JP4303964B2 - 組換え抗ｃｄ３０抗体およびその使用 - Google Patents

組換え抗ｃｄ３０抗体およびその使用 Download PDF

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Description

１．発明の分野
本発明は、CD30と結合するタンパク質を投与することを含んでなる、ホジキン病を治療するための方法および組成物に関する。かかるタンパク質には、モノクローナル抗体AC10およびHeFi-1の組換え体／変異体、ならびにそれらの誘導体が含まれる。本発明は、非修飾形態で、CD30を発現するホジキン病細胞の増殖を抑制することができる、CD30受容体に対するモノクローナル抗体の新規クラスに関する。
２．発明の背景
ホジキン病に対する化学療法計画は臨床腫瘍学に画期的躍進をもたらしている。多剤化学療法計画はこれらの患者の治癒率を80％以上に向上させた。それにもかかわらず、患者の3％は治療が原因で死亡し、標準的な治療に応答しないか又は最前線の治療の後に再発する患者の場合、唯一利用可能な治療法は大量化学療法と幹細胞移植の組合せである。この治療法は死亡率80％、高い罹病率、および50％より低い5年生存率と関連している（例えば、Engertら、1999, Seminars in Hematology 36:282-289を参照されたい）。
腫瘍再発の主な原因は化学療法剤に耐性を示す腫瘍細胞クローンの発生である。免疫療法は耐性を迂回する可能性がある選択的ストラテジーに相当する。悪性腫瘍細胞を特異的にターゲッティングするモノクローナル抗体が、多数の免疫療法アプローチの注目の的にされてきた。数種の悪性疾患については、抗体に基づく治療法が標準的治療法の一部として今や認知されている。例えば、人工的に開発された抗CD20抗体Rituxan（登録商標）は、再発した初期段階のNHLの治療用に1997年の後期に承認されたものである。
CD30は120キロダルトンの膜糖タンパク質であり（Froeseら、1987, J. Immunol. 139: 2081-87）、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。このファミリーには、とりわけ、TNF-RI、TNF-RII、CD30、CD40、OX-40およびRANKが含まれる。
CD30は、ホジキン病（HD）および未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）(すなわち、非ホジキン(NHL)リンパ腫のサブセット）において既に証明されている悪性細胞のマーカーである（Durkopら、1992, Cell 88: 421-427）。CD30は、もともとはモノクローナル抗体Ki-1（Schwabら、1982, Nature 299:65-67）を用いて、培養したホジキン-リード・スターンバーグ（H-RS）細胞上に確認されたもので、全てのHDリンパ腫と大多数のALCLの細胞表面に高度に発現されているが、正常組織や毛包周囲部の少数のリンパ系細胞では発現が非常に限られている（Josimovic-Alasevicら、1989, Eur. J. Immunol. 19: 157-162）。CD30抗原に特異的なモノクローナル抗体は、前臨床モデルおよび臨床研究の両方において細胞増殖抑制薬、植物毒素および放射性同位元素を送達するための運搬体として研究されている（Engertら、1990, Cancer Research 50: 84-88; Barthら、2000, Blood 95: 3909-3914）。HD患者において、CD30抗原のターゲッティングは低用量の抗CD30モノクローナル抗体BerH2により達成することができた（Faliniら、1992, British Journal of Haematology 82:38-45）。しかし、悪性腫瘍細胞のin vivoターゲッティングの成功にも係わらず、腫瘍の退行を経験した患者はひとりもいなかった。その後の臨床試験では、毒素（サポリン）が抗体BerH2と化学的にコンジュゲートされ、４名の患者全員が腫瘍塊の急速かつ顕著な縮小を示した（Faliniら、1992, Lancet 339: 1195-1196）。
これらの所見は標的抗原としてのCD30受容体の有効性を強調するものである。しかし、mAb-毒素コンジュゲードで治療した患者の全員がこの毒素に対する抗体を発現した。イムノトキシンの主たる制限の一つはその固有の免疫原性にあり、こうした免疫原性が毒素分子に対する抗体を惹起させて、その効果を中和してしまう（Tsutsumiら、2000, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 97: 8545-8553）。さらに、イムノトキシンと関連した肝臓毒性および血管漏出症候群は、治療量のこれら薬剤を送達する能力を制限する可能性がある（Tsutsumiら、2000, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 97: 8545-8553）。
2.1 CD30モノクローナル抗体
CD30は最初にモノクローナル抗体Ki-1により同定されたもので、当初はKi-1抗原と呼ばれていた（Schwabら、1982, Nature 299: 65-67）。このmAbはホジキン病（HD）の悪性細胞であるホジキン-リード・スターンバーグ（H-RS）細胞に対して生起されたものである。その後、Ki-1により認識されるmAbとは異なり、ホルマリン抵抗性のエピトープと結合する能力がある第2のmAbが開示された（Schwartingら、1989, Blood 74: 1678-1689）。４種の更なる抗体の同定は、1986年に開催された第三回白血球タイピングワークショップ(the Third Leukocyte Typing Workshop)において、結果的にCD30クラスターの生成をもたらした（McMichael, A.編, 1987, Leukocyte Typing III (Oxford: Oxford University Press))。
2.2 CD30モノクローナル抗体に基づく治療薬
ホジキン病（HD）の診断および病期分類におけるCD30 mAbの有用性は、免疫療法に利用しうるツールとしてのそれらの評価につながった。HD患者においては、低用量（30〜50mg）の抗CD30モノクローナル抗体BerH2を用いてCD30抗原の特異的ターゲッティングが達成された（Faliniｏら、1992, British Journal of Haematology 82:38-45）。悪性H-RS腫瘍細胞のin vivoターゲッティングが成功したにも係わらず、腫瘍の退行を経験した患者は皆無であった。
これらの結果に基づき、CD30 mAbを用いた標的免疫療法の有効性は、非修飾抗体によっては達成され得ないと結論された（Faliniら、1992, Lancet 339: 1195-1196）。以後の臨床試験において、mAb BerH2と化学的にコンジュゲートさせた毒素サポリンを用いて４名の難治性ホジキン病患者を治療したところ、一時的ではあったが、腫瘍塊の急速かつ大幅な縮小が示された（Faliniら、1992, Lancet 339: 1195-1196）。近年、研究者らはCD30を発現する腫瘍細胞の処置法を改善することに努めている。それらの例としては、組換え一本鎖イムノトキシンの開発（Barthら、2000, Blood 95: 3909-3914）、抗CD16/CD30二重特異性mAbの開発（Rennerら、2000, Cancer Immunol., Immunother., 49: 173-180）、および細胞表面からのCD30分子の放出を阻止する新しい抗CD30 mAbの同定が挙げられる(Horn-Lohrensら、1995, Int. J. Cancer 60: 539-544)。このフォーカスは、ホジキン病の治療におけるシグナル伝達活性を有する抗CD30 mAbの可能性を退けてきた。
2.3 アゴニスト活性を有する抗CD30モノクローナル抗体の同定
ヒトCD30リガンド（CD30L）をクローニングして、その生物学的活性を特徴づける際に、２種のモノクローナル抗体M44およびM67が開示されたが、これらはCD30Lにより誘導された受容体架橋の活性をまねたものである（Grussら、1994, Blood 83: 2045-2056）。in vitroアッセイにおいて、これらのmAbは、固定化された状態で、活性化Ｔ細胞とＴ細胞起源のホジキン病細胞系L540およびHDLM-2の増殖を刺激することができた。対照的に、これらのmAbはＢ細胞起源のホジキン病細胞系L428およびKM-H2に対してほとんど効果を示さなかった（Grussら、1994, Blood 83: 2045-2056）。これらのアッセイのすべてにおいて、抗CD30 mAb Ki-1によるCD30受容体の結合はほとんど影響を及ぼさなかった。
ホジキン病細胞系に対するこれらのアゴニスト抗CD30 mAbの増殖活性は、シグナル伝達活性を有する抗CD30 mAbがHDの治療において何の効用も有しないことを示唆するものであった。
対照的に、最近になって、抗CD30 mAbは、アポトーシスを誘導せずに、細胞周期停止の誘導によりKarpas-299をはじめとするALCL細胞の増殖を阻害しうることが示された（Hubingerら、2001, Oncogene 20:590-598）。さらに、固定化M44およびM67 mAbの存在は、CD30を発現するALCLに相当する細胞系の増殖を強力に阻害する（Grussら、1994, Blood 83:2045-2056）。このALCL細胞系に対する阻害活性はさらにin vivo動物実験へと拡張された。mAb M44を投与した後では、ALCL異種移植片を保有するSCIDマウスの生存が顕著に増加した。加えて、M44と同様のエピトープを認識する抗CD30 mAb HeFi-1によっても、このモデル動物の生存が引き延ばされた（Tianら、1995, Cancer Research 55:5335-5341）。
2.3.1 モノクローナル抗体AC10
当技術分野で知られているマウス抗CD30 mAbの大多数は、マウスをHD細胞系または精製CD30抗原で免疫することにより生成されている。AC10は、もともとC10と呼ばれていたが（Bowenら、1993, J. Immunol. 151:5896-5906）、この抗CD30 mAbがヒトNK様細胞系であるYTに対して調製されたものであるという点で明確に区別される（Bowenら、1993, J. Immunol. 151:5896-5906）。初期に、このmAbのシグナル伝達活性は、CD28およびCD45分子の細胞表面発現のダウンレギュレーション、細胞表面CD25発現のアップレギュレーション、ならびにC10のYT細胞への結合後の同型接着の誘導により証明された。
2.3.2 モノクローナル抗体HeFi-1
HeFi-1はマウスをL428ホジキン病細胞系で免疫することにより産生された抗CD30 mAbである（Hechtら、J. Immunol. 134:4231-4236）。HeFi-1とホジキン病細胞系L428またはL540との共培養は、このmAbがこれらの細胞系の生存能に及ぼす直接的効果を明らかにすることができなかった。HeFi-1のin vitroおよびin vivoでの抗腫瘍活性は、Karpas 299 ALCL細胞系に対してTianらにより記載された（Tianら、1995, Cancer Research 55:5335-5341）。
2.4 シグナル伝達CD30抗体の直接的抗腫瘍活性
モノクローナル抗体は特定の細胞集団のin vivoターゲッティングのための魅力的なアプローチを提供する。天然のmAbおよびその誘導体は、補体活性化、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、細胞周期進行の抑制、およびアポトーシスの誘導を含むがこれらに限らない、多くの作用機序により、腫瘍細胞を排除しうる（Tuttら、1998, J. Immunol. 161:3176-3185）。
上述したように、Ki-1やBer-H2などのCD30抗原に対するmAbは、直接的な抗腫瘍活性をうまく実証することができなかった（Faliniら、1992, British Journal of Haematology 82:38-45; Grussら、1994, Blood 83:2045-2056）。M44、M67およびHeFi-1を含めて、CD30に対するいくつかのシグナル伝達mAbは、ALCL細胞系の増殖をin vitro (Grussら、1994, Blood 83:2045-2056) またはin vivo (Tianら、1995, Cancer Res. 55:5335-5341)で阻害することが分かっているが、既知の抗CD30抗体が培養下のHD細胞の増殖を阻害するのに有効であることは示されていない。事実、２つのシグナル伝達抗CD30 mAbであるM44とM67は、ALCL細胞系のKarpas-299の増殖を阻害したものの、T細胞様HD細胞系の増殖をin vitroで増強する一方で、B細胞様HD細胞系に対しては何の効果も示さないことが分かった（Grussら、1994, Blood 83:2045-2056）。
抗体Ki-1とリシンA鎖とのコンジュゲートはイムノトキシンとしての効果がなかった。その原因は、抗体Ki-1の親和性が低いためであると結論づけられた（Engertら、1990, Cancer Research 50:84-88）。Ki-1-リシンA鎖コンジュゲートの毒性が弱いことには、ほかに２つの理由が関係していると考えられる。すなわち、a) 抗体Ki-1は、ホジキン由来細胞系L428およびL540からばかりでなく、CD30+非ホジキンリンパ腫細胞系Karpas 299からもsCD30の放出を高めた（Hansenら、1991, Immunobiol. 183:214）；b) 細胞膜からのKi-1エピトープの距離が比較的遠かったことも、効力のあるイムノトキシンの構築には都合がよくなかった（Pressら、1988, J. Immunol. 141:4410-4417; Mayら、1990, J. Immunol. 144:3637-3642）。
1989年2月にウィーンで開催された「白血球分化抗原」に関する第四回ワークショップで、モノクローナル抗体が３つの異なる研究所により提起され、これらは最終的にCD30グループに属すると決定された。本発明者らによる、L540細胞と現技術水準に従う各種抗体との共培養と、これに続く培養上清液からのsCD30の単離実験から、sCD30の放出は、抗体Ki-1によって最も強く増加し、抗体HeFi-1によって弱く増加する一方で、抗体Ber-H2によっては比較的強く抑制されることが明らかになった。しかしながら、抗体Ber-H2はまた、形質細胞のサブ集団を標識し（Schwartingら、1988, Blood 74:1678-1689）、G. Pallesen (G. Pallesen, 1990, Histopathology 16:409-413)は、411頁で、Ber-H2はホルムアルデヒドにより改変された無関係の抗原のエピトープと交差反応する、と述べている。
当技術分野ではホジキン病を治療または予防するための効力の強い治療薬の必要性が存在している。臨床実験および多数の前臨床評価は、いくつかの非修飾形態の抗CD30 mAbがホジキン病を代表する細胞に対して抗腫瘍活性を示すことを、これまでうまく証明することができなかった。GrussらがmAb Ki-1、M44およびM67を評価する際に利用した条件と同様な条件のもとで、本発明者らは、以前に開示されたものと機能的に区別されるCD30 mAbのクラスを実証する。このクラスの抗CD30 mAbは試験した全てのホジキン細胞系のin vitro増殖を阻害することが可能である。さらに、これらの非修飾mAbはHD腫瘍異種移植片に対してin vivo抗腫瘍活性を保持している。
本明細書に記載または引用される参考文献はいずれも、そうした文献が本発明の先行技術として利用可能であることを容認するものと解釈されるべきでない。
３．発明の概要
本発明は、特定のクラスの抗CD30抗体（このクラスにはAC10およびHeFi-1が含まれる）に関連した新規活性、すなわち、Ｔ細胞様とＢ細胞様の両方のホジキン病（Hodgkin’s Disease: HD）細胞の増殖を抑制するそれらの能力、の驚くべき発見に基づいている。
本発明は、CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合し、かつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質を提供する。本発明はさらに、CD30と免疫特異的に結合し、かつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制または細胞傷害作用を及ぼす抗体を提供する。一般的に、本発明の抗体は、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤とコンジュゲートさせなくとも、ホジキン病細胞系に対して、それぞれ細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすことができる。
本発明はさらに、ホジキン病を治療または予防するのに有効な量で、CD30と免疫特異的に結合しかつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体、および製薬上許容される担体、を被験者に投与することを含んでなり、該抗体が、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、それぞれ細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用をホジキン病細胞系に及ぼすことができる、被験者におけるホジキン病の治療または予防方法を提供する。本発明は、ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合しかつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質、を被験者に投与することを含んでなる、被験者におけるホジキン病の治療または予防方法を提供する。一実施形態において、本発明のタンパク質は細胞傷害性分子とコンジュゲートされる。別の実施形態では、本発明のタンパク質はブリオジン（bryodin）またはプロドラッグ変換酵素のような第２タンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。コンジュゲートや融合タンパク質を含めて、本発明のタンパク質は放射線療法、化学療法、ホルモン療法および／または免疫療法と併用することが可能である。
本発明はさらに、(i) CD30と免疫特異的に結合し、(ii) ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼし、かつ(iii) モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10またはHeFi-1の切断により得られるものでもない抗体を提供する。最も好ましくは、該抗体は、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、それぞれ細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用をホジキン病細胞系に及ぼすことができる。
本発明はさらに、(i) CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合し、(ii) ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼし、かつ(iii) モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10またはHeFi-1の切断により得られるものでもないタンパク質を提供する。最も好ましくは、該タンパク質は、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、それぞれ細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用をホジキン病細胞系に及ぼすことができる。
本発明はさらに、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体AC10ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10の切断により得られるものでもない、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号12、配列番号14、または配列番号16を含んでなるタンパク質を提供する。
本発明はさらに、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体HeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたHeFi-1の切断により得られるものでもない、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号28、配列番号30、または配列番号32を含んでなるタンパク質を提供する。
本発明はさらに、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体AC10ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10の切断により得られるものでもない、配列番号２または配列番号10に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を提供する。
本発明はさらに、ホジキン病の治療または予防に有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体HeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたHeFi-1の切断により得られるものでもない、配列番号18または配列番号26に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を提供する。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、(ii) ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼし、かつ(iii) モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10またはHeFi-1の切断により得られるものでもない抗体、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。最も好ましくは、該抗体は、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、それぞれ細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用をホジキン病細胞系に及ぼすことができる。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合し、(ii) ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼし、かつ(iii) モノクローナル抗体AC10またはHeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10またはHeFi-1の切断により得られるものでもないタンパク質、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体AC10ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10の切断により得られるものでもない、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号12、配列番号14、または配列番号16を含んでなるタンパク質、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体HeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたHeFi-1の切断により得られるものでもない、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号28、配列番号30、または配列番号32を含んでなるタンパク質、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体AC10ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたAC10の切断により得られるものでもない、配列番号２または配列番号10に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、(a) ホジキン病を治療または予防するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) モノクローナル抗体HeFi-1ではなく、また、パパインまたはペプシンを用いたHeFi-1の切断により得られるものでもない、配列番号18または配列番号26に対して少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、および(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態において、本発明のタンパク質または抗体はヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。別の好ましい実施形態では、該タンパク質または抗体が細胞傷害剤にコンジュゲートされている。さらに別の好ましい実施形態では、該タンパク質または抗体が、抗体ではない第２タンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。
本発明のタンパク質（抗体を含む）がホジキン病細胞系に及ぼす細胞増殖抑制作用を測定するには、ホジキン病細胞系の培養物に前記タンパク質を72時間にわたり接触させ（ただし、該培養物は約0.33cm2の培養面積中に約5,000個の細胞を含むものである）；72時間のうち最後の8時間にわたり該培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露し；そして、該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定する。その際、該培養物の細胞による3H-チミジン取り込みが、同一の条件下で培養したが該タンパク質に接触させていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して低下していれば、該タンパク質はホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を有する。本発明のタンパク質の細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を測定するのに適したホジキン病細胞系はL428、L450、HDLM2またはKM-H2である。
本発明のタンパク質が抗体であるとき、該抗体はモノクローナル抗体、好ましくは組換え抗体であり、そして最も好ましくはヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。
本発明はさらに、CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合し、かつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質（抗体を含むが、これに限らない）をコードする単離された核酸を提供する。本発明はさらに、CD30と免疫特異的に結合し、かつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体をコードする核酸の単離方法を提供する。前記核酸によりコードされるタンパク質および抗体も提供する。
本発明はさらに、CD30との結合についてモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1と競合し、かつホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を含む細胞を増殖させて、該タンパク質を該細胞により発現させ、そして発現タンパク質を回収することを含んでなる、タンパク質の産生方法を提供する。
本発明はまた、ホジキン病の治療または予防に有用な抗CD30抗体を同定する方法を提供し、この方法は、ホジキン病細胞系の培養物に前記タンパク質を72時間にわたり接触させ（ただし、該培養物は約0.33cm2の培養面積中に約5,000個の細胞を含むものである）；72時間のうち最後の8時間にわたり該培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露し；そして、該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することにより、該抗CD30抗体がホジキン病細胞系に細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすか否かを判定することを含んでなる。該培養物の細胞による3H-チミジン取り込みが、同一の条件下で培養したが該抗CD30抗体に接触させていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して低下していれば、該抗CD30抗体はホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を有し、ホジキン病の治療または予防に有用である。
４．図面の説明
図１．ホジキン病細胞系の増殖抑制。ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×104細胞／ウェルで10μg/mlの固定化AC10の存在下または不在下に培養した。これらのアッセイにおいてはKi-1を対照として使用した。72時間の培養後の3H-チミジン取り込みにより増殖を測定した。
図２．ホジキン病細胞系の増殖抑制。ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×103細胞／ウェルで10μg/mlの固定化AC10の存在下または不在下に培養した。これらのアッセイにおいてはKi-1を対照として使用した。72時間の培養後の3H-チミジン取り込みにより増殖を測定した。
図３．ホジキン病細胞系の増殖抑制。ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×104細胞／ウェルで0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1（20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加により架橋させてある）の存在下または不在下に培養した。72時間の培養後の3H-チミジン取り込みにより増殖を測定した。
図４．ホジキン病細胞系の増殖抑制。ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×103細胞／ウェルで0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1（20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加により架橋させてある）の存在下または不在下に培養した。72時間の培養後の3H-チミジン取り込みにより増殖を測定した。
図５．散在性(A)および皮下(B)L540cyホジキン病異種移植片におけるAC10（丸）およびHeFi-1（四角）の抗腫瘍活性。A) 0日目に1×107個の細胞を尾静脈からマウスに移植し、q2dx10の投与計画を用いて抗体を1mg/kg/注射で腹腔内注射した。B) 2×107個のL540cy細胞をマウスに皮下移植した。腫瘍が触知できるようになった時点で、AC10またはHeFi-1を2mg/kg/注射q2dx10で腹腔内注射してマウスを処置した。両実験において、未処置のマウス（Ｘ）にはいかなる治療も施さなかった。
図６．キメラAC10発現ベクター。mAb AC10の重鎖可変領域（Vp）をコードするDNAを、ヒトγ１定常領域をコードする配列に連結し、同様にAC10軽鎖可変領域（VL）を別個のクローニングベクター中のヒトκ定常領域に連結した。CHO細胞内でのインタクトなキメラモノクローナル抗体の発現のために、重鎖および軽鎖キメラ配列をプラスミドpDEF14にクローニングした。pDEF14はチャイニーズハムスター延長因子１α遺伝子プロモーターを利用しており、このプロモーターが異種遺伝子の転写を駆動する（米国特許第5,888,809号）。
図７．AC10およびキメラAC10（cAC10）のCD30陽性Karpas-299への結合飽和。細胞を次第に濃度を増加させたAC10またはcAC10と20分間混合し、2% PBS/PBS（染色媒体）で洗浄して遊離のmAbを除去し、それぞれヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCとともにインキュベートした。標識された細胞を染色媒体で再度洗浄し、フローサイトメトリーで検査した。第9.1節で説明するように、得られた平均蛍光強度をmAb濃度に対してプロットした。
図８．キメラAC10（cAC10）によるin vitro増殖阻害。CD30陽性細胞系とCD30陰性細胞系HL-60を5,000細胞／ウェルでプレートした。キメラAC10を表示濃度で、対応して10倍過剰のヤギ抗ヒトIgGの存在下に、添加した。未処理対照ウェルに対する阻害パーセントをcAC10濃度に対してプロットした。
図９．L540cy HD細胞に対するキメラAC10の細胞周期効果。細胞を1pg/mlのcAC10および10pg/mlのヤギ抗ヒト第二抗体で処理した。表示した時間に細胞をBrdUで標識し、透過性にし、抗BrdUで染色して新生DNA合成（下のパネル）を検出し、また、ヨウ化プロピジウムで染色して総DNA含量（上のパネル）を検出した。上のパネルはP1染色によるG1、S期およびG2の含量を示し、下のパネルはBrdU取り込みにより検出された含量およびDNA合成を示す。領域２、５および３はそれぞれG1、S期およびG2を示す。領域４（G2含量より少ないDNAを含み、DNA合成を行っていない）および領域６（G2含量より少ないDNA）はアポトーシスDNA断片化を伴う細胞を示す（Donaldsonら、1997, J. Immunol. Meth. 203:25-33）。
図１０．HDモデルにおけるキメラAC10の効力。(A) SCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病に対するcAC10の抗腫瘍活性。各グループのマウス（１グループにつき５匹）は、腫瘍接種後１日目に開始して１（□）、２（△）または４（●）mg/kgのcAC10（q4dx5）を受け取るか、未処置（ｘ）のままとした。(B) SCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病。各グループのマウス（１グループにつき５匹）は、１日目（□）、５日目（△）または９日目（●）に治療を開始し、q4dx5の計画に従って4mg/kgのcAC10を受け取るか、未処置（ｘ）のままとした。(C) SCIDマウスにおける皮下L540cy HD腫瘍モデル。マウスの右側腹部に2×107個のL540cyホジキン病細胞を移植した。各グループのマウス（１グループにつき５匹）は、各グループ５匹の腫瘍の大きさが平均して約50mm3になったとき開始して、１（□）、２（△）または４（●）mg/kgのキメラAC10（q4dx5）を受け取るか、未処置（ｘ）のままとした。
図１１．皮下L540cyホジキン病異種移植片におけるキメラAC10（cAC10）の抗腫瘍活性。SCIDマウスにL540cy細胞を皮下移植し、腫瘍が平均して150mm3より大きくなったとき、マウスは2mg/kgのcAC10（□）を週２回ずつ５回注射して処置するか、未処置（ｘ）のままとした。
図１２．キメラAC10によるCD30陽性細胞へのAEBの送達。表示した細胞系の細胞を、アウリスタチン(auristatin)Eの誘導体である細胞傷害剤AEBにコンジュゲートさせたキメラAC10（このコンジュゲートは、2001年4月30日出願の米国特許出願第09/845,786号に記載されており、この文献をそのまま本明細書に組み入れるものとする）に曝露した。細胞の生存率（対照に対するパーセント）を投与したcAC10-薬物コンジュゲートの濃度に対してプロットした。
図１３．L540cyホジキン病異種移植片を持担するマウスに対するキメラAC10-AEBコンジュゲートの活性。マウスにL540cy細胞を皮下移植した。アウリスタチンEの誘導体である細胞傷害剤AEBにコンジュゲートさせたキメラAC10を表示量にて40日間隔で合計４回投与した。腫瘍の体積（mm3）を腫瘍移植後の日数に対してプロットした。
５．発明の詳細な説明
本発明は、CD30と結合し、かつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質に関する。本発明はさらに、CD30との結合についてAC10またはHeFi-1と競合し、かつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質に関する。一つの実施形態において、上記タンパク質は抗体である。この実施形態の好ましい態様において、上記抗体はAC10またはHeFi-1であり、最も好ましくはヒト化またはキメラAC10またはHeFi-1である。
本発明はさらに、AC10およびHeFi-1遺伝子によりコードされるタンパク質ならびに該遺伝子のヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、かかるAC10およびHeFi-1タンパク質の断片ならびに他の誘導体および類似体に関する。このような断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲内である。前記タンパク質の生産（例えば、組換え法による）も提供する。
本発明はまた、機能的に活性な（すなわち、CD30への結合を示しかつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすことができる）融合／キメラタンパク質を含めて、AC10およびHeFi-1タンパク質および誘導体に関する。
本発明が意図するCD30に対する抗体には、ヒト、キメラまたはヒト化抗体、ならびに化学療法薬などの細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体が含まれる。
本発明はさらに、本発明のタンパク質または核酸を含む組成物を、単独であるいは細胞傷害剤（化学療法薬を含むが、これに限らない）と組み合わせて、投与することを含んでなる、HDの治療または予防方法に関する。
開示を明瞭にするために、本発明の詳細な説明を以下の小分節に分けて記載することにする。
5.1 本発明のタンパク質
本発明は、CD30と結合し、かつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす、抗体を含むがこれに限らないタンパク質を包含する。本発明はさらに、CD30との結合についてAC10またはHeFi-1と競合し、かつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質に関する。
本発明はさらに、HeFi-1のCDR（配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号28、配列番号30、または配列番号32）、あるいはAC10のCDR（配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号12、配列番号14、または配列番号16）を含んでなる、または、からなるタンパク質を包含する。
本発明はさらに、HeFi-1の可変領域（配列番号18または配列番号26）、あるいはAC10の可変領域（配列番号２または配列番号10）を含んでなる、または、からなるタンパク質を包含する。各配列番号に対応するAC10またはHeFi-1の領域を示す表を以下に提供する。
Figure 0004303964
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本発明はさらに、AC10およびHeFi-1の機能性誘導体または類似体を含んでなる。本発明のペプチドまたはタンパク質に関して本明細書中で用いる「機能性」とは、そのペプチドまたはタンパク質が、1) CD30と結合する能力があり、かつ2) HD細胞に対して細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害作用を及ぼすことを示す。
一般的に、本発明の抗体は、CD30と免疫特異的に結合し、しかもホジキン病の悪性細胞に対して細胞増殖抑制作用および細胞傷害作用を及ぼすものである。本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナルであり、多重特異性のヒト、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、および上記のいずれかのCD30結合性フラグメントであり得る。本明細書中で用いる「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、CD30と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をさす。本発明の免疫グロブリン分子は免疫グロブリン分子のどのようなタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスのものであってもよい。
本発明の特定の実施形態において、抗体は本発明のヒト抗原結合性抗体フラグメントであり、限定するものではないが、Fab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、ならびにVLもしくはVHドメインを含むフラグメントが含まれる。一本鎖抗体をはじめとする抗原結合性抗体フラグメントは、可変領域を単独で、あるいは次のもの：ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメイン、の全体もしくは一部と組み合わせて含むことができる。本発明にはまた、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、CH3およびCLドメインとの任意の組合せを含む抗原結合性フラグメントも含まれる。好ましくは、抗体はヒト、ネズミ（例えば、マウス、ラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリのものである。本明細書中で用いる「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列をもつ抗体が含まれ、後述するような、そしてまた、例えばKucherlapatiらの米国特許第5,939,598号に記載されるような、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、ヒトＢ細胞から、あるいは１以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックの動物から、単離された抗体が含まれる。
本発明の抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性のものでありうる。多重特異性抗体はCD30の異なるエピトープに対して特異的であっても、CD30と異種タンパク質の両方に特異的であってもよい。例えば、PCT公開WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tuttら、1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号；同第4,714,681号；同第4,925,648号；同第5,573,920号；同第5,601,819号；Kostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
本発明の抗体は、それらに含まれる特定のCDRに関して記載し特定することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体はAC10および／またはHeFi-1の１以上のCDRを含む。本発明は、CD30と免疫特異的に結合する重鎖または軽鎖の可変ドメインを含む抗体またはその誘導体を包含し、該可変ドメインは、(a)3つのCDRのセット（該CDRのセットはモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1に由来する）、および(b)4つのフレームワーク領域のセット（該フレームワーク領域のセットはそれぞれモノクローナル抗体AC10またはHeFi-1のフレームワーク領域のセットとは異なる）を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、CD30と免疫特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体を包含し、該可変ドメインは、(a)3つのCDRのセット（該CDRのセットは配列番号４、６または８を含む）、および(b)4つのフレームワーク領域のセット（該フレームワーク領域のセットはモノクローナル抗体AC10のフレームワーク領域のセットとは異なる）を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、CD30と免疫特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体を包含し、該可変ドメインは、(a)3つのCDRのセット（該CDRのセットは配列番号20、22または24を含む）、および(b)4つのフレームワーク領域のセット（該フレームワーク領域のセットはモノクローナル抗体HeFi-1のフレームワーク領域のセットとは異なる）を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、CD30と免疫特異的に結合する軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体を包含し、該可変ドメインは、(a)3つのCDRのセット（該CDRのセットは配列番号12、14または16を含む）、および(b)4つのフレームワーク領域のセット（該フレームワーク領域のセットはモノクローナル抗体AC10のフレームワーク領域のセットとは異なる）を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、CD30と免疫特異的に結合する軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体を包含し、該可変ドメインは、(a)3つのCDRのセット（該CDRのセットは配列番号28、30または32を含む）、および(b)4つのフレームワーク領域のセット（該フレームワーク領域のセットはモノクローナル抗体HeFi-1のフレームワーク領域のセットとは異なる）を含んでなる。
さらに、本発明の抗体はまた、その一次構造に関して記載し特定することができる。AC10またはHeFi-1の可変領域に対して少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の同一性（本明細書中に記載する当技術分野で公知の方法を用いて計算）を有する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体はCD30に対するその結合親和性に関して記載し特定することもできる。好適な結合親和性としては、解離定数またはKdが5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15Mより小さいものが挙げられる。
本発明の抗体には、ある種の分子の抗体への共有結合により修飾されている誘導体が含まれ、この共有結合によって抗体がCD30と結合することまたはHD細胞に対する細胞増殖抑制作用もしくは細胞傷害作用を及ぼすことを妨げられないようにする。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体としては、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾された抗体が含まれる。どのような化学的修飾も公知の方法で行うことができ、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。さらに、抗体誘導体は１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。
本発明の抗体は当技術分野で公知のどのような適当な方法で作製してもよい。CD30に対するポリクローナル抗体は当技術分野で周知のさまざまな方法により生産することができる。例えば、CD30を、ウサギ、マウス、ラットを含むがこれらに限らない各種宿主動物に投与して、このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体を含む血清を生成させる。宿主種に応じて、さまざまなアジュバントを使って免疫応答を高めることができ、こうしたアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（カルメット・ゲランウシ型結核菌）やコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有効なヒトアジュバントが挙げられる。かかるアジュバントも当技術分野で周知である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換え法、ファージディスプレイ法、およびこれらの組合せを含めて、当技術分野で公知のいろいろな方法により作製することができる。例えば、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版, 1988); Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)に記載されるような当技術分野で公知の方法を含むハイブリドーマ法を用いて、モノクローナル抗体を作製する（上記文献を参考としてそのまま組み入れるものとする）。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ法により作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」とは、真核、原核、またはファージクローンなどの単一クローンに由来する抗体をさし、抗体が作製される方法をさすのではない。
ハイブリドーマ法を用いて特異的抗体を作製しスクリーニングする方法はルーチンであって、当技術分野で周知である。非限定的な例として、マウスをCD30またはCD30発現細胞またはその断片もしくは誘導体で免疫する。免疫応答が検出されたら（例えば、CD30に特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら）、マウス脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。次いで、周知の技法により脾細胞を適当なミエローマ細胞（例えば、ATCCから入手可能な細胞系SP20由来の細胞）と融合させる。ハイブリドーマを限界希釈により選択してクローニングする。その後、当技術分野で公知の方法により、CD30と結合できる抗体を分泌する細胞についてハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性のハイブリドーマクローンをマウスに注入することで、一般には高レベルの抗体を含む腹水を生成させる。
したがって、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含んでなるモノクローナル抗体の産生方法、ならびに該方法により得られる抗体を提供する。その際、ハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞をミエローマ細胞と融合させ、次にこの融合から得られたハイブリドーマを、CD30と結合可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより得ることが好ましい。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技法により生成することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab’)2フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントをもたらす）またはペプシン（F(ab’)2フラグメントをもたらす）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子を加水分解することにより得られる。F(ab’)2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含んでいる。
例えば、本発明の抗体は当技術分野で公知の各種ファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインを、それをコードする核酸配列を保有するファージ粒子の表面に展示させる。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを展示させるために利用される。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードする核酸配列を担うファージ粒子の表面に展示される。詳細には、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を動物cDNAライブラリー（例えば、リンパ様組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー）から増幅する。VHおよびVLドメインをコードするDNAをscFvリンカーによりPCRで再結合し、ファージミドベクター（例えば、pCANTAB 6またはpComb 3 HSS）にクローニングする。そのベクターを大腸菌にエレクトロポレーションで導入し、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。こうした方法に用いるファージは典型的には、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質に組換えにより融合されたFab、Fv、またはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインと共にファージから発現されるfdおよびM13結合ドメインを含む繊維状ファージである。CD30またはそのAC10もしくはHeFi-1結合性部分に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識した抗原または固相表面やビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて、選択し同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用しうるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら、1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesら、1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persicら、1997, Gene 187:9-18; Burtonら、1994, Advances in Immunology, 191-280; PCT出願番号PCT/GB91/01 134; PCT公開WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；および米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5,969,108号に記載されているものがある（上記の各文献を参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。
上記文献に記載されるように、ファージの選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、ヒト抗体をはじめとする全抗体または他の所望の抗原結合性フラグメントを作製するために使用し、そして以下で詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌などの所望の宿主内で発現させる。例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)2フラグメントを組換え的に作製する方法は、PCT公開WO92/22324；Mullinaxら、BioTechniques 1992, 12(6):864-869；およびSawaiら、1995, AJRI 34:26-34；およびBetterら、1988, Science 240:1041-1043に記載される方法など、当技術分野で公知の方法を用いて、利用することもできる（上記の各文献を参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。
一本鎖Fvおよび抗体を作製するために使用できる技法の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号；Hustonら、1991, Methods in Enzymology 203:46-88；Shuら、1993, PNAS 90:7995-7999；ならびにSkerraら、1988, Science 240:1038-1040に記載される方法がある。ヒトでの抗体のin vivo使用や、in vitro増殖または細胞傷害アッセイなど、いくつかの用途では、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を使用するほうが好ましい。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域をもつ抗体のように、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrisonら、Science, 1985, 229:1202；Oiら、1986, BioTechniques 4:214；Gilliesら、1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第5,807,715号；同第4,816,567号；および同第4,816,397号を参照されたい（上記の各文献を参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上のCDRとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワークおよび定常領域をもつ、所望の抗原と結合する抗体のような、非ヒト種由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変する（好ましくは、改善する）ためにCDR提供抗体からの対応残基で置換されるだろう。こうしたフレームワーク置換は、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングならびに特定位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により、当技術分野で周知の方法を用いて同定される。Queenら、米国特許第5,585,089号；Riechmannら、1988, Nature 332:323を参照されたい（参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。抗体をヒト化するには、例えば、CDRグラフティング（EP239,400；PCT公開WO91/09967；米国特許第5,225,539号；第5,530,101号；および第5,585,089号）、ベニアーリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)（EP592,106；EP519,596；Padlan, Molecular Immunology, 1991, 28(4/5):489-498；Studnickaら、1994, Protein Engineering 7(6):805-814；Roguskaら、1994, PNAS 91:969-973）、およびチェーンシャフリング(chain shuffling)（米国特許第5,565,332号）を含めて、当技術分野で知られた各種方法を使用することができる。
ヒト患者の治療処置には完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法などの当技術分野で公知の各種方法により作製することができる。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号；ならびにPCT公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741も参照されたい（上記の各文献を参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。
ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムにまたは相同的組換えによりマウス胚性幹細胞に導入する。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々にまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座の相同的組換えによる導入と同時に非機能性にする。特に、JH領域のホモ接合欠失により内因的抗体産生が妨げられる。改変した胚性幹細胞を増やし、胚盤胞にマイクロインジェクションで導入してキメラマウスを作製する。その後、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を得る。トランスジェニックマウスを通常のやり方で所定の抗原（例えば、CD30の全部または一部）により免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫したトランスジェニックマウスから従来のハイブリドーマ技法を使って得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の間に再配列し、続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技法を用いると、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生産することが可能である。ヒト抗体を生産するための上記技法の概要については、LonbergおよびHuszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の上記生産方法、ならびにそのような抗体の生産プロトコルの詳細については、例えば、PCT公開WO98/24893、WO92/01047、WO96/34096、WO96/33735、ヨーロッパ特許第0598877号；米国特許第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；第5,885,793号；第5,916,771号；および第5,939,598号を参照されたい（上記の各文献を参考としてそのまま本明細書に組み入れるものとする）。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)やGenpharm (San Jose, CA)のような会社は、上記と同様の技法を用いて、所定の抗原に対するヒト抗体を提供している
。
所定のエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」(guided selection)と称される技法を用いて作製することができる。この方法では、所定の非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Jespersら、1994, Bio/Technology 12:899-903）。
さらに、CD30に対する抗体を利用して、本発明のタンパク質を「まねた」抗イディオタイプ抗体を当業者に周知の技法により生成することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438を参照されたい）。そのような抗イディオタイプのFabフラグメントを治療計画において使用して、CD30およびHD細胞に対する個体自身の免疫応答を引き出すことができる。
上で触れたように、ホジキン病に対して治療上または予防上有用なタンパク質は抗体である必要はない。したがって、本発明のタンパク質はCD30と結合しかつHD細胞に細胞傷害および／または細胞増殖抑制作用を及ぼす抗体からの１以上のCDRを含んでいてもよい。好ましくは、本発明のタンパク質は多量体であり、最も好ましくは二量体である。
本発明はまた、競合結合を測定するための当技術分野で公知の方法（例えば、本明細書に記載するイムノアッセイ）により判定して、AC10またはHeFi-1のCD30への結合を競合的に阻害するタンパク質（抗体を含むが、これに限らない）を提供する。好ましい実施形態において、該タンパク質はAC10またはHeFi-1のCD30への結合を50％以上、より好ましくは60％以上、より一層好ましくは70％以上、最も好ましくは75％以上競合的に阻害する。他の実施形態では、該タンパク質はAC10またはHeFi-1のCD30への結合を80％以上、85％以上、90％以上、または95％以上競合的に阻害する。
以下でより詳細に述べるように、本発明のタンパク質はHDの予防または治療において単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。さらに、該タンパク質は、そのN-またはC-末端で異種タンパク質と組換え的に融合させたり、細胞傷害剤、タンパク質もしくは他の組成物と化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションを含む）させたりしてもよい。例えば、本発明の抗体は、化学療法薬または毒素として有用な分子に組換え的に融合またはコンジュゲートさせたり、放射線療法薬として使用するために放射性核種を含んでいてもよい。例えば、PCT公開WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624；米国特許第5,314,995号；およびEP396,387を参照されたい。
本発明のタンパク質は、本発明の抗体の１以上のCDRのコード領域を、読み枠を合わせて、異種タンパク質のコード配列に融合させることにより組換え的に生産することができる。異種タンパク質は１以上の次の特徴を提供しうる：治療効果を追加する；本発明のタンパク質の安定した発現を促進する；本発明のタンパク質の高い組換え発現率を促進する手段を提供する；または多量体化ドメインを提供する。
本発明の抗体の１以上のCDRを含むタンパク質に加えて、本発明のタンパク質はタンパク質−タンパク質相互作用をスクリーニングするのに適した方法を用いて同定することができる。初めに、CD30と結合するタンパク質を同定し、次いでHD細胞に細胞増殖抑制または細胞傷害作用を及ぼすその能力を調べる。使用できる伝統的な方法の中に、上記λgt11ライブラリーの抗体プロービングの技法と類似した方法で発現ライブラリーを標識CD30によりプロービングすることを伴う「相互作用クローニング」法がある。限定ではなく一例として、これは次のように行うことができる。すなわち、CD30（またはそのAC10もしくはHeFi-1結合ドメイン）をコードするcDNAクローンを心筋キナーゼ（HMK）のためのリン酸化部位を挿入することにより改変する（Blanar & Rutter, 1992, Science 256:1014-1018）。この組換えタンパク質を大腸菌において発現させてGDPアフィニティーカラムで均一になるまで精製し（Ederyら、1988, Gene 74:517-525）、γ32P-ATPとウシ心筋キナーゼ（Sigma）を用いて１×108cpm/μgの比活性へと標識し、これを用いてヒト胎盤λgt11 cDNAライブラリーを「ファーウェスタンアッセイ」（far-Western assay）でスクリーニングする（Blanar & Rutter, 1992, Science 256:1014-1018）。CD30と相互作用するプラークを単離する。陽性λプラークのcDNA挿入物を分離し、pBluescript KS (Stratagene)のような配列決定用のベクターにサブクローニングする。
タンパク質相互作用をin vivoで検出する一つの方法として、ツーハイブリッドシステムを、限定ではなく単なる例として詳述する。このシステムの１バージョンが記載されており（Chienら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）、Clontech（Palo Alto, CA）から販売されている。
簡単に述べると、このようなシステムを利用して、２つのハイブリッドタンパク質（一方はCD30に融合された転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインからなり、他方はcDNAライブラリーの一部としてこのプラスミドに組換えられているcDNAによりコードされる未知のタンパク質に融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる）をコードするプラスミドを構築する。該プラスミドを、レポーター遺伝子（例えば、lacZ）（その調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含む）を含む酵母 Saccharomyces cerevisiaeの菌株にトランスフォームする。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化することができない（DNA結合ドメインハイブリッドが活性化機能を提供できないためであり、また、活性化ドメインハイブリッドがアクチベーターの結合部位に局在できないためである）。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用により、機能性アクチベータータンパク質が再構成されてレポーター遺伝子の発現をもたらし、レポーター遺伝子産物のアッセイにより検出する。
ツーハイブリッドシステムまたは関連の方法論を用いて、CD30（この場合には「ベイト」遺伝子産物である）と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニングすることができる。全ゲノムまたはcDNA配列を、活性化ドメインをコードするDNAに融合させる。このライブラリーと、DNA結合ドメインに融合させたCD30コード領域（例えば、HeFi-1またはAC10と相互作用することが知られているCD30のドメインをコードするヌクレオチド配列）のハイブリッドをコードするプラスミドを、酵母レポーター株に同時トランスフォームし、得られる形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、限定するものではないが、CD30コード領域がGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNAに翻訳可能に融合されるようなベクターにCD30コード領域をクローニングすることが可能である。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子の発現を招いたライブラリープラスミドを単離する。その後、DNA配列決定を用いて、該ライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質を同定する。
CD30結合タンパク質が同定されたら、L428、L450、HDLM2またはKM-H2などのHD細胞系の培養物に該タンパク質を接触させることにより、HD細胞に細胞増殖抑制または細胞傷害作用を及ぼすその能力（単独で、あるいは多量体化させて、または二量体化もしくは多量体化ドメインに融合させて）を調べる。培養条件は最も好ましくは、約0.33cm2の培養面積中に約5,000個の細胞とし、培養時間は約72時間とする。その後、培養物を72時間のうち最後の8時間にわたり0.5μCiの3H-チミジンに曝露し、該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定する。該培養物の細胞による3H-チミジン取り込みが、同一の条件下で培養したが該タンパク質に接触させていない同一の細胞系の細胞と比較して低下していれば、該タンパク質はHD細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を有する。
作用機序について限定することなく、本発明のタンパク質は２以上のCD30結合部位を有し、それゆえにCD30分子を架橋する能力を備えていることが好ましい。CD30と結合するか、またはCD30との結合についてAC10またはHeFi-1と競合するタンパク質は、二量体化または多量体化されると、HD細胞に対する細胞増殖抑制または細胞傷害作用を引き出す能力を獲得しうる。CD30結合タンパク質が単量体のタンパク質である場合には、それをタンデムで発現させることができ、それによって複数のCD30結合部位を含むタンパク質が得られる。CD30結合部位をフレキシブルなリンカー領域で分離してもよい。別の実施形態では、CD30結合タンパク質を、投与に先立って、例えばグルタルアルデヒドを用いて、化学的に架橋することができる。好ましい実施形態においては、CD30結合領域を異種タンパク質と融合させる。その際、異種タンパク質は二量体化および多量体化ドメインを含む。HDの治療または予防のために本発明のタンパク質を被験者に投与する前に、該タンパク質をホモ二量体またはへテロ二量体の形成を可能にする条件に付す。本明細書中で用いるヘテロ二量体は、同一の二量体化ドメインを含むが異なるCD30結合領域を含むもの、同一のCD30結合領域を含むが異なる二量体化ドメインを含むもの、または異なるCD30結合領域と二量体化ドメインを含むものでありうる。
特に好ましい二量体化ドメインは転写因子に由来するものである。
一つの実施形態において、二量体化ドメインは塩基性領域ロイシンジッパー（「bZIP」）のものである。bZIPタンパク質は２つのドメインをもつことを特徴とし、すなわち、「フォーク」(fork)ドメインにより分離された、ロイシンジッパー構造ドメインと塩基性アミノ酸に富む塩基性ドメインである（C. Vinsonら、1989, Science, 246:911-916）。２つのbZIPタンパク質はコイルドコイル領域を形成することによって二量体化し、その際、ロイシンジッパードメインが二量体化する。したがって、これらのコイルドコイル領域を本発明のタンパク質の融合パートナーとして使用することができる。
特に有用なロイシンジッパードメインは、酵母転写因子GCN4、哺乳動物転写因子CCAAT/エンハンサー結合タンパク質C/EBP、ならびに癌遺伝子産物FosおよびJunにおける核トランスフォームのものである（Landschultzら、1988, Science 240: 1759-1764; BaxevanisおよびVinson, 1993, Curr. Op. Gen. Devel., 3:278-285;ならびにO’Sheaら、1989, Science, 243:538-542を参照されたい）。
別の実施形態では、二量体化ドメインは塩基性領域ヘリックス・ループ・ヘリックス（「bHLH」）タンパク質のものである（Murreら、1989, Cell, 56:777-783）。bHLHタンパク質もまた、分離しているドメインから構成され、その構造により該ドメインはこれらDNA配列を認識してそれと相互作用することが可能である。ヘリックス・ループ・ヘリックス領域は、bZIPタンパク質のロイシンジッパー領域と同様の方法で、その両親媒性ヘリックスを介して二量体化を促進する（Davisら、1990 Cell, 60:733-746; VoronovaおよびBaltimore, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4722-4726を参照されたい）。特に有用なhHLHタンパク質はmyc、maxおよびmacである。
ヘテロ二量体は、FosとJun間（Bohmannら、1987, Science, 238:1386-1392）、ATF/CREBファミリーのメンバー間（Haiら、1989, Genes Dev., 3:2083-2090）、C/EBPファミリーのメンバー間（Caoら、1991, Genes Dev., 5:1538-1552; Williamsら、1991, Genes Dev., 5:1553-1567；およびRomanら、1990, Genes Dev., 4:1404-1415）、ならびに、ATF/CREBおよびFos/Junファミリーのメンバー間（HaiおよびCurran, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3720-3724）で形成されることが知られている。したがって、本発明のタンパク質を、異なる二量体化ドメインを含むヘテロ二量体として被験者に投与する場合、上記のものの任意の組合せを使用することができる。
５．２ 結合アッセイ
上述のように、本発明の抗体などのタンパク質はCD30に結合して、HD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす。本発明のタンパク質のCD30への結合能力を証明する方法について、以下に記載する。
本発明の抗体は、当分野で知られたいずれかの方法によって、CD30への免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイとして、限定するわけではないが、以下に一部を列挙するような技法を使用する競合および非競合アッセイ系が含まれる：ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイ。こうしたアッセイは慣用のものであり、当分野で周知である（例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York、を参照されたい。この全部を参照により本明細書に組み入れる）。限定する意図はないが、代表的なイムノアッセイについて以下に簡単に記載する。
免疫沈降プロトコルは一般的に以下の操作を含む：タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインイビター（例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したRIPAバッファー（1％NP-40もしくはTriton X-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH 7.2、1％Trasylol）などの溶解バッファー中での細胞集団の溶解；細胞溶解物への抗体の添加；40℃で一定期間（例えば1〜4時間）のインキュベート；細胞溶解物へのプロテインAおよび／またはプロテインGセファロースビーズの添加；40℃で約１時間以上のインキュベート；溶解バッファー中でのビーズの洗浄；ならびにSDS／サンプルバッファーへのビーズの再懸濁。抗体がCD30を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者であれば、抗体のCD30への結合を増加させ、またバックグラウンド値を減少させるために改変することができるパラメーターについて精通しているはずである（例えばセファロースビーズによって細胞溶解物を事前に清澄化する）。免疫沈降プロトコルについてのこれ以上の説明については、例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York,10.16.1、を参照されたい。
ウエスタンブロット分析は一般的に以下の操作を含む：タンパク質サンプルの調製；ポリアクリルアミドゲル（抗原の分子量に応じて例えば8％〜20％ SDS-PAGE）中でのタンパク質サンプルの電気泳動；タンパク質のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF、もしくはナイロンなどの膜への移行；ブロッキング液（例えば3％BSAもしくは脱脂乳を含むPBS）中での膜のインキュベート；洗浄バ ッファー（例えばPBS-Tween20）での膜の洗浄；ブロッキングバッファーで希釈した 一次抗体（すなわち推定上の抗CD30抗体）での膜のブロッキング；洗浄バッファーでの膜の洗浄；ブロッキングバッファーで希釈した酵素基剤（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば32Pもしくは125I）とコンジュゲートさせた二次抗体（一次抗体を認識するもの、例えば抗ヒト抗体）と膜とのインキュベート；洗浄バッファーでの膜の洗浄；ならびに二次抗体の存在の検出。当業者であれば、検出されるシグナルを増加させ、またバックグラウンドノイズを減少させるために改変することができるパラメーターについて精通しているはずである。ウエスタンブロットについてのこれ以上の説明については、例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.8.1、を参照されたい。
ELISAは以下の操作を含む：抗原（すなわちCD30）の調製；96ウェルマイクロタイタープレートのウェルのCD30によるコーティング；酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物とコンジュゲートさせた抗体のウェルへの添加および一定時間のインキュベート；ならびに抗体の存在の検出。ELISAでは、抗体は検出可能な化合物とコンジュゲートされていなくてもよい。代わりに、検出可能な化合物とコンジュゲートさせた（目的の抗体を認識する）第２抗体をウェルに添加する。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な化合物とコンジュゲートさせた第２抗体は、コーティングしたウェルへのCD30タンパク質の添加後に添加する。当業者であれば、検出されるシグナルを増加させるために改変することができるパラメーター、ならびに当分野で公知のその他のELISAの変法について精通しているはずである。ELISAについてのこれ以上の説明については、例えば、Ausubelら編、1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York,11.2.1、を参照されたい。
抗体のCD30との結合親和性および抗体−CD30相互作用のオフレート(off-rate)は、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの１例は、標識CD30（例えば3Hもしくは125I）と目的の抗体との非標識CD30の量を増加させながらのインキュベート、ならびに標識CD30に結合した抗体の検出を含む、ラジオイムノアッセイである。その後、Scatchardプロット分析によるデータから、抗体のCD30に対する親和性および結合オフレートを決定することができる。第２抗体（AC10もしくはHeFi-1など）との競合も、ラジオイムノアッセイを使用して判定することができる。この場合、標識化合物（例えば3Hもしくは125I）とコンジュゲートさせた目的の抗体とCD30とを、非標識第２抗体の量を増加させながらインキュベートする。
本発明のタンパク質は、当分野で知られている標準的アッセイによって、CD30に結合するその能力についてアッセイすることもできる。こうしたアッセイとして、酵母ツーハイブリッドシステムが含まれる。これらのアッセイは上記第5.2節に記載されている。上述のファーウエスタン技法についての別の変法には、ウエスタンブロットでの標識候補タンパク質のCD30への結合能の測定が必要である。ファーウエスタンブロットの限定するわけではない１例では、目的のCD30もしくはその断片を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）およびプロテインセリン／トレオニンキナーゼ認識部位（cAMP依存性キナーゼ認識部位など）をさらに含む融合タンパク質として発現させる。その融合タンパク質は、グルタチオン-セファロースビーズ（Pharmacia Biotech）上で精製し、ウシ心臓キナーゼ（Sigma）および100μCiの 32P-ATP（Amersham）で標識する。目的の試験タンパク質はSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットした後、標識CD30とともにインキュベートする。その後、膜を洗浄し、放射活性を定量する。逆に、目的のタンパク質を同一の方法で標識し、CD30がブロットされているニトロセルロース膜をプローブするのに使用してもよい。
５．３ 細胞傷害活性および細胞増殖抑制活性のアッセイ
定義によると、本発明のタンパク質はHDの細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすものでなければならない。この目的のために好適なHD細胞系として、L428、L450、HDLM2およびKM-H2が含まれる（これらのすべてが German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DMSZ：Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手可能である）。
あるタンパク質が細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすかどうかを判定する多くの方法が当業者に知られており、これらを使用してある特定のタンパク質が本発明のタンパク質であるかどうかを解明することができる。こうした方法の例示を以下に記載する。
CD30に結合するタンパク質がHDに対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を発揮しない場合は、上記第5.1節に記載した方法にしたがって、そのタンパク質を多量体化し、その多量体について、HD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす能力をアッセイすることができる。
あるタンパク質について (ｉ)CD30に結合することと、 (ii)HD細胞に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすことの両方が同定された後、下記第６節に記載するように、モデル動物においてその治療上の価値が評価される。
好ましい実施形態では、あるタンパク質があるHD細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすかどうかの判定は、培養面積約0.33cm2中5,000個のHD細胞系細胞の培養物とそのタンパク質とを72時間接触させることによって実施することができる。72時間のうち最後の８時間にわたり、培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露する。次に、培養物の細胞中への3H-チミジンの取り込みを測定する。タンパク質と接触させた培養物の細胞の方が、抗CD30抗体と接触させない以外は同一条件で培養した同一のHD細胞系の細胞に比較して、3H-チミジンの取り込みが低下したならば、このタンパク質はHD細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼし、HDの治療または予防に有用である。
多数の細胞傷害作用のアッセイが当業者に知られている。これらのアッセイのいくつかは壊死を測定し、その他ではアポトーシス（プログラムされた細胞死）が測定される。壊死には原形質膜の透過性の増大が伴い、その細胞は膨潤して原形質膜が数分以内で破裂する。一方、アポトーシスは膜の水疱形成(blebbing)、細胞質の濃縮および内因性エンドヌクレアーゼの活性化に特徴がある。HD細胞に対するこれらの効果の１つがあれば、あるCD30結合性タンパク質がHDの治療または予防に有用であることを示すのに十分であって、上記の細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を測定するアッセイの代替法となる。
ある実施形態において、細胞はニュートラルレッド、トリパンブルーまたはALAMARTMブルーなどの色素を取り込む能力または不能性によって壊死が測定された（Pageら、1993, Intl.J. of Oncology 3:473-476）。このようなアッセイでは、細胞を色素含有培地中でインキュベートし、その細胞を洗浄し、色素の細胞内取り込みを反映している残存色素を分光光度測定によって測定する。
別の実施形態では、色素はスルホローダミンB（SRB）であり、タンパク質へのこの結合を細胞傷害性の尺度として使用することができる（Skehanら、1990, J.Nat'l Cancer Inst.82:1107-12）。
さらに別の実施形態では、MTTなどのテトラゾリウム塩が、生細胞（死んではいない）を検出することによる哺乳動物細胞の生存および増殖の定量比色アッセイで使用される（例えば、Mosmann, 1983, J.Immunol.Methods 65:55-63、参照）。
さらに別の実施形態では、培養物の付着区画と「浮遊」区画の両方でアポトーシス細胞を測定する。両区画は、上清を除去し、付着細胞をトリプシン消化し、遠心洗浄ステップ（2000 rpmで10分）後に両調製物を一緒にすることによって、回収する。相当量のアポトーシスを取得するために腫瘍細胞培養物をスリンダック（sulindac）および関連化合物で処理するプロトコルは、文献に記載されている（例えば、Piazzaら、1995, Cancer Research 55:3110-16参照）。この方法の特徴として、浮遊および付着細胞の両方を回収し、アポトーシスを観測するための最適の処理時間および用量範囲を確定し、そして最適細胞培養条件を確定することが含まれる。
さらに別の実施形態では、DNA断片化を測定することによって、アポトーシスを定量する。DNA断片化のin vitro定量測定のための市販品による分光測定法が利用可能である。TUNEL（断片化DNA中の標識ヌクレオチドの取り込みを検出するもの）およびELISAを基礎とするアッセイを含む、こうした方法の例が、Biochemica, 1999, no.2, pp.34-37（Roche Molecular Biochemicals）に記載されている。
さらに別の実施形態では、アポトーシスを形態学的に観察することができる。試験タンパク質もしくは核酸での処理に続いて、培養物をアクリジンオレンジおよび臭化エチジウムで標識した後、蛍光顕微鏡法によって、アポトーシスおよび壊死についてアッセイすることができる。アポトーシス細胞数の測定方法は、Duke & Cohen, 1992, Current Protocols In Immunology, Coliganら編、3.17.1-3.17.16、にすでに記載されている。この実施形態の別の様式では、細胞をDNA染料のヨウ化プロピジウムで標識し、内部核膜に沿ったクロマチンの凝集および有縁化、細胞質の凝縮、膜の水疱形成の増加、ならびに細胞の収縮などの形態学的変化について、細胞を観察することができる。
さらに別の実施形態では、ブロモデオキシウリジンの取り込み速度を測定することによって、細胞傷害作用および／または細胞増殖抑制作用を判定することができる。細胞は、試験タンパク質もしくは核酸を含む完全培地で培養される。新生DNA合成を検出するためにブロモデオキシウリジンで、また総DNA含量を検出するためにヨウ化プロピジウムで、別々の時間に細胞を標識する。標識した細胞は、既報（Donaldsonら、1997, J.Immunol.Meth.203:25-33）のようにBecton-Dickinson Cellfitプログラムを使用して、フローサイトメトリーによって、細胞周期段階について分析される。本発明の抗CD30抗体の細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害作用を判定するためのブロモデオキシウリジンの取り込みの使用の例について、下記第９節に記載する。
５．４ 本発明の核酸
本発明はさらに、限定するわけではないが本発明のタンパク質およびそのフラグメントなどの、タンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は好ましくは、CD30に結合してHD細胞に対して細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を及ぼす抗体の１以上のCDRをコードする。本発明の代表的な核酸として以下のものが含まれる：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29または配列番号31。本発明の好ましい核酸として、配列番号１、配列番号９、配列番号17または配列番号25が含まれる（これらの配列番号に対応している、AC10またはHeFi-1のドメインの確認については、上記の表１を参照されたい）。
本発明は、本発明の核酸、好ましくは本発明の抗体をコードする核酸に、ストリンジェント、中度もしくは低度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸をも包含する。
限定するわけではない例示であるが、90ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション領域のためのこうした低度ストリンジェント条件を使用する手法として以下のものがある（Shilo and Weinberg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78,:6789-6792、も参照されたい）。35％ホルムアミド、5X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中、40℃で6時間、DNAを含むフィルターを前処理する。以下のように改変した同一の溶液中でハイブリダイゼーションを実施する：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％(wt/vol)硫酸デキストラン、そして5〜20 X 106 cpm 32P-標識プローブを使用する。フィルターは、ハイブリダイゼーション混合液中、40℃で18〜20時間インキュベートした後、2X SSC、25 mM Tris-HCl(pH 7.4)、5 mM EDTAおよび0.1％SDSを含有する溶液中、55℃で1.5時間洗浄する。洗浄液を新しい溶液と交換して、60℃でさらに1.5時間インキュベートする。フィルターを吸水して乾燥させ、オートラジオグラフィーのために感光させる。必要ならば、フィルターを65〜68℃で3回目の洗浄にかけ、フィルムに再感光させる。使用可能なその他の低度ストリンジェント条件は当分野で周知である（例えば交差種ハイブリダイゼーションに利用されるものなど）。
また、限定するわけではない例示であるが、90ヌクレオチドを超えるハイブリダイゼーション領域のためのこうした高度ストリンジェント条件を使用する手法として以下のものがある。6X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含むバッファー中、65℃で8時間から一晩、DNAを含むフィルターの前処理を実施する。100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20 X106 cpm 32P-標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中、65℃で48時間、フィルターをハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.01％ PVP、0.01％ Ficollおよび0.01％ BSAを含有する溶液中、37℃で1時間実施する。これに続いて0.1X SSC中、50℃で45分洗浄した後、オートラジオグラフィーにかける。
使用可能なその他の高度ストリンジェント条件は核酸の特性（例えば長さ、GC含量など）およびハイブリダイゼーションの目的（検出、増幅その他）如何によるもので、当分野で周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）での約15〜40塩基の核酸の相補的配列へのストリンジェントハイブリダイゼーションは、以下の条件下で実施される：50 mM KClの塩濃度、10 mM Tris-HClのバッファー濃度、1.5 mMのMg2+濃度、pH 7〜7.5、およびアニーリング温度 55〜60℃。
別の特定の実施形態では、中度ストリンジェント条件下で本発明の核酸またはその相補体にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。こうしたストリンジェンシーのための適切な条件の選択は当分野で周知である（例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい；また、Ausubelら編、実験技術マニュアルのCurrent Protocols in Molecular Biologyシリーズ, 1987-1997中、Current Protocols, 1994-1997 John Wiley & Sons, Inc.も参照されたい）。
当分野のどの方法によっても、本発明の核酸を取得することができ、またその核酸のヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、タンパク質のヌクレオチド配列が既知ならば、（例えば、Kutmeierら、1994, BioTechniques 17:242、に記載されたようにして）化学的に合成したオリゴヌクレオチドから、その抗体をコードする核酸を組み立てることができる。これを簡単に述べると、そのタンパク質をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、その後のPCRによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を必要とする。
あるいは、本発明のタンパク質をコードする核酸を好適な起源の核酸から作製することができる。特定のタンパク質をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、そのタンパク質分子の配列が既知である場合は、そのタンパク質をコードする核酸を化学的に合成するか、あるいは好適な起源（例えば抗体cDNAライブラリーなどのcDNAライブラリー、あるいはそのタンパク質を発現する任意の組織もしくは細胞から作製したcDNAライブラリー、またはそれらから単離した核酸、好ましくはポリA＋RNA。そのタンパク質が抗体の場合、ライブラリー起源は本発明の抗体を発現するものとして選択されたハイブリドーマ細胞とすることができる）から取得することができる。その方法は、その配列の3'および5'末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するPCR増幅によるか、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングして、例えばそのタンパク質をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンを同定することによる。その後、PCRにより生成された増幅核酸を、当分野で周知の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
抗体の核酸配列および対応するアミノ酸配列が決定されたら、当分野で周知の核酸配列の操作法、例えば組換えDNA法、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを使用して、そのタンパク質のヌクレオチド配列を操作し（例えば、Sambrookら、1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編、1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY、を参照されたい。この両者の全部を参照により本明細書に組み入れる）、例えばアミノ酸の置換、欠失および／または挿入をして、異なるアミノ酸配列をもつ抗体を作製することができる。
特定の実施形態において、そのタンパク質は抗体であり、その重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、当分野で周知の方法によって精査して、CDRの配列を同定することができる。例えば別の重鎖および軽鎖可変ドメインの既知のアミノ酸配列と比較するなどによって、配列超可変領域を決定することができる。慣用の組換えDNA技法を使用して、フレームワーク領域、例えばヒトフレームワーク領域内に、１以上のCDRを挿入して、上記のように、非ヒト抗体をヒト化することができる。そのフレームワーク領域は天然のまたは共通のフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えばChothiaら、1998, J.Mol.Biol.278:457-479、を参照されたい）。フレームワーク領域とCDRの組合せによって作製された核酸は、CD30に特異的に結合し、かつHD細胞に対して細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害作用を及ぼす抗体をコードする。好ましくは、上記のように、フレームワーク領域内に１以上のアミノ酸置換を実施し、そのアミノ酸置換によって抗体のCD30への結合が改善され、かつ／また、抗体の細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害性作用が強化されることが好ましい。その上、こうした方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関わる１以上の可変領域内システイン残基のアミノ酸置換または欠失を実施することによって、１以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成させることができる。核酸に対するその他の変更も本発明に包含され、当分野の技量の範囲内である。
さらに、「キメラ抗体」の製造のために開発された技法を使用することができる（Morrisonら、1984, Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neubergerら、1984, Nature 312:604-608；Takedaら、1985, Nature 314:452-454）。これは、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とを、切り継ぐものである。上記のように、キメラ抗体とは、マウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域をもつもの（例えばヒト化抗体）などの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子のことである。
あるいは、一本鎖抗体の製造について記載された技法（米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423-42：Hustonら、1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；およびWardら、1989, Nature 334:544-54）を応用して、一本鎖抗体を製造することができる 。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結して、結果的に一本鎖タンパク質とすることによって、形成される。E.coli中の機能性Fvフラグメントの組み立てのための技術を使用してもよい（Skerraら、1988, Scence 242:1038-1041）。
５．５ AC10およびHeFi-1に関係する配列
本発明はさらに、それぞれAC10およびHeFi-1のCDRに相同な領域、またはそのためのコード領域を含む、タンパク質および核酸を包含する。多様な実施形態の中で、相同な領域とは、対応するAC10またはHeFi-1の領域と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％の同一性があることを特徴とする。
ある実施形態では、本発明はHeFi-1のCDRに相同な領域をもつタンパク質を提供する（配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号28、配列番号30または配列番号32）。別の実施形態では、本発明はAC10のCDRに相同な領域をもつタンパク質を提供する（配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号12、配列番号14または配列番号16）。
別の実施形態では、本発明はHeFi-1のCDRコード領域に相同な領域をもつ核酸を提供する（配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29または配列番号31）。別の実施形態では、本発明はAC10のCDRコード領域に相同な領域をもつ核酸を提供する（配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号11、配列番号13、配列番号15）。
本発明はさらに、それぞれAC10およびHeFi-1の可変領域に相同な領域またはそのコード領域を含む、タンパク質および核酸を包含する。多様な実施形態の中で、相同な領域とは、対応するAC10またはHeFi-1の領域と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％の同一性があることを特徴とする。
ある実施形態において、本発明はHeFi-1の可変領域に相同な領域をもつタンパク質を提供する（配列番号18または配列番号26）。別の実施形態では、本発明はAC10の可変領域に相同な領域をもつタンパク質を提供する（配列番号２または配列番号10）。
ある実施形態では、本発明はHeFi-1の可変領域をコードする領域に相同な領域をもつ核酸を提供する（配列番号17または配列番号25）。別の実施形態では、本発明はAC10の可変領域をコードする領域に相同な領域をもつ核酸を提供する（配列番号１または 配列番号９）。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列、例えばAC10もしくはHeFi-1可変領域の配列とAC10もしくはHeFi-1可変領域に相同な領域をもつ別のタンパク質からの配列の間、の同一性％を決定するために、配列を最適比較目的でアラインメントする（例えば、第１アミノ酸もしくは核酸配列の配列中に、第２アミノ酸もしくは核酸配列との最適アラインメントとなるように、ギャップを導入することができる）。次に、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置で比較する。第１配列のある位置が第２配列の対応する位置で同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドで占められているならば、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性％はそれらの配列に共通する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の合計数(例えば重複位置)ｘ100）。ある実施形態では、２つの配列が同一の長さである。
２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの、限定するわけではない好ましい例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268に記載のアルゴリズムを、Karlin and Altschul, 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877に記載のように改変したアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムをAltschulら、1990, J.Mol.Biol.215:403-410に記載のNBLASTおよびXBLASTプログラムに取り入れる。NBLASTプログラムでスコア＝100、ワード長＝12として、BLASTヌクレオチド検索を実施して、SCA-1モディファイアータンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLASTプログラムでスコア＝50、ワード長＝3として、BLASTタンパク質検索を実施して、SCA-1モディファイアータンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ入りアラインメントを得るため、Altschulら、1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されたように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、限定するわけではない別の好ましい例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムを、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）中に組み入れる。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー4を使用することができる。配列分析のためのその他のアルゴリズムが当分野で知られており、これらとして、Torellis and Robotti, 1994, Comput.Appl.Biosci., 10:3-5、に記載されたADVANCEおよびADAM、ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8に記載されたFASTAが含まれる。FASTA中、ktupは検索の感度およびスピードをセットするコントロールオプションである。ktup＝2の場合、比較する2つの配列中の類似領域が、アラインメントさせた残基のペアを検査することによってわかる。ktup＝1の場合は、単一アラインメントさせたアミノ酸が調べられる。ktupはタンパク質配列について2または１に、DNA配列について１〜6にセットすることができる。ktupを特定しない場合のデフォルトはタンパク質について2、およびDNAについて6である。FASTAパラメーターのこれ以上の記述については、http://bioweb.pasteur.fr./docs/man/man/fasta.1.html#sect2、を参照されたい。この内容を参照により本明細書に組み入れる。
あるいは、Higginsら、1996, Methods Enzymol.266:383-402に記載された、CLUSTAL Wアルゴリズムを使用して、タンパク質配列アラインメントを実施することができる。
2つの配列間の同一性％は、上記のものと同様の技法をギャップを入れるか入れないで使用して、決定することができる。同一性％の計算では、厳密な一致のみを計数する。
５．６ 本発明のタンパク質の調製方法
抗体を含む本発明のタンパク質は、当分野で知られたどのタンパク質合成法によっても調製することができるが、特に化学的合成法、または好ましくは組換え発現法によって調製される。
本発明のタンパク質、およびそのフラグメント、誘導体もしくは類似体（例えば本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖）の組換え発現には、このタンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターの構築が必要である。本発明のタンパク質をコードする核酸が取得された後、当分野で周知の技術を使用する組換えDNA技法によって、このタンパク質分子の産生のためのベクターが作製される。そこで、タンパク質の調製方法であって、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を発現させることによる方法について、本明細書に記載する。当業者に周知の方法を使用して、コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。こうした方法として例えば、in vitro組換えDNA法、合成法およびin vivo遺伝子組換え法が含まれる。かくして、本発明は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をプロモーターに機能し得るように連結して含む、複製可能なベクターを提供する。タンパク質が抗体の場合は、ヌクレオチド配列はその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをプロモーターに機能し得るように連結してコードしている。かかるベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えばPCT公開WO 86/05807；PCT公開WO 89/01036；および米国特許第5,122,464号参照）、重鎖および軽鎖全体の発現のために、こうしたベクター中にその抗体の可変ドメインをクローニングしてもよい。
発現ベクターは慣用技法によって宿主細胞に導入され、次にトランスフェクトされた細胞が慣用技法によって培養されて、本発明のタンパク質が産生される。したがって本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸を異種プロモーターに機能し得るように連結して含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現に適した実施形態では、以下に記載するように、完全な免疫グロブリン分子の発現のため、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞中で同時発現させることができる。
本発明のタンパク質分子を発現させるために、多様な宿主-発現ベクター系を利用することができる。こうした宿主-発現系とは、目的のコード配列を作製した後精製することができるビヒクルを表すとともに、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換もしくはトランスフェクトした時に本発明のタンパク質をin situ発現することができる細胞をも表す。これらとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌（例えば大腸菌、枯草菌）などの微生物； 抗体コード配列を含有する組換え酵母で形質転換した酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させるか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有している哺乳動物細胞系（例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞）。本発明の組換えタンパク質の発現のために、好ましくは大腸菌などの細菌細胞、またさらに好ましくは、特に組換え抗体分子全体の発現のために真核細胞が使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと連携させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞が、本発明のタンパク質のために有効な発現系である（Foeckingら、1986, Gene 45:101；Cockett ら、1990, Bio/Technology 8:2）。
細菌系では、発現させるタンパク質に必要なフォールディングおよび翻訳後修飾のために、意図された用途に応じていくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。可能ならば、本発明のタンパク質を含む医薬組成物の調製のために、多量のこうしたタンパク質を製造しようとする場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい。こうしたベクターとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：大腸菌発現ベクター pUR278（Rutherら、1983, EMBO 1.2:1791）、この場合、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列をlacZコード領域と読み枠を合わせてベクター中に個々に連結させる；pINベクター類（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J.Biol.Chem.24:5503-5509）；など。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質を発現させるために、pGEXを使用することもできる。一般的に、こうした融合タンパク質は可溶性であって、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶離させることによって、溶解細胞から容易に精製することができる。トロンビンもしくはファクターXaプロテアーゼ切断部位を含むようにpGEXベクターを設計することによって、クローン化標的遺伝子産物をGST部分から遊離させることができる。
昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）を使用する。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。抗体コード配列をこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合は、本発明のタンパク質のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよび3部分反復リーダー配列、に連結する。次にこのキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1もしくはE3）中への挿入の結果、感染宿主中で生存して本発明のタンパク質を発現することができる組換えウイルスとなる（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359参照）。挿入したコード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルとして、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、全インサートの翻訳を確実にするためには、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と合わせる必要がある。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは天然および合成の両方の、多様な起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって、高めることができる（Bittnerら、1987, Methods in Enzymol.153:51-544参照）。
その上、挿入配列の発現をモジュレートしたり、あるいは所望する特定の様式でその遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする、宿主細胞株を選別することができる。タンパク質産物のこうした修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、本発明のタンパク質の機能にとって重要となることがある。異なる宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾について特徴的で特異的な機序を持つ。発現させる外来タンパク質の適正な修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主細胞が選別される。この目的のため、的確な一次転写産物のプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞として、限定するわけではないが、CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、およびW138が含まれる。
組換えタンパク質の長期間の高収率産生のため、安定した発現が好ましい。例えば、本発明のタンパク質を安定して発現する細胞系を人工的に作製することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他）によって調節されるDNAおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作した細胞を富化培地で1〜2日間生育させた後、選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を賦与し、細胞がその染色体中にプラスミドを安定して組み込み、成長して増殖巣を形成し、続いてそれをクローン化して細胞系へと増やすことを可能にする。この方法を有効に使用して、本発明のタンパク質を発現する細胞系を人工的に作製することができる。
多数の選択系を使用することができ、限定するわけではないが、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977, Cell 11:223 ）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980, Cell 22:8-17）遺伝子をそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で使用することができる。また、以下の遺伝子についての選択の基準として、代謝拮抗物質耐性を使用することができる：dhfr、これはメトトレキセートに対する耐性を賦与する（Wiglerら、1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O'Hareら、1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527）；gpt、これはミコフェノール酸に対する耐性を賦与する（Mulligan & Berg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072）；neo、これはアミノグリコシドG-418に対する耐性を賦与する（Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215）；ならびにhygro、これはヒグロマイシンに対する耐性を賦与する（Santerreら、1984, Gene 30:147）。所望の組換えクローンを選択するためには、組換えDNA法の分野で公知の方法をルーチンに適用することができるが、こうした方法が例えば以下に記載されている：Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)；および Dracopoliら(編)、Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994)、12および13章；Colberre-Garapinら、1981, J.Mol.Biol.150:1、これらの全部を参照により本明細書に組み入れる。
本発明のタンパク質の発現レベルはベクター増幅によって増加させることができる（総説について、Bebbington and Hentschel, "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNY Cloning", Vol.3.(Academic Press, New York, 1987)参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルの増加はマーカー遺伝子のコピー数を増加させるだろう。増幅した領域は抗体遺伝子と関連性があるので、本発明のタンパク質の産生も増加することになる（Crouseら、1983, Mol.Cell Biol.3:257）。
本発明のタンパク質が抗体である場合、宿主細胞に本発明の２つの発現ベクターを共トランスフェクトすることができる。第１ベクターは重鎖由来のタンパク質をコードし、第２ベクターは軽鎖由来のタンパク質をコードする。２つのベクターは同一の選択マーカーを含有してもよい。その場合は重鎖および軽鎖タンパク質の等量発現が可能になる。あるいは重鎖および軽鎖タンパク質の両方をコードし、したがって発現することができる、単一ベクターを使用することができる。こうした状況では、過剰の毒性フリー重鎖を回避するため、軽鎖を重鎖の前に置かなければならない（Proudfoot, 1986, Nature 322:52(1986)；Kohler, 1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197）。重鎖および軽鎖のためのコード配列はcDNAでもゲノムDNAでもよい。
本発明のタンパク質分子が動物によって産生され、化学合成され、または組換え的に発現されたら、タンパク質の精製について当分野で知られた任意の方法を用いて精製することができる。かかる方法として、例えばクロマトグラフィー（例：イオン交換；アフィニティー、特に(抗体分子についての)特異的抗原であるプロテインAに対するアフィニティー、またはタンパク質が融合タンパク質の場合は、異種融合パートナーに対するアフィニティー；およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度、あるいはタンパク質精製のためのその他の標準的技法がある。
本発明は、本発明の（好ましくは少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または少なくとも100個のアミノ酸からなる）異種タンパク質に組換え的に融合させるか、化学的にコンジュゲートさせて（共有結合および非共有結合によるコンジュゲーションを含む）融合タンパク質とした、CD3結合タンパク質を包含する。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介したものでもよい。
本発明にはさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合またはコンジュゲートさせた本発明のタンパク質を含む組成物が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は抗体Fc領域またはその一部に融合またはコンジュゲートされる。本発明のタンパク質に融合される抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CR2ドメイン、およびCH3ドメイン、または全ドメインもしくはその一部の任意の組合せを含みうる。このタンパク質を上記の抗体部分に融合またはコンジュゲートさせて多量体を形成させてもよい。例えば、本発明のタンパク質に融合されたFc部分は、Fc部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。このタンパク質をIgAおよびIgMの部分に融合させることによって、さらに大きい多量体形態を作製することができる。本発明のタンパク質を抗体部分に融合またはコンジュゲートさせる方法は当分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号；5,622,929号；5,359,046号；5,349,053号；5,447,851号；5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；PCT公開 WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenaziら、1991,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zhengら、1995, J.Immunol.154:5590-5600；およびVilら、1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341、を参照されたい（これらの文献の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
５．７ コンジュゲートおよび融合タンパク質
上で述べたように、本発明のタンパク質は、CD30に結合して、HD細胞に対して細胞増殖抑制作用および／または細胞傷害作用を及ぼし、さらに異種タンパク質もしくは細胞傷害剤と融合またはコンジュゲートされるタンパク質を包含する。
こうして本発明は、本発明のタンパク質もしくは核酸の投与によるホジキン病の治療法を提供する。本発明のタンパク質として、限定するわけではないが、（例えば本明細書に上記したような）AC10およびHeFi-1タンパク質、それらの抗体および類似体および誘導体が含まれ、本発明の核酸として、限定するわけではないが、これらの（例えば本明細書に上記したような）AC10およびHeFi-1タンパク質、それらの抗体および類似体もしくは誘導体をコードする核酸が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のタンパク質もしくは核酸を化学的に修飾して、細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性を改善することができる。例えば、本発明のタンパク質をコンジュゲートとして投与することができる。本発明のタンパク質とのコンジュゲート形成に特に好適な成分は化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素もしくは化合物、またはトキシンである。あるいは、本発明の核酸を修飾して、本発明のタンパク質のコード配列にプロドラッグ変換酵素のコード配列を機能し得るように連結することによって、下記第5.7節に記載する遺伝子治療法にしたがってこの核酸を投与したとき、被験者内で機能的に活性なプロドラッグ変換酵素および本発明のタンパク質を含む融合タンパク質が発現されるようにしてもよい。
ある実施形態では、精製を容易にするために、本発明のタンパク質をペプチドなどのマーカー配列に融合させる。好ましい実施形態において、そのマーカーアミノ酸配列は、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）中に置かれたタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである。そのほかにもあるが、多くは市販されている。例えばGentzら、1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824に記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製に便利である。精製に有用なその他のペプチドタグとして、限定するわけではないが、インフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当する「HA」タグ（Wilsonら、1984, Cell 37:767）、および「flag」タグが含まれる。こうした融合タンパク質は、当業者に知られた標準的組換え法によって作製することができる。
別の実施形態では、本発明のタンパク質を治療薬と融合またはコンジュゲートさせる。例えば、本発明のタンパク質は、化学療法剤、トキシン（例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞致死剤）または放射性核種（例えばアルファ放射体、例えば212Bi、211Atなど、またはベータ放射体、例えば131I、90Yもしくは67Cuなど）などの細胞傷害剤とコンジュゲートさせることができる。
メトトレキセート（Endoら、1987, Cancer Research 47:1076-1080）、ダウノマイシン（Gallegoら、1984, Int.J.Cancer.33:737-744）、マイトマイシンC（MMC）（Ohkawaら、1986, Cancer Immunol.Immunother.23:81-86）およびビンカアルカロイド（Rowlandら、1986, Cancer Immunol Immunother.21:183-187）などの薬物を抗体に付着させて、誘導されたコンジュゲートの抗腫瘍活性が検討された。化学療法剤コンジュゲートの作製にあたっては、コンジュゲーション操作の結果、その薬物および／またはタンパク質の活性が確実に低下しないように注意すべきである。
化学療法剤の例として以下の排他的でないクラスの化学療法剤が含まれる：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸薬、代謝拮抗薬、抗チューブリン薬、アウリスタチン、化学療法増感剤、DNA副溝結合剤、DNA複製インヒビター、デュオカマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン代謝拮抗薬、プロマイシン、放射増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼインヒビター、およびビンカアルカロイド。本発明の核酸もしくはタンパク質とコンジュゲートさせることができる個々の化学療法剤の例として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：アンドロゲン、アントラマイシン（AMC）、アスパラギナーゼ、5-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（BSNU）、CC-1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルチシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン（従来のアクチノマイシン）、ダウノルビシン 、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン類、5-フルオロデオキシウリジン、5-フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、6-チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16およびVM-26。好ましい実施形態では、化学療法剤はアウリスタチンE (auristatin E)である。さらに好ましい実施形態では、化学療法剤はアウリスタチンE 誘導体AEBである（米国特許出願番号 09/845,786、2001年4月30日出願、に記載されている。この全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本発明のタンパク質の治療効果を強化するために使用する本発明のコンジュゲートは、トキシンなどの非古典的治療薬を含む。こうしたトキシンとして、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素が含まれる。
こうした治療薬成分をタンパク質（特に抗体）とコンジュゲートさせる技法は周知である。例えば以下を参照されたい：Arnonら、「癌治療における薬物の免疫ターゲッティングのためのモノクローナル抗体 (Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)」 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc., 1985)；Hellstromら、「ドラッグデリバリー用抗体(Antibodies For Drug Delivery)」 Controlled Drug Delivery(第2版), Robinsonら(編), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987)；Thorpe, 「癌治療における細胞傷害剤の抗体キャリアー：レビュー (Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)」 Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), pp.475-506(1985)；「癌治療における放射性標識抗体の治療用途の分析、結果および今後の展望 (Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)」 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), pp.303-16(Academic Press 1985), およびThorpeら、1982, Immunol. Rev.62:119-58。
あるいは、Segalによって米国特許第4,676,980号（この全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されているように、本発明の抗体を第2の抗体とコンジュゲートさせて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることができる。
上述したように、本発明のいくつかの実施形態では、本発明のタンパク質をプロドラッグ変換酵素と同時投与することができる。プロドラッグ変換酵素は本発明のタンパク質との融合タンパク質として発現させるか、またはこれとコンジュゲートさせることができる。代表的なプロドラッグ変換酵素はカルボキシペプチダーゼG2、βグルクロニダーゼ、ペニシリン-V-アミダーゼ、ペニシリン-G-アミダーゼ、βラクタマーゼ、βグルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼAである。
５．８ 遺伝子治療
特定の実施形態においては、HDを治療、抑制または予防するために本発明の核酸が投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸の被験者への投与による治療を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸がそのコード化タンパク質をもたらし、該タンパク質が治療効果を媒介する。
当分野で利用可能などんな遺伝子治療の方法でも、本発明にしたがって使用することができる。代表的な方法を以下に記載する。
遺伝子治療法の全般的な検討のためには、以下を参照されたい：Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann.Rev.Pharmaccol.Toxicol.32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；Morgan and Anderson, 1993, Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May, 1993, TIBTECH 1, 1(5):155-215。使用することができる組換えDNA技術の当分野で公知の方法は以下に記載されている：Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)。
好ましい態様において、治療薬は抗体をコードする核酸配列を含むが、その核酸配列は、好適な宿主内でその抗体もしくはそのフラグメントまたはキメラタンパク質または重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、こうした核酸配列は抗体コード領域に機能し得るように連結されたプロモーターを持ち、そのプロモーターは誘導性または構成性であり、場合によっては組織特異性である。別の特定の実施形態では、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域に隣接させて、抗体コード配列および任意のその他の所望の配列を配置した核酸分子を使用することによって、抗体をコードする核酸の染色体内発現を得る（Koller and Smithies, 1989, Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstraら、1989, Nature 342:435-438）。特定の実施形態では、発現する抗体分子は一本鎖抗体である。あるいは、核酸配列がその抗体の重鎖および軽鎖の両方、またはそのフラグメントをコードする配列を含む。
核酸の患者への送達には、その患者にその核酸もしくは核酸担持ベクターを直接曝露する場合の直接法か、あるいは最初に細胞をin vitroでその核酸により形質転換し、次にその細胞を患者に移植する場合の間接法がある。これらの2つの技法は、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られている。
特定の実施形態においては、核酸配列が直接in vivo投与され、そこで発現してコードされた産物を産生する。これは当分野で知られた多数の方法のいずれによっても達成することができる。例えば、これらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そのベクターを投与してその核酸配列を細胞内のものとさせることによる。遺伝子治療用ベクターは以下のようにして投与することができる：欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを使用する感染（例えば米国特許第4,980,286号参照）；裸のDNAの直接注入；ミクロ粒子ボンバードメントの使用（例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont）；脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクト剤によるコーティング；リポソーム、ミクロ粒子もしくはマイクロカプセル内への封入；核内に入ることが知られているペプチドに連結して投与；受容体仲介エンドサイトーシスを受けやすいリガンドに連結して投与（例えばWu and Wu, 1987, J.Biol.Chem.262:4429-4432参照）（これは受容体を特異的に発現する標的細胞型に使用できる）；その他。別の実施形態では、核酸-リガンド複合体を形成させるが、この場合、リガンドはエンドソームを破壊する融合誘導性ウイルスペプチドを含み、それによって核酸がリソソーム分解を回避できるようにする。さらに別の実施形態では、核酸は、細胞の特異的取り込みおよび発現のために、特定の受容体をターゲッティングすることによってin vivoでターゲッティングされ得る（例えばPCT公開WO92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；WO 93/14188、およびWO 93/20221参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えによって宿主細胞DNA内に取り込ませて発現させることができる（Koller and Smithies, 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstraら、1989, Nature 342:435-438）。
特定の実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Millerら、1993, Meth.Enzymol.217:581-599参照）。これらのレトロウイルスベクターにはウイルスゲノムの適正なパッケージングおよび宿主細胞DNA中への組み込みのために必要な成分を含ませる。遺伝子治療で使用する抗体をコードする核酸配列は１以上のベクター中にクローン化され、それによってその遺伝子の患者への送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのこれ以上の詳細は、Boesenら、1994, Biotherapy 6:29 1-302に見出せる。これには、幹細胞を化学療法に耐えられるようにすることを目的にした、mdr 1遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療でのレトロウイルスベクターの使用を説明するその他の参照文献として以下のものがある：Clowesら、1994, J.Clin.Invest.93:644-651；Kleinら、1994, Blood 83:1467-1473；Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；およびGrossman and Wilson, 1993, Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114。
遺伝子治療の別の手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって、遺伝子（例えばAC10もしくはHeFi-1遺伝子）を組織培養下の細胞に導入することを含む。通常、導入の方法には、その細胞への選択マーカーの導入が含まれる。次に細胞を選択条件下に置くと、導入された遺伝子を取り込んで発現している細胞が単離される。その後、それらの細胞が患者に送達される。
この実施形態では、核酸を細胞中に導入してから、得られた組換え細胞をin vivo投与する。こうした導入は当分野で知られたどんな方法によっても実施することができる。これらとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：トランスフェクション；エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクターによる感染；細胞融合；染色体介在遺伝子導入；ミクロセル介在遺伝子導入；スフェロプラスト融合；その他。外来遺伝子の細胞中への導入については、多数の技法が当分野で知られており（例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth.Enzymol.217:599-618；Cohenら、1993, Meth.Enzymol.217:618-644；Cline, 1985, Pharmac.Ther.29:69-92参照）、レシピエント細胞に必要な発生的および生理学的機能が破壊されないかぎり、本発明に従って使用することができる。その技術は、細胞への核酸の安定した導入をもたらし、結果的にその核酸が細胞によって発現され、好ましくは遺伝されて、その細胞子孫によって発現されるようにすべきである。
得られる組換え細胞は、当分野で知られた多様な方法によって、患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば造血幹細胞もしくは前駆細胞）は好ましくは静脈内投与される。想定される細胞の使用量は所望の効果、患者の状態その他によって左右され、当業者が決定することができる。
遺伝子治療の目的で核酸を導入される細胞はあらゆる所望の入手可能な細胞型を包含し、それらとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：繊維芽細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；各種の幹細胞もしくは前駆細胞、特に造血幹細胞もしくは前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓その他から得られるもの。
好ましい実施形態では、遺伝子治療用の細胞は患者自身に由来するものである。
組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態では、抗体をコードする核酸配列を細胞中に、これらがその細胞もしくはその子孫によって発現され得るように導入して、次に治療効果を得るように、組換え細胞をin vivo投与する。特定の実施形態では、幹細胞もしくは前駆細胞が使用される。単離してin vitroで維持することができるならば、どのような幹細胞および／もしくは前駆細胞でも本発明の実施形態に従って使用できる可能性がある（例えば、PCT公開WO 94/08598；Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985；Rheinwald, 1980, Meth.Cell Bio.21A:229；およびPittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc.61:771参照）。
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、適切な転写誘導物質の存在もしくは不在を制御することによって核酸の発現を調節できるように、コード領域に機能し得るように連結された誘導性プロモーターを含む。
本発明の化合物もしくは医薬組成物は好ましくは、ヒトでの使用前に、所望の治療または予防活性について、in vitroで、その後in vivoで試験される。例えば、タンパク質もしくは医薬組成物の治療または予防上の有用性を証明するためのin vitroアッセイは、ホジキン細胞系またはホジキン病患者由来の組織サンプルにそのタンパク質または医薬組成物が及ぼす効果を判定することを含む。ホジキン細胞系および／または組織サンプルに対するタンパク質または組成物の細胞傷害性および／または細胞増殖抑制作用は、当業者に知られた技法を利用して判定することができる。下記第6節に記載する好ましい方法は以下の操作を要する：0.33cm2の培養面積に約5,000個の細胞密度になるように増殖させたホジキン病細胞系の培養物にタンパク質または医薬組成物を72時間にわたり接触させる；この72時間のうち最後の8時間にわたり、培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露する；そして培養物の細胞中への3H-チミジンの取り込みを測定する。同一の条件で培養したがこのタンパク質または医薬組成物とは接触させていない同一のホジキン病細胞系の細胞に比較して、培養物の細胞の3H-チミジンの取り込みが低下するならば、このタンパク質または医薬組成物はホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用もしくは細胞傷害作用を持つので、ホジキン病の治療または予防に有用である。あるいは、特定のタンパク質または医薬組成物の投与が意味を持つかどうかを判定するために使用することができるin vitroアッセイとして、in vitro細胞培養アッセイがある。これはホジキン病患者からの組織サンプルを培地中で増殖させ、タンパク質または医薬組成物に曝露するかあるいは曝露しないで、ホジキン病組織サンプルに対するこの化合物の効果を観察するものである。
５．９ 治療／予防上の投与および組成物
本発明は、ホジキン病細胞に対して細胞傷害性または細胞増殖抑制作用を持つCD30結合性タンパク質（すなわち本発明のタンパク質）、このCD30結合性タンパク質をコードする核酸（すなわち本発明の核酸）、あるいは本発明のタンパク質または核酸を含有する医薬組成物（以後、本発明の医薬と称する）の有効量を被験体に投与することによる、HDと診断された患者の治療を包含し、こうした治療の結果、腫瘍の増殖が遅延し、かつ／または腫瘍の退行が促進されるものである。
好ましい実施形態において、本発明のタンパク質はモノクローナル抗体 AC10もしくはHeFi-1またはそのフラグメントもしくは誘導体である。好ましい態様では、本発明の医薬は実質的に精製された本発明のタンパク質または核酸を含む（例えば、その効果を制限するか望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。被験体は好ましくは、限定するわけではないが、牛、豚、馬、鶏、猫、犬その他の動物を含む動物であり、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。
使用できる製剤および投与法を上に記載したが、その他の適切な製剤および投与経路は以下に記載するものから選択することができる。
各種の送達システムが知られており、本発明の核酸またはタンパク質を投与するために使用することができる。例えば、リポソーム、ミクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、その化合物を発現することができる組換え細胞、受容体仲介エンドサイトーシス（例えばWu and Wu, 1987, J.Biol.Chem.262:4429-4432参照）、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築、その他がある。導入方法としては、限定するわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。本発明の核酸およびタンパク質はどのような経路でも投与することができ、例えば注入もしくはボーラス注射によるもの、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば口粘膜、直腸もしくは腸粘膜など）からの吸収によるものがあり、また化学療法剤などの他の生理活性物質とともに投与することもできる。投与は全身的でも局所的でもよい。
特定の実施形態では、本発明の核酸もしくはタンパク質を注射、カテーテル、座薬またはインプラントによって投与するのが望ましい。このインプラントは多孔質、非多孔質、もしくはゼラチン質の材料（シアラスティック(sialastic)膜などの膜、もしくは繊維を含む）のものである。好ましくは、本発明の抗体などのタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するように注意しなければならない。
別の実施形態では、化合物もしくは組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（例えばLanger, 1990, Science 249:1527-1533；Treatら、1989, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(編), Liss, New York, pp.353-365；Lopez-Berestein, 同書, pp.317-327参照；全般的には同書参照）。
さらに別の実施形態では、化合物もしくは組成物を制御放出システムで送達することができる。ある実施形態においては、ポンプを使用することができる（例えば、Langer, 上記；Sefton, 1989, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwaldら、1980, Surgery 88:507；Saudekら、1989, N.Engl.J.Med.321:574参照）。別の実施形態においては、ポリマー材料を使用することができる（以下の文献参照：Medical Applications of Controlled Release, 1974, Langer and Wise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, Smolen and Ball(編), Wiley, New York；Ranger and Peppas, 1983, Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；また、Levyら、1985, Science 228:190；Duringら、1989, Ann.Neurol.25:351；Howardら、1989, J.Neurosurg.71:105も参照されたい）。
その他の制御放出システムはLanger, 1990, Science 249:1527-1533により検討され考察されている。
本発明の核酸を投与する特定の実施形態においては、核酸を、これによりコードされたタンパク質の発現を促進するようにin vivo投与する。これは、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、この核酸が細胞内のものとなるようにそのベクターを投与することによる。これは例えばレトロウイルスベクターの使用による（例えば米国特許第4,980,286号参照）か、直接の注入によるか、ミクロ粒子ボンバードメントの使用による（例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont）か、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングするか、核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与する（例えばJoliotら、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868参照）ことにより行う。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えによって、発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
上で言及したように、本発明は医薬組成物（本発明の医薬）をも提供する。こうした組成物は、治療上有効な量の本発明の核酸またはタンパク質と、製薬上許容される担体とを含む。特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」とは、動物、さらに特定するとヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方もしくは一般的に公認されている薬局方に掲示されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。こうした医薬用担体は水および油などの無菌液体であってよく、石油、動物、植物もしくは合成起源の油類が含まれ、落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油などがある。水は医薬組成物を静脈内投与するときの好ましい担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射液用に使用することができる。好適な医薬用賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望ならば、組成物に少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤をも含ませることができる。これらの組成物は溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態とすることができる。組成物を従来からの結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに座薬として製剤化することができる。経口製剤には、医薬級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含ませることができる。好適な医薬用担体の例は、E.W.Martinによる "Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載されている。こうした組成物は、治療上有効な量の本発明の核酸もしくはタンパク質（好ましくは精製された形態）を、患者への適正な投与のための形態を提供するように適量の担体とともに含んでなる。製剤は投与様式に適合させるべきである。
好ましい実施形態では、本発明の医薬は、人体への静脈内投与に適応させた医薬組成物として、慣用の操作にしたがって製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は無菌等張水性バッファーの溶液である。必要な場合、本発明の医薬に可溶化剤、および注射部位の痛みを軽減するためにリグノカインなどの局所麻酔剤を含ませてもよい。一般的に諸成分は、例えば活性成分の量を明示したアンプルもしくは小袋(sachette)などの密封容器に入れた凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、単位投与剤形で別々にまたは一緒に混合されて供給される。本発明の医薬を輸液によって投与する場合、医薬等級の無菌水もしくは生理食塩水を含有する輸液用ビンを用いて分配することができる。本発明の医薬を注射によって投与する場合は、投与前に諸成分を混合することができるように注射用の無菌水もしくは生理食塩水の入ったアンプルを用意する。
HDの治療もしくは予防に有効な、本発明の核酸もしくはタンパク質の量は、標準的臨床技法によって決定することができる。その上、最適な投与範囲を確定する助けになるように、場合によってはin vitroアッセイを利用することができる。製剤中で使用する正確な用量は、投与経路およびHDの病期にも左右され、医師の判断および患者それぞれの状況にしたがって決定されるべきものである。有効な用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から誘導された用量-応答曲線から外挿により決定することができる。
５．１０ キット
本発明は、本発明の核酸またはタンパク質、および場合によって１種以上の医薬用担体を入れた容器１個以上を含む、医薬パックまたはキットをも提供する。場合によってこうした１個以上の容器に、医薬製剤もしくは生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された方式の注意書を添付することができる。この注意書はヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映するものである。
ある実施形態において、キットは本発明の精製したタンパク質を含む。この実施形態の好ましい様式では、タンパク質は抗体である。タンパク質は放射性核種もしくは化学療法剤とコンジュゲートさせてもよい。このキットにさらに別の医薬用担体を含ませてもよい。
別の実施形態では、本発明のキットは、本発明の核酸、または組換え発現のためのプロモーターに機能し得るように連結された本発明の核酸を含む宿主細胞を含んでなる。
５．１１ 有効投与量
本発明のタンパク質の毒性および治療上の効力は、例えばLD50（集団の50％が致死する用量）およびED50（集団の50％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準薬学的手法によって決定することができる。毒性作用と治療効果間の用量比は治療係数であり、これをLD50／ED50の比で表すことができる。大きな治療係数を示すタンパク質が好ましいものである。毒性副作用を示すタンパク質を使用してもよいが、未感染細胞に対して起こりうる損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低下させるため、こうしたタンパク質が罹患組織の部位をターゲッティングするような送達システムを設計するように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いる投与量範囲を決定するのに使用することができる。こうしたタンパク質の投与量は、毒性をほとんどまたは全く示さないED50を含む循環濃度の範囲内とすることが好ましい。この投与量は使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法で使用するどの化合物についても、治療上有効な用量を最初に細胞培養アッセイから推定する。細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで用量を処方することができる。こうした情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
一般的に、ホジキン病患者に投与する本発明の医薬中の本発明のタンパク質の用量は、典型的には0.1 mg/kg〜100 mg/kg 患者体重 である。好ましくは患者への投与量は0.1 mg/kg〜20 mg/kg 患者体重、さらに好ましくは1 mg/kg〜10 mg/kg 患者体重である。一般的に、外来タンパク質に対する免疫応答のため、他の生物種由来の抗体よりもヒト抗体はヒト体内での半減期が長い。したがって、ヒト化、キメラもしくはヒト抗体は、しばしば、用量を低くしかつ投与回数を少なくすることが可能である。
５．１２ 製剤
本発明にしたがって使用するための医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、慣用方法によって製剤化することができる。
こうして、タンパク質ならびに生理学的に許容されるその塩および溶媒和物は、（口もしくは鼻のいずれかを経由する）吸入もしくは吹入れによる投与、または経口、口腔粘膜、非経口もしくは直腸投与用に製剤化することができる。
経口投与用には、医薬組成物は以下のような製薬上許容される賦形剤とともに慣用手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形態とすることができる：結合剤（例えば予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリピニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は当分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は例えば溶液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態とすることができ、あるいは使用前に水もしくはその他の好適なビヒクルを用いて再構成される乾燥製品として提供してもよい。こうした液体製剤は以下のような製薬上許容される添加剤を用いて慣用手段によって調製することができる：懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用油）；乳化剤（例えばレシチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールもしくは分留植物油）；および保存剤（例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）。この製剤に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を適宜含ませてもよい。
経口投与用の製剤は活性化合物の制御放出をもたらすように好適に製剤化することができる。
口腔粘膜投与用には、組成物を慣用手段によって製剤化した錠剤もしくはトローチ剤の形態としてもよい。
吸入投与用には、本発明にしたがって使用するためのタンパク質を、加圧パック、または例えば以下のような好適な噴射剤の使用を併せたネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達することができる：ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適な気体。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は一定量を送達するためのバルブを配備することによって決定することができる。吸入器もしくはインサフレーターで使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースもしくはデンプンなど）のパウダーミックスを含有させて製剤化することができる。
タンパク質を注射、例えばボーラス注射もしくは連続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は例えばアンプルに入れた単位投与剤形または保存剤を添加した複数回用容器に入れて提供することができる。組成物は油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳濁剤などの形態とすることができ、また懸濁化剤、安定化剤および／または分散助剤などの処方剤を含有させてもよい。あるいは、活性成分を、使用前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない無菌水）を用いて再構成する粉末形態として提供してもよい。
タンパク質は、例えばカカオバターもしくはその他のグリセリドなどの慣用の坐剤用基剤を含有する、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物に製剤化することもできる。
前記製剤に加えて、タンパク質をデポー製剤として製剤化することもできる。こうした長期作用性製剤はインプラント（例えば皮下もしくは筋内）または筋内注射によって投与することができる。この場合、例えばタンパク質は、（例えば許容される油中のエマルジョンとして）好適なポリマーもしくは疎水性物質を用いて、またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体（例えば難溶性塩）として製剤化することができる。
必要ならば、活性成分を含む１以上の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサー容器で組成物を提供してもよい。パックは例えば金属もしくはプラスチックフォイルから構成され、ブリスターパックなどがある。パックもしくはディスペンサー容器に、投与のための、好ましくはヒトへの投与のための説明書を添付してもよい。
５．１３ ホジキン病治療のための併用療法
本発明の核酸およびタンパク質は、照射または１以上の化学療法剤による治療と同時に投与することができる。
照射治療について、照射はガンマ線またはX線とすることができる。照射治療の全般的概説については、Principles and Ptactice of Oncology, DeVitaら編, 第2版, J.B.Lippencott Company, Philadelphia中、Hellman, 第12章: Principles of Radiation Therapy Cancerを参照されたい。
有用なクラスの化学療法剤として、限定するわけではないが、以下の相互に排他的でないクラスの薬物が含まれる：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸薬、代謝拮抗剤、抗チューブリン剤、抗スタチン、化学療法増感剤、DNA副溝結合剤、DNA複製インヒビター、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン類、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン代謝拮抗剤、プロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキセン、トポイソメラーゼインヒビターおよびビンカアルカロイド。本発明に包含される個別の化学療法剤として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：アンドロゲン、アントラマイシン（AMC）、アスパラギナーゼ、5-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（BSNU）、CC-1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン（従来のアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5-フルオロデオキシウリジン、5-フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、6-チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16およびVP26。
特定の実施形態において、本発明の核酸またはタンパク質は放射線治療または１以上の化学療法剤と同時に投与される。別の特定の実施形態では、本発明の核酸またはタンパク質の投与の少なくとも１時間から数ヵ月前または後に、例えば本発明の核酸またはタンパク質の投与の少なくとも１時間、5時間、12時間、1日、1週間、1ヵ月もしくは3ヵ月前または後に、化学治療または放射線治療を施す。
本発明のタンパク質がプロドラッグ変換酵素とコンジュゲートされている特定の実施形態、または本発明の核酸がプロドラッグ変換酵素を含む融合タンパク質をコードしている特定の実施形態において、該タンパク質または核酸はプロドラッグと一緒に投与される。プロドラッグの投与は、本発明の核酸またはタンパク質の投与と同時とすることができるが、より好ましくは本発明の核酸またはタンパク質の投与の少なくとも１時間から最大１週間後、例えば約５時間、12時間、もしくは１日後とすることができる。投与されるプロドラッグ変換酵素に応じて、プロドラッグは以下のものとすることができる：安息香酸マスタード、アニリンマスタード、フェノールマスタード、p-ヒドロキシアニリンマスタード-グルクロニド、エピルビシン-グルクロニド、アドリアマイシン-Nフェノキシアセリル、N-(4'-ヒドロキシフェニルアセチル)-パリトキシンドキソルビシン、メルファラン、ナイトロジェンマスタード-セファロスポリン、β-フェニレンジアミン、ビンブラスチン誘導体-セファロスポリン、セファロスポリンマスタード、シアノフェニルメチル-β-D-グルコピラノシドウロン酸、5-(アダリジン-1-イル-)2,4-ジニトロベンズアミド、またはメトトレキセート-アラニン。
本発明は本明細書に記載する特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではない。実際、前記説明および添付する図面から、本明細書に記載するものの他に、本発明の各種の改変が当業者には明らかになるであろう。こうした改変は本特許請求の範囲内に入るものとする。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらはいかなる場合も本発明の範囲を限定するものではない。
６． 抗CD30モノクローナル抗体 AC10およびHeFi-1は、CD30を発現するホジキン病細胞系の増殖を抑制する
６．１ 材料および方法
細胞および培養条件：
CD30発現細胞系であるL540、HDLM2、L428、KM-H2およびKarpas299は、ドイツ、Braunschweig所在のGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures/DSMZから入手した。ホジキン細胞系 L540cyは、ドイツ、Cologne所在のCologne大学のV. Diehl博士により提供されたものである。細胞系は推奨された組成の培地中に維持し、3〜4日毎に継代培養した。
試薬および抗体：
抗CD30モノクローナル抗体ハイブリドーマ系 AC10は、Bowenら（Bowenら、1993, J.Immunol.151:5896-5906）によって記載されており、Miami大学のE. Podack博士から提供された。精製済み抗体は、血清を含まない上清からプロテインGイムノアフィニティーカラムを使用して単離した。得られたAC10抗体はサイズ排除クロマトグラフィーによって＞97％が単量体であると判定された。モノクローナル抗体 HeFi-1は既報があり、NCI (Bethesda, MD)のT. Hecht博士から提供された。HeFi-1 mAbはサイズ排除クロマトグラフィーによって単量体が98％を超えることが証明された。
増殖アッセイ：
CD30発現細胞系は、増殖培地（細胞系L428、KM-H2およびKarpas 299については10％ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI、そして細胞系HDLM-2およびL540についてはRPMI／20％FBS）中、50,000もしくは5,000個／ウェルの細胞密度で、平底96ウェルプレートにて培養した。以下に記載するように、架橋した可溶性抗CD30 mAbもしくは固定化した抗CD30 mAbの不在下または存在下で、細胞系を培養した。
溶液中での抗体の架橋：
溶液中で抗体を架橋させるため、20μg/ml ポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の不在下または存在下で96ウェル平底組織培養プレート中にAC10もしくはHeFi-1の各種希釈物をタイトレートした(titrated)。次にこのプレートに50,000もしくは5,000個／ウェルの細胞でホジキン病細胞系を添加した。プレートを37℃で72時間インキュベートし、最後の5時間にわたり、1μCi／ウェルの3H-チミジンで標識した。
抗体の固定化：
抗体の固定化は、4℃で18時間、50 mmol/L Trisバッファー（pH8.5）中で抗体によりウェルをコーティングすることによって得られた。細胞の添加前に、ウェルをPBSで2回洗浄して、未結合のmAbを除去した。合計容積200μl中の50,000もしくは5,000個の細胞を各ウェルに添加した。72時間の培養期間の最後の8時間にわたる3H-チミジン（0.5μCi/ウェル）の取り込みから、増殖を判定した。
６．２ 結果
抗CD30 mAbの生物学的活性を検討するため、固定化抗CD30 mAbの存在下で、CD30発現HD細胞系（50,000個／ウェルの細胞）を培養した。mAb AC10はＴ細胞様（L540およびHDLM-2）またはＢ細胞様（L428およびKM-H2）HD系の細胞増殖の抑制を証明した（図１）。HD細胞系に対する効果がないことが以前に示されているKi-1（Grussら、1996, Blood 83:2045-2056）を対照として使用した。
AC10の活性をさらに検討するため、２回目の一連のアッセイを実施した。腫瘍細胞の対数増殖期のAC10活性を評価するため、培養物の細胞密度を減少させて、より適当な増殖条件になるようにした。この目的のため、平底96ウェルプレート中でmAB AC10の存在下または不在下にHD細胞系を5,000個／ウェルの細胞密度で培養した。AC10は、試験した4種すべてのHD細胞系（L540、HDLM-2、L428およびKM-H2；図２）の増殖抑制を示した。
別のセットの実験で、可溶性ヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって溶液中で架橋させた可溶性AC10またはHeFi-1とともに、HD細胞系をインキュベートした。これらの架橋条件下で、細胞を5x104個／ウェルでプレーティングしたとき、4種すべてのHD細胞系がAC10およびHeFi-1によって増殖抑制された（図３）。細胞を5x103個／ウェルでプレーティングしたとき、AC10はHDLM-2、L540およびL428の、そして程度は少ないが細胞系KM-H2の増殖を抑制し、一方HeFi-1は細胞系HDLM-2、L540およびL428の増殖を抑制した（図４）。
CD30を発現する腫瘍細胞系に対するAC10およびHeFi-1の効果を試験する実験結果のデータを下記表２に要約する。表２はさらに、AC10およびHeFi-1の抗腫瘍活性とmAb M44の活性との比較も提供する。
Figure 0004303964
まとめると、これらのデータは、モノクローナル抗体AC10およびHeFi-1は、CD30発現HD系の増殖を抑制する能力によって、すでに開示されている抗CD30 mAb類と区別されることを示している。Hubingerらが固定化形態の抗CD30 mAb M44の活性について、5,000個／ウェルの細胞を利用する増殖アッセイで最近検討したことに注目すると、興味深い。これらの条件下で、M44はCD30発現ALCL系のKarpas 299の増殖を抑制したが、HD細胞系のHDLM-2は抑制しなかった（Hublingerら、1999, Exp.Hematol.27(12):1796-805）。
７． AC10はホジキン病細胞系に対する化学療法剤の細胞傷害性効果を増強する
７．１ 材料および方法
20μg/ml ポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加によって架橋させた、0.1μg/ml 抗CD30抗体AC10の存在下または不在下で、L428細胞を24時間培養した。24時間の培養期間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。次に細胞を96ウェル平底組織培養プレート中、5x103個／ウェルになるように添加し、化学療法剤の各種希釈物と混合した。この薬剤への１時間の曝露後、細胞を2回洗浄し、その後新しい培地を添加した。次にこのプレートを37℃で72時間インキュベートし、その後0.5μCi／ウェルの3H-チミジンとともに4時間インキュベートした。増殖の抑制は、処理細胞中に取り込まれた3H-チミジンの量を未処理の対照細胞に取り込まれた量と比較することによって、判定した。
７．２ 結果
化学療法剤と併用した抗CD30 mAbの効果を検討するため、0.1μg/ml 抗CD30抗体AC10の存在下または不在下で、一次抗体の架橋用の20μg/ml ポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体とともに、L428細胞を24時間培養した。このインキュベーション後、ドキソルビシン、シスプラチンおよびエトポシドを含む化学療法剤の希釈物を存在させた、96ウェル組織培養プレートに5x103個／ウェルで細胞をプレーティングした（表３）。次に、薬剤のみ、または薬剤と抗体の組合せ物で処理した細胞について、EC50（未処理対照細胞と比較して、3H-チミジンの取り込みを50％抑制するのに必要な薬剤濃度）を判定した。ドキソルビシンについては、AC10とのインキュベーションはL428細胞に対するEC50を約45 nM（ドキソルビシン単独）から約9 nM に減少させ（すなわち、DNA合成の50％を抑制するのに必要な薬剤の量を減少させ）、シスプラチンについては、AC10はEC50を約1,500 nMから約500 nMに減少させ、そしてエトポシドについては、AC10はEC50を約1,500 nMから約600 nMに減少させた。
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８． 散在性および局所性（皮下）L540cyホジキン病異種移植片中のAC10およびHeFi-1の抗腫瘍活性
８．１ 材料および方法
ヒト腫瘍異種移植片モデル：
Taconic（Germantown, NY）から4〜6週齢で取得した、雌C.B-17 SCIDマウスを全効力試験のために使用した。ホジキン病の異種移植片モデルを樹立するため、L540cy(HD)細胞を細胞培養物から回収し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBSに再懸濁し、移植まで氷上に維持した。散在性疾患モデルのため、マウスの尾静脈から107個のL540cy細胞を静脈内注入した。マウスに2x107個のL540cy細胞を皮下(s.c.)注入することによって、固形腫瘍異種移植片を樹立した。治療の評価のため、示した治療量および治療計画を使用した。
AC10およびHeFi-1の投与：
散在性 L540cy腫瘍を保有するマウスに0日目に尾静脈から107個の細胞を入れ、その後１日目に治療を開始した。処置マウスには、AC10もしくはHeFi-1のいずれかを1回につき1 mg/kgで、2日毎に合計10回(q2dx10)、腹腔内注入した。
皮下L540cyモデルについては、マウスに2x107個の細胞を皮下注入し、固形腫瘍の形成について毎日観察した。腫瘍が触知できた時点で、動物を無作為にグループ分けし、AC10もしくはHeFi-1のいずれかを1回につき2 mg/kgで、q2dx10、投与した。
８．２ 結果
上記のように、L540cyホジキン病異種移植SCIDマウスにおいてAC10およびHeFi-1を試験した。散在性L540cy腫瘍があるマウス集団では、未処置対照マウスのすべてが、後肢麻痺または固形腫瘍塊の形成などの重症散在性疾病の徴候を発症して、犠牲にする必要があった（平均生存日数＝37日）。対照的に、AC10またはHeFi-1のいずれかを投与されたマウスのすべてが疾病の徴候を示さずに、46日を越えて生存した（図５Ａ）。
皮下L540cy腫瘍があるマウス集団については、未処置対照腫瘍は急速に＞450mm3に増殖したが、図５Ｂに示すように、両mAbとも腫瘍増殖を顕著に遅延させた。
本発明者らは、ヒトCD30受容体をターゲットとし、かつ他の抗CD30 mAbについて既報にはない活性のプロファイルを呈示するマウスモノクローナル抗体（mAb）を同定した。非修飾形態で、これらの抗体AC10およびHeFi-1は、HDおよびALCL系Karpas 299の増殖を抑制し、ホジキン病の腫瘍異種移植モデルでin vivo抗腫瘍活性を示す。
９． キメラAC10のin vitro活性
９．１ 材料および方法
細胞および試薬：
10％ウシ胎仔血清を補充したRPMI-1640培地（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）で、AC10ハイブリドーマを増殖させた。抗体を培養上清からプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。CD30陽性HD系のL540、KM-H2、HDLM-2およびL428ならびにALCL系のKarpas-299は、Deutches Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH（Braunschweig, Germany）から入手した；L540cyはV. Diehl博士から提供された；HL-60およびDaudiはATCC（Manassas, VA）から入手した。DG44 CHO細胞はLawrence Chasm（Columbia University, New York, NY）から取得した。ヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCはJackson Immunoresearch（West Grove, PA.）からのものである。抗CD30 mAb Ki-1はAccurate Chemicals（Westbury, NY）からのものである。
FACS分析：
細胞系でのCD30発現を検討するため、3x105個の細胞と、氷冷2％ FBS/PBS（染色用培地）中のAC10またはキメラAC10（cAC10）のいずれかの飽和レベル（4μg/ml）とを、氷上で20分結合させ、氷冷染色用培地で2回洗浄して、未結合のmAbを除去した。次に氷冷染色用培地中1:50に希釈した第２mAb（AC10についてはヤギ抗マウスFITC、またはcAC10についてはヤギ抗ヒトFITC）で細胞を染色し、氷上で20分インキュベートし、上記のように洗浄し、5μg/mLのヨウ化プロピジウム（PI）中に再懸濁させた。Becton Dickinson FACScanフローサイトメーター上でのフローサイトメトリーによって標識細胞を検査し、ゲーティングして非生存細胞を排除した。データは、Becton Dickinson CellQuestソフトウェア、バージョン3.3を使用して分析し、各細胞型についてバックグラウンドを補正した平均蛍光強度を測定した。
抗体飽和結合については、3x105個のKarpas 299細胞と、氷冷染色用培地で希釈したAC10またはcAC10の次第に増加する濃度とを、氷上で20分結合させ、氷冷染色用培地で2回洗浄して、遊離のmAbを除去し、それぞれ1:50のヤギ抗マウスFITCまたはヤギ抗ヒトFITCとともにインキュベートした。標識細胞を洗浄し、PI中に再懸濁させて、上記のように分析した。得られた平均蛍光強度をmAb濃度に対してプロットした。
細胞周期の時期を分析するため、細胞を完全培地で培養し、表示した時間にブロモデオキシウリジン（BrdU）（最終 10μM；Sigma, St.Louis, MO）で20分標識して新生DNA合成を検出し、また既報（Donaldsonら、1997, J.Immunol.Mech.203:25-33）のようにPIで標識して総DNA含量を検出した。前記のようにBecton Dickinson CellQuestを使用するフローサイトメトリーによって、細胞周期の時期およびアポトーシスについて、標識細胞を分析した（Donaldsonら、1997, J.Immunol.Mech.203:25-33）。
in vitro増殖抑制：
50 mM Tris-HCl pH8.5中10μg/mLのマウスmAbをプラスチック製96ウェル組織培養プレートに4℃で一晩固定化することによって、このmAbによる増殖抑制を検討した。プレートをPBSで2回洗浄して未結合mAbを除去した後、100μl完全培地中の細胞を5,000個／ウェルで添加した。37℃、5％ CO2で48時間のインキュベーション後、0.5μCiの3H-TdRを含有する50μl完全培地の添加によって、細胞を3H-TdRで2時間標識し、未処理対照ウェル中の細胞に対するDNA合成レベルを測定した。cAC10による増殖抑制の評価は、可溶性mAbおよび二次架橋物を使用して実施した。細胞を96ウェルフォーマット中の180μl完全培地にて5,000個／ウェルでプレーティングした。対応して10倍過剰のヤギ抗ヒトIgGを含有する完全培地中のcAC10を20μl中の記載した濃度で添加した。インキュベーションの96時間後、細胞を3H-TdRで4時間にわたって標識し、その後細胞を回収し、シンチレーションカウントして、新生DNA合成のレベルを定量した。未処理対照ウェルに対する抑制％をcAC10濃度に対してプロットした。
キメラAC10（cAC10）の構築および発現：
cAC10の構築のため、Gillilandら、1996, Tissue Antigen 47:1-20の方法を使用して、AC10ハイブリドーマから重鎖および軽鎖可変領域をクローン化した。AC10ハイブリドーマから総RNAを単離し、マウスκおよびIgG2b遺伝子特異的プライマーを使用して、可変領域のcDNAを作製した。AC10重鎖可変領域（VH）をクローニングベクター中のヒトγＩ定常領域（huCγ1、SwissProt登録番号P01857）をコードする配列に結合させ、そしてAC10軽鎖可変領域（VL）を同様に別のクローニングベクター中のヒトκ定常領域（huCκ、PID G185945）に結合させた。CHO細胞中でのインタクトなキメラモノクローナル抗体の発現のために、重鎖および軽鎖キメラ配列の両方をpDEF14中にクローン化した。プラスミドpDEF14は異種遺伝子の転写を駆動するチャイニーズハムスター延長因子１α遺伝子プロモーターを利用し（米国特許第5,888,809号）、これは遺伝子増幅の必要がない組換えタンパク質の高レベル発現を導く。得られたプラスミドをpDEF14-C3と命名した（図６）。
AC10発現細胞系を作製するため、pDEF14-C3を直線化し、エレクトロポレーションによってDG44 CHO細胞中にトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、10％ FBSを含有する完全DMEM/F12培地中で2日間回復させ、その後培地をヒポキサンチンおよびチミジンを含まない選択培地と交換した。DLIFR遺伝子を含むプラスミドDNAを取り込んだ細胞のみが、ヒポキサンチンおよびチミジンの不在下で増殖する能力を有していた。高力価クローンを選択してバイオリアクターで培養した。cAC10抗体をプロテインA、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製し、HPLC-SECによって最終産物は単量体が99％を超える抗体であることを判定した。
９．２ 結果
マウスAC10およびキメラAC10のホジキン病細胞系への結合：
AC10はもともとはCD30陽性大顆粒性リンパ腫細胞系YTでマウスを免疫することによって得られたもので、CD30に対して特異的であることが示された（Bowenら、1993, J.Immunol.151:5896-5906）。HD細胞の増殖に対するAC10およびcAC10の効果を評価する前に、いくつかの培養細胞系上のCD30発現のレベルを比較した。フローサイトメトリー蛍光比に基づいて、試験した4種すべてのHD系がCD30陽性であった（表４）。Ｔ細胞様HD細胞系 HDLM-2およびL540、ならびにALCL系 Karpas-299は質的に類似した、高レベルのCD30を発現したが、2つのＢ細胞様HD系 KM-H2およびL428上の発現はやや低かった。L540のサブクローン L540cyは中間レベルのCD30発現を示した。cAC10およびAC10のこれらの細胞系への結合は異なる第２抗体-それぞれFITCとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウス-を使用して検出したが、これらのデータはキメラ化プロセスが細胞表面CD30へのcAC10特異的結合を低下させなかったことを証明している。前骨髄球白血病系 HL-60およびバーキット(Burkitt)リンパ腫系 Daudiは両方ともCD30陰性だったので、後続の研究の対照として供した。
マウスおよびキメラ抗体の結合活性をさらに比較するため、AC10またはcAC10を添加してKarpas-299細胞をインキュベートした後、それぞれヤギ抗マウス-FITCまたはヤギ抗ヒト-FITC（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）で標識して、飽和に必要なレベルを決定した。標識細胞をフローサイトメトリーで分析し、平均蛍光強度をmAb濃度に対してプロットした。両形態のmAbについて、結合飽和は約0.5μg/mlで起こった（図７）。飽和は試験したすべてのCD30陽性細胞系について一致していた（データは示していない）ので、cAC10が親マウス抗体の結合活性を保持していたことがさらに証明された。
新たに単離した末梢血単核細胞はcAC10と反応せず、このアッセイではバックグラウンドより上のシグナルを示さなかった。同様に、単離したヒト初代Ｂ細胞およびＴ細胞はcAC10と結合しなかった。抗CD3および抗CD28で活性化したＴ細胞、ならびにブタクサマイトジェンで活性化したＢ細胞の両方が、活性化後72時間後に一過性で低レベルのcAC10の結合を示し、これはその後低下した（データは示していない）。
AC10およびcAC10のin vitro活性：
M44およびM67などの抗CD30抗体はALCL系に対して抗増殖効果があるが、HD系の増殖には何らの効果も刺激もないことが示されている（Grussら、1994, Blood 83:2045-2056；Tianら、1995, Cancer Res.55:5335-5341）。最初にHD細胞増殖に対するmAb AC10の効果を検討するため、既報（Grussら、1994, Blood 83:2045-2056）の固相条件下で、AC10をmAb Ki-1と比較した。これらの研究のため、「材料および方法」の項に記載したように、mAbをプラスチック製組織培養プレート上に固定化した後、HD細胞を添加した。37℃で48時間のインキュベート後、細胞を3H-TdRで標識し、未処理対照ウェル中の細胞に対するDNA合成のレベルを判定した。図３Ａは、固定化mAb Ki-1の存在がHD系の増殖にごくわずかな影響しか及ぼさないことを示している。対照的に、固定化AC10の存在は顕著な増殖抑制の結果となった。
キメラ化後、HD細胞系のL540、L540cyおよびL428、ならびにALCL系のKarpas-299に対するcAC10の力価測定を実施した。記載した濃度のcAC10を10倍過剰のヤギ抗ヒトIgGの存在下で溶液中に添加した。cAC10の効果を増強し、また、in vivoで起こりうるFcR介在架橋の効果をまねるため、架橋用抗体を添加した。CD30陽性ALCL系はcAC10に高度に感受性でIC50（細胞増殖の50％を抑制したmAbの濃度）が2 ng/mlだった。HD系、L428、L540およびL540cyはcAC10に対するIC50感受性がそれぞれ100 ng/ml、80 ng/mlおよび15 ng/mlを示した。並行研究で、非結合性対照mAbおよび架橋物で処理したこれらの細胞は、試験した濃度範囲ではDNA合成の低下を示さず（データは示していない）、またCD30陰性系 HL-60は試験した最高濃度でcAC10によるわずかな抑制を示しただけだった（図８）。
cAC10の細胞周期効果：
Hubingerらは、抗CD30 mAbが、アポトーシスの誘導を伴わずに細胞周期停止の誘導によって、Karpas-299を含むALCL細胞の増殖を抑制することができることを最近示した（Hubingerら、2001, Oncogene 20:590-598）。しかし、これらの抗体はHD細胞に対する抑制効果を持たず、ある場合には増殖を刺激した。cAC10のin vitroでの細胞周期効果をより綿密に調べるため、10μg/mlでヤギ抗ヒトIgGと複合体化させたcAC10 1.0μg/mlを含有する完全培地中で、HD細胞系、L540cyを培養した。表示した時間に、細胞をブロモデオキシウリジンで20分標識して新生DNA合成を検出し、ヨウ化プロピジウムで標識して総DNA含量を検出した。既報（Donaldsonら、1997, J.Immunol.Mech.203:25-33）のようにBecton Dickinson Cellfitを使用するフローサイトメトリーによって、細胞周期の時期について、標識細胞を分析した。
図９は、cAC10への曝露後のL540cy HD細胞中のDNA含量およびDNA合成の典型的なシフトを示す。第9.1節に記載し、表５に示すように、各区域の集団のパーセントを定量した。L540cyのcAC10への曝露は、未処理集団の40％から曝露2日後の13％へと、S期細胞の時間依存的減少をもたらした。これに整合して、この集団のG1含量は未処理細胞の40％から曝露3日後には65％へと増加した。G1含量より低い区域は、DNA断片化を受けているアポトーシス細胞を正確に示すものである（Donaldsonら、1997, J.Immunol.Mech.203:25-33）が、この集団は未処理集団の6％からcAC10曝露の48時間後では29％となった。これらのフローサイトメトリー研究は、ヘモサイトメーターを使用する並行色素排除アッセイによって確証された。色素排除によって測定すると、未処理L540cy細胞は93％が生存し、これはcAC10曝露の48時間後に72％に減少した。cAC10で処置したKarpas細胞はS期で40％からcAC10曝露の48時間後には11％へと同様の減少を示した（表５）。対照研究では、CD30陰性Ｂ細胞系 Daudiは細胞周期のごくわずかな変調のみを示し、cAC10での処理後のアポトーシスの増加はなかった（表５）。CD30に固定化したmAbがALCL細胞でアポトーシスを誘発した以前の研究（Mirら、2000, Blood 96:4307-43 12.）とは異なって、これらの細胞について可溶性cAC10および架橋用第２抗体によるアポトーシスはほとんどまたは全く観察されなかった。総合すると、これらのデータは、cAC10が成長停止およびG1集団の蓄積、ならびに両CD30陽性細胞系でのS期の減少を誘導したこと、さらにin vitroでL540cy HD細胞のアポトーシスを誘導したことを証明している。
Figure 0004303964
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１０． ホジキン病異種移植片に対するキメラAC10のin vivo効力
１０．１．材料および方法
ヒトホジキン病の異種移植モデル：
散在性HDモデルの場合は、C.B-17 SCIDマウスの尾部に1x107個のL540cy細胞を注入した。指定した時間にcAC10による処置を開始し、4日毎に合計5回の腹腔内注入によって投与した。動物を散在性疾患の徴候、特に後肢麻痺について、毎日評価した。その後、これらまたはその他の疾病の徴候を発症したマウスを犠牲にした。HDの局所性モデルについては、SCIDマウスの右側腹部にL540cy細胞を2x107個移植した。各群5匹の動物の平均腫瘍サイズが約50 mm3になったとき、cAC10による処置を開始した。処置は4日毎に合計5回のcAC10腹腔内注入とした。式(LxW2)/2を使用して、腫瘍サイズを判定した。
１０．２ 結果
L540cy細胞を使用してSCIDマウスにおけるcAC10のin vivo活性を評価した。マウスでのヒトHDモデルの樹立は困難であることがわかっている。免疫欠損マウスでの移植定着率が非常に低い他のHD由来細胞系とは異なって、L540cy HD腫瘍細胞モデルはSCIDマウスでうまく樹立することができる（Kappら、1994, Ann Oncol.5Suppl 1:121-126）。L540cy細胞を使用した2つの別個の疾患モデル、散在性モデルおよび局所性皮下腫瘍モデル、を使用して、cAC10のin vivo効力を評価した。
以前の研究で、SCIDマウスに静脈内注入されたL540cy細胞はヒトHDの散在性に匹敵する様相で拡散し、リンパ節への優先的局在を示すことが明らかにされている（Kappら、1994, Ann Oncol.5Suppl 1:121-126）。この散在性HDモデルでのcAC10を評価するため、C.B-17 SCIDマウスの尾部に1x107個のL540cy細胞を注入した。未処置マウス、または非結合性対照mAbで処置したマウスは、腫瘍細胞注入後30〜40日以内に、散在性疾病、特に後肢麻痺の徴候を発症した（図１０Ａ）。その後、これらまたはその他の疾病の徴候を発症したマウスをIACUCガイドラインにしたがって犠牲にした。腫瘍細胞の注入の１日後にcAC10による処置を開始し、4日毎に合計5回の腹腔内注入によって投与した。1回につき4 mg/kgの投薬計画を受けた全動物（5/5）、および1回につき1 mg/kgまたは2 mg/kgのいずれかを受けた動物の4/5が、疾病の徴候を示さずに120日（実験期間）より長く生存した。
その後の研究で、処置を開始する日を変更することによって、cAC10の効力をさらに検討した。この研究のため、０日目にL540cy細胞をSCIDマウスの尾部に注入し、１日目、5 日目または9日目のいずれかに処置を開始した（図１０Ｂ）。処置群のすべてに、q4dx5の計画を使用して、4 mg/kgでcAC10を投与した。前研究に一致して、cAC10は１日目に開始する処置を受けた動物の生存に顕著な影響を与え、140日後でも4/5の動物に疾病がなかった。処置の開始を遅らせたとき、cAC10は依然として有意な効力を明示し、5日目に開始する処置を受けた3/5の動物、および9日目に開始する処置を受けた2/5の動物が実験期間中に疾病を発症しなかった。
cAC10は皮下L540cy腫瘍モデルでも効力を示した。SCIDマウスの側腹部に2x107個の細胞を移植した。各群5匹の動物の平均腫瘍サイズが約50 mm3になったとき、cAC10による処置を開始した。処置は、散在性モデルと同用量、すなわち1回につき1、2、および4 mg/kgを使用して、4日毎に5回のcAC10腹腔内注入とした。未処置動物の腫瘍は急速に増殖し、34日目には平均で＞800 mm3に達した。cAC10は試験した全濃度で、用量依存的に腫瘍増殖の顕著な遅延をもたらした（図１０Ｃ）。
１１． ハイブリドーマ細胞系中で産生されたキメラAC10の皮下L540cyホジキン病異種移植片に対する抗腫瘍活性
１１．１ 材料および方法
ヒトIgG1-κ重鎖および軽鎖変換ベクターを使用し、基本的に既報のような相同的組換えによって、キメラAC10（cAC10）を作製した（Yarnold and Fell, 1994, Cancer Res.54:506-512）。これらのベクターは、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖定常領域遺伝子座を切除して、相同的組換えによって、ヒトγ1およびκ定常領域遺伝子座と置換するように、設計した。得られたキメラハイブリドーマ細胞系は、もとのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域とヒトγ1およびκ定常領域とで構成されるキメラ抗体を発現する。
１１．２ 結果
AC10のin vivo効力を評価するため、上記のようにSCIDマウスにL540cy細胞を皮下移植した。腫瘍が150 mm3より大きい平均サイズになったとき、マウスを2群に分けて、未処置、または2 mg/kgのcAC10による１週間に2回、合計5回の処置のいずれかとした。未処置マウスの腫瘍は600 mm3を超える平均サイズに急速に増殖した（図１１）。対照的に、cAC10で処置した動物の平均腫瘍サイズはほぼ同じサイズのままだった。
１２． キメラAC10-薬物コンジュゲートのin vitro活性
cAC10はCD30陽性細胞に選択的に細胞傷害剤を送達するのに使用することができる 。図１２に示すように、CD30陽性Karpas（ALCL）およびL540cy（HD）、ならびにCD30陰性Ｂ細胞系 Daudiについて、cAC10抗体-薬物コンジュゲート（ADC）によって送達された細胞傷害剤に対する相対的感受性を試験した。細胞傷害剤 AEBとコンジュゲートさせたcAC10（cAC10-AEB）に細胞を2時間曝露し、洗浄して遊離のADCを除去し、96時間後の細胞生存率を測定した。テトラゾリウム色素（XTT）還元アッセイによって細胞傷害性を判定した。Karpas 299およびL540cyの両方がcAC10-AEBコンジュゲートに感受性で、IC50値（細胞の50％を殺傷した濃度）は＜0.1マイクログラム/mlであった。対照的に、Daudi細胞に対するIC50値は＞10マイクログラム/mlであった。3種すべての細胞系がコンジュゲートさせないアウリスタチンE単独に対して同程度に感受性だった（データは示していない）。
１３． キメラAC10-薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
L540cyホジキン病異種移植片を持つSCIDマウスで、2001年4月30日出願の米国特許出願番号09/845,786 (この全体を参照により本明細書に組み入れる)に記載されているように、アウリスタチンE誘導体 AEBとコンジュゲートさせたキメラAC10の抗腫瘍活性を評価した（図１３）。マウスにL540細胞を皮下移植し、腫瘍がおよそ75 mm3の平均体積に到達した時点で、処置を開始した。処置は、cAC10-AEBを1回につき3 mg/kgもしくは10 mg/kgのいずれかで、4日おきに合計4回（q4dx4）投与することから成っていた。両投与量のcAC10-AEBを受けたマウスの全部で、腫瘍が完全に退縮し、腫瘍移植後18日目、処置開始の9日後に治癒した。これらの完全な退縮は実験期間にわたり事実上維持された。これらの結果は、アウリスタチンEなどの化学療法剤とコンジュゲートさせたキメラ抗CD30抗体がホジキン病に格別の効力を持ち得ることを証明している。
１４． 特定の実施形態、参照文献の引用
本発明は本明細書に記載した特定の実施形態によってその範囲を限定されるべきものではない。実際、上記の説明び添付する図面から、本明細書に記載するものの他に、本発明の多様な改変が当業者に明らかになるであろう。こうした改変も特許請求の範囲に含まれるものとする。
特許出願、特許および科学的出版物を含む各種の参照文献を本明細書に引用したが、これらの開示の全部を参照により本明細書に組み入れるものとする。
ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×104細胞／ウェルで10μg/mlの固定化AC10の存在下または不在下に培養したときの細胞増殖抑制を示した図である。 ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×103細胞／ウェルで10μg/mlの固定化AC10の存在下または不在下に培養したときの細胞増殖抑制を示した図である。 ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×104細胞／ウェルで0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1（20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加により架橋させてある）の存在下または不在下に培養したときの細胞増殖抑制を示した図である。 ホジキン病細胞系HDLM-2、L540、L428およびKM-H2を5×103細胞／ウェルで0.1μg/mlのAC10またはHeFi-1（20μg/mlのポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体の添加により架橋させてある）の存在下または不在下に培養したときの細胞増殖抑制を示した図である。 散在性(A)および皮下(B)L540cyホジキン病異種移植片におけるAC10（丸）およびHeFi-1（四角）の抗腫瘍活性を示した図である。 キメラAC10発現ベクターの模式図である。 AC10およびキメラAC10（cAC10）のCD30陽性Karpas-299への結合飽和を示した図である。 キメラAC10（cAC10）によるin vitro増殖阻害を示した図である。 L540cy HD細胞に対するキメラAC10の細胞周期効果を示した図である。 SCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病に対するキメラAC10（cAC10）の抗腫瘍活性を示した図である。 SCIDマウスにおける散在性L540cyホジキン病に対するcAC10の抗腫瘍活性を示した図である。 SCIDマウスにおける皮下L540cyホジキン病に対するcAC10の抗腫瘍活性を示した図である。 皮下L540cyホジキン病異種移植片におけるキメラAC10（cAC10）の抗腫瘍活性を示した図である。 キメラAC10によるCD30陽性細胞へのAEBの送達を示した図である。 L540cyホジキン病異種移植片を持担するマウスに対するキメラAC10-AEBコンジュゲートの活性を示した図である。
配列表
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Claims (17)

  1. ホジキン病の治療のために被験者に投与するための医薬の製造における抗体の使用であって、該抗体が、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) 細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、また、ホジキン病細胞系の細胞以外の細胞が存在しなくとも、ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼすものである、上記使用。
  2. 前記抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１に記載の使用。
  3. 前記抗体がCD30との結合についてモノクローナル抗体AC10と競合する、請求項２に記載の使用。
  4. 前記抗体がCD30との結合についてモノクローナル抗体HeFi-1と競合する、請求項２に記載の使用。
  5. 細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用が、
    (a) ホジキン病細胞系の培養物に前記抗体を72時間にわたり接触させること、ただし、該培養物は約0.33cm2の培養面積中に約5,000個の細胞を含むものであること、
    (b) 72時間のうち最後の8時間にわたり該培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露すること、そして
    (c) 該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定すること、
    を含む方法を行うことにより示され、
    その際、該培養物の細胞による3H-チミジン取り込みが、同一の条件下で培養したが該抗体に接触させていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して低下していれば、該抗体はホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を有する、請求項２に記載の使用。
  6. 前記抗体が、配列番号４、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含んでなる、請求項２に記載の使用。
  7. 前記抗体が、配列番号４、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含みかつ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも95％同一である重鎖可変領域と、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含みかつ配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも95％同一である軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項２に記載の使用。
  8. 前記抗体が配列番号２および配列番号１０のアミノ酸配列を含むそれぞれ重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項２に記載の使用。
  9. 前記抗体が配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含んでなる、請求項２に記載の使用。
  10. 前記抗体が細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
  11. (a) ホジキン病を治療するのに有効な量の、(i) CD30と免疫特異的に結合し、かつ(ii) 細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤にコンジュゲートさせなくとも、また、ホジキン病細胞系の細胞以外の細胞が存在しなくとも、ホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体、および
    (b) 製薬上許容される担体、
    を含有するホジキン病治療用の医薬組成物。
  12. 前記抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記抗体がCD30との結合についてモノクローナル抗体AC10と競合する、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記抗体がCD30との結合についてモノクローナル抗体HeFi-1と競合する、請求項１２に記載の医薬組成物。
  15. 細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用が、
    (a) ホジキン病細胞系の培養物に前記抗体を72時間にわたり接触させること、ただし、該培養物は約0.33cm2の培養面積中に約5,000個の細胞を含むものであること、
    (b) 72時間のうち最後の8時間にわたり該培養物を0.5μCiの3H-チミジンに曝露すること、そして
    (c) 該培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを測定すること、
    を含む方法を行うことにより示され、
    その際、該培養物の細胞による3H-チミジン取り込みが、同一の条件下で培養したが該抗体に接触させていない同一のホジキン病細胞系の細胞と比較して低下していれば、該抗体はホジキン病細胞系に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
  16. 前記抗体が配列番号２および配列番号１０のアミノ酸配列を含むそれぞれ重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項１２に記載の医薬組成物。
  17. 前記抗体が細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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