UA127731C2 - Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7) - Google Patents

Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7) Download PDF

Info

Publication number
UA127731C2
UA127731C2 UAA201810089A UAA201810089A UA127731C2 UA 127731 C2 UA127731 C2 UA 127731C2 UA A201810089 A UAA201810089 A UA A201810089A UA A201810089 A UAA201810089 A UA A201810089A UA 127731 C2 UA127731 C2 UA 127731C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
binding
human
antibodies
cells
Prior art date
Application number
UAA201810089A
Other languages
English (en)
Inventor
Кетрін Енн Ваусден
Кэтрин Энн ВАУСДЕН
Джулі Енн Даутуейт
Джули Энн Даутуейт
Мелісса Марі Дамшродер
Мелисса Мари ДАМШРОДЕР
Мігель Анхель Санхуан
Мигель Анхель САНХУАН
Original Assignee
Вієла Байо, Інк.
Виела Байо, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вієла Байо, Інк., Виела Байо, Инк. filed Critical Вієла Байо, Інк.
Publication of UA127731C2 publication Critical patent/UA127731C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Винахід стосується афукозильованого, людського, моноклонального антитіла до ILT7, полінуклеотиду, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла до ILT7, способу виявлення антитіла до ILT7, способу зменшення вивільнення інтерферону (IFN)-альфа з плазмоцитоїдної дендритної клітини (pDC), способу лікування суб’єкта-людини з аутоімунним захворюванням, способу профілактики аутоімунного захворювання у суб’єкта-людини, афукозильованого IgG1 людського моноклонального антитіла до ILT7 та фармацевтичної композиції, що його містить.

Description

Вирівнювання УК: хан судсорвовве вовна ск кот по пнконнекекен о ее с У ФУКО, Ж х ума мк Ки о и НК су УКХ к У ОН ДК ку нщо-яж жави снслемюмсюмн оон о. се -ч норка нова Позов пу з ї, Ух х сх ех З ух ж вав чемукохакотУкнезетУХт ні внотеровнУтоо ооо? їбріш- Мекекновинере терми сто оон ОМ реч юкехтко нн ота уми обовавоватхсто С оо тя що
Фіг. 1А
Посилання на список послідовностей, наданий в електронному виді
Вміст наданого в електронному виді списку послідовностей у текстовому файлі АЗСІЇ (назва 2943 08351К0 5Зеадг'івйпд 5Т25414хЕ; розмір: 143686 байт і дата створення: З березня 2016 року), поданого із заявкою, повністю включено в даний опис за допомогою посилання.
Рівень техніки, що передує винаходу
Плазмацитоїдні дендритні клітини (РОС) являють собою окрему популяцію дендритних клітин (0С) у периферичній крові і вторинних лімфоїдних органах, які становлять тільки приблизно від 0,1 до 0,5 95 мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС). Однак ці клітини є особливо важливими регуляторами імунної системи, тому що вони є основним джерелом інтерферону | типу (ІЕМ). ІЕМ І типу підтримують функцію МК клітин, В-клітин, Т-клітин і мієлоїдних дендритних клітин. Ці ІЕМ є важливими при первинних імунних відповідях і мають противірусну і протипухлинну активність. Однак вважають, що рос і ЕМ І типу також відіграють роль у розвитку аутоїмунних захворювань, таких як системний червоний вовчак, хронічний ревматизм і псоріаз. Таким чином, розуміння того, як регулювати молекулярні шляхи, що беруть участь у вивільненні ІЕМ, є придатним для придушення імунних відповідей і лікування і профілактики захворювання. рос вивільняють ІЕМ у відповідь на нуклеїнові кислоти, які розпізнаються ТоїІ- подібними рецепторами (ТІК) ТІ К7 і ТІ КУ, що експресуються на поверхні рос. Індукована ТІ К відповідь регулюється рецепторами, що містять імунорецепторні тирозинові мотиви, що активують (ІТАМ). Імуноглобуліновидний транскрипт 7 (ІТ7), також називаний ГІКА4, ПІ.КА4 або СО855, є одним з таких рецепторів.
І-Т7 є представником родини генів імуноглобуліноподібного транскрипту, (ІТ) або лейкоцитарного імуноглобуліноподібного рецептора (ІК). І-Т7 селективно експресується на поверхні плазмацитоїдних дендритних клітин людини (рос) і не експресується на мієлоїдних дендритних клітинах або інших лейкоцитах периферичної крові. Сао еї аї., 9. Ехр. Меаісіпе 6:1399-1405 (2006). І/Т7 містить чотири імуноглобуліноподібних позаклітинних домени і трансмембранний домен. Позаклітинна частина є важливою для взаємодії з лігандом І-Т7, антигеном стромальних клітин кісткового мозку 2 (В512), і трансмембранний домен І-Т7 містить позитивно заряджений залишок, який дозволяє йому утворювати комплекс із Ес5кІу.
Зо Передбачалося, що взаємодія В5Т 2-І/Т7 негативно регулює природню імунну функцію рос, можливо, як механізм негативного зворотного зв'язку. Крім того, було показано, що антитіло, що зшиває І-Т7, іп міго негативно регулює продукцію ІЄМ- альфа і ТМЕ- альфа за допомогою рос.
Таким чином, необхідними є антитіла та інші зв'язуючи І-Т7 молекули, які є придатними для нейтралізуючої І-7Т7 і регулюючої рос активності та вивільнення ІЕМ, наприклад, для лікування і профілактики захворювань, таких як аутоїмунні захворювання.
Винахід належить до зв'язуючих І/Т7 молекул, наприклад, до антитіл до І/Т7 і їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних, способів використання антитіл і фрагментів, і способів лікування або профілактики аутоїмунних захворювань і станів, пов'язаних з експресуючими І-Т7 клітинами.
У даному описі надані зв'язуючи ІТ7 молекули, наприклад, антитіла до ІСТ7/ і їх антигензв'язуючі фрагменти.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, який може зв'язуватися з тим же епітопом ІСТ7/, що і антитіло, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) 5ЕО ІЮ МО:202 і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) ЗЕО ІЮ МО:207.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, який конкурентно інгібує зв'язування з ІЇТ7 антитіла, що містить МН 5ЕО ІЮ МО:202 і
МІ ЗЕО ІЮ МО :207.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, що містить визначальні комплементарність ділянки (СОМ) НСОМКІ, НОК2, НСОКЗ,
ГСОК1, ГСОКа2 і СО, що містять послідовності БЕО ІЮО МО: 203, 204, 205, 208, 209 і 210, відповідно.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІТ7 білок містить МН щонайменше на 85 95, 90 96, 95 96, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО:202 і/або МІ щонайменше на 85 Фо, 90 У, 95 95, 96 о, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО:207.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий І/Т7 білок містить МН, що містить ЗЕО ІЮ
МО:202, і МІ, що містить 5ЕО ІЮ МО:207.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, що містить МН, що містить 5ЕО ІЮ МО:202.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, що містить МН, що містить 5ЕО ІЮ МО:207.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, який може зв'язуватися з тим же епітопом І-Т7, що і антитіло, що містить МН і Мі, вибрані із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:12 і 5ЕО ІЮ МО:17, відповідно ЗЕО ІЮ МО:22 і
ЗЕО ІЮ МО:27, відповідно; БЕО ІЮ МО:32 і 5ЕО ІЮО МО:37, відповідно; БЕО ІЮ МО:42 і 5ЕО ІО
МО:47, відповідно; ЗЕО ІЮО МО:52 і 5ЕО ІЮО МО:57, відповідно; БЕО ІЮ МО:62 і 5ЕО ІЮ МО:67, відповідно; ЗЕО ІЮ МО:72 і 5ЕО ІЮ МО:77, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:82 і БЕО ІЮО МО:87, відповідно;
ЗЕО ІЮ МО:92 і 5ЕО ІО МО:97, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:102 і 5ЕО ІЮО МО:107, відповідно; ЗЕО ІЮ
МО:112 ї 5ЕО ІЮО МО:117, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:122 ії 5ЕО ІЮ МО:127, відповідно; 5Е0 ІЮ
МО:132 ї 5ЕО ІЮ МО:137, відповідно; зЕО ІЮ МО:142 і 5ЕБЕО ІЮ МО:147, відповідно; 5ЕО ІЮ
МО:152 ї 5ЕО ІЮ МО:157, відповідно; зЕО ІЮ МО:162 і 5ЕБЕО ІЮ МО:167, відповідно; 5ЕО ІЮ
МО:172 ї 5ЕО ІЮО МО:177, відповідно; зЕО ІЮ МО:182 ії 5ЕО ІЮ МО:187, відповідно; 5Е0 ІЮ
МО:192 ї 5ЕО ІЮ МО:197, відповідно; зЕО ІЮ МО:212 і 5ЕБЕО ІЮ МО:217, відповідно; 5ЕО ІЮ
МО:222 і 5ЕО ІЮ МО:227, відповідно; БЕО ІЮ МО:232 і 5ЕО ІЮ МО:237, відповідно і 5ЕО ІЮ
МО:242 і БЕО ІЮ МО:247, відповідно.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, який конкурентно інгібує зв'язування з ІІТ7 антитіла, що містить МН і МІ,, вибрані із групи, що складається з БЕО І МО:12 ії 5ЕО ІО МО:17, відповідно БЕО ІЮ МО:22 і 5ЕО І
МО:27, відповідно; БЕО ІЮО МО:32 ії 5ЕО ІЮО МО:37, відповідно; БЕО ІЮ МО:42 і 5ЕО ІЮО МО:47, відповідно; ЗЕО ІЮО МО:52 і 5ЕО ІЮ МО:57, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:62 і БЕО ІЮ МО:67, відповідно;
ЗЕО ІЮ МО:72 і 5ЕО ІЮО МО:77, відповідно; БЕО ІЮ МО:82 і 5ЕО ІЮ МО:87, відповідно; 5ЕО ІЮ
МО:92 і БЕО ІОЮ МО:97, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:102 і 5ЕО ІЮ МО:107, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:112 і
ЗЕО ІЮ МО:117, відповідно; зЕО ІЮ МО:122 і 5ЕО ІЮ МО:127, відповідно; ЗЕО ІЮ МО:132 і ЗЕО
ІЮО МО:137, відповідно; ФЕО ІЮ МО:142 і 5ЕО ІЮ МО:147, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:152 і 5ЕО ІЮ
МО:157, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:162 і 5ЕО ІЮ МО:167, відповідно; БЕО ІЮ МО:172 і 5ЕО ІЮ
МО:177, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:182 і 5ЕО ІЮ МО:187, відповідно; БЕО ІЮ МО:192 і 5ЕО ІЮ
МО:197, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:212 і 5ЕО ІЮ МО:217, відповідно; зЕО ІЮ МО:222 і 5ЕО ІОЮ
МО:227, відповідно; БЕО ІЮ МО:232 і 5ЕО ІЮ МО:237, відповідно і 5ЕО ІЮ МО:242 і 5ЕО ІЮ
МО:247, відповідно.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок являє собою зв'язуючий
І-Т7 білок, що містить СОК: НСОКІ, НОК2, НСОМЗ, І СОК1, СО і 1 СОКУ, вибрані із групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 13, 14, 15, 18, 19 і 20, відповідно; ЗЕО ІЮО МО: 23, 24, 25, 28, 291 30, відповідно; 5ХЕО ІЮО МО: 33, 34, 35, 38, 39 і 40, відповідно; ЗЕО ІЮ МО: 103, 104, 105, 108, 109 і 110, відповідно; 5ЕО ІЮО МО: 213, 214, 215, 218, 219 і 220, відповідно; 5ЕО ІЮ МО: 223, 224, 225, 228, 229 і 230, відповідно; 5ЕО ІЮ МО: 233, 234, 235, 238, 239 і 240, відповідно і 5ЕО ІЮ МО: 243, 244, 245, 248, 249 і 250, відповідно.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІІ 77 білок містить УН і МІ щонайменше на 85 95, 90 ов, 95 9, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичні: БЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮО МО:17, відповідно; ЗЕО
ІЮО МО:22 і БЕО ІЮ МО:27, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:32 і 5ЕО ІЮО МО:37, відповідно; ЗЕ ІЮО МО:42 і
ЗЕО ІЮ МО:47, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:52 і 5ЕО ІЮО МО:57, відповідно; БЕО ІЮ МО:62 і 5ЕО ІО
МО:67, відповідно; БЕО І МО:72 і 5ЕО ІЮО МО:77, відповідно; БЕО ІЮ МО:82 і 5ЕО ІЮ МО:87, відповідно; ЗЕСО ІЮ МО:92 і 5ЕО ІЮО МО:97, відповідно; ЗЕО ІЮ МО:102 і 5ЕО ІЮ МО:107, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:112 ії 5ЕО ІЮ МО:117, відповідно; 5600 ІЮ МО:122 ії 5ЕО ІЮ МО:127, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:132 ії 5ЕО ІЮ МО:137, відповідно; 560 ІЮ МО:142 ії 5ЕО ІЮО МО:147, відповідно; 5ХЕО ІЮ МО:152 і 5ЕО ІО МО:157, відповідно; 560 ІЮ МО:162 і 5ЕО ІЮО МО:167, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:172 ії 5ЕО ІЮ МО:177, відповідно; 560 ІЮ МО:182 ії 5ЕО ІЮО МО:187, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:192 ії 5ЕО ІЮ МО:197, відповідно; 560 ІЮ МО:212 ії 5ЕО ІЮ МО:217, відповідно; 5ХЕО ІЮ МО:222 і 5ЕО ІО МО:227, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:232 ії 5ЕО ІЮ МО:237,
БО відповідно, або 5ЕО ІЮ МО:242 і 5ЕО ІЮ МО:247, відповідно.
В одному з варіантів здійснення МН і МІ. містять 5ЕО ІЮО МО:12 і БЕО ІО МО:17, відповідно;
ЗЕО ІЮ МО:22 і 5ЕО ІЮО МО:27, відповідно; БЕО ІЮ МО:32 ії 5ЕО ІЮ МО:37, відповідно; ЗЕО ІЮ
МО:42 і 5ЕО ІЮ МО:47, відповідно; БЕО ІЮ МО:52 і 5БЕО ІЮ МО:57, відповідно; ЕО ІЮ МО:62 і
ЗЕО ІЮ МО:67, відповідно; 5БЕО ІЮ МО:72 і 5ЕО ІОЮО МО:77, відповідно; БЕО ІЮ МО:82 і БЕО ІО
МО:87, відповідно; ЗЕО ІЮ МО:92 і 5ЕО ІЮ МО:97, відповідно; зЗЕО ІЮ МО:102 і 5ЕО ІЮ МО:107, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:112 ії 5ЕО ІЮ МО:117, відповідно; 5600 ІЮ МО:122 ії 5ЕО ІЮ МО:127, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:132 ії 5ЕО ІЮ МО:137, відповідно; 560 ІЮ МО:142 ії 5ЕО ІЮО МО:147, відповідно; 5ХЕО ІЮ МО:152 і 5ЕО ІО МО:157, відповідно; 560 ІЮ МО:162 і 5ЕО ІЮО МО:167, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:172 ії 5ЕО ІЮ МО:177, відповідно; 560 ІЮ МО:182 ії 5ЕО ІЮО МО:187, 60 відповідно; 5ЕО ІЮ МО:192 ії 5ЕО ІЮ МО:197, відповідно; 560 ІЮ МО:212 ії 5ЕО ІЮ МО:217,
відповідно; 5ХЕО ІЮ МО:222 і 5ЕО ІО МО:227, відповідно; 5ЕО ІЮ МО:232 ії 5ЕО ІЮО МО:237, відповідно, або 5ЕО ІЮ МО:242 і 5ЕО ІЮ МО:247, відповідно.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий ІСТ7 білок містить УН, що містить
ЗЕО І МО: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 212, 222, 232 або 242.
В одному з варіантів здійснення виділений зв'язуючий І-Т7 білок містить Мі, що містить ЗХЕО
ІО МО:17, 27, 37, 47, 57,67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 217, 227, 237 або 247.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий |/Т7 білок містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. В одному з варіантів здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент є афукозильованими.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІТ7 білок зв'язується з ділянкою Ід! І-Т7. В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІІ-Т7 білок зв'язується з ділянкою Ід2 І-Т7.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІІ. Т7 білок зв'язується з ІЇ"Т7 людини і яванського макака.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІЇТ7 білок пригнічує вивільнення інтерферону (ЕМ) альфа з мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС). В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІЇТ7 білок має активність АОСС проти плазмацитоїдних дендритних клітин (рОС) в РМВС.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІТ7 білок містить антитіло миші, антитіло людини, химерне, гуманізоване антитіло або антитіло з вимірюваною поверхнею, або його антигензв'язуючий фрагмент.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий І Т7 білок містить антитіло, Раб, Раб", Е(арзд2,
Ед, одноланцюговий Ем або 5сЕм, зв'язаний дисульфідними зв'язками Ем, домен У-МАВ, ІдМаг, інтраантитіло, ІДСАСНО2, мініантитіло, Е(ар)З3, тетратіло, триотіло, діатіло, однодоменне антитіло, ОМО-Ід, Есар, тАба2, (5СЕМм)2 або 5сЕм-Ес.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІТ7 білок містить моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий І-Т7 білок містить константний домен важкого
Зо ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з: (а) константного домену ІдА; (Б) константного домену Ідо; (с) константного домену ІДЕ; (4) константного домену Ідс1; (е) константного домену Ідз2; (Ї) константного домену ІдсзЗ; (9) константного домену Ідсзса і (п) константного домену ІдМ.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий І-Т7 білок містить константний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з: (а) константного домену каппа - ланцюга Ід і (Б) константного домену лямбда-ланцюга Ід.
В одному з варіантів здійснення зв'язуючий ІТ7 білок містить константний домен Ідс1 людини і константний домен лямбда-ланцюга людини.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою клітину-хазяїна, що продукує зв'язуючу І-Т7 молекулу.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою виділений полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує МН, де МН містить амінокислотну послідовність щонайменше на 85 95, 90 9», 95 95 ідентичну або ідентичну МН ЗЕО ІО МО:202, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 212, 222, 232 або 242. В одному з варіантів здійснення полінуклеотид містить послідовність щонайменше на 85 95, 90 95, 95 9о ідентичну або ідентичну ЗЕО ІЮ МО:201, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 211, 221, 231 або 241.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою виділений полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує Мі, де Мі містить амінокислотну послідовність щонайменше на 85 95, 90 95, 95 95 ідентичну або ідентичну МІ. 207, 17,27, 47,57,67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 217, 227, 237 або 247. В одному з варіантів здійснення полінуклеотид містить послідовність щонайменше на 85 95, 90 95, 95 95 ідентичну або ідентичну БЕО ІЮ МО:206, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 216, 226, 236 або 246.
В одному з варіантів здійснення нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаною з контрольною послідовністю. В одному з варіантів здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що містить МН або МІ, що кодуються нуклеїновою кислотою, може специфічно зв'язуватися з І 77.
В одному з варіантів здійснення полінуклеотид, що кодує зв'язуючу ІТ7 молекулу, 60 наведений у даному описі.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою вектор, що містить полінуклеотид.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою поліпептид, що кодується полінуклеотидом.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою клітину-хазяїна, трансформовану полінуклеотидом, наданим у даному описі (наприклад, полінуклеотидом, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує МН, і полінуклеотидом, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує МІ.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою клітину-хазяїна, що містить полінуклеотид, наданий у даному описі (наприклад, полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує МН, і полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує Мі), вектор, наданий у даному описі, або поліпептид, наданий у даному описі. В одному з варіантів здійснення клітина-хазяїн є клітиною-хазяїном ссавців. В одному з варіантів здійснення клітина- хазяїн являє собою мієломні клітини миші М50О, клітини людини РЕК.СбФ або клітини яєчника китайського хом'яка (СНО). В одному з варіантів здійснення клітина-хазяїн не містить фермент о-1,6-фукозилтрансферазу.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб одержання зв'язуючої молекули проти І-Т7, що включає культивування клітини-хазяїна, наданої в даному описі, і виділення зазначеної зв'язуючої молекули. Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою зв'язуючу молекулу проти ІЇТ7, одержувану способом.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб детекції експресії
І-Т7 у зразку, що включає (а) приведення зразка в контакт із зв'язуючою І-Т7 молекулою, наданою в даному описі, і (б) детекцію зв'язування зв'язуючої молекули в зразку.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб детекції плазмацитоїдних дендритних клітин, що включає (а) приведення зразка, що містить клітини, у контакт із зв'язуючою І/Т7 молекулою, наданою в даному описі, і (Б) детекцію зв'язування зв'язуючої молекули в зразку.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою фармацевтичну композицію, що містить (а) зв'язуючу І/Т7 молекулу, надану в даному описі, полінуклеотид, наданий у даному описі, вектор, наданий у даному описі, поліпептид, наданий у даному описі, або клітину-хазяїна, надану в даному описі, і (Б) носій.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб зниження вивільнення ІЕМ-альфа із плазмацитоїдної дендритної клітини, що включає приведення плазмацитоїдної дендритної клітини в контакт із зв'язуючою ІЇТ7 молекулою, представленою в даному описі, полінуклеотидом, наданому в даному описі, вектором, наданому в даному описі, поліпептидом, наданому в даному описі, клітиною-хазяїном, наданою в даному описі, або фармацевтичною композицією, наданою в даному описі.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб лікування індивідуума, що є людиною, з аутоїмунним захворюванням, що включає введення індивідуумові ефективної кількості зв'язуючої І/Т7 молекули, наданої в даному описі, полінуклеотидом, наданим у даному описі, вектором, наданим у даному описі, поліпептидом, наданим у даному описі, клітиною-хазяїном, наданим у даному описі, або фармацевтичною композицією, наданої в даному описі.
Один з варіантів здійснення, наданий у даному описі, являє собою спосіб профілактики аутоїмунного захворювання в індивідуума, який є людиною, що включає введення індивідуумові ефективної кількості зв'язуючої ІТ7/ молекули, наданої в даному описі, полінуклеотиду, наданого в даному описі, вектора, наданого в даному описі, поліпептиду, наданого в даному описі, клітини-хазяїна, наданої в даному описі, або фармацевтичної композиції, наданої в даному описі. В одному з варіантів здійснення аутоїмунне захворювання являє собою системний червоний вовчак. В одному з варіантів здійснення аутоїмунне захворювання являє собою хронічний ревматизм. Короткий опис креслень/фігур
Фігури 1А і 18: демонструють вирівнювання послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга (ТА) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (1В) антитіл 5ВІ28 (Мо 28), 10010 ї 7С7.
Затінення вказує на послідовності СОК. Відкриті прямокутники представляють мутації, що вводяться в 10010 з одержанням 7С7.
Фігура 2: демонструє зв'язування антитіл до ІЇТ7 і антитіла негативного контролю (К437) із клітинами СТ-550, що експресують І-Т7 людини, як визначають проточною цитометрією. ЗВІЗЗ належить до антитіла до І/Т7 І/Т7 Мо 33, як наведено в опублікованій заявці США Мо 2009/0280128.
Фігура 3: демонструє зв'язування антитіл до І-Т7 і антитіла негативного контролю (К437) із клітинами СТтТ-125, що експресують І/Т7 яванського макака, як визначають проточною цитометрією.
Фігура 4: демонструє активність АОСС антитіл до І/Т7 і антитіла негативного контролю (К437) проти клітин, що експресують ІСТ7 людини.
Фігура 5: демонструє активність АОСС антитіл до І-Т7 і антитіла негативного контролю (К437) проти клітин, що експресують ІЇТ7 яванського макака.
Фігури 6А і 6В: демонструють зв'язування антитіл до ІІ Т7 і антитіла негативного контролю (К437) із плазмацитоїдними дендритними клітинами (рОС) у мононуклеарних клітинах периферичної крові (РВМО).
Фігура 7: демонструє зв'язування афукозильованих антитіл до 1/7 і їх вихідних антитіл із клітинами СТ-550, що експресують ІЇТ7 людини (ліва панель) і І-Т7 яванського макака (права панель) І-Т7, як визначають проточною цитометрією.
Фігура 8: демонструє активність АОСС афукозильованих антитіл до ІЇ- 77 і їх вихідних антитіл проти експресуючих І Т7 людини (ліва панель) і І-Т7 яванського макака (права панель) клітин.
Фігури 9А і 9В: демонструють вирівнювання послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга (9А) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (98) семи варіантів І-Т70080. У вирівнюванні також продемонстровані найбільш близькі послідовності зародкової лінії (НМ - 69701 і 1 М - 21701).
Фігури 10А і 108: демонструють вирівнювання послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга (10А) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (108) дев'яти варіантів І.Т70083. У вирівнюванні також продемонстровані найбільш близькі послідовності зародкової лінії ((НМЗ - 23701 111 М1 - 51701).
Фігура 11: демонструє зв'язування варіантів І.Т70080 із клітинами, що експресують І-Т7 людини (СТ-550; верхня панель), і клітинами, що експресують І-Т7 яванського макака (СтТ-125; нижня панель).
Фігура 12: демонструє зв'язування варіантів І.Т70083 із клітинами, що експресують І-Т7 людини (верхня панель) або ІІ.Т7 яванського макака (нижня панель).
Фігура 13: демонструє активність АЮСС антитіл варіантів І-Т70080 проти клітин, що
Зо експресують ІСТ7 людини.
Фігура 14: демонструє активність АЮСС антитіл варіантів І.Т70083 проти клітин, що експресують І-Т7 людини.
Фігура 15: демонструє зв'язування афукозильованих антитіл до ІТ70080.6 і І Т70083 з експресуючими І-Т7 людини (ліва панель) і яванського макака (права панель) клітинами.
Фігура 16: демонструє активність АОСС афукозильованих антитіл до ІТ70080.6 і І.Т70083 на експресуючі ІЇТ7 людини (ліва панель) і І-Т7 яванського макака (права панель) клітини.
Фігура 17: демонструє цитотоксичність (ліворуч) і секрецію ІЄМ-а (праворуч) РВМС людини, що піддаються дії афукозильованих антитіл до ІІ Т70080.6 і 1.770083.
Фігура 18: демонструє зв'язування афукозильованого І-Т70137 із клітинами, що експресують
І-Т7 людини (ліва панель) або І/Т7 яванського макака (права панель). Кружки означають афукозильований І-Т70137 і трикутники означають контроль.
Фігура 19: демонструє активність АОСС афукозильованого ІТ70137 на клітини, експресуючі
ІЇ-Т7 людини (ліва панель) або ІІЇТ7 яванського макака (права панель). Трикутники означають афукозильований 1.770137, і кружки означають контроль.
Фігура 20: демонструє активність АОСС афукозильованого І-Т70137 шляхом вимірювання інгібування продукції ІЕМ- альфа, як непряма оцінка здатності антитіла індукувати АрСС мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМО) іп міїго.
Фігура 21: демонструє зв'язування афукозильованого 1 Т70137 з первинними плазмацитоїдними дендритними клітинами (рос) людини.
Фігура 22: демонструє виснаження рос у яванських макак, оброблюваних афукозильованим 7С7 або афукозильованим І-Т70137. Стрілки внизу графіка вказують на моменти часу введення антитіла.
Фігура 23: демонструє продукцію ІРМо після обробки афукозильованим 7С7 або афукозильованим ІСТ70137. Стрілки внизу графіка вказують на моменти часу введення антитіла.
І. Визначення
Слід зазначити, що термін в однині належить до одного або більше об'єктів; наприклад, розуміють, що "антитіло до І-Т7" являє собою один або більше антитіл до ІЇТ7. Таким чином, у даному описі терміни в однині, "один або більше" і "щонайменше один" можуть 60 використовуватися взаємозамінно.
Як використовують у даному описі, термін "поліпептид" призначений включати окремий "поліпептид", а також багато "поліпептидів" і належить до молекули, що складається з мономерів (амінокислот), лінійно зв'язаних амідними зв'язками (також відомими як пептидні зв'язки). Термін "поліпептид" належить до будь-якого ланцюга або ланцюгів двох або більше амінокислот і не належить до певної довжини продукту. Таким чином, пептиди, дипептиди, трипептиди, олігопептиди, "білок", "амінокислотний ланцюг" або будь-який інший термін, використовуваний для позначення ланцюга або ланцюгів двох або більше амінокислот, входять у визначення "поліпептиду", і термін "поліпептид" можна використовувати замість або взаємозамінно щодо будь-якого із цих термінів. Термін "поліпептид" також призначений позначати продукти постекспресійної модифікацій поліпептиду, включаючи без обмеження, глікозилювання, ацетилування, фосфорилювання, амідування, дериватизацію відомими захисними/локувальними групами, протеолітичне розщеплення або модифікацію неприродними амінокислотами. Поліпептид можна одержувати із природнього біологічного джерела або одержувати рекомбінантною технологією, але він не обов'язково транслюється із зазначеної послідовності нуклеїнової кислоти. Його можна одержувати будь-яким способом, включаючи хімічний синтез.
Розмір поліпептиду за винаходом може становити приблизно З або більше, 5 або більше, 10 або більше, 20 або більше, 25 або більше, 50 або більше, 75 або більше, 100 або більше, 200 або більше, 500 або більше, 1000 або більше, або 2000 або більше амінокислот. Поліпептиди можуть мати певну тривимірну структуру, хоча вони не обов'язково мають таку структуру.
Поліпептиди певною тривимірною структурою позначають як згорнуті і поліпептиди, що не мають певну тривимірну структуру, але можуть приймати велике число різних конформацій, позначають як не згорнуті. Як використовують у даному описі, термін глікопротеїн належить до білка, зв'язаного щонайменше з однією вуглеводною групою, яка приєднана до білка через бічний ланцюг амінокислотного залишку, що містить кисень або містить азот, наприклад, залишку серину або залишку аспарагіну.
Під "виділеним" поліпептидом або його фрагментом, варіантом або похідним розуміють поліпептид, який не перебуває у своєму природному оточенні. Не потрібні конкретні рівні очищення. Наприклад, виділений поліпептид можна видаляти з його нативного або природного
Зо оточення. Поліпептиди і білки, які рекомбінантно продукуються, що експресуються в клітинах- хазяїнах, вважають ізольованими для цілей винаходу, а також є нативними або рекомбінантними поліпептидами, які відокремлювали, фракціонували або частково, або значною мірою очищали будь-яким підходящим способом.
Також у поняття поліпептиди за даним винаходом входять фрагменти, похідні, аналоги або варіанти зазначених вище поліпептидів і будь-яка їх комбінація. Терміни "фрагмент, " "варіант", "похідне" і "аналог" щодо антитіл до І/Т7 або поліпептидів антитіл за даним винаходом включають будь-які поліпептиди, які зберігають щонайменше певні антигензв'язуючі властивості відповідного антитіла або поліпептиду антитіла за винаходом. Фрагменти поліпептидів за даним винаходом включають протеолітичні фрагменти, а також фрагменти делеції, на додаток до конкретних фрагментів антитіл, описуваних в іншому місці в даному описі. Варіанти антитіл до
І-Т7 ї поліпептидів антитіл за даним винаходом включають фрагменти, як описано вище, а також поліпептиди зі зміненими амінокислотними послідовностями внаслідок заміни, делецій або вставок амінокислот. Варіанти можуть виникати природно або бути неприродними.
Неприродні варіанти можна одержувати з використанням відомих технік мутагенезу.
Поліпептиди-варіанти можуть містити консервативні або неконсервативні заміни, делеції або додавання амінокислот. Поліпептиди-варіанти також можуть бути позначені в даному описі як "аналоги поліпептидів". Як використовують у даному описі, "похідне" антитіла до І/Т7 або поліпептиду антитіла означає окремий поліпептид, що містить один або більше залишків, підданих хімічній дериватизації в результаті взаємодії функціональної групи бічного ланцюга.
Також як "похідні" включають такі пептиди, які містять одне або більше природних похідних амінокислот двадцяти стандартних амінокислот. Наприклад, 4-гідроксипролін можна заміщати проліном; 5-гідроксилізин можна заміщати лізином; З-метилгістидин можна заміщати гістидином; гомосерин можна заміщати серином, і орнітин можна заміщати лізином. Похідні антитіл до І-Т7 і поліпептиди антитіл за даним винаходом можуть включати поліпептиди, які змінювали таким чином, щоб вони мали додаткові властивості, які не зустрічаються в еталонному антитілі або поліпептиді антитіла за винаходом.
Термін "полінуклеотид" призначений включати окрему нуклеїнову кислоту, а також сукупність нуклеїнових кислот, і належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти або конструкції, наприклад, інформаційної РНК (ІРНК) або плазмідної ДНК (пДНК). Полінуклеотид бо може містити загальноприйнятий фосфодіефірний зв'язок або незагальноприйнятий зв'язок
(наприклад, амідний зв'язок, як такий, що зустрічається в пептидних нуклеїнових кислотах (ПНК)). Термін "нуклеїнова кислота" належить до будь-якого одного або більше сегментів нуклеїнової кислоти, наприклад, фрагментів ДНК або РНК, що містяться в полінуклеотиді. "Виділена" нуклеїнова кислота або полінуклеотид призначений включати молекулу нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, яку вилучили з її природного оточення. Наприклад, рекомбінантний полінуклеотид, що кодує зв'язуючу молекулу проти І-Т7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що міститься у векторі, вважають виділеним для цілей даного винаходу. Додаткові приклади виділеного полінуклеотиду включають рекомбінантні полінуклеотиди, що містяться в гетерологічних клітинах-хазяїнах, або очищені (частково або по суті) полінуклеотиди в розчині. Виділені молекули РНК включають РНК транскрипти іп мімо або іп міго полінуклеотидів за даним винаходом. Виділені полінуклеотиди або нуклеїнові кислоти за даним винаходом додатково включають такі молекули, одержувані синтетично. Крім того, полінуклеотид або нуклеїнова кислота може являти собою або може включати регуляторний елемент, такий як промотор, ділянка зв'язування рибосоми або термінатор транскрипції.
Як використовують у даному описі, "ділянка, що кодує" являє собою ділянку нуклеїнової кислоти, яка складається з кодонів, трансльованих в амінокислоти. Незважаючи на те, що "стоп- кодон" (ТАС, ТОА або ТАА) не транслюється в амінокислоту, його можна вважати частиною ділянки, що кодує, але які-небудь фланкуючі послідовності, наприклад, промотори, ділянки зв'язування рибосоми, термінатори трансляції, інтрони тощо, не є частиною ділянки, що кодує.
Дві або більше ділянки, що кодують, за даним винаходом можуть міститися в одній полінуклеотидній конструкції, наприклад, в одному векторі або в окремих полінуклеотидних конструкціях, наприклад, в окремих (різних) векторах. Крім того, будь-який вектор може містити одну ділянку, що кодує, або може містити дві або більше ділянки, що кодують, наприклад, один вектор може окремо кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну і варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну. Крім того, вектор, полінуклеотид або нуклеїнова кислота за винаходом може кодувати гетерологічні ділянки, що кодують, злиті або не злиті з нуклеїновою кислотою, що кодують антитіло до І-Т7 або його фрагмент, варіант або похідне. Гетерологічні ділянки, що кодують, включають без обмеження спеціалізовані елементи або мотиви, такі як секреторний сигнальний пептид або гетерологічний функціональний домен.
Зо У певних варіантах здійснення полінуклеотид або нуклеїнова кислота являє собою ДНК. У випадку ДНК полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, як правило, може містити промотор і/або інші елементи контролю транскрипції або трансляції, функціонально зв'язані з однією або більше ділянками, що кодують. Функціонально зв'язаний означає, у випадку ділянки, що кодує, продукту гена, наприклад, поліпептиду, Є зв'язаною з однією або більше регуляторних послідовностей таким чином, щоб поміщати експресію продукту гена під вплив або контроль регуляторної послідовності(ей). Два фрагменти ДНК (такі як ділянка, що кодує, поліпептиду і промотор, зв'язаний з нею) є "функціонально зв'язаними", якщо введення функції промотору призводить до транскрипції ІРНК, що кодує бажаний продукт гена, і якщо природа зв'язку між двома фрагментами ДНК не порушує здатності регулюючих експресію послідовностей управляти експресією продукту гена або не порушує здатність ДНК - матриці транскрибуватися. Таким чином, промоторна ділянка функціонально зв'язана з нуклеїновою кислотою, що кодує поліпептид, якщо промотор міг здійснювати транскрипцію цієї нуклеїнової кислоти. Промотор може являти собою клітинноспецифічний промотор, який спрямовує по суті транскрипцію ДНК тільки в певних клітинах. Інші елементи контролю транскрипції, поряд із промотором, наприклад, енхансери, оператори, репресори і сигнали термінації транскрипції, можна функціонально зв'язувати з полінуклеотидом для спрямовування клітинноспецифічною транскрипцією. Підходящі промотори та інші ділянки контролю транскрипції описані в даному описі.
Фахівцям у даній галузі відомі різні ділянки контролю транскрипції. Вони включають без обмеження ділянки контролю транскрипції, які функціонують у клітинах хребетних, такі як, але, не обмежуючись ними, промоторні і енхансерні сегменти із цитомегаловірусів (передранній промотор у комбінації з інтроном А), вірусу мавп 40 (ранній промотор) і ретровірусів (таких як вірус саркоми Рауса). Інші ділянки контролю транскрипції включать ділянки контролю транскрипції, одержувані з генів хребетних, такі як актин, білок теплового шоку, бичачий гормон росту і р-глобін кролика, а також інші послідовності, здатні регулювати експресію гена в еукаріотичних клітинах. Додаткові підходящі ділянки контролю транскрипції включають тканиноспецифічні промотори і енхансери, а також індуцибельні лімфокіном промотори (наприклад, промотори, що індукуються інтерферонами або інтерлейкінами).
Подібним чином, фахівцям у даній галузі відомі різні елементи контролю трансляції. Вони бо включають, але не обмежуються ними, ділянки зв'язування рибосоми, кодони ініціації трансляції і термінації трансляції, і елементи, одержувані з пікорнавірусів (зокрема, внутрішню ділянку зв'язування рибосоми або ІКЕ5, також позначувану як послідовність СІТЕ).
В інших варіантах здійснення полінуклеотид за даним винаходом являє собою РНК, наприклад, у формі інформаційної РНК (ІРНК).
Полінуклеотид і нуклеїнова кислота, що кодують ділянки за даним винаходом, можна зв'язувати з додатковими ділянками, що кодують, які кодують секреторні або сигнальні пептиди, які направляють секрецію поліпептиду, що кодується полінуклеотидом за даним винаходом.
Згідно із сигнальною гіпотезою білки, що секретуються клітинами ссавців, містять сигнальний пептид або секреторну лідерну послідовність, яка відщеплюється від зрілого білка після того, як почалося виведення зростаючого білкового ланцюга через шорсткуватий ендоплазматичний ретикулум. Фахівцям у даній галузі відомо, що поліпептиди, що секретуються клітинами хребетних, як правило, містять сигнальний пептид, злитий з М- кінцем поліпептиду, який відщеплюється від повного або "повнорозмірного" поліпептиду з одержанням секретованої або "зрілої" форми поліпептиду. У певних варіантах здійснення нативний сигнальний пептид, наприклад, використовують сигнальний пептид важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобуліну або функціональне похідне такої послідовності, яке зберігає здатність направляти секрецію поліпептиду, який є функціонально зв'язаний з ним. Альтернативно, можна використовувати гетерологічний сигнальний пептид ссавця або його функціональне похідне. Наприклад, лідерну послідовність дикого типу можна заміщати лідерною послідовністю активатора тканинного плазміногену людини(ТРА) або р-глюкуронідази миші. "Зв'язуюча молекула" або "антигензв'язуюча молекула" за даним винаходом належить в широкому сенсі до молекули, яка специфічно зв'язується з антигенною детермінантою. В одному з варіантів здійснення зв'язуюча молекула специфічно зв'язується з ІІТ7, наприклад, повнорозмірним І-Т7 або зрілим І-Т7. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше один важкий або легкий ланцюг СОК молекули еталонного антитіла. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше дві СО. з однієї або більше молекул еталонного антитіла. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше три СОК з
Зо однієї або більше молекул еталонного антитіла. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше чотири СОК з однієї або більше молекул еталонного антитіла. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше п'ять СОК з однієї або більше молекул еталонного антитіла. В іншому варіанті здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить щонайменше шість СОМ з однієї або більше молекул еталонного антитіла. У певних варіантах здійснення еталонна молекула антитіл являє собою 7С7, І/Т70080, І. 770080.1-І.770080.7, 1.770083, І.Т70083.1-І 770083.9, І. 770089,
І-Т70100, І.Т70137, 1.770142, 1.770144 або ІІ 7170052.
Даний винахід належить до певних антитіл до ІЇТ7 або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних. Термін "антитіло" означає молекулу імуноглобуліну, яка розпізнає і специфічно зв'язується з мішенню, такою як білок, поліпептид, пептид, вуглевод, полінуклеотид, ліпід або комбінації зазначених вище через щонайменше одна антиген ділянка розпізнавання у варіабельній ділянці молекули імуноглобуліну. Як використовують у даному описі, термін "антитіло" включає інтактні поліклональні антитіла, інтактні моноклональні антитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, злиті білки, що містять антитіло, і будь-яку іншу модифіковану молекулу імуноглобуліну за умови, що антитіла володіють бажаною біологічною активністю. Антитіло може належати до будь-якого з п'яти основних класів імуноглобулінів: ІА, дО, ІДЕ, до і ДМ або їх підкласів (ізотипів) (наприклад, Ідс1, Ід, ДСЗ,
ІЧО4, ІДА1 і ІдДА2), на основі ідентичності їх константних доменів важких ланцюгів, позначуваних як альфа, дельта, епсилон, гамма і мю, відповідно. Різні класи імуноглобулінів мають різні і добре відомі структури субодиниць і тривимірними конфігураціями. Антитіла можуть бути "голими" або кон'югованими з іншими молекулами, такими як токсини, радіоактивні ізотопи тощо.
Термін "фрагмент антитіла" або "його фрагмент антитіло" належить до частини інтактного антитіла. "Антигензв'язуючий фрагмент" або "його антигензв'язуючий фрагмент" належить до частини інтактного антитіла, яка зв'язується з антигеном. Антигензв'язуючий фрагмент може містити антигенвизначальні варіабельні ділянки інтактного антитіла.
Приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, Бар, Раб", К(аб)2 і фрагменти Ем, лінійні антитіла, 5сЕм і одноланцюгові антитіла.
Як використовують у даному описі, антитіла "людини" або "повністю приналежні людині" бо антитіла включають антитіла, що містять амінокислотну послідовність імуноглобуліну людини, і включають антитіла, виділені з бібліотек імуноглобуліну людини або від тварин, трансгенних за одним або більше імуноглобулінами людини, і в яких не експресуються ендогенні імуноглобуліни, як описано нижче і, наприклад, у патенті США Мо 5939598 на ім'я Киспегіараїі еї аі. Повністю приналежні людині антитіла є особливо бажаними для терапевтичного лікування пацієнта, що є людиною.
Антитіла людини можна одержувати різними відомими в даній галузі способами, включаючи способи фагового дисплея з використанням бібліотек антитіл, одержуваних з послідовностей імуноглобуліну людини, як описано в Мацойап еї аї., Маї. Віоїесй. 14:309-314 (1996), ЗНевів ві аї.,
Ргос. Маї (1. Асад. 5сі. 95:6157-6162 (1998), Ноодепроот апа У/іптег, У. Мої. Віо!. 227:381 (1992) |і
Магкз5 еї аї., У. Мої. ВіоЇ. 222:581 (1991)). Додаткові приклади способів фагового дисплея, які можна використовувати для одержання і використання антитіл, включають способи, описувані в
Коїшпе еї аї., У. Мої. Віої!., 376:1182 (2008), Вгіпктап еї аї., 9. Іттипої. Мештоаз 182:41-50 (1995);
Атевз еї аї., у. Іттипої. Мешоа5 184:177-186 (1995); КешШерогоцон еї аї., Єик. У. Іттипої. 24:952- 958 (1994); Регзіс єї аІ., Сепе 187:9-18 (1997); Випоп еї аї!., Адмапсез іп Іттипоіоду 57:191-280 (1994); заявці РСТ Мо РСТ/ЗВО91/01134; публікаціях РСТ МО 90/02809, УМО 91/10737, МО 92/01047, УМО 92/18619, УМО 93/11236, УМО 95/15982, УМО 95/20401 і патентах США Ме 6172197, 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915, 6593081, 6300064, 6653068, 6706484, 7264963, 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 і 5969108, кожний з яких повністю включений у даний опис за допомогою посилання.
Крім того, як відомо в даній галузі, антитіла людини можна одержувати з використанням трансгенних мишей, у яких не можуть експресуватися функціональні ендогенні імуноглобуліни, але в яких можуть експресувати гени імуноглобулінів людини. Для огляду цієї технології див.
Гопрегод апа Низлаїг, Іпії. Неум. Іттипо). 13:65-93 (1995).
Додаткові способи, доступні в даній галузі конструювання антитіл, дозволили виділяти антитіла людини або їх фрагменти. Наприклад, гібридоми людини можна одержувати так, як описано Копіеєппапп апа беїап. Апіїбоду Епдіпеегіпу, Зргіпдег І арогаїогу Мапиаї5 (2001).
Повністю приналежні людині антитіла можна, аналогічно, одержувати різними технологіями дисплея, наприклад, фагового дисплея або іншими системами на основі вірусного дисплея. У
Зо способах фагового дисплея функціональні домени антитіла надають на поверхні фагових частинок, які несуть полінуклеотидні послідовності, що кодують їх. Наприклад, послідовності
ДНК, кодуючи ділянки МН і МІ. ампліфікують з бібліотек КкДНК тварини (наприклад, бібліотек
КДНК із лімфоїдної тканини людини або миші) або бібліотек синтетичної КДНК. У певних варіантах здійснення ДНК ділянки, що кодують, МН і МІ, з'єднують один з одним через лінкер 5СЕм за допомогою ПЛР і клонують у фагмідний вектор (наприклад, р САМТАВ 6 або рСоть З
НзіЗ). Вектор електропорують в БЕ. соїї і інфікують Е. соїї фагом-помічником. Використовуваний у цих способах фаг, як правило, являє собою ниткоподібний фаг, включаючи їй і М13, і ділянки МН або МІ, як правило, рекомбінантно зливають із геном І або геном МІ! фага. Фаг, що експресує антигензв'язуючий домен, який зв'язується з антигеном, що представляє інтерес (тобто ІІ-Т7), можна вибирати або ідентифікувати з антигеном, наприклад, з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного або захопленого на твердій поверхні або гранулі.
Антитіла "людини" або "повністю приналежні людині" антитіла також включають антитіла, що містять щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга або щонайменше варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга, де варіабельний домен(и) містять амінокислотну послідовність варіабельного домену(ів) імуноглобуліну людини.
Антитіла "людини" або "повністю приналежні людині" антитіла також включають антитіла "людини" або "повністю приналежні людині" антитіла, як описано вище, які містять, по суті складаються з або складаються з варіантів (включаючи похідні) молекул антитіл (наприклад, ділянки МН і/або ділянки МІ), описуваних у даному описі, де антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні імуноспецифічно зв'язуються з поліпептидом І/Т7 або його фрагментом або варіантом. Стандартні способи, відомі фахівцям у даній галузі, можна використовувати для введення мутацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло людини до І/Т7, включаючи, але, не обмежуючись ними, сайт-спрямований мутагенез і опосередкований ПЛР мутагенез, які призводять до замін амінокислот. Варіанти (включаючи похідні) можуть кодуватися менше ніж 50 замінами амінокислот, менше ніж 40 замінами амінокислот, менше ніж 30 замінами амінокислот, менше ніж 25 замінами амінокислот, менше ніж 20 замінами амінокислот, менше ніж 15 замінами амінокислот, менше ніж 10 замінами амінокислот, менше ніж 5 замінами амінокислот, менше ніж 4 замінами амінокислот, менше ніж
З замінами амінокислот або менше ніж 2 замінами амінокислот щодо еталонної ділянки МН, бо МНСОМ1, МНСОВ2, УНСО, ділянки МІ, М СОРК1, М СОК2 або МІ СОР.
У певних варіантах здійснення заміни амінокислот є консервативними замінами амінокислот, додатково описаними нижче. Альтернативно, мутації можна вводити у випадковому порядку по всій довжині або в частині послідовності, що кодує, таким чином, як за допомогою насичувального мутагенезу, і можна проводити скринінг мутантів, що вийшли, на біологічну активність для ідентифікації мутантів, які зберігають активність (наприклад, здатність зв'язуватися з поліпептидом ІСТ7, наприклад, людини, примата, миші або будь-якою комбінацією ІСТ7 людини, примата і миші). Такі варіанти (або їх похідні) антитіл "людини" або "повністю приналежних людині" антитіл також можуть бути позначені як антитіла людини або повністю приналежні людині антитіла, які є "оптимізованими" або "оптимізованими за зв'язуванням антигену", і включають антитіла, які мають поліпшену афінність до антигену.
Основні структури імуноглобуліну в хребетних організмах відносно добре відомі. Див., наприклад, Нагіоу еї аІ. (1988) Апіїбодієв: А І арогаїюту Мапиаї! (2па єйд.; Соїд З5ргіпд Нагрог
Гарогаїогу Ргевв5).
Як описано більш докладно нижче, термін "імуноглобулін" включає різні великі класи поліпептидів, які можна розрізняти на біохімічному рівні. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що важкі ланцюги класифікують як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, (у, н., с, 6, є) з деякими підкласами серед них (наприклад, уї - у4). Саме природа цього ланцюга визначає "клас" антитіла як Ідс, ІЮДМ, ІдА до або ІДЕ, відповідно. Підкласи імуноглобулінів (ізотипи), наприклад,
І9С1, ІдС2, ІдсЗ, Ідс4, ІДАТ тощо добре охарактеризовані і, як відомо, забезпечують функціональну спеціалізацію. Фахівець у даній галузі може легко розрізняти модифіковані варіанти кожного із цих класів і ізотипів, беручи до уваги даний опис, і, таким чином, вони входять в об'єм даного винаходу. Незважаючи на те, що наступний нижче опис, як правило, належить до молекул імуноглобулінів класу Ідс, усі класи імуноглобулінів повністю входять в об'єм даного винаходу. Відносно до, стандартна молекула імуноглобуліну містить два ідентичні поліпептиди легкого ланцюга молекулярної маси приблизно 23000 Дальтон, і два ідентичні поліпептиди важкого ланцюга молекулярною масою 53000-70000. Чотири ланцюги, як правило, з'єднані дисульфідними зв'язками в конфігурації "у", де легкі ланцюги закріплюють важкі ланцюги, що починаються в місці початки "У" і продовжуються у варіабельній ділянці.
Легкі ланцюги класифікують як каппа або лямбда (к, Х). Кожний клас важких ланцюгів може
Зо зустрічатися з легким каппа - або лямбда-ланцюгом. В основному, легкі і важкі ланцюги є ковалентно зв'язаними один з одним, і "хвостові" ділянки двох важких ланцюгів зв'язано один з одним ковалентними дисульфідними зв'язками або нековалентними зв'язками, коли імуноглобуліни одержують за допомогою гібридом, В-клітин або сконструйованими за допомогою генетичної інженерії хазяїнами. У важкому ланцюзі амінокислотні послідовності йдуть від М- кінця на роздвоєному кінці У- конфігурації до С-кінця на кінці кожного ланцюга.
Основа антитіла "у" називається Ес- ділянка (фрагмент, що кристалізується) і складається із двох важких ланцюгів, які надають два або три константні домени залежно від класу антитіла.
Таким чином, Ес- ділянка зв'язується з конкретним класом Ес- рецепторів і іншими імунними молекулами, такими як комплементні білки. Легкі і важкі ланцюги розділяють на ділянки структурної і функціональної гомології. Терміни "константний" і "варіабельний" використовують щодо функції. Відносно цього, слід розуміти, що варіабельні домени ділянок легких (МІ. або МУК) і важких (УН) ланцюгів визначають розпізнавання антигену і специфічність. На противагу цьому, константні домени легкого ланцюга (СІ) і важкого ланцюга (СНІ, СН2 або СНЗ) забезпечують важливі біологічні властивості, такі як секреція, трансплацентарний перенос, зв'язування Ес- рецептора, зв'язування комплементу тощо. За згодою нумерація доменів константної ділянки збільшується в міру того, як вони віддаляються від антигензв'язуючої ділянки або М- кінця антитіла. М- кінцева ділянка являє собою варіабельну ділянку, і на С-кінцевій ділянці розташовується константна ділянка; домени СНЗ і СІ фактично містять С-кінець важких і легких ланцюгів, відповідно.
Як зазначено вище, варіабельна ділянка дозволяє антитілу селективно розпізнавати і специфічно зв'язувати епітопи на антигенах. Таким чином, домен Мі. і домен МН або підгрупа визначальних комплементарність ділянок (СОК) у цих варіабельних доменах антитіла поєднується, утворюючи варіабельну ділянку, яка визначає тривимірну антигензв'язуючу ділянку. Така четвертинна структура антитіла утворює антигензв'язуючу ділянку, що є присутньою на кінці кожного плеча У. Більш конкретно, антигензв'язуючу ділянку визначають три СОК на кожному з ланцюгів МН і ММ. У деяких випадках, наприклад, певні молекули імуноглобуліну одержують від видів верблюжих або конструюють на підставі імуноглобулінів верблюжих, повна молекула імуноглобуліну може складатися тільки з важких ланцюгів без легких ланцюгів. Див., наприклад, Натег5-Савіептанп еї а!., Майте 363:446-448 (1993).
У природних антитілах шість "визначальних комплементарність ділянок" або "СОК", що містяться на кожному антигензв'язуючому домені, являють собою короткі, безперервні послідовності амінокислот, які розташовуються особливим чином, утворюючи антигензв'язуючий домен, тому що антитіло приймає свою тривимірну конфігурацію у водному середовищі. Частина амінокислот, що залишилася в антигензв'язуючих доменах, позначувані як "каркасні" ділянки, мають меншу міжмолекулярну мінливість. Каркасні ділянки головним чином приймають конформацію (рД- листа, ії СОК утворюють петлі, які з'єднують і в деяких випадках утворюють частину структури р-листа. Таким чином, каркасні ділянки функціонують із утворенням каркаса, який забезпечує розташування СОК у правильній орієнтації в результаті міжланцюгових нековалентних взаємодій. Антигензв'язуючий домен, утворений розташованими в особливому порядку СОК, визначає поверхню, комплементарну епітопу на імунореактивному антигені. Така комплементарна поверхня сприяє нековалентному зв'язуванню антитіла з його когнатним епітопом. Фахівець у даній галузі може легко ідентифікувати амінокислоти, що містять СОН і каркасні ділянки, відповідно, для будь-якого даного варіабельного домену важкого або легкого ланцюга, тому що вони були точно визначені (див. нижче).
У випадку, коли є два або більш визначень терміна, які використовуються і/або прийняті в даній галузі, то використовуване в даному описі визначення терміна призначене включати всі такі значення, якщо явно не зазначене інше. Конкретним прикладом є використання терміна "визначальна комплементарність ділянка" ("СОК") для опису несуміжних антигензв'язуючих ділянок, що зустрічаються у варіабельній ділянці поліпептидів важкого і легкого ланцюгів. Ця конкретна ділянка описана в Кабаї еї аІ. (1983) ОО. 5. Оері. ої Неайй апа Нитап 5егмісев, "зедцепсев ої Ргоївіп5 ої Іттипоїіодіса! Іпіегезі" і Споїпіа апа ГезкК, ) Мої. ВіоїЇ. 196:901-917 (1987), які включені в даний опис за допомогою посилання, де визначення включають такі, що перекриваються, або підгрупи амінокислотних залишків при порівнянні один з одним. Однак застосування будь-якого визначення для посилання на СОК антитіла або його варіантів призначене входити в об'єм терміна, як визначено і як використовують у даному описі. ІМСТ (тМипосСепетіс5) також надає систему нумерації варіабельних ділянок імуноглобулінів, що містять СОК. Див., наприклад, І еїгапс М. Р. еї аїІ., Оєем. Сотр. Іттипої. 27: 55-77(2003), який включений у даний опис за допомогою посилання. Система нумерації ІМСТ була основана на
Зо вирівнюванні більш ніж 5000 послідовностей, даних про структуру і характеристику гіперваріабельних петель і дозволяє легко порівнювати варіабельні ділянки і ділянки СОК для всіх видів. Підходящі амінокислотні залишки, які включають СОК, як визначають за допомогою кожним із зазначених вище посилань, зазначені нижче в таблиці 1 як порівняння. Точна нумерація залишків, які включають конкретну СОЖК, може змінюватися залежно від послідовності і розміру СОК. Фахівці в даній галузі можуть загальноприйнято визначати, які залишки містять конкретну СОК з врахуванням амінокислотної послідовності варіабельної ділянки антитіла.
Таблиця 1
Визначення СОВ' 11111101 кава | Спошаїд///// | мої "Нумерація всіх визначень СОБЕ у таблиці 1 відповідає системам нумерацій, зазначених Кабаї егаї. (див. нижче).
Кабаї єї аІ. також визначили систему нумерації для послідовностей варіабельних доменів, яка є застосовною до будь-якого антитіла. Фахівець у даній галузі може однозначно застосовувати дану систему "нумерації за Кабраї" до будь-якої послідовності варіабельного домену без врахування яких-небудь експериментальних даних за межами самої послідовності.
Як використовують у даному описі, термін "нумерація за Кабвбаї" належить до системи нумерації, викладеної в Кабаї єї а!ї. (1983) 0. 5. Оері. ої Неайй апа Нитап Зегмісев5, "Зедиепсе ої Ргоївіп5 ої
Інкнапипоіодісаї Іптегеві".
Антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом включають без обмеження поліклональні, моноклональні, антитіла миші, антитіла людини, гуманізовані, приматизовані або химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, фрагменти, що зв'язують епітоп, наприклад, Раб, Раб'ї Е(аб')», га, Ем, одноланцюгові Ем (зсЕм), зв'язані дисульфідними зв'язками
Ем (загм), фрагменти, що містять домен Мі або МН, фрагменти, одержувані за допомогою ехргез5іоп бібліотеки експресії Рар, і анти-ідіотипові антитіла (антитіла Ід) (включаючи, наприклад, антитіла 4 до антитіла до ІЇТ7, описуваному в даному описі). Молекули 5сЕм відомі в даній галузі і описані, наприклад, у патенті США Мо 5892019. Молекули імуноглобуліну або антитіла за винаходом можуть бути будь-якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, І9М, Ід, ІдА і Іди, класу (наприклад, ІДС, Ід052, Ідс3, Ід054, ДАТ і ІА? тощо) або підкласу молекули імуноглобуліну.
Як використовують у даному описі, термін "частина важкого ланцюга" включає амінокислотні послідовності, одержувані з важкого ланцюга імуноглобуліну. Поліпептид, що містить частину важкого ланцюга, містить щонайменше один з: домену СНІ, шарнірного домену (наприклад, верхньої, середньої і/або нижньої шарнірної ділянки), домену СН2, домену СНЗ або їх варіанта або фрагмента. Наприклад, зв'язуючий поліпептид для застосування у винаході може містити поліпептидний ланцюг, що містить домен СНІ; поліпептидний ланцюг, що містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену і домен СН2; поліпептгидний ланцюг, що містить домен СНІ і домен СНЗ; поліпептидний ланцюг, що містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену, і домен СНЗ або поліпептидний ланцюг, що містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену, домен СН2 і домен СНЗ. В іншому варіанті здійснення поліпептид за винаходом містить поліпептидний ланцюг, що містить домен СНЗ.
Крім того, зв'язуючий поліпептид для застосування у винаході може не містити щонайменше частину домену СНАІ2 (наприклад, увесь або частину домену СН2). Як зазначено вище, фахівцеві в даній галузі повинно бути зрозуміло, що ці домени (наприклад, частини важкого ланцюга) можна модифікувати таким чином, щоб вони відрізнялися амінокислотною послідовністю від природної молекули імуноглобуліну.
У певних антитілах до ІТ7 або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних, описуваних у даному описі, частини важкого ланцюга одного поліпептидного ланцюга
Зо мультимера є ідентичними частинам на другому поліпептидному ланцюзі мультимера.
Альтернативно, мономери, що містять частину важкого ланцюга за винаходом, не є ідентичними.
Частини важкого ланцюга зв'язуючої молекули для застосування в способах діагностики і лікування, описаних у даному описі, можна одержувати з різних молекул імуноглобуліну.
Наприклад, частина важкого ланцюга поліпептиду може містити домен СНІ, одержуваний з молекули ІдДС1, ії шарнір, одержуваний з молекули Ідш3. В іншому прикладі частина важкого ланцюга може містити шарнірну частину, одержувану частково з молекули ІдДС1 і частково з молекули ІдеЗ3. В іншому прикладі частина важкого ланцюга може містити химерний шарнір, одержуваний частково з молекули Ідс1 і частково з молекули Ідс4.
Як використовують у даному описі, термін "частина легкого ланцюга" включає амінокислотні послідовності, одержувані з легкого ланцюга імуноглобуліну, наприклад, легкого каппа- або лямбда-ланцюга. Частина легкого ланцюга може містити щонайменше один з домену Мі. або
СІ.
Антитіла до І-Т7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, описувані в даному описі, можна описувати або визначати щодо епітопу(ів) або частини (частин) антигену, наприклад, описуваного в даному винаході цільового поліпептиду (наприклад, повнорозмірного або зрілого І-Т7), який вони розпізнають або специфічно зв'язують. Частина поліпептиду- мішені, яка специфічно взаємодіє з антигензв'язуючим доменом антитіла, являє собою "епітоп" або "антигенну детермінанту". Поліпептид-мішень може містити один епітоп, але, як правило, містить щонайменше два епітопи і може включати будь-яке число епітопів залежно від розміру, конформації і типу антигену. Крім того, слід зазначити, що "епітоп" на поліпептиді-мішені може являти собою або може містити не поліпептидні елементи, наприклад, епітоп може містити вуглеводневий бічний ланцюг.
Вважається, що мінімальний розмір пептидного або поліпептидного епітопу для антитіла становить приблизно від чотирьох до п'яти амінокислот. Пептидні або поліпептидні епітопи можуть містити щонайменше сім, переважніше щонайменше дев'ять або щонайменше приблизно від 15 до приблизно 30 амінокислот. Оскільки СОК може розпізнавати антигенний пептид або поліпептид у його третинній формі, амінокислоти, що містять епітоп, не повинні бути безперервними, і в деяких випадках, можуть навіть не перебувати на одному і тому ж 60 пептидному ланцюзі. Пептидний або поліпептидний епітоп, розпізнаваний антитілами до І Т7 за даним винаходом, може містити послідовність щонайменше з 4, щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 7, переважніше щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 25 або від приблизно 15 до приблизно 30 суміжних або безперервних амінокислот ІІ 17.
Під "специфічно зв'язується" у цілому мається на увазі, що антитіло зв'язується з епітопом через його антигензв'язуючий домен, і що зв'язування спричиняє деяку комплементарність між антигензв'язуючим доменом і епітопом. Відповідно до цього визначення говорять, що антитіло "специфічно зв'язується" з епітопом, коли воно зв'язується з таким епітопом через свій антигензв'язуючий домен легше, ніж воно зв'язувалося б з випадковим, неспорідненим епітопом. Термін "специфічність" використовується в даному описі для визначення відносної афінності, з якої певне антитіло зв'язується з певним епітопом. Наприклад, можна вважати, що антитіло "А" має більш високу специфічність до даного епітопу, ніж антитіло "В", або можна сказати, що антитіло "А" зв'язується з епітопом "С" з більшою специфічністю, ніж воно має специфічність до спорідненого епітопу "Ю".
Під "переважно зв'язується" мають на увазі, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом легше, ніж воно б зв'язувалося зі спорідненим, подібним, гомологічним або аналогічним епітопом. Таким чином, антитіло, яке "переважно зв'язується" з даним епітопом, більш імовірно зв'язувалося б із цим епітопом, ніж з спорідненим епітопом, навіть хоча таке антитіло може перехресно реагувати зі спорідненим епітопом.
В іншому не обмежуючому прикладі, можна вважати, що антитіло переважно зв'язується з першим антигеном, якщо воно зв'язується з першим епітопом з афінністю, яка щонайменше на один порядок величини менша, ніж Ко антитіла до другого епітопу. В іншому не обмежуючому прикладі, можна вважати, що антитіло переважно зв'язується з першим епітопом, якщо воно зв'язується з першим епітопом з афінністю, яка є щонайменше на два порядки величини менша, ніж Ко антитіла до другого епітопу.
В іншому не обмежуючому прикладі можна вважати, що антитіло переважно зв'язує перший епітоп, якщо воно зв'язується з першим епітопом зі швидкістю зворотної реакції (К(ОоП)), яка є менше, ніж К(ої) антитіла К(ої) до другого епітопу. В іншому не обмежуючому прикладі, можна сказати, що антитіло переважно зв'язується з першим епітопом, якщо воно зв'язується з
Зо першим епітопом з афінністю, яка щонайменше на один порядок величини менша, ніж К(оїй) антитіла до другого епітопу. В іншому необмежуючому прикладі можна вважати, що антитіло переважно зв'язується з першим епітопом, якщо воно зв'язується з першим епітопом з афінністю, яка щонайменше на два порядки величини менша, ніж К(ої) антитіла до другого епітопу. Можна сказати, що антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, описуване в даному описі, зв'язується з описуваним у даному описі поліпептидом-мішенню (наприклад, ІСТ7, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примата і миші) або його фрагментом, або варіантом зі швидкістю зворотної реакції (К (ої)) меншою або такою, що дорівнює 5х102 с", 102 с, 5х103 с" або 103 с". Можна сказати, що антитіло зв'язується з описуваним у даному описі поліпептидом-мішенню (наприклад, І-Т7, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примата і миші) або його фрагментом, або варіантом зі швидкістю зворотної реакції (К(ої)) меншою або такою, що дорівнює 5х107 с", 107 с! 5х105 с! або 105 с", 5х105 с" 106 с 5х107 с або 107 с7.
Можна сказати, що антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, описуване в даному описі, зв'язується з поліпептидом-мішенню, описуваним у даному описі, (наприклад, ІСТ7, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примата і миші) або його фрагментом, або варіантом зі швидкістю прямої реакції (К(оп)) більшою або такою, що дорівнює 103 М" с", 5х103 МИ сл, 105 МИ с" або 5х104 МИ сл. Антитіло за винаходом може зв'язуватися з поліпептгидом-мішенню, описуваним у даному описі, (наприклад, ІСТ7, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примат і миші) або його фрагментом або варіантом зі швидкістю прямої реакції (К(оп)) більшою або такою, що дорівнює 107 М" с", 5х105 М" с", 105 М" с" або 5(106 М-1 с-1, або 107
М-1 с-1.
Вважають, що антитіло конкурентно інгібує зв'язування еталонного антитіла з даним епітопом, якщо переважно зв'язується із цим епітопом або епітопом, що перекривається, у тих випадках, коли воно блокує до певної міри зв'язування еталонного антитіла з епітопом.
Конкурентне інгібування можна визначати будь-яким відомим у даній галузі способом, наприклад, аналізами конкурентного ЕГІЗБА. Можна сказати, що антитіло конкурентно інгібує зв'язування еталонного антитіла з даним епітопом щонайменше на 90 956, щонайменше на 8 0 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 60 95 або щонайменше на 50 95.
Як використовують у даному описі, термін "афінність" належить до міри сили зв'язування окремого епітопу з СОК молекули імуноглобуліну. Див., наприклад, Нагіому еї аї. (1988) Антитіла:
Апіїродієв: А І арогаюгу Мапиаї (Со рііпуд Нагбог І арогаїогу Ргезв, 2па єд.) радез 27-28. Як використовують у даному описі, термін "авідність" належить до загальної стабільності комплексу популяції імуноглобулінів з антигеном, тобто міцності функціонального з'єднання суміші імуноглобулінів з антигеном. Див., наприклад, Нагіом/ на сторінках 29-34. Авідність належить до афінності окремих молекул імуноглобуліну в популяції з конкретними епітопами, а також з валентностями імуноглобулінів і антигену. Наприклад, взаємодія двовалентного моноклонального антитіла і антигену з високоповторюваної структурою епітопу, таким як полімер, було б взаємодією з високою авідністю.
Антитіла до І-Т7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом також описують або визначають із погляду їх перехресної реактивності. Як використовують у даному описі, термін "перехресна реактивність" належить до здатності антитіла, специфічного до одно антигену, взаємодіяти із другим антигеном; показником споріднення між двома різними антигенними речовинами. Таким чином, антитіло дає перехресну реакцію, якщо воно зв'язується з епітопом, відмінним від епітопу, який індукує його утворення. Перехресно реагуючий епітоп, як правило, містить багато з тих же комплементарних структурних ознак, що і індукуючий епітоп, і в деяких випадках, може фактично ліпше підходити, ніж оригінальний.
Наприклад, певні антитіла мають деякий ступінь перехресної реактивності, яка полягає в тому, що вони зв'язуються зі спорідненими, але неідентичними епітопами, наприклад, епітопами щонайменше з 9595, щонайменше з 9095, щонайменше з 8595, щонайменше з 8 0 95, щонайменше з 7 595, щонайменше з 7095, щонайменше з 6595, щонайменше з 60 95, щонайменше з 55 95 і щонайменше з 50 95 ідентичністю (як розраховують відомими в даній галузі способами і описуваними в даному описі) з еталонним епітопом. Можна сказати, що антитіло має невелику перехресну реактивність або не має її, якщо воно не зв'язується з епітопами з ідентичністю менше 95 95, менше 90 95, менше 85 95, менше 80 965, менше 75 95, менше 70 95, менше 65 95, менше 60 95, менше 55 95 і менше 50 95 (як розраховують відомими в даній галузі способами і описуваними в даному описі) з еталонним епітопом. Антитіло можна вважати "високоспецифічним" до певного епітопу, якщо воно не зв'язується з яким-небудь
Зо іншим аналогом, ортологом або гомологом цього епітопу.
Зв'язуючи молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом також можна описувати або визначати щодо їх афінності зв'язування з поліпептидом за винаходом, наприклад, І-Т7, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примата і миші. Придатні афінності зв'язування включають афінності зв'язування з константою дисоціації або Ка менше ніж 5х102 М, 102 М, 5х103 М, 103 М, 5х102 М, 102 М, 5х105 М, 105 М, 5х106 М, 105 М, 5х10-7 М, 107 М, 5х10 М, 10- 8 М, 5х103 М, 109 М, 5х10-79 М, 1070 М, 5х10-7 М, 10-17 М, 5х1072 М, 1072 М, 5х1073 М, 10-73 М, 5х1072 М, 1072 М, 5х1075М або 10-5 М.
У певних варіантах здійснення антитіло зв'язується з людина ІГТ7 з константою дисоціації або Ка менше 1 нМ. У певних варіантах здійснення антитіло зв'язується з ІЇТ7 яванського макака з константою дисоціації або Ка менше 5 нМ. У певних варіантах здійснення антитіло зв'язується з людина І-Т7 з константою дисоціації або Ка менше 1 нМ і зв'язується з ІЇ/Т7 яванського макака з константою дисоціації або Ка менше 5 нМ.
Як зазначено вище, структури субодиниці та тривимірна конфігурація константних ділянок різних класів імуноглобулінів є добре відомими. Як використовують у даному описі, термін "домен МН" включає варіабельний домен на М- кінці важкого ланцюга імуноглобуліну, і термін "домен СНІ" включає перший (у більшості випадків на М- кінці) домен константної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну. Домен СНІ є суміжним з доменом МН і розташовується на М- кінці щодо шарнірної ділянки важкого ланцюга молекули імуноглобуліну.
Як використовують у даному описі, термін "домен СН2" включає частину молекули важкого ланцюга, який розташовується, наприклад, приблизно від залишку 244 до залишку 360 антитіла з використанням загальноприйнятих систем нумерації (залишки від 244 до 360 система нумерації за Кабаї; і залишки 231-340 система нумерації ЕМО; див. Кабаї ЕА еї аІ.). Домен СНЕ2 є унікальним тим, що він не перебуває в тісному зв'язку з іншим доменом. Навпаки, два М- зв'язані розгалужені вуглеводні ланцюги розташовуються між двома доменами СНІ інтактної нативної молекули до. Також документально підтверджено, що домен СНЗ простягається від домену СН2 до С-кінця молекули Ідс і містить приблизно 108 залишків.
Як використовують у даному описі, термін "шарнірна ділянка" включає частину молекули важкого ланцюга, який з'єднує домен СНІ з доменом СН2. Така шарнірна ділянка містить бо приблизно 25 залишків і є гнучкою, таким чином, забезпечуючи можливість двом М-кінцевим антигензв'язуючим ділянкам рухатися незалежно. Шарнірні ділянки можна розділити на три окремі домени: верхній, середній і нижній домени шпильки (Коих еї аї.,.. Іттипої. 261:4083 (1998)).
Як використовують у даному описі термін, "дисульфідний зв'язок" включає ковалентний зв'язок, утворений між двома атомами сірки. Амінокислота цистеїн містить тіольну групу, яка може утворювати дисульфідний зв'язок або місток із другою тіольною групою. У багатьох природних молекулах Ідс, ділянки СНІ і Сі є зв'язаними дисульфідним зв'язком, і два важкі ланцюги є зв'язаними двома дисульфідними зв'язками в положеннях, що відповідають 239 і 242 з використанням системи нумерації за Кабаї (положення 226 або 229 система нумерації ЕМ).
Як використовують у даному описі, термін "химерне антитіло" буде означати будь-яке антитіло, де імунореактивну ділянку або відрізок одержують або виділяють від першого виду, а константну ділянку (яка може бути інтактною, частковою або модифікованою відповідно до даного винаходу) одержують від другого виду. У певних варіантах здійснення зв'язуюча ділянка- мішень або відрізок є з джерела, не приналежного людині, (наприклад, миші або примата), і константна ділянка належить людині.
Як використовують у даному описі, термін "сконструйоване антитіло" належить до антитіла, у якому варіабельний домен у важкому або легкому ланцюзі або в обох змінюють щонайменше частковою заміною однією або більше СОМ з антитіла з відомою специфічністю і при необхідності частковою заміною каркасної ділянки та зміною послідовності. Хоча СОК можна виділяти з антитіла того ж класу або навіть підкласу, що і антитіло, з якого одержують каркасні ділянки, передбачено, що СОК виділяють із антитіла іншого класу або з антитіла від іншого виду. Сконструйоване антитіло, у якому одну або більше "донорних" СОК з не приналежного людині антитіла відомої специфічності пересаджують у каркасну ділянку важкого або легкого ланцюга людини, позначають у даному описі як "гуманізоване антитіло". Може необов'язково бути необхідною заміна всіх СОК повністю СОК з донорного варіабельного домену для передачі антигензв'язуючої здатності одного варіабельного домену іншому. Навпаки, необхідним може бути тільки перенос цих залишків, які є необхідними для збереження активності цільової ділянки зв'язування.
Крім того, зрозуміло, що каркасні ділянки в межах варіабельного домену у важкому або
Зо легкому ланцюзі, або обох гуманізованого антитіла можуть містити тільки залишки людського походження, у цьому випадку такі каркасні ділянки гуманізованого антитіла позначають як "повністю приналежні людині каркасні ділянки". Альтернативно, один або більше залишків каркасної ділянки(ок) донорного варіабельного домену можна конструювати у відповідному положенні приналежної людині каркасної ділянки(ок) варіабельного домену у важкому або легкому ланцюзі, або обох гуманізованого антитіла, якщо необхідно зберігати відповідне зв'язування або підвищувати зв'язування з антигеном І-Т7. Приналежну людині каркасну ділянку, яку конструювали, таким чином, щоб вона містила суміш приналежних людині і донорові каркасних залишків, і позначають її в даному описі як "частково приналежну людині каркасну ділянку.
Наприклад, гуманізацію антитіла до ІСТ7 можна по суті проводити наступним нижче способом Уміпіег і співавторами (допез еї аї., Маїиге 321:522-525 (1986); Віеєсптапп еї аї., Маїиге 332:323-327 (1988); Мептптоеуєп еї аї., Зсієпсе 239:1534-1536 (1988)), заміною СОМ антитіло гризуна до ІЇТ7 або мутантного антитіла гризуна до І-Т7 або послідовностей СОК відповідними послідовностями людини. Також див. патенти США Мо 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205; включені в даний опис за допомогою посилання. Одержуване гуманізоване антитіло до І-Т7 буде містити щонайменше одну СОК гризуна або мутантну СОК гризуна в повністю приналежних людині каркасних ділянках варіабельного домену важкого і/або легкого ланцюга гуманізованого антитіла. У деяких випадках залишки в каркасних ділянках одного або більше варіабельних доменів гуманізованого антитіла до /І/Т7 заміняють відповідними не приналежними людині (наприклад, що належать гризуну) залишками (див., наприклад, патенти
США Мо 5585089; 5693761; 5693762 і 6180370), на випадок чого одержуване гуманізоване антитіло до І-Т7 містить частково каркасні ділянки людини у варіабельному домені важкого іл або легкого ланцюга.
Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не зустрічаються в реципієнтному антитілі або в донорному антитілі. Ці модифікації проводять для додаткового поліпшення характеристик антитіла (наприклад, для одержання бажаної афінності). В основному гуманізоване антитіло містить по суті всі і щонайменше з одного і, як правило, двох варіабельних доменів, у яких усі або по суті всі СОК відповідають усім СОК не приналежного людині імуноглобуліну, і всі або по суті всі каркасні ділянки є каркасними ділянками бо послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло також необов'язково містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), як правило, константної ділянки імуноглобуліну людини. Більш докладно див. Уопез еї а!., Маїшге 331:522-525 (1986); Віесптапп еї аї., Маїште 332:323-329 (1988); і Ргезіа, Си. Ор. 5ігисі. ВіоЇ. 2:593-596 (1992); включені в даний опис за допомогою посилання. Таким чином, такі "гуманізовані" антитіла можуть включати антитіла, де по суті менш інтактний варіабельний домен людини заміняли відповідною послідовністю від видів, що не є людиною. На практиці гуманізовані антитіла, як правило, являють собою антитіла людини, у яких деякі залишки СОР. і, можливо, деякі каркасні залишки заміняють залишками ділянок-аналогів в антитілах гризунів. Див., наприклад, патенти США Мо 5225539, 5585089, 5693761, 5693762, 5859205. Також див. патент США Мо 6180370 і міжнародну публікацію Мо М/О 01/27160, де описані гуманізовані антитіла і техніки одержання гуманізованих антитіл з поліпшеною афінністю до визначених антигенів.
Як використовують у даному описі, терміни "зв'язаний", "злитий" або "злиття" використовують взаємозамінно. Ці терміни належать до з'єднання один з одним двох інших елементів або компонентів, будь-якими способами, включаючи хімічну кон'югацію або рекомбінантні способи. Злиття "у рамці зчитування" належить до з'єднання двох або більше відкритих рамок зчитування (ОРЕ) полінуклеотиду з утворенням безперервної більшої ОКЕ, таким чином, щоб зберігати правильну рамку зчитування трансляції вихідних ОКЕ. Таким чином, рекомбінантний злитий білок являє собою один білок, що містить два або більше сегмента, які відповідають поліпептидам, що кодується оригінальними ОКЕ (де сегменти зазвичай не з'єднані таким чином у природі). Незважаючи на те, що рамка зчитування, одержувана таким чином, є безперервною на всій протяжності злитих сегментів, сегменти можуть бути фізично або просторово розділеними, наприклад, лінкерною послідовністю в рамці зчитування. Наприклад, полінуклеотиди, що кодують СОК варіабельної ділянки імуноглобуліну можуть бути злитими в рамці зчитування, але розділеними полінуклеотидом, що кодують щонайменше одну каркасну ділянку або додаткові ділянки СОМК імуноглобуліну, за умови, що "злиті" СОК котранслюються як частина безперервного поліпептиду.
Відносно поліпептидів "лінійна послідовність" або "послідовність" являє собою порядок амінокислот у поліпептиді в напрямку від М- до С- кінця, у якому залишки, які розташовуються у сусідстві один з одним у послідовності, є суміжними в первинній структурі поліпептиду.
Зо Термін "експресія", як використовують у даному описі, належить до процесу, у результаті якого ген продукує біохімічну сполуку, наприклад, поліпептид. Процес включає будь-який прояв функціональної присутності гена в клітині, включаючи без обмеження, нокдаун гена, а також транзиторну експресію і стабільну експресію. Він включає без обмеження транскрипцію гена в інформаційну РНК (ІРНК) і трансляцію такої ІРНК у поліпептид(и). Якщо кінцевий бажаний продукт є біохімічною сполукою, експресія включає утворення цієї біохімічної сполуки і будь- яких попередників. Експресія гена призводить до утворення "продукту гена". Як використовують у даному описі, продукт гена може являти собою нуклеїнову кислоту, наприклад, інформаційну
РНК, що продукується в результаті транскрипції гена, або поліпептид, який транслюється із транскрипту. Продукти генів, описувані в даному описі, додатково включають нуклеїнові кислоти з посттранскрипційними модифікаціями, наприклад, поліаденілюванням, або поліпептиди з посттрансляційними модифікаціями, наприклад, метилюванням, глікозилюванням, додаванням ліпідів, зв'язком з іншими білковими субодиницями, протеолітичним розщепленням тощо.
Як використовують у даному описі, терміни "лікувати" або "лікування" належать до терапевтичного лікування і профілактичних або превентивних заходів, де метою є запобігання або вповільнення (зменшення) небажаної фізіологічної зміни або порушення, такого як прогресування аутоїмунного стану. Сприятливі або бажані клінічні результати включають, але не обмежуються ними, ослаблення симптомів, зменшення тяжкості захворювання, стабілізований (тобто, що не погіршується) стан захворювання, відстрочення або вповільнення прогресування захворювання, поліпшення стану або полегшення стану хвороби і ремісію (незалежно від того, чи є вона частковою або повною), незалежно від того, чи є вони такими, що детектуються, або такими, що не детектуються. "Лікування" також може означати збільшення виживаності в порівнянні з очікуваним виживанням, у випадку відсутності лікування. Ті, хто потребує лікування, включають тих, які вже страждають станом або порушенням, а також тих, хто схильний до стану або порушення, або тих, у кого слід проводити профілактику стану або порушення.
Під "об'єктом" або "індивідуумом", або "твариною", або "пацієнтом", або "ссавцем" мають на увазі будь-якого індивідуума, що зокрема є ссавцем індивідуума, у якого бажаним є проведення діагностики, прогнозу або терапії. Індивідууми, що є ссавцями, включають людей, свійських тварин, сільськогосподарських тварин і тварин із зоопарку, тварин, що брали участь у спорті,
або свійських тварин, таких як собаки, кішки, морські свинки, кролики, щури, миші, коні, велика рогата худоба, корови тощо.
Як використовують у даному описі, фрази, такі як "Індивідуум, для якого введення антитіла до І/Т7 буде ефективним", і "тварина, що потребує лікування" включає індивідуумів, таких як індивідууми, що є ссавцями, для яких ефективним буде введення антитіла до ІТ7, використовуваного, наприклад, для детекції антитіла до поліпептиду І-Т7 (наприклад, для діагностичної процедури) і/або для лікування, тобто полегшення або профілактики захворювання антитілом до 1-17.
ПОСТУ
Як використовують у даному описі, терміни "І-Т7" ї "поліпептид ІСТ7" використовують взаємозамінно. У певних варіантах здійснення І-Т7 є повнорозмірним. В іншому варіанті здійснення І-Т7 являє собою зрілий ІЇ-Т7 (амінокислоти 24-499). В інших варіантах здійснення
І-Т7 може включати повнорозмірний І-Т7, його фрагмент або варіант поліпептиду І-Т7, де фрагмент І-Т7 або варіант поліпептиду ІЇ-Т7 зберігає деякі або всі функціональні властивості активного І-Т7.
Повнорозмірний І-Т7 людини являє собою білок довжиною 499 амінокислоти (номер доступу Р5Б990О1), що містить сигнальний пептид (амінокислоти 1-23), позаклітинний домен (амінокислоти 24-446), трансмембранний домен (амінокислоти 447-467) і цитоплазматичний домен (амінокислоти 468-499). Позаклітинний домен містить чотири імуноглобуліноподібних домени С2 (амінокислоти 24-118, 123-213, 224-313 і 324-413). І.Т7 є представником родини генів імуноглобуліноподібного транскрипту, (І-Т) або лейкоцитарного імуноглобуліноподібного рецептора (ІК). Послідовність ІТ7 яванського макака надана як 5ЕО ІЮ МО:292:
РАТНМОАЕМІКРІ ММАЕРЕРМІМККРМТІМСОСТІ ЕАОЄМВІ ОКЕСМ5ЗІЗАНМІ КТГ ЕЗЕМК
АКЕ5БІРЗОММУЕНАСВУНСУМОБРАСМУЗЕРЗОРІ ЕІ ММТАУЗАРБІ ЗА РОЕРУМТЗОаУММТтІ ВСА
ЗВ с авЕТЕЕСОННАІ ЗМ/ТІ О5НОНМНИаИкеЕоОАГЕРУОаРІ ТЕЗМАаТеАСУаТмЕММТРУММУЗЕ
РБОРІ ОП УБИауУЗАКРЗІИЇ ТІ ОСРУМАРООМІ ТІ ОСаБОМамІАМАГУкКЕасраі РОВРОСОВО
АС БОАЗЕТІ МРУВОЗНОСОУАСУСАНМУЗЗКМЗАРБЗОРІ ОВІПАСОІРОВРБІ МОЇ СРТМАБ
СЕКМП І СОБМОРМЕТЕ Г АКЕСААНРРІ ВІ ВАЗТУВАСОМОАЕЕРМО5РУТЗАНАСТУВСМОЗНО
ЗОРМІИЇ ЗНЗОЗЕРІЕЇ МУМ5ЕАТЕТІ МРАОМКЗОЗКТАРНІ ОБУТМЕМІ ТА!АМИатасі МІМЕССШ
ЕЕАООБОВОЗРТАСЗОЕММЗАЕОМАРЕВУМЕРМ/ЕОІ (5ЕО І МО:292).
І.Т7 селективно експресується на підгрупі мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС), називаних плазмацитоїдними дендритними клітинами (рОС). рОС5 є основним джерелом імуномодулюючої молекули інтерферону (ІЕМ- альфа, і І-Т7 відіграє роль у регуляції вивільнення ІЕМ- альфа із цих клітин.
І. Зв'язуючи молекули проти ІС-Т7
У певних варіантах здійснення зв'язуючи ІСТ-7 молекули, надані в даному описі, являють собою антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, які містять послідовності і/або володіють властивостями зв'язуючими І-Т7 антитіл, наданих у даному описі. «ЕО ІЮ МО послідовностей антитіл до ІЇТ7 наведені в таблиці 2.
Таблиця 2
ЗЕО ІЮ МО послідовності антитіла до І Т7 . УН УН МІ. МІ 828 | 1 | 2 | з | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 оі-т7оо8о.3 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 оі-т70080.4 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 оі-ст7оо80.5 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 оі-т70080.6 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 оі-т70080.7 | 91 | 92 | 93 / 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100
Таблиця 2
ЗЕО ІЮ МО послідовності антитіла до І Т7 . УН УН М. М.
У певних варіантах здійснення зв'язування молекул, наприклад, антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних за винаходом, наприклад, антитіл 7С7,
І/Т70080, 17770080.1-І Т70080.7, 1/770083, 1 770083.1-І 170083.9, 1770089, 1770100,
І-Т70137, І.Т70142, І/Т70144 ії ІІ 770052 зв'язуються з ІІ Т7 і інгібують вивільнення ІЕМ-альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
У певних варіантах здійснення антитіла за винаходом включають антитіла до ІЇТ7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, які зв'язуються з ІІ Т7, наприклад, антитіла 7С7, ІСт70080, І. Т70080.1-ІІ 770080.7, 1.770083, ІІ Т70083.1-І Т170083.9, І 770089, І! 770100,
І-Т70137, 1.770142, ІСТ70144 їі І/ 770052. У певних варіантах здійснення антитіла до ІСТ7 зв'язуються з ІЇТ7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією І-Т7 людини, примата і миші.
В одному з варіантів здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з тим же епітопом ІСТ7, як ії антитіло 7С7, ІСТ70080, І/.770080.1-
І-770080.7, І.770083, І.Т70083.1-ІІ 770083.9, І 770089, 1.770100, ІСТ70137, І.770142, І. 7170144 або І-Т70052. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з тим же епітопом І-Т7, як і антитіло, що містить МН і МІ 7С7,
І/Т70080, 17770080.1-І Т70080.7, 1/770083, 1 770083.1-І 170083.9, 1770089, 1770100,
І-Т70137, ІСТ70142, ІТ70144 або І/Т70052. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з тим же епітопом ІГТ7, як і антитіло, що містить МН або МІ 7С7, ІТ70080, ІСТ70080.1-І 770080.7, І .Т70083, ІІ. 770083.1-
І-770083.9, 1.770089, 1.701000, І.770137, І.Т70142, І-Т70144 або І.Т70052.
В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з І/Т7 і конкурентно інгібує специфічне зв'язування антитіла 7С7,
І/Т70080, 11 770080.1-ІТ70080.7, 1770083, 1Т770083.1-І 770083. 9, І/Т70089, 1770100,
І-Т70137, І-Т70142, ІТ70144 або ІІ. Т70052 з І. Т7, наприклад, ІСТ7 людини, примата, миші або будь-яким сполученням І-Т7 людини, примата і миші. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з |/77 і конкурентно інгібує специфічне зв'язування антитіла, що містить МН ії МІ 7С7, ІСТ70080,
І.770080.1-І770080.7, 1770083, 1/770083.1-І 170083.9, 1/770089, 70100, 11770137,
І-Т70142, І-Т70144 або ІІ Т70052 з ІІ 77, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-якою комбінацією ІТ7 людини, примата і миші. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеної зв'язуючої молекули, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке специфічно зв'язується з І/Т7 і конкурентно інгібує специфічне зв'язування антитіла, що містить МН або МІ 7С7, ІСТт70080, І/.Т70080.1-І Т70080.7, І .Т70083,
І. 770083.1-І-Т70083.9, ІСТ70089, І.Т70100, ІСТ70137, ІСТ70142, І-Т70144 або І-Т70052, з ІІ 17, наприклад, І-Т7 людини, примата, миші або будь-яким сполученням І-Т7 людини, примата і миші.
У певних варіантах здійснення зв'язуюча молекула за винаходом містить амінокислотну послідовність, яка володіє щонайменше 80 95, 85 95, 88 о, 89 90, 90 Уо, 91 Фо, 92 90, 93 95, 94 Фо або 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю молекули еталонного антитіла до І/Т7. У додатковому варіанті здійснення зв'язуюча молекула має щонайменше 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з еталонним антитілом. У певних варіантах здійснення еталонне антитіло являє собою 7С7, ІІ Т70080, ІІ 770080.1-ІІ 770080.7,
І.Т70083, 1/770083.1-І.Т70083.9, І/Т70089, 1СТ70100, 1СТ70137, І/Т70142, ІСТ70144 або
І.Т70052.
В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, що містить, складається по суті з або, що складається з домену МН, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності МН 5ЕО ІЮО МО: 22, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252 і 262, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, що містить домен МН, специфічно або переважно зв'язується з І/Т7. У додатковому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне інгібує вивільнення ІБМ- альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
У додатковому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, що містить, складається по суті з або, що складається з домену МІ, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності М ЗЕО ІЮО МО: 27, 47, 57,67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257 або 267, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, що містить домен Мі, специфічно або
Зо переважно зв'язується з ІЇ/Т7. У додатковому варіанті здійснення і антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне інгібує вивільнення ІБМ- альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
У додатковому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, що містить, складається по суті з або, що складається з домену МН і домену Мі, які містять амінокислотні послідовності, які є щонайменше на 80 95, 85 95, 90 965, 91 95, 92 95, 93 о, 94 95, 95 96, 96 96, 97 90, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентичними послідовностям МН і МІ ЗЕО ІЮ МО: 22і127;542і47;52157;62167;721і77; 82 ів7;5921і97; 1021107; 1121117;1221і127;132і137; 142 і 147; 1521157; 1621і1167;172і177;182 і 187; 1921 197; 2021207; 2121 217; 222 і 227; 232 і 237; 242 і 247; 252 і 257 або 262 і 267, відповідно, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, що містить домени МН і МІ, специфічно або переважно зв'язується з ІЇ/Т7. У додатковому варіанті здійснення і антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне інгібує вивільнення ІЕМ- альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
У додатковому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, що містить, складається по суті з або, що складається з домену МН і домену МІ, які містять послідовності МН-СОВІ, МН-СОВ2, УН-
СОВЗ, МІ-СОВІ1, МІ -СОВК2 і МІ-СОВЗ 5ЕО ІО МО: 23, 24, 25, 28, 29 і 30; 43, 44, 45, 48, 49 і 50; 53, 54, 55, 58,59160; 63, 64, 65,68,691 70; 73, 74, 74,78, 79180; 83, 84, 85, 88, 89 і 90; 93, 94, 95, 98, 991100; 103, 104, 105, 108, 109 ї 110; 113, 114, 115, 118, 119 і 120; 123, 124, 125, 128, 129
БО і 130; 133, 134, 135, 138, 139 і 140; 143, 144, 145, 148, 149 і 150; 153, 154, 155, 158, 159 і 160; 163, 164, 165, 168, 169 і 170; 173, 174, 175, 178, 1791 180; 183, 184, 185, 188, 189 і 190; 193, 194, 195, 198, 199 і 200; 203, 204, 205, 208, 209 і 210; 213, 214, 215, 218, 219 і 220; 223, 224, 225, 228, 229 і 230; 233, 234, 235, 238, 239 і 240; 243, 244, 245, 248, 249 і 250; 253, 254, 255, 258, 259 і 260; 263, 264, 265, 268, 269 і 270, відповідно, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, що містить домени МН і МІ, специфічно або переважно зв'язується з ЇЇ 17.
У додатковому варіанті здійснення і антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне інгібує вивільнення ІЕМ- альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
Підходящі біологічно активні варіанти антитіл до І-Т7 за винаходом можна використовувати в способах за даним винаходом. Такі варіанти зберігають бажані властивості зв'язування батьківського антитіла до І-Т7. Способи одержання варіантів антитіл, як правило, доступні в даній галузі.
Способи мутагенезу і змін нуклеотидної послідовності добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, УлаіІКег апа Саавіга, еаз. (1983) Тесппіднез іп МоїІесціаг Віоїоду (МасміМйап Рибіїзпіпд
Сотрапу, Мем мок); КипкКеї, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 82:488-492 (1985); Кипкеї еї а!., Меїйподзь
Епгутої!. 154:361-382 (1987); Затргоок еї а!. (1989) МоїІесшаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї (Соїа зргіпд Нагтог, М. У.); патент США Мо 4 873192 і цитовані в них посилання, включені в даний опис за допомогою посилання. Посібник щодо відповідних замін амінокислот, які не впливають на біологічну активність поліпептиду, що представляє інтерес, можна знайти в моделі в Юаупої еї аІ. (1978) в АЙЦазх ої Ргоївіп Зеднепсе апа 5ігисіиге (Маї!. Віотеа. Вев5. Еоипа., УМазпіпаїоп, 0. С.), рр. 345-352, повністю включеному в даний опис за допомогою посилання. У моделі Баупоїї еї аї. використовують матрицю подоби точкової мутації, що закріпилася, (РАМ) амінокислоти (матриця РАМ 250) для визначення підходящих консервативних замін амінокислот.
Консервативні заміни, такі як заміна однієї амінокислоти іншою, що володіє подібними властивостями, можуть бути корисними. Приклади консервативних замін амінокислот, як зазначено в матриці РАМ 250 моделі ЮБаупоїй еї а включають, але не обмежуються ними, сіуєАа, Ма!еїІеєї єи, Азресіи, Гуз«езАго, Азпе»Сіп ії РпеєттретТуг.
При конструюванні варіантів зв'язуючих молекул проти І-Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного роблять модифікації таким чином, що варіанти зберігають необхідні властивості, наприклад, є здатними специфічно зв'язуватися з
І-Т7, і в певних варіантах здійснення є здатними інгібувати вивільнення ІЕМ-альфа. Очевидно, що будь-які мутації, проведені в ДНК, що кодує варіант поліпептиду, не повинні виносити послідовність за рамку зчитування. У певному варіанті здійснення будь-які мутації, проведені в
ДНК, не будуть створювати комплементарні ділянки, які можуть утворювати вторинну структуру
ІРНК.
Способи вимірювання специфічності зв'язування антитіла зв'язуючої молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, включають, але не обмежуються ними, стандартні аналізи конкурентного зв'язування, аналізи цитотоксичності, аналізи вивільнення ІЕМ, аналізи ЕГІЗА тощо.
Під час обговорення в даному описі незалежно від того, чи є який-небудь конкретний поліпептид, включаючи константні ділянки, СОР, домени МН або домени У, описувані в даному описі, щонайменше на 65 то, 70 Зо, 75 б, 80 то, 85 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 95, 98 95, 99 95 або навіть 100 95 ідентичним іншому поліпептиду, 95 ідентичності можна визначати із застосуванням способів і комп'ютерних програм/програмного забезпечення, відомих у даній галузі, такі як, але не обмежуючись ними, програма ВЕ5ТРІТ (М/5сопвіп зедцепсе Апаїузіз РасКкаде, Мегзіоп 8 для Опіх, Сепеїйс5 Сотршег Сгоцир, Опімегейу Кезеагсп
Рак, 575 Зсіепсе Огіме, Мадізоп, УмМі5. 53711). В ВЕ5ТРЇІТ використовують алгоритм локальної гомології 5піййп апа Умаїептанп (1981) Адм. Аррі. Май. 2:482-489, для пошуку ліпшого сегмента гомології між двома послідовностями. При використанні ВЕЗТРЕЇТ або будь-якої іншої програми для вирівнювання послідовностей для визначення, чи є конкретна послідовність, наприклад, на 95 95 ідентичною еталонній послідовності за даним винаходом, параметри встановлюють, як відомо, таким чином, щоб відсоток ідентичності розраховувати по всій довжині послідовності еталонного поліпептиду, і щоб допускати пропуски в гомології до 5 95 від загального числа амінокислот в еталонній послідовності.
Для цілей за даним винаходом відсоток ідентичність послідовності можна визначати з використанням алгоритму пошуку гомології Сміта-Уотермана з використанням пошуку афінного пропуску зі штрафом за створення пропуску 12 і штрафом за продовження пропуску 2, матриці
ВГОБИОМ 62. Алгоритм пошуку гомології Сміта-Уотермана описаний в 5тійй апа У/аїегтап (1981) Айм. Аррі. Май. 2:482-489. Варіант, наприклад, може відрізнятися від еталонного антитіла до І/Т7 (наприклад, 7С7, І/Т70080, І.770080.1-І.Т70080.7, І.Т70083, І. 770083.1-
І-Т70083.9, 1.770089, І.Т70100, 1.770137, 1.770142, І/Т70144 або І Т70052) тільки на 1-15 амінокислотних залишків, тільки на 1-10 амінокислотних залишків, таких як 6-10, тільки на 5, тільки на 4, 3, 2, або навіть на 1 амінокислотний залишок.
Точна хімічна структура поліпептиду, здатного специфічно зв'язуватися з ІІТ7 і зберігати бажану активність залежить від ряду факторів. Внаслідок того, що в молекулі присутні аміно- і карбоксильні групи, які іонізуються, конкретний поліпептид можна одержувати як кислу або основну сіль, або в нейтральній формі. Усі такі препарати, які зберігають свою біологічну активність при поміщенні в підходящі умови навколишнього середовища, входять у визначення антитіл до ІСТ7, як використовують у даному описі. Крім того, первинну амінокислотну бо послідовність поліпептиду можна збільшувати за допомогою дериватизації з використанням фрагментів цукрів (глікозилювання) або за допомогою інших додаткових молекул, таких як ліпіди, фосфатні, ацетильні групи тощо. її також можна збільшувати за допомогою кон'югації із сахаридами. Певні аспекти такого збільшення проводять через системи посттрансляційного процесінгу продукуючого хазяїна; інші такі модифікації можна вводити іп міїго. У будь-якому разі такі модифікації входять у визначення антитіла до І-Т7, використовуваного в даному описі, за умови, що бажані властивості антитіла до І-Т7 не порушуються. Очікують, що такі модифікації можуть кількісно або якісно впливати на активність, через збільшення або зменшення активності поліпептиду в різних аналізах. Крім того, окремі амінокислотні залишки в ланцюзі можна модифікувати через окиснення, відновлення або іншої дериватизації, і поліпептид можна розщеплювати з одержанням фрагментів, які зберігають активність. Такі зміни, які не порушують бажані властивості (наприклад, специфічність зв'язування до ІТ7, афінність зв'язування і супутню активність, наприклад, здатність інгібувати вивільнення, що направляється ІТ7, цитокінів гладкими клітинами, ендотеліальними клітинами і проліферацію клітин ТЕ-1) не виключає послідовність поліпептиду з визначення антитіл, що представляють інтерес, до І 77, як використовують у даному описі.
Рівень техніки надає основне керівництво щодо одержання і використання варіантів поліпептидів. При одержанні варіантів зв'язуючої молекули проти ІТ7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, фахівець у даній галузі може легко визначати, які модифікації в нативній нуклеотидній або амінокислотній послідовності білка призведуть до варіанта, який є придатним для використання як терапевтично активного компонента фармацевтичної композиції, використовуваної в способах за даним винаходом.
Константну ділянку антитіла до І-Т7 можна піддавати мутації для зміни ефекторної функції декількома способами. Наприклад, див. патент США Мо 673705681 і публікацію патентної заявки США Мо 2004/0132101А1, у яких описані мутації Ес, які оптимізують зв'язування антитіла з Ес-рецепторами.
У певних антитілах до ІТ7 ділянку Ес можна піддавати мутації для підвищення ефекторної функції з використанням технік, відомих з рівня техніки. Наприклад, делеція або інактивація (через точкові мутації або іншими способами) домену константної ділянки може зменшувати зв'язування Ес- рецептора циркулюючого модифікованого антитіла. В інших випадках може відбуватися наступне: модифікації константної ділянки відповідно до даного винаходу послабляють зв'язування комплементу і, таким чином, зменшують час напіввиведення із сироватки і неспецифічне зв'язування кон'югованого цитотоксину. Ще одні інші модифікації константної ділянки можна використовувати для модифікації дисульфідних зв'язків або олігосахаридних фрагментів, що забезпечить можливість підвищеної локалізації внаслідок збільшеної антигенної специфічності або гнучкості антитіла. Одержуваний фізіологічний профіль, біодоступність і інші біохімічні ефекти модифікацій, такі як біорозподілення і час напіввиведення із сироватки, можна легко вимірювати і кількісно оцінювати з використанням добре відомих імунологічних технік без зайвого експериментування.
Певні антитіла до ІТ7, надані в даному описі, є афукозильованими. Антитіла, що не містять корову фукозу залишки з М-гліканів Ес, проявляють сильну АЮСС при більш низьких концентраціях з набагато більш високою ефективністю в порівнянні з фукозильованими аналогами, і вони можуть вислизати від інгібуючої дії імуноглобуліну С (0) сироватки щодо
АрСС у результаті свого сильного зв'язування з гамма-рецептором ПІ а (Ес ЕсувІП! а).
Антитіла до І/Т7 за винаходом також включають похідні, які модифікують, наприклад, ковалентним приєднанням будь-якого типу молекули з антитілом, таким чином, що ковалентне приєднання не порушує специфічне зв'язування антитіла з його когнатним епітопом. Наприклад, але не як обмеження, похідні антитіл включають антитіла, які модифікували, наприклад, глікозилюванням, ацетилуванням, пегілюванням, фосфорилюванням, амідуванням, дериватизацією відомими захисними/блокувальними групами, протеолітичним розщепленням, зв'язуванням із клітинним лігандом або іншим білком тощо. Будь-яку з багатьох хімічних модифікацій можна проводити відомими способами, включаючи, але, не обмежуючись ними, специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілювання тощо. Додатково похідне може містити одну або більше некласичних амінокислот. "Консервативна заміна амінокислоти" являє собою заміну, при якій амінокислотний залишок заміняють амінокислотним залишком, що містить бічний ланцюг з аналогічним зарядом. Родини амінокислотних залишків з бічними ланцюгами з аналогічними зарядами були визначені в рівні техніці. Ці родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислі бічні ланцюги (наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, бо тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін,
фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин).
Альтернативно, мутації можна вводити у випадковому порядку по всій довжині або частині послідовності, що кодує, таким чином, як за допомогою мутагенезу, що насичує, і багато проводити скринінг одержуваних мутантів на біологічну активність для ідентифікації мутантів, які зберігають активність (наприклад, здатність зв'язуватися з антитілом до поліпептиду І-17).
Наприклад, можна вводити мутації тільки в каркасні ділянки або тільки в ділянки СОК молекули антитіла. Мутації що вводяться, можуть бути мовчазними або нейтральними безглуздими мутаціями, тобто не виявляють або виявляють незначний ефект на здатність антитіла зв'язуватися з антигеном. Ці типи мутацій можуть бути придатними для оптимізації частоти використання кодонів або поліпшення продукції антитіла гібридоми. Альтернативно, ненейтральні безглузді мутації можуть змінювати здатність антитіла зв'язуватися з антигеном.
Локалізація найбільш мовчазних і нейтральних безглуздих мутацій найімовірніше припадає на каркасні ділянки, тоді як локалізації найбільш не нейтральних безглуздих мутацій найімовірніше припадає на СОК, хоча це не є абсолютною вимогою. Фахівець у даній галузі здатний конструювати і тестувати мутантні молекули з бажаними властивостями, такими як відсутність зміни антигензв'язуючої активності або зміна активності зв'язування (наприклад, поліпшення антигензв'язуючої активності або зміна специфічності антитіла). Після мутагенезу білок, що кодується, можна загальноприйнято експресувати і функціональну і/або біологічну активність білка, що кодується, (наприклад, здатність імуноспецифічно зв'язуватися щонайменше з одним епітопом поліпептиду ІЇ-Т7) можна визначати з використанням технік, описуваних у даному описі, або загальноприйнятими техніками, що модифікують, відомими в даній галузі.
У певних варіантах здійснення антитіла до І-Т7 за винаходом містять щонайменше одну оптимізовану визначальну комплементарність ділянку (СОК). Під "оптгимізованою СОК" мають на увазі, що СОК модифікували і оптимізовані послідовності відбирали на підставі стійкої або поліпшеної афінності зв'язування і/або активності антитіла до І-Т7, яка передається антитілу до
І-Т7, що містить оптимізовану СОК. "Активність антитіла до І-Т7" може включати, наприклад, активність, яка модулює одну або більше наступних нижче видів активності, асоційованих з
І-Т7, наприклад, кероване І-Т7 вивільнення інтерферону плазмацитоїдні дендритні клітини, цитотоксичність до експресуючих ІТ7 клітин, або будь-яка інша активність, пов'язана з ІТ7.
Активність антитіла до ІЇ-Т7 також може бути зв'язана зі зниженням частоти виникнення або тяжкості захворювань, пов'язаних з експресією І-Т7, включаючи, але, не обмежуючись ними, певні типи аутоїмунних станів, наприклад, системний червоний вовчак, хронічний ревматизм і псоріаз. Модифікації можуть поліпшувати заміну амінокислотних залишків в СОК, таким чином, що антитіло до ІЇТ7 зберігає специфічність до антигену ІЇТ7 і володіє поліпшеною афінністю зв'язування і/або поліпшеною активністю антитіла до І-Т7.
ЇМ. Полінуклеотиди, що кодують антитіла до ІСТ7
Даний винахід також належить до молекул нуклеїнової кислоти, що кодує антитіла до ІЇТ7 за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні.
У додатковому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного полінуклеотиду, що містить, складається по суті або, що складається з нуклеїнової кислоти, що кодує домен УН, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 95, 85 Фо, 90 Фо, 91 о, 92 96, 93 9, 94 9», 95 Фо, 96 9», 97 9, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною еталонній послідовності домену
МН поліпептиду, що містить ЗЕО ІЮ МО: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232 або 242, де антитіло до ІЇТ7, що містить домен МН, що кодується, специфічно або переважно зв'язується з ІЇТ7. У певних варіантах здійснення полінуклеотид кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, яке інгібує вивільнення ІЕМ-альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
У додатковому варіанті здійснення даний винахід належить до виділеного полінуклеотиду, що містить, складається по суті або, що складається з нуклеїнової кислоти, що кодує домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 95, 85 Фо, 90 Фо, 91 о, 92 96, 93 9, 94 9», 95 Фо, 96 9», 97 9, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною еталонній послідовності домену
МІ. поліпептиду, що містить ЗЕО ІЮ МО: 17,27, 37,47,57,67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237 або 247, де антитіло до ІЇ-Т7, що містить домен Мі, що кодується, специфічно або переважно зв'язується з ІЇ/Т7. У певних варіантах здійснення полінуклеотид кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, яке інгібує вивільнення ІЕМ-альфа плазмацитоїдними дендритними клітинами.
Будь-який з описаних вище полінуклеотидів може додатково містити додаткові нуклеїнові кислоти, що кодують, наприклад, сигнальний пептид для спрямовування секреції поліпептиду, 60 що кодується, константних ділянок антитіла, як описано в даному описі, або інших гетерологічних поліпептидів, як описано в даному описі. Також, як описано більш докладно в іншому місці в даному описі, даний винахід належить до композицій, що містять один або більше полінуклеотидів, описаних вище.
В одному з варіантів здійснення винахід включає композиції, що містять перший полінуклеотид і другий полінуклеотид, де зазначений перший полінуклеотид кодує домен УН, як описано в даному описі, і де зазначений другий полінуклеотид кодує домен МІ., як описано в даному описі. Зокрема, композиція може містити, складатися по суті або складатися з кодуючого домен УН полінуклеотиду, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231 або 241, і кодуючого домен МІ. полінуклеотиду, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО:16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236 або 246. Композиція також може містити, складатися по суті або складатися з кодуючого домен МН полінуклеотиду, що кодує послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232 або 242, і кодуючого домен МІ полінуклеотиду, що кодує послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257 або 2 67. У певних варіантах здійснення кодуючий домен МН поліпептид і кодуючий домен МІ. поліпептид перебувають у тому самому векторі. У певних варіантах здійснення кодуючий домен МН поліпептид і кодуючий домен МІ. поліпептид перебувають у різних векторах.
Даний винахід також належить до фрагментів полінуклеотидів за винаходом, як описано де- небудь в іншому місці. Додатково полінуклеотиди, які кодують злиті поліпептиди, фрагменти
Еаь і інші похідні, як описано в даному описі, також передбачені винаходом.
Полінуклеотиди можна одержувати або виготовляти будь-яким відомим у даній галузі способом. Наприклад, якщо відома нуклеотидна послідовність антитіла, полінуклеотид, що кодує антитіло, можна збирати з хімічно синтезованих олігонуклеотидів (наприклад, як описано в Кийтеїєег еї аіІ., Віо Тесппідиеб5 17:242 (1994)), що в короткому викладі включає синтез олігонуклеотидів, що перекриваються, які містять ділянки послідовностей, що кодують антитіло, вирівнювання і о літування таких олігонуклеотидів, а потім ампліфікацію лігованих олігонуклеотидів за допомогою ПЛР.
Альтернативно, полінуклеотид, що кодує антитіло до І/Т7 або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне за винаходом, можна одержувати з нуклеїнової кислоти з підходящого джерела. Якщо клон, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує конкретне антитіло, недоступний, але відома послідовність молекули антитіла, нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, можна хімічно синтезувати або одержувати з підходящого джерела (наприклад, бібліотеки кКДНК антитіл або бібліотеки КДНК, одержуваної з будь-якої тканини або клітин, що експресують антитіло або інше антитіло до І-Т7, або нуклеїнової кислоти, наприклад, полі
АЖТРНК, виділеної з будь-якої тканини або клітин, що експресують антитіло або інше антитіло до
І-Т7, таких як гібридомні клітини, відібрані для експресії антитіла) ампліфікацією ПЛР. із використанням синтетичних праймерів, що гібридизуються на 3'- і 5'-кінцях послідовностей, або клонуванням з використанням олігонуклеотидного зонда, специфічного до послідовності конкретного гена для ідентифікації, наприклад, лона кКДНК бібліотеки кДНК, що кодує антитіло або інше антитіло до І-Т7. Ампліфіковані нуклеїнові кислоти, одержувані ПЛР, можна потім клонувати в клонуючі вектори, що реплікуються, будь-яким добре відомим у даній галузі способом.
Після того, як визначають нуклеотидну послідовність і відповідну амінокислотну послідовність антитіла до І-Т7 або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, його нуклеотидну послідовність можна піддавати маніпуляції із застосуванням добре відомих у даній галузі способів маніпуляції нуклеотидними послідовностями, наприклад, технології рекомбінантної ДНК, сайт-спрямований мутагенез, ПЛР тощо, (див., наприклад, техніки, описані в затбгоок еї аїЇ. (1990) МоїІесшаг Сіопіпд, А Гарогаїгу Мапиаї! (2п4 єа.; Соїй 5ргіпд Нагрог
І арогаїогу, Соїд бргіпа Натог, М.У.) апа А!зибеї еї а!., єд5. (1998) Ситепі Ргоїосоїв іп МоЇІесшціаг
Віоїоду (опп Уміеу 5 Зоп5, МУ), які повністю включені за допомогою посилання в даному описі), для одержання антитіл з різною амінокислотною послідовністю, наприклад, для проведення замін амінокислот, делецій і/або вставок.
Полінуклеотид, що кодує зв'язуюча молекула проти ІЇТ7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, може складатися з будь-якого полірибонуклеотиду або полідезоксирибонуклеотиду, який може представляти собою немодифіковану РНК або ДНК, або модифіковану РНК або ДНК. Наприклад, полінуклеотид, що кодує антитіло до ІСТ7, або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне може 60 складатися з одноланцюгової і дволанцюгової ДНК, ДНК, яка є сумішшю одноланцюгових і дволанцюгових ділянок, одноланцюгової і дволанцюгової РНК, і РНК, яка є сумішшю одноланцюгових і дволанцюгових ділянок, гібридних молекул, що містять ДНК і РНК, які можуть бути одноланцюговими або, що більш характерно, дволанцюговими або сумішшю одноланцюгових і дволанцюгових ділянок. Крім того, полінуклеотид, що кодує зв'язуюча молекула проти ІЇТ7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне може складатися із триланцюгових ділянок, що містять РНК або ДНК або як РНК, так і
ДНК. Полінуклеотид, що кодує зв'язуюча молекула проти І-Т7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, також може містити одну або більше модифікованих основ або кістяків ДНК або РНК, модифікованих для стабільності або з інших причин. "Модифіковані" основи включають, наприклад, тритильовані основи і незвичайні основи, такі як інозин. Ряд модифікацій можна вносити в ДНК і РНК; таким чином, "полінуклеотид" включає хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми.
Виділений полінуклеотид, що кодує неприродний варіант поліпептиду, який походить з імуноглобуліну (наприклад, частини важкого ланцюга або частини легкого ланцюга імуноглобуліну), можна одержувати шляхом внесення однієї або декількох нуклеотидних замін, вставок або делецій у нуклеотидну послідовність імуноглобуліну, так щоб вносити в білок, що кодується, одну або більше амінокислотних замін, вставок або делецій. Мутації можна вводити стандартними способами, такими як сайт-специфічний мутагенез і опосередкований ПЛР мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни можна одержувати в одному або більше не відносних до незамінних амінокислотних залишків.
М. Злиті білки і кон'югати антитіла
Як більш докладно описано в іншому місці в даному описі, зв'язуючі молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, можна додатково піддавати рекомбінантному злиттю з гетерологічним поліпептидом на М- або
С-кінці або хімічно кон'югувати (включаючи ковалентну і нековалентну кон'югації) з поліпептидами або іншими композиціями. Наприклад, антитіла до І/Т7 можна піддавати рекомбінантному злиттю або кон'югувати із молекулами, придатними як мітки в аналізах для детекції і ефекторними молекулами, такими як гетерологічні поліпептиди, лікарські засоби, радіонукліди або токсини. Див., наприклад, публікації РОСТ УМО 92/08495; УМО 91/14438;. УМО
Зо 89/12624; патент США Мо 5314995 і ЕР 396387.
Антитіла до І-Т7 за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можуть включати похідні, які модифікували, тобто шляхом ковалентного приєднання будь-якого типу молекули до антитіла, таким чином, щоб ковалентне приєднання не перешкоджало зв'язуванню антитіла з І-Т7. Наприклад, але, не обмежуючись цим, похідні антитіл включають антитіла, які модифікували, наприклад, шляхом глікозилювання, ацетилування, пегілювання, фосфорилювання, амідування, дериватизація за допомогою відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичного розщеплення, зв'язування із клітинним лігандом або іншим білком тощо.
Будь-які з багатьох хімічних модифікацій можна проводити відомими способами, включаючи, але не обмежуючись ними, специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілювання тощо. Крім того, похідне може містити одну або декілька некласичних амінокислот.
Зв'язуючі молекули проти ІЇТ7, наприклад антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можуть складатися з амінокислот, зв'язаних одна з одною пептидними зв'язками або модифікованими пептидними зв'язками, тобто пептидних ізостер, і можуть містити амінокислоти, відмінні від кодованих генами 20 амінокислот. Наприклад, антитіла до ІСТ7/ можна модифікувати за допомогою природних процесів, таких як посттрансляційний процесінг, або способами хімічної модифікації, які добре відомі в даній галузі. Такі модифікації широко описані в основних посібниках і в більш докладних монографіях, а також у великій науковій літературі. Модифікації можуть відбуватися в будь-якій частині зв'язуючої молекули проти ІТ7, включаючи пептидний кістяк, бічні ланцюги амінокислот і М- або
С-кінці, або в таких молекулах, як вуглеводи. Слід розуміти, що той самий тип модифікації може бути присутнім в однаковому або в різному ступені в декількох ділянках у даній зв'язуючій молекулі проти І-Т7. Також дана зв'язуюча молекула проти ІЇ-Т7 може містити багато типів модифікацій. Зв'язуючі молекули проти ІТ7 можуть бути розгалуженими, наприклад, у результаті убіквітинілювання, і вони можуть бути циклічними з розгалуженням або без нього.
Циклічна, розгалужена і розгалужена циклічна зв'язуюча молекула проти І/Т7 може бути результатом посттрансляційних природних процесів, або її можна одержувати синтетичними способами. Модифікації включають ацетилування, ацилювання, АЮОР-рибозилювання, амідування, ковалентне приєднання флавіну, ковалентне приєднання групи гема, ковалентне приєднання нуклеотиду або похідного нуклеотиду, ковалентне приєднання ліпіду або похідного бо ліпіду, ковалентне приєднання фосфотидилінозитолу, зшивання, циклізацію, утворення дисульфідних зв'язків, деметилювання, утворення ковалентних зшивок, утворення цистеїну, утворення піроглутамату, формілювання, гамма-карбоксилювання, глікозилювання, утворення
СРІ-якоря, гідроксилювання, йодування, метилювання, міристоїлування, окиснення, пегілювання, протеолітичний процесінг, фосфорилювання, пренілування, рацемізацію, селеноїлування, сульфатування, опосередковуване транспортною РНК додавання амінокислот до білків, таке як аргінілування і убіквітинілювання (див., наприклад, Ргоїеіп5-Сігисіге апа
МоїІесшіаг Ргорепіе5, Т.Е. Стеідпіоп, М.Н. Ггеєетап апа Сотрапу, Мемж/ Мої 2па Еа. (1993);
РознНгапзіайопа! Сомаїепі Моадіїісайоп ОЇ Ргоївіп5, В.С. Чдоппзоп, Ей. (1983), Асадетіс Ргезв, Мем
Мої, р. 1-12; Зсійег єї аІ., Мей Епгутої! 182:626-646 (1990); Вацап еї аЇ., Апп МУ Асай 5сі 663:48-62 (1992)).
Даний винахід також належить до злитих білків, що містять антитіло до Ї/Т7 або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне і гетерологічний поліпептид. Гетерологічний поліпептид, з яким зливають антитіло, може бути придатним для функції або придатним для спрямованої доставки до клітин, експресуючих поліпептид проти І-Т7.
В одному з варіантів здійснення злитий білок за винаходом містить, складаєтсья по суті або складається з поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність будь-якого одного або більше доменів УН антитіла за винаходом або амінокислотну послідовність будь-якого одного або більше доменів Мі антитіло за винаходом або її фрагменти, варіанти або похідні і гетерологічну послідовність поліпептиду.
В іншому варіанті здійснення злитий білок для застосування в способах діагностики і лікування, описуваних у даному описі, містить, складається по суті або складається з поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність будь-якої однієї, двох, трьох СОК домену
МН антитіла до ІСТ7 або його фрагментів, варіантів або похідних, або амінокислотну послідовність будь-якої однієї двох, трьох СОК домену Мі антитіла до І/Т7 або його фрагментів, варіантів або похідних, і послідовність гетерологічного поліпептиду. В одному з варіантів здійснення злитий білок містить поліпептид, що містить амінокислотну послідовність щонайменше одного домену МН антитіла до І-Т7 за винаходом і амінокислотну послідовність щонайменше одного домену Мі. антитіла до І-Т7 за винаходом або його фрагментів, похідних або варіантів, і послідовність гетерологічного поліпептиду. У певних варіантах здійснення домени МН і Мі. злитого білка відповідають антитілу з одного джерела (або фрагменту 5сЕм або
Раб), яке специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом І-Т7. У ще одному іншому варіанті здійснення злитий білок для застосування в способах діагностики і лікування, описуваних у даному описі, містить поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь- якої однієї двох, трьох або більше СОК домену МН антитіла до І-Т7 ї амінокислотну послідовність будь-якої однієї, двох, трьох або більше СОК домену МІ. антитіла до І Т7 або його фрагментів або варіантів, і послідовність гетерологічного поліпептиду. У певних варіантах здійснення дві, три, чотири, п'ять, шість або більше СОК домену МН або домену Мі. відповідають антитілу з одного джерела (або фрагменту 5сЕм або Раб) за винаходом. Також винахід охоплює молекули нуклеїнових кислот, що кодують такі злиті білки.
Ілюстративні злиті білки, описані в літературі, включають злиття Т-клітинного рецептора (Сазсоїдпе єї аїЇ., Ргос Майї Асай 5сі ОБА 54:2936-2940 (1987); 004 (Сароп єї аї., Машгє 337:525531 (1989); ТтайпескКег єї а!., Маште 339:68-70 (1989); 7еНтвізвві єї а!., ОМА Сеї! Віої. ОБА 9:347-353 (1990); і Вугп еї аїЇ., Машге 344:667-670 (1990)); І -селектину (рецептор хомінгу) (У/аїзоп вї аї., у. Сеї! Віо!. 110:2221-2229 (1990); і УМаїхоп еї аї., Маїшге 349:164-167 (1991)); С044 (Агипйо еї а!., СеїІ (57:13031313 (1990)); СО28 і В7 (І іпзіІеу єї а!., У. Ехр Меа. 773:721-730 (1991));
СТІ А-4 (І ізІєеу єї аї., У. Ехр Мед. 174:561-569 (1991)); 022 (СіатепкКоміс єї а!., Сеї! 66: 1133-1144 (1991)); рецептора ТМЕ (А5зпКепаі еї аЇ., Ргос Май Асай За ОБА 55:10535-10539 (1991);
Ї езвіІацег єї аї., Єик 9. Іттипої. 27:2883-2886 (1991); і Рер-реї єї а!., У. Ехр Мед. 774: 1483-1489 (1991)); і рецептора ІЗЕ (Кідду/ау апа Соптап, у. Сеї! Віої! Мої. 115, Арзігасі Мо 1448 (1991)).
Як обговорювалося в інших розділах даного опису, зв'язуючі молекули проти 77, наприклад, антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можна зливати з гетерологічними поліпептидами для збільшення часу напівжиття іп мімо поліпептидів або для застосування в імунологічних аналізах із застосуванням відомих у даному рівні техніки способів. Наприклад, в одному з варіантів здійснення РЕС можна кон'югувати із антитілами до ІЇТ7 за винаходом для збільшення їх часу напівжиття іп мімо. Див. І еопод еї аї.,
СуїоКіпе 16:106 (2001); Адм. іп Огид Оєїїм. Вем. 54:531 (2002); ог М/вїк єї а!., Віоспет. бос.
Ткапзасіопз5 30:512 (2002).
Крім того, зв'язуючі молекули проти І/Т7, наприклад антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можна зливати з маркерними 60 послідовностями, такими як пептид, для полегшення їх очищення або детекції. У певних варіантах здійснення маркерна амінокислотна послідовність являє собою гекса-гістидиновий пептид, такий як маркер, наданий у векторі РОЕ (ОІАСЕМ, Іпс., 9259 ЕюЮп Амепиє, Спаїзуопй,
Саїїї., 91311), поряд з іншими, багато з яких є комерційно доступними. Як описано в Сепія еї аї.,
Ргос. Май. Асай. осі. ОБА 55:821-824 (1989), наприклад, гексагістидин забезпечує зручне очищення злитого білка. Інші пептидні мітки, придатні для очищення, включають, але не обмежуються ними, мітку "НА", яка відповідає епітопу, що походить з білка гемагглютиніну вірусу грипу (УМізОПп еї а!., СеїІ 37:161 (1984)) і мітку "Пад".
Злиті білюим можна одержувати із застосуванням способів, які добре відомі в даній галузі (див. наприклад патенти США Мо 5116964 і 5225538). Точну ділянку, у якій можна проводити злиття, можна вибирати емпірично для оптимізації секреції або характеристик зв'язування злитого білка. Потім ДНК, що кодує злитий білок, трансфікують у клітину-хазяїна для експресії.
Зв'язуючі молекули проти ІСТ7, наприклад, антитіла за даним винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можна використовувати в некон'югованій формі або їх можна кон'югувати щонайменше з одним типом молекул, наприклад, для поліпшення терапевтичних властивостей молекули, для полегшення детекції мішені або для візуалізації і терапії пацієнта. Зв'язуючі молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можна мітити або кон'югувати або до очищення, або після нього, або коли проводять очищення.
Зокрема, антитіла до ІЇ/Т7 за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні можна кон'югувати із терапевтичними засобами, проліками, пептидами, білками, ферментами, вірусами, ліпідами, модифікаторами біологічної відповіді фармацевтичними засобами або РЕЯ.
Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що кон'югати також можна формувати із застосуванням різних способів залежно від вибраного засобу, що підлягає кон'югації. Наприклад, кон'югати з біотином одержують, наприклад, за допомогою реакції зв'язуючого поліпептиду з активованим складним ефіром біотину, таким як М-гідроксисукцинімідний ефір біотину. Подібним чином кон'югати із флуоресцентним маркером можна одержувати в присутності приєднувального засобу, що приєднує, наприклад засобів, перерахованих у даному описі, або за допомогою реакції з ізотіоціанатом, таким як флуоресцеїн-ізотіоціанат. Кон'югати антитіл до І/Т7 за
Зо винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні одержують аналогічним чином.
Даний винахід додатково охоплює зв'язуючі молекули проти ІГТ7, наприклад, антитіла за винаходом або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, кон'юговані з діагностичним або терапевтичним засобом. Антитіла до І-Т7, включаючи їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, можна використовувати в діагностичних цілях, наприклад, для моніторингу розвитку або прогресування захворювання як частини процедури клінічного дослідження, наприклад, для визначення ефективності даної схеми лікування і/або профілактики. Наприклад, детекцію можна полегшувати зв'язуванням антитіла до І/Т7 або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного з речовиною, яка детектується. Приклади речовин, яку детектуються, включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини, біолюмінесцентні речовини, радіоактивні речовини, позитронно- активні метали при використанні різних способів позитронно-емісійної томографії і нерадіоактивних іонів парамагнітних металів. Див., наприклад, патент СІЛА Мо 4741900 для іонів металів, які можна кон'югувати із антитілами для застосування як діагностичних засобів відповідно до даного винаходу. Приклади підходящих ферментів включають пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, р-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади підходящих комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади підходящих флуоресцентних речовин включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїну ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклад люмінесцентної речовини включає люмінол; приклади біолюмінесцентних речовин включають люциферазу, люциферин і екворин, і приклади придатної радіоактивної речовини включають 125, 191), 11|д, зо або 99Тб.
Зв'язуючу молекулу проти ІТ7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне також можна мітити міткою, що детектується, шляхом приєднання його до хемілюмінесцентної сполуки. Потім присутність міченої хемілюмінесцентною сполукою зв'язуючої молекули проти І-Т7 визначають детекцією наявності люмінесценції, яка з'являється в ході хімічної реакції. Прикладами особливо придатних хемілюмінесцентних сполук, що мітять, є люмінол, ізолюмінол, тероматичний складний ефір акрідинію, імідазол, сіль акрідинію і складний ефір щавлевої кислоти.
Одним зі шляхів, яким антитіло до ІЇТ7 або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне можна детектовано мітити, є його зв'язування з ферментом і використання зв'язаного продукту у ферментному імуноаналізі (ЕІА) (Моїег, А., "пе Епгуте Гіпкейа Іттипозогрепі Аззау (ЕПІЗА)" Містобіоіодіса! Аззосіаїез Оцапепу Рибіїсайіоп, УаїКегвміПе, мМа.; Оіадповіїс Ногіг2оп5 2:1- 7 (1978); МоПег еї аї., 9. Сіїп. Раїйої. 37:507-520 (1978); Вийег, Мей. Епгутої. 73:482-523 (1981);
Маддіо, ед. (1980), Еплуте Іттипоаззау, САС Ргев55, Воса Ваїйоп, Ріа.; Івпікамжа еї аї., едв. (1981), Епгуте Іттипоаззау (КааКи Зпот, ТоКуо). Фермент, який зв'язують із антитілом до
І-Т7, взаємодіє з відповідним субстратом, таким як хромогенний субстрат, таким чином, щоб утворювалася хімічна група, яку можна детектувати, наприклад, спектрофотометричними, флуориметричними або візуальними способами. Ферменти, які можна використовувати для детектованого мічення антитіла, включають, але не обмежуються ними, малатдегідрогеназу, стафілококову нуклеазу, дельта-5-стероїдізомеразу, алкогольдегідрогеназу дріжджів, альфа- гліцерофосфат, дегідрогеназу, триозофосфатізомеразу, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, аспарагіназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкоза-б- фосфатдегідрогеназу, глюкоамілазу і ацетилхолінестеразу. Крім того, детекцію можна проводити колориметричними способами, у яких застосовують хромогенний субстрат для ферменту. Також детекцію можна проводити шляхом візуального порівняння ступеня ферментативної реакції субстрату в порівнянні з подібним чином отриманими стандартами.
Детекцію також можна проводити з використанням будь-якого з ряду інших імунологічних аналізів. Наприклад, шляхом радіоактивного мічення зв'язуючої молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, можливо проводити детекцію зв'язуючої молекули з використанням радіоімунологічного аналізу (КІА) (див., наприклад, М/еіпігацо (Магсі, 1986), Ргіпсіріе5 ої Кадіоїттипоаззау5, Земепій Тгаїпіпд
Социгбе оп Кадіоїїдапа А5зау Тесппіднез (Те Епаосгіпе Босіеїу), включеної в даний опис за допомогою посилання). Радіоактивний ізотоп можна детектувати за допомогою засобів, що включають, але не обмежуваних ними, гамма-лічильник, сцинтиляційний лічильник або радіоавтографію.
Зв'язуючу молекулу проти ІТ7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне також можна детектовано мітити з використанням металів, що випускають
Зо флуоресценцію, таких як 152Еи або інші метали серії лантаноїдів. Ці метали можна приєднувати до зв'язуючої молекули з використанням таких хелатуючих метали груп, як діетилентриамінпентаоцтова кислота (ОТРА) або етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕЮОТА).
Способи кон'югації різних молекул з антитілом (наприклад, антитілом до І-Т7) або його антигензв'язуючим фрагментом, варіантом або похідним добре відомі, див., наприклад, Агпоп еї
З5 а), "Мопосіопа! Апіїродіеєє Рог Іттипоїагдейпо ОЇ Огид5 п оСапсег Тнегару", Мопосіопаї
Апііродієз Апа Сапсег Тнегару, Веївтейа еї аї. (єдв.), р. 243-56 (АІап В. І і55, Іпс. (1985); НеїЇвітот еї аї. "Апіїродіез Бог Огид Оеїїмегу", Сопігопей Огид Оеєїїмегу (2па Еа.), Вобіпзоп еї аї. (єав.),
Магсе! Оеккег, Іпс., р. 623-53 (1987); Тпогре, "Апіїроду Сапівєт5 ОЇ Суюїохіс Адепів Іп Сапсег
Тпегару: А Вемієму", Мопосіопа! Апііродієз "84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріісайіоп5, Ріпснега еї аї. (єд».), р. 475-506 (1985); "Апаїузіз, Незийв, Апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ Те ТНегарешіс Ове ОЇ
Вадіоїабеієд Апіроду Іп Сапсег Тпегару", Мопосіопа! Апіїродієє Рог Сапсег Оеїесіоп Апа
Тпегару, Ваїдуіп еї аї. (сд5), Асадетіс Ргеб55 р. 3003-16 (1985), ії Тпогре еї аї. (1982), "пе
Ргерагаїйоп Апа Суїоюхіс Ргорепієз ОЇ Апіїроду-Тохіп Сопіцдаїев", Іттипої. Нем. 62:11958.
МІ. Експресія поліпептидів антитіл
Послідовності ДНК, які кодують легкий і важкий ланцюги антитіла, можна одержувати одночасно або окремо з використанням зворотної транскриптази і ДНК-полімерази відповідно до добре відомих способів. ПЛР можна ініціювати за допомогою праймерів для консенсусної константної ділянки або за допомогою більш специфічних праймерів на основі опублікованих послідовностей ДНК і амінокислотних послідовностей важких і легких ланцюгів. Як зазначено вище, ПЛР також можна використовувати для виділення клонів ДНК, що кодують легкі і важкі ланцюги антитіла. У цьому випадку бібліотеки можна піддавати скринінгу за допомогою консенсусних праймерів або більших гомологічних зондів, таких як зонди константної ділянки миші.
ДНК, як правило, плазмідну ДНК, можна виділяти із клітин із застосуванням відомих у даній галузі способів, піддавати рестрикційному картуванню і секвенувати відповідно до стандартних добре відомих способів, представлених в деталях, наприклад, у зазначених вище посиланнях, що стосуються технологій рекомбінантних ДНК. Як відомо, ДНК може бути синтетичною відповідно до даного винаходу в будь-який момент у процесі виділення або при наступному аналізі.
Після маніпуляції виділеним генетичним матеріалом для одержання антитіл до ІТ7 або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних за винаходом полінуклеотиди антитіла, що кодують, до І-Т7, як правило, вбудовують в експресуючий вектор для введення в клітини- хазяї, які можна використовувати для одержання бажаного кількості антитіла до І-Т7.
Для рекомбінантної експресії антитіла або його фрагмента, варіанта або похідного, наприклад важкого або легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з молекулою-мішенню, описуваною в даному описі, наприклад, ІСТ7, потрібні конструкції експресуючого вектора, що містить полінуклеотид, що кодує антитіло. Після одержання полінуклеотиду, що кодує молекулу антитіла або важкий або легкий ланцюг антитіла, або його частини (наприклад, що містить варіабельний домен важкого або легкого ланцюга) за винаходом, можна одержувати вектор для продукції молекули антитіла технологією рекомбінантних ДНК із використанням способів, добре відомих у даній галузі. Таким чином, способи одержання білка за допомогою експресії полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, описані в даному описі. Способи, які добре відомі фахівцям у даній галузі, можна використовувати для конструкції експресуючих векторів, що містять кодуючі антитіло послідовності і підходящі сигнали контролю транскрипції і трансляції. Ці способи включають, наприклад, способи рекомбінантних ДНК іп міо, синтетичні способи і генетичну рекомбінацію іп мімо. Таким чином, винахід належить до векторів, які реплікуються, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує молекулу антитіла за винаходом або його важкий або легкий ланцюг, або варіабельний домен важкого або легкого ланцюга, функціонально пов'язаний із промотором. Такі вектори можуть включати нуклеотидну послідовність, що кодує константну ділянку молекули антитіла (див., наприклад, публікацію РСТ
УМО 86/05807; публікацію РСТ УМО 89/01036 і патент США Мо 5122464) і в такий вектор можна клонувати варіабельний домен антитіла для експресії всього важкого або легкого ланцюга.
Термін "вектор" або "експресуючий вектор" використовують у даному описі для позначення векторів, використовуваних відповідно до даного винаходу як носії для введення в клітину- хазяїна і експресії в клітині-хазяїні бажаного гена. Як відомо фахівцям у даній галузі, такі вектори можна легко вибирати із групи, що складається із плазмід, фагів, вірусів і ретровірусів.
Як правило, вектори, сумісні з даним винаходом, містять селективний маркер, ділянки рестрикції, що підходять, для полегшення клонування бажаного гена і здатності проникати і/або
Зо реплікуватися в еукаріотичних або прокаріотичних клітинах.
Для цілей цього винаходу можна застосовувати ряд систем експресуючих векторів.
Наприклад, в одному класі векторів використовують елементи ДНК, які походять із вірусів тварин, таких як вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус поліоми, аденовірус, вірус вісповакцини, бакуловірус, ретровіруси (К5М, ММТМ або МОМІУМ,) або вірус 5МА 0. Інші вектори припускають використання поліцистронних систем із внутрішніми ділянками зв'язування рибосом. Крім того, клітини, у хромосоми яких вмонтувалася ДНК, можна відбирати шляхом введення одного або декількох маркерів, які дозволяють селекцію трансфікованих клітин-хазяїв.
Маркер може забезпечувати фототрофність для ауксотрофного хазяїна, стійкість до біоцидів (наприклад, антибіотиків) або стійкість до важких металів, таких як мідь. Ген селективного маркера можна прямо зв'язувати з послідовностями ДНК, які необхідно експресувати, або вводити в ту ж клітину котрансформацією. Також для оптимального синтезу мРНК необхідними можуть бути додаткові елементи. Такі елементи включають сигнальні послідовності, сигнали сплайсингу, а також промотори транскрипції, енхансери і сигнали термінації.
У певних варіантах здійснення клоновані гени варіабельної ділянки вбудовують в експресуючий вектор разом з генами константної ділянки важкого і легкого ланцюгів (наприклад, людини), синтезованими як зазначено вище. Як відомо, у даному винаході можна використовувати будь-який експресуючий вектор, який здатний забезпечувати експресію в еукаріотичних клітинах. Приклади підходящих векторів включають, але не обмежуються ними, плазміди рсСОМАЗ, РНСМУ/2ео, рСКЗ.1, рЕБЕ І/Ні5, рІМО/55, рКкс/НСМмМ2, рам40/2ео02, РТЕАСЕК-
НОМУ, ривб/У5-Нів, рмМАХІ ї ргеозмМ2 (доступні від Іпмігодеп, Зап Оіедо, Саїйї.) і плазміду ре (доступну від Рготеда, Майдізоп, УМі5.). Як правило, скринінг великих кількостей трансформованих клітин відносно клітин, які відповідно експресують високі рівні важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів, є загальноприйнятим експериментуванням, яке можна проводити, наприклад, за допомогою роботизованих систем.
У більш загальному сенсі, після одержання вектора або послідовності ДНК, що кодує мономерну субодиницю антитіла до І-Т7, експресуючий вектор можна вводити в підходящу клітину-хазяїна. Введення плазміди в клітину-хазяїна можна проводити різними способами, добре відомими фахівцям у даній галузі Вони включають, але не обмежуються ними, трансфекцію (включаючи електрофорез і електропорацію), злиття протопластів, осадження бо фосфатом кальцію, злиття клітин з поміщеною в оболонку ДНК, мікроін'єкцію і інфекцію незміненим вірусом. Див. Кіддуау (1988), "Маттаїїйап Ехргеззіоп месіогв", Месіогв5, ей. Коагідце? апа Оепнагаї, Еаз. (ВишегмопНв5, Возіоп, Маз5.), Спарієг 24.2, р. 470-472 (1988). Як правило, плазміду вводять у хазяїна електропорацією. Клітин-хазяїв, що несуть експресуючу конструкцію, вирощують в умовах, що підходять для продукції легких ланцюгів і важких ланцюгів, і аналізують відносно синтезу білків важкого і/або легкого ланцюгів. Ілюстративні способи аналізу включають твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5ЗА), радіоїмунний аналіз (КІА) або аналіз за допомогою активованої флуоресценції сортування клітин (РГАС5), імуногістохімію тощо.
Експресуючий вектор переносять у клітину-хазяїна загальноприйнятими способами, а потім трансфіковані клітини культивують загальноприйнятими способами з одержанням антитіла для застосування в способах, описуваних у даному описі. Таким чином, винахід включає клітини- хазяї, що містять полінуклеотид, що кодує антитіло за винаходом або його важкий або легкий ланцюг, функціонально зв'язані з гетерологічним промотором. У певних варіантах здійснення для експресії дволанцюгових антитіл вектори, що кодують як важкі, так і легкі ланцюги, можна коекспресувати у клітині-хазяїні для експресії повної молекули імуноглобуліну, як докладно описане нижче.
Як використовують у даному описі, термін "клітини-хазяї" належить до клітин, які містять вектори, сконструйовані з використанням технологій рекомбінантних ДНК і кодуючі щонайменше один гетерологічний ген. В описах способів виділення антитіл з рекомбінантних хазяїв терміни "клітина" і "клітинна культура" використовують взаємозамінно для позначення джерела антитіла, якщо явно не зазначене інше. Інакше кажучи, виділення поліпептиду з "клітин" може означати виділення або з осаджених цілих клітин, або із клітинної культури, що містить як середовище, так і суспендовані клітини.
Для експресії молекул антитіл для застосування в способах, описуваних у даному описі, можна використовувати ряд систем хазяїн-експресуючий вектор. Такі системи хазяїн- експресуючий вектор являють собою носії за допомогою яких можна одержувати і потім очищати кодуючі послідовності, що представляють інтерес, а також вони являють собою клітини, які при трансформації або трансфекції підходящими нуклеотидними послідовностями, що кодують, можуть експресувати молекулу антитіла за винаходом іп 5йи. Вони включають, але
Зо не обмежуються ними, мікроорганізми, такі як бактерії (наприклад, Е. соїї, В. 5иЙиБіі5), трансформовані рекомбінантними експресуючими векторами з бактерофагової ДНК, плазмідної
ДНК або космідної ДНК, що містять кодуючі антитіло послідовності; дріжджі (наприклад, зЗасспаготусевз, Ріспіа), трансформовані рекомбінантними експресуючими векторами дріжджів, що містять послідовності, що кодують антитіло; системи клітин комах, інфіковані рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, бакуловірусом), що містять кодуючі антитіло послідовності; системи клітин рослин, інфікованих рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, вірусом мозаїки кольорової капусти, Саму; вірусом тютюнової мозаїки, ТММ) або трансформованих рекомбінантними плазмідними експресуючими векторами (наприклад, плазмідою Ті), що містять, кодуючі антитіло послідовності; або системи клітин ссавців (наприклад, клітини СО5, СНО, ВІК, 293, 3713), що несуть рекомбінантні експресуючі конструкції, що містять промотори, які походять з генома клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу; промотор 7. 5К вірусу вісповакцини). Переважно для експресії рекомбінантної молекули антитіла використовують бактеріальні клітини, такі як ЕвсПегісніа соїї, або еукаріотичні клітини, особливо для експресії цілої рекомбінантної молекули антитіла. Наприклад, ефективною експресуючою системою для антитіл є клітини ссавців, такі як клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), у комбінації з векторами, такими як основний середньо-ранній промоторний елемент із цитомегаловірусу (Еоеєскіпад єї а)І., Сепе 5:101 (1986); СоскКей еї а!., Віо/Тесппоіоду 8:2 (1990)).
Лінія клітин-хазяїв, використовувана для експресії білків, часто походить зі ссавців; фахівці в даній галузі здатні визначати конкретні лінії клітин-хазяїв, які щонайкраще підходять для експресії в них бажаного продукту гена. Ілюстративні лінії клітин-хазяїв включають, але не обмежуються ними, клітини СНО (китайський хом'як), 044 і ПИОХВІЇ (лінії яєчника китайського хом'яка, ОНЕК-мінус), НЕГА (карцинома шийки матки людини), СМІ (лінія нирки мавпи), СО5 (похідне СМІ з Т-антигеном 5М40), МЕКУ, ВНК (нирки дитинчат хом'ячка), МОСК, 293, УМІЗ8,
К1610 (фібробласти китайського хом'яка) ВАГ ВС/З3Т3 (фібробласти миші), НАК (лінія нирки хом'яка), ЗР2/О (мієлома миші), РЗйтез.63-А93.653 (мієлома миші), ВЕА-їс 1ВРТ (ендотеліальні клітини великої рогатої худоби), КАХ (лімфоцити людини) і 293 (нирка людини).
Лінії клітин-хазяїв, як правило, є доступними від комерційних організацій, Атегісап Тіз5це 60 Сийиге СоПесійоп або з опублікованої літератури.
Крім того, можна вибирати лінію клітин-хазяїв, яка модулює експресію вбудованих послідовностей або модифікує і процесує продукт гена певним бажаним чином. Такі модифікації (наприклад, глікозилювання) і процесінг (наприклад, розщеплення) білкових продуктів можуть бути важливі для функції білка. Різні клітини-хазяї мають характерні і конкретні механізми посттрансляційного процесінгу і модифікації білків і продуктів генів. Для забезпечення правильної модифікації і процесінгу чужорідного білка, що експресується, можна вибирати підходящі лінії клітин або системи хазяїв. Із цією метою, можна використовувати еукаріотичні клітини-хазяї, які мають клітинний апарат для правильного процесінгу первинного транскрипту, глікозилювання і фосфорилювання продукту гена.
Для тривалої продукції рекомбінантних білків з високим виходом переважною є стабільна експресія. Наприклад, можна конструювати лінії клітин, які стабільно експресують молекулу антитіла. Замість застосування експресуючих векторів, які містять вірусні ділянки початку реплікації, клітини-хазяї можна трансформувати ДНК, що контролюється відповідними елементами контролю експресії (наприклад, промоторною, енхансерною послідовностями, термінаторами транскрипції, ділянками поліаденілювання тощо), і із селективним маркером.
Після введення чужорідної ДНК сконструйовані клітини можна залишати рости протягом 1-2 діб в збагаченому середовищі, а потім їх можна переключати на селективні середовища.
Селективний маркер у рекомбінантній плазміді надає стійкість при селекції і дозволяє клітинам стабільно вбудовувати плазміду в їх хромосоми і рости з утворенням осередків, які, у свою чергу, можна клонувати і розмножувати в клітинні лінії. Цей спосіб можна переважно використовувати для конструювання ліній клітин, які стабільно експресують молекулу антитіла.
Можна використовувати ряд систем для селекції, включаючи, але, не обмежуючись ними, гени тимідинкінази вірусу простого герпесу (М/ідіег еї аї., Сеї!І 11: 223 (1977)), гіпоксантин-гуанін- фосфорибозилтрансферази (572ураїєКа 8 52убБаї5Кі, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 48:202 (1992)) і аденінфосфорибозилтрансферази (І осугу еї аї., СеїІ 22:817, 1980) в їК-, Норп- або аргі-клітинах відповідно. Також можна використовувати стійкість до антиметаболітів як основу для селекції для наступних генів: ант, який надає стійкості до метотрексату (Уідіег еї аї., Май). Асад. 5сі. ОБА 77:357 (1980); С'Наге еї аї., Ргос. Май. Асад. зсі. ОБА 78: 1527 (1981)); дрі, який надає стійкості до мікофенолової кислоти (Миїїїдап «5 Вего, Ргос. Маї!. Асад. зсі. ОБА 78:2072 (1981)); пео, який надає стійкості до аміноглікозиду 5-418, Сіїіпіса! Рнаптасу 12:488-505; Ми апа Ми, Віоїпегару 3:87-95 (1991); ТоІвіо5пєм, Апп. Вему. РНаптасої. Тохісої. 32:573-596 (1993); Миїйїдап, бсієпсе 260:926-932 (1993); і Могдап апа Апдегзоп, Апп. Кем. Віоспет. (52:191-217 (1993); ТІВ ТЕСН 11(5): 155-215 (Мау, 1993), ії пудго, який надає стійкості до гігроміцину (Запіе!їте еї аїЇ.,, Сепе 30:147 (1984)). Способи, широко відомі в галузі технології рекомбінантних ДНК, які можна використовувати, описані в А!йзиреї! єї аї. (1993), Ситепі РгоїосоЇїв іп МоіІесшаг Віоіоду, Щдопп
Муйеу 5 5оп5, МУ; Кіїєдіег (1990), Сепе Тгапвіег апа Ехргезвіоп, А ІГарогаїгу Мапиаї, 5іоскюп
Ргез5, МУ; і в главах 12 і 13, Огасороїї єї а!. (ваз) (1994), Ситепі Ргоїосої5 іп Нитап Сепеїїсв5.
Уопп У/їеу а 5оп5, МУ; СоІрегте-Сагаріп еї аї!. (1981), 9. Мої. Віої. 150:1, які повністю включені в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі.
Рівні експресії молекули антитіла можна збільшувати за допомогою ампліфікації вектора (для огляду див. Веббіпдіоп апа Непізспе! (1987), "пе О5зе ОЇ Месіог5 Вазей Оп Сепе
Атрійісайоп Рог Те Ехргезвзіоп ОЇ Сіопед Сепез Іп Маттаїап Сеїв іп ОМА Сіопіпд". (Асадетіс
Ргез55, Мем/ УогК), Мої. 3). Коли маркер у векторній системі, що експресує антитіло, є таким, що ампліфікується, збільшення рівня інгібітору, що є присутнім в культурі клітин-хазяїв, призведе до збільшення кількості копій маркерного гена. Оскільки ампліфікована ділянка зв'язана з геном антитіла, продукція антитіла також буде зростати (Сгоизе еї а!., Мої. СеїІ. Віої. 3:257 (1983)).
Продукція іп міо дозволяє збільшувати масштаб з одержанням більших кількостей бажаних поліпептидів. Способи культивування клітин ссавців в умовах культивування тканин відомі в даній галузі і включають гомогенну суспензійну культуру, наприклад, в ерліфтному ферментері або в реакторі з безперервним перемішуванням, або іммобілізовану або поміщену клітинну культуру, наприклад у порожніх волокнах, мікрокапсулах, на агарозних мікрогранулах або керамічних касетах. Якщо необхідно і/або бажано, розчини поліпептидів можна очищати стандартними способами хроматографії наприклад гель-фільтрацією, іонообмінною хроматографією, хроматографією над ОЕАЕ-целюлозою або (імуно)дафінною хроматографією, наприклад, після вибіркового біосинтезу синтетичного поліпептиду шарнірної ділянки або перед або після етапу НІС-хроматографії, описуваної в даному описі.
Гени, що кодують антитіла до СО100 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом, також можна експресувати у клітинах не приналежних ссавцям, таких як клітини бактерій або дріжджів, або рослин. Бактерії, які легко захоплюють нуклеїнові кислоти, 60 включають представників епієгорасієгасєає, таких як штами ЕзсПегісніа соїї або ЗаІтопеїа;
Зо
ВасіПасеєає, такі як Васійи5 5ибБійй5; Рпештососсив; 5ігеріососсив і Наеторніш5 іпПшепгає. Крім того, зрозуміло, що при експресії в бактеріях гетерологічні поліпептиди, як правило, стають частиною тілець включення. Гетерологічні поліпептиди необхідно виділяти, очищати, а потім збирати у функціональні молекули. У випадку, коли чотиривалентні форми антитіл є бажаними, те субодиниці потім будуть піддаватися самоскладанню в чотиривалентні антитіла (М/о 02/096948А2).
У бактеріальних системах ряд експресуючих векторів можна переважно вибирати залежно від передбачуваного застосування молекули антитіла, яку експресують. Наприклад, коли необхідно одержувати велику кількість такого білка для одержання фармацевтичних композицій молекули антитіла, необхідними можуть бути вектори, які спрямовують експресію високих рівнів злитих білкових продуктів, очищення яких легко проводити. Такі вектори включають, але не обмежуються ними, експресуючий вектор Е. соїї рОК278 (КшПег еї аІ., ЕМВО .. 2: 1791 (1983)), у якому послідовність, що кодує антитіло, можна лігувати індивідуально у вектор у рамці зчитування з кодуючою Іас7 ділянкою таким чином, щоб одержувати злитий білок; вектори рім (Іпоцуе 4. Іпоцує, Мисієїс Асіаз Рез. 73: 3101-3109 (1985); Мап НеекКе апа 5спивіег, 9. Віої Снет. 24:5503-5509 (1989)) тощо. Також можна використовувати вектори рОЕХ для експресії чужорідних поліпептидів у вигляді злитих білків із глутатіон 5-трансферазою (С5Т). Як правило, такі злиті білюи є розчинними і їх можна легко виділяти з лізованих клітин адсорбцією і зв'язуванням із гранулами на основі матриці із глутатіон-агарози з наступним елююванням у присутності вільного глутатіону. Вектори РОЕХ конструюють так, щоб вони включали ділянки розщеплення протеази тромбіну або фактора Ха, так щоб продукт клонованого гена-мішені міг вивільнятися із групи 5517.
На додаток до прокаріотів також можна використовувати еукаріотичні мікроорганізми.
Засспаготусев сегемівіде або звичайні пекарські дріжджі найбільш часто використовуються серед еукаріотичних мікроорганізмів, хоча широко доступний ряд інших штамів, наприклад,
Ріспіа равіюгів.
У системі комах як вектор для експресії чужорідних, як правило, генів використовують вірус ядерного поліедрозу Ашіодгарна саїїйогпіса (АСМРМ). Цей вірус росте в клітинах 5родорієга
Тгидірегда. Послідовність, що кодує антитіло, можна клонувати індивідуально в ділянки, що не є
Зо необхідними (наприклад, ген поліедрину), вірусу і поміщати під контроль промотору АСМРУ (наприклад, промотору полієдрину).
Після рекомбінантної експресії зв'язуючої молекули за винаходом її можна очищати будь- яким відомим у даній галузі способом очищення молекули імуноглобуліну, наприклад, хроматографією (наприклад, іонообмінною, афінною, зокрема, на основі афінності до специфічного антигену після хроматографії з білком А і колонковою хроматографією з розподілом за розміром), центрифугуванням, диференціальною розчинністю або будь-яким іншим стандартним способом очищення білків. Альтернативно, переважний спосіб збільшення афінності антитіл за винаходом описаний у публікації патентної заявки США Мо 2002-0123057
А1.
МІІ. Способи лікування з використанням терапевтичних зв'язуючих молекул проти І Т7
Способи за винаходом належать до застосування зв'язуючих молекул проти ІТ7, наприклад, антитіл, включаючи їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти та похідні, для лікування пацієнтів, що страждають захворюванням, пов'язаним з експресією І-Т7 або експресуючими І-Т7 клітинами. Під "експресуючою ІСТ7 клітиною" мають на увазі клітини, експресуючі антиген ІІ.Т7. Способи детекції експресії ІІ 77 у клітинах добре відомі в даній галузі і включають, але не обмежуються ними, способи ПЛР, імуногістохімію, проточну цитометрію, вестерн-блотинг, ЕГІЗА тощо.
Хоча наступне нижче обговорення належить до способів діагностики і лікування різних захворювань і порушень антитілом до І-Т7 за винаходом, способи, описувані в даному описі, також застосовні для антигензв'язуючих Фрагментів, варіантів і похідних цих антитіл до І/Т7, які зберігають бажані властивості антитіл до Ї/Т7 за винаходом, наприклад, здатні специфічно зв'язувати ІІТ7 і мають нейтралізуючу активність щодо І Т7.
В одному варіанті здійснення лікування включає застосування або введення зв'язуючої молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за даним винаходом пацієнтові або застосування, або введення зв'язуючої молекули проти СО100 у виділену тканину або лінію клітин від пацієнта, де пацієнт страждає на захворювання, має симптомом захворювання або схильність до захворювання. В іншому варіанті здійснення лікування також включає застосування або введення фармацевтичної композиції, що містить зв'язуючу молекулу проти ІЇТ7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за бо даним винаходом, пацієнтові або застосування, або введення фармацевтичної композиції, що містить зв'язуючу молекулу проти ІТ7, у виділену тканину або лінію клітин від пацієнта, який страждає на захворювання, має симптомом захворювання або схильність до захворювання.
Зв'язуючі молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за даним винаходом є придатними для лікування різних аутоімунних станів.
Наприклад, терапія щонайменше одним антитілом до І-Т7 викликає фізіологічну реакцію, наприклад, зниження інтерферону, яке є сприятливим для лікуванні станів хвороби, пов'язаних з експресуючими І-7Т7 клітинами в людини.
В одному з варіантів здійснення винахід належить до зв'язуючих молекул проти І-Т7, наприклад, антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних для застосування як лікарського засобу, зокрема, для застосування в лікуванні або профілактики аутоїмунного стану або захворювання. Приклади аутоїмунних захворювань включають, але не обмежуються ними: міозит, діабет, хворобу Хашимото, аутоїмунну надниркову недостатність, еритроцитарну анемію, розсіяний склероз, ревматоїдний кардит, системний червоний вовчак, псоріаз, ревматоїдний артрит, хронічне запалення, синдром Шегрена, поліміозит, дерматоміозит, міозит з тільцями включення, юнацький міозит і склеродермію.
Відповідно до способів за даним винаходом щонайменше одну зв'язуючу молекулу проти
І-Т7, наприклад, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, варіант або похідне, як визначено в іншому місці в даному описі, використовують для стимуляції позитивної терапевтичної відповіді щодо аутоімунної відповіді. Під "позитивною терапевтичною відповіддю" щодо лікування аутоїмунного захворювання мають на увазі поліпшення стану захворювання у зв'язку з активністю цих зв'язуючих молекул, наприклад, антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних і/або поліпшення симптомів, асоційованих із захворюванням.
Таким чином, можна спостерігати зниження рівнів інтерферону-альфа, зниження кількості або активності плазмацитоїдних дендритних клітин або поліпшення одного або більше симптомів, асоційованих із захворюванням. Таким чином, наприклад, поліпшення стану захворювання можна характеризувати як повну відповідь. Під "повною відповіддю" мають на увазі відсутність клінічно детектованого захворювання з нормалізацією будь-яких отриманих раніше результатів дослідження. Така відповідь може зберігатися протягом щонайменше одного місяця після лікування способами за винаходом. Альтернативне поліпшення стану захворювання може бути класифіковане як часткова відповідь.
Зв'язуючі молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, описувані в даному описі, також можуть бути придатними при лікуванні аутоїмунних захворювань і дефіцитних станів або порушень імунної системи, які асоційовані з експресуючими І-Т7 клітинами. Аутоімунні захворювання характеризуються ушкодженням на рівні клітин, тканин і/або органів, викликуваним імунологічною реакцією індивідуума на свої власні клітини, тканини і/або органи. В одному з варіантів здійснення аутоїмунне захворювання являє собою системний червоний вовчак.
Клінічну відповідь можна оцінювати з використанням способів скринінгу, таких як сканування магнітно-резонансною томографією (МК), рентгенівську радіографічну візуалізацію, сканування комп'ютерною томографією (СТ), проточну цитометрію або аналіз активованою флуоресценцією сортуванням клітин (БГАС5), гістологію, макроскопічне дослідження патології і хімію крові, включаючи, але не обмежуючись ними, зміни, що детектуються за допомогою
ЕПІЗА, КІА, хроматографії тощо. На додаток до цих позитивних терапевтичних відповідей, індивідуум, що піддається лікуванню зв'язуючою молекулою проти ІІТ7, наприклад, антитілом або його антигензв'язуючих фрагментом, може випробовувати сприятливий ефект поліпшення симптомів, асоційованих із захворюванням.
Додатковим варіантом здійснення винаходу є застосування зв'язуючої молекули проти І-Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних для діагностичного моніторингу рівнів білків у тканині як частини процедури клінічного тестування, наприклад, для визначення ефективності даної схеми лікування. Наприклад, детекцію можна полегшувати зв'язуванням антитіла з речовиною, що детектуєтья. Приклади речовин, що детектуються, включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини, біолюмінесцентні речовини і радіоактивні речовини. Приклади підходящих ферментів включають пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, р-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади підходящих комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади підходящих флуоресцентних речовин включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклад люмінесцентної речовини включає люмінол; приклади біолюмінесцентних речовин включають люциферазу, люциферин і екворин, і 60 приклади підходящої придатної радіоактивної речовини включають "251і, 191, 355 або УЗН.
МІ. Фармацевтичні композиції і способи введення
Способи одержання і введення зв'язуючих молекул проти ІТ7, наприклад, антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних, наданих у даному описі індивідуумові, що потребує цього, добре відомі фахівцям у даній галузі, або фахівці у даній галузі легко їх визначають.
Як описано в даному описі, зв'язуючі молекули проти ІЇ-Т7, наприклад, антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні, надані в даному описі, можна вводити у фармацевтично ефективній кількості для лікування іп мімо опосередковуваних експресуючими
І-Т7 клітинами захворювань, таких як певні типи аутоїмунних захворювань. Щодо цього слід розуміти, що описані зв'язуючі молекули за винаходом можна формулювати так, щоб полегшувати введення і забезпечувати стабільність активної речовини. Фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу можуть містити фармацевтично прийнятний нетоксичний стерильний носій. Для цілей даної заявки фармацевтично ефективна кількість зв'язуючої молекули проти ІЇТ7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, кон'юЮпгованого або некон'югованого, повинна означати кількість, достатню для досягнення ефективного зв'язування з мішенню і для позитивного ефекту, наприклад, для поліпшення стану симптомів захворювання або стану, або детекції речовини або клітини.
Фармацевтичні композиції, підходящі для ін'єкцій, повинні бути стерильними і повинні бути рідкими в тому ступені, щоб існувала можливість введення в шприц. Вони повинні бути стабільними в умовах виробництва та зберігання і надійно захищені від заражаючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби. Попередження дії мікроорганізмів можна забезпечувати різними антибактеріальними і протигрибковими засобами. Підходящі склади для застосування в терапевтичних способах, описуваних у даному описі, описані в Кептіпдіоп'є
Ріпаптасеціїса! 5сіепсез (Маск Рибіїзніпуд Со.) 161й єд. (1980).
Відповідно до об'єму даного винаходу антитіла до І-Т7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом можна вводити людині або іншій тварині відповідно до зазначених вище способів лікування в кількості, достатній для надання терапевтичної дії.
Антитіла до ІІТ7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом можна
Зо вводити такій людині або іншій тварині в загальноприйнятій лікарській формі, одержуваній об'єднанням антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного за винаходом із загальноприйнятим фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем відповідно до відомих способів. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що форма і характер фармацевтично прийнятного носія або розріджувача залежить від кількості активного інгредієнта, з яким його поєднують, шляху введення і інших добре відомих змінних. Фахівцеві в даній галузі також буде зрозуміло, що суміш, що містить один або більше типів зв'язуючих молекул проти І-Т7, наприклад, антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, варіантів або похідних за винаходом може виявитися особливо ефективною.
Під "терапевтично ефективною дозою або кількістю" або "ефективною кількістю" мають на увазі кількість зв'язуючої молекули проти І Т7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, яке при введенні призводить до позитивної терапевтичної відповіді відносно лікування пацієнта із захворюванням або станом, що підлягають лікуванню.
Терапевтично ефективні дози композицій за даним винаходом для лікування опосередкованих експресуючими І-Т7 клітинами захворювань, таких як певні типи аутоїмунних захворювань, включаючи, наприклад, системний червоний вовчак, змінюються залежно від багатьох різних факторів, включаючи шляхи введення, ділянку-мішень, фізіологічний стан пацієнта, чи є пацієнт людиною або твариною, інших, що вводяться, лікарських препаратів, і чи є лікування профілактичним або терапевтичним. Як правило, пацієнт є людиною, але не приналежних людині ссавців, включаючи трансгенних ссавців, також можна лікувати. Лікувальні дози можна ститрувати для оптимізації показників безпеки і ефективності.
Даний винахід також належить до використання зв'язуючої молекули проти ІЇТ7, наприклад, антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного у виробництві лікарського засобу для лікування аутоїмунного захворювання, включаючи, наприклад, системний червоний вовчак.
ЇХ. Діагностика
Винахід додатково належить до способу діагностики, придатному під час діагностики опосередкованих експресуючими І-Т7 клітинами захворювань, таких як певні типи аутоїмунних захворювань, включаючи, наприклад, системний червоний вовчак, які включають вимірювання рівня експресії білка або транскрипту І-Т7 у тканині або інших клітинах або рідинах організму від бо індивідуума і порівняння вимірюваного рівня експресії зі стандартним рівнем експресії І-Т7 у нормальній тканині або рідині організму, тим самим збільшення рівня експресії за порівнянням зі стандартом є показником порушення.
Антитіла до ІЇТ7 за винаходом і їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти і похідні можна використовувати для аналізу рівнів білка І-Т7 у біологічному зразку, включаючи застосування класичних імуногістологічних способів, відомих фахівцям у даній галузі (наприклад, див.
УаїКапен, еї аї., у. Сеї). Віої. 202:976-985 (1985); даІКапеп еї аї., У. Сеї! Віо!І. 105:3087-3096 (1987)).
Інші способи на основі антитіл, придатні для детекції експресія білка І-Т7, включають імунологічні аналізи, такі як твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5А), імунопреципітацію або вестерн-блотинг. Підходящі аналізи більш докладно описані в іншому місці в даному описі.
Під "аналізом рівня експресії поліпептиду І/Т7" мають на увазі якісне або кількісне вимірювання або оцінку рівня поліпептиду ЇТ7 у першому біологічному зразку або прямо (наприклад, шляхом визначення або оцінки абсолютного рівня білка), або відносно (наприклад, шляхом порівняння з асоційованим із захворюванням рівнем поліпептиду в другому біологічному зразку). Рівень експресії поліпептиду І-Т7 у першому біологічному зразку можна вимірювати або оцінювати і порівнювати зі стандартним рівнем поліпептиду ІЇТ7, де стандарт беруть із другого біологічного зразка, одержуваного від індивідуума, що не страждає на порушення, або визначають за усередненими рівнями для популяції індивідуумів, що не страждають порушенням. Як буде зрозуміло в даній галузі, після того, як "стандартний" рівень поліпептиду І-Т7 відомий, його можна повторно використовувати як стандарту для порівняння.
Під "біологічним зразком" розуміють будь-який біологічний зразок, одержуваний від індивідуума, з лінії клітин, тканинної культури або іншого джерела клітин, потенційно експресуючих ІТ7. Способи одержання біопсій тканин і рідин організму від ссавців добре відомі в даній галузі.
Х. Імунологічні аналізи
Зв'язуючі молекули проти ІЇТ7, наприклад, антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом можна аналізувати щодо імуноспецифічного зв'язування будь-яким способом, відомим у даній галузі. Імуноаналізи, які можна використовувати, включають, але не обмежуються ними, системи конкурентного і неконкурентного аналізу із застосуванням способів, таких як вестерн-блотинг, радіоіїмунологічні аналізи, ЕГІ5А
Зо (твердофазний імуноферментний аналіз), радіоімунологічні аналізи формату "сендвіч", аналізи імунопреципітації, реакції із преципітином, реакції із преципітином з дифузією в гелі, аналізи імунодифузії, аналізи аглютинації, аналізи фіксації комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імунологічні аналізи, імунологічні аналізи з білком А, поряд з іншими. Такі аналізи є загальноприйнятими і добре відомі фахівцеві в даній галузі (див., наприклад, А!,5ибе еї а!., ед5 (1994), Сиштепі Ргоїюосої5 іп Моіесшаг Віо(оду Фопп УмМіеу 5 Бопв5, Іпс., МУ), Мої. 1, яка повністю включена в даний опис за допомогою посилання). Ілюстративні імунологічні аналізи описані в короткому викладі нижче (але не призначені для обмеження).
Антитіла до І-Т7 або їх антигензв'язуючі фрагменти, варіанти або похідні за винаходом додатково можна застосовувати гістологічно, як в імунофлуоресценції, імуноелектронній мікроскопії або неімунологічних аналізах для детекції іп 5йи білка ІТ7 або його консервативних варіантів, або пептидних фрагментів. Детекцію іп 56йи можна проводити шляхом витягання гістологічного зразка з пацієнта і нанесення на нього міченого антитіла до І-Т7 або його антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного, наприклад, що наносяться нашаруванням міченого антитіла (або фрагмента) на біологічний зразок. З використанням такої процедури можна визначити не тільки присутність білка ІТ7 або консервативних варіантів або пептидних фрагментів, а також його розподіл у досліджуваній тканині. З використанням даного винаходу фахівець у даній галузі може легко зрозуміти, що будь-який із широкого спектра гістологічних способів (таких як процедури забарвлювання) можна модифікувати для проведення такої детекції іп 5йи.
Імуноаналізи і неімунні аналізи продуктів гена І-Т7 або їх консервативних варіантів, або пептидних фрагментів, як правило, включають інкубацію зразка, такого як біологічна рідина, екстракт тканини, свіжозібрані клітини або лізати клітин, які інкубували в клітинній культурі, у присутності міченого, що піддається детекції міткою, антитіла, здатного зв'язуватися з ІІ Т7 або його консервативними варіантами, або пептидними фрагментами, і детекцію зв'язаного антитіла будь-яким з ряду добре відомих у даній галузі способів.
Біологічний зразок можна приводити в контакт або імобілізовувати на твердофазній підкладці або носії, таких як нітроцелюлоза або інша тверда підкладка, на якій можна імобілізовувати клітини, клітинні частинки або розчинні білки. Потім підкладку можна промивати підходящими буферами з наступною обробкою міченим міткою, що піддається детекції, бо антитілом до І-Т7 або його антигензв'язуючим фрагментом, варіантом або похідним. Потім твердофазну підкладку можна промивати буфером другий раз для видалення незв'язаного антитіла. Потім антитіло необов'язкове мітять. Потім можна проводити детекцію кількості зв'язаної мітки на твердій підкладці загальноприйнятими способами.
Під ""вердофазною підкладкою або носієм" мають на увазі будь-яку підкладку, здатну зв'язувати антиген або антитіло. Добре відомі підкладки або носії включають скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, декстран, нейлон, амілази, нейтральні і модифіковані целюлози, поліакриламіди, габро і магнетит. Для цілей даного винаходу характер носія може бути або розчинним певною мірою, або нерозчинним. Матеріал підкладки може мати практично будь-яку можливу структурну конфігурацію, за умови, що зв'язана з ним молекула здатна зв'язуватися з антигеном або антитілом. Таким чином, конфігурація підкладки може бути сферичною, як у гранулах, або циліндричною, як у внутрішній поверхні тестової пробірки або зовнішня поверхня стрижня. Альтернативно, поверхня може бути плоскою, такою як аркуш, тест-смужка тощо.
Ілюстративні підкладки включають полістиролові гранули. Фахівцям у даній галузі відомо багато інших придатних носіїв для зв'язування антитіла або антигену, або вони здатні визначити їх з використанням загальноприйнятого експериментування.
Активність зв'язування даної партії антитіл до І-Т7 або їх антигензв'язуючого фрагмента, варіанта або похідного можна добре визначати відомими способами. Фахівці в даній галузі здатні визначати діючі і оптимальні умови аналізу для кожного визначення з використанням загальноприйнятого експериментування.
Афінність зв'язування антитіла з антигеном і швидкість зворотної реакції взаємодії антитіло- антиген можна визначати аналізами конкурентного зв'язування. Один із прикладів аналізу конкурентного зв'язування являє собою радіоіїмунологічний аналіз, що включає інкубацію міченого антигену (наприклад, ЗН або 7251) з антитілом, що представляє інтерес, у присутності кількостей, що збільшуються, неміченого антигену і детекцію антитіла, пов'язаного з міченим антигеном. Афінність антитіла, що представляє інтерес, до конкретного антигену і швидкості зворотних реакцій зв'язування можна визначати на підставі даних за допомогою аналізу графіка
Скетчарда. Також можна визначати конкуренцію із другим антитілом з використанням радіоїмунологічних аналізів. У цьому випадку антиген інкубують з антитілом, що представляє інтерес, кон'югованим з міченою сполукою (наприклад, ЗН або "2ч»І) у присутності кількостей, що
Зо збільшуються, неміченого другого антитіла.
Доступна множина способів вимірювання афінності взаємодії антитіло-антиген, але відносно мало для визначення констант швидкостей реакцій. Більшість способів основана на міченні антитіла або антигену, що неминуче ускладнює повсякденні вимірювання і вносить неточність у вимірювані кількості.
Поверхневий плазмонний резонанс (ЗРК), як такий, що проводиться на ВІАСОКЕФ), забезпечує ряд переваг над загальноприйнятими способами вимірювання афінності взаємодій антитіло-антиген: (і) не потрібне мічення ні антитіла, ні антигену; (її) не потрібне попереднє очищення антитіл, можна використовувати безпосередньо супернатант культури клітин; (іїї) для багатьох цілей оцінки можливі і достатні вимірювання в реальному часі, що дозволяють швидке напівкількісне порівняння різних взаємодій моноклональних антитіл; (ім) біоспецифічну поверхню можна регенерувати так, щоб серії різних моноклональних антитіл можна було легко порівнювати в ідентичних умовах; (м) аналітичні процедури є повністю автоматизованими і можна проводити великі серії вимірювань без втручання користувача. ВіАарріїсайоп5 Напароок, мегзіоп АВ (нове видання в 1998 році), ВІАСОКЕФ соде Мо ВК-1001-86; ВІАТесппоЇоду Напаросок, мегзіоп АВ (гергіпієй 1998), ВІАСОКЕФ соде Ме ВК-1001-84. Основані на 5РК дослідження зв'язування вимагають, щоб один представник зв'язуючої пари був іммобілізований на поверхні сенсора. Іммобілізований партнер зі зв'язування позначають як ліганд. Партнер зі зв'язування в розчині позначають як аналізовану сполуку. У деяких випадках ліганд зв'язаний посередньо з поверхнею через зв'язування з іншою іммобілізованою молекулою, яку позначають як уловлювальну молекулу. Відповідь ЗРЕ відображує зміну у ваговій концентрації на поверхні детектора в міру зв'язування або дисоціації аналізованих сполук.
На основі ЗРК способи вимірювання ВІАСОКЕФ у реальному часі здійснюють моніторинг взаємодій, безпосередньо коли вони відбуваються. Спосіб добре підходить для визначення кінетичних параметрів. Ранжирування порівняльної афінності проводити просто і кінетичні константи та константи афінності можна встановлювати з даних сенсограм.
Коли аналізовану сполуку ін'єкують окремим імпульсом над поверхнею ліганду, отриману сенсограму можна підрозділити на три істотні фази: (ї) асоціація аналізованої сполуки з лігандом у процесі ін'єкції зразка; (ії) стан рівноваги або стійкий стан у процесі ін'єкції зразка, де швидкість зв'язування аналізованої сполуки врівноважується дисоціацією з комплексу; (її) бо дисоціація аналізованої сполуки з поверхні під час течії буфера.
Фази асоціації і дисоціації забезпечують інформацію про кінетику взаємодії аналізована сполука-ліганд (ка і Ка, швидкості утворення комплексу і дисоціації Кажа-кКО). Фаза рівноваги забезпечує інформацію про афінність взаємодії аналізована сполука-ліганд (КО).
Програмне забезпечення ВіАемаїчайоп забезпечує великі засоби для апроксимації кривих з використанням алгоритмів як чисельного інтегрування, так і глобальної апроксимації. При підходящому аналізі даних із простих досліджень ВІАСОКЕФ можна одержувати окремі константи швидкості і афінності для взаємодії. Діапазон афінності, що піддається вимірюванню цим способом, є дуже широким, від мМ до пМ.
Епітопна специфічність є важливою характеристикою моноклонального антитіла.
Картування епітопу за допомогою ВІАСОКЕФ на відміну від загальноприйнятих способів з використанням радіоімунологічного аналізу, ЕГІ5А або інших способів поверхневої адсорбції не вимагає мічення або очищення антитіл і дозволяє тести специфічності множини ділянок з використанням послідовності з декількох моноклональних антитіл. Крім того, більші кількості аналізів можна проводити автоматично.
Експерименти попарного зв'язування тестують здатність двох МАБ зв'язуватися одночасно з тим самим антигеном. МАБ, спрямовані проти окремих епітопів, зв'язуються незалежно, у той час як МАбБ, спрямовані проти ідентичних або близькоспоріднених епітопів, будуть перешкоджати зв'язуванню один одного. Ці експерименти зі зв'язування з використанням
ВІАСОВЕЄФ легко виконувати.
Наприклад, ожна використовувати уловлювальну молекулу для зв'язування першого Мар з наступним додаванням антигену і другого МАБ послідовно. Сенсограми виявляють: (1) скільки антигену зв'язується з першим Маб, (2) у якому ступені друге МАБ зв'язується зі зв'язаним з поверхнею антигеном, (3) якщо друге МАБ не зв'язується, чи змінить результати зворотний порядок попарного тесту.
Пептидне інгібування є іншим способом, використовуваним для картування епітопів. Цей спосіб може доповнювати дослідження попарного зв'язування антитіл і може співвідносити функціональні епітопи зі структурними ознаками, коли первинна послідовність антигену відома.
Пептиди або антигенні фрагменти тестують щодо інгібування зв'язування різних МАБ з іммобілізованим антигеном. Пептиди, які можуть перешкоджати зв'язуванню даного МАБбБ,
Зо вважають структурно спорідненими епітопу, визначеному за допомогою цього МАБ.
У практичному здійсненні даного винаходу використовують, якщо не зазначене інше, загальноприйняті способи клітинної біології, клітинної культури, молекулярної біології, трансгенної біології, мікробіології, рекомбінантних ДНК і імунології, які відомі фахівцям у даній галузі. Такі способи докладно пояснені в літературі. Див., наприклад, затьгоок еї аї., ей. (1989),
Моїіесшіаг Сіопіпа А І арогаюгу Мапцпаї (2па єд.; Соїа 5ргіпд Натбог І арогаюгу Ргев5); Затьгоок єї а!., ед. (1992), МоіІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїюгу Мапиаї, (Соїд рігіпдз Нагбог І арогаїогу, ММ); 0. М.
Сіомег ей. (1985), ОМА Сіопіпу, Моїштевз І апа Ії; Саїй, є. (1984), Оіїдописієоїіде Зупіпевів; Миїїв еїаІ. патент США Мо 4683195; Натез апа Ніддіп5, ейв5. (1984), Мисієїс Асіа Нубргіаіганоп; Натев5 апа Ніоддіпв, едв5. (1984), Тгапвсгпріюп Апа Тгапвзіайоп; Егезнпеу (1987), Сийште ОЇ Апітаї! СеїЇв (Аіап В. І ів5, Іпс.); Ітторбіїгей Сеїї5 Апа Епгутез (ІВ! Ргезвз) (1986); Регїбаї! (1984), А Ргасіїсаї
Спціде То МоіІесшаг Сіопіпо; пе їгєаїїзе, Меїйподвз Іп Епгутоіоду (Асадетіс Ргезв5, Іпс., М.М.); МіПег апа Саоз есйв5. (1987), Сепе Тгапбієї Месіог5 Бог Маттаїйап Сеїє, (Соїй Зргіпд Нагбог
І арогагогу); УМи єї аї., еа5., Меїйод5 Іп Епгуто!оду, Мої. 154 і 155; Мауег апа УмаїКег, еа5. (1987),
Іттипоспетіса! Меїйподе Іп Се Апа Моїіесшіаг Віооду (Асадетіс Ргев5, І опдоп); М/евїг апа
ВіасКуеїї, едв. (1986), Напароок ОЇ Ехрегітепіа! Іттипоіоду, Моїштев І-ІМ; Мапіршаїййпу Ше
Моизхе Етрбгуо, Соїа Зргіпуд Нагброг І абогайогу Ргез5, Соїй Бргіпуд Нагрог, М.У., (1986); і Аизибеї еї а!. (1989), Сбитепі Ргоїосої5 іп МоІесшаг Віоіоду (онп УміІеу апа 5опв, Вайітоге, Ма.).
Загальні принципи конструювання антитіл зазначені в ВоггераесК, ей. (1995), Апіїбоду
Еподіпеегіпд (2п4 ей.; Охіога Опім. Рге55). Загальні принципи інженерії білків зазначені в
Віскмооа еї аї., едв. (1995), Ргоївіп Епдіпеегіпд, А Ргасіїса! Арргоасі (ІВІ. Ргезз аї Охтога Опім.
Ргез5, Охіога, Епа.). Загальні принципи антитіл і зв'язування антитіло-гептен зазначені в:
Мізопоїї (1984), МоїІесшаг Іттипоїіоду (2па ей. Зіпацег Аз5зосіа(ех, зЗ,ипаепапа, Маз55.); і Темага (1984), Апіїбодіе5, Тпеїг Зігисіиге апа Еипсбоп (Спартап апа НаїЇ, Мем/ МогКк, М.М.). Крім того, як правило, додержуються стандартних способів в імунології, відомих у даній галузі, і не описаних конкретно, як в Сигепі Ргоїосої5 іп Іттипоїіоду, хойпп УМіеу 5 5оп5, Мем МогКк; зі йез еї аї., едв. (1994), Вавіс апа Сііїпіса! Іттипоіоду (81п єд; Аррієїоп 5 ІГапде, МогуаіК, Сопп.) і Мізпеї!Ї апа
Зі (едз5) (1980), ЗеІесієд Меїпосдз іп СеїІшаг Іттипоіоаду (М.Н. Егеетап апа Со., МУ).
Стандартні довідкові видання, у яких зазначені загальні принципи імунології, включають
Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду, Чопп УМіеу 5 5оп5, Мем мок; Ківїп (1982), 9., Іттипоіоду: Те 60 Зсіепсе ої Бей-Мопзеїї Оівстітіпайоп (Чонйп МУйеу а Боп5, МУ); Кеппей єї аї., єдв. (1980),
Зб
Мопосіопа! Апііродієх, Нубгідотав: А Мем Оітепвіоп іп Віоіодіса! Апаїузе5 (Ріепит Ргезв5, МУ);
Сатррбеї! (1984), "Мопосіопа! Апіїбоду Тесппоіоду", Іарогаюгу Теснпіднев іп Віоспетівігу апа
Моїесшіаг Віоіоду, ей. Вигдеп еї аї. (ЕІ-земеге, Атвівєгдат); Соїавру єї аї., едв5. (2000), Кибу
Іттиппоіоду (4 єд.; Н. Егеетапа 5 Со.); Воїй еї а!. (2001), Іттипоїіоаду (6Ій єд.; Гопдоп: Мовбу);
АБбрав вї аї. (2005), Сейшіаг апа Моїіесшаг Іттипо!іоду (5Ій єд.; ЕІземієї Неацй Зсіепсев Оімівіоп);
Копіептапп апа Оибеї (2001), Апіброду Епдіпеегіпу (Зргіпдег Мепап); ЗатртоокК апа Виззеї (2001), МоїІєсшаг Сіопіпд: А І абогаюгту Мапиаї! (Соїа бргіпд Натог Ргевзв5); І ем/іп (2003), Сепев5
МІ (Ргепіїсе НаїіпІ2003); Напом апа І апе (1988), Апіїродієв: А І арогаїогу Мапиа! (Соїй бргіпа
Нарог Ргезв); Оіенепрасі апа Омекзвієг (2003), РСВ Р'іітег (Соїд Зргіпда Натог Ргезв).
Усі цитовані вище посилання, а також усі цитовані в даному описі посилання повністю включені в даний опис за допомогою посилання.
Наступні нижче приклади надані як ілюстрація і не для обмеження.
Приклади
Матеріали і способи
Біологічні зразки
Периферичну кров людини від нормальних здорових добровольців одержували через програму МеаІттипе Віооса Бопог з письмовою інформованою згодою і схваленням від ІКВ.
Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли зі свіжої цільної крові з використанням пробірок для одержання клітин Масшаіїпег СРТ із цитратом натрію (Весіоп
Біскіпзоп Віозсіепсе5, МУ, ОА). Пробірки центрифугували при 170009 протягом 25 хв, 22 7С з мінімальним гальмуванням. Після центрифугування видаляли сироватку і переносили клітинний лейкоцитарний шар у конічні пробірки 50 мл (ВО Віозсіепсе5). Очищені клітини двічі відмивали стерильним фосфатно-сольовим буфером (РВ5) (Іпмйгодеп І Ме ТесппоЇодіе5, СА, ОБА) при 3509 протягом 10 хвилин при 22 "С. Клітини ресуспендували в РВ5 або середовищі КРМІ 1640, доповненому 1095 ембріональною телячою сироваткою (Іпийгодеп) і фільтрували з використанням пробірок ВО Раїсоп 5 мл із кришками з фільтром для клітин (ВО Віозсіепсе5).
Густини клітин визначали з використанням лічильника клітин Мі-Клітина ХКФ (ВесКтап СоикКег,
СА, ОА).
Периферичну кров яванських макак від здорових тварин одержували від Віодиаї! (Віодааї,
Іпс. МО, ОА) відповідно до посібників Маїййопаї! Іпбійшев ої Неайй ог саге апа изе ої ргітагїев.
РВМС яванських макак виділяли з використанням пробірок для одержання клітин Масшіаїпег
СРТ із цитратом натрію (як описано вище) або з Ніхіорадне 10771 (Зідта-Аїадгісй, МО, ОА). У короткому викладі, свіжу цільну кров доводили до 50х початкового об'єму крові стерильним
РВ5. Потім 25 мл розведеної крові наносили на 10 мл 90 95 Нібїорадне 10771 (Зідта Аїагісп) і центрифугували зразки при 400д протягом 20 хв при кімнатній температурі з мінімальним гальмуванням. Кільце клітин видаляли і переносили в нову 50 мл конічну пробірку. Очищені клітини двічі відмивали стерильним РВ5 при З50д протягом 10 хвилин при 22 "С. Клітини ресуспендували в РВ5 або середовищі КРМІ 1640, доповненому 10 95 ембріональною телячою сироваткою, фільтрували і підраховували, як описано вище.
Клітини
Клітини СТ-125 і СТ-550 одержували від Ог. МХопд-Уип Гіи (Спімегейу ої Теха5 М.О. Апаегзоп
Сапсег Сепіег, Ноивіоп, ТХ, ОБА). Клітини СТ-125 одержували трансдукцією Т-клітинної гібридоми 284 миші неміченим Ес5КІу миші і репортерний ген МЕАТ-СЕР, і клітини СТ-550 одержували трансдукцією клітин СТ-125 міченим НА ІГ/Т7 людини (ОйізикКа М. єї аіІ., РМА5 101: 8126-8131 (2004); Сао МУ. еї аіІ., "ЕМ 203: рр 1399-1405 (2006)). Стабільну лінію клітин СТ-125
Супо І-Т7 одержували франсфекцією клітин СТ-125 геном І-Т7 яванського макака, клонованим у плазмідний вектор рМЕ1Т8Х. Клітини СТ культивували в КРМІ 1640, доповненому 10 95 ембріональною телячою сироваткою (ЕВ5) і 1 (пеніциліном/стрептоміцином (усі реактиви від
Іпмігодеп І їе Тесппо!одієв).
Клетки КС1333 получали от Віоша (Віожа, МУ, ОБА). Клетки КС1333 культивировали в
Адумапсе АРМІ 1640, дополненной 10 95 ЕВ5, 4 мМ І-глутамина, 0,2 мкг/мл генетицина (все реактивь от Іпмігодеп) и 18,3 пг/мл рекомбинантного ІІ -2 человека (РергоТесі, МУ, О5А).
Антитіла і реагенти
Гуманізовані варіанти антитіла до ІСТ7У, 7С7 до І/Т7 (7С7), і гуманізований ізотиповий контроль К347 одержували в рамках Медіттипе. Гуманізовані варіанти кон'югованого з алофікоціаніном (АРС) антитіла до ІСТ7У, 7С7 і ізотиповий контроль К347 одержували з використанням наборів АРС топосіопа! апіїбоду Іабеїйпуд (Тпегпто Рібпег Зсіепіййіс, П, ОА).
Мічене К-фікоеритрином (РЕ) і РІТС антитіло до ВОСА-2 людини (клон АС144), антитіло-В-РЕ до ВОСА-4 людини (клон АЮ5-17Е6) і ЕСЕ людини блокувальний реагент були від МіКепуї 60 Віотесп, СА, С5А. Антитіло до СЮО123 людини (клон 703), кон'юговане з К-РЕ, РІТС або АРС,
мічене Аїеха Ріног 488 антитіло до СО8 людини (клон КРА-Т8), мічене Аїеха Ріног 488 антитіло до СОЗ людини (клон 5РЗ4-2), мічене РІТС антитіло до СО14 людини (клон М5Ег), мічене РІТС антитіло до СО2О людини (клон 2Н7) і мічене РегСР-Су 5,5 апіі-людина НІ А-ОК (клон 546-6) одержували від ВО Віозсіепсе5. Расійс Віце антитіло до людини СО5б (клон МЕМ-188) одержували від ВіоїЇ едепа, СА, ОБА. Будні 64 9 антитіло до (Дб людини і порожниною приналежний людині до одержували від даскзоп Іттипогезеагси, РА, ОА.
Забарвлювання цільної крові проводили з використанням лізуючого розчину ВО БАСЗ (ВО
Віозсіепсез). 7-ААЮО одержували від Іпмігодеп. Плазму крові групи АВ людини чоловічої статі одержували від бідта-Ліагісп. Рекомбінантний І--2 людини одержували від КО Зузіет5, ММ,
ЗА, і рекомбінантний інтерферон В людини (ІЕМ-В) одержували від РВІ. Віотедіса!, МУ, О5А.
Сро А ОМ 2216 одержували від ІпмімосСеп, СА, О5А.
Мічення рекомбінантного І-Т7 людини і яванського макака
Білки піддавали біотинілюванню через вільні аміни з використанням Е2-ІїпкК бипМо-МН5Б-І С-
Віоїіп (Тпегто/Ріегсе, ргодисі: 21335). Реагент розчиняли в безводному диметилформаміді і розчини білків на основі РВ5 доводили до рН-8 1 М Мансоз в О-РВ5.
Вбудовування мітки оцінювали мас-спектрометрією МА! 0І-ТОЕ у всіх випадках, і реагенти, що не прореагували, видаляли заміною буфера з використанням врівноважених 0-РВ5 одноразових колонок Зерпадех 25. Для біотинілювання кінцеві концентрації білків визначали за оптичною густиною при 280 нм із використанням коефіцієнтів екстинкції, що розраховуються з амінокислотних послідовностей. Аналіз зв'язування ЕГІЗА
Одноланцюгові фрагменти Ем надавали на фагових частинках і тестували в аналізі зв'язування для визначення перехресної реактивності і специфічності до панелі рекомбінантних антигенів. Зразки супернатанту наданих на фагах 5сЕм одержували в 9 б-лункових планшетах із глибокими лунками так, як зазначено нижче. 5 мл культури з кожної лунки 96б-лункового вихідного планшета переносили в планшет для культивування сгеїпег із глибокими лунками, що містить 500 мл середовища 2ТУАС (27У-100 мг/мл ампіциліную2 95 глюкози) і інкубували протягом 5 годин при 37 "С, 280 об./хв. Потім додавали 100 мл/лунку фага-помічника КО7 М13 (розведеного до 1,5х10" БУО/ мл в 2ТУАсС) і інкубували планшет при 37 "С, 150 об./хв. для забезпечення інфекції. Потім планшет центрифугували при 3200 об./хв. протягом 10 хвилин і
Зо видаляли супернатант. Бактеріальні осадки ресуспендували в 500 мл/лунка 2ТУАК (271-100 мг/мл ампіцилінух5 0 мг/мл канаміцину) і інкубували планшет протягом ночі при 25 "С, 280 об./хв. Ранком у кожну лунку додавали 500 мл 6 95 (мас./0б.) знежирене порошкове молоко в 2х
РВЗ і інкубували планшет протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім планшет центрифугували при 3200 об./хв. протягом 10 хвилин і використовували блоковані супернатанти надаваних фагом 5сЕм безпосередньо в експериментах ЕЇ ІЗА.
Для визначень ЕС5о, як правило, очищені дб розводили в З рази в 395 (мас./об.) порошковим молоком в РВ5 (РВЗ-М) з одержанням 11 точок концентрацій. Для розведення препарату використовували 96-лункові поліпропіленові планшети Сгеїпег (Сгеїіпег, 650201). Як правило, кожне розведення одержували у двох повтореннях. Перед використанням безпосередньо в експериментах ЕГІЗА розведені дО залишали в РВ5О-М протягом 1 години при кімнатній температурі для блокування.
Аналізи зв'язування І-Т7 проводили в планшетах для ЕГІЗА по суті так, як зазначено нижче. У кожному експерименті не використовували всі антигени, а, як правило, тестували антиген І--Т7 людини, миші і яванського макака. Для тестування неспецифічного зв'язування також використовували відповідні контрольні антигени (бичачий інсулін плюс Ії -4Ка РІГ АСОНІ5, за необхідністю). За винятком бичачого інсуліну всі антигени піддавали біотинілюванню і їх усіх одержували з використанням бактеріальної експресії. Антигени І--17 піддавали біотинілюванню через вільні сульфгідрильні групи з використанням Е7 ІпК Віоїіп-ВМОС (Регбріо/Рієтсе 21900).
Спосіб одержання 1 -4Кої РІ АСФНІі5, який використовували як контрольний антиген, описано в
М/О/2010/070346. 1/-4Ка РГАСФНІіх піддавали біотинілюванню через вільні аміни з використанням Е2 ІпКк З!йМо-МН5Б-Ї О-Віоїіп (Регріо/Рієгсе, 21335).
Планшети зі стрептавідином (Тпегто б5сіепійіс, АВ-1226) покривали біотинільованим антигеном при 0,5мкг/мл в РВЗ і інкубували протягом ночі при 4 "С. Планшети відмивали Зх
РВЗ і блокували 300 мкл/лунку блокувальним буфером (РВЗ-М) протягом 1 години. Планшети відмивали ЇХІРВ5З і додавали блоковані зразки 50 мкл/лунку протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети відмивали Зх РВЗ-Т (РВБ--НІ 95 (об./06.) Тмееп-20) і додавали реагенти для детекції (антитіло до Їдо людини НЕР (Зідта, АО170) або антитіло до М13-НАР (Атегзнат, 27-9421-01) для детекції (дб або надані фагом 5сЕм, відповідно| у розведенні 1:5000 по 50 мкл/лунку в РВ5-М протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети відмивали Зх РВ5-Т бо і проявляли ТМВ 50 мкл/лунку (Зідта, 70440). Реакцію гасили 0,1М Н2504 50 мкл/лунку перед читанням на Епмізіоп "М планшетному спектрофотометрі або аналогічному устаткуванні при 450 нм.
Криві доза-відповідь графічно відображали для титрувань дос з використанням програмного забезпечення для добору кривої Ргізт (Сгарпрад). Вважали, що надавані фагом 5сЕм зв'язуються з антигеном 1-17, якщо оптична густина 450 нм становила 20,5 і «0,1-0,2 для того ж зразка на контролях (інсулін і І--4ВНо РіадФНівх). Одноланцюгові фрагменти Ем надавали на фагових частках і тестували як неочищені препарати в одноточковому скринінгу ЕГІЗА.
Аналіз зв'язування клітин з використанням технології флуоресцентного аналізу в мікрооб'"ємі (ЕМАТ)
Цей гомогенний аналіз оцінює зв'язування зразків супернатанту неочищених 5сЕм або очищеного ІдсС із клітинами китайського хом'яка (СНО), що експресують ЇТ7 людей або яванського макака, в 384-лунковому (Соб5іаг 3655) форматі. Зв'язування 5сЕм або АБ із клітинами детектували з використанням антитіла миші до суміші мічених Ніз/АІехайиоге-647 антитіл кози проти коза антитіла миші (МоіІесшаг Ргобе5 А21236) або антитіло кози до міченого антитіла людини АїІехайциоге-647 (МоїІесціаг Ргобе5 А21445), відповідно. Планшети читали на пристрої для читання планшетів Арріїей Віозузієт5 СеїшШаг ЮОеїесіоп зузіет 8200. Гелій- неоновий лазер фокусували на глибині 100 мкм від дна лунки, сканували площу 1 мм". Клітини, що осідають на дні лунки, і при збудженні лазером при 633 нм, ті гранули зі зв'язаним флуорофором (де локальна концентрація флуорофору є відносно високою в порівнянні з незв'язаним флуорофором) випускали сигнал при 650-685 нм, який вимірювали з використанням фотоелектронного помножувача 1 (РМТ1). Незв'язаний флуорофор у розчині перебував за межами глибини збудження або у відносно низькій локальній концентрації і, таким чином, не випускав істотного сигналу. Присутність зразків 5сЕм або ІдсС, що зв'язуються із клітинами на дні лунки, викликала збільшення детекції міченого АІехайцог антитіла в глибині збудження. Це вимірювали як збільшення флуоресценції.
У цих експериментах буфер для аналізу являв собою РВ5 (сірсо 14190-094), що містить 0,195 ВБА (бБідта АЗ9У576-50 мл), 0,195 Гуєеп-20 (Зідта Р2287) і 0,01 95 азид натрію. Для одержання суміші для детекції 5сЕм антитіла миші до Ні і антитіла до АЕб47 миші змішували при 1 мкг/мл і 2 мкг/мл відповідно в буфері для аналізу. Для одержання суміші для детекції ДО
Зо одержували антитіло до АЕб4 7 людини в концентрації 2 мкг/мл у буфері для аналізу.
Використовувані клітини являли собою клітини СНО-КІ, експресуючі ІТ7 людини або яванського макака, які культивували стандартними техніками культивування тканин. Клітини вирощували приблизно до 80 95 конфлюентності в Е-10 (Сірсо, 22390-025)-10 95 ЕС5 (5АЕС
Віозсіепсе5, 13068С)-0,5 мг/мл зеоцину В (Іпмігодеп, К250-01), промивали РВ5, відкріплювали за допомогою акутази (РАА, 111-007) і ресуспендували в РВЗ 1,5х105 клітин/мл.
Зразки супернатанту неочищеного 5сЕм одержували в 96-лункових планшетах з глибокими лунками. 5 мкл культури з кожної лунки 9б-лункового вихідного планшета переносили в планшет для культивування сСгеїпег із глибокими лунками, що містить 900 мкл середовища 2ТУ (1,6 до триптон, 1 96 дріжджового екстракту, 0,5 о масі, рН 7,0)- 100 мкг/мл ампіцилінучтО,1 Фо глюкози і інкубували протягом 5 годин при 37 "С, 280 об./хв. Потім додавали 100 мкл/лунку 10
ММ ІРТО в ТУ і інкубували блок протягом ночі при 30 "С, 280 об./хв. Ранком блок центрифугували при 3200 об./хв. протягом 15 хвилин. Для високопродуктивного скринінгу супернатанти 5сЕм із блоку із глибокими лунками переносили безпосередньо в планшет для аналізу для необхідного розведення 20 95.
У тестовані лунки 384-лункового чорного планшета Созіаг із прозорим дном з незв'язуючої поверхні додавали наступне: 10 мкл зразка (дос або 5сЕм), 10 мкл антитіла для детекції або суміші антитіл і 30 мкл клітин. Негативні контролі, використовувані в цих експериментах, як правило, включали додавання ізотипових (Ід) або нерелевантних (5сСЕм) контролів, або буфера для аналізу замість експериментального зразка. Планшети герметизували та інкубували протягом чотирьох годин при кімнатній температурі в темряві, а потім читали на пристрої для читання планшетів Арріїєй Віозузіет5 СейЙйшаг ОЮОеїесноп 5уз(ет 8200. Як правило, дані аналізували з використанням алгоритму зі швидкості з гейтуванням, установлюваним як відношення кольорів «0,4, розмір 15-30 і мінімальне число подій 20. Влучення від зразків супернатанту неочищеного 5сЕм визначали як такі, що демонструють 5095 або більше інгібування сигналу в порівнянні з лунками загального контрольного зв'язування. Криві доза- відповідь графічно відображали для титрувань до з використанням "програмного забезпечення для добору кривої Ргізт (Сгарпрад).
Для визначень ІСво, як правило, очищені ДС розводили в 2 рази в буфері для аналізу від 500 нМ із одержанням 11 точок концентрацій. Для розведення препаратів використовували 96- бо лункові поліпропіленові планшети Огеїіпег(Огеїпег, 650201). Як правило, кожне розведення одержували у двох повтореннях. Альтернативно, тестування дес проводили з однією концентрацією в діапазоні концентрацій від 500 нМ до 0,2 НМ.
Оцінка зв'язування антитіла на лініях клітин проточною цитометрією
Зв'язування варіантів антитіл до І-Т7 і ізотипових контролів з Ї/Т7 людини і яванського макака оцінювали аналізом проточної цитометрії з використанням клітин СТ-550 і супо!ЇТ7 Ст- 125, відповідно. Клітини СТ-125 використовували як контроль. Клітини ресуспендували в блокувальному буфері (РВ5, доповненому 10 95 ЕВ5) у концентрації 5 мільйонів клітин на мл і переносили в круглодонні 9б-лункові планшети (ВО РаісопТтМ Сіеаг Місгоїе5і Ріагє, ВО
Віозсіепсе5) 100 мкл на лунку. Варіанти антитіл до І-7Т7 і контроль додавали до клітин протягом 30 хв при 4 "С на струшувачі для планшетів. Клітини відмивали три рази РВЗ і ресуспендували в блокувальному буфері (100 мкл/лунку). Зв'язування ІдОС людини на клітинній поверхні детектували з використанням вторинного антитіла до (39 людини кон'югованого з Буг ідні 64 9 (1 в 1000 розведенні). Клітини інкубували в темряві протягом 30 хв при 4 "С на струшувачі для планшетів. Клітини відмивали три рази РВЗ і реєстрували флуоресценцію на поверхні з використанням системи для проточної цитометрії І ЗКІІ і програмного забезпечення ЕАСЗО ма (обидва від ВО Віозсіепсе5).
Оцінка зв'язування антитіл на цільній крові і РВМС проточною цитометрією
Зв'язування мічених АРС антитіл до І-Т7 їі ізотипових контролів на цільній крові людини і яванського макака оцінювали аналізом проточної цитометрії. Цільну кров переносили в 50 мл конічні пробірки, 1 мл на пробірку. Мічені АРС антитіла додавали безпосередньо в цільну кров.
Антитіла до ВОСА-2-РЕ і антитілло до СО123-РЕ використовували як специфічні маркери плазмацитоїдних дендритних клітин (рОС) при забарвлюванні цільної крові людини і забарвлюванні цільної крові яванського макака, відповідно. Цільну кров інкубували з антитілами протягом 30 хв при 4 "С у темряві на струшувачі для планшетів. Кров обробляли лізуючим розчином ВО ЕАС5 за інструкціями виробника. Клітини відмивали і оцінювали зв'язування антитіла проточною цитометрією з використанням системи проточної цитометрії І ЗКІ і програмного забезпечення ЕАС5ОЇма.
Для забарвлювання РВМС спочатку РВМС промивали РВ5 і ресуспендували в холодному блокувальному буфері на основі РВ5, що містить 50 95 плазми людини чоловічої статі із групою
Зо крові АВ, 20 мкг/мл дО людини і 200 мкл/ мл блокувального ЕсЕК людини реагенту протягом 15 хв при 4 "С на струшувачі для планшетів. Через 15 хв варіанти мічених АРС антитіл до ІЇТ7 або міченого АРС ізотипового контролю додавали безпосередньо в блокувальний розчин. Антитіла до ВОСА-2-РЕ і антитіла до ВОСА-4-РЕ альтернативно використовували як специфічний до рос маркер для забарвлювання РВМС людини. В РВМС яванського макака рос визначали як
НГА-ОНВУ, Гіпеаде, СОПс і СО123г"оп (Маїегеї єї аї., Іттипоіоду, 124: 223-233 (2008)). Таким чином, антитіла до НГА-ОВ РегСР-СубБ,5, І іпеаде-РІТС (антитіла до СОЗ, СО8, СО20 і СО14) і антитіла до СЮО123-РЕ використовували як специфічний до рОоС маркера для забарвлювання
РВМС яванського макака. РВМС інкубували протягом 30 хв 4 "С у темряві на струшувачі для планшетів. Клітини відмивали і оцінювали зв'язування антитіла проточною цитометрією з використанням системи проточної цитометрії І ЗКІІ і програмного забезпечення ЕАСЗОЇма.
Оцінка активності антитіла аналізом антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОСС) з використанням ліній клітин
Активність антитіл до І-Т7 визначали з використанням аналізу на основі АОСС клітин іп міїго.
Клітини КС1333 (ефектори) і клітини СТ (мішені) спільно культивували щодо 5:1 (2,5х105 КС1333 на 0,5х105 клітин СТ) у круглодонних 96-лункових планшетах. Клітини спільно культивували в присутності антитіл до Ї-Т7 або ізотипового контролю протягом 16 годин у середовищі для культивування КРМІ 1640, доповненому 10 95 ЕВ5, при 37 "С, 5 95 СО». Потім клітини відмивали та переносили в блокувальний буфер (РВЗ-1095 ЕВ5). Клітини КС1333 детектували з використанням Расіїйс-Війе-антитіла до СО56. Мертві клітини детектували з використанням 7-
ААЮ. Життєздатність клітин-мішеней оцінювали проточною цитометрією з використанням системи проточної цитометрії І5ЗКІІ і програмного забезпечення ЕАСЗОїма. Відсоток цитотоксичності одержували із застосуванням наступної нижче формули: відсоток цитотоксичності-100-(кількість живих мішеней/кількість живих мішеней на вихідному рівні) Пх100.
Оцінка активності антитіла аналізом АОСС з використанням РВМС людини
РВМС людини відмивали РВ5 і ресуспендували в середовищі ЕРМІ, доповненому 10 95 ЕВ5 і 200 нг/мл рекомбінантного 1-2 людини в концентрації 5,0х106 клітин на мл. РВМС висівали у двох повтореннях у круглодонні 96-лункові планшети, 100 мкл на лунку. Одержували 10-кратні серійні розведення антитіл до ІІ1Т7 і контрольних антитіл і у відповідні лунки додавали 100 мкл розчинів антитіл, додавали до кінцевих концентрацій 33,85 нМ-3,385 ФМ. Клітини інкубували 60 протягом б годин при 37 "С, 5595 СО». Після інкубацій клітини двічі відмивали в 250 мкл холодного РВ5. Клітини ресуспендували в 100 мкл холодного блокувального буфера на основі
РВ5, що містить 50 95 плазми людини чоловічої статі із групою крові, 2 0 мкг/мл до людини і 200 мкл/ мл блокувального БСК людини реагенту протягом 15 хв при 4 "С. Після етапу блокування 100 мкл холодного блокувального буфера, що містить ЕІТС-антитіла до ВОСА2 людини і АРС-антитіла до СО123 людини, додавали у відповідні лунки. Планшети інкубували, акуратно струшували протягом 30 хвилин при 4 "С. Після інкубації клітини двічі відмивали в 250 мкл холодного РВЗ з кінцевим ресуспендуванням в 200 мкл холодного РВ5. В усі лунки додавали 50 мкл холодного розчину 7-ААЮ (Іпмігодеп) і позитивні за 7-ААЮО плазмацитоїдні дендритні клітини оцінювали з використанням системи проточної цитометрії І ЗКІ! і програмного забезпечення ЕАСЗОЇма.
Аналізи секреції ІРМо; з РВМС людини
РВМС людини відмивали РВ5 і висівали у двох повтореннях у круглодонні 96-лункові планшети в кінцевій густині 150000-156000 клітин на лунку в середовищі ЕРМІ, доповненому 10 95 ЕВ5 ї 200нг/мл рекомбінантного ІЇ-2 людини. Одержували 10-кратні серійні розведення антитіл до І 17 і контрольних антитіл і у відповідні лунки додавали 100 мкл розчинів антитіл до кінцевих концентрацій 6,77 нМ-0,677 ФМ. Клітини і антитіла інкубували протягом 9,5-10 годин при 37 "С, 5 95 СО». Після інкубацій 50 мкл О0М2216 (Іпмігодеп "М) додавали у відповідні лунки до кінцевої концентрації 0,5 мкМ і додатково інкубували планшети ще 16 годин при 37 "С, 5 95
СО». Після інкубацій планшети центрифугували при 3509 протягом 10 хвилин, обережно видаляли супернатанти і кількісно визначали ІЄМа з використанням набору ІЕМа Мийні-5иБіуре
ЕПЗА (РВІ Віотедісаї).
Аналізи секреції ІЕМа з використанням РВМС яванського макака
РВМС яванського макака відмивали РВ5З і ресуспендували в КРМІ 1640, доповненому 10 95
ЕВ5, 220 нг/мл рекомбінантного ІЇ/-2 людини і 500 МОд./мл рекомбінантного ІЕМ-Р людини. У відповідні лунки додавали максимальні кількості клітин у густинах у діапазоні від 314000 до 818000 клітин на лунку. Одержували 10 кратні серійні розведення антитіл до ІЇТ7 і контрольних антитіл і у відповідні лунки додавали 100 мкл розчинів антитіл до кінцевих концентрацій 33,85
НМ-3,385 ФМ. Клітини і антитіла інкубували протягом 9,5-10 годин при 37 "С, 595 СО2. Після інкубацій у відповідні лунки додавали 50 мкл О0ОМ2216 (Іпийгодеп "М) до кінцевої концентрації 0,5
Зо МКМ ії додатково інкубували планшети ще 16 годин при 37 "С, 5595 СО». Після інкубацій планшети центрифугували при 3509 протягом 10 хвилин, акуратно видаляли супернатанти і кількісно визначали ІЕМа у супернатанті з використанням набору Кпезиз/СупотоїЇди5 ІРМа
ЕПЗА (РВІ Віотедісаї).
Статистичний аналіз
Криві ЕСво і ІСво для аналізів зв'язування, АОСС і секреція цитокінів аналізи одержували з використанням програмного забезпечення СгарпРаа Ргіт5 5 (сгарпРай боїмаге, СА, ОА).
Приклад 1
Одержання гуманізованих антитіл до ІТ7 з антитіла миші 5В128 тАБ миші 5ВІ28 (5ВІ28 належить до антитіла до І-Т7 І/Т7Ме28, наданому в опублікованій заявці США Мо 2009/0280128) гуманізували шляхом перестановки каркаса (баІгАсдца еї аї.,
Меїподз» 36:43-60 (2005)). Із застосуванням цього способу тАб миші 5ВІ28 гуманізували за допомогою синтезованої комбінаторної бібліотеки, що складається із шести СОК, злитих у рамці читання із сукупності окремих каркасів зародкової ділянки людини. Гени каркаса людини вибрали із загальнодоступної сукупності генів зародкової лінії антитіла. Ці універсальні праймерні сукупності каркасів включають 4 б генів каппа-ланцюга зародкової лінії людини, 5 послідовностей УК зародкової лінії людини, 44 генів важкого ланцюга зародкової лінії людини і 6 послідовностей УН зародкової лінії людини. Конструювали банк праймерів так, щоб кодувати кожний каркас кожного гена зародкової лінії. Також синтезували праймери СОК, специфічні до антитіла, з виродженими кінцями, які перекриваються із сукупностями каркасів. Конструювали бібліотеку з перестановкою каркаса 5ВІ28 шляхом об'єднання підбібліотеки з перестановкою каркаса варіабельної ділянки важкого ланцюга з підбібліотекою з перестановкою каркаса варіабельної ділянки легкого ланцюга. Підбібліотеки з перестановкою каркаса збирали послідовно з використанням ПЛР шляхом добудування, що перекривається, ланцюгів. Першу "ПЛР-злиття" проводили для синтезу кожного окремого каркаса зародкової лінії людини, злитого в рамці читання з ділянкою відповідних СОК. Потім проводили другу "ПЛР-складання" з використанням продукту ПЛР-злиття як матриці для ампліфікації підбібліотек повнорозмірніх МН і М. Бібліотеку з перестановкою каркаса 5ВІ28 клонували у вектор експресії Раб на основі М1З з використанням способу гібридизаційного мутагенезу за Кункелем. Приблизно 1300 клонів з бібліотеки з перестановкою каркаса 5ВІ28 піддавали скринінгу на клітинах СНО, що бо експресують рекомбінантний І/Т7СНО-клітина, з використанням аналізу МезобсаЇіе Оізсомегу
(М50). Один гуманізований варіант, 10010, зв'язувався з І/Т7 людини з афінністю в З рази нижче в порівнянні з його химерним батьком ("ЗВІ28сп"), як вимірювали поверхневим плазмонним резонансом (5РЕ) на РгоїеОп. 5ВІ28сп належить до антитіла до ІСТ7 ІСТ7Мо28, як надано в опублікованій заявці СІЛА Мо 2009/0280128, яка повністю включена в даний опис за допомогою посилання.
Оптимізацію афінності 10010 почали проводити для поліпшення його афінності зв'язування з ІЇ-Т7 людини і яванського макака. Спочатку 10010 клонували у вектор для експресії зсЕм на основі МІЗ для ощадливого мутагенезу. У цьому способі кожну окрему амінокислоту всіх б СОК піддавали випадковій мутації з використанням двох окремих бібліотек (М55 і МУУ5) на положення залишку. Конструювали всього 12 незалежних бібліотек для 6 СОК способу гібридизаційного мутагенезу за Кункелем. (Кипкеї! Т. А., еї аІ., Метод» Епгутої. 154:367 (1987).
Скринінг синтезованих бібліотек складався з одноточкового ЕГІЗА, сконструйованого з можливістю захоплення обмежених концентрацій секретованого 5сЕм з бактеріальних середовищ для культивування для нормалізації концентрації 5сЕм у кожній лунці. Мічений антиген І-Т7 зв'язувався із захопленим 5сСЕм і сила сигналу від цієї взаємодії корелювала з відносною афінністю зв'язування. Приблизно від 2000 до 3000 клонів піддавали скринінгу. Щоб додатково сконструювати варіант із поліпшеною афінністю, усі сприятливі одиничні заміни амінокислот спільно кодували з одержанням невеликої і злитої комбінаторної бібліотеки. На цьому етапі 14 окремих позитивних влучень в У положеннях в б СОК кодували одночасно з одержанням комбінаторної бібліотеки 5сЕм. У короткому викладі, конструювали вироджені праймери, які кодували всі сприятливі амінокислотні заміни, а також батьківський залишок у тому ж положенні. Цю комбінаторну бібліотеку піддавали скринінгу з використанням ЕГІЗА з можливістю захоплення однієї точки, як описано раніше. Скринінгу піддавали приблизно 1200 клонів. Варіабельні ділянки варіанта з поліпшеної афінністю 7С7 індивідуально клонували у вектор ссавців експресії рРОЕ і транзиторно експресували в клітини НЕК293. Розчинні дО людини, що секретуються виділяли безпосередньо з кондиційованих середовищ. Очищені дО аналізували на зв'язування з гпі/Т7 з використанням РгоїеОп і ЕАС5. В експерименті РгоїеОп демонстрували 6б0-кратне збільшення КО афінності оптимізованого антитіла 7С7 у порівнянні з
ЗВІ28сп. За допомогою ЕАС, у якому вимірювали зв'язування з рекомбінантним ІТ7 людей і
Зо яванського макака, що експресується клітинами СНО, для 7С7 демонстрували в 2,2 рази і в 14 раз більше ЕС5О для І-Т7 людини і яванського макака, відповідно, у порівнянні з ЗВІ28сй.
Вирівнювання послідовностей МН і МІ 5ВІ28, 10010 і 7С7 наведено на фігурах 1А і ЇВ, відповідно.
Приклад 2
Одержання антитіл до ІТ7 людини із приналежної людині бібліотеки
На додаток до гуманізації антитіла миші до І-Т7 (як описано вище в прикладі 1) одержували антитіла людини з використанням бібліотеки послідовностей людини. Застосування декількох стратегій одержання антитіл до І-Т7 максимально збільшує шанси одержання антитіла до ІТ7 з різними ознаками, таким чином, що можна вибрати ідеальне антитіло для конкретної мети. 2.1 Селекція
Для селекції використовували велику бібліотеку антитіл людини на основі одноланцюгового
Ем (5сЕм), одержувану з використанням індивідуальних варіабельних ділянок важкого ланцюга і варіабельних ділянок легкого ланцюга, виділюваних з кісткового мозку в дорослих, що не одержували раніше лікування донорів, які клонували у фагмідний вектор на основі ниткоподібного фага М13 (Ниїспіпо5 С, "Сепегаїйоп ої Маїме Нитап Апііроду І іргагієв" іп Апіїроду
Епдіпеегіпо, ЮБибеї. Вепіп, Зргіпдег І арогаїогу Мапиаї!5: р. 93 (2001); Поуа еї аї., Ргоївіп Епд. Оеєв.
Зеї!. 22(3):159-68 (2009)). Антитіла зі специфічним до І-Т7 5сЕм виділяли з бібліотеки фагового дисплея в серії повторних циклів селекції рекомбінантного І-Т7 людини і/або яванського макака по суті, як описано раніше в Мацднап еї аї. (Маї. Віотесппої. 14(3):309-14 (1996)). У короткому викладі, 5сЕм-фагові частинки інкубували з біотинільованим рекомбінантним І-Т7 у розчині (біотинільованим через вільні аміни з використанням Ел Іїпк 5йийо-МН5-І С-Віоїнп (Тнепто/Рієгсе, продукт: 21335)). Як правило, 5сЕм-фагів частинки інкубували з 100 нМ біотинільованого рекомбінантного ІЇ-Т7 протягом 1 години. Потім 5сім, зв'язаний з антигеном, уловлювали на покриті стрептавідином парамагнітні гранули (ЮЮСупабеайзФ М-280), дотримуючись рекомендацій виробника. Незв'язаний фаг відмивали в серії циклів промивання з використанням РВ5З- Гуееп.
Фагові частинки, утримувані на антигені, елюювали, вводили шляхом інфекції в бактерії і рятували для наступного раунду селекції. Як правило, таким чином проводили три раунди селекції. 2.2 Ідентифікація специфічних до ІЇ-Т7 зв'язуючих засобів за допомогою фагового ЕГІЗА
5сЕм5 надавали на фагових частинках і тестували в аналізі зв'язування для визначення перехресної реактивності і специфічності до рекомбінантних антигенів. Докладний опис способу аналізу наведений в розділі "матеріали і способи". Приблизно 2100 окремих точок даних одержували з аналізу зв'язування і ідентифікували влучення, тобто клони 5СсЕм, для яких демонстрували зв'язування з рекомбінантним ІТ7, піддавали секвенуванню ДНК (О5Ббоигп еї а!., Іттипоїесппоіоду 2(3):181-96 (1996); Мацонап сеї а!., Маї. Віотесппої. 14(3):309-14 (1996)). 2.3 Ідентифікація зв'язуючих І/Т7 засобів за допомогою ЕМАТ 100289) Унікальні 5сЕм експресували в периплазмі бактерій і піддавали скринінгу на їх активність зв'язування в аналізі зв'язування на основі технології флуоресцентного аналізу в мікрооб'ємі (ЕМАТ). Зв'язування 5оЕм з І-Т7, що експресуються на поверхні клітин детектували з використанням антитіла кози до міченого АІехайнйоге-647 антитіла миші. Докладний опис способу аналізу наведений в розділі "матеріали і способи". 2.4 Переформатування 5сЕм в Ід
Найбільш ефективні 5сЕм зв'язуючі засоби перетворювали у формат повного імуноглобуліну
С1 (антитіло ІДС), по суті як описано Регзіс еї а). (сепе 287(1):9-18 (1997)), з наступними модифікаціями. Фрагмент ОгіР включали в експресуючі вектори для полегшення використання із транзиторними клітинами СНО і для забезпечення епісомальної реплікації. Домен МН клонували у вектор (рЕШ1.3), що містить константні домени людини важкого ланцюга і регуляторні елементи для експресії повного важкого ланцюга Ідсі у клітинах ссавців. Подібним чином, домен МІ клонували у вектор (рЕО4.4) для експресії константних доменів легкого ланцюга (лямбда) людини і регуляторних елементів для експресії легкого повного ланцюга до у клітинах ссавців. Для одержання Ідс, вектори, експресуючі важкі і легкі ланцюги Ідс, трансфікували в СНО-транзиторні клітини ссавців. дО експресували і він секретувався в середовище. Перед очищенням збори поєднували і фільтрували. Потім Ддс очищали з використанням хроматографії з білююм А. Супернатанти культур навантажували на керамічну колонку підходящого розміру з білком А (Віоберга) і промивали 50 мМ Тті5-НСЇІ рН 8,0, 250 мМ масі. Зв'язаний (Дб елюювали з колонки з використанням 0,1 М цитрату натрію (рН 3,0) і нейтралізували додаванням Ттгі5-НСЇІ (рн 9,0). В елюйованому речовині заміняли буфер на РВ5 з використанням колонок МаріО (Атегепат, Ме17-0854-02) і визначали концентрацію Ід
Зо спектрофотометрично з використанням коефіцієнта екстинкції на основі амінокислотної послідовності Ідс (Мас еї а!., Апаї. Віоспет. 200(1):74-80 (1992)). 2.5 Аналіз зв'язування Іо
Види перехресної реактивності антитіл до ІТ7 визначали з використанням аналізу зв'язування ЕМАТ. Докладний опис способу аналізу наведений в розділі "матеріали і способи".
Наступні 11 антитіл ідентифікували як антитіла, які ефективно зв'язувалися з І-Т7 людини і яванського макака в скринінговому аналізі ЕМАТ: ІСТ70019, І770028, ІСТ70052, І.Т70076,
І-Т70080, І.Т70083, 1.770089, 1.770100, І.Т70137, 1.770142 і 11. 770144.
Приклад З
Антитіла до ІТ7 зв'язуються з експресуючими І-Т7 клітинами
Для визначення зв'язування ЕСво І Т70019, І/Т70028, І/Т70052, 1770076, ІСТ70080,
І-Т70083, І.770089, І.Т70100, І. 770137, 1.770142 ії І. 770144 із клітинами, що експресують І-Т7 людини, кандидатів піддавали скринінгу на зв'язування із клітинами СТ-550 проточною цитометрією. І/Т70080 (ЕС5о-0,28 нМ), І/Т70083 (ЕСво-0,37 нМ), ІСТ70137 (ЕС»о-0,41 НМ),
І-СТ70144, І 770142, І.Т70052 і І.Т70100 зв'язувалися з експресуючими І-Т7 людини клітинами.
Кандидати ІСТ70019, ІСТ70028 і І/Т70076 не зв'язувалися з експресуючими І-Т7 людини клітинами. Антитіла до ІСТ7 7С7 (7С7 описане вище в прикладі 1) і 5ВІЗЗ (З5ВІЗЗ належить до антитіла до ІТ7 І/Т7Мо33, наданому в опублікованій заявці США Мо 2009/0280128) використовували як позитивні контролі. Ізотиповий контроль КЗ347 використовували як негативний контроль і не демонстрували для нього якого-небудь зв'язування з експресуючими
І-Т7 клітинами. На графіку, представленому на фігурі 2, наведене середнє значення двох незалежних експериментів, і в таблиці, представленій на фігурі 2, продемонстрована середня
ЕСво.
Для визначення ЕСзо зв'язування варіантів із клітинами, що експресують ІСТ7 яванського макака, антитіла піддавали скринінгу на зв'язування із клітинами СупоЇЇТ7 СТ-125 проточною цитометрією. І/Т70052 (ЕСво-0,35 нМ), І/Т70080 (ЕСв5о-0,44 нМ), І.Т70083 (ЕСво-1,37 нМ),
І-Т70137 (ЕСво-1,40 нМ), ІСТ70100 (ЕСво-1/63 нМ) ії ІСТ70144 (ЕСво-7/,81 нМ), І-Т70142 і
І-Т70089 давали позитивний результат в аналізі зв'язування з І-Т7 людини. ІСТ70019, І.770028 і І-Т70076 не викликалися з експресуючими І-Т7 яванського макака клітинами. Для ізотипового контролю 347 не демонстрували якого-небудь зв'язування з експресуючими 1-17 клітинами.
На графіку, представленому на фігурі З, наведене середнє значення двох незалежних експериментів, і таблиці, представленої на фігурі 3, продемонстровано середня ЕСобо.
Таким чином, усі І/Т70052, І.Т70080, 1.770083, І.Т70100, 1.770137, І.Т70142 ї І/.Т70144 зв'язувалися із клітинами, що експресують ІЇТ7 яванського макака або І-Т7 людини. Особливо низькі значення ЕС50 одержували із клітинами, що експресують І-Т7 як яванського макака, так і людини, з використанням ІТ70080, І. 770083 11770137.
Приклад 4
Активність АОСС антитіл до І-Т7
Антитіла до І-Т7 тестували на активність АОСС проти експресуюяих І-Т7 людини ліній клітин з використанням клітинного аналізу іп міо. Клітини, експресуючі ІСТ7 людини, (клітини- мішені) висівали в співвідношенні 1:5 з лінією клітин природніх кілерів (МК) КС1333 (ефекторні клітини) у присутності варіантів антитіл до І-Т7 або ізотипового контролю протягом 18 годин.
Під час аналізу проточної цитометрії клітини КС1333 виділяли з використанням маркера МК
СсО56 (Віоіїєдепа Ме304624) і використовували 7-ААЮ, щоб відрізняти живі клітини від мертвих.
Відсоток живих клітин-мішеней розраховували із застосуванням цього способу і порівнювали з вихідним рівнем (контроль без антитіла). Цитотоксичність розраховували за наступною нижче формулою:
Відсоток цитотоксичності-100-(кількість живих мішеней/кількість живих мішеней у контролі без антитіл) х 100
І-Т70080 мав найвищу АЮОСС активність щодо експресуючих І-СТ7 людини клітинам (ЕСво-0,022 нМ), далі слідували І-Т70137 (ЕСво-0,044 нМ) і І-Т70083 (ЕС»о-0,094 нМ). І-Т70142,
І-Т70052, ІСТ70100 ї І/Т70144 також проявляли активність АЮСС (фігура 4). Ізотиповий контроль К347 і афукозильований варіант 347 ("Аїтис К347") не проявляли якої-небудь активності АОСС з експресуючими І-Т7 людини клітинами.
Також тестували антитіла до І-Т7 на АОСС активність щодо експресуючих ІСТ7 яванського макака клітин за допомогою активності на основі клітин іп міїто. І-Т70080 володів найвищою
АрСС активністю щодо експресуючих ІТ7 яванського макака клітин (ЕСзо-0,008 нМ), далі йшли
І-Т70137 (ЕСво-0,015 нМ), І-Т70142 (ЕС5о-0,058 нМ), І-Т70052 (ЕС»о-0,073 нМ), І-Т70144 (ЕСво-0,123), І. Т70100 (ЕСво-0,188 нМ) і І/Т70083 (ЕС»о-0,433 нМ). І-Т70089 також проявляв
Зо активність АОСС. Позитивний контроль 7С7 проявляв АОСС, і ізотиповий (негативний) контроль
КЗ347 не проявляв який-небудь АЮСС з експресуючими І-Т7 яванського макака клітинами. На графіку і в таблиці на фігурі 5 наведено два незалежні експерименти.
Таким чином, ІСТ70080 ї І/Т70137 мали найвищу активність АЮСС у клітинах, що експресують ІГТ-7 яванського макака, і клітинах, що експресують ІСТ-7 людей.
Приклад 5
Зв'язування антитіла до ІЇТ7 з РВМС
Зв'язування антитіл до ІСТ7 ІТ70080, І 770083 і І/Т7 0137 з РВМС людини оцінювали проточною цитометрією з використанням концентрації антитіла 2,5 мкг/мл. ІТІ 70080, І.770083 і
І-Т70137 специфічно зв'язувалися з рос (клітини ВОСА-4 х) (фігури бА і В). Зв'язування не відбувалося з ізотиповим контролем К347.
Зв'язування антитіл до ІТ7 ІТ70080, І. Т70083 і І. 770137 з РВМС яванського макака також оцінювали проточною цитометрією. 17170080 ії І/"770083 специфічно зв'язувалися з рос (клітини
НГА-ОВУ, Гіпеаде", СО12 Зо),
Приклад 6
Ефект антитіл до І Т7 на секрецію ІЕМ-альфа
Варіанти антитіл до І-Т7 тестували на АЮОСС активність на РВМС людини і яванського макака, як описано вище. Секрецію ІЄМа у супернатанті РВМС, культивованих з антитілами до
І-Т7 ї Сро-А, вимірювали за допомогою ЕЇГ ІЗА. Всі з І-"Т70080, І. 770083 і І-"Т70137 пригнічували реакцію ІЕМа на СроО-А в РВМС людини і яванського макака. І/Т70080 мав найбільший пригнічуючий ефект щодо реакції ІЄМа.
Приклад 7
Афукозилювання антитіл І.Т70080 і І."Т70083
Антитіла ІдСІ містять дві ділянки М-зв'язаних олігосахаридів в Ес-ділянці, і ці ділянки є значною мірою фукозильованими в антитілах людини. Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АОСС) опосередкована зв'язуванням лімфоцитарних рецепторів з РГс- ділянками антитіла, і на це впливає ступінь фукозилювання. Збільшення АЮСС спостерігали при зниженому фукозилюванні. Таким чином, одержували і аналізували афукозильовані варіанти
І. Т7. 7.1 Одержання афукозильованого варіанта антитіл до ІСТ
І-Т70080 ії І-Т70083 ІдСІ експресували в лінії клітин СНО, які не містять фермент с-1,6- фукозилтрансферазу. Експресія в цій лінії клітин призводить до антитіла, яке не містить молекулу о-1,6-фукози на М-глікані в Азп-297 важкого ланцюга. 1.2 Тестування афукозильованих антитіл до І-Т7 ІСТ70080 і 1.700083
Аналіз зв'язування з афукозильованими і батьківськими антитілами І-Т70080 і ІІ. 770083 на експресуючих І-Т7 клітинах проводили для оцінки, чи впливало афукозилювання на ЕС5О0 зв'язування антитіл. Для батьківських і афукозильованих антитіл демонстрували подібне зв'язування із клітинами, що експресують І/Т7 людини, і клітинами, що експресують 1-77 яванського макака (фігура 7).
АРрСС активність афукозильованих антитіл І-Т70080 і І.770083 тестували на експресуючих
І-Т7 людини і яванського макака клітинах з використанням клітинного аналізу іп міо, описаного вище (Приклад 3). Афукозилювання підвищувало АОСС активність у всіх тестованих кандидатів (фігура 8). Спостерігали збільшення активності вдесятеро для антитіла І/Т70080 при афукозилюванні в аналізах як для людини, так і для яванського макака (від ЕС5о-0,013 НМ до
ЕСвхо-0,001 нМ і від ЕС5о-0,006 нМ до ЕСв»о-0,00051 нМ, відповідно), при цьому спостерігали збільшення в 6-7 раз для ІТ70083 (від ЕС5о-0,089 нМ до ЕСзо-0,0105 нМ і від ЕС5о-0,36 нМ до
ЕСво-0,057 нМ відповідно). Афукозильований ізотиповий контроль К347 не проявляв який- небудь АОСС щодо експресуючих ІЇ-Т7 клітин.
Зв'язування афукозильованих антитіла до І/Т7 І/Т70080 і 170083 з РВМС людини оцінювали проточною цитометрією. Афукозильовані варіанти ІТ 70080 і І/Т70083 специфічно зв'язувалися з рос (клітини ВОСА-2 7") . Зв'язування було відсутнє з ізотиповим контролем 347.
Зв'язування афукозильованих варіантів антитіл до І/Т7 І/Т70080 і І/ 770083 з РВМС яванського макака також оцінювали проточною цитометрією. Афукозильовані варіанти ІТ 70080 і І-Т70083 специфічно зв'язувалися з рОоС (НГА-ОВ І іпеаде" СО123гоМ), Зв'язування було відсутнє з ізотиповим контролем КЗ347.
Приклад 8
Конструювання антитіл І-Т70080 і І.Т70083 8.1 Конструювання І 770080
Амінокислотні послідовності МН ї МІ ІСТ70080 вирівнювали з відомими послідовностями зародкової лінії людини в базі даних МВАБЕ (АйКпаих Н-Н, МийПег УМ апа Топтіїпбоп І: М ВАЗЕ; пЕру//у/базе. тгсо-сре.сат.ас.ик/) і ідентифікували найбільш близьку послідовність зародкової лінії за подібністю послідовності. Для домену УН вона являла собою УНІ-69 (ОР-10) і для домену МІ. вона являла собою Міатрааз-п. Вибирали сім залишків у каркасах (ЕМ/) кожного домену МН (АТЗК, Т165, 1691", 5707, 180М, У845 і О85Е) і домену МІ (ЕЗМ, К2ОК, 522тТ, М461І", МА81І",
Е5ОУ" ії ІЄ6М"У) для перетворення в найбільш близьку послідовність зародкової лінії. Мутації, відзначені зірочкою, перебувають у положеннях, класифікованих як залишки Верньє (Рооїе .). еї а. У. Мої. Віої. 224: 487 (1992), і їх, як правило, не змінювали. Однак на підставі аналізу як класифікації СОМ за Кабаї (Ууи Т. Т. апа Кабраї Е. А. У. Ехр. Мей. 132:211-250 (1970)) і ІМОТ (Геїйпапс, М.-Р. еї аІ. Оем. Сотр. ІттипоїЇ. 27: 55-77 (2003)) вважають, що ці положення забезпечують додаткову можливість додатково зменшувати імуногенність із невеликим ризиком зміни властивостей зв'язування батьківського антитіла. Крім того, мутагенез важкого ланцюга
Мб64С) проводили в послідовності СОК2 МН (як визначено за Кара) для усунення можливої ділянки дезамідування (МО) у цьому положенні. Мутагенез проводили на послідовності 5сЕм
І-Т70080 в рСапіарб (МсоСапепу еї аїІ., Аррі Віоспет Віоїесп 47:157 (1994)) стандартними способами молекулярної біології. У реакції множинного мутагенезу використовували різні комбінації мутагенних олігонуклеотидів для одержання бібліотек послідовностей, що містять різні комбінації мутацій ЕМУ. Потім тестували панелі варіантів 5сЕм І-Т70080 на збереження зв'язування з І /Т7 людини у вигляді неочищених периплазматичних екстрактів у клітинному аналізі зв'язування ЕМАТ, як описано вище.
Одержували сім ІСТ70080 варіантів у вигляді Ід. Див. фігури 9А ї 9В для вирівнювання послідовностей МН і М'., відповідно. 8.2 Конструювання І. Т70083
Також здійснювали приведення І/Т70083 до зародкової лінії. Найбільш близькими ідентифікованими послідовностями зародкової лінії були МНЗ-23 (ОР-47) і Матбаа!-6 (ОРІ -5) для послідовностей УН і Мі, відповідно. Один залишок ЕУМ вибирали для мутагенезу в домені
МН (МІббК) і вісім залишків ЕММ вибирали в домені М, знову включаючи вибрані положення
Верньє (м41", К42Т, Аб4О", Іб6К", 56806", А72Т, А740 і Е81с). Варіанти ІІ. Т70083, що містять різні комбінації мутацій, одержували безпосередньо у векторах рЕ), що містять окремі ланцюги бо МН їі МІ, стандартними способами молекулярної біології. Потім спільно трансфікували ланцюги
МН ї М. 1770083 у різні комбінації з одержанням дев'яти варіантів І.Т70083 Ід. Див. фігури 10А і 108 для вирівнювань МН і М',, відповідно. 8.3 Тестування сконструйованих антитіл
Одержувані ді! тестували для підтвердження того, що зміни послідовності вводили в
І-Т70080 ї П1/Т70083, і вони не виявляли негативного впливу на зв'язування батьківського антитіла із клітинами, що експресують І-Т7 людини (клітини СТ-550) або ІЇТ7 яванського макака (клітини СТ-125). Варіанти піддавали скринінгу на зв'язування проточною цитометрією. Усі варіанти І/Т70080 мали зв'язування з ІЇ/Т7/ людини і яванського макака аналогічним батьківському антитілу І/Т70080 (ЕСв5о-0,213 нМ і 0,547 нМ, відповідно). Див. фігуру 11.
Зв'язування варіантів І/.Т70083 з І Т7 людини також було аналогічним батьківському антитілу (ЕСво-0,464 нМ). Див. фігуру 12. Однак п'ять варіантів І/Т70083 (1/770083.4, ІІ 770083.9,
І-Т70083.3, І/.Т70083.6 і 1 770083.8) мали поліпшену зв'язуючу здатність у порівнянні з батьківським антитілом з ІТ7 яванського макака. Див. фігуру 12.
Сконструйовані антитіла І/Т70080 і ІСТ70083 тестували на АОСС активність щодо експресуючих І-Т7 людини ліній клітин з використанням клітинного аналізу іп міо. Усі варіанти
І-770080 мали підвищену АЮСС активність в порівнянні з батьківським антитілом (ЕСво«14,1
ПМ). Див. фігуру 13. Два кандидати з найнижчими ЕСзо являли собою ІІ.Т70080.6 (ЕС»о-6,9 пМ) і
І-Т70080.1 (ЕС5о-8,0 пМ). Значення ЕсСво для інших варіантів І. 770080 були таким, як зазначено нижче: І-Т70080.1 ЕСво-10,0 пм; І-Т70080.3 ЕСво-11,0 пМ; І-Т70080.4 ЕС»о-11,9 пмМ; ІСТ70080.5
ЕС5о-8,6 пМ і ІСТ70080.7 ЕС5о-7/,8 пМ. Було виявлено, що всі варіанти І-Т70083 мають підвищену активність у порівнянні з батьківським антитілом (ЕСзо»89,0 пМ). Див. фігуру 14.
Приклад 9
Афукозилювання сконструйованих антитіл І.Т70080 і І. 770083
Одержували афукозильований варіант І.770080.6. Афукозилювання антитіла І.770080.6 не впливало на його зв'язування із клітинами, що експресують ІЇТ7 людини або яванського макака.
ЕСво зв'язування афукозильованого ІСТ70080.6 з експресуючими ІСТ7 людини і яванського макака клітинами становило 152,3 пМ і 366,2 пМ, відповідно. Див. фігуру 15. У таблицях на фігурі 15 наведені середні результати трьох незалежних експериментів зв'язування, у яких вимірювали середню інтенсивність флуоресценції (МЕ).
Зо Також оцінювали АОСС активність афукозильованих варіантів І.770080.6 ї І-Т70083 (див. приклад 7 вище). Афукозилювання І770080.6 поліпшувало його АОСС активність відносно як до експресуючих І-Т7 людини клітин, так і до експресуючих І/Т7 яванського макака клітин приблизно в 10 раз. Див. фігуру 16. ЕСво афукозильованого ІІ.Т0080.6 становило 1,12 пМ проти експресуючих І-Т7 людини клітин і 0,44 пМ проти експресуючих І-Т7 яванського макака клітин.
У таблицях на фігурі 16 наведені середні результати трьох незалежних аналізів АОСС, у яких вимірювали цитотоксичність.
Афукозильовані І/770080.6 і 770083 тестували на АОСС активність на РВМС людини.
Цитотоксичність антитіл оцінювали проточною цитометрією і вимірювали в супернатанті опосередковану Сро А секрецію ІЄМос за допомогою ЕГІЗА.
Результати наведено на фігурі 17. В РВМС яванського макака значення ЕС5О для секреції
ІЕМа з використанням афукозильованих антитіл І770080.6 і І.Т70083 становили 58 пМ і 5216
ПМ, відповідно.
Було виявлено, що в цільній крові і РВМС людини афукозильовані антитіла І/Т70080.6 і
І-Т70083 специфічно зв'язувалися з ВОСА-2-позтивними клітинами. Зв'язування антитіл обмежувалося рос людини для всіх тестованих концентрацій (0,1-5,0 мкг/мл).
Було виявлено, що в цільній крові яванського макака афукозильовані антитіла ІТ70080.6 і
І.Т70083 зв'язувалися з рОС (клітини НІГА-ОВ' іпеаде" СО123"9") у всіх тестованих концентраціях (0,5-2,5 мкг/мл).
Приклад 10
Афукозилювання антитіла І-Т70137
Афукозильований варіант антитіла І-Т770137 одержували, як описано вище в прикладі 7 для антитіл І"Т70080 і І. 770083. 10.1 Зв'язування з розчинним рекомбінантним І-СТ7 людини
Використовували ВіАсоге (поверхневий плазмонний резонанс) для вимірювання кінетичних констант швидкості (Коп, Кої) для зв'язування афукозильованого Ідс1 І Т70137 з білком ІСТ7 людини з використанням формату аналізу захоплення дос. Зв'язування кожної концентрації двократної серії розведень білка І-Т7 реєстрували після першого захоплення Ідс на поверхні сенсорного чипа, за яким ішов білок Ї/Т7 або буфер пристрою. Між кожною парою ін'єкцій поверхню захоплення дос регенерували. Потім розраховували індивідуальні константи бо швидкості асоціації і дисоціації на підставі одержуваних кривих зв'язування з використанням програмного забезпечення Віаємаінайоп доступного через програмне забезпечення постачальника, що використовує модель апроксимації 1:11, яка включала термін для коректування на обмежене масопереносом зв'язування, якщо його будуть детектувати. Із графіка даних ВіІАсоге з високим розрізненням визначали, що константа швидкості асоціації і константи швидкості дисоціації для зв'язування білка ІЇ/Т7 з афукозильованим Ідсі І/770137 становить 1,855х105 М" с". Цей же графік також використовували для визначення відповідної константи швидкості дисоціації для таких взаємодій, яку вимірювали як 3,175х102с7. Із цих констант швидкостей реакцій потім розраховували Ко з коефіцієнта Кон/Коп, ЩО дорівнює 171 нМ.
Ці результати узагальнено в таблиці З нижче. Помилки спостерігача для Коп і Коє були низькими, і повна сумісність із даними була гарною, як судили за значеннями Спі2 «1 95 від розрахованого
Втах (максимальної відповіді). У своїй сукупності це дозволяє припустити, що використання моделі односайтового зв'язування для апроксимації даних було виправданим. Оцінка не вказувала на те, що зв'язування було обмеженим масопереносом, таким чином, вимірювані константи швидкості асоціації вважали правильними.
Таблиця З
Узагальнення кінетичної константи швидкості реакції і даних КО для зв'язування білка І-Т7 людини з афукозильованим Ідс1 ІСТ70137
Коп-константа швидкості асоціації; Конк-константа швидкості дисоціації; Ко-рівноважна константа зв'язування 10.2 Зв'язування з лініями клітин, що експресують ІСТ7 1(00320| Зв'язування афукозильованого ІТ70137 з І/Т7 визначали з використанням ліній клітин, що стабільно експресують І-Т7 людини або яванського макака. Середню інтенсивність флуоресценції пов'язаних із клітинами антитіл оцінювали проточною цитометрією. Клітини інкубували з тестованим антитілом у концентраціях, що збільшуються, у діапазоні від 0,004 до 333,3 нм протягом 30 хвилин при 4 "С. Після інкубації клітини відмивали холодним РВ5 і інкубували протягом 30 хвилин при 4 С з антитілом до людина-АІїеха Біпог 647. Потім визначали інтенсивність флуоресценції за допомогою БАСб5 і розраховували значення ЕСв5о з використанням нелінійного емпіричного рівняння в програмному забезпеченні СгарпРай Ргізт б.
Результати представлено на фігурі 18. Було виявлено, що афукозильоване 1-770137 зв'язувалося із клітинами, що експресують рекомбінантний І/Т7 людини і І/Т7 яванського макака залежним від дози способом. Не спостерігали значимого зв'язування з ізотиповими
Зо контролями. Середня половина максимальної ефективної концентрації (ЕСво) афукозильованого І-Т70137 становила 0,303 НМ для зв'язування із клітинами, що експресують
І-Т7 людини, і 2,148 нМ для клітин, що експресують І-Т7 яванського макака. 10.3 АОСС активність на лініях клітин, що експресують І-Т7
Здатність афукозильованого І-Т70137 індукувати АОСС вимірювали за допомогою аналізу сортування, що активується флуоресценцією, клітин (БАС5) на клітинах-мішенях, які експресували І-Т7 людини або ІЇ/Т7 яванського макака. Клітини-мішені культивували разом з лінією ефекторних МК клітин КС1333 у відношенні 1:5 у присутності концентрацій, що збільшуються, афукозильованого ІСТ70137 або ізотипового контролю (у діапазоні від 0 до 6,66бх105 М). Для оцінки життєздатності клітин-мішеней проточною цитометрією КС1333 виділяли з використанням СО56 і мертві клітини виділяли з використанням вітального барвника 7-аміно-актиноміцину О (7-ААВ). Живі клітини-мішені визначали як негативні за СО56, негативні за 7-ААО. Відсоток цитотоксичності розраховували за наступною нижче формулою: 95 цитотоксичності-100- (відсоток живих клітин-мішеней/відсоток живих мішеней у контролях без антитіл) Пх100. Значення напівмаксимальної ефективної концентрації (ЕС50О) розраховували з використанням нелінійного емпіричного рівняння в програмному забезпеченні СгарпРаай Ргізт.
Вісь х: концентрація антитіла.
Результати представлені на фігурі 19. Афукозильоване І-Т70137 індукувало АЮОСС на клітинах, що експресують І-Т7 способом, що залежить від дози, з ЕСвхо 4,19 пМ на клітинах, що експресують ІСТ-7 людини, і 1,89 пМ для клітин, що експресують ІТ7 яванського макака.
10.4 АОСС активність на первинних плазмацитоїдних дендритних клітинах
Секреція ІРМ-ос у відповідь на агоніст ТоїЇІ-подібного рецептора 9 (ТІ КУ) багато в чому обумовлена плазмацитоїдними дендритними клітинами (рОС) у препараті мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМСО). Таким чином, безпосередньо визначали можливість афукозилювання ІСТ70137 індукувати АОСС первинних рОС шляхом оцінки його здатності блокувати секрецію ІБМ-а в РВМОС. У цих аналізах очищені РВМС висівали в 96-лункові круглодонні планшети в середовищі, доповненому 10 95 ембріональною телячою сироваткою і 200 нг/мл рекомбінантного І/-2 людини. У відповідні лунки додавали серійні розведення афукозильованого ІТ70137 і контрольних антитіл у двох повтореннях і інкубували протягом 9,5 годин. Після інкубації в кожну лунку додавали 50 мкл ТІ КУ агоніста О0ОМ2216 до кінцевої концентрації 0,5 мкМ. ІЄМ-о; кількісно визначали в супернатантах з використанням набору
Мийізибіуре ІЄМ-о ЕГІ5А, ії його значення наведене у вигляді пг/мл супернатанту на фігурі 20.
ІС5О АССС розраховували з використанням нелінійного емпіричного рівняння в програмному забезпеченні сгарпРаай Ргібт м5.01.
Афукозильований ІСТ70137 знижував опосередковану ТКУ секрецію ІБМ-х в РВМС залежним від дози чином з напівмаксимальною інгібуючою концентрацією (ІСзо) 0,048 нМ. Ці результати вказують на те, що афукозильований ІСТ70137 ефективно виснажував природні первинні РОС людини в РВМС. 10.5 Зв'язування з первинними плазмацитоїдними дендритними клітинами
У мононуклеарних клітинах периферичної крові (РВМС) оцінювали специфічність афукозильованого І-Т70137 до первинних плазмацитоїдних дендритних клітин (рос) людини за допомогою ЕАС5. РВМС виділяли від донорів, що є людьми. Для правильної ідентифікації цієї підпопуляції дендритних клітин спочатку використовували маркери СО123 (що експресуються рос і базофілами) і СО304 (унікальний для рос). роС були СО123-4С20304 ї- подвійними позитивним, і забарвлювання СО304 було достатнім для ідентифікації рос. Див. фігуру 21 (верхня панель).
Афукозильований 1770137 зв'язувався тільки з СО 304-позитивними клітинами, що вказує на те, що воно зв'язувалося тільки з рос. Див. фігуру 21 (нижня права панель). Не спостерігали значимого зв'язування із цією популяцією з афукозильованим контрольним антитілом КЗ3-47
Зо ізотипом ІДОЇ людини. Див. фігуру 21 (нижня ліва панель).
Приклад 11
Активність іп мімо антитіл до І Т7
Три антитіла до ІТ7 вводили самцям яванського макака: афукозильоване 7сС7, афукозильоване І/Т70080.6 і афукозильоване Ідсі І/Т70137. Усі три антитіла активно виснажували плазмацитоїдні дендритні клітини (рос).
Введення афукозильованого ІТ70080.6, як правило, добре переносилося. Однак спостерігали наступні результати патологічного дослідження: зменшення числа нейтрофілів, судинний лейкоцитоз, збільшення гломерулярного матрикса і васкулярного/периваскулярного запалення. Крім того, поява антитіл до афукозильованого антитіла І.770080.6 (антитіла до лікарського засобу) була асоційована зі збільшеним кліренсом афукозильованого ІЇТ70080.6.
В іншому дослідженні вивчали токсикокінетику афукозильованого 7С7 і афукозильованого
І-Т70137. У даному дослідженні 5 еквівалентних доз антитіл вводили яванським макакам за допомогою інфузії. Після введення експозиція була порівнянною між афукозильованим 7С7 і афукозильованим ІСТ70137 у рівноважному стані. Крім того, як продемонстровано на фігурі 22, специфічне і оборотне виснаження рОС одержували з використанням будь-якого антитіла.
Виснаження рос призводило до інгібування ех мімо продукції ІЕМа. Див. фігуру 23.
Однак патологія тварин, яких обробляли афукозильованим 7С7 і афукозильованим
І-Т70137, була різною. У деяких тварин, яких обробляли афукозильованим 7С7 спостерігали збільшення маси селезінки. Також спостерігали мікроскопічні дані в деяких тварин, яких обробляли афукозильованим 7С7. Зокрема, у селезінці спостерігали червону пульпу і гіпертрофію/гіперплазію макрофагів. У печінці спостерігали гіпертрофію/гіперплазію клітин
Купфера. Крім того, імуногістохімія показала гранулярні відкладання, які містять Ід людини/7С7 і Їдо мавпи, пов'язані з гіпертрофованими/гіперплазованими клітинами Купфера в печінці і макрофагами червоної пульпи в селезінці. Ці спостереження відповідають надмірному фізіологічному кліренсу імунних комплексів, що містять лікарський засіб (7С7) і антитіла до лікарського засобу (АБА). На противагу цьому з афукозильованим І-Т70137 не спостерігали змін маси органів і макроскопічних або мікроскопічних даних.
Крім того, незважаючи на те, що кількість нейтрофілів падала нижче 1 ЕЗ/мкл у двох мавп, яких обробляли афукозильованим антитілом 7С7, не спостерігали значимих змін кількості 60 нейтрофілів у мавп, яких обробляли контролем або афукозильованим 1.770137.
Таким чином, незважаючи на те, що всі три антитіла виснажували роС іп мімо чудові показники безпеки і відсутність антитіл до лікарського засобу після введення афукозильованого
І-Т70137 були несподіваною перевагою.
Приклад 12
Картування епітопів
Для визначення епітопу, що зв'язується антитілами до ІСТ7, конструювали химерні поліпептиди, що містять поліпептиди І-77 і І-Т1, ї тестували зв'язування антитіл до ІТ7 із цими конструкціями. І-Т1 (номер доступу О8М149) вибирали для конструювання химерних варіантів, тому що він володіє такою ж модульною структурою, як і І Т7, і має 65 95 ідентичність з І-Т7, але не розпізнається моноклональними антитілами І-СТ7. Химерні поліпептиди одержували заміною позаклітинних доменів Ід І-Т7 аналогами І/-Т1. Усі ці конструкції містили М-кінцеву мітку
Над. Результати демонстрували, що 1770080 ї І.Т70083 зв'язуються з доменом ді ІСТ7. На противагу цьому, антитіло 7С7 зв'язується з доменом /д2 І-Т7.
Зазначений вище опис конкретних варіантів здійснення повністю відкриє загальний характер винаходу, який фахівці в даній галузі, застосовуючи знання в даній галузі, можуть легко модифікувати і/або адаптувати для різних застосувань, таких як конкретні варіанти здійснення, без зайвого експериментування, не виходячи за рамки загальної концепції даного винаходу.
Таким чином, такі адаптації і модифікації призначені входити в значення і діапазон еквівалентів варіантів здійснення, що розкриваються, на підставі вказівок і керівництва, наданих у даному описі. Слід розуміти, що формулювання або термінологію в даному описі використовують для мети опису, а не обмеження, таким чином, що фахівець у даній галузі інтерпретує термінологію або формулювання даного опису у світлі вказівок і керівництва.
Об'єм і суть даного винаходу не повинні бути обмежені яким-небудь із описаних вище ілюстративних варіантів здійснення, а слід їх визначати тільки відповідно до наступної нижче формули винаходу і її еквівалентів.
Список послідовностей «110» Медіттипе
Зо щи, «120» ЗВ'ЯЗУЮЧІ І/Т7 МОЛЕКУЛИ І СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ -130» -160» 292 «170» Раїепінп мегвіоп 3.5 «21051 «2115 351 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 УН «4005 1 сачастовоєс сасачесвасс баусдостчЧач созустуазає січЧаЧасстс зчасчЧаззавсо во їссгпсавчоа сс сазссв сасосттсаєє зсестасссаз Хачазчтачає зчаадсадаве 120 сасдзочаача чессачзааса часєдваак сІссаксссЄ асбСзаабсдаєцча бтастваздкає іо засцаававу савоудсва дассвавсгуУ астастацаза заксссстач сасачестас
ЕкодвоасЕса чесзаєтаас віссовсдаєсє ссгсустаЄсЄ аїбассобсос заччезчацоає за чаєсасоцдда єчуастаєсєсєч чаЧЕсзазча зесхсачеса ссусесссссс а з51 -21052 «2115117 0212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 УН «40052 біп Уаї бів без біп осів бек сіу АтТа бій) ГПез Уаї Пуз Рко 5зіу Аа 1 5 19 15
Зех Уаії Пцув Мек Бех Суз Гуз Аза Рбе біу Тух ТВжх Рпе Тпх ТБх Туг 20 25 30
Рго І1ї1ее бій Тер Меє Був біп Авп Нів біу буз бек Пец 513 Ттр Те 35 40 45 біу Азв о Бе Ні Рхо Тух Авп Азр о Авр Тпх пСув ТУух Азп обі Ббуз РБе
ЗО 55 бо
Туз сіу мує Аза пу Тез Тих Уаї біц Пув Яех бет Бех Тпх Удаії Туг 65 то 75 що пей січ пе) бех Аху йец Трх бех Ар Авр о бех Аза Уві Тух Тук Сув ва 0 з5
Аїа Акз біу АБр о Аво Тух біу Меб Двкр Тут Тер біу біп Ту тТНх Бех 100 105 то
Уаї Тих Уаї Вех Бех ї15 «2105 З «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 УНСОВІ «4005 З
Тву тух Вко ї1е Січ і 5 «21054 -211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» 5ВІ28 УНСОВ2 «4005» 4
Азв Ре Ніз Еко Тук Азп Авр Азр о ТЬї пу Тут Азп бій Пув РБе Буз 1 а 10 15 сіу «2105» 5 «-2115 8 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» 5ВІ28 УНСОВЗ «400» 5 су Аво Ар о Тук С1у Мебє АврБотух
Ї 5 «2105» 6 «2115» 321
Зо «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» ЗВІ28 МІ «400» 6 часаєсабза гуасссазсс ссвазазаєктсо асзбЄссвсах сзадсбаддача сазучесаче 0 ассвсисстчса апчссазєса завсазессає ассассоасвУ сескаарасса асачававссв 12о зачдсазсссс ссаваазсвсє часєсбаНссса дсасссаавсс ддсавсассса ачессссцає счссїсасач зсачевувес годоасачає бЕсСасїстсса ссабтазсвза бубосаатсе хо чавчасствач сазассаЕсс стагстцдсєва сабсочвасЕ асссасссвс чссовЧссесо 300
Ччачасаввачу сочазасавна а 321 -2105 7 «2115107 0212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 МІ «4005 7
Ав т1їє Уаї Меї Тих біп бек бів Буз Ре Меї бек Ту бЗех Уаіїі біу 1 5 10 15
Авр Аха Узі бек Іі ТЬк Сув буз Віа Зек бів Азп Уаї Ах ТвпЕ Аїа 20 25 30
Уаї Аіа Ткр Тух біп біз Був Ро біу бів бЗех Бко Був діа пен їіє 35 40 45 тТук Беч Аїа Бех Ах втч Нів Тпхї біу Узі Рхо Авр о Аку Ре Тк об1У о 5а БО
Зех піу бех біу ТВх Авр ре Тпх Пец Тк Ті бек Авп о уаї бій бек 655 7а 75 во сій Авр о Геч Аза Авр Тух Ре Суз їги бів Нів Тгр АвпоТук Рко РБе 85 зо з5
ТвЕ Рпе біу Зек біу ТВвкЕ о Пув Бей бій Т1іе Буз 100 195 «-2105 8 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 М СО «А00» 8
Був Аза Бех біп Ав о Узі АхчЯЧ ТВх Аів Уаї діа 1 5 То «2105 9 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 М СОВ2 «400» 9 їец Аза Бех АзпоАга Нів ТпЕ 210510 «-21159 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗВІ28 М СОВЗ «4005 10
Бей біп Ні ТКр о Азп о ТУЮ Ро Ре ТЕХ 1 5 «2105 11 «2115 351 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» 707 УНН
З5 «4005 11 чачасосвис сузсосазес сзасоуачас зсадсасазчс сізууачаєс ссодачассс 5О їсскоогосвоа ссгссачаке сассткєвас асствасссоса ссочауїдоах здсовсачосе 129 сессзуазсвазз ассточаасо зассзосзас: стссатсоссі всдасоузсда свссвачіаєс їв авсчацазис їсазадусач адссассаєбо ассасачаса сасбссасзау сасадтосає 240 асачачстаа ссвусстова асссзчаузчас асчассУсчє ассаскоотас здзааввасаас зо часєасоцос годастіакєкса осздссаоцас асссссакца сечбЯабсссо 351 «2105 12 «2115117 «212» білок
213» Штучна послідовність «223» 707 УНН «4005 12 сій уУаї бів ей уаї бій Бек біу біу Сіу Уаї Уаї бів Рго сіу Акад і 5 18 15
Бех Пец Аку пе) Бех Сув Аза Аза бек біу РБе Тпх Ре бек Ше Тух 20 25 30
Бгто Іїе бій Тур Уаї ДдкФ бів діа Рго біу біп біу ей біз Ткр т1е 35 чо 45 ді АвпорРре Нія Рко Тух Ап Ав Аве ТЕ Був Тух Ав о бій Пув РВе о За во
Гуз щу дка уві Ту Меї Тпх о ТвВх Аво Тв бек ТНК Зех Так о уаї Тух 5 7о 75 но
Мебє біз без бек щвх Без Ага бек біз Азр о Тьж Аза Узі Тух Тук Сув 5 за за
Твх Акз біУ Азр о Аве оТук о біу Бе) Авр о Тух Тер біу бів ша Твж їяви 1209 їз 11 210513 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 707 МУНСОВІ1 «4005 13 їі Тух рРко Ті 52 і 5 «2105 14 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 707 УНСОВ2 «400» 14
Авп оре Ні рхо Тух Азп Аяр о Азр Так о Буз Тук Ап сь Тув РпЄ Був 1 5 10 15 сім «210515 «2115 8 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 7С7 УНСОВЗ «4005» 15 сіу АБр о Азр Тух с1іу Бей Авр Тукх
Ї 5 «210516 «2115 321 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» 7С7 МІ «400» 16 аагагсссаца тдасссадад сссдадсадс стдаасусаа чесодЕсадєда гсосдесасс 60 астасстцру асуссацесса заасчкссЯє ассосацЕсЧ сахсучсаєса чсачЧазасосд 120 счсааачсас счавастяссї частсасєста чдсзаачеівнаєс Ччісастассоас соасЕссдадес 180 сешгсссачся часа сс Сододсассчає ссСсазссссда ссаєЄєвасад сескоасадаає 240 чаачаєссся ссасссаєка Єсоєстосауч саєсодаавсюї аєссоуєєсас ссусооссса 300
Часасаааає сочазасстава а 321 «210517 «2115107
Зо «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 7С7 МІ «400» 17
Азв о Тіє біп Мес Тих бів бек Рто бек Бех Пец Бех А1їа Звжх Уаї щу 1 5 10 15 дер лк Маї Тих І1е ТЕ Сув дер Аїа бех сіп Ап уаї Ака тах Аза 20 25 за чаї Аза Тхр тТух бів бів був Руб сіу Був Аза Рго Ббуб АкЯ Бей ї1е 35 40 45
Тук Пец Азїа бек Азп Ак Нів Тв біу Уаї Рхо бек Адку Ре Бех б1у
ЗО 55 60
Чек біу бех сІіу Тік Адвзр Рпе ТПк Пей ТрІ Т1є Зек бек цем біп Зек 65 7т7о 75 о сі) Авр Ре діа Так тує Тук Суз Тецй бів Нів Тгр Авп Тук Рко РНіе 85 0 95
ТП оБпе 01у Рко б5біу ТВБЕ Пуз пес бій Це уз 109 105. «2105 18 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 707 МІ СОВІ1 «4005 18
Азр о Аіа Бех біп Авп оуаї Ак Твх Аза Уві Аіа ї 5 10 «2105 19 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 707 М СбОВ2 «4005 19 їви Азїа бек Ав Ак Нія ТВЕ 1 5 «2105» 20 «-21159 «212» білок 213» Штучна послідовність
«223» 7С7 М СОВЗ «400» 20 йем Бій Нія Тхр Азп Тух Рго вне ТвЕ ї З «2105 21 «2115 375 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080 УН «400» 21 саччбдсаче сдасоасаакєс бододессдач згодзацасус ссдочасескс дусчавадчессе бо жсссасваця сасссточача сацстссвоач застабосся СсаукссоЧУуєЄ ссдасазоасс
Т20 ссаадчасази чЕсСеЕєдЧазчсо зсабосчоавачся аєсчасчестста чЕсссСодваас авчадачесає
І80 їсасзвасач ссзасцасзу забсасссєЕ гссаоасочасяЯ звабсссассад сасадестає 40
КЕдочвзасіза чсачесстаацч акгасзасоас асаЗзсстесс агтассосоас содасавесод 300 частасааєу сетаєсєсаєтсь єкКадассочЕ сесссбуасє ссбадовссо ачузассссоа зо аЕсавосЯбсЄ сазає 375 «2105» 22 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080 УН «400522
Зі таї біп Гей Уаї біп бек біу діа біц Уаі Бу Афа рРко біу ТЕ 1 З 10 15 йек Уаї Був Узі Беї Сув БуБ Аза бех біу Авр Бек Ре Ахоа Авп о Туг 20 25 30
Аза чаї Бек Тер Уві Ака сів Аза Рко спі бів біу Пецз біз Тр Меї 35 40 45 сСіу діа Мебє Меї Рхо Бех Рпе біу ТВх Ага біс Ні Бех б5іп біп ВББе во 55 о
Ап обіу дса Уві ТВх без Бех Аіа дяр бі бек Тпк беїг ТБх Аза Тух 65 то 75 но
Пец бін Тез бек бек ез Аку Тух Авр Азр Тпх Аза Хаї Тух Тух Суз 85 30 95
Аіз біу Бех АкЯ Авр Тух Авп о Аїа Тух Ні РБє Ткр ТІ сіу Рко Рко 100 105 110
Аврорпе Ткр б1у Аку 951у Тпх Ббецп Уаі ТВх Уаї Бех зек 115 129 125 «2105» 23 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.т170080 УНСОВ1 «4005» 23
Двп Тут Дів Уві Век і 5 «210» 24 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70080 УНСОВН2 «400» 24
А1а Межє Меї Рко Бех Рі біу Тр Агуд біш Нів Бех біп Сіп Ре Авп ї З 10 15 іш «2105» 25 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70080 УНСОВЗ «400» 25 ек аку Авр тТухк Авп діа Тух Нів Бра ТЕБ Тйх біу Рко Рго Авр РБе 1 5 10 15 «210» 26 «211» 324 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080 МІ. «400» 26 тсетасазує бцЧасісацес ассстісачсд ссачеуаєсе сауузавадає дассавчаєє во жест сазач сзаасадсає Едосазусаса ашвтготссасс чабассвоса озадссоу9о 1209 сачасссску Єсабочксаї зскесасаас азсозассцос ссссауачає ссссзачеча 18 тЕссссадсс ссасссссуо даасасаосс асессдаєса Єсачсаззче счавусєсову 240 часчазусся астаєсасєта ссазасоєЧчоа часастааята чедарсассс одчачексаце 00 чоадудасса адстдассує сота 324 «2105» 27 «2115108
Зо «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080 МІ. «400» 27 бех Ту бій Печ Ту бій Рхо Рго бех Уаї Бех чаї Аа Рхо щ1у Був ї 5 10 15
Тих Віз Буз Ї1е бек Сув біу сіу Ар Бетг Уаї сіу бек ТВк бехтх Уві 2 25 30
Нів Тер Тух іп бів був Рхо бі іп Аза Рко Уві Ме: уаї Мебє рРпе 435 40 45
Тут Аєп бах Авр Ак Рко бек біу Т1іе Рко біз Аку Ре бек 51у Бег
ЗО а во
Ті Зек біу Авп Тпг Аза Тк Пец Твах ЇІ1е Бех Акд Уаії бій Азїа б1у 55 79 75 во
Авр бій Аза Азр Тух Тух Сув бів Уаії Тгр Авр ТЕ бех Бех Авр НІВ 85 Зо 95
Во бій Рве б1у біу Б1у Тих Гуз цей ТВх Маї Тей 100 105 «210» 28 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70080 МІ СОВ1 «400» 28 сбіу Ф1у Авзр Зех Уві Сіу Зек Тк бЯех Уві Ніз 1 5 15 «210» 29 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70080 МІ СОВ2 «400» 29
Тух Ави Зетх Авр АхкЯ РЕ бех -2105» 30 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність
«223» І. Т70080 МІ СОВЗ «400» 30 біп Уаї Тхр о Авзр ТП 5ек Бег Авр Нів РКо біш 1 З 10 «2105 31 «2115 375 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т7008041 УН «400» З1 садуєчсадс саобуслаєс бадодссуад сбозадаадє сбддасссс удговаачес
БО
Кеседсзачу саєстодаца сачссссадоу аассаєсчсся Єсауссодчає одсдасадучєео 120 ссацддасаао Чссссазату даксаауадся асуабєуєста «СЕскоОдаас аадодаєсає 189
Єсасвасачє гссаззодсас аддеєсасссїє ассосодасу загбссасдаза сасаусессає 240 асудаассоза дусачсстазо аєссуадоаас асудссчсєсє агсассясбоаєс часу 300. частасаасо сстассаїсї сбоуасєдуює сесссстдасо єссадддосся вдчавесссу 36О0 чЕсассосес сссса 375 «2105 32 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т7008041 УН
Зо «4005 32 біп Уаї біп цец Уаї біп бек біу діа біц Узі Бруз був Рхо б1іу бек 1 5 10 15
Зек Уаї Був уаї бек Сув Ббуз Аза Бех біу Авр Бех Рве Ах Азп Тух 2 25 30
Аїа уаї бех Тер Уаї Ака зіп Аїа Рго біу сіп біу ем біч Тхр Меє 35 о 45 сіу Аїа Мес Мебс Рко Бех Рів обіУу ТВК Ах бі; Нівз Бех біп біп РБе
З 55 БО ів сіу дко баії ТВжх Бей ТБЕ діа Авр о бТц бек Тпх Бех ТВх Аза Тух 65 70 75 во
Меє бій Без Зах бЗех Бей Акч о бех бій Ар ТВх Аїа Уаї Тух Тук Сув 85 зо а5
Аіа бі Бех Ахоа Авр Тук Аа діа Тук Ні Рре Тер Тих 01у Рко Рго 100 105 110
Авр Рпе Тхр біУ Аку біу ТВх тен Уаії ТБх Уаї бек Зех 115 150 125 -2105 33 «2115 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 7700801 МНСОВІ «4005» 33
Азп отут Аіз Уаї бек 1 5. «210» 34 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.т700801 УНСОВ2 «400» 34
Аза МебЄ Меє Рко бех Ріе біу Тих Аку біш Ніз Бех біп біп ВНе сСіп 1 В во 15 сіу «2105 35 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність в2
«223» І. 170080.1 УНСОВЗ «4005 35 бек Ак АзротТує АвпоАіа Тух Ніз Рпе Тжхр тб Сіу РКО Рго Авр Ре 1 5 10 15 -2105» 36 «2115» 324 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.1 МІ «400» 36
Єссрабасос Есасесаудсс асесстсваса гсадчесдчссс саддааачає дуссадчаєє 6о асстасачоо бадасачсяє сочсадсаса азосукесасї дасСассадса Заассуччс 190 ; ! : і садусссес єдасудесає ЯгеЄрасаас адсдассоде ссссадодає сессбодвоасда 180 бЕсСсссдаст ссабсєссосса чЧазсасоцЧес асесссуасса Ссазсадочу счааоссоадУ о чатззяадеся астаєтаєста єсачосачсЧо чатгастачса усчассаєсс очачсесоуде 00 чоазаачасса ачесаассЯє сста 354 «2105 37 «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.1 МІ
Зо «4005» 37
Зеї ТУ Уді їй Тк бів Рто Рхо бек Ууді беїх Уві Аза рРхо бі Був 1 5 10 15
Тих Аїа Ага Іїе Так Сув біу б5іу АБр Зех Уаї біу веї ТВх Бех Уві 20 25 зо
Ніз Ттр Тук біп біп був Рго біу біп Аза Рго Уві Меє Уаї Меб Рреє
35 40 45
Тух Ап бЗехг Авр Ако Рго бек біу І12 Рго сій Аку Рее бек біу бек 5а 55 бо
Ті Бек біу Ап Так Аїа Тих Бен Тпжх їі Бек Аку Ууаї бій Аза біу
Б 7а 75 по
Авр біц Авіа Ввр Тух Тукх Суз біп уаі Ткр Авр Так бЗег Бех Авр Нів 85 90 5
Рго біз Ре сі біу біу ТпЕ Був цей ТПх уа1ї пей 1600 105. -2105» 38 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т770080.1 МІ СОВ1 «400» 38 біу біу Азр Бех Уві б1у беж ТрІ бек Уві Нів 1 З То «2105» 39 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т700801 МІ СОВ2 «400» 39
Тут Ав зЗех Ар о Ахка Рко бек ов 1 я «210» 40 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.1 МІ СОВЗ «400» 40
Зіп Уаї Тквр Авр Тпх Бех Бек Авр Ніз РКО бій 1 5 18
«2105» 41 «2115 375 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т170080.2 УНН «400» 41 саччкасацс СччбСасваєс содозссозУу дсдазозаце ссчзаускус ччсчавачесс бо сссросвааЗу сасссадада садссссада аасбаєуєсу бсадссоЗоаї чсдасадасс 120 есевччасваЗз зссссоваса зчасззауєсч асбзакуєста сесссадаав задудаосає: ї89 жсасаусадї Кссадудсєва адссасеско сесусудчася аатессасуад сасадестас 2-40 абддвастода дсачсставо абссоаудає асоддссувсє аєсассубсує дудсвоєсод 300 частасааєа стсбассаєтє Єгадастаді ссссседасе єссодадесоа зодавосссвд 350
Чесассуєст ссеса 375 «2105» 42 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т170080.2 УНН «400» 42 сійп Маї бій їсц Уаї бів бек біу діа Сів Уві був буз Рко біу бех 1 5 10 15 цех УуУаі Ппуз уаї бек Суя Пцув Аїа Бех біУ Авр Бех Рне АкЯ Авп тує 20 25 за
А1їа тазі Зех Тер Уаї Ах біп діа Рхо пі1у бів біу Бей біч Тхр Меїх
ОА 1277531 С2 біу діа Меї Меб Рто Зеї Рпе біу тіх Аку Сіц Нів Зекг біп біп Ре 50 55 БО біп сіу Ак Хаї ТВ пей бек Атїа Азр бій бек Так Зек Тпх Аїа Тук 65. то 7В во
Месє сіш пейп бек бЗехг без Аку Зек бій Авр ТПх Аза Уаї Тук Тук сСув. 85 90 95
Аїа біу Бех Аку Авр Туг Авп о А1а Тух Нів Ре Тхр Тік Сіу рРхо Рто 100: 105 115
Авр Ре Ттр сіу лка бБіу тп Бей УМаії Тпх Уаії Бек Бех 115 120 125 «-210» 43 -21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І,/т70080.2 УНСОВІ «400» 43
Ав Тук Аза Уаі Бех 1 5 «-210» 44 -211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І," Тт70080.2 УНСОВ2 «400» 44 о шк
Аїа Мек Меж Рхго бек Ре с1у ТІ Ака біс Ніз Бех біп біп Рпе бід 1 5 10 15 в1у «-2105» 45 -211516
Зо «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І," т70080.2 УНСОВЗ «400» 45
Зеї Аку Ар оТук Авп Аза Тух Нів Ве Тур Та біу Рко Рко Авр РБе 1 5 19 15 «210» 46 «2115» 324 00 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170080.2 МІ «400» 46 ссстактобує бЧасесазесс асосссачіч бсачсоассс сзудлзазаас дассадстаєх 50 авсегосоуччч чачасачовс Счасачсаса азсЧєссасс зобассачеоа одзадссочос 120 сацчссеста счЧасдаєсає аЕссбабаас асгдассодс сессаваздачаї ссстідадесда 180 З ! : на ї 149 сЕСЕСтудсСЄ ссаєстессау чаасаєуасс асессдасса ссаддсачоазї ссчавудссова 240 чзакчачоссу астаєсаєсу Есадуєосоу засаствоаба чеуакєсассос ядачеєсаде: нема 5 чЧчазчдоадчасса ачссчассояє сста 324 «2105» 47 «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.2 МІ «400» 47
Зек Тух Чаі Бей ТвВк біп Рко Рто бек Уаї Бех Уаїі Аза Рко б1у Муз 1 В 16 15
ТвЕ Аза Аху ї1е ТВх Сув бІ1у 51уУ Авр Зех Уаї сьу бЗеї ТпЕ бБеї Уві г о. за "Нів Ткр Тух біп біз Буз Рко сбіу біп Аїа ко Уві Меб Уаії Меє РБе
Тух Ави ех Авр и Аку рРко зек сіу ГТе Рто 511 Ахо Бе бек б5іу Бех 5О 55 во
І1е бек біу Азп Три Аїа Тік Тец ТВс І1іе бек АкдФ Чаї біц А1з С1у 55 70 75 80
Авр бій Аза Авр Тух Тук Сув бів чаї Тгр Авр ТВх Зех Зек Авр Нів 85 90. 95
Рхо сій Ре віу Сіу біу ТЕ Був Пец Тк Уаї Цей 100 105 «-210» А8 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І/,/т70080.2 МІ СОВІ1 «400» 48 бБіу п1у АДяр Зехг Чаї біу Зек ТпПх бех Уві Нів 1 5 10 «-210» 49 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І,/Тт70080.2 МІ СОВН2 «400» 49
Туг Азп Бех Авр Аку Рко Зег і 5 «210» 50 «211511 212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І," т70080.2 М СОВЗ «400» 50 сіп Уаіїії Тр Авр ТПІ бек бек Авр Нів Рго бій 1 в 10 «-2105 51 «-2115 375 «212» ДНК
213» Штучна послідовність «223» І. 7700803 УНН «4005 51 сацаєсдсзає буЧсусавксс Сзодочссова чсдазазсас ссоачцчассєс дусчааачсес 80
Хостдсавоч сасссоуача сачссссадоа вастасассо ссаассосЧау ссоасаудос 120 ссадучасаву зссссдадсо дасоддоаясо абуасосста сесскодаас азоддоаусає 180
Їсасаусаду сбосадудсаву адесасссс: сссусодася засссасодач сасадесесає 240 асчдаасеча дсачіссаачд аїсечЧаууаєс асоуссдїсї аскассовує чдодвкачессоа зп частасзасеа ссттассассє сксусассаче ссссспчасє сссчаовЧчасся ачадвасссовд 360
ЧЕсСасеЯЧЕсЕВ сера 375 «2105 52 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 770080.3 МН «4005 52 сіп уаї сіп о пем Уаї біп бек біу А1іа сій Ма1і Був Аза Рго біу Так 1 8 10 15
Бех Уаії Гув уаї бек Сув Пув Аїа бек б5іу Авр бек Ре АКЯ АБп Туг 20 25 30
Аїа Уаї Бех Ткр Уаї Ага біп Аза Рко біу Сіп біу ем Січ Тер Мес 49 45
Стіу Віа Меє Мебє Рко Бех Ріе біу Тк Ак біо Ніз Бех біп біп РБе
ВО 55 БО біп 51у Ах Уаї ТВх Пе бЗеїх іа АввБ бі; бек ТНЕ бек ТБтх Аїа Тук 6 7а | е во
Меїє бій пе бек Зех Пе Аку бек бій Авр ТБх Ата Уаї Тук Тук Сув 85 ЗО ре лея діа біу бег Аку двр Тут Авподіа Тух Ні Ре Тгр ТВх біу Рхо рхо : 100 105 110.
Ввр Епе ТЕр шіу Аку сіу Тк Пей уа1і Ту Ууаї Бек Бек 115 120 125 «2105» 53 -21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ Т70080.3 УНСОВІ1 «400» 53
АвпотТук Аза Узі Бех ї З «-2105» 54 -211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70080.3 УНСОВ2 «400» 54
Аїа Меб Месє Рго Бех РНе сіу Так Ахо сій Нів зех б1іп бів Рпе біп 1 5 що 15 о5 біу «2105» 55 -211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ Т70080.3 УНСОВЗ «400» 55
Зех АкУу Ввр Тухк Ап оАїа Тух Ні Рпе Тхр ТП обі Рхо РКО Ав Рре 1 5 1О 15
«2105 56 «2115 324 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70080.3 МІ «400» 56
Есетабсукас сзассісадсс ассссбсауку їсвубудссс свзаддавачас чассадчасе
БО асегасадоаз сапасадсоє садсатаса адіутссасї дусассадса чазассодає 1-0 савдчессесста єдаброчссає зЕсссасзас звчгдЧассодо сесссадчовс ссссдазсда 180
ЕКСКсСЕдЧуєт ссасссстоу саасзсдосс ассстдасса Ксаусачозс соазассоя 240 часчадачссо астаєсасво Ксаучбасуча дасастачка чЕЧаєсаєсс дааЧчеесоде
Зо чазачЧасса ачесспчассяє ссба 324 -2105 57 15. «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» 20. «р2З» І Т70080.3 МІ. «4005 57 бек Тухк Уаї цец Ту біп Рхо Рхо Бех Уаі бЗех Уаі Аза Рго б51у Гув 1 5 10 15
Та Аїа Ака ІЗїе Тв Сув Б1у С1у Авр бек Уаї біу Беїт Тпх Зек Уаї
Нівз ТЕв Тук бій бій пуз Ркго біу б1іп А1їа Рко Уаіїі Меє Уаї Меб РНе
Тух Авп бек Авр Ага Ржо бек біУу І1е Рхо бій Ак Рпе Зек біу Бек 5О 55 БО
Т1е Бех біу Авп Тк Аза ТЬк Бей Тс ІШе бег Аг Уаї сій Аза б1у 70 75 во
Адяр сін діа Авр Тух Тук Суз біп Маї Ттр Авр Так бех бех Авр НІіЗ 8: З 95,
РБІо бій Рпе сіу біу біу ТНК Пуз Бе) Тпж Уві Пей 100 1085 «210» 58 «211511 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. т70080.3 МІ СОВ1 «400» 58 біу сіу др бек чаї сіу беж Ти Зежх уді Нів т 5 10 «210» 59 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70080.3 М СО ВН2 «400» 59
Тук АБп ошетх Авр Акад Рко зек о5 1 5 «210» 60 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70080.3 М СОВЗ «400» 60 біп Уаі Тур Авр ТВІ бек Зехк Авр НіЗз Рко 01) 1 5 10 «-2105» 61 «-2115 375 «212» ДНК
213» Штучна послідовність «223» ІІ. 170080.4 УН «4005 61 сачасасадс содтусавасс боадазстдау дсдавзодсус сеудуасєсс здецаавоєе ке : ; тсесбдсаацо сатствавав свастісвуЧ застабостУ гсадЕгоас9є сссасасуєс 120 ссвччасаваз чзЕссусазса часосочачеч асзасусста з соддаас засчуачсаєс 180 сасаосачх єссвудуасач адбссавосссї гссосочасЯа авбссасчву сасацссбас 240 асудаастда усачістаау аксбуадбас аседссоаєсо ассастовоє заовсачесво 309
Чаєсасааєу сссассаєтє ссодасечос сесесідасе гстоадудесЯа ачозассесу 360 десассдесе сстса 375 «2105 62 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. 170080.4 УН «4005 62 біп Уаї біп Цец узі біп бех біу Аїа біш Уаї1ї Пув Аіа Рго біу ТЕ 1 5 10 15 зех Уаї Був Уаі бЗегт Су бух А1їа бек Сбіу Азр бек Рпце Агу Авп о Тук 2гз о
Аїа Уаї бЗех Ттр Узі Аку біп Аіа Рго біу біп б1іу Пец бід Тер Мес 145 51у АчЧа Меє Меб Рхо бек Рпе 51у Тпх Аху бі Нівз бек біп біп РДде бо біп б1у Ака Уаї ТвВх Пец бех Аїа Авр біс бек Тих Зех ТВ Ата Тух 70 75 во
Меє б1ц Бей беж Бех рез Ак бек бі Авр Тк Аза Уаї Тух Тух Сув 5 20. 5
Аїа сбіу бек Ак Авр Тук Азов Азїа Тух нів Ре Ткр тих щІ1у Рко РЕб 100 105 110
Авр Ре Тер сіу Аку біу ТЬх Пец Ууаї Ту Уаї Бек бек 115 120 125 -2105» 63 «2115 5 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. 770080.4 УНСОВ1 «400» 63
Ап о Тук Аіїа Уаї Бек 1 З «210» 64 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 770080.4 УНСОВ2 «400» 64
Аїа Мебс Меї Рго леї РП 51 ТБвІ Ахта бій Ніз Бек біп бій Ре біб ії 5 10 15 оіу «2105 65 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. 770080.4 УНСОВЗ «4005» 65 цех дкЗ Аво Тут Авап Аіа Тух Ні Ре Тур Тих біу Рхо РХО АяБ Рпе 1 | в | 13 І5
«2105» 66 «2115 324 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.4 МІ. «400» 66
Жхсесаєсацас сЧасєісаусс ассстсачся бсадксауссс садчавачас ддссазчасє во ссосуєсозда дадасадеоь Кодсабсаса зусукссасє добсассауса чаачссучус 120 сачччессстЯ сдасочссас дсЕсбаєзас ачсдассоуєс ссссачоає сесєуадесда 189 сЕсессдасе ссабстстоад дайсасудес ассссдасса ссадсазучЕ свавоссучу 249 часдадуссоя асЕаєсаєсу ссадубусод дасассачка збдассаєсс зчачсссоЧе
ЗО чачучасса адесдассує сста
За «2105» 67 15. «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» 20. «223» 1. Т70080.4 МІ. «400» 67 дек Тук під Бен ТВх бів Рхо Рко Зек Узі Зех Уві Аїа Рхо Б1іу Гуз ї З 10 15
Твх діа уз ї1іє шешех Су б1у йіу Авр бек Уаії біу бек Тих Зех Уві) 29 25 30 нів Тгр Тух сСіп о бій Був Рхо 5іУ бій Аза Рхо Уві Мес Уаї Меє Рре 35 40 45
ТУж Аз обех Авор о дку Рхо Бех пі Т16е РКО бій АхчЧ Бе бек піу цех 59 З5 во ті Зеї біу Авп о ТрІ Діа ТВх їз ТВх Іі Зех дДку уаї сій Аза с1у 58 То 75 во
Аве обі Аіа дяр Тух Тух Суз біп За) тТхр Ар тТапх беж бек Аво Ні 85 Зо 95 рхо біл пе сбіу ЗіУу біу Тпх Був їйец ТВх ві цей 100 105 -2105» 68 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170080.4 М ІСОВ1 «400» 68 5іу біу Авр бек уаї сіу йек Тих Бек Уві Ніз 3 5 10 15. «2105» 69 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170080.4 М СОВ2 «400» 69
Тух Авподех Азр Ака Бко Бех 1 З -2105 70 «2115 11
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» І Т70080.4 МІ СОВЗ «400» 70 сів уаї Тер о Ахр о ТвВжх бех бек о Аяр Нів Рко бій і 5 19 -2105 71 -2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70080.5 МН «4005 71 савдасоасацс коадсосаасс сассодсєдад абозачаавос ссдоЧесЕсс досдазачес і
Есстдсеаацчоа саєстодада саодссєсаца зассаєдекуо ссачксооуує десдчасачоасе 120 ссаддасагд дссссдадсу дагсоддадчся асааєдеста дЕсссодаас гаадудчадсас 180 ссасачсаці ссозадачсва ачЕсассстсї ассусочасу васссастау сасаческсаєс 240 асочаасєда усадсссаау акстдаучас асудссеєстя ассасєдкоас сдусадесод 300 чассасаасо себассавсв Етудассдує ссссстдчасі гсбоудодссо аудаассссв 360 чесассцєся ссеса 375. -2105 72 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70080.5 МН
Зо «4005 72
-іоп Уві зів без Уві біз Бех 51Уу Аїа сію Узі Ццуз Був Рко біуУ Бех 1 а 10 15 чех Уві бує Уаії бек Су Буз Аїа бдех бі Авр Бех Рпе Аха Аза Тух 20 ав 30
Аіа чаї Бек Тжхвр Уаї Аха бій Лів Рко 01у бів біу йец 51 Тхр Меє 35 40 45
Сіу діа Меє Меї Рго Бех Рпе сіу ТВх Ако біз Нів Бек біп бій Рпе 50 55 бо біп біу Ахо Уаї ТВх Пец ТВйх Аіа Азр біз бех Трх Зех Твх Аза Тух бо 70 75 Во.
Меї бій Бей бех Зех Пец Аху бек біз Азвр тк Аїа Уаї Тухк Тух сСув 85 з0 з5
А1їа біу бех Агу Авр о Тух Авп діа Тух Ніз Ре Ттр Тих буу Рхо Рко 100 105 110
Авр о РБе тТЕр сіу Агу біу Тпх Бей Уаї Тих Уаї Бек бек 115 125 125 -2105 73 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т170080.5 УНСОВ1 «4005 73
Азп тТух А1з1а Уаії бех 1 5 «2105» 74 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70080.5 УНСОВ2 «400» 74
Аіз Мес Мес Рхо бех Ре біу Тих Аху бій Нів бек біп біп Ре біп 1 5 16 15 сіу «2105» 75 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т170080.5 УНСОВЗ «400» 75 бЗех Ага Вер тТух дяп Аза Тук Ні РМпе Тхр ТВх б1у Рхо Рхо Азр Ре 1 З 15: ї15 «210» 76 «211» 324 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170080.5 МІ «400» 76 тестататас сзасссадсс азсестсаасєа ссазсодцесс садозааовс чоссвчзатх
БО зсстосаЧазч зачасвоасЯє счасаорасав восоусссвсї засассааса чавзсечаде 1250 свачоссста СЄзасацссесє чт агсазс зассассзчас ссоїсаччає сссбдаусоа ї5О
Екестссучеє ссаассстяч дзасасуасс ассссозсса саддсачаче суазассчаа чЧчасазачсся вебаєсаєса ссасостобоз Ччатастачсв чсдаєсвсос зас Че зва чазачсассз ззстгзассяє сета в 324 «2105 77 «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170080.5 МІ
«4005 77 бек Тух Уаії Пемй Тпх біп Рхо Ро Вех Чаї Бех Уаї дів Рко біу Був 1 5 19 15
Тих Ата дко Ге ТВ Сув сіу сіу Авр Бех Чаї біу Бех ТЬж цех уаї 20 23 39
Нік Тв Тук сів біп Був Рхо Біу біп Аза Рко Уві Меб Уаії Мебє Рпе 35 40 45
Ттух Аза Зекх Авр Аку Рко Век БІУ ї31іе Бко біс Ако Ве бЗех біу бех
ТВ 25 5
Авп бек біу Аяп Так Аза ТВх Пец тах Ї1е бек Ахка Уаї біс Аза 51іу 55 70 ТВ во
Азр бін Аїа Авр Тук Тух Сув біп уяі Тхр дЕр Так Зех бЗех Авр Нів 85 збо Зо рхо бій Рпе біу біу біуУу Тк Пуз йва Тпх Чаї Пей 105 105 -2105 78 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т170080.5 М СОВ1 «400» 78 сіу біу Авр бех Узі біу бек Тнх Зех Уаї Ні 1 5 10 2105» 79 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т170080.5 М СОВН2 «400» 79
Тух Ап бех Азр Аку Рхо Зех і 5
Зо -2105» 80
«2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.5 МЕСОВЗ «400» 80 сіп Уаї Ткр Аво ТВх Бех Зех Авр Нія РКО бій ї 5 19 -210» 81 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.6 МН «400» 81 саавубсасачс бопобоасавес содзуоастоавау убсдаааваде ссдзуєстєс досовазуєс 5
Кесстосаауч сабссадаза садссссвод авассасчстя Єсадссозає дедасводесс 130 ссаздасаач ЧчЕсссовосУ засччуачся азвасоссса чсссоЗавс азачодадсас 1580 ссасаддсачї сссачаусаз ацбсасссїіє ассасоадвсу васссаєчадй сасачессас 240 агуцдаасєся уусазссстаао абсочачоас асоузссавес актассасоас азаєсвоєсоо 300 частасавкц сЕтассаїЕє ЄсочастФаї сссоссбуасе єссаозочасрса адувасоссу 36о чесассцесе ссеса 375 -2105» 82 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.6 МН -4005» 82 сіп чаї біп Бей Уаї біз беж біу Аза бін Узі ув уз Рхо б1у Бех ії 5 10 15
Бек Уаї Був Узі Зехк Суя Був Аїа Бек біу Авр Бех Ре Акод Дяп Тух 58 еВ За
Аіа уаї Бех Тхр уаї дк бів Азія вхо пбіУу бів біу тей бів ТЕЮ Меє 35 480 45 сіу Аіяа Мебї Мес Ехо Бех Ре біу ТВХх Аху бі Нів Бех бів бів ВНе 55 во біп біу Ак УМаї Трж Пеп Тпх Аза Авр бій Бех ТБх Зах ТВх Аза Тух 5 то 78 що
Мес бій ї-ц бек Бех Пец Ак бек бій Аяр ТЬБх Аіїяз Уаії Тух Тут Сув 85 0 З5
Аїз біу ек Ак Авр Тух АБп Аіяа Тух Ніз Ре Тхр ТІ бі ро Рез 100 105 110 аАвр Ре Тер біу Ага 51іу ТВг їей Уаї Трх Уаї Зек Вех
МІ 120 155 5 -2105» 83 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 7170080.6 УНСОВ1 «4005» 83
Авгп тТух Аза Уаї ек і З «210» 84 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70080.6 УНСОВ2 «400» 84
А1іа Меб Мес Рго Зег Рпе сіу Тіг Ак біцш Нівз бек сіп біп Рве біп 1 5. о 15 вБіу -2105» 85 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.6 УНСОВЗ «4005» 85
Бек Акад Авр о Тух Азп діа Тук Нів РБе Тур Твх біу вко Рго Двр Рре ї 5 16 15 -2105» 86 «2115» 324 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170080.6 МІ «4005» 86 ксстасуєує бсдасесадсс асссеісадесу Есадбодессс садузавчає дассзацчасе 50 ассічссЧод дадасачсує садчдсацсаса ачсабссасї дасассачса дагассдаче 1250 саццсссссоа састудесає гбассазєаас зодбдассодуе сессадудчає сессцачеда 180 тЕсгссродсЕ ссаастссоад даасасдасс ассссцасса ссадсачачЕ сдавассчау 2480 чаєчачцесу ассатєсассая ссвчасосач часастачса здсдаєсаєсс одуачессоде 300 ччасозасса ацстчассує сста ов З «210» 87 «2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170080.6 МІ «400» 87
Бех Тук аї Пей Твх біз Рхо Рхо бек уаї Зек Уаї Аіїа Рто 5іу Був ії З 19 15
ТвВх Аза Ак І11е ТБ Сув біу біу Авр беж Уаї біу бек ТНху Бех Уді 20 25 30
Нів Ткр Тук біп біп бує Рко біу сій Аза Рко Узі рез уаї її Тук 38 40 45
Тух Авц Зек Авр АкЯ Рко Бех віу ЇЗМе Рхо 01 Ак Рпе Бех 5іу ех 50 55 бо
Ав обБех біу Авп о Тйх діа Тпх пей Таж Її бех АхчЯ Уа) січ Аза біу 85 7о ТВ о
Авробій Азїа Авр Тук Тук Суз бів Уаї Тер Авр ТЬх бех бек Авзр Нів 85 90 25
Рко і) Ре біу с1іу біу тах Буз Гей ТЕ Уаї Гей 100 1305 -2105» 88 «211511 «212» білок -213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. 770080.6 МІ СОВ1 «400» 88
Сіу біу Дар бек Уа1і біу Бек Тік Зег Уаї Нів 1 5 10 -2105» 89 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.т70080.6 М СОВ2 «400» 89 туї АнпобБех дер Асу Рко зехї 1 5 -2105» 90 «211511
Зо «212» білок 213» Штучна послідовність
«223» І. Т70080.6 МЕСОВЗ «400» 90 зів уаї Тр дво ТВХ бЗетх бек Авр Ні вхо 5ІЦ 1 5 185 «2105» 91 «2115 375 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.7 МН «400» 91 сачасасазс бадсосаасс содазоссзач ЧЕЧчаачазис ссдоуЧесесс забдвавасе 50 жЖсссдсаачо сабссоачацча садстєїсазя застатусбоа ссазчссоацає дсуасачсс 120 ссазудасазуч зісссузуєу часодааусо асдасчсеста чЕстсСоздаас аводдадсає 180 їсасадсачі їссауачсач ачгсасесссо асосзсчдчасу зваїссасцчач сасаасобасй 240 асзззастча ссвасстаза асессазоадас асочассатсї асстассоєос чачсазесоз зо часкасавку стсассаєтх сгодассоче сессосідасї ссбодадосу зудаасссста 350 чеЕсассяссї сстса 375 «210» 92 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.7 МН «400» 92
Зо бЗіп чаї біз ей Уаії бів Зех біу діа січ Уаїії уз був рРхо бу пек 1 5 10 15 дек Уаї цуз Уді Зех Сув Був Аїа бег біу Дар бег Рве Агу Авп о Туг 28 25 30
Аїа Уаї Зек Ткр Уаї Аху бій Аза Рко сіу біл біу бею БМ Тхр мес 35 40 45 з1у Ада Меї Мебє Рхіз бБех Ре біу Тпх Ага бі Нів бех бів бів Ре о З» бо біп о біу Ака Уаї Тип без ТК Аза дзр бів бБеї Тйх Бек ТВхт Аза тТух 55 79 75 80
Меб біс Пец бек бек песо Ак бек біо Авр о ТвВх А1іа Уа1ї1 Тух Тук Суз 85 90 а5
Аіа 51 Бех АкЯ Азр о Туг Авип Аза Тут Нів Ре ТЕр Тпх біу Рко рко 100 105 110
Авр Ре Тер 01у Ак біу Тих бе Уаї Трх Уаї бек Бех 115 129 125 -2105» 93 «2115 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70080.7 УНСОВІ1 «4005» 93
Азп тук Аіїз Уаї ек 1 5. «210» 94 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.т70080.7 УНСОВ2 «400» 94
Аіїа Ме Мебє рко бех Ре б1у Тих Бк біз Нів бек бів бів Рбе бів 1 5 18 15 біу «2105» 95 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.7 УНСОВЗ «400» 95 зах Акхоа Або ТУХ Аза діа Тук Ніз рБае Тев ТВх бі Рко Ро Авр рве ї 5 15 15 15. «2105 96 «2115 324 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.7 МІ. «400» 96 сссавсасос ссастісазсєс асссссвасу гсачтчассс саоучаяавачас содссаччаєх 50 асесчсччач чачасачсчЕ Єчусассаса засусессасє часассачуба чазодссачис 129 сацчсссстоа састодчксах зсессасаас азсавесоас сессазадає сессодвасоа 180
ЕсСсссо9УсЄ ссазстстуд узасасодсос ассстддаєса ссвасваЗаї саавзассзаа 2-49 чассцазчсесу астассассу ссацусоакац сасастачба зсцабсаксе заз
Зо заачачасса адсічассяє сста ов 324 2105» 97 -2115108 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.7 МІ.
«400» 97 бех Тух Уаї Пес тТвх бів Рхо Рго Бех Уві бЗеї Уаї Аїа рхо біу був 1 5 10 15
Тнж Аза Аху Гі Тах Сує біу біу дер бек Уаї б31іу бек Тах Зек Чаї 2-й 35 30
Нів Тер Тук біп біп Був Рхо б1іу біп Дів Рхо Уаї Бей Уа) Меб РМе 35 48 45
Тук Авп о Зех Авзр Ак рРто Зех біу її вхо бій Ако Ре Зех біу бек 50 55 о
Ави бех біу Авп Тих Аза Тпх Пец ТВХ ї1е бек Аку баз біз віз біу
Азр вій Азїа Авр оТух Тух Сув біз Уаї Тр Аввр Твг бех Зеїг Авр нів 85 50 95
Рко біц Ре біу біу біу ТВ був бец ТВк Уві Гей 190 105 -2105» 98 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70080.7 МІ СОВ1 «400» 98
Сіу біу Азр бек Уаіїі Сіу бех Тих бех уаї Нія ів Я 5 10 2105» 99 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70080.7 М СОВ2 «400» 99
Тух Ав ошщех Авр о АкЯа ЕКО ех ї 5
«2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70080.7 М СОВЗ «4005100
Сіп чаї Тжхр Авр Ту бек бек Авр Нів Рко 61 1 в їа «2105101 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 20. «223» І, 770083 МН «4005 101 часчсссзасє бУгсодачес соцодЧавачс кбоЧсасачс ссозсаЧасс сссазуаске 50 тоскусосза ссістудакєс сассіссаус аздстабосса сузастоЧа ссассадаєє 158 ссзацазазчо застачЧчачсо Ччоссісазеє абсазубчаса згода сасабастсасє 159 чсадассссу сЧазодоссч асссассаєс сссауабаса ассссзадаа сасуєсоасає 240 стасаазєуа асачеседад здссодадуас асууссесує астастатус дасусудаса 300 тассастатч абачзєчатза бсасктсзуає чЕсоссаасв сстачазссоа дучудсасссто 369 чссассоаєсе сазає 375 «2105102 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І/Т70083 МН «4005 102 ій Уаї бів без пе біз Вес біу Сіу б1у Бену Уаїії біп Рто біу Щ1У 1 5 но; 15
Бех Бей Ату їі бех Суз Дія Аіїа Зех Сіу Рпе Трх Рнє Зет Зек Тук 29 25 30
А1їа Меб бех Ткр Уаі Ага біп Аза Рко біу був біу пейш бій ТЕр Уві 35 йо 45
Бех Аїа Іі бек Сіу Зек біу біу бЗех Тих Тух Тух Аза Авр Бех Уаї 5о0 8 во
Муз піу Ткр Бе Тр о І1е бек Ако Двр Двп о Бех пцуз Азп Тахо Пей Тух 55 то 75 о їви 5Бід Мебє Ап обек пей Ах Аза біз Аво Тих Аза Уві Тух Тух Сув
ВЗ зо З
Аїа Ак Ак ТБЕх Тух Тух Тух Авр Бех Авр біу Нів бех Авр Ууаї Рпе 109 105 110
Ав Ії ТЕр біу Аку піу Тк пейп Уаї Тк о Уаї бек бех 115 129 125 -2105103 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» 10. «223» І. Т70083 УНСОВІ1 «4005 103 бек Тук Азїа Меї Бех 1 5 «2105 104 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Тт70083 УНСОВ2 «4005 104
Аіїа чі Бех біу чек біу біу Бех Тпх Тух Тук Аїз Авр бек уаї Був ї З 10 15 су
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т170083 УНСОВЗ «4005 105 дхоа ТВ Тух тТук ТУух Азр о бех Авр осіу Нів Бех Ар Узі Рне Авр ї1е 1 5 то 5 -2105 106 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083 МІ «400» 106 сачсстассоу гдасусачсс дссстсаува сстодсудассс садчасваза зассассаєс во
ЖсскчЕЕсву дзаадсуєссс саасаєвозу адтавекуваЯа гуссстудса ссваасаасте ї20 Ії сесчаадачау ссессааасе ссісастсаї часзасєсабта засачачастєї ачочаскссї 180 чассяссЕсї стусбоссесає стсксесася ссвассадссесс сапдссатсаєс сачастссад 49 ассчачзчасу адассчаєста стассодсоуда асасудуаса ссазеесдає гасвсацдачеє 300 сесдасоудау ддассаачеє дассоєсота 330 2105 107 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І. 170083 МІ «4005 107 бів бек Уаї Уаї Тк бій РБго Рхо Зех Уаії Зеїх Аіа діа Рхо біу віп 1 5 То 15 їйув Чаї ТЕВх Т1іє Зек Сує бек піуУу бех Аза Зег Ази її біу Зех Дай
Буз біу Тхр Рпе ТВж Ії бек Ах Авр одап Зех Буз Ав о ТВх Пеп Тух 55 70 75 но їв біп Мебє Авпобаех Бей Акоа Аза бій Аво ТВах Аза Уаїі Тукє Тух Сув 85 зо 5 діа вхчЧ АхЯ ТОвх Тук Тух Тух Авр о бек Авр обіу Нів бех Авр Уві РНе 100 105 30
Авр о їіе ТІр біу Ак біу ТБ Пец Уві Тк Уаї Зех бух 115 12 125 «2105 113 «2115 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І, 7700831 МНСОВІ1 «4005 113 цех Тух Аіа Меє бах 1 З «2105 114 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Тт70083.1 УНСОВ2 «400» 114
Аіїа ї1е бетх Біу Зек щі б1у бек ТИк Тух Тук А1їа Авр бек Уаі Був. 1 5 10 15 сіу «2105 115 «211516
Зо «212» білок 213» Штучна послідовність «220»
ОА 1277531 С2 «223» ІІ т70083.1 УНСОВЗ «4005 115 вхо тах Тух Тук Тух Азр Зекг Авр біу Нів Зех Авр уаї Ре Дер її6. 1 5 10 15
Твх Уаї пьу Уаї Рпе бзіу біу сіу Тржх Пув Гей ТЕ Уві Пец 100 105 4110 -2105» 118 «-2115 13 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. 770083.1 МІ СОВ1 «400» 118
Бех біу бет Аіїа Бех АБп І1е біу бек Авзп Рпе Уві бек ї 5 10 -210» 119 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т70083.1 М СОВ2 «400» 119
Авр Азп о Ар був Ака Азр бе) 1 5 «210» 120 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ Т70083.1 М СОВЗ «400» 120 сі Твх Ткр Авр отТВх бек Пес Тахо Уа1 біу чаї 1 5 19 «2105 121 «-2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ Т170083.2 УН
«4005» 121 чазчсасечсе сессаЗачсс содзодачас ссчазсасаус стчоозцеасс сссазавесте «о
Есесбасасач сессссоадасе Сассїсвбазчзс азстатоасса саачссочдосє ссасовУех 120 ссацачавча чзассочдвабо дассбсвасі ассаосзаса обсачаосад сасаєаєтсає 189 чеваастссса гозазччеху Чессассасєс бесвуачаса ассссзавачав сасассосає 45 стцсазаєтча зсачсссзву аззоссовоспає зсачссабтеє астассакас Ччасусозчаса 308 тастастаса збазкозсоч Ссастсчзає зЕстсгдаса сссоссассЯ сдасассска 369 чесассаєст своє 375 «2105» 122 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70083.2 МН «400» 122
Сі Ууаї біп Ббец Пец бі бек біу біу біу пеп Уві бів Рко біу біу 1 5 10 15
Зех Пец Ак Бей Зех Суз Аза Аїа бВеїх б1іу Рпе ТПпх Рпе Бех Бех Тух
Зо
Аіа Мек Зек Тер уаї Ак біп Аїіа Рхо біу Пуз 5іу ей бій Тер Уаї 3 40 45
Бек Азїа ї16е бек сіу Бек біу біу бек Тих Тух Тух Аїа Авр бек Уаї
ЗО 8 60
Буз Зіу тЕр вРре ТП І1е Зех Ак Ар Авп бЗеїх Був Ав ТАх Пем Тухг 55 70 75 во їейп біз Мебс Авп бек їмпі Ах Азїа бій Ар Так Аїа Уаї Тук Тух Сув 85 зо 95
Аза АкЧ Ах ТІ Тух Тук Тух Авр бек Авр сіу Нів 8ех Азр уаї Ре 100 105 119.
Авр І1іеє ТЕр п1у Ака сіу ТПх йец уві Ту Уа1ї бех бах 1ї5 120 125 «2105» 123 -21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70083.2 УНСОВІ1 «400» 123 ек Тух Аіа Мебс Бех
Її 5 «2105» 124 -211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70083.2 УНСОВ2 «400» 124
Аїа ї16 бех біу Зек біу біу Бех Тих Тук Тух Аза Авр Зекх Уві Гу ї 5 їй 15 о1у «-2105 125 -211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70083.2 УНСОВЗ «400» 125
Аху ТвВх Тух Тух Тук Авр Бех Авр б1у Нія Бех Авр Уаї Ре Аво» Т1е 1 5 10 15 «2105 126 «2115 330 500 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.2 МІ «400» 126 сачЕстуєсе сЧасоасачес чсоссссауєа сЄссосадсосс саддасачаа здаєсассаєс во тесезсссто давасуссвс сааєсаєтуду адбаакссву сосссесдуава ссаасаасссо 129 сссодудасад сососазаст ссссаєссає дасааєдата засчачастє зучавекесе 180 чассасексЕ сеосстссаї сЕсткссасу бсадссассс бсодасаєсаєс содасєссач 249 ассочдачасу здассцаєта стассасуда зсасудуаса сезусссуве хассадачс 300 гЕссчоасочач чдассааасї чассасоста 330 «2105» 127 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.2 МІ «4005» 127 іп Бех Уаї еп Тпх біп Рко Рхо бек Узі Бех Аїа Аза Рго біу біп ї 5 10 15 пуз Уаї ТВх І1еєе Бек Суз бек бі1Уу Бех Аіїа Вех Азп оті біу бек Авп 29 25 30
Тпе Уаі бек Тхр Тух біп біп пецй Рко Б1у Тк Аза Ро Буз Беч йо їіе Тух Авр Ази Авр Був Ах Авр о їец біу Т1е Рхо Азр Ахо Ре Зех 1 за 50
Аіа Зех їі1іе Бек Зек ТИХ бЗех Аза ТИЖ Пез біу тТЗіе ТЕ біу їви 510 55 7. ТУ во
Тв біу Авр бій Аїа Авр о Тух Тук Сув сіу Трк Тгр дер Так Бех їец 85 зо 95
ТвВЕ Узі біу Уаї Рре біу Бі біу ТВх був Пец ТВх Маю їецй 100 105 119 «2105» 128 «-2115 13 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т170083.2 МІ СОВ1 «400» 128
Бех біу Бех діа бек Ап Ті біу деж Депп Ре Уаії Зак 1 З 18 «2105» 129 -21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» ІІ т70083.2 М СОВ2 «400» 129
Ав Азп о Аво Був дека двр Бе 1 5 «-2105 130 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т170083.2 М СОВЗ «400» 130 сіу Тв Тер Ав Тпжх Бех Бей Тих Уаії бі1у Уві 1 З 10 -2105 131 «-2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020»
«223» І/Т70083.3 УН «4005» 131 здазчсчсадс согсудачеєс соооодачас ссосасаус ссозодууєс сссдадассс 60 їссідбосау собсбодавс сассбстадс адссабудсса бсададскадає ссассаууєє 120 сесачачаасоч доссочачса ЗассесачсЄ астачзсзчса зкозсачсад сасабастає 180 зчзсауастсся сЧаазадзсся зЕссассаєс ксесвоаудаса ассссазудва сасуєсєзсає 240 ссасазаєда асадсссчач задссуаочас асодесЯсЯї асстасбсасас завусодаса 00 таїтастаку асадсоатод ссасссодає зєссссрата сстододсся адасаєсесу 360 зксассчсст саваде 375 «2105 132 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/Т70083.3 УН «4005132 бі хХаї Бій пец йей бій Бех біу біу біУу Печ Уві біп Ро б1у Б1у 1 5 о 15:
Зег Тс Аг це бек Сув Азїа Ала бек Сіу Ре ТвВху БРвБе бек Бек Тух 250 2 30
А1а Мекє бех Ттр уаї Ака біп діа рко біу буз біу Бей бій Тер Уаї
Бех Аїа їЇі1іє бек біу Бех б1у б1іу бек ТВжх Тух Тухк Аза Авр бек Уві 58 бо
Пух біу Тер Рпе Тік Ії Бех Ахо АБроАвп о бехт Пубз АвпоТтТвВк Тец Тук 65 не 75 во
Бе бій Меє Авп обех Без АкЧЯ діа біч Авр тах діа Уаі Тук Тук Сув 85 зо з5
Віа Ах Ак ТВх Тух Тух Тук Авр бетх двр Сіу Ніз Бек Авр Чаї Рпе 100 155 мо
Авр ї1е Тер Б1у Аху біу Тйх Бей Уві Тих Уві Бех Зек 115 120 125 «2105 133 «2115 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.3 УНСОВ1 «4005» 133
Зек Тукх Аіа Меб Бек 1 З 15. «2105134 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Тт70083.3 УНСОВ2 «400» 134
Аїа іє бек б1іу Бех Біу біу бек Тпх Тух Тух Аза Авр беї Уаі Був
З 5 10 15 ов 00 З1У «2105 135 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.3 УНСОВЗ «4005 135
Ака ТбЕ Тут Тух Тух Авр йех Азр біу Ні бек Авр Чаї Ріє Азр о їі1є 1 З 10 15 «2105» 136 «2115 330 0«212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/Т70083.3 МІ. «4005» 136 сазчзєссасса соассасвчсс Чесссачко бсбасЧассос свозчасадаа часбсассатсєс
БО сстассссу Чавасусосс савасассЗчо весваскска собсссоаса соезасавосо 129 спссочасаз сесссаааст ссксатсєтах часвнатдЧата васчачаскє восздаєкесх 180 часецчестсх сбоауссссва асссцосасо гсвассасос бадасвесає сочассесад ай астзцззасч адцессоавЕкса Стастосчоав звсакодоваса ссачксєзчас каскад оое зпо тссочдсздач дзассавусї чассуєсста 359 «2105 137 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/Т70083.3 МІ. «400» 137 біп Зак Уаї уаї Твх біп Рто Рхо бек Уаї бех Аза Аза Рко біу бів 1 В 19 15 пув чаї Тих Т1іе дех Сув Зех піу Бех діа дек Азп о Тів сіу Бех Ав 20 25 ЗО рве Уві бек Тжр Тук ів бБіп ем Рко бі ТВ АБа Рхо буз Сей беч за 40 45
Те Тук АвроАяп Авропуз Аху Авроїеа біу Тїе Рхго Авр Аку ББе бек о 55 60 біу Бек був бех біу Тпх бек Аїа ТЕ Гец біу т1е Твх біу Бей бів 25 70 75 во
Тих а1Уу Авр бін діа Азвр Тут Тух Суз 01у Тих Ттр Азр о ТвБЕк Бех Гей за з5
ТЕ Уаїі бфу Уаї Ре сіу біу б1Уу ТВЕ Був Пец ТЕ Узі Гей 150 105 110 -2105 138 5 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.3 М СОВ1 «4005» 138
Бех Біу Бех Аза бех Ав І16е піу Бех Авп обПпе Уві Бех 1 5 10 «2105 139 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.3 М СОВН2 «4005» 139
Азр Авп Аз о пух Ак АзрогГей 1 5 «210» 140 «2115 11
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «2235» І Т70083.3 МІСОВЗ «400» 140 сіу Таж Тер Авр ТЕ бех Бей ТВх узі с1у Уві 1 З 19 «2105 141 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/,/Т70083.4 УН «400» 141 чадусасаче БЄсссаЧчачсс Соададчачос сЕоддсасачс стучачоЧєс сссоадчассс. бо
Есссасдсад себесбочзаєсє сассксстадес адссаєсчсса гддачссояує сечсесауєсєе 120 ссадччавау частазачсЯ дассссадсє ассадсаува сбодсочЧкач сасабастас 180 чсачассссу бдавоадассо чЧЕссассаєс бссададаса аєсесаадаа сасчссоаває 280 стчсааасада асечсстзазч айссдаччас асдуссасбоає абссасечсас чадчеодаса зЗао тавтсасєсаєа абадедаєод Есастсочає чЕкессдака ЕСсоЗчоассо доддсасссту 360 чЕсассЧчЕст суаде 375. «2105 142 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/,/Т70083.4 УН «4005» 142 біз чаї біп рей ва п) бек біу біу сіу реп Маї біп Вхо біу б1у ї 5 19 15 бех ей йху Ппез Бех Сув Аїа Аза Бех сі1у РВе Тнх Рпе бех Бех Тухк 20 25 30
Аїа Меє Зех Ткр Уа1ї Ак біп Віа Рхго біу був б1Уу Пец бі Тер Уаї 35 40 45
Бех Аїа Ії бЗех біу Бек сіу біу Бех Тптх Ту Тук Аіа Авр Бех Уаї1 ва 55 850
Вуз біу Тер Рпе ТВх І1їе Зек Дк9у Авр Азп о Вех Гуз Ап о ТВх їй тТук 65 7о 75 во ей біп Меї Ап оЗех пец Агу Аїа бій Авєр ТБ Аза Уаї Тух Тух Сув 85 за 95
Аіа Ах Ак Тпх Тут Тух Тух Авр бек Авр біу Нів бек Азвр Уві Ріе 100 105 110
Аз І1е Тхр біу Ахд біу Тих Бей Уаї Тих Чаї бек Зех 115 120 125 «210» 143 -21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І," т70083.4 УНСОВІ1 «400» 143
Бех: Тук Аіа Мебї 8ек 1 В «210» 144 -211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І," т70083.4 УНСОВ2 «400» 144
А1іаз їі бек біу Бех біу Сіу Бех ТЬвх Тух Тує Аза Азр Зах Узі Був 1 8 10 15 свіу «2105» 145 «211516 0212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ Т70083.4 УНСОВЗ «4005» 145
Аху Твх Тух Тук Тук АБр бек Авр о біу Нів бек Авр Уаії Рре Авр Це 1 й 10 15 15. «2105 146 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.4 МІ. «400» 146 сацісотассос бпасосачес зсссісачія бсбасачоссс садчасачава ачЕсСассакс во тсстоастссу чаааасосссс сзахастсзчу ачсзастсс«ч бассоссбоуса ссвасваєссе 120 сссазазсач сссссадаск ссссаїсскає дасваєчаса азсцачастє адчоазскссе 18о чассческсї сідассссав зссївасваса ссзассассс Сеоасаєссає созчассссзу 240 астзчочасо задоссдатса сСастусоза асабдауасва ссваєссдає сассчаЧасе 00 сгсоацсзчзаз зчаассавачсї дассабсста 330 «2105» 147 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.4 МІ. «4005 147 біз бдех Уаї Бем ТвВх біп Рхо Рхо бех Узі Зех Аіїа Аїз Бхо сіу бій ї з 10 15 їуз Уві Трх їЇїеє бех Суз бек біу бек діа бек Двп ї1іє біу бех Авп 2-й 25 30
Ре Уаї Зехк Тхр ТУук бБіп піп йец бко бБіу ТНх Аза Ро Був Бей гей 35 4о 45
Іїе Тук Двр двп Двр о пуз дк Ар Бей біу Ї1ї2е Рго Авр Ака Рпе бек 50 ' 55 БО спіу Зех бує бек біу ТПх Бек Аїа Ту Гей біу Ії Тих б1іу Без бій
Бо 7т7о 7 80 тах біу Авр бі Аїа Авр Тут Тук Сув с1іу ТвВх Тер Авр Тир бек Бей 85 зо 55
Те Уаї біу Уаї РНе біу біу 51іу Тах Пув Бей Твх Уві Пей 109 105 110 «210» 148 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.4 М СОВ1 «400» 148
Зех піу бек діа бек Аза ї1е піу Бек Аво Рпе Уаї ех ї З 15 «210» 149 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ 170083.4 М СОВ2 «400» 149
Ав Азп Ав обу Вк АБ бе 1 5 «2105 150
Зо «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність
«223» І. Т70083.4 М СОВЗ «400» 150 сіу Тйх ТкЕвр Азр ТПУ дек ем Ту Уаії 5Ху Уві 1 5 10 «2105 151 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 15. «2235» І, Т70083.5 МН «4005 151 чавсчсчсадс Соссачачсс суачочачос сбодсасаує ссазачаЗвес сссдачасьс
Бо тсссасосвза сссессодасє сасссссвує зчссазбасса бозЗссачає сесчссазчсЕ 120 ссачоасазоач часова чЧассссвасЕ асбсазсбчоса чсачсвасацч сасабаєсає 180 шо чсачастссу созааддчсся ЧЕссассаєс бссадазаса ассссовачаа сзсастакає 240 ссдсаваєсуа асачестдадч адссуводчас асчуссобаєЄ аєсассачєдс уадусучаса зо тастассасу абадсоаєЧу єсасксодає зсЕісссдаєса сЕбСодочессаЯ додчсассесбо зво чесасеческ сссса 375 «2105152 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70083.5 УН «4005 152
Зо сій Уа! біп Бей Бей біз Зехк зіу біу 5БіУу Пей Уаї біп Рхо біу зІїу 1 5 10 15
Бек Пец Аку Тей Бех Сув Аїа Аза бек біу Рне Тих РБе бах ет Тук 20 25 30
Аїа Мек Зек Тер чаї Ак сСіп Азіа Ро йіу буз сіу їем бій Тер Уві 35 48 45
Бек Аїа Ті бек сбіу Бех сі1у біу Бек Ту Тут Тух Аіа Авр бек Узі о 25 бо
Бу біу Аку Ре ТВх ї1е Бек Ак Азр Азп обег Гуз АвпоТвІ Пец Тує 6 7 75 ва їз біз Мес Авп о Зех ей Ага Аіа біз Авр о Твх Аза уаї Тух Тухк Сув 85 зо 5 діа йдхо дк ТвВх Тук Тук Тук Азр бек Авр біу Ні бЗех Авр Уаї пе 100 105 110
Авр І1їє Тхр о біу Ак біу ТБк Бео уаї Твх баї Бех Бех 115 120 125 «2105 153 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.5 УНСОВ1 «4005 153
Бех Тух Аїа Меї Бех 1 5 «2105 154 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.5 УНСОВ2 «4005 154
Аіа Це бех біу Зежє біу сіу бЗех Тік Тух Тук Аїа Ар бек Уві Був 1 5 10 15 біт «2105 155 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.5 УНСОВЗ «4005» 155
Акуу Твжх Тухк тує Тух Авр Зек Авр біу Ніз Бек Абвр Уаї Ріе Авр ї1е 1 5 10 15 «2105 156 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.5 МІ «4005» 156 сачеЕсточсЯ сЧасасаосс чессксачьоа ксбосчасос Сасозсадза зассассаєс по тсссоастстч баацецестс свататтодда азбаатхсскУ гаїтсессадка ссаасаасїс 120 песозавава сссссазаєт ссстсвоксає часзасоавнса засчазассє азчзчаастосе 180 чассусЕсес сктзестссає стстессвсу Єсадссдссс Кудссаєсає сздуасессад 240 ассдзачасе ададссчаєса Кбасксусоца асасчочаса ссачестдає бассЧачЧасе 300 сссадсддач ччассавасс чЧчассдбсста ов 330 «2105 157 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.5 МІ
«4005 157 бів ЯЗежх Уві Чаї Тву біб Рхо Бко Бех Уаізі Бех Аза Аза Рхго біу Бій 1 5 10 15
Пув Уаї ТЕ Тіе Бех Суз Бех біу бех діз Бех Аєп ї1е біу Бек Авп 2 5 за
БЕпе Уві Зек Тхр ТУх біп бів бе Вхо бі Акоа Аза Рхо йух Ббецу Бей о 45
Ті Тук Аяр Ап АБр о Був йхо Ар Пеи біу Т1іе Рхо Авр АхЯ ре беж ва 55 50
Аза бБет Іїе бех бЗех Твх дек Аїя Аїа Пец Аїа їі Тву біу Гей Бій 5 т7а та во
ТВх бій Авр бій Азїа Авр оТтух Тух Суз біу ТЕ Тхгр Авр Тк бек Ге 85 Зо з5
Тк Уаї сіу Уаї Рне піу біу п0іу Тпж Був їви ТВ баї Пец 1890 105 мо 5 «2105 158 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.5 М СОВ1 «400» 158
Бек сіу бек Аїа дек Ап їЇ1е б1у Бех Ап ре Уаї Бек 1 З о «2105 159 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.5 М СОВН2 «400» 159
Авр Ав Авр оБуз ха Авр опе і 5
Зо -2105» 160
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.5 МЕСОВЗ «4005 160 бі ТвВх Тв Аво Твх бек без ТВх Уаії б1У Уаї ії ке 1 «2105 161 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.6 МН «4005 161 чадчсчсвас костчовасс коспссдадас Сбассасачес сбпочЧчачакс ссссзчаскс 59 сстасЧсач ссксточасє сасссесаче ачесасчсста кчазссазах ссоассаЧасЕ 128 совучузачу чостчаваба адуєсссачеї аскзасчаобса часа сад сасасастас іо
Чсачасксссу сдазлоцесо Чдессассаєс Ессададаса агхосвазаай сасастдєає 240 стдезаатча асачестЯву адссзаузасє асчдсечктї аксастчецче чачасачаса 300 састассасу асзоасдасоц ссзстсдачаї зсссесдава сСссододсся воодсасссєа 360 чисвссуїео осїса 375 «2105162 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І. Т70083.6 МН «4005 162 бій Уаїі бій їей Пей бій Зех сі біу біу Пей уаї біп Ро б1у сту 1 а | 19 15
Чех їви Ак Бей бек Суз Дія Аза бек біу Рпе Тржх Рпе Зех бек Тух 20 25 30
Аїа Меї бет Тхв Уаї Аха б1іп Аза Рхо біу був біу бец їй тТЕхр Ууаї 35 49 45
Зех діа Іі Зех біу Зех біу біу Зек ТБІ Тух Тух Аїа Авр Бех Уві о 55 50 цув біу Ак РНе ТВх Т1їе бЗех Ако Авр Авп о бех Був Ав о ТВх цей тух 65 то 75 о їв бів Меї Авп о дех пе йо діа бій Авб ТБ Аза Уві Тух Тук Сув 85 за з діа АкЗз Ак ТВх Тух ТУух ТУух Ар о Зех Авр обіу Нів Зех Авор Уві РБа їТоао0 505 110
Авр їі Ткр піу Дкч б1іу ТБх Бед Уаі ТБжх Уаії Зех Вех 115 170 155 2105 163 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.6 УНСОВ1 «4005» 163
Бех Тух Аізіа Меб 52ех 1 5 «2105» 164 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.6 УНСОВ2 «4005» 164
Аіа ї1їє Зех біу Зеїх біу біу Чек Тпї Тухк Тух Діаз Дер бек Уаї Був 1 З 19 15 -5іУ «2105» 165 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ Т70083.6 УНСОВЗ «4005 165 дгч Тих Тут Тук Тух Авр бек Авр біт Ніз Вех Авр уа1ї Ре Азр Тіє 1 З 16 ї5 «2105 166 «2115» 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.6 МІ. «4005 166 чачасосвас Ссссодвасс сСздоачоваоале Ссоцівсвас ссочоЧчачкс сесточвчасеес 0 сссїчсчсва сесссчзаасс сассстсавуе ауссаєчсса сзачссочЧчаєЄ ссоссавасе 120 ссвзадазчо зассззачса зассссзост ассачзеоачсз зсочсчосаз сасаєсастає їво псазчассссо бдавоапасся чсссассаєс сссаздаваасв астсосавцаа сасуєссовбає а січЧевааїча асацсессчад зассзайчас асочесасає зссасстоосоас чачусадаса
Зо бассассзко асачзсчасаа ссасссочає зсісссзахта єссоаочасся чассасеста зво чесассУкесс секса о5 75 асєчачовсу задссдаєса сбасктчсуда асаєуздаса ссзабстцаєс суассопааЕх 300 їтсдусоасач ддассавуєї дассукссса 330
«2105» 167 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.6 МІ «4005 167 біп бех Уаї Уаї ТНІ біп Ро Ро Зех Уаії бех Аза Аза Рко сту біп 1 5 10 15 був чаї Тв те бек Сув Бек о піу Бех Аїа бек Аяп Т1іе біу Бех Ав 20 | Я 30
Ре Уаї Бек Ткр Тук біп біп Пец рхо біу Ти дів Рхо пу ви Бей 35 40 45
Т1є Тух Авр Авп Авр оБбуз Ак Ар їв біу ті Рхо Авр Аку Ре 5ех 0 23 во
Аїа бек І1є бе бек Трх бех Атїа Тв ей 5ту т1е тах біу пе» бів еВ 7о 75 що
Твпх біу Авр обі) Віа Авр о Тук Тух Суз ПТу ТВпх Тер Двр ТпПх Зех Бей 85 зо 5
ТВх чаї біу Уа) Ре біу Біу 5Б1у Тк був їжі ТЬх Уві Бей 100 195 119 -2105 168 «2115 13 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.6 М СОВ1 «400» 168 ак сіу Бек Азія беж Ап ї16 бі бек Авп о РБе Уві Ве ї 5 10 «2105 169 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220»
«223» І.Т70083.6 М СОВа2 «400» 169
АвроАвап АвроБуз Ака Агро Пец 1 5 ; З 2105 170 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70083.6 М СОВЗ «4005 170 сіу ТВЕ ТЕв АвротТву бех Беб ТВвК Узі бі Уді 1 5 то «2105 171 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «23» І, 170083.7 МН «4005 171 чачабсосвас Усач с бочачзазаєс ЄбзЧсасвує сезузачасс сстзвавесе а сстчсчса ссіссяцаєє сассесеїсачс застасчсса сазоасічач ссоссачасе 120 ссзаччазаз сасечазася соссстсассе ассваєаЧез осссастоасвза сасасаєтаєс їв чсвсастсса бовацчцсся чсссассябс бссвовзаса аЕсссзачав сасУстасає 2540 скусзаакув асаосстузу водссузводаєс асочесубух зЕсастобоаєс Задасздаса зо їассвсебасч асачсзасцЗ сбсасссзазах зсссссата сссацаасез чадсвсова
Зв зксассУсех ссгса
Зо «2105172 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність 35
«ге2З» І Т70083.7 УН «4005 172
Сі Маі біб їееєба пе) біз бек біу біу бі Пе) Уаї бів Рхо біу бБіу ї З 15 15 зек Бей ба Гей ек Сув Аіз Аза бек сі Рпе ТВх Ре Бех Бех Тух о о 30
Аів Меї Бех Тхв уаії Акоа біб Аза Ро бі Гуз бБіу їй бід Тср Уаї 35 43 5 зек Аза їі бек бі Зек сіУу Біу бек Тих ТУжЖ Тух Аза Авр Бех Уві 50 З БИ муз піу Аку Рпе Тпх Ііє Зег Акад Дзр Азпобетх Був Авп ТВк оцей Тут 65 70 75 во
Бей бів Меб Ази бек без Аху Аіз сій Авв ТВХх Аза Узі Тук Тух Сув ва зо а5
Аза Ах Аг ТВІ Тух Тух Тук Азр Бех Авр о біу Ніз бек Ар о Уаі Рпе 100 105 110
Авр т1іе Ткр 21у Акч біу Тпжх бе Уаї Тпх Уаї Бех век 115 129 125 «2105 173 «21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70083.7 УНСОВІ «4005 173 век Тух Аза Меї Зех і 5 «2105 174 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70083.7 УНСОВ2
«400» 174
А1їа їі Зех біу Зех пі піу Зех ТБк Тух Тух Аїа Авр бек чУаї Пув 1 5 19 15 іу «2105 175 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70083.7 УНСОВЗ «400» 175 дк тТпх Тук тТух Тух Авр бек Авробіу Нів дех Авр Уаї Ре АДвр ї1є і 5 10 15 «2105 176 «2115» 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.7 МІ. «400» 176 сачестусос гуасзсачЧес зсестсазЗса Кессосоассс саччасауаа аусСсассаке 5о тсстасксса здаазсуєссс сазабсаєтово аусзасєксса субсстддта ссвасаасто 120 ссгадчасву сссосазаєє ссссаєссає часазсчзата засчачассх зазааєстоси 180 чассостссс стусесосає стсбсссасу ссадссасос сЯдасассаєс судастссад 240 асічосчасу зозссдасса стассосууа асасуєуаєса ссачестуас сУуссоЧчоЧее з00 сксоачсузач счаассваачесх дассабессєа
За
Зо «2105177 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220»
«223» І. Т70083.7 МІ «4005 177 біп Бек Уаї цей Трх бі» Рго Бкго Бех Уаї бек ліз Аза Рхо сі1у бів 1 5 10 15
Був Уаі ТвВх СТІе бек Сувзв бех біу Бех Аза бдех Авп ї1є біу бек Ав 20 З 30
Ре Уаї Зек Ткр Тух бБіп біз лей Рхо біу ТЕ Аза хо був Ппей Ей 35 49 5
Іїе Тух Азр Ап Азр о Пув Ако Авропец біу Ії рРхо Азр Ак Ре Бег 50 55 5О
Аза бек Ї1їеє Зеї бех Тік Бех Аза ТПпж Пец бі ї1їе ТВх біу Гей біп 55 70 75 що
Тв біу Авр бій Аіа Авр Тух Тут Сузв біу Тах Тр Авр Тах Бех Бей 85 зо 25
Ттвх уаї б1іу Чаї пе біу біу б1у ТБІ Був пец Твх Уві Тец 110 105 119 2105 178 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.7 М СОВІ1 «4005 178 как біу Зек Аза дек Авпоїівз Біу Зежх Авв о Вре Ухі Бех «2105 179 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.7 МІ СОВН2 «4005 179 азр о азповвр Гуз Ах Авр цей во З
210» 180 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70083.7 М СОВЗ «4005 180 щі1у тТрк Тхр Азов ТВу бех бен Тк Уві сі Уві 1 З 19 «2105 181 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 20. «23» І, Т70083.8 МН «400» 181 часчкчсазес сЗзстоачаУкс сазчуЧчавазс бСссотасвос сгчадаЗакс сосчачасте їсстосгосау ссссбачате сассвссвоас застатоссв сЧачессчоаУх ссзссаччсе іо сесапловача засгозчачіо зассссаасе абеЕЗоєоата зсЧзсочтва сасзтастає чсачассссо бЧазазчесо озксассваєєс сссозлачЧаса астссазцавз сасуссУкак 240 стссаваєча асвоассбовЧч ачессоавачаєс всочссаса вссассосоас ззчасзоааса 30о тапсзствтч абассаавксаз ссасссочає зЗсКссоаса єсгтЧпучссоа адпсасоссся чеІсассс сс са 375
«2105 182 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність
«220» «геЗ» І Т70083.8 УН «4005 182 зі Уві бів Пец Ббец бід бек БіУу с1у біу без Уві біп хо біуУу Щі 1 З їв 15 зех цей Аку цей Зех Сув Аіа дія бек біу рМпе ТБх РМе Зеє Бех Тух о 28 за
Аіа Мес Зекх ТІвр Узі Аку бів Аза Ро 01 Був Б1у зі біз Тхр Уаї 35 49 45
Зех дій Ііє Звк обіу бек сіу біу бек ТНК Тук Тух Аїа Авр бЗех Уаї 50 55 ва
Муз біу Аху Рпе ТВх Їіє Бех Агч Ар Депо Бех йув Авап оТВЕ Пей Тук 8 7о 75 во
Бїец біп Мебс дяп о Зех цей Агу діа бій Авр тах Аїа Уві Тух Тух Сув 85 зо 55 діа ха Ако ТБ Тух Тук Тух Авр Бех Авр біу Ні бЗех Авр Уаї Рне 100 105 118
Авр о тіє Ткр бі Акоа біу ТвВу бе Уаї Тк Уаї Бех Заг 115 120 125 -2105 183 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І 7170083.8 УНСОВ1 «400» 183
Зех ТУК Аза Мебї Бекг 1 5 «2105» 184 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т170083.8 УНСОВ2 «400» 184
Аіа їі Зех біу Бех О1у біу Зех Так Тух Тух Аїа Авр бек Уві їМуз і 5 10 15 51У -2105 185 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ Т70083.8 УНСОВЗ «400» 185 го ТвЕ Тук Тух Тух Вар бех Авр б1іу нів Зекх Азвр Узі Бпе Авр її 1 5 10 15 -2105 186 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.8 МІ. «400» 186 біп бех Маії Уаї ТпІ біп Рко Рко бек Ма1ї бБех Аїа Аїа Рко б1у біп 1 5 10 15
Був Маії Тпх ї1і1е Бек Суз бек біу Бех Аза Бех Авп І1е біу Бек Авп 20 25 за
Ре Уаї бЗеї Тер Тук біп біп цей Ркго Ссіу Тих Аза Рго Пуз пей Гей 35 40 45
І1іе Тух Азр Авп Азробув Аку АвБр оГПей б1іу Іч11е Рко Авр Ага Рпе бек 5О 28 бо сіу Бек ГПув Бек біу Тпх Зег Аіа ТПх Бей біу ї1е Тк біу ей б1п 2105 187 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.8 МІ.
«400» 187 бЗіп бек Уві Заі ТвВху бів вхо Рко пек Уа) Бех Аза Діва рРко біу іп ї в 10 15
Був чаї ТЕ їі Бек Суз бек Сіу Бех Аза Бех Азп Тіз С1у бек Ав о 25 КІ пе Маії лек Тер Тух біп біп без Бко ЗіУу Так Аза Бко був бен Гей 35 40 43
Їїїіе Тух Авр Ап Адзр о був Ах Ар о без бпіу тів Рко Ар Ака Ре бе за 5У З сіу зЗек бу бех сіу Тпх Бех Аїа ТвЖ бец біу їіїє ТУ біу Бей бів 8 70 75 80 тТвх сі дво обі Аіа Авр о Тук Тух Суз біУу Тих Тер дер Тк бек пе 85 Зо 35
Твх Уаі 5іу Уаї Рне піу біу біу ТВх Бу Пе ТВх Уаїі їви 100 105 110 -210» 188 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.8 МІ СОВ1 «400» 188
Зек йіу бах Аіа бех Азо Ті Зіу дек Аза рБе Уві ех і а 18 210» 189 «21157 20. «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70083.8 М СОВа2 «400» 189
Авнр о Азп Ар о Бу Ахго АвроБехй і З -2105 190 «211511 «212» білок -213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ Т70083.8 МІСОВЗ «400» 190
Зіу ТВх Тер Авр Так Зек ем ТВх Уві бу Уві 1 5 185 15. «2105 191 «2115 375 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.9 МН «400» 191 чачусдсацче боскчцаціс сазоодвачас сбоугасаче сеЧчаооЧоЧУуєс сссуачаєссе
БО єсстабчсай себссоачайсх сасстїкадс азссасчсса соавассочає ссчссааочоє 120 спсадочазоач часедсачся доєссссадс: астадсоата чЧсоосчасад сасабаєстає 180 чсачастсесу бозацачесу зсбсассаєс сссаздадаса ассссазуаа сасястуксає 40 стдсазаєца асадссоссач адссавоачас асадссасчо аксСассосас чацоасадаса 300 тагтастаєу абавобсуаєсао Єсасєссучає чек кєцЧаба гсСкооЧассУ доадсасеска 360 чксассчес сосов 375 «2105 192 «2115 125 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70083.9 МН
«400» 192 біз Уаі бів Пец Бей біз бек бїіу біу біу ей Уаї бів Рхо Біу Ту 1 5 10 15 зек Ми Ако Сей Зех Сув Аіа Аіа Бех біу рРпПеє ТЕ Рпе Бех Бек Тук 20 25 30
Аіз Меє Бех ТБ Уаії Аху сіп Аза Рхо біу буз біу Пец бі Тхр Уаї 35 40 45
Бех Аза їі бек біу Зек біу сіу Бек ТВх Тук Тух Аїа Авр бек Уві 50 55 БО
Муз біу Ат Рпре ТВх їі беж АкЯ Азр о Алп о бетї Був Аяп о ТВХ Пец тух 25 76 75 во їеч біп Мес Депо Зек пе) Ага діа сій АвроТпх Аза баї Тух Тук Сув 85 за З5
Аіа Ахо Акоа Тв Тух Тук Тух Авр о бЗех Азр о біу Мівз бек Азр о Ууаї Ріг 109 105 119
Дзо Ті Ткв о біу дхз біу ТВх б Уві Тож Уві Зах бЗег в 115 180 155 2105 193 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.9 УНСОВ1 «400» 193 цех Ту Аїз Меї Бек 1 5 «2105» 194 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.9 УНСОВ2 «400» 194 діа їі бек біу бех бі» біу бЗех Трх Тук Тух Азія Авр Бех Маї Був 1 5 о 15 щу «210» 195 «211516 00«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ Т70083.9 УНСОВЗ «400» 195 вка ТВ: Тух ТуУк ТУк Дав бек Авр обі Ні бех дар о уаі Ре Авр її1з 1 5 ЇВ ї5 «2105» 196 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70083.9 МІ «400» 196 садсссатсс совсосадес зссстісачто сстуєуассс сзоддасавовза зоссассабе о5 5 сстссЕсба чазасуєсіс свабассочоа зусазвієксо гебссбоацса ссаасваєссе 129 ссосусцчасау ссесссаваєст сстсассвсає часавесзаєа авсчачасес ззачастосс і80 чассасстсе сецостссва зісбодесвся ссачосаєссс буЗзасассавс суавссосад 240 астачоадчасч зачссдаєса ктаскчасоуча асабсоачавса ссвуєстчас СассаЗа ке 300 тЕсоЗсдазу заассавасї зассасоста 130 2105» 197 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70083.9 МІ
З5 «400» 197 сів Зек Уаі Пец ТвВх бів Рхо Бо Зех Уаї чех Аза Аіїв рхо піу біп 1 5 10 15
Був уаї ТПж І1є бЗег Суя беїг Сі Бех Аїа Зех Авп їі біу ВЗех Аз 20 28 ЗО пе Уаї бек Ткр Тук бів біп бе) ро біу Тк Аза рхо Був їем Бей ! 35 40 45 їі Тух Авр дяп Азр Гуз Ах Дар йо біу іє рхо Азр Ак Бе бек 50 55 5О сСіу Бех Пув Бех біу Тпх Зеї діа ТЕ Без біу ї11є тах Зіу без 518 55 То те по
Тих біу лавр іч Аза Авр о Тух Тух Сув біу Тйх Ткр йо ТвВх бек Гі 0 95
Твх Уві б3іу Уві Рне біу біу біу Тйх був пед ТВх уаї їв 109 105 110 5 -2105 198 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.9 М СОВ1 «400» 198 дек біу Зеї Діа Зех Аап її біу Бех Адвп Бпе Уві Зек і З 16 2105 199 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170083.9 М СОВН2 «400» 199
Агро Авп о Ар о Буз Аа Ав пе 1 5 «2105» 200
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70083.9 МІ СОВЗ «400» 200 сСіу ТНЕ Тер дкр ТІ бек це Тнк Уві сіу Узі 1 5 15 «2105» 201 «2115» 366 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70137 МН «4005» 201 сацуксасацєе сусвусачіс зудаоставу зчЕчЧазовачо ссуддасссс аусдазчуес 60 тсстсосвача ссКессоасса сасссєтасс аастаєсчоба ссасстуоач: дсоаасаЗоасе 120 сесдсасавч чассссаачасоя засчачасоч аксачечесх аваозасоацчтва сасавастах 180 чсасачавас сссачучсвоа зассассаго ассасачаса сасссасцаз сасаусстбає
ЩО асочачсєча чзадсссузоа асссдасдчас асопессобає ассасксусує дадааваєчує 300 сістЧачЧоЧЕ чачастстца госетєсЧас ахсстдусоасс чаздчазсссу зуссасосдес 36О
Ксебеса. збе 25. «2105202 «2115 122 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70137 МН «4005» 202 бів Уаі бій бен біп бій бек біу Аза біз Ууаї був Буз Рко б1у Аза 1 З 18 18
Зек Узі був Уаї Зах Сув уз Аза Беб сСіу Тух ТВ Рпе ТВух Зах Тук 2о ав 3а зіу їі бЗех ТЕвБ Уаї Ах сій Дія Рхо біу ЄЇїп7 біу Бей біз Тхв Мех 35 40 45 біу Ткгр ї1є Зех Аза Тукг Авп о біу Ана ТВ Ав Тух Аза біб Був Гей
ЗО 55 во сіп біу АкУ Уаї Тпйх Меїжї Трхе Тих Авр тТрх Бех ТВ бек Тех Аа Тут 55 78 75 во мес бій цей АхЯ бек Пем Ах Зект АвроАвр Тах Аза Уаї Тух Тук Сув в а0 зЗ5
Аїа АхЧ Авп біу Пем Тхр сіу Тер Авр бех Авзр дьа Ре Авр Ті Ткр 100 105 119 5іу Ахч О1у Тих Пец Уаї Тр Ууаї Бех беж 115 120 2105» 203 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «2235» 1.770137 УНСОВІ1 «400» 203
Жехк Тук Зіу Ії бек ії 5 «210» 204 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70137 УНСОВ2 «400» 204
Тер ї1е Бех 8із Тух дз біу Аза ТоОх Ввзп о Тух Віа бів уз еч біп 4 5 10 15 сі «2105» 205 «211513 00«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70137 УНСОВЗ «400» 205
Азп о обіу пен Тхр б1у Тхр Авр Бех Авр о Аія Ре Авр їі1е
А 5 19 «-2105» 206 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70137 МІ «400» 206 саяасстдссс бдастсачос тасссссасч сєсбаЧасссс сгоцасазіс сабсаєссаєс во ксесзсасту чаассвусаз кчаасоассоої ЧасЄсаєвасе асокссссста ссассаасад 150 сасссацоса зацсссессав астсясцаєу бабзаксачєса усааєсоцдес сесаучочсх їв бстаатсоаст сСсбсосоуссс савуєсссозс заасасудчесе ссстдассає стсбоЗадесе 240 сачоастчачо зсзасачстда сЄКассасгоас ачесссатака сСавучсвосачй саскчксоса 30
ЕЄспосчазд дажссавзуці сассабсста 430 -2105» 207 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70137 МІ
«4005» 207 зій Зек Аїа ви ТВ Сіп Рхо йзіа Зах Уаї бек біу бек Бхо Б5іу бій 1 а 10 15
Зек Іі ТВжх ї1е Бех Суз ТВЕК біу Тих бек ет Азр Уві бБіу біуУу Тух 28 25 30 дз тТуУук Уві Чех Ткр ТтТУукК біп сій Ніз рхо Бі Ббуя Аза Рко ув Пем 35 40 45
Мет Ііе Тут Авр о Уаї Зехїх деп о Аха Рто Зех сіу ді Бех Авап Ак Рне 55 50 бЗех піу Вехє Був бек біу Азп ТЕ діа Зех їєц ТІ Її1е Зех біу їецй 65 70 78 во сів віз Бій Ар обі Аза Авкр Тук ТУух Сув дек бех Тух ТБх зЗех Бех 5 29 5 зек Тпх Уві Уві Рпе Біу п3іу біу Тьх пуя Уаї ТП Уаії бе 100 105 19 5 -2105» 208 «2115 14 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1.170137 М СОВ1 «400» 208
ТВх біу ТЕ Бех Бек Авр Уаї Бі Бі Тек Аво тТУуКкК Уві бек 1 5 12 «2105» 209 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1.170137 МЕСОВ2 «400» 209
Авр о Уаії Бех Ап Ага Ро Бек 1 5
«210» 210 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70137 МЕСОВЗ «400» 210
Звх бек Тух ТВх Бех бек Бек тах Уві Уаї 1 5 їо «2105 211 «2115 360 15.«2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70052 УНН «4005» 211 зваЧчЕЗсадес їТозпЧазее содацаваЧес сбадісавцчє ствдазачас ссгаававеке о ссегаїсаво себссузаєх сасссєсасб частвсбаса сдазстадчах ссассзудеї 120 ссвачсозачоа зЗассздачсоа сааксссзсас зкесСачсссста зоаздоасастасє счбаєвесає 18о чсазассску бсзазауєса асксзссавс сссзучаса асссаацаа стсаєєсасає чо сіссвааєца асазцссідад зубсоадуаєс асчцссобсх абстасбтобсує дададасахте 300 ачзсзчссаго чеуастчаєс соассссскоач засзачзузса соссочісас сУубсссовах зо 25. «2105212 «2115 120 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І/.Т70052 УНН «4005» 212 зіз Уві сій Бей узі бій Бех біу Зіу біу ШЦеоб Узі був Рхз бБ1У Піх
М 5 і 15
З5
Зех Гей Аху без бек Сув бі) Аза Вех біу РБе Твх Рпе ТБЕ Авр Тук 20 25 30
Тух Меї Авп о Тхр Т1еє Ак біп діа Рко біу Буз біу їви біз Ткр 118 35 40 45
Бас Тух Т1іе бек Рко Зіу біу ТВйх ТВх Уаі Тук Тух Аїа Авр Бек Уві 50 35 во їув біу Аку Рпе Тк Т1е Бек Ако Ар Авп оАіа Пуз Авп оЗех Бей Тує
Ба 70 75 во їв біп Меє Двп о бек рев Аку уаї бій АДвр Твх Аіа Уаі Тух Тух Сув 20 5
Аіїа Аку др їїє беж піу Тух піу Авр ТЕр Ре Аве о Рко Тхр о біУу Був 100 105 110
Сіу ТБх бе уУаіїі ТВх Уа) бек бех 115 120 «2105 213 5 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170052 УНСОВІ1 «400» 213 двроТух Тух Меї Ав ї 5 «2105» 214 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170052 УНСОВ2 «400» 214
Тух Ії бек рРхо щу біу Твх ТВх Уаії Тух Тук Азча Азр бЗех Уаї Був 1 5 10 18 біу
«2105» 215 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170052 УНСОВЗ «400» 215
Авв.їіе ех сту Тух 5іУ Ав Тхр Епе Ар Рхо і а 18 «2105 216 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170052 МІ. «4005» 216 сачесстаєсу сдасоасвуєс зсссєсачео Єссдоудассс ссуцасачау чаєсассвсс
БИ всЕсУксссо дааосацесс саасабсоцча ацїааєавсся сааассочса ссачестоссе 129 ссачсстасцо сссссачааб ссбсасскає аабаззівзаєсс адсочесаке ачаччкссса ї180 часссчасксу ссазсіссав чссдозсасс єсвчсссссс садесаєЄсво Счосстссад 240 гсссазчоавса асостчаєта сбассобоза зсасоадаас асазсссова Єазсссоася з00 тссчосудач учассавась зассчсеста 33 «2105» 217 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І. 170052 МІ. «400» 217 сій бек уаї чаї ТВх бій Рко Рго бек Аіа бЗеїх б1іу Твк вхо біу вій 1 5 10 15
Ака Уаї ТВх ї1іє бех Суя Зех сіу Бех бех Бех Авп Т1е біу бек Ап 0 25 30
Тих Уаі Авп о Ткр Тук бій Пес Бей Рко Аза ТВх діа Рго дк ІЗ Бец 35 40 45
І1е Тук Аяєп Авп Авоп бів Ако Рго бех б1іу уаії Рго Азр Ак Ре Аза 5о 35 50 біу Бет Пух Зех біу Тих Зех Аїз Бех Пед Аза т16є бех 1у рез біп 65 79 75 во
Зек піц Авробіц Діа йвроТух Тух Суз біу Аїа Ткр Авр Азю Зех їв 85 зо 5
Ав) Зах Рхо Чаї рве біу сіу б1іу Ту буз Гео ТВжх уаї ей 120 105 110 «2105» 218 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1.170052 МІ СОВ1 «400» 218
Чек біу Бех бек Зет Авп І18 біу бЗех дбай Тпх Чаї Авп 1 5 10 «2105» 219 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 170052 М СОВ2 «400» 219
Авап оАвп о Двп обід Ага Рхо бек 1 5
«210» 220 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 70052 М СОВЗ 10. «400» 220 біт Аза Ткр даю дз дек ему Аяоп Бех Рго уаї і З ЩО «2105 221 «2115 360 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 20. «223» І/,/Т70100 УН «400» 221 чаччсосаце сасгодазсс счаЧачазас Єсуосасаує сбоЧчоачЧочсе сссчазасес 6О ссстусасво себстасаєт сасстєтвас востакосса казустудує ссуссводоїх ї2о ссзачозаачо засада суссесачсї астачесууєса чбсозчсозсазч сасакєаєтає їв чезваассссо базачазесу ясксассвсс сосадачаса ассссзачаа сасчесасах 249 сідсаваїча асацсссчву ачссоадоачас асочоасєеЧчкує абтастесос чадчсахачч 300 ччессдсЯце Сассубаєссе счаєстстоЯ здоассоводеача сзатоачеєсає счгсксдаче
Зо «2105 222 «2115 120 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» І.Т70100 УН «400» 222 біз Уві бій Бей ей Бій бех БіУ біу Біу пе чаї Бій ро Бі щу 1 5 10 15
ЯЗех їем Аку Без бек Сув Діа діа Зек біу Ре ТвВх Ре бЗет Зех Тух «о 25 ЗО
Аза Мек чех Тхр Узі Аку сій Аза рРхо бі Був б1уУу Бей бій Ткр чаї 35 40 45
Бех Аїа їіз беж біу Бех біу 51 Зех ТЕХ Тух Тук Аїа дев Чек ові 50 55 во пув 031у Ака Ре Тпх їі бдек Аку Азр Ап Бех Був Ази о Твх Бей Тух 65 7а 75 во їви зів Меї Азп Бех Пен Аху Аїа бін Авр твВх Віз уаії Ттуюк Тук Суз 85 аз 35
Аїз йху Мія Аа б01у Ахо Тгр бем Рхо Тух Ре Ар Сем Ткр оту За 0 105 110
Біу ТВЕ Мекс Чаї Твї Чаї бесє ех 115 1250 «2105» 223 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170100 УНСОВ «400» 223 зе Тух Аіа Мех Зек ї З «2105» 224 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70100 УНСОВ2 «400» 224
Аїа тів 5Зєехк біу бек біу біу Бех Тих Тук Тух діа Азр йех Ууаї цуз і в 10 15 5іу «210» 225 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70100 УНСОВЗ «400» 225
Ні Аку Б1У Ах тТхр бе Рко Тухк Ре Дар о їви і 5 18 «2105» 226 «2115 321 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70100 УНН «400» 226 часаєссачі: кдасссачіс сссавісссес сбоєстосає сспксоддчада чачадссасс
БО ассасскасс азасчаціся чувсасссус васкасєссаз астцусаєса сазазвасса 125 чазавачссс стазассссс чабстсабуає збасссаасї сочаааєссоч зчїсссвуса 180 соачЕссазбо сзачсачасєс сЗаоасвовЯа Табтасессса чдсаїсвзасза сесдсачссяе 4о чазаавсєске сазсабтаєта бої свзасва сбабчасзаава ссссасстас ссссдасадча за чазчзассаачч счаааатсаа а
З
«210» 227 «2115107 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170100 МІ. «400» 227
Авр її біп Пем Тк Сів Зек Вко бек бек Пец бЗех Аза бЗетх Уаі 61у 1 З 10 15 січ Акз Уаї Тк її ТБбЕк Сув біп Аза бЗех біп Авр Ті Аку бетї Тух 20 25 30 їй АвпоТкр Тух біп біп Гуз Рхо бБіуУу був Азія Рко Був Бей пе Тіє 35 зо 45
Тут Авр Уві Бек Авпоївц сій ТЕ сіу Уаїі Рко Зеїх Ак Ре бЗех 61
ЗО 58 й цех біу бек біу Таих біз Тук Тпх Ре Зеж Ї1е Бек беж їз бій РЕо .5 зо т на бі Аз Ре Аіа Тих Тух Тух Суз бів біп Тух Ар и Ппув Аіз Ро Бац 35 Зо а5
ТВЕж Ре Біу С1у бі ТНж був Уаї бій 116 Був 100 105 «2105» 228 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70100 МСОВ1 «400» 228 сіп діа Бех біп Аброї1е дка Вех Тук їйви Ав 1 5 10 «2105» 229 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70100 М СОВ2 «400» 229
Авр чаї бек Авип їм бі ТЕ 1 З «210» 230 «-21159 «212» білок
213» Штучна послідовність «223» І/.Т70100 М СОВЗ «400» 230 ціп зів тТук Авр о пПуз Аза Ехо ей ТВ і З «2105» 231 «2115 366 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70142 УН «400» 231 сацаєсссваєс саукасвосс гздазоастоза Чкозачазоас ссочопасссс адразазчес во тсстосааду сстссгаЧега сасессттасс зассаєдута гсазсїзоЧЕ ссаасадуєс 1280 ссбучасазу засссчазакт Ччасоазоасча ассвоасассс яасаасзчсаа сасзавсгах 180 чсасацавує ссадудсву ауссассасо ассацудаса сагссассач сасачостає 240 акдоачстза осадастояу авсстуасово асудсезкає аксСассосос чадавасоаде зо стсбачозоЄ Чачасксвда бастєксцає асстоддоче аадоадассає чассассассо
З5О0 тсаває зва «2105» 232 «2115 122 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70142 УН
Зо «400» 232 біп Уаї біл їєй Уаї біп бех біу Аза бій Чаї Буз Пув Рко б1іу діа 1 З То 15
Бех уаї Був Узі бек Сузв Був Аза Бех біу Тух Тих Рье Тк Вех Тук 20 25 30
Сіу ї1є бех Тгр оУуаї Ахо бій діа Рто біу біп біу йез бій Ткр Меє 35 40 45 -1у Тжхр Ііе бек Аза Тух Ап сіу Ап ТИХ Аза Тух Аза біп Пуз Без
Зо 55 80 сіп біу Ак Уві Тпх Меб Твт Аку АвроТвгобех ї1е Яег ТНх ліва Тує 55 то 78 во
Меє сін Пец бек Аху їви Ату бек Авзр Ар о ТВх Аза Уві Тух Тух Сув 85 за 95 діа Аку Азп о біу Гей Тер біу Тер Авр бек Авр діа Ре Азр Т1є Ткр 150 105 мо біу біп біу тТпх Тнх Уаї ТьЕК Уаії Зех ех 115 120 «2105» 233 «2115 5 «212» білок -213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170142 УНСОВІ1 «400» 233
Зек Тух піу Кіе бег 1 З «2105» 234 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.170142 УНСОВ2 «400» 234
Ткр Іі Бех Аза Тух Азп йіу Аяп ТВ Авп о ТтТух Віа біп буз ем бів 1 З 19 15 щіу «2105» 235 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/Т70142 УНСОВЗ «400» 235
АзпосСіу Пей Тер піу Тер Авр бБеї Авр Аза Ре Ар Ті1е 1 5 10 «2105» 236 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І/,/Т70142 МІ. «400» 236 сваєсссасоас сцасчсаЗсс чессісачвсу егасуцдссс седчасачай дЧесассавус
БО їсескЧссссЯ дзазсачсесс свасаєсоуа аабавеєсава бассосссоуга ссвусавочссе 129 ссвзвоаЧчавасвя сссссавась ссссакесає засаасзаєса двасчассстс задасабссссх ї180 часесчасссу сстоуЧеєссваа чЕсстспосасу ссавоассассс бодЧасабсзо сучассосач 240 ассучочасо адассдчатса Ссбасбросоуа асзсцчазаса усадсссдаз Суссоадсоке 300 скЕсадаавсса ссасссачсї сассЯєссса 2105» 237 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/,/Т70142 МІ.
З5 «4005» 237 біп бек о Уаї Фей Тато обіп Рго Рко бех Уаї Зек Аза Дія Рхо біу бій 1 5 зо ї5 уз Уаї Тих ї16 Зех Суз Бех біу Бех Бех цех Аяп їі біу Ап Ав о 25 за
Тух Уаї Бек Ттр Тух віп пів ей Рхо піт ТВХ Аїа Ро Ббуз Пец Гей 38 40 45
Ті тух Авр Ап Азп о бує Аху Ро Зех біу Її Рхо Взр Аку Ре Бех
ЗО 55 БО біу Зех Пуа бек бБіу ТрВх бех Аза Тах Пей бі їТ1в ТВх біу без бів
В 7 ТВ о
Твх щіу Авр біо Аза дер о ТУх Тухє Сув Щ1уУу ТНІ Тер Авр Зех Зех Гец ва за З
Зех Аза б1іу Маї Рне сіу Так біу Твхж бів Пец ТБжх Уаї Гей 109 105 110 «2105» 238 «2115 13 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170142 М СОВ1 «400» 238 чек сіу Зех бек бехї Азп о Г1е біу Авп Ап Тухк Уаіїі Бег 1 5 10 «2105» 239 «2115 7 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1 170142 МІ СОВ2 «400» 239
Аго Авп дао цу Ах БКро Бег «210» 240
Зо «211511
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «2235» Т70142 МІСОВЗ «400» 240
Сіу Твх Тк АвробЗех бек Іез бек Аза біу чаї 1 З 19 «2105 241 «2115 366 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70144 УН «400» 241 сачасссаче ссубасавсс судавссзва Ззсозачавує ссазацестс вчсчавачеес во ксскдсаауа ссгесуувса сасстстаєс адстасодса ксачссоцує устасауаєс 129 сстодасава осусссоваса забсоачагсад ассачсочссї асаабсудсаа сасавастах 188
Чсасвозачс їссаозусва вуссассаку ассачочаса счсгссатсач сасячсстає 240 асцюшачссоав чсазоессчач аксічЧасавас асзчссасЯає вгсассцсчс одадазакооес запо скстдаочаї дозасестоа бостсєсдає абсточоцос аачоцассає зухсассцкс
ЗО їсавух 355 «2105» 242 «2115 122 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70144 УН
Зо «400» 242 сій Уаї біп їви Уаії бів бек біу діа бій Уаїі Був Пуз Рхо б1у Аза 1 5 10 15.
Бек уві Суя Чаї ЧЗех Суз Був Атїа бЗех біу Тух Трпх РПеЄ Тих бек Тух 20 25 Зо
Сіу їїз Бех Тер Уа) Аха біп Адзіа Рхо б1іу біп Біу без біз Тер Меє 35 | 48 48 сіу Тхр ї1е Бех Аїа Тух Авп біу Авп Тпх Ап Тух Аів сій Буз Бей 50 58. о бів біу Агу Уві ТвВх Мебє Ту Ак Азр ТЕ бех І1е Бех ТВпх Аза Тух 68 70 та яо
Меє біз пес Бек Ака Бе Аху ех Авр Авр Тпжх Аза Уві Тук Тук Сув 85 за а5 діа Аху Азп обіу цей Ткр біу Тхр дДзр бЗех дзр діа Рре АДвр т1е Тер 100 105 110 ббіу бБіп Біу ТВх ТІ Маї ТЕ Уаї Бек Бех 115 150 «2105» 243 «2115 5 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170144 УНСОВІ1 «400» 243
Зехт Тухк сіу І1е бЗех 1 5 «210» 244 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170144 УНСОВ2 «400» 244
Ткр 11іе Бек Аїа Тух Ап біу Аяп ТВх Авап о Тук Аза біп Був ей бів
«-210» 245 «-2115 13 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. 170144 УНСОВЗ «400» 245
Аяп біу пей Ткр с1іу Ттр Авр Бех Авзр Аіїа РБе Авр І1е 1 5 10 «210» 246 «-2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» 1.170144 МІ. «400» 246 сачЕстаЯбЯас гозсосвасс здесстсваху ссгосодесс саоцчасачаа зуїсаєссвке 5 ксебосеста здазасазсїс савсакбаЧа азаїааєтака бассссдта сбадсачеке ї2о ссаччавсадч сессосазасє себсаєссає часазєваса засузесстє адчавЕкесх по чассозактсс стоачсстссза чссстчсасоа ссазесассс соадчасаєссас сочассссвя 240 астзазаасЗ вачссовсса ссазсточсоаза зсассчоаЗаса десвзєссавач сассоасое 300
КЕсздазессоя здасссазск сассуєксеа 338 «-2105» 247 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» 1.170144 МІ. «400» 247 сів Бек Уа) пев Тах Зір Рео Рко бек Уві бех Аза Аіа Рхо біу бБіп 1 5 19 15
Гуз Уаї Тпх Іі Бек Суз бек 5іу бек Бек ех Авп Ті біу Авп Авп 2 ай 30
ТуУух Уві Зек Тхр Тух біп біп Бей Рко б5іу ТВвх Аза Рко Був Пец бе 35 40 45
Іі тТух дар Ат. Аап о був дку Рхо бех біу Ї1е Рко Авр Ахо Рбе Бех зо 5 БО біу бек Пух бех біу ТНх Бех Аїа Тих Ів: біу ї1е Твх б31у дез бів а5 70 5. во
Так бі Аво сії Аза Ар Тух Тух Сув Б1у ТВх ТКкр о Авр бек Бех ей зо 25 бек Аїіа бі Уаі Ре піу Так о біу Тих біп бей Твк Уаї бе 180 1605 Її 5 «2105» 248 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» ІІ. Т70144 МІ СОВІ1 «400» 248 ех Біу ех Бек Бех азп їїе 5і1у Ап Ав о тТУух ав вах і 5 10 «210» 249 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т70144 МЕ СОВ2 «А00» 249 дав Аво о Азпобув Ак Бко 5ег 1 а «2105» 250
Зо «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність
«р2З» ІІ 170144 М СОВЗ «400» 250
Біу Тпх Тхр Акр Чех бек Гей бех Аіа Б5іу Уві 1 5 10 «-2105 251 «2115 351 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 15. «2235» І. 170019 МН «400» 251 сачосссазс спчтосазсс сосоасадас сстдассазце сточоачочес себодачасее бо ксстотосає ссєскузаєє сассієсазє зосстасадса сзазвскодає седссачасе 120 ссачоачавач частоздачсо здассісзвссс ассачсвоасз чдсзассвсає акассасаса ї8о часксацзісчЧа ачуассчаст сассаєсссс суадасаасу ссзадаастс ассобаєссо 240 сазасдааса чсссдачаче сочаводасасу зссосасСаїсє яастабусуву авуазучсасса 300 ватчосства сссассвсося заспссочцаза асааєзасся сечессстсс а 351 «2105» 252 «2115117 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «р2З» І. Т70019 УН «400» 252
Зо сій уаї біп пей уаї біп бек біу б51іу біу пеш Уаї пуб Рхго б1іу Б1у 1 5 10 15
Бех пен Ака Ти Бех Сув діа Аїа Бек біу Рра Тах рРпе Яех Зег Тух 20 аа 30 зек Меї Авзп Тур Уаї дк біп Аза Рго б1іу Був б1іу Бей бій Ттр чаї 38 40 45
Бех Бех Ії Зег Бех бек бет Тух Ії1е Тух Тук Віа Дер Бех Уві Бу 5О 55 650 сіу Аха РВе тТВт Т1е Бех Аку Азр о Авп Аза Був Авоп Бек цем Тух Бей 65 79 75 о біп Мес Ав бек ей Аку діа піц Авр ТВх Аза Ууаї Тух Тук Сув Аза я за 95
Ахч бБіч Аза Рко деп біу їеа їі ДвроТух ку біу Ак сіу тах Меб 100 185 110
Уаї ТржЕ Уві Бех Зекх 115 «2105 253 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т170019 УНСОВІ1 «400» 253
Зехк Тук бек Ме Авп 3 ц «2105» 254 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70019 УНСОВ2 «400» 254 ех Тіє Чех бех бех бЗет Тук їі1ісе Тух Тух Азїа Дер бех Узі був бі1у ї 5 10 15 «2105» 255 «-21159 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І.Т170019 УНСОВЗ
«4005» 255 «2105» 256 «2115» 321 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» 1 170019 МІ. «4005» 256 ззсакссчхча кузсесачтс гссєтссассо стчсстасає стуєсзодача сачзазєсасс во ассассктчес чодссвассавз зоаочсаствасє асстзчассза сссЗЧевеса зсачзаавеса 128 чачасавассс стазачсстЄ чаєсстаєзацч зчсатстасес гадзазасоау дассссассв 150 зчсзсссзасо чзсзасачасс сооасавчаї сгссассссса ссабсавзсач Сбебдсавасс 2-48 завчасссссо сазсессасса ссуєсазвсза ваксасвака сессчбудас Язсссоцчесва зо чачассавос содачассав а «-2105» 257 -2115107 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» 1 170019 МІ. «400» 257
Авр оті Уаї Мебс Тпх бій бек Рхо Бех Тих Без Бех Аза цех Узі біу 1 З 16 15
Авр Ах Уаї Тих їТ1е Тих Сух Дха діа Бех біп біу Т1є Зех бек Ткр 20 25 ЗО їйви Аза Тхр Тух бЗіп біпй був Рго біу Ах Аіа Рхо Був Уві цей Т1е 35 40 45
Тух пу Аіа хХех ТИйх Ппей бі Бех сіу Ууаї Рко бех Ако Рпе бах сіу 50 З5 БО
Зек біу чех С1у Тих Авр Ре Трх Пец Тих Т1е Бех бЗех їйей біп Рго 55 70 75 о біз Авр Бпе Аіїа ТБ Тух Тук Сув біп бів бЗех Тух бех Тах Рко Ткр 85 зо З
ТВвІ Ре біУу біп біу Таж Був Се біз Т1іе Був 100 105 «2105» 258 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70019 МЕСОВ1 «400» 258
Аха Аїв бек бів сіу Ті Бех Зех Ткр Гей Дія ї З хо «2105» 259 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І/.Т70019 МЕСОВ2 «400» 259
Пуз Аіз Зек Тих Бевои бід Зах 1 а «210» 260 «21159
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Т70019 МІСОВЗ «400» 260 сіп о біп Дек Тух Беж Тпх Рхо Тур ТБЕ 1 5
«2105 261 «2115 351 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«220» «р2З» І .Т70028 УН «400» 261 сваастусавас босвоауассс чодсзсаауа абассчавас сттсчовчас сстукссске во зсасасаасч сссаззвасчя чсссгсач асссассвої зчассеозак ссзссвусос 120 ссевоаччЧавач чЧасточваса дастддадаєсє ассаваєсвава зцоцавчбас саассавсває 180 сесабсссса чуауссцаст сассатаєса зсауасссЯаї ссазоазаєся ЗСесссваси зчаєкЧастс стзчсзассос сусоцасаєсу чсбаїегакї восоубосдаз ассдавсуве закчаєчскє ссозгахстч чочзссзузач звсзаїоцеса созссссчво 351 «2105 262 «2115 117 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 70028 МН «400» 262 зів Бей біп без сіп бій бБет сіу Діаз Ах Ме пес був бро Бех 51
Її 5 18 15
Так Без бех ви Тих Сув Аво Уаї біп Ап о с1у бек Ре бдевх ТВх Нів хо а 3
ТУух Тхр тах Тхр її Ах бій Рко Рко зЗіу Був біу ей Бі ТЕр ї1е 35 4 5 біу двр Ії1їє деп сіп вх біу Чек ТвВх дп Ніз АДвпорко беїх цей АК
За за бо бек Ах їец Так о ї1е бек Уаії Ар Рко бек Був Ап сій Ре Бех Уді1 65 та 7 во
Аха ей Тпх Зех Узі ТВх Аза Аа Авор о ТВх Віз Уаї Тухк Тух Сув ді1з я5 зо 95
Аха Гей Азп о Авзр АвзроАвр Аза Бре Ар о їіє Тр біУу Аха піу Твх Меє 100 105 110 уаї тТнх Маї бек цехк 115 «2105» 263 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т170028 УНСОВІ «400» 263
ТвІ нів ТУє ТЕр Ти 1 5 «2105» 264 «211516 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70028 УНСОВ2 «400» 264 джр її Азп о біп Акз біу Зех Трах Аза Нів Авп о Рхо Бех це Ако Бех і 5 10 15 «2105» 265 «21159 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170028 УНСОВЗ
«400» 265 їво Авп оАвройвр о Азр о Аія Ре Авр о ї1е 1 5 «2105» 266 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170028 МІ. «400» 266 свасстостас єсасасаасе чессссзася сесадоавссс ссаЗчеазаз васеавсасо во їсзсасхсту дзадсавусто сазсаєсооуч азісасасто сааассооба ссаасаєссе 150 чусзаззасоач сссесваавсе ссобсасссає азсазутзаєс ачсоЗссосе аЧчочассссЕ ї8о чассчасєссс ссочссоссза Ясстдсексс ссачестссс сачесассва сечасессва 40 І сссдазчаса зддосдаєса сСтассцєоса дсссочааку ссочосассда соксасасс зап їхсодзаєся ддассаачзає сассябеста ов 330 «210» 267 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170028 МІ. «4005» 267 сій Бех уаї рем ТЕ піп Рко Ро Беж Аїа Бех біу Тпх Рг біу 313 1 З 10 15 піу уаї ТВх ї11їє Бех Сув бек біу бех бет Зах АвпоТ1їе Сіу бек Ніж 20 25 Ко
ТВх Уві Ап То Тух бів Ні їву Ада бі Тих Аза ко цув Бей їей 35 48 45
Їїє Тух Бех Ап Авп о біп Ако Вко Зех біу Узі Вхо Авр АхЯ пе Зех 5 60
Сіу Бех Ппуз Вех Аіа бек бех діа бек пе Азія Ї1еє бек біу пец біп 65 70 75 во чех бій Авробій Аза АвроТук Тук Сув Аїа Азїа Ттр Авр Аза б1у Чаї 85 зо 35 дав сіу Тук Уаії Рне біу Тпх біу ТВх цуз Уа) тТьх Ууа)х ви 109 105 350 «2105» 268 5 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170028 М СОВ1 «400» 268
Зех ЗіУу Бех беї дек Азпоїів піт бек мів ТЕ Уаї Дай 1 5 10 «2105» 269 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. Т170028 М СОВ2 «400» 269 бЗех Азп Ав бів Аку Вко бек «2105» 270 «2115 11
«212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І 170028 МІ СОВЗ «400» 270
Аїа Аїз Тхр авр Діаз су Узі двр Біу Тук Чаї
А З 18 «-2105 271 «2115 354 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т70076 УНН «4005» 271 чачосасвас счЗзбсачазсс ссаазвоастова чзоззвачавоас ссоачасоссс вубовачаєе
БО їсссзсаазо сЕсссоЧчКа свостусазсс зассзсЧчаса сСсазчесЧчає асавсвачее 170 ссгодасааз честіцазса чабачзчасод вгсазсассо асзасуасвна сасадастат 1859 чсасачцазоає Кссвоцосгаз аздїсассасч ассвсазаса сасссевсдву сасасчсстає всчааастсла зчацестчатч ассідласуас асочосзсаї ассастосус зчададЧвсоси
Чччссазссаа чесеЕсЕзассв стазадосоч сдасассстча бсзосяасссс вас 354 «-2105 272 «2115 118 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т70076 УНН
Зо «4005 272 зіч Уві сів без уаї сі) Бех бі Аіїа бі) Уві Ппуз Ббуз Рхо біу Аїа і 5 15 15 ех Ууаї Був Чаї Зек Суз Був Аза Бех Сіу Тук Тих Рре Тптг бек Тук о 5 30 сіу Іі бек Ттр Уаї Ака біп Аза Рко біу сіп біу пе бій Ткр Мех 35 40 45 біу тТЕр їі бЗех Аза тує Авп о біу АдвпотТвІ Авзп Тухк Аза піп був бе ве 55 ва біп б1у Аку Уаі Тік Мекс Тих Тк Авзр Тих бБет Тік бек Тих Атїа тує 70 75 во
Мес біс Без АхЯ бек Бей Ака бек Авр Ар ТЕ Аза Уаї Тук Тух Сув 85 зо 55
Аіїа Аха біу Рхо біу Тур рец біу Рпе Авр Тух Тер б1у Ака б1у ТЕ 100 105 110 їйез Уаї Тпх Уаї Зеїх Вех 115 «2105 273 5 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170076 УНСОВ1 «4005 273
Зек Туг біу І1е бек 1 З «2105» 274 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170076 УНСОВ2 «400» 274
Ттр І12е бек Азїа Тук Авзпобіу Азп Трх Авп о Тук Аз1а біп Був їец біп 1 5 10 15 1у
«2105 275 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170076 УНСОВЗ «4005» 275 біу Рко біу ТЕр їзна Сіу Ре Авр о тух 1 З «2105 276 «2115 330 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 20. «2235» І, 170076 МІ «4005» 276 сачхсточссс гцасссацес Басстсвоко сесаЗасессс ссоацчасатчьс чассвесасе
БО
Есссосасса даассвусач счасуєсоаЄ чассасвасє асоєсссстУу укассзасав ї20
Ччасссасаяаса ацассесссва асктсаєсаатс басзакуєса збааксочсс стсзаочоасе 180 їстваєсоаск Кобссдуассс сзазсстоос вабасачесе сесессдассає скскуЧчуєссе 240 сазчстдацу асозачссса Ебабсассус ачзсссасаса савасазсаву сасєсбасаєсео з0О тссдазассу дозссавуєє уасеубесса 330 «2105» 277 «2115110 «212» білок 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» 1 170076 МІ. «4005» 277 бів бек Аза без Тр біз Рко дів Бех Уаї бек 51 Зежї рРко біу бій і З їі 15 чек Ті ТвЖ Їзіе Зех Суя ТПпх піу ТпПх Зех Бех дяр Уаії біуУу бБіу Тух о 2 30
Ава о Тух Маї Хек Тер Тук бій сіп АзроРхо сбіу Був Аза Рхо ув Бей
І 3 40 45
Меї Ії Тух Авп Уаї Бех Азп Ас рхо бек сіу Уа1ї Зех АзпоАху Рве за 55 ай
Зех біу Зах Буз Чех бпіу Азвп тТВвх Аза Беж Гецш ТВЕ їТ1іе хек сіу Бей 65 70 75 во сів Азїз біз Азр біз Аза Азр Тух Тух Сув Чех Зехк Тух ТВж бек пек 85 за 95
Бех ТІ Тух Уді РБе біу Тс біу ТВх був цей Тк Чаї Бей 180 105 110 «2105 278 «2115 14 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170076 УНСОВ1 «4005» 278
ТВі Бу ТВу бек Зех дар уві біУу Щ1уУ Тух Азп Тух Уві Зех 1 З 10 «2105» 279 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170076 УНСОВ2 «4005» 279
Авпоуаї дек АвподхЗ Рхо йек ї 5 «210» 280
«212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І.Т70076 УНСОВЗ «400» 280
Бех ех Тут ТПх Бех Зек Зек Тих Тух Уаї і в За «210» 281 «2115 360 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «р2З» ІІ. Т70089 УН «400» 281 чачасасвос СасбоЧчачес созЧачачус сбочтасзас сгучачоасес ссєдавасес 5о бсскобосач сеєсстачаки сассєїсвас азстатчсєса бзачсєцачеЕ ссеадсесачасє 120 ссазчазачо сзсхтчооваса чвассссацеє ассачсчака чЕссЕзоаса сасасвсбас 188 чсачастссу гЧавоцоссЯя дорсаєссаєс сссададаса аєсссаачаа сасуєстубає 240 стцсазаєза асацсстоазу адсосовучаєс асдчссасає агсастостс чдааадчаєсєсав за ччасакассс бачасасвадч сдасстссоз поассчачаса сестчоєсає сакесксдаче зо «210» 282 25. «2115 120 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 170089 УН «400» 282 біз Уаїі сіб їй бе Бі бех бі піу біУу би Узі бів Рхо біУу біу 1 5 10 15 век бео Ак їв бек Сує Вів Аза Зек б5іу Ре ТИХ Ре Бек бек ту о 25 30
Аїа Меє дек Тхр Уаії Акч бів Аза Рхо біу Ббуз біу Бей бі) Тев Уві 35 40 45
Зех Аїа Ії бЗежх біт Бех біу сі Бех Тих Тух Тух Аіа Авр Бех Уаї
ЗО За Бо
Був бБіуУу Агу йей ТВ І3Зе Бек Аку Авр Авп Бех пПуз Азп оТВах бе тує
Ба 7 15 о їец біп Меї Азп Бех їем Аха діа біб Авр тах дів уві Тук Тук Су 85 зо 5 діа Був Авробец Піу Туїх ТНх Гец йзроТВБх бек Авр Ре Тхр щу АкЕд 190 105 110 зіу ТЕ Пец Уаї Тк Маі Бех Бех 115 120 «2105» 283 «-21155 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. 7170089 УНСОВ1 «400» 283
Зеї Тух Аїа Меї Бех 1 5 «210» 284 «211517 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» І. т70089 УНСОВ2 «400» 284
Віз ї1з бек біу Зек Сіу 5іу Бек ТВх Тук Тух Аїа Авр бЗех Уві уз 1 З 10 15 зі «-210» 285 «211511 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т170089 УНСОВЗ «400» 285
Ар обец біу ТУк Тахо Бе) Азр Тс бех Авр Ра 1 а 10 «210» 286 «2115» 330 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т70089 МІ. «400» 286 ссстасасас совсосадсос асссесвася ЄссчзЧкссс ссочоасвада чоассассаєє во сеї ссга узаачсвассс свасаєсяда аставсассу сбавастцута сесшсассе 170 ссачцаасло сесссадаас?ї ссогсастсає зосзасазасо засоадсоссгс ачасасосСсав 180 чассдавсос ссудссссаа Ядсссдасася ксачеосссос сезссаєсвя Судоскесау 240 чесзазчасо зачасуаєса гсастокусч асакаачасо асвусстуза боззсекадесу
ЗО
Ксоачечзаз авассваосх зассясеста 33 «-210» 287 «2115 110 «212» білок 213» Штучна послідовність «2020» «223» І. Т170089 МІ. «400» 287 бЗех Тук Чаї їжи Ттпх бів Рхо Рко Бех діа бех б3іу бех Рхо щіу 5185 1 5 10 15 біу Чаї ТвАх І1е бех Сув Бех біу Бех Бех бет Авпап її Біу Тк Авзп 2 25 Зо
Твх Уаії Авп Тхр Тух йец Ніз Уаії Рхо біу ТВ Аза Рго Був Пец Бей 35 40 45
Так Тух ТВЕ Авп Азп бів Ака Рко бех біу Уа) Сіп Азр Ака Рпе бех 50 55 60
Сіу Бех був дех Авр Тйх бетх Аза Бек Пез Аза їі бЗех біу ев біп 7 5 що
Аза біз Авр обі сіу Авр Тук Тут Сув Аза Тпх Тер Авр Аяр Зех Геї 5 зо за
Авпобіу Бей Аза вне біу БіуУу біу ТНЕУ Бу їви ТВ Уві їй 180 105 116 «2105» 288 5 «211513 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 1.170089 МІ СОВ1 «400» 288
Зак біу ех Бек бек вп ї16 Зіу ТНх Аве тах Уві деп і ї 10 «210» 289 «21157 «212» білок 213» Штучна послідовність «220» «223» 170089 М СОВ2 «400» 289
Тих Ап Аза пів Акз Бо бех «2105» 290 «2115 11 «212» білок 213» Штучна послідовність
«223» І/.Т70089 МІ СОВЗ «4005 290
Аза Тпх Тер Аве Авр оБек бе Авпобіу ви Аза 1 я 10 «2105» 291 «2115 499 «212» білок «213» Ното зарієп5 «400» 291
Мек Тахо ії-и Тіе Пен Тк Зек цеб Бей Ве Ре біуУу ей Зех Гви бі 1 в 10 жа
Вк КУ Тпх Аку таі біз Аіа із Авй цецп Рхо Був Рко Ті цей Ткр о 85 30
Аїа біз Ро біу Рхо уаї їі твх Тер Нів дяв бко узі Тих їіе Тер
З 40 45
Суз бій сіу ТЕ Пем біз Аза біп б1іу Тук АкчЧ пев АБр опув бій З1іУ 60
Азп Зес Меї бек Акоа Ні Те Те Буз ТВХх Бе) бій Бек зі Азп обу 5 70 75 39 чаї Був цец бек їі Рко Бех Меє Мебє Тер біс Нів Аіба біу АхУ тТук я5 Зо 5
Ніз Суз Тух Тук бів чек Рхо Аза біу Тер Зек Бій Рко Бех Азр вхо 1600 105 110 їец біз рей Уаї Чаї ТВЕ Аїа Тух бек Аку Рхо ТБх ей Бех Аїа Бей 15 150 125
Рхо бек Рхо Улі Уаії ТП бЗех біу чаї Ап Уві ТВжх їжи вка Сув Аза 139 135 149 бЗех Ак їн сбіу ва біу Аха Ве ТВ бе їТ1е біз сії зіу Авб Нів 148 159 155 ї150
Ах іїєц вк Тгр Тих без Авп беж Нів бів Нівз двп о нія сіу Був Ре 165 170 іт ціп Віа цей Ре Рхо Меї біу Рко Би Тих Вре Зех дяв дха Ф1у ТЕ 180 185 130
Епе Аку Сув Тук Сіу Тух бій Авап Ап о Твх Рто Тух Уві Тхр Зех Бім 135 200 205 тхо Зеїх Авр вхо цей бій Пец бе) Уаї бех бі уві бЗех Дхд Був ро «ів 215 220 ех Тем без ТВжх во біп біу Рко Чаї Уаї ТВх Бхо бБіу біш Авпобей
Ше 30 235 -40
Твх без бів Сув біу бек Авроуаі біу Тух Ті Атха Тух Твжх Гео тує га5 25О 255
Муз січ біу Азїа Ар біу цей РЕо бій Ак Ро біу Бка4 біп ВБко бів 269 255 21О
Аіїа біу це бек бів Аза Авп Ре Тс Бей бек Рго Маї Бех Аку йех аа ва 85
Тук вБіуУу Б1Уу бій Тук Аха Сув Тух Сіу Аіа Ніз Авп Уві Зек Бех бій 90 ЗУ 309
Тур Бех діа Рто Зех Азр орто Гез Азов їі їей І16 Аза біу бів Ті 305 з1а 315 зо
Зех Анр Ах Рто Зех цес бек уаї бів ро біу Рко Тпх Уаї Твх бек 325 330 335 біу біз був Уві Тіх їв їеи Сув біп бех ТЕр Авр Бко Меї Рпе ТВу 348 345 350
Ре йец Бей ТЕ Ппує бід біу Азїз Аїа Нія Бко РО без Ахка пеб АБо 355 160 365
Зех Меїс Тух біу Азїва Нів Пує Тук 5ів Аза біб Ре Рко Мек бек Рго 370 375 зво
Уаї Тапх бек Азїа Нів Аза с1у ТВх Тук Аку Суз Тук біу Бех Ах Бек 385 390 395 400 ех Авп вка Тух цей йви Вех Нія Рко бех бі Вхо Без біз ви Уаї 404 410 415
Уаї Бек біу діа Тпх Зі Тахо без Авп о РКО Аза бів Був Був Зеї Авр 420 428 430 ех Ппув Тих Аза Рхо Кі Бей біп Авр о Тух Тржх Узі біз вп Пец Те 425 440 145
Ака Мет біу Уві Аза бі Пец Уві їецс їва вБе пев біу (ее беч бем 450 455 ей
РВе бі Дів біп Нів бех біп дку Зек бго Рко Ака Сув бек о біп Бій 55 0 475 «о
Аза Азов о бЗех Ако цуз Азр о АвпоАіа Рхо ББе Аку Узі Уві бі рго ТЕюр 45 450 455 спів бід тів «2105 292 «2115 483 «212» білок «213» Яванський макак
«4005» 292
Бко дха Тк Нів Меє бій діа бій Ап оцей Бей пуз Рхо Т1е їец Тур 1 5 10 15
Віа бі рко біу Бго Уаії їі їі Тр був Був Рхо Уаї ТВк їі1іе Тер 20 Ка 30
Су біт біу Таж Бей біз Аїа біп бій Тух Ак без Авр о був біо 61Уу 35 49 45
Ап о бех ї1іє Бех дк Нів Меї Пец був ТВжх бе бід бЗех біз Або оБбуз 50 38 во діа буа Рпе Чех ї1є Рко Зек Мек Меб Тер біл нія Аза біу Ах тут то 75 що
Ні Суз Тук Тух бій бек Рко Аза біу ТК Бек сій реко Зек Авр РЕ 5 зо 35 їеи бій їйен Уві Уа) ТВх Аза Тух Бех Ага Рко Зек рей зек Аза Пец 100 105 116
Бто Яек о Бко Уаії Уві ТВ бек біу Уаі Азп Уаї ТБх їв Ах Суя Аза в 115 120 25
Бех Аг ем біу Пецп бБіу Аку Ре ТВх йей ї1е біц бі) біу Авр Ні 138 135 140
Ак їв бех Ткхр Тих Сей Дер Зех Нів біп Нів Ази Нів Ссіу Був Рпе 145 1 155 160
Сів Аіва беи Ре Рко Уві бі Ро Бей ТвБх РБе бех Ав Акоа б1у їВЕ 165 179 175
Бе Акч Сув Тух бБ1іу Тух біцп Азп Авип ТВх рко Тух уаії Ткр бек бій 189 185 159
Рго Бех Авр Рхо Пе бів без би Уаї бех біу Уві Бех Ахо Ббуз Рго 155 па 505 зЗекх цец йец Твх без бій біу Вб Уві уаї Аза Рко Біу Авр Ази Бей 210 215 2-9
ТВХх їв бів Суз Біу Бех Авр Уаї стіу Тух Її АхЧ Тух Аїа їем Тух 225 230 23 240 пу січ Бі б1у двр о біу Бей рКко бЗіп Аку РКО біу бів біп беї бівй 245 2З0 255
Аіа зіу цей Зек біп Аїіа Бек Рре ТП бем Аєв Рго Уаї Ака зіу Бек 260 265 270
Ні біу біу біп Тук Аку Су Тук біу діа Ніз Дан оуаї Бех бек Буз
З 28о 285
Ткхр о Бех віз вхо ех Авр РХо Бей Авр о їіє їж І11е Аїа Бі бів сів хо 285 305
Ехо Азр о Ако Вго бек їеми дек Уві біз бе 5іу Рхо ТВх Уві діа бех 0 310 315 32о сіу 61й Пуз Уаї Так йей пе Суз бів Бек Тр об1іУ Рго Ме Ріае Тнх 325 330 335 те їй пец віа цпув біз сіу Аза іа Нів ро Рго Пе Да цей Аа 340 345 350
Бек Тнк Тут Аха Аза біп біп Тух сіп Аза біс РБе Ркго Меб Бех Рко 355 Зо 365
Уаї Тих Бех діа Ніз Аіїа біу ТвтІ Тух Аха Сув Тух біу Зах Ахо бех 370 375 в)
зЗех Авр рРхо Тух Ге йецй бек Нівз Бек бет бій Ро їй біб Пец Уаї 85 39 395 яп
Уві Зек бію Аза Тахо бі) тпк Бей Авп оРго Аза біп Ази Буз Бех Ар 415 210 415 ек був ЖЖ Аіа Рко Ні бец бів АзротТух ТВх Уаї біб зв о без тів 420 4175 430
АхчЯ мех біу Гіе 8із сіУу Бей Уаї ей Уаії Ре гец сіу їЇ1іе ев пей 458 440 445 вРре біс Аза піп біп бех сіп Ака бек РБхо ТІ Аха Суз Зех біп 51) 4510 455 460
Заї Авп Бех Ака сій Авр Аяп Аза Рко Бе Ак Узі Ууаї бій Ркго Ткр 455 47 475 480 с2із бів їіїе

Claims (28)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7/ (І/Т7), що містить визначальні комплементарність ділянки (СОК) НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, І СОКІ1, СО ії СОКЗ, де НСОНМІ, неОоК2г, НСОКЗ, СО1, І СО2 і І СОКЗ містять амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ МО: 203, 204, 205, 208, 209 і 210, відповідно.
2. Антитіло до ІЇТ7 за п. 1, де антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де ділянки МН і Мі містять амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 95 ідентичну БЕО ІЮ МО: 202 ії БЕО ІЮ МО: 207, відповідно.
3. Антитіло до ІІ Т7 за п. 2, де ділянки МН і МІ. містять амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 202 і 5ЕО ІЮ МО: 207, відповідно.
4. Антитіло до ІЇТ7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з константного домену ІдА, константного домену ІДЕ, константного домену ІдДО1, константного домену ІдС2, константного домену ДОЗ, константного домену Ідоса і константного домену ІМ.
5. Антитіло до ІІ Т7 за п. 4, де антитіло містить константний домен Ідс1.
6. Антитіло до ІЇТ7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло містить константний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з константного домену каппа-ланцюга Ід та константного домену лямбда-ланцюга Ід.
7. Антитіло до ІІ Т7 за п. 6, де антитіло містить константний домен лямбда-ланцюга.
8. Антитіло до ІІ.Т7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло є моноклональним антитілом.
9. Антитіло до ІЇТ7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло є антитілом миші, людини, химерним, гуманізованим антитілом або антитілом з вимірюваною поверхнею.
10. Антитіло до ІІ 17 за п. 9, де антитіло є антитілом людини.
11. Антитіло до ІЇ-Т7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло є афукозильованим.
12. Антитіло до І-Т7 за будь-яким із попередніх пунктів, де антитіло специфічно зв'язується з І-Т7 людини та яванського макака.
13. Афукозильоване, людське, моноклональне антитіло до І-Т7, що містить: ї) визначальні комплементарність ділянки (СОК) НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, І СО, І СОК2 і І СОВЗ; і) константний домен ЇдДс1 людини; і ії) константний домен лямбда-ланцюга людини, де НСОКІ, НСОК2г, НСОКзЗ, СОК1, СО і ГГ СОЗ містять амінокислотні послідовності ЗЕ) ІО МО: 203, 204, 205, 208, 209 і 210, відповідно.
14. Антитіло до ІІ Т7 за п. 5, де антитіло містить константний домен Ідс1 і константний домен лямбда-ланцюга.
15. Полінуклеотид, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло до Ії Т7 за будь-яким із попередніх пунктів.
16. Полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де ділянки МН і МІ. містять ЗЕО ІЮ МО: 202 і 5ЕО І МО: 207, відповідно.
17. Клітина-хазяїн, що містить полінуклеотид за п. 15 або 16.
18. Спосіб одержання антитіла до І-Т7, що включає культивування клітини-хазяїна за п.17 і виділення антитіла до І-Т7.
19. Спосіб виявлення експресії І-Т7 у зразку, який включає (а) контактування зразка з антитілом до ІІ Т7 за будь-яким із пп. 1-14; і (Б) виявлення зв'язування антитіла в зразку.
20. Спосіб зменшення вивільнення інтерферону (ІЕМ)-альфа з плазмоцитоїдної дендритної клітини (рос), який включає контактування рос з антитілом до ІЇ-Т7 за будь-яким із пп. 1-14.
21. Спосіб лікування суб'єкта-людини з аутоїмунним захворюванням, який включає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла до І Т7 за будь-яким із пп. 1-14.
22. Спосіб профілактики аутоїмунного захворювання у суб'єкта-людини, який включає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла до І Т7 за будь-яким із пп. 1-14.
23. Спосіб за п. 21 або 22, де аутоїмунне захворювання вибирають із групи, що складається 3: міозиту, діабету, хвороби Хашимото, аутоїмунної надниркової недостатності, чистої еритроцитарної анемії, розсіяного склерозу, ревматоїдного кардиту, системного червоного вовчака, псоріазу, ревматоїдного артриту, хронічного запалення, синдрому Шегрена, поліміозиту, дерматоміозиту, міозиту з тільцями включення, ювенільного міозиту, хронічного ревматизму і склеродермії.
24. Спосіб за п. 23, де аутоїмунне захворювання являє собою системний червоний вовчак.
25. Спосіб за п. 23, де аутоїмунне захворювання являє собою дерматоміозит. Зо
26. Афукозильоване (Д01 людське моноклональне антитіло до І/Т7, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислоту 5ЕО ІЮ МО: 202; і де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислоту ЗЕО ІЮ МО: 207.
27. Афукозильоване ІдДо1 людське моноклональне антитіло до ІІТ7 за п. 26, де афукозильоване І991 людське моноклональне антитіло до ІЇ-Т7 містить константний домен ЇдДс1 людини та константний домен лямбда-ланцюга людини.
28. Фармацевтична композиція, що містить афукозильоване ДО! людське моноклональне антитіло до ІТ7 за будь-яким із пп. 26-27. Вивівнювання УН: вав пеупоооновнекосваекнисювети т мхонноканне І ЗХ со вмео-н шАНеВЕНОРООВи ВАН евонновнян хо пеня коником оон ас аокт: Озон ЗУ вав махуканас вно ту нн тврнняутусАо Я НН рБроотютув з жхОріШ-Ун ВиМеКОМ ев стьО оорютжмна ОС а -УВ ненонотеОое ет Умевонявнжиео оеУня о
Фіг. 1А
Вирівнювання У Вов-яї» печену тауссвнет Ох хоркевовева яю НО бно ко щоб ВІН еаае нан меетто ОООооуоохеоквеннехю Оки Ко они а а НИЙ Щі МК Я т Зате ніс ввнанонннх т ОО З покров ов хе о р с сяк с. м я - ил МЕ ох ин. шк ск я ав-чь вттововстокс това ом аву ПП света ме зоба Ую. невозазетиетоттІввинярат М. По зо? зав юх мевозавоте етан кок П.П овотиия ї0?
Фіг. 18 оо т -- ВК А. і - Я КК о ВЕ івент ВЕ г о не зх. ваду ї зоба ОО жо ВВ Я НА в дО нон В о Е Бе ; ою. 5 Кп жи я "ре: сш и ше ши ни як В й ик к-Я ЕІ -- ВИ 3 ТК вай й ї дО : ща. : ЯК ж ак (00 ою Вб ЯЯ Я, СИ; ЗК, Кк ЩО . ду о Кмин я 00 ж зв дж 0 0 ОО, оз ше в Ки ще ев нн он нн ин мк АХ Я ро, дих . а Ек 43 Її. щи ще 3 24 Ж 15 х ота рон пнів кВ ке сн Я «же ге яд Хм КААКААЖКАЮКККЮВ КК КК ХХХ МААААМАААХАКААКККААЮТИЬККХХ ек їх ЕК. гак 7 гаму жахом Я Бен ВВ ре Я ооо ос ооооооокккфкннн ном фапапппппооеснн ще й «й В й Бод конц. АБІНА
Фіг. 2
«в МАЗ7 ще Я дент рення Що - Ко а с "Я ат ші: Щщ ще : - З дк нини ! в й - ВО - А у м е- оз ев 15 055 їй й СВ Я.
Ту. І ОБ сен КА: / | : поета ОКА І ра ек и нн ж й ко тя х КО я Щі м 7 : т б 7 й Ш а: ж ни в АБ ЗВ шен з зд » лі
Фіг. З ч . , зах ЗДУ сет : | ак о. ЩЕ они о ТС? шо ши що де -. а соді я Гаки ВИ г ЩЕ і Ж я Ой оови я ще цк і. ї вх с 3; с т т щі ЕК ва св З вк но ЕТ ла с. Х ї ха «ке х ЯК, : БІ : - 8 Ку х Її ї я ся ек Ще : в шин 3 ях х ; ! с в. - У я зв (ОВ ення с Ж я й з- вІа ря пом і в-и гаю СІК ве я потр ї і . си шк М т ! ' З т сь тя Мне З ї є щі БЕ т Я й; с Ки «В З, с я т ооокккукнкнникн на :
Кон. АВМ кове я я ї ХК нкнняк нн хек
Фіг. 4 о. ЖВ. І Й дососВовкноій, У к м щі Я д й Е й; же ВЕ Х ТЕ ї
; а. 37 ї ш ще ЕЕ 7 шнен д т і МО х й с КЗ ! Ту х лей А. щ ! ще -а ВОЩО ї - ях ЗОМ о ЕН з КУ ї ї: Кк ' їі Вау пня ЩЕ х я Її «вх МИ фени У Е ЕК з і -- 083 веде МА са "Е їХ х - чу плете : : пост ох . б ї сн ї М Я її : соеееасете нн ї я З ссосессстетсесесюєсес ї Ва ї у; Я сесескс я х с у «ак у ЕВ У ї ще сао, Й е У З 00 БІ ї дере Но Ж як длходаля х З ї ях й р ооовзі окччччччккккчтя ат З неон ВЕ ст де теж : вах і 8 Й й, пен МИ ВВ т. 5 83 В я МАВ ім МУК й У з і «еВ пен Й х Ох А ех ї о, і АЖ Од ї С скай ЩО ї РОН пу ух Кс ОК і ї ї ля МС Кт ЧУ Ж ОЇ ї З ОХ ах де ІОВ Ж Се ВАК ї ї ї і ОК ОКХ . їх пуную З ноя ек сн : -кі : ї ї к . пря ЖЕ ве З пишні Ж І і КО і Ж Ж БЕ хх ї ЕЕ Я ссехсекіов. ЕМ їх КЕ ї ТЕ Я ОК ня хх 53 ї «ке вфк ен енит ї З м ї
Т.О М ї ча ОК упіттттнкессскоох Ба г з ВК х кої ШК З ї НЕ СО ТЕ 5 Ж сссеенк (Ж ї КЕ ех що З ї Коко М КЕ ххх їх сосен нтя 1 0 ох ї ХВ . і 5 КУ щи дек ИН ЖЕ пе НК КИ А Я з МЕ ОМ ЗХ т їх Ко : я І Зх ї
Ж. г Сх ах "З КО ОТО ВХ КЕ М ших швоі с в : І С ї вх се ВК се й о с ши яд ЛЕ о Ще щ З ї й ОВ ТІВ ї де Ми а дв ук о ї - КЕ ях хЕ БУК КК УКХ Увкх В: х СЕК ОВО д-Я МОВ бан ї ТЕ КуАКиКу тжнітиМмиї две З ще Мам МКК В х ші : шо вк дояв коетнеюсь денно яко Но і Ї «жк жжки жк жикжтижж кю жк тн вве 1 ТК Р Ж одн «ку Ек їжи тн ж нн ВК Кк Й і шен 8 а: ї З юний 20 ЗІ : ї : Ачнтятннннх Ж їх Ж ї ЩЕ 1ї х ї ; і жа М х т 3 8 3 Офее її Ж ою й ї ї ї 1 ї і ще щЕ фееерфниня ва 3 3 Ба ОАЕ ТЯ ОК З ! пе У 33 1 ХЕ . МЕ 24 Я ї ШЕ Ж оодщ ї хх ія 1 Ж 3-Х КО КІ 5 Ж Пе Дрю ї і З БЖ ож ще ЕН НУ МЕ В шо
Б о. 5 г Й ! 4 1 1 БИ СЗУЕІ ї ЕЕ. Ії 3 й ; І її. і СВ щі В рченюеере З і Ті 1 Ж Її ї 3 КУ ЩО зоденой Ка с 1 ТОщОЖМ ЕН 3 7 г ча ох ох х Ж щк ї 3 3 ОК Я у ден її о К З Ви ДЕЕОЙ туеоннк еореостнн ЯКО ЩЕ! : ЩЕ о ще з а ! ЕЕ У ще шнек КК М сни ку. о Ж. дек
ФМ. ЗБ ще ее Х ї їх ЯКЕ дес її
ВЕ 3 438 Мк ж : ра Них і м х 3 ! ро ' ! 3 ї ; 3 : : о м сх в і зд - що. : Я о нн Й екон : КУ ї ие т, ще ен я ну М не С, і ех ШЕ : Ж ПК. 1 я ЩЕ С поБЯЯ : З оКАХННННКЯ і Ж СМ - : о їі з Пш . Б : ї З : і Ж ІОННІ - ї кп В СО і Н С ЗВ . ї хо з ЯК. і змі ОАЕ Я ї й ' ше й і З ОКХ ха ТЯ. ї що юю йо і сист Ж я Ео УчУУнях Люхнк ММК сиХХ ХУ Ук нанки КЕ ВИС ПИКА веканНи сегсотвнкоссс Я й ден ВК яд ВК ту : В ї ня у І ше ПЕ М Кос дії Щ. щ х М В Х : хх В Х ще В с і жо ї г укфюююєсо екю ЗХ. З ря он : Еш ши ВШ ш Дуреенм ннн Б ЖК 1 іш ал 5 : а БЕ, / ва г жо що ї : и я Еш сх ШК Ко ї г хх У й ї. Кок : ж; о Ох Ж ще ІОВ ОКЕ енестінкттссестетесо ТЕ рн. Зоосроюреос сосен ор ще я КК т кв ос ХО КОХ ЩО В'як не ве ще Цт люди свя
СТ. людини ПЦТ/ яванського макак: дим іт/яванського макака за «а ми. УВК : с шо : - . : «кий Я ОЖ жк ко с еся ї сої Ми в и з -е ТВО» ШО Е Ж ще Ж я тва Її 7 зве щі ї ОБ Є шо Як оххіхо ов ї ЕЕ а Павук ке сеоме я. с. В дея і 4 шк ЕК к З адУк і а і | Ей ШИ ЕК ОО с с ще дн» ох -к ї ; т денне ва Жено . кеетеккеювння є -й я й й ж ; : і З , я Я КЗ - З а х а іоз ни ВЛА ; КЕ же ЗК А М ЖК: ям МАХ кодОни АБ Мод нови АВІА В ОО УВК ОХ ЕК БО ХЕ ї див 5 - ; г х ї х х о ТИ ше пе ! І ОО : па . є сх сх Ер лотяі моля 5 сежинаннижиих сяг : АВ ща і нини ШИ. ї пшх : ! т сх ї ОКХ т. УХООАДААкссо АААннсосс нн ою ння КО он Кн нн 5 ! дек Я М З м ни нн нн я Б О. Ша Хоненнннннной с как ї до прое ; ; св Е сета ШУ : сиву я КЕ : те. Ко - хе ІСТ? людини ТУ яванського макака й ех Зх - ЩЕ : ї о Кук : саскетг. ї ; : Зк фев В ВО соді де оввефнна е доук ВУ Ку ше ВВ град п їх Ї ХХ их а: -х Кк - : КЗ ї ях ШЕ ож ШИ. ОМ ИН Жокай геї З в й ж, що Ж і ї.: не ж я ву ву о | ту - ВОК В ГЕ со ЗДО х КО в й СК ОС : ИН НН Хі ТКА їж і. ми і, зе Вр ОБО
НН. з, зе БА 5 ож; як ща х : ї "З -вк ник СКНЯ ОЖ Ж Ї ва захи МЕ Божою КО Ол жововівся фон ОК В У ще сесефесів Сорос одесосдору БУ Бо ен я ке Яку пов окт яв ОО мово б Е зятя : дк х Гев жен. Ж я сх МОНЕ. Аа І ПОНЕННВрВВЕИ ОВЕН ХУ 3 М У МА : Ва і Ма Кер фс ююскння Ес п КК тс ОВ ОМА ІОВ А їж У ее дн дея ; т ї 0 ВОВО| Е і ЗМО Ва. то т Кто МК к і З ОЗ ек З 7 : Аж ВОК ЩО ї АВОБЗ : ща : МОВО : ЗИ перуку рве Кекс ох ся Е Сафе ТУ АВ НН 5 Б ОКО шо: хо ЛКК з - ЕХ З ІК ЕХ ся МОПЯВЕЕЕ дет В КВУ ВОМУ ВХ ЖОВТКУ В КІВ В зон Ж У КВК КО ВЕ ДЖ МЕ «сне ВЕДЕ ТВ ВЕЗУ ВОВК ВОНИ 0 пошукове а хе о ВЕ ВЕ КВК ет КВК ВЕК ВМО ВЕ есе ВВЕ ВК КОХ ТЕО: 0 сеотАКУ ВК ЕЖе ОСКЕ ВЕК В ОН В КВ ех ВАХ У КЕ ДЖЕМ кю КЕ зевежо у - АТР ОВХ УСІ УВА КК КТ В ВВ КВ ТУ КА КВ ек УК КК ККД сн КВИТОК ІМЯ ОККО АЕТК ЕМО КИВКАКУКИ КИЕВА ее МИ КОВКИ ВМО сх ЕФЕ неВОККЕ ВТК ПУ ВЕ. Кк ш й ати ОМ ЕКОН хи У ВТОМА з ВЛУПУННЯ меси ше ТВ. КЕКВ ОН ХК КУН КРОВ ККЕАНМЕ з се КОВКИ ВВ ЩОБ Ома КУЄ ХАУНКЕ я ОККО т ЕН ВМ М АМК ни вТ хевоце З НІНУ сур Ик ЕК екс ке Ки МВ в КОТ М ННЯ Ж Ко МУМММИ АХ лин вух сова Кая но Зк оо яко Зк ак КЗ ЩО кт ВаКЛиТИ МИ Ві ВЕ ВИМУУ ВИ ВКВКВОК титмя ВЕК В їх СВК пики щи ж хм Мих пики ки г с. Я ОКУКОКЕ ТИ сет БЛТУНМО БТКХКЕОКАтИ тА фе еаньня ще УБОКУСАКВВЕВНВ ВЕНИ ЮЕ ни КВК ЖИВ БЛЕМ УВІ АИЕИТЕ тих пі ЗМО АВІА МЕ ЕВ У КМУ ВЛ УХА щік ЕД що ПКУ И ВАХ М КД ся я ЕВ МВ ЩИХ БУРЕ ЕНВККУККАВ хівея Яішя ще УСВА НКЮ лю ЕКО а БЕН ше кще ЕЛ пил дже бе ЕКОН МК юю ДУК М ДЕУЮИ ХУ МЛМ аж Мидех ЕЕ ВККЕК ОВ «о СТІБОК ВВВЕНКАХВК ВМ хх КВУ ЛЖВ оті Аква Е тк Бах ВО еАтковоВно ек вхенюо сх ВЕК ВЕН нецке Е втазАХВВ их КК ота ШЕ. сх кутя ня юю я вх юю
Фіг. ЗА
ПЕН ОО ОКОМ Со КОН я КУ ЯЗ ТЕ я : : ж ж яке же БУМ оштЕаЕКВ еВ В тн МВВ НК ВУ ММК Же ВИК УВО ЖЕК: ОВЕН вн ХХ ДОД ок тя КК КОХ ХК М КК кю нн ВВЕ БУМЖМЖЯХ ох її Медик уУвихЕ тя ОВУ тот У МТВ КВ КВ ОО М ММ ЕМ я нон еВ ЖК ху «ЗЕНУ ВЕК КВН ет В ВВ НЕ КК КК ВЖЕ МТМО ок ую вв ко В ХВ хни не НРК ВЗН Ж ТК ТЗ ДЕ ЕК КВ нн но «КВН МЕМИ Мов мВ КМ КК хх ВО ХК КЕ не ВВЕ РНК є ам сишиекиже ак едо ДЕЩО хе МКМ КО нем КЕ тео и МКУ весен та кову В он В ВВ оо ков ВОК Вова х З КА З КУЖЯ Є УК ПЕ: п о. СУТІ МЕДИ М АЖ ТИ КТК У В лу кн вони ПД дя нн ОКУ ІШОВ УМХ КК ММ Ж совка КТ ВНАУ ХК НК я ЕК ння МТМ Ін ВЕХОНОХВае КУА ТК ВК ВАХ КОСУ КВ юн ВК УК КК нд ВТБ о ствеврана рве КВК КУКА КС МВВ кою ВЕУ ЖК ее АЕН я Ки в Я БУК сІРЕКОВОКВВО ТВ ВВ КАНВИ ОО ВОВ ю и ВЕІ КУ ВК Ухн МВКУЬО птевкх ОБ "КЕ ЮКІ ЕМВ ИКИХ У КОМУ ВК тю ою ВЖК К ХВ М ТМ осонвах вах пе КЕК ТВО ХК ММА ет т МЕМ ВК у ки НН нн Я ЕН фа и НН
Фіг. ЗВ ИН : нхкми : к : ЕКО м ва ах ях ов БУХ о шУШТИКИСШВ УВК ВАВ ЕК я и ММА Ах Ве н ВВККВВ УНК ЕМО ИИИВВИ КЕ АНИЕМКЕВАМВ н НКЕККИКККИЕВ осені Еи КК Е В ТНВЯ ке ЕД НИМ ВВЕ Е КЕКВ УАНМ КВЕД ВОК ЕЕ ВИКУКУ Ва ЕС в в А в ККУ ВВЕ КУМ ШТ В ЛЕ АД В М К Ж ВОК В КК КУ ВИК ВТЕКЛА ВХ ВЖК я КЕ ВИК ЩЯУННКЯ БУСКОНИОКИТИ КВ ЕМВ ВК КВКМве У ВКККВККААКВ те ВВВКЕ МАНКИ ЩТННВЯ Боско ЕВ САКЕ ЕВ АЕН ВЖХ В и ВВ ВКККВ В КК Я ТОЖ - МОЖЛИВИХ ЖИ УК У КК КМ АХ У т и ВВ МЕ АВ БІЛЯ МУЛУ АКТА КОВКА ВИК ЕКО УКВ ЩТММЯМЯ жпУШЬКЕ УВО АВКХК КАЖАН КОКО сскУВВ ВИ КЕКВ УК НОАНЖДААЯЧЯ 0 БУК УВК В ЖОВ ОАКНЕ ВТ ТЕН ВДВ хе В ВОВК ВК ЕА ВОК В ВВ ВОДИ несе ВЕНАХ КЗ Ж, Ж я й ШИ. 0 яща Бл тео хЕу о крокия фу ВУДКА «куту свовиацукея желюжоюнки я «нІЖиВау пуття МОМ ВЖЕ ВИК КЕ ВН ЖЕК ХО КМНВ КК МОВНЕ ут ТЕХ ЖК КУ МВ КУН ВЕЖІ НЕ КК НН с юн хи КТ ЕНН КК БТНМЖЕОЯ ВРЕУЕВЦЕКНК КУКИ КОТІВ КОМИ ВМ Ю кю КЕКВ ВТМ МЕХІКО Ми Вами хт ОВ МОВНЕ З У КО НВО дн юю я УКВ КІВ В ВТК це ЕЕ ВНИМ АНКЕТИ НК ЕК КМ ВНУ я елнокля пою КК ТА ВВ Ще ПЕКИ М ЕОМ АНЕТТИ К НИ мя КК КВК МВ ТВОЇ ке ІОНИ Т МК А КМТ АВК хестомі кивнув ВУ И форте Ви КЕ Х ОВК КАК ААУ Ж ВО КВ ВО ВК нт ніх КВК ВОРУКОІАЕ пе МПК ВІ КК НИ КК ВАЖИВ САКЕ МВВ КК м ВЕ Е КУ КОКО ще теки ВЕЖ УКВ УПЮ дет етчкучттуття валити
Фіг. ОА,
п ОО ОК ТММ НК МОВ пі х КМУ є я я ЕВККа: плУМупериУкЕ х 7 І х р я су п ОУЕН К ТЕЗ я ДПД | Ж МЕМ си-кх пкт оВАНУСНОЮЧЯ КО ВАЕЕВЖ я: | я пн МУЗОКУ а спав я ня ОБОВ Ек ех І ВЕК жк я КОХ В ПЕ схе МО ААВННЕУ ЕЕ ДЕЖЕЖ» ях й уВУЖЕХ ов вакАВ сн ОК» вл сах ПЕВ Ул І ЕВ «ХаКВЕеВУ КМ вия Їх дан сажки сиди Ву. Ж юю о КЕ ЖЖ КОВО ХХ Хе вв МЛЮБИВХ в орто на а ЗЕ ВВ» ІОВ ЖЖВ ех Твх УвВих з коми шаУСТИКЕХ АКА МОЖ кт м КВ ММК КК КВК не Ва хх ТЯ УЕЕЕХ- У АХ нЕКутх ово аех ХоЗвухя со МОГИ КУ. ваше чи ї ТТ ВЕ АЖ ХУ МИ СДМ ж ВІК ЖЕК дУВВеее х ВКЕВ злиневх ця в А КАНеня ХХХ Іавиюивис Удав х ще Вже ж . КЕ важити Джек юю п Я ук ВК плихая Ме тиви. сздЕ ше стул «Іманухан ви Уа вкисІ вх каш КЛІ ся ит дав ЗОБЖтІ еСВЕЖКЖЕ» плн ЖЕВ свБотАВКК ВЕ: мех ВЖЕ ми кв сек овеви ВАВ ЕК ТЕЖ» яти х «ФК. птахи ХО ЖКЖ хоох о ККККІКХ Ва пато флак хЕчиї ПЕВНА хе кавнвеветоо ще ат ХЕ ВМя зах пачки хи и В У сжекою о ЕЛЕ КУ ХВ щих М Хати УА коки ТІ ЛЕВ ІЕЕ ій ще о. хи вин АЖ МКК тах рю чеки т ІВ ХЕ жо н ВВ к ФЖЖХ ЖЕ замках «хакнЕеам ть . ЕХ хлів МК Х ПКТ, шсюх лок ВОК ШМК швея ЧЕ о еВ я таових -к жа Хе нв кот й с кіт твжятяя Вже к со пу з з ях т М МЕМ ЕЛЬ. жи ЖЖ ДНІ поки вв Дрекусітажнях как вт сткВакиват й ТТ ут ка - «Ве «ЕМ шо п жк ВАВ ЗВ ІІ ж От ОТ Ж мих раки ух ке шо дпЕаИиЖ Ост. ? ї ТВЕІЖЯ мех ХкшеВн А панки ХОЗНЕЕЕЕВ ВЖЕ ек ях я ва плнУя втаие ках вах ким АМКУ ВНАНЕКНУ янв ККУ кеВ вив Е ве х вк ококтх Ба -ї х Са пеУгавов Ку пустки, шара, де й В Є - раку Ве КБМКИХя УВК Ох ее КДКА Ом КО МВ юю ктя ШИ Км нм ТВО УДОБКІЕК ЖЕ ях З - С М шу тоже пех " УКВ ККИ ВЕ зх ВЕК «кі ї хх го ехняи схтвЕрих жен тика А КУ В ки пе МИ сюнтя ню ткнння ВЕК Де ИЙ ет, ВВ ік ЕВВХ авт В хе шу сУкжахх тих я ВЕК х МТА ме ска кате а тя ни теБД Ван ВОЯКИ феЕИ КЕ ян, міки що ЕД ки РО . А юю я ВЕ Ин, ал зак сах пат ЕК НКТ атраентнх У й пен "КАЖЕ пидишу ВЕНИ поли тянжо тя и В КУ КЕМК я их ЗУ шк Же я пи ки ке зон Кт ТЕМ ЗУБКОВ УК х штвици. ШЕ. ТЕМАМ Дю ОК я ножни сю КВК ЕМ ЗК ве шк о І і: ск УТ ТВЕ ВК ВЕ меду х Ле ТК ЖМ І ще шишки ше бен юю МЕЖ ТКЕТЖжнАнЕ ен ве Б вино ХВО ЕК рабин ШИ х 7 ЖУКИ: хх слвЕ аю х яки мя МЛ
Тг. лов 7 Ж ве ух МЕ «ВЕ Те І ї І І З З В х з ВІ т ду у «й м ОВ 3 : о я свй зеже ес пет ї Я я -ж: ЩЕ кв от ї КЕ леї щі ж ях Голюдй я ї : до : АЖ Х КК : Є я в ПНТ есе : зі я ЯК У НОВЕ Ходіння МАК "і Її пз ско КЕ дакя МОНО І пенею З їЗ о ЗК х 7 що їх Осн і ТК. пит З ою Й же ТЯ дао плн 1 яко Я Носорооібоорсосй ах інн ння ще «Ко еоосоодссн Ж 7 ОО ЩОКУ птн І ; «й У В З з Ії фе 1 ЕЕ сежііке х " 3 песо кже я мовюон: АВНВ 5 - В пи ї ев ї с Заннь жин ? Не з АХ т ер хе ЗК ; Є мой КК нон зву унеН люте ї сові діння ЖЕНЯ ж є як З Ж чн сих ТЕ Я Досссс ХУ ТЕКТИ КХ ще СКК . : ни днннннй КАК ще уоововв ее ЦНС ще Х НВ ї. ї сх. ХМ ен Як сво ах КО мк Ба З ї су ки ВІВ. ВІКИ КО ко ї я У Я КККВ У Ен о Кон я ї яко Ж М-ВО ще и : - З їй ї ОКА ит ЖУК лаку мова ння
В. ; ги ДАМА ннннні ща тенет ж ва ше те Еш : шк ще : он я кін зе ВЕ М -ОВЯ фен ! Яд ун свв. - ВЕ і КК Коко стннннн о НК : ту кВ В Одне МН Гев'жн АВМ ду А- себя
КОН. АБО 1 588 ши ш З с КК ддлчйу КУ Я сеняння оо ї осей Фі
Ци. ї А
UAA201810089A 2016-03-10 2017-03-09 Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7) UA127731C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662306125P 2016-03-10 2016-03-10
PCT/US2017/021616 WO2017156298A1 (en) 2016-03-10 2017-03-09 Ilt7 binding molecules and methods of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127731C2 true UA127731C2 (uk) 2023-12-20

Family

ID=59790876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201810089A UA127731C2 (uk) 2016-03-10 2017-03-09 Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7)

Country Status (17)

Country Link
US (3) US11072652B2 (uk)
EP (1) EP3426298A4 (uk)
JP (3) JP6979976B2 (uk)
KR (4) KR102439395B1 (uk)
CN (2) CN109414499B (uk)
AR (2) AR109450A1 (uk)
AU (1) AU2017231833B2 (uk)
BR (1) BR112018067951A2 (uk)
CA (1) CA3017197A1 (uk)
IL (1) IL261653A (uk)
MX (1) MX2018010771A (uk)
RU (1) RU2756109C2 (uk)
SG (2) SG11201807523PA (uk)
TW (1) TWI755380B (uk)
UA (1) UA127731C2 (uk)
WO (1) WO2017156298A1 (uk)
ZA (1) ZA201806597B (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2756109C2 (ru) 2016-03-10 2021-09-28 Виела Байо, Инк. Связывающие ilt7 молекулы и способы их применения
WO2018119425A2 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-lilrb3 antibodies and methods of use thereof
AU2020257252A1 (en) * 2019-04-19 2021-10-14 Allogene Therapeutics, Inc. Antibodies against 4G7-derived chimeric antigen receptors
KR20220110523A (ko) * 2019-12-06 2022-08-08 비엘라 바이오, 인크. Ilt7 결합 단백질을 사용하는 치료 방법
BR112022011957A2 (pt) * 2019-12-20 2022-09-06 Medimmune Llc Composições e métodos de tratamento de câncer com receptores de antígenos quiméricos visando glipicana 3
WO2021203013A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Viela Bio, Inc. Methods of treating immune mediated pulmonary injury
EP4333877A1 (en) 2021-05-04 2024-03-13 Viela Bio, Inc. Methods of treatment of autoimmune disorders using ilt7 binding proteins
TW202404640A (zh) 2022-07-27 2024-02-01 美商維埃拉生物股份有限公司 包含免疫球蛋白樣轉錄本７（ｉｌｔ７）結合蛋白之調配物

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2096948A (en) 1935-12-20 1937-10-26 Anchor Steel & Conveyor Co Conveyer system
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
DE4440354A1 (de) 1994-11-11 1996-05-15 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Kombinationen aus Phenylsulfonylharnstoff-Herbiziden und Safenern
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2353268T3 (es) 1999-07-02 2011-02-28 Morphosys Ag Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est.
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
NZ520392A (en) 2000-02-10 2005-04-29 Abbott Lab Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
US6897067B2 (en) 2000-11-03 2005-05-24 Regents Of The University Of Michigan Surface transfection and expression procedure
DE60126130T2 (de) 2000-11-17 2007-10-18 The University Of Rochester In-vitro verfahren zur herstellung und identifizierung von immunglobulin moleküle in eukaryotischen zellen
WO2003012061A2 (en) * 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
WO2003081376A2 (en) 2002-03-20 2003-10-02 Catalina Marketing International Inc. Targeted incentives based upon predicted behavior
NZ571508A (en) 2002-05-24 2010-05-28 Schering Corp Neutralizing human anti-IGFR antibody
AU2003289716A1 (en) 2002-09-12 2004-04-30 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
CA2532781A1 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd The anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
US9208495B2 (en) 2003-10-06 2015-12-08 Yellowpages.Com Llc Methods and apparatuses for advertisement presentation
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
BRPI0607490A2 (pt) 2005-02-10 2009-09-08 Baylor Res Inst anticorpos monoclonais antiinterferon alfa e métodos para uso
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
EP1964852B1 (en) 2005-12-20 2013-04-17 SBI Biotech Co., Ltd. Anti-ilt7 antibody
AU2012244391B2 (en) 2005-12-20 2014-09-11 Sbi Biotech Co., Ltd. Anti-ILT7 antibody
KR20090029184A (ko) * 2006-04-07 2009-03-20 더 가브먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 항체 조성물 및 신생물성 질병의 치료 방법
MX2008013993A (es) 2006-05-03 2009-05-11 Univ Colorado Combinación adyuvante sinergistica de anticuerpo agonista de cd40/interferona tipo 1, conjugados que la contienen y uso de los mismos como un terapeutico para aumentar la inmunidad celular.
US7781306B2 (en) 2007-06-20 2010-08-24 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Semiconductor substrate and method for manufacturing the same
WO2010065536A2 (en) 2008-12-01 2010-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Recombinant bone marrow stromal antigen-2 in the treatment of autoimmune diseases
PT2473636T (pt) 2009-09-03 2017-02-06 Medimmune Llc Diagnóstico de interferão de tipo-1
EP2496600A1 (en) 2009-11-04 2012-09-12 Fabrus LLC Methods for affinity maturation-based antibody optimization
AR086074A1 (es) 2011-04-26 2013-11-13 Genentech Inc Composiciones y metodo para tratar enfermedades autoinmunes
PT2702146T (pt) 2011-04-28 2019-04-22 Univ Leland Stanford Junior Identificação de polinucleótidos associados a uma amostra
US9427464B2 (en) 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
HUE054362T2 (hu) * 2012-01-31 2021-09-28 Sbi Biotech Co Ltd Foszfolipáz D4 elleni antitest
US8605807B1 (en) 2012-05-22 2013-12-10 Nigel Iain Stuart Macrae Communicating distinct data over a single frequency using multiple linear polarized signals
BR112015010566A2 (pt) * 2012-11-08 2017-07-11 Clearside Biomedical Inc métodos e dispositivos para o tratamento de doenças oculares em indivíduos humanos
US9114438B2 (en) 2013-05-21 2015-08-25 Applied Materials, Inc. Copper residue chamber clean
MA40528A (fr) * 2014-08-29 2017-07-05 Sorrento Therapeutics Inc Anticorps thérapeutiques qui se lient à oprf et oprl
RU2756109C2 (ru) 2016-03-10 2021-09-28 Виела Байо, Инк. Связывающие ilt7 молекулы и способы их применения
KR20220110523A (ko) 2019-12-06 2022-08-08 비엘라 바이오, 인크. Ilt7 결합 단백질을 사용하는 치료 방법
EP4333877A1 (en) 2021-05-04 2024-03-13 Viela Bio, Inc. Methods of treatment of autoimmune disorders using ilt7 binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
KR102632796B1 (ko) 2024-02-02
US20200339673A1 (en) 2020-10-29
KR20230148266A (ko) 2023-10-24
US11072652B2 (en) 2021-07-27
RU2756109C2 (ru) 2021-09-28
KR102603010B1 (ko) 2023-11-16
JP6979976B2 (ja) 2021-12-15
JP2022043038A (ja) 2022-03-15
SG11201807523PA (en) 2018-09-27
CN109414499A (zh) 2019-03-01
KR20180138201A (ko) 2018-12-28
JP2024009808A (ja) 2024-01-23
CN109414499B (zh) 2022-05-17
RU2018135550A3 (uk) 2020-07-23
AU2017231833A1 (en) 2018-10-11
SG10202008769SA (en) 2020-10-29
JP2019516392A (ja) 2019-06-20
MX2018010771A (es) 2019-05-15
WO2017156298A1 (en) 2017-09-14
BR112018067951A2 (pt) 2019-02-05
EP3426298A4 (en) 2019-11-27
AR109450A1 (es) 2018-12-12
TW201742874A (zh) 2017-12-16
CA3017197A1 (en) 2017-09-14
KR20220123344A (ko) 2022-09-06
AU2017231833B2 (en) 2024-03-14
CN114874322A (zh) 2022-08-09
RU2018135550A (ru) 2020-04-10
IL261653A (en) 2018-10-31
KR20240017421A (ko) 2024-02-07
AR122196A2 (es) 2022-08-24
TWI755380B (zh) 2022-02-21
EP3426298A1 (en) 2019-01-16
KR102439395B1 (ko) 2022-09-05
ZA201806597B (en) 2023-04-26
US20230250167A1 (en) 2023-08-10
US20220144940A1 (en) 2022-05-12
JP7354212B2 (ja) 2023-10-02
US11673950B2 (en) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127731C2 (uk) Антитіло до імуноглобуліновидного транскрипту-7 (ilt7)
US11292836B2 (en) Anti-CD47 antibodies and uses thereof
JP6827021B2 (ja) 単一抗原抗ｐｄ−ｌ１およびｐｄ−ｌ２二重結合抗体およびその使用方法
US11723972B2 (en) Compositions, kits, and methods for the diagnosis, prognosis, monitoring, treatment and modulation of post-transplant lymphoproliferative disorders and hypoxia associated angiogenesis disorders using galectin-1
US20210318322A1 (en) Anti-vista antibodies and fragments
TWI756204B (zh) 抗ｖｉｓｔａ抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
JP5727406B2 (ja) 慢性リンパ性白血病細胞に由来するポリペプチドおよび抗体、ならびにそれらの使用
KR102207672B1 (ko) Il-18 결합 분자
CN104011078B (zh) 抗聚泛素抗体及使用方法
CN110267678A (zh) 抗mic抗体和使用方法
CN106103486A (zh) 抗ox40抗体和使用方法
CN107847568A (zh) 抗cll‑1抗体和使用方法
CN109563157A (zh) 特异性地结合至寨卡病毒表位的新型抗体和其用途
JP2018527299A (ja) Ｃｄ３８を特異的に結合する抗体による免疫調節及び固形腫瘍の治療
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
AU2014339900A1 (en) Anti-PD-L1 monoclonal antibodies and fragments thereof
UA128035C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язує pd-1, і спосіб його застосування
UA115641C2 (uk) Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить
UA126115C2 (uk) Антитіло до gitr
WO2023014809A2 (en) Cd3 targeting antibodies and uses thereof
US20200115452A1 (en) Anti-phosphotyrosinylated pd-1 antibodies and uses thereof
EP1708961B1 (en) Anti-ip-10 antibodies
KR101629073B1 (ko) 항-인간 에리스로포이에틴 수용체 항체 및 이의 사용 방법
WO2008088594A2 (en) Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl orginating from multiple species