ES2339333T3 - Anticuerpos anti-cd30 recombinantes y usos de los mismos. - Google Patents
Anticuerpos anti-cd30 recombinantes y usos de los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2339333T3 ES2339333T3 ES01986050T ES01986050T ES2339333T3 ES 2339333 T3 ES2339333 T3 ES 2339333T3 ES 01986050 T ES01986050 T ES 01986050T ES 01986050 T ES01986050 T ES 01986050T ES 2339333 T3 ES2339333 T3 ES 2339333T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- baselineskip
- seq
- cells
- hodgkin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un anticuerpo que (i) se enlaza immunoespecíficamente con CD30 y (ii) por sí mismo ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de una conjugación a un agente citostático o citotóxico, respectivamente, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.
Description
Anticuerpos anti-CD30
recombinantes y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a anticuerpos y
a composiciones para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin,
comprendiendo la administración de un anticuerpo que enlaza con
CD30. Tales anticuerpos incluyen formas recombinantes/variantes de
los anticuerpos monoclonales AC10 y HeFi-1, y
derivados de los mismos. Esta invención se refiere a una clase nueva
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor CD30 los
cuales, en forma no modificada, son capaces de inhibir el
crecimiento de las células de la enfermedad de Hodgkin que expresan
CD30.
Los regímenes de quimioterapia curativa para la
enfermedad de Hodgkin representan uno de los avances más importantes
en la oncología clínica. Los regímenes de quimioterapia multiagente
han aumentado el índice de curación en más de un 80% para estos
pacientes. Sin embargo, el 3% de los pacientes mueren por causas
relacionadas con el tratamiento, y para los pacientes que no
responden a la terapia estándar o recaen después del tratamiento de
primera línea, la única modalidad de tratamiento disponible es de
dosis altas de quimioterapia en combinación con transplantes de
células madre. Este tratamiento se asocia a un 80% de incidencia de
mortalidad, morbilidad significante y un nivel de supervivencia de
cinco años inferior al 50% (véase p. ej., Engert, et al.,
1999, Seminars in Hematology 36:282-289).
La causa primaria de recaída tumoral es el
desarrollo de clones de células tumorales resistentes a los agentes
quimioterapéuticos. La inmunoterapia representa una estrategia
alternativa que puede evitar potencialmente la resistencia. Los
anticuerpos monoclonales para la focalización de células tumorales
malignas han sido el foco de varios enfoques inmunoterapéuticos.
Para diferentes malignidades, los programas terapéuticos basados en
anticuerpos son ahora una parte reconocida de la terapia estándar.
El anticuerpo anti-CD20 creado genéticamente
Rituxan®, por ejemplo, se aprobó a finales de 1997 para el
tratamiento del NHL recurrente de bajo grado.
CD30 es una glicoproteína de membrana de 120
kilodaltons (Froese et al., 1987, J. Immunol. 139:
2081-87) y un elemento de la superfamilia de
receptores de TNF. Esta familia incluye TNF-RI,
TNF-RII, CD30, CD40, OX-40 y RANK,
entre otros.
CD30 es un marcador probado de células malignas
en la enfermedad de Hodgkin (HD) y el linfoma de célula grande
anaplástico (ALCL), un subconjunto de linfomas diferentes de Hodgkin
(NHL) (Dürkop et al., 1992, Cell 88:421-427).
Originalmente identificado en células cultivadas de Reed Steinberg
de Hodgkin (H-RS) usando el anticuerpo monoclonal
Ki-1 (Schwab et al., 1982, Nature
299:65-67), CD30 se expresa con gran frecuencia en
la superficie de la célula de todos los linfomas de HD y de la
mayoría de ALCL, aún tiene una expresión muy limitada en tejidos
normales para pequeños números de células linfoides en las áreas
perifoliculares (Josimovic-Alasevic et al.,
1989, Eur. J. Immunol. 19:157-162). Anticuerpos
monoclonales específicos para el antígeno CD30 se han explorado como
vehículos para la administración de fármacos citostáticos, toxinas
de planta y radioisótopos en ambos modelos preclínicos y estudios
clínicos (Engert et al., 1990, Cancer Research
50:84-88; Barth et al., 2000, Blood
95:3909-3914). En pacientes con HD, la focalización
del antígeno CD30 podría conseguirse con dosis bajas del mAb
anti-CD30, BerH2 (Falini et al., 1992,
British Journal of Haematology 82:38-45). Aún más, a
pesar de la exitosa focalización in vivo de las células
tumorales malignas, ninguno de los pacientes experimentó regresión
tumoral. En una prueba clínica posterior, una toxina (saporin) se
conjugó químicamente con el anticuerpo BerH2 y los cuatro pacientes
demostraron reducciones rápidas y sustanciales de masa tumoral
(Falini et al., 1992, Lancet 339:
1195-1196).
Estas observaciones recalcan la validez del
receptor CD30 como un antígeno objetivo. No obstante, todos los
pacientes tratados con el conjugado de toxina mAb desarrollaron
anticuerpos para la toxina. Una de las limitaciones más importante
de las inmunotoxinas es su inmunogenicidad inherente que resulta en
el desarrollo de anticuerpos para la molécula de la toxina y
neutraliza sus efectos (Tsutsumi et al., 2000, Proc. Nat'l
Acad. Sci. U.S.A. 97:8545-8553). Adicionalmente, la
toxicidad del hígado y el síndrome de fuga vascular asociado a las
inmunotoxinas limita de forma potencial la capacidad para
administrar dosis curativas de estos agentes (Tsutsumi et
al., 2000, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A.
97:8545-8553).
El CD30 se identificó originalmente por el
anticuerpo monoclonal Ki-1 y se refirió inicialmente
como el antígeno Ki-1 (Schwab et al., 1982,
Nature 299:65-67). Este mAb se desarrolló contra las
células de Hodgkin y de Reed Stemberg (H-RS), las
células malignas de la enfermedad de Hodgkin (HD). Un segundo mAb,
capaz de unir un epítopo resistente a la formalina, diferente del
reconocido por Ki-1 se describió posteriormente
(Schwarting et al., 1989 Blood 74:1678-1689).
La identificación de cuatro anticuerpos adicionales resultó en la
creación del grupo de CD30 en el Tercer Seminario sobre la
Clasificación de Leucocitos (Third Leucocyte Typing Workshop) en
1986 (McMichael, A.., ed., 1987, Leukocyte Typing III (Oxford:
Oxford University Press).
La utilidad de los mAbs CD30 en el diagnóstico y
la estadificación de la HD llevados a su evaluación como
herramientas potenciales para la inmunoterapia. En pacientes con HD,
la focalización específica del antígeno CD30 se consiguió con dosis
bajas (30-50 mg) del mAb anti-CD30
BerH2 (Falini et al., 1992, British Journal of Haematology
82:38-45). A pesar de la exitosa focalización in
vivo de las células tumorales malignas H-RS,
ninguno de los pacientes experimentó regresiones tumorales.
En base a estos resultados, se concluyó que la
eficacia con la inmunoterapia prevista de mAb CD30 no podría
conseguirse con anticuerpos inmodificados (Falini et al.,
1992, Lancet 339:1195-1196). En una prueba clínica
posterior, el tratamiento de cuatro pacientes con HD refractaria con
una toxina, saporin, conjugada químicamente al mAb BerH2 demostró
reducciones rápidas y sustanciales, aunque transitorias, de masa
tumoral (Falini et al., 1992, Lancet
339:1195-1196). En los últimos años, los
investigadores han trabajado para refinar los enfoques para tratar
las células neoplásicas que expresan el CD30. Ejemplos incluyen el
desarrollo de inmunotoxinas de cadena única recombinantes (Bart
et al., 2000, Blood 95:3909-3914), mAbs
bi-específicos anti CD16/CD30 (Renner et al.,
2000, Cancer Immunol. Immunother. 49:173-180), y la
identificación de nuevos mAbs anti-CD30 que
previenen la liberación de moléculas CD30 de la superficie de la
célula (Horn-Lohrens et al., 1995, Int. J.
Cancer 60:539-544).
Este enfoque ha descartado el potencial de las
mAbs anti-CD30 con actividad de señalización en el
tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.
En la clonación y caracterización de la
actividad biológica del ligando CD30 humano (CD30L), se describieron
dos mAbs, M44 y M67, los cuales imitaban la actividad de la
reticulación receptora inducida de CD30L (Gruss et al., 1994,
Blood 83: 2045-2056). En ensayos in vitro,
estos mAbs, en su forma inmovilizada, fueron capaces de estimular la
proliferación de células T activadas y las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin de origen de células T, L540 y
HDLM-2. Por otra parte, estos mAbs tuvieron poco
efecto en las líneas celulares de Hodgkin con origen de célula B,
L428 y KM-H2 (Gruss et al., 1994, Blood
83:2045-2056). En todos estos ensayos, la unión del
receptor de CD30 por el mAb anti-CD30
Ki-1 tuvo poco efecto.
La actividad proliferativa de estos mAbs
anti-CD30 agonistas en las líneas celulares de
Hodgkin sugirió que las mAbs anti-CD30 que poseen
actividad de señalización no tendrían ninguna utilidad en el
tratamiento de HD.
Por otra parte, se ha mostrado recientemente que
los mAbs anti-CD30 pueden inhibir el crecimiento de
las células ALCL, incluyendo Karpas-299, induciendo
a la detención del ciclo celular y no induciendo a la apoptosis
(Hubinger et al., 2001, Oncogene 20:
590-598). Además, la presencia de los mAbs M44 y M67
inmovilizados inhibe fuertemente la proliferación de las líneas
celulares que representan el ALCL que expresa CD30 (Gruss et
al., 1994, Blood 83:2045-2056). Esta actividad
inhibitoria contra las líneas celulares del ALCL pasó a formar parte
de estudios en animales in vivo. La supervivencia del ratón
SCID portando xenotransplantes tumorales de ALCL aumentó
significativamente tras la administración del mAb M44. Además, el
mAb HeFi-1 anti-CD30, reconociendo
un epítopo similar al de M44, también prolongaba la supervivencia en
este modelo de animal (Tian et al., 1995, Cancer Research
55:5335-5341).
La mayoría de mAbs anti-CD30 de
murina conocidos en la técnica se han generado por inmunización de
ratones con líneas celulares de HD o antígeno CD30 purificado. El
AC10, originalmente denominado como C10 (Bowen et al., 1993,
J. Immunol. 151:5896-5906), es diferente por el
hecho de que este mAb anti CD30 que se preparó contra una línea
celular humana de tipo NK, YT (Bowen et al., 1993, J.
Immunol. 151:5896-5906). Inicialmente, la actividad
de señalización de este mAb se averiguó mediante la regulación a la
baja de la expresión de la superficie celular de las moléculas CD28
y CD45, la regulación a la alta de la superficie celular de la
expresión CD25 y la inducción a una unión homotípica seguida de la
adhesión de C10 a células YT.
HeFi-1 es un mAb
anti-CD30 que se produjo inmunizando ratones con la
línea celular de la enfermedad de Hodgkin L428 (Hecht et al.,
1985, J. Immunol. 134:4231-4236). El cocultivo de
HeFi-1 con las líneas celulares de la enfermedad de
Hodgkin L428 o L540 no consiguió revelar efecto directo alguno del
mAb en la viabilidad de estas líneas celulares. La actividad
antitumoral in vitro e in vivo de
HeFi-1 se describió por Tian et al contra la
línea celular de ALCL Karpas 299 (Tian et al., 1995, Cancer
Research 55:5335-5341).
Los anticuerpos monoclonales representan un
enfoque atractivo para focalizar poblaciones específicas de células
in vivo. Los mAbs nativos y sus derivados pueden eliminar
células tumorales mediante varios mecanismos incluyendo, pero no
limitándose a, la activación de complemento, la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la inhibición de la
progresión del ciclo celular y la inducción a la apoptosis (Tutt
et al., 1998, J. Immunol. 161:3176-3185).
Como se ha descrito anteriormente, los mAbs para
el antígeno CD30 tales como Ki-1 y
Ber-H2 no consiguieron demostrar actividad
antitumoral directa (Falini et al., 1992, British Journal of
Haematology 82:38-45; Gruss et al., 1994,
Blood 83:2045-2056). Mientras que algunos mAbs de
señalización para CD30, incluyendo M44, M67 y
HeFi-1, han demostrado inhibir el crecimiento de las
líneas ALCL in vitro (Gruss et al., 1994, Blood
83:2045-2056) o in vivo (Tian et al.,
1995, Cancer Res. 55:5335-5341), los anticuerpos
anti-CD30 conocidos no han demostrado ser eficaces
en la inhibición de la proliferación de células de HD en cultivo. De
hecho, dos mAbs de señalización anti-CD30, M44 y
M67, que inhibieron el crecimiento de la línea de ALCL
Karpas-299, mostraron realzar la proliferación de
líneas de HD de tipo células T in vitro mientras que no
mostraron ningún efecto en líneas de HD de tipo célula B (Gruss
et al., 1994, Blood 83:2045-2056).
El conjugado del anticuerpo Ki-1
con la cadena A de Ricina conllevó más bien a una immunotoxina
inefectiva y se concluyó que esta inefectividad se debía más bien a
la baja afinidad del anticuerpo Ki-1 (Engert et
al., 1990, Cancer Research 50:84-88). Otras dos
cuestiones también pueden explicar la toxicidad débil de los
conjugados de cadena A Ki-1-Ricina:
a) el anticuerpo Ki-1 mejora la liberación del sCD30
de las líneas celulares derivadas de Hodgkin L428 y L540 al igual
que de la línea celular de un linfoma diferente al de Hodgkin CD30+
Karpas 299 (Hansen et al., 1991, Immunobiol. 183:214); b) la
distancia relativamente grande del epítopo Ki-1 de
la membrana celular tampoco es favorable para la construcción de
inmunotoxinas potentes (Press et al., 1988, J. Immunol.
141:4410-4417; May et al., 1990, J. Immunol.
144:3637-3642).
La publicación PCT WO 96/22384 describe un
anticuerpo que se enlaza al antígeno CD30 y a) libera sCD30 a partir
de células de la enfermedad de Hodgkin en una cantidad de, o menor
de, el 10% y b) no enlaza con la célula B de un linfoma diferente al
de Hodgkin o con células de plasma en una extensión considerable y
es útil para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.
En el Cuarto Seminario sobre Antígenos de
Diferenciación de Leucocitos en Viena en febrero de 1989, los
anticuerpos monoclonales se sometieron por tres laboratorios
diferentes y finalmente se caracterizaron como pertenecientes al
grupo CD30. Los experimentos de cocultivo por los inventores de las
células L540 con diferentes anticuerpos según el nivel de la
técnica, seguidos del aislamiento de sCD30 a partir de fluidos
sobrenadantes del cultivo, revelaron que la liberación del sCD30 se
aumentó más fuertemente por el anticuerpo Ki-1, y
se mejoró débilmente por el anticuerpo HeFi-1,
mientras que a la vez se inhibe más fuertemente por el anticuerpo
Ber-H2. Sin embargo, el anticuerpo
Ber-H2 también categoriza una
sub-población de células de plasma (Schwarting et
al., 1988, Blood 74:1678-1689) y G. Pallesen (G.
Pallesen, 1990, Histopatology 16:409-413) describe,
en la página 411, que Ber-H2 reacciona en cruce con
un epítopo de un antígeno no relacionado el cual se altera por
formaldehído.
Existe una necesidad en la técnica de terapia
con eficacia aumentada para tratar o prevenir la enfermedad de
Hodgkin, una necesidad proporcionada por la presente invención.
Procesos clínicos y numerosas evaluaciones preclínicas no han
conseguido demostrar actividad tumoral de ciertos mAbs
anti-CD30 en forma inmodificada contra células
representativas de la enfermedad de Hodgkin. Bajo condiciones
similares a aquellas utilizadas por Gruss et al. en sus
evaluaciones de los mAbs Ki-1, M44 y M67 (Gruss
et al., 1994, Blood 83:2045-2056), los
inventores presentes demuestran una clase de mAbs de CD30
funcionalmente diferente a la previamente descrita. Esta clase de
mAbs anti-CD30 es capaz de inhibir el crecimiento
in vitro de todas las líneas de Hodgkin evaluadas. Además,
estos mAbs no modificados poseen actividad antitumoral in
vivo contra xenotransplantes tumorales de HD.
La citación o identificación de cualquier
referencia aquí no debe interpretarse como una admisión de que tal
referencia está disponible como técnica anterior a la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en el
descubrimiento sorprendente de una actividad nueva asociada a una
clase determinada de anticuerpos anti-CD30,
comprendiendo dicha clase AC10 y HeFi-1, incluyendo
su capacidad para inhibir el crecimiento de las células de la
enfermedad de Hodgkin (HD) de tipo T y de tipo B.
La presente invención proporciona un anticuerpo
que enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30 y (II) el mismo ejerce
un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la
enfermedad de Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto
citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de
Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente citostático o
citotóxico, respectivamente, para el uso en el tratamiento de la
enfermedad de Hodgkin.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de
Hodgkin que comprende:
- a)
- un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico que se enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30, (ii) el mismo ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de la conjugación a un agente citostático o citotóxico, respectivamente, en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin; y
- b)
- un portador aceptable farmacéuticamente.
La presente invención también proporciona el uso
de un anticuerpo que se enlaza (i) immunoespecíficamente a CD30 y
(ii) el mismo ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea
celular de la enfermedad de Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce
el efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la
enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente
citostático o citotóxico, respectivamente, en la producción de un
medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.
También se describe un método para el
tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin en un sujeto
comprendiendo la administración al sujeto, en una cantidad eficaz
para dicho tratamiento o prevención, de un anticuerpo que se enlaza
immunoespecíficamente a CD30 y ejerce un efecto citostático o
citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin, donde
dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o citotóxico en la
línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación
a un agente citostático o citotóxico, respectivamente; y un portador
farmacéuticamente aceptable. También se describe un método para el
tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin en un sujeto
comprendiendo la administración al sujeto de una cantidad de una
proteína, la cual compite por enlazarse con CD30 con el anticuerpo
monoclonal AC10 o HeFi-1, y ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin, cuya cantidad es eficaz para el tratamiento o prevención de
la enfermedad de Hodgkin. En una forma de realización, un anticuerpo
de la invención se conjuga a una molécula citotóxica. En otra forma
de realización, un anticuerpo de la invención es una proteína de
fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de una segunda
proteína tal como briodina o una enzima de conversión a un
profármaco. Los anticuerpos de la invención, incluyendo conjugados y
proteínas de fusión, pueden usarse conjuntamente con terapia de
radiación, quimioterapia, terapia hormonal y/o inmunoterapia.
La presente invención comprende además un
anticuerpo que se enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30, (ii)
ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la
enfermedad de Hodgkin, y (iii) no es el anticuerpo monoclonal AC10 o
HeFi-1 y no resulta del clivaje de AC10 o
HeFi-1 con papaina o pepsina. El anticuerpo puede
ejercer un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la
enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente
citostático o citotóxico, respectivamente.
La presente invención comprende además un
anticuerpo comprendiendo la SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO: 8,
SEC ID NO:12, SEC ID NO:14 o SEC ID NO:16, cuya proteína se enlaza
(i) immunoespecíficamente con CD30, y (ii) no es el anticuerpo
monoclonal AC10 y no resulta del clivaje de AC10 con papaina o
pepsina.
La presente invención comprende además un
anticuerpo comprendiendo la SEC ID NO:20, SEC ID NO:22, SEC ID
NO:24, SEC ID NO:28, SEC ID NO:30 o SEC ID NO:32, cuya proteína se
enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30, y (ii) no es el
anticuerpo monoclonal HeFi-1 y no resulta del
clivaje de HeFi-1 con papaina o pepsina.
La presente invención comprende además un
anticuerpo comprendiendo una secuencia de aminoácidos con al menos
un 95% de identidad con la SEC ID NO:2 o la SEC ID NO:10, cuya
proteína se enlaza (i) immunoespecíficamente a CD30; y (ii) no es el
anticuerpo monoclonal AC10 y no resulta del clivaje de AC10 con
papaina o pepsina.
La presente invención comprende además un
anticuerpo comprendiendo una secuencia de aminoácidos con al menos
un 95% de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO:26, cuya
proteína se enlaza (i) immunoespecíficamente a CD30; y (ii) no es el
anticuerpo monoclonal HeFi-1 y no resulta del
clivaje de HeFi-1 con papaina o pepsina, en una
cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfermedad de
Hodgkin.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica comprendiendo (a) un anticuerpo que se
enlaza (i) immunoespecíficamente a CD30, (ii) ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin, y (iii) no es el anticuerpo monoclonal AC10 o
HeFi-1 y no resulta del clivaje de AC10 o
HeFi-1 con papaina o pepsina, en una cantidad eficaz
para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b)
un portador farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo puede ejercer
un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la
enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente
citostático o citotóxico, respectivamente.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica que comprende (a) una proteína, cuya
proteína (i) compite por enlazarse con CD30 con el anticuerpo
monoclonal AC10 o HeFi-1, (ii) ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin, y (iii) no es el anticuerpo monoclonal AC10 o
HeFi-1 y no resulta del clivaje de AC10 o
HeFi-1 con papaina o pepsina, en una cantidad eficaz
para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b)
un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica comprendiendo (a) una proteína que
comprende la SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:12,
SEC ID NO:14 o SEC ID NO: 16, cuya proteína se enlaza (i)
immunoespecíficamente con CD30, y (ii) no es el anticuerpo
monoclonal AC10 y no resulta del clivaje de AC10 con papaina o
pepsina, en una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de
la enfermedad de Hodgkin; y (b) un portador farmacéuticamente
aceptable.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica que comprende (a) una proteína
comprendiendo la SEC ID NO:20, SEC ID NO:22, SEC ID NO:24, SEC ID
NO:28, SEC ID NO:30 o SEC ID NO:32, cuya proteína se enlaza (i)
immunoespecíficamente con CD30, y (ii) no es el anticuerpo
monoclonal HeFi-1 y no resulta del clivaje de
HeFi-1 con papaina o pepsina, en una cantidad eficaz
para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b)
un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica que comprende (a) una proteína
comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95%
de identidad con la SEC ID NO:2 o la SEC ID NO: 10, cuya proteína se
enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30; y (ii) no es el
anticuerpo monoclonal AC10 y no resulta del clivaje de AC10 con
papaina o pepsina, en una cantidad eficaz para el tratamiento o
prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b) un portador
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención comprende además una
composición farmacéutica que comprende: (a) una proteína
comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95%
de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO:26, cuya proteína
se enlaza (i) immunoespecíficamente con CD30; y (ii) no es el
anticuerpo monoclonal HeFi-1 y no resulta del
clivaje de HeFi-1 con papaina o pepsina, en una
cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfermedad de
Hodgkin; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización preferida, un
anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano, humanizado o
quimérico. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se
conjuga a un agente citotóxico. En otra forma de realización
preferida más, el anticuerpo es una proteína de fusión que comprende
la secuencia de aminoácidos de una segunda proteína que no es un
anticuerpo.
A la hora de determinar el efecto citostático de
los anticuerpos, de la invención en las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin, un cultivo de la línea celular de la
enfermedad de Hodgkin se pone en contacto con la proteína, siendo
dicho cultivo de aproximadamente 5.000 células en un área de cultivo
de aproximadamente 0,33 cm^{2}, el mismo poniéndose en contacto
durante un periodo de 72 horas; expuesto a 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina durante las 8 horas finales de
dicho periodo de 72 horas; y se mide la incorporación de
^{3}H-timidina en células del cultivo. El
anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea
celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han
reducido la incorporación de ^{3}H-timidina en
comparación con las células de la misma línea celular de la
enfermedad de Hodgkin cultivada bajo las mismas condiciones pero no
estando en contacto con el anticuerpo. Líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin adecuadas para determinar los efectos
citostáticos o citotóxicos de los anticuerpos de la invención son
L428; L450, HDLM2 o KM-H2.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo
monoclonal, preferiblemente un anticuerpo recombinante, y de la
forma más preferible es humano, humanizado, o quimérico.
También se describen ácidos nucleicos aislados
codificando una proteína, incluyendo pero no limitándose a un
anticuerpo, que compite por enlazarse con CD30 con el anticuerpo
monoclonal AC10 o HeFi-1, y ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin. También se describen métodos para aislar ácidos nucleicos
codificando anticuerpos que se enlazan immunoespecíficamente con
CD30 y ejercen un efecto citostático o citotóxico en una línea
celular de la enfermedad de Hodgkin. También se describen las
proteínas codificadas por cualquiera de los ácidos nucleicos
precedentes.
También se describe un método para producir una
proteína comprendiendo desarrollar una célula conteniendo una
secuencia de nucleótidos recombinante codificando una proteína, cuya
proteína compite por enlazarse con CD30 con el anticuerpo monoclonal
AC10 o HeFi-1 y ejerce un efecto citostático o
citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin, de
manera que la proteína se expresa por la célula; y recuperando la
proteína expresada.
También se describe un método para identificar
un anticuerpo anti-CD30 útil para el tratamiento o
prevención de la enfermedad de Hodgkin, comprendiendo determinar si
el anticuerpo anti-CD30 ejerce un efecto citostático
o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin
poniendo en contacto un cultivo de la línea celular de la enfermedad
de Hodgkin con la proteína, dicho cultivo siendo de aproximadamente
5.000 células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33
cm^{2}, dicho contacto teniendo un periodo de 72 horas; exponiendo
el cultivo a 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina
durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y midiendo
la incorporación de ^{3}H-timidina en células del
cultivo. El anticuerpo anti-CD30 tiene un efecto
citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de
Hodgkin y es útil para el tratamiento o prevención de la enfermedad
de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación
de ^{3}H-timidina en comparación con las células
de la misma línea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas
bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con
el anticuerpo anti-CD30.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Inhibición del crecimiento de líneas
celulares de la enfermedad de Hodgkin: las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 y
KM-H2 se cultivaron a 5x10^{4} células/pocillo en
presencia o en ausencia de 10 \mug/ml de AC10 inmovilizado. Se usó
Ki-1 como un control en estos ensayos. La
proliferación se midió mediante la incorporación de
^{3}H-timidina tras 72 horas de cultivo.
Fig. 2. Inhibición del crecimiento de líneas
celulares de la enfermedad de Hodgkin: las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 y
KM-H2 se cultivaron a 5x10^{3} células/pocillo en
presencia o en ausencia de 10 \mug/ml de AC10 inmovilizado. Se usó
Ki-1 como un control en estos ensayos. La
proliferación se midió mediante la incorporación de
^{3}H-timidina tras 72 horas de cultivo.
Fig. 3. Inhibición del crecimiento de líneas
celulares de la enfermedad de Hodgkin: las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 y
KM-H2 se cultivaron en 5x10^{4} células/pocillo en
presencia o en ausencia de 0,1 \mug/ml AC10 o
HeFi-1 que se había reticulado por la adición de 20
\mug/ml de anticuerpos policlonales de cabra
anti-IgG de ratón. La proliferación se midió
mediante la incorporación de ^{3}H-timidina
pasadas las 72 horas de cultivo.
Fig. 4. Inhibición del crecimiento de líneas
celulares de la enfermedad de Hodgkin: las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 y
KM-H2 se cultivaron en 5x10^{3} células/pocillo en
presencia o en ausencia de 0,1 \mug/ml de AC10 o
HeFi-1 que se había reticulado mediante la adición
de 20 \mug/ml de anticuerpos policlonales de cabra
anti-IgG de ratón. La proliferación se midió
mediante la incorporación de ^{3}H-timidina
pasadas las 72 horas de cultivo.
Fig. 5. Actividad tumoral de AC10 (círculos) y
HeFi-1 (cuadrados) en xenotransplantes de la
enfermedad de Hodgkin de L540cy diseminados (A) y subcutáneos (B).
A) Se implantaron 1x10^{7} células en ratones a través de la vena
caudal el día 0 y se les pusieron inyecciones intraperitoneales de
anticuerpo en 1 mg/kg/inyección usando un horario de administración
de q2dx10. B) Se implantaron subcutáneamente 2x10^{7} de células
L540cy en ratones. Cuando los tumores eran palpables los ratones se
trataron con inyecciones intraperitoneales de AC10 o
HeFi-1 en 2 mg/kg/inyección de q2dx10. En ambos
experimentos los ratones no tratados (X) no recibieron terapia.
Fig. 6. Vector de expresión quimérico AC10. El
ADN codificando la región variable de cadena pesada (Vp) del mAb
AC10 se unió a la secuencia codificando la región constante de la
gamma humana 1, y la región variable de cadena ligera (LV) AC10 se
unió de forma similar a la región constante de la kappa humana en
diferentes vectores de clonación. Las secuencias quiméricas de
cadena pesada y ligera se clonaron en el plásmido pDEF14 para la
expresión del anticuerpo monoclonal quimérico intacto en células
CHO. pDEF14 utiliza el promotor del gen alfa 1 del factor de
alargamiento del Hámster chino que conduce la transcripción de genes
heterólogos (Patente U.S. nº.
5.888.809).
5.888.809).
Fig. 7. Saturación de unión de AC10 y de AC10
quimérico (cAC10) para Karpas-299 positivo de CD30.
Se combinaron células con concentraciones en aumento de AC10 o cAC10
durante 20 minutos, se lavaron con un 2% de PBS/PBS (medios de
coloración) para eliminar el rnAb libre y se incubaron con
anticuerpos de cabra anti FITC de ratón o con anticuerpos de cabra
anti FITC humano, respectivamente. Las células marcadas se lavaron
otra vez con medios de coloración y se examinaron mediante
citometría de flujo. Las intensidades de fluorescencia medias
resultantes se fijaron con respecto a la concentración de mAb como
se describe en la sección 9.1.
Fig 8. Inhibición del crecimiento in
vitro mediante AC10 quimérico (cAC10). Las líneas CD30 positivas
y la línea CD30 negativa HL-60 se colocaron en
placas de 5.000 células/pocillo. Se añadió AC10 quimérico en las
concentraciones registradas en presencia de un exceso multiplicado
por 10 correspondiente de anticuerpo de cabra
anti-IgG humano. La inhibición porcentual relativa a
pocillos de control no tratados se fijó en relación a la
concentración de cAC10.
Fig. 9. Efectos cíclicos celulares de AC10
quimérico en células de HD L540cy. Las células se trataron con 1
pg/ml de cAC10 y 10 pg/ml de anticuerpo secundario de cabra
anti-humano. En los momentos en que las células
indicadas se marcaron con BrdU, se permeabilizaron y se mancharon
con anti-BrdU para detectar la síntesis de ADN
naciente (panel inferior), y se mancharon con yodina de propidio
para detectar el contenido de ADN total (panel superior). De los
paneles superiores, el perfil G_{1}, la fase S y el contenido de
G_{2} manchando mediante P1 y los paneles inferiores
muestran contenido y síntesis de ADN según se detecta mediante la
incorporación de BrdU. Las regiones 2, 5 y 3 designan G_{1}, la
fase S y G_{2} respectivamente. La región 4, conteniendo ADN del
sub-contenido de G_{2} no experimenta una síntesis
de ADN y la región 6, el ADN del sub-contenido de
G_{1}, indica células con fragmentación de ADN apoptótico
(Donaldson et al., 1997, J. Immunol. Meth.
203:25-33).
Fig 10. Eficacia del AC10 quimérico en modelos
de HD. La (A) actividad antitumoral de cAC10 en L540cy diseminado de
la enfermedad de Hodgkin en ratones SCID. Grupos de ratones
(cinco/grupo) o bien quedaron sin tratarse (X) o recibieron 1
(\boxempty), 2, (\Delta) o 4 (\medbullet) mg/kg de cAC10
(q4dx5) desde el día 1 después de la inoculación tumoral. (B) El
L540cy diseminado de la enfermedad de Hodgkin en ratones SCID donde
grupos de ratones (cinco/grupo) o bien quedaron sin tratarse (X) o
recibieron terapia iniciada o bien el día 1 (\boxempty), el día 5
(\Delta), o el día 9 (\medbullet) por cAC10 administrado en 4
mg/kg usando una planificación de q4dx5. (C) Modelo tumoral
subcutáneo L540cy de HD en ratones SCID. A los ratones se les
implantaron 2x10^{7} células de L540cy de la enfermedad de Hodgkin
en el lado adecuado. Grupos de ratones (cinco/grupo) o bien quedaron
sin tratarse (X) o recibieron 1 (\boxempty), 2, (\Delta) o 4
(\medbullet) mg/kg de AC10 quimérico (q4dx5; \ding{115})
empezando cuando el tamaño tumoral en cada grupo de 5 animales tenía
un promedio de \sim50 mm^{3}.
Fig. 11. Actividad antitumoral de AC10 quimérico
(cACO) en xenotransplantes subcutáneos de L540cy de la enfermedad de
Hodgkin. A los ratones SCID se les implantaron subcutáneamente
células de L540cy y cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de
>150 mm^{3} los ratones o bien quedaron sin tratarse (X) o se
trataron con cAC10 (\boxempty) en 2 mg/kg dos veces por semana
mediante 5 inyecciones.
Fig. 12. Administración de AEB a células
positivas CD30 a través de AC10 quimérico. Las células de las líneas
celulares indicadas se expusieron al AC10 quimérico conjugado al
agente citotóxico AEB, un derivado de auristatin E (el conjugado se
describe en la solicitud U.S. nº. 09/845,786 solicitada el 30 de
abril de 2001). La viabilidad celular en porcentaje de control se
fija sobre la concentración del conjugado de fármaco cAC10 que se
administró.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Fig. 13. Actividad de conjugado de
AC10-AEB quimérico en ratones portadores de
xenotransplantes de la enfermedad de Hodgkin de L540cy. A los
ratones se les implantaron células de L540cy subcutáneamente. AC10
quimérico conjugado al agente citotóxico AEB, un derivado de
auristatin E, se administró en dosis indicadas con un total de 4
dosis en intervalos de 40 días. El volumen tumoral en mm^{3} se
fija durante días después de la implantación tumoral.
La presente invención se refiere a anticuerpos
que enlazan con CD30 y ejercen un efecto citostático o citotóxico en
células de HD. La invención se refiere además a anticuerpos que
compiten con AC 10 o HeFi-1 por enlazarse con CD30 y
ejercen un efecto citostático o citotóxico en células de HD. En una
forma de realización preferida, el anticuerpo es AC10 o
HeFi-1, de la forma más preferible un AC10 o
HeFi-1 humanizado o quimérico.
La invención también se refiere a anticuerpos
codificados por y a secuencias de nucleótidos de genes AC10 y
HeFi-1. La invención se refiere además a fragmentos
y otros derivados y análogos de tales anticuerpos AC10 y
HeFi-1. También se describen ácidos nucleicos
codificando tales fragmentos o derivados. La producción de los
anticuerpos anteriormente descritos, p. ej., por métodos
recombinantes, está descrita.
La invención también se refiere a anticuerpos
AC10 y HeFi-1 y derivados incluyendo anticuerpos de
fusión/quimé-
ricos funcionalmente activos, es decir, capaces de mostrar un enlace con CD30 y ejercer un efecto citostático o citotóxico en células de HD.
ricos funcionalmente activos, es decir, capaces de mostrar un enlace con CD30 y ejercer un efecto citostático o citotóxico en células de HD.
Los anticuerpos para CD30 comprendidos por la
invención incluyen anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados, y
anticuerpos de este tipo conjugados a agentes citotóxicos tales como
fármacos quimioterapéuticos.
También se describen métodos para tratar o
prevenir la HD comprendiendo la administración de una composición
comprendiendo una proteína o ácido nucleico sólo o en combinación
con un agente citotóxico, incluyendo pero no limitándose a un
fármaco quimioterapéutico.
Para clarificar la descripción, y no a modo de
limitación, la descripción detallada de la invención se divide en
las subsecciones que siguen.
La presente invención comprende anticuerpos que
enlazan con CD30 y ejercen efectos citostáticos y/o citotóxicos en
células HD. La invención también se refiere a anticuerpos que
compiten con AC10 o HeFi-1 para enlazarse con CD30 y
ejercer un efecto citostático o citotóxico en células de HD.
La presente invención comprende además
anticuerpos que comprenden, o de forma alternativa que consisten en,
un CDR de HeFi-1 (SEC ID NO:20, SEC ID NO:22, SEC ID
NO:24, SEC ID NO:28, SEC ID NO:30 o SEC ID NO:32) o AC10 (SEC ID
NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO: 12, SEC ID NO:14, o SEC
ID NO:16).
La presente invención comprende además
anticuerpos que comprenden, o de forma alternativa que consisten en,
una región variable de HeFi-1 (SEC ID NO:18 o SEC ID
NO:26) o AC10 (SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 10). Abajo se proporciona
una tabla que indica la región de AC10 o HeFi-1 a la
que cada SEC ID nº corresponde:
\newpage
La presente invención además comprende derivados
funcionales o análogos de AC10 y HeFi-1. Como se
utiliza en este caso, el término "funcional" en el contexto de
un anticuerpo de la invención indica que el anticuerpo es 1) capaz
de enlazarse con CD30 y 2) ejerce un efecto citostático y/o
citotóxico en células de HD.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Generalmente, los anticuerpos de la invención se
enlazan immunoespecíficamente con CD30 y ejercen efectos
citostáticos y citotóxicos en células malignas en la HD. Los
anticuerpos de la invención son preferiblemente monoclonales, y
pueden ser anticuerpos multiespecíficos, humanos, humanizados o
quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de Fab,
fragmentos de F(ab'), fragmentos producidos por una
biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de enlace de CD30 de
cualquiera de los de arriba. El término "anticuerpo", como se
usa aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes
immunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir,
moléculas que contienen un sitio de unión del antígeno que se enlaza
immunoespecíficamente con CD30. Las moléculas de inmunoglobulina de
la invención pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE,
IgM, IgD, IgA y Igi), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y
IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
En determinadas formas de realización de la
invención, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo humano de
unión de antígenos de la presente invención e incluyen, pero no se
limitan a, Fab, Fab' y F(ab')_{2}, Fd, FVs monocatenario
(scFv), anticuerpos monocatenarios, FVs enlazado de disulfuro (sdFv)
y fragmentos comprendiendo un dominio o bien VL o VH. Fragmentos de
anticuerpo de unión de antígenos, incluyendo anticuerpos
monocatenarios, pueden comprender la(s) región(es)
variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad
o una parte de lo siguiente: región de articulación, dominios CH1,
CH2, CH3 y CL. También se incluyen en la invención fragmentos de
unión de antígenos comprendiendo también cualquier combinación de
región(es) variable(s) con una región de articulación,
dominios CH1, CH2, CH3 y CL. Preferiblemente, los anticuerpos son
humanos, de murina (p. ej., ratón y rata), asno, oveja, conejo,
cabra, cobaya, camélido, caballo, o pollo. Como se utiliza aquí, los
anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos teniendo la
secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen
anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana, a
partir de células B humanas, o a partir de animales transgénicos
para una o más inmunoglobulinas humanas, como se describe abajo y,
por ejemplo en la patente estadounidense nº. 5.939.598 por
Kucherlapati et al.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de
multiespecificidad superior. Los anticuerpos multiespecíficos pueden
ser específicos para epítopos diferentes de CD30 o pueden ser
específicos tanto para CD30 como para una proteína heteróloga.
Véase, p. ej., las publicaciones PCT WO 93/17715, WO 92/08802, WO
91/00360, WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol.
147:60-69; patentes U.S. Nos. 4.474.893, 4.714.681,
4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kostelni et al., 1992, J.
Immunol. 148:1547-1553.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
describirse o especificarse en cuanto a los CDRs particulares que
estos comprenden. En determinadas formas de realización los
anticuerpos de la invención comprenden uno o más CDRs de AC10 y/o
HeFi-1. La invención comprende un anticuerpo o
derivado del mismo comprendiendo un dominio variable de cadena
pesada o ligera, comprendiendo dicho dominio variable (a) un
conjunto de tres CDRs, en el cual dicho conjunto de CDRs es del
anticuerpo monoclonal AC10 o HeFi-1, y (b) un
conjunto de cuatro regiones de armazón, en cuyo conjunto de regiones
de armazón se difiere del conjunto de regiones de armazón en el
anticuerpo monoclonal AC10 o HeFi-1,
respectivamente, y en el cual dicho anticuerpo o derivado del mismo
se enlaza immunoespecíficamente con CD30.
En una forma de realización específica, la
invención comprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo
un dominio variable de cadena pesada, comprendiendo dicho dominio
variable (a) un conjunto de tres CDRs, en el cual dicho conjunto de
CDRs comprende las SEC ID NO:4, 6, ó 8 y (b) un conjunto de cuatro
regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de regiones de
armazón se difiere del conjunto de regiones de armazón en el
anticuerpo monoclonal AC10, y en el cual dicho anticuerpo o derivado
del mismo se enlaza immunoespecíficamente con
CD30.
CD30.
En una forma de realización específica, la
invención comprende un anticuerpo o derivado comprendiendo un
dominio variable de cadena pesada, comprendiendo dicho dominio
variable (a) un conjunto de tres CDRs, en el cual dicho conjunto de
CDRs comprende las SEC ID NO:20, 22 o 24 y (b) un conjunto de cuatro
regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de regiones de
armazón difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo
monoclonal HeFi-1, y en el cual dicho anticuerpo o
derivado del mismo se enlaza immunoespecíficamente con CD30.
En una forma de realización específica, la
invención encierra un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo
un dominio variable de cadena ligera, comprendiendo dicho dominio
variable (a) un conjunto de tres CDRs, en el cual dicho conjunto de
CDRs comprende las SEC ID NO: 12, 14 o 16, y (b) un conjunto de
cuatro regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de regiones de
armazón difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo
monoclonal AC 10, y en el cual dicho anticuerpo o derivado del mismo
se enlaza immunoespecíficamente con CD30.
En una forma de realización específica, la
invención comprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo
un dominio variable de cadena ligera, comprendiendo dicho dominio
variable (a) un conjunto de tres CDRs, en el cual dicho conjunto de
CDRs comprende las SEC ID NO:28, 30, o 32, y (b) un conjunto de
cuatro regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de regiones de
armazón difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo
monoclonal HeFi-1, y en el cual dicho anticuerpo o
derivado del mismo se enlaza immunoespecíficamente con CD30.
Adicionalmente, los anticuerpos de la presente
invención también pueden estar descritos o especificados en cuanto a
sus estructuras primarias. Los anticuerpos teniendo al menos un 50%,
al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%,
al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%,
al menos un 95% y de la forma más preferible al menos un 98% de
identidad (calculado usando métodos conocidos en la técnica y
descritos aquí) con las regiones variables y AC10 o
HeFi-1 también se incluyen en la presente invención.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse
o especificarse en cuanto a su afinidad de enlace con CD30. Las
afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante
de disociación o Kd
menor que 5 X 10^{-2} m, 10^{-2} m, 5 X 10^{-3} m, 10^{-3} m, 5 X 10^{-4} m, 10^{-4} m, 5 X 10^{-5} m, 10^{-5} m, 5 X 10^{-6} m, 10^{-6} m,
5 X 10^{-7} m, 10^{-7} m, 5 X 10^{-8} m, 10^{-8} m, 5 X 10^{-9} m, 10^{-9} m, 5 X 10^{-10} m, 10^{-10} m, 5 X 10^{-11} m, 10^{-11} m,
5 X 10^{-12} m, 10^{-12} m, 5 X 10^{-13} m, 10^{-13} m, 5 X 10^{-14} m, 10^{-14} m, 5 X 10^{-15} m, ó 10^{-15} m.
menor que 5 X 10^{-2} m, 10^{-2} m, 5 X 10^{-3} m, 10^{-3} m, 5 X 10^{-4} m, 10^{-4} m, 5 X 10^{-5} m, 10^{-5} m, 5 X 10^{-6} m, 10^{-6} m,
5 X 10^{-7} m, 10^{-7} m, 5 X 10^{-8} m, 10^{-8} m, 5 X 10^{-9} m, 10^{-9} m, 5 X 10^{-10} m, 10^{-10} m, 5 X 10^{-11} m, 10^{-11} m,
5 X 10^{-12} m, 10^{-12} m, 5 X 10^{-13} m, 10^{-13} m, 5 X 10^{-14} m, 10^{-14} m, 5 X 10^{-15} m, ó 10^{-15} m.
Los anticuerpos de la invención incluyen
derivados modificados, es decir, mediante la fijación covalente de
cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la fijación
covalente no previene al anticuerpo de enlazarse con CD30 o de
ejercer un efecto citostático o citotóxico en células de HD. Por
ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados del anticuerpo
incluyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante
glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación,
derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, rotura
proteolítica, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se
puede realizar cualquiera de las diferentes modificaciones químicas
por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitándose a rotura
química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de
tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener
uno o más aminoácidos no tradicionales.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los
anticuerpos policlonales para CD30 pueden producirse por diferentes
procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el CD30
puede administrarse a diferentes animales huésped incluyendo, pero
no limitándose a, conejos, ratones, ratas, etc. para inducir la
producción de sueros conteniendo anticuerpos policlonales
específicos para la proteína. Pueden usarse diferentes adyuvantes
para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies
huésped, e incluyendo pero no limitándose a, el de Freund (completo
e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio,
sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles
plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceites,
hemocianinas de la lapa cerradura, dinitrofenol, y adyuvantes
humanos útiles de forma potencial tales como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y corinebacterium parvum.
Tales adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica
incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de
exposición en fago, o una combinación de las mismos. Por ejemplo,
los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de
hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica y enseñadas,
por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory
Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed., 1988);
Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and
T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier,
N.Y., 1981). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza
aquí no está limitado a los anticuerpos producidos mediante
tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se
refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, incluyendo
cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método
por el cual se produce.
Los métodos para producir y seleccionar
anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son
rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no
limitativo, los ratones pueden inmunizarse con CD30 o una expresión
de la célula de CD30 o un fragmento o derivado del mismo. Una vez se
ha detectado una respuesta inmunitaria, p. ej., se han detectado
anticuerpos específicos para CD30 en el suero del ratón, se recoge
el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplenocitos se
fusionan después por técnicas bien conocidas para cualquier célula
de mieloma adecuada, por ejemplo células de la línea celular SP20
disponibles a partir del ATCC.
Los hibridomas se seleccionan y clonan por
dilución limitada. Los clones del hibridoma se evalúan después por
métodos conocidos en la técnica para células que segregan
anticuerpos capaces de enlazarse con CD30. El fluido ascítico, que
contiene generalmente niveles altos de anticuerpos, puede generarse
inyectando clones de hibridoma positivos a los ratones.
También se describen métodos para generar
anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el
método que comprende el cultivo de una célula de hibridoma
secretando un anticuerpo de la invención donde, preferiblemente, el
hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados a partir de un
ratón inmunizado con un antígeno de la invención con células de
mieloma y después seleccionando los hibridomas que resultan de la
fusión para los clones de hibridoma que segregan un anticuerpo capaz
de enlazarse con CD30.
Fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos
específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo,
los fragmentos de Fab y F(ab')_{2} de la invención pueden
producirse por rotura proteolítica de moléculas de inmunoglobulina,
usando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos de Fab)
o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')_{2}). Los
fragmentos de F(ab')_{2} contienen la región variable, la
región constante de cadena ligera y el dominio CH 1 de cadena
pesada.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente
invención también pueden generarse usando diferentes métodos de
exposición en fago conocidos en la técnica. En métodos de exposición
en fago, se muestran dominios de anticuerpos funcionales en la
superficie de partículas de fago que portan las secuencias de ácidos
nucleicos codificándolas. En una forma de realización particular,
tal fago puede utilizarse para mostrar dominios de unión de
antígenos expresados a partir de un repertorio o librería de
anticuerpos combinatoria (p. ej., humanos o de murina). En métodos
de exposición en fago, se muestran dominios de anticuerpos
funcionales en la superficie de partículas de fago que portan las
secuencias de ácidos nucleicos que las codifican. En particular, las
secuencias de ADN que codifican los dominios V_{H} y V_{L} se
amplifican a partir de bancos de ADNc animal (p. ej., tejidos
oflimfoides de bancos de ADNc humano o de murina). El ADN que
codifica los dominios V_{H} y V_{L} se recombina junto con un
enlazador scFv por PCR y se clona en un vector fagémido (p. ej., p
CANTAB 6 o pComb 3 HSS).
El vector se somete a electroporación en E.
coli y el E. coli se infecta con fago auxiliar. El fago
usado en estos métodos es típicamente fago filamentoso incluyendo fd
y dominios de unión M13 expresados a partir del fago con dominios de
anticuerpos de Fab, FV o FV de disulfuro estabilizado
recombinantemente fusionados bien a la proteína del gen III o gen
VIII de fago. El fago expresando un dominio de unión de antígenos
que enlaza con CD30 o una parte de unión de AC10 o HeFi del mismo
puede seleccionarse o identificarse con antígeno p. ej.,
usando antígeno marcado o antígeno enlazado o capturado en una
superficie sólida o reborde. Ejemplos de métodos de exposición en
fago que pueden utilizarse para hacer los anticuerpos de la presente
invención incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J.
Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al.,
1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough
et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958;
Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton
et al., 1994, Advances in Immunology,
191-280; número de solicitud de PCT. PCT/GB91/01
134; Publicaciones PCT WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO
92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401; y los números de
patente estadounidense 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717,
5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637,
5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias de arriba,
después de la selección de fago, las regiones codificantes de
anticuerpos de fago pueden aislarse y usarse para generar
anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier
otro fragmento enlazante de antígenos deseado, y expresado en
cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células
de insecto, células vegetales, levadura, y bacterias, p. ej., como
se describe en detalle más abajo. Por ejemplo, las técnicas para
producir de forma recombinante fragmentos de Fab, Fab' y
F(ab')_{2} también pueden emplearse usando métodos
conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación
PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 1992,
12(6):864-869; y Sawai et al., 1995,
AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science
240: 1041-1043.
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para
producir FVs monocatenarios y anticuerpos incluyen los descritos en
las patentes estadounidenses nos. 4.946.778 y 5.258.498; Huston
et al., 1991, Methods in Enzymology
203:46-88; Shu et al., 1993, PNAS
90:7995-7999; y Skerra et al., 1988, Science
240:1038-1040. Para algunos usos, incluyendo el uso
in vivo de anticuerpos en seres humanos y en ensayos de
citotoxicidad o de proliferación in vitro, es preferible usar
anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos. Un anticuerpo
quimérico es una molécula en la cual las diferentes partes del
anticuerpo se derivan de distintas especies animales, tales como
anticuerpos con una región variable derivada de un anticuerpo
monoclonal de la murina y una región constante de la inmunoglobulina
humana. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos
quiméricos. Véase p. ej., Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi
et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al.,
1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes
estadounidenses nos. 5.807.715, 4.816.567, y 4.816.397.
Los anticuerpos humanizados son de moléculas de
anticuerpos a partir de anticuerpos de especies no humanas que
enlazan con el antígeno deseado teniendo uno o más CDRs a partir de
las especies no humanas y las regiones constantes y de armazón a
partir de una inmunoglobulina humana. Frecuentemente, los residuos
de armazón en las regiones de armazón humanas se sustituirán por el
residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar,
preferiblemente mejorar, el enlace de antígeno. Estas sustituciones
del armazón se identifican por métodos bien conocidos en la técnica,
p. ej., modelando las interacciones de los residuos de CDR y del
armazón para identificar residuos de estructura importantes para el
enlace de antígenos y la comparación de secuencia para identificar
residuos del armazón inusuales en posiciones particulares. (Véase,
p. ej., Queen et al., patente estadounidense nº. 5.585.089;
Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.
Los anticuerpos pueden humanizarse usando una
variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo, por
ejemplo, injertos de CDR (EP 239.400; publicación PCT WO 9 1/09967;
patentes estadounidenses Nos. 5.225.539, 5.530.101, y 5.585.089),
revistiendo o renovando la capa superficial (EP 592.106; EP 519.596;
Padlan, Molecular Immunology, 1991,
28(4/5):489-498; Studnicka et al.,
1994, Protein Engineering 7(6):805-814;
Roguska. et al., 1994, PNAS 91:969-973), y
redistribuyendo la cadena (patente estadounidense nº.
5.565.332).
Los anticuerpos completamente humanos son
particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de
pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden crearse por una
variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo los métodos
de exposición en fago anteriormente descritos usando bibliotecas de
anticuerpos derivadas de secuencias de la inmunoglobulina humana.
Véase también, las patentes U.S. Nos. 4.444.887 y 4.716.111, y las
publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO
98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
Los anticuerpos humanos también pueden
producirse usando ratones transgénicos que expresen genes de la
inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de
inmunoglobulina humanos de cadena pesada y ligera pueden
introducirse de forma aleatoria o por recombinación homóloga en
células madre embrionarias de ratón. Los genes de inmunoglobulina de
ratón de cadena pesada y ligera pueden restituirse de forma no
funcional separadamente o simultáneamente a la introducción de
lugares geométricos de la inmunoglobulina humana por recombinación
homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH
impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre
embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos
para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se
reproducen después para producir descendencia homocigota que exprese
anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la
forma normal con un antígeno seleccionado, p. ej., todos o una parte
de CD30. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno
pueden obtenerse a partir de los ratones inmunizados y transgénicos
usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de
inmunoglobulina humana albergados en los ratones transgénicos se
reordenan durante la diferenciación de la célula B, y posteriormente
experimentan conmutación de clase y mutación somática. Así, usando
tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM y IgE
terapéuticamente útiles. Para una visión de conjunto de esta
tecnología para producir anticuerpos humanos, véase, Lonberg and
Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para una
discusión detallada sobre esta tecnología para producir anticuerpos
humanos y anticuerpos humanos monoclonales y protocolos para
producir anticuerpos de este tipo, véanse, p. ej., las publicaciones
PCT WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096, WO 96/33735, la patente
europea nº. 0 598 877; las patentes estadounidenses Nos. 5.413.923,
5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318,
5.885.793, 5.916.771. Además, compañías tales como Abgenix, inc.
(Freemont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden comprometerse a
proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno
seleccionado usando tecnología similar a la anteriormente
descrita.
Los anticuerpos completamente humanos que
reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una
técnica referida como "selección guiada". En este enfoque un
anticuerpo monoclonal no-humano seleccionado, p.
ej., un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de
un anticuerpo completamente humano reconociendo el mismo epítopo.
(Jespers et al., 1994, Bio/technology
12:899-903).
Además, los anticuerpos para CD30 pueden,
sucesivamente, utilizarse para generar anticuerpos
anti-idiotipo que "imiten" a proteínas de la
invención usando técnicas bien conocidas por los expertos en la
técnica. (Véase, p. ej., Greenspan & Bona, 1989, FASEB J.
7(5):437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol.
147(8):2429-2438). Fragmentos de Fab de tales
anti-idiotipos pueden usarse en regímenes
terapéuticos para suscitar una respuesta inmunitaria propia
individual contra el CD30 y las células de HD.
La invención también comprende anticuerpos, que
inhiben competitivamente la unión de AC10 o HeFi-1
con CD30 como se ha determinado por cualquier método conocido en la
técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los
inmunoensayos descritos aquí. En formas de realización preferidas,
el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de AC10 o
HeFi-1 con CD30 al menos en un 50%, más
preferiblemente al menos en un 60%, aún más preferiblemente al menos
en un 70%, y de la forma más preferible al menos en un 75%. En otras
formas de realización, el anticuerpo inhibe competitivamente la
unión de AC10 o HeFi-1 con CD30 en al menos un 80%,
al menos un 85%, al menos un 90%, o al menos un 95%.
Como se discute en más detalle abajo, el
anticuerpo de la presente invención puede usarse o bien sólo o en
combinación con otras composiciones en la prevención o tratamiento
de la HD. Los anticuerpos pueden además conjugarse químicamente
(incluyendo conjugaciones de manera covalente y no covalente) a
agentes citotóxicos, proteínas u otras composiciones. Por ejemplo,
los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse o
conjugarse recombinantemente a moléculas útiles como
quimioterapéuticos o toxinas, o comprender un radionucleido para el
uso como un radioterapéutico. Véase, p. ej., las publicaciones PCT
WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624, la patente estadounidense nº.
5.314.995, y EP 396.387.
Las proteínas pueden producirse
recombinantemente fusionando la región codificante de uno o más de
los CDRs de un anticuerpo de la invención en la estructura con una
codificación de secuencia para una proteína heteróloga. La proteína
heteróloga puede proporcionar una o más de las siguientes
características: beneficios añadidos terapéuticos; promueven la
expresión estable de la proteína proporcionan unos medios para
facilitar la expresión recombinante de rendimiento elevado de la
proteína; o proporcionan un dominio de multimerización.
Además de las proteínas que comprenden uno o más
CDRs de un anticuerpo de la invención, las proteínas pueden
identificarse usando cualquier método adecuado de selección para
interacciones proteína-proteína. Inicialmente, las
proteínas se identifican por enlazarse con CD30, entonces se puede
determinar su capacidad para ejercer un efecto citostático o
citotóxico en células de HD. Entre los métodos tradicionales que se
pueden emplear están las técnicas de "clonación por
interacción" las cuales implican evaluar las bibliotecas de
expresión con CD30 marcado de modo similar a la técnica de la
evaluación del anticuerpo de las bibliotecas de \lambdagt11,
supra. A modo de ejemplo y no de limitación, esto puede
conseguirse de la siguiente manera: un clon de ADNc que codifica
CD30 (o un dominio de unión de AC10 o HeFi-1 del
mismo) se modifica en el extremo insertando el sitio de
fosforilación para la quinasa del músculo del corazón (HMK) (Blanar
& Rutter, 1992 Science 256:1014-1018). La
proteína recombinante se expresa en E. coli y se purifica en
una columna de afinidad con GDP hasta su homogeneidad (Edery et
al., 1988, Gene 74:517-525) y se marca usando
\gamma^{32}P-ATP y (Sigma) quinasa de músculo de
corazón bovino a una actividad específica de 1x10^{8} cpm/\mug,
y se usa para seleccionar genoteca de ADNc de É...gt11 de una
placenta humana en un "ensayo Far Western" (Blanan &
Rutten, 1992 Science 256:1014-1018). Las placas que
interactúan con la sonda CD30 se aíslan Los insertos de ADNc de
placas de É... positivo se liberan y se subclonan en un vector
adecuado para la secuenciación, tal como Ks PBluescript
(Stratagene).
Un método que detecta interacciones de proteínas
in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe en detalle
con objetivos ilustrativos solamente y no a modo de limitación. Se
ha descrito una versión de este sistema (Chien et al., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 88:9578-9582) y está
comercialmente disponible a través de Clontech (Palo Alto, CA).
Brevemente, utilizando tal sistema, los
plásmidos se construyen de manera que codifican dos proteínas
híbridas: uno consiste en el dominio de enlace de ADN de una
proteína activadora de transcripción fusionada con CD30, y el otro
consiste en el dominio de activación de la proteína activadora
fusionado con una proteína desconocida que está codificada por un
ADNc que se ha recombinado en este plásmido como parte de una
genoteca de ADNc. Los plásmidos se transforman en una cadena de la
levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen
indicador (p. ej., lacZ) cuya región reguladora contiene los sitios
de unión del activador de la transcripción. Cualquier proteína
híbrida por sí misma no puede activar la transcripción del gen
indicador, el híbrido del dominio de enlace de ADN no puede porque
no proporciona la función de activación, y el híbrido del dominio de
activación no puede porque no puede localizar los sitios de unión
activadores. La interacción de las dos proteínas híbridas
reconstruye la proteína funcional activadora y resulta en la
expresión del gen indicador, que se detecta por un ensayo sobre el
producto del gen
indicador.
indicador.
El sistema de dos híbridos o la metodología
relacionada puede utilizarse para seleccionar bibliotecas de
dominios de activación para proteínas que interactúen con CD30, que
en este contexto es un producto genético "trampa". Las
secuencias totalmente genómicas o de ADNc se fusionan con el ADN
codificando un dominio de activación. Esta librería y un plásmido
codificando un híbrido de una región de codificación CD30 (por
ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de
CD30 conocido por interactuar con HeFi-1 o AC10)
fusionado con el dominio de unión de ADN se cotransforman en una
cadena indicadora de la levadura, y de los transformantes
resultantes se seleccionan los que expresan el gen indicador. Por
ejemplo, y no a modo de limitación, la región de codificación de
CD30 puede clonarse en un vector de manera que se fusiona
traduccionalmente con el ADN que codifica el dominio de enlace de
ADN de la proteína Gal4. Estas colonias se purifican y los plásmidos
de la librería responsables de la expresión del gen indicador se
aíslan La secuenciación de ADN se usa después para identificar las
proteínas codificadas por los plásmidos de la librería.
Una vez se identifica una proteína de enlace de
CD30, su capacidad (sola o al multimerizarse o fusionarse con un
dominio de dimerización o multimerización) para producir un efecto
citostático o citotóxico en células HD se determina poniendo en
contacto un cultivo de una línea celular de HD, tal como L428, L450,
HDLM2 o KM-H2, con la proteína. Las condiciones de
cultivo son de la forma más preferible de aproximadamente 5.000
células en una área de cultivo de aproximadamente 0,33 cm^{2}, y
siendo el periodo de contacto de aproximadamente 72 horas. El
cultivo se expone después a 0.5 \muCi de
^{3}H-timidina durante las 8 horas finales del
periodo de 72 horas y se mide la incorporación de
^{3}H-timidina en las células de cultivo. La
proteína tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea
celular de HD si las células del cultivo han reducido la
incorporación de ^{3}H-timidina en comparación con
las células de la misma línea celular cultivada bajo las mismas
condiciones pero no estando en contacto con la proteína.
Sin limitación en cuanto al mecanismo de acción,
una proteína tiene preferiblemente más de un sitio de unión de CD30
y en consecuencia una capacidad para reticular moléculas de CD30.
Las proteínas que se enlazan con CD30 o compiten por enlazarse a
CD30 con AC10 o HeFi-1 pueden adquirir la capacidad
de inducir efectos citostáticos o citotóxicos en células de HD al
dimerizarse o multimerizarse. Donde la proteína de unión de CD30 es
una proteína monomérica, puede expresarse en serie, dando de ese
modo como resultado una proteína con múltiples sitios de unión de
CD30. Los sitios de unión de CD30 pueden separarse por una región
del enlazador flexible. En otra forma de realización, las proteínas
de unión de CD30 pueden reticularse químicamente, por ejemplo usando
gluteraldehido, antes de la administración. En una forma de
realización preferida, la región de unión de CD30 se fusiona con una
proteína heteróloga, donde la proteína heteróloga comprende un
dominio de dimerización y multimerización. Antes de la
administración de la proteína a un sujeto con motivo de tratar o
prevenir la HD, tal proteína está sujeta a condiciones que permiten
la formación de un homodímero o heterodímero. Un heterodímero, como
se utiliza en este caso, puede comprender dominios de dimerización
idénticos pero regiones de unión de CD30 diferentes, idénticos
dominios de unión de CD30 pero diferentes regiones de dimerización,
o diferentes regiones de unión de CD30 y dominios de
dimerización.
Son dominios de dimerización particularmente
preferidos los que se originan a partir de factores de
transcripción.
En una forma de realización, el dominio de
dimerización es el de un cierre de leucina de la región básico
("bZIP"). Las proteínas de bZIP poseen de forma característica
dos dominios: un dominio estructural de cierre de leucina y un
dominio básico rico en aminoácidos básicos, separado por un dominio
"de horquilla" (C. Vinson et al., 1989, Science,
246:911-916). Dos proteínas de bZIP se dimerizan
formando una región de la bobina enrollada en la cual se dimerizan
los dominios del cierre de leucina. Por consiguiente, estas regiones
de la bobina enrollada pueden usarse como compañeras de fusión para
las proteínas.
Son dominios de cierre de leucina
particularmente útiles aquellos del factor de transcripción de la
levadura GCN4, el factor de transcripción mamífera
CCAAT/estimulador-proteína C de unión/EBP, y la
transformación nuclear en productos de oncogenes, Fos y Jun (véase
Landschultz et al., 1988, Science
240:1759-1764; Baxevanis y Vinson, 1993, Curr. Op.
Gen. Devel., 3:278-285; y O'Shea et al.,
1989, Science, 243:538-542).
En otra forma de realización, el dominio de
dimerización es el de una proteína de
hélice-bucle-hélice de una región
básica ("bHLH") (Murre et al, 1989, Cell,
56:777-783). Las proteínas bHLH también están
compuestas por dominios específicos, la estructura de las cuales
permite reconocer e interactuar con secuencias específicas de ADN.
La región de hélice-bucle-hélice
promueve la dimerización a través de sus hélices amfipáticas de un
modo análogo al de la región de cierre de leucina de las proteínas
bZIP (Davis et al., 1990 Cell, 60:733-746;
Voronova y Baltimore, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:4722-4726). Son proteínas hHLH particularmente
útiles mic, max, y mac.
Los heterodímeros se conocen por formarse entre
Fos y Jun (Bohmann et al., 1987, Science,
238:1386-1392), entre miembros de la familia de
ATF/CREB (Hai et al.. 1989, Genes Dev.,
3:2083-2090), entre miembros de la familia de C/EBP
(Cao et al., 1991, Genes Dev., 5:1538-1552;
Williams et al., 1991, Genes Dev.,
5:1553-1567; y Román et al., 1990, Genes
Dev., 4:1404-1415), y entre miembros de las
familias de ATF/CREB y de Fos/Jun Hai y Curran, 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88:3720-3724). En consecuencia,
cuando se administra una proteína a un sujeto como un heterodímero
comprendiendo dominios de dimerización diferentes, se puede usar
cualquier combinación de las anteriores.
Como se ha descrito anteriormente, los
anticuerpos de la invención se enlazan con CD30 y ejercen un efecto
citostático o citotóxico en células de HD. Métodos para demostrar la
capacidad de un anticuerpo de la invención para enlazarse con CD30
se describen aquí.
En los anticuerpos de la invención se puede
analizar su unión inmunoespecífica con CD30 por cualquier método
conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse incluyen
pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no
competitivos usando técnicas tales como Western blots,
radioinmunoanálisis, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas),
inmunoensayos de "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación,
reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de
gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de
fijación de complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos
fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, sólo por nombrar unos
pocos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica
(véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, Vol.. 1,
John Wiley & Sons, Inc., New York,). Inmunoensayos ejemplares se
describen brevemente abajo (pero no se utilizan a modo de
limitación).
Los protocolos de inmunoprecipitación
generalmente comprenden el lisado de una población de células en un
tampón de lisis tal como el tampón RIPA (1% de NP-40
o Tritón X-100, 1% de deoxicolato de sodio, 0.1% de
SDS, 0.15 M de NaCl, 0.01 M de fosfato sódico a pH 7.2, 1% de
Trasilol) suplementado con fosfatasa de proteína y/o inhibidores de
proteasa (p. ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio),
añadiendo el anticuerpo al lisado de la célula, incubando durante un
periodo temporal (p. ej., de 1-4 horas) a 40ºC,
añadiendo microesferas de sefarosa de proteína A y/o proteína G al
lisado de la célula, incubando durante aproximadamente una hora o
más a 40ºC, lavando las microesferas en el tampón de lisis y
resuspendiendo las microesferas en SDS/muestra del tampón. La
capacidad del anticuerpo para inmunoprecipítar CD30 puede analizarse
mediante, p. ej., el análisis Western blot. Un experto en la técnica
entendería en cuanto a los parámetros que estos pueden modificarse
para aumentar la unión del anticuerpo con CD30 y reducir el fondo
(p. ej., precompensando el lisado de la célula con microesferas de
sefarosa). Para más información sobre protocolos de
inmunoprecipitación véase, p. ej., Current Protocols in Molecular
Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en
10.16.1.
El análisis Western blot generalmente comprende
preparar muestras de proteína, la electroforesis de las muestras de
proteína en un gel de poliacrilamida (p. ej., un 8%-20% de
SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del
antígeno), transferir la muestra de proteína del gel de
poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nilón,
incubar la membrana en solución de bloqueo (p. ej., PBS con un 3% de
BSA o leche no grasa), lavar la membrana en tampón de lavado (p.
ej., PBS-Tween 20), bloquear la membrana con
anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo
anti-CD30 putativo) diluido en tampón de bloqueo,
lavar la membrana en tampón de lavado, incubar la membrana con un
anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, p. ej.,
un anticuerpo anti-humano) conjugada para un
sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa
alcalina) o molécula radiactiva (p. ej., ^{32}P ó ^{125}I)
diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado,
y detectar la presencia del anticuerpo secundario. Un experto en la
técnica entendería en cuanto a los parámetros que estos pueden
modificarse para aumentar la señal detectada y para reducir el ruido
de fondo. Para mayor discusión sobre protocolos de Western blot
véase, p. ej., Ausubel et al., Eds., Current Protocols in
Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York a
10.8.1.
Los ELISA comprenden preparar el antígeno (es
decir, CD30), revestir el pocillo de una placa de microtitulación de
96 pocillos con el CD30, añadir el anticuerpo conjugado a un
compuesto detectable tal como uno enzimático (p. ej., peroxidasa de
rábano o fosfatasa alcalina) al pocillo e incubar durante un periodo
de tiempo, y detectar la presencia del anticuerpo. En los ELISA el
anticuerpo no tiene que conjugarse a un compuesto detectable; en
cambio, un segundo anticuerpo (el cual reconoce el anticuerpo de
interés) conjugado a un compuesto detectable puede añadirse al
pocillo. Además, en vez de revestir el pocillo con el antígeno, el
anticuerpo puede revestirse por el pocillo. En este caso, un segundo
anticuerpo conjugado a un compuesto detectable puede añadirse tras
la adición de proteína CD30 al pocillo revestido. Un experto en la
técnica entendería que los parámetros pueden modificarse para
aumentar la señal detectada al igual que otras variaciones de los
ELISA conocidas en la técnica. Para mayor discusión relacionada con
los ELISA véase, p. ej., Ausubel et al., Eds., Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc.,
Nueva York a 11.2.1.
La afinidad de enlace de un anticuerpo con CD30
y la velocidad de interacción de un anticuerpo CD30 puede
determinarse por ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un
ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoanálisis que comprende
la incubación de CD30 marcado (p. ej., ^{3}H ó ^{125}I) con el
anticuerpo de interés en presencia de cantidades en aumento de CD30
no marcado, y la detección del enlace del anticuerpo con el CD30
marcado. La afinidad del anticuerpo por CD30 y las velocidades de
unión pueden determinarse a partir de los datos mediante un análisis
Scatchard plot. La competición con un segundo anticuerpo (tal como
AC10 o HeFi-1) también puede determinarse usando
radioinmunoanálisis. En este caso, el CD30 se incuba con el
anticuerpo de interés conjugado a un compuesto marcado (p. ej.,
^{3}H o ^{125}I) en presencia de cantidades en aumento de un
segundo anticuerpo no marcado.
En los anticuerpos de la invención también puede
analizarse su capacidad para enlazarse con CD30 mediante un ensayo
estándar conocido en la técnica. Tales ensayos incluyen far Westerns
y el sistema de dos híbridos de levadura. Estos ensayos se describen
en la sección 5.2, arriba. Otra variación en la técnica de far
Western anteriormente descrita implica la medición de la capacidad
de un anticuerpo candidato marcado para enlazarse con CD30 en una
Western blot. En un ejemplo no limitativo de una Western blot, el
CD30 o el fragmento de interés del mismo se expresa como una
proteína de fusión comprendiendo además
glutationa-S-transferasa (GST) y un
sitio de reconocimiento de la serina/treonina quinasa de proteína
(tal como un sitio de reconocimiento de la quinasa dependiente de
AMPc). La proteína de fusión se purifica en microesferas de Sefarosa
de glutationa (Pharmacia Biotech) y se marca con quinasa de corazón
bovino (Sigma) y 100 \muCi de ^{32}P-ATP
(Amersham). Los anticuerpos de prueba de interés se separan mediante
SDS-PAGE y se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa, después se incuban con el CD30 marcado. Luego, la
membrana se lava y la radioactividad se cuantifica. A la inversa, el
anticuerpo de interés puede marcarse por el mismo método y se usa
para probar una membrana de nitrocelulosa sobre la que se ha
transferido el CD30.
Por definición, un anticuerpo de la invención
debe ejercer un efecto citostático o citotóxico en una célula de HD.
Líneas celulares HD adecuadas para este propósito incluyen L428,
L450, HDLM2 y KM-H2 (la totalidad de los cuales está
disponible a través de la Colección Alemana de Microorganismos y
Cultivos de Células (DMSZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH)).
Muchos métodos para determinar si un anticuerpo
ejerce un efecto citostático o citotóxico en una célula se conocen
por los expertos en la técnica, y pueden utilizarse para averiguar
si una proteína en particular es una proteína de la invención.
Ejemplos ilustrativos de métodos de este tipo se describen
abajo.
Un vez se ha identificado un anticuerpo de
manera que ambos (i) se enlazan con CD30 y (ii) ejercen un efecto
citostático o citotóxico en células de HD, su valor terapéutico se
valida en un modelo animal, como se describe en la Sección 6,
abajo.
En una forma de realización preferida, se puede
determinar si un anticuerpo ejerce un efecto citostático o
citotóxico en una línea celular de HD poniendo en contacto un
cultivo de 5.000 células de la línea celular de HD en un área del
cultivo de aproximadamente 0,33 cm^{2} con el anticuerpo durante
un periodo de 72 horas. Durante las últimas 8 horas del periodo de
72 horas, el cultivo se expone a 0.5 \muCi de
^{3}H-timidina. La incorporación de
^{3}H-timidina en células del cultivo se mide
después. El anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en
la línea celular de HD y es útil para el tratamiento o prevención de
la HD si las células del cultivo que estuvieron en contacto con el
anticuerpo han reducido la incorporación de
^{3}H-timidina en comparación con las células de
la misma línea celular de HD cultivada bajo las mismas condiciones
pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo
anti-CD30.
Hay muchos ensayos de citotoxicidad conocidos
por los expertos en la técnica. Algunos de estos ensayos miden la
necrosis, mientras que otros miden la apoptosis (muerte programada
de la célula). La necrosis va acompaña de una permeabilidad
aumentada de la membrana plasmática; las células se hinchan y la
membrana plasmática se rompe en unos minutos. En cambio, la
apoptosis se caracteriza por el blebbing de la membrana, la
condensación del citoplasma y la activación de endonucleasas
endógenas. Sólo uno de estos efectos en células de HD es suficiente
para mostrar que un anticuerpo de enlace de CD30 es útil en el
tratamiento o prevención de la HD como una alternativa a los ensayos
de medición de efectos citostáticos o citotóxicos anteriormente
descritos.
En una forma de realización, la necrosis medida
por la capacidad o incapacidad de una célula para aceptar un
colorante tal como rojo neutral, azul de tripán, o ALAMAR (Page
et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476).
En tal ensayo, las células se incuban en medios conteniendo el
colorante, las células se lavan, y el colorante restante, reflejando
la aceptación celular del colorante, se mide
espectrofotométricamente.
En otra forma de realización, el colorante es
sulforhodamina B (SRB), cuya unión con anticuerpos puede usarse como
una medida de citotoxicidad (Skehan et al., 1990, J. Nat'l
Cancer Inst. 82:1107-12).
En otra forma de realización más, una sal de
tetrazolio, tal como MTT, se usa en un ensayo colorimétrico
cuantitativo de supervivencia y proliferación de la célula mamífera
detectando células vivas, pero no muertas (véase, p. ej., Mosmann,
1983, J. Immunol. Métodos 65:55-63).
En otra forma de realización más, las células
apoptóticas se miden en el compartimento unido y en el
"flotante" del cultivo. Ambos compartimentos se recogen
eliminando el sobrenadante, tripsinizando las células unidas, y
combinando ambas preparaciones después de una fase de lavado de
centrifugado (10 minutos, 2000 r.p.m.). El protocolo para tratar
cultivos de células tumorales con sulindac y compuestos relacionados
para obtener una cantidad significante de apoptosis se ha descrito
en la bibliografía (véase, p. ej., Piazza et al., 1995,
Cancer Research 55:3110-16). Las características de
este método incluyen recoger las células flotantes y unidas, la
identificación de los tiempos de tratamiento y rango de dosis
óptimos para observar la apoptosis, y la identificación de
condiciones óptimas de cultivo celular.
En otra forma de realización más, la apoptosis
se cuantifica midiendo la fragmentación de ADN. Hay disponibles
métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa
in vitro de la fragmentación de ADN. Ejemplos de ensayos de
este tipo, incluyendo TUNEL (que detecta incorporación de
nucleótidos marcados en ADN fragmentado) y ensayos basados en ELISA,
se describen en Biochemica, 1999, nº. 2, págs. 34-37
(Roche Molecular Biochemicals).
En otra forma de realización más, la apoptosis
se puede observar morfológicamente. Tras el tratamiento con un
anticuerpo de prueba, se pueden analizar cultivos para apoptosis y
necrosis por microscopía fluorescente después del marcado con
naranja de acridina y bromuro de etidio. El método para medir el
número de células apoptóticas se ha descrito previamente por Duke
& Cohen, 1992, Current Protocols In Immunology, Coligan et
al., eds., 3.17.1-3.17.16. En otro modo de la
forma de realización, las células pueden marcarse con el yoduro de
propidio del colorante del ADN, y las células en las que se han
observado cambios morfológicos tales como condensación de cromatina
y marginación a lo largo de la membrana nuclear interna,
condensación citoplásmica, blebbing de membrana aumentado y
contracción celular.
En otra forma de realización más, los efectos
citotóxicos y/o citostáticos pueden determinarse midiendo el nivel
de incorporación de bromodeoxiuridina. Las células se cultivan en
medios completos con un anticuerpo de prueba. En momentos
diferentes, las células se marcan con bromodeoxiuridina para
detectar la síntesis de ADN naciente, y con yodina de propidio para
detectar el contenido de ADN total. Las células marcadas se analizan
para averiguar la posición del ciclo celular por citometría de flujo
usando el programa informático Cellfit de
Becton-Dickinson tal y como se describe
anteriormente (Donaldson et al., 1997, J. Immunol. Meth.
203:25-33). Un ejemplo de uso de la incorporación de
bromodeoxiuridina para determinar los efectos citostáticos y/o
citotóxicos de los anticuerpos anti-CD30 de la
invención se describe en la Sección 9, abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen ácidos nucleicos
comprendiendo una secuencia de nucleótidos codificando una proteína,
y fragmentos de la misma. Los ácidos nucleicos preferiblemente
codifican uno o más CDRs de anticuerpos que enlazan con CD30 y
ejercen efectos citotóxicos o citostáticos en células de HD. Ácidos
nucleicos ejemplares comprenden la SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SÉC ID
NO:7, SEC ID nº: 11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:15, SEC ID NO:19, SEC
ID NO:21, SEC ID NO:23, SEC ID NO:27, SEC ID NO:29 o SEC ID NO:31.
Los ácidos nucleicos preferidos comprenden la SEC ID NO:1, SEC ID
NO:9, SEC ID NO: 17, ó SEC ID NO:25. (véase la Tabla 1 en las
páginas 9-10, arriba, para la identificación del
dominio de AC10 o HeFi-1 a los cuales estos
identificadores de secuencia corresponden).
También se describen ácidos nucleicos que
hibridan bajo condiciones de hibridación rigurosas, moderadas o de
baja astringencia, para los ácidos nucleicos, preferiblemente,
ácidos nucleicos codificando un anticuerpo de la invención.
A modo de ejemplo y no de limitación, a
continuación hay procedimientos que usan tales condiciones de baja
astringencia para regiones de hibridación de alrededor de 90
nucleótidos (véase también Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 78,: 6789-6792). Los filtros
conteniendo ADN se pretratan durante 6 horas a 40ºC en una solución
conteniendo un 35% de formamida, 5X de SSC, 50 mM de
tris-HCl (a pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.1% de PVP, 0.1%
de Ficoll, 1% de BSA, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado. Las hibridaciones se realizan en la misma solución
con las modificaciones siguientes: un 0,02% de PVP, un 0,02% de
Ficoll, 0,2% de BSA, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, un
10% (p/vol) de sulfato de dextrano, y se usa una sonda marcada con
^{32}P de 5-20 X 106 cpm. Los filtros se incuban
en una mezcla de hibridación durante 18-20 h a 40ºC,
y después se lavan durante 1,5 H a 55ºC en una solución que contiene
2X de SSC, 25 mM de tris-HCl (a pH 7.4), 5 mM de
EDTA, y un 0,1% de SDS. La solución de lavado se sustituye por una
solución fresca y se incuba durante 1,5 h adicional a 60ºC. Los
filtros se transfieren secos y se exponen a autoradiografía. Si es
necesario, los filtros se lavan una tercera vez a
65-68ºC y se reexponen a una película. Otras
condiciones de astringencia baja que pueden usarse se conocen bien
en la técnica (p. ej., como se emplea para las hibridaciones de
cruces de especies).
Además, a modo de ejemplo y no de limitación,
los procedimientos que usan tales condiciones de alta astringencia
para regiones de hibridación de más de 90 nucleótidos son de la
siguiente manera. La prehibridación de filtros conteniendo ADN se
realiza durante 8 h o durante toda la noche a 65ºC en un tampón
compuesto por 6X de SSC, 50 mM de tris-HCl (a pH
7.5), 1 mM de EDTA, 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.02% de BSA, y
500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los
filtros se hibridizan durante 48 H a 65 \ring{A}\tilde{a}C en
una mezcla de prehibridación conteniendo 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y una sonda marcada con ^{32}P
de 5-20 X 10^{6} cpm. El lavado de filtros se
realiza a 37ºC durante 1 h en una solución conteniendo 2X de SSC, un
0,01% de PVP, un 0,01% de Ficoll, y un 0,01% de BSA. Esto va seguido
por un lavado en 0,1X de SSC a 50ºC durante 45 min antes de la
autoradiografía.
Otras condiciones de alta astringencia que
pueden usarse dependen de la naturaleza del ácido nucleico (p. ej.
longitud, contenido de GC, etc.) y el propósito de la hibridación
(detección, amplificación, etc.) y se conocen en la técnica. Por
ejemplo, la hibridación rigurosa de un ácido nucleico de
aproximadamente 15-40 bases a una secuencia
complementaria en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se
realiza bajo las condiciones siguientes: una concentración de sal de
50 mM de KCl, una concentración de tampón de 10 mM de
tris-HCl, una concentración de Mg^{2+} de 1,5 mM,
un pH de 7-7.5 y una temperatura de reconocimiento
de 55-60ºC.
En otra forma de realización específica, se
provee un ácido nucleico hibridizable a un ácido nucleico, o su
complemento, bajo condiciones de astringencia moderada. La selección
de condiciones apropiadas para este tipo de astringencias se conoce
bien en la técnica (véase p. ej., Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; véase también,
Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular
Biology series of laboratory technique manuals, ©
1987-1997, Current Protocols, ©
1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).
Pueden obtenerse los ácidos nucleicos, y puede
determinarse la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos
determinados, por cualquier método conocido en la técnica. Por
ejemplo, si la secuencia de nucleótidos de la proteína se conoce, un
ácido nucleico codificando el anticuerpo puede ensamblarse a partir
de oligonucleótidos químicamente sintetizados (p. ej., como se
describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo
que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos de
superposición conteniendo partes de la secuencia codificando la
proteína, el recocido y el ligado de estos oligonucleótidos, y
después la amplificación de los oligonucleótidos ligados por
PCR.
De forma alternativa, un ácido nucleico
codificando una proteína puede generarse a partir de ácido nucleico
de una fuente adecuada. Si un clon conteniendo un ácido nucleico
codificando una proteína particular no está disponible, pero la
secuencia de la molécula de la proteína se conoce, un ácido nucleico
codificando la proteína puede sintetizarse químicamente u obtenerse
a partir de una fuente adecuada (p. ej., una genoteca de ADNc tal
como una genoteca de ADNc de un anticuerpo o una genoteca de ADNc
generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente poli A+ ARN,
aislado a partir de, cualquier tejido o célula expresando la
proteína. Si la proteína es un anticuerpo, la fuente de la librería
puede ser células del hibridoma seleccionadas para expresar el
anticuerpo de la invención) por amplificación de PCR usando
cebadores sintéticos hibridizables a los extremos 3' y 5' de la
secuencia o clonando usando una sonda de oligonucleótidos específica
para la secuencia de genes particular a identificar, p. ej., un clon
de ADNc a partir de una genoteca de ADNc que codifica la proteína.
Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse
entonces en vectores de clonación replicables usando cualquier
método bien conocido en la técnica.
Una vez se han determinado la secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes de los
anticuerpos, la secuencia de nucleótidos de la proteína puede
manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la
manipulación de secuencias de nucleótidos, p. ej., técnicas de ADN
recombinantes, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véanse, por ejemplo,
las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., eds., 1998,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY),
para generar anticuerpos con una secuencia de aminoácidos diferente,
por ejemplo para crear sustituciones de aminoácido, deleciones, y/o
inserciones.
En una forma de realización específica, la
proteína es un anticuerpo, y la secuencia de aminoácidos de los
dominios variables de cadena pesada y/o ligera pueden inspeccionarse
para identificar las secuencias de las CDRs por métodos que se
conocen bien en la técnica, p. ej., por comparación con secuencias
de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena
pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de
secuencia. Usando técnicas de ADN recombinantes rutinarias, una o
más de las CDRs pueden insertarse dentro de regiones tipo, p. ej.,
en regiones tipo humanas para humanizar un anticuerpo no humano,
como se describe arriba. Las regiones tipo pueden tener origen
natural o ser regiones tipo consensuadas, y preferiblemente son
regiones tipo humanas (véase, p. ej., Chothia et al., 1998,
J. Mol. Biol. 278:457-479 para catalogar regiones de
estructura humana). El ácido nucleico generado por la combinación de
las regiones tipo y CDRs codifica un anticuerpo que se enlaza
específicamente con CD30 y ejerce un efecto citostático y/o
citotóxico en células de HD. Preferiblemente, como se ha tratado
anteriormente, pueden realizarse una o más sustituciones del
aminoácido dentro de las regiones tipo, y, preferiblemente, las
sustituciones del aminoácido mejoran la unión del anticuerpo con
CD30 y/o para realzar el efecto citostático y/o citotóxico del
anticuerpo. Adicionalmente, pueden usarse métodos de este tipo para
hacer sustituciones de aminoácidos o deleciones de uno o más
residuos de cisteína de región variable participando en un enlace de
disulfuro dentro de la cadena para generar moléculas de anticuerpos
carentes de uno o más enlaces de disulfuro dentro de la cadena.
Otras alteraciones al ácido nucleico están comprendidas en la
habilidad de la técnica.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et
al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855;
Neubergen et al., 1984, Nature 312:604-608;
Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)
uniendo genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de una
especificidad de antígeno apropiada junto con genes a partir de una
molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como
se describe anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula
en la cual partes diferentes se derivan de distintas especies
animales, tales como las que tienen una región variable derivada de
un mAb de murina y una región constante de inmunoglobulina humana,
p. ej., anticuerpos humanizados.
De forma alternativa, técnicas descritas para la
producción de anticuerpos monocatenarios (patente U.S. nº.
4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios se forman conectando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región FV a través de un puente de aminoácidos, dando como resultado una proteína monocatenaria. También pueden usarse técnicas para el ensamblaje de fragmentos funcionales de FV en E. Coli (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041).
4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios se forman conectando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región FV a través de un puente de aminoácidos, dando como resultado una proteína monocatenaria. También pueden usarse técnicas para el ensamblaje de fragmentos funcionales de FV en E. Coli (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041).
La presente invención comprende además
anticuerpos comprendiendo una región de homología con las CDRs de
AC10 y HeFi-1, o las regiones codificantes de los
mismos, respectivamente. En diferentes formas de realización, la
región de homología se caracteriza por al menos un 50%, al menos un
55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un
75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un
95% o al menos un 98% de identidad con la región correspondiente de
AC10 o HeFi-1.
En una forma de realización, la presente
invención comprende un anticuerpo con una región de homología con
una CDR de HeFi-1 (SEC ID NO:20, SEC ID NO:22, SEC
ID NO:24, SEC ID NO:28, SEC ID NO:30 o SEC ID NO:32). En otra forma
de realización, la presente invención comprende un anticuerpo con
una región de homología con un CDR de AC10 (SEC ID nº: 4, SEC ID
NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:16).
La presente invención comprende además
anticuerpos que comprenden una región de homología con las regiones
variables de AC10 y HeFi-1, o la región de
codificación de los mismos, respectivamente. En diferentes formas de
realización, la región de homología se caracteriza por al menos un
50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un
70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un
90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad con la región
correspondiente deAC10o HeFi-1.
En una forma de realización, la presente
invención comprende un anticuerpo con una región de homología con
una región variable de HeFi-1 (SEC ID NO: 18 o SEC
ID nº: 26). En otra forma de realización, la presente invención
comprende un anticuerpo con una región de homología con una región
variable de AC10 (SEC ID nº: 2 ó SEC ID nº: 10).
Para determinar la identidad del porcentaje de
dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, p. ej.
entre las secuencias de una región variable de AC10 o
HeFi-1 y secuencias de otros anticuerpos con
regiones de homología con la región variable de AC10 o
HeFi-1, las secuencias se alinean con propósitos de
comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en la
secuencia de un primer aminoácido o secuencia de ácidos nucleicos
para la alineación óptima con una segunda secuencia de amino o de
ácido nucleico). Después se comparan los residuos aminoácidos o
nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos
correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia se
ocupa por el mismo residuo aminoácido o nucleótido como la posición
correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son
idénticas en esta posición. La identidad porcentual entre las dos
secuencias es una función del número de posiciones idénticas
compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de
idénticas posiciones/total # de posiciones (p. ej., posiciones de
superposición) x 100). En una forma de realización, las dos
secuencias tienen la misma longitud.
La determinación de identidad porcentual entre
dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático. Un
ejemplo preferido y no limitativo de un algoritmo matemático
utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de
Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal
algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul,
et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Las
búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa
NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener
secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico codificando
una proteína modificadora SCA-1. Las búsquedas de
proteína BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación
= 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos
homólogas a una proteína modificadora SCA-1. Para
obtener alineaciones distanciadas con fines de comparación, se puede
utilizar BLAST distanciado como se describe en Altschul et
al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. De
forma alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST para
realizar una búsqueda repetida que detecte relaciones de distancia
entre moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, BLAST
distanciado, y PSI-Blast, pueden usarse los
parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., XBLAST
y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlln.nih.gov. Otro ejemplo
preferido y no limitador de un algoritmo matemático utilizado para
la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller,
CABIOS (1989). Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN
(versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de
secuencia GCG. Utilizando el programa ALIGN para secuencias de
aminoácidos de comparación, se pueden usar una tabla de residuo de
peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12, y una
penalización de espacio de 4. Se conocen en la técnica algoritmos
adicionales para el análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM
como se describe en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. BioSci.,
10: 3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988,
Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA,
ktup es una opción de control que configura la sensibilidad y
velocidad de la búsqueda. Si ktup=2, se obtienen regiones similares
en las dos secuencias que se comparan mirando en parejas de residuos
alineados; si ktup=1, se examinan aminoácidos alineados únicos, ktup
puede configurarse en 2 ó 1 para secuencias protéicas, o entre 1 y 6
para secuencias de ADN. Por defecto si ktup no está especificado es
2 para proteínas y 6 para ADN. Para una descripción de parámetros de
FASTA más detallada, véase
http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.html#sect2.
De forma alternativa, la alineación de la
secuencia protéica puede realizarse usando el Algoritmo CLUSTAL W,
como se describe por Higgins et al., 1996, Methods Enzymol.
266:383-402.
La identidad porcentual entre dos secuencias
puede determinarse usando técnicas similares a las anteriormente
descritas, permitiendo o sin permitir espacios. Al calcular la
identidad porcentual, sólo se cuentan las coincidencias exactas.
Los anticuerpos, de la invención se pueden
producir por cualquier método conocido en la técnica para la
síntesis de proteínas, en particular, por síntesis química o
preferiblemente, por técnicas de expresión recombinante.
La expresión recombinante de un anticuerpo de la
invención, incluyendo un fragmento, derivado o análogo del mismo,
(p. ej., una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la
invención) requiere la construcción de un vector de expresión
conteniendo un ácido nucleico que codifique el anticuerpo. Una vez
se ha obtenido un ácido nucleico codificando un anticuerpo de la
invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo
puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas
bien conocidas en la técnica. Así, métodos para preparar un
anticuerpo expresando un ácido nucleico que contiene una secuencia
de nucleótidos codificando dicho anticuerpo se describen aquí.
Métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden
utilizarse para construir vectores de expresión conteniendo
secuencias codificantes y señales de control transcripcionales y
traduccionales apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo,
técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas sintéticas,
y recombinación genética in vivo. Se describen vectores
replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos codificando
un anticuerpo de la invención operativamente enlazado a un promotor.
La secuencia de nucleótidos puede codificar una cadena pesada o
ligera relacionada, o un dominio variable de cadena pesada o ligera,
operativamente enlazado a un promotor. Vectores de este tipo pueden
incluir la secuencia de nucleótidos codificando la región constante
de la molécula de anticuerpos (véase, p. ej., la publicación PCT WO
86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente U.S. nº.
5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en
tal vector para la expresión de la cadena entera pesada o
ligera.
El vector de expresión se transfiere a una
célula huésped mediante técnicas convencionales y las células
modificadas se cultivan después por técnicas convencionales para
producir un anticuerpo de la invención. También se describen células
huésped que contienen un ácido nucleico codificando un anticuerpo de
la invención, operativamente enlazado a un promotor heterólogo. En
formas de realización preferidas para la expresión de anticuerpos de
doble cadena, los vectores codificando tanto la cadena ligera como
la pesada pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión
de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla abajo.
Puede utilizarse una variedad de sistemas de
vectores de expresión huésped para expresar los anticuerpos de la
invención. Tales sistemas de expresión huésped representan vehículos
mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden
producirse y posteriormente purificarse, pero también representan
células que pueden, al transformarse o modificarse con las
secuencias codificantes nucleótidas apropiadas, expresar un
anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero no se
limitan a microorganismos tales como bacterias (p. ej., E.
coli, B. subtilis) transformadas con ADN bacteriófago
recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido
conteniendo secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (p.
ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión
de levadura recombinantes conteniendo secuencias codificantes de
anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores
de expresión de virus recombinante (p. ej., baculovirus) conteniendo
secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células
vegetales infectados con vectores de expresión recombinantes de
virus (p. ej., virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico
de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de
plásmido recombinantes (p. ej., plásmido Ti) conteniendo secuencias
codificantes de anticuerpos; o sistemas de células mamíferas (p.
ej., las células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) conteniendo constructos de
expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma
de células mamíferas (p. ej., promotor de la metalotioneína) o de
virus mamíferos (p. ej., el promotor tardío del adenovirus; el
promotor 7,5K del virus vaccinia). Preferiblemente, células
bacterianas tales como Escherichia coli, y más
preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la
expresión de moléculas de anticuerpos enteras recombinantes, se usan
para la expresión de una proteína recombinante de la invención. Por
ejemplo, células mamíferas tales como células ováricas de hámster
chino (CHO), conjuntamente con un vector tal como el elemento
promotor más importante del gen temprano intermedio a partir del
citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para
proteínas de la invención (Foecking et al., 1986, Gene
45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
En sistemas bacterianos, varios vectores de
expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso
previsto para los requisitos de modificación del pliegue y la
post-traducción del anticuerpo que se está
expresando. Donde sea posible, cuando una gran cantidad de tal
anticuerpo se va a producir, para la generación de composiciones
farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención, pueden
ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles
de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente.
Vectores de este tipo incluyen, pero no se limitan a, el vector de
expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO
1. 2:1791), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede
ligarse individualmente en el vector en la estructura con la región
codificante lac Z de modo que se produce una proteína de fusión;
vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.
13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J.
Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores
pGEX también pueden usarse para expresar proteínas de fusión con
glutationa S-transferasa (GST). En general, tales
proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a
partir de células lisadas por adsorción y unión con microesferas de
glutationa-agarosa matricial seguida de la elución
en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX están diseñados
para incluir trombina o sitios de rotura de trombina o de proteasa
factor Xa de manera que el producto genético objetivo clonado puede
liberarse a partir de la fracción GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus de
polihedrosis nuclear Autógrafa californica (AcNPV) como un vector
para expresar genes foráneos. El virus crece en células de
Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del
anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales
(por ejemplo el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo
control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de la
polihedrina).
En células huésped mamíferas, se pueden utilizar
varios sistemas de expresión basados en virus. En casos donde un
adenovirus se usa como un vector de expresión, la secuencia
codificante del anticuerpo de la invención puede ligarse a una
unidad de control de la transcripción/traducción del adenovirus, p.
ej., el promotor tardío y la secuencia guía tripartita. Este gen
quimérico puede insertarse después en el genoma del adenovirus por
recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una
región esencial del genoma vírico (p. ej., la región E1 o E3)
resultará en un virus recombinante viable y capaz de expresar la
proteína de la invención en huéspedes infectados, (véase, p. ej.,
Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 8 1:
355-359). También pueden requerirse señales de
iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias
codificantes insertadas. Estas señales incluyen el codón iniciador
ATG y secuencias contiguas. Además, el codón iniciador debe estar
sincronizado con el marco de lectura de la secuencia codificante
deseada para asegurar la traducción de la inserción entera. Estas
señales de control traduccionales exógenas y codones de iniciación
pueden ser de una variedad de orígenes, ambos naturales y
sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse por la
inclusión de elementos intensificadores de la transcripción
apropiados, terminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et
al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Además, puede seleccionarse una cadena de la
célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas,
o modifique y procese el producto genético de la forma específica
deseada. Tales modificaciones (p. ej., glicosilación) y tratamientos
(p. ej., ruptura) de productos de proteína pueden ser importantes
para la función del anticuerpo de la invención. Diferentes células
huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el
tratamiento postraduccional y modificación de proteínas y productos
genéticos. Se pueden elegir líneas celulares apropiadas o sistemas
huésped para asegurar la modificación y el tratamiento correctos de
la proteína foránea expresada. Con este fin, pueden usarse células
huésped eucarióticas que posean la maquinaria celular para el
tratamiento apropiado de la transcripción primaria, glicosilación, y
fosforilación del producto genético. Tales células huésped mamíferas
incluyen pero no se limitan a CHO, VERO, BHK, Hela, Cos, MDCK, 293,
3T3, y W138.
Para la producción a largo plazo y con alto
rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión
estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma
estable el anticuerpo de la invención pueden crearse genéticamente.
Mejor que usando vectores de expresión que contengan orígenes
víricos de replicación, las células huésped pueden transformarse con
ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (p.
ej., promotor, intensificador, secuencias, terminadores de
transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador
seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, las
células creadas genéticamente pueden dejarse crecer durante
1-2 días en unos medios enriquecidos, y después se
trasladan a unos medios selectivos. El marcador seleccionable en el
plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite
a las células integrar de forma estable el plásmido en sus
cromosomas y crecer para formar focos que a su vez pueden clonarse y
expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse
ventajosamente para crear genéticamente líneas celulares que
expresen el anticuerpo de la invención.
Se pueden usar varios sistemas de selección,
incluyendo pero no limitándose a los genes timidinquinasa del virus
herpes simplex (Wiglen et al., 1977, Cell 11:223), la
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa
(Szibalska & Szibalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
48:202), y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al.,
1980, Cell 22:8-17), pueden emplearse en las células
tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, la resistencia a los
antimetabolitos puede usarse como la base de selección para los
genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato
(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357;
O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527);
gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan &
Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere
resistencia al aminoglicósido G 418 (Clinical Pharmacy
12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy
3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science
260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ana. Rev.
Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH
11(5):155-215); e hygro, que confiere
resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene
30:147). Métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología
del ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para
seleccionar el clon recombinante deseado, y se describen métodos de
este tipo, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual,
Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli
et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley
& Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et
al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, que se incorpora por referencia
aquí en sus
totalidades.
totalidades.
Los niveles de expresión de un anticuerpo de la
invención puede aumentarse por amplificación de vector (para una
revisión, véase Bebbington y Hentschel, "The Use of Vectors Based
on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in
Mammalian Cells in DNY Cloning", Vol.3. (Academic Press, New
York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema del vector que
expresa el anticuerpo de la expresión es amplificable, el aumento en
el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped
aumentará el número de copias del gen marcador. Ya que la región
amplificada se une con el gen del anticuerpo, la producción del
anticuerpo de la invención también aumentará (Crouse et al.,
1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped puede comodificarse con dos
vectores de expresión, el primer vector codificando una proteína
derivada de cadena pesada y el segundo vector codificando una
proteína derivada de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener
marcadores seleccionables idénticos que permiten igual expresión de
proteínas de cadena pesada y ligera. De forma alternativa, puede
usarse un único vector que codifique, y sea capaz de expresar, ambas
proteínas de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena
ligera debería estar colocada delante de la cadena pesada para
evitar un exceso de cadena pesada tóxica libre (Proudfoot, 1986,
Nature 322:52 (1986); Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:2
197). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras
pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Un vez se ha producido un anticuerpo de la
invención por un animal, se ha sintetizado químicamente, o expresado
recombinantemente, puede purificarse por cualquier método conocido
en la técnica de purificación de proteínas, por ejemplo, por
cromatografía (p. ej., intercambio iónico; afinidad, particularmente
por afinidad con el antígeno específico, Proteína A (para moléculas
de anticuerpos, o afinidad con un compañero de fusión heteróloga
donde el anticuerpo es una proteína de fusión; y calcular la
cromatografía de columna), centrifugado, solubilidad diferencial, o
por cualquier otra técnica estándar para la purificación de
proteínas.
También se describen proteínas de unión con CD3
recombinantemente fundidas o químicamente conjugadas (incluyendo la
conjugación covalente y la no covalente) a proteínas heterólogas
(preferiblemente de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o al
menos 100 aminoácidos) de la presente invención para generar
proteínas de fusión. La fusión no debe ser necesariamente directa,
pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras.
También se describen composiciones comprendiendo
proteínas fusionadas o conjugadas a otros dominios de anticuerpos
diferentes de las regiones variables. Por ejemplo, las proteínas
pueden fusionarse o conjugarse a una región Fe del anticuerpo, o
parte de la misma. La parte del anticuerpo fusionada a una proteína
puede comprender la región constante, región de bisagra, dominio
CH1, dominio CR2, y dominio CH3 o cualquier combinación de dominios
enteros o partes de los mismo. Las proteínas también pueden
fusionarse o conjugarse con las partes del anticuerpo de arriba para
formar multímeros. Por ejemplo, las partes de Fe fusionadas con las
proteínas pueden formar dímeros a través de la unión de disulfuro
entre las partes de Fe. Pueden hacerse formas multiméricas más altas
fusionando las proteínas a partes de IgA y IgM. Se conocen en la
técnica métodos para fusionar o conjugar las proteínas a partes de
anticuerpos. Véase, p. ej., las patentes estadounidenses nos.
5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112.946; EP
307.434; EP 367.166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 9 1/06570;
Ashkenazi et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA
88:10535-10539; Zheng et al., 1995, J.
Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Como se ha tratado, supra, los
anticuerpos de la invención comprenden proteínas que enlazan con
CD30 y ejercen un efecto citostático y/o citotóxico en células de
HD, y estos se fusionan o conjugan después con proteínas heterólogas
o agentes citotóxicos.
La presente invención proporciona por tanto un
tratamiento para la enfermedad de Hodgkin mediante la administración
de un anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de la invención
incluyen pero no se limitan a: los anticuerpos AC10 y
HeFi-1 y análogos y derivados de los mismos (p. ej.,
como se describe en este caso arriba);
En formas de realización determinadas de la
invención, un anticuerpo de la invención puede modificarse
químicamente para mejorar sus propiedades citotóxicas y/o
citostáticas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede
administrarse como un conjugado. Fracciones particularmente
adecuadas para la conjugación con anticuerpos de la invención son
agentes quimioterapéuticos, enzimas de conversión a profármacos,
isótopos radiactivos o compuestos, o toxinas. De forma alternativa,
un ácido nucleico puede modificarse para acoplar funcionalmente la
secuencia codificante de una enzima de conversión a profármaco con
la secuencia codificante de un anticuerpo de la invención, de manera
que una proteína de fusión que comprende la enzima de conversión a
profármaco funcionalmente activa y el anticuerpo de la invención se
expresa en el sujeto bajo la administración del ácido nucleico
conforme a los métodos de la terapia genética descritos en la
sección 5.7, infra.
En una forma de realización, un anticuerpo de la
invención se fusiona con una secuencia marcadora, tal como un
peptídico, para facilitar la purificación. En formas de realización
preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de
hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en
un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA,
91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles
comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la
hexa-histidina proporciona una purificación
conveniente de la proteína de fusión. Otros identificativos
peptídicos útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan
a, la marca "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la
proteína de hemagglutinin de la gripe (Wilson et al., 1984,
Cell 37:767) y la marca "flag". Proteínas de fusión de este
tipo pueden generarse por métodos recombinantes estándar conocidos
por los de expertos en la técnica.
En otra forma de realización, los anticuerpos de
la invención se fusionan o conjugan con un agente terapéutico. Por
ejemplo, un anticuerpo de la invención puede conjugarse con un
agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina
(p. ej., un agente citostático o citocidal), o un radionucleido (p.
ej., alfa-emisores tales como, por ejemplo,
^{212}Bi, ^{211}At, o beta-emisores tales como,
por ejemplo, ^{131}I, ^{90}Y, o ^{67}Cu).
Fármacos tales como metotrexato (Endo et
al., 1987, Cancer Research 47:1076-1080),
daunomicin (Gallego et al., 1984, Int. J. Cancer.
33:737-744), mitomicina C (MMC) (Ohkawa et
al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 23:81-86)
y alcaloides vinca (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol
Immunother. 21:183-187) se han unido a anticuerpos y
los conjugados derivados se han utilizado en un estudio sobre
actividades antitumorales. Se debería tener cuidado en la generación
de conjugados de agentes quimioterapéuticos para asegurar que la
actividad del fármaco y/o de anticuerpos no disminuye como resultado
del proceso de la conjugación.
Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen
las siguientes clases no mutuamente exclusivas de agentes
quimioterapéuticos: agentes alquilantes, antraciclinas,
antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, agentes de antitubulina,
auristatinos, sensibilizadores a la quimioterapia, ligandos de unión
al surco menor de ADN, inhibidores de replicación de ADN,
duocarmicinas, etoposidas, pirimidinas fluorinadas, lexitropsinas,
nitrosoureas, platinóles, antimetabolitos de purina, puromicinas,
sensibilizadores a la radiación, esferoides, taxanas, inhibidores de
topoisomerasa, y alcaloides de vinca. Ejemplos de quimioterapia
individual que se puede conjugar a un ácido nucleico o proteína de
la invención incluyen pero no se limitan a un andrógeno, antramicína
(AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprína,
bleomicina, busulfano, sulfoximina butionina, camptotecina,
carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065,
clorambucil, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina,
arabinósido de citidina, citochalasin B, dacarbazina, dactinomicina
(antiguamente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel,
doxorubicina, un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina,
5-fluorouracil, gramicidina D, hidroxiurea,
idarubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU),
mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina,
metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol,
paclitaxel, plicamicina, procarbizina, streptozotocina, tenoposido,
6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina,
vincristina, vinorelbina, VP-16 y
VM-26. En una forma de realización preferida, el
agente quimioterapéutico es auristatin E. En una forma de
realización más preferida, el agente quimioterapéutico es el AEB
derivado de auristatin E (como se describe en la solicitud
norteamericana nº. 09/845.786 solicitada el 30 de Abril de
2001).
Los conjugados de la invención usados para
aumentar el efecto terapéutico del anticuerpo de la invención
incluyen agentes terapéuticos no tradicionales tales como toxinas.
Las toxinas de este tipo incluyen, por ejemplo, abrina, ricina A,
exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica.
Las técnicas para conjugar tales fracciones
terapéuticas con anticuerpos se conocen bien, véase, p. ej., Arnon
et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs
In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,
Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug
Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et
al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.,
1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And
Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs.
475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In
Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection
And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.
303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et
al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
De forma alternativa, un anticuerpo de la
invención puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un
anticuerpo heteroconjugado como se describe por Segal en patente
estadounidense nº. 4.676.980.
Como se ha mencionado anteriormente, en formas
de realización determinadas de la invención, un anticuerpo de la
invención puede coadministrarse con una enzima de conversión a
profármaco. La enzima de conversión a profármaco puede expresarse
como una proteína de fusión con o conjugada con un anticuerpo de la
invención. Enzimas de conversión a profármaco ejemplares son
carboxipeptidasa G2, beta-glucuronidasa,
penicilina-V-amidasa,
penicilina-G-amidasa,
\beta-lactamasa,
\beta-glucosidasa, nitroreductasa y
carboxipeptidasa A.
También se describen ácidos nucleicos que se
administran para tratar, inhibir o prevenir la HD. La terapia
genética se refiere a la terapia realizada por la administración a
un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. Los ácidos
nucleicos producen sus proteínas codificadas que median un efecto
terapéutico.
Puede usarse cualquiera de los métodos para
terapia genética disponibles en la técnica. Abajo se describen
métodos ejemplares. Para revisiones generales de los métodos de
terapia genética, véase, Goldspiel et al., 1993, Clinical
Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy
3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science
260:926-932; Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev.
Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 1,
1(5):155-215. Métodos comúnmente conocidos en
la técnica de la tecnología del ADN recombinante que pueden usarse
se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler,
Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press,
NY (1990).
En un aspecto preferido, la terapia comprende
secuencias de ácidos nucleicos codificando un anticuerpo, dichas
secuencias de ácidos nucleicos siendo parte de vectores de expresión
que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o
cadenas pesadas o ligeras del mismo en un huésped adecuado. En
particular, tales secuencias de ácidos nucleicos tienen promotores
operativamente enlazados a la región codificante de anticuerpos,
siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente,
específico para el tejido. En otra forma de realización particular,
se usan moléculas de ácido nucleico en las cuales las secuencias
codificantes de anticuerpos y cualquier otra secuencia deseada se
rodean de regiones que promueven la recombinación homóloga en un
sitio deseado en el genoma, suministrando de este modo una expresión
intracromosómica de los ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos
(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature
342:435-438. En formas de realización específicas,
la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo monocatenario;
de forma alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos incluyen
secuencias codificando tanto la cadena pesada como la ligera, o
fragmentos de lo mismo, del anticuerpo.
La administración de los ácidos nucleicos en un
paciente puede ser o bien directa, en cuyo caso el paciente está
directamente expuesto al ácido nucleico o a vectores portadores de
ácido nucleico, o bien indirecta, en cuyo caso, en primer lugar las
células se transforman con los ácidos nucleicos in vitro, y
después se transplantan en el paciente. Estos dos enfoques son
conocidos, respectivamente, como terapia genética in vivo o
ex vivo.
En una forma de realización específica, las
secuencias de ácidos nucleicos se administran directamente in
vivo, donde se expresan para producir el producto codificado.
Este se puede realizar por cualquiera de los numerosos métodos
conocidos en la técnica, por ejemplo construyendo estos como parte
de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y
administrando el vector de modo que las secuencias de ácidos
nucleicos se vuelven intracelulares. Se pueden administrar vectores
de terapia genética por infección usando retroviricos defectuosos o
atenuados u otros vectores víricos (véase, p. ej., la patente
estadounidense nº. 4.980.286); la inyección directa de ADN desnudo;
el uso del bombardeo de micropartículas (p. ej., una pistola de
genes; Biolistic, Dupont); el revestimiento con lípidos o receptores
de superficie celular o agentes transfectantes; la encapsulación en
liposomas, micropartículas, o microcápsulas; la administración en
conexión con un peptídico conocido por introducirse en el núcleo; la
administración en conexión con un sujeto de ligando para una
endocitosis mediada por un receptor (véase,p. ej., Wu and Wu, 1987,
J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (lo cual puede
utilizarse para tipos de células objetivo expresando específicamente
los receptores); etc. En otra forma de realización, se pueden formar
complejos de ligando de ácido nucleico en los que el ligando
comprende un péptido vírico fusogénico para disgregar endosomas,
permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica.
En otra forma más de realización, el ácido nucleico puede marcarse
como objetivo in vivo para obtener una absorción y una
expresión celular específicas, marcando como objetivo un receptor
específico (véase, p. ej., las publicaciones PCT WO 92/06 180; WO
92/22635; W092/20316; W093/14188, y WO 93/20221). De forma
alternativa, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente
e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión
por recombinación homóloga (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU 86:8932-8935; Zijlstra et
al., 1989, Nature 342:435-438).
En una forma de realización específica, se usan
vectores víricos que contienen secuencias de ácidos nucleicos
codificando un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, puede usarse
un vector retrovírico (véase Miller et al., 1993, Meth.
Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovíricos
contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento
correcto del genoma vírico y la integración en el ADN de la célula
huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos codificando el
anticuerpo para su uso en terapia genética se clonan en uno o más
vectores, facilitando de ese modo la administración del gen en un
paciente. Se pueden encontrar más detalles sobre vectores
retrovíricos en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:29
1-302, que describe el uso de un vector retrovírico
para administrar el gen mdr 1 a células madre hematopoyéticas para
hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras
referencias que ilustran el uso de vectores retrovíricos en terapia
genética son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest.
93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:
1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene
Therapy 4:129-141; y Grossman and Wilson, 1993,
Curr. Opin, in Genetics and Devel. 3:110-114.
Otro enfoque hacia la terapia genética implica
transferir un gen, p. ej. un gen AC10 o HeFi-1, a
células en cultivo de tejido por métodos tales como por
electroporación, lipofección, transfección mediante fosfato cálcico,
o infección vírica. Normalmente, el método de transferencia incluye
la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las
células se colocan después bajo selección para aislar las células
que han absorbido y están expresando el gen transferido. Estas
células se administran después a un paciente.
En esta forma de realización, el ácido nucleico
se introduce en una célula antes de la administración in vivo
de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede
llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica,
incluyendo pero no limitándose a la transfección, electroporación,
microinyección, infección con un vector vírico o bacteriófago
conteniendo las secuencias de ácidos nucleicos, fusión celular,
transferencia de gen mediante cromosoma, transferencia de gen
mediante microcélula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas
técnicas son conocidas en la técnica para la introducción de genes
foráneos en células (véase, p. ej., Loeffler and Behr, 1993, Meth.
Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993,
Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac.
Ther. 29: 69-92) y pueden usarse a condición de que
las funciones desarrollables y fisiológicas necesarias de las
células receptoras no se interrumpan. La técnica debería proveer la
transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el
ácido nucleico sea expresable por la célula y preferiblemente
hereditable y expresable por su progenie celular.
Las células recombinantes resultantes pueden
administrarse a un paciente por diferentes métodos conocidos en la
técnica. Los glóbulos rojos recombinantes (p. ej., las células madre
hematopoyéticas o progenitoras) se administran preferiblemente por
vía intravenosa. La cantidad de células previstas para el uso
depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede
determinarse por un experto en la técnica.
Las células en las cuales puede introducirse un
ácido nucleico con fines de terapia genética comprenden cualquier
tipo de célula deseada y disponible, e incluyen pero no se limitan a
fibroblastos; glóbulos rojos tales como linfocitos T, linfocitos B,
monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos,
granulocitos; diferentes vástagos o células progenitoras, en
particular células madre hematopoyéticas o progenitoras, p. ej.,
como se obtienen a partir de médula ósea, sangre de cordón
umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.
En una forma de realización preferida, la célula
usada para terapia genética es autóloga para el paciente.
En una forma de realización en la cual se usan
células recombinantes en terapia genética, se introducen en las
células secuencias de ácidos nucleicos codificando un anticuerpo de
manera que éstas son expresables por las células o su progenie, y
las células recombinantes se administran después in vivo para
conseguir un efecto terapéutico. En una forma de realización
específica, se usan células madre o progenitoras. Cualquier célula
madre y/o progenitora que se puede aislar y mantener in vitro
puede usarse de forma potencial conforme a esta forma de realización
de la presente invención (véase p. ej. la publicación PCT WO
94/08598; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:
973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A.229; y
Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771).
En una forma de realización específica, el ácido
nucleico a introducirse con fines de terapia genética comprende un
promotor inducible operativamente enlazado a la región codificante,
de manera que la expresión del ácido nucleico es controlable al
controlar la presencia o ausencia del inductor de transcripción
apropiado.
Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de
la invención se analizan preferiblemente in vitro, y luego
in vivo para obtener la actividad terapéutica o profiláctica
deseada, antes del uso en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos
in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o
profiláctica de un anticuerpo o composición farmacéutica incluyen
determinar el efecto del anticuerpo o composición farmacéutica en
una línea celular de Hodgkin o una muestra de tejido de un paciente
con la enfermedad de Hodgkin. El efecto citotóxico y/o citostático
del anticuerpo o composición en la línea celular de Hodgkin y/o
muestra de tejido puede determinarse utilizando técnicas conocidas
para los expertos en la técnica. Un método preferido, descrito en la
sección 6 abajo, implica poner en contacto un cultivo de la línea
celular de la enfermedad de Hodgkin desarrollada en una densidad de
aproximadamente 5.000 células en 0,33 cm^{2} de área de cultivo
durante un periodo de 72 horas con el anticuerpo o composición
farmacéutica, exponer el cultivo a 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina durante las 8 horas finales de
dicho periodo de 72 horas, y medir la incorporación de
^{3}H-timidina en células del cultivo. El
anticuerpo o composición farmacéutica tiene un efecto citostático o
citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin y es útil
para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin si las
células del cultivo han reducido la incorporación de
^{3}H-timidina en comparación con las células de
la misma línea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas bajo
las mismas condiciones pero sin estar en contacto con el anticuerpo
o composición farmacéutica. De forma alternativa, ensayos in
vitro que pueden usarse para determinar si está indicada la
administración de un anticuerpo específico o composición
farmacéutica, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en
los que se cultiva una muestra de tejido de un paciente con la
enfermedad de Hodgkin, y se expone a o de otra manera un anticuerpo
o composición farmacéutica, y se observa el efecto de tal compuesto
sobre la muestra de tejido de Hodgkin.
También se describen métodos de tratamiento y
profilaxis por la administración a un sujeto de una cantidad eficaz
de una proteína de anticuerpo enlazante a CD30 que tiene un efecto
citotóxico o citostático en células de la enfermedad de Hodgkin (es
decir, un anticuerpo de la invención), una composición farmacéutica
comprendiendo un anticuerpo de la invención (de ahora en adelante,
un fármaco de la invención). Según la presente invención, el
tratamiento de la HD comprende el tratamiento de pacientes ya
diagnosticados como portadores de la HD en cualquier fase clínica;
tal tratamiento dando como resultado un retraso en el crecimiento
del tumor; y/o promoviendo la regresión tumoral.
En una forma de realización preferida, el
anticuerpo de la invención es el anticuerpo monoclonal AC10 o
HeFi-1 o un fragmento o derivado. En un aspecto
preferido, un fármaco de la invención comprende un anticuerpo
sustancialmente purificado de la invención (p. ej., sustancialmente
libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos
secundarios indeseados). El sujeto es preferiblemente un animal,
incluyendo pero no limitándose a animales tales como vacas, cerdos,
caballos, pollos, gatos, perros,etc., y es preferiblemente un
mamífero, y de la forma más preferible un humano.
Formulaciones y métodos de administración que
puede emplearse se describen arriba; pueden seleccionarse
formulaciones adicionales apropiadas y vías de administración de
entre las descritas aquí abajo.
Diferentes sistemas de administración son
conocidos y pueden utilizarse para administrar un anticuerpo de la
invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas,
microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar endocitosis
mediante el receptor del anticuerpo (véase, p. ej., Wu and Wu, 1987,
J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un
ácido nucleico como parte de un retrovírico u otro vector, etc.
Métodos de introducción incluyen pero no se limitan a, vías
intradérmicas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas,
subcutáneas, intranasales, epidurales, y orales. Los anticuerpos de
la invención pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por
ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de
revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral,
mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con
otros agentes biológicamente activos tales como agentes
quimioterapéuticos (véase la Sección). La administración puede ser
sistémica o local.
En una forma de realización específica, puede
ser deseable administrar el anticuerpo de la invención por
inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio, o mediante
un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso,
o gelatinoso, incluyendo una membrana, tal como una membrana
sialástica, o una fibra. Preferiblemente, al administrar un
anticuerpo de la invención, se debe tener cuidado al usar materiales
los cuales el anticuerpo no absorbe.
En otra forma de realización, el anticuerpo o
composición puede administrarse en una vesícula, en particular un
liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527-1533;
Treat et al., 1989, in Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler
(eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365;
Lopez-Berestein, ibid., pp.
317-327; véase generalmente, ibid.)
En otra forma más de realización, el anticuerpo
o composición puede administrarse en un sistema de liberación
controlada. En una forma de realización, se puede usar una bomba
(véase Langer, supra; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed.
Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek
et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra forma de
realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical
Applications of Controlled Release, 1974, Langer and Wise (eds.),
CRC Pres., Boca Ratón, Florida; Controlled Drug Bioavailability,
Drug Product Design and Performance, 1984, Smolen and Ball (eds.),
Wiley, Nueva York; Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev.
Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985,
Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351;
Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).
Otros sistemas de liberación controlada se
discuten en la revisión por Langen, 1990 Science
249:1527-1533.
Donde se administra un ácido nucleico, el ácido
nucleico puede administrarse in vivo para promover la
expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un
vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándola
de modo que se vuelva intracelular, p. ej., usando un vector
retrovírico (véase la patente estadounidense nº. 4.980.286), o por
inyección directa, o usando el bombardeo de micropartícula (p. ej.,
una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o revistiendo con lípidos
o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o
administrándola en conexión con un péptido de tipo homeobox conocido
por introducirse en el núcleo (véase p. ej., Joliot et al.,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 88:1864-1868),
etc. Deforma alternativa, un ácido nucleico puede ser introducido
intracelularmente e incorporado dentro del ADN de la célula huésped
para la expresión, por recombinación
homóloga.
homóloga.
Como se alude a lo anterior, la presente
invención también proporciona composiciones farmacéuticas (fármacos
de la invención). Tales composiciones comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención, y un
portador farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización
específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa
aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o de un
gobierno estatal o catalogada en la Farmacopea estadounidense u otra
farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales, y más
particularmente en seres humanos. El término "portador" se
refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el
cual se administra el terapéutico. Tales portadores de fármacos
pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo
los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como
aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de
sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la
composición del fármaco se administra por vía intravenosa. También
pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa
y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones
inyectables. Excipientes para fármacos adecuados incluyen almidón,
glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso,
gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco,
cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol,
agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede
contener cantidades menores de humidificación o agentes
emulsionantes, o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones
pueden coger la forma de soluciones, suspensiones, emulsión,
comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación
sostenida y similares. La composición puede formularse como un
supositorio, con ligantes tradicionales y soportes tales como
triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar
tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón,
estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato
magnésico, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se
describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W.
Martin. Composiciones de este tipo contendrán una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención,
preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada
de portador para proporcionar la forma para la administración
apropiada al paciente. La formulación debería adaptarse al modo de
administración.
En una forma de realización preferida, el
fármaco de la invención se formula conforme a procedimientos
rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la
administración intravenosa en seres humanos. Típicamente, las
composiciones para la administración intravenosa son soluciones en
tampón acuoso isotónico estéril. Donde sea necesario, el fármaco de
la invención también puede incluir un agente de solubilización y un
anestésico local tal como lidocaína para calmar el dolor en el lugar
de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien
separadamente o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria,
por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de
agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolla o
sachette indicando la cantidad de agente activo. Donde se haya de
administrar el fármaco de la invención por infusión, éste puede
dispensarse con una botella de infusión conteniendo agua o solución
salina de grado farmacéutico estéril. Donde el fármaco de la
invención se administre por inyección, puede proveerse una ampolla
de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los
ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
La cantidad de anticuerpo de la invención que
será eficaz en el tratamiento o prevención de HD puede determinarse
por técnicas clínicas estándar. Además, se pueden emplear
opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar
rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se debe emplear
en la formulación también dependerá de la vía de administración, y
de la fase de la HD, y debería decidirse según la decisión del
profesional y las circunstancias de cada paciente. Se pueden
extrapolar dosis eficaces a partir de curvas de respuesta según la
dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o en un modelo
animal.
También se describe un paquete o equipo
farmacéutico comprendiendo uno o más recipientes llenados con un
anticuerpo de la invención y opcionalmente con uno o más portadores
farmacéuticos. Opcionalmente asociado a tal(es)
contenedor(es) puede haber un aviso en la forma prescrita por
una agencia gubernamental regulando la manufactura, el uso o la
venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la
aprobación por la agencia de la manufactura, el uso o venta para la
administración humana.
En una forma de realización, un equipo comprende
un anticuerpo purificado de la invención. El anticuerpo puede
conjugarse a un agente radionucleido o quimioterapéutico. El equipo
comprende además opcionalmente un portador farmacéutico.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los
anticuerpos de la invención pueden determinarse por procedimientos
farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales
experimentales, p. ej., para determinar el LD_{50} (la dosis letal
para el 50% de la población) y el ED_{50} (la dosis
terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de
la dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice
terapéutico y puede expresarse como la proporción
LD_{50}/ED_{50}. Se prefieren los anticuerpos que exhiben
índices terapéuticos grandes. A pesar de que se pueden usar
anticuerpos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debería
tener cuidado al diseñar un sistema de administración que fije como
objetivo tales anticuerpos al sitio de tejido afectado para
minimizar el daño potencial hacia las células no infectadas y, de
ese modo, reduzca los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo
celular y los estudios animales pueden usarse formulando un rango de
dosificación para el uso en seres humanos. La dosificación de tales
anticuerpos se sitúa preferiblemente dentro de un rango de
concentraciones circulantes que incluyen el ED_{50} con toxicidad
pequeña o nula. La dosificación puede variar dentro de este rango
dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de
administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el
método, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse
inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede
formularse en modelos animales para conseguir un rango de
concentración del plasma circulante que incluye el IC_{50} (es
decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una
inhibición media-máxima de los síntomas) como se ha
determinado en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse
para determinar con más precisión la dosis útil en seres humanos.
Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía
en fase líquida de alto rendimiento.
Generalmente, la dosificación de un anticuerpo
de la invención en un fármaco de la invención administrado a un
paciente con la enfermedad de Hodgkin es típicamente de 0,1 mg/kg
para 100 mg/kg de la masa corporal del paciente. Preferiblemente, la
dosificación administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20
mg/kg de la masa corporal del paciente, más preferiblemente de 1
mg/kg para 10 mg/kg de la masa corporal del paciente. Generalmente,
los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga dentro del
cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la
respuesta inmunitaria para las proteínas foráneas. Así, son
frecuentemente posibles dosificaciones inferiores de anticuerpos
humanizados, quiméricos o humanos y una administración menos
frecuente.
Composiciones farmacéuticas para el uso conforme
a la presente invención pueden formularse de manera convencional
usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente
aceptables.
Así, los anticuerpos pueden formularse para la
administración por inhalación o insuflación (bien a través de la
boca o la nariz) o la administración oral, bucal, parenteral o
rectal.
Para la administración oral, las composiciones
farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o
cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes
farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p.
ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o
metilcelulosa de hidroxipropilo); productos de relleno (p. ej.,
lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de hidrógeno de calcio)
lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice);
desintegrantes (p. ej., almidón de patata o glicolato de almidón de
sodio); o agentes de humidificación (p. ej., sulfato de lauril de
sodio). Los comprimidos pueden revestirse por métodos bien conocidos
en la técnica. Preparaciones líquidas para la administración oral
pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o
suspensiones, o éstas pueden presentarse como un producto seco para
la constitución con agua u otros vehículos adecuados antes del uso.
Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios
convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como
agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de
celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes
(p. ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de
almendras, ésteres oleaginosos, alcohol etílico o aceites vegetales
fraccionados); y conservantes (p. ej., metilo o
propilo-P-hidroxibenzoatos o ácido
sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón,
agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea
apropiado.
Las preparaciones para la administración oral
pueden formularse adecuadamente para ofrecer una liberación
controlada del compuesto activo.
Para la administración bucal las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de
manera convencional.
Para la administración por inhalación, los
anticuerpos para el uso según la presente invención se administran
convenientemente en forma de una presentación en spray de aerosol de
paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor
adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede
determinarse mediante una válvula para suministrar una cantidad
dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para el
uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una
mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuado tal como
lactosa o almidón.
Los anticuerpos pueden formularse para la
administración parenteral por inyección, p. ej., por inyección de
bolo o infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden
presentarse en forma de dosis únicas, p. ej., en ampollas o en
recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las
composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones,
soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, y pueden
contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión,
estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, la sustancia
activa puede estar en forma de polvo para la constitución con un
vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógeno, antes de
su uso.
Los anticuerpos también pueden formularse en
composiciones rectales tales como supositorios o enemas de
retención, p. ej., que contienen bases supositorias convencionales
tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
previamente, los anticuerpos también pueden formularse como una
preparación de depósito. Tales formulaciones de efecto duradero
pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutáneamente o
intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo,
los anticuerpos pueden formularse con materiales poliméricos o
hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite
aceptable) o resinas de cambio iónico, o como derivados
moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente
soluble.
Las composiciones pueden, si se desea,
presentarse en un paquete o dispositivo dispensador que puede
contener una o más formas de dosificación unitarias conteniendo la
sustancia activa. El paquete puede comprender por ejemplo metal u
hoja plástica, tal como un blíster. El paquete o dispositivo
dispensador puede acompañarse por instrucciones para la
administración preferiblemente para la administración a un
humano.
Los anticuerpos de la invención pueden
administrarse junto con el tratamiento con irradiación o uno o más
agentes quimioterapéuticos.
Para el tratamiento de irradiación, la
irradiación puede ser de rayos gamma o rayos X. Para una vista de
perspectiva general de la terapia de radiación, véase Hellman,
Capítulo 12: "Principies of Radiation Therapy Cancer", en:
"Principies and Practice of Oncology", DeVita et al.,
eds., 2a. Ed., J.B. Lippencott Company, Philadelphia.
Clases útiles de agentes quimioterapéuticos
incluyen, pero no se limitan a, las siguientes clases no mutuamente
exclusivas de agentes: agentes alquilantes, antraciclinas,
antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, agentes de antitubulina,
auristatinas, sensibilizadores a la quimioterapia, ligandos de unión
al surco menor de ADN, inhibidores de la replicación de ADN,
duocarmicinas, etoposidas, pirimidinas fluorinadas, lexitropsinas,
nitrosoureas, platinóles, antimetabolitos de purina, puromicinas,
sensibilizadores a la radiación, esferoides, taxanes, inhibidores de
topoisomerasa, y alcaloides de vinca. La quimioterapia individual
comprendida por la invención incluye pero no se limita a un
andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa,
5-azacitidina, azatioprina, bleomicino, busulfano,
butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina
(BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatina,
colchicína, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosida,
citochalasin B, dacarbazína, dactinomicina (antiguamente
actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina,
un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina, 5 fluorouracil,
gramicidina D, hidroxíurea, idarubicino, ifosfamida, irinotecano,
lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán,
6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicin,
mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazola, paclitaxel, plicamicin,
procarbizina, streptozotocina, tenoposida,
6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina,
vincristina, vinorelbina, VP-16 y
VM-26.
En una forma de realización específica, un
anticuerpo de la invención se administra al mismo tiempo con terapia
de radiación o uno o más agentes quimioterapéuticos. En otra forma
de realización especifica, la quimioterapia o terapia de radiación
se administra antes o después de administrar un anticuerpo de la
invención, durante al menos una hora y hasta varios meses, por
ejemplo al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una
semana, un mes, o tres meses, antes o después de administrar un
ácido nucleico o una proteína de la invención.
En una forma de realización específica en la que
un anticuerpo de la invención se conjuga a una enzima de conversión
a profármaco, el anticuerpo se administra con un profármaco. La
administración del profármaco puede ser simultánea a la
administración del anticuerpo de la invención, o, más
preferiblemente, posterior a la administración del anticuerpo de la
invención tras al menos una hora hasta una semana, por ejemplo
aproximadamente cinco horas, 12 horas, o un día. Dependiendo de la
enzima de conversión a profármaco administrada, el profármaco puede
ser una mostaza de ácido benzoico, una mostaza anilínica, una
mostaza de fenol, mostaza-glucuronida de
p-hidroxianilina,
epirubicin-glucuronida, fenoxiaceril de
adriamicina-N,N-(4'-hidroxifenil
acetil)-palitoxin doxorubicina, melfalán,
cefalosporina de mostaza de nitrógeno,
\beta-fenilenodiamina, cefalosporina derivada de
vinblastina, mostaza de cefalosporina, ácido
cianofenilmetil-\beta-d-gluco-piranosidurónico,
5(adaridin-1-il)2,4-dinitrobenzamida,
o alanina de metotrexato.
La invención se describe posteriormente en los
ejemplos siguientes los cuales no pretenden limitar el ámbito de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Células y condiciones de cultivo: las
líneas celulares que expresan CD30, L540, HDLM2; L428,
KM-H2 y Karpas 299. se obtuvieron de la Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células/DSMZ en
Braunschweig, Alemania. La línea celular de Hodgkin L540cy fue
proporcionada por el Dr. V. Diehl de la Universidad de Colonia,
Colonia, Alemania. Las líneas celulares se mantuvieron en las
formulaciones de medios recomendados y se subcultivaron cada
3-4 días.
Reactivos y anticuerpos: la línea de
hibridoma del anticuerpo monoclonal Anti-CD30 AC10
se describió por Bowen et al. (Bowen et al., 1993, J.
Immunol. 151:5896-5906) y se proporcionó por el Dr.
E. Podack, Universidad de Miami. El anticuerpo purificado se aisló
de los sobrenadantes sin suero usando una columna de inmunoafinidad
de proteína G. El anticuerpo AC10 resultante se determinó como >
97% monomérico por cromatografía por exclusión de tamaño. El
anticuerpo monoclonal HeFi-1 se ha descrito
previamente y fue proporcionado por el Dr. T. Hecht, NCl, Bethesda,
MD. Se demostró por cromatografía por exclusión de tamaño que el mAb
de HeFi-1 era mayor del 98% de monómero.
Ensayos de proliferación: las líneas
celulares que expresan CD30 se cultivaron en placas de 96 pocillos
de fondo plano a una densidad de 50.000 o 5.000 células/pocillo en
medios de crecimiento (RPMI con un 10% de suero fetal bovino (FBS)
para las líneas celulares L428, KM-H2 y Karpas 299,
y RPMI/20%FBS para las líneas celulares HDLM-2 y
L540. Las líneas celulares se cultivaron en ausencia o en presencia
mAbs anti-CD30 soluble reticulados o de mAbs
anti-CD30 inmovilizados, como se describe abajo.
Reticulación de anticuerpos en la
solución: Para reticular los anticuerpos
anti-CD30 en la solución, diferentes diluciones de
AC10 o HeFi-1 se valoraron placas de cultivo de
tejido de fondo plano de 96 pocillos en ausencia o en presencia de
20 \mug/ml de anticuerpos policlonales de cabra
anti-IgG de ratón. Las líneas celulares de la
enfermedad de Hodgkin se añadieron después a las placas a o bien
50.000 o 5.000 células/pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC
durante 72 horas y se marcaron con ^{3}H-timidina,
1 \muCi/pocillo, durante las 5 horas finales.
Inmovilización de anticuerpos: La inmovilización
de anticuerpos se obtuvo revestiendo los pocillos con anticuerpo en
tampón Tris de 50 mmol/L (pH 8.5) durante 18 horas a 4ºC. Antes de
la adición de células, los pocillos se lavaron dos veces con PBS
para eliminar el mAb no unido. En cada pocillo se añadieron 50.000 o
5.000 células en un volumen total de 200 \mul. La proliferación se
determinó por la absorción de ^{3}H-timidina (0.5
\muCi/pocillo) durante las 8 horas finales de un periodo de
cultivo de 72 horas.
Para evaluar la actividad biológica de los mAbs
anti-CD30, se cultivaron líneas celulares de HD
expresando CD30 (50.000 células/pocillo) en presencia del mAb
anti-CD30 inmovilizado AC10. El mAb AC10 demostró la
inhibición del crecimiento celular de líneas de HD de tipo células T
(L540 y HDLM-2) o tipo célula B (L428 y
KM-H2) (Fig. 1). Ki-1, que mostró
previamente no tener ningún efecto en las líneas celulares de HD
(Gruss et al., 1996, Blood 83:2045-2056), se
usó como un control.
Para seguir evaluando la actividad de AC10, se
realizó una segunda serie de ensayos. Para valorar la actividad de
AC10 durante un periodo de crecimiento de la célula tumoral
logarítmico, se disminuyó la densidad de la célula de los cultivos
para proporcionar condiciones de crecimiento más óptimas. Para ese
fin, las líneas celulares de HD se cultivaron en placas de 96
pocillos de fondo plano a una densidad de 5.000 células/pocillo en
presencia o en ausencia del mAb AC10. AC10 demostró una inhibición
del crecimiento de las cuatro líneas celulares de HD evaluadas
(L540, HDLM-2, L428 y KM-H2; Fig.
2).
En otro conjunto de experimentos, las líneas
celulares de HD se incubaron con AC10 o HeFi-1
solubles que se habían reticulado en solución mediante la adición de
anticuerpos solubles de cabra anti-IgG de ratón.
Bajo estas condiciones de reticulación, las cuatro líneas celulares
HD, al colocarse en placas a 5x10^{4} células/pocillo, se les
inhibió el crecimiento con AC10 y HeFi-1 (Fig. 3).
Cuando las células se colocaron en placas a 5x10^{3}
células/pocillo, AC10 inhibió el crecimiento de
HDLM-2; L540, y L428 y, en una extensión menor, la
línea celular KM-H2, puesto que
HeFi-1 inhibió el crecimiento de las líneas
celulares HDLM-2, L540, y L428 (Fig. 4).
Los datos resultantes de los experimentos
probando los efectos de AC10 y HeFi-1 en líneas
celulares tumorales que expresan CD30 se resumen en la Tabla 2,
infra. La Tabla 2 también proporciona una comparación de la
actividad anti-tumoral de AC10 y
HeFi-1 con la del mAb M44.
Tomados juntos, estos datos indican que los mAbs
AC10 y HeFi-1 se distinguen de los mAbs
anti-CD30 previamente descritos por su capacidad
para inhibir el crecimiento de líneas de HD expresando CD30. Es de
interés tener en cuenta que Hubinger et al. recientemente
evaluó la actividad del mAb anti-CD30 M44, en forma
inmovilizada, en un ensayo de proliferación utilizando 5.000
células/pocillo. Bajo estas condiciones, M44 inhibió el crecimiento
de la línea ALCL expresando CD30, Karpas 299 pero no la línea
celular de HD HDLM-2 (Hubinger et al., 1999,
Exp. Hematol. 27(12): 1796-805).
Las células L428 se cultivaron durante 24 horas
en presencia o en ausencia de 0.1 \mug/ml de anticuerpo
anti-CD30, AC10, reticulado por la adición de 20
\mug/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón.
Después del periodo de cultivo de 24 horas, las células se
cosecharon y lavaron con suero salino tamponado con fosfato (PBS).
Las células se colocaron después en placas de cultivo de 96 pocillos
de tejido de fondo plano en 5x10^{3} células/pocillo y se
mezclaron con diferentes diluciones de fármacos quimioterapéuticos.
Después de 1 hora de exposición a los fármacos las células se
lavaron dos veces, y después se añadieron medios de cultivo nuevos.
Las placas se incubaron entonces a 37ºC durante 72 horas y
seguidamente se incubaron durante 4 horas con 0.5 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina. La inhibición del crecimiento se
determinó comparando la cantidad de ^{3}H-timidina
incorporada en células tratadas con la cantidad incorporada en
células de control no tratadas.
Para evaluar el efecto del mAb
anti-CD30 en combinación con fármacos
quimioterapéuticos, las células L428 se incubaron durante 24 horas o
bien en ausencia del anticuerpo o en presencia de AC10 en 0.1
\mug/ml con 20 \mug/ml de anticuerpos de cabra
anti-IgG de ratón para proporcionar la reticulación
para el anticuerpo primario. Después de esta incubación las células
se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en
5x10^{3} células/pocillo en presencia de diluciones de fármacos
quimioterapéuticos incluyendo doxorubicina, cisplatina, y etoposida
(Tabla 3). El EC50, concentración de fármaco necesario para inhibir
la incorporación de ^{3}H-timidina en un 50% en
comparación con las células de control no tratadas, se determinó
entonces para las células tratadas solamente con los fármacos o con
las combinaciones de fármaco y anticuerpo. Para la doxorubicina, la
incubación con AC10 disminuyó el EC50 en células L428 (es decir,
disminuyó la cantidad de fármaco necesario para inhibir el 50% de la
síntesis de ADN) de aproximadamente 45 nm (doxorubicina sola) hasta
aproximadamente 9nM, para la cisplatina el AC10 disminuyó el EC50 de
1.500 nm hasta 500 nm, y para la etoposida el AC10 disminuyó el EC50
de 1.500 nm hasta 600 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Modelos de xenotransplante de tumor
humano: Ratones SCID C.B-17 hembra, obtenidos a
través de Taconic (Germantown, NY) con 4-6 semanas
de edad, se usaron para todos los estudios de eficacia. Para
establecer modelos de xenotransplante de la enfermedad de Hodgkin,
se recogieron células L540cy (HD) de un cultivo celular, se lavaron
en suero salino tamponado con fosfato helado (PBS), se
resuspendieron en PBS, y se mantuvieron en hielo hasta la
implantación. Para modelos de la enfermedad diseminados, a los
ratones se les inyectó 10^{7} células de L540cy por vía
intravenosa a través de la vena caudal. Se establecieron
xenotransplantes de tumor sólidos inyectándoles a los ratones
subcutáneamente (s.c.) 2 X 10^{7} de células L540cy. Para la
evaluación terapéutica se utilizaron las dosis de tratamiento
indicadas.
La administración de AC10 y
HeFi-1: Los ratones Diseminado portadores del
tumor L540cy diseminado recibieron 10^{7} células a través de la
vena caudal en d0 y seguidamente se inició una terapia en d1. Los
ratones tratados recibieron inyecciones i.p. o bien de AC10 o de
HeFi-1 cada dos días hasta un total de 10
inyecciones, q2dx10, en 1 mg/kg/inyección.
Para el modelo L540Ci subcutáneo, a los ratones
se les inyectó s.c. con 2 X 10^{7} células y se les observó a
diario para analizar la formación tumoral sólida. Cuando los tumores
fueron palpables, los animales se distribuyeron de forma aleatoria
en grupos y recibieron o bien q2dx10 de AC10 o
HeFi-1 en 2 mg/kg/inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron AC 10 y HeFi-1 en
ratones SCID xenotransplantados L540cy de la enfermedad de Hodgkin,
como se ha descrito anteriormente. En la población de ratones con
tumores L540Ci diseminados, todos los animales de control no
tratados desarrollaron signos de enfermedad severa diseminada tales
como la parálisis de brazo posterior o la formación de una masa
tumoral sólida y tuvieron que sacrificarse (tiempo de supervivencia
medio = 37 días). Por el contrario, todos los ratones que recibieron
o bien AC10 o HeFi-1 sobrevivieron durante > 46
días sin signos de la enfermedad (Fig. 5A).
Con respecto a la población de ratones con
tumores L540Ci subcutáneos, mientras los tumores de control no
tratados crecieron rápidamente crecido a > 450 mm^{3}, ambos
mAbs retrasaron significativamente el crecimiento del tumor como se
muestra en la Fig. 5B.
Los inventores han identificado anticuerpos
monoclonales de murina (mAbs) que tienen como objetivo el receptor
CD30 humano y exponen un perfil de actividad no descrito previamente
para otros mAbs anti-CD30. En forma no modificada,
estos anticuerpos, AC10 y HeFi-1 inhiben el
crecimiento de HD y la línea de ALCL Karpas 299 y muestran actividad
antitumoral in vivo en un modelo del xenotransplante tumoral
de la enfermedad de Hodgkin.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Células y reactivos: el hibridoma AC10 se
desarrolló en medios RPMI-1640 (Life Technologies
Inc.. Gaithersburg, MD) suplementados con un 10% de suero bovino
fetal. El anticuerpo se purificó a partir de sobrenadantes de
cultivo por cromatografía de proteína A. Las líneas HD positivas de
CD30 L540, KM-H2, HDLM-2 y L428, al
igual que la línea ALCL Karpas-299, se obtuvieron a
partir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
Gmbh (Braunschweig, Alemania); L540cy estuvo proporcionada por el
Dr. V. Diehl; HL-60 y Daudi se obtuvieron a partir
de ATCC (Manassas, VA). Se obtuvieron células CHO DG44 a partir de
Lawrence Chasm (Universidad de Colombia, Nueva York, NY). La cabra
anti FITC de ratón o la cabra anti FITC humano se obtuvieron a
partir de Jackson Immunoresearch, (West Grove, PA.). El mAb
anti-CD30 Ki-1 se obtuvo a partir de
Accurate Chemicals (Westbury, NY).
Análisis FACS: para evaluar la expresión de CD30
en líneas celulares, se combinaron 3 X 10^{5} células con niveles
de saturación (4 \mug/ml) de o bien AC10 o AC10 quimérico (cAC10)
en un 2% de FBS/PBS helado (medios colorantes) durante 20 mM en
hielo y se lavaron dos veces con medios de coloración de frío de
hielo para eliminar el mAb no unido. Las células se tiñeron entonces
con mAbs secundarios diluidos 1:50 en medios de coloración en frío
helado, anticuerpos de cabra anti FITC de ratón para AC10 o
anticuerpos de cabra anti FITC humano para cAC 10, se incubaron
durante 20 minutos en hielo, se lavaron como se ha descrito
anteriormente y se resuspendieron en 5 \mug/ml de yoduro de
propidium (Pl). Las células marcadas se examinaron por citometría de
flujo en un citometro de flujo fACScan de Becton Dickinson y se
controlan para excluir las células no viables. Los datos se
analizaron usando la versión 3.3 del software CellQuest de Becton
Dickinson y la intensidad de fluorescencia del medio corregido de
fondo se determinó para cada tipo célula.
Para la unión de saturación de anticuerpos, se
combinaron 3 X 10^{5} células de karpas 299 con concentraciones en
aumento de AC10 o cAC10 diluido en medios de coloración en frío
helado durante 20 minutos en hielo, se lavaron dos veces con medios
de coloración en frío helado para eliminar el mAb libre y se
incubaron con 1:50 de anticuerpo de cabra anti FITC de ratón o
anticuerpo de cabra anti FITC humano, respectivamente. Las células
marcadas se lavaron, se resuspendieron en P1 y se analizaron como se
ha descrito anteriormente. Las intensidades de fluorescencia medias
resultantes se fijaron con respecto a la concentración de mAb.
Para el análisis de células de posición de ciclo
celular éstas se cultivaron en medios completos y se marcaron en los
tiempos indicados con bromodeoxiuridina (BrdU) (10 \muM final;
Sigma, St. Louis, MO) durante 20 mm para detectar síntesis de ADN
nacientes, y con Pl para detectar el contenido de ADN total tal y
como se describe anteriormente (Donaldson et al., 1997, J.
Immunol. Meth. 203:25-33). Las células marcadas se
analizaron para obtener la posición de ciclo celular y la apoptosis
por citometría de flujo usando el programa CellQuest de Becton
Dickinson tal y como se describe anteriormente (Donaldson et
al., 1997, J. Immunol. Meth. 203:25-33).
Inhibición del crecimiento in
vitro : La evaluación de la inhibición del crecimiento por
mAbs de murina se efectuó inmovilizando el mAb a 10 \mug/ml en 50
mm de tris-HCl a pH 8.5, en placas de cultivo de
tejido de 96 pocillos de plástico durante la noche a 4ºC. Las placas
se lavaron dos veces con PBS para eliminar el mAb no unido y
seguidamente se añadieron células en medios completos de 100 \mul
a 5.000 células/pocillo. Tras 48 h de incubación a 37ºC, 5% de
CO_{2}, las células se marcaron con ^{3}H-TdR
por la adición de medios completos de 50 \mul conteniendo 0,5
\muCi de ^{3}H-TdR durante 2 h y el nivel de
síntesis de ADN determinado en relación a las células en pocillos de
control no tratados. La evaluación de la inhibición del crecimiento
por cAC10 se efectuó usando mAb soluble y un reticulador secundario.
Las células se colocaron en placas a 5.000 células/pocillo en medios
completos de 180 \mul en un formato de 96 pocillos. Se añadió
cAC10 en medios completos conteniendo un exceso multiplicado por 10
correspondiente de anticuerpo de cabra anti IgG humano en las
concentraciones anotadas, en 20 \mul. A las 96 h de postincubación
las células se marcaron con ^{3}H-TdR durante 4 h
tras la recogida de células y el recuento de escintilaciones para
cuantificar el nivel de la síntesis del ADN naciente. La inhibición
del porcentaje en relación a los pocillos de control no tratados se
fijó con respecto a la concentración de cAC 10.
Construcción y la expresión de AC10 quimérico
(cAC10): Para la construcción de cAC10, las regiones variables
de cadena pesada y de cadena ligera se clonaron a partir del
hibridoma de AC 10 usando los métodos de Gilliland et al.,
1996, Tissue Antigens 47:1-20. El ARN total se aisló
del hibridoma de AC10 y de ADNc de las regiones variables se
generaron usando kappa de ratón y cebadores específicos del gen
IgG2b. El ADN codificando la región variable (VH) de cadena pesada
de AC10 se unió con la secuencia codificando la región constante de
lagamma humana I (huC\gamma1, número de acceso SwissProt P01857)
en un vector de clonación y la región variable de cadena ligera (VL)
de AC 10 se unió de forma similar a la región constante de la kappa
humana (huC\kappa, PID G185945) en un vector de clonación
separado. Tanto la secuencia quimérica de cadena pesada como la de
cadena ligera se clonaron dentro de pDEF14 para la expresión de
anticuerpo monoclonal quimérico intacto en células CHO. El plásmido
pDEF14 utiliza el promotor del gen alfa del factor de alargamiento
del hámster chino que conduce la transcripción de genes heterólogos
(patente estadounidense 5.888.809) resultando en niveles altos de la
expresión de proteínas recombinantes sin necesidad de amplificación
génica. El plásmido resultante se designó como
pDEF14-C3 (Fig. 6).
Para la generación de la línea celular de
expresión de AC10c, pDEF14-C3 se linealizó y
modificó en las células CHO DG44 por electroporación. Tras la
electroporación, las células pudieron recuperarse durante dos días
en medios completo DMEM/F12 conteniendo un 10% de FBS, después de lo
cual los medios se sustituyeron por medios selectivos sin
hipoxantína ni timidina. Sólo aquellas células que incorporaban el
ADN plásmido, lo cual incluye el gen DLIFR, pudieron desarrollarse
en ausencia de hipoxantina y timidina. Se seleccionaron y cultivaron
clones de título alto en biorreactores. Se purificó anticuerpo de
cAC10 por proteína A, intercambio iónico, y cromatografías de
interacción hidrofóbica, con el producto final determinado por
hPLC-SEC en >99% de anticuerpo de monómero.
El AC10 se produjo originalmente inmunizando
ratones con la línea celular YT de linfoma granuloso grande positiva
de CD30 y se mostró como específica para CD30 (Bowen et al.,
1993, J. Immunol. 151:5896-5906). Antes de valorar
los efectos de AC10 y AC10c en el crecimiento de células HD, se
compararon los niveles de la expresión de CD30 en diferentes líneas
celulares cultivadas. Las cuatro líneas de HD evaluadas se basaron
en CD30-positivo en proporciones de fluorescencia de
citometría de flujo (Tabla 4). La líneas celulares HD de tipo célula
T HDLM-2 y L540 al igual que la línea ALCL
Karpas-299 expresaron niveles altos cualitativamente
similares a CD30 mientras que la expresión en dos líneas HD de tipo
célula B KM-H2 y L428 fueron un tanto bajas. L540cy,
un subclón de L540, mostró un nivel intermedio de expresión de CD30.
Aunque la unión de cAC10 y AC10 con estas líneas celulares se
detectó usando diferentes anticuerpos secundarios (anticuerpo de
cabra anti-humano o anticuerpo de cabra
anti-ratón conjugado de FITC, respectivamente) estos
datos demuestran que el proceso del quimerización no disminuyó la
unión específica de cAC10 con la superficie de la célula de CD30. La
línea de leucemia promielocítica HL-60 y la línea
del linfoma de Burkitt Daudi fueron ambas
CD30-negativas y sirvieron como controles en
estudios posteriores.
Para seguir comparando la actividad de unión de
los anticuerpos de murina y quiméricos, las células
Karpas-299 se incubaron con titulaciones de AC10 o
cAC10 y después se marcaron con anticuerpo de cabra anti FITC de
ratón o anticuerpo de cabra anti FITC humano (Jackson
Immunoresearch, West Grove, PA), respectivamente, para determinar
niveles requeridos para la saturación. Las células marcadas se
examinaron por citometría de flujo y la intensidad de fluorescencia
media se fijó contra la concentración de mAb. La saturación de unión
para ambas formas de mAb tuvo lugar en 0.5 \mug/ml (Fig. 7). La
saturación fue consistente para todas las líneas celulares positivas
de CD30 examinadas (datos no mostrados) demostrando que el cAC10
retuvo la actividad de unión del anticuerpo de murina parental.
Las células mononucleares de sangre periféricas
recientemente aisladas no reaccionaron con cAC10 y no mostraron
ninguna señal por encima de lo ya mencionado en este ensayo. De
forma similar, las células B y las células T primarias humanas
aisladas no se unieron con cAC10. Las células T periféricas humanas
primarias activadas con anti-CD3 y
anti-CD28, y las células B activadas por el mitógeno
de la hierba camín mostraron un nivel de unión bajo y transitorio de
cAC10 tras 72 h de la activación, el cual disminuyó después (datos
no mostrados).
Actividades in vitro de AC10 y
cAC10: Anticuerpos anti-CD30 tales como M44 y
M67 han mostrado tener efectos anti-proliferativos
en las líneas ALCL, mientras que no tienen ningún efecto ni estimula
el crecimiento de líneas HD (Gruss et al, 1994, Blood
83:2045-2056; Tian et al., 1995, Cancer Res.
55:5335-5341). Para evaluar inicialmente el efecto
del mAb AC10 en proliferación celular de HD, se comparó AC10 con el
mAb Ki-1 bajo condiciones de fase sólida
proporcionadas previamente (Gruss et al, 1994, Blood
83:2045-2056). Para estos estudios se inmovilizaron
mAbs sobre placas de cultivo de tejido plástico antes de la adición
de células HD como se describe en Materiales y Métodos. Tras la
incubación durante 48 H a 37ºC, las células se marcaron con
^{3}H-TdR y el nivel de síntesis de ADN se
determinó en relación a las células en pocillos de control no
tratados. La Figura 3A muestra que la presencia del mAb inmovilizado
Ki-1 tenía efecto nominal en el crecimiento de las
líneas HD. Por el contrario, la presencia de AC10 inmovilizado
resultó en una inhibición del crecimiento significante.
Tras la quimerización, se realizó una titulación
de cAC10 en las líneas celulares de HD L540, L540cy y L428 al igual
que la línea ALCL Karpas-299. Se añadió cAC10 en
solución a las concentraciones anotadas en presencia de exceso de 10
veces de anticuerpo de cabra anti IgG humano. Se añadió anticuerpo
de reticulación para potenciar los efectos de cAC10 y para
aproximarse a los efectos de la reticulación mediada por FcR que
podría ocurrir in vivo. El línea de ALCL positiva de CD30 fue
altamente sensible al cAC10, con anlC50 (concentración de mAb que
inhibió en un 50% el crecimiento celular) de 2 ng/ml. El líneas de
HD L428, L540 y L540cy mostraron sensibilidades de IC_{50} al
cAC10 de 100 ng/ml, 80 ng/ml y 15 ng/ml respectivamente. En estudios
paralelos estas células tratadas con un mAb de control y enlazador
no vinculante no mostraron ninguna reducción en la síntesis de ADN
sobre el rango de concentración analizado (datos no mostrados) y la
línea negativa de CD30 HL-60 mostró solamente una
ligera inhibición por cAC10 en el nivel máximo evaluado (Fig.
8).
Efectos del ciclo celular de cAC10: Hubinger
et al. ha mostrado recientemente que los mAbs
anti-CD30 pueden inhibir el crecimiento de las
células ALCL, incluyendo Karpas-299, a través de la
inducción de la detención del ciclo celular y sin inducción de la
apoptosis (Hubinger et al., 2001, Oncogene
20:590-598). No obstante, estos anticuerpos no
causaron ningún efecto inhibitorio en células de HD, y en algunos
casos estos estimularon la proliferación. Para examinar más de cerca
los efectos del ciclo celular de cAC10 in vitro, se cultivó
la línea celular de HD L540cy en medios completos conteniendo 1.0
\mug/ml de cAC10 formando un complejo con anticuerpos de cabra
anti IgG humano en 10 \mug/ml. En los tiempos indicados, las
células se marcaron con bromodeoxiuridina durante 20 min para
detectar una síntesis de ADN naciente, y con yoduro de propidio para
detectar el contenido de ADN total. Las células marcadas se
analizaron para averiguar la posición del ciclo celular por
citometría de flujo usando el programa Cellfit de Becton Dickinson
tal y como se describe anteriormente (Donaldson et al., 1997,
J. Immunol: Meth. 203:25-33).
La Fig. 9 muestra un cambio representativo en el
contenido de ADN y la síntesis de ADN en las células de HD de L540ci
tras la exposición a cAC10. El porcentaje de la población en cada
región se cuantificó como se describe en la sección 9.1 y se mostró
en la Tabla 5. La exposición de L540cy a cAC10 resulta en una
pérdida dependiente del tiempo de las células de la fase S desde un
40% en la población no tratada hasta un 13% a los 2 días (tras la
exposición). De forma coordinada, el contenido de G1 de esta
población aumentó de un 40% en células no tratadas a un 65% a los 3
días (tras la exposición). La región de menos del contenido de G1 da
una indicación precisa de las células apoptóticas que experimentan
una fragmentación de ADN (Donaldson et al., 1997, J. Immunol.
Meth. 203:25-33) y esta población aumentó de un 6%
en la población no tratada a un 29% a las 48 h tras la exposición a
cAC10. Estos estudios citométricos de flujo fueron corroborados por
un ensayo paralelo de exclusión del colorante usando un
hemocitómetro. Como al medirse por exclusión de colorante, las
células L540cy no tratadas tuvieron un 93% de viabilidad y ésta
disminuyó a un 72% a las 48 h tras la exposición a cAC10. Las
células karpas tratadas con cAC10 mostraron una reducción similar en
la fase S desde el 40% al 11% a las 48 h post-cAC10
(Tabla 5). En estudios de control, la línea de células B negativa de
CD30 Daudi sólo mostró la modulación nominal del ciclo celular y no
mostró ningún aumento en la apoptosis tras el tratamiento siguiente
con cAC10 (Tabla 5). Estudios previos diferentes en los cuales mAb
inmovilizado para CD30 indujo a la apoptosis en células ALCL (Mir
et al, 2000, Blood 96:4307-43 12.), se
observó de pequeña a ninguna apoptosis en estas células con cAC10
soluble y un anticuerpo secundario de reticulación. Tomados juntos,
estos datos demuestran una detención del crecimiento inducida de
cAC10 y la acumulación de la población de G1 y la disminución de la
fase S en ambas líneas positivas de CD30, y la inducción de la
apoptosis en las células HD L540cy in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Modelos de xenotransplantes de la enfermedad
de Hodgkin humana: Para el modelo de la HD diseminada, se
inyectaron 1x10^{7} de células L540cy a través de la vena caudal
en ratones SCID C.B-17. El tratamiento con cAC10 se
inició en los tiempos indicados y se administró mediante inyección
intraperitoneal cada cuatro días hasta un total de 5 inyecciones.
Los animales se evaluaron a diario para detectar síntomas de la
enfermedad diseminada, en particular la parálisis en la extremidad
posterior. Los ratones que desarrollaron estos u otros síntomas de
la enfermedad se sacrificaron después. Para el modelo localizado de
HD, las células L540cy se implantaron con 2x10^{7} células en el
flanco adecuado de los ratones SCID. La terapia con cAC10 se inició
cuando el tamaño tumoral en cada grupo de 5 animales alcanzó un
promedio de \sim50 mm^{3}. El tratamiento consistió en
inyecciones intraperitoneales de cAC10 cada 4 días hasta 5
inyecciones. El tamaño tumoral se determinó usando la fórmula
(LxW2)/2.
La actividad in vivo de cAC10 se evaluó
en los ratones SCID usando células L540cy. El establecimiento de
modelos de HD humanos en ratones ha demostrado ser difícil.
Diferentes líneas celulares derivadas de la HD que dan un injerto
muy pobre en ratones immunodeficientes, pueden establecerse
exitosamente modelos de células tumorales de HD L540cy en ratones
SCID (Kapp et al., 1994, Ann Oncol. 5Suppl
1:121-126). Se usaron dos modelos diferentes de la
enfermedad que utilizan células L540cy, un modelo diseminado, y un
modelo tumoral subcutáneo localizado para evaluar la eficacia del
cAC10 in vivo.
Los estudios previos han mostrado que las
células L540cy inyectadas por vía intravenosa en ratones SCID se
extienden de forma comparable a la diseminación de la HD humana y
muestran una localización preferencial para los ganglios linfáticos
(Kapp et al., 1994, Ann Oncol. 5Suppl
1:121-126). Para evaluar cAC10 en este modelo de HD
diseminado, se inyectaron 1x10^{7} L540cy células fueron
inyectadas a través de la vena caudal en ratones SCID
C.B-17. Los ratones no tratados, o los que se
trataron con un mAb de control no vinculante, desarrollaron síntomas
de la enfermedad diseminada, en particular parálisis de la
extremidad posterior, durante los 30-40 días de
inyección de células tumorales (Fig. 10A). Los ratones que
desarrollaron estos u otros síntomas de la enfermedad se
sacrificaron después conforme a las pautas IACUC. La terapia con cAC
10 se inició un día después de la inyección de células tumorales y
se administró mediante inyección intraperitoneal cada cuatro días
hasta un total de 5 inyecciones. Todos los animales (5/5) que
recibieron un régimen de dosificación de 4 mg/kg/inyección, y 4/5
que recibieron o bien 1 mg/kg/inyección o 2 mg/kg/inyección,
sobrevivieron durante más de 120 días (la longitud del estudio) sin
síntomas de enfermedad.
En un estudio posterior se evaluó la eficacia de
cAC10 variando el día en el cual se inició la terapia. Para este
estudio se inyectaron células L540cy en los ratones SCID a través de
la vena caudal el día 0 y la terapia se inició o bien el día 1, el
día 5, o el día 9 (Fig. 10B). En todos los grupos tratados, se
administró cAC10 en 4 mg/kg usando una fórmula de q4dx5.
Consecuentemente con el estudio anterior cAC10 impactó
significativamente en la supervivencia de los animales que
recibieron terapia comenzando el día 1, con 4/5 animales sin
enfermedad después de 140 días. Cuando el inicio de la terapia se
retrasó, cAC10 siguió demostrando una eficacia significante; 3/5
animales que recibieron terapia desde el día 5, y 2/5 que empezaron
el día 9, permanecieron sin la enfermedad durante todo el
estudio.
cAC 10 también demostró eficacia en los modelos
tumorales de la HD de L540cy subcutáneos. A los ratones SCID se les
implantaron 2x10^{7} células en el flanco. La terapia con cAC10 se
inició cuando el tamaño tumoral en cada grupo de 5 animales alcanzó
un promedio de 50 mm^{3}. El tratamiento consistió en inyecciones
intraperitoneales de cAC10 cada 4 días hasta S inyecciones usando
las mismas dosis que en el modelo diseminado: es decir, 1, 2, y 4
mg/kg/inyección. Los tumores en los animales no tratados crecieron
rápidamente y alcanzaron un promedio de >800 mm^{3} en el día
34. El cAC10 produjo un retraso significante en el crecimiento
tumoral en todas las concentraciones evaluadas de una manera
dependiente de la dosis (Fig. 10C).
El AC10 quimérico (cAC 10) se generó mediante
recombinación homóloga esencialmente como se describe anteriormente
usando vectores de conversión kappa de cadena pesada y ligera de
IgG1 humano (Yarnold and Fell, 1994 Cancer Res. 54:
506-512). Estos vectores se diseñaron de manera que
los sitios de región constante de inmunoglobulina de murina de
cadena pesada y ligera se cortan y se sustituyen por los sitios de
región constante gamma 1 y kappa humana mediante recombinación
homóloga. La línea celular de hibridoma quimérico resultante expresa
un anticuerpo quimérico consistiendo en las regiones variables de
cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal original y de las
regiones constantes gamma 1 y kappa humanas.
Para evaluar la eficacia de cAC10 in
vivo, se les implantó células L540cy subcutáneamente a los
ratones SCID como se ha descrito anteriormente. Cuando los tumores
alcanzaron un tamaño medio mayor de 150 mm^{3} se dividió a los
ratones en grupos que o bien no se habían tratado o se habían
tratado con 2 mg/kg de cAC 10 dos veces por semana hasta un total de
cinco inyecciones. Los tumores en los ratones no tratados crecieron
rápidamente hasta un tamaño medio mayor de 600 mm^{3} (Fig. 11).
Por el contrario, el tamaño tumoral medio en los animales tratados
con cAC 10 permaneció más o menos igual.
Se puede utilizar cAC10 para administrar
selectivamente un agente citotóxico a las células positivas de CD30.
Como se muestra en la Fig. 12, Karpas positivo de CD30 (ALCL) y
L540cy (HD), y la línea de células B negativa de CD30 Daudi se
examinaron para averiguar la sensibilidad relativa a un agente
citotóxico administrado mediante un conjugado de fármacos del
anticuerpo cAC10 (ADC). Las células se expusieron a CAC10 conjugado
al agente citotóxico AEB (cAC10-AEB) durante 2 h, se
lavaron para eliminar el ADC libre y se determinó la viabilidad
celular a las 96 h. La citotoxicidad como se determina por el ensayo
de reducción de colorantes de tetrazolio (XTT). Tanto Karpas 299
como L540cy fueron sensibles al conjugado cAC10-AEB
con valores de IC_{50} (concentración que mató al 50% de las
células) de <0.1 microgramo/ml. Por el contrario, los valores de
IC_{50} en las células Daudi fueron >10 microgramo/ml. Las tres
líneas celulares fueron igual de sensibles al auristatin E no
conjugado por sí mismo (datos no mostrados).
La actividad antitumoral del AC10 quimérico
conjugado al AEB derivado de auristatin E (como se describe en la
solicitud estadounidense nº. 09/8.45.786 presentada el 30 de abril
de 2001, se evaluó en ratones SCID portadores, de xenotransplantes
L540cy de la enfermedad de Hodgkin (Fig. 13). A los ratones se les
implantaron subcutáneamente células de L540cy y la terapia se inició
cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 75
mm^{3}. La terapia consistió en la administración de
cAC10-AEB en o bien 3 mg/kg/dosis o 10 mg/kg/dosis
con un total de 4 dosis administradas a intervalos de 4 días
(q4dx4). Los tumores en todos los ratones que recibieron
cAC10-AEB en ambas dosis se recuperaron
completamente y estaban curados el día 18 tras implante tumoral, 9
días después del inicio de la terapia. Estas recuperaciones
completas mantuvieron su efecto durante la duración del estudio.
Estos resultados demuestran que un anticuerpo
anti-CD30 quimérico conjugado a un fármaco
quimioterapéutico, tal como auristatin E, puede tener una eficacia
significante en la enfermedad de Hodgkin.
\vskip1.000000\baselineskip
- - WO 9622384 A [0018]
- - US 5427908 A [0070]
- - US 5888809 A [0044] [0228]
- - US 5750753 A [0070]
- - US 84578601 A, 2001 [0044]
- - US 5821047 A [0070]
- [0153] [0246]
- - US 5571698 A [0070]
- - US 5939598 A, Kucherlapati [0056]
- - US 5516637 A [0070]
- - WO 9317715 A [0057]
- - US 5780225 A [0070]
- - WO 9208802 A [0057]
- - US 5658727 A [0070]
- - WO 9100360 A [0057]
- - US 5733743 A [0070]
- - WO 9205793 A [0057]
- - US 5969108 A [0070]
- - US 4474893 A [0057]
- - WO 9222324 A [0071]
- - US 4714681 A [0057]
- - US 4946778 A [0072] [0123]
- - US 4925648 A [0057]
- - US 5258498 A [0072]
- - US 5573920 A [0057]
- - US 5807715 A [0072]
- - US 5601819 A [0057]
- - US 4816567 A [0072]
- - GB9101134W [0070]
- - US 4816397 A [0072]
- - WO 9002809 A [0070]
- - US 5585089 A, Queen [0073]
- - WO 9110737 A [0070]
- [0074]
- - WO 9201047 A [0070] [0076]
- - EP 239400 A [0074]
- - WO 9218619 A [0070]
- - WO 9109967 A [0074]
- - WO 9311236 A [0070]
- - US 5225539 A [0074]
- - WO 9515982 A [0070]
- - US 5530101 A [0074]
- - WO 9520401 A [0070]
- - EP 592106 A [0074]
- - US 5698426 A [0070]
- - EP 519596 A [0074]
- - US 5223409 A [0070]
- - US 5565332 A [0074]
- - US 5403484 A [0070]
- - US 4444887 A [0075]
- - US 5580717 A [0070]
- - US 4716111 A [0075]
- - WO 9846645 A [0075]
- - WO 8605807 A [0133]
- - WO 9850433 A [0075]
- - WO 8901036 A [0133]
- - WO 9824893 A [0075] [0076]
- - US 5122464 A [0133]
- - WO 9816654 A [0075]
- - US 5336603 A [0146]
- - WO 9634096 A [0075] [0076]
- - US 5622929 A [0146]
- - WO 9633735 A [0075] [0076]
- - US 5359046 A [0146]
- - WO 9110741 A [0075]
- - US 5349053 A [0146]
- - EP 0598877 A [0076]
- - US 5447851 A [0146]
- - US 5413923 A [0076]
- - US 5112946 A [0146]
- - US 5625126 A [0076]
- - EP 307434 A [0146]
- - US 5633425 A [0076]
- - EP 367166 A [0146]
- - US 5569825 A [0076]
- - WO 9604388 A [0146]
- - US 5661016 A [0076]
- - WO 9106570 A [0146]
- - US 5545806 A [0076]
- - US 4676980 A, Segal [0156]
- - US 5814318 A [0076]
- - US 4980286 A [0162] [0180]
- - US 5885793 A [0076]
- - WO 9206180 A [0162]
- - US 5916771 A [0076]
- - WO 9222635 A [0162]
- - WO 9208495 A [0080]
- - WO 9220316 A [0162]
- - WO 9114438 A [0080]
- - WO 9314188 A [0162]
- - WO 8912624 A [0080]
- - WO 9320221 A [0162]
- - US 5314995 A [0080]
- - WO 9408598 A [0169]
- EP 396387 A [0080]
- Engert et al. Seminars in
Hematology, 1999, vol. 36, 282-289
[0002]
- Froese et al. J.
Immunol., 1987, vol. 139, 2081-87
[0004]
- Dürkop et al. Cell,
1992, vol. 88, 421-427 [0005]
- Schwab et al. Nature,
1982, vol. 299, 65-67 [0005] [0007]
- Josimovic-Alasevic
et al. Eur. J. Immunol., 1989, vol. 19,
157-162 [0005]
- Engert et al. Cancer
Research, 1990, vol. 50, 84-88 [0005]
[0017]
- Barth et al. Blood,
2000, vol. 95, 3909-3914 [0005] [0009]
- Falini et al. British Journal
of Haematology, 1992, vol. 82, 38-45
[0005] [0008] [0016]
- Falini et al. Lancet,
1992, vol. 339, 1195-1196 [0005] [0009]
[0009]
- Tsutsumi et al. Proc. Nat'l
Acad. Sci. U.S.A., 2000, vol. 97,
8545-8553 [0006] [0006]
- Schwarting et al. Blood,
1989, vol. 74, 1678-1689 [0007]
- Leukocyte Typing III Oxford University
Press1987. [0007]
- Renner et al. Cancer Immunol.
Immunother., 2000, vol. 49, 173-180
[0009]
- Horn-Lohrens et
al. Int. J. Cancer, 1995, vol. 60,
539-544 [0009]
- Gruss et al. Blood,
1994, vol. 83, 2045-2056 [0010] [0010] [0012]
[0016] [0016] [0016] [0020] [0233] [0233]
- Hubinger et al. Oncogene,
2001, vol. 20, 590-598 [0012] [0235]
- Tian et al. Cancer
Research, 1995, vol. 55, 5335-5341 [0012]
[0014]
- Bowen et al. J. Immunol.,
1993, vol. 151, 5896-5906 [0013] [0013]
[0230]
- Hecht et al. J. Immunol.,
1985, vol. 134, 4231-4236 [0014]
- Tutt et al. J. Immunol.,
1998, vol. 161, 3176-3185 [0015]
- Tian et al. Cancer Res.,
1995, vol. 55, 5335-5341 [0016] [0233]
- Hansen et al.
Immunobiol., 1991, vol. 183, 214- [0017]
- Press et al. J. Immunol.,
1988, vol. 141, 4410-4417 [0017]
- May et al. J. Immunol.,
1990, vol. 144, 3637-3642 [0017]
- Schwarting et al. Blood,
1988, vol. 74, 1678-1689 [0019]
- G. Pallesen Histopathology,
1990, vol. 16, 409-413 [0019]
- Donaldson et al. J. Immunol.
Meth., 1997, vol. 203, 25-33 [0044]
[0111] [0226] [0226] [0236]
- Tutt et al. J. Immunol.,
1991, vol. 147, 60-69 [0057]
- Kostelny et al. J.
Immunol., 1992, vol. 148, 1547-1553
[0057]
- Harlow et al. Antibodies: A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press1988.
[0066]
- Hammerling et al. Monoclonal
Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier1981.
563-681 [0066]
- Brinkman et al. J. Immunol.
Methods, 1995, vol. 182, 41-50 [0070]
- Ames et al. J. Immunol.
Methods, 1995, vol. 184, 177-186
[0070]
- Kettleborough et al. Eur. J.
Immunol., 1994, vol. 24, 952-958
[0070]
- Persic et al. Gene,
1997, vol. 187, 9-18 [0070]
- Burton et al. Advances in
Immunology, 1994, 191-280 [0070]
- Mullinax et al.
BioTechniques, 1992, vol. 12, no. 6.
864-869 [0071]
- Sawai et al. AJRI,
1995, vol. 34, 26-34 [0071]
- Better et al. Science,
1988, vol. 240, 1041-1043 [0071]
- Huston et al. Methods in
Enzymology, 1991, vol. 203, 46-88
[0072]
- Shu et al. PNAS,
1993, vol. 90, 7995-7999 [0072]
- Skerra et al. Science,
1988, vol. 240, 1038-1040 [0072]
- Morrison Science, 1985,
vol. 229, 1202- [0072]
- Oi et al. BioTechniques,
1986, vol. 4, 214- [0072]
- Gillies et al. J. Immunol.
Methods, 1989, vol. 125, 191-202
[0072]
- Riechmann et al. Nature,
1988, vol. 332, 323- [0073]
- Padlan Molecular Immunology,
1991, vol. 28, no. 4, 5. 489-498 [0074]
- Studnicka et al. Protein
Engineering, 1994, vol. 7, no. 6. 805-814
[0074]
- Roguska et al. PNAS,
1994, vol. 91, 969-973 [0074]
- Lonberg Huszar Int. Rev.
Immunol., 1995, vol. 13, 65-93 [0076]
- Jespers et al.
Bio/technology, 1994, vol. 12, 899-903
[0077]
- Greenspan Bona FASEB J.,
1989, vol. 7, no. 5. 437-444 [0078]
- Nissinoff J. Immunol.,
1991, vol. 147, no. 8. 2429-2438 [0078]
- Blanar Rutter Science,
1992, vol. 256, 1014-1018 [0082] [0082]
- Edery et al. Gene,
1988, vol. 74, 517-525 [0082]
- Chien et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 9578-9582
[0083]
- C. Vinson et al. Science,
1989, vol. 246, 911-916 [0089]
- Landschultz et al.
Science, 1988, vol. 240, 1759-1764
[0090]
- Baxevanis Vinson Curr. Op. Gen.
Devel., 1993, vol. 3, 278-285 [0090]
- O'Shea et al. Science,
1989, vol. 243, 538-542 [0090]
- Murre et al. Cell,
1989, vol. 56, 777-783 [0091]
- Davis et al. Cell,
1990, vol. 60, 733-746 [0091]
- Voronova Baltimore Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1990, vol. 87, 4722-4726
[0091]
- Bohmann et al. Science,
1987, vol. 238, 1386-1392 [0092]
- Hai et al. Genes Dev.,
1989, vol. 3, 2083-2090 [0092]
- Cao et al. Genes Dev.,
1991, vol. 5, 1538-1552 [0092]
- Williams et al. Genes
Dev., 1991, vol. 5, 1553-1567 [0092]
- Roman et al. Genes Dev.,
1990, vol. 4, 1404-1415 [0092]
- Hai Curran Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1991, vol. 88, 3720-3724 [0092]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons, Inc. 1994. vol. 1, [0094]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons, Inc. 1994. vol. 1, 10.16.1- [0095]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons, Inc. 1994. vol. 1, 10.8.1- [0096]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons, lnc.1994. vol. 1, 11.2.1- [0097]
- Page et al. Intl. J. of
Oncology, 1993, vol. 3, 473-476
[0105]
- Skehan et al. J. Nat'l Cancer
Inst., 1990, vol. 82, 1107-12 [0106]
- Mosmann J. Immunol. Methods,
1983, vol. 65, 55-63 [0107]
- Piazza et al. Cancer
Research, 1995, vol. 55, 3110-16
[0108]
- Biochemica, 1999,
34-37 [0109]
- Duke Cohen et al. Current
Protocols In Immunology 1992.
3.17.1-3.17.16 [0110]
- Shilo Weinberg Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 1981, vol. 78, 6789-6792
[0114]
- Sambrook et al. Molecular
Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory
Press1989. [0117]
- Current Protocols in Molecular Biology series
of laboratory technique manuals 1987. [0117]
- Current Protocols John Wiley and Sons, Inc.
1994. [0117]
- Kutmeier et al.
BioTechniques, 1994, vol. 17, 242- [0118]
- Sambrook et al. Molecular
Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory1990.
[0120]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons1998. [0120]
- Chothia et al. J. Mol.
Biol., 1998, vol. 278, 457-479 [0121]
- Morrison et al. Proc. Natl.
Acad. Sci., 1984, vol. 81, 851-855
[0122]
- Neuberger et al. Nature,
1984, vol. 312, 604-608 [0122]
- Takeda et al. Nature,
1985, vol. 314, 452-454 [0122]
- Bird Science, 1988, vol.
242, 423-42 [0123]
- Huston et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 5879-5883
[0123]
- Ward et al. Nature,
1989, vol. 334, 544-54 [0123]
- Skerra et al. Science,
1988, vol. 242, 1038-1041 [0123]
- Karlin Altschul Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1990, vol. 87, 2264-2268
[0129]
- Karlin Altschul Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1993, vol. 90, 5873-5877
[0129]
- Altschul et al. J. Mol.
Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0129]
- Altschul et al. Nucleic Acids
Res., 1997, vol. 25, 3389-3402 [0129]
- Myers Miller CABIOS,
1989, [0129]
- Torellis Robotti Comput. Appl.
Biosci., 1994, vol. 10, 3-5 [0129]
- Pearson Lipman Proc. Natl. Acad.
Sci., 1988, vol. 85, 2444-8 [0129]
- Higgins et al. Methods
Enzymol., 1996, vol. 266, 383-402
[0130]
- Foecking et al. Gene,
1986, vol. 45, 101- [0135]
- Cockett et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 2- [0135]
- Ruther et al. EMBO 1.,
1983, vol. 2, 1791- [0136]
- Inouye Inouye Nucleic Acids
Res., 1985, vol. 13, 3101-3109 [0136]
- Van Heeke Schuster J. Biol.
Chem., 1989, vol. 24, 5503-5509
[0136]
- Logan Shenk Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1984, vol. 8 1, 355-359 [0138]
- Bittner et al. Methods in
Enzymol., 1987, vol. 153, 51-544
[0138]
- Wigler et al. Cell,
1977, vol. 11, 223- [0141]
- Szybalska Szybalski Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1992, vol. 48, 202- [0141]
- Lowy et al. Cell,
1980, vol. 22, 8-17 [0141]
- Wigler et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 357- [0141]
- O'Hare et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, 1527- [0141]
- Mulligan Berg Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1981, vol. 78, 2072- [0141]
- Clinical Pharmacy, vol. 12,
488-505 [0141]
- Wu Wu Biotherapy, 1991,
vol. 3, 87-95 [0141] [0159]
- Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol., 1993, vol. 32, 573-596 [0141]
[0159]
- Mulligan Science, 1993,
vol. 260, 926-932 [0141] [0159]
- Morgan Anderson Ann. Rev.
Biochem., 1993, vol. 62, 191-217 [0141]
[0159]
- TIB TECH, 1993, vol. 11, no. 5.
155-215 [0141]
- Santerre et al. Gene,
1984, vol. 30, 147- [0141]
- Current Protocols in Molecular Biology John
Wiley & Sons1993. [0141] [0159]
- Kriegler Gene Transfer and Expression,
A Laboratory Manual Stockton Press1990. [0141]
- Current Protocols in Human Genetics John Wiley
& Sons1994. [0141]
- Colberre-Garapin et
al. J. Mol. Biol., 1981, vol. 150, 1- [0141]
- Bebbington Hentschel The Use of Vectors
Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in
Mammalian Cells in DNY Cloning Academic Press1987. vol. 3,
[0142]
- Crouse et al. Mol. Cell.
Biol., 1983, vol. 3, 257- [0142]
- Proudfoot Nature, 1986,
vol. 322, 52- [0143]
- Kohler Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1980, vol. 72, no. 2. 197- [0143]
- Ashkenazi et al. Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88,
10535-10539 [0146]
- Zheng et al. J. Immunol.,
1995, vol. 154, 5590-5600 [0146]
- Vil et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, vol. 89, 11337-11341
[0146]
- Gentz et al. Proc. Natl. Acad
Sci. USA, 1989, vol. 86, 821-824
[0150]
- Wilson et al. Cell,
1984, vol. 37, 767- [0150]
- Endo et al. Cancer
Research, 1987, vol. 47, 1076-1080
[0152]
- Gallego et al. Int. J.
Cancer., 1984, vol. 33, 737-744
[0152]
- Ohkawa et al. Cancer
Immunol. Immunother., 1986, vol. 23,
81-86 [0152]
- Rowland et al. Cancer
Immunol Immunother., 1986, vol. 21,
183-187 [0152]
- Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of
Drugs In Cancer Therapy Arnon et al. Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc. 1985.
243-56 [0155]
- Antibodies For Drug Delivery Hellstrom
et al. Controlled Drug Delivery Marcel Dekker, Inc. 1987.
623-53 [0155]
- Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In
Cancer Therapy: A Review Thorpe et al. Monoclonal Antibodies
'84: Biological And Clinical Applications 1985.
475-506 [0155]
- Analysis, Results, And Future Prospective Of
The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy
Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy Academic
Press1985. 303-16 [0155]
- Thorpe et al. Immunol.
Rev., 1982, vol. 62, 119-58 [0155]
- Goldspiel et al. Clinical
Pharmacy, 1993, vol. 12, 488-505
[0159]
- TIBTECH 1, 1993, vol. 1, no. 5.
155-215 [0159]
- Gene Transfer and Expression Kriegler A
Laboratory Manual Stockton Press1990. [0159]
- Koller Smithies Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1989, vol. 86, 8932-8935 [0160]
[0162]
- Zijlstra et al. Nature,
1989, vol. 342, 435-438 [0160] [0162]
- Wu Wu J. Biol. Chem.,
1987, vol. 262, 4429-4432 [0162] [0175]
- Miller et al. Meth.
Enzymol., 1993, vol. 217, 581-599
[0163]
- Boesen et al. Biotherapy,
1994, vol. 6, 29 1-302 [0163]
- Clowes et al. J. Clin.
Invest., 1994, vol. 93, 644-651
[0163]
- Klein et al. Blood,
1994, vol. 83, 1467-1473 [0163]
- Salmons Gunzberg Human Gene
Therapy, 1993, vol. 4, 129-141 [0163]
- Grossman Wilson Curr. Opin, in
Genetics and Devel., 1993, vol. 3,
110-114 [0163]
- Loeffler Behr Meth. Enzymol.,
1993, vol. 217, 599-618 [0165]
- Cohen et al. Meth.
Enzymol., 1993, vol. 217, 618-644
[0165]
- Cline Pharmac. Ther.,
1985, vol. 29, 69-92 [0165]
- Stemple Anderson Cell,
1992, vol. 71, 973-985 [0169]
- Rheinwald Meth. Cell Bio.,
1980, vol. 21 A, 229- [0169]
- Pittelkow Scott Mayo Clinic
Proc., 1986, vol. 61, 771- [0169]
- Langer Science, 1990,
vol. 249, 1527-1533 [0177] [0179]
- Treat et al. Liposomes in the
Therapy of Infectious Disease and Cancer Liss1989.
353-365 [0177]
- Lopez-Berestein
LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER
317-327 [0177]
- Sefton CRC Crit. Ref. Biomed.
Eng., 1989, vol. 14, 201- [0178]
- Buchwald et al. Surgery,
1980, vol. 88, 507- [0178]
- Saudek et al. N. Engl. J.
Med., 1989, vol. 321, 574- [0178]
- Medical Applications of Controlled Release CRC
Pres.1974. [0178]
- Controlled Drug Bioavailability, Drug Product
Design and Performance Wiley1984. [0178]
- Ranger Peppas Macromol. Sci. Rev.
Macromol. Chem., 1983, vol. 23, 61- [0178]
- Levy et al. Science,
1985, vol. 228, 190- [0178]
- During et al. Ann.
Neurol., 1989, vol. 25, 351- [0178]
- Howard et al. J.
Neurosurg., 1989, vol. 71, 105- [0178]
- Joliot et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 1864-1868
[0180]
- Bowen J. Immunol., 1993,
vol. 151, 5896-5906 [0206]
- Gruss et al. Blood,
1996, vol. 83, 2045-2056 [0210]
- Gruss et al. Blood, vol.
83, no. 8. 2045-2056 [0213]
- Hubinger et al. Exp.
Hematol., 1999, vol. 27, no. 12. 1796-805
[0214]
- Gilliland et al. Tissue
Antigens, 1996, vol. 47, 1-20 [0228]
- Donaldson et al. J. Immunol:
Meth., 1997, vol. 203, 25-33 [0235]
- Mir et al. Blood,
2000, vol. 96, 4307-43 12 [0236]
- Kapp et al. Ann Oncol.,
1994, vol. 5, no. 1. 121-126 [0239]
[0240]
- Yarnold Fell Cancer Res.,
1994, vol. 54, 506-512 [0243]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Seattle Genetics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS
ANTI-CD30 RECOMBINANTES Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
9632-022-228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A Asignar
<141 > Concurrentemente En Este
Documento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(351)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactactata taacc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatttatc ctggaagcgg taatactaag tacaatgaga agttcaaggg c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
<211 >24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatggtaact actggtttgc ttac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(333)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggccagcc aaagtgttga ttttgatggt gatagttata tgaac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcatcca atctagaatc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcaaagta atgaggatcc gtggacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(375)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattactata tgaac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttattagaa acaaagctaa tggttacaca acagagttca gtgcatctgt gatgggt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcccccct atggtaaccc ccattattat gctatggact ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(333)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggccagca aaagtgtcag tgcatctggc tataattata tgcac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgcatcca acctagaatc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcacagtg gggagcttcc attcacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Seattle Genetics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS
ANTI-CD30 RECOMBINANTES Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
9632-022-228
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A Asignar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Concurrentemente En Este
Documento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(351)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactactata taacc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatttatc ctggaagcgg taatactaag tacaatgaga agttcaaggg c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatggtaact actggtttgc ttac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(333)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggccagcc aaagtgttga ttttgatggt gatagttata tgaac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcatcca atctagaatc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcaaagta atgaggatcc gtggacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(375)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattactata tgaac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttattagaa acaaagctaa tggttacaca acagagttca gtgcatctgt gatgggt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcccccct atggtaaccc ccattattat gctatggact ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(333)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggccagca aaagtgtcag tgcatctggc tataattata tgcac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgcatcca acctagaatc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcacagtg gggagcttcc attcacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211>9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
Claims (29)
1. Un anticuerpo que (i) se enlaza
immunoespecíficamente con CD30 y (ii) por sí mismo ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o
citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en
ausencia de una conjugación a un agente citostático o citotóxico,
respectivamente, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de
Hodgkin.
2. El anticuerpo según la reivindicación 1,
siendo el anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
3. El anticuerpo según la reivindicación 2,
donde el anticuerpo compite para unirse con CD30 con el anticuerpo
monoclonal AC10.
4. El anticuerpo según la reivindicación 2,
donde el anticuerpo compite para unirse con CD30 con el anticuerpo
monoclonal HeFi-1.
5. El anticuerpo según la reivindicación 3,
donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:4, la SEC ID nº:6, y la
SEC ID nº:8, y comprende una región variable de cadena ligera
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº: 12, la SEC ID nº:14 y la
SEC ID nº:16.
6. El anticuerpo según la reivindicación 3,
donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada
que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID nº:2, y una región variable de cadena
ligera que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID
nº:10.
nº:10.
7. El anticuerpo según la reivindicación 6,
donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y
una región variable de cadena ligera comprendiendo las secuencias de
aminoácidos de la SEC ID nº: 2 y la SEC ID nº: 10,
respectivamente.
8. El anticuerpo según la reivindicación 4,
donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:20, la SEC ID nº:22, y la
SEC ID nº:24, y comprende una región variable de cadena ligera
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:28, la SEC ID nº:30 y la
SEC ID nº:32.
9. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, donde el anticuerpo se conjuga a un agente
citotóxico.
10. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el efecto citostático o citotóxico se
exhibe al emplear un método comprendiendo:
- a)
- poner en contacto un cultivo de la línea celular de la enfermedad de Hodgkin con el anticuerpo, siendo dicho cultivo de aproximadamente 5.000 células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33 cm^{2}, dicho contacto teniendo una duración de 72 horas;
- b)
- exponer el cultivo a 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y
- c)
- medir la incorporación de ^{3}H-timidina en las células del cultivo, donde el anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de ^{3}H-timidina en comparación con las células de la misma línea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivada bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo.
11. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de la enfermedad de Hodgkin comprendiendo:
- a)
- un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico que (i) se enlaza immunoespecíficamente con CD30, (ii) ejerce por sí mismo un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de una conjugación a un agente citostático o citotóxico, respectivamente, en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin; y
- b)
- un portador farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
12. La composición según la reivindicación
farmacéutica 11, donde el anticuerpo compite para unirse con CD30
con el anticuerpo monoclonal AC10.
13. La composición farmacéutica según la
reivindicación 11, donde el anticuerpo compite para unirse con CD30
con el anticuerpo monoclonal HeFi-1.
14. La composición farmacéutica según la
reivindicación 12, donde el anticuerpo comprende una región variable
de cadena pesada comprendiendo regiones de determinación
complementarias teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID
nº:4, la SEC ID nº:6, y la SEC ID nº:8, y comprende una región
variable de cadena ligera comprendiendo regiones de determinación
complementarias teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID
nº:12, la SEC ID nº: 14 y la SEC ID nº:16.
15. La composición farmacéutica según la
reivindicación 12, donde el anticuerpo comprende una región variable
de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº:2, y una región variable de
cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº:10.
16. La composición farmacéutica según la
reivindicación 15, donde el anticuerpo comprende una región variable
de cadena pesada y una región variable de cadena ligera
comprendiendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:2 y la
SEC ID nº:10, respectivamente.
17. La composición farmacéutica según la
reivindicación 13, donde el anticuerpo comprende una región variable
de cadena pesada comprendiendo regiones de determinación
complementarias teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID
nº:20, la SEC ID nº:22, y la SEC ID nº:24, y comprende una región
variable de cadena ligera comprendiendo regiones de determinación
complementarias teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID
nº:28, la SEC ID nº:30 y la SEC ID nº:32.
18. La composición farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 17, en la cual el anticuerpo se conjuga a
un agente citotóxico.
19. La composición farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 17, donde el efecto citostático o
citotóxico se exhibe al realizar un método comprendiendo:
- a)
- poner en contacto un cultivo de la línea celular de la enfermedad de Hodgkin con el anticuerpo, siendo dicho cultivo de aproximadamente 5.000 células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33 cm^{2}, dicho contacto teniendo una duración de 72 horas;
- b)
- exponer el cultivo a 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y
- c)
- medir la incorporación de ^{3}H-timidina en las células del cultivo, donde el anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de ^{3}H-timidina en comparación con las células de la misma línea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con el anti- cuerpo.
20. Uso de un anticuerpo que (i) se enlaza
immunoespecíficamente a CD30 y (ii) por sí mismo ejerce un efecto
citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de
Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o
citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en
ausencia de una conjugación a un agente citostático o citotóxico,
respectivamente, en la producción de un medicamento para el
tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.
21. El uso según la reivindicación 20, siendo el
anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
22. El uso según la reivindicación 21, donde el
anticuerpo compite para unirse con CD30 con el anticuerpo monoclonal
AC10.
23. El uso según la reivindicación 21, donde el
anticuerpo compite para unirse con CD30 con el anticuerpo monoclonal
HeFi-1.
24. El uso según la reivindicación 22, donde el
anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:4, la SEC ID nº:6, y la
SEC ID nº:8, y comprende una región variable de cadena ligera
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:12, la SEC ID nº:14 y la
SEC ID nº:16.
25. El uso según la reivindicación 22, donde el
anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene
al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID nº:2, y una región variable de cadena ligera que tiene al
menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID
nº:10.
nº:10.
26. El uso según la reivindicación 25, donde el
anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una
región variable de cadena ligera comprendiendo las secuencias de
aminoácidos de la SEC ID nº: 2 y la SEC ID nº: 10,
respectivamente.
27. El uso según la reivindicación 23, donde el
anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:20, la SEC ID nº:22, y la
SEC ID nº:24, y comprende una región variable de cadena ligera
comprendiendo regiones de determinación complementarias teniendo las
secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº:28, la SEC ID nº:30 y la
SEC ID nº:32.
28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
24 a 27, donde el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico.
29. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
20 a 27, donde el efecto citostático o citotóxico se expone al
emplear un método comprendiendo:
- a)
- poner en contacto un cultivo de la línea celular de la enfermedad de Hodgkin con el anticuerpo, siendo dicho cultivo de aproximadamente 5.000 células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33 cm^{2}, dicho contacto teniendo una duración de 72 horas;
- b)
- exponer el cultivo a 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y
- c)
- medir la incorporación de ^{3}H-timidina en las células del cultivo, donde el anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de ^{3}H-timidina en comparación con las células de la misma línea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/724,406 US7090843B1 (en) | 2000-11-28 | 2000-11-28 | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| US724406 | 2000-11-28 | ||
| PCT/US2001/044811 WO2002043661A2 (en) | 2000-11-28 | 2001-11-28 | Recombinant anti-cd30 antibodies and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2339333T3 true ES2339333T3 (es) | 2010-05-19 |
| ES2339333T5 ES2339333T5 (es) | 2013-09-26 |
Family
ID=24910311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01986050T Expired - Lifetime ES2339333T5 (es) | 2000-11-28 | 2001-11-28 | Anticuerpos anti-CD30 recombinantes y usos de los mismos |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7090843B1 (es) |
| EP (1) | EP1347730B2 (es) |
| JP (1) | JP4303964B2 (es) |
| AT (1) | ATE454124T1 (es) |
| AU (2) | AU3651802A (es) |
| CA (1) | CA2430135C (es) |
| CY (1) | CY1110700T1 (es) |
| DE (1) | DE60141043D1 (es) |
| DK (1) | DK1347730T4 (es) |
| ES (1) | ES2339333T5 (es) |
| PT (1) | PT1347730E (es) |
| WO (1) | WO2002043661A2 (es) |
Families Citing this family (121)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7090843B1 (en) † | 2000-11-28 | 2006-08-15 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| US20040018194A1 (en) * | 2000-11-28 | 2004-01-29 | Francisco Joseph A. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| US20110313230A1 (en) | 2001-05-11 | 2011-12-22 | Terrance Grant Johns | Specific binding proteins and uses thereof |
| AU2002363939A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Seattle Genetics, Inc. | Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies |
| CA2471645A1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-07-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Immunoconjugates useful for treatment of tumours |
| JP4562395B2 (ja) | 2002-01-09 | 2010-10-13 | メダレックス， インク． | Ｃｄ３０に対するヒトモノクローナル抗体 |
| US20070148171A1 (en) * | 2002-09-27 | 2007-06-28 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD30 antibodies |
| US7659241B2 (en) * | 2002-07-31 | 2010-02-09 | Seattle Genetics, Inc. | Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease |
| BR122018071808B8 (pt) | 2003-11-06 | 2020-06-30 | Seattle Genetics Inc | conjugado |
| AU2005292227A1 (en) | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Medarex, Inc. | Methods of treating CD30 positive lymphomas |
| BRPI0607203A2 (pt) | 2005-02-18 | 2009-08-25 | Medarex Inc | anticorpo anti-cd30 isolado, célula hospedeira, métodos para inibir o crescimento de células cd30+, e, uso de um anticorpo anti-cd30 desfucosilado |
| EP1951757B1 (en) | 2005-10-06 | 2014-05-14 | Xencor, Inc. | Optimized anti-cd30 antibodies |
| WO2008025020A2 (en) * | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Seattle Genetics, Inc. | Cd30 binding agents and uses thereof |
| CR20190516A (es) | 2007-07-16 | 2020-02-18 | Genentech Inc | ANTICUERPOS ANTI-CD79B E INMUNOCONJUGADOS (Divisional 2015-0040) |
| PE20090481A1 (es) | 2007-07-16 | 2009-05-18 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados humanizados y metodos de uso |
| WO2009026274A1 (en) | 2007-08-22 | 2009-02-26 | Medarex, Inc. | Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions |
| CN101969970B (zh) * | 2007-10-12 | 2014-10-15 | 西雅图基因公司 | 用抗体-药物偶联物联合治疗 |
| CN101981055B (zh) | 2008-01-31 | 2016-03-09 | 健泰科生物技术公司 | 抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法 |
| WO2010027513A2 (en) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | Psma Development Company, Llc | Methods for killing psma-expressing, taxane-resistant cancer cells |
| CA3051090C (en) | 2009-01-09 | 2022-04-12 | Seattle Genetics, Inc. | Weekly dosing regimens for anti-cd30 vc-pab-mmae antibody drug-conjugates |
| KR101224468B1 (ko) | 2009-05-20 | 2013-01-23 | 주식회사 파멥신 | 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도 |
| US20110076232A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-03-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
| US9272052B2 (en) | 2010-10-22 | 2016-03-01 | Seattle Genetics, Inc. | Synergistic effects between auristatin-based antibody drug conjugates and inhibitors of the PI3K-AKT mTOR pathway |
| EP2793949B1 (en) | 2011-12-23 | 2018-08-22 | Innate Pharma | Enzymatic conjugation of antibodies |
| JP6370774B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2018-08-08 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | ヒトｃｄ３０リガンド抗原結合性タンパク質 |
| EP2872894B1 (en) | 2012-07-13 | 2019-04-17 | Innate Pharma | Screening of conjugated antibodies |
| NZ740948A (en) | 2012-10-11 | 2019-11-29 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Glycinamide derivatives and production methods thereof |
| ES2782248T3 (es) | 2012-10-19 | 2020-09-11 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Conjugado de anticuerpo y fármaco producido por la unión a través de un enlazador que tiene estructura hidrófila |
| EP2916872B1 (en) | 2012-11-09 | 2019-02-27 | Innate Pharma | Recognition tags for tgase-mediated conjugation |
| WO2014080251A1 (en) | 2012-11-24 | 2014-05-30 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules |
| US9353150B2 (en) | 2012-12-04 | 2016-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment |
| MY169117A (en) | 2012-12-21 | 2019-02-18 | Bioalliance Cv | Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof |
| BR112015023520A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-10-24 | Abbvie Inc | purificação do conjugado de anticorpo-fármaco (adc) |
| TWI689313B (zh) | 2013-03-15 | 2020-04-01 | 德商艾伯維德國有限及兩合公司 | 抗-ｅｇｆｒ抗體藥物結合物調配物 |
| EP2968582B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-07-01 | Innate Pharma | Solid phase tgase-mediated conjugation of antibodies |
| JP6433085B2 (ja) | 2013-04-09 | 2018-12-05 | ボストン バイオメディカル， インコーポレイテッド | がんの処置に使用するための２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン |
| EP3010547B1 (en) | 2013-06-20 | 2021-04-21 | Innate Pharma | Enzymatic conjugation of polypeptides |
| CN105517577A (zh) | 2013-06-21 | 2016-04-20 | 先天制药公司 | 多肽的酶促偶联 |
| CN105764503A (zh) | 2013-10-15 | 2016-07-13 | 西雅图基因公司 | 用于改善配体-药物偶联物药代动力学的peg化的药物-接头 |
| AU2015210578B2 (en) | 2014-01-29 | 2020-04-16 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Ligand-cytotoxic drug conjugate, preparation method therefor, and uses thereof |
| DK3122757T3 (da) | 2014-02-28 | 2023-10-09 | Hangzhou Dac Biotech Co Ltd | Ladede linkere og anvendelse deraf til konjugering |
| JP2017513818A (ja) | 2014-03-15 | 2017-06-01 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
| WO2015196167A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Bioalliance C.V. | Anti-folate receptor aplha (fra) antibody-drug conjugates and methods of using thereof |
| ES2785551T3 (es) | 2014-06-30 | 2020-10-07 | Glykos Finland Oy | Derivado de sacárido de una carga útil tóxica y sus conjugados con anticuerpos |
| EP3193915A1 (en) | 2014-07-21 | 2017-07-26 | Novartis AG | Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars |
| PT3262071T (pt) | 2014-09-23 | 2020-06-16 | H Hoffnabb La Roche Ag | Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b |
| US11161907B2 (en) | 2015-02-02 | 2021-11-02 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
| EP3286211A1 (en) | 2015-04-23 | 2018-02-28 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
| LT3303373T (lt) | 2015-05-30 | 2020-07-10 | Molecular Templates, Inc. | Deimunizuoto shiga toksino a subvieneto karkasai ir juos apimančios ląstelės taikinio molekulės |
| CA2988126A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Boston Biomedical, Inc. | Compositions comprising a cancer stemness inhibitor and an immunotherapeutic agent for use in treating cancer |
| JP6759326B2 (ja) | 2015-07-12 | 2020-09-23 | ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | 細胞結合分子の共役のための架橋連結体 |
| US9839687B2 (en) | 2015-07-15 | 2017-12-12 | Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. | Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule |
| WO2017027392A1 (en) | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins |
| LT3380620T (lt) | 2015-11-23 | 2024-09-10 | Novartis Ag | Optimizuoti lentivirusiniai pernešimo vektoriai ir jų panaudojimas |
| EP4219689A3 (en) | 2015-12-30 | 2023-12-20 | Novartis AG | Immune effector cell therapies with enhanced efficacy |
| TWI753875B (zh) | 2016-01-08 | 2022-02-01 | 美商美國全心醫藥生技股份有限公司 | 四價抗psgl-1抗體及其用途 |
| US11549099B2 (en) | 2016-03-23 | 2023-01-10 | Novartis Ag | Cell secreted minibodies and uses thereof |
| CN109843919A (zh) | 2016-03-25 | 2019-06-04 | 西雅图基因公司 | 用于制备聚乙二醇化的药物-接头及其中间体的方法 |
| WO2017197045A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Movassaghi Mohammad | Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs |
| AU2016429272A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-05-02 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers |
| JP7523907B2 (ja) | 2016-11-14 | 2024-07-29 | 武田薬品工業株式会社 | 非成人のヒトに対する抗ｃｄ３０抗体－薬物コンジュゲートの投与 |
| WO2018102427A1 (en) | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Boston Biomedical, Inc. | Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof |
| WO2018111340A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Novartis Ag | Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells |
| CN106854245A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-06-16 | 无锡傲锐东源生物科技有限公司 | 抗cd30蛋白单克隆抗体及其用途 |
| ES2912408T3 (es) | 2017-01-26 | 2022-05-25 | Novartis Ag | Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos |
| WO2018144535A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities |
| WO2018160731A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
| US20210330801A1 (en) | 2017-03-02 | 2021-10-28 | Cadila Healthcare Limited | Novel protein drug conjugate formulation |
| IL269398B2 (en) | 2017-03-24 | 2024-05-01 | Seagen Inc | A process for the preparation of glucuronide-drug binders and their intermediates |
| CA3062656A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Boston Biomedical, Inc. | Methods for treating cancer |
| WO2018229715A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof |
| MA50767A (fr) | 2017-10-11 | 2020-08-19 | Seattle Genetics Inc | Procédés de réduction des effets secondaires d'une thérapie par conjugués de médicament anticorps anti-cd30 |
| US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
| CN111566124A (zh) | 2017-10-25 | 2020-08-21 | 诺华股份有限公司 | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 |
| US20210040205A1 (en) | 2017-10-25 | 2021-02-11 | Novartis Ag | Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof |
| WO2019089798A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
| MX2020004563A (es) | 2017-11-01 | 2020-08-13 | Seattle Genetics Inc | Metodos de reduccion de efectos secundarios del tratamiento con conjugado anticuerpo anti-cd30-farmaco. |
| CN117126279A (zh) | 2018-03-20 | 2023-11-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| MA52135A (fr) | 2018-03-23 | 2021-01-27 | Seagen Inc | Utilisation de conjugués anticorps-médicament comprenant des agents de rupture de tubuline pour traiter une tumeur solide |
| EP3784351A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Novartis AG | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
| US20210396739A1 (en) | 2018-05-01 | 2021-12-23 | Novartis Ag | Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome |
| US20210213063A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
| EP3802825A1 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-14 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunooncology |
| AR116109A1 (es) | 2018-07-10 | 2021-03-31 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos |
| US11584799B2 (en) | 2018-09-24 | 2023-02-21 | Medical College Of Wisconsin, Inc. | Anti-CD30 antibodies and methods for treating CD30+ cancer |
| CA3114137A1 (en) | 2018-09-26 | 2020-04-02 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Ligand-drug conjugate of exatecan analogue, preparation method therefor and application thereof |
| CA3114922A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Seagen Inc. | Methods of treating peripheral t cell lymphoma using anti-cd30 antibody drug conjugate therapy |
| KR20210116437A (ko) | 2018-11-20 | 2021-09-27 | 코넬 유니버시티 | 방사성핵종의 마크로사이클릭 복합체 및 암의 방사선 요법에서의 이의 용도 |
| JP2022514315A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-10 | ノバルティス アーゲー | ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ |
| JP7483732B2 (ja) | 2019-02-15 | 2024-05-15 | ノバルティス アーゲー | ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用 |
| JP7488826B2 (ja) | 2019-02-15 | 2024-05-22 | ノバルティス アーゲー | 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用 |
| WO2020210719A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Elevatebio Management, Inc. | Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same |
| EP4032892A4 (en) | 2019-09-18 | 2023-10-18 | Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. | CAMPTOTHECIN DERIVATIVE AND CONJUGATE THEREOF |
| MX2022003357A (es) | 2019-09-25 | 2022-05-03 | Seagen Inc | Combinación de anticuerpo anti-cd30 conjugado con un farmaco, anti-pd-1 y quimioterapia para el tratamiento de cánceres hematopoyéticos. |
| EP4037717A1 (en) | 2019-10-04 | 2022-08-10 | Seagen Inc. | Camptothecin peptide conjugates |
| WO2021067820A1 (en) | 2019-10-04 | 2021-04-08 | Seagen Inc. | Formulation of antibody-drug conjugate |
| MX2022005240A (es) | 2019-11-04 | 2022-08-19 | Seagen Inc | Conjugados de farmaco-anticuerpo anti-cd30 y su uso para el tratamiento de infeccion por vih. |
| CA3165399A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Novartis Ag | Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases |
| KR20220130160A (ko) | 2020-01-22 | 2022-09-26 | 상하이 센후이 메디슨 컴퍼니 리미티드 | 에리불린 유도체의 약물 접합체, 이를 제조하기 위한 방법 및 의료분야에서 이의 용도 |
| WO2021155129A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Seagen Inc. | Anti-cd30 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of non-hodgkin lymphoma |
| US20230165969A1 (en) | 2020-03-25 | 2023-06-01 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising antibody drug conjugate and use thereof |
| AU2021243080A1 (en) | 2020-03-25 | 2022-09-22 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Preparation method for antibody medicament conjugate |
| US20230173093A1 (en) | 2020-04-10 | 2023-06-08 | Seagen Inc. | Charge variant linkers |
| EP4149559A1 (en) | 2020-05-13 | 2023-03-22 | Seagen Inc. | Methods of treating cancer using a combination of anti-cd30 antibody-drug conjugates |
| EP4165169A1 (en) | 2020-06-11 | 2023-04-19 | Novartis AG | Zbtb32 inhibitors and uses thereof |
| US20230321067A1 (en) | 2020-06-23 | 2023-10-12 | Novartis Ag | Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives |
| JP2023536164A (ja) | 2020-08-03 | 2023-08-23 | ノバルティス アーゲー | ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用 |
| AU2022208054A1 (en) | 2021-01-15 | 2023-07-27 | Seagen Inc. | Immunomodulatory antibody-drug conjugates |
| US12036286B2 (en) | 2021-03-18 | 2024-07-16 | Seagen Inc. | Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds |
| TW202304979A (zh) | 2021-04-07 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途 |
| JP2024514673A (ja) | 2021-04-20 | 2024-04-02 | シージェン インコーポレイテッド | 抗体依存性細胞傷害の調節 |
| EP4330381A1 (en) | 2021-04-27 | 2024-03-06 | Novartis AG | Viral vector production system |
| CA3221398A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Seagen Inc. | Anthracycline antibody conjugates |
| KR20240099363A (ko) | 2021-10-29 | 2024-06-28 | 씨젠 인크. | 항-pd-1 항체와 항-cd30 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법 |
| CN114891101B (zh) * | 2021-12-02 | 2023-06-16 | 吉林省农业科学院 | 一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用 |
| WO2023178289A2 (en) | 2022-03-17 | 2023-09-21 | Seagen Inc. | Camptothecin conjugates |
| WO2023214325A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors |
| WO2023215740A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Seagen Inc. | Immunomodulatory antibody-drug conjugates |
| WO2024089639A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Novartis Ag | Lentiviral formulations |
| WO2024129756A1 (en) | 2022-12-13 | 2024-06-20 | Seagen Inc. | Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates |
| WO2024197151A2 (en) | 2023-03-22 | 2024-09-26 | Salubris Biotherapeutics, Inc. | Anti-5t4 antigen binding domains, antibody-drug conjugates and methods of use thereof |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5165923A (en) * | 1989-11-20 | 1992-11-24 | Imperial Cancer Research Technology | Methods and compositions for the treatment of hodgkin's disease |
| WO1991007437A2 (en) | 1989-11-20 | 1991-05-30 | Parker, David, L. | Improved cd-30 antibodies and fragments thereof |
| DE4200043A1 (de) | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Stein Harald Prof Dr | Lymphoides cd30-antigen (ki-1), dessen protein- und die zugehoerige nucleotidsequenz, seine herstellung sowie mittel zur diagnose und untersuchung von tumoren |
| CA2110799A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Arnold H. Horwitz | Microbially-produced antibody fragments and their conjugates |
| DK0615451T3 (da) | 1992-05-26 | 2006-04-24 | Immunex Corp | Hidtil ukendt cytokin der binder til CD30 |
| ATE200625T1 (de) | 1992-10-09 | 2001-05-15 | Advanced Tissue Sciences Inc | Leberreservezellen |
| WO1994015969A1 (en) | 1993-01-14 | 1994-07-21 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant anti-hiv antibody and preparation thereof |
| WO1996004925A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Immunomedics, Inc. | Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells |
| JP3066983B2 (ja) | 1995-01-18 | 2000-07-17 | ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膜結合ｃｄ３０抗原の蛋白質分解性開裂及び遊離を防ぐ抗ｃｄ３０抗体 |
| DE19543039C1 (de) | 1995-11-08 | 1996-11-21 | Medac Klinische Spezialpraep | Rekombinante Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 |
| DE19640733A1 (de) * | 1996-10-02 | 1998-04-09 | Abken Hinrich | Verfahren zur Hemmung der unbegrenzten Profileration, Tumorbildung oder Metastasierung CD30 Antigen exprimierender Zellen |
| US20030186384A1 (en) | 2000-04-22 | 2003-10-02 | Stefan Barth | Apoptotic agents |
| US20040018194A1 (en) | 2000-11-28 | 2004-01-29 | Francisco Joseph A. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| US7090843B1 (en) † | 2000-11-28 | 2006-08-15 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| AU2002363939A1 (en) | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Seattle Genetics, Inc. | Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies |
-
2000
- 2000-11-28 US US09/724,406 patent/US7090843B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-28 DE DE60141043T patent/DE60141043D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 JP JP2002545640A patent/JP4303964B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 PT PT01986050T patent/PT1347730E/pt unknown
- 2001-11-28 WO PCT/US2001/044811 patent/WO2002043661A2/en active Application Filing
- 2001-11-28 DK DK01986050.1T patent/DK1347730T4/da active
- 2001-11-28 ES ES01986050T patent/ES2339333T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 CA CA2430135A patent/CA2430135C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 AU AU3651802A patent/AU3651802A/xx active Pending
- 2001-11-28 AU AU2002236518A patent/AU2002236518B2/en active Active
- 2001-11-28 EP EP01986050.1A patent/EP1347730B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 AT AT01986050T patent/ATE454124T1/de active
-
2010
- 2010-01-29 CY CY20101100089T patent/CY1110700T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3651802A (en) | 2002-06-11 |
| US7090843B1 (en) | 2006-08-15 |
| JP2005506035A (ja) | 2005-03-03 |
| CY1110700T1 (el) | 2015-06-10 |
| AU2002236518B2 (en) | 2006-10-26 |
| PT1347730E (pt) | 2010-03-03 |
| DK1347730T4 (da) | 2020-04-27 |
| ATE454124T1 (de) | 2010-01-15 |
| WO2002043661B1 (en) | 2003-03-06 |
| WO2002043661A2 (en) | 2002-06-06 |
| CA2430135A1 (en) | 2002-06-06 |
| DE60141043D1 (de) | 2010-02-25 |
| EP1347730A2 (en) | 2003-10-01 |
| JP4303964B2 (ja) | 2009-07-29 |
| EP1347730A4 (en) | 2005-08-17 |
| ES2339333T5 (es) | 2013-09-26 |
| DK1347730T3 (da) | 2010-02-01 |
| WO2002043661A3 (en) | 2003-01-16 |
| CA2430135C (en) | 2012-10-02 |
| EP1347730B2 (en) | 2013-05-29 |
| EP1347730B1 (en) | 2010-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2339333T3 (es) | Anticuerpos anti-cd30 recombinantes y usos de los mismos. | |
| US20230107639A1 (en) | Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof | |
| AU2002236518A1 (en) | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof | |
| KR102584675B1 (ko) | GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
| ES2354865T3 (es) | Anticuerpos anti-cd40 humanizados y métodos para utilizarlos. | |
| ES2945313T3 (es) | Construcciones de anticuerpos biespecificos para CDH3 y CD3 | |
| US20070258987A1 (en) | Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof | |
| US20040018194A1 (en) | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof | |
| US20080213289A1 (en) | Recombinant anti-cd30 antibodies and uses thereof | |
| WO2018049248A1 (en) | Oncolytic virus equipped with bispecific engager molecules | |
| CN105745224B (zh) | 用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体 | |
| KR102143887B1 (ko) | Toso 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물 | |
| KR102602329B1 (ko) | Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
| JP6998309B2 (ja) | 抗ポドカリキシン抗体及びその使用方法 | |
| CN117136071A (zh) | 多肽及其在治疗疾病中的用途 | |
| TW202128754A (zh) | 抗癌胚抗原相關細胞黏附分子（ｃｅａｃａｍ）抗體及其用途 | |
| JP2019511199A (ja) | 新規の抗ｕｐｋ１ｂ抗体及び使用方法 | |
| US20100129361A1 (en) | Immunosuppression with antibody against itm2a | |
| RU2478648C2 (ru) | Антитело против удлиненного гликосфинголипида i типа, его производные и применение | |
| AU2007200173B2 (en) | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof | |
| BR112020001320A2 (pt) | combinações farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-bst-1 e um análogo de citidina | |
| KR20220088438A (ko) | 글리코실화된 lag3에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법 | |
| KR20230107478A (ko) | 치료 항체 및 그의 용도 |