JP2012512641A - ミオスタチン結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)配列番号7または配列番号25から選択される重鎖可変領域;および/または配列番号8または配列番号21から選択される軽鎖可変領域;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域または軽鎖可変領域;もしくは
(ii)配列番号26の重鎖;および/または配列番号27または配列番号37から選択される軽鎖;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖
を含む抗原結合タンパク質も提供する。
(i)配列番号12、13または14のいずれか1つから選択される重鎖可変領域;および/または配列番号15、16、17、18また24のいずれか1つから選択される軽鎖可変領域;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域または軽鎖可変領域;もしくは
(ii)配列番号28、29、30、98または99のいずれか1つから選択される重鎖;および/または配列番号31、32、33、34または40のいずれか1つから選択される軽鎖;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖
を含む抗原結合タンパク質も提供する。
CDRH1基準: Y32I、Y32H、Y32F, Y32T、Y32N、Y32C、Y32E、Y32D、F33Y、F33A、F33W、F33G、F33T、F33L、F33V、M34I、M34V、M34W、H35E、H35N、H35Q、H35S、H35Y、H35T;
CDRH2基準: N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F、N58Y;
CDRH3基準: V102Y、V102H、V102I、V102S、V102D、V102G;
CDRL1基準: D28N、D28S、D28E、D28T、I29V、N30D、N30L、N30Y、N30V、N30I、N30S、N30F、N30H、N30G、N30T、S31N、S31T、S31K、S31G、Y32F、Y32N、Y32A、Y32H、Y32S、Y32R、L33M、L33V、L33I、L33F、S34A、S34G、S34N、S34H、S34V、S34F;
CDRL2基準: A51T、A51G、A51V;
CDRL3基準: L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、L96F。
H2: G55D、G55L、G55S、G55T、G55V;
H3: Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N、V102S;
L3: C91S。
重鎖:位置2のV、IまたはG;位置4のLまたはV;位置20のL、I、MまたはV;位置22のC;位置24のT、A、V、GまたはS;位置26のG;位置29のI、F、LまたはS;位置36のW;位置47のWまたはY47;位置48のI、M、VまたはL;位置69のI、L、F、MまたはV;位置78のA、L、V、YまたはF;位置80のLまたはM;位置90のYまたはF;位置92のC;および/または位置94のR、K、G、S、HまたはN;および/または
軽鎖:位置2のI、LまたはV;位置3のV、Q、LまたはE;位置4のMまたはL;位置23のC;位置35のW;位置36のY、LまたはF;位置46のS、L、RまたはV;位置49のY、H、FまたはK;位置71のYまたはF;位置88のC;および/または位置98のF。
無傷抗体
ほとんどの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと呼ばれる2つの型のうちの1つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は、5つの異なるクラス IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り当てられ得る。IgGおよびIgAは、さらに、サブクラス IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4;ならびにIgA1およびIgA2に細分され得る。種変異体は、少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットに伴って存在する。
ヒト抗体は、当業者に既知の多数の方法により産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞株を用いて、ハイブリドーマ法により作製され得る(Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001および Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照)。代替的方法としては、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用(これらはともに、ヒト可変領域レパートリーを利用する)が挙げられる(Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455;Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23参照)。
キメラ抗体は、典型的には、組換えDNA法を用いて産生される。慣用的手法を用いて(例えば、抗体のHおよびL鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)、抗体をコードするDNA(例えば、cDNA)が単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの典型的供給源として役立つ。一旦単離されると、DNAは発現ベクター中に入れられ、これは次に、別の状況では抗体の合成を得るために免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌、COS細胞、CHO細胞または骨髄腫細胞中にトランスフェクトされる。DNAは、ヒトLおよびH鎖に関するコード配列を対応する非ヒト(例えばネズミ)HおよびL定常領域の代わりに置換することにより修飾され得る(例えば、Morrison (1984) PNAS 81: 6851参照)。
二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも2つの異なるエピトープに関する結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。このような抗原結合タンパク質の製造方法は、当該技術分野で既知である。伝統的に、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え的産生は、2つの免疫グロブリンH鎖−L鎖の同時発現に基づいており、この場合、2つのH鎖は異なる結合特異性を有する(Millstein et al. (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829;およびTraunecker et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659参照)。HおよびL鎖の無作為取り合わせのため、10個の異なる抗体構造の考え得る混合物が産生され、このうちの1つだけが所望の結合特異性を有する。代替的アプローチは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域と融合することを包含する。軽鎖結合に必要な部位を含有するCH1領域は、縮合物のうちの少なくとも1つに存在し得る。これらの融合物をコードするDNA、ならびに所望により、L鎖は、別個の発現ベクター中に挿入され、次いで、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトされる。しかし、2つまたは3つ全ての鎖に関するコード配列を1つの発現ベクター中に挿入することが可能である。一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕における第一結合特異性を有するH鎖、ならびに他方の腕における第二結合特異性を提供するH−L鎖対で構成される(WO 94/04690参照)。Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210も参照されたい。
定常領域を欠く断片は、古典的経路により補体を活性化する能力、または抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を欠く。伝統的に、このような断片は、例えばパパイン消化による無傷抗体のタンパク質分解的消化により産生される(例えばWO 94/29348参照)が、しかし、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接産生されることもある。ScFvの産生に関しては、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426を参照されたい。さらに、抗原結合断片は、下記のような種々の工学処理技法を用いて産生され得る。
ヘテロ接合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて形成される2つの共有的に結び付けられた抗体からなる(例えば、US4,676,980参照)。
本発明の抗原結合タンパク質は、それらのエフェクター機能を増強するかまたは変えるために、他の修飾を含み得る。抗体のFc領域と種々のFc受容体(FcγR)との間の相互作用は、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、補体の固定、食作用ならびに抗体の半減期/クリアランスを包含する抗体のエフェクター機能を媒介する、と考えられる。抗体のFc領域に対する種々の修飾は、所望の特性に依って実行され得る。例えば、別の状況では溶解性である抗体を非溶解性にさせるFc領域における特異的突然変異は、EP0629 240およびEP0307 434に詳述されており、あるいは、血清半減期を増大するために抗体中にサルベージ受容体結合エピトープを組み入れ得る(US5,739,277参照)。ヒトFcγ受容体としては、FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよび新生児FcRnが挙げられる。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604は、共通組のIgG1残基が全てのFcγRsを結合するのに関与するが、一方、FcγRIIおよびFcγRIIIはこの共通組の範囲外の別個の部位を利用する、ということを実証した。IgG1残基の一群は、アラニン:Pro−238、Asp−265、Asp−270、Asn−297およびPro−239に変更された場合、全てのFcγRとの結合を低減した。全てがIgG CH2ドメイン中に存在し、CH1およびCH2をつなぐヒンジの近くに群をなす。FcγRIは結合のためにIgG1残基の共通組のみを利用するが、しかしFcγIIおよびFcγRIIIは、共通組のほかに、別個の残基と相互作用する。いくつかの残基の変更は、FcγRII(例えばArg−292)またはFcγRIII(例えば、Glu−293)との結合のみを低減した。いくつかの変異体は、FcγIIまたはFcγRIIIとの改良された結合を示したが、しかし、他の受容体との結合に作用しなかった(後Ser−267Alaは、FcγIIとの結合を改良したが、しかしFcγRIIIとの結合は作用を受けなかった)。他の変異体は、FcγIIまたはFcγRIIIとの改良された結合を示し、他の受容体との結合の低減を伴った(例えば、Ser−298AlaはFcγIIIとの結合を改良し、FcγRIIとの結合を低減した)。FcγIIIaに関して、最良の結合IgG1変異体は、Ser−298、Glu−333およびLys−334でのアラニン置換を併有した。新生児FcRn受容体は、抗体クリアランスおよび組織全体の経細胞輸送の両方に関与すると考えられる(Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57;およびGhetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766参照)。ヒトFcRnと直接的に相互作用するよう決定されたヒトIgG1残基としては、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435が挙げられる。この節に記載された位置のいずれかでの置換は、抗体の血清半減期増大および/またはエフェクター特性変更を可能にし得る。
抗原結合タンパク質は、トランスジェニック生物、例えばヤギ(Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157参照)、ニワトリ(Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55参照)、マウス(Pollock et al.参照)または植物(Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590参照)中で産生され得る。
抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のN末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として産生され得る。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシングされるはずである。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性腸毒素IIリーダーであり得る。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであり得る(例えばWO90/13646参照)。哺乳類細胞系では、ウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルおよびネイティブ免疫グロブリンシグナル配列が適切であり得る。典型的には、シグナル配列は、リーディングフレーム中で、抗原結合タンパク質をコードするDNAと結紮される。配列番号9で示されるようなシグナル配列が用いられ得る。
複製の起点は当該技術分野で周知であり、ほとんどのグラム陰性細菌に関してはpBR322、ほとんどの酵母に関しては2μプラスミド、そしてほとんどの哺乳類細胞に関しては種々のウイルス起点、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVが適している。一般的に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターのためには必要でないが、しかし早期プロモーターを含有するため、SV40が用いられ得る。
典型的選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、あるいは(b)栄養要求性欠損を補足し、または複合培地中で利用可能でない栄養素を供給する、あるいは(c)両方の組合せであるタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止することを包含し得る。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時送達された選択マーカーにより付与される薬剤抵抗性のために生き残る。一例は、DHFR選択マーカーであって、この場合、形質転換体はメトトレキサートの存在下で培養される。細胞は、漸増量のメトトレキサートの存在下で培養されて、当該外因性遺伝子のコピー数を増幅し得る。CHO細胞は、DHFR選択のために、特に有用な細胞株である。さらなる一例は、グルタミン酸合成酵素発現系(Lonza Biologics)である。酵母に用いるための選択遺伝子の一例は、trp1遺伝子である(Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38参照)。
抗原結合タンパク質を発現するための適切なプロモーターは、抗原結合タンパク質をコードするDNA/ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターとしては、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばTacが挙げられる。酵母細胞における発現に適したプロモーターとしては、3−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセラートムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導可能な酵素プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、ならびに窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。
例えば高等真核生物に関して適切である場合、ベクター中でプロモーター要素に操作可能的に連結されるエンハンサー要素が用いられ得る。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質およびインスリンからのエンハンサー要素が挙げられる。代替的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサー要素、例えばSV40エンハンサー(bp100〜270で)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミIgG2a遺伝子座を用い得る(WO04/009823参照)。エンハンサーは、プロモーターに対して蒸留の部位でベクター上に置かれ得る。代替的には、エンハンサーは、他の場所に、例えば非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に置かれ得る。エンハンサーの選択および位置決めは、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。
真核生物系において、ポリアデニル化シグナルは、抗原結合タンパク質をコードするDNA/ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。このようなシグナルは、典型的には、オープンフレームワークの3’に配置される。哺乳類系では、非限定例としては、成長ホルモンに由来するシグナル、伸長因子1αおよびウイルス(例えばSV40)遺伝子またはレトロウイルス長末端反復が挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化/終結シグナルとしては、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)およびアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH)遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、典型的には必要とされず、その代わりに、より短く、より限定されたターミネーター配列を用いることが常である。ポリアデニル化/終結配列は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。
上記のほかに、収量を高めるために用いられ得るその他の特徴としては、クロマチンリモデリング要素、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン修飾が挙げられる。
抗原結合タンパク質をコードするクローニングまたは発現ベクターのための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。適切な原核生物細胞としては、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌属、例えば大腸菌(例えば、ATCC 31,446;31,537;27,325)、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア族、例えばセラチア・マルセセンス、および赤痢菌属、ならびにバスラス属、例えば枯草菌およびバシラス・リケニフォルミス(DD266 710参照)、シュードモナス属、例えば緑膿菌、およびストレプトミセス属が挙げられる。酵母宿主細胞のうち、出芽酵母、分裂酵母、クルイベロミセス(例えば、ATCC 16,045;12,424;24178;56,500)、ヤロウイア属(EP402,226)、メタノール資化酵母(EP 183070、Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192も参照)、カンジダ属、トリコデルマ・リーシア(EP 244234)、ペニシリン、トリポクラジウム属およびアスペルギルス属宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランスおよびクロカビも意図される。
抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に既知の任意の方法により培養され得る。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトルまたは中空繊維系中で培養され得るが、しかし、大量生産のためには、撹拌タンク反応器が、特に懸濁培養のために用いられる。撹拌タンクは、例えばスパージャー、そらせ板または低剪断翼を用いて、曝気のために適応され得る。気泡塔およびエアリフト反応器に関しては、空気または酸素気泡による直接曝気が用いられ得る。宿主細胞が無血清培地中で培養される場合、曝気工程の結果としての細胞損傷を防止するのに役立つよう、細胞保護剤、例えばプルロニックF−68を、培地は補足される。宿主細胞特性によって、微小担体が足場依存性細胞株のための増殖基質として用いられ得るか、あるいは細胞は懸濁培養に適応され得る(これが典型的)。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、種々の操作方式、例えばフェドバッチ、反復バッチ処理(Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109参照)、延長バッチ法または還流培養を利用し得る。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞は血清含有培地、例えばウシ胎仔血清(FCS)中で培養され得るが、しかし、例えばこのような宿主細胞は、Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163に開示されているような合成無血清培地、あるいは市販の培地、例えばProCHO−CDMまたはUltraCHO(商標)(Cambrex NJ, USA)中で、必要な場合には、エネルギー源、例えばグルコースおよび合成成長因子、例えば組換えインスリンを補足して、培養される。宿主細胞の無血清培養は、それらの細胞が無血清条件で増殖するよう順応されることを必要とし得る。一順応アプローチは、血清含有培地中でこのような宿主を培養し、そして、宿主細胞が無血清条件で順応することを習得するよう、繰り返し、培地の80%を無血清培地に交換することである(例えば、Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers参照)。
疾患、障害および症状という用語は、互換的に用いられる。本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の精製調製物は、本明細書中に記載されるヒト疾患の治療に用いるために医薬組成物中に組み入れられ得る。医薬組成物は、ミオスタチンが疾患に寄与するかまたはミオスタチンの活性の中和が有益である疾患の治療に用いられ得る。治療的有効量の本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、ミオスタチン中和に応答する疾患の治療に用いられ得る。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、診断目的のためにin vitroまたはin vivoで生物学的試料中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。例えば、抗ミオスタチン抗原結合タンパク質は、培養細胞中、組織中または血清中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。組織は、先ず、ヒトまたは動物身体から除去され得た(例えば、生検)。慣用的イムノアッセイ、例えばELISA、ウエスタンブロット、免疫組織化学、または免疫沈降法が用いられ得る。
本明細書中に記載される抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、それを必要とする被験体に投与され得る。核酸分子は、適切な足場またはドメイン、可変ドメインまたは全長抗体中でCDRを発現し得る。核酸分子は、ヒトまたは動物細胞中での発現を可能にするベクター中に含まれ得る。核酸分子またはベクターは、製薬上許容可能な賦形剤および/または上記のような1つ以上の治療的に活性な薬剤とともに投与するために処方され得る。
1.組換えタンパク質の生成
1.1 成熟二量体ミオスタチンの精製
HexaHisGB1Tev/(D76A)マウスミオスタチンポリタンパク質配列(配列番号101)を、CHO分泌系中で発現させた。GB1タグ(配列番号102)はWO2006/127682に記載されており、高レベルでのミオスタチンの発現を可能にすることが判明したが、これは、Fcタグを用いた構築物と比較して、ミオスタチンの適正なフォールディングを可能にした。ヒトおよびマウス成熟ミオスタチンの配列は100%同一であるため、マウスポリタンパク質配列(配列番号103)を用いて、成熟ミオスタチン配列(配列番号104)を生成した。ミオスタチン任意の潜在的分解を低減するために、マウスポリタンパク質配列を、領域「DVQRADSSD」におけるD76A突然変異を用いて工学処理した。
ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定(Thies et al., (2001) Growth Factors 18(4) 251-259)を用いて、横紋筋肉腫細胞(A204)におけるミオスタチンのin vitro活性を査定した。204細胞(LGC Promochem HTB−82)を、DMEM 高グルコース(フェノールレッドなし)(Invitrogen)、5%活性炭処理済みFCS(Hyclone)および1×グルタマックス(Invitrogen)中で増殖させた。次に、細胞をトリプシン処理して懸濁液を生成し、Geminiトランスフェクション試薬(社内試薬、特許WO2006/053782に記載)を用いて、PAI−1プロモーターの12×CAGAボックスの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpLG3プラスミドでトランスフェクトした。96ウェルFluoronuncプレート(VWR)のウェル当たり40,000細胞で細胞を植えつけて、定住させて、一晩増殖させた。翌日、ともに配列番号104で示される配列を有するR&D Systemsミオスタチン(788−G8−010/CF)または社内ミオスタチン(1.1に上記)である組換え成熟ミオスタチンを、連続希釈により各ウェルの培地に付加し、細胞を放置して、さらに6時間インキュベートした後、SteadyLite(Perkin Elmer LAS)を付加して、これを、室温で20分間インキュベートし、SpectraMax M5読取器(Molecular Devices)で読み取った。ルシフェラーゼ発現を生じる細胞シグナル伝達のミオスタチン活性化を実証する用量応答曲線を、図3Aに示す。R&D Systemsおよび社内成熟二量体ミオスタチン種はともにA204細胞を活性化して、用量依存的にルシフェラーゼシグナルを生じる、ということが明白に認められ得る。社内精製ミオスタチンは、検定における選択的により低いバックグラウンドならびにR&D Systemsミオスタチンを上回る改善された動的範囲を実証する。
2.1 モノクローナル抗体
成熟ミオスタチン(実施例1.1に上記したように調製)を各々に腹腔内注射することにより、SJL/Jマウス(Jackson Laboratories)を免疫化した。免疫化前に、ミオスタチンをクリプトスポリジウム・パルブム(C. parvum)と接合させて、マウスを接合体(2.5μgのミオスタチンを10μgのクリプトスポリジウム・パルブムに接合)で、さらに7.5μgの可溶性ミオスタチンで免疫化した。マウスからの脾臓細胞を取り出し、Bリンパ球を、PEG1500(Boehringer)の存在下で、P3X63BCL2−13細胞(社内で生成、Kilpatrick et al., 1997 Hybridoma 16(4) pages 381-389参照)由来のマウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成した。限界希釈(E Harlow and D Laneに記載された方法を使用)により、個々のハイブリドーマ細胞株をクローン化した。単一クローンを含有するウェルを顕微鏡で同定し、活性に関して上清を試験した。
総RNAを10B3ハイブリドーマ細胞から抽出して、予定アイソタイプ(IgG2a/κ)によりリーダー配列および抗体定常領域に特異的なプライマーを用いた逆転写により、重鎖および軽鎖可変ドメインのcDNAを生成した。可変重鎖および軽鎖ドメインのcDNAを、次に、シーケンシングのためにプラスミド中にクローン化した。10B3 VH領域アミノ酸配列は、配列番号7で示される。10B3 VL領域アミノ酸配列は、配列番号8で示される。10B3に関するカバットCDR配列を、表3および表4に示す。
サンドイッチELISAにおける10B3および10B3キメラ(10B3C)結合ミオスタチン(R&D Systems、788−G8−010/CF)。プレートを10ng/ウェルでミオスタチンで被覆し、遮断溶液(PBS、0.1%トゥイーンおよび1%BSA)で遮断した。洗浄(PBS、0.1%トゥイーン)後、抗体を、37℃で2時間、希釈シリーズ全体で、インキュベートし、プレートを再び洗浄した後、抗マウスHRPまたは抗ヒトHRP(それぞれ、Dako、 P0161およびSigma、A−8400)とともに37℃で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、呈色反応が起こるまでOPD基質(Sigma、P9187)を付加し、反応を、H2SO4の付加により停止させた。プレートを490nmの吸光度で読み取り、EC50を確定した(表5参照)。
10アミノ酸重複する(オフセット 4アミノ酸)ビオチニル化14merペプチドを、ミオスタチンアミノ酸配列を基礎にして合成して、10B3(供給:Mimotopes, Australia)により認識される結合エピトープの位置をマッピングした。
炭酸塩緩衝液中で、4℃で一晩、1μg/mlで、ELISAプレートのウェル中に組換え可溶性ActRIIb(R&D Systems 339−RBB)を被覆した。標準ELISAプロトコールに従って、プレートを遮断し(2.3に上記した遮断溶液を参照)、洗浄した。平行して、2nMビオチニル化ミオスタチン(社内、1.1に記載。ビオチニル化物質)を、10B3、10B3Cおよび陰性対照(IgG1アイソタイプ対照)からなる抗体希釈シリーズとともに、37℃で2時間、予備インキュベートした。次に、ビオチニル化ミオスタチン:抗体反応物を、37℃で1時間、ActRIIb被覆プレートに付加した。標準洗浄手順を実行後、1:1000希釈ストレプトアビジン−HRP接合体(Dako P0397)を付加して、さらに37℃で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、OPD基質(Sigma)および酸停止溶液処置後、490nmの吸光度で検定した。ミオスタチン活性の抑制に関する抑制曲線およびIC50値を、それぞれ、図5および表8に示す。
1.2で上記したミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定を用いて、ミオスタチンの活性に及ぼす抗ミオスタチン抗体のin vitro作用を査定した。2.8nM(細胞活性化検定におけるED70と等価)の濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の10B3または10B3C抗体(0.1〜20nM)とともに37℃で予備インキュベート氏、その後、トランスフェクト化A204細胞に付加するよう、検定を修正した。ルシフェラーゼ値を読み取り、これから、図6に示した抑制曲線を作成した。表9は、当該検定およびANOVA分析を3回反復した後に抗体に関して確定したIC50値を示す。データは、明らかに、A204筋肉細胞株のミオスタチン活性化の用量依存的抑制を実証するが、一方、対照抗体は、ミオスタチン活性の抑制を示さなかった。
親10B3の効力を実証するために、8週齢雌CB17 SCIDマウスにおける35日試験を5週間実行した。3、10または30mg/kgで腹腔内注射により、1、4、8、15、22および29日目に、処置群(10匹/群)に用量投与したが、一方、対照群には、PBSまたはアイソタイプ対照抗体(IgG2a)を投与した。試験完了時に、動物の総体重(A)および総除脂肪筋肉量(B)を、それぞれ、動物を計量することおよびQMRI分析により決定した(図7)。動物の選択時(35日目)に、個々の筋肉(腓腹筋(A)、四頭筋(B)および長指伸筋(EDL)(C))を、筋肉量決定のために動物から切り出した(図8)。筋肉機能に及ぼす作用を確定するために、ex-vivo収縮性試験をいいDL筋で実施した(図9)が、この場合、筋肉の強直力(図9A)および筋肉量1mg当たりの強直力(図9B)を確定した。
3.1 配列解析
10B3可変領域の配列と、他のネズミおよびヒトの免疫グロブリン配列との間で比核を行なった。これは、FASTAおよびBLASTプログラムを用いて、ならびに視覚的検査により実行した。
Rld EflおよびRln Efl哺乳類発現ベクター中でのクローニングのための制限部位ならびにシグナル配列を含めた重複オリゴヌクレオチドのde novo構築により、ヒト化VHおよびVL構築物を調製した。Hind IIIおよびSpe I制限部位を導入して、シグナル配列(配列番号9)を含有するVHドメインを枠で囲み、ヒトIgG1野生型定常領域を含有するRld Ef1中にクローニングした。Hind IIIおよびBsiW I部位を導入して、シグナル配列(配列番号9)を含有するVLドメインを枠で囲み、ヒトκ定常領域を含有するRln Ef1中にクローニングした。これは、本質的に、WO 2004/014953に記載されたものと同じである。
4.1 抗体の調製
ヒト化VH構築物(H0、H1およびH2)およびヒト化VL構築物(L0、L1、L2およびL3)を、Rld_Ef1およびRln_Ef1哺乳類発現ベクター中で調製した。プラスミド重鎖−軽鎖組合せ(H0L0、H0L1、H0L2、H0L3、H1L0、H1L1、H1L2、H1L3、H2L0、H2L1、H2L2、H2L3)を、一時的に、CHOK1細胞中にトランスフェクトして、小規模で発現させて、12の異なるヒト化抗体を得た。
このプロトコールに大体従って、ミオスタチン結合ELISAを実行した。96ウェルELISAプレートを、4℃で一晩、10ng/ウェルの組換えミオスタチンで被覆した。次に、このプレートを洗浄緩衝液(PBS、0.1%トゥイーン20)で3回洗浄した。ウェルを、室温で1時間、遮断溶液(PBS、0.1%トゥイーン20+1%ウシ血清アルブミン[BSA])で遮断した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。次に、抗体を適切な濃度範囲(約100〜0.001μg/ml)に滴定して、プレートに付加し、室温で1時間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。抗マウスIgG HRP接合抗体(DakoによるP0260、この試薬は、メーカーの仕様説明書に従って用いた)を用いて、10B3のようなマウス抗体の結合を検出した。抗ヒトκ軽鎖HRP接合抗体(Sigma-AldridgeによるA7164、この試薬は、メーカーの仕様説明書に従って用いた)を用いて、ヒト化またはキメラ抗体、例えば10B3キメラまたはH0L0の結合を検出した。次に、プレートを洗浄緩衝液中で3回洗浄し、OPD基質(Sigma、メーカーの使用説明書に従って用いた)とともに展開させて、プレート読取機で490nmで読み取った。
精製H0L0、H1L2およびH2L2は、BIAcore(商標)により、組換えミオスタチンを結合した。組換えミオスタチンを、3つの異なる密度(低、中および高、それぞれ、約35,120および350RUのR最大値を生じる)で、BIAcore(商標)チップ上に固定した。抗体を、256、64、16、4および1nMで全体に通した。0nMの抗体を二重参照のために用いて、データを1:1モデルに適合させた。
ヒト化抗体を、上記(1.2)のミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定で試験して、in vitro効力を査定した。2.8nMの濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の抗体(0.1〜20nM)とともに37℃で予備インキュベートした後、トランスフェクト化A204細胞をトランスフェクトして、その後、ルシフェラーゼを読み取った。その結果生じたデータを、図12に示す。決定されたIC50(ANOVA分析)を、表13に示す。
10B3キメラおよびヒト化抗体の重鎖および軽鎖の両方における潜在的脱アミド化部位に関するin silico分析は、脱アミド化に関する高い潜在性を有するとして、重鎖CDRH2中のカバット位置54でアスパラギン(N54)を同定した。この残基をさらに特性化するために、10B3キメラ抗体およびヒト化H2L2抗体を生成したが、この場合、N54はアスパラギン酸(D)またはグルタミン(Q)アミノ酸残基に代わって置換された。
関連H2重鎖およびL2軽鎖発現ベクターの部位特異的突然変異誘発により、これらの抗体を発現するために必要な重鎖および軽鎖構築物を調製した。プラスミド重鎖−軽鎖組合せ(H2L2−N54D;H2L2−N54Q;H2L2−N54D−C91S;H2L2−N54Q−C91S;H2L2−C91S)を、一時的に、CHO細胞中に同時トランスフェクトして、小規模で発現させて、5つの異なるヒト化抗体を得た。さらに、10B3キメラ(HCLC)およびH2L2を、陽性対照として発現させた。
1%重炭酸アンモニウムとともに、pH9.0で、37℃で48時間、インキュベートすることにより、H0L0、H2L2、H2L2−C91S、H2L2−N54QおよびH2L2−N54Q−C91S抗体を、脱アミド化を誘導するストレス条件に付した。処置後、ミオスタチン結合ELISA(4.2に記載)における機能的活性に関して、H0L0、H2L2、H2L2−C91S、H2L2−N54QおよびH2L2−N54Q−C91Sを分析した。(合計2つの実験からの)ただ1つの実験に関するELISAデータを、図16〜20に示す。これらのデータは、処置手順が、ミオスタチンと結合する抗体のいずれかの能力に影響を及ぼさなかった、ということを明白に示す。
6.1 CDRH3変異体ヒト化抗体の構築
代替的アミノ酸残基への各残基のCDRH3(配列番号3)の部位特異的突然変異誘発を、基本分子として抗体H2L2−C91S(可変配列:それぞれ配列番号14および24;全長配列:それぞれ配列番号30および40)を用いて実行した。全長DNA発現構築物、例えばH2およびL2−C91S塩基配列(それぞれ配列番号45および55)に関するヒト定常領域を、pTTベクター(National Research Council Canada、 修飾化多クローニング部位(MCS)を有する)を用いて産生した。
約200のCDRH3変異体のそれぞれ重鎖および軽鎖をコードするpTTプラスミドを、一時的にHEK 293 6E細胞中に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。重鎖は、変異体CDRH3配列を伴うH2の塩基配列を有し、軽鎖は、上記と同様に、L2−C91Sの塩基配列を有する。抗体を、組織培養上清から直接査定した。
CDRH3スクリーニングに関する初期動態分析を、ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)で実行した。残基R95〜P100_Bに関して、プロテインA/G捕捉表面(Pierce 21186)を用いて分析を実行し、残基A100_C〜V102に関しては抗ヒトIgG表面を用いた(BIAcore/GE Healthcare BR−1008−39)。GLMチップ(BioRad, Laboratories 176−5012)上に捕捉分子を固定するために第一アミンカップリングを用いて、両捕捉表面を同様に調製した。当該特定変異体を発現する一次的トランスフェクションからの組織培養上清からのプロテインA/G抗ヒトIgG表面(突然変異化される残基によって)上に、CDRH3変異体を直接捕捉した。捕捉後、社内組換えヒトミオスタチン(上記1.1参照)を、256nM、32nM、4nM、0.5nMおよび0.0625nMで、分析物として用い、緩衝液注射単独(すなわち0nM)は、結合曲線を二重参照するために用いた。ミオスタチン結合事象後、捕捉表面を再生した:プロテインA/G捕捉表面に関しては、100mMリン酸を用いて捕捉表面を再生した;抗ヒトIgG表面に関しては、3M MgCl2を用いて捕捉表面を再生した;再生は、別の周期の捕捉および結合分析のために準備された予備捕捉抗体を除去した。次に、ProteOn分析ソフトウェアに固有の1:1モデル(質量運搬)に、データを適合させた。HBS−EP(BIAcore/GE−Healthcare BR−1006−69)を用いて作業を実行し、分析温度は25℃であった。
表18に記述された11のCDRH3変異体の重鎖および軽鎖を、HEK 293 6E細胞中で発現させて(6.2に記載)、固定化プロテインAカラム(GE Healthcare)を用いてアフィニティー精製して、280nmでの吸光度を読み取ることにより定量した。
ProteOn XPR36上での初期スクリーニングからの構築物の選択が上首尾であったか否かを判断するために、オフ速度等級分け実験を精製組換え抗体に関して実施した。用いられる抗体の濃度で、ぞれぞれ約60共鳴単位(RU)、250RUおよび1000RUの最大結合シグナルを生じる異なる密度(低、中、高)でカップリングする第一アミンにより、ミオスタチン(組換え社内、上記1.1参照)を、CM5チップ(Biacore/GE Healthcare BR−1000−14)上に共有的に固定した。抗体の単一濃度、256nMを緩衝液注射で用いて、結合相互作用を二重参照した。ミオスタチン表面の各密度に対する抗体全ての相互作用に関して、BIAcore300機に固有のソフトウエアを用いて、解離の初期速度(オフ速度)を算定した。再生は、100mMリン酸を用いることによるものであり、25℃でHBS−EP緩衝液を用いて、検定を実行した。
ミオスタチン(組換え社内、上記1.1参照)を、それぞれ約15RU、37RUおよび500RUの最大結合シグナルを出す表面を生じる低、中および高密度で、Series S CM5チップ(Biacore/GE Healthcare BR−1006−68)上に固定した。CDRH3変異体を、256nM、64nM、16nM、4nM、1nMで全3つの表面全体に通して、緩衝液注射(すなわち0nM)を二重参照のために用い、再生は100mMリン酸を用いた。T100BIAcore機に固有の二価モデルにデータを適合させて、HBS−EPを用いて、25℃で作業を実行した。
11のアフィニティー精製CDRH3を、ミオスタチン捕捉ELISAにおける結合活性に関しても分析した。
3つの異なるミオスタチン競合ELISAにおいて、CDRH3変異体をさらに調べた。10B3ネズミmAbと競合する能力に関して、精製抗体を分析した。
6.7に記述されたプロトコールを用いて、各ウェルに10B3(最終濃度 0.3μg/ml)を付加し、適切な濃度範囲(約10〜0.01μg/ml)に滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体(DAKO P0260、メーカーの仕様説明書に従って用いた)を用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表19に示す。
6.7に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、4℃で一晩、5μgl/mlのストレプトアビジンで被覆した。ビオチニル化ミオスタチンを0.3μg/ml遮断緩衝液で1時間の間、付加し、その後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。10B3(最終濃度 0.2μg/ml)を各ウェルに付加し、適切な濃度範囲(約10〜0.01μg/ml)に滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体(DAKO P0260、メーカーの仕様説明書に従って用いた)を用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表19に示す。
6.7に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、4℃で一晩、0.2μgl/mlのミオスタチン(組換え社内、上記1.1参照)で被覆した。10B3(最終濃度 0.3μg/ml)を各ウェルに付加し、適切な濃度範囲(約10〜0.01μg/ml)に滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体(DAKO P0260、メーカーの仕様説明書に従って用いた)を用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表19に示す。
6.8の5つの選択CDRH3変異体を、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定(上記1.2参照)で試験して、in vitro効力を査定した。5nMの濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の抗体とともに37℃で予備インキュベートした後、トランスフェクト化A204細胞に付加した。細胞を37℃でさらに6時間インキュベートした後、相対ルシフェラーゼ発現を、冷光により確定した。その結果生じたIC50を、表20に示す。
in vivoでの抗ミオスタチンの作用様式はミオスタチンの単純結合および無能力化であるので、ADCCおよびCDC応答を発揮するために分子がそのFc機能を保有するということは必要でない。さらに、Fc機能の無能力化は、注入関連免疫反応への可能性に対して軽減する手助けをし得る。Fc機能を無能力かする突然変異は、以下の置換(EU番号付与系を使用)を包含する:Leu235Ala;およびGly237Ala。
8.1 CDRH2変異体ヒト化抗体の構築
実施例5で上記したように、重鎖CDRH2中のカバット位置54でのアスパラギン(N54)は、脱アミド化のための効力を有する。この潜在的危険を軽減するために、このアミノ酸を突然変異化して、H2_F100G_Yの多数のCDRH2変異体を生成した。これらは全て、CDRH2(配列番号2)で異なり、H2_F100G_Y重鎖をコードするpTTベクターを用いた部位特異的突然変異誘発により生成した。軽鎖(配列番号40 L2−C91S)を、重鎖の各々を用いて発現した。これらの構築物は、Fc領域で無能力化されなかった。
6.2で上記したように、重鎖および軽鎖をそれぞれコードするpTTプラスミドを、一時的に、HEK 293 6E細胞中で同時トランスフェクトした。さらに、H2L2−C91S_F100G_Yを陽性対照として発現した。HEK 293細胞上清中で産生される抗体を、BIAcoreにより組換えミオスタチンとの結合に関して分析した。CDRH2変異体のスクリーニングは、全て組換えミオスタチンと結合する、ということを示した。
5つの抗体全てを、ミオスタチン結合ELISAにおける結合活性に関して分析した(実施例4.2に記載)。図22は、H2L2−C91S_F100G_Y、H2L2 C91S、HcLc(10B3C)、および陰性対照mAb;ならびに全5つのCDRH2変異体抗体に関する結果を示す。CDRH2変異体は、H2L2−C91S_F100G_Yの場合より良好なまたは同様のミオスタチンに対する結合活性を有した。
BIAcoreによりミオスタチン結合親和性における任意の変化を確定するためにも、CDRH2変異体を試験した。プロテインAを、C1 BIAcoreバイオセンサーチップ上に固定し、精製抗体を低密度で捕捉し、したがって、ミオスタチンの最大結合は30共鳴単位未満を生じた。256nMのみの濃度で捕捉抗体表面全体にミオスタチンを通した;緩衝液注射(すなわち0nM)を、結合データを二重参照するために用いた。プロテインA表面の再生は、100mMリン酸を用いた。T100 BIAcore分析ソフトウェアにともに固有の二価モデルおよび2状態モデルにデータを適合させた。しかしながら、ミオスタチンは二量体であるため、二価モデルデータにより重きを置いた。HBS−EPを用いて、25℃で作業を実行した。
in vitro無能力化検定に及ぼすCDRH2変異体の作用も、A204ルシフェラーゼ検定を用いて調べた(節1.2に記載)。抑制曲線のIC50値を、表24に示す。
A204検定において最高の見掛けの効力を有する開発可能性増強分子であるH2L2 C91S_G55S F100G_Yを、配列番号99で例示されるように、(EU番号付与系を用いて、以下の置換を作ることによって:Leu 235 Ala;およびGly 237 Ala)Fc無能力化した。受容体結合検定(実施例2.5)を用いて、この新規の分子H2L2 C91S_G55S F100G_Y−Fc無能力化が、H2L2 C91S_G55S F100G_Yに比して、わずかに改善された効力を有する、ということを実証した(表25参照)。
本試験において、10B3処置がマウスにおけるステロイド誘導性筋損失を防止し得るか否かを調べた。C57BLマウスを、PBS、mIgG2aまたは10B3で処置した。デキサメタゾンをステロイドとして用いて、筋肉損失を誘導した。
ここで、神経損傷モデルを用いて、マウスにおける廃用性萎縮の防止における10B3の効力を評価した。
最新の研究において、体重変化、筋肉の量および機能に及ぼす10B3処置の作用を、癌悪液質試験のために広範に用いられる前臨床モデルである結腸−26腫瘍保有マウスで試験した。
ここで、マウス腱切除モデルにおける筋肉量に及ぼすミオスタチン抗体10B3の作用を確定した。
Claims (25)
- ミオスタチンと特異的に結合し、配列番号3のCDRH3または変異体CDRH3を含む抗原結合タンパク質。
- 前記変異体CDRH3が(i)配列番号82〜92または110のいずれか1つ;または(ii)以下のカバット置換V102Y、V102H、V102I、V102DまたはV102Gである請求項1記載の抗原結合タンパク質。
- CDRH1(配列番号1)または変異体CDRH1;CDRH2(配列番号2)または変異体CDRH2;CDRL1(配列番号4)または変異体CDRL1;CDRL2(配列番号5)または変異体CDRL2;およびCDRL3(配列番号6または109)または変異体CDRL3から選択される1つ以上または全てのCDRをさらに含む請求項1または2記載の抗原結合タンパク質。
- 前記変異体CDRH2が(i)配列番号93〜97のいずれか1つ;または(ii)以下のカバット置換:N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58FまたはN58Yのうちの1つである請求項2記載の抗原結合タンパク質。
- CDRH3が配列番号90であり;および/またはCDRH2が配列番号95であり;および/またはCDRL3が配列番号109である前記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- ミオスタチンと特異的に結合し、配列番号7の可変ドメイン配列の対応するCDRH3またはその変異体CDRH3を含む抗原結合タンパク質。
- 配列番号7の可変ドメイン配列のCDRH1またはその変異体CDRH1、あるいはCDRH2またはその変異体CDRH2;もしくは配列番号8の可変ドメイン配列のCDRL1またはその変異体CDRL1、あるいはCDRL2またはその変異体CDRL2およびCDRL3またはその変異体CDRL3から選択される対応するCDRのうちの1つ以上または全てをさらに含む請求項6記載の抗原結合タンパク質。
- ミオスタチンと特異的に結合し、配列番号7のカバット残基95〜101を含む結合単位H3または変異体H3を含む抗原結合タンパク質。
- 配列番号7のカバット残基31〜32を含むH1または変異体H1;配列番号7のカバット残基52〜56を含むH2または変異体H2;配列番号8のカバット残基30〜34を含むL1または変異体L1;配列番号8のカバット残基50〜55を含むL2または変異体L2;ならびに配列番号8のカバット残基89〜96を含むL3または変異体L3から選択される1つ以上のまたは全ての結合単位をさらに含む請求項8記載の抗原結合タンパク質。
- 以下の:
(a)可変重鎖の位置28のSまたはT;
(b)可変重鎖の位置105のTまたはQ;
(c)可変重鎖の位置2のV、IまたはG;位置4のLまたはV;位置20のL、I、MまたはV;位置22のC;位置24のT、A、V、GまたはS;位置26のG;位置29のI、F、LまたはS;位置36のW;位置47のWまたはY;位置48のI、M、VまたはL;位置69のI、L、F、MまたはV;位置78のA、L、V、YまたはF;位置80のLまたはM;位置90のYまたはF;位置92のC;および/または位置94のR、K、G、S、HまたはN;
(d)可変軽鎖の位置16のRまたはG;
(e)可変軽鎖の位置71のYまたはF;
(f)可変軽鎖の位置100のAまたはQ;および/または
(g)可変軽鎖の位置2のI、LまたはV;位置3のV、Q、LまたはE;位置4のMまたはL;位置23のC;位置35のW;位置36のY、LまたはF;位置46のS、L、RまたはV;位置49のY、H、FまたはK;位置88のC;および/または位置98のF;
から選択されるカバットアミノ酸残基のいずれか1つまたは組合せをさらに含む前記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。 - 配列番号10で示されるようなフレームワーク領域と75%以上の配列同一性を有する重鎖可変領域受容体抗体フレームワーク;または配列番号11で示されるようなフレームワーク領域と75%以上の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン受容体抗体フレームワークをさらに含む前記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- ミオスタチンと特異的に結合し、以下の:
(i)配列番号7または配列番号25から選択される重鎖可変領域;および/または配列番号8または配列番号21から選択される軽鎖可変領域;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域または軽鎖可変領域;もしくは
(ii)配列番号26の重鎖;および/または配列番号27または配列番号37から選択される軽鎖;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖
を含む抗原結合タンパク質。 - ミオスタチンと特異的に結合し、以下の:
(i)配列番号12、13または14のいずれか1つから選択される重鎖可変領域;および/または配列番号15、16、17、18また24のいずれか1つから選択される軽鎖可変領域;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖可変領域または軽鎖可変領域;もしくは
(ii)配列番号28、29、30、98または99のいずれか1つから選択される重鎖;および/または配列番号31、32、33、34または40のいずれか1つから選択される軽鎖;あるいは75%以上の配列同一性を有する変異体重鎖または軽鎖
を含む抗原結合タンパク質。 - 以下のカバット置換が存在する請求項12または13記載の抗原結合タンパク質:
(i)重鎖可変領域または重鎖におけるY96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102NまたはV102S;および/または
(ii)重鎖可変領域または重鎖におけるG55D、G55L、G55S、G55TまたはG55V;および/または
(iii)軽鎖可変領域または軽鎖におけるC91S。 - Fc無効化された前記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 請求項1〜15のいずれか一項で定義されるような抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
- 以下の:
(i)配列番号41の重鎖DNA配列;および/または配列番号42また52から選択される軽鎖DNA配列;あるいは75%以上の同一性を有する変異体重鎖または軽鎖;もしくは
(ii)配列番号43、44または45のいずれか1つから選択される重鎖DNA配列;および/または配列番号46、47、48、49または55のいずれか1つから選択される軽鎖DNA配列;あるいは75%以上の同一性を有する変異体重鎖または軽鎖
を含む請求項16記載の核酸分子。 - 前記DNA配列が、以下のカバット置換を有する重鎖または軽鎖をコードする請求項16記載の核酸分子:
(i)重鎖におけるY96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102NまたはV102S;および/または
(ii)重鎖におけるG55D、G55L、G55S、G55TまたはG55V;および/または
(iii)軽鎖におけるC91S。 - 請求項16〜18のいずれか一項で定義されたような核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項19で定義されたような発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 請求項1〜15のいずれか一項で定義されたような抗原結合タンパク質の産生方法であって、請求項20で定義されたような宿主細胞を培養するステップ、ならびに前記抗原結合タンパク質を回収するステップを包含する方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項で定義されたような抗原結合タンパク質ならびに製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか1つまたはそれらの組合せを低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療方法であって、請求項1〜15のいずれか一項で定義された抗原結合タンパク質または請求項22記載の組成物を投与するステップを包含する方法。
- 筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、HIV、AIDS、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病(II型真性糖尿病を含む)、関節炎、慢性腎不全(CRF)、末期腎疾患(ESRD)、うっ血性心不全(CHF)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、待機的関節修復、多発性硬化症(MS)、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症に苦しんでいる被験体の治療方法であって、請求項1〜15のいずれか一項で定義された抗原結合タンパク質または請求項22記載の組成物を投与するステップを包含する方法。
- 被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および/または筋肉機能を改善する方法であって、請求項1〜15のいずれか一項で定義された抗原結合タンパク質または請求項22記載の組成物を投与するステップを包含する方法。
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