CN105368938B - 一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法 - Google Patents

一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法 Download PDF

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Abstract

一种电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法，包括S1：测量薄膜两端的IV曲线，通过Labview程序线性拟合获得薄膜两端的电阻值；S2：通过圆柱模型的纳米孔电导率公式，薄膜两端的电导率可估算出小孔的孔径，进而实时输出；S3：对比测量小孔孔径与目标孔径的关系，决定下一步脉冲电压的强度Voutput；本发明具有成本低、系统操作简单、操作全自动、纳米孔大小可调节、尺寸控制精度高等特点，可制备2.5nm以上任意尺寸的纳米孔，尺寸精度可控制在±0.5nm以内；在下一代DNA测序仪器开发，单分子检测以及癌症等医学检测领域具有非常好的应用前景。

Description

一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法
技术领域
本发明属于纳米加工技术领域，特别涉及一种基于电击穿方法在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法。
背景技术
DNA序列的测定对生命科学研究，人类健康和医药卫生事业、疾病预防等方面的发展起着至关重要的作用。纳米孔(Nanopore)单分子检测是第三代基因测序的重要技术代表，相比于传统测序技术，它对样品处理简单，无需扩增、标记，省掉了昂贵的化学试剂，并且检测片段长、速度快、成本低，是实现单分子DNA直接测序强有力的手段。纳米孔单分子检测技术基于Coulter原理，即在电解质溶液中，当粒子穿过小孔时引起小孔电阻变化反应出粒子的基本物理性质，如尺寸，形状、带电量等。纳米孔DNA测序的基本思路如下：当带负电的单链DNA(ssDNA)分子在电场驱动下电泳通过纳米孔洞时，其各个碱基会依次进入纳米孔，从而在电流信号中依次观察到碱基的特征信号。理论上认为不同碱基在同等条件下的过孔速度不同，可通过离子电流信号直接读出DNA的碱基序列。
目前纳米孔可分为两大类：生物纳米孔及固态纳米孔。相比于生物纳米孔，固态纳米孔具有优良的热学、化学和力学稳定性，更适用于DNA测序及蛋白分析。固态纳米孔的制备方法主要是高能粒子束打孔，即直接用能量高的电子束或者离子束进行单个纳米孔的加工，整个过程精密繁琐。一般的钻孔方法包含透射电镜(TEM)、聚焦粒子束(FIB)、聚焦氦离子束(HIM)等。TEM和FIB方法制备纳米孔的原理是一样的——离子或电子经过磁透镜聚焦成粒子束流，将材料瞬间击穿。由于焦点尺度小，焦点位置粒子束有一定的角度，因此形成的小孔为双锥形。目前TEM制备纳米孔可达2nm尺度，传统的聚焦离子束即镓粒子束的尺度为10nm，而近年来聚焦氦离子束制备纳米孔尺度为5nm。
2014年加拿大Kwok等人提出用电击穿方法在氮化硅薄膜上制备纳米孔，将纳米孔制备成本大大的降低。电击穿一般认为是电子密度达到临界值产生的破坏(Criticalelectron trap density，CETD)。当电子被捕获在缺陷中，会在空气带和导带的禁带中间产生缺陷能级，这种缺陷能级可以通过电场或者热效应产生。由于其能级低于导带，电子(或空穴)更容易在缺陷态上填满。又由于该缺陷在空间上是局域绝缘的，因此电子会被局域在某些空间区域，我们称之为电子阱。缺陷态能级的出现导致了电子可以遂穿通过这些电子阱，当达到一定的临界值时，就发生了电击穿。也就是说电击穿实际上是一个累积到一定临界值引起质变，产生一个发热点并进一步产生物理损伤的结果。对于氮化硅薄膜，其击穿电场为0.5～1V/nm。2014年Yanagi等人通过控制脉冲压的脉冲宽度，实现了孔径在1-2nm的纳米孔制备。然而，利用电压击穿的方法耗时较长，且击穿瞬间电流突增容易引起小孔瞬间扩大。并且此方法电压脉冲为固定值，不适用于不同的薄膜厚度以及不同的材料。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述背景技术的不足，提出一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法。该方法具有成本低、系统操作全自动、纳米孔大小可调节、尺寸控制精度高等特点，并适用于不同膜厚以及不同材料。
本发明所涉及的一种电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法，包括以下步骤：
S1：测量薄膜两端的IV曲线，通过Labview程序线性拟合获得薄膜两端的电阻值；
S2：通过圆柱模型的纳米孔电导率公式，薄膜两端的电导率可估算出小孔的孔径，进而实时输出；
S3：对比测量小孔孔径与目标孔径的关系，决定下一步输出脉冲电压的强度Voutput；
进一步S1步骤中通过Labview编程进行线性拟合；
进一步S2步骤中所采用的公式为
进一步上述公式中电解质的电导率通过电导率仪测得，为11.36S/m；
进一步S3步骤中小孔孔径与目标孔径的关系及其反馈脉冲电压强度分为三种情况：
Case1：当前孔径离目标孔径较远，即d<D–2(nm)，脉冲电压强度为正常递增电压，Voutput＝V0+ΔV*n，n为脉冲次数；
Case2：当前孔径接近目标孔径，即D–2(nm)<d<D，脉冲电压强度为case1的1/3，即Voutput＝(V0+ΔV*n)/3，n为脉冲次数；
Case3：当前孔径达到目标孔径，即d≥D,脉冲电压强度为安全电压，即Voutput＝100mV；
本发明的方法可实时观测纳米孔的形成过程，并精确控制纳米孔直径精度在±0.5nm以内。该纳米孔制备系统成本低，操作简单、全自动，纳米孔尺寸可精确控制，并且适用于不同薄膜材质、不同薄膜厚度。
附图说明
图1为基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的实验装置图；其中，1为氮化硅薄膜，下方为氮化硅薄膜放大示意图；2为自制PMMA流体腔；3为Ag/AgCl电极；4为电解质溶液；5为Keithley 2450源表；6为控制电脑。
图2为基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的控制流程图。
图3为基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的(a)打孔电压、电流，及(b)小孔电阻值及孔径的实时反馈数据。
图4为浓度2.5ng/μL，1000bps nolimit dsDNA经过纳米孔的离子电流信号。
图5为1000bps nolimit dsDNA的通过纳米孔的离子电流信号统计结果；其中(a)为阻塞电流幅值与过孔时间的散点分布图；(b)为阻塞电流幅值的柱状分布图，呈高斯分布；(c)为过孔时间的柱状分布图，呈e指数衰减分布。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明提供一种低成本在氮化硅薄膜上制备纳米孔的方法，该制备方法包括三个部分：氮化硅薄膜装配流体腔、Keithley 2450源表、电脑远程控制系统。如图1所示，自制PMMA流体腔1将氮化硅薄膜固定在电解质溶液中，将电解质溶液分trans和cis两个腔室；Keithley 2450源表的正极和负极连接Ag/AgCl电极，分别浸入trans和cis两个腔室的电解质液中；通过Keithley 2450作为电压源测量薄膜两端IV曲线，同时作为电压源输出递增脉冲电压进行电击穿打孔；保证孔径实时可见，并且施加递增电压源可适应不同膜厚。
本发明的基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的控制流程如图2所示，通过测量薄膜两端的IV曲线，拟合出薄膜电阻值R，根据小孔电导率公式得到小孔孔径，并与目标孔径对比，分为三种情况对打孔电压进行控制；在保证打孔速度的情况下，不会因为电压过大导致孔径过大，并且在达到目标孔径后保持测量，以减少噪音影响。
如图1所示，本发明的基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法包含以下三个步骤：
(1)装配氮化硅薄膜：利用PMMA流体腔将电解质溶液分割成两个腔室，腔室由氮化硅薄膜分隔开。
(2)Keithley 2450源表测量孔径，根据实时测量孔径精确控制打孔电压强度。
(3)DNA单分子电流信号检测。
实施例1：精确制备氮化硅薄膜纳米孔
步骤一：氮化硅薄膜制备本发明中氮化硅薄膜从Nanopore solution公司中直接购得(http://www.nanoporesolutions.com/nano/)，薄膜结构如图1中1所示，氮化硅薄膜通过低应力化学气相乘积(LPCVD)生长在P型硅片上，厚度为20nm；背面的硅片通过传统硅加工工艺(光刻及湿法刻蚀)将硅片刻成倒锥形窗口，形成25μm×25μm的氮化硅悬浮层；
步骤二：氮化硅薄膜装配上述氮化硅薄膜首先浸泡在食人鱼洗液(浓硫酸：双氧水＝3:1)中浸泡30min，取出冲洗干净后待用。将自制PMMA(有机玻璃)流体腔用超声波纯水洗净，氮气吹干。氮化硅薄膜固定在PMMA流体腔中，薄膜两端被隔开成两个独立腔室(trans和cis)，并用硅橡胶垫圈防止腔室漏液；
步骤三：电解质及银/氯化银电极流体腔两端腔室加入电解质溶液，具体配方为：1M KCl+10mM Tris溶液，调节PH值至PH8；Ag/AgCl电极分别浸泡在步骤二分隔开的两个腔室之中，电极为0.3mm银丝浸泡在巴氏消毒液中制备而成；
步骤四：设定初始参数，包括初始电压V0，电压增幅ΔV，脉冲持续宽度t0；
步骤五：IV曲线测量。步骤三中Ag/AgCl电极分别连接在Keithley 2450源表的正极(Force Hi)和负极(Force Lo)接口，Keithley 2450输出电压同时测量薄膜两端的电流，并通过线性拟合得到电阻值R；
步骤六：实时小孔孔径显示。利用测量电阻值，根据小孔电导率公式给出纳米孔孔径大小，并实时显示；
步骤七：递增脉冲电压源电击穿打孔。电压源由Keithley 2450提供，脉冲宽度为500ms，脉冲强度由Labview控制输出；
步骤八：参照图2的流程图，根据步骤四，比较纳米孔孔径与目标孔径的关系，反馈分为三种情况控制：
Case1：当前孔径离目标孔径较远，即d≤D-2(nm)
Case2：当前孔径离接近目标孔径，即D-2(nm)<d<D
Case3：当前孔径达到目标孔径，即d≥D
步骤九：根据上述步骤一的三种情况，决定输出脉冲电压源的强度Voutput
Case1：脉冲电压强度为正常递增电压，Voutput＝V0+ΔV*n，n为脉冲次数；即，打孔状态下，第一个脉冲为初始电压强度，之后为每个脉冲强度增加ΔV，以适应不同的膜厚及不同的薄膜材料(如氧化硅)；
Case2：脉冲电压强度为case1的1/3，Voutput＝(V0+ΔV*n)/3，n为脉冲次数；即，在接近纳米孔目标孔径时，降低打孔电压强度，降低扩孔速度；
Case3：脉冲电压强度为安全电压，Voutput＝100mV；达到目标孔径后，主要测量纳米孔孔径，长时间测量以降低噪音的影响；
步骤十：输出脉冲电压，脉冲宽度为500ms；
步骤十一：重复步骤一至步骤三，直至当前孔径值稳定在目标孔径；
步骤十二：纳米孔形成，参见图3,目标孔径为7.5nm的纳米孔制备数据，具体包含薄膜两端电压、电流，以及对应时间测定的薄膜两端电阻和孔径大小。
实施例2：DNA单分子测量
步骤一：DNA样品。所采用DNA样品为Thermo Scientific NoLimits DNAfragments(1000-bp)，取1μLDNA样品加入到200μL电解质溶液中，混合均匀，加入到实例二中已经制备好纳米孔的PMMA流体腔的cis腔室；
步骤二：单分子离子电流信号检测。Trans连接膜片钳放大器(Axon 200B)的正极，cis连接负极。施加电压为200mV，低通滤波100kHz，采样率250kHz，经过10kHz高斯滤波后获得DNA分子过孔信号参见图4；
步骤三：通过MATLAB程序，分析上述DNA单分子测量的统计结果，参见图5；
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法，其特征是：该制备方法包括以下步骤：
S0：将氮化硅薄膜固定在PMMA流体腔中，薄膜两端被隔开成两个独立腔室；两个腔室加入电解质溶液，Ag/AgCl电极的正负电极分别浸泡在分隔开的两个腔室之中，并分别连接至Keithley 2450源表；
S1：Keithley 2450输出电压，同时测量薄膜两端的电流、测量薄膜两端的IV曲线，通过Labview程序线性拟合获得薄膜两端的电阻值R，进而计算出纳米孔的电导Gpore；
S2：通过圆柱模型的纳米孔电导率公式：根据薄膜的厚度l，电解质溶液的电导率σ，S1中计算出的纳米孔电导Gpore计算出纳米孔的当前孔径d，进而作为S3输出电压Voutput的调整依据；
S3:根据当前孔径d与目标孔径D的关系调整输出脉冲电压Voutput，Voutput调整的调整方式分为三种：
Case1：当d≤D–2nm，脉冲电压强度为正常递增电压，Voutput＝V0+ΔV*n；n为脉冲次数，V0为初始电压，ΔV为电压增幅；
Case2：当D–2nm<d<D，脉冲电压强度为case1的1/3，即Voutput＝(V0+ΔV*n)/3；n为脉冲次数，V0为初始电压，ΔV为电压增幅；
Case3：当d≥D,脉冲电压强度为安全电压，即Voutput＝100mV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述电解质溶液的电导率采用电导率仪测出。
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