NL1026776C2

NL1026776C2 - Antilichamen tegen c-MET.

Info

Publication number: NL1026776C2
Application number: NL1026776A
Authority: NL
Inventors: Vahe Bedian; Larry L Green; Xiao-Chi Jia; Neil R Michaud; Shama Kajiji; Gary Borzillo; Kevin Coleman
Original assignee: Pfizer Prod Inc; Abgenix
Priority date: 2003-08-04
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2005-08-02
Also published as: US20050054019A1; JP2007501013A; EP1660127A4; TW200523269A; US7498420B2; US20140086914A1; EP1660127A1; GB0417384D0; US8821869B2; US8562985B2; NL1026776A1; HN2004000285A; WO2005016382A1; US8163280B2; GB2404660A; US20100040629A1; PA8608401A1; GT200400149A; BRPI0413272A; UY28453A1

Description

Antilichamen tegen c-MET Achtergrond van de uitvinding S [0001] Hepatocyt groeifactor (HGF), ook bekend als verstrooiingsfactor, is een multifunctionele groeifactor die transformatie en het ontwikkelen van tumoren bevordert door het induceren van mitogenese en celmotiliteit Verder bevordert HGF metastase door het stimuleren van celmotiliteit en invasie door diverse signalerende routes.

10 [0002] Teneinde cellulaire effecten te produceren, moet HGF binden aan zijn receptor, c-Met, een receptor tyrosinekinase. c-Met is een breed tot expressie gebracht heterodimeer proteïne bestaande uit een 50 kilodalton (kDa) a-subeenheid en een 145 kDa β-subeenheid (Maggioraet al., .J CellFysiol, 173:183-186 (1997)). De c-Met β-subeenheid omvat het tyrosine kinase domein en twee l s autofosfoiylatieplaatsen, Y1349 en Y1356, die kritisch zijn voor de transmissie van het HGF signaal (Maggiora et al., J Cell Fysiol, 173:183-186 (1997); Ponzetto et al., Cell, 77:2610271 (1994); Mainaet al., Cell, 87:531-542 (1996)).

[0003] HGF binding aan c-Met resulteert in activering van een aantal signaleringsroutes die resulteren in diverse celactiviteiten die geassocieerd worden 20 met ziekten zoals kanker. Deze omvatten het bevorderen van mitogenese, celoverleving, celmotiliteit, invasie van de extracellulaire matrix (ECM), angiogenese en metastase, die allemaal activiteiten zijn die transformatie en progressie van ziekte bevorderen (JefFers et al., .J Mol. Med., 74:505-513 (1996); Amicone et al., EMBO J, 16:495-503 (1997); Matsumoto enNakamura, Biochem.

25 Biofys. Res.Comm., 239:639-644 (1997); Corps et al., Int J Cancer, 73:151-155 (1997)). Expressie of overexpressie van zowel HGF als c-Met kan resulteren in morfologische transformatie en tumorigeniciteit van diverse celtypen (Jeffers et al., J. Mol. Med., 74:505-513 (1996). HGF en c-Met expressie of overexpressie bevorderen ook mitogenese en verankering onafhankelijke groei (Rubin et al., Proc. 30 Natl Acad. Sci. USA, 88:514-419 (1991); Kan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:331-337 (1991). Vooral is invasie van de ECM gerapporteerd wanneer activering van c-Met de expressie veroorzaakt van proteasen, zoals urokinase-achtige plasminogeen activator en collegenase, hetgeen het cellen toestaat 1026776- I 2

I om af te breken en een invasie te plegen van lokaal weefsel (Jeffers et al., .J. Mol. I

I Med, 74:505-513(1996). Verder maken diverse tumoren die alleen c-Met en niet I

I HGF tot expressie of overexpressie brengen, gebruik van een paracrien in plaats van I

I een autocrien signaleringsmechanisme voor het ondersteunen van tumorgenese I

I 5 (Beviglio et al., Int J..: Caneer, 74:301-309 (1997).

I [0004] HGF en c-Met zijn ook geïmpliceerd in de etiologie van vele humane I kankers. Samengaande expressie of overexpressie van HGF en c-Met is I waargenomen in borst carcinomen (Nagy et al., Surg. Qncol., 5:15-21 (1996); Tuck I et al., Am. .J. Pathol., 148:225-232 (1996), pancreas carcinomen (Ebert et al., I 10 Caneer Res., 54: 5775-5778 (1994), orale squamose cel carcinomen (Marshall en

Komberg, Laryngoscope, 108:1413-1417 (1998), glioma’s (Koochekpour et al., I CancerRes., 57:5391-5398(1997), en kwaadaardige pleurale mesotheliomen I (Tolpay et al., J. CancerRes. Clin. Oncol., 124:291-296 (1998); Klominek et al. Intl.

I J. Caneer, 76:240-249 (1998)). Bovendien kan overproductie van c-Met belangrijk I 1 s zijn in de ontwikkeling van andere tumoren waarin een rol voor HGF nog hard I gemaakt dient te worden. Deze kankers omvatten hepatocellulair carcinoom (Suzuki I et al. Hepatolögy, 20:1231-1236 (1996), renale cel carcinoom (Natali et al., Intl. J.

I Caneer, 69:212-217 (1996), long carcinoom (Harvey et al., J. Pathol., 180:389-394 I (1996), eierstok kanker (Nagy et al., J.Surg. Oncol., 60:95-99(1995), gastris I 20 carcinoom (Taniguchi et al., Caneer, 82:2112-2122 (1998), en colorectaal carcinoom I (Hiscox et al., Cancerlnvest, 15:513-521 (1997). Bovendien zijn kiemlijn en I somatische mutaties die de c-Met receptor activeren in de afwezigheid van HGF in I individuen met papilaire renale carcinomen gerapporteerd. (Schmidt et al., Nat I Genet, 16:68- 73 (1997); Jeffers et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94:11445-11450 25 (1997)). Andere carcinomen, waaronder die van de maag, rectum, long, pancreas, I borst, en galleiders zijn waargenomen in individuen met c-Met dat activerende I mutaties bevat (Zbar et al., J. Urol., 151:561-566 (1994).

[0005] Een strategie voor het inhibiteren van c Met binding is noodzakelijk voor het I voorkomen van activering van routes die leiden tot ziekten zoals kanker. C-Met I 30 functie kan bijdragen aan c-Met activering en/of HGF-geïnduceerde biologische I reeponsen (Date et al., FEBS Letters, 420:1-6 (1997); (Kaji et al, Caneer Gene Ther., I 1026776- 3 3:393-404 (1996); (Li et al., Clin. Exp. Metastasis, 16:74-82 (1998)) en daarom tumor progressie inhibiteren. Hoewel muizen anti-c-Met monoklonale antilichamen met anti-mitogene activiteit in cel cultuur gerapporteerd zijn (US 5646036, US 6207152, US 6214344), kan een muizen antilichaam niet eenvoudig toegepast 5 worden voor het behandelen van menselijke patiënten. Aldus is er een behoefte aan verbeterde samenstellingen die c-Met binden en die bijvoorbeeld gebruikt kunnen worden voor het inhibiteren van HGF- en c-Met-afhankelijke tumorgroei door het inhibiteren van mitogenese, invasie, metastase,en/of overleving.

10 Samenvatting van de uitvinding

[0006] De onderhavige uitvinding voorziet in een geïsoleerd antilichaam of antigen bindend deel daarvan dat specifiek c-Met bindt en voornamelijk werkt als een c-Met antagonist, en, in sommige gevallen als een c-Met agonist antilichaam en IS samenstellingen die dit antilichaam of dit deel omvatten._

[0007] De uitvinding voorziet in een samenstelling omvattende de zware en/of lichte keten, de variabele domeinen daarvan, of antigenbindende delen daarvan een anti-c-Met antilichaam, of nucleühezuurmoleculen die coderen voor een antilichaam, antilichaam keten of variabel domein daarvan van de uitvinding en een farmaceutisch 20 aanvaardbare drager. Samenstellingen van de uitvinding kunnen verder een andere component omvatten, zoals een therapeutisch middel of een diagnostisch middel. In diagnostische en therapeutische methoden wordt ook voorzien door de uitvinding.

[0008] De uitvinding voorziet verder in een geïsoleerde cellijn, die een anti-c-Met antilichaam of een antigenbindend deel daarvan produceert 25 [0009] De uitvinding voorziet ook in nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de zware en/of lichte keten van een anti-c-Met antilichaam, de variabele domeinen daarvan of antigenbindende delen daarvan.

[0010] De uitvinding voorziet in vectoren en gastheercellen omvattende de nucleïnezuurmoleculen, evenals methoden voor het door recombinante technieken 30 produceren van de polypeptiden waarvoor de nucleïnezuurmoleculen coderen.

1026776-

I 4 I

I [OOI 1] In niet humane transgene dieren of planten die de zware en/of lichte keten of I

I antigenbindende delen daarvan, van een anti-c-Met antilichaam produceren wordt I

I ook voorzien. I

I 5 Korte beschrijving van de tekeningen I

I [0012] Figuren 1A en 1B tonen dat de anti-c-Met antilichamen ligand binding aan I

I een geïsoleerd c-Met ECD/Fc proteïne inhibiteren en inhibiteert c-Met fosforylering I

I in cellen na stimulatie met HGF. I

I 10 [0013] Figuur IA is een grafiek die inhibitie van ligandbinding met anti-c-Met I

I monoklonale antilichamen van de uitvinding illustreert Anti-c-Met monoklonale I

I antilichamen 13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T en 13.3.2 binden aan de c-Met receptor I

I en inhibiteren HGF binding. I

I [0014] Figuur 1B is een grafiek die inhibitie in een c-Met fosfoiylatie ELISA I

I 15 illustreert. Anti-c-Met monoklonale antilichamen 13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T en I

I 13.3.2 inhibiteren c-Met tyrosine fosforylering, zoals gemeten door een c-Met I

I fosforylering ELISA, in cellen na stimulering met HGF. I

I [0015] Figuur 2 is een grafiek die anti-c-Met monoklonale antilichaam specificiteit I

I illustreert. Anti-IGF-IR monoklonale antilichamen 2.13.2 en 2.12.1 binden aan IGF- I

I 20 IR en veroorzaken een afname in tyrosine fosforylering van het IGF-IR na I

I behandeling met IGF-1. Anti-c-Met antilichamen 9.1.2 en 13.3.2 binden niet aan I

I IGF-IR, zelfs niet bij hoge concentraties antilichaam, en veroorzaken geen afname in I

I tyrosine fosforylering van het IGF-1R. I

I [00016] Figuur 3 A-3H zijn sequentieuitlijningen van de voorspelde I

I 25 aminozuursequenties van lichte en zware keten variabele domeinen uit vier anti-c- I

I Met antilichamen vergeleken met de kiemlijn aminozuursequenties van de I

I corresponderende humane genen. Verschillen tussen de antilichaamsequenties en de I

I kiemlijnsequentie zijn geïndiceerd door beschaduwen van de antilichaamsequenties. I

I De onderstreepte sequenties in elke uitlijning staan voor, van links naar rechts, de I

I 30 kiemlijnsignaalpeptide, CDR1, CDR2, en CDR3 sequenties. I

I 1026776- 5

[0017] Figuur 3A toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de lichte keten voor antilichaam 13.3.2 (SEQ ED NO: 4, waarin X8 alanine is) en de 13.3.2L-A91 T (SEQ Π) NO: 4, waarin Xg threonine is) variant tegen de kiemlijn LSVkI, Jk4 sequentie (SEQ ED NÓ: 17).

5 [0018] Figuur 3B toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de lichte keten voor antilichaam 9.1.2 (SEQ ID NO: 8) tegen de kiemlijnA27Vic3, Jk2 sequentie (SEQ ED NO: 18).

[0019] Figuur 3C toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de lichte keten voor antilichaam 8.70.2 (SEQ Π) NO: 12) tegen de kiemlijn L5Vk1 , Jk3 10 sequentie (SEQ ED NO: 19).

[0020] Figuur 3D toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de |

lichte keten voor antilichaam 8.90.3 (SEQ ID NO: 16) tegen de kiemlijn LSVkI, JkI

sequentie (SEQ ID NO: 20).

[0021] Figuur 3E toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de 15 lichte keten voor antilichaam 13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X4 is serine en X« is alanine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine en X6 is alanine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ Π) NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine en Xe is alanine); 13.3.2H-A14P (SEQ ED NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X« is serine en Xe is proline); 13.3.2H-A14P, E42K (SEQ ED NO: 2, 20 waarin X2 lysine is, Xe is serine en X6 is proline); en 13.3.2H-A14P, E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, is threonine en Xe is proline) tegen de kiemlijn VH1-18, D2-1S, J^b sequentie (SEQ ID NO: 21).

[0022] Figuur 3F toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de lichte keten voor antilichaam 9.1.2 (SEQ ID NO: 6) tegen de kiemlijn VH 4-31, D2-2, 25 D7-27, JH6b sequentie (SEQ ID NO: 22).

[0023] Figuur 3G toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de lichte keten voor antilichaam 8.70.2 (SEQ ID NO: 10) tegen de kiemlijn VH 4-39, D2- 2, J,j4b sequentie (SEQ ED NO: 23).

[0024] Figuur 3H toont een uitlijning van de voorspelde aminozuursequentie van de 30 lichte keten voor antilichaam 8.90.3 (SEQ ED NO: 14) tegen de kiemlijn VH 3-48,4- 17, Jn4b sequentie (SEQ ID NO: 24).

1026776- I 6

I [0025] Figuur 4A-4E tonen dat anti-c-Met antilichamen tumorgroei in vivo I

I inhibiteren. De pijlen langs de x-as staan voor toegediende doseringen anti-c-Met I

I antilichaam. I

I [0026] Figuur 4A toont de resultaten van een experiment dat demonstreert dat anti-c- I

I 5 Met antilichamen de groei inhibiteren van 3T3-S114 tumoren. I

I [0027] Figuur 4B toont de resultaten van een experiment dat demonstreert dat anti-c- I

I Met antilichamen de groei inhibiteren van U87 tumoren. I

I [0028] Figuur 4C toont de resultaten van een experiment dat demonstreert dat anti-c- I

I Met antilichamen de groei inhibiteren van A549 tumoren. I

I 10 [0029] Figuur 4D toont de resultaten van een experiment dat demonstreert dat anti-c-

I Met antilichamen de groei inhibiteren van GTL-16 tumoren. I

I [0030] Figuur 4E toont de resultaten van een experiment dat demonstreert dat anti-c- I

I Met antilichaam 13.32L-A91T, H-E42K, S97T de groei inhibiteert van U87 tumoren I

I in een dosering afhankelijke manier. I

I 15 [0031] Figuur 5 toont de relatie tussen anti-c-Met antilichaam 13.3.2L-A91 T, Η- I

I E42K, S97T serum niveaus en inhibitie van c-Met activiteit Figuur 5 toont ook de

relatie tussen anti-c-Met antilichaam 13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T serum niveaus I

I en c-Met neerregulering in U87 tumoren. I

I [0031a] Figuren 6A-6p zijn zware en lichte keten nucleotiden van volledige lengte en I

I 20 voorspelde aminozuursequenties van vier anti-c-Met antilichamen. Het I

signaalpeptide voor elke zware of lichte keten sequentie is aangegeven door onderstreepte kleine letters. De CDR1, CDR2 en CDR3 sequenties voor elke zware

I of lichte keten zijn aangegeven door onderstreepte hoofdletters. Het variabele domein I

voor elke sequentie is aangegeven door hoofdletters. De constante regio voor elke 25 sequentie is aangegeven door kleine letters.

[0031b] Figuur 6A toont de 13.3.2 zware keten DNA sequentie (SEQID NO:l).

I [003 lc] Figuur 6B toont de 13.3.2 zware keten proteïnesequentie (SEQ ID NO:2).

I [003ld] Figuur 6C toont de 13.3.2 lichte keten [kappa keten] DNA sequentie (SEQ

I ID NO:3).

I 30 [0031e] Figuur 6D toont de 13.3.2 lichte keten [kappa keten] proteïnesequentie (SEQ

I ID NO:4).

I 1026776- 7 [0031 f] Figuur 6E toont de 9.1.2 zware keten DNA sequentie (SEQ Π) NO:5).

[0031 g] Figuur 6F toont de 9.1.2 zware keten proteïnesequentie (SEQ ID NO:6).

[0031h] Figuur 6G toont de 9.1.2 lichte keten [kappa keten] DNA sequentie (SEQ JD NO:7).

5 [0031 i] Figuur 6H toont de 9.1.2 lichte keten [kappa keten] proteïnesequentie (SEQ

ID NO:8).

[003 lj] Figuur 61 toont de 8.70.2 zware keten DNA sequentie (SEQ ID NO:9).

[003 lk] Figuur 6J toont de 8.70.2 zware keten proteïnesequentie (SEQ ID NO:10). [00311] Figuur 6K toont de 8.70.2 lichte keten [kappa keten] DNA sequentie (SEQ 10 IDNO:ll).

[003lm] Figuur 6L toont de 8.70.2 lichte keten [kappa keten] proteïnesequentie (SEQ Π) NO: 12).

[003 ln] Figuur 6M toont de 8.90.3 zware keten DNA sequentie (SEQ ID NO: 13). [0031 o] Figuur 6N toont de 8.90.3 zware keten proteïnesequentie (SEQ ID NO: 14).

15 [003 lp] Figuur 60 toont de 8.90.3 lichte keten [kappa keten] DNA sequentie (SEQ

IDNO:15).

[003 lq] Figuur 6P toont de 8.90.3 lichte keten [kappa keten] proteïnesequentie (SEQ IDNO:16).

20 Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

Definities en algemene technieken

[0032] Tenzij hierin anderszins gedefinieerd, zullen wetenschappelijke en technische 25 termen die gebruikt worden in samenhang met de onderhavige uitvinding de betekenissen hebben die gewoonlijk begrepen worden door zij met gebruikelijke bekwaamheid in het vakgebied. Verder, tenzij anderszins vereist door de context, zullen enkelvoudige termen meervouden omvatten en meervoudige termen zullen het enkelvoud omvatten. In het algemeen zijn nomenclaturen die gebruikt worden in 30 samenhang met, en technieken van, cel en weefselcultuur, moleculaire biologie, immunologie, microbiologie, genetica en proteïne· en nucleïnezuurchemie en 1026776- I 8 I hybridisatie zoals hierin beschreven, die welke goed bekend zijn en algemeen I toegepast worden in het vakgebied.

I [0033] De methoden en technieken van de onderhavige uitvinding worden in het I algemeen uitgevoerd volgens conventionele methoden die goed bekend zijn in het I 5 vakgebied en zoals beschreven in diverse algemene en meer specifieke referenties die I geciteerd en beschreven zijn in de gehele onderhavige beschrijving, tenzij anders I aangegeven. Zie bijvoorbeeld Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratoiy I Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

I (1989) en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing I 10 Associates (1992), en Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual. Cold

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), hierin door I middel van referentie ingevoegd. Enzymatische reacties en zuiveringstechnieken zijn I uitgevoerd volgens de specificaties van de fabrikant, zoals gewoonlijk uitgevoerd in I het vakgebied of zoals hierin beschreven. De nomenclatuur die gebruikt is in I IS samenhang met, en de laboratoriumprocedures en technieken van, analytische I chemie, organisch synthetische chemie en medicinale en farmaceutische chemie I zoals hierin beschreven zijn allen goed bekend en algemeen toegepast in het I vakgebied. Standaardtechnieken zijn gebruikt voor chemische synthesen, chemische I analyses, farmaceutische bereiding, formulering en afgifte, en voor de behandeling 20 van patiënten.

I [0034] De volgende termen zullen, tenzij anderszins aangegeven, begrepen worden I als hebbend de volgende betekeningen: I [0035] De term "polypeptide" omvat natieve of kunstmatige proteïnen, proteïne I fragmenten en polypeptide analogen van een proteïnesequentie. Een polypeptide kan I 25 monomeer of polymeer zijn.

I [0036] De term "geïsoleerd proteïne", "geïsoleerd polypeptide" of "geïsoleerd I antilichaam" is een proteïne, polypeptide of antilichaam dat dankzij zijn oorsprong of I derivatiebron (1) niet geassocieerd is met van nature geassocieerde componenten die het vergezellen in zijn natieve staat, (2) vrij is van andere proteïnen van hetzelfde I 30 soort, (3) tot expressie is gebracht door een cel van een ander soort of ( 4) niet in de I natuur voorkomt Aldus is een polypeptide dat chemisch gesynthetiseerd is of I 1026776- 9 gesynthetiseerd in een cellulair systeem dat afwijkt van de cel waar het van nature van afkomt, "geïsoleerd" van zijn van nature geassocieerde componenten. Een proteïne kan ook substantieel vrij gemaakt worden van van nature geassocieerde componenten door isolatie, gebruikmakend van proteïne zuiveringstechnieken die 5 goed bekend zijn in het vakgebied.

[0037] Voorbeelden van geïsoleerde antilichamen omvatten een anti-c-Met antilichaam dat op affiniteit is gezuiverd gebruikmakend van c-Met, een anti-c-Met antilichaam dat gesynthetiseerd is door een hybridoma of andere cellijn in vitro, en een humaan anti-c-Met antilichaam dat afkomstig is uit een transgene muis.

10 [0038] Een proteïne of polypeptide is "substantieel zuiver", "substantieel homogeen" of "substantieel gezuiverd” wanneer tenminste ongeveer 60 tot 75 % van een monster een enkele verbinding van een polypeptide vertoont Het polypeptide of proteïne kan monomeer of multimeer zijn. een substantieel zuiver polypeptide of proteïne zal typerend ongeveer 50 %, 60 %, 70 %, 80 % of 90 % W/W van een proteïnemonster 15 uitmakend, gewoonlijker ongeveer 95 %, en zal bij voorkeur meer dan 99 % zuiver zijn. Proteïne zuiverheid of homogeniciteit kan geïndiceerd worden door een aantal middelen die goed bekend zijn in het vakgebied, zoals polyaciylamidegel elektroforese van een proteïnemonster, gevolgd door het visualiseren van een enkele polypeptideband bij kleuring van de gel met een kleurmiddel dat goed bekend is in 20 het vakgebied. Voor zekere doelen kan een hogere resolutie verkregen worden door gebruik te maken van HPLC of andere middelen die goed bekend zijn in het vakgebied voor zuivering.

[0039] De term "polypeptide fragment" zoals hierin gebruikt verwijst naar een polypeptide dat een amigoterminale en/of carboxyterminale weglating heeft, maar 25 waar de overgebleven aminozuursequentie identiek is met de corresponderende posities in de van nature optredende sequentie. In sommige uitvoeringsvormen zijn fragmenten tenminste 5,6,8 of 10 aminozuren lang. In andere uitvoeringsvormen zijn de fragmenten tenminste 14, tenminste 20, tenminste 50, of tenminste 70,80,90, 100,150 of200 aminozuren lang.

30 [0040] De term "polypeptide analoog" zoals hierin gebruikt verwijst naar een polypeptide dat een segment omvat dat een substantiële identiteit heeft met een deel 1026776-

I 10 I

I van een aminozuursequentie en dat tenminste een van de volgende eigenschappen I

I heeft: (1) specifieke binding aan c-Met onder geschikte bindingscondities, (2) het I

I vermogen om c-Met de inhibiteren of te activeren. Typerend omvatten polypeptide I

I analogen een conservatieve aminozuur substitutie (of insertie of wegneming) met I

I 5 betrekking tot de natieve sequentie. Analogen zijn typerend tenminste 20 of 25 I

I aminozuren lang, bij voorkeur tenminste 50,60,70,80,90,100,150 of200 I

I aminozuren lang of langer, en kunnen vaak zo lang zijn als een polypeptide van I

I volledige lengte. Sommige uitvoeringsvormen van de uitvinding omvatten

I polypeptide fragmenten of polypeptide analoge antilichamen met 1,2,3,4,5,6,7,8, I

I 10 9,10,11,12,13,14,15,16 of 17 substituties van de kiemlijn aminozuursequentie. I

I [0041] In zekere uitvoeringsvormen zijn aminozuursubstituties aan een anti-c-Met I

I antilichaam of antigenbindend deel daarvan die welke: (1) de vatbaarheid voor I

I proteolyse verminderen, (2) de vatbaarheid voor oxidatie verminderen, (3) de I

I bindingsaffiniteit voor het vormen van proteïnecomplexen veranderen, en (4) fysisch I

I 15 chemische of functionele eigenschappen van zulke analogen verlenen of modificeren, I

maar toch de specifieke binding aan c-Met behouden. Analogen kunnen diverse I

mutemen van een sequentie anders dat de normaal voorkomende peptide sequentie I

I omvatten. Bijvoorbeeld enkele of meervoudige aminozuursubstituties, bij voorkeur I

I conservatieve aminozuursubstituties, kunnen gemaakt worden in de normaal I

I 20 voorkomende sequentie, bij voorkeur in het deel van het polypeptide buiten het I

I domein (de domeinen) die intermoleculaire contacten vormen. Een conservatieve I

I aminozuursubstitutie dient de structurele karakteristieken van de uitgangssequentie I

I niet substantieel te veranderen, dus een vervangend aminozuur dient het anti- I

I parallelle β-vel dat het immunoglobuline bindingsdomein vormt niet te veranderen I

I 25 dat voorkomt in de uitgangssequentie, of andere typen van secondaire structuur te I

I verstoren die de uitgangssequentie karakteriseert. In het algemeen zouden glycine en I

I praline niet gebruikt worden in een anti-parallel β-vel. Voorbeelden van in het vak I

I erkende secundaire en tertiaire polypeptidestructuren zijn beschreven in Proteins, I

I Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, I

I 30 New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., I

I 1026776- 11

Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); en Thomton et al., Nature 354:105 (1991), hierin opgenomen door middel van referentie.

[0042] Niet-peptide analogen worden gewoonlijk gebruik in de farmaceutische industrie als middelen met eigenschappen die analoog zijn aan die van het mal- 5 peptide. Deze typen van niet-peptide verbinding worden aangeduid als "peptide nabootsers" of "peptidomimetica". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber en Freidinger, TINS p.392 (1985); en Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), hierin opgenomen door middel van referentie. Zulke verbindingen worden vaak ontwikkeld met behulp van gecomputeriseerde ‘molecular modeling’. Peptide 10 mimetica die structureel overeenstemmend zijn met therapeutisch bruikbare peptiden kunnen gebruikt worden voor het produceren van een equivalent therapeutisch of profylactisch effect In het algemeen zijn peptidomimetica structureel overenstemmend met een paradigma polypeptide (zoals een polypeptide dat een gewenste biochemische eigenschap of een farmacologische activiteit heeft), zoals een 15 menselijk antilichaam, maar hebben een of meerdere peptidebanden optioneel vervangen door een band gekozen uit de groep bestaande uit: —CH2NH-~, —CH2S—, --CH2-CH2-, ~CH=CH-(cis en trans), ~COCH2-, ~CH(OH)CH2~, en -CH2SO-, volgens methoden die goed bekend zijn in het vakgebied. Systematische substitutie van een of meerdere aminozuren van een consensussequentie met een D-aminozuur 20 van hetzelfde type (dus D-lysine in plaats van L-lysine) kan ook gebruikt worden voor het genereren van stabielere peptiden. Bovendien kunnen beperkte peptiden omvattende een consensussequentie of een substantieel identieke consensussequentie variatie gevormd worden door middel van methoden die bekend zijn in het vakgebied (Rizo en Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), hierin ingevoegd door 25 middel van referentie); bijvoorbeeld door het toevoegen van interne cystetoe residuen die in staat zijn oim intramoleculaire disulfide bruggen te vormen, die het peptide cycliseren.

[0043] Waar hierin verwezen wordt naar een "antilichaam" met betrekking tot de uitvinding, wordt dit normaal gesproken opgevat dat ook een antigen bindend deel 30 daarvan gebruikt kan worden. Een antigenbindend deel concurreert met het intacte antilichaam voor specifieke binding. Zie in het algemeen Fundamental Immunology, 1026776-

I 12 I

hoofdstuk 1 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (hierin in zijn geheel I voor alle doelen ingevoegd door middel van referentie). Antigenbindende delen I kunnen geproduceerd worden door middel van recombinant DNA technieken of door I enzymatische of chemische klieving van intacte antilichamen. In sommige 5 uitvoeringsvoorbeelden omvatten de antigenbindende delen Fab, Fab', F(ab*) 2, Fd, I Fv, dAb, en complementaire bepalende regio (CDR) fragmenten, enkele keten antilichamen (scFv), chimaere antilichamen, dialichamen en polypeptiden die I tenminste een deel van een antilichaam bevatten dat voldoende is om specifieke antigenbinding te verlenen aan het polypeptide.

I 10 [0044] Van N-terminus naar C-terminus, omvatten zowel de gerijpte lichte als zware I keten variabele domeinen de regionen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 en FR4.

I De toekenning van aminozuren aan elk domein hierin is in overeenstemming met de I definities van Kabat, Seguences of Proteins oflmmunological Interest (National I InstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1987en 1991», Chothia & Lesk, .J. Mol. Biol.

I IS 196:901-917 (1987) of Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

I [0045] Zoals hierin gebruikt, is een antilichaam dat aangeduid wordt door een getal hetzelfde als een monoklonaal antilichaam dat verkregen is uit het hybridoma met I hetzelfde getal. Bijvoorbeeld monoklonaal antilichaam 13.32 is hetzelfde I antilichaam als een dat verkregen is van hybridoma 13.32, of een subkloon daarvan.

20 [0046] Zoals hierin gebruikt, betekent een Fd fragment een antilichaamfragment dat

I bestaat uit de VH en ChI domeinen; een Fv fragment bestaat uit de VL en VH

domeinen van een enkele arm van een antilichaam; en een dAb fragment (Ward et I al., Nature 341:544-546 (1989)) bestaat uit een VH domein.

[0047] In sommige uitvoeringsvormen is het antilichaam een enkele keten I 25 antilichaam (scFv) waarin een VL en VH domein gepaard zijn om een monovalent molecule te vormen via een synthetische verbinder die het ze mogelijk maakt om als I een enkele proteïheketen tot expressie gebracht te worden. (Bird et al., Science I 242:423-426 (1988) en Ruston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 I (1988». In sommige uitvoeringsvoorbeelden zijn de antilichamen dialichamen, dus I 30 ze zijn bivalente antilichamen waarin VH en VL domeinen tot expressie gebracht zijn op een enkele polypeptide keten, maar gebruikmakend van een linker die te kort is I 1026776- 13 om paring tussen de twee domeinen op dezelfde keten mogelijk te maken, waardoor de domeinen geforceerd worden om te paren met complementaire domeinen van een andere keten en twee antigenbindingsplaatsen gevormd worden. (Zie bijvoorbeeld Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), en Poljak R. J. et 5 al., Structure 2:1121-1123 (1994).) In sommige uitvoeringsvormen kunnen een of meerdere CDR’s van een antilichaam van de uitvinding opgenomen worden in een molecule, covalent of niet covalent, om het een immunohechtmiddel te maken dat specifiek bindt aan c-Met. In zulke uitvoeringsvormen kan (kunnen) de CDR(s) opgenomen zijn als een deel van een langere polypeptide keten, kunnen covalent 10 verbonden zijn aan een andere polypeptideketen, of kunnen niet covalent opgenomen zijn.

[0048] In uitvoeringsvormen met een of meerdere bindingsplaatsen kunnen de bindingsplaatsen identiek aan elkaar zijn of ze kunnen verschillend zijn.

[0049] Zoals hierin gebruikt, betekent de term "humaan antilichaam" elk antilichaam IS waarin de variabele- en constantedomein sequenties humane sequenties zijn. De term omvat antilichamen met sequenties die afgeleid zijn van humane genen, maar die veranderd zijn, bijvoorbeeld om mogelijke immunogeniciteit te verminderen, affiniteit te verhogen, cysteïnen te verwijderen die ongewenste vouwing zouden kunnen veroorzaken et cetera. De term omvat zulke antilichamen die door 20 recombinante technieken in niet-humane cellen zijn geproduceerd, die glycosylering kunnen verlenen die niet typerend is voor humane cellen. Deze antilichamen kunnen in een veelheid aan manieren bereid zijn, zoals hieronder beschreven.

[0050] De term "chimaer antilichaam" zoals hierin gebruikt betekent een antilichaam dat regionen omvat van twee of meerdere verschillende antilichamen. In een 25 uitvoeringsvorm zijn een of meer van de CDR’s van het chimaere antilichaam afgeleid van een humaan anti-c-Met antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm zijn al de CDR’s afgeleid van een humaan anti-c-Met antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm worden de CDR’s van meer dan een humaan anti-c-Met antilichaam gecombineerd in een chimaer antilichaam. Bijvoorbeeld kan een chimaer antilichaam 30 een CDR1 omvatten van de lichte keten van een eerste humaan anti-c-Met antilichaam, een CDR2 van de lichte keten van een tweede humaan anti-c-Met 1026776-

I 14 I

I antilichaam en een CDR3 van de lichte keten van een dode humaan anti-c-Met I

I antilichaam, en CDR’s van de zware keten kunnen afgeleid worden van een of I

I meerdere andere anti-c-Met antilichamen. Verder kunnen de framewerk regionen I

afgeleid zijn van een van de anti-c-Met antilichamen waarvan een of meerdere van de I

I 5 CDR’s genomen zijn of van een of meerdere andere humane antilichamen. I

I [0051] In sommige uitvoeringsvormen is een chimaer antilichaam van de uitvinding I een gehumaniseerd anti-c-Met antilichaam. Een gehumaniseerd anti-c-Met I antilichaam van de uitvinding omvat de aminozuursequentie van een of meer I framewerk regionen en/of de aminozuursequentie van tenminste een deel van de I io constante regio van een of meer humane anti-c-Met antilichamen van de uitvinding I en CDR’s die afgeleid zijn van een niet-humaan anti-cMet antilichaam.

I [0052] Een "activerend antilichaam" (hierin ook aangeduid als een "agonist I antilichaam" zoals hierin gebruikt betekent een antilichaam dat een of meerdere c- I Met activiteiten vergroot met tenminste ongeveer 40 % indien toegevoegd aan een I 15 cel, weefsel of organisme dat c-Met tot expressie brengt. In sommige I uitvoeringsvormen activeert het antilichaam c-Met activiteit met tenminste 50 %, 60 I %, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% of meer dan 100%. In sommige I uitvoeringsvormen wordt het activerende antilichaam toegevoegd in de aanwezigheid I van HGF. In sommige uitvoeringsvormen vergroot een agonist antilichaam van de I 20 uitvinding tenminste een activiteit van c-Met tienvoudig.

I [0053] Fragmenten of analogen van antilichamen of immunoglobuline moleculen I kunnen gemakkelijk bereid worden door hen met gebruikelijke bekwaamheid in het I vakgebied door de leerstellingen van deze beschrijving te volgen. Voorkeurs amino- I en carboxy-termini van fragmenten of analogen komen voor nabij grenzen van I 25 functionele domeinen. Structurele en functionele domeinen kunnen geïdentificeerd I worden doorvergelijking van de nucleotide en/of aminozuursequentie gegevens met publieke of in eigendom zijnde sequentie databasen. Bij voorkeur worden I gecomputeriseerde vergelijkingsmethoden gebruikt voor het identificeren van sequentiemotieven of voorspelde protelhe conformatie domeinen die optreden in I 30 andere proteïnen van bekende structuur en/of functie. Methoden voor het identificeren van proteïnesequenties die vouwen tot een bekende driedimensionale I 1026776- 15 structuur zijn bekend. Zie Bowie et al., Science 253:164 (1991).

[0054] De term "oppervlakplasmon resonantie", zoals hierin gebruikt verwijst naar een optisch fenomeen dat analyse mogelijk maakt van real-time biospecifieke interacties door het detecteren van veranderingen in proteïneconcentraties in een 5 biosensormatrix, bijvoorbeeld gebruikmakend van het BIACORE™ systeem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Zweden en Piscataway, N.J.). Voor verdere beschrijvingen, zie Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit 8:125-131 (1995); en Johnsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277 (1991).

10 [0055] De term "KD" verwijst naar de evenwicht dissociatie constante van een bepaalde antilichaam-antigen interactie.

[0056] De term "epitoop" omvat elke proteïne determinant die in staat is om specifiek te binden aan een immunoglobuline of T -cel receptor of anderszins een interactie aan te gaan met een molecule. Epitopische determinanten bestaan in het IS algemeen uit chemische actieve oppervlak groepen van moleculen zoals aminozuren of koolhydraat of suiker zijketens en hebben in het algemeen specifieke driedemensionele structurelekarakteristieken, evenals specifieke ladingkarakteristieken. Een epitoop kan "lineair" of "conformationeer zijn. In een lineair epitoop komen al de interactiepunten tussen het proteïne en het een interactie 20 aangaande molecule (zoals een antilichaam) lineair voor langs de primaire aminozuursequentie van het proteïne. In een conformationeel epitoop komen de interactiepunten voor over verschillende aminozuurresiduen op het proteïne die van elkaar gescheiden zijn. Van een antilichaam wordt gezegd dat het specifiek bindt aan een antigen wanneer de dissociatieconstante ,</= 1 mM is, bij voorkeur </= 100 nM 25 en met grootste voorkeur <1= 10 nM. In zekere uitvoeringsvormen is de Kq 1 pM tot 500 pM. In andere uitvoeringsvormen is de Kq tussen 500 pM en 1 μΜ. In andere uitvoeringsvormen is de Kq tussen 1 μΜ en 100 nM. In andere uitvoeringsvormen is de Kq tussen 100 mM en 10 nM. Zodra een verlangd epitoop op een antigen bepaald is, is het mogelijk om antilichamen tegen dat epitoop te genereren, bijvoorbeeld 30 gebruikmakend van de technieken die beschreven zijn in de onderhavige uitvinding. Alternatief kan gedurende het ontdekkingsproces de vorming en karakterisatie van 1026776-

I 16 I

I antilichamen informatie opleveren over wenselijke epitopen. Uit deze informatie is I het dan mogelijk om antilichamen competitief te screenen voor binding aan hetzelfde I epitoop. Een benadering om dit te bereiken is het uitvoeren van kruis-concurrentie I studies voor het vinden van antilichamen die competitief binden met elkaar, dat wil I s zeggen, de antilichamen concurreren voor binding aan het antigen. Een proces met I hoge doorvoer voor het "binnen" van antilichamen gebaseerd op hun I kruisconcurrentie is beschreven in de internationale octrooiaanvrage WO 03/48731.

I [0057] Zoals hierin gebruikt, volgen de twintig conventionele aminozuren en hun I afkortingen het conventionele gebruik. Zie Immunology - A Synthesis (2* editie, I 10 E.S. Golub en D.R. Oren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), I hierin ingevoegd door middel van referentie.

I [0058] De term "polynucleotide" zoals hierin aangeduid betekent een polymere vorm I van nucleotiden van tenminste 10 basen lang, ribonucleotiden of deoxynucleotiden of I een gemodificeerde vorm van een van deze nucleotidetypen. De term omvat enkel en I 15 dubbelstrengse vormen.

I [0059] De term "geïsoleerd polymicleotide" zoals hierin gebruikt betekent een I polynucleotide van genomisch, cDNA, of synthetische oorsprong of een combinatie I daarvan, waarbij dankzij zijn oorsprong het "geïsoleerde polynucleotide" (1) niet I geassocieerd is met het gehele of een deel van een polynucleotiden waarmee het I 20 "geïsoleerde polynucleotide" in de natuur aangetroffen wordt, (2) functioneel I verbonden is met een polynucleotide waanneer het niet verbonden is in de natuur, of I (3) niet in de natuur voorkomt als deel van een grotere sequentie.

I [0060] De term "van nature voorkomende nucleotiden" zoals hierin gebruikt omvat I deoxyribonucleotiden en ribonucleotiden. De term "gemodificeerde nucleotiden zoals I 25 hierin gebruikt omvat nucleotiden met gemodificeerde of gesubstitueerde I suikergroepen en dergelijke. De term "oligonucleotide banden" zoals hierin verwezen I wordt omvat oligonucleotide bindingen zoals fosforthioaat, fosforodithioaat, I fosforoselenoaat, fosforodiselenoaat, fosforoanilothioaat, fosforaniladaat, I fosforoamidaat, en dergelijke. Zie bijvoorbeeld LaPlanche et al., Nucl. Acids Res.

I 30 14:9081 (1986); Stee et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl.

I Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon I 1 02 6776-' 17 et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); U.S. octrooischriit 5.151.510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), welke beschrijvingen hierbij ingevoegd zijn door middel van referentie. Een 5 oligonucleotide kan indien gewenst een detectielabel omvatten.

[0061] "Functioneel verbonden" sequenties omvatten zowel expressie controle sequenties die contiaanliggend zijn met het van belang zijnde gen als expressie controle sequenties die in trans werken of op een afstand om het van belang zijnde gen te controleren. De term "expressie controle sequentie” zoals hierin gebruikt 10 betekent polynucleotide sequenties die noodzakelijk zijn voor het effectueren van de expressie en de verwerking van coderende sequenties waarmee ze geligateerd zijn. Expressie controle sequenties omvatten geschikte transcriptie, initiatie, terminatie, promotor en versterker sequenties; efficiënte RNA verwerkingssingmalen zoals splicing en polyadenyleringssignalen; sequenties die cytoplasmisch mRNA 15 stabiliseren; sequenties die translatie efficiëntie versterken (zoals Kozak consensus sequentie); sequenties die proteïnestabiliteit versterken en, indien gewenst, sequenties die proteïne secretie versterken. De aard van zulke controlesequenties verschilt afhankelijk van het gastheer organisme; in prokaryoten omvatten zulke controle sequenties in het algemeen promotor, ribosomale bindingsplaats en 20 transcriptie terminatie sequentie; in eukaiyoten omvatten zulke controle sequenties in het algemeen promotoren en transcriptie terminatie sequentie. De term "controle sequenties" is bedoeld minimaal al de componenten te omvatten waarvan de aanwezigheid essentieel is voor expressie en verwerking en kan ook aanvullende componenten omvatten waarvan de aanwezigheid gunstig is, bijvoorbeeld leider 25 sequenties en fusie partner sequenties.

[0062] De term "vector" zoals hierin gebruikt, betekent een nucleïnezuurmolecule dat in staat is om een andere nucleïnezuur waarmee het verbonden is te transporteren. In sommige uitvoeringsvormen is de vector een plasmide, dus een circulair dubbelstrengs stuk DNA waarin aanvullende DNA segmenten geligeerd kunnen 30 worden. In sommige uitvoeringsvormen is de vector een virale vector, waarin aanvullende DNA segmenten geligeerd kunnen worden in het virale genoom. In 1026776- I 18 I sommige uitvoeringsvormen zijn de vectoren in staat tot autonome replicatie in een gastheercel waarin zij geïntroduceerd zijn (zoals bacteriële vectoren met een I bacteriële replicatieoorsprong en episomale zoogdierlijke vectoren). In andere I uitvoeringsvormen kunnen de vectoren (bijvoorbeeld niet episomale zoogdierlijke S vectoren) geïntegreerd worden in het genoom van een gastheercel bij introductie in de gastheercel en daarbij gerepliceerd worden tezamen met het genoom van (te I gastheer. Verder zijn zekere vectoren in staat om de expressie van genen waarmee ze I functioneel verbonden zijn te sturen. Zulke vectoren worden hierin aangeduid als I "recombinante expressievectoren" (of eenvoudigweg als "expressie vectoren").

I 10 [0063] De term "recombinante gastheercel" (of eenvoudigweg "gastheercel"), zoals I hierin gebruikt, betekent een cel waarin een recombinante expressievector I geïntroduceerd is. Het dient begrepen te worden dat "recombinante gastheercel" en I "gastheercel" niet alleen de de bepaalde onderhavige cel betekenen, maar ook het I nageslacht van zulk een cel. Aangezien zekere modificaties kunnen optreden in I is opvolgende generaties als gevolg van mutatie of milieuinvloeden, kan het zijn dat I zulk nageslacht feitelijk niet identiek is met de uitgangscel, maar ze zijn nog steeds I inbegrepen binnen de reikwijdte van de term "gastheercel" zoals hierin gebruikt I [0064] De term "selectief hybridiseren" zoals hierin aangeduid betekent het I detecteerbaar en specifiek binden. Polynucleotiden, oligonucleotiden en fragmenten 20 daarvan volgens de uitvinding hybridiseren selectief aan nucleïnezuurstrengen onder I hybridisatie en wassing condities die waarneembare hoeveelheden detecteerbare I binding aan niet specifieke nucleïnezuren minimaliseren. "Hoge stringentie" of "sterk I stringente" condities kunnen gebruikt worden voor het bereiken van selectieve I hybridisatiecondities zoals bekend si in het vakgebied en hierin beschreven is. Hen I 25 voorbeeld van "hoge stringentie” of "sterk stringente" condities is de incubatie van I een polynucleotide met een ander polynucleotide, waarin een polynucleotide gehecht I kan zijn aan een vast oppervlak zoals een membraan, in een hybridisatiebuffer van I 6X SSPE of SSC, 50% formamide, 5X Denhardfs reagens, 0,5% SDS, 100 pg/ml gedenatureerd, gefragmenteerd zalmsperma DNA bij een hybridisatietemperatuur

I 30 van 42 *C gedurende 12-16 uur, gevolgd door tweemaal wassen bij 55 ’C

I 1026776- 19 gebruikmakend van een wasbuffer van IX SSC, 0,5% SDS. Zie ook Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55.

[0065] De term "procent sequentie identiteit" in de context van nucleïnezuur sequenties betekent de residuen in twee sequenties die hetzelfde zijn wanneer 5 uitgelijnd voor maximale correspondentie. De lengte van sequentie identiteit vergelijking kan over een gebied zijn van tenminste ongeveer negen nucleotiden, gewoonlijk tenminste ongeveer 18 nucleotiden gebruikelijke tenminste ongeveer 24 nucleotiden, typerend tenminste ongeveer 28 nucleotiden typerender tenminste ongeveer 32 nucleotiden, en bij voorkeur tenminste ongeveer 36,48 of meer 10 nucleotiden. Er is een aantal verschillende algoritmen bekend in het vakgebied die gebruikt kunnen worden voor het meten van nucleotidesequentie identiteit Bijvoorbeeld kunnen polynucleotide sequenties vergeleken worden gebruikmakend van FASTA, Gap of Bestfit, welke programma’s zijn in Wisconsin verpakking versie 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, dat 15 bijvoorbeeld de programma’s FASTA2 en FASTA3 omvat, voorziet in uitlijningen en procent sequentie identiteit van de regionen van de beste overlap tussen de ‘queiy’en ‘search’ sequenties (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J Mol. Biol. 276:71-84 (1998); hierin ingevoegd door 20 middel van referentie). Tenzij anderszins gespecificeerd, worden default parameters voor een programma in kwestie of algoritme gebruikt. Bijvoorbeeld kan het percentage sequentie identiteit tussen nucleïnezuur sequenties bepaald worden gebruikmakend van FASTA met zijn default parameters (een woord grootte van 6 en de NOPAM factor voor de scoringsmatrix) of gebruikmakend van Gap met zijn 25 default parameters zoals voorzien door GCG versie 6.1, hierin ingevoerd door middel van referentie.

[0066] Een naar een nucleotidesequentie omvat zijn complement tenzij anderszins aangegeven. Dus, een referentie naar een nucleïnezuur met een bepaalde sequentie dient opgevat te worden als zijn complementaire streng omvattend, met zijn 30 complementaire sequentie.

i 02 6776-' I 20

I [0067] Zoals hierin gebruikt, zijn de termen "procent sequentie identiteit" en "procent I

I sequentie homologie" uitwisselbaar gebruikt I

I [0068] De term "substantiële overeenstemming" of "substantiële sequentie I

I overeenstemming," indien verwezen wordt naar een nucleïnezuur of fragment I

I S daarvan, betekent dat wanneer optimaal uitgelijnd met geschikte nucleotide inserties I

I of weglatingen met een ander nucleïnezuur (of zijn complementaire streng), er een I

I nucleotidesequentie identiteit is van tenminste ongeveer 85 %, bij voorkeur I

I tenminste ongeveer 90 %, en met grotere voorkeur tenminste ongeveer 95 %, 96 %, I

I 97 %, 98 % of 99 % van de nucleotide basen, zoals gemeten door een goed bekend I

I 10 algoritme voor sequentie identiteit zoals FASTA,BLAST of Gap, zoals hierboven I

I beschreven. I

I [0069] Zoals toegepast op polypeptiden betekent de term "substantiële identiteit" dat I

I twee peptide sequenties, indien optimaal uitgelijnd, zoals door de programma's GAP I

I of BESTFIT gebruikmakend van default tussenruimtegewichten zoals geleverd met I

I 15 de programma’s, tenminste 70%,75 % of 80% sequentie identiteit delen, bij I

I voorkeur tenminste 90 % of 95 % sequentie identiteit en met grotere voorkeur I

I tenminste 97 %, 98 % of 99 % sequentie identiteit In zekere uitvoeringsvormen I

I verschillend residuposities die niet identiek zijn door conservatieve aminozuur I

I substituties. Een "conservatieve aminozuur substitutie" is er een waarin een I

I 20 aminozuur residu gesubstitueerd is met een ander aminozuur residu met een zijketen I

I R groep met overeenstemmende chemische eigenschappen (zoals lading of I

I hydrofobiciteit). In het algemeen zal een conservatieve aminozuur substitutie de I

functionele eigenschappen van een proteïne niet substantieel veranderen. In gevallen I

waar twee of meer aminozuursequenties van elkaar verschillen door conservatieve I

25 substituties, kan het percentage sequentie identiteit naar boven aangepast worden om I

I te corrigeren voor de conservatieve aard van de substitutie. Middelen voor het maken I

I van deze aanpassing zijn goed bekend zijn zij die bekwaam zijn in het vakgebied, zie

I bijvoorbeeld Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307*31 (1994). Voorbeelden van I

I groepen van aminozuren met zij ketens met overeenstemmende chemische 30 eigenschappen omvatten 1) alifatische zijketens: glycine, alanine, valine, leucine, en I isoleucine; 2) alifatische hydroxyl zijketens: serine en threonine; 3) amide-bevattende I 1026776- 21 zijketens: asparagine en glutamine; 4) aromatische zijketens: fenylalanine, tyrosine, en tryptofan; 5) basische zijketens: lysine, arginine, en histidine; 6) zure zijketens: aspartaamzuur en glutaminezuur en 7) zwavel bevattende zijketens: cysteïhe en methionine. Conservatieve aminzuur substitutiegroepen zijn: 5 valine-leucine-isoleucine, fenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamaat-aspartaat, en asparagine-glutamine.

[0070] Alternatief is een conservatieve vervanging elke verandering met een positieve waarde in de PAM250 log-waarschijnlijkheid matrix beschreven in Gonnet et al., Science 256:1443-45 ¢1992), hierin ingevoegd doormiddel van referentie. Een 10 "matig conservatieve" vervanging is elke verandering met een niet negatieve waarde in de PAM250 log-waarschijnlijkheid matrix.

[0071] Sequentie identiteit voor polypeptiden wordt typerend gemeten gebruikmakend van sequentie analyse software. Proteïne analyse software past sequenties gebruikmakend van maten van overeenstemming, toegekend aan diverse 15 substituties, weglatingen en andere modificaties, waaronder conservatieve aminozuur substituties. Bijvoorbeeld bevat GCG programa’s zoals "Gap" en "Bestfit" die gebruikt kunnen worden met default parameters zoals gespecificeerd door de programma’s voor het bepalen van sequentie homologie of sequentie identiteit tussen nauw verwante polypeptiden, zoals homologe polypeptiden uit verschillende soorten 20 organismen of tussen een wildtype proteïne en een muteöie daarvan. Zie bijvoorbeeld GCG versie 6.1 (Universiteit van Wisconsin, WI). Polypeptide sequenties kunnen ook vergeleken worden gebruikmakend van FASTA gebruikmakend van default of aangeraden parameters, zie GCG versie 6.1. FASTA (bijvoorbeeld FASTA 2 en FASTA 3) voorziet in uitlijningen en procent sequentie identiteit vande regionen met 25 de beste overlap tussen de ‘query’ en ‘search’ sequenties (Pearson, Methods

Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000). Een ander voorkeurs algoritme bij het vergelijken van een sequentie van de uitvinding met een database die een groot aantal sequenties bevat van verschillende organismen is het computer programma BLAST, vooral blastp of tblastn, gebruikmakend van 30 default parameters zoals geleverd met de programma’s. 53e bijvoorbeeld.,

Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res.

1026776-

I 22 I

I 25:3389-402 (1997).

I [0072] De lengte van polypeptidesequenties die vergeleken worden voor homologie I

I zal in het algemeen tenminste ongeveer 16 aminozuur residuen, gewoonlijk I

I tenminste ongeveer 20 residuen, gewoonlijker tenminste ongeveer 24 residuen, I

I s typerend tenminste ongeveer 28 residuen en bij voorkeur meer dan ongeveer 35 I

I residuen zijn. Wanneer een database onderzocht wordt die sequenties bevat van een I

groot aantal verschillende organismen, heeft het de voorkeur om I

I aminozuursequenties te vergelijken. I

I [0073] Zoals hierin gebruikt, verwijzen de termen "label” of "gelabeld” naar opname I

I 10 van een ander molecule in het antilichaam. In een uitvoeringsvorm is het label een I

I detecteerbare marker, zoals opname van een radiogelabeld aminozuur of hechting I

aan een polypeptide met biotinyl eenheden dat gedetecteerd kan worden met gemarkt

avidine (zoals streptavidine dat een fluorescente marker bevat of enzymatische I

I activiteit die gedetecteerd kan worden door middel van optische of colorimetrische I

I 13 methoden). In een andere uitvoeringsvorm kan het label of de marker therapeutisch I

I zijn, zoals een geneesmiddel conjugaal of toxine. Diverse methoden voor het labelen I

I van polypeptiden en glycoprotetnen zijn bekend in het vakgebied en kunnen gebruikt I

I worden. Voorbeelden van labels voor polypeptiden omvatten, maar zijn niet bepertkt I

I tot, de volgende: radioisotopen of radionucliden (zoals 3H, MC, lsN, 35S, *°Y, "Tc, I

I 20 u,In, 1251,131I), fluorescente labels (zoals FITC, rhodamine, lanthanide fosfors), I

I enzymatische labels (zoals paardenradijs peroxidase, β-galactosidase, luciferase, I

I alkaline fosfatase), chemiluminescente markers, biotinyl groepen, voorbepaalde I

I polypeptide epitopen die herkend worden door een secundaire reporter (zoals leucine I ritspaar sequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbindende I 23 domeinen, epitoop markers), magnetische middelen zoals gadolinium chelaten, I toxinen zoals pertussis toxine, taxol, cytochalasine B, gramicidine D, ethidium I bromide, emetine, mitomycine, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, I colchicine, doxorubicine, daunorubicine, dihydroxy anthracinedion, mitoxantron, I mithramycine, actinomycine D, 1-dehydrotestosteron, glucocorticoïden, procaöie, I 30 tetracalne, lidocaïne, propranolol, en puromycine en analogen of homologen daarvan.

I In sommige uitvoeringsvormen zijn labels gebonden door afstand bepalende armen I 1026776- 23 van diverse lengte om potentiële sterische hindering te reduceren.

[0074] Overal in deze beschrijving en de conclusies zal het woord "omvat," of variaties zoals "omvattend" of "omvattende," begrepen worden om de opname van een gegeven getal of groep van getallen te impliceren, maar niet de uitsluiting van 5 enig ander getal of groep van getallen.

Humaan Anti-c-Met antilichamen en karakterisatie daarvan

[0076] In een uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in gehumaniseerde anti-c-Met 10 antilichamen. In een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in humane anti-c-Met antilichamen. In enkele uitvoeringsvormen worden humane anti-c-Met antilichamen geproduceerd door het immuniseren van een niet humaan transgeen dier zoals een knaagdier, waarvan het genoom humane immunoglobuline genen omvat, zodat het transgene dier humane antilichamen produceert 15 [0075] Een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding kan een humane kappa of een humane labda lichte keten omvatten of een aminozuursequentie die daarvan afgeleid is. In sommige uitvoeringsvormen die een kappa lichte keten omvatten, in het lichte keten variabele domein (VJ gedeeltelijk gecodeerd door een humaan L5 VkI of A27 Vk3 gen.

20 [0077] In sommige uitvoeringsvormen omvat de VL van het c-Met antilichaam een of meer aminozuur substituties ten opzichte van de kiemlijn aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen omvat de VL van het anti-c-Met antilichaam 1,2,3,4,5, 6,7,8,9, of 10 aminozuur substituties ten opzichte van de kiemlijn aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen is een of meer van deze 25 substituties van kiemlijn in de CDR regionen van de lichte keten. In sommige uitvoeringsvormen zijn de aminozuur substituties ten opzichte van de kiemlijn op een of meer van dezelfde posities als de substituties ten opzichte van kiemlijn in een of meer van de VL van antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L-A91T. Bijvoorbeeld kan de VL van het anti-c-Met antilichaam een of meerdere aminozuur 30 substituties bevatten vergeleken met kiemlijn aangetroffen in de VL van antilichaam 9.1.2. of er kunnen een of meerdere aminozuur substituties zijn vergeleken met 1028778-

I 24 I

I kiemlijn aangetroffen in de VL van antilichaam 13.3.2, hetgeen gebruik maakt van I

I hetzelfde VK gen als antilichaam 8.70.2. In sommige uitvoeringsvormen zijn de I

I aminozuur veranderingen op een of meer van dezelfde posities, maar omvatten een I

I andere substitutie dan in het referentie antilichaam. I

I s [0078] In sommige uitvoeringsvormen treden aminozuurveranderingen op ten I

I opzichte van de kiemlijn op een of meer van dezelfde posities als in een van de VL

I van antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L-A91 T, maar de I

I veranderingen kunnen een conservatieve aminozuur substitutie vertegenwoordigen I

I op zulke positie(s) ten opzichte van het aminozuur in het referentie antilichaam.

I 10 Bijvoorbeeld indien een bepaalde positie in een van deze antilichamen veranderd is I ten opzichte van de kiemlijn en glutamaat is, kan aspartaat op die positie

I gesubstitueerd worden. Net zo, indien een aminozuur substitutie vergeleken met de I

I kiemlijn serine is, kan conservatief threonine voor serine op die positie substitueren.

Conservatieve aminozuursubstituties zijn hierboven beschreven. I

I IS [0079] In sommige uitvoeringsvormen omvat de lichte keten van het humane anti-c- I Met antilichaam de VL aminozuursequentie van antilichaam 13.3.2 (SEQID NO: 4, I waarin X, alanine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin X, threonine is); 9.1.2 I (SEQ Π) NO: 8); 8.70.2 (SEQ ID NO: 12); of 8.90.3 (SEQ ID NO: 16)ofde I aminozuursequentie met tot aan 1,2,3,4,5,6,7,8,9 of 10 conservatieve aminozuur I 20 substituties en/of een totaal van tot aan 3 niet-conservatieve aminozuur substituties.

I In sommige uitvoeringsvormen omvat de lichte keten de aminozuur sequentie vanaf I het begin van het CDR1 tot het eind van het CDR3 van een van de voorgaande I antilichamen.

I [0080] In sommige uitvoeringsvormen kan de lichte keten CDR1, CDR2 en CDR3 I 25 regionen omvatten die onafhankelijk gekozen zijn van de lichte keten CDR1, CDR2 I en CDR3, respectievelijk van de lichte keten van het antilichaam 13.3.2;9.1.2; I 8.70.2; 8.90.3 of 13.32L-A91T, of CDR regionen die elk minder dan 4 of minder I dan 3 conservatieve aminozuur substituties en/of een totaal van drie of minder niet I conservatieve aminozuur substituties hebben. In sommige uitvoeringsvormen omvat I 30 de lichte keten van het anti-c-Met antilichaam een lichte keten CDR1,CDR2 en I CDR3, die elk onafhankelijk gekozen zijn uit de lichte keten CDR1, CDR2 en CDR3 I 1026776- 25 regionen van monoklonaal antilichaam 13.3.2 (SEQ Π) NO: 4, waarin X8 alanine is; SEQID NO: 3 waarin X7 guanosine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin Xg threonine is; SEQ ID NO: 3, waarin X7 adenosine is); 9.1.2. (SEQ Π) NO: 8; SEQ ID NO: 7); 8.70.2 (SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 11); of 8.90.3 (SEQ ID NO: 16; SEQ 5 Π) NO: 15). In zekere uitvoeringsvormen omvat de lichte keten van het anti-c-Met antilichaam de lichte keten CDR1, CDR2 en CDR3 regionen van een antilichaam omvattende de aminozuursequentie van de VL regio van een antilichaam gekozen uit 13.3.2 (SEQ ID NO: 4, waarin X8 alanine is); 9.1.2. (SEQ ID NO: 8); 8.70.2 (SEQ ID NO: 12); 8.90.3 (SEQ ID NO: 16) of 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin Xg 10 threonine is) of de CDR regionen elk met minder dan 4 of minder dan 3 conservatieve aminozuur substituties en/of een totaal van drie of minder niet conservatieve aminozuursubstituties.

[0081] Met betrekking tot de zware keten, is in sommige uitvoeringsvormen het variabele domein (Vh) gedeeltelijk gecodeerd door een humaan VH 1-18, VH 4-31, VH

is 4-39, of VH 3-48 gen. In sommige uitvoeringsvormen bevat de VH sequentie van het anti-c-Met antilichaam een of meer aminozuur substituties, weglatingen of invoegingen (aanvullingen) ten opzichte van de kiemlijn aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen omvat het variabele domein van de zware keten 1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 of 17 mutaties van de kiemlijn 20 aminozuursequentie. In sommige uitvoeringsvormen is (zijn) de mutatie(s) niet conservatieve substituties vergeleken met de kiemlijn aminozuursequentie. In sommige uitvoringsvormen zijn de mutaties in de CDR regionen van de zware keten. In sommige uitvoringsvormen zin de aminozuurveranderingen gemaakt op een of meer van dezelfde posities als de mutaties van kiemlijn in elk van de VH van 25 antiüchamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-A14P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-A14P ,E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; of 13.3.2H-A14P, E42K, S97T.

In andere uitvoeringsvormen zijn de aminozuur veranderingen op een of meer van dezelfde posities maar omvatten een andere mutatie dan in het referentie antilichaam.

[0082] In sommige uitvoeringsvormen omvat de zware keten de VH

30 aminozuursequentie van antilichaam 13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X4 is serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine); 1026776-

I 26 I

I 13.3.2H-E42K, S97T (SEQID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine); 9.1.2

I (SEQ ID NO: 6); 8.70.2 (SEQ ID NO: 10) of 8.90.3 (SEQ JD NO; 14); of de VH

I aminozuursequentie met tot aan 1,2,3,4,6,8 of 10 conservatieve aminozuur I substituties en/of een totaal van tot aan 3 niet conservatieve aminozuur substituties.

I 5 In sommige uitvoeringsvormen omvat de zware keten de aminozuursequentie van de I beginning van het CDR1 tot het einde van het CDR3 van een van de voorgaande I antilichamen.

I [0083] In sommige uitvoeringsvormen omvat de zware keten de zware keten CDR.1, I CDR2 en CDR3 regionen van antilichaam 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H- I 10 A14P; 13.3.2H-E42K; 13;3.2H-S97T; 13.3.2H-A14P, E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; I of 13.3.2H-A14P,E42K,S97T of de CDR regionen met elk minder dan 8, minder dan I 6, minder dan 4, of minder dan 3 conservatieve aminozuur substituties en/of een I totaal van drie of minder niet conservatieve aminozuur substituties.

I [0084] In sommige uitvoeringsvormen zijn de zware keten CDR regionen I 15 onafhankelijk gekozen uit de CDR regionen van twee of meer antilichainen van I 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-AI4P; 13.3.2H-E42K; 13.32H-S97T; 13.3.2H- I A14P.E42K; 13.3.2H-E42K,S97T of 13.3.2H-A14PJB42K,S97T. In een andere I uitvoeringsvorm omvat de zware keten CDR regionen die onafhankelijk gekozen zijn I uit twee of meer VH regionen gekozen uit 13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 I 20 glutamaat is, X4 is serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is I serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X« is threonine); I 9.1.2 (SEQ ID NO: 6); 8.70.2 (SEQ ID NO: 10) of 8.90.3 (SEQ ID NO: 14). In een I andere uitvoeringsvorm omvat het antilichaam een lichte keten zoals hierboven I beschreven en een zware keten zoals hierboven beschreven. In een verdere 25 uitvoeringsvorm zijn de lichte keten CDR’s en de zware keten CDR’s van hetzelfde I antilichaam.

I [0085] Een type van aminozuur substitutie dat gemaakt kan worden is het veranderen I van een of meer cysteïnen in het antilichaam, die chemisch reactief kunnen zijn, naar I een ander residu, zoals, zonder beperking alanine of serine. In een uitvoeringsvorm is 30 er een substitutie van een niet kanoniek cysteïne. De substitutie kan gemaakt worden I in een CDR of framewerk regio van een variabel domein of in het constante domein I 1026776- % 27 van een antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen is het cysteïne kanoniek.

[0086] Een ander type van aminozuur substitutie dat gemaakt kan worden is het veranderen van eventuele proteolytische plaatsen in het antilichaam. Zulke plaatsen kunnen optreden in een CDR of framewerk regio van een variabel domein of in het s constante domein van een antilichaam. Substitutie van cysteïne residuen en verwijdering van proteolytische plaatsen kan het risico verminderen op enige heterogeniciteit in het antilichaamproduct en dus zijn homogeniciteit vergroten. Een ander type van aminozuur substitutie is het elimineren van asparagine-glycine paren die potentiële deamidatieplaatsen vormen, door een of beide vande residuen te 10 vervangen.

[0087] In sommige uitvoeringsvormen wordt het C-terminale lysine van de zware keten van het anti c-Met antilichaam van de uitvinding gekliefd. In diverse uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen de zware en lichte ketens van de anti-c-Met antilichamen optioneel een signaal sequentie omvatten.

15 [0088] In een aspect heeft de uitvinding betrekking op vier inhibiterende humane anti-c-Met monoklonale antilichamen en de hybridoma cellijnen die deze produceren. Tabel 1 somt de sequentie identificatoren (SEQ Π) NO’s:) op van de nucleuiezuren die coderen voor de zware en lichte ktens van volledige lengte (inclsief de inleidingssequentie), en de corresponderende afgeleide 20 aminozuursequenties van volledige lengte.

1026776-

I 28 I

I Tabel 1 I

I _ Humane anti c-Met antilichamen_ I

I Monoklonaal _Sequentie identificator (SEQID NO’s)_ I

I 5 antUiohaam -Volledige lengte -

_zwaar__licht_ I

I__DNA__Proteïne__DNA__Proteïne I

I 13.3.2__1__2__3__4 I

I 9.1.2__5__6__7__8 I

I 8.70.2__9__10__Π__12 I

I 8.90.3 13 14 ~~ I 15 1 16 I

I 10 I

I [0089] De uitvinding voorziet verder in zware en/of lichte keten varianten van zekere I

I van de bovenstaand opgesomde humane anti-c-Met antilichamen, omvattende een of I

I meerdere aminozuur substituties. Om de varianten aan te geven, is de eerste letter het I

I een letter symbool voor het aminozuur van de van nature voorkomende antilichaam I

I 15 keten, het nummer verwijst naar depositie van het aminozuur (waarin positie een het I

I N-terminale aminozuur is), en de tweede letter is het een letter symbool voor het I

I variante aminozuur. In sommige uitvoeringsvormen voorziet de uitvinding in zware I

I keten variant van monoklonaal antilichaam 13.3.2. Een 13:3.2 zware keten variant is I

I E42K, hetgeen een lysine heeft op positie X2 van SEQ ID NO: 2. De DNA sequentie I

I 20 die codeert voor de E42K 13.3.2 variant heeft een adenosine op X, van SEQ ID NO: I

I L I

I [0090] Een tweede 13.3.2 zware keten variant is S97T, hetgeen een threonine residue I

I heeft op positie X4. De DNA sequentie die codeert voor de S97T 13.3.2 variant heeft I

I een adenosine op X3 van SEQ ID NO: 1. Een derde 13.3.2 zware keten variant is I

I 25 Al 4P, hetgeen een proline residu heeft op van SEQ Π) NO: 2. In de DNA I

I sequentie, is de A14P 13.3.2 variant is gecodeerd door SEQ ID NO:l, waarin X5 een I

I cytosine is. De uitvinding voorziet ook in een variante lichte keten van monoklonaal I

I antilichaam 13.3.2. A91T is 13.3.2 licht keten variant, weergegeven door SEQ Π) I

I NO: 4, waarin Xg een threonine residue is. In de DNA sequentie is de A91T 13.3.2 I

I 30 variant gecodeerd door SEQ ID NO: 3, waarin X7 een adenosine is. Antilichamen I

I omvattende een variante zware of lichte keten en een wildtype keten, worden I

I aangeduid door de variant keten. Dus, een antilichaam dat een wildtype lichte keten I

I 1026776- 29

van antiüchaam 13.3.2 en de E42K zware keten variant bevat wordt aangeduid als 13.3.2H-E42K

[0091] In andere uitvoeringvormen van de uitvinding kunnen antilichamen die combinaties bevatten van aminozuur varianten geproduceerd worden, zoals 13.3.2H-s E42K,S97T. Verdere combinaties van een variant zware keten en de variant lichte keten van of 13.3.2 zijn inbegrepen. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-A14P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-A14PJE42K; 13.3.2H-E42K.S97T; 13.3.2H-AI4P,E42K,S97T; 13.3.2H-S97T; 13.32L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-A14P; 13.3.2L-A91TJH-E42K; 13.3.2L· 10 A91T3-A14PJE42K; 13.3.2L-A91 T,H-E42K,S97T of 13.3.2L-A91T,H- A14P,E42K,S97T. In nog verdere uitvoeringsvormen omvat de uitvinding antilichamen die variabele domein aminozuursequenties bevatten met meer dan 80%, meer dan 85%, meer dan 90%, meer dan 95%, meer dan 96%, meer dan 97%, meer dan 98% of meer dan 99% sequentie identiteit op een variabele domein IS aminozuursequentie van enig van de boven opgesomde humane anti-c-Met antilichamen.

Klasse en subklasse van and-c-Met antilichamen 20 [0092] De klasse en subklasse van and-c-Met antilichamen kan bepaald worden volgens elke methode die bekend is in het vakgebied. In het algemeen kan de klasse en subklasse van een antilichaam bepaald worden gebruikmakend van antilichamen die specifiek zijn voor een bepaalde klasse en subklasse van antilichaam. Zulke antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. De klasse en subklasse kan bepaald 25 worden door middel van ELISA, of Western Blot evenals andere technieken.

Alternatief kunnen de klassen en subklasse bepaald worden door het sequensen van de gehele, of een gedeelte van, de constante domeinen van de zware en/of lichte ketens van de antilichamen, waarbij de aminozuursequenties vergeleken worden met de bekende aminozuursequenties van diverse klassen en subklassen van 30 immunoglobulinen en de klassen en subklasse bepaald wordt van de antilichamen. [0093] In sommige uitvoeringsvormen is het anti-c-Met antilichaam een 1026776=

I 30 I

I monoklonaal antilichaam. Het anti-c-Met antilichaam kan een IgG, een IgM, een IgE, I

I een IgA, of een IgD molecule zijn. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het anti-c- I

I Met antilichaam is een IgG en is een IgGl,IgG2,IgG3,IgG4 subklasse. In een ander I

I voorkeurs uitvoeringsvorm is het antilichaam subklasse IgG2. I

Is I

I Bindinesaffiniteit van anti-c-Met antilichamen voor c-Met I

I [0094] In sommige uitvoeringsvormen van de uitvinding binden de anti-c-Met I

| antilichamen aan c-Met met hoge affiniteit In sommige uitvoeringsvormen bindt het I

I 10 anti-c-Met antilichaam aan c-Met met een Kq van 2 x 10"7 M of minder. In andere I

I voorkeurs uitvoeringsvormen bindt het antilichaam aan c-Met met een Kq van 2x10* I

| * M, 2 x 10"9 M, of 5 x ΙΟ'10 M of minder. In een uitvoeringsvorm met nog grotere I

I voorkeur bindt het antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde KD als een I

I antilichaam gekozen uit 13.32; 9.1.2; 8.702; 8.90.3; 13.32H-AI4P; 13.3.2H-E42K; I

I 15 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-A14P,E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2H- I

I A14P,E42K,S97T; 13.32L·A91T; 13.3.2ΙΜ91Τ,Η-Α14Ρ; 13.32L-A91T,H-E42K; I

I 13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K;13.3.2L·A91T,H-E42K,S97Tofl3.3.2L-A91T,H- I

I A14P,£42K,S97T. In nog een andere voorkeurs uitvoeringsvorm, bindt het I

I antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde Kq als een antilichaam dat een I

I 20 zware keten domein omvat met de aminozuur sequentie van een VH regio van SEQ I

I ID NO: 2 [13.32 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, 5Q is serine); 13.3.2H- I

I E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X* is serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ I

I ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine)], 6,10, of 14, een lichte keten variabel | I domein met de aminozuursequentie van een VL regio van SEQ ID NO: 4 [13.3.2 |

I 25 (SEQ ID NO: 4, waarin Xg alanine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin Xg I

I threonine is)), 8,12, of 16 of beide. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm, bindt I

I het antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde KD als een antilichaam dat de I

I CDR regionen omvat van een lichte keten variabel domein met de I

I aminozuursequentie van een VL regio van SEQ ID NO: 4 (13.3.2 (SEQ Π) NO: 4, I

I 30 waarin Xg alanine is); 13.3.2L-A91T (SEQ Π) NO: 4, waarin X8 threonine is)], 8,12, I

I of 16 of dat de CDR regionen omvat van een zware keten variabel domein met de I

I 1026776- 31 aminozuursequentie een VH regio van SEQ ED NO: 1 [13.3.2 (SEQID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X,, is serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X, is serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is,X4is threonine)], 6,10, of 14.

5 [0095] In sommige uitvoeringsvormen heeft het anti-c-Met antilichaam een lage dissociatie snelheid constante (k^n). In sommige uitvoeringsvormen heeft het anti-c-Met antilichaam een van 1,0 x 10"3 s*‘ of lager of een k^van 5,0 x 10^ s*1 of lager. In andere voorkeurs uitvoeringsvormen bindt het antilichaam aan c-Met met een koff van 2 x 10*4 s'1 of lager. In sommige uitvoeringsvormen is de k^ substantieel 10 hetzelfde als een hierin beschreven antilichaam waaronder een antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-A14P; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-A14P,E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2H-Al 4P,E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-A14P; 13.3.2L-A91T.H-E42K; 13.3.2L-A91T,H-A14P.E42K; 13.3.2L.A91T,H-E42K,S97Tof 13.3.2L-A91 TJI-A14P ,E42K,S97T. l s In sommige uitvoeringsvormen bindt het antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde k„ff als een antilichaam dat de CDR regionen van een zware keten omvat, of de CDR regionen van een lichte keten van een antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L.A91T. In sommige uitvoeringsvormen bindt het antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde k^ als een antilichaam dat een zware keten 20 variabel domein omvat met de aminozuursequentie van een VH regio van SEQ Π)

NO: 2 [13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X4 is serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ED NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin Xj lysine is, X4 is threonine)], 6,10, of 14, een lichte keten variabel domein met de aminozuur sequentie van een VL regio van SEQ ID NO: 4 (13.3.2 25 (SEQ ID NO: 4, waarin X8 is alanine); 13.3.2L-A91 T (SEQ ID NO: 4, waarin X* is threonine)], 8,12, of 16 of beide. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm, bindt het antilichaam aan c-Met met substantieel dezelfde als een antilichaam dat de CDR regionen omvat van een lichte keten variabel domein met de aminozuursequentie van een VL regio van SEQ ID NO: 4 [13.3.2 (SEQ Π) NO: 4, waarin Xg alanine is) en de 30 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin X8 threonine is)], 8,12, of 16; of de CDR

regionen van een zware keten variabel domein met de aminozuursequentie van een 1 026776- I 32 I V„ regio van SEQID NO: 2 [13.3.2 (SEQID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X< is I serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 Iysine is, X« is serine); 13.3.2H- I E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 Iysine is, X4 is threonine)], 6,10, of 14.

I [0096] De bindingsaffiniteit en dissociatie snelheid van een anti-c-Met antilichaam I S tegen c-Met kan bepaald worden door middel van methoden die bekend zijn in het vakgebied. De bindingsaffiniteit kan gemeten worden door middel; van ELISA’s, I RIA’s, stroming cytometrie, oppervlak plasmon resonantie, zoals BIACORE™. De I dissociatesnelheid kan gemeten worden door middel van oppervlak plasmon I resonantie. Bij voorkeur worden de bindingsaflïniteit en dissociatiesnelheid gemeten I 10 door oppervlak plasmon resonantie. Met grotere voorkeur worden de I bindingsaffiniteit en dissociatiesnelheid gemeten gebruikmakend van BIACORE™.

I Men kan bepalen of een antilichaam substantieel dezelfde Kp heeft als een anti-c-Met I antilichaam door gebruik te maken van methoden die bekend zijn in het vakgebied.

I Voorbeeld Vin verduidelijkt een methode voor het bepalen van affiniteitconstanten IS van anti-c-Met monoklonale antilichamen door BIACORE™.

I Identificatie van c-Met enitonen die herkend worden door anti-c-Met antilichamen

[0097] De uitvinding voorziet in een humaan anti-c-Met monoklonaal antilichaam I 20 dat bindt aan c-Met en concurreert of kruisconcurrent met en/of bindt aan hetzelfde I epitoop als: (a) een antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H- I A14P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-AI4P,E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2H- I A14P342K,S97T; 13.3.2H-S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91 T,H-A14P;13.3.2L- I A91T ,H-E42K; 13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K; 13.3.2L-A91T,H-E42K,S97T or I 25 13.3.2L-A91T^l-A14P342K,S97T;(b) een antilichaam dat omvat een zware ketan I variabel domein met een aminozuursequentie van SEQ ID NO: 2,6,10 of 14, (c) een I antilichaam dat omvat een lichte keten variabel domein met een aminozuursequentie I van SEQ ID NO: 4,8,12, of 16, of (d) een antilichaam dat zowel een zware keten I variabel domein omvat zoals gedefinieerd in (b) en een lichte keten variabel domein I 30 zoals gedefinieerd (c).

I [0098] Men kan bepalen of een antilichaam bindt aan hetzelfde epitoop of I 1026776- 33 kruisconcurrent voor binding met een anti-c-Met antilichaam door gebruik te maken van methoden die bekend zijn in het vakgebied. In een uitvoeringsvorm laat men het anti-c-Met antilichaam van de uitvinding binden met c-Met onder verzadigende condities en meet dan het vermogen van het testantilichaam om te binden aan c-Met 5 Indien het testantilichaam in staat is om te binden aan c-Met op dezelfde tijd als het anti-c-Met antilichaam, dan bindt het test antilichaam aan een ander epitoop als het anti-c-Met antilichaam. Echter, indien het test antilichaam niet in staat is om gelijktijdig te binden aan c-Met dan bindt het testantilichaam aan hetzelfde epitoop, een overlappend epitoop, of een epitoop dat in dichte nabijheid is met het epitoop dat 10 gebonden wordt door het humane anti-c-Met antilichaam. Dit experiment kan uitgevoerd worden gebruikmakend van ELISA, RIA, BIACORE™, of stroming cytometrie. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, wordt het experiment uitgevoerd gebruikmakend van ELISA. Methoden voor het bepalen van Kq worden verderop beschreven.

15

Inhibitie van c-Met activiteit door anti-c-Met antilichaam • _

[0099] In een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een anti-c-Met antilichaam dat de binding van HGF aan de c-Met receptor inhibiteert In een 20 voorkeurs uitvoeringsvorm, is de c-Met receptor humaan. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam een humaan antilichaam. De ICW kan gemeten worden in een ligand bindings assay door middel van ELISA, RIA, of andere assays en cel-gebaseerde assays zoals verstrooiings assay, zachte agar groei en tubulomorfogenese assay. In een uitvoeringsvorm, inhibiteert het antilichaamordeel 25 daarvan ligandbinding tussen HGF en c-Met met een IC*, van niet meer dan 5 pg/ml, bij voorkeur niet meer dan 1 pg/ml, met grotere voorkeur dan 0,5 pg/ml, met nog grotere voorkeur niet meer dan 0,20 pg/ml zoals gemeten door een ELISA assay. (zie figuur IA). Voorbeeld UI geeft een voorbeeld voor dit type assay.

[0100] In een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een anti-c-Met 30 antilichaam dat de activering voorkomt van c-Met in de aanwezigheid van HGF. In een voorkeurs uitvoeringsvorm inhibiteert het anti-c-Met antilichaam HGF- 1 026776-

I 34 I

I geïnduceerde tyrosine fosforylering die optreedt bij binding aan c-Met Men kan I

I bepalen of een anti-c-Met antilichaam activering van c-Met kan voorkomen in de I

I aanwezigheid van HGF door het bepalen van de mate van autofosforylering voor ο I

I Met door middel van Western blotting of een ELISA assay. In een voorkeurs I

I 5 uitvoeringsvorm, zou men de autofosforyleringsniveaus van c-Met gebruikmakend I

I van een ELISA assay bepalen. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm is de Ι0Λ I

I gemeten gebruikmakend van een ELISA assay, niet meer dan 5 pg/ml, bij voorkeur I

I niet meer dan 1 pg/ml, met grotere voorkeur dan 0,5 pg/ml, met nog grotere I

I voorkeur niet meer dan 0,20 pg/ml. Voorbeeld IV geeft een voorbeeld van een type I

I 10 van assay dat inhibitie meet van c-Met activering door een anti-c-Met antilichaam in I

I de aanwezigheid van HGF (zie figuur 1B). I

I [0101] In een ander aspect van de uitvinding kan het antilichaam een neerregulering I

I veroorzaken van celoppervlak c-Met niveaus na een incubatie met het antilichaam. In I

I sommige uitvoeringsvormen kan de incubatie een korte tijdspanne zijn (bijvoorbeeld I

I 1$ 4 uur) of een langere tijdspanne (bijvoorbeeld 24 uur). Een neerregulering van I

I celoppervlak c-Met niveaus kan gemeten worden gebruikmakend van western I

I blotting of ELISA. In zekere uitvoeringsvormen van de uitvinding kan het I

I antilichaam bij voorkeur een 6 % neerregulering veroorzaken van celoppervlak c-Met I

I niveaus, bij voorkeur een 10 % neerregulering, of met grotere voorkeur een 20 % I

I 20 neerregulering, met grotere voorkeur een 50 % neerregulering of met nog grotere I

I voorkeur tenminste 50% neerregulering van celoppervlak c-Met niveaus zoals I

I gemeten door middel van western blotting of ELISA. Voorbeeld V geeft een I

I voorbeeld van een type van een ELISA die neerregulering meet van celoppervlak c- I

I Met niveaus na een korte incubatie met het antilichaam. I

I 25 [0102] In een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een anti-c-Met I

I antilichaam dat kolonievorming inhibiteert in zachte agar. In diverse I

I uitvoeringsvormen is de IC^, zoals gemeten door een zachte agar groei assay, niet I

I meer dan 25 pg/ml, bij voorkeur niet meer dan 20 pg/ml, met grotere voorkeur niet I

meer dan 5 pg/ml, met nog grotere voorkeur niet meer dan 1 pg/ml. hl een andere I

I 30 uitvoeringsvorm kan een buisvormige morfogenese assay gebruikt worden voor het I

I meten van het percentage inhibitie van c-Met aihankelijke morfologische I

I 1 0 2 6 7 7 6 J.

i 35 veranderingen in cellen die gegroeid zijn in de aanwezigheid van HGF en behandeld met antilichamen van de uitvinding. Bij voorkeur is het percentage inhibitie gemeten met de buisvormige morfogenese assay niet minder dan 20 %, bij voorkeur niet minder dan 60 %, of met grotere voorkeur niet minder dan 80 %. Voorbeelden VI en 5 VU geven voorbeelden van diverse typen van assays.

Inhibitie van tumor cel groei in vivo met anti-c-Met antilichamen

[0103] Volgens sommige uitvoeringsvormen voorziet de uitvinding in een anti-c-Met 10 antilichaam dat de proliferatie van tumorcellen in vivo inhibiteert. De tumorcel kan afgeleid zijn van elk celtype waaronder zonder beperking epidermale, epitheel, endotheel of mesodermale cellen. De tumorcellen kunnen afgeleid zijn van vaste of niet vaste tumoren waaronder, maar niet beperkt tot, leukemie, sarcoma, meervoudig myeloma, glioblastoma, choriocarcinoma, Kaposi of cervikale intraepitheliala l s neoplasie. In een andere uitvoeringsvorm inhibiteert het anti-c-Met antilichaam prostaat, dikke darm, borst, eierstok, maag, long en glioblastoma tumorgroei in een dier. Voorbeelden van cellen die de c-Met antilichamen inhibiteien SI 14, een NIH-3T3 cellijn bewerkt om humaan HGF tot expressie te brengen en humaan c-Met (Rong et al., Mol. Cell. Biol., 12(11):5152-5158; (1992); U.S. octrooischrift 20 4.405.712). In sommige uitvoeringsvormen wordt een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding gebruikt voor het behandelen van longkanker, botkanker, pancreas kanker, huidkanker, kanker van het hoofd en nek, cutaan of intraoculair melanoom, eierstok kanker baarmoeder kanker, rectale kanker, kanker van de anale regio, maagkanker, dikke darm kanker, borstkanker, gynaecologische tumoren (zoals baarmoeder 25 sarcoma’s, carcinoom van de fallopiane buizen, carcinoom van het endometrium, carcinoom van de cervix, carcinoom van de vagina of carcinoom van de vulva), de ziekte van Hodgkin, kanker van de slokdarm, kanker van de dunne darm, kanker van het endocriene systeem (zoals kanker van de schildklier, de paraschildklier of de adrenerge klieren), sarcoma’s van zachte weefsels, kanker van de baarmoeder, kanker 30 van de penis, prostaatkanker, chronische of acute leukemie, vaste tumoren bij kinderen, lymfocyte lymfomen, blaaskanker, kanker van de nier of de urineleiders 1026776-

I 36 I

I (zoals renale cel carcinoom, carcinoom van het nierbekken), of neoplasmen van het I

I centrale zenuwstelsel (zoals primair CNS lymfoom, spinale as tumoren, hersenstam I

I gliomen of hypofyse adenomen). I

I [0104] In een voorkeurs uitvoeringsvorm inhibiteert het antilichaam tumor celgroei I

I 5 vergeleken met de groei van de tumor in een onbehandeld dier. In een I

I uitvoeringsvorm waar grotere voorkeur naar uitgaat, inhibiteert het anti-c-Met I

I antilichaam tumor celgroei met tenminste 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 I

I %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % of 100%. In een uitvoeringsvorm I

I wordt de inhibitie van tumor celgroei tenminste 7 dagen nadat de dieren de I

I 10 behandeling met het antilichaam hebben begonnen gemeten. In een andere I

I uitvoeringsvorm wordt de inhibitie van tumor celgroei tenminste 14 dagen nadat de I

I dieren met de behandeling met het antilichaam begonnen zijn gemeten. Zie I

I voorbeeld IX. In een andere uitvoeringsvorm resulteert het anti-c-Met antilichaam in I

I tumor regressie van tenminste 10 % tot 100 %. I

I 15 I

I Activering van c-Met door anti-c-Met antilichaam I

I * [0105] Een ander aspect van de onderhavige uitvinding omvat een anti-c-Met I

I antilichaam dat een activerend antilichaam is, zoals een c-Met agonist. Een I

I activerend antilichaam amplificeert of substitueert voor de effecten van HGF op ο I

I 20 Met In sommige uitvoeringsvormen is het activerende antilichaam in essentie een I

I nabootsing van HGF, en concurreert het met HGF voor binding met c-Met In I

I sommige uitvoeringsvormen concurreert het antilichaam niet met HGF voor binding I

I aan c-Met maar amplificeert het effect van HGF binding aan c-Met In sommige I

I uitvoeringsvormen activeert het anti-c-Met antilichaam c-Met in de aanwezigheid of I

I 25 oafwezigheid van HGF. De anti-c-Met antilichaam agonist activiteit kan gemeten I

I worden gebruikmakend van een c-Met activerings ELISA assay. In sommige I

I uitvoeringsvormen van de uitvinding is agonist activiteit 2 tot 3-voudige stimuleruing I

I ten opzichte van cellen die niet gestimuleerd zijn met HGF. In andere I

I uitvoeringsvormen is de agonist activiteit tenminste 6-voudig. Voorbeeld X beschrijft I

I 30 een voorbeeld van c-Met activeringsassay. De anti-c-Met antilichaam agonist I

I activiteit kan gemeten worden gebruikmakend van een tubulaire morfogenese assay. I

I 102677Θ* 37

In een uitvoeringsvorm van de uitvinding kan zwakke agonist activiteit gemeten worden door gebruit te maken van een tubulaire morfogenese assay die c-Met agonist activiteit meet Voorbeeld X geeft een voorbeeld van een type van een tubulaire morfogenese assay die c-Met agonist activiteit meet 5

Soort- en moleculaire selectiviteit

[0106] In een ander aspect van de uitvinding demonstreren de the anti-c-Met anti lichamen zowel soort- als moleculaire selectiviteit In sommige 10 uitvoeringsvormen bindt het anti-c-Met antilichaam aan humane en cynomologus en rhesusaap c-Met In een andere uitvoeringsvorm, bindt het anti-c-Met antilichaam bovendien aan ratten c-Met In een andere uitvoeringsvorm, bindt het anti-c-Met antilichaam niet aan muizen of honden c-Met De leertellingen van de beschrijving volgend, is het mogelijk om de soortselectiviteit voor het anti-c-Met antilichaam te is bepalen gebruikmakend van methoden die goed bekend zijn in het vakgëbied.

Bijvoorbeeld, is het mogelijk om de soortselectiviteit te bepalen gebruikmakend van Western blot, stroming cytometrie, ELISA, immunoprecipitatie of RIA. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, kan men de soortselectiviteit bepalen gebruikmakend van stroming cytometrie.

20 [0107] In een andere uitvoeringsvorm heeft het anti-c-Met antilichaam een selectiviteit voor c-Met die meer dan 100 maal groter is dan zijn selectiviteit voor IGF-1R (Insulineachtige Groeifactor 1 Receptor) (zie figuur 2). In sommige uitvoeringsvormen vertoont het anti-c-Met antilichaam geen meetbare specifieke binding aan enig ander proteïne dan c-Met Het is mogelijk om de selectiviteit van 25 het anti-c-Met antilichaam voor c-Met te bepalen gebruikmakend van methoden die geod bekend zijn in het vakgebied, de leerstellingen van de beschrijving volgend. Bijvoorbeeld is het mogelijk om de selectiviteit te bepalen gebruikmakend van Western blot, stroming cytometrie, ELISA, immunoprecipitatie of RIA.

30 Methoden voor het produceren van antilichamen en antilichamen producerende cellijnen 1026776- I 38 I Immunisering I [0108] In sommige uitvoeringsvormen worden humane antilichamen geproduceerd I S door het immuniseren van een niet-humaan transgeen dier omvattende in zijn I genoom een deel van, of de gehele, humane immunoglobuline zware keten en lichte I keten loei met een c-Met antigen. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het niet humane dier een XENOMOUSE™ dier. (Abgenix, Ine., Fremont, CA).

I [0109] XENOMOUSE™ muizen zijn bewerkte muizenstammen die grote

I 10 fragmenten omvatten van humaan immunoglobuline zware keten en lichte keten loei I

I en zijn deficiënt in de productie van muizen antilichaam. Zie bijvoorbeeld Green et I al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) en de U.S. octrooischriften 5.916.771,5.939.598, I 5.985.615,5.998.209,6.075.181,6.091.001,6.114.598,6.130.364,6.162.963 en I 6.150.584. Zie ook WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735,

I 15 WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO

I 00/09560, en WO 00/037504.

I [0110] In een ander aspect voorziet de uitvinding in een methode voor het maken van I

I anti-c-Met antilichamen uit niet-humane, niet-muis dieren door het immuniseren van I

I niet humane transgene dieren die humane immunoglobuline loei omvatten met een c- I

I 20 Met antigen. Het is mogelijk om zulke dieren te produceren gebruikmakend van de

I methoden die beschreven zijn in de boven aangehaalde documenten. De methoden I

I die beschreven zijn in deze documenten kunnen gemodificeerd worden zoals I

I beschreven in U.S. octrooischrift 5.994.619, hetgeen hierbij is ingevoegd door I middel van referentie. U.S. octrooischrift 5.994.619 beschrijft methoden voor het

I 25 produceren van nieuw in cultuur gebrachte binnen celmassa (CICM) cellen en I

I cellijnen, afkomstig van varkens en koeien, en transgene CICM cellen waarin I

heteroloog DNA is ingebracht. CICM transgene cellen kunnen gebruikt worden voor I

I het produceren van gekloonde transgene embryo’s, foetussen en nageslacht. Het '619 I

I octrooi beschrijft ook methoden voor het produceren van transgene dieren die in staat I

I 30 zijn om het heterologe DNA door te geven aan hun nageslacht In voorkeurs I

I uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding zijn de niet humane dieren I

I 1026776- 39 zoogdieren, vooral ratten, schapen, varkens, geiten, rundvee of paarden.

[0111] XENOMOUSE™ muizen produceren een volwassenachtig humaan repertoire van volledig menselijke antilichamen en generen antigenspecifieke humane

anti lichamen. In sommige uitvoeringsvormen bevatten de XENOMOUSE1*4 muizen s bij benadering 80 % van het humane antilichaam V gen repertoire door introductie van kiemlijnconfiguratie fragmenten van megabase grootte, van de humane zware keten loei en kappa lichte keten loei in gist kunstmatig chromosoom (YAC). In andere uitvoeringsvormen bevatten XENOMOUSE™ muizen verder bij benadering de gehele humane labda lichte keten locus. Zie Mendez et al., Nature Genetics 10 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, 1: Exp. Med. 188:483-495 (1998), en WO

98/24893, welke beschrijvingen hierbij zijn ingevoegd door middel van referentie

[0112] In sommige uitvoeringsvormen is het niet-humane dia: dat humane immunoglobuline genen bevat een dier dat een humane immunoglobuline "minilocus" heeft In de minilocus benadering, wordt een exogene Ig locus 15 nagebootst door de opname van individuele genen van de Ig locus. Dus, een of meer VH genen, een of meer DH genen, een of meer JH genen, een mu constant domein, en een tweede constant domein (bij voorkeur een gamma constant domein) worden in een construct gevormd voor inbrenging in een dier. Deze benadering is ondr andere beschreven in U.S. octrooischriften 5.545.807,5.545.806,5.569.825,5.625.126, 20 5.633.425,5.661.016,5.770.429,5.789.650,5.814.318,5.591.669,5.612.205, 5.721.367,5.789.215 en 5.643.763, hierbij ingevoegd doormiddel van referentie.

[0113] In een ander aspect voorziet de uitvinding in een methode voor het maken van gehumaniseerde anti-c-Met antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen worden niet-humane dieren geïmmuniseerd met een c-Met antigen zoals hieronder 25 beschreven onder condities die antilichaam productie toestaan. Antilichaam producerende cellen worden geïsoleerd uit de dieren, gefuseerd met myeloma’s om hybridoma’s te produceren, en nucleïnezuren die de zware en lichte ketens van een van belang zijnd anti-c-Met antilichaam produceren worden geïsoleerd. Deze nucleïnezuren worden vervolgens bewerkt gebruikmakend van technieken die bekend 30 zijn bij hen die bekwaam zijn in het vakgebied en zoals verderop beschreven om de hoeveelheid niet humane sequentie te reduceren, dus om het antilichaam te 1 026776·= I 40 I humaniseren om de immuunrespons in mensen te reduceren.

[0114] In sommige uitvoeringsvormen is het c-Met antigen geïsoleerd en/of I gezuiverd c-Met. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het c-Met antigen humaan c- I Met In sommige uitvoeringsvormen is het c-Met antigen een fragment van c-Met In I 5 sommige uitvoeringsvormen is het c-Met fragment het extracellulaire domein van ΟΙ Met In sommige uitvoeringsvormen omvat het c-Met fragment tenminste een I epitoop van c-Met. In andere uitvoeringsvormen is het c-Met antigen een cel die o I Met of een immunogeen fragment daarvan op zijn oppervlak tot expressie, of tot overexpressie brengt. In sommige uitvoeringsvormen is het c-Met antigen een c-Met I 10 fusie proteïne. In sommige uitvoeringsvormen is het c-Met een synthetisch peptide I immunogen.

I [0115] Immunizatie van dieren kan volgens elke methode die bekend is in het vakgebied. XZie bijvoorbeeld Harlow en Lane, Antibodies: A Laboralory Manual, I New York: Cold Spring Haibor Press, 1990. Methoden voor het immuniseren van 15 niet humane dieren zoals muizen, ratten, schapen, geiten, varkens, rundvee en I paarden zijn goed bekend in het vakgebied, zie bijvoorbeeld Harlow ai Lane, supra, I en U.S. octrooischrift 5.994.619. In een voorkeurs uitvoeringsvorm wordt het c-Met I antigen toegediend met een hulpmiddel voor het stimuleren van de immuunrespons.

I Voorbeeld hulpmiddelen omvatten compleet of incompleet Freund’s hulpmiddel, I 20 RIBI (muramyl dipeptiden) of ISCOM (immunostimulerende complexen). Zulke I hulpmiddelen kunnen het polypeptide beschermen tegen snelle verspreiding door het I te sequesteren in een lokaal depot, of ze kunnen substanties bevatten die de gastheer I stimuleren om factoren af te geven die chemotactisch kunnen zijn voor macrofagen I en andere componenten van het immuunsysteem. Bij voorkeur zal, indien een I 25 polypeptide wordt toegediend, het immunisatieschema twee of meer toedieningen I van het polypeptide omvatten, uitgespreid over verschillende weken. Voorbeeld I is I een voorbeeld van een methode voor het produceren van monoklonale anti-c-Met I antilichamen in XENOMOUSE™ muizen. 1 I 1026776- 30 Productie van antilichamen en antilichaamproducerende cellijnen 41

[0116] Na immunisatie van een dier met een c-Met antigen, kunnen antüichamen en/of antilichaam producerende cellen verkregen worden van het dier. In sommige uitvoeringsvormen wordt anti-c-Met antilichaam bevattend serum verkregen van het dier door verbloeden of doden van het dier. Het serum kan zoals het van het dier 5 verkregen is gebruikt worden, een immunoglobuline fractie kan verkregen worden van het serum, of de anti-c-Met antilichamen kunnen uit het serum gezuiverd worden.

[0117] hi sommige uitvoeringsvormen worden antilichaamproducerende geïmmortaliseerde cellijnen bereid uit cellen die geïsoleerd zijn uit het 10 geïmmuniseerde dier. Na immunisatie, wordt het dier gedood en lymfe knoop- en/of milt B cellen worden geïmmortaliseerd volgens elke manier die bekend is in het vakgebied. Methoden voor het immortaliseren van cellen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, ze transfecteren met oncogenen, ze te infecteren met een oncogeen virus en ze te cultiveren onder condities die selecteren voor geïmmortaliseerde cellen, ze 15 bloot te stellen aan caicinogene of muterende verbindingen, ze te fuseren met een geïmmortaliseerde cel, zoals een myeloomcel, en het inactiveren van een tumor onderdrukkend gen. Zie bijvoorbeeld Harlow en Lane, supra. Indien fusie met myeloma cellen gebruikt wordt, geven de myeloma cellen bij voorkeur geen immunoglobuline polypeptiden af (een niet secreterende cellijn). Geïmmortaliseerde 20 cellen worden gescreend gebruikmakend van c-Met, een deel daarvan of een cel die c-Met tot expressie brengt. In een voorkeurs uitvoeringsvorm wordt de initiële screening uitgevoerd gebruikmakend van een enzym getinkte immunoassay (EUSA) of een radioimmunoassay. Een voorbeeld van ELISA screening is gegeven in WO 00/37504, hierbij opgenomen door middel van referentie.

25 [0118] Anti-c-Met antilichaam producerende cellen, zoals hybridoma’s, worden geselecteerd, gekloneerd en verder gescreend voor wenselijke karakteristieken, waaronder robuuste groei, hoge antilichaam productie en wenselijke antilichaam karakteristieken, zoals hieronder beschreven. Hybridoma’s kunnen in vivo geëxpandeerd worden in syngene dieren, in dieren die een immuunsysteem missen, 30 zoals naakte muizen, of in celcultuur in vitro. Methoden voor het selecteren, kloneren en expanderen van hybridoma’s zijn goed bekend bij hen met gebruikelijke 1 02 6776-'

I 42 I

I vaardigheid in het vakgebied.

[0119] In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het geïmmuniseerde dier een niet

I humaan dier dat humane immunoglobuline genen tot expressie brengt en de milt B

cellen worden gefuseerd met een myeloma cellijn van hetzelfde soort als het niet I 5 humane dier. In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur, is het geïmmuniseerde I dier een XENOMOUSE™ muis en de myeloma cellijn is een niet secreterende I muizen myeloma. In een uitvoeringsvorm met nog grotere voorkeur, is de myeloma I cellijn P3-X63-Ag8.653 (American Type Cultuur Collectie. Zie bijvoorbeeld I voorbeeld I.

I 10 [0120] Aldus voorziet de uitvinding in een uitvoeringsvorm in methoden voor het I produceren van een cellijn die een humaan monoklonaal antilichaam of een fragment I daarvan produceert gericht tegen c-Met omvattende (a) het immuniseren van een I niet-humaan transgeen dier zoals hierin beschreven met c-Met, een deel van c-Met of I een cel of weefsel dat c-Met tot expressie brengt; (b) het transgene dier een I 15 immuunrespons laten opbouwen tegen c-Met; (c) het isoleren van antilichaam- I producerende cellen van het transgene dier, (d) het immortaliseren van de I antilichaam producerende cellemn; (e) het creëren van individuele monoklonale I populaties van de geïmmortaliseerde antilichaam producerende cellen; en (f) het screenen van de geïmmortaliseerde antilichaam producerende cellen voor het I 20 identificeren van een antilichaam dat gericht is tegen c-Met I [0121] In een ander aspect voorziet de uitvinding in hybridoma’s doe een humaan I anti-c-Met antilichaam produceren. In een voorkeurs uitvoeringsvorm zijn de I hybridoma’s muizen hybridoma’s, zoals hierboven beschreven. In andere I uitvoeringsvormen zijn de hybridoma’s geproduceerd in een niet humane, niet muis I 25 soort zoals ratten schapen, varkens, geiten, rundvee of paarden. In een andere I uitvoeringsvorm zijn de hybridoma’s humane hybridoma's.

[0122] In een uitvoeringsvorm van de uitvinding zijn de antilichaam producerende I cellen geïsoleerd en tot expressie gebracht in een gastheercel, bijvoorbeeld myeloma cellen. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm wort een transgeen dier I 30 geïmmuniseerd met c-Met, primaire cellen, zoals milt of perifere bloedcellen, worden I geïsoleerd uit een geïmmuniseerd transgeen dier en individuele cellen die I 102 6776-1 43 antilichamen produceren die specifiek zijn voor het verlangde antigen worden geïdentificeerd. Gepolyadenyleerd mRNA van elke individuele cel wordt geïsoleerd en omgekeerde transcriptie polymerase keten reactie (RT-PCR) wordt uitgevoerd gebruikmakend van sense primers die binden met variabele regio sequenties, zoals 5 gedegenereerde primers die de meeste of al de FR1 regionen van de humane zware en lichte keten variabele regio genen herkennen en antisense primers die binden aan constante of samenvoegende regio sequenties. cDNA’s van de zware en lichte keten variabele domeinen worden dan gekloneerd en tot expressie gebracht in enige geschikte gastheercel, zoals een myeloma cel, als chimaere antilichamen met 10 respectievelijke immunoglobuline constante regionen zoals de zware keten en κ of λ constante domeinen. See Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48,1996, hierin opgenomen door middel van referentie. Anti c-Met antilichamen kunnen dan geïdentificeerd en geïsoleerd worden zoals hierin beschreven.

[0123] hi een andere uitvoeringsvorm kunnen faag display technieken gebruikt IS worden om te voorzien in bibliotheken die een repertoire van antilichamen bevatten met variërende affiniteiten voor c-Met. Voor de productie van zulke repertoires is het niet nodig om de B cellen van het geïmmuniseerde dier te immortaliseren. in tegendeel kunnen de primaire B cellen direct gebruikt worden als een bron van DNA. Het mengsel van cDNA’s dat verkregen is van B cellen, bijvoorbeeld afkomstig van 20 milten, wordt gebruikt voor het bereiden van een expressie bibliotheek, bijvoorbeeld een faag display bibliotheek getransfecteerd in E.coli. De resulterende cellen worden getest voor immunoreactiviteit jegens c-Met Technieken voor de identificatie van hoge affiniteit humane antilichamen uit zulke bibliotheken zijn beschreven door Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 en 2S door Griffiths et al., ibid, 12:725- 734, die ingevoegd zijn door middel van referentie. Uiteindelijk worden klonen uit de bibliotheek geïdentificeerd die bindingsaffiniteiten produceren van een gewenste grootte voor het antigen en het DNA dat codeert voor het product dat verantwoordelijk is voor zulke binding wordt gewonnen en gemanipuleerd voor standaard recombinant expressie. Faag display 30 bibliotheken kunnen ook geconstrueerd worden gebruikmakend van eerder gemanipuleerde nucleotide sequenties en gescreend op een zelfde manier. In het 1026776-

I 44 I

I algemeen worden de cDNA’s die coderen voor zware en lichte ketens onafhankelijk I

I geleverd of verbonden om Fv analogen te vormen voor productie in de faag I

I bibliotheek. I

I [0124] De faagbibliotheek wordt dan gescreend voor de antilichamen met de hoogste I

I S affiniteiten voor c-Met en het genetische materiaal dat gewonnen is van de passende I

I kloon. Verdere screeningsrondes kunnen de affiniteit vergroten van het originele I

I geïsoleerde antilichaam. I

I Nucleïnezuren. vectoren gastheercellen en recombinante methoden voor het maken I

I io van antilichamen I

I Nucleïnezuren I

I [0125] De onderhavige uitvinding omvat ook nucleïnezuurmoleculen die coderen I

I IS voor anti-c-Met antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen coderen verschillende I

I nucleïnezuurmoleculen voor een zware keten en een lichte keten van een anti-c-Met I

I immunoglobuline. In andere uitvoeringsvormen codeert hetzelfde I

I nucleïnezuurmolecule voor een zware keten en een lichte keten van een anti-c-Met I

I immunoglobuline. In een uitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur voor een c-Met I

I 20 antilichaam van de uitvinding. I

I [0126] In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule dat codeert I

I voor het variabele domein van de lichte keten (VJ een humaan L5Vk1 of A27Vk3 I

I gen, en een JkI , Jk2, Jk3 of Jk4 gen. I

I [0127] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuurmolecule dat codeert I

I 25 voor de lichte keten, voor een aminozuursequentie die 1,2,3,4,5,6,7,8,9 of 10 I

I substituties omvat van de kiemlijn aminozuursequentie(s). In sommige I

I uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule een nucleotidesequentie die I

I codeert voor een VL aminozuursequentie omvattende 1,2,3,4,5,6,7,8,9 of 10 I

I conservatieve aminozuur substituties en/of 1,2 of 3 niet conservatieve substituties I

I 30 vergeleken met kiemlijn VL en JK sequenties. Substituties kunnen in de CDR I

I regionen, de framewerk regionen of in het constante domein zijn. I

I 1026776-: 45

[0128] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuurmolecule voor een VL aminozuur sequentie omvattende een of meer varianten vergeleken met kiemlijn sequentie die identiek zijn met de variaties die aangetroffen worden in de VL van een van de antilichamen 13.3.2,9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L-A91T.

5 [0129] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuurmolecule voor tenminste drie aminozuur substituties vergeleken met de kiemlijnsequentie die aangetroffen wordt in de VL van een van de antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L-A91T.

[0130] In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule een 10 nucleotidesequentie die codeert voor de VL aminozuursequentie van monoklonaai antilichaam 13.3.2 (SEQ ÜD NO: 4, waarin Xs alanine is); 13.3.2L-A91T (SEQ Π) NO: 4, waarin X8 threonine is); 9.1.2 (SEQ ID NO: 8); 8.70.2 (SEQ ID NO: 12); of 8.90.3 (SEQ ID NO: 16), of een variant of deel daarvan. In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuur voor een aminozuursequentie IS omvattende de lichte keten CDR’s van een van de boven genoemde antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen is het deel een continue deel omvattende CDR1-CDR3.

[0131] In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule een nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie van een van SEQ ID NO’s: 4[13.3.2 (SEQ ID NO: 4, waarin Xg alanine is); 13.3.2L-A91 T (SEQ ID NO: 20 4, waarin Xg threonine is)], 8,12, of 16, of deze sequentie zonder de signaal sequentie. In sommige voorkeurs uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule de nucleotidesequentie van SEQ Π) NO’s: 3[13.3.2 (SEQ ID NO: 3 waarin X7 guanosine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 3, waarin X7 adenosine is)], 7,11, of 15, of een deel daarvan, welke sequenties optioneel de signaalsequentie 25 missen.

[0132] In sommige uitvoeringsvormenn codeert het nucleïnezuur voor de aminozuursequentie van de lichte keten CDR’s van het antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen codeert dit deel voor een aanliggende regio van CDRI-CDR3 van de lichte keten van een anti-c-Met antilichaam.

30 [0133] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuurmolecule voor een VL

aminozuursequentie die tenminste 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 1026776“

I 46 I

I of 99 % identiek is aan een VL aminozuursequentie zoals getoond in Fig. 3A-3D of I

I aan een VL aminozuursequentie van een van een VL regio van de antilichamen 13.3.2; I

I 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of 13.3.2L-A91T,ofeen aminozuursequentie van een VL regio I

I van een van de SEQID NO’s: 4[13.3.2 (SEQID NO: 4, waarin Xs alanine is); I

I S 13.3^Α91 TiSEQIDNO^.waarinXjthreonineisM^^of 16. I

I Nucleïnezuurmoleculen van de uitvinding omvatten nucleïnezuren die hybridiseren I

I onder sterk stringente condities, zoals die welke hierboven beschreven zijn, met een I

I nucleïnezuursequentie die codeert voor de aminozuursequentie van een I

I nucleïnezuurmolecule dat codeet voor een VL regio van SEQ ID NO’s: 4[13.3.2 I

I 10 (SEQ ID NO: 4, waarin Xg alanine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 4, waarin X, I

I threonine is)], 8,12, of 16, of dat de nucleïnezuursequentie heeft van een I

I nucleïnezuurmolecule dat codeert voor een VL regio van SEQ ÏÏ) NO’s: 3 [13.3.2 I

I (SEQ ID NO: 3 waarin X7 guanosine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 3, waarin X7 I

I adenosine is)], 7,11, of 15. I

I 15 [0134] In een andere uitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur voor een lichte keten I

I van volledige lengte van een antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of I

I 13.3.2L-A91T,ofeen lichte keten omvattende de aminozuursequentie van SEQ ID I

I NOs: 4[13.3.2 (SEQ ID NO: 4, waarin Xg alanine is); 13.3.2L-A91 T (SEQ ID NO: I

I 4, waarin Xg threonine is)], 8,12 of 16, of een lichte keten die een mutatie bevat, I

I 20 zoals een die hierin beschreven is. Verder kan het nucleïnezuur de I

I nucleotidesequentie omvatten van SEQ ID NO’s: 3 [13.3.2 (SEQ Π) NO: 3 waarin I

I X7 guanosine is); 13.3.2L-A91T (SEQ ID NO: 3, waarin X7 adenosine is)], 7,11, of I

I 15, of een nucle?nezuurmolecule dat codeert voor een lichte keten die een mutatie I

I omvat, zoals een die hierin beschreven is. I

I 25 [0135] In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm, codeert het nucleïnezuurmolecule I

I voor het variabele domein van de zware keten (Vh) die een humane 1-18,4-31,4-39 I

I of 3-48 VH gen sequentie of en daarvan afgeleide sequentie omvat. In diverse I

I uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuurmolecule een humaan 1-18 VH gen, een I

I D2-15 gen en een humaan JH4b gen; een humaan 4-31 VH gen, een humaan D2-2 en I

I 30 D7-27 genen en een JH6b gen; een humaan 4-31 VH gen, een humaan D2-2 gen en I

I een humaan JH6b gen; een humaan 4-31 VH gen, een humaan D7-27 gen en een I

I 1026776- 47 humaan JH6b gen; een humaan 4-39 VH gen, een humaan D2-2 gen en een humaan JH4b gen; een humaan 3-48 VH gen, een humaan D4-17 gen en een humaan JH4b gen, of sequenties die afgeleid zijn van de humane genen.

[0136] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuunnolecule voor een 5 aminozuursequentie omvattende 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 of 18 mutaties vergeleken met de kiemlijn aminozuursequentie van de humane V, D of J genen. In sommige uitvoeringsvormen zijn deze mutaties in de VH regio. In sommige uitvoeringsvormen zijn deze mutaties in de CDR regionen.

[0137] In sommige uitvoeringsvormen codeert het nucleïnezuunnolecule voor een of 10 meer aminozuur mutaties vergeleken met de kiemlijnsequentie die identiek zijn met aminozuur mutaties die aangetroffen worden in de VR van monoklonaal antilichaam 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-AI4P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; 133.2H-A14PJB42K; 13.3.2H-E42K,S97T of 13.3.2H-A14P,E42K,S97T. In sommige uitvoeringsvormen coderen de nucleïnezuien voor tenminste drie aminozuurmutaties l s vergeleken met de kiemlijnsequenties die identiek zijn met tenminste drie aminozuur mutaties die aangetroffen worden in de boven opgesomde monoklonale antilichamen.

[0138] In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuunnolecule een nucleotidesequentie die codeert voor tenminste een deel van de VH aminozuursequentie van een monoklonaal antilichaam gekozen uit 13.3.2 (SEQ Π) 20 NO: 2, waarin X2 glutamaat is en X4 is serine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is en X4 is serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ED NO: 2, waarin X2 lysine is en X4 is threonine); 9.1.2 (SEQ ED NO: 6); 8.70.2 (SEQ ID NO: 10); of

8.90.3 (SEQ ID NO: 14), een variant daarvan of deze sequentie met conservatieve aminozuur mutaties en/of een totaal van drie of minder niet conservatieve aminozuur 25 substituties. In diverse uitvoeringsvormen codeert de sequentie een of meer CDR

regionen, bij voorkeur een CDR3 regio, alle drie CDR regionen, een aanliggend deel dat CDR1-CDR3 omvat of de gehele VH regio, met of zonder een signaalsequentie.

[0139] In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuunnolecule een nucleotidesequentie die codeert voor de aminozuursequentie van een van SEQ ID

30 NO’s: 2,6,10, of 14, van de sequentie die de signaalsequentie mist In sommige voorkeurs uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuunnolecule tenminste een deel 1026776-

I 48 I

I van de nucleotidesequentie van SEQID NO: 1 [13.3.2 (SEQID NO: 1, waarin X, I guanosine is, X3 is threonine and X5 is guanosine); 13.3.2H-É42K (SEQ ID NO: 1,

I waarin X, adenosine is, X3 is threonine en Xj is guanosine); 13.3.2H-E42K, S97T

I (SEQ IDNO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is adenosine en X3 is guanosine); I S 13.3.2H-A14P (SEQ Π) NO: 1, waarin waarin X, guanosine is, X3 is threonine en Xj I is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is I threonine en X5 is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K, S97T (SEQ ID NO: 1, waarin X, I adenosine is, X3 is adenosine en Xj is cytosine)], 5,9, of 13, of deze sequentie die de

I signaalsequentie mist In sommige uitvoeringsvormen codeert het deel voor de VH

I 10 regio (met of zonder een signaalsequentie), een CDR3 regio, alle drie CDR regionen I of een aanliggende regio die CDR1-CDR3 omvat

I [0140] In sommige uitvoeringsvormen codeert nucleïnezuur molecule voor een VH

I aminozuursequentie die tenminste 70 %, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of 99 I % identiek is aan de VH aminozuursequenties die getoond zijn in de Figs. 3E-3H of aan een I 15 VH aminozuursequentie van enig ander van de SEQ ID NO’s: 2 [13.3.2 (SEQ ID NO: 2, I waarin X2 glutamaat is en X4 serine is); 13J.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is I en X4 is serine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is en X4 is threonine)], 6,10, of 14. Nucleïnezuur moleculen van de uitvinding omvatten nucleïnezuren I die hybridiseren onder steile stringente condities, zoals die welke hierboven beschreven rijn, 20 met een nucleïnezuursequentie die codeert voor de aminozuursequentie van SEQ Π) NO’s: 2 I (13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X4 is serine en X* is alanine); 13.3.2H- I E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine en X« is alanine); 13.3.2H-E42K,

I S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine en Xt is alanine); 13.3.2H-A14P

I (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X4 is serine en X« is proline); 13.3.2H-A14P, E42K

I 25 (SEQ ED NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine en Xt is proline); 13.3.2H-A14P, E42K, I S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine en Xt is proline)], 6,10, of 14, of I met een VH regio daarvan, of dat de nucleïnezuursequentie heeft van SEQ ID NO’s: 1 I [13.3.2 (SEQ ID NO: 1, waarin X, guanosine is, X3 is threonine en X, is guanosine); I 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is threonine en Xs is guanosine); I 30 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is adenosine en X, is I guanosine); 13.3.2H-A14P (SEQ ED NO: 1, waarin waarin Xt guanosine is, X3 is threonine I en Xj is cytosine); 13.32H-A14P, E42K (SEQ IDNO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is I threonine en X, is cytosine); 13.32H-A14P, E42K, S97T (SEQ ID NO: 1, waarin X, I 0267764 49 adenosine is, X3 is adenosine en X3 is cytosine)], S, 9, of 13 of dat codeert voor een VH regio daarvan.

[0141] In een andere uitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur voor een zware keten van volledige lengte van een antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; $.70.2; 8.90.3; 13.3^H- 5 A14P; 133.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-A14P.E42K; 13.3.2H-E42K,S97T of 13.3.2H-A14P,E42K,S97T, of een zware keten met de aminozuursequentie van SEQ Π> NO’s: 2 [13.3.2 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X* is serine en X^ is alanine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 2, waarin ^ lysine is, X, is serine en is alanine); 13.3^H- E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X* is threonine en Xe is alanine); 13.3.2H-10 A14P (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X« is serine en Xe is praline); 13.3.2H-A14P, E42K (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X^ is serine en Xe is praline); 13.3.2H-A14P, E42K, S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine en Xe is praline)], 6,10, of 14, met of zonder een signaalsequentie, of een zware keten die een mutatie omvat, zoals een van de hierin beschreven varianten. Verder kan het nucleïnezuur de nucleotidesequentie IS omvatten van SEQ ID NO’s: 1 [13.3.2 (SEQ ID NO: 1, waarin X, guanosine is, X3 is threonine en X5 is guanosine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 1, waarin Xt adenosine is, X3 is threonine en Xs is guanosine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ IDNO: 1, waarin Xt adenosine is, X3 is adenosine en Xj is guanosine); 13;3.2H-A14P (SEQ ID NO: 1, waarin waarin X| guanosine is, X3 is threonine en Xs is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K (SEQ IDNO: 1,

20 waarin X, adenosine is, X3 is threonine en X} is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K, S97T

(SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is adenosine en X} is cytosine)], 5,9 of 13, met of zonder een signaalsequentie, of een nucleïnezuur molecule dat codeert voor een zware keten omvattende een mutatie, zoals een van de hierin beschreven varianten.

[0142] Een nucleïnezuur molecule dat codeert voor de zware of lichte keten van een anti-c- 25 Met antilichaam of delen daarvan kan geïsoleerd worden uit elke bron die zulk een antilichaam produceert. In diverse uitvoeringsvormen worden de nucleïnezuur moleculen geïsoleerd uit een B cel geïsoleerd uit een dier dat geïmmuniseerd is met c-Met of uit en geïmmortaliseerde cel die afgeleid is van zulk een B-cel die een anti-c-Met antilichaam tot expressie brengt Methoden voor het isoleren van mRNA dat codeert voor een antilichaam 30 zijn goed bekend in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld Sambrook et al. Het mRNA kan gebruikt worden voor het produceren van cDNA voor gebruik in de polymerase keten reactie (PCR) of voor cDNA klonering van antilichaam genen. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, is het nucleïnezuur molecule geïsoleerd uit een hybridoma die als een van zijn fusie partners een humaan immunoglobuline producerende cel van een niet humaan 1026776- I 50 I transgeen dier heeft. In een uitvoeringsvorm waar nog grotere voorkeur naar uitgaat, is de I humane immunoglobuline producerende cel geïsoleerd uit een XENOMOUSË™ dier. In een I andere uitvoeringsvorm, is de humane immunoglobuline producerende cel van een niet I humane, niet muis transgeen dier, zoals hierboven beschreven. In een andere I 5 uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur geïsoleerd van een niet humaan, niet transgeen dier. De I nucleïnezuur moleculen die geïsoleerd zijn uit era niet non-humaan, niet transgeen dier I kunnen gebruikt worden, bijvoorbeeld voor gehumaniseerde antilichamen.

[0143] In sommige uitvoeringsvormen kan era nucleïnezuur dat codeert voor een zware I keten van een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding een nucleotidesequentie omvatten I 10 die codeert voor een VH domein van de uitvinding, in-frame samengevoegd met een I nucleotidesequentie die codeert voor een zware keten constant domein uit enige bron. Net zo I kan era nucleïnezuur molecule dat codeert voor een lichte keten van een anti-c-Met

antilichaam van de uitvinding era nucleotidesequentie omvatten die codeert voor een VL

I domein van de uitvinding in-frame samengevoegd met een nucleotidesequentie die codeert I IS voor een lichte keten constant domein uit enige bron.

I [0144] In een verder aspect van de uitvinding worden nucleïnezuur moleculen die coderen I voor het variabele domein van de zware (V,,) en/of lichte (VJ ketens "omgezet” naar I antilichaam genen van volledige lengte. In een uitvoeringsvorm worden nucleïnezuur I moleculen die coderen voor de VH of VL domeinen omgezet tot antilichaam genen van 20 volledige lengte door insertie in een expressie vector die reeds codeert voor de zware keten I constante (Ch) of lichte keten constant (CJ domeinen, respectievelijk, zodat het VH segment I functioneel verbonden is met het (de) Ch segmenten) in de vector, en/of het VL segment is I functioneel verbonden met het Cl segment in de vector. In era andere uitvoeringsvorm worden nucleïnezuur moleculen die coderen voor de VH en/of VL domeinra omgezet tot I 25 antilichaam genen van volledige lengte door het verbinden, bijvoorbeeld ligateren, van era I nucleïnezuur molecule dat codeert voor een VH en/of VL domeinen met era nucleïnezuur I molecule dat codeert voor era Ch en/of domein gebruikmakend van standaard moleculair I biologische technieken. Nucleïnezuur sequenties van humane zware ra lichte keten immunoglobuline constant domein genen zijn bekend in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld I 30 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5* Ed, NIH Publ. No.91- I 3242,1991. Nucleïnezuur moleculen die coderen voor de zware en/of lichte ketens van I volledige lengte kunnen dan tot expressie gebracht worden uit era cel waarin ze I geïntroduceerd en het anti-c-Met antilichaam geïsoleerd zijn.

I [0145] De nucleïnezuur moleculen kunnen gebruikt worden voor het door recombinante I 1026776- 51 technieken tot expressie brengen van grote hoeveelheden anti-c-Met antilichamen. De nucleïnezuur moleculen kunnen ook gebruikt worden voor het produceren van chimaere antilichamen, bispecifieke antilichamen, enkele keten antilichamen, immunoadhesinen, dialichamen, gemuteerde antilichamen en antilichaam derivaten, zoals hieronder verder 5 beschreven. Indien de nucleïnezuur moleculen afgeleid zijn van een niet humaan, niet transgeen dier, kunnen de nucleïnezuur moleculen gebniikt worden voor antilichaam humanisatie, zoals ook verderop beschreven is.

[0146] In een andere uitvoeringsvorm wordt een nucleïnezuur molecule van de uitvinding gebruikt als een probe of PCR primer voor een specifieke antilichaam sequentie.

10 Bijvoorbeeld kan het nuclelhezuur gebruikt worden als een probe in diagnostische methoden of als een PCR primer voor het amplificeren van regionen van DNA die, onder andere, gebruikt zouden kunnen worden voor het isoleren van additionele nucleïnezuur moleculen die coderen voor variabele domeinen van anti-c-Met antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen zijn de nucleïnezuur moleculen oligonucleotiden. In sommige 15 uitvoeringsvormen zijn de oligonucleotiden van sterk variabele domeinen van de zware en lichte ketens van het van belang zijnde antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen coderen de oligonucleotiden voor het gehele, of een deel van, een of meer van de CDR’s van antilichamen 133.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3 of varianten daarvan zoals hierin beschreven.

20 Vectoren

[0147] De uitvinding voorziet in vectoren omvattende nucleïnezuur moleculen die coderen voor de zware keten van een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding of een antigen bindend deel daarvan. De uitvinding voorziet ook in vectoren omvattende nucleïnezuur 25 moleculen die coderen voor de lichte keten van zulke antilichamen of antigen bindend deel daarvan. De uitvinding voorziet verder in vectoren omvattende nucleïnezuur moleculen die coderen voor fusie proteïnen, gemodificeerde antilichamen, antilichaamfragmenten en proben daarvan.

[0148] In sommige uitvoeringsvormen worden de anti-c-Met antilichamen of antigen- 30 bindende delen van de uitvinding tot expressie gebracht door het inbrengen van DNA’s die coderen voor zware en lichte ketens van gedeeltelijke of volledige lengte, verkregen zoals hierboven beschreven, in expressievectoren zodat de genen functioneel verbonden zijn met de noodzakelijke expressie controle sequenties zoals transcriptionele en tnmslationele controle sequenties. Expressievectoren omvatten plasmiden, retrovirussen, adenovirussen, >026776·^ I 52

I

I met adeno geassocieerde virussen (AAV), plantvirussen zoals bloemkool mozaikvirus, tabak I

I mozaikvirus, cosmiden, YAC’s, van EBV afgeleide episomen en dergelijke. Het I

I antilichaamgen is geligateerd in een vector zodat transcriptionele en translationele I

I controlesequenties in de vector hun beoogde doel dienen van het reguleren van de I

I 5 transcriptie en translatie van het antilichaam gen. De expressievector en de expressie I

I controlesequenties worden gekozen om compatibel te zijn met de gebruikte expressie I

I gastheercel. Het antilichaam lichte keten gen en het antilichaam zware keten gen kunnen I

I ingebracht worden in aparte vectoren. In een voorkeurs uitvoeringsvorm worden beide I

I genen ingebracht in dezelfde expressievector. De antilichaam genen worden ingebracht in de I

I 10 expressievector door middel van standaard methoden (zoals ligatie van complementaire I

I restrictieplaatsen op het antilichaam genfragment en de vector, of stomp einde ligatie indien I

I geen restrictieplaatsen aanwezig zijn). I

I [0149] Een bruikbare vector is er een die codeert voor een functionele complete humane CH I

I of Q immunoglobuline sequentie, met de juiste restrictieplaatsen erin bewerkt, zodat enige I

I 15 VH of VL sequentie gemakkelijk ingebracht en tot expressie gebracht kan worden, zoals I

I hierboven beschreven. In zulke vectoren treedt splijting gewoonlijk op tussen de splijting I

I donorplaats in de ingebrachte J regio en de splijting acceptor plaatst die aan het humane C I

I domein voorafgaat en eveneens op de splijting regionen die optreden binnen de humane Ck I

I exonen. Pofyadenylatie en transcriptie terminatie treedt op bij natieve chromosomale I

I 20 plaatsen downstream van de coderende regionen. De recombinante expressievector kan ook I

I een signaalpeptide coderen dat uitscheiding van de antilichaam keten uit een gastheercel I

I vergemakkelijk. Het antilichaam keten gen kan gekloneerd worden in de vector zodat het I

I signaalpeptide in-frame verbonden is met de amino terminus van de immunoglobuline keten. I

I Het signaalpeptide kan een immunoglobuline signaalpeptide zijn of een heteroloog I

I 25 signaalpeptide (zoals een signaalpeptide van een niet immunoglobuline proteïne). I

I [150] In aanvulling op de antilichaamketen genen, dragen de recombinante I

I expressievectoren van de uitvinding regulerende sequenties die de expressie controleren van I

I de antilichaamketen genen in een gastheercel. Het zal erkend worden door wie bekwaam is I

in het vakgebied dat het ontwerp van de expressievector, waaroder de selectie van I

I 30 regulerende sequenties afkan hangen van zulke factoren als de keuze van de te I

I transformeren gastheercel, het gewenste proteïne expressieniveau et cetera. Voorkeurs I

I regulerende sequenties voor zoogdierlijke gastheercel expressie omvatten virale elementen I

I die hoge expressieniveaus aansturen in zoogdierlijke celen, zoals promotoren en/of I

I versterkers die afgeleid zijn van retrovirale LTR’s, cytomegalovirus (CMV) (zoals de CMV I

I 1026776- 53 promotor/versterker), Siraian Virus 40 (SV40) (zoals de SV40 promotor/versterker), adenovirus, (zoals de adenovirus belangrijke late promotor (AdMLP)), polyoma en sterke zoogdierlijke promotors zoals natieve immunoglobuline en actine promotoren. Voor verdere beschrijving van virale regulerende elementen en sequenties daarvan zie bijvoorbeeld U.S.

5 octrooischrift 5.168.062, U.S. octrooischrift 4.510.245 en U.S. octrooischrift 4.968.615. Methoden voor het tot expressie brengen van antilichamen in planten, waaronder een beschrijving van promotoren en vectoren, evenals transformatie van planten is bekend in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld United States octrooi 6.517.529, hierin opgenomen door middel van referentie. Methoden voor het tot expressie brengen van polypeptiden in bacteriele 10 cellen of schimmelcellen zoals gistcellen zijn ook goed bekend in het vakgebied.

[0151] In aanvulling op de antilichaam ketengenen en regulerende sequenties, kunnen de recombinante expressievectoren van de uitvinding verdere sequenties dragen, zoals sequenties die replicatie van de vector in gastheercellen reguleren (zoals replicatie oorsprongen) en selecteerbare markergenen. Het selecteerbare markergen vergemakkelijkt 15 de selectie van gastheercellen waarin de vector geïntroduceerd is (zie bijvoorbeeld U.S.

octrooischriften 4.399.216,4.634.665 en 5.179.017, hierin opgenomen door middel van referentie). Bijvoorbeeld verleent typerend het selecteerbare markergen resistentie jegens geneesmiddelen, zoals G418, hygromycine of methotrexaat, aan een gastheercel waarin de vector geïntroduceerd is. Voorkeurs selecteerbare markergenen omvatten het dihydrofoiaai 20 reductase (DHFR) gen (voor gebruik in dhfr gastheercellen met methotrexaat selectie/amplificatie), het neo gen (voor G418 selectie), en het glutamaat synthetase gen.

Niet hybridoma gastheercellen en methoden voor het door recombinante technieken produceren van proteïne 25

[0152] Nucleïnezuur moleculen die coderen voor anti-c-Met antilichamen en vectoren die deze nucleïnezuur moleculen bevatten kunnen gebruikt worden voor transfectie van een geschikte zoogdierlijke, plantaardige, bacteriële of gist gastheercel. Transformatie kan zijn volgens elke bekende methode voor het introduceren van poiynucleotiden in een 30 gastheercel. Methoden voor introductie van heterologe poiynucleotiden in zoogdierlijke cellen zijn goed bekend in het vakgebied en omvatten door dextran gemedieerde transfectie, calciumfosfaat precipitatie, door polybreen gemedieerde transfectie, protoplastfusie, elektroporatie, inkapseling van het (de) po!ynucleotide(n) in liposomen, en directe microinjectie van het DNA in kernen. Bovendien kunnen nucleïnezuur moleculen 1026776-

I 54 I

I geïntroduceerd worden in zoogdierlijke cellen door virale vectoren. Methoden voor het I

I transformeren van cellen zijn goed bekend in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld U.S. I

I octrooischriften 4.399.216,4.912.040,4.740.461, en 4.959.455, hierin ingevoegd door I

I middel van referentie). Methoden voor het transformeren van plantencellen zijn goed I

I S bekend in het vakgebied, waaronder bijvoorbeeld Agrobacterium gemedieerde I

I transformatie, biolistische transformatie, directe injectie, electroporatie en virale I

I transformatie. Methoden voor het transformeren van bacteriële en gistcellen zijn ook goed I

I bekend in het vakgebied. I

I [0153] Zoogdierlijke cellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie zijn goed I

I 10 bekend in het vakgebied en omvatten vele geïmortaliseerde cellijnen die beschikbaar zijn I

I van de American Type Cultuur Collectie (ATCC). Deze omvatten, onder andere, Chinese I

I hamster eierstok (CHO) cellen, NSO cellen, SP2 cellen, HEK-293T cellen, NIH-3T3 cellen, I

I Hela cellen, baby hamster nier (BHK) cellen, Afrikaanse groene aap nier cellen (COS), I

I humane hepatocellulaire carcinoma cellen (zoals Hep G2), AS49 cellen en een aantal andere I

I IS cellijnen. Cellijnen met een bijzondere voorkeur worden geselecteerd door te bepalen welke I

I cellijnen hoge expressie niveaus hebben. Andere cellijnen die gebruikt kunnen worden zijn I

I insecten cellijnen, zoals Sf9 of S£21 cellen. Wanneer recombiriante expressie vectoren die I

I coderen voor antilichaam genen geïntroduceerd worden in zoogdierlijke gastheercellen, I

I worden de antilichamen geproduceerd door het in cultuur brengen van de gastheercellen I

I 20 gedurende een tijdspanne die voldoende is om expressie van het antilichaam in de I

I gastheercellen mogelijk te maken, of met grotere voorkeur, afgifte van het antilichaam in het I

I cultuurmedium waarin de gastheercellen gegroeid worden. Antilichamen kunnen gewonnen I

I worden uit het cultuurmedium gebruikmakend van standaard proteïne zuiveringsmethoden. I

I Planten gastheercellen omvatten bijvoorbeeld Nicotiana, Arabidopsis, eendenkroos, maïs, I

I 25 tarwe, aardappel et cetera. Bacteriële gastheercelen omvatten E. coli en Streptomyces I

I soorten. Gist gastheercellen omvatten Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces I

I cerevisiae en Pichia pastoris. I

I [0154] Verder kan expressie van antilichamen van de uitvinding uit productie cellijnen I

I versterkt worden gebruikmakend van een aantal bekende technieken. Bijvoorbeeld is het I

I 30 glutamine synthetase gen expressiesysteem (het GS systeem) een gebruikelijke benadering I

I voor het versterken van expressie onder zekere condities. Het GS systeem is geheel of I

I gedeeltelijk beschreven in samenhang met de Europese octrooischriften 0 216 846,0 256 I

I 055,0 323 997 en 0 338 841.

I [0155] Het is waarschijnlijk dat antilichamen die tot expressie gebracht zijn door I

I 1026776- 55 verschillende cellijnen of in transgene dieren een glycosylatie zullen hebben die van elkaar verschilt echter, alle antilichamen die gecodeerd zijn door de nucleïnezuur moleculen waarin hierin is voorzien, of die de aminozuursequenties omvatten waarin hiem is voorzien, zijn deel van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylatie van de antilichamen.

5

Transgene dieren en planten

[0156] Anti-c-Met antilichamen van de uitvinding kunnen ook transgeen geproduceerd worden door het vormen van een zoogdier of een plant die transgeen is voor de 10 immunoglobuline zware en lichte keten van belang zijnde sequenties en die het antilichaam in een winbare vorm daaruit produceren. In samenhang met de transgene productie in zoogdieren, kunnen anti-c-Met antilichamen geproduceerd worden in, en gewonnen uit de melk van geiten, koeien of andere zoogdieren. Zie bijvoorbeeld U.S. octrooischriften 5.827.690,5.756.687,5.750.172 en 5.741.957, hierin ingevoegd door middel van referentie.

15 In sommige uitvoeringsvormen worden niet humane transgene dieren die humane immunoglobuline loei bevatten geïmmuniseerd met c-Met of een immunogeen deel daarvan, zoals hierboven beschreven. Methoden voor het maken van antilichamen in planten aajn, bijvoorbeeld, beschreven in U.S. octrooien 6.046.037 en 5.959.177, hierin ingevoegd door middel van referentie.

20 [0157] In sommige uitvoeringsvormen worden niet humane transgene dieren of planten geproduceerd door het introduceren van een of meer nucleïnezuur moleculen die coderen voor een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding in het dier of plant door middel van standaard transgene technieken. Zie Hogan en United States octrooischrift 6.417.429, supra. De transgene cellen die gebruikt worden voor het maken van het transgene dier kunnen 25 embryonische stamcellen of somatische cellen of een bevruchte eicel. De transgene niet humane organismen kunnen chimaer, niet chimaere heterozygoten en niet chimaere homozygoten zijn. Zie bijvoorbeeld Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford Univershy Press (2000); en 30 Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Academie Press (1999), allen hierin ingevoegd door middel van referentie. In sommige uitvoeringsvormen hebben de transgene niet humane dieren een doelgerichte onderbreking en vervanging door een doelgericht construct dat codeert voor een van belang zijnde zware keten en/of lichte ketel. In een voorkeurs uitvoeringsvorm omvatten de transgene dieren nucleïnezuur moleculen die 1026776- I 56 I coderen voor zware en lichte ketens die specifiiek binden aan c-Met, bij voorkeur humaan c- I Met en brengen ze deze tot expressie. In sommige uitvoeringsvormen! omvatten de transgene dieren nucleïnezuur moleculen die coderen voor een gemodificeerd antüichaam I zoals een enkele keten antilichaam, een chimaer antilichaara of een gehumaniseerd 5 antilichaam. De anti-c-Met antilichamen kunnen gemaakt zijn in elk transgeen dier. In een I voorkeurs uitvoeringsvorm zijn de niet humane dieren muizen, ratten schapen, varkens, I geiten, rundvee of paarden. Het niet humane transgene dier brengt de gecodeerde I polypeptiden tot expressie in bloed, melk, urine, speeksel, tranen, mucus en andere I lichaamsvloeistoffen.

I 10

Faag display bibliotheken I [0158] De uitvinding voorziet in een methode voor het produceren van een anti-c-Met I antilichaam of antigen bindend deel daarvan omvattende de stappen van het synthetiseren 15 van een bibliotheek van humane antilichamen op faag, het screenen van de bibliotheek met c-Met of een deel daarvan, het isoleren van faag dat c-Met bindt en het verkrijgen van het I antilichaam van de faag. Als voorbeeld, een methode voor het boeiden van de bibliotheek I van antilichamen voor gebruik in faag display technieken omvat de stappen van het I immuniseren van een niet numaan dier omvattende humane immunoglobuline loei met c- I 20 Met of een antigeen deel daarvan voor het creëren van een immuunrespons, het extraheren

I van antilichaam producerende cellen van het geïmmuniseerde dier; het isoleren van RNA

I dat codeert voor zware en lichte ketens van antilichamen van de uitvinding uit de I geëxtraheerde cellen, omgekeerd transcriberen van het RNA om cDNA te produceren, het I cDNA amplificeren gebruikmakend van primers, en het inbrengen van het cDNA in een faag I 25 display vector zodat antilichamen tot expressie gebracht worden op de faag. Recombinante anti-c-Met antilichamen van de uitvinding kunnen op deze manier verkregen worden.

I [0159] Recombinante anti-c-Met humane antilichamen van de uitvinding kunnen geïsoleerd I worden door het screenen van een recombinante combinatoriële antilichaam bibliotheek. Bij I voorkeur is de bibliotheek een scFv faag display bibliotheek, gegenereerd gebruikmakend I 30 van humane VL en VH cDNA’s bereid uit mRNA geïsoleerd uit B cellen. Methoden voor het bereiden en screenen van zulke bibliotheken zijn bekend in het vakgebied. Kits voor het I genereren van faag display bibliotheken zijn commercieel verkrijgbaar (bijvoorbeeld het I Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalogus nr 27-9400-01; en de Stratagene I SurfZAP™ faag display kit, catalogus nr 240612). Er zijn ook andere methoden en reagens I 1026776- 57 die gebruikt kunnen worden in het genereren en screenen van antilichaam display bibliotheken (zie bijvoorbeeld U.S. octrooischrift 5.223.409; PCT Publicatie Nrs. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod.

S Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO.1:12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al, Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al, Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); en Barbas et al, . 10 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991), allen hierin ingevoegd door middel van referentie.

[0160] In een uitvoeringsvorm wordt voor het isoleren en produceren van humane anti-c-Met antilichamen met de gewenste karakteristieken, een humaan anti-c-Met antilichaam zoals hierin beschreven eerst gebruikt voor het selecteren van humane zware en lichte keten 15 sequenties met een overeenkomende bindingsactiviteit jegens c-Met, gebruikmakend van de epitoop imprinting methoden zoals beschreven in PCT Publicatie WO 93/06213, hierin ingevoegd door middel van referentie. De antilichaambibliotheken die gebruikt zijn in deze methode zijn bij voorkeur scFv libraries doie bereid en gescreend zijn zoals beschreven in PCT Publicatie WO 92/01047, McCafferty et al. Nature 348:552-554 (1990); en Griffiths et 20 al, EMBO J: 12:725-734 (1993), al hierin ingevoegd door middel van referentie. De scFv antilichaam bibliotheken worden bij voorkeur gescreend gebruikmakend van humaan c-Met als het antigen.

[0161] Zodra initiële humane VL en VH domeinen zijn geselecteerd, worden "mix and match" experimenten uitgevoerd, waarin verschillende paren van de oorspronkelijk 25 geselecteerde VL en VH segmenten gescreend worden voor c-Met binding voor het selecteren van voorkeurs VL/VH paar combinaties. Bovendien, voor het verder verbeteren van de kwaliteit van het antilichaam, kunnen de VL en VH segmenten van het voorkeurs Vi/VH paar (paren) statistisch gemuteerd worden, bij voorkeur in de CDR3 regio van VH en/ofV^ in een proces dat analoog is aan het in vivo somatische mutatie proces dat verantwoordelijk is

30 voor affiniteit rijping van antilichamen gedurende een natuurlijke immuunrespons. Deze in vitro affiniteit rijping kan tot stand gebracht worden door het amplificeren van VH en VL domeinen gebruikmakend van PCR primers die complimentair zijn met het VM CDR3 of VL CDR3, respectievelijk, welke primers "gespiked" rijn met een statistisch mengsel van de vier nucleotide basen op zekere posities zodat de resulterende PCR producten VH en VL

102 6776J

I 58

I segmenten coderen waarin statistische mutaties zijn geïntroduceerd in de VH en/of VL

I CDR3 regionen. Deze statistisch gemuteerde VH en VL segmenten kunnen opnieuw

I gescreend worden voor binding aan c-MeL

I [0162] Na screening en isolatie van een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding uit een I 5 recombinante immunoglobuline display bibliotheek, kunnen nucleïnezuren die coderen voor I het gekozen antilichaam gewonnen worden uiit de display verpakking (bijvoorbeeld uit het I faag genoom) en gesubkloneerd in andere expressievectoren volgens standaard recombinant DNA technieken. Indien gewenst, kan het nuclelnezuur verder gemanipuleerd worden voor I het creëren van andere antilichaamvormen van de uitvinding, zoals hieronder beschreven.

I 10 Om een recombinant humaan antilichaam dat geïsoleerd is door screening van een I combinatoriële bibliotheek tot expressie te brengen, wordt het DNA dat codeert voor het antilichaam gekloneerd in een recombinante expressievector en geïntroduceerd in een I zoogdierlijke gastheercel, zoals hierboven beschreven. j 15 Klasse omschakeling I [0163] Een ander aspect van de uitvinding voorziet in een methode voor het omzetten van de I klasse of subklasse van een anti-c-Met antilichaam naar een andere klasse of subklasse. In.

I sommige uitvoeringsvormen wordt een nuclelnezuur molecule dat codeert voor een VL of I 20 VH dat geen sequenties omvat die coderen voor Q of CH geïsoleerd gebruikmakend van I methoden die goed bekend zijn in het vakgebied. Het nucleïnezuur molecule wordt dan I functioneel verbonden met een nucleïnezuursequentie die codeert voor een of Ch van een gewenste immunoglobuline klasse of subklasse. Dit kan bereikt worden gebruikmakend van I een vector of nucleïnezuur molecule dat een CL of Ch keten omvat, zoals hierboven I 25 beschreven. Bijvoorbeeld een anti-c-Met antilichaam dat oorspronkelijk IgM was kan klasse I omgeschakeld worden naar een IgG. Verder kan de klasse omschakeling gebruikt worden I voor het omzetten van een IgG subklasse naar een andere, zoals van IgGl naar IgG2. Een andere methode voor het produceren van een antilichaam van de uitvinding omvattende een I gewenst isotype omvat de stappen van het isoleren van een nuclelnezuur dat codeert voor I 30 een zware keten van een anti-c-Met antilichaam en een nuclelnezuur dat codeert voor era I lichte keten van een anti-c-Met antilichaam, het isoleren van de sequentie die codeert voor I de VH regio, het ligateren van de VH sequentie met een sequentie die codeert voor een zware I keten constant domein van het gewenste isotype, het lichte keten gen en het zware keten I construct tot expressie brengen in een cel, ra het verzamelen van het anti-c-Met antilichaam I 102 6776-’ 59 met het gewenste isotype.

Gede-immimiseerde antilichamen 5 [0164] In een ander aspect van de uitvinding kan het antilichaam gede-immuniseerd worden om zijn immunogeniciteit te reduceren gebruikmakend van technieken die bijvoorbeeld beschreven zijn in PCT Publicatie W098/52976 en WO 00/34317 (hierin ingevoegd door middel van referentie).

10 Gemuteerde antilichamen

[0165] In een andere uitvoeringsvorm kunnen de nucleïnezuur moleculen, vectoren en gastheercellen gebruikt worden voor het maken van gemuteerde anti-c-Met antilichamen. De antilichamen kunnen gemuteerd zijn in de variabele domeinen van de zware en/of lichte 15 ketens, bijvoorbeeld voor het veranderen van een bindingseigenschap van het antilichaam.

Bijvoorbeeld kan een mutatie gemaakt worden in een of meer van de CDR regionen voor het vergroten of verlagen van de KD van het antilichaam voor c-Met, voor het vergroten of verlagen van koff, of voor het veranderen van de bindingsspecificiteit van het antilichaam.

Technieken in plaats gerichte mutagenese zijn goed bekend in het vakgebied. Zie 20 bijvoorbeeld Sambrook et al. en Ausubel et al., supra. In een andere uitvoeringsvorm worden een of meerdere mutaties gemaakt op een aminozuur residu waarvan bekend is dat j het veranderd is vergeleken met de kiemlijn in monoklonaal antilichaam 133.2; 9.13; 8.70.2; 8.90.3; 1333H-A14P; 133.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-A14P,E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2H-A14P,E42K,S97T; 133.2L-A91T; 13.33L-A91TJH-A14P; 25 133.2L-A91 T JH-E42K; 133.2L-A91T.H-A14P ,E42K; 13.33L-A91T,H-E42K,S97T of 13.3.2L-A91 T,H-A 14P,E42K,S97T. De mutaties kunnen gemaakt worden in een CDR regio of framewerk regio van een variabel domein, of in een constant domein. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, worden de mutaties gemaakt in een variabel domein. In sommige uitvoeringsvormen, wordt een of meer mutaties gemaakt op een aminozuur residu dat 30 bekend is dat het veranderd is vergeleken met de kiemlijn in een CDR regio of framewerk regio van een variabel domein van een aminozuursequentie gekozen uit SEQID NO’s: 2 [13.33 (SEQ ID NO: 2, waarin X2 glutamaat is, X« is serine en Xe is alanine); 1333H-E42K (SEQ Π> NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is serine en Xe is alanine); 13.33H-E42K,

S97T (SEQ Π) NO: 2, waarin X2 lysine is, X4 is threonine en is alanine); 133.2H-A14P

1026776-

Η I

I 60 I

I (SEQ Π) ΝΟ: 2, waarin Χ2 glutamaat is, Χ< serine is en X< proline is); 13.3.2H-A14P, E42K I

I (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X« is serine en X6 is proline); 13.3.2H-A14P, E42K, I

I S97T (SEQ ID NO: 2, waarin X2 lysine is, X* is threonine en Xi is proline)], 4 [13.3.2 (SEQ I

I ID NO: 4, waarin Xt is alanine) en het 13.3.2L-A91 T (SEQ ID NO: 4, waarin X* threonine I

I 5 is)], 6,8,10,12,14 of 16 of waarvan de nucleïnezuursequentie is gepresenteerd in SEQ ID I

I NO’s: 1 [13.3.2 (SEQ ID NO: 1, waarin X, guanosine is, X3 is threonine en X, is I

I guanosine); 13.3.2H-E42K (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is threonine en X, is I

I guanosine); 13.3.2H-E42K, S97T (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, X3 is adenosine I

I en Χ, is guanosine); 133.2H-A14P (SEQ ID NO: 1, waarin waarin X| guanosine is, X3 is I

I 10 threonine en X, is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K (SEQ ID NO: 1, waarin X, adenosine is, I

I X3 is threonine en X, is cytosine); 13.3.2H-A14P, E42K, S97T (SEQ ID NO: 1, waarin X| I

I adenosine is, X3 is adenosine en X, is cytosine)), 3 [133.2 (SEQ ID NO: 3 waarin X, I

I guanosine is); 133.2L-A91 T (SEQ ID NO: 3, waarin X7 adenosine is)], 5,7,9,11,13 of I

I 15. I

I 15 [0166] In een andere uitvoeringsvorm, is de framewerk regie gemuteerd zodat de I

resulterende framewerk regio(nen) de aminozuur sequentie hebben van het I

I corresponderende kiemlijngen. Een mutatie kan gemaakt worden in een framewerk regio of I

I constant domein voor het vergroten van de halfwaardetijd van het anti-c-Met antilichaam. I

I Zie bijvoorbeeld PCT Publicatie WO 00/09560, hierin ingevoegd door middel van I

20 referentie. Een mutatie in een framewerk regio of constant domein kan ook gemaakt worden I

I voor het veranderen van de immunogeniciteit van het antilichaam, om te voorzien in een I

I plaats voor covalente of niet covalente binding aan een ander molecule, ofvoor het I

veranderen van zulke eigenschappen als complement fixatie, FcR binding en antilichaam I

I afhankelijke cel gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Volgens de uitvinding kan een enkel I

I 25 antilichaam mutaties in elke, of meerdere, van de CDR’s of fi-ameweric regionen hebben van I

het variabele domein of in het constante domein. I

[0167] In sommige uitvoeringsvormen zijn er van 1 tot 8, inclusief elk aantal hiertussen, I

I aminozuurmutaties in de VH of VL domeinen van het gemuteerde anti-c-Met antilichaam I

I vergeleken met het anti-c-Met antilichaam voorafgaand aan mutatie. In elk van de I

30 bovenstaande, kunnen de mutaties optreden in een of meerdere CDR regionen. Verder kan I

I elk van de mutaties conservatieve aminozuursubstituties zijn. In sommige I

I uitvoeringsvormen zijn er niet meer dan 5,4,3,2, of 1 aminozuur veranderingen in de I

I constante domeinen. I

I 1026776^ 61

Gemodificeerde antilichamen

[0168] In een andere uitvoeringsvorm, kan een fusie antilichaam of immunoadhesine gemaakt worden dat het gehele, of een deel van, een anti-c-Met antilichaam van de s uitvinding verbonden met een ander polypeptide omvat In een voorkeurs uitvoeringsvorm zijn alleen de variabele domeinen van het anti-c-Met antilichaam gebonden aan het polypeptide. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm is het VH domein van een anti-c-Met antilichaam verbonden met een eerste polypeptide, terwijl het VL domein van een anti-c-Met antilichaam verbonden is met een tweede 10 polypeptide dat associeert met het eerste polypeptide op een manier zo, dat de VH en VL domeinen met elkaar een interactie kunnen aangaan om een bindingsplaats te vormen. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm is het VH domein afgescheiden van het VL domein door een verbinder zodat de VH en VL domeinen een interactie met elkaar kunnen aangaan (zie hieronder onder enkele keten antilichamen). Het V^-15 linker-VL antilichaam wordt dan verbonden met het van belang zijnde polypeptide.

Het fusieantilichaam is bruikbaar voor het sturen van een polypeptide naar een c-Met tot expressie brengende cel of weefsel. Het polypeptide kan een therapeutisch middel zijn, zoals een toxine, groeifactor of ander regulerend proteïne, of kan diagnostisch middel zijn, zoals een enzym, dat gemakkelijk gevisualiseerd kan worden, zoals 20 paardenradijs peroxidase. Bovendien kunnen fusie antilichamen gecreëerd worden waarin twee (of meer) enkele keten antilichamen met elkaar verbonden zijn. Dit is bruikbaar indien men een divalent of polyvalent antilichaam op een enkele polypeptideketen wil vormen, of indien men een bispecifiek antilichaam wil creëren.

[0169] Voor het creëren vaneen enkele keten antilichaam, (scFv), worden de VH- en 25 VL -coderende DNA fragmenten functioneel met een ander fragment verbonden dat codeert voor een flexible linker, zoals dat codeert voor de aminozuursequentie (Gly4 -Ser)3, zodat de VH en VL sequenties tot expressie gebracht kunnen worden als een aanliggend enkele keten proteïne, met de VL en VH domeinen samengevoegd door de flexibele linker. Zie bijvoorbeeld Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Ruston et 30 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Het enkele keten antilichaam kan monovalent zijn, indien 1 026776-1

I 62 I

I slechts een enkele VH en VL gebruikt zijn, bivalent, indien twee VH en VL gebruikt I

I zijn, of polyvalent, indien meer dan twee VH en VL gebruikt zijn. Bispecifieke of I

I polyvalente antilichamen kunnen gevormd worden die specifiek binden aan c-Met en I

I aan een ander molecule. I

I 5 [0170] In andere uitvoeringsvormen kunnen andere gemodificeerde antilichamen I

I bereid worden gebruikmakend van anti-c-Met antilichaam coderende nucleïnezuur I

I moleculen. Bijvoorbeeld kunnen “Kappa lichamen” (Ql et al., Protein Eng. 10:949- I

I 57 (1997)), .”*Minilichamen” (Martin et al., EMBOJ 13:5303-9 (1994), I

I “Dialichamen” (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), of I

I 10 “Janusins” (Traunecker et al., EMBO J 10:3655-3659 (1991) en Traunecker et al., I

I Int. J Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) bereid worden gebruikmakend van standaard I

moleculair biologische technieken volgens de leerstellingen van de beschrijving. I

I [0171] Bispecifieke antilichamen of antigen bindende fragmenten kunnen I

I geproducererd worden door een veelheid aan methoden waaronder fusie van I

I IS hybridoma’s of het verbinden van Fab' fragmenten. Zie bijvoorbeeld Songsivilai & I

I Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J Immunol. I

I 148:1547-1553 (1992). Bovendien kunnen bispecifieke antilichamen gevormd I

I worden als “dialichamen” of “Janusins”. In sommige uitvoeringsvormen bindt het I

I bispecifieke antilichaam aan twee verschillende epitopen van c-Met In sommige I

I 20 uitvoeringsvormen heeft het bispecifieke antilichaam een eerste zware keten en een I

I eerste lichte keten van monoklonaal antilichaam 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; I

I 13.3.2H-A14P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-A14P,E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H- I E42K,S97T; 13.3.2H-A14P,E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-A14P;

I 13.3.2L-A91 T,H-E42K; 13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K; 13.3.2L-A91T,H-E42K,S97T

I 25 of 13.3.2L-A91T,H-AI4P,E42K,S97T en een aanvullende antilichaam zware keten I

I en lichte keten. In sommige uitvoeringsvormen zijn de aanvullende lichte keten en I

I zware keten ook van een van de bovenstaand geïdentificeerde monoklonale I

I antilichaam, maar zijn ze verschillend van de eerste zware en lichte ketens. I

I [0172] In sommige uitvoeringsvormen worden de hierboven beschreven I

I 30 gemodificeerde antilichamen bereid gebruikmakend van een of meer van de variabele I

I 1026776- 63 domeinen of CDR regionen van een humaan anti-c-Met monoklonaal antilichaam waarin hierin is voorzien.

Gederiveerde en gelabelde antilichamen 5

[0173] Een anti-c-Met antilichaam of antigen bindend deel van de uitvinding kan gederiveerd worden of verbonden met een ander molecule (zoals een ander peptide of proteïne). In het algemeen worden de antilichamen of het deel daarvan zo gederiveerd, dat de c-Met binding niet nadelig beïnvloed wordt door het denveren of 10 labelen. Hiermee in overeenstemming wordt met de antilichamen en delen van de uitvinding bedoeld dat ze zowel intact als gemodificeerde vormen van de hierin beschreven humane anti-c-Met antilichamen omvatten. Bijvoorbeeld kan een antilichaam of antilichaam deel van de uitvinding functioneel verbonden zijn (door chemisch koppelen, genetische fusie, niet covalente associatie of anderszins) met een 1 s of meer andere moleculaire entiteiten, zoals een ander antilichaam (bijvoorbeeld een bispecifiek antilichaam of een dialichaam), een detectiemiddel, een cytotoxisch middel, een farmaceutisch middel en/of een proteïne of peptide dat de associatie van het antilichaam of antilichaamdeel met een ander molecule kan mediëren (zoals een streptavidine kern regio of een polyhistidine staart).

20 [0174] Een type van gederivatiseerd antilichaam wordt geproduceerd door het verknopen van twee of meer antilichamen (van hetzelfde type of van verschillende typen, zoals voor het vormen van bispecifieke antilichamen). Geschikte verknopers omvatten die welke heterobifunctioneel zijn, met twee aparte reactieve groepen gescheiden door een geschikte afstandbepaler (zoals m-maleimidobenzoyl-N-25 hydroxysuccinimide ester) of homobifunctioneel (zoals disucdnimidyl suberaat). Zulke verbinders zijn verkrijgbaar van Pierce Chemical Company, Rockford, Π.

[0175] Een ander type van gederiveerd antilichaam is een gelabeld antilichaam. Bruikbare detectiemiddelen waarmee een antilichaam of een antigen bindend deel van de uitvinding gederiveerd kunnen worden omvatten fluorescente verbindingen 30 waaronder fluoresceïne, fluoresceïne isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-l- naftaleensulfonylchloride, fycoerythrine, lanthanidefosforverbindingen en dergelijke.

1026776-

I 64 I

I Een antilichaam kan ook gelabeld worden met enzymen die bruikbaar zijn voor I detectie, zoals paardenradijs peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline I fosfatase, glucose oxidase en dergelijke. Wanneer een antilichaam gelabeld is met I een detecteerbaar enzym, wordt het waargenomen door het toevoegen van I 5 aanvullende reagens die het enzym gebruikt om een reactieproduct te produceren dat I onderscheiden kan worden. Bijvoorbeeld wanneer het middel paardenradijs I peroxidase aanwezig is, leidt de toevoeging van waterstofperoxide en diaminobenzidine tot een gekleurd reactieproduct, dat waarneembaar is. Een I antilichaam kan ook gelabeld zijn met biotine, en gedetecteerd door indirecte meting I 10 van avidine of streptavidine binding. Een antilichaam kan ook gelabeld zijn met een I voorbepaald polypeptide epitoop dat herkend wordt door een secundaire reporter I (zoals leucine ritspaar sequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, I metaalbindende domeinen, epitoop staarten). In sommige uitvoeringsvormen zijn labels gehecht door afstand bepalende armen van diverse lengtes voor het reduceren I IS van potentiële sterische hindering.

[0176] Een anti-c-Met antilichaam kan ook gelabeld zijn met een radiogelabeld I aminozuur. Het radiolabel kan zowel gebruikt worden voor diagnostische als I therapeutische doelen. Bijvoorbeeld kan het radiolabel gebruikt worden voor het I detecteren van c-Met tot expressie brengende tumoren door Röntgen of andere I 20 diagnostische technieken. Verder kan het radiolabel therapeutisch gebruikt worden I als een toxine voor kankerachtige cellen of tumoren. Voorbeelden van labels voor I polypeptiden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende radio-isotopen of

I radio-nucliden: 3H, ,4C, l3N, 35S, *Y, "Tc, "Tn, l25l en ,3,L

I [0177] Een anti-c-Met antilichaam kan ook gederiveerd worden met een chemische I 25 groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of ethylgroep, of een I koolhydraatgroep. Deze groepen zijn bruikbaar voor het verbeteren van de I biologische karakteristieken van het antilichaam, bijvoorbeeld voor het vergroten van I de serum halfwaardetijd of voor het vergroten van binding aan weefsel.

30 Farmaceutische samenstellingen en kits I 1026776-

V

65

[0178] De uitvinding heeft betrekking op samenstellingen omvattende een humaan anti-c-Met antilichaam met agonist eigenschappen voor de behandeling van patiënten die behoefte hebben aan een therapeutische procedure omvattende, maar niet beperkt tot, weefsel regeneratie of wond herstel. In sommige uitvoeringsvormen is de te S behandelen patiënt menselijk. In andere uitvoeringsvormen is de patiënt een veterinaire patiënt. Voorbeelden van weefsels die behoefte hebben aan weefsel regeneratie omvatten, maar zijn niet beperkt tot leverweefsel (zoals in het geval van acute, chronische of alcoholische hepatitis of cirrose), longweefsel, maagweefsel (zoals in het geval van maagzweren) en nierweefsel (zoals in het geval van acuut 10 renaal falen). Agonist anti-c-Met antilichamen van de uitvinding en samenstellingen die ze omvatten kunnen toegediend worden in combinatie met een of meerdere therapeutische, diagnostische of profylactische middelen. In sommige uitvoeringsvormen kan een of meer agonist c-Met antilichamen van de uitvinding gebruikt worden als een vaccin of als hulpmiddelen voor een vaccin. Behandeling is kan omvatten toediening van een of meer agonist anti-c-Met monoklonale antilichamen van de uitvinding, of antigen-bindende fragmenten daarvan, alleen of met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

[0179] In een verder aspect, kan een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding dat inhibiterende eigenschappen heeft, betrekking hebben op enig orgaan, waaronder 20 maar niet beperkt tot, brein, long, schubachtige cellen, blaas, maag, pancreas, borst, hoofd, nek, lever, renaal, eierstokken, prostaat, colorectaal, slokdarm, gynecologisch, nasofarynx of schildklier kankers, melanomen, lymfomen, leukemiën, multiple myelomen, choriocarcinoma, Kaposi of cervikale intraepitheel neoplasie. Andere aandoeningen die behandeld kunnen worden of voorkomen kunnen worden met een 25 anti-c-Met antilichaam van de uitvinding dat inhibiterende eigenschappen heeft, omvatten, maar zijn niet beperkt tot, proliferatieve vitreoretinopathie, proliferatieve diabetische retinopathie, endometriose en artritis. In andere uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen anti-c-Met antilichamen gebruikt worden voor het inhibiteren van plaque vorming bij de ziekte van Alzheimer en voor het inhibiteren van 30 cellulaire mitogene responsen. Anti-c-Met antilichamen van de uitvinding zouden gebruikt kunnen worden voor het inhibiteren van embryo innesteling door opname in 1 026776*? I 66

I een injecteerbaar anticonceptiemiddel. Anti-c-Met antilichamen kunnen gebruikt I

I worden voor het behandelen van tumorgroei door het inhibiteien van proliferatie, I

I behandelen/inhibiteren van tumor angiogenese, of voor het behandelen van I

I metastatische verspreiding/disseminatie van metastasen. Vooral zijn humane anti-c- I

I 5 Met antilichamen van de uitvinding met inhibiterende eigenschappen bruikbaar voor I

I het behandelen van glioblastoom, sarcoma’s, of carcinomen, bijvoorbeeld van de I

I borst, eierstok, dikke darm of long. I

I [0180] Behandeling kan toediening omvatten van een of meer inhibiterende anti-c- I

I Met monoklonale antilichamen van de uitvinding, of antigen-bindende fragmenten I

I 10 daarvan, alleen of met een farmaceutisch aanvaardbare drager. Inhibiterende anti-c- I

I Met antilichamen van de uitvinding en samenstellingen die ze omvatten, kunnen toegediend worden in combinatie met een of meerdere andere therapeutische, I diagnostische of profylactische middelen. Additionele therapeutische middelen I omvatten andere anti-neoplastische, anti-tumor, anti-angiogene of I IS chemotherapeutische middelen. Zulke additionele middelen kunnen opgenomen I worden in dezelfde samenstelling of apart toegediend worden. In sommige I . uitvoeringsvormen kan een of meerdere inhibiterende anti-c-Met antilichamen van de I uitvinding gebruikt worden als een vaccin of als hulpmiddelen voor een vaccin.

I [0181] In aanvulling op kankervaccins samengesteld uit met kanker geassocieerde I 20 antigenen, omvatten vaccins die bruikbaar zijn in combinatie met het anttiichaam, I zonder beperking, GM-CSF DNA en op cel gebaseerde vaccins, dendritische cel I vaccins, recombinante virale (zoals vaccinia virus) vaccins, en ‘heat shock' proteïne I (HSP) vaccins. Bruikbare vaccins omvatten ook tumor vaccins, zoals die welke I gevormd zijn uit melanoma cellen en kunnen autoloog of allogeen zijn. De vaccines I 25 kunnen, bijvoorbeeld, peptide, DNA of op cellen gebaseerd zijn.

I [0182] Zoals hierin gebruikt, betekent "farmaceutisch aanvaardbare drager" elke en I alle oplosmiddelen, dispersie media, coatings, antibacterfële en antifungale middelen, I isotone en absorptie vertragende middelen en dergelijke die fysiologisch compatibel I zijn. Sommige voorbeelden van farmaceutisch aanvaardbare dragers zijn water, I 30 zoutoplossing, met fosfaat gebufferde zoutoplossing, dextrose, glycerol, ethanol en dergelijke, evenals combinaties daarvan. In vele gevallen zal het de voorkeur hebben I 026776-1 67 om isotone middelen op te nemen, bijvoorbeeld suikers, polyalcoholen zoals mannitol, sorbitol of natriumchloride, in de samenstelling. Aanvullende voorbeelden van farmaceutisch aanvaardbare substanties zijn bevochtigers of geringe hoeveelheden helpende substanties zoals bevochtigende of emulgerende middelen, 5 conserveermiddelen of buffers, die de houdbaarheid of werkzaamheid van het anti lichaam vergroten.

[0183] De samenstellingen van deze uitvinding kunnen in een veelheid aan vormen zijn, bijvoorbeeld vloeibare, semi-vaste en vaste doseringsvormen, zoals vloeibare oplossingen (bijvoorbeeld injecteerbare en infuseerbare oplossingen), dispersies of 10 suspensies, tabletten, pillen, poeders, liposomen en zetpillen. De voorkeursvorm is afhankelijk van de beoogde toedieningsroute en de therapeutische toepassing. Typerende voorkeurs samenstellingen zijn in de vorm van injecteerbare of infuseerbare oplossingen zoals samenstellingen die overeenkomen met die welke gebruikt worden voor passieve immunisatie van mensen. De voorkeurs IS toedieningsroute is parenteraal (zoals intraveneus, subcutaan, intraperitoneaal, intramusculair). In een voorkeurs uitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door middel van intraveneuze infusie of injectie. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door middel van intramusculaire of subcutane injectie.

20 [0184] Therapeutische samenstellingen moeten typerend steriel en stabiel zijn onder de vervaardigings- en opslagcondities. De samenstelling kan geformuleerd worden als een oplossing, microemulsie, dispersie, liposoom, of andere geordende structuur die geschikt is voor hoge geneesmiddel concentratie. Steriele injecteerbare oplossingen kunnen bereid worden door het anti-c-Met antilichaam in de vereiste 25 hoeveelheid op te nemen in een geschikt oplosmiddel met een van de, of een combinatie van de ingrediënten die hierboven opgesomd zijn, zoals vereist, gevolgd door gefilterde sterilisatie. In het algemeen worden dispersies bereid door het opnemen van de actieve verbinding in een steriele drager die een basisch dispersiemedium bevat en de vereiste andere ingrediënten van die welke hierboven 30 opgesomd zijn. In het geval van steriele poeders voor de bereiding van steriele injecteerbare oplossingen, zijn de voorkeurs bereidingsmethoden vacuflmdrogen en 1026776- I 68

I vriesdrogen die een poeder van het actieve ingrediënt plus enig aanvullend gewenst I

ingrediënt opleveren uit een eerder steriel gefilterde oplossing daarvan. De juiste I

I fluïditeit van een oplossing kan bijvoorbeeld gehandhaafd worden door het gebruik I

I van een coating zoals lecithine, door het handhaven van de vereiste deeltjesgrootte in I

I S het geval van dispersie en doorgebruik te maken van surfactanten. Verlengde I

I absorptie van injecteerbare samenstellingen kan tot stand gebracht worden door in de I

I samenstelling een middel op te nemen dat absorptie vertraagt, bijvoorbeeld I

I monostearaatzouten en gelatine. I

I [0185] De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen toegediend worden I

I 10 door een veelheid aan methoden die bekend zijn in het vakgebied, alhoewel voor vele I

I therapeutische toedieningen de voorkeurs route/toedieningsvorm subcutane, I

I intramusculaire of intraveneuze infusie is. Zoals erkend zal worden door de bekwame I

I beoefenaar, zal de route en/of toedieningsvorm variëren afhankelijk van de gewenste I

I resultaten. I

I is [0186] In zekere uitvoeringsvormen kunnen de antilichaamsamenstellingen van I

actieve verbinding bereid zijn met een drager die het antilichaam zal beschermen I

I tegen snelle afgifte zoals een gecontroleerde afgifte formulering, waaronder I

I implantaten, transdermale pleisters en micro-ingekapselde afgifte systemen. I

I Bioafbreekbare, biocompatibele polymeren kunne gebruikt worden, zoals ethyleen I

I 20 vinylacetaat, polyanhydriden, polyglycolzuur, collageen, polyorthoesters en I

I polymelkzuur. Veel methoden voor de bereiding van zulke formuleringen zijn I

I geoctrooieerd of algemeen bekend bij hen die bekwaam zijn in het vakgebied. Zie I

I bijvoorbeeld Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J.R. I

I Robinson, ed., Marcel Dekker, Ine., New York, 1978). I

I 25 [0187] In zekere uitvoeringsvormen kan een anti-c-Met antilichaam van de I

I uitvinding oraal toegediend worden, bijvoorbeeld met een inert verdunningsmiddel I

I of een assimileerbare eetbare drager. De verbinding (en andere ingrediënten, indien I

I gewenst) kan ook ingesloten worden in een hard- of zachtschalige gelatine capsule, I

I samengepast tot tabletten of direct opgenomen in het dieet van de patiënt Voor I

I 30 orale therapeutische toediening, kunnen de anti-c-Met antilichamen opgenomen I

I worden met hulpstoffen in gebruikt in de vorm van inslikbare tabletten, buccale I 1026776- 69 tabletten, troches, capsules, elixers, suspensies, siropen, wafers en dergelijke. Voor het toedienen van een verbinding van de uitvinding door andere dan parenterale toediening, kan het noodzakelijk zijn om de verbinding toe coaten met, of de verbinding gezamenlijk toe te dienen met, een materiaal om zijn inactivering te s voorkomen.

[0188] Additionele actieve verbindingen kunnen ook opgenomen worden in de samenstellingen. In zekere uitvoeringsvormen is een inhibiterend anti-c-Met antilichaam van de uitvinding gezamenlijk geformuleerd met en/of gelijktijdig toegediend met een of meer 10 additionele therapeutische middelen. Deze middelen omvatten, zonder beperking, antilichamen die andere doelen binden, antineop 1 astische middelen, antitumor middelen, chemotherapeutische middelen, peptide analogen die c-Met inhibiteren of antilichamen of andere moleculen die binden aan HGF en zijn binding aan of de activering van c-Met voorkomen. Zulke combinatietherapieën kunnen lagere IS doseringen vereisen van het inhibiterende anti-c-met antilichaam evenals van de andere toegediende middelen, zodat mogelijke toxiciteiten of complicaties die geassocieerd worden met de diverse monotherapieën vermeden Worden.

[0189] Inhibiterende anti-c-Met antilichamen van de uitvinding en samenstellingen die deze omvatten kunnen ook toegediend worden in combinatie met andere 20 therapeutische regimes, vooral in combinatie met bestralingstherapie.

[0190] In zekere uitvoeringsvormen wordt een activerend of inhibiterend anti-c-Met antilichaam van de uitvinding gezamenlijk geformuleerd met e/of gezamenlijk toegediend met een of meer additionele therapeutische middelen. In het geval van een activerend c-Met antilichaam, omvatten deze middelen, zonder beperking, een of 25 meer chemische middelen die c-Met activeren en/of andere middelen waarvan in het vakgebied bekend is dat ze een therapeutische procedure zoals weefsel regeneratie of wondheling bevorderen. In het geval van een inhibiterend antilichaam omvatten deze middelen die welke c-Met inhibiteren. Verder kunnen zulke combinatietherapieën ook gebruik worden voor het behandelen van ziekten zoals arteriosclerosis 30 obliterans, renale tubulointerstitiële fibrose, intrekbare huidzweren, maagzweren of problemen die geassocieerd zijn met een transplant Dergelijke combinatietherapieën I 02 6776-1

I 70 I

I kunnen lagere doseringen van het inhibiterende of agonist anti-c-met antilichaam I

I evenals van de mee toegediende middelen vereisen, waardoor mogelijke toxiciteiten I

I of complicaties die geassocieerd worden met de diverse monotherapieën vermeden I

I worden. I

I 5 [0191] De samenstellingen van de uitvinding kunnen een "therapeutisch effectieve I

I hoeveelheid" of een "profylactisch effectieve hoeveelheid" bevatten van een I

I antilichaam of een antigen bindend deel van de uitvinding. Een "therapeutisch I

I effectieve hoeveelheid" verwijst naar een hoeveelheid die effectief is bij doseringen I

I en tijdsduren die noodzakelijk zijn voor het bereiken van het gewenste therapeutische I

I 10 resultaat. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het antilichaam of I

I antilichaamdeel kan variëren afhankelijk van factoren zoals de staat van de ziekte, I

I leeftijd, geslacht en gewicht van het individu, en het vermogen van het antilichaam of I

I antilichaamdeel om een gewenste respons in het individu op te wekken. Een I

I therapeutisch effectieve hoeveelheid is er ook een waarin enige toxische of nadelige I

I 15 effecten van het antilichaam of antilichaamdeel meer dan goed gemaakt worden door I

I de. therapeutisch gunstige effecten. Een "profylactisch effectieve hoeveelheid" I

I verwijst naar een hoeveelheid die effectief is, bij doseringen en gedurende I

I tijdspannen die noodzakelijk zijn voor het bereiken van het gewenste profylactische I

I resultaat Typerend, aangezien een profylactische dosering gebruikt wordt in I

I 20 patiënten voorafgaand aan of in een vroeger stadium van de ziekte, zal de I

I profylactisch effectieve hoeveelheid minder zijn dan de therapeutisch effectieve I

hoeveelheid. I

I [0192] Dosering regimes kunnen aangepast worden om te voorzien in de optimale I

gewenste respons (bijvoorbeeld een therapeutische of profylactische respons). I

I 25 Bijvoorbeeld kan een enkele bolus toegediend worden, meerdere verdeelde I

doseringen kunnen toegediend worden in een periode of de dosering kan I

I proportioneel gereduceerd of vergroot worden zoals geïndiceerd door de noodzaak I van de therapeutische situatie. Het is vooral gunstig om parenterale samenstellingen I in doserings eenheidsvorm te formuleren voor het gemak van de toediening en I 30 uniformiteit van de dosering. Dosering eenheidsvorm zoals hierin gebruikt verwijst naar fysisch discrete eenheden die geschikt zijn voor de te behandelen zoogdierlijke I 1 026776-i * 71 patiënten; elke eenheid bevat een voorbepaalde hoeveelheid actieve verbinding berekend om het gewenste therapeutische effect te produceren in samenhang met de vereiste farmaceutische drager. De specificatie voor de dosering eenheidsvormen van de uitvinding worden bepaald door, en zijn direct afhankelijk van (a) de unieke 5 karakteristieken van het anti-c-Met antilichaam of deel daarvan en het therapeutische of profylactische effect in kwestie dat bereikt dient te worden, en (b) de beperkingen die inherent zijn in het vakgebied van het vermengen van zulk een antilichaam voor de behandeling van gevoeligheden in individuen.

[0193] Een niet beperkend voorbeeld gebied voor een therapeutisch of profylactisch 10 effectieve hoeveelheid van een antilichaam of antilichaamdeel van de uitvinding is 0,025 tot 50 mg/kg, met grotere voorkeur 0,1 tot 50 mg/kg, met grotere voorkeur 0,1- 25,0,1 tot 10 of 0,1 tot 3 mg/kg. In sommige uitvoeringsvormen bevat een formulering 5 mg/ml antilichaam in een buffer van 20mM natriumcitraat, pH 5,5, 140 mM NaCl, en 0,2 mg/ml polysorbaat 80. Het dient opgemerkt te worden dan 15 doseringswaarden kunnen variëren met het type en de ernst van de te verlichten aandoening. Het dient verder begrepen te worden dat voor elke patiënt in kwestie specifieke doseringsregimes in de tijd aangepast dienen te worden afhankelijk van de individuele behoefte en de professionele beoordeling van de persoon die de toediening van de samenstellingen uitvoert of de supervisie heeft en dat 20 doseringsgebieden zoals hierin uiteengezet slechts voorbeelden zijn en niet bedoeld zijn om de werkingsreikwijdte van de geclaimde samenstelling te beperken.

[0194] Een ander aspect van de onderhavige uitvinding voorziet in kits omvattende een anti-c-Met antilichaam of antilichaamdeel; van de uitvinding of een samenstelling die zulk een antilichaam omvat. Een kit kan, naast het antilichaam of 25 de samenstelling, diagnostische of therapeutische middelen omvatten. Een kit kan ook gebruiksinstructies omvatten voor een diagnostische of therapeutische methode. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, omvat de kit het antilichaam of een samenstelling die deze omvat en een diagnostisch middel dat gebruikt kan worden in een onderstaand beschreven methode. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm omvat de 30 kit het antilichaam of een samenstelling die het omvat en een of meer therapeutische middelen die gebruikt kunnen worden in een onderstaand beschreven methode.

1026776- I 72 I [195] Deze uitvinding heeft ook betrekking op samenstellingen voor het inhibiteren I van abnormale celgroei in een zoogdier omvattende een hoeveelheid van een I antilichaam van de uitvinding in combinatie met een hoeveelheid van een I chemotherapeutisch middel, waarin de hoeveelheden van de verbinding, zout, I 5 solvaat, of promiddel en van het chemotherapeutische middel tezamen effectief zijn I in het inhibiteren van abnormale celgroei. Vele chemotherapeutische middelen zijn I op het ogenblik bekend in het vakgebied. In sommige uitvoeringsvormen wordt het I chemotherapeutische middel gekozen uit de groep bestaande uit mitotische I inhibitoren, alkyleringsmiddelen, anti-metaboliten, intercalaterende antibiotica, I 10 groeifactor inhibitoren, cel cyclus inhibitoren, enzymen, topoisomerase inhibitoren, I biologische respons modificatoren, anti-hormonen, zoals anti-androgenen en anti- I angiogenese middelen.

I [0196] Anti-angiogene middelen zoals MMP-2 (matrix-metalloproteïnease 2) I inhibitoren, MMP-9 (matrix-metalloproteïnease 9) inhibitoren en COX-Π I IS (cyclooxygenase II) inhibitoren, kunnen gebruikt worden in samenhang met een anti- I c-Met antilichaam van de uitvinding. Voorbeelden van bruikbare COX-Π inhibitoren I _ omvatten CELEBREXTM (celecoxib), valdecoxib, en rofecoxib. Voorbeelden van I bruikbare matrix metalloproteïnease inhibitoren zijn beschreven in WO 96/33172 I (gepubliceerd op 24 oktober 1996), WO 96/27583 (gepubliceerd op 7 maart 1996), I 20 Europese octrooiaanvrage 97304971.1 (ingediend op 8 juli 1997), Europese I octrooiaanvrage 99308617.2 (ingediend op 29 oktober 1999), WO 98/07697 I (gepubliceerd op 26 februari 1998), WO 98/03516 (gepubliceerd op 29 januari 1998), I WO 98/34918 (gepubliceerd op 13 augustus 1998), WO 98/34915 (gepubliceerd op I 13 augustus 1998), WO 98/33768 (gepubliceerd op 6 augustus 1998), WO 98/30566 I 25 (gepubliceerd op 16 juli 1998), Europese octrooiaanvrage 606 046 (gepubliceerd op I 13 juli 1994), Europese octrooipublicatie 931 788 (gepubliceerd op 28 juli 1999), I WO 90/05719 (gepubliceerd op 31 mei 1990), WO 99/52910 (gepubliceerd op 21 I oktober 1999), WO 99/52889 (gepubliceerd op 21 oktober 1999), WO 99/29667 I (gepubliceerd op 17 juni 1999), PCT Internationale aanvrage PCT/IB98/01113 I 30 (ingediend op 21 juli 1998), Europese octrooi aanvrage 99302232.1 (ingediend op 25 I maart 1999), Britse octrooiaanvrage 9912961.1 (ingediend op 3 juni 1999), U.S.

I 1026776" 73 voorlopige aanvrage 60/148,464 (ingediend op 12 augustus 1999), U.S. octrooischrift 5.863.949 (uitgegeven op 26 januari 1999), U.S. octrooischrift 5.861.510 (uitgegeven op 19 januari 1999), en Europese octrooipublicatie 780 386 (gepubliceerd op 25 juni 1997), welke allemaal in hun geheel hierin opgenomen zijn door middel van S referentie.

[0197] Voorkeurs MMP inhibitoren zijn die welke geen arthralgia demonstreren. Grotere voorkeur gaat uit naar die welke MMP-2 en/of MMP-9 selectief inhibiteren ten opzichte van de andere matrix-meta 1 loproteïnasen (zoals MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, en 10 MMP-13). Sommige specifieke voorbeelden van MMP inhibitoren die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, en de verbinding die genoemd worden in de volgende lijst: 3-[[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonyl]-( 1 -hydroxycarbamoyl-cyclopentyl)-amino]-propionzuur; 3-exo-3-[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2. l]octaan-3-carbonzuur 15 hydroxyamide; (2R, 3R) l-[4-(2-chloor-4-fluor-benzyloxy)-benzeensulfonyl)-3- hydroxy-3 -methyl-piperidine-2-carboxylzuur hydroxyamide; 4-[4-(4-fluor-fenoxy)benzeensulfonylamino]-tetrahydro-pyran-4-carbonuur hydroxyamide; 3-[[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonyI]-(l-hydroxycarbamoyl-cyclobutyl)-amino ]-propionzuur, 4-[4-(4-chloor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]-tetrahydro-pyran-4-20 carbonzuur hydroxyamide; (R) 3-[4-(4-chloor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]- tetrahydro-pyran-3 -carbonzuur hydroxyamide; (2R, 3R) 1 -[4-(4-fluor-2-methyl-benzyloxy)-benzeensulfonyl]-3- hydroxy-3 -methyl-piperidine-2-carbonzuur hydroxyamide; 3-[[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonyl]-(l-hydroxycarbamoyl-l-methyl-ethyl)-amino]-propionzuur; 3-[[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonyl] -(4-25 hydroxycarbamoyl- tetrahydro-pyran -4-yl)-amino]-propionzuur; 3-exo-3-[4-(4- chloor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2.1]octaan-3-carbonzuur hydroxyamide; 3-endo-3-[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]-8-oxa-bicyclo[3.2.1]octaan-3-carbonzuur hydroxyamide; en (R) 3-[4-(4-fluor-fenoxy)-benzeensulfonylamino]-tetrahydro-furan-3-carbonzuur hydroxyamide; en 30 farmaceutisch aanvaardbare zouten en solvaten van deze verbindingen.

1026776- I 74 I [0198] Een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding kan ook gebruikt worden met signaaltransductie inhibitoren, zoals middelen die EGF-R (epidermale groeifactor

receptor) responsen kunnen inhibiteren, waaronder maar niet beperkt tot EGF-R

I antilichamen, EGF antilichamen, en moleculen die EGF-R inhibitoren zijn; VEGF

I S (vasculaire endotheel groeifactor) en VEGF receptor (VEOF-R) inhibitoren; en erbB2 receptor inhibitoren zoals organische moleculen of antilichamen die binden

aan de erbB2 receptor, bijvoorbeeld HERCEPTINTM (Genentech, Ine.). EGF-R

I inhibitore nzijn beschreven in bijvoorbeeld WO 95/19970 (gepubliceerd op 27 juli I 1995), WO 98/14451 (gepubliceerd op 9 april 1998), WO 98/02434 (gepubliceerd op I 10 22 januari 1998), en United States octrooischrift 5.747.498 (uitgegeven op 5 mei I 1998), allen hier ingevoegd door middel van referentie, en zulke substanties kunnen I gebruikt worden in de onderhavige uitvinding zoals hierin beschreven.

I [0199] EGF-R-inhibiterende middelen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de monoklonale antilichamen C225 en anti-EGF-R 22Mab (ImClone Systems I 15 Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD- 7200 (Merck KgaA), I EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Ine. en Merck KgaA), en de I verbindingen ZD-1834, ZD-1838 en IRESSA™ (ZD-1839) (AstraZeneca), PKI-166 I (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), C P 701 (Cefalon), I leilunomide (Pharmacia/Sugen), Tarceva™ (OSI, Roche en Genetech), CI-1033 I 20 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parice Davis), I CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (BoehringerMannheim GmbH/Roche), I Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-Π (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), I EGF fusie toxin (Seragen Ine.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial 25 Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Rughes Cancer I Center), WHI-P97 (parker Rughes Cancer Center), GW-282974 (Olaxo), KT-8391 I (Kyowa Hakko) en EOF-R Vaccin (York Medical/Centro de Immunologia Molecular I (CIM)). Deze en andere EGF-R-inhibiterende middelen kunnen gebruikt worden in I de onderhavige uitvinding.

I 30 [0200] VEGF-R en VEGF inhibitoren, bijvoorbeeld SU-5416,SU-11248 en SU- I 6668 (Sugen Ine.), SH-268 (Schering), en NX-1838 (NeXstar) kunnen ook I 1026776- 75 gecombineerd worden met de verbinding van de onderhavige uitvinding. VEGF en VEGF-R inhibitoren zijn beschreven in bijvoorbeeld WO 99/24440 (gepubliceerd 20 mei 1999), PCT Internationale aanvrage PCT/IB99/00797 (ingediend 3 mei 1999), in WO 95/21613 (gepubliceerd 17 augustus 1995), WO 99/61422 (gepubliceerd 2 5 december 1999), United States octrooischrift 5.834.504 (uitgegeven 10 november 1998), WO 98/50356 (gepubliceerd 12 november 1998), United States octrooischrift 5.883.113 (uitgegeven 16 maart 1999), United States octrooischrift 5.886.020 (uitgegeven 23 maart 1999), United States octrooischrift 5.792.783 (uitgegeven 11 augustus 1998), WO 99/10349 (gepubliceerd 4 maart 1999), WO 97/32856 10 (gepubliceerd 12 september 1997), WO 97/22596 (gepubliceerd 26 juni 1997), WO 98/54093 (gepubliceerd 3 december 1998), WO 98/02438 (gepubliceerd 22 januari 1998), WO 99/16755 (gepubliceerd 8 april 1999), en WO 98/02437 (gepubliceerd 22 januari 1998), die allen in hun geheel ingevoegd zijn door middel van referentie.

[0201] Andere voorbeelden van sommige specifieke VEGF-R en VEGF inhibitoren 15 die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn IM862 (Cytran Ine.); Avastin™; en angiozyme, een synthetisch ribozym van Ribozyme en Chiron. Deze en andere VEGF en VEGF-R inhibitoren kunnen gebruikt worden in de onderhavige uitvinding zoals hierin beschreven.

[0202] ErbB2 receptor inhibitoren, zoals GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), en de 20 monoklonale antilichamen AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Ine.) en 2B-1 (Chiron), kunnen verder gecombineerd worden met de verbinding van de uitvinding, bijvoorbeeld die welke aangegeven zijn in WO 98/02434 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 99/35146 (gepubliceerd op 15 juli 1999), WO 99/35132 (gepubliceerd opl5 juli 1999), WO 98/02437 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 97/13760 25 (gepubliceerd op 17 april 1997), WO 95/19970 (gepubliceerd op 27 juli 1995),

United States octrooischrift 5.587.458 (uitgegeven op 24 december 1996), en United States octrooischrift 5.877.305 (uitgegeven op 2 maart 1999), die hier allemaal in hun geheel ingevoegd zijn door middel van referentie. ErbB2 receptor inhibitoren die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn ook beschreven in United States 30 octrooischrift 6.465.449 (uitgegeven op 15 oktober 2002), en in United States octrooischrift 6.284.764 (uitgegeven op 4 september 2001), hierin ingevoegd door 1026776-

I 76 I

middel van referentie. De eibB2 receptor inhibitor verbindingen en substanties die beschreven zijn in de voorgenoemde octrooidocumenten, evenals andere I verbindingen en substanties die de erbB2 receptor inhibiteren, kunnen volgens de I onderhavige uitvinding gebruikt worden met de verbinding van de onderhavige 5 uitvinding.

I [0203] Een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding kan ook gebruikt worden met I inhibitoren van PDGFR, BCR-ABL of c-kit zoals Gieevec™ (Novaritis).

I [0204] Een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding kan ook gebruikt worden met I anti-IGF-IR antilichamen zoals die welke beschreven zijn in WO 02053596 10 (gepubliceerd op 11 juli 2002), bijvoorbeeld een antilichaam met de sequentie van I antilichaam 2.12.1,2.13.2,2.14.3, I 3.1.1,4.9.2 of 4.17.3. Het antilichaam van de uitvinding kan ook gebruikt worden met CTLA-4 antilichamen, zoals die welke beschreven zijn in United States I octrooischrift 6.682.736, waaronder een antilichaam met de sequentie van I 15 antilichaam 3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1, I 12.3.1.1, of 12.9.1.1. Het antilichaam kan ook gebruikt worden met CD40 antilichamen, zoals die welke beschreven zijn in W003040170, gepubliceerd op 15 mei 2003, waaronder een met de sequentie van antilichaam 3.1.1,3.1.1H-A78T, I 3.1.1 H-A78T-V88 A-V97A, 7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,212.1,22.1.1,22.1.1H- I 20 C109A, 23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1H-D16E, 23.29.1 of 24.2. De antilichamen I kunnen ook gecombineerd worden met anti-integrine middelen, zoals anti-integrine I antilichamen.

[0205] Sommige specifieke voorbeelden van middelen waarmee het antilichaam I gecombineerd kan worden omvatten de volgende: (1) de alkyleringsmiddelen stikstof 25 mosterd N-oxide, cyclofosfamide, ifosfamide, melfalan, busulfanmitobronitol, I carboquon, thiotepa, ranimustine, nimustine, en temozolomide;;(2) de anti- metabolieten methotrexaat, 6-mercaptopurine, riboside, mercaptopurine, 5-FU, I tegafur, doxifluridine, carmofur, cytarabine, cytarabine, ocfosfaat, enocitabine, S-l, I Gemcitabine, Fludarabine en Capecitabine; (3) de;antibiotica actinomycine D, I 30 doxorubicine, daunorubicine, neocarzinostatine, bleomycine, peplomycine, I 1026776- 77 mitomycine C, aclarubicine, pirarubicine, epirubicine, zinostatine, stimalamer, en idarubicine; (4) de van planten afgeleide antitumor middelen vincristine, vinblastine, vindeshine, etoposide,sobuzoxan, docetaxel, paclitaxel, en vinorelbine; (5) de platina gecoördineerde verbindingen cisplatina, carboplatina, nedaplatina, en oxaliplatina; 5 (6) camptothecine derivaten irinotecan, topotecan en campthotecine; (7) tyrosine kinase inhibitoren Iressa™ (gefitinib) en SU5416; (8) anti-CD20 middelen zoals Rituxan™ (Rituximab) Bexxar (tositumomab), en ZevalinTM (Ibritumomab tiuxetan); (9) interferonen interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferonbèta, interferon gamma-la en interferon gamma-nl; (10) biologische 10 respons modificatoren krestine, lentinan, sizofiran, picibanil en ubenimex; of (11) andere antitumor middelen mitoxantron, 1-asparaginase, procarbazine, dacarbazine, hydroxycarbamide, pentostatine en Tretinoïne. Bovendien kan het antilichaam van de uitvinding gecombineerd worden met antikanker middelen zoals exemestaan, Edotecarin™ (J-107088), en SU11248. is

Diagnostische gebmiksmethoden

[0206] In een ander aspect voorziet de uitvinding in diagnostische methoden. De anti-c-Met anti lichamen kunnen gebruikt worden voor het detecteren van c-Met in a 20 biologisch monster, in vitro of in vivo. In een uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een methode voor het diagnosticeren van de aanwezigheid of de locatie van een c-Met tot expressie brengende tumor in een patiënt die daaraan behoefte heeft, omvattende de stappen van het injecteren van het antilichaam in de patiënt, het bepalen van de expressie van c-Met in de patiënt door het lokaliseren waar het 25 antilichaam gebonden is, het vergelijken van de expressie in de patiënt met die van een normale referentie patiënt of een standaard, en het diagnosticeren van de aanwezigheid of de locatie van de tumor.

[0207] De anti-C-Met antilichamen kunnen gebruikt worden in een conventionele immunoassay, waaronder zonder beperking een ELISA, een RIA, stroming 30 cytometrie, weefsel immunohistochemie, Western blot of immunoprecipitatie. De anti-c-Met antilichamen van de uitvinding kunnen gebruikt worden voor het 1 02 6776- I 78 1 I detecteren van c-Met uit mensen. In een andere uitvoeringsvorm kunnen de anti- c- I Met antilichamen gebruikt worden voor het detecteren van c-Met uit Cynomolgus I apen of rhesusapen. In een andere uitvoeringsvorm kunnen de anti-c-Met antilichamen gebruikt worden voor het detecteren van c-Met van ratten.

I 5 [0208] De uitvinding vóórziet in een methode voor het detecteren van c-Met in een I biologisch monster omvattende het in contact brengen van het biologische monster I met een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding en het detecteren van het gebonden I antilichaam. In een uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam direct gelabeld met I een detecteerbaar label. In een andere uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam 10 (het eerste antilichaam) ongelabeld en een tweede antilichaam of een ander molecule dat aan het anti-c-Met antilichaam kan binden is gelabeld. Zoals goed bekend is bij hen die bekwaam zijn in het vakgebied, wordt een tweede antilichaam gekozen dat in I staat is om specifiek te binden aan het soort in kwestie en de klasse van het eerste I antilichaam. Bijvoorbeeld, indien het anti-c-Met antilichaam een humaan IgG is, dan I 15 zou het tweede antilichaam een anti-humaan-IgG zijn. Andere moleculen die aan I antilichamen zouden kunnen binden omvatten, zonder beperking, Proteïne A en I Proteïne G, die beide commercieel verkrijgbaar zijn, bijvoorbeeld van Pierce I Chemical Co.

I [0209] Geschikte labels voor het antilichaam of secundaire antilichaam zijn I 20 hierboven beschreven, en omvatten diverse enzymen, prosthetische groepen, I fluorescente materialen, luminescente materialen en radioactieve materialen.

Voorbeelden van geschikte enzymen omvatten paardenradijs peroxidase, alkaline I fosfatase, β-galactosidase, of acetylcholinesterase; voorbelden van geschikte prosthetische groep complexen omvatten streptavidine/biotine en avidine/biotine; I 25 voorbeelden van geschikte fluorescente materialen omvatten umbelliferon, I fluoresceïne, fluorescente isothiocyanaat, rhodamine, ctichlorotriazmylamine fluoresceïne, dansylchloride of fycoeiythrine; een voorbeeld van een luminescent I materiaal omvat luminol; en voorbeelden van geschikte radioactieve I materialen omvatten I25I, ,3% 33S of 3H.

I 30 [0210] In andere uitvoeringsvormen kan c-Met geassayd worden in een biologisch I monster door een competitie immunoassay gebruikmakend van c-Met standaarden I 1026776^ 79 gelabeld met een detecteerbare substantie en een ongelabeld anti-c-Met antilichaam. In deze assay worden het biologische monster, het label en c-Met standaarden en het anti-c-Met antilichaam gecombineerd en de hoeveelheid gelabeld c-Met standaard gebonden aan het ongelabelde antilichaam wordt bepaald. De hoeveelheid c-Met in 5 het biologische monster is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid gelabeld c-Met standaard gebonden aan het anti-c-Met antilichaam.

[0211] Het is mogelijk om de bovenstaand beschreven immunoassays te gebruiken voor een aantal verschillende doelen. Bijvoorbeeld kunnen de anti-c-Met antilichamen gebruikt worden voor het detecteren van c-Met in in cultuur gebrachte 10 cellen. In een voorkeurs uitvoeringsvorm worden de anti-c-Met antilichamen gebruikt voor het bepalen van de hoeveelheid c-Met op het oppervlak van cellen die met diverse verbindingen behandeld zijn. Deze methode kan gebruikt worden voor het identificeren van verbindingen die c-Met proteïne gehaltes moduleren. Volgens deze methode wordt een monster van cellen behandeld met een testverbinding 15 gedurende een tijdspanne, terwijl een ander monster onbehandeld blijft Indien het totale gehalte van c-Met gemeten dient te worden, worden de cellen gelyseerd en het totale c-Met niveau wordt gemeten gebruikmakend van een van de boven beschreven immunoassays. Het totale gehalte c-Met in de behandelde versus de onbehandelde cellen wordt vergeleken om het effect van de testverbinding te bepalen.

20 [0212] Een voorkeurs immunoassay voor het meten van totale c-Met gehaltes is stroming cytometrie of immunohistochemie. Indien het celoppervlak niveau van c-Met gemeten dient te worden, worden de cellen niet gelyseerd, en de celoppervlak niveaus van c-Met worden gemeten gebruikmakend van een van de boven beschreven immunoassays. Een voorkeurs immunoassay voor het bepalen van 25 celoppervlak niveaus van c-Met omvat de stappen van het labelen van de celoppervlak proteïnen met een detecteerbaar label, zoals biotine of 1251, het c-Met immunoprecipiteren met een anti-c-Met antilichaam en dan het detecteren van het gelabelde c-Met

[0213] Een andere voorkeurs immunoassay voor het bepalen van de localisatie van c-30 Met, zoals celoppervlak niveaus is door gebruik te maken van immunohistochemie.

Een voorkeurs immunoassay voor het detecteren van celoppervlak niveaus van c-Met 1026776- I 80 I omvat het binden van een anti-c-Met antilichaam gelabeld met een geschikte

I fluorofoor, zoals fluoresceïne of fycoerythrine, en het detecteren van het primaire I

I antilichaam gebruikmakend van stroming cytometrie. In een andere uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam ongelabeld en een tweede antilichaam of een ander s molecule dat kan binden aan het anti-c-Met antilichaam is gelabeld. Methoden zoals I ELISA, RIA, stroming cytometrie, Western blot, immunohistochemie, celoppervlak I labellen van integrale membraanproteïnen en immunoprecipitade zijin goed bekend I in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld Harlow en Lane, supra. Bovendien kunnen de I immunoassays opgeschaald worden voor hoge doorvoer screening om een groot I 10 aantal verbindingen te testen op activering of inhibitie van c-Met.

I [0214] De anti-c-Met antilichamen van de uitvinding kunnen ook gebruikt worden I voor het bepalen van de niveaus van c-Met in een weefsel of in cellen die afgeleid I zijn van het weefsel. In sommige uitvoeringsvormen is het weefsel een ziek weefsel.

I In sommige uitvoeringsvormen is het weefsel een tumor of een biopsie daarvan. In I 15 sommige uitvoeringsvormen van de werkwijze wordt een weefsel of een biopsie I daarvan uitgenomen uit een patiënt Het weefsel of de biopsie wordt dan gebruikt in een immunoassay voor het bepalen van bijvoorbeeld totale c-Met niveaus, I celoppervlak niveaus van c-Met of localisatie van c-Met door middel van de boven I beschreven werkwijzen.

I 20 [0215] De boven beschreven diagnostische methode kan gebruikt worden om te 1 bepalen of een tumor hoge gehalten van c-Met tot expressie brengt, hetgeen een I indicatie zou kunnen zijn dat de tumor een doel is voor behandeling met anti-c-Met I antilichaam. De diagnostische methode kan ook gebruikt worden voor het bepalen of I een weefsel of cel onvoldoende niveaus van c-Met of geactiveerd c-Met tot expressie I 25 brengt, en aldus een kandidaat is voor behandeling met activerende anti-c-Met I antilichamen, HGF en/of andere therapeutische middelen voor het vergroten van c-

Met gehaltes of activiteit.

I [0216] De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen ook in vivo gebruikt I worden voor het identificeren van weefsels en organen die c-Met tot expressie 30 brengen. In sommige uitvoeringsvormen worden de anti-c-Met antilichamen gebruikt I voor het identificeren van c-Met tot expressie brengende tumoren. Een voordeel van I 1 02 6776-’ 81 het gebruik maken van de humane anti-c-Met antilichamen van de onderhavige uitvinding is dat ze veilig in vivo gebruikt kunnen worden zonder een substantiële immuunrespons jegens het antilichaam op te wekken bij toediening, in tegenstelling tot antilichamen van niet humane oorsprong of met gehumaniseerde of chimaere 5 antilichamen.

[0217] De methode omvat de stappen van het toedienen van een detecteerbaar gelabeld anti-c-Met antilichaam of een samenstelling die deze omvat aan een patiënt die behoefte heeft aan zulk een diagnostische test en de patiënt 'knaging’ analyse te laten ondergaan om de locatie te bepalen van de c-Met tot expressie brengende 10 weefsels. Imaging analyse is goed bekend in het medische vakgebied, en omvat, zonder beperking, Röntgen analyse, magnetische resonantie imaging (MRI) of gecomputeriserde tomografy (CT). Het antilichaam kan gelabeld zijn met elk middel dat geschikt is voor in vivo imaging, bijvoorbeeld een contrastmiddel, zoals barium, hetgeen gebruikt kan worden voor Röntgen analyse, of een magnetisch IS contrastmiddel zoals een gadoliniumchelaat, hetgeen gebruikt kan worden voor MRI of CT. Andere labelingsmiddelen omvatten, zonder beperking, radioisotopen zoals "Tc. In een andere uitvoeringsvorm zal het anti-c-Met antilichaam ongelabeld zijn en zal het geftnaged worden door het toedienen van een tweede antilichaam of een ander molecule dat detecteerbaar is en dat het anti-c-Met antilichaam kan binden. In 20 uitvoeringsvorm wordt een biopsie verkregen van de patiënt om te bepalen of het van belang zijnde weefsel c-Met tot expressie brengt

Therapeutische gebruiksvormen 25 [0218] hi een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een methode voor het inhibiteren van c-Met activiteit door het toedienen van een anti-c-Met antilichaam aan een patiënt die daaraan behoefte heeft In een andere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in een methode voor het activeren van c-Met activiteit door het toedienen van een anti-c-Met antilichaam aan een patiënt die hieraan behoefte heeft Elk van de 30 typen van antilichamen die hierin beschreven zijn kan therapeutisch gebruikt worden. In een voorkeurs uitvoeringsvorm, is het anti-c-Met antilichaam een humaan, 1026778- I 82 I chimaer of gehumaniseerd antilichaam. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm is I het c-Met humaan en de patiënt is een menselijke patiënt Alternatief kan de patiënt I een zoogdier zijn dat een c-Met tot expressie brengt waarmee het anti-c-Met I antilichaam kruisreageert. Het antilichaam kan toegediend worden aan een niet 5 humaan zoogdier dat c-Met tot expressie brengt waarmee het antilichaam I kruisreageert (zoals een rat, of een Cynomologus aap) voor veterinaire doelen of als een diermodel van menselijke ziekte. Zulke diermodellen kunnen bruikbaar zijn voor I het evalueren van de therapeutische werking van antilichamen van deze uitvinding.

I [0219] Zoals hierin gebruikt wordt met de term "een aandoening waarin c-Met I 10 activiteit schadelijk is" ziekten en andere aandoeningen te omvatten waarin van de aanwezigheid van hoge niveaus van c-Met in een patiënt die leidt aan de aandoening I aangetoond, of verdacht, is dat die verantwoordelijk is voor de pathofysiologie van I de aandoening of een factor die bijdraagt aan een verergering van de aandoening.

I Zulke aandoeningen kunnen bijvoorbeeld bewezen worden door een toename in de IS gehaltes van c-Met op het celoppervlak of in toegenomen tyrosine autofosforylering I van c-Met in de aangedane cellen of weefsels van een patiënt die leidt aan de aandoening. De toename in c-Met niveaus kan bijvoorbeeld gedetecteerd worden I gebruikmakend van een anti-c-Met antilichaam zoals hierboven beschreven.

I [0220] In een uitvoeringsvorm kan een anti-c-Met antilichaam toegediend worden I 20 aan een patiënt die een c-Met tot expressie brengende tumor heeft. Een tumor kan I een vaste tumor of een niet vaste tumor, zoals een lymfoom, zijn. In een I uitvoeringsvorm met grotere voorkeur kan een anti-c-Met antilichaam toegediend I worden aan een patiënt die een c-Met tot expressie brengende tumor heeft die kankerachtig is. In een uitvoeringsvorm met nog grotere voorkeur wordt het anti-c- I 25 Met antilichaam toegediend aan een patiënt die een c-Met tot expressie brengende I tumor heeft van de long, borst, prostaat of dikke darm. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm wordt het anti-c-Met antilichaam toegediend aan een patiënt die een I glioblastoma tumor heeft die c-Met tot expressie brengt In een uitvoeringsvorm met I grote voorkeur zorgt de methode ervoor dat de tumor niet toeneemt in gewicht of I 30 volume of afneemt in gewicht of volume. In een andere uitvoeringsvorm voorkomt I de methode HGF binding aan c-Met op het oppervlak van tumorcellen of resulteert in I 1026776- 83 een neerregulering van c-Met celoppervlak proteïne. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het antilichaam gekozen uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-A14P; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-A14P,E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2H-AI4P,E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T.H-A14P; 13.3.2L-5 A91T3-E42K; 13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K; 13.3.2L-A91 T,H-E42K,S97T of 13.3.2L-A91T,H-Al 4P,E42K,S97T, of omvat het een zware keten, lichte keten of antigen bindende regio daarvan.

[0221] In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm kan een anti-c-Met antilichaam toegediend worden aan een patiënt die onjuist hoge gehaltes c-Met tot expressie 10 brengt Het is bekend in het vakgebied dat hoge niveau expressie van c-Met kan leiden tot een veelheid aan algemene kankers. In een uitvoeringsvorm heeft de methode betrekking op de behandeling van kanker zoals brein, schubvormige cellen, blaas, maag, pancreas, borst, hoofd en nek, slokdarm, prostaat, colorectaal, long, renaal, nier eierstok, gynecologisch of schildklierkanker. Patiënten die behandeld IS kunnen worden met een verbinding van de uitvinding volgens werkwijzen van deze uitvinding omvatten, bijvoorbeeld, patiënten die gediagnostiseerd zijn met longkanker, botkanker, pancreaskanker, huidkanker, kanker van het hoofd en nek, cutaan of intraoculair melanoma, baarmoederkanker, eierstokkanker, rectale kantor, kanker van de anale regio, maagkanker, dikke darm kanker, borstkanker, 20 gynacologische tumoren (zoals baarmoeder sarcoma’s, carcinoom van de eileiders, carcinoom van het endometrium, carcinoom van de cervix, carcinoom van de vagina of carcinoom van de vulva), de ziekte van Hodgkin, kanker van de slokdarm, kanker van de dunne darm, kanker van het endocriene systeem (zoals kanker van de schildklier, paraschildklier of adrenale klieren), sarcoma's van zachte weefsels, 25 kanker van de urethra, kanker van de penis, prostaatkanker, chronische of acute leukemie, vaste kindertumoren, lymfocytische lymfomen, kanker van de blaas, kanker van de nier of urineleider (zoals renal e cel carcinoom, vooral erfelijk en sporadische papillaire renale cel carcinomen die activerende mutaties hebben in het c-Met kinase domein, carcinoom van het nierbekken), of neoplasmen van het centrale 30 zenuwstelsel zoals primair CNS lymfoom, tumoren van de spinale as, hersenstam glioma’s of hypofyse adenoma’s). In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur, 1026776-

I 84 I

I wordt het anti-c-Met antilichaam toegediend aan een patiënt met borstkanker, I

I prostaatkanker, longkanker, dikke darm kanker of een glioblastoma. In een I

uitvoeringsvorm met nog grotere voorkeur laat de werkwijze de kanker stoppen met I

I zich abnormaal te prolifereren of niet toe te nemen in gewicht of volume of af te I

I 5 nemen in gewicht of volume. I

I [0222] Het antilichaam kan eenmaal toegediend worden, maar wordt met grotere I

I voorkeur meerdere malen toegediend. Het antilichaam kan van driemaal daags tot I

I eenmaal per zes maanden of langer toegediend worden. De toediening kan op schema I

I zijn zoals driemaal daags tweemaal daags eenmaal daags, eenmaal per twee dagen, I

I 10 eenmaal per drie dagen, eenmaal per week, eenmaal per twee weken, eenmaal per I

I maand, eenmaal per twee maanden, een maal per drie maanden en eenmaal per zes I

I maanden. Het antilichaam kan ook continu toegediend worden via een minipomp.

I Het antilichaam kan toegediend worden via een orale, mucosale, buccale, intranasale,

I inhaleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire, parenterale, intratumor of I

I 15 topikale route. Het antilichaam kan toegediend worden op de plaats van de tumor, in I de tumor, of op een plaats verwijderd van de tumor. Het antilichaam kan eenmaal

I toegediend worden, tenminste tweemaal of gedurende tenminste de tijdspanne totdat I

de aandoening behandeld, gepalliateerd of genezen is. Het antilichaam zal in het algemeen toegediend worden voor zo lang als de tumor aanwezig is, aangenomen dat I 20 het antilichaam ervoor zorgt dat de tumor of kanker stopt met groeien of afheemt in I gewicht of volume. Het antilichaam zal in het algemeen toegediend worden als deel I van een farmaceutische samenstelling zoals hierboven beschreven. De dosering van antilichaam zal in het algemeen in het gebied zijn van 0,1-100 mg/kg, met grotere I voorkeur 0,5-50 mg/kg, met grotere voorkeur voor 1-20 mg/kg, en met nog grotere I 25 voorkeur voor 1-10 mg/kg. De serumconcentratie van het antilichaam kan volgens I elke methode die bekend is in het vakgebied gemeten worden.

[0223] In een ander aspect kan het anti-c-Met antilichaam gezamenlijk toegediend I worden met andere therapeutische middelen, zoals anti-neop 1 astische I geneesmiddelen of moleculen, aan een patiënt die een hyperproliferatieve I 30 aandoening, zoals kanker of een tumor heeft In een aspect heeft e uitvinding I betrekking op een methode voor de behandeling van de hyperproliferatieve I 1026776- 85 aandoening in een zoogdier omvattende het toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een verbinding van de uitvinding in combinatie met een anti-tumor middel gekozen uit de groep bestaande uit, maar niet beperkt tot, mitotische inhibitoren, alkyleringsmiddelen, anti-metabolieten, 5 intercalaterende middelen, groeifactor inhibitoren, celcyclus inhibitoren, enzymen, topoisomerase inhibitoren, biologische respons modificatoren, anti-hormonen, kinase inhibitoren, matrix metalloprotease inhibitoren, genetische therapeutica en anti-androgenen. In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur kan het antilichaam toegediend worden met een antineoplastisch middel, zoals adriamycine of taxol. In 10 een andere voorkeurs uitvoeringsvorm, wordt het antilichaam of de combinatie therapie toegediend tezamen met radiotherapie, chemotherapie, fotodynamische therapie, chirurgie of andere immunotherapie. In nog een andere voorkeurs uitvoeringsvorm zal het antilichaam toegediend worden met een ander antilichaam. Bijvoorbeeld kan het anti-c-Met antilichaam toegediend worden met een antilichaam IS of ander middel waarvan bekend is dat het tumor- of kankercel proliferatie inhibiteert, zoals een antilichaam of middel dat de erbB2 receptor, EGF-R, CD20 of VEGF inhibiteert

[0224] Gezamenlijke toediening van het antilichaam met een aanvullend therapeutisch middel 20 (combinatie therapie) omvat het toedienen van een farmaceutische samenstelling die het anti-c-Met antilichaam en het aanvullende therapeutische middel omvat evenals het toedienen van twee of meer aparte farmaceutische samenstellingen, de een omvat het anti-c-Met antilichaam en de andere(n) omvatten) het (de) aanvullende therapeutische middel(len). Verder, alhoewel gezamenlijk toediening of combinatie 25 therapie in het algemeen betekent dat het antilichaam en de aanvullende therapeutische middelen gezamenlijk toegediend worden op dezelfde tijd, omvat het ook gevallen waarin het antilichaam en de aanvullende therapeutische middelen toegediend worden op verschillende tijden. Bijvoorbeeld kan het antilichaam eenmaal per drie dagen toegediend worden, terwijl het aanvullende therapeutische 30 middel eenmaal per dag toegediend wordt Alternatief kan het antilichaam toegediend worden voorafgaand aan of volgend op behandeling van de aandoening 1 02 6776-

I 86 I

I met het aanvullende middel, bijvoorbeeld nadat een patiënt een mislukte therapie I

I heeft gehad met het aanvullende middel. Net zo kan toediening van het anti-c-Met I

I antilichaam toegediend worden voorafgaand aan, of volgend op, andere therapie, I

I zoals radiotherapie, chemotherapie, fotodynamische therapie, chirurgie of andere I

I S immunotherapie. I

I [0225] Het antilichaam en een of meer aanvullende therapeutische middelen (de I

I combinatie therapie) kan eenmaal, tweemaal of tenminste gedurende de tijdspanne I

I totdat de aandoening behandeld, gepalliateerd of genezen is toegediend worden. Bij I

I voorkeur wordt de combinatietherapie meerdere malen toegediend. De I

I 10 combinatietherapie kan van driemaal daags tot eenmaal per zes maanden toegediend I

I worden. De toediening kan op een schema zijn zoals driemaal daags, tweemaal I

I daags, eenmaal daags, eenmaal per twee dagen, eenmaal per drie dagen, eenmaal per I

I week eenmaal per twee weken, eenmaal per maand, eenmaal per twee maanden, I

I eenmaal per drie maanden en eenmaal per zes maanden of kan continu toegediend I

I 15 worden via een minipomp. De combinatietherapie kan toegediend worden via een I

I orale, mucosale, buccale, intranasale, inhal eerbare, intraveneuze, subcutane, I

I intramusculaire, parenterale, intratumor of topikale route. De combinatietherapie kan I

I toegediend worden op een plaats die afgelegen is van de plaats van de tumor. De I

I combinatietherapie zal in het algemeen toegediend worden voor zo lang als de tumor I

I 20 aanwezig in, indien het antilichaam ervoor zorgt dan de tumor of kanker stopt met I

I groeien of afheemt in gewicht of volume. I

I [0226] In nog een verdere uitvoeringsvorm is het anti-c-Met antilichaam gelabeld I

I met een radiolabel, een immunotoxine of een toxine, of het is een fusieproteïne I

I omvattende een toxisch peptide. Het anti-c-Met antilichaam of het anti-c-Met I

I 25 antilichaam ftisie proteïne stuurt het radiolabel, immunotoxine, toxine of toxische I

I peptide naar de c-Met tot expressie brengende tumor of kankercel. In een voorkeurs I

I uitvoeringsvorm wordt het radiolabel, immunotoxine, toxine of toxische peptide I

I geïnternaliseerd nadat het anti-c-Met antilichaam bindt aan het c-Met op het I

I oppervlak van de tumor of kankercel. I

I 30 [0227] In een ander aspect kan het anti-c-Met antilichaam gebruikt worden voor het I

I behandelen van niet kankerachtige ziekten of condities die geassocieerd zijn met c- I

I 1026776- 87

Met In een uitvoeringsvorm omvat de methode de stap van het toedienen van een anti-c-Met antilichaam aan een patiënt die een niet-kankerachtige pathologische staat heeft, veroorzaakt of verergerd door c-Met activiteit In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur, vertraagt het anti-c-Met antilichaam de progressie van de niet 5 kankerachtige pathologische staat In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur, stopt het anti-c-Met antilichaam de niet kankerachtige pathologische staat of keert het deze, in elk geval gedeeltelijk, om.

[0228] In een ander aspect voorziet de uitvinding in een methode voor het toedienen van een activerend anti-c-Met antilichaam aan een patiënt die daar behoefte aan 10 heeft. In sommige uitvoeringsvormen, wordt het activerende antilichaam of een farmaceutische samenstelling die het omvat toegediend aan een patiënt die daaraan behoefte heeft met een hoeveelheid die effectief is voor het vergroten van c-Met activiteit In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het activerende antilichaam in staat om de normale c-Met activiteit te restaureren. In een andere voorkeurs 15 uitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam toegediend worden aan een patiënt die behoefte heeft aan weefsel regeneratie. In een andere uitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam toegediend worden aan een patiënt voor het behandelen van renale of tubulointerstitiale fibrose. In een andere uitvoeringsvorm kan het activerende anti-c-Met antilichaam toegediend worden aan een patiënt voor het 20 behandelen van problemen die geassocieerd worden met transplantatie chirurgie, bijvoorbeeld voor het behandelen van ischemie die geassocieerd wordt met niertransplantaat afstoting. In een andere uitvoeringsvorm kan het antilichaam gebruikt worden voor het verminderen van toxiciteit geassocieerd met cyclosporine behandeling na transplantaat chirurgie. In een andere uitvoeringsvorm kan het 25 activerende anti-c-Met antilichaam toegediend worden voor het behandelen van myocardiaal infarct, cardiacale ischemie als gevolg van reperfusie verwonding, restenose na angioplastie of vasculaire ziekten zoals arteriosclerosis obliterans. In een andere uitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam toegediend worden voor het helen van een wond, bijvoorbeeld teruggetrokken huidzweren of voor het behandelen 30 van maagzweren. In een andere voorkeurs uitvoeringsvorm kan het activerende antilichaam toegediend worden met een of meerdere andere factoren die een 1026776-

I 88 I

I therapeutische procedure versnellen zoals weefsel regeneratie of toename van c-Met I

I activiteit Zulke factoren omvatten groeifactoren zoals HGF en/of analogen van HGF I

I die c-Met activeren. In een voorkeurs uitvoeringsvorm is het antilichaam gekozen uit I

I 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3, varianten daarvan of die een zware keten, lichte keten of I

I 5 antigen bindend deel daarvan omvatten. I

I Gentherapie

I [0229] De nucleïnezuur moleculen van de onderhavige uitvinding kunnen toegediend I

I 10 worden aan een patiënt die daar behoefte aan heeft via gentherapie. De therapie kan I

I zowel in vivo als ex vivo plaatsvinden. In een voorkeurs uitvoeringsvorm worden I

I nucleïnezuur moleculen die zowel coderen voor een zware keten als een lichte keten I toegediend aan een patiënt In een uitvoeringsvorm met grotere voorkeur worden de

I nucleïnezuur moleculen zo toegediend, dat ze stabiel geïntegreerd worden in I

I 15 chromosomen van B cellen, aangezien deze cellen gespecialiseerd zijn in het I produceren van antilichamen. In een voorkeurs uitvoeringsvorm worden B cellen ex I vivo getransfécteerd of geïnfecteerd en teruggetransplanteerd in een patiënt die I daaraan behoefte heeft In een andere uitvoeringsvorm worden precursor B cellen of I andere cellen in νάνο geïnfecteerd gebruikmakend van een virus waarvan bekend is I 20 dat het het van belang zijnde celtype infecteert. Typerende vectoren die gebruikt I worden voor gentherapie omvatten liposomen, plasmiden en virale vectoren.

I Voorbeelden van virale vectoren zijn retro virussen, adenovirussen en adeno I geassocieerde virussen. Na infectie in vivo of ex vivo, kunnen de niveaus van antilichaam expressie gemonitord worden door een monster te nemen van de I 25 behandelde patiënt en gebruik te maken van enige immunoassay die bekend is in het I vakgebied of hierin beschreven.

I [0230] In een voorkeurs uitvoeringsvorm omvat de gentherapie methode de stappen I van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecule dat codeert voor de I zware keten of een antigenbindend deel daarvan van een anti-c-Met antilichaam en I 30 het nucleïnezuur molecule tot expressie brengen. In een andere uitvoeringsvorm I omvat de gentherapie methode de stappen van het toedienen van een geïsoleerd I 1026776- 89 nucleïnezuur molecule dat codeert voor de lichte keten of een antigen bindend deel daarvan van een anti-c-Met antilichaam en het tot expressie brengen van het nucleïnezuur molecule. In een methode met grotere voorkeur omvat de gentherapie methode de stappen van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuur molecule dat s codeert voor de zware keten of een antigen bindend deel daarvan en een geïsoleerd nucleïnezuur molecule dat codeert voor de lichte keten of het antigen bindende deel daarvan van een anti-c-Met antilichaam van de uitvinding en het tot expressie brengen van de nucleïnezuur moleculen. De gentherapie methode kan ook de stappen omvatten van het toedienen van een ander anti kanker middel, zoals taxol of 10 adriamycine.

[0231] Opdat deze uitvinding beter begrepen wordt, zijn de volgende voorbeelden uiteen gezet. Deze voorbeelden zijn slechts ten behoeve van illustratie en dienen niet opgevat te worden als een beperking van de reikwijdte van de uitvinding in enige manier.

15

Voorbeeld I

Genereren van hvbridoma’s die anti-c-Met ^ntilinhaam produceren 20 [0232] Antilichamen van de uitvinding werden bereid, geselecteerd en als volgt geassayd:

Acht tot tien weken oude enoMouseTM muizen werden intraperitoneaal of in de achtervoetzolen geïmmuniseerd met een c-Met extracellulair domein fusieprotdhe (10 pg/dosering/muis) (R&D Systems, Catalogus #358MT) of met een met NIH-3T3 25 getransfecteerde cellijn die humaan c-Met op zijn plasmamembraan tot expressie brengt (10 x 106 cellen/dosering/muis). Deze dosering werd vijf tot zeven maal herhaald over een periode van drie tot acht weken. Vier dagen voor de fusie kregen de muizen een laatste injectie van het extracellulaire domein fusieproteïne van humaan c-Met in PBS. De milt en de lymfeknoop lymfocyten uit geïmmuniseerde 30 muizen werden gefuseerd met de niet afgevende myeloma P3-X63-Ag8.653 cellijn, en deze gefuseerde cellen ondergingen HAT zoals selectie zoals eerder beschreven (Galfre en Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46,1981). Een panel van hybridoma’s 102 6776-·

I 90 I

I werd gewonnen die alleen c-Met specifieke humane IgG2 antilichamen afgeven. Vier I

I hybridoma’s werden geselecteerd voor verdere studie en werden aangeduid als I

I 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3. De hybridoma’s werden gedeponeerd onder termen in I

I overeenstemming met het Boedapest verdrag bij de American Type Cultuur Collectie I

I 5 (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 op 4 maart 2003. Aan I

I de hybridoma’s zijn de volgende toegangsnummers toegekend: I

I Hybridoma 13.3.2 (LN15883) PTA-5026 I Hybridoma 9.1.2 (LN 15884) PTA-5027 I 10 Hybridoma 8.70.2 (LN 15885) PTA-5028 I Hybridoma 6.90.3 (LN 15886) PTA-5029

I Voorbeeld Π I

I 15 Sequenties van anti-c-Met-antilichamen bereid volgens de uitvinding I

I [0233] Voor het analyseren van de structuur van antilichamen die geproduceerd zijn I

I volgens de uitvinding, werden nucleünezuren gekloneerd die coderen voor zware en I lichte keten fragmenten van hybridoma’s die anti-c-Met monoklonale antilichamen I 20 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3 produceren. Kloneren en sequensen werd als volgt I uitgevoerd:

[0234] Poly(A)+ mRNA werd geïsoleerd gebruikmakend van een Fast-Track kit I (Invitrogen) van bij benadering 2 X103 hybridoma cellen afgeleid van XENOMOUSE™ muizen geïmmuniseerd met humaan c-Met cDNA werd I 25 gesynthetiseerd uit het mRNA door gebruik te maken van statistische primers. Het I statistisch geprimede cDNA werd geamplificeerd gebruikmakend van humane VH of humane Vk familie specifieke variabele domein primers (Marks et al., I "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide I 30 probes." Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) of een universele humane VH primer I [MG-30, 5-CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG-3'] (SEQΠ)NO: 25)],in I 0287764 91 samenhang met primers die specifiek zijn voor de humane C γ2 constante regio, MG-40d [5-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (SEQ1D NO: 26)] of een Ck constante regio [hKP2; zoals eerder beschreven in Green et al., 1994]. Nucleïnezuurmoleculen waden verkregen die coderen voor humane zware en kappa s lichte keten transcripten van de anti-c-Met producerende hybridoma’s door direct sequencen van PCR producten die gevormd zijn uit poly(A*) RNA gebruikmakend van de boven beschreven primers. De PCR producten werden gekloneerd in pCRII (Invitrogen) gebruikmakend vaneen TA kloneringskit (Invitrogen) en beide strengen woren gesequensd gebruikmakend van Prism dye-terminator sequensing kits 10 (Applied Biosystems Ine) en een ABI377 sequensing machine (Applied Biosystems Ine). Al de sequenties werden geanalyseerd door middel van uitlijningen met de "V BASE sequentie directory" (Tamlinsan et al., MRC Centre for Protein Engineering, -Cambridge, UK) gebruikmakend van Mac Vector en Genewoiks software programma's.

13 [0235] Monoklonale antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3 ondergingen volledige lengte DNA kloneren en sequensen. Voor dergelijk sequensen werd RNA geïsoleerd uit bij benadering 1 X 106 hybridoma cellen gebruikmakend van QIAGEN RNeasy RNA isolatie kit (QIAGEN). Het mRNA werd omgekeerd getranscribeerd gebruikmakend van statistische hexameren (Roche Applied Science) en de 20 SuperScript Π RNase H-reverse transcriptase kit (Invitragen). V Base werd gebruikt voor het ontwerpen van voorwaartse amplificatie primers die restrictie plaatsen, optimale Kozak sequentie, de ATG startplaats en een deel van de signaalsequentie van de zware keten omvat. Tabel 2 somt de voorwaardse amplificatie primers op die gebruikt zijn voor het verkrijgen van de antilichaam klonen.

25 1026776-

I 92 I

I TabsU I

Kloon Voorwaartse primer zware keten SEQID

I__NO_ I 13.3.2 TATCTAAGCTTCTAGACGCCACCATGGACTGGACCTG 31 I _GAGCATC___ I 9.1.2 TATCTAAGCTTCTAGACGCCACCATGAAACACCTGTG 32 I _GTTCTTC__ I 5 8.70.2 TATCTAAGCTTCTAGACGCCACCATGAAGCACCTGTG 33 I _GTTCTTC___ I 8.90.3 TATCTAAGCTTCTAGACGCCACCATGGAGTTGGGGCT 34 I GTGCTGG__

Dezelfde methode werd gebruikt voor het ontwerpen van een primer om de 3' I

I coderende sequenties, het stop codon van de IgG2 constante regio [5- I

I 10 TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(SEQ

I ID NO:27)] en restrictieplaatsen te omvatten I

I [0236] Dezelfde methode werd gebruikt voor het ontwerpen van een primer rond de I

I ATG startplaats van de kappa keten [5- I

I TATCTAAGTTCTAGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT -3' (SEQ ID

I 15 NO: 28)]. Een optimale Kozak sequentie (CCGCCACC) werd 5' toegevoegd aan de I

I ATG startplaats. Deze primer werd gebruikt voor het PCR kloneren van de lichte I

I ketens van antilichaam klonen 13.3.2; 8.70.2 en 8.90.3. Een tweede voorwaartse I

I primer [5- I

I TATCTAAGCTTCTAGACGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTC-3'(SEQ

I 20 IDNO:29)] werd gebruikt voor het klonen van de lichte keten van kloon 9.1.2. I

I Dezelfde methode werd ook gebruikt voor het ontwerpen van een primer rond het I

stopcodon van de kappa constante regio [51- I

I TTCTTTDGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'(SEQID

I NO:30)]. Platina Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) werd gebruikt met de primer I

I 25 paren voor het amplificeren van de cDNA’s. Het PCR product werd gekloneerd in I

pCR-Blunt-Π-ΤΟΡΟ (Invitrogen) om de sequentie te verkrijgen van drie tot vijf I

I klonen voor elk kappa keten gen gebruikmakend van standaard technieken (zoals I

I primer lopen) die gebruik maakten van dye-teiminator sequentie kits en een ABI I

I 1026776-' 93 PRISM 3700 DNA analysator (Applied Biosystems Ine). Het PCR product werd gekloneerd in een zoogdierlijke expressievector en klonen werden gesequensd om somatische mutaties te bevestigen. Voor elke kloon werd de sequentie geverifieerd op beide strengen in tenminste drie reacties.

5

Gen toepassingsanalvse

[0237] Uit de nucleïnezuursequentie en de voorspelde aminozuursequentie van de antilichamen werd de gentoepassing geïdentificeerd voor elke antilichaamketen.

10 Tabel 3 zet de gentoepassing uiteen van geselecteerde hybridoma klonen van antilichamen volgens de uitvinding:

Tabel 3

Zware en lichte keten gentoepassing 15 kloon Zware keten kienlijn__Kappa lichte keten kiemlijn SEQID |VH 1¾ Γζ SEQIDlVK |Jk ~ _NO____NO___ 13.32 21_1-18 D2-15 J„4b 17_L5Vk1 4_ 9.1.2 22_4-31 D2-2, D7-27 J„6b 18_A27Vk3 2_ 20 8.702 23_4-39 D2-2_J„4b 19_L5Vk1 3_ OÖ.3 124 13-48 ID4-17 | J^4b |20 |l5Vk1 |l

[0238] Mutagenese van specifieke residuen van de zware en lichte ketens weid uitgevoerd door het ontwerpen van primers en gebruik te maken van de QuickChange 25 Site Directed Mutagenesis Kit van Stratagene, volgens de gebruiksaanwijzingen.

Mutaties werden bevestigd door geautomatiseerd sequensen, en gemutageniseerde inserts werden gesubkloneerd in expressievectoren. Deze expressievectoren werden getransfecteerd in NSO (ECACC #85110503) en HEK-293T cellen (American Type Cultuur Collectie) om recombinant antilichamen van de uitvinding toit expressie te 30 brengen.

Voorbeeld ΠΙ 10267764

I 94 I

I Humane anti-c-Met antiïichamen blok binding van HGF aan c-Met I

I [0239] In vitro assays voor het meten van HGF binding aan c-Met in de I

I S aanwezigheid van anti-c-Met antiïichamen werd uitgevoeid om te bepalen of de anti- I

I c-Met antiïichamen in staat waren om HGF binding aan c-Met te inhibiteren en voor I

I de mate van inhibitie. I

I [0240] Wells van een 96-well weefselcultuur plaat werden overnacht bij I

I kamertemperatuur gecoat met 100 μΐ van een 5 pg/ml oplossing omvattende c-Met I

I 10 ECD/Fc (R&D Systems #358 MT) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). I

I De platen werden op 4 ’C gehouden totdat ze nodig waren voor experimenten. De I

I wells werden viermaal gewassen met Tris-gebufferde zoutoplossing (pH = 8,0) met I

I 0,0 5% TWEEN-20 (TBS-T). vervolgens werd 200 μΐ/well blokkeringsbuffer (3% I

I bovine serum albumine (BSA) in TBS-T) toegevoegd voor 60 minuten (min) bij I

I 15 kamertemperatuur om niet specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. De wells I

I werden 4 maal gewassen met 300 μΐ/well TBS-T. Vervolgens werd 100 μΐ I

I Dulbecco's gemodificeerd eagle medium (DMEM), gesupplementeerd met 10 % FBS I

I dat anti-c-Met antiïichamen uit hybridoma supematanten of gezuiverde antiïichamen I

I bevat in PBS of 20 mM natriumacetaat (pH = 5,5), 140 mM NaCl bij diverse I

I 20 concentraties (zoals 10,3,1,0,3,0,1,0,03 en 0,01 μg/ml, gebaseerd op humane IgG2 I

I concentraties in de supematanten) aan elke well toegevoegd. Anti-c-Met antilichaam I

I werd niet toegevoegd aan de controle wells van het experiment De monsters werden I

I 4 uur (hrs) gemengd bij kamertemperatuur. Vervolgens werd 10 μΐ van 100 ng/ml I

I HGF in serumvrij DMEM aan elke well toegevoegd. De monsters werden 15 I

I 25 minuten gemengd bij kamertemperatuur. De wells werden 4 maal gewassen met 300 I

I μΐ/well/wassing TBS-T. vervolgens werd 100 μΐ van een 1:2000 verdunning van I

I 100 pg/ml anti-HGF gebiotinyleerd antilichaam in blokkeringsbuffer toegevoegd. De I

I oplossingen werden in de wells geïncubeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur. I

I De wells werden 5 maal gewassen met 300 μΐ/well TBS-T. vervolgens werd 100 I

I 30 μΐ/well van een 1,25 mg/ml streptavidine paardenradijs peroxidase (HRP) in een I

I 1:5000 verdunning in blokkeringsbuffer toegevoegd. De monsters werden 30 min I

I 1026776- 95 geïncubeerd bij kamertemperatuur. De wells werden 5 maal gewassen met TBS-T, ongeveer 300 μΐ/well/wassing. Vervolgens werd 100 μΐ/well 33',5,5'-tetramethylbenzidienë (TMB) peroxidase substraat (Kiikegaard & Peny Laboratories) toegevoegd en 1-2 min ontwikkeld bij kamertemperatuur. Om de 5 reactie te stoppen werd 100 μΐ/well TMB stopoplossing (Kiikegaard & Peny Laboratories, #50-85-04) toegevoegd. De monsters werden afgelezen bij een golflengte van 450 nanometer (nm) op een 96-well plaatlezer en geen achtergrond werd afgetrokken.

[0241] Deze experimenten demonstreren dat de anti-c-Met antilichamen de binding 10 van HGF inhibiteerden vergeleken met controle monsters. Ligandbinding assay (tabel 4) toont de IC^ voor inhibitie van ligandbinding voor antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3.

Tabel 4 15 Antilichaam 9.1.2 8.90.3 13.3.2 8.70.2 13.3.2L- A91T, H-

Assay E42K,

_____S97T

Ligandbinding Assay flCffl, pg/ml] 0,093 0,110 0,090 0,115 0,127

Cellulaire pTyr Assay pg/ml] 0,033 0,086 0,033 0,143 0,032 Cellulaire Met niveaus [% verlies bij 46,9 17,5 23,8; 11,0 28,5 20 1.0 Mg/mll___21,9___

Zachte agaigroei fIC<n, pg/ml]_ 5,5 10,5 8,5 25 ND_

Tubulaire morfogenese antagonisme 84 61 ND 25 ND

F% inhibitie bij 1 Ug/ml]______

Agonist activiteit [maximale 6,5 23 2,7 2,5 2,5 25 stimulering]______

Tubulaire morfogenese agonise 2,2 2,5 ND 8,2 ND

rstimulering bij 50 μg/InlΊ______ ND: Niet gedaan

30 Voorbeeld IV

Inhibitie van c-Met fosforilerine door anti-c-Met antilichamen 1026776- I 96 I [0242] Anti-c-Met antilichamen van de uitvinding werden gebruikt voor het meten van inhibitie van c-Met fosforilering in cellen na stimulering met HGF.

I [0243] A549 cellen werden uitgeplaat met en dichtheid van 1 x 10* cellen per well in I 5 een totaal volume van 200 μΐ/well DMEM gesupplementeerd met 10% FBS in 96- I well U-bodem weefselcultuur behandelde platen (Falcon, #3077). De platen werden I geïncubeerd bij 37 *C in een 10 % C02 atmosfeer gedurende 24 hrs. de media werden I voorzichtig afgezogen uit elke well van de platen. Te testen hybridoma supematanten I werden micro-gecentrifugeerd bij 14.000 rpm gedurende 5-10 min en de cellen I 10 werden behandeld met 200 μΐ/well van het hybridoma supematant of een verdunning I daarvan, of gezuiverde antilichamen in PBS of 20 mM natriumacetaat (pH = 5,5), I 140 mM NaCl. Een irrelevant hybridoma supematant werd toegevoegd aan negatieve I controle wells. De cellen werden geïncubeerd bij 37 *C gedurende een korte I tijdspanne (bijvoorbeeld 4 uur) of een langere tijdspanne (bijvoorbeeld 24 uur) en I 15 dan gestimuleerd door de toevoeging van 22 μΐ/well van een 2 μg/ml oplossing van I HGF in serum vrije DMEM media of Hank's buffer om een uiteindelijke concentratie I te geven van 44 ng/well HGF. De platen werden 15 min bij 37 *C geïncubeerd en dan I werden de media voorzichtig afgezogen uit de wells van de platen. De cellen werden I gewassen met koude PBS dat 1 mM Na3V04 bevat en de oplossing werd voorzichtig I 20 afgezogen uit de platen. De cellen werden gelyseerd met 50 μΐ lysebuffer (NP-40 I Lysebuffer: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH = 8,0,1% NP-40,10 mM EDTA,

I 10% glycerol), met vers toegevoegd 1 mM

I Na3V04 en protease inhibitoren (Complete tablet, Roche #1-873-580, gebruikt I volgens de instructies van de vervaardiger). De platen werden geschud bij 25 kamertemperatuur gedurende 10 minuten. De platen konden dan opgeslagen worden I bij -20 *C tot aan noodzakelijk voor ELISA.

I [0244] Een ELISA werd gebruikt om c-Met fosforyleringsniveaus te baaien. Voor het bereiden van de ELISA werden Reacti-Bind geit anti konijn gecoate platen I driemaal gewassen met wasbuffer (TBS-T Sigma #T -9039). Vervolgens werd 100 μΐ I 30 c-Met polyklonaal invang antilichaam (Santa Cruz, sc-10) in verdunningsbuffer (10% I SuperBlock van Pierce in TBS-T) (uiteindelijke concentratie van 5 μg/ml) I 1026776“ 97 toegevoegd. De platen werden geïncubeerd bij kamertemperatuur met schudding gedurende 2 hrs en dan werden de platen vijfmaal gewassen met TBS-T. Niet specifieke bindingsplaatsen worden geblokkeerd met 200 μΐ/well Superblock in TBS-T gedurende 30 min bij kamertemperatuur, onder schudden. Direct voor 5 gebruik werd de blokkeringsoplossing van de Reacti-Bind platen afgezogen.

[0245] Cel lysaten werden bereid door het toevoegen van 100 μΐ verdunningsbufifer dat 1 mM Na3V04 bevat en het op en neer pipetteren van de lysaten terwijl de wells met de punt geschrapt werden. Vervolgens werd 100 μΐ/well cellysaten 1:3 verdund toegevoegd aan de Reacti-Bind platen en de platen werden 60 min geïncubeerd bij 10 kamertemperatuur onder schudding. De platen werden vijfmaal gewassen met TBS- T. vervolgens werd 100 μΐ/well van 1 pg/ml anti-fosfotyrosine antilichaam PY20-HRP (Transductie Labs, #PI 1625) in 3 % bovine serum albumine TBS-T dat 1 mM Na3V04 bevat toegevoegd. De platen werden 2 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur onder schudding. Dé platen werden vijf maal gewassen met TBS-15 T, waarbij de wassingen verwijderd werden door afzuiging. De platen werden geblot ' op papieren handdoeken om overmatige vloeistof te verwijderen. Vervolgens werd 100 μΐ/well TMB peroxidase substraat oplossing (Kirkegaard & Perry Laboratories, #50- 76-04) toegevoegd en werd 4-5 min ontwikkeld onder voorzichtig schudden bij kamertemperatuur. De reacties werden gestopt met 100 μΐ/well TMB stopoplossing 20 (Kirkegaard & Perry Laboratories, #50-85-04). De platen werden afgelezen bij een golflengte van 450 nm gebruikmakend van een 96-well plaatlezer.

[0246] Deze experimenten demonstreren dat de anti-c-Met antilichamen c-Met fosforylering in cellen die gestimuleerd waren met HGF inhibiteerden vergeleken met controle cellen. Cellulaire fosfo-tyrosine assay (Table 4) toont de IC^ voor 25 inhibitie van cellulaire c-Met fosforylering voor antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3 (Cellulaire pTyr assay).

Voorbeeld V

30 Neerregulerine van c-Met met anti-c-Met antilichamen in cellen na stimulering met ΗΩΕ 1026776- I 98 I [0247] Hen assay werd uitgevoerd om het inhibiterende effect van anti-c-Met I antilichamen op c-Met expressieniveaus in cellen die gestimuleerd zijn met HGF te I meten.

I 5 [0248] A549 cellysaten werden bereid zoals beschreven in voorbeeld IV. Voor het I bepalen van c-Met niveaus werd een ELISA uitgevoerd. De ELISA werd in essentie

zoals beschreven in voorbeeld IV uitgevoerd, met de volgende veranderingen: in I

I plaats van gebruik te maken van een anti-fosfo-tyrosine antilichaam, werd 100 μΐ I UBI05-237 antilichaam (ascites) (Anti-Met, ECD, kloon D024 Upstate I 10 Biotechnology, #21601) 1:1000 verdund in 3 %BSA-TBS-T (met lmMNa3V04) I aan elke well toegevoegd. De incubatie en wassingsstappen waren dezelfde als in

I voorbeeld IV. Vervolgens werd 100 μΐ/well 0,8 mg/ml geit anti muis IgG

I geconjugeerd met (H+L)-HRP(Jackson ImmunoResearch Labs, #115-035-146 I opnieuw opgebouwd in 750 μΐ water + 750 μΐ glycerol), 1 :5000 verdund in 3 % I 15 BSA-TBS-T, toegevoegd. De platen werden 60 min geüicubeerd bij I kamertemperatuur onder schudden. De was en detectie stappen waren dezelfde als in I voorbeeld IV.

[0249] Deze experimenten demonstreren dat c-Met niveaus ietwat neergereguleerd zijn in cellen na stimulering met HGF in de aanwezigheid van anti-c-Met I 20 antilichamen, vergeleken met controle cellen gestimuleerd met HGF (Cellulaire Met I niveaus neerregulatie, zie cellulaire Met niveaus, tabel 4).

I Voorbeeld VI

I Anti-proliferatieve effecten van anti-c-Met antilichamen op cellen die gegroeid 25 wordeqmzOcht6.ag«

[0250] Zachte agar groei assays werden uitgevoerd om de anti-proliferatieve effecten I van anti-c-Met antilichamen te meten.

I [025 IJ SI 14 tumorcellen, NIH-3T3 cellen die bewerkt waren om humaan HGF en I 30 humaan c-Met tot expressie te brengen, werden gehandhaafd in DMEM aangevuld I met 10 % kalverserum, 1.000 eenheden/ml penicilline, 1.000 μg/ml streptomycine en I 1026776- 99 2 mM L-glutamine (groeimedium). De eetculturen werden getrypsineerd en gewassen in serum vrij DMEM en de concentratie werd op 50.000 cellen/ml gebracht De gezuiverde antilichamen in PBS of 20 mM natriumacetaat (pH = 5,5), 140 mM NaCl werden bereid in 15 ml buizen in 10 maal de diverse gebruikte eindconcentraties.

5 Twee agarlagen van 0,5 (bodem) en 0,35 % (top) verdund in celgroeimedia in 35 mm petrischalen werden bereid. De bodemlaag bestond uit groeimedium dat 0,5 % agar bevatte in een totaalvolume van 2 ml. De toplaag bestond uit groeimedium dat 0,35 % agar, 5.000 SI 14 cellen en de antilichaambehandeling in een eindconcentratie van tussen 0,625 - 50 pg/ml bevatte in een totaalvolume van 1 ml, hetgeen uitgeplaat 10 werd bovenop de bodeom agarlaag. Deze oplossing mocht stollen bij kamertemperatuur en werd overnacht geïncubeerd bij 37 *C in een 10 % C02 atmosfeer. 24 uur later werd 0,5 ml media toegevoegd met een passende antilichaambehandeling om het vochtig te houden en de schalen werden geïncubeerd bij 37 *C in een 10 % C02 atmosfeer gedurende een verdere 7*10 dagen. De media 15 werden verwijderd en vervangen door 0,5 ml van 1 mg/ml p-joodnitrotetrazolium paars in PBS voor 48 uur. Het aantal kolonies werd geteld met ROBOT (Ludel Electronics, Ltd.) gebruikmakend van ETC3000 software (Engineering Technology Center).

[0252] Deze experimenten demonstreren dat de anti-c-Met antilichamen proliferatie 20 van celgroei inhibiteerden in zachte agar. Zachte agar groei (tabel 4) toont de IC*, voor inhibitie van proliferatie van de cellen in zachte agar voor antilichamen 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3.

Voorbeeld VII 25

Inhibitie van c-Met-afhankeliike morfologische veranderingen in cellen met anti-c-

Met antilichamen

[0253] HepG2 cellen, die c*Met tot expressie brengen, vormen buisvormige 30 structuren indien gegroeid in MATRIGEL™ (Becton-Dickinson), een extracellulair matrixmateriaal dat componenten bevat van het ondersteunende membraan, in de 1026776- I 100

I aanwezigheid van HGF. Assays weiden uitgevoerd gebruikmakend van HepG2 I

I cellen voor het meten van buisvorming (buisachtige morfogenese) en zijn inhibitie I

I wanneer cellen gegroeid worden inde aanwezigheid van HGF en behandeld met anti*

c-Met antilichamen. I

I 5 [0254] Twee ml van een medium-MATRIGEL™ oplossing (MATRIGEL™ (Becton- I Dickinson) verdund in Opti-MEM I (Invitrogen), 10% hitte geïnactiveerd FBS, 2 I mM L-glutamine, en IX penicilline/streptomycine)) werd uitgeplaat in 35 millimeter (mm) weefselcultuur platen. Nadat de medium-MATRIGEL™ oplossing stolde, werd I 1 ml medium aangevuld met 10 % serum en 40.000 HepG2 cellen toegevoegd.

I 10 Vervolgens werd HGF (eindconcentratie 50 ng/ml)en/of c-Met antilichamen I (eindconcentratie van 1,5 of 10 pg/ml) toegevoegd aan het medium. De cellen I werden gegroeid gedurende 4 dagen bij 37 'C in een 10% C02 atmosfeer. Aan het I eind van de 4 dagen werd het topmedium verwijderd en 0,5 ml 1 mg/ml p* I joodnitrotetrazolium paars in PBS werd toegevoegd voor 48 uur. Foto’s werden I IS genomen van de gekleurde 35 mm platen en geanalyseerd gebruikmakend van

ImagePro (Media Cybemetics, Silver Spring, MD).

I [0255] Deze experimenten demonstreren dat de anti-c-Met antilichamen c-Met- afhankelijke buis morfologene veranderingen inhibiteren wanneer cellen die c-Met I tot expressie brengen gegroeid worden in de aanwezigheid van HGF vergeleken met I 20 controle monsters. Tabel 4 toont inhibitie van buis morfogenese voor antüichamen I 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3 bij 1 pg/ml concentratie.

I Voorbeeld Vin 25 Bepaling van affiniteit constanten (KD1 van Anti-c-Met monoklonale antilichamen I met BIACORE™ I [0256] De bindingsaffiniteit van gezuiverde antilichamen werd bepaald gebruikmakend van oppervlak plasmon resonantie gebruikmakend van het I 30 BIACORE™ 3000 instrument (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Zweden en I Piscataway, N.J.), volgens de protocollen van de vervaardiger.

I 1026776- 101

[0257] Experimenten werden uitgevoerd in een BIACORE™ 3000 instrument bij 25 *C in Dulbecco’s met fosfaat gebufferde zoutoplossing dat 0,0005% Tween-20 bevat Proteïneconcentraties werden verkregen uit sedimentatiesnelheid experimenten of door het meten van de golflengte van het monster bij 280 nm gebruikmakend van s theoretische extinctie coëfficiënten die afgeleid zijn van aminozuursequenties. Voor experimenten die de binding meten van antilichaam aan geïmmobiliseerde antigenen, werd 220 RU (resonantie eenheden) c-Met ECD-Fc (humaan of cynomoloog) geïmmnobiliseerd op een BI chip (BIACORE™) volgens standaard directe aminekoppeling procedures. Antilichaam monsters werden bereid van 0,69 μΜ voor 10 13.3.2; 8.70.2 en 8.90.3 en van 0,23 μΜ voor 9.1.2. Deze Tmonsters werden drievoudig serieel verdund tot 8,5 nM of 2,8 nM voor een ruwweg 100-voudig concentratiegebied. Voor elke concentratie werden monsters in duplo geïnjecteerd met een stroming van 5 μΐ/min voor 4 min. De dissociatie werd gemonitoid gedurende 2000 seconden. De gegevens werden globaal gefit op een eenvoudig 1:1 15 bindingmodel gebruikmakend van BIACORE™ Biavel software. Bovendien, om de ^ onafhankelijk van enige potentiële fout in de actieve concentratie of het fittingsmodel te bepalen, werden de dissociatie gegevens globaal en onafhankelijk van associatie gegevens gefit op een eenvoudig dissociatie model. In alle gevallen werd deze methode gebruikt om k^ te verkrijgen en gevonden dat ze goed overeen 20 kwamen met gegevens die verkregen waren van globale fitting van «««η™**™» en dissociatie gegevens.

[0258] Tabel 5 geeft KD en k^ gegevens gegenereerd met «ntilir.hgmon 13.3.2; 8.70.2; 8.90.3 en 9.1.2.

25 Tabel 5 13.3.2 9.1.2 8.70.2 8.90.3 13.3.2L- A91T, H-E42K,

_______S97T

Kn (M) (humaan) 2,2 MO'10 8,2 » 1Q~10 3,3 * lQ-»> 53 ♦ 10-io 2,0 ♦ IQ10 ' k„ff (1/s) (humaan) 1,5 * lft4 6,8 * 10-5 6,1 * 1Ö5 1 «; * in-* 1*8 ♦ ΙΟ*

Kn (M) 16,0 * IQ·10 1,1 ♦ IQ'10 13,2 ♦ 10^|i iq-io |6j ♦ ÏO-io ~| 1026776-

I 102 I

I (cynomoloog)______ I

I koffO/s) 2,9 * 10-4 9,8* 10-5 6,5 * 10*5 2,5 * 104 4,0*10·* I

I (cynomoloog) _____ I

I 5 Voorbeeld IX I

I Bepaling van affiniteit constanten (KD) van anti-c-Met monoklonale antilichamen I

I met Stroming cvtometrie I

I 10 [0259] De bindingsaffiniteit van gezuiverde antilichamen voor c-Met tot expressie I

I gebracht op het oppervlak van humane A549 longcarcinoma cellen en cynomologe I

I niercellen werd bepaald door middel van stroming cytometrie gebruikmakendvan de I

I BDTM Biosciences LSR stroming cytometer volgens de protocollen van de I

I vervaardiger. I

I IS [0260] Cellen gegroeid in cultuur werden gewassen met PBS, kort geïncubeerd in de I

I aanwezigheid van 0,25 % tryrpsine-EDTA (Invitragen) en verzameld. De verzamelde I

I cellen werden gewassen in PBS wasbuffer dat 0,025 % natriumazide en 1 % hitte I

I geïnactiveerd serum bevat, gepelleteerd en 5 x 105 cellen en gehersuspendeerd in 500 I

I μΐ van dezelfde buffer. De tijd die vereist is om evenwicht binding te bereiken bij I

I 20 kamertemperatuur werd onafhankelijk bepaald op tussen zes en acht uur door het I

I incuberen van subverzadigende concentraties van elk antilichaam met cellen. I

I Vervolgens werd halfmaximale binding (Kj,) van elk antilichaam bepaald uit het I

I geometrische gemiddelde van fluorescentie intensiteit voor antilichaamconcentraties I

I die uiteenlopen van 0,1 ng/ml tot 3 pg/ml. Elk antilichaam werd geïncubeerd met I

I 25 losgemaakte cellen gedurende 6 tot 8 uur bij kamertemperatuur afhankelijk van de I

I tijd die noodzakelijk is om evenwicht te bereiken. Cellen werden gewassen, I

I gehersuspendeerd en geïncubeerd in 500 μΐ van een 1:500 verdunning van I

I gebiotinyleerd muis anti-humaan IgG (Jackson Labs) in PBS wasbuffer gedurende 45 I

I minuten op ijs. Vervolgens werden cellen gewassen, gehersuspendeerd en I

I 30 geïncubeerd met 10 pg/ml streptavidine R-fycoerythrine conjugaat (Caltag) in 200 I

I μΐ PBS wasbuffer gedurende 15 min op ijs, van licht beschermd. Cellen werden I

I 1026776- 103 gewassen en signaal werd gedetecteerd met een BD Biosciences LSR stroming cytometer volgens de protocollen van de vervaardiger.

[0261] Deze experimenten demonstreren dat elk van de beschreven anti-c-Met antilichamen binden aan humaan en cynomoloog c-Met tot expressie gebracht op het 5 celoppervlak met vergelijkbare affiniteiten (zie tabel 6).

Tabel 6 13.3.2 19.1.2 8.70.2 8.9Ö.3 13.3.2L- A91T.H-

______E42K, S97T

10 K„(M) (humaan) 3,93 * IQr 1,69 * KT 4,07*10- 2,60*1Qr 5,60* KT" 11 10 11 11 kffQ/s)(humaan) ND~ ND, ~ ND ND ND~ KD(M) (cynomoloog) 4,86* 10- 1,68* 10' 5,53 * 10- 3,93 * 10r 7,33*10-n 11 10 11 10 k'ffd/s) (cynomoloog) ND_ND ND_ND_ND_

15 Voorbeeld X

Inhibitie van tumorgroei in vivo met anti-c-Met antilichamen

[0262] In vivo assays werden uitgevoerd om tumorgroei inhibitie van vaste tumoren 20 na behandeling met anti-c-Met antilichamen te meten.

[0263] SI 14, U87 (humane güoblastoma cellen), GTL-16 (humane maagtumor cellen) en A549 (humane long carcinoom epitheelcellen) werden gehandhaafd in DMEM (Invitrogen) aangevuld met 10 % hitte geïnactiveerd FBS (Invitrogen), 2 mM L-Glutamine (Invitrogen), en 1% [volume/volume] penicilline (1.000 eenheden/ml)- 25 streptomycine (1.000 p/ml)(Invitrogen) in een 37 ‘<2/10% C02 weefeelcultuur incubator. Voor het enten van athynische (nu/nu) muizen met tumorcellen, werd 0,25 % trypsine in 1 mM EDTA gebruikt voor het verwijderen van tumorcellen uit hun weefselcultuur kolven. De cellen werden geteld en verdund met Hank’s gebufferde zoutoplossing. Gebruikmakend van 1,0-5,0 x 106 tumorcellen in een eindvolume van 1026776“ I 104 I 02 ml Hank's gebufferde zoutoplossing, werden de tumorcellen subcutaan geënt in I elke dierlijke patiënt Zodra de tumoren 100-200 mm3 in grootte bereikt hadden (dag I 5 na enting voor SI 14 en U87 tumoren, ongeveer 15-20 dagen voor A549 tumoren en I ongeveer 6 dagen voor GTL-16 tumoren), werd 200 μΐ antilichaamoplossing I 5 geïnjecteerd. De antilichamen werden opgeslagen in 20 mM natriumacetaat, pH 5,5, I 140 mM natriumchloride en werden verdund met steriel fosfaat gebufferde I zoutoplossing tot een gewenste antilichaam concentratie. 100 μg of200 μg I antilichaam werd geïnjecteerd in de intraperitoneale (IP) holte van elke I experimentele dierlijke patiënt. Drager oplossingen worden toegediend aan controle I 10 dieren. Tumor groottes werden elke twee tot drie dagen in de muizen gemeten I gebruikmakend van schuifmaten na de IP afgifte van de antilichaam oplossing tot aan I de beëindiging van de experimenten.

I [0264] Deze experimenten demonstreren dat al de anti-c-Met antilichamen de groei I inhibiteren van vaste tumoren in vivo vergeleken met controle dieren. Verder, door I IS gebruik te maken van diverse concentraties van antilichamen, werd het percentage I tumorgroei inhibitie door antilichamen 13.32; 9.12; 8.702,8.90.3 en 13.3.2L-A91T, I H-E42K, S97T(zie tabel 7) bepaald. In het in tabel 7 samengevatte experiment I werden al de antilichamen toegediend in een enkele intraperitoneale dosering, I behalve voor het 41-daagse experiment met A549 tumor dragende dieren, welk vier I 20 doseringen van antilichaam omvatte en het 21 daagse experiment met GTL-16 tumor I dragende dieren dat twee doseringen van antilichaam omvatte. Gebruikte doseringen I waren 200 μg voor de SI 14 tumoren, 100 pg voor de U87 tumoren, 200 pg voor de I A549 tumoren en 200 pg voor de GTL-16 tumoren. De waarde tussen haakjes I correspondeert met een 200 pg dosering van 13.32 in het U87 model. ND, niet I 25 gedaan in het getoonde experiment I 1026776- 105

Tabel 7

Tumor type % inhibitie (tumor volume

Antilichaam I SI 14 (dag 12) IU 87 (dag 17) IA549 (dag41) GTL-16 (dag 21)1 5 9Λ2_77,2_61J_4^6_ND_ 13.3.2 _99J_ 74,3 (83,1) 45,9_ND_ 8.70.2 _8^2_ND_ND_ND_ 8.90.2 _9^8_49£_ND_ND_ 13.3.2L-A91T, ND ND ND 55,7 10 H-E42K, S97TI____

Voorbeeld XI

Aeonist activiteit met anti-c-Met anti lichamen 15

Activering van c-Met door anti-c-Met antilichamen in de afwezigheid van HGF stimulering

[0265] De activering van c-Met in cellen geïncubeerd met anti-c-Met antilichamen in 20 de afwezigheid van HGF werd gemeten om de agonist activiteit van de c-Met antilichamen van de uitvinding te bepalen. Een ELIS A werd gebruikt om te bepalen of c-Met gectiveerd was in de cellen door het meten van fosforilering van c-Met. Tussen 0,01 -10 pg/ml antilichaam werd toegevoegd aan A549 cellen uitgeplaat zoals beschreven in voorbeeld IV, behalve dat de cellen niet gestimuleerd werden 25 met HGF. De A549 cellysaten werden bereid zoals beschreven in voorbeeld IV. Een ELISA werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld IV.

[0266] Deze experimenten demonstreren dat drie van de geteste antilichamen een zwakke, ongeveer 2-3 voudige activering van c-Met vertonen, in de afwezigheid van HGF, vergeleken met cellen die niet geïncubeerd waren met anti-c-Met antilichaam 30 of HGF (Zie tabel 4); echter, antilichaam 9.1.2 vertoonde een hoger-voudige activering.

c-Met-qfhankelijke cellulaire morfologische veranderingen in cellen behandeld met 1026776-

I 106 I

I anti-c-Met antilichamen in de afwezigheid van HGF I

I [0267] Tubulaire morfogenese assays werden uitgevoerd voor het meten van anti-c- I

I Met antilichaam agonist activiteit. De assays werden uitgevoerd zoals beschreven in I

I 5 voorbeeld VII, behalve dat de cellen gegroeid werden in de afwezigheid van HOF en I

I behandeld met anti-c-Met antilichamen (1,10 en 50 pg/ml). De hoeveelheid I

I buisvormige morfogenese werd bepaald zoals beschreven in voorbeeld VII. De assay I

I toont dat drie geteste anti-c-Met antilichamen zwakke tot gematigde agonist activiteit I

I hebben. Tabel 4 toont de hoeveelheid agonist activiteit zoals gemeten door I

I 10 buisvormige morfogenese voor antilichamen 9.1.2; 8.70.2 en 8.90.3 I

I Voorbeeld XQ I

I Inhibitie van c-Met fosforilerine en inductie van c-Met afbraak door anti-c-Met I

I 15 antilichamen in vivo I

I [0268] We bepaalden de effecten van de anti-c-Met antilichamen op de fosforylering I

I staat en de proteïne niveaus van c-Met in vivo. Humane tumorcellen werden I

I geïntroduceerd in athymische muizen hetgeen resulteerde in de vorming van I

I 20 xenograft tumoren volgens de methoden van VA. Pollack et al., ("Inhibition of I

I epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human I

I carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor I

I efifects in athymic mice,"J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999)). I

I [0269] U87 humane glioblastoma cellen (5 x 106) werden subcutaan geïnjecteerd in I

I 25 3-4 weken oude athymische (nu/nu) muizen, en vervolgens word een anti-c-Met I

I antilichaam van de onderhavige uitvinding intraperitoneaal geïnjecteerd in muizen I

I die gevestigde tumoren huisvesten (bij benadering 300 mm3). Tumoren werden op I

I diverse tijdstippen uitgenomen (1,3,6,12,24,48,72,96,168 en 216 uur) na I

I antilichaam injectie en homogenaten werden geproduceerd (1 ml lysisbufifet/100 mg I

I 30 tumorgewicht) teneinde c-Met fosforylering en proteïne niveaus vast te stellen. I

I Lysaten die twee milligram proteïne bevatten werden immunogeprecipiteerd met 25 I

I 1Ü26776-' 107 μΐ sc-10 agarose kralen (Santa Cruz) specifiek voor c-Met gedurende 2 uur bij 4 *C. De kralen werden gewassen en gebonden proteïne werd geëlueerd door te koken in Laemmli monsterbuffer gedurende 5 min en gescheiden door SDS-PAGE gebruikmakend van 4-12 % gradiënt Novex™ gelen. ïmmuno ingevangen proteïnen 5 werden dan geëlektroblot op 0,45 μΜ PVDF membranen (Invitrogen). De membranen werden geblokt in 3% BSA in PBS-T (0,5% Tween 20) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en geprobed met het anti-fosfotyrosine-specifieke antilichaam PY100 (Cel Signaling Technology) gevolgd door anti-muis IgG-HRP voor eht detecteren van fosfoMet of sc-10-HRP (Invitrogen) om totaal Met proteïne te 10 detecteren. Signaal werd ontwikkeld met ECL reagens (Amersham Biosciences) en gedetecteerd door blootstelling van radiografische film (Kodak).

[0270] Figuur 5 toont de serum 13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T antilichaam niveaus, fosfo c-Met niveaus en totaal c-Met proteïne niveaus in de tijd. Het experiment demonstreert dat de afgenomen fosfo c-Met en totaal c-Met proteïne niveaus IS gerelateerd zijn aan het antilichaam en dat de mate van c-Met inhibitie dosering proportioneel is met de serum concentratie van het antilichaam.

Voorbeeld ΧΠΤ 20 Epitnnp in kaart breng studies

[0271] Competitie experimenten gebruikmakend van een ELISA format werden uitgevoerd voor het bepalen van epitoop klassen die herkend worden door de antilichamen van de uitvinding.

25 [0272] Wells van een 96-well plaat werden gecoat met 50 μΐ/wèll van een 0,5 μ^πύ voorraad van humaan Met ECD-Fc in 0,1 M NaHC03 buffer, pH 9,6 overnacht bij 4 °C of gedurende 2 uur bij 37 *C. De platen werden gewassen in PBS, 0,05% Tween-20 (PBS-T) en afgesloten met 200 μΐ/wel blokkeringsbuffer (PBS dat 0,5% BSA, 0,1% Tween-20, en 0,01% thimerosal bevat) bij kamertemperatuur gedurende een 30 uur. Na wassen werd 100 μΐ antilichaam in diverse concentraties (15,5,1,7, en 0,6 μg/ml) in blokkeringbufifer toegevoegd en de platen werden geïncubeerd bij 1026776- I 108 I kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vervolgens werd 100 μΐ van een 83 pg/ml I oplossing van gebiotinyleerd antilichaam (~ 4 biotinen/molecule) in bloldcering buffer toegevoegd en de platen werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na wassen werd streptavidine-HRP toegevoegd en de platen werden 15 I s minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Binding wed geïndiceerd door

I kleurontwikkeling gevolgd door de toevoeging van 100 μΐ/well onverdunde TMB

I peroxidase oplossing (BioFX Labs). Kleurontwikkeling werd beëindigd met 100 I μΐ/well onverdunde stopoplossing (BioFX Labs) en gekwantificeerd door meting bij I OD450nm.

10 [0273] Deze experimenten demonstreren dat monoklonale antiïichamen 13.3.2, I 13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T, 8.70.2, en 8.90.3 binden aan een gezamenlijk epitoop I (bin I) op het extracellulaire domein van c-Met en dat monoklonaal antilichaam 9.1.2 bindt aan een apart epitoop (bin 2).

I [0274] Al de geciteerde publicaties en octrooiaanvragen in deze beschrijving zijn IS hierin ingevoegd door middel van referentie alsof elke individuele publicatie of octrooiaanvrage specifiek en individueel aangegeven was opgenomen te zijn door I middel van referentie. Alhoewel de voorgaande uitvinding tot in zeker detail is I beschreven als illustratie en voorbeeld ten behoeve van het heldere begrip, zal het snel duidelijk zijn voor het met gebruikelijke bekwaamheid in het vakgebied in het I 20 licht van de leerstellingen van deze uitvinding dat zekere veranderingen en I modificaties daarin gemaakt kunnen worden zonder af te wijken van de geest of I reikwijdte van de bijgaande conclusies I 102 6778-^

Claims

1. Een humaan monoklonaal antilichaam of een antigenbindend deel daarvan dat specifiek bindt aan c-Met 5

2. Het humane monoklonale antilichaam of antigen bindende deel volgens conclusie 1, waarin het antilichaam of het deel tenminste een van de volgende eigenschappen heeft: (a) het bindt aan humane cellen; 10 (b) het heeft een selectiviteit voor c-Met die tenminste 100 maal groter is dan zijn selectiviteit voor insulineachtige groeifactor 1 receptor, (c) het bindt aan c-Met met een Kq van 8,2 x ΙΟ"10 M of minder (d) het heeft een eraf snelheid (k^ voor c-Met van 1,0 x ÏO'V1 of kleiner (c) het bindt aan humaan c-Met in de aanwezigheid van humaan HGF. 15

3. Het humane monoklonale antilichaam of antigen bindende deel volgens conclusie 2, waarin het antilichaam of het deel bindt aan c-Met met een Kq van 8,2 x 10'10 Mof minder en HGF binding aan c-Met inhibiteert

4. Een humaan monoklonaal antilichaam of antigen bindend deel daarvan volgens conclusie 1, dat specifiek bindt aan humaan c-Met en het inhibiteert, waarin het antilichaam of deel daarvan tenminste een eigenschap heeft gekozen uit de groep bestaande uit: (a) Het kruis-concurreert voor binding aan c-Met met een antilichaam 25 gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-E42K.S97T; 13.3.2L-A91 T; 13.3.2L-A91 T,H-E42K; en 13.3.2L-A91TJÏ-E42K.S97T; (b) het concurreert voor binding aan c-Met met een antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-

30 E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-E42K; en 13.3.2L-A91TJÏ- E42K,S97T; 1026776- I 110 I I (c) het bindt aan hetzelfde epitoop van c-Met als een antilichaam gekozen uit I I de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H- I I E42K.S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-E42K; en 13.3.2L-A91T,H- I I E42K,S97T; I I S (d) het bindt aan c-Met met substantieel dezelfde Kq als een antilichaam I I gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; I I 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91T,H-E42K; en 13.3.2L-A91 Τ,Η- I I E42K,S97T; en I (e) het bindt aan c- Met met substantieel dezelfde dissociatiesnelheid als een I I 10 antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H- I I E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; 13.3.2L-A91T; 13.3.2L-A91 T,H-E42K; en 13.3.2L- I I A91 T,H-E42K,S97T. I

5. Een monoklonaal antilichaam dat specifiek c-Met bindt, waarin het I I 15 antilichaam omvat: I I (a) een zware keten met de aminozuursequentie uiteengezet in SEQ Π) NO: 2 I I zonder een signaalsequentie, waarin X2 lysine is en X« is threonine, en I I (b) een lichte keten met de aminozuursequentie uiteengezet in SEQ Π) NO: 4 I I zonder een signaalsequentie, waarin Xg threonine is. I I 20 I

6. Een monoklonaal antilichaam dat specifiek c-Met bindt, waarin het I I antilichaam is gekozen uit de groep bestaande uit: I I (a) een antilichaam omvattende een zware keten met de aminozuursequenties I I zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 2 waar X2glutamaat is en Xg is serine en een lichte I 25 keten met de aminozuursequentie zoals uiteengezet in SEQ Π) NO: 4 waar Xg I I alanine is, beide zonder signaalsequentie^ I I (b) een antilichaam omvattende een zware keten met de aminozuursequenties I I zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 6 en een lichte keten met de aminozuursequentie I I zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 8, beide zonder signaalsequenties; I 30 (c) een antilichaam omvattende een zware keten met de aminozuursequenties I I 1026776- zoals uiteengezet in SEQID NO: 10 en een lichte keten met de aminozuursequentie zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 12, beide zonder signaalsequenties; (d) een antilichaam omvattende een zware keten met de aminozuursequenties zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 14 en een lichte keten met de aminozuursequentie s zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 16, beide zonder signaalsequenties;

7. Een monoklonaal antilichaam of een antigen bindend deel daarvan dat specifiek c-Met bindt, waarin: (a) de zware keten de zware keten CDR1, CDR2 and CDR3 10 aminozuursequenties omvat van een antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit: 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; en 13.3.2H-S97T; (b) de lichte keten de lichte keten CDR1, CDR2 en CDR3 aminozuursequenties omvat van een antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; en 13.3.2L-A91T; 15 (c) het antilichaam een zware keten van ( a) en een lichte keten van (b) omvat; en (d) het antilichaam van (c) waarin de zware keten en de lichte keten CDR aminozuursequenties gekozen zijn uit hetzelfde antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit: 13.3.2; 9.1.2; 8.70.2; 8.90.3; 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-E42K,S97T; en 20 13.3.2H-S97T; 13.3.2L-A91T. 1 1026776- Het monoklonale antilichaam of deel daarvan volgens conclusie 7, (a) waarin de zware keten de aminozuursequentie omvat van het variabele domein van de zware keten van een antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit: 25 13.3.2 (SEQ Π) NO:2, waar X2 glutamaat is en X« is serine); 9.1.2 (SEQ ID NO:6); 8.70.2 (SEQ ID NO:10); 8.90.3 (SEQ ID NO:14); 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; en 13.3.2H-E42K,S97T; (b) waarin de lichte keten de aminozuursequentie omvat van het variabele domein van de lichte keten van een antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit 30 13.3.2 (SEQ ID NO:4, waar X8 alanine is); 9.1.2 (SEQ ID NO:8); 8.70.2 (SEQ ID NO: 12); 8.90.3 (SEQ ID NO: 16); en 13.3.2L-A91T; I 112 I (c) waarin het antilichaam of deel een variabel domein omvat van (a) en een variabel domein van (b); of (d) waarin het antilichaam of deel variabele domain sequenties omvat van I hetzelfde antilichaam gekozen uit de groep bestaande uit 13.3.2 (SEQ Π) NO:2, I 5 waar X2 glutamaat is en X* is serine en SEQ ID NO:4, waar X, alanine is); 9.12 I (SEQ ID NO’s:6 en 8); 8.70.2 (SEQ ID NO’s:10 en 12); 8.90.3 (SEQ ID NO’s:14 en I 16); 13.3.2H-E42K; 13.3.2H-S97T; 13.3.2H-E42K,S97Ten 13.3.2L-A91T.

9. Het monoklonale antilichaam volgens conclusie 1 dat specifiek c-Met I 10 bindt» waarin het antilichaam gekozen is uit de groep bestaande uit (a) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I SEQ Π3 NO: 4 waarin X, threonine is en SEQ Π) NO: 2 waarin X^ lysine is, X4 is I serine; I (b) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I 15 SEQ ID NO: 4 waarin X, threonine is en SEQ Π) NO: 2 waarin ^threonine is «1X4 I is lysine; (c) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I SEQ ID NO: 4 waarin Xt threonine is en SEQ Π) NO: 2 waarin Xj glutamaat is, X« is I serine; I 20 (d) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I SEQ ID NO: 4 waarin Xs alanine is en SEQ ID NO: 2 waarin Xj glutamaat is, X* is threonine; (e) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I SEQ ID NO: 4 waarin X, alanine is en SEQ ID NO: 2 waarin Xj lysine is, X* is I 25 serine; en I (f) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties zoals uiteengezet in I SEQ ID NO: 4 waarin Xt alanine is en SEQ ID NO: 2 waarin X2 lysine is, X* is I threonine, alle sequenties zonder signaalsequenties. I 30 10. Een farmaceutische samenstelling omvattende het antilichaam of I antigenbindende deel volgens een van de conclusies 1 tot 9 en een farmaceutisch I 1026776“ aanvaardbare drager.

11. Gebruik van een antilichaam of antigen bindend deel volgens een van de conclusies 1 tot 9, waarin het antilichaam of deel een c-Met antagonist is, in de 5 vervaardiging van een medicament voor het behandelen van een hyperproliferatieve aandoening in een patiënt die daaraan behoefte heeft

12. Gebruik van een antilichaam of antigen bindend deel volgens een van de conclusies 1 tot 9, waarin het antilichaam, antigen bindend deel of farmaceutische 10 samenstelling c-Met activeert voor de vervaardiging van een medicament voor het bevorderen van wondheling of weefsel regeneratie in een patiënt die daaraan behoefte heeft

13. Een geïsoleerde cellijn die het antilichaam of antigenbindende deel IS volgens een van de conclusies 1 tot 9 of de zware keten of lichte keten van het antilichaam of het deel produceert

14. Een geïsoleerd nucleïnezuurmolecule omvattende era nucleotidesequentie die codeert voor de zware keten of het antigen bindende deel daarvan of de lichte 20 keten of het antigen bindende deel daarvan volgens een van de conclusies 1 tot 9.

15. Een vector omvattende het nucleïnezuurmolecule volgens conclusie 14, waarin de vector optioneel era expressie controlesequentie omvat die functioneel verbinden is met het nucleïnezuurmolecule. 25

16. Een gastheercel omvattende de vector volgens conclusie 15 van het nucleïnezuurmolecule volgens conclusie 14.

17. Een werkwijze voor het produceren van era anti-c-Met antilichaam of 30 antigen bindend deel daarvan, omvattende het in cultuur brengen van de gastheercel volgens conclusie 16 of de cellijn volgens conclusie 16 onder geschikte condities en 1026776- I 114 I I het winnen van het antilichaam of antigen bindend deel. I

18. Het antilichaam of antigen bindende deel volgens conclusie 1 gekozen uit I I de groep bestaande uit: I I 5 (a) een antilichaam omvattende de zware keten aminozuursequentie van I I antilichaam 13.3.2H-E42K en de lichte keten aminozuursequentie die uiteen is gezet I I in SEQ Π) NO: 4 waar X,alanine is, zonder de signaalsequenties; I I (b) een antilichaam omvattende de zware keten aminozuursequentie van I I antilichaam 13.3.2H-E42K,S97T en de lichte keten aminozuursequentie die uiteen is I I 10 gezet in SEQ ID NO: 4 waar Xg alanine is, zonder de signaalsequenties; I I (c) een antilichaam omvattende de zware keten aminozuursequentie van SEQ I I ID NO: 2 waar X2glutamaat is en X« is serine en de lichte keten aminozuursequentie I I van antilichaam 13.3.2L-A91T, zonder de signaalsequenties; I I (d) een antilichaam omvattende de zware keten aminozuursequentie van I I IS antilichaam 13.3.2H-E42K en de lichte keten aminozuursequentie van antilichaam I I 13.3.2L-A91T, zonder de signaalsequenties; en I I (e) een antilichaam omvattende de zware keten aminozuursequentie van I I antilichaam 13.3.2H-E42K,S97T en de lichte keten aminozuursequentie van I I antilichaam 13.3.2L-A91T, zonder de signaalsequenties; I I 20 I I 1026776-