CN115728353B - MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丙戊酸检测领域,具体涉及一种MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用。一方面,本发明提供了一种MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用。另一方面,本发明还提供了一种检测样本中丙戊酸类药物的非诊断方法。本发明的试剂盒至少具有以下优点:对丙戊酸类药物的针对性检测;检测所需的时间短;检测所需样本量少;便于实际使用。
Description
优先权申请
本申请要求2022年8月5日提交的中国发明专利申请CN202210936905.4“MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用”的优先权,该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及丙戊酸检测领域,具体涉及一种MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用。
背景技术
丙戊酸(valproic acid,VPA)是临床上常用的一线广谱抗癫痫药,其能够有效地治疗全身性、部分性癫痫或其他癫痫。丙戊酸血药浓度是患者病理与生理条件、环境、遗传等多种因素共同作用的结果。除患者自身因素(例如,个体吸收代谢差异较大)外,丙戊酸血药浓度易受药物相互作用(drug interaction)的影响,例如,神经阻滞剂、抗抑郁药等其他精神系统疾病药物以及苯巴比妥、卡马西平等其他抗癫痫药等。此外,丙戊酸的治疗窗(therapeutic window)较窄。据报道,丙戊酸的有效血药浓度范围是50~100μg/mL,而潜在中毒剂量是>100μg/mL。由此,丙戊酸的临床给药剂量实际上难以把握,很有可能对消化系统、肝脏及血液系统造成不良反应。为了保证用药的安全性和有效性,对服用丙戊酸的患者进行治疗药物检测(therapeutic drug monitoring,TDM)是至关重要的。
目前常用的丙戊酸的检测方法是色谱分析法和免疫分析法。色谱分析法的主要原理是,利用物理方法将待测成分从其他干扰物中分离出来。由于丙戊酸不具有芳香环或共轭双键结构,其在紫外光下无吸收,因此其不能直接地被高效液相色谱法(HPLC)的紫外检测器监测到。基于此,使用HPLC检测丙戊酸前,需要衍生化处理丙戊酸,这使整个检测过程更加繁琐,并限制了HPLC在临床中的使用。近年来,液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)联用技术、气相色谱法(GC)发展迅速,表现出灵敏度和准确性高、特异性强等优点,但仍受仪器昂贵、测定周期较长、分析技术较难掌握、检测用试剂需自配等限制。免疫分析法的主要原理是,利用待测物抗原与抗体的特异反应,通过酶与底物或荧光标记等方法产生可供检测的化学反应来进行定量测定。临床上多采用匀相酶联免疫法(EMIT)、荧光偏振免疫法(FPIA)、化学发光微粒子免疫法(CMIA)来测定丙戊酸游离血药浓度。与色谱法相比,免疫分析法表现出分析速度快、样品无需前处理、试剂商品化、操作简单等优点,但其检测结果不稳定,易受到外部因素(例如温度)干扰且受样本类型(仅限于血液)、专属性稍差、试剂盒昂贵等限制。
发明内容
一方面,本发明提供了一种MscCG在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用,其特征在于,所述MscCG位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道,待测样本中的丙戊酸类药物被加入到所述第一介质,向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后,所述丙戊酸类药物与所述MscCG相互作用,进而所述MscCG检测所述丙戊酸类药物。
在一些实施方案中,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸钠。
在一些实施方案中,所述MscCG包括野生型MscCG和/或MscCG变体。
在一些实施方案中,所述待测样本来源于已接受所述丙戊酸类药物治疗的受试者。
在一些实施方案中,所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液和痰中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述试剂盒用于确定所述待测样本中所述丙戊酸类药物的存在。
在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于确定所述丙戊酸类药物的浓度或浓度范围的标准曲线或参照标准。
在一些实施方案中,所述标准曲线通过所述MscCG检测不同浓度的含所述丙戊酸类药物的丙戊酸类药物标准液所产生的信号频率来确定;所述丙戊酸类药物标准液所含有的所述丙戊酸类药物的浓度已知。
在一些实施方案中,所述参照标准由经所述MscCG检测的来源于已接受所述丙戊酸类药物治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。
在一些实施方案中,所述试剂盒用于评估所述丙戊酸类药物中毒的风险。
另一方面,本发明还提供了一种检测样本中丙戊酸类药物的非诊断方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1将所述样本加入纳米孔系统,所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质和第二介质,其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中,所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开,所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道,所述纳米孔为MscCG纳米孔;所述样本被加入到所述第一介质;
S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力,所述样本中的丙戊酸类药物与所述纳米孔相互作用并产生电信号;
S3分析所述电信号,进而获得所述样本中丙戊酸类药物的信息。
在一些实施方案中,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸钠。
在一些实施方案中,所述MscCG包括野生型MscCG和/或MscCG变体。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明提供了谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白(MscCG)制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用。本发明的试剂盒至少具有以下优点:
(a)对丙戊酸类药物的针对性检测:一方面,在多种抗癫痫类药物中,MscCG展现出仅对丙戊酸类药物的特异性识别和检测(参见图7-图12);另一方面,在多种纳米孔中,丙戊酸类药物仅能使MscCG“阻塞”并产生特异性电信号(参见图14-图15)。因此,本发明提供的试剂盒能够针对性地检测待测样本中的丙戊酸类药物。
(b)检测所需的时间短:目前,医院急诊检验出报告的时间通常为30min及以上。而基于本发明提供的试剂盒,仅需要大约5min的时间,即可实现快速检测待测样本的丙戊酸浓度和/或判断待测样本的丙戊酸类药物浓度是否处于治疗窗或潜在中毒剂量范围内。这在一定程度上保证了检测结果的实时性和避免了现有技术中因耗费的检验时间较长而导致的检测结果的延迟及受试者承担的风险的增加。
(c)检测所需样本量少:基于本发明提供的试剂盒,仅需要大约2–20μL样本量,即可实现快速检测待测样本的丙戊酸类药物。由于本发明提供的试剂盒所需要的样本量低,因此受试者仅需要被采集少量样本(例如,以皮肤采血来代替静脉采血),特别适用于需要在短时间内连续、多次检测受试者的丙戊酸类药物浓度的情况(例如,监测服用丙戊酸类药物的受试者的血浆药物浓度的达峰时间(由于个体药代动力学的差异或者过量服用等情况,受试者的达峰时间可能会延迟))。
(d)便于实际使用:临床实践中,丙戊酸类药物的检测主要依赖LC/MS、HPLC及电化学发光等设备进行。这些设备不仅费用高、体积大、对操作人员的技术要求较高,而且难以满足患者即时检验(POCT,point-of-care testing)的需求。本发明提供的试剂盒对操作人员没有特定要求,且可以与适用于POCT检测的小型化便携式设备联用(例如,便携式纳米孔装置)。这在一定程度上不仅满足了临床应用上的较大需求,而且方便在基层医疗结构、家庭、医院等多种应用场景中使用。此外,本发明提供的试剂盒为保证接受丙戊酸类药物治疗的受试者所使用的丙戊酸类药物的剂量适当、能达到预期效果以及避免丙戊酸类药物中毒等方面提供了便利。
如本文所使用,“治疗窗”是指可以提供治疗效能而没有不可接受的毒性的浓度范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为MscCG的侧视图和俯视图;
图2为单个MscCG通道嵌入电流图及电导分布图;
图3为MscCG的电生理特性测试——单个纳米孔道的IV曲线测试图;
图4为MscCG的电生理特性测试——单个纳米孔道的Ramp曲线测试图;
图5为MscCG检测硫酸庆大霉素的电流信号轨迹图与硫酸庆大霉素阻塞信号的散点图;
图6为MscCG纳米孔检测抗癫痫药物的装置示意图;
图7为MscCG纳米孔检测丙戊酸钠——不同梯度浓度丙戊酸钠下MscCG纳米孔的电流轨迹图;
图8为MscCG纳米孔检测丙戊酸钠——不同梯度浓度丙戊酸钠加入后MscCG纳米孔特征信号频率变化图;
图9为MscCG纳米孔检测左乙拉西坦——不同梯度浓度左乙拉西坦下MscCG纳米孔的电流轨迹图;
图10为MscCG纳米孔检测左乙拉西坦——不同梯度浓度左乙拉西坦加入后MscCG纳米孔特征信号频率变化图;
图11为MscCG纳米孔检测拉考沙胺——不同梯度浓度拉考沙胺下MscCG纳米孔的电流轨迹图;
图12为MscCG纳米孔检测拉考沙胺——不同梯度浓度拉考沙胺加入后MscCG纳米孔特征信号频率变化图;
图13为MscCG纳米孔检测丙戊酸——MscCG纳米孔背景信号分布特征(左)以及加入丙戊酸后的特征信号分布特征(右);
图14为PC1纳米孔检测丙戊酸的结果图;
图15为PaMscS纳米孔检测丙戊酸结果图;
图16为PaMscS_271I(右)与MscCG(左)嵌孔用时分布统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的,术语“大约”,典型地表示为所述值的+/-5%,更典型的是所述值的+/-4%,更典型的是所述值的+/-3%,更典型的是所述值的+/-2%,甚至更典型的是所述值的+/-1%,甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中,某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解,这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁,且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此,范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如,范围1~6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3,从1到4,从1到5,从2到4,从2到6,从3到6等,以及此范围内的单独数字,例如1,2,3,4,5和6。无论该范围的广度如何,均适用以上规则。
纳米孔
本发明所使用的纳米孔是谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白(mechanosensitive channel ofCorynebacterium glutamicum,MscCG)或其变体。所述变体(也可以理解为“突变体”)可以是由生物体(例如谷氨酸棒状杆菌)表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。本领域技术人员可以根据实际情况,对上述MscCG进行修饰(例如,任何的突变、截短、融合、化学修饰等),来获得相应MscCG变体,且修饰手段都是本领域公知的。
分析物
所述分析物是荷电物质。如果分析物带有净电荷则它是荷电的。所述分析物可以荷负电也可以荷正电。如果分析物带有净负电荷则它是荷负电的。如果分析物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的分析物应为尺寸小于或等于所述纳米孔孔径的物质,优选为药物分子。
在本发明的一些实施例中,所述分析物包括药物分子。药物分子可以是一种化合物。更具体地,“药物分子”可以是具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如,低于800、700、600、500、400、300或200g/mol)。作为优选,所述药物分子可以是氨基糖苷类抗生素。
在本发明的一些优选实施例中,所述药物分子为丙戊酸类药物,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸及其药学上可接受的盐,例如丙戊酸钠、丙戊酸镁。
纳米孔系统
“纳米孔系统”包括具有纳米级尺寸的孔(简称为“纳米孔”)、绝缘膜、第一介质和第二介质。在本发明的一些实施例中,所述具有纳米级尺寸的孔为谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白(MscCG)。所述具有纳米级尺寸的孔允许所述分析物从所述绝缘膜的一侧易位到另一侧。
在本发明的一些实施例中,所述具有纳米级尺寸的孔被嵌入所述绝缘膜中,所述绝缘膜(也可以理解为,所述纳米级尺寸的孔和所述绝缘膜的复合体)将所述第一介质与所述第二介质分隔开,所述具有纳米级尺寸的孔的孔道提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道;向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力后,位于所述第一介质的分析物与所述MscCG纳米孔相互作用以形成电流(即电信号)。在本发明中,“第一介质”是指所述分析物被加入所述纳米孔系统时位于的介质;“第二介质”则是指被所述绝缘膜分隔开的两部分介质中,“第一介质”的另一侧。在本发明中,驱动力是指通过电势、电渗流、浓度梯度等方式驱动分析物与所述纳米孔相互作用的力。
所述第一介质和所述第二介质可以相同或不同,并且所述第一介质和所述第二介质可以包括电导液。所述电导液为碱金属卤化物水溶液,具体为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaBr)。在本发明的一些实施例中,所述第一介质和所述第二介质含有的电导液的浓度是不同的,换句话说,所述第一介质和所述第二介质中电导液的浓度存在差值,进而使得所述绝缘膜两侧的渗透压存在差值。所述第一介质和/或所述第二介质还可以包括缓冲液,例如HEPES。所述第一介质和/或所述第二介质的浓度范围可以是30mM-3M。
绝缘膜是指具有搭载纳米孔并阻塞非纳米孔通过的离子电流的能力的膜。所述绝缘膜可以包括磷脂膜和/或高分子膜。示例性的磷脂膜包括DPHPC、DOPC、E.coli lipid,示例性的高分子膜包括三嵌段共聚物高分子膜。
在本发明的一些具体实施例中,所述纳米孔系统包括两个电解液室,其被绝缘膜分隔开而形成反式(-trans)隔室和顺式(-cis)隔室,所述MscCG纳米孔的孔嵌入绝缘膜中,绝缘膜上只有所述MscCG纳米孔来连通上述两个电解液室。当向上述两个电解液室施加电势时,电解液室中溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过所述纳米孔。
所述纳米孔和分析物之间的相互作用
所述分析物可与所述纳米孔在所述绝缘膜两侧的任一侧接触。所述分析物可以与所述绝缘膜两侧中的任一侧相接触,使得所述分析物穿过所述纳米孔的通道以到达所述绝缘膜的另一侧。在这种情况下,所述分析物在其经由所述孔的通道穿过所述绝缘膜时,与所述纳米孔相互作用。或者,所述分析物可与所述绝缘膜的侧面接触,所述绝缘膜的侧面可使所述分析物与所述纳米孔相互作用,使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。所述分析物可以以任何方式并在任何位点与所述纳米孔相互作用。所述分析物还可以撞击到所述纳米孔,与所述纳米孔相互作用,使其与所述纳米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。
在所述分析物与所述纳米孔相互作用的过程中,所述分析物会以该分析物特异性的方式影响流过所述纳米孔的电流,即流经所述纳米孔的电流对特定分析物是特征性的。可进行对照实验以测定特定分析物对流过所述纳米孔的电流的效应,然后以鉴定样本中的特定分析物或测定样本中是否存在特定分析物。更具体地,可以根据通过检测分析物所获得的电流模式与在相同的条件下使用已知的分析物获得的已知的电流模式进行比较,以鉴定分析物的存在与否、浓度或与已知的电流模式的偏离程度等。
本发明的纳米孔系统还可以包括一个或多个测量流过所述纳米孔的电流的测量装置,例如膜片钳放大器或数据采集设备。
样本
所述分析物可存在于任何合适的样本中。本发明通常在已知含有或怀疑含有所述分析物的样本上进行。本发明可以在含有一种或多种种类未知的分析物的样本上进行。或者,本发明可以确认所述一种或多种已知存在或预计存在于所述样本中的分析物的种类。
所述样本可以包括生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。优选地,所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本,例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类,也可以源自其他哺乳动物。所述样本可以包括非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本,例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。
所述样本在分析之前可以不经过处理,例如直接在全血中检测所述分析物。所述样本在分析之前也可以经过处理,例如通过离心、过滤、稀释、沉淀、富集或其他本领域已知的物理手段或化学手段。
在本发明的一些实施例中,所述样本为全血样本。
检测丙戊酸类药物的试剂盒
本发明还提供了一种检测丙戊酸类药物的试剂盒。试剂盒是指一组包装好的相关组分,通常是一种或多种化合物或组合物。在一些实施例中,本发明提供的试剂盒包括MscCG蛋白、一种或多种电导液、绝缘膜或能够生成绝缘膜的物质。所述试剂盒可以包括缓冲液(例如HEPES)。所述电导液为碱金属卤化物水溶液,具体可以为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaBr)。所述电导液的浓度范围可以是30mM-3M。所述能够生成绝缘膜的物质可以是脂质或三嵌段共聚物。
在一些具体实施例中,所述MscCG位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道,待测样本中的丙戊酸类药物被加入到所述第一介质,向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后,所述丙戊酸类药物与所述MscCG相互作用,进而所述MscCG检测所述丙戊酸类药物。在一些实施例中,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸钠;所述MscCG包括野生型MscCG和/或MscCG变体。所述试剂盒可以用于确定所述待测样本中所述丙戊酸类药物的存在。
在一些具体实施例中,所述待测样本来源于已接受所述丙戊酸类药物治疗的受试者,所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。
在一些具体实施例中,所述试剂盒进一步包括用于确定所述丙戊酸类药物的浓度或浓度范围的标准曲线或参照标准。所述标准曲线通过所述MscCG检测不同浓度的含所述丙戊酸类药物的丙戊酸类药物标准液所产生的信号频率来确定。也就是说,所述丙戊酸类药物标准液所含有的所述丙戊酸类药物的浓度已知,例如4mM、8mM、12mM。MscCG纳米孔检测不同浓度梯度的丙戊酸类药物,会产生不同的信号频率。丙戊酸类药物的浓度与对应的信号频率呈线性关系,并可以拟合成丙戊酸类药物的标准曲线(参见图7-图8)。更具体地,可以将待测样本中的丙戊酸类药物与所述MscCG纳米孔相互作用所产生的电信号的信号频率f1减去空白对照频率f0,并通过所述标准曲线,得到信号频率f1-f0对应的丙戊酸类药物的浓度,该浓度即为待测样本中丙戊酸类药物的浓度。如果待测样本为经过处理的样本,则可以通过本领域已知的计算方式来计算待测样本中丙戊酸类药物的浓度(例如,待测样本为被稀释10倍的样本,则待测样本中丙戊酸类药物的浓度应为信号频率f1-f0对应的丙戊酸类药物的浓度的10倍)。
在本发明的一些实施例中,所述参照标准由经MscCG检测的来源于已接受丙戊酸类药物治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定,例如所述参照样本中的所述丙戊酸类药物浓度可以为处于治疗窗或高于治疗窗。如上所述,MscCG纳米孔检测不同浓度梯度的丙戊酸类药物,会产生不同的信号频率,且丙戊酸类药物的浓度与对应的信号频率呈线性关系(参见图7-图8)。通过将待测样本的信号频率和所述参照标准进行对比,可以获得待测样本与参照样本的偏离程度(例如大于、小于、近似),进而预估待测样本的丙戊酸类药物的浓度。待测样本和参照样本的样本类型应该相同。待测样本的来源可以与参照样本相同或不同。由于不同个体的丙戊酸类药物的药代动力学相差较大,因此待测样本和参照样本来自相同受试者时(例如,参照样本为该受试者先前已被确定处于治疗窗的样本),所获得的预估结果更为准确。即使待测样本和参照样本来自不同受试者,可以对参照样本中的丙戊酸类药物浓度精确测量,进而通过信号频率的偏离程度来判断浓度的差异。基于此,所述试剂盒还可以用于评估所述丙戊酸类药物中毒的风险。
本发明提供的试剂盒在实际应用中所需样本量少(大约2–20μL)、检测时间短(大约5min),并能够实现对丙戊酸类药物的特异性检测(例如,定性和定量)。
检测样本中丙戊酸类药物的非诊断方法
本发明还提供一种检测样本中丙戊酸类药物的非诊断方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1将所述样本加入纳米孔系统,所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质,其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中,所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开,所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道,所述纳米孔为MscCG纳米孔;所述样本被加入到所述第一介质;
S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力,所述样本中的丙戊酸类药物与所述纳米孔相互作用并产生电信号;
S3分析所述电信号,进而获得所述丙戊酸类药物的信息。
在一些实施例中,所述样本可以是生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。优选地,所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本,例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类,也可以源自其他哺乳动物。在另一些实施例中,所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本,例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。
实施例一
实验条件:
缓冲液:-Cis:1M CsCl、10mM Hepes、pH 7.5;-Trans:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5
嵌孔电压:+200~+300mV
记录电压:+50mV
磷脂膜:E.coli
检测装置:Warner竖直样品槽
MscCG蛋白的电生理特性测试
本实施例评估了MscCG的电生理特性。MscCG(mechanosensitive channel ofCorynebacterium glutamicum)为谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白,具体结构如图1所示:其为七聚体蛋白,由跨膜区和胞质区构成;蛋白纵向的中心为通道,通道开口分别位于跨膜区上端与胞质区下端;在胞质区侧面存在七个较小开口,这些开口均为小分子的传感提供了结构基础。MscCG的序列信息如下:
图2显示单个MscCG蛋白插入到绝缘膜的电流轨迹和电导分布。单通道记录的电流轨迹表明,MscCG蛋白可以稳定地插入绝缘膜(图2左)。在1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5和+50mV的电压下,MscCG的电导为4nS(图2右)。
图3和图4分别显示MscCG在-200~+200mV下的I-V曲线和Ramp曲线,这表明MscCG在该电压范围内保持稳定,无高电压门控。
实施例二
实验条件:
缓冲液:-Cis:1M CsCl、10mM Hepes、pH 7.5;-Trans:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5
嵌孔电压:+200~+300mV
记录电压:+50mV
磷脂膜:E.coli
检测装置:Warner竖直样品槽
MscCG检测药物分子
以硫酸庆大霉素为例,本实施例尝试利用MscCG蛋白来检测小分子药物(也可以理解为“药物分子”),以评估其单分子传感能力。电流信号轨迹图与硫酸庆大霉素阻塞信号的散点图如图5所示,这表明硫酸庆大霉素能够阻塞MscCG,MscCG纳米孔具备检测小分子药物的能力。
实施例三
实验条件:
缓冲液:-Cis:1M CsCl、10mM Hepes、pH 7.5;-Trans:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5
嵌孔电压:+200~+300mV
记录电压:+50mV
磷脂膜:E.coli
检测装置:Warner竖直样品槽
MscCG纳米孔检测抗癫痫药物
本实施例尝试利用MscCG纳米孔来检测不同类型的抗癫痫药物,包括丙戊酸(valproic acid,VPA)、左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)、拉考沙胺(Lacosamide,LCM)。MscCG纳米孔检测抗癫痫药物的装置示意图如图6所示。分别用MscCG纳米孔检测不同梯度浓度(4mM、8mM、12mM)的丙戊酸钠、左乙拉西坦和拉考沙胺,实验结果如下。
图7、图9、图11分别显示了不同梯度浓度的丙戊酸钠、左乙拉西坦、拉考沙胺下MscCG纳米孔电流轨迹。图8、图10、图12分别显示了不同梯度浓度的丙戊酸钠、左乙拉西坦、拉考沙胺加入后MscCG纳米孔特征信号频率变化。上述实验结果表明,MscCG纳米孔检测不同浓度梯度的丙戊酸类药物,会产生不同的信号频率,且丙戊酸类药物的浓度与对应的信号频率呈线性关系。从图9-图12可明显看出,不同浓度梯度的左乙拉西坦或拉考沙胺并不会使MscCG纳米孔产生有规律的信号频率变化,即MscCG纳米孔实际上检测不到左乙拉西坦或拉考沙胺,而MscCG纳米孔所产生的信号可能属于MscCG纳米孔在溶液环境中自身的波动范围。上述实验结果表明,MscCG纳米孔可以实现对抗癫痫药物中的丙戊酸类药物的定量检测。
图13左图显示了MscCG纳米孔背景信号分布特征(即加入丙戊酸前),图13右图显示了MscCG纳米孔加入丙戊酸后的特征信号分布特征。这证实了MscCG纳米孔具备检测丙戊酸的能力。
实施例四
实验条件:
缓冲液:-Cis:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5;-Trans:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5
嵌孔电压:+200~+300mV
记录电压:+50mV
磷脂膜:E.coli
检测装置:Warner竖直样品槽
本实施例尝试利用其他机械力敏感性通道蛋白(以PaMscS为例)和其他离子通道蛋白(以PC1为例)来检测丙戊酸。其中,PaMscS为铜绿假单胞菌的小电导机械力敏感性通道蛋白,PC1纳米孔为地热嗜氢杆菌(Geothermobacter hydrogeniphilus)的钾离子通道蛋白1。图14和图15显示,丙戊酸均不能使PC1纳米孔和PaMscS纳米孔阻塞(产生信号),即PC1纳米孔和PaMscS纳米孔并不具备检测丙戊酸的能力。
PaMscS的氨基酸序列为:MELNYDRLVQQTESWLPIVLEYSGKVALALLTLAIGWWLINTLTGRVGGLLARRSVDRTLQGFVGSLVSIVLKILLVVSVASMIGIQTTSFVAAIGAAGLAIGLALQGSLANFAGGVLILLFRPFKVGDWIEAQGVAGTVDSILIFHTVLRSGDNKRIIVPNGALSNGTVTNYSAEPVRKVIFDVGIDYDADLKNAQNILLAMADDPRVLKDPAPVAVVSNLGESAITLSLRVWVKNADYWDVMFMFNEKARDALGKEGIGIPFPQRVVKVVQGAMAD(SEQ ID NO:3)
PC1的氨基酸序列为:MTLKPHSQPAPRPEAAAIRHRLHTIIFEADTPAGKLFDLGLIFSILLSVLVVMLDSVGPLHADYGGLFLRIEWGFTILFSVEYLLRLLCIGRPLKYAVSFFGIVDLLSILPTYLSLLLPGSQYLLTIRILRILRIFRVLKLAQYVGEANHLVRALRASRRKIIVFLFAVATMVVIFGSLIYLVEGPEAGFTNLFEAYYYAIVTLSTVGYGDIIPITPLGKAISCFIMILGYGIIAVPTGIVSVELAQTRKLEVSTQSCPECSAEGHDSDAAFCKYCGAQL(SEQ ID NO:4)
实施例五
实验条件:
缓冲液:-Cis:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5;-Trans:1M CsCl、10mM Hepes、pH7.5
嵌孔电压:+200~+300mV
记录电压:+50mV
磷脂膜:E.coli
检测装置:Warner竖直样品槽
MscCG的嵌孔效率评价:
本实施例选择同属于机械力敏感性通道蛋白的PaMscS_271I(铜绿假单胞菌的小电导机械力敏感性通道蛋白)和MscCG进行嵌孔实验,并比较PaMscS_271I和MscCG的嵌孔效率(插入绝缘膜的效率)。
嵌孔效率主要评估的是单个纳米孔-绝缘膜复合物的制备效率。在实际应用场景中,稳定且快速的嵌孔有助于单分子传感器件的快速制备。实验结果如表1和图16所示,PaMscS_271I在30min内获得单个绝缘膜-纳米孔复合物的比例为16%,而MscCG在30min内获得单个绝缘膜-纳米孔复合物的比例为40%。PaMscS_271I的嵌孔用时不稳定,主要分布在60min以上。而MscCG的嵌孔用时可以稳定地保持在60min以下,甚至可以达到30min以下。
表1PaMscS_271I和MscCG的嵌孔用时(统计实验组数量)
嵌孔用时 | 0~30min | 30~60min | 60min以上 |
MscS_271I | 3 | 4 | 12 |
MscCG | 6 | 7 | 2 |
注:经统计,MscS_271I的总实验次数为19,MscCG的总实验次数为15。
PaMscS_271I的氨基酸序列为:MELNYDRLVQQTESWLPIVLEYSGKVALALLTLAIGWWLINTLTGRVGGLLARRSVDRTLQGFVGSLVSIVLKILLVVSVASMIGIQTTSFVAAIGAAGLAIGLALQGSLANFAGGVLILLFRPFKVGDWIEAQGVAGTVDSILIFHTVLRSGDNKRIIVPNGALSNGTVTNYSAEPVRKVIFDVGIDYDADLKNAQNILLAMADDPRVLKDPAPVAVVSNLGESAITLSLRVWVKNADYWDVMFMFNEKARDALGKEGIGIPFPQRVVKIVQGAMAD(SEQ ID NO:5)
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述,但是本发明并不局限于上述的具体实施方式,上述的具体实施方式仅仅是示意性的,而不是限制性的,本领域的普通技术人员在本发明的启示下,在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下,还可做出很多形式,这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种MscCG纳米孔在制备检测丙戊酸类药物的试剂盒中的应用,其特征在于,所述MscCG纳米孔位于分隔第一介质与第二介质的绝缘膜中并提供连通所述第一介质和所述第二介质的通道,待测样本中的丙戊酸类药物被加入到所述第一介质,向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力后,所述丙戊酸类药物与所述MscCG纳米孔相互作用,进而所述MscCG纳米孔检测所述丙戊酸类药物;其中,所述MscCG指谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白;所述绝缘膜指具有搭载所述MscCG纳米孔能力并具有阻塞非纳米孔通过的离子电流的能力的膜;所述第一介质和所述第二介质包括电导液,所述电导液为碱金属卤化物水溶液;所述驱动力指通过电势、电渗流或浓度梯度方式驱动分析物与纳米孔相互作用的力;
其中,在所述待测样本与所述MscCG纳米孔相互作用的过程中,流经所述MscCG纳米孔的电流对所述丙戊酸类药物是特征性的。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸钠;所述MscCG包括野生型MscCG和/或MscCG变体。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述待测样本来源于已接受所述丙戊酸类药物治疗的受试者,所述待测样本的类型包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液和痰中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒用于确定所述待测样本中所述丙戊酸类药物的存在。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒进一步包括用于确定所述丙戊酸类药物的浓度或浓度范围的标准曲线或参照标准。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述标准曲线通过所述MscCG纳米孔检测不同浓度的含所述丙戊酸类药物的丙戊酸类药物标准液所产生的信号频率来确定;所述丙戊酸类药物标准液所含有的所述丙戊酸类药物的浓度已知。
7.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述参照标准由经所述MscCG纳米孔检测的来源于已接受所述丙戊酸类药物治疗的受试者的参照样本所产生的信号频率来确定。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述试剂盒用于评估所述丙戊酸类药物中毒的风险。
9.一种检测样本中丙戊酸类药物的非诊断方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1 将所述样本加入纳米孔系统,所述纳米孔系统包括纳米孔、绝缘膜、第一介质和第二介质,其中所述纳米孔被嵌入所述绝缘膜中,所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开,所述纳米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道,所述纳米孔为MscCG纳米孔;所述样本被加入到所述第一介质;
S2 向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力,所述样本中的丙戊酸类药物与所述纳米孔相互作用并产生电信号;
S3 分析所述电信号,进而获得所述样本中丙戊酸类药物的信息;
其中,所述MscCG指谷氨酸棒状杆菌的机械力敏感性通道蛋白;所述绝缘膜指具有搭载所述MscCG纳米孔能力并具有阻塞非纳米孔通过的离子电流的能力的膜;所述第一介质和所述第二介质包括电导液,所述电导液为碱金属卤化物水溶液;所述驱动力指通过电势、电渗流或浓度梯度方式驱动分析物与纳米孔相互作用的力;
在所述S2中,所述电信号对所述丙戊酸类药物是特征性的。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述丙戊酸类药物包括丙戊酸钠;所述MscCG包括野生型MscCG和/或MscCG变体。
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