KR20110103431A - 미오스타틴 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

미오스타틴에 결합하는 항체와 같은 항원 결합 단백질, 이러한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항원 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물 및 제조 방법을 개시한다. 또한, 근육 질량의 감소, 근력의 감소 및 근육 기능의 감소 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합과 관련이 있는 질병의 치료 또는 예방을 위한 상기 항원 결합 단백질의 용도를 개시한다.

Description

미오스타틴 결합 단백질{MYOSTATIN BINDING PROTEINS}
본 발명은 미오스타틴(myostatin)에 결합하는 항체와 같은 항원 결합 단백질, 이러한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항원 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 근육 질량 감소, 근력 감소 및 근육 기능 감소 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
성장 및 분화 인자(GDF-8)라고도 알려진 미오스타틴은 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 상과에 속하는 것으로서, 근육 질량의 음성 조절 인자이다. 미오스타틴은 진화 동안 고도로 보존되며, 인간, 닭, 마우스 및 쥐의 서열들은 성숙한 C-말단 도메인이 서로 100% 동일하다. 미오스타틴은 신호 서열, 프로펩티드 도메인(pro-peptide domain) 및 C-말단 도메인을 포함하는 전구 단백질의 형태로 합성된다. 분비되는 순환 형태의 미오스타틴은 활성의 성숙한 C-말단 도메인을 포함하는 외에도, 프로펩티드 및/또는 다른 억제 단백질과 관련 있는 잠재성 복합체(latent complex)에서 성숙한 C-말단 도메인을 포함하고 있는 비활성 형태를 포함한다.
근육 질량 감소, 근력 감소 및 근육 기능 감소와 관련이 있는 다수의 상이한 질병, 장애 및 증상이 있다. 오늘날, 이러한 질병의 치료를 위해 가장 중요한 것은 운동량을 증가시키고 영양섭취를 개선하는 것이다. 불운하게도, 신체 운동 증가의 이점은 환자의 인내력 및 순응도가 불충분하기 때문에 실현하기가 어렵다. 또한, 일부 환자의 경우 운동이 어렵거나, 고통스럽거나 불가능할 수 있다. 또한, 근육에 어떤 유익한 효과를 생성하기 위한 운동과 관련된 근육 활동이 불충분할 수도 있다. 잠재적인 식이성 결핍 상태에 있고 환자의 식욕이 충분한 경우에는 영양중재방법(nutritional intervention)이 유일하게 효과적이다. 이러한 한계로 인해, 근육 질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합의 감소와 관련된 질병을 더욱 광범위하게 달성가능한 이점을 가지고서 치료하는 것은 실질적으로 충족되지 않는 욕구(unmet need)이다.
미오스타틴에 대한 항체가 설명되어 왔다(WO 2008/030706, WO 2007/047112, WO 2007/044411, WO 2006/116269, WO 2005/094446, WO 2004/037861, WO 03/027248 및 WO 94/21681). 또한, Wagner 등(Ann Neurol. (2008) 63(5): 561-71)은 이러한 설명된 항미오스타틴 항체들 중 어느 하나를 사용하는 경우 성인 근이영양증(벡커형 근이영양증, 안면견갑 이영양증 및 지대형 근이영양증)의 경우 근력 및 기능의 탐색 종말점(exploratory end point)이 개선되지 않는다는 것을 설명하고 있다.
따라서, 근육 질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합의 감소와 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 더욱 효과적인 치료법이 필요하다.
[발명의 요약]
본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 이러한 항원 결합 단백질을 이용하여, 근육 질량 감소, 근력 감소, 근육 기능 감소 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합과 관련된 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 3의 CDRH3 또는 변이(variant) CDRH3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 가변 도메인 서열의 상응하는 CDRH3 또는 이의 변이 CDRH3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 7의 카밧(Kabat) 잔기 95 내지 101을 포함하는 결합 단위체인 H3 또는 변이 H3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다:
(i) 서열번호 7 또는 서열번호 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 8 또는 서열번호 21로부터 선택된 경쇄 가변 영역; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역;
(ii) 서열번호 26의 중쇄; 및/또는 서열번호 27 또는 서열번호 37로부터 선택된 경쇄; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다:
(i) 서열번호 12, 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 15, 16, 17, 18 또는 24 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역;
(ii) 서열번호 28, 29, 30, 98 또는 99 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄; 및/또는 서열번호 31, 32, 33, 34 또는 40 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄.
또한, 본 발명은 본원에서 정의한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 원에서 정의한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 원에서 정의한 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질 제조 방법으로서, 상기 정의한 숙주 세포를 배양하고 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 근육 질량, 근력 및/또는 근육 기능을 감소시키는 질병으로 고생하는 개체(subject)를 치료하는 방법으로서, 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 근육 감소증, 악액질, 근육 소모(muscle-wasting), 불용성 근위축(disuse muscle atrophy), HIV, AIDS, 암, 수술, 화상, 근육골 및 신경에 대한 외상 및 손상, 비만, 당뇨병(제 2형 당뇨병 포함), 관절염, 만성 신부전(CRF), 말기 신질환(ESRD), 울혈성 심부전(CHF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선택적 관절 수복(elective joint repair), 다발성 경화증(MS), 뇌졸중, 근육 이영양증, 운동 뉴런 신경병증(motor neuron neuropathy), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 지방간 질환, 간경변증, 에디슨병, 쿠싱 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 소모(steroid induced muscle wasting), 근육염 또는 척추측만증으로 고생하는 개체를 치료하는 방법으로서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에서 근육 질량을 증가시키고/시키거나 근력을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 개선하는 방법으로서, 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 근육질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합을 감소시키는 질병으로 고생하는 개체의 치료에 사용하기 위한 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 근육 감소증, 악액질, 근육 소모, 불용성 근위축, HIV, AIDS, 암, 수술, 화상, 근육골 및 신경에 대한 외상 및 손상, 비만, 당뇨병(제 2형 당뇨병 포함), 관절염, 만성 신부전(CRF), 말기 신질환(ESRD), 울혈성 심부전(CHF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선택적 관절 수복, 다발성 경화증(MS), 뇌졸중, 근육 이영양증, 운동 뉴런 신경병증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 지방간 질환, 간경변증, 에디슨병, 쿠싱 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 소모, 근육염 또는 척추측만증의 치료에 사용하기 위한 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 개체에서 근육 질량을 증가시키고/시키거나 근력을 증가시키고/시키거나 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 기능을 개선하는 방법에서 사용하기 위한 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 근육 질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합을 감소시키는 질병으로 고생하는 개체의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 원에 기재한 항원 결합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 근육 감소증, 악액질, 근육 소모, 불용성 근위축, HIV, AIDS, 암, 수술, 화상, 근육골 및 신경에 대한 외상 및 손상, 비만, 당뇨병(제 2형 당뇨병 포함), 관절염, 만성 신부전(CRF), 말기 신질환(ESRD), 울혈성 심부전(CHF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선택적 관절 수복, 다발성 경화증(MS), 뇌졸중, 근육 이영양증, 운동 뉴런 신경병증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 지방간 질환, 간경변증, 에디슨병, 쿠싱 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 소모, 근육염 또는 척추측만증의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 개체에서 근육 질량을 증가시키고/시키거나 근력을 증가시키고/시키거나 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 기능을 개선하는 방법에서 사용하기 위한 약물의 제조에서 본 원에서 정의한 항원 결합 단백질의 용도를 제공한다.
도 1은 정제된 성숙 미오스타틴(예측 분자량(MW): 12406.25 Da, 관측 분자량(MW): 24793.98 Da)에 대한 LC/MS 분석 결과로서, 상기 성숙 미오스타틴이 9 쌍의 디설파이드 결합을 갖는 이합체 분자를 나타내어, 9개 시스테인 잔기를 갖는 예측 미오스타틴 단량체와 일치하는 것을 나타내고 있다.
도 2는 MOPS 완충액을 이용한 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔을 도시한다. 레인 1: DTT에 의해 감소한 성숙 미오스타틴. 레인 2: DTT가 없는 경우의 감소하지 않은 성숙 미오스타틴. 레인 3: 마크(Mark) 12 단백질 표준.
도 3A는 미오스타틴(R&D Systems사 및 자사의 미오스타틴 종)이 세포 신호전달을 유도하여 A204 세포에서 6 시간 후 용량 의존적인 방식으로 루시퍼라제 발현을 초래한 것을 설명하는 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 3B는 서로 다른 날에 얻은 데이터로 나타낸 바와 같이 서로 다른 시험을 실시한 경우, 자사의 미오스타틴이 세포 신호전달을 유도하여 A204 세포에서 용량 의존적인 방식으로 루시퍼라제 발현을 초래한 것을 설명하는 용량 반응 곡선을 도시한다.
도 4는 성숙 미오스타틴, 잠재성 복합체(latent complex) 및 잠재성 복합체로부터 방출된 성숙 미오스타틴에 10B3이 결합하는 것을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 5는 ActRIIb에의 미오스타틴의 결합이 10B3 및 10B3 키메라에 의해 억제되는 것을 도시한다.
도 6은 10B3 및 10B3 키메라가 미오스타틴에 의해 유발된 세포 신호전달의 활성화를 억제하여 A204 세포에서 루시퍼라제 발현을 감소시킨 것을 도시한다.
도 7은 마우스에서 체중(A) 및 제지방 질량(B)에 대한 10B3의 생체내 효과를 도시한다.
도 8은 마우스의 비복근(A), 사두근(B) 및 장지신근(EDL)(C)에서 10B3의 생체내 효과를 도시한다.
도 9는 EDL의 근육 수축성에 대한 10B3의 생체외 효과를 도시하는 것으로, 강직력(tetanic force)(A) 및 근육 질량으로 보정한 강직력(B)를 도시한다.
도 10A는 미오스타틴에의 인간화 항-미오스타틴 변이체(CHOKl 상등액에 함유) 및 10B3C의 결합을 나타내는 ELISA 결과이다. 도 10B는 도 10A로부터 유래한 것으로, H2 및/또는 L2 사슬을 포함하는 항체 및 10B3 키메라를 나타낸다.
도 11은 미오스타틴에 대한 정제된 H0L0, H1L2 및 H2L2 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체 및 10B3C의 결합을 도시하는 ELISA 결과이다.
도 12는 10B3, 10B3C, H0L0 및 H2L2가 미오스타틴에 의해 유도되는 세포 신호전달 활성화를 억제하여 A204 세포에서 루시퍼라제 발현을 초래한 것을 도시한다.
도 13은 미오스타틴에의 정제(purified) H2L2-N54D, H2L2-N54Q, H2L2-C91S, H2L2-N54D-C91S 및 H2L2-N54Q-C91S 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체, H2L2 및 10B3C (HCLC)의 결합을 보여주는 ELISA 결과를 도시한다.
도 14는 미오스타틴에의 정제 H2L2-N54Q, H2L2-C91S, H2L2- N54Q-C91S 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체, H2L2, H0L0 및 10B3C (HCLC)의 결합을 보여주는 ELISA 결과를 도시한다.
도 15는 H2L2-N54Q, H2L2-C91S, H2L2-N54Q-C91S 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체, H0L0, H2L2 및 10B3C가 미오스타틴에 의해 유도되는 세포 신호전달 활성화를 억제하여 A204 세포에서 루시퍼라제의 발현을 초래한 것을 도시한다.
도 16은 H2L2 인간화 항-미오스타틴 항체의 탈아미드화를 유도할 수 있는 중탄산암모늄을 이용하여 상기 항체를 처리하거나 처리하지 않은 후 미오스타틴에의 상기 항체의 결합을 도시한다.
도 17은 H2L2-N54Q 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체의 탈아미드화를 유도할 수 있는 중탄산암모늄을 이용하여 상기 항체를 처리하거나 처리하지 않은 후 미오스타틴에의 상기 항체의 결합을 도시한다.
도 18은 H2L2-C91S 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체의 탈아미드화를 유도할 수 있는 중탄산암모늄을 이용하여 상기 항체를 처리하거나 처리하지 않은 후 미오스타틴에의 상기 항체의 결합을 도시한다.
도 19는 H2L2-N54Q-C91S 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체의 탈아미드화를 유도할 수 있는 중탄산암모늄을 이용하여 상기 항체를 처리하거나 처리하지 않은 후 미오스타틴에의 상기 항체의 결합을 도시한다.
도 20은 H0L0 인간화 항-미오스타틴 항체 변이체의 탈아미드화를 유도할 수 있는 중탄산암모늄을 이용하여 상기 항체를 처리하거나 처리하지 않은 후 미오스타틴에의 상기 항체의 결합을 도시한다.
도 21은 11 개의 친화성 정제된 CDRH3 변이체, 및 대조 항체로서 사용된 H2L2-C91S, H0L0, HcLc(10B3 키메라) 및 음성 대조 단클론 항체의 미오스타틴 포획(capture) ELISA에서의 결합 활성을 도시한다.
도 22는 5 개의 친화성 정제된 CDRH2 변이체, 및 대조 항체로서 사용된 H2L2-C91 S_F100G_Y, H2L2-C9 IS, HcLc (10B3 키메라) 및 음성 대조 단클론 항체의 미오스타틴 결합 ELISA에서의 결합 활성을 도시한다.
도 23은 0 일 내지 25 일에서 C-26 종양 함유 마우스에서 체중에 대한 10B3 및 대조 항체 처리의 효과를 도시한다.
도 24는 C-26 종양 함유 마우스에서, 전체 체지방(A), 부고환 지방 조직(B) 및 제지방 질량에 대한 10B3 및 대조 항체 처리의 효과를 도시한다.
도 25는 C-26 종양 함유 마우스의 넓적다리의 좌골 신경의 전기 자극시의 수축력으로 측정한 것으로, 하지 근력에 대한 10B3 및 대조 항체 처리의 효과를 도시한다.
도 26은 모의 수술 및 건절제 수술시 마우스 전경근((TA)에 대한 10B3 및 대조 항체 처리의 효과를 도시한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 미오스타틴, 예를 들어, 동종이합(homodimeric) 성숙 미오스타틴에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴, 예를 들어, 인간 미오스타틴에 결합하여 상기 미오스타틴을 중화시킬 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 항체, 예를 들어, 단클론 항체일 수 있다.
미오스타틴 및 GDF-8은 모두 하기 미오스타틴 중 어느 하나를 말한다: 미오스타틴의 전장(full length) 미처리 전구체 형태, 및 C-말단 도메인의 전사후 분열에 따른 잠재성 및 비잠재성(활성) 형태의 성숙 미오스타틴. 또한, 용어 "미오스타틴"은 미오스타틴과 관련된 하나 이상의 생물학적 활성을 유지하는 미오스타틴의 임의의 단편 및 변이체를 의미한다.
상기 미오스타틴의 전장 비처리 전구체 형태는 펩티드를 포함하는 외에도, 신호 서열이 있거나 없는 성숙 단백질을 형성하는 C-말단 도메인을 포함한다. 미오스타틴 프로-펩티드와 C-말단 도메인을 합한 것은 다단백질(polyprotein)이라고도 알려져있다. 상기 미오틴 전구체는 단량체 또는 동종이합체 형태로 존재할 수 있다.
성숙 미오스타틴은 C-말단 도메인이라고도 알려진, 미오스타틴 전구체 단백질의 C-말단으로부터 분열되는 단백질이다. 성숙 미오스타틴은 단량체, 동종이합체, 또는 미오스타틴 잠재성 복합체의 형태로 존재할 수 있다. 조건에 따라, 성숙 미오스타틴은 이러한 상이한 형태들이 평형을 이룬 상태로 존재할 수 있다. 인간, 닭, 마우스 및 쥐의 미오스타틴의 성숙 C-말단 도메인 서열들은 서로 100% 동일하다(서열번호 104 참조). 일 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열 번호 104에 나타낸 동종이합체형 성숙 미오스타틴에 결합한다.
미오스타틴 프로-펩티드는 신호 서열의 절단 후 미오스타틴 전구체 단백질의 N-말단 도메인으로부터 절단되는 폴리펩티드이다. 프로-펩티드는 잠재성 관련 펩티드(LAP)라고도 알려져 있다. 미오스타틴 프로-펩티드는 성숙 미오스타틴 상의 프로-펩티드 결합 도메인에 비공유 결합할 수 있다. 인간 프로-펩티드 미오틴 서열의 일례가 서열번호 108에 나타나 있다.
미오스타틴의 잠재성 복합체는 성숙 미오스타틴과 미오스타틴 프로-팹티드 또는 다른 미오스타틴 결합 단백질 사이에 형성되는 단백질들의 복합체이다. 예를 들어, 두 개의 프로-펩티드 분자들은 두 분자의 성숙 미오스타틴의 두 분자와 결합하여 비활성의 사합체형 잠재성 복합체를 형성할 수 있다. 상기 미오스타틴의 잠재성 복합체는 상기 미오스타틴 프로-펩티드들 중 하나 또는 두 개 대신에 또는 그에 더하여 다른 미오스타틴 결합 단백질을 포함할 수 있다. 다른 미오스타틴 결합 단백질의 예로는 폴리스타틴(follistatin), 폴리스타틴 관련 유전자(FLRG) 및 성장 분화 인자 관련 혈청 단백질-1(GASP-1)이 있다.
상기 미오스타틴 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 전구체 형태, 성숙 형태, 단량체 형태, 이합체 형태, 잠재성 형태 및 활성 형태들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 임의의 조합에 결합할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 단량체 및/또는 이합체 형태의 성숙 미오스타틴에 결합할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 프로-펩티드 및/또는 폴리스타틴과 복합체 형태로 존재하는 경우 미오스타틴에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 항원 결합 단백질은 폴리스타틴 관련 유전자(FLRG) 및/또는 성장 및 분화 관련 혈청 단백질 1(GASP-1)과 복합체 형태로 존재하는 경우 미오스타틴에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 성숙한 이합체형 미오스타틴에 결합한다.
본 원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 미오스타틴에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편 및 기타 단백질 작제물(예, 도메인)을 의미한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 유사 영역을 갖는 분자를 의미하도록 가장 넓은 의미로 본 원에서 사용되며, 이러한 항체로는 단클론 항체, 재조합 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이중특이성(bispecific) 항체, 이종접합(heteroconjugate) 항체, 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 유효한 단편, 단쇄 Fv, 이중특이 항체 절편(diabody), Tandabs™ 등이 있다(택일적인 "항체" 포맷의 요약에 대하여는 다음문헌[Holliger 및 Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136]을 참조한다.
문구 "단일 가변 도메인"은 다른 가변 영역 또는 도메인과 상관없이 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 가변 영역(예를 들어, VH, VHH, VL)을 의미한다.
"도메인 항체" 또는 "dAb"는 항원에 결합할 수 있는 "단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주할 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 항체의 가변 도메인일 수 있을 뿐 아니라, 설치동물과 같은 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, WO 00/29004에 개시한 바와 같은 가변 도메인), 너스 상어(nurse shark) 및 낙타류(Camelid)의 VHH dAb가 포함된다. 낙타류의 VHH는 본래는 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 야생 라마를 비롯한 종들로부터 유래하는 면역글로불린의 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 업계에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 도메인 항체로 간주할 수 있다. 본 원에서 사용되는 VH는 낙타류의 VHH 도메인을 포함한다.
본 원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 잔여 부분과 무관한 3차 구조를 갖는 접혀진 단백질 구조를 말한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 각각의 기능적 특성의 원인이 되고, 많은 경우 상기 단백질 및/또는 도메인의 잔여 부분의 기능의 감소 없이 다른 단백질에 부가, 제거 또는 전달될 수 있다. "단일 가변 도메인"은 항체 가변 영역의 특징적 서열을 포함하는 접혀진 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전 항체의 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인을 포함하는데, 예를 들어 이러한 변형 도메인의 하나 이상의 루프(loop)는 항체 가변 도메인의 특징이 없는 서열로 치환되어 있다. 그렇지 않으면, 상기 단일 가변 도메인은 끝이 절단되었거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하는 외에도, 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 접혀진 단편을 포함한다. 도메인은 다른 가변 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.
항원 결합 단편은 도메인과 같은 비항체 단백질 스캐폴드(scaffold)상에 하나 이상의 CDR을 배열함으로써 제공될 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드 또는 도메인은 그의 천연 리간드 이외의 리간드에의 결합을 얻기 위하여 단백질 공학(protein engineering)을 통해 처리된 것이다. 예를 들어, 상기 도메인은 이의 천연 리간드 이외의 리간드 결합을 얻기 위하여 단백질 공학을 통해 차리된 것으로 하기의 것들로부터 선택된 스캐폴드의 유도체이다: CTLA-4 (Evibody); 리포칼린; 단백질 A의 Z-도메인(Affibody, SpA), A-도메인(Avimer/Maxibody)과 같은 분자에서 유래한 단백질 A; GroEl 및 GroES와 같은 열충격 단백질; 트랜스페린(trans-body); 안키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 압타머; C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린(crystallin) 및 인간 유비퀴틴(affilins); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈독(scorpion toxinkunitz) 타입 도메인; 및 피브로넥틴(adnectin).
CTLA-4(Cytotoxic T Lymphocyte-associated Antigen 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 영역 유사 Ig 접힘(fold)을 갖는다. 항체의 CDR에 해당하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하기 위하여 이종 서열로 치환될 수 있다. 서로 다른 결합 특이성을 가지도록 조작된 CTLA-4 분자들은 에비바디(evibody)라고도 알려져 있다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조한다.
리포칼린(lipocalin)은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 작은 소수성 분자들을 운반하는 세포외 단백질들의 패밀리이다. 이는 서로 다른 표적 항원들에 결합하도록 조작될 수 있는 표준적인(canonical) 구조의 개방 말단에 다수의 루프가 있는 경질 β-시이트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린(Anticalin)은 크기가 160 개 내지 180개 아미노산이고 리포칼린에서 유래한 것이다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 및 US20070224633]을 참조한다.
애피바디(affibody)는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로콕커스 아우레스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 유래한 스캐폴드이다. 상기 도메인은 약 58 개 아미노산으로 이루어진 삼중 나선형 다발로 구성된다. 표면 잔기를 무작위화하여 라이브러리들이 얻어져 왔다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) 및 EP1641818Al]을 참조한다.
아비머(avimer)는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래한 다중 도메인 단백질이다. 약 35 개 아미노산으로 이루어진 천연 도메인은 한정된 디설파이드 결합 구조를 채택한다. A-도메인의 패밀리가 나타낸 천연 변이를 셔플링(shuffling)하면 다양한 것들이 얻어진다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) 및 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다.
트랜스페린은 단량체형 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 하나 이상의 CDR과 같은 펩티드 서열을 임의의 표면 루프에 삽입하여 표적 항원을 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예로는 트랜스바디(Trans-body)가 있다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[J. Biol. Chem 274, 24066- 24073 (1999)]을 참조한다.
설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins; (DARPins))은 내재성 막 단백질(integral membrane protein)의 세포골격에의 부착을 매개하는 단백질 패밀리인 안키린에서 유래한 것이다. 단일 안키린 반복체는 두 개의 α-나선 및 하나의 β-회전부(turn)로 구성되는 33개 잔기의 모티프(motif)이다. 이들은 각 반복체의 첫 번째 α-나선 및 β-회전부의 잔기를 무작위화하거나 하나 이상의 CDR과 같은 펩티드 서열을 삽입함으로써 서로 다른 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이의 결합 계면은 분자의 수를 증가시킴으로써(친화성 성숙 방법) 증가시킬 수 있다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[J. MoI. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 및 J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 및 US20040132028Al]을 참조한다.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴( Adnectins)은 인간 피브로넥틴 타입 III (FN3)의 15 개 반복 단위체들 중 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 골격(backbone)으로 구성된다. 그 β-샌드위치의 일 말단의 세 개의 루프는 애드넥틴이 표적 항원을 특이적으로 인식하도록 조작될 수 있다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 및 US6818418Bl]을 참조한다.
펩티드 압타머는 불변 스캐폴드 단백질, 대표적으로는 활성 부위에 삽입된 속박 가변 펩티드 루프를 포함하는 티오레독신(TrxA)으로 구성되는 인식 분자들의 조합이다. 더욱 상세한 사항에 대하여는 다음문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다.
마이크로바디(Microbody)는 3 내지 4개의 시스테인 결합을 함유하는 25 개 내지 50 개 아미노산 길이의 천연 마이크로 단백질이며, 마이크로 단백질의 예로는 KalataBl, 코노독소(conotoxin) 및 노틴(knottin)이 있다. 상기 마이크로 단백질은 이의 전체 접힘에 영향을 주지않고 25 개까지의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 노틴 도메인의 상세한 사항에 대하여는 WO2008098796을 참조한다.
다른 결합 도메인으로는 서로 다른 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위한 스캐폴드로서 사용되어온 단백질, 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴((affilins), 인간 프로테아제 억제제의 전갈독 타입 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈독소(charybdotoxin), C-타입 렉틴 도메인(tetranectins)이 있다. 이러한 도메인들은 다음문헌[Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, Stefan Dubel 발행) 및 Protein Science 15:14-27 (2006)]에서 검토되어 있다. 본 발명의 결합 도메인은 이러한 택일적인 단백질 도메인들 중 어느 것 및 상기 도메인에 이식된 본 발명의 CDR들의 임의의 조합에서 유도할 수 있었다.
항원 결합 단편 및 면역학적으로 유효한 단편은 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 단편은 적어도 5개, 6개, 8개 또는 10개 아미노산의 길이를 갖는다. 그렇지 않으면, 상기 단편은 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 50개, 적어도 75개, 또는 적어도 100개의 아미노산의 길이를 갖는다.
본 명세서에서 항원 결합 단백질에 관하여 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 항원 결합 단백질이 다른(예를 들어, 관련없는) 단백질에는 거의 결합하지 않고 미오스타틴에 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 이 용어는 항원 결합 단백질이 밀접하게 관련 있는 분자(예를 들어, 성장 및 분화 인자-11)과 교차 반응성이 있을 수도 있다는 것을 배제하는 것은 아니다. 본 원에서 설명한 항원 결합 단백질은 GDF-11과 같은 밀접한 관련이 있는 분자에 결합하는 것보다 적어도 2배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 1000배 이상 큰 친화성을 가지고서 미오스타틴에 결합할 수 있다.
항원 결합 단백질과 미오스타틴 사이의 상호작용의 결합 친화성 또는 평형 해리 상수(KD)는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하일 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 KD는 5 내지 10 nM 또는 1 내지 2 nM일 수 있다. 상기 KD는 1 pM 내지 500 pM 또는 500 pM 내지 1 nM일 수 있다. 상기 항원 결합 단백질의 결합 친화성은 해리 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd) (KD = kd/ka)에 의해 결정된다. 상기 결합 친화성은 BIAcore™을 이용하여 측정할 수 있는데, 예를 들어, 일차 아민 결합을 통해 CM5 칩에 결합된 미오스타틴으로 항원을 포획하고 이러한 표면상에 항체를 포획함으로써 측정할 수 있다. 실시예 2.3에서 기재한 BIAcore™ 방법을 이용하여 결합 친화성을 측정할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 결합 친화성은 FORTEbio를 이용하여 측정할 수 있는데, 예를 들어, 일차 아민 결합을 통해 CM5 니들(needle)에 결합된 미오스타틴으로 항원을 포획하고 이러한 표면상에 항체를 포획함으로써 측정할 수 있다. 실시예 5.1에서 기재한 FORTEbio 방법을 이용하여 결합 친화성을 측정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항원 결합 단백질의 결합 특성 때문에, 결합 친화성은 등급매김(ranking)의 목적으로 사용될 수 있다.
상기 kd는 1x10-3s-1 이하, 1x10-4s-1 이하, 또는 1x10-5s-1 이하일 수 있다. 상기 kd는 1x 10-5s-1 내지 1x10-4s-1, 또는 1x10-4s-1 내지 1x10-3s-1일 수 있다. kd가 느릴수록 항원 결합 단백질과 리간드의 복합체의 해리가 느릴 수 있고 리간드의 중화가 개선될 수 있다.
본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "중화시킨다"는 미오스타틴의 생물학적 활성이 시험관내 및 생체내에서 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 부재하에서의 미오스타틴의 활성과 비교하여 상기 항원 결합 단백질의 존재하에서 감소되는 것을 의미한다. 중화는 미오스타틴이 이의 수용체에 결합하는 것을 차단, 미오스타틴이 이의 수용체를 활성화하는 것을 방지, 미오스타틴 또는 이의 수용체를 하향 조절, 또는 작용 기능성(effector functionality)을 저해하는 것 중 하나 이상에 기인할 수 있다. 중화는 미오스타틴이 이의 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써 미오스타틴이 이의 수용체를 활성화하는 것을 방지하는 것에 기인할 수 있다.
미오스타틴 활성은 활성 미오스타틴과 관련된 성장 활성, 조절 활성 및 형태형성 활성 중 하나 이상을 포함하는데, 예를 들어, 근육 질량, 근력 및 근육 기능을 조절하는 것을 포함한다. 활성 미오스타틴과 관련이 있는 그 밖의 활성으로는 근육 섬유의 수, 근육 섬유의 크기, 근육 재생, 근육 섬유화, 근육 모세포 증식 속도 및 근육 분화의 조절, 위성 세포의 활성화, 위성 세포의 자가 재생, 근육 성장 및 기능에 관여하는 단백질의 합성 및 이화작용을 들 수 있다. 상기 근육은 골격근일 수 있다.
생물학적 활성의 감소 또는 억제는 부분적 또는 전체적일 수 있다. 중화 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 활성을 상기 항원 결합 단백질의 부재하에서의 미오스타틴 활성과 비교하여 적어도 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 만큼 중화시킬 수 있다. 기능의 분석(예를 들어, 후술한 중화 분석)에 있어서, IC50은 생물학적 반응을 이의 최대치의 50%만큼 감소시키는 농도이다.
중화는 당업자에게 알려진 하나 이상의 분석법을 이용하거나 또는 본 원에서 기재한 바와 같이 확인 또는 측정할 수 있다. 예를 들어, 미오스타틴에 결합하는 항원 결합 단백질은 샌드위치 ELISA, BIAcore™, FMAT, FORTEbio™, 또는 이와 유사한 시험관내 분석법(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명)을 이용하여 평가할 수 있다.
ELISA 기반 수용체 결합 분석법을 이용하여, 항원 결합 단백질의 존재하에서 플레이트 상에 고정된 가용성 ActRIIb 수용체에의 미오스타틴의 결합을 측정함으로써 항원 결합 단백질의 중화 활성을 확인할 수 있다(더욱 상세한 사항에 대하여는 실시예 2.5를 참조한다). 상기 수용체 중화 분석법은 효능을 기준으로 1 nM 이하의 IC50을 갖는 분자를 구별하는데 이용가능한 민감한 방법이다. 그러나, 이는 결합할 수 있는 비오티닐화 미오스타틴의 정확한 농도에 그 자체가 민감한 것은 아니다. 따라서, 0.1 nM 내지 5 nM 범위의 IC50 값이 얻어질 수 있는데, 예를 들어, 0.1 nM 내지 3 nM 범위, 0.1 nM 내지 2 nM 범위, 또는 0.1 nM 내지 1 nM 범위의 IC50 값이 얻어질 수 있다.
그렇지 않으면, 세포 기반 수용체 결합 분석법을 이용하여, 수용체 결합, 하위 신호전달 및 유전자 활성화의 억제를 측정함으로써 항원 결합 단백질의 중화 활성을 확인할 수 있다. 예를 들어, 중화 항원 결합 단백질은 PAI-1 특이 프로모터의 조절하에서 루시퍼라제를 엔코딩하는 작제물로 형질감염된 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma) 세포에서 미오스타틴에 의해 유발된 루시퍼라제 활성을 억제하기 위한 상기 단백질의 능력을 통해 확인할 수 있는데, 이는 미오스타틴 반응 리포터 유전자 분석법이라고도 알려져 있다(더욱 상세한 사항에 대하여는 실시예 1.2를 참조한다).
생체내 중화는 동물에서 다수의 상이한 분석법을 이용하여 근육 질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합의 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 체중, 근육 질량(예를 들어, 제지방 근육 질량), 근육 수축률(예, 강직력), 그립 강도, 동물의 매달리는 능력, 및 유영 시험을 따로따로 또는 임의의 조합으로 이용하여 미오스타틴 항원 결합 단벡질의 중화 활성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 하기의 근육들의 질량을 측정할 수 있다: 비복근, 사두근, 삼두근, 장지신근(EDL), 전경골근(TA) 및 넙치근.
용어 "유래한"은 물질에 대한 물리적 기원이 되는 의미의 출처를 정의하는 외에도, 구조적으로는 동일하지만 대조 출처로부터 유래하지 않는 물질을 정의한다는 것이 당업자에게 명백하게 된다. 따라서, "공여체 항체에서 확인되는 잔기"는 상기 공여체 항체로부터 반드시 정제될 필요가 없다.
"분리된"이란 항원 결합 단백질과 같은 분자가 이것이 확인될 수 있는 환경으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 분자는 이와 함께 정상적으로 존재할 수 있는 물질로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 이를 함유하는 배지와 비교하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 정제될 수 있다.
"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 함께 공여체 항체로부터 유래한 천연 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 함유하는 형태의 조작된 항체를 의미한다.
"인간화 항체"는 비인간 공여 면역글로불린에서 유래한 하나 이상의 CDR을 갖는 형태의 조작된 항체를 말하는 것으로서, 상기 분자의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 하나 이상의 면역글로불린에서 유래하는 것이다. 또한, 결합 친화성이 보존되도록 골격 지지체 잔기를 변경시킬 수 있다(예를 들어, Queen 외, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029- 10032 (1989), Hodgson 외, Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 적당한 인간 수용체 항체는 공여체 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 동일성을 통해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, KABAT® 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 아미노산을 기준으로 공여체 항체의 골격 영역과의 동일성에 의해 특성규명된 인간 항체는 공여 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 골격 영역을 제공하기에 적당할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 골격 영역을 공여할 수 있는 적당한 수용체 항체를 유사한 방식으로 선택할 수 있다. 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체로부터 유래할 필요가 없다는 점에 유념하여야 한다. 종래 기술에서는 이러한 인간화 항체를 제조하는 몇 가지 방법을 설명하고 있다(예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조).
용어 "공여체 항체"(donor antibody)는 그의 가변 영역, 하나 이상의 CDR, 또는 다른 기능적 단편 또는 이의 유사체의 아미노산 서열을 첫 번째 면역글로불린 짝에 제공하는 항체를 의미한다. 따라서, 공여자는 공여체 항체의 항원 특이성 및 중화 활성의 특징을 갖는 변형된 면역글로불린 엔코딩 영역 및 이에 따른 발현된 변형 항체를 제공한다.
용어 " 수용체 항체"(acceptor antibody)는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 골격 영역 및/또는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 엔코딩하는 아미노산 서열의 전부(또는 임의의 일부)를 첫 번째 면역 글로불린 짝에 제공하는 것으로, 공여체 항체에 대하여 이종인 항체를 말한다. 인간 항체가 수용체 항체일 수 있다.
본 원에서 사용되는 용어 ""VH" 및 "VL"은 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 의미한다.
"CDR"은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 말한다. 이들은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변(hypervariable) 영역이다, 면역글로불린의 가변 부위에는 세 개의 중쇄 및 세 개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본 원에서 사용되는 용어 "CDR"은 세 개의 중쇄 CDR 전부, 세 개의 경쇄 CDR 전부, 중쇄 및 경쇄 CDR 전부, 또는 적어도 두 개의 CDR을 의미한다.
본 명세서에서, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기는 달리 나타내지 않는 경우 카밧 넘버링 규정(Kabat numbering convention)에 따라 넘버링된다. 유사하게, 실시예에서 사용된 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2" 및 "CDRH3"도 카밧 넘버링 규정에 따른다. 더욱 상세한 정보에 대하여는 다음문헌[Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다.
당업자는 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기에 대한 다른 넘버링 규정이 있다는 것을 명백히 알 수 있다. 또한, CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규정, 예를 들어 다음문헌[Chothia 외, (1989) Nature 342: 877-883]에 기재된 넘버링 규정이 있다. 항체의 구조 및 단백질 접힘은 다른 잔기가 CDR 서열의 일부로 간주되고 당업자가 이와 같이 이해할 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본 원에서 사용되는 용어 "상응하는 CDR"은 예를 들어 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이 임의의 넘버링 규정을 이용한 CDR 서열을 의미한다.
당업자에게 유용한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규정으로는 "AbM"(University of Bath) 및 "접촉"(University College London) 방법이 있다. 상기 카밧(Kabat), 코티아(Chothia), AbM 및 접촉 방법 중 적어도 두 방법을 이용하여 최소 중첩 영역(minimum overlapping region)을 확인하여 "최소 결합 단위체"를 규정할 수 있다. 상기 최소 결합 단위체는 CDR의 서브 부위(sub-portion)일 수 있다.
하기 표 1은 각각의 CDR 또는 결합 단위체에 대한 각각의 넘버링 규정을 이용한 한 가지 정의를 나타낸다. 표 1에서는 카밧(Kabat) 넘버링 규정을 이용하여 가변 도메인의 아미노산 서열을 넘버링하고 있다. 이러한 CDR 정의의 일부는 사용되는 개개 규정에 따라 다양할 수 있다는 것을 유념하여야 한다.
표 1
Figure pct00001
본원에서 사용되는 용어"항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 상의 부위를 의미한다. 이는 단일 도메인(예를 들어, 에피토프-결합 도메인) 또는 단쇄(single-chain) Fv (ScFv) 도메인일 수 있거나, 또는 표준 항체에서 확인할 수 있는 바와 같이 쌍을 이룬 VH/VL 도메인일 수 있다.
본 원에서 사용되는 용어 "에피토프"(epitope)는 항원 결합 단백질의 특정 결합 도메인과 접촉하는 항원 부위를 의미한다. 에피토프는 선형일 수 있고 항원 유래의 실질적으로 선형의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 에피토프는 입체적이거나 불연속적일 수 있다. 예를 들어, 입체적인(conformational) 에피토프는 구조적 속박 요소를 필요로 하는 아미노산 잔기를 포함한다. 불연속적인 에피토프는 다른 서열에 의해 분리되어 있는, 즉, 항원의 일차 서열에서 연속적인 서열로 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 항원의 3차 및 4차 구조에 있어서, 불연속적인 에피토프의 잔기들은 항원 결합 단백질에 의해 서로 결합되도록 서로 충분히 근접한다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 경우, 용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 두 개의 핵산 또는 두 개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타내는 것으로서, 필요한 경우 최적으로 정렬하고 적절한 삽입 또는 결실과 비교한 경우의 동일성의 정도를 나타낸다.
두 서열 사이의 동일성%은 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 수와 상관하는데(즉, 동일성% = 동일한 위치들의 수/위치들의 총수 x 100), 이때, 갭(gap)들의 수 및 각각의 갭의 길이가 고려되고 이러한 고려사항은 두 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 서열들의 비교 및 두 서열 사이의 동일성(%)의 측정은 후술하는 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 PAM 120 가중치 잔기 테이블(weight residue table), 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 이용하면서, ALIGN 프로그램(version 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하면서, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. MoI. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
하나의 방법에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 본 원에 기재한 바와 같은 100% 동일한 참조 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어 서열번호 41 내지 55 참조)과 동일할 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 비교하여 특정 수 이하의 뉴클레오티드 변형들을 포함할 수도 있는데, 예를 들어 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 치환(전이 및 교차(transversion)를 포함), 또는 삽입으로부터 선택되는데, 상기 변형은 참조 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 발생할 수 있거나, 참조 서열의 뉴클레오티드들의 사이에 개별적으로 산재하거나 참조 서열의 하나 이상의 인접 그룹들 내에 산재한 것으로 상기 말단 위치들의 사이의 임의 위치에서 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변형들의 수는 본 원에서 기재한 바와 같은 참조 뉴클레오티드 서열(예를 들어 서열번호 41 내지 55 참조)내의 뉴클레오티드의 총수에 각각의 동일성의 %의 수치(100으로 나눈)를 곱하고, 본 원에서 기재한 바와 같은 참조 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어 서열번호 41 내지 55 참조)의 뉴클레오티드들의 총수로부터 상기 곱한 값을 뺌으로써 산정하거나 하기의 식을 이용하여 산정한다:
Figure pct00002
상기 식에서, nn는 뉴클레오티드 변형들의 수이고, xn는 본 원에서 기재한 바와 같은 참조 뉴클레오티드 서열(예를 들어 서열번호 41 내지 55 참조)내의 뉴클레오티드들의 총수이고, y는 0.50(50%의 경우), 0.60(60%), 0.70(70%), 0.75(75%), 0.80(80%), 0.85(85%), 0.90(90%), 0.95(95%), 0.98(98%), 0.99(99%) 또는 1.00(100%)이고, ●는 곱셈 연산 기호이고, xn와 y의 어떠한 정수가 아닌 곱셈 값은 xn에서 이를 빼기에 앞서 가장 근접한 정수로 사사오입한다.
유사하게, 폴리펩티드 서열은 본 원에서 기재한 바와 같은 100% 동일한 폴리펩티드 참조 서열(예를 들어, 서열번호 7 내지 40, 98 또는 99 참조)과 동일할 수 있거나, 참조 서열과 비교하여 그 동일성%가 100% 미만, 예를 들어, 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%이도록 특정 정수까지의 아미노산 변형들을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환(보존적 치환 및 비보존적 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 군에서 선택되는데, 상기 변형은 참조 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 위치에서 발생할 수 있거나, 참조 서열의 뉴클레오티드들의 사이에 개별적으로 산재하거나 참조 서열의 인접 기들 내에 산재한 것으로 상기 말단 위치들의 사이의 임의 위치에서 발생할 수 있다. 소정의 동일성(%)의 경우에 대한 아미노산 변형들의 수는 본 원에서 기재한 바와 같은 폴리펩티드 참조 서열(예를 들어, 서열번호 7 내지 40, 98 또는 99 참조)에 의해 엔코딩되는 폴리뉴클레오티드 서열의 아미노산의 총수에 각각의 동일성%의 수치(100으로 나눈)를 곱하고, 본 원에서 기재한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 참조 서열(예를 들어, 서열번호 7 내지 40 또는 82 내지 108, 98 또는 99)내의 아미노산의 총수에서 상기 곱한 값을 뺌으로써 산정하거나 하기의 식을 이용하여 따라 산정한다:
Figure pct00003
상기 식에서, na는 아미노산 변형들의 수이고, xa는 전술한 바와 같은 참조 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열번호 7 내지 40, 98 또는 99 참조)내의 아미노산의 총수이고, y는 0.50(50%의 경우에 대한), 0.60(60%), 0.70(70%), 0.75(75%), 0.80(80%), 0.85(85%), 0.90(90%), 0.95(95%), 0.98(98%), 0.99(99%) 또는 1.00(100%)이고, ●는 곱셈 연산 기호이고, xa와 y의 어떠한 정수가 아닌 곱셈 값은 xa에서 이를 빼기에 앞서 가장 근접한 정수로 사사오입한다.
동일성(%)은 임의의 결실이 있거나 없는 서열 또는 이의 임의의 단편의 전장(full length)에 걸쳐서 산정할 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 각각 의미한다. 펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
특정 아미노산 치환은 "보존적"인 것으로 간주한다는 것이 당 업계에 잘 알려져 있다. 아미노산들은 공통되는 측쇄 특성을 기준으로 그룹들로 나누어지고, 항원 결합 단백질의 결합 친화성을 전부 또는 실질적으로 전부 유지하는 치환은 보존적인 치환으로 간주한다(하기 표 2 참조).
표 2
Figure pct00004
본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 서열번호 3의 CDRH3 또는 이의 변이 CDRH3 (예를 들어, 서열번호 82 내지 92 또는 110 중 어느 하나)를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴 활성을 중화시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 서열번호 2의 CDRH2 또는 이의 변이 CDRH2(예를 들어, 서열번호 93 내지 97 중 어느 하나)를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴 활성을 중화할 수도 있다.
상기 항원 결합 단백질은 상기 CDRH3 또는 CDRH2 서열 외에도, CDRH1(서열번호 1), CDRH2(서열번호 2), CDRL1(서열번호 4), CDRL2(서열번호 5), 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109)로부터 선택된 하나 이상의 CDR 또는 모든 CDR의 임의의 조합, 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 93 내지 97의 CDRH2 변이체들 중 어느 하나)를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 3) 및 CDRH1(서열번호 1), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110중 어느 하나)를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 3) 및 CDRH2 (서열번호 2), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나, 또는 서열번호 93 내지 97의 CDRH2 변이체들 중 어느 하나)를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 1) 및 CDRH2(서열번호 2) 및 CDRH3(서열번호 3), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나, 또는 서열번호 93 내지 97의 CDRH2 변이체들 중 어느 하나)를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 4) 및 CDRL2(서열번호 5), 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRL2(서열번호 5) 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109), 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 4), CDRL2(서열번호 5) 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109), 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원결합 단백질은 CDRH3(서열번호 3) 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나)를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 3), CDRH2(서열번호 2) 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나, 또는 서열번호 93 내지 97의 CDRH2 변이체들 중 어느 하나)를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 3), CDRH2(서열번호 2), CDRL2(서열번호 5) 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109), 또는 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 82 내지 92, 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나, 또는 서열번호 93 내지 97의 CDRH2 변이체들 중 어느 하나)를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 1), CDRH2(서열번호 2), CDRH3 (서열번호 3), CDRL1(서열번호 4), CDRL2(서열번호 5) 및 CDRL3(서열번호 6)을 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 서열번호 82 내지 92 또는 110의 CDRH3 변이체들 중 어느 하나, 또는 서열번호 109의 CDRH3 변이체와 같은 CDR 변이체가 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 1), CDRH2(서열번호 95), CDRH3(서열번호 90), CDRL1(서열번호 4), CDRL2(서열번호 5) 및 CDRL3(서열번호 109)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 서열번호 7의 가변 도메인 서열의 상응하는 CDRH3 또는 이의 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴 활성을 중화시킬 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 가변 도메인 서열로부터 선택된 CDR들 중 하나 이상 또는 전부, 또는 이의 CDR 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRH1, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRH2, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, 상응하는 CDRH2 및 상응하는 CDRH3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL1 및 상응하는 CDRL2, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL1, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRH2 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRH2, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, 상응하는 CDRH2, 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRL1, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 상응하는 CDR들은 카밧(1987), 코티아(1989), AbM 또는 접촉 방법을 참고하여 정의할 수 있다. 상기 각각의 방법의 한 가지 정의가 표 1에서 확인될 수 있고 서열번호 7의 참조 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 참조 경쇄 가변 도메인에 적용하여 상응하는 CDR을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하는 항원 결합 단백질로서, 서열번호 7의 카밧(Kabat) 잔기 번호 95 내지 101을 포함하는 결합 단위체 H3 또는 이의 변이체 H3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴을 중화시킬 수도 있다.
상기 항원 결합 단백질은 하기의 것들로부터 선택된 하나 이상 또는 전부의 결합 단위체 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다: 서열번호 7의 카밧(Kabat) 잔기 번호 31 내지 32를 포함하는 H1; 서열번호 7의 카밧 잔기 번호 52 내지 56을 포함하는 H2; 서열번호 8의 카밧 잔기 번호 30 내지 34를 포함하는 L1; 서열번호 8의 카밧 잔기 번호 50 내지 55를 포함하는 L2; 및 서열번호 8의 카밧 잔기 번호 89 내지 96을 포함하는 L3.
예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H3 및 결합 단위체 H1, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H3 및 결합 단위체 H2, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H1, 결합 단위체 H2 및 결합 단위체 H3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 L1 및 결합 단위체 L2, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 L2 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 L1, 결합 단위체 L2 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H3 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H3, 결합 단위체 H2 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H3, 결합 단위체 H2, 결합 단위체 L2 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 결합 단위체 H1, 결합 단위체 H2, 결합 단위체 H3, 결합 단위체 L1, 결합 단위체 L2 및 결합 단위체 L3, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
CDR 변이체 또는 변이체 결합 단위체는 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는데, 상기 변형은 아미노산의 화학적 또는 부분적 변형(예를 들어, 10 개 이하의 아미노산)일 수 있는데, 상기 변형은 비변형 서열이 생물학적 특성을 유지하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 상기 변이체는 미오스타틴에 결합하는 기능적 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적 변형은 한 개 내지 몇 개의 아미노산의 결실 또는 치환, 한 개 내지 몇 개의 아미노산의 부가 또는 삽입, 또는 이들의 조합(예를 들어, 10 개 이하의 아미노산)을 통해 이루어질 수 있다. 상기 CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열에서 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환일 수 있는데, 예를 들어, 택일적인 소수성 아미노산을 하나의 소수성 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다. 예를 들어, 루신이 발린 또는 이소루신으로 치환될 수 있다.
상기 CDR의 L1, L2, L3, H1 및 H2는 구조적으로 한정된 수의 주쇄 배좌(main chain conformation)들 중 하나를 나타내려는 경향이 있다. CDR의 특정의 표준적인(canonical) 구조 부류는 CDR의 길이 및 루프 패킹 모두에 의해 정의되는데, 이러한 길이 및 패킹은 CDR 및 골격 영역 모두의 존재하는 핵심 위치에 있는 잔기에 의해 결정된다(잔기 또는 SDR을 구조적으로 결정하는 것). Martin 및 Thornton(1996; J MoI Biol 263:800-815)은 "핵심 잔기"의 표준적인 주형을 정의하는 자동적인 방법을 개발했다. 클러스터 방법을 이용하여 CDR의 세트에 대한 표준적인 부류를 정의한 다음, 매립된 소수성 물질, 수소 결합 잔기, 및 보존된 글리신 및 프롤린을 분석하여 표준적인 주형을 확인한다. 항체 서열의 CDR은, 그 서열을 핵심 잔기 주형과 비교하고 동일성 또는 유사성 매트릭스를 이용하여 각각의 주형을 기록함으로써 표준적인 부류로 할당될 수 있다.
카밧 번호 이전의 아미노산이 서열번호 14 또는 24의 최초 아미노산 서열이고, 카밧 번호의 종료시의 아미노산 서열이 치환된 아미노산 서열인 경우의 CDR 표준(canonicals)의 예로는 하기의 것들이 있다:
CDRH1 표준: Y32I, Y32H, Y32F, Y32T, Y32N, Y32C, Y32E, Y32D, F33Y, F33A, F33W, F33G, F33T, F33L, F33V, M34I, M34V, M34W, H35E, H35N, H35Q, H35S, H35Y, H35T;
CDRH2 표준: N50R, N50E, N50W, N50Y, N50G, N50Q, N50V, N50L, N50K, N50A, I51L, I51V, I51T, I51S, I51N, Y52D, Y52L, Y52N, Y52S, Y53A, Y53G, Y53S, Y53K, Y53T, Y53N, N54S, N54T, N54K, N54D, N54G, V56Y, V56R, V56E, V56D, V56G, V56S, V56A, N58K, N58T, N58S, N58D, N58R, N58G, N58F, N58Y;
CDRH3 표준: V102Y, V102H, V102I, V102S, V102D, V102G;
CDRL1 표준: D28N, D28S, D28E, D28T, I29V, N30D, N30L, N30Y, N30V, N30I, N30S, N30F, N30H, N30G, N30T, S31N, S31T, S31K, S31G, Y32F, Y32N, Y32A, Y32H, Y32S, Y32R, L33M, L33V, L33I, L33F, S34A, S34G, S34N, S34H, S34V, S34F;
CDRL2 표준: A51T, A51G, A51V;
CDRL3 표준: L89Q, L89S, L89G, L89F, Q90N, Q90H, S91N, S91F, S91G, S91R, S91D, S91H, S91T, S91Y, S91V, D92N, D92Y, D92W, D92T, D92S, D92R, D92Q, D92H, D92A, E93N, E93G, E93H, E93T, E93S, E93R, E93A, F94D, F94Y, F94T, F94V, F94L, F94H, F94N, F94I, F94W, F94P, F94S, L96P, L96Y, L96R, L96I, L96W, L96F.
CDR 마다, 상응하는 CDR 마다, 결합 단위체 마다, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 마다, 중쇄 또는 경쇄 마다, 그리고 항원 결합 단백질 마다 다수의 변이 CDR 표준 위치가 존재할 수 있으므로, CDR의 표준 구조가 유지되는 경우 치환의 임의의 조합이 본 발명의 항원 결합 단백질에 존재할 수 있다.
카밧 번호 이전의 아미노산이 서열번호 14 또는 24의 최초 아미노산 서열이고 카밧 번호의 종료시의 아미노산 서열이 치환 아미노산인 경우의 카밧 넘버링 규정을 이용하여 결정되는 CDR 변이체 및 변이 결합 단위체들의 다른 예로는 하기의 것들이 있다:
H2: G55D, G55L, G55S, G55T, G55V;
H3: Y96L, G99D, G99S, G100A_K, P100B_F, P100B_I, W100E_F, F100G_N, F100G_S, F100G_Y, V102N, V102S;
L3: C91S.
예를 들어, 미오스타틴에 결합하는 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 90의 CDRH3을 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 93 내지 97 중 어느 하나의 CDRH2를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 CDRH2는 서열번호 95일 수 있다. 또한, 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 109의 CDRL3를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 1), CDRL1(서열번호 4) 및 CDRL2(서열번호 5)중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합 또는 전부를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴 활성을 중화시킬 수도 있다.
전술한 CDR, 상응하는 CDR, 변이 CDR, 결합 단위체 또는 변이 결합 단위체를 포함하는 항원 결합 단백질은 EC50으로 확인되는 바와 같이, 10배 이내의 미오스타틴에의 결합능을 나타내거나, 10B3 또는 10B3 키메라(중쇄: 서열번호 7 또는 25, 경쇄: 서열번호 8)가 나타낸 결합능의 5배 이내의 결합능을 나타낼 수 있다. EC50에 의해 확인되는 바와 같은 미오스타틴에의 결합능은 ELISA 분석법을 수행하여 확인할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 중쇄의 아미노산 카밧 위치 54에서 아스파리긴((N)에서 아스파르테이트(D) 또는 글루타민(Q)으로의 치환을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 경쇄의 아미노산 카밧 위치 91에서 시스테인(C)에서 세린(S)치환을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 경쇄의 위치 91에서 세린(S) 잔기 및 중쇄의 위치 54에서 아스파라긴(N)을 갖는다.
상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄는 위치 28에서 세린(S) 또는 트레오닌(T) 아미노산 잔기, 및/또는 위치 105에서 트레오닌(T) 또는 글루타민(Q) 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄는 위치 16에서 아르기닌(R) 또는 글리신(G) 아미노산 잔기, 및/또는 위치 71에서 티로신(Y) 또는 페닐알리닌(F) 아미노산 잔기, 및/또는 위치 100에서 알라닌(A) 또는 글루타민(Q) 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 가변 중쇄의 위치 28에서 세린(S), 가변 중쇄의 위치 105에서 글루타민(Q), 및/또는 가변 경쇄의 위치 16에서 글리신(G), 위치 71에서 티로신(Y), 및 위치 100에서 글루타민을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, CDR의 특정의 표준적인 구조 부류는 CDR 및 골격 영역 모두의 핵심 위치의 잔기에 의해 결정되는 CDR의 길이 및 루프 패킹 모두에 의해 정의된다. 따라서, 서열번호 1 내지 3에서 나타낸 CDR, 서열번호 82 내지 97 및 서열번호 109에서 나타낸 변이 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위체, 또는 이들의 변이체 외에도, 본 발명의 항원 결합 단백질의 표준 골격 잔기는 카밧 넘버링 규정을 이용하여 정의되는 하기의 것들을 포함할 수 있다:
중쇄: 위치 2에서 V, I 또는 G; 위치 4에서 L 또는 V; 위치 20에서 L, I, M 또는 V; 위치 22에서 C; 위치 24에서 T, A, V, G 또는 S; 위치 26에서 G; 위치 29에서 I, F, L 또는 S; 위치 36에서 W; 위치 47에서 W 또는 Y; 위치 48에서 I, M, V 또는 L; 위치 69에서 I, L, F, M 또는 V; 위치 78에서 A, L, V, Y 또는 F; 위치 80에서 L 또는 M; 위치 90에서 Y 또는 F; 위치 92에서 C, 및/또는 위치 94에서 R, K, G, S, H 또는 N; 및/또는
경쇄: 위치 2에서 I, L 또는 V; 위치 3에서 V, Q, L 또는 E; 위치 4에서 M 또는 L; 위치 23에서 C; 위치 35에서 W; 위치 36에서 Y, L 또는 F; 위치 46에서 S, L, R 또는 V; 위치 49에서 Y, H, F 또는 K; 위치 71에서 Y 또는 F ; 위치 88에서 C, 및/또는 위치 98에서 F.
전술한 골격 위치들 중 어느 하나, 임의 조합 또는 전부가 본 발명의 항원 결합 단백질에 존재할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 영역마다, 중쇄 또는 경쇄마다, 그리고 항원 결합 단백질마다 다수의 변이 골격 표준 위치가 존재할 수 있으므로, 골격의 표준 구조가 유지되는 경우 본 발명의 항원 결합 단백질에는 임의의 조합이 존재할 수 있다.
예를 들어, 상기 중쇄 가변 골격은 위치 2에서 V, 위치 4에서 L, 위치 20에서 V, 위치 22에서 C, 위치 24에서 A, 위치 26에서 G, 위치 29에서 F, 위치 36에서 W, 위치 47에서 W, 위치 48에서 M, 위치 69에서 M, 위치 78에서 A, 위치 80에서 M, 위치 90에서 Y, 위치 92에서 C, 및 위치 94에서 R을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 경쇄 가변 골격은 위치 2에서 I, 위치 3에서 Q, 위치 4에서 M, 위치 23에서 C, 위치 35에서 W, 위치 36에서 F, 위치 46에서 S, 위치 49에서 Y, 위치 71에서 Y, 위치 88에서 C 및 위치 98에서 F를 포함할 수 있다.
본 원에서 기재한 CDR들, 상응하는 CDR들, 변이 CDR들 또는 결합 단위체들 중 하나 이상은 인간 골격에서 예를 들어 인간화 또는 키메라 가변 도메인 형태로 존재할 수 있다.
상기 인간화 중쇄 가변 도메인은 서열번호 10의 인간 수용체 가변 도메인 서열과 비교하여 골격 영역이 75% 이상,80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 수용체 항체 골격내에서 서열번호 1 내지 3의 CDR; 서열번호 82 내지 97, 109 및 110의 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위체, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 인간화 경쇄 가변 도메인은 서열번호 11의 인간 수용체 가변 도메인 서열과 비교하여 골격 영역이 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 수용체 항원 골격내에서 서열번호 4 내지 6의 CDR, 서열번호 82 내지 97, 109 및 110의 변이 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위체, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 서열번호 10 및 서열번호 11 모두에 있어서, CDRH3의 위치는 X로 나타내었다. 서열번호 10 및 서열번호 11에서의 10 X 잔기는 CDR의 위치에 대한 위치지정자(placeholder)이고, 각각의 CDR에서의 아미노산 서열들의 수의 척도는 아니다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 서열번호 7 또는 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 8 또는 21로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합들 중 어느 하나를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다: 10B3(서열번호 7 및 서열번호 8), 10B3C(서열번호 25 및 서열번호 8), 또는 10B3C-C91S(서열번호 25 및 서열번호 21). 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴을 중화시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 서열번호 12, 13, 14, 22 및 23으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 15, 16, 17, 18 또는 24 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 가변 영역들 중 임의의 것은 상기 경쇄 가변 영역들 중 임의의 것과 합쳐질 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴을 중화시킬 수도 있다.
상기 항원 결합 단백질은 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: H0L0(서열번호 12 및 서열번호 15), H0L1(서열번호 12 및 서열번호 16), H0L2(서열번호 12 및 서열번호 17), H0L3(서열번호 12 및 서열번호 18), H1L0(서열번호 13 및 서열번호 15), H1L1(서열번호 13 및 서열번호 16), H1L2(서열번호 13 및 서열번호 17), H1L3(서열번호 13 및 서열번호 18), H2L0(서열번호 14 및 서열번호 15), H2L1(서열번호 14 및 서열번호 16), H2L2(서열번호 14 및 서열번호 17), H2L3(서열번호 14 및 서열번호 18), H2L2-C91S(서열번호 및 서열번호 24).
상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 7, 25, 12, 13, 14, 19, 20, 22 또는 23 중 어느 하나와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 15, 16, 17, 18, 21 또는 24 중 어느 하나와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
서열번호 7, 25, 12, 13, 14, 19, 20, 22, 23, 8, 15, 16, 17, 18, 21 또는 24의 변이체의 동일성(%)은 그 서열의 전장(full length)에 걸쳐서 측정될 수 있다.
상기 항체의 중쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 7, 25, 12, 13, 14, 19, 20, 22 또는 23 중 어느 하나의 변이체일 수 있다. 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 8, 15, 16, 17, 18, 21 또는 24 중 어느 하나의 변이체일 수 있다.
예를 들어, 전술한 표준적인 CDR 및 표준적인 골격 잔기 치환은, 적어도 75% 동일하거나 30 개까지의 아미노산 치환을 포함하는 변이 서열인 변이 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 존재할 수도 있다.
상기 치환은 전술한 항체의 중쇄 가변 영역들 중 어느 하나에서 하기의 것들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: Y96L, G99D, G99S, G100A_K, P100B_F, P100B_I, W100E_F, F100G_N, F100G_S, F100G_Y, V102N 및 V102S. 전술한 치환들 중 어느 하나 외에도, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 전술한 항체의 중쇄 가변 영역들 중 어느 하나에서 하기의 치환들 중 어느 하나를 포함할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V.
상기 항체의 중쇄 가변 영역은 F100G Y 치환을 갖는 서열 번호 14의 서열을 가질 수 있다. F100G_Y 치환 외에도, 하기의 치환들 중 어느 하나가 존재할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V. 특히, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 하기의 치환을 갖는 서열번호 14의 서열을 가질 수 있다: F100G_Y; 또는 F100G_Y 및 G55S. 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 24의 서열의 경쇄 가변 영역과 짝을 이룰 수 있다.
상기 중쇄 가변 영역들 중 어떤 것은 적당한 인간 불변 영역과 합쳐질 수 있다. 상기 경쇄 가변 영역들 중 어떤 것은 적당한 불변 영역과 합쳐질 수 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고, 하기의 중쇄와 경쇄의 조합들 중 어느 하나를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다: 10B3C(서열번호 26 및 서열번호 27), 또는 10B3C-C91S(서열번호 26 및 서열번호 37). 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴을 중화시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 미오스타틴에 결합하고 서열번호 28, 29, 30, 35, 36, 38, 39, 98 또는 99 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 31, 32, 33, 34 또는 40 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄를 포함할 수 있다. 상기 중쇄들 중 어느 하나는 상기 경쇄들 중 어느 하나와 합쳐질 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴을 중화시킬 수도 있다.
상기 항원 결합 단백질은 하기의 중쇄와 경쇄의 조합들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: H0L0(서열번호 28 및 서열번호31), H0L1(서열번호 28 및 서열번호 32), H0L2(서열번호 28 및 서열번호 33), H0L3(서열번호 28 및 서열번호 34), H1L0(서열번호 29 및 서열번호 31), H1L1(서열번호 29 및 서열번호 32), H1L2(서열번호 29 및 서열번호 33), H1L3(서열번호 29 및 서열번호 34), H2L0(서열번호 30 및 서열번호 31), H2L1(서열번호 30 및 서열번호 32), H2L2(서열번호 30 및 서열번호 33), H2L3(서열번호 30 및 서열번호 34), H2L2-C91S(서열번호 30 및 서열번호 40), Fc가 무능화(disabled)된 H2L2-C91S F100G_Y (서열번호 98 및 서열번호 40), 또는 Fc가 무능화된 H2L2-C91S G55S-F100G_Y(서열번호 99 및 서열번호 40).
상기 항체의 중쇄는 서열번호 26, 28, 29, 30, 35, 36, 38, 39, 98 또는 99 중 어느 하나와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 상기 항체의 경쇄는 서열번호 27, 31, 32, 33, 34, 37 또는 40 중 어느 하나와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다.
서열번호 26, 28, 29, 30, 35, 36, 38, 39, 98, 99, 27, 31, 32, 33, 34, 37 또는 40의 변이체의 동일성(%)은 그 서열의 전체 길이에 걸쳐서 측정될 수 있다.
상기 항체의 중쇄는 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 26, 28, 29, 30, 35, 36, 38, 39, 98 또는 99 중 어느 하나의 변이체일 수 있다. 상기 항체의 경쇄는 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 27, 31, 32, 33, 34, 37 또는 40 중 어느 하나의 변이체일 수 있다.
예를 들어, 전술한 표준적인 CDR 및 표준적인 골격 잔기 치환은, 적어도 75% 동일하거나 30 개까지의 아미노산 치환을 포함하는 변이 서열인 변이 중쇄 또는 변이 경쇄에 존재할 수도 있다.
상기 치환은 전술한 항체 중쇄들 중 어느 하나에서 하기의 것들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: Y96L, G99D, G99S, G100A_K, P100B_F, P100B_I, W100E_F, F100G_S, F100G_N, F100G_Y, V102N, 및 V102S. 상기 치환들 중 어느 하나 외에도, 상기 항체의 중쇄는 전술한 항체 중쇄들 중 어느 하나에서 하기의 치환들 중 어느 하나를 포함할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V.
상기 항체의 중쇄는 F100G_Y 치환을 갖는 서열번호 30의 서열을 가질 수 있다. 상기 F100G_Y 치환 외에도, 하기의 치환들 중 어느 하나가 존재할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V. 특히, 상기 항체의 중쇄는 하기의 치환을 갖는 서열번호 30의 서열을 가질 수 있다: F100G_Y; 또는 F100G_Y 및 G55S. 상기 항체의 중쇄는 서열번호 49의 서열의 경쇄와 짝을 이룰 수 있다.
전술한 바와 같은 항원 결합 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변형 및/또는 삽입, 결실 또는 치환에 의한 서열의 부분적 변형을 갖는 변이체, 또는 전술한 서열들 중 어느 하나와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 변이체들은 EC50에 의해 확인되는 바와 같이, 10B3 또는 10B3 키메라(중쇄: 서열번호 7 또는 25, 경쇄: 서열번호 8)가 나타낸 미오스타틴에의 결합능의 10 배 이내 또는 5 배 이내의 결합능을 나타낼 수 있다. EC50에 의해 확인되는 미오스타틴에의 결합능은 ELISA 분석을 수행함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 Fc가 무능화(disabled)될 수 있다. Fc 무능화를 달성하기 위한 한 가지 방법은 중쇄 불변 영역의 235 및 237 위치 (EU 색인의 넘버링)에서의 알리닌 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 Fc가 무능화될 수 있고, 서열번호 98(인간화 중쇄: Fc 무능화된 H2 F100G_Y ); 또는 서열번호 99(인간화 중쇄: Fc 무능화된 H2 G55S - F100G_Y)의 서열을 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 항원 결합 단백질은 Fc가 유능화(enabled)될 수 있고 235 및 237 위치에서 알라닌 치환을 포함하지 않을 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴에 결합할 수 있고, 서열번호 7 또는 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체와 미오스타틴에의 결합에 대하여 경쟁할 수 있는데, 이때, 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 펩티드 단편에 결합하지 않는다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 서열번호 81(CCTPTKMSPINMLY)로 구성될 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 미오스타틴 서열의 14 개 이하의 아미노산으로 구성되는 임의의 단편일 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 선형일 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 전장 서열을 포함한 미오스타틴 서열의 임의의 단편일 수 있는데, 이때 상기 펩티드 단편은 선형이다. 이는 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트상에 포획된 비오티닐화 펩티드 및 SRU BIND 판독기(reader)를 이용하는 실시예 2.4에서 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
그렇지 않으면, 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴과 결합할 수 있고, 서열번호 7 또는 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체와 미오스타틴에의 결합을 위해 경쟁할 수 있는데, 이때, 상기 항원 결합 단백질은 서열번호 74로 구성되는 인위적인 펩티드 서열(인공 미오스타틴 선형 펩티드 37-SGSGCCTPTKMSPINMLY)에 결합하지 않는다. 상기 인공 펩티드 서열은 하기 표 7에서 나타낸 서열들 중 어느 하나로 구성될 수 있다. 이는 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트상에 포획된 비오티닐화 펩티드 및 SRU BIND 판독기를 이용하는 실시예 2.4에서 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
상기 참조 항체는 하기의 중쇄와 경쇄의 조합을 포함할 수 있다: 10B3C (서열번호 26 및 서열번호 27). 서열번호 26의 중쇄 서열은 서열번호 25의 가변 도메인 서열을 포함하고, 서열번호 27의 경쇄 서열은 서열번호 8의 가변 도메인 서열을 포함한다.
상기 항원 결합 단백질과 참조 항체 사이의 경쟁은 경쟁 ELISA에 의해 측정할 수 있다. 미오스타틴의 중화를 위한 경쟁은 하기의 것들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합을 통해 측정할 수 있다: 예를 들어, ELISA, FMAT 또는 BIAcore에 의해 측정되는 미오스타틴 결합을 위한 경쟁; ActRIIb 수용체에의 미오스타틴 결합의 억제를 위한 경쟁; 및 A204 분석에서 루시퍼라제 발현을 초래하는 세포 신호전달의 억제를 위한 경쟁. 경쟁하는 항원 결합 단백질은 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나, 상기 참조 항체가 결합하는 에피토프에 아주 근접한 에피토프에 결합할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열에 유의적으로 결합할 수 없다. 상기 항원 결합 단백질은 1:1 내지 1:10의 항원 결합 단백질 대 펩티드의 비율 범위에서는 상기 미오스타틴 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열에 결합할 수 없다.
상기 항원 결합 단백질과 미오스타틴 펩티드 단편 또는 인공 서열 사이의 결합 또는 결합의 상실은 환원 조건을 이용하여 ELISA 또는 SDS PAGE를 통해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 선형의 전장 미오스타틴 서열에 대한 항원 결합 단백질의 결합 또는 결합 상실은 환원성(reducing) SDS PAGE를 통해 측정할 수 있다.
본 발명에서 설명한 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 펩티드 단편에 결합하지 않을 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 서열번호 81(CCTPTKMSPINMLY)로 구성될 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 미오스타틴 서열의 14 개 이하의 아미노산으로 구성되는 임의의 단편일 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드단편은 선형일 수 있다. 상기 미오스타틴의 펩티드 단편은 전장 서열을 포함한 미오스타틴 서열의 임의의 단편일 수 있는데, 이때, 상기 서열은 선형이다. 이는 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트상에 포획된 비오티닐화 펩티드 및 SRU BIND 판독기(reader)를 이용하는 실시예 2.4에서 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
그렇지 않으면, 본 발명에서 기재한 항원 결합 단백질은 서열번호 74로 구성되는 인위적인 펩티드 서열(인공 미오스타틴 선형 펩티드 37 - SGSGCCTPTKMSPINMLY)에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 상기 인공 펩티드 서열은 하기 표 7에서 나타낸 서열들 중 어느 하나로 구성될 수 있다. 상기 인공 펩티드 서열은 선형일 수 있다. 이는 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트상에 포획된 비오티닐화 펩티드 및 SRU BIND 판독기를 이용하는 실시예 2.4에서 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열에 유의적으로 결합할 수 없다. 상기 항원 결합 단백질은 각각 1:1 내지 1:10의 비율 범위에서는 상기 미오스타틴 펩티드 단편 또는 인위적인 펩티드 서열에 결합할 수 없다.
상기 항원 결합 단백질과 미오스타틴 펩티드 단편 또는 인공 서열 사이의 결합 또는 결합의 상실은 환원 조건을 이용하여 ELISA 또는 SDS PAGE를 통해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 선형의 전장 미오스타틴 서열에 대한 항원 결합 단백질의 결합 또는 결합 상실은 환원성(즉, 변성) SDS PAGE를 통해 측정할 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트상에 포획된 비오티닐화 펩티드 및 SRU BIND 판독기를 이용하는 실시예 2.4에서 기재된 방법을 이용할 수 있다. 실시예 2.4의 데이터로부터, 10B3는 입체적인 서열(conformational sequence)에 결합할 수 있기 때문에, 치료를 위한 생체내 천연 미오스타틴의 결합 및 중화의 이점을 확인할 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 미오스타틴의 에피토프는 입체적 또는 불연속적 에피토프일 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 미오스타틴 상의 선형 에피토프에는 결합하지 않을 수 있는데, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 환원 또는 변성 시료에는 결합하지 않을 수 있다. 입체적 또는 불연속적 에피토프는 미오스타틴 수용체 결합 부위와 동일, 유사 또는 중첩될 수 있다. 상기 에피토프는 미오스타틴이 성숙 형태이고 또 다른 미오스타틴 분자와의 이합체(동형이합체)의 일부로서 존재하는 경우에는 접근하기 용이할 수 있다. 또한, 상기 에피토프는 미오스타틴이 성숙 형태이고 다른 미오스타틴 결합 분자들과의 사합체의 일부로서 존재하는 경우에 접근하기 용이할 수 있다. 상기 에피토프는 두 개의 미오스타틴 폴리펩티드에 걸쳐 분포할 수 있다. 이러한 형태의 불연속적 에피토프는 각각의 미오스타틴 분자 유래의 서열을 포함할 수 있다. 이합체의 3차 또는 4차 구조에서의 서열들은 에피토프를 형성하도록 서로 충분히 근접할 수 있고 항원 결합 단백질에 결합할 수 있다. 입체적 및/또는 불연속적 에피토프는 CLIPS™(Pepscan Systems사)와 같은 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
스케폴드 상의 화학적으로 결합된 면역학적 펩티드(Chemically Linked Immunogenic Peptides on Scaffolds (CLIPS)) 기술을 이용하여 10B3C의 미오스타틴 결합 부위를 나중에 분석하면, 미오스타틴의 "PRGSAGPCCTPTKMS" 아미노산 서열이 키메라 항체에 대한 결합 부위일 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 인간 또는 쥐과 동물 모델의 생체내에서 적어도 6시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 또는 적어도 9일의 반감기를 가질 수 있다.
상기 항원 결합 단백질이 결합하는 미오스타틴 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 미오스타틴은 용액일 수 있거나 고체 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 미오스타틴은 자성 비드와 같은 비드에 결합될 수 있다. 미오스타틴은 비오티닐화될 수 있다. 미오스타틴에 접합된 비오틴 분자를 이용하여, 고체 표면상에 비오틴스트렙타비딘을 결합시킴으로써 고체 표면상에 미오스타틴을 고정할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 쥐, 마우스, 영장류(예를 들어, 필리핀 원숭이, 구세계 원숭이 또는 대형 원숭이) 또는 인간에서 유래할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 임의의 아형 또는 아류에 속할 수 있는 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 불변 영역은 아형에 속할 수 있는데, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 변이체일 수 있다. 상기 항원 결합 단백질의 불변 영역은 IgG1일 수 있다.
상기 항체의 Fc 작용 부분에 대한 돌연변이적 변화를 이용하여, FcRn과 항체 사이의 상호작용의 친화성을 변화시켜서 항체의 전도(turnover)를 조절할 수 있다. 상기 항체의 반감기는 생체내에서 연장될 수 있다. 이는 환자 개체군에 유리할 수 있는데, 생체내 IC50을 더욱 긴 시간 동안 유지한 결과 최대 투여량 및 최대 투여 빈도가 달성될 수 있기 때문이다. 상기 항체의 Fc 작용 기능은 완전히 또는 부분적으로 제거할 수 있는데, 미오스타틴이 가용성 표적이기 때문이다. 이와 같이 제거한 결과, 안전성 프로필이 증가할 수 있다.
상기 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질은 ADCC 및/또는 보체 활성 또는 작용 기능이 감소될 수 있다. 상기 불변 도메인은 IgG2 또는 IgG4 아형의 본래 무능화된 불변 영역 또는 성숙한 IgG1 불변 도메인을 포함할 수 있다. 적당한 변형의 예가 EP0307434에 기재되어 있다. Fc 무능화를 달성하기 위한 한 가지 방법은 상기 중쇄 가변 영역의 235 및 237 위치(EU 인덱스 넘버링)의 알라닌 잔기를 치환하는 것을 포함한다.
상기 항원 결합 단백질은 항체의 작용 기능/ADCC 및/또는 보체 활성이 향상되도록 돌연변이 불변 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 적당한 변형의 예가 다음문헌[Shields 외, J. Biol. Chem (2001) 276:6591-6604, Lazar 외, PNAS (2006) 103:4005-4010 및 US6737056, WO2004063351 및 WO2004029207]에 기재되어 있다.
상기 항원 결합 단백질은 작용 기능/ADCC 및/또는 보체 활성이 향상되도록, 변형된 글리코실화 프로필을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 변형된 글리코실화 프로필을 갖는 항원 결합 단백질을 제조하기 위한 적당한 방법의 예가 WO2003/011878, WO2006/014679 및 EP1229125에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 본 원에 기재된 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 (i) 하나 이상의 CDRH, 중쇄 가변 서열, 또는 전장 중쇄 서열, 및 (ii) 하나 이상의 CDRL, 경쇄 가변 서열, 또는 전장 경쇄 서열을 엔코딩하는 서열을 포함할 수 있는데, 상기 (i) 및 (ii)는 동일 핵산 분자 상에 존재한다. 그렇지 않으면, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 (a) 하나 이상의 CDRH, 중쇄 가변 서열 또는 전장 중쇄 서열, 또는 (b) 하나 이상의 CDRL, 경쇄 가변 서열 또는 전장 경쇄 서열을 엔코딩하는 서열을 포함할 수 있는데, 상기 (a) 및 (b)는 서로 분리된 핵산 분자들 상에 존재한다.
상기 중쇄를 엔코딩하는 핵산 분자는 서열번호 41을 포함할 수 있다. 상기 경쇄를 엔코딩하는 핵산 분자는 서열번호 42 또는 서열번호 52를 포함할 수 있다.
상기 중쇄를 엔코딩하는 핵산은 서열번호 43, 44 또는 45 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 경쇄를 엔코딩하는 핵산 분자는 서열번호 46, 47, 48, 49 또는 55 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자(들)는 하기의 중쇄와 경쇄의 조합들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: H0L0 (서열번호 43 및 서열번호 46), H0L1(서열번호 및 43 및 서열번호 47), H0L2(서열번호 43 및 서열번호 48), H0L3(서열번호 43 및 서열번호 49), H1L0(서열번호 44 및 서열번호 46), H1L1(서열번호 44 및 서열번호 47), H1L2(서열번호 44 및 서열번호 48), H1L3(서열번호 44 및 서열번호 49), H2L0(서열번호 45 및 서열번호 46), H2L1(서열번호 45 및 서열번호 47), H2L2(서열번호 45 및 서열번호 48), H2L3(서열번호 45 및 서열번호 49), H2L2-C91S(서열번호 45 및 서열번호 55).
또한, 전술한 핵산 분자는 하기의 치환들 중 어느 하나를 갖는 중쇄를 엔코딩할 수도 있다: Y96L, G99D, G99S, G100A K, P100B F, P100B I, W100E F, F100G N, F100G Y, F100G S, V102N, 및 V1022S. 전술한 치환들 중 어느 하나 외에도 또는 그 대신에, 상기 핵산 분자는 하기의 치환들 중 어느 하나를 포함하는 중쇄를 엔코딩할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V. 전술한 핵산 분자는 C91S 치환을 갖는 경쇄를 엔코딩할 수도 있다.
상기 핵산 분자는 F100G_Y를 엔코딩하는 치환을 갖는 서열번호 45의 서열을 가질 수 있다. F100G_Y 치환 외에도, 하기의 치환들 중 어느 하나가 존재할 수도 있다: G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V. 특히, 상기 핵산 분자는 하기의 것을 엔코딩하는 치환을 갖는 서열번호 45의 서열을 가질 수 있다: F100G_Y, 또는 F100G_Y 및 G55S. 상기 중쇄를 엔코딩하는 핵산 분자는 경쇄를 엔코딩하는 서열번호 55의 핵산 분자와 짝을 이룰 수 있다.
또한, 본 발명은 본 원에서 기재한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 원에서 기재한 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 적당한 숙주 세포에서 제조할 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 제조 방법은 본 원에서 기재한 숙주 세포를 배양하고 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 재조합 형태의 형질전환, 형질감염, 또는 형질도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 카세트를 포함함으로써, 상기 발현 카세트는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외에도, 상기 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 재조합 형태의 형질전환, 형질감염, 또는 형질도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 카세트를 포함할 수 있으므로, 재조합 형태의 형질전환, 형질감염, 또는 형질도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 카세트를 포함함으로써, 제 1 발현 카세트는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 카세트는 상기 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 안정하게 형질전환된 숙주 세포는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 숙주 세포는 상기 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터 및 상기 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함할 수 있다.
상기 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포일 수 있다. 이러한 세포주의 예로는 CHO 또는 NSO가 있다. 상기 숙주 세포는 비인간 숙주 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 비배아 숙주 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 배지, 예를 들어, 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 숙주 세포에 의해 배지내로 분비될 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 이를 포함하는 배지와 비교하여 적어도 95%(예를 들어, 98%)까지 정제될 수 있다.
상기 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공될 수 있다. 사용 지시서와 함께 약학적 조성물을 포함하는 부품 키트(kit-of-parts)가 제공될 수 있다. 편의를 위해, 상기 키트는 사용 지시서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
항체 구조
원형 항체
대부분의 척추 동물 종 유래의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 카파(Kappa) 및 람다(Lambda)로 알려진 두 형태들 중 하나로 분류될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5 개의 상이한 부류로 분류될 수 있다. IgG 및 IgA는 하기의 아류로 더욱 분류될 수 있다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2. 적어도 IgG2a 및 IgG2b를 갖는 마우스 및 쥐에서는 종 변이체가 존재한다.
가변 영역의 더욱 보존된 부위는 골격 영역(Framework regions (FR))으로 알려져있다. 원형의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각 CDR에 의해 연결된 네 개의 FR을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 아주 근접하여 일제히 유지되고, 다른 사슬 유래의 CDR은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.
상기 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC), Fcγ 수용체에의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/제거 속도, 및 보체 경로(complement cascade)의 C1q 활성화를 통한 보체 의존성 세포독성에의 관여와 같은 여러 작용 효과를 나타낸다.
인간의 IgG2 불변 영역은 고전적인 경로에 의해 보체를 활성화하는 능력 및 항체-의존성 세포독성을 매개하는 능력이 실질적으로 없는 것으로 보고되어 왔다. IgG4 불변 영역은 고전적인 경로에 의해 보체를 활성화하는 능력이 없는 것으로 보고되어 왔고 항체-의존성 세포 독성을 약하게만 매개한다. 이러한 작용 기능이 실질적으로 없는 항체는 "비용해"(non-lytic) 항체로 명명될 수 있다.
인간 항체
인간 항체는 당업자에게 알려진 다수의 방법을 통해 제조할 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 및 이종골수종 세포주를 이용하여 하이브리도마 방법을 통해 제조할 수 있다. 다음문헌[Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, 및 Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)]을 참조한다. 다른 방법들은 파지 라이브러리 및 형질전환 마우스를 이용하는 것을 포함하는데, 이러한 라이브러리 및 마우스는 인간 가변 영역의 레퍼토리를 이용한다(Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23 참조).
몇 가지 형질전환 마우스를 이용할 수 있는데, 이들의 면역글로불린 좌(loci)는 인간 면역글로불린 유전자 절편으로 치환되어 왔다(Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156 참조). 항원 투여 시험에서, 이러한 마우스는 관련 항체가 생성될 수 있는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있다.
파지 디스플레이 기술을 이용하여, 인간 항원 결합 단백질(및 이의 단편)을 제조할 수 있다. 다음문헌[McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 및 Griffiths 외, (1994) EMBO 13: 3245-3260]을 참조한다.
친화성 성숙 기술(Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783)을 이용하여, 결합친화성을 개선할 수 있는데, 상기 일차 인간 항체의 결합 친화성은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 천연 변이체로 순차적으로 치환하고, 개선된 결합 친화성을 기준으로 선택을 함으로써 개선된다. "에피토프 임프린팅"과 같은 이러한 기술의 변이체가 이용될 수도 있는데, 예를 들어, 다음문헌[WO 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266]을 참조한다.
키메라 및 인간화 항체
대표적으로, 키메라 항체는 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조된다. 상기 항체를 엔코딩하는 DNA(예, cDNA)는 통상적인 방법(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 분리 및 서열 분석할 수 있다. 이러한 DNA의 대표적인 출처로서 하이브리도마 세포를 이용한다. 분리된 후, DNA는 발현 벡터내에 위치한 다음, 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균, COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질 감염되어, 상기 항체의 합성을 달성한다. 상기 DNA는 상응하는 비인간(예, 쥐과동물) 중쇄 및 경쇄 영역을 인간 경쇄 및 중쇄로 치환함으로써 변형될 수 있는데, 예를 들어 다음문헌[Morrison (1984) PNAS 81: 6851]을 참조한다.
면역원성의 큰 감소는 인간 골격("수용체 골격") 및 불변 영역상에 비인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 CDR 만을 이식하여 인간화 항체를 생성함으로써 달성할 수 있다(Jones 외, (1986) Nature 321: 522-525; 및 Verhoeyen 외, (1988) Science 239: 1534-1536 참조). 그러나, CDR 이식 그 자체는 항원 결합 특성을 완전히 유지하는 결과를 제공할 수 없고, 유의적인 항원 결합 친화성이 회복되어야 하는 경우 공여체 항체의 일부 골격 잔기(때때로 "복귀 돌연변이"라고 나타냄)는 보존될 필요가 있는 것으로 종종 확인된다(Queen 외, (1989) PNAS 86: 10,029-10,033: Co et al. (1991) Nature 351: 501-502 참조). 이러한 경우에 있어서, 비인간 공여체 항체와 가장 높은 서열 동일성을 나타내는 인간 가변 영역은 인간 골격(FR)을 제공하도록 데이터베이스로부터 선택된다. 인간 FR의 선택은 인간 컨센서스 또는 개개의 인간 항체로부터 얻어질 수 있다. 필요한 경우, 공여체 항체 유래의 핵심 잔기는 CDR 구조를 유지하도록 인간 수용 골격으로 치환될 수 있다. 상기 항체의 컴퓨터 모델링을 이용하면, 이러한 구조적으로 중요한 잔기를 확인하는데 도움이 될 수 있다(WO 99/48523 참조).
그렇지 않으면, 인간화는 "베니어링"(veneering) 방법을 통해 달성할 수 있다. 독특한 인간 및 쥐과동물의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들의 통계학적 분석 결과, 노출된 잔기들의 정밀한 패턴들은 인간 및 쥐과동물의 항체에서 서로 다르고, 대부분의 개개의 표면 위치는 소수의 상이한 잔기를 강하게 선택하는 것으로 확인되었다(Padlan 외, (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498; 및 Pedersen 외, (1994) J. MoI. Biol. 235: 959-973). 따라서, 인간 항체에서 일반적으로 확인되는 것들과 상이한 골격 영역의 노출된 잔기들을 치환함으로써 비인간 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질의 항원성은 표면 접근성과 상관관계가 있을 수 있기 때문에, 상기 표면 항원을 치환하는 것은 마우스의 가변 영역을 인간 면역계에 노출되지 않게(invisible)하는데 충분할 수 있다(Mark 외, (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134 참조). 이러한 인간화 과정은 "베니어링"(veneering)으로 나타내는데, 항체의 표면만이 변형되므로 지지 잔기가 교란되지 않은 상태로 유지되기 때문이다. 그 밖의 다른 방법으로는 WO04/006955에 기재된 것, 및 세균 발현 시스템을 이용하고 인간 성선과 서열이 근접한 항체를 생성하는 Humaneering™(Kalobios사)의 과정이 있다(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California).
이중특이성 항원 결합 단백질
이중특이성(bispecific) 항원 결합 단백질은 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항원 결합 단백질이다. 이러한 항원 결합 단백질을 만드는 방법은 당 업계에 알려져 있다. 전형적으로, 이중특이 항원 결합 단백질의 재조합적 제조는 두 개의 면역글로불린의 중쇄-경쇄 쌍들의 동시 발현에 기반하는데, 상기 두 개의 중쇄는 상이한 결합 특이성을 갖는다(Millstein 외, (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829; 및 Traunecker 외, (1991) EMBO 10: 3655-3659 참조). 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류 때문에, 10 개의 상이한 항체 구조들의 가능한 혼합물이 제조되는데, 이중 하나만이 원하는 결합 특이성을 갖는다. 다른 대안의 방법은 원하는 특이성을 갖는 가변 도메인을, 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부분을 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합하는 것을 포함한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 CH1 영역이 상기 융합체들 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. 이러한 융합체를 엔코딩하는 DNA 및 필요한 경우 경쇄를 서로 분리된 발현 벡터에 삽입한 다음, 적당한 숙주 생물에 동시 형질 감염시킨다. 두 개 또는 세 개의 사슬에 대한 엔코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다. 한 가지 방법에서, 상기 이중특이 항체는 하나의 암(arm)에서 제 1 결합 특이성을 갖는 중쇄 및 다른 암에서 제 2 특이성을 갖는 경쇄로 이루어져서 중쇄-경쇄 쌍으로 이루어진다(WO 94/04690 참조). 또한, 다음문헌[Suresh 외, (1986) Methods in Enzymology 121: 210]을 참조한다.
항원 결합 단편
불변 영역이 결핍된 단편은 고전적인 경로로 보체를 활성화하는 능력 및 항체 의존성 세포독성을 매개하는 능력이 결핍되어 있다. 통상적으로, 이러한 단편은 예를 들어 파파인 절단(papain digestion)과 같은 원형 항체의 단백질분해 절단을 통해 제조되지만(예를 들어, WO 94/29348 참조), 재조합 방법으로 형질전환된 숙주 세포로부터 직접 제조할 수도 있다. ScFv의 제조에 대하여는, 다음문헌[Bird 외, (1988) Science 242: 423-426]을 참조한다. 또한, 후술하는 바와 같은 여러 공학적 기법을 이용하여 항원 결합 단편을 제조할 수도 있다.
Fv 단편은 Fab 단편보다 그의 두 개의 사슬의 상호작용 에너지가 더욱 낮은 것으로 보인다. VH 및 VL 도메인들의 결합을 안정화하기 위하여, Fv 단편이 펩티드와 연결되어 왔다(Bird 외, (1988) Science 242: 423-426; Huston 외. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883), disulphide bridges (Glockshuber 외, (1990) Biochemistry 29: 1362-1367) 및 "knob in hole" mutations (Zhu 외, (1997) Protein ScL, 6: 781-788) 참조). ScFv 단편은 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 제조할 수 있다(Whitlow 외, (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105 및 Huston 외, (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217 참조). ScFv는 대장균과 같은 박테리아 세포 및 진핵 세포에서 제조할 수 있다. ScFv의 한 가지 단점은 그 생성물이 일가(monovalency)이므로, 다가 결합에 따른 결합 활성의 증가가 배제되고 그 반감기가 짧다는 것이다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 시도로는 화학적 결합(Adams 외, (1993) Can. Res 53: 4026-4034; 및 McCartney 외, (1995) Protein Eng. 8: 301-314) 또는 짝을 이루지않은 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는 ScFv의 자발적인 부위 특이적 이합체화(Kipriyanov 외, (1995) Cell. Biophys 26: 187-204 참조)를 통해 추가의 C-말단 시스테인을 포함하는 ScFv로부터 제조한 이가 (ScFv')2가 있다. 그렇지 않으면, ScFv는 펩티드 링커를 3 개 내지 12 개 잔기로 단축하여 "이중특이성 항체 절편"(diabody)을 형성함으로써 다합체를 형성하도록 처리될 수 있다(Holliger 외, (1993) PNAS 90: 6444-6448 참조). 상기 링커를 단축시키면 ScFv 삼합체("triabodies"; Kortt 외, (1997) Protein Eng 10: 423-433 참조) 및 사합체("tetrabodies", Le Gall 외, (1999) FEBS Lett, 453: 164- 168 참조)가 얻어질 수 있다. 또한, 이가 ScFv 분자의 제작은 "미니안티바디"(miniantibody; Pack 외, (1992) Biochemistry 31: 1579-1584 참조) 및 "미니바디"(minibody; Hu 외, (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061)를 형성하도록 단백질 이합체화 모티프를 이용한 유전적 융합을 통해서 달성할 수 있다. 또한, ScFv-Sc-Fv 탠덤(tandem)((ScFv)2)은 제 3의 펩티드 링커를 통해 두 개의 ScFv 들을 연결함으로써 제조할 수도 있다(Kurucz 외, (1995) J. Immol. 154: 4576- 4582 참조). 이중특이성 항체 절편은 짧은 링커를 통해 또 다른 항체의 VL 도메인에 연결된 하나의 항체 유래의 VH 도메인으로 이루어지는 두 개의 단일 사슬 융합 생성물들의 비공유 결합을 통해서 제조할 수 있다(Kipriyanov 외, (1998) Int. J. Can 77: 763-772 참조). 이러한 이중특이성 항체 절편의 안정성은 전술한 바와 같이 디설파이드 결합 또는 "노브" 인 홀"(knob in hole) 돌연변이를 도입하거나, 두 개의 하이브리드 ScFv 단편들이 펩티드 링커를 통해 연결되어 있는 단일 사슬 이중특이성 항체 절편(ScDb)을 형성함으로써 향상될 수 있다(Kontermann 외, (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188 참조). 예를 들어, ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인 또는 Fab 단편에 힌지 영역을 통해 융합함으로써 사가의 이중특이성 분자를 얻을 수 있다(Coloma 외, (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163 참조). 그렇지 않으면, 이중특이성의 단일 사슬 항체 절편들을 융합하여 사가의 이중특이성 분자들이 생성되어 왔다(Alt 외, (1999) FEBS Lett 454: 90- 94 참조). 또한, ScFv-ScFv 탠덤들을 나선-루프-나선 모티프(helix-loop-helix motif)를 함유하는 링커를 이용하여 이합체화(DiBi 미니안티바디; Muller 외, (1998) FEBS Lett 432: 45-49)하거나 배향 방해 분자간 쌍에서 4 개의 항체 가변 도메인(VH 및 VL)을 포함하는 단일 사슬 분자를 이합체화(탠덤 이중특이성 항체 절편; Kipriyanov 외, (1999) J. MoI. Biol. 293: 41-56 참조)함으로써 더욱 작은 사가의 이중특이성 분자를 형성할 수도 있다. Fab' 단편들을 화학적 결합 또는 루신 지퍼(zipper)를 통한 이종이합체화에 의해 이중특이성 F(ab')2 단편을 생성할 수 있다(Shalaby 외, (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225; 및 Kostelny 외, (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553 참조). 또한, 분리한 VH 및 VL 도메인(Domantis pic)을 이용할 수도 있다(US 6,248,516; US 6,291,158; 및 US 6,172,197 참조).
이종접합 항체
이종접합 항체(heteroconjugate antibody)는 임의의 통상적인 가교 방법을 이용하여 형성한 두 개의 공유 결합된 항체들로 구성된다(예를 들어, US 4,676,980 참조).
다른 변형
본 발명의 항원 결합 단백질은 이의 작용 기능을 향상 또는 변화시키기 위한 다른 변형을 포함할 수 있다. 항체의 Fc 영역과 여러 Fc 수용체(FcγR) 사이의 상호작용은 항체-의존성 세포독성(ADCC), 보체의 고정, 항체의 식작용 및/또는 반감기/제거율을 포함하는 항체의 작용 기능을 매개하는 것으로 판단된다. 항체의 Fc 영역에 대한 여러 변형은 원하는 특성에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 용해(lytic) 항체를 비용해 항체로 만들기 위한 Fc 영역의 특정 돌연변이가 EP 0629 240 및 EP 0307 434에 상세히 기재되어 있거나, 구출 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 항체에 도입하여 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다(US 5,739,277 참조). 인간 Fcγ 수용체로는 FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn가 있다. 다음문헌[Shields 외, (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604]에서는 IgG1 잔기들의 공통 세트가 모든 FcγR들을 결합시키는데 관여하는 한편, FcγRII 및 FcγRIII는 이러한 공통 세트 외측의 서로 별개의 부위들을 이용한다는 것을 설명하고 있다. 하기의 IgG1 잔기들의 한 가지 그룹은 알라닌으로 변형된 때 모든 FcγR에의 결합을 감소시켰다: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239. 모두 IgG CH2에 존재하고, CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 근처에 모인다. FcγRI는 IgG1 잔기들의 공통 세트만을 결합에 이용하지만, FcγRII 및 FcγRIII는 상기 공통 세트 외에도 서로 별개의 잔기들과 상호작용한다. 일부의 잔기들을 변형시킨 결과, FcγRII(예를 들어, Arg-292) 또는 FcγRIII(예를 들어, Glu-293)에 대한 결합만이 감소되었다. 일부의 변이체들은 FcγRII 또는 FcγRIII에의 개선된 결합을 나타냈지만, 다른 수용체에의 결합에는 영향을 주지 않았다(예를 들어, Ser-267Ala은 FcγRII에의 결합을 개선했지만, FcγRIII에의 결합은 영향을 받지 않았다). 다른 변이체들은 FcγRII 또는 FcγRIII에의 개선된 결합을 나타내면서 다른 수용체에의 결합은 감소했다(예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII에의 결합을 개선하고 FcγRII에의 결합을 감소시켰다) FcγRIIIa의 경우, 가장 좋은 결합 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 결합된 알라닌 치환을 가졌다. 신생아의 FcRn 수용체는 항체 제거 및 조직을 통한 세포전달작용(transcytosis) 모두에 관여하는 것으로 판단된다(Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57; 및 Ghetie 외, (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766 참조). 인간 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 확인된 인간 IgG1 잔기로는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435이 있다. 이 단락에서 기재한 위치들 중 임의 위치에서의 치환은 혈청 반감기를 증가 및/또는 항체의 작용 특성을 변화시킬 수 있다.
다른 변형으로는 상기 항체들의 글리코실화 변이체가 있다. 그 불변 영역의 보존된 위치에서 항체의 글리코실화는 항체 기능, 특히 전술한 것들과 같은 작용 기능에 의미 있는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Boyd 외, (1996) MoI. Immunol. 32: 1311-1318 참조). 하나 이상의 탄수화물 부분이 부가, 치환, 결실 또는 변형되어 있는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 글리코실화 변이체가 떠오른다. 아스파리긴-X-세린 또는 아스파리긴-X-트레오닌 모티프를 도입하면, 탄수화물의 부분의 효소적 부착을 위한 가능한 부위가 얻어지고, 이를 이용하여 항체의 글리코실화를 실시할 수 있다. 다음문헌[Raju 외, (2001) Biochemistry 40: 8868-8876]에서는, 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 및/또는 알파, 2,3 시알릴트랜스퍼라제를 이용하여 재갈락토실화 또는 재시알릴화를 통해 TNFR-IgG 면역부착물의 말단 시알릴화를 증가시켰다. 말단 시알릴화를 증가시키면 면역글로불린의 반감기가 증가하는 것으로 판단된다. 대부분의 당단백질과 공통되는 항체는 일반적으로 단백당형(glycoform)들의 혼합물의 형태로 제조된다. 이러한 혼합물은 항체들이 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에서 제조되는 경우에 특히 명백하게 된다. 한정된 단백당형들을 제조하기 위한 여러 가지 방법들이 개발되어 왔다(Zhang 외, (2004) Science 303: 371: Sears 외, (2001) Science 291: 2344; Wacker 외, (2002) Science 298: 1790; Davis 외, (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang 외, (2001) Ace. Chem. Res 34: 727 참조). 본 원에서 기재된 항체(예를 들어, IgG1과 같은 IgG 아형의 항체)는 한정된 수(예를 들어, 7 이하, 예를 들어, 2 또는 1과 같은 5 이하)의 단백당형(들)을 포함할 수 있다.
상기 항체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 비단백질성 중합체에 결합될 수 있다. PEG에 단백질을 접합하는 것은 단백질의 반감기를 증가시키는 외에도 단백질의 항원성 및 면역원성을 감소시키기 위한 확인된 방법이다. 서로 다른 분자량 및 스타일(직쇄 또는 측쇄)로서 페길화(PEGylation)의 사용이 원형 항체 외에도 Fab' 단편을 이용하여 연구되어 왔다(Koumenis 외, (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95 참조).
제조 방법
항원 결합 단백질은 염소(Pollock 외, (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157 참조), 닭(Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55 참조), 마우스(Pollock 외 참조) 또는 식물(Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601- 606; Baez 외, (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger 외, (2000) Plant MoI. Biol. 42: 583-590)와 같은 형질전환 생물체에서 제조될 수 있다.
또한, 항원 결합 단백질은 화학적 합성을 통해 제조할 수도 있다. 그러나, 항원 결합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 재조합 세포 배양 기술을 이용하여 제조하는 것이 일반적이다. 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하여 플라스미드와 같은 복제 가능한 벡터에 삽입하여 더욱 클로닝(증폭) 또는 발현시킨다. 한 가지 발현 시스템은 글루타메이트 합성효소계(Lonza Biologies사에 의해 시판되는 것과 같은 계)인데, 숙주 세포가 CHO 또는 NSO인 경우에 특히 그러하다. 상기 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 과정(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)을 이용하여 쉽게 분리 및 서열 분석된다. 사용될 수 있는 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 그 플라스미드가 일반적으로 사용되는 미니 염색체가 있다. 일반적으로 이러한 벡터는 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소(enhancer element), 발현을 촉진하도록 상기 항원 결합 단백질 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되는 프로모터 및 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 상기 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서로 별개의 벡터들에 삽입하고 동일한 숙주 세포에 동시에 또는 순차적으로 도입(예를 들어, 형질전환, 전기충격 또는 형질도입을 통해)할 수 있거나, 바람직한 경우, 중쇄 및 경쇄 모두를 상기 도입에 앞서 동일 벡터에 삽입할 수 있다.
숙주 세포에 의해 제조되는 단백질의 전체 수준이 야생형 서열을 이용한 형질감염의 경우와 비교하여 코돈 최적화한 유전자를 이용한 형질감염의 경우에 더 크도록 하는 목적으로 코돈 최적화를 이용할 수 있다. 몇 가지 방법들이 알려져 있다(Nakamura 외, (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; W098/34640; W097/11086). 과잉의 유전자 코드로 인해, 본 원에서 개시한 것들(특히, 소정의 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화한 것들)에 대한 대체 폴리뉴클레오티드가 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 엔코딩할 수도 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질의 코돈 사용빈도를 변화시켜, 전사체 및/또는 생성물 수율을 증가시키도록 숙주 세포의 코돈 편향을 조절할 수 있다(예를 들어, Hoekema 외, Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24). 코돈의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적당한 양립성에 기초할 수 있다.
신호 서열
항원 결합 단백질은 성숙 단백질의 N-말단에서 특정 분열 부위를 갖는 이종 신호 서열과의 융합 단백질의 형태로 제조될 수 있다. 상기 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 처리되어야 한다. 원핵 숙주 세포의 경우, 상기 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 인산분해효소, 페니실린 분해효소 또는 열안정성 엔테로독신 II 리더(leader)일 수 있다. 효모 분비의 경우, 상기 신호 서열은 예를 들어 효모 전이효소 리더, α 인자 리더 또는 산 인산분해효소 리더일 수 있다(예를 들어 WO90/13646). 포유동물 세포 계의 경우, 단순포진 gD 신호 및 천연 면역글로불린 신호 서열과 같은 바이러스 분비 리더가 적당할 수 있다. 일반적으로, 상기 신호 서열은 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA에 해독 프레임(reading frame)으로 라이게이션된다. 서열번호 9에서 나타낸 것과 같은 신호 서열을 사용할 수 있다.
복제 기원
복제 기원으로 적당한 것은 대부분의 그램 양성 박테리아의 경우 pBR322, 대부분의 효모의 경우 2μ 플라스미드, 그리고 대부분의 포유동물 세포의 경우 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV와 같은 여러 가지 바이러스 기원이 적당한 것으로 당 업계에서 잘 알려져 있다. 일반적으로, 복제 성분의 기원은 포유동물의 발현 벡터에는 필요하지 않지만, 초기 프로모터(early promoter)를 포함하는 SV40를 사용할 수 있다.
선별 마커
대표적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메소트렉세이트 또는 테트라시이클린에 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나 복합 배지에서 이용될 수 없는 영양소를 공급하거나, 또는 (c) 상기 (a) 및 (b)의 조합을 수행하는 단백질을 엔코딩한다. 선별 과정은 숙주 세포의 성장을 정지시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환한 세포는 예를 들어 동시 운반된 선별 마커에 의해 부여된 약물 내성으로 인해 생존한다. 한 가지 예는 형질전환체가 메소트렉세이트의 존재하에서 배양되는 경우의 DHFR 선별 마커이다. 세포는 관련 외래 유전자의 복제수를 증폭하도록 증가하는 양의 메소트렉세이트의 존재하에서 배양할 수 있다. CHO 세포가 DHFR 선별을 위한 특히 유용한 세포주이다. 그 밖의 예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템(Lonza Biologies)이다. 효모에서 사용하기 위한 선별 유전자의 예는 trp1 유전자이다(Stinchcomb 외, (1979) Nature 282: 38 참조).
프로모터
항원 결합 단백질을 발현하기 위한 적당한 프로모터는 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주를 위한 프로모터로는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토오스 프로모터계, 알칼리성 인산분해효소, 트립토판, 및 Tac와 같은 하이브리드 프로모터가 있다. 효모 세포에서의 발현에 적당한 프로모터로는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소(glycolytic enzyme), 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드 3 포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제 및 글루코키나아제가 있다. 유도성 효모 프로모터로는 알콜 디히드로게나아제 2, 이소시토크롬 C, 산 인산분해효소, 메탈로티오네인, 및 질소 대사 또는 말토오스/갈락토오스 이용을 초래하는 효소가 있다.
포유동물 세포 계에서의 발현을 위한 프로모터로는 폴리오마(polyoma), 계두 및 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 새 육종 바이러스, 거대세포 바이러스(특히, 즉시 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 악틴, 루육종 바이러스(RSV) 프로모터 및 초기 및 후기 시미안 바이러스 40과 같은 바이러스 프로모터가 있다. 물론, 프로모터의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적당한 양립성을 기준으로 이루어진다. 제 1 플라스미드는 네오마이신 및 암피실린 저항성 선별 마커와 함께 RSV 및/또는 SV40 및/또는 CMV 프로모터, 경쇄 가변 영역(VL)을 엔코딩하는 DNA, κC 영역을 포함할 수 있고, 제 2 플라스미드는 RSV 또는 SV40 프로모터, 중쇄 가변 영역((VH)을 엔코딩하는 DNA, γ1 불변 영역을 엔코딩하는 DNA, DHFR 및 암피실린 저항성 마커를 포함한다.
인핸서 요소
예를 들어, 고등 진핵생물에서의 발현에 적절한 경우, 벡터내에서 프로모터에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소를 사용할 수 있다. 포유동물의 인핸서 요소는 글로빈, 알부민, 태아단백질 및 인슐린 유래의 인핸서 요소를 포함한다. 그렇지 않으면, SV40 인핸서(100-270 bp 길이), 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 초기 프로모터 인핸서, 폴리마 인핸서(polyma enhancer), 바큘로바이러스 인핸서 또는 쥐과동물의 IgG2a 로커스와 같은 진핵세포 바이러스 유래의 인핸서 요소를 사용할 수 있다(WO04/009823 참조). 상기 인핸서는 벡터내에서 프로모터의 상류 부위에 위치할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 인핸서는 에를 들어 폴리아데닐화 신호 서열의 하류 또는 비번역 영역내의 임의 부위에 위치할 수 있다. 인핸서의 선택 및 위치지정은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적당한 양립성을 기준으로 할 수 있다.
폴리아데닐화 /종결 신호 서열
진핵세포 계에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 신호서열은 일반적으로 오픈 전사 해독 프레임(open reading frame)의 3' 부위에 위치한다. 포유동물 계에서, 이러한 신호서열의 비제한적인 예로는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스(예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스의 긴 말단 반복체 유래의 신호 서열이 있다. 효모 계에서, 폴리아데닐화/종결 신호 서열의 비제한적인 예로는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 및 알코올 디히드로게나아제 1 (ADH) 유전자에서 유래한 것들이 있다. 원핵생물 계에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 일반적으로 필요하지 않은 대신에, 더욱 짧고 더욱 한정된 종결 서열을 이용하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적당한 양립성을 기준으로 할 수 있다.
수율 향상을 위한 다른 방법 및 요소
상기 성분들 외에도, 수율을 향상시키기 위해 이용될 수 있는 다른 성분으로는 염색질 리모델링 요소, 인트론 및 숙주 세포 특이적 코돈이 있다.
숙주 세포
항원 결합 단백질을 발현하는 벡터에 적합한 숙주 세포는 진핵 세포, 효모 세포 또는 고등 원핵 세포이다. 적당한 원핵 세포로는 진정세균, 예를 들어, 대장균(예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325)과 같은 에스케르키아, 엔테로박터와 같은 장내세균, 에르위니아(Erwinia ), 크랩시엘라 프로테우스( Klebsiella Proteus), 살모넬라( Salmonella ; 예를 들어, Salmonella typhimurium ), 세라티아( Serratia ; 예를 들어, Serratia marcescans 및 Shigella)외에도, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis ) 및 바실러스 리케미포르미스(B. licheniformis)와 같은 바실러스(DD 266 710 참조), 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 있다. 효모 숙주세포로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베르마이세스(Kluyveromyces; 예를 들어, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로위아(yarrowia; EP402, 226), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris; EP 183 070 및 Peng 외, (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192 참조), 칸디다(Candida), 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia; EP 244 234), 페니실린, 토리포클라듐(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스 니듈란스(A. nidulans) 및 아스퍼질러스 나이거(A. niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주가 있다.
고등 진핵 세포로는 COS-1(ATCC No.CRL 1650) COS-7(ATCC CRL 1651)와 같은 포유동물 세포, 인간 배아 신장 세포주 293, 베이비 햄스터 신장 세포(BHK)(ATCC CRL.1632), BHK570(ATCC NO: CRL 10314), 293(ATCC NO.CRL 1573), 중국 햄스터 난소 세포 CHO(예를 들어, CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, DHFR-CHO 세포주, 예를 들어 DG44(Urlaub 외, (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556 참조), 특히 현탁 배양을 위해 적합화된 CHO 세포주), 마우스의 세르톨리(sertoli) 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개과동물의 신장 세포(ATCC CCL 34), 인간 폐 세포(ATCC CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포, 예를 들어, NSO(US 5,807,715 참조), Sp2/0, Y0가 있다.
또한, 이러한 숙주 세포는 항원 결합 단백질의 품질, 기능 및/또는 수율을 변화시키도록 추가로 조작 또는 적합화될 수도 있다. 이러한 조작의 비제한적인 예로는 특정 변형(예, 글리코실화) 효소 및 단백질 폴딩 샤페론(folding chaperone)을 발현시키는 것이 있다.
세포 배양 방법
항원 결합 단백질을 이용하여 형질전환한 숙주 세포는 당업자에게 알려진 임의의 방법을 이용하여 배양할 수 있다. 숙주 세포는 스피너 플라스크(spinner flask), 로울러 병(roller bottle) 또는 유공(hollow) 섬유 시스템에서 배양할 수 있지만, 대규모 제조의 경우 교반식 텡크 반응기가 특히 현탁 배양을 위해 사용된다. 상기 교반식 탱크 반응기는 예를 들어, 스파저(sparger), 배플(baffle) 또는 저전단 임펠러를 이용하여 통기를 위해 개조될 수 있다. 기포 칼럼 및 공기부상 반응기의 경우, 공기 또는 산소 기포를 이용한 직접 통기를 이용할 수 있다. 숙주 세포를 무혈청 배지에서 배양하는 경우, 그 배지는 통기 공정의 결과에 따른 세포 손상의 방지를 돕기 위하여 pluronic F-68과 같은 세포보호제가 첨가된다. 숙주 세포의 특징에 따라, 마이크로담체(microcarrier)를 부착 의존성 세포주를 위한 성장 기재로서 이용할 수 있거나, 세포를 대표적인 현탁 배양을 위해 적합화할 수 있다. 숙주 세포, 특히 무척추 동물의 배양은 유가식(fed-batch), 반복 회분식 공정(Drapeau 외, (1994) Cytotechnology 15: 103-109 참조), 연장 회분식 공정 또는 관류식 배양과 같은 여러 가지 조작 방식을 이용할 수 있다. 재조합 방식으로 형질전환한 포유동물 세포를 송아지 태아 혈청(FCS)과 같은 혈청 함유 배지에서 배양할 수 있는데, 예를 들어 이러한 숙주 세포는 다음문헌[Keen 외, (1995) Cytotechnology 17: 153-163]에 기재된 바와 같은 합성 무혈청 배지, 또는 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지에서 배양되는데, 필요한 경우 상기 배지에는 글루코스와 같은 에너지원 및 제조합 인슐린과 같은 합성 성장 인자가 첨가된다. 상기 숙주 세포의 무혈청 배양의 경우, 상기 세포는 무혈청 조건에서 성장하도록 적응시켜야 한다. 한 가지 적응 방법은 이러한 숙주 세포를 혈청 함유 배지에서 배양하고 상기 배지의 80%를 무혈청 배지로 반복적으로 교환하여, 상기 숙주 세포가 무혈청 조건에 적응하도록 하는 것이다(예를 들어, Scharfenberg 외, (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers) 참조)..
배지에 분비된 항원 결합 단백질은 예정 용도에 적당한 정제도를 제공하는 여러 가지 방법을 이용하여 회수 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위해 항원 결합 단백질을 사용하는 경우, 일반적으로는 미정제 배지와 비교하여 적어도 95% 순도, 더욱 일반적으로는 98% 또는 99% 순도가 요구된다. 배지의 세포 파편(Cell debris)은 일반적으로 원심분리한 다음 예를 들어 정밀여과, 한외여과 및/또는 심층 여과를 이용하여 상등액을 정제하는 단계를 통해 제거한다. 투석 및 겔 전기영동과 같은 다른 여러 가지 방법 및 히드록시아파타이트(HA), 친화성 크로마토그래피(폴리히스티딘과 같은 친화성 태킹 시스템을 임의적으로 포함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC, US 5,429,746 참조)와 같은 크로마토그래피 기법을 이용할 수 있다. 여러 가지 정제 단계 이후의 항체는 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 포획할 수 있다. 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산 암모늄 침전과 같은 그 밖의 크로마토그래피 단계를 추가로 실시할 수 있다. 또한, 여러 가지 바이러스 제거 단계를 이용할 수도 있다(예를 들어, DV-20을 이용한 나노여과). 이러한 여러 단계에 따라, 적어도 75mg/ml 이상 또는 100mg/ml 이상의 항원 결합 단백질을 포함하는 정제된(예를 들어, 단클론) 제제가 얻어진다. 이러한 제제에는 항원 결합 단백질의 응집 형태가 실질적으로 없다.
항원 결합 단편의 발현을 위해 박테리아 시스템을 이용할 수 있다. 이러한 단편은 세포내 또는 주변 세포질내로 집중될 수 있거나 세포외로 분비될 수 있다. 불용성 단백질을 당업자에게 알려진 방법에 따라 추출 및 리폴딩하여 활성 단백질을 형성할 수 있다(예를 들어, Sanchez 외, (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20; 및 Cupit 외, (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277 참조).
탈아미드화는 아미드 작용기가 제거되는 화학적 반응이다. 생화학에서, 상기 반응은 아미노산인 아스파라긴 및 글루타민의 아미드 함유 측쇄를 손상시키기 때문에 단백질의 분해에 중요한 것이다. 탈아미드화 반응은 단백질의 유용한 반감기를 제한할 수 있는 요인들 중 하나인 것으로 판단되므로, 치료용 단백질의 제조 동안 가장 일반적인 전사후 변형들 중 하나이다. 예를 들어, 재조합 인간 DNA 분해효소 및 재조합 가용성 CD4의 경우 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성을 감소 또는 상실시키는 것이 보고되어온 반면에, 다른 재조합 단백질은 영향받지 않는 것으로 보인다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 미오스타틴에의 결합 능력은 탈아미드화를 유발하는 스트레스 조건하에서 영향받지 않는 것으로 보인다. 따라서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 생물학적 활성 및 이의 유용한 반감기는 탈아미드화에 영향을 받을 것 같지 않다.
약학적 조성물
용어 "질병", "장애" 또는 "증상"은 상호 교환적으로 사용된다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 정제된 제제는 본 원에서 기재한 인간 질병의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 미오스타틴이 질병의 원인이 되거나 미오스타틴 활성을 중화시키는 것이 이롭게 되는 질병의 치료에 상기 약학적 조성물을 사용할 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 치료적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물은 미오스타틴의 중화에 반응하는 질병의 치료에 사용될 수 있다.
상기 약학적 제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 단독으로 투여할 수 있거나 약학적 조성물의 일부로서 투여할 수 있다.
일반적으로, 이러한 조성물은 허용가능한 약학적 실시에서 알려져 있고 요구되는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다(예를 들어, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co. 참조). 이러한 담체의 예로는 적당한 완충액을 이용하여 5 내지 8 범위의 pH로 임의적으로 완충한 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액과 같은 멸균 담체가 있다.
약학적 조성물은 주사 또는 연속적 주입(예를 들어, 정맥내, 복막내, 피내, 피하, 근육내 또는 간문내)을 통해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 육안으로 보이는 입자상 물질이 없는 것이 적당하다. 약학적 조성물은 1 mg 내지 10g의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 5mg 내지 1g의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 조성물은 5mg 내지 500mg, 예를 들어, 5mg 내지 50mg의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
이러한 약학적 조성물의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 약학적 조성물은 1mg 내지 10g의 항원 결합 단백질을 단위 투여 형태로 포함할 수 있고, 사용 지시서를 임의적으로 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 당업자에게 잘 알려져 있거나 명백한 방법에 따라, 투여에 앞서 재구성을 위해 동결건조될 수 있다. 항체가 IgG1 아형을 갖는 경우, 구연산염(예를 들어, 구연산나트륨) 또는 EDTA 또는 히스티딘과 같은, 구리의 킬레이터(chelator)를 약학적 조성물에 첨가하여 이러한 아형의 항체의 구리-매개 분해의 정도를 감소시킬 수 있다(EP0612251 참조). 또한, 약학적 조성물은 아르기닌 염기와 같은 가용성화제, 폴리소르베이트 80과 같은 세제/항응집제, 및 바이알의 헤드스페이스 산소를 치환하기 위한 질소와 같은 불활성 가스를 포함할 수도 있다.
일반적으로, 항원결합 단백질을 투여하기 위한 효과적인 용량 및 치료 요법은 실험적으로 결정되고, 환자의 성별, 체중 및 건강 상태, 치료하고자 하는 질병 또는 장애와 같은 요인에 의존할 수 있다. 적당한 용량을 선택하는데 있어서의 지침은 예를 들어 다음문헌[Smith 외, (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 치료적 유효량으로 투여할 수 있다.
개체에게 투여되는 항원 결합 단백질의 투여량은 일반적으로 개체의 체중 1 kg을 기준으로 1 μg/kg 내지 150 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 내지 25 mg/kg 또는 1 내지 10 mg/kg 이다. 예를 들어, 상기 투여량은 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 60 mg/kg일 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 비경구 경로, 예를 들어 피하, 정맥내 또는 근육내 경로로 투여할 수 있다.
바람직한 경우, 치료용 조성물의 효과적인 하루 투여량은 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 여섯 번 또는 이 이상의 횟수로 나누어 적절한 간격으로 임의적으로는 단위 투여 형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여량은 투여 일마다 다중 투여 형태로 14일 또는 28일 마다 한번 피하 투여할 수 있다.
용량의 투여는 일반적으로 15 분 내지 24 시간, 예를 들어 2 내지 12 시간, 또는 2 내지 6 시간 동안 정맥내 주입을 통해 이루어질 수 있다. 이렇게 함으로써, 독성 부작용을 감소시킬 수 있다.
용량의 투여는 필요한 경우 한 번 이상, 예를 들어 하루에 3회, 매일 한번, 2일마다 한번, 일주일 마다 한번, 2주일 마다 한번, 한 달 마다 한번, 3달 마다 한번, 6 달마다 한번, 또는 12 달마다 한번 반복할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 예를 들어 6 개월 이상의 기간 동안 지속 요법으로 투여할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 예를 들어 3 내지 6 달 동안 투여한 다음 3 내지 6 달 동안 투여하지 않은 다음 3 내지 6 달 동안 다시 투여하는 방식으로 간헐적 요법으로 투여할 수 있다.
상기 투여량은 항-미오스타틴 항원 결합 단백질을 표적하는 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 이용하여 생물학적 시료에서 투여 후의 순환하는 항-미오스타틴 항원 결합 단백질의 양을 특정함으로써 결정 또는 조절할 수 있다. 투여량을 결정 또는 조절하는 다른 수단을 이용할 수도 있는데, 이의 예로는 약물학적 상태의 생물학적 마커('바이오마커'), 근육 질량 및/또는 기능, 안전성, 허용성 및 치료 반응의 척도 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 항원 결합 단백질은 개체에서 미오스타틴 활성을 하향 조절하는데 효과적인 양 및 기간 동안 투여할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 특정 부위를 표적하도록 개체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 근육, 예를 들어 골격근에 국소적으로 주사할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 하나 이상의 다른 치료적 유효 성분, 예를 들어, 모르타자핀(Mortazapine; Remeron, Zispin: Organon), 매게스테롤 아세테아트(Megestrol acetate; Megace: BMS), 드로나비놀(Dronabinol; Marinol: Solvay Pharmaceutical Inc.), 옥산드롤론(Oxandrolone; Oxandrin: Savient), 테스토스테론, 재조합 성장 호르몬(예를 들어, Somatropin (Serostim: Serono), 뉴트로핀(Genentech), 휴마트로프(Humatrope; Lilly), 게노트로핀(Genotropin; Pfizer), 노르디트로핀(Norditropin; Novo), 사이젠(Merck Serono)), 및 옴니트로프(Sandoz)), 시프로헵타딘(Cyproheptadine; Periactin: Merck), 오르니틴 옥소글루타레이트(Cetornan), 메틸페니데이트(Methylphenidate; Ritalin: Novartis), 및 모다피닐(Modafinil; Provigil: Cephalon), 올리스타트(orlistat; alii: GSK), 시부트라민(sibutramine; Meridia, Reductil), 리모나반트(rimonabant; Acomplia, Monaslim, Slimona)와 조합하여 본 원에서 기재한 질병의 치료에 사용할 수 있다. 이러한 조합은 미오스타틴이 질병의 원인이거나 미오스타틴 활성을 중화하는 것이 이롭게 되는 질병의 치료에 사용될 수 있다.
상기 항원 결합 단백질을 다른 치료적 유효 성분과 조합하여 사용하는 경우, 그 개개의 성분들은 함께 또는 따로따로 투여될 수 있거나, 순차적으로 또는 동시에, 분리되거나 합쳐진 약학적 제제의 형태로 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다. 따로따로 또는 순차적으로 투여하는 경우, 상기 항원 결합 단백질 및 치료적 유효 성분(들)은 임의의 순서로 투여할 수 있다.
전술한 조합은, 전술한 조합을 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 임의적으로 포함하는 단일의 약학적 제제의 형태로 사용되도록 제공될 수 있다.
동일한 제제에 결합되는 경우, 상기 성분들은 안정하고 상기 제제의 다른 성분들과 양립할 수 있어야 하고 투여를 위해 제제화될 수 있어야 한다. 따로따로 제제화되는 경우, 상기 성분들은 예를 들어 당 업계에서 항원 결합 단백질에 대하여 알려진 바와 동일한 방법으로 임의의 통상적인 제제 형태로 제공될 수 있다는 것을 알 수 있다.
동일한 질병에 대한 제 2의 치료제와 조합하는 경우, 각 성분의 용량은 항원 결합 단백질이 단독으로 사용되는 경우와 상이할 수 있다. 당업자는 적절한 용량을 쉽게 인식할 수 있다.
상기 항원 결합 단백질 및 치료적 유효 성분(들)은 상승효과적으로 작용할 수 있다. 즉, 상기 항원 결합 단백질 및 치료적 유효 성분(들)을 조합하여 투여하는 것은 각각의 단독의 효과들을 합한 것보다 본 원에서 기재한 질병, 장애 또는 증상에 대하여 더욱 큰 치료 효과를 가질 수 있다.
상기 약학적 조성물은 다른 약물 및 임의적으로 사용 지시서와 함께 항원 결합 단백질의 부품 키트를 포함할 수 있다. 편의를 위해, 상기 키트는 사용 지시서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
용어 "개체" 및 "환자"는 본 원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 개체는 일반적으로 인간이다. 또한, 상기 개체는 마우스, 쥐 또는 영장류(명주원숭이 또는 원숭이)와 같은 포유동물일 수도 있다. 상기 개체는 인간이 아닌 동물일 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 수의학적 용도를 가질 수도 있다. 상기 치료될 개체는 농장 동물, 예를 들어, 암소 또는 황소, 양, 돼지, 염소 또는 말일 수 있거나 개 또는 고양이와 같은 가축일 수 있다. 상기 동물은 임의 연령일 수 있거나 성숙한 성체 동물일 수 있다. 상기 개체가 마우스, 쥐 또는 영장류와 같은 실험용 동물인 경우, 상기 동물은 근육 소모, 근육증 또는 근육 감소와 관련 있는 질병 또는 증상을 유발하도록 처리될 수 있다.
치료는 치료적 또는 예방적 치료일 수 있다. 상기 개체는 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 자일 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들로는 특정의 의학적 질병으로 이미 고생하는 개체 외에도 미래에 이러한 질병을 발생할 수 있는 자들이 있다.
따라서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 예방적 치료에 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상의 개시를 예방 또는 지연시키기 위하여 개체에게 투여된다. 상기 개체는 증상이 없을 수 있다. 상기 개체는 상기 질병에 대한 유전적 소인을 가질 수 있다. 예방적 유효량의 상기 항원 결합 단백질이 이러한 개체에게 투여된다. 예방적 유효량은 본 원에서 기재한 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상의 개시를 예방 또는 지연시키는 양이다.
또한, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 치료 방법에서 사용할 수도 있다. 용어 "치료"(therapy)는 질병의 적어도 하나의 양상 또는 증상의 완화, 감소 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 본 원에서 기재한 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상을 완화 또는 감소시킬 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 치료 또는 예방에 유효한 양으로 사용된다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 치료적 유효량은 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상을 완화 또는 감소시키는 양이다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 본 원에서 기재한 질병을 치료, 예방 또는 치유할 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 환자의 건강에 일반적으로 유익한 효과를 갖는데, 예를 들어, 이는 환자의 예상 수명을 증가시킬 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 완전 치유에 영향을 미칠 필요가 없거나 질병의 모든 증상 또는 징후를 근절할 필요가 없으므로 존립가능한 치료법을 구성한다. 관련 분야에서 인식되고 있는 바와 같이, 치료제로서 이용되는 약물은 소정 질병 상태의 심각성을 감소시킬 수 있지만, 질병의 모든 징후를 제거할 필요가 없으므로 유용한 치료제로 간주한다. 유사하게, 예방적으로 투여되는 치료제는 질병의 개시를 예방하는데 완전히 효과적일 필요는 없으므로 존립가능한 예방제를 구성한다. 질병의 영향을 단순히 감소시키는 것(예를 들어, 그 증상들의 수 또는 심각성을 감소시키거나 또는 또 다른 치료의 효과를 증가시키거나 또는 또 다른 이로운 효과를 증가시킴으로써) 또는 개체에서 질병이 발생 또는 악화될 가능성을 감소시키는 것(예를 들어, 질병의 개시를 지연시킴으로써)으로 충분하다.
상기 장애, 질병 또는 증상으로는 근육 감소증, 악액질, 근육 소모, 불용성 근위축, HIV, AIDS, 암, 수술, 화상, 근육골 및 신경에 대한 외상 및 손상, 비만, 당뇨병(제 2형 당뇨병 포함), 관절염, 만성 신부전(CRF), 말기 신질환(ESRD), 울혈성 심부전(CHF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선택적 관절 수복, 다발성 경화증(MS), 뇌졸중, 근육 이영양증, 운동 뉴런 신경병증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 지방간 질환, 간경변증, 에디슨병, 쿠싱 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 소모, 근육염 및 척추측만증이 있다.
연령 관련 근육 소모(근질환으로도 불리움) 또는 근육감소증은 노화에 따라 발생하는 근육 질량 및 근력의 점진적인 감소이다. 이러한 증상은 근육 합성 및 회복의 감소 외에도 근육 파괴의 증가 때문인 것으로 판단된다. 연령 관련 근육 소모의 경우, 개개의 섬유가 손실되기 때문에 근육 섬유 다발이 수축할 수 있다. 또한, 이러한 개체에서의 무용성 근위축(disuse muscle atrophy) 때문에, 군육 섬유가 더욱 작아진다. 치료제는 이러한 근위축을 호전시킬 수 있다. 따라서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 근육 감소증을 치료할 수 있다.
연령 관련 근육 소모은 중년 연령에서 시작되고 여생 동안 가속된다. 이러한 증상에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 정의는 젊은 성인과 비교하여 2의 표준 편차 미만인 사지 골격근 질량/신장((kg/m)이다. 이러한 장애는 운동성 감소, 기능 장애 및 독립심의 상실로 이어질 수 있다.
무용성 근위축은 다수의 상이한 증상, 질병 또는 장애, 예를 들어, 부동화, 수술후, 투석, 중환자 치료(예를 들어, 화상, ICU), 근육 및 뼈에 대한 외상 및 손상과 관련이 있을 수 있다. 무용성 근위축은 장기간의 근육 불사용으로 이어지는 다수의 원인 및 사고의 결과일 수 있다. 근위축은 근섬유의 크기의 감소 및/또는 수의 감소 및/또는 기능의 감소를 수반한다.
악액질은 체중 감소, 근육 질량 감소, 근위축, 피로, 및 체중 감소를 적극적으로 시도하지 않는 개체의 식욕의 약화 및 감소 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합과 관련이 있는 증상이다. 악액질은 본 원에서 기재한 질병들 중 어느 하나를 포함하는 여러 다른 장애와 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 악액질은 암, 감염(예를 들어, HIV 또는 AIDS 감염), 신부전, 자가면역, 및 약물 또는 알코올 중독과 관련이 있을 수 있다. 또한, 심장성 악액질은 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있는데, 예를 들어, 심근 경색을 경험했던 환자 또는 울혈성 심부전 환자의 악액질을 치료할 수 있다. 따라서, 암에 의한 악액질을 갖는 환자는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 환자는 상기 질병의 경증, 중등증 또는 중증을 나타낼 수 있다. COPD 환자는 폐기종 및 기관지염 환자를 포함한다. 폐기종 환자는 일반적으로 매우 여위고 허약하지만, 그 질병은 일반적으로 반전될 수 없는 것으로 간주된다. 따라서, 환자의 근원적인 폐기능을 개선하는 것은 더욱 어렵기 때문에 본 원에 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 폐기종 환자를 치료할 수 있다. 기관지염 환자는 일반적으로 더욱 강건하지만, 근육이 부족할 수 있고, 그 질병은 어느 정도 호전시킬 수 있는 것으로 판단된다. 따라서, 본 원에서 기재한 항원결합 단백질을 이용하여 기관지염 환자를 치료할 수 있고, 임의적으로 환자의 근원적인 폐기능을 치료할 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용한 치료는 페기종 또는 기관지염 환자의 호흡에 관여하는 근육 기능을 개선하는데 직접적인 효과를 가질 수 있다.
흔히 암 환자는 입원 가료, 감염, 탈수, 엉덩이뼈 골절, 및 궁극적으로는 사망으로 이어질 수 있는 근육 소모를 나타낸다. 예를 들어, 근육 질량의 10% 감소는 암환자의 아주 불량한 예후와 관련이 있을 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용한 치료는 암환자의 기능 상태를 개선하여, 예를 들어, 완전 화학요법 및 화학요법의 더욱 적극적인 사용을 가능하게 하고 환자의 삶의 품질을 개선할 수 있다. 따라서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 암에 의한 악액질을 치료할 수 있다.
암의 예로는 전립선암, 췌장암, 폐암, 두경부암, 결장직장암 및 임파종이 있다. 예를 들어 전립선암의 경우, 그 개체는 전이성 전립선 암을 가질 수 있고/있거나 안드로겐 박탈 요법(ADT)을 받을 수 있다. 암이 있는 개체는 국소적으로 진행된 암 또는 전이성 암, 예를 들어, 초기 단계의 전이성 암을 가질 수 있다. 따라서, 전립선 암에 따른 ADT 요법을 받는 환자는 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다.
만성 신부전(CRF) 또는 말기 신장 질환(ESRD)을 갖는 환자는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다. 예를 들어, 환자를 투석(pre-dialysis)전에 치료하여 투석의 출발을 지연시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 1 년 이상, 2 년 이상 또는 3 년 이상 동안 투석 받아온 환자를 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 단기간 또는 장기간 만성 사용하여 근육 소모를 예방 또는 치료할 수 있다.
근육, 뼈 또는 신경에 대한 외상 또는 손상의 예로는 엉덩이뼈 골절 및 급성 무릎 손상이 있다. 엉덩이뼈 골절을 갖는 환자는 흔히 골절 전에 근위축을 갖고, 많은 환자의 경우 근육 소모가 엉덩이뼈 골절의 주요 원인이다. 엉덩이뼈 골절에 따라, 근력가 불사용으로 인해 감소되고, 흔히 엉덩이뼈 골절 환자는 보행 및 기능의 수준이 골절 전의 수준으로 회복되지 않는다. 또한, 많은 엉덩이뼈 환자는, 상당한 근육 소모를 초래할 수 있고 엉덩이뼈 골절에 걸리기 쉽게 하는 COPD, ESRD 및 암과 같은 증상으로 고생한다. 따라서, 환자가 엉덩이뼈 골절의 위험이 있는 경우, 그 환자를 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다. 엉덩이뼈 골절 환자는 즉시 수술받아야 하기 때문에, 엉덩이뼈 골절 환자와 관련된 상당한 치료적 긴급상황이 있다. 따라서, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 수술 후 치료하면 근육 질량 및 강도의 감소를 완화시키고/시키거나 근육 질량 및 강도의 회복을 개선함으로써 엉덩이뼈 골절 환자의 회복에 도움을 줄 수 있다. 엉덩이뼈 골절의 위험이 있는 환자 또는 엉덩이뼈 골절이 있는 환자를 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용하여 치료할 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 선택 수술(elective surgery) 환자를 치료하여 수술 전 상기 환자에 근육을 축적하는데 도움을 줄 수 있다.
근육 이영양증(muscular dystrophy)은 점진적인 근육 약화를 초래하는 유전적인 근육 질환들의 그룹을 말한다. 근육 이영양증은 점진적인 골격근 약화, 근육 단백질의 결함, 및 근육 세포 및 조직의 사망에 특징이 있다. 근육 이영양증의 예로는 듀센(Duchenne)형 근육 이영영증(DMD), 베커형 근육 이영양증, 지대형 근육 이영양증(limb-girdle (LGMD)), 선천성 근육 이영양증, 얀면견갑상완 근육 이영양증(FSHD), 근긴장성 이영양증, 안인두근 이영양증, 원위 이영양증, 및 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss) 근이영양증이 있다. 예를 들어, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 듀센형, 베커형 또는 지대형 근육 이영양증을 치료할 수 있다. 또한, 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 국소적 근위축 보다는 확산성 근위축을 치료할 수 있다. 특히, 더욱 집중된 근위축/기능장애 및 근긴장성 이영양증에서의 골격/뼈 및 심장 문제의 역할 때문에 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용하여 근긴장성 이영양증을 치료할 수 있다.
비만은 건강이 부정적으로 영향을 받을 수 있는 정도까지 과량의 체지방이 축적되어온 증상이다. 일반적으로 비만은 30 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI = 제곱한 신장으로 나눈 체중)으로 정의된다. 이러한 정의는 비만을 25 내지 29.9 kg/m2의 BMI인 과체중으로부터 구별시킨다. 비만은 심혈관 질환, 제2형 당뇨병, 폐쇄성 수면 무호흡증, 및 골관절염을 비롯한 여러 가지 질병과 관련이 있을 수 있다. 따라서, 비만은 기대 수명을 감소시키는 것으로 확인되어 왔다. 비만에 대한 대표적인 치료법으로는 식이요법, 운동 및 수술이 있다. 근육 질량을 증가시켜서 기초 대사량을 증가시킬 수 있는 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 비만을 치료할 수 있다. 예를 들어, 이러한 치료 결과, 혈청 화학 검사 및 인슐린 감수성이 개선될 수 있다.
근육 질량 감소, 근력 감소 및 근육 기능 감소의 대표적인 양상 또는 증상은 일반적인 약화, 피로, 운동량의 감소, 낙하에 대한 취약성, 기능 장애, 자율성 감소, 움직임의 감소로 인한 우울, 식욕 감소, 영양실조, 및 비정상적인 체중 감소 중 어느 하나 또는 조합을 포함한다.
상기 질병은 높은 수준의 미오스타틴과 관련될 수 있다. 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여 미오스타틴 수준 및/또는 미오스타틴 활성을 조절할 수 있다.
다수의 종점(multiple endpoint)을 이용하여 근육 질량, 근력 및 근육 기능의 변화를 설명할 수 있다. 이러한 종점으로는 간이 신체 능력 배터리(Short Physical Performance Battery), 래그 프레스(Leg Press), 삶의 질 조사, 일상 생활 활동도(ADLs), 기능 자립 평가(functional independence measure (FIM)), 기능 시험 및 척도(예를 들어, 걷기 테스트, 계단 오르기, 자전거 에르고미터), 강도 시험 및 척도(예를 들어, 악력 시험, 도수 근력 검사 척도), 생체 전기저항 분석, 근전도, 근력계, 이중 에너지 X-선 흡수계측법, 단층 촬영 시험, 자기 공명 영상화, 근육 생검, 근육 조직학적 분석, 혈액/생화학 시험, 신체계측, 피부 두께 측정, 체질량지수 평가, 및 체중 관찰이 있다. 근력은 양방향성 사지 근육, 목 근육 또는 복부 근육을 이용하여 평가할 수 있다.
간이 신체 능력 배터리(SPPB)는 기립 균형, 걷는 속도, 및 의자로부터 오르려는 능력의 측정에 의해 0 내지 4 점의 척도로 평가되는 하지 능력의 다성분 척도이다. 걷기 시험은 환자가 특정 거리를 걷는데 걸리는 시간을 측정하는 하지 기능의 평가이다. 래그 프레스는 웨이트 및 힘의 평가를 이용하여 각근력을 측정한다. 다중 척도 및 시스템을 이용하여 환자의 삶의 질을 정량적으로 평가한다. 이중 에너지 X-선 흡수계측법(DEXA)은 추정된 골격 근육 질량의 측정이다.
또한, 동물에서 다수의 분석법을 이용하여 근육 질량의 변화 및 근력의 변화를 설명할 수 있다. 예를 들어, 악력 시험은 악력계에 대하여 당기는 경우의 동물의 힘을 측정한다. 경사면 시험은 동물의 매달리는 능력을 측정한다. 유영 시험은 대표적인 활동, 예를 들어, 유영을 통해 기능 능력을 측정하는 것으로, 인간의 걷기 시험과 유사하다. 뒷다리 진력 시험(Hindlimb Exertion Force Test (HEFT))은 꼬리 자극의 인가에 따라 발휘된 최대의 힘을 측정한다. 동물에 대한 다른 신체 기능 시험으로는 걷는 속도 및 휠 런닝(wheel running)이 있다. 이러한 시험법/모델들은 단독 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
고지방 식이(HFD)에 의해 유발된 인슐린 저항성 마우스 모델이 비만 모델로서 사용될 수 있다.
전신성 홍반성 루프스, 유육종증, 류머티스성 관절염, 및 기관지 천식과 같은 많은 종류의 만성 염증성 질병의 치료에는 글루코코르티코이드가 일반적으로 사용된다. 그러나, 인간 및 동물에 고용량의 글루코코르티코이드를 투여하면 근육 위축이 발생한다. 유사하게, 과코티졸혈증(hypercortisolism)은 쿠싱병의 경우 근육 위축에 주요한 역할을 한다. 덱사메타손(dex)에 의해 유발된 근육 위축은 근육 미오스타틴 mRNA 및 단백질 발현의 용량 의존적 유발과 관련이 있다((Ma K, 외, 2003 Am J Physiol Endocrinol Metab 285:E363-E371). 또한, 글루코코르티코이드가 주요한 역할을 하는 근육 위축의 몇 가지 모델에서 미오스타틴 발현의 증가가 보고되어 왔다(Lalani R 외, 2000 J Endocrinol 167:417-428; Kawada S 외, 2001 J Muscle Res Cell Motil 22:627-633; 및 Lang CH 외, 2001 FASEB J 15:NIL323-NIL338). 따라서, 글루코코르티코이드에 의해 유발된 근육 소모의 마우스 모델을 이용하여 본 발명의 항원 결합 단백질을 연구할 수 있다.
인간의 불용성 근육 위축은 일반적으로, 연골의 만성 골관절염과 같은 정형외과 질환 또는 골절의 치료를 위한 석고붕대 부동화와 관련하여 발생하는 외에도, 다른 의학적 또는 수술의 이유 때문에 침상 안정 시간이 긴 경우에 발생한다. 불용성 근육 위축은 근력 감소 및 근육 장애를 초래한다. 물리적 재활 치료가 유일한 치료 선택 방법일 수 있는데, 이는 흔히 긴 시간 동안 요구되고 이것이 항상 근육을 정상 크기 및 근력으로 회복시키는 것은 아니다. 따라서, 좌골 신경 파괴를 이용하여 근육 위축을 유발하는 마우스 모델을 이용하여, 본 발명의 항원 결합 단백질을 연구할 수 있다.
상당 수의 암환자가 지반 조직의 점진적인 감소 및 근육 소모에 따른 체중 감소로 고생하고 있다. 암 사망의 약 20%는 근육 감소에 의해 발생되는 것으로 추정된다. 많은 질병의 경우 근육 소모가 일반적으로 양호한 사망 예후인자이다. AIDS, 기아(starvation) 및 암에 대한 연구 데이터는 개체의 질병전 제지방 질량의 30-40% 이상의 감소는 치명적이라는 것을 나타내고 있다(DeWye WD.. In Clinics in Oncology. Edited by Caiman KC and fearon KCH. London: Saunders, 1986, Vol. 5, no 2, p.251-261; Kotter DP 외, 1990 J Parent Enteral Nutr 14:454-358; 및 Wigmore SJ 외, 1997 Br J Cancer 75:106-109). 따라서, 근육 소모에 관여하는 신호전달 경로의 억제를 통해 근육 위축을 완화시킬 수 있는 것이 매우 바람직하다. 따라서, C-26 종양 함유 마우스 모델을 이용하여 본 발명의 항원 결합 단백질을 연구할 수 있다.
임상에서, 건절제술(tenotomy)은 근건부(myotendinous unit)의 선천적 및/또는 후천적 기형으로 인한 건(tendon)의 외과적 횡절제를 의미하지만, 외상 또는 퇴행성 근골격성 질환의 경우에는 건 연속성의 감소가 발생할 수도 있다. 건절제술은 안정 장력의 즉각적인 감소, 근절 단축 및 후속하는 근육 질량 및 힘발생 능력의 감소를 초래한다(Jamali 외, 2000 Muscle Nerve 23: 851-862). 따라서, 골격근 위축을 유발하는 마우스 건절제 모델을 이용하여 본 발명의 항원 결합 단백질을 연구할 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 급성, 만성 및/또는 예방 치료에 사용할 수 있다. 급성 치료는 강도를 신속히 축적시키고 환자를 적절한 기능 수준에 으르게 하여 그 기능 수준을 운동 또는 만성 치료를 통해 유지할 수 있도록 한다. 만성 치료를 이용하여, 근력을 유지하거나 시간 경과에 따라 서서히 축적시킬 수 있았다. 예방 치료를 이용하여, 본 원에서 기재한 환자 개체군에서 시간 경과에 따라 일반적으로 발생하는 근육 질량 및 근력의 감소를 방지할 수 있었다. 그다지 심하지 않은 근육 소모의 초기 억제에는 근육 기능의 유지만이 요구되므로, 근육 기능을 개선하는 것이 성공적인 치료에 항상 필요한 것은 아니다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 근력, 근육 질량 및 근육 기능을 증가시키기 위해 화장품 용도를 가질 수도 있다. 또한, 본 발명의 항원 결합 단백질은 우주 비행 또는 우주비행사의 훈련 동안에 사용할 수도 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 골격근과 같은 근육에 직접적인 생물학적 영향을 미칠 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명의 항원 결합 단백질은 골격근과 같은 근육에 간접적인 생물학적 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 근육 조직상태, 근육 질량, 근육섬유, 근육 섬유 크기, 근육 재생 및 근육 섬유화 중 하나 이상에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 근육 질량을 증가시킬 수 있다. 특히, 개체의 제지방 질량을 증가시킬 수 있다. 하기의 근육들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합의 질량을 증가시킬 수 있다: 사두근, 삼두근, 넙치근, 전경골근(TA), 및 장지신근(EDL). 상기 항원 결합 단백질은 근섬유수 및/또는 근섬유 크기를 증가시킬 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 근육 재생을 향상시키고/시키거나 근육 섬유화를 감소시킬 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 근육모세포의 증식 속도를 증가시키고/시키거나 근육 분화를 활성화할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 근육 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 증가시킬 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은 위성 세포에 대하여 하기의 효과들 중 하나 또는 둘 이상의 조합을 가질 수 있다: 상기 세포를 활성화, 증식을 증가 및 자가 재생을 촉진. 상기 항원 결합 단백질은 미오스타틴 수준을 조절할 수 있다. 상기 항원 경합 단백질은 개체의 체중을 증가시킬 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 근육 수축을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 개선할 수 있다. 상기 항원 결합 단백질은 골밀도를 증가시킬 수 있다.
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질은 근육 성장, 기능 및 수축에 관여하는 단백질의 합성 및 이화작용을 조절할 수 있다. 예를 들어, 미오신, 디스트로핀, 미오게닌 등의 근육 관련 단백질들의 합성이 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 사용을 통해 상향 조절될 수 있다. 예를 들어, 미오신, 디스트로핀, 미오게닌 등의 근육 관련 단백질들의 이화작용이 본 원에서 기재한 항원 결합 단백질의 사용을 통해 하향 조절될 수 있다.
사용의 진단 방법
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 이용하여, 진단 목적으로 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 시료에서 미오스타틴을 검출할 수 있다. 예를 들어, 상기 항-미오스타틴 항원 결합 단백질을 이용하여 배양 세포, 조직 또는 혈청에서 미오스타틴을 검출할 수 있다. 상기 조직은 인체 또는 동물 신체로부터 우선적으로 제거된 것(예를 들어, 생검 시료)일 수 있다. ELISA, 웨스턴 블럿, 면역조직화학 분석 또는 면역침강을 비롯한 통상적인 면역분석법을 이용할 수 있다.
미오스타틴의 존재 또는 수준을 질병과 상관시킴으로써, 당업자는 관련 질병을 진단할 수 있다. 또한, 개체에서 미오스타틴 수준의 증가가 검출되면, 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용한 치료에 반응할 수 있는 환자 개체군이 있다는 것을 알 수 있다. 미오스타틴 수준의 감소가 검출되면, 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용한 개체에서 근력, 근육 질량 및 근육 기능 증가의 생물학적 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
상기 항원 결합 단백질은, 한 종 이상의 항원 결합 단백질, 검출가능한 라벨, 및 사용 지시서를 포함하는 진단 키트의 형태로 제공될 수 있다. 편의를 위해, 상기 키트는 사용 지시서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
유전자 치료
본 원에서 기재한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 이를 필요로 하는 개체에게 투여할 수 있다. 상기 핵산 분자는 적절한 스케폴드 또는 도메인에서 CDR, 가변 도메인 또는 전장 항체를 발현시킬 수 있다. 상기 핵산 분자는 인간 또는 동물 세포에서의 발현을 가능하게 하는 벡터에 포함될 수 있다. 상기 핵산 분자 또는 도메인은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 전술한 한 종 이상의 치료적 유효 성분과 함께 투여하기 위한 용도로 제제화할 수 있다.
실시예
1. 재조합 단백질의 제조
1.1 성숙한 이합체형 미오스타틴의 정제
HexaHisGBITev/ (D76A) 마우스의 미오스타틴 다단백질 서열(서열번호 101)을 CHO 분비 시스템에서 발현시켰다. GB1 태그(tag)(서열번호 102)는 WO2006/127682호에서 설명되어 있는데, Fc 태그를 이용한 작제물과 비교하여 더욱 높은 수준에서 미오스타틴의 발현을 가능하게 하고 미오스타틴의 적절한 접힘을 가능하게 하는 것으로 확인되었다. 인간 및 동물의 성숙한 미오스타틴의 서열들은 서로 100% 동일하기 때문에 마우스의 다단백질 서열(서열번호 103)을 이용하여 성숙한 미오스타틴 서열(SEQ ID NO: 104)을 만들었다. 미오스타틴의 어떤 가능한 분해를 감소시키기 위하여, "DVQRADSSD" 영역의 D76A 돌연변이를 이용하여 상기 마우스의 다단백질 서열을 조작했다.
신호 서열이 없는 발현된 HexaHisGBITev/ (D76A) 마우스 미오스타틴 다단백질을, 50 Tris-HCl 완충액(0.5M NaCl을 이용하여 pH8.0으로 조절)에서 Ni-NTA 아사로스(Qiagen)를 이용하여 CHO 배지로부터 포획했다. 그 Ni 용출물(eluate)을 Furin 절단 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 0.1M NaCl, 0.1% Triton X-100, 1mM CaCl2)으로 완충액 교환한 다음, 실온에서 밤새 1:25 V/V의 Furin/단백질 비로 Furin(자사에서 발현시킴, 서열번호 105의 Furin 서열)을 이용하여 절단했다. Furin은 다단백질을 프로-펩티드 및 성숙 미오스타틴(즉, "TPKRSRR" 및 "DFGLDCD")로 절단하여 프로-펩티드 및 성숙 미오스타틴을 생성했다.
상기 Furin 절단 반응의 전체 혼합물을 6M Gdn-HCl에 첨가하여 그 응집물을 해리시켰다. 60 ℃에서 40 분내에 15-60% 완충액 B 구배로 C8 RP-HPLC(Vydac 208TP, Grace, Deerfield, IL, USA)를 이용하여 상기 혼합물로부터 성숙 미오스타틴을 분리했다(C8 RP-HPLC 완충액 A: 0.1% TFA(H2O에서), 완충액 B: 0.1% TFA(100% 아세토니트릴에서). 성숙 미오스타틴을 함유하는 피이크 전방의 분획들을 풀링(pooling)하여 후속 시험관내 분석에 사용했다. 도 1은 성숙 미오스타틴에 대한 LC/MS 분석 결과를 도시하고, 도 2는 환원 및 비환원 미오스타틴 시료를 이용한 NuPAGE 겔 분석 결과를 도시한다.
1.2 재조합 미오스타틴의 시험관내 생물학적 활성
미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석(Thies 외, (2001) Growth Factors 18(4) 251-259)를 이용하여 횡문근육종 세포(A204)세포에서 미오스타틴의 시험관내 활성을 평가했다. A204 세포(LGC Promochem HTB-82)를, 페놀 래드가 없고, 5% 챠콜-스트리핑된 FCS(Hyclone) 및 1X Glutamax(Invitrogen)를 함유한 고글루코스 DMEM(Invitrogen)에서 성장시켰다. 다음에, 세포를 트립토신화하여 현탁액을 만들고, Gemini 형질감염 시약(자사의 시약, WO2006/053782호에 기재됨)을 이용하여 PAI-1 프로모터의 12x CAGA 박스의 조절하에 루시퍼라제 유전자 함유 pLG3로 형질감염시켰다. 세포를 96 웰 Fluoronunc 플레이트(VWR)에 웰당 40,000개 세포의 밀도로 분주하고, 밤새 침강 및 건조시켰다. 다음날, 서열번호 104에서 나타낸 서열을 갖는 R&D Systems사의 미오스타틴(788-G8-010/CF) 또는 자사의 미오스티틴(상기 실시예 1.1에서 기재한 바와 같은)인 재조합 성숙 미오스타틴을 연속희석하여 각 웰의 배지에 첨가하고, 세포를 6 시간 동안 추가로 배양한 다음, SteadyLite(Perkin Elmer LAS)를 첨가하여 실온에서 20 분간 배양하고 SpectraMax M5 판독기(Molecular Devices)를 이용하여 판독했다. 미오스타틴에 의한 세포의 활성화 및 이에 따른 루시퍼라제 발현을 나타내는 용량 반응 곡선이 도 3에서 도시되어 있다. R&D Systems사 및 자사의 성숙한 이합체형 미오스타틴 종들은 용량 의존적으로 A204 세포를 활성화하여 루시퍼라제 신호를 나타낸다는 것을 명백히 알 수 있다. 자사의 정제된 미오스타틴은 R&D Systems사의 미오스타틴과 비교하여 배경이 더욱 낮고 동적 범위가 개선된 것을 보여준다.
또 다른 방법에서는, A204 세포(LGC Promochem HTB-82)를 McCoys 배지(Invitrogen) 및 10% 열불활성화된 FBS(Invitrogen)에서 성장시켰다. 다음에, versene(Invitrogen) 및 TrypLE(Invitrogen)의 1:1 혼합물을 이용하여 세포를 떼어내고, 페놀 래드가 없고 5% 챠콜-스트리핑 혈청(Hyclone) 및 2mM 글루타맥스(Invitrogen)를 함유한 고글루코스 DMEM(분석 배지)에 재현탁했다. 14x106 개의 세포를, 현탁액에서 18.2μg의 pLG3 플라스미스(PAI-1 프로모터의 12x CAGA 박스의 조절하에 있는 루시퍼라제 유전자 함유)를 182μl의 1mM Gemini 형질감염 시약(자사의 시약, WO2006/053782호에 기재됨)와 혼합하여 형질감염시켰다. 세포를 T 175 배양 플라스크에 옮기고 밤새 배양했다. 다음날, R&D Systems사의 미오스타틴(788-G8- 010/CF) 또는 자사의 미오스타틴(상기 실시예 1.1에서 기재된 바와 같은)인 재조합 미오스타틴을 20μl의 최종 체적까지 시험 항체의 연속 희석액의 존재하에서 연속희석하거나 일정 농도로 96웰의 블랙 FluoroNUNC 분석 플레이트(VWR)에 첨가했다. 미오스타틴과 항체의 혼합물을 30분간 예비배양시켰다. 그 형질 감염된 세포를 versene:TrypLE를 이용하여 떼어내고, 분석 배지에 2.2x105 개 세포/ml의 밀도로 재현탁하고 180μl/웰의 농도로 분주했다. 플레이트들을 6 시간 동안 추가로 배양한 다음, 50μl의 SteadyLite 시약(Perkin Elmer LAS)을 첨가하여 실온에서 20 분간 배양하고 SpectraMax M5 판독기(Molecular Devices)를 이용하여 판독했다. 성숙한 이합체형 미오스타틴에 의한 세포 신호전달의 활성화 및 이에 따른 루시퍼라제 발현을 나타내는 용량 반응 곡선을 도 3B에서 나타낸다. 자사의 미오스타틴 종은, 서로 다른 날에 얻은 데이터에 의해 확인되는 바와 같이 상이한 시험들의 경우마다 재현가능하고 용량 의존적인 방식으로 A204 세포를 활성화하여 루시퍼라제 신호를 나타낸다.
2. 단클론 항체의 생성 및 마우스의 단클론 항체인 10B3의 특성 규명
2.1 단클론 항체
SJL/J 마우스(Jackson Laboratories)를, 성숙 미오스타틴(상기 실시예 1.1)에서 기재한 바와 같이 제조함)을 복막내 주사하여 면역시켰다. 면역 전에, 미오스타틴을 크립토스포리디움 파븀(C. parvum)에 접합하고 마우스를 상기 접합체(10 μg의 C.parvum에 접합된 2.5 μg의 미오스타틴)로 면역시키고 7.5 μg의 가용성 미오스타틴으로 추가로 면역시켰다. 상기 마우스로부터 비장 세포를 제거하고 B 림프구를 PEG1500(Boehringer)의 존재하에서 P3X63BCL2-13 세포(자사에서 생성됨, Kilpatrick 외, 1997 Hybridoma 16(4) pages 381-389 참조) 유래의 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 얻었다. 개개의 하이브리도마 세포주를 제한 희석을 통해 클로닝했다(E Harlow 및 D Lane에서 기재된 방법을 이용). 단일 콜로니를 함유하는 웰을 현미경 분석으로 확인하고 상등액을 활성에 대하여 시험했다.
우선, 하이브라도마 상등액을 FMAT 샌드위치 분석 포맷으로 재조합 미오스타틴에 대한 결합 활성에 대하여 스크리닝했다. BIAcore™ 방법을 이용하여 재조합 미오스타틴(R&D Systems, 788-G8-010/CF) 및 자사의 발현 정제된 미오스타틴(상기 1.1 참조)에의 결합을 검출하여 상기 양성 하이브리도마들의 2차 스크리닝을 완료했다.
상기 미오스타틴 결합 분석에서 확인한 양성 하이브리도마들을 제한 희석을 통해 서브클로닝하여 안정한 단클론 세포주들을 얻었다. 무혈청 조건하에서 세포 공장에서 성장시킨 상기 하이브라도마 유래의 면역글로불린을 고정된 단백질 A 칼럼을 이용하여 정제했다. 다음에, 이러한 단클론 항체들을 ELISA 및 BIAcore™을 이용하여 미오스타틴 결합에 대하여 다시 스크리닝했다.
단클론 항체인 10B3이 제조합 미오스타틴에 결합한 유력한 항체인 것으로 확인되었다.
2.2 단클론 항체인 10B3의 서열 분석 및 10B3 키메라의 클로닝
10B3 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 미리 결정한 아형isotype (IgG2a/κ)에 따른 항체 불변 영역 및 선도 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 역전사를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA를 생성했다. 다음에, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA를 플라스미드에 클로닝하여 서열분석했다. 10B3의 VH 영역의 아미노산 서열이 서열번호 7에서 나타나있다. 10B3의 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8에서 나타나있다. 10B3에 대한 카밧(Kabat) CDR 서열이 하기 표 3 및 표 4에서 나타나있다.
표 3. 중쇄 CDR 서열
Figure pct00005
표 4. 경쇄 CDR 서열
Figure pct00006
10B3 쥐과동물 단클론 항체(VH: 서열번호 7; VL: 서열번호 8)로부터 가변 영역을 취하고 이를 인간 IgG1/k 야생형 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 작제했다. 이러한 작제물의 제작에 신호 서열(서열번호 9)을 이용했다.
간략히 말해서, 상기 클로닝된 쥐과동물의 가변영역을 PCR로 증폭하여 클로닝에 필요한 제한 부위를 포유동물의 발현 벡터(Rld_Efl 및 Rln_Efl)에 도입했다. Hind III 및 Spe I 부위를 디자인하여 VH 도메인을 만들고, 인간의 γ1 야생형 불변 영역을 함유하는 벡터(Rld_Efl)에 클로닝했다. Hind III 및 BsiW I 부위를 디자인하여 VL 도메인을 만들고, 인간의 κ 불변 영역을 포함하는 벡터(R1n_Ef1)에 클로닝했다. 정확한 VH(서열번호 25) 및 VL(서열번호 8) 서열을 갖는 클론을 확인하고 플라즈미드를 제조하여(표준 분자 생물 기술을 이용) CHOK1 세포 상등액에서 발현시켰다. 고정된 단백질 A 칼럼을 이용하여 상기 세포 상등액으로부터 항체를 정제하고 280nm에서의 흡광도를 판독하여 정량했다.
상기 얻어지는 키메라 항체를 10B3 키메라(10B3C 또는 HCLC)로 명명했다. 상상기 10B3 키메라 항체는 서열번호 26에서 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 갖는다. 상기 10B3 키메라 항체는 서열번호 27에서 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 갖는다.
2.3 재조합 미오스타틴에의 결합
10B3 및 10B3 키메라(10B3C)는 샌드위치 ELISA 분석시 미오스타틴(R&D Systems, 788-G8- 010/CF)을 결합했다. 플레이트를 10ng/웰의 농도로 미오스타틴을 코팅하고 블록 용액(PBS, 0.1% TWEEN 및 1% BSA)으로 블로킹했다. 세척(PBS, 0.1% TWEEN) 후, 항체를 희석 시리즈에 따라 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고 플레이트를 다시 세척한 다음 항-마우스 HRP 또는 항-인간 HRP(각각, Dako, P0161 & Sigma, A-8400)와 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양했다. 플레이트를 다시 세척하고, 발색 반응(colourometric reaction)이 일어날 때까지 OPD 기질(Sigma, P9187)을 첨가하고 H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 490 nm의 흡광도에서 판독하고 EC50을 산정했다(표 5 참조).
표 5. 모체 10B3 및 키메라 10B3 항체의 EC50
Figure pct00007
제조합 미오스타틴에 대한 10B3 마우스 모체 및 10B3의 친화성을 BIAcore™ (표면 플라즈몬 공명) 분석을 통해 평가했다. 분석은 포획 표면을 이용하여 수행하였는데, 항-마우스 IgG를 10B3 마우스 모체에 대한 일차 아민 결합을 통해 C1 칩에 결합시키고, 단백질 A 표면을 10B3 키메라에 대한 일차 아민 결합을 통해 C1 칩 상에서 생성했다.
포획 후, 완충 주입액(즉, OnM)을 이중 참조(double referencing)에 사용하면서 재조합 항체를 64nM, 16nM, 4nM, 1nM, 0.25nM 및 0.0625nM의 농도로 상기 표면 위를 통과시켰다. 각각의 검체의 주입 사이에는 재생 단계를 가진 후, 새로운 항체 포획이 발생한 다음, 미오스타틴을 주입했다. 얻어지는 데이터를 T100 기계의 분석 프로그램에 고유적인 비발렌트(Bivalent) 모델 및 1:1 모델을 모두 이용하여 분석했다(표 6 참조). 두 포획 표면은 100mM 인산을 이용하여 재생할 수 있었고, 분석은 이동 완충액으로 HBS-EP를 이용하고 25 ℃ 분석 온도를 이용하여 수행했다.
표 6. 미오스타틴에의 모체 10B3 및 키메라 10B3의 결합에 대한 T100 데이터
Figure pct00008
10B3의 결합 능력을 더욱 분석하기 위하여, ELISA 기반 분석을 수행하여 결합이 순수한 성숙 미오스타틴에 특이적인지의 여부 또는 잠재 복합체, 및 미오스타틴의 프로펩티드(Wolfman 외, (2003) PNAS 100: pages 15842-15846)의 Arg 75 및 Asp 76 사이의 BMP-1 절단에 따라 잠재 복합체로부터 방출된 성숙 미오스티틴을 비롯한 다른 미오스타틴 항원의 경우에도 결합이 일어날 수 있는지의 여부를 확인했다.
인간 미오스타틴의 프로-펩티드의 정제를 HexaHisGBITev/인간 미오스타틴 프로-펩티드 서열(서열번호 106)을 이용하여 수행했다. 이러한 서열을 CHO 분비 시스템에서 발현시키고, 발현된 단백질을 Ni-NTA(GE Healthcare, NJ)를 이용하여 상기 CHO 배지로부터 포획했다. HexaHisGBltag를 Tev 프로테아제(자사에서 발현되었음, 서열번호 107에 나타낸 서열)를 이용하여 절단했다. Tev 프로테아제는 서열번호 106의 태그와 프로-펩티드(즉, "ENLYFQ" 와 "ENSEQK")의 사이를 절단하여 서열번호 108의 서열을 생성한다.
상기 절단된 태그 및 절단되지 않은 hexaHisGBITev/Human 미오스타틴 다단백질을 6M 구아니딘 HCL의 존재하에 Ni-NTA 상에 포획하면서, 태그가 절단된 인간 미오스타틴 다단백질은 비결합 유동통과 분획(unbound flowthrough)에 유지했다. 상기 유동통과 분획을 1xPBS 완충액에서 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare, NJ) 상에 가하고, 응집된 이합체 형태 및 단량체 형태를 상기 칼럼 상에서 분리했다. 상기 인간 미오스타틴 프로-펩티드(서열번호 108)의 이합체 형태는 잠재 복합체의 형성에 사용했다.
6M 구아니딘 HCl에서 실온에서 2 시간 동안 상기 정제된 인간 미오스타틴 프로-펩티드(서열번호 108) 및 성숙 미오스타틴(서열번호 104)를 3:l(w/w)의 비로 혼합한 다음, 4 ℃에서 밤새 1xPBS에 투석하여 미오스타틴의 잠재 복합체를 제조하고, 1xPBS 완충액에서 Superdex 200(GE Healthcare, NJ)에 로딩했다. 미오스타틴 프로펩티드 및 성숙 미오스타틴을 함유하는 피이크의 분획을 풀링했다. 상기 잠재 복합체는 LC/MS 및 SDS-PAGE로 확인했다(데이터 미도시). BMP-1 절단을 위하여, 150μl의 인간 미오스타틴의 잠재성 복합체(1.5mg/ml) 225 μl의 BMP-1(0.217mg/ml), 75μl의 25mM HEPES(pH 7.5) 및 150μl의 20mM CaC12, 4μM ZnCl2 및 0.04% Brij 35와 반응시켰다. 상기 반응은 30 ℃에서 밤새 수행했다. BMP-1 단백질을 CHO 발현 시스템을 이용하여 자사에서 발현시켰다(서열번호 111로 나타낸 서열).
미오스타틴 항원을 PBS에서 4 ℃로 밤새 EIA/RIA 플레이트(Costar)의 웰에 100ng/웰의 농도로 코팅한 다음, 실온에서 30 분간 블로킹(PBS, 3% BSA)했다. 플레이트를 세척(PBS, 1% BSA 및 0.1% Tween20)한 다음, 세척 완충액에 희석한 10B3의 연속 희석액을 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 배양했다. 플레이트를 다시 세척한 다음, 세척 희석액에 1:10,000으로 희석한 퍼옥시다제-접합 Affinipure F(ab')2 당나귀 항-마우스 IgG(Jackson Laboratories cat 715-036-151)를 첨가하고 실온에서 1 시간 배양했다. 최종 세척을 수행한 다음, TMB 기질을 첨가하고, 일어난 발색 변화를 황산으로 정지시키고 450nm에서 플레이트를 판독했다. 도 4는 10B3가 성숙한 이합체형 미오스타틴, 잠재성 복합체(사합체), 및 BMP-1 절단에 따라 잠재성 복합체로부터 방출된 미오스타틴을 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 10B3 는 프로펩티드 이합체에는 결합하지 않는 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
2.4 미오스타틴 상의 10B3 결합 에피토프의 개략적 지도작성( crude mapping )
10 개의 아미노산에 의해 중첩(4개의 아미노산에 의해 오프셋)되는 비오티닐화된 14 mer 펩티드들을 미오스타딘의 아미노산 서열을 기준으로 합성하여, 10B3에 의해 인식되는 결합 에피토프(공급처: Mimotopes, Australia)의 위치를 지도작성했다.
연구는 SRU BIND 판독기(SRU Biosystems)에서 수행했다. 스트렙타비딘 바이오센서 플레이트를 세척하고, 기선 판독치(baseline reading)를 취하고, 비오티닐화 펩티드를 상기 스트렙타비딘이 코팅된 바이오센서 플레이트 상에 포획했다. 상기 플레이트를 다시 세척하고, 새로운 기선 판독치를 취한 다음, 항체를 첨가하고 결합을 관찰했다.
상기 10 개의 아미노산에 의해 중첩(4 개의 아미노산에 의해 오프셋)되는 14 mer 맞춤 디자인한 인공 펩티드 서열들은 하기 표 7에서 나타낸다.
표 7. 미오스타틴 인공 펩티드
Figure pct00009
상기 14 mer 펩티드의 결합 데이터 분석 결과는 10B3가 미오스타틴 내의 어떤 선형 에피토프에도 결합할 수 없었다는 것을 나타냈다. 그러나, 대조 항-미오스타틴 항체는 펩티드 세트내의 에피토프에 결합하는 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
스캐폴드 상의 화학적 결합 면역원성 펩티드(Chemically Linked Immunogenic Peptides on Scaffolds (CLIPS))인 Pepscan을 이용한 10B3C의 미오스타틴 결합 부위의 후속 분석 결과, 미오스타틴의 "PRGSAGPCCTPTKMS" 아미노산 서열은 키메라 항체에 대한 결합 부위일 수 있는 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
2.5 미오스타틴의 ActRIIb 수용체 결합의 중화
재조합 가용성 ActRIIb(R&D Systems 339-RBB)를 탄산염 완충액에서 1μg/ml의 농도로 ELISA 플레이트의 웰에 4 ℃에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 블로킹(상기 2.3의 블로킹 용액 참조)하고, 표준 ELISA 프로토콜에 따라 세척했다. 병행하여, 2nM의 비오티닐화 미오스타틴(상기 1.1에서 기재된 바와 같은 자사의 비오티닐화 물질)을 10B3, 10B3C, 및 음성 대조구(IgG1 아형 대조구)로 구성되는 항체의 연속 희석액과 함께 37 ℃에서 2 시간 동안 예비배양했다. 다음에, 상기 비오티닐화 미오스타틴과 항체의 반응물을 ActRIIb 코팅된 플레이트에 37 ℃에서 1 시간 동안 첨가했다. 표준 세척 과정을 수행한 다음, 1: 1000으로 희석한 스트렙타비딘-HRP 접합체(Dako P0397)를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 추가로 배양했다. 플레이트를 다시 세척하고 OPD 기질(Sigma) 및 산 정지 용액을 이용한 처리 후 490nm의 흡광도에서 분석했다. 미오스타틴 활성의 억제에 대한 억제 곡선 및 IC50 값을 도 5 및 도 8에서 각각 나타낸다.
표 8. ActRIIb 수용체 중화의 IC50
Figure pct00010
상기 수용체 중화 분석법은 효능을 기준으로 1 nM 미만의 IC50을 갖는 분자를 구별하기 위해 이용가능한 가장 민감한 방법이다. 그러나, 이러한 방법 그 자체는 결합가능한 비오티닐화 미오스타틴의 정확한 농도에 민감하지 않다. 따라서, 때때로, 10B3 대한 상이한 IC50 값들, 예를 들어, 0.13nM, 0.108nM, 0.109nM, 또는 0.384 nM의 IC50 값들이 측정되어 왔다(표 8에서 132ng/ml = 0.88nM임).
2.6 시험관내에서 미오스타틴의 생물학적 활성의 억제
상기 1.2에서 기재한 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석법을 이용하여 미오스타틴의 활성에 대한 항-미오스타틴 항체의 시험관내 효과를 평가했다. 상기 분석법을 변형하여, 2.8nM의 농도(세포 활성화 분석에서의 ED70에 해당)의 미오스타틴을 37 ℃에서 여러 농도의 10B3 또는 10B3C 항체(0.1-20nM)와 함께 예비배양한 다음, 형질감염된 A204 세포에 첨가했다. 루시퍼라제 판독을 수행하고, 이로부터 도 6에서 도시한 억제 곡선을 얻었다. 표 9는 상기 분석 및 ANOVA 분석을 3회 반복한 후 상기 항체에 대하여 측정한 IC50 값을 나타낸다. 그 데이터는 미오스타틴에 의한 A204 근육 세포주의 활성화가 용량 의존적으로 억제된다는 것을 나타내고 있는 반면에, 대조 항체는 미오스타틴 활성의 억제를 나타내지 않았다.
표 9. 시험관내 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석(A204 세포)의 IC50
Figure pct00011
2.7 10B3의 생체내 효능
모체 10B3의 효능을 확인하기 위하여, 8 주령의 암컷 CB 17 SCID 마우스에 대한 연구를 5 주간 수행했다. 처리군들(군당 10마리)에는 1, 4, 8, 15, 22, 및 29일째에 3, 10 또는 30 mg/kg의 10B3를 복막내 주사로 투여한 반면에, 대조군에는 PBS 또는 아형 대조 항체(IgG2a)를 투여했다. 연구의 종료 시, 동물의 체중을 측정하고 QMRI 분석을 수행하여 동물의 전체 체충(A) 및 전체 제지방 근육 질량(B)을 측정했다(도 7). 동물을 희생시킬 때(35일째), 개개의 근육(비복근(A), 사두근(B), 및 장지신근(EDL)(C))을 동물로부터 절개하여 질량을 측정했다(도 8). 근육 기능에 대한 효과를 확인하기 위하여, EDL 근육에 대한 생체외 수축 시험을 수행하였는데(도 9), 근육에 대한 강직력을 측정하고(도 9A), 근육 질량(mg)당 강직력을 측정했다(도 9B).
35일간의 연구 후 체중 및 제지방 근육 질량의 가장 유의적인 개선(각각 8% 및 8.5%)을 나타내는 30mg/kg 용량 투여 처리군에서 10B3에 대한 명백한 용량 의존적인 반응이 관찰되었다. 근육 질량의 분석 결과 비복근, 사두근 및 EDL 모두에서 동일한 경향이 확인되었는데, 상기 근육들은 질량의 투여량 의존적인 증가를 나타냈고, 마찬가지로 30mg/kg 용량 처리군이 가장 큰 유의성을 나타냈다.
또한, 연구(설명하지 않은)의 결과, 악력(grip strength)의 유의적인 개선은 35일째 와 같은 초기 시점에서는 관찰될 수 없는 것으로 확인되었다. 그러나, 생체외 수축 시험 결과, EDL의 강직력 측정치의 유의적인 개선이 확인될 수 있다. 또한, 이러한 개선은 근육 질량과 무관한 것으로 확인되었다. 따라서, 10B3은 기존의 근육 질량의 기능을 개선하는 능력을 나타낸다.
3. 10B3의 인간화
3.1 서열 분석
10B3의 가변 영역의 서열을 다른 쥐과동물 및 인간의 면역글로불린 서열과 비교했다. 이러한 서열 비교는 FASTA 및 BLAST 프로그램 및 육안 검사를 이용하여 수행했다.
10B3 VH에 대한 적당한 인간 수용체 골격을 확인했다(IGHV 1 18 및 JH3 인간 J 분절 서열): 서열번호 10. 10B3 VL에 대한 적당한 인간 수용체 골격을 확인했다(IGKV 1_16 및 JK2 인간 J 분절 서열): 서열번호 11. 서열번호 10에서는, 수용체골격의 CDRH1 및 CDRH2가 존재하고, CDRH3는 XXXXXXXXXX로 표시된다. 서열번호 11에서는, 수용체 골격의 CDRL1 및 CDRL2가 존재하고, CDRL3는 XXXXXXXXXX로 표시된다. (10 X 잔기는 CDR의 위치에 대한 위치지정자로서, 각각의 CDR에서의 아미노산 서열들의 수의 척도가 아니다).
CDR 이식(grafting)에서는, 만족스러운 결합을 얻기 위하여 수용체 골격에서의 상동유전자(orthologue) 대신에 포함될 공여체 항체 유래의 하나 이상의 골격 잔기가 대표적으로 필요하다. 10B3 내의 하기의 쥐과동물의 골격 잔기는 상기 항체의 CDR-이식된(인간화된) 변형체의 디자인에 중요할 수 있는 것으로 확인되었다(위치는 카밧 등의 넘버링 규정에 따름):
Figure pct00012
Figure pct00013
서로 다른 역돌연변이들을 갖는 세 개의 인간화 VH 작제물들을 디자인하여 만족스러운 활성을 갖는 인간화 항체를 얻었다. 이들 작제물들은 H0 내지 H2로 번호 매긴다. H0(서열번호 12)는 CDR의 카밧 정의에 따르면 상기 특정한 수용체 서열내로 이식된 10B3 VH CDR의 CDR 이식체(graft)로 구성된다. H1(서열번호 13)은 H0와 동일하지만, 105 위치의 아미노산이 글루타민 대신에 트레오닌인 역돌연변이를 갖는다는 점이 상이하다. H2(서열번호 14)는 H0와 동일하지만, 위치 28의 아미노산이 트레오닌 대신에 세린인 역돌연변이를 갖는다는 점이 상이하다.
유념할 점은, 모든 인간화 VH 영역(및 이에 상응하는 중쇄)의 경우, 골격 4의 서열((WGQGTMVTVSS)이 변형됨으로써, 메티오닌 아미노산 잔기(카밧 위치 108)이 루신 아미노산 잔기를 치환하였다는 것이다. 이는 인간화 VH 영역을 엔코딩하는 DNA 서열에 Spel 클로닝 부위를 삽입한 결과이다.
서로 다른 역돌연변이들을 갖는 네 개의 인간화 VL 작제물들을 디자인하여 만족스러운 활성을 갖는 인간화 항체를 얻었다. 이들 작제물들은 L0 내지 L3로 번호 매긴다. L0(서열번호 15)는 CDR의 카밧 정의를 이용하여 상기 특정한 수용체 서열내로 이식된 10B3 VL CDR의 CDR 이식물로 구성된다. L1(서열번호 16)은 L0와 동일하지만, 위치 16의 아미노산이 글리신 대신에 아르기닌인 역돌연변이를 갖는다는 점이 다르다. L2(서열번호 17)는 L0와 동일하지만, 위치 71의 아미노산이 폴리알라닌 대신에 티로신인 역돌연변이를 갖는다는 점이 다르다. L3(서열번호 18)은 L0와 동일하지만, 위치 100의 아미노산이 글루타민 대신에 알라닌인 역돌연변이를 갖는다는 점이 다르다.
3.2 10B3의 인간화
Rld_Ef1 및 Rln_Ef1의 포유동물 발현 시스템에의 클로닝을 위한 제한 부위 외에도 신호 서열을 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 새로이 만들어서 인간화 VH 및 VL 작제물을 제조했다. Hind III 및 Spe I 제한 효소를 도입하여, 인간 IgG1 야생형의 불변 영역을 포함하는 Rld Efl에의 클로닝을 위한 신호 서열(서열번호 9)을 포함하는 VH 도메인을 만들었다. Hind III 및 BsiW I 제한 부위를 도입하여, 인간의 카파 불변 영역을 포함하는 RIn Ef1에의 클로닝을 위한 신호 서열(서열번호 9)를 포함하는 VL 도메인을 만들었다. 이는 WO 2004/014953호에 기재된 것과 실질적으로 동일하다.
4. 인간화 항체의 발현 및 특성 규명
4.1 항체의 제조
인간화 VH 작제물(H0, H1 및 H2) 및 인간화 VL 작제물(L0, L1, L2 및 L3)을 Rld_Ef1 및 Rln_Ef1의 포유동물 발현 벡터에서 제조했다. 플라스미드의 중쇄와 경쇄의 조합들(H0L0, H0L1, H0L2, H0L3, H1L0, H1L1, H1L2, H1L3, H2L0, H2L1, H2L2, H2L3)을 CHOK1 세포에 일시적으로 동시 형질감염시키고 소규모로 발현시켜서 12 개의 서로 다른 인간화 항체들을 얻었다.
각각의 항체에 대한 플라스미드들을 CHOK1 세포에 이중으로 그리고 2번의 서로 다른 실험에서 CHOK1 세포에 형질감염시켰다. 또한, 양성 대조군으로 10B3 키메라를 발현시켰다. CHOK1 세포의 상등액에서 제조한 항체를 미오스타틴 결합 ELISA를 통해 활성 분석했다(4.2 참조). 하나의 실험에 대한 ELISA 데이터가 도 10A의 그래프에 도시되어 있다. 12개의 인간화 mAb는 모두 ELISA 분석에서 재조합 미오스타틴에의 결합을 나타냈다. 두 실험 모두에서, H2 또는 L2 사슬을 포함하는 mAb는 10B3 키메라에 대하여 관찰되는 것과 유사하게 미오스타틴에 대하여 더욱 좋은 결합 친화성을 가지려는 경향이 있었다.
도 10B는 도 10A에서 유도한 것으로, H2 및/또는 L2 사슬을 포함하는 항체 및 10B3 키메라 항체를 나타낸다.
H0L0, H1L2 및 H2L2를 선택하여 더욱 대규모의 발현, 정제 및 추가의 분석을 수행했다.
정제된 H0L0, H1L2 및 H2L2는 직접 ELISA를 통해 재조합 미오스타틴에 결합했다. 그 분석 방법은 4.2에서 기재한 바와 같이 수행했고, 그 ELISA 데이터가 도 11의 그래프에서 도시되어 있다. H2L2 및 H0L0는 CHOE1a 및 CHOK1 세포 발현 시스템 모두에서 생성했다. CHOK1 제제로부터 얻은 항체들의 낮은 농도 때문에, 정확한 정량화가 어려웠다. CHOE1a 제제로부터 고농도의 정제된 항체를 얻었다. 10B3 키메라 항체를 ELISA에 양성 대조구로 포함시켰다(이러한 물질은 CHOE1a에서 만들었음). 미오스타틴에 대한 H2L2의 결합 친화성은 10B3 키메라와 대등했고 H0L0에 대하여 관찰된 것보다 좋았다.
4.2 미오스타틴 결합 ELISA
이러한 프로토콜에 따라 미오스타틴 결합 ELISA를 수행했다. 96-웰 ELISA 플레이트에 4 ℃에서 밤새 10ng/웰의 재조합 미오스타틴을 코팅했다. 다음에, 상기 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% Tween-20)에서 3회 세척했다. 상기 웰들을 실온에서 1 시간 동안 블로킹 용액(PBS, 0.1% Tween-20 + 1% 우혈청 알부민[BSA])을 이용하여 블로킹한 다음, 세척 완충액에서 3회 세척했다. 다음에, 항체를 적당한 농도 범위(약 100 내지 0.001 μg/ml)까지 적정하여 상기 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 반응시켰다. 다음에, 상기 플레이트를 세척 완충액에서 3회 세척했다. 항-마우스 IgG HRP-접합 항체(P0260, Dako사, 이 시약은 제조사의 지시에 따라 사용했음)를 이용하여 10B3과 같은 마우스 항체의 결합을 검출했다. 항-인간 카파 경쇄 HRP-접합 항체(A7164, Sigma Aldridge사, 이 시약은 제조사의 지시에 따라 사용했음)를 이용하여 10B3 키메라 또는 H0L0와 같은 인간화 또는 키메라 항체의 결합을 검출했다. 다음에, 상기 플레이트를 세척 완충액에서 3회 세척하고 OPD 기질(Sigma사로부터 구입, 제조사의 지시에 따라 사용했음)을 이용하여 발색시키고 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 판독했다.
4.3 BIAcore ™을 이용한 재조합 미오스타틴에의 결합
정제된 H0L0, H1L2 및 H2L2를 BIAcore™을 이용하여 재조합 미오스타틴에 결합시켰다. 재조합 미오스타틴을 BIAcore™ 칩 상에 세 개의 서로 다른 밀도(각각 약 35, 120 및 350 RU를 얻기 위한 저밀도, 중간밀도 및 고밀도)로 고정화했다. 항체를 256, 64, 16, 4 및 1nM의 농도로 통과시켰다. 0 nM의 항체를 이중 참조에 사용했고, 데이터를 1:1 모델에 맞추었다.
이러한 분석에서 얻은 데이터에 적용가능한 다수의 유의사항(caveat)이 있는데, 칩 상에 미오스타틴을 고정화하면 단백질의 형태 변화가 일어날 수 있거나 또는 단백질 상의 항체 결합 에피토프가 가려질 수 있고, 이종 표면(이마도 다수의 결합이 발생하는 경우)이 초래될 수 있다. 미오스타틴을 저밀도로 고정화하면, 1:1 결합(압도적)이 얻어지고, 미오스타틴을 중간 및 고밀도로 고정화하는 것은 이가(강한 친화성; avidity) 결합에 영향을 받을 수 있다. 이러한 분석법에서 정밀한 값을 측정하기 위하여는 정확한 항체 농도가 필수적이다.
따라서, BIAcore™를 이용하여 얻은 데이터는 한정적인 반응속도(kinetics)를 제공하기보다는 작제물들을 평가하기 위하여 사용된다. BIAcore™ 데이터를 다음 표 10 내지 표 12에서 나타낸다.
표 10. 저밀도 미오스타틴에 대한 10B3 키메라, H0L0, H1L2 및 H2L2의 결합의 BIAcore™ 분석
Figure pct00014
표 11. 중간밀도 미오스타틴에 대한 10B3 키메라, H0L0, H1L2 및 H2L2의 결합의 BIAcore™ 분석
Figure pct00015
표 12. 고밀도 미오스타틴에 대한 10B3 키메라, H0L0, H1L2 및 H2L2의 결합의 BIAcore™ 분석
Figure pct00016
상기 데이터는 강한 친화성 결합에 기인할 수 있는 것으로 BIAcore™ 상의 미오스타틴 표면 밀도의 증가에 따라 결합 친화성이 증가한다는 것을 나타낸다. 그러나, 등급 순서는 거의 동일하고, 친화성의 측정에 사용된 표면과 무관하다(결합 친화성의 등급 순서 = 10B3 키메라 > H2L2 > H0L0 > H1L2). 이러한 데이터는 미오스타틴의 ELISA 데이터와 광범위하게 일치한다.
4.4 리포터 세포의 생물학적 분석에서 재조합 미오스타틴의 중화
상기 1.2에서 기재한 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석에서 인간화 항체를 시험하여 시험관내 효능을 평가했다. 2.8nM 농도의 미오스타틴을 37 ℃에서 여러 농도(0.1-20nM)의 항체와 함께 예비배양한 후 형질감염된 A204 세포를 첨가한 다음 루시퍼라제를 판독했다. 얻어지는 데이터는 도 12에 도시되어 있고 산정된 IC50(ANOVA 분석) 값은 다음 표 13에 나타나있다.
표 13. A204 시험관내 활성 분석에서 인간화 항체의 IC50
Figure pct00017
상기 인간화 항체는 미오스타틴에 의해 유발된 A204 세포 활성화를 키메라 10B3와 비교하여 억제하지만, 활성의 일부의 감소가 관찰되었는데, 이는 아마도 인간 골격 영역의 영향 때문이다. 그러나 활성의 감소는 아주 작고 분석시 2 배 이내인 것이 확실하다.
5. 인간화 항체의 전개( DEVELOPABILITY ) 분석
10B3 키메라 및 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 모두에서의 가능한 탈아미드와 부위에 대한 인실리코(in silico) 분석 결과, 높은 탈아미드화 가능성을 갖는 것으로 중쇄 CDRH2의 카밧 위치 54 (N54)에서 아스파라긴이 확인되었다. 이러한 잔기를 더욱 특성 규명하기 위하여, 본 발명자들은 N54가 아스파르테이트(D) 또는 글루타민(Q) 아미노산 잔기를 치환하고 있는 10B3 키메라 항체 및 인간화 H2L2 항체를 만들었다.
인간화 항체 및 10B3 키메라의 경쇄는 CDRL3의 카밧 위치에서 시스테인(C) 잔기를 갖는다. 짝을 이루지않은 시스테인들은 항체 과정 동안 화학적으로 반응하여 변형을 초래하여, 생성물의 이종성(heterogeneity)을 초래하거나 친화성을 변화시킬 수 있다. 또한, 이러한 잔기는 면역글로불린 접힘을 만드는데 필수적인 가변 영역의 다른 시스테인과의 잘못된 짝지움(mis-pairing)으로 인해 오접힘(misfolding) 또는 응집을 촉진할 수 있다. 이러한 잔기를 특성 규명하기 위하여, 본 발명자들은 C91이 세린(S) 아미노산을 치환하고 있는 10B3 키메라 및 인간화 H2L2 항체를 만들었다.
또한, 본 발명자들은 중쇄 CDRH2에서 만들어진 탈아미드화 치환을 경쇄 CDRL3의 위치 91의 치환과 합쳤다. 이러한 분석의 일부로서 얻어지는 항체들이 하기 표 14에서 보여진다.
표 14. 전개 분석 동안에 얻은 인간화 항체 변이체
Figure pct00018
5.1 전개 변이체(developability variant)의 발현 및 특성 규명
상기 항체를 발현하는데 필요한 중쇄 및 경쇄 작제물을 관련된 H2 중쇄 및 L2 경쇄 발현 벡터의 위치 특이적 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)을 통해 제조했다. 플라스미드의 중쇄와 경쇄의 조합물(H2L2-N54D; H2L2-N54Q; H2L2-N54D-C91S; H2L2-N54Q-C91S; H2L2-C91S)을 CHO 세포에 일시적으로 동시 형질감염시키고 소규모로 발현시켜서 5 종의 서로 다른 인간화 항체를 얻었다. 또한, 양성 대조구로서 10B3 키메라(HCLC) 및 H2L2를 발현시켰다.
각각의 항체에 대한 플라스미드를 두 번의 서로 다른 실험을 통해 이중으로 CHOK1 세포에 형질감염시켰다. CHOK1 세포의 상등액에서 생성된 항체를 미오스타틴 결합 ELISA를 통해 활성 분석했다. 상기 ELISA 분석법은 4.2에 기재된 바와 같이 수행했고, 오직 하나의 실험에 대한 ELISA 데이터가 도 13의 그래프에서 나타나있다. N54Q 및/또는 C91S 치환을 포함하는 상기 ELISA 분석에서 재조합 미오스타틴에의 결합을 나타냈고, 이러한 결합은 10B3 키메라 (HCLC) 또는 H2L2와 거의 동일했다. N54D 치환 단독 (또는 C91S 치환과의 조합으로)을 포함하는 10B3 키메라 및 H2L2 mAb는 상기 ELISA에서 재조합 미오스타틴에 결합하지 않았다.
H2L2-N54Q, H2L2-C91S, 및 H2L2-N54Q C91S를 선택하여 대규모 발현(CHOKl 및 CHOE1a 발현 시스템 모두에서), 정제 및 추가의 분석을 수행했다. 이러한 항체들을 미오스타틴 결합 ELISA를 통해 활성 분석했다. 상기 ELISA 분석법은 상기 4.2에서 기재한 바와 같이 수행하였고, 오직 한 번의 실험에 대한 ELISA 데이터(3회의 합)를 도 14에서 나타낸다. H2L2 C91S는 미오스타틴에의 결합 활성이 10B3 키메라, H0L0 및 H2L2와 유사한 것으로 보였다. 그러나, H2L2 N54Q 및 H2L2 N54Q C91S는 미오스타딘에의 결합 활성이 감소된 것으로 보였다.
또한, 상기 4.3에서 기재한 바와 유사한 방법을 이용하여 전개 작제물(developability construct)을 BIAcore를 통해 시험하여 미오스타틴 결합 활성의 임의의 변화를 확인했다(표 15 참조). 그 데이터(저밀도 표면에 대한)는 예상된 탈아미드화 부위(N54Q)의 치환이 H2L2 인간화 변이체의 활성의 적어도 2배 감소를 초래한다는 것을 나타내고 있다.
표 15. 미오스타틴 전개 변이의 미오스타틴 결합의 동역학
Figure pct00019
또한, 10B3 마우스 모체 및 H2L2-C91S 전개 변이체의 제조합 미오스타틴에 대한 친화성을 FORTEbio™(생물층 간섭계(bio-layer inferometry))분석을 통해 평가했다. FORTEbio™ 분석은 항원 포획을 통해 수행했다. 미오스타틴(자사의 미오스타틴, 상기 1.1 참조)을 제조사의 지시에 따라 일차 아민 결합을 통해 아민 반응성 바이오센서 상에 결합시켰다. 다음에, 항체를 20nM의 농도로 상기 표면상에 포획시켰다. 얻어지는 데이터는 상기 기계에 고유적인 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하고 1:1 맞춤을 이용하여 분석했다(표 16 참조). 바이오센서 표면에 결합된 미오스타틴 분자수의 제한 및 낮은 항체 농도 때문에, 강한 친화성 효과가 감소되어, Biacore 분석과 비교하여 더욱 정확한 친화성 측정값을 얻는 것이 가능하다. 얻어지는 데이터는 모체 항체(10B3)는 310pM의 친화성을 갖는 반면에 전개 변이체인 H2L2-C91S는 73pM의 친화성을 갖는 것을 나타내고 있다. 그러나, 미오스타탄에 대한 항체의 결합의 특성 때문에, 이러한 값들은 주로 등급 순서 지정의 목적으로 사용되고, 그 친화성이 시험관내 친화성을 대표하는 것이 아니다.
표 16. 10B3 모체 및 H2L2-C91S 전개 변이체의 미오스타틴에 대한 친화성
Figure pct00020
또한, 생체내 중화 분석에 대한 전개 돌연변이들의 영향을 상기 1.2에서 기재한 A204 루시퍼라제 분석법을 이용하여 수행했다. 억제 곡선의 그래프를 도 15에서 나타내고 그에 상응하는 IC50 값을 하기 표 17에서 나타낸다. 이러한 분석법에서 상기 인간화 항체는 전개 변이체와 비교하여 명백한 중화 능력이 감소하지 않았다.
표 17. A204 시험관내 활성 분석에서 전개 항체 변이체의 IC50
Figure pct00021
5.2 전개 변이체의 탈아미드화 가능성
H0L0, H2L2, H2L2-C91S, H2L2-N54Q 및 H2L2-N54Q-C91S 항체를 37 ℃에서 48 시간 동안 1% 중탄산암모늄(pH 9.0)과 함께 배양하여, 탈아미드화를 유발하는 스트레스 조건을 주었다. 처리 후, H0L0, H2L2, H2L2-C91S, H2L2-N54Q 및 H2L2-N54Q-C91S를 미오스타틴 결합 ELISA(상기 4.2에서 기재된 바와 같음)를 통해 작용 활성을 분석했다. 오직 한 번의 실험에 대한 ELISA 데이터(두 번의 측정의 합으로부터)를 도 16 내지 20에서 나타낸다. 이러한 데이터는 상기 처리 과정이 상기 항체들 중 어느 것의 미오스타딘 결합 능력에도 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
6. CDRH3 변이 인간화 항체
6.1 CDRH3 변이 인간화 항체의 제작
CDRH3(서열번호 3)의 각각의 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 부위 특이적 돌연변이 유발을 기본 분자(base molecule)로서 항체인 H2L2-C91S(가변 서열: 각각 서열번호 14 및 24; 전장 서열: 각각 서열번호 30 및 40)를 이용하여 수행했다. H2 및 L2-C91S(각각 서열번호 45 및 55)의 염기 서열에 대한 인간 불변 영역을 포함하는 전장 DNA 발현 작제물을 pTT 벡터(National Research Council Canada, 변형된 다중 클로닝 부위(MCS)를 가짐)를 이용하여 제조했다.
약 300 개의 CDRH3 변이체를 얻은 다음, 약 200 개의 변이체를 분석했다(6.2 및 6.3 참조).
6.2 HEK 293 6E 세포에서 CDRH3 변이체의 발현
약 200 개의 CDRH3 변이체의 중쇄 및 경쇄를 각각 엔코딩하는 pTT 플라스미드를 HEK 293 6E 세포에 일시적으로 동시 형질감염시키고 소규모로 발현시켜 항체를 생성했다. 상기 중쇄는 변이 CDRH3 서열과 함께 H2의 염기 서열을 가지며, 상기 경쇄는 전술한 바와 같은 L2-C91S의 염기 서열을 갖는다. 항체는 조직 배양 상등액으로부터 직접 평가했다.
6.3 조직 배양 상등액의 ProteOn XPR36 상에서의 초기 스크리닝
선별된(screen) CDRH3에 대한 초기 속도(kinetic) 분석을 ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)상에서 수행했다. 잔기 R95 내지 P100_B의 경우, 분석은 단백질 A/G 포획 표면(Pierce 21186)을 이용하여 수행했고, 잔기 A100_C 내지 V102의 경우, 항-인간 IgG 표면을 사용했다(Biacore/GE Healthcare BR-1008-39). 두 포획 표면은 일차 이민 결합을 이용하여 포획 분자를 GLM 칩(Biorad Laboratories 176-5012)에 고정화시켜서 유사한 방법으로 제조했다. CDRH3 변이체는 특정의 변이체를 발현하는 일시적인 형질감염에 따른 조직 배양액으로부터 단백질 A/G 또는 항-인간 IgG 표면(돌연변이된 잔기에 따라)상에 직접 포획시켰다. 포획 후, 자사의 재조합 인간 미오스타틴(상기 1.1 참조)을 256nM, 32nM, 4nM, 0.5nM 및 0.0625nM의 농도로 검체로 이용하면서, 완충 주입액 단독(즉, 0 nM)을 이용하여 결합 곡선을 이중 참조했다. 미오스타틴 결합 후, 포획 표면을 재생시켰는데, 단백질 A/G 포획 표면의 경우 100mM 인산을 이용하여 재생시켰고, 항-인간 IgG 표면의 경우 3M MgCl2를 이용하여 재생시켰으며, 이러한 재생에 따라 이미 포획된 항체가 제거되어 또 다른 사이클의 포획 및 결합 분석에 사용될 수 있게 된다. 다음에, 얻어지는 데이터는 ProteOn 분석 프로그램에 고유적인 1:1 모델(물질 수송이 있음)에 맞추었다. 분석은 HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)를 이용하여 수행했고, 분석 온도는 25 ℃였다.
얻어지는 결과는 상호작용의 성질 때문에 해석하기 어려웠는데, 1:1 모델은 그 상호작용을 충분히 설명할 수 없기 때문이다. 그러나, 센서그램(sensorgram)을 판정함으로써, 기본 분자에 비해 개선된 친화성을 가질 수 있는 작제물을 선택할 수 있었다. 본 발명자들은 상기 선별된 것들을 판정하여, 기본 분자에 비해 좋은 속도 프로필(kinetic profile)을 갖는 것으로 보이는 11 개의 CDRH3 변이체를 확인했다. 상기 11개의 CDRH3 변이체의 중쇄는 하기 표 18에서 나타낸다(카밧 넘버링을 이용함). 상기 변이체들은 모두 경쇄인 L2-C91S(가변 서열: 서열번호 24; 전장 서열: 서열번호 40, 전장 DNA 서열: 서열번호 55)를 가졌다. 상기 기본 분자보다 속도 프로필이 더 좋은 것으로 확인된 그 밖의 CDRH3 변이체는 F100G_S(서열번호 110)이었으나, 이는 추가로 분석하지 않았다.
표 18. CDRH3 변이체의 서열
Figure pct00022
코드(즉, H2L2-C91S_Y96L)에 의한 항체의 언급은 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 제 1 및 제 2 플라스미드, 예를 들어, 적당한 세포주에서 pTT5_H2_Y96L 서열을 포함하는 플라스미드 및 pTT5_L2-C91S 서열을 포함하는 플라스미드의 동시 형질감염 및 발현을 통해 얻은 항체를 의미한다.
6.4 CDRH3 변이체들의 선택된 패널의 발현
표 18에서 나타낸 11개의 CDRH3 변이체들의 중쇄 및 경쇄를 HEK 293 6E 세포(6.2에서 기재된 바와 같음)에서 발현시키고, 고정화된 단백질 A 칼럼(GE Healthcare)을 이용하여 친화성 정제하고, 280nm에서 흡광도를 판독하여 정량했다.
6.5 BIAcore ™을 통한 제조합 미오스타틴에의 결합
ProteOn XPR36 상에서의 초기 선별물(screen)들로부터 작제물 선택이 성공적이었는 지의 여부를 확인하기 위하여, 정제된 재조합 항체에 대하여 오프-속도 등급매김(off-rate ranking) 실험을 수행했다. 미오스타틴(자사의 재조합 미오스타틴, 상기 1.1 참조)를 저밀도, 중간 밀도 및 고밀도의 세 개의 서로 다른 밀도로 일차 아민 결합을 통해 CM5 칩(Biacore/GE Healthcare BR-1000-14)상에 공유결합적으로 고정화하였는데, 상기 미오스타틴 밀도들은 사용된 항체 농도에서 각각 약 60개 공명 단위(RU), 250개 RU 및 1000개 RU의 최대 결합 신호를 나타낸 표면을 제공했다. 단일 농도(256 nM)의 항체를 완충액과 함께 이용하여 결합 상호작용을 이중으로 참조했다. 초기 해리 속도(오프 속도)를 Biacore 3000 기계에 고유적인 소프트웨어를 이용하여 계산하여, 각각의 미오스타틴 표면 밀도에 대한 모든 항체들의 상호작용을 측정했다. 상기 표면들을 100mM 인산을 이용하여 재생하고, 25 ℃에서 HBS-EP 완충액을 이용하여 분석을 수행했다.
시험한 모든 작제물들은 기본 분자(H2L2 C91S)보다 더 좋은 오프-속도(해리 속도 상수)를 나타낸 것으로 확인되었는데, 그 오프-속도는 H2L2 C91S보다 느렸다. 상기 고밀도 표면에서, 10B3 키메라를 제외한 상위 5 개의 작제물은 H2L2-C91S_P100B_I, H2L2-C91S_W1OOE_F, H2L2-C91S_F1OOG_Y, H2L2-C91S_G99S, 및 H2L2-C91S_P100B_F 였다.
6.6 BIAcore ™에 의한 재조합 미오스타틴에 대한 결합의 전체 속도 분석( full kinetic analysis )
미오스타틴(자사의 재조합 미오스타틴, 상기 1.1 참조)을, 각각 약 15 RU, 37 RU 및 500 RU의 최대 결합 신호를 나타내는 표면을 제공하는 저밀도, 중간 밀도 및 고밀도로 Series S CM5 칩(Biacore/GE Healthcare BR- 1006-68)상에 고정화했다. 상기 CDRH3 변이체들을 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM 및 1 nM의 농도로 상기 세 표면들의 위를 통과시키면서 완충액(즉, 0 nM)을 이중 참조에 사용하고, 100 mM 인산을 이용하여 재생했다. 얻어지는 데이터를 T100 Biacore 기계에 고유적인 비발렌트(Bivalent) 모델에 맞추고 25 ℃에서 HBS-EP를 이용하여 분석을 진행했다.
일반적으로, 상기 기본 H2L2-C91S에 대한 맞춤은 모든 세 밀도 표면들 상에서 CDR 변이체들과 비교하여 불충분하여, 정확한 기선 값을 얻기가 어려웠다. 이러한 세 표면들 중에서, 최대 밀도의 표면은 H2L2-C91S 기본 분자에 대한 맞춤이 불충분하긴 하지만 기본 항체와 CDR 변이체 사이의 가장 좋은 분리를 나타냈다. 그러나, 이러한 표면은 상기 작제물들 사이의 최대의 분리를 나타내는 외에도, 정확한 이가 결합을 위한 최상의 표면을 제공할 수 있는 것으로 예상될 수 있는데, 이는 강한 친화성 결합 및 재결합이 더욱 빈번하여 작은 친화성의 차이를 확대하여 나타낼 수 있기 때문이다. 일반적으로, 상기 CDR 변이체들은 모두 기본 분자인 H2L2-C91S 보다 다 좋은 것으로 보였는데, 이는 특히 고밀도 표면에서의 오프-속도가 더욱 우수(즉, 더욱 느림)하기 때문이다.
표적 항원을 바이오센서 칩의 표면에 공유결합시키는데 있어서 이러한 분석에 사용된 방법 때문에, 유도한 실제 밀도는 생체내에서 볼 수 있는 친화성을 반영할 수 없다. 그러나, 등급을 매기는 목적에 유용하다. 이러한 분석의 고밀도 표면에서 얻은 데이터를 이용할 때, 전체 친화성에 기반하지만 10B3 키메라를 제외한 상위 5개 작제물은 F100G_Y, P100B_I, P100B_F, F100G_N 및 W100E_F 였다. 그러나, 다른 모든 작제물들의 친화성은 F100G_Y의 2 배 이내였다.
6.7 미오스타틴 포획 ELISA
또한, 상기 11 개의 정제된 CDRH3 변이체들을 미오스타틴 포획 ELISA를 통해 결합 친화성을 분석했다.
96-웰 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 미오스타틴에 대한 2.5 μg/ml의 다클론 항체(R&D Systems AF788)로 코팅했다. 다음에, 상기 플레이트를 세척 완충액((PBS, 0.1% Tween-20)에서 3회 세척하고 블로킹 용액(PBS, 0.1% Tween-20 + 1% 우혈청 알부민[BSA])을 이용하여 실온에서 1 시간 동안 블로킹했다. 다음에, 미오스타틴을 블로킹 완충액에 1 μg/ml의 농도로 용해시켜 1 시간 동안 첨가한 다음, 세척 완충액에서 3회 세척했다. 다음에, 항체를 적당한 농도 범위(약 10 내지 0.01 μg/ml)까지 적정하고, 상기 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 다음에, 상기 플레이트를 완충 세척액에서 3회 세척했다. 항-인간 카파 경쇄 HRP-접합 항체(Sigma A7164, 제조사의 지시에 따라 사용됨)를 이용하여, 10B3 키메라(HcLc) 또는 H0L0와 같은 인간화 또는 키메라 항체의 결합을 검출했다. 다음에, 상기 플레이트를 세척 완충액에서 3회 세척하고 OPD 기질(제조사의 지시에 따라 사용됨)을 이용하여 발색시키고 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 판독했다.
그 실험 결과가 도 21에서 도시되어 있는데, 여기서는 H2L2-C91S, H0L0, HcLc(10B3 키메라) 및 음성 대조 단클론 항체가 대조 항체로 사용되었다. 상기 ELISA에서 11개의 CDRH3 변이 항체는 모두 재조합 미오스타틴에 결합했다. H2L2-C91S_P100B_I, H2L2-C91S_V102N, H2L2-C91S_G100A_K, H2L2-C91S_P100B_F 및 H2L2-C91S_F100G_Y는 미오스타틴에 대한 결합 친화성이 기본 분자인 H2L2-C91S 및 H0L0 보다 좋은 경향이 있었다.
6.8 미오스타틴 경쟁 ELISA
상기 CDRH3 변이체들을 세 개의 상이한 미오스타틴 경쟁 ELISA 분석법을 통해 추가로 조사했다. 상기 항체들을 10B3 쥐과동물 mAb와 경쟁하는 능력에 대하여 분석했다.
6.8.1 포획 방법으로서 디클론 Ab 의 이용
상기 6.7에서 기재된 프로토콜을 이용하여, 각각의 웰에 10B3를 0.3 μg/ml의 최종 농도까지 첨가하고, 적당한 농도 범위(약 10 내지 0.01 μg/ml)까지 적정한 항체와 혼합했다. 항-마우스 HRP-접합 항체(DAKO P0260, 제조사의 지시에 따라 사용됨)를 이용하여 10B3 항체의 결합을 검출했다. 상기 ELISA 데이터로부터 얻은 순위를 다음 표 19에서 나타낸다.
6.8.2 포획 방법으로서 비오티닐화 미오스타틴의 사용
상기 6.7에서 기재한 프로토콜을 이용했지만, 우선 플레이트를 4 ℃에서 밤새 5 μg/ml의 스트렙타비딘으로 코팅했다. 비오티닐화 미오스타틴을 블로킹 완충액에 0.3 μg/ml의 농도로 용해하여 1 시간 동안 첨가한 다음, 세척 완충액에서 3회 세척했다. 10B3(0.2 μg/ml의 최종 농도)를 각각의 웰에 첨가하고, 적당한 농도 범위(약 10 내지 0.01 μg/ml)까지 적정한 항체와 혼합했다. 항-마우스 HRP-접합 항체(DAKO P0260, 제조사의 지시에 따라 사용됨)를 이용하여 상기 10B3 항체의 결합을 검출했다. 상기 ELISA 데이터로부터 얻은 순위를 다음 표 19에서 나타낸다.
6.8.3 포획 방법으로서 미오스타틴의 사용(직접 포획)
상기 6.7에서 기재한 프로토콜을 이용하였지만, 우선 플레이트를 4 ℃에서 밤새 0.2 μg/ml의 미오스타틴(자사의 재조합 미오스타틴, 상기 1.1 참조)으로 코팅했다. 10B3(0.3 μg/ml의 최종 농도)를 각각의 웰에 첨가하고, 적당한 농도 범위(약 10 내지 0.01 μg/ml)까지 적정한 항체와 혼합했다. 항-마우스 HRP-접합 항체(DAKO P0260, 제조사의 지시에 따라 사용됨)를 이용하여 상기 10B3 항체의 직접 결합을 검출했다. 상기 ELISA 데이터로부터 얻은 순위를 다음 표 19에서 나타낸다.
상기 CDRH3 변이체들은 모두 10B3과 경쟁할 수 있었다. 상기 서로 다른 ELISA 분석법들로부터 각각 얻은 5 개의 가장 유력한 분자들을 하기 표 19에서 나타낸다.
표 19. 5 개의 가장 유력한 CDRH3 변이 분자들의 순위(상위(1) 내지 하위(5))
Figure pct00023
이 단락 (6.8)에서의 분석 결과 및 이전의 단락 6.6 및 6.7에서의 BIAcore 데이터에 기초하여, 변이체들인 H2L2-C91S_P1OOB_F, H2L2-C91S_P1OOB_I, H2L2- C91S_1OOG_Y, H2L2-C91S_V102N 및 H2L2-C91S_V102S를 선택하여 추가로 분석했다.
6.9 시험관내에서 미오스타틴의 생물학적 활성의 억제
상기 6.8에서 선택된 5 개의 CDRH3 변이체들을 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석법(상기 1.2 참조)을 통해 분석하여, 시험관내 효능을 평가했다. 5 nM 농도의 미오스타틴을 여러 농도의 항체와 함께 37 ℃와 함께 예비배양한 다음, 형질감염된 A204 세포에 첨가했다. 상기 세포를 37 ℃에서 6 시간 동안 배양한 다음, 반응성 루시퍼라제의 발현을 발광을 통해 확인했다. 얻어지는 IC50 값들을 하기 표 20에서 나타낸다.
표 20. 시험관내 활성 분석시 A204에서 인간화 항체의 IC50
Figure pct00024
상기 데이터는 시험한 항체들은 모두 10B3 키메라와 유사한 효능으로 미오스타틴을 중화시켰다는 것을 나타내는데, H2L2-C91S_F100G_Y가 상기 분석에서 최대 효능을 가졌지만 그다지 유의적이지는 않았다.
7. Fc 가 무능화된 불변 영역 변이체의 작제 및 발현
생체내에서 항-미오스타틴의 작용 방식은 미오스타틴의 단순한 결합 및 중화이므로, 상기 분자는 ADCC 및 CDC 반응을 유도하기 위한 기능을 유지할 필요가 없을 수 있다. 또한, Fc 기능을 무능화하는 것은 주입 관련 면역 반응의 가능성을 배제하는데 도움을 줄 수 있다. Fc 기능을 무능화하기 위한 돌연변이는 EU 넘버링 체계를 이용하는 표현되는 하기의 치환을 포함한다: Leu 235 Ala; 및 GIy 237 Ala.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, CDRH3 변이체인 H2_F100G_Y의 가변 중쇄 영역에 대한 서열을 엔코딩하는 유전자를 기존의 작제물로부터 hlgG1 Fc-무능화 불변 영역을 포함하는 발현 벡터로 옮겼다. 중쇄(서열번호 98; H2_F100G_Y_Fc 무능화) 및 경쇄(서열번호 40; L2-C91S)를 엔코딩하는 전장 DNA 발현 작제물들을 pTT 벡터를 이용하여 제조했다. 중쇄에 대한 사항들은 하기 표 21에서 나타낸다.
표 21. Fc가 무능화된 CDRH3 변이체의 서열
Figure pct00025
Fc가 무능화된 불변 영역의 영향을 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 분석(상기 1.2에서 기재됨)을 통해 분석했다. 얻어지는 IC50 데이터를 하기 표 22에서 나타낸다.
표 22. 시험관내 활성 분석시 A204에서 Fc 무능화 CDRH3 변이체의 IC50
Figure pct00026
상기 데이터는 전술한 바와 같이 "Fc가 무능화된 H2L2-C91S_F100G_Y"의 Fc 기능을 무능화하는 것은 미오스타틴을 중화시키기 위한 항체의 효능에 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
8. CDRH2 변이 인간화 항체
8.1 CDRH2 변이 인간화 항체의 제작
상기 실시예 5에서 기재한 바와 같이, 중쇄 CDRH2의 카밧(Kabat) 위치 54의 아스파라긴(N54)은 탈아미드화 가능성이 있다. 이러한 가능성을 감소시키기 위하여, 상기 아미노산을 변이시켜 H2_F100G_Y의 다수의 CDRH2 변이체들을 얻었다. 이러한 변이체들은 모두 CDRH2(서열번호 2)가 서로 달랐으며, H2_F100G_Y를 엔코딩하는 pTT 벡터를 이용하여 부위 특이적 돌연변이유발을 통해 얻었다. 그 경쇄(서열번호 40; L2-C91S)를 각각의 중쇄와 함께 발현시켰다. 상기 작제물들은 Fc 영역이 무능화되지 않았다.
8.2 HEK293 6E 세포에서 CDRH2 변이체의 발현
중쇄 및 경쇄를 각각 엔코딩하는 pTT 플라스미드들을 상기 6.2에서 기재한 바와 같이 HEK 293 6E 세포에 일시적으로 동시 형질감염시켰다. 또한, 양성대조구로 H2L2-C91S_F100G_Y를 발현시켰다. 상기 HEK293 세포의 상등액에서 생성된 항체를 BIAcore를 통해 재조합 미오스타틴에의 결합에 대하여 분석했다. 상기 선별된 변이체들은 모두 재조합 미오스타틴에 결합하는 것으로 확인되었다.
얻어지는 친화성 데이터 및 탈아미드화의 가능성에 대한 인실리코(in silico) 분석 결과를 이용하여, 하기 표 23에서 나타낸 5 개의 CDRH2 변이체들의 패널을 선택하여 대규모 발현시키고, 정제하고 추가로 분석했다.
표 23. CDRH2 변이체의 서열
Figure pct00027
8.3 CDRH2 변이체의 특성 규명
5 개의 항체 전부를 미오스타틴 결합 ELISA(상기 실시예 4.2에서 기재된 바와 같음)를 통해 결합 친화성에 대하여 분석했다. 도 22는 H2L2-C91_S F100G_Y, H2L2_C91S, HcLc(10B3C) 및 음성 대조구인 mAb에 대한 결과 및 5 개의 CDRH2 변이 항체에 대한 결과를 도시한다. 상기 CDRH2 변이체는 미오스타틴에 대한 결합 친화성이 H2L2-C91S_F100G_Y와 비교하여 좋거나 유사했다.
8.4 CDRH2 변이체의 BIAcore 분석
또한, 상기 CDRH2 변이체들을 BIAcore를 통해 시험하여 미오스타틴 결합 친화성에 어떠한 변화가 있는 지의 여부를 확인했다. 단백질 A를 C1 Biacore 바이오센서 칩 상에 고정화하고, 정제된 항체를 저밀도로 포획하여 미오스타틴의 최대 결합이 30개 미만의 공명 단위를 나타내도록 하였다. 미오스타틴을 256nM의 농도로 상기 포획 항체 표면 위를 통과시켰으며, 완충액 단독(즉, 0 nM)을 이용하여 결합 데이터를 이중으로 참조했다. 단백질 A 표면을 100mM 인산을 이용하여 재생했다. 데이터를 T100 Biacore 분석 프로그램에 고유적인 비발렌트(Bivalent) 모델 및 2-상태 모델에 맞추었다. 그러나, 미오스타틴은 이합체이므로, 비발렌트 모델 데이터에 더욱 많은 가중치를 주었다. 분석은 25 ℃에서 HBS-EP를 이용하여 진행했다.
상기 사용된 모델들은 정확한 생체내 결합을 반영할 수 없고, 그 자체는 상호작용을 정확히 반영할 수 없으므로, 계산된 값들은 순위 매기는 목적으로만 사용했다. 얻어지는 데이터는 H2L2-C91S_F100G_Y와 비교하여, CDRH2 변이체는 친화성에 그다지 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는데, 비발렌트 모델에 의해 평가된 가장 나쁜 작제물(H2L2 C91S_G55L F100G_Y)은 전체 친화성이 6.8 배 나빴다.
8.5 시험관내에서 미오스타틴의 생물학적 활성의 억제
또한, 시험관내 중화 분석에 대한 CDRH2 변이체의 영향을 A204 루시퍼라제 분석(상기 1.2에서 기재됨)을 이용하여 평가했다. 얻어지는 억제 곡선의 IC50 값을 하기 표 24에서 나타낸다.
표 24. 시험관내 활성 분석시 A204 세포에서 항체 변이체의 IC50
Figure pct00028
상기 데이터로부터, 상기 CDRH2 변이 항체들은 모두 상기 분석에서 H2L2-C91S_F100G_Y와 유사한 효능을 가지고서, 미오스타틴에 의해 유발된 A204 세포의 활성화를 억제했다.
8.6 Fc 가 무능화된 CDRH2 변이체
상기 A204 분석에서 최대 효능을 갖는 것으로 확인된 전개 강화 분자(developability enhanced molecule)인 H2L2 C91S_G55S F100G_Y를 서열번호 99에서 예시한 바와 같이 Fc-무능화했다(EU 넘버링 체계를 이용하여 표시되는 치환인 Leu 235 Ala 및 GIy 237 Ala를 만들어서). 수용체 결합 분석(실시예 2.5)을 이용하여 이러한 분자인 H2L2 C91S G55S_F100G_Y(Fc 무능화됨)이 H2L2 C91S_G55S F100G_Y와 비교하여 약간 개선된 효능을 갖는다는 것을 확인했다(하기 표 25 참조).
표 25. ActRIIb 수용체 결합 분석에서 항체 변이체의 IC50
Figure pct00029
9. 글루코코르티코이드에 의해 유발된 근육 소모에서 10B3의 효능
본 발명에서, 본 발명자들은 10B3 처리가 쥐에서 스테로이드에 의해 유발된 근육 감소를 예방할 수 있는 지의 여부를 조사했다. C57BL 마우스를 PBS, mIgG2a 또는 10B3로 처리했다. 덱사메타손을 근육 감소를 유발하기 위한 스테로이드로 사용했다.
덱사메타손 처리는 대조 항체로 전처리한 동물의 체중 감소를 유발했다. 덱사메타손에 의해 유발된 체중 감소는 10B3를 이용한 전처리에 의해 약화되었다. 대조 항체로 전처리한 동물은 장지신근(EDL), 전경골근(TA) 및 사두근에서 근육 위축을 나타냈다. 이와 대조로, 10B3로 전처리한 동물에 덱사메타손을 처리한 결과, TA, EDL 및 비두근에서 근육 위축이 유발되지 않았다. 대조 항체로 전처리한 동물은 체지방 축적의 증가를 나타냈다. 그러나, 10B3로서 전처리한 동물을 덱사메타손으로 처리한 경우에는 체지방의 증가가 없었다.
이러한 실시예 9의 결과는 10B3 또는 이의 인간화 항체가 글루코코르티코이드에 의해 유발된 근육 감소의 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 글루코코르티코이드 요법에서 환자의 예방 치료에 유리할 수 있다.
10. 10B3를 이용한 처리는 좌골 신경 압좌손상 모델에서 근육 위축을 약화시켰다
본 발명자들은 신경 손상 모델을 이용하여 마우스에서 불용성 근육 위축의 예방에 대한 10B3의 효능을 평가했다.
C57BL 마우스를 mIgG2a 대조구 또는 10B3 항체로 처리했다. 넓적다리의 우측 좌골 신경을 노출시켜서, 그대로 방치하거나(모의군) 지혈 핀셋을 이용하여 10초간 압좌(crush)하여 손상을 유발했다(신경 압좌손상 군). 좌골 압죄 손상 결과, 장지신근(EDL), 전경골근(TA), 비복근 및 넙치근의 질량이 모의군과 비교하여 감소되었다. 모의 수술군에서, 10B3을 처리한 결과, TA, EDL, 비복근 및 사두근의 질량이 IgG2a 대조군과 비교하여 증가되었다. 10B3으로 처리한 동물은 IgG2a로 처리한 대조 동물과 비교하여 더욱 많은 근육을 유지했다. 또한, 10B3을 이용한 처리는 모의 동물군 및 신경압좌 동물군 모두에서 전체 체중을 증가시켰다.
이러한 결과는 10B3 또는 이의 인간화 항체가 인간의 불용성 근육 위축의 예방 및/또는 치료 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
11. 10B3를 이용한 처리는 C-26 종양 함유 마우스에서 근육 소모를 약화시켰다
본 발명에서, 체중 변화, 근육 질량 및 기능에 대한 10B3 처리의 효과를 암에 의해 유발된 악액질의 연구를 위해 광범위하게 사용된 잠복기 모델인 Colon-26 종양 함유 모델을 이용하여 연구했다.
38마리의 8 주령의 수컷 CD2F1 마우스를 하기와 같이 4 개의 군으로 무작위로 나누었다: mIgG2a (n=9), 10B3 (n=9), mIgG2a+C-26 (n=10), 및 10B3+C-26 (n=10). 결장(Colon)-26(C-26) 종양 세포를 마우스당 1x106개 세포의 밀도로 20 마리의 쥐에게 피하 이식했다. 몇 시간 후, 동물에게 항체를 주사하기 시작했다. 0, 3, 7, 14, 21일에 마우스에게 IgG2a 대조 항체 또는 10B3을 30 mg/kg의 용량으로 복막내 주사했다. 실험 기간 동안 체중 및 지방 질량을 관찰했다. 25일째 되는 날 수술하기 바로 전에, 넓적다리의 좌골 신경의 전기 자극시의 수축력을 측정하여 하지 근력을 평가했다. 실험의 종료시, 종양 중량, 및 개개의 근육 질량 및 부고환 지방 조직 질량을 측정했다.
도 23은 0일 내지 25일에서 C-26 종양 함유 마우스에서 체중에 대한 항체 처리의 효과를 도시한다. 종양 함유 마우스는 종양 이식 후 21일째부터 체중이 급격히 감소하기 시작한다. 10B3으로 처리한 결과, 종양 함유 마우스의 체중 감소가 효과적으로 완화되었다. 10B3으로 처리한 종양 함유 마우스의 평균 체중은 mIgGa2a 대조 항체로 처리한 종양 함유 마우스의 평균 체중보다 8% 많았다. 종양 크기(IgG2a의 경우 2.2 g 대 10B3의 경우 1.9 g)는 10B3 처리군과 대조 mIgG2a 처리군 사이에 유의적인 차이가 없었다.
도 24는 C-26 종양 함유 마우스에서 전체 체지방(A), 부고환 지방 조직(B) 및 제지방 질량(C)에 대한 항체 처리의 효과를 도시한다. 종양 함유 마우스는 유의적으로 적은 체지방을 가졌다(도 24A). 부고환 지방 조직은 10B3 처리 종양 함유 마우스 및 대조 mIgG2a 처리 마우스 모두의 경우 거의 완전히 사라져서(도 24B), 10B3가 체지방 감소로부터 종양 함유 마우스를 보호하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
도 24C에서 도시한 바와 같이, 10B3으로 처리하면, 정상 동물 외에도 종양 함유 마우스에서의 제지방 질량이 유의적(p<0.01)으로 증가한다. 대조 IgG2a로 처리한 종양 함유 마우스는 종양 제거 후 제지방 근육 질량이 유의적으로 낮았다. 이와 대조로, 10B3로 처리한 종양 함유 마우스는 제지방 질량이 IgG2a로 처리한 종양 함유 마우스보다 유의적(p<0.01)으로 컸다. 실제로, 제지방 질량은 10B3으로 처리리한 종양 함유 마우스와 정상 동물 사이에 유의적인 차이가 없었다.
표 26은 근육 질량에 대한 항체 처리의 효과를 도시한다. 예상된 바와 같이, 종양 함유 마우스는 TA, EDL, 사두근, 넙치근 및 비복근이 유의적으로 감소했다(표 26). 10B3으로 처리한 결과, 정상 동물의 근육 질량이 증가했다. 더욱 중요한 것은 10B3 처리가 종양 함유 마우스의 근육 감소를 약화시켰다는 것이다. 10B3으로 처리한 종양 함유 모델에서, TA, EDL, 사두근, 넙치근 및 비복근의 중량은 대조 IgG2a로 처리한 종양 함유 마우스와 비교하여 각각 17.8%, 11.3%, 16.9%, 13.4% 및 14.6% 많았다.
표 26. 10B3 처리는 종양 함유 모델에서 근육 감소를 약화시켰다. 데이터는 평균 근육 질량(mg) +/- SEM 이다. 위첨자 * 및 #로 나타낸 평균치는 Student T 테스트에 따라 IgG2a 군 및 C-26+IgG2a 군과 유의적으로(p<0.05) 상이하다는 것을 나타낸다.
Figure pct00030
도 25는 넓적다리의 좌골신경의 전기 자극시의 수축력을 측정하여 평가한 것으로, 하지 근력에 대한 항체 처리의 효과를 도시한다. 25일간 종양 이식 후, 하지근 수축력은 대조 항체군의 경우 20% 만큼 유의적으로(p<0.001) 감소했다. 10B3으로 처리한 결과, 최대 수축력이 대조군과 비교하여 건강한 동물의 경우 10.2%, 종양 함유 마우스의 경우 17.5% 만큼 증가했다(p<0.05). 최대 수축력의 측정치는 10B3으로 처리한 종양 함유 마우스와 건강한 대조군의 사이에 유의적인 차이가 없었다. 따라서, 10B3으로 처리한 결과, 건강한 마우스 및 종양 함유 마우스 모드의 근육 기능이 개선되었다.
상기 데이터는 10B3 또는 이의 인간화 항체를 이용한 처리가 암에 의해 유발된 악액질과 관련 있는 근육 감소 및 기능 감소를 약화시킬 수 있었다는 것을 나타낸다.
12. 마우스 건절제 모델에서 골격근 위축에 대한 10B3 처리의 효과
본 발명자들은 마우스 건절제(tenotomy) 모델에서 근육 질량에 대한 미오스타틴 항체인 10B3의 효과를 확인했다.
젊고 성숙한 수컷 C57BL 마우스를 mIgG2a 처리군 또는 10B3 처리군(n = 6/군)으로 무작위로 나누고 1, 4, 8, 및 15일째에 30 mg/kg의 용량으로 복막내 투여했다. 투여 당일(0 일) 아침에, 모든 마우스를 하기와 같이 수술했다. 전경골근(TA)의 건(tendon)을 왼쪽 다리의 말초 유착부(distal insertion)를 통해 분리했지만(건절제), 우측 TA의 건들을 모두 노출시켰지만 그대로 방치했다(모의절제). 3 주(21일) 후, 마우스를 희생시켜서 TA의 근육 질량의 변화를 평가했다.
3 주간 10B3으로 처리한 결과, 마우스의 모의 절제 및 건절제 수술 후 TA의 근육 질량이 유의적으로 증가했다(도 26). 놀랍게도, 10B3의 효과는 온전한 모의 조건(+14%)과 비교하여 건절제(+21%)의 경우에 더욱 명백했다.
상기의 데이터는 10B3 또는 이의 인간화 항체를 이용한 처리가 외상/손상과 관련이 있는 근육 감소 및 기능 감소를 약화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
[서열목록]
서열번호: 1 (CDRHl)
GYFMH
서열번호: 2 (CDRH2)
NIYPYNGVSNYNQRFKA
서열번호: 3 (CDRH3)
RYYYGTGPADWYFDV
서열번호: 4 (CDRLl)
KASQDINSYLS
서열번호: 5 (CDRL2)
RANRLVD
서열번호: 6 (CDRL3)
LQCDEFPLT
서열번호: 7 (마우스 단클론 10B3 Vn)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY
PYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTTVTVSS
서열번호: 8 (마우스 단클론 10B3 및 10B3 키메라 VL)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANR
LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEL
K
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K
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서열번호: 35 (10B3 키메라 N54D 중쇄)
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서열번호: 38 (인간화 중쇄: H2 N54D)
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서열번호: 40 (인간화 경쇄: L2 C91S)
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EC
서열번호: 41 (10B3 키메라 중쇄, DNA 서열)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
ACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 42 (10B3 키메라 경쇄, DNA 서열)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTA
CGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTA
TTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCT
ATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT
GGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGA
TATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTGTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGG
TGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT
TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG
TGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA
GGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG
CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG
CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACC
AGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
서열번호: 43 (인간화 중쇄 : HO, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 44 (인간화 중쇄: Hl, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GAACGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 45 (인간화 중쇄: H2, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 46 (인간화 경쇄: L0, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAG
GACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTC
GGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGT
GTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCG
TGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG
AAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG
AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA
서열번호: 47 (인간화 경쇄: Ll, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GCGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
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TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
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GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA
서열번호: 48 (인간화 경쇄: L2, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA
서열번호: 49 (인간화 경쇄: L3, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCGCGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA
서열번호: 50 (10B3 키메라 N54D 중쇄, DNA 서열)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACGATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
ACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 51 (10B3 키메라 N54Q 중쇄, DNA 서열)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACCAAGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
ACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 52 (10B3 키메라 C91S 경쇄, DNA 서열)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTA
CGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTA
TTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCT
ATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT
GGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGA
TATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGG
TGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT
TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG
GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA
GGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG
CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG
CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACC
AGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
서열번호: 53 (인간화 중쇄 : H2 N54D, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
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TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACGACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
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GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
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CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
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ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
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서열번호: 54 (인간화 중쇄: H2 N54Q, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
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GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
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CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
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CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
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CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
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CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
서열번호: 55 (인간화 경쇄: L2 C91S, DNA 서열)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
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TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGA
GCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA
CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCT
GA
서열번호: 56 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 1)
DFGLDCDEHSTESRGSG
서열번호: 57 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 3)
SGSGDCDEHSTESRCCRY
서열번호: 58 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 5)
SGSGHSTESRCCRYPLTV
서열번호: 59 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 7)
SGSGSRCCRYPLTVDFEA
서열번호: 60 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 9)
SGSGRYPLTVDFEAFGWD
서열번호: 61 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 11)
SGSGTVDFEAFGWDWIIA
서열번호: 62 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 13)
SGSGEAFGWDWIIAPKRY
서열번호: 63 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 15)
SGSGWDWIIAPKRYKANY
서열번호: 64 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 17)
SGSGIAPKRYKANYCSGE
서열번호: 65 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 19)
SGSGRYKANYCSGECEFV
서열번호: 66 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 21)
SGSGNYCSGECEFVFLQK
서열번호: 67 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 23)
SGSGGECEFVFLQKYPHT
서열번호: 68 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 25)
SGSGFVFLQKYPHTHLVH
서열번호: 69 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 27)
SGSGQKYPHTHLVHQANP
서열번호: 70 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 29)
SGSGHTHLVHQANPRGSA
서열번호: 71 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 31)
SGSGVHQANPRGSAGPCC
서열번호: 72 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 33)
SGSGNPRGSAGPCCTPTK
서열번호: 73 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 35)
SGSGSAGPCCTPTKMSPI
서열번호: 74 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 37)
SGSGCCTPTKMSPINMLY
서열번호: 75 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 39)
SGSGTKMSPINMLYFNGK
서열번호: 76 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 41)
SGSGPINMLYFNGKEQII
서열번호: 77 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 43)
SGSGLYFNGKEQIIYGKI
서열번호: 78 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 45)
SGSGGKEQIIYGKIPAMV
서열번호: 79 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 47)
SGSGIIYGKIPAMVVDRC
서열번호: 80 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 49)
SGSGGKIPAMVVDRCGCS
서열번호: 81 (인공 미오스타틴 선형 펩티드 )
CCTPTKMSPINMLY
서열번호: 82 (CDRH3 변이 Y96L)
RLYYGTGPADWYFDV
서열번호: 83 (CDRH3 변이 G99D)
RYYYDTGPADWYFDV
서열번호: 84 (CDRH3 변이 G99S)
RYYYSTGPADWYFDV
서열번호: 85 (CDRH3 변이 G100A_K)
RYYYGTKPADWYFDV
서열번호: 86 (CDRH3 변이 P100B_F)
RYYYGTGFADWYFDV
서열번호: 87 (CDRH3 변이 P100B_I)
RYYYGTGIADWYFDV
서열번호: 88 (CDRH3 변이 W100E_F)
RYYYGTGPADFYFDV
서열번호: 89 (CDRH3 변이 F100G_N)
RYYYGTGPADWYNDV
서열번호: 90 (CDRH3 변이 F100OG_Y)
RYYYGTGPADWYYDV
서열번호: 91 (CDRH3 변이 V102N)
RYYYGTGPADWYFDN
서열번호: 92 (CDRH3 변이 V102S)
RYYYGTGPADWYFDS
서열번호: 93 (CDRH2 변이 G55D)
NIYPYNDVSNYNQRFKA
서열번호: 94 (CDRH2 변이 G55L)
NIYPYNLVSNYNQRFKA
서열번호: 95 (CDRH2 변이 G55S)
NIYPYNSVSNYNQRFKA
서열번호: 96 (CDRH2 변이 G55T)
NIYPYNTVSNYNQRFKA
서열번호: 97 (CDRH2 변이 G55V)
NIYPYNVVSNYNQRFKA
서열번호: 98 (인간화 중쇄 : H2_F100G_Y Fc 무능화)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
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VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호: 99 (인간화 중쇄: H2_G55S-F100G_Y Fc 무능화)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
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YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
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VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호: 100 (VL 에 대한 인간 수용체 골격)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSL QSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPXXXXXXXXXXFG
QGTKLEIK
서열번호: 101 (HexaHisGBITev/ (D76A) 마우스 미오스타틴 다단백질)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAV
DAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQEGSEREEN
VEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPL
RELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFF
KFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLK
LDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGE
DGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWII
APKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINML
YFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
서열번호: 102 (GBl 태그)
DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATK
TFTVTE
서열번호: 103 (마우스 미오스타틴 다단백질 (D76A))
EGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIR
QLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQA
DGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGT
RYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDL
AVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDF
EAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTP
TKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
서열번호: 104 (성숙 미오스타틴)
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFL
QKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVD
RCGCS
서열번호: 105 (Furin 발현 작제물)
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVAR
KHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVA
KRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSIL
DDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEV
AAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSAS
WGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCN
CDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQ
KCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNAND
WATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDI
GKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRST
LLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTK
FTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACENLYFQG
서열번호: 106 (HexaHisGBITev/인간 미오스타틴 프로펩티드)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAV
DAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQENSEQKE
NVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPP
LRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCF
FKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLK
LDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPG
EDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
서열번호: 107 (Tev 프로테아제 발현 작제물)
MHGHHHHHHGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNK
HLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKL
KFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQC
GSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWR
LNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNE
서열번호: 108 (인간 미오스타틴 프로펩티드)
ENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIR
QLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQV
DGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGT
RYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDL
AVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
서열번호: 109 (CDRL3 변이 C91S)
LQSDEFPLT
서열번호: 110 (CDRH3 변이 F100G_S)
RYYYGTGPADWYSDV
서열번호: 111 (BMP-I 발현 작제물)
MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRPLDLADYTYDLAEEDDSEPLNYKDPCKAAAF
LGDIALDEEDLRAFQVQQAVDLRRHTARKSSIKAAVPGNTSTPSCQSTNGQPQ
RGACGRWRGRSRSRRAATSRPERVWPDGVIPFVIGGNFTGSQRAVFRQAMR
HWEKHTCVTFLERTDEDSYIVFTYRPCGCCSYVGRRGGGPQAISIGKNCDKFG
IVVHELGHVVGFWHEHTRPDRDRHVSIVRENIQPGQEYNFLKMEPQEVESLG
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Furin expression construct <400> 105 Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn 20 25 30 Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val 35 40 45 Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr 50 55 60 Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His 65 70 75 80 Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu 85 90 95 Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gln Glu 100 105 110 Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr 115 120 125 Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His 145 150 155 160 Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn 165 170 175 Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn 180 185 190 Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn 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myostatin pro-peptide <400> 106 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Thr His His His His His His Asp Thr Tyr 20 25 30 Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu 35 40 45 Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn 50 55 60 Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80 Phe Thr Val Thr Glu Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Glu Asn Ser 85 90 95 Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr 100 105 110 Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln 115 120 125 Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp 130 135 140 Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile 145 150 155 160 Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu 165 170 175 Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr 180 185 190 Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe 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Claims (25)

  1. 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 CDRH3 또는 변이 CDRH3를 포함하는 항원 결합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 CDRH3가 (i) 서열번호 82 내지 92 또는 110 중 어느 하나; 또는 (ii) 카밧(Kabat) 치환 V102Y, V102H, V102I, V102D 또는 V102G 중 어느 하나인 항원 결합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, CDRH1(서열번호 1) 또는 변이 CDRH1; CDRH2(서열번호 2) 또는 변이 CDRH2; CDRL1(서열번호 4) 또는 변이 CDRL1; CDRL2(서열번호 5) 또는 변이 CDRL2; 및 CDRL3(서열번호 6 또는 109) 또는 변이 CDRL3로부터 선택된 하나 이상 또는 전부의 CDR을 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 변이 CDRH2가 (i) 서열번호 93 내지 97 중 어느 하나; 또는 (ii) 카밧 치환 N50R, N50E, N50W, N50Y, N50G, N50Q, N50V, N50L, N50K, N50A, I51L, I51V, I51T, I51S, I51N, Y52D, Y52L, Y52N, Y52S, Y53A, Y53G, Y53S, Y53K, Y53T, Y53N, N54S, N54T, N54K, N54D, N54G, V56Y, V56R, V56E, V56D, V56G, V56S, V56A, N58K, N58T, N58S, N58D, N58R, N58G, N58F 또는 N58Y 중 어느 하나인 항원 결합 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, CDRH3가 서열번호 90이고/이거나 CDRH2가 서열번호 95이고/이거나 CDRL3가 서열번호 109인 항원 결합 단백질.
  6. 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 가변 도메인 서열의 상응하는 CDRH3 또는 이의 변이 CDRH3를 포함하는 항원 결합 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서, 서열번호 7의 가변 도메인 서열의 CDRH1 또는 이의 변이 CDRH1, 또는 CDRH2 또는 이의 변이 CDRH2; 또는 서열번호 8의 가변 도메인 서열의 CDRL1 또는 이의 변이 CDRL1, CDRL2 또는 이의 변이 CDRL2, 및 CDRL3 또는 이의 변이 CDRL3으로부터 선택된 상응하는 CDR들 중 하나 이상 또는 전부를 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  8. 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 카밧 잔기 95 내지 101을 포함하는 결합 단위체 H3 또는 이의 변이 H3를 포함하는 항원 결합 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열번호 7의 카밧 잔기 31 내지 32를 포함하는 H1 또는 변이 H1; 서열번호 7의 카밧 잔기 52 내지 56을 포함하는 H2 또는 변이 H2; 서열번호 8의 카밧 잔기 30 내지 34를 포함하는 L1 또는 변이 L1; 서열번호 8의 카밧 잔기 50 내지 55를 포함하는 L2 또는 변이 L2; 및 서열번호 8의 카밧 잔기 89 내지 96을 포함하는 L3 또는 변이 L3로부터 선택된 하나 이상 또는 전부의 결합 단위체를 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (a) 내지 (g)로부터 선택된 카밧 아미노산 잔기들 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합을 추가로 포함하는 항원 결합 단백질:
    (a) 가변 중쇄의 위치 28의 S 또는 T;
    (b) 가변 중쇄의 위치 105의 T 또는 Q;
    (c) 가변 중쇄의 위치 2의 V, I 또는 G; 위치 4의 L 또는 V; 위치 20의 L, I, M 또는 V; 위치 22의 C; 위치 24의 T, A, V, G 또는 S; 위치 26의 G; 위치 29의 I, F, L 또는 S; 위치 36의 W; 위치 47의 W 또는 Y; 위치 48의 I, M, V 또는 L; 위치 69의 I, L, F, M 또는 V; 위치 78의 A, L, V, Y 또는 F; 위치 80의 L 또는 M; 위치 90의 Y 또는 F; 위치 92의 C; 및/또는 위치 94의 R, K, G, S, H 또는 N;
    (d) 가변 경쇄의 위치 16의 R 또는 G;
    (e) 가변 경쇄의 위치 71의 Y 또는 F;
    (f) 가변 경쇄의 위치 100의 A 또는 Q; 및/또는
    (g) 가변 경쇄의 위치 2의 I, L 또는 V; 위치 3의 V, Q, L 또는 E; 위치 4의 M 또는 L; 위치 23의 C; 위치 35의 W; 위치 36의 Y, L 또는 F; 위치 46의 S, L, R 또는 V; 위치 49의 Y, H, F 또는 K; 위치 88의 C; 및/또는 위치 98의 F.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10에서 나타낸 골격 영역과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역의 수용체 항체 골격을 추가로 포함하거나, 서열번호 11에서 나타낸 골격 영역과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인의 수용체 항체 골격을 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  12. 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 항원 결합 단백질:
    (i) 서열번호 7 또는 서열번호 25로부터 선택된 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 8 또는 서열번호 21로부터 선택된 경쇄 가변 영역, 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역; 또는
    (ii) 서열번호 26의 중쇄, 및/또는 서열번호 27 또는 서열번호 37로부터 선택된 경쇄, 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄.
  13. 미오스타틴에 특이적으로 결합하고, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 항원 결합 단백질:
    (i) 서열번호 12, 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 15, 16, 17, 18 또는 24 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역; 또는
    (ii) 서열번호 28, 29, 30, 98 또는 99 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄; 및/또는 서열번호 31, 32, 33, 34 또는 40 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄; 또는 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 하기의 카밧 치환이 존재하는 항원 결합 단백질:
    (i) 중쇄 가변 영역 또는 중쇄에서 Y96L, G99D, G99S, G100A_K, P100B_F, P100B_I, W100E_F, F100G_N, F100G_S, F10OG_Y, V102N, 또는 V102S; 및/또는
    (ii) 중쇄 가변 영역 또는 중쇄에서 G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V; 및/또는
    (iii) 경쇄 가변 영역 또는 경쇄에서 C91S.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc가 무능화(disable)되어 있는 항원 결합 단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자.
  17. 제 16 항에 있어서, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 핵산 분자:
    (i) 서열 번호 41의 중쇄 DNA 서열; 및/또는 서열번호 42 또는 52로부터 선택된 경쇄 DNA 서열; 또는 75% 이상의 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄; 또는
    (ii) 서열번호 43, 44 또는 45 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 DNA 서열; 및/또는 서열번호 46, 47, 48, 49 또는 55 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 DNA 서열; 또는 75% 이상의 동일성을 갖는 변이 중쇄 또는 경쇄.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 DNA 서열이 하기의 카밧 치환을 갖는 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩하는 것인 핵산 분자:
    (i) 중쇄에서 Y96L, G99D, G99S, G100A_K, P100B_F, P100B_I, W100E_F, F100G_N, F100G_S, F100G_Y, V102N, 또는 V102S; 및/또는
    (ii) 중쇄에서 G55D, G55L, G55S, G55T 또는 G55V; 및/또는
    (iii) 경쇄에서 C91S.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에서 정의한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  20. 제 19 항에서 정의한 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  21. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질의 제조 방법으로서, 제 20 항에서 정의한 숙주 세포를 배양하고, 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 근육 질량, 근력 및 근육 기능 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합을 감소시키는 질병으로 고생하는 개체를 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질 또는 제 22 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 근육 감소증, 악액질, 근육 소모, 불용성 근육 위축, HIV, AIDS, 암, 수술, 화상, 근육골 및 신경에 대한 외상 및 손상, 비만, 당뇨병(제 2형 당뇨병 포함), 관절염, 만성 신부전(CRF), 말기 신질환(ESRD), 울혈성 심부전(CHF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 선택적 관절 수복, 다발성 경화증(MS), 뇌졸중, 근육 이영양증, 운동 뉴런 신경병증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 지방간 질환, 간경변증, 에디슨병, 쿠싱 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 스테로이드 유발 근육 소모, 근육염 또는 척추측만증으로 고생하는 개체를 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질 또는 제 22 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 개체의 근육 질량을 증가시키고/시키거나, 근력을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 개선하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의한 항원 결합 단백질 또는 제 22 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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