待测样本的来源可以与参照样本不同，也可以相同。也就是说，本发明的“健康人信号”还可以来源于受试者处于健康状态时所采集的样本(例如，体检时)对应的电信号，医院等医疗机构以及受试者可以将该“健康人信号”存档，以作为将来对比的参照标准。本发明的“健康人信号”还可以来源于接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者，例如，该受试者按医生综合评估后规定的剂量服用去氢表雄酮类激素且处于相对健康的状态(即参照样本中的去氢表雄酮硫酸酯的水平为该受试者应该保持的水平)。因此，可以通过与“健康人信号”进行对比，预估待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯的浓度大于、小于、近似于“参照样本”中的去氢表雄酮硫酸酯的浓度，进而判断该受试者的实际去氢表雄酮硫酸酯的激素水平与应保持的去氢表雄酮硫酸酯的激素水平之间的差异(偏高、偏低或正常)。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种孔蛋白在制备检测去氢表雄酮硫酸酯的试剂盒中的应用，其特征在于，所述孔蛋白位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道，待测样本中的去氢表雄酮硫酸酯被加入到所述第一介质，向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后，所述去氢表雄酮硫酸酯与所述孔蛋白相互作用，进而所述孔蛋白检测所述去氢表雄酮硫酸酯，所述孔蛋白为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1包括野生型地热嗜氢杆菌的钾离子通道1和/或地热嗜氢杆菌的钾离子通道1变体。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述待测样本来源于已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于确定所述待测样本中所述去氢表雄酮硫酸酯的存在。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒进一步包括用于确定所述去氢表雄酮硫酸酯的浓度或浓度范围的参照标准。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于已接受去氢表雄酮类激素治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述参照标准由经地热嗜氢杆菌的钾离子通道1检测的来源于健康受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。

9.一种检测样本中去氢表雄酮硫酸酯的非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将所述样本加入纳米孔系统，所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述纳米孔为地热嗜氢杆菌的钾离子通道1纳米孔；所述样本被加入到所述第一介质；

S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯与所述纳米孔相互作用并产生电信号；

S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的去氢表雄酮硫酸酯。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述地热嗜氢杆菌的钾离子通道1包括野生型地热嗜氢杆菌的钾离子通道1和/或地热嗜氢杆菌的钾离子通道1变体。

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