CN115927738A - 一种检测样本中目标核酸的存在的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种检测样本中目标核酸的存在的方法，其包括如下步骤：S1将样本置于核酸扩增体系并进行核酸扩增，确定所述核酸扩增体系中底物核苷酸的数量，获得所述样本的核酸扩增产物；S2将所述样本的核酸扩增产物加入单通道电生理检测系统，所述单通道电生理检测系统包括：跨膜孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，所述样本的核酸扩增产物被加入到所述第一介质；S3向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力，所述样本的核酸扩增产物中剩余核苷酸穿过所述跨膜孔并产生电信号；S4对所述电信号进行量化，获得所述剩余核苷酸的数量；S5将所述剩余核苷酸的数量与所述底物核苷酸的数量进行对比，确定所述样本中所述目标核酸是否存在。本发明还提供了一种病毒快速检测试剂盒。

Description

一种检测样本中目标核酸的存在的方法
本申请要求2021年08月30日提交的中国发明专利申请【CN2021110062606】、名称为“基于PaMscS的用于dNTPs和新冠病毒检测的生物纳米孔系统”的优先权，以及，2021年08月30日提交的中国发明专利申请【CN2021110042496】、名称为“基于PaMscS的用于小分子药物检测和全血检测的生物纳米孔系统”的优先权，两个优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种检测样本中目标核酸的存在的方法。
背景技术
作为传感器的跨膜孔(例如纳米孔)已经在核酸检测领域展现出巨大的潜力。当分子通过纳米孔内部的通道时，特定的阻塞电流和易位事件产生。根据分子的阻塞电流和易位频率，可以实现对目标分子的定性和/或定量分析。一些具有合适通道孔径的蛋白质纳米孔已被用于纳米生物技术的应用，如α-溶血素(α-HL)、MspA、CsgG、气单胞菌溶素(Aerolysin)、 phi29连接器等。这些蛋白质纳米孔主要来自细菌孔蛋白或病毒门，并且有大约为单链DNA (ssDNA)或双链DNA(dsDNA)大小的孔径(1.0nm-3.6nm)。因此，它们适用于检测核酸，并已被用于DNA/RNA测序、核酸生物标记物检测和生物分子相互作用研究。
然而，目前的基于纳米孔的检测思路是使单个多核苷酸(DNA/RNA)通过孔并直接鉴定核苷酸。因此，往往需要多核苷酸结合蛋白(例如解旋酶、聚合酶)来作为多核苷酸通过纳米孔的分子制动器。例如，CN106459159B公开了一种使用纳米孔表征目标多核苷酸的方法。该方法需要辅助的“分子制动器”的参与，即需要使多核苷酸与构建的纳米孔和多核苷酸结合蛋白接触，以使得多核苷酸移动穿过纳米孔且这种移动受多核苷酸结合蛋白的控制。 CN110168104A公开了一种使用纳米孔表征分析物的方法。该方法不仅需要多核苷酸结合蛋白的参与，还需要对纳米孔进行标签修饰以及可以附接于双链多核苷酸的衔接子来提高互补链的过孔概率。上述方法的测序体系复杂，成本昂贵，且无法满足临床等应用场景中对核酸检测技术快速、便捷的需要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测样本中目标核酸的存在的方法，具体技术方案如下。
一种检测样本中目标核酸的存在的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将样本置于核酸扩增体系并进行核酸扩增，确定所述核酸扩增体系中底物核苷酸的数量，获得所述样本的核酸扩增产物；
S2将所述样本的核酸扩增产物加入单通道电生理检测系统，所述单通道电生理检测系统包括：跨膜孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述跨膜孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述跨膜孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述样本的核酸扩增产物被加入到所述第一介质；
S3向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力，所述样本的核酸扩增产物中剩余核苷酸与所述跨膜孔相互作用并产生电信号；
S4对所述电信号进行量化，获得所述剩余核苷酸的数量；
S5将所述剩余核苷酸的数量与所述底物核苷酸的数量进行对比，确定所述样本中所述目标核酸是否存在。
进一步地，所述跨膜孔为MscS变体埃米孔。
进一步地，所述MscS变体包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
进一步地，所述MscS变体埃米孔的开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的。
进一步地，所述开口的调节方式包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化。
进一步地，所述机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
进一步地，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的。
进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差为大约0-270mM。
进一步地，所述第一介质和/或所述第二介质包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
进一步地，所述MscS变体埃米孔源自杆菌。
进一步地，所述MscS变体埃米孔包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述MscS变体埃米孔为PaMscS变体埃米孔。
进一步地，所述PaMscS变体埃米孔包括130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。
进一步地，通过聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增技术、转录介导的扩增技术、环介导等温扩增技术中的一种或多种进行所述核酸扩增。
进一步地，所述核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。
进一步地，所述核苷酸包括dGTP、dATP、dTTP、dCTP、dUTP、GTP、ATP、TTP、CTP、 UTP中的一种或多种。
进一步地，所述核酸扩增体系进一步包括：
(1)探针，所述探针包括互补区和重复区，所述互补区包括与所述目标核酸互补配对的序列，所述重复区包括重复同一个碱基的寡核苷酸序列，所述碱基包括A、T、C、G、U；或者
(2)所述目标核酸的特异性引物。
进一步地，所述目标核酸为冠状病毒核酸。
进一步地，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV中的一种或多种。
进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
另一方面，本发明还提供一种病毒快速检测试剂盒，包括：
(1)MscS埃米孔；
(2)绝缘膜；
(3)电导液；
(4)所述病毒的核酸的特异性引物或探针。
进一步地，所述MscS埃米孔包括MscS的侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
进一步地，所述电导液包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
进一步地，所述埃米孔为PaMscS变体埃米孔。
进一步地，所述埃米孔包括130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种利用单通道电生理检测系统检测样本中目标核酸的存在的方法。
1)本发明提供的方法可以快速检测样本中目标核酸的存在。传统的核酸检测方法通常需要对目标核酸进行荧光标记或染色，因此，其依赖昂贵的荧光监测设备或染色体系。目前基于纳米孔的核酸检测方法，往往需要辅助性的多核苷酸结合蛋白(例如解旋酶、聚合酶)等复杂的体系。本发明提供的方法利用跨膜孔，仅需检测体外核酸扩增体系(例如底物dNTPs、聚合酶、反转录酶)中底物dNTPs的消耗，进而判断核酸扩增体系里是否存在目标核酸，具有快速、成本低、易于高通量检测、特异性和敏感性较佳的优势。本发明涉及的跨膜孔能够检测(或区分)不同核苷酸，且不受核酸扩增体系中的其他物质(例如，扩增出的核酸、酶) 的干扰。
2)作为优选，本发明的跨膜孔为MscS(小电导机械力敏感性通道)埃米孔，其孔径狭窄、孔径可调(也可以理解为结构灵活)。据估计，MscS埃米孔的孔径范围为～6-16埃米，远小于现有技术中常用的纳米孔(例如，α-溶血素纳米孔的孔径约为1.4-2.4nm，即14–24埃米)。MscS埃米孔可在毫秒内将机械刺激转化为电信号或生化信号，从而引发通道构型的调节。利用MscS埃米孔对绝缘膜所受到的机械力刺激和/或绝缘膜的物理状态变化的敏感性，可以通过影响绝缘膜来实现对MscS埃米孔孔径的调整，无需繁复的化学修饰。例如，可以调整第一介质和第二介质的浓度(即30mM NaCl/300mM NaCl、100mM NaCl/300mM NaCl和300mM NaCl/300mM NaCl)来调整绝缘膜两侧的渗透压差进而调节孔径，实现优化对dNTPs的选择性并提高对dNTPs的区分。现有技术中的蛋白质纳米孔通常具有固定的通道结构，对核苷酸(例如，dNTP等类似分子)的直接检测通常需要额外的蛋白质工程修饰或者化学修饰引入。而本发明涉及的MscS埃米孔的孔径只需改变外界条件即可实现可逆性原位调整，适用于对核苷酸直接地单分子传感识别(也可以理解为对核苷酸的直接检测)。
如本文所使用，术语“源自”不仅是指所讨论的生物菌株产生的蛋白质，还指由分离自此类菌株的DNA序列编码且在含有此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出了基于PaMscS埃米孔的电生理测试；
图2示出了基于通过PaMscS2实时监测dNTPs消耗的SARS-CoV-2核酸检测；
图3示出了PaMscS蛋白(包括：1：野生型PaMscS；2：W130A突变体；3：K180R突变体；4：标记物)的SDS-PAGE结果；
图4示出了PaMscS埃米孔的电信号信息；
图5示出了在0mV到+100mV的斜坡电压下，通过单个PaMscS1埃米孔的电流轨迹；
图6示出了不同离子通过PaMscS1孔中的转运能力(缓冲条件为：-cis侧300mMNaCl， -trans侧30mM NaCl，每个数据点n≥3，平均值±SD)；
图7示出了不同电压下dNTPs通过PaMscS1埃米孔的易位频率统计(n＝3)；
图8示出了单链DNA不能通过PaMscS1孔易位；
图9示出了通过环介导等温扩增(LAMP)的SARS-CoV-2orf1ab基因的埃米孔检测结果；
图10示出了不同渗透压差条件下dNTP通过PaMscS1孔的转运频率；
图11示出了由PaMscS1通过dNTPs消耗检测AFP适配体和miR21；
图12示出了PaMscS1检测单核苷酸的电流轨迹和停留时间分布；
图13示出了与miR21和AFP适配体混合的PCR试剂的非变性(native)PAGE电泳的结果；
图14示出了基于野生型PaMscS埃米孔的dNTP检测；
图15示出了野生型EcMscS的单个通道嵌入电流轨迹(电压+100mV，电导液30mM:300 mM NaCl)；
图16示出了野生型EcMscS的通道扫描电压(-100mV到100mV)；
图17示出了野生型EcMscS的电导分布；
图18示出了PaMscS与其他细菌的MscS的序列比对。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4， 5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
详细附图说明
图1：A.电生理测量室示意图。B.在+50mv电压下，PaMscS1和PaMscS2埃米孔的单孔插入。C.PaMscS1和PaMscS2埃米孔在电压范围-50mv到+50mv下的I-V关系。D.PaMscS1 和PaMscS2埃米孔的电导分布(分别为N＝18)(缓冲条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mM NaCl)。E.通过PaMscS突变体埃米孔检测dNTPs(缓冲条件为-cis端：300mM NaCl， -trans端：30mM NaCl，并且电压为+50mv)。
图2：A.埃米孔检测SARS-CoV-2的示意图。B.梯度拷贝数下SARS-CoV-2 Orf1ab基因检测结果(缓冲液条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：100mM NaCl，电压+50mV，阴性对照(NC)组：n＝4，10^11拷贝/mL组：n＝4，10^8拷贝/mL组：n＝4，10^5拷贝/mL组： n＝4，10^3拷贝/mL组：n＝3)。C.22份临床样本检测结果，包括15个阳性样本(患者编号： 1～15)和7个阴性样本(患者编号：16～22)，21份样本的埃米孔检测结果与医院qPCR检测结果一致(患者编号：1～15，17～22)，1个阴性样本(患者编号：16)被埃米孔诊断为阳性(缓冲条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：100mM NaCl，电压为+50mV)。D.通过 MscS埃米孔监测dNTPs的消耗可以结合核酸扩增技术(NAAT)，如聚合酶链反应(PCR)和链式置换扩增(SDA)。
图4：A.野生型PaMscS和突变型PaMscS1、PaMscS2的背景信号频率，PaMscS1和PaMscS2 的背景噪音频率低于野生型PaMscS(电压为+50mv，n≥3)。B.PaMscS1和PaMscS2埃米孔插入的时间，PaMscS2埃米孔具有比PaMscS1更高的膜融合效率(n≥3)。C.PaMscS1和PaMscS2埃米孔的dNTPs阻塞电流分布。
图5：当电压升高到+90mV以上时，观察到电压门控(缓冲条件为-cis端:300mMNaCl， -trans端:30mM NaCl，采样频率：4999hz)。
图8：电压：+50mV；缓冲条件：cis侧300mM NaCl，trans侧30mM NaCl。ssDNA的最终浓度为5μM，序列为5′TAGCTTATCAGACTGATGTTGA 3′(SEQ ID NO:5)。
图9：包含10^3拷贝/mL至10^11拷贝/mL的Orf1ab基因的样本可被检测。
图10：在不同的渗透压差的条件下测试了dCTP(以橙色表示)和dGTP(以蓝色表示)的易位频率，对称(A，300mM NaCl：300mM NaCl用于cis端：trans端)，低渗透压差(LOD)(B，300mM NaCl：100mM NaCl用于cis端：trans端)，以及高渗透压差(HOD)(C，300mM NaCl：30mM NaCl用于cis端：trans端)。四组dNTPs浓度，0.5mM、1.0mM、1.5mM和2.0mM，以测试了dCTP和dGTP的易位。D.在对称、低渗透压差和高渗透压差条件下，易位频率与 dCTP/dGTP浓度之间的关系(每个数据点n＝3)。E.在3种不同的渗透压差条件下，fdCTP和fdGTP的增加率。
图11：A.检测策略示意图。B.无靶标对照组、miR21组、AFP适配体组和既有miR21又有AFP适配体组的电流轨迹。C.4个检测组的电流分布。D.4组中dATP和dGTP信号的相对增加。没有miR21和AFP适配体的样本不会导致dNTPs消耗；有miR21的样本会导致更多的dATP消耗和相对更低的dATP易位频率；有AFP适配体的样本会导致更多的dGTP消耗和相对更低的dGTP易位频率；既有miR21又有AFP适配体的样本将导致更多的dATP和 dGTP消耗以及相对更低的dATP和dGTP易位频率(缓冲条件为-cis端：300mM NaCl，-trans 端：100mM NaCl，电压为+50mV，每个实验n＝3)。
图12：停留时间分布：dGTP(A)、dATP(B)、dTTP(C)和dCTP(D)；每个核苷酸的浓度为2mM且缓冲条件为-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mM NaCl，电压为+50mV。
图13：1：DNA模板1(含poly T)；2：DNA模板2(含poly C)；3：有miR21和AFP 适配体的PCR试剂；4：对照组(没有miR21和AFP适配体)。
跨膜孔
跨膜孔是在某种程度上穿过膜的结构。它允许由施加的驱动力驱动的分析物流过膜或膜内。跨膜孔通常穿过整个膜，使得分析物可以从膜的一侧流到膜的另一侧。然而，跨膜孔不是必须得穿过膜。它的一端可以封闭。例如，孔可以是膜中的阱、间隙、通道、沟槽或狭缝，分析物可以沿着它流动或流入其中。本发明中可以使用任何跨膜孔。跨膜孔可以是生物的或人造的。合适的孔可以是蛋白质孔、多核苷酸孔和固态孔。
本发明中，跨膜孔至少应具备检测和区分多种核苷酸的能力，优选为跨膜蛋白孔。换句话说，本发明的跨膜蛋白孔能够允许由驱动力驱动的分析物从膜的一侧流到另一侧。
在本发明的一个具体实施例中，本发明所使用的跨膜孔是小电导机械力敏感性通道 (Mechanosensitive channel of small conductance,MscS)，优选的是PaMscS(铜绿假单胞菌小电导机械力敏感性通道)或其变体。所述变体(也可以理解为“突变体”)可以是由生物体 (例如铜绿假单胞菌)表达的天然存在变体。变体还包括由重组技术产生的非天然存在变体。在本发明中，“PaMscS变体”、“突变型PaMscS”、“突变体PaMscS”、“PaMscS突变体”表示相同含义，除非另有说明。
在本发明的一个实施例中，所述跨膜孔可以为MscS变体。可以对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如对单个或多个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代。作为优选，可以对SEQ ID NO:1或SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个或多个位置进行非保守取代，其中被取代的氨基酸残基被化学性质和/或物理尺寸明显不同的氨基酸所替换。进一步地，所述 MscS变体可分为侧孔体积变体和侧孔电荷变体。侧孔体积变体是指突变位点位于胞质端的侧面开口(也可以理解为“侧孔”)处且通过改变该位点的氨基酸，使得其侧孔体积改变的变体。侧孔电荷变体是指突变位点位于胞质端的侧面开口处且通过改变该位点的氨基酸，使得其侧孔电荷改变的变体。例如，所述侧孔体积变体可以是将较大体积的氨基酸(例如，色氨酸(W))替换成较小体积的氨基酸(例如，丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或脯氨酸(P))，或反之。侧孔电荷变体可以是将带某种电荷的氨基酸替换成带相反电荷或中性的氨基酸，也可以是将中性的氨基酸替换成带电荷的氨基酸。一般来说，带正电荷的氨基酸的非限定性实例包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸；带负电荷的非限定性实例包括天冬氨酸和谷氨酸；中性的非限定性实例包括甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和色氨酸。氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加)等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对MscS进行修饰，以得到相应MscS变体。修饰的手段包括对相应的DNA序列进行修改(例如，修改DNA序列信息后直接合成相应蛋白质或者利用PCR对DNA序列进行定点突变)，进而得到相应变体(及其对应的DNA序列)。
在一个具体实施例中，所述MscS变体可以是PaMscS变体。所述PaMscS变体例如包括 130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。PaMscS的侧孔体积突变体例如包括130A、130S、130P，PaMscS的侧孔电荷变体例如包括130H、180R、271I。这样的修饰可以改变被修饰的侧孔的孔径(也可以理解为“孔道尺寸”)，进而提高对特定分子体积的分析物的检测能力；还可以改变被修饰的侧孔通道的局部电荷特性，进而提高对特定带电荷分析物的检测能力；还可以增强所述PaMscS变体的蛋白通道电流的稳定性。
在本发明的一个实施例中，所述跨膜孔可以为野生型PaMscS，其虽背景噪声较高，但仍具备检测分析物的能力。
在本发明的一个实施例中，所述跨膜孔可以为野生型EcMscS(大肠杆菌小电导机械力敏感性通道)或其变体。EcMscS与PaMscS的结构高度相似，且同样能够形成稳定的通道电流，具备检测分析物的能力。PaMscS与EcMscS的序列相似性为60％。而对氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加)等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对EcMscS进行修饰，以得到相应EcMscS变体。
在本发明另一个实施例中，除大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外，所述MscS还可以源自其他杆菌，例如腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)和幽门螺杆菌(Helicobactor pylori)。PaMscS与TtMscS、HpMscS的结构同样高度相似，而序列相似性分别为55％、44％。结合PaMscS与EcMscS的实际电生理检测结果可以看出，MscS能够作为跨膜孔检测分析物的原因在于其高度相似的结构和类似的功能。而对氨基酸的保守取代或非保守取代，以及对氨基酸的许多不同类型(删除、置换、添加) 等修饰都是本领域公知的，本领域技术人员可根据实际情况来对MscS进行修饰，以得到相应MscS变体。
分析物
所述分析物是荷电物质。如果分析物带有净电荷则它是荷电的。所述分析物可以荷负电也可以荷正电。如果分析物带有净负电荷则它是荷负电的。如果分析物带有净正电荷则它是荷正电的。合适的分析物应为尺寸小于或等于所述跨膜孔孔径的物质，优选为核苷酸、氨基酸、肽、药物分子。
在本发明的一个实施例中，所述分析物可以为核苷酸。“核苷酸”是指由杂环碱基、糖和磷酸基团组成的单体单元。应当理解，杂环碱基包括天然存在的碱基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))及非天然存在的碱基类似物。糖包括天然存在的糖(脱氧核糖和核糖)及非天然存在的糖类似物。所述核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，例如ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP、GMP、UMP、TMP、 CMP、dGMP、dAMP、dTMP、dCMP、dUMP、ADP、GDP、TDP、UDP、CDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCDP。所述核苷酸包括天然存在的核苷酸和以天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的非天然存在的核苷酸类似物。所述核苷酸为游离的(或者，可以理解为“单个”)。作为优选，核苷酸为ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP。
单通道电生理检测系统
“单通道电生理检测系统”是指能够检测在分析物的影响下的单个通道的电生理特性(例如，电流)变化的系统，其包括跨膜孔、绝缘膜、第一介质和第二介质。在本发明的一个实施例中，所述跨膜孔为具有埃米级尺寸的孔(简称为“埃米孔”)，具体为小电导机械力敏感性通道(MscS)埃米孔。所述具有埃米级尺寸的孔优选为具有径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构，所述七聚体结构包含7个侧面开口和1个底部开口。在本发明的一个实施例中，所述具有埃米级尺寸的孔具有一个径向对称且形状似圆柱体的典型七聚体结构，所述七聚体结构包含8个开口，其中7个相等的开口分布在侧面，第8个开口分布于底部且由7个亚基形成；上述8个开口孔径大小均可调节。所述具有埃米级尺寸的孔允许所述分析物从所述绝缘膜的一侧易位到另一侧。
在本发明的一个实施例中，所述具有埃米级尺寸的孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜 (也可以理解为，所述埃米级尺寸的孔和所述绝缘膜的复合体)将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述具有埃米级尺寸的孔的孔道提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道；向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力后，位于所述第一介质的分析物与所述MscS 埃米孔相互作用以形成电流(即电信号)。在本发明中，“第一介质”是指所述分析物被加入所述单通道电生理检测系统时位于的介质；“第二介质”则是指被所述绝缘膜分隔开的两部分介质中，“第一介质”的另一侧。在本发明中，驱动力是指通过电势、电渗流、浓度梯度等方式驱动分析物与所述跨膜孔相互作用的力。
所述第一介质和所述第二介质可以相同或不同，并且所述第一介质和所述第二介质可以包括电导液。所述电导液为碱金属卤化物水溶液，具体为氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、溴化钠(NaCl)。在本发明一个实施例中，所述第一介质和所述第二介质含有的电导液的浓度是不同的，换句话说，所述第一介质和所述第二介质中电导液的浓度存在差值，进而使得所述绝缘膜两侧的渗透压存在差值。所述第一介质和/或所述第二介质还可以包括缓冲液，例如HEPES。所述第一介质和/或所述第二介质的浓度范围可以是30 mM-3M。
绝缘膜是指具有搭载跨膜孔(或纳米孔)并阻塞非跨膜孔(或纳米孔)通过的离子电流的能力的膜。所述绝缘膜可以包括磷脂膜和/或高分子膜。示例性的磷脂膜包括DPHPC、DOPC、E.coli lipid，示例性的高分子膜包括三嵌段共聚物高分子膜。
本发明单通道电生理检测系统可包含本文所描述的任何小电导机械力敏感性通道，例如野生型PaMscS(SEQ ID NO:1)、野生型EcMscS(SEQ ID NO:2)、野生型TtMscS(SEQID NO:3)和野生型HpMscS(SEQ ID NO:4)及其相应变体，上述四种MscS的具体序列信息如表4所示。例如，所述小电导机械力敏感性通道可以为突变体PaMscS1(W130A)、突变体PaMscS2(K180R)、突变体PaMscS3(V271I)(其具有检测小分子药物的能力，实验数据未显示)。
表4：四种MscS的氨基酸序列信息
Figure BDA0003720314580000071
Figure BDA0003720314580000081
在本发明的一个具体实施例中，所述单通道电生理检测系统包括两个电解液室，其被绝缘膜分隔开而形成反式(-trans)隔室和顺式(-cis)隔室，所述埃米孔的孔嵌入绝缘膜中，绝缘膜上只有小电导机械力敏感性通道埃米孔来连通上述两个电解液室。当向上述两个电解液室施加电势时，电解液室中溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过所述埃米孔。
在本发明的一个实施例中，所述小电导机械力敏感性通道(MscS)埃米孔可以被嵌入绝缘膜中，但其保留了响应绝缘膜受到的机械力刺激和绝缘膜的物理状态变化而改变蛋白质结构的能力。具体地，机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的渗透压变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激、气压负压对所述绝缘膜的刺激等。绝缘膜的物理变化包括所述绝缘膜的厚度变化、所述绝缘膜的组成成分变化、所述绝缘膜的表面曲率变化。所述改变蛋白质结构包括改变MscS的开口的电荷性质和/或孔径大小。进一步地，可利用MscS埃米孔改变的开口的电荷性质和/或孔径大小来检测不同的分析物。本发明所涉及的埃米孔的孔径的可调节范围可以是5–15埃米。
所述跨膜孔和分析物之间的相互作用
所述分析物可与所述跨膜孔在所述绝缘膜两侧的任一侧接触。所述分析物可以与所述绝缘膜两侧中的任一侧相接触，使得所述分析物穿过所述跨膜孔的通道以到达所述绝缘膜的另一侧。在这种情况下，所述分析物在其经由所述孔的通道穿过所述绝缘膜时，与所述跨膜孔相互作用。或者，所述分析物可与所述绝缘膜的侧面接触，所述绝缘膜的侧面可使所述分析物与所述跨膜孔相互作用，使其与所述跨膜孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。所述分析物可以以任何方式并在任何位点与所述跨膜孔相互作用。所述分析物还可以撞击到所述跨膜孔，与所述跨膜孔相互作用，使其与所述跨膜孔分离并停留在所述绝缘膜的同一侧。
在所述分析物与所述跨膜孔相互作用的过程中，所述分析物会以该分析物特异性的方式影响流过所述跨膜孔的电流，即流经所述跨膜孔的电流对特定分析物是特征性的。可进行对照实验以测定特定分析物对流过所述跨膜孔的电流的效应，然后以鉴定样本中的特定分析物或测定样本中是否存在特定分析物。更具体地，可以根据通过检测分析物所获得的电流模式与在相同的条件下使用已知的分析物获得的已知的电流模式进行比较，以鉴定分析物的存在与否或浓度等。
本发明的单通道电生理检测系统还可以包括一个或多个测量流过所述跨膜孔的电流的测量装置，例如膜片钳放大器或数据采集设备。
样本
所述分析物可存在于任何合适的样本中。本发明通常在已知含有或怀疑含有所述分析物的样本上进行。本发明可以在含有一种或多种种类未知的分析物的样本上进行。或者，本发明可以确认所述一种或多种已知存在或预计存在于所述样本中的分析物的种类。
所述样本可以是生物样本。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的样本上在体外进行。本发明还可以在获自或提取自任何病毒的样本上在体外进行。优选地，所述样本为流体样本。所述样本通常包括体液。所述样本可以是体液样本，例如尿液、血液、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、胸膜液、腹水液、腹膜液、羊水、附睾液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、母乳、泪液、唾液、痰或其组合。所述样本可以源自人类，也可以源自其他哺乳动物。所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选地为流体样本，例如饮用水、海水、河水以及用于实验室试验的试剂。
所述样本在分析之前可以不经过处理，例如直接在全血中检测所述分析物。所述样本在分析之前也可以经过处理，例如通过离心、过滤、稀释、沉淀或其他本领域已知的物理手段或化学手段。
在本发明一个实施例中，所述样本为核酸扩增产物。
检测样本中核酸的存在的方法
本发明还提供一种检测样本中核酸的存在的方法。所述方法包括：S1将样本置于核酸扩增体系并进行核酸扩增，确定所述核酸扩增体系中底物核苷酸的数量，获得所述样本的核酸扩增产物；S2将所述样本的核酸扩增产物加入单通道电生理检测系统，所述单通道电生理检测系统包括：跨膜孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述跨膜孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述跨膜孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述样本的核酸扩增产物被加入到所述第一介质；S3向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力，所述样本的核酸扩增产物中剩余核苷酸与所述跨膜孔相互作用并产生电信号(电流)；S4对所述电信号进行量化，获得所述剩余核苷酸的数量；S5 将所述剩余核苷酸的数量与所述底物核苷酸的数量进行对比，确定所述样本中所述目标核酸是否存在。在一些实施例中，S1可以和S2同时进行或在同一体系中进行。在检测前，还可以设置阈值，例如，只有剩余核苷酸中的至少一种的数量低于该阈值时，视为样本中目标核酸存在；或者，只有全部种类的剩余核苷酸的数量高该阈值时，视为样本中目标核酸不存在。
“核酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。目标核酸的“核酸扩增”是指体外构建与目标核酸序列至少一部分相同或互补的核酸链的过程，仅当该目标核酸存在于样本中时才可能发生核酸扩增过程。在核酸扩增过程，通常利用酶(例如核酸聚合酶、转录酶)来产生目标核酸或者其片段的多个拷贝，或者与该目标核酸或者其片段互补的序列的多个拷贝。发生核酸扩增过程后，核酸扩增体系的底物核苷酸会随拷贝数的增加而相应地减少。例如，图2和11分别为核酸扩增的示例。
本发明方法的原理基于体外核酸扩增技术，以消耗核酸扩增体系中的底物核苷酸，因此常见的体外核酸扩增技术，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增技术 (SDA)、转录介导的扩增技术(TMA)、环介导等温扩增技术(LAMP)都可以配合本发明提供的方法所使用。
在一个具体实施例中，本发明提供的方法可以检测样本中是否存在新冠病毒核酸。
在一个具体实施例中，本发明提供的方法可以检测样本中是否存在单链核酸。
在本发明的一个实施例中，本发明通过构建合适的引物(例如，SARS-CoV-2核酸的特异性引物)并将所述引物引入到核酸扩增体系(包括底物dNTPs、聚合酶、反转录酶)，如果样本中存在该新冠病毒核酸，则所述新冠病毒核酸在合适的条件下核酸扩增，消耗底物dNTPs并生成所述核酸的多个拷贝。而将所述样本的核酸扩增产物加入本发明提供的单通道电生理检测系统后，所述核酸扩增体系中的大分子物质(例如，酶、多核苷酸等)难以穿过跨膜孔，也就是说，所述核酸扩增体系中只有游离的单核苷酸能够穿过所述跨膜孔并产生特异性电流，进而确定剩余核苷酸的数量，以判断样本中是否存在目标新冠病毒核酸(即如果样本中无目标新冠病毒核酸，则剩余核苷酸的数量更接近核酸扩增前的底物核苷酸数量；如果样本中存在新冠病毒核酸，则剩余核苷酸的数量显著低于核酸扩增前的底物核苷酸数量，更具体地，底物核苷酸中可能至少一种核苷酸被完全消耗)。
在本发明的一个实施例中，本发明通过构建合适的探针(例如，所述探针包括与目标核酸序列互补配对的序列和多聚核苷酸序列)并将所述探针引入到核酸扩增体系(包括底物 dNTPs、聚合酶)，如果样本中存在该目标核酸序列，则所述目标核酸序列在合适的条件下核酸扩增，消耗底物dNTPs并生成所述目标核酸序列的多个拷贝；更具体地，由于探针还具有多聚核苷酸序列(例如，Poly T、PolyA、Poly C、Poly G)，因此，所述目标核酸序列与所述探针结合后，还会大量消耗与多聚核苷酸序列相对应的底物核苷酸，因此可以从某种底物核苷酸的特异性消耗来判断样本中是否存在目标核酸序列。将所述样本的核酸扩增产物加入本发明提供的单通道电生理检测系统后，所述核酸扩增体系中的大分子物质(例如，酶、多核苷酸等)难以穿过跨膜孔，也就是说，所述核酸扩增体系中只有游离的单核苷酸能够穿过所述跨膜孔并产生特异性电流，进而确定剩余核苷酸的数量，以判断样本中是否存在目标核酸序列(即如果样本中无目标核酸序列，则剩余核苷酸的数量更接近核酸扩增前的底物核苷酸数量；如果样本中存在目标核酸序列，则剩余核苷酸的数量显著低于核酸扩增前的底物核苷酸数量且探针中所对应的多聚核苷酸被大量消耗。基于此，可设计不同的探针在同一个核酸扩增体系中同时检测不同的目标核酸序列。
具体实施举例：
实施例一
材料与方法：
氯化钠(NaCl，>99.0％，CAS#7647-14-5)、dNTP混合物(>99.0％)、dATP(>97％，CAS#1927-31-7)、dCTP(>98％，CAS#102783-51-7)、dGTP(>98％，CAS#93919-41-6)、 dTTP(>98％，CAS#18423-43-3)购自Sangon Biotech。酵母提取物(CAS#8013-01-2)、胰蛋白酶(CAS#73049-73-7)、氨苄青霉素钠盐(≥98.5％，CAS#69-52-3)、Tris(≥99.9％，CAS#77-86-1)、咪唑(Imidazole)(≥99％，CAS#288-32-4)、十二烷基-β-D-麦芽糖苷 (n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside，DDM)(≥99％，CAS#69227-93-6)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)(≥99％，CAS#367-93-1)、苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(≥99.％，CAS#329-98-6)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid，HEPES)(>99.5％，CAS#7365-45-9) 购自Sigma-Aldrich。大肠杆菌提取磷脂购自Avanti。PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自TaKaRa。
野生型和突变型PaMscS的表达和纯化：
使用基因特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增出来自铜绿假单胞菌基因组DNA中 PaMscS的基因。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)将基因插入质粒中。将包含 PaMscS基因的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在37℃、存在50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养并进行蛋白质的表达纯化。通过SDS-PAGE分析确定峰值。特别说明，本发明中野生型和突变型蛋白的表达纯化步骤一样，只是由于野生型蛋白与突变型蛋白存在序列差异，因此在质粒合成阶段有差异。
本发明实验团队通过建模揭示了该蛋白质埃米孔的结构，其为径向对称且类似圆柱体的典型七聚体。它包含8个开口，7个在侧面，1个在底部。N-末端残基1-13太过灵活，无法在模型中解析。在拓扑结构上，PaMscS可分为2个部分，跨膜区和大的胞质部分。每个单体产生三个N-末端跨膜螺旋，包括TM1(残基17～52)、TM2(残基58～83)和TM3(残基 90～122)。C-末端胞质区可分为中间β结构域和COOH末端结构域。每个亚单位中的TM1 和TM2以反平行方向排列在一起，TM1穿过通道外侧的双层膜并且TM2形成中心层，从而形成围绕通道轴的渗透路径。TM3螺旋可以描述为两个螺旋片段，TM3a和TM3b，在Gly108 处被一个明显的扭结
Figure BDA0003720314580000112
分开，其在同源性上是保守的残基。TM3a像TM1一样，以不同的偏转穿过该膜，而TM3b则返回细胞质，与胞质区域相互作用。此外，7个亚基形成一个半径为
Figure BDA0003720314580000111
的中心孔，其感受张力并与构象变化有关。比较铜绿假单胞菌和大肠杆菌的MscS结构，前者的TM1和TM2的倾斜角度小于后者，这导致TM区域的大偏转，尤其是TM1和TM2之间的环。在胞质区，中间β结构域(残基123～172)包含5条β链，其与其他不同亚基的β链紧密相连。并且C末端结构域(177～273残基)以5条β链和2条α螺旋组成，其为混合结构。在相邻单体的这两个结构域之间，在侧面有7个相等的开口，清晰可见，半径约为
Figure BDA0003720314580000118
其被提出认为是EcMscS中的离子渗透的原因。除这些入口外，第8个开口存在于蛋白质底部，其通过7条β链表现，最窄半径为
Figure BDA0003720314580000113
在所有尺寸中，延伸至
Figure BDA0003720314580000114
的PaMscS2平行于七倍轴，并在垂直方向宽度为
Figure BDA0003720314580000115
PaMscS的结构类似于关闭状态 (PDB:2OAU)下的EcMscS，TM结构域有超过101个rmsd为
Figure BDA0003720314580000116
的Cα原子，但在开放状态(PDB:2VV5)下，TM区域存在较大差异，rmsd为
Figure BDA0003720314580000117
这些结果表明PaMscS在结构上的构象反映了关闭状态。总的来说，PaMscS埃米孔独特而精细的结构显示出用于检测的巨大潜力。
位点突变：
对相应的氨基酸位点所对应的DNA序列进行修改(包括DNA序列修改后直接送合成或者PCR突变)，将目标突变位点所在的DNA序列修改为突变蛋白所对应的DNA序列。突变型PaMscS蛋白埃米孔的突变蛋白可以包括130A、130H、180R、271I、130S或130P。
膜的合并和单通道记录：
实验在由华纳仪器(Warner instrument)提供的垂直样品池中进行，如果没有特别提到，所有的电流痕迹都由采样频率为9900Hz的HEKA EPC 10USB膜片钳放大器记录。1μL的 25mg/mL大肠杆菌膜被预涂在杯子的150μm孔口上，然后将1mL的电解质溶液(-trans端：100mM NaCl，10mM HEPES，pH7.0；-cis端：300mM NaCl，10mM HEPES，pH7.0)分别加入到样品池的两面。然后用1mL吸管从-cis端吸出样品池的大约2/3的电解质溶液。当平均电流接近0pA时，电解质溶液被驱动到样品池的-cis侧，以形成一个平面磷脂双分子膜。磷脂膜形成后，PaMscS1蛋白溶液被加入到-cis端中。当PaMscS1被嵌入到平面磷脂双分子膜中时，电流有明显的变化。蛋白质被嵌入后，更换1mL溶液，然后进行后续实验。
单核苷酸检测：
通过MscS埃米孔检测不同组的扩增产物。将不同的样品加入-cis端，在+50mV下记录并观察20分钟。当平面磷脂膜上形成稳定的PaMscS1埃米孔时，将待检测的单核苷酸加入样品孔的-cis端，然后施加电压，记录电流信号。
冠状病毒临床样本的收集和处理
SARS-CoV-2患者的临床样本通过咽拭子(患者编号：1～15)和血液(患者编号：16～22)采集，经反转录后获得cDNA。
RNA反转录和PCR扩增
本发明SARS-CoV-2 RNA反转录扩增系统如下：随机六聚体(60μM)和锚poly T(23):1μL， dNTP混合物(各10mM):1μL，RNA样品:11μL。将反应在热循环仪中、于65℃孵育5分钟。立即将样品放在冰上快速冷却大于1分钟。然后，在一个干净的预PCR罩中，将下列试剂与样品混合：5X SuperScript IV缓冲液：4μL，DTT(100mM)：1μL，RNaseOUT RNase抑制剂：1μL，Superscript IV逆转录酶：1μL。使用42℃50分钟和70℃10分钟的程序将样品在热循环仪中孵化后获得cDNA。本发明实验中的cDNA PCR扩增系统如下：ddH2O：26.5μL， 5×PrimeSTAR缓冲液(Mg2+Plus)：10μL，dNTP混合物(2.5mM)：4μL，引物1(正向引物 ORF P1，10μM)：2μL，引物2(反向引物ORF P2，10μM)：2μL，PrimeSTARHS DNA聚合酶(2.5U/μL)：0.5μL，cDNA样品：5μL。扩增程序如下：95℃预热5分钟，98℃热变性 10秒。55℃折射退火15秒，然后72℃延伸12秒。重复所述循环，共35次。上述引物由本研究团队自主合成，序列如下：
ORF P1(SEQ ID NO:7)：TTGTTTGAATAGTAGTTGTCTGA
ORF P2(SEQ ID NO:8)：TCAACTCAATATGAGTATGGTACTG
逆转录酶环状介导的等温扩增(RT-LAMP)和检测
进行包含以下体系的RT-LAMP反应：ddH2O：4.1μL，
Figure BDA0003720314580000121
Colorimetric LAMP2X Master Mix(DNA&RNA)：12.5μL，F3(20μM)：0.2μL，B3(20μM)：0.2μL，FIP(20μM)： 1μL，BIP(20μM)：1μL，LoopF(20μM)：0.5μL，LoopB(20μM)：0.5μL，模板：5μL。 LAMP反应在60℃下运行30分钟。
核酸扩增和检测：
本发明的核酸扩增体系如下：ddH2O：64.6μL，5×PrimeSTAR缓冲液(Mg2+Plus)：20μL，dNTP混合物(各10mM)：6μL，引物1(miRNA21，100μM)：0.4μL，引物2(AFP 适配体，10μM)：4μL，模板1(提取，poly T)：2μL，模板2(poly C，1μM)：2μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL)：1μL。扩增程序如下：95℃预热5min且98℃热变性10s。60℃折射退火15秒，然后68℃延伸23秒。共重复循环30次，核酸扩增结果如图13所示。
电生物学数据分析
在本发明中，电生物学数据由Clampfit软件处理，并用Origin软件绘图。
实施例二
PaMscS埃米孔的电生理检测
MscS的基本功能是对机械刺激(如渗透压期间的膜张力变化)反应的快速开/关的开关。 MscS的胞质结构域功能为在渗透适应(osmoadaptation)过程中平衡渗透剂的损失的分子筛。本发明的蛋白质埃米孔中，来自胞质区的7个侧孔在离子和溶质的易位(translocation)过程中起着关键作用。因此，侧孔突变体PaMscS1(W130A)和PaMscS2(K180R)由于其低背景噪音而被选择用于后续研究(图3、图4A-C)。在电生理实验中，将纯化的蛋白质加入到电生理装置的-cis端中(图1A)。当PaMscS突变体通道嵌入双层脂质膜(BLM，绝缘膜的一种)时，在+50mV的电压下可以观察到稳定的通道电流跳跃(图1B)。在范围从-50mV 至+50mV的电压下，PaMscS1的通道电导保持稳定(图1C)，并且当电压高于+90mV时， PaMscS1的门控概率增加(图5)。PaMscS1埃米孔的电导为0.64±0.02nS(n＝91，高斯拟合的峰值±SD，-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mM NaCl)，PaMscS2埃米孔的电导分布为34.9±7.0pA(平均值±SD，来自18个独立插入事件)(图1D)。PaMscS1的离子转运结果表明，PaMscS1对Br-具有更好的选择性(图6)。
以检测单核苷酸为例，在BLM中插入PaMscS1埃米孔，并在-cis端中存在dNTPs的情况下，在正电压下可以观察到dNTPs的易位信号。dNTPs的易位频率随着电压的增加而增加(图7)。PaMscS1和PaMscS2都被分析用于dNTP混合物检测(dNTPs浓度：0.2mM，电压：+50mV，-cis端：300mM NaCl，-trans端：30mM NaCl)。在两个突变体之间可以观察到阻塞电流分布的明显差异，表明dNTPs的易位与PaMscS埃米孔的侧孔有关(图1E)。即，在同样的检测条件下，PaMscS1和PaMscS2埃米孔对于dNTPs阻塞电流的分布呈现出不同的情况。具体表现为PaMscS1埃米孔对于四种dNTPs混合物阻塞率呈现3个峰，而PaMscS2 埃米孔对于四种dNTPs混合物阻塞率呈现2个峰。因为PaMscS1和PaMscS2突变的差异在于侧孔氨基酸的差异，因此推测dNTPs的检测信号与侧孔相关。由于PaMscS1对dNTP混合物有更好的区分效果，它被用于单核苷酸混合物的区分。而对于PaMscS2，它表现出更稳定的通道电导和相对更高的膜融合效率，因此它更适合用于快速诊断(图4A-C)。野生型PaMscS 埃米孔对于四种dNTPs混合物阻塞率呈现2个峰(图14)。PaMscS1检测单核苷酸的电流轨迹和停留时间分布如图12所示。
与目前报道的含有am7βCD、MoS2和α-Hederin的α-溶血素相比，虽然PaMscS1埃米孔的检测准确度低于报道的含有am7βCD结合物(即利用α溶血素突变蛋白与6-氨基-6脱氧-β- 环糊精适配体构建)的最佳生物纳米孔，但易位速度与固态纳米孔相当。在单链DNA(ssDNA) 检测实验中，50μM的ssDNA在30mM NaCl/300mM NaCl的缓冲条件下和+50mV偏置电压下进行检测，而由于其通道尺寸较窄，因此未观察到易位事件(图8)。因此，PaMscS变体埃米孔有潜力成为一种有用的小分子传感器。
实施例三
PaMscS1埃米孔的选择性调整用于优化的dNTPs检测：
考虑到PaMscS1埃米孔的机械力敏感性，实验人员通过应用不同的渗透压差来调节 PaMscS1埃米孔的选择性。为了在不同的渗透压差下保持dCTP和dGTP的恒定电荷特性，实验人员将-cis端的电导缓冲液浓度保持在300mM并改变-trans端的电导液浓度来改变渗透压差。在3种渗透压差条件下测试了PaMscS1埃米孔对大分子dGTP和小分子dCTP的检测能力，包括对称(symmetric)条件(图10A，300mM NaCl/300mM NaCl，+50mV偏置电压)，低渗透压差条件(图10B，100mM NaCl/300mM NaCl，+50mV偏置电压)和高渗透压差条件 (图10C，30mM NaCl/300mM NaCl，+50mV偏置电压)。在对称渗透压条件下，dCTP的易位频率从0.16±0.03s-1增加到0.22±0.07s-1，而dGTP从0.09±0.02s-1变化到0.07±0.003s-1。在低渗透压差(LOD)条件下，dCTP的易位频率从0.34±0.1s-1增加到0.67±0.14s-1，而dGTP 从0.06±0.01s-1增加到0.3±0.04s-1。在高渗透压差(HOD)条件下，dCTP的易位频率从0.12 ±0.04s-1增加到0.22±0.07s-1，而dGTP从0.37±0.08s-1增加到1.12±0.12s-1(图10D，每个实验n＝3，平均值±S.E.M)。图10E总结了dGTP和dCTP的检测，并且它总结为低渗透压差条件显示dCTP的最高的易位事件增加，而高渗透压差条件显示最高的dGTP的易位事件增加(图10E)。与高渗透压条件的dCTP的降低的捕获效率相比，低渗透压差条件显示对dCTP 和dGTP二者的平衡的捕获能力。鉴于dGTP和dCTP的大小和电荷特性在给定的实验条件下保持恒定，且MscS家族的通道大小在不同的压力、渗透压条件或膜电位下可以变化，实验人员可以得出结论：PaMscS1埃米孔对dNTPs的选择性差异是由不同渗透压差条件下的通道大小的变化引起的。
实施例四
通过PaMscS2检测SARS-CoV-2临床样本
SARS-CoV-2的快速而简单的核酸检测是对SARS-CoV-2流行的重要预防方法。在本实施例中，实验人员使用SARS-CoV-2Orf1ab(cDNA)的特异性引物进行SARS-CoV-2的检测(图 2A)，其目的是验证本发明涉及的埃米孔针对已知核酸的快速诊断能力。由于PaMscS2埃米孔具有较高的膜融合效率，因此被应用于该实验。目标序列为172bp，且扩增产物的片段分析表明引物可用于目标基因的扩增(表1)。合成了SARS-CoV-2 Orf1ab基因并检测了SARS-CoV-2Orf1ab基因的梯度浓度。在10^3拷贝数/mL至10^11拷贝数/mL的浓度范围内，合成的SARS-CoV-2 Orf1ab基因可以被检测到(图2B)。然后，对22个临床样本进行了检测，包括15个确诊病人的样本和7个健康对照组的样本。通过埃米孔检测的15个阳性样本和6 个阴性样本(病人编号：1～15，17～22)都显示出与临床检测一致的结果(表2)，1个阴性样本被诊断为假阳性结果(病人编号：16)。本方法的特异性为86％，灵敏度为100％(图2C)。作为核酸扩增监测的纳米设备，PaMscS突变体埃米孔可以与各种NAAT如聚合酶链式反应和链式置换扩增(图9)相结合，进行目标基因的检测(图2D)。其原理是，特异性引物能够引发靶标核酸的扩增，扩增过程会导致体系中dNTPs含量的减少，从而被埃米孔检测到，代表体系中存在靶标核酸。该埃米孔还具有监测逆转录过程的潜力，其可以实现对目标RNA的快速且无扩增的检测。
表1 片段长度和扩增产物浓度
Figure BDA0003720314580000131
Figure BDA0003720314580000141
表2 Ct值和临床样本的埃米孔检测结果
Figure BDA0003720314580000142
实施例五：
通过PaMscS1埃米孔检测多种生物标记物：
实验人员设计了一种dNTP条形码探针的区分策略，并通过PaMscS1埃米孔验证了其在多种生物标记物检测中的应用。设计了两个探针以结合目标DNA序列并且在链式聚合反应中引起特异性dNTPs消耗，其中miR21探针(探针A)：包括与一条与miR21互补配对的序列和一条polyT的条形码序列；AFP适配体探针(探针B)：包括一条与AFP适配体互补配对的序列和一条poly C的条形码序列(miR21和AFP适配体的序列信息见表3)。当样品中存在探针A或探针B时，聚合酶链反应可被激活，消耗反应体系中的dATP或dGTP(图 11A)。
检测无目标序列的对照样品、有miR21的样品、有AFP适配体的样品和既有miR21还有AFP适配体的样品。相应的电流轨迹和阻塞电流分布如图11B和11C所示。可以观察到，在对照组(没有miR21和AFP适配体的样品)中，dATP(δfdATP＝fdATP/f背景)的易位事件频率的相对增加为1.7±0.2(平均值±S.E.M)，dGTP(δfdGTP＝fdGTP/f背景)的易位事件频率的相对增加为1.8±0.03。在有miR21的样品中，δfdATP显著低于对照组(1.4±0.1，平均值±S.E.M)，同时有AFP适配体的样品中，δfdGTP降至1.0±0.3(平均值±S.E.M)。对于既有miR21又有AFP 适配体的样品，与对照组相比，δfdATP(1.1±0.2，平均值±S.E.M)和δfdGTP(1.3±0.2，平均值±S.E.M)均降低(图11D)。这些结果表明，PaMscS1可以同时检测单个或多个生物标记物 (每个实验n≥3)。
表3 miR21和AFP适配体的序列
Figure BDA0003720314580000151
实施例六：
一种增强信号的策略：
A.通过离子调控增强对于待检测物的检测限，具体为对于dNTPs，通过在本发明涉及的埃米孔的胞质端加入镍离子、钴离子等二价阳离子，可以提高对于dNTPs的检测下限；B. 通过电导液渗透差异的调节增强信噪比，具体为通过提高电导液浓度，可以提高对于结构类似药物分子的区分能力，通过提高磷脂膜两侧电导液的渗透差异，可以提高对于dGTP的检测效果。
实施例七：
基于EcMscS埃米孔的电生理检测
当野生型EcMscS通道嵌入双层脂质膜(BLM)时，在+100mV的电压下可以观察到稳定的通道电流跳跃(图15)。在范围从-100mV至+100mV的电压下，野生型EcMscS通道电流保持稳定(图16)。野生型EcMscS埃米孔的电导为0.334±0.028nS(-cis端：300mM NaCl， -trans端：30mM NaCl)(图17)。图18a-c分别显示了EcMscS、TtMscS和HpMscS的结构，其与PaMscS的结构高度相似，即都为径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构。此外，图18a-c和图18d进一步比较了PaMscS与EcMscS、TtMscS、HpMscS的序列(序列信息见表4)，结果表明EcMscS、TtMscS、HpMscS与PaMscS具有一定的同源性，但这种同源性并非高度同源。EcMscS和PaMscS的相似性仅为60％，但其二者都有检测分析物的能力。因此，本领域技术人员可以理解，决定细菌的MscS能够作为埃米孔检测分析物的关键在于其径向对称且形状似圆柱体的七聚体结构和通道孔径，并非仅仅在于同源性。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
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<110> 四川大学
<120> 一种检测样本中目标核酸的存在的方法
<150> CN2021110062606
<151> 2021-08-30
<150> CN2021110042496
<151> 2021-08-30
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 278
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
Met Glu Leu Asn Tyr Asp Arg Leu Val Gln Gln Thr Glu Ser Trp Leu
1               5                   10                  15
Pro Ile Val Leu Glu Tyr Ser Gly Lys Val Ala Leu Ala Leu Leu Thr
            20                  25                  30
Leu Ala Ile Gly Trp Trp Leu Ile Asn Thr Leu Thr Gly Arg Val Gly
        35                  40                  45
Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ser Val Asp Arg Thr Leu Gln Gly Phe Val
    50                  55                  60
Gly Ser Leu Val Ser Ile Val Leu Lys Ile Leu Leu Val Val Ser Val
65                  70                  75                  80
Ala Ser Met Ile Gly Ile Gln Thr Thr Ser Phe Val Ala Ala Ile Gly
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Leu Ala Leu Gln Gly Ser Leu Ala Asn
            100                 105                 110
Phe Ala Gly Gly Val Leu Ile Leu Leu Phe Arg Pro Phe Lys Val Gly
        115                 120                 125
Asp Trp Ile Glu Ala Gln Gly Val Ala Gly Thr Val Asp Ser Ile Leu
    130                 135                 140
Ile Phe His Thr Val Leu Arg Ser Gly Asp Asn Lys Arg Ile Ile Val
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gly Ala Leu Ser Asn Gly Thr Val Thr Asn Tyr Ser Ala Glu
                165                 170                 175
Pro Val Arg Lys Val Ile Phe Asp Val Gly Ile Asp Tyr Asp Ala Asp
            180                 185                 190
Leu Lys Asn Ala Gln Asn Ile Leu Leu Ala Met Ala Asp Asp Pro Arg
        195                 200                 205
Val Leu Lys Asp Pro Ala Pro Val Ala Val Val Ser Asn Leu Gly Glu
    210                 215                 220
Ser Ala Ile Thr Leu Ser Leu Arg Val Trp Val Lys Asn Ala Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Trp Asp Val Met Phe Met Phe Asn Glu Lys Ala Arg Asp Ala Leu Gly
                245                 250                 255
Lys Glu Gly Ile Gly Ile Pro Phe Pro Gln Arg Val Val Lys Val Val
            260                 265                 270
Gln Gly Ala Met Ala Asp
        275
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Glu Asp Leu Asn Val Val Asp Ser Ile Asn Gly Ala Gly Ser Trp
1               5                   10                  15
Leu Val Ala Asn Gln Ala Leu Leu Leu Ser Tyr Ala Val Asn Ile Val
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Ala Ile Ile Ile Val Gly Leu Ile Ile Ala Arg Met Ile
        35                  40                  45
Ser Asn Ala Val Asn Arg Leu Met Ile Ser Arg Lys Ile Asp Ala Thr
    50                  55                  60
Val Ala Asp Phe Leu Ser Ala Leu Val Arg Tyr Gly Ile Ile Ala Phe
65                  70                  75                  80
Thr Leu Ile Ala Ala Leu Gly Arg Val Gly Val Gln Thr Ala Ser Val
                85                  90                  95
Ile Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Leu Ala Val Gly Leu Ala Leu Gln
            100                 105                 110
Gly Ser Leu Ser Asn Leu Ala Ala Gly Val Leu Leu Val Met Phe Arg
        115                 120                 125
Pro Phe Arg Ala Gly Glu Tyr Val Asp Leu Gly Gly Val Ala Gly Thr
    130                 135                 140
Val Leu Ser Val Gln Ile Phe Ser Thr Thr Met Arg Thr Ala Asp Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ile Ile Val Ile Pro Asn Gly Lys Ile Ile Ala Gly Asn Ile Ile
                165                 170                 175
Asn Phe Ser Arg Glu Pro Val Arg Arg Asn Glu Phe Ile Ile Gly Val
            180                 185                 190
Ala Tyr Asp Ser Asp Ile Asp Gln Val Lys Gln Ile Leu Thr Asn Ile
        195                 200                 205
Ile Gln Ser Glu Asp Arg Ile Leu Lys Asp Arg Glu Met Thr Val Arg
    210                 215                 220
Leu Asn Glu Leu Gly Ala Ser Ser Ile Asn Phe Val Val Arg Val Trp
225                 230                 235                 240
Ser Asn Ser Gly Asp Leu Gln Asn Val Tyr Trp Asp Val Leu Glu Arg
                245                 250                 255
Ile Lys Arg Glu Phe Asp Ala Ala Gly Ile Ser Phe Pro Tyr Pro Gln
            260                 265                 270
Met Asp Val Asn Phe Lys Arg Val Lys Glu Asp Lys Ala Ala
        275                 280                 285
<210> 3
<211> 282
<212> PRT
<213> Thermoanaerobacter tengcongensis
<400> 3
Met Trp Ala Asp Ile Tyr His Lys Leu Val Glu Ile Tyr Asp Ile Lys
1               5                   10                  15
Ala Val Lys Phe Leu Leu Asp Val Leu Lys Ile Leu Ile Ile Ala Phe
            20                  25                  30
Ile Gly Ile Lys Phe Ala Asp Phe Leu Ile Tyr Arg Phe Tyr Lys Leu
        35                  40                  45
Tyr Ser Lys Ser Lys Ile Gln Leu Pro Gln Arg Lys Ile Asp Thr Leu
    50                  55                  60
Thr Ser Leu Thr Lys Asn Ala Val Arg Tyr Ile Ile Tyr Phe Leu Ala
65                  70                  75                  80
Gly Ala Ser Ile Leu Lys Leu Phe Asn Ile Asp Met Thr Ser Leu Leu
                85                  90                  95
Ala Val Ala Gly Ile Gly Ser Leu Ala Ile Gly Phe Gly Ala Gln Asn
            100                 105                 110
Leu Val Lys Asp Met Ile Ser Gly Phe Phe Ile Ile Phe Glu Asp Gln
        115                 120                 125
Phe Ser Val Gly Asp Tyr Val Thr Ile Asn Gly Ile Ser Gly Thr Val
    130                 135                 140
Glu Glu Ile Gly Leu Arg Val Thr Lys Ile Arg Gly Phe Ser Asp Gly
145                 150                 155                 160
Leu His Ile Ile Pro Asn Gly Glu Ile Lys Met Val Thr Asn Leu Thr
                165                 170                 175
Lys Asp Ser Met Met Ala Val Val Asn Ile Ala Phe Pro Ile Asp Glu
            180                 185                 190
Asp Val Asp Lys Ile Ile Glu Gly Leu Gln Glu Ile Cys Glu Glu Val
        195                 200                 205
Lys Lys Ser Arg Asp Asp Leu Ile Glu Gly Pro Thr Val Leu Gly Ile
    210                 215                 220
Thr Asp Met Gln Asp Ser Lys Leu Val Ile Met Val Tyr Ala Lys Thr
225                 230                 235                 240
Gln Pro Met Gln Lys Trp Ala Val Glu Arg Asp Ile Arg Tyr Arg Val
                245                 250                 255
Lys Lys Met Phe Asp Gln Lys Asn Ile Ser Phe Pro Tyr Pro Arg Thr
            260                 265                 270
Thr Val Ile Leu Ser Glu Lys Lys Thr Asn
        275                 280
<210> 4
<211> 274
<212> PRT
<213> Helicobactor pylori
<400> 4
Met Asp Glu Ile Lys Thr Leu Leu Val Asp Phe Phe Pro Gln Ala Lys
1               5                   10                  15
His Phe Gly Ile Ile Leu Ile Lys Ala Val Ile Val Phe Cys Ile Gly
            20                  25                  30
Phe Tyr Phe Ser Phe Phe Leu Arg Asn Lys Thr Met Lys Leu Leu Ser
        35                  40                  45
Lys Lys Asp Glu Ile Leu Ala Asn Phe Val Ala Gln Val Thr Phe Ile
    50                  55                  60
Leu Ile Leu Ile Ile Thr Thr Ile Ile Ala Leu Ser Thr Leu Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Thr Thr Ser Ile Ile Thr Val Leu Gly Thr Val Gly Ile Ala Val
                85                  90                  95
Ala Leu Ala Leu Lys Asp Tyr Leu Ser Ser Ile Ala Gly Gly Ile Ile
            100                 105                 110
Leu Ile Ile Leu His Pro Phe Lys Lys Gly Asp Ile Ile Glu Ile Ser
        115                 120                 125
Gly Leu Glu Gly Lys Val Glu Ala Leu Asn Phe Phe Asn Thr Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu His Asp Gly Arg Leu Ala Val Leu Pro Asn Arg Ser Val Ala
145                 150                 155                 160
Asn Ser Asn Ile Ile Asn Ser Asn Asn Thr Ala Cys Arg Arg Ile Glu
                165                 170                 175
Trp Val Cys Gly Val Gly Tyr Gly Ser Asp Ile Glu Leu Val His Lys
            180                 185                 190
Thr Ile Lys Asp Val Ile Asp Thr Met Glu Lys Ile Asp Lys Asn Met
        195                 200                 205
Pro Thr Phe Ile Gly Ile Thr Asp Phe Gly Ser Ser Ser Leu Asn Phe
    210                 215                 220
Thr Ile Arg Val Trp Ala Lys Ile Glu Asp Gly Ile Phe Asn Val Arg
225                 230                 235                 240
Ser Glu Leu Ile Glu Arg Ile Lys Asn Ala Leu Asp Ala Asn His Ile
                245                 250                 255
Glu Ile Pro Phe Asn Lys Leu Asp Ile Ala Ile Lys Asn Gln Asp Ser
            260                 265                 270
Ser Lys
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 5
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 6
tcaggtgcag ttctcgactc ggtcttgatg tgggt 35
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 7
ttgtttgaat agtagttgtc tga 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 8
tcaactcaat atgagtatgg tactg 25

Claims (12)

1.一种检测样本中目标核酸的存在的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将样本置于核酸扩增体系并进行核酸扩增，确定所述核酸扩增体系中底物核苷酸的数量，获得所述样本的核酸扩增产物；
S2将所述样本的核酸扩增产物加入单通道电生理检测系统，所述单通道电生理检测系统包括：跨膜孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述跨膜孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述跨膜孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述样本的核酸扩增产物被加入到所述第一介质；
S3向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力，所述样本的核酸扩增产物中剩余核苷酸与所述跨膜孔相互作用并产生电信号；
S4对所述电信号进行量化，获得所述剩余核苷酸的数量；
S5将所述剩余核苷酸的数量与所述底物核苷酸的数量进行对比，确定所述样本中所述目标核酸是否存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述跨膜孔为MscS变体埃米孔，所述MscS变体可选地包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MscS变体埃米孔的开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的；所述开口的调节方式可选地包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化，所述机械力刺激可选地包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差可选地为大约0-270mM。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MscS变体埃米孔源自杆菌，可选地包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MscS变体埃米孔为PaMscS变体埃米孔，可选地包括以下变体的一种或多种：130A、130H、180R、271I、130S和130P。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，所述核苷酸可选地包括dGTP、dATP、dTTP、dCTP、dUTP、GTP、ATP、TTP、CTP、UTP中的一种或多种。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增体系进一步包括：
(1)探针，所述探针包括互补区和重复区，所述互补区包括与所述目标核酸互补配对的序列，所述重复区包括重复同一个碱基的寡核苷酸序列，所述碱基包括A、T、C、G、U；或者
(2)所述目标核酸的特异性引物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标核酸为冠状病毒核酸，所述冠状病毒可选地包括SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV中的一种或多种。
11.一种病毒快速检测试剂盒，包括：
(1)MscS埃米孔，所述MscS埃米孔可选地包括MscS的侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体；
(2)绝缘膜，可选地包括磷脂膜和/或高分子膜；
(3)电导液，所述电导液可选地包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种；
(4)所述病毒的核酸的特异性引物或探针。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述埃米孔为PaMscS变体埃米孔，可选地包括130A、130H、180R、271I、130S和130P中的一种或多种。
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