TW201029662A - Novel antigen binding proteins - Google Patents

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TW201029662A
TW201029662A TW098143432A TW98143432A TW201029662A TW 201029662 A TW201029662 A TW 201029662A TW 098143432 A TW098143432 A TW 098143432A TW 98143432 A TW98143432 A TW 98143432A TW 201029662 A TW201029662 A TW 201029662A
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seq
antigen binding
myostatin
binding protein
muscle
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Claire Ashman
Andrew Beaton
Jonathan Henry Ellis
Bajin Han
Ian Kirby
Frederick Kull
Alan Lewis
Kathryn Mason Lindley
Martin Anibal Orecchia
Ying Shen
Paul Wilson
Tian Shun Xu
Hong Zhang
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Glaxo Group Ltd
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Description

201029662 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種與肌肉抑制素結合之抗原結合蛋白 (諸，抗體)、編碼該等抗原結合蛋白之聚核普酸、包含該 等抗原蛋白之醫藥組合物及製造方法。本發明亦係關 於》亥等抗原結合蛋白治療或預防與低肌肉質量、肌力及肌 肉功能中之任—者或其组合相關之疾病的用途。 【先前技術】 亦稱為生長分化因子(GDF_8)之肌肉抑制素為轉化生長 子P(TGF β)超豕族之成員且為肌肉質量之負調控劑。 肌肉抑制素在整個演化過程中高度保守，且人類、難、小 乳及大鼠之序列在成熟c端域中1〇〇%一致。肌肉抑制素係 以3有信號序列、前肽域及c端域之前媒蛋白形式合成。 在與前肽域及/或其他抑制蛋白相關之潛伏複合物中經 刀泌循環形式之肌肉抑制素包括活性成熟〇端域及包含 0 成熟C端域之非活性形式。 存在與低肌肉質量、肌力及肌肉功能相關之許多不同疾 病、病症及病狀。增加運動及較佳營養為治療該等疾病之 當前療法的主要支持。不幸的是，就患者而言，由於持續 性及順應性較差，故增強身體活動之益處很難實現。又， 運動對於一些患者可能有困難、感疼痛或無法進行。此 外，與運動相關之肌肉施力可能不足以對肌肉產生任何有 益作用。若存在潛在的飲食缺乏且患者具有足夠食懲，則 僅營養介入有效❶由於此等限制，具有較廣泛可得之益處 145280.doc 201029662 的對與肌肉質量、肌力及肌肉功能中之任一者或其組合降 低相關之疾病的治療為實質上未得到滿足之需要。 已描述針對肌肉抑制素之抗體（WO 2008/030706、WO 2007/047112、WO 2007/044411、WO 2006/116269 ' WO 2005/094446、WO 2004/037861、WO 03/027248 及 WO 94/21681)。又，Wagner 等人（Ann Neurol. (2008) 63(5): 561-71)描述當使用一種所述抗肌肉抑制素抗體時，成人肌 營養不良（貝克型肌營養不良（Becker muscular dystrophy)、 面肩肢型肌營養不良（facioscapulohumeral dystrophy)及肢 帶型肌營養不良（limb-girdle muscular dystrophy))之肌力或 肌肉功能的探察終點並無改良。 因此，仍需要治療或預防與肌肉質量、肌力及肌肉功能 中之任一者或其組合降低相關之疾病的較有效療法。 【發明内容】 本發明提供一種與肌肉抑制素結合之抗原結合蛋白。該 抗原結合蛋白可用於治療或預防與低肌肉質量、肌力及肌 肉功能中之任一者或其組合相關之疾病。 本發明提供一種與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 3 之CDRH3或變異型CDRH3之抗原結合蛋白。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 7之可變域序列之相應CDRH3或其變異型CDRH3的抗原結 合蛋白。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含含有SEQ ID NO: 7之Kabat殘基95-101之結合單元H3或變異型H3的抗原 145280.doc 201029662 結合蛋白。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含以下之抗原 結合蛋白： (I) 選自SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 25之重鏈可變 區，及/或選自SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21之輕鏈可 變區，或具有75°/。或75%以上之序列一致性的變異型重 鏈可變區或輕鏈可變區；或
(II) SEQ ID NO: 26之重鏈；及/或選自 SEQ ID NO: 27 或SEQ ID NO: 37之輕鏈；或具有75%或75%以上之序列 一致性的變異型重鏈或輕鏈。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含以下之抗原 結合蛋白： (0選自SEQ ID NO: 12、13或14中之任一者的重鏈可 變區；及，或選自SEQ ID NO: 15、16、17、18或24中之 任一者的輕鏈可變區；或具有75%或75%以上之序列一 致性的變異型重鏈可變區或輕鏈可變區；或 ⑴）選自SEQ ID NO: 28、29、30、98或99中之任一者 的重鏈；及/或選自SEQ ID N〇: 31、32、33、34或4〇中 之任一者的輕鏈；或具有75%或7嫩上之序列一致性 的變異型重鏈或輕鏈。 發明亦提供—種編碼如本文所定義之抗原結合蛋白之 .本發明亦提供-種包含如本文敎義之核酸分 現載體本發明亦提供一種包含如本文所定義之表 載體之重組宿主細胞。本發明亦提供一種產生如本文所 145280.doc 201029662 定^之抗原結合蛋白之方法’該方㈣含培養如上所定義 之伯主細胞及回收該抗原結合蛋白之步驟。本發明亦提供 種包含如本文所定義之其抗原結合蛋白及醫藥學上可接 受之載劑的醫藥組合物。 本發明亦提供-種治療罹患降低肌肉質量、肌力及/或 肌肉功能之疾病之個體的方法’該方法包含投與治療有效 量之如本文所定義之抗原結合蛋白之步驟。 本發明提供-種治療罹患以下疾病之個體的方法：肌肉 減少症、惡病質、肌肉消痩（muscle_wasting)、廢用性肌肉 萎縮、HIV、AIDS、癌症、外科疾病、灼傷、肌骨或神經 創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包括^型糖尿病）、關節 炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病（ESRD)、充血性心臟衰 竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性關節修復 (elective j〇int repair)、多發性硬化症（MS)、中風肌營養 不良、運動神經元神經病、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、 帕金森氏病（Parkinson's disease)、骨質疏鬆症、骨關節 炎、脂肪肝（fatty acid liver disease)、肝硬化、艾迪森氏 病（Addison's disease)、庫欣氏症候群（Cushing，s syndr〇me)、 急性呼吸窘迫症候群、類固醇誘發之肌肉消瘦、肌炎或脊 柱側彎’該方法包含投與治療有效量之如本文所述之抗原 結合蛋白之步驟。 本發明提供一種增加個體之肌肉質量、增強個體之肌力 及/或改良個體之肌肉功能的方法，該方法包含投與治療 有效量之如本文所定義之抗原結合蛋白之步驟。 145280.doc 201029662 本發明提供一種如本文所述之抗原結合蛋白，其係用於 /〇療羅患降低肌肉質量、肌力及肌肉功能中之任一者或其 組合之疾病的個體。 本發明提供一種如本文所述之抗原結合蛋白，其係用於 . 治療以下疾病：肌肉減少症、惡病質、肌肉消瘦、廢用性 • 肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌症、外科疾病、灼傷、肌骨或 神經創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包括π型糖尿病）、關 參 即炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病（ESRD)、充血性心臟 衰竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性關節修復、 多發性硬化症（MS)、中風、肌營養不良、運動神經元神經 病、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏病、骨質疏鬆 症、骨關節炎、脂肪肝、肝硬化、艾迪森氏病、庫欣氏肌 肉消痩（Cushing's muscle wasting)、肌炎或脊柱側彎。 本發明提供一種如本文所述之抗原結合蛋白，其係用於 增加個體之肌肉質量、增強個體之肌力及/或改良個體之 φ 症候群、急性啤吸窘迫症候群、類固醇誘發之肌肉功能的 方法中。 本發明提供如本文所述之抗原結合蛋白之用途，其係用 於製造用以治療罹患降低肌肉質量、肌力及肌肉功能中之 任一者或其組合之疾病之個體的藥劑。 本發明提供如本文所述之抗原結合蛋白之用途，其係用 於製造用以治療以下疾病之藥劑：肌肉減少症、惡病質、 肌肉消瘦、廢用性肌肉蒌缩、4 τ J要縮HIV、AIDS、癌症、外科疾 病m肌骨或神經創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包 145280.doc 201029662 括π型糖尿病）、關節炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病 (ESRD)、充血性心臟衰竭（CHF)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、選擇性關節修復、多發性硬化症（MS)、中風、 肌營養不良、運動神經元神經病、肌肉萎縮性側索硬化 (ALS)、帕金森氏病、骨質疏鬆症、骨關節炎、脂肪肝、 肝硬化、艾迪森氏病、庫欣氏肌肉消痩、肌炎或脊柱側 本發明提供如本文所述之抗原結合蛋白之用途，其係用 於製造在增加個體之肌肉質量、增強個體之肌力及/或改 良個體之症候群、急性呼吸窘迫症候群、類固醇誘發之肌 肉功能之方法中使用的藥劑。 【實施方式】 本發明提供-種與例如均二聚成熟肌肉抑制素之肌肉抑 制素結合之抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白可結合並中和 肌肉抑制素，例如人類肌肉抑制素。抗原結合蛋白可為抗 體’例如單株抗體。 义肌肉抑制素與GDF_8均係指以下任_者：全長未經加工 前驅形式之肌肉抑制素；端域轉譯後裂解產生且呈潛 及非潛伏(活性)形式之成熟肌肉抑制素。術語肌肉 抑制素亦係指保留-或多種與肌肉抑制素相關之生物活性 的任何肌肉抑制素月段及變異體。 全長未經加工前驅形式之肌肉抑制素 域，該C端域在有或無信號序列之情況下形成成孰蛋白端 肌肉抑制素前肽加上C端域亦稱為聚合蛋二肉素 145280.doc 201029662 刚驅體可以單體或均二聚體形式存在。 f熟肌肉抑制素為由肌肉抑制素前驅蛋白之c端（亦稱為 一端域)裂解產生之蛋白質。成熟肌肉抑制素可以單體均 :聚體形式存在’或存在於肌肉抑制素潛伏複合物中。視 冑件而疋’成熟肌肉抑制素可在此等不同形成之組合之間 、平衡人類，雞、小鼠及大鼠肌肉抑制素之成熟C端 域序列1 GG%-致（參見例如SEQ ID Να] G4)。在—實施例 ❿:，本發明之抗原結合蛋白與SEQ ID NO: 104所示之均二 聚成熟肌肉抑制素結合。 肌肉抑制素前肽為在信號序列裂解之後由肌肉抑制素前 驅蛋白之N端域裂解產生之多狀。前狀亦稱為潛伏相關狀 (:AP)、。肌肉抑制素前肽能夠與成熟肌肉抑制素上之前肽 -〇域非共價結合。人類前肽肌肉抑制素序列之—實 供於 SEQ ID NO: 1〇8 中。 ▲肌肉抑制素潛伏複合物為成熟肌肉抑制素與肌肉抑制素 ❹冑肽或其他肌肉抑制素結合蛋白之間所形成之蛋白質複合 物。舉例而言，兩個肌肉抑制素前肽分子可與兩個成熟肌 肉抑制素分子締合形成非活性四聚潛伏複合物。替代—或 =種肌肉抑制素刖肽或除此之外，肌肉抑制素潛伏複合物 〇 其他肌肉抑制素結合蛋白。其他肌肉抑制素結合蛋 白之實例包括印泡抑素(f〇Uistatin)、卵泡抑素相關基因 (FLRG)及生長分化因子相關▲清蛋自i(gash)。 肌肉抑制素抗原結合蛋白可結合前驅形式、成熟形式、 單體形式、二聚形式、潛伏形式及活性形式之肌肉抑制素 145280.doc 201029662 中之任一者或其任何組合。抗原結合蛋白可結合呈單體形 式及/或二聚形式之成熟肌肉抑制素。當抗原結合蛋白與 前肽及/或印泡抑素形成複合物時，該抗原結合蛋白可能 結合或可能不結合肌肉抑制素。或者，當抗原結合蛋白與 卵泡抑素相關基因（FLRG)及/或生長分化因子相關血清蛋 白l(GASP-l)形成複合物時，該抗原、结合蛋白可能結合或 可能不結合肌肉抑制素。舉例而言，抗原結合蛋白與成熟 二聚肌肉抑制素結合。 如本文所用之術語「抗原結合蛋白」係指能夠與肌肉抑 制素結合之抗體、抗體片段及其他蛋白質構築體（諸如結 構域）。 術語「抗體」在本文中以最寬泛含義使用以指代具有免 疫球蛋白樣結構域之分子，且包括單株抗體、重組抗體、 多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體及異源 結合抗體·，單可變域、域抗體、抗原結合片段、免疫有效 片段、單鏈Fv、微型雙功能抗體、丁⑽如心很等（關於替代 性「杬體」形式之概述，參見H〇出ger&Huds〇n，Nature
Biotechnology，2005,第 23卷，第 9期，1126_1136)。 短語「單可變域」係指獨立於不同可變區或可變域而特 異性結合抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白可變域（例如
Vh、VHH、VL)。 「域抗體」或「dAb」可視為與能夠結合抗原之「單可 變域」相同。單可變域可為人類抗體可變域，但亦包括來 自其他物種之單抗體可變域，諸如齧齒動物（例如，如W〇 145280.doc •10· 201029662 00/29004中所揭示）、古舊+娑广 魚（nurse shark)及駱駝科動物 ((7α/«θ/ζ·ί/)νΗΗ dAb。絡齡斜缸此” 科動物VHH為源自包括路，轮、美 洲騎、羊駝、單峰駱駝及屌 汉席銳之物種的免疫球蛋白單可變 域多肽’其產生天然不.含蘇綠+各* 輕鏈之重鏈抗體。可根據此項技 術中可用之標準技術對嗜漦v 议何對4 4Vhh域進行人類化，且該等結 構域被視為「域抗體如太 如本文所用之νΗ包括駱駝科動物
Vhh 域。 ❿ 本文所用之術$「域/結構域」係指具有與蛋白質之 其餘部分無關之三級結構的摺疊蛋白質結構。一般而言， 結構域對蛋白質之離散功能特性負責，且在許多情況下可 將其添加、移除或轉移至其他蛋白質而不使蛋白質其餘部 分及/或結構域之功能損失。「單可變域“包含抗體可變 域所特有之序列的摺疊多肽域。因此，其包括完全抗體可 變域及經修飾之可變域（例如其中一或多個環已經並非抗 體可變域所特有之序列置換），或已經截短或包含N端或C ❹料長之抗體可變域，以及至少保留全長域之結合活性及 特異性的可變域肖疊片段。結構域可獨立於不同可變區或 可變域而結合抗原或抗原決定基。 可藉助於在非抗體蛋白質骨架（諸如結構域）上排列一或 多個CDR來提供抗原結合片段。非抗體蛋白質骨架或結構 域為已歷經蛋白質工程改造以與除其天然配位體以外之配 位體獲得結合性的非抗體蛋白質骨架或結構域，例如作為 骨架衍生物之結構域，該骨架係選自：CTLA_4 (Evib〇dy); 脂質運載蛋白（lipocalin);源自蛋白質A之分子，諸如蛋白質 I45280.doc 201029662 A之Z域（Affibody，SpA)、A域（Avimer/Maxibody);熱休克蛋 白，諸如GroEl及GroES ;運鐵蛋白（trans，body);錨蛋白 重複蛋白（DARPin);肽適體；C型凝集素域（Tetranectin); 人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素（affilins) ; PDZ域；人類 蛋白酶抑制劑之缴毒素孔尼茲型域（scorpion toxinkunitz type domain);及纖維結合蛋白（adnectin);其已歷經蛋白 質工程改造以與除其天然配位體以外之配位體獲得結合 性。 CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為主要在CD4+T 細胞上表現之CD28家族受體。其胞外域具有可變域樣Ig摺 疊。對應於抗體CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結 合特性。經工程改造而具有不同結合特異性之CTLA-4分 子亦稱為Evibody。欲知詳情，參見Journal of Immunological Methods 248 〇2)，31-45 (2001) ° 脂質運載蛋白為輸送諸如類固醇、後膽色素、類視色素 及脂質之疏水性小分子的細胞外蛋白質家族。脂質運載蛋 白具有在典型結構之開放端具多個環的硬性β-摺疊二級結 構，其可經工程改造以與不同標靶抗原結合。抗運載蛋白 (anticalin)之大小介於160-1 80個胺基酸之間，且係源自脂 質運載蛋白。欲知詳情’參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000) ; US7250297B1 ;及 US20070224633 ° afTibody為源自金黃色葡萄球菌（《Siap/zy/ococcwi awrewi) 之蛋白質A的骨架，其可經工程改造以與抗原結合。該結 構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。文庫已藉由使 145280.doc -12- 201029662 表面殘基隨機化而產生。欲知詳情，參見Protein Eng. Des· Sel· 17, 455-462 (2004)及 EP1641818A1。
Avimer為源自A域骨架家族之多域蛋白。具有約35個胺 基酸之原生域採用規定二硫鍵鍵結之結構。Α域家族所展 現之天然變化之改組產生多樣性。欲知詳情，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)及 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917 (2007年 6 月）° 運鐵蛋白為單體血清輸送醣蛋白。可藉由將肽序列（諸 ^ 如一或多個CDR)插入容許性表面環中來對運鐵蛋白進行 工程改造以結合不同標靶抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨 架之實例包括Trans-body。欲知詳情，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)° 經設計之錨蛋白重複蛋白（DARPin)係源自錨蛋白，一種 介導整合膜蛋白與細胞骨架連接之蛋白質家族。單一錨蛋 白重複序列為由兩個α-螺旋及一個β-轉角（β-turn)組成的33 φ 個殘基之基元。可藉由使各重複序列之第一 α-螺旋及β-轉 角中之殘基隨機化，或插入肽序列（諸如一或多個CDR)來 對錨蛋白重複蛋白進行工程改造以結合不同標靶抗原。錨 . 蛋白重複蛋白之結合界面可藉由增加模組之數目（一種親 和力成熟方法）而增加。欲知詳情，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及 US20040132028A1。 纖維結合蛋白為可經工程改造以與抗原結合之骨架。 Adnectin由III型人類纖維結合蛋白（FN3)之15個重複單元 145280.doc -13· 201029662 的第1 〇結構域之天然胺基酸序列之主結構組成。β-夾層一 端之三個環可經工程改造以使Adnectin能夠特異性識別相 關治療標粗。欲知詳情，參見Protein Eng. Des. Sel. 18， 435·444 (2005) ; US20080139791 ; W02005056764 ;及 US6818418B1 。 肽適體為由恆定骨架蛋白組成之組合識別分子，該恆定 骨架蛋白通常為含有在活性位點處插入之限制性可變肽環 的硫氧還蛋白（TrxA)。欲知詳情，參見Expert Opin. Biol. Ther_ 5, 783-797 (2005)。 微體係源自含有3-4個半胱胺酸橋且長度為25-5 0個胺基 酸的天然存在之微蛋白；微蛋白之實例包括KalataB 1及芋 螺毒素（conotoxin)及打結素（knottin)。微蛋白具有可經工 程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微蛋白之整體摺疊 的環。欲知經工程改造之打結素域的詳情，參見 W02008098796 ° 其他結合域包括已用作對不同標靶抗原結合特性進行工 程改造之骨架的蛋白質，包括人類γ-晶狀體球蛋白及人類 泛素（affilins)、人類蛋白酶抑制劑之孔尼茲型域、Ras結合 蛋白AF-6之PDZ域、蛾毒素（卡律嫩毒素（charybdotoxin))、C 型凝集素域（四連接素（tetranectin))，其評述於Non-Antibody Scaffolds- 第 7 章， Handbook of Therapeutic Antibodies (2007，Stefan Dubel編）及Protein Science 15:14-27 (2006)中。本發明之結合域可源自任一此等替代性蛋白 域及移植至結構域上之本發明CDR之任何組合。 145280.doc -14- 201029662 抗原結合片段或免疫有效片 變序列。片段長度為至少5個 或者，片段長度為至少15個、 75個或至少100個胺基酸。 段可包含部分重鏈或輕鏈可 、6個、8個或10個胺基酸。 至少20個、至少50個、至少
如本說明書通篇關於抗原結合蛋白利之術語「特異性 結合」意謂抗原結合蛋白與肌肉抑制素結合而不與其他 (例如無關)蛋白質結合或不與之顯著結合。然而，該術語 並不排除抗原結合蛋白亦可與密切相關分子（例如生長分 化因子-11)交又反應。本文所述之抗原結合蛋白可以至少 為與密切相關分子（諸如GDF_U)結合之親和力的2倍、5 倍、膽、50倍、100倍或議倍之親和力與肌肉抑制素 結合。 抗原結合蛋白-肌肉抑制素相互作用之結合親和力或平 衡解離常數（KD)可為100 11]^或10〇 nM以下、1〇 ηΜ*ι〇 nM以下、2 nM或2 nM以下或i nM或j nM以下。或者， φ 可介於5 nM與10 nM之間；或介於1 11“與2 nM之間。尺口可 "於1 ρΜ與500 pM之間；或介於5〇〇 ?]^與1 nM之間。抗 原結合蛋白之結合親和力係由締合速率常數（ka)及解離速 率常數（kd)(KD=Kd/Ka0!|定。結合親和力可由BIAc〇reTM， 例如藉由用經由一級胺偶合而偶合至CM5晶片上之肌肉抑 制素進行抗原捕捉及於此表面上進行抗體捕捉來量測。實 例2.3中所述之BIAcore™方法可用於量測結合親和力。或 者’結合親和力可由FORTEbio，例如藉由用經由一級胺 偶合而偶合至CM5針上之肌肉抑制素進行抗原捕捉及於此 145280.doc 201029662 表面上進行抗體捕捉上來量測。實例5.1中所述之 FORTEbio方法可用於量測結合親和力。然而，由於本發 明之抗原、结合蛋白與R肉抑制素之結合性f，&結合親和 力可用於達成分級目的。
Kd可為 1x10 3 s 1或 1χ1〇-3 ,以下、ΐχΐ〇-4，或 ΐχΐ〇.4 s] 以下’或1x10 5 S·1或lxl〇-5 s-i以下。可介於ΐχΐ〇-5 s]與 1x10 S之間，或介於1χ1〇·4 s-i與1χΐ〇.3 s.!之間。較慢 可使付抗原結合蛋白_配位體複合物較慢解離且配位體中 和得到改良。 如本說明書通篇所用之術語「中和」意謂在活體外或活 體内與不存在抗原結合蛋白之情況下肌肉抑制素之活性 相比，在如本文所述之抗原結合蛋白存在下肌肉抑制素之 生物活〖生降低。中和可歸因於以下一或多者：阻斷肌肉抑 制素與其受體結合、阻止肌肉抑制素活化其受體、下調肌 肉抑制素或其受體，或影響效應功能。中和可歸因於阻斷 肌肉抑制素與其受體結合，且從而阻止肌肉抑制素活化其 受體。 肌肉抑制素活性包括一或多種與活性肌肉抑制素相關之 生長活性、調控活性及形態發生活性，例如調節肌肉質 里、肌力及肌肉功能。與活性肌肉抑制素相關之其他活性 可包括調節肌肉纖維數目、肌肉纖維大小、肌肉再生、肌 肉纖維化、肌母細胞增殖速率、肌原性分化；衛星細胞之 活化、衛星細胞之增殖、衛星細胞之自我更新；肌肉生長 及肌肉功能所涉及之蛋白質合成或異化。肌肉可為骨骼 145280.doc 16 201029662 肌0 生物活性之降低或抑制可為部分或完全的。中和抗原結 合蛋白相對於在不存在該抗原結合蛋白之情況下肌肉抑制 素之活性可將肌肉抑制素之活性中和至少2〇%、30%、 40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、 84%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100°/❶。在功能分析法（諸如以下所述之中和分 析法）中，IC5G為使生物反應降至其最大值之50°/。的濃度。 ^ 中和作用可使用熟習此項技術者已知或如本文所述之一 或多種分析法來測定或量測。舉例而言，可在夾心ELISA 中由BIAcoreTM、FMAT、FORTEbioTM或類似活體外分析法 (諸如表面電漿共振）來評估抗原結合蛋白與肌肉抑制素之 結合性。 基於ELISA之受體結合分析法可用於藉由量測在抗原結 合蛋白存在下肌肉抑制素與固定於板上之可溶性ActRIIb φ 受體之結合性來測定抗原結合蛋白之中和活性（欲知詳 情，參見實例2.5)。受體中和分析法為可用於基於效能區 分IC5〇低於1 nM之分子的敏感性方法。然而，該分析法本 .身對結合感受態生物素標記肌肉抑制素之精確濃度敏感° 因此，可獲得0.1 nM至5 nM範圍内之IC50值，例如〇·1 nM 至 3 nM，或 0·1 nM至 2 nM，或 0.1 nM至 1 nM。 或者，基於細胞之受體結合分析法可用於藉由量測對受 體結合、下游信號傳導及基因活化之抑制作用來測定抗原 結合蛋白之中和活性。舉例而言，中和抗原結合蛋白可由 145280.doc -17- 201029662 其在ΡΑΙ-l特異性啟動子控制下、在經編碼螢光素酶基因 之構築體轉染之橫紋肌肉瘤細胞（A2G4)中抑制肌肉抑制素 誘導之螢光素酶活性的能力來鑑別，亦稱為肌肉抑制素反 應性報導基因分析法（欲知詳情’參見實例12)。 活體内中和作用可使用展示肌肉質量、肌力及肌肉功能 中之任一者或其、組合之變化的許多不肖㈣分析法來測 疋舉例而5，體重、肌肉質量（諸如瘦肌肉質量）、肌肉 收縮性（例如強直收縮力）、握力、動物自我懸吊之能力及 游泳測試可單獨或則續組合形錢用，崎估肌肉抑制 素抗原結合蛋白之中和活性。舉例而言，可測定以下肌肉 之肌肉質量··腓腸肌、四頭肌、三頭肌、伸趾長肌 (EDL)、脛骨前肌（TA)及比目魚肌。 熟習此項技術者顯而易見的是，術語「源自」不僅意欲 定義在作為材料之物理起源之意義上的來源而且定義在 結構上與材料相同但並非起源於參考來源之材料。因此， 供體抗體中所見之殘基」未必需要自供體抗體純化得 到。 分離意謂自其所存在之自然界環境中移出諸如抗原結合 蛋白之分子。舉例而言，分子可經過純化而與自然界中通 吊與之一起存在之物質分開。舉例而言就含有抗原結合 蛋白之培養基而言，可將抗原結合蛋白純化為至少95%、 96°/。、97%、98%或 99%或 99°/。以上。 「嵌合抗體」係指一種類型之工程改造抗體，其含有源 自供體抗體且與源自受體抗體之輕鏈及重鏈恆定區相關聯 145280.doc -18- 201029662 的天然存在之可變區（輕鏈及重鍵）。 人類化抗體」係指一種類型之工程改造抗體，其具有 一或多個源自非人類供體免疫球蛋白之CDR，該分子之其 餘免疫球蛋白源性部分係源自一或多個人類免疫球蛋白。 另外，可改變構架支持殘基以保存結合親和力（參見，例 如 Queen等人，proc· Natl Acad Sci USA，86:10029-10032 (1989)，Hodgson等人，Bio/Technology，9:421 (1991))。適 _ 合之人類受體抗體可為基於與供體抗體之核苷酸及胺基酸 序列之同源性而選自例如KABAT®資料庫、Los Alamos資 料庫及Swiss Protein資料庫之習知資料庫的人類受鱧抗 體。特徵為與供體抗體之構架區之同源性（在胺基酸基礎 上）的人類抗體可適於為插入供體Cdr提供重鏈恒定區及/ 或重鏈可變構架區。可以類似方式選擇能夠供給輕鏈恆定 區或可變構架區之適合受體抗體。應注意，受體抗體重鏈 及輕鏈並不需要起源於相同受體抗體。先前技術描述產生 ❿ 該等人類化抗體之若干方式，參見例如EP-A-0239400及 EP-A-054951。 術5吾供體抗體」係指向第一免疫球蛋白搭配物貢獻其 可變區、一或多個CDR或其他功能片段或其類似物之胺基 酸序列的抗體。因此，供體提供經改變之免疫球蛋白編碼 區及由此產生之具有供體抗體所特有之抗原特異性及中和 活性的經表現且經改變之抗體。 術語「受體抗體」係指與供體抗體異源之抗體，其向第 一免疫球蛋白搭配物貢獻編碼該受體抗體之重鏈及/或輕 145280.doc 201029662 鏈構架區及/或該受體抗體之重鏈及/或輕鏈恆定區的所有 胺基酸序列（或胺基酸序列之任何部分）。人類抗體可為受 體抗體。 術語「vH」及「vL」在本文中用於分別指代抗原結合 蛋白之重鏈可變區及輕鏈可變區。 「CDR」定義為抗原結合蛋白之互補決定區胺基酸序 列。此等CDR為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高變區。在免疫 球蛋白之可變部分中存在三個重鏈CDR及三個輕鏈 CDR(或CDR區）。因此，如本文所用之「CDR」係指所有 三個重鏈CDR、所有三個輕鏈CDR、所有重鏈及輕鏈CDR 或至少兩個CDR。 在本說明書通篇，除非另外說明，否則可變域序列及全 長抗體序列中之胺基酸殘基係根據Kabat編號規定來編 號。類似地，實例中所用之術語「CDR」、「CDRL1」、 「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、 「CDRH3」遵循Kabat編號規定。欲知詳細資訊，參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 4版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) 〇 熟習此項技術者顯而易見的是，可變域序列及全長抗體 序列中之胺基酸殘基的替代性編號規定存在。CDR序列之 替代性編號規定亦存在，例如Chothia等人，（1989) Nature 342: 877-883中所述之編號規定。抗體之結構及蛋白質摺 疊意謂其他殘基被視為CDR序列之一部分且將為熟習此項 145280.doc •20- 201029662 技術者如此理解。因此，術語「相應CDR」在本文中用於 指代使用任何編號規定之CDR序列，例如表1中所述之編 號規定。 可為熟習此項技術者所用之其他CDR序列編號規定包括 「AbM」（University of Bath)及「接觸」（University College London)方法。可確定使用Kabat、Chothia、AbM及接觸方 法中之至少兩者的最小重疊區以提供「最小結合單元」。 最小結合單元可為CDR之子部分。 下表1表示一種使用各編號規定對各CDR或結合單元之 定義。Kabat編號機制在表1中用於對可變域胺基酸序列進 行編號。應注意，一些CDR定義可視所用之個別出版物而 變。 表1
Kabat CDR Chothia CDR AbM CDR 接觸CDR 最小結合單元 H1 31-35/35A/35B 26-32/33/34 26-35/35A/35B 30-35/35A/35B 31-32 H2 50-65 52-56 50-58 47-58 52-56 H3 95-102 95-102 95-102 93-101 95-101 L1 24-34 24-34 24-34 30-36 30-34 L2 50-56 50-56 50-56 46-55 50-55 L3 89-97 89-97 89-97 89-96 89-96 如本文所用之術語「抗原結合位點」係指抗原結合蛋白 上能夠與抗原特異性結合之位點。此抗原結合位點可為單 域（例如抗原決定基結合域）或單鏈Fv(ScFv)域，或其可為 如標準抗體上可見之成對VH/VL域。 如本文所用之術語「抗原決定基」係指與抗原結合蛋白 之特定結合域接觸之抗原部分。抗原決定基可呈線性，其 包含來自抗原之基本上呈線性的胺基酸序列。或者，抗原 145280.doc -21 - 201029662 決定基可具有構形或為不連續的。舉例而言，構形抗原決 定基包含需要結構限制成份之胺基酸殘基。不連續抗原決 定基包含由其他序列隔斷（亦即不處於抗原一級序列之連 續序列中）之胺基酸殘基。在抗原三級結構及四級結構.之 情形下，不連續抗原決定基之殘基彼此足夠接近，以由抗 原結合蛋白結合。 對於核苷酸序列及胺基酸序列’術語「一致」或「序列 一致性」指示兩個核酸序列或兩個胺基酸序列之間的一致 性程度’且若需要’則屆時以適當插入或缺失而進行最佳 比對及比較。 兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之相同 位置數的函數（亦即，一致性％=相同位置數/總位置數χ 100) ’將為兩個序列之最佳比對所需引入之空陈數及各空 隙長度考慮在内。可如下所述’使用數學演算法來實現兩 個序列之間的序列比較及一致性百分比之測定。 兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟 體之GAP程式’使用NWSgapdna.CMP矩陣及空隙權數40、 50、60、70或80及長度權數1、2、3、4、5或6來確定。兩 個核苷酸序列或胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用 已併入ALIGN程式（2.0版）中之E. Meyers及W. Miller之演算 法（Comput. Appl. Biosci.，4:11 -1 7 (1988)) ’ 使用 ΡΑΜΙ20 權數餘量表、空隙長度罰分12及空隙罰分4來確定。另 外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用已併入 GCG套裝軟體之GAP程式中的Needleman及Wunsch之演算 145280.doc -22- 201029662 法（J. Mol. Biol. 48:444_453 (197〇))，使用 m〇s_ Q 矩陣 或PAM250矩陣及空隙權數16、14、12、1〇、8、6或4及長 度權數1、2、3、4、5或6來確定。 舉例而言，聚核苷酸序列可與如本文所述之參考聚核苷 酸序列（參見例如SEQ ID NO: 41-55)—致，亦即1〇〇%一 致；或與參考序列相比可包括至多某一整數量之核苷酸變 更’諸如至少 50°/〇、60%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%、98%或99°/。一致。該等變更係選自由至少一個 核苷酸缺失、取代（包括轉換及易位）或插入，且其中該等 變更可在參考核苷酸序列之5,端位或3'端位處或彼等端位 之間的任何處發生，其個別地散布於參考序列之核普酸中 或以一或多個相連群組散布於參考序列中。核苷酸變更數 係藉由將如本文所述之參考聚核苷酸序列（參見例如SEQ ID NO: 41-55)之核苷酸總數乘以各別一致性百分比之數值 百分比（除以100)且用如本文所述之參考聚核苷酸序列（參 見例如SEQ ID NO: 41-55)之該核苷酸總數減去彼乘積來確 定，或： nn<xn-(xn«y) » 其中ηη為核苷酸變更數，χη為如本文所述之參考聚核普酸 序列（參見例如SEQ ID NO: 41-55)之核苷酸總數，且y為 〇.50(對於 50%)、0.60(對於 60%)、0.70(對於 70%)、〇.75(對 於 75%)、〇_80(對於 80%)、0,85(對於 85%)、〇.9〇(對於 90%)、0.95(對於 95%)、0.98(對於 98%)、0.99(對於 99%)或 145280.doc -23· 201029662 !.〇〇(對於誦)，·為乘法運算子符號，且其中將x如之 任何非整數乘積四捨五入至最接近之整數，隨 該整數。 類似地，多肽序列可與如本文所述之多狀參考序列（參 見例如SEQ ID NO: 7-40或 82_108)一致，亦即1〇〇%一致； 或與參考序列相比可包括至多某一整數量之胺基酸變更，’ 使得一致性％小於100% ’諸如至少5〇%、6〇% ' 7〇%、 75%、80%、85。/。、90%、95。/。、98% 或 99〇/〇—致。該等變 更係選自由至少一個胺基酸缺失、取代（包括保守性及非 保守性取代）或插入組成之群，且其中該等變更可在參考 多肽序列之胺基端位或羧基端位處或彼等端位之間的任何 處發生’其個別地散布於參考序列之胺基酸中或以一或多 個相連群組散布於參考序列中。既定一致性％之胺基酸變 更數係藉由將如本文所述之多肽參考序列（參見例如SEq ID NO: 7-40或82-108、98或99)所編碼之多肽序列的胺基 酸總數乘以各別一致性百分比之數值百分比（除以丨00)且接 著用如本文所述之多肽參考序列（參見例如SEQ ID NO: 7-40或82-108、98或99)之該胺基酸總數減去彼乘積來確定， 或： na^Xa-(Xa*y) 5 其中na為胺基酸變更數，xa為如本文所述之參考多肽序列 (參見例如SEQ ID NO: 7-40或82-108、98或99)之胺基酸總 數，且 y 為 0.50(對於 50%)、〇.60(對於 60°/。）、0.70(對於 145280.doc • 24· 201029662 70%)、0.75(對於 75%)、0.80(對於 80%)、0.85(對於 85%)、 0.90(對於 90%)、〇.95(對於 95%)、0.98(對於 98%)、0.99(對 於99%)或1.〇〇(對於1〇〇%)，·為乘法運算子符號，且其中 將xa與y之任何非整數乘積四捨五入至最接近之整數，隨 後用xa減去該整數。 可在序列全長或其任何片段上及在有或無插入或缺失的 情況下確定一致性％。 術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各指代包含兩個或兩 個以上胺基酸殘基之分子。肽可為單體肽或聚合肽。 在此項技術中充分認識到，某些胺基酸取代視為具有 「保守性」。基於常見側鏈特性將胺基酸分組，且維持抗 原結合蛋白之所有或實質上所有結合親和力的組内取代視 為保守性取代，參見下表2 : 表2 ' 成貝 疏水性 met' ala ' val' leu ' ile 中性親水性 cys ' ser ' thr 酸性 asp、glu asn、gin、his、lys、arg 影響鍵定向之殘基 gly' pro 芳族 trp ' tyr ' phe 本發明提供一種與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 3 之CDRH3或其變異型CDRH3(例如 SEQ ID NO·· 82-92或 110 中之任一者）之抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白亦可中和 肌肉抑制素活性。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 145280.doc -25- 201029662 2之CDRH2或其變異型CDRH2(例如SEQ ID NO: 93-97中之 任一者）之抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白亦可中和肌肉 抑制素活性。 抗原結合蛋白除上述CDRH3或CDRH2序列以外可進一 步包含任何組合形式之一或多個CDR或所有CDR，該等 CDR係選自：CDRH1(SEQ ID NO: 1)、CDRH2(SEQ ID NO: 2)、CDRL1(SEQ ID NO: 4)、CDRL2(SEQ ID NO: 5)及 CDRL3(SEQ ID NO: 6或109);或其變異體（例如CDRH2變 異體SEQ ID NO: 93-97中之任一者）。 舉例而言，抗原結合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO: 3) 及CDRH1(SEQ ID NO: 1)或其變異體（例如CDRH3變異體 82-92或110中之任一者）。抗原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 3)及CDRH2(SEQ ID NO: 2)或其變異體（例如 CDRH3變異體SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者；或 CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97中之任一者）。抗原結合 蛋白可包含 CDRH1(SEQ ID NO: 1)及 CDRH2(SEQ ID NO: 2)及CDRH3(SEQ ID NO: 3)或其變異體（例如CDRH3變異體 SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者；或CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97 中之任一者）。 抗原結合蛋白可包含CDRL1(SEQ ID NO: 4)及CDRL2 (SEQ ID NO: 5)或其變異體。抗原結合蛋白可包含CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3(SEQ ID NO: 6 或 109)或其變異 體。抗原結合蛋白可包含CDRL1(SEQ ID NO: 4)、CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3(SEQ ID NO: 6或 109)或其變異 145280.doc -26- 201029662 體。
抗原結合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO: 3)及CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如CDRH3變異體SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者）。抗原結合蛋白可包含 CDRH3(SEQ ID NO: 3)、CDRH2(SEQ ID NO: 2)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如CDRH3變異體SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者；或CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97中之任一者）。抗原結合蛋白可包含CDRH3(SEQ 參 ID NO: 3) ' CDRH2(SEQ ID NO: 2) ' CDRL2(SEQ ID NO: 5)及CDRL3(SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如CDRH3 變異體SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者；或CDRH2變 異體SEQ ID NO: 93-97中之任一者）。 抗原結合蛋白可包含CDRH1(SEQ ID NO: 1)、CDRH2 (SEQ ID NO: 2)、CDRH3(SEQ ID NO: 3)、CDRL1(SEQ ID NO: 4)、CDRL2(SEQ ID NO: 5)及 CDRL3(SEQ ID NO: 6或 φ 109)或其變異體（例如CDRH3變異體SEQ ID NO: 82-92或 110中之任一者；或CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97中之 任一者）。 - 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 7之可變域序列之相應CDRH3或其變異型CDRH3的抗原結 合蛋白。該抗原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素活性。抗原 結合蛋白可為嵌合抗體或人類化抗體。 抗原結合蛋白可進一步包含一或多個或所有選自SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8之可變域序列的相應CDR或其變異 145280.doc -27- 201029662 型 CDR。 舉例而言，抗原結合蛋白可包含相應CDRH3及相應 CDRH1或其變異體。抗原結合蛋白可包含相應CDRH3及 相應CDRH2或其變異體。抗原結合蛋白可包含相應 CDRH1、相應CDRH2及相應CDRH3或其變異體。 抗原結合蛋白可包含相應CDRL1及相應CDRL2或其變異 體。抗原結合蛋白可包含相應CDRL2及相應CDRL3或其變 異體。抗原結合蛋白可包含相應CDRL1、相應CDRL2及相 應CDRL3或其變異體。 抗原結合蛋白可包含相應CDRH3及相應CDRL3或其變異 體。抗原結合蛋白可包含相應CDRH3、相應CDRH2及相 應CDRL3或其變異體。抗原結合蛋白可包含相應CDRH3、 相應CDRH2、相應CDRL2及相應CDRL3或其變異體。 抗原結合蛋白可包含相應CDRH1、相應CDRH2、相應 CDRH3、相應CDRL1、相應CDRL2及相應CDRL3或其變異 體。 相應 CDR 可參考 Kabat (1987)、Chothia (1989)、AbM 或 接觸方法來定義。各方法之一種定義可見於表1中且可應 用於參考重鏈可變域SEQ ID NO: 7及參考輕鏈可變域SEQ ID NO: 8以確定相應CDR。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含含有SEQ ID NO: 7之Kabat殘基95-101之結合單元H3或變異型H3的抗原 結合蛋白。該抗原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素。 抗原結合蛋白可進一步包含一或多個或所有選自以下之 145280.doc 28· 201029662 結合單元··包含SEQ ID NO: 7之Kabat殘基31-32之HI、包 含 SEQ ID NO: 7 之 Kabat 殘基 52-56 之 H2、包含 SEQ ID NO: 8 之 Kabat 殘基 30-34 之 LI、包含 SEQ ID NO: 8 之 Kabat 殘基 50-55 之 L2 及包含 SEQ ID NO: 8 之 Kabat 殘基 89-96 之 L3， 或變異型結合單元。 舉例而言，抗原結合蛋白可包含結合單元H3及結合單元 H1或其變異體。抗原結合蛋白可包含結合單元H3及結合 單元H2或其變異體。抗原結合蛋白可包含結合單元H1、 結合單元H2及結合單元H3，或其變異體。 抗原結合蛋白可包含結合單元L1及結合單元L2或其變異 體。抗原結合蛋白可包含結合單元L2及結合單元L3或其變 異體。抗原結合蛋白可包含結合單元L1、結合單元L2及結 合單元L3，或其變異體。 抗原結合蛋白可包含結合單元H3及結合單元L3或其變 異體。抗原結合蛋白可包含結合單元H3、結合單元H2及 結合單元L3，或其變異體。抗原結合蛋白可包含結合單元 H3、結合單元H2、結合單元L2及結合單元L3，或其變異 體。 抗原結合蛋白可包含結合單元H1、結合單元H2、結合 單元H3、結合單元L1、結合單元L2及結合單元L3，或其 變異體。 CDR變異體或變異型結合單元包括由至少一個胺基酸修 飾之胺基酸序列，其中該修飾可為化學修飾或胺基酸序列 之部分變更（例如不多於1 〇個胺基酸），此修飾使變異體保 145280.doc -29- 201029662 留未經修飾序列之生物特徵。舉例而言，變異體為與肌肉 抑制素結合之功能變異體。CDR胺基酸序列之部分變更可 為一至數個胺基酸之缺失或取代，或一至數個胺基酸之添 加或插入，或其組合（例如不多於10個胺基酸）。CDR變異 體或結合單元變異體在胺基酸序列中可含有任何組合形式 之1個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸取代、添加或缺 失。CDR變異體或結合單元變異體在胺基酸序列中可含有 任何組合形式之1個、2個或3個胺基酸取代、插入或缺 失。胺基酸殘基之取代可為保守性取代，例如用一個疏水 性胺基酸取代替代性疏水性胺基酸。舉例而言，白胺酸可 經纈胺酸或異白胺酸取代。 CDR LI、L2、L3、H1及H2傾向於在結構上展現有限數 目之主鏈構形之一。CDR之特定典型結構類別係由CDR長 度與環填充（loop packing)來定義，由位於CDR與構架區中 之關鍵位置處的殘基（結構決定殘基或SDR)來決定。 Mart in 及 Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815)已創造一 種定義「關鍵殘基」典型模板之自動方法。使用群集分析 來定義CDR組之典型類別，且接著藉由分析内埋式疏水物 (buried hydrophobic)、與氫鍵結之殘基及保守性甘胺酸及 脯胺酸來鑑別典型模板。可藉由將序列與關鍵殘基模板比 較且使用一致性或相似性矩陣對各模板進行記分來將抗體 序列之CDR歸類為典型類別。
Kabat編號之前的胺基酸為SEQ ID NO: 14或24之原始胺 基酸序列且Kabat編號末尾之胺基酸序列為經取代之胺基 145280.doc -30- 201029662 酸的CDR典型類別之實例包括： CDRH1 典型類別：Y32I、Y32H、Y32F、Y32T、Y32N、 Y32C、Y32E、Y32D、F33Y、F33A、F33W、F33G、 F33T、F33L、F33V、M34I、M34V、M34W、H35E、 H35N、H35Q、H35S、H35Y、H35T ;
CDRH2典型類別：N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、 N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、 I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、 Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、 N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、 V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、 N58D、N58R、N58G、N58F、N58Y ; CDRH3 典型類別：V102Y、V102H、V102I、V102S、 V102D、V102G。 D28S ' D28E、 D28T、 N30V ' N30I ' N30S、 S31N、 S31T、 S31K、 Y32H、 Y32S、 Y32R、 S34A 、 S34G ' S34N、 I29V、 N30F、 S31G、 L33M、 S34H 、 L1典型類別：D28N、 N30D、N30L、N30Y、 N30H、N30G、N30T、 Y32F、Y32N、Y32A、 L33V、L33I、L33F、 S34V > S34F ；
CDRL2典型類別：A51T、A51G、A51V ; CDRL3 典型類別：L89Q、L89S、L89G L89F、 Q90N、 Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、 S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、 145280.doc -31 - 201029662 D92S、 D92R、 D92Q、 D92H、 D92A、E93N、 E93G、 E93H、 E93T、 E93S、 E93R、 E93A、F94D、 F94Y、 F94T、 F94V、 F94L、 F94H、 F94N、F94I、 F94W、 F94P、 F94S、 L96P、 L96Y、 L96R、L96I、 L96W、 L96F。 每個CDR、每個相應CDR、每個結合單元、每個重鏈或 輕鏈可變區、每個重鏈或輕鏈及每個抗原結合蛋白可存在 多個變異型CDR典型位置，且因此本發明之抗原結合蛋白 中可存在任何取代組合。 CDR變異體或變異型結合單元之其他實例包括（使用 Kabat編號機制，其中Kabat編號之前的胺基酸為SEQ ID NO: 14或24之原始胺基酸序列且Kabat編號末尾之胺基酸 序列為經取代之胺基酸）： H2 : G55D、G55L、G55S、G55T、G55V ; H3 : Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、 P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、 V102N、V102S ; L3 : C91S。 舉例而言，與肌肉抑制素結合之本發明抗原結合蛋白可 包含SEQ ID NO: 90之CDRH3。該抗原結合蛋白可進一步 包含SEQ ID NO: 93-97中之任一者之CDRH2。詳言之， CDRH2可為SEQ ID NO: 95。抗原結合蛋白亦可包含SEQ ID NO: 109之CDRL3。抗原結合蛋白可進一步包含 CDRH1(SEQ ID NO: 1)、CDRL1(SEQ ID NO: 4)及 145280.doc -32- 201029662 CDRL2(SEQ ID NO: 5)中之任一者或其組合或全部。抗原 結合蛋白亦可中和肌肉抑制素活性。 包含所述CDR、相應CDR、變異型CDR、結合單元或變 異型結合單元之抗原結合蛋白可展示如EC5〇所示，與肌肉 抑制素結合之效能在10B3或10B3嵌合體（重鏈：SEQ ID NO: 7或25，輕鏈：SEQ ID NO: 8)所示之效能的10倍以内 或5倍以内。如EC50所示，與肌肉抑制素結合之效能可由 ELISA分析法得到。 抗原結合蛋白可能會或可能不會在重鏈之胺基酸Kabat 位置54處用天冬胺酸（D)或麩醯胺酸（Q)取代天冬醯胺（N)。 抗原結合蛋白變異體可能會或可能不會在輕鏈之胺基酸位 置91處用絲胺酸（S)取代半胱胺酸（C)。舉例而言，抗原結 合蛋白在輕鏈之位置91處具有絲胺酸（S)殘基且在重鏈之 位置54處具有天冬醯胺（N)。 抗原結合蛋白可變重鏈可在位置28處具有絲胺酸（S)或 蘇胺酸（T)胺基酸殘基；及/或在位置105處具有蘇胺酸（T) 或麩醯胺酸（Q)胺基酸殘基。抗原結合蛋白可變輕鏈可在 位置16處具有精胺酸（R)或甘胺酸（G)胺基酸殘基；及/或在 位置71處具有酪胺酸（Y)或苯丙胺酸（F)胺基酸殘基；及/或 在位置100處具有丙胺酸（A)或麩醯胺酸（Q)胺基酸殘基。 舉例而言，抗原結合蛋白可在可變重鏈之位置28處包含絲 胺酸（S)，在位置105處包含麩醯胺酸（Q);及/或在可變輕 鏈之位置16處包含甘胺酸（G)，在位置71處包含酪胺酸 (Y)，及在位置100處包含麩醯胺酸（Q)。 145280.doc -33- 201029662 如以上所討論，CDR之特定典型結構類別係由CDR長度 與環填充來定義，由位於CDR與構架區中之關鍵位置處的 殘基來決定。因此，除SEQ ID NO: 1-3中所列之CDR、 SEQ ID NO: 82-97及SEQ ID NO: 109中所列之變異型 CDR、相應CDR、結合單元或其變異體以外，本發明之抗 原結合蛋白之典型構架殘基亦可包括（使用Kabat編號）： 重鏈：在位置2處，V、I或G;在位置4處，L或V;在位 置20處’ L、I、Μ或V ;在位置22處，C ;在位置24處， Τ、A、V、G或S ;在位置26處，G ;在位置29處，I、F、 ® L或S ;在位置36處，W ;在位置47處，W或Y ;在位置48 處，I、M、V或L;在位置69處，I、L、F、M或V;在位 置78處’ A、L、V、Y或F;在位置80處，L或M;在位置 9〇處’ Y或F;在位置92處，C;及/或在位置94處，R、 K、G、S、Η或N ;及/或 輕鏈：在位置2處，I、L或V;在位置3處，V、Q、L或 E;在位置4處，Μ或L;在位置23處，C;在位置35處， W ·’在位置％處’ γ、l或F ;在位置牝處，S、L、R或V ; 粵 在位置49處，γ、H、F或Κ ;在位置71處，Υ或F ;在位置 88處，C;及/或在位置98處，F。 本發明之抗原結合蛋白中可存在上述構架位置中之任一 者其任何組合或全部。每個重鍵或輕鍵可變區、每個重 鏈或輕鏈及每個抗原結合蛋白可存在多個變異型構架典型 位置，且因此本發明之抗原結合蛋白中可存在任何組合。 舉例而言’重鏈可變構架可在位置2處包含V，在位置4 145280.doc -34- 201029662 處包含L，在位置20處包含V，在位置22處包含C，在位置 24處包含A，在位置26處包含G，在位置29處包含F，在位 置36處包含W，在位置47處包含W，在位置48處包含Μ， 在位置69處包含Μ，在位置78處包含Α，在位置80處包含 Μ ’在位置90處包含Y ’在位置92處包含C，及在位置94處 包含R。舉例而言，輕鏈可變構架可在位置2處包含I，在 位置3處包含Q，在位置4處包含Μ，在位置23處包含C，在 位置35處包含W，在位置36處包含F，在位置46處包含S， 在位置49處包含Υ，在位置71處包含Υ，在位置88處包含 C，及在位置98處包含F。 本文所述之一或多個CDR、相應CDR、變異型CDR或結 合單元可在人類構架之情形下存在，例如以人類化可變域 或嵌合可變域存在。 人類化重鏈可變域可在構架區與SEQ ID NO: 10之人類 受體可變域序列具有75%或75%以上、80%或80%以上、 85%或85%以上、90%或90%以上、95%或95%以上、98% 或98%以上、99%或99%以上或100%之一致性的受體抗體 構架内包含SEQ ID NO: 1-3中所列之CDR ; SEQ ID NO: 82-97及110及SEQ ID NO: 109中所列之變異型CDR;相應 CDR ;結合單元；或其變異體。人類化輕鏈可變域可在構 架區與SEQ ID NO: 11之人類受體可變域序列具有75%或 75%以上、80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90% 以上、95%或95%以上、98°/。或98%以上、99%或99%以上 或100%之一致性的受體抗體構架内包含SEQ ID NO: 4-6中 145280.doc -35- 201029662 所列之 CDR ; SEQ ID NO: 82-97及 110及 SEQ ID NO: 109 中 所列之變異型CDR ;相應CDR ;結合單元；或其變異體。 在 SEQ ID NO: 10與 SEQ ID NO: 11 中，CDRH3之位置已由 X表示。SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11中之10個X殘基為 CDR位置之佔位，而非各CDR中胺基酸序列數目之量度。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含以下重鍵與 輕鏈可變區組合中之任一者的抗原結合蛋白：l〇B3(SEQ ID NO: 7與 SEQ ID NO: 8)、10B3C(SEQ ID NO: 25與 SEQ ID NO: 8)或 10B3C-C91S(SEQ ID NO: 25 與 SEQ ID NO: 21)。該抗原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含選自SEQ ID NO: 12、13、14、22及23中之任一者之重鏈可變區的抗原 結合蛋白。該抗原結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 15、 16、17、18或24中之任一者之輕鍵可變區。任一重鏈可變 區均可與任一輕鏈可變區組合。抗原結合蛋白亦可中和肌 肉抑制素。 抗原結合蛋白可包含以下重鏈與輕鍵可變區組合中之任 一者：H0L0(SEQ ID NO: 12 與 SEQ ID NO: 15)、 H0L1(SEQ ID NO: 12與 SEQ ID NO: 16)、H0L2(SEQ ID NO: 12與 SEQ ID NO: 17)、h〇L3(SEQ ID NO: 12與 SEQ ID NO: 18)、H1L0(SEQ id NO: 13 與 SEQ ID NO: 15)、 H1L1(SEQ ID NO: 13 與 SEQ ID NO: 16)、H1L2(SEQ ID NO: 13與 SEQ ID NO: 17)、H1L3(SEQ ID NO: 13與 SEQ ID NO: 18)、H2L0(SEQ ID NO: 14 與 SEQ ID NO: 15)、 145280.doc -36- 201029662 H2L1(SEQ ID NO: 14與 SEQ ID NO: 16)、H2L2(SEQ ID NO: 14與 SEQ ID NO: 17)、H2L3(SEQ ID NO: 14與 SEQ ID NO: 18)、H2L2-C91S(SEQ ID NO: 14與 SEQ ID NO: 24)。 抗體重鏈可變區可與SEQ ID NO: 7、25、12、13、14、 19、20、22或23中之任一者具有75%或75%以上、80%或 80°/。以上、85%或85%以上、90%或90%以上、95%或95% 以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%之一致 性。抗體輕鏈可變區可與SEQ ID NO: 8、15、16、17、 參 18、 21或24中之任一者具有75%或75%以上、80%或80%以 上、85%或85%以上、90%或90%以上、95%或95%以上、 98%或98%以上、99%或99%以上或100%之一致性。 可在序列全長上確定SEQ ID NO: 7、25、12、13、14、 19、 20、22、23、8、15、16、17、18、21 或 24 之變異體 的一致性百分比。 抗體重鏈可變區可為SEQ ID NO: 7、25、12、13、14、 φ 19、20、22或23中之任一者之變異體，該變異體含有30 個、25個、20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5 個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代、插入或缺失。抗體 '· 輕鏈可變區可為 SEQ ID NO: 8、15、16、17、18、21 或 24 . 中之任一者之變異體，該變異體含有30個、25個、20個、 15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個 或1個胺基酸取代、插入或缺失。 舉例而言，上述典型CDR及典型構架殘基取代亦可以至 少75%—致或含有至多30個胺基酸取代之變異型序列存在 145280.doc -37- 201029662 於變異型重鏈或輕鏈可變區中。 取代可在上述任一抗體重鏈可變區中包含以下任一者： Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、 W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N 及 VI02S。除任一所述取代以外，抗體重鏈可變區亦可在上 所任一抗體重鏈可變區中包含以下任一取代·· G55D、 G55L、G55S、G55T或 G55V。 抗體重鏈可變區可具有帶有取代F100G_YiSEQ ID NO: 14之序列。除取代F100G_Y以外，亦可存在以下任一取 代：G55D、G55L、G55S、G55T 或 G55V。詳言之，抗體 重鏈可變區可具有帶有以下取代之SEQ ID NO: 14之序 列：F100G_Y ;或F100G_Y&G5 5S。抗體重鏈可變區可與 SEQ ID NO: 24之序列之輕鏈可變區配對。 任一重鏈可變區可與適合之人類恆定區組合。任一輕鏈 可變區可與適合之怪定區組合。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含以下重鏈與 輕鏈組合中之任一者的抗原結合蛋白：10B3C(SEQ ID NO: 26與 SEQ ID NO: 27)或 10B3C-C91S(SEQ ID NO: 26與 SEQ ID NO: 3 7)。該抗原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素。 本發明亦提供一種與肌肉抑制素結合且包含選自SEQ ID NO: 28、29、30、35、36、38、39、98 或 99 中之任一者之 重鏈的抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 31、32、33、34或40中之任一者之輕鏈。任一重鏈可 與任一輕鏈組合。抗原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素。 145280.doc -38 - 201029662 抗原結合蛋白可包含以下重鏈與輕鏈組合中之任一者： H0L0(SEQ ID NO: 28與 SEQ ID NO: 31)、H0L1(SEQ ID NO: 28與 SEQ ID NO·· 32)、H0L2(SEQ ID NO: 28與 SEQ ID NO: 33)、H0L3(SEQ ID NO: 28 與 SEQ ID NO: 34)、 H1L0(SEQ ID NO: 29與 SEQ ID NO: 31)、H1L1(SEQ ID NO: 29與 SEQ ID NO: 32)、H1L2(SEQ ID NO: 29與 SEQ ID NO: 33)、H1L3(SEQ ID NO: 29 與 SEQ ID NO: 34)、 H2L0(SEQ ID NO: 30與 SEQ ID NO: 31)、H2L1(SEQ ID NO: 30與 SEQ ID NO: 32)、H2L2(SEQ ID NO: 30與 SEQ ID NO: 33)、H2L3(SEQ ID NO: 30與 SEQ ID NO: 34)、H2L2-C91S(SEQ ID NO: 30 與 SEQ ID NO: 40)、Fc 失能之 H2L2-C91S_F100G_Y(SEQ ID NO: 98 與 SEQ ID NO: 40)或 Fc 失能 之 H2L2-C91S—G55S_F100G_Y(SEQ ID NO: 99 與 SEQ ID NO: 40)。 抗體重鏈可與 SEQ ID NO: 26、28、29、30、35、36、 38、39、98或99中之任一者具有75%或75%以上、80%或 80%以上、85%或85%以上、90%或90%以上、95%或95% 以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100%之一致 性。抗體輕鏈可與SEQ ID NO: 27、31、32、33、34、37 或40中之任一者具有75%或75%以上、80%或80%以上、 85%或85%以上、90%或90%以上、95%或95%以上、98% 或98%以上、99%或99%以上或100%之一致性。 可在序列長度上確定SEQ ID NO: 26、28、29、30、 35、36、38、39、98、99、27、31、32、33、34、37或40 145280.doc -39- 201029662 之變異體的一致性百分比。 抗體重鏈可為 SEQ ID NO: 26、28、29、30、35、36、 38、39、98或99中之任一者之變異體，該變異體含有30 個、25個、20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5 個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代、插入或缺失。抗體 輕鏈可為 SEQ ID NO: 27、31、32、33、34、37 或 40 中之 任一者之變異體，該變異體含有30個、25個、20個、15 個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或 1個胺基酸取代、插入或缺失。 舉例而言，上述典型CDR及典型構架殘基取代亦可以至 少75%—致或含有至多30個胺基酸取代之變異型序列存在 於變異型重鏈或輕鏈中。 取代可在上述任一抗體重鏈中包含以下任一者： Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、 W100E_F、F100G_S、F100G_N、F100G_Y、V102N 及 VI02S。除任一所述取代以外，抗體重鏈亦可在上述任一 抗體重鏈中包含以下任一取代：G55D、G55L、G55S、 G55T或 G55V。 抗體重鏈可具有帶有取代F100G_YiSEQ ID ΝΟ··3 0之序 列。除取代F100G_Y以外，亦可存在以下任一取代： G55D、G55L、G55S、G55T 或 G55V。詳言之，抗體重鏈 可具有帶有以下取代之SEQ ID NO:30之序列：F100G_Y ; 或F100G_Y& G55S。抗體重鏈可與SEQ ID ΝΟ··40之序列 之輕鍵配對。 145280.doc -40- 201029662 如上所述之抗原結合蛋白，例如藉由化學修飾及/或一 或多個胺基酸殘基之插入、缺失或取代而具有序列部分變 更之變異體，或與上述任一序列具有75%或75%以上、 80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90%以上、95% 或95%以上、98%或98%以上或99%或99%以上之一致性的 變異體可展示如EC5Q所示，與肌肉抑制素結合之效能在 10B3或10B3嵌合體（重鏈：SEQ ID NO: 7或25，輕鏈： SEQ ID NO: 8)所示之效能的10倍以内或5倍以内。如EC50 所示，與肌肉抑制素結合之效能可由ELIS A分析法得到。 本發明之抗原結合蛋白可具有Fc失能。一種達成Fc失能 之方式包含重鏈恆定區之位置23 5及237(EU索引編號）處丙 胺酸殘基之取代。舉例而言，抗原結合蛋白可具有Fc失能 且包含SEQ ID NO: 98(人類化重鏈：Fc失能之H2_F100G_Y) 或SEQ ID NO: 99(人類化重鏈：Fc失能之H2_G55S-F100G—Y)之序列。或者，抗原結合蛋白質可具有Fc失能 且在位置235及237處不含丙胺酸取代。 抗原結合蛋白可與肌肉抑制素結合且與包含SEQ ID NO: 7或25之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區序 列的參考抗體競爭結合肌肉抑制素；其中該抗原結合蛋白 不與肌肉抑制素之肽片段結合。肌肉抑制素之肽片段可由 SEQ ID NO: 81(CCTPTKMSPINMLY)組成。肌肉抑制素之 肽片段可為由肌肉抑制素序列之至多14個胺基酸組成之任 何片段。肌肉抑制素之肽片段可呈線性。肌肉抑制素之肽 片段可為肌肉抑制素序列（包括全長序列）之任何片段，其 145280.doc -41 · 201029662 中該肽片段呈線性。此可使用實例2.4中所述之方法，使 用SRU BIND讀取器及捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之生物 感測器板上之生物素標記肽來評估。 或者，抗原結合蛋白可與肌肉抑制素結合且與包含SEQ ID NO·. 7或25之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 8之輕鏈可 變區序列的參考抗體競爭結合肌肉抑制素；其中該抗原結 合蛋白不毳由SEQ ID NO: 74組成之人工肽序列（人工肌肉 抑制素線性肽37-SGSGCCTPTKMSPINMLY)結合。該人工 肽序列可由表7中所述之任一序列組成。人工肽序列可呈 線性。此可使用實例2.4中所述之方法，使用SRU BIND讀 取器及捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之生物感測器板上之生 物素標記肽來評估。 參考抗體可包含以下重鏈與輕鏈組合：l〇B3C(SEQ ID NO: 26與 SEQ ID NO: 27)。重鏈序列 SEQ ID NO: 26 包含可 變域序列SEQ ID NO: 25 ;且輕鏈序列SEQ ID NO: 27包含 可變域序列SEQ ID NO: 8。 抗原結合蛋白與參考抗體之間的競爭可由競爭ELISA來 測定。針對中和肌肉抑制素之競爭可由以下任一者或其組 合來測定：競爭結合肌肉抑制素，例如如ELISA、FMAT 或BIAcore所測定；競爭抑制肌肉抑制素與ActRIIb受體結 合；及在A204分析法中競爭抑制細胞信號傳導，從而抑制 螢光素酶表現。競爭性抗原結合蛋白可與同一抗原決定 基、重疊抗原決定基或與參考抗體所結合之抗原決定基極 接近的抗原決定基結合。 145280.doc -42- 201029662 抗原結合蛋白可能不與肌肉抑制素肽片段或人工肽序列 顯著結合。抗原結合蛋白可能不會以1:1至1:1 〇之抗原結合 蛋白與肽之比率範圍分別結合肌肉抑制素肽片段或人工肽 序列。 抗原結合蛋白與肌肉抑制素肽片段或人工肽序列之間的 結合或結合缺乏可由ELISA或由SDS PAGE使用還原條件 來測定。舉例而言，抗原結合蛋白與線性全長肌肉抑制素 序列之結合或結合缺乏可由還原SDS PAGE來測定。 本文所述之抗原結合蛋白可能不與肌肉抑制素之肽片段 結合。肌肉抑制素之肽片段可由SEQ ID NO: 81 (CCTPTKMSPINMLY)組成。肌肉抑制素之肽片段可為由 肌肉抑制素序列之至多1 4個胺基酸組成之任何片段。肌肉 抑制素之肽片段可呈線性。肌肉抑制素之肽片段可為肌肉 抑制素序列（包括全長序列）之任何片段，其中該序列呈線 性。此可使用實例2·4中所述之方法，使用SRU BIND讀取 φ 器及捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之生物感測器板上之生物 素標記肽來評估。 或者，本文所述之抗原結合蛋白可能不與由SEQ ID ' NO: 74組成之人工肽序列（人工肌肉抑制素線性肽37- ； SGSGCCTPTKMSPINMLY)結合。該人工肽序列可由表7中 所述之任一序列組成。人工肽序列可呈線性。此可使用實 例2.4中所述之方法，使用SRU BIND讀取器及捕捉於塗有 抗生蛋白鏈菌素之生物感測器板上之生物素標記肽來評 估。 145280.doc -43- 201029662 抗原〜合蛋白可能不與肌肉抑制素肽片段或人工肽序列 顯著、° σ。抗原結合蛋白可能不會以1:1至1:10之比率範圍 分別結合肌肉抑制素肽片段或人工肽序列。 抗原結合蛋白與肌肉抑制素肽片段或人工肽序列之間的 、、。σ或結合缺乏可由ELISA或由SDS PAGE使用還原條件 來測疋。舉例而言’抗原結合蛋白與線性全長肌肉抑制素 序歹丨之結合或結合缺乏可由還原（亦即變性）SDS PAGE來測 疋。舉例而言，可使用SRU BIND讀取器及捕捉於塗有抗 生蛋白鍵菌素之生物感測器板上之生物素標記肽進行實例 2.4中所述之方法。實例2 4中之數據表明可結合構形 序列，此可證實10B3有益於活體内結合及中和原生肌肉抑 制素以供治療性處理用。 本文所述之抗原結合蛋白所結合的肌肉抑制素之抗原決 疋基可為構形抗原決定基或不連續抗原決定基。本文所述 之抗原結合蛋白可能不與肌肉抑制素上之線性抗原決定基 、’·〇 & ’例如抗原結合蛋白可能不與經還原或經變性之肌肉 抑制素樣品結合。構形抗原決定基或不連續抗原決定基可 與肌肉抑制素受體結合位點一致、相似或重疊。當肌肉抑 制素呈其成熟形式且作為與另一肌肉抑制素分子之二聚體 (均一聚體）之一部分時，抗原決定基可為易接近的。當肌 肉抑制素呈其成熟形式且作為與所述其他肌肉抑制素結合 刀子之四聚體之一部分時，抗原決定基亦可為易接近的。 抗原決定基可分布於兩個肌肉抑制素多肽上。此種類型之 不連續抗原決定基可包含來自各肌肉抑制素分子之序列。 145280.doc -44· 201029662 在二聚體三級及四級結構之情形下，該等序列可彼此足夠 接近’以形成抗原決定基且由抗原結合蛋白結合。構形抗 原決定基及/或不連續抗原決定基可由例如CLIPS™ (Pepscan Systems)之已知方法來鑑別。 使用肽掃描（pepscan)_骨架上之化學鍵聯免疫原性肽 (Chemically Linked Immunogenic Peptides on Scaffolds > CLIPS)技術對10B3C之肌肉抑制素結合位點進行後續分 析’表明肌肉抑制素之「PRGSaGPCCTPTKMS」胺基酸 序列可為嵌合抗體之結合位點。肽掃描方法使用限制性 狀0 在人類中或鼠類動物模型中，抗原結合蛋白之活體内半 衰期可為至少6小時、至少r、至少2天、至少3天、至少 4天、至少5天、至少7天或至少9天。 几α蛋白所結合之肌肉抑制素多肽可為重組多肽。 肌肉抑制素可於溶液中或可附著於固體表面。舉例而古，
=:Γ:=，:如磁性珠粒。肌肉抑制;可 素標5己。可使用與肌肉抑制素結合之生物素分子以 生物素-抗生蛋白鏈菌素於固體表 肉抑制素固定固體表面上。 豸表面上偶合來將肌 抗原結合蛋白可源自大鼠、小 狼、舊世 長類動物（例如獼 抗體或嵌合抗體。 &原結合蛋白可為人類化 抗原結合蛋白可包含恆定區， 類。恆定其了八有任何同型或子 ^可具有砂同型，例如邮卜收⑽、 145280.d〇c -45- 201029662
IgG4或其變異體。抗原結合蛋白恆定區可為IgGl。 抗體之Fc效應部分之突變可用於改變FcRn與抗體之間相 互作用之親和力以調節抗體轉換。可延長抗體之活體内半 衰期。此舉將有益於患者群體，屆時由於維持活體内IC50 較長時段而可達成最大劑量及最大給藥頻率。因為肌肉抑 制素為可溶性標靶，所以可整體或部分移除抗體之Fc效應 功能。此移除可使安全概況增強。 包含恆定區之抗原結合蛋白可具有低ADCC及/或補體活 化或效應功能。恆定域可包含IgG2或IgG4同型之天然失能 恆定區，或突變IgGl恆定域。適合之修飾的實例描述於 EP0307434中。一種達成Fc失能之方式包含重鏈恆定區之 位置23 5及23 7斤11索引編號）處丙胺酸殘基之取代。 抗原結合蛋白可包含一或多個選自突變恆定域之修飾以 使抗體具有增強之效應功能/ADCC及/或補體活化。適合 之修飾的實例描述於Shields等人，J. Biol. Chem (2001) 276:6591-6604 ; Lazar等人，PNAS (2006) 103:4005-4010 ； 及 US6737056、W02004063351 及 W02004029207 中 ° 抗原結合蛋白可包含具有經改變之糖基化概況的恆定域 以使該抗原結合蛋白具有增強之效應功能/ADCC及/或補 體活化。產生具有經改變之糖基化概況之抗原結合蛋白的 適合方法之實例描述於W02003/011878、W02006/014679 及EP1229125中。 本發明亦提供一種編碼如本文所述之抗原結合蛋白之核 酸分子。該核酸分子可包含編碼以下之序列：（i)一或多個 145280.doc -46- 201029662 CDRH、重鏈可變序列或全長重鏈序列；及（ii) 一或多個 CDRL、輕鏈可變序列或全長輕鏈序列，其中⑴及（ii)在同 一核酸分子上。或者，編碼本文所述之抗原結合蛋白之核 酸分子可包含編碼以下之序列：（a)—或多個CDRH、重鏈 可變序列或全長重鏈序列；或（b) —或多個CDRL、輕鏈可 變序列或全長輕鏈序列，其中（a)及（b)在獨立核酸分子 上。 編碼重鏈之核酸分子可包含SEQ ID NO: 41，且編碼輕 鏈之核酸分子可包含SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 52。 編碼重鏈之核酸分子可包含SEQ ID NO: 43、44或45中 之任一者。編碼輕鏈之核酸分子可包含SEQ ID NO: 46、 47、48、49或55中之任一者。編碼抗原結合蛋白之核酸分 子可包含以下重鏈與輕鏈組合中之任一者：H0L0(SEQ ID NO: 43與 SEQ ID NO: 46)、H0L1(SEQ ID NO: 43與 SEQ ID NO: 47)、H0L2(SEQ ID NO: 43 與 SEQ ID NO: 48)、 H0L3(SEQ ID NO: 43與 SEQ ID NO: 49)、H1L0(SEQ ID NO: 44與 SEQ ID NO: 46)、H1L1(SEQ ID NO: 44與 SEQ ID NO: 47)、H1L2(SEQ ID NO: 44 與 SEQ ID NO: 48)、 H1L3(SEQ ID NO: 44與 SEQ ID NO: 49)、H2L0(SEQ ID NO: 45與 SEQ ID NO: 46)、H2L1(SEQ ID NO: 45與 SEQ ID NO: 47)、H2L2(SEQ ID NO: 45 與 SEQ ID NO: 48)、 H2L3(SEQ ID NO: 45與 SEQ ID NO: 49)、H2L2-C91S(SEQ ID NO: 45與 SEQ ID NO: 55)。 上述核酸分子亦可編碼具有以下任一取代之重鏈： 145280.doc • 47- 201029662 Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、 W100E F、F100G_N、F100G_Y、F100G_S、V102N 及 VI02S。除任一所述取代以外，核酸分子亦可編碼包含以 下任一取代之重鏈：G55D、G55L、G55S、G55T或 G55V。 核酸分子可具有帶有編碼F100G_Yi取代的SEQ ID NO:45之序列。除取代F100G_Y以外，亦可存在以下任一 取代：G55D ' G55L、G55S、G55T 或 G55V。詳言之，核 酸分子可具有帶有編碼以下之取代的SEQ ID NO: 45之序 列：卩1000_丫或卩1000_丫及0558。編碼重鏈之核酸分子可 與編碼輕鏈之SEQ ID NO:55之序列的核酸分子配對。 本發明亦提供一種包含如本文所述之核酸分子的表現載 體。亦提供一種包含如本文所述之表現載體的重組宿主細 胞。 本文所述之抗原結合蛋白可於適合之宿主細胞中產生。 產生如本文所述之抗原結合蛋白之方法可包含培養如本文 所述之宿主細胞及回收該抗原結合蛋白之步驟。重組經轉 型、轉染或轉導之宿主細胞可包含至少一個表現卡匣，藉 以該表現卡匣包含編碼本文所述之抗原結合蛋白之重鏈的 聚核苷酸且進一步包含編碼本文所述之抗原結合蛋白之輕 鏈的聚核苷酸。或者，重組經轉型、轉染或轉導之宿主細 胞可包含至少一個表現卡匣，藉以第一表現卡匣包含編碼 本文所述之抗原結合蛋白之重鏈的聚核苷酸，且該宿主細 胞進一步包含含有編碼本文所述之抗原結合蛋白之輕鏈之 145280.doc -48- 201029662 聚核苷酸的第二卡匣。經穩定轉型之宿主細胞可包含含有 一或多個編碼本文所述之抗原結合蛋白之重鏈及/或輕鏈 之表現卡匣的載體。舉例而言，該等宿主細胞可包含編碼 輕鏈之第一載體及編碼重鏈之第二載體。 宿主細胞可為真核細胞，例如哺乳動物細胞。該等細胞 株之實例包括CH◦或NS0。宿主細胞可培養於例如無血清 培養基之培養基中。抗原結合蛋白可由宿主細胞分泌至培 養基中。就該含有抗原結合蛋白之培養基而言，可將抗原 結合蛋白純化為至少95%或95%以上（例如98%或98%以 上）。 可提供一種包含抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑 的醫藥組合物。可提供一種包含醫藥組合物以及使用說明 書的分裝部分之套組（kit-of-parts)。為方便起見，該套組 可包含預定量之試劑與使用說明書。 抗體結構 完整抗體 基於恆定區之胺基酸序列，來自大多數脊椎動物物種之 抗體之輕鏈可歸類為兩種稱作κ及λ之類型之一。視該等抗 體之重鏈之恆定區的胺基酸序列而定，人類抗體可歸類為 五種不同類別，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA可 進一步細分成子類，IgGl、IgG2、IgG3及IgG4 ;及IgAl及 IgA2。物種變異體存在於至少具有IgG2a、IgG2b之小鼠及 大鼠中。 可變區之較保守部分稱作構架區（FR)。完整重鏈及輕鏈 145280.doc -49- 201029662 之可變域各包含由三個CDR連接之四個FR。各鏈中之CDR 係由該等FR區極接近地保持在一起且與來自另一鏈之CDR 一起促成抗體之抗原結合位點形成。 恆定區不直接涉及於抗體與抗原之結合中，但展現各種 效應功能，諸如參與抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、經由與Fey受體結合之吞噬作用、經由新生Fc受 體（FeRn)之半衰期/清除率及經由補體級聯之Clq組份之補 體依賴性細胞毒性。 已報導人類IgG2恆定區基本上缺乏由經典路徑活化補體 或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。已報導IgG4恆定區缺 乏由經典路徑活化補體之能力且僅微弱地介導抗體依賴性 細胞毒性。基本上缺乏此等效應功能之抗體可稱為『非溶 解性』抗體。 人類抗體 可由熟習此項技術者所知之許多方法來產生人類抗體。 可由融合瘤方法，使用人類骨髓瘤或小鼠-人類異源骨髓 瘤細胞株來製得人類抗體，參見Kozbor (1984) J. Immunol 133， 3001 及 Brodeur， Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)。替代性方法包括使用噬菌體文庫或轉殖基因小 鼠，兩者均利用人類可變區譜（參見Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23)。 若干轉殖基因小鼠品系當前可用，其中該等品系之小鼠 145280.doc -50- 201029662 免疫球蛋白基因座已經人類免疫球蛋白基因區段置換（參 見 Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996)
Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156)。一旦進行抗原攻毒，該等小鼠即 能夠產生可自其中選擇相關抗體之人類抗體譜。 噬菌體呈現技術可用於產生人類抗原結合蛋白（及其片 段），參見McCafferty (1990) Nature 348: 552-553及Griffiths 等人，（1994) EMBO 13: 3245-3260。 親和力成熟技術（Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783) 可用於改良結合親和力，其中初級人類抗體之親和力係藉 由用天然存在之變異體依序置換Η鏈及L鏈可變區且基於 改良之結合親和力進行選擇而改良。此技術之變型，諸如 「抗原決定基印記（epitope imprinting)」當前亦可用，參 見例如 WO 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 *> 嵌合抗體及人類化抗體 通常使用重組DNA方法產生嵌合抗體。使用習知程序， 例如藉由使用能夠與編碼抗體之Η鏈及L鏈之基因特異性 結合的寡核苷酸探針來分離編碼抗體之DNA(例如cDNA) 並對其進行定序。融合瘤細胞充當該DNA之典型來源。一 旦分離DNA，即將該DNA置於表現載體中，隨後使該等表 現載體轉染至不會以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞 (諸如大腸桿菌細胞、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞） 中，從而合成抗體。DNA可藉由用人類L鏈及Η鏈之編碼 145280.doc -51 - 201029662 序列取代相應非人類（例如鼠類）Η及L恆定區來修飾，參見 例如 Morrison (1984) PNAS 81: 685 1。 免疫原性之大幅降低可藉由僅將非人類（例如鼠類）抗體 (「供體」抗體）之CDR移植至人類構架（「受體構架」）及 值定區上以產生人類化抗體來達成（參見jones等人， (1986) Nature 321: 522-525 ;及 Verhoeyen 等人，（1988)
Science 239: 1534-1536)。然而，CDR移植本身可能不會 完全保留抗原結合特性，且常常發現若欲恢復顯著抗原結 合親和力’則在人類化分子中需要保存供體抗體之一些構 架殘基（有時稱為「回復突變」）（參見Queen等人，（1989) PNAS 86: 1〇,〇29-10,033 ; Co等人，（1991) Nature 351: 501-502)。在此情況下，自資料庫中選擇與非人類供體抗 體顯示最大序列同源性之人類可變區，以提供人類構架 (FR)。可自人類共同抗體或個別人類抗體選擇人類fr。必 要時’可將來自供體抗體之關鍵殘基取代至人類受體構架 中以保存CDR構形。對抗體進行電腦模擬可用於幫助鑑別 該等結構上重要之殘基，參見WO 99/48523。 或者，可由「面飾（veneering)」方法達成人類化。對獨 特人類及鼠類免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之統計分析揭 不人類抗體與鼠類抗體中所曝露殘基之精確型態不同，且 大多數個別表面位置強烈偏向於少量不同殘基（參見Padlan 等人 ’（1991) Mol· Immunol. 28: 489-498 ;及 Pedersen 等 人 ’（1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973)。因此，有可能藉 由置換非人類Fv之構架區中所曝露之殘基（其不同於人類 145280.doc •52- 201029662 抗體中通常所見之彼等殘基）來降低非人類Fv之免疫原 性。因為蛋白質抗原性可能與表面可接近性有關，所以表 面殘基之置換可足以使小鼠可變區對人類免疫系統而言 「不可見」（亦參見Mark等人，（1994)，Handbook of Experimental Pharmacology 1 第 1.13 卷：The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag，105-134)° 此 人類化程序稱為「面飾」，因為僅改變抗體表面，而支撐 殘基保持原狀。其他替代性方法包括W004/006955中所述 之方法及HumaneeringTM程序（Kalobios)，該程序利用細菌 表現系統且產生序列接近於人類生殖系之抗體（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, 2007年 1月，San Diego, California)。 雙特異性抗原結合蛋白 雙特異性抗原結合蛋白為對至少兩個不同抗原決定基具 有結合特異性之抗原結合蛋白。製造該等抗原結合蛋白之 方法在此項技術中為已知的。傳統上，重組產生雙特異性 抗原結合蛋白係基於兩個免疫球蛋白Η鏈-L鏈對之共同表 現，其中兩個Η鏈具有不同結合特異性，參見Millstein等 人，（1983) Nature 305: 537-539 ; WO 93/08829 ;及 Traunecker等人，（1991) EMBO 10: 3655-3659。由於Η鍵 及L鏈之隨機分配，故產生10種不同抗體結構之可能混合 物，其中僅一者具有所要結合特異性。替代性方法涉及使 具有所要結合特異性之可變域與包含至少一部分鉸鏈區、 CH2區及CH3區之重鏈恆定區融合。含有輕鏈結合所必需 145280.doc • 53- 201029662 之位點的CH1區可存在於至少一種融合體中。將編碼此等 融合體之DNA及L鏈（必要時）插入獨立表現載體中且接著 共轉染至適合之宿主生物體中。然而’有可能將兩個或全 部三個鍵之編碼序列插入一個表現載體中。在一種方法 中，雙特異性抗體係由在一臂中具有第一結合特異性之Η 鏈及在另一臂中提供第二結合特異性之H-L鏈對構成，參 見 WO 94/04690。亦參見Suresh等人，（1986) Methods in
Enzymology 121: 210。 抗原結合片段 缺乏恆定區之片段缺乏由經典路徑活化補體或介導抗體 依賴性細胞毒性之能力。傳統上，該等片段係藉由完整抗 體之蛋白水解消化，例如藉由木瓜蛋白酶消化而產生（參 見例如WO 94/29348)，但可由經重組轉型之宿主細胞直接 產生。對於產生ScFv，參見Bird等人，（1988) Science 242: 423-426。另外，可使用如下所述之多種工程改造技術來 產生抗原結合片段。 與Fab片段相比，Fv片段之兩個鏈似乎具有較低相互作 用能。為穩定Vh域與Vl域之締合，其已與以下相關聯：肽 (Bird等人，（1988) Science 242: 423-426 ; Huston等人， (1988) PNAS 85(16): 5879-5883)、二硫橋（Glockshuber等 人，（1990) Biochemistry 29: 1362-1367)及「杵入臼（knob in hole)」突變（Zhu 等人，（1997) Protein Sci.，6: 781-788)。可由熟習此項技術者所熟知之方法產生ScFv片段， 參見 Whitlow 等人，（1991) Methods Companion Methods 145280.doc • 54· 201029662
Enzymol，2: 97-105 及 Huston 等人，（1993) Int. Rev.
Immunol 10: 195-217。可在諸如大腸桿菌細胞之細菌細胞 中或在真核細胞中產生ScFv。ScFv之一缺點在於產物單 價，此阻礙歸因於多價結合之親和力增加；及其較短半衰 期。克服此等問題之嘗試包括藉由化學偶合（Adams等人， (1993) Can. Res 53: 4026-4034 ;及McCartney等人，（1995) Protein Eng. 8: 301-3 14)或藉由含有不成對C端半胱胺酸殘 基之ScFv的自發位點特異性二聚（參見Kipriyanov等人， ^ (1995) Cell. Biophys 26: 187-204)，自含有另一 C端半胱胺 酸之ScFv而產生二價（ScFv’）2。或者，可藉由將肽連接子 縮短至3至12個殘基以形成「微型雙功能抗體」來迫使 ScFv形成多聚體，參見Holliger等人，（1993) PNAS 90: 6444-6448。縮短連接子可進一步產生ScFv三聚體（「微型 三功能抗體」，參見Kortt等人，（1997) Protein Eng 10: 423433)及四聚體（「微型四功能抗體」，參見Le Gall等 φ 人，（1999) FEBS Lett，453: 164-168)。構築二價 ScFv分子 亦可藉由與蛋白質二聚基元進行基因融合以形成「微型抗 體（miniantibody)」（參見 Pack等人，（1992) Biochemistry '· 31: 1579-1584)及「小體（minibody)」（參見 Hu 等人，（1996) _ Cancer Res. 56: 3055-3061)來達成。ScFv-Sc-Fv 串聯體 ((ScFV)2)亦可藉由經第三肽連接子連接兩個ScFv單元來產 生，參見Kurucz等人，（1995) J. Immol. 154: 4576-4582。 雙特異性微型雙功能抗體可經由兩種由來自一個抗體且經 短連接子與另一抗體之VL域連接之VH域組成的單鏈融合產 145280.doc -55- 201029662 物非共價締合來產生，參見Kipriyanov等人，（1998) Int. J. Can 77: 763-772。該等雙特異性微型雙功能抗體之穩定性 可藉由引入如上所述之二硫橋或「杵入臼」突變或藉由形 成單鏈微型雙功能抗體（ScDb)而增強，其中兩個雜交ScFv 片段係經由肽連接子連接，參見Kontermann等人，（1999) J. Immunol. Methods 226:179-188。可藉由例如使ScFv 片段 與IgG分子之CH3域或Fab片段經鉸鏈區融合而得到四價雙特 異性分子，參見Coloma等人，（1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163。或者，已藉由雙特異性單鏈微型雙功能抗體融合 而產生四價雙特異性分子（參見Alt等人，（1999) FEBS Lett 454: 90-94)。較小四價雙特異性分子亦可藉由ScFv-ScFv 串聯體與含有螺旋-環-螺旋基元之連接子（DiBi微型抗體， 參見 Muller 等人，（1998) FEBS Lett 432: 45-49)二聚或在 阻止分子内配對之定向中包含4個抗體可變域（VH及VL)之 單鍵分子（串聯微型雙功能抗體，參見Kipriyanov等人， (1999) J· Mol. Biol· 293: 41-56)二聚來形成。雙特異性 F(ab')2片段可藉由Fab·片段之化學偶合或藉由經白胺酸拉 鏈異源二聚來產生（參見Shalaby等人，（1992) J. Exp. Med. 175: 217-225 ;及 Kostelny 等人，（1992)，J. Immunol. 148: 1547-1553)。亦可利用經分離之vH及vL域（Domantis pic)， 參見 US 6,248,516 ; US 6,291，158 ;及 US 6，172，197。 異源結合抗體 異源結合抗體係由使用任何適宜之交聯方法所形成之兩 個共價連接之抗體構成。參見例如US 4,676,980。 145280.doc -56- 201029662 其他修飾 本發明之抗原結合蛋白可包含其他修飾以增強或改變其 效應功能。咸信抗體Fc區與各種Fc受體（FcyR)之間的相互 作用介導該抗體之效應功能，該等效應功能包括抗體依賴 性細胞毒性（ADCC)、補體固定、吞噬作用及抗體之半衰 期/清除率。可視所要特性而對抗體之Fc區進行各種修 飾。舉例而言，在F c區中進行特異性突變以促使在其他情 況下溶解之抗體變成非溶解性抗體詳述於EP 0629 240及 EP 0307 434中，或可將救助受體結合抗原決定基併入抗體 中以增加血清半衰期，參見US 5,739,277。人類FcY受體包 括 FcyR (I)、FcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIIa及新生 FcRn。 Shields等人，（2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604展示一 通用組之IgGl殘基涉及於結合所有FcyR中，而FcyRII及 FcyRIII利用此通用組以外之相異位點。一組IgGl殘基當變 為丙胺酸時降低與所有FcyR之結合性：Pro-238、Asp-265 、 Asp-270 、 Asn-297 及 Pro-239 。 所有 皆處於 IgG CH2 域中且在連接CH1及CH2之鉸鏈附近叢集。FcYRI僅利用通 用組之IgGl殘基以供結合，而FcyRII及FcyRIII與除通用組 以外之相異殘基相互作用。一些殘基之變更僅降低與 FcyRII(例如 Arg-292)或 FcyRIII(例如 Glu-293)之結合性。一 些變異體顯示與FcyRII或FcyRIII之結合性有所改良，但不 影響與另一受體之結合性（例如Ser-267Ala改良與FcyRII之 結合性，但與FcyRIII之結合性未受影響）。其他變異體展 現與FcyRII或FcyRIII之結合性有所改良，而與另一受體之 145280.doc -57- 201029662 結合性降低（例如Ser-298Ala改良與FcyRIII之結合性且降低 與FcyRII之結合性）。對於FcyRIIIa，最佳結合IgGl變異體 在Ser-298、Glu-333及Lys-334處具有組合丙胺酸取代。咸 信新生FcRn受體涉及於抗體清除率與跨越組織之胞轉作用 (transcytosis)中（參見 Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57 ;及 Ghetie等人，（2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766) »經確定與人類FcRn直接發生相互作用之人類IgGl殘 基包括 Ile253 、 Ser254 、 Lys288 、 Thr307 、 Gln311 、 Asn434及His435。在此部分所述之任一位置處之取代能夠 增加抗體之血清半衰期及/或改變抗體之效應特性。 其他修飾包括抗體之糖基化變異體。據知抗體恆定區中 保守位置處之抗體糖基化對抗體功能、尤其效應功能（諸 如上述效應功能）具有深度影響，參見例如Boyd等人， (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318。涵蓋其中一或多個 碳水化物部分經添加、取代、缺失或修飾之抗體或其抗原 結合片段之糖基化變異體。引入天冬醯胺-X-絲胺酸或天 冬醯胺-X-蘇胺酸基元產生碳水化合物部分之酶促連接的 潛在位點且因此可用於操縱抗體糖基化。在Raju等人， (2001) Biochemistry 40: 8868-8876 中，經由使用 β-1，4-半 乳糖基轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶進行再半乳糖基化 及/或再唾液酸化過程來增加TNFR-IgG免疫黏附素之末端 唾液酸化。咸信增加末端唾液酸化會增加免疫球蛋白之半 衰期。與大多數醣蛋白相同，抗體通常以糖型（glycoform) 之混合物形式產生。當在真核細胞、尤其哺乳動物細胞中 J45280.doc -58 - 201029662 產生抗體時，此混合物尤其顯而易見。已開發多種方法來 製造規定糖型，參見Zhang等人，（2004) Science 303: 371 ; Sears 等人，（2001) Science 291: 2344 ; Wacker 等人， (2002) Science 298: 1790 ; Davis等人，（2002) Chem. Rev. 102: 579 ; Hang等人，（2001) Acc. Chem. Res 34: 727。如 本文所述之抗體（例如IgG同型（例如IgGl)之抗體）可包含規 定數目（例如7個或7個以下，例如5個或5個以下，諸如2個 或1個）之糖型。 抗體可與諸如聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯之 非蛋白性聚合物偶合。蛋白質與PEG之結合為增加蛋白質 半衰期以及降低蛋白質之抗原性及免疫原性的既定技術。 已由完整抗體以及Fab'片段研究具有不同分子量及線型（線 性或分枝）之聚乙二醇化的用途，參見Koumenis等人， (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95。 產生方法 可於諸如山羊（參見Pollock等人，（1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157)、雞（參見 Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55)、小鼠（參見Pollock等人）或植物（參見 Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204 ； Ma (1998) Nat. Med· 4: 601-606 ; Baez等人，（2000) BioPharm 13: 50-54 ; Stoger等人，（2000) Plant Mol_ Biol. 42: 583-590)之轉殖基因生物體中產生抗原結合蛋白。 抗原結合蛋白亦可藉由化學合成而產生。然而，通常使 用熟習此項技術者所熟知之重組細胞培養技術來產生抗原 145280.doc -59- 201029662 結合蛋白。將編碼抗原結合蛋白之聚核《分離且插入可 複製載體（諸如質體）中以供進一步選殖（擴增）或表現。一 種表現系統為麵胺酸合成酶系統（諸如LGnza 所出 售），尤其在冑主細胞為CH0或刪之情況下。將編碼抗原 結合蛋白之聚核苦酸輕易地分離且制習知程序（例如寡 核普酸探針)進行定序。可用載體包括質體、病毒、噬菌 趙、轉座子、微型染色體’其中通常使用質體。一般而 言，該等載體進一步包括信號序列、複製起點、一或多個 標記基因、強化子成份、啟動子及轉錄終止序μ，上述者 與抗原結合蛋白聚核㈣可操作性地連接以有利於表現。 可將編碼輕鏈及重鏈之聚核芽酸插人獨立載體中且同時或 依序引入（例如藉由轉型、轉染、電穿孔或轉導）同一宿主 細胞中，或必要時在該引入之前可將重鏈與輕鏈插入同一 載體中。 可採用密碼子最佳化，意欲使得經密碼子最佳化之基因 轉染時宿主細胞所產生之總蛋白質含量相較於經野生型序 列轉染時之含量較高。已公開若干方法（Nakamura等人， (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215 ； W098/34640 ； W097/11086)。由於遺傳密碼冗餘，本文所揭示之密碼子 (尤其針對既定宿主細胞中之表現而最佳化之彼等密碼子） 之替代性聚核苷酸亦可編碼本文所述之抗原結合蛋白。可 改變本發明之抗原結合蛋白之密碼子使用以適應於宿主細 胞之密碼子偏倚（codon bias) ’從而增加轉錄物及/或產物 產率（例如 Hoekema等人 ’ Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914- 145280.doc -60- 201029662 24)。密碼子之選擇可基於與表現所用之宿主細胞之適合 相容性。 信號序列 抗原結合蛋白可以融合蛋白之形式產生，該融合蛋白具 有在成熟蛋白之N端處具有特異性裂解位點之異源信號序 列。仏號序列應由宿主細胞識別並加工。對於原核宿主細 胞，k號序列可為例如鹼性磷酸酶、青黴素酶（penicimnase) ❹ 或熱穩定腸毒素Π前導序列。對於酵母分泌，信號序列可 為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列或酸性磷酸 酶前導序列，參見例如W〇9〇/U646。在哺乳動物細胞系 統中，病毒分泌前導序列（諸如單純疱疹§〇信號）及原生免 疫球蛋白信號序列可能適合。通常，信號序列在閱讀框架 中與編碼抗原結合蛋白之DNA接合。可使用諸如seq m NO: 9所示之信號序列。 複製起點 ❿ 複製起點在此項技術中已為熟知，纟中pBR3 22適於大 多數革蘭氏陰性細菌（gram_negative baeterium)，2 p質體 適於大多數酵母，且諸如別4()、多瘤病毒、腺病毒、㈣ 或BPV之多種病毒起點適於大多數哺乳動物細胞。一般而 言’哺乳動物表現載體並不需要複製起點組份，但可使用 SV40，因為其含有早期啟動子。 選擇標記 典型選擇基因編碼如下蛋白f ’其（a)賦予對抗生素或盆 他毒素（例如安比西林（ampiciUin)、新徽素（n_心）、甲 145280.doc 201029662 胺喋呤（methotrexate)或四環素（tetracycline))之抗性，或 (b)補充自養不足（auxiotr〇phic deficiency)或供應複合培養 基中不可得之營養物，或（c)兩者之組合。選擇機制可涉及 遏止宿主細胞生長。已經編碼抗原結合蛋白之基因成功轉 型之細胞由於例如共同傳遞之選擇標記所賦予之耐藥性而 存活。一實例為DHFR選擇標記，其中轉型體係在甲胺喋 呤存在下培#。可在漸增量<甲胺嗓吟存在下培養細胞以 擴增相關外源基因之複本數。對於DHFR選擇，ch〇細胞 為尤其適用之細胞株。另一實例為麩胺酸合成酶表現系統 (L〇nza Bi〇logics)。酵母中所用之選擇基因之一實例為（印i 基因，參見Stinchcomb等人，（1979) Nature 282: 38。 啟動子 適於表現抗原結合蛋白之啟動子與編碼抗原結合蛋白之 腦/聚核㈣可操作性地連接。用於原核宿主之啟動子 包括Ph〇A啟動子、β_内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷 酸酶、色胺酸及雜交啟動子（諸如Tac)。適於酵母細胞中之 表現的啟動子包括3_鱗酸甘油酸激酶或其他糖解酶，例如 烯醇酶、甘油搭-3-鱗酸去氫酶、己糖激酶、丙嗣酸去缓 酶、鱗酸果糖激酶、葡萄糖冬峨酸異構酶、％鱗酸甘油酸 變位酶及葡萄糖激酶。誘導性酵母啟動子包括乙醇去氮酶 2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及對氣代謝或 麥芽糖/半乳糖利用負責之酶。 用於哺乳動物細胞系統中之表現的啟動子包括病毒啟動 子，諸如多瘤病毒、禽痘病毒及腺病毒(例如腺病㈣、牛 145280.doc •62- 201029662 乳突狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒（詳言之， 即刻早期基因啟動子）、反轉錄病毒、B型肝炎病毒、肌動 蛋白、勞斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus，RSV)啟動子及 早期或晚期猿猴病毒40。當然，啟動子之選擇係基於與表 現所用之宿主細胞之適合相容性。第一質體可包含RSV及/ 或SV40及/或CMV啟動子，編碼輕鏈可變區（VL)、kC區之 DNA，以及新黴素及安比西林抗性選擇標記；且第二質體 包含RSV或SV40啟動子、編碼重鏈可變區（VH)之DNA、編 碼γΐ恆定區之DNA、DHFR及安比西林抗性標記。 強化子成份 適當時，例如對於在高等真核細胞中表現，可使用與載 體中之啟動子成份可操作性地連接之強化子成份。哺乳動 物強化子序列包括來自血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、 胎蛋白及胰島素之強化子成份。或者，可使用來自真核細 胞病毒之強化子成份，諸如SV40強化子（bpl00-270)、細 胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒（polyma)強化 子、桿狀病毒強化子或鼠類IgG2a基因座（參見 W004/009823)。強化子可位於載體上啟動子上游位點之。 或者，強化子可位於別處，例如在未轉譯區内或聚腺苷酸 化信號下游。強化子之選擇及定位可基於與表現所用之宿 主細胞之適合相容性。 聚腺苷酸化/終止 在真核系統中，聚腺苷酸化信號與編碼抗原結合蛋白之 DNA/聚核苷酸可操作性地連接。該等信號通常置於開放 145280.doc -63- 201029662 閱讀框架之3’處。在哺乳動物系統中，非限制性實例包括 源自生長激素、延伸因子-Ια及病毒（例如8乂4〇)基因或反 轉錄病毒長末端重複序列之信號。在酵母系統中，聚腺普 酸化/終止信號之非限制性實例包括源自磷酸甘油酸激酶 (PGK)及乙醇去氫酶1(ADH)基因之信號。在原核系統中， 通常不需要聚腺苷酸化信號且通常替代地採用較短且較明 確之終止子序列。聚腺苷酸化/終止序列之選擇可基於與 表現所用之宿主細胞之適合相容性。 用於增加產率之其他方法/成份 除上述以外’可用於增加產率之其他特徵包括染色質重 塑成份、内含子及宿主細胞特異性密碼子修飾。 宿主細胞 適於選殖或表現編碼抗原結合蛋白之載體的宿主細胞為 原核細胞、酵母細胞或高等真核細胞。適合之原核細胞包 括真細菌，例如腸内菌科，諸如大腸桿菌屬（五， 例如大腸桿菌（例如ATCC 31，446、31,537、27,325);腸内 才干鹵屬;伊文氏桿菌屬（五;克雷伯氏 菌屬;變形桿菌屬（/Voiews);沙門氏菌屬 (<Sa/mo«e//i2)，例如鼠傷寒沙門氏菌（*Sa/wo«e//a ; 沙雷氏菌屬，例如黏質沙雷氏菌（Serraifa warcescaw);及志贺桿菌屬（％扭此）；以及桿菌屬（5α<^7/〇， 諸如枯草桿菌（凡以⑽’//^1)及地衣桿菌（5. /ie/2e«(/brA«i’5·)(參 見DD 266 710);假單胞菌屬，諸如、繡色假 單胞菌（_P. ;及鍵球菌屬。在酵母 145280.doc • 64- 201029662 宿主細胞中，亦涵蓋釀酒酵母cerev/ϋβ)、 粟酒裂殖酵母（iSc/n'zc^aec/mromycej jpow6e)、克魯維酵母 ([/wjvvero/wjvce)(例如 ATCC 16,045 ' 12,424 ' 24178 ' 56,500)、耶氏酵母（yarrowia)(EP 402 226)、甲醇酵母 (Pz’c/H’fl _ραίίοη_5)(ΕΡ 183 070，亦參見Peng等人，（2004) J. Biotechnol· 1 08: 1 85-192)、假絲酵母（Ca«<^_i/a)、里氏木黴 (JWc/zoi/erwa reehaKEP 244 234)、青徽素（Penicillin)、彎 頸黴（Γο/xpoc/a山·μα«)，及趟菌宿主（諸如小巢 狀麵菌（A 及黑麵菌（d. «z_ger))。 高等真核宿主細胞包括哺乳動物細胞，諸如COS-1 (ATCC編號：CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651);人胚 腎細胞株293 ;幼倉鼠腎細胞（BHK)(ATCC CRL 1632); BHK570(ATCC編號：CRL 10314) ; 293(ATCC編號：CRL 1573);中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1，ATCC編 號：CCL 61) ; DHFR-CHO 細胞株，諸如 DG44(參見 Urlaub 等人，（1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556)，尤其 適於懸浮液培養之彼等CHO細胞株；小鼠赛特利細胞 (mouse sertoli cell);狼腎細胞；非洲綠狼腎細胞（ATCC CRL-1587) ; HELA細胞；犬腎細胞（ATCC CCL 34);人肺 細胞（ATCC CCL 75) ; Hep G2 ;及骨髓瘤或淋巴瘤細胞， 例如 NS0(參見 US 5,807,715)、Sp2/0、Y0 〇 該等宿主細胞亦可經進一步工程改造或改適以改進抗原 結合蛋白之品質、功能及/或產率。非限制性實例包括特 異性修飾（例如糖基化）酶及蛋白質摺疊伴侣之表現。 145280.doc -65- 201029662 細胞培養方法 經編碼抗原結合蛋白之載體轉型之宿主細胞可由熟習此 項技術者已知之任何方法來培養。可於旋轉式燒瓶、轉瓶 或中空纖維系統中培養宿主細胞’但對於大規模生產而 言’尤其使用攪拌槽反應器用於懸浮液培養。該等授拌槽 可適於使用例如噴霧器、擋板或低剪切葉輪進行通氣。對 於氣泡柱及氣升式反應器，可使用空氣或氧氣氣泡直接進 行通氣。當在無血清培養基中培養宿主細胞時，用細胞保 護劑（諸如普流尼克F_68(plur〇nic F_68))補充培養基以有助 於防止細胞因通氣過程而受損害。視宿主細胞特徵而定， 微載體可用作固著依賴性細胞株之生長基質，或細胞可適 於懸$液培養（此為典型的）。宿主細胞、尤其無脊椎動物 宿主細胞之培養可利用多種操作模式，諸如分批饋料、重 複分批處理（參見 Drapeau等人，（1994) Cyt〇techn〇l〇gy 15: 103-109)、擴展式分批處理或灌注培養。儘管可於諸如胎 牛血^ (FCS)之含金清培養基中培養經重組轉型之哺乳動 物宿主細胞，但該等宿主細胞係於例如以下者中培養：合 成無血清培養基，諸如Keen等人，（1995) Cyt〇teehnQl()gy 17: 153-163中所揭示’或市售培養基，諸如pr〇cH〇-CDM 或UltraCHO™ (Cambrex NJ，USA)，必要時該等培養基補 充有諸如葡萄糖之能源及諸如重組胰島素之合成生長因 子。宿主細胞之無血清培養可能需要使彼等細胞適於在無 金清條件下生長。一種改適方法為在含血清培養基中培養 該等宿主細胞且反覆更換8G%之培養基為無血清培養基以 I45280.doc -66 - 201029662 使該等宿主細胞學會適應無血清條件（參見例如Scharfenberg 等人，（1995), Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (BeUVery 等人編），619_623, Kluwer Academic publishers)。 可回收分泌至培養基中之抗原結合蛋白且使用多種技術 純化以得到適於預期用途之純度。舉例而言，使用抗原結 合蛋白治療人類患者通常要求純度至少95%，純度更通常 _ 為98%或99%或99%以上（與粗培養基相比）。通常使用離心 自培養基中移除細胞碎片（cell debris)，繼而使用例如微 濾、超濾及/或深度過濾進行上清液澄清步驟。可利用多 種其他技術，諸如透析；及凝膠電泳；及層析技術，諸如 輕基填灰石（HA)、親和層析（視情況涉及親和力標記系 統，諸如聚組胺酸）及/或疏水性相互作用層析（mc，參見 US 5,429,746)。繼各種澄清步驟之後，可使用蛋白質a或 G親和層析來捕捉抗體。其他層析步驟可遵循諸如離子交 φ 換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻層析及 硫酸銨沈澱。亦可採用各種病毒移除步驟（例如，使用例 如DV-20過濾器進行奈米過濾）。繼此等各種步驟之後’得 ‘到包含至少75 mg/ml或75 mg/ml以上、或1〇〇 mg/m^1〇〇 mg/ml以上之抗原結合蛋白的經純化（例如單株）製劑。該 等製劑實質上不含聚集形式之抗原結合蛋白。 細菌系統可用於表現抗原結合片段。該等片段可位於細 胞内之周質中或分泌至細胞外。可根據熟習此項技術者已 知之方法提取不溶性蛋白質且將其再摺疊以形成活性蛋白 145280.doc -67. 201029662 質，參見 Sanchez 等人，（1999) J. Biotechnol. 72: 13-20; 及 Cupit 等人，（1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277。 脫除醯胺基（deamidation)為移除醯胺官能基之化學反 應。在生物化學中，該反應在蛋白質降解方面較重要，因 為其破壞胺基酸天冬醯胺及麵醯胺酸之含醯胺側鏈。咸信 脫除酿胺基反應為可限制蛋白質之有效壽命的因子之一， 其亦為在製造治療性蛋白質期間所發生之最常見的轉譯後 修飾之一。舉例而言，重組人類DNAse及重組可溶性cD4 之活體外或活體内生物活性降低或損失已有報導，而其他參 重組蛋白質似乎未受影響。在誘導脫除醯胺基之應激條件 下，本文所述之抗原結合蛋白與肌肉抑制素結合之能力似 乎未受影響。因此’本文所述之抗原結合蛋白之生物活性 及其有效壽命不太可能受脫除醯胺基影響。 . 醫藥组合物 。可將如本文所述之
通常， 該等組合物包含獲知於可接受 術語疾病、病症及病狀可互換使用 k原結合蛋白之經純化製劑併入醫藥 之醫藥規範且為醫 145280.doc -68 - 201029662 藥規範所提倡之醫藥學上可接受之載劑，參見例如
Remingtons Pharmaceutical Sciences，第 16 版（1980) Mack
Publishing c〇.。該等載劑之實例包括經滅菌載劑，諸如生 理食鹽水、林格氏溶液⑻叫奶s〇luti〇n)或右旋糖溶液， 其視情況經適合之緩衝液緩衝至5至8範圍内之pH值。 醫藥組合物可藉由注射或連續輸注（例如靜脈内、腹膜 内、皮内、皮下、肌肉内或門脈内）來投與。該等組合物 φ 宜不含可見微粒物質。醫藥組合物可包含1 mg至10 g之間 的抗原結合蛋白，例如5 111§與丨g之間的抗原結合蛋白。 或者組合物可包含5 mg與500 mg之間，例如5 mg與50 mg之間的抗原結合蛋白。 製備該等醫藥組合物之方法為熟習此項技術者所熟知。 醫藥組合物可包含丨mg至1〇 g之間的呈單位劑型之抗原結 «蛋白，視情況連同使用說明書一起。醫藥組合物可經凍 乾（冷凍乾燥）以供在投藥之前根據熟習此項技術者所熟知 # 或顯而易見之方法進行復原。當抗體具有IgGl同型時，可 將諸如檸檬酸鹽（例如檸檬酸鈉）或EDTA或組胺酸之銅螯合 劑添加至醫藥組合物中以降低此同型之抗體的銅介導之降 •解程度’參見EP0612251。醫藥組合物亦可包含增溶劑， .諸如精胺酸鹼；清潔劑/抗聚集劑，諸如聚山梨醇酯8〇 ; 及置換小瓶頂空氧氣之惰性氣體’諸如氮氣。 投與抗原結合蛋白之有效劑量及治療方案一般憑經驗確 定’且可視諸如患者年齡、重量及健康狀況以及待治療疾 病或病症之因素而定。該等因素在主治醫師之考慮範圍 145280.doc -69- 201029662 内。選擇適當劑量之導則可見於例如Smith等人，（1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York 中0 投與個體之抗原結合蛋白之劑量一般在每公斤個體體重 1 Kg與 150 mg之間、0.1 mg與 100 mg之間、0.5 mg與 50 mg 之間、1 mg與25 mg之間或1 mg與10 mg之間。舉例而言， 劑量可為10 mg/kg、30 mg/kg或60 mg/kg。抗原結合蛋白 可非經腸投與’例如皮下、靜脈内或肌肉内投與。 必要時’治療性組合物之有效日劑量可以2個、3個、4 個、5個、6個或6個以上依適當時間間隔獨立投與之子劑 量，視情況以單位劑型投與。舉例而言，劑量可在投藥每 天以多個子劑量之形式，每14天或28天1次皮下投與。 可藉由靜脈内輸注，通常經15分鐘至24小時，諸如2至 12小時或2到6小時投與劑量。此可降低毒性副作用。 必要時可一或多次重複投與劑量，例如每天三次、每天 次、每兩天一次、每週一次、兩週一次、一個月一次、 每三個月-次、每六個月—次或每十二個月—次。抗原結 合蛋白可依維持療法投與，例如每週—次，歷時6個月或: 個月以上。抗原結合蛋白可依間歇療法投與，例如歷時3 至6個月，且接著停止給藥3至6個月，隨後再次投與抗原 結合蛋白歷時3至6個月等，如此循環。 劑量可藉由使絲向抗肌肉抑制素抗原結合蛋白之抗個 體基因型抗趙量測投與後生物機〇中诚播> 王物樣D口中循環抗肌肉抑制素抗 原結合蛋白之量來測定或謂粒 —- 疋次調整。可利用測定或調整劑量之 J45280.doc 201029662 其他方法，包括（但不限於）藥理學之生物標記（『生物指 標』）、肌肉質量及/或功能之量度、安全性、耐受性及治 療反應。抗原結合蛋白可以有效下調個體體内肌肉抑制素 活性之量及持續時間投與。 可以使療法靶向特定部位之方式向個體投與抗原結合蛋 白。舉例而言，可將抗原結合蛋白局部注射至肌肉（例如 骨骼肌）中。
抗原結合蛋白可與一或多種用於治療本文所述疾病之其 他治療活性劑組合使用，該等治療活性劑包括米氮平 (Mortazapine)(Remeron, Zispin: Organon)、乙酸曱地孕酮 (Megestrol acetate)(Megace: BMS)、屈大麻驗（Dronabinol) (Marinol: Solvay Pharmaceutical Inc.)、氧雄龍（Oxandrolone) (Oxandrin: Savient)、睪固酮（testosterone)、重組生長激素 (例如索瑪托平（Somatropin)(Serostim: Serono)、努托平 (Nutropin)(Genentech)、優猛茁（Humatrope)(Lilly)、增若 托平（Genotropin)(Pfizer)、諾德托平（Norditropin)(Novo)、 思真（Saizen)(Merck Serono)及奥尼茁（Omnitrope) (Sandoz))、赛庚咬（Cyproheptadine)(Periactin: Merck)、鳥 胺酸酮戊二酸（ornithine oxoglutarate)(Cetornan)、娘醋甲 酉旨(Methylphenidate)(Ritalin: Novartis)及莫達非尼 (Modafinil)(Provigil: Cephalon)、羅氏鮮（orlistat)(alli: GSK)、諾美婷（sibutramine)(Meridia，Reduetil)、利莫納班 (rimonabant)(Acomplia, Monaslim，Slimona)。該等組合可 用於治療肌肉抑制素促成疾病或中和肌肉抑制素之活性將 145280.doc -71 - 201029662 有益之疾病。 當抗原結合蛋白與其他治療活性劑組合使用時，個別組 份可以獨立或組合醫藥調配物形式，由任何適合途徑，- 起或獨立依序或同時投與。若獨立或依序投與，則抗原 結合蛋白及治療活性劑可則壬何次序投與。 、以上所提及之組合可以包含如上所定義之組合，視情況 連同醫藥予上可接受之載劑或賦形劑之單_醫藥調配物之 形式呈現以供使用。 '^ 您嚟解，組份必須穩定且彼 此及”調配物之其他組份相容且可經調配以供投藥。當獨 立調配時，組份可以任何適宜之調配物形式，例如以如此 項技術中關於抗原結合蛋白所知之方式提供。 當與針對㈣疾病具活性之第二治療劑组合時各組份 之劑量可不同於單獨使用抗原結合蛋白時的劑量。適當劑 量將易於為熟習此項技術者所瞭解。 ❹ 抗原結合蛋白及治療活性劑可起協同作用。換古之，以 組合形式投與抗原結合蛋自及治療活性劑對本文料之疾 病、病症或病狀相較各單獨作用之總和可具有較大作用。、 醫樂組合物可包含抗原結合蛋白以及其他藥劑，視情況 =吏用，的分裝部分之套組。為方便起見，該套組 含預疋量之試劑與使用說明書。 術語「個體., , 」及 ^者」在本文中可互換使用。個 常為人類。個體亦可為哺乳動物，諸如小鼠 類動物(例如賊猿或猴)。個體可為非人類動物。= 145280.doc -72· 201029662 蛋白亦可具有獸醫學用途。待治療之個體可為農畜，例如 母牛或公牛、綿羊、豬、闇牛、山羊或馬；或可為家畜， 諸士犬或冑。動物可為任何年齡之動物或成熟成年動物。 • 菖個體為實驗動物(諸如小鼠、大鼠或靈長類動物)時，可 ^動物進行處理以誘發與肌肉消瘦、肌病或肌肉損失相關 之疾病或病狀。 處理可為治療性或預防性處理。個體可為有此需要者。 φ 需要處理者除將來可能顯現疾病者以外亦可包括已罹患特 定醫學疾病之個體。 因此，本文所述之抗原結合蛋白可用於預防性處理。在 此情況下，將本文所述之抗原結合蛋白投與個體以預防或 延緩疾病之一或多種態樣或症狀發作。個體可能無症狀。 個體可能具有疾病之遺傳素因.將預防有效量之抗原結合 蛋白投與此類個體。預防有效量為預防或延緩本文所述疾 病之一或多種態樣或症狀發作之量。 • 本文所述之抗原結合蛋白亦可用於治療方法中。術語 治療」涵蓋緩和、減輕或預防疾病之至少—種熊樣戋症 狀。舉例而言，本文所述之抗原結合蛋白可用於改善或= 輕本文所述疾病之一或多種態樣或症狀。 本文所述之抗原結合蛋白係以有效量用於治療性或預防 性處理。本文所述抗原結合蛋白之治療有效量為有效改善 或減輕疾病之一或多種態樣或症狀之量。太 尽文所述之抗原 結合蛋白亦可用於治療、預防或治癒本文所述之疾病。 本文所述之抗原結合蛋白對個體健康可具有一般有兴之 145280.doc -73- 201029662 作用，例如其可增加個體之預期壽命。 核所述之抗原結合蛋白無需實現完全治癒或根除疾病 之每-症狀或表現即構成可行的治療性處理。如相關領域 中所瞭解’用作治療劑之藥物可降低既定疾病病況之嚴重 度’但無需消除疾病之每一表現即視為適用之治療劑。類 似地預防性投與之治療無需完全有效地預防疾病發作即 構成可行的預防劑。僅僅降低對疾病之影響（例如降低立 症狀之數目或嚴重度，或增加另一治療之有效性，或產生 另有上作用）或降低個體之疾病發生（例如延緩疾病發作） 或惡化之可能性即足矣。 病症、疾病或病狀包括肌肉減少症、惡病質、肌肉消 瘦、廢用性肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌症、外科疾病、灼 傷肌月或神經創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包括η型糖 尿病）、關節炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病（腿d)、充 血性心臟衰竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性關 節修復、多發性硬化症（MS)、中風、肌營養不良、運動神 經兀神經病、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏病、 骨質疏鬆症、骨關節炎、脂肪肝、肝硬化、艾迪森氏病、 庫欣氏症候群、急性哞吸窘迫症候群、類固醇誘發之肌肉 消瘦、肌炎及脊柱側彎。 年齡相關之肌肉消瘦（亦稱為肌病）或肌肉減少症為隨著 年齡發生之肌肉質量及肌力的進行性損失。此病狀據信除 肌肉分解增加以外亦為肌肉合成及修復減少之結果。在年 齡相關之肌肉消痩中，肌纖維束因個別纖維損失而縮減。 145280.doc •74- 201029662 肌纖維亦變小。 此外，由於該等個體之廢用性肌肉萎縮 治療可逆轉此肌肉萎縮。 年齡相關之肌肉消瘦始於中年且在整個生命之剩餘時間 加速發展。該病狀之最常用定義為附肢骨骼質量/身古2 (kg/m2)低於年輕人之平均值兩個標準m此病症可^ 致活動性減少、功能性失能及獨立性損失。
廢用性肌肉萎縮可與許多不同病狀、疾病或病症相關， 例如固定、術後外科疾病、透析、重症護理(例如灼傷、 ICU)、肌肉或骨路創傷或損傷。廢用性萎縮可由導致長期 肌肉廢用之眾多制或事件所致。肌肉#縮涉及肌纖維之 尺寸及/或數目及/或功能降低。 惡病質為在並未主動試圖減輕重量之個體中與重量損 失、肌肉質量損失、肌肉萎縮、疲勞、食慾較差及食慾減 退中之任者或其組合相關之病狀。惡病質可與各種其他 病症（包括本文所提及之任一疾病）相關。舉例而言，惡病 質可與癌症、感染（例如HIV或AIDS感染）、腎衰竭、自體 免疫疾病及藥物或酒精成瘾相關。此外，在例如已患有心 肌梗塞之患者或患有充企性心臟衰竭之患者中，可使用本 文所述之抗原結合蛋白治療心臟惡病質。 慢性阻塞性肺病（COPD)患者可展示該疾病之輕度、中 度或重度症狀。COPD包括患有肺氣腫及支氣管炎之患 者。肺氣腫患者一般極痩或極虛弱’且其疾病一般視為不 可逆的。因此’本文所述之抗原結合蛋白可用於治療肺氣 腫患者，因為該患者之潛在肺功能較難得到改良。支氣管 145280.doc -75· 201029662 炎患者一般較健壯，但其亦可能缺乏肌肉，且據信其疾病 具有一定程度的可逆性。因此，本文所述之抗原結合蛋白 可用於治療支氣管炎患者’視情況與該患者之潛在肺功能 的治療組合。用本文所述之抗原結合蛋白治療對改良肺氣 腫或支氣管炎患者之呼吸中所涉及之肌肉功能可具有直接 作用。 癌症患者常常展示可導致住院治療、感染、脫水、競部 骨折及最終死亡之肌肉消痩。舉例而言，丨〇%之肌肉質量 損失可與癌症患者之顯著較差之預後相關。用本文所述之 抗原結合蛋白治療可改良癌症患者之表現狀況，例如使得 化學療法全面或化學療法的使用更具侵入性，且改良患者 之生活品質。因此，本文所述之抗原結合蛋白可用於治療 癌症惡病質。 癌症包括例如前列腺癌、胰腺癌、肺癌、頭頸癌、結腸 直腸癌及淋巴瘤。舉例而言，在前列腺癌中，個體可具有 轉移性岫列腺癌及/或可能正經歷雄激素去除療法（ADT)。 患有癌症之個體可具有局部晚期癌症或轉移性癌症，例如 早期轉移性癌症。 患有k性腎衰竭（CRF)或末期腎病（ESRD)之患者可使用 本文所述之抗原結合蛋白治療。舉例而言可對患者進行 透析前治療以延遲透析起始時間。或者，可用本文所述之 抗原結合蛋白治療已透析丨年或丨年以上、2年或2年以上或 3年或3年以上之患者。使用本文所述之抗原結合蛋白可短 期預防或治療肌肉消痩，或經由長期使用抗原結合蛋白來 145280.doc -76- 201029662 長期預防或治療肌肉消瘦。 肌肉、骨骼或神經創傷或損傷之實例包括髖部骨折及急 性膝損傷。髖部骨折患者在骨折之前常常患有肌肉萎縮， 且在許多患者中肌肉消痩為髖部骨折之關鍵促因。髖部骨 折之後’肌肉及肌力因廢用而損失，且髖部骨折患者之行 走或功能常常不會恢復至骨折前水準。此外，許多髖部骨 折患者亦罹患諸如COPD、ESRD及癌症之病狀，該等病狀 φ 可能促成顯著肌肉消瘦且使該等患者易發生髖部骨折。與 髖部骨折患者相關之治療緊急性不容小覷，因為此等患者 必須即刻動手術。因此，用本文所述之抗原結合蛋白進行 術後治療，可藉由減少肌肉質量及肌力損失及/或改良肌 肉質量及肌力恢復而幫助髖部骨折患者康復。 本文所述之抗原結合蛋白可有助於治療選擇性手術 (elective surgery)患者，以在手術之前塑造患者之肌肉。 肌營養不良係指一組引起進行性肌肉無力之基因遺傳性 Φ 肌肉疾病。肌營養不良之特徵為進行性骨骼肌無力、肌肉 蛋白缺乏以及肌細胞及組織死亡。肌營養不良之實例包括 裘馨型肌營養不良（Duchenne)(DMD)、貝克型肌營養不 良、肢帶型肌營養不良（LGMD)、先天性肌營養不良、面 肩肱型肌營養不良（FSHD)、強直性肌營養不良、眼咽型肌 營養不良、遠端型肌營養不良及埃_德型肌營養不良 (Emery-Dreifuss)。舉例而言，本文所述之抗原結合蛋白可 用於治療裘馨型肌營養不良、貝克型肌營養不良或肢帶型 肌營養不良。此外，非局部萎縮之彌漫性肌肉萎縮可由本 145280.doc •77· 201029662 文所述之抗原結合蛋白治療。詳言之，由於肌肉萎縮/功 能障礙較集中及骨架/骨骼及心臟問題在疾病中之作用， 強直性營養不良可由本文所述之抗原結合蛋白治療。 肥胖症為過量體脂肪已積累至可對健康產生負面影響之 程度的病狀。身體質量指數（BMI=重量/高度巧為3〇 kg/m2 或3 0 kg/m以上通常即疋為該病狀。此將肥胖症與超重區 分開，BMI介於25-29.9 kg/m2之間即定為超重。肥胖症可 與包括心血管疾病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、 癌症及骨關節炎之各種疾病相關。因此，已發現肥胖症會 縮短預期壽命《肥胖症之典型治療包括飲食、身體運動及 手術。肥胖症可由本文所述之抗原結合蛋白治療，該等抗 原結合蛋白增加肌肉質量且從而可增加基礎代謝率。舉例 而言，該治療會改良企清化學及胰島素敏感性。 肌肉質量、肌力及肌肉功能降低之典型態樣或症狀包括 全身無力、疲勞、身體活動減少、易摔傷、功能性失能、 自主性損失、活動性減少所致之抑鬱症、食慾減退、營養 不良及重量損失異常中之任一者或其任何組合。 疾病可與高含量之肌肉抑制素相關。本文所述之抗原結 合蛋白可用於調節肌肉抑制素之含量及/或肌肉抑制素之 活性。 多個終點可用於展示肌肉質量、肌力及肌肉功能之變 化。該等終點包括短期身體表現評估（Sh〇rt physical
Performance Battery)、腿推舉（Leg Press)、定向生活品質 調查、日常生活活動（ADL)、功能獨立量測（FIM)、功能測 145280.doc •78· 201029662 試及量表（例如步行測試、爬樓梯、腳踏車測力計）、力量 測試及量表（例如手握力試驗、手肌力測試量表）、生物且 抗分析、肌電圖、測力計、雙能量χ射線吸收測定術、電 腦斷層攝影測試、磁共振成像、肌肉活組織檢查、肌肉組 織學、血液/生物化學測試、人體量測術、皮膚厚度量 測、身體質量指數評估及重量監測。肌力可使用雙側肢體 肌肉、頸部肌肉或腹部肌肉來評估。 _ 短期身體表現評估（SPPB)為藉由量測站立平衡、步行速 度及自椅子起立之能力來評估下肢功能之多組份量測，按 0-4之級別定級。步行測試為下肢功能之評估，其對患者 步行一段距離所花費之時間進行計時。腿推舉使用重量及 力評估來量測腿力。在此項技術中使用多個量表及系統來 定性地評估患者之生活品質。雙能量χ射線吸收測定術 (DEXA)為估計骨骼肌質量之量測。 許多動物分析法亦可用於展示肌肉質量及肌力及肌肉功 φ 能之變化。舉例而言，握力測試量測動物反向拉動握力計 之力量。斜面測試量測動物自我懸吊之能力。游泳測試經 由代表性活動（例如游泳）來量測功能性能力，且與人類之 步行測試類似。下肢發力測試（Hindlimb Exertion Force Test ’ HEFT)量測施加尾部刺激後所發揮之最大力。動物 之其他身體表現測試包括步行速度及轉輪。此等測試/模 型可單獨使用或以任何組合使用。 高脂飲食（HFD)誘發之胰島素抗性可用作肥胖症之小鼠 模型。 145280.doc -79- 201029662 糖皮質激素通常用於治療一大系列之慢性發炎疾患，諸 如全身性紅斑狼瘡症、肉狀瘤病、類風濕性關節炎及支氣 管氣喘。然而，投與高劑量之糖皮質激素會導致人類及動 物之肌肉萎縮。類似地’高皮質醇症對庫欣氏病 (Cushing’s disease)之肌肉萎縮起主要作用。地塞米松 (dexamethasone，dex)誘發之肌肉萎縮與肌肉之肌肉抑制 素mRNA及蛋白質表現之劑量依賴性顯著誘導相關（Ma κ 等人 ’ 2003 Am J Physiol Endocrinol Metab 285:E363- E371)。在糖皮質激素起主要作用之若干肌肉萎縮模型（諸 如固定及灼傷損傷）中亦已報導肌肉抑制素之表現增加 (Lalani R等人，2000 J Endocrinol 167:417-428 ; Kawada S 等人 ’ 2001 J Muscle Res Cell Motil 22:627-633 ;及 Lang CH等人，2001 FASEB J 15:NIL323-NIL338)。因此，糠皮 質激素誘發之肌肉消瘦的小鼠模型可用於研究本發明之抗 原結合蛋白。 人類廢用性肌肉萎縮通常與諸如關節之慢性骨關節炎或 用於治療骨折之石膏固定的矯形外科病症相關聯發生，且 在出於其他醫學或手術原因而長期臥床休息之情況下發 生。廢用性肌肉萎縮會降低肌力且導致失能。身體復原仍 然為唯一治療選擇，且此通常需要較長時間且並不總是會 使肌肉恢復至正常尺寸或力量。因此，擠壓坐骨神經以誘 發肌肉萎縮之小鼠模型可用於研究本發明之抗原結合蛋 白。 一大部分癌症患者因脂肪組織之進行性萎縮及肌肉消瘦 145280.doc -80- 201029662 而罹受重量損失。據估計約20%之癌症死亡係由肌肉損失 引起。肌肉消瘦一般為許多疾病病狀中死亡率之良好預測 因子。AIDS、饑餓及癌症之研究數據指示30%-40%以上之 個體病前痩體質量損失為致命的（DeWye WD. ζ·«
Owco/o幻;.Caiman KC 及 fearon KCH編 London: Saunders， . 1986 ’ 第 5 卷，第 2 期，第 251-261 頁；Kotter DP 等人， 1990 J Parent Enteral Nutr 14:454-358 ;及 Wigmore SJ等 ⑩ 人，1997 Br J Cancer 75..106-109)。因此，經由抑制肌肉 消瘦所涉及之信號傳導路徑可能緩解肌肉萎縮為極具吸引 力的。因此’帶有C-26腫瘤之小鼠模型可用於研究本發明 之抗原結合蛋白。 臨床中，腱切除術係指因肌腱單元之先天及/或後天變 形而對腱進行手術橫切，但在創傷或退化性肌肉骨胳疾病 中亦可能發生腱連續性損失。腱切除術導致靜態張力即刻 損失、肌節縮短以及肌肉質量及肌力產生能力隨後降低 φ (Jamah等人，2000 Muscle Nerve 23: 851-862)。因此，誘 發骨骼肌萎縮之小鼠腱切除術模型可用於研究本發明之抗 原結合蛋白。 所述抗原結合蛋白可用於急性、慢性及/或預防性療 法。急性療法可快速增進力量且使患者之功能性能力恢復 至適當程度，隨後可藉由運動或慢性療法而維持。慢性療 法可用於隨時間維持肌力或緩慢增進肌力。預防性療法可 用於預防所述患者群體中通常隨時間發生之肌肉質量及肌 力下降。肌肉功能之改良並不總是為界定成功治療所必 145280.doc •81 · 201029662 需’因為對較不嚴重之肌肉 肉功能。 肖瘦的早期介入僅需要維持肌 所述抗原結合蛋白亦可具有化妝 用途以增加肌力、肌肉 質量及肌肉功能。所述抗原結合蛋 蛋白亦可在太空飛行及訓 練演習中用於太空人。 所述抗原結合蛋白對肌肉（諸如骨路肌）可具有直接生物 作用。或者，所述抗原結合蛋白對肌肉(諸如骨骼肌)可具 有間接生物作用。 舉例而言’抗原結合蛋白可對肌肉組織結構、肌肉質 量、肌肉纖維數目、肌肉纖維大小、肌肉再生及肌肉纖維 化中之一或多者具有作用。舉例而言，可增加肌肉質量。 詳言之，可增加個體之瘦肉質量。可增加以下肌肉中之任 一者或其組合之質量：四頭肌、三頭肌、比目魚肌、脛骨 前肌（TA)及伸趾長肌（EDL)。所述抗原結合蛋白可增加肌 肉纖維數目及/或肌肉纖維大小。所述抗原結合蛋白可增 強肌肉再生及/或減少肌肉纖維化。所述抗原結合蛋白可 增加肌母細胞之增殖速率及/或活化肌原性分化。舉例而 言，抗原結合蛋白可增加肌肉前驅細胞之增殖及/或分 所述抗原結合蛋白對衛星細胞可具有以下作用之一或其 組合：活化、增加增殖及促進自我更新。所述抗原結合蛋 白可調節肌肉抑制素含量。所述抗原結合蛋白可增加個體 之體重。所述抗原結合蛋白可增加肌肉收縮性及/或改良 肌肉功能。抗原結合蛋白可增加骨密度。 145280.doc -82 - 201029662 本文所述之抗原結合蛋白可調節肌肉生長、功能及收縮 所涉及之蛋白質合成及/或異化。舉例而言，可藉由使用 本文所述之抗原結合蛋白來上調諸如肌凝蛋白、肌縮蛋 白肌漿蛋白之肌肉相關蛋白的蛋白質合成。舉例而言， 可藉由使用本文所述之抗原結合蛋白來下調諸如肌凝蛋 * 白、肌縮蛋白、肌漿蛋白之肌肉相關蛋白的蛋白質異化。 所用診斷方法 φ 本文所述之抗原結合蛋白可用於活體外或活體内偵測生 物樣品中之肌肉抑制素以達成診斷目的。舉例而言，抗肌 肉抑制素抗原結合蛋白可用於偵測經培養細胞中、組織中 或血清中之肌肉抑制素。可首先自人體或動物體中移出組 織（例如活組織檢查）。可採用習知免疫分析法，包括 ELIS A、西方墨點法（Westem biGt)、免疫組織化學法或免 疫沈澱。 藉由使肌肉抑制素之存在或含量與疾病相關聯，熟習此 • 項技術者可診斷相關疾病。此外，在個體中偵測到肌肉抑 制素之含量增加可指示將對本文所述之抗原結合蛋白治療 起反應之患者群體。纟經本文所述之抗原、结合蛋白治療之 個體中價測到肌肉抑制素之含量降低可指示增加肌力、肌 肉質量及肌肉功能之生物作用。 抗原結合蛋白可於包含一或多種抗原结合蛋白、可偵測 標記及套組使用說明書之診斷套組中提供。為方便起見， 該套組可包含預定量之試劑與使用說明書。 基因療法 145280.doc • 83 · 201029662 可將編碼本文所述之抗原結合蛋白之核酸分子投與有此 需要之個體。核酸分子可於適當骨架或結構域、可變域或 全長抗體中表現CDR。核酸分子可包含於用於人類或動物 細胞中之表現的載體中。核酸分子或載體可經調配以供與 醫藥學上可接受之賦形劑及/或一或多種如上所討論之治 療活性劑一起投與。 實例 1.產生重組蛋白質 1.1純化成熟二聚肌肉抑制素 在CHO分泌系統中表現HexaHisGBlTev/(D76A)小鼠肌肉 抑制素聚合蛋白序列（SEQ ID NO·· 101)。GB1標籤（SEQ ID NO: 102)描述於WO2006/127682中且據發現與使用Fc標籤 之構築體相比能夠以較高量表現肌肉抑制素且能夠適當摺 疊肌肉抑制素。小鼠聚合蛋白序列（SEQ ID NO: 103)用於 產生成熟肌肉抑制素序列（SEQ ID NO: 104)，此係因為人 類與小鼠成熟肌肉抑制素之序列1 〇〇% —致。為降低肌肉 抑制素之任何可能降解，在區域「DVQRADSSD」中用 D76A突變對小鼠聚合蛋白序列進行工程改造。 使用於含0.5 M NaCl之50 Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)中之 Ni-NTA瓊脂糖（Qiagen)自CHO培養基中捕捉扣除信號序列 之經表現HexaHisGBlTev/(D76A)小鼠肌肉抑制素聚合蛋 白。將Ni溶離液之緩衝液交換為弗林蛋白酶（Furin)裂解缓 衝液（50 mM HEPES，pH 7.5，0.1 M NaCl，0.1% Triton X-100，1 mM CaCl2)，隨後在室溫下以1:25(V/V)之弗林蛋 145280.doc -84- 201029662 白酶/蛋白質比率由弗林蛋白酶（自身（in-house)表現，弗林 蛋白酶之序列示於SEQ ID NO: 105中）裂解隔夜。弗林蛋 白酶使前肽與成熟肌肉抑制素之間（「TPKRSRR」與 「DFGLDCD」之間）的聚合蛋白裂解產生前肽及成熟肌肉 抑制素。 將弗林蛋白酶裂解反應之全部混合物置於6 M Gdn-HCl 中以使聚集體解離。在60°C下，使用C8 RP-HPLC(Vydac 208TP, Grace，Deerfield，IL，USA)且在 40 分鐘内以 15%-60%之緩衝液B梯度（C8 RP-HPLC緩衝液A : 0.1% TFA之 H20溶液，緩衝液B : 0.1% TFA於100%乙腈中之溶液）自混 合物中分離成熟肌肉抑制素。將峰前部含有成熟肌肉抑制 素之溶離份彙集且用於後續活體外分析法。圖1展示成熟 肌肉抑制素之LC/MS分析，且圖2展示具有經還原及未經 還原肌肉抑制素樣品之NuPAGE凝膠。 1.2重組肌肉抑制素之活體外生物活性 肌肉抑制素反應性報導基因分析法（Thies等人，（2001) Growth Factors 18(4) 251_259)用於評估橫紋肌肉瘤細胞 (A204)中肌肉抑制素之活體外活性。使A204細胞（LGC Promochem HTB-82)於不含盼紅（Invitrogen)、5%木炭貧化 FCS(Hyclone)及 IX麩丙.胺酸二肽（Glutamax)(Invitrogen)之 高葡萄糖DMEM中生長。接著以胰蛋白酶處理細胞以產生 懸浮液且用在PAI-1啟動子之12xCAGA盒控制下含有螢光 素酶基因之pLG3質體，使用Gemini轉染試劑（自身試劑， 描述於專利W02006/053782中）轉染。以每孔40,000個細胞 145280.doc -85- 201029662 將細胞接種於96孔Fluoronunc板（VWR)，且使其沈降並生 長隔夜。第二天，藉由連續稀釋將重組成熟肌肉抑制素 (R&D Systems肌肉抑制素（編號788-G8-010/CF)或自身肌肉 抑制素（如上1·1所述）’兩者均具有SEQ ID NO: 104所示之 序列）添加至各孔之培養基中且將細胞再培育6小時，隨後 添加SteadyLite(Perkin Elmer LAS)，在室溫下培育20分鐘 且在 SpectraMax M5 讀取器（Molecular Devices)中進行讀 數。展示肌肉抑制素活化細胞信號傳導，從而引起螢光素 酶表現之劑量反應曲線展示於圖3A中。清楚可見，R&D Systems與自身成熟二聚肌肉抑制素物質均以劑量依賴性 方式活化A204細胞，從而產生螢光素酶信號。自身經純化 肌肉抑制素相較R&D Systems肌肉抑制素在分析法中展示 較佳低的本底及改良之動態範圍。 在替代性方法中，使A204細胞（LGC Promochem HTB· 82)於 McCoys 培養基（Invitrogen)及 10% 熱滅活 FBS (Invitrogen)中生長。接著用凡爾生（versene)(Invitrogen)與 TrypLE(Invitrogen)之1:1混合物分離細胞且使其再懸浮於 不含酚紅、5%木炭貧化血清（Hyclone)及2 mM麩丙胺酸二 肽（Invitrogen)之高葡萄糖DMEM(分析培養基）中。藉由於 懸浮液中將18.2 pg在PAI-1啟動子之12XCAGA盒控制下含 有螢光素酶基因之pLG3質體與182 μΐ 1 mM Gemini轉染試 劑（自身試劑，描述於專利W02006/053782中）混合來轉染 14x106個細胞。將細胞轉移至T175培養瓶中且培育隔夜。 第二天’藉由連續稀釋或在測試抗體之連續稀釋液（最終 145280.doc 86· 201029662 體積20 μΐ)存在下以恆定濃度將重組肌肉抑制素（R&D Systems肌肉抑制素（編號788-G8-010/CF)或自身肌肉抑制 素（如上1.1所述））添加至96孔黑色FluoroNUNC分析板 (VWR)中。將肌肉抑制素抗體混合物預培育30分鐘。用凡 爾生：TrypLE自燒瓶中分離經轉染細胞，且以2.2x 105個 細胞/毫升再懸浮於分析培養基中，且以180微升/孔分配至 分析板中。將板再培育6小時，隨後添加50 μΐ SteadyLite 試劑（Perkin Elmer LAS)，在室溫下培育20分鐘且在 SpectraMax M5讀取器（Molecular Devices)中進行讀數。展 示成熟二聚肌肉抑制素活化細胞信號傳導，從而引起螢光 素酶表現之劑量反應曲線展示於圖3B中。自身肌肉抑制素 物質以劑量依賴性方式且如不同天所獲得之數據所示在不 同測試時刻以可再現方式活化A204細胞，從而產生螢光素 酶信號。 2.產生單株抗體及表徵小鼠單株抗體i〇B3 2.1單株抗體 藉由用成熟肌肉抑制素（如實例1.1所述而製備）腹膜内注 射各隻小鼠來使SJL/J小鼠（Jackson Laboratories)免疫。免 疫之前，使肌肉抑制素與小隱孢子球菌（C. parvwm)結合， 且用結合物（2.5 pg肌肉抑制素與10 pg小隱孢子球菌結合） 及另外7.5 可溶性肌肉抑制素使小鼠免疫。自小鼠中移 除脾細胞且在PEG1500(Boehringer)存在下使Β淋巴細胞與 源自P3X63BCL2-13細胞（自身產生，參見Kilpatrick等人， 1997 Hybridoma 16(4)第38 1-389頁）之小鼠骨趙瘤細胞融合 145280.doc .87- 201029662 以產生融合瘤。由限制稀釋法選殖個別融合瘤細胞株（使 用E Harlow及D Lane中所述之方法）。以顯微鏡鑑別含有單 一群落之孔且測試上清液之活性。 最初，以FMAT夾心分析模式，針對對重組肌肉抑制素 之結合活性來篩選融合瘤上清液。使用BIAcore™方法對 此等陽性物質進行二次篩選以偵測與重組肌肉抑制素 (R&D Systems，編號788-G8-010/CF)及自身經表現及經純 化之肌肉抑制素（參見上述1.1)的結合性。 由限制稀釋法次選殖肌肉抑制素結合分析法所鑑別之陽 性物質以產生穩定單株細胞株。使用經固定之蛋白質A管 柱來純化在無血清條件下於細胞工廠中生長之來自此等融 合瘤之免疫球蛋白。接著由ELISA及BIAcore™針對肌肉抑 制素結合性再篩選此等經純化之單株抗體。 與重組肌肉抑制素結合之有效抗體即定為單株抗體 10B3。 2.2對單株抗體10B3進行定序及選殖10B3嵌合體 自10B3融合瘤細胞中提取全部RNA且藉由使用對前導序 列具特異性之引子及根據預定同型（IgG2a/K)之抗體恆定區 進行反轉錄來產生重鏈及輕鏈可變域之cDNA。接著將可 變重鏈及輕鏈域之cDNA選殖至質體中以供定序。10B3 VH 區胺基酸序列示於SEQ ID NO: 7中。10B3 VL區胺基酸序 列示於SEQ ID NO: 8中。10B3之Kabat CDR序列展示於表3 及表4中。 145280.doc •88- 201029662 表3 :重鏈CDR序列 抗體 CDRH1 CDRH2 CDRH3 10B3 GYFMH NIYPYNGVSNYNQRFKA RYYYGTGPADWYFDV (SEQIDNO: 1) (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) 表4 輕鏈CDR序列 抗體 CDRL1 CDRL2 CDRL3 10B3 KASQDINSYLS RANRLVD LQCDEFPLT (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) 藉由自10B3鼠類單株抗體（VH: SEQ ID NO: 7 ; VL: SEQ φ ID NO: 8)獲取可變區且將此等可變區移植至人類IgGl/k野 生型恆定區中來構築嵌合抗體。使用信號序列（如SEQ ID NO: 9所示）構築此等構築體。 簡言之，由PCR擴增經選殖之鼠類可變區以引入選殖至 哺乳動物表現載體（Rld_Efl及Rln_Efl)中所需之限制位 點。Hind III及Spe I位點經設計以框入VH域且選殖至含有 人類γΐ野生型恆定區之載體（Rld_Efl)中。Hind III及BsiW I位點經設計以框入VL域且選殖至含有人類κ恆定區之載體 φ (Rln_Efl)中。鑑別具有正確 Vh(seQ ID NO: 25)及 VL (SEQ ID NO: 8)序列之純系且製備質體（使用標準分子生物技術） 以供CHOK1細胞上清液中之表現用。使用經固定之蛋白質 A管柱自細胞上清液純化抗體且藉由在280 nm下讀取吸光 度來定量。 所得嵌合抗體稱為10B3嵌合體（10B3C或HCLC)。10B3 嵌合抗體具有如SEQ ID NO: 26所示之重鏈胺基酸序列。 10B3嵌合抗體具有如Seq ID NO: 27所示之輕鏈胺基酸序 列。 145280.doc -89· 201029662 2.3與重組肌肉抑制素結合 在夾心ELISA中，10B3及10B3嵌合體（10B3C)結合肌肉 抑制素（R&D Systems，編號788-G8-010/CF)。用肌肉抑制 素以10奈克/孔塗布板，且用阻斷溶液（PBS、0.1% TWEEN 及 1% BSA)阻斷。洗滌（PBS、0.1% TWEEN)之後，在 37°C 下經連續稀釋培育抗體2小時，且再次洗滌板，隨後在 3 7°C下與抗小鼠HRP或抗人類HRP(分別為Dako，P0161及 Sigma，A-8400) —起培育1小時。再次洗務板且添加OPD 受質（Sigma，P9187)直至發生比色反應為止且藉由添加 H2S04中止反應。在490 nm之吸光度下對板進行讀數且測 定EC50 (參見表5)。 表5.親本10B3及嵌合10B3抗體之EC50 抗體 平均 ECsc(ng/ml) 95%信賴度(ng/ml) 10B3 69 46-102 10B3嵌合體 49 33-73 藉由BIAcore™ (表面電漿共振）分析來評估10B3小鼠親 本體及10B3C對重組肌肉抑制素之親和力。藉由使用捕捉 表面進行分析：對於10B3小鼠親本體，藉由一級胺偶合使 抗小鼠IgG與C1晶片偶合；且對於10B3嵌合體，藉由一級 胺偶合在C1晶片上產生蛋白質A表面。 捕捉之後，使64 nM、16 nM、4 nM、1 nM、0.25 nM及 0.0625 nM之重組肌肉抑制素通過表面，且緩衝注射液（亦 即0 nM)用於雙重參考。在各次分析物注射之間存在再生 步驟，其後在下次注射肌肉抑制素之前發生新的抗體捕捉 145280.doc •90- 201029662 事件。使用ΤΙ 00機器分析軟體所固有之1:1模型與二價模 型來分析數據（參見表6)。兩個捕捉表面均可使用1〇〇 mM 碌酸再生’該工作係使用hbs-ερ作為操作緩衝液且使用 25°C作為分析溫度來進行。
10B3嵌合體之 平衡常數(KD) 88 pM 1(>B3小鼠親本體之 土衝常數(KD) nM 所有曲線二價模型
3.6 nM
5.9 nM 為進一步分析10B3之結合能力，進行基於ELISA之分析 法以判定結合對純的成熟肌肉抑制素是否具特異性或與其 他肌肉抑制素抗原是否仍可發生結合，該等其他肌肉抑制 素抗原包括潛伏複合物及在BMP-1裂解之後自潛伏複合物 釋放之成熟肌肉抑制素。
使用HexaHisGBITev/人類肌肉抑制素前肽序列（SEQ ID NO: 106)進行人類肌肉抑制素前肽之純化。於ch〇分泌系 統中表現此序列’且由Ni-NTA(GE Healthcare，NJ)自CHO 培養基中捕捉經表現之蛋白質。由Tev蛋白酶（自身表現， 序列示於SEQ ID NO: 107中）使HexaHisGBl標籤裂解。Tev 蛋白酶使SEQ ID NO: 106之標籤與前肽之間（「ENLYFQ」 與「ENSEQK」之間）發生裂解，得到SEQ ID NO: 108之序 列。 在6 Μ鹽酸胍存在下將經裂解標籤及未經裂解之 hexaHisGBITev/人類肌肉抑制素聚合蛋白捕捉於Ni-NTA 上，其中標籤裂解之人類肌肉抑制素聚合蛋白處於未結合 145280.doc •91- 201029662 之徑流中。將該徑流施加於具有1 xPBS緩衝液之Superdex 200管柱（GE Healthcare, NJ)上，且在管柱上分離聚集二聚 體及單體形式。人類肌肉抑制素前肽（SEQ ID NO: 108)二 聚體形式用於形成潛伏複合物。 藉由在室溫下於6 Μ鹽酸胍中將經純化之人類肌肉抑制 素前肽（SEQ ID NO: 108)與成熟肌肉抑制素（SEQ ID NO: 104)以3: l(w/w)之比率混合2小時來製備肌肉抑制素潛伏複 合物，隨後在4°C下透析至lxPBS中隔夜，且加載至具有lx PBS 緩衝液之 Superdex 200(GE Healthcare, NJ)上。彙集含 有肌肉抑制素前肽與成熟肌肉抑制素之峰處的溶離份。由 LC/MS與SDS-PAGE確認潛伏複合物（數據未示）。 在4°C下將肌肉抑制素抗原以1〇〇奈克/孔塗布於具有PBS 之EIA/RIA板（Costar)之孔上隔夜，隨後在室溫下阻斷 (PBS, 3% BSA) 30 分鐘。洗滌（PBS，1% BSA 及 0.1% Tween20)板，隨後添加10B3於洗滌緩衝液中之連續稀釋液 且在室溫下培育2小時。再次洗滌板，隨後添加以洗滌緩 衝液1:10,000稀釋之結合過氧化酶之入丨行11丨911^?(313')2片段 驢抗小鼠 IgG(Jackson Laboratories，目錄號 715-036-151) 且在室溫下培育1小時。最終洗滌步驟之後，添加TMB受 質且發生色度變化，用硫酸中止，且在450 nm下對板進行 讀數。圖4展示10B3能夠結合成熟二聚肌肉抑制素、潛伏 複合物（四聚體）及在BMP-1裂解之後自潛伏複合物釋放之 肌肉抑制素。亦發現10B3不會與前肽二聚體結合（數據未 示）。 145280.doc -92- 201029662 2.4粗定位肌肉抑制素上之10B3結合抗原決定基 基於肌肉抑制素胺基酸序列來合成由10個胺基酸重疊 (以4個胺基酸補償）之生物素標記14元肽（14 mer peptide)以 定位由10B3(Mimotopes, Australia供應）識別之結合抗原決 •定基之位置。 .在SRU BIND讀取器（SRU Biosystems)上進行工作。洗滌 抗生蛋白鏈菌素生物感測器板，進行基線讀取，且將生物 素標記肽捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之生物感測器板上。 再次洗滌板，且進行新的基線讀取，接著添加抗體且監測 結合。 由10個胺基酸重疊（以4個胺基酸補償）之經專門設計的 14元人工肽序列之詳情提供於表7中。 表7.肌肉抑制素人工肽
肽編號 N端 序列 C端 Hydro MWt 1 H- DFGLDCDEHSTESRGSG (SEQ ID NO: 56) -NH2 -0.045 2164.84 3 生物素- SGSGDCDEHSTESRCCRY (SEQ ID NO: 57) -NH2 0.118 2217.09 5 生物素- SGSGHSTESRCCRYPLTV (SEQ ID NO: 58) -NH2 0.346 2165.17 7 生物素- SGSGSRCCRYPLTVDFEA (SEQ ID NO: 59) -NH2 0.394 2173.18 9 生物素- SGSGRYPLTVDFEAFGWD (SEQ ID NO: 60) -NH2 0.456 2229.16 11 生物素- SGSGTVDFEAFGWDWIIA (SEQ ID NO: 61) -NH2 0.646 2183.13 13 生物素- SGSGEAFGWDWIIAPKRY (SEQ ID NO: 62) -NH2 0.505 2265.28 15 生物素- SGSGWDWIIAPKRYKANY (SEQ ID NO: 63) -NH2 0.416 2337.39 17 生物素- SGSGIAPKRYKANYCSGE (SEQ ID NO: 64) -NH2 0.183 2113.11 19 生物素- SGSGRYKANYCSGECEFV (SEQ ID NO: 65) -NH2 0.286 2182.15 21 生物素- SGSGNYCSGECEFVFLQK (SEQ ID NO: 66) -NH2 0.436 2180.17 145280.doc -93- 201029662 23 生物素- SGSGGECEFYFLQKYPHT (SEQ ID NO: 67) -NH2 0.447 2211.21 25 生物素- SGSGFVFLQKYPHTHLVH (SEQ ID NO: 68) -NH2 0.593 2279.36 27 生物素- SGSGQKYPHTHLYHQANP (SEQ ID NO: 69) -NH2 0.279 2183.14 29 生物素- SGSGHTHLVHQANPRGSA (SEQ ID NO: 70) -NH2 0.218 2037.94 31 生物素- SGSGVHQANPRGSAGPCC (SEQ ID NO: 71) -NH2 0.297 1909.85 33 生物素- SGSGNPRGSAGPCCTPTK (SEQ ID NO: 72) -NH2 0.238 1901.87 35 生物素- SGSGSAGPCCTPTKMSPI (SEQ ID NO: 73) -NH2 0.468 1905.96 37 生物素- SGSGCCTPTKMSPINMLY (SEQ ID NO: 74) -NH2 0.582 2115.27 39 生物素- SGSGTKMSPINMLYFNGK (SEQ ID NO: 75) -NH2 0.39 2157.27 41 生物素- SGSGPINMLYFNGKEQII (SEQ ID NO: 76) -NH2 0.504 2193.28 43 生物素- SGSGLYFNGKEQIIYGKI (SEQ ID NO: 77) -NH2 0.434 2199.26 45 生物素- SGSGGKEQIIYGKIPAMV (SEQ ID NO: 78) -NH2 0.416 2060.17 47 生物素- SGSGIIYGKIPAMVVDRC (SEQ ID NO: 79) -NH2 0.558 2091.25 49 生物素- SGSGGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO: 80) -OH 0.396 1950.02 14元肽結合數據之分析顯示10B3不能結合肌肉抑制素内 之任何線性抗原決定基。然而，對照抗肌肉抑制素抗體顯 示結合肽組内之抗原決定基（數據未示）。 使用肽掃描-骨架上之化學鍵聯免疫原性肽（CLIPS)技術 對10B3C之肌肉抑制素結合位點進行後續分析，表明肌肉 抑制素之「PRGSAGPCCTPTKMS」胺基酸序列可為嵌合 抗體之結合位點（數據未示）。 2.5中和肌肉抑制素ActRIIb受體結合性 在4°C下，將重組可溶性ActRIIb(R&D Systems，編號 3 39-RBB)以lμg/ml塗布於具有碳酸鹽緩衝液之ELISA板之 145280.doc -94· 201029662 孔中隔夜。對板進行阻斷（參見上述2·3之阻斷溶液）且遵循 標準ELISA方案進行洗蘇。平行地，在37。〇下，將2 ηΜ生 物素標記肌肉抑制素（自身，如1.1所述，生物素標記材料） 與由10Β3、10B3C及陰性對照（igG1同型對照）組成之抗體 連續稀釋液一起預培育2小時。接著在37°C下將生物素標 s己肌肉抑制素：抗體反應物添加至塗有ActRIIb之板中， 歷時1小時。遵循標準洗滌程序，隨後添加1:1000稀釋之 抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物（Dako P0397)且在37。(：下再培 育1小時。再次洗滌板，且在OPD受質（Sigma)及酸停止溶 液處理之後於490 nm之吸光度下進行分析。抑制肌肉抑制 素活性之抑制曲線及IC5〇值分別展示於圖5及表8中。 表8.中和ActRIIb受想之ICse
受體中和分析法為可用於基於效能區分ICs〇低於！ nM之 • 分子的最敏感方法。然而，該分析法本身對結合感受態生 物素標記肌肉抑制素之精確濃度敏感。因此，在不同情況 下，已使用相同方法測定10B3之其他1(：5〇值，例如Ο。 nM、0.108 nM、0.109 nM或 0.384 nM(注意，在表 8 中 132 ng/ml=0.88 ηΜ)。 2.6活體外抑制肌肉抑制素之生物活性 使用以上1.2所述之肌肉抑制素反應性報導基因分析、、 來評估活體外抗肌肉抑制素抗體對肌肉抑制素活性 之作 145280.doc 95- 201029662 用。對該分析法進行改進以在37°C下將濃度為2.8 nM(相 當於細胞活化分析法中之ED70)之肌肉抑制素與不同濃度 之10B3或10B3C抗體（0.1-20 nM)—起預培育，隨後添加至 經轉染之A204細胞中。對螢光素酶進行讀數，由此產生圖 6所示之抑制曲線。表9展示在3次重複分析及ANOVA分析 之後針對抗體所測定之IC5G值。數據清楚顯示對A204肌細 胞株之肌肉抑制素活化的劑量依賴性抑制，而對照抗體顯 示對肌肉抑制素活性無抑制作用。 表9.活體外肌肉抑制素反應性報導基因分析法之IC50 (A204細胞） 抗體 平均 IC5〇(nM) 95%信賴度(nM) 10B3 10.0 6.5-15.5 10B3嵌合體 6.2 3.9-9.9 2.7 10B3之活體内功效 為顯示親本10B3之功效，對8週齡雌性CB17 SCID小鼠 進行為期5週之35天研究。第1天、第4天、第8天、第15 天、第22天及第29天藉由腹膜内注射3、10或30 mg/kg 10B3對處理組（每組10隻動物）進行給藥，而對照組接受 PBS或同型對照抗體（IgG2a)。研究結束後，分別藉由對動 物稱重及QMRI分析來測定動物之總體重（A)及總瘦肌質量 (B)(圖7)。精選動物後（第35天），自動物中解剖出個別肌 肉（腓腸肌（A)、四頭肌（B)及伸趾長肌（EDL)(C))以供質量 測定（圖8)。為測定對肌肉功能之作用，對EDL肌肉進行離 體收縮性測試（圖9)，其中測定肌肉之強直收縮力（圖9A)及 145280.doc -96· 201029662 每毫克肌肉質量之強直收縮力（圖9B)。 在30 mg/kg劑量下在處理組中觀測到對10B3之明顯劑量 依賴性反應，表明35天研究之後體重及瘦肌質量有最顯著 改良（分別為8%及8.5%)。肌肉質量之分析顯示腓腸肌、四 頭肌及EDL具有相同趨勢，皆展示質量之劑量依賴性增 加，此外30 mg/kg給藥組展示最大顯著性。 又，研究（未描述）已顯示在較早時間點（諸如35天）不能 觀察到握力有顯著改良。然而，離體收縮性測試顯示在 EDL之強直收縮力量測中可顯示顯著改良。此外’該改良 顯示與肌肉質量無關。因此，10B3展現改良現有肌肉質量 之功能的能力。 3.對10B3進行人類化 3.1序列分析 在10B3可變區之序列與其他鼠類及人類免疫球蛋白序列 之間進行比較。使用FASTA及BLAST程式及藉由目視檢查 來進行此比較。 鑑別適於10B3 VH之人類受體構架（IGHV1_18及JH3人類 J區段序列）：SEQ ID NO: 10。鑑別適於10B3 VL之人類受 體構架（IGKV1_16及JK2人類J區段序列）：SEQ ID NO: 11。 在SEQ ID NO: 10中，存在受體構架之CDRH1及CDRH2，且 CDRH3 由XXXXXXXXXX表示。在SEQ ID NO: 11中，存 在受體構架之CDRL1及CDRL2，且CDRL3由XXXXXXXXXX 表示。（10個X殘基為CDR位置之佔位，而非各CDR中胺基 酸序列數目之量度）。 145280.doc •97· 201029662 在CDR移植中，通常需要一或多個來自所包括供體抗體 之構架殘基替代其在受體構架中之直系同源殘基以獲得令 人滿意的結合。10B3中之以下鼠類構架殘基經鑑別在抗體 之CDR移植（人類化）型式之設計方面具潛在重要性（位置係 根據Kabat等人之編號規定）：
位置（Kabat編號） 小鼠10B3 VH 人類VH 28 S T 105 T Q 位置（Kabat編號） 小鼠10B3 VL 人類VL 16 R G 71 Y F 100 A Q 三個具有不同回復突變之人類化VH構築體經設計以獲得 具有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號為 H0 至 H2。使用 CDR之 Kabat 定義，H0(SEQ ID NO: 12)由 10B3 VH CDR移植至指定受體序列中之CDR移植體組成。 H1(SEQ ID NO: 13)與H0—致，但具有回復突變，其中位 置105處之胺基酸為取代麩醯胺酸之蘇胺酸。H2(SEQ ID NO: 14)與H0—致，但具有回復突變，其中位置28處之胺 基酸為取代蘇胺酸之絲胺酸。 應注意，對於所有人類化VH區（及相應重鏈），已對構架4 (WGQGTMVTVSS)之序列進行修飾，藉以用曱硫胺酸胺基 酸殘基（Kabat位置108)取代白胺酸胺基酸殘基。此由在編 碼人類化VH區之DNA序列中包括Spel選殖位點而產生。 145280.doc -98- 201029662 四個具有不同回復突變之人類化vL構築體經設計以獲得 具有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號為 L0 至 L3。使用 CDR之 Kabat 定義，L0(SEQ ID NO: 15)由 10B3 VL CDR移植至指定受體序列中之CDR移植體組成。 L1(SEQ ID NO: 16)與L0—致，但具有回復突變，其中位 置16處之胺基酸為替代甘胺酸之精胺酸。L2(SEQ ID NO: 17)與L0—致，但具有回復突變，其中位置71處之胺基酸 為替代苯丙胺酸之酪胺酸。L3(SEQ ID NO: 18)與L0 — 致，但具有回復突變，其中位置100處之胺基酸為替代麩 醯胺酸之丙胺酸。 3.2對10B3進行人類化 藉由重新建構重疊寡核苷酸來製備人類化vH及VL構築 體，該等寡核苷酸包括供選殖至Rid ΕΠ及Rln ΕΠ哺乳動 物表現載體中之限制位點以及信號序列。引入Hind III及 Spe I限制位點以框入含有信號序列（SEQ ID NO: 9)之VH域 _ 以供選殖至含有Rid Efl之人類IgGl野生型恆定區中。引 入Hind III及BsiW I限制位點以框入含有信號序列（SEQ ID NO: 9)之VL域以供選殖至含有Rln Efl之人類κ恆定區中。 . 此舉基本上如WO 2004/014953中所述。 4.表現及表徵人類化抗體 4.1製備抗體 在Rld_Ef 1及Rln_Ef 1哺乳動物表現載體中製備人類化VH 構築體（H0、HI及H2)及人類化VL構築體（L0、LI、L2及 L3)。將質體重鏈-輕鏈組合（H0L0、H0L1、H0L2、 145280.doc •99· 201029662 H0L3、HILO、H1L1、H1L2、H1L3、H2L0、H2L1、 H2L2、H2L3)短暫地共轉染至CHOK1細胞中且小規模表現 以得到12種不同人類化抗體。 一式兩份且在兩個獨立實驗中將各抗體之質體轉染至 CHOK1細胞中。另外，表示10B3嵌合體，作為陽性對 照。在肌肉抑制素結合ELISA中分析CHOK1細胞上清液中 所產生之抗體的活性（參見4.2) ^圖10A之圖表中說明僅一 個實驗之ELISA數據。在此ELISA中所有12種人類化mAb 皆顯示與重組肌肉抑制素結合。在兩個實驗中，含有H2或 L2鏈之mAb傾向於對肌肉抑制素具有較佳結合活性，其類 似於針對10B3嵌合體所觀測之結合活性。 圖10B由圖10A引出且展示含有H2及/或L2鏈之抗體及 10B3嵌合體。 H0L0、H1L2及H2L2經選擇以供較大規模表現、純化及 進一步分析。 藉由直接ELISA分析，經純化之H0L0、H1L2及H2L2結 合重組肌肉抑制素。該方法係如4.2所述而進行且ELISA數 據在圖11之圖表中說明。在CHOEla與CHOK1細胞表現系 統中均產生H2L2及H0L0。自CHOK1製劑獲得之低濃度抗 體難以精確定量。自CHOEla製劑獲得高濃度之經純化抗 體。10B3嵌合抗體包括於ELISA中，作為陽性對照（此材 料由CHOEla製得）。H2L2對肌肉抑制素之結合活性與 10B3嵌合體相當且優於針對H0L0所觀測之結合活性。
4.2肌肉抑制素結合ELISA 145280.doc 201029662 大致根據此方案進行肌肉抑制素結合ELISA。在4°C 下’用1〇奈克/孔重組肌肉抑制素塗布96孔ELISA板隔夜。 接著用先'條緩衝液（PBS、0.1% Tween-20)洗蘇此板3次。 在宮，田下田 /皿 β P且斷溶液（PBS、0.1% Tween-20+l%牛血清白 蛋白[BSA]))對孔進行阻斷1小時，隨後用洗滌緩衝液洗滌 3次。接著將抗體滴定至適合之濃度範圍（約100至0.001 pg/ml) ’添加至板中且在室溫下培育1小時。接著用洗滌 緩衝液洗務板3次。使用抗小鼠IgG HRP結合抗體（Dako供 應之P0260 ’根據製造商之說明書使用此試劑）偵測小鼠抗 體（諸如10B3)之結合。使用抗人類κ輕鏈HRP結合抗體 (Sigma Aldridge供應之A7164，根據製造商之說明書使用 此試劑）偵測人類化抗體或嵌合抗體（諸如10B3嵌合體或 H0L0)之結合。接著用洗滌缓衝液洗滌板3次且用OPD受質 (來自Sigma，根據製造商之說明書使用）進行顯色且在490 nm下於板讀取器上進行讀數。 4.3藉由BIAcore™分析舆重組肌肉抑制素之結合 藉由BIAcore™分析，經純化之H0L0、H1L2及H2L2結合 重組肌肉抑制素。將重組肌肉抑制素以三種不同密度 (低、中及高密度，以分別得到約35、120及350 RU之R-max值）固定於BIAcore™晶片上。使256、64、Ιό、4及1 nM之抗體通過。將〇 nM抗體用於雙重參考且使數據與1:1 模型擬合。 存在許多告誡適用於此分析法所產生之數據；肌肉抑制 素固定於晶片表面上可能引起蛋白質構形改變’或可能使 145280.doc -101 - 201029662 抗體與蛋白質上之抗原決定基結合不明顯，且將產生異質 表面（可能產生多個結合事件）。肌肉抑制素之低密度固定 應顯示1:1結合（主要），肌肉抑制素之中密度及高密度固定 可能受二價（親和力）結合事件影響。在此分析法中，正確 抗體濃度為精確值的測定所必需。 因此，使用BIAcore™所產生之數據一般用於對構築體 進行分級，而非提供明確動力學。BIAcore™數據在表10 至表12中說明。 表10 : 10B3嵌合體、H0L0、H1L2及H2L2與低密度肌肉抑 制素表面結合之BIAcoreTM分析 構築體 締合速率， ka (Ms·1) 解離速率， kd (s'1) 結合親和力， KD(nM) 10B3嵌合體 5.987xl05 9.668X10·4 1.615 H0L0 8.012xl05 6.615xl0'j 8.255 H1L2 2.205x10s 3.324x10'" 15.08 H2L2 3.206xl05 2.682x10'" 8.366 注意：分析之解ί 猿階段縮短至約250秒，以改良曲線擬合 表11 : 10B3嵌合體、H0L0、H1L2及H2L2舆中密度肌肉抑 制素表面結合之BIAcoreTM分析 構築體 締合速率， ka (Ms*1) 解離速率， kd(s“） 結合親和力， KD(nM) 10B3嵌合體 4.129x10s 5.593X10·4 1.355 H0L0 1 2.575χ105 9.301χ10'4 3.612 H1L2 1.369χ105 6.932χ10'4 5.064 H2L2 2.456x10s 7.368χ10·4 3.000 注意：曲線擬合一般較差 145280.doc •102· 201029662 表12 : 10B3嵌合體、H0L0、H1L2及H2L2與高密度肌肉抑 制素表面結合之BIAcoreTM分析 構築體 締合速率， ka (Ms'1) 解離速率， kcUs1) 結合親和力， KD(nM) 10B3嵌合體 2.478xl05 2.185X10·4 0.882 H0L0 1.463x10s 3.375Χ10·4 2.307 H1L2 9.224xl04 2.232χ104 2.420 H2L2 1.473xl05 2.160χ104 1.467 注意：曲線擬合一般較差 φ 此等數據指示結合親和力隨著BIAeore™晶片上之肌肉 抑制素表面密度增加而改良，此可能歸因於親和力結合。 然而，等級次序大致保持相同，且與用於量測親和力之表 面無關（結合親和力之等級次序=10B3嵌合體>H2L2>H0L0> H1L2)。此等數據與肌肉抑制素ELISA數據廣泛一致。 4.4在報導細跑生物分析法中中和重組肌肉抑制素 在以上（1.2)所述之肌肉抑制素反應性報導基因分析法中 測試人類化抗體，以評估活體外功效。在37°C下，將濃度 ® 為2.8 nM之肌肉抑制素與不同濃度之抗體（0.1-20 nM)—起 預培育，隨後添加至經轉染之A204細胞中，且隨後對螢光 素酶進行讀數。所得數據展示於圖12中且經測定之IC50 (ANOVA分析）展示於表13中。 表13. A204活體外活性分析法中人類化抗體之ICS0 抗艟 平均 ICs〇(nM) 95%信賴度(nM) 10B3 8.5 7.2-10.1 10B3嵌合體 5.1 4.2-6.1 H0L0 10.2 7.9-13.1 H2L2 8.6 6.8-10.7 145280.doc -103· 201029662 人類化抗體抑制A204細胞之肌肉抑制素誘導之活化，然 而，與嵌合10B3相比，已觀測到活性有一些損失，此可能 歸因於人類構架區之影響。然而，在分析法中，活性損失 極小且確定處於2倍以内。 5.人類化抗體之可展性分析（developability analysis) 1 0B3嵌合體與人類化抗體之重鏈及輕鏈中之潛在脫除醯 胺基位點的電子雜交分析（in silico analysis)鑑別重鏈 CDRH2中Kabat位置54處之天冬醯胺（N54)具有脫除醯胺基 之高潛力。為進一步表徵此殘基，產生10B3嵌合抗體及人 類化H2L2抗體，其中用N54取代天冬胺酸（D)或麩醯胺酸 (Q)胺基酸殘基。 10B3嵌合體及人類化抗體之輕鏈在CDRL3中之Kabat位 置91處具有半胱胺酸（C)殘基。在抗體加工發展期間，未 配對半胱胺酸可具有化學反應性而產生修飾，從而引起產 物之可能異質性及親和力之潛在變化。另外，此殘基可能 能夠因與產生免疫球蛋白摺疊所必需之可變區中其他半胱 胺酸的錯誤配對而促使錯誤摺疊或聚集。為進一步表徵此 殘基，產生10B3嵌合抗體及人類化H2L2抗體，其中用C91 取代絲胺酸（S)胺基酸殘基。 另外，亦將重鏈CDRH2中進行之脫除醯胺基取代與輕鏈 CDRL3中位置91處之取代組合。作為此等分析之一部分所 產生之抗體在表14中說明。 145280.doc -104- 201029662 表14:產生以供可展性分析之人類化抗艎變異體 抗體分子名_ 重鏈可變區： SE〇 ID NO: 輕鏈可變區： SE〇 ED NO: 10B3 嵌合體 N54D 〇KXG_N54D> 19 8 10B3 嵌合體 N54Q 20 8 10B3 嵌合體 N54D & C91S (HCLC-N54D-C91S) 19 21 10B3 嵌合體 N54Q & C91S (HCLC-N54Q-C91S) 20 21 10B3 嵌合體 C91S( HCLC-C91S) 25 21 H2L2 N54D (H2L2-N54D) 22 17 H2L2 N54〇 (H2L2-N540) 23 17 H2L2 N54D & C91S (H2L2-N54D-C91S) 22 24 H2L2 N54〇 & C91S (H2L2-N54Q-C91S) 23 24 H2L2 C91S (H2L2-C91S) 14 24 ❿ 5.1表現及表徵可展性變異髏 藉由相關H2重鏈及L2輕鏈表現載體之定點突變誘發來 製備表現此等抗體所必需之重鏈及輕鏈構築體。將質體重 鏈-輕鏈組合（H2L2-N54D ; H2L2-N54Q ； H2L2-N54D-C91S ; H2L2-N54Q-C91S ; H2L2-C91S)短暫地共轉染至 CHO細胞中且小規模表現以得到5種不同人類化抗體。另 外，表現10B3嵌合體（HCLC)及H2L2，作為陽性對照。 ❿ 一式兩份且在兩個獨立實驗中將各抗體之質體轉染至 CHOK1細胞中。在肌肉抑制素結合ELISA中分析CHOK1細 胞上清液中所產生之抗體的活性。如4.2所述進行ELISA方 ’ 法且圖13之圖表中說明僅一個實驗之ELISA數據。在此 ELISA中，含有N54Q及/或C91S取代之H2L2 mAb顯示與重 組肌肉抑制素結合，且此結合分別與10B3嵌合體（HCLC) 或H2L2大致相當。在此ELISA中，10B3嵌合體及含有單獨 N54D取代（或與C91S取代組合）之H2L2 mAb不會與重組肌 肉抑制素結合。 145280.doc -105- 201029662 H2L2-N54Q、H2L2-C91S及 H2L2-N54Q C91S經選擇以 供較大規模表現（在CHOK1與CHOEla表現系統中）、純化 及進一步分析。在肌肉抑制素結合ELISA中分析此等抗體 之活性。如第4.2節所述進行ELISA方法且圖14之圖表中說 明僅一個實驗（來自總共三個實驗）之ELISA數據。H2L2 C91S對肌肉抑制素之結合活性似乎類似於10B3嵌合體、 H0L0 及 H2L2。然而，H2L2 N54Q 及 H2L2 N54Q C91S 對肌 肉抑制素似乎具有較低結合活性。 亦由BIAcore，使用以上4.3所述之類似方法測試可展性 構築體以測定肌肉抑制素結合親和力之任何變化（參見表 15)。數據（對於低密度表面）顯示在H2L2人類化變異體 中，預定脫除醯胺基位點（N54Q)之取代導致親和力損失至 少2倍。 表15.肌肉抑制素可展性變異體之肌肉抑制素結合動力學 構築體 ka kd KD(nM) 10B3 嵌合體(HCLC) 3.323E+5 1.477E-3 4.44 H2L2 3.113E+5 3.735E-3 12.0 H0L0 1.922E+5 4.363E-3 22.7 H2L2-C91S 1.903E+5 3.153E-3 16.6 H2L2-N54Q 1.590E+5 4.447E-3 28.0 H2L2-N54Q-C91S 1.389E+5 4.623E-3 33.3 亦藉由FORTEM〇tm (生物膜層干涉技術）分析來評估 10B3小鼠親本體及H2L2-C91 S可展性變異體對重組肌肉抑 制素之親和力。藉由抗原捕捉進行FORTEbio™分析。根據 製造商之說明書，藉由一級胺偶合將肌肉抑制素（自身， 參見以上1_1)偶合至胺反應性生物感測器上❶接著將濃度 145280.doc -106- 201029662 為20 nM之抗體捕捉於此表面上。使用機器所固有之評估 軟體分析數據且使用1:1擬合分析數據（參見表16)。由於與 感應器表面結合之肌肉抑制素分子數目有限及抗體濃度較 低，故親和力作用降低，從而與Biacore分析相比能夠更精 確地量測親和力。數據顯示親本抗體（10B3)具有310 pM之 . 親和力，而可展性變異體H2L2-C91S具有73 pM之親和 力。然而，由於抗體與肌肉抑制素之結合性質，故此等值 主要用於達成分級目的，且親和力可能並不代表活體内親 參 和力。 表16. 10B3親本體及H2L2-C91S可展性變異體對肌肉抑制 素之親和力 ί/b體 莫耳濃度 「Ml kd [1/s] ka [1/Ms] KD [M] 締合R2 10B3親本體 2E-8 1.31E-4 4.24E5 3.10E-10 0.9981 H2L2-C91S 2E-8 2.99E-5 4.10E5 7.30E-11 0.99652 亦使用以上1.2所述之A204螢光素酶分析法可展性突變 ® 對活體外中和分析法之影響。抑制曲線之圖解表示展示於 圖15中且相應IC50值呈現於表17中。根據此分析法，人類 化變異體之表觀中和效能相對於可展性變異體並無損失。 表17. A204活體外活性分析法中可展性抗體變異體之IC50 抗體 平均IC50 (nM) 95%信賴度(nM) 10B3嵌合體 8.45 5.36-13.31 H0L0 10.07 5.74-17.65 H2L2 10.14 5.87-17.49 H2L2-C91S 9.26 5.17-16.62 H2L2-N54Q 11.98 6.35-22.59 H2L2-N54Q-C91S 10.42 5.99-18.11 145280.doc -107- 201029662 5.2可展性變異體之脫除醢胺基潛力 藉由在37°C下與1%碳酸氫銨（pH 9.0) —起培育48小時使 H0L0、H2L2、H2L2-C91S、H2L2-N54Q 及 H2L2-N54Q-C91S抗體歷經誘導脫除醯胺基之應激條件。處理之後，在 肌肉抑制素結合ELISA中分析H0L0、H2L2、H2L2-C91S、 H2L2-N54Q及 H2L2-N54Q-C91S 之功能活性（如 4·2所述）。 圖16至圖20中說明僅一個實驗（來自總共兩個實驗）之 ELISA數據。此等數據清楚指示處理程序不會影響任一抗 體與肌肉抑制素結合之能力。 6. CDRH3變異型人類化抗體 6.1構築CDRH3變異型人類化抗體 使用抗體H2L2-C91S(可變序列分別為：SEQ ID NO: 14 及24 ;全長序列分別為：SEQ ID NO: 30及40)作為基礎分 子來進行各殘基至替代性胺基酸殘基之CDRH3(SEQ ID NO: 3)的定點突變誘發。使用pTT載體（加拿大國家研究委 員會（National Research Council Canada)，具有經修飾之多 重選殖位點（MCS))產生包括H2及L2-C91S之基礎序列（分 別為SEQ ID NO: 45及55)之人類恆定區的全長DNA表現構 築體。 產生約300個CDRH3變異體且在後續分析中測試約200個 變異體（參見6.2及6.3)。 6.2 HEK 293 6E細胞中之CDRH3變異艘表現 將分別編碼約200個CDRH3變異體之重鏈及輕鏈的pTT 質體短暫地共轉染至ΗΕΚ 293 6Ε細胞中且小規模表現以產 145280.doc -108 - 201029662 生抗體。如上所述，重鏈具有H2之基礎序列與變異型 CDRH3序列，且輕鏈具有L2-C91S之基礎序列。直接評估 來自組織培養上清液之抗體。 6.3對組織培養上清液進行初始掃描-ProteOnXPR36 在 ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)上對 CDRH3 篩選 物進行初始動力學分析。對於殘基R95至Ρ1〇〇_Β，使用蛋 白質A/G捕捉表面（Pierce 21186)進行分析，且對於殘基 A100_C 至 V102，使用抗人類 IgG 表面（Biacore/GE Healthcare BR-1008-39)。使用一級胺偶合將捕捉分子固定 於 GLM 晶片（Biorad Laboratories 176-5012)上來類似地製 備兩種捕捉表面。將來自表現相關特定變異體之短暫性轉 染而得之組織培養上清液的CDRH3變異體直接捕捉於蛋白 質A/G表面或抗人類表面上（視經突變之殘基而定）。捕 捉之後，將 256 nM、32 nM、4 nM、0.5 nM及0.0625 nM之 自身重組人類肌肉抑制素（參見以上1.1)用作分析物，且單 獨緩衝注射液（亦即〇 nM)用於對結合曲線進行雙重參考。 在肌肉抑制素結合事件之後’使捕捉表面再生：對於蛋白 質A/G捕捉表面’使用1 〇〇 填酸使捕捉表面再生，且對 於抗人類IgG表面，使用3 M MgCh使捕捉表面再生；該再 & # & &前所捕捉之抗體以準備用於捕捉及結合分析之另 一循環。接著將數據與ProteOn分析軟體所固有之1··1模型 (具有質量輸送）擬合。使用 HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare 幻進行操作且分析溫度為25°C ° I士果因相立作用之性質而難以解釋，此係因為I:1模型 •109- 145280.doc 201029662 不太可能充分描述相互作用，然而，藉由判斷感測器圖譜 有可能選擇相較基礎分子具有改良之親和力的構築體。判 斷篩選物具有經鑑別之11種CDRH3變異體，其相較基礎分 子似乎具有較佳動力學概況。11種CDRH3變異體之重鏈描 述於下表18中（使用Kabat編號）。所有變異體皆具有輕鏈 L2-C91S(可變序列：SEQ ID NO: 24 ;全長序列：SEQ ID NO: 40，全長DNA序列：SEQ ID NO: 55)。經鑑別相較基 礎分子具有較佳動力學概況之另一 CDRH3變異體為 F100G_S(SEQ ID NO: 110)，但此未作進一步分析。 ❹ 表18. CDRH3變異型人類化抗體序列 名稱 CDRH3之序列 H2L2-C91S RYYYGTGPADWYFDV (SEQ ID NO: 3) H2L2-C91S—Y96L RLYYGTGPADWYFDV (SEQ ID NO: 82) H2L2-C91S_G99D RYYYDTGPADWYFDV (SEQ ID NO: 83) H2L2-C91S_G99S RYYYSTGPADWYFDV (SEQ ID NO: 84) H2L2-C91S_G100A_K RYYYGTKPADWYFDV (SEQ ID NO: 85) H2L2-C91S_P100B_F RYYYGTGFADWYFDV (SEQ ID NO: 86) H2L2-C91S—P100B—I RYYYGTGIADWYFDV (SEQ ID NO: 87) H2L2-C91S_W100E_F RYYYGTGPADFYFDV (SEQ ID NO: 88) H2L2-C91S_F100G_N RYYYGTGPADWYNDV (SEQ ID NO: 89) H2L2-C91S_F100G_Y ’ RYYYGTGPADWYYDV (SEQ ID NO: 90) H2L2-C91S_V102N RYYYGTGPADWYFDN (SEQ ID NO: 91) H2L2-C91S_V102S RYYYGTGPADWYFDS (SEQ ID NO: 92) 提及經編碼之抗體（亦即H2L2-C91S_Y96L)意謂編碼輕 鏈及重鏈之第一質體及第二質體（例如含有pTT5_H2_Y96L 序列之質體及含有PTT5_L2-C91S序列之質體）在適合之細 胞株中共轉染及表現所產生之抗體。 6·4表現一組經選揮之CDRH3變異體 145280.doc -110- 201029662 在HEK 293 6E細胞中表現表18所述之11種CDRH3變異 體之重鏈及輕鏈（如6.2所述），使用經固定之蛋白質A管柱 (GE Healthcare)進行親和純化且藉由在280 nm下讀取吸光 度來定量。 6.5藉由BIAcoreTM*析舆重組肌肉抑制素之結合 為判斷是否成功選擇經ProteOn XPR36初始篩選之構築 體，對經純化之重組抗體進行解離速率分級實驗。藉由一 級胺偶合將肌肉抑制素（自身重組肌肉抑制素，參見以上 1·1)以三種不同密度（低、中及高密度）共價固定於CM5晶 片（Biacore/GE Healthcare .BR-1000-14)上，產生對於所用 抗體濃度分別得到約60個共振單位（RU)、250 RU及1000 RU之最大結合信號的表面。使用單一濃度（256 nM)之抗 體，且緩衝注射液用於對結合相互作用進行雙重參考。針 對所有抗體對各種密度之肌肉抑制素表面的相互作用，使 用Biacore 3000機器所固有之軟體計算初始解離速率（off-rate)。藉由使用100 mM磷酸進行再生，且在25°C下使用 HBS-EP緩衝液進行分析。 據發現所測試之所有構築體相較基礎分子（H2L2 C91S) 顯示較佳之解離速率（解離速率常數），此係因為解離速率 與H2L2 C91S相比較慢。在高密度表面上，除10B3嵌合體以 外之前 5種構築體為 H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_W100E_F、 H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S—G99S及H2L2-C91S_P100B_F。 6.6由BIAcoreTM對與重組肌肉抑制素之結合進行完全動 力學分析 145280.doc -111- 201029662 將低、中及高密度之肌肉抑制素（自身重組肌肉抑制 素，參見以上1.1)固定於Series S CM5晶片（Biacore/GE Healthcare BR-1006-68)上，產生分別得到約 15 RU、37 RU及500 RU之最大結合信號的表面。使256 nM、64 nM、 1 6 nM、4 nM、1 nM之CDRH3變異體通過所有三個表面， 且緩衝注射液（亦即0 nM)用於雙重參考，使用100 mM磷酸 進行再生。使數據與T100 Biacore機器所固有之二價模型 擬合且在25°C下使用HBS-EP操作。 一般而言，在所有三種密度表面上，基礎H2L2-C91S相 較CDR變異體擬合較差，以致難以獲得精確基線值。在三 種表面中，最高密度表面在基礎抗體與CDR變異體之間得 到最佳分離，但此外基礎H2L2-C91S分子之擬合較差。然 而，預期此表面可能在構築體之間得到最大分離，且該表 面最有可能提供用於真正的二價結合之最佳表面，此係因 為親和力結合及再結合事件可能較為頻繁見且因此可「放 大」親和力之小差異。一般而言，所有CDR變異體相較基 礎H2L2-C91S似乎皆較佳，此主要因為解離速率優良（亦即 較慢），高密度表面上尤其如此。 由於此分析法所涉及之方法，故在標靶抗原與生物感測 器晶片表面之共價偶合中，所得實際親和力可能不會反映 活體内可觀察到的親和力。然而，此數據適用於達成分級 目的。使用來自此分析法之高密度表面之數據，基於總體 親和力（平衡常數KD)但除嵌合體10B3以外，前5種構築體 為 F100G_Y、P100B_I、P100B_F、F100G_N&W100E_F。 145280.doc -112- 201029662 然而，所有其他構築體之親和力皆在FI00G_Yi 2倍以 内。
6.7肌肉抑制素捕捉ELISA 在肌肉抑制素捕捉ELISA中亦分析11種經親和純化之 CDRH3變異體的結合活性。 .在4°C下，用2.5 pg/ml針對肌肉抑制素之多株抗體（R&D Systems，AF788)塗布96孑L ELISA板隔夜。接著用洗務緩衝 液（PBS、0.1% Tween-20)洗滌此板3次且在室溫下用阻斷 溶液（PBS、0.1% Tween-20 + l%牛血清白蛋白[BSA])阻斷1 小時。接著，在1小時内添加1 pg/ml於阻斷缓衝液中之肌 肉抑制素，隨後用洗滌緩衝液洗滌3次。接著將抗體滴定 至適合之濃度範圍（約10至〇·〇1 pg/ml)，添加至板中且在室 溫下培育1小時。接著用洗滌緩衝液洗滌板3次。使用抗人 類κ輕鏈HRP結合抗體（Sigma A7164，根據製造商之說明書 使用）偵測人類化抗體或嵌合抗體（諸如10B3嵌合體（HcLc) φ 或H0L0)之結合。接著用洗滌緩衝液洗滌板3次，且用OPD 受質（根據製造商之說明書）進行顯色且在490 nm下於板讀 取器上進行讀數。 • 該實驗在圖21中說明，將H2L2-C91S、H0L0、
HcLc(10B3嵌合體）及陰性對照單株抗體用作對照抗體。在 此ELISA中，所有11種CDRH3變異型抗體皆與重組肌肉抑 制素結合。H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91 S_V 102N ' H2L2-C91S_G100A_K 、 H2L2-C91 S_P 100B_F A H2L2- €918_?1000_丫相較基礎H2L2-C91S及H0L0傾向於對肌肉 145280.doc •113· 201029662 抑制素具有較佳結合活性。
6.8肌肉抑制素競爭EL1SA 在三種不同肌肉抑制素競爭ELISA中進一步研究CDRH3 變異體。分析經純化之抗體與10B3鼠類mAb競爭的能力。 6.8.1使用多株Ab作為捕捉方法 使用6.7所述之方案’將10B3(最終濃度為〇·3 gg/ml)添加 至各孔中且與滴定至適合濃度範圍（約10至0 01 pg/ml)之抗 體混合。使用抗小鼠HRP結合抗體（DAKO P0260，根據製 造商之說明書使用）偵測10B3抗體之結合。自ELISA數據 獲得之分級展示於表19中。 6.8.2使用生物素標記肌肉抑制素作為捕捉方法 使用6.7所述之方案，但最初在4。(：下用5 pg/ml抗生蛋白 鍵函素塗布板隔伏。在1小時内添加〇.3 gg/mi於阻斷緩衝 液中之生物素標記肌肉抑制素，隨後用洗滌緩衝液洗滌3 次。將10B3(最終濃度為〇.2 μ§/πι1)添加至各孔中且與滴定 至適合濃度範圍（約10至0.01 pg/ml)之抗體混合。使用抗小 鼠HRP結合抗體（DAKO P〇260，根據製造商之說明書使用） 偵測10B3抗體之結合。自ELISA數據獲得之分級展示於表 19中。 6.8.3使用肌肉抑制素作為捕捉方法（直接捕捉） 使用6.7所述之方案，但最初在4它下用0.2 gg/ml肌肉抑 制素（自身重組肌肉抑制素，參見以上M)塗布板隔夜。將 10B3(最終濃度為0.3 pg/mi)添加至各孔中且與滴定至適合 濃度範圍（約1〇至〇·〇1 pg/ml)之抗體混合。使用抗小鼠HRp 145280.doc -114- 201029662 結合抗體（DAKO P0260，根據製造商之說明書使用）偵測 10B3抗體之結合。自ELISA數據獲得之分級展示於表19 中。 所有CDRH3變異體皆能夠與10B3競爭。5種來自各不同 競爭ELISA之最有效分子列於表19。 表19 : 5種最有效CDRH3變異型分子之等級次序首位（1)至 末位（5)
肌肉抑制素競爭ELISA 生物素標記肌肉抑制素 多株Ab 直接捕捉 H2L2-C91S_V102S H2L2-C91S P100B F H2L2-C91S P100B F H2L2-C91S_F100G_Y H2L2-C91S V102N H2L2-C91S F100G Y H2L2-C91S_P100BJ H2L2-C91S V102S H2L2-C91S V102N H2L2-C91S_V102N H2L2-C91S F100G Y H2L2-C91S V102S H2L2-C91S—Y96L H2L2-C91S G99D H2L2-C91S P100B I
基於本節（6.8)中之分析及6.6及6.7中之先前BIAcore數 據，選擇變異體 H2L2-C91S_P100B_F、H2L2-C91S_P100B_I、 H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S—V102N 及 H2L2-C91S_V102S 以供進一步分析。 6.9活體外抑制肌肉抑制素之生物活性 在肌肉抑制素反應性報導基因分析法中測試6.8之5種所 選CDRH3變異體（參見以上1.2)以評估活體外功效。在37。〇 下’將濃度為5 nM之肌肉抑制素與不同濃度之抗體一起預 培育，隨後添加至經轉染之A204細胞中。在37°C下將細胞 再培育6小時，隨後由發光來測定相對螢光素酶表現。所 得IC50展不於表20中。 145280.doc -115- 201029662 表20 : A204活體外活性分析法中人類化抗體之IC50 抗體 平均ICs〇 (nM) 950/〇 CI之 下限(nM) 95% CI之 上限(nM) 10B3嵌合體 3.534 1.941 6.435 H2L2-C91S 5.137 2.350 11.230 H2L2-C91S_P100B_F 4.235 2.295 7.818 H2L2-C91S—P100B—I 4.525 1.837 11.140 H2L2-C91S—F100G—Y 3.639 1.908 6.940 H2L2-C91S—V102N 5.514 3.023 10.060 H2L2-C91S_V102S 4.221 2.234 7.975 數據顯示在此分析法中所測試之所有抗體以與10B3嵌合 體類似之效能中和肌肉抑制素，其中H2L2-C91S_F100G_Y 具有最高效能，儘管並不顯著。 7.構築及表現FC失能之恆定區變異體 因為抗肌肉抑制素之活體内作用模式為簡單結合及中和 肌肉抑制素，所以分子保留其引發ADCC及CDC反應之Fc 功能可能未必需要。此外，使Fc功能失能可能有助於降低 輸注相關之免疫反應的潛力。使Fc功能失能之突變涉及以 下取代（使用EU編號系統）：Leu 235 Ala ;及Gly 237 Ala。 使用標準分子生物技術，將編碼CDRH3變異體 H2_F100G_Yi可變重鏈區之序列的基因自現有構築體轉 移至含有hlgGl Fc失能恆定區之表現載體中。使用pTT載 體產生編碼重鏈（SEQ ID NO: 98，Fc失能之H2_F100G_Y) 及輕鏈（SEQ ID NO: 40，L2-C91S)之全長DNA表現構築 體。重鏈之詳情示於表21中。 145280.doc -116- 201029662 名稱 全長蛋白質序列ID Fc 失能之 H2L2-C91S_F100G_Y 98 在肌肉抑制素反應性報導基因分析法中分析Fc失能恆定 區之影響（如上1.2所述）。所得IC5q數據展示於表22中。 表22 抗體 平均ics« (nM) 95% CI之 下限(nM) 95% CI之 上限ίηΜ) H2L2-C91S 4.083 1.319 12.640 Fc 失能之 H2L2-C91S_F100G_Y 1.239 0.524 2.932 此等數據顯示使如上所述「Fc失能之H2L2-C91S_F100G_Y」 之Fc功能失能對抗體中和肌肉抑制素之效能無顯著影響。 8. CDRH2變異型人類化抗餿 8.1構築CDRH2變異型人類化抗艘 如以上實例5所述，重鏈CDRH2中Kabat位置54處之天冬 醯胺（N54)具有脫除醯胺基之潛力。為降低此潛在風險， ® 使此胺基酸突變產生許多H2_F100G_Y2CDRH2變異體。 此等變異體在CDRH2(SEQ ID NO: 2)中皆不同且藉由定點 突變誘發，使用編碼H2_F100G_Y重鏈之pTT載體產生。 使輕鏈（SEQ ID NO: 40，L2-C91S)與各重鏈一起表現。未 使此等構築體之Fc區失能。 8.2 HEK293 6E細胞中CDRH2變異艘之表現 如以上6.2所述，將分別編碼重鏈及輕鏈之pTT質體短暫 地共轉染至ΗΕΚ 293 6Ε細胞中。另外，表現H2L2- 145280.doc •117- 201029662 C91S_F100G_Y，作為陽性對照。由BIAcore分析HEK293細 胞上清液中所產生之抗體與重組肌肉抑制素的結合。CDRH2 變異體之篩選指示所有變異體皆與重組肌肉抑制素結合。 使用所獲得之親和力數據及潛在脫除醯胺基風險之電子 雜交分析，選擇一組5種CDRH2變異體（列於表23中）以供 較大規模表現、純化及進一步分析。 表23 名稱 CDRH2之序列 H2L2C91S NIYPYNGVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 2) H2L2 C91S_G55D F100G_Y MYPYNDVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 93) H2L2 C91S_G55L F100G_Y NIYPYNLVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 94) H2L2 C91S_G55S F100G_Y NIYPYNSVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 95) H2L2 C91S_G55TF100G_Y NIYPYNTVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 96) H2L2 C91S_G55V F100G_Y MYPYNWSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 97) 8.3表徵CDRH2變異艎 在肌肉抑制素結合ELISA中分析所有5種抗體之結合活 性（如實例4.2所述）。圖22展示H2L2-C91S—F100G_Y、 H2L2 C91S、HcLc(10B3C)及陰性對照mAb以及所有5種 CDRH2變異型抗體之結果。CDRH2變異體相較H2L2-C91S_F100G_Y對肌肉抑制素具有較佳或類似之結合活 性。 8.4 CDRH2變異體BIAcore分析 亦由BIAcore測試CDRH2變異體以測定肌肉抑制素結合 親和力之任何變化。將蛋白質A固定於Cl Biacore生物感 測器晶片上，以低密度捕捉經純化抗體，使得肌肉抑制素 145280.doc -118- 201029662 之最大結合產生小於30個共振單位。僅使濃度為256 nM之 肌肉抑制素通過經捕捉之抗體表面；緩衝注射液（亦即0 nM)用於對結合數據進行雙重參考。使用1 00 mM磷酸使蛋 白質A表面再生。將數據與T100 Biacore分析軟體所固有 之二價模型及兩態模型擬合。然而，因為肌肉抑制素為二 聚體，所以二價模型數據較為重要。使用HBS-EP且在 25°C之溫度下進行操作。 所用模型可能不會反映真正的活體内結合且模型本身可 能不會精確反映相互作用，因此計算值僅用於分級。數據 表明與H2L2-C91S_F100G_Y相比，CDRH2變異體不會太 過顯著地影響親和力，由二價模型分析之最差構築體 (1121^2。918_05 5[尸1000_丫）顯示總體親和力差6.8倍。 8.5活體外抑制肌肉抑制素之生物活性 亦使用A204螢光素酶分析法分析CDRH2變異體對活體 外中和分析法之作用（第1.2節所述）。抑制曲線之IC5〇值示 ❿ 於表24中。 表24 : A204活體外活性分析法中可展性抗體變異體之IC50 抗體 平均ic50 (nM) 95% Cl之下限 (nM) 95% Cl之上限 (nM) 10B3嵌合體 3.570 1.473 8.654 H2L2-C91S_F100G_Y 11.070 3.686 33.230 H2L2 C91S_G55D F100G一Y 5.530 1.649 18.540 H2L2 C91S_G55L F100G_Y 5.581 1.601 19.460 H2L2 C91S—G55S F100G—Y 4.425 1.730 11.310 H2L2 C91S_G55T F100G_Y 6.892 2.452 19.370 H2L2 C91S_G55V F100G_Y 3.840 1.044 14.130 145280.doc •119· 201029662 此分析法中之數據指示所有CDRH2變異型抗體皆以與 扣1^2-€918_卩1000_丫類似之效能抑制A204細胞之肌肉抑 制素誘導之活化。 8.6 Fc失能之CDRH2變異體 H2L2 C91S_G55S F100G_Y(在A204分析法中具有最高表 觀效能之可展性增強分子）為Fc失能的（藉由進行以下取代 (使用 EU編號系統）：Leu 235 Ala ;及Gly 237 Ala)，如 SEQ ID NO: 99所例示。使用受體結合分析法（實例2.5)展示此 新穎分子Fc失能之H2L2 C91S_G55S F100G_Y相對於H2L2 C91S_G55S F100G_Y具有稍加改良之效能（參見表25)。 表25 : ActRIIb受體結合分析法中可展性抗體變異體之 1<：50值 mAb 平均IC50 (nM) 95% Cl之 下限(nM) 95% Cl之 上限(nM) 10B3 0.161 0.087 0.295 H2L2 C91S_G55S F100G_Y 0.786 0.326 1.898 Fc失能之H2L2 C91S_G55S F100G_Y 0.518 0.206 1.298 9. 10B3在糖皮質激素誘發之肌肉消痩中之功效 在當前研究中，研究10B3處理是否可預防小鼠體内類固 醇誘發之肌肉損失。用PBS、mIgG2a或10B3處理C5 7BL小 鼠。將地塞米松用作誘發肌肉損失之類固醇。 地塞米松處理引起經對照抗體預處理之動物體重損失。 藉由用10B3預處理而降低地塞米松誘發之重量損失。經對 照抗體預處理之動物顯示伸趾長肌（EDL)、脛骨前肌（TA) 145280.doc -120- 201029662 及腓腸肌之肌肉萎縮。相比之下，在經丨〇B3預處理之動物 中用地塞米松處理不會引起TA、EDL及腓腸肌萎縮。經對 照抗體預處理之動物顯示體脂肪之積累增加。然而，在經 10B3預處理之動物中用地塞米松處理之後體脂肪百分比並 未增加。 實例9中之此等結果表明i〇B3或其人類化抗體可用於處 理糖皮質激素誘發之肌肉消瘦。舉例而言，對經糖皮質激 φ 素治療之患者之肌肉消瘦的預防性處理可為有利的。 10. 10B3處理減輕坐骨神經播壓模型之肌肉萎縮 此處使用神經損傷模型來評估1 〇B3在預防小鼠之廢用性 萎縮方面的功效。 用mIgG2a對照或10B3抗體處理C57BL小鼠。露出大腿中 部之右側坐骨神經且保持完整（假組）或藉由使用止血鉗擠 壓1 〇秒而受損傷（神經摘·壓組）。與假對照相比，坐骨神經 擠壓損傷導致伸趾長肌（EDL)、脛骨前肌（TA)、腓腸肌及 ❿ 比目魚肌之質量下降。與IgG2a對照組相比，在假手術組 中’ 10B3處理增加TA、EDL、腓腸肌及四頭肌之質量。與 經IgG2a對照處理之動物相比，經1 〇B3處理之動物保留較 多肌肉。10B3處理亦增加經假手術與經神經擠壓之動物的 總體重。 此等結果顯示10B3或其人類化抗體可具有預防及/或治 療人類廢用性肌肉萎縮之潛力。 11. 10B3處理減輕帶有C-26腫瘤之小鼠的肌肉消痩 在當前研究中，在帶有結腸-26腫瘤之小鼠中研究10B3 145280.doc -121 - 201029662 處理對體重變化、肌肉質量及肌肉功能之作用，此為癌症 惡病質研究廣泛使用之臨床前模型。 將39隻8週齡雄性CD2F1小鼠隨機分成4組：mIgG2a (n-9)、l〇B3(n=9)、mIgG2a+C-26(n=l〇)及 i〇B3+C-26 (n=l〇)。將結腸-26(C-26)腫瘤細胞以每隻小鼠1χ1〇6個細胞 皮下植入20隻小鼠中。數小時後，動物開始接受抗體注 射。第0天、第3天、第7天、第14天、第21天將劑量為30 mg/kg之小鼠igG2a對照抗體或10Β3腹膜内注射至小鼠中。 在整個實驗中監測體重及脂肪質量。在第25天臨處死之 前’藉由在對大腿中部坐骨神經電刺激之後量測收縮力來 評估下肢肌力。實驗結束時測定腫瘤重量及個別肌肉質量 及附睪脂肪墊質量。 圖23展示第〇天至第25天抗體處理對帶有C_26腫瘤之小 鼠之體重的作用。腫瘤植入之後21天，帶有腫瘤之小鼠的 體重開始明顯下降。用10B3處理有效減輕帶有腫瘤之小鼠 的重量損失。經10B3處理之帶有腫瘤小鼠之平均體重比經 mIgGa2a對照抗體處理之帶有腫瘤小鼠高8%。在1〇b3處理 組與mIgG2a對照處理組之間腫瘤大小並無顯著差異（針對 IgG2a之2.2 g相對於針對i〇B3之1.9 g)。 圖24展示抗體處理對帶有c_26腫瘤之小鼠之總體脂肪 (A)、附睪脂肪墊（B)及瘦肉質量（c)的作用。帶有腫瘤小鼠 之總體脂肪顯著較少（圖24A)。經10B3與mIgG2a對照處理 之帶有腫瘤小鼠的附睪脂肪墊幾乎完全消失（圖24B)，表 明1OB3不會保護帶有腫瘤之動物免受體脂肪損失。 145280.doc • 122- 201029662 如圖24C所示，在正常動物以及帶有腫瘤之小鼠中， 10B3處理使得瘦肉質量顯著㈣.G1)增加。在移除廬瘤之 後，經對照IgG2a處理之帶有腫瘤小鼠之瘦肉質量顯著較 低。相比之下，經1〇Β3處理之帶有腫瘤小鼠之痩肉質量顯 著（p<0.01)高於經IgG2a處理之帶有腫瘤小鼠。實際上，在 經10B3處理之帶有腫瘤小鼠與正常動物之間痩肉質量並無 顯著差異。 ❿ 表26展示抗體處理對肌肉質量之作用。正如所料，帶有 腫瘤小鼠之TA、EDL、四頭肌、比目魚肌及腓腸肌並無顯 著損失（表26)。10B 3處理增加正常動物之肌肉質量。最重 要的疋’ 10B3處理減少帶有腫瘤小鼠之肌肉損失。在經 10B3處理之帶有腫瘤小鼠中，TA、EDL、四頭肌、比目魚 肌及腓腸肌之重量分別比經IgG2a對照處理之帶有腫瘤小 鼠大 17.8%、11.3%、16.9%、13.4% 及 14.6%。 表26 : 10B3處理減少帶有腫瘤小鼠之肌肉損失。數據為平 φ 均肌肉質量（mg) +/· SEM。根據學生T檢驗，帶有上標*及 #之平均值分別指示舆IgG2a組及C-26+IgG2a組顯著 (ρ<0·05)不同》 組 四頭肌 腓腸肌 ΤΑ EDL 比目魚肌 IgG2a 216+/-2.1 159+/-2.2 51 +/-0.5 11.1 +/0.5 8.0+/-0.4 10B3 244 +J- 4.7^ 173 +/- 4.8 58+/- 1.2* 12.6 +/0.6* 8.5 +/- 0.2 C-26+IgCi2a 174 +/- 123+/-4.5^ 40+/- 1.6* 8.9 +/- 0.3¥ 6.9 +/- 0.3" C-26+10B3 204 +/- 8.67- 140 +/- 5.8* 47+/-1.8* 9.9 +/- 〇.6# 7.9 +/- 0.5* 圖25展示抗體處理對下肢肌力之作用，此係藉由在對大 腿中部坐骨神經電刺激之後量測收縮力來評估。腫瘤植入 145280.doc -123- 201029662 25天之後’在對照抗體組中下肢肌肉收縮力顯著（p<〇 〇〇1) 降低20%。與對照組（p<〇.〇5)相比，在健康動物及帶有腫 瘤小鼠中10B3處理分別使最大收縮力增加10.2%及 17.5%。在經1〇Β3處理之帶有腫瘤小鼠與健康對照之間最 大力量測值並無顯著差異。因此，10B3處理改良健康小鼠 與帶有腫瘤小鼠之肌肉功能。 此等數據指示10B3或其人類化抗體處理可減少與癌症惡 病質相關之肌肉損失及功能下降。 I2· 10B3處理對小鼠腱切除模型之骨骼肌萎縮的作用 此處’測定肌肉抑制素抗體1 〇B3對小鼠腱切除模型之肌 肉質量的作用。 將幼年雄性C57BL小鼠隨機分成mIgG2a或10B3處理組 (每組n=6) ’且第1天、第4天、第8天及第15天以3〇 mg/kg 腹膜内給藥。給藥前的早晨（第〇天），所有小鼠接受以下手 術方案：在左腿之遠端附著處分離脛骨前肌（TA)腱（腱切 除術），同時露出所有右側TA腱，但保持完整（假）^ 3週後 (第21天）’對小鼠施以無痛致死術以評估TA肌肉質量之變 化。 在對小鼠進行假手術與腱切除手術之後，3週丨〇B3處理 顯著增加TA肌肉質量（圖26)。有趣的是，與完整假狀況 (+14%)相比，在腱切除術之情況下1〇幻之作用較為明顯 (+21%) 〇 此等數據指示10B3或其人類化抗體處理可減少與創傷/ 損傷相關之肌肉損失及功能下降。 145280.doc -124- 201029662 序列 SEQIDNO: 1 (CDRH1)
GYFMH SEQIDNO:2(CDRH2)
NIYPYNGVSNYNQRFKA SEQIDNO:3(CDRH3)
RYYYGTGPADWYFDV SEQIDNO:4(CDRLl)
KASQDINSYLS ❹ SEQ ID NO: 5 (CDRL2)
RANRLVD SEQIDNO:6(CDRL3)
LQCDEFPLT SEQ ID NO: 7 (小鼠單株 10B3 VH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGMY
PYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTTVTVSS SEQ ID NO: 8(小鼠單株10B3及10B3嵌合體VL)
DKMTQSPSSMYASLRERVmCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANR
LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEL _ κ SEQ ID NO: 9 (人工信號序列）
MGWSCIILFLVATATGVHS SEQ ID NO: 10 (VH之人類受體構架）
. QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWI
SAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXXX • XXXXXXXWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 11 (VL之人類受體構架）
DIQMTQSPSSLSASYGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSL
QSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCXXXXXXXXXXFGQGTKLEI
K SEQ ID NO: 12(人類化VH : HO) 145280.doc -125- 201029662
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS SEQIDNO: 13 (人類化VH : HI)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMT YYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS
NIYPYNGVSNYNORFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY SEQIDNa 14(人類化VH : H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS SEQIDNO: 15 (人類化VL : L0)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTiCLEIK SEQIDNO: 16(人類化VL : LI)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTn'CKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRL
VDGVPSKFSCJSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK SEQIDNO: 17(人類化VL : L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK SEQIDNO: 18(人類化VL : L3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVITTCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIK SEQIDNO: 19(10B3嵌合體VH : N54D)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY
PYDGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTLVTVSS SEQ ID NO: 20 (10B3嵌合體VH : N54Q)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY
PYQGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTLVTVSS SEQIDNO: 21 (10B3嵌合體VL : C91S)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANR
LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELK SEQIDNO: 22(Am^ibVH : H2N54D) 145280.doc -126- 201029662
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG NIYPYDGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY YYGTGP ADW YFD VWGQGTL VT VS S SEQ ID NO: 23 (人類化VH : H2 N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG NIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY YYGTGP ADWYPD VWGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 24 (人類化VL : L2 C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 25 (10B3嵌合體VH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGMY PYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG TGPADWYFDVWGTGTL VTVSS SEQ ID NO: 26 (10B3 嵌合體重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY
PYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ΥΡΡΕΡντν3\νΝ80Α£Τ8σνΐΠΤΡΑνΐ^38σΕΥ8Ι^3νντνΡ553Ι^Τ(5ΤΥΚ：Νν
NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
IPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL
TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEraSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 27 (10B3嵌合體輕鏈） DKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRAm
LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEL
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR
GEC SEQ ID NO: 28 (人類化重鏈：HO)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKIXPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 29(人類化重鏈：HI) 145280.doc -127- 201029662
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8£〇101^0:30(人類化重鏈：112)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTXGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY
ICNYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFISrWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS 〇
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQIDNO: 31 (人類化輕鏈：L0)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSUYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC SEQ ID NO: 32 (人類化輕鏈：LI)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRL
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C SEQ ID NO: 33 (人類化輕鏈：L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC SEQ ID NO: 34 (人類化輕鏈：L3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR
LVDGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC 145280.doc -128- 201029662 SEQ ID NO: 35 (10B3嵌合體N54D重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY PYDGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG TGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR IPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEmSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV . DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ HD NO: 36 (10B3嵌合體N54Q重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIY
PYQGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYG
TGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV
NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
TPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL
TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTGLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 37 (10B3嵌合體C91S輕鏈）
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANR
LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQIDNO:38(人類化重鏈：H2N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYDGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEMNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ IDNO: 39 (人類化重鏈：H2 N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSWPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHnFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSWLFPPKPKDTL
MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKnSKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 145280.doc -129- 201029662 SEQ ID NO: 40 (人類化輕鏈：L2 C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANR ΙΛΤ)〇νΡ3ΚΡ3α8(^(ΪΤΟΥΊΧΤΙ88Ι^ΡΕΟΡΑτΥΥ(Χ(^ΌΕΡΡΙ^ΤΡΟ(56ΤΚ1ΕΙΚ
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVYCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC SEQIDNO:41 (10B3嵌合體重鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
Λ(Χ 丁 GTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC 丁 GAGGTGAAGT 丁 CAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 42 (10B3嵌合體輕鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTA
CGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTA
TTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCT
ATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT
GGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGA
TATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTGTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGG 145280.doc 130- 201029662
TGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT
TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG
GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA
GGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG
CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG
CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACC
AGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 43 (人類化重鏈：HO，DNA序列） ，
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
❹
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 44(人類化重鏈：HI，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCGAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GAACGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG 145280.doc -131 - 201029662
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQIDNO: 45 (人類化重鏈：H2，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGOAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA 145280.doc -132- 201029662 SEQIDNO: 46 (人類化輕鏈：LO，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAG
GACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTC
GGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGT
GTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCG
TCKtTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG
AAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG
AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA ® SEQ ID NO: 47 (人類化輕鏈：LI，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GCGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTCKjCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO: 48 (人類化輕鏈：L2，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA 145280.doc -133- 201029662 SEQIDNO:49(人類化輕鏈：L3，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGO
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCGCGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCC
ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
TGA
SEQIDNO: 50 (10B3嵌合體N54D重鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACGATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT e
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
ACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQIDNO: 51 (10B3嵌合體N54Q重鏈，DNA序列) 145280.doc -134- 201029662
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC
CACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGG
GGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
CTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTG
GAAATATTTATCCTTACCAAGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGG
CCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAG
CTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGC
TATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACT
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT
CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAAC
AGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG
CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCC
TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCT
GCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT
TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTG
ACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCA
GCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACA
AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC
AAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT
GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTG
AGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQIDNO: 52 (10B3嵌合體C91S輕鏈，DNA序列） ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC CACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTA φ CGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTA TTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCT ATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGA TATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGG TGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA GGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACC AGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQIDNO: 53 (人類化重鏈：H2N54D，DNA序列) 145280.doc -135- 201029662
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG
GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGC
TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT
GGGCAACATCTACCCCTACGACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA
AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG
GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG
GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG
CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT
GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG
CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA
CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG Θ
AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQIDNO: 54(人類化重鏈：H2N54Q，DNA序列） ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG CACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCG GCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGC TACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGAT GGGCAACATCTACCCCTACCAGGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCA AGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATG GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAG GAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGG GACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCT GGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAG CAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA CACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTT CCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCG AGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCC 145280.doc -136- 201029662
CAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCC
AACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC
TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT
ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC
AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA
GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGC
CTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQIDNO: 55 (人類化輕鏈：L2 C91S，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTG
CACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGT
GGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCT
ACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATC
TACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAG
CGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGG
ACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCG
GCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTG
TTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGT
GGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGA
AGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA
GCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCA(3CACCCTGACCCTGA
GCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA
CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCT
GA SEQ ID NO. 56 (人工肌肉抑制素線性狀i)
DFGLDCDEHSTESRGSG SEQ ID NO: 57 (人工肌肉抑制素線性肽3)
SGSGDCDEHSTESRCCRY SEQ ID NO: 58 (人工肌肉抑制素線性肽5)
SGSGHSTESRCCRYPLTV SEQ ID NO: 59 (人工肌肉抑制素線性肽7)
SGSGSRCCRYPLTVDFEA SSEG==(e=肉抑制素線性肽9) SEQIDNO: 62 (人卫肌肉抑婦線性狀13) 145280.doc -137- 201029662
SGSGEAFGWDWIIAPKRY
SEQ ID NO: 63 (人工肌肉抑制素線性肽15) SGSGWDWIIAPKRYKANY
SEQ ID NO: 64 (人工肌肉抑制素線性肽17) SGSGIAPKRYKANYCSGE
SEQ ID NO: 65 (人工肌肉抑制素線性肽19) SGSGRYKANYCSGECEFV
SEQ ID NO: 66 (人工肌肉抑制素線性肽21) SGSGNYCSGECEFVFLQK
SEQ ID NO: 67 (人工肌肉抑制素線性肽23) SGSGGECEFVFLQKYPHT
SEQ ID NO: 68 (人工肌肉抑制素線性肽25) SGSGFVFLQKYPHTHLVH
SEQ ID NO: 69(人工肌肉抑制素線性肽27) SGSGQKYPHTHLVHQANP
SEQ ID NO: 70 (人工肌肉抑制素線性肽29) SGSGHTHLVHQANPRGSA
SEQ ID NO: 71 (人工肌肉抑制素線性肽31) SGSGVHQANPRGSAGPCC
SEQ ID NO: 72 (人工肌肉抑制素線性肽33) SGSGNPRGSAGPCCTPTK
SEQ ID NO: 73 (人工肌肉抑制素線性肽35) SGSGSAGPCCTPTKMSPI
SEQ ID NO: 74 (人工肌肉抑制素線性肽37) SGSGCCTPTKMSPINMLY
SEQ ID NO: 75 (人工肌肉抑制素線性肽39) SGSGTKMSPINMLYFNGK SEQ ID NO: 76 (人工肌肉抑制素線性肽41) 145280.doc -138- 201029662
SGSGPINMLYFNGKEQD
SEQ ID NO: 77 (人工肌肉抑制素線性肽43) SGSGLYFNGKEQnYGKI
SEQ ID NO: 78 (人工肌肉抑制素線性肽45) SGSGGKEQIIYGKIPAMV ‘ SEQ ID NO: 79 (人工肌肉抑制素線性肽47)
SGSGIIYGKIPAMVVDRC
SEQ ID NO: 80 (人工肌肉抑制素線性肽49) SGSGGKIPAMVVDRCGCS 〇 SEQ ID NO: 81 (人工肌肉抑制素線性肽）
CCTPTKMSPINMLY
SEQ HD NO·· 82 (CDRH3 變異體Y96L) RLYYGTGPADWYFDV
SEQ ID NO: 83 (CDRH3 變異體G99D) RYYYDTGPADWYFDV
SEQ ID NO: 84 (CDRH3 變異體G99S) RYYYSTGPADWYFDV SEQ ID NO: 85 (CDRH3 變異體G100A_K)
• RYYYGTKPADWYFDV
SEQIDNO: 86(CDRH3變異體P100B—F) RYYYGTGFADWYFDV
SEQ ID NO: 87 (CDRH3 變異體PI 00B_I) RYYYGTGIADWYPDV • SEQ ID NO: 88 (CDRH3變異體W100E_F)
RYYYGTGPADFYFDV
SEQ ID NO: 89 (CDRH3變異體F100G_N) RYYYGTGPADWYNDV SEQ ID NO: 90 (CDRH3 變異體F100G_Y) 145280.doc -139- 201029662
RYYYGTGPADWYYDV SEQIDNO: 91 (CDRH3變異體V102N)
RYYYGTGPADWYFDN SEQIDNO: 92 (CDRH3變異體V102S)
RYYYGTGPADWYFDS SEQ ID NO: 93 (CDRH2 變異體G55D)
NIYPYNDVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 94 (CDRH2 變異體G55L)
NIYPYNLVSNYNQRFKA SEQIDNO: 95 (CDRH2變異體G55S)
NIYPYNSVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 96 (CDRH2變異體G55T)
NIYPYNTVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 97 (CDRH2變異體G55V)
NIYPYNWSNYNQRFKA SEQIDNO: 98 (人類化重鏈：Fc失能之H2—F100G一Y)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMG
NIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP 5ΚΌΕίΤΚΝ(5ν8Ετ(ΧνΚΟΡΥΡ3ϋΙΑνΕ\νΕ3ΝΟ(5ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐΧ)3〇α8ΡΡΙ^
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8丑(^撤99(人類化重鏈：卩。失能之112_0558孑1000_丫）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGhMHWVRQAP0QGLEWMG
NIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRY
YYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTIPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 145280.doc -140- 201029662 SEQ ID NO: 100 (VL之人類受體構架）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSL
QSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPXXXXXXXXXXFG
QGTKLEIK SEQIDNO: 101 (HexaHisGBlTev/(D76A)小鼠肌肉抑制素聚合蛋白）
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAWGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAV
DAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQEGSEREEN
VEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPL
RELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETnTMPTESDFLMQADGKPKCCFF
KFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLK
LDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESISILGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGE DGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWn
APKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINML
YFNGKEQIIYGKIPAMWDRCGCS SEQ ID NO: 102 (GB1 標籤）
DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATK
TFTVTE SEQ ID NO: 103 (小鼠肌肉抑制素聚合蛋白(D76A))
EGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIR
QLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETnilVIPTESDFLMQA
DGKPKCCFFKFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGT
RYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGffilKALDENGHDL
AVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDF
EAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTP
TKMSPINML YFNGKEQIIYGKIPAMWDRCGCS SEQ ID NO: 104 (成熟肌肉抑制素）
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFL
QKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMWD
RCGCS SEQ ID NO: 105(弗林蛋白酶序列）
MELRPWLLWWAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVAR
KHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVA
KRRIXRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIWSIL
DDGffiKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEV
AAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSAS
WGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCN
CDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGTSTQNEKQIVTTDLRQ
KCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNAND
WATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDI
GKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRST
LLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTK
FTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACENLYFQG 145280.doc -141 - 201029662 SEQ ID NO: 106 (HexaHisGBITev/人類肌肉抑制素前肽）
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAWGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAV
DAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQENSEQKE
NVEKEGLCNACTWRQNTKSSRffiAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPP
LRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETniMPTESDFLMQVDGKPKCCF
FKFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLK
LDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGffilKALDENGHDLAVTFPGPG
EDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR SEQ ID NO: 107 (Tev蛋白酶）
MHGHHHHHHGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFnTNK
HLFRKNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKL
KFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQC
GSPLVSTRDGFIVGfflSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWR
LNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNE SEQ ID NO: 108(人類肌肉抑制素前肽）
ENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAlKIQILSKLRLETAPISilSKDVIR QLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETniMPTESDFLMQV DGKPKCCFFKF S SKIQ YNK WKAQLWIYLRPVETPTTVF VQDLRLIKPMKDGT RYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESISILGffilKALDENGHDL AVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR SEQIDNO: 109(CDRL3 變異體 C91S)
LQSDEFPLT SEQIDNO: 110(CDRH3 變異體 F100G_S) RYYYGTGPADWYSDV _ 【圖式簡單說明】 圖1展示經純化成熟肌肉抑制素之LC/MS分析：預測分 子量（MW)為 12406.25 Da，觀測 MW 為 24793.98 Da,此指 示具有九對二硫鍵之二聚分子，與具有九個半胱胺酸殘基 之預測肌肉抑制素單體相對應； 圖2展示採用MOPS緩衝液之4-12% NuPAGE Bis-Tris凝 膠。色帶1 :經DTT還原之成熟肌肉抑制素。色帶2 :未經 DTT還原之成熟肌肉抑制素。色帶3 :標記12蛋白質標準 物； 145280.doc 142- 201029662 圖3 A展示劑量反應曲線，其顯示肌肉抑制素（R&D Systems及自身肌肉抑制素物質）以劑量依賴性方式誘導活 化A204細胞中之細胞信號傳導，從而在6小時後引起螢光 素酶表現。圖3B展示劑量反辱曲線，其顯示如不同天所獲 得之數據所示在不同測試時刻，自身肌肉抑制素以劑量依 賴性方式誘導活化A204細胞中之細胞信號傳導，從而引起 螢光素酶表現； 圖4展示藉由ELISA分析，10B3與成熟肌肉抑制素、潛 伏複合物及自潛伏複合物釋放之成熟肌肉抑制素的結合； 圖5展示10B3及10B3嵌合體對肌肉抑制素與ActRIIb結合 之抑制作用； 圖6展示10B3及10B3嵌合體抑制肌肉抑制素誘導活化細 胞信號傳導，從而降低A204細胞中之螢光素酶表現； 圖7展示10B3對小鼠體重（A)及痩肉質量（B)之活體内作 用； 圖8展示10B3對小鼠腓腸肌（A)、四頭肌（B)及伸趾長肌 (EDL)(C)之肌肉質量的活體内作用； 圖9展示10B3對EDL之肌肉收縮性的離體作用，其展示 強直收縮力（A)及由肌肉質量校正之強直收縮力（B); 圖1OA展示藉由ELIS A分析，人類化抗肌肉抑制素抗體 變異體（CHOK1上清液中）及10B3C與肌肉抑制素之結合。 圖10B由圖10A引出且展示含有H2及/或L2鏈之抗體及10B3 嵌·合體； 圖11展示藉由ELISA分析，經純化之H0L0、H1L2及 145280.doc -143- 201029662 H2L2人類化抗肌肉抑制素抗體變異體及i〇B3C與肌肉抑制 素之結合； 圖12展示l〇B3、10B3C，H0L0及H2L2抑制肌肉抑制素 誘導活化細胞信號傳導，從而抑制A204細胞中之螢光素酶 表現； 圖13展示藉由ELISA分析，經純化之H2L2-N54D、 H2L2-N54Q、H2L2-C91S、H2L2-N54D-C91S 及 H2L2-N54Q-C91S人類化抗肌肉抑制素抗體變異體、H2L2及 10B3C(HCLC)與肌肉抑制素之結合； 圖14展示藉由ELISA分析，經純化之H2L2-N54Q、 H2L2-C91S、H2L2-N54Q-C91S人類化抗肌肉抑制素抗體 變異體、H2L2、H0L0及10B3C(HCLC)與肌肉抑制素之結 合； 圖 15 展示 H2L2-N54Q、H2L2-C91S、H2L2-N54Q-C91S 人類化抗肌肉抑制素抗體變異體、H0L0、H2L2及10B3C 抑制肌肉抑制素誘導活化細胞信號傳導，從而抑制A204細 胞中之螢光素酶表現； 圖16展示在經或未經可誘導抗體脫除醯胺基之碳酸氫銨 處理抗體之後，H2L2人類化抗肌肉抑制素抗體與肌肉抑 制素之結合； 圖17展示在經或未經可誘導抗體脫除醯胺基之碳酸氫銨 處理抗體之後，H2L2-N54Q人類化抗肌肉抑制素抗體變異 體與肌肉抑制素之結合； 圖18展示在經或未經可誘導抗體脫除醯胺基之碳酸氫銨 145280.doc 201029662 處理抗體之後，H2L2-C91S人類化抗肌肉抑制素抗體變異 體與肌肉抑制素之結合； 圖19展示在經或未經可誘導抗體脫除醯胺基之碳酸氫銨 處理抗體之後，H2L2-N54Q-C91S人類化抗肌肉抑制素抗 體變異體與肌肉抑制素之結合； 圖20展示在經或未經可誘導抗體脫除醯胺基之碳酸氫銨 處理抗體之後，H0L0人類化抗肌肉抑制素抗體與肌肉抑 制素之結合； 圖21展示在肌肉抑制素捕捉ELISA中，11種經親和純化 之CDRH3變異體以及用作對照抗體之H2L2-C91S、H0L0、 HcLc(10B3嵌合體）及陰性對照單株抗體之結合活性； 圖22展示在肌肉抑制素結合ELISA中，5種經親和純化 之CDRH2變異體以及用作對照抗體之H2L2-C91S_F100G_Y、 H2L2-C91S、HcLc(10B3嵌合體）及陰性對照單株抗體之結 合活性； 圖23展示第0天至第25天10B3及對照抗體處理對帶有C-26腫瘤之小鼠之體重的作用； 圖24展示10B3及對照抗體處理對帶有C-26腫瘤之小鼠之 總體脂肪（A)、附睪脂肪墊（B)及瘦肉質量（C)的作用； 圖25展示10B3及對照抗體處理對下肢肌力之作用，此係 藉由在對帶有C-26腫瘤之小鼠之大腿中部坐骨神經電刺激 之後的收縮力來量測；及 圖26展示在假手術及腱切除手術中，10B3及對照抗體處 理對小鼠脛骨前肌（TA)肌肉之作用。 145280.doc -145- 201029662 序列表 <11〇>英商葛蘭素集團有限公司 <120>新穎抗原結合蛋白 <130> PB63376 <140> 098143432 <141> 2009-12-17 <150> US61/138980 <151> 2008-12-19 <160> 110 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>小家鼠
<400> 1
Gly Tyr Phe Met His <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 2
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys 1 5 10 15
Ala <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 3
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15
<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 4 Lys Ala Ser Gin
Asp lie Asn Ser Tyr Leu Ser 10 <210〉 5 <211> 7 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 5
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 6 145280·序列表.doc 201029662
Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu Thr <210> 7 <211> 124 <212> PRT <213>小家鼠 <4QO> 7
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Asn He Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 1 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 8
Asp lie Lys Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Arg 15 10 15
Glu Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80
Glu Asp Met Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210〉9 <211> 19 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工信號序列 <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys 1 5 Val His Ser lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>VH之人類受體構架 <221> VARIANT <222> (99)...(108) 2- 145280-序列表.doc 201029662 <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 10
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 A!a Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Met Val Thr Va〗Ser Ser 115 <210> 11 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列
<220> <223> vl之人類受體構架 <221> VARIANT <222> (89)...(98) <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 11
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu G3n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 12 <211> 〗24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VH : HO <400> 12
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met- His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 145280·序列表.doc 201029662 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類4匕VH : H1 <400> 13
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VH : H2 <400> 14
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn He Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Giy Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VL : L0 <400> 15
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 4- 145280-序列表.doc 201029662
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VL : LI <400> 16
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Arg 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VL : L2 <400> 17
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VL : L3 <400> 18
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 145280·序列表.doc 201029662
Gla Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phc Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 10B3嵌合體VH : N54D <400> 19
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Asn lie Leu Asp Trp He 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asp Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 10B3 嵌合體VH : N54Q <400> 20
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Asn He Leu Asp Trp He 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Gin Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 21 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 10B3嵌合艘VL : C91S <400> 21
Asp lie Lys Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Arg 15 10 15
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Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu He 35 40 45 6- 145280-序列表.doc 201029662
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80
Glu Asp Met Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VH : H2 N54D <400> 22
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asp Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 23 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VH : H2 N54Q <400> 23
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Gin Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類化VL : L2C91S <400> 24
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 145280-序列表.doc 201029662
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 25 <211> 124 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 10B3 嵌合體 VH <400> 25
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Asn lie Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <21I> 454 <212> PRT <2i3>人工序列 <220> <223> l〇B3嵌合體重鏈 <400> 26
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Asn lie Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 SO
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125
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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 145280-序列表.doc 201029662 195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220
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Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 370 375 380
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430
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Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu He 35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 SO
Glu Asp Met Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95
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Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
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Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Aia Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 28 9- 145280-序列表.doc 201029662 <211> 454 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化重鏈：H0 <400> 28
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe ΊΙίγ Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 195 . 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 2S5
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 29 <211> 454 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人類化重鏈：HI 10- 145280-序列表.doc 201029662 <400> 29
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp 100 丨 05 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335
Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415
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Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Va】Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 10B3嵌合體重鏈 <400> 41 atgggatgga gctgtatcat octettettg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgag 60 gttcagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacttcatgc actgggtgaa gcagagccat 180 ggcaatatcc tegattggat tggaaatatt tatccttaca atggtgtttc taactacaac 240 cagagattca aggccaaggc cacattgact gtagacaagt cctctagtac agcctacatg 300 gagctccgca gccttacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag acgctattac 360 tacggtaccg gaccggctga ttggtacttc gatgtctggg gcactgggac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg 540 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatca^c 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 9(X) ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaascc cagggaggag 960 cagtacaaca 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gacaggggac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg 540 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatct£taa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcage 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca a^accaagcc cagggaggag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggcts 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tategagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga sagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgage tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtsaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac sgccagcccg a^aacaacta 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201029662 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcage 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatstgagee acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc stgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tategagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga gagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgage tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggeagette ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 ageagatgge agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgeaegagge cctgcacaat 1380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 1422 <210> 45 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化重鏈：H2 <400> 45
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgeagagegg cgcagaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaagtgagc 120 tgcaaggcca gcggctactc cttcaccggc tacttcatgc actgggtgag gcaggctccc 180 ggccagggcc tggagtggat gggcaacatc tacccctaca aeggegteag caactacaac 240 cagaggttca aggccagggt gaccatgacc accgacacct ctaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagga gcctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gaggtactat 360 tacggcaccg gacccgccga ttggtacttc gacgtgtggg gacaggggac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg 540 accgtgtcct ggaacagogg agccctgacc agcsgcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcagc 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgs cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tategagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga gagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgage tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtsgagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggeagette ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 ageagatgge agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgeaegagge cctgcacaat 1380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 1422 <210> 46 <211> 702 <212> 腕 <213>人工序列 <220>
<223>人類化輕鏈：LO <400> 46 atgggctggt at tcagatga acctgcaagg aaggctccca tttageggea gacttcgcca accaaactgg gatgageage cgggaggcca agcgtgaccg agcaaggccg tccagccccg cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagcgac 60 cccagagccc cagctctctg agcgccagcg tgggcgatag ggtgaccatc 120 ccagccagga catcaacagc tacctgagct ggttccagca gaagcccggc 180 agagcctgat ctacagggcc aacaggctcg tggacggcgt gcctagcaag 240 geggaagegg cacagacttc accctgacca tcagctccct gcagcccgag 300 cctactactg cctgcagtgc gacgagttcc ccctgacctt cggccagggc 360 agatcaagcg tacggtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 tgaagagegg caccgccagc gtggtgtgtc tgctgaacaa cttctacccc 480 aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agageggeaa cagccaggag 540 agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgageageae cctgaccctg 600 actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgtg aggtgaccca ccagggcctg 660 tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 47 <211> 702 <212> DNA <213>人工序列 -21- 145280-序列表.doc 201029662 <220> <223>人類化輕錢：LI <400> 47 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt 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catcaacagc tacctgagct ggttccagca gaagcccggc 180 aaggctccca agagcctgat ctacagsgcc aacaggctcg tggacggcgt gcctagcaag 240 tttagcggca gcggaagcss cacagactac accctgacca tcagctccct gcagcccgag 300 gacttcgcca cctactactg cctgca^tgc gacgagttcc ccctsacctt cggccagggc 360 accaaactgg agatcaagcg tacggtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 gatgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgtc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgggaggcca aggtgcagtg £aaggt£gac aatgccctgc agagcggcaa cagccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaagsts tacgcctgtg aggtgaccca ccagggcctg 660 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 49 <211> 702 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化輕鏈：L3 <40Q> 49 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagcgac 60 attcagatga cccagagccc cagctctctg agcgccagcg tgggcgatag ggtgaccatc 120 acctgcaagg ccagccagga catcaacagc tacctgagct ggttccagca gaagcccggc 180 aaggctccca agagcctgat ctacagggcc aacaggctcg tggacggcgt gcctagcaag 240 tttagcggca gcggaagcgg cacagacttc accctgacca tcagctccct gcagcccgag 300 gacttcgcca cctactactg cctgcagtgc gacgagttcc ccctgacctt cggcgcgggc 360 accaaactgg agatcaagcg tacggtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 gatgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgtc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agagcggcaa cagccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgtg aggtgaccca ccagggcctg 660 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 50 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> l〇B3嵌合艘N54D重鏈 <400> 50 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgag 60 gttcagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacttcatgc actgggtgaa gcagagccat 180 ggcaatatcc tcgattggat tggaaatatt tatccttacg atggtgtttc taactacaac 240 22- 145280·序列表.doc 201029662 cagagattca aggccaaggc cacattgact gtagacaagt cctctagtac 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agagatgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tsgtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccs agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 1422 ❹
<210> 51 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 10B3嵌合艘N54Q重鏈 <400> 51 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgag 60 gttcagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacttcatgc actgggtgaa gcagagccat 180 ggcaatatcc tcgattggat tggaaatatt tatccttacc aaggtgtttc taactacaac 240 cagagattea aggccaaggc cacattgact gtagacaagt cctctagtac agcctacatg 300 gagctccgca gccttacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag acgctattac 360 tacggtaccg gaccggctga ttggtacttc gatgtctggg gcactgggac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccas cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg 540 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaasgt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcagc 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca asaccaagcc cagggaggag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga gagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgage tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgeaegagge cctgcacaat Ϊ380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 1422 <210> 52 <211> 702 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> l〇B3 嵌合I4C91S輕鏈 <400> 52 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60 atcaagatga cccagtctcc atcttccatg tatgcatctc taegagagag agtcactatc 120 acttgcaagg egagteagga cattaatagc tatttaaget ggttccagca saaaccaggg 180 aaatctccta agaccctaat etategtgea aacagattgg tagatggggt cccatcaagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gcaagattat tctctcacca tcagcagcct ggagtatgaa 300 gatatgggaa tttattattg tctacagtct gatgaatttc cgctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaacg tacggtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 gatgageage tgaagagegg caccgccagc gtggtgtgtc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agageggeaa cagccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgageageae cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgtg aggtgaccca ccagggcctg 660 23· 145280·序歹[|表.doc 201029662 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 53 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化重鏈：H2 N54D <40Q> 53 atggsctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaagtgagc 120 tgcaaggcca gcggctactc cttcaccggc tacttcatgc actgggtgag gcaggctccc 180 ggccagggcc tggagtggat ggscaacatc tacccctacg acggcgtcag caactacaac 240 cagaggttca aggccagggt gaccatgacc accgacacct ctaccagcac cgcctacats 300 gaactgagga gcctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gaggtactat 360 tacggcaccg gacccgccga ttggtacttc gacgtgtggg gacagssgac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgsgctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg 540 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccglgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcas cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa c^t^aaccac aagcccagca acaccaaggt ssacaagaag 720 gtggasccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ctgggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatsatcagc 840 agaacccccg asgtgacctg tstgstggtg gatgtgascc acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacga cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagggasaag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattgsctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga gagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgagc tgaccaagaa ccasgtgtcc ctsacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380 cactacaccc agaagagcct gascctgtcc cctggcaagt ga 1422 <210> 54 <211> 1422 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化重鏈：H2N54Q <400〉 54 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60 £tsca£ctg£ tgcagagcgg cgcagaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaagtgagc 120 tgcaaggcca gcggctactc cttcaccggc tacttcatgc actgggtsag gcaggctccc 180 ggccagggcc tggagtggat gggcaacatc tacccctacc agggcgtcag caactacaac 240 cagaggttca aggccagggt gaccatgacc accgacacct ctaccagcac cgcctacatg 300 gaactsagga gcctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcsccag gaggtactat 360 tacggcaccg gacccgccga ttggtacttc gacgtgtggs gacag^ssac actagtgacc 420 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 accagcggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgaaccggtg S40 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgtaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggi £gacaagaag 720 gtggagccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg 780 ct^ggaggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcagc 840 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag 960 cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagcccaga sagccccagg tgtacaccct gccccctagc 1140 agagatgagc tsaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 1422 <210> 55 <211> 702 <212> DNA <213>人工序列 24- 145280·序列表.doc 201029662 <220> <223>人類化輕鏈：L2 C91S <400> 55 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagcgac 60 attcagatga cccagagccc cagctctctg agcgccagcg tgggcgatag ggtgaccatc 120 acctgcaagg ccagccagga catcaacagc tacctgagct ggttccagca gaagcccggc 180 aaggctccca agagcctgat ctacagggcc aacaggctcg tggacggcgt gcctagcaag 240 tttagcggca gcggaagcgg cacagactac accctgacca tcagctccct gcagcccgag 300 gacttcgcca cctactactg cctgcagagc gacgagttcc ccctgacctt cggccagggc 360 accaaactgg agatcaagcg tacggtggcc gcccccagcg tgttcatctt cccccccagc 420 gatgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgtc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agagcggcaa cagccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgtg aggtgaccca ccagggcctg 660 tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工肌肉抑制素線性肽i <400> 56
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Gly Ser 」 5 10 15 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽3 <400> 57
Ser Gly Ser Gly Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys a t 5 10 15
Arg Tyr <210> 58 <2H> IE <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽5 <400> 58
<210> 59 <211> 18 <212> m <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽7 <400> 59 S〒r Gly Ser Gly Sgr Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Va丨 Asp Phe
Glu Ala 5 10 15 25- 145280-序列表.d〇c 201029662 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽9
Pro Leu Thr Val 10 <400> 60
Ser Gly Ser Gly Arg Tyr 1 5
Trp Asp
Asp Phe Glu Ala Phe Gly 15 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <2【3>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽11 <400> 61
Ser Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽13 <400> 62
Ser Gly Ser Gly Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie He Ala Pro Lys 15 10 15
Arg Tyr <210> 63 <21l> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽15 <400> 63
Ser Gly Ser Gly Trp Asp Trp lie He Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala 15 10 15
Asn Tyr <210〉 64 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽17 <400> 64
Ser Gly Ser Gly lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser 15 10 15
Gly Glu 26- 145280-序列表.doc 201029662 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線*[±肽19 <400> 65
Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 10 15
Phe Vai <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽21 <400> 66
Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu 15 10 15
Gin Lys <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽23 <400> 67
Ser Gly Ser Gly Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽25 <400> 68
Ser Gly Ser Gly Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu 15 10 15 <210> 69 <211> IB <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工肌肉抑制素線性肽27 <400> 69
Ser Gly Ser Gly Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 15 10 15 27- 145280-序列表.doc 201029662 <210〉 70 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽29 <400> 70
Ser Gly Ser Gly His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽31 <400> 71
Ser Gly Ser Gly Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro 15 10 15
Cys Cys <210> 72 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽33 <400> 72
Ser Gly Ser Gly Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽35 <400> 73
Ser Gly Ser Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 15 10 15
Pro He <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽37 <400> 74
Ser Gly Ser Gly Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met 15 10 15
Leu Tyr 28· 145280-序列表.doc 201029662 <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽39 <400> 75
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn 15 10 15
Gly Lys <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽41 <400> 76
Ser Gly Ser Gly Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin
<210> 77 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽43 <400> 77
Ser Gly Ser Gly Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin He lie Tyr Gly 1 5 10 15
Lys lie <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工肌肉抑制素線性肽45 <400> 78
Ser Gly Ser Gly Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala 1 5 10 15 <210> 79 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽47 <400> 79
Ser Gly Ser Gly lie lie Tyr Gly Lys He Pro Ala Met Val Val Asp 15 10 15
Arg Cys 29- 145280-序列表,doc 201029662 <210> 80 <211> 18 <212> m <213>人工序列 <220> <223>人工肌肉抑制素線性肽49 <400> 80
Ser Giy Ser Gly Gly Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 81
Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體Y96L <400> 82
Arg Leu Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 15 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體G99D <400> 83
Arg Tyr Tyr Tyr Asp Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 15 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體G99S <400> 84
Arg Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體G100A_K <400> 85 30· 145280-序歹[J表.doc 201029662
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Lys Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 15 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3變異體P100BJF <400> 86
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Phe Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3變異體Ρ100Β_Ι
<400> 87
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly lie Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體W100E_F <400〉 88
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Phe Tyr Phe Asp Val 15 10 15 <210〉 89 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉CDRH3變異體F100G_N <400> 89
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Asn Asp Val 15 10 15 <210> 90 <21I> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3變異體F100G_Y <400> 90
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Tyr Asp Val 15 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> -31 - 145280-序列表.doc 201029662 <223> CDRH3 變異體V102N <400> 91
Are Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Asn 15 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3變異體V102S <400> 92
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Phe Asp Ser 15 10 15 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH2 變異體G55D <400> 93
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Asp Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH2 變異體G55L <400> 94
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Leu Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH2變異體G55S <400> 95
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Ser Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys 15 10 15
Ala <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH2變異體G55T <400> 96
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Thr Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys 32- 145280-序列表.doc 201029662 15 10 15
Ala <210> 97 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH2變異體G55V <400> 97
Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Val Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys <210> 98 <211> 454 <212> PRT <213>人工序列
<220> <223>人類化重鏈：Fc失能之H2_F100G_Y <400> 98
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Tyr Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn 195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240
Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 -33- 145280-序列表.doc 201029662
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Fro Ser Asp lie 370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 99 <211> 454 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人類化重鏈·· Fc失能之H2_G55S-F100G_Y <400> 99
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Tyr Asn Ser Vai Ser Asn Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Tyr Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240
Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255
Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 300
Ser liu Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 -34- 145280-序列表.doc 201029662
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 100 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL之人類受體構架 <221> VARIANT <222> (96)...(105) <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 100
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Phe G3n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Scr Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Cln Gly Thr Lys Leu 100 105 110
Glu lie Lys 115 <210> 101 <211> 444 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HexaHisGBITev/ (D76A)小鼠肌肉抑制素聚合蛋白 <400> 101
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15
Trp Gly Ala Val Val Gly Thr His His His His His His Asp Thr Tyr 20 25 30
Lys Leu lie Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu 35 40 45
Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr Ala Asn 50 55 60
Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80
Phe Thr Val Thr Glu Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Glu Gly Ser 85 90 95
Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala 100 105 110
Trp Arg Gin Asn Thr Arg Tyr Ser Arg He Glu Ala He Lys lie Gin 115 120 125 ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp 130 135 140
Ala Ile Arg Gin Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile 145 150 155 160
Asp Gin Tyr Asp Val Gin Arg Ala Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu 165 170 175
Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr lie Ile Thr Met Pro Thr 180 185 190
Glu Ser Asp Phe Leu Met Gin Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe 195 200 205
Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gin -35· 145280-序列表.doc 201029662 210 215 220
Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val 225 230 235 240
Gin lie Leu Arg Leu lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr 245 250 255
Gly lie Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Scr Pro Gly Thr Gly lie Trp 260 265 270
Gin Ser lie Asp Val Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro 275 280 285
Glu Ser Asn Leu Gly He GIu lie Lys Ala Leu Asp GIu Asn Gly His 290 295 300
Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro 305 310 315 320
Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp 325 330 335
Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg 340 345 350
Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp He lie 355 360 365
Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe 370 375 380
Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn 385 390 395 400
Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro 405 410 415 lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys 420 425 430 lie Pro Ala Met·Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 435 440 <210> 102 <211> 56 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223> GB1 標籤 <400> 102
Asp Thr Tyr Lys Leu He Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys G!y Glu Thr 15 10 15
Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin 20 25 30
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 103 <2U> 351 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>鼠肌肉抑制素聚合蛋白（D76A) <400> 103
Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn 15 10 15
Ala Cys Ala Trp Arg Gin Asn Thr Arg Tyr Ser Arg lie GIu Ala He 20 25 30
Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn He 35 40 45
Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg 50 55 60
Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp Val Gin Arg Ala Asp Ser Ser Asp Gly 65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr 85 90 95
Met Pro Thr GIu Ser Asp Phe Leu Met Gin Ala Asp Gly Lys Pro Lys 100 105 110
Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys lie Gin Tyr Asn Lys Val Val 115 120 125 -36- 145280·序列表.doc 201029662
Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr 130 135 140
Val Phe Val Gin lie Leu Arg Leu lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr 145 150 155 160
Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr 165 170 175
Gly lie Trp Gin Ser lie Asp Val Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu 180 185 190
Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly He Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu 195 200 205
Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly 2l〇 215 220
Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser 225 230 235 240
Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg 245 250 255
Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp 260 265 270
Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu 275 280 285
Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His 290 295 300
Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys 305 310 315 320
Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie
325 330 335
Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 340 345 350 <210> 104 <211> 109 <212> PRT <213>智人 <400> 104
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val· Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie 20 25 30 lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45
Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 50 55 60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65 70 75 SO
Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly 85 90 95
Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 β <210> 105 <211> 603 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>弗林蛋白酶表現構築體 <400> 105 * Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr 15 10 15
Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gin Gly Gin Lys Val Phe Thr Asn 20 25 30
Thr Trp Ala Val Arg lie Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val 35 40 45
Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gin He Phe Gly Asp Tyr 50 55 60
Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His 65 70 75 80
Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gin Arg Glu Pro Gin Val Gin Trp Leu 85 90 95
Glu Gin Gin Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gin Glu 100 105 110 -37- 145280-序列表.doc 201029662
Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gin Gin Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr 115 120 125
Gin Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gin Gly Tyr Thr Gly 130 135 140
His Gly lie Val Val Ser lie Leu Asp Asp Gly lie Glu Lys Asn His 145 150 155 160
Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn 165 170 175
Asp Gin Asp Pro Asp Pro Gin Pro Arg Tyr Thr Gin Met Asn Asp Asn 180 185 190
Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn 195 200 205
Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg lie Gly Gly Val 220 215 220
Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu 225 230 235 240
Gly Leu Asn Pro Asn His lie His lie Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro 245 250 255
Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu 260 265 270
Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gin Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser lie 275 280 285
Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn 290 295 300
Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser lie Tyr Thr Leu Ser lie Ser Ser Ala 305 310 315 320
Thr Gin Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr 325 330 335
Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gin Asn Glu Lys Gin lie Val 340 345 350
Thr Thr Asp Leu Arg Gin Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser 355 360 365
Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly lie lie Ala Leu Thr Leu Glu Ala 370 375 380
Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gin His Leu Val Val Gin Thr 385 390 395 400
Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val 405 410 415
Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly 420 425 430
Ala Met Val Ala Leu Ala Gin Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gin Arg 435 440 445
Lys Cys lie lie Asp lie Leu Thr Glu Pro Lys Asp lie Gly Lys Arg 450 455 460
Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His 465 470 475 480 lie Thr Arg Leu Glu His Ala Gin Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn 485 490 495
Arg Arg Gly Asp Leu Ala lie His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg 500 505 510
Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe 515 520 525
Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser 530 535 540
Gly Glu Trp Val Leu Glu lie Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr 545 550 555 560
Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu 565 570 575
Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser 580 585 590
Ser Gin Ala Cys Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly 595 600 <210> 106 <211> 335 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HexaHisGBITev/人類肌肉抑制素前肽 <400> 106
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15 38- 145280-序列表.doc 201029662
Trp Gly Ala Val Val Gly Thr His His His His His His Asp Thr Tyr 20 25 30
Lys Leu lie Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu 35 40 45
Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr Ala Asn 50 55 60
Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80
Phe Thr Val Thr Glu Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Glu Asn Ser 85 90 95
Glu Gin Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr 100 105 110
Trp Arg Gin Asn Thr Lys Ser Ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin 115 120 125 lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp 130 135 140
Val lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie 145 150 155 160
Asp Gin Tyr Asp Val Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu 165 170 175
Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr lie He Thr Met Pro Thr 180 185 190
Glu Ser Asp Phe Leu Met Gin Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe 195 200 205
Phe Lys Phe Ser Ser Lys lie Gin Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gin 210 215 220
Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro Val G]u Thr Pro Thr Thr Va] Phe Val 225 230 235 240
Gin lie Leu Arg Leu lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr 245 250 255
Gly lie Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp 260 265 270
Gin Ser lie Asp Val Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pto 275 280 285
Glu Ser Asn Leu Gly lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His 290 295 300
Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro 305 310 315 320
Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg 325 330 335 <210> 107 <211> 246 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Tev蛋白酶表現構築體 <400> 107
Met His Gly His His His His His His Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly I 5 10 15
Pro Arg Asp Tyr Asn Pro lie Ser Ser Thr lie Cys His Leu Thr Asn 20 25 30
Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu Tyr Gly lie Gly Phe Gly Pro 35 40 45
Phe lie lie Thr Asn Lys His Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu 50 55 60
Leu Val Gin Ser Leu His Gly Val Phe Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr 65 70 75 80
Leu Gin Gin His Leu lie Asp Gly Arg Asp Met He lie lie Arg Met 85 90 95
Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gin Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro 100 105 110
Gin Arg Glu Glu Arg lie Cys Leu Val Thr Thr Asn Phe Gin Thr Lys 115 120 125
Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser 130 135 140
Asp Gly lie Phe Trp Lys His Trp lie Gin Thr Lys Asp Gly Gin Cys 145 150 155 160
Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp Gly Phe lie Val Gly lie His 165 170 175
Scr Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro 180 185 190 -39- H5280-序列表.doc 201029662
Lys Asn Phe Met Glu Leu,Leu Thr Asn Gin Glu Ala Gin Gin Trp Val 195 200 205
Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser Val Leu Trp Gly Gly His Lys 210 215 220
Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro Phe Gin Pro Val Lys Glu Ala 225 230 235 240
Thr Gin Leu Met Asn Glu 245 <210> 108 <211> 242 <212> PRT <213>智人 <400> 108
Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn 15 10 15
Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr Lys Ser Ser Arg He Glu Ala lie 20 25 30
Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie 35 40 45
Ser Lys Asp Val lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg 50 55 60
Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp Val Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly 65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr He lie Thr 85 90 95
Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gin Val Asp Gly Lys Pro Lys 100 105 110
Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys lie Gin Tyr Asn Lys Val Val 115 120 125
Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro Val Giu Thr Pro Thr Thr 130 135 140
Val Phe Val Gin He Leu Arg Leu He Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr 145 150 155 160
Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr 165 170 175
Gly lie Trp Gin Ser lie Asp Val Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu 180 185 190
Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu 195 200 205
Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly 210 215 220
Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser 225 230 235 240
Arg Arg <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRL3變異體C91S <400> 109
Leu Gin Ser Asp Glu Phe Pro Leu Thr <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> CDRH3 變異體Y100G_S <400> 110
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Ala Asp Trp Tyr Ser Asp Val 15 10 15 40- 145280-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201029662 七、申請專利範圍： 1. 一種抗原結合蛋白，其與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID NO: 3之CDRH3或變異型CDRH3。 2. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該變異型CDRH3包含 (i) SEQ ID NO: 82-92或110中之任一者；或（ii)以下任一 取代：V102Y、V102H、V102I、V102D或 V102G。 3. 如請求項1或2之抗原結合蛋白，其進一步包含一或多個 或所有選自以下之CDR : CDRH1(SEQ ID NO: 1)、 ❹ CDRH2(SEQ ID NO: 2)、CDRL1(SEQ ID NO: 4)、 CDRL2(SEQ ID NO: 5)及 CDRL3(SEQ ID NO: 6或 109); 或變異型 CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2 或 CDRL3。 4. 如請求項2之抗原結合蛋白，其中該變異型CDRH2包含 (i) SEQ ID NO: 93-97中之任一者；或（ii)以下任一取 代：N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、 N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、 I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、 Y53G、Y53S、Y53K > Y53T、Y53N、N54S、N54T、 N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、 V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、 N58R、N58G、N58F 或 N58Y。 5. 如請求項1、2及4中任一項之抗原結合蛋白，其中CDRH3 為 SEQ ID NO·· 90 ;且/或 CDRH2 為 SEQ ID NO: 95 ;且 / 或 CDRL3 為 SEQ ID NO: 109。 6. 一種抗原結合蛋白，其與肌肉抑制素結合且包含SEQ ID 145280.doc 201029662 NO: 7之可變域序列之相應CDRH3或其變異型CDRH3。 7. 如請求項6之抗原結合蛋白，其進一步包含一或多個或 所有選自以下之相應CDR : SEQ ID NO: 7之可變域序列 之CDRH1或CDRH2;或SEQ ID NO: 8之可變域序列之 CDRL1 、 CDRL2 、 CDRL3 ；或其變異型 CDRH1 、 CDRH2、CDRL1、CDRL2 或 CDRL3。 8. 一種抗原結合蛋白，其與肌肉抑制素結合且包含含有 SEQ ID NO: 7之Kabat殘基95-101之結合單元H3或變異型 H3。 9. 如請求項8之抗原結合蛋白，其進一步包含一或多個或 所有選自以下之結合單元：包含SEQ ID NO: 7之Kabat殘 基 31-32 之 HI、包含 SEQ ID NO: 7 之 Kabat 殘基 52-56 之 H2、包含 SEQ ID NO: 8 之 Kabat 殘基 30-34之 LI、包含 SEQ ID NO: 8 之 Kabat 殘基 50-55 之 L2 及包含 SEQ ID NO: 8之Kabat殘基89-96之L3 ;或變異型HI、H2、LI、L2或 L3。 10. 如請求項1、2、4及6至9中任一項之抗原結合蛋白，其 進一步包含選自以下之胺基酸殘基中之任一者或其組 合： (a) 可變重鏈之位置28處之S或T ; (b) 可變重鏈之位置105處之T或Q ; (c) 可變重鏈之位置2處之V、I或G;位置4處之L或 V ;位置20處之L、I、Μ或V ;位置22處之C ;位置24處 之Τ、A、V、G或S ;位置26處之G ;位置29處之I、F、L 145280.doc 201029662 或S ;位置36處之W ;位置47處之贾或丫 ；位置48處之【 Μ、V或L;位置69處之卜L、F、_v;位置78處之 A、L、V、Y或F ;位置8〇處之[或河；位置9〇處之γ或 F，位置92處之C ;及/或位置94處之R、κ、G、s、Η戋 Ν ； 一 (d) 可變輕鏈之位置16處之R或G ; (e) 可變輕鏈之位置71處之γ或F ;
    (f) 可變輕鏈之位置1〇〇處之A或Q ;及/或 (g) 可變輕鏈之位置2處之i、L或V;位置3處之γ、 Q、L或E ;位置4處之Μ或L ;位置23處之C ;位置35處之 W ;位置36處之Υ、L或F ;位置46處之S、L、R或ν ;位 置49處之Υ、Η、F或Κ ;位置88處之C ;及/或位置98處 之F。 11·如請求項1、2、4及6至9中任一項之抗原結合蛋白，其 進一步包含與SEQ ID NO: 10所示之構架區具有75%或 75%以上之序列一致性的重鏈可變區受體抗體構架；或 與SEQ ID NO: 11所示之構架區具有75%或75%以上之序 列一致性的輕鏈可變域受體抗體構架。 12. —種抗原結合蛋白，其與肌肉抑制素結合且包含： ⑴選自SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 25之重鍵可變 區；及/或選自SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21之輕鍵可 變區；或具有75%或75%以上之序列一致性的變異型重 鏈可變區或輕鏈可變區；或 (ii) SEQ ID NO: 26之重鏈；及/或選自 SEQ ID NO: 27 145280.doc 201029662 或SEQ ID NO: 37之輕鏈；或具有75%或75%以上之序列 一致性的變異型重鍵或輕鏈。 13. 14. 15. 16. 17. 18. 一種抗原結合蛋白，其與肌肉抑制素結合且包含： (i) 選自SEQ ID NO: 12、13或14中之任一者的重鏈 可變區；及/或選自SEQ ID NO: 15、16、17、18或24中 之任一者的輕鏈可變區；或具有75%或75%以上之序列 一致性的變異型重鍵可變區或輕鏈可變區；或 (ii) 選自 SEQ ID NO: 28、29、30、98 或 99 中之任一 者的重鍵；及/或選自SEQ ID NO: 31、32、33、34或40 瘳 中之任一者的輕鍵；或具有75%或75%以上之序列一致 性的變異型重鏈或輕鏈。 如請求項12或13之抗原結合蛋白，其中存在以下取代： (I) 重鍵可變區或重鍵中之Y96L、G99D、G99S、 G100A—K、P100B—F、PlOOB i、W100E F、F100G一N、 F100G_S、F100G_Y、V102N 或 V102S ;及/或 (II) 重鍵可變區或重鍵中之G55D、G55L、G55S、 G55T或 G55V ;及/或 ® (iii) 輕鍵可變區或輕鏈中之C91S。 如請求項1、2、4、6至9、12及13中任一項之抗原結合 蛋白’其為Fc失能。 一種核酸分子’其編碼如請求項1至15中任一項之抗原 結合蛋白。 一種表現載體，其包含如請求項16之核酸分子。 一種重組宿主細胞，其包含如請求項17之表現載體。 145280.doc -4- 201029662 19. 一種產生如請求項1至_ 項主15中任一項之抗原結合蛋白之方 法’該方法包含培卷如杳·屯1。 /項18之佰主細胞及回收該抗 原結合蛋白之步驟。 20. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中 原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。 任一項之抗 2!. -種如請求項任一項之抗原結合蛋白或如請求 項20之組合物之用途，其係用於製造用以治療罹患降低
    之肌肉質量、肌力及肌肉功能中之任一者或其組合之疾 病之個體的藥劑。 22. —種如請求項丨至15中任一項之抗原結合蛋白或如請求 項20之組合物之用途，其係用於製造用以治療罹患以下 疾病之個體的藥劑：肌肉減少症、惡病質、肌肉消瘦 (mUSCle_Wasting)、廢用性肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌 症、外科疾病、灼傷、肌骨或神經創傷或損傷、肥胖 症、糖尿病（包括π型糖尿病）、關節炎、慢性腎衰竭 〇 (CRF)、末期腎病（ESRD)、充血性心臟衰竭（CHF) 、慢性 阻塞性肺病（COPD)、選擇性關節修復（elective j〇int repair)、多發性硬化症（ms)、中風、肌營養不良、運動 - 神經元神經病、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏 病（Parkinson’s disease)、骨質疏鬆症、骨關節炎、脂肪 肝（fatty acid liver disease)、肝硬化、艾迪森氏病（Addis〇n，s disease)、庫欣氏症候群（Cushing’s syndrome)、急性呼吸 箸迫症候群、類固醇誘發之肌肉消瘦、肌炎或脊柱側 145280.doc 201029662 23. —種如請求項1至1 5中任一項之抗原結合蛋白或如請求 項20之組合物之用途，其係用於製造用以增加個體之肌 肉質量、增加個體之肌力及/或改良個體之肌肉功能的藥 劑。 145280.doc
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