CN117136071A

CN117136071A - 多肽及其在治疗疾病中的用途

Info

Publication number: CN117136071A
Application number: CN202280024873.9A
Authority: CN
Inventors: A·卡巴基比; A·S·哈米尔
Original assignee: Wujing Co ltd
Current assignee: Wujing Co ltd
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-11-28
Also published as: EP4291233A1; WO2022173949A1; US20240101668A1

Abstract

本文披露了多肽，如单克隆抗体(mAb)及其功能性片段、合成的抗原结合蛋白如单链可变片段(scFv)、以及嵌合抗原受体(CAR)，这些多肽可以特异性识别癌细胞例如表达CD33、FLT3和CLL‑1的那些癌细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)，这些多肽可用于治疗疾病如癌症。

Description

多肽及其在治疗疾病中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月10日提交的美国临时专利申请号63/148,012的优先权和权益，将该申请的全部内容通过引用并入本文。

靶向免疫疗法基于免疫受体对抗原的识别，抗原是病变细胞或病原体上限定的结构，免疫受体是可溶性的(即抗体)或存在于免疫细胞表面，如携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(如CAR-T细胞)中的CAR。免疫受体对抗原的识别和结合通常触发效应功能，最终导致相应的病原体或细胞的破坏。可溶性免疫受体包括天然的或合成的抗体、抗体衍生分子和其他结构，它们在与抗原结合时触发补体系统或募集并在大多数情况下激活效应细胞。可替代地，靶向抗原的细胞可以通过将工程化免疫受体(如转基因T细胞受体(TCR)或CAR)经基因插入T细胞或其他免疫效应细胞(包括自然杀伤(NK)细胞)而产生。通常，CAR包含源自对某个靶抗原具有特异性的抗体的单链可变片段(scFv)，该scFv经由铰链区和跨膜区与T细胞信号传导分子的细胞质结构域偶联。CAR介导的过继免疫疗法允许经CAR移植的细胞以非HLA限制的方式直接识别靶细胞上的希望的抗原。

这些免疫疗法的一个常见应用是治疗癌症，尽管其不是唯一的应用。癌症是涉及细胞生长失调的一组广泛的疾病。在癌症中，细胞不受控制地分裂和生长，从而形成恶性肿瘤，并侵入附近身体部位。癌症也可能通过淋巴系统或血流扩散到体内更远的部位。已知人类中有200多种不同的癌症。尽管对于许多癌症类型，可获得良好的治疗选择，但对于其他癌症类型，仍然存在未满足的医疗需求。

在这些中就有血液癌症。造血系统的癌症可以大致分为不同的亚型。白血病通常影响初级淋巴器官(即骨髓和胸腺)，并起源于造血祖细胞群，例如像急性髓系白血病(AML)。另一方面，淋巴瘤通常源自成熟的淋巴细胞，并起源于次级淋巴器官。

目前大多数造血系统癌症的一线治疗涉及施用化疗药剂(广谱或靶向疗法)、放疗或两者的组合。在许多情况下，将这样的疗法与造血干细胞转移(HSCT)组合或者在这样的疗法后进行HSCT，其中由供体来源的淋巴细胞(尤其是T细胞)介导的移植物抗白血病(GvL)效应可以促使在预调理性化疗或放疗中存活下来的癌细胞的根除，并达致完全缓解(CR)。根据血液恶性肿瘤的类型、患者的状况和造血干细胞移植物的可获得性，临床上常规进行各种形式的HSCT。目前，所希望的GvL效应仅在同种异体HSCT中实现，与此同时经常伴随移植物抗宿主病(GvHD)的发生，GvHD是严重且有时致命的并发症。此外，在所有情况下，持续存在的癌症干细胞经常导致疾病的复发。

近年来，用于治疗癌症的靶向免疫疗法(如CAR-T细胞)的开发取得了巨大进展。然而，大多数靶向免疫疗法广泛地靶向在恶性细胞和健康细胞上表达的抗原，并且使用以多态性非选择性方式靶向抗原的多肽来靶向。另外，进行了HSCT移植的患者的血液癌症复发仍然是有待解决的问题。因此，需要开发用于治疗疾病(如癌症)的新颖疗法，这些疗法能够利用可替代的靶分子，并减少或避免通常与目前普遍靶向免疫疗法、特别是CAR T细胞疗法相关的副作用。

发明内容

本文提供了多态性选择性多肽，包括单链可变片段、单克隆抗体及其抗原结合片段、抗体-药物缀合物、和嵌合抗原受体，以及包含它们的工程化免疫效应细胞，其可用于治疗疾病(如癌症)，并且在一些实施例中，以允许选择性杀伤患者的患病细胞同时保留移植的造血细胞的方式与多态性错配的造血细胞移植物组合。

序列简要说明

SEQ ID NO:1至200：多态性选择性抗CD33多肽1-25的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:201至336：多态性选择性抗CD33多肽26-42的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:337至528：多态性选择性抗CLL-1多肽43-66的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:529至704：多态性选择性抗CLL-1多肽67-88的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:705-1144和1979-2002：多态性非选择性抗CD33多肽89-143和191-193的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:1145-1520和2003-2058：多态性非选择性抗CLL-1多肽144-190和194-200的CDR以及VH和VL链的序列。

SEQ ID NO:1521至1538：选择的CAR组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1539至1598：可以使用本文披露的多肽制备的示例性CAR的序列。

SEQ ID NO:1599至1626：人抗体Fc组分，其可以与本文披露的多肽组合以形成诊断性或治疗性抗体。

SEQ ID NO:1627-1802：包含多肽1-88的示例性抗CD33和抗CLL-1IgG1抗体的序列。

SEQ ID NO:1803至1978：包含多肽1-88的示例性抗CD33和抗CLL-1IgG4抗体的序列。

SEQ ID NO:2059至2810：多态性非选择性抗FLT3多肽201-294的CDR以及VH和VL链的序列。

附图说明

图1显示了CD33细胞外结构域(ECD)，其中左分图中的氨基酸(AA)69和右分图中的FLT3 ECD AA267各自处于相对溶剂可及的位置。

图2显示了对照(C)亲本Jurkat细胞、表达CD33-R69的Jurkat细胞(R69)和表达CD33-G69的Jurkat细胞(G69)，并且它们经以下处理：

·A：作为阴性对照的PD-L1 scFv，其导致R69和G69相对于亲本细胞的平均倍数强度变化分别为0.73和0.66；

·B：作为阳性对照的CD33非选择性scFv，其导致R69和G69相对于亲本细胞的MFI变化分别为78.9和74.6；

·C：CD33-R69选择性scFv，其导致R69和G69相对于亲本细胞的MFI变化分别为20.3和0.58；以及

·D：CD33-G69选择性scFv，其导致R69和G69相对于亲本细胞的MFI变化分别为0.59和45.9。

图3显示了多肽1-42针对Jurkat细胞中稳定表达的huCD33-R69或huCD33-G69的倍数选择性。

图4显示了体外细胞毒性测定的结果，其中用CART33^ARG69、CART33^GLY69或CART33处理CD33^GLY69细胞靶标的培养物。CART33^GLY69和CART33有效地杀伤表达CD33^GLY69的细胞，但CART33^ARG69并非如此。

图5显示了体外细胞毒性测定的结果，其中用CART33^ARG69、CART33^GLY69或CART33处理CD33^ARG69细胞靶标的培养物。CART33^ARG69和CART33有效地杀伤表达CD33^ARG69的细胞，但CART33^GLY69并非如此。

具体实施方式

实施例

因此，尽管在整个披露中可以找到其他实施例，但是本文提供了以下实施例：

实施例1.一种多肽，该多肽相对于人癌细胞抗原的第二多态性变体选择性结合该人癌细胞抗原的第一多态性变体；或相对于该抗原的第一多态性变体选择性结合该抗原的第二多态性变体。

实施例2.如实施例1所述的多肽，其中该抗原选自CD33、CLL-1和FLT3。

实施例3.如实施例2所述的多肽，其中该抗原是CD33。

实施例4.一种多肽，该多肽相对于CD33的第二多态性变体选择性结合CD33的第一多态性变体；或相对于该CD33的第一多态性变体选择性结合该CD33的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

实施例5.如实施例4所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

实施例6.如实施例5所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

实施例7.如实施例3-6中任一项所述的多肽，其中该CD33的第一多态性变体是R69，并且该CD33的第二多态性变体是G69；或者该CD33的第一多态性变体是G69，并且该CD33的第二多态性变体是R69。

实施例8.如实施例7所述的多肽，该多肽包含六个互补决定区(CDR)。

实施例9.如实施例8所述的多肽，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3。

实施例10.如实施例7-9中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:1-25和201-217的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:26-50和218-234的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:51-75和235-251的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例11.如实施例7-9中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:1-25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:26-50的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:51-75的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例12.如实施例7-9中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:201-217的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:218-234的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:235-251的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例13.如实施例10-12中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例14.如实施例10-12中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3具有所述氨基酸序列。

实施例15.如实施例7-9和8-14中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:76-100和252-268的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:101-125和269-285的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:126-150和286-302的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例16.如实施例7-9和8-14中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:76-100的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:101-125的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:126-150的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例17.如实施例7-9和8-14中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:252-268的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:269-285的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:286-302的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例18.如实施例15-17中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例19.如实施例15-17中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3具有所述氨基酸序列。

实施例20.如实施例7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 151-175和303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例21.如实施例7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 151-175中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例22.如实施例7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例23.如实施例20-22中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例24.如实施例20-22中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

实施例25.如实施例7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200和320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例26.如实施例7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例27.如实施例7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例28.如实施例25-27中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例29.如实施例25-27中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

实施例30.如实施例20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-42中所述的那些。

实施例31.如实施例20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-25中所述的那些。

实施例32.如实施例20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号26-42中所述的那些。

实施例33.如实施例30-33中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域和该V_L结构域与所述氨基酸序列对中的一对具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例34.如实施例2所述的多肽，其中该抗原是FLT3。

实施例35.一种多肽，该多肽相对于FLT3的第二多态性变体选择性结合FLT3的第一多态性变体；或相对于该第一多态性变体选择性结合该FLT3的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

实施例36.如实施例35所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

实施例37.如实施例36所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

实施例38.如实施例34-37中任一项所述的多肽，其中该FLT3的第一多态性变体是T227，并且该FLT3的第二多态性变体是M227；或者FLT3的第一多态性变体是M227，并且该FLT3的第二多态性变体是T227。

实施例39.如实施例2所述的多肽，其中该抗原是CLL-1。

实施例40.一种多肽，该多肽相对于CLL-1的第二多态性变体选择性结合CLL-1的第一多态性变体；或相对于该第一多态性变体选择性结合该CLL-1的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

实施例41.如实施例40所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

实施例42.如实施例40所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

实施例43.如实施例39-42中任一项所述的多肽，其中该CLL-1的第一多态性变体是K224，并且该CLL-1的第二多态性变体是Q244；或者CLL-1的第一多态性变体是Q224，并且该CLL-1的第二多态性变体是K244。

实施例44如权利要求43所述的多肽，该多肽包含六个互补决定区(CDR)。

实施例45.如实施例44所述的多肽，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3。

实施例46.如实施例43-45中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:337-360和529-550的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:361-384和551-572的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:385-408和573-594的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例47.如实施例43-45中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:337-360的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:361-384的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:385-408的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例48.如实施例43-45中任一项所述的多肽，其中：

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:529-550的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:551-572的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:573-594的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例49.如实施例46-48中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例50.如实施例46-48中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3具有所述氨基酸序列。

实施例51.如实施例43-50中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:409-432和595-616的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:433-456和617-638的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:457-480和639-660的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例52.如实施例43-50中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:409-432的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:433-456的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:457-480的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例53.如实施例43-50中任一项所述的多肽，其中：

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:595-616的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:617-638的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:639-660的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例54.如实施例51-53中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例55.如实施例51-53中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3具有所述氨基酸序列。

实施例56.如实施例44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 151-175和303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例57.如实施例44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 151-175中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例58.如实施例44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO 303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例59.如实施例56-58中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例60.如实施例56-58中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

实施例61.如实施例44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200和320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例62.如实施例44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例63.如实施例44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例64.如实施例61-63中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例65.如实施例61-63中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

实施例66.如实施例56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-88中所述的那些。

实施例67.如实施例56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-66中所述的那些。

实施例68.如实施例56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号67-88中所述的那些。

实施例69.如实施例66-68中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域和该V_L结构域与所述氨基酸序列对中的一对具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例70.一种单链可变片段(scFv)，该scFv包含如实施例1-69中任一项所述的多肽。

实施例71.一种单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段包含如实施例1-69中任一项所述的多肽。

实施例72.如实施例71所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG、IgM或IgA同种型。

实施例73.如实施例72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG1同种型。

实施例74.如实施例72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG3同种型。

实施例75.如实施例72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG4同种型。

实施例76.如实施例72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb是人的或人源化的。

实施例77.如实施例71-76中任一项所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb包含选自SEQ ID NO:1201-1368的序列。

实施例78.一种抗体-药物缀合物(ADC)，该ADC包含如实施例71-77中任一项所述的mAb或其抗原结合片段。

实施例79.如实施例52所述的ADC，该ADC具有式I：

Ab-(L-D)_p

(I)

其中：

Ab是包含如实施例1-43中任一项所述的多肽的抗体、或如实施例45-51中任一项所述的抗体、或前述两者之一的抗原结合片段；

L是接头；

D是药物；并且

p是约1至约20。

实施例80.如实施例79所述的ADC，其中D选自皂草毒蛋白、MMAE、MMAF、DM1和DM4。

实施例81.一种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含含有如实施例1-69中任一项所述的多肽的细胞外配体结合结构域。

实施例82.如实施例81所述的CAR，该CAR另外包含：

铰链结构域；

跨膜结构域；

任选地，一个或多个共刺激结构域；以及

细胞质信号传导结构域。

实施例83.如实施例82所述的CAR，其中该铰链结构域选自FcεRIIIa、CD8α、CD28和IgG1。

实施例84.如实施例83所述的CAR，其中该铰链结构域是CD8α。

实施例85如实施例82-84中任一项所述的CAR，其中该跨膜结构域选自该T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CDS0，CD86，CD134，CD137和CD154。

实施例86.如实施例85所述的CAR，其中该跨膜结构域是CD28。

实施例87.如实施例82-86中任一项所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域选自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD22、CD32、DAP10、DAP12、CD66d、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ、FcεRIγ、FcRγ、FcRβ和FcRε。

实施例88.如实施例87所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域是CD3ζ。

实施例89.如实施例82-88中任一项所述的CAR，其中一个共刺激结构域选自4-1BB、CD28和ICOS。

实施例90.如实施例89所述的CAR，其中该共刺激结构域是CD28。

实施例91.如实施例89所述的CAR，其中该共刺激结构域是4-1BB。

实施例92.如实施例89所述的CAR，该CAR包含两个或更多个共刺激结构域。

实施例93.如实施例89所述的CAR，其中这些共刺激结构域中的两个是CD28和4-1BB。

实施例94.如实施例82所述的CAR，该CAR包含选自SEQ ID NO:1539-1598的序列。

实施例95.一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码如实施例1-94中任一项所述的多肽、scFv、mAb或CAR。

实施例96.一种载体，该载体包含如实施例95所述的核苷酸序列。

实施例97.如实施例96所述的载体，其中该载体是慢病毒载体。

实施例98.如实施例97所述的载体，其中该慢病毒载体包含VSVG结构域。

实施例99.一种工程化免疫效应细胞，该工程化免疫效应细胞在该细胞的表面表达如实施例81-94中任一项所述的CAR。

实施例100.如实施例99所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞在该细胞的表面表达：

人癌细胞抗原的第一多态性变体；以及

CAR，该CAR相对于该抗原的第一多态性变体对第二多态性变体具有选择性。

实施例101.如实施例99所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是原代细胞。

实施例102.如实施例99所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞源自：

诱导多能干细胞(iPSC)；

脐带血；

外周血；或者

永生化细胞系。

实施例103.如实施例102所述的工程化免疫效应细胞，其中该永生化细胞系是NK-92。

实施例104.如实施例99-103中任一项所述的工程化免疫细胞，其中该细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、恒定自然杀伤T(iNKT)细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

实施例105.如实施例104所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是T细胞。

实施例106.如实施例105所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞选自炎症性T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。

实施例107.如实施例105所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏该T细胞受体复合物的亚基。

实施例108.如实施例107所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞受体复合物的亚基选自TCRα(TRAC)、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、和CD3ζ。

实施例109.如实施例99-108中任一项所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏细胞表面蛋白，该细胞表面蛋白是该CAR的靶标。

实施例110.如实施例104所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是NK细胞。

实施例111.如实施例110所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是记忆样(ML)NK细胞。

实施例112.如实施例111所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞。

实施例113.如实施例104所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是iNKT细胞。

实施例114.一种治疗有需要的受试者的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

a.任选地，用一种或多种调理方案治疗该受试者以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞；

b.向该受试者施用：

-表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞群，该CAR选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体；或者

-单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体；或者

-包含单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体；以及

c.向该受试者施用供体造血细胞群，这些造血细胞中的多个包含该抗原的第二多态性变体；

其中这些造血细胞的施用和这些表达CAR的细胞、mAb或ADC的施用可以同时进行，或者按任一顺序依序进行。

实施例115.一种有需要的人受试者的免疫疗法的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

b.向该受试者施用供体造血细胞群，这些造血细胞中的多个包含该抗原的第二多态性变体；以及

c.向该受试者施用：

-表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞群，该CAR在靶细胞表面上特异性结合该抗原的第一多态性变体；或者

-包含单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

实施例116.一种治疗有需要的受试者的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

a.向该受试者施用：

-表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞群，该CAR结合在该靶细胞表面上的该抗原；或者

-单克隆抗体(mAb)，该mAb结合在该靶细胞表面上的该抗原；或者

-包含单克隆抗体(mAb)的抗体-药物缀合物(ADC)，该mAb结合在该靶细胞表面上的该抗原；以及

b.任选地，用一种或多种调理方案治疗该受试者以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞；

c.向该受试者施用：

d.向该受试者施用供体造血细胞群，这些造血细胞中的多个包含该抗原的第二多态性变体；

实施例117.如实施例114-116中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

实施例118.如实施例114-117中任一项所述的方法，其中该结合具有至少2倍的选择性。

实施例119.如实施例118所述的方法，其中该结合具有至少10倍的选择性。

实施例120.如实施例119所述的方法，其中该结合具有至少30倍的选择性。

实施例121.如实施例114-120中任一项所述的方法，其中该抗原选自CD33、CLL-1和FLT3。

实施例122.如实施例121所述的方法，其中该抗原是CD33。

实施例123.如实施例122所述的方法，其中该CD33的第一多态性变体是R69，并且该CD33的第二多态性变体是G69；或者该CD33的第一多态性变体是G69，并且该CD33的第二多态性变体是R69。

实施例124.如实施例121所述的方法，其中该抗原是FLT3。

实施例125.如实施例124所述的方法，其中该FLT3的第一多态性变体是T227，并且该FLT3的第二多态性变体是M227；或者FLT3的第一多态性变体是M227，并且该FLT3的第二多态性变体是T227。

实施例126.如实施例121所述的方法，其中该抗原是CLL-1。

实施例127.如实施例126所述的方法，其中该CLL-1的第一多态性变体是K224，并且该CLL-1的第二多态性变体是Q244；或者CLL-1的第一多态性变体是Q224，并且该CLL-1的第二多态性变体是K244。

实施例128.如实施例114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者同时施用该工程化免疫效应细胞群和该造血细胞群两者。

实施例128.如实施例114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者依序施用该造血细胞群，以及该工程化免疫效应细胞群、mAb或ADC。

实施例130.如实施例114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者依序施用该工程化免疫效应细胞群、mAb或ADC，以及该造血细胞群。

实施例131.如实施例114-130中任一项所述的方法，其中在施用这些造血细胞之前，用一种或多种调理方案治疗该受试者以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞。

实施例132.如实施例114-130中任一项所述的方法，其中该受试者已经用一种或多种调理方案调理以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞。

实施例133.如实施例114-12中任一项所述的方法，其中这些造血细胞是造血干细胞和/或造血祖细胞。

实施例134.如实施例114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞群，该CAR选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

实施例135.如实施例134所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞源自该受试者(即自体的)，并且这些造血细胞源自供体(即同种异体的)。

实施例136.如实施例134所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞和造血细胞源自单个供体。

实施例137.如实施例134所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞源自第一供体，并且造血细胞源自第二供体。

实施例138.如实施例134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)包含如实施例1-69中任一项所述的多肽。

实施例139.如实施例134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)包含如实施例70所述的scFv。

实施例140.如实施例134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)是如实施例81-94中任一项所述的CAR。

实施例141.如实施例134-137中任一项所述的方法，其中该工程化免疫效应细胞是如实施例99-113中任一项所述的工程化免疫效应细胞。

实施例142.如实施例114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

实施例143.如实施例142所述的方法，其中该单克隆抗体(mAb)包含如实施例1-69中任一项所述的多肽。

实施例144.如实施例116所述的方法，其中该单克隆抗体(mAb)是如实施例71-77中任一项所述的mAb。

实施例145.如实施例114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用包含单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

实施例146.如实施例142-145中任一项所述的方法，其中在移植后预防性施用该mAb或ADC以防止复发。

实施例147.如实施例114-146中任一项所述的方法，该方法另外包括对该受试者和供体进行基因分型，以确保该HSC供体和患者表达该靶抗原的不同变体。

实施例148.如实施例147所述的方法，其中使用基于蛋白质的测定(FACS)或基于DNA的测定(PCR)进行该基因分型。

实施例149.如实施例147所述的方法，其中在移植复发后对该患者进行基因分型。

实施例150.如实施例147所述的方法，其中在移植之前对该患者进行基因分型。

实施例151.如实施例147所述的方法，其中在造血细胞移植之前对该造血细胞供体进行基因分型。

实施例152.如实施例137-147中任一项所述的方法，其中在移植表达该CAR的工程化免疫效应细胞群之前对该免疫效应细胞供体进行基因分型。

实施例153.如实施例137-147中任一项所述的方法，其中在造血细胞移植之前对该免疫效应细胞供体进行基因分型。

实施例154.一种多肽，其结合CD33，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:705-7559和1979-1981的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:760-814和1982-1984的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:815-869和1985-1987的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:870-924和1988-1990的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:925-979和1991-1993的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:980-1034和1994-1996的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例155.如实施例154所述的多肽，该多肽包含分别选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合：

SEQ ID NO.:705、760、815、870、925和980；

SEQ ID NO.:706、761、816、871、926和981；

SEQ ID NO.:707、762、817、872、927和982；

SEQ ID NO.:708、763、818、873、928和983；

SEQ ID NO.:709、764、819、874、929和984；

SEQ ID NO.:710、765、820、875、930和985；

SEQ ID NO.:711、766、821、876、931和986；

SEQ ID NO.:712、767、822、877、932和987；

SEQ ID NO.:713、768、823、878、933和988；

SEQ ID NO.:714、769、824、879、934和989；

SEQ ID NO.:715、770、825、880、935和990；

SEQ ID NO.:716、771、826、881、936和991；

SEQ ID NO.:717、772、827、882、937和992；

SEQ ID NO.:718、773、828、883、938和993；

SEQ ID NO.:719、774、829、884、939和994；

SEQ ID NO.:720、775、830、885、940和995；

SEQ ID NO.:721、776、831、886、941和996；

SEQ ID NO.:722、777、832、887、942和997；

SEQ ID NO.:723、778、833、888、943和998；

SEQ ID NO.:724、779、834、889、944和999；

SEQ ID NO.:725、780、835、890、945和1000；

SEQ ID NO.:726、781、836、891、946和1001；

SEQ ID NO.:727、782、837、892、947和1002；

SEQ ID NO.:728、783、838、893、948和1003；

SEQ ID NO.:729、784、839、894、949和1004；

SEQ ID NO.:730、785、840、895、950和1005；

SEQ ID NO.:731、786、841、896、951和1006；

SEQ ID NO.:732、787、842、897、952和1007；

SEQ ID NO.:733、788、843、898、953和1008；

SEQ ID NO.:734、789、844、899、954和1009；

SEQ ID NO.:735、790、845、900、955和1010；

SEQ ID NO.:736、791、846、901、956和1011；

SEQ ID NO.:737、792、847、902、957和1012；

SEQ ID NO.:738、793、848、903、958和1013；

SEQ ID NO.:739、794、849、904、959和1014；

SEQ ID NO.:740、795、850、905、960和1015；

SEQ ID NO.:741、796、851、906、961和1016；

SEQ ID NO.:742、797、852、907、962和1017；

SEQ ID NO.:743、798、853、908、963和1018；

SEQ ID NO.:744、799、854、909、964和1019；

SEQ ID NO.:745、800、855、910、965和1020；

SEQ ID NO.:746、801、856、911、966和1021；

SEQ ID NO.:747、802、857、912、967和1022；

SEQ ID NO.:748、803、858、913、968和1023；

SEQ ID NO.:749、804、859、914、969和1024；

SEQ ID NO.:750、805、860、915、970和1025；

SEQ ID NO.:751、806、861、916、971和1026；

SEQ ID NO.:752、807、862、917、972和1027；

SEQ ID NO.:753、808、863、918、973和1028；

SEQ ID NO.:754、809、864、919、974和1029；

SEQ ID NO.:755、810、865、920、975和1030；

SEQ ID NO.:756、811、866、921、976和1031；

SEQ ID NO.:757、812、867、922、977和1032；

SEQ ID NO.:758、813、868、923、978和1033；

SEQ ID NO.:759、814、869、924、979和1034；

SEQ ID NO.:1979、1982、1985、1988、1991和1994；

SEQ ID NO.:1980、1983、1986、1989、1992和1995；以及

SEQ ID NO.:1981、1984、1987、1990、1993和1996；

或与前述各项具有至少95％序列同一性的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3的组合。

实施例156.如实施例154所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域，其中：

该V_H结构域包含与选自SEQ ID NO:1035-1089和1997-1999的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且/或者

该V_L结构域包含与选自SEQ ID NO:1090-1144和2000-2002的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例157.如实施例156所述的多肽，该多肽包含选自以下的V_H结构域和V_L结构域的组合：

SEQ ID NO.:1035和1090；

SEQ ID NO.:1036和1091；

SEQ ID NO.:1037和1092；

SEQ ID NO.:1038和1093；

SEQ ID NO.:1039和1094；

SEQ ID NO.:1040和1095；

SEQ ID NO.:1041和1096；

SEQ ID NO.:1042和1097；

SEQ ID NO.:1043和1098；

SEQ ID NO.:1044和1099；

SEQ ID NO.:1045和1100；

SEQ ID NO.:1046和1101；

SEQ ID NO.:1047和1102；

SEQ ID NO.:1048和1103；

SEQ ID NO.:1049和1104；

SEQ ID NO.:1050和1105；

SEQ ID NO.:1051和1106；

SEQ ID NO.:1052和1107；

SEQ ID NO.:1053和1108；

SEQ ID NO.:1054和1109；

SEQ ID NO.:1055和1110；

SEQ ID NO.:1056和1111；

SEQ ID NO.:1057和1112；

SEQ ID NO.:1058和1113；

SEQ ID NO.:1059和1114；

SEQ ID NO.:1060和1115；

SEQ ID NO.:1061和1116；

SEQ ID NO.:1062和1117；

SEQ ID NO.:1063和1118；

SEQ ID NO.:1064和1119；

SEQ ID NO.:1065和1120；

SEQ ID NO.:1066和1121；

SEQ ID NO.:1067和1122；

SEQ ID NO.:1068和1123；

SEQ ID NO.:1069和1124；

SEQ ID NO.:1070和1125；

SEQ ID NO.:1071和1126；

SEQ ID NO.:1072和1127；

SEQ ID NO.:1073和1128；

SEQ ID NO.:1074和1129；

SEQ ID NO.:1075和1130；

SEQ ID NO.:1076和1131；

SEQ ID NO.:1077和1132；

SEQ ID NO.:1078和1133；

SEQ ID NO.:1079和1134；

SEQ ID NO.:1080和1135；

SEQ ID NO.:1081和1136；

SEQ ID NO.:1082和1137；

SEQ ID NO.:1083和1138；

SEQ ID NO.:1084和1139；

SEQ ID NO.:1085和1140；

SEQ ID NO.:1086和1141；

SEQ ID NO.:1087和1142；

SEQ ID NO.:1088和1143；

SEQ ID NO.:1089和1144；

SEQ ID NO.:1997和2000；

SEQ ID NO.:1998和2001；以及

SEQ ID NO.:1999和2002；

或与前述各项具有至少95％序列同一性的V_H结构域和V_L结构域的组合。

实施例158.一种多肽，其结合CLL-1，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:1145-1191和2003-2009的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:1192-1238和2010-2016的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:1239-1285和2017-2023的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:1286-1332和2024-2030的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:1333-1379和2031-2037的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:1380-1426和2038-2044的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例159.如实施例158所述的多肽，该多肽包含分别选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合：

SEQ ID NO.:1145、1192、1239、1286、1333和1380；

SEQ ID NO.:1146、1193、1240、1287、1334和1381；

SEQ ID NO.:1147、1194、1241、1288、1335和1382；

SEQ ID NO.:1148、1195、1242、1289、1336和1383；

SEQ ID NO.:1149、1196、1243、1290、1337和1384；

SEQ ID NO.:1150、1197、1244、1291、1338和1385；

SEQ ID NO.:1151、1198、1245、1292、1339和1386；

SEQ ID NO.:1152、1199、1246、1293、1340和1387；

SEQ ID NO.:1153、1200、1247、1294、1341和1388；

SEQ ID NO.:1154、1201、1248、1295、1342和1389；

SEQ ID NO.:1155、1202、1249、1296、1343和1390；

SEQ ID NO.:1156、1203、1250、1297、1344和1391；

SEQ ID NO.:1157、1204、1251、1298、1345和1392；

SEQ ID NO.:1158、1205、1252、1299、1346和1393；

SEQ ID NO.:1159、1206、1253、1300、1347和1394；

SEQ ID NO.:1160、1207、1254、1301、1348和1395；

SEQ ID NO.:1161、1208、1255、1302、1349和1396；

SEQ ID NO.:1162、1209、1256、1303、1350和1397；

SEQ ID NO.:1163、1210、1257、1304、1351和1398；

SEQ ID NO.:1164、1211、1258、1305、1352和1399；

SEQ ID NO.:1165、1212、1259、1306、1353和1400；

SEQ ID NO.:1166、1213、1260、1307、1354和1401；

SEQ ID NO.:1167、1214、1261、1308、1355和1402；

SEQ ID NO.:1168、1215、1262、1309、1356和1403；

SEQ ID NO.:1169、1216、1263、1310、1357和1404；

SEQ ID NO.:1170、1217、1264、1311、1358和1405；

SEQ ID NO.:1171、1218、1265、1312、1359和1406；

SEQ ID NO.:1172、1219、1266、1313、1360和1407；

SEQ ID NO.:1173、1220、1267、1314、1361和1408；

SEQ ID NO.:1174、1221、1268、1315、1362和1409；

SEQ ID NO.:1175、1222、1269、1316、1363和1410；

SEQ ID NO.:1176、1223、1270、1317、1364和1411；

SEQ ID NO.:1177、1224、1271、1318、1365和1412；

SEQ ID NO.:1178、1225、1272、1319、1366和1413；

SEQ ID NO.:1179、1226、1273、1320、1367和1414；

SEQ ID NO.:1180、1227、1274、1321、1368和1415；

SEQ ID NO.:1181、1228、1275、1322、1369和1416；

SEQ ID NO.:1182、1229、1276、1323、1370和1417；

SEQ ID NO.:1183、1230、1277、1324、1371和1418；

SEQ ID NO.:1184、1231、1278、1325、1372和1419；

SEQ ID NO.:1185、1232、1279、1326、1373和1420；

SEQ ID NO.:1186、1233、1280、1327、1374和1421；

SEQ ID NO.:1187、1234、1281、1328、1375和1422；

SEQ ID NO.:1188、1235、1282、1329、1376和1423；

SEQ ID NO.:1189、1236、1283、1330、1377和1424；

SEQ ID NO.:1190、1237、1284、1331、1378和1425；

SEQ ID NO.:1191、1238、1285、1332、1379和1426；

SEQ ID NO.:2003、2010、2017、2024、2031和2038；

SEQ ID NO.:2004、2011、2018、2025、2032和2039；

SEQ ID NO.:2005、2012、2019、2026、2033和2040；

SEQ ID NO.:2006、2013、2020、2027、2034和2041；

SEQ ID NO.:2007、2014、2021、2028、2035和2042；

SEQ ID NO.:2008、2015、2022、2029、2036和2043；以及

SEQ ID NO.:2009、2016、2023、2030、2037和2044；

实施例160.如实施例158所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域，其中：

该V_H结构域包含与选自SEQ ID NO:1427-1473和2045-2051的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且/或者

该V_L结构域包含与选自SEQ ID NO:1474-1520和2052-2058的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例161.如实施例160所述的多肽，该多肽包含选自以下的V_H结构域和V_L结构域的组合：

SEQ ID NO.:1427和1474；

SEQ ID NO.:1428和1475；

SEQ ID NO.:1429和1476；

SEQ ID NO.:1430和1477；

SEQ ID NO.:1431和1478；

SEQ ID NO.:1432和1479；

SEQ ID NO.:1433和1480；

SEQ ID NO.:1434和1481；

SEQ ID NO.:1435和1482；

SEQ ID NO.:1436和1483；

SEQ ID NO.:1437和1484；

SEQ ID NO.:1438和1485；

SEQ ID NO.:1439和1486；

SEQ ID NO.:1440和1487；

SEQ ID NO.:1441和1488；

SEQ ID NO.:1442和1489；

SEQ ID NO.:1443和1490；

SEQ ID NO.:1444和1491；

SEQ ID NO.:1445和1492；

SEQ ID NO.:1446和1493；

SEQ ID NO.:1447和1494；

SEQ ID NO.:1448和1495；

SEQ ID NO.:1449和1496；

SEQ ID NO.:1450和1497；

SEQ ID NO.:1451和1498；

SEQ ID NO.:1452和1499；

SEQ ID NO.:1453和1500；

SEQ ID NO.:1454和1501；

SEQ ID NO.:1455和1502；

SEQ ID NO.:1456和1503；

SEQ ID NO.:1457和1504；

SEQ ID NO.:1458和1505；

SEQ ID NO.:1459和1506；

SEQ ID NO.:1460和1507；

SEQ ID NO.:1461和1508；

SEQ ID NO.:1462和1509；

SEQ ID NO.:1463和1510；

SEQ ID NO.:1464和1511；

SEQ ID NO.:1465和1512；

SEQ ID NO.:1466和1513；

SEQ ID NO.:1467和1514；

SEQ ID NO.:1468和1515；

SEQ ID NO.:1469和1516；

SEQ ID NO.:1470和1517；

SEQ ID NO.:1471和1518；

SEQ ID NO.:1472和1519；

SEQ ID NO.:1473和1520；

SEQ ID NO.:2045和2052；

SEQ ID NO.:2046和2053；

SEQ ID NO.:2047和2054；

SEQ ID NO.:2048和2055；

SEQ ID NO.:2049和2056；

SEQ ID NO.:2050和2057；以及

SEQ ID NO.:2051和2058；

实施例162.一种多肽，其结合FLT3，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中

HCDR1包含与选自SEQ ID NO:2059-2152的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:2153-2246的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

HCDR3包含与选自SEQ ID NO:2247-2340的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR1包含与选自SEQ ID NO:2341-2434的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；

LCDR2包含与选自SEQ ID NO:2435-2528的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且

LCDR3包含与选自SEQ ID NO:2529-2622的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例163.如实施例162所述的多肽，该多肽包含分别选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合：

SEQ ID NO.:2059、2153、2247、2341、2435和2529；

SEQ ID NO.:2060、2154、2248、2342、2436和2530；

SEQ ID NO.:2061、2155、2249、2343、2437和2531；

SEQ ID NO.:2062、2156、2250、2344、2438和2532；

SEQ ID NO.:2063、2157、2251、2345、2439和2533；

SEQ ID NO.:2064、2158、2252、2346、2440和2534；

SEQ ID NO.:2065、2159、2253、2347、2441和2535；

SEQ ID NO.:2066、2160、2254、2348、2442和2536；

SEQ ID NO.:2067、2161、2255、2349、2443和2537；

SEQ ID NO.:2068、2162、2256、2350、2444和2538；

SEQ ID NO.:2069、2163、2257、2351、2445和2539；

SEQ ID NO.:2070、2164、2258、2352、2446和2540；

SEQ ID NO.:2071、2165、2259、2353、2447和2541；

SEQ ID NO.:2072、2166、2260、2354、2448和2542；

SEQ ID NO.:2073、2167、2261、2355、2449和2543；

SEQ ID NO.:2074、2168、2262、2356、2450和2544；

SEQ ID NO.:2075、2169、2263、2357、2451和2545；

SEQ ID NO.:2076、2170、2264、2358、2452和2546；

SEQ ID NO.:2077、2171、2265、2359、2453和2547；

SEQ ID NO.:2078、2172、2266、2360、2454和2548；

SEQ ID NO.:2079、2173、2267、2361、2455和2549；

SEQ ID NO.:2080、2174、2268、2362、2456和2550；

SEQ ID NO.:2081、2175、2269、2363、2457和2551；

SEQ ID NO.:2082、2176、2270、2364、2458和2552；

SEQ ID NO.:2083、2177、2271、2365、2459和2553；

SEQ ID NO.:2084、2178、2272、2366、2460和2554；

SEQ ID NO.:2085、2179、2273、2367、2461和2555；

SEQ ID NO.:2086、2180、2274、2368、2462和2556；

SEQ ID NO.:2087、2181、2275、2369、2463和2557；

SEQ ID NO.:2088、2182、2276、2370、2464和2558；

SEQ ID NO.:2089、2183、2277、2371、2465和2559；

SEQ ID NO.:2090、2184、2278、2372、2466和2560；

SEQ ID NO.:2091、2185、2279、2373、2467和2561；

SEQ ID NO.:2092、2186、2280、2374、2468和2562；

SEQ ID NO.:2093、2187、2281、2375、2469和2563；

SEQ ID NO.:2094、2188、2282、2376、2470和2564；

SEQ ID NO.:2095、2189、2283、2377、2471和2565；

SEQ ID NO.:2096、2190、2284、2378、2472和2566；

SEQ ID NO.:2097、2191、2285、2379、2473和2567；

SEQ ID NO.:2098、2192、2286、2380、2474和2568；

SEQ ID NO.:2099、2193、2287、2381、2475和2569；

SEQ ID NO.:2100、2194、2288、2382、2476和2570；

SEQ ID NO.:2101、2195、2289、2383、2477和2571；

SEQ ID NO.:2102、2196、2290、2384、2478和2572；

SEQ ID NO.:2103、2197、2291、2385、2479和2573；

SEQ ID NO.:2104、2198、2292、2386、2480和2574；

SEQ ID NO.:2105、2199、2293、2387、2481和2575；

SEQ ID NO.:2106、2200、2294、2388、2482和2576；

SEQ ID NO.:2107、2201、2295、2389、2483和2577；

SEQ ID NO.:2108、2202、2296、2390、2484和2578；

SEQ ID NO.:2109、2203、2297、2391、2485和2579；

SEQ ID NO.:2110、2204、2298、2392、2486和2580；

SEQ ID NO.:2111、2205、2299、2393、2487和2581；

SEQ ID NO.:2112、2206、2300、2394、2488和2582；

SEQ ID NO.:2113、2207、2301、2395、2489和2583；

SEQ ID NO.:2114、2208、2302、2396、2490和2584；

SEQ ID NO.:2115、2209、2303、2397、2491和2585；

SEQ ID NO.:2116、2210、2304、2398、2492和2586；

SEQ ID NO.:2117、2211、2305、2399、2493和2587；

SEQ ID NO.:2118、2212、2306、2400、2494和2588；

SEQ ID NO.:2119、2213、2307、2401、2495和2589；

SEQ ID NO.:2120、2214、2308、2402、2496和2590；

SEQ ID NO.:2121、2215、2309、2403、2497和2591；

SEQ ID NO.:2122、2216、2310、2404、2498和2592；

SEQ ID NO.:2123、2217、2311、2405、2499和2593；

SEQ ID NO.:2124、2218、2312、2406、2500和2594；

SEQ ID NO.:2125、2219、2313、2407、2501和2595；

SEQ ID NO.:2126、2220、2314、2408、2502和2596；

SEQ ID NO.:2127、2221、2315、2409、2503和2597；

SEQ ID NO.:2128、2222、2316、2410、2504和2598；

SEQ ID NO.:2129、2223、2317、2411、2505和2599；

SEQ ID NO.:2130、2224、2318、2412、2506和2600；

SEQ ID NO.:2131、2225、2319、2413、2507和2601；

SEQ ID NO.:2132、2226、2320、2414、2508和2602；

SEQ ID NO.:2133、2227、2321、2415、2509和2603；

SEQ ID NO.:2134、2228、2322、2416、2510和2604；

SEQ ID NO.:2135、2229、2323、2417、2511和2605；

SEQ ID NO.:2136、2230、2324、2418、2512和2606；

SEQ ID NO.:2137、2231、2325、2419、2513和2607；

SEQ ID NO.:2138、2232、2326、2420、2514和2608；

SEQ ID NO.:2139、2233、2327、2421、2515和2609；

SEQ ID NO.:2140、2234、2328、2422、2516和2610；

SEQ ID NO.:2141、2235、2329、2423、2517和2611；

SEQ ID NO.:2142、2236、2330、2424、2518和2612；

SEQ ID NO.:2143、2237、2331、2425、2519和2613；

SEQ ID NO.:2144、2238、2332、2426、2520和2614；

SEQ ID NO.:2145、2239、2333、2427、2521和2615；

SEQ ID NO.:2146、2240、2334、2428、2522和2616；

SEQ ID NO.:2147、2241、2335、2429、2523和2617；

SEQ ID NO.:2148、2242、2336、2430、2524和2618；

SEQ ID NO.:2149、2243、2337、2431、2525和2619；

SEQ ID NO.:2150、2244、2338、2432、2526和2620；

SEQ ID NO.:2151、2245、2339、2433、2527和2621；以及

SEQ ID NO.:2152、2246、2340、2434、2528和2622；

实施例164.如实施例162所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域，其中：

该V_H结构域包含与选自SEQ ID NO:2623-2716的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且/或者

该V_L结构域包含与选自SEQ ID NO:2717-2810的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

实施例165.如实施例164所述的多肽，该多肽包含选自以下的V_H结构域和V_L结构域的组合：

SEQ ID NO.:2623和2717；

SEQ ID NO.:2624和2718；

SEQ ID NO.:2625和2719；

SEQ ID NO.:2626和2720；

SEQ ID NO.:2627和2721；

SEQ ID NO.:2628和2722；

SEQ ID NO.:2629和2723；

SEQ ID NO.:2630和2724；

SEQ ID NO.:2631和2725；

SEQ ID NO.:2632和2726；

SEQ ID NO.:2633和2727；

SEQ ID NO.:2634和2728；

SEQ ID NO.:2635和2729；

SEQ ID NO.:2636和2730；

SEQ ID NO.:2637和2731；

SEQ ID NO.:2638和2732；

SEQ ID NO.:2639和2733；

SEQ ID NO.:2640和2734；

SEQ ID NO.:2641和2735；

SEQ ID NO.:2642和2736；

SEQ ID NO.:2643和2737；

SEQ ID NO.:2644和2738；

SEQ ID NO.:2645和2739；

SEQ ID NO.:2646和2740；

SEQ ID NO.:2647和2741；

SEQ ID NO.:2648和2742；

SEQ ID NO.:2649和2743；

SEQ ID NO.:2650和2744；

SEQ ID NO.:2651和2745；

SEQ ID NO.:2652和2746；

SEQ ID NO.:2653和2747；

SEQ ID NO.:2654和2748；

SEQ ID NO.:2655和2749；

SEQ ID NO.:2656和2750；

SEQ ID NO.:2657和2751；

SEQ ID NO.:2658和2752；

SEQ ID NO.:2659和2753；

SEQ ID NO.:2660和2754；

SEQ ID NO.:2661和2755；

SEQ ID NO.:2662和2756；

SEQ ID NO.:2663和2757；

SEQ ID NO.:2664和2758；

SEQ ID NO.:2665和2759；

SEQ ID NO.:2666和2760；

SEQ ID NO.:2667和2761；

SEQ ID NO.:2668和2762；

SEQ ID NO.:2669和2763；

SEQ ID NO.:2670和2764；

SEQ ID NO.:2671和2765；

SEQ ID NO.:2672和2766；

SEQ ID NO.:2673和2767；

SEQ ID NO.:2674和2768；

SEQ ID NO.:2675和2769；

SEQ ID NO.:2676和2770；

SEQ ID NO.:2677和2771；

SEQ ID NO.:2678和2772；

SEQ ID NO.:2679和2773；

SEQ ID NO.:2680和2774；

SEQ ID NO.:2681和2775；

SEQ ID NO.:2682和2776；

SEQ ID NO.:2683和2777；

SEQ ID NO.:2684和2778；

SEQ ID NO.:2685和2779；

SEQ ID NO.:2686和2780；

SEQ ID NO.:2687和2781；

SEQ ID NO.:2688和2782；

SEQ ID NO.:2689和2783；

SEQ ID NO.:2690和2784；

SEQ ID NO.:2691和2785；

SEQ ID NO.:2692和2786；

SEQ ID NO.:2693和2787；

SEQ ID NO.:2694和2788；

SEQ ID NO.:2695和2789；

SEQ ID NO.:2696和2790；

SEQ ID NO.:2697和2791；

SEQ ID NO.:2698和2792；

SEQ ID NO.:2699和2793；

SEQ ID NO.:2700和2794；

SEQ ID NO.:2701和2795；

SEQ ID NO.:2702和2796；

SEQ ID NO.:2703和2797；

SEQ ID NO.:2704和2798；

SEQ ID NO.:2705和2799；

SEQ ID NO.:2706和2800；

SEQ ID NO.:2707和2801；

SEQ ID NO.:2708和2802；

SEQ ID NO.:2709和2803；

SEQ ID NO.:2710和2804；

SEQ ID NO.:2711和2805；

SEQ ID NO.:2712和2806；

SEQ ID NO.:2713和2807；

SEQ ID NO.:2714和2808；

SEQ ID NO.:2715和2809；以及

SEQ ID NO.:2716和2810；

实施例165.如实施例154-164中任一项所述的多肽，其中

·该HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或该LCDR1、LCDR2和LCDR3，或者

·该V_H结构域和/或V_L结构域

与所述氨基酸序列具有至少97％、98％或99％的序列同一性。

实施例166.一种单链可变片段(scFv)，该scFv包含如实施例154-164中任一项所述的多肽。

实施例167.一种单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段包含如实施例154-164中任一项所述的多肽。

实施例168.如实施例167所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG、IgM或IgA同种型。

实施例169.如实施例170所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG1同种型。

实施例170.如实施例170所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG3同种型。

实施例171.如实施例170所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG4同种型。

实施例172.如实施例170所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb是人的或人源化的。

实施例173.一种抗体-药物缀合物(ADC)，该ADC包含如实施例167-172中任一项所述的mAb或其抗原结合片段。

实施例174.如实施例173所述的ADC，该ADC具有式I：

Ab-(L-D)_p

(I)

其中：

L是接头；

D是药物；并且

p是约1至约20。

实施例175.如实施例174所述的ADC，其中D选自皂草毒蛋白、MMAE、MMAF、DM1和DM4。

实施例176.一种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含含有如实施例1-69中任一项所述的多肽的细胞外配体结合结构域。

实施例177.如实施例176所述的CAR，该CAR另外包含：

铰链结构域；

跨膜结构域；

任选地，一个或多个共刺激结构域；以及

细胞质信号传导结构域。

实施例178.如实施例177所述的CAR，其中该铰链结构域选自FcεRIIIa、CD8α、CD28和IgG1。

实施例179.如实施例178所述的CAR，其中该铰链结构域是CD8α。

实施例180.如实施例177-179中任一项所述的CAR，其中该跨膜结构域选自该T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CDS0，CD86，CD134，CD137和CD154。

实施例181.如实施例180所述的CAR，其中该跨膜结构域是CD28。

实施例182.如实施例177-181中任一项所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域选自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD22、CD32、DAP10、DAP12、CD66d、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ、FcεRIγ、FcRγ、FcRβ和FcRε。

实施例183.如实施例182所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域是CD3ζ。

实施例184.如实施例177-183中任一项所述的CAR，其中一个共刺激结构域选自4-1BB、CD28和ICOS。

实施例185.如实施例184所述的CAR，其中该共刺激结构域是CD28。

实施例186.如实施例184所述的CAR，其中该共刺激结构域是4-1BB。

实施例187.如实施例184所述的CAR，该CAR包含两个或更多个共刺激结构域。

实施例188.如实施例184所述的CAR，其中这些共刺激结构域中的两个是CD28和4-1BB。

实施例189.一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码如实施例154-188中任一项所述的多肽、scFv、mAb或CAR。

实施例190.一种载体，该载体包含如实施例189所述的核苷酸序列。

实施例191.如实施例190所述的载体，其中该载体是慢病毒载体。

实施例192.如实施例191所述的载体，其中该慢病毒载体包含VSVG结构域。

实施例193.一种工程化免疫效应细胞，该工程化免疫效应细胞在该细胞的表面表达如实施例176-188中任一项所述的CAR。

实施例194.如实施例193所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞在该细胞的表面表达：

人癌细胞抗原的第一多态性变体；以及

实施例195.如实施例193所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是原代细胞。

实施例196.如实施例193所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞源自：

诱导多能干细胞(iPSC)；

脐带血；

外周血；或者

永生化细胞系。

实施例197.如实施例196所述的工程化免疫效应细胞，其中该永生化细胞系是NK-92。

实施例198.如实施例193-197中任一项所述的工程化免疫细胞，其中该细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、恒定自然杀伤T(iNKT)细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

实施例199.如实施例198所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是T细胞。

实施例200.如实施例199所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞选自炎症性T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。

实施例201.如实施例199所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏该T细胞受体复合物的亚基。

实施例202.如实施例201所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞受体复合物的亚基选自TCRα(TRAC)、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、和CD3ζ。

实施例203.如实施例193-202中任一项所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏细胞表面蛋白，该细胞表面蛋白是该CAR的靶标。

实施例204.如实施例198所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是NK细胞。

实施例205.如实施例204所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是记忆样(ML)NK细胞。

实施例206.如实施例205所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞。

实施例207.如实施例198所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是iNKT细胞。

实施例208.一种在患者中治疗癌症的方法，该方法包括向癌症患者施用治疗有效量的：

如实施例167-170中任一项所述的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段；

如实施例173-175中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)；或者

如实施例193-207中任一项所述的工程化免疫效应细胞。

实施例209.如实施例208所述的方法，其中该癌症是血液恶性肿瘤。

实施例210.如实施例209所述的方法，其中该血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。

实施例211.如实施例210所述的方法，其中该血液恶性肿瘤是急性髓系白血病(AML)。

多肽

本文披露了多肽，如单克隆抗体(mAb)及其功能性片段、合成的抗原结合蛋白(如单链可变片段(scFv))、以及嵌合抗原受体(CAR)，这些多肽可以特异性识别癌细胞(例如表达CD33、FLT3和CLL-1的那些癌细胞)上的肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施例中，mAb、scFv或CAR识别在癌细胞上表达的CD33、FLT3和CLL-1的多态性变体；在一些实施例中，它们对一种多态性变体相对于其他多态性变体具有选择性。还披露了免疫效应细胞，如T细胞、自然杀伤(NK)细胞和恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，这些细胞被工程化以表达特异性识别肿瘤相关抗原(TAA)CD33、FLT3和CLL-1或者CD33、FLT3和CLL-1的多态性变体的CAR。还披露了使用所披露的单克隆抗体和表达CAR的免疫效应细胞在患有表达CD33、FLT3和CLL-1的癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法。

可以在所披露的组合物和方法中使用的抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即完整抗体)、其片段以及(在更宽松地使用术语的情况下)含有至少抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质(例如，单链可变片段(scFv))。可变结构域在多种抗体中的序列不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不是均匀分布在抗体的可变结构域上。其典型地集中在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的四个FR区，这些FR区主要采用β-片构型，这些CDR形成连接β-片结构的环，并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区非常靠近地连在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点的形成。

可以使用在免疫后，在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下能够产生全套人抗体的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变体小鼠中将导致在抗原激发后产生人抗体。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生。Cote等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。

任选地，抗体在其他物种中产生，并经“人源化”用于在人中施用。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补性决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可以包含既不见于受体抗体中也不见于输入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个(典型地两个)可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且全部或基本全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白的Fc的至少一部分。

用于将非人抗体人源化的方法在本领域中是熟知的。通常，人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操作编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。人源化基本上可以按照Winter及其共同工作者的方法(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然],332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，非人抗体的人源化形式(或其抗原结合片段)是嵌合抗体或片段(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。

本披露的实施例包括通过参考结构特征来定义的多肽，特别是单克隆抗体(mAb)、其抗原结合片段、合成的抗原结合蛋白(如scFv)和嵌合抗原受体(CAR)，这些结构特征即互补性决定区(CDR)、重链或轻链可变结构域(V_H或V_L)、或全长重链或轻链(HC或LC)的特定氨基酸序列。本披露的单克隆抗体或其抗原结合片段结合例如CD33、FLT3、或CLL-1、或其多态性变体。

还披露了具有生物活性的抗体片段。无论是否附接至其他序列，这些片段都包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，前提是与未经修饰的抗体或抗体片段相比，该片段的活性没有显著改变或受损。

技术也可适用于产生对本披露的抗原蛋白质具有特异性的合成单链抗体(实际上是抗体样融合蛋白)。用于产生单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。单链抗体可以通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重构抗原结合位点来产生。已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C-末端经由15至25个氨基酸的肽或接头与另一个可变结构域的N-末端相连，而未显著破坏抗原结合或结合的特异性。选择接头以允许重链和轻链以其适当的构象取向结合在一起。

本披露的单克隆抗体或其抗原结合片段包含至少一个、通常至少三个CDR序列，这些序列与来自人可变区的框架序列组合或呈分离的CDR肽的形式。在一些实施例中，抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，该至少一条重链包含位于可变区框架中的三个重链CDR序列，该可变区框架可以是人或鼠可变区框架，该至少一条轻链包含本文提供的位于可变区框架中的三个轻链CDR序列，该可变区框架可以是鼠或人可变区框架。

抗CD33多肽

在本披露的一些实施例中，提供了抗CD33多肽，包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CD33多肽包含一个或多个识别并结合CD33的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗CD33多肽包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CD33多肽相对于CD33的第二多态性变体选择性结合CD33的第一多态性变体；或相对于第一多态性变体选择性结合CD33的第二多态性变体。在一些实施例中，该结合具有至少2倍、10倍或30倍的选择性。

在一些实施例中，该CD33的第一多态性变体是R69，并且该CD33的第二多态性变体是G69；或者CD33的第一多态性变体是G69，并且该CD33的第二多态性变体是R69。

在本披露的一些实施例中，提供了抗CD33多肽，包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CD33多肽包含一个或多个识别并结合CD33的互补决定区(CDR)。下面的表和实例中提供了用于结合CD33的本文所述的抗CD33多肽的CDR以及V_H和V_L结构域的序列。

因此，本文提供了重链可变(V_H)结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 1-25和201-217中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 26-50和218-234中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQ ID NO 51-75和235-251中任一个的氨基酸序列。还提供了HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 1-25中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 26-50中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQ ID NO 51-75中任一个的氨基酸序列。还提供了HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 201-217中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 218-234中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQ ID NO 235-251中任一个的氨基酸序列。

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_H结构域。抗CD33 mAb或其抗原结合片段的V_H结构域可以包含所列出的HCDR1序列中的任一个与HCDR2序列中的任一个的组合、以及与HCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，提供的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列源自单个共同V_H结构域，其实例在本文中描述。

抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)可以另外包含轻链可变(V_L)结构域，该V_L结构域与V_H结构域配对形成CD33抗原结合结构域。

因此，本文提供了轻链可变(V_L)结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 76-100和252-268的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO 101-125和269-285的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO 126-150和286-302的氨基酸序列。还提供了LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 76-100中任一个的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO 101-125中任一个的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO125-150中任一个的氨基酸序列。还提供了LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 252-268中任一个的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO269-285中任一个的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO 286-302中任一个的氨基酸序列。

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_L结构域。抗CD33 mAb、其抗原结合片段、或合成的抗原结合蛋白(如scFv)的V_L结构域可以包含所列出的LCDR1序列中的任一个与LCDR2序列中的任一个的组合、以及与LCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，LCDR1、LCDR2和LCDR3序列源自单个共同V_L结构域，其实例在本文中描述。

还提供了mAb、其抗原结合片段、和合成的抗原结合蛋白(如scFv)，它们包含本文披露的CDR、V_H结构域和/或V_L结构域。包含与V_L结构域配对的V_H结构域的任何给定抗CD33mAb(及其某些抗原结合片段)或scFv将包含以下六(6)个CDR的组合：V_H结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)、V_L结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)。尽管选自上述CDR氨基酸序列的六(6)个CDR的所有组合均是可允许的并且在本披露的范围内，但本文仍提供了六(6)个CDR的某些组合。

在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号1-42中的每一个中所述的组合。在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号1-25中的每一个中所述的组合。在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号26-42中的每一个中所述的组合。

在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 151-175和303-319中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 151-175中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 303-319中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

可替代地或另外，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 176-200和320-336中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 176-200中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 320-336中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

尽管选自以上所列出的V_H结构域和V_L结构域氨基酸序列的V_H结构域和V_L结构域的所有可能的配对均是可允许的并且在本披露的范围内，但一些实施例仍提供了V_H结构域和V_L结构域的某些组合。因此，在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-42中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:176；

SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:177；

SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:178；

SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:179；

SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:180；

SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:181；

SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:182；

SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:183；

SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:184；

SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:185；

SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:186；

SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:187；

SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:188；

SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:189；

SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:190；

SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:191；

SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:192；

SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:193；

SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:194；

SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:195；

SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:196；

SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:197；

SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:198；

SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:199；

SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:200；

SEQ ID NO:303和SEQ ID NO:320；

SEQ ID NO:304和SEQ ID NO:321；

SEQ ID NO:305和SEQ ID NO:322；

SEQ ID NO:306和SEQ ID NO:323；

SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:324；

SEQ ID NO:308和SEQ ID NO:325；

SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:326；

SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:327；

SEQ ID NO:311和SEQ ID NO:328；

SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:329；

SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:330；

SEQ ID NO:314和SEQ ID NO:331；

SEQ ID NO:315和SEQ ID NO:332；

SEQ ID NO:316和SEQ ID NO:333；

SEQ ID NO:317和SEQ ID NO:334；

SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:335；

以及

SEQ ID NO:319和SEQ ID NO:336。

在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-25中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:176；

SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:177；

SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:178；

SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:179；

SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:180；

SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:181；

SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:182；

SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:183；

SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:184；

SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:185；

SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:186；

SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:187；

SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:188；

SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:189；

SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:190；

SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:191；

SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:192；

SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:193；

SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:194；

SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:195；

SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:196；

SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:197；

SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:198；

SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:199；

以及

SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:200。

在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号26-42中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:303和SEQ ID NO:320；

SEQ ID NO:304和SEQ ID NO:321；

SEQ ID NO:305和SEQ ID NO:322；

SEQ ID NO:306和SEQ ID NO:323；

SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:324；

SEQ ID NO:308和SEQ ID NO:325；

SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:326；

SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:327；

SEQ ID NO:311和SEQ ID NO:328；

SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:329；

SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:330；

SEQ ID NO:314和SEQ ID NO:331；

SEQ ID NO:315和SEQ ID NO:332；

SEQ ID NO:316和SEQ ID NO:333；

SEQ ID NO:317和SEQ ID NO:334；

SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:335；

以及

SEQ ID NO:319和SEQ ID NO:336。

在一些实施例中，抗CD33抗体、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)也可以包含可变重链结构域和可变轻链结构域的组合，其中该可变重链结构域包含与以上所示的可变重链氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_H序列，并且/或者其中该可变轻链结构域包含与以上所示的可变轻链结构域氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_L序列。可保留以上特定V_H和V_L配对或组合用于具有V_H和V_L结构域序列的抗CD33抗体、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)，这些V_H和V_L结构域序列与本文披露的这些参考序列具有特定的氨基酸序列同一性百分比。

对于其中抗体、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)的可变重链和/或轻链结构域通过与参考序列的特定氨基酸序列同一性百分比来限定的所有实施例，V_H和/或V_L结构域可以保留与参考序列中存在的那些相同的CDR序列，使得变化仅存在于框架区内。

抗FLT3多肽

在本披露的一些实施例中，提供了抗FLT3多肽，包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗FLT3多肽包含一个或多个识别并结合FLT3的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗FLT3多肽包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗FLT3多肽相对于FLT3的第二多态性变体选择性结合FLT3的第一多态性变体；或相对于第一多态性变体选择性结合FLT3的第二多态性变体。在一些实施例中，该结合具有至少2倍、10倍或30倍的选择性。

在一些实施例中，该FLT3的第一多态性变体是T227，并且该FLT3的第二多态性变体是M227；或者FLT3的第一多态性变体是M227，并且该FLT3的第二多态性变体是T227。

因此，本文提供了重链可变(V_H)结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)，以及包含它们的多肽。

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_H结构域。抗FLT3 mAb、其抗原结合片段、或合成的抗原结合蛋白(如scFv)的V_H结构域可包以含所列出的HCDR1序列中的任一个与HCDR2序列中的任一个的组合、以及与HCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，提供的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列源自单个共同V_H结构域，其实例在本文中描述。

抗FLT3 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)可另外包含轻链可变(V_L)结构域，该V_L结构域与V_H结构域配对形成FLT3抗原结合结构域。

因此，本文提供了轻链可变(V_L)结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)，以及包含它们的多肽

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_L结构域。抗FLT3 mAb、其抗原结合片段、或合成的抗原结合蛋白(如scFv)的V_L结构域可以包含所列出的LCDR1序列中的任一个与LCDR2序列中的任一个的组合、以及与LCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，LCDR1、LCDR2和LCDR3序列源自单个共同V_L结构域，其实例在本文中描述。

还提供了mAb、其抗原结合片段、和合成的抗原结合蛋白(如scFv)，它们包含本文披露的CDR、V_H结构域和/或V_L结构域。包含与V_L结构域配对的V_H结构域的任何给定抗FLT3mAb(及其某些抗原结合片段)或scFv将包含以下六(6)个CDR的组合：V_H结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)、V_L结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)。尽管选自上述CDR氨基酸序列的六(6)个CDR的所有组合均是可允许的并且在本披露的范围内，但本文仍提供了六(6)个CDR的某些组合。

尽管选自以上所列出的V_H结构域和V_L结构域氨基酸序列的V_H结构域和V_L结构域的所有可能的配对均是可允许的并且在本披露的范围内，但一些实施例仍提供了V_H结构域和V_L结构域的某些组合。

在一些实施例中，抗FLT3抗体、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)也可以包含可变重链结构域和可变轻链结构域的组合，其中该可变重链结构域包含与以上所示的可变重链氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_H序列，并且/或者其中该可变轻链结构域包含与以上所示的可变轻链结构域氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_L序列。可保留在整个(i)部分中的特定V_H和V_L配对或组合用于具有与本文披露的这些参考序列具有特定氨基酸序列同一性百分比的V_H和V_L结构域序列的抗FLT3抗体。

抗CLL-1多肽

在本披露的一些实施例中，提供了抗CLL-1多肽，包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CLL-1多肽包含一个或多个识别并结合CLL-1的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗CLL-1多肽包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CLL-1多肽相对于CLL-1的第二多态性变体选择性结合CLL-1的第一多态性变体；或相对于第一多态性变体选择性结合CLL-1的第二多态性变体。在一些实施例中，该结合具有至少2倍、10倍或30倍的选择性。

在一些实施例中，该CLL-1的第一多态性变体是K224，并且该CLL-1的第二多态性变体是Q244；或者CLL-1的第一多态性变体是Q224，并且该CLL-1的第二多态性变体是K244。

在本披露的一些实施例中，提供了抗CLL-1多肽，包括mAb、其抗原结合片段、以及合成的融合蛋白(如单链可变片段(scFv))，这些抗CLL-1多肽包含一个或多个识别并结合CLL-1的互补决定区(CDR)。下面的表和实例中提供了用于结合CLL-1的本文所述的抗CD33多肽的CDR以及V_H和V_L结构域的序列。

因此，本文提供了重链可变(V_H)结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 337-360和529-550中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 361-384和551-572中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQ ID NO 385-408和573-594中任一个的氨基酸序列。还提供了HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 337-360中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 361-384中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQ ID NO 361-384中任一个的氨基酸序列。还提供了HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含它们的多肽，其中该HCDR1包含选自SEQ ID NO 529-550中任一个的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO 551-572中任一个的氨基酸序列；并且HCDR3包含选自SEQID NO 573-594中任一个的氨基酸序列。

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_H结构域。抗CLL-1mAb、其抗原结合片段、或合成的抗原结合蛋白(如scFv)的V_H结构域可以包含所列出的HCDR1序列中的任一个与HCDR2序列中的任一个的组合、以及与HCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，提供的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列源自单个共同V_H结构域，其实例在本文中描述。

抗CLL-1mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)可以另外包含轻链可变(V_L)结构域，该V_L结构域与V_H结构域配对形成CLL-1抗原结合结构域。

因此，本文提供了轻链可变(V_L)结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 409-432和595-616的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO 433-456和617-638的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO 457-480和639-660的氨基酸序列。还提供了LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 409-432中任一个的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO 433-456中任一个的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO433-456中任一个的氨基酸序列。还提供了LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及包含它们的多肽，其中该LCDR1包含选自SEQ ID NO 595-616中任一个的氨基酸序列；LCDR2包含选自SEQ ID NO617-638中任一个的氨基酸序列；并且LCDR3包含选自SEQ ID NO 639-660中任一个的氨基酸序列。

还提供了包含这些CDR中的一个或多个的V_L结构域。抗CLL-1mAb、其抗原结合片段、或合成的抗原结合蛋白(如scFv)的V_L结构域可以包含所列出的LCDR1序列中的任一个与LCDR2序列中的任一个的组合、以及与LCDR3序列中的任一个的组合。然而，在某些实施例中，LCDR1、LCDR2和LCDR3序列源自单个共同V_L结构域，其实例在本文中描述。

还提供了mAb、其抗原结合片段、和合成的抗原结合蛋白(如scFv)，它们包含本文披露的CDR、V_H结构域和/或V_L结构域。包含与V_L结构域配对的V_H结构域的任何给定抗CLL-1mAb(及其某些抗原结合片段)或scFv将包含以下六(6)个CDR的组合：V_H结构域CDR1(HCDR1)、V_H结构域CDR2(HCDR2)和V_H结构域CDR3(HCDR3)、V_L结构域CDR1(LCDR1)、V_L结构域CDR2(LCDR2)和V_L结构域CDR3(LCDR3)。尽管选自上述CDR氨基酸序列的六(6)个CDR的所有组合均是可允许的并且在本披露的范围内，但本文仍提供了六(6)个CDR的某些组合。

在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号43-88中的每一个中所述的组合。在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号43-66中的每一个中所述的组合。在一些实施例中，六(6)个CDR的组合选自多肽编号67-88中的每一个中所述的组合。

在一些实施例中，抗CLL-1mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 481-504和661-682中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 481-504中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含选自SEQ ID NO 661-682中任一个的V_H结构域，该V_H结构域具有与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

可替代地或另外，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 505-528和683-704中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 505-528中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含具有选自SEQ ID NO 683-704中任一个的氨基酸序列的V_L结构域，并且氨基酸序列与所述氨基酸序列中的一个展现出至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

尽管选自以上所列出的V_H结构域和V_L结构域氨基酸序列的V_H结构域和V_L结构域的所有可能的配对均是可允许的并且在本披露的范围内，但一些实施例仍提供了V_H结构域和V_L结构域的某些组合。因此，在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-88中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:481和SEQ ID NO:505；

SEQ ID NO:482和SEQ ID NO:506；

SEQ ID NO:483和SEQ ID NO:507；

SEQ ID NO:484和SEQ ID NO:508；

SEQ ID NO:485和SEQ ID NO:509；

SEQ ID NO:486和SEQ ID NO:510；

SEQ ID NO:487和SEQ ID NO:511；

SEQ ID NO:488和SEQ ID NO:512；

SEQ ID NO:489和SEQ ID NO:513；

SEQ ID NO:490和SEQ ID NO:514；

SEQ ID NO:491和SEQ ID NO:515；

SEQ ID NO:492和SEQ ID NO:516；

SEQ ID NO:493和SEQ ID NO:517；

SEQ ID NO:494和SEQ ID NO:518；

SEQ ID NO:495和SEQ ID NO:519；

SEQ ID NO:496和SEQ ID NO:520；

SEQ ID NO:497和SEQ ID NO:521；

SEQ ID NO:498和SEQ ID NO:522；

SEQ ID NO:499和SEQ ID NO:523；

SEQ ID NO:500和SEQ ID NO:524；

SEQ ID NO:501和SEQ ID NO:525；

SEQ ID NO:502和SEQ ID NO:526；

SEQ ID NO:503和SEQ ID NO:527；

SEQ ID NO:504和SEQ ID NO:528；

SEQ ID NO:661和SEQ ID NO:683；

SEQ ID NO:662和SEQ ID NO:684；

SEQ ID NO:663和SEQ ID NO:685；

SEQ ID NO:664和SEQ ID NO:686；

SEQ ID NO:665和SEQ ID NO:687；

SEQ ID NO:666和SEQ ID NO:688；

SEQ ID NO:667和SEQ ID NO:689；

SEQ ID NO:668和SEQ ID NO:690；

SEQ ID NO:669和SEQ ID NO:691；

SEQ ID NO:670和SEQ ID NO:692；

SEQ ID NO:671和SEQ ID NO:693；

SEQ ID NO:672和SEQ ID NO:694；

SEQ ID NO:673和SEQ ID NO:695；

SEQ ID NO:674和SEQ ID NO:696；

SEQ ID NO:675和SEQ ID NO:697；

SEQ ID NO:676和SEQ ID NO:698；

SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:699；

SEQ ID NO:678和SEQ ID NO:700；

SEQ ID NO:679和SEQ ID NO:701；

SEQ ID NO:680和SEQ ID NO:702；

SEQ ID NO:681和SEQ ID NO:703；

以及

SEQ ID NO:682和SEQ ID NO:704。

在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-66中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:481和SEQ ID NO:505；

SEQ ID NO:482和SEQ ID NO:506；

SEQ ID NO:483和SEQ ID NO:507；

SEQ ID NO:484和SEQ ID NO:508；

SEQ ID NO:485和SEQ ID NO:509；

SEQ ID NO:486和SEQ ID NO:510；

SEQ ID NO:487和SEQ ID NO:511；

SEQ ID NO:488和SEQ ID NO:512；

SEQ ID NO:489和SEQ ID NO:513；

SEQ ID NO:490和SEQ ID NO:514；

SEQ ID NO:491和SEQ ID NO:515；

SEQ ID NO:492和SEQ ID NO:516；

SEQ ID NO:493和SEQ ID NO:517；

SEQ ID NO:494和SEQ ID NO:518；

SEQ ID NO:495和SEQ ID NO:519；

SEQ ID NO:496和SEQ ID NO:520；

SEQ ID NO:497和SEQ ID NO:521；

SEQ ID NO:498和SEQ ID NO:522；

SEQ ID NO:499和SEQ ID NO:523；

SEQ ID NO:500和SEQ ID NO:524；

SEQ ID NO:501和SEQ ID NO:525；

SEQ ID NO:502和SEQ ID NO:526；

SEQ ID NO:503和SEQ ID NO:527；

以及

SEQ ID NO:504和SEQ ID NO:528。

在一些实施例中，抗CD33 mAb、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号67-88中所述的那些，例如：

SEQ ID NO:661和SEQ ID NO:683；

SEQ ID NO:662和SEQ ID NO:684；

SEQ ID NO:663和SEQ ID NO:685；

SEQ ID NO:664和SEQ ID NO:686；

SEQ ID NO:665和SEQ ID NO:687；

SEQ ID NO:666和SEQ ID NO:688；

SEQ ID NO:667和SEQ ID NO:689；

SEQ ID NO:668和SEQ ID NO:690；

SEQ ID NO:669和SEQ ID NO:691；

SEQ ID NO:670和SEQ ID NO:692；

SEQ ID NO:671和SEQ ID NO:693；

SEQ ID NO:672和SEQ ID NO:694；

SEQ ID NO:673和SEQ ID NO:695；

SEQ ID NO:674和SEQ ID NO:696；

SEQ ID NO:675和SEQ ID NO:697；

SEQ ID NO:676和SEQ ID NO:698；

SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:699；

SEQ ID NO:678和SEQ ID NO:700；

SEQ ID NO:679和SEQ ID NO:701；

SEQ ID NO:680和SEQ ID NO:702；

SEQ ID NO:681和SEQ ID NO:703；

以及

SEQ ID NO:682和SEQ ID NO:704。

在一些实施例中，抗CLL-1抗体、其抗原结合片段、以及合成的抗原结合蛋白(如scFv)也可以包含可变重链结构域和可变轻链结构域的组合，其中该可变重链结构域包含与以上所示的可变重链氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_H序列，并且/或者其中该可变轻链结构域包含与以上所示的可变轻链结构域氨基酸序列具有至少90％序列同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_L序列。可保留在整个(i)部分中的特定V_H和V_L配对或组合用于具有与本文披露的这些参考序列具有特定氨基酸序列同一性百分比的V_H和V_L结构域序列的抗CLL-1抗体。

嵌合抗原受体(CAR)和携带CAR的免疫效应细胞

本文还提供了嵌合抗原受体(CAR；以及转基因T细胞受体，TCR)和表达它们的免疫效应细胞，这些嵌合抗原受体包含如本文披露的多肽，例如如表2、3、12和13中披露的多肽。CAR是重组融合蛋白，其包含：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)铰链结构域，3)跨膜结构域，和4)细胞质信号传导结构域，5)以及任选地共刺激结构域。

用于CAR设计、递送和表达以及制造临床级别的CAR-T细胞群的方法是本领域已知的。CAR设计通常针对每种细胞类型进行定制。

嵌合抗原受体的细胞外配体结合结构域识别并特异性结合抗原(典型地恶性细胞的表面表达抗原)。例如，当细胞外配体结合结构域以约0.1pM至约10μM、或约0.1pM至约1μM、或约0.1pM至约100nM的亲和常数或相互作用亲和力(K_D)结合抗原时，该细胞外配体结合结构域特异性结合该抗原。用于确定相互作用亲和力的方法是本领域已知的。当细胞外配体结合结构域相对于抗原的第二多态性变体选择性结合相同抗原的第一多态性变体时，也可以说该细胞外配体结合结构域特异性结合该抗原的第一多态性变体。

适合用于CAR的细胞外配体结合结构域可以是任何抗原结合多肽，本领域已知非常多的抗原结合多肽。在一些情况下，细胞外配体结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域))及其人源化形式、lgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化形式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)及“骆驼化”抗体可变结构域也适合使用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域，如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适合使用。在一些实施例中，从与靶抗原的天然结合伴侣或其功能性片段构建细胞外配体结合结构域。例如，CAR通常可以用APRIL蛋白的一部分构建，其靶向B细胞成熟抗原(BCMA)以及跨膜激活物和CAML相互作用物(TACI)的配体，有效地共同靶向BCMA和TACI两者以治疗多发性骨髓瘤。

CAR经由其细胞外配体结合结构域与之结合的靶向抗原可以是在恶性髓(AML)细胞、T细胞或其他细胞上表达的抗原。在恶性髓(AML)细胞上表达的抗原包括CD33、FLT3、CD123和CLL-1。T细胞上表达的抗原包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRα(TRAC)和TCRβ。在恶性浆细胞上表达的抗原包括BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19。在恶性B细胞上表达的抗原包括CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38和CD45。

典型地，细胞外配体结合结构域通过跨膜(TM)结构域与嵌合抗原受体的细胞内结构域连接。肽铰链将细胞外配体结合结构域连接至跨膜结构域。跨膜结构域穿过细胞膜，将CAR锚定到T细胞表面，并将细胞外配体结合结构域连接至细胞质信号传导结构域，从而影响CAR在T细胞表面的表达。

跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自(即包括以下中的至少一个或多个跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8(例如，CD8α、CD8β)，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Ly108)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR和PAG/Cbp。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，并且主要包含疏水性氨基酸残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。在一些情况下，将在合成的跨膜结构域的每一末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施例中，跨膜结构域源自T细胞表面糖蛋白CD8α链亚型1前体(NP_001139345.1)或CD28。短的寡肽或多肽接头(如长度为2至10个氨基酸)可以在CAR的跨膜结构域与内质网结构域之间形成连接。在一些实施例中，CAR具有多于一个跨膜结构域，其可以是相同跨膜结构域的重复，或者可以是不同的跨膜结构域。

NK细胞表达许多发出激活信号的跨膜(TM)衔接子，这些衔接子经由与激活受体的缔合而触发。这经由从激活受体并从而利用内源性衔接子对TM结构域进行工程化而提供NK细胞特异性信号增强。TM衔接子可以是任何能够发出激活信号的内源性TM衔接子。在一些实施例中，TM衔接子可以选自FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)、或DAP10(YxxM/YINM)、NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C、CD8α、和IL15Rb。

CAR可以进一步包含在细胞外配体结合结构域与所述跨膜结构域之间的铰链区。术语“铰链区”(相当于“铰链”或“间隔子”)通常意指任何发挥作用以将跨膜结构域连接至细胞外配体结合结构域的寡肽或多肽。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更多的灵活性和可及性，并且可以为高效CAR表达和活性赋予稳定性。铰链区可以包含多达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，并且最优选地25至50个氨基酸。铰链区可以源自天然存在的分子的全部或部分，这些分子如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、CD3ζ、T细胞受体α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154；或源自抗体恒定区的全部或部分。在一些实施例中，例如，铰链序列源自CD8a分子或CD28分子。可替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者铰链区可以是完全合成的铰链序列。在一个实施例中，铰链结构域包含人CD8α、FcγRIIIα受体或IgGl的一部分，并且与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。

在抗原识别后，细胞质信号传导结构域向免疫效应细胞传递信号，从而激活免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。虽然通常可以使用整个细胞质信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞质信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用来代替完整的链，只要其转导效应功能。

以刺激方式起作用来调节TCR复合物的初级激活的细胞质信号传导序列可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。含ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括源自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的那些。

第一代CAR典型地具有来自CD3链的细胞质信号传导结构域，其是来自内源性TCR的信号的主要传递者。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、4-1BB、ICOS)的细胞质信号传导结构域添加至CAR的细胞质信号传导结构域，以向T细胞提供另外的信号。

“共刺激结构域”源自共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域，其增强细胞因子在体内的产生、增殖、细胞毒性和/或持续性。临床前研究已表明第二代CAR设计改善了T细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代和更晚一代的CAR结合了多个共刺激结构域以进一步增强效力。移植有这些CAR的T细胞已经表现出不依赖于共刺激受体/配体相互作用的改善的扩增、激活、持续性和肿瘤根除效率。

例如，CAR的细胞质信号传导结构域可以被设计为包含信号传导结构域(例如CD3ζ)自身，或者与在CAR的背景下有用的一个或多个任何其他希望的细胞质结构域的组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含信号传导结构域(例如CD3ζ)链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR中包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3和NKG2D特异性结合的配体。

在一些实施例中，细胞质信号传导结构域是CD3 zeta(CD3ζ)信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28、4-1BB或其组合的细胞质结构域。在一些情况下，共刺激信号传导区含有一种或多种细胞内信号传导和/或共刺激分子的1、2、3或4个细胞质结构域。

一个或多个共刺激信号传导结构域可以在CD28和/或4-1BB的细胞质结构域中含有一个或多个增强信号传导的突变。在一些实施例中，所披露的CAR包含含有CD28的细胞质结构域的突变形式的共刺激信号传导区，该突变形式在Y206和/或Y218处具有改变的磷酸化。在一些实施例中，所披露的CAR包含在Y206处的减弱突变，其将降低该CAR的活性。在一些实施例中，所披露的CAR包含在Y218处的减弱突变，其将降低该CAR的表达。任何氨基酸残基(如丙氨酸或苯丙氨酸)都可以取代酪氨酸以实现减弱。在一些实施例中，用拟磷酸残基取代Y206和/或Y218处的酪氨酸。在一些实施例中，所披露的CAR包含拟磷酸残基对Y206的取代，其将增加该CAR的活性。在一些实施例中，所披露的CAR包含拟磷酸残基对Y218的取代，其将增加该CAR的表达。例如，拟磷酸残基可以是磷酸酪氨酸。在一些实施例中，CAR可以含有拟磷酸氨基酸和在同一CAR的不同残基中用不可磷酸化氨基酸进行的一个或多个取代的组合。例如，CAR可以含有Y209和/或Y191中的丙氨酸或苯丙氨酸取代加上Y206和/或Y218中的拟磷酸取代。

在一些实施例中，所披露的CAR包含一个或多个具有增强与特异性TRAF蛋白结合的突变的4-1BB结构域，这些TRAF蛋白如TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6或其任何组合。在一些情况下，41BB突变例如通过NF-kB增强T细胞的TRAF1和/或TRAF2依赖性增殖和存活。在一些情况下，4-1BB突变例如通过IRF7/INFβ增强TRAF3依赖性抗肿瘤功效。因此，所披露的CAR可以包含4-1BB的一个或多个细胞质结构域，该一个或多个细胞质结构域在这些序列中具有增强TRAF结合和/或增强NFκB信号传导的至少一个突变。

同样如本文所披露的，TRAF蛋白在一些情况下可以增强CAR T细胞的功能，而不依赖于NFκB和4-1BB。例如，TRAF蛋白在一些情况下可以增强T细胞中的CD28共刺激。因此，本文还披露了共表达CAR和一种或多种TRAF蛋白(如TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、或其任何组合)的免疫效应细胞。在一些情况下，CAR是任何靶向肿瘤抗原的CAR。例如，第一代CAR典型地具有来自CD3链的细胞内结构域，而第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、4-1BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域添加至CAR的细胞质信号传导结构域以向T细胞提供另外的信号。在一些情况下，CAR是所披露的CAR，其具有增强的4-1BB激活。

CAR组分的变化可以是有利的，这取决于表达CAR的细胞的类型。

例如，在NK细胞中，在一些实施例中，跨膜结构域可以是与NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C或CD8α相关的序列。在某些实施例中，NK细胞是ML-NK或CIML-NK细胞，并且TM结构域是CD8α。不能在NK细胞中运作良好的某些TM结构域通常可以在亚群中运作；例如，CD8α在ML-NK中运作，但通常不在NK细胞中运作。

类似地，在NK细胞中，在一些实施例中，一个或多个细胞内信号传导结构域可以是能够在NK细胞中发挥作用的任何一种或多种共激活受体，例如像CD28、CD137/41BB(TRAF、NFkB)、CD134/OX40、CD278/ICOS、DNAM-1(Y基序)、NKp80(Y基序)、2B4(SLAMF)::ITSM、CRACC(CS1/SLAMF7)::ITSM、CD2(Y基序、MAPK/Erk)、CD27(TRAF、NFkB)、或整合素(例如多种整合素)。

类似地，在NK细胞中，在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以是能够在NK细胞中发挥作用的细胞因子受体。例如，细胞因子受体可以是与持续性、存活或代谢相关的细胞因子受体，如IL-2/15Rbyc::Jak1/3、STAT3/5、PI3K/mTOR、MAPK/ERK。作为另一实例，细胞因子受体可以是与激活相关的细胞因子受体，如IL-18R::NFkB。作为另一实例，细胞因子受体可以是与IFN-γ产生相关的细胞因子受体，如IL-12R::STAT4。作为另一实例，细胞因子受体可以是与细胞毒性或持续性相关的细胞因子受体，如IL-21R::Jak3/Tyk2、或STAT3。作为另一实例，细胞内信号传导结构域可以是TM衔接子，如FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)或DAP10(YxxM/YINM)。作为另一实例，CAR细胞内信号传导结构域(也称为内结构域)可以源自CD28家族(如CD28和ICOS)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因家族(如4-1BB、OX40或CD27)的共刺激分子。TNFR家族成员通过募集TRAF蛋白而发出信号，并与细胞激活、分化和存活相关。不能在所有NK细胞中运作良好的某些信号传导结构域通常可以在亚群中运作；例如，CD28或4-1BB在ML-NK中运作。

制备CAR和携带CAR的细胞的方法

编码嵌合受体的嵌合抗原受体(CAR)构建体可以以常规方式制备。由于在大多数情况下使用天然序列，因此视情况分离和操作天然基因(例如，当使用II型受体时，免疫信号传导受体组分可能必须是反向的)，以允许各种组分的适当连接。因此，可以通过采用聚合酶链反应(PCR)，使用导致不希望的基因部分缺失的适当引物来分离编码嵌合受体的N-末端和C-末端蛋白质的核酸序列。可替代地，克隆的基因的限制性酶切物可用于产生嵌合构建体。在任一情况下，可以选择序列以提供钝端的或具有互补重叠的限制性位点。

用于制备嵌合构建体的各种操作可以在体外进行，并且在特定的实施例中，使用标准转化或转染方法将嵌合构建体引入载体中用于在适当的宿主中克隆和表达。因此，在每次操作之后，克隆从DNA序列的连接所得的构建体，分离载体，并且筛选序列以确保序列编码所希望的嵌合受体。可以通过限制性分析、测序等筛选序列。

可以将作为裸DNA或在合适的载体中的嵌合构建体引入免疫效应细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染免疫效应细胞的方法是本领域已知的。裸DNA通常是指编码嵌合受体的DNA，其以适当的取向包含在质粒表达载体中用于表达。

可替代地，可以使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫细胞(例如T细胞)中。合适的载体在受试者的免疫效应细胞中是非复制性的。已知大量基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒拷贝数目足够低以维持该细胞的活力。说明性载体包括pFB-neo载体(STRATAGENE^TM)以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。一旦确立了转染或转导的免疫效应细胞能够以希望的调节并以希望的水平表达作为表面膜蛋白质的嵌合受体，就可以确定嵌合受体在宿主细胞中是否发挥作用以提供所希望的信号诱导(例如，在用适当的配体刺激时产生Rantes、Mip1-α、GM-CSF)。

可以使用逆转录病毒将工程化CAR引入携带CAR的免疫效应细胞中，这些逆转录病毒有效且稳定地将编码嵌合抗原受体的核酸序列整合到靶细胞基因组中。本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接RNA转染和CRISPR/Cas系统(例如，使用合适的Cas蛋白的I型、II型或III型系统，该Cas蛋白如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas1 Od、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等)。也可以使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。参见例如Shearer RF和Saunders DN,"Experimental design for stable geneticmanipulation in mammalian cell lines:lentivirus and alternatives[哺乳动物细胞系中稳定基因操作的实验设计：慢病毒和替代物],"Genes Cells[基因到细胞]2015年1月；20(1):1-10。

选择的可用于构建CAR的组分的氨基酸序列披露于下面的表1中。

表1.选择的CAR组分的氨基酸序列。

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细胞特异性变化

以上披露的CAR组分和构建方法适合用于T细胞和其他免疫效应细胞，但并不是穷尽的。某些变体可用于细胞的亚群，并且是本领域已知的。

例如，在NK细胞中，TM结构域可以选自或改编自NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C或CD8α。NK细胞还表达许多跨膜衔接子，这些衔接子经由与激活受体缔合而触发，从而提供NK细胞特异性信号增强。例如，TM衔接子可以选自或改编自FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)或DAP10(YxxM/YINM)。在某些实施例中，可以将TM结构域和衔接子配对，例如：NKG2D和DAP10、FcγRIIIa和CD3ζ或FceR1γ、NKp44和DAP12、NKp30和CD3ζ或FceR1γ、NKp46和CD3ζ或FceR1γ、actKIR和DAP12、以及NKG2C和DAP12。

在某些实施例中，在NK细胞中，铰链结构域可以选自或改编自例如NKG2、TMα或CD8。

在某些实施例中，在NK细胞中，细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域可以包含以下中的一种或多种：CD137/41BB(TRAF、NFkB)、DNAM-1(Y基序)、NKp80(Y基序)、2B4(SLAMF)::ITSM、CRACC(CS1/SLAMF7)::ITSM、CD2(Y基序、MAPK/Erk)、CD27(TRAF、NFkB)；一种或多种整合素(例如多种整合素)；与持续性、存活或代谢相关的细胞因子受体，如IL-2/15Rbyc::Jak1/3、STAT3/5、PI3K/mTOR、和MAPK/ERK；与激活相关的细胞因子受体，如IL-18R::NFkB；与IFN-γ产生相关的细胞因子受体，如IL-12R::STAT4；与细胞毒性或持续性相关的细胞因子受体，如IL-21R::Jak3/Tyk2、或STAT3；以及如上所披露的TM衔接子。在一些实施例中，NK细胞CAR包括三个信号传导结构域、一个TM结构域和任选地一个TM衔接子。

共刺激结构域的选择也可取决于NK细胞的表型或亚型；例如，在一些实验中，4-1BB在记忆样(ML)NK细胞(包括CIML)中作为共刺激结构域可以是有效的，但在NK细胞中功效较低。另外，可以利用的在ML NK细胞中更为选择性地表达的信号传导结构域包括DNAM-1、CD137和CD2。

免疫效应细胞

如本文披露的免疫效应细胞可以包括T细胞、NK细胞、iNKT细胞和其他细胞，例如巨噬细胞及其亚型。

可以使用本领域已知的技术用CAR转导这些免疫效应细胞中的任一种。可以将所得的携带CAR的免疫效应细胞通过过继细胞转移(ACT)到有需要的受试者中而用于疾病(例如癌症)的免疫疗法。携带CAR的免疫效应细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞(及其亚型，如CAR-ML NK细胞和CAR-CIML)、CAR-iNKT细胞和CAR巨噬细胞。

用于ACT的免疫效应细胞可以是自体的或同种异体的。在一些实施例中，同种异体细胞的使用允许有意的在供体与受体之间的多态性错配，这提供了下文讨论的某些优点。

T细胞

T细胞是在其表面表达T细胞受体(TCR)的免疫细胞。效应T细胞包括细胞毒性(CD8+)T细胞、辅助性(CD4+)T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞、γδT细胞。

T细胞可以是原代T细胞，或者可以源自祖细胞。T细胞可以源自各种来源，包括外周血细胞或脐带血细胞、干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。富集/分离、分化和以其他方式产生T细胞的方法是本领域已知的。

iNKT细胞

恒定自然杀伤T细胞(也称为iNKT细胞或I型NKT细胞)代表不同的淋巴细胞群体，其特征在于表达恒定T细胞受体α链和某些TCRβ链(Vα24-Jα18与Vβ11组合)。iNKT TCR介导的反应受到CD1d的限制，CD1d是非多态性CD1抗原呈递蛋白家族的成员，其促进内源性和病原体源性的脂质抗原向TCR的呈递。恒定受体的原型配体是α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)。在恒定TCR与CD1d-αGalCer结合后，iNKT将扩增。CD1d基因是单态性的，并且仅由少数细胞类型表达，这限制了NKT细胞在自体或同种异体环境中的潜在毒性。

NK细胞

传统上认为自然杀伤(NK)细胞是通过靶向和消除异常或应激细胞而介导针对病原体的宿主防御和抗肿瘤免疫反应的先天免疫效应淋巴细胞，该靶向和消除不是通过抗原识别或先前的致敏，而是通过整合来自激活和抑制性受体的信号。自然杀伤(NK)细胞是用于同种异体细胞免疫疗法的T细胞替代物，因为它们施用安全而没有重大毒性，不会引起移植物抗宿主病(GvHD)，其自然地识别和消除恶性细胞，并且可用于细胞工程。

NK细胞可以是原代NK细胞，或者可以源自祖细胞。NK细胞可以源自各种来源，包括外周血细胞或脐带血细胞、干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。富集/分离、分化和以其他方式产生NK细胞的方法是本领域已知的。

记忆样NK细胞

除了其先天的细胞毒性和免疫刺激活性外，NK细胞还构成异质性和多功能的细胞亚群，包括产生稳健回忆反应的持续性记忆样NK群。ML-NK细胞可以通过促炎性细胞因子或激活受体通路的刺激自然或人工产生。通过细胞因子激活产生的ML-NK细胞已在临床上用于白血病免疫疗法的情况中。

在体内分化的ML NK细胞中已观察到CD56、Ki-67、NKG2A增加以及活化受体NKG2D、NKp30和NKp44增加。另外，体内分化显示CD16和CD11b的中值表达轻度降低。与ACT和BL NK细胞两者相比，在ML NK细胞中观察到TRAIL、CD69、CD62L、NKG2A和NKp30阳性NK细胞的频率增加，而CD27+和CD127+NK细胞的频率降低。最后，与体外分化的ML NK细胞不同，体内分化的ML NK细胞不表达CD25。

细胞因子诱导的记忆样自然杀伤细胞(CIML-NK)

例如通过用细胞因子的组合预激活可以诱导NK细胞以获得记忆样表型，这些细胞因子如白细胞介素-12(IL-12)、IL-15和IL-18。这些细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞(CIML-NK或CIML)在用细胞因子再刺激或经由激活受体触发时表现出增强的反应。CIML NK细胞可通过用细胞因子(如IL-12、IL-15和IL-18)及其相关家族成员、或其功能性片段、或包含其功能性片段的融合蛋白激活而产生。

CIML NK细胞可以通过其产生方法来鉴定。CIML细胞可以由分化的细胞因子激活的(即CIML)NK细胞产生。

与传统NK细胞相比，CIML NK细胞典型地表现出差异性细胞表面蛋白表达模式。这样的表达模式是本领域已知的，并且可以包含例如CIML NK细胞中增加的CD56、CD56亚群CD56暗、CD56亚群CD56亮、CD16、CD94、NKG2A、NKG2D、CD62L、CD25、NKp30、NKp44和NKp46(与对照NK细胞相比)(参见例如Romee等人Sci Transl Med.[科学转化医学]2016年9月21日；8(357):357)。记忆样(ML)和细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞也可以通过观察到的体外和体内特性来鉴定，这些特性如增强的效应功能，如细胞毒性、改善的持续性、增加的IFN-γ产生等。

NK细胞可以使用细胞因子如IL-12/15/18来激活。可以在细胞因子存在下将NK细胞孵育足够的时间量以形成细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞。这样的技术是本领域已知的。

CD33、FTL-3和CLL-1特异性嵌合抗原受体(CAR)

CAR通常掺入来自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)的抗原识别结构域，该抗原识别结构域具有参与淋巴细胞激活的跨膜信号传导基序(Sadelain M等人Nat RevCancer[癌症自然评论]2003 3:35-45)。本文披露了CD33、FTL-3和CLL-1特异性嵌合抗原受体(CAR)，其可以在免疫效应细胞中表达以增强针对表达CD33、FTL-3和CLL-1的肿瘤细胞的抗肿瘤活性。

如以上所讨论，所披露的CAR通常包含：细胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞质信号传导结构域以及任选地共刺激结构域。细胞外配体结合结构域包含CD33结合区并负责抗原识别。在另一实施例中，细胞外配体结合结构域包含FLT3结合区。在又另一实施例中，细胞外配体结合结构域包含CLL-1结合区。跨膜结构域将细胞外配体结合结构域连接至细胞质信号传导结构域，并且当由细胞表达时驻留在细胞膜内。在抗原识别后，细胞质信号传导结构域向免疫效应细胞传递激活信号。例如，细胞质信号传导结构域可以任选地含有能够增强T细胞受体对T细胞的激活的共刺激蛋白结构域，如CD28、41BB和ICOS。

抗体

本文提供了包含本文披露的多肽的抗体。在一些实施例中，抗体包含本文披露的V_H链和V_L链。

本文考虑了不同形式的披露的抗体。例如，抗体可以具有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(更特别是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的人框架和恒定区，并且在一些情况下具有改变Fc受体功能或防止Fab臂交换的不同突变，或者抗体片段，例如F(ab')2片段、F(ab)片段、单链Fv片段(scFv)等。

在某些实施例中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。例如，还可以通过分离选自人源性噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后，可以将这样的可变结构域序列与希望的人恒定结构域组合。

如本文提供的抗体可以是嵌合抗体，例如包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区的嵌合抗体，或者是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。

如本文提供的抗体可以是人源化抗体。典型地，非人抗体经人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

本文披露的抗体也可以是双特异性或三特异性的--即其包含含有本文披露的多肽中的一种的抗原识别结构域以及一个或多个与另一抗原结合的其他抗原识别结构域。例如，抗体的一个臂可以结合AML细胞上的抗原的多态物，并且另一个臂可以结合CD3或另一T细胞靶标以使T细胞靠近肿瘤细胞。在三特异性抗体的实例中，抗体还将结合T细胞上的另一靶标(如CD28)以增强募集的T细胞的活性和持续性。

在一些实施例中，除了可变区之外，人源化抗体还包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。可用于人源化的人框架区包括但不限于使用“最佳拟合”方法选择的框架区、源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区、人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区、以及源自筛选FR文库的框架区。

在某些实施例中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。例如，结合特异性中的一种是针对CD33，并且另一种是针对任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以与同一抗原的两个不同表位结合。双特异性抗体也可用于将细胞毒性药剂定位至表达靶抗原的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达、“杵臼(knob-in-hole)”工程化、用于制备抗体Fc异二聚体分子的对静电导向作用的工程化、使两个或更多个抗体或片段交联、使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体、使用“双抗体”技术制备双特性抗体片段、以及使用单链Fv(sFv)二聚体。

考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码该抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如从抗体的氨基酸序列中缺失和/或在抗体的氨基酸序列中插入和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，前提是该最终的构建体具有所希望的特征，例如抗原结合。

用于取代性诱变的目的位点包括可变区和框架区。可以根据常见的侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、He；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

可以将氨基酸取代引入目的抗体和针对希望的活性筛选的产物中，该活性例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。保守取代在本领域中是已知的并且是优选的。非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一类别的成员。

抗体还可以包含对聚糖链的修饰，从而取代某些残基，如Asn297。例如，可以将抗体工程化或处理为去岩藻糖基化以改善ADCC。

包含本文披露的CDR、可变重链和轻链的抗体可以通过本领域已知的方法制备。

例如，可以将可变抗体结构域克隆到IgG表达载体中(IgG转化)。可以将PCR扩增的重链和轻链V结构域的DNA片段框内插入到例如含有人IgG1恒定重链的受体哺乳动物表达载体中。抗体表达可由MPSV启动子驱动，并且转录可由位于CDS下游的合成聚A信号序列终止。

可以使用重组方法和组合物产生抗体。提供了编码本文所述抗体的核酸。这样的核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。提供了包含这样的核酸(即用这样的核酸转化)的表达载体，以及包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施例中，宿主细胞包含(1)包含编码含有VL的氨基酸序列和含有VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有该抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。

宿主细胞可以是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。可以在适用于表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并从宿主细胞或培养基中回收抗体。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的其他原核或真核细胞。例如，可以在细菌(例如大肠杆菌(E.coli))中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。除了原核生物外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化通路已“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。用于表达糖基化抗体的另外的合适的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以使用植物细胞培养物作为宿主。

在一些实施例中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)为<1μΜ、<100nM、<50nM、<10nM、<5nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM，并且任选地为>10^-13M(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在一个实施例中，通过利用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)或者使用表面等离子体共振测定(例如WO2015089344)来测量Kd。

抗体-药物缀合物

本文还提供了免疫缀合物，其包含与一种或多种药物(例如，细胞毒性药剂，如化疗剂、生长抑制剂、毒素或放射性同位素)缀合的如本文所披露的抗体或其抗原结合片段。免疫缀合物允许将药物或其他细胞毒性药剂靶向递送至肿瘤，通过最大程度提高功效和最大程度降低脱靶毒性来提高治疗指数。本文披露的抗体-药物缀合物(ADC)包括具有抗癌活性的那些。抗体可以通过接头共价附接至药物部分。

ADC的示例性实施例包含：靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)或其抗原结合片段、细胞毒性部分(如药物(D))、以及将Ab附接至D的接头部分(L)。在一些实施例中，抗体通过一个或多个氨基酸残基(如赖氨酸和/或半胱氨酸)附接至接头部分(L)。

ADC可以具有式I：

Ab-(L-D)_p

其中：

Ab是如本文所披露的抗体或其抗原结合片段；

L是接头；

D是药物；并且

p是约1至约20。

抗体(Ab)可以包含本文披露的多肽。

ADC的药物部分(D)可以包括具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团，或者可以是诊断剂或可检测剂。

接头(L)是双功能性或多功能性部分，其具有例如用于附接至药物和抗体的反应性官能团。接头可以具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团，或者能够与抗体上存在的亲电基团反应的官能团。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可易于切割(可切割接头)，如酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割以及二硫键切割。可替代地，接头可以基本上抵抗切割(例如，稳定的接头或不可切割的接头)。在一些方面，接头是预带电接头、亲水性接头或基于二羧酸的接头。

可切割接头的实例包括酸不稳定接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)接头、光不稳定接头或含二硫化物的接头。接头可以是例如以下中的任一个：N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基-SMCC)、和2,5-二氧代吡咯烷-l-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-l-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-l-酸酯(CXl-1)。

可以与抗体缀合的药物部分的数目(例如，p)可以受到游离半胱氨酸残基(其可以是天然存在的或引入抗体氨基酸序列中的，或在缀合之前使用还原条件产生的)的数目的限制。在一些实施例中，p可以是1至10、2至8、或2至5。在一些实施例中，p是3至4。

在一些实施例中，药物部分(D)可以选自抗癌剂、抗血液障碍剂、自身免疫治疗剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、麻醉剂、细胞毒素或放射性毒素。

在一些实施例中，D可以是美登素类、V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质核输出CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟黏合剂和DHFR抑制剂。

在一些实施例中，药物(D)可以是抗癌剂。抗癌剂包括并且D可以是例如：

1)参与一种或多种DNA损伤修复(DDR)通路的蛋白质的抑制剂或调节剂，如：

a.PARP1/2，包括但不限于：奥拉帕尼、尼拉帕尼、卢卡帕尼；

b.检查点激酶1(CHK1)，包括但不限于：UCN-01、AZD7762、PF477736、SCH900776、MK-8776、LY2603618、V158411和EXEL-9844；

c.检查点激酶2(CHK2)，包括但不限于：PV1019、NSC 109555和VRX0466617；

d.双重CHK1/CHK2，包括但不限于：XL-844、AZD7762、和PF-473336；

e.WEE1，包括但不限于：MK-1775和PD0166285；

f.ATM，包括但不限于KU-55933；

g.DNA依赖性蛋白激酶，包括但不限于NU7441和M3814；以及

h.参与DDR的另外的蛋白质；

2)一种或多种免疫检查点的抑制剂或调节剂，包括但不限于：

a.PD-1抑制剂，如纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011)和AMP-224(AMPLIMMUNE)；

b.PD-L1抑制剂，如阿替利珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(Bavencio)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)、MPDL3280A(Tecentriq)、BMS-936559和MEDI4736；

c.抗CTLA-4抗体，如伊匹单抗(YERVOY)和CP-675,206(TREMELIMUMAB)；

d.T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3(Tim-3)的抑制剂；

e.T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(Vista)的抑制剂；

f.B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)的抑制剂；

g.淋巴细胞活化基因3(LAG3)的抑制剂；以及

h.T细胞免疫球蛋白和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)的抑制剂；

3)端粒酶抑制剂或端粒DNA结合化合物；

4)烷化剂，包括但不限于：苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、奥沙利铂(ELOXATIN)、链脲霉素(ZANOSAR)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、丙卡巴肼(MATULAN)、替莫唑胺(TEMODAR)和噻替派；

5)DNA交联剂，包括但不限于：卡莫司汀、苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、卡铂(PARAPLATIN)、顺铂(PLATIN)、白消安(MYLERAN)、美法仑(ALKERAN)、丝裂霉素(MITOSOL)和环磷酰胺(ENDOXAN)；

6)抗代谢药，包括但不限于：克拉屈滨(LEUSTATIN)、阿糖孢苷(ARA-C)、巯基嘌呤(PURINETHOL)、硫鸟嘌呤、喷司他丁(NIPENT)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷，ARA-C)、吉西他滨(GEMZAR)、氟尿嘧啶(5-FU，CARAC)、卡培他滨(XELODA)、亚叶酸(FUSILEV)、甲氨蝶呤(RHEUMATREX)和雷替曲塞；

7)抗有丝分裂剂，通常是植物生物碱和萜类或其衍生物，包括但不限于：紫杉烷如多西紫杉醇(TAXITERE)、紫杉醇(ABRAXANE、TAXOL)，长春花生物碱如长春新碱(ONCOVIN)、长春碱、长春地辛、和长春瑞滨(NAVELBINE)；

8)拓扑异构酶抑制剂，包括但不限于：安吖啶、喜树碱(CTP)、染料木素(genisten)、伊立替康(CAMPTOSAR)、托泊替康(HYCAMTIN)、多柔比星(ADRIAMYCIN)、柔红霉素(CERUBIDINE)、表柔比星(ELLENCE)、ICRF-193、替尼泊苷(VUMON)、米托蒽醌(NOVANTRONE)和依托泊苷(EPOSIN)；

9)DNA复制抑制剂，包括但不限于：氟达拉滨(FLUDARA)、阿非迪霉素、更昔洛韦和西多福韦；

10)核糖核苷二磷酸还原酶抑制剂，包括但不限于：羟基脲；

11)转录抑制剂，包括但不限于：放线菌素D(更生霉素，COSMEGEN)和普卡霉素(光辉霉素)；

12)DNA切割剂，包括但不限于：博来霉素(BLENOXANE)和伊达比星；

13)芳香化酶抑制剂，包括但不限于：氨鲁米特、阿那曲唑(ARIMIDEX)、来曲唑(FEMARA)、伏氯唑(RIVIZOR)、和依西美坦(AROMASIN)；

14)血管生成抑制剂，包括但不限于：染料木素、舒尼替尼(SUTENT)和贝伐珠单抗(AVASTIN)；

15)抗类固醇药或抗雄激素药，包括但不限于：氨鲁米特(CYTADREN)、比卡鲁胺(CASODEX)、环丙孕酮、氟他米特(EULEXIN)、尼鲁米特(NILANDRON)；

16)酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于：伊马替尼(GLEEVEC)、埃罗替尼(TARCEVA)、拉帕替尼(TYKERB)、索拉非尼(NEXAVAR)和阿昔替尼(INLYTA)；

17)mTOR抑制剂，包括但不限于：依维莫司、替西罗莫司(TORISEL)和西罗莫司；

18)细胞凋亡诱导剂，如虫草菌素；

19)蛋白质合成抑制剂，包括但不限于：克林霉素、氯霉素、链霉素、茴香霉素和环己酰亚胺；

20)抗糖尿病药，包括但不限于：二甲双胍和苯乙双胍；

21)细胞毒性抗生素，包括但不限于：

a.四环素类，包括但不限于：强力霉素；

b.红霉素类，包括但不限于：阿奇霉素；

c.双甘氨肽类，包括但不限于：替加环素；

d.抗寄生虫药，包括但不限于：扑蛲灵(pyrvinium pamoate)；

e.β-内酰胺类，包括但不限于青霉素类和头孢菌素类；

f.蒽环类抗生素，包括但不限于：多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌；

g.博来霉素，如经典博来霉素A2(BLENOXANE)和平阳霉素(也称为博来霉素A5)

h.另一抗生素，包括但不限于：氯霉素、丝裂霉素C和放线菌素D(更生霉素，COSMEGEN)；以及

22)另一药剂，如卡介苗(B-C-G)疫苗；布舍瑞林(ETILAMIDE)；氯喹(ARALEN)；氯膦酸盐、帕米膦酸盐或另一双膦酸盐；秋水仙碱；脱甲绿胶酶素(demethoxyviridin)；二氯乙酸盐；雌莫司汀；非格司亭(NEUPOGEN)；氟氢可的松(FLORINEF)；戈舍瑞林(ZOLADEX)；干扰素；亚叶酸；亮丙瑞林(LUPRON)；左旋咪唑；氯尼达明；美司钠；二甲双胍；米托坦(o,p'-DDD，LYSODREN)；诺考达唑；奥曲肽(SANDOSTATIN)；哌立福新；卟菲尔钠(特别是与光疗和放疗组合)；苏拉明；他莫昔芬；二氯二茂钛；维甲酸；合成代谢类固醇，如氟甲睾酮(HALOTESTIN)；雌激素，如雌二醇、己烯雌酚(DES)和双烯雌酚；孕激素，如醋酸甲羟孕酮(MPA)和甲地孕酮；以及睾酮。

在一些实施例中，药物部分(D)可以是毒素。植物来源的蛋白质毒素包括核糖体失活蛋白质(RIP)，如I型志贺毒素(例如天花粉蛋白和丝瓜毒素(luffin))和II型志贺毒素(例如蓖麻毒素、凝集素和相思豆毒蛋白)，以及皂草毒蛋白、多花白树毒蛋白和商陆抗病毒蛋白；并且细菌毒素包括假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素和白喉毒素。

在一些实施例中，药物部分(D)可以是诊断剂或可检测剂。这样的免疫缀合物可用于监测或预测疾病或障碍的发作、发展、进展和/或严重程度，作为临床测试程序的一部分，例如确定特定疗法的功效。这样的诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来完成，这些可检测物质包括但不限于各种酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素生物素(streptavidinfoiotin)和亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor750、伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、萤光素和水母蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、和^mI,)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、和^mIn)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、⁶⁴Cu、¹¹³Sn和¹¹⁷Sn；以及使用各种正电子发射断层成像的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。

在一些实施例中，药物部分D选自皂草毒蛋白、MMAE、MMAF、DM1、DM4。在一些实施例中，药物是皂草毒蛋白。

治疗应用

多肽(包括抗体及其功能性抗原结合片段)、携带CAR的免疫效应细胞、以及本文所述的组合物、抗体-药物缀合物、以及包含它们的药物组合物，可用于治疗增殖性疾病或预防增殖性疾病的进展，这些增殖性疾病如癌症和骨髓增生异常综合征。癌症可以是血液恶性肿瘤或实体瘤。血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、及其亚型。淋巴瘤可以通过各种方式进行分类，通常基于潜在的恶性细胞类型进行分类，包括霍奇金淋巴瘤(通常是里德-斯滕伯格(Reed-Sternberg)细胞的癌症，但有时也起源于B细胞；所有其他淋巴瘤均是非霍奇金淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及如本文定义的和本领域已知的其他淋巴瘤。骨髓增生异常综合征包含一组影响未成熟的白细胞和/或造血干细胞(HSC)的疾病；MDS可能发展为AML。

B细胞淋巴瘤包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、以及如本文定义的和本领域已知的其他B细胞淋巴瘤。

T细胞淋巴瘤包括T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、以及如本文定义的和本领域已知的其他T细胞淋巴瘤。

白血病包括急性髓系(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓系(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(有时被分类为淋巴瘤)、以及如本文定义的和本领域已知的其他白血病。

浆细胞恶性肿瘤包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。

实体瘤包括黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或癌，例如脑、头颈、乳房、肺(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如卵巢)、上消化道、胰腺、肝脏、肾系统(例如肾脏)、膀胱、前列腺和结直肠的肿瘤。

本文所述的方法通常在有需要的受试者上进行。需要本文所述的治疗性方法的受试者可以是患有、诊断出患有、怀疑患有癌症，或有发展为癌症的风险，或有进展到癌症后期的风险的受试者。治疗需求的确定将典型地通过病史、身体检查或与具有争议的疾病或病症相符的诊断测试来评估。通过本文所述的方法可治疗的各种病症的诊断在本领域的技术范围内。受试者可以是动物受试者，包括哺乳动物，如马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和人，或者其他动物，如鸡。例如，受试者可以是人受试者。

通常，疗法(例如抗体或其功能性抗原结合片段、携带CAR的免疫效应细胞或抗体-药物缀合物)的安全有效量是例如将在受试者中引起希望的治疗性效果同时最大程度减少不希望的副作用的量。

根据本文所述的方法，施用可以是肠胃外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、肿瘤内、鞘内、颅内、侧脑室内、皮下、鼻内、硬膜外、眼、口腔或直肠施用。例如，在产品是生物疗法或细胞疗法的情况下，施用方式将可能是经由注射或输注。

用于免疫疗法的护理标准和调理方案

癌症(如AML)的标准护理治疗可以涉及抗癌药物疗法(包括化疗和靶向疗法)以及造血干细胞移植(HSCT)。

例如，阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷或ara-C)和蒽环类如柔红霉素(道诺霉素)或伊达比星的组合是AML的一线化疗。可用于治疗AML的其他化疗剂包括克拉屈滨(Leustatin、2-CdA)、氟达拉滨(Fludara)、米托蒽醌、依托泊苷(VP-16)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、羟基脲、皮质类固醇如泼尼松或地塞米松、甲氨蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)、阿扎胞苷(Vidaza)和地西他滨(Dacogen)。另外，靶向疗法可用于适当的患者，如米哚妥林(Rydapt)或吉瑞替尼(Xospata)用于具有FLT-3突变的患者；吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)用于CD33阳性AML；BCL-2抑制剂，如维奈托克(Venclexta)；IDH抑制剂，如艾伏尼布(Tibsovo)或恩西地平(Idhifa)；以及hedgehog通路抑制剂，如格拉吉布(Daurismo)。尽管初次诱导化疗后的完全缓解率可高达80％，但大多数AML患者将最终进展为复发性或难治性(RR)疾病，并且60岁以下的人的五年存活率为约35％，并且超过60岁的人的五年存活率为10％。参见Walter RB等人,"Resistanceprediction in AML:analysis of 4601patients from MRC/NCRI,HOVON/SAKK,SWOG andMD Anderson Cancer Center[AML中的抗性预测：来自MRC/NCRI、HOVON/SAKK、SWOG和MD安德森癌症中心的4601名患者的分析],"Leukemia[白血病]29(2):312-20(2015)以及H等人,"Acute Myeloid Leukemia[急性髓系白血病],"NEJM[新英格兰医学杂志]373(12):1136-52(2015)。

过继细胞转移(ACT)疗法也可能与或不与调理方案一起治疗癌症(如AML)。目前，使用造血干细胞移植(HSCT)；其他疗法如NK细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞(CAR-T)和其他携带CAR的免疫效应细胞的移植的正在开发中。

造血干细胞移植(HSCT)

造血干细胞移植(HSCT)是多种恶性和非恶性造血疾病的潜在治愈性治疗方法，这些造血疾病如AML、CML、ALL、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、神经胶质瘤和实体瘤。用于AML的HSCT典型地是同种异体的，并且出于以下几个原因需要供体与患者之间的HLA匹配。首先是预防HvGD，但另外的益处是移植物抗白血病(GvL)作用，其中供体免疫细胞将患者白血病细胞识别为外来的并攻击它们。在一些情况下，例如，在患者可能无法耐受同种异体移植的情况下，可以使用自体移植，通常是在仔细清除以试图去除白血病细胞后。

典型地，当在患有恶性障碍的患者中进行HSCT时，施用预备方案或调理方案作为实现免疫消融的程序的一部分，以预防移植物排斥并减轻肿瘤负荷。传统上，这些目标已通过以其他方式使用超致死剂量的全身辐照(TBI)和具有非重叠毒性的化疗剂(所谓的“高强度”前HSCT调理)来实现。然而，由于认识到供体细胞针对恶性宿主细胞的免疫反应(即移植物抗肿瘤作用)实质上促成HSCT的有效性，因此已经开发出强度降低且非清髓性的调理方案，使HCT适用于老年和医学上体弱的患者。

调理方案是本领域已知的。参见例如，Gyurkocza和Sandmaier BM,"Conditioningregimens for hematopoietic cell transplantation:one size does not fit all[用于造血细胞移植的调理方案：一种方案无法适合所有人],"Blood[血液]124(3):344-353(2014)。根据国际血液和骨髓移植研究中心(CIBMTR)在2006年骨髓移植串联会议期间召开的强度降低调理方案研讨会，调理方案可分类为高剂量(清髓性)的、强度降低的和非清髓性的。

使用携带CAR的免疫效应细胞的免疫疗法

携带CAR的免疫效应细胞已用于AML的治疗，结果各不相同。使用靶向AML抗原(如CD33和CD123)的CAR-T细胞进行的临床试验已经注册并正在进行中，但迄今为止尚未取得明确的成功。一个问题是难以靶向合适的不同时在健康细胞上表达的可靶向表面抗原。还测试了来自靶向AML抗原CD33的永生化NK-92细胞系的CAR工程化细胞。

在多种情景下，使用携带CAR的免疫效应细胞的疗法将可用于AML。在用CAR细胞疗法治疗AML患者的一种情景下，存在于携带CAR的免疫效应细胞表面的CAR识别并结合AML细胞抗原(如CD33、FLT-3或CLL-1)，并且AML细胞被靶向杀伤。CAR细胞疗法还将靶向患者自身造血干细胞上的相同抗原。此后，患者接受造血干细胞移植(HSCT)，任选地经历初步程序以消灭CAR细胞并针对HSCT预先对患者进行调理，然后植入的供体干细胞攻击剩余的AML细胞。尽管这对许多患者来说是有效的疗法，但AML仍可能复发(例如，在约50％的病例中)，并且用相同的CAR细胞疗法进行另外的治疗典型地是不可行的，因为植入的干细胞及其后代会将新输注的CAR干细胞识别为外来的并破坏它们。

癌症抗原的多态性靶向

多态性靶向。使用携带CAR的免疫效应细胞治疗AML的另一方法利用AML靶抗原多态性的自然变异来解决此问题。某些AML抗原(如CD33、FLT-3和CLL-1)作为多态性变体出现。例如，在给定的群体中，AML抗原以两种主要的多态物存在，例如A和B，在A中，在抗原的基因组序列中的给定碱基对是A-T，在B中，在相同位置处的碱基对是C-G。这将导致不同的氨基酸残基被翻译，并且前提是碱基对出现在编码区，导致抗原具有不同氨基酸残基、以及从而不同的一级结构和进而不同的三级结构。如果变化是显著的，并且残基处于细胞表面上的溶剂暴露位置中，该溶剂暴露位置对抗体、其抗原结合片段或合成的抗原结合蛋白(如scFv)可及，则可将CAR设计为相对于其他一种或多种多态物选择性地结合单一多态物。并且携带这样的选择性CAR的CAR-T细胞或其他免疫效应细胞可以靶向并杀伤单一多态形式的AML细胞。参见例如下面的表2，其列出了三种AML抗原及其常见的多态性：

表2.AML抗原的多态性

还参见图1，其显示了CD33细胞外结构域的位置，其中左分图中的氨基酸69和右分图中的FLT3 ECD AA267各自处于相对溶剂可及的位置。

患者-供体错配。当患者具有AML抗原的一种多态形式，并且用于HSCT的细胞供体具有该抗原的另一种多态形式，从而产生AML抗原多态性的“错配”时，就会出现几种可用的治疗情景。

当供体提供用于HSCT的多态性“错配”的干细胞，并且那些细胞被植入受体患者中时，即使在HSCT移植后，也可以使用携带CAR的免疫效应细胞疗法(利用对患者的多态性变体具有选择性的CAR)以靶向和杀伤任何剩余的携带患者的抗原多态形式的细胞。因为这些细胞选择性地靶向患者的多态性，所以供体的植入细胞将得以保留。治疗可以是预防性的，或在出现复发疾病的体征之后进行。因此，复发得以预防或治疗，并且患者可以实现无疾病存活。

HSC和将经工程化以表达CAR的T细胞或其他免疫效应细胞可以都来自同一供体，该供体与预期的受体多态性错配。如下表3中所示，供体对于一种多态性或另一种多态性必须是纯合的(即不能是杂合的)，并且接受的患者对于另一种多态性可以是纯合的或者是杂合的。

表3.抗CD33多态性抗体和CAR的治疗方案

在另一种变化中，HSC可来自一个错配的供体，并且将经工程化以表达CAR的免疫效应细胞将来自不同的供体。如果携带CAR的免疫效应细胞是CAR-T细胞，则这些细胞可能使T细胞受体失能，例如，通过例如使用CRISPR或另一基因组编辑工具或技术(如PEBL)对其一种或多种组分(如TRAC)进行基因破坏。

药物组合物

还披露了药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的披露的分子。药物载剂是本领域技术人员已知的。这些最典型地将是用于向人施用药物的标准载剂，包括溶液如无菌水、盐水和生理pH缓冲溶液。典型地，在配制品中使用适当量的药学上可接受的盐以赋予该配制品等渗性。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选地为约7至约7.5。溶液应不含RNA酶。另外的载剂包括缓释制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，这些基质呈成形制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员来说将显而易见的是，某些载剂可以是更优选的，这取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度。

除了选择的分子之外，药物组合物还可以包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

定义

除非另有定义，否则结合本披露使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。总体而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡聚体或多核苷酸化学及杂交学结合使用的命名法及其技术是本领域中熟知并且常用的那些。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语还应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物，并且应用到天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物上。

如本文所用，术语“抗体”是指包括经典免疫球蛋白序列元件(足以赋予特异性结合或例如免疫反应)和/或针对特定靶抗原的多肽。如本领域所知，天然产生的完整抗体是大约150kD的四聚体试剂，该四聚体试剂由彼此缔合成通常称为“Y形”结构的两条相同的重链多肽(各约50kD)和两条相同的轻链多肽(各约25kD)构成。每条重链由至少四个结构域(各长约110个氨基酸)构成：氨基末端可变(V_H)结构域，随后是三个恒定结构域：C_H1、C_H2、以及羧基末端C_H3。被称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将C_H2和C_H3结构域连接至抗体的其余部分。该铰链区的两个二硫键将完整抗体中的两条重链多肽连接至彼此。每条轻链由两个结构域构成：氨基末端可变(V_L)结构域，随后是羧基末端恒定(C_L)结构域，它们由另一“开关”彼此隔开。完整的抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中重链和轻链由单个二硫键连接至彼此；其他两个二硫键将重链铰链区连接至彼此，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也经糖基化，典型地在C_H2结构域上。天然抗体中每个结构域的结构特征在于由两个β片(例如，3-、4-或5-链片)形成的“免疫球蛋白折叠”，这些β片在压缩的反平行β桶中相对彼此封装。每个可变结构域含有三个被称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构性框架的β片，并且使来自重链和轻链的CDR环区域在三维空间中聚集在一起，使得它们在Y结构的尖端产生单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体结合。

术语“抗原”是指可以是可溶性或特别地细胞膜结合的分子实体，但不限于可通过适应性免疫系统识别的分子实体，该系统包括但不限于抗体或TCR，或工程化分子，这些工程化分子包括但不限于转基因TCR、嵌合抗原受体(CAR)、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或任何其他能够以高亲和力与结构实现结合的分子。

关于抗原识别受体，术语“特异性结合”或“对……具有特异性”或“特异性识别”是指所述抗原识别受体的抗原结合结构域，其识别并结合抗原的特异性多态性变体，但基本上不识别或结合其他变体。

如应用于本披露中所述的抗体的术语“单克隆抗体”(mAb)是源自任何真核、原核或噬菌体克隆的单个拷贝或克隆的化合物，而不是其产生方法。本披露的mAb可以以均质或基本均质的群体存在。

如本文所用，术语“结合亲和力”是指一个分子在该分子上的一个位点处结合到另一个分子上的强度。如果特定的分子将结合到另一个特定的分子上或者与之特异性地缔合，则这两个分子被称为对彼此表现出结合亲和力。结合亲和力与一对分子的缔合常数和解离常数有关，但这些常数单独测量或确定对于本文的这些方法不是关键的。相反，用来描述在这些所述方法的分子之间的相互作用的如本文所用的亲和力通常是在经验研究中观察到的表观亲和力(除非另有说明)，其可以用来比较一个分子(例如，抗体或其他特异性结合配偶体)将藉此结合两个其他分子(例如，肽的两种形式或变体)的相对强度。结合亲和力、缔合常数、和解离常数的概念是熟知的。

如本文所用，术语“序列同一性”意指当将序列进行比对以使得序列匹配最大化时(即，考虑空位和插入)，在两个或更多个序列中的对应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。通过已知的方法可以容易地计算同一性。用于确定同一性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。此外，确定同一性的方法被编篡在可公开获得的计算机程序中。例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法，通过同源性比对算法，通过相似性捜索方法，或者通过这些算法的计算机化执行(在GCG威斯康星软件包(Wisconsin Package)中的GAP、BESTFIT、PASTA和TFASTA，可获自阿森尼克斯公司(Accelrys，Inc.)。通常参见Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)和Altschul等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402(1997))，可以进行用于比较的最佳序列比对。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法。

“抗体片段”是指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的几个实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、双抗体、线性抗体、单链可变片段(scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施例中，抗体片段是抗原结合片段。

当前用于抗体工程化和改善的方法的综述可见于R.Kontermann和S.Dubel,(2010)Antibody Engineering[抗体工程化]第1卷和第2卷,Springer Protocols[施普林格方案],第2版以及W.Strohl和L.Strohl(2012)Therapeutic antibody engineering:Current and future advances driving the strongest growth area in thepharmaceutical industry[治疗性抗体工程化：驱动制药工业中的最强增长区域的当前和未来进展],Woodhead Publishing[伍德海德出版社]。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法在本领域是熟知的，并且可以见于Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,第5-8和15章。

“患病细胞”是指细胞、组织或生物体的状态与正常或健康状态不同，并且可由病原体、有毒物质、辐照或细胞内部失调的影响导致。“患病细胞”也可以指已感染致病性病毒的细胞。此外，术语“患病细胞”可以指在个体中可能构成或引起癌症的恶性细胞或瘤细胞。

术语“癌症”在医学上被称为恶性赘生物。癌症是涉及细胞生长上调的一组广泛的疾病。在癌症中，细胞(癌性细胞)不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，并侵入身体附近部位。癌症也可能通过淋巴系统或血流扩散到体内更远的部位。已知有200多种不同的影响人的癌症。

术语“恶性”或“恶性肿瘤”描述了构成赘生物的细胞、细胞群或组织，其源自赘生物或者可能是新的瘤细胞的来源。该术语用于描述与组织的正常或健康细胞形成对比的瘤细胞。恶性肿瘤与非癌性良性肿瘤的对比在于，恶性肿瘤的生长不受自身限制，能够侵入相邻组织，并可能能够扩散到远端组织。良性肿瘤没有这些特性。恶性肿瘤的特征是间变、侵袭性和转移以及基因组不稳定性。术语“癌前细胞”是指尚非恶性但即将变为恶性的细胞或组织。

术语“化疗”是指使用一种或多种细胞毒性抗瘤药物(“化疗剂”或“化疗药物”)作为标准化方案的一部分治疗癌症(癌性细胞)。化疗的给予可以具有治愈性意图，或者其可以旨在延长寿命或减轻症状。它通常与其他癌症治疗(如放疗、手术和/或高温热疗)结合使用。传统的化疗剂通过杀伤快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。这意味着化疗也会伤害在正常情况下快速分裂的细胞，如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化疗最常见的副作用，如骨髓抑制(减少血细胞的产生，因此也导致免疫抑制)、黏膜炎(消化道衬里的炎症)和脱发(毛发损失)。

术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞(包括ML-NK和CIML-NK)、NKT细胞(包括iNKT细胞)、B细胞、先天淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞和巨噬细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒性效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞(包括ML-NK和CIML-NK)、NKT细胞(包括iNKT细胞)、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。“效应功能”意指细胞的特殊功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。

术语“副作用”是指除所希望的治疗结果外，使用抗原识别受体的免疫疗法出现的任何并发症、不想要的或病理性结果。术语“副作用”优先是指在细胞上存在靶抗原的情况下，在免疫疗法期间可能发生的中靶脱肿瘤毒性，该细胞是表达抗原的非靶细胞，但不是如本文所述的患病细胞。免疫疗法的副作用可能是移植物抗宿主病的发展。

术语“减少副作用”是指降低使用抗原识别受体的免疫疗法的任何并发症、不想要的或病理性结果的严重程度，如对表达抗原的非靶细胞的毒性。“减少副作用”还指在使用抗原识别受体的免疫疗法期间，减少或避免患者的疼痛、伤害或死亡风险的措施。

术语“组合免疫疗法”是指共同应用两种治疗方法，例如本领域已知的用于治疗疾病(如癌症)的治疗方法。术语“组合免疫疗法”也可指共同应用免疫疗法(如使用抗原识别受体进行治疗)和另一种疗法，如造血细胞(例如对抗原识别受体的识别具有抗性的造血细胞)的移植。抗原在细胞上的表达意指抗原充分存在于所述细胞的细胞表面上，使得其可以被抗原识别受体检测、结合和/或识别。

术语“造血细胞”是指能够造血的造血谱系的细胞群，包括但不限于造血干细胞和/或造血祖细胞(即，能够增殖并至少部分重构不同的血细胞类型，包括红系细胞、淋巴细胞和骨髓细胞)。如本文所用，术语“造血细胞”还包括从造血干细胞和/或造血祖细胞分化以形成血细胞(即血细胞类型，包括红系细胞、淋巴细胞和骨髓细胞)的细胞。

对抗原识别受体识别抗原具有抗性的供体造血细胞意指所述细胞不能那么容易地被对所述抗原具有特异性的抗原识别受体检测、结合和/或识别，或者检测、结合和/或识别受损，因此该细胞在免疫疗法期间不会被杀伤。

术语“自相残杀”是指观察到除了患病细胞外，与疾病相关的抗原还可能存在于经工程化的免疫效应细胞(如表达抗原识别受体(如CAR)的T细胞)上。在该情况下，抗原识别受体的副作用将影响经工程化以表达抗原识别受体的免疫效应细胞。这样的副作用在本领域中也被称为自相残杀。

通常，术语“受体”是指如下生物分子，其可以是可溶性的或附接至细胞表面膜上，并特异性结合限定的结构，该结构可附接至细胞表面膜上或是可溶性的。受体包括但不限于抗体和抗体样结构、黏附分子、转基因或天然存在的TCR或CAR。特别地，如本文所用，术语“抗原识别受体”可以是膜结合受体或可溶性受体，如天然TCR、转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、双特异性T细胞增强物(BiTE)、双抗体或任何其他能够以高亲和力实现特异性结合的分子。

术语“靶标”或“靶抗原”是指任何细胞表面蛋白、糖蛋白、糖脂或任何其他存在于靶细胞表面上的结构。该术语还指特别地存在于靶细胞上任何其他结构，但不限于可通过适应性免疫系统识别的结构，该适应性免疫系统包括但不限于抗体或TCR，或工程化分子，这些工程化分子包括但不限于转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或任何其他能够以高亲和力与结构实现结合的分子。

如本文所用，术语“靶细胞”是指由应用或将应用于个体的抗原识别受体识别的细胞。

如本文所用，术语“用于免疫疗法的系统”是指需要两种组合物来进行如本文披露的组合免疫疗法的集合。因此，该系统(或套组或试剂盒或组合物的组合)包含a)抗原识别受体，其中所述抗原识别受体特异性识别所述个体中的靶细胞上的抗原；b)造血细胞，其对于所述抗原识别受体对所述抗原的识别具有抗性。

“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将抗原特异性移植到细胞(例如T细胞)上的工程化受体。本文披露的CAR包含抗原结合结构域(也称为抗原靶向区)、细胞外间隔子结构域或铰链区、跨膜结构域以及至少一个细胞内信号传导结构域或至少一个共刺激结构域和至少一个细胞内信号传导结构域。

通常，CAR可以包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域(细胞外部分)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞外结构域可以通过接头连接至跨膜结构域。细胞外结构域还可以包含信号肽。

“信号肽”是指指导蛋白质在细胞内转运和定位(例如至某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面)的肽序列。

“抗原结合结构域”是指CAR中与抗原特异性结合(并从而能够靶向含有抗原的细胞)的区域。CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域。通常，CAR上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。任何与给定抗原特异性结合的分子(如亲和体或来自天然存在的受体的配体结合结构域)都可以用作抗原结合结构域。抗原结合结构域通常是scFv。正常情况下，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合以形成scFv。这样的接头可以是例如(GGGG₄S)₃。在一些情况下，有益的是，抗原结合结构域源自将使用CAR的同一物种。例如，当计划在人中治疗性地使用CAR时，可能有益的是，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段。人或人源化抗体或其片段可以通过本领域熟知的多种方法制备。

如本文所用，“间隔子”或“铰链”是指在抗原结合结构域与跨膜结构域之间的亲水性区域。本文披露的CAR可以包含细胞外间隔子结构域，但也可能跳过这样的间隔子。间隔子可以包括抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔子序列、或其组合。间隔子的突出实例是CD8α铰链。

CAR的“跨膜结构域”可以源自这样的结构域的任何希望的天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域可以源自例如CD8α或CD28。当关键信号传导和抗原识别模块在两个(或甚至更多个)多肽上时，则CAR可能具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异二聚化结构域，拆分关键的信号传导和抗原识别模块使得能够对CAR细胞表达进行小分子依赖性、可滴定和可逆的控制(Wu等人,2015,Science[科学]350:293-303)。

CAR的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。“效应功能”意指细胞的特殊功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。细胞内信号传导结构域是指蛋白质中转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞执行特殊功能的部分。

细胞内信号传导结构域可以包括足以转导效应功能信号的给定蛋白质的细胞内信号传导结构域的任何完整或截短部分。用于CAR的细胞内信号传导结构域的突出实例包括T细胞受体(TCR)和辅助受体的细胞质序列，它们共同作用以在抗原受体接合后启动信号转导。

通常，T细胞激活可以由两类不同的细胞质信号传导序列介导，首先是通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)，其次是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列、共刺激信号传导结构域)。因此，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞质信号传导结构域和/或次级细胞质信号传导结构域。

以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序信号传导基序)。CAR中经常使用的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例是源自TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。最突出的是源自CD3ζ的序列。

CAR的细胞质结构域可以被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域自身，或者其与任何其他希望的一个或多个细胞质结构域的组合。CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR中包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效反应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子的实例是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序彼此连接。优选地长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可以形成连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。

作为实例，细胞质结构域可以包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一实例中，细胞质结构域可以包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在另外的实例中，细胞质结构域可以包含CD3-ζ的信号传导结构域、CD28的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。

如前所述，CAR的细胞外部分或跨膜结构域或细胞质结构域也可以包含异二聚化结构域，目的是拆分CAR的关键信号传导模块和抗原识别模块。

可以将CAR设计为包含如本文所述的上述结构域的任何部分(portion或part)的任何组合，以产生功能性CAR。

“嵌合抗原受体”具有与以下效应细胞信号传导结构域连接的至少一个抗原特异性可变区(典型地是由抗体重链和轻链可变区构成的单链可变区)：典型地，T细胞受体的细胞内结构域，示例为(但不限于)CD3的ζ结构域。在抗原特异性区域与对应的抗原结合后，信号传导结构域在宿主细胞中介导效应细胞功能(如细胞毒性)。CAR可以任选地但不一定包含另外的结构域，如接头、跨膜结构域和如上所述的其他细胞内信号传导元件。

术语“基因修饰”或“基因修饰的”是指核酸(包括但不限于细胞的基因组DNA)含量的改变。这包括但不限于通过引入、交换或缺失核酸序列的单个核苷酸或片段来改变细胞基因组DNA序列。该术语还指将核酸向细胞内的任何引入，其与是否导致细胞基因组DNA序列的直接或间接改变无关。

如本文所用，术语“工程化细胞”和“基因修饰的细胞”可以互换地使用。该术语意指含有和/或表达外来基因或核酸序列，其转而修饰细胞或其后代的基因型或表型。这些术语尤其是指如下事实，即可以通过本领域熟知的重组方法来操作细胞，以稳定地或瞬时地表达肽或蛋白质，在天然状态下这些肽或蛋白质在这些细胞中不表达。细胞的基因修饰可以包括但不限于转染，电穿孔，核转染，使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、非整合逆转录病毒或慢病毒载体的转导，转座子，设计核酸酶(包括锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas)。

术语“治疗有效量”意指提供治疗性益处的量。

免疫疗法是定义为“通过诱导、增强或遏制免疫反应来治疗疾病”的医学术语。经设计以引发或放大免疫反应的免疫疗法被分类为激活免疫疗法，而减少或遏制免疫反应的免疫疗法则被分类为遏制免疫疗法。作为激活免疫疗法的癌症免疫疗法试图刺激免疫系统以排斥和破坏肿瘤。过继细胞转移使用基于细胞的细胞毒性反应来攻击癌细胞。在体外产生对患者的癌症具有天然或基因工程化反应性的免疫细胞(如T细胞)，然后将其转移回癌症患者体内。

如本文所用，术语“移植”意指向受试者施用供体细胞群，例如造血细胞或携带CAR的免疫效应细胞。

如本文所用，术语“治疗”意指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

如本文所用，术语“个体”是指动物。优先地，个体是哺乳动物，如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、狗、猴或人。更优先地，个体是人。个体可以是患有疾病(如癌症)的个体(患者)，但是受试者也可以是健康受试者。

如本文所用，术语“选择性倍数”意指对一种靶标(例如，抗原的第一多态性变体)的亲和力比其对另一靶标(例如，抗原的第二多态性变体)的亲和力大至少x倍，其中x至少是2，并且可以更高，例如10、20、50、100或1000。在优选的实施例中，倍数选择性在治疗上是有意义的，即，足以允许杀伤表达一种靶标的细胞并且杀伤携带另一种靶标的细胞。

实例

实例1：多态性选择性多肽的靶标的鉴定

可以鉴定用于抗原靶标的多态性选择性多肽，最佳地，这些靶标1)在细胞外结构域中具有可靶向部分，2)是溶剂暴露的并且对于多态性选择性多肽(如scFv)的结合是可及的，3)具有高群体频率，使得供体-患者错配是可能的，以及4)在靶细胞上具有高抗原密度。

例如，CD33 ARG69GLY具有高群体频率，其中最小等位基因频率(MAF)为0.42。类似地，CLL-1LYS244GLN的MAF为0.35，并且FLT3 THR227MET的MAF为0.40。

实例2：抗人CD33 scFv克隆的鉴定

使用人CD33细胞外结构域抗原的两种重组多态形式(CD33^R69和CD33^G69)通过人抗体文库的标准筛选方法发现了选择性抗人CD33 scFv克隆。采用多种淘选策略来促进具有所希望的亲和范围的热稳定克隆的富集。通过流式细胞术和生物层干涉测量(BLI)在人CD33的两个单核苷酸多态性(SNP)变体(精氨酸69和甘氨酸69)之间针对选择性结合来筛选scFv，例如如下在实例5和6中所述。所选择的序列披露于下面的多肽1-42中。

可以使用这些方法鉴定另外的抗人CD33多肽。

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实例3：抗人CLL-1scFv克隆的鉴定

已使用类似于实例1中的方法来发现选择性抗人CLL-1scFv克隆。使用人CLL-1细胞外结构域抗原的两种重组多态形式(CLL-1-K244和CLL-1-Q244)通过人抗体文库的标准筛选方法发现了选择性抗人CLL-1scFv克隆。使用这些抗原，采用多种淘选策略来促进具有所希望的亲和范围的热稳定克隆的富集。通过生物层干涉测量(BLI)在人CLL-1的两个单核苷酸多态性(SNP)变体(赖氨酸244和谷氨酰胺244)之间针对选择性结合来筛选scFv。

/>

实例4：流式细胞术(FACS)

对于CD33，将Jurkat细胞工程化，使其以>200,000个受体/细胞稳定表达huCD33-R69或huCD33-G69变体。用不同水平的CellTrace紫罗兰色细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，目录号C34557)对亲本huCD33-R69和huCD33-G69 Jurkat细胞系进行染色，以将每个细胞系进行条形码编码。将经条形码编码的Jurkat细胞系用多聚甲醛固定，并与myc标记的scFv周质提取物和次级抗myc PE缀合的单克隆抗体一起孵育。使用适当的阳性和阴性对照。通过流式细胞术(CytoFLEX，贝克曼库尔特股份有限公司(BeckmanCoulter,Inc.))分析染色的细胞，并通过经条形码编码的细胞群的PE平均荧光强度(MFI)的变化来评估结合。

对于FLT3，将Ramos细胞工程化，使其以>200,000个受体/细胞稳定表达huFLT3-T227或huFLT3-M227变体。用不同水平的CellTrace紫罗兰色细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔公司，目录号C34557)对亲本huFLT3-T227和huFLT3-M227 Ramos细胞系进行染色，以将每个细胞系进行条形码编码。将经条形码编码的Ramos细胞系用多聚甲醛固定，并与myc标记的scFv周质提取物和次级抗myc PE缀合的单克隆抗体一起孵育。使用适当的阳性和阴性对照。通过流式细胞术(CytoFLEX，贝克曼库尔特股份有限公司)分析染色的细胞，并通过经条形码编码的细胞群的PE平均荧光强度(MFI)的变化来评估结合。

对于CD33，该测定的结果显示在表8a中，其将相对于亲本的倍数变化报告为(-)：指示<2倍；(+)：指示2-10倍；(++)：指示10-30倍；以及(+++)：指示>30倍。数据也显示于图2和图3中。

表8a.多肽选择性-CD33

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前述方法可适用于证明其他scFv对抗原(如癌症抗原)的结合和多态性选择性。例如，预期这些方法证明抗FLT3 scFv选择性结合T227或T227M多态性。

实例5：生物层干涉测量(BLI)

在颇尔富迪生物公司(ForteBio)的Octet HTX仪器上使用BLI分析所发现的scFv与huCD33-R69-His或huCD33-G69-Fc重组蛋白(对于抗CD33 scFv；对于CLL-1scFv，使用huCLL1-K244-Avi-Tev-His或huCLL1-Q244-Avi-Tev-His；对于FLT3，使用huFLT3-T227-His或huFLT3-M227-Fc)的结合。用生物素化抗V5标签单克隆抗体加载链霉亲和素包被的生物传感器持续5min，然后用20μM胺-PEG2-生物素猝灭并封闭5min。在生物传感器上捕获来自scFv克隆周质提取物的scFv。然后将huCD33(或huCLL-1、或huFLT3)蛋白与捕获的scFv缔合2分钟，随后用缓冲液(1X HBST[10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.05％Tween-20]，1g/LBSA)解离5分钟。针对阴性对照scFv减去参考缓冲液的数据，并在缔合步骤即将结束前的时间点(115秒或119秒)收集报告点以评估是/否结合。将数据用1:1朗缪尔方程(Langmuirequation)拟合，并报告解离速率的值。

对于CD33，该测定的结果显示在表9a中，其报告了结合、不结合或不明确。

表9a.多肽选择性-CD33

/>

使用类似的方法来评估多肽与CLL-1K244或CLL-1Q244结合的选择性。该测定的结果显示在表9b中，其报告了结合、不结合或不明确。

表9b.多肽选择性-CLL-1

/>

实例6：包含scFv的嵌合抗原受体

下面在表10和表11中提供了包含如本文所披露的scFv的嵌合抗原受体的实例，这些嵌合抗原受体可以根据本领域已知的和本文披露的方法在免疫效应细胞中构建和表达(CAR实例1-60)。表10和表11旨在提供如何可以构建包含本文披露的scFv的V_H和V_L链的CAR的实例。另外的CAR可以从本文披露的其他scFv V_H和V_L链构建。

下表10中的CAR具有如下形式：

|--[(信号)(scFv V_H)(接头)(scFv V_L)(铰链)(TMD)(共刺激)(效应子)]--|+(标签)

或者

|--[(信号)(scFv V_L)(接头)(scFv V_H)(铰链)(TMD)(共刺激)(效应子)]--|+(标签)，

其中：

·CD8a信号序列MALPVTALLLPLALLLHAARP具有SEQ ID NO:1521，或者可替代地，可以使用SEQ ID NO.1522-1525中的一个；

·(GGGGS)₄接头具有SEQ ID NO:1536，或者可替代地，可以使用SEQ ID NO.1532-1535中的一个；

·CD8铰链序列TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR

GLDFACD具有SEQ ID NO:1526；

·CD28跨膜结构域序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV具有SEQ ID NO:1527；

·CD28共刺激结构域序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRS具有SEQ ID NO:1530；

·4-1BB共刺激结构域序列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRF PEEEEGGCEL具有SEQ ID NO:1529；

·CD3z效应子结构域序列RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR具有SEQ IDNO:1531；

·P2A序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP具有SEQ ID NO:1532；

·CD34标签序列MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPI具有SEQ ID NO:1537，或者可替代地，可以使用变体或截短的CD34序列；

·实例1-3和31-33的V_H和V_L结构域来自多肽1，例如分别来自SEQ ID NO:151和SEQID NO:176；

·实例4-6和34-36的V_H和V_L结构域来自多肽5，例如分别来自SEQ ID NO:155和SEQID NO:180；

·实例7-9和37-39的V_H和V_L结构域来自多肽6，例如分别来自SEQ ID NO:156和SEQID NO:181；

·实例10-12和40-42的V_H和V_L结构域来自多肽7，例如分别来自SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:182；

·实例13-15和43-45的V_H和V_L结构域来自多肽25，例如分别来自SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:200；

·实例16-18和46-48的V_H和V_L结构域来自多肽30，例如分别来自SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:324；

·实例19-21和49-51的V_H和V_L结构域来自多肽31，例如分别来自SEQ ID NO:308和SEQ ID NO:325；

·实例22-24和52-54的V_H和V_L结构域来自多肽32，例如分别来自SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:326；

·实例25-27和55-57的V_H和V_L结构域来自多肽33，例如分别来自SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:337；并且

·实例28-30和58-60的V_H和V_L结构域来自多肽38，例如分别来自SEQ ID NO:315和SEQ ID NO:332。

表10.CAR构建体

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因此，本文提供了嵌合抗原受体，这些嵌合抗原受体包含以下说明性实例中披露的序列。

表11.CAR序列

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包含具有变化的scFv的类似CAR也是可能的。

例如，CD34标签可以与P2A序列(使得其共表达为离散的蛋白质)一起包括在表达载体中，或者(GGGGS)₄接头可以被(GGGGS)₃、(GGGGS)₂或(GGGGS)₁接头取代。例如，还提供了：

·CAR实例1a-60a，其与上面那些相同，只是它们伴随CD34标签；

·CAR实例1b-60b，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)₃接头；

·CAR实例1c-60c，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)₃接头，并且它们伴随CD34标签；

·CAR实例1d-60d，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)₂接头；

·CAR实例1e-60e，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)₂接头，并且它们伴随CD34标签；

·CAR实例1f-60f，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)接头；以及

·CAR实例1g-60g，其与上面那些相同，只是它们具有(GGGGS)接头，并且它们伴随CD34标签。

实例7：携带CAR的免疫效应细胞

可以构建携带CAR的免疫效应细胞，任选地使用基因组编辑步骤以实现一种或多种表面蛋白的缺失或遏制。这样的表面蛋白很多包括例如形成TCR复合物的一部分的那些表面蛋白，如果在同种异体情况下向患者施用细胞，其可诱导GvHD；或者属于CAR的靶抗原的那些表面蛋白，如果不遏制该抗原在CAR-T上的表达，其可诱导自相残杀。

例如，在一个方案中，在第0天，将CD4+CD8+T细胞在细胞培养基中解冻。在室温下将所需数目的细胞以200x g离心10分钟。将上清液完全去除，将细胞以1x 10⁶个/ml的浓度重悬于补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的细胞培养基(TexMacs)中。用美天旎公司(Miltenyi)的研究级TransAct^TM(10μl/ml)刺激T细胞。

在第1天，将所需量的包含CAR的病毒载体以所需的M.O.I(感染复数)添加到激活的细胞中。将细胞和病毒混合并放回37℃的培养箱中。

表12.

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在第3天，洗涤激活的细胞以去除刺激。

如果希望进行基因组编辑，则收获细胞并进行计数。在室温下将所需数目的细胞以100x g离心10分钟。将上清液完全去除，将细胞重悬于电穿孔缓冲液(1ml)(例如MaxcyteEP缓冲液)中，并转移到微量离心管中，并在室温下以100x g离心10分钟。将上清液完全去除，然后将细胞以所希望的浓度(例如5x 10⁷个/ml)重悬于电穿孔缓冲液(例如MaxCyte EP缓冲液)中。

在室温下将可商购的Cas9蛋白(10μg)和商业合成的gRNA(20μg)复合10分钟。

将细胞(100μl)转移到含有复合的Cas9/gRNA的管中，轻轻混合，并将所有物质转移到MaxCyte OC100管中。此后，使用Maxcyte程序Expanded T cell 2开始电穿孔。在该程序之后，可以将激活的细胞转移到10ml预热的培养基中，并返回培养箱以再扩增7-12天。

FACS分析可用于显示经CAR转导的细胞的纯度(CAR表达和靶基因缺失)。

实例8：体外细胞杀伤测定

靶AML细胞系可以从商业供应商(ATCC)获得。通过FACS分析来确认靶标表达并通过DNA测序获得靶细胞基因型。对细胞进行修饰以表达CBR-GFP(叩甲虫荧光素酶和绿色荧光蛋白)。将Jurkat细胞(靶标阴性)工程化以过度表达与CD90.1标志物结合的CD33^G69变体或CD33^R69变体，以使得能够通过FACS以靶蛋白非依赖性方式进行区分。在FACS分析之前，将靶细胞与以下共孵育24小时：

·CART33^ARG69，其包含含有多肽编号6中披露的V_H和V_L结构域的抗原识别结构域，或者

·CART33^GLY69，其包含含有多肽编号30中披露的V_H和V_L结构域的抗原识别结构域；或者

·阳性对照、变体非特异性CART33，

效应子与靶细胞比率的范围为例如E:T 2:1至E:T 1:32。有活力的靶细胞的绝对细胞计数通过流式细胞术(attune，使用定义体积中的绝对计数)进行定量。将细胞毒性百分比定义为有活力的靶标相对于仅肿瘤对照。使用FlowJo V10分析数据。

结果显示在图4和图5中。CART33^ARG69有效杀伤CD33^ARG69靶标但并不杀伤CD33^GLY69靶标。CART33^GLY69有效杀伤CD33^GLY69靶标但并不杀伤CD33^ARG69靶标。CART33杀伤CD33^ARG69靶标和CD33^GLY69靶标两者。

可以用包含替代多肽的其他CAR细胞和表达适当靶标的细胞重复以上测定，并且可以根据本领域已知的方法而改变；例如，可以使用效应子与靶标的不同比率。预期在该类型的另外的实验中，表达多态性选择性CARS的细胞将杀伤表达选择的靶多态物的细胞。

例如，CART33将杀伤CD33+靶标，而与CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关。预期CART-CD33^G69杀伤CD33^G69靶标(例如HL60、KG1a或Jurkat CD33^G69)，但不杀伤CD33^R69靶标(例如TF1、THP1或Jurkat CD33^R69)。预期CART-CD33^R69杀伤CD33^R69靶标(例如TF1、THP1或JurkatCD33^R69)，但不杀伤CD33^G69靶标(例如HL60、KG1a、Jurkat CD33^G69)。

类似地，表达靶向FLT3和CLL1的多态性的多态性选择性CARS的细胞将杀伤表达选择的靶多态物的细胞，并将保留表达另一种多态物的细胞。CART-FLT3将杀伤FLT3+靶标，而与FLT3基因型(FLT3^T227或FLT3^M227)无关。预期CART-FLT3^M227杀伤FLT3^M227靶标(例如JurkatFLT3^M227)，但不杀伤FLT3^T227靶标(例如Jurkat FLT3^T227)。预期CART-FLT3^T227杀伤FLT3^T227靶标(例如Jurkat FLT3^T227)，但不杀伤FLT3^M227靶标(例如Jurkat FLT3^M227)。CART-CLL1将杀伤CLL1+靶标，而与CLL1基因型(CLL1^K244或CLL1^Q244)无关。预期CART-CLL1^Q244杀伤CLL1^Q244靶标(例如Jurkat CLL1^Q244)，但不杀伤CLL1^K244靶标(例如Jurkat CLL1^K244)。预期CART-CLL1^K244杀伤CLL1^K244靶标(例如Jurkat CLL1^K244)，但不杀伤CLL1^Q244靶标(例如Jurkat CLL1^Q244)。

实例9：CAR-T活性的AML细胞系异种移植物模型

可以在鼠患者来源的异种移植物实验中使用六至十周龄的免疫缺陷NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ(NSG-SGM3)小鼠。雄性和雌性小鼠两者都可以用于实验，并将其随机分配到治疗组。

靶AML细胞系可以从商业供应商(ATCC)获得。通过FACS分析来确认靶标表达并通过DNA测序获得靶细胞基因型。对细胞进行修饰以表达CBR-GFP(叩甲虫荧光素酶和绿色荧光蛋白)。

在第-7天将适当量例如1x10⁶个细胞植入小鼠，随后在第0天输注适当量例如2x10⁶个CAR-T细胞和适当的对照。

例如，可以将CD33^G69 AML细胞系KG1a植入小鼠中，并用CD33^G69 CAR-T细胞或CD33^R69 CAR-T细胞、阳性对照(CD33 CAR-T细胞)或阴性对照(例如CAR阴性T细胞)处理。

可以每周通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷。将监测小鼠的存活期。可以从小鼠中提取骨髓，并使用FACS评估肿瘤负荷。

预期CART33(阳性对照)将杀伤CD33+靶标而与CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关，减少肿瘤负荷并延长存活期。预期CART-CD33^G69杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。CD33^R69靶标(例如TF1、THP1或Jurkat CD33^R69)不会被CART-CD33^G69杀伤，并因此CART-CD33^G69不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。预期CART-CD33^R69杀伤CD33^R69靶标(例如TF1或THP1)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。预期CART-CD33^R69不杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，并因此在携带CD33^G69靶细胞系的小鼠中，CART-CD33^R69不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。

实例10：CAR-T活性的AML细胞系人源化异种移植物模型

可以在患者来源的异种移植物实验中使用人CD34+造血干细胞植入的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ(CD34+hu-NSG-SGM3)小鼠。雄性和雌性小鼠两者都可以用于实验，并将其随机分配到治疗组。

将小鼠放血，并使用基于PCR的测序对植入的人细胞进行基因分型以确定多态性靶标的表型。

在CD34脐带血植入后8-10周，将适当量例如1x 10⁶个AML细胞植入小鼠，随后在第0天输注适当量例如2x 10⁶个CAR-T细胞和适当的对照。

例如，可以将CD33^G69 AML细胞系KG1a植入人源化CD34+CD33^R69小鼠中，并用CD33^G69CAR-T细胞或CD33^R69 CAR-T细胞、阳性对照(CD33 CAR-T细胞)或阴性对照(例如CAR阴性T细胞)处理。

可以每周通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷。可监测小鼠的存活期。可以从小鼠中提取骨髓，并使用FACS评估肿瘤负荷。将通过FACS分析从小鼠的血液、脾脏和骨髓中获得的植入的脐带血来源的细胞上的CD33表达。使用红细胞裂解缓冲液(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))裂解红细胞，并用冰冷的PBS洗涤。通过将细胞重悬于染色缓冲液(补充有0.5％牛血清白蛋白和2mM EOTA的PBS)中，并在4℃下与适当的荧光色素标记的单克隆抗体的预滴定饱和稀释液一起孵育30min，制备用于流式细胞术的样品。可以使用FlowJoV10分析数据。

预期CART33(阳性对照)将杀伤CD33+靶标而与CD33基因型(CD33^R69+或CD33^G69)无关，并减少肿瘤负荷，但也丧失人植入造血细胞。预期CART-CD33^G69杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，并且不杀伤CD33^R69植入的干细胞，从而通过减少肿瘤负荷而延长存活期，同时维持人造血细胞。预期CART-CD33^R69杀伤CD33^R69靶标(例如TF1、THP)，并且不杀伤CD33^G69植入的干细胞，从而通过减少肿瘤负荷而延长存活期，同时维持人造血细胞。预期在AML和植入的干细胞上具有相同CD33变体的小鼠将具有减少的肿瘤负荷，但不能维持人造血细胞。

实例11：CAR-T活性的患者来源的异种移植物模型。

人血液癌症(例如AML)的异种移植物可以从本领域已知的多种来源获得，这些来源包括例如公共异种移植物资源库(Public Repository of Xenografts，PRoXe，www.PRoXe.org)。在第-7天将适当量例如1x 10⁶个细胞植入小鼠，随后在第0天输注适当量例如2x 10⁶个CAR-T细胞和适当的对照。

例如，可以将CD33^R69 AML异种移植物植入小鼠中，并用CD33^G69 CAR-T细胞或CD33^R69 CAR-T细胞、或阴性对照(例如CAR阴性T细胞)处理。

在CAR-T输注后两周、四周和六周之后，通过流式细胞术分析外周血和脾脏。使用红细胞裂解缓冲液(西格玛奥德里奇公司)裂解红细胞，并用冰冷的PBS洗涤。通过将细胞重悬于染色缓冲液(补充有0.5％牛血清白蛋白和2mM EDTA的PBS)中，并在4℃下与适当的荧光色素标记的单克隆抗体的预滴定饱和稀释液一起孵育30min，制备用于流式细胞术的样品。可以使用FlowJo V10分析数据。

预期CD33^R69 CAR-T将杀伤植入的CD33^R69 AML细胞，减少肿瘤负荷并延长存活期。预期CD33^G69 CAR-T将不能杀伤植入的CD33^R69AML细胞，并且不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。如果植入的AML是杂合的，其表达CD33^R69和CD33^G69两者，则CD33^G69 CAR-T和CD33^R69CAR-T两者都将有效杀伤植入的原代AML，延长小鼠的存活期。

实例12：AML细胞系体外CAR-NK活性

靶AML细胞系可以从商业供应商(ATCC)获得。通过FACS分析来确认靶标表达并通过DNA测序获得靶细胞基因型。

例如，CD33^G69 AML细胞系(如KG1a或HL60)和CD33^R69AML细胞系(如TF1或THP1)可以在体外进行培养。

然后将经工程化以表达针对CD33^R69的scFv-CAR的NK细胞添加到培养4-24小时的CD33^R69或CD33^G69细胞中。培养后，预期CD33^R69细胞的死亡将增强，而CD33^G69细胞的死亡将不高于未修饰的NK细胞的背景杀伤。预期针对CD33^G69的scFv-CAR NK将杀伤CD33^G69细胞，但不增强对CD33^R69细胞的杀伤。作为阳性对照，可以使用抗CD33 CAR，而作为阴性对照，可以使用单独的NK细胞。

可替代地，NK细胞可以在存在CD33^R69或CD33^G69 AML细胞系的情况下以及在存在具有靶向CD33^R69的人IgG1或IgG3同种型的抗体的情况下培养。共培养后，将评估AML细胞系的死亡，并且预期CD33^R69AML细胞的死亡率更高。作为阳性对照，可以使用抗CD33抗体，而作为阴性对照，可以使用单独的NK细胞。

预期CARNK33(阳性对照)将杀伤CD33+靶标而与AML的CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关。预期CARNK-CD33^G69杀伤CD33^G69靶标(例如，HL60或KG1a)。CD33^R69靶标(例如TF1或THP1)不会被CARNK-CD33^G69杀伤，并因此在该体外测定中CARNK-CD33^G69在此方面不会增强。预期CARNK-CD33^R69杀伤CD33^R69靶标(例如，TF1或THP1)。预期CARNK-CD33^R69不会杀伤CD33^G69靶标(例如，HL60或KG1a)，并因此在该体外测定中CARNK-CD33^R69在此方面不会增强。

预期包括施用NK细胞与抗CD33抗体(阳性对照)的治疗将杀伤CD33+靶标而与AML的CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关。预期与抗CD33^G69抗体一起培养的NK细胞杀伤CD33^G69靶标(例如，HL60或KG1a)。CD33^R69靶标(例如，TF1或THP1)将不会被与抗CD33^G69抗体一起培养的NK细胞杀伤，并且因此在针对CD33^R69靶细胞系的该测定中，与抗CD33^G69抗体一起施用的NK细胞不会增加AML细胞死亡。预期与抗CD33^R69抗体一起施用的NK细胞杀伤CD33^R69靶标(例如，TF1或THP1)。预期与抗CD33^R69抗体一起培养的NK细胞不会杀伤CD33^G69靶标(例如，HL60或KG1a)，并且因此在针对CD33^G69靶细胞系的该测定中，与抗CD33^R69抗体一起施用的NK细胞不会增加AML细胞死亡。

实例13：CAR-NK活性的AML细胞系异种移植物模型

在第-7天将适当量例如1x10⁶个细胞植入小鼠，随后在第0天输注适当量例如5x10⁶个CAR-NK或NK细胞和适当的对照。

例如，可以将CD33^G69 AML细胞系KG1a植入小鼠中，并用CD33^G69 CAR-NK细胞或CD33^R69 CAR-NK细胞、阳性对照(CD33 CAR-NK细胞)或阴性对照(例如CAR阴性NK细胞)处理。

可替代地，可以将CD33^R69 AML细胞系TF1植入小鼠中，并用以下处理：与针对CD33^G69或CD33^R69的人IgG1或人IgG3同种型的抗体共施用的NK细胞、阳性对照(NK细胞和通用抗CD33抗体)或阴性对照(例如，仅NK细胞)。

可以每周通过生物发光成像(BLI)和骨监测肿瘤负荷。将监测小鼠的存活期。可以从小鼠中提取骨髓，并使用FACS评估肿瘤负荷。

预期CARNK33(阳性对照)将杀伤CD33+靶标而与AML的CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关，减少肿瘤负荷并延长存活期。预期CARNK-CD33^G69杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。CD33^R69靶标(例如TF1或THP1)不会被CARNK-CD33^G69杀伤，并因此CARNK-CD33^G69不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。预期CARNK-CD33^R69杀伤CD33^R69靶标(例如TF1或THP1)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。预期CARNK-CD33^R69不杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，并因此在携带CD33^G69靶细胞系的小鼠中，CARNK-CD33^R69不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。

预期包括施用NK细胞与抗CD33抗体(阳性对照)的治疗将杀伤CD33+靶标而与AML的CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关，减少肿瘤负荷并延长存活期。预期与抗CD33^G69抗体一起施用的NK细胞杀伤CD33^G69靶标(例如HL60或KG1a)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。CD33^R69靶标(例如，TF1或THP1)将不会被与抗CD33^G69抗体一起施用的NK细胞杀伤，并且因此与抗CD33^G69抗体一起施用的NK细胞不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。预期与抗CD33^R69抗体一起施用的NK细胞杀伤CD33^R69靶标(例如，TF1或THP1)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。预期与抗CD33^R69抗体一起施用的NK细胞不会杀伤CD33^G69靶标(例如，HL60或KG1a)，并且因此在携带CD33^G69靶细胞系的小鼠中，与抗CD33^R69抗体一起施用的NK细胞不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。

实例14：包含scFv的抗体

抗体可以使用本领域已知的方法从本文披露的scFv构建。例如，本文披露的抗体可以在pFuse IgG1 Fc融合蛋白表达质粒(例如Invivogen公司)中从形式为

|--[(前导序列)(scFv V_H)(hCγ1)(hCγ2)(hCγ3)(Cγs)]--|

的表达盒产生，以及在pFuse IgK Fc融合蛋白表达质粒(例如Invivogen公司)中从形式为

|--[(前导序列)(scFv V_L)(hC_κ/λ)]--|

的表达盒产生。

可替代地，抗CD33-R69或抗CD33-G69抗体可以从以下形式的表达盒产生：

|--[(前导序列)(scFv V_H)(hCγ1)(hCγ2)(hCγ3)(Cγs)]-[P2A]-[(前导序列)(scFvV_L)(C_κ/λ)]-|。

在前述任一情况下，Cγs可以任选地是hCγ3结构域的一部分。

抗体可以属于各种同种型，其恒定结构域是本领域已知的。例如，对于IgG1或IgG4，序列组分可以如表13中所示：

表13.人抗体Fc组分

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前述内容可以与例如以下组合：具有SEQ ID NO 151-175中任一个的多肽序列的V_H结构域和/或具有SEQ ID NO 176-200中任一个的多肽序列的V_L结构域；具有SEQ ID NO303-319中任一个的多肽序列的V_H结构域和/或具有SEQ ID NO 320-336中任一个的多肽序列的V_L结构域；具有SEQ ID NO 481-504中任一个的多肽序列的V_H结构域和/或具有SEQ IDNO 505-528中任一个的多肽序列的V_L结构域；或者具有SEQ ID NO 661-682中任一个的多肽序列或编码SEQ ID NO 661-682中任一个的核苷酸序列的V_H结构域和/或具有SEQ ID NO683-704中任一个的多肽序列的V_L结构域；或编码前述任一个的核苷酸序列。

另外的抗体可以从V_H和V_L结构域构建，这些结构域对于特定的多态性是非选择性的。例如，表13中的元件可以与例如以下组合：具有SEQ ID NO 1035-1089中任一个的多肽序列的V_H结构域和/或具有SEQ ID NO 1090-1144中任一个的多肽序列的V_L结构域；或者具有SEQ ID NO 1427-1473中任一个的多肽序列的V_H结构域和/或具有SEQ ID NO 1474-1520中任一个的多肽序列的V_L结构域；或编码前述任一个的核苷酸序列。

包含前述形式的序列的克隆载体(例如质粒)可以在适当的细胞系(例如293F细胞)中表达；瞬时转染典型地是足够的。使293F细胞在不含IgG的FBS中伴随搅拌(例如，滚瓶)生长，并在几(例如，5)天的过程中收获上清液。使用蛋白A或G柱纯化上清液，并使用本领域已知的方法回收抗体。

如此产生的抗体可以包含VH和VL结构域，如下表14所示。抗体(mAb)实例1-42靶向CD33并且实例43-88靶向CLL-1。

表14-IgG1抗体

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表15.IgG4抗体

抗体(mAb)实例89-130靶向CD33并且实例131-176靶向CLL-1。

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实例15：使用抗体药物缀合物的AML细胞系异种移植物模型

抗体药物缀合物可以通过使生物活性化合物缀合至变体特异性抗体来产生。实例可以包括分子(如皂草毒蛋白(核糖体失活蛋白质)、MMAE、MMAF、DM1或DM4)与抗CD33^R69抗体或抗CD33^G69抗体的缀合，其导致在抗原结合和抗体介导的药物内化之后的细胞死亡。

靶AML细胞系可以从商业供应商(ATCC)获得。通过FACS分析来确认靶标表达并通过DNA测序获得靶细胞基因型。可以对细胞进行修饰以表达CBR-GFP(叩甲虫荧光素酶和绿色荧光蛋白)。

在第-7天将适当量例如1x10⁶个细胞植入小鼠。在第0天，在第0、+7和+14天用适当量的ADC(例如，剂量范围为0.1mg/kg至5mg/kg)处理小鼠。

例如，可以将CD33^R69 AML细胞系KG1a植入小鼠中，并用抗CD33^G69-皂草毒蛋白或抗CD33^R69-皂草毒蛋白、阳性对照(抗CD33-皂草毒蛋白)或阴性对照(抗CD33并且不含皂草毒蛋白)处理。

预期抗CD33-皂草毒蛋白(阳性对照)将杀伤CD33+靶标而与CD33基因型(CD33^R69或CD33^G69)无关，减少肿瘤负荷并延长存活期。预期抗CD33^R69-皂草毒蛋白杀伤CD33^R69靶标(例如KG1a)，减少肿瘤负荷并延长小鼠的存活期。预期抗CD33^G69-皂草毒蛋白不会杀伤CD33^R69靶标，并且不会提供存活期优势或减少肿瘤负荷。

实例16：临床应用

下面给出了受试者的多态性选择性治疗的几种临床应用。在下面的实例中，多态性抗原可以是例如CD33、FLT3或CLL-1；出于说明的目的，将使用CD33。

情景1：无既往筛选，复发时筛选患者。在该情景下，对患有癌症(例如MDS或AML)的受试者进行调理，并用来自相关或不相关的组织相容性供体(无论是来自人白细胞抗原(HLA)相同的兄弟姐妹、HLA匹配的供体、脐带血单位或是单倍体供体)的HSC进行移植，针对低概率的同种异体排斥和移植物抗宿主病(GvHD)对该供体进行筛选。大多数HSCT受体最终复发。如果出现复发，受试者就有资格接受使用多态性选择性治疗如携带CAR的免疫效应细胞(例如，TCR缺失的CAR-T或CAR-NK或CAR-iNKT)、或NK细胞与诱导ADCC的抗体的组合的疗法，这些多态性选择性治疗靶向在受试者的恶性细胞的表面上表达的抗原。

如果受试者在移植后复发，则使用基于蛋白质的方法(例如FACS)或基于DNA的方法(PCR)对该受试者进行基因分型，以确保HSC供体和患者表达靶抗原(例如CD33)的不同变体。如果受试者和供体确实表达靶抗原的不同变体，例如一个表达CD33^R69，而另一个表达CD33^G69，则该受试者有资格进行多态性治疗。然后对受试者进行调理(例如，环磷酰胺/氟达拉滨，3天)，并用携带CAR的免疫效应细胞(例如，TCR缺失的CAR-T或CAR-NK或CAR iNKT)、或NK细胞与诱导ADCC的靶向患者特异性靶抗原的抗体的组合进行治疗。例如，其细胞表达CD33^R69且其HSCT移植物表达可用CD33^G69处理的患者可用TCR缺失的CD33^R69-CART、或CD33^R69-CAR-NK、或供体NK细胞与诱导ADCC的抗CD33^R69抗体的组合进行治疗。CD33^R69选择性疗法将杀伤受试者的癌性细胞，并保留表达CD33^G69的HSCT细胞。反向错配的组合也是有效的。然后可以监测受试者，并任选地用这些选择性疗法中的一种或多种再次治疗。

情景2：前瞻性筛选，复发时筛选患者。在该情景下，对HSCT供体进行前瞻性筛选，以评估供体表达给定靶抗原(例如CD33)的多态性变体，并鉴定表达与预期受体受试者不同的变体的供体。这可以通过使用基于(PCR)的基因分型方法对患者和供体进行基因分型来实现。此时，HSC和免疫效应细胞(如T细胞、NK细胞和iNKT细胞)可从同一供体收获，并经由白细胞去除术分离。HSC可用于移植到靶标错配的受体中；并且免疫效应细胞可以用选择性结合由受体而不是供体的细胞表达的抗原变体(例如CD33^R69或CD33^G69)的CAR转导，或者如果需要的话储存以供以后使用。

对受试者进行调理，并用来自靶标错配的供体的HSC进行移植，该供体是例如表达CD33^G69的供体并且其用于表达CD33^R69的患者，或相反。供体可以是如上所述的相关或不相关的组织相容性供体。

如果出现复发，则对受试者进行调理(例如，环磷酰胺/氟达拉滨，3天)，并用多态性选择性治疗如携带CAR的免疫效应细胞(例如，CAR-T、TCR缺失的CAR-T、CAR-NK或CAR-iNKT)、或NK细胞与诱导ADCC的抗体的组合进行治疗，这些多态性选择性治疗靶向在受试者的恶性细胞表面上表达的抗原的变体并且不靶向在供体的细胞表面上表达的变体。例如，其细胞表达CD33^R69且其HSCT移植物表达可用CD33^G69处理的患者可用TCR缺失的CD33^R69-CART、或CD33^R69-CAR-NK、或供体NK细胞与诱导ADCC的抗CD33^R69抗体的组合进行治疗。CD33^R69选择性疗法将杀伤受试者的表达CD33^R69的癌性细胞，并保留表达CD33^G69的HSCT细胞。反向错配的组合也是有效的。然后可以监测受试者，并任选地用这些选择性疗法中的一种或多种再次治疗。

情景3：前瞻性筛选，复发时治疗患者。在该情景下，对HSCT供体进行前瞻性筛选，以评估供体表达给定靶抗原(例如CD33)的多态性变体，并鉴定表达与预期受体受试者不同的变体的供体。这可以通过使用基于(PCR)的基因分型方法对患者和供体进行基因分型来实现。

对受试者进行调理，并用来自靶标错配的供体的HSC进行移植，该供体是例如表达CD33^G69的供体并且其用于表达CD33^R69的患者，或相反。供体可以是如上所述的相关或不相关的组织相容性供体。如果出现复发，则对受试者进行调理(例如，环磷酰胺/氟达拉滨，3天)，并用多态性选择性治疗如携带CAR的免疫效应细胞(例如，TCR缺失的CAR-T、CAR-NK或CAR-iNKT)、或NK细胞与诱导ADCC的抗体的组合、或包含诱导ADCC的抗体的抗体-药物缀合物进行治疗，这些多态性选择性治疗靶向在受试者的恶性细胞表面上表达的抗原的变体并且不靶向在供体的细胞表面上表达的变体。例如，其细胞表达CD33^R69且其HSCT移植物表达可用CD33^G69处理的患者可用TCR缺失的CD33^R69-CART、或CD33^R69-CAR-NK、或供体NK细胞与诱导ADCC的抗CD33^R69抗体的组合进行治疗。CD33^R69选择性疗法将杀伤受试者的表达CD33^R69的癌性细胞，并保留表达CD33^G69的HSCT细胞。反向错配的组合也是有效的。然后可以监测受试者，并任选地用这些选择性疗法中的一种或多种再次治疗。

情景4：前瞻性筛选，在移植时治疗。在该情景下，对HSCT供体进行前瞻性筛选，以评估供体表达给定靶抗原(例如CD33)的多态性变体，并鉴定表达与预期受体受试者不同的变体的供体。这可以通过使用基于(PCR)的基因分型方法对患者和供体进行基因分型来实现。

对受试者进行调理，并用来自靶标错配的供体的HSC进行移植，该供体是例如表达CD33^G69的供体并且其用于表达CD33^R69的患者，或相反。供体可以是如上所述的相关或不相关的组织相容性供体。调理可以是如同标准HSCT(完全清髓性)或强度降低的调理(RIC)；或者可替代地，可以是T细胞耗竭的移植。

几乎与移植同时(即在HSCT的1天、2天、3天或10天内，但在任何情况下，都不要求复发)，用多态性选择性治疗如携带CAR的免疫效应细胞(例如，CAR-T、TCR缺失的CAR-T、CAR-NK或CAR-iNKT)、或NK细胞与诱导ADCC的抗体的组合治疗受试者，这些多态性选择性治疗靶向在受试者的恶性细胞表面上表达的抗原的变体并且不靶向在供体的细胞表面上表达的变体。例如，其细胞表达CD33^R69且其HSCT移植物表达可用CD33^G69处理的患者可用TCR缺失的CD33^R69-CART、或CD33^R69-CAR-NK、或供体NK细胞与诱导ADCC的抗CD33^R69抗体的组合进行治疗。CD33^R69选择性疗法将杀伤受试者的表达CD33^R69的癌性细胞，并保留表达CD33^G69的HSCT细胞。反向错配的组合也是有效的。然后可以监测受试者，并任选地用这些选择性疗法中的一种或多种再次治疗。

前述方法可适用于证明其他scFv、抗体、抗体-药物缀合物、和CAR对抗原(如癌症抗原)的结合和多态性选择性。例如，预期这些方法证明抗FLT3 scFv选择性结合T227或M227变体。也预期这些方法证明抗CLL-1scFv选择性结合K244或Q244变体。

实例17：非选择性抗人CD33 scFv克隆的鉴定

上面实例1中的方法已用于发现多态性非选择性抗人CD33scFv克隆。

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表16b.非选择性抗CD33多肽的序列(VH和VL序列)

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如上在实例4和5中披露的那样测试上述多肽。数据披露在下表16c中，其将相对于亲本的FACS倍数变化报告为(-)：指示<2倍；(+)：指示2-10倍；(++)：指示10-30倍；以及(+++)：指示>30倍。

表16c.多肽活性(FACS和BLI)

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实例18：非选择性抗人CLL-1scFv克隆的鉴定

上面实例1中的方法已用于发现非选择性抗人CLL-1scFv克隆。

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表17b.非选择性抗CLL-1多肽的序列(VH和VL序列)

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如上在实例4中披露的那样测试上述多肽。数据披露在下表17c中，其将相对于亲本的FACS倍数变化报告为(-)：指示<2倍；(+)：指示2-10倍；(++)：指示10-30倍；以及(+++)：指示>30倍。

表17c.多肽活性(FACS)

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实例19：非选择性抗人FLT3 scFv克隆的鉴定

上面实例1中的方法已用于发现非选择性抗人FLT3 scFv克隆。使用人FLT3细胞外结构域抗原的两种重组多态形式(huFLT3-T227和huFLT3-M227)通过人抗体文库的标准筛选方法发现了抗人FLT-3scFv克隆。使用这些抗原，采用多种淘选策略来促进具有所希望的亲和范围的热稳定克隆的富集。通过流式细胞术和生物层干涉测量(BLI)针对与人FLT-3的两个单核苷酸多态性(SNP)变体(苏氨酸227和甲硫氨酸227)的结合来筛选scFv。

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表18b.非选择性抗FLT3多肽的序列(VH和VL序列)

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如上在实例4和5中披露的那样测试上述多肽。数据披露在下表18c中，其将相对于亲本的FACS倍数变化报告为(-)：指示<2倍；(+)：指示2-10倍；(++)：指示10-30倍；以及(+++)：指示>30倍。

表18c.多肽活性(FACS和BLI)

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提供以上列出的详细描述是为了帮助本领域的技术人员实践本披露。然而，本文描述和要求权利的本披露的范围并不受本文所披露的具体实施例的限制，因为这些实施例旨在阐明本披露的若干方面。任何等效的实施例都旨在处于本披露的范围之内。事实上，除了本文所示和所述的那些，本披露的各种修改根据前面描述对于本领域技术人员来说也将变得清楚，这些修改并不偏离本发明性发现的精神或范围。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。

Claims

1.一种多肽，该多肽相对于人癌细胞抗原的第二多态性变体选择性结合该人癌细胞抗原的第一多态性变体；或相对于该抗原的第一多态性变体选择性结合该抗原的第二多态性变体。

2.如权利要求1所述的多肽，其中该抗原选自CD33、CLL-1和FLT3。

3.如权利要求2所述的多肽，其中该抗原是CD33。

4.一种多肽，该多肽相对于CD33的第二多态性变体选择性结合CD33的第一多态性变体；或相对于该CD33的第一多态性变体选择性结合该CD33的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

5.如权利要求4所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

6.如权利要求5所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

7.如权利要求3-6中任一项所述的多肽，其中该CD33的第一多态性变体是R69，并且该CD33的第二多态性变体是G69；或者该CD33的第一多态性变体是G69，并且该CD33的第二多态性变体是R69。

8.如权利要求7所述的多肽，该多肽包含六个互补决定区(CDR)。

9.如权利要求8所述的多肽，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3。

10.如权利要求7-9中任一项所述的多肽，其中：

HCDR2包含与选自SEQ ID NO:26-50和218-234的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且

11.如权利要求7-9中任一项所述的多肽，其中：

12.如权利要求7-9中任一项所述的多肽，其中：

13.如权利要求10-12中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

14.如权利要求10-12中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3具有所述氨基酸序列。

15.如权利要求7-14中任一项所述的多肽，其中：

16.如权利要求7-14中任一项所述的多肽，其中：

17.如权利要求7-14中任一项所述的多肽，其中：

18.如权利要求15-17中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

19.如权利要求15-17中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3具有所述氨基酸序列。

20.如权利要求7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO151-175和303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

21.如权利要求7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO151-175中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

22.如权利要求7所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

23.如权利要求20-22中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

24.如权利要求20-22中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

25.如权利要求7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200和320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

26.如权利要求7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

27.如权利要求7和20-24中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

28.如权利要求25-27中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

29.如权利要求25-27中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

30.如权利要求20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-42中所述的那些。

31.如权利要求20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号1-25中所述的那些。

32.如权利要求20-29中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号26-42中所述的那些。

33.如权利要求29-32中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域和该V_L结构域与所述氨基酸序列对中的一对具有至少97％、98％或99％序列同一性。

34.如权利要求2所述的多肽，其中该抗原是FLT3。

35.一种多肽，该多肽相对于FLT3的第二多态性变体选择性结合FLT3的第一多态性变体；或相对于该第一多态性变体选择性结合该FLT3的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

36.如权利要求35所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

37.如权利要求36所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

38.如权利要求34-37中任一项所述的多肽，其中该FLT3的第一多态性变体是T227，并且该FLT3的第二多态性变体是M227；或者该FLT3的第一多态性变体是M227，并且该FLT3的第二多态性变体是T227。

39.如权利要求2所述的多肽，其中该抗原是CLL-1。

40.一种多肽，该多肽相对于CLL-1的第二多态性变体选择性结合CLL-1的第一多态性变体；或相对于该第一多态性变体选择性结合该CLL-1的第二多态性变体；其中该结合具有至少2倍的选择性。

41.如权利要求40所述的多肽，其中该结合具有至少10倍的选择性。

42.如权利要求40所述的多肽，其中该结合具有至少30倍的选择性。

43.如权利要求39-42中任一项所述的多肽，其中该CLL-1的第一多态性变体是K224，并且该CLL-1的第二多态性变体是Q244；或者该CLL-1的第一多态性变体是Q224，并且该CLL-1的第二多态性变体是K244。

44.如权利要求43所述的多肽，该多肽包含六个互补决定区(CDR)。

45.如权利要求44所述的多肽，该多肽包含：

三个重链可变(V_H)结构域CDR：HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及

三个轻链可变(V_L)结构域CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3。

46.如权利要求43-45中任一项所述的多肽，其中：

47.如权利要求43-45中任一项所述的多肽，其中：

48.如权利要求43-45中任一项所述的多肽，其中：

49.如权利要求46-48中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

50.如权利要求46-48中任一项所述的多肽，其中该HCDR1、HCDR2和HCDR3具有所述氨基酸序列。

51.如权利要求43-50中任一项所述的多肽，其中：

52.如权利要求43-50中任一项所述的多肽，其中：

53.如权利要求43-50中任一项所述的多肽，其中：

54.如权利要求51-53中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

55.如权利要求51-53中任一项所述的多肽，其中该LCDR1、LCDR2和LCDR3具有所述氨基酸序列。

56.如权利要求44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO151-175和303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

57.如权利要求44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO151-175中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

58.如权利要求44所述的多肽，该多肽包含V_H结构域，该V_H结构域具有与选自SEQ ID NO303-319中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

59.如权利要求56-58中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

60.如权利要求56-58中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

61.如权利要求44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200和320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

62.如权利要求44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 176-200中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

63.如权利要求44和56-60中任一项所述的多肽，该多肽包含V_L结构域，该V_L结构域具有与选自SEQ ID NO 320-336中任一个的序列展现出至少95％序列同一性的氨基酸序列。

64.如权利要求61-63中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域与所述氨基酸序列中的一个具有至少97％、98％或99％序列同一性。

65.如权利要求61-63中任一项所述的多肽，其中该V_L结构域具有所述氨基酸序列中的一个。

66.如权利要求56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-88中所述的那些。

67.如权利要求56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号43-66中所述的那些。

68.如权利要求56-65中任一项所述的多肽，该多肽包含V_H结构域和V_L结构域的组合，其中该组合选自多肽编号67-88中所述的那些。

69.如权利要求66-68中任一项所述的多肽，其中该V_H结构域和该V_L结构域与所述氨基酸序列对中的一对具有至少97％、98％或99％序列同一性。

70.一种单链可变片段(scFv)，该scFv包含如权利要求1-69中任一项所述的多肽。

71.一种单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段包含如权利要求1-69中任一项所述的多肽。

72.如权利要求71所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG、IgM或IgA同种型。

73.如权利要求72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG1同种型。

74.如权利要求72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG3同种型。

75.如权利要求72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb属于IgG4同种型。

76.如权利要求72所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb是人的或人源化的。

77.如权利要求45-50中任一项所述的mAb或其抗原结合片段，其中该mAb包含选自SEQID NO:1627-1978的序列。

78.一种抗体-药物缀合物(ADC)，该ADC包含如权利要求71-78中任一项所述的mAb或其抗原结合片段。

79.如权利要求52所述的ADC，该ADC具有式I：

Ab-(L-D)_p

(I)

其中：

Ab是包含如权利要求1-43中任一项所述的多肽的抗体、或如权利要求45-51中任一项所述的抗体、或前述两者之一的抗原结合片段；

L是接头；

D是药物；并且

p是约1至约20。

80.如权利要求79所述的ADC，其中D选自皂草毒蛋白、MMAE、MMAF、DM1和DM4。

81.一种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含含有如权利要求1-69中任一项所述的多肽的细胞外配体结合结构域。

82.如权利要求81所述的CAR，该CAR另外包含：

a.铰链结构域；

b.跨膜结构域；

c.任选地，一个或多个共刺激结构域；以及

d.细胞质信号传导结构域。

83.如权利要求82所述的CAR，其中该铰链结构域选自FcγRIIIa、CD8α、CD28和IgG1。

84.如权利要求83所述的CAR，其中该铰链结构域是CD8α。

85.如权利要求82-84中任一项所述的CAR，其中该跨膜结构域选自该T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CDS0，CD86，CD134，CD137和CD154。

86.如权利要求85所述的CAR，其中该跨膜结构域是CD28。

87.如权利要求82-86中任一项所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域选自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD22、CD32、DAP10、DAP12、CD66d、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ、FcεRIγ(FCERIG)、FcRγ、FcRβ和FcRε。

88.如权利要求87所述的CAR，其中该细胞质信号传导结构域是CD3ζ。

89.如权利要求82-88中任一项所述的CAR，其中一个共刺激结构域选自4-1BB、CD28和ICOS。

90.如权利要求89所述的CAR，其中该共刺激结构域是CD28。

91.如权利要求89所述的CAR，其中该共刺激结构域是4-1BB。

92.如权利要求89所述的CAR，该CAR包含两个或更多个共刺激结构域。

93.如权利要求89所述的CAR，其中这些共刺激结构域中的两个是CD28和4-1BB。

94.如权利要求82所述的CAR，该CAR包含选自SEQ ID NO:1539-1598的序列。

95.一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码如权利要求1-94中任一项所述的多肽、scFv、mAb或CAR。

96.一种载体，该载体包含如权利要求95所述的核苷酸序列。

97.如权利要求96所述的载体，其中该载体是慢病毒载体。

98.如权利要求97所述的载体，其中该慢病毒载体包含VSVG结构域。

99.一种工程化免疫效应细胞，该工程化免疫效应细胞在其细胞表面表达如权利要求81-94中任一项所述的CAR。

100.如权利要求99所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞在其细胞表面表达：

人癌细胞抗原的第一多态性变体；以及

101.如权利要求99所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是原代细胞。

102.如权利要求99所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞源自：

-诱导多能干细胞(iPSC)；

-脐带血；

-外周血；或者

-永生化细胞系。

103.如权利要求102所述的工程化免疫效应细胞，其中该永生化细胞系是NK-92。

104.如权利要求99-103中任一项所述的工程化免疫细胞，其中该细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、恒定自然杀伤T(iNKT)细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

105.如权利要求104所述的工程化免疫效应细胞，其中该细胞是T细胞。

106.如权利要求105所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞选自炎症性T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。

107.如权利要求105所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏该T细胞受体复合物的亚基。

108.如权利要求107所述的工程化免疫效应细胞，其中该T细胞受体复合物的亚基选自TCRα(TRAC)、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、和CD3ζ。

109.如权利要求105-108中任一项所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞缺乏细胞表面蛋白，该细胞表面蛋白是该CAR的靶标。

110.如权利要求104所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是NK细胞。

111.如权利要求110所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是记忆样(ML)NK细胞。

112.如权利要求111所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞。

113.如权利要求104所述的工程化免疫效应细胞，其中该工程化免疫效应细胞是iNKT细胞。

114.一种治疗有需要的受试者的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

c.向该受试者施用：

115.一种有需要的人受试者的免疫疗法的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

c.向该受试者施用：

116.一种治疗有需要的受试者的方法，该受试者在靶细胞表面上具有抗原的第一多态性变体，该方法包括：

a.向该受试者施用：

c.向该受试者施用：

117.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

118.如权利要求114-117中任一项所述的方法，其中该结合具有至少2倍的选择性。

119.如权利要求118所述的方法，其中该结合具有至少10倍的选择性。

120.如权利要求119所述的方法，其中该结合具有至少30倍的选择性。

121.如权利要求114-120中任一项所述的方法，其中该抗原选自CD33、CLL-1和FLT3。

122.如权利要求121所述的方法，其中该抗原是CD33。

123.如权利要求122所述的方法，其中该CD33的第一多态性变体是R69，并且该CD33的第二多态性变体是G69；或者该CD33的第一多态性变体是G69，并且该CD33的第二多态性变体是R69。

124.如权利要求121所述的方法，其中该抗原是FLT3。

125.如权利要求124所述的方法，其中该FLT3的第一多态性变体是T227，并且该FLT3的第二多态性变体是M227；或者该FLT3的第一多态性变体是M227，并且该FLT3的第二多态性变体是T227。

126.如权利要求121所述的方法，其中该抗原是CLL-1。

127.如权利要求126所述的方法，其中该CLL-1的第一多态性变体是K224，并且该CLL-1的第二多态性变体是Q244；或者该CLL-1的第一多态性变体是Q224，并且该CLL-1的第二多态性变体是K244。

128.如权利要求114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者同时施用该工程化免疫效应细胞群和该造血细胞群两者。

129.如权利要求114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者依序施用该造血细胞群，以及该工程化免疫效应细胞群、mAb或ADC。

130.如权利要求114-127中任一项所述的方法，其中向该受试者依序施用该工程化免疫效应细胞群、mAb或ADC，以及该造血细胞群。

131.如权利要求114-130中任一项所述的方法，其中在施用这些造血细胞之前，用一种或多种调理方案治疗该受试者以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞。

132.如权利要求114-130中任一项所述的方法，其中该受试者已经用一种或多种调理方案调理以耗竭该受试者的携带该抗原的第一多态性变体的靶细胞。

133.如权利要求114-132中任一项所述的方法，其中这些造血细胞是造血干细胞和/或造血祖细胞。

134.如权利要求114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞群，该CAR选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

135.如权利要求134所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞源自该受试者(即自体的)，并且这些造血细胞源自供体(即同种异体的)。

136.如权利要求134所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞和造血细胞源自单个供体。

137.如权利要求108所述的方法，其中这些工程化免疫效应细胞源自第一供体，并且造血细胞源自第二供体。

138.如权利要求134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)包含如权利要求1-69中任一项所述的多肽。

139.如权利要求134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)包含如权利要求70所述的scFv。

140.如权利要求134-137中任一项所述的方法，其中该嵌合抗原受体(CAR)是如权利要求81-94中任一项所述的CAR。

141.如权利要求134-137中任一项所述的方法，其中该工程化免疫效应细胞是如权利要求99-113中任一项所述的工程化免疫效应细胞。

142.如权利要求114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

143.如权利要求142所述的方法，其中该单克隆抗体(mAb)包含如权利要求1-69中任一项所述的多肽。

144.如权利要求142所述的方法，其中该单克隆抗体(mAb)是如权利要求71-77中任一项所述的mAb。

145.如权利要求114-133中任一项所述的方法，其中向该受试者施用包含单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，该mAb或其抗原结合片段选择性结合在该靶细胞表面上的该抗原的第一多态性变体。

146.如权利要求142-145中任一项所述的方法，其中在移植后预防性施用该mAb或ADC以防止复发。

147.如权利要求114-146中任一项所述的方法，该方法另外包括对该受试者和供体进行基因分型，以确保该HSC供体和患者表达该靶抗原的不同变体。

148.如权利要求147所述的方法，其中使用基于蛋白质的测定(FACS)或基于DNA的测定(PCR)进行该基因分型。

149.如权利要求147所述的方法，其中在移植复发后对该患者进行基因分型。

150.如权利要求147所述的方法，其中在移植之前对该患者进行基因分型。

151.如权利要求147所述的方法，其中在造血细胞移植之前对该造血细胞供体进行基因分型。

152.如权利要求137-147中任一项所述的方法，其中在移植表达该CAR的工程化免疫效应细胞群之前对该免疫效应细胞供体进行基因分型。

153.如权利要求137-147中任一项所述的方法，其中在造血细胞移植之前对该免疫效应细胞供体进行基因分型。