CN110392694A - 针对pd-1的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了关于抗体的各种实施方案。一些实施方案包括结合PD‑1的拮抗剂抗体。此类抗体可用于治疗例如癌症的方法中。

Description

针对PD-1的抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月2日提交的美国临时申请号62/416,602的优先权权益，所述临时申请出于任何目的以引用的方式整体并入本文。
技术领域
提供了结合至程序性死亡-1蛋白(PD-1)的抗体。还提供了包括施用抗PD-1抗体的治疗方法。
背景技术
程序性死亡1(PD-1)蛋白是CD28受体家族的抑制性成员，所述受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS以及BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞的表面上表达。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)以及膜远端基于酪氨酸的转换基序(ITSM)。虽然结构类似于CTLA-4，但PD-1缺乏对于B7-1和B7-2结合而言关键的MYPPY基序。另外，虽然CD28、ICOS和CTLA-4(CD28家族的其他成员)均具有允许同源二聚化的未配对半胱氨酸残基，但据信PD-1作为单体存在，从而缺乏在其他CD28家族成员中具有特征的未配对半胱氨酸残基。PD-1受体具有两种配体PD-配体-1(PD-L1)和PD-L2。术语“PD-L1”是指还称为CD274B7H 1的PD-1受体的配体。PD-L1是一种290个氨基酸的蛋白质，其具有细胞外IgV样结构域、细胞外IgC样结构域、跨膜结构域以及大约30个氨基酸的高度保守的细胞内结构域。PD-L1在诸如抗原呈递细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)以及造血和非造血细胞(例如血管内皮细胞、胰岛和免疫赦免位点)的许多细胞上组成性地表达。术语“PD-L2”是指还称为CD273和B7-DC的PD-1受体的配体。人中PD-L2具有细胞外IgV样结构域、细胞外IgC样结构域、跨膜结构域以及大约30个氨基酸的细胞内结构域。PD-L2的表达比PD-L1更受限制，其表达主要局限于造血细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、一些B细胞亚群以及骨髓源性肥大细胞。
PD-1充当免疫检查点并且用于防止T细胞的活化。PD-1拮抗剂活化免疫系统来攻击肿瘤并且已显示成功治疗癌症，并且在一些情况下，毒性小于其他化学治疗剂治疗。PD-1拮抗剂还可与其他化学治疗剂的方案组合使用。当前批准的PD-1拮抗剂包括抗PD-1抗体、和以及抗PD-L1抗体TecentriqTM。
仍然需要额外的PD-1拮抗剂用于治疗癌症以及其他疾病和病症。
发明内容
提供了结合程序性死亡1(PD-1)的抗体，其中所述抗体结合人PD-1和小鼠PD-1，并且其中所述抗体阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合。
在一些实施方案中，提供了一种结合至程序性死亡1(PD-1)的分离的抗体，其中所述抗体结合至包含人PD-1的氨基酸126至136的表位。在一些实施方案中，氨基酸126至136是根据SEQ ID NO:1编号。在一些实施方案中，所述抗体以比所述抗体结合至选自I126A、L128A、A132L、I134A以及E136A的一种或多种PD-1变体大至少10倍的亲和力结合至SEQ IDNO:382的人PD-1。
在一些实施方案中，所述抗体：
a)以比所述抗体结合至PD-1变体I126A ECD-Fc(SEQ ID NO:389)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
b)以比所述抗体结合至PD-1变体L128A ECD-Fc(SEQ ID NO:390)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
c)以比所述抗体结合至PD-1变体A132L ECD-Fc(SEQ ID NO:391)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
d)以比所述抗体结合至PD-1变体I134A ECD-Fc(SEQ ID NO:392)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
e)以比所述抗体结合至PD-1变体E136A ECD-Fc(SEQ ID NO:393)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc。
在一些实施方案中，所述抗体结合至SEQ ID NO:403的小鼠PD-1ECD-Fc。在一些实施方案中，所述抗体以比所述抗体结合至小鼠PD-1变体H129P ECD-Fc(SEQ I NO:394)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:403的小鼠PD-1ECD-Fc。在一些实施方案中，所述抗体以比所述抗体结合至大鼠PD-1ECD-Fc(SEQ ID NO:405)大至少10倍的亲和力结合至大鼠PD-1变体P129H ECD-Fc(SEQ ID NO:397)。
在各种实施方案中，通过生物层干涉测量法来测定亲和力。
在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，所述抗体包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区(VH)以及与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述抗体包含有包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，提供了结合至程序性死亡1(PD-1)的抗体，其中所述抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3；或
iii)(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3；或
iv)(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3；或
v)(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3；或
vi)(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3；或
vii)(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3；或
viii)(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，提供了一种结合PD-1的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
i)所述VH与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
ii)所述VH与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iii)所述VH与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iv)所述VH与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
v)所述VH与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vi)所述VH与选自SEQ ID NO:44、52、60、68、76、84、92、100、108以及116的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQ ID NO:48、56、64、72、80、88、96、104、112以及120的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vii)所述VH与选自SEQ ID NO:124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276以及284的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQ ID NO:128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280以及288的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
viii)所述VH与选自SEQ ID NO:292、300、308以及316的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQID NO:296、304、312以及320的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，提供了一种结合PD-1的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
i)所述VH包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或
ii)所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；或
iii)所述VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
iv)所述VH包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或
v)所述VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或
vi)所述VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或
vii)所述VH包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或
viii)所述VH包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或
ix)所述VH包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或
x)所述VH包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或
xi)所述VH包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或
xii)所述VH包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；或
xiii)所述VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；或
xiv)所述VH包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或
xv)所述VH包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列；或
xvi)所述VH包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；或
xvii)所述VH包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列；或
xviii)所述VH包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列；或
xix)所述VH包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列；或
xx)所述VH包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列；或
xxi)所述VH包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
xxii)所述VH包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列；或
xxiii)所述VH包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列；或
xxiv)所述VH包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列；或
xxv)所述VH包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；或
xxvi)所述VH包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列；或
xxvii)所述VH包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；或
xxviii)所述VH包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列；或
xxix)所述VH包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；或
xxx)所述VH包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列；或
xxxi)所述VH包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列；或
xxxii)所述VH包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列；或
xxxiii)所述VH包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列；或
xxxiv)所述VH包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列；或
xxxv)所述VH包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列；或
xxxvi)所述VH包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列；或
xxxvii)所述VH包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列；或
xxxviii)所述VH包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列；或
xxxix)所述VH包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列；或
xl)所述VH包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种与本文提供的抗体竞争结合至人PD-1的抗体，其中所述抗体结合至人PD-1和小鼠PD-1，并且其中所述抗体抑制人PD-1与人PD-L1的结合，抑制人PD-1与人PD-L2的结合，抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L1的结合，并且抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至人PD-1的亲和力(KD)小于5nM。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至小鼠PD-1的亲和力(KD)小于10nM。在一些实施方案中，使用生物层干涉测量法测定亲和力。
在一些实施方案中，本文提供的抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体为选自Fab、Fab’、Fv、scFv或(Fab’)2片段的抗体片段。在一些实施方案中，本文提供的抗体为全长抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体为IgG1或IgG4抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合人PD-1。在一些实施方案中，人PD-1包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合小鼠PD-1。在一些实施方案中，小鼠PD-1包含SEQ ID NO:383的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，食蟹猴PD-1包含SEQ ID NO:384的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制PD-1与PD-L2的结合。在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制PD-1与PD-L1的结合并且抑制PD-1与PD-L2的结合。
在一些实施方案中，将本文提供的抗体施用至哺乳动物增加选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平。在一些实施方案中，本文提供的抗体使选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平增加至少2倍。在一些实施方案中，在施用所述抗体之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时或48小时测量细胞因子的水平。在一些实施方案中，至少一种细胞因子为IFNγ。在一些实施方案中，至少一种细胞因子为IL-2。在一些实施方案中，在施用所述抗体之后24小时测量趋化因子的水平。
在一些实施方案中，向哺乳动物施用本文提供的抗体增强哺乳动物中的免疫应答。在一些实施方案中，向哺乳动物施用本文提供的抗体引起哺乳动物中的T细胞活化。在一些实施方案中，向哺乳动物施用本文提供的抗体减小患有癌症的哺乳动物中的肿瘤尺寸。在一些实施方案中，哺乳动物为人。在一些实施方案中，人患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，提供了一种分离的核酸，其编码本文提供的抗体。在一些实施方案中，提供了一种载体，其包含所述核酸。在一些实施方案中，提供了一种宿主细胞，其包含所述载体。在一些实施方案中，提供了一种宿主细胞，其产生本文提供的抗体。在一些实施方案中，提供了一种用于制备抗PD-1抗体的方法，所述方法包括在适合于表达所述抗体的条件下培养所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括回收由所述宿主细胞产生的抗体。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文提供的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供了一种治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括施用有效量的本文提供的抗PD-1抗体或包含本文提供的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，提供了一种增强哺乳动物中的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的本文提供的抗PD-1抗体或包含本文提供的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了一种增加哺乳动物中的T细胞活化的方法，所述方法包括施用有效量的本文提供的抗PD-1抗体或包含本文提供的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了一种减小患有癌症的哺乳动物中的肿瘤尺寸的方法，所述方法包括施用有效量的本文提供的抗PD-1抗体或包含本文提供的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在本文提供的任何实施方案中，哺乳动物可为人。
在一些实施方案中，向哺乳动物施用至少一种额外治疗剂。在一些此类实施方案中，所述额外治疗剂与抗PD-1抗体同时或依序施用。在一些实施方案中，所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂为抗ICOS抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂为癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
在一些实施方案中，提供了本文提供的抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，所述药物与至少一种额外治疗剂一起施用。在一些实施方案中，所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为癌症疫苗。在一些实施方案中，所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
在一些实施方案中，本公开提供了本文提供的抗体或包含本文提供的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物用于治疗癌症的用途。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，本公开提供了本文提供的抗体或包含本文提供的抗体和药学上可接受的载体和至少一种额外治疗剂的药物组合物用于治疗癌症的用途。在一些实施方案中，所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为癌症疫苗。在一些实施方案中，所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，提供了本文提供的抗体或包含本文提供的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，提供了一种增加哺乳动物中选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用本文提供的抗体。在一些实施方案中，在施用所述抗体之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时或48小时测量所述细胞因子的水平。在一些实施方案中，至少一种细胞因子为IFNγ。在一些实施方案中，至少一种细胞因子为IL-2。在一些实施方案中，在施用所述抗体之后24小时测量所述细胞因子的水平。在一些实施方案中，哺乳动物为人。在一些实施方案中，人患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
在一些实施方案中，在施用抗PD-1抗体之后免疫应答增强。在一些实施方案中，在施用抗PD-1抗体之后T细胞活化增加。在一些实施方案中，在施用抗PD-1抗体之后肿瘤尺寸减小。
在一些实施方案中，向哺乳动物施用至少一种额外治疗剂。在一些实施方案中，所述额外治疗剂与抗PD-1抗体同时或依序施用。在一些实施方案中，所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。在一些实施方案中，所述额外治疗剂为癌症疫苗。在一些实施方案中，所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
在一些实施方案中，已确定来自哺乳动物的癌症样品表达PD-1。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)，所述样品显示PD-1的1+、2+或3+染色。在一些实施方案中，已确定所述样品具有升高的PD-L1水平。在一些实施方案中，使用IHC测定PD-L1水平。
附图说明
图1示出在用抗CD3和抗CD28抗体活化的小鼠脾细胞T细胞与抗PD-1抗体接触之后的IFNγ浓度。小鼠IgG1和大鼠IgG2a用作对照。RMP1-14用作阳性对照抗PD-1抗体。
图2示出在用葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的全血样品中在与抗PD1抗体一起孵育之后IL-2增加的EC50。纳武单抗(Nivo)和派姆单抗(Pembro)用作对照抗PD1抗体。显示来自抗体12228(28)、13406(6)、13407(7)、13408(8)以及13409(9)的作用。
图3A-3B示出本文公开的抗PD-1抗体阻断小鼠配体与小鼠PD-1的结合的能力。在Forte-Bio仪器上的Octet分析用于评估抗体对小鼠PD-L1和小鼠PD-L2与小鼠PD-1之间的相互作用的作用。
图4A-1、4A-2、4B-1、4B-2以及4C示出本文公开的抗PD-1抗体阻断人配体与人PD-1的结合的能力。在Forte-Bio仪器上的Octet分析用于评估抗体对人PD-L1和人PD-L2与人PD-1之间的相互作用的作用。
图5示出小鼠肿瘤模型中在施用本文公开的抗PD-1抗体之后肿瘤尺寸的减小。将C57BL6/J小鼠在其侧腹中皮下注射MC38细胞。小鼠IgG1(MOPC-21)和大鼠IgG2a(2A3)用作对照。RMP1-14用作阳性对照抗PD1抗体。
具体实施方式
提供了结合PD-1的抗体。还提供了能够形成结合PD-1的抗体的抗体重链和轻链。另外，提供了包含一个或多个特定互补决定区(CDR)的抗体、重链和轻链。提供了编码针对PD-1抗体的多核苷酸。还提供了编码抗体重链或轻链的多核苷酸。提供了产生和/或纯化针对PD-1的抗体的方法。提供了使用针对PD-1的抗体的治疗方法。此类方法包括但不限于治疗癌症的方法。提供了检测PD-1的方法。此类方法包括用于鉴定可受益于用抗PD-1抗体治疗的个体、用抗PD-1抗体监测个体的治疗以及提高抗PD-1抗体在个体中的治疗功效的方法。
本文中使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公布以及Genbank登录号均以引用的方式并入本文中，如同每个单独参考文献具体地且单独地指示以引用的方式整体并入一般。
使用常规方法，本领域的技术人员总体上更好地了解并且通常采用本文中描述或引用的技术和程序，例如像以下中描述的广泛利用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编,(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995)),Harlow和Lane编(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.Lippincott Company,1993)；以及其最新版本。
I.定义
除非另外定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语将具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要或明确指示，否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。对于各种来源或参考文献之间的关于定义的任何矛盾，以本文提供的定义为准。
应了解本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“实质上由实施方案组成”。如本文所用，除非另外指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个提及物。本文中术语“或”的使用不意味着替代物是互斥的。
在本申请中，除非明确阐述或本领域的技术人员所了解，否则“或”的使用意指“和/或”。在多个附属权利要求的上下文中，“或”的使用重新提及超过一个前述独立或附属权利要求。
如本领域的技术人员所了解，本文中对“约”值或参数的提及包括(并且描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指包含核酸分子或多核苷酸的核苷酸线性序列。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基聚合物并且不局限于最小长度。此类氨基酸残基聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本公开的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(一般本质上是保守的)的蛋白质，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可为故意的，如通过定点诱变，或可为偶然的，诸如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而引起的错误。
如本文所用的“PD-1”和“程序性死亡1”是指由细胞中PD-1的表达和加工产生的任何天然PD-1。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的PD-1，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人和食蟹猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。所述术语还包括天然存在的PD-1变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人PD-1前体蛋白的氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-20)显示于SEQ ID NO:1中。示例性成熟人PD-1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:382中。示例性小鼠PD-1前体蛋白的氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-20)显示于SEQ ID NO:2中。示例性成熟小鼠PD-1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:383中。示例性食蟹猴PD-1前体蛋白的氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-20)显示于SEQ ID NO:3中。示例性成熟食蟹猴PD-1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:384中。
术语“特异性地结合”至抗原或表位为本领域中熟知的术语，并且本领域中还熟知确定这种特异性结合的方法。如果分子与特定细胞或物质的反应或缔合比其与替代细胞或物质的反应或缔合更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称其表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体以比其结合至其他物质更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长持续时间结合靶标，则其“特异性地结合”或“优先结合”至靶标。例如，特异性地或优先结合至PD-1表位的抗体为以比其结合至其他PD-1表位或非PD-1表位更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长持续时间结合此表位的抗体。通过阅读此定义，还了解例如，特异性地或优先结合至第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性地或优先结合至第二靶标。因而，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(不过其可包括)专一结合。一般但不一定，对结合的提及意指优先结合。“特异性”是指结合蛋白选择性结合抗原的能力。
如本文所用，“基本上纯”是指物质至少50％纯(即不含污染物)，更优选至少90％纯，更优选至少95％纯，而更优选至少98％纯，并且最优选至少99％纯。
如本文所用，术语“表位”是指靶分子(例如抗原，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)上抗原结合分子(例如抗体、抗体片段或含有抗体结合区的支架蛋白)所结合的位点。表位经常包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、多肽或糖侧链，并且具有特定三维结构特性以及比电荷特征。表位可由靶分子的连续和/或并置非连续残基(例如氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)两者形成。由连续残基(例如氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后失去。表位可包括但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如氨基酸或核苷酸)。在一些实例中，表位长度少于20个残基(例如氨基酸或核苷酸)、少于15个残基或少于12个残基。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则其可结合抗原内的相同表位。在一些实施方案中，表位可通过距离抗原结合分子上CDR残基的某一最小距离来鉴定。在一些实施方案中，表位可通过上述距离鉴定，并且不限于抗体残基与抗原残基之间的键(例如氢键)中所涉及的那些残基。表位还可通过多种扫描鉴定，例如丙氨酸或精氨酸扫描可指示抗原结合分子可与其相互作用的一个或多个残基。除非明确表示，否则作为表位的一组残基不排除来自特定抗体的表位部分的其他残基。更确切些，此类组的存在表示表位的最小系列(或物质组)。因此，在一些实施方案中，鉴定为表位的一组残基表示抗原的最小相关表位，而非抗原上表位的残基的唯一清单。
“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白质内对表位具有特异性的抗体所结合的非连续多肽、氨基酸和/或糖。在一些实施方案中，至少一个残基将与表位的其他指示残基不相邻；但是，所述残基中的一个或多个还可与其他残基相邻。
“线性表位”包含抗原蛋白质内对表位具有特异性的抗体所结合的相邻多肽、氨基酸和/或糖。注意在一些实施方案中，并非线性表位内的每一个残基均必须直接与抗体结合(或在键中涉及)。在一些实施方案中，线性表位可来自于有效由线性表位的序列组成的肽的免疫作用，或来自于与蛋白质其余部分相对分离(使得抗体可相互作用、至少主要)的蛋白质的结构部分，仅仅具有所述序列部分。
本文中术语“抗体”以最广泛意义使用并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性(诸如双特异性T细胞衔接分子)以及三特异性抗体)以及抗体片段，只要抗体片段表现出所需抗原结合活性即可。
术语抗体包括但不限于能够结合至抗原的片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、二-scFv、sdAb(单结构域抗体)以及(Fab’)2(包括化学连接的F(ab')2)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点；以及残余“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，所述F(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体以及诸如小鼠、人、食蟹猴等的多种物种的抗体。此外，对于本文提供的所有抗体构建体，还涵盖具有来自其他生物体的序列的变体。因此，如果公开抗体的人型式，则本领域的技术人员将了解如何将基于人序列的抗体转化成小鼠、大鼠、猫、狗、马等序列。抗体片段还包括单链scFv、串联二scFv、双功能抗体、串联三sdcFv、微型抗体等的取向。抗体片段还包括纳米抗体(sdAb，其为具有单个单体结构域，诸如一对重链可变结构域，并且无轻链的抗体)。在一些实施方案中，抗体片段可称为特定物种(例如人scFv或小鼠scFv)。这表示非CDR区的至少一部分的序列而非构建体的来源。
术语“单克隆抗体”是指实质上均质的抗体群体的抗体，即构成所述群体的个别抗体除可少量存在的天然存在的可能突变外均相同。单克隆抗体为高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，单克隆抗体的样品可结合至抗原上的相同表位。修饰语“单克隆”指示如自实质上均质的抗体群体获得的抗体特征，并且不应视为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可通过首先由Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤法制备，或可通过诸如美国专利号4,816,567中描述的重组DNA方法制备。单克隆抗体还可从使用例如McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554中描述的技术产生的噬菌体文库分离。
术语“CDR”表示如由本领域的技术人员根据至少一种鉴定方式所定义的互补决定区。在一些实施方案中，CDR可根据Chothia编号方案、Kabat编号方案、Kabat与Chothia的组合、AbM定义、接触定义和/或Kabat、Chothia、AbM和/或接触定义的组合中的任一者定义。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65以及H3的氨基酸残基95-102。(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。AbM定义可包括例如L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基H26-H35B、H2的氨基酸残基50-58以及H3的氨基酸残基95-102处的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)。接触定义可包括例如L1的氨基酸残基30-36、L2的氨基酸残基46-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基30-35、H2的氨基酸残基47-58以及H3的氨基酸残基93-101处的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)。Chothia定义可包括例如L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基26-32……34、H2的氨基酸残基52-56以及H3的氨基酸残基95-102处的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)。CDR还可如任一个或多个附图中所示来提供。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。抗体内的多个CDR可通过其适当数字以及链类型表示为(包括不限于)：a)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；b)CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2以及CDRH3；c)LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3、HCDR-1、HCDR-2以及HCDR-3；或d)LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2以及HCDR3；等等。在本文中使用术语“CDR”还涵盖HVR或“高变区”，包括高变环。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)
如本文所用的术语“重链可变区”是指包含至少三个重链CDR的区域。在一些实施方案中，重链可变区包括三个CDR以及至少FR2和FR3。在一些实施方案中，重链可变区包括至少重链HCDR1、框架(FR)2、HCDR2、FR3以及HCDR3。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。
如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。当然，除非另外表示，否则结构域内的非功能改变性缺失以及改变涵盖在术语“重链恒定区”范围内。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区还包括ε和μ。各重链恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体为IgG抗体，包含δ恒定区的抗体为IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体为IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体为IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体为IgE抗体。某些同种型可进一步再分成子类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)以及IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
如本文所用的术语“重链”是指至少包含重链可变区，有或无前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区，有或无前导序列的多肽。
如本文所用的术语“轻链可变区”是指包含至少三个轻链CDR的区域。在一些实施方案中，轻链可变区包含三个CDR以及至少FR2和FR3。在一些实施方案中，轻链可变区包含至少轻链LCDR1、框架(FR)2、LCDR2、FR3和LCDR3。例如，轻链可变区可包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3以及CDR3。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。
如本文所用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。当然，除非另外表示，否则结构域内的非功能改变性缺失和改变涵盖在术语“轻链恒定区”范围内。
如本文所用的术语“轻链”是指至少包含轻链可变区，有或无前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区，有或无前导序列的多肽。
出于本文中的目的，“受体人框架”为包含如以下定义，来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变数目为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或者2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架的序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法(例如像ELISA KD、KinExA、生物层干涉测量法(BLI)和/或表面等离子体共振装置(诸如装置)，包括本文所述的那些方法)测量。
如本文所用的术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
在一些实施方案中，抗体的“KD”、“Kd”、“Kd”或“Kd值”通过使用表面等离子体共振测定，使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，在25℃下，利用固定抗原CM5芯片，在约10个反应单元(RU)下测量。简言之，将羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)根据供应商的说明书用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，接着以5μL/min的流速注射，以实现大约10个反应单元(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为进行动力学测量，将多肽，例如全长抗体的连续稀释液在具有0.05％TWEEN-20TM表面活性剂(PBST)的PBS中在25℃下以大约25μL/min的流速注射。使用简单一对一朗缪尔结合模型(评估软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离感应图，来计算缔合速率(kon)和离解速率(koff)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定，缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可通过使用荧光淬灭技术测定，所述技术在25℃下20nM PBS中的抗-抗原抗体，pH 7.2中在递增浓度的抗原存在下测量的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在分光计，诸如配备截流的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中，利用搅拌比色皿来测量。
在一些实施方案中，所述两个值(例如Kd值)之间的差实质上相同，例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％，随参考/比较值而变。
在一些实施方案中，所述两个值(例如Kd值)之间的差实质上不同，例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％，随参考/比较分子的值而变。
“表面等离子体共振”表示通过在生物传感器矩阵内，例如使用BIAcoreTM系统(BIAcore International AB,GE Healthcare公司,Uppsala,Sweden和Piscataway,N.J.)检测蛋白质浓度的改变，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步描述，参见Jonsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26。
“生物层干涉测量法”是指一种分析从生物传感器尖端上的固定蛋白质层和内反射层反射的光的干涉图的光学分析技术。结合至生物传感器尖端的分子数目的变化引起干涉图的变化，可实时测量。用于生物层干涉测量法的非限制性示例性装置为ForteBioRED96系统(Pall Corporation)。参见例如Abdiche等人,2008,Anal.Biochem.377:209-277。
如本文所用的术语“kon”是指抗体与抗原缔合的速率常数。具体而言，使用IgG(二价)与单价PD-1抗原测量速率常数(kon和koff)和平衡解离常数。“Kon”、“kon”、“缔合速率常数”或“ka”在本文中可互换使用。所述值指示结合蛋白与其靶抗原的结合速率，或抗体与抗原之间的复合物形成速率，如下等式所示：抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用的术语“koff”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的速率常数。koff还表示为“Koff”或“解离速率常数”。此值指示抗体从其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间推移分离成游离抗体和抗原，如下等式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
术语“生物活性”是指分子的任一种或多种生物性质(无论如在体内发现天然存在，还是通过重组方式提供或启动)。生物性质包括但不限于结合受体、诱导细胞增殖、抑制细胞生长、诱导其他细胞因子、诱导细胞凋亡以及酶活性。在一些实施方案中，PD-1蛋白的生物活性包括例如促进抗原特异性T细胞的细胞凋亡、减少调控性T(Treg)细胞的细胞凋亡、抑制T细胞活化、抑制T细胞增殖以及促进T细胞无能或耗尽。
“亲和力成熟”抗体是指与不具有一个或多个改变的亲本抗体相比，在一个或多个CDR中具有此类改变的抗体，此类改变产生抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所用的“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分的至少一部分来源于不同来源或物种的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体是指包含至少一个来自第一物种(诸如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(诸如人、食蟹猴等)的恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种并且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。嵌合构建体还可为功能性片段，如上所述。
如本文所用的“人源化抗体”是指其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸被来自人可变区的对应氨基酸置换的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体为抗体片段，诸如Fab、scFv、(Fab')2等。术语人源化还表示作为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的含有非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如鼠科)抗体的形式。人源化抗体可包括其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力以及能力的非人物种的CDR的残基(供体抗体)取代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含既未在接受者抗体中发现，也未在输入CDR或框架序列中发现，并且包括以进一步改善并优化抗体性能的残基。一般而言，人源化抗体可实质上包含至少一个以及通常两个可变结构域的全部，其中全部或实质上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且全部或实质上全部FR区为人免疫球蛋白相同序列的FR。在一些实施方案中，人源化抗体还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常人免疫球蛋白的恒定区或结构域。人源化抗体的其他形式具有一个或多个相对于原始抗体改变的CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2和/或CDR H3)，还称为为“来源于”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。如所了解，人源化序列可通过其一级序列鉴定并且不一定表示产生抗体的过程。
如本文所用的“CDR移植抗体”是指其中第一(非人)物种的一个或多个互补决定区(CDR)移植至第二(人)物种的框架区(FR)的人源化抗体。
如本文所用的“人抗体”涵盖在人中产生的抗体；在包含人免疫球蛋白基因的非人动物，诸如小鼠中产生的抗体；以及使用体外方法，诸如噬菌体展示选择的抗体(Vaughan等人,1996,Nature Biotechnology,14:309-314；Sheets等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581)，其中所述抗体谱系是基于人免疫球蛋白序列。术语“人抗体”表示作为人序列的序列种类。因此，所述术语不表示产生所述抗体的过程，而是相关序列的种类。
“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性“效应功能”包括Fc受体结合；C1q结合；CDC；ADCC；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。此类效应功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合并且可使用多种测定评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区；以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含与天然序列Fc区的不同之处在于至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，“变体Fc区”包含与天然序列Fc区的不同之处在于至少一个氨基酸修饰，然而保留天然序列Fc区的至少一种效应功能的氨基酸序列。在一些实施方案中，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如约一个至约十个氨基酸取代，并且优选约一个至约五个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文中的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合至抗体的Fc区的受体。在一些实施方案中，FcγR为天然人FcR。在一些实施方案中，FcR为结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括那些受体的等位基因变体和交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，所述受体具有主要不同在于其细胞质结构域的类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在例如以下中评述：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中术语“FcR”涵盖其他FcR，包括待在将来鉴定的FcR。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))以及调控免疫球蛋白的体内平衡。已知测量与FcRn的结合的方法(参见例如Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的生物活性，其随抗体同种型而变。抗体效应功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；以及B细胞活化。
“人效应细胞”为表达一种或多种FcR并且执行效应功能的白细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达至少FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞以及嗜中性粒细胞。效应细胞可从天然来源，例如从血液分离。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合至某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)的分泌Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至负载有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀死靶细胞。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056(Presta)中所述的测定。适用于此类测定的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可在体内评估，例如在动物模型，诸如Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)以及ADCC活性增加或减少的额外多肽变体描述于例如美国专利号7,923,538和美国专利号7,994,290中。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(C1q)结合至与其同源抗原结合的抗体(适当子类)开始。为评估补体活化，可执行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)以及C1q结合能力增加或减少的多肽变体描述于例如美国专利号6,194,551B1、美国专利号7,923,538、美国专利号7,994,290以及WO 1999/51642中。还参见例如Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的多肽变体为与亲本多肽或者包含天然序列Fc区的多肽相比，FcR结合活性和/或ADCC活性增强或减少的多肽变体。“展示与FcR结合增加”的多肽变体以比亲本多肽更好的亲和力结合至少一种FcR。“展示与FcR结合减少”的多肽变体以比亲本多肽更低的亲和力结合至少一种FcR。展示与FcR的结合减少的此类变体可具有很少或没有明显的结合，例如与天然序列IgG Fc区相比，0％-20％与FcR结合。
“在人效应细胞存在下比亲本抗体更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”的多肽变体为当用于测定中的多肽变体和亲本抗体的量实质上相同时在体外或体内更有效地介导ADCC的多肽变体。一般而言，将使用如本文中公开的体外ADCC测定鉴定此类变体，但涵盖用于例如在动物模型等中测定ADCC活性的其他测定或方法。
如本文所用的术语“实质上类似”或“实质上相同”表示两个或更多个数值之间足够高程度的类似性，以使得本领域的技术人员将认为两个或更多个值之间的差异在通过所述值测量的生物学特征的背景下几乎没有生物学和/或统计显著性。在一些实施方案中，两个或更多个实质上类似值相差不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％中的任一个。
如本文所用的短语“实质上不同”表示两个或更多个数值之间足够高程度的差异，以使得本领域的技术人员将认为两个或更多个值之间的差异在通过所述值测量的生物学特征的背景下具有统计显著性。在一些实施方案中，两个实质上不同数值相差大于约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个。
如本文所用的短语“实质上减少”表示数值与参考数值之间足够高程度的减少，以使得本领域的技术人员将认为所述两个值之间的差异在通过所述值测量的生物学特征的背景下具有统计显著性。在一些实施方案中，与参考值相比，实质上减少数值减少大于约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个。
术语“前导序列”是指位于多肽的N-末端，促进多肽从哺乳动物细胞分泌的氨基酸残基序列。前导序列可在多肽从哺乳动物细胞输出后裂解，从而形成成熟蛋白质。前导序列可为天然或合成的，并且它们可与它们所连接的蛋白质异源或同源。
“天然序列”多肽包含具有与在自然界中发现的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可从自然界中分离或可通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽特别涵盖多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如细胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如交替剪接形式)以及多肽的天然存在的等位基因变体。
多肽“变体”意指在比对序列以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后并且不考虑任何保守性取代为序列同一性的一部分，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N-末端或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约95％氨基酸序列同一性。
如本文所用，相对于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可根据本领域技能内的多种方式，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件，实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括实现在比较的全长序列上最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可包括但不限于多肽中的一个氨基酸经另一个氨基酸置换。示例性取代显示于表1中。氨基酸取代可引入目标抗体中，并且针对所需活性，例如保留/提高抗原结合、减少免疫原性或提高ADCC或CDC，筛选产物。
表1
原始残基 示例性取代
Ala(A) Val；Leu；Ile
Arg(R) Lys；Gln；Asn
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn；Glu
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K) Arg；Gln；Asn
Met(M) Leu；Phe；Ile
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Val；Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
氨基酸可根据常见侧链性质分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要这些类别之一的成员换成另一类别。
术语“载体”用于描述可进行工程化以含有克隆的多核苷酸的多核苷酸或可在宿主细胞中繁殖的多核苷酸。载体可包括以下元件中的一个或多个：复制起点、调控目标多肽的表达的一个或多个调控序列(例如像启动子和/或强化子)和/或一个或多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色测定的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”是指可为或已成为载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、细胞(Crucell)和293以及CHO细胞以及其衍生物，分别诸如293-6E和DG44细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或故意突变，后代可无需与原始亲本细胞完全相同(形态学或基因组DNA互补)。宿主细胞包括在体内用本文提供的多核苷酸转染的细胞。
如本文所用的术语“分离”是指分子已与在自然界中通常发现伴随其或产生其的至少一些组分分开。例如，当多肽与产生其的细胞的至少一些组分分开时，称其为“分离”。在表达之后细胞分泌多肽的情况下，将含有多肽的上清液从产生其的细胞物理分开视为“分离”多肽。类似地，当多核苷酸并非通常在自然界中发现的较大多核苷酸(诸如在DNA多核苷酸情况下基因组DNA或粒线体DNA)的一部分时或在与产生其的细胞的至少一些组分分开时，例如在RNA多核苷酸的情况下，多核苷酸称为“分离的”。因此，宿主细细胞内的载体中所含的DNA多核苷酸可称为“分离的”。
术语“个体”或“受试者”可在本文中互换使用，是指动物；例如哺乳动物。在一些实施方案中，提供治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物、猿、猫科动物、狗科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳动物实验动物、哺乳动物家畜、哺乳动物运动动物以及哺乳动物宠物。在一些实例中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或病症的个体或受试者。在一些实施方案中，接受治疗的受试者可为患者，表示受试者已鉴定为患有治疗相关病症或处于感染病症的足够风险下。
如本文所用的“疾病”或“病症”是指需要和/或希望治疗的疾患。
如本文所用的“癌症”和“肿瘤”为可互换术语，是指动物中的任何异常细胞或组织生长或增殖。如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体和血液/淋巴癌症并且还涵盖恶性、癌前以及良性生长，诸如发育异常。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。此类癌症的更特定非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睪丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤、间皮瘤以及各种类型头颈部癌。
如本文所用，“治疗”为一种用于获得有益或所需临床结果的方法。如本文所用，“治疗”涵盖针对包括人的哺乳动物中的疾病，治疗剂的任何施用或施加。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下的任一种或多种：减轻一种或多种症状、降低疾病程度、预防或延迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进展、抑制或减缓疾病或其进展、阻止其发展以及缓解(无论部分还是整体)。“治疗”还涵盖减轻增生性疾病的病理性结果。本文提供的方法涵盖任一种或多种这些治疗方面。根据上述，术语治疗无需百分百除去病症的所有方面。
“改善”意指与未施用抗PD-1抗体相比，一种或多种症状减轻或改善。“改善”还包括症状持续时间缩短或减少。
在癌症背景下，术语“治疗”包括以下任一个或全部：抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整个肿瘤负荷以及改善与疾病相关的一种或多种症状。
术语“生物样品”意指一些来自活物或从前为活物的物质。此类物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结以及脾。
具有“升高的PD-1水平”或“表达升高水平的PD-1”或“PD-1高”的样品意指PD-1的水平是使得本领域的技术人员将断定癌症可用抗PD-1疗法，诸如本文提供的抗体治疗。在一些实施方案中，“升高的PD-1水平”为其中肿瘤样品内1％细胞显示PD-1染色的水平。在一些实施方案中，关于PD-1的“高水平”为1％或更多染色，例如肿瘤样品内1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％细胞显示染色。在一些实施方案中，PD-1含量可通过显色IHC或免疫荧光IHC(Aqua评分)测量。
“表达PD-1”或具有“PD-1阳性染色”或“PD-1阳性”的样品意指样品中1％或更多细胞显示PD-1染色。在一些实施方案中，PD-1阳性的样品显示至少弱、中度和/或强细胞染色(基于PD-1的膜表达)。具有中度或强PD-1细胞染色的样品还视为“PD-1高”。
具有“低水平的PD-L1”或“表达低水平的PD-L1”或“PD-L1低”的样品意指PD-L1水平低于通常指示癌症用PD-1疗法治疗的阈值表达水平。在一些实施方案中，“低水平的PD-L1”为其中肿瘤中少于5％细胞显示PD-L1膜染色的含量。在一些实施方案中，关于PD-L1的“低水平”为肿瘤细胞少于5％染色，例如4％、3％、2％、1％或0％显示染色。在一些实施方案中，PD-L1水平可通过显色IHC或免疫荧光IHC(Aqua评分)测量。未表达可检测的PD-L1的样品还可称为“表达低水平的PD-L1”。因此，术语“低”内涵盖不可检测的PD-L1。
具有“升高的PD-L1水平”或“表达升高的PD-L1水平”或“PD-L1高”的样品意指PD-L1的水平是使得本领域的技术人员将断定癌症可用PD-1疗法治疗。在一些实施方案中，“升高的PD-L1水平”为肿瘤中50％细胞或更多具有PD-L1膜染色，例如肿瘤的50％、60％、70％、80％、90％或100％细胞显示膜染色。在一些实施方案中，PD-L1水平可通过显色IHC或免疫荧光IHC(AQUA评分)测量。
“表达PD-L1”或具有“PD-L1阳性染色”或“PD-L1阳性”的样品意指样品中1％或更多细胞具有PD-L1膜染色。在一些实施方案中，PD-L1阳性的样品显示至少弱、中度和/或强细胞染色(基于PD-L1的膜表达)。
“缺乏PD-L1表达”或具有“PD-L1阴性染色”或“PD-L1阴性”的样品意指通过IHC，诸如显色IHC或免疫荧光IHC(Aqua评分)，在样品的细胞表面上未检测到PD-L1表达。PD-L1阴性样品还被认为是“PD-L1低”。
在一些实施方案中，可采用任何测量PD-L1水平的方法。在一些实施方案中，这可包括使用PD-L1 IHC 22C3 pharmDx测试(Dako,Inc.,Carpinteria,CA)，所述测试为经临床证实并且经FDA批准的用于评估NSCLC中的PD-L1表达的测试。PD-L1 IHC 22C3 pharmDx为定性免疫组织化学测定，其使用单克隆小鼠抗PD-L1抗体(克隆22C3)，其可用于检测福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的PD-L1蛋白质。测定可在Autostainer Link 48系统上进行并使用EnVision FLEX系统目测。PD-L1蛋白质表达使用肿瘤比例分数(TPS)来鉴定，肿瘤比例分数为显示部分或完整膜染色的活肿瘤细胞的百分比。在一些实施方案中，如果TPS≥1％活肿瘤细胞表现出任何强度的膜染色，则认为试样是PD-L1阳性。在一些实施方案中，如果TPS≥50％活肿瘤细胞表现出任何强度的膜染色，则认为试样是PD-L1高。指示PD-L1 IHC 22C3 pharmDx有助于鉴定用(派姆单抗)治疗的NSCLC患者。关于评分系统和对派姆单抗的反应的额外细节描述于Garon等人(NEngl J Med 2015；372:2018-28)的论文中。
术语“对照”是指已知不含分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准物”在本文中可互换使用，是指包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可用于确定分析性能特征并且为试剂(例如分析物)完整性的有用指示剂。
“预定截止”和“预定水平”一般是指通过相对于预定截止/水平，比较分析结果，用于评估诊断/预后/治疗功效结果的分析截止值，其中预定截止/水平已与多种临床参数(例如疾病严重程度、进展/无进展/改善等)相联或有关。虽然本公开可提供示例性预定水平，但熟知截止值可取决于免疫测定性质(例如所采用的抗体等)而变化。本领域普通技术人员完全能够针对其他免疫测定来修改本文中的公开内容，以基于本公开获得那些其他免疫测定的免疫测定特定截止值。虽然预定截止/水平的精确值可在测定之间变化，但如本文所述的相关性(如果存在)一般可适用。
术语“抑制(inhibition或inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止或所述特征的发生率、程度或可能性的降低或停止。“减少”或“抑制”是指与参考相比降低、减少或阻止活性、功能和/或量。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起整体减少20％或更大。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起整体减少50％或更大。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起整体减少75％、85％、90％、95％或更大。在一些实施方案中，在一段时间内，相对于相同时段内的对照剂量(诸如安慰剂)，抑制或减少以上指示的量。如本文所用的“参考”是指用于实现比较目的的任何样品、标准或水平。可从健康和/或未患病样品获得参考。在一些实例中，参考可从未处理样品获得。在一些实例中，参考从受试个体的未患病、未处理样品获得。在一些实例中，参考从一个或多个并非受试者或患者的健康个体获得。
如本文所用，“延迟疾病发展”意指延迟、阻碍、减缓、推迟、稳定、抑制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。这种延迟可具有变化的时间长度，取决于病史和/或所治疗的个体。如本领域的技术人员显而易见，当个体未发展疾病时，足够或显著延迟实际上可涵盖预防。例如，可延迟晚期癌症，诸如转移的发展。
如本文所用的“预防”包括在可能易患疾病但尚未诊断患有疾病的受试者中相对于疾病的发生或复发进行预防。除非另作说明，否则术语“减少”、“抑制”或“预防”不表示或需要一直完全预防。
如本文所用，“抑制”功能或活性是与除目标状态或参数外的其他相同状态相比，或替代地，与另一状态相比，减少功能或活性。例如，与不存在抗体下肿瘤的生长速率相比，抑制肿瘤生长的抗体减小肿瘤的生长速率。
物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量还为治疗有益作用胜过物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何有毒或不利影响的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。治疗有效量是指在实现所需治疗和/或预防结果必需的剂量和时段下有效的量。
“预防有效量”是指在实现所需预防结果必需的剂量和时段下有效的量。通常但不一定，因为预防剂量在发病前或在疾病早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指为使活性成分的生物活性有效而呈此类形式并且不含对制剂将施用的受试者具有不可接受的毒性的额外组分的制剂。此类制剂可无菌。
“药学上可接受的载体”是指本领域中常规用于治疗剂以一起构成用于施用至受试者的药物组合物的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料、配制助剂或载体。药学上可接受的载体在所采用剂量和浓度下对接受者无毒性，并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载体适于所采用的制剂。
“无菌”制剂是防腐的，或实质上不含活微生物及其孢子。
术语“IDO抑制剂”是指能够抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的活性，从而逆转IDO介导的免疫抑制的药物。IDO抑制剂可抑制IDO1和/或IDO2(INDOL1)。IDO抑制剂可为可逆或不可逆IDO抑制剂。“可逆IDO抑制剂”是可逆地抑制催化位点或者非催化位点的IDO酶活性的化合物，并且“不可逆IDO抑制剂”是通过与酶形成共价键而不可逆地抑制IDO酶活性的化合物。非限制性示例性IDO抑制剂包括碘西莫德(Indoximod)(New Link Genetics)、INCB024360(Incyte Corp.)、1-甲基-D-色氨酸(New Link Genetics)以及GDC-0919(Genentech,Inc.)。
“嵌合抗原受体T细胞疗法”或“CAR-T疗法”是指包含经遗传修饰以表达识别肿瘤细胞所表达的抗原的受体的T细胞的治疗剂。抗原可为肿瘤特异性表达的抗原或癌细胞与健康组织表达的抗原。在一些实施方案中，CAR-T疗法为过继性CAR-T疗法，其中移出患者T细胞并且进行修饰以表达嵌合抗原受体，接着返回患者。参见例如Dai等人,2016,J NatlCancer Inst,108(7):djv439,doi:10.1093/jnci/djv439；Gill等人,2015,Blood Rev,pii:S0268-960X(15)00080-6,doi:10.1016/j.blre.2015.10.003；Gill等人,2015,Immunol Rev,263(1):68-89.doi:10.1111/imr.12243。
与“一种或多种其他治疗剂组合”施用包括同时(并行)以及以任何次序连续或依序施用。
术语“并行”在本文中用于指如下施用两种或更多种治疗剂，其中施用的至少一部分在时间上重叠或一种治疗剂的施用在相对于另一治疗剂的施用的短时间内。例如，施用两种或更多种治疗剂，时间相隔至多约特定分钟数。
术语“依序”在本文中用于指两种或更多种治疗剂如下施用，其中一种或多种药物的施用在停止一种或多种其他药物施用之后继续，或其中在施用一种或多种其他药物前开始施用一种或多种药物。例如，施用两种或更多种治疗剂，时间相隔超过约特定分钟数。
如本文所用，“结合(in conjunction with)”是指除另一治疗模态外的一种治疗模态的施用。因而，“结合”是指一种治疗模态在另一治疗模态施用至个体前、期间或之后施用。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品内的说明书，其含有有关适应症、用量、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或关于此类治疗产品使用的警告的信息。
“制品”为包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症(例如癌症)的药物或特异性检测本文所述的生物标记物的探针的任何制造产品(例如包装或容器)或药盒。在一些实施方案中，制造产品或药盒呈用于进行本文所述的方法的单元推销、分配或出售。
术语“标记”和“可检测标记”意指连接于抗体或其分析物以使特定结合对的成员之间的反应(例如结合)可检测的部分。特定结合对的标记成员称为“可检测标记的”。因此，术语“标记的结合蛋白”是指并有用于鉴定结合蛋白的标记的蛋白质。在一些实施方案中，标记为可产生目测或仪器手段可检测的信号的可检测标记物，例如并入放射性标记的氨基酸或连接于可通过标记抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或比色法检测的荧光标记物或酶活性的抗生蛋白链菌素)检测的生物素基部分的多肽。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；发色团、荧光标记(例如FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基；由第二报告基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；以及磁性剂，诸如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记的代表性实例包括产生光的部分，例如吖啶(acridinium)化合物以及产生荧光的部分，例如荧光素。在此方面，部分本身可能无法可检测地标记，但可在与另一部分反应后变成可检测。
术语“缀合物”是指化学上连接于第二化学部分，诸如治疗剂或细胞毒性剂的抗体。术语“剂”包括化合物、化合物混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。在一些实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于百日咳毒素、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睪酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普奈洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及其类似物或同系物。当用于免疫测定的背景下时，缀合物抗体可为用作检测抗体的可检测标记抗体。
II.抗PD-1抗体
提供针对PD-1的新颖抗体。抗PD-1抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体以及包含本文中论述的重链和/或轻链CDR的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合PD-1的分离的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合PD-1的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体为拮抗剂抗PD-1抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体的施用增强受试者中的免疫应答和/或增加受试者中的T细胞活化。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ IDNO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ IDNO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:194、202、210、218、226、以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ ID NO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分的重链以及至少一个包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含两个重链，其中各重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分；以及两个轻链，其中各轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，认为单链Fv(scFv)或包含例如包含所有六个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单个多肽链的任何其他抗体具有重链和轻链。在一些实施方案中，重链为包含三个重链CDR的抗PD-1抗体区。在一些实施方案中，轻链为包含三个轻链CDR的抗PD-1抗体区。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ IDNO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ IDNO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ IDNO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ IDNO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:194、202、210、218、226、以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ IDNO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含六个包括以下的CDR：(a)包含选自SEQ IDNO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如上所述的六个CDR并且结合PD-1。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如上所述的六个CDR，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如上所述的六个CDR，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如上所述的六个CDR，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如上所述的六个CDR，结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。
在一些实施方案中，提供与本文所述的抗PD-1抗体竞争结合至PD-1的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，可制备和/或使用与本文提供的任何抗体竞争结合的抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ ID NO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ IDNO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:194、202、210、218、226以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，本文提供的六个CDR中的任一个可作为子部分与本文提供的任一其他CDR组合，构成构建体中总共六个CDR。因此，在一些实施方案中，来自第一抗体的两个CDR(例如HCDR1和HCDR2)可与来自第二抗体的四个CDR(HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3)组合。在一些实施方案中，一个或多个CDR中的两个或更少残基可置换以获得其变体。在一些实施方案中，1、2、3、4、5或6个CDR中的两个或更少残基可置换。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ IDNO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ IDNO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ IDNO:194、202、210、218、226以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ ID NO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含(I)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；以及(II)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗PD-1抗体保留结合PD-1的能力。在一些实施方案中，总共1至10个氨基酸在SEQID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316中取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失存在于CDR外的区域(即FR中)。任选地，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ IDNO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ ID NO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，VH包含：(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗PD-1抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗PD-1抗体保留结合至PD-1的能力。在一些实施方案中，总共1至10个氨基酸在SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320中取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失存在于CDR外的区域(即FR中)。任选地，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:194、202、210、218、226以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，VL包含：(a)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(c)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列以及与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，并且具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗PD-1抗体保留结合至PD-1的能力。在一些实施方案中，总共1至10个氨基酸在SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316中取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，总共1至10个氨基酸在SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320中取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失存在于CDR外的区域(即FR中)。任选地，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316中的VH序列以及SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320的VL序列，包括一个或两个序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:285、237、245、253、261以及269的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:286、238、246、254、262以及270的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:287、239、247、255、263以及271的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:289、241、249、257、265以及273的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:290、242、250、258、266以及274的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:291、243、251、259、267以及275的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:189、197、205、213、221以及229的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:190、198、206、214、222以及230的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:191、199、207、215、223以及231的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:193、201、209、217、225以及233的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:194、202、210、218、226、以及234的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:195、203、211、219、227以及235的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:277、125、133、141、149、157、165、173以及181的氨基酸序列的HCR1；(b)包含选自SEQ ID NO:278、126、134、142、150、158、166、174以及182的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:279、127、135、143、151、159、167、175以及183的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:281、129、137、145、153、161、169、177以及185的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:282、130、138、146、154、162、170、178以及286的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQID NO:283、131、139、147、155、163、171、179以及187的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如本文提供的任一实施方案中的VH以及如本文提供的任一实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:8中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:40中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:48中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:64中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO:68和SEQ ID NO:72中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:80中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:88中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:92和SEQ IDNO:96中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:104中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:112中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:120中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO:124和SEQ ID NO:128中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:144中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:160中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:168中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:172和SEQ IDNO:176中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:184中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:192中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:200中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO:204和SEQ ID NO:208中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:216中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:224中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:232中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:236和SEQ ID NO:240中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:244和SEQ ID NO:248中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:252和SEQ IDNO:256中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:260和SEQ ID NO:264中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:268和SEQ ID NO:272中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:276和SEQ ID NO:280中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO:284和SEQ ID NO:288中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:292和SEQ ID NO:296中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:300和SEQ ID NO:304中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:308和SEQ ID NO:312中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:316和SEQ ID NO:320中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，提供与本文提供的抗PD-1抗体竞争结合至PD-1的抗体。在一些实施方案中，抗体与本文提供的抗PD-1抗体竞争结合至PD-1上的表位。
在一些实施方案中，竞争测定可用来鉴定与本文所述的抗PD-1抗体(诸如12228、13406、13407、13408以及13409)竞争结合至PD-1的单克隆抗体。竞争测定可用于确定两种抗体是否通过识别相同或空间重叠的表位而结合相同表位或一种抗体是否竞争性地抑制另一抗体与抗原的结合。在一些实施方案中，此类竞争抗体结合至本文所述的抗体所结合的相同表位。示例性竞争测定包括但不限于常规测定，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.)中提供的那些测定。用于定位抗体所结合的表位的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中。在一些实施方案中，如果各阻断另一方的结合达50％或更多，则称两种抗体结合至相同表位。在一些实施方案中，与本文所述的抗PD-1抗体竞争的抗体为嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，提供与如本文所述的嵌合、人源化或人抗PD-1抗体竞争的抗体。
在一些实施方案中，提供结合至本文提供的抗体所结合的任一种或多种表位的抗体。在一些实施方案中，提供结合并且重叠本发明抗体所结合的表位的抗体。在一些实施方案中，提供与本文提供的至少一种抗体竞争的抗体。在一些实施方案中，提供与本文提供的至少两种抗体竞争的抗体。在一些实施方案中，提供与本文提供的至少三种抗体竞争的抗体。在一些实施方案中，抗体结合至本文中的实施例中描述的抗体重叠的表位。在一些实施方案中，竞争抗体结合和/或阻碍整个表位。在一些实施方案中，竞争抗体结合和/或阻碍表位一部分。在一些实施方案中，竞争抗体的抗体结合部位(paratope)结合至本文提供的抗体的至少一部分表位。在一些实施方案中，竞争抗体的抗体结合部位结合靶标，并且竞争抗体的结构的不同部分阻碍本文提供的抗体的至少一部分表位。
示例性嵌合抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；以及Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，诸如猴)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类从亲本抗体的类别或子类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
非限制性示例性嵌合抗体包括包含选自例如以下的抗体的重链和/或轻链可变区的嵌合抗体：抗体11606；抗体11613；抗体11645；抗体12191；抗体12195；抗体12220；抗体12228；抗体12535；抗体12536；抗体12541；抗体12543；抗体12544；抗体12545；抗体12549；抗体12550；抗体12553；抗体12554；抗体12562；抗体12563；抗体12564；抗体12565；抗体12571；抗体12572；抗体12576；抗体12583；抗体12584；抗体13396；抗体13398；抗体13399；抗体13401；抗体13402；抗体13403；抗体13404；抗体13405；抗体13406；抗体13407；抗体13408；抗体13409；抗体11624；以及抗体12190，如本文所公开。额外非限制性示例性嵌合抗体包括包含选自以下的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3的嵌合抗体：抗体11606；抗体11613；抗体11645；抗体12191；抗体12195；抗体12220；抗体12228；抗体12535；抗体12536；抗体12541；抗体12543；抗体12544；抗体12545；抗体12549；抗体12550；抗体12553；抗体12554；抗体12562；抗体12563；抗体12564；抗体12565；抗体12571；抗体12572；抗体12576；抗体12583；抗体12584；抗体13396；抗体13398；抗体13399；抗体13401；抗体13402；抗体13403；抗体13404；抗体13405；抗体13406；抗体13407；抗体13408；抗体13409；抗体11624；以及抗体12190，如本文中公开。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体包含上述可变区并且结合至PD-1。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体包含上述可变区，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含上述可变区，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含上述可变区，结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含上述可变区，结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。在一些实施方案中，施用本文所述的抗PD-1抗体刺激免疫细胞的活性，减少免疫细胞的下调，或增加受试者中的T细胞应答。
在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体包含有包含与选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列的重链，其中抗体结合PD-1。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体包含有包含与选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列的轻链，其中抗体结合PD-1。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体包含有包含与选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116、124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308或316的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列的重链；以及包含与选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312或320的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列的轻链；其中抗体结合PD-1。
示例性嵌合抗PD-1抗体还包括与本文所述的抗体或其片段竞争结合至PD-1的嵌合抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自以下的抗体竞争结合至PD-1的嵌合抗PD-1抗体：抗体11606；抗体11613；抗体11645；抗体12191；抗体12195；抗体12220；抗体12228；抗体12535；抗体12536；抗体12541；抗体12543；抗体12544；抗体12545；抗体12549；抗体12550；抗体12553；抗体12554；抗体12562；抗体12563；抗体12564；抗体12565；抗体12571；抗体12572；抗体12576；抗体12583；抗体12584；抗体13396；抗体13398；抗体13399；抗体13401；抗体13402；抗体13403；抗体13404；抗体13405；抗体13406；抗体13407；抗体13408；抗体13409；抗体11624；以及抗体12190，或其片段。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，嵌合抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
如上所述，是否需要效应功能可取决于对抗体所意图的特定治疗方法。因此，在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的嵌合抗PD-1抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的嵌合抗PD-1抗体。
示例性人源化抗体
在一些实施方案中，提供结合PD-1的人源化抗体。人源化抗体适用作治疗分子，因为与可引起对抗体治疗剂的免疫应答(诸如人抗小鼠抗体(HAMA)应答)并且降低治疗剂的有效性的非人抗体相比，人源化抗体减少或消除人免疫应答。
在一些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体经人源化，以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个其中CDR(或其部分)来源于非人抗体并且FR(或其部分)来源于人抗体序列的可变结构域。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如CDR残基所来源于的抗体)的对应残基取代，以例如恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法评述于例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633，并且进一步描述于例如Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,(2005)Methods 36:25-34；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,(2005)Methods 36:61-68和Klimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述FR改组的“引导选择”法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”法选择的框架区(参见例如Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；来源于具有轻链或重链可变区的特定子群的人抗体的共同序列的特定框架区(参见例如Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；和Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684和Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。
示例性人源化抗PD-1抗体包括与本文所述的抗体或其片段竞争结合至PD-1的人源化抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自以下的抗体或其片段竞争结合至PD-1的人源化抗PD-1抗体：抗体11606；抗体11613；抗体11645；抗体12191；抗体12195；抗体12220；抗体12228；抗体12535；抗体12536；抗体12541；抗体12543；抗体12544；抗体12545；抗体12549；抗体12550；抗体12553；抗体12554；抗体12562；抗体12563；抗体12564；抗体12565；抗体12571；抗体12572；抗体12576；抗体12583；抗体12584；抗体13396；抗体13398；抗体13399；抗体13401；抗体13402；抗体13403；抗体13404；抗体13405；抗体13406；抗体13407；抗体13408；抗体13409；抗体11624；以及抗体12190。在一些实施方案中，人源化抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，人源化抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，人源化抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，人源化抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。
示例性人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体为人抗体。可使用本领域中已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上描述于van Dijk和van de Winkel,(2001)Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374以及Lonberg,(2008)Curr.Opin.Immunol.20:450-459中。在一些实施方案中，人抗体并非天然存在的抗体。在一些实施方案中，人抗体为单克隆抗体；因此，在一些实施方案中，一组中的每种人抗体可结合至抗原上的相同表位。
人抗体可通过向经修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的评述，参见Lonberg,(2005)Nat.Biotech.23:1117-1125。还参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述技术；美国专利号7,041,870，其描述K-M技术；以及美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述技术)。来自通过此类动物产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同人恒定区组合而进一步修饰。
人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。已描述人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体。(参见例如Kozbor(1984)J.Immunol,133:3001；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,(1991)J.Immunol.,147:86)。经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人,(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562中。额外方法包括例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,(2006)Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(描述人-人杂交瘤)中描述的方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)还描述于Vollmers和Brandlein,(2005)Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,(2005)Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-191中。
人抗体还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生。此类可变结构域序列然后可与所需人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
抗体可通过针对具有一种或多种所需活性的抗体筛选组合文库来分离。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库以及针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的方法。此类方法评述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)并且进一步描述于例如McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-554；Clackson等人,(1991)Nature 352:624-628；Marks等人,(1992)J.Mol.Biol 222:581-597；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,(2004)J.Mol.Biol.338(2):299-310；Lee等人.,(2004)J.Mol.Biol.340(5):1073-1093；Fellouse,(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472；以及Lee等人,(2004)J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132和PCT公布WO 99/10494中。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的谱系分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其然后可针对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等人,(1994)Ann.Rev.Immunol.,12:433-455中所描述。噬菌体通常呈现抗体片段，呈单链Fv(scFv)片段或呈Fab片段形式。来自免疫接种来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可(例如自人)克隆未致敏谱系，以在无任何免疫作用下提供针对大量非自身抗原以及自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,(1993)EMBO J 12:725-734所描述。最终，还可通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并且使用含有随机序列的PCR引物以编码高变CDR3区并且实现体外重排来合成未致敏文库，如Hoogenboom和Winter(1992),J.Mol.Biol,227:381-388所描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936以及2009/0002360。
在一些实施方案中，人抗PD-1抗体结合至具有SEQ ID NO:1、2、3、382、383或384的序列的多肽。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。
示例性人抗PD-1抗体还包括与本文所述的人抗体或其片段竞争结合至PD-1的人抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自以下的抗体或其片段竞争结合至PD-1的人抗PD-1抗体：抗体11606；抗体11613；抗体11645；抗体12191；抗体12195；抗体12220；抗体12228；抗体12535；抗体12536；抗体12541；抗体12543；抗体12544；抗体12545；抗体12549；抗体12550；抗体12553；抗体12554；抗体12562；抗体12563；抗体12564；抗体12565；抗体12571；抗体12572；抗体12576；抗体12583；抗体12584；抗体13396；抗体13398；抗体13399；抗体13401；抗体13402；抗体13403；抗体13404；抗体13405；抗体13406；抗体13407；抗体13408；抗体13409；抗体11624；以及抗体12190。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施方案中，人抗PD-1抗体与本文所述的抗体竞争结合至PD-1并且在抗体施用至受试者后，增强受试者中的免疫应答，和/或增加受试者中的T细胞活化。
在一些实施方案中，提供嵌合人抗PD-1抗体，其中所述抗体包含来自结合PD-1的人抗体的可变区和来自不同人抗体的恒定区。在一些实施方案中，提供嵌合人抗PD-1抗体，其中所述抗体包含来自结合PD-1的人抗体的CDR和来自不同人抗体的框架。在一些实施方案中，抗体并非天然存在的人抗体。
在一些实施方案中，人抗PD-1抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的人抗PD-1抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的人抗PD-1抗体。
如本文中指示，术语“人抗体”表示抗体构建体的可能序列的种类，而非抗体来源。
示例性抗体恒定区
在一些实施方案中，本文所述的抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
在本说明书和权利要求中，除非明确陈述或本领域的技术人员已知，否则免疫球蛋白重链中的残基的编号是如以引用的方式明确并入本文中的Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU指数。“如Kabat中的EU指数”是指人IgG1EU抗体的残基编号。
如上所述，是否需要效应功能可取决于对抗体所意图的特定治疗方法而定。因此，在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗体包含变体Fc区，所述变体Fc区与野生型IgG或野生型抗体的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体Fc区在野生型抗体的Fc区中具有两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体Fc区在野生型抗体的Fc区中具有三个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体Fc区具有至少一个、两个或三个或更多个本文所述的Fc区氨基酸取代。在一些实施方案中，本文中的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性。在一些实施方案中，本文中的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约90％同源性。在一些实施方案中，本文中的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约95％同源性。在一些实施方案中，重链恒定区缺乏C-末端赖氨酸(K)残基。在一些此类实施方案中，重链或重链恒定区可称为“desK”。在一些实施方案中，缺乏C-末端赖氨酸的重链恒定区为IgG，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，改变本文提供的抗体，以增加或降低抗体糖基化程度。向抗体添加或缺失糖基化位点可方便地通过改变氨基酸序列，以以使得产生或移除一个或多个糖基化位点来实现。
在抗体包含Fc区的情况下，所连接的碳水化合物可改变。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N-键联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在双触角寡糖结构的“茎干”中连接于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，提供具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量例如通过以下来测定：如WO 2008/077546中所描述，如通过MALDI-TOF质谱测定所测量，相对于连接于Asn 297的所有糖结构的和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即介于位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。关于“去岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”的抗体变体的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化不足的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams等人,尤其实施例11)以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
进一步提供具有等分寡糖的抗体变体，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供寡糖中的至少一个半乳糖残基连接于Fc区的抗体变体。此类抗体变体可具有改进的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
还提供具有氨基-末端前导延伸的抗体变体。例如，氨基-末端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任一个或多个重链或轻链的氨基-末端。示例性氨基-末端前导延伸包含三个氨基酸残基VHS或由其组成，存在于抗体变体的一个或两个轻链上。
可例如在具有变体Fc区的向其施用多肽的转基因小鼠、人或非人灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽的体内或血清半衰期。还参见例如Petkova等人InternationalImmunology 18(12):1759-1769(2006)。
在一些实施方案中，在人效应细胞存在下抗体变体比亲本抗体更有效地介导ADCC。在一些实施方案中，当用于测定中的多肽变体和亲本抗体的量实质上相同时，抗体变体实质上更有效地在体外介导ADCC。在一些实施方案中，当用于测定中的多肽变体和亲本抗体的量实质上相同时，抗体变体实质上更有效地在体内介导ADCC。一般而言，将使用如本文中公开的体外ADCC测定来鉴定此类变体，但涵盖用于例如在动物模型等中测定ADCC活性的其他测定或方法。
示例性抗体缀合物
在一些实施方案中，抗PD-1抗体缀合至另一分子。在一些实施方案中，另一分子可为可检测标记物，诸如标记。在一些实施方案中，另一分子可为治疗性分子，诸如细胞毒性剂。在一些实施方案中，标记和/或细胞毒性剂可缀合至抗体。如本文所用，标记为促进抗体检测和/或促进抗体结合的分子的检测的部分。非限制性示例性标记包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素、表位标签、金属结合标签等。本领域的技术人员可根据特定应用选择合适标记。
如本文所用，细胞毒性剂为使一种或多种细胞的增殖能力下降的部分。当细胞变得不太能增殖时，细胞的增殖能力下降，例如因为细胞经历细胞凋亡或以其他方式死亡，细胞无法进行细胞周期和/或无法分裂，细胞分化等等。非限制性示例性细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、毒素和化学治疗剂。本领域的技术人员可根据所意图应用选择合适的细胞毒性剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂为抗代谢物、烷基化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类药物、毒素或细胞凋亡剂中的至少一种。
在一些实施方案中，标记和/或细胞毒性剂在体外使用化学法缀合至抗体。本领域中已知非限制性示例性缀合化学法，并且包括可从例如Thermo Scientific Life ScienceResearch Produces(先前Pierce；Rockford,Ill.)、Prozyme(Hayward,Calif.)、SACRIAntibody Services(Calgary,Canada)、AbD Serotec(Raleigh,N.C.)等可商购的服务、方法和/或试剂。在一些实施方案中，当标记和/或细胞毒性剂为多肽时，标记和/或细胞毒性剂可从具有至少一个抗体链的相同表达载体表达以产生包含标记和/或细胞毒性剂与抗体链融合的多肽。本领域的技术人员可根据所意图应用选择用于将标记和/或细胞毒性剂缀合至抗体的合适方法。
在一些实施方案中，缀合可为共价的。在一些实施方案中，缀合可为非共价的。在一些实施方案中，缀合可通过特定结合相互作用，例如通过二级抗体的结合。
示例性前导序列
为大量表达和分泌一些分泌蛋白，可能需要来自异源蛋白的前导序列。在一些实施方案中，采用异源前导序列可为有利的，因为当在分泌过程期间在ER中移除前导序列时，所得成熟多肽可仍然不变。异源前导序列的添加可用于表达和分泌一些蛋白。
某些示例性前导序列的序列描述于例如新加坡国立大学生物化学系(theDepartment of Biochemistry,National University of Singapore)维持的在线前导序列数据库中。参见Choo等人,BMC Bioinformatics,6:249(2005)；和PCT公布号WO 2006/081430。
III.抗体表达和产生
编码抗PD-1抗体的核酸分子
本文提供包含编码抗PD-1抗体的一个或多个链的多核苷酸的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗PD-1抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗PD-1抗体的重链的多核苷酸与编码抗PD-1抗体的轻链的多核苷酸两者。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些实施方案中，重链和轻链从一种核酸分子表达，或从两种分开核酸分子表达为两种分开多肽。在一些实施方案中，诸如当抗体为scFv时，单一多核苷酸编码包含重链与轻链连接在一起的单一多肽。
在一些实施方案中，编码抗PD-1抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码至少一个本文提供的CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗PD-1抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码至少3个本文提供的CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗PD-1抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码至少6个本文提供的CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗PD-1抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，其在翻译时，位于重链或轻链的N-末端。如以上讨论，前导序列可为天然重链或轻链前导序列，或可为另一异源前导序列。
在一些实施方案中，核酸为编码本文中的序列表中的抗体的任何氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，核酸为与编码本文中的序列表中的抗体的任何氨基酸序列的核酸至少80％相同，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98或99％相同的核酸。在一些实施方案中，核酸为与本文提供的任一种或多种核酸序列杂交的核酸。在一些实施方案中，杂交是在中度条件下。在一些实施方案中，杂交是在高度严格条件下，诸如：至少约6X SSC和1％SDS，在65℃下，在约42℃下用含约20％(v/v)甲酰胺的0.1XSSC进行第一次洗涤，历时10分钟，并且随后在65℃下用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤。
核酸分子可使用本领域中常规的重组DNA技术构建。在一些实施方案中，核酸分子为适合于在所选宿主细胞中表达的表达载体。
提供包含编码抗PD-1抗体重链和/或抗PD-1轻链的多核苷酸的载体。还提供包含编码抗PD-1抗体重链和/或抗PD-1轻链的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链和轻链从载体表达为两种分开多肽。在一些实施方案中，重链和轻链表达为单个多肽的一部分，例如像当抗体为scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以类似量转染至宿主细胞(诸如类似摩尔量或类似质量)。在一些实施方案中，5:1与1:5之间的摩尔或质量比的第一载体与第二载体转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，使用编码重链的载体和编码轻链的载体1:1与1:5之间的质量比。在一些实施方案中，使用编码重链的载体和编码轻链的载体1:2的质量比。
在一些实施方案中，选择针对在CHO或CHO源性细胞或NSO细胞中表达多肽而优化的载体。示例性此类载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。
宿主细胞
在一些实施方案中，抗PD-1抗体重链和/或抗PD-1抗体轻链可在诸如细菌细胞的原核细胞中表达；或在诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞以及哺乳动物细胞的真核细胞中表达。这种表达可例如根据本领域中已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞以及FUT8 CHO细胞；PER.细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，抗PD-1抗体重链和/或抗PD-1抗体轻链可在酵母中表达。参见例如美国公布号US 2006/0270045 A1。在一些实施方案中，基于对抗PD-1抗体重链和/或抗PD-1抗体轻链进行所需翻译后修饰的能力，选择特定真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生唾液酸化比293细胞中产生的相同多肽程度高的多肽。
一种或多种核酸引入所需宿主细胞可通过任何方法实现，方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。核酸可根据任何合适的方法，在所需宿主细胞中瞬时或稳定转染。
还提供包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供包含抗PD-1抗体的宿主细胞。可使用能够过表达异源DNA的任何宿主细胞以分离编码目标抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、海拉(HeLa)和CHO细胞。还参见PCT公布号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))以及酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或克鲁维酵母(K.lactis))。
抗体的纯化
抗PD-1抗体可通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和力基质或疏水性相互作用色谱法。合适的亲和力配体包括ROR1 ECD和结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和力柱可用于结合恒定区并纯化抗PD-1抗体。疏水性相互作用色谱法，例如丁基或苯基柱，也可适合于纯化一些多肽，诸如抗体。离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)也可适合于纯化一些多肽，诸如抗体。混合模式色谱法(例如逆相/阴离子交换、逆相/阳离子交换、亲水性相互作用/阴离子交换、亲水性相互作用/阳离子交换等)也适合于纯化一些多肽，诸如抗体。本领域中已知纯化多肽的许多方法。
抗体的无细胞产生
在一些实施方案中，抗PD-1抗体在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。
组合物
在一些实施方案中，提供通过上述方法制备的抗体。在一些实施方案中，抗体在宿主细胞中制备。在一些实施方案中，抗体在无细胞系统中制备。在一些实施方案中，抗体进行纯化。在一些实施方案中，在宿主细胞或无细胞系统中制备的抗体为嵌合抗体。在一些实施方案中，在宿主细胞或无细胞系统中制备的抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，在宿主细胞或无细胞系统中制备的抗体为人抗体。在一些实施方案中，提供包含抗PD-1抗体的细胞培养基。在一些实施方案中，提供包含抗PD-1抗体的宿主细胞培养液。
在一些实施方案中，提供包含通过上述方法制备的抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞中制备的抗体。在一些实施方案中，组合物包含在无细胞系统中制备的抗体。在一些实施方案中，组合物包含纯化的抗体。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的嵌合抗体。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的人源化抗体。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的人抗体。
在一些实施方案中，提供包含浓度超过约10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL或250mg/mL中任一者的抗PD-1抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的嵌合抗体。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的人源化抗体。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞或无细胞系统中制备的人抗体。
IV.治疗性组合物和方法
使用抗PD-1抗体治疗疾病的方法
提供抗体以及包含抗体的组合物用于治疗人或动物的方法中。还提供包括施用抗PD-1抗体的治疗疾病的方法。可用抗PD-1抗体治疗的非限制性示例性疾病包括但不限于癌症。
在一些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，其中肿瘤样品内的细胞表达PD-L1。在一些此类实施方案中，可认为肿瘤为PD-L1阳性或表达PD-L1。PD-L1的表达可通过IHC确定，例如如本文中论述。在一些实施方案中，当通过IHC，来自肿瘤的样品显示PD-L1的1+、2+或3+染色时，认为肿瘤表达PD-L1。在一些实施方案中，通过IHC，来自肿瘤的样品显示PD-L1的2+或3+染色。在一些实施方案中，分析来自受试者的肿瘤样品的PD-L1表达并且如果肿瘤样品显示PD-L1表达，则选择受试者用本文所述的抗体治疗。在一些实施方案中，如果肿瘤样品显示升高的PD-L1表达，则选择受试者。
在一些实施方案中，如果受试者肿瘤为PD-L1高，则选择受试者用本文提供的抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，如果受试者肿瘤为PD-L1低，则选择受试者用本文提供的抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，如果受试者肿瘤为PD-1高/PD-L1低，则选择受试者用本文提供的抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，如果受试者肿瘤为PD-1高/PD-L1高，则选择受试者用本文提供的抗PD-1抗体治疗。
抗PD-1抗体可按需要施用至受试者。施用频率通过本领域的技术人员，诸如主治医师，考虑所治疗的疾患、治疗的受试者的年龄、所治疗的疾患的严重程度、所治疗的受试者的整体健康状态以及其类似因素来确定。在一些实施方案中，向受试者施用有效剂量的抗PD-1抗体一次或多次。在一些实施方案中，向受试者施用有效剂量的抗PD-1抗体一月一次、少于一月一次，诸如例如每两个月一次或每三个月一次。在一些实施方案中，施用有效剂量的抗PD-1抗体少于一月一次，诸如例如每三周一次、每两周一次或每周一次。向受试者施用有效剂量的抗PD-1抗体至少一次。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的有效剂量可施用多次，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时期。
在一些实施方案中，施用有效治疗(包括预防)癌症的量的药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、其身体或健康状况、待治疗的疾患的广泛性或所治疗的受试者的年龄。一般而言，抗PD-1抗体可以每剂量约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。
药物组合物以受试者中有效增强免疫应答和/或增加T细胞活化的量施用。
治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、其身体或健康状况、待治疗的疾患的广泛性或所治疗的受试者的年龄。一般而言，抗PD-1抗体可以每剂量约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约50μg/kg至约5mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。
药物组合物
在一些实施方案中，包含抗PD-1抗体的组合物以具有多种药学上可接受的载体的制剂提供(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy withFacts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人,PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,PharmaceuticalPress(2000))。可利用包括媒介物、佐剂和稀释剂的多种药学上可接受的载体。此外，还可利用诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂以及其类似物的多种药学上可接受的辅助物质。非限制性示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及其组合。
在一些实施方案中，提供包含抗PD-1抗体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含嵌合抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的在宿主细胞或无细胞系统中制备的抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，施用有效治疗(包括预防)癌症的量的药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、其身体或健康状况、待治疗的疾患的广泛性或所治疗的受试者的年龄。一般而言，抗PD-1抗体可以每剂量约0.05mg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.05mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.05mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约0.05mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以约5mg/kg体重或更低，例如少于4、少于3、少于2或少于1mg/kg抗体范围内的量施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量存在。例如，在一些实施方案中，20kg人的剂量可在约1mg至约100mg范围内。在一些实施方案中，剂量可在2mg至200mg抗PD-1抗体范围内。在一些实施方案中，剂量可在10mg至400mg抗PD-1抗体范围内。
施用途径
在一些实施方案中，抗PD-1抗体可在体内通过多种途径施用，所述途径包括但不限于静脉内、动脉内、胃肠外、肿瘤内、腹膜内或皮下。适当制剂和施用途径可根据所意图应用选择。
组合疗法
抗PD-1抗体可单独或与其他治疗模式一起施用。它们可在其他治疗模式，例如外科手术、化学疗法、放射疗法或施用生物制剂，诸如另一治疗抗体之前、实质上同时和/或之后提供。在一些实施方案中，抗PD-1抗体结合另一抗癌剂一起施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体与第二治疗剂并行给与。例如，施用两种或更多种治疗剂，时间相隔至多约60分钟，诸如至多约30、15、10、5或1分钟中的任一者。在一些实施方案中，抗PD-1抗体与第二治疗剂相继施用。例如，施用两种或更多种治疗剂，时间相隔超过约15分钟，诸如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周或1个月或更长时间中的任一者。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体与用于治疗的第二治疗方法一起施用。因此，施用本文提供的抗体可与另一治疗系统组合。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与抗ICOS疗法一起施用。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与结合诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)的抗体一起施用。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与结合ICOS的分离的抗体一起施用，其中抗ICOS抗体为CD4+ T细胞(诸如CD4+ T效应子(Teff)细胞)的激动剂。在一些实施方案中，结合ICOS的抗体为CD4+ T细胞(诸如CD4+Teff细胞)的激动剂并且耗尽T调控(Treg)细胞。在一些实施方案中，结合ICOS的抗体耗尽Treg细胞，但不耗尽Teff细胞。在一些实施方案中，结合ICOS的抗体诱导CD4+T细胞上的pAKT信号传导。在一些实施方案中，结合ICOS的分离的抗体诱导CD4+ T细胞上的pAKT信号传导并且耗尽Treg细胞。在一些实施方案中，结合ICOS的分离的抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:327的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:328的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:331的氨基酸序列的LCDR3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:336的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:339的氨基酸序列的LCDR3；或
iii)(a)包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:343的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:345的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:347的氨基酸序列的LCDR3；或
iv)(a)包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:351的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:352的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:353的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:355的氨基酸序列的LCDR3；或
v)(a)包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:359的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:360的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:361的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:362的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:363的氨基酸序列的LCDR3；或
vi)(a)包含SEQ ID NO:366的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:367的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:369的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:370的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:371的氨基酸序列的LCDR3；或
vii)(a)包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:376的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:377的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:378的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ IDNO:379的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，提供结合至ICOS的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
i)VH与SEQ ID NO:324的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:325的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
ii)VH与SEQ ID NO:332的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:333的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iii)VH与SEQ ID NO:340的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:341的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iv)VH与SEQ ID NO:348的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:349的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
v)VH与SEQ ID NO:356的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:357的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vi)VH与SEQ ID NO:364的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:365的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vii)VH与SEQ ID NO:372的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且VL与SEQ ID NO:373的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
一般而言，抗ICOS抗体可以每剂量约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗ICOS抗体可以每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗ICOS抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗ICOS抗体可以每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。在一些实施方案中，抗ICOS抗体可以每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与激动剂抗OX40抗体(诸如Medi6469，MedImmune；MOXR0916/RG7888，Roche)一起施用。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与抗CTLA4抗体(诸如伊匹单抗(ipilimumab)、BMS)一起施用。
在一些实施方案中，额外治疗剂为化学治疗剂。可与本文提供的抗PD-1抗体组合的示例性化学治疗剂包括但不限于卡培他滨、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、阿霉素、道诺霉素、顺铂、卡铂、表柔比星、艾日布林、5-FU、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、氨甲蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、nab-紫杉醇、(蛋白质结合的紫杉醇))、培美曲塞、长春瑞滨以及长春新碱。在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与至少一种激酶抑制剂一起施用。非限制性示例性激酶抑制剂包括埃罗替尼、阿法替尼、吉非替尼、克唑替尼、达拉菲尼、曲美替尼、威罗菲尼以及可比替尼。
在一些实施方案中，额外治疗剂为IDO抑制剂。非限制性示例性IDO抑制剂描述于例如US 2016/0060237和US 2015/0352206中。非限制性示例性IDO抑制剂包括碘西莫德(New Link Genetics)、INCB024360(Incyte Corp)、1-甲基-D-色氨酸(New LinkGenetics)以及GDC-0919(Genentech)。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与免疫改善药物(IMiD)组合施用。非限制性示例性IMiD包括沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
在一些实施方案中，额外治疗剂为癌症疫苗。癌症疫苗已作为抗原转移和树突状细胞活化的潜在方法进行研究。特别地，接种疫苗与免疫检查或用于共刺激途径的激动剂组合已经表明克服耐受性并且产生增加的抗肿瘤应答。已测试一系列采用不同方法促进针对肿瘤的免疫应答的癌症疫苗(参见例如Emens LA,Expert Opin Emerg Drugs 13(2):295-308(2008))。已设计增强B细胞、T细胞或针对肿瘤的专门抗原呈递细胞的应答的方法。癌症疫苗的示例性类型包括但不限于采用靶向不同肿瘤抗原的基于肽的疫苗，其可呈肽/蛋白质或呈基因工程化的DNA载体、病毒、细菌或其类似物递送；以及例如用于研发针对定义不明确的靶标的癌症疫苗的细胞生物学方法，包括但不限于从患者来源的树突状细胞、自体肿瘤细胞或肿瘤细胞溶解产物、异源肿瘤细胞以及其类似物研发的疫苗。
因此，在某些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体可与癌症疫苗组合使用。示例性癌症疫苗包括但不限于树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等。在一些实施方案中，此类疫苗加强抗肿瘤应答。可与本文提供的抗PD-1抗体组合使用的癌症疫苗的实例包括但不限于MAGE3疫苗(例如用于黑素瘤和膀胱癌)、MUC1疫苗(例如用于乳癌)、EGFRv3(诸如瑞多帕特(Rindopepimut)，例如用于脑癌，包括多形性成胶质细胞瘤)或ALVAC-CEA(例如用于CEA+癌症)。
非限制性示例性癌症疫苗还包括Sipuleucel-T，其来源于自体外周血单核细胞(PBMC)，包括抗原呈递细胞(参见例如Kantoff PW等人,N Engl J Med 363:411-22(2010))。在Sipuleucel-T产生中，患者的PBMC用PA2024离体活化，PA2024是前列腺酸性磷酸酶(前列腺抗原)与粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(免疫细胞活化剂)的重组融合蛋白。候选癌症疫苗的另一方法是产生针对在诸如黑素瘤的肿瘤组织中突变的特定肽的免疫应答(参见例如Carreno BM等人,Science 348:6236(2015))。在一些实施方案中，此类突变肽可称为新抗原。作为肿瘤疫苗中新抗原使用的非限制性实例，针对患有诸如黑素瘤的癌症的个别患者，鉴定肿瘤中预测结合主要组织相容性复合物蛋白质HLA-A*02:01的新抗原。来自患者的树突状细胞离体成熟，接着与新抗原一起孵育。接着向患者施用活化树突状细胞。在一些实施方案中，施用癌症疫苗后，可检测针对新抗原的稳健T细胞免疫性。
在一些此类实施方案中，使用新抗原研发癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗为DNA疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗为包含癌症抗原的工程化的病毒，诸如PROSTVAC(瑞莫加维(rilimogene galvacirepvec)/瑞莫格维(rilimogene glafolivec))。在一些实施方案中，癌症疫苗包含工程化的肿瘤细胞，诸如GVAX，其为粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)基因转染的肿瘤细胞疫苗(参见例如Nemunaitis,2005,Expert Rev Vaccines,4:259-74)。
在一些实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体在癌症疫苗之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，使用新抗原研发的癌症疫苗与本文所述的抗PD-1抗体组合使用。在一些此类实施方案中，组合用于治疗具有高突变负荷的癌症，诸如黑素瘤、肺癌、膀胱癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体与嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T疗法)组合施用。
诊断用途
本文提供使用抗PD-1抗体、多肽和核苷酸检测、诊断以及监测与抗PD-1抗体表位表达有关(相对于正常样品增加或减少，和/或不相称表达，诸如在通常缺乏表位表达的组织和/或细胞中表达)的疾病、病症或疾患的方法。本文提供确定患者是否将对抗PD-1抗体疗法有反应的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括使用抗PD-1抗体检测患者是否具有表达PD-1的细胞。在一些实施方案中，检测方法包括使样品与抗体、多肽或多核苷酸接触并且确定结合程度是否不同于参考或比较样品(诸如对照)的结合程度。在一些实施方案中，所述方法可用于确定本文所述的抗体或多肽是否为受试者的适当治疗。
在一些实施方案中，细胞或细胞/组织溶解产物与抗PD-1抗体接触并且测定抗体与细胞之间的结合。当与相同组织类型的参考细胞相比测试细胞显示结合活性时，其可指示受试者将受益于抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，测试细胞来自于人组织。在一些实施方案中，测试细胞来自于人血液。
可使用本领域中已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的多种方法。可进行的示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、浊度抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及放射免疫测定(RIA)。指示剂部分或标记基团可连接于本发明的抗体并且进行选择以便满足方法的各种用途的需要，经常由分析设备的可用性和相容免疫测定程序决定。适当标记包括不限于放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶或β-半乳糖苷酶)、荧光部分或蛋白(例如荧光素、若丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)或发光部分(例如由Quantum DotCorporation(Palo Alto,Calif.)供应的QdotTM纳米离子)。本领域的技术人员已知用于进行以上指示的多种免疫测定的通用技术。
为进行诊断，包括抗体的多肽可用可检测部分标记，所述可检测部分包括但不限于本领域中已知的放射性同位素、荧光标记以及多种酶-底物标记。本领域中已知将标记缀合至抗体的方法。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体不必标记，并且可使用结合至第一抗PD-1抗体的第二标记抗体检测其存在。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体可用于任何已知的测定方法中，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies:AManual ofTechniques,第147-158页(CRC Press,Inc.1987)。
抗PD-1抗体以及多肽还可用于体内诊断测定，诸如体内成像。一般而言，抗体或多肽用放射性核素(诸如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H或任何其他放射性核素标记，包括本文中概述的那些放射性核素标记)标记以便目标细胞或组织可使用免疫闪烁成像定位。
使用本领域中熟知的技术，抗体还可用作病理学中的染色试剂。
在一些实施方案中，第一抗体用于诊断并且第二抗体用作治疗剂。在一些实施方案中，第一和第二抗体不同。在一些实施方案中，第一抗体来自非人，而治疗剂来自人。在一些实施方案中，第一和第二抗体可通过结合至分开表位而同时结合至抗原。
药盒/制品
本文还提供用于本文所述的任一方法中的药盒、药物、组合物以及单位剂型。
药盒可包括一个或多个包含抗PD-1抗体(或单位剂型和/或制品)的容器。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的包含抗PD-1抗体的组合物，有或无一种或多种额外药物。在一些实施方案中，此类单位剂量供应于用于注射的一次性预填充注射器中。在一些实施方案中，单位剂量中所含的组合物可包含盐水、蔗糖或其类似物；缓冲液，诸如磷酸盐或其类似物；和/或在稳定且有效pH范围内配制。在一些实施方案中，组合物可呈冻干粉末提供，其可在添加适当液体，例如无菌水后复原。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
在一些实施方案中，用于单位剂量的抗PD-1抗体的量可为本文提供的用于所述多种方法和/或组合物的任一量。
在一些实施方案中，药盒还包含根据本文所述的任一方法治疗癌症的使用说明书。药盒还可包含选择适合治疗的个体的描述。药盒中提供的说明书通常为标签或包装说明书上的书面指导(例如包括在药盒中的纸片)，但机器可读说明书(例如磁性或光存储盘上携带的说明书)也可接受。在一些实施方案中，药盒还包括另一治疗剂。在一些实施方案中，另一治疗剂为例如，如本文所述的抗ICOS抗体或抗CTLA4抗体。
药盒在合适包装中。合适包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封Mylar或塑料袋)以及其类似物。药盒可任选地提供诸如缓冲液的额外组分以及说明性信息。因此，本申请还提供包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、罐、柔性包装以及其类似物的制品。
实施例
以下论述的实施例意图仅仅例示本发明并且不应视为以任何方式限制本发明。所述实例不意图表示以下实验均进行或进行唯一实验。努力确保关于所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1：抗PD-1抗体的产生
如先前所述来设计、产生以及扩展八个各约109种多样性的自然人合成酵母文库(参见例如WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568；Xu等人,Protein Eng DesSel.2013年10月；26(10):663-70)。对于前2轮选择，实质上如所描述，进行利用MiltenyiMAC系统的磁珠分选技术(Siegel等人,J Immunol Methods.2004年3月；286(1-2):141-53)。简言之，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与3ml 10nM生物素化的人PD-1-Fc融合抗原一起在室温下在FACS洗涤缓冲液具有0.1％BSA的PBS中孵育15分钟(使用EZ-Link磺酸基-NHS-生物素化试剂盒，Thermo Scientific，目录号21425)。在用50ml冰冷洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞团粒再悬浮于40mL洗涤缓冲液中，并且将500μl抗生蛋白链菌素微珠粒(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,目录号130-048-101)添加至酵母并且在4℃下孵育15分钟。接着，酵母成团粒，再悬浮于5mL洗涤缓冲液中，并且负载至MACS LS柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,目录号130-042-401)。负载5mL之后，将柱用3ml FACS洗涤缓冲液洗涤3次。接着从磁场移除柱，并且用5mL生长培养基洗脱酵母，接着生长过夜。使用流式细胞术进行以下三轮分选。大约1×108个酵母成团粒，用洗涤缓冲液洗涤三次，并且与200、100或10nM生物素化的人PD-1或10nM或1nM生物素化的人PD-1-Fc融合抗原一起在室温下孵育10分钟至2小时。孵育时间随抗原浓度而变。接着将酵母洗涤两次并且在4℃下用1:100稀释的山羊抗人F(ab’)2κ-FITC(Southern Biotech,Birmingham,Alabama,目录号2062-02)和1:500稀释的抗生蛋白链菌素-Alexa Fluor 633(LifeTechnologies,Grand Island,NY,目录号S21375)或1:50稀释的Extravidin-藻红蛋白(Sigma-Aldrich,St Louis,目录号E4011)二级试剂染色15分钟。在用冰冷洗涤缓冲液洗涤两次之后，将细胞团粒再悬浮于0.4mL洗涤缓冲液中并且转移至盖有过滤器的分选管。使用FACS ARIA分选器(BD Biosciences)进行分选，并且确定分选闸以仅仅选择PD-1结合克隆用于两轮。取决于群体，第三轮为阴性分选以减少试剂结合剂或进一步阳性富集。在最后一轮分选之后，将酵母接种并且挑选个别菌落进行表征。
第5轮或第6轮结合群体用于轻链多样化。提取重链质粒并且转化成轻链文库，具有1×106种多样性。如上所述进行选择，其中一轮进行MACS分选，并且三轮进行FACS分选，使用生物素化抗原的多种浓度。
亲和力成熟
利用CDRH1和CDRH2的多样化，进行天然和轻链分批改组克隆的结合优化。
CDRH1和CDRH2选择：来自选自轻链多样化程序的克隆(轻链分批改组克隆)的CDRH3与CDRH1和CDRH2变体重组成预先制备的文库，多样性为1×108，并且使用PD-1抗原进行选择，如上所述。通过将生物素化抗原滴定至低于纳米摩尔浓度并且与抗体呈递酵母一起孵育来施加亲和压力。
抗体产生和纯化
酵母克隆生长至饱和，且然后在30℃下在振荡下诱导48小时。诱导后，使酵母细胞成团粒并且收获上清液用于纯化。使用蛋白质A柱纯化IgG并且用pH 2.0乙酸洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段并且经KappaSelect(GE Healthcare LifeSciences,目录号17-5458-01)纯化。
PD-1抗体的亲和力测量
通过ForteBio或MSD-SET测量PD-1抗体的KD来测定PD-1抗体的亲和力。一般如先前描述，进行ForteBio亲和力测量(Estep等人,MAbs.2013年3月-4月；5(2):270-8)。简言之，通过将在线IgG负载至AHQ传感器上，进行ForteBio亲和力测量。使传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，接着在线监测60秒，以确定基线。将负载IgG的传感器暴露于100nM抗原5分钟，之后转移至测得缓冲液中5分钟，以测量解离速率。使用1:1结合模型分析动力学。
平衡亲和力测量如先前所述进行(Estep等人,2013)。在PBS+0.1％无IgG的BSA(PBSF)中进行溶液平衡滴定(Solution equilibrium titrations，SET)，抗原保持恒定在50pM下，并且与抗体的以10nM开始的3至5倍连续稀释液一起孵育。在4℃下将抗体(PBS中20nM)涂覆到标准结合MSD-ECL板上过夜，或在室温下30分钟。接着将板在振荡下在700rpm下阻断30分钟，接着用洗涤缓冲液(PBSF+0.05％Tween 20)洗涤三次。施加SET样品并且在700rpm振荡下在板上孵育150秒，接着洗涤一次。捕获在板上的抗原通过在板上与PBSF中250ng/mL磺酸基标签标记的抗生蛋白链菌素一起孵育3分钟来检测。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，接着在MSD Sector成像器2400仪器上使用具有表面活性剂的1x读取缓冲液T读取。在Prism中游离抗原百分比作为滴定抗体的函数绘图并且与二次方程拟合以求得KD。为提高通量，在整个MSD-SET实验中，包括SET样品制备，使用液体处置机器人。表1显示ForteBio亲和力测量的结果。
表1
抗体 人PD-1单价亲和力(K<sub>D</sub>) 小鼠PD-1单价亲和力(K<sub>D</sub>)
mAb 1(12228) 49nM 6.3nM
mAb 2(13405) 73nM 7.2nM
mAb 3(13406) 3.2nM 3.5nM
mAb 4(13407) 3.9nM 3.2nM
mAb 5(13408) 1.2nM 5.3nM
实施例2：针对抗PD-1抗体的小鼠活化脾细胞应答
当来源于脾细胞的小鼠T细胞用抗CD3和抗CD28抗体活化时，它们表达细胞表面分子并且分泌可溶性分子干扰素-γ(IFNγ)。阻断针对PD-1的抗体引起IFNγ的产生增加。获得小鼠脾细胞并且与可溶性抗CD3和抗CD28抗体一起孵育。在5天之后，将它们与从新鲜制备的脾细胞纯化的同等数目的T细胞以及不同浓度的抗PD-1抗体混合。阳性和阴性对照抗体RMP1-14、2A3以及C1.18.4购自BioXCell。在24小时之后，收集上清液并且通过细胞因子珠阵列测量IFNγ浓度。本文公开的抗PD-1抗体能够以与参考抗体相似的方式增加IFNγ的产生。参见图1。至少抗体12191、13396、13398、13399、12195、13406、13407、13408以及13409显著增加IFNγ表达。抗体13396、13399、12195、13406、13407以及13408引起IFNγ表达最大程度增加。
实施例3：人活化外周单核血细胞对抗PD-1抗体有反应
已显示用葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的全血样品对使用抗PD-1抗体进行免疫检查点阻断有反应，通过IL-2分泌的增加测量(参见例如EP2170959B1)。制备一系列浓度的抗PD-1抗体并且添加至96孔板的孔。将来自四个供体的全血在完全RPMI中1:10稀释，并且添加至相同孔。将板在室温下孵育30分钟，接着每孔添加50μl浓度为40μg/ml的SEB，最终浓度为10μg/ml。将板在37℃下孵育4天并且收集上清液以通过细胞因子珠阵列(CBA)测定来测量分泌IL-2。本文公开的抗PD-1抗体能够增加IL-2从这些培养物的产生，至与参考抗PD-1抗体相同的水平。图2示出在四个健康人供体样品中每种测试的抗体的这种增加的EC50。
实施例4：抗体对小鼠PD-L1和小鼠PD-L2与小鼠PD-1的结合的阻断
PD-L1和PD-L2为PD-1的两种天然配体，并且任一配体与PD-1的相互作用可下调T细胞中的活化应答。诸如纳武单抗和派姆单抗的批准的治疗性抗体已显示阻断这种相互作用并且下调人T细胞应答，但是抗体既不结合至小鼠PD-1，也不阻断小鼠PD-1与小鼠PD-L1或小鼠PD-L2的相互作用。在Forte-Bio仪器上的Octet分析用于评估本文公开的抗PD-1抗体对小鼠PD-L1与小鼠PD-1之间以及小鼠PD-L2与小鼠PD-1之间的相互作用的作用。将抗体稀释至10μg/mL，包括同种型对照抗体以用于减去背景。将小鼠PD-1-Fc融合物稀释至所需浓度(例如100nM)。将用作阻断试剂的可溶性小鼠同种型抗体稀释至250μg/mL。将小鼠-PD-1涂覆至传感器上，接着人Fc。添加抗PD-1抗体并且最终测量小鼠PD-L1或小鼠PD-L2的结合。图3示出所测试的抗PD-1抗体能够阻断小鼠配体与小鼠PD-1的结合。相比之下，派姆单抗或纳武单抗两者均未结合至小鼠PD-1或阻断小鼠配体与小鼠PD-1的结合。
实施例5：抗体对人PD-L1和人PD-L2与人PD-1的结合的阻断
PD-L1和PD-L2为PD-1的两种天然配体，并且任一配体与PD-1的相互作用可下调T细胞中的活化应答。诸如纳武单抗和派姆单抗的批准的治疗性抗体已显示阻断这种相互作用并且下调人T细胞应答。在Forte-Bio仪器上的Octet分析用于评估本文公开的抗PD-1抗体对人PD-L1与人PD-1之间以及人PD-L2与人PD-1之间的相互作用的作用。将抗体稀释至10μg/mL，包括同种型对照抗体以用于减去背景。将人PD-1-Fc融合物稀释至所需浓度(例如100nM)。将用作阻断试剂的可溶性人Fc稀释至250μg/mL。将人-PD-1涂覆至传感器上，接着人Fc。添加抗PD-1抗体并且最终测量人PD-L1或人PD-L2的结合。图4示出所测试的抗PD-1抗体能够阻断两种人配体与人PD-1的结合，类似于派姆单抗和纳武单抗。
实施例6：体内肿瘤激发
通过将MC38细胞皮下注射到C57BL6/J小鼠的侧腹中来检查小鼠模型中抗PD-1抗体减少肿瘤生长的能力。将小鼠随机化至第11天平均肿瘤尺寸为大约100mm3的组，并且腹膜内注射200μg抗PD-1抗体13407。在第14天、第18天和第21天重复剂量。对照抗体小鼠IgG1(MOPC-21)、大鼠IgG2a(2A3)和阳性对照大鼠抗小鼠PD-1(RMP1-14)购自BioXcell。每周测量肿瘤尺寸两次并且实验在24天之后终止。实验结束时的肿瘤重量显示在图5中并且表明抗PD-1抗体13407减少小鼠中的肿瘤生长，程度与参考抗PD-1抗体类似。
实施例7：抗体表位定位
通过Atum inc合成编码多种PD-1变体、PD-L1、PD-L2以及抗体Fab片段的基因并且进行密码子优化。在所有基因的5'末端包括人κ轻链信号序列(MGTPAQLLFLLLLWLPDTTG；SEQID NO:400)。将基因克隆至哺乳动物表达载体中并且在蛋白质表达之前证实序列。
在Expi293TM表达系统(Thermo Fisher Scientific)中，利用制造商的关于培养基、转染试剂、进料以及细胞的试剂盒表达重组蛋白。根据制造商方案，将细胞以1μg/mL质粒DNA与培养基比率使用ExpifectamineTM转染。将细胞在保持在37℃和5％CO2下的孵育箱中在摇瓶中培养。在5天之后，通过在3000rcf下离心15分钟，接着使用0.2微米过滤器过滤来收获培养物。
收获上清液进行亲和力纯化。蛋白质含有六-组氨酸标签或Fc标签，所述标签能够进行Ni亲和力纯化或蛋白质A亲和力纯化。
Ni亲和力纯化在HisTrapTMExcel IMAC柱(GE Healthcare Life Sciences)上使用43mM磷酸钠、0.5M氯化钠pH 7.4作为结合缓冲液进行。将结合蛋白质用结合缓冲液洗涤，接着用含有20mM咪唑的结合缓冲液洗涤。用含有90mM、150mM和250mM咪唑的结合缓冲液进行洗脱步骤。在HiTrap MabSelect Sure柱(GE Healthcare Life Sciences)上使用PBS pH7.4作为结合缓冲液进行蛋白质A亲和力纯化。使用pH 4.0、pH 3.5和pH 2.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液进行洗脱步骤以洗脱结合的蛋白质。使用20％v/v比率用1M Tris pH 9.0中和所有酸性洗脱级分。所有洗脱级分均通过SEC-HPLC分析以确定超过目标纯度的级分(>90％单体)。对于未产生超过目标纯度的级分的纯化，使用Superdex200柱进行制备型尺寸排阻色谱法，以实现目标纯度。在冷冻前，将纯化的蛋白质缓冲液交换成最终缓冲液(20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0，或20mM HEPES、150mM NaCl pH 7.5)，保持在距离靶蛋白的预测pI至少1个单位的pH值下。
在ForteBio OctetRED96仪器上评估所有蛋白质相互作用。将蛋白质在动力学缓冲液制剂(PBS+0.1％BSA、0.02％吐温20、0.05％叠氮化钠)中稀释，样品体积为220μl/孔。将配体浓度在10μg/ml标准化并且分析物浓度在100nM下。阻断试剂以250μg/ml的浓度采用。传感器平衡时间设定为60秒，并且样品负载时间确定为300秒。人Fc阻断时间设定为300秒。缔合时间的分析设定为300秒，并且解离时间设定为600秒。
对于这种方法，使目标抗体定向并且捕获在用抗人(或抗小鼠)Fc抗体衍生化的生物传感器上。接着测定溶液中目标靶蛋白与抗体负载的传感器的结合。
对于蛋白质含有类似物种Fc结构域的相互作用，包括额外阻断步骤以将与捕获抗体无关的靶蛋白与生物传感器的直接结合最小化。
如果对另一物种的PD-1变体或PD-1的亲和力与对野生型人PD-1的亲和力相比在大约5倍内，则证实结合事件，为Y(是)。降低>10倍且<100倍的亲和力表示为减少。降低>100倍的亲和力表示为N(否)。未评估的相互作用列为ND(未测定)。
人PD-1的变体作为具有C-末末端His6标签的细胞外结构域(ECD)-Fc融合物产生，并且用于PD-1配体以及纳武单抗、派姆单抗和13407的Fab片段的结合分析。结果显示于表2中。
表2：PD-1结合数据的总结
针对与分子组的结合评估据报告影响派姆单抗结合的氨基酸取代(Na等人,2017,Cell Res.,27:147-150)。在D85G取代下派姆单抗消除与PD-1结合，而纳武单抗和13407的结合未受影响。当针对N-末端截短的变体N33-Q167评估时纳武单抗与PD-1的结合也减少。这些结果指示13407接触的氨基酸显著不同于派姆单抗和纳武单抗接触的氨基酸。
产生先前针对PD-L1和PD-L2配体评估的额外变体(Lázár-Molnár等人,2008,PNAS,105:10483-10488)。纳武单抗和派姆单抗的结合实质上不受这些氨基酸取代影响，而13407的结合亲和力在I126A、L128A和E136A取代下显著减少，并且在A132L和I134A取代下消除。所述数据揭示13407与PD-L1类似的结合特征。
还针对与额外物种PD-1的结合，评估Fab片段组。派姆单抗和纳武单抗无法结合至小鼠、大鼠或狗PD-1。相比之下，13407结合至小鼠PD-1。意外地，尽管大鼠与小鼠PD-1之间存在高同源性，但13407无法结合至大鼠PD-1。产生其中残基129被置换为来自大鼠序列的对应残基(H129P)的小鼠PD-1的变体并且发现13407消除结合。当将互逆突变P129H引入大鼠序列时，13407结合至变体。值得注意地，13407不结合的狗PD-1序列在这一位置缺乏脯氨酸。
总之，13407结合与纳武单抗和派姆单抗所结合的表位不同的PD-1的表位。
在不脱离本发明的精神或基本特征下本发明可通过其他特定形式体现。因此，认为前述实施方案在所有方面均为说明性，而非限制本发明。因此本公开的范围通过所附权利要求指示，而非通过前述描述指示，并且因此意图本文中涵盖在权利要求的等效物的含义和范围内的所有变化。
序列表
序列表
<110> 震动疗法股份有限公司（JOUNCE THERAPEUTICS, INC.）
<120> 针对PD-1的抗体及其用途
<130> 01140-0006-00PCT
<150> US 62/416,602
<151> 2016-11-02
<160> 406
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
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Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
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100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
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Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
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Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
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<211> 288
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
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Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 3
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
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Gly
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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Glu Ala Ser Ser Leu Glu Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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100 105 110
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1 5
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 11
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<400> 83
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1 5
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<400> 84
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Ser Tyr
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Asn Pro Ser Val Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Glu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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1 5
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Gly
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Gly
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Glu Ala Ser Ser Leu Glu Ser
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<211> 9
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<211> 116
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met Ser
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<400> 118
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1 5 10 15
Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 120
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 7
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Glu Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Pro Thr
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<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
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115
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<211> 9
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<400> 125
Phe Thr Phe Ser His Tyr Leu Met Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
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Gly
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
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1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
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<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
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100 105 110
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115
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Phe Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Met Ser
1 5
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 135
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
Ala Lys Val Tyr Tyr Gly Met Pro Tyr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
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<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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65 70 75 80
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Ala Lys Val Tyr Tyr Gly Met Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 141
Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Met Met Ser
1 5
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 143
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
Ala Lys Val Tyr Tyr Gly Met Pro Tyr
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<210> 144
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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<400> 145
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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Gln Gln Ala Ser Asp Val Pro Trp Thr
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<400> 148
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Tyr Tyr Gly Met Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
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Gly
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1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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65 70 75 80
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<400> 187
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<211> 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 188
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35 40 45
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 197
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<211> 17
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 204
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
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100 105 110
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115 120
<210> 205
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 206
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
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1 5 10 15
Gly
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<211> 14
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
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<210> 208
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
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85 90 95
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100 105 110
Lys
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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Ala
<210> 210
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
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<400> 211
Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
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<211> 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Ala Ile Ser
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<210> 214
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Gly
<210> 215
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
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1 5 10
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<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Ser Tyr Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
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1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
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20 25 30
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Gly Val Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
Gly Thr Phe Ser Gln Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 222
Val Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 223
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
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Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<400> 228
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Gly
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Ala Arg Gly Ala Ser Asp Gly Glu Thr Gly Arg Leu Asp Leu
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Lys
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<400> 236
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<400> 238
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Gly
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<400> 244
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<400> 268
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<400> 269
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<211> 17
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 273
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 274
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 275
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<211> 116
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 276
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100 105 110
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 277
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
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<210> 278
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 278
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1 5 10 15
Gly
<210> 279
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 279
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Asp Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 281
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 281
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 282
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 282
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 283
Gln Gln Ala Ser Asp Val Pro Trp Thr
1 5
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<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 284
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Gly Pro Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 285
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 286
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 287
Ala Arg Asp Gly Pro Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Val
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 288
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ala Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
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<213> 智人(Homo sapiens)
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1 5
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<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
Ala Arg Ala Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Trp Gly Gly Ser Asn Ile
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 296
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Gly Ser Phe Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
Gln Gln Asp Gly Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 303
Ala Arg Asp Pro Arg Tyr Thr Thr Leu Thr Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 304
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 306
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 307
Gln Gln Ala Val Asn Phe Pro Pro Ile Thr
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<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 308
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 9
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Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 310
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 311
Ala Arg Glu Ala Ser Trp Leu Pro Gly Ser Leu Asp Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 312
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Tyr Asp Asn Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys
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<211> 17
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 313
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 314
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 315
Gln Gln Tyr Asp Asn Phe Pro Ile Thr
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<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 316
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 317
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 318
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Gly
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<211> 19
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 319
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Met Asp Val
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 320
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<400> 321
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 322
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 323
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<211> 117
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 324
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 325
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Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly
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<220>
<223> 人源化抗体
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<220>
<223> 人源化抗体
<400> 327
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1 5 10 15
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<220>
<223> 人源化抗体
<400> 328
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<220>
<223> 人源化抗体
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<220>
<223> 人源化抗体
<400> 330
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<220>
<223> 人源化抗体
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 332
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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115
<210> 333
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 333
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 334
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 335
Asn Ile Asp Glu Asp Gly Ser Ile Thr Glu Tyr Ser Pro Phe Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 336
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 336
Trp Gly Arg Phe Gly Phe Asp Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 337
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 338
Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 339
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 340
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 341
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 341
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly
20 25 30
Ser Phe Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His His His Tyr
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly Ser Phe Asn Tyr Leu Thr
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<223> 人源化抗体
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Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<223> 人源化抗体
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His His His Tyr Asn Ala Pro Pro Thr
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<211> 117
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<223> 人源化抗体
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
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65 70 75 80
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 372
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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<223> 人源化抗体
<400> 373
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly
20 25 30
Ser Phe Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<223> 人源化抗体
<400> 377
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly Ser Phe Asn Tyr Leu Thr
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 378
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 379
His His His Tyr Asn Ala Pro Pro Thr
1 5
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<211> 447
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 380
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
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Ser Asn Ile Asp Glu Asp Gly Ser Ile Thr Glu Tyr Ser Pro Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 381
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 381
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly
20 25 30
Ser Phe Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His His His Tyr
85 90 95
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 382
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 382
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165 170 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180 185 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195 200 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210 215 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 383
<211> 268
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 383
Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn
35 40 45
Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn
50 55 60
Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala
100 105 110
Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile
115 120 125
Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly
130 135 140
Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala Leu Val Gly Ile
145 150 155 160
Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val Phe Cys Ser Thr
165 170 175
Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp Asp Thr Leu Lys
180 185 190
Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala Tyr Glu Glu Leu
195 200 205
Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro Thr Ala Cys Val
210 215 220
His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly Leu Gly Ala Ser
225 230 235 240
Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln Gly Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 384
<211> 268
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 384
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
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Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
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<211> 384
<212> PRT
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<223> 小鼠H129P PD-1 ECD-Fc-His6
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35 40 45
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln
50 55 60
Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His
65 70 75 80
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Pro Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser
115 120 125
Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 395
<211> 287
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 395
Met Trp Val Gln Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Leu Asn Lys Pro Trp
20 25 30
Arg Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Lys
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln Pro Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Val Gln Leu Pro Asn Gly His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Pro Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Pro Thr Arg Tyr Pro Arg Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Gln Phe Gln Gly Leu Val Ile Val Ile Met Ser Val
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Ala
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Gly Met Ser Glu Ala Arg Glu Ala Gly Arg Lys Glu
195 200 205
Asp Pro Pro Lys Glu Ala His Ala Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly Leu
245 250 255
Asp Ala Ser Ala Ile Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Gln Gly
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 396
<211> 263
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 396
Leu Glu Val Leu Asn Lys Pro Trp Arg Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr
1 5 10 15
Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Lys Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln
50 55 60
Pro Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile Val Gln Leu Pro Asn Gly His
65 70 75 80
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Pro Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Pro
115 120 125
Thr Arg Tyr Pro Arg Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Leu Val Ile Val Ile Met Ser Val Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu
145 150 155 160
Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Ala Phe Cys Ser Thr Gly Met Ser Glu
165 170 175
Ala Arg Glu Ala Gly Arg Lys Glu Asp Pro Pro Lys Glu Ala His Ala
180 185 190
Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly
195 200 205
Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Ala Pro Cys Val His Thr Glu Tyr Ala
210 215 220
Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly Leu Asp Ala Ser Ala Ile Gly Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ser Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp
245 250 255
Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260
<210> 397
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 大鼠P129H PD-1 ECD-Fc-His6
<400> 397
Leu Glu Val Leu Asn Lys Pro Trp Arg Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr
1 5 10 15
Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Lys Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln
50 55 60
Pro Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile Val Gln Leu Pro Asn Gly His
65 70 75 80
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Pro
115 120 125
Thr Arg Tyr Pro Arg Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 398
<211> 288
<212> PRT
<213> 家犬(Canis lupus familiaris)
<400> 398
Met Gly Ser Arg Arg Gly Pro Trp Pro Leu Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Trp Pro Gly Trp Leu Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Ser Pro Leu Thr Phe Ser Pro Ala Gln Leu Thr Val Gln Glu Gly Glu
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ala Asp Ile Pro Asp Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Arg Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Gln Glu Asp Arg Ile Glu Pro Gly Arg Asp Arg Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Ile Val Ala
100 105 110
Ala Arg Leu Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Tyr Leu
115 120 125
Pro Pro Asn Thr Gln Ile Asn Glu Ser Pro Arg Ala Glu Leu Ser Val
130 135 140
Thr Glu Arg Thr Leu Glu Pro Pro Thr Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro
145 150 155 160
Arg Leu Ser Gly Gln Leu Gln Gly Leu Val Ile Gly Val Thr Ser Val
165 170 175
Leu Val Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Trp Val Leu Ala Ala
180 185 190
Val Phe Pro Arg Ala Thr Arg Gly Ala Cys Val Cys Gly Ser Glu Asp
195 200 205
Glu Pro Leu Lys Glu Gly Pro Asp Ala Ala Pro Val Phe Thr Leu Asp
210 215 220
Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro
225 230 235 240
Ala Pro Cys Ala Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro
245 250 255
Gly Arg Pro Ala Ser Pro Gly Arg Arg Ala Ser Ala Ser Ser Leu Gln
260 265 270
Gly Ala Gln Pro Pro Ser Pro Glu Asp Gly Pro Gly Leu Trp Pro Pro
275 280 285
<210> 399
<211> 264
<212> PRT
<213> 家犬(Canis lupus familiaris)
<400> 399
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Ser Pro Leu Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gln Leu Thr Val Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Ile Pro Asp Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Arg Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Gln Glu Asp Arg Ile Glu
50 55 60
Pro Gly Arg Asp Arg Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Ile Val Ala Ala Arg Leu Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Tyr Leu Pro Pro Asn Thr Gln Ile Asn Glu
100 105 110
Ser Pro Arg Ala Glu Leu Ser Val Thr Glu Arg Thr Leu Glu Pro Pro
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Arg Leu Ser Gly Gln Leu Gln Gly
130 135 140
Leu Val Ile Gly Val Thr Ser Val Leu Val Gly Val Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Leu Leu Thr Trp Val Leu Ala Ala Val Phe Pro Arg Ala Thr Arg Gly
165 170 175
Ala Cys Val Cys Gly Ser Glu Asp Glu Pro Leu Lys Glu Gly Pro Asp
180 185 190
Ala Ala Pro Val Phe Thr Leu Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp
195 200 205
Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro Cys Ala Pro Glu Gln Thr
210 215 220
Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Gly Arg Pro Ala Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Arg Ala Ser Ala Ser Ser Leu Gln Gly Ala Gln Pro Pro Ser Pro Glu
245 250 255
Asp Gly Pro Gly Leu Trp Pro Pro
260
<210> 400
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 400
Met Gly Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 401
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人PD-1细胞外结构域(ECD)-Fc-His6
<400> 401
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 402
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人PD-1 D85G/R86L ECD-Fc-His6
<400> 402
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr
115 120 125
Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His
370 375 380
His His
385
<210> 403
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 小鼠PD-1 ECD-Fc-His6
<400> 403
Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala
1 5 10 15
Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu
20 25 30
Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln
50 55 60
Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His
65 70 75 80
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser
115 120 125
Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 404
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 食蟹猴PD-1 ECD-Fc-His6
<400> 404
Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 405
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 大鼠PD-1 ECD-Fc-His6
<400> 405
Leu Glu Val Leu Asn Lys Pro Trp Arg Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr
1 5 10 15
Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Lys Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln
50 55 60
Pro Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile Val Gln Leu Pro Asn Gly His
65 70 75 80
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Pro Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Pro
115 120 125
Thr Arg Tyr Pro Arg Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380
<210> 406
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 狗PD-1 ECD-Fc-His6
<400> 406
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Ser Pro Leu Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gln Leu Thr Val Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Ile Pro Asp Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro
35 40 45
Arg Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Gln Glu Asp Arg Ile Glu
50 55 60
Pro Gly Arg Asp Arg Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Ile Val Ala Ala Arg Leu Asn Asp Ser Gly Ile
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Tyr Leu Pro Pro Asn Thr Gln Ile Asn Glu
100 105 110
Ser Pro Arg Ala Glu Leu Ser Val Thr Glu Arg Thr Leu Glu Pro Pro
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Pro Pro Pro Arg Leu Ser Gly Gln Leu Gln Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly His His His His His His
370 375 380

Claims (106)

1.一种结合至程序性死亡1(PD-1)的分离的抗体，其中所述抗体结合至包含人PD-1的氨基酸126至136的表位，其中氨基酸126至136是根据SEQ ID NO:1编号。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体以比所述抗体结合至选自I126A、L128A、A132L、I134A以及E136A的一种或多种PD-1变体大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:382的人PD-1。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体：
a)以比所述抗体结合至PD-1变体I126A ECD-Fc(SEQ ID NO:389)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
b)以比所述抗体结合至PD-1变体L128A ECD-Fc(SEQ ID NO:390)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
c)以比所述抗体结合至PD-1变体A132L ECD-Fc(SEQ ID NO:391)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
d)以比所述抗体结合至PD-1变体I134A ECD-Fc(SEQ ID NO:392)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc；和/或
e)以比所述抗体结合至PD-1变体E136A ECD-Fc(SEQ ID NO:393)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:401的人PD-1ECD-Fc。
4.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO:403的小鼠PD-1ECD-Fc。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体以比所述抗体结合至小鼠PD-1变体H129PECD-Fc(SEQ INO:394)大至少10倍的亲和力结合至SEQ ID NO:403的小鼠PD-1ECD-Fc。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体以比所述抗体结合至大鼠PD-1ECD-Fc(SEQ ID NO:405)大至少10倍的亲和力结合至大鼠PD-1变体P129H ECD-Fc(SEQ IDNO:397)。
7.如权利要求2至6中任一项所述的抗体，其中亲和力通过生物层干涉测量法来测定。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区(VH)以及与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区(VL)。
10.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含有包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。
11.一种结合至程序性死亡1(PD-1)的抗体，其中所述抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3；或
iii)(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR3；或
iv)(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR3；或
v)(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR3；或
vi)(a)包含选自SEQ ID NO:45、53、61、69、77、85、93、101、109以及117的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:46、54、62、70、78、86、94、102、110以及118的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:47、55、63、71、79、87、95、103、111以及119的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:49、57、65、73、81、89、97、105、113以及121的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:50、58、66、74、82、90、98、106、114以及122的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:51、59、67、75、83、91、99、107、115以及123的氨基酸序列的LCDR3；或
vii)(a)包含选自SEQ ID NO:125、133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、229、237、245、253、261、269、277以及285的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ IDNO:126、134、142、150、158、166、174、182、190、198、206、214、222、230、238、246、254、262、270、278以及286的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279以及287的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:129、137、145、153、161、169、177、185、193、201、209、217、225、233、241、249、257、265、273、281以及289的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQID NO:130、138、146、154、162、170、178、186、194、202、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282以及290的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:131、139、147、155、163、171、179、187、195、203、211、219、227、235、243、251、259、267、275、283以及291的氨基酸序列的LCDR3；或
viii)(a)包含选自SEQ ID NO:293、301、309以及317的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:294、302、310以及318的氨基酸序列的HCDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:295、303、311以及319的氨基酸序列的HCDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:297、305、313以及321的氨基酸序列的LCDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:298、306、314以及322的氨基酸序列的LCDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO:299、307、315以及323的氨基酸序列的LCDR3。
12.如权利要求11所述的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
i)所述VH与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
ii)所述VH与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iii)所述VH与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
iv)所述VH与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
v)所述VH与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且所述VL与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vi)所述VH与选自SEQ ID NO:44、52、60、68、76、84、92、100、108以及116的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQ ID NO:48、56、64、72、80、88、96、104、112以及120的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
vii)所述VH与选自SEQ ID NO:124、132、140、148、156、164、172、180、188、196、204、212、220、228、236、244、252、260、268、276以及284的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQ ID NO:128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280以及288的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
viii)所述VH与选自SEQ ID NO:292、300、308以及316的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且所述VL与选自SEQ ID NO:296、304、312以及320的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
13.如权利要求11或权利要求12所述的抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
i)所述VH包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或
ii)所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；或
iii)所述VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
iv)所述VH包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或
v)所述VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或
vi)所述VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或
vii)所述VH包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或
viii)所述VH包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或
ix)所述VH包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或
x)所述VH包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或
xi)所述VH包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或
xii)所述VH包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；或
xiii)所述VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；或
xiv)所述VH包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或
xv)所述VH包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列；或
xvi)所述VH包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；或
xvii)所述VH包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列；或
xviii)所述VH包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列；或
xix)所述VH包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列；或
xx)所述VH包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列；或
xxi)所述VH包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
xxii)所述VH包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列；或
xxiii)所述VH包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列；或
xxiv)所述VH包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列；或
xxv)所述VH包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列；或
xxvi)所述VH包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列；或
xxvii)所述VH包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列；或
xxviii)所述VH包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列；或
xxix)所述VH包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；或
xxx)所述VH包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列；或
xxxi)所述VH包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列；或
xxxii)所述VH包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列；或
xxxiii)所述VH包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列；或
xxxiv)所述VH包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列；或
xxxv)所述VH包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列；或
xxxvi)所述VH包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列；或
xxxvii)所述VH包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列；或
xxxviii)所述VH包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列；或
xxxix)所述VH包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列；或
xl)所述VH包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。
14.一种与如前述权利要求中任一项所述的抗体竞争结合至人PD-1的抗体，其中所述抗体结合至人PD-1和小鼠PD-1，并且其中所述抗体抑制人PD-1与人PD-L1的结合，抑制人PD-1与人PD-L2的结合，抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L1的结合，并且抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合。
15.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至人PD-1的亲和力(KD)小于5nM。
16.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至小鼠PD-1的亲和力(KD)小于10nM。
17.如权利要求15或权利要求16所述的抗体，其中使用生物层干涉测量法测定亲和力。
18.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
19.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
20.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为选自Fab、Fab’、Fv、scFv或(Fab’)2片段的抗体片段。
21.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体。
22.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合人PD-1。
23.如权利要求22所述的抗体，其中人PD-1包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列。
24.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合小鼠PD-1。
25.如权利要求24所述的抗体，其中小鼠PD-1包含SEQ ID NO:383的氨基酸序列。
26.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合食蟹猴PD-1。
27.如权利要求26所述的抗体，其中食蟹猴PD-1包含SEQ ID NO:384的氨基酸序列。
28.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制PD-1与PD-L1的结合。
29.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制PD-1与PD-L2的结合。
30.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制PD-1与PD-L1的结合并且抑制PD-1与PD-L2的结合。
31.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向哺乳动物施用所述抗体增加选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平。
32.如权利要求31所述的抗体，其中所述抗体使选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平增加至少2倍。
33.如权利要求32所述的抗体，其中在施用所述抗体之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时或48小时测量所述细胞因子的水平。
34.如权利要求31至33中任一项所述的抗体，其中至少一种细胞因子为IFNγ。
35.如权利要求31至34中任一项所述的抗体，其中至少一种细胞因子为IL-2。
36.如权利要求31至35中任一项所述的抗体，其中在施用所述抗体之后24小时测量趋化因子的水平。
37.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向哺乳动物施用所述抗体增强所述哺乳动物中的免疫应答。
38.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向哺乳动物施用所述抗体引起所述哺乳动物中的T细胞活化。
39.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向哺乳动物施用所述抗体减小患有癌症的哺乳动物中的肿瘤尺寸。
40.如权利要求31至39中任一项所述的抗体，其中所述哺乳动物为人。
41.如权利要求40所述的抗体，其中所述人患有癌症。
42.如权利要求41所述的抗体，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
43.如权利要求42所述的抗体，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
44.一种分离的核酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的抗体。
45.一种载体，其包含如权利要求44所述的核酸。
46.一种宿主细胞，其包含如权利要求45所述的载体。
47.一种宿主细胞，其产生如权利要求1至43中任一项所述的抗体。
48.一种用于制备抗PD-1抗体的方法，所述方法包括在适合于表达所述抗体的条件下培养如权利要求47所述的宿主细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其还包括回收由所述宿主细胞产生的所述抗体。
50.一种药物组合物，其包含如权利要求1至43中任一项所述的抗PD-1抗体和药学上可接受的载体。
51.一种治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1至43中任一项所述的抗PD-1抗体或如权利要求50所述的药物组合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
54.一种增强哺乳动物中的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1至43中任一项所述的抗PD-1抗体或如权利要求50所述的药物组合物。
55.一种增加哺乳动物中的T细胞活化的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1至43中任一项所述的抗PD-1抗体或如权利要求50所述的药物组合物。
56.一种减小患有癌症的哺乳动物中的肿瘤尺寸的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1至43中任一项所述的抗PD-1抗体或如权利要求50所述的药物组合物。
57.如权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
58.如权利要求51至57中任一项所述的方法，其中向所述哺乳动物施用至少一种额外治疗剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述额外治疗剂与所述抗PD-1抗体同时或依序施用。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。
62.如权利要求58或权利要求59所述的方法，其中所述额外治疗剂为癌症疫苗。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
64.如权利要求1至43中任一项所述的抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。
65.如权利要求64所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
67.如权利要求64至66中任一项所述的用途，其中所述药物与至少一种额外治疗剂一起施用。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。
69.如权利要求68所述的用途，其中所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。
70.如权利要求67所述的用途，其中所述额外治疗剂为癌症疫苗。
71.如权利要求70所述的用途，其中所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
72.如权利要求1至43中任一项所述的抗体或如权利要求50所述的药物组合物用于治疗癌症的用途。
73.如权利要求72所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
74.如权利要求73所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
75.如权利要求1至43中任一项所述的抗体或如权利要求50所述的药物组合物和至少一种额外治疗剂用于治疗癌症的用途。
76.如权利要求75所述的用途，其中所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。
77.如权利要求76所述的用途，其中所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。
78.如权利要求75所述的用途，其中所述额外治疗剂为癌症疫苗。
79.如权利要求78所述的用途，其中所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
80.如权利要求75至79中任一项所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
81.如权利要求80所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
82.如权利要求1至43中任一项所述的抗体或如权利要求50所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
83.如权利要求82所述的抗体，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
84.如权利要求83所述的抗体，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
85.一种增加哺乳动物中选自IFNγ和IL-2的至少一种细胞因子的水平的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用如权利要求1至43中任一项所述的抗体。
86.如权利要求85所述的方法，其中在施用所述抗体之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时或48小时测量所述细胞因子的水平。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中至少一种细胞因子为IFNγ。
88.如权利要求85至87中任一项所述的方法，其中至少一种细胞因子为IL-2。
89.如权利要求85至88中任一项所述的方法，其中在施用所述抗体之后24小时测量所述细胞因子的水平。
90.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述人患有癌症。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述癌症是选自黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤以及三阴性乳癌(TNBC)。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述癌症是选自黑素瘤、胃癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)以及三阴性乳癌(TNBC)。
94.如权利要求85至93中任一项所述的方法，其中在施用所述抗PD-1抗体之后免疫应答增强。
95.如权利要求85至94中任一项所述的方法，其中在施用所述抗PD-1抗体之后T细胞活化增加。
96.如权利要求85至95中任一项所述的方法，其中在施用所述抗PD-1抗体之后肿瘤尺寸减小。
97.如权利要求85至96中任一项所述的方法，其中向所述哺乳动物施用至少一种额外治疗剂。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述额外治疗剂与所述抗PD-1抗体同时或依序施用。
99.如权利要求97或98中任一项所述的方法，其中所述额外治疗剂是选自抗ICOS抗体和抗CTLA4抗体。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述额外治疗剂为抗ICOS抗体。
101.如权利要求97或98所述的方法，其中所述额外治疗剂为癌症疫苗。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述癌症疫苗是选自DNA疫苗、工程化的病毒疫苗、工程化的肿瘤细胞疫苗以及使用新抗原研发的癌症疫苗。
103.如权利要求51至81中任一项所述的方法或用途，其中已确定所述癌症的样品表达PD-1。
104.如权利要求103所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)，所述样品显示PD-1的1+、2+或3+染色。
105.如权利要求51至81、103或104中任一项所述的方法，其中已确定所述样品具有升高的PD-L1水平。
106.如权利要求105所述的方法，其中使用IHC测定PD-L1水平。
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