CN107847568A - 抗cll‑1抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗CLL‑1抗体，包括包含CLL‑1结合域和CD3结合域的抗CLL‑1抗体(例如抗CLL‑1/CD3 T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体)及其使用方法。

Description

抗CLL-1抗体和使用方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年6月16日提交的美国临时申请No.62/180,376和2016年3月11日提交的美国临时申请No.62/307,003的优先权，据此通过援引将其完整收录。
序列表
本申请含有序列表，已经以ASCII格式电子提交且据此通过援引完整收录。2016年6月7日创建的所述ASCII拷贝命名为P32920-WO_SL.txt，而且大小为62,510个字节。
发明领域
本发明涉及抗CLL-1抗体，包括包含CLL-1结合域和CD3结合域的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体)及其使用方法。
发明背景
细胞增殖性病症(诸如癌症)的特征在于细胞亚群的生长不受控制。它们是发达世界的首位死亡原因和发展中国家的第二位死亡原因，每年诊断超过1200万例新癌症病例且发生700万例癌症死亡。(美国)国家癌症学会估计2013年超过50万美国人会死于癌症，占全国死亡人数的接近四分之一。由于老龄人口增加，因此癌症的发病率伴随升高了，因为发生癌症的概率在70岁后要高超过两倍。如此，癌症护理构成一项重大的且不断变大的社会负担。
CLL-1(也称作CLEC12A，MICL，和DCAL2)编码C型凝集素/C型凝集素样域(CTL/CTLD)超家族的一个成员。这个家族的成员分享共同的蛋白质折叠且具有多样的功能，诸如细胞粘附，细胞-细胞信号传导，糖蛋白周转，和在炎症和免疫应答中的作用。已经显示CLL-1是II型跨膜受体，包含一个C型凝集素样域(预测不结合钙或糖任一)，一个杆(stalk)区，一个跨膜域和一个含有ITIM基序的短胞质尾。而且，CLL-1存在于正常外周血和骨髓(BM)中的单核细胞和粒细胞上，而缺失于非造血组织中。CLL-1还在急性髓样白血病(AML)，骨髓增生异常综合征(myelodisplastic syndrome，MDS)，和慢性髓性白血病(CML)细胞上表达。特别是，CLL-1是在CD34阳性(CD34+)AML中的CD34+CD38-AML细胞的一种成分上表达的一种白血病干细胞(LSC)相关表面抗原。
基于单克隆抗体(单抗)的疗法已经成为癌症的一种重要治疗模态。白血病非常适合这种办法，原因在于恶性细胞在血液，骨髓，脾，和淋巴结中的可及性及造血分化的各种谱系和阶段的适当定义的免疫表型，允许鉴定抗原性靶物。急性髓样白血病(AML)的大多数研究聚焦于CD33。然而，未缀合的抗CD33单抗林托珠单抗(lintuzumab)的响应具有轻微的针对AML的单一药剂活性，而且在两项随机化试验中在与常规化疗组合时未能改善患者结局。
本领域需要靶向包括CLL-1的AML的安全且有效药剂来诊断和治疗CLL-1相关状况，诸如癌症。本发明满足该需要且提供其它好处。
发明概述
本发明提供包含CLL-1结合域和CD3结合域的抗CLL-1抗体及其使用方法。在一些实施方案中，本文中提供的是分离的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含：(i)CLL-1结合域，其中该CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO：49的氨基酸的交叠CLL-1表位且不结合包含SEQ ID NO：50和/或SEQ ID NO：51的表位；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ IDNO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。
在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO：49的氨基酸的交叠CLL-1表位且不结合包含SEQ ID NO：50和/或SEQ ID NO：51的CLL-1表位。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合包含SEQ ID NO：49的氨基酸的CLL-1表位。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合由或本质上由SEQ ID NO：49的氨基酸组成的CLL-1表位。在一些实施方案中，该CLL-1表位是通过羟基自由基足迹法确定的。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种高变区(HVR)：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ IDNO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ IDNO:46的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
而且，例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ IDNO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ IDNO:33的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
另外，例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ IDNO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ IDNO:48的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ ID NO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
而且，例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ IDNO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ ID NO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ IDNO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含(a)包含SEQ IDNO:40的序列的重链可变区和(b)包含SEQ ID NO:39的序列的轻链可变区。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗体具有一项或多项下述特征:a)结合重组人CLL-1；b)结合重组食蟹猴CLL-1；c)结合人外周血单个核细胞(PBMC)表面上的内源CLL-1；d)结合食蟹猴PBMC表面上的内源CLL-1；e)结合癌细胞表面上的内源CLL-1；f)结合AML癌细胞表面上的内源CLL-1；g)结合HL-60细胞表面上的内源CLL-1；h)结合EOL-1细胞表面上的内源CLL-1；i)结合包含K244Q突变的CLL-1；j)与R&D克隆687317抗体竞争人CLL-1结合；k)以小于15nM，小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合内源人CLL-1；l)以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合重组人CLL-1；和/或m)以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM，小于2nM，或小于1nM的Kd结合重组食蟹猴CLL-1。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该抗体包含结合包含人CD3ε多肽的Glu6和/或由人CD3ε多肽的Glu6组成的CD3表位的CD3结合域。在某些方面中，该CD3表位进一步包含一个或多个选自由CD3的Gln1，Asp2，和Met7组成的组的另外的氨基酸残基。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该抗体包含结合包含人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，和Glu6和/或由人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，和Glu6组成的CD3表位的CD3结合域。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该抗体包含结合包含人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，Glu6，和Met7和/或由人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，Glu6，和Met7组成的CD3表位的CD3结合域。另一方面，该CD3表位不包含人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。又一方面，该CD3表位不包含人CD3ε多肽的氨基酸残基Gly3和Glu5。在某些方面中，该CD3表位由人CD3ε多肽的氨基酸残基Gln1，Asp2，Glu6，和Met7组成。
在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于50nM且大于1nM的亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于1nM且大于0.1nM的亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于0.1nM且大于0.01nM的亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该CD3结合臂的亲和力是通过Biacore测定的。在一些实施方案中，该人CD3是hCD3εγ。在一些实施方案中，该人CD3是hCD3ε 1-27Fc。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列的HVR-L3。例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:82的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:83的序列的轻链可变区。例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:82的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:83的序列的轻链可变区。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:32的序列的轻链可变区。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:85的序列的轻链可变区。例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:81的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:85的序列的轻链可变区。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:93的序列的轻链可变区。例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:93的序列的轻链可变区。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为单克隆，人，人源化，或嵌合抗体。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为IgG抗体。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为结合CLL-1和CD3的抗体片段。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体片段为Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和/或(Fab’)2片段。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为全长抗体。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含无糖基化位点突变。在一些实施方案中，该无糖基化位点突变为替代突变。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含降低的效应器功能。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含在依照EU编号方式的氨基酸残基N297，L234，L235，D265，和/或P329G处的替代突变。在一些实施方案中，该替代突变选自由依照EU编号方式的N297G，N297A，L234A，L235A，D265A，和P329G组成的组。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体在依照EU编号方式的氨基酸残基297处包含N297G替代突变。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体在依照EU编号方式的氨基酸残基234，235，和329处包含L234A，L235A，和P329G突变。
在该多特异性抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含一个或多个重链恒定域，其中该一个或多个重链恒定域选自第一CH1(CH11)域，第一CH2(CH21)域，第一CH3(CH31)域，第二CH1(CH12)域，第二CH2(CH22)域，和第二CH3(CH32)域。在一些实施方案中，该一个或多个重链恒定域中至少一个与另一个重链恒定域配对。在一些实施方案中，该CH31和CH32域各自包含隆起或空腔，且其中该CH31域中的隆起或空腔分别可位于该CH32域中的空腔或隆起中。在一些实施方案中，该CH31和CH32域在所述隆起和空腔之间的界面处相遇。在一些实施方案中，该CH21和CH22域各自包含隆起或空腔，且其中该CH21域中的隆起或空腔分别可位于该CH22域中的空腔或隆起中。在一些实施方案中，该CH21和CH22域在所述隆起和空腔之间的界面处相遇。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，(a)该CD3结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366S，L368A，Y407V，和N297G替代突变且(b)该CLL-1结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366W和N297G替代突变。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，(a)该CD3结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的L234A，L235A，P329G，T366S，L368A，和Y407V，替代突变且(b)该CLL-1结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的L234A，L235A，P329G，和T366W替代突变。
本文中进一步提供的是分离的核酸，其编码本文中描述的抗CLL-1抗体。本文中还提供的是载体，其包含一种分离的核酸，该分离的核酸编码本文中描述的抗CLL-1抗体。本文中还提供的是宿主细胞，其包含一种载体，该载体包含一种分离的核酸，该分离的核酸编码本文中描述的抗CLL-1抗体。本文中还提供的是生成本文中描述的抗CLL-1抗体的方法，该方法包括在培养基中培养宿主细胞，其包含一种载体，该载体包含一种分离的核酸，该分离的核酸编码本文中描述的抗CLL-1抗体。
另外，本文中提供的是药物组合物，其包含本文中描述的抗CLL-1抗体。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体具有小于约200ng/mL，例如小于约150，100，50，25，20，或15ng/mL任一的细胞杀伤EC50。在一些实施方案中，该细胞杀伤为人自体CD14+。在一些实施方案中，该细胞杀伤为细胞系细胞杀伤，例如U937细胞系，HL-60细胞系，PL-21细胞系，NOMO-1细胞系，EOL-1细胞系，THP-1细胞系，ML-2细胞系，Molm-13细胞系。在该多特异性抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体具有小于约50ng/mL任一，例如小于约25ng/mL或20ng/mL任一的细胞毒性T细胞激活EC50。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞激活是通过CD8+T细胞中的CD69+CD25+T细胞的％测量的。
本文中提供的是如本文中描述的抗CLL-1抗体，其用作药物。本文中提供的是如本文中描述的抗CLL-1抗体，其用于在有所需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展。本文中提供的是如本文中描述的抗CLL-1抗体，其用于在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为癌症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为急性髓样白血病(AML)，慢性髓样白血病(CML)，和/或骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是CLL-1阳性的。在该细胞增殖性病症任一的一些实施方案中，该细胞增殖性病症对抗AML抗体药物缀合物(例如抗CLL1，抗CD123，和/或抗CD33抗体药物缀合物)治疗有抗性。在一些实施方案中，该抗体药物缀合物的药物是DNA损伤剂(例如PBD)。
本文中提供的是本文中描述的抗CLL-1抗体任一在制造用于治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展的药物中的用途。本文中提供的是本文中描述的抗CLL-1抗体任一在制造用于在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能的药物中的用途。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为癌症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为AML，CML，和/或MDS。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是CLL-1阳性的。在该细胞增殖性病症任一的一些实施方案中，该细胞增殖性病症对抗AML抗体药物缀合物(例如抗CLL1，抗CD123，和/或抗CD33抗体药物缀合物)治疗有抗性。在一些实施方案中，该抗体药物缀合物的药物是DNA损伤剂(例如PBD)。
本文中提供的是在有所需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展的方法，该方法包括对该受试者施用本文中描述的抗CLL-1抗体。本文中提供的是在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能的方法，该方法包括对该受试者施用有效量的本文中描述的抗CLL-1抗体。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为癌症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症为AML，CML，和/或MDS。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是CLL-1阳性的。在该细胞增殖性病症任一的一些实施方案中，该细胞增殖性病症对抗AML抗体药物缀合物(例如抗CLL1，抗CD123，和/或抗CD33抗体药物缀合物)治疗有抗性。在一些实施方案中，该抗体药物缀合物的药物是DNA损伤剂(例如PBD)。
在该方法任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体结合(a)位于免疫效应器细胞上的CD3分子和(b)位于细胞上的CLL-1分子。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体在结合至(a)和(b)后激活该免疫效应器细胞。在该方法任一的一些实施方案中，该激活的免疫效应器细胞能够对靶细胞发挥细胞毒性效应和/或凋亡效应。
在该方法任一的一些实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用PD-1轴结合拮抗剂或另外的治疗剂。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂为PD-L2结合拮抗剂。
在该方法任一的一些实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用糖皮质激素。在一些实施方案中，该糖皮质激素为地塞米松。
在该方法任一的一些实施方案中，该方法与干细胞移植组合使用。
在该方法任一的一些实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，该第二治疗剂包含阿糖胞苷和/或柔红霉素。在一些实施方案中，该第二治疗剂包含阿糖胞苷。在一些实施方案中，该第二治疗剂包含抗AML抗体药物缀合物(例如抗CLL1，抗CD123，和/或抗CD33抗体药物缀合物)。
附图简述
图1A-B显示鼠(m)6E7，m21C9，m20B1，和m28H12的轻链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 30，37，35和41)(A)和重链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO31，38，36和42)(B)的比对。
图2A-B显示K1H1，m6E7，人源化(h)6E7.L4H1e，和h6E7.L4H1e.A54的轻链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 109，30，32和32)(A)和重链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 110，31，33和34)(B)的比对。
图3A-B显示K1H1，m21C9，和h21C9.L2H3的轻链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 109，37和39)(A)和重链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 110，38和40)(B)的比对。
图4A-C显示抗CLL-1/CD3 TDB的体外杀伤表征。(A)显示在多种浓度的TDB，μg/mL，(gD，h6E7(6E7.L4H1e)，h6E7D(6E7.L4H1eD54)，h6E7A(6E7.L4H1eA54)，m20B1，和m28H12与38E4v1组合)，EOL-1的百分比杀伤。(B)和(C)分别显示在多种浓度的TDB(μg/mL)，使用gD，6E7(6E7.L4H1e)，和h21C9(h21C9.L2H3)与38E4v1组合的百分比细胞杀伤(PBMC，EOL-1，和THP-1)和CD8(CD8+，CD69+，CD25+)T细胞激活。
图5A-D显示使用gD x 38E4v1，h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1，和h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1，在多种TDB浓度(μg/mL)，抗CLL-1 TDB对多种AML肿瘤细胞系的效力，比较针对药物标准化的百分比存活。
图6A-B显示h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1和h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1的体外表征，在多种TDB浓度(μg/mL)，在含有所有亚型的T细胞的自体食蟹猴PBMC存在下食蟹猴CD14+细胞的杀伤和CD8(CD8+，CD69+，CD25+)T细胞激活。
图7A-B显示使用h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1和gD x 38E4v1，抗CLL-1TDB对AML患者骨髓的体外效力。
图8A-D显示使用HL60，THP-1，和EOL-1细胞系，抗gD x 38E4v1对照，具有低亲和力CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)x40G5c)，高亲和力抗CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1)，和很高亲和力抗CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v11)的抗CLL-1 TDB的体外表征。图8E-G显示与低亲和力抗CD3 Fab(h40G5c)或高亲和力抗CD3 Fab(38E4v1)配对的h6E7.L4H1e N54-A或-S或-E或-Q或-D人源化Fab的变体的体外表征。图8H-I显示响应与高亲和力抗CD3臂(38E4v1)或低亲和力抗CD3臂(h40G5c)配对的h6E7N54变体的CD8T细胞激活。
图9A-B显示hCLL-1和hCD3e转基因在双重BAC-Tg(hCL-1/hCD3ε)小鼠中的表达。
图10A-D显示hCLL-1和hCD3e转基因在杂合双重BAC-Tg(hCL-1/hCD3ε)小鼠中的表达，与纯合亲本比较。
图11显示用抗CLL-1 TDB，gD x 38E4v1，6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1，N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1，和N54A(6E7.L4H1eA54)x40G5(40G5c)处理的双重BAC-Tg(hCL-1/hCD3e)中的CD8+T细胞的离体激活。
图12显示用抗CLL-1 TDBs，gD x 38E4v1，gD x 40G5c，h6E7A(6E7.L4H1eA54)x40G5c，h6E7A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1，和h6E7A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11处理的双重BAC-Tg(hCL-1/hCD3e)中的CD8+T细胞的体内激活。
图13A-B显示用抗CLL-1 TDB，抗CLL-1 TDB，gD x CD3高(38E4v1)，gD x CD3低(40G5c)，CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)xCD3低(40G5c)，CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)xCD3高(38E4v1)，和CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)xCD3很高(38E4v11)处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中的hCLL-1+细胞的体内消减。
图14A-B显示正常和AML人白细胞上CLL-1(A)和(B)和CD33(B)的表达概况。
图15A-C显示用抗CLL-1 h6E7A(6E7.L4H1eA5)x38E4v1 TDB处理人骨髓细胞后对造血的影响。
图16A-B显示38E4v1，38E4v11，和40G5C的轻链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 85，93和83)(A)和重链可变区序列(以出现的次序分别为SEQ ID NO 84，84和82)(B)的比对。
图17A-D显示用抗CLL-1 TDB处理的SCID.beige小鼠(A和B)和hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠(C和D)中的药动学(PK)数据。
图18A-C显示用h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c TDB处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠的外周血(A)，骨髓(B)，和脾(C)中的药效学(PD)数据。
图19A-C显示用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1 TDB处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠的外周血(A)，骨髓(B)，和脾(C)中的PD数据。
图20A-C显示用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11 TDB处理的hCLL-1/hCD3eBAC-Tg小鼠的外周血(A)，骨髓(B)，和脾(C)中的PD数据。
图21A-F显示用h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c TDB(A和D)，h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1 TDB(B和E)，和h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11 TDB(C和F)处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中与同最大靶降低相关的时间点有关的小鼠CD8+细胞上的CD69上调。
图22A-B显示用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c和抗PD-L1处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中的髓样细胞减少。图22C-D显示用抗CLL-1/CD3 TDB抗体处理的hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中的单核细胞和粒细胞上的PD-L1上调。
图23A-D显示用低亲和力抗CLL-1/CD3 TDB抗体((6E7.L4H1eA54)xh40G5c)处理的食蟹猴中的髓样细胞数或CLL-1阳性细胞数。
图24显示用低亲和力抗CLL-1/CD3 TDB抗体((6E7.L4H1eA54)x h40G5c)处理的食蟹猴中的循环淋巴细胞数。
图25显示用抗CLL-1/CD3 TDB抗体处理的食蟹猴中的PK参数。
发明详述
I.定义
如本文中使用的，术语“CLL-1”指源自细胞中CLL-1前体蛋白加工的任何天然，成熟CLL-1。该术语包括来自任何脊椎动物来源的CLL-1，包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人和食蟹猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语还包括CLL-1的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性的人CLL-1蛋白质序列的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，该人CLL-1蛋白质序列包含K244Q SNP(SEQ ID NO：1，其中K244为Q)。一种例示性的胞外域的氨基酸序列是SEQ ID NO：2的氨基酸。一种例示性的C型凝集素样域(CTLD)的氨基酸序列是SEQ ID NO：3的氨基酸。一种例示性的食蟹猴CLL-1蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4。
术语“CLL-1的糖基化形式”指通过添加碳水化合物残基经过翻译后修饰的天然存在形式的CLL-1。
如本文中所使用的，术语“分化簇3”或“CD3”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然CD3，除非另有说明，包括例如CD3ε，CD3γ，CD3α，和CD3β链。该术语涵盖“全长”、未加工的CD3(例如未加工的或未修饰的CD3ε或CD3γ)以及自细胞中加工得到的任何形式的CD3。该术语还涵盖天然存在的CD3变体，包括例如剪接变体或等位变体。CD3包括例如长度为207个氨基酸的人CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)和长度为182个氨基酸的人CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)。
术语“抗CLL-1抗体”和“结合CLL-1的抗体”指能够以足够亲和力结合CLL-1，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向CLL-1的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗CLL-1抗体结合无关的，非CLL-1的蛋白质的程度小于该抗体对CLL-1的结合的约10％。在某些实施方案中，结合CLL-1的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CLL-1抗体结合在来自不同物种的CLL-1中保守的CLL-1表位。
术语“抗CD3抗体”和“结合CD3的抗体”指能够以足够亲和力结合CD3，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向CD3的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗CD3抗体结合无关的，非CD3的蛋白质的程度小于该抗体对CD3的结合的约10％。在某些实施方案中，结合CD3的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CD3抗体结合在来自不同物种的CD3中保守的CD3表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352：624-628(1991)。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地，抗体包含6个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR，存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda，MD(1991))；
(c)抗原接触，存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另有说明，HVR残基及可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是依照Kabat等，见上文编号的。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选与它们具有至少约90％的同源性，更优选与它们具有至少约95％的同源性。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
“结合域”表示特异性结合靶表位，抗原，配体，或受体的化合物或分子的一部分。结合域包括但不限于抗体(例如单克隆，多克隆，重组，人源化，和嵌合抗体)，抗体片段或其部分(例如Fab片段，Fab’2，scFv抗体，SMIP，域抗体，双抗体，微型抗体(minibody)，scFv-Fc，亲和体(affibody)，纳米抗体(nanobody)，和抗体的VH和/或VL域)，受体，配体，适体，和具有已鉴定的结合配偶的其它分子。
术语“表位”指抗原分子上抗体所结合的特定位点。在一些实施方案中，抗原分子上抗体所结合的特定位点是通过羟基自由基足迹法(例如CLL-1结合域)确定的。在一些实施方案中，抗原分子上抗体所结合的特定位点是通过结晶学(例如CD3结合域)确定的。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体下调；和B细胞活化。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗CLL-1抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
“编码抗CD3抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech，Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘以100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态，年龄，性别，和重量，和抗体引发个体中期望的应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或不利效果的量。为了预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或者延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病形成期间呈现的中间病理学表型。为了治疗性使用，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少源自疾病的一种或多种症状，提高那些患有疾病的对象的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病的进展，和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况中，药物的有效量在减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓或者期望地停止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓且期望地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状中可以具有效果。可以在一次或多次施用中施用有效量。出于本发明的目的，药物，化合物，或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防或治疗性处理的量。如在临床背景中理解的，药物，化合物，或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物，化合物，或药物组合物一起实现。如此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效量”，并且若与一种或多种其它药剂一起，可以实现或者实现期望的结果，则可以认为单一药剂以有效量给予。
如本文中使用的，“治疗”(及其语法变化形式，诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发生/发展，或用于减缓疾病的进展。
如本文中使用的，“延迟病症或疾病的进展”意指推迟，阻碍，减缓，延迟，稳定，和/或延缓疾病或病症(例如细胞增殖性病症，例如癌症)的形成。根据疾病史和/或治疗的个体，此延迟可以是不同时间长度的。如对于本领域技术人员明显的是，充分或显著的延迟实质上可以涵盖预防，因为个体不形成疾病。例如，可以延迟晚期阶段癌症，诸如转移的形成。
“降低”或“抑制”表示引起例如20％或更多，50％或更多，或75％，85％，90％，95％，或更多总体降低的能力。在某些实施方案中，降低或抑制可以指抗体的由抗体Fc区介导的效应器功能，此类效应器功能具体包括补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，和抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(docetaxel)苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomibCCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodiumpixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus，)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
如本文中定义的化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrazole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指起抑制或掩盖本文中所治疗哺乳动物的免疫系统作用的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见美国专利No.4,665,077)；非类固醇抗炎药类(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素类诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎剂类诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂类，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil,MMF)；烷化剂类，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)、溴隐亭(bromocryptine)、达那唑(danazol)、氨苯砜(dapsone)、戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所记载的)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；类固醇类，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)包括SOLU-甲泼尼龙琥珀酸钠、和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；抗疟剂类，诸如氯喹(chloroquine)和羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体，抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))，抗TNF-α免疫粘附素(依那西普(etanercept))，抗TNF-β抗体，抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体，和抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂(诸如ACTEMRATM(tocilizumab))；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan)T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合域的可溶性肽(WO 90/08187，发布于90年7月26日)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen et al.,美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.,Science 251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO 91/01133)；BAFF拮抗剂，诸如BAFF抗体和BR3抗体和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay and Mackay,TrendsImmunol.23:113-5(2002)及还见下文定义)；干扰T辅助细胞信号的生物制剂，诸如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的阻断性抗体(例如Durie et al.，Science，261:1328-30(1993)；Mohan et al.，J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck et al.,Science,265:1225-7(1994))；及T细胞受体抗体(EP 340，109)，诸如T10B9。本文中的一些优选免疫抑制剂包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF、或甲氨蝶呤。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍–一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-L1，PD-L2)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1结合PD-L1和/或PD-L2。例如，PD-1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述MDX-1106(nivolumab)。在另一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述MK-3475(lambrolizumab)。在另一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述CT-011(pidilizumab)。在另一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述AMP-224。
术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1结合PD-1和/或B7-1。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述YW243.55.S70。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述MDX-1105。在仍有另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述MPDL3280A(CAS登记号1380723-44-3)。在仍有另一个具体方面，抗PD-L1抗体是本文所述MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2结合PD-1。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。在一些实施方案中，癌症为CLL-1阳性癌症。包括CLL-1阳性癌症的癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤(例如何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)，母细胞瘤，肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括急性髓样白血病(AML)，骨髓增生异常综合征(MDS)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性骨髓单核细胞性白血病，急性早幼粒细胞性白血病(APL)，慢性骨髓增生性病症，血小板性白血病，前体B细胞急性成淋巴细胞性白血病(pre-B-ALL)，前体T细胞急性成淋巴细胞性白血病(preT-ALL)，多发性骨髓瘤(MM)，肥大细胞病，肥大细胞性白血病，肥大细胞肉瘤，髓样肉瘤，淋巴样白血病，和未分化性白血病。在一些实施方案中，癌症是髓样白血病。在一些实施方案中，癌症是急性髓样白血病(AML)。
术语“CLL-1阳性细胞”指在其表面上表达CLL-1的细胞。
术语“CLL-1阳性癌症”指包含在其表面上表达CLL-1的细胞的癌症。在一些实施方案中，例如使用针对CLL-1的抗体在诸如免疫组织化学，FACS，等方法中测定细胞表面上CLL-1的表达。或者，认为CLL-1mRNA表达与细胞表面上的CLL-1表达有关，而且可通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
如本文及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”，和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文明确另有规定。
本文中提及“约”某个数值或参数包括(并描述)涉及该数值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
应当理解，本文中描述的本发明的方面和变型包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方面和变型。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于抗CLL-1抗体。在某些实施方案中，提供了包含CLL-1结合域和CD3结合域的抗CLL-1抗体。在某些实施方案中，该抗CLL-1抗体为抗CLL-1T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体。本发明的抗体对于例如癌症诸如急性髓样白血病(AML)的诊断或治疗是有用的。
A.例示性抗CLL-1抗体
本发明提供包含CLL-1结合域和CD3结合域的抗CLL-1抗体及其使用方法。在一些实施方案中，本文中提供的是分离的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含(i)CLL-1结合域，其中该CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO:49的氨基酸的交叠CLL-1表位且不结合包含SEQ ID NO:50和/或SEQ ID NO:51的表位；和(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ IDNO:86)或1-27(SEQ ID NO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。
a)抗CLL-1抗体的CLL-1结合域
在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO:49的氨基酸的CLL-1交叠表位且不结合包含SEQ ID NO:50和/或SEQ ID NO:51的CLL-1表位。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合包含SEQ ID NO:49的氨基酸的CLL-1表位。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CLL-1结合域结合由或本质上由SEQ ID NO:49的氨基酸组成的CLL-1表位。在一些实施方案中，该CLL-1表位是通过羟基自由基足迹法确定的。在一些实施方案中，通过羟基自由基足迹法确定的CLL-1表位具有大于约1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，或3.0任一的[抗原速率常数]/[抗原和抗体复合物速率常数]之比。在一些实施方案中，通过羟基自由基足迹法确定的CLL-1表位具有大于约2.0的[抗原速率常数]/[抗原和抗体复合物速率常数]之比。
羟基自由基足迹法可以如实施例中所述实施。例如，在Brookhaven国家实验室使用X28c束线将样品暴露于羟基自由基达0，10，15，和20毫秒(ms)的间隔。可以将经过标记的样品提交使用PNGase F的脱糖基化。可以在丙酮中使用三氯乙酸沉淀样品，并提交LC-MS分析。然后可以将样品提交还原和烷基化，使用胰蛋白酶消化，接着是液体层析术偶联高分辨率质谱术(LC-MS)。可以使用ProtMapMS分析MS数据，产生每一种肽的剂量响应图。可以针对每一种复合物形式比较来自游离抗原的结果。可以使用Swiss-Model软件生成抗原的基于同源性的模型，并可以为三种复合物每一种定位溶剂保护区。可以为未氧化和所有氧化形式的肽离子(具有特定m/z的)对选定的离子层析图(SIC)进行提取和积分。可以使用这些峰面积值以剂量响应(DR)图的形式表征反应动力学，该图作为羟基自由基暴露的函数测量完整肽的损失。与游离抗原相对，复合物中的溶剂保护区经历逐渐氧化反应，而且氧化速率(称作速率常数，RC)的差异可用来突显表位(例如CLL-1表位)的定位。
在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合重组人CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合重组食蟹猴CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合人外周血单个核细胞(PBMC)表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合食蟹猴PBMC表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合癌细胞表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合AML癌细胞表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合HL-60细胞表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合EOL-1细胞表面上的内源CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合包含K244Q突变的CLL-1(具有K244Q的SEQ ID NO:1)。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO:49的氨基酸的交叠CLL-1表位。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域不结合包含SEQ ID NO:50和/或SEQ IDNO:51的CLL-1表位。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域与R&D System克隆687317抗体竞争人CLL-1结合。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域以小于15nM，小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合内源人CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合重组人CLL-1。在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该CLL-1结合域以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM，小于2nM，或小于1nM的Kd结合重组食蟹猴CLL-1。在一些实施方案中，该Kd是通过本文，特别是实施例中描述的任何方法测定的。在一些实施方案中，Kd是通过BIACORE测定的。在一些实施方案中，Kd是通过以低密度固定化的CLL-1测定的。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体具有小于约200ng/mL，例如小于约150，100，50，25，20，或15ng/mL任一的细胞杀伤EC50。在一些实施方案中，该细胞杀伤为人自体CD14+。在一些实施方案中，该细胞杀伤为细胞系细胞杀伤，例如U937细胞系，HL-60细胞系，PL-21细胞系，NOMO-1细胞系，EOL-1细胞系，THP-1细胞系，ML-2细胞系，Molm-13细胞系。在该多特异性抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL-1抗体具有小于约50ng/mL任一，例如小于约25ng/mL或20ng/mL任一的细胞毒性T细胞激活EC50。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞激活是通过CD8+T细胞中的CD69+CD25+T细胞的％测量的。
在一些实施方案中，该CLL-1结合域和/或CLL-1抗体的特征是如本文中在下文实施例中所述测定的。
CLL-1结合域6E7和其它实施方案
在该CLL-1抗体任一的一些实施方案中，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，一种抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，其包含：(a)VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
在上述实施方案任一中，包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，其包含上述实施方案任一中的HVR，且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，该人受体框架是人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，该人受体框架是人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或该VH框架VH1，其包含下面的突变中任一。
另一方面，抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，其包含与SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的CLL-1结合域保留结合CLL-1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：46和/或SEQ ID NO：48中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：46和/或SEQ ID NO:48中替代，插入和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，该抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含SEQ ID NO:31，SEQ ID NO：33，和/或SEQ ID NO：34的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
另一方面，提供了一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含与SEQ ID NO：30和/或SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：30和/或SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的CLL-1结合域保留结合CLL-1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:32中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:32中替代，插入和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:32的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，提供了一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含上文提供的实施方案任一中的VH和上文提供的实施方案任一中的VL。
在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含分别在SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:30中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含分别在SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含分别在SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:32中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含分别在SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:32中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含分别在SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:32中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，本文中提供的是与本文中提供的CLL-1结合域结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包含分别SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:46和/或SEQ ID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:32的VL序列的CLL-1结合域结合相同表位的抗体。
本文中提供的是一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，该CLL-1结合域包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含如图2A中所示依照Kabat编号方式的HVR1-LC，HVR2-LC和HVR3-LC序列，该重链可变域包含如图2B中所示依照Kabat编号方式HVR1-HC，HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含如图2A中所示HVR1-LC，HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和FR1-LC，FR2-LC，FR3-LC和/或FR4-LC序列。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含如图2B中所示HVR1-HC，HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和/或FR4-HC序列。
在本发明的又一方面，依照上述实施方案任一的包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体为抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体为实质性全长抗体，例如IgG1抗体，IgG2a抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
CLL-1结合域21C9和其它实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
另一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本发明的一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含：(a)VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种抗CLL-1抗体，其包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在上述实施方案任一中，包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体是人源化的。在一个实施方案中，一种抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，其包含：上述实施方案任一中的HVR，且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，该人受体框架是人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，该人受体框架是人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或该VH框架VH1，其包含下面的突变中任一。
另一方面，一种抗CLL-1抗体包含CLL-1结合域，其包含与SEQ ID NO:38和/或SEQID NO:40的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的CLL-1结合域保留结合CLL-1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40中替代，插入和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
另一方面，提供了一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含与SEQID NO:37和/或SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQID NO:37和/或SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的CLL-1结合域保留结合CLL-1的能力。在某些实施方案中，在SEQID NO:37和/或SEQ ID NO:39中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:39中替代，插入和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:39的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
另一方面，提供了一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含上文提供的实施方案任一中的VH和上文提供的实施方案任一中的VL。
在一个实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含分别在SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:37中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:39中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，本文中提供的是与本文中提供的抗CLL-1抗体结合相同表位的包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体结合相同表位的抗体，该CLL-1结合域包含分别SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:40的VH序列和SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:39的VL序列。
本文中提供的是一种包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体，该CLL-1结合域包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含如图3A中所示依照Kabat编号方式的HVR1-LC，HVR2-LC和HVR3-LC序列，该重链可变域包含如图3B中所示依照Kabat编号方式HVR1-HC，HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含如图3A中所示HVR1-LC，HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和FR1-LC，FR2-LC，FR3-LC和/或FR4-LC序列。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含重链可变域，该重链可变域包含如图3B中所示HVR1-HC，HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和/或FR4-HC序列。
在本发明的又一方面，依照上述实施方案任一的包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体为抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体为实质性全长抗体，例如IgG1抗体，IgG2a抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
b)抗CLL1抗体的CD3结合域
在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CD3结合域结合人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽。在一些实施方案中，该人CD3多肽或该食蟹猴CD3多肽分别为人CD3ε多肽或食蟹猴CD3ε多肽。在一些实施方案中，该人CD3多肽或该食蟹猴CD3多肽分别为人CD3γ多肽或食蟹猴CD3γ多肽。在某些实施方案中，提供了一种抗CLL-1抗体，其包含CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26或1-27组成的CD3(例如人CD3ε)片段内的表位。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体为双特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，CD3结合域以250nM或更低的Kd结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中，该CD3结合域以100nM或更低的Kd结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中，该CD3结合域以15nM或更低的Kd结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中，CD3结合域以10nM或更低的Kd结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中，CD3结合域以5nM或更低的Kd结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于50nM且大于1nM亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于1nM且大于0.1nM亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂以小于0.1nM且大于0.01nM亲和力结合人CD3。在一些实施方案中，该CD3结合臂的亲和力是通过Biacore测定的。在一些实施方案中，该人CD3为hCD3εγ。在一些实施方案中，该人CD3为hCD3ε1-27Fc。
在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体的CD3结合域以3.5埃，3.25埃，3.00埃，2.75埃，或更短的距离结合接触人CD3ε的氨基酸。在某些实施方案中，提供了CD3结合域，其以3.5埃，3.25埃，3.00埃，2.75埃或更短的距离结合由一个，两个，三个，四个，或五个人CD3ε氨基酸组成的表位。在一个实施方案中，该抗CLL-1抗体的CD3结合域以3.5埃或更短距离与人CD3ε的氨基酸构成独特接触。在某些实施方案中，提供了CD3结合域，其以3.5埃或更短的距离结合由一个，两个，三个，四个，或五个人CD3ε氨基酸组成的表位。例如，在某些实施方案中，提供了CD3结合域，其结合由选自Gln1，Asp2，Asn4，Glu6，和Met7的人CD3ε氨基酸组成的表位。在一个特定实施方案中，该CD3结合域结合具体包括Glu6的表位。在某些其它实施方案中，提供了CD3结合域，其不结合包括人CD3ε氨基酸Glu5的表位。在某些其它实施方案中，提供了CD3结合域，其不结合包括人CD3ε氨基酸Gly3和Glu5的表位。
CD3表位可以通过结合该表位的肽片段的CD3结合域来确定。或者，CD3表位可以通过丙氨酸扫描诱变来确定。在一个实施方案中，CD3结合域对突变型CD3的结合降低20％，30％，50％，80％或更多指示丙氨酸扫描诱变测定法中突变的CD3氨基酸残基是该CD3结合域的表位残基。或者，CD3表位可以通过质谱术来确定。在一些实施方案中，表位是通过结晶学(例如结晶学方法)确定的。
在一些实施方案中，通过结晶学确定的CD3表位是使用CD3的氨基酸Q1-M7确定的。在一些实施方案中，通过结晶学确定的CD3表位是使用CD3的氨基酸QDGNEEMGGITQTPYK(SEQID NO:107)确定的。
在一些实施方案中，通过结晶学确定的CD3表位可以如下实施，即组合以10mg/ml在0.15M NaCl，25mM tris，pH 7.5中溶解的抗CD3抗体Fab与2倍摩尔过量(1mg)的CD3ε肽并最初以坐滴蒸汽扩散型式筛选沉淀物的稀疏基质。可以自含有70％v/v甲基-戊二醇的储备溶液和0.1M HEPES缓冲液pH 7.5的1:1混合物生长经过优化的晶体。储备液可用作防冻剂。可以通过突然浸入液氮中将晶体转移至低温温度。
可以使用MAR300CCD检测器以高级光子源束线22ID收集晶体的衍射数据。可以使用程序HKL2000对所记录的衍射进行整合和定标。
可以使用程序Phaser通过分子置换(MR)方法对结构进行定相。例如，MR搜索模型是自HGFA/Fab复合物的晶体结构(PDB代码：2R0L)衍生的Fab亚基。基于Fo-Fc图将CD3ε肽构建入该结构中。随后可以用程序REFMAC5和PHENIX使用最大似然靶功能，各向异性个别B因子精化方法，和TLS精化方法将该结构精化，以实现会聚。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含下述高变区(HVR)：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)VH域，该VH域包含：(i)包含SEQID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含：(i)包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。
例如，在该抗CLL1抗体任一的一些实施方案中，该抗CLL1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含下述高变区(HVR)：(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)VH域，该VH域包含：(i)包含SEQID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含：(i)包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，该CD3结合域可具有包括与SEQ IDNO:82具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO：82的序列的重链可变(VH)域，和/或包含与SEQ ID NO：83具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO：83的序列的轻链可变(VL)域。在一些情况中，该CD3结合域可具有包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VH域和包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的VL域。在一种特定情况中，该CD3结合域可以为40G5c，或其衍生物或克隆亲属。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO:75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:82的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:83的序列的轻链可变区。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)VH域，该VH域包含：(i)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含：(i)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO：80的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该包含CLL-1结合域的抗CLL-1抗体包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)VH域，该VH域包含：(i)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含：(i)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，该CD3结合域可具有包含与SEQ ID NO:84具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:84的序列的VH域，和/或包含与SEQ ID NO:85具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:85的序列的VL域。在一些情况中，该CD3结合域可具有包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL域。在一种特定情况中，该CD3结合域可以为38E4v1，或其衍生物或克隆亲属。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:85的序列的轻链可变区。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该CD3结合域包含：(a)VH域，该VH域包含：(i)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，该VL域包含：(i)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，该CD3结合域可具有包含与SEQ ID NO:84具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:84的序列的VH域，和/或包含与SEQ ID NO:93具有至少90％序列同一性(例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:93的序列的VL域。在一些情况中，该CD3结合域可具有包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL域。在一种特定情况中，该CD3结合域可以为38E4v11，或其衍生物或克隆亲属。
例如，本文中提供的是抗CLL1抗体，其包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含：(i)CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：32的序列的轻链可变区和(ii)CD3结合域，该CD3结合域包含包含SEQ ID NO：84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：93的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂为嵌合抗鼠CD3结合臂。在一些实施方案中，该嵌合抗鼠CD3结合臂为2C11(Leo et al.Proc Natl Acad Sci USA.84：1374-1378,1987)。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂为小鼠抗人CD3结合臂。在一些实施方案中，该小鼠抗人CD3结合臂为SP34(Pessano et al.The EMBO Journal.4：337-344，1985)。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂为OKT3(Fernandes，R.A.etal.2012.J.Biol.Chem.287：13324-13335)。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂为UCHT1(同上)。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂为Muromonab-CD3(CAS登记号：140608-64-6)。在一些实施方案中，该抗CLL1抗体的CD3结合臂记载于美国专利申请公开文本2010/0150918。
c)多特异性抗CLL-1抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗CLL-1抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对CLL-1，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合CLL-1的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达CLL-1的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305：537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等,EMBO J.10：3655(1991))，和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等,J.Immunol.147：60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。多特异性抗体也可以使用免疫球蛋白交叉(也称作Fab域交换或CrossMab型式)技术来工程化改造(见例如WO2013026833，WO2009/080253；Schaefer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108：11187-11192(2011))。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1，WO2013026833，和WO2012073985)。
本文中的抗CLL-1抗体或片段还包括包含结合CLL-1及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
又一方面，依照任何上述实施方案的CLL-1结合域，CD3结合域和/或CLL-1抗体可单一地或组合地并入下文1-6节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤50nM，≤10nM，≤5nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM，且任选≥10-13M的解离常数(Kd)(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下面的测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等,CancerRes.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-)洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用-2000，-T200或-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)和/或HBS-P(0.01M Hepes pH7.4,0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)，然后以5μl/分钟和/或30μl/分钟的流速注射以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以大约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等,Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等，J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；及Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein，Histologyand Histopathology，20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等，于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等,于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
在一些方面，该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1 TDB抗体)包含包含N297G突变的Fc区。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体包含依照EU编号方式的氨基酸残基234，235，和329处的L234A，L235A，和P329G突变。
在一些实施方案中，该包含N297G突变的抗CLL-1抗体包含一个或多个重链恒定域，其中该一个或多个重链恒定域选自第一CH1(CH11)域，第一CH2(CH21)域，第一CH3(CH31)域，第二CH1(CH12)域，第二CH2(CH22)域，和第二CH3(CH32)域。在一些情况中，该一个或多个重链恒定域中至少一个与另一个重链恒定域配对。在一些情况中，该CH31和CH32域各自包含隆起或空腔，且其中该CH31域中的隆起或空腔分别可位于该CH32域中的空腔或隆起中。在一些情况中，该CH31和CH32域在所述隆起和空腔之间的界面处相遇。在一些情况中，该CH21和CH22域各自包含隆起或空腔，且其中该CH21域中的隆起或空腔分别可位于该CH22域中的空腔或隆起中。在其它情况中，该CH21和CH22域在所述隆起和空腔之间的界面处相遇。在一些情况中，该抗CD3抗体为IgG1抗体。
在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，(a)该CD3结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366S，L368A，Y407V，和N297G替代突变且(b)该CLL-1结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366W和N297G替代突变。在该抗CLL-1抗体任一的一些实施方案中，(a)该CD3结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的L234A，L235A，P329G，T366S，L368A，和Y407V，替代突变且(b)该CLL-1结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的L234A，L235A，P329G，和T366W替代突变。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO 99/51642，及Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380，382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗CLL-1抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗CLL-1抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗CLL-1抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237，5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗CLL-1抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗CLL-1抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对本发明的抗体和/或结合域测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，FACS，或Western印迹来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中描述的任何抗体竞争对CLL-1或CD3的结合的抗体和/或结合域。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中描述的抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合CLL-1或CD3，例如本文中描述的任何抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对CLL-1或CD3的结合的能力)的溶液中温育固定化CLL-1或CD3。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化CLL-1或CD3。在允许第一抗体结合CLL-1或CD3的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化CLL-1或CD3联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化CLL-1或CD3联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对CLL-1或CD3的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定法
一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)的测定法。生物学活性可以包括例如抑制细胞生长或增殖的能力(例如“细胞杀伤”活性)、诱导细胞死亡(包括程序性细胞死亡(凋亡))的能力、或抗原结合活性。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在一些实施方案中，该活性包含支持靶细胞(例如CLL-1阳性细胞)杀伤和/或细胞毒性T细胞激活的能力。在某些实施方案中，通过本文，特别是实施例中描述的任何方法对本发明的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)测试此类靶细胞(例如CLL-1阳性细胞)杀伤和/或T细胞细胞毒性效应激活生物学活性。在一些实施方案中，可以将靶细胞诸如AML肿瘤细胞系，PBMC，或AML患者骨髓细胞在含有10％FCS，2mM谷氨酰胺和0.3mg/ml经过纯化的低内毒素人IgG(Molecular Innovations，HU-GF-ED)的RPMI培养基中于37℃预温育1-2小时以阻止TDB对具有FcγR的表面表达的细胞的非特异性结合。在一些实施方案中，可以自正常人供体分离PBMC，并使用来自Miltenyi Biotec GmbH(Miltenyi；130-096-495)的试剂盒富集PBMC中未触碰的CD8+T细胞。该测定法可以在装有60,000个细胞/孔的人CD8+T细胞和20,000个细胞/孔的经hIgG封闭的靶细胞的96孔圆底板(Costar 3799)中实施；效应对靶比(E:T)为3:1。可以作为连续3倍稀释至跨越0–10ug/ml或0–1ug/ml的最终测定浓度的10倍工作溶液来添加抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。添加的次序可以如下，50ul2X靶细胞，11ul 10X 3倍连续稀释的TDB，和50ul 2X CD8+ T细胞。可以将内容物在处于设置6的滴定板摇床(Thermo)上混合15秒并于37℃温育约40小时。可以每天一次将板混合。在一些实施方案中，可以使用抗CD123-APC(BD Pharmingen；560087)或抗CD33-APC试剂(BDPharmingen；551378)任一和碘化丙啶通过FACS来监测表达hCLL-1的EOL-1，THP-1，HL-60，Nomo-1，ML-2，PL-21，U937和Molm-13细胞的消减。可以使用抗CD8-FITC(BD Pharmingen；555634)，抗CD69-PE(BD Pharmingen；555531)和抗CD25(BD Pharmingen；555434)的组合来监测CD8+ T细胞的激活。
在一些实施方案中，可以通过Hypaque-Ficoll梯度离心(Ficoll-Paque Plus，GEHealthcare)来分离人或食蟹猴PBMC，以低速清洗以去除血小板并在含有hIgG以封闭TDB对FcγR的非特异性结合的RPMI中重悬浮。该测定法可以如上所述实施，只是将浓度为200,000/孔的PBMC与11ul 10X 3倍连续稀释的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)一起温育。可以在～40小时时通过FACS来评估靶细胞杀伤(CD14+单核细胞)和效应T细胞激活(CD8+)。可以使用抗CD14-APC试剂(人BD Pharmingen；555399，食蟹猴Miltenyi；130-091-243)和碘化丙啶来监测表达hCLL-1的CD14+单核细胞的消减。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合的本文中的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他赛，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
一方面，本文中提供的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)可用于检测生物学样品中CLL-1的存在。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织。在某些实施方案中，此类组织包括以相对于其它组织的更高水平表达CLL-1的正常和/或癌性组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗CLL-1抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中CLL-1的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗CLL-1抗体结合CLL-1的条件下使生物学样品与抗CLL-1抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗CLL-1抗体与CLL-1间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗CLL-1抗体来选择适合用抗CLL-1抗体治疗的受试者，例如其中CLL-1是一种用于选择患者的生物标志。
可依照任何上述实施方案来诊断或检测的例示性病症包括CLL-1阳性癌症，诸如CLL-1阳性AML，CLL-1阳性CML，CLL-1阳性MDS，CLL-1阳性慢性骨髓单核细胞性白血病，CLL-1阳性APL，CLL-1阳性慢性骨髓增生性病症，CLL-1阳性血小板性白血病，CLL-1阳性pre-B-ALL，CLL-1阳性preT-ALL，CLL-1阳性多发性骨髓瘤，CLL-1阳性肥大细胞病，CLL-1阳性肥大细胞性白血病，CLL-1阳性肥大细胞肉瘤，CLL-1阳性髓样肉瘤，CLL-1阳性淋巴样白血病，和CLL-1阳性未分化性白血病。在一些实施方案中，CLL-1阳性癌症是在实施例B中本文所述条件下得到大于“0”的抗CLL-1免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，CLL-1阳性癌症以1+，2+或3+水平表达CLL-1，如在实施例B中本文所述条件下定义的。在一些实施方案中，CLL-1阳性癌症是根据检测CLL-1mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法表达CLL-1的癌症。在一些实施方案中，所述RT-PCR是定量RT-PCR。
可使用某些其它方法来检测抗CLL-1抗体对CLL-1的结合。此类方法包括但不限于本领域公知的抗原结合测定法，诸如Western印迹，放射免疫测定法，ELISA(酶联免疫吸附测定法)，“三明治”免疫测定法，免疫沉淀测定法，荧光免疫测定法，蛋白A免疫测定法，和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗CLL-1抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)的药物配制剂。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载剂进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，除了抗CLL-1抗体之外，可能还期望在一种配制剂中含有另一种抗体，例如结合CLL-1多肽上不同表位的第二抗CLL-1抗体，或针对一些其它靶物诸如影响特定癌生长的生长因子的抗体。或者/另外，所述组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗方法和组合物
可以在治疗方法中使用本文中提供的任何抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。
一方面，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于作为药物使用。在又一些方面，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于在治疗细胞增殖性病症(例如癌症和/或AML)或延迟细胞增殖性病症(例如癌症和/或AML)进展中使用。在某些实施方案中，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体)，其用于在治疗方法中使用。在某些实施方案中，本发明提供抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于在治疗具有细胞增殖性病症的个体的方法中使用，包括对该个体施用有效量的该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。在又一个实施方案中，本发明提供抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于在在具有细胞增殖性病症(例如AML)的个体中增强免疫功能中使用。在某些实施方案中，本发明提供抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于在在具有细胞增殖性病症(例如AML)的个体中增强免疫功能的方法中使用，包括对该个体施用有效量的该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)以激活效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)，扩充(增加)效应细胞群体，和/或杀伤靶细胞(例如靶细胞)。依照上述实施方案任一的“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体))在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症和/或AML)。在又一个实施方案中，该药物用于治疗细胞增殖性病症(例如AML)的方法，包括对具有细胞增殖性病症(例如AML)的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。在又一个实施方案中，该药物用于在该个体中激活效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)，扩充(增加)效应细胞群体，和/或杀伤靶细胞(例如靶细胞)。在又一个实施方案中，该药物用于在具有细胞增殖性病症(例如AML)或自身免疫性病症的个体中增强免疫功能的方法，包括对该个体施用有效量的该药物以激活效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)，扩充(增加)效应细胞群体，和/或杀伤靶细胞(例如靶细胞)。依照上述实施方案任一的“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供一种用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症和/或AML)的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有此类细胞增殖性病症(例如AML)的个体施用有效量的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。依照上述实施方案任一的“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供一种用于在具有细胞增殖性病症(例如AML)的个体中增强免疫功能的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)以激活效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)，扩充(增加)效应细胞群体，和/或杀伤靶细胞(例如靶细胞)。在一个实施方案中，“个体”为人。
可以在例如体外，离体，和体内治疗方法中使用本发明的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。一方面，本发明提供在体内或在体外用于抑制细胞生长或增殖的方法，该方法包括在允许结合至CLL-1的条件下将细胞暴露于抗CLL-1抗体。“抑制细胞生长或增殖”表示将细胞的生长或增殖降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，或100％，而且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，该细胞为肿瘤细胞。在又一些实施方案中，该细胞是单核细胞，粒细胞，和/或单核细胞/粒细胞谱系的祖先。在一些实施方案中，该细胞对于FLT3内部串联重复的存在呈阳性。在一些实施方案中，细胞对于MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞对于染色体11q23易位的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞对于易位t(9；11)(p22；q23)的存在呈阳性。
本文中提供的任何抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)可以在例如治疗方法等方法中使用。
一方面，本文中提供的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)用于抑制CLL-1阳性细胞增殖(CLL-1阳性细胞增殖性病症)的方法，该方法包含在允许该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)结合该细胞表面上的CLL-1的条件下将该细胞暴露于该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，由此抑制该细胞的增殖。在某些实施方案中，该方法是体外或体内方法。在又一些实施方案中，该细胞是单核细胞，粒细胞，和/或单核细胞/粒细胞谱系的祖先。在一些实施方案中，该细胞对于FLT3内部串联重复的存在呈阳性。在一些实施方案中，细胞对于MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞对于染色体11q23易位的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞对于易位t(9；11)(p22；q23)的存在呈阳性。
体外细胞增殖抑制可使用可购自Promega(Madison，WI)的CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法来测定。该测定法基于存在的ATP(它是代谢活跃细胞的指标)的量化来测定培养物中的可存活细胞数目。参见Crouch et al.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree et al.(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(CellTiter-试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
另一方面，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用作药物的。在又一些方面，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于治疗方法。在某些实施方案中，提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，其用于治疗细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)。在某些实施方案中，本发明提供了抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3TDB抗体)，其用于治疗具有细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)的个体的方法，该方法包含对该个体施用有效量的该抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一个另外的治疗剂，例如下文描述的。
又一方面，本发明提供抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)。在一些实施方案中，该癌症是AML。在又一个实施方案中，该药物用于治疗细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)的方法，该方法包含对具有CLL-1阳性癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一个另外的治疗剂，例如下文描述的。
又一方面，本发明提供用于治疗CLL-1阳性癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包含对具有此类CLL-1阳性癌症的个体施用有效量的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3TDB抗体)。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一个另外的治疗剂，例如下文描述的。
依照上述实施方案任一的细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)可以是例如CLL-1阳性AML，CLL-1阳性慢性髓样白血病(CML)，CLL-1阳性骨髓增生异常综合征(MDS)，CLL-1阳性慢性骨髓单核细胞白血病，CLL-1阳性APL，CLL-1阳性慢性骨髓增生性病症，CLL-1阳性血小板性白血病，CLL-1阳性pre-B-ALL，CLL-1阳性preT-ALL，CLL-1阳性多发性骨髓瘤，CLL-1阳性肥大细胞病，CLL-1阳性肥大细胞白血病，CLL-1阳性肥大细胞肉瘤，CLL-1阳性髓样肉瘤，CLL-1阳性淋巴样白血病，和CLL-1阳性未分化性白血病。在一些实施方案中，CLL-1阳性癌症是在实施例B中本文所述条件下得到大于“0”的抗CLL-1免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，CLL-1阳性癌症以1+，2+或3+水平表达CLL-1，如在实施例B中本文所述条件下定义的。在一些实施方案中，CLL-1阳性癌症是根据检测CLL-1mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法表达CLL-1的癌症。在一些实施方案中，该RT-PCR是定量RT-PCR。
在一些实施方案中，依照上述实施方案任一的细胞增殖性病症可以是例如AML，CML，和/或MDS。在一些实施方案中，CLL-1阳性细胞增殖性病症是CLL-1阳性AML，CLL-1阳性CML，CLL-1阳性MDS。在一些实施方案中，该AML是AML亚型1，AML亚型2，AML亚型3，AML亚型4，AML亚型5，AML亚型6，和AML亚型7中的一项或多项。在一些实施方案中，该AML是AML亚型3(急性早幼粒细胞性白血病，APML)。在一些实施方案中，该AML是AML亚型1，AML亚型2，AML亚型4，AML亚型5，AML亚型6，和AML亚型7中的一项或多项，而非AML亚型3。
在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于FLT3，核磷蛋白(NPM1)，CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)(CEBPA)，和/或c-KIT中的突变的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于FLT3内部串联重复的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于FLT3酪氨酸激酶域点突变的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于异柠檬酸脱氢酶1和/或2(IDH1和/或IDH2)中的突变的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)中的突变的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)是对于(a)在NPM1和FLT3中的突变，(b)野生型NPM1和突变型FLT3，和/或(c)野生型NPM1和FLT3的存在呈阳性的NK-AML。
在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)是阳性细胞遗传学异常，诸如t(15；17)，t(8；21)，inv(16)，t(16；16)，t(9；11)(p22；q23)，t(6；9)(p23；q34)，inv(3)(q21q26.2)，inv(3；3)(q21；q26.2)，t(1；22)(p13；q13)，t(8；21)(q22；q22)，inv(16)(p13；1q22)，t(16；16)(p13.1；q22)，和/或t(15；17)(q22；q12)中的一项或多项。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对于染色体11q23易位的存在呈阳性。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症)是对于易位t(9；11)(p22；q23)的存在呈阳性的细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)。
在一些实施方案中，该细胞增殖性病症(例如CLL-1阳性癌症和/或AML)对抗AML抗体药物缀合物不应和/或有抗性。在一些实施方案中，该抗AML抗体药物缀合物是抗CD33抗体药物缀合物，抗CLL1抗体药物缀合物，和/或抗CD123抗体药物缀合物。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物是抗CLL-1抗体药物缀合物(例如抗CLL-1吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物是抗CD33抗体药物缀合物(例如抗CD33吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CD123抗体药物缀合物是抗CD123抗体药物缀合物(例如抗CD123吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物记载于US 8,088,378和/或US 2014/0030280任一，据此通过援引将其完整收录。
依照上述实施方案任一的“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)，例如用于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗CLL-1抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)和至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
在本文中描述的方法，用途，和/或药物配制剂任一的一些实施方案中，该抗CLL-1/CD3 TDB抗体可用作治疗诱导疗法(treatment induction therapy)。在本文中描述的方法，用途，和/或药物配制剂任一的一些实施方案中，该抗CLL-1/CD3 TDB抗体可用作巩固疗法(consolidation therapy)。在本文中描述的方法，用途，和/或药物配制剂任一的一些实施方案中，该抗CLL-1/CD3 TDB抗体可用作挽救疗法(salvage therapy)。
可以在疗法中单独或与其它药剂组合使用本文中描述的抗体(例如抗CLL-1/CD3TDB抗体)。例如，可以与至少一种另外的治疗剂共施用本文中描述的抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是蒽环类抗生素。在一些实施方案中，该蒽环类抗生素是柔红霉素或伊达比星。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是阿糖胞苷。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是克拉屈滨。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是氟达拉滨或托泊替康。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是低甲基化剂，诸如5-氮胞苷或decitabine或guadecitabine。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是ATRA(全反式视黄酸)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是三氧化二砷(也称作trisenox)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是盐酸柔红霉素(也称作cerubidine或rubidomycin)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是环磷酰胺(也称作clafen，cytoxan，或neosar)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是阿糖胞苷(也称作cytosar-u，tarabine pfs，或Ara-C)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是盐酸多柔比星。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是盐酸伊达比星(也称作idamycin)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是硫鸟嘌呤(也称作tabloid)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是硫酸长春新碱(也称作vincasar pfs)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是沙帕他滨(sapacitabine)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是laromustine。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是tipifarnib。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是硼替佐米(bortezomib)(也称作VELCADE)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是羟脲。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是依托泊苷。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是米托蒽醌。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是氯法拉滨(clofarabine)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是羟脲。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是FLT3抑制剂，诸如quizartinib或米哚妥林(midostaurin)。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是抗癌喹诺酮衍生物。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是vosaroxin。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是IDH1抑制剂或IDH2抑制剂。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是CHK1抑制剂。在一些实施方案中，该CHK1抑制剂是GDC-0575。在一些实施方案中，该另外的治疗剂是Plk抑制剂，诸如volasertib。
在该方法任一的一些实施方案中，该另外的治疗剂是BCL2抑制剂。在一些实施方案中，该BCL2抑制剂是venetoclax。
在该方法任一的一些实施方案中，该另外的治疗剂是表观遗传修饰剂。在一些实施方案中，该表观遗传修饰剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。在一些实施方案中，该表观遗传修饰剂是DNA甲基转移酶I抑制剂。在一些实施方案中，该表观遗传修饰剂是组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，该表观遗传修饰剂是BET抑制剂。在一些实施方案中，该BET抑制剂选择性靶向第一bromo域(BD1)。在一些实施方案中，该BET抑制剂选择性靶向第二bromo域(BD2)。在一些实施方案中，该BET抑制剂是GSK1210151A，GSK525762，OTX-01，TEN-010，CPI-203，和CPI-0610中一种或多种。
在一些实施方案中，本文中描述的抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)可以与化疗剂共施用。在一些实施方案中，该化疗剂是阿糖胞苷，盐酸柔红霉素，和依托泊苷。在一些实施方案中，该化疗剂是盐酸柔红霉素和阿糖胞苷。在一些实施方案中，该化疗剂是fludara和oforta。在一些实施方案中，该化疗剂是阿糖胞苷和蒽环类抗生素。在一些实施方案中，该蒽环类抗生素是柔红霉素，伊达比星，多柔比星，或表柔比星。在一些实施方案中，该化疗剂是米托蒽醌，依托泊苷，和阿糖胞苷。在一些实施方案中，该化疗剂是阿糖胞苷，蒽环类抗生素，和氯法拉滨。
在一些实施方案中，本文中描述的抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)可以与化疗剂和粒细胞集落刺激因子共施用。在一些实施方案中，该化疗剂是氟达拉滨和阿糖胞苷。在一些实施方案中，该化疗剂是氟达拉滨，阿糖胞苷，和伊达比星。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括另外的疗法。所述另外的疗法可以为放射疗法、手术、化学疗法、基因疗法，DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法(nanotherapy)，单克隆抗体疗法，或前述疗法的组合。所述另外的疗法可以为辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用副作用限制剂(例如意图减轻治疗副作用的发生和/或严重性的药剂，诸如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法。在一些实施方案中，所述另外的疗法为手术。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，所述另外的疗法为γ照射。在一些实施方案中，所述另外的疗法为干细胞移植。在一些实施方案中，所述另外的疗法可以为分开施用一种或多种上文所述治疗剂。
在该方法任一的一些实施方案中，该另外的治疗剂为糖皮质激素。在一些实施方案中，该糖皮质激素选自由地塞米松，氢化可的松，可的松，泼尼松龙，泼尼松，甲泼尼龙，曲安西龙，帕拉米松，倍他米松，氟氢可的松，及其药学可接受酯，盐，和复合物组成的组。在一些实施方案中，该糖皮质激素为地塞米松。在一些实施方案中，该糖皮质激素为地塞米松的药学可接受酯，盐，或复合物。在一些实施方案中，该糖皮质激素为泼尼松。
在一些实施方案中，该另外的疗法进一步包含抗AML抗体药物缀合物。在一些实施方案中，该抗AML抗体药物缀合物是抗CD33抗体药物缀合物，抗CLL1抗体药物缀合物，和/或抗CD123抗体药物缀合物。在一些实施方案中，该抗CD33抗体药物缀合物是吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(也称作MYLOTARG)。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物是抗CLL-1抗体药物缀合物(例如抗CLL-1吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物是抗CD33抗体药物缀合物(例如抗CD33吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CD33抗体药物缀合物是vadastuximab talirine(也称作SGN-CD33A)。在一些实施方案中，该抗CD123抗体药物缀合物是抗CD123抗体药物缀合物(例如抗CD123吡咯苯并二氮杂卓(PBD)抗体药物缀合物)。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体药物缀合物记载于US 8,088,378和/或US 2014/0030280任一，据此通过援引将其完整收录。
在该方法任一的一些实施方案中，该另外的疗法包含癌症免疫疗法。在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含PD-1轴结合拮抗剂。在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体结合人PD-1。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是MDX-1106(也称作(BMS-936558/ONO-4538，nivolumab或OPDIVO)。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是MK-3475(也称作SCH900475，pembrolizumab，lambrolizumab，或KEYTRUDA)。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是pidilizumab(也称作CT-011)。
在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体结合人PD-L1。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是单克隆抗体。可以在本文所述方法中使用的抗PD-L1抗体的例子记载于PCT专利申请WO 2010/077634 A1和美国专利No.8,217,149，通过援引将其完整收入本文。可用于本文所述方法的抗PD-L1抗体的别的例子记载于PCT专利申请WO 2007/005874，WO 2011/066389，和US 2013/034559，通过援引将其完整收入本文。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是选自由Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和(Fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是人抗体。
可以在本文所述方法中使用WO 2010/077634A1和US 8,217,149中记载的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是BMS-936559。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是MEDI4736。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是MPDL3280A(CAS登记号1380723-44-3)。在某些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:94的重链可变区序列和SEQ ID NO:95的轻链可变区序列。在仍有又一个实施方案中，提供的是分离的抗PD-L1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:94)，且
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:95)。
在一个实施方案中，该抗PD-L1抗体包含重链可变区，其包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其中：
(a)该HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:96)；
(b)该HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:97)；且(c)该HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:98)；
进一步其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。
在一个具体的方面，X1是D；X2是S且X3是T，使得
(a)该HVR-H1序列是GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:99)；
(b)该HVR-H2序列是AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:100)；且
(c)该HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:98)；
另一方面，该重链多肽进一步与可变区轻链组合，其包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中：
(a)该HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:101)；
(b)该HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:102)；且
(c)该HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:103)；
其中：X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。在仍有又一个方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A，使得
(a)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:104)；
(b)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQ ID NO:105)；且
(c)该HVR-L3序列是QQYLYHPAT(SEQ ID NO:106)。
如此，在某些实施方案中，抗PD-L1抗体包含包含下述HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区，且包含包含下述HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列的轻链可变区：
(a)该HVR-H1序列是GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:99)；
(b)该HVR-H2序列是AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:100)；
(c)该HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:98)；
(d)该HVR-L1序列是RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:104)；
(e)该HVR-L2序列是SASFLYS(SEQ ID NO:105)；且
(f)该HVR-L3序列是QQYLYHPAT(SEQ ID NO:106)。
在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法疗法包含PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含PD-L2/IgG1融合蛋白(AMP-224)。
在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含针对激活性共刺激分子的激动剂。在一些实施方案中，激活性共刺激分子可包括CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127。在一些实施方案中，该针对激活性共刺激分子的激动剂是结合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127的激动性抗体。在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含针对抑制性共刺激分子的拮抗剂。在一些实施方案中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也称作CD152)，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶。在一些实施方案中，该针对抑制性共刺激分子的拮抗剂是结合CTLA-4，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶的拮抗性抗体。
在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含CTLA-4(也称作CD152)抑制。在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含CTLA-4拮抗剂。在一些实施方案中，该CTLA-4拮抗剂是抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，该抗CTLA-4抗体是ipilimumab(也称作MDX-010，MDX-101，或)。在一些实施方案中，该抗CTLA-4抗体是tremelimumab(也称作ticilimumab或CP-675,206)。
在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含针对B7-H3(也称作CD276)的拮抗剂，例如阻断性抗体。在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含MGA271(也称作enoblituzumab)。
在一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含针对TGFβ的拮抗剂，例如metelimumab(也称作CAT-192)，fresolimumab(也称作GC1008)，或LY2157299。在该方法任一的一些实施方案中，该癌症免疫疗法包含免疫激动剂。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)(例如CAR T细胞)的过继转移。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对WT1的CAR T细胞。在一些实施方案中，该针对WT1的CAR T细胞是WT128z。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对LeY的CAR T细胞。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD33的CAR T细胞。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD123的CART细胞。在一些实施方案中，该另外的治疗包含包含显现-阴性TGFβ受体，例如显现-阴性TGFβII型受体的T细胞的过继转移。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD47的拮抗剂。在一些实施方案中，该针对CD47的拮抗剂是抗CD47抗体。在一些实施方案中，该抗CD47抗体是Hu5F9-G4。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD137(也称作TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的激动剂，例如激活性抗体。在一些实施方案中，该另外的疗法包含urelumab(也称作BMS-663513)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD40的激动剂，例如激活性抗体。在一些实施方案中，该另外的疗法包含CP-870893或RO7009789。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对OX40(也称作CD134)的激动剂，例如激活性抗体。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对CD27的激动剂，例如激活性抗体。在一些实施方案中，该另外的疗法包含CDX-1127(也称作varlilumab)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是GDC-0919(也称作NLG919和RG6078)。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸(也称作1-D-MT)。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是WO2010/005958中显示的IDO拮抗剂(通过记录将其内容明确收入本文)。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N’-羟基-1,2,5-口恶二唑-3-亚氨代甲酰胺(例如记载于WO2010/005958的实施例23)。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是
在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是INCB24360。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是Indoximod(1-甲基-色氨酸的D异构体)。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含抗肿瘤剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向CSF-1R(也称作M-CSFR或CD115)的药剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含抗CSF-1R抗体(也称作IMC-CS4或LY3022855)在一些实施方案中，该另外的疗法包含抗CSF-1R抗体，RG7155(也称作RO5509554或emactuzumab)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含干扰素，例如干扰素α或干扰素γ。在一些实施方案中，该另外的疗法包含Roferon-A(也称作重组干扰素α-2a)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含GM-CSF(也称作重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，rhuGM-CSF，沙格司亭(sargramostim)，或)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-2(也称作阿地白介素或)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-12。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL27。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-15。在一些实施方案中，该另外的疗法包含ALT-803。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向GITR的抗体。在一些实施方案中，该靶向GITR的抗体是TRX518。在一些实施方案中，该靶向GITR的抗体是MK04166(Merck)。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含AG-120(Agios)。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含癌症疫苗。在一些实施方案中，该癌症疫苗是个性化癌症疫苗。在一些实施方案中，该癌症疫苗是肽癌症疫苗。在一些实施方案中，该肽癌症疫苗是多价长肽，多重肽，肽混合物，杂合肽，或经肽脉冲的树突细胞疫苗(参见例如Yamada et al.,Cancer Sci,104:14-21,2013)。在一些实施方案中，该癌症疫苗是基于DNA的癌症疫苗。在一些实施方案中，该基于DNA的癌症疫苗包含裸DNA。在一些实施方案中，该基于DNA的癌症疫苗包含经DNA转染的细胞。在一些实施方案中，该细胞是树突细胞。在一些实施方案中，该癌症疫苗是基于RNA的癌症疫苗。在一些实施方案中，该基于RNA的癌症疫苗是基于mRNA的癌症疫苗。在一些实施方案中，该基于mRNA的癌症疫苗包含裸RNA。在一些实施方案中，该基于RNA的癌症疫苗包含经RNA转染的细胞。在一些实施方案中，该RNA包被在颗粒上。在一些实施方案中，该RNA在体外转染到树突细胞中。在一些实施方案中，该mRNA剪裁成作为佐剂起作用来刺激先天免疫系统。在一些实施方案中，该癌症疫苗包含佐剂。在一些实施方案中，该佐剂包含TLR激动剂，例如Poly-ICLC(也称作)，LPS，MPL，或CpG ODN。在一些实施方案中，该癌症疫苗包含脂质体。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-10拮抗剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-4拮抗剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-13拮抗剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含IL-17拮抗剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含HVEM拮抗剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含ICOS激动剂，例如通过施用ICOS-L，或针对ICOS的激动性抗体。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向CX3CL1的治疗。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向CXCL9的治疗。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向CXCL10的治疗。在一些实施方案中，该另外的疗法包含靶向CCL5的治疗。在一些实施方案中，该另外的疗法包含LFA-1或ICAM1激动剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含选择蛋白激动剂。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含MEK，诸如MEK1(也称作MAP2K1)和/或MEK2(也称作MAP2K2)的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含cobimetinib(也称作GDC-0973或XL-518)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含trametinib(也称作)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含binimetinib。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的δ-选择性抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含idelalisib(也称作GS-1101或CAL-101)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含taselisib(也称作GDC-0032)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含BYL-719。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含LSD1(也称作KDM1A)的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含ORY-1001。在一些实施方案中，该另外的疗法包含GSK2879552。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含MDM2的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含RG7112。在一些实施方案中，该另外的疗法包含idasanutlin(也称作RG7388或RO5503781)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含DS-3032b。在一些实施方案中，该另外的疗法包含SAR405838。在一些实施方案中，该另外的疗法包含CGM-097。在一些实施方案中，该另外的疗法包含MK-8242。在一些实施方案中，该另外的疗法包含AMG-232。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含BCL2的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含venetoclax。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含CHK1的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含GDC-0575(也称作ARRY-575)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含GDC-0425(也称作RG7602)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含LY2606368。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含激活的hedgehog信号传导途径的抑制剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含ERIVEDGE。
在一些实施方案中，该另外的疗法包含将T细胞募集至肿瘤的药剂。在一些实施方案中，该另外的疗法包含lirilumab(IPH2102/BMS-986015)。在一些实施方案中，该另外的疗法包含Idelalisib。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生CLL-1/CD3 TDB抗体的施用。
在任何方法的一些实施方案中，可以通过任何合适的手段(包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用)来施用本发明抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。在一些实施方案中，施用是皮下的。
本发明抗体会以一种符合优秀的医学实践的方式配制，定剂量和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂投递部位，施用方法，施用日程表及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药物的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文所述其它因素。这些通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的斟酌。抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。
作为一般建议，施用于人的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)的治疗有效量会在约0.01至约100mg/kg患者体重的范围中，无论是通过一次或多次施用。在一些实施方案中，所使用的抗体为例如每天施用约0.01至约45mg/kg，约0.01至约40mg/kg，约0.01至约35mg/kg，约0.01至约30mg/kg，约0.01至约25mg/kg，约0.01至约20mg/kg，约0.01至约15mg/kg，约0.01至约10mg/kg，约0.01至约5mg/kg，或约0.01至约1mg/kg。在一个实施方案中，在21天周期的第1天以约100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg的剂量将本文中描述的抗CLL-1抗体(例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)施用于人。该剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。对于几天或更长时间上的重复施用，根据状况，治疗通常会持续直至疾病症状发生期望的阻抑。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以将一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，或10mg/kg(或其任意组合)施用于患者。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20剂，或例如约6剂抗CLL-1抗体，例如抗CLL-1/CD3 TDB抗体)。可以施用较高的初始加载剂，接着是较低的一或多剂。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
H.制品
在本发明的另一个方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品或试剂盒可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针，和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括抗CLL-1抗体，其中该抗体包含本发明的CLL-1结合域和CD3结合域。在一些实施方案中，该抗CLL-1抗体是双特异性抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1：抗CLL-1抗体
A.单克隆抗体生成
使用下述规程生成针对人(hu)和食蟹猴(cyno)CLL-1的单克隆抗体，即给动物免疫接种在哺乳动物表达系统中表达的融合至N端Flag(DYKDDDDK(SEQ ID NO:108))的重组huCLL-1和cynoCLL-1胞外域(ECD，huCLL-1的氨基酸65-265和cynoCLL-1的氨基酸65-265)。huCLL1ECD蛋白质(氨基酸65-265)包含一处SNP，AAA(Lys，K)244->CAA(GLN，Q)，且具有29％的次要等位基因频率(MAF)。
扩充阳性克隆，并通过ELISA和FACS重筛选对huCLL-1和cynoCLL-1的结合。鉴定出5个克隆：m3H10，m6E7，m20B1，m21C9，和m28H12，它们与表达重组人和食蟹猴CLL-1的稳定细胞系(根据荧光激活细胞分选(FACS))和在急性髓样白血病肿瘤细胞系上表达的肿瘤衍生CLL-1强烈反应。鼠重和轻可变域的氨基酸序列的比对显示于图1A和B。m3H10和m21C9分享相同的重和轻链CDR，只有m21C9重和轻链可变区的氨基酸序列显示于图1。
B.物种交叉反应性和结合亲和力
测试单克隆抗体以测定它们是否与cynoCLL-1胞外域(ECD)(它与huCLL-1蛋白质ECD85.07％同一且87.35％相似)交叉反应。通过在CM5传感器芯片上包被的小鼠抗人IgG捕捉嵌合抗CLL-1人IgG。为了动力学测量，注射人或食蟹猴CLL-1在HBS-EP缓冲液中的3倍连续稀释液(4.1nM至1000nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为koff/kon比计算平衡解离常数(KD)。下文表2显示了嵌合型式的五种抗体(m3H10，m6E7，m20B1，m21C9，和m28H12)识别重组人和食蟹猴CLL-1二者且提供关于与人和食蟹猴CLL-1的相互作用的动力学的详情。通过来自食蟹猴(毛里求斯起源)的血液的FACS分析，进行对cynoCLL-1的交叉反应性的进一步确认(数据未显示)。
表2。抗CLL-1抗体的Biacore
配体 分析物 Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
ch3H10 huCLL-1-Flag 2.7X105 2.4X10-3 8.7nM
cynoCLL-1 Flag 1.7X105 7.7X10-4 4.3nM
ch6E7 huCLL-1-Flag 4.6X105 4.4X10-4 0.9nM
cynoCLL-1 Flag 4.0X105 4.6X10-4 1.1nM
ch20B1 huCLL-1-Flag 2.2X105 1.0X10-3 4.5nM
cynoCLL-1 Flag 1.9X105 1.2X10-3 6.1nM
ch21C9 huCLL-1-Flag 2.5X105 2.4X10-3 9.7nM
cynoCLL-1 Flag 1.6X105 1.2X10-3 7.1nM
ch28H12 huCLL-1-Flag 5.0X105 9.5X10-3 18nM
cynoCLL-1 Flag 6.7X105 2.3X10-4 0.3nM
遵循标准规程(Holmes et al.，Science 256:1205-1210(1992))实施Scatchard分析以测定抗体的相对结合亲和力，包括ch6E7和ch21C9。
使用间接Iodogen方法[I125]标记抗CLL-1抗体。使用NAP-5柱(GE Healthcare)通过凝胶过滤自游离125I-Na纯化[I125]标记的抗CLL-1抗体；纯化后的碘化抗CLL-1抗体具有8-10μCi/μg的比活性范围。将50μL体积的含有固定浓度的[I125]标记的抗体和递减浓度的连续稀释的未标记的抗体的竞争测定法混合物分配入96孔板中。于37℃在5％CO2中在生长培养基中培养稳定表达重组huCLL-1或cynoCLL-1的HEK293AD细胞或表达内源CLL-1的HL-60肿瘤细胞。使用Sigma细胞解离溶液自烧瓶脱离细胞，并用由含1％牛血清清蛋白(BSA)，300mM人IgG和0.1％叠氮化钠的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)组成的结合缓冲液清洗。以0.2mL结合缓冲液中100,000个细胞的密度将清洗后的细胞添加至96孔板。每个孔中[I125]标记的抗体的终浓度为约250pM。竞争测定法中未标记的抗体的终浓度范围为1000nM(经由10个2倍稀释步骤)至0nM仅测定缓冲液。一式三份进行竞争测定法。竞争测定体系于室温温育2小时。2小时温育后，将竞争测定体系转移至Millipore Multiscreen滤板(Billerica，MA)，并用结合缓冲液清洗4次以自结合的[I125]标记的抗体分出游离的[I125]标记的抗体。在Wallac Wizard 1470伽马计数器(PerkinElmer Life and AnalyticalSciences Inc.；Wellesley，MA)上对滤器计数。使用NewLigand软件(Genentech)评估结合数据，该软件使用Munson和Robard的拟合算法来确定抗体的结合亲和力(Munson andRobard,1980)。
表3显示对由HEK293AD CLL-1稳定细胞表达的重组huCLL-1和cynoCLL-1和HL-60细胞的亲和力(kD范围0.45-1.2nM)。
表3：抗体对CLL-1的亲和力[kD＝nM](Scatchard分析)
细胞 ch6E7 ch21C9
HL-60 KD(nM) 0.65 0.45
EOL-1 KD(nM)
293AD/huCLL-1 KD(nM) 0.80 0.59
293AD/cynoCLL-1 KD(nM) 1.0 1.2
C.单克隆抗体表位分组
还使用一种基于细胞的竞争结合FACS测定法来测定表位分组。将HL-60细胞在有或无50-100倍过量的未标记的竞争抗体下预温育，然后用直接标记的检测抗体染色，来自检测抗体的信号降低指示未标记的竞争抗体与检测抗体结合CLL-1上相同或相似的区域–这应当在使用同一抗体作为检测物和竞争物时发生。当检测物信号没有被不同的未标记的抗体封闭时，未标记的抗体结合CLL-1中不同的区域。
表4。抗CLL-1竞争实验
表4显示针对CLL-1的抗体的表位分组。ch6E7和ch21C9，与R&DSystems-PE(克隆687317)同仓，但是ch20B1和ch28H12不然。R&D Systems还封闭eBioscience克隆HB3，但是ch6E7和ch21C9不能够封闭eBioscience克隆HB3结合。ch20B1和ch28H12未能与任何其它抗体竞争，提示每一种抗体结合独特的表位。所有抗体未能与BD Biosciences克隆50C1竞争，也提示它结合独特的表位。
D.抗CLL-1抗体的人源化
如下所述人源化单克隆抗体6E7和21C9。残基编号依照Kabat et al.,Sequencesof proteins of immunological interest，5th Ed.，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
以IgG的形式评估在6E7和21C9的人源化期间构建的变体。将来自鼠6E7和21C9的VL和VH域与人VL卡帕I(VLKI)和人VH亚组I(VHI)共有序列比对。将来自鼠抗体的高变区工程化改造入VLKI和VHI受体框架中。具体而言，将来自mu6E7和mu21C9VL域的位置24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)嫁接入VLKI中并将来自mu6E7和mu21C9VH域的位置26-35(H1)，50-65(H2)和93-102(H3)嫁接入VHI中。
通过BIAcoreTMT200型式测定这一节中的抗体的结合亲和力。简言之，用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂依照供应商的说明书活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。将山羊抗人Fc IgG偶联至芯片以实现每一个流动室中大约10,000个响应单位(RU)。用1M乙醇胺封闭未反应的偶联基团。为了动力学测量，捕捉抗体以实现大约300RU。于25℃以流速30μl/min注射人CLL-1在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中的3倍连续稀释液。使用1:1Langmuir结合模型(BIAcoreTMT200Evaluation Software version 2.0)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为koff/kon比计算平衡解离常数(Kd)。
将CDR嫁接人源化6E7抗体的结合亲和力与嵌合6E7比较。生成另外的CDR嫁接人源化6E7抗体的变体以评估其它游标位置对结合CLL-1的贡献。对于6E7，最初是4种另外的轻链(L1:CDR嫁接+(L4，L48，和K49)，L2:CDR嫁接+L4，L3:CDR嫁接+K49，和L4:CDR嫁接+K49)和5种另外的重链(H1:CDR嫁接+(A67，L69，V71，K73)，H2:CDR嫁接+A67，H3:CDR嫁接+L69，H4:CDR嫁接+V71，和H5:CDR嫁接+K73)。基于突变分析(数据未显示)，轻链上的K49是关键的小鼠游标残基，而重链上的L69和V71确定是关键的小鼠游标残基。嵌合6E7以9.59E-10M的Kd结合，而CDR嫁接+K49(LC)+(A67，L69，V71，K73(HC))，CDR嫁接+K49(LC)+(L69，V71(HC))分别以1.40E-9M，和1.37E-9M的Kd结合。
将CDR嫁接人源化21C9抗体的结合亲和力与嵌合21C9抗体比较。生成另外的CDR嫁接人源化21C9抗体的变体以评估其它游标位置对结合CLL-1的贡献。对于21C9，最初是3种另外的轻链(L1:CDR嫁接+(F36和S43)，L2:CDR嫁接+F36，L3:CDR嫁接+S43)和5种另外的重链(H1:CDR嫁接+(A67，L69，V71，K73)，H2:CDR嫁接+A67，H3:CDR嫁接+L69，H4:CDR嫁接+V71，和H5:CDR嫁接+K73)。轻链上的F36是关键小鼠游标残基。嵌合21C9以8.615E-9M的KD结合，而CDR嫁接+(F36和S43(LC))+L69(HC)和CDR嫁接+F36(LC)+L69(HC)分别以1.053E-8M和9.785-9M的KD结合。重链上的L69确定是关键小鼠游标残基。
如上所述对人源化6E7.L4H1e和21C9.L2H3测试它们结合人和食蟹猴CLL-1的能力，只是在食蟹猴结合测定法中cynoCLL-1替换huCLL-1。人源化抗体的结合特性显示于下文表5。使用HL-60，EOL-1，293AD/cynoCLL1，和293AD/huCLL-1细胞通过Scatchard测定的人源化6E7.L4H1e的结合亲和力分别为0.34，0.29，0.22，和0.35Kd(nM)。使用HL-60，EOL-1，293AD/cynoCLL1，和293AD/huCLL-1细胞通过Scatchard测定的人源化21C9.L2H3的结合亲和力分别为1.3，0.74，2.4，和3.6Kd(nM)。
表5
在热应力(40℃，pH 5.5，2周)和2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)氢氯化物(AAPH)分析下测试人源化抗体6E7.L4H1e和21C9.L2H3。对样品施加热应力以模拟产品在保存期里的稳定性。将样品交换缓冲液入20mM组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，pH 5.5并稀释至1mg/mL的浓度。对1mL样品施加应力，于40℃达2周，并将第二份保存于-70℃作为对照。然后使用胰蛋白酶消化这两份样品以产生能使用液体层析术(LC)–质谱术(MS)分析来分析的肽。对于样品中的每一种肽，自LC获取保留时间，以及在MS中获取高分辨率精确质量和肽离子片段化信息(氨基酸序列信息)。为感兴趣肽(天然和经修饰肽离子)以+-10ppm的窗口自数据集取得提取离子层析图(XIC)并对峰积分以确定面积。为每一份样品计算修饰的相对百分比，即将(经修饰肽的面积)/(经修饰肽的面积+天然肽的面积)x100。
6E7.L4H1e和h21C9.L2H3均在DR-H2中具有N54G55，其对脱氨基易感(对于6E7.L4H1e，t0＝13.2％和t2wk＝14.5％；和r0＝11％和t2wk＝11.9％)。测试这两种抗体的N54变体以确定是否能在不影响结合huCLL-1和cynoCLL-1的情况下降低潜在的脱氨基。见表6。
表6
对于人源化的6E7.L4H1e CDR-H2 N54抗体变体，A54具有与N54最相似的可接受的结合特征。对于人源化的21C9.L2H3 CDR-H2 N54抗体变体，所有变体显示亲和力的下降，针对huCLL-1在解离速率方面(10-30倍)，针对cynoCLL-1在结合速率方面(60-500倍)。使用293AD/cynoCLL1，293AD/huCLL-1，HL-60，和EOL-1细胞通过Scatchard测定的人源化6E7.L4H1e的结合亲和力分别为0.67，0.68，0.6，和0.25Kd(nM)。使用293AD/cynoCLL1，293AD/huCLL-1，HL-60，和EOL-1细胞通过Scatchard测定的人源化6E7.L4H1eN54A的结合亲和力分别为0.9，0.89，0.64，和0.32Kd(nM)。人源化6E7和21C9抗体的重和轻可变域氨基酸序列的比对分别显示于图2A-B和图3A-B。
E.表位作图
为了确定CLL-1的结合表位，实施使用羟基自由基足迹法(HRF)技术检查(a)游离抗原CLL-1和(b)三种不同抗原-单抗复合物。在Brookhaven国家实验室使用X28c束线将样品暴露于羟基自由基达0，10，15，和20毫秒(ms)的间隔。将经过标记的样品提交使用PNGaseF的脱糖基化。首先对脱糖基化样品进行试点实验来优化实验方案。使用MS的试点调查揭示该样品含有显著量的聚合物污染，需要另外的清洁。为了去除聚合物污染，在丙酮中使用三氯乙酸沉淀样品，并提交LC-MS分析。沉淀步骤是成功的，而且MS中的聚合物污染信号显著削弱。将经过清洁的样品提交还原和烷基化，使用胰蛋白酶消化，接着是液体层析术偶联高分辨率质谱术(LC-MS)。使用ProtMapMS分析MS数据，产生每一种肽的剂量响应图。针对每一种复合物形式比较来自游离抗原的结果。使用Swiss-Model软件生成抗原的基于同源性的模型，并为三种复合物每一种定位溶剂保护区。
使用胰蛋白酶定位获得的总体序列覆盖率为90.05％。缺少的区域主要由长度比4个残基要短的胰蛋白酶肽构成，由于它们在LC柱上的弱保留特性，它们会是内在难以检测的。HRF过程引入稳定的侧链氧化性修饰，导致特定的质量移位，自串联质谱术数据得到鉴定。为未氧化和所有氧化形式的肽离子(具有特定m/z)对选定的离子层析图(SIC)进行提取和积分。使用这些峰面积值以剂量响应(DR)图的形式表征反应动力学，其作为羟基自由基暴露的函数测量完整肽的损失。与游离抗原相反，复合物中的溶剂保护区经历逐渐氧化反应。氧化速率的差异(称作速率常数，RC)用来突显表位的定位。
使用ProtMapMS来加工MS数据，产生每一种肽的RC值。最终结果显示于表6。肽定位和对应的序列显示于第一和二栏。第三栏显示复合物1(6E7.L4H1eA54抗体和CLL-1抗原)的保护比，PR(＝RC抗原/RC复合物)。类似地，第四和五栏显示复合物2(工程化改造成轻链在依照Kabat编号方式的K149处包含半胱氨酸残基(K149C)的21C9.L2H3抗体和CLL-1抗原)和复合物3(R&D Systems单克隆抗CLL1抗体(克隆687317)和CLL-1抗原)的对应保护比。如果给定肽对于特定的PR值小于1，那么对应区域由于复合物形成期间引入的结构变化而经历溶剂可及性增益。接近1的PR值指示该区域的溶剂可及性保持不变，而PR>1提示作为复合物形成的功能，对应区域展现针对溶剂的保护。大多数肽对于每一种复合物的PR值接近1，指示对应区域的溶剂可及性中的最小限度变化。肽142-158对于所有三种抗体一致地显示最高PR值，暗示对该区域的显著保护。不像6E7.L4H1eAG和21C9.L2H3，在肽142-158的保护以外，R&D Systems单克隆抗CLL1抗体(克隆687317)还显示103-116区域的显著保护，如交叠肽103-116和105-116证明的。
表6
F.抗CLL-1抗体的内在化
为了测定抗CLL-1抗体是否在结合后得以内在化，将HL-60或HL-60细胞与0.3mg/ml hIgG一起在RPMI培养基中于37℃预温育2小时以降低对FcR的非特异性结合，之后在细胞培养物处理的4孔腔式载玻片(Nalge Nunc International)中接种。将终浓度1μg/mL的直接缀合至Dylight 488的抗体与hIgG封闭后的细胞一起在冰上在黑暗中温育30分钟。于37℃用Leica SP5共焦显微镜立即将细胞成像以显示膜染色(T0)，接着是10小时时段上的延时摄影。代表例ch21C9在30分钟内被HL-60细胞快速内在化(数据未显示)。使用一种体外基于细胞的测定法确认了ch21C9定位至溶酶体。
实施例2：CLL1T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体的功效
下面的实施例显示了包含一个臂上抗人CLL-1的和另一个臂上抗人CD3e的结合决定簇的工程化T细胞依赖性双特异性抗体是有力的免疫调控性分子，能重新引导个人的免疫系统来杀死来自人供体的急性髓样白血病肿瘤细胞和正常CD14+单核细胞。通过监测未触碰的人CD8+ T细胞对AML肿瘤细胞系(EOL-1，HL-60，THP-1，U937，Nomo-1，PL-21，ML-2和Molm-13)的杀伤或监测人PBMC群体中自体T细胞对自体CD14+单个核细胞的杀伤来证明TDB功效。
下面的实施例中使用的TDB含有来自抗CLL-1小鼠和人源化单克隆抗体克隆(它们来自三个不同表位仓：1)6E7和/或21C9，2)20B1，和3)28H12)的CLL-1结合决定簇，和来自人源化抗CD3ε克隆，通过Biacore测定的高亲和力抗体38E4v1和低亲和力抗体40G5c(hCD3ε1-27 Fc分别为1.0和13nM，hCD3εγ分别为0.5和12nM，及cynoCD3εγ分别为0.7和14nM)以及很高亲和力抗体38E4v11(hCD3为0.05nM；对hCD3ε的Fab Biacore测量为-5.00E+07ka(1/Ms)，1.60E-03kd(1/s)，和0.032KD(nM))的结合决定簇。对hCD3ε的Fab Biarcore测量，38E4v1为8.15E+06ka(1/Ms)，3.17E-03kd(1/s)，和0.389KD(nM)。38E4v1，38E4v11，和40G5c结合人CD3ε多肽(由氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ ID NO:87)组成的人CD3ε多肽片段)，而且结合不需要CD3ε的氨基酸残基Glu5(数据未显示；还参见PCT/US14/70951，通过援引将其完整收录)。
A.材料和方法
在所有实验中，靶细胞，AML肿瘤细胞系，PBMC，或AML患者骨髓细胞在含有10％FCS，2mM谷氨酰胺和0.3mg/ml经过纯化的低内毒素人IgG(Molecular Innovations，HU-GF-ED)的RPMI培养基中于37℃预温育1-2小时以阻止TDB对具有FcγR表面表达的细胞的非特异性结合。在第一个例子中，自正常人供体分离PBMC，并使用来自Miltenyi Biotec GmbH的试剂盒(Miltenyi；130-096-495)富集PBMC中的未触碰的CD8+T细胞。该测定法在装有60,000个细胞/孔的人CD8+T细胞和20,000个细胞/孔的hIgG封闭的靶细胞的96孔圆底板(Costar 3799)中实施；效应对靶比(E:T)为3:1。作为连续3倍稀释至跨越0–10ug/ml或0–1ug/ml的最终测定浓度的10倍工作溶液来添加TDB(例如h6E7(6E7.L4H1e)-38E4v1，h21C9(h21C9.L2H3)-38E4v1或阴性对照抗gD-38E4v1)。添加的次序如下：50ul 2X靶细胞，11ul10X 3倍连续稀释的TDB，和50ul 2X CD8+T细胞。将内容物在处于设置6的滴定板摇床(Thermo)上混合15秒并于37℃温育约40小时。每天一次将板混合。使用抗CD123-APC(BDPharmingen；560087)或抗CD33-APC试剂(BD Pharmingen；551378)任一和碘化丙啶通过FACS来监测表达hCLL-1的EOL-1，THP-1，HL-60，Nomo-1，ML-2，PL-21，U937和Molm-13细胞的消减。使用抗CD8-FITC(BD Pharmingen；555634)，抗CD69-PE(BD Pharmingen；555531)和抗CD25(BD Pharmingen；555434)的组合来监测CD8+T细胞激活。将Fluoresbrite校准微球体(Polysciences，Warrington，PA)添加至每一份样品以确保获取一致数目的事件。使用Flowjo v9.7.5进行数据分析并使用程序PRISM-4(GraphPad Software)确定EC50。
对于第二个例子，通过Hypaque-Ficoll梯度离心(Ficoll-Paque Plus，GEHealthcare)来分离人或食蟹猴PBMC，以低速清洗以去除血小板并在含有hIgG以封闭TDB对FcγR的非特异性结合的RPMI中重悬浮。该测定法如上所述实施，只是将浓度为200,000个/孔的PBMC与11ul 10X 3倍连续稀释的TDB一起温育。E:T比未测定且是供体依赖性的。在～40小时时通过FACS来评估靶细胞杀伤(CD14+单核细胞)和效应T细胞激活(CD8+)。使用抗CD14-APC试剂(人BD Pharmingen；555399，食蟹猴Miltenyi；130-091-243)和碘化丙啶来监测表达hCLL-1的CD14+单核细胞的消减。如上一节中概述地进行CD8+T细胞的激活。
TDB的生成–作为人IgG1以节入穴型式作为全长抗体生成TDB抗体，如先前描述的(Atwell et al.J.Mol.Biol.270：26-35,1997)。在大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞任一中表达半抗体，通过蛋白A亲和层析术来纯化，并在体外使正确的半抗体对退火，如先前描述的(Spiess et al.，Nat.Biotechnol.2013)。如果在CHO细胞中进行TDB抗体生成，那么该抗体可包括无糖基化突变，例如在残基N297处(例如N297G)，使得该TDB抗体是效应器较小变体且不能启动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
退火后，通过疏水相互作用层析术(HIC)来纯化抗CLL-1/CD3 TDB抗体并通过分析性凝胶过滤，质谱术，和聚丙烯酰胺凝胶电泳来表征。经过纯化的抗体在凝胶过滤中作为单峰(>99％的信号)运行，聚集体小于0.2％。质谱术没有检测到同二聚体。
B.结果
以TDB型式测试不同抗CLL1抗体组的功效。仓1包括亲本h6E7和h6E7变体和亲本h21C9，仓2包括20B1，而仓3包括28H12。如图4A所示，与非靶向性抗gD臂与38E4v1组合相比，亲本h6E7(6E7.L4H1eN54)以及变体6E7.L4H1eA54(仓1)与38E4v1组合导致显著的肿瘤细胞(EOL-1)杀伤，既是剂量依赖性的又是抗原特异性的。而且，具有显著降低的对hCLL-1的亲和力(113.2nM)的h6E7脱酰胺型式产物(6E7.L4H1eD54)与38E4v1组合显示可忽略的细胞杀伤。表位仓2抗CLL-1抗体20B1虽然具有与6E7.L4H1eA54相似的对人CLL-1的亲和力，但是与相同抗CD3臂(38E4v1)组合具有显著降低的肿瘤细胞(EOL-1)杀伤。表位仓3抗CLL-1抗体28H12与38E4v1组合显示可忽略的肿瘤细胞杀伤。见图4A。下文表7提供了结果的汇总。基于这些结果，进一步探索人/食蟹猴CLL-1表位仓1。
名称 huCLL-1[nM] cyCLL-1[nM] 细胞杀伤EC50(ng/ml)
h6E7.L4H1N54 1.1 2.2 14
h6E7.L4H1A54 3.1 3.1 34
H6E7.L4H1D54 113.2 48.7 >1000
20B1 4.5 6.1 531
28H12 18 0.3 >1000
h6E7和h21C9均是CLL-1表位仓1的一部分。如图4B所述实施实验以测试h6E7和h21C9抗CLL-1 TDB杀伤来自单一供体的表达人CLL-1的自体CD14+细胞或AML肿瘤细胞系(EOL-1/THP-1)任一的功效。与在最大TDB浓度1μg/ml显示无特异性杀伤或CD8+T细胞激活的阴性对照TDB，抗gD x38E4v1相比，两种CLL-1 TDB，h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1和h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1，均以剂量依赖性方式显示显著的靶细胞杀伤。而且，引发最大杀伤的TDB浓度与最大CD8+T细胞激活相符(图4C)。h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1杀伤靶细胞的EC50为9.1ng/ml(EOL-1)，5.4ng/ml(THP-1)，2.8ng/ml(人CD14+单核细胞)，而h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1为14.8ng/ml(人CD14+单核细胞)。
在使用其它供体的实验中(图5A)，h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1显示显著的对EOL-1的杀伤(EC50为16.3ng/ml)和很弱的对HL-60的活性，而h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1展现显著的对EOL-1(EC50为7.4ng/ml)和HL-60(EC50为95.6ng/ml)的杀伤。来自代表疾病的不同亚型的AML细胞系的CLL-1表达和杀伤数据以第三供体显示(图5B和C)，包括缺乏hIgG Fc区的Bis-Fab TDB，h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1对EOL-1细胞(点线)具有与h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1 hIgG TDB相似的杀伤。总之，h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1显示较好的体外效力，而且甚至对低细胞表面CLL-1表达性细胞系Molm-13也是有效的。
如图6A所示，h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1和h21C9(h21C9.L2H3)x38E4v1(程度较低)能够在含有所有亚型的T细胞的自体食蟹猴PBMC存在下杀伤食蟹猴CD14+细胞。另外，自PBMC分离的泛T细胞在EOL-1靶细胞和6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1存在下显示显著的靶细胞杀伤，EC50为～5ng/ml，与用人T细胞观察到的相似。引发最大杀伤的TDB浓度与最大CD8+T细胞激活相符(图6B)。
自多个供体测定的平均EC50的汇总显示于表8。如表7所示，使用HL-60细胞，EOL-1细胞，和人自体CD14+，h6E7(6E7.L4H1e)的功效比具有相同抗CD3臂(38E4v1)的h21C9(h21C9.L2H3)要大大约5-17倍。
表8。
在另一个例子中，对具有经过确认的AML诊断和CD34+细胞上显著的CD33和CLL-1二者表达(根据流式细胞术)的患者样品测试h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1 TDB的效力(图7A)。使用分离的未实验的同种异基因人CD8+T细胞和来自AML患者的冷冻的密度梯度纯化的骨髓细胞(Stanford Blood Bank，Stanford，CA)如上所述实施体外杀伤测定法。在含有下述补充物以支持造血干细胞/祖先的下述培养基中进行实验：Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)，10％热灭活的FCS，2mM谷氨酰胺，1X StemSpan CC100细胞因子混合物(StemCellTechnologies)，20ng/ml人GM-CSF，20ng/ml人G-CSF和0.3mg/ml低内毒素人IgG(MolecularInnovations，Novi，MI)。E∶T比为3∶1，分别使用150,000和50,000个细胞，并如上所述实施～40小时。
图7B显示与Ig匹配的非靶向性TDB，抗gD x 38E4v1相比，h6E7x38E4v1能够以剂量依赖性方式杀死AML暴发物(blast)。活的AML暴发物的数目在与抗gD x 38E4v1 TDB的40小时温育期间保持不变，提示h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1的杀伤是TDB特异性的，不是生长条件所致。
C.抗CLL-1 TDB的体内功效
下面的例子中使用的T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体包含人CLL-1和人CD3e抗原结合决定簇。抗人CLL-1臂包含6E7(6E7.L4H1e)或经过优化的变体h6E7(N54-A或-S或-E或-Q或-D)人源化Fab的序列任一，且抗人CD3e臂序列包含h40G.5c，38E4v1，或38E4v11人源化Fab任一(对应于低，高，或很高的对hCD3ε的亲和力任一)。
如上文关于体外杀伤测定法所述进行h6E7N54A(也称作6E7.L4H1eA54)的体外表征。图8A-D显示携带低亲和力(h40G5c)或高(38E4v1)或很高(38E4v11)亲和力hCD3e臂任一的6E7.L4H1eA54 TDB能够以剂量依赖性方式以相似的效力杀伤AML肿瘤细胞系。另外，进行与包含38E4v1或h40G5c任一的抗人CD3εFab配对的h6E7.L4H1e N54-A或-S或-E或-Q或-D人源化Fab的经过优化的变体的体外评估以测定hCLL-1臂的效力。图8E-G显示h6E7臂的更高的对人CLL-1的亲和力与同N54D变体相比改善的体外效力有关–天冬氨酸(D)是天冬酰胺(N)脱酰胺的产物，而且N54的这种修饰导致对CLL-1的更低亲和力结合。h6E7变体的效力的排序是相似的，不管人CD3ε臂是38E4v1或h40G5c。然而，如图8H-I所示，利用高亲和力抗人CD3e臂(38E4v1)导致在与低亲和力人CD3臂h40G5c相比要低的双特异性抗体浓度升高水平的T细胞激活。总之，EC50对于在38E4v1存在下的h6E7变体(N54-A或-S或-E或-Q)，和在h40G5c存在下的h6E7变体(N54-A或-E或-Q)是相似的。
表征共表达人CLL-1和人CD3ε的遗传工程改造小鼠并用于在体内测试抗人CLL-1TDB的功效。在Genentech生成人CLL-1(CLEC12a)BAC转基因C57BL/6N小鼠(Charles River，Wilmington，MA)和人CD3εBAC转基因C57BL/6N小鼠并依照美国实验动物护理联合会指导方针维持。另外，共表达人CLL-1和人CD3ε二者的双重BAC转基因小鼠通过亲本hCLL-1和hCD3εBAC转基因动物的繁殖来实现。证明抗人CLL-1x抗CD3εTDB在体内的效力的研究符合国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行且得到Genentech科研动物护理和使用委员会批准。
双重BAC-Tg(2xBAC-Tg)小鼠通过流式细胞术表征并显示表达转基因–人CLL-1和人CD3ε二者。用ACK裂解缓冲液处理来自转基因小鼠的血液以去除红血球并与封闭液(5％小鼠，5％大鼠和0.2mg/ml人IgG，0.5％BSA，2mM EDTA，在PBS中)一起在冰上预温育20分钟以减少对FcγR的非特异性结合。2xBAC-Tg CD8+效应T细胞上的人CD3ε表面表达的确认通过大鼠抗小鼠CD8-FITC(Miltenyi)和小鼠抗人CD3-PE(BD Biosciences)的染色来确认，而2xBAC-Tg CD11b+单核细胞上的人CLL-1表达的确认通过大鼠抗小鼠CD11b-FITC(BDBiosciences)和变体h6E7A(6E7L4H1eA54-Dylight650(Genentech)的染色来证明。图9显示来自双重BAC-Tg(hCLL-1/hCD3ε)小鼠的血液在小鼠CD8+T细胞上表达人CD3，且在小鼠CD11b+单核细胞但非小鼠粒细胞上表达人CLL-1。另外，图10显示任一转基因的表达水平与它们的对应亲本的相似。
为了证明嵌合CD8+T细胞(表达小鼠和人CD3二者)能够被包含抗人CD3ε臂的TDB激活，用多种浓度的TDB离体刺激血液达20-40小时，如A节中描述的。在这个实验中，使用Histopaque-1083(Aldrich-Sigma，St Louis，MO)通过密度梯度离心分离来自2xBAC-Tg小鼠的PBMC，接着是低速旋转以去除血小板。TDB的最终浓度范围为0.3–3000ng/ml，还为每一个测试项目包括无TDB对照。所使用的TDB为：抗gD x 38E4v1(同种型匹配的阴性对照)或亲本h6E7(6E7.L4H1eN54)x38E4v1或变体h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1或变体h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c。在～20或～40小时任一之后，将细胞用抗小鼠CD8-FITC和抗小鼠CD69(eBioscience，San Diego，CA)染色以通过流式细胞术量化T细胞效应器激活。图11显示所有CLL-1特异性TBD能够在3000ng/ml实现最大激活。
使用2xBAC-Tg小鼠进行测试含有抗人CLL-1和抗人CD3的多种臂组合的TDB抗体的效力的体内功效研究。将小鼠随机化分入5只的多个组并在第0天给予单剂静脉内0.1mg/kg或0.5mg/kg任一。将小鼠如下随机化分入各组：第1组(媒介；组氨酸缓冲液)，第2组(抗gD x38E4v1，以0.5mg/kg)，第3组(抗gD x h40G5，以0.5mg/kg)，第4组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)X38E4v1，以0.1mg/kg)，第5组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1，以0.5mg/kg)，第6组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5，以0.1mg/kg)，第7组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5，以0.5mg/kg)，和第8组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11，以0.5mg/kg)；抗gD TDB代表非CLL-1靶向性同种型匹配的抗体对照。在随机化和剂量给药之前，通过流式细胞术测定所有动物的表型以确认两种转基因的预期表达概况及CD8+细胞未激活(通过来表面CD69的表达判断)。在第-6，1，7，和14天通过流式细胞术进行CD8+细胞的激活和CD11b+单核细胞的计数。在分析时，使用来自未实验的2xBAC-Tg小鼠个体的血液来设置BD FACS Caliber及建立基线。在结束时(第15天)，收集来自小鼠的血液用于PK分析。
图12显示在剂量给药那天(第1天)之后，只有第4-8组中的动物具有显著升高水平的CD69表达。通过使用抗小鼠CD11b-FITC和抗人CLL-1-Alexa 647抗体(50C1；BDBiosciences，San Jose，CA)(它显示没有交叉封闭我们的治疗性抗体h6E7或h21C9)监测mCD11b+/hCLL-1+细胞消减来测量效力。效力与CD8+效应细胞的抗原特异性激活有关，因为在剂量给药之后那天用(G5)0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1 TDB和(G8)0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11 TDB处理的小鼠实现hCLL-1+细胞的最大消减，和用(G4)0.1mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1或(G7)0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c或(G6)0.1mg/kg h6E7(6E7.L4H1eN54)x h40G5c处理的小鼠实现显著的消减(图13)。在实验过程里，抗CLL-1特异性TDB在0.5mg/kg是最有效的，不管TDB包括低，高，或很高亲和力hCD3ε结合臂任一。在第14天，第5和7组中的小鼠维持至少～25-50％消减。在媒介或非CLL-1靶向性同种型匹配的TDB对照组中没有观察到CD8+T细胞激活或hCLL-1+细胞消减。在相似的实验中，亲本和h6E7的变体的效力是非常相似的(数据未显示)。
D.抗CLL-1 TDB的体外安全性评估
人造血干细胞(HSC；CD34+，CD38-)表达CD33但表现为不表达CLL-1。因此，为了确定对CLL-1特异性的TDB是否会是比靶向CD33的TDB更加有效且安全的治疗剂，用抗gD x38E4v1 TDB或h6E7(6E7.L4H1e)x 38E4v1 TDB处理人骨髓细胞，接着清点自HSC和祖细胞衍生的所得GEMM(粒细胞，红细胞，单核细胞，巨核细胞)集落形成单位。根据定义，HSC拥有自我更新和形成祖先和已分化谱系特异性细胞的特性，而祖先具有形成已分化谱系特异性细胞的集落的能力但不能自我更新。我们对HSC(CD34+和CD38-)和祖先/已分化(CD34+CD38+)细胞的表型测定显示CLL-1只由后者表达，比较而言，CD33在CD34+/CD38-和祖先/已分化细胞上检测到(图14)。
在下面的例子中，使用一种人集落形成细胞(CFU)测定法，MethoCult(StemCellTechnologies，Vancouver，BC，Canada)来测定抗人CLL-1 TDB处理对人骨髓衍生HSC在培养物中增殖和分化的能力的影响。在这种测定法中，可能预测没有CLL-1表达的未成熟造血细胞(HSC)应当免于CLL-1 TDB处理所致消减，而在细胞表面上表达CLL-1的谱系注定祖先和已分化细胞应当因该处理而消除。
自ALLCELLS(Alameda，CA)获取来自相同供体的新鲜人骨髓和血液，并通过密度梯度分开来加工。自血液PBMC分离人CD8+ T细胞并与骨髓白细胞一起用于体外杀伤测定法，如A节中描述的。效应(CD8+ T细胞)对靶(BM白细胞)比为3(150,000个细胞):1(50,000个细胞)。在含有下述补充物以支持HSC的Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)中重悬浮靶细胞：10％热灭活的FCS，2mM谷氨酰胺，StemSpan CC100细胞因子混合物(StemCellTechnologies)，20ng/ml人GM-CSF，20ng/ml人G-CSF和0.3mg/ml低内毒素人IgG(MolecularInnovations，Novi，MI)，并于37℃预温育1小时以封闭FcγR，之后添加CD8+T细胞和TDB。100ul测定体积中TDB的终浓度为5或50ng/ml任一。测试项目为h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1TDB，而IgG匹配的非靶向性阴性对照为抗人gD x 38E4v1 TDB。将细胞温育40小时。对两份复制品通过FACS检查CD14+单核细胞消减，并收获剩余3份复制品，清洗并在3ml MethoCult中重悬浮。自配有16g钝头针的3ml注射器将1.1ml小样分配入35mm皿(StemCellTechnologies)；每个处理组两块板。将皿温育14天，并自第7天至第14天进行监测。
杀伤测定法显示与抗人gD x 38E4v1阴性对照TDB相比，h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1TDB在5和50ng/ml两种浓度对CD14+骨髓单核细胞的特异性消减(图15A)。这确认了抗CLL-1TDB是功能性的。在第10天进行清点CFU-GM，-M，和-GEMM，结果显示于图15B。与用抗人gD x38E4v1处理或无处理的细胞相比，对以5ng/ml和50ng/ml用h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1处理的细胞观察到CFU-GM，-M和GEMM的～80％下降。假设这种CFU损失代表表达人CLL-1的成熟谱系已分化细胞和造血髓样祖先的消减。剩余CFU最有可能是人CLL-1(-)HSC的自我更新和分化能力的结果。这个结果提供了证据证明靶向表达人CLL-1的细胞的TDB并不显著影响造血能力。一项使用多200倍的h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1 TDB的类似实验给出了类似的结果。另外，在第14天达到红细胞的再生。h6E7(6E7.L4H1e)x38E4v1 TDB处理显示CFU-E和BFU-E与无处理细胞相比略微降低～25％，与抗人gDx 38E4v1 TDB相比略微降低～16％(图15C)。结果提示HSC的类红细胞再生大部分是完好无缺的。最后，表达CD33或CLL-1任一的人骨髓CD34+细胞的分选和在MethoCult测定法中的涂布只显示CD34+/CLL-1+群体的CFU-GM，CFU-G，或CFU-M重建，而CD34+/CD33+群体生成另外的细胞谱系(CFU-E和CFU-GEMM)，其指示更加原始的造血细胞(数据未显示)。
E.抗CLL-1 TDB的体内药动学和药效学
在体内研究抗人CLL-1 h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)和抗人CD3ε(h40G5c或38E4v1或38E4v11)双特异性抗体的组合以测定它们在外周血，骨髓和脾中的PK和PD。分别在SCIDbeige和2XBAC-Tg小鼠中表征非特异性和靶特异性PK。将小鼠随机化分入3只的多个组并在第0天给予单剂静脉内0.5mg/kg。将小鼠指派至下述组：第1组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)xh40G5c)，第2组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1)和第3组(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11)。如上所述进行使用hCLL-1x hCD3e BAC-Tg小鼠(2xBAC-Tg)的研究，并在下述时间点收集血液和组织：第-7天(给药前)，和给药后15分钟，2小时，6小时，第1，7，和14天。除给药前以外，所有时间点为终结。测量血液中的双特异性抗体浓度和细胞因子浓度。测量血液和组织中的T细胞激活和靶细胞数减少。在8色BD LSR Fortessa细胞分析仪上实施流式分析。
图17A显示在SCID小鼠(没有表达人CLL-1的T细胞(CD3)和髓样细胞)中，与非CLL-1靶向性同种型匹配的抗体对照(抗gD x h40G5c和抗gD x 38E4v1)相比，双特异性抗体(第1-3组)具有相似的随时间的抗体浓度。PK参数汇总于图17B，并说明在靶缺失下抗hCLL-1x抗CD3ε双特异性抗体展现与抗gD对照相似的PK和相当的清除。当在表达两种靶(人CD3ε和人CLL-1)的小鼠中检查这些双特异性抗体时，Cmax值在hCLL-1 x抗CD3ε分子之间是相当的。然而，观察到暴露中的CD3臂亲和力依赖性差异(图17C)。与包含38E4v1(CL＝23.5mL/d/Kg，AUC＝21.3d.μg/mL)或38E4v11(CL＝37.4mL/d/Kg，AUC＝18.1d.μg/mL)的双特异性抗体相比，h6E7N54A x h40G5c具有最慢的清除(CL＝10.6mL/d/Kg)，这转化为更高的随时间的药物暴露(AUC＝47.1d.μg/mL)(图17D)。
使用表达人CLL-1的小鼠细胞的减少作为外周血，骨髓和脾中的PD的度量。图18显示单剂0.5mg/kg h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c导致第7天左右外周血中的最大靶减少，伴随骨髓和脾中的靶细胞减少。用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v1(图19)和h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x38E4v11(图20)看到了类似且更加突出的效果。小鼠CD8+细胞上CD69的上调也与同最大靶减少相关的时间点有关(图21)。血液，骨髓和脾中靶细胞的缺失提示表达hCLL-1的靶细胞的减少不是因为边缘化至骨髓或脾。在合并的淋巴结中看到了类似的结果(数据未显示)。
在另一项实验中，用媒介或抗PD-L1(6E11)或0.1mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c或0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)xh40G5c和抗PD-L1的组合处理2xBAC-Tg小鼠。在第0天以10mg/kg IV给予抗PD-L1施用，接着是每周两次IP给药5mg/kg。两项独立体内研究的结果显示0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c和10mg/kg抗PD-L1的组合处理导致与用任一单一药剂处理的小鼠相比更好的总体髓样减少(图22A-B)。然而，根据流式细胞术在这种小鼠模型中只有单核细胞和粒细胞的一个亚群(嗜曙红细胞)表达可检测水平的人CLL-1。可能的是2X-BAC-Tg模型中的大多数粒细胞表达人CLL-1，但是在流式细胞术的检测限度以下。在食蟹猴和人中，CLL-1在单核细胞和粒细胞上有显著的细胞表面表达。2xBAC-Tg模型中粒细胞减少的改善可以通过h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c可能上调髓样细胞上的PD-L1实情来解释。为了检验这种假说，在第7天(研究结束)对来自用媒介或0.1mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c或0.5mg/kg h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c任一处理的小鼠的血液分析CD11b+髓样细胞上细胞表面PD-L1的存在。图22C-D显示了用单一药剂h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c处理的小鼠展现与阴性对照组(媒介)相比显著的粒细胞上的PD-L1表达上调。单核细胞上明显有类似的响应。总之，PD-L1上调的水平与h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c的剂量相关。这些结果证明h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c具有调控免疫检查点分子(像PD-L1)的能力，而且组合抗PD-L1治疗剂与抗CLL-1定向双特异性抗体(像h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v1或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v11)是AML的另一种治疗策略。
实施例3：食蟹猴中的毒性，毒动学(TK)，和PD研究
在食蟹猴中评估上文所述抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c(低亲和力抗人CD3ε臂)和h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v1(高亲和力抗人CD3ε臂))以测定毒性，毒动学(TK)，和药效学(PD)。这项研究是使用毛里求斯起源的目的繁殖的，未实验的食蟹猴(Macaca fascicularis)进行的。为该研究选择的动物通过流式细胞术证明在循环CD11b+髓样细胞(粒细胞和单核细胞)上表达CLL-1。经由单次静脉内输注对4组雄性食蟹猴施用媒介或抗CLL-1/CD3 TDB抗体并关于靶细胞消减和恢复研究8-29天，如表9中汇总的。
表9：食蟹猴中的单剂毒性，TK，和PD研究的研究设计
在多个时间点收集血清并保存于-70℃，用于ELISA来测定每一份血清样品中测试项目的量。使用WinNonlin软件(Pharsight；Mountain View，CA)使用血清浓度-时间概况评估PK参数。通过标准造血评估(差别白细胞计数)及通过流式细胞术测量外周血和骨髓中CD11b+髓样细胞的减少来测定PD效果。骨髓流式细胞术如下进行：使用90％Hypaque-Ficoll通过梯度离心去除污染性红血球来加工新鲜骨髓抽吸物。随后，使用上文所述活细胞染色条件在存活力染料7AAD存在下用对非人灵长动物CD4(Pe-Cy7)，CD8(PacificBlue)，C20(FITC)，CD11b(APC)和CLL-1(PE)特异性的抗体对经过纯化的骨髓细胞染色。用多路测定法分析血清细胞因子水平并使用标准测定法评估血清生物化学。
在它们的计划尸检之前对4只动物处以安乐死(第4组中的所有3只动物和第2组中的1只)。给予具有高亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)xh38E4v1)(0.5mg/kg)的第4组中的所有3只动物展示与显著升高的血清细胞因子水平(包括TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，和IL-6)有关的发热和垂死状况。在第1天(N＝1)或第2天(N＝2)对这些动物处以安乐死，它们具有与细胞因子释放综合征一致的循环崩溃的微观证据。由于这种毒性，没有进一步评估具有高亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v1)。
第2组中的动物在给药后4-8天之间展示发热。这些动物之一在第6天发生较差的食欲和不适，需要提早安乐死。没有鉴定这只动物发病的具体原因，而且在第3组中调查更低剂量0.2mg/kg具有低亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)xh40G5c)。这个剂量在所有动物中得到较好耐受，研究期间没有发热或其它临床体征。与施用具有高亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v1)的那些动物相比，在施用具有低亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)xh40G5c)的动物中观察到降低的细胞因子应答，大多数评估的促炎性细胞因子稍微升高。所有第3组动物存活至第8天(N＝3)和第22天(N＝3)的计划尸检。
一般而言，具有低和高亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体的临床病理学变化相似且一致，有相关急性期炎症反应，细胞因子释放，和髓样和淋巴样细胞的靶相关显著降低。与存活至计划尸检的给予≥0.2mg/kg具有低亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c)的猴相比，第4组动物和第2组中需要非计划尸检的动物具有相似程度的血液学(PD)效应但通常更加突出的急性期反应。
接受具有低亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(6E7.L4H1eA54)x h40G5c)的动物展示预期的双特异性抗体的药理学活性所致髓样细胞降低。单核细胞和嗜中性细胞有显著降低，分别在第2-4天和第4-8天占优势(图23A和B)，与第6天(非计划)和第8天尸检时显著降低的骨髓中的晚期阶段髓样细胞和脾中的嗜中性细胞有关。来自在第8天处以安乐死的动物的骨髓的流式细胞术评估确认了总CD11b+髓样细胞的显著降低(图23C)。另外，所有CD11b+细胞共表达食蟹猴CLL-1(见图23D)，由此证明靶特异性，伴随血液和骨髓髓样细胞二者消减。循环淋巴细胞在第2天开始降低(图24)。嗜中性细胞，单核细胞，和淋巴细胞到第12天有回弹恢复，以0.2mg/kg在第15天有显著升高的嗜中性细胞，认为是回弹反应的继续且与到第8天发生的G-CSF升高有关。动物个体的所有白细胞计数趋势朝向基线或到第22天或第29天接近基线，而且脾和骨髓中的微观变化分别到22天和第29天完全恢复。
与高亲和力型式相比降低的细胞因子释放，发病，和临床体征的降低指示具有低亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h40G5c)与具有高亲和力CD3臂的抗CLL-1/CD3 TDB抗体(h6E7A(6E7.L4H1eA54)x h38E4v1)相比改善的安全性概况。
药物暴露在治疗组中的所有动物中得到确认。浓度-时间概况和PK参数汇总显示于图25。在0.2和0.5mg/kg之间对h6E7A x h40G5c TDB抗体((6E7.L4H1eA54)x h40G5c)观察到剂量比例Cmax。在第15天在所有样品中确认了阳性抗治疗剂抗体(“ATA”)。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
序列表
<110> 基因泰克公司（GENENTECH, INC.）等
<120> 抗CLL-1抗体和使用方法
<130> P32920-WO
<140>
<141>
<150> 62/307,003
<151> 2016-03-11
<150> 62/180,376
<151> 2015-06-16
<160> 110
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 265
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
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Leu Ser Pro Glu Lys Asp Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Val Asp Asp Ile
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Ile Asn Ser Ser Ala Trp Val Thr Arg Asn Ala Ser Asp Leu Asn Asn
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Phe Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Tyr Arg Tyr Asp Pro Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Tyr Arg Tyr Asp Pro Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Val Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Ser Gly Pro Pro Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 43
Arg Ile Asn Pro Tyr Glu Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 44
Arg Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Glu" 或 "Ser" 或 "Asn"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(17)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 45
Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> 变体
<222> (55)..(55)
<223> /替换="Glu" 或 "Ser" 或 "Asn"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(122)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Glu Arg Gly Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Glu" 或 "Ser"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(17)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 47
Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 48
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> 变体
<222> (55)..(55)
<223> /替换="Glu" 或 "Ser"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(122)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Glu Arg Gly Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 49
Asp Ser Cys Tyr Phe Leu Ser Asp Asp Val Gln Thr Trp Gln Glu Ser
1 5 10 15
Lys
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 50
Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ile Ala Thr Lys
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 51
Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ile Ala Thr Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 52
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu His Val Thr Leu Lys
1 5 10 15
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 53
Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu His Val Thr Leu Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 54
Met Asn Lys Leu Gln Asn Ile Ser Glu Glu Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 55
Leu Gln Asn Ile Ser Glu Glu Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 56
Asn Ile Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn Met Asn Ile Ser Asn Lys
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 57
Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ile Ala Thr Lys Leu Cys Arg
1 5 10 15
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 58
Glu Leu Tyr Ser Lys
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 59
Trp Ile Trp His Lys
1 5
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 60
Met Ala Cys Ala Ala Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 61
Ile Asn Asn Lys Asn Ala Leu Glu Phe Ile Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 62
Asn Ala Leu Glu Phe Ile Lys
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 63
Asn Ala Leu Glu Phe Ile Lys Ser Gln Ser Arg
1 5 10
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 64
Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Asp Ser Thr Arg
1 5 10 15
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 65
Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Asp Ser Thr Arg
1 5 10 15
Gly Met Arg
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 66
Val Asp Asn Ile Ile Asn Ser Ser Ala Trp Val Ile Arg
1 5 10
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 67
Asn Ala Pro Asp Leu Asn Asn Met Tyr Cys Gly Tyr Ile Asn Arg
1 5 10 15
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 68
Leu Tyr Val Gln Tyr Tyr His Cys Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 69
Met Ile Cys Glu Lys
1 5
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 70
Met Ala Asn Pro Val Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Phe Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 71
Asn Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 72
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 73
Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 74
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 75
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 76
Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 77
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 78
Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 79
Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 80
Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 81
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 84
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 86
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
20 25
<210> 87
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 87
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys
20 25
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(5)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 88
Asn Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Glu"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Asn"
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> 变体
<222> (17)..(17)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(17)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 89
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Arg"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(10)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 90
Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换="Thr"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Lys"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(7)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 91
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Thr"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(8)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 92
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 93
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 94
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(10)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 96
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 97
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(18)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 97
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 98
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 100
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Val"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Ile"
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Asn"
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Phe"
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(11)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 101
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Thr"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Ala"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(7)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 102
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换="Gly" 或 "Phe" 或 "Ser"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Tyr" 或 "Phe" 或 "Trp"
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Asn" 或 "Ala" 或 "Thr" 或 "Gly" 或 "Phe" 或 "Ile"
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Val" 或 "Pro" 或 "Thr" 或 "Ile"
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换="Trp" 或 "Arg" 或 "Pro" 或 "Thr"
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)..(9)
<223> /注释="序列中给出的变体残基就注解中对于变体位置给出的那些而言没有偏爱"
<400> 103
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 104
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 105
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 106
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 107
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 108
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 109
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 110
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110

Claims (58)

1.一种分离的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含
(i)CLL-1结合域，其中该CLL-1结合域结合CLL-1表位和/或结合包含SEQ ID NO:49的氨基酸的交叠CLL-1表位且不结合包含SEQ ID NO:50和/或SEQ ID NO:51的表位；和
(ii)CD3结合域，其中该CD3结合域结合人CD3ε多肽和食蟹猴CD3ε多肽，该CD3结合域结合在由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:86)或1-27(SEQ ID NO:87)组成的人CD3ε多肽片段内的CD3表位，且该CD3结合域的结合不需要人CD3ε多肽的氨基酸残基Glu5。
2.权利要求1的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1表位是通过羟基自由基足迹法确定的。
3.权利要求1或2任一项的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含下述六种高变区(HVR)：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
4.权利要求3的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2。
5.权利要求3的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H2。
6.权利要求5的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2。
7.权利要求5的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2。
8.权利要求5的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H2。
9.权利要求3的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含：
a)包含SEQ ID NO:33的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区；
b)包含SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区；
c)包含SEQ ID NO:46的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区；或
d)包含SEQ ID NO:48的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。
10.权利要求1或2任一项的抗CLL-1抗体，其中该CLL-1结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
11.权利要求9的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域包含(a)包含SEQ ID NO:40的序列的重链可变区和(b)包含SEQ ID NO:39的序列的轻链可变区。
12.前述权利要求任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含CLL-1结合域，该CLL-1结合域具有一项或多项下述特征：
a.结合重组人CLL-1；
b.结合重组食蟹猴CLL-1；
c.结合人外周血单个核细胞(PBMC)表面上的内源CLL-1；
d.结合食蟹猴PBMC表面上的内源CLL-1；
e.结合癌细胞表面上的内源CLL-1；
f.结合AML癌细胞表面上的内源CLL-1；
g.结合HL-60细胞表面上的内源CLL-1；
h.结合EOL-1细胞表面上的内源CLL-1；
i.结合包含K244Q突变的CLL-1；
j.与R&D克隆687317抗体竞争人CLL-1结合；
k.以小于15nM，小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合内源人CLL-1；
l.以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM的Kd结合重组人CLL-1；和/或
m.以小于10nM，小于7nM，小于5nM，或小于3nM，小于2nM，或小于1nM的Kd结合重组食蟹猴CLL-1。
13.权利要求1-11任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含结合包含人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，Glu6，和Met7和/或由人CD3ε多肽的Gln1，Asp2，Glu6，和Met7组成的CD3表位的CD3结合域。
14.权利要求1-12任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含下述六种HVR：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列的HVR-L3。
15.权利要求14的抗CLL-1抗体，其中该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H3；(e)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列的HVR-L3。
16.权利要求14的抗CLL-1抗体，其中该CD3结合域包含：(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-H3；和(e)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-L2。
17.权利要求16的抗CLL-1抗体，其中该CD3结合域包含(f)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-L3。
18.权利要求16的抗CLL-1抗体，其中该CD3结合域包含(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L3。
19.权利要求14的抗CLL-1抗体，该抗体包含CD3结合域，该CD3结合域包含：
a)包含SEQ ID NO:82的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:83的序列的轻链可变区；
b)包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:85的序列的轻链可变区；或
c)包含SEQ ID NO:84的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:93的序列的轻链可变区。
20.权利要求1-19任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体为单克隆，人，人源化，或嵌合抗体。
21.权利要求1-20任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体为IgG抗体。
22.权利要求1-21任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗体为双特异性抗体。
23.权利要求1-22任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体为结合CLL-1和CD3的抗体片段。
24.权利要求23的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体片段为Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和/或(Fab’)2片段。
25.权利要求1-22任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体为全长抗体。
26.权利要求1-25任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体包含无糖基化位点突变。
27.权利要求26的抗CLL-1抗体，其中该无糖基化位点突变为替代突变。
28.权利要求1-27任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体包含降低的效应器功能。
29.权利要求1-28任一项的抗CLL-1抗体，其中该抗CLL-1抗体在依照EU编号方式的氨基酸残基N297，L234，L235，D265，和/或P329G处包含替代突变。
30.权利要求29的抗CLL-1抗体，其中该替代突变选自由依照EU编号方式的N297G，N297A，L234A，L235A，D265A，和P329G组成的组。
31.权利要求29的抗CLL-1抗体，其中该抗体在依照EU编号方式的氨基酸残基297处包含N297G替代突变。
32.权利要求1-31任一项的抗CLL-1抗体，其中(a)该CD3结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366S，L368A，Y407V，和N297G替代突变，且(b)该CLL-1结合域包含Fc域，其中该Fc域包含依照EU编号方式的T366W和N297G替代突变。
33.一种分离的核酸，其编码权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体。
34.一种载体，其包含权利要求33的分离的核酸。
35.一种宿主细胞，其包含权利要求34的载体。
36.一种生成权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求35的宿主细胞。
37.一种药物组合物，其包含权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体。
38.权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体，其用作药物。
39.权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体，其用于在有所需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展。
40.权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体，其用于在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能。
41.权利要求39-40任一项的抗CLL-1抗体，其中该细胞增殖性病症为癌症。
42.权利要求39-41任一项的抗CLL-1抗体，其中该细胞增殖性病症为急性髓样白血病(AML)，慢性髓样白血病(CML)，和/或骨髓增生异常综合征(MDS)。
43.权利要求39-42任一项的抗CLL-1抗体，其中该细胞增殖性病症为AML。
44.权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体在制造用于治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展的药物中的用途。
45.权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体在制造用于在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能的药物中的用途。
46.权利要求44-45任一项的用途，其中该细胞增殖性病症为癌症。
47.权利要求44-46任一项的用途，其中该细胞增殖性病症为AML，CML，和/或MDS。
48.一种在有所需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症或延迟细胞增殖性病症或自身免疫性病症进展的方法，该方法包括对该受试者施用权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体。
49.一种在具有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的受试者中增强免疫功能的方法，该方法包括对该受试者施用有效量的权利要求1-32任一项的抗CLL-1抗体。
50.权利要求48-49任一项的方法，其中该细胞增殖性病症为癌症。
51.权利要求48-50任一项的方法，其中该细胞增殖性病症为AML，CML，和/或MDS。
52.权利要求48-51任一项的方法，其进一步包括对该受试者施用柔红霉素和/或阿糖胞苷。
53.权利要求48-52任一项的方法，其进一步包括对该受试者施用糖皮质激素(诸如地塞米松(dexamethasone))。
54.权利要求48-53任一项的方法，进一步包括对该受试者施用PD-1轴结合拮抗剂(诸如抗PD-L1抗体)。
55.权利要求54的方法，其中该PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。
56.权利要求54-55任一项的方法，其中该抗PD-L1抗体包含：
(a)HVR-H1序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:99)；
(b)HVR-H2序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:100)；
(c)HVR-H3序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:98)；
(d)HVR-L1序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:104)；
(e)HVR-L2序列SASFLYS(SEQ ID NO:105)；和
(f)HVR-L3序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:106)。
57.权利要求54-56任一项的方法，其中该抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:94的重链可变区和SEQ ID NO:95的轻链可变区。
58.权利要求54-57任一项的方法，其中该抗PD-L1抗体为MPDL3280A。
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