TW201303295A - 偵測血液失調中之人平衡型核苷轉運蛋白１（ｈＥＮＴ１）表現用之系統和方法 - Google Patents

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Abstract

本發明大抵關於偵測血液失調中之人平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)表現量之方法、檢測及系統，利用流式細胞分析偵測血液失調中之hENT1表現量之方法、檢測及系統，及利用流式細胞分析偵測骨髓發育不良性症候群(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)中之hENT1表現量之方法、檢測及系統。本發明亦關於偵測個體之hENT1表現量之診斷及治療用途。

Description

偵測血液失調中之人平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)表現用之系統和方法 相關申請案
本申請案主張於2011年4月15日提出申請之美國臨時申請案號61/475,953、2011年8月11日提出申請之美國臨時申請案號61/522,318及2011年12月20日提出申請之美國臨時申請案號61/577,771之權益。各該申請案之內容以參照方式整體納入本文。
本發明大抵關於偵測血液失調中之人平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)表現量之方法、檢測及系統，利用流式細胞分析偵測血液失調中之hENT1表現量之方法、檢測及系統，及利用流式細胞分析偵測骨髓發育不良性症候群(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)中之hENT1表現量之方法、檢測及系統。本發明亦關於偵測個體之hENT1表現量之診斷及治療用途。
人平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)係一種由SLC29A1基因編碼之蛋白質。此基因係平衡型核苷轉運蛋白家族之成員。該基因編碼位於細胞膜及粒線體膜且媒介該細胞自周圍介質攝取核苷之跨膜糖蛋白。該蛋白被分類為對硝基苯硫嘌呤核苷(NBMPR)之抑制敏感之平衡型(相對於集中型)轉運蛋白。核苷轉運蛋白係缺乏從頭(de novo)核苷 合成途徑之細胞合成核苷酸所需，且亦為攝取用於癌及病毒性化學治療之細胞毒性核苷及核苷類似物藥物所需。
因此，需要選擇性偵測及定量腫瘤細胞中之hENT1表現量之方法。
本發明提供用於測量樣本或個體內之核苷轉運蛋白之量及關聯此量與給定抗癌藥物配方之預期療效的方法及組成物。本發明之方法允許以合理選擇及經設計之藥物配方治療癌。在本發明之一些態樣中，癌細胞中之人平衡型核苷轉運蛋白(hENT)之量係經測定，具有低量之hENT1之個體係以抗癌藥物諸如核苷類似藥物及/或源自核苷類似物之藥物治療。舉例來說，該抗癌藥物係選自嘧啶衍生物包括例如阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、氮雜胞苷(azacytidine)及彼等之衍生物及嘌呤衍生物包括例如氟達拉濱(fludarbine)、克拉屈濱(cladribine)、克羅拉濱(clofarabine)及彼等之衍生物。在一些實施態樣中，該抗癌藥物係親脂性吉西他濱類似物諸如吉西他濱-5’-反油酸酯、親脂性阿糖胞苷類似物諸如阿糖胞苷-5’-反油酸酯、或親脂性氮雜胞苷類似物諸如氮雜胞苷-5’反油酸酯。其他適當之嘧啶類似物包括但不限於氮雜胞苷-5’-順6-十八烯酸酯、地西他濱(decitabine)-5’-反油酸酯、地西他濱-5’-順6-十八烯酸酯及利巴韋林(ribavirin)-5’-反油酸酯。其他適當之嘌呤 類似物包括但不限於克羅拉濱(clofarabine)-5’-反油酸酯、克羅拉濱-5’-順6-十八烯酸酯、氟達拉濱(fludarbine)-5’-反油酸酯、氟達拉濱-5’-順6-十八烯酸酯、克拉屈濱(cladribine)-5’-反油酸酯及克拉屈濱-5’-順6-十八烯酸酯。
在一些實施態樣中，該等類似物可用來作為抗感染疾病化合物，諸如舉例來說抗病毒化合物及/或抗寄生蟲化合物包括抗瘧疾化合物。(見例如Quashie et al.,“Uptake of purines in Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes is mostly mediated by the human equilibrative nucleoside transporter and the human facilitative nucleobase transporter,”Malaria Journal,vol.9：36(2010))。在該等實施態樣中，本發明提供用於治療個體(例如人個體)之感染性疾病、延緩該疾病之進展、預防該疾病之復發、緩和該疾病之症狀或以其他方式改善該疾病之方法，該方法藉由偵測個體內之hENT1表現量及比較該個體內之hENT1表現量與hENT1表現量之對照量；及投予有效劑量之抗感染性疾病藥物以改善該個體內顯示減少hENT1表現量之感染性疾病。
在一些實施態樣中，hENT1表現對照量係源自比較白血病性胚細胞、單核球、顆粒球及嗜酸性球中之一或多者之hENT1表現量與正常自體淋巴細胞中之hENT1表現量之比值指數。
本發明提供用於治療個體(例如人個體)之癌、延緩 該癌之進展、預防該癌之復發、緩和該癌之症狀或以其他方式改善該癌之方法，該方法藉由偵測個體內之hENT1表現量及比較該個體內之hENT1表現量與hENT1表現量之對照量；及投予有效劑量之抗癌藥物以改善該個體內顯示減少hENT1表現量之癌。個體內之hENT1表現量係藉由例如偵測該個體內之細胞群所表現之hENT1之量決定。舉例來說，在一些實施態樣中，個體內之hENT1表現量係藉由偵測及定量腫瘤細胞所表現之hENT1之量決定。在一些實施態樣中，個體內之hENT1表現量係藉由偵測及定量經感染之細胞所表現之hENT1之量決定，諸如舉例來說經病毒感染之細胞或經寄生蟲感染之細胞。
本發明提供治療個體之癌之方法，該方法藉由測定源自需要治療癌之個體的樣本中之核苷轉運蛋白之量，及傳送關於該核苷轉運蛋白量之資料給醫師，該醫師根據該核苷轉運蛋白量提供關於投予治療有效量之抗癌藥物(例如化學治療性核苷類似物)給該個體之指示。
在一些實施態樣中，該抗癌藥物之量係根據hENT1表現量決定。在一些實施態樣中，該抗癌藥物之量係根據hENT1表現量相較於hENT1表現對照量決定。在一些實施態樣中，hENT1表現對照量係源自比較白血病性胚細胞、單核球、顆粒球及嗜酸性球中之一或多者之hENT1表現量與正常自體淋巴細胞中之hENT1表現量之比值指數。
在一些實施態樣中，特定抗癌藥物係根據hENT1表現量投予。在一些實施態樣中，該抗癌藥物之量係根據 hENT1表現量相較於hENT1表現對照量決定。在一些實施態樣中，hENT1表現對照量係源自比較白血病性胚細胞、單核球、顆粒球及嗜酸性球中之一或多者之hENT1表現量與正常自體淋巴細胞中之hENT1表現量之比值指數。
在一些實施態樣中，該癌係血液性癌。舉例來說，該癌係骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)或慢性骨髓單球性白血病(CMML)。
在一些實施態樣中，hENT1表現量係於源自被識別為罹患血液失調或具有罹患血液失調之風險的個體之樣本中偵測。適當樣本包括自個體分離之組織、細胞及生物液體，以及存在於個體體內之組織、細胞及液體。此處使用之用語「生物樣本」包括血液及血液之組分或成份包括血清、血漿或淋巴液。
在一些實施態樣中，該樣本係骨髓抽取物。在一些實施態樣中，該樣本係週邊血液。在一些實施態樣中，該樣本係腦脊液或彼之成份。在一些實施態樣中，該樣本係胸膜滲液。在一些實施態樣中，該樣本係腹水。
在一些實施態樣中，該樣本係新鮮樣本。舉例來說，該樣本採集不到48小時，例如不到24小時。
在一些實施態樣中，該樣本係冷凍樣本。在一些實施態樣中，該冷凍樣本係藉由緩慢冷凍(例如慢速冷凍)以凍存於二甲亞碸(DMSO)或其他適當溶劑中之例如經Ficoll密度梯度分離之細胞。
在一些實施態樣中，hENT1表現量係利用流式細胞分析偵測。
在一些實施態樣中，hENT1表現量係利用與hENT1或彼之抗原結合片段特異性結合之抗體偵測。在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體係單株抗體，其包括重鏈可變區序列諸如VH3-12重鏈可變區、VH5-9重鏈可變區、VH5-12重鏈可變區、VH5-13重鏈可變區、或此處所提供且被稱為重鏈可變區一致序列1(VH一致序列1)之一致性重鏈可變區。在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體係單株抗體，其包括VH1-1重鏈可變區、VH1-4重鏈可變區、VH1-6重鏈可變區、VH4-2重鏈可變區、VH4-3重鏈可變區、VH4-4重鏈可變區、或此處所提供且被稱為重鏈可變區一致序列2(VH一致序列2)之一致性重鏈可變區。在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體係單株抗體，其包括例如輕鏈可變區序列諸如舉例來說VL2輕鏈可變區、VL10輕鏈可變區、VL11輕鏈可變區、VL20輕鏈可變區、VL21輕鏈或此處所提供且被稱為輕鏈可變區一致序列1(VL一致序列1)之一致性輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體係單株抗體，其包括VL2-2輕鏈可變區、VL2-3輕鏈可變區、VL2-7輕鏈可變區、VL2-10輕鏈可變區、VL2-12輕鏈可變區、VL2-16輕鏈可變區或此處所提供且被稱為輕鏈可變區一致序列2(VL一致序列2)之一致性輕鏈可變區。該些抗體在此處分別被稱為「 hENT1抗體」或「抗hENT1抗體」。hENT1抗體包括全人單株抗體，也包括人化單株抗體及嵌合性抗體。hENT1抗體可包括源自其他物種(諸如舉例來說兔)之重鏈或輕鏈恆定區以改善穩定性及/或偵測。這些抗體顯示對hENT1之特異性。
在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括具有SEQ ID NO：2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38或39之胺基酸序列的重鏈可變區。在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括具有SEQ ID NO：14、16、18、20、22、23、43、45、47或49之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括與SEQ ID NO：2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38或39之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列的重鏈可變區。在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括與SEQ ID NO：14、16、18、20、22、23、43、45、47或49之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括重鏈可變區互補決定區1(VH CDR1)、重鏈可變區互補決定區2(VH CDR2)及重鏈可變區互補決定區3(VH CDR3)，該VH CDR1序列包含胺基酸序列GYTFTDYE(SEQ ID NO：10)，該VH CDR2序列包含胺基酸序列IDPETGAI(SEQ ID NO：11)或胺基酸序列IDPETGKT(SEQ ID NO：40 )，且該VH CDR3序列包含胺基酸序列TREFTY(SEQ ID NO：12)或胺基酸序列TRELTY(SEQ ID NO：41)。
在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括重鏈可變區互補決定區1(VH CDR1)、重鏈可變區互補決定區2(VH CDR2)及重鏈可變區互補決定區3(VH CDR3)，該VH CDR1包含與胺基酸序列GYTFTDYE(SEQ ID NO：10)具有至少87%或更高一致性之胺基酸序列，該VH CDR2包含與胺基酸序列IDPETGAI(SEQ ID NO：11)或胺基酸序列IDPETGKT(SEQ ID NO：40)具有至少87%或更高一致性之胺基酸序列，且該VH CDR3包含與胺基酸序列TREFTY(SEQ ID NO：12)或胺基酸序列TRELTY(SEQ ID NO：41)具有至少83%或更高一致性之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括輕鏈可變區互補決定區1(VL CDR1)、輕鏈可變區互補決定區2(VL CDR2)及輕鏈可變區互補決定區3(VL CDR3)，該VL CDR1序列包含與胺基酸序列QSLLFSNGKTY(SEQ ID NO：24)具有至少90%或更高一致性之胺基酸序列，該VL CDR2序列包含與胺基酸序列LVS(SEQ ID NO：25)具有至少66%或更高一致性之胺基酸序列，且該VL CDR3序列包含與胺基酸序列VQGTHFPWT(SEQ ID NO：26)具有至少88%或更高一致性之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，該hENT1抗體包括輕鏈可變區互補決定區1(VL CDR1)、輕鏈可變區互補決定區2(VL CDR2)及輕鏈可變區互補決定區3(VL CDR3)，該VL CDR1序列包含胺基酸序列QSLLFSNGKTY(SEQ ID NO：24)，該VL CDR2序列包含胺基酸序列LVS(SEQ ID NO：25)，且該VL CDR3序列包含胺基酸序列VQGTHFPWT(SEQ ID NO：26)。
在一些實施態樣中，hENT1表現量係與hENT1表現對照量比較。
在一些實施態樣中，該對照量係「內部對照」，諸如舉例來說使用樣本內一致地表現高/中或低量hENT1之正常細胞。在一些實施態樣中，hENT1表現對照量係源自比較白血病性胚細胞、單核球、顆粒球及嗜酸性球中之一或多者之hENT1表現量與正常自體淋巴細胞中之hENT1表現量之比值指數。選擇性地或另外地，該對照量係「外部對照」，諸如舉例來說經工程化處理以表現給定量之hENT1之細胞系，例如細胞系CCRF-CEM(每細胞大約表現100,000至300,000 hENT1轉運蛋白)及/或缺乏hENT1之CEM/ara-C。
在一些實施態樣中，該對照量已經先於該個體以外之來源測定。在一些實施態樣中，該hENT1對照量係同時於該個體以外之來源測定。該等實施態樣之適當來源包括此處所描述之任一者。
在一些實施態樣中，該對照量係於自該個體取得之第二非癌性樣本中測定。在一些實施態樣中，該對照量係於自不同個體取得之非癌性樣本中測定。適當樣本包括自個 體分離之組織、細胞及生物液體，以及存在於個體體內之組織、細胞及液體。此處使用之用語「生物樣本」包括血液及血液之組分或成份包括血清、血漿或淋巴液。
在一些實施態樣中，hENT1表現對照量係源自比較白血病性胚細胞、單核球、顆粒球及嗜酸性球中之一或多者之hENT1表現量與正常自體淋巴細胞中之hENT1表現量之比值指數。
在一些實施態樣中，該對照量係利用多重對照來源中之hENT1表現量決定。適當之對照來源包括此處所描述之任一者。
在一些實施態樣中，該對照量係藉由取得hENT1量之統計分布決定。
在一些實施態樣中，該對照量係自經工程化處理以表現hENT1之培養細胞測定。在一些實施態樣中，該對照量係自經工程化處理以不表現hENT1之細胞測定。適當之細胞類型包括該領域已知之適合用於細胞培養之細胞及細胞系及/或此處所述之任何細胞。
在一些實施態樣中，該對照量係臨床上可接受之參考量。
在一些實施態樣中，在個體內之hENT1表現量根據H評分(H-Score)被分成高、中或低。
在一些實施態樣中，當個體內之hENT1表現量之H評分低於或等於H評分總中位數時，其被當成低量樣本。
在一些實施態樣中，抗癌藥物之有效劑量係以單一劑 量投予。在一些實施態樣中，抗癌藥物之有效劑量係以多重劑量投予。
在一些實施態樣中，個體對化學治療劑之治療係無反應、反應較差或停止反應。舉例來說，在一些實施態樣中，該化學治療劑係吉西他濱(gemcitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)及/或氮雜胞苷。其他適當之化學治療劑包括該領域熟知者、此處所描述之化學治療劑及抗腫瘤劑之任一者、及/或此處所描述之抗感染疾病劑之任一者。
在一些實施態樣中，該抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物係與各種已知之治療劑之任一者組合投予，包括例如化學治療劑及其他抗腫瘤劑、抗發炎化合物及/或免疫抑制化合物。在一些實施態樣中，該抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物係與各種已知之治療之任一者組合使用，包括但不限於手術治療及方法、放射線治療、化學治療及/或荷爾蒙或其他內分泌相關治療。
在一些實施態樣中，該抗癌藥物係與一或多種化學治療劑及/或細胞毒性劑組合投予。適當之劑及/或細胞毒性劑包括該些該領域熟知者及/或此處所述之化學治療劑、抗腫瘤劑及/或細胞毒性劑之任一者。
這些「共同療法」可依序投予或同時投予。抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物與額外之劑可於相同之醫藥組成物中被投予至個體，較佳地人個體。或者，抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物與第二劑可於分開之醫藥組成物中被同時、分開或依序投予至個體。抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物 與第二治療可經相同或不同之投予途徑投予至個體。
在一些實施態樣中，本發明之共同治療包含有效量之抗癌藥物及/或彼之醫藥組成物與有效量之至少一種其他治療(例如預防性或治療性劑)，該其他治療之作用機轉異於此處描述之吉西他濱、阿糖胞苷及/或氮雜胞苷類似物，例如吉西他濱-5’-反油酸酯、阿糖胞苷-5’-反油酸酯及/或氮雜胞苷-5’反油酸酯。在一些實施態樣中，本發明之共同治療藉由共同作用之加成或協同效應以改善抗癌藥物與第二治療之預防性或治療性效應。在一些實施態樣中，本發明之共同治療減少與該第二治療(例如預防性或治療性劑)有關之不良反應。
在一些實施態樣中，抗癌藥物係與額外之劑組合投予。在此情況中用語「組合」係指該抗癌藥物與該額外之劑係實質上同時給予，即同步或依序給予。若依序給予，當開始投予第二化合物時，在治療部位仍可較佳地偵測到該二種化合物之第一者之有效濃度。該抗癌藥物可先被投予，接著再投予該額外之劑，或者該額外之劑可先被投予，接著再投予該抗癌藥物。
在一些實施態樣中，組合療法可包括與一或多種額外之劑共同調製之一或多種抗癌藥物諸如氮雜胞苷-5’反油酸酯、阿糖胞苷-5’-反油酸酯、及/或吉西他濱-5’-反油酸酯。
抗癌藥物與額外之劑可藉由相同或不同之投予途徑投予。
在一些實施態樣中，抗癌藥物、組合療法及/或彼等 之醫藥組成物係呈經口投予之劑型，例如錠劑、丸劑、膠囊(硬膠囊或軟膠囊)、橢圓形錠劑、散劑、顆粒劑、懸浮液、溶液、凝膠、扁囊劑、口含片、含錠、糖漿、酏劑、乳劑、油在水中乳劑、水在油中乳劑、及/或頓服劑。
投予抗癌藥物、組合療法及/或彼等之醫藥組成物至罹患細胞增生疾病或病狀之病患被認為是成功的，若達成多種實驗室或臨床結果之任一者。舉例來說，若與細胞增生疾病或病狀有關之一或多種症狀被緩和、減少、抑制或不再繼續進展(至惡化狀態)，則投予被認為成功。若該細胞增生疾病(例如癌或其他腫瘤狀況)進入緩解及/或不再繼續進展(至惡化狀態)，則投予被認為成功。
本發明亦提供指導疾病治療之方法，該方法藉由遞送疑似具有低量之功能性hENT1之樣本至診斷實驗室以測定hENT1之量；提供具有已知量之hENT之對照樣本；提供偵測hENT1之抗體或其他方式；使該樣本及對照樣本與該抗體或其他抗hENT1劑結合並偵測抗體或抗hENT1劑結合之相對量，其中具有低量hENT1結合之樣本被用來提供病患應接受特定抗癌藥物諸如氮雜胞苷-5’反油酸酯、阿糖胞苷-5’反油酸酯或吉西他濱-5’-反油酸酯之結論。
本發明亦提供指導疾病治療之方法，該方法另包含回顧或分析與樣本中hENT1之存在有關之資料；及提供結論給個體、健康照護提供者或健康照護經理，該結論係根據資料之回顧或分析。在本發明之態樣中，結論係透過網絡傳送資料。
本發明提供偵測個體內hENT1表現量之方法，該方法藉由使源自個體之樣本與一或多種抗體接觸，該一或多種抗體在足以允許該抗體與細胞表面標誌結合之條件下與細胞表面標誌或細胞標誌結合，其中該樣本包含至少白血病性胚細胞、淋巴細胞及至少一或多種其他類型之選自單核球、顆粒球或嗜酸性球之正常、非白血病性血液細胞；使該樣本之細胞經通透化；使該樣本之經通透化之細胞與抗體接觸，該抗體在足以允許該抗體與hENT1結合之條件下與hENT1結合，其中該抗hENT1抗體係經螢光團(諸如舉例來說FITC及/或PE)可偵測地標示；藉由流式細胞分析偵測下列之螢光量：(i)該樣本之一或多種其他類型之正常、非白血病性血液細胞、(ii)該樣本之淋巴細胞，及(iii)該樣本之白血病性胚細胞；藉由比較(i)之各種其他類型之正常、非白血病性血液細胞的螢光量與(ii)之淋巴細胞的螢光量以測定該樣本之hENT1表現量的對照比；藉由比較(iii)之白血病性胚細胞的螢光量與(ii)之淋巴細胞的螢光量以測定該樣本之白血病性胚細胞的hENT1表現量之比；及比較白血病性胚細胞之hENT1表現量之比與對照比以測定該個體之hENT1的表現量。
在一些實施態樣中，hENT1表現量係藉由比較白血病性胚細胞、單核球(mono)、顆粒球(gran)及嗜酸性球(eos)中之hENT1量與正常自體淋巴細胞(lymph)中之hENT1量之比值指數加以定量。比值方法係基於使用二個 螢光強度之比，不受可能會影響測定之條件變異之影響(諸如但不限於儀器與儀器之差異、正常細胞內之hENT1之量、非特異性結合)。因此，使用比值避免許多與絕對螢光值有關之問題。
在一些實施態樣中，此處所提供之測定比值係如下計算：
在一些實施態樣中，該個體罹患急性骨髓性白血病(AML)。在一些實施態樣中，該血液失調係骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)或慢性骨髓單球性白血病(CMML)。
在一些實施態樣中，該細胞表面標誌或細胞標誌係選自CD45、CD163、CD33、CD34、CD38、CD123、CD117、CD13、CD64、HLA-DR、骨髓過氧化酶(MPO)或彼等之多種組合。在一些實施態樣中，該與細胞表面標誌或細胞標誌結合之一或多種抗體係經可偵測之標記(例如螢光團)標示。適當之螢光團包括但不限於FITC、PE、PerCP-Cy5.5及/或PE-Cy7。
在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體包括重鏈可變區互補決定區1(VH CDR1)、重鏈可變區互補決定區2(VH CDR2)、重鏈可變區互補決定區3(VH CDR3)、輕鏈可變區互補決定區1(VL CDR1)、輕鏈可變區互補決定區2(VL CDR2)及輕鏈可變區互補決定區3(VL CDR3)，該VH CDR1序列包含胺基酸序列GYTFTDYE(SEQ ID NO：10)，該VH CDR2序列包含胺基酸序列IDPETGAI(SEQ ID NO：11)或胺基酸序列IDPETGKT(SEQ ID NO：40)，該VH CDR3序列包含胺基酸序列TREFTY(SEQ ID NO：12)或胺基酸序列TRELTY(SEQ ID NO：41)，該VL CDR1序列包含胺基酸序列QSLLFSNGKTY(SEQ ID NO：24)，該VL CDR2序列包含胺基酸序列LVS(SEQ ID NO：25)，且該VL CDR3序列包含胺基酸序列VQGTHFPWT(SEQ ID NO：26)。
在一些實施態樣中，該抗hENT1抗體包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，該重鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38或39之胺基酸序列，該輕鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、23、43、45、47或49之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明之方法包括免疫原性hENT1肽。舉例來說，在一些實施態樣中，此處提供之流式細胞分析包括免疫原性hENT1肽。此處所使用之用語「免疫原性hENT1肽」及「抗原性肽」可交換使用，係指保留引起或以其他方式刺激病患免疫反應之能力的hENT1蛋白質、多肽及/或肽。在一些實施態樣中，該免疫原性 hENT1肽係全長hENT1蛋白質之片段。在一些實施態樣中，該免疫原性hENT1肽係人全長hENT1蛋白質之片段。舉例來說，免疫原性hENT1肽係具有例如GenBank編號AAC51103.1、NP_001071645.1、NP_001071644.1、NP_0010171643.1、NP_001071642.1、NP_004946.1、NP_001523.2、AAM11785.1、AAF02777.1所示之序列的全長hENT1蛋白質之片段。舉例來說，該免疫原性hENT1肽係人全長hENT1蛋白質之片段，該片段包含至少hENT1蛋白質之跨膜區6及7之間的預期細胞內圈環之部分。(見例如Zhang et al.“The role of nucleoside transporters in cancer chemotherapy with nucleoside drugs,”Cancer Metastasis Rev.26(2007)：85-110。)舉例來說，該免疫原性hENT1肽係包含至少序列SKGEEPRAGKEESGVSVS之人全長hENT1蛋白質之片段，該片段對應如圖2所示之hENT1蛋白質之跨膜區6及7之間的預期細胞內圈環之胺基酸254至271。在一些實施態樣中，該免疫原性hENT1肽片段包含如圖2所示之hENT1蛋白質之跨膜區6及7之間的預期細胞內圈環之至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個胺基酸。
在一些實施態樣中，該免疫原性hENT1肽係全長hENT1人蛋白質之片段。舉例來說，該免疫原性hENT1肽片段與全長人hENT1蛋白質具有2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%或超過50%之一致性，該全長人hENT1蛋白質舉例來說諸如該些於GenBank編號AAC51103.1、NP_001071645.1、NP_001071644.1、NP_0010171643.1、NP_001071642.1、NP_004946.1、NP_001523.2、AAM11785.1、AAF02777.1所示者。
在這些流式細胞分析中使用免疫原性hENT1肽允許測量hENT1抗體與細胞內抗原之特異性結合量。包括免疫原性hENT1肽之流式細胞分析具有優於不包括此肽之其他分析之好處。舉例來說，該等免疫原性hENT1肽可被用於定量病患或樣本內之hENT1量。該等免疫原性hENT1肽亦可被用於正常化病患或樣本內之hENT1定量。此外，該等免疫原性hENT1肽解決常見於不包括該等肽之流式細胞分析之問題，即偵測或以其他方式識別該抗體結合具特異性或不具特異性之能力。包含免疫原性hENT1肽表示該偵測到之hENT1之量係因抗體與hENT1之間之特異性結合，而不是非特異性結合。
在一實施態樣中，流式細胞分析係於至少二支平行管中進行，其中一支管不包括免疫原性hENT1肽，另一支管包含特定濃度之免疫原性hENT1肽。該肽之相對抑制或抑制百分比接著被用來作為定量手段。校正珠被添加於樣本中作為內部參考。不同之正常細胞族群可被用來作為對照。以下實施例中之資料顯示不同細胞類型之間的信號不同。
本發明亦提供利用流式細胞分析偵測樣本內標靶蛋白 質、多肽及/或肽之量之方法。在一些實施態樣中，本發明之該等方法亦包括免疫原性版本之標靶肽。此處所使用之用語「免疫原性標靶肽」、「免疫原性肽」及/或「抗原性肽」係指保留引起或以其他方式刺激病患免疫反應之能力的標靶蛋白質、多肽及/或肽。在一些實施態樣中，該免疫原性肽係全長標靶蛋白質之片段。在一些實施態樣中，該免疫原性肽係人全長標靶蛋白質之片段。舉例來說，該免疫原性肽係人全長標靶蛋白質之片段，該片段包含至少該標靶蛋白質之胞外結構域之部分。在一些實施態樣中，該免疫原性肽片段包含該全長標靶蛋白質之至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超過100個胺基酸。
在一些實施態樣中，該免疫原性肽係全長人標靶蛋白質之片段。舉例來說，該免疫原性肽片段係與全長人標靶蛋白質具有2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或超過50%之一致性。
在這些流式細胞分析中使用免疫原性肽允許測量抗標靶抗體與標靶抗原之特異性結合量。包括免疫原性肽之流式細胞分析具有優於不包括該肽之其他分析之好處。舉例來說，該等免疫原性肽可被用於定量病患或樣本內之標靶量。該等免疫原性肽亦可被用於正常化病患或樣本內之標靶定量。此外，該等免疫原性偵測或以其他方式識別該抗體結合具特異性或不具特異性。包含免疫原性肽表示該偵 測到之標靶之量係因抗體與該標靶之間之特異性結合，而不是非特異性結合。
在一實施態樣中，流式細胞分析係於至少二支平行管中進行，其中一支管不包括免疫原性標靶肽，另一支管包含特定濃度之免疫原性標靶肽。該肽之相對抑制或抑制百分比接著被用來作為定量手段。校正珠被添加於樣本中作為內部參考。不同之正常細胞族群可被用來作為對照。
〔本發明之詳細說明〕
hENT1係富含於大多數健康細胞及許多腫瘤細胞中之跨膜/膜蛋白。由於hENT1之普遍表現，此處所提供之方法必須能選擇性偵測及定量腫瘤細胞內之hENT1，包括諸如胚細胞之細胞亞群。
本發明提供治療罹患血液癌或其他疾病之病患的方法。該方法包含預測個體對癌治療之反應，包括癌病人之反應。本發明亦提供根據預測療效配對特定化學治療劑與特定個體之方法，以及用於指導治療及知會病患和醫師之方法。
核苷類似物藥物依賴核苷轉運蛋白進入彼等展現效應處的細胞內，這些分子無法藉由擴散通過細胞膜，細胞要有效地攝取需要靠這些特化細胞膜核苷轉運蛋白之存在。
阿糖胞苷(cytarabine)和吉西他濱(gemcitabine)(健澤(Gemzar)，禮來(Eli Lilly)，印第安那州印第安納波利斯市)是兩種依賴人平衡型核苷轉運蛋白 1(hENT1)才能發揮作用之抗癌藥物。大部分之癌細胞具有低表現之hENT1。低表現及/或活性之hENT1已於具有癌及其他腫瘤性疾病諸如舉例來說急性骨髓性白血病(AML)或胰癌之病患被發現。治療之低臨床效應係與癌細胞中減少或不存在之hENT1相關。(見例如Galmarini,et al.,“Potential mechanisms of resistance to cytarabine in AML patients,”Leuk Res 26(2002)621-629；Farrell,et al.,“Human Equilibrative Nucleoside Transporter 1 Levels Predict Response to Gemcitabine in Patients With Pancreatic Cancer,”Gastroenterology 136(2009)187-195及Giovannetti,et al.,“Transcription analysis of human equilibrative nucleoside transporter-1 predicts survival in pancreas cancer patients treated with gemcitabine,”Cancer Res 66(2006)3928-3935。)研究顯示在胰癌病患之腫瘤細胞上缺乏hENT1表現與該病患對核苷類似物及其他化學治療藥物諸如吉西他濱(gemcitabine)之反應不佳之間具有直接相關性。(見Farrell,et al.,“Human Equilibrative Nucleoside Transporter 1 Levels Predict Response to Gemcitabine in Patients With Pancreatic Cancer,”Gastroenterology 136(2009)187-195)。hENT1對於利巴韋林(ribavirin)之經口攝取亦為重要，可造成對利巴韋林C型肝炎治療之抗藥性。(見Ibarra et al.,“Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance,”J.Virol.,vol. 83(9)：4583-47(2009))。
在此處提供之方法中，具有低量或以其他方式減少之hENT1表現及/或活性之病患族群係經識別以提供其他或以別種方式改變之治療療法。舉例來說，此經識別之病患族群被投予一種經設計以允許hENT1缺乏細胞攝取之治療，諸如舉例來說經脂質共軛之吉西他濱衍生物諸如吉西他濱-5’-反油酸酯、經脂質共軛之阿糖胞苷衍生物諸如阿糖胞苷-5’-反油酸酯、或經脂質共軛之氮雜胞苷衍生物諸如5-氮雜胞苷-5’-反油酸酯。(見Brueckner,et al.,“Delivery of 5-azacytidine to human cancer cells by elaidic acid esterification increases therapeutic drug efficacy,”Mol Cancer Ther.,vol.9(5)：1256-1264(2010))。研究顯示這些藥物與已建立之核苷藥物諸如吉西他濱、阿糖胞苷及氮雜胞苷不同，它們能夠不依賴癌細胞之hENT1表現量地進入癌細胞且保留彼等於癌細胞中之活性。(見例如Breistol,et al.,“Antitumor activity of P-4055(elaidic acid-cytarabine)compared to cytarabine in metastatic and s.c.human tumor xenograft models,”Cancer Res 59(1999)2944-2949及Galmarini et al.,“CP-4055 and CP-4126 are active in ara-C and gemcitabine-resistant lymphoma cell lines,”Br J Haematol 144(2009)273-275)。
吉西他濱-5’-反油酸酯及阿糖胞苷-5’-反油酸酯於hENT1缺乏細胞中之攝取亦於試管內得到證實，其中在 hENT1缺乏癌細胞中具有經證實之高度形成阿糖胞苷-5’-反油酸酯及吉西他濱-5’-反油酸酯之活性三磷酸酯代謝物。一旦進入細胞內，該脂質共軛藥物諸如吉西他濱-5’-反油酸酯或阿糖胞苷-5’-反油酸酯之脂質尾被切斷，並釋放該母體藥物。由於缺乏hENT1轉運蛋白(因為在該經識別之病患族群中hENT1之低表現及/或活性)，該藥物被困在細胞內，並測量到高濃度之活性代謝物。(見Adema et al.,“Metabolism and accumulatiin of the lipophilic deoxynucleoside analogs elacytarabine and CP-4126,Invest.New Drugs,2011 Oct 15.[先行發表電子版])。
這些觀察顯示經脂質共軛之吉西他濱衍生物諸如吉西他濱-5’-反油酸酯、經脂質共軛之氮雜胞苷衍生物諸如氮雜胞苷-5’-反油酸酯、及/或經脂質共軛之阿糖胞苷衍生物諸如阿糖胞苷-5’-反油酸酯可用於治療因為缺乏hENT1或低hENT1表現及/或活性而對阿糖胞苷、氮雜胞苷和吉西他濱具抗藥性或以其他方式不具反應性之腫瘤。
在一些實施態樣中，病患目前接受之治療療法包括投予一或多種核苷類似物藥物及/或衍生自核苷類似物之藥物，諸如嘧啶衍生物包括例如阿糖胞苷、吉西他濱、氮雜胞苷及彼等之衍生物，及嘌呤衍生物包括例如氟達拉濱(fludarbine)、克拉屈濱(cladribine)、克羅拉濱(clofarabine)及彼等之衍生物。在一些實施態樣中，病患目前接受之治療療法包括投予一或多種核苷類似物藥物及/或衍生自核苷類似物之藥物，諸如嘧啶衍生物包括例如 阿糖胞苷、吉西他濱、氮雜胞苷及彼等之衍生物，及嘌呤衍生物包括例如氟達拉濱、克拉屈濱、克羅拉濱及彼等之衍生物，且這些病患停止對治療之反應或以其他方式減少對該核苷類似物藥物之反應性。
在一些實施態樣中，病患先前接受之治療療法包括投予一或多種核苷類似物藥物及/或衍生自核苷類似物之藥物，諸如嘧啶衍生物包括例如阿糖胞苷、吉西他濱、氮雜胞苷及彼等之衍生物，及嘌呤衍生物包括例如氟達拉濱、克拉屈濱、克羅拉濱及彼等之衍生物。在一些實施態樣中，病患先前接受之治療療法包括投予一或多種核苷類似物藥物及/或衍生自核苷類似物之藥物，諸如嘧啶衍生物包括例如阿糖胞苷、吉西他濱、氮雜胞苷及彼等之衍生物，及嘌呤衍生物包括例如氟達拉濱、克拉屈濱、克羅拉濱及彼等之衍生物，且這些病患停止對治療之反應或以其他方式減少對該核苷類似物藥物之反應性。
在一些實施態樣中，病患係新病患，此處所提供之方法提供及/或協助初步診斷。舉例來說，在具有罹患AML風險或另外疑似罹患AML之病患中，hENT1之表現量係用於預測病患對阿糖胞苷之反應及決定該病患是否應該接受阿糖胞苷類似物諸如阿糖胞苷-5’反油酸酯。該經偵測之hENT1表現量係用於預測該病患對抗癌化合物或彼之類似物之治療的反應及/或結果。因此，在此實施態樣中，此處提供之方法可用於協助初步診斷及初步治療性治療選擇。
方法
為了治療癌病患，本發明揭示下列一般性態樣。首先，識別血液癌病患，或識別疑似罹患或具有罹患血液癌風險之病患。個體係利用任何已知之診斷技術識別。該識別可由醫師進行。對該個體之識別可藉由與該醫師、該個體、健康照護公司、保險公司、或儲存與該個體相關之資料之電腦資料庫之溝通。在一些實施態樣中，個體識別係與檢測樣本併行。在一些實施態樣中，個體係經識別，接著實施進一步之檢測。此處使用之用語「個體(individual)」係與「病患」或「個體(subject)」同義。在一些實施態樣中，該個體係疑似罹患癌。在一些實施態樣中，該個體已被診斷為罹患癌。在一些實施態樣中，該個體已被證實為罹患癌。在一些實施態樣中，該個體係人，然而在一些實施態樣中，該個體係非人哺乳動物。在一些實施態樣中，該非人哺乳動物係罹患癌之豢養動物。在一些實施態樣中，該個體係正在接受進行中之治療療程。在一些實施態樣中，該個體尚未接受治療。在一些實施態樣中，該個體在進行中之治療療程接受診斷性檢測，以識別癌細胞或組織中之轉運蛋白諸如hENT1或hCNT1之量。
第二，包含癌細胞之樣本係得自此個體並經分析以測定一或多種核苷轉運蛋白之表現量。在一些實施態樣中，該核苷轉運蛋白量係於體液樣本中測定。在一些實施態樣中，體液樣本係取自個體且核苷轉運蛋白之量係得自體液。在一些實施態樣中，核苷轉運蛋白之量係得自從體液樣 本獲得之細胞亞群。體液包括但不限於血液、淋巴液、唾液、精液、CSF、乳汁、腹水及胸膜滲液。
第三，此資訊接著被用來決定該病患應使用哪一種可用之抗癌藥物。舉例來說，缺乏或具有低量核苷轉運蛋白之病患被告知親水性核苷抗癌藥物可能不具療效，因為這些藥物可能無法進入癌細胞內。該種病患可被給予這些藥物之經改質而不靠轉運蛋白進入癌細胞之衍生物，諸如舉例來說吉西他濱-5’-反油酸酯、阿糖胞苷-5’-反油酸酯及/或氮雜胞苷-5’反油酸酯。
本發明之方法較佳地利用流式細胞分析偵測hENT1表現量。流式細胞分析係偵測及定量癌(諸如AML、MDS、ALL及CMML)和其他血液失調中之hENT1的理想平台，因為胚細胞具有許多表型表現，且可以少量細胞族群存在於病患中。流式細胞分析係例行性用於這些病患之臨床診斷檢驗，第一線治療通常在得知流式細胞分析及免疫表型分析之結果後立即開始，例如通常在24至48小時之內。此處提供之方法可被輕易地整合至目前臨床上對AML、MDS、ALL、CMML及/或其他血液失調之治療。此處提供之方法係經設計以用於搭配、組合或以其他方式補充目前用於AML、MDS、ALL、CMML及其他血液失調之治療方法。
雖然流式細胞分析被用於診斷癌之先前方法，此處描述之方法提供優於目前流式細胞分析之改進。舉例來說，流式細胞分析被用來作為偵測急性白血病中與阿糖胞苷( ara-C)活性有關之核苷轉運部位之測量技術的一部分(見例如Wiley,J.S.,Jones,S.P.,Sawyer,W.H.,and Paterson,A.R.(1982)Cytosine arabinoside influx and nucleoside transport sites in acute leukemia,J Clin Invest 69,479-489)。與此處所提供之方法不同的是，Wiley et al.描述之方法要求細胞在分析核苷轉運部位以前必須經過分離，例如藉由沉降梯度諸如Ficoll梯度分離。同樣地，流式細胞分析係與SAENTA-螢光素組合使用以偵測AML病患之血液中的核苷轉運部位之數量(見例如Gati,W.P.,Paterson,A.R.,Larratt,L.M.,Turner,A.R.,and Belch,A.R.(1997)Sensitivity of acute leukemia cells to cytarabine is a correlate of cellular es nucleoside transporter site content measured by flow cytometry with SAENTA-fluorescein,Blood 90,346-353)。然而，Gati et al.描述之此方法亦要求在細胞分析以前先進行Ficoll梯度分離。另外，Gati et al.描述之方法需要精細詳盡之校正曲線以及較大之病患樣本大小，才能評估病患內之結合部位之數量。
和這些利用流式細胞分析之先前方法不同的是，此處描述之方法提供易於使用之可輕易整合至AML標準診斷程序之方法。此處提供之流式細胞方法不要求細胞在樣本分析前藉由Ficoll梯度分離(或其他細胞分離)。另外，當使用不同量之分析劑時，此處提供之流式細胞分析方法不需要使用不同之校正曲線，然而Wiley et al.及Gati et al.之方法需要使用不同量之NBMPR或SAENTA螢光素之校正曲線。相較於先前之流式細胞分析方法，此處描述之方法使用抗hENT1抗體以穩健、可靠且可再現地分析各種細胞類型中之hENT1表現的比值指數。因此，此處描述之方法提供相較於目前之流式細胞分析方法有利且非預期之改善。
在此處提供之方法中，流式細胞分析係用於分選或以其他方式識別及分離特定細胞亞群(諸如舉例來說白血球亞群包括胚細胞)與病患樣本內之其他細胞。該等方法利用以特定表面標誌為目標之抗體以識別相關之胚細胞及測量樣本中之hENT1。在一些實施態樣中，病患樣本內之細胞係經通透化以允許抗hENT1抗體接近彼之目標之hENT1膜蛋白之細胞內部分。
圖1之示意圖說明此處所使用以偵測hENT1表現之流式細胞分析及方法。該分析包括下列步驟：1)利用抗體混合物以自樣本內之其他細胞中識別及分選出胚細胞(即癌細胞)，該抗體混合物偵測胚細胞表面標誌(此處亦稱為「分選抗體混合物」)且經第一偵測手段可偵測地標示，該第一偵測手段像是螢光團諸如R-藻紅素(PE)或螢光素異硫氰酸酯(FITC)或其他適當之染料包括但不限於Alexa Fluor染料、DyLight染料、Cy染料、複合染料包括例如PE-Cy5及PE-Cy7、太平洋藍/橘、螢光黃、德克薩斯紅及/或別藻藍蛋白( APC)；2)使步驟1)所識別之胚細胞經通透化以允許進入細胞內之細胞質hENT1蛋白質；及3)利用特異性結合及識別hENT1之抗體偵測及定量hENT1表現，其中該抗hENT1抗體係經第二偵測手段例如螢光團可偵測地標示，惟其步驟1)所使用之第一偵測手段係與使用抗hENT1抗體之第二偵測手段不同。
在此處所提供之方法中使用具有相容光譜之不同染料允許同步偵測不同染料，因為流式細胞儀具有數個偵測器(重疊光譜可被校正)。因此，此處提供之方法允許在一次樣本分析中進行多參數測定。換言之，單一管之反應係經實施，因此簡化目前之分析及偵測方法。
分選細胞亞群
在此處提供之方法中，以特定表面標誌為目標之抗體被用來自樣本或個體內識別該相關之細胞亞群，諸如舉例來說胚細胞。由於源自不同血液失調之胚細胞可處於不同之發展階段，因此此處提供之方法使用多種不同之以特定表面標誌為目標之抗體以識別及分選該胚細胞。抗體可以該領域中任何已知之表面標誌為目標。舉例來說，用於此處提供之方法中之抗體可識別及結合表面標誌，諸如CD45(單核球標誌)、CD163(泛白血球標誌)、CD33、CD34、CD38、CD123、CD117、CD13、CD64、HLA-DR 、骨髓過氧化酶(MPO，一種在溶酶體中之細胞標誌，其可被用來識別源自骨髓樣細胞系之白血病細胞)及彼等之任何組合。
在一些實施態樣中，用來識別及分選或以其他方式分離與AML、MDS、ALL、CMML或任何其他血液失調有關之細胞的標誌包括下列之一或多者：CD1a、CD2、CD3、cCD3、CD3(m)、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22(s或c)、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD35/36、CD38、CD41、CD43、CD44、CD45、CD52、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、CD65、CD68(c)、CD71、CD79a(包括cCD79a)、CD79b、CD81、CD86、CD87、CD94、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、細胞質重鏈、細胞質輕鏈、DR、FMC7、顆粒溶解酶B、Ig、IgM(c)、K(kappa輕鏈)、K/L(kappa IgG輕鏈與lambda IgG輕鏈之比)、L(lambda輕鏈)、LZ(溶菌酶)、MPO、單獨之MPO或與LF(乳鐵蛋白)組合之MPO、與CDI4組合之MPO/LF、排除CD19及CD3細胞之NK細胞、穿孔素、RBC標誌諸如CD238(血型糖蛋白A)或CD36、sIg、T-ALL,c及/或s之TCR鏈、TdT、uPAR(CD87)/uPACD116、或任何彼等之組合。(見例如Béné et al.,“Proposals for the immunological classification of acute leukemias.European Group for the Immunological Characterization of Leukemias(EGIL),” Leukemia.vol.9：1783-6(1995)；Lacombe,et al.“Flow cytometry CD45 gating for immunophenotyping of acute myeloid leukemia,”Leukemia.vol.11：1878-86(1997)；Ratei et al.,“Immunophenotype and clinical characteristics of CD45-negative and CD45-positive childhood acute lymphoblastic leukemia,”Ann.Hematol.vol.77：107-114(1998)；Knapp et al.,“Flow cytometric analysis of cell-surface and intracellular antigens in leukemia diagnosis,Cytometry.vol.18：187-98(1994)；Strobl H et al.“Myeloperoxidase expression in CD34+ normal human hematopoietic cells,”Blood.vol.1；82：2069-78(1993)；Strobl H et al.,“Identification of CD68+lin- peripheral blood cells with dendritic precursor characteristics,”J Immunol.vol.161：740-8(1998)；Scholz W et al.,“Initial human myeloid/dendritic cell progenitors identified by absence of myeloperoxidase protein expression,”Exp Hematol.vol.32：270-6(2004)；Strobl H,et al.,“Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis,”Br J Haematol.vol.90：774-82(1995)；Scheinecker C,et al.,“Granulomonocyte-associated lysosomal protein expression during in vitro expansion and differentiation of CD34+ hematopoietic progenitor cells,”Blood.vol.86：4115-23(1995)；Di Noto R et al.“All-trans retinoic acid(ATRA) and the regulation of adhesion molecules in acute myeloid leukemia,”Leuk Lymphoma.vol.21：201-9(1996)；Paietta E.“Expression of cell-surface antigens in acute promyelocytic leukaemia,”Best Pract Res Clin Haematol.vol.16：369-85(2003)；.Braylan RC et al.“Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias：results of an international consensus meeting,”Cytometry.vol.46：23-7(2001)；Castaneda VL,et al.“Childhood undifferentiated leukemia with early erythroid markers and c-myb duplication,”Leukemia.vol.5：142-9(1991)；Veltroni M,Det al.“I-BFM-ALL-FCM-MRD-Study Group.Expression of CD58 in normal,regenerating and leukemic bone marrow B cells：implications for the detection of minimal residual disease in acute lymphocytic leukemia,”Haematologica.vol.88：1245-52(2003)；Strobl H and Knapp W.“Myeloid cell-associated lysosomal proteins as flow cytometry markers for leukocyte lineage classification,”J Biol Regul Homeost Agents.vol.18：335-9(2004)；Garand R,et 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proliferation via p27Kip1,”Blood.vol.103：1059-68(2004)；Abi-Habib RJ,et al.“A urokinase-activated recombinant diphtheria toxin targeting the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor is selectively cytotoxic to human acute myeloid leukemia blasts,”Blood.vol.104：2143-8(2004)；Krober A,et al.“V(H)mutation status,CD38 expression level,genomic aberrations,and survival in chronic lymphocytic leukemia,”Blood vol.100：1410-6(2002)；Laane E et al.,“Flow cytometric immunophenotyping including Bcl-2 detection on fine needle aspirates in the diagnosis of reactive lymphadenopathy and non-Hodgkin's lymphoma,”Cytometry B Clin Cytom.vol.64：34-42(2005)；Thornton PD et al.,“CD38 expression as a prognostic indicator in chronic lymphocytic leukaemia,”Hematol J.vol.5：145-51 (2004)；Crespo M,et al.“ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia,”N Engl J Med vol.348：1764-75(2003)；Attygalle AD,et al.,“CD10 expression in extranodal dissemination of angioimmunoblastic T-cell lymphoma,”Am J Surg Pathol.vol.28：54-61(2004)；Lee PS et al.,“Immunophenotyping of angioimmunoblastic T-cell lymphomas by multiparameter flowcytometry,”Pathol Res Pract.vol.199：539-45(2003)；Perez-Andres M,et al.,“Spanish Network on multiple myeloma(G03/136)；the Spanish Network of Cancer Research Centers(C03/10).Clonal plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance,multiple myeloma and plasma cell leukemia show different expression profiles of molecules involved in the interaction with the immunological bone marrow microenvironment,”Leukemia.vol.19：449-55(2005)；Vergez et al.,“High levels of CD34+CD38low/-CD123+ blasts are predictive of an adverse outcome in acute myeloid leukemia：a Groupe Ouest-Est des Leucémies Aiguës et Maladies du Sang(GOELAMS)study,”Haematologica.vol.96(12)：1792-1798(2011))。
在一些實施態樣中，此處提供之方法係於至少四色流式細胞儀上進行以廣泛地運用於臨床診斷上，包括例如下列細胞儀：Navios及FC-500(二者皆來自貝克曼庫爾特 (Beckman Coulter)公司)和Canto II及FACSCalibur(二者皆來自BD公司(Becton Dickinson))。在一些實施態樣中，此處提供之方法係於六色或更多色之流式細胞儀上進行。
利用此處所述之細胞表面標誌或細胞標誌(例如MPO)以識別及分選胚細胞之此處所使用之抗體係可自商業途徑獲得，並具有各種螢光團(例如FITC、PE、APC及複合染料諸如PE-Cy5、PE-Cy7)。舉例來說，溶酶體酶MPO可被經營光團標示之抗MPO抗體識別，且該抗MPO抗體可被包括於「分選抗體混合物」中或在通透化後施用於樣本。
適當之染料及其他用於分選或以其他方式分離細胞之可偵測之手段包括螢光團諸如R-藻紅素(PE)或螢光素異硫氰酸酯(FITC)。其他適當之染料包括但不限於Alexa Fluor染料、DyLight染料、Cy染料、複合染料包括例如PE-Cy5及PE-Cy7、太平洋藍/橘、螢光黃、德克薩斯紅、及/或別藻藍蛋白(APC)。
其他適當之染料及可偵測之手段包括如下表1所示之螢光染料之任一者，該表係改編自沙克研究所細胞儀及分子成像中心(The Center for Cytometry and Molecular Imaging at the Salk Institute)之網站。表1說明可用於流式細胞分析或螢光顯微鏡之螢光染料的特徵(激發波長(Ex)、發射波長(Em)及分子量(MW))。表1中之螢光染料大約按激發波長之高低排序。
通透化
在此處提供之方法中，該經分選之胚細胞係經固定及通透化處理，以使得抗hENT1抗體得以接近其所欲結合之hENT1之細胞內圈環。適當之通透化劑包括可自商業途徑獲得之通透化劑諸如延齡草診斷(Trillium Diagnostics)公司之IntraCellTM，該劑係以清潔劑氚核(Triton)X100為基底之通透化劑。其他適當之通透化劑包括例如Fix+PermTM(Becton Dickenson)、CaltagTM(Beckman coulter)、皂素或適當之以甲醇為基底之方法。
抗hENT1抗體
一旦該等細胞經通透化處理以允許接近hENT1之細胞內圈環後，該等細胞係與抗hENT1抗體接觸。較佳地，該抗hENT1抗體係單株抗體。
舉例來說，該抗hENT1抗體係藉由以合成性肽(SKGEEPRAGKEESGVSVS，與KLH共軛)免疫接種小鼠所產製之抗體，該合成性肽對應hENT1之跨膜區6及7之間的預期細胞內圈環的胺基酸254至271。(見Jennings,et al,“Distinct regional distribution of human equilibrative nucleoside transporter proteins 1 and 2(hENT1 and hENT2)in the central nervous system,”Neuropharmacology,vol.40(5)：722-31(2001))。hENT1之拓撲學係顯示於圖2。
示範性抗hENT1抗體包括選自此處所述之下列VH鏈之重鏈可變區序列：VH3-12重鏈可變區、VH5-9重鏈可變區、VH5-12重鏈可變區、VH5-13重鏈可變區、或此處所提供且被稱為重鏈可變區一致序列1(VH一致序列1)之一致性重鏈可變區。示範性抗hENT1抗體亦包括具有選自此處所述之下列VH鏈之重鏈可變區序列之抗體：VH1-1重鏈可變區、VH1-4重鏈可變區、VH1-6重鏈可變區、VH4-2重鏈可變區、VH4-3重鏈可變區、VH4-4重鏈可變區或此處所提供且被稱為重鏈可變區一致序列2(VH一致序列2)之一致性重鏈可變區。各重鏈序列之可變結構域係於下列序列中以粗體顯示。互補決定區(CDR)係於下列序列中以方框顯示。該等CDR係利用IMGT演算法識別。(Lefranc,et al.,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)；Brochet et al.,“IMGT/V-QUEST：the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis,”Nucl.Acids Res.,vol.36：W503-508(2008))。
該VH3-12重鏈可變區(SEQ ID NO：2)係由SEQ ID NO：1所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH3-12核酸序列(SEQ ID NO：1)
>VH3-12胺基酸序列(SEQ ID NO：2)
該VH5-9重鏈可變區(SEQ ID NO：4)係由SEQ ID NO：3所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEO ID NO：4所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH5-9核酸序列(SEQ ID NO：3)
>VH5-9胺基酸序列(SEQ ID NO：4)
該VH5-12重鏈可變區(SEQ ID NO：6)係由SEQ ID NO：5所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH5-12核酸序列(SEQ ID NO：5)
>VH5-12胺基酸序列(SEQ ID NO：6)
該VH5-13重鏈可變區(SEQ ID NO：8)係由SEQ ID NO：7所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH5-13核酸序列(SEQ ID NO：7)
>VH5-13胺基酸序列(SEQ ID NO：8)
重鏈可變區一致序列1之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：9。該可變結構域係於SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH一致性胺基酸序列1(SEQ ID NO：9)
該VH1-1重鏈可變區(SEQ ID NO：28)係由SEQ ID NO：27所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH1-1核酸序列(SEQ ID NO：27)
>VH1-1胺基酸序列(SEQ ID NO：28)
該VH1-4重鏈可變區(SEQ ID NO：30)係由SEQ ID NO：29所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH1-4核酸序列(SEQ ID NO：29)
>VH1-4胺基酸序列(SEQ ID NO：30)
該VH1-6重鏈可變區(SEQ ID NO：32)係由SEQ ID NO：31所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：32所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：32所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH1-6核酸序列(SEQ ID NO：31)
>VH1-6胺基酸序列(SEQ ID NO：32)
該VH4-2重鏈可變區(SEQ ID NO：34)係由SEQ ID NO：33所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH4-2核酸序列(SEQ ID NO：33)
>VH4-2胺基酸序列(SEQ ID NO：34)
該VH4-3重鏈可變區(SEQ ID NO：36)係由SEQ ID NO：35所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH4-3核酸序列(SEQ ID NO：35)
>VH4-3胺基酸序列(SEQ ID NO：36)
該VH4-4重鏈可變區(SEQ ID NO：38)係由SEQ ID NO：37所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH4-4核酸序列(SEQ ID NO：37)
>VH4-4胺基酸序列(SEQ ID NO：38)
重鏈可變區一致序列2之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：39。該可變結構域係於SEQ ID NO：39所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：39所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VH一致性胺基酸序列2(SEQ ID NO：39)
示範性抗hENT1抗體包括選自此處所述之下列VL鏈之輕鏈可變區序列：VL2輕鏈可變區、VL10輕鏈可變區、VL11輕鏈可變區、VL20輕鏈可變區、VL21輕鏈或此處所提供且被稱為輕鏈可變區一致序列1(VL一致序列1)之一致性輕鏈可變區。示範性抗hENT1抗體亦包括具有選自此處所述之下列VL鏈之輕鏈可變區序列之抗體：VL2-2輕鏈可變區、VL2-3輕鏈可變區、VL2-7輕鏈可變區、VL2-10輕鏈可變區、VL2-12輕鏈可變區、VL2-16輕鏈可變區或此處所提供且被稱為輕鏈可變區一致序列2(VL一致序列2)之一致性輕鏈可變區。
該VL2輕鏈可變區(SEQ ID NO：14)係由SEQ ID NO：13所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2核酸序列(SEQ ID NO：13)
>VL2胺基酸序列(SEQ ID NO：14)
該VL10輕鏈可變區(SEQ ID NO：16)係由SEQ ID NO：15所示之核酸序列編碼。該CDR區係於SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL10核酸序列(SEQ ID NO：15)
>VL10胺基酸序列(SEQ ID NO：16)
該VL11輕鏈可變區(SEQ ID NO：18)係由SEQ ID NO：17所示之核酸序列編碼。該CDR區係於SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL11核酸序列(SEQ ID NO：17)
>VL11胺基酸序列(SEQ ID NO：18)
該VL20輕鏈可變區(SEQ ID NO：20)係由SEQ ID NO：19所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL20核酸序列(SEQ ID NO：19)
>VL20胺基酸序列(SEQ ID NO：20)
該VL21輕鏈可變區(SEQ ID NO：22)係由SEQ ID NO：21所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL21核酸序列(SEQ ID NO：21)
>VL21胺基酸序列(SEQ ID NO：22)
該輕鏈可變區一致序列1係由SEQ ID NO：23所示之核酸序列編碼。該CDR區係於SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL一致性胺基酸序列1(SEQ ID NO：23)
該VL2-2輕鏈可變區(SEQ ID NO：43)係由SEQ ID NO：42所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：43所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：43所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-2核酸序列(SEQ ID NO：42)
>VL2-2胺基酸序列(SEQ ID NO：43)
該VL2-3輕鏈可變區(SEQ ID NO：45)係由SEQ ID NO：44所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-3核酸序列(SEQ ID NO：44)
>VL2-3胺基酸序列(SEQ ID NO：45)
該VL2-7輕鏈可變區(SEQ ID NO：45)係由SEQ ID NO：44所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-7核酸序列(SEQ ID NO：44)
>VL2-7胺基酸序列(SEQ ID NO：45)
該VL2-10輕鏈可變區(SEQ ID NO：47)係由SEQ ID NO：46所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：47所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：47所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-10核酸序列(SEQ ID NO：46)
>VL2-10胺基酸序列(SEQ ID NO：47)
該VL2-12輕鏈可變區(SEQ ID NO：43)係由SEQ ID NO：48所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：43所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：43所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-12核酸序列(SEQ ID NO：48)
>VL2-12胺基酸序列(SEQ ID NO：43)
該VL2-16輕鏈可變區(SEQ ID NO：45)係由SEQ ID NO：44所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL2-16核酸序列(SEQ ID NO：44)
>VL2-16胺基酸序列(SEQ ID NO：45)
該輕鏈可變區一致序列2係由SEQ ID NO：49所示之核酸序列編碼。該可變結構域係於SEQ ID NO：49所示之胺基酸序列中以粗體顯示。該CDR區係於SEQ ID NO：49所示之胺基酸序列中以方框顯示。
>VL一致性胺基酸序列2(SEQ ID NO：49)
其他適當之抗hENT1抗體包括與此處所描述之抗體的相同表位結合之抗體類。舉例來說，本發明之抗體與hENT1特異性結合，其中該抗體與包括在人hENT1上之一或多個胺基酸殘基之表位結合(見例如編號AAC51103.1、NP_001071645.1、NP_001071644.1、 NP_0010171643.1、NP_001071642.1、NP_004946.1、NP_001523.2、AAM11785.1、AAF02777.1)。
該領域之技藝人士當能了解藉由測定單株抗體是否防止此處所述之抗體與hENT1之結合，即可確知前者是否與後者具有相同之特異性，無須過度實驗。若該經測試之單株抗體與此處所述之單株抗體互相競爭，使得此處所述之單株抗體之結合減少，則該二種單株抗體與相同或密切相關之表位結合。
另一種用於測定單株抗體是否具有如此處所述之單株抗體之特異性的方法，係將此處所述之單株抗體與可溶性hENT1蛋白質或合成性hENT1多肽或肽預先培養，接著添加該欲測試之單株抗體以測定該欲測試之單株抗體與hENT1結合之能力是否受到抑制。若該測試之單株抗體係經抑制，則該測試之單株抗體極有可能具有與此處所述之單株抗體相同或功能上相等之表位特異性。
所有本發明所引述之公開資料及專利文件係以參照方式納入此處，如同將各份公開資料或文件特別且分開說明以藉由參照方式納入本發明。公開資料及專利文獻之引用並非意圖用來承認任一者係相關先前技術，其亦不構成對該相同者之內容或日期之任何承認。本發明現藉由書面說明描述，該領域之技藝人士當能了解本發明可以各種較佳體系實施，且前述之說明及以下之實施例是為了說明之目的，並非用於限制後文之申請專利範圍。
下列實施例包括所進行之實驗及得到之結果係僅為說明目的提供，不可被視為對本發明之限制。
實施例1：利用流式細胞分析偵測hENT1
在以下描述之試驗中，細胞係利用下列流程染色。每個樣本使用100 uL之全血。在各樣本中加入10 uL與細胞表面標誌結合之抗體。舉例來說，10 uL之與FITC或PE共軛之抗CD163抗體被加入各樣本中，及/或10 uL之抗CD45抗體例如PerCP被添加至各樣本。該樣本接著於室溫中培養10分鐘。
在各樣本中加入65 mL之10%甲醛(3.51%終濃度)以固定細胞，在室溫中培養5分鐘。接著，在各樣本中加入1 mL之Intra-CellTM，震盪培養30分鐘。經過30分鐘後，在各樣本中加入2 mL之清洗緩衝液，然後離心該等樣本。接著倒掉上清液，添加50 mL之清洗緩衝液至團塊。接著，在各樣本中加入10 mL之經可偵測之標記標示之抗hENT1抗體，培養20分鐘。舉例來說，該抗hENT1抗體係經可自商業途徑獲得之螢光團諸如PE或FITC標示。研究顯示經FITC標示之抗hENT1抗體與經PE標示之抗hENT1抗體在此處提供之方法中同樣有效。最後，0.5 mL之清洗緩衝液被加至各樣本，該等樣本於流式細胞儀(Navios、Canto II)上分析。
上述染色流程之總時間不超過60分鐘，最短可在30 分鐘內完成。試驗顯示這些方法可有效地偵測幾乎二個對數範圍之hENT1。
實施例2：在免疫原性hENT1肽存在時利用流式細胞分析偵測hENT1
下列流程被用於此處所述之hENT1檢測。首先，取適當量之血液加入二支試管中。第二，所有樣本皆經表面抗體染色，其中10 mL CD64 PE及10 mL CD45 PerCP被添加至各試管並於室溫中培養10分鐘。第三，所有樣本皆經甲醛固定，其中65 mL之10%甲醛(3.42%終濃度)被添加至各試管並於室溫中培養5分鐘。經過5分鐘後，在各試管中加入1 mL之IntraCell，震盪培養30分鐘。經過30分鐘後，在各試管中加入2 mL之清洗緩衝液，接著離心2分鐘，然後倒掉及吸乾上清液。各樣本於細胞清洗器中清洗二次，添加50 mL之清洗緩衝液至各試管並加以震盪。步驟四，僅於一試管/樣本中加入免疫原性hENT1肽(10mL之10mg/mL 10mg/mL BSA-肽稀釋液)。其他樣本/試管並不添加該肽。最後，藉由添加60mL之hENT1抗體之適當稀釋液至無肽試管及50mL之hENT1抗體之適當稀釋液至肽抑制試管以染色各樣本中之hENT1。在培養20分鐘之後，各樣本加入0.5 mL之清洗緩衝液及5mL之Leuko64珠。該等樣本接著於流式細胞儀上分析。
因此，在這些試驗中，各捐贈樣本利用二支試管同時處理：其中一支試管省略步驟四(即不添加肽)，另一支 試管包括步驟四(即添加肽)。
在此處所述之試驗中，hENT1之量係於免疫原性hENT1肽存在及不存在時偵測。如圖3所示，相較於正常樣本(稱為Normal #1)在免疫原性hENT1肽不存在時所偵測到之信號量(該圖之上面兩排)，當免疫原性hENT1肽存在時可見信號量之減少(該圖之下面兩排)。其他正常樣本在該免疫原性hENT1肽存在時展現相同之信號減少。
這些試驗顯示不同的正常細胞族群可被用來作為此處提供之任一方法之對照物，因為免疫原性hENT1肽造成之相對抑制或抑制百分比似乎依不同細胞類型而異。圖4顯示下列正常細胞族群所展示之抑制百分比：單核球、顆粒球、淋巴細胞及嗜酸性球。圖5及下表2所示之資料說明，在免疫原性hENT1肽存在時給定細胞族群(單核球、顆粒球、淋巴細胞及/或嗜酸性球)之信號中位數(螢光強度中位數(MFI))與珠信號之比值和免疫原性hENT1肽不存在時給定細胞族群(單核球、顆粒球、淋巴細胞及/或嗜酸性球)之信號中位數(MFI)與珠信號之比值之間的差異(即[無肽之細胞族群信號/珠信號]-[含肽之細胞族群信號/珠信號])。
抗體結合在hENT1肽存在時受到劑量依賴性抑制。如圖6A至6D所示，在顆粒球(多形核(PMN)細胞，圖6A)、單核球(圖6B)、淋巴細胞(圖6C)及嗜酸性球(圖6D)中，抗hENT1抗體信號係受到經BSA共軛之hENT1肽之抑制。
實施例3：利用流式細胞分析之比值方法偵測hENT1
在此實施例中，hENT1表現量係藉由比較白血病性胚細胞、單核球(mono)、顆粒球(gran)及嗜酸性球(eos)中之hENT1量與正常自體淋巴細胞(lymph)中之 hENT1量之比值指數加以定量。如上所述，比值方法係基於使用二個螢光強度之比，不受可能會影響測定之條件變異之影響(諸如但不限於儀器與儀器之差異、正常細胞內之hENT1之量、非特異性結合)。這些方法使用比值以避免許多與絕對螢光值有關之問題。
此處所提供之測定比值係如下計算：
此種使用比值之量測原則先前在診斷性流式細胞分析測量慢性淋巴細胞性白血病細胞中之蛋白質ZAP-70表現時已得到驗證(見例如Shults et.al.,“A standardized ZAP-70 assay--lessons learned in the trenches.”Cytometry B Clin Cytom.Jul 15；70(4)(2006)：276-83；Davis and Schwartz,“ZAP-70 expression is low in normal precursor B cells or hematogones.”Cytometry B Clin Cytom.70(4)(2006)：315-9)。此處所述之hENT1檢測(如同許多免疫螢光方法中之細胞內測量)將非特異性結合標準化成為不同的血液與骨髓樣本間之變數。如此處所述，該公式涵蓋可行性細胞樣本之抗體飽和條件範圍介於1×102至1×1011細胞/ml樣本，例如在1.5至10×106細胞/ml之範圍內。在這些可行性試驗所測定之範圍內，正常淋巴細胞、單核 球、嗜中性顆粒球及嗜酸性球之細胞類型的hENT1表現之相對染色維持恆定(CV<20%)。正常細胞類型之間有不同的hENT1表現之發現，加上在健康個體之間特定細胞類型內之hENT1表現差異相對狹窄之事實，提供一種測定白血病性胚細胞中之hENT1差異表現之方法。圖7顯示利用二種不同的流式細胞儀所測得之AML胚細胞之hENT1表現指數呈現相對狹窄之表現差異。正常細胞之間的表現範圍可相差高達20倍，從最低之淋巴細胞，單核球次之，嗜中性球再次之，到最高表現量之嗜酸性球。先期試驗發現由此方法檢測之白血病性胚細胞內的hENT1表現量相差幾乎10倍。
因此，hENT1檢測係設計為報告AML胚細胞之hENT1表現指數，同時利用內部正常細胞類型作為內部表現對照，添加外部珠允許外部校正亦用於標示該抗hENT1抗體試劑之螢光染料。
本發明現藉由書面說明及實施例加以描述，該領域之技藝人士當能了解本發明可以各種較佳體系實施，且前述之說明及實施例是為了說明之目的，並非用於限制以下之申請專利範圍。
圖1示意說明偵測樣本中之hENT1表現量之流式細胞分析方法之實施態樣。
圖2係Zhang et al.,“The role of nucleoside transporters in cancer chemotherapy with nucleoside drugs,”Cancer Metastasis Rev.,vol.26：85-110(2007)之hENT1拓撲學示意圖，另外說明本發明之流式分析方法之原則。
圖3顯示相較於正常樣本(稱為Normal #1)在免疫原性hENT1肽不存在時所偵測到之信號量(該圖之上面兩排)，當免疫原性hENT1肽存在時可見信號量減少(該圖之下面兩排)。
圖4說明正常之單核球、顆粒球、淋巴細胞及嗜酸性球細胞族群所展示之抑制百分比。
圖5說明在免疫原性hENT1肽存在或不存在時細胞族群中位數與珠之比值差異。
圖6A至6D之系列圖說明在(A)PMN細胞、(B)單核球、(C)淋巴細胞及(D)嗜酸性球中，抗hENT1抗體信號受到經BSA共軛之hENT1肽之抑制。
圖7說明在二種不同的流式細胞儀之間所測得之AML胚細胞之hENT1表現的比值指數差異。
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Claims (34)

  1. 一種偵測樣本中人平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)表現量之方法，該方法包含下列步驟：a)使該樣本之第一部分與一或多種抗體接觸，該一或多種抗體在足以允許該抗體與細胞表面標誌結合之條件下與細胞表面標誌或細胞標誌結合，b)篩選步驟a)之樣本的第一部分中與該一或多種抗體結合之細胞，c)使該樣本之第一部分中經篩選之細胞經通透化，d)使該樣本之第一部分中經通透化之細胞與抗體接觸，該抗體在足以允許該抗體與hENT1結合之條件下與hENT1結合，及e)利用流式細胞分析偵測該樣本之第一部分中與該抗hENT1抗體結合之細胞量。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞表面標誌或細胞標誌係選自CD45、CD163、CD33、CD34、CD38、CD123、CD117、CD13、CD64、HLA-DR、骨髓過氧化酶(MPO)或彼等之多種組合。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該與細胞表面標誌或細胞標誌結合之一或多種抗體係經可偵測之標記標示。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該標記係螢光團。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該螢光團係 FITC、PE、PerCP-Cy5.5或PE-Cy7。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗hENT1抗體係經可偵測之標記標示。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該標記係螢光團。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該螢光團係FITC或PE。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗hENT1抗體包含：(a)包含胺基酸序列GYTFTDYE(SEQ ID NO：10)之重鏈可變區互補決定區1(VH CDR1)序列；(b)包含胺基酸序列IDPETGAI(SEQ ID NO：11)或胺基酸序列IDPETGKT(SEQ ID NO：40)之重鏈可變區互補決定區2(VH CDR2)序列；(c)包含胺基酸序列TREFTY(SEQ ID NO：12)或胺基酸序列TRELTY(SEQ ID NO：41)之重鏈可變區互補決定區3(VH CDR3)序列；(d)包含胺基酸序列QSLLFSNGKTY(SEQ ID NO：24)之輕鏈可變區互補決定區1(VL CDR1)序列；(e)包含胺基酸序列LVS(SEQ ID NO：25)之輕鏈可變區互補決定區2(VL CDR2)序列；及(f)包含胺基酸序列VQGTHFPWT(SEQ ID NO：26)之輕鏈可變區互補決定區3(VL CDR3)序列。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗hENT1 抗體包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，該重鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38或39之胺基酸序列，該輕鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、23、43、45、47或49之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法之步驟a)另包含使該樣本之第二部分與包含免疫原性hENT1肽及一或多種抗體之溶液接觸，該一或多種抗體在足以允許該抗體與細胞表面標誌結合之條件下與細胞表面標誌或細胞標誌結合，其中步驟b)另包含篩選該樣本之第二部分中與該一或多種抗體結合之細胞，其中步驟c)另包含使該樣本之第二部分中經篩選之細胞經通透化，其中步驟d)另包含使該樣本之第二部分中經通透化之細胞與抗體接觸，該抗體在足以允許該抗體與hENT1結合之條件下與hENT1結合，且其中步驟e)另包含利用流式細胞分析偵測該樣本之第二部分中與該抗hENT1抗體結合之細胞量，且該方法另包含步驟f)測定該樣本之第一部分中與該抗hENT1抗體結合之細胞量與該樣本之第二部分中與該抗hENT1抗體結合之細胞量之間的差異，藉此測定該樣本之hENT1的表現量。
  12. 一種偵測個體內hENT1表現量之方法，該方法包含下列步驟：a)使個體之樣本與一或多種抗體接觸，該一或多種抗體在足以允許該抗體與細胞表面標誌結合之條 件下與細胞表面標誌或細胞標誌結合，其中該樣本包含白血病性胚細胞、淋巴細胞及至少一或多種其他類型之選自單核球、顆粒球或嗜酸性球之正常、非白血病性血液細胞，b)使該樣本之細胞經通透化，c)使該樣本之經通透化之細胞與抗體接觸，該抗體在足以允許該抗體與hENT1結合之條件下與hENT1結合，其中抗hENT1抗體係經螢光團可偵測地標示，d)藉由流式細胞分析偵測下列之螢光量：(i)該樣本之一或多種其他類型之正常、非白血病性血液細胞，(ii)該樣本之淋巴細胞，及(iii)該樣本之白血病性胚細胞，e)藉由比較(i)之各種其他類型之正常、非白血病性血液細胞的螢光量與(ii)之淋巴細胞的螢光量以測定該樣本之hENT1表現量的對照比，f)藉由比較(iii)之白血病性胚細胞的螢光量與(ii)之淋巴細胞的螢光量以測定該樣本之白血病性胚細胞的hENT1表現量之比，及g)比較步驟f)的量之比與步驟e)的量之對照比以測定該個體之hENT1的表現量。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該個體罹患急性骨髓性白血病(AML)。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該血液失調係骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)或慢性骨髓單球性白血病(CMML)。
  15. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該細胞表面標誌或細胞標誌係選自CD45、CD163、CD33、CD34、CD38、CD123、CD117、CD13、CD64、HLA-DR、骨髓過氧化酶(MPO)或彼等之多種組合。
  16. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該與細胞表面標誌或細胞標誌結合之一或多種抗體係經可偵測之標記標示。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該標記係螢光團。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該螢光團係FITC、PE、PerCP-Cy5.5或PE-Cy7。
  19. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該經可偵測之標記標示之抗hENT1抗體包含選自FITC或PE之螢光團。
  20. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該抗hENT1抗體包含：(a)包含胺基酸序列GYTFTDYE(SEQ ID NO：10)之重鏈可變區互補決定區1(VH CDR1)序列；(b)包含胺基酸序列IDPETGAI(SEQ ID NO：11)或胺基酸序列IDPETGKT(SEQ ID NO：40)之重鏈可變區互補決定區2(VH CDR2)序列； (c)包含胺基酸序列TREFTY(SEQ ID NO：12)或胺基酸序列TRELTY(SEQ ID NO：41)之重鏈可變區互補決定區3(VH CDR3)序列；(d)包含胺基酸序列QSLLFSNGKTY(SEQ ID NO：24)之輕鏈可變區互補決定區1(VL CDR1)序列；(e)包含胺基酸序列LVS(SEQ ID NO：25)之輕鏈可變區互補決定區2(VL CDR2)序列；及(f)包含胺基酸序列VQGTHFPWT(SEQ ID NO：26)之輕鏈可變區互補決定區3(VL CDR3)序列。
  21. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該抗hENT1抗體包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，該重鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：2、4、6、8、9、36、30、32、34、36、38或39之胺基酸序列，該輕鏈可變區序列包含選自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、23、43、45、47或49之胺基酸序列。
  22. 一種以低量之hENT1表現作為個體之血液失調的指標之用途，藉此投予有效劑量之抗癌藥物以改善該個體之血液失調。
  23. 一種以低量之hENT1表現作為個體之感染疾病的指標之用途，藉此投予有效劑量之抗感染疾病藥物以改善該個體之感染疾病。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該抗癌藥物或抗感染疾病藥物係選自吉西他濱(gemcitabine)-5’-反油酸酯、阿糖胞苷(cytarabine)-5’-反油酸酯、 氮雜胞苷-5’反油酸酯、氮雜胞苷-5’-順6-十八烯酸酯、地西他濱(decitabine)-5’-反油酸酯、地西他濱-5’-順6-十八烯酸酯、利巴韋林(ribavirin)-5’-反油酸酯、克羅拉濱(clofarabine)-5’-反油酸酯、克羅拉濱-5’-順6-十八烯酸酯、氟達拉濱(fludarbine)-5’-反油酸酯、氟達拉濱-5’-順6-十八烯酸酯、克拉屈濱(cladribine)-5’-反油酸酯或克拉屈濱-5’-順6-十八烯酸酯。
  25. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該抗癌藥物或抗感染疾病藥物係吉西他濱-5’-反油酸酯。
  26. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該抗癌藥物或抗感染疾病藥物係阿糖胞苷-5’-反油酸酯。
  27. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該抗癌藥物或抗感染疾病藥物係氮雜胞苷-5’-反油酸酯。
  28. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該血液失調係骨髓發育不良性症候群(MDS)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴胚細胞性白血病(ALL)或慢性骨髓單球性白血病(CMML)，或其中該感染疾病係病毒感染疾病或寄生蟲感染疾病。
  29. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該有效劑量之抗癌藥物或抗感染疾病藥物係以單劑或多劑投予。
  30. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該有效劑量之抗癌藥物或抗感染疾病藥物係經靜脈內、皮下、經口或經彼等之組合投予。
  31. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該個 體係人。
  32. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該個體對化學治療劑或抗感染疾病劑之治療係無反應、反應性較低、或停止反應。
  33. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該化學治療劑係吉西他濱、氮雜胞苷、阿糖胞苷、地西他濱或利巴韋林。
  34. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該吉西他濱-5’-反油酸酯、阿糖胞苷-5’-反油酸酯或氮雜胞苷-5’反油酸酯係與一或多種其他化學治療劑、細胞毒性劑或抗感染疾病劑組合投予。
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