CN102325793A - 肌生成抑制素结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文阐述了与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白例如抗体、编码所述抗原结合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原结合蛋白的药物组合物和制备方法。此外，本文阐述了所述抗原结合蛋白在治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合有关的疾病的用途。

Description

肌生成抑制素结合蛋白
发明领域
本发明涉及与肌生成抑制素(myosatin)结合的抗原结合蛋白例如抗体、编码所述抗原结合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原结合蛋白的药物组合物和制备方法。本发明亦涉及所述抗原结合蛋白在治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合有关的疾病的用途。
发明背景
肌生成抑制素亦称为生长和分化因子(GDF-8)，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，是肌肉质量的负调节物。肌生成抑制素在进化过程中高度保守，人、鸡、小鼠和大鼠序列在成熟C-末端结构域为100％相同。肌生成抑制素作为前体蛋白合成，所述前体蛋白含有信号序列、前肽结构域和C-末端结构域。分泌的肌生成抑制素的循环形式包括活性成熟C-末端结构域和无活性形式，所述无活性形式包含在与前肽结构域和/或其它抑制蛋白相关的潜在复合物中的成熟C-末端结构域。
有多种与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能相关的不同疾病、病症和病况。增加锻炼和较好的营养是用于治疗所述疾病的目前疗法的支柱。很遗憾，由于患者方面不能坚持和顺从，增加身体活动的益处很少被认识到。对于某些患者锻炼亦可能困难、疼痛或办不到。此外，可能存在与锻炼有关的肌肉用力不足而不能对肌肉产生任何有益作用。营养介入只有在隐含饮食缺陷且患者有恰当的食欲时有效。由于这些限制，对于与肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合降低相关的疾病的治疗，基本上不能满足获得更广泛利益的需求。
业已阐述肌生成抑制素抗体(WO 2008/030706、WO 2007/047112、WO 2007/044411、WO 2006/116269、WO 2005/094446、WO2004/037861、WO 03/027248和WO 94/21681)。Wagner等(Ann Neurol.(2008)63(5)：561-71)亦阐述当用所述抗-肌生成抑制素抗体之一时，未改善成年人肌营养不良症(贝克型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症和肢节型肌营养不良症)中肌肉力量或功能的探索性终点。
因此，仍然需要用于治疗或预防与肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合降低相关的疾病的更有效疗法。
发明简述
本发明提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白可用于治疗或预防与降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合相关的疾病。
本发明提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的CDRH3或变体CDRH3。
本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：7的可变结构域序列的对应CDRH3或其变体CDRH3。
本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包括包含SEQ ID NO：7的95-101位Kabat残基的结合单位H3或变体H3。
本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含：
(i)选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：25的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：21的轻链可变区；或具有75％或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或
(ii)SEQ ID NO：26重链；和/或选自SEQ ID NO：27或SEQ IDNO：37的轻链；或具75％或更高序列同一性的变体重链或轻链。
本发明亦提供与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，其包含：
(i)选自SEQ ID NO：12、13或14中任一种的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO：15、16、17、18或24中任一种的轻链可变区；或具75％或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或
(ii)选自SEQ ID NO：28、29、30、98或99中任一种的重链；和/或选自SEQ ID NO：31、32、33、34或40中任一种的轻链；或具75％或更高序列同一性的变体重链或轻链。
本发明亦提供编码本文所定义的抗原结合蛋白的核酸分子。本发明亦提供包含本文所定义的核酸分子的表达载体。本发明亦提供包含本文所定义的表达载体的重组宿主细胞。本发明亦提供用于制备本文所定义的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括培养如上所定义的宿主细胞和回收抗原结合蛋白的步骤。本发明亦提供包含本文所定义的抗原结合蛋白和药用载体的药物组合物。
本发明亦提供治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和/或肌肉功能的疾病的受试者的方法，所述方法包括给予本文所定义的抗原结合蛋白的步骤。
本发明提供治疗罹患以下疾病的受试者的方法：少肌症(sarcopenia)、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复(elective joint repair)、多发性硬化病(MS)、中风、肌营养不良症(muscular dystrophy)、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病(fatty acid liver disease)、肝硬化、阿狄森病(Addison’s disease)、库欣病(Cushing’s diease)、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸，所述方法包括给予本文所述抗原结合蛋白的步骤。
本发明提供在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进肌肉功能的方法，所述方法包括给予本文所定义的抗原结合蛋白的步骤。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白用于治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在治疗以下疾病中的用途：少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MS)、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣氏肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进综合征、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉功能的方法中的用途。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者的药物中的用途。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途：少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MS)、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣氏肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸。
本发明提供本文所述抗原结合蛋白在制备用于在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进综合征、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉功能的方法的药物中的用途。
附图简述
图1显示纯化的成熟肌生成抑制素的LC/MS分析：预测的分子量(MW)12406.25Da，观察到的MW 24793.98Da，这表明含9对二硫键的二聚体化分子与含9个半胱氨酸残基的预测的肌生成抑制素单体匹配。
图2显示含MOPS缓冲液的4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶。第1道：用DTT还原的成熟肌生成抑制素。第2道：不用DTT的非还原性成熟肌生成抑制素。第3道：Mark 12蛋白质标准品。
图3A显示剂量反应曲线，其显示了肌生成抑制素(R&D Systems和内部(in house)肌生成抑制素种类)诱导的细胞信号转导的激活，这导致6小时后在A204细胞中以剂量依赖方式表达荧光素酶。图3B显示剂量反应曲线，其显示了内部肌生成抑制素诱导的细胞信号转导的激活，这导致于不同测试时刻在A204细胞中以剂量依赖方式表达荧光素酶，其由在不同天数所获得的数据来表示。
图4显示通过ELISA测定的10B3与成熟肌生成抑制素、潜在复合物(latent complex)和从潜在复合物释放的成熟肌生成抑制素的结合。
图5显示10B3和10B3嵌合体对肌生成抑制素结合ActRIIb的抑制。
图6显示10B3和10B3嵌合体抑制肌生成抑制素诱导的细胞信号转导的激活，这导致降低A204细胞中的荧光素酶表达。
图7显示10B3在体内对小鼠体重(A)和瘦肉质量(B)的影响。
图8显示10B3在体内对小鼠腓肠肌(A)、四头肌(B)和趾长伸肌(EDL)(C)肌肉质量的影响。
图9显示10B3对离体EDL肌肉收缩性的影响，其显示强直性张力(A)和通过肌肉质量校正的强直性张力(B)。
图10A显示通过ELISA测定的人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体(在CHOK1上清液中)和10B3C与肌生成抑制素结合。图10B源自图10A，显示含有H2和/或L2链及10B3嵌合体的抗体。
图11显示通过ELISA测定的纯化的H0L0、H1L2和H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体和10B3C与肌生成抑制素结合。
图12显示10B3、10B3C、H0L0和H2L2抑制肌生成抑制素-诱导的细胞信号转导的激活，其导致在A204细胞中表达荧光素酶。
图13显示通过ELISA测定的纯化的H2L2-N54D、H2L2-N54Q、H2L2-C91S、H2L2-N54D-C91S和H2L2-N54Q-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H2L2和10B3C(HCLC)与肌生成抑制素结合。
图14显示通过ELISA测定的纯化的H2L2-N54Q、H2L2-C91S、H2L2-N54Q-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H2L2、H0L0和10B3C(HCLC)与肌生成抑制素结合。
图15显示H2L2-N54Q、H2L2-C91S、H2L2-N54Q-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体、H0L0、H2L2和10B3C对肌生成抑制素-诱导的细胞信号转导激活的抑制，其导致在A204细胞中表达荧光素酶。
图16显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。
图17显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-N54Q人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。
图18显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。
图19显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H2L2-N54Q-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗体变体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。
图20显示在用或不用碳酸氢铵处理抗体后H0L0人源化的抗-肌生成抑制素抗体与肌生成抑制素的结合，所述碳酸氢铵处理可诱导抗体脱酰胺。
图21显示在肌生成抑制素捕获ELISA中11种亲和纯化的CDRH3变体的结合活性；H2L2-C91S、H0L0、HcLc(10B3嵌合体)和阴性对照单克隆抗体(用作对照抗体)。
图22显示在肌生成抑制素结合ELISA中5种亲和纯化的CDRH2变体的的结合活性；H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S、HcLc(10B3嵌合体)和阴性对照单克隆抗体(用作对照抗体)。
图23显示在第0天-第25天10B3和对照抗体治疗对荷有C-26肿瘤的小鼠体重的影响。
图24显示10B3和对照抗体治疗对荷有C-26肿瘤的小鼠的总身体脂肪(A)、附睾脂肪垫(B)和瘦肉质量(C)的影响。
图25显示10B3和对照抗体治疗对下肢肌肉力量的影响，其通过电刺激荷有C-26肿瘤的小鼠大腿中区的坐骨神经时的收缩力来测量。
图26显示在假手术和割腱手术中10B3和对照抗体治疗对小鼠胫骨前肌(TA)肌肉的影响。
发明详述
本发明提供与肌生成抑制素例如同型二聚体成熟肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可结合并中和肌生成抑制素，例如人肌生成抑制素。抗原结合蛋白可为抗体，例如单克隆抗体。
肌生成抑制素和GDF-8二者都指以下任何一种：肌生成抑制素的全长未经加工的前体形式；呈潜在及非潜在(活性)形式的成熟肌生成抑制素，其因翻译后裂解C-末端结构域而产生。术语肌生成抑制素亦指保留与肌生成抑制素有关的一种或多种生物学活性的肌生成抑制素的任何片段和变体。
肌生成抑制素的全长未经加工的前体形式包含前肽及形成成熟蛋白质的C-末端结构域，含或不含信号序列。亦已知肌生成抑制素前肽加C-末端结构域为多蛋白。肌生成抑制素前体可作为单体或同型二聚体存在。
成熟肌生成抑制素为从肌生成抑制素前体蛋白的C-末端裂解的蛋白，亦称为C-末端结构域。成熟的肌生成抑制素可作为单体、同型二聚体或以肌生成抑制素潜在复合物存在。成熟的肌生成抑制素可视条件而确立这些不同的形式组合之间的平衡。人、鸡、小鼠和大鼠肌生成抑制素的成熟C-末端结构域序列具有100％的同一性(参见例如SEQ ID NO：104)。在一个实施方案中，本发明抗原结合蛋白与SEQ IDNO：104中所示的同型二聚体成熟肌生成抑制素结合。
肌生成抑制素前肽为从切割信号序列后的肌生成抑制素前体蛋白的N-末端结构域切割的多肽。前肽亦称为潜在相关肽(latency-associated peptide，LAP)。肌生成抑制素前肽能够与成熟肌生成抑制素上的前肽结合结构域非共价结合。人前肽肌生成抑制素序列的实例提供在SEQ ID NO：108中。
肌生成抑制素潜在复合物为在成熟肌生成抑制素与肌生成抑制素前肽或其它肌生成抑制素结合蛋白之间形成的蛋白复合物。例如，两个肌生成抑制素前肽分子可与两个成熟肌生成抑制素分子缔合，形成无活性的四聚体潜在复合物。肌生成抑制素潜在复合物可包括代替肌所述生成抑制素前肽中的一个或两个的其它肌生成抑制素结合蛋白，或除所述肌生成抑制素前肽中的一个或两个之外还包括其它肌生成抑制素结合蛋白。其它肌生成抑制素结合蛋白实例包括促滤泡素抑制素(follistatin)、促滤泡素抑制素相关基因(FLRG)和生长及分化因子相关血清蛋白1(GASP-1)。
肌生成抑制素抗原结合蛋白可结合肌生成抑制素的前体形式、成熟形式、单体形式、二聚体形式、潜在形式和活性形式中的任一种或任意组合。抗原结合蛋白可结合呈其单体和/或二聚体形式的成熟肌生成抑制素。当肌生成抑制素为与前肽和/或促滤泡素抑制素的复合物时，抗原结合蛋白可与其结合或不与其结合。或者，当肌生成抑制素为与促滤泡素抑制素相关基因(FLRG)和/或生长和分化因子相关血清蛋白1(GASP-1)的复合物时，抗原结合蛋白可与其结合或不与其结合。例如，抗原结合蛋白与成熟二聚体肌生成抑制素结合。
本文所用术语″抗原结合蛋白″指能够与肌生成抑制素结合的抗体、抗体片段和其它蛋白构建体，例如结构域。
本文所用术语″抗体″以其最广泛的意义指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并包括：单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合物抗体；单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫学有效片段、单链Fv、双抗体、TandabsTM等(对于可供选择的″抗体″样式的综述，参见Holliger和Hudson，NatureBiotechnology，2005，第23卷，第9期，1126-1136)。
短语″单可变结构域″指抗原结合蛋白可变结构域(例如VH、VHH、VL)，其可特异性结合抗原或结合独立于不同的可变区或结构域的表位。
可认为″结构域抗体″或″dAb″与″单可变结构域″相同，其能够结合抗原。单可变结构域可为人抗体可变结构域，但亦包括来自其它物种的单抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如如WO 00/29004中所揭示)、绞口鲨(nurse shark)和骆驼科(Camelid)VHH dAb。骆驼科VHH为源自包括骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和原驼(guanaco)在内的物种的免疫球蛋白单可变结构域多肽，所述物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。所述VHH结构域可按照本领域可获得的标准技术人源化，认为所述结构域为″结构域抗体″。本文所用VH包括骆驼科VHH结构域。
本文所用术语″结构域″指具有独立于蛋白质的其余部分的四级结构的折叠蛋白质结构。结构域通常负责蛋白质的不相关联的功能性质，在很多情况下可将其加入、移走或转移到其它蛋白质，而不丢失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。″单可变结构域″为包含抗体可变结构域序列特性的折叠多肽结构域。因此，其包括完全抗体可变结构域和经修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被以下序列取代：不具有抗体可变结构域特性的序列；或业已被截平或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域；以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。结构域可结合抗原或结合独立于不同的可变区或结构域的表位。
可借助在非抗体蛋白质支架例如结构域上安排一个或多个CDR来提供抗原结合片段。非抗体蛋白质支架或结构域为经过蛋白质工程改造以获得与不同于其天然配体的配体结合的蛋白质支架或结构域，例如作为选自以下的支架的衍生物的结构域：CTLA-4(Evibody)；脂笼蛋白(lipocalin)；源自蛋白A的分子例如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白例如GroE1和GroES；转铁蛋白(穿膜抗体(transbody))；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素(Tetranectin))；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们业已经过蛋白质工程改造以实现与不同于其天然配体的配体结合。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)为主要在CD4+T细胞上表达的CD28-家族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可被异源序列取代，以提供不同的结合特性。工程改造为具有不同的结合特异性的CTLA-4分子亦被称为Evibodies。进一步的详细资料参见Journal of Immunological Methods248(1-2)，31-45(2001)。
脂笼蛋白为运输小疏水分子(例如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂类)的细胞外蛋白质家族。它们具有在规范结构(canonical structure)的开放末端有多个环的刚性β-折叠二级结构，可将其工程改造以结合不同的靶标抗原。Anticalin大小为160-180个氨基酸，源自脂笼蛋白。关于进一步的详细资料参见Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。
Affibody是源自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，可将其进行工程改造以结合抗原。结构域由大约58个氨基酸的3个螺旋束组成。通过让表面残基随机化产生文库。关于进一步的详细资料参见ProteinEng.Des.Sel.17，455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimer是源自A-结构域支架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采取限定的二硫化物键合的结构。通过A-结构域家族展示的天然变异穿梭来产生多样性。关于进一步的详细资料参见Nature Biotechnology 23(12)，1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6)，909-917(2007年6月)。
转铁蛋白为单体血清转运糖蛋白。可通过在容许的表面环插入例如一个或多个CDR肽序列，将转铁蛋白进行工程改造以结合不同的靶标抗原。工程改造的转铁蛋白支架实例包括穿膜抗体。关于进一步的详细资料参见J.Biol.Chem 274，24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自介导完整膜蛋白与细胞骨架连接的蛋白质家族的锚蛋白。单锚蛋白重复为由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基模体。可通过以下方法对其进行工程改造以结合不同的靶标抗原：使每一个重复的第一个α-螺旋和β-转角处的残基随机化；或插入肽序列，例如一个或多个CDR。可通过增加模块数量来增加其结合界面(亲和力成熟的方法)。关于进一步的详细资料参见J.Mol.Biol.332，489-503(2003)、PNAS 100(4)，1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369，1015-1028(2007)和US20040132028A1。
纤连蛋白为可进行工程改造以结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列骨架组成。可对β-夹层的一端的三个环进行工程改造以使Adnectin特异性识别目的治疗靶标。关于进一步的详细资料参见Protein Eng.Des.Sel.18，435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定支架蛋白组成的组合型的识别分子，其通常为含有在活性位点插入的限定的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于进一步的详细资料参见Expert Opin.Biol.Ther.5，783-797(2005)。
微抗体源自天然存在的25-50个氨基酸长的微蛋白，其含有3-4半胱氨酸桥；微蛋白质实例包括KalataB1和芋螺毒素和打结素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包括至多25个氨基酸而不影响所述微蛋白的总折叠的环。关于工程改造的打结素结构域的进一步的详细资料参见WO2008098796。
其它结合结构域包括一直用作工程改造不同靶标抗原结合特性的支架的蛋白质，所述蛋白质包括人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的knuitz型结构域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型血凝素结构域(四连接素)，它们在Handbook of Therapeutic Antibodies(2007，由Stefan Dubel编辑)和Protein Science 15：14-27(2006)的第7章非抗体支架中综述。本发明结合结构域可源自任何这些备选蛋白质结构域和移植到所述结构域上的本发明CDR的任何组合。
抗原结合片段或免疫学有效片段可包含部分重链或轻链可变序列。片段为至少5、6、8或10个氨基酸长。或者，片段为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸长。
本说明书通篇所用与抗原结合蛋白有关的术语″特异性结合″，意即抗原结合蛋白与肌生成抑制素结合，且不结合或不显著结合其它(例如不相关)蛋白。然而，该术语不排除所述抗原结合蛋白亦可与亲缘关系相近的分子(例如生长和分化因子-11)交叉反应这一事实。本文所述抗原结合蛋白可按为结合亲缘关系相近的分子例如GDF-11的亲和力的至少2、5、10、50、100或1000倍来结合肌生成抑制素。
抗原结合蛋白-肌生成抑制素相互作用的结合亲和力或平衡解离常数(KD)可为100nM或更小、10nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。或者，KD可为5-10nM之间；或1-2nM之间。KD可为1pM-500pM之间；或500pM-1nM之间。
通过结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)(KD＝kd/ka)来测定抗原结合蛋白的结合亲和力。可通过BIAcoreTM，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5芯片上的肌生成抑制素来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面，来测量结合亲和力。可将实施例2.3中阐述的BIAcoreTM方法用于测量结合亲和力。或者，可通过FORTEbio，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5针上的肌生成抑制素来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面，来测量结合亲和力。可将实施例5.1中所述的FORTEbio方法用于测量结合亲和力。然而，由于本发明抗原结合蛋白与肌生成抑制素的结合特性，可将结合亲和力用于等级评定的目的。
kd可为1x10-3s-1或更小、1x10-4s-1或更小或1x10-5s-1或更小。kd可在1x10-5s-1-1x10-4s-1之间；或在1x10-4s-1-1x10-3s-1之间。缓慢的kd可导致抗原结合蛋白-配体复合物慢解离，并配体中和改进。
本说明书通篇所用术语″中和″，意即与缺乏抗原结合蛋白时的肌生成抑制素的活性比较，在本文所述抗原结合蛋白存在下，体外或体内肌生成抑制素的生物学活性降低了。中和可因以下原因中的一种或多种而产生：阻断肌生成抑制素与其受体的结合；防止肌生成抑制素激活其受体；下调肌生成抑制素或其受体；或影响效应功能。中和可由于封阻肌生成抑制素与其受体结合并因此防止肌生成抑制素激活其受体而产生。
肌生成抑制素活性包括与活性肌生成抑制素有关的生长、调节和形态发生活性中的一种或多种，例如调节肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能。与活性肌生成抑制素有关的另外的活性可包括：调节肌纤维数量、肌纤维大小、肌肉再生、肌肉纤维变性、成肌细胞增殖率、肌分化；卫星细胞激活、卫星细胞增殖、卫星细胞自我更新；参与肌肉生长和功能的蛋白质的合成或分解。所述肌肉可为骨骼肌。
生物学活性的降低或抑制可为部分或全部。相对于在缺乏抗原结合蛋白时的肌生成抑制素的活性，中和抗原结合蛋白可中和肌生成抑制素活性至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在功能测定(例如以下所述中和测定)中，IC50是降低生物学反应最大值的50％的浓度。
用技术人员已知或本文所述的一种或多种测定可测定或测量中和。例如，可在三明治ELISA中通过BIAcoreTM、FMAT、FORTEbioTM或相似体外测定例如表面等离子共振，来评估抗原结合蛋白与肌生成抑制素的结合。
可通过在抗原结合蛋白存在下测量肌生成抑制素与固定在板上的可溶性ActRIIb受体的结合，将基于ELISA的受体结合测定用于测定抗原结合蛋白的中和活性(更详细资料参见实施例2.5)。受体中和测定是灵敏的方法，其可用于基于效价区分IC50低于1nM的分子。然而，其本身对有结合能力的生物素化肌生成抑制素的精确浓度敏感。因此，可获得介于0.1nM-5nM范围的IC50值，例如0.1nM-3nM或0.1nM-2nM或0.1nM-1nM范围。
或者，可通过测量对受体结合、下游信号转导和基因激活的抑制，将基于细胞的受体结合测定用于测定抗原结合蛋白的中和活性。例如，可通过其在横纹肌肉瘤细胞(A204)中抑制肌生成抑制素-诱导的荧光素酶活性的能力，来确定抗原结合蛋白的中和，所述横纹肌肉瘤细胞用在PAI-1特异性启动子调控下编码荧光素酶基因的构建体转染，本测定亦称为肌生成抑制素响应报告基因测定(关于更详细资料参见实施例1.2)。
可在显示肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中的任一种或组合变化的动物中用多种不同测定来确定体内中和。例如，可将体重、肌肉质量(例如瘦肉质量)、肌肉收缩性(例如强直性张力)、握力、动物悬空自己的能力和游泳测定，单独或以任何组合用于评估肌生成抑制素抗原结合蛋白的中和活性。例如可测定以下肌肉的肌肉质量：腓肠肌、四头肌、三头肌、趾长伸肌(EDL)、胫骨前肌(TA)和比目鱼肌。
本领域技术人员显然明白，术语″起源″意欲不仅从来源意义上界定所述材料的身体来源，而且界定在结构上与所述材料一样但并不是来源于参考来源的材料。因此″在供体抗体中存在的残基″不必一定纯化自供体抗体。
分离意指分子例如抗原结合蛋白被从其可实际存在的环境中移出。例如，所述分子可从其实际上正常存在的物质中纯化。例如，抗原结合蛋白可被纯化为关于含有抗原结合蛋白的培养基至少95％、96％、97％、98％或99％或更高。
″嵌合抗体″指工程抗体类型，其含有与源自受体抗体的轻链和重链恒定区缔合的源自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)。
″人源化的抗体″指工程抗体类型，其具有源自非人供体免疫球蛋白的一个或多个CDR，所述分子的源自免疫球蛋白的其余部分源自一个或多个人免疫球蛋白。另外，可改变构架支撑残基以保留结合亲和力(参见例如Queen等Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)、Hodgson等Bio/Technology，9：421(1991))。合适的人受体抗体可为通过与供体抗体的核苷酸及氨基酸序列的同源性选自以下常规数据库的一种：例如KABAT数据库、Los Alamos数据库和SwissProtein数据库。特征为与供体抗体构架区同源(基于氨基酸)的人抗体，可适宜地提供重链恒定区和/或重链可变构架区用于插入供体CDR。可按相似的方式选择能够贡献轻链恒定或可变构架区的合适的受体抗体。应该注意，受体抗体重链和轻链不必源自同一个受体抗体。现有技术阐述了产生所述人源化的抗体的几种方式，参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语″供体抗体″指将其可变区、一个或多个CDR或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给初始免疫球蛋白伴侣的抗体。因此，供体提供改变的免疫球蛋白编码区，得到具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特点的表达的改变的抗体。
术语″受体抗体″指与供体抗体异源的抗体，其将编码其重链和/或轻链构架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分)贡献给初始免疫球蛋白伴侣。人抗体可为受体抗体。
本文所用术语″VH″和″VL″分别指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。
″CDR″定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。在免疫球蛋白的可变部分有3个重链和3个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文所用″CDR″指所有3个重链CDR、所有3个轻链CDR、所有重链和轻链CDR或至少两个CDR。
除非另外规定，否则在本说明书中通篇按照Kabat编号规则来对可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基进行编号。同样地，实施例中所用术语″CDR″、″CDRL1″、″CDRL2″、″CDRL3″、″CDRH1″、″CDRH2″、″CDRH3″遵循Kabat编号规则。对于进一步的资料，参见Kabat等，SEQuences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes ofHealth(1987)。
本领域技术人员显然明白，对于可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基，有备选编号规则。对于CDR序列亦有备选编号规则，例如在Chothia等(1989)Nature 342：877-883中提出的那些编号规则。抗体的结构及蛋白质折叠可意味着认为其它残基是CDR序列的部分，技术人员应该如此理解。因此，本文所用术语″对应的CDR″指用任何编号规则(例如表1中提出的那些)的CDR序列。
技术人员可获得的用于CDR序列的其它编号规则包括″AbM″(University of Bath)和″接通(contact)″(University College London)方法。用Kabat、Chothia、AbM和接通方法中的至少两种可测定最小重叠区，以提供″最小结合单位″。最小结合单位可为CDR的亚部分。
下表1代表用每一种编号规则对每一个CDR或结合单位的一种定义。表1中用Kabat编号方案来给可变结构域氨基酸序列编号。应该注意，某些CDR定义可视所用的单独出版物而变化。
表1
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本文所用术语″抗原结合位点″指在抗原结合蛋白上能够特异性与抗原结合的位点。其可为单结构域(例如表位结合结构域)或单-链Fv(ScFv)结构域，或其可为如在标准抗体中存在的配对的VH/VL结构域。
本文所用术语″表位″指使得能与抗原结合蛋白的特定结合结构域接触的抗原部分。表位可为线性，包含来自抗原的基本为线性的氨基酸序列。或者，表位可是构象的或不连续的。例如，构象表位包含需要结构约束元件的氨基酸残基。不连续表位包含由其它序列分开的氨基酸残基，即在抗原的一级序列中不是连续的序列。在抗原的三级及四级结构情况下，不连续表位的残基靠近到足以使彼此被抗原结合蛋白结合。
对于核苷酸和氨基酸序列，术语″同一″或″序列同一性″，表示若有需要当与合适的插入或缺失最佳比对及比较时，在两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的同一性程度。
两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共有的相同位置数目的函数(即％同一性＝相同的位置数目/总位置数目乘以100)，这要考虑到空位数目和每一空位的长度，对于两个序列的最佳比需要引入它们。可用如下所述的数学算法完成两个序列间的序列比较和同一性百分比测定。
可用以下算法来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比：GCG软件包中的GAP程序、NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重。用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))算法亦可测定两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的同一性百分比，将所述算法纳入ALIGN程序(2.0版)中，用PAM 120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，可用以下算法测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：纳入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法、Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
在一种方法中，多核苷酸序列可与本文所述的参考多核苷酸序列(参见例如SEQ ID NO：41-55)同一，即为100％相同，或与参考序列比较，其可包括达某些整数数值的核苷酸改变，例如具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性。所述改变选自至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换及颠换)或插入，其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或这些末端位置之间的任何位置，可各自散布在参考序列核苷酸之间或散布在参考序列内的一个或多个邻接基团中。核苷酸改变的数量通过以下方法确定：让本文所述参考多核苷酸序列(参见例如SEQ ID NO：41-55)中的核苷酸总数乘以各自同一性百分比的百分比数值(除以100)，并从本文所述的参考多核苷酸序列(参见例如SEQ ID NO：41-55)的所述核苷酸总数中减去该乘积，或者：
nn≤xn-(xn·y)
其中nn为核苷酸改变的数目，xn为本文所述参考多核苷酸序列中的核苷酸总数(参见例如SEQ ID NO：41-55)，y对于50％为0.50、对于60％为0.60、对于70％为0.70、对于75％为0.75、对于80％为0.80、对于85％为0.85、对于90％为0.90、对于95％为0.95、对于98％为0.98、对于99％为0.99或对于100％为1.00，·为乘法运算符号，其中在从xn减去xn和y的乘积之前，将其任何非整数乘积四舍五入为最接近的整数。
同样地，多肽序列可与本文所述多肽参考序列(参见例如SEQ IDNO：7-40、98或99)同一，即为100％相同，或与参考序列比较，其可包括至多某些整数数值的氨基酸改变，例如具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性。所述改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，可各自散布在参考序列氨基酸之间或散布在参考序列内的一个或多个邻接基团中。通过以下方法确定关于既定同一性％的氨基酸改变的数量：让本文所述多肽参考序列编码的多肽序列(参见例如SEQ ID NO：7-40、98或99)中的氨基酸总数乘以各自同一性百分比的百分比数值(除以100)，然后从本文所述的多肽参考序列(参见例如SEQ ID NO：7-40或82-108、98或99)的所述氨基酸总数中减去该乘积，或：
na≤xa-(xa·y)
其中na为氨基酸改变的数目，xa为本文所述参考多肽序列(参见例如SEQ ID NO：7-40、98或99)中的氨基酸总数，y对于50％为0.50、对于60％为0.60、对于70％为0.70、对于75％为0.75、对于80％为0.80、对于85％为0.85、对于90％为0.90、对于95％为0.95、对于98％为0.98、对于99％为0.99或对于100％为1.00，·为乘法运算符号，其中在从xa减去xa和y的乘积之前，将其任何非整数乘积四舍五入为最接近的整数。
可在全长序列或其任何片段中测定同一性％；且含或不含任何插入或缺失。
术语″肽″、″多肽″和″蛋白质″每一种都指包含两个或多个氨基酸残基的分子。肽可为单体或多聚体。
本领域充分了解的是，将某些氨基酸取代认作″保守的″。基于共有的侧链特性将氨基酸分组，认为保留全部或基本上全部抗原结合蛋白的结合亲和力的组别中的取代为保守取代，参见下表2：
表2
  侧链  成员
  疏水  met、ala、val、leu、ile
  中性亲水  cys、ser、thr
  酸性  asp、glu
  碱性  asn、gln、his、lys、arg
  影响链方向的残基  gly、pro
  芳香族  trp、tyr、phe
本发明提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含SEQ IDNO：3的CDRH3；或其变体CDRH3。(例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种)。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素活性。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含SEQID NO：2的CDRH2；或其变体CDRH2(例如SEQ ID NO：93-97中的任一种)。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素活性。
除上述CDRH3或CDRH2序列外，抗原结合蛋白可进一步以任意组合包含选自以下的一个或多个CDR或所有CDR：CDRH1(SEQID NO：1)、CDRH2(SEQ ID NO：2)、CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6或109)；或其变体(例如SEQID NO：93-97中的任一种CDRH2变体)。
例如，抗原结合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO：3)和CDRH1(SEQ ID NO：1)或其变体(例如82-92或110的CDRH3变体中的任一种)。抗原结合蛋白可包含CDRH3(SEQ IDNO：3)和CDRH2(SEQ IDNO：2)或其变体(例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体；或SEQ ID NO：93-97中的任一种CDRH2变体)。抗原结合蛋白可包含CDRH1(SEQ ID NO：1)和CDRH2(SEQ ID NO：2)和CDRH3(SEQ ID NO：3)或其变体(例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体；或SEQ ID NO：93-97中的任一种CDRH2变体)。
抗原结合蛋白可包含CDRL1(SEQ ID NO：4)和CDRL2(SEQ IDNO：5)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6或109)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6或109)或其变体。
抗原结合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO：3)和CDRL3(SEQ IDNO：6或109)或其变体(例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体)。抗原结合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO：3)、CDRH2(SEQ ID NO：2)和CDRL3(SEQ ID NO：6或109)或其变体(例如SEQID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体；或SEQ ID NO：93-97中的任一种CDRH2变体)。抗原结合蛋白可包含CDRH3(SEQ ID NO：3)、CDRH2(SEQ ID NO：2)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQID NO：6或109)或其变体(例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体；或SEQ ID NO：93-97中的任一种CDRH2变体)。
抗原结合蛋白可包含CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRH2(SEQ IDNO：2)、CDRH3(SEQ ID NO：3)、CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6)。或者，可存在变体CDR，例如SEQ ID NO：82-92或110中的任一种CDRH3变体；或SEQ ID NO：93-97中的任一种CDRH2变体；或SEQ ID NO：109的CDRH3变体。例如，抗原结合蛋白可包含CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRH2(SEQ IDNO：95)、CDRH3(SEQ ID NO：90)、CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：109)。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含SEQID NO：7的可变结构域序列的对应的CDRH3或其变体CDRH3。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素活性。抗原结合蛋白可为嵌合抗体或人源化抗体。
抗原结合蛋白可进一步包含一种或多种或全部选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的可变结构域序列的对应的CDR或其变体CDR。
例如，抗原结合蛋白可包含对应的CDRH3和对应的CDRH1或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRH3和对应的CDRH2或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRH1、对应的CDRH2和对应的CDRH3；或其变体。
抗原结合蛋白可包含对应的CDRL1和对应的CDRL2或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRL2和对应的CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRL1、对应的CDRL2和对应的CDRL3或其变体。
抗原结合蛋白可包含对应的CDRH3和对应的CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRH3、对应的CDRH2和对应的CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可包含对应的CDRH3、对应的CDRH2、对应的CDRL2和对应的CDRL3或其变体。
抗原结合蛋白可包含对应的CDRH1、对应的CDRH2、对应的CDRH3、对应的CDRL1、对应的CDRL2和对应的CDRL3或其变体。
可通过参考Kabat(1987)、Chothia(1989)、AbM或接通方法来定义对应的CDR。可在表1中找出每一方法的一个定义，并可施用于参考重链可变结构域SEQ ID NO：7和参考轻链可变结构域SEQ ID NO：8，以确定对应的CDR。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包括包含SEQ ID NO：7的95-101位Kabat残基的结合单位H3或变体H3。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素。
抗原结合蛋白可进一步包含选自以下的一种或多种或全部结合单位：包含SEQ ID NO：7的31-32位Kabat残基的H1；包含SEQ IDNO：7的52-56位Kabat残基的H2；包含SEQ ID NO：8的30-34位Kabat残基的L1；包含SEQ ID NO：8的50-55位Kabat残基的L2；和包含SEQ ID NO：8的89-96位Kabat残基的L3；或变体结合单位。
例如，抗原结合蛋白可包含结合单位H3和结合单位H1或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位H3和结合单位H2或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位H1、结合单位H2和结合单位H3；或其变体。
抗原结合蛋白可包含结合单位L1和结合单位L2或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位L2和结合单位L3或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位L1、结合单位L2和结合单位L3；或其变体。
抗原结合蛋白可包含结合单位H3和结合单位L3或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位H3、结合单位H2和结合单位L3；或其变体。抗原结合蛋白可包含结合单位H3、结合单位H2、结合单位L2和结合单位L3；或其变体。
抗原结合蛋白可包含结合单位H1、结合单位H2、结合单位H3、结合单位L1、结合单位L2和结合单位L3；或其变体。
CDR变体或变体结合单位包括由以下修饰的氨基酸序列：至少一个氨基酸，其中所述修饰可为化学修饰，或氨基酸序列部分改变(例如通过不超过10个氨基酸)，所述修饰使得变体可保留未经修饰的序列的生物学特性。例如，变体为与肌生成抑制素结合的功能变体。可通过缺失或取代一个至若干个氨基酸，或通过添加或插入一个至若干个氨基酸，或通过其组合(例如通过不超过10个氨基酸)，来部分改变CDR氨基酸序列。CDR变体或结合单位变体可在氨基酸序列中以任何组合含有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代、添加或缺失。CDR变体或结合单位变体可在氨基酸序列中以任何组合含有1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸残基取代可为保守取代，例如，将一个疏水氨基酸取代为备选的疏水氨基酸。例如亮氨酸可被缬氨酸或异亮氨酸取代。
CDR L1、L2、L3、H1和H2往往在结构上表现出有限数量的主链构象之一。通过CDR长度并通过环包裹(loop packing)二者来确定CDR的特定规范结构类型，其通过位于CDR和构架区二者内的关键位置的残基来决定(结构决定残基或SDR)。Martin和Thornton(1996；J Mol Biol 263：800-815)开发了确定″关键残基″规范模板(canonicaltemplate)的自动方法。用簇分析(cluster analysis)来确定CDR系列的规范类别(canonical class)，然后通过分析埋入的疏水氢-键合的残基和保守的甘氨酸和脯氨酸来鉴别规范模板。可通过让序列与关键残基模板比较，并用同一性或相似性矩阵为每一个模板记分，将抗体序列的CDR指定为规范类别。
CDR规范(CDR canonical)的实例(其中在Kabat编号前的氨基酸为SEQ ID NO：14或24的初始氨基酸序列，在Kabat编号末端的氨基酸序列为取代的氨基酸)包括：
CDRH1规范：Y32I、Y32H、Y32F、Y32T、Y32N、Y32C、Y32E、Y32D、F33Y、F33A、F33W、F33G、F33T、F33L、F33V、M34I、M34V、M34W、H35E、H35N、H35Q、H35S、H35Y、H35T；
CDRH2规范：N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F、N58Y；
CDRH3规范：V102Y、V102H、V102I、V102S、V102D、V102G；
CDRL1规范：D28N、D28S、D28E、D28T、I29V、N30D、N30L、N30Y、N30V、N30I、N30S、N30F、N30H、N30G、N30T、S31N、S31T、S31K、S31G、Y32F、Y32N、Y32A、Y32H、Y32S、Y32R、L33M、L33V、L33I、L33F、S34A、S34G、S34N、S34H、S34V、S34F；
CDRL2规范：A51T、A51G、A51V；
CDRL3规范：L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、L96F。
每一个CDR、每一个对应的CDR、每一个结合单位、每一个重链或轻链可变区、每一个重链或轻链和每一个抗原结合蛋白可有多种变体CDR规范位置，因此，本发明抗原结合蛋白中可存在任何取代组合，前提为保持CDR的规范结构。
CDR变体或变体结合单位的其它实例包括(用Kabat编号方案，其中Kabat编号前的氨基酸为SEQ ID NO：14或24的初始氨基酸序列，Kabat编号末端的氨基酸序列为取代的氨基酸)：
H2：G55D、G55L、G55S、G55T、G55V；
H3：Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_J、W100EF、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N、V102S；
L3：C91S。
例如，与肌生成抑制素结合的本发明抗原结合蛋白可包含SEQ IDNO：90的CDRH3。抗原结合蛋白可进一步包含SEQ ID NO：93-97中任一种的CDRH2。具体而言，CDRH2可为SEQ ID NO：95。抗原结合蛋白亦可包含SEQ ID NO：109的CDRL3。抗原结合蛋白可进一步包含CDRH1(SEQ ID NO：1)、CDRL1(SEQ ID NO：4)和CDRL2(SEQID NO：5)中的任一种或组合或全部。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素活性。
包含所述的CDR、对应CDR、变体CDR、结合单位或变体结合单位的抗原结合蛋白，表现出的以EC50显示的结合肌生成抑制素的效价，可在10B3或10B3嵌合体(重链：SEQ ID NO：7或25，轻链：SEQ ID NO：8)显示的效价的10倍内或5倍内。可通过ELISA测定来测定由EC50显示的结合肌生成抑制素的效价。
抗原结合蛋白可或不可以在重链的Kabat 54位氨基酸有天冬酰胺(N)被天冬氨酸盐(D)或谷氨酰胺(Q)的取代。抗原结合蛋白变体可或不可在轻链的91位氨基酸有半胱氨酸(C)被丝氨酸(S)的取代。例如，抗原结合蛋白具有轻链91位丝氨酸(S)残基和重链54位天冬酰胺(N)。
抗原结合蛋白可变重链可在28位具有丝氨酸(S)或苏氨酸(T)氨基酸残基；和/或在105位有苏氨酸(T)或谷氨酰胺(Q)氨基酸残基。抗原结合蛋白可变轻链可在16位具有精氨酸(R)或甘氨酸(G)氨基酸残基；和/或在71位具有酪氨酸(Y)或苯基丙氨酸(F)氨基酸残基；和/或在100位具有丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)氨基酸残基。例如，抗原结合蛋白可包含可变重链的28位丝氨酸(S)、105位谷氨酰胺(Q)；和/或可变轻链的16位甘氨酸(G)、71位酪氨酸(Y)和100位谷氨酰胺(Q)。
如上所述，通过CDR长度并通过环包裹二者来界定CDR的特定规范结构类型，所述环包裹通过位于CDR和构架区二者中的关键位置的残基来决定。因此，本发明除可包括SEQ ID NO：1-3中所列的CDR、SEQ ID NO：82-97和SEQ ID NO 109中所列的变体CDR、对应的CDR、结合单位或其变体外，还可包括本发明抗原结合蛋白的以下规范构架残基(用Kabat编号)：
重链：2位V、I或G；4位L或V；20位L、I、M或V；22位C；24位T、A、V、G或S；26位G；29位I、F、L或S；36位W；47位W或Y；48位I、M、V或L；69位I、L、F、M或V；78位A、L、V、Y或F；80位L或M；90位Y或F；92位C；和/或94位R、K、G、S、H或N；和/或
轻链：2位I、L或V；3位V、Q、L或E；4位M或L；23位C；35位W；36位Y、L或F；46位S、L、R或V；49位Y、H、F或K；71位Y或F；88位C；和/或98位F。
本发明抗原结合蛋白中可存在上述构架位置中的任何一种、任意组合或全部。每一个重链或轻链可变区、每一个重链或轻链和每一个抗原结合蛋白中可有多个变体构架规范位置，因此，本发明抗原结合蛋白中可存在任何组合，前提为保留构架的规范结构。
例如，重链可变构架可包含2位V、4位L、20位V、22位C、24位A、26位G、29位F、36位W、47位W、48位M、69位M、78位A、80位M、90位Y、92位C和94位R。例如，轻链可变构架可包含2位I、3位Q、4位M、23位C、35位W、36位F、46位S、49位Y、71位Y、88位C和98位F。
本文所述的一个或多个CDR、对应的CDR、变体CDR或结合单位可例如作为人源化的或嵌合的可变结构域存在于人构架情况中。
人源化的重链可变结构域可在受体抗体构架内包含SEQ ID NO：1-3中所列的CDR、SEQ ID NO：82-97和110和SEQ ID NO 109中所列的变体CDR、对应的CDR、结合单位、或其变体，其在构架区中与SEQ ID NO：10的人受体可变结构域序列具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。人源化的轻链可变结构域可在受体抗体构架内包含SEQ ID NO：4-6中所列的CDR、SEQ ID NO：82-97和110和SEQ IDNO 109中所列的变体CDR、对应的CDR、结合单位、或其变体，其在构架区中与SEQ ID NO：11中的人受体可变结构域序列具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。在SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11二者中，CDRH3的位置由X标示。SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的10X残基是CDR位置的占位符，不是每一CDR中的氨基酸序列的数目的量度。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：7或25的重链可变区。抗原结合蛋白可包含选自SEQ IDNO：8或21的轻链可变区。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含以下重链和轻链可变区组合中的任一种：10B3(SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8)、10B3C(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：8)或10B3C-C91S(SEQID NO：25和SEQ ID NO：21)。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：12、13、14、22和23中的任一种重链可变区。抗原结合蛋白可包含选自SEQ ID NO：15、16、17、18或24中的任一种的轻链可变区。任何重链可变区可与任何轻链可变区组合。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素。
抗原结合蛋白可包含以下重链和轻链可变区组合中的任一种：H0L0(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15)、H0L1(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16)、H0L2(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17)、H0L3(SEQID NO：12和SEQ ID NO：18)、H1L0(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15)、H1L1(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16)、H1L2(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17)、H1L3(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：18)、H2L0(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)、H2L1(SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：16)、H2L2(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：17)、H2L3(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18)、H2L2-C91S(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：24)。
抗体重链可变区可与SEQ ID NO：7、25、12、13、14、19、20、22或23中的任一种，具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。抗体轻链可变区可与SEQ ID NO：8、15、16、17、18、21或24中的任一种，具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。
可在全长序列中测定SEQ ID NO：7、25、12、13、14、19、20、22、23、8、15、16、17、18、21或24变体的同一性百分比。
抗体重链可变区可为SEQ ID NO：7、25、12、13、14、19、20、22或23中任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。抗体轻链可变区可为SEQ ID NO：8、15、16、17、18、21或24中任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。
例如，上述规范CDR和规范构架残基取代，亦可作为至少75％同一性或含有至多30个氨基酸取代的变体序列，存在于变体重链或轻链可变区中。
取代可包含以下中的任一种：Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N和V102S；上述抗体重链可变区的中的任一种。除上述任一种取代外，抗体重链可变区亦可包含在上述任一种抗体重链可变区中的以下任一种取代：G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。
抗体重链可变区可具有含F100G_Y取代的SEQ ID NO：14序列。除F100G_Y取代外，亦可存在以下取代中的任一种：G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。具体而言，抗体重链可变区可具有含以下取代的SEQ ID NO：14序列：F100G_Y；或F100G_Y和G55S。所述抗体重链可变区可与SEQ ID NO：24序列的轻链可变区配对。
任何重链可变区可与合适的人恒定区组合。任何轻链可变区可与合适的恒定区组合。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含以下重链和轻链组合中的任一种：10B3C(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)或10B3C-C91S(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：37)。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素。
本发明亦提供与肌生成抑制素结合的抗原结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：28、29、30、35、36、38、39、98或99中的任一种的重链。抗原结合蛋白可包含选自SEQ ID NO：31、32、33、34或40中的任一种的轻链。任何重链可与任何轻链组合。所述抗原结合蛋白亦可中和肌生成抑制素。
抗原结合蛋白可包含以下重链和轻链组合中的任一种：H0L0(SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：31)、H0L1(SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：32)、H0L2(SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：33)、H0L3(SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34)、H1L0(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31)、H1L1(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32)、H1L2(SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：33)、H1L3(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：34)、H2L0(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31)、H2L1(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32)、H2L2(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：33)、H2L3(SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：34)、H2L2-C91S(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：40)、H2L2-C91SF100G_Y Fc无效化(SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：40)或H2L2-C91SG55S-F100G_Y Fc无效化(SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：40)。
抗体重链可与SEQ ID NO：26、28、29、30、35、36、38、39、98或99中的任一种，具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。抗体轻链可与SEQ ID NO：27、31、32、33、34、37或40中的任一种，具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性。
可在全长序列中测定SEQ ID NO：26、28、29、30、35、36、38、39、98、99、27、31、32、33、34、37或40变体的同一性百分比。
抗体重链可为SEQ ID NO：26、28、29、30、35、36、38、39、98或99中的任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。抗体轻链可为SEQ IDNO：27、31、32、33、34、37或40中任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。
例如，上述规范CDR和规范构架残基取代作为至少75％同一或含有至多30个氨基酸取代的变体序列，亦可存在于变体重链或轻链中。
取代可包含以下中的任一种：上述抗体重链中的任一种中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100GS、F100G_N、F100G_Y、V102N和V102S。除上述任一种取代外，抗体重链亦可包含以下取代中的任一种：上述抗体重链中的任一种中的G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。
抗体重链可具有含取代F100G_Y的SEQ ID NO：30序列。除F100G_Y取代外，亦可存在以下取代中的任一种：G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。具体而言，抗体重链可具有含以下取代的SEQ ID NO：30序列：F100G_Y；或F100G_Y和G55S。所述抗体重链可与SEQ ID NO：40序列的轻链配对。
如上所述，抗原结合蛋白例如含部分通过化学修饰和/或插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基来改变序列的变体，或与上述任一种序列具有75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高或99％或更高同一性的变体，可表现出由EC50所显示为10B3或10B3嵌合体(重链：SEQ ID NO：7或25，轻链：SEQID NO：8)所显示效价的10倍或5倍内的与肌生成抑制素结合的效价。可通过ELISA测定来进行由EC50显示的与肌生成抑制素结合的效价的测定。
本发明抗原结合蛋白可为Fc无效化。实现Fc无效化的一种方式包括取代重链恒定区的235和237位(EU索引编号)的丙氨酸残基。例如，抗原结合蛋白可为Fc无效化，并包含SEQ ID NO：98序列(人源化的重链：H2_F100G_Y Fc无效化)；或SEQ ID NO：99序列(人源化的重链：H2_G55S-F100G_Y Fc无效化)。或者，抗原结合蛋白可为Fc有效，不包含235和237位的丙氨酸取代。
抗原结合蛋白可结合肌生成抑制素，并与包含SEQ ID NO：7或25重链可变区序列和SEQ ID NO：8轻链可变区序列的参考抗体竞争结合肌生成抑制素；其中所述抗原结合蛋白不与肌生成抑制素的肽片段结合。肌生成抑制素的肽片段可由SEQ ID NO：81(CCTPTKMSPINMLY)组成。所述肌生成抑制素的肽片段可为由至多肌生成抑制素序列的14个氨基酸组成的任何片段。所述肌生成抑制素的肽片段可为线性。肌生成抑制素肽片段可为肌生成抑制素序列的任何片段，包括全长序列，其中所述肽片段为线性。这可用SRU BIND读数器和捕获在链霉亲和素包被的生物传感器板上的生物素化肽，用实施例2.4中所述方法来评估。
或者，抗原结合蛋白可结合肌生成抑制素，并与包含SEQ ID NO：7或25重链可变区序列和SEQ ID NO：8轻链可变区序列的参考抗体竞争结合肌生成抑制素；其中所述抗原结合蛋白不与由SEQ ID NO：74(人工肌生成抑制素线性肽37-SGSGCCTPTKMSPINMLY)组成的人工肽序列结合。所述人工肽序列可由表7中所述的任一种序列组成。人工肽序列可为线性。这可用SRU BIND读数器和捕获在链霉亲和素包被的生物传感器板上的生物素化肽，用实施例2.4中所述方法来评估。
参考抗体可包含以下重链和轻链组合：10B3C(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)。重链序列SEQ ID NO：26包含可变结构域序列SEQID NO：25；轻链序列SEQ ID NO：27包含可变结构域序列SEQ ID NO：8。
可通过竞争ELISA来测定抗原结合蛋白和参考抗体之间的竞争。可通过以下任一种或组合来测定肌生成抑制素的竞争性中和：竞争性结合肌生成抑制素，例如通过ELISA、FMAT或BIAcore测定；竞争性抑制肌生成抑制素与ActRIIb受体的结合；和竞争性抑制细胞信号转导，所述细胞信号转导导致在A204测定中表达荧光素酶。竞争性抗原结合蛋白可结合相同表位、重叠表位或最接近与参考抗体结合的表位的表位。
抗原结合蛋白可不与肌生成抑制素肽片段或人工肽序列显著结合。抗原结合蛋白可不以1∶1-1∶10的抗原结合蛋白∶肌生成抑制素肽片段或人工肽序列的比率范围分别与所述片段或肽结合。
可通过ELISA或通过用还原条件的SDS PAGE，来测定抗原结合蛋白和肌生成抑制素肽片段或人工肽序列之间的结合或不结合。例如，可通过还原性SDS PAGE，来测定抗原结合蛋白与线性全长肌生成抑制素序列的结合或不结合。
本文所述抗原结合蛋白可不与肌生成抑制素肽片段结合。肌生成抑制素肽片段可由SEQ ID NO：81(CCTPTKMSPINMLY)组成。肌生成抑制素肽片段可为由肌生成抑制素序列的至多14个氨基酸组成的任何片段。肌生成抑制素肽片段可为线性。肌生成抑制素的肽片段可为肌生成抑制素序列的任何片段，包括全长序列，其中所述序列为线性。这可用SRU BIND读数器和捕获在链霉亲和素包被的生物传感器板上的生物素化肽，用实施例2.4中所述方法来评估。
或者，本文所述抗原结合蛋白可不结合由SEQ ID NO：74(人工肌生成抑制素线性肽37-SGSGCCTPTKMSPINMLY)组成的人工肽序列。人工肽序列可由表7中所述序列中的任一种组成。人工肽序列可为线性。这可用SRU BIND读数器和捕获在链霉亲和素包被的生物传感器板上的生物素化肽，用实施例2.4中所述方法来评估。
抗原结合蛋白可不与肌生成抑制素肽片段或人工肽序列显著结合。抗原结合蛋白可不以1∶1-1∶10的比率范围分别与肌生成抑制素肽片段或人工肽序列结合。
可通过ELISA或通过用还原条件的SDS PAGE，来测定抗原结合蛋白和肌生成抑制素肽片段或人工肽序列之间的结合或不结合。例如，可通过还原性(即变性)SDS PAGE，来测定抗原结合蛋白与线性全长肌生成抑制素序列的结合或不结合。例如，可用SRU BIND读数器和捕获在链霉亲和素包被的生物传感器板上的生物素化肽，采用实施例2.4中所述方法来进行。实施例2.4中的数据表明，10B3可与构象序列结合，这可证明在体内结合和中和天然肌生成抑制素用于治疗性治疗的益处。
肌生成抑制素与本文所述抗原结合蛋白结合的表位可为构象表位或不连续表位。本文所述的抗原结合蛋白可不与肌生成抑制素上的线性表位结合，例如抗原结合蛋白可不与肌生成抑制素的还原或变性样品结合。构象表位或不连续表位可与肌生成抑制素受体结合位点相同、相似、或重叠。当肌生成抑制素呈其成熟形式及作为含另一肌生成抑制素分子的二聚体(同型二聚体)的部分时，可取得所述表位。当肌生成抑制素呈其成熟形式及作为含所述其它肌生成抑制素结合分子的四聚体的部分时，可取得所述表位。表位可散布在两个肌生成抑制素多肽之间。该类不连续表位可包含来自每一个肌生成抑制素分子的序列。在二聚体三级和四级结构情况中，序列可彼此足够靠近以形成表位并由抗原结合蛋白结合。可由已知方法例如CLIPSTM(PepscanSystems)来鉴别构象表位和/或不连续表位。
随后用Pepscan(在支架上化学连接免疫原性肽(ChemicallyLinked Immunogenic Peptides on Scaffolds，CLIPS)技术)进行的10B3C肌生成抑制素结合位点分析，提示肌生成抑制素的氨基酸序列″PRGSAGPCCTPTKMS″可为嵌合抗体的结合位点。Pepscan方法利用限制肽。
抗原结合蛋白在人或在鼠动物模型体内可具有至少6小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少7天或至少9天的半衰期。
与抗原结合蛋白结合的肌生成抑制素多肽可为重组多肽。肌生成抑制素可在溶液中，或可被连接到固态表面。例如，肌生成抑制素可被连接到珠粒，例如磁性珠粒。肌生成抑制素可被生物素化。可通过在固体表面偶联生物素链霉亲和素，将缀合肌生成抑制素的生物素分子用于让肌生成抑制素固定到固体表面。
抗原结合蛋白可源自大鼠、小鼠、灵长类(例如猕猴、旧大陆猴(OldWorld monkey)或类人猿)或人。抗原结合蛋白可为人源化的抗体或嵌合抗体。
抗原结合蛋白可包含恒定区，其可为任何同种型或亚类。恒定区可为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗原结合蛋白恒定区可为IgG1。
可将对抗体的Fc效应部分的突变性变化用于改变FcRn和抗体之间相互作用亲和力，以调节抗体转换(turnover)。可延长体内抗体的半衰期。这对患者群将有益，因为可由于保持体内IC50更长时间而达到最大给药量和最大给药频率。可以其整体或部分除掉抗体Fc效应功能，因为肌生成抑制素为可溶性靶标。这种除去可导致提高安全性概况。
包含恒定区的抗原结合蛋白可降低ADCC和/或补体激活或效应功能。恒定结构域可包含IgG2或IgG4同种型的天然无效化的恒定区或突变的IgG1恒定结构域。合适的修饰实例阐述于EP0307434中。实现Fc无效化的一种方式包括取代重链恒定区的235和237位(EU索引编号)的丙氨酸残基。
抗原结合蛋白可包含选自突变的恒定结构域的一种或多种修饰，以使抗体效应功能/ADCC和/或补体激活提高。合适的修饰实例阐述于以下文献中：Shields等，J.Biol.Chem(2001)276：6591-6604；Lazar等，PNAS(2006)103：4005-4010；和US6737056、WO2004063351和WO2004029207。
抗原结合蛋白可包含具改变的糖基化概况致使抗原结合蛋白效应功能/ADCC和/或补体激活提高的恒定结构域。制备具改变糖基化概况的抗原结合蛋白的合适的方法的实例阐述于WO2003/011878、WO2006/014679和EP1229125中。
本发明亦提供编码本文所述抗原结合蛋白的核酸分子。所述核酸分子可包含编码以下的序列：(i)一个或多个CDRH、重链可变序列或全长重链序列；和(ii)一个或多个CDRL、轻链可变序列或全长轻链序列，且(i)和(ii)在同一个核酸分子上。或者，编码本文所述抗原结合蛋白的核酸分子可包含编码以下的序列：(a)一个或多个CDRH、重链可变序列或全长重链序列；或(b)一个或多个CDRL、轻链可变序列或全长轻链序列，且(a)和(b)在分开的核酸分子上。
编码重链的核酸分子可包含SEQ ID NO：41。编码轻链的核酸分子可包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：52。编码重链的核酸分子可包含SEQ ID NO：43、44或45中的任一种。编码轻链的核酸分子可包含SEQ ID NO：46、47、48、49或55中的任一种。编码抗原结合蛋白的一种或多种核酸分子可包含以下重链和轻链组合中的任一种：H0L0(SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：46)、H0L1(SEQ ID NO：43和SEQ IDNO：47)、H0L2(SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：48)、H0L3(SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：49)、H1L0(SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：46)、H1L1(SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：47)、H1L2(SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：48)、H1L3(SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49)、H2L0(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46)、H2L1(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：47)、H2L2(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48)、H2L3(SEQ ID NO：45和SEQ IDNO：49)、H2L2-C91S(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：55)。
上述核酸分子亦可编码含以下取代中的任一种的重链：Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_Y、F100G_S、V102N和V102S。除上述任一种取代之外，或作为上述任一种取代的备选，核酸分子亦可编码包含以下取代中的任一种的重链：G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。上述核酸分子亦可编码具以下取代的轻链：C91S。
核酸分子可具有含编码F100G_Y取代的SEQ ID NO：45序列。除F100G_Y取代外，亦可存在以下取代中的任一种：G55D、G55L、G55S、G55T或G55V。具体而言，核酸分子可具有含编码以下取代的SEQ IDNO：45序列：F100G_Y或F100G_Y和G55S。编码重链的核酸分子可与编码轻链的SEQ ID NO：55序列核酸分子配对。
本发明亦提供包含本文所述核酸分子的表达载体。亦提供包含本文所述表达载体的重组宿主细胞。
可在合适的宿主细胞中制备本文所述抗原结合蛋白。用于制备本文所述抗原结合蛋白的方法可包括培养本文所述宿主细胞和回收抗原结合蛋白的步骤。重组转化、转染或转导的宿主细胞可包含至少一种表达盒，由此所述表达盒包含编码本文所述抗原结合蛋白重链的多核苷酸，并进一步包含编码本文所述抗原结合蛋白轻链的多核苷酸。或者，重组转化、转染或转导的宿主细胞可包含至少一种表达盒，由此第一表达盒包含编码本文所述抗原结合蛋白重链的多核苷酸，并进一步包括包含编码本文所述抗原结合蛋白轻链的多核苷酸的第二表达盒。稳定转化的宿主细胞可包括包含一个或多个编码本文所述抗原结合蛋白的重链和/或轻链的表达盒的载体。例如所述宿主细胞可包含编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体。
宿主细胞可为真核的例如哺乳动物。这类细胞系实例包括CHO或NS0。宿主细胞可为非人宿主细胞。宿主细胞可为非胚胎宿主细胞。宿主细胞可在培养基例如无血清培养基中培养。可由宿主细胞将抗原结合蛋白分泌到培养基中。可将抗原结合蛋白纯化到关于所述含有抗原结合蛋白的培养基的至少95％或更高(例如98％或更高)。
可提供包含抗原结合蛋白和药用载体的药物组合物。可提供包含药物组合物连同使用说明书的试剂盒(kit-of-part)。为了方便，试剂盒可包括预定量的试剂及使用说明。
抗体结构
完整抗体
可基于恒定区氨基酸序列将来自大部分脊椎动物物种的抗体轻链指定为称为κ和λ的两种类型中的一种。视其重链恒定区的氨基酸序列而定，可将人抗体指定为5种不同的种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。可将IgG和IgA进一步细分为亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和IgA1和IgA2。存在于小鼠和大鼠的物种变体具有至少IgG2a、IgG2b。
可变区的更保守的部分称为构架区(FR)。完整重链和轻链的可变结构域各包含由3个CDR连接的4个FR。各链中的CDR由FR区接近地结合在一起，并与来自其它链的CDR结合在一起，这样有助于形成抗体的抗原结合位点。
恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、参与经由与Fcγ受体结合的吞噬作用、参与经由新生Fc受体(FcRn)的半衰期/清除率和参与经由补体级联C1q组分的补体依赖的细胞毒性。
业已报道人IgG2恒定区基本上缺乏通过经典途径激活补体的能力或介导抗体依赖的细胞细胞毒性的能力。业已报道IgG4恒定区缺乏通过经典途径激活补体的能力和介导抗体依赖的细胞细胞毒性的能力，并仅能很弱地介导抗体依赖的细胞的细胞毒性。可将基本上缺乏这些效应功能的抗体命名为“非溶胞”抗体。
人抗体
可通过本领域技术人员已知的多种方法来制备人抗体。可通过杂交瘤方法用人骨髓瘤或小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系来制备人抗体，参见Kozbor(1984)J.Immunol 133，3001和Brodeur，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，51-63(Marcel Dekker Inc，1987)。备选方法包括使用噬菌体库或转基因小鼠，二者都利用人可变区谱(repertory)(参见Winter(1994)Annu.Rev.Immunol 12：433-455；Green(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23)。
现在可获得若干转基因小鼠品系，其中业已用人免疫球蛋白基因区段取代其小鼠免疫球蛋白基因座(参见Tomizuka(2000)PNAS 97：722-727；Fishwild(1996)Nature Biotechnol.14：845-851；Mendez(1997)Nature Genetics，15：146-156)。在用抗原攻击所述能够产生人抗体谱的小鼠后，可从其中选择目的抗体。
可将噬菌体展示技术用于制备人抗原结合蛋白(及其片段)，参见McCafferty(1990)Nature 348：552-553和Griffiths等(1994)EMBO 13：3245-3260。
可将亲和力成熟技术(Marks Bio/technol(1992)10：779-783)用于提高结合亲和力，其中通过用天然存在的变体按顺序取代H和L链的可变区，并基于结合亲和力提高进行选择，来提高初始人抗体的亲和力。现在亦可使用该技术的改编版例如″表位印记(epitopeimprinting)″，参见例如WO 93/06213；Waterhouse(1993)Nucl.AcidsRes.21：2265-2266。
嵌合抗体和人源化抗体
通常用重组DNA方法来制备嵌合抗体。分离编码抗体的DNA(例如cDNA)，并用常规程序测序(例如通过用能够与编码抗体的H和L链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作所述DNA的典型来源。分离后将DNA置于表达载体中，然后转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌(E.coli)、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，来获得合成抗体，所述细胞不会产生其它免疫球蛋白。可通过将编码人L和H链的序列取代为相应的非人(例如鼠)H和L恒定区，来修饰DNA，参见例如Morrison(1984)PNAS 81：6851。
可通过仅将非人(例如鼠)抗体(″供体″抗体)的CDR移植到人构架(″受体构架″)和恒定区上产生人源化的抗体，来实现免疫原性大大降低(参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；和Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)。然而，CDR移植本身不能导致完全保留抗原结合特性，经常发现假如要恢复显著的抗原结合亲和力，则供体抗体的某些构架残基(有时称为″回复突变″)需要被保留在人源化的分子中(参见Queen等(1989)PNAS 86：10,029-10,033：Co等(1991)Nature 351：501-502)。在这种情况下，从数据库选择显示与非人供体抗体具有最大序列同源性的人可变区，以便提供人构架(FR)。可从人共同或单独人抗体进行人FR选择。必要时来自供体抗体的关键残基可被取代为人受体构架，以保留CDR构象。可将抗体的计算机建模用于鉴别所述结构上重要的残基，参见WO 99/48523。
或者，可通过“镶饰(veneering)”方法实现人源化。独特的人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计学分析，显示暴露的残基的确切方式在人和鼠抗体中不同，大部分单独的表面位置对少数不同残基有强烈偏好(参见Padlan等(1991)Mol.Immunol.28：489-498；和Pedersen等(1994)J.Mol.Biol.235：959-973)。因此，通过在其构架区中取代不同于通常在人抗体中存在的那些的暴露的残基，可能降低非人Fv的免疫原性。因此蛋白质抗原性可与表面易接近性相关，所以取代表面残基可能足以使人免疫系统对小鼠可变区″不可见(invisible)″(亦参见Mark等(1994)在Handbook of Experimental Pharmacology第113卷中的：The pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，Springer-Verlag，105-134)。称该人源化程序为″镶饰″，是因为仅改变了抗体表面，支撑性的残基保持不受干扰。另外的备选方法包括WO04/006955中提出的方法及HumaneeringTM程序(Kalobios)，所述程序利用细菌表达系统，产生序列上接近人种系的抗体(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics，2007年1月，San Diego，California)。
双特异性抗原结合蛋白
双特异性抗原结合蛋白为对至少两个不同表位具有结合特异性的抗原结合蛋白。制备所述抗原结合蛋白的方法为本领域所知。传统上双特异性抗原结合蛋白的重组制备基于两个免疫球蛋白H链-L链对的共表达，其中所述两个H链具有不同的结合特异性，参见Millstein等(1983)Nature 305：537-539；WO 93/08829；和Traunecker等(1991)EMBO 10：3655-3659。因为H和L链的随机分配，产生了10种不同抗体结构的潜在混合物，其中仅一种具有所期需的结合特异性。备选方法包括让具有所期需的结合特异性的可变结构域与包含至少铰链区、CH2和CH3区部分的重链恒定区融合。含有轻链结合必需位点的CH1区可存在于至少一种融合体中。将编码这些融合体的DNA(若需要还有L链)插入到单独的表达载体中，然后共转染到合适的宿主生物体中。认为将2条或所有3条链编码序列插入到一个表达载体中是可能的。在一种方法中，双特异性抗体包含在一条臂上具第一结合特异性的H链和H-L链对组成，前提是第二结合特异性在另一条臂上，参见WO 94/04690。亦参见Suresh等(1986)Methods in Enzymology 121：210。
抗原结合片段
缺乏恒定区的片段缺乏由经典途径激活补体的能力或介导抗体依赖性细胞细胞毒性的能力。传统上通过蛋白质水解消化完整抗体，通过例如木瓜蛋白酶消化，来制备所述片段(参见例如WO 94/29348)，但可从重组转化的宿主细胞直接制备。关于ScFv制备参见Bird等(1988)Science 242：423-426。另外，可用如下所述的多种工程改造技术来制备抗原结合片段。
Fv片段似乎比Fab片段的两条链具有更低的相互作用能量。为了使VH和VL结构域的缔合稳定，让它们与肽连接(Bird等(1988)Science242：423-426；Huston等(1988)PNAS 85(16)：5879-5883)、二硫桥连接(Glockshuber等(1990)Biochemistry 29：1362-1367)和″knob in hole″突变连接(Zhu等(1997)Protein Sci.，6：781-788)连接。可通过本领域技术人员众所周知的方法制备ScFv片段，参见Whitlow等(1991)MethodsCompanion Methods Enzymol，2：97-105和Huston等(1993)Int.Rev.Immunol 10：195-217。可在细菌细胞例如大肠杆菌或真核生物细胞中制备ScFv。ScFv的一个缺点是产物的单价，这排除了由于多价结合而产生的高亲合力，且其半衰期短。解决这些问题的尝试包括通过化学偶联从含有另外的C-末端半胱氨酸的ScFv产生二价(ScFv′)2(Adams等(1993)Can.Res 53：4026-4034；和McCartney等(1995)Protein Eng.8：301-314)，或通过含有未配对的C-末端半胱氨酸残基的ScFv自发位点特异性二聚体化产生二价(ScFv′)2(参见Kipriyanov等(1995)Cell.Biophys 26：187-204)。或者，可通过缩短肽接头到3-12个残基以形成″双抗体″，来迫使ScFv形成多聚体，参见HoLliger等(1993)PNAS 90：6444-6448。减少接头仍进一步可导致ScFv三聚体(″三聚抗体(triabody)″，参见Kortt等(1997)Protein Eng 10：423-433)和四聚体(″四聚抗体(tetrabody)″，参见Le Gall等(1999)FEBS Lett，453：164-168)。亦可通过与蛋白质二聚体化模体遗传融合(genetic fusion)以形成″微型抗体(miniantibodies)″(参见Pack等(1992)Biochemistry 31：1579-1584)和″微抗体(minibodies)″(参见Hu等(1996)Cancer Res.56：3055-3061)，来完成二价ScFv分子的构建。亦可通过让两个ScFv单位连接第三个肽接头，来制备ScFv-Sc-Fv串联物((ScFv)2)，参见Kurucz等(1995)J.Immol.154：4576-4582。可通过两个单链融合产物的非共价缔合来制备双特异性双抗体，所述两个单链融合产物由通过短接头与另一抗体的VL结构域连接的一个抗体的VH结构域组成，参见Kipriyanov等(1998)Int.J.Can 77：763-772。可通过引入上文所述的二硫桥或″knobin hole″突变，或通过其中通过肽接头连接的两个杂合ScFv片段形成单链双抗体(ScDb)，来提高所述双特异性双抗体的稳定性，参见Kontermann等(1999)J.Immunol.Methods 226：179-188。通过例如ScFv片段与IgG分子的CH3结构域融合，或经由铰链区与Fab片段融合，来获得四价双特异性分子，参见Coloma等(1997)Nature Biotechnol.15：159-163。或者，通过双特异性单链双抗体的融合来制造四价双特异性分子(参见Alt等(1999)FEBS Lett 454：90-94)。亦可通过ScFv-ScFv串联物与含有螺旋-环-螺旋模体的接头二聚体化(DiBi微抗体，参见Muller等(1998)FEBS Lett 432：45-49)，或包含呈防止分子内配对的方向的四个抗体可变结构域(VH和VL)的单链分子二聚体化(串联双抗体，参见Kipriyanov等(1999)J.Mol.Biol.293：41-56)，来形成较小的四价双特异性分子。可通过化学偶联Fab′片段或通过亮氨酸拉链的异二聚体化来制造双特异性F(ab′)2片段(参见Shalaby等(1992)J.Exp.Med.175：217-225；和Kostelny等(1992)，J.Immunol.148：1547-1553)。亦可获得分离的VH和VL结构域(Domantis plc)，参见US 6,248,516；US 6,291,158；和US 6,172,197。
异源缀合物抗体
异源缀合物抗体由用任何合宜的交联方法形成的两个共价连接的抗体组成。参见例如US 4,676,980。
其它修饰
本发明抗原结合蛋白可包含其它修饰以提高或改变其效应功能。认为抗体Fc区和各种Fc受体(FcγR)之间的相互作用介导抗体的效应功能，所述效应功能包括抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、补体的固定、吞噬作用和抗体的半衰期/清除率。可视所期需特性来进行抗体Fc区的各种修饰。例如，Fc区特异性突变以提供另外的溶胞抗体，非溶胞抗体详述于EP 0629 240和EP 0307 434中，或人们可将抢救受体(salvage receptor)结合表位掺入到抗体中以增加血清半衰期，参见US 5,739,277。人Fcγ受体包括FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生FcRn。Shields等(2001)J.Biol.Chem 276：6591-6604证明，IgG1残基常见集合参与结合所有的FcγR，而FcγRII和FcγRIII利用该常见集合外的不同位点。当以下一组IgG1残基改变为丙氨酸时，降低与所有FcγR的结合：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。它们全部都在IgG CH2结构域中，并聚集在铰链连接的CH1和CH2附近。当FcγRI仅利用IgG1残基的常见集合结合时，FcγRII和FcγRIII还与除常见集合之外的不同残基互相作用。某些残基改变仅降低了与FcγRII(例如Arg-292)或FcγRIII(例如Glu-293)的结合。某些变体显示改进了与FcγRII或FcγRIII的结合，但不影响与其它受体的结合(例如Ser-267Ala改进与FcγRII的结合，但不影响与FcγRIII的结合)。其它变体表现出改进与FcγRII或FcγRIII的结合，且降低与其它受体的结合(例如Ser-298Ala改进与FcγRIII的结合，降低与FcγRII的结合)。对于FcγRIIIa，最好的结合IgG1变体为在Ser-298、Glu-333和Lys-334的丙氨酸取代的组合。认为新生FcRn受体既参与抗体清除又参与组织间的胞转作用(参见Junghans(1997)Immunol.Res 16：29-57；和Ghetie等(2000)Annu.Rev.Immunol.18：739-766)。确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在本节中所述任何位置的取代可提高抗体的血清半衰期和/或改变效应特性。
其它修饰包括抗体的糖基化变体。已知抗体在其恒定区保守位置的糖基化对抗体功能具有巨大的影响，尤其是对效应功能，例如上述那些功能，参见例如Boyd等(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318。涵盖抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，其中一个或多个碳水化合物部分被添加、取代、缺失或修饰。引入天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸模体产生潜在的碳水化合物部分的酶连接位点，因此，可用于操作抗体的糖基化。在Raju等(2001)Biochemistry 40：8868-8876中，通过用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α，2，3唾液酸转移酶的再次半乳糖苷化和/或再次唾液酸化(sialyation)过程，增加了TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。认为增加末端唾液酸化提高免疫球蛋白的半衰期。和大部分糖蛋白一样，通常作为糖形混合物来制备抗体。当在真核细胞尤其是哺乳动物细胞中产生抗体时，该混合物尤其明显。开发了多种方法来制备明确的糖形，参见Zhang等(2004)Science 303：371；Sears等(2001)Science 291：2344；Wacker等(2002)Science 298：1790；Davis等(2002)Chem.Rev.102：579；Hang等(2001)Ace.Chem.Res 34：727。本文所述抗体(例如IgG同种型，例如IgG1)可包含明确数量(例如7个或更少、例如5个或更少、例如两个或单个)的糖形。
可让抗体与非蛋白聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯偶联。蛋白质与PEG的缀合为已确定的用于增加蛋白质半衰期以及降低蛋白质的抗原性和免疫原性的技术。业已用完整抗体以及Fab′片段研究了具不同分子量和类型(线性或支链)的PEG化的应用，参见Koumenis等(2000)Int.J.Pharmaceut.198：83-95。
制备方法
可在以下转基因生物体中制备抗原结合蛋白：例如山羊(参见Pollock等(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157)、鸡(参见Morrow(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(参见Pollock等)或植物(参见Doran(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11：199-204；Ma(1998)Nat.Med.4：601-606；Baez等(2000)BioPharm 13：50-54；Stoger等(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)。
亦可通过化学合成来制备抗原结合蛋白。然而，通常用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术来制备抗原结合蛋白。分离编码抗原结合蛋白的多核苷酸，将其插入到可复制的载体例如质粒中用于进一步克隆(扩增)或表达。一个表达系统为谷氨酸盐合成酶系统(例如由Lonza Biologies所销售)，尤其是当宿主细胞为CHO或NS0时。易于分离编码抗原结合蛋白的多核苷酸，并用常规程序(例如寡核苷酸探针)测序。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、通常所用质粒的微染色体。通常所述载体进一步包括与抗原结合蛋白多核苷酸可操作地连接的信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，以便促进表达。可将编码轻链和重链的多核苷酸插入到单独的载体，并在同时或序贯被引入(例如通过转化、转染、电穿孔或转导)到同一个宿主细胞，或在需要时可在所述引入之前将重链和轻链二者插入到同一个载体中。
可有目的地使用密码子优化，使当用密码子优化基因转染与用野生型序列转染的水平比较时，宿主细胞产生的蛋白质总水平更高。已公开了若干方法(Nakamura等(1996)Nucleic Acids Research 24：214-215；W098/34640；W097/11086)。由于遗传编码的丰余性，本文揭示的备选多核苷酸(尤其是那些密码子优化用于在既定宿主细胞中表达的多核苷酸)亦可编码本文所述抗原结合蛋白。可修改本发明抗原结合蛋白的密码子使用以满足宿主细胞的密码子偏好，来增加转录物和/或产物产量(例如Hoekema等Mol Cell Biol 19877(8)：2914-24)。密码子选择可基于用于表达的宿主细胞的合适的相容性。
信号序列
抗原结合蛋白可作为含在成熟蛋白质的N-末端具有特异性切割位点的异源信号序列的融合蛋白产生。信号序列应该由宿主细胞识别并处理。对于原核宿主细胞，信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母，分泌信号序列可为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列，参见例如WO90/13646。在哺乳动物细胞系统中，病毒分泌性前导序列例如单纯疱疹gD信号和天然免疫球蛋白信号序列可能合适。通常信号序列在读框中与编码抗原结合蛋白的DNA连接。可使用例如SEQ ID NO：9中所示的信号序列。
复制起始点
对于适于大部分革兰氏阴性细菌的pBR322，适于大部分酵母的2μ质粒和适于大部分哺乳动物细胞的各种病毒来源(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)，复制起始点在本领域众所周知。通常对于哺乳动物表达载体不需要复制起始点元件，但可使用SV40，因为其含有早期启动子。
选择标记
典型的选择基因编码以下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)抗性；或(b)补充营养缺陷或提供在复杂培养基中不能获得的营养物；或(c)二者组合。选择方案可包含阻止宿主细胞生长。业已用编码抗原结合蛋白的基因成功转化的细胞，可因例如由共同递送的选择标记赋予的对药物的抗性而可以存活。一个实例是DHFR选择标记，其中在甲氨蝶呤存在下培养转化株。细胞可在增加量的甲氨蝶呤存在下培养，以扩增外来目的基因的拷贝数。CHO细胞是用于DHFR选择的特别有用的细胞系。另一实例是谷氨酸盐合成酶表达系统(Lonza Biologies)。用于酵母的选择基因实例是trp1基因，参见Stinchcomb等(1979)Nature 282：38。
启动子
让适于表达抗原结合蛋白的启动子可操作地与编码抗原结合蛋白的DNA/多核苷酸连接。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂交启动子例如Tac。适于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖分解酶，例如烯醇酶、甘油醛3磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡萄糖激酶。诱导型酵母启动子包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶。
用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(尤其是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、罗氏肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猴病毒40。当然，启动子的挑选基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。第一质粒可包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码轻链可变区(VL)、κC区、连同新霉素和氨苄青霉素抗性选择标记的DNA，第二质粒包含RSV或SV40启动子、编码重链可变区(VH)的DNA、编码γ1恒定区的DNA、DHFR和氨苄青霉素抗性标记。
增强子元件
若合适时，例如用于在高等真核细胞中表达时，可使用在载体中可操作地与启动子元件连接的增强子元件。哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，人们可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子(在100-270bp处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子(polyma enhancer)、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座(参见WO04/009823)。增强子可位于载体的启动子上游位点。或者，增强子可位于另外地方，例如在不翻译区或聚腺苷酸化信号下游。增强子定位的选择可基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。
聚腺苷酸化/终止
在真核生物系统中，让聚腺苷酸化信号序列可操作地与编码抗原结合蛋白的DNA/多核苷酸连接。通常将所述信号序列置于开放读框的3′端。在哺乳动物系统中，非限制性实例包括源自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的信号序列。在酵母系统中，聚腺苷酸化/终止信号序列的非限制性实例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脱氢酶1(ADH)基因的信号序列。在原核系统中，通常不需要聚腺苷酸化信号，通常代之以采用更短更明确的终止子序列。聚腺苷酸化/终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。
用于提高产量的其它方法/元件
除以上外，可用于提高产量的其它特征包括染色质重构元件、内含子和宿主-细胞特异性密码子修饰。
宿主细胞
用于克隆或表达编码抗原结合蛋白载体的合适的宿主细胞为原核细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。合适的原核细胞包括真细菌类，例如肠杆菌科，例如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325))；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如沙门伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(参见DD 266 710)；假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。在酵母宿主细胞中，亦涵盖酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)、毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183070，亦参见Peng等(2004)J.Biotechnol.108：185-192)、念珠菌属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、reesia(EP 244 234)、青霉属(Penicillin)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲菌(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
高等真核生物宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如COS-1(ATCCNo.CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系293；幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)；中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1，ATCC NO：CCL 61)、DHFR-CHO细胞系例如DG44(参见Urlaub等(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12：555-556)，尤其是用于悬浮培养的CHO细胞系；小鼠Sertoli细胞；猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCCCRL-1587)；HELA细胞；犬肾细胞(ATCC CCL 34)；人肺细胞(ATCCCCL 75)；Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞，例如NS0(参见US5,807,715)、Sp2/0、Y0。
亦可进一步对所述宿主细胞进行工程改造或改变，以改进抗原结合蛋白的品质、功能和/或产量。非限制性实例包括特异性修饰(例如糖基化)酶和蛋白质折叠伴侣的表达。
细胞培养方法
可通过本领域技术人员已知的任何方法来培养用编码抗原结合蛋白的载体转化的宿主细胞。可将宿主细胞培养在旋转培养瓶、滚动瓶或中空纤维系统中，但尤其对于悬浮培养使用搅拌罐反应器大规模生产。可将搅拌罐改为用例如喷头、阻墩(baffle)或低剪切力叶轮通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可使用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，向培养基中补充细胞保护剂(例如pluronic F-68)来帮助预防因通气过程而造成的细胞损伤。视宿主细胞特性而定，可将微载体用作贴壁依赖性细胞系的生长底面，或可让细胞变得适应于悬浮培养(其具有代表性)。宿主细胞尤其是无脊椎动物宿主细胞的培养可利用多种操作方式，例如分批补料式、重复批量处理(参见Drapeau等(1994)Cytotechnology 15：103-109)、持续批处理或灌注培养。尽管可将重组转化的哺乳动物宿主细胞培养在含血清培养基，例如胎牛血清(FCS)，但例如所述宿主细胞可培养在合成的无血清培养基，例如揭示在Keen等(1995)Cytotechnology 17：153-163中的培养基，或市购培养基，例如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)，需要时补充能源，例如葡萄糖和合成生长因子，例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能需要使那些细胞习惯于在无血清条件下生长。一种适应方法是在含血清培养基中培养所述宿主，反复将80％的培养基更换为无血清培养基，以使宿主细胞学会适应无血清条件(参见例如Scharfenberg等(1995)在Animal Cell Technology：Developmentstowards the 21st century(Beuvery等编辑，619-623，Kluwer Academicpublishers)。
可回收分泌到培养基中的抗原结合蛋白，并用多种技术纯化以提供适合计划使用目的的纯度。例如用于治疗人患者的抗原结合蛋白通常强制执行至少95％纯度，更通常98％或99％或更高纯度(与粗培养基比较)。通常用离心，接着用例如微孔过滤、超滤和/或滤床过滤来澄清上清液的步骤，从培养基中除去细胞碎片。可利用多种其它技术，例如透析和凝胶电泳和色谱技术，例如羟磷灰石(HA)、亲和色谱法(任选包括亲和标签系统，例如聚组氨酸)和/或疏水作用色谱法(HIC，参见US 5,429,746)。在进行各种澄清步骤后，可用蛋白A或G亲和色谱法来捕获抗体。可接着进行另外的色谱步骤，例如离子交换和/或HA色谱法、阴离子或阳离子交换、大小排阻色谱法和硫酸铵沉淀。亦可采用各种病毒除去步骤(例如用例如DV-20过滤器纳米过滤)。在这些不同步骤后，提供包含至少75mg/ml或更高、或100mg/ml或更高的抗原结合蛋白的纯化的(例如单克隆)制剂。所述制剂基本上没有抗原结合蛋白的聚集形式。
可将细菌系统用于表达抗原结合片段。所述片段可局限在细胞内、外周胞质内或分泌到细胞外。可按照本领域技术人员已知的方法，提取不溶性蛋白，再折叠形成活性蛋白，参见Sanchez等(1999)J.Biotechnol.72：13-20；和Cupit等(1999)Lett Appl Microbiol 29：273-277。
脱酰胺作用是其中除去酰胺官能团的化学反应。在生物化学中，该反应在蛋白质降解中很重要，因为其损伤含有酰胺侧链的氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺。认为脱酰胺反应是限制蛋白质的有用寿命的因素之一，其亦为制备治疗性蛋白质期间发生的最常见的翻译后修饰之一。例如，业已报道在体外或体内降低或丢失重组人DNA酶和重组可溶性CD4的生物学活性，而其它重组蛋白似乎不受影响。本文所述抗原结合蛋白结合肌生成抑制素的能力，似乎在诱导脱酰胺的应激条件下不受影响。因此，本文所述抗原结合蛋白的生物学活性及其有用寿命不可能受到脱酰胺作用的影响。
药物组合物
术语疾病、病症和病况可互换使用。可将本文所述抗原结合蛋白的纯化制剂纳入药物组合物中，用于治疗本文所述人疾病。可将药物组合物用于治疗其中肌生成抑制素是疾病原因之一或其中中和肌生成抑制素活性将有益的疾病。将包含治疗有效量的本文所述抗原结合蛋白的药物组合物用于治疗对中和肌生成抑制素有响应的疾病。
药物制剂可包含抗原结合蛋白与药用载体组合。可单独给予抗原结合蛋白或作为药物组合物的部分给予。
通常所述组合物包含已知并被称为可接受药用实践的药用载体，参见例如Remingtons Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)MackPublishing Co.。所述载体包括无菌载体，例如盐水、Ringer溶液或右旋糖溶液，任选用合适的缓冲液缓冲到pH在5-8的范围内。
可通过注射或连续输注(例如静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌肉内或门静脉内)给予药物组合物。所述组合物合适地为无可见颗粒的物质。药物组合物可包含1mg-10g的抗原结合蛋白，例如5mg-1g抗原结合蛋白。或者，组合物可包含5mg-500mg、例如5mg-50mg的抗原结合蛋白。
用于制备所述药物组合物的方法为本领域技术人员所熟知。药物组合物可包含呈单位剂型的1mg-10g抗原结合蛋白，任选连同使用说明。可将药物组合物冻干(冷冻干燥)用于在按照本领域技术人员所熟知或明了的方法给予前复溶。当抗体具有IgG1同种型时，可将铜螯合剂例如柠檬酸(例如柠檬酸钠)或EDTA或组氨酸加入到药物组合物中，以降低铜介导的该同种型抗体降解的程度，参见EP0612251。药物组合物亦可包含：溶解剂，例如精氨酸碱；去污剂/抗凝集剂，例如聚山梨醇酯80；和惰性气体，例如取代小瓶顶部空间氧气的氮气。
用于给予抗原结合蛋白的有效剂量和治疗方案通常由经验确定，可视诸如患者年龄、体重及健康状态和待治疗的疾病或病症等因素而定。所述因素在主治医生的知识范围内。可在例如Smith等(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy，Raven PresS、New York中找到选择合适剂量的指南。因此本发明抗原结合蛋白以以治疗有效量给予。
给予受试者的抗原结合蛋白的剂量通常为1μg/kg-150mg/kg、0.1mg/kg-100mg/kg、0.5mg/kg-50mg/kg、1-25mg/kg或1-10mg/kg受试者体重。例如，剂量可为10mg/kg、30mg/kg或60mg/kg。抗原结合蛋白可胃肠外给予，例如皮下、静脉内或肌肉内给予。
若需要，可以以以下方式来给予治疗组合物的有效日剂量：以合适的间隔任选单位剂型分开2次、3次、4次、5次、6次或更多次亚剂量给予。例如，剂量可在每一给药日以多个亚剂量形式经皮下每14或28天给予一次。
可通过静脉内输注通常经15分钟-24小时例如2-12小时或2-6小时来给予剂量。这可导致降低毒性副作用。
若需要可重复一次或多次给予剂量，例如，每天3次，每天2次，每2天1次，每周1次，每14天1次，每月1次，每3个月1次，每6个月1次或每12个月1次。可通过维持疗法来给予抗原结合蛋白，例如在6个月或更长时间每周1次。可通过间歇疗法来给予抗原结合蛋白，例如3-6个月给药，然后3-6个月不给药，接着再次3-6个月给予抗原结合蛋白，如此循环。
可通过在给药后用靶向抗-肌生成抑制素抗原结合蛋白的抗-独特型抗体，测量生物学样品中的循环抗-肌生成抑制素抗原结合蛋白的量，来确定或调整剂量。可使用确定或调整剂量的其它手段，所述手段包括但不限于药理学生物学标记(“生物标记”)、肌肉质量和/或功能度量、安全性、耐受性和治疗响应。可以以有效下调受试者肌生成抑制素活性的量及持续时间来给予抗原结合蛋白。
可以以靶向特定位点治疗的方式来给予受试者抗原结合蛋白。例如，可将抗原结合蛋白局部注射到肌肉中，例如骨骼肌中。
抗原结合蛋白可与一种或多种其它治疗活性剂联合用于治疗本文所述疾病，例如：米氮平(Mortazapine)(瑞美隆(Remeron)、米尔塔扎平(Zispin)：Organon)、乙酸甲地孕酮(美可治(Megace)：BMS)、屈大麻酚(Dronabinol)(屈大麻酚(Marinol)：Solvay Pharmaceutical Inc.)、氧雄龙(Oxandrolone)(氧雄龙(Oxandrin)：Savient)、睾丸激素、重组生长激素(例如促生长激素(Serostim：Serono)、Nutropin(Genentech)、优猛茁(Humatrope)(Lilly)、健豪宁(Genotropin)(Pfizer)、健高宁(Norditropin)(Novo)、思增(Saizen)(Merck Serono)和Omnitrope(Sandoz))、赛赛庚啶(Cyproheptadine)(盐酸赛庚啶(Periactin)：Merck)、氧代戊二酸瓜氨酸(ornithine oxoglutarate)(Cetornan)、哌甲酯(利他宁(Ritalin)：Novartis)和莫达非尼(Modafinil)(莫达非尼(Provigil)：Cephalon)、奥利斯特(orlistat)(alii：GSK)、西布曲明(sibutramine)(诺美婷(Meridia)、诺美亭(Reductil))、利莫那班(rimonabant)(Acomplia、苗丝丽(Monaslim)、Slimona)。所述组合可用于治疗其中肌生成抑制素是造成疾病的原因之一或其中中和肌生成抑制素活性将有益的疾病。
当将抗原结合蛋白用于与其它治疗活性剂组合时，可一起或单独、序贯或同时、在分开的或组合的药物制剂中以任何合适途径给予各个组分。若单独或序贯给予，可以以任何次序给予抗原结合蛋白和一种或多种治疗活性剂。
上面谈及的组合可以以单药物制剂形式呈提使用，所述单药物制剂包含如上所定义的组合任选连同药用载体或赋形剂。
当在同一制剂中组合时，应该了解各组分应该稳定并彼此及与制剂的其它组分相容，并可调配用于给予。当分开调配时，可将它们提供在任何方便的制剂中，例如以已知用于本领域抗原结合蛋白的方式。
当与对同一疾病有活性的第二治疗剂组合时，每一组分的剂量可不同于单独使用抗原结合蛋白时的剂量。合适的剂量易于由本领域技术人员来估量。
抗原结合蛋白和一种或多种治疗活性剂可协同起作用。换言之，联合给予抗原结合蛋白和一种或多种治疗活性可对本文所述疾病、病症或病况具有比每一种单独使用的作用总和更大的作用。
药物组合物可包含抗原结合蛋白连同其它药物部分的试剂盒，任选含使用说明。为了方便，试剂盒可包括预定量的试剂及使用说明。
本文所用术语″个体″、″受试者″和″患者″可互换使用。受试者通常为人。受试者亦可为哺乳动物，例如小鼠、大鼠或灵长类(例如绒或猴)。受试者可为非人动物。抗原结合蛋白亦可具有兽医用途。待治疗的受试者可为农场动物，例如母牛或公牛、绵羊、猪、阉牛、山羊或马，或可为家养动物，例如狗或猫。动物可为任何年龄或成熟成年动物。当受试者为实验室动物例如小鼠、大鼠或灵长类时，可治疗动物以诱导与肌肉萎缩、肌病或肌肉损失有关的疾病或病况。
治疗可为治疗性的和预防性或防止性的。受试者可为需要治疗或预防的对象。在需要治疗的受试者中可包括已经罹患特定医学疾病的个体，还有在未来可能发展疾病的个体。
因此，可将本文所述抗原结合蛋白用于预防性或防止性治疗。在该情况下，将本文所述抗原结合蛋白给予个体以便预防或推迟疾病的一个或多个方面或症状的发作。受试者可无症状。受试者可具有所述疾病的遗传倾向。将预防有效量的抗原结合蛋白给予所述个体。预防有效量为预防或推迟本文所述疾病的一个或多个方面或症状发作的量。
本文所述抗原结合蛋白亦可用于治疗方法中。术语″治疗″包含减轻、降低或防止疾病的至少一个方面或症状。例如，可将本文所述抗原结合蛋白用于减轻或降低本文所述疾病的一个或多个方面或症状。
本文所述抗原结合蛋白以用于治疗性、预防性或防止性治疗的有效量来使用。治疗有效量的本文所述抗原结合蛋白为有效减轻或降低疾病的一个或多个方面或症状的量。本文所述抗原结合蛋白亦可用于治疗、预防或治愈本文所述疾病。
本文所述抗原结合蛋白可对受试者的健康具有通常有益的作用，例如，其可提高受试者的预期寿命。
本文所述抗原结合蛋白不必对疾病具有完全治愈或根除每一种症状或表现的作用，就可构成切实可行的治疗性治疗。如有关领域所认识，用作治疗剂的药物可降低特定疾病状态的严重程度，但不必消除疾病的每一种表现，就可被认作为有用治疗剂。同样地，预防性给予治疗不必完全有效预防疾病的发作，就能构成切实可行的预防性作用剂。只要降低疾病的发作(例如，通过降低其症状的数量或严重程度，或通过增加另一治疗的有效性，或通过产生另一有益作用)，或降低受试者疾病发生(例如通过推迟疾病发作)或恶化的可能性，就够了。
病症、疾病或病况包括：少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MS)、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣病、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉萎缩、肌炎和脊柱侧凸。
年龄相关的的肌肉萎缩(亦称为肌病)或少肌症，是随年龄而发生的肌肉质量和肌肉力量的进行性损失。认为该病况为降低肌肉合成及修复另外还有增加肌肉分解的结果。在年龄相关的的肌肉萎缩中，肌纤维束可收缩，因为失去了个别纤维。此外，由于所述受试者中的废用性肌肉萎缩，肌纤维亦变小了。治疗可逆转这种肌肉萎缩。因此，可将本文所述抗原结合蛋白用于治疗少肌症。
年龄相关的肌肉萎缩在中年开始，在剩下的生命中逐渐加快。对该病况最常用的定义是四肢骨骼质量/高度(kg/m)在年轻成年人的平均值之下小于两个标准偏差。该病症可导致降低移动、功能障碍和独立性丧失。
废用性肌肉萎缩可与多种不同的病况、疾病或病症有关，例如固定术、手术后外科手术、透析、病危护理(例如烧伤、ICU)、肌肉或骨的创伤或损伤。失用性萎缩可因多种导致长期肌肉废用的原因或事件而发生。肌肉萎缩包括减少肌纤维的大小和/或数量和/或功能。
恶病质是与个体的体重减轻、肌肉质量、肌肉萎缩、疲惫、虚弱和食欲不振但未活跃到使体重减轻中任何一种或组合有关的病况。恶病质可与各种其它病症有关，包括上述疾病中的任一种。例如，恶病质可与癌症、感染(例如通过HIV或AIDS)、肾衰竭、自身免疫病和药物成瘾或酒精成瘾有关。此外，例如在业已经历心肌梗塞患者或充血性心力衰竭患者中，心源性恶病质可用本文所述抗原结合蛋白治疗。因此，癌症恶病质患者可通过本文所述抗原结合蛋白来治疗。
慢性阻塞性肺病(COPD)患者可表现出温和的、中度的或严重的疾病症状。COPD包括肺气肿和支气管炎患者。肺气肿患者通常极为瘦削或虚弱，通常认为其疾病不可挽回。因此，既然改善患者的基础肺功能更困难，可将本文所述抗原结合蛋白用于治疗肺气肿患者。支气管炎患者通常更强壮，尽管他们亦可缺乏肌肉，但认为其疾病具有某种程度的可逆转性。因此，可将本文所述抗原结合蛋白用于治疗支气管炎患者，任选与治疗患者的基础肺功能联合。用本文所述抗原结合蛋白治疗可具有改进参与肺气肿或支气管炎患者的呼吸的肌肉功能的直接作用。
癌症患者通常表现出肌肉萎缩，这可导致住院治疗、感染、脱水、髋部骨折及最终死亡。例如，肌肉质量丢失10％可与癌症患者显著的预后不良有关。用本文所述抗原结合蛋白治疗可改进癌症患者的体力状态，例如以使得可进行全化疗或更积极使用化疗，并改进患者的生活品质。因此，可将本文所述抗原结合蛋白用于治疗癌症恶病质。
癌症包括例如前列腺、胰腺癌、肺癌、头颈癌、结直肠癌和淋巴瘤。例如在前列腺癌症中，受试者可具有转移性前列腺癌和/或可经受雄性激素剥夺疗法(ADT)。癌症受试者可有局部晚期癌症或转移性癌症，例如早期转移性癌。因此，可通过本发明抗原结合蛋白来治疗前列腺癌后经历ADT的患者。
可用本文所述抗原结合蛋白治疗慢性肾衰竭(CRF)或末期肾病(ESRD)患者。例如，透析前的患者可接受治疗以推迟透析的开始。或者，可用本文所述抗原结合蛋白治疗业已透析1年或更长、2年或更长或3年或更长的患者。本文所述抗原结合蛋白的应用可在短期或长期经由长期使用抗原结合蛋白来预防或治疗肌肉萎缩。
对肌肉、骨或神经的创伤或损伤实例包括髋部骨折和急性膝损伤。髋部骨折患者通常在骨折前具有肌肉萎缩，肌肉萎缩在很多患者中是髋部骨折的主要促成因素。在髋部骨折后，因不用而丢失肌肉和力量，通常髋部骨折患者不能恢复到骨折前的移动或功能水平。此外，很多髋部骨折患者亦罹患诸如COPD、ESRD和癌症等病况，这可造成显著肌肉萎缩，并倾向于使其髋部骨折。因此，若患者处于髋部骨折风险中，则可用本文所述抗原结合蛋白来治疗。与髋部骨折患者有关的治疗紧迫性巨大，因为这些患者必须马上手术。因此，用本文所述抗原结合蛋白进行的手术后治疗，可通过减少肌肉质量和力量损失和/或改进肌肉质量和恢复，来帮助髋部骨折患者恢复。可通过本发明抗原结合蛋白来治疗处于髋部骨折风险中的受试者或髋部骨折受试者。
本文所述抗原结合蛋白可帮助治疗选择性外科手术患者在手术前的患者中构建肌肉。
肌营养不良症指引起进行性肌肉虚弱的基因遗传性的肌肉疾病组。肌营养不良症特征为进行性骨骼肌无力、缺乏肌肉蛋白和肌肉细胞及组织死亡。肌营养不良症实例包括Duchenne型肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症、肢节型肌营养不良症(LGMD)、先天性肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症(FSHD)、强直性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和Emery-Dreifuss肌营养不良症。例如，本文所述抗原结合蛋白可用于治疗Duchenne型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症或肢节型肌营养不良症。通过本文所述抗原结合蛋白亦可治疗弥散性肌营养不良症而不是局部营养不良。具体而言，本文所述抗原结合蛋白可治疗强直性肌营养不良，因为在该疾病中有更多的肌营养不良/机能失调和骨骼/骨的作用和心脏问题。
肥胖症是其中累积过量体脂肪到健康可受到负面影响的程度的病况。其通常定义为体重指数(BMI＝体重除以身高的平方)为30kg/m2或更高。这可将肥胖症与定义为BMI为25-29.9kg/m2的超重区别开。肥胖症可与多种疾病相关，包括心血管疾病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、癌症和骨关节炎。因此，业已发现肥胖症降低预期寿命。对肥胖症的典型治疗包括节食、体育运动和手术。可通过提高肌肉质量因此可提高基础代谢率的本文所述抗原结合蛋白来治疗肥胖症。例如，可由所述治疗产生改进的血清化学和胰岛素敏感性。
肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能的降低的典型方面或症状，包括全身无力、疲惫、体力活动降低、易跌倒、功能残疾、自主性丧失、因减少移动而引起的抑郁、食欲不振、营养不良和异常重量减轻中的任一种或任何组合。
该疾病可与高水平的肌生成抑制素有关。可将本文所述抗原结合蛋白用于调节肌生成抑制素水平和/或肌生成抑制素活性。
可将多种终点用于显示肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能的变化。所述终点包括：简易体能状况量表、蹬腿练习、直接生活品质概览、日常生活活动(ADL)、功能独立性评定(FIM)、功能测试和评分(例如步行测试、爬台阶、踏车测力计)、力量测试及评分(例如手握力试验、手法肌力测试评分)、生物阻抗分析、肌动电流图、测力计、双能量X射线吸收法、计算机断层扫描试验、磁共振成像、肌活组织检查、肌肉组织学、血液/生化试验、人体测量学、皮肤厚度测量、体重指数评估和体重监护。可用双侧肢体肌肉、颈部肌肉或腹部肌肉来评估肌肉力量。
简易体能状况量表(SPPB)是下肢功能的多组成测量，其通过测量站立平衡、步行速度和从椅子中站起的能力来评估，以0-4级评估。步行试验是对下肢功能的评估，其测定患者步行某个距离所花的时间长度。蹬腿练习用砝码测量腿的力量并评估力气。本领域用多种评分及系统来定量评估患者的生活质量。双能量X射线吸收法(DEXA)是对估测的骨骼肌质量的量度。
亦可将动物中的多种测定用于显示肌肉质量和肌肉力量和肌肉功能的变化。例如，握力试验测量动物在拉抓力计时的力量。斜面法试验测量动物悬空自己的能力。游泳试验通过有代表性的活动来测量功能性能力，例如游泳，与在人中的步行试验相似。后肢运用力量试验(Hindlimb Exertion Force Test，HEFT)测量在施用尾巴刺激后施加的最大力量。动物中的其它身体活动能力试验包括步行速度和转轮跑。这些试验/模型可单独使用或以任何组合使用。
可将高脂饮食(HFD)诱导的胰岛素抗性小鼠模型用作肥胖症的模型。
糖皮质激素常用于治疗大量的慢性炎性疾病，例如系统性红斑狼疮、肉状瘤病、风湿性关节炎和支气管哮喘。然而，给予高剂量糖皮质激素引起人和动物的肌肉萎缩。同样地，皮质醇增多症在库欣氏病肌肉萎缩中起重要作用。地塞米松(Dexamethasone)(dex)-诱导的肌肉萎缩与剂量依赖性的肌肉的肌生成抑制素mRNA和蛋白质表达的显著诱导有关(Ma K等，2003Am J Physiol Endocrinol Metab285：E363-E371)。在几种肌肉萎缩(例如固定不动和烧伤伤害)模型中，亦报道了增加肌生成抑制素的表达，其中糖皮质激素起重要作用(Lalani R等，2000 J Endocrinol 167：417-428；Kawada S等，2001 JMuscle Res Cell Motil 22：627-633；和Lang CH等，2001FASEB J15：NIL323-NIL338)。因此，可将糖皮质激素-诱导的肌肉萎缩小鼠模型用于研究本发明的抗原结合蛋白。
人废用性肌肉萎缩常与以下整形手术病症联合发生：例如关节的慢性骨关节炎，或用于治疗骨折的石膏固定以及因其它医学或手术理由的长期卧床情况。废用性肌肉萎缩引起肌肉力量减弱和残疾。身体康复仍然是唯一的治疗选项，其通常需要长期时间，并不总是让肌肉恢复到正常大小或力量。因此，可将用坐骨神经夹伤诱导肌肉萎缩的小鼠模型用于研究本发明抗原结合蛋白。
大量的癌症患者因脂肪组织进行性萎缩和肌肉萎缩而遭受重量减轻。估计约20％癌症死亡由肌肉损失引起。在很多疾病状况中肌肉萎缩通常是必然死亡的合适的预测。来自对AIDS、饥饿和癌症的研究数据表明，损失个体病前的30-40％以上的精肉体重是致命性的(DeWye WD..In Clinics in Oncology.Caiman KC和fearon KCH编辑.London：Saunders，1986，第5卷，第2期，第251-261页；Kotter DP等，1990 J Parent Enteral Nutr 14：454-358；和Wigmore SJ等，1997 BrJ Cancer 75：106-109)。因此，通过抑制参与肌肉萎缩的信号转导途径可能减轻肌肉萎缩非常吸引人。因此，可将荷有C-26肿瘤的小鼠模型用于研究本发明抗原结合蛋白。
在临床上，割腱术指因肌腱单元的先天和/或后天畸形而导致的手术横切肌腱，但亦可在创伤或退化性肌骨骼疾病期间发生腱连续性的损失。割腱术导致马上失去静息张力、肌节缩短和随后降低肌肉质量和力量产生能力(Jamali等2000 Muscle Nerve 23：851-862)。因此，可将诱导骨骼肌萎缩的小鼠割腱术模型用于研究本发明抗原结合蛋白。
可将所述抗原结合蛋白用于急性、慢性和/或预防性治疗。急性治疗可快速构建力量，并将患者带回适宜的功能性能力水平，然后可通过锻炼或慢性治疗来保持所述水平。可将慢性治疗用于随时间保持或缓慢构建肌肉力量。可将预防性治疗用于预防通常在所述患者群中随时间发生的肌肉质量和力量的降低。定义治疗成功并不总是需要改进肌肉功能，因为在较不严重的肌肉萎缩中的早期介入仅需要保持肌肉功能。
所述抗原结合蛋白亦可具有用于增加肌肉力量、质量和功能的美容用途。所述抗原结合蛋白亦可在太空飞行及训练宇航员期间具有用途。
所述抗原结合蛋白可对肌肉例如骨骼肌具有直接生物学作用。或者，所述抗原结合蛋白可对肌肉例如骨骼肌具有间接生物学作用。
例如，抗原结合蛋白可对以下一种或多种有作用：肌肉组织学、肌肉质量、肌纤维数量、肌纤维大小、肌肉再生和肌肉纤维变性。例如，可增加肌肉质量。具体而言，可增加受试者的瘦肉质量。可增加以下肌肉中的任一种或组合的质量：四头肌、三头肌、比目鱼肌、胫骨前肌(TA)和趾长伸肌(EDL)。所述抗原结合蛋白可增加肌纤维数量和/或肌纤维大小。所述抗原结合蛋白可提高肌肉再生和/或降低肌肉纤维变性。所述抗原结合蛋白可增加成肌细胞的增殖率和/或激活肌分化。例如，抗原结合蛋白可增加肌肉前体细胞的增殖和/或分化。
所述抗原结合蛋白可对卫星细胞具有以下作用之一或组合：激活、增加增殖和促进自身更新。所述抗原结合蛋白可调节肌生成抑制素水平。所述抗原结合蛋白可增加受试者体重。所述抗原结合蛋白可增加肌肉收缩性和/或改进肌肉功能。抗原结合蛋白可增加骨密度。
本文所述抗原结合蛋白可调节参与肌肉生长、功能和收缩性的蛋白质的合成和/或分解。例如，可通过使用本文所述抗原结合蛋白，上调肌肉相关蛋白的蛋白质合成，例如肌凝蛋白、抗肌萎缩蛋白、肌细胞生成素。例如，可通过使用本文所述抗原结合蛋，下调肌肉相关蛋白的蛋白质分解，例如肌凝蛋白、抗肌萎缩蛋白、肌细胞生成素。
诊断方法应用
可将本文所述抗原结合蛋白用于为诊断目的在体外或体内检测生物学样品中的肌生成抑制素。例如，可将抗-肌生成抑制素抗原结合蛋白用于在培养的细胞、在组织或在血清中检测肌生成抑制素。可首先从人或动物身体取走组织(例如活检)。可采用包括ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学或免疫沉淀在内的常规免疫测定。
通过肌生成抑制素的存在或水平与疾病的相关性，技术人员可诊断相关疾病。此外，检测到受试者中肌生成抑制素水平增加，可表明患者群将对用本文所述抗原结合蛋白的治疗有响应。检测到降低肌生成抑制素水平，可表明用本文所述抗原结合蛋白治疗的受试者有肌肉力量、质量和功能增加的生物学效应。
可将抗原结合蛋白提供在诊断试剂盒中，所述试剂盒包括一种或多种抗原结合蛋白、可检测标记和试剂盒的使用说明。为了方便，试剂盒可包括预定量的试剂和使用说明。
基因疗法
可将编码本文所述抗原结合蛋白的核酸分子给予需要治疗的受试者。核酸分子可表达合适支架或结构域、可变结构域或全长抗体中的CDR。核酸分子可包含在允许在人或动物细胞中表达的载体中。可用上述药用赋形剂和/或一种或多种治疗活性剂来调配核酸分子或载体。
实施例
1.重组蛋白的产生
1.1成熟二聚体化肌生成抑制素的纯化
在CHO分泌系统中表达HexaHisGB1Tev/(D76A)小鼠肌生成抑制素多蛋白序列(SEQ ID NO：101)。GB1标签(SEQ ID NO：102)阐述于WO2006/127682中，发现与用Fc标签的构建体比较，其能使肌生成抑制素以较高水平表达，并能使肌生成抑制素合适折叠。可将小鼠多蛋白序列(SEQ ID NO：103)用于产生成熟的肌生成抑制素序列(SEQID NO：104)，因为人和小鼠成熟肌生成抑制素序列具有100％同一性。为了减少肌生成抑制素任何可能的降解，用″DVQRADSSD″区域中的D76A突变来对小鼠多蛋白序列进行工程改造。
用在pH8.0含0.5M NaCl的50Tris-HCl缓冲液中的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，从CHO培养基中捕获表达的HexaHisGB1Tev/(D76A)小鼠肌生成抑制素多蛋白(减去信号序列)。Ni洗脱液被缓冲交换为弗林蛋白酶裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，0.1M NaCl，0.1％TritonX-100，1mM CaCl2)，接着由弗林蛋白酶(内部表达，弗林蛋白酶序列示于SEQ ID NO：105中)以1∶25V/V的弗林蛋白酶/蛋白质比率，室温过夜裂解。弗林蛋白酶在前肽和成熟肌生成抑制素(″TPKRSRR″和″DFGLDCD″之间)之间裂解多蛋白，产生前肽和成熟肌生成抑制素。
将弗林蛋白酶裂解反应的全部混合物置于6M Gdn-HCl中，以使聚集物离散。用C8 RP-HPLC(Vydac 208TP，GracE、Deerfield，IL，USA)在60℃以15-60％缓冲液B梯度(C8 RP-HPLC缓冲液A：H2O中的0.1％TFA；缓冲液B：100％乙腈中的0.1％TFA)于40分钟内，从混合物分离成熟肌生成抑制素。合并峰前含有成熟肌生成抑制素的流份，用于随后的体外测定。图1显示成熟肌生成抑制素的LC/MS分析，图2显示还原性和非还原性肌生成抑制素样品的NuPAGE凝胶。
1.2重组肌生成抑制素的体外生物学活性
用肌生成抑制素响应报告基因测定(Thies等.，(2001)GrowthFactors 18(4)251-259)，来评估横纹肌肉瘤细胞(A204)中肌生成抑制素的体外活性。A204细胞(LGC Promochem HTB-82)在DMEM高葡萄糖无酚红(Invitrogen)、5％活性炭处理FCS(Hyclone)和IX Glutamax(Invitrogen)中培养。然后胰蛋白酶处理细胞，产生悬浮液，并用含有荧光素酶基因的pLG3质粒，在PAI-I启动子12x CAGA盒调控下，用Gemini转染试剂(内部试剂，在专利WO2006/053782中阐述)转染。将细胞以每孔40,000个细胞铺在96孔Fluoronunc板(VWR)上，使其沉静并过夜生长。第二天，将具有SEQ ID NO：104中所示序列的重组成熟肌生成抑制素(R&D SYSTEMS肌生成抑制素(788-G8-010/CF)或内部肌生成抑制素(如上1.1所述))通过系列稀释加入到每孔培养基中，让细胞再孵育6小时，然后加入SteadyLite(Perkin Elmer LAS)，在室温孵育20分钟，在SpectraMax M5读数器(Molecular Devices)上读数。显示肌生成抑制素激活细胞信号转导导致荧光素酶表达的剂量响应曲线示于图3A中。可清楚地看到，R&D SYSTEMS的和内部的两种成熟二聚体肌生成抑制素种类都激活A204细胞，以剂量依赖方式产生荧光素酶信号。纯化的内部肌生成抑制素相对于R&DSYSTEMS的肌生成抑制素，在测定中显示特别低的背景，并改进动态范围。
在备选方法中，在McCoys培养基(Invitrogen)和10％热灭活的FBS(Invitrogen)中培养A204细胞(LGC Promochem HTB-82)。然后以1∶1的维尔烯(Invitrogen)和TrypLE(Invitrogen)混合物使细胞脱壁(detach)，重悬于DMEM高葡萄糖无酚红、5％活性炭处理的血清(Hyclone)和2mM glutamax(Invitrogen)(测定培养基)中。通过让18.2μg的含有荧光素酶基因的pLG3质粒，在PAI-I启动子的12x CAGA盒调控下与182μl的1mM Gemini转染试剂(内部试剂，在专利WO2006/053782中阐述)悬浮混合，来转染14x106个细胞。将细胞转移到T 175培养瓶中，并孵育过夜。第二天，通过系列稀释或在系列稀释的测试抗体存在下以恒定浓度，将终体积为20μl的重组肌生成抑制素(R&D SYSTEMS的肌生成抑制素(788-G8-010/CF)或内部肌生成抑制素(如上1.1所述))，加到96孔黑色FluoroNUNC测定板(VWR)中。让肌生成抑制素抗体混合物预孵育30分钟。用维尔烯：TrypLE从培养瓶中使转染细胞脱壁，以2.2x105个细胞/ml重悬于测定培养基中，以180μl/孔分配到测定板中。让板再孵育6小时，然后加入50μl的SteadyLite试剂(Perkin Elmer LAS)，在室温孵育20分钟，并在SpectraMax M5读数器(Molecular Devices)中读数。显示成熟二聚肌生成抑制素激活细胞信号转导导致荧光素酶表达的剂量响应曲线示于图3B中。内部制备的肌生成抑制素种类激活A204细胞，以剂量依赖方式并在不同测试机会可重复地产生荧光素酶信号，其通过不同天获得的数据来表示。
2.单克隆抗体的产生及小鼠单克隆抗体10B3的表征
2.1单克隆抗体
通过每次用成熟肌生成抑制素(如上实施例1.1所述制备)腹膜内注射来免疫SJL/J小鼠(Jackson Laboratories)。免疫前让肌生成抑制素与小球隐孢子虫(C.parvum)缀合，用该缀合物(2.5μg肌生成抑制素与10μg小球隐孢子虫缀合)和另外的7.5μg可溶性肌生成抑制素免疫小鼠。取出来自小鼠的脾细胞，让B淋巴细胞与源自P3X63BCL2-13细胞(内部产生，参见Kilpatrick等，1997Hybridoma 16(4)，第381-389页)的小鼠骨髓瘤细胞在PEG1500(Boehringer)存在下融合，产生杂交瘤。通过有限稀释来克隆单个杂交瘤细胞系(用E Harlow和D Lane所述方法)。在显微镜下确定含有单个克隆的孔，上清液用于活性测定。
最初，用FMAT夹心测定形式针对重组肌生成抑制素的结合活性筛选杂交瘤上清液。用BIAcoreTM方法完成对这些阳性克隆的第二次筛选，来检测与重组肌生成抑制素(R&D SYSTEMS，788-G8-010/CF)和内部表达的肌生成抑制素(参见以上1.1)的结合情况。
通过有限稀释来亚克隆从肌生成抑制素结合测定确定的阳性克隆，以产生稳定的单克隆细胞系。用固定蛋白A柱纯化来自这些在无血清条件下的细胞工厂中产生的杂交瘤的免疫球蛋白。然后通过ELISA和BIAcoreTM针对与肌生成抑制素的结合再筛选这些纯化的单克隆抗体。
确定单克隆抗体10B3为与重组肌生成抑制素结合的有效抗体。
2.2单克隆抗体10B3的序列测定和10B3嵌合体的克隆
从10B3杂交瘤细胞提取总RNA，通过逆转录用针对前导序列和符合预定同种型(IgG2a/κ)的抗体恒定区的引物产生重链和轻链可变结构域的cDNA。然后将可变重链和轻链结构域cDNA克隆到质粒中用于序列测定。10B3VH区氨基酸序列示于SEQ ID NO：7中。10B3VL区氨基酸序列示于SEQ ID NO：8中。10B3的Kabat CDR序列示于表3和表4中。
表3：重链CDR序列
Figure BPA00001423782500661
表4：轻链CDR序列
Figure BPA00001423782500662
通过从10B3鼠单克隆抗体取可变区(VH：SEQ ID NO：7；VL：SEQID NO：8)，并将其移植到人IgG1/k野生型恒定区，来构建嵌合抗体。在这些构建体的构建中使用信号序列(如SEQ ID NO：9所示)。
简言之，通过PCR扩增克隆的鼠可变区，以引入克隆到哺乳动物表达载体(R1d_Ef1和R1n_Ef1)所需的限制性位点。将Hind III和Spe I位点设计为框入VH结构域，并使其能克隆到含有人γ1野生型恒定区的载体(Rld_Ef1)中。将Hind III和BsiW I位点设计为框入VL结构域并使其能克隆到含有人κ恒定区的载体(R1n_Efl)中。鉴别了含正确VH(SEQ ID NO：25)和VL(SEQ ID NO：8)序列的克隆，将制备的质粒(用标准分子生物学技术)用于在CHOK1细胞上清液中表达。用固定蛋白A柱从细胞上清液纯化抗体，通过读取280nm处的吸光度来定量测定。
将得到的嵌合抗体命名为10B3嵌合体(10B3C或HCLC)。10B3嵌合抗体具有SEQ ID NO：26所示的重链氨基酸序列。10B3嵌合抗体具有SEQ ID NO：27所示的轻链氨基酸序列。
2.3与重组肌生成抑制素的结合
10B3和10B3嵌合体(10B3C)在夹心ELISA中结合了肌生成抑制素(R&D SYSTEMS，788-G8-010/CF)。用肌生成抑制素以10ng/孔包被板，并用封闭液(PBS，0.1％TWEEN和1％BSA)封闭。洗涤(PBS，0.1％TWEEN)后，让抗体稀释系列液中在37℃孵育2小时，再次洗涤板，然后在37℃与抗-小鼠HRP或抗-人HRP(分别为Dako，P0161 & Sigma，A-8400)孵育1小时。再次洗涤板，加入OPD底物(Sigma，P9187)，直到发生色度反应(colourometric reaction)，通过加入H2SO4来终止反应。在490nm吸光度下读板，并测定EC50(参见表5)。
表5.亲本10B3和嵌合10B3抗体的EC50
  抗体   平均EC50(ng/ml)   95％置信水平(ng/ml)
  10B3   69   46-102
  10B3嵌合体   49   33-73
通过BIAcoreTM(表面等离子体共振)分析来评估10B3小鼠亲本和10B3C对重组肌生成抑制素的亲和力。通过使用捕获表面来实施分析：通过伯胺偶联10B3小鼠亲本让抗-小鼠IgG与C1芯片偶联；和通过伯胺偶联10B3嵌合体在C1芯片上制造蛋白A表面。
捕获后，让重组肌生成抑制素以64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nM和0.0625nM及用于双参考的缓冲注射液(即0nM)流经表面。在每次注射被分析物之间有再生步骤，之后在下次注射肌生成抑制素之前发生新抗体捕获事件。用T100设备分析软件内有的1∶1模型和二价模型二种模型分析数据(参见表6)。两种捕获表面都可用100mM磷酸再生，用HBS-EP作为流动缓冲液并用25℃作为分析温度运行。
表6.亲本10B3和嵌合10B3结合肌生成抑制素的T100数据
Figure BPA00001423782500671
为了进一步分析10B3的结合能力，进行了基于ELISA的测定，以确定结合是针对纯粹的成熟肌生成抑制素，还是与其它肌生成抑制素抗原也能发生结合，所述其它肌生成抑制素抗原包括潜在复合物和释放自肌生成抑制素前肽的Arg 75和Asp 76之间BMP-1裂解后的潜在复合物的成熟肌生成抑制素(Wolfman等(2003)PNAS 100：第15842-15846页)。
用HexaHisGB1Tev/人肌生成抑制素前肽序列(SEQ ID NO：106)进行人肌生成抑制素前肽的纯化。该序列在CHO分泌系统中表达，通过Ni-NTA(GE Healthcare，NJ)从CHO培养基捕获表达的蛋白质。通过Tev蛋白酶(内部表达，序列示于SEQ ID NO：107中)来裂解HexaHisGB1标签。Tev蛋白酶在标签和SEQ ID NO：106前肽(在″ENLYFQ″和″ENSEQK″之间)之间裂解，产生SEQ ID NO：108序列。
在6M盐酸胍存在下将裂解的标签和未裂解的hexaHisGB1Tev/人肌生成抑制素多蛋白捕获到Ni-NTA上，而裂解标签的人肌生成抑制素多蛋白在未结合的液流中。将该液流在1xPBS缓冲液中上样到Superdex 200柱(GE Healthcare，NJ)中并聚集，在柱上分离二聚体和单体形式。将人肌生成抑制素前肽(SEQ ID NO：108)二聚体形式用于潜在复合物形成。
通过让纯化的人肌生成抑制素前肽(SEQ ID NO：108)和成熟肌生成抑制素(SEQ ID NO：104)在6M盐酸胍中以3∶1(w/w)比率于室温混合2小时，接着4℃过夜透析到1xPBS中，并上样到1xPBS缓冲液的Superdex 200(GE Healthcare，NJ)中，来制备肌生成抑制素潜在复合物。合并含有肌生成抑制素前肽和成熟肌生成抑制素二者的峰馏分。通过LC/MS和SDS-PAGE(数据未显示)二者来确证潜在复合物。对于BMP-1消化，让150μl人肌生成抑制素潜在复合物(1.5mg/ml)与225μl的BMP-1(0.217mg/ml)、75μl的25mM HEPES(pH 7.5)和150μl的20mM CaCl2、4μM ZnCl2和0.04％Brij 35孵育。让反应物在30℃孵育过夜。用CHO分泌系统内部表达BMP-1蛋白(序列示于SEQ ID NO：111中)。
将肌生成抑制素抗原以100ng/孔在PBS中于4℃过夜包被到EIA/RIA板(Costar)的孔中，然后于室温封阻(PBS，3％BSA)30分钟。洗涤(PBS，1％BSA和0.1％Tween20)板，然后加入10B3的洗涤缓冲液稀释系列，室温孵育2小时。再次洗涤板，然后加入用洗涤缓冲液1∶10,000稀释的缀合过氧化物的Affinipure F(ab′)2片段驴抗-小鼠IgG(Jackson Laboratories，货号715-036-151)，室温孵育1小时。在加入TMB底物之前进行最后洗涤步骤，用硫酸终止色度变化，在450nm处读板。图4显示，10B3能够结合成熟二聚肌生成抑制素、潜在复合物(四聚体)和在BMP-1裂解后释放自潜在复合物的肌生成抑制素。亦发现10B3不与前肽二聚体结合(数据未显示)。
2.4肌生成抑制素上的10B3结合表位的简略作图
基于肌生成抑制素氨基酸序列合成了10个氨基酸重叠的(被4个氨基酸抵消了)生物素化的14聚体肽，以对10B3所识别的结合表位位置作图(由Mimotopes，Australia提供)。
在SRU BIND读数器(SRU Biosystems)上进行工作。洗涤链霉亲和素生物传感板，取基线读数，将生物素化肽捕获到链霉亲和素包被的生物传感器板。再次洗涤板，取新基线读数，然后加入抗体监测结合。
在表7中提供10个氨基酸重叠(被4个氨基酸抵消)的惯常设计的14聚体人工肽序列的详细资料。
表7：肌生成抑制素人工肽
14聚体肽结合数据分析显示，10B3不能结合肌生成抑制素内的任何线性表位。然而，对照抗-肌生成抑制素抗体显示结合肽设置内的表位(数据未显示)。
随后用Pepscan、在支架上化学连接免疫原性肽(CLIPS)技术分析肌生成抑制素的10B3C结合位点，提示肌生成抑制素的″PRGSAGPCCTPTKMS″氨基酸序列可为嵌合抗体的结合位点(数据未显示)。
2.5肌生成抑制素ActRIIb受体结合的中和
让重组可溶性ActRIIb(R&D SYSTEMS 339-RBB)以1μg/ml碳酸盐缓冲液于4℃过夜包被ELISA板孔。封闭(参见以上2.3的封闭液)板，并根据标准ELISA方案洗涤。同时进行2nM生物素化的肌生成抑制素(如1.1所述内部制备生物素化材料)与由10B3、10B3C和阴性对照(IgG1同种型对照)组成的抗体系列稀释液在37℃预孵育2小时。然后将生物素化肌生成抑制素：抗体反应物加到ActRIIb包被的板中37℃1小时。接着进行标准洗涤程序，然后加入1∶1000稀释的链霉亲和素-HRP缀合物(Dako P0397)，在37℃再孵育1小时。再次洗涤板，在OPD底物(Sigma)和酸终止溶液处理后，测定490nm处的吸光度。抑制肌生成抑制素活性的抑制曲线和IC50值分别如图5和表8所示。
表8.ActRIIb受体中和IC50
  抗体   平均EC50(ng/ml)   95％置信水平(ng/ml)
  10B3   132   99-176
  10B3嵌合体   138   97-196
受体中和测定是基于效价的可用于区分低于1nM IC50的分子的最敏感的方法。然而，它本身对能结合生物素化肌生成抑制素的准确浓度很敏感。因此，在不同场合业已用同样的方法测定10B3的其它IC50值，例如0.13nM、0.108nM、0.109nM或0.384nM(注意在表8中，132ng/ml＝0.88nM)。
2.6体外肌生成抑制素生物学活性的抑制
将以上1.2中所述的肌生成抑制素响应报告基因测定用于体外评估抗肌生成抑制素抗体对肌生成抑制素活性的作用。对该测定进行改良，以使肌生成抑制素以2.8nM浓度(等同于细胞激活测定中的ED70)在37℃与不同浓度的10B3或10B3C抗体(0.1-20nM)预孵育，然后将其加入到转染的A204细胞中。读取荧光素酶，由此产生图6中所示的抑制曲线。表9显示了3次重复测定和ANOVA分析后测定的抗体的IC50值。数据清楚地表明，剂量依赖性抑制A204肌肉细胞系的肌生成抑制素激活，而对照抗体显示不抑制肌生成抑制素活性。
表9.体外肌生成抑制素响应报告基因测定的IC50(A204细胞)
  抗体   平均EC50(ng/ml)  95％置信水平(ng/ml)
  10B3   10.0  6.5-15.5
  10B3嵌合体   6.2  3.9-9.9
2.7 10B3的体内功效
为了显示亲本10B3的功效，在8周龄雌性CB 17SCID小鼠中进行5周35天的研究。在第1、4、8、15、22和29天通过腹膜内注射3、10或30mg/kg 10B3，给予治疗组(每组10只动物)药物，同时对照组接受PBS或同种型对照抗体(IgG2a)。在完成研究后，分别通过称重动物和QMRI分析，来测定动物的总体重(A)和总瘦肉质量(B)(图7)。在挑选出动物(第35天)后，从动物解剖各种肌肉(腓肠肌(A)、四头肌(B)和趾长伸肌(EDL)(C))用于质量测定(图8)。为了测定对肌肉功能的影响，对EDL肌肉进行了离体收缩性试验(图9)，其中测定了肌肉的强直性张力(图9A)和每毫克肌肉质量的强直性张力(图9B)。
在30mg/kg剂量的治疗组中观察到对10B3有明显的剂量依赖响应，其代表了在35天研究后体重和瘦肉质量的最显著改进(分别为8％和8.5％)。对腓肠肌、四头肌和EDL的肌肉质量分析显示相同的倾向，它们都显示剂量依赖性增加质量，再次是在30mg/kg给药组中显示最显著。
研究同样(未阐述)显示，在早期时间点例如35天不能观察到抓力的显著提高。然而，离体收缩性试验证明，在EDL的强直性张力测量中可显示显著改进。此外，证明所述改进与肌肉质量无关。因此，10B3显示出改进已有的肌肉质量功能的能力。
3.10B3的人源化
3.1序列分析
在10B3可变区序列和其它鼠及人免疫球蛋白序列之间进行了比较。这用FASTA和BLAST程序并通过肉眼检查来进行。
鉴定了合适的10B3VH人受体构架(IGHV1_18和JH3人J区段序列)：SEQ ID NO：10。鉴定了合适的10B3VL人受体构架(IGKV1_16和JK2人J区段序列)：SEQ ID NO：11。在SEQ ID NO：10中，存在受体构架的CDRH1和CDRH2，CDRH3由XXXXXXXXXX代表。在SEQ ID NO：11中，存在受体构架的CDRL1和CDRL2，CDRL3由XXXXXXXXXX代表。(10个X残基是CDR位置的占位符，不是对每一个CDR中氨基酸序列数量的量度)。
在CDR移植中，为了获得满意的结合，通常需要将来自供体抗体的一个或多个构架残基包括在其受体构架的同源位置。确定以下10B3中的鼠构架残基在设计抗体的CDR移植(人源化的)形式中可能重要(位置按照Kabat等编号规则)：
Figure BPA00001423782500731
设计了3个具不同回复突变的人源化的VH构建体，以获得具满意活性的人源化的抗体。将这些编号为H0到H2。H0(SEQ ID NO：12)包括10B3 VH CDR到特定受体序列中的CDR移植组成，其用CDR的Kabat定义。H1(SEQ ID NO：13)与H0相同，但含在105位氨基酸为苏氨酸代替谷氨酰胺的回复突变。H2(SEQ ID NO：14)与H0相同，但含在28位氨基酸为丝氨酸取代苏氨酸的回复突变。
注意对于所有人源化的VH区(及相应的重链)，构架4的序列(WGQGTMVTVS S)都经过修饰，由此甲硫氨酸氨基酸残基(Kabat 108位)被取代为亮氨酸氨基酸残基。这因在编码人源化的VH区的DNA序列中包含Spe1克隆位点而产生。
设计了四种含不同回复突变的人源化的VL构建体，以获得具满意活性的人源化的抗体。将它们编号为L0到L3。L0(SEQ ID NO：15)包括10B3 VL CDR到特定受体序列中的CDR移植，其用CDR的Kabat定义。L1(SEQ ID NO：16)与L0相同，但具有16位氨基酸为精氨酸取代甘氨酸的回复突变。L2(SEQ ID NO：17)与L0相同，但具有71位氨基酸为酪氨酸取代苯基丙氨酸的回复突变。L3(SEQ ID NO：18)与L0相同，但具有100位氨基酸为丙氨酸取代谷氨酰胺的回复突变。
3.2 10B3的人源化
从头合成建立重叠寡核苷酸来制备人源化的VH和VL构建体，所述构建体包括克隆到R1d Ef1和R1n Ef1哺乳动物表达载体的限制性位点以及信号序列。将Hind III和Spe I限制性位点在框内引入到含有信号序列(SEQ ID NO：9)的VH结构域中，用于克隆到含有人IgG1野生型恒定区的R1d Ef1。将Hind III和BsiW I限制性位点引入含有信号序列(SEQ ID NO：9)的构架VL结构域，用于克隆到含有人κ恒定区的R1n Ef1。这大体上如WO 2004/014953所述。
4.人源化抗体的表达和表征
4.1抗体的制备
在R1d_Ef1和R1n_Ef1哺乳动物表达载体中制备人源化的VH构建体(H0、H1和H2)和人源化的VL构建体(L0、L1、L2和L3)。将质粒重链-轻链组合(H0L0、H0L1、H0L2、H0L3、H1L0、H1L1、H1L2、H1L3、H2L0、H2L1、H2L2、H2L3)瞬时共转染到CHOK1细胞中，并小规模表达以得到12种不同的人源化抗体。
将每一抗体的质粒在两个独立实验中一式二份转染到CHOK1细胞。另外，10B3嵌合体作为阳性对照表达。在肌生成抑制素结合ELISA中分析CHOK1细胞上清液中产生的抗体的活性(参见4.2)。仅一个实验的ELISA数据阐释于图10A图表中。所有12种人源化的mAb都显示在该ELISA中与重组肌生成抑制素结合。在这两个实验中，含有H2或L2链的mAb都倾向于具有较好的肌生成抑制素结合活性，其与在10B3嵌合体中观察到的相似。
图10B自图10A获得，显示含有H2和/或L2链的抗体和10B3嵌合体。
选择H0L0、H1L2和H2L2用于大规模表达、纯化和进一步分析。
纯化的H0L0、H1L2和H2L2通过直接ELISA结合了重组肌生成抑制素。该方法如4.2所述进行，ELISA数据阐明于图11的图表中。在两种CHOE1a和CHOK1细胞表达系统中产生H2L2和H0L0。自CHOK1制备物获得的抗体的低浓度使得准确定量很困难。自CHOE1a制备物获得高浓度的纯化的抗体。10B3嵌合抗体(该材料在CHOE1a中制备)作为阳性对照包括在ELISA中。H2L2对肌生成抑制素的结合活性等同于10B3嵌合体，强于在H0L0中所观察到的结合活性。
4.2肌生成抑制素结合ELISA
大体上按照本方案进行肌生成抑制素结合ELISA。在4℃用10ng/孔的重组肌生成抑制素过夜包被96-孔ELISA板。然后用洗涤缓冲液(PBS，0.1％Tween-20)将该板洗涤3次。在室温用封闭液(PBS，0.1％Tween-20+1％牛血清白蛋白[BSA])封闭各孔1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。然后将抗体滴定到合适的浓度范围(大约100-0.001μg/ml)，将其加到板中，于室温孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤板3次。用抗-小鼠IgG HRP-缀合的抗体(Dako的P0260，本试剂按照厂商说明使用)来检测小鼠抗体例如10B3的结合。用抗-人κ轻链HRP-缀合的抗体(Sigma Aldridge的A7164，本试剂按照厂商说明使用)来检测人源化或嵌合抗体例如10B3嵌合体或H0L0的结合。然后用洗涤缓冲液洗涤板3次，用OPD底物(来自Sigma，按照厂商说明使用)显色，并在板读数器上于490nm处读数。
4.3通过BIAcore TM 测定对重组肌生成抑制素的结合
通过BIAcoreTM测定结合纯化的H0L0、H1L2和H2L2的重组肌生成抑制素。以三种不同的密度(低、中和高，以分别获得大约35、120和350RU的R-max值)将重组肌生成抑制素固定到BIAcoreTM芯片上。抗体以256、64、16、4和1nM流过。0nM抗体用于双参考，数据拟合为1∶1模型。
有多个提醒说明(caveat)适用于从该测定产生的数据；将肌生成抑制素固定到芯片表面可引起蛋白质构象改变，或其可掩盖蛋白质上的抗体结合表位，并将导致不均一的表面(可能产生多个结合事件)。低密度固定肌生成抑制素应该产生1∶1的结合(占优势)，中密度及高密度固定肌生成抑制素很可能受到二价(亲合力)结合事件的影响。在该测定中为了测定准确的值必须有正确的抗体浓度。
因此，通常将用BIAcoreTM产生的数据用于为构建体排列等级，而不是提供确定的动力学。BIAcoreTM数据阐明于表10-12中。
表10：10B3嵌合体、H0L0、H1L2和H2L2与低密度肌生成抑制素表 面结合的BIAcore TM 分析
Figure BPA00001423782500761
表11：10B3嵌合体、H0L0、H1L2和H2L2与中密度肌生成抑制素表 面结合的BIAcore TM 分析
Figure BPA00001423782500771
表12：10B3嵌合体、H0L0、H1L2和H2L2与高密度肌生成抑制素表 面结合的BIAcore TM 分析
Figure BPA00001423782500772
这些数据表面，随着BIAcoreTM芯片上的肌生成抑制素表面密度的增加，改进了结合亲和力，这很可能是由于亲合力结合。然而，等级次序大体保持一样，且不依赖所用表面来测量亲和力(结合亲和力的等级次序＝10B3嵌合体＞H2L2＞H0L0＞H1L2)。这些数据明显与肌生成抑制素的ELISA数据一致。
4.4在报告细胞生物测定中中和重组肌生成抑制素
在如上(1.2)所述的肌生成抑制素响应报告基因测定中检测人源化的抗体，以评估体外功效。肌生成抑制素以2.8nM浓度与不同浓度的抗体(0.1-20nM)在37℃预孵育，然后将其加入到转染的A204细胞中，随后读取荧光素酶。得到的数据示于图12中，测定的IC50(ANOVA分析)示于表13中。
表13.A204中的人源化抗体体外活性测定IC50
  抗体   平均EC50(ng/ml)  95％置信水平(ng/ml)
  10B3   8.5   7.2-10.1
  10B3嵌合体   5.1   4.2-6.1
  H0L0   10.2   7.9-13.1
  H2L2   8.6   6.8-10.7
人源化的抗体抑制肌生成抑制素-诱导的A204细胞的激活，然而，与嵌合10B3比较，观察到一定程度的活性损失，这可能是由于人构架区的作用。但活性损失极小，在该测定中肯定在2倍以内。
5.人源化抗体的可发展性分析
在10B3嵌合体重链和轻链和人源化抗体二者中的可能的脱酰胺位点的计算机模拟分析(silico analysis)中，确定了重链CDRH2的Kabat54位天冬酰胺(N54)具有脱酰胺的高度可能性。为了进一步表征该残基，我们产生了10B3嵌合抗体和人源化的H2L2抗体，其中N54被取代为天冬酰胺(D)或谷氨酰胺(Q)氨基酸残基。
10B3嵌合体轻链和人源化抗体在CDRL3的Kabat 91位具有半胱氨酸(C)残基。未配对的半胱氨酸可具有化学反应性，其导致产生在抗体加工发展期间的修饰，从而导致产物可能不均一以及亲和力可能变化。另外，该残基可能因与为形成免疫球蛋白折叠所必须的可变区的其它半胱氨酸错误配对而促使错误折叠或凝集。为了进一步表征该残基，我们产生了10B3嵌合抗体和人源化的H2L2抗体，其中C91被取代为丝氨酸(S)氨基酸残基。
另外，我们亦让重链CDRH2中进行的脱酰胺取代与轻链CDRL3的91位取代组合。作为这些分析的部分产生的抗体阐明于表14中。
表14：为可发展性分析产生的人源化的抗体变体
Figure BPA00001423782500791
5.1可发展性变体的表达和表征
通过相关H2重链和L2轻链表达载体的位点定向突变来制备表达这些抗体所需的重链和轻链构建体。将质粒重链-轻链组合(H2L2-N54D；H2L2-N54Q；H2L2-N54D-C91S；H2L2-N54Q-C91S；H2L2-C91S)瞬时共转染到CHO细胞，并以小规模表达以获得5种不同的人源化的抗体。另外，10B3嵌合体(HCLC)和H2L2作为阳性对照表达。
在两个独立的实验中一式二份将每一抗体的质粒转染到CHOK1细胞。在肌生成抑制素结合ELISA中分析在CHOK1细胞上清液中产生的抗体的活性。如4.2所述进行ELISA方法，仅一个实验的ELISA数据阐释于图13的图表中。含有N54Q和/或C91S取代的H2L2mAb显示在该ELISA中与重组肌生成抑制素结合，该结合大体上分别等同于10B3嵌合体(HCLC)或H2L2。10B3嵌合体和含有单独的N54D取代(或与C91S取代组合)的H2L2 mAb在该ELISA中不与重组肌生成抑制素结合。
选择H2L2-N54Q、H2L2-C91S和H2L2-N54Q C91S用于大规模表达(在CHOK1和CHOE1a两种表达系统中都表达)、纯化和进一步分析。在肌生成抑制素结合ELISA中分析这些抗体的活性。如4.2章节所述进行ELISA方法，仅一个实验(来自所有3种抗体)的ELISA数据阐释于图14的图表中。H2L2C91S似乎具有与10B3嵌合体、H0L0和H2L2相似的肌生成抑制素结合活性。然而，H2L2 N54Q和H2L2N54Q C91S似乎具有降低的肌生成抑制素结合活性。
亦用与以上4.3所述相似方法检测可发展性(developability)构建体，以通过BIAcore来测定肌生成抑制素结合亲和力的任何变化(参见表15)。数据(对于低密度表面)显示，取代预测的脱酰胺位点(N54Q)导致在H2L2人源化变体中亲和力至少损失2倍。
表15.肌生成抑制素可发展性变体的肌生成抑制素结合动力学
  构建体   ka   kd   KD(nM)
  10B3嵌合体(HCLC)   3.323E+5   1.477E-3   4.44
  H2L2   3.113E+5   3.735E-3   12.0
  H0L0   1.922E+5   4.363E-3   22.7
  H2L2-C91S   1.903E+5   3.153E-3   16.6
  H2L2-N54Q   1.590E+5   4.447E-3   28.0
  H2L2-N54Q-C91S   1.389E+5   4.623E-3   33.3
10B3小鼠亲本和H2L2-C91S可发展性变体对重组肌生成抑制素的亲和力亦由FORTEbioTM(生物膜层反射光干涉技术(bio-layerinferometry))分析来评估。通过抗原捕获来进行FORTEbioTM分析。将肌生成抑制素(内部，参见以上1.1)按照厂商说明通过伯胺偶联偶联到胺反应性生物传感器上。然后将抗体以20nM浓度捕获到该表面上。用设备内有的评估软件来分析数据，用1∶1拟合分析的数据(参见表16)。由于有限量的肌生成抑制素分子与传感器表面及低抗体浓度结合，亲合作用降低了，这使得与Biacore分析比较能更准确地测量亲和力。数据显示亲本抗体(10B3)具有310pM的亲和力，而可发展性变体H2L2-C91S具有73pM的亲和力。然而，由于抗体与肌生成抑制素结合的性质，这些数值主要用于等级评定目的，所述亲和力不可代表体内的亲和力。
表16.10B3亲本和H2L2-C91S可发展性变体对肌生成抑制素的亲和 力
Figure BPA00001423782500811
亦用如上1.2所述A204荧光素酶测定，测定了可发展性突变对体外中和测定的影响。抑制曲线的图形代表示于图15中，相应的IC50值如表17中所示。按照本测定，人源化的变体相对于可发展性变体未明显失去中和效价。
表17.A204中可发展性抗体变体的体外活性测定IC50
  抗体   平均EC50(ng/ml)   95％置信水平(ng/ml)
  10B3嵌合体   8.45   5.36-13.31
  H0L0   10.07   5.74-17.65
  H2L2   10.14   5.87-17.49
  H2L2-C91S   9.26   5.17-16.62
  H2L2-N54Q   11.98   6.35-22.59
  H2L2-N54Q-C91S   10.42   5.99-18.11
5.2可发展性变体脱酰胺的可能性
通过与1％碳酸氢铵(pH9.0)在37℃孵育48小时，让H0L0、H2L2、H2L2-C91S、H2L2-N54Q和H2L2-N54Q-C91S抗体经受诱导脱酰胺的应激条件。处理后，在肌生成抑制素结合ELISA(如4.2中所述)中分析H0L0、H2L2、H2L2-C91S、H2L2-N54Q和H2L2-N54Q-C91S的功能性活性。仅一个实验的ELISA数据(来自全部两种抗体)阐明于图16-20中。这些数据清楚地表明，处理程序不影响任何抗体结合肌生成抑制素的能力。
6.CDRH3变体人源化抗体
6.1CDRH3变体人源化抗体的构建
用抗体H2L2-C91S(可变序列：分别为SEQ ID NO：14和24；全长序列：分别为SEQ ID NO：30和40)作为基础分子，对CDRH3(SEQID NO：3)每一残基实施定点突变为备选氨基酸残基。用pTT载体(National Research Council Canada，含修饰的多克隆位点(MCS))产生包括H2和L2-C91S基础序列(分别为SEQ ID NO：45和55)的人恒定区的全长DNA表达构建体。
产生大约300个CDRH3变体，在随后的分析中检测了大约200个变体(参见6.2和6.3)。
6.2CDRH3变体在HEK 293 6E细胞中的表达
将分别编码大约200种CDRH3变体的重链和轻链的pTT质粒瞬时共转染到HEK 293 6E细胞中，并以小规模表达以产生抗体。如上所述，重链具有含变体CDRH3序列的H2基础序列，轻链具有L2-C91S基础序列。从组织培养上清液中直接评估抗体。
6.3对组织培养上清液的初始扫描-ProteOn XPR36
在ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)上进行对CDRH3筛选的初始动力学分析。对于残基R95至P100_B，用蛋白A/G捕获表面(Pierce 21186)进行分析，对于残基A100_C至V102，用抗-人IgG表面(Biacore/GE Healthcare BR-1008-39)。类似地用伯胺偶联以将捕获分子固定到GLM芯片(Biorad Laboratories 176-5012)上来制备两个捕获表面。在从来自表达特定目的变体的瞬时转染的组织培养上清液中，直接将CDRH3变体捕获到蛋白A/G或抗-人IgG表面(视突变的残基而定)。捕获后，将内部重组人肌生成抑制素(参见以上1.1)以256nM、32nM、4nM、0.5nM和0.0625nM用作分析物，且将单独的缓冲注射液(即0nM)用作双参考结合曲线。在肌生成抑制素结合事件后，让捕获表面再生：对于蛋白A/G捕获表面，用100mM磷酸来再生捕获表面；对于抗-人IgG表面，用3M MgCl2来再生捕获表面；再生除掉先前捕获的抗体，准备用于另一轮捕获和结合分析。然后将数据拟合到ProteOn分析软件内在的1∶1模型(用传质(mass transport)模型)。用HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)进行运行，分析温度为25℃。
由于相互作用的性质，结果很难解释，因为1∶1模型不太可能适当地阐述了相互作用，然而，通过判断传感图(sensorgram)，可能要选择可相对于基础分子亲和力改进的构建体。我们断定所述筛选确定了似乎比基础分子具有更好动力学曲线的11个CDRH3变体。11个CDRH3变体重链阐述于下表18(用Kabat编号)中。所有变体都具有轻链L2-C91S(可变序列：SEQ ID NO：24；全长序列：SEQ ID NO：40、全长DNA序列SEQ ID NO：55)。确定比基础分子具有更好动力学曲线的其它CDRH3变体为F100G_S(SEQ ID NO：110)，但未对其进行进一步分析。
表18.CDRH3变体序列
  名称   CDRH3的序列
  H2L2-C91S   RYYYGTGPADWYFDV(SEQ ID NO：3)
  H2L2-C91S_Y96L   RLYYGTGPADWYFDV(SEQ ID NO：82)
  H2L2-C91S_G99D   RYYYDTGPADWYFDV(SEQ ID NO：83)
  H2L2-C91S_G99S   RYYYSTGPADWYFDV(SEQ ID NO：84)
  H2L2-C91S_G100A_K   RYYYGTKPADWYFDV(SEQ ID NO：85)
  H2L2-C91S_P100B_F   RYYYGTGFADWYFDV(SEQ ID NO：86)
  H2L2-C91S_P100B_I   RYYYGTGIADWYFDV(SEQ ID NO：87)
  H2L2-C91S_W100E_F   RYYYGTGPADFYFDV(SEQ ID NO：88)
  H2L2-C91S_F100G_N   RYYYGTGPADWYNDV(SEQ ID NO：89)
  H2L2-C91S_F100G_Y   RYYYGTGPADWYYDV(SEQ ID NO：90)
  H2L2-C91S_V102N   RYYYGTGPADWYFDN(SEQ ID NO：91)
  H2L2-C91S_V102S   RYYYGTGPADWYFDS(SEQ ID NO：92)
通过代号提及抗体(即H2L2-C91S_Y96L)意指通过在合适细胞系中共转染和表达编码轻链和重链的第一和第二质粒产生的抗体，所述质粒例如为含有pTT5_H2_Y96L序列的质粒和含有pTT5_L2-C91S序列的质粒。
6.4挑选的CDRH3变体组的表达
表18中提出的11种CDRH3变体组的重链和轻链在HEK 293 6E细胞中表达(如6.2所述)，用固定蛋白A柱(GE Healthcare)亲和力纯化，通过在280nm读取吸光度来定量。
6.5通过BIAcore TM 测定与重组肌生成抑制素的结合
为了评判在ProteOn XPR36上初筛的构建体的选择是否成功，对纯化的重组抗体进行解离速率等级评定实验。通过伯胺偶联以三种不同密度(低、中、高)让肌生成抑制素(内部重组，参见以上1.1)共价固定到CM5芯片(Biacore/GE Healthcare BR-1000-14)上，这导致产生分别以所用抗体浓度获得大约60共振单位(RU)、250RU和1000RU的最大结合信号的表面。将256nM单个浓度的抗体与缓冲注射液用于双参考结合相互作用。用Biacore 3000设备内有的软件计算所有抗体对每种密度的肌生成抑制素表面相互作用的初始解离速率(解离速率(off-rate))。用100mM磷酸再生，用HBS-EP缓冲液在25℃进行测定。
发现所检测的所有构建体都显示比基础分子(H2L2 C91S)更好的解离速率(解离速率常数)，因为该解离速率慢于H2L2 C91S。方面高密度表面，不包括10B3嵌合体的前5种构建体是H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_W100E_F、H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S_G99S和H2L2-C91S_P100B_F。
6.6通过BIAcore TM 进行与重组肌生成抑制素的结合的全动力学分析
将肌生成抑制素(内部重组，参见以上1.1)以低、中、高密度固定到Series CM5芯片(Biacore/GE Healthcare BR-1006-68)上，这导致产生分别获得大约15RU、37RU和500RU的最大结合信号的表面。让CDRH3变体以256nM、64nM、16nM、4nM、1nM及用于双重参考的缓冲注射液(即0nM)流经所有3种表面，用100mM磷酸再生。将数据拟合到T100 Biacore设备内有的二价模型，用HBS-EP在25℃运行。
大体上，与CDR变体相比，基础H2L2-C91S在所有三种密度表面上的拟合不好，因此很难获得准确的基线值。在三种表面中，最高密度表面在基础抗体和CDR变体之间提供最好的分离，但基础H2L2-C91S分子的拟合仍不好。然而，可预期该表面在构建体之间产生最好的分离，以及成为最可能提供真正二价结合的最好表面的表面，因为可能亲合结合和再结合事件更频繁，因此，可″放大″亲和力的小差异。大体上，所有CDR变体表现出都比基础H2L2-C91S好，主要是因为较好(即较慢)的解离速率，尤其是在高密度表面。
由于在本测定中涉及靶标抗原共价偶联到生物传感器芯片表面的方法，因此获得的实际亲和力可能不反映可在体内观察到的亲和力。然而，该数据可用于等级评定的目的。用来自本测定高密度表面的数据，基于总亲和力(平衡常数KD)但不包括嵌合体10B3的前5种构建体为F100G_Y、P100B_I、P100B_F、F100G_N和W100E_F。然而，所有其它构建体的亲和力都在F100G_Y的2倍以内。
6.7肌生成抑制素捕获ELISA
亦在肌生成抑制素捕获ELISA中分析了11种亲和力纯化的CDRH3变体的结合活性。
用针对肌生成抑制素的2.5μg/ml多克隆抗体(R&D SYSTEMSAF788)于4℃过夜包被96-孔ELISA板。然后用洗涤缓冲液(PBS，0.1％Tween-20)洗涤该板3次，用封闭液(PBS，0.1％Tween-20+1％牛血清白蛋白[BSA])室温封闭1小时。然后，在1小时期间以1μg/ml将肌生成抑制素加入封闭缓冲液中，接着用洗涤缓冲液洗涤3次。然后将抗体滴定到合适的浓度范围(大约10-0.01μg/ml)，加到板中，于室温孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤板3次。用抗-人κ轻链HRP-缀合的抗体(Sigma A7164，按照厂商说明使用)来检测人源化或嵌合抗体例如10B3嵌合体(HcLc)或H0L0的结合。然后用洗涤缓冲液洗涤板3次，用OPD底物(按照厂商说明使用)显色，在板读数器上于490nm处读数。
本实验阐明于图21中，其中将H2L2-C91S、H0L0、HcLc(10B3嵌合体)和阴性对照单克隆抗体用作对照抗体。在该ELISA中所有11种CDRH3变体抗体与重组肌生成抑制素结合。H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_V102N、H2L2-C91S_G100A_K、H2L2-C91S_P100B_F和H2L2-C91S_F100G_Y往往都具有比基础H2L2-C91S和H0L0更好的肌生成抑制素结合活性。
6.8肌生成抑制素竞争ELISA
在3种不同的肌生成抑制素竞争ELISA中进一步研究CDRH3变体。分析了纯化的抗体与10B3鼠mAb竞争的能力。
6.8.1用多克隆Ab作为捕获方法
用6.7提出的方案，将10B3(终浓度0.3μg/ml)加到每孔中，与滴定到合适浓度范围(大约10-0.01μg/ml)的抗体混合。用抗-小鼠HRP-缀合的抗体(DAKO P0260，按照厂商说明使用)来检测10B3抗体的结合。自ELISA数据获得的等级评定示于表19中。
6.8.2用生物素化肌生成抑制素作为捕获方法
用6.7提出的方案，但板开始在4℃用5μg/ml链霉亲和素过夜包被。1小时期间以0.3μg/ml封闭缓冲液加入生物素化的肌生成抑制素，接着用洗涤缓冲液洗涤3次。将10B3(终浓度0.2μg/ml)加入到每孔中，与滴定到合适的浓度范围(大约10-0.01μg/ml)的抗体混合。用抗-小鼠HRP-缀合的抗体(DAKO P0260，按照厂商说明使用)来检测10B3抗体的结合。自ELISA数据获得的等级评定示于表19中。
6.8.3用肌生成抑制素作为捕获方法(直接捕获)
用6.7提出的方案，但板开始在4℃用0.2μg/ml肌生成抑制素(内部重组，参见以上1.1)过夜包被。将10B3(终浓度0.3μg/ml)加入到每孔中，与滴定到合适的浓度范围(大约10-0.01μg/ml)的抗体混合。用抗-小鼠HRP-缀合的抗体(DAKO P0260，按照厂商说明使用)来检测10B3抗体的结合。自ELISA数据获得的等级评定示于表19中。
所有CDRH3变体都能与10B3竞争。来自不同竞争ELISA的每一个中的5种最有效的分子列于表19中。
表19：5种最有效的CDRH3变体分子的等级次序顶(1)到底(5)
Figure BPA00001423782500871
基于本章节(6.8)的分析和先前6.6和6.7中的BIAcore数据，选择变体H2L2-C91S_P100B_F、H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S_V102N和H2L2-C91S_V102S用于进一步分析。
6.9体外抑制肌生成抑制素的生物学活性
在肌生成抑制素响应报告基因测定(参见以上1.2)中检测5种挑选的6.8的CDRH3变体，以评估体外功效。肌生成抑制素以5nM的浓度与不同浓度的抗体在37℃预孵育，然后将其加到转染的A204细胞中。让细胞在37℃再孵育6小时，然后通过发光来测定相对荧光素酶表达。获得的IC50示于表20中。
表20：在A204中的人源化抗体体外活性测定的IC50
数据表明，所检测的所有抗体以与10B3嵌合体相似的效价中和肌生成抑制素，且H2L2-C91S_F100G_Y具有最高效价，但在本测定中没有显著性。
7.FC无效化的恒定区变体的构建和表达
因为抗-肌生成抑制素体内作用模式将是简单结合和中和肌生成抑制素，所以分子保留其Fc-功能以引发ADCC和CDC反应并非必需。此外，使Fc功能无效化可有助于减轻输注相关的免疫反应的可能性。使Fc功能无效化的突变涉及用EU编号系统的以下取代：Leu 235 Ala；和Gly 237 Ala。
用标准分子生物学技术，将编码CDRH3变体H2_F100G_Y重链可变区序列的基因从已有的构建体转移到含有hIgGl Fc无效化恒定区的表达载体。用pTT载体产生编码重链(SEQ ID NO：98H2_F100G_Y_Fc无效化)和轻链(SEQ ID NO：40L2-C91S)的全长DNA表达构建体。重链的详细资料在表21中。
表21.CDRH3变体Fc无效化序列
  名称   全长蛋白SEQ ID
  H2L2-C91S_F100G_Y Fc无效化   98
分析了Fc无效化恒定区在肌生成抑制素响应报告基因测定(如以上1.2所述)中的作用。获得的IC50数据示于表22中。
表22.在A204中的CDRH3变体Fc无效化抗体体外活性测定IC50
这些数据显示，如上所述使″H2L2-C91S_F100G_Y Fc无效化″的Fc-功能无效化，对抗体中和肌生成抑制素的效能没有显著影响。
8.CDRH2变体人源化抗体
8.1 CDRH2变体人源化抗体的构建
如以上实施例5所述，重链CDRH2中的Kabat 54位天冬酰胺(N54)有脱酰胺的可能性。为了减轻这种可能的风险，让该氨基酸突变以产生多种H2_F100G_Y CDRH2变体。它们在CDRH2(SEQ ID NO：2)方面都不同，通过用编码H2_F100G_Y重链的pTT载体定点诱变产生。使轻链(SEQ ID NO：40L2-C91S)与各种重链一起表达。这些构建体没有在Fc区无效化。
8.2在HEK293 6E细胞中表达CDRH2变体
如上6.2所述分别将编码重链和轻链的pTT质粒瞬时共转染到HEK 293 6E细胞中。另外，让H2L2-C91S_F100G_Y作为阳性对照表达。通过BIAcore分析了在HEK293细胞上清液中产生的抗体与重组肌生成抑制素的结合。CDRH2变体的筛选表明，它们全部与重组肌生成抑制素结合。
用获得的亲和力数据和可能脱酰胺风险的计算机模拟分析，选择5种CDRH2变体组(列于表23中)用于大规模表达、纯化和进一步分析。
表23.CDRH2变体序列
  名称   CDRH2序列
  H2L2 C91S   NIYPYNGVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：2)
  H2L2 C91S_G55D F100G_Y   NIYPYNDVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：93)
  H2L2 C91S_G55L F100G_Y   NIYPYNLVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：94)
  H2L2 C91S_G55S F100G_Y   NIYPYNSVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：95)
  H2L2 C91S_G55T F100G_Y   NIYPYNTVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：96)
  H2L2 C91S_G55V F100G_Y   NIYPYNVVSNYNQRFKA(SEQ ID NO：97)
8.3 CDRH2变体的表征
在肌生成抑制素结合ELISA中分析了所有5种抗体的结合活性(如实施例4.2所述)。图22显示H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2 C91S、HcLc(10B3C)和阴性对照mAb和所有5种CDRH2变体抗体的结果。CDRH2变体与H2L2-C91S_F100G_Y相比，具有更好或相似的肌生成抑制素结合活性。
8.4 CDRH2变体的BIAcore分析
亦通过BIAcore测试了CDRH2变体，以确定肌生成抑制素结合亲和力的任何变化。将蛋白A固定在Cl Biacore生物传感器芯片上，以低密度捕获纯化的抗体，以使肌生成抑制素的最大结合产生少于30的共振单位。让肌生成抑制素仅以256nM的浓度流经捕获的抗体表面；用缓冲注射液(即0nM)作为双参考结合数据。用100mM磷酸再生蛋白A表面。将数据拟合到二价模型和二态模型(Two State Model)中，二者都为T100 Biacore分析软件所固有。然而，由于肌生成抑制素为二聚体，将更高权重给予二价模型数据。用HBS-EP及25℃的温度实施运行。
所用模型不能反映体内的真正结合，模型本身可能不能准确反映相互作用，因此，计算的值仅用于等级评定。数据表明，与H2L2-C91SF100G_Y比较，CDRH2变体对亲和力的影响并不很显著，且最差的二价模型构建体(H2L2 C91S_G55L_F100G_Y)显示6.8倍更差的总亲和力。
8.5体外抑制肌生成抑制素的生物学活性
亦用A204荧光素酶测定(如1.2章节所述)进行了CDRH2变体对体外中和测定的影响。抑制曲线的IC50值显示于表24中。
表24.在A204中的抗体变体体外活性测定IC50
Figure BPA00001423782500911
数据表明，在本测定中，所有CDRH2变体抗体以与H2L2-C91SF100G_Y相似的效价，抑制肌生成抑制素-诱导的A204细胞的激活。
8.6 Fc-失效化CDRH2变体
在A204测定中具有最高表观效价的可发展性提高的分子H2L2C91S_G55S F100G_Y，是如SEQ ID NO：99中所述被Fc-失效化(通过进行用EU编号系统的以下取代：Leu 235 Ala；和Gly 237 Ala)。用受体结合测定(实施例2.5)来证明，该新分子H2L2 C91S_G55S F100GY-Fc无效化相对于H2L2 C91S_G55S F100G_Y具有稍微改进的效价(参见表25)。
表25.在ActRIIb受体结合测定中抗体变体的IC50值
Figure BPA00001423782500912
9.10B3在糖皮质激素-诱导的肌肉萎缩中的功效
在本研究中，我们调查了10B3治疗是否能在小鼠中预防类固醇诱导的肌肉损失。用PBS、mIgG2a或10B3治疗C57BL小鼠。将地塞米松用作诱导肌肉损失的类固醇。
在用对照抗体预治疗的动物中地塞米松处理导致体重损失。通过10B3预治疗可减弱地塞米松-诱导的重量减轻。用对照抗体预治疗的动物显示在趾长伸肌(EDL)、胫骨前肌(TA)和腓肠肌方面肌肉萎缩。与此形成对比，用10B3预治疗的动物中的地塞米松处理不引起TA、EDL和腓肠肌的萎缩。用对照抗体预治疗的动物显示增加体脂肪聚积。然而在用10B3预治疗的动物中，地塞米松处理后身体脂肪％不增加。
实施例9中的这些结果表明，10B3或其人源化的抗体可用于治疗糖皮质激素-诱导的肌肉萎缩。例如，在用糖皮质激素治疗的患者中预防性治疗肌肉萎缩可能有利。
10.在坐骨神经夹伤模型中10B3治疗减弱肌肉萎缩
本文中我们用神经损伤模型来评估10B3在预防小鼠废用性萎缩中的功效。
用mIgG2a对照或10B3抗体治疗C57BL小鼠。暴露大腿中区右边的坐骨神经，使其保留完整性(假手术组)或通过用止血钳(haemostatic forcep)夹伤10秒来使其损伤(神经夹伤组)。与假手术对照比较，坐骨神经夹伤导致降低趾长伸肌(EDL)、胫骨前肌(TA)、腓肠肌和比目鱼肌的质量。在假手术组中，与IgG2a对照组比较，10B3治疗增加TA、EDL、腓肠肌和四头肌的质量。用10B3治疗的动物比IgG2a对照治疗的动物保留更多的肌肉。10B3治疗亦提高假手术和神经压伤两种动物的总体重。
这些结果显示，10B3或其人源化的抗体可具有用于预防和/或治疗人废用性肌肉萎缩的潜能。
11.10B3治疗减弱荷有C-26肿瘤的小鼠的肌肉萎缩
在当前的研究中，在荷有结肠-26肿瘤的小鼠中研究了10B3治疗对体重变化、肌肉质量和功能的作用，所述荷有结肠-26肿瘤的小鼠是用于癌症恶病质研究广泛使用的临床前模型。
将38只8周龄雄性CD2F1小鼠随机分为4组：mIgG2a(n＝9)、10B3(n＝9)、mIgG2a+C-26(n＝10)和10B3+C-26(n＝10)。将结肠-26(C-26)肿瘤细胞以1x106个细胞/小鼠皮下植入到20只小鼠中。几个小时后，动物开始接受抗体注射。在第0、3、7、14、21天用小鼠IgG2a对照抗体或10B3以30mg/kg剂量腹膜内注射小鼠。在整个实验中监测体重和脂肪量。在第25天临处死前，通过测量电刺激大腿中区时坐骨神经的收缩力，来评估下肢肌肉力量。实验结束时测定肿瘤重量和个体肌肉质量和附睾脂肪垫质量。
图23显示抗体治疗对第0天到第25天的荷有C-26肿瘤的小鼠体重的影响。荷瘤小鼠在肿瘤植入后的21天开始明显失去体重。用10B3治疗有效缓和荷瘤小鼠的重量减轻。10B3治疗的荷瘤小鼠的平均体重比用mIgGa2a对照抗体治疗的荷瘤小鼠的平均体重高8％。在10B3治疗组和mIgG2a对照治疗组之间，在肿瘤大小方面没有显著性差异(IgG2a的2.2g对比10B3的1.9g)。
图24显示抗体治疗对荷有C-26肿瘤的小鼠的总身体脂肪(A)、附睾脂肪垫(B)和瘦肉质量(C)的影响。荷瘤小鼠具有显著低的总身体脂肪(图24A)。在10B3和mIgG2a对照治疗的两类荷瘤小鼠中，附睾脂肪垫几乎完全消失(图24B)，这表明10B3不能防止荷瘤动物体脂肪损失。
如图24C所示，10B3治疗在正常动物以及荷瘤小鼠中都引起瘦肉质量显著增加(p＜0.01)。用对照IgG2a治疗的荷瘤小鼠在除去肿瘤后具有显著低的瘦肉质量。与此相反，用10B3治疗的荷瘤小鼠肿瘤比IgG2a处理的荷瘤小鼠具有显著(p＜0.01)更高的瘦肉质量。实际上，在10B3治疗的荷瘤小鼠和正常动物之间瘦肉质量没有显著差异。
表26显示抗体治疗对肌肉质量的影响。如所预期的一样，荷瘤小鼠显著损失TA、EDL、四头肌、比目鱼肌和腓肠肌肌肉(表26)。10B3治疗提高正常动物的肌肉质量。最重要的是，10B3治疗减弱了荷瘤小鼠的肌肉损失。在用10B3治疗的荷瘤小鼠中中，TA、EDL、四头肌、比目鱼肌和腓肠肌肌肉的重量，比用IgG2a对照治疗的荷瘤小鼠的所述肌肉重量分别大17.8％、11.3％、16.9％、13.4％和14.6％。
表26：10B3治疗减弱荷瘤小鼠的肌肉损失。数据为平均肌肉质量(mg) +/-SEM。含上标 * 和#的平均值分别表示符合学生T检验的与IgG2a 组和C-26+IgG2a组的显著差异(p＜0.05)
  组别   四头肌   腓肠肌   TA   EDL   比目鱼肌
  IgG2a   216+/-2.1   159+/-2.2   51+/-0.5   11.1+/0.5   8.0+/-0.4
  10B3   244+/-4.7*   173+/-4.8   58+/-1.2*   12.6+/0.6*   8.5+/-0.2
  C-26+IgG2a   174+/-3.7*   123+/-4.5*   40+/-1.6*   8.9+/-0.3*   6.9+/-0.3*
  C-26+10B3   204+/-8.6#   140+/-5.8*   47+/-1.8#   9.9+/-0.6#   7.9+/-0.5#
图25显示抗体治疗对下肢肌肉力量的影响，其通过测量电刺激大腿中区时的坐骨神经收缩力来评估。在肿瘤植入25天后，对照抗体组中下肢肌肉收缩力显著(p＜0.001)降低20％。10B3治疗与对照组(p＜0.05)比较，分别使健康动物和荷瘤小鼠收缩力最大值提高10.2％和17.5％。在10B3治疗的荷瘤小鼠和健康对照间，最大力测量值有显著差异。因此，10B3治疗在健康和荷瘤小鼠二者中都改善肌肉功能。
这些数据表明，10B3或其人源化的抗体治疗可减弱与癌症恶病质有关的肌肉损失和功能降低。
12.10B3治疗对小鼠割腱术模型中的骨骼肌萎缩的影响
本文中我们测定了在小鼠割腱术模型中肌生成抑制素抗体10B3对肌肉质量的影响。
将年轻成年雄性C57BL小鼠随机分为mIgG2a或10B3治疗组(n＝6/组)，在第1、4、8和15天以30mg/kg腹膜内给药。在给药前(第0天)的早上，让所有小鼠接受以下手术方案：在其左腿远端插入处分开胫骨前肌(TA)腱(割腱术)，而所有右腿TA腱暴露但保留完整性(假手术)。3周(第21天)后，让小鼠安乐死，来评估TA肌肉质量的变化。
在小鼠假手术和割腱手术后，3周的10B3治疗显著增加二者的TA肌肉质量(图26)。令人感兴趣的是，与保留完整的假手术情况(+14％)比，10B3在割腱情况下作用更明显(+21％)。
这些数据表明，10B3或其人源化的抗体治疗能减弱与创伤/损伤有关的肌肉损失和功能下降。
序列
SEQ ID NO：1(CDRH1)
GYFMH
SEQ ID NO：2(CDRH2)
NIYPYNGVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：3(CDRH3)
RYYYGTGPADWYFDV
SEQ ID NO：4(CDRL1)
KASQDINSYLS
SEQ ID NO：5(CDRL2)
RANRLVD
SEQ ID NO：6(CDRL3)
LQCDEFPLT
SEQ ID NO：7(小鼠单克隆10B3 VH)
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SEQ ID NO：8(小鼠单克隆10B3和10B3嵌合体VL)
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SEQ ID NO：9(人工信号序列)
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID NO：10(VH人受体构架)
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SEQ ID NO：11(VL人受体构架)
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SEQ ID NO：12(人源化的VH：H0)
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SEQ ID NO：13(人源化的VH：H1)
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SEQ ID NO：14(人源化的VH：H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：15(人源化的VL：L0)
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SEQ ID NO：16(人源化的VL：L1)
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SEQ ID NO：17(人源化的VL：L2)
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SEQ ID NO：18(人源化的VL：L3)
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SEQ ID NO：19(10B3嵌合体VH：N54D)
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SEQ ID NO：20(10B3嵌合体VH：N54Q)
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SEQ ID NO：21(10B3嵌合体VL：C91S)
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SEQ ID NO：22(人源化的VH：H2：N54D)
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SEQ ID NO：23(人源化的VH：H2：N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：24(人源化的VL：L2：C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：25(10B3嵌合体VH)
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SEQ ID NO：26(10B3嵌合体重链)
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SEQ ID NO：27(10B3嵌合体轻链)
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SEQ ID NO：28(人源化的重链：H0)
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SEQ ID NO：29(人源化的重链：H1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：30(人源化的重链：H2)
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SEQ ID NO：31(人源化的轻链：L0)
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SEQ ID NO：32(人源化的轻链：L1)
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SEQ ID NO：33(人源化的轻链：L2)
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SEQ ID NO：34(人源化的轻链：L3)
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SEQ ID NO：35(10B3嵌合体N54D重链)
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SEQ ID NO：36(10B3嵌合体N54Q重链)
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SEQ ID NO：37(10B3嵌合体C91S轻链)
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SEQ ID NO：38(人源化的重链：H2 N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYDGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：39(人源化的重链：H2 N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：40(人源化的轻链：L2 C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：41(10B3嵌合体重链，DNA序列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：42(10B3嵌合体轻链，DNA序列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTGTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：43(人源化的重链：H0，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：44(人源化的重链：H1，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGAACGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：45(人源化的重链：H2，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：46(人源化的轻链：L0，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：47(人源化的轻链：L1，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGCGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：48(人源化的轻链：L2，DNA序列)ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：49(人源化的轻链：L3，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCGCGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：50(10B3嵌合体N54D重链，DNA序列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACGATGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：51(10B3嵌合体N54Q重链，DNA序列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACCAAGGTGTTTCTAACTACAACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTATTACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：52(10B3嵌合体C91S轻链，DNA序列)
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：53(人源化的重链：H2 N54D，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACGACGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：54(人源化的重链：H2 N54Q、DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACCAGGGCGTCAGCAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
SEQ ID NO：55(人源化的轻链：L2 C91S，DNA序列)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCCTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID NO：56(人工肌生成抑制素线性肽1)
DFGLDCDEHSTESRGSG
SEQ ID NO：57(人工肌生成抑制素线性肽3)
SGSGDCDEHSTESRCCRY
SEQ ID NO：58(人工肌生成抑制素线性肽5)
SGSGHSTESRCCRYPLTV
SEQ ID NO：59(人工肌生成抑制素线性肽7)
SGSGSRCCRYPLTVDFEA
SEQ ID NO：60(人工肌生成抑制素线性肽9)
SGSGRYPLTVDFEAFGWD
SEQ ID NO：61(人工肌生成抑制素线性肽11)
SGSGTVDFEAFGWDWIIA
SEQ ID NO：62(人工肌生成抑制素线性肽13)
SGSGEAFGWDWIIAPKRY
SEQ ID NO：63(人工肌生成抑制素线性肽15)
SGSGWDWIIAPKRYKANY
SEQ ID NO：64(人工肌生成抑制素线性肽17)
SGSGIAPKRYKANYCSGE
SEQ ID NO：65(人工肌生成抑制素线性肽19)
SGSGRYKANYCSGECEFV
SEQ ID NO：66(人工肌生成抑制素线性肽21)
SGSGNYCSGECEFVFLQK
SEQ ID NO：67(人工肌生成抑制素线性肽23)
SGSGGECEFVFLQKYPHT
SEQ ID NO：68(人工肌生成抑制素线性肽25)
SGSGFVFLQKYPHTHLVH
SEQ ID NO：69(人工肌生成抑制素线性肽27)
SGSGQKYPHTHLVHQANP
SEQ ID NO：70(人工肌生成抑制素线性肽29)
SGSGHTHLVHQANPRGSA
SEQ ID NO：71(人工肌生成抑制素线性肽31)
SGSGVHQANPRGSAGPCC
SEQ ID NO：72(人工肌生成抑制素线性肽33)
SGSGNPRGSAGPCCTPTK
SEQ ID NO：73(人工肌生成抑制素线性肽35)
SGSGSAGPCCTPTKMSPI
SEQ ID NO：74(人工肌生成抑制素线性肽37)
SGSGCCTPTKMSPINMLY
SEQ ID NO：75(人工肌生成抑制素线性肽39)
SGSGTKMSPINMLYFNGK
SEQ ID NO：76(人工肌生成抑制素线性肽41)
SGSGPINMLYFNGKEQII
SEQ ID NO：77(人工肌生成抑制素线性肽43)
SGSGLYFNGKEQIIYGKI
SEQ ID NO：78(人工肌生成抑制素线性肽45)
SGSGGKEQIIYGKIPAMV
SEQ ID NO：79(人工肌生成抑制素线性肽47)
SGSGIIYGKIPAMVVDRC
SEQ ID NO：80(人工肌生成抑制素线性肽49)
SGSGGKIPAMVVDRCGCS
SEQ ID NO：81(人工肌生成抑制素线性肽)
CCTPTKMSPINMLY
SEQ ID NO：82(CDRH3变体Y96L)
RLYYGTGPADWYFDV
SEQ ID NO：83(CDRH3变体G99D)
RYYYDTGPADWYFDV
SEQ ID NO：84(CDRH3变体G99S)
RYYYSTGPADWYFDV
SEQ ID NO：85(CDRH3变体G100A_K)
RYYYGTKPADWYFDV
SEQ ID NO：86(CDRH3变体P100B_F)
RYYYGTGFADWYFDV
SEQ ID NO：87(CDRH3变体P100B_I)
RYUYGTGIADWYFDV
SEQ ID NO：88(CDRH3变体W100E_F)
RYYYGTGPADFYFDV
SEQ ID NO：89(CDRH3变体F100G_N)
RYUYGTGPADWYNDV
SEQ ID NO：90(CDRH3变体F100G_Y)
RYYYGTGPADWYYDV
SEQ ID NO：91(CDRH3变体V102N)
RYYYGTGPADWYFDN
SEQ ID NO：92(CDRH3变体V102S)
RYUYGTGPADWYFDS
SEQ ID NO：93(CDRH2变体G55D)
NIYPYNDVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：94(CDRH2变体G55L)
NIYPYNLVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：95(CDRH2变体G55S)
NIYPYNSVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：96(CDRH2变体G55T)
NIYPYNTVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：97(CDRH2变体G55V)
NIYPYNVVSNYNQRFKA
SEQ ID NO：98(人源化的重链：H2_F100G_Y Fc无效化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：99(人源化的重链：H2_G55S-F100G_Y Fc无效化)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：100(VL人受体构架)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：101(HexaHisGB1Tev/(D76A)小鼠肌生成抑制素多蛋白)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQEGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
SEQ ID NO：102(GB1标签)
DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
SEQ ID NO：103(小鼠肌生成抑制素多蛋白(D76A))
EGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
SEQ ID NO：104(成熟肌生成抑制素)
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS
SEQ ID NO：105(弗林蛋白酶表达构建体)
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEA NNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACENLYFQG
SEQ ID NO：106(HexaHisGB1Tev/人肌生成抑制素前肽)
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
SEQ ID NO：107(Tev蛋白酶表达构建体)
MHGHHHHHHGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNE
SEQ ID NO：108(人肌生成抑制素前肽)
ENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
SEQ ID NO：109(CDRL3变体C91S)
LQSDEFPLT
SEQ ID NO：110(CDRH3变体F100G_S)
RYYYGTGPADWYSDV
SEQ ID NO：111(BMP-1表达构建体)
MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRPLDLADYTYDLAEEDDSEPLNYKDPCKAAAFLGDIALDEEDLRAFQVQQAVDLRRHTARKSSIKAAVPGNTSTPSCQSTNGQPQRGACGRWRGRSRSRRAATSRPERVWPDGVIPFVIGGNFTGSQRAVFRQAMRHWEKHTCVTFLERTDEDSYIVFTYRPCGCCSYVGRRGGGPQAISIGKNCDKFGIVVHELGHVVGFWHEHTRPDRDRHVSIVRENIQPGQEYNFLKMEPQEVESLGETYDFDSIMHYARNTFSRGIFLDTIVPKYEVNGVKPIGQRTRLSKGDIAQARKLYKCPACGETLQDSTGNFSSPEYPNGYSAHMHCVWRISVTPGEKIILNFTSLDLYRSRLCWYDYVEVRDGFWRKAPLRGRFCGSKLPEPIVSTDSRLWVEFRSSSNWVGKGFFAVYEAICGGDVKKDYGHIQSPNYPDDYRPSKVCIWRIQVSEGFHVGLTFQSFEIERHDSCAYDYLEVRDGHSESSTLIGRYCGYEKPDDIKSTSSRLWLKFVSDGSINKAGFAVNFFKEVDECSRPNRGGCEQRCLNTLGSYKCSCDPGYELAPDKRRCEAACGGFLTKLNGSITSPGWPKEYPPNKNCIWQLVAPTQYRISLQFDFFETEGNDVCKYDFVEVRSGLTADSKLHGKFCGSEKPEVITSQYNNMRVEFKSDNTVSKKGFKAHFFSEKRPALQPPRGRPHQLKFRVQKRNRTPQENLYFQGWSHPQFEKGTDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

Claims (25)

1.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：3的CDRH3；或变体CDRH3。
2.权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述变体CDRH3为：(i)SEQID NO：82-92或110中的任一种；或(ii)以下Kabat取代中的任一种：V102Y、V102H、V102I、V102D或V102G。
3.权利要求1或2的抗原结合蛋白，其进一步包含选自以下的一种或多种或所有CDR：CDRH1(SEQ ID NO：1)或变体CDRH1；CDRH2(SEQ ID NO：2)或变体CDRH2；CDRL1(SEQ ID NO：4)或变体CDRL1；CDRL2(SEQ ID NO：5)或变体CDRL2；和CDRL3(SEQ IDNO：6或109)或变体CDRL3。
4.权利要求2的抗原结合蛋白，其中所述变体CDRH2为：(i)SEQID NO：93-97中的任一种；或(ii)以下Kabat取代中的任一种：N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F或N58Y。
5.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中CDRH3为SEQID NO：90；和/或CDRH2为SEQ ID NO：95；和/或CDRL3为SEQ IDNO：109。
6.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋包含SEQ ID NO：7可变结构域序列的对应的CDRH3或其变体CDRH3。
7.权利要求6的抗原结合蛋白，其进一步包含选自以下的一种或多种或全部对应的CDR：所述SEQ ID NO：7可变结构域序列的CDRH1或其变体CDRH1或CDRH2或其变体CDRH2；或所述SEQ IDNO：8可变结构域序列的CDRL1或其变体CDRL1、CDRL2或其变体CDRL2和CDRL3或其变体CDRL3。
8.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括包含SEQ ID NO：7的95-101位Kabat残基的结合单位H3或变体H3。
9.权利要求8的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含选自以下的一种或多种或全部结合单位：包含SEQ ID NO：7的31-32位Kabat残基的H1或变体H1；包含SEQ ID NO：7的52-56位Kabat残基的H2或变体H2；包含SEQ ID NO：8的30-34位Kabat残基的L1或变体L1；包含SEQ ID NO：8的50-55位Kabat残基的L2或变体L2；和包含SEQ ID NO：8的89-96位Kabat残基的L3或变体L3。
10.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含选自以下的Kabat氨基酸残基中的任一种或组合：
(a)所述可变重链28位的S或T；
(b)所述可变重链105位的T或Q；
(c)所述可变重链的以下位置：2位V、I或G；4位L或V；20位L、I、M或V；22位C；24位T、A、V、G或S；26位G；29位I、F、L或S；36位W；47位W或Y；48位I、M、V或L；69位I、L、F、M或V；78位A、L、V、Y或F；80位L或M；90位Y或F；92位C；和/或94位R、K、G、S、H或N；
(d)所述可变轻链的16位R或G；
(e)所述可变轻链71位的Y或F；
(f)所述可变轻链100位的A或Q；和/或
(g)所述可变轻链的以下位置：2位I、L或V；3位V、Q、L或E；4位M或L；23位C；35位W；36位Y、L或F；46位S、L、R或V；49位Y、H、F或K；88位C；和/或98位F。
11.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白进一步包含与SEQ ID NO：10所示构架区具有75％或更高序列同一性的重链可变区受体抗体构架；或与SEQ ID NO：11所示构架区具有75％或更高序列同一性的轻链可变结构域受体抗体构架。
12.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
(i)选自SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：25的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：21的轻链可变区；或具有75％或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或
(ii)SEQ ID NO：26的重链；和/或选自SEQ ID NO：27或SEQ IDNO：37的轻链；或具有75％或更高序列同一性的变体重链或轻链。
13.与肌生成抑制素特异性结合的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
(i)选自SEQ ID NO：12、13或14中任一种的重链可变区；和/或选自SEQ ID NO：15、16、17、18或24中任一种的轻链可变区；或具有75％或更高序列同一性的变体重链可变区或轻链可变区；或
(ii)选自SEQ ID NO：28、29、30、98或99中任一种的重链；和/或选自SEQ ID NO：31、32、33、34或40中任一种的轻链；或具有75％或更高序列同一性的变体重链或轻链。
14.权利要求12或13的抗原结合蛋白，其中存在以下Kabat取代：
(i)所述重链可变区或重链中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N或V102S；和/或
(ii)所述重链可变区或重链中的G55D、G55L、G55S、G55T或G55V；和/或
(iii)所述轻链可变区或轻链中的C91S。
15.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为Fc无效化。
16.编码权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白的核酸分子。
17.权利要求16的核酸分子，所述核酸分子包含：
(i)SEQ ID NO：41重链DNA序列；和/或选自SEQ ID NO：42或52的轻链DNA序列；或具有75％或更高同一性的变体重链或轻链；或
(ii)选自SEQ ID NO：43、44或45中任一种的重链DNA序列；和/或选自SEQ ID NO：46、47、48、49或55中任一种的轻链DNA序列；或具有75％或更高同一性的变体重链或轻链。
18.权利要求16的核酸分子，其中所述DNA序列编码具有以下Kabat取代的重链或轻链：
(i)所述重链中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100BI、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N或V102S；和/或
(ii)所述重链中的G55D、G55L、G55S、G55T或G55V；和/或
(iii)所述轻链中的C91S。
19.包含权利要求16-18中任一项所定义的核酸分子的表达载体。
20.包含权利要求19中所定义的表达载体的重组宿主细胞。
21.用于制备权利要求1-15中任一项所定义的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求20的宿主细胞及回收所述抗原结合蛋白的步骤。
22.包含权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白及药用载体的药物组合物。
23.治疗罹患降低肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能中任一种或组合的疾病的受试者的方法，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
24.治疗罹患以下疾病的受试者的方法：少肌症、恶病质、肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩、HIV、AIDS、癌症、外科手术、烧伤、肌肉骨头或神经创伤或损伤、肥胖症、糖尿病(包括II型糖尿病)、关节炎、慢性肾衰竭(CRF)、末期肾病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、选择性关节修复、多发性硬化病(MS)、中风、肌营养不良症、运动神经元神经病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨质疏松症、骨关节炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、库欣病、急性呼吸窘迫综合征、类固醇诱导的肌肉萎缩、肌炎或脊柱侧凸，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
25.在受试者中增加肌肉质量、增加肌肉力量和/或改进肌肉功能的方法，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的抗原结合蛋白或权利要求22的组合物的步骤。
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