CN109239112A - 一种用于电镜扫描的样品制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于样品制备技术领域，公开了一种用于电镜扫描的样品制备方法，样品从戊二醛固定液中取出，用PBS缓冲液清洗三次，每次20min；1％锇酸固定1h，pH7.4 PBS清洗三次，每次15min；低浓度梯度乙醇脱水，30％乙醇，50％乙醇各15min；高浓度梯度乙醇脱水。本发明通过电子扫描显微镜(SEM)样品制备技术的探索和改进，不仅成功了制备了蚊虫各个发育时期的电镜样品，而且较全面的对中华按蚊各个发育时期的超细微结构进行电镜拍照和再描述，不仅为昆虫电镜样品制备提供了较为全面的技术，也为中华按蚊的分类学分析提供了更为详细的形态特征数据。

Description

一种用于电镜扫描的样品制备方法

技术领域

本发明属于电镜材料技术领域，尤其涉及一种用于电镜扫描的样品制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

蚊虫的形态分类一般不仅仅借助于成虫的形态特征，还要观察各个发育时期的形态特征进行更为准确的鉴定和分类，才能对种类进行准确的鉴定。

扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)是超微形态学分析中的重要工具。SEM具有分辨率高、视野大、景深长和立体感强等优势，可对光学显微镜下分辨困难的结构进行深入解析。而由于蚊虫个体较小，光学显微镜下一些涉及到的微小的分类特征很难进行观察和鉴别，因此借助于电镜对蚊虫各个发育时期进行细微特征的拍照和特征鉴别也是目前常常采用的形态分类方法。1981年徐锦江等采用戊二醛固定，各级乙醇脱水置换于醋酸乙酯的方法制备电镜样品并对中华按蚊、雷氏按蚊嗜人亚种(A.lesterianthropophagus Xü et Feng)的成蚊体表的喙、触角、平衡棒、中胸盾片、腹部，蛹的呼吸管，卵的细微结构等进行了电镜拍照和观察描述^[13]。1989年柯昭喜等对幼虫样品进行各级酒精脱水，醋酸戊酯置换，液态二氧化碳干燥电镜拍照，并对14种库蚊和6种其他蚊属幼虫颅壳、呼吸管、尾节体表细微结构进行电镜拍照和观察描述^[14]。2010年李旦等采用戊二醛固定过夜，酒精-丙酮梯度脱水，醋酸异戊酯置换的方法制备电镜样品并对白纹伊蚊(Aedesalbopictus)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、中华按蚊和五指库蚊(Cluexbarraudi)的幼虫栉齿、成蚊小盾板、蛹呼吸管和外壁纹饰和卵的超微结构进行了电镜拍照和观察描述^[15]。

而由于蚊虫的幼虫和蛹期电镜样品处理困难的缘故，在对中华按蚊整个发育时期进行详细的电镜扫描和观察描述的分析几乎没有。

本分析在他人分析的基础上，进一步找出了一种制备中华按蚊各个发育时期虫体的电镜样品制备方法，并对中华按蚊各个发育时期的形态特征进行了电镜扫描拍照和形态描述，为蚊虫及相关昆虫电镜样品的制备和中华按蚊的形态分类提供了参考的分析方法和数据基础

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术的样品制备性能差；蚊虫的形态分类一般不仅仅借助于成虫的形态特征，还要观察各个发育时期的形态特征进行更为准确的鉴定和分类，才能对种类进行准确的鉴定；

现有技术中并没有对中华按蚊各个发育时期的形态特征进行电镜扫描拍照和形态描述，不能为蚊虫及相关昆虫电镜样品的制备和中华按蚊的形态分类提供了参考的分析方法和数据基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种扫描电镜材料及制备方法。

本发明是这样实现的，一种用于电镜扫描的样品制备方法，所述用于电镜扫描的样品制备方法包括：

样品从2.5％戊二醛固定液中取出，用pH7.4PBS缓冲液清洗三次，每次20min；

1％锇酸固定1h，pH7.4PBS清洗三次，每次15min；

低浓度梯度乙醇脱水，30％乙醇，50％乙醇各15min；

高浓度梯度乙醇脱水，60％、70％、80％、90％、100％乙醇各15min；

50％叔丁醇，75％、100％叔丁醇各10min；

叔丁醇：乙醇＝2:1，叔丁醇：乙腈＝1:1，乙腈各10min。

进一步，所述的用于电镜扫描的样品制备方法还包括样品的离心；具体包括：

1)先将纯化后的样品离心12000r/8min，弃上清，加入2.5％戊二醛200ul，温室静置5h；

2)静置后12000r/8min，小心吹取上清去掉加入200ul PBS(7.4)，摇匀，摇床混匀20min，后12000r/10min弃上清，留沉淀；完全PBS清洗一次；

3)继续步骤2)操作，且重复两次，后两次加入500ul PBS清洗；

3)50％乙醇脱水后12000r/15min，弃上清，留沉淀。

进一步，所述用于电镜扫描的样品制备方法还包括：

(1)风干后的卵粒直接均匀的平铺在导电胶带上后，吹风，卵粒粘连在胶带上后，用离子溅射仪镀膜1.5min后在5kv电压下进行拍照；

(2)取得中华按蚊羽化成成蚊之后留下的蛹皮，羽化三天的雌蚊和雄蚊至于-20℃冰柜冷冻3～5分钟；用双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，经0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次；样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水50％乙醇10～15min、70％乙醇10～15min、80％乙醇10～15min、90％乙醇10～15min、95％乙醇10～15min、100％乙醇2次每次30min；之后叔丁醇与乙醇混合液置换至100％叔丁醇；移入叔丁醇低温冷冻干燥机的模子中，在样品表面滴上100％叔丁醇，将样品置于4℃以下使样品快速固化；后置于VFD-21S叔丁醇冷冻干燥剂使样品在真空中升华干燥；用特质的导电胶带将样品固定在金属样品台上，用MSP-2S型离子溅射镀膜仪进行镀膜；最后置于SU3500型扫描电子显微镜下拍照；

(3)取得三龄时期的中华按蚊幼虫，于小白瓷碗中，饲养一至二天得到四龄幼虫；双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，用0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次，用1％锇酸固定1h，0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次；样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于电镜扫描的样品制备方法的用于电镜扫描的样品制备设备。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明将样品按背面和腹面的姿势置于黑色导电双面胶上，E-1010型离子溅射镀膜仪镀膜。扫描电镜S-3000N下观察各组织结构并照相。样品结构清晰，为下一步分析提供保证。

本发明对蚊虫的特征进行扫描电镜观察是形态学分析的重要手段，分析在蚊虫各个发育时期电镜样品制备技术上基于前人的分析进行了探索和创新。由于蚊卵卵壳的几丁质层较硬，且卵的含水量和失水性底的特点，在本次分析中，蚊卵采用自然干燥的方式进行制样，虽然电镜观察下有少部分样品发生形变，但是并不影响整体上蚊卵结构的观察和拍照。蚊虫的幼虫和蛹都生活在水中，其含水量和失水性都要明显高于其他的陆生昆虫，而幼虫皮和蛹壳的含水量很低，且能够较完整的展现蚊虫幼虫期和蛹期的形态特征，但在取样过程中，由于蚊虫个体较小，幼虫皮较薄的特性，在逐级脱水过程中，极易发生损坏，因此本分析中华按蚊幼虫期和蛹期的取样分别是IV龄幼虫和蛹皮，但是建议陆生或者个体较大的昆虫可以采用取幼虫皮来进行制样的方法，避免制样和拍照过程中失水造成虫体发生较大的形变。

在制备样品固定过程中，成蚊和蛹壳由于含水量较低，延用了许锦江等(1981年)的方法，使用PH7.4磷酸缓冲液配置的浓度为6％戊二醛进行固定。但是对于IV龄幼虫的电镜样品，为了避免样品发生较大的形变，在进行6％戊二醛固定之后，将样品置于1％锇酸溶液中4℃1h固定，使其形态更为稳固。2014年杨瑞等采用微波和3％戊二醛中加入氯化钠及吐温-80的方法，固定了桃蛀螟幼虫电镜样品，效果。

在蚊虫幼虫、蛹和成蚊电镜样品的脱水和干燥阶段，此次分析脱水过程采取乙醇梯度，该操作不仅简便而且安全。不同于以往的临界点干燥法，此次试验中采用的是叔丁醇真空冷冻干燥法，在李向党(1993年)等分析中涉及到的单用叔丁醇的扫描电镜样品的制备方法，在原先乙醇梯度脱水之后，用叔丁醇与乙醇以一系列浓度梯度比进行置换至100％叔丁醇干燥，后置于叔丁醇冷冻干燥机让样品在真空下迅速升华干燥，使样品在较短时间内达到干燥，避免了形变的发生。

本发明通过电子扫描显微镜(SEM)样品制备技术的探索和改进，不仅成功了制备了蚊虫各个发育时期的电镜样品，而且较全面的对中华按蚊各个发育时期的超细微结构进行电镜拍照和再描述，不仅为昆虫电镜样品制备提供了较为全面的技术，也为中华按蚊的分类学分析提供了更为详细的形态特征数据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于电镜扫描的样品制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的中华按蚊雄蚊整体及头部电镜扫描图。

图3是本发明实施例提供的中华按蚊雄蚊胸部电镜扫描图。

图4是本发明实施例提供的中华按蚊雄蚊腹部电镜扫描图。

图5是本发明实施例提供的中华按蚊雌蚊头部电镜扫描图。

图6是本发明实施例提供的中华按蚊雌蚊喙电镜扫描图。

图7是本发明实施例提供的中华按蚊雌蚊外生殖器电镜扫描图。

图8是本发明实施例提供的中华按蚊蛹壳整体及呼吸管电镜扫描图。

图9是本发明实施例提供的中华按蚊雄蚊及雌蚊蛹时期外生殖器电镜扫描图。

图10是本发明实施例提供的中华按蚊四龄幼虫时期头部电镜扫描图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1，本发明实施例提供的用于电镜扫描的样品制备方法，包括：

S101：样品从2.5％戊二醛固定液中取出，用pH7.4PBS缓冲液清洗三次，每次20min；

S102：1％锇酸固定1h，pH7.4PBS清洗三次，每次15min；

S103：低浓度梯度乙醇脱水，30％乙醇，50％乙醇各15min；

S104：高浓度梯度乙醇脱水，60％、70％、80％、90％、100％乙醇各15min；

S105：50％叔丁醇，75％、100％叔丁醇各10min；

S106：叔丁醇：乙醇＝2:1，叔丁醇：乙腈＝1:1，乙腈各10min。若来不及观察，可先放置在4℃冰箱保存。

S107：将样品按背面和腹面的姿势置于黑色导电双面胶上，E-1010型离子溅射镀膜仪镀膜。

S108：扫描电镜S-3000N下观察各组织结构并照相.

所述的用于电镜扫描的样品制备方法还包括样品的离心；具体包括：

1)先将纯化后的样品离心12000r/8min，弃上清，加入2.5％戊二醛200ul，温室静置5h；

2)静置后12000r/8min，小心吹取上清去掉加入200ul PBS(7.4)，摇匀，摇床混匀20min，后12000r/10min弃上清，留沉淀；完全PBS清洗一次；

3)继续步骤2)操作，且重复两次，后两次加入500ul PBS清洗；

3)50％乙醇脱水后12000r/15min，弃上清，留沉淀。

本发明将样品按背面和腹面的姿势置于黑色导电双面胶上，E-1010型离子溅射镀膜仪镀膜。扫描电镜S-3000N下观察各组织结构并照相。样品结构清晰，为下一步分析提供保证。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

1材料与方法

1.1实验蚊虫

用于本分析的中华按蚊各个发育时期的虫体均来自重庆师范大学昆虫与分子生物学分析所蚊虫饲养室的中华按蚊江苏无锡的实验室(WX-LS)品系。蚊虫饲养室的饲养条件：光周期为12h光照：8h黑暗；饲养温度为(27±1)℃；相对湿度为70％～75％。

1.2实验重要仪器

VFD-21S型真空冷冻干燥仪(美国，IXRF公司)，MSP-2S型磁控离子溅射仪(美国，IXRF公司)，SU3500扫描电子显微镜(日本，日立)。

1.3实验试剂

(1)双蒸水。

(2)0.1M PH7.4磷酸缓冲液(PBS)：磷酸氢二钠(十二水)40.5ml约1.263g，磷酸二氢钠(二水)9.5ml约0.680g，双蒸水定容至100ml。

(3)6％戊二醛：市售50％戊二醛12ml，0.2M PH7.4磷酸缓冲液(PBS)50ml，双蒸水定容至100ml。

(4)各级浓度乙醇：50％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，100％乙醇。

(5)各级浓度叔丁醇与乙醇混合液：70％叔丁醇和30％乙醇，80％叔丁醇和20％乙醇，90％叔丁醇和10％乙醇，100％叔丁醇。

(6)1％锇酸。

1.4取样方法

(1)卵：取产卵后8～10h的卵100个左右，放置在滤纸上自然风干2～3h；

(2)幼虫：取Ⅳ龄幼虫8～10只，用吸管吸取双蒸水反复清洗2～3次后制样，清洗过程要尽量小心，避免损坏幼虫形态；

(3)蛹：用牙签挑取羽化后的蛹皮雌、雄各8-10个，轻轻放在75％的乙醇溶液中，轻微的清洗2～3次(每次清洗都用牙签轻轻挑出放在需清洗的溶液中)；

(4)成蚊：取羽化3～5天的雌雄成蚊各5只，至于-20℃的冰箱中冷冻3～5min后制样。

1.5电镜样品的制备方法

(1)卵：风干后的卵粒直接均匀的平铺在导电胶带上后，轻微吹风，保证卵粒都粘连在胶带上后，用离子溅射仪镀膜1.5min后在5kv电压下进行观察和拍照。

(2)蛹皮及成蚊：取得中华按蚊羽化成成蚊之后留下的蛹皮，羽化三天的雌蚊和雄蚊至于-20℃冰柜冷冻3～5分钟。用双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，经0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次。样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水50％乙醇10～15min、70％乙醇10～15min(可置于4℃冰箱过夜)、80％乙醇10～15min、90％乙醇10～15min、95％乙醇10～15min、100％乙醇2次每次30min。之后叔丁醇与乙醇混合液置换至100％叔丁醇(70％叔丁醇和30％乙醇，80％叔丁醇和20％乙醇，90％叔丁醇和10％乙醇，100％叔丁醇/2次，每次5～10min)，用牙签轻轻地移入叔丁醇低温冷冻干燥机的模子中，在样品表面滴上100％叔丁醇，将样品置于4℃以下使样品快速固化。后置于VFD-21S叔丁醇冷冻干燥剂使样品在真空中升华干燥。用特质的导电胶带将样品固定在金属样品台上，用MSP-2S型离子溅射镀膜仪进行镀膜。最后置于SU3500型扫描电子显微镜下观察拍照。

(3)四龄幼虫：取得三龄时期的中华按蚊幼虫，于小白瓷碗中，饲养一至二天得到四龄幼虫。双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，用0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次，用1％锇酸固定1h(可放置于4℃冰箱)，0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次。样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水，叔丁醇与乙醇混合液置换等之后步骤与成蚊和蛹壳的步骤方法一致。

2结果与分析

2.1成蚊

2.1.1雄蚊

(1)头部

复眼，稠密而整齐的排列，单个复眼圆润饱满(图2C)。触角一对，雄蚊触角末端有两节膨大，向外弯曲，内侧分布有长须毛，整个触角布满毛鳞片。触须一对，呈现类似于马尾状，但不同的是有一中心轴，所有的长毛由中心轴的某个节点发出，大约有13个中心的节点，形成一条触须(图2B)。雄蚊与雌蚊的梗节存在明显差异，雄蚊梗节类似于中间凹陷的圆饼状(图2C)，雌蚊较雄蚊饱满呈球状(图5B)，触须喙，细长表面布满鳞片和小毛，末端唇瓣布满刚毛和小毛。

(2)胸部

中胸发达，背板占据全胸背，中胸有一对气门，为前气门。后胸一对平衡棒，平衡棒有一膨大的基部似铰链状关节、细长的棒柄以及结节状膨大的头部构成，其中头部布满鳞片，整个平衡棒布满小毛(图3A)。后胸也有一对气门，为后气门。中胸小盾板后缘呈弧形，缘毛均匀分布。

(3)腹部

雄性中华按蚊腹部末端的尾器有一对钳状抱肢(图4B,4C,4D)，抱肢基节有鳞片，小毛及刚毛附着，抱肢端节向内折叠弯曲，相互交错，且抱肢端节明显长于抱肢基节。

图2中华按蚊雄蚊整体及头部电镜扫描图，A：中华按蚊雄蚊整体B：雄蚊触须触角喙C：雄蚊复眼D：雄蚊触须端部；其中，AbS-腹部气门；Ant-触角；AS-触角窝；Ce-尾毛；CE-复眼；CS-颈硬结；Cv-颈部；Fl-鞭毛；Flm-鞭小节；FW-鞭毛螺纹；FT-额叶丛；Ge-颊；CoF-角膜小面；Hl-绞索；La-唇；LBS-唇基毛；Lg-韧带；Mem-体节；Mm-中胸气门；Mplp-下颚须；Ms-中胸前侧片；MS-中胸气门；Msm-中腹节；Mtpn-后背板；MtS-后胸气门；OcS-眼板；OSc-眼缝合；P-吻；Pa-侧背片；Pe-梗节；PG-盾颊；PgS-刚毛；PGL-生殖后叶；PK-翼前旋钮；Pl-负颚须节；PMe-胸膜；Prm-前颏；PrN-前背板；Ps-前胸前侧片；S-胸骨；Sal-后上侧片；Scu-盾片；Stm-小盾板；Te-背板；W-翼。

图3中华按蚊雄蚊胸部电镜扫描图，A：雄蚊腹部整体B：平衡棒C：后足附节第三至第五节D：后足爪勾。其中：AEC-上前侧板裂缝；AnA-前翼区；AnS-翅前部；AnSc-前额；Ap-前胸背板；ApS-前额叶；Ba-前上侧片；Ca-肱骨小头；Em-爪间突；Hl-绞索；HyA-下裂区；ICI-节段间裂；iss-节段间缝合；LPt-下胸膜翼；Mam-间翼；Mem-元翼；MeSl-下半侧毛；MeSU-下半侧毛；Mkm-下后侧片；Mks-中膜上位；MkSL-下甲；MkSU-上甲；mts-中胸膜缝合；MS-中胸气门；MScL-下中膜；MScU-上中胸膜；Mtm-后胸后侧片；Mtn-后胸前侧片；Mtpn-后背板；Mtr-中转节；mts-上胸膜缝合；Mts-后胸前测片；MtS-上胸气门；Pa-侧背片；PA-后气孔；PAP-胸膜突窝；PaS-翅前桥刚毛；Pc-梗节；PCP-胸膜髋突；PeSU-上胸骨柄刚毛；PK-翼前旋钮；Pm-前胸后侧片；PM-前额骨后膜；PMas-后内侧脑膜；PnS-侧背板翅缝合；Ppn-后前胸背板；PpS-前毛；PrB-翼前桥；PrP-前切坑；PrS-表皮下缝合；ps-胸膜前缝合；Ps-上胸骨；PsA-前腔区；pwp-胸膜翼突；SA-气孔；SaA-翅上鬃；SaG-翼上沟；ScA-盾形角；Scu-长形盾；SF-前盾窝；Sl-平衡棒基；SpS-气门盾片；Ta-ш-后足附节；U-ш-后足爪勾；UPSc-上前突。

图4中华按蚊雄蚊腹部电镜扫描图；A：雄蚊腹部整体B-C：雄蚊外生殖器腹面D：雄蚊外生殖器侧面。

BLA-基侧臂；Ce-尾毛；Gc-生殖突基节；Gs-生殖刺突；PGL-后生殖器；S-胸板；Te-背板；W-翼。

2.1.2雌蚊

(1)头部

触角一对，末端逐渐变细，向外弯曲，表面布满鳞片(图5A)。触须一对，细长末端逐渐变窄，基部有少量鳞片附着，整个触须布满刚毛和小毛(图5C,5D)。喙，由上内唇及上唇咽、舌各一个，上、下颚各一对，共同组成细长的针管结构，包藏在鞘状下唇之间。下唇表面附着毛鳞片，刚毛以及小毛，末端裂为两片为唇瓣，其表面仅有刚毛和小毛附着。上颚末端较宽呈现刀状，内侧分布细锯齿，用于切割皮肤；下颚末端较窄呈现细刀状，末端具有粗锯齿，在上颚切开皮肤后用于锯刺皮肤(图6)。这也是雌蚊用于吸食血液的重要工具。

(2)腹部

雌性中华按蚊腹部末端的尾器为一对向内弯曲的尾须，其上布满刚毛和小毛(图8)。

图5中华按蚊雌蚊头部电镜扫描图；A：雌蚊头部整体B：复眼及触角梗节C-D：触须端部

其中，Ant-触角；AS-触角窝；CE-复眼；Mplp-上颚须；PE-梗节。

图6中华按蚊雌蚊喙电镜扫描图；A-C：雌蚊喙外观D：雌蚊上颚。

其中，La-唇瓣；LaBS-唇基硬结；LaS-唇硬结；Lg-唇舌；Mn-上颚；Prm-前颏。

图7中华按蚊雌蚊外生殖器电镜扫描图，A：雌蚊外生殖器背面B-C：雌蚊外生殖器侧面D：雌蚊外生殖器腹面。其中，Ce-尾毛；Go-生殖口；PGL-生殖后叶；Pr-载肛突；S-胸板；Te-背板。

2.2蛹

中华按蚊蛹与其他蚊较为不同，其呼吸管开口呈锐角三角形(图8C)。呼吸管管缘有一圈较为平滑整齐的钝圆齿，每个钝圆齿呈现锐角三角形。呼吸管外壁表面有较多的锯齿状突起，每一个突起的背面中央均有一条纵脊。呼吸管内壁表面布满微细管状的分枝，每个小枝之间相互连接而形成许多组，每组约有4～6枝，在连接处各有一个较小的中心部(图8D)。在对中华按蚊蛹时期的观察鉴定，可以从呼吸管的管缘、外壁、内壁进行分析。

尾鳍为两瓣，呈扇形，齿缘较长，缘毛短而少。每一瓣2/3靠近中间的位置有一条贯穿整个尾鳍的长中轴，且在最外端有两根较长的长枝。

雄性中华按蚊蛹时期的外生殖器较雌性长，对称，且由外生殖器到末端逐渐变得扁平，末端正中心位置有微小且向内裂开的口子，表面光滑有不规则的横纹(图9A,9B)。雌性中华按蚊蛹时期的外生殖器较短小，且呈现圆形，末端有对称呈现镰刀状的钩子，表面平整，外缘有呈现刺状的突起(图9C,9D)。

图8中华按蚊蛹壳整体及呼吸管电镜扫描图，A：蛹壳整体B：呼吸管正面C：呼吸管覆面D：呼吸管内壁。其中，A-触角；FA-滤器；Mea-管；Pa-尾鳍；Pi-羽；T-呼吸管；MW-中胸翼。

图9中华按蚊雄蚊及雌蚊蛹时期外生殖器电镜扫描图，A-B：雄蚊蛹时期外生殖器C-D：雌蚊蛹时期外生殖器。

其中，Bu-铰板；ce-尾毛；Gl-生殖叶；Mr-中脉；Pa-尾鳍；Se-边缘锯齿；Sp-边缘针。

2.3四龄幼虫

幼虫头部呈现莲花状，口刷毛简单不分支。中华按蚊幼虫颅壳有一些零碎的长微棘，存在方式为单个存在或排成行(图10A)。触角上明显有数量众多的分布不规则，大小不一，形态大多为刺状的感受器，这些感受器主要作用的部位尚不明确。触角最顶端有两根较大的分叉，基部生长一些细小的分叉(图10D)。

图10中华按蚊四龄幼虫时期头部电镜扫描图，A：四龄幼虫头部正面B：四龄幼虫头部腹面C-D：触角。其中，A-触角；APr-触角突起；CG-冠状间隙；Col-颈部项圈；DAp-下颌骨顶；LPB-侧腭刷；Mn-下颌骨；Mx-上颌骨；Vm-腹突。

2.4卵

蚊卵整体呈船形，船面较其他蚊种大，长度约为0.5毫米，宽度约为0.18毫米，表面有分布均匀呈细粒状的小突起(图10A,10B)，且分布呈现五边形或六边形的花纹结构，其中以六边形居多(图10D)这是中华按蚊区别于其他蚊种的一个特征。浮器长约0.3毫米，浮肋数22～24条，前隆饰约有5～7个，后隆饰约有4～6个，每个隆饰约有6～10瓣，期间有细丝相连。卵背面两端较为圆钝称为精孔区，精孔区的外围有一圈花瓣形的护环与之相连，护环表面平整光滑，一般为7瓣，相互之间有细丝相连接。精孔扁平凹陷，大部分的凹陷中心可见一小结节(图10C)。

图10中华按蚊蚊卵时期电镜扫描图，A：蚊卵背面B：蚊卵腹面C：蚊卵端部及精孔区D：蚊卵背面网纹。其中，De-甲板；DeT-甲板结节；FR-浮器；Fr-褶边；LoT-隆饰；Mi-精孔；MiC-珠孔领；MiD-珠孔盘；OCT-外绒毛结节。

下面结合效果对本发明作进一步描述。

对蚊虫的特征进行扫描电镜观察是形态学分析的重要手段，本分析在蚊虫各个发育时期电镜样品制备技术上基于前人的分析进行了探索和创新。由于蚊卵卵壳的几丁质层较硬，且卵的含水量和失水性底的特点，在本次分析中，蚊卵采用自然干燥的方式进行制样，虽然电镜观察下有少部分样品发生形变，但是并不影响整体上蚊卵结构的观察和拍照。蚊虫的幼虫和蛹都生活在水中，其含水量和失水性都要明显高于其他的陆生昆虫，而幼虫皮和蛹壳的含水量很低，且能够较完整的展现蚊虫幼虫期和蛹期的形态特征，但在取样过程中，由于蚊虫个体较小，幼虫皮较薄的特性，在逐级脱水过程中，极易发生损坏，因此本分析中华按蚊幼虫期和蛹期的取样分别是IV龄幼虫和蛹皮，但是建议陆生或者个体较大的昆虫可以采用取幼虫皮来进行制样的方法，避免制样和拍照过程中失水造成虫体发生较大的形变。

在制备样品固定过程中，成蚊和蛹壳由于含水量较低，延用了许锦江等(1981年)的方法，使用PH7.4磷酸缓冲液配置的浓度为6％戊二醛进行固定。但是对于IV龄幼虫的电镜样品，为了避免样品发生较大的形变，在进行6％戊二醛固定之后，将样品置于1％锇酸溶液中4℃1h固定，使其形态更为稳固。2014年杨瑞等采用微波和3％戊二醛中加入氯化钠及吐温-80的方法，固定了桃蛀螟幼虫电镜样品，效果。

在蚊虫幼虫、蛹和成蚊电镜样品的脱水和干燥阶段，此次分析脱水过程采取乙醇梯度，该操作不仅简便而且安全。不同于以往的临界点干燥法，此次试验中采用的是叔丁醇真空冷冻干燥法，在李向党(1993年)等分析中涉及到的单用叔丁醇的扫描电镜样品的制备方法，在原先乙醇梯度脱水之后，用叔丁醇与乙醇以一系列浓度梯度比进行置换至100％叔丁醇干燥，后置于叔丁醇冷冻干燥机让样品在真空下迅速升华干燥，使样品在较短时间内达到干燥，避免了形变的发生。

本发明通过电子扫描显微镜(SEM)样品制备技术的探索和改进，不仅成功了制备了蚊虫各个发育时期的电镜样品，而且较全面的对中华按蚊各个发育时期的超细微结构进行电镜拍照和再描述，不仅为昆虫电镜样品制备提供了较为全面的技术，也为中华按蚊的分类学分析提供了更为详细的形态特征数据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于电镜扫描的样品制备方法，其特征在于，所述用于电镜扫描的样品制备方法包括：

样品从2.5％戊二醛固定液中取出，用pH7.4PBS缓冲液清洗三次，每次20min；

1％锇酸固定1h，pH7.4PBS清洗三次，每次15min；

低浓度梯度乙醇脱水，30％乙醇，50％乙醇各15min；

高浓度梯度乙醇脱水，60％、70％、80％、90％、100％乙醇各15min；

50％叔丁醇，75％、100％叔丁醇各10min；

叔丁醇：乙醇＝2:1，叔丁醇：乙腈＝1:1，乙腈各10min。

2.如权利要求1所述的用于电镜扫描的样品制备方法，其特征在于，所述的用于电镜扫描的样品制备方法还包括样品的离心；具体包括：

1)先将纯化后的样品离心12000r/8min，弃上清，加入2.5％戊二醛200ul，温室静置5h；

2)静置后12000r/8min，小心吹取上清去掉加入200ul PBS(7.4)，摇匀，摇床混匀20min，后12000r/10min弃上清，留沉淀；完全PBS清洗一次；

3)继续步骤2)操作，且重复两次，后两次加入500ul PBS清洗；

3)50％乙醇脱水后12000r/15min，弃上清，留沉淀。

3.如权利要求1所述的用于电镜扫描的样品制备方法，其特征在于，所述用于电镜扫描的样品制备方法还包括：

(1)风干后的卵粒直接均匀的平铺在导电胶带上后，吹风，卵粒粘连在胶带上后，用离子溅射仪镀膜1.5min后在5kv电压下进行拍照；

(2)取得中华按蚊羽化成成蚊之后留下的蛹皮，羽化三天的雌蚊和雄蚊至于-20℃冰柜冷冻3～5分钟；用双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，经0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次；样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水50％乙醇10～15min、70％乙醇10～15min、80％乙醇10～15min、90％乙醇10～15min、95％乙醇10～15min、100％乙醇2次每次30min；之后叔丁醇与乙醇混合液置换至100％叔丁醇；移入叔丁醇低温冷冻干燥机的模子中，在样品表面滴上100％叔丁醇，将样品置于4℃以下使样品快速固化；后置于VFD-21S叔丁醇冷冻干燥剂使样品在真空中升华干燥；用特质的导电胶带将样品固定在金属样品台上，用MSP-2S型离子溅射镀膜仪进行镀膜；最后置于SU3500型扫描电子显微镜下拍照；

(3)取得三龄时期的中华按蚊幼虫，于小白瓷碗中，饲养一至二天得到四龄幼虫；双蒸水反复清洗，6％戊二醛固定1～3h，用0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次，用1％锇酸固定1h，0.1M磷酸缓冲液清洗8～9次；样品经漂洗后用逐级增高浓度的乙醇脱水。

4.一种利用权利要求1所述用于电镜扫描的样品制备方法的用于电镜扫描的样品制备设备。