CN117568437A - 一种基于生物埃米孔检测药物分子的方法 - Google Patents

一种基于生物埃米孔检测药物分子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种基于生物埃米孔检测药物分子的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：S1将所述样本加入埃米孔系统，所述埃米孔系统包括：埃米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，所述埃米孔为MscS埃米孔，所述埃米孔具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口；所述样本被加入到所述第一介质；S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的药物分子与所述埃米孔相互作用并产生电信号；S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的药物分子。本发明提供的方法能够检测药物分子及其浓度(定量分析)，还能够对全血样本中的药物分子直接检测。

Description

一种基于生物埃米孔检测药物分子的方法
本申请要求2021年08月30日提交的中国发明专利申请【CN2021110062606】的优先权，以及，2021年08月30日提交的中国发明专利申请【CN2021110042496】、名称为“基于PaMscS的用于小分子药物检测和全血检测的生物纳米孔系统”的优先权，两个优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种基于生物埃米孔检测药物分子的方法。
背景技术
血药浓度监测在合理且有效使用药物以减少副作用方面起着重要作用。目前用于临床监测血液药物浓度的方法主要是HPLC、LS/MS2和ELISA等。然而，现有的这些血液监测设备往往需要相对高的成本和复杂的操作。首先，这些设备通常使血液药物监测变得复杂和昂贵，严重限制了血液药物监测的普及。由于缺乏适当的方法，一些医学治疗是根据医生的临床经验而不是准确的治疗药物监测(therapeuticdrugmonitoring,简称TDM)仪器进行的，导致了医疗过失的发生率增加。其次，目前临床应用的血液药物监测大多是离散的，不能准确显示药物代谢的连续过程，然而，连续的药物监测方法在临床上却有迫切的需求。目前有方法可以实现对血液中药物浓度的精确测量，但主要依靠化学反应、适配体或抗体，虽然具有较高的特异性，但药物检测范围受限。
纳米孔传感是一种单分子传感技术，有着类似于库尔特计数器(Kurtcounter)的检测原理。该技术具有在单分子水平上实时和直接监测的特点，且一般不需要对分析物进行标记或修饰。这些优点使纳米孔成为生物传感和生物检测的新兴技术。大多数生物纳米孔的直径在大约1nm到大约4nm之间(如MspA、α-HL20和phi29DNA包装马达)，适用于单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)的传感。但对于较小分子的传感，通常需要标记或适配体，如定点诱变或修饰特定的适配器。以α-HL为例，其有限的孔径约1.4nm，因此应用范围仅限制在ssDNA、RNA或其他分子的分析中，通过利用环糊精(cyclodextrin)修饰，可用于直接检测单磷酸脱氧核糖核苷dNMPs，无需荧光标记。但通过修饰手段改变生物纳米孔的孔径需要大量的生物工程技术辅助，此外，现有的方法技术结合适配体对药物分子进行连续检测是困难的，并且只有标准产物能被检测。因此，全血样本中的药物通过纳米孔进行连续检测仍是一项挑战。
基于此，本发明开发了一种基于埃米孔传感的药物分子监测策略，以期缓解现有难题中的一种或多种。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于埃米孔检测药物分子方法，具体技术方案如下。
一种检测样本中的药物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将所述样本加入埃米孔系统，所述埃米孔系统包括：埃米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述埃米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述埃米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述埃米孔为MscS埃米孔，所述埃米孔具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口；所述样本被加入到所述第一介质；
S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的药物分子与所述埃米孔相互作用并产生电信号；
S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的药物分子。
进一步地，所述开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的。
进一步地，所述开口的调节方式包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化。
进一步地，所述机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
进一步地，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
进一步地，所述埃米孔为MscS变体埃米孔。
进一步地，所述MscS变体包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
进一步地，所述埃米孔源自杆菌。
进一步地，所述埃米孔包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述埃米孔为PaMscS变体埃米孔。
进一步地，所述埃米孔包括以下变体的一种或多种：130A、130H、180R、271I、130S和130P。
进一步地，所述药物分子的分子量为小于1000g/mol。
进一步地，所述药物分子的分子量为177.98～712.72g/mol。
进一步地，所述药物分子的浓度为大于10nM。
进一步地，所述样本为体液样本。
进一步地，所述体液样本包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。
进一步地，所述体液样本的样本量为大于10μL。
进一步地，所述体液样本中的药物分子的浓度为大于10nM。
进一步地，所述方法进一步包括S4：将透析装置通过导管与所述第一介质连通，使得所述血液样本通过所述透析装置进入所述埃米孔系统，其中S4先于S1。
进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种利用埃米孔系统检测样本中药物分子的方法，其中埃米孔系统包含MscS埃米孔。本发明创造性地利用小电导机械力敏感性通道(Mechanosensitivechannelof smallconductance,MscS)的特性来检测样本中的药物分子，具体体现为：
1)MscS埃米孔的孔径狭窄。据估计，MscS埃米孔的孔径范围为～6-16埃米，远小于现有技术中常用的纳米孔(例如，α-溶血素纳米孔的孔径约为1.4-2.4nm，即14–24埃米)。
2)MscS埃米孔的孔径可调(也可以理解为结构灵活)。MscS埃米孔可在毫秒内将机械刺激转化为电信号或生化信号，从而引发通道构型的调节。利用MscS埃米孔对绝缘膜所受到的机械力刺激和/或绝缘膜的物理状态变化的敏感性，可以通过影响绝缘膜来实现对MscS埃米孔孔径的调整，无需繁复的化学修饰。例如，可以调整第一介质和第二介质的浓度(即30mMNaCl/300mMNaCl、100mMNaCl/300mMNaCl和300mMNaCl/300mMNaCl)来调整绝缘膜两侧的渗透压差进而调节孔径，实现对分析物的选择性的优化并提高对分析物的区分。现有技术中的蛋白质纳米孔通常具有固定的通道结构，需要额外的蛋白质工程修饰或者化学修饰等才能实现通道结构调整。而本发明涉及的MscS埃米孔的孔径只需改变外界条件即可实现可逆性原位调整，适用于多种类型、尺寸的药物分子的直接检测。具体地，例如氨基糖苷类抗生素和谷氨酸等药物分子都可以引起MscS埃米孔相应的阻塞电流信号，MscS埃米孔能在单分子水平上检测药物分子。
3)MscS埃米孔可以实现对药物分子的定量分析。药物分子的梯度浓度测量在信号频率和药物浓度之间呈现出良好的线性关系，因此MscS埃米孔不仅能够检测药物分子还能够实现对药物分子的浓度的检测(定量分析)。
4)MscS埃米孔具有较强的抗干扰能力。MscS胞质端为类似筛状的结构，底部1个底部开口、侧部7个侧面开口，且各个开口(孔)的通道狭窄，这种结构有利于离子和小分子的通过，却能够将大分子物质(例如蛋白质)阻挡在通道外，因此这些生物大分子无法进入通道并无法对通道造成阻塞。因此，MscS展现出较强的抗干扰能力，并能够对体液样本(例如全血样本)进行直接检测。更具体地，本发明方法还可以与透析装置等装置联用，实现对血药浓度的实时、连续监测。
如本文所使用，术语“源自”不仅是指所讨论的生物菌株产生的蛋白质，还指由分离自此类菌株的DNA序列编码且在含有此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出了PaMscS埃米孔的电生理测定；
图2示出了基于PaMscS2埃米孔的药物单分子生物传感；
图3示出了全血样品的药物浓度测量；
图4示出了通过埃米孔连续监测活体大鼠体内药物浓度的概念验证；
图5示出了PaMscS蛋白的SDS-PAGE结果；
图6示出了PaMscS的总体结构；
图7示出了有硫酸庆大霉素的PaMscS2(V271I)埃米孔的连续电流轨迹；
图8示出了有硫酸新霉素的PaMscS2(V271I)埃米孔的连续电流轨迹；
图9示出了高浓度硫酸庆大霉素和硫酸新霉素可以长时间阻塞PaMscS2(V271I)埃米孔；
图10示出了MspA-2NNN埃米孔可被全血样本(10μL全血样本到加入1mL端)频繁阻塞；
图11示出了血液样本中PaMscS2(V271I)埃米孔的连续电流轨迹；
图12示出了通过PaMscS2(V271I)埃米孔直接测量大鼠全血样本的电流轨迹；
图13示出了从-50mV至-80mV通过PaMscS2(V271I)埃米孔的硫酸庆大霉素的电流信号；
图14示出了从-50mV到-80mV通过PaMscS2(V271I)埃米孔的西索米星的电流信号；
图15示出了不同渗透压差条件下dNTP通过PaMscS3(W130A)孔的转运频率；
图16示出了基于野生型PaMscS埃米孔的dNTP检测；
图17示出了PaMscS1检测谷氨酸的电流轨迹；
图18示出了基于PaMscS埃米孔的氨基酸检测方案和不同氨基酸阻塞电流分布；
图19示出了野生型EcMscS的单个通道嵌入电流轨迹(电压+100mV，电导液30mM:300mMNaCl)；
图20示出了野生型EcMscS的通道扫描电压(-100mV到100mV)；
图21示出了野生型EcMscS的电导分布；
图22示出了PaMscS与其他细菌的MscS的序列比对。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
详细附图说明
图1：A.电生理测量端的示意图。B.PaMscS1(K180R)埃米孔和PaMscS2(V271I)在+50mV电压下的单孔插入，PaMscS1和PaMscS2埃米孔在此条件下都能保持稳定的通道电流。C.PaMscS1和PaMscS2埃米孔在-50mV到+50mV的电压范围下的I-V关系(分别N＝4)。D.PaMscS2埃米孔在+50mV的电压下的电导分布(N＝108)。电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：30mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0。
图2：A.通过PaMscS2(V271I)埃米孔检测硫酸庆大霉素的结果，包括代表性电流轨迹和阻塞信号。B.通过PaMscS2埃米孔检测硫酸新霉素的结果。C.硫酸庆大霉素的定量标准曲线(N＝3)和阻塞信号的热图(右，878个阻塞事件)。D.硫酸新霉素的定量标准曲线(中间，N＝4)和阻塞信号的热图(右，883个阻塞事件)。电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：30mM NaCl，10mMHEPES，pH7.0，药物检测的电压为-50mV。E.比较LC-MS和PaMscS2埃米孔之间对1.5μM硫酸庆大霉素的检测结果。电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，药物的检测电压为-50mV。
图3：A.通过PaMscS2(V271I)埃米孔直接检测全血样品，加入全血样品后PaMscS2埃米孔保持开放。电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为-50mV。B.加入20μL大鼠血液后，-cis端的电导缓冲液变成红色。C.全血样本的通道开放的百分比。D.硫酸庆大霉素的定量标准曲线范围为0至3μM。E.通过PaMscS2埃米孔测量注射庆大霉素后不同时间间隔的大鼠的药物浓度。全血埃米孔检测的电解质条件是-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为-50mV，N≥3。
图4：A.大鼠药物浓度监测系统的装置。B.硫酸庆大霉素的定量标准曲线范围从0到30μM。C.在注射4mg/kg和20mg/kg硫酸庆大霉素的药物浓度监测期间，PaMscS2(V271I)埃米孔的典型电流轨迹。D.以不同剂量的硫酸庆大霉素、通过PaMscS2埃米孔对大鼠的连续药物血液浓度监测结果(N＝1)。灰色数据点表明药物阻塞信号频率高于标准曲线范围内的最高信号频率，双步信号频繁出现并使定量不准确。电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为-50mV。
图5：条带包括：标记物；PaMscS1(K180R)突变体；PaMscS2(V271I)突变体。
图6：MscS家族的序列比对。红色突出显示的残基在4条序列中是相同的。序列上方的圆柱指定为α螺旋和β链。
图7：埃米孔背景的电流轨迹和加入硫酸庆大霉素后的轨迹。电解质条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为-50mV，N＝3。
图8：埃米孔的背景电流轨迹和添加硫酸新霉素后的轨迹。电解质条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为-50mV，N＝3。
图9：在高浓度药物下，药物的阻塞信号难以统计且PaMscS2埃米孔可被长时间阻塞，导致无法定量计算。电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：30mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，药物检测的电压为-50mV。
图10：电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：300mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，电压为+100mV，N＝3。
图11：埃米孔背景的电流轨迹和全血样品加入后的轨迹。
图12：将20μL大鼠全血加入-cis端(1mL)，PaMscS2埃米孔可以在全血样品存在下工作良好。
图13：电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0。值得注意的是，梯度电压中出现了两个峰值。
图14：电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0。西索米星的结构接近硫酸庆大霉素的C1a组分。在梯度电压下，只观察到一个阻塞电流峰值。
图15：在不同的渗透压差的条件下测试了dCTP(以橙色表示)和dGTP(以蓝色表示)的易位频率，对称(A，300mMNaCl：300mMNaCl用于cis端：trans端)，低渗透压差(LOD)(B，300mMNaCl：100mMNaCl用于cis端：trans端)，以及高渗透压差(HOD)(C，300mMNaCl：30mMNaCl用于cis端：trans端)。四组dNTPs浓度，0.5mM、1.0mM、1.5mM和2.0mM，以测试了dCTP和dGTP的易位。D.在对称、低渗透压差和高渗透压差条件下，易位频率与dCTP/dGTP浓度之间的关系(每个数据点n＝3)。E.在3种不同的渗透压差条件下，fdCTP和fdGTP的增加率。
埃米孔
本发明所使用的埃米孔是小电导机械力敏感性通道(Mechanosensitivechannelofsmall conductance,MscS)，优选的是PaMscS(铜绿假单胞菌小电导机械力敏感性通道)或其变体。所述变体(也可以理解为“突变体”)可以是由生物体(例如铜绿假单胞菌)表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。在本发明中，“PaMscS变体”、“突变型PaMscS”、“突变体PaMscS”、“PaMscS突变体”表示相同含义，除非另有说明。
在本发明的一个实施例中，所述埃米孔可以为MscS变体。可以对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如对单个或多个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代。作为优选，可以对SEQ ID NO:1或SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个或多个位置进行非保守取代，其中被取代的氨基酸残基被化学性质和/或物理尺寸明显不同的氨基酸所替换。进一步地，所述MscS变体可分为侧孔体积变体和侧孔电荷变体。侧孔体积变体是指突变位点位于胞质端的侧面开口(也可以理解为“侧孔”)处且通过改变该位点的氨基酸，使得其侧孔体积改变的变体。侧孔电荷变体是指突变位点位于胞质端的侧面开口处且通过改变该位点的氨基酸，使得其侧孔电荷改变的变体。例如，所述侧孔体积变体可以是将较大体积的氨基酸(例如，色氨酸(W))替换成较小体积的氨基酸(例如，丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或脯氨酸(P))，或反之。侧孔电荷变体可以是将带某种电荷的氨基酸替换成带相反电荷或中性的氨基酸，也可以是将中性的氨基酸替换成带电荷的氨基酸。一般来说，带正电荷的氨基酸的非限定性实例包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸；带负电荷的非限定性实例包括天冬氨酸和谷氨酸；中性的非限定性实例包括甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和色氨酸。氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加)等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对MscS进行修饰，以得到相应MscS变体。修饰的手段包括对相应的DNA序列进行修改(例如，修改DNA序列信息后直接合成相应蛋白质或者利用PCR对DNA序列进行定点突变)，进而得到相应变体(及其对应的DNA序列)。
在一个具体实施例中，所述MscS变体可以是PaMscS变体。所述PaMscS变体例如包括130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。PaMscS的侧孔体积突变体例如包括130A、130S、130P，PaMscS的侧孔电荷变体例如包括130H、180R、271I。这样的修饰可以改变被修饰的侧孔的孔径(也可以理解为“孔道尺寸”)，进而提高对特定分子体积的分析物的检测能力；还可以改变被修饰的侧孔通道的局部电荷特性，进而提高对特定带电荷分析物的检测能力；还可以增强所述PaMscS变体的蛋白通道电流的稳定性。
在本发明的一个实施例中，所述埃米孔可以为野生型PaMscS，其虽背景噪声较高，但仍具备检测分析物的能力。
在本发明的一个实施例中，所述埃米孔可以为野生型EcMscS(大肠杆菌小电导机械力敏感性通道)或其变体。EcMscS与PaMscS的结构高度相似，且同样能够形成稳定的通道电流，具备检测分析物的能力。PaMscS与EcMscS的序列相似性为60％。而对氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加)等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对EcMscS进行修饰，以得到相应EcMscS变体。
在本发明另一个实施例中，除大肠杆菌(Escherichiacoli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外，所述埃米孔还可以源自其他杆菌，例如腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)和幽门螺杆菌(Helicobactorpylori)。PaMscS与TtMscS、HpMscS的结构同样高度相似，而序列相似性分别为55％、44％。结合PaMscS与EcMscS的实际电生理检测结果可以看出，MscS能够作为埃米孔检测分析物的原因在于其高度相似的结构和类似的功能。而对氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加)等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对MscS进行修饰，以得到相应MscS变体。
分析物
所述分析物是荷电物质。如果分析物带有净电荷则它是荷电的。所述分析物可以荷负电也可以荷正电。如果分析物带有净负电荷则它是荷负电的。如果分析物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的分析物应为尺寸小于或等于所述埃米孔孔径的物质，优选为核苷酸、氨基酸、肽、药物分子。
在本发明的一个实施例中，所述分析物可以为核苷酸。“核苷酸”是指由杂环碱基、糖和磷酸基团组成的单体单元。应当理解，杂环碱基包括天然存在的碱基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))及非天然存在的碱基类似物。糖包括天然存在的糖(脱氧核糖和核糖)及非天然存在的糖类似物。所述核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，例如ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP、GMP、UMP、TMP、CMP、dGMP、dAMP、dTMP、dCMP、dUMP、ADP、GDP、TDP、UDP、CDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCDP。所述核苷酸包括天然存在的核苷酸和以天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的非天然存在的核苷酸类似物。所述核苷酸为游离的(或者，可以理解为“单个”)。作为优选，核苷酸为ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP。
在本发明的一个实施例中，所述分析物可以为氨基酸。“氨基酸”是指蛋白质中发现的20种天然存在的氨基酸中的任何氨基酸、天然存在的氨基酸的D-立体异构体(例如，D-苏氨酸)、非天然氨基酸以及化学修饰的氨基酸。这些氨基酸类型中的每一种类型不是相互排斥的。下列缩写用于20种天然存在的氨基酸：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。氨基酸的具体性质(例如，极性、带电荷、亲水性、平均体积)对本领域技术人员是已知的。在本发明另一个实施例中，所述分析物可以为短肽，例如二肽。
在本发明的一个实施例中，所述分析物可以为药物分子。药物分子可以是一种化合物。更具体地，“药物分子”可以是具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如，低于800、700、600、500、400、300或200g/mol)。作为优选，药物分子可以是氨基糖苷类抗生素。在本发明的另一个实施例中，药物分子包括氨基酸及其盐(包括不能成药的氨基酸)和肽。
埃米孔系统
“埃米孔系统”包括具有埃米级尺寸的孔(简称为“埃米孔”)、绝缘膜、第一介质和第二介质。在本发明的一个实施例中，所述具有埃米级尺寸的孔为小电导机械力敏感性通道(MscS)埃米孔。所述具有埃米级尺寸的孔优选为具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口。在本发明的一个实施例中，所述具有埃米级尺寸的孔具有一个径向对称且形状似圆柱体的典型七聚体结构，所述七聚体结构包含8个开口，其中7个相等的开口分布在侧面，第8个开口分布于底部且由7个亚基形成；上述8个开口孔径大小均可调节。所述具有埃米级尺寸的孔允许所述分析物从所述绝缘膜的一侧易位到另一侧。
在本发明的一个实施例中，所述具有埃米级尺寸的孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜(也可以理解为，所述埃米级尺寸的孔和所述绝缘膜的复合体)将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述具有埃米级尺寸的孔的孔道提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道；向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力后，位于所述第一介质的分析物与所述MscS埃米孔相互作用以形成电流(即电信号)。在本发明中，“第一介质”是指所述分析物被加入所述埃米孔系统时位于的介质；“第二介质”则是指被所述绝缘膜分隔开的两部分介质中，“第一介质”的另一侧。在本发明中，驱动力是指通过电势、电渗流、浓度梯度等方式驱动分析物与所述埃米孔相互作用的力。
所述第一介质和所述第二介质可以相同或不同，并且所述第一介质和所述第二介质可以包括电导液。所述电导液为碱金属卤化物水溶液，具体为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaCl)。在本发明一个实施例中，所述第一介质和所述第二介质含有的电导液的浓度是不同的，换句话说，所述第一介质和所述第二介质中电导液的浓度存在差值，进而使得所述绝缘膜两侧的渗透压存在差值。所述第一介质和/或所述第二介质还可以包括缓冲液，例如HEPES。所述第一介质和/或所述第二介质的浓度范围可以是30mM-3M。
绝缘膜是指具有搭载埃米孔(或纳米孔)并阻塞非埃米孔(或纳米孔)通过的离子电流的能力的膜。所述绝缘膜可以包括磷脂膜和/或高分子膜。示例性磷脂膜包括DPHPC、DOPC、E.colilipid，示例性高分子膜包括三嵌段共聚物高分子膜。
本埃米孔系统可包含本文所描述的任何小电导机械力敏感性通道，例如野生型PaMscS(SEQ ID NO:1)、野生型EcMscS(SEQ ID NO:2)、野生型TtMscS(SEQ ID NO:3)和野生型HpMscS(SEQ ID NO:4)及其相应变体，上述四种MscS的具体序列信息如表1所示。例如，所述小电导机械力敏感性通道可以为突变体PaMscS1(K180R)、突变体PaMscS2(V271I)、突变体PaMscS3(W130A)。
在本发明的一个具体实施例中，所述埃米孔系统包括两个电解液室，其被绝缘膜分隔开而形成反式(-trans)隔室和顺式(-cis)隔室，所述埃米孔的孔嵌入绝缘膜中，绝缘膜上只有小电导机械力敏感性通道埃米孔来连通上述两个电解液室。当向上述两个电解液室施加电势时，电解液室中溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过所述埃米孔。
在本发明的一个实施例中，所述小电导机械力敏感性通道(MscS)埃米孔可以被嵌入绝缘膜中，但其保留了响应绝缘膜受到的机械力刺激和绝缘膜的物理状态变化而改变蛋白质结构的能力。具体地，机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的渗透压变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激、气压负压对所述绝缘膜的刺激等。绝缘膜的物理变化包括所述绝缘膜的厚度变化、所述绝缘膜的组成成分变化、所述绝缘膜的表面曲率变化。所述改变蛋白质结构包括改变MscS的开口的电荷性质和/或孔径大小。进一步地，可利用MscS埃米孔改变的开口的电荷性质和/或孔径大小来检测不同的分析物。本发明所涉及的埃米孔的孔径的可调节范围可以是5–15埃米。
所述埃米孔和分析物之间的相互作用
所述分析物可与所述埃米孔在所述绝缘膜两侧的任一侧接触。所述分析物可以与所述绝缘膜两侧中的任一侧相接触，使得所述分析物穿过所述埃米孔的通道以到达所述绝缘膜的另一侧。在这种情况下，所述分析物在其经由所述孔的通道穿过所述绝缘膜时，与所述埃米孔相互作用。或者，所述分析物可与所述绝缘膜的侧面接触，所述绝缘膜的侧面可使所述分析物与所述埃米孔相互作用，使其与所述埃米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。所述分析物可以以任何方式并在任何位点与所述埃米孔相互作用。所述分析物还可以撞击到所述埃米孔，与所述埃米孔相互作用，使其与所述埃米孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。
在所述分析物与所述埃米孔相互作用的过程中，所述分析物会以该分析物特异性的方式影响流过所述埃米孔的电流，即流经所述埃米孔的电流对特定分析物是特征性的。可进行对照实验以测定特定分析物对流过所述埃米孔的电流的效应，然后以鉴定样本中的特定分析物或测定样本中是否存在特定分析物。更具体地，可以根据通过检测分析物所获得的电流模式与在相同的条件下使用已知的分析物获得的已知的电流模式进行比较，以鉴定分析物的存在与否或浓度等。
本发明的埃米孔系统还可以包括一个或多个测量流过所述埃米孔的电流的测量装置，例如膜片钳放大器或数据采集设备。
样本
所述分析物可存在于任何合适的样本中。本发明通常在已知含有或怀疑含有所述分析物的样本上进行。本发明可以在含有一种或多种种类未知的分析物的样本上进行。或者，本发明可以确认所述一种或多种已知存在或预计存在于所述样本中的分析物的种类。
所述样本可以是生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。本发明还可以在获自或提取自任何病毒的样本上在体外进行。优选地，所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本，例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类，也可以源自其他哺乳动物。所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本，例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。
所述样本在分析之前可以不经过处理，例如直接在全血中检测所述分析物。所述样本在分析之前也可以经过处理，例如通过离心、过滤、稀释、沉淀或其他本领域已知的物理手段或化学手段。
在本发明的一个实施例中，所述样本为全血样本。
检测样本中的药物分子的方法
本发明还提供一种检测样本中的药物分子的方法，所述方法包括：S1将所述样本加入埃米孔系统，所述埃米孔系统包括：埃米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述埃米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述埃米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述埃米孔为MscS埃米孔，所述埃米孔具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口；所述样本被加入到所述第一介质；S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的药物分子与所述埃米孔相互作用并产生电信号；S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的药物分子。
在本发明的一个实施例中，所述样本为体液样本。所述体液样本可以是尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本在分析之前可以不经过处理，例如直接在全血(血液)中检测所述分析物。当然，所述样本在分析之前也可以经过处理，例如通过离心、过滤、稀释、沉淀或其他本领域已知的物理手段或化学手段。本发明所指的样本包括不经过处理的样本和经过处理的样本。
在本发明的一个实施例中，所述药物分子的可检测范围可以是大于10nM(也可以理解为检测下限为10nM)。作为优选，所述药物分子的可检测范围可以是10nM～1mM。如果药物分子的浓度远大于10nM(例如10mM)，可以将其浓度稀释至10nM～1mM。
在本发明的一个实施例中，所述药物分子是一种化合物。更具体地，“药物分子”可以是具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如，低于800、700、600、500、400、300或200g/mol)。作为优选，药物分子可以是氨基糖苷类抗生素。在本发明的另一个实施例中，药物分子包括氨基酸及其盐(包括不能成药的氨基酸)和肽。
在本发明的一个实施例中，本发明检测体液样本中的药物分子，其中药物分子的检测限为10nM。换句话说，体液样本中的所述药物分子的可检测范围可以是大于10nM。
在本发明的一个实施例中，本发明检测全血样本(也可以理解为“血液样本”)中的药物分子。将所述全血样本加入本发明提供的埃米孔系统后，所述全血样本中的细胞(例如，红细胞、白细胞、血小板)和大分子物质(例如蛋白质)无法穿过埃米孔，也就是说，所述全血样本中的细胞和大分子物质不会使本发明提供的埃米孔堵塞。而存在于所述全血样本中的药物分子能够穿过所述埃米孔并产生特异性电流，本发明提供的埃米孔可以灵敏地识别较低浓度的所述药物分子，进而判断全血样本中所述药物分子的存在及浓度。
在本发明的一个实施例中，本发明提供的方法可以用于对受试者体内的药物分子的血药浓度的连续监测。
在本发明的一个实施例中，采用PaMscS1(K180R)和PaMscS2(V271I)埃米孔来检测全血样本中的药物分子，但其他MscS及其相应变体也包含在本发明的保护范围之中，依据是上述变体均有对药物分子进行传感检测的能力。
实施例一
材料与方法
化学品：氯化钠(NaCl，>99.0％，CAS#7647-14-5)，酵母提取物(CAS#8013-01-2)，胰蛋白酶(CAS#73049-73-7)，氨苄青霉素钠盐(≥98.5％，CAS#69-52-3)，Tris(≥99.9％，CAS#77-86-1)，咪唑(≥99％，CAS#288-32-4)，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)(≥99％，CAS#69227-93-6)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(≥99％，CAS#367-93-1)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(≥99.％，CAS#329-98-6)，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES，>99.5％，CAS#7365-45-9)购自Sigma-Aldrich。大肠杆菌极性脂质提取物(100600P)购自Avanti。
突变体PaMscS的表达和纯化：
使用基因特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增出PaMscS的基因。使用ClonExpressIIOneStepCloningKit(Vazyme)将基因插入质粒中。将含有包含PaMscS基因的质粒的的大肠杆菌BL21(DE3)细胞培养于37℃、50μg/mL氨苄青霉素存在的Luria-Bertani(LB)培养基中并纯化表达。通过SDS-PAGE分析确定峰值。特别说明，本发明中野生型和突变型蛋白的纯化表达步骤一致，只是由于野生型蛋白与突变型蛋白存在序列差异，因此在质粒合成阶段有差异。
通过LC-MS的药物测量：
LC-MS和LC-MS/MS分析是在岛津超快速液相色谱系统(UFLC，岛津)和ABSCIEXQtrap5500质谱仪上进行的，配备了Turbo喷雾离子源(TurboSprayionsource)。色谱和质谱数据的收集和分析由Analyst1.6.2软件(ABSCIEX,USA)完成。
色谱分离是在WatersACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×100mmI.D.，1.7μm)上进行的。流动相由水(A)和乙腈(B)组成，梯度洗脱如下：0-1.0分钟，10-90％B；1-2.0分钟，90％B。流速为0.5mL/min。柱温和自动进样器的温度分别保持在35℃和15℃。注射量为1μL。
在MS/MS分析中，采用正电离模式用于样品检测，采用以下的优化质谱参数：离子喷雾电压，5500V；去簇电压，100V；温度，500℃。选择MRM(多反应监测)模式定量来硫酸庆大霉素和IS(内标)，离子对分别为450.2-160.1、464.2-160.1、478.2-157.1和265.2-232.2。
从连接到活体大鼠血管的透析装置中连续监测硫酸庆大霉素：
雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)由成都达硕实验动物有限公司提供，本发明中的所有动物实验都得到了四川大学华西医院伦理委员会的批准(批准号2021885A)。
大鼠(n＝1)用2％戊巴比妥麻醉，且左股静脉被分离并插入导管以提供一个静脉注射口。接下来，通过该导管注入最初的0.4mL肝素溶液(250U/mL)，然后每40分钟周期注射0.1mL以防止监测期间血块的形成。然后分离左股动脉，插入导管，并立即通过预先设计的带透析膜的管连接到设备。设备中的空气被血流排出后，管与静脉导管相连，形成一个稳定的循环。对于连续监测，首先记录没有目标药物时的基线信号，然后通过静脉导管以缓慢的速度注入特定浓度的硫酸庆大霉素。对于血液浓度的间隔测量，建立一个类似的循环，既无设备也无透析膜。从动脉导管收集0、15、30、45和60分钟的血液样本，并用PaMscS2(V271I)埃米孔测量药物浓度。每次实验结束后，大鼠用颈椎脱臼处死。
全血检测：
采集大鼠血液10微升，加入到融合有埃米孔的样品槽中(-cis端)，施加偏置电压，记录加样一定时间内的信号频率，随后将该信号频率减去空白血液对照频率，根据所检测分子的标准曲线，计算获得该分子对应的浓度。
实施例二
包含埃米孔的检测系统
本实施例提供一种包含本发明埃米孔的检测系统
系统包括两个电解液室，其被绝缘膜分隔开而形成顺式(-cis)和反式(-trans)隔室，膜上只有一个小电导机械力敏感性通道埃米孔连通两腔室，埃米孔的孔嵌入绝缘膜中，当向电解液室施加电压时，溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过该埃米孔。所述绝缘膜包括磷脂膜、DPHPC、DOPC、E.colilipid和/或三嵌段共聚物高分子膜。
实施例三
PaMscS埃米孔的结构
本实施例中详细描述了两个PaMscS突变体，包括PaMscS1(K180R)和PaMscS2(V271I)(图5)。研究人员解析了PaMscS1的结构。通过建模显示，该埃米孔的功能性通道形成了一个经典的同源七聚体，其是径向对称、类似于圆柱体。它包含8个开口，7个在侧面，1个在底部。拓扑学地，PaMscS可以分为两部分，一个跨膜区和一个大的胞质部分。每个单体贡献了3个N端跨膜螺旋，包括TM1(残基17至52)、TM2(残基58至83)和TM3(残基90至22)。并且C端胞质区可分为中间β结构域和COOH端结构域。每个亚单位中的TM1和TM2以反平行方向排列在一起，TM1穿过通道外侧的双分子层且TM2形成中心层，从而它们形成了围绕通道轴线的渗透通路。TM3螺旋可被描述为2个螺旋段，TM3a和TM3b，在Gly108处有一个明显的扭结～53°，这是一个同源上的保守残基。TM3a像TM1一样以不同的偏转穿过层，而TM3b回到细胞质，与胞质区相互作用。此外，所述7个亚基形成了一个半径为的中心孔，其传感张力并与构象变化相联系。在胞质区，中间的β结构域(残基123至172)包含5条β链，与不同亚单位的其他链组装在一起。而C端结构域(残基177至273)形成了5条β链和2个α螺旋，其是一个混合的结构。在这两个相邻单体的结构域之间，有7个清晰可见的相等的开口，半径大约是这被提出是EcMscS中离子渗透的原因。除了这些入口，第8个开口存在于蛋白质的底部，它由7条β链组成，最窄的半径为/>在所有的尺寸中，延伸了/>的PaMscS1平行于七倍轴，在垂直方向上宽度延伸了/>PaMscS的结构与关闭状态下的EcMscS相似(PDB:2OAU)，TM结构域超过101个Cα原子有/>的rmsd，但在开放状态下(PDB:2VV5)，位于TM结构域的差异较大，有/>的rmsd。这些结果表明，结构中PaMscS的构象反映了关闭状态。PaMscS突变体埃米孔的独特和精致的结构也表现出用于检测的巨大潜力。
实施例四
PaMscS埃米孔的电生理检测：
PaMscS埃米孔的单通道电生理研究是在平面脂质双层膜结构中进行的(图1A)。PaMscS1(K180R)埃米孔和PaMscS2(V271I)埃米孔在+50mV的电压下可以形成稳定的通道电流，分别为34.9±7.0pA(平均值±SD，来自18个独立的插入事件)和37.6±3.8pA(平均值±SD，来自108个独立的插入事件)(图1B，电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：30mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0)。从-50mV到+50mV的IV曲线表明在此电压范围内PaMscS1和PaMscS2没有电压门控(图1C)，由于PaMscS2埃米孔在脂质双层膜融合中的高效率，因此被选择用于进一步检测。根据电导分布，PaMscS2埃米孔在+50mV下的峰值电导率为0.78nS(图1D)。
基于PaMscS埃米孔的药物单分子生物传感：
根据PaMscS埃米孔的通道结构特征分析，选择小分子药物(摩尔质量小于1000g/mol)用于检测。以硫酸庆大霉素(gentamicinsulphate；分子量MW:561.65)和硫酸新霉素(neomycin sulphate；分子量MW:712.72)为例进行定量测定，由于上述两种药物在临床上的大规模使用，因此迫切需要便利的TDM。硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的检测实验是在300mMNaCl(-cis端)和30mMNaCl(-trans端)、10mMHEPES、pH7.0的电解质条件下进行，药物检测的电压为-50mV。药物加入检测系统后出现了明显的阻塞电流信号(图2A、2B，图7、图8)。硫酸庆大霉素的标准曲线显示线性检测范围为10nM至10μM(N＝3)，典型的硫酸庆大霉素信号的2D密度图显示峰值阻塞电流为11.57±0.02pA，峰值停留时间为1.33±0.02ms(图2C，高斯拟合的峰值，878次阻塞事件)。硫酸新霉素的标准曲线显示线性检测范围为100nM至100μM(N＝3)，典型硫酸新霉素信号的2D密度图显示峰值阻塞电流为9.44±0.02pA，峰值停留时间为1.06±0.01ms(图2D，高斯拟合的峰值，883次阻塞事件)。更高的药物浓度可能导致通道的严重阻塞，并且使药物浓度计算变得困难，因此该系统更适合检测微量浓度的药物分子(硫酸庆大霉素：10nM至10μM；硫酸新霉素：100nM至100μM)(图9A-B)。
除硫酸庆大霉素和硫酸新霉素之外，PaMscS埃米孔还可以单分子传感其他药物，例如西索米星(MW:447.53)、焦磷酸(MW:177.975)。
为了评估PaMscS2埃米孔检测药物的精确度，使用LC-MS来测量硫酸庆大霉素的浓度。对于1.5μM的硫酸庆大霉素样品，PaMscS2埃米孔和LC-MS呈现出相似的检测结果，表明PaMscS2埃米孔的检测具有良好的精确度(图2E)。
全血样本的药物浓度测量：
血液是TDM的主要介质，但全血成分复杂，会对埃米孔检测造成严重干扰，即，全血检测中的阻塞是指埃米孔被检测分子以外的物质阻塞并影响靶标分子检测效果。常用的埃米孔MspA-2NN在-cis端中加入10μL全血样本后被阻塞(-cis端和-trans端的体积为1mL)，300s内+100mV下开放通道的概率仅为5％±4.7％(图10，电解质条件为-cis端：300mMNaCl，-trans端：300mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，N＝3)。相比之下，PaMscS2埃米孔即使在-cis端中加入20μL全血，也可以保持通道的开放，在300s内、+100mV下开放通道的概率为99％±1％(图3A、3B、3C，电解质条件为-cis端：130mMNaCl，-trans端：130mMNaCl，10mMHEPES，pH7.0，N＝3)。考虑到PaMscS2埃米孔的稳定检测能力，在对大鼠注射4mg/mL硫酸庆大霉素后的不同时间间隔(0分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟，图11、图12)，直接测量大鼠的硫酸庆大霉素血药浓度。硫酸庆大霉素标准曲线范围从0到3μM，用于计算药物浓度(图3D，N≥3)。在5个监测点中，15分钟的药物浓度最高，60分钟的浓度降低到注射前水平(0分钟)(图3E，N≥3)。PaMscS2埃米孔测得的药物浓度趋势符合药物代谢动力学规律，表明PaMscS埃米孔可以准确测量活体大鼠体内药物浓度的变化。此外，硫酸庆大霉素的阻塞电流分布显示，在130mMNaCl的缓冲液中，在较高的负电压下出现两个峰值(图13)，这是由于庆大霉素药物是多个组分药物的混合物，其组分具有不同的分子结构，因此，多个阻塞电流峰值可能与其组分有关。而单组分的西索米星(sisomicin)在相同条件下则只显示一个阻塞电流峰值(图14)。连接到活体大鼠血管的透析装置对药物的连续监测：
由于不同的病人，特别是危重病人体内的药物代谢率有很大的差异，用间隔的TDM技术很难满足精准医疗的需要。因此，对药物浓度的连续监测是非常必要的。为了实现对活体动物药物浓度的长时间监测，实验人员引入了透析膜以避免血液消耗。在TDM过程中，少量的血液通过导管流向透析装置，然后再流回体内。血液中的药物分子可以通过透析装置渗透到-cis端的导电液体中，而血液基本上没有消耗(图4A)。硫酸庆大霉素的标准曲线范围从0到30μM，用于连续监测的药物浓度计算(图4B)。在活体大鼠的可行性验证实验中，基于简单的透析装置，可以连续观察到硫酸庆大霉素的明显信号，直至注射后3小时(图4C)。对大鼠的不同剂量的硫酸庆大霉素，包括4mg/kg和20mg/kg，可以通过埃米孔监测装置区分(图4D)。这些结果表明，该系统可以连续监测活体动物的药物浓度，损失极少。
PaMscS3(W130A)埃米孔的dNTPs检测：
考虑到PaMscS3(W130A)埃米孔的机械力敏感性，实验人员通过应用不同的渗透压差来调节PaMscS3埃米孔的选择性。为了在不同的渗透压差下保持dCTP和dGTP的恒定电荷特性，实验人员将-cis端的电导缓冲液浓度保持在300mM并改变-trans端的电导液浓度来改变渗透压差。在3种渗透压差条件下测试了PaMscS3埃米孔对大分子dGTP和小分子dCTP的检测能力，包括对称(symmetric)条件(图15A，300mMNaCl/300mMNaCl，+50mV偏置电压)，低渗透压差条件(图15B，100mMNaCl/300mMNaCl，+50mV偏置电压)和高渗透压差条件(图15C，30mMNaCl/300mMNaCl，+50mV偏置电压)。在对称渗透压条件下，dCTP的易位频率从0.16±0.03s-1增加到0.22±0.07s-1，而dGTP从0.09±0.02s-1变化到0.07±0.003s-1。在低渗透压差(LOD)条件下，dCTP的易位频率从0.34±0.1s-1增加到0.67±0.14s-1，而dGTP从0.06±0.01s-1增加到0.3±0.04s-1。在高渗透压差(HOD)条件下，dCTP的易位频率从0.12±0.04s-1增加到0.22±0.07s-1，而dGTP从0.37±0.08s-1增加到1.12±0.12s-1(图15D，每个实验n＝3，平均值±S.E.M)。图15E总结了dGTP和dCTP的检测，并且它总结为低渗透压差条件显示dCTP的最高的易位事件增加，而高渗透压差条件显示最高的dGTP的易位事件增加(图15E)。与高渗透压条件的dCTP的降低的捕获效率相比，低渗透压差条件显示对dCTP和dGTP二者的平衡的捕获能力。鉴于dGTP和dCTP的大小和电荷特性在给定的实验条件下保持恒定，且MscS家族的通道大小在不同的压力、渗透压条件或膜电位下可以变化，实验人员可以得出结论：PaMscS3(W130A)埃米孔对dNTPs的选择性差异是由不同渗透压差条件下的通道大小的变化引起的。野生型PaMscS埃米孔对于四种dNTPs混合物阻塞率呈现2个峰(图16)。
实施例五
基于PaMscS埃米孔的氨基酸检测
本实施例以PaMscS3(W130A)为例进行氨基酸的检测。谷氨酸(10mM)的检测实验是在300mMNaCl(-cis端)和30mMNaCl(-trans端)、10mMHEPES、pH7.0的电解质条件下进行的，药物检测的电压为-50mV。谷氨酸的电流轨迹如图17所示。
除单个氨基酸外，本发明涉及的埃米孔还可以检测短肽(例如，二肽)。如图18左图所示，将待测氨基酸与天冬氨酸载体脱水缩合，形成二肽，在300mMNaCl(-cis端)和30mMNaCl(-trans端)、10mMHEPES、pH7.0的电解质条件下检测形成的二肽，并将其产生的电流信号与已测的氨基酸的特定电流信号比较，以判断待测氨基酸的种类。
实施例六
基于EcMscS埃米孔的电生理检测
当野生型EcMscS通道嵌入双层脂质膜(BLM)时，在+100mV的电压下可以观察到稳定的通道电流跳跃(图19)。在范围从-100mV至+100mV的电压下，野生型EcMscS通道电流保持稳定(图20)。野生型EcMscS埃米孔的电导为0.334±0.028nS(-cis端：300mMNaCl，-trans端：30mMNaCl)(图21)。图22a-c分别显示了EcMscS、TtMscS和HpMscS的结构，其与PaMscS的结构高度相似，即都为径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构。此外，图22a-c和图6进一步比较了PaMscS与EcMscS、TtMscS、HpMscS的序列(序列信息见下表1)，结果表明EcMscS、TtMscS、HpMscS与PaMscS具有一定的同源性，但这种同源性并非高度同源。EcMscS和PaMscS的相似性仅为60％，但其二者都有检测分析物的能力。因此，本领域技术人员可以理解，决定细菌的MscS能够作为埃米孔检测分析物的关键在于其径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构和通道孔径，并非仅仅在于同源性。
表1：四种MscS的氨基酸序列信息
总结
本发明提供了一种基于突变型PaMscS埃米孔(一种源自铜绿假单胞菌的超窄通道)的治疗药物监测方法。突变型PaMscS埃米孔表现出稳健性且在复杂的生物学条件下(如全血)保持敏感。用该埃米孔检测大鼠血液样本，证明了其测量药物浓度的能力。概念验证研究证明了从连接到活体大鼠血管的透析装置中连续监测药物。
经证实，该突变型PaMscS埃米孔还在小分子直接检测中发挥独特的作用。验证了PaMscS埃米孔用于TDM的可行性。包含该埃米孔的孔膜系统可以直接检测药物，无需修饰、适配体或抗体，有潜力在科学研究和临床治疗中实现低成本且方便的TDM。
本发明的研究还表明，PaMscS埃米孔在施加偏置电压时产生稳定的通道电流，并能以纳摩尔的灵敏度直接测量全血中的药物浓度。在活体大鼠上的实验表明，所述系统有潜力对活体动物的药物浓度进行连续监测。这种基于埃米孔的TDM系统适用于微采样、高通量和面向POCT的便携式血液药物监测设备和用于病人和实验动物的长期治疗药物监测的发展。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
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Claims (10)

1.一种检测样本中的药物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将所述样本加入埃米孔系统，所述埃米孔系统包括：埃米孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述埃米孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述埃米孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述埃米孔为MscS埃米孔，所述埃米孔具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口；所述样本被加入到所述第一介质；
S2向所述第一介质和所述第二介质施加驱动力，所述样本中的药物分子与所述埃米孔相互作用并产生电信号；
S3分析所述电信号，进而识别所述样本中的药物分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的；所述开口的调节方式可选地包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化，所述机械力刺激可选地包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔为MscS变体埃米孔，所述MscS变体可选地包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔源自杆菌，可选地包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃米孔为PaMscS变体埃米孔，可选地包括以下变体的一种或多种：130A、130H、180R、271I、130S和130P。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物分子的分子量为小于1000g/mol，可选地为177.98～712.72g/mol；所述药物分子的浓度可选地为大于10nM。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为体液样本，所述体液样本可选地包括尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰中的一种或多种。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述体液样本的样本量可选地为大于10μL；所述体液样本中的药物分子的浓度可选地为大于10nM。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括S4：将透析装置通过导管与所述第一介质连通，使得所述血液样本通过所述透析装置进入所述埃米孔系统，其中S4先于S1。
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