PT1347730E - Anticorpos anti-cd30 recombinantes e suas utilizações - Google Patents

Description

ΕΡ 1 347 730/ΡΤ DESCRIÇÃO "Anticorpos anti-CD30 recombinantes e suas utilizações"

1. CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a anticorpos e composições para o tratamento da Doença de Hodgkin, compreendendo a administração de um anticorpo que se liga a CD30. Tais anticorpos incluem formas recombinantes/variantes dos anticorpos monoclonais AC10 e HeFi-1, e seus derivados. 0 presente invento refere-se a uma nova classe de anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor CD30 que, na forma não modificada, são capazes de inibir o crescimento de células da Doença de Hodgkin que expressam CD30.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

Os regimes de quimioterapia curativa para a Doença de Hodgkin representam um dos maiores avanços na oncologia clinica. Regimes de quimioterapia de multi-agentes aumentaram a taxa de cura para mais de 80% para estes pacientes. Contudo, 3% dos pacientes morrem de causas relacionadas com o tratamento e para os pacientes que não respondem à terapia padrão ou têm relapsos após o tratamento de primeira linha, a única modalidade de tratamento disponível é a quimioterapia de dose elevada em combinação com transplante de células estaminais. Este tratamento está associado a uma incidência de mortalidade de 80%, uma significativa morbilidade e uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos de 50% (Ver, p.ex., Engert, et al., Seminars in Hematology 36: 282-289, 1999). A causa primária para o relapso tumoral é o desenvolvimento de clones de células tumorais resistentes aos agentes quimioterapêuticos. A imunoterapia representa uma estratégia alternativa que pode potencialmente contornar a resistência. Anticorpos monoclonais para direccionamento especifico para células tumorais malignas foram o foco de várias abordagens imunoterapêuticas. Para várias malignidades, os produtos terapêuticos baseados em anticorpos são agora uma parte reconhecida da terapia padrão. O anticorpo anti-CD20 2 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ manipulado Rituxan®, por exemplo, foi aprovado no final de 1997 para o tratamento de LNH de baixo grau relapso. CD30 é uma glicoproteina membranar de 120 quilodaltons (Froese et al., J. Immunol. 139: 2081-87, 1987) e um membro da superfamília de receptores de TNF. Esta familia inclui TNF-RI, TNF-RII, CD30, CD40, OX-40 e RANK, entre outros. CD30 é um marcador comprovado de células malignas na doença de Hodgkin (DH) e no linfoma anaplásico de grandes células (LAGC), um subconjunto de linfomas não Hodgkin (LNH) (Diirkop et al., Cell 88: 421-427, 1992). Originalmente identificado em células cultivadas de Hodgkin-Reed Steinberg (H-RS) utilizando o anticorpo monoclonal Ki-1 (Schwab et ai., Nature 299: 65-67, 1982), CD30 é altamente expresso na superfície celular de todos os linfomas da DH e a maioria dos LAGC, contudo tem uma expressão muito limitada em tecidos normais em poucas células linfóides nas áreas perifoliculares (Josimovic-Alasevic et ai., Eur. J. Immunol. 19: 157-162, 1989). Os anticorpos monoclonais específicos para o antigénio CD30 foram explorados como veículos para a entrega de fármacos citostáticos, toxinas vegetais e radioisótopos tanto em modelos pré-clínicos como em estudos clínicos (Engert et al., Câncer Research 50: 84-88, 1990; Barth et al., Blood 95: 3909-3914, 2000) . Em pacientes com DH, o direccionamento para o antigénio CD30 poderia ser alcançado com doses baixas do mAb anti-CD30, BerH2 (Falini et al., British Journal of Haematology 82: 38-45, 1992). Contudo, apesar do sucesso do direccionamento in vivo para células tumorais malignas, nenhum dos pacientes experimentou regressão tumoral. Num ensaio clínico subsequente, uma toxina (saporina) foi quimicamente conjugada com o anticorpo BerH2 e todos os quatro pacientes demonstraram reduções rápidas e substanciais na massa tumoral (Falini et al., Lancet 339: 1195-1196, 1992).

Estas observações realçam a validade do receptor CD30 como antigénio alvo. No entanto, todos os pacientes tratados com o conjugado mAb-toxina desenvolvem anticorpos para a toxina. Uma das maiores limitações das imunotoxinas é a sua inerente imunogenicidade que resulta no desenvolvimento de anticorpos contra a molécula da toxina e neutraliza os seus efeitos (Tsutsumi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97: 3

ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 8545-8553, 2000) . Adicionalmente, a toxicidade para o fígado e a síndroma de derrame vascular associada a imunotoxinas limita potencialmente a capacidade para entregar doses curativas destes agentes (Tsutsumi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 8545-8553, 2000) . 2.1 ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA CD30 CD30 foi originalmente identificado através do anticorpo monoclonal Ki-1 e inicialmente referido como o antigénio Ki-1 (Schwab et al., Nature 299: 65-67, 1982). Este mAb foi desenvolvido contra células malignas de Hodgkin e Reed-Sternberg (H-RS), as células malignas da Doença de Hodgkin (DH). Um segundo mAb, capaz de se ligar a um epítopo resistente a formalina, diferente do reconhecido por Ki-1 foi subsequentemente descrito (Schwarting et al., Blood 74: 1678-1689, 1989). A identificação de quatro anticorpos adicionais resultou na criação do grupo CD30 no Third Leucocyte Typing Workshop em 1986 (McMichael, A., ed., 1987, "Leukocyte Typing III" (Oxford: Oxford University Press)). 2.2 TERAPÊUTICOS BASEADOS EM ANTICORPOS MONOCLONAIS DE CD30 A utilidade de mAb contra CD30 no diagnóstico e determinação do estádio da DH conduziu à sua avaliação como potenciais ferramentas para imunoterapia. Em pacientes com DH, o direccionamento específico para o antigénio CD30 foi alcançado com doses baixas (30-50 mg) do mAb anti-CD30 BerH2 (Falini et al., British Journal of Haematology 82: 38-45, 1992) . Apesar do direccionamento com sucesso in vivo para as células tumorais malignas H-RS, nenhum dos pacientes experimentou regressões tumorais.

Com base nestes resultados, concluiu-se que a eficácia com imunoterapia direccionada por mAb CD30 não podia ser alcançada com anticorpos não modificados (Falini et al., Lancet 339: 1195-1196, 1992). Num ensaio clínico subsequente, o tratamento de quatro pacientes com DH refractária com uma toxina, saporina, quimicamente conjugada com o mAb BerH2 demonstrou reduções rápidas e substanciais, embora transientes, na massa tumoral (Falini et al., Lancet 339: 1195-1196, 1992) . Nos últimos anos, os investigadores trabalharam para refinar as abordagens para tratamento de 4 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ células neoplásicas que expressam CD30. Exemplos incluem o desenvolvimento de imunotoxinas de cadeia simples recombinantes (Barth et al., Blood 95: 3909-3914, 2000), mAb biespecíficos anti-CDl6/CD30 (Renner et al.r Câncer Immunol. Immunother. 49: 173-180v) e a identificação de novos mAb anti-CD30 que impedem a libertação de moléculas de CD30 a partir da superfície celular (Horn-Lohrens et al., Int. J. Câncer 60: 539-544, 1995). Este foco rejeitou o potencial dos mAb anti-CD30 com actividade de sinalização no tratamento da Doença de Hodgkin.

2.3. IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CD30 COM ACTIVIDADE AGONISTA

Na clonagem e caracterização da actividade biológica do ligando de CD30 humano (CD30L), foram descritos dois mAb, M44 e M67, que imitavam a actividade de ligação cruzada do receptor induzida por CD30L (Gruss et al., Blood 83: 2045- 2056, 1994) . Em ensaios in vltro, estes mAb, na forma imobilizada, foram capazes de estimular a proliferação de células T activadas e das linhas celulares da Doença de Hodgkin de origem em células T, L540 e HDLM-2. Em contraste, estes mAb tiveram pouco efeito nas linhas celulares de Hodgkin de origem em células B, L428 e KM-H2 (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1994). Em todos estes ensaios, a ligação do receptor CD30 ao mAb anti-CD30 Ki-1 teve pouco efeito. A actividade proliferativa destes mAb agonistas anti-CD30 em linhas celulares de Hodgkin sugeriu que os mAb anti-CD30 possuindo actividade sinalizadora não teriam qualquer utilidade no tratamento da DH.

Em contraste, foi recentemente mostrado que os mAb anti-CD30 podem inibir o crescimento de células de LAGC, incluindo Karpas-299, através da indução de paragem do ciclo celular e sem indução de apoptose (Hubinger et al., Oncogene 20: 590-598, 2001) . Para além disso, a presença dos mAb M44 e M67 imobilizados inibe fortemente a proliferação de linhas celulares representando LAGC que expressam CD30 (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1994). Esta actividade inibidora contra linhas celulares de LAGC foi ainda estendida a estudos com animais in vivo. A sobrevivência de ratinhos SCID possuindo xenoenxertos tumorais de LAGC foi significativamente aumentada 5 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ após a administração do mAb M44. Adicionalmente, o mAb anti-CD30 HeFi-1, reconhecendo um epitopo semelhante ao de M44, prolongou também a sobrevivência neste modelo animal (Tian et al., Câncer Research 55: 5335-5341, 1995). 2.3.1 ANTICORPO MQNOCLONAL AC10 A maioria dos mAb anti-CD30 de murideo conhecidos na especialidade foi gerada através de imunização de ratinhos com linhas celulares de DH ou antigénio CD30 purificado. 0 AC10, originalmente designado CIO (Bowen et al.f J. Immunol. 151: 5896-5906, 1993), é distinto por este mAb anti-CD30 ter sido preparado contra uma linha celular semelhante a NK humana, YT (Bowen et al., J. Immunol. 151: 5896-5906, 1993).

Inicialmente, a actividade de sinalização deste mAb foi evidenciada através de infra-regulação da expressão na superfície celular das moléculas CD28 e CD45, supra-regulação da expressão de CD25 na superfície celular e a indução de adesão homotípica após ligação de CIO a células YT. 2.3.2 ANTICORPO MQNOCLONAL HeFi-1

HeFi-1 é um mAb anti-CD30 que foi produzido através de imunização de ratinhos com a linha celular da Doença de Hodgkin L428 (Hecht et al., J. Immunol. 134: 4231-4236, 1985). A co-cultura de HeFi-1 com as linhas celulares da Doença de Hodgkin L428 ou L540 não conseguiu revelar qualquer efeito directo do mAb na viabilidade destas linhas celulares. A actividade antitumoral In vitro e in vivo de HeFi-1 foi descrita por Tian et al. contra a linha celular de LAGC Karpas 299 (Tian et al., Câncer Research 55: 5335-534, 19951). 2.4 ACTIVIDADE ANTITUMORAL DIRECTA DE ANTICORPOS DE SINALIZAÇÃO CONTRA CD30

Os anticorpos monoclonais representam uma abordagem atractiva de direccionamento para populações específicas de células in vivo. Os mAb nativos e seus derivados podem eliminar células tumorais através de vários mecanismos incluindo, mas não se limitando a, activação do complemento, citotoxidade celular dependente de anticorpos (ADCC), inibição da progressão do ciclo celular e indução de apoptose (Tutt et al., J. Immunol. 161: 3176-3185, 1998). 6 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Tal como descrito acima, os mAb contra o antigénio CD30 tais como Ki-1 e Ber-H2 não conseguiram demonstrar actividade antitumoral directa (Falini et al., British Journal of Haematology 82: 38-45, 1992; Gruss et al.r Blood 83: 2045-2056, 1994) . Embora se tenha mostrado que alguns mAb de sinalização para CD30, incluindo M44, M67 e HeFi-1, inibem o crescimento de linhas de LAGC in vitro (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1994) ou in vivo (Tian et al., 1995, Câncer Res. 55: 5335-5341), não se mostrou que os anticorpos anti-CD30 conhecidos fossem eficazes na inibição da proliferação de células de DH em cultura. De facto, mostrou-se que dois mAb de sinalização anti-CD30, M44 e M67, que inibiam o crescimento da linha de LAGC Karpas-299, aumentam a proliferação de linhas de DH semelhantes a células T in vitro ao mesmo tempo que se mostrou que não houve efeito em linhas de DH semelhantes a células B (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1994). O conjugado do anticorpo Ki-1 com a cadeia A de Ricina produziu uma imunotoxina bastante ineficaz e concluiu-se que esta ineficácia era devida à bastante baixa afinidade do anticorpo Ki-I (Engert et al., Câncer Research 50: 84-88, 1990). Duas outras razões podem também contribuir para a fraca toxicidade dos conjugados Ki-l-cadeia A de Ricina: a) o anticorpo Ki-1 aumentou a libertação do sCD30 das linhas celulares derivadas de Hodgkin L428 e L540 bem como da linha celular de linfoma não Hodgkin CD30+ Karpas 299 (Hansen et al., Immunobiol. 183: 214, 1991); b) a distância relativamente grande do epitopo de Ki-1 à membrana celular também não é favorável para a construção de imunotoxinas potentes (Press et al., J. Immunol. 141: 4410-4417, 1988; May et al., J. Immunol. 144: 3637-3642, 1990) . A publicação PCT WO 96/22384 descreve um anticorpo que se liga ao antigénio CD30 e a) liberta sCD30 de células da Doença de Hodgkin até uma quantidade de 10% ou menos e b) não se liga numa extensão considerável a linfomas de Hodgkin de células B nem a células plasmáticas e é útil para o tratamento de doença de Hodgkin.

No Fourth Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens em Viena em Fevereiro de 1989, foram submetidos anticorpos 7 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ monoclonais por três laboratórios diferentes e finalmente caracterizados como pertencentes ao grupo CD30. Experiências de co-cultura pelos inventores de células L540 com vários anticorpos de acordo com o estado da especialidade, seguidas de isolamento de sCD30 a partir dos fluidos sobrenadantes, revelaram que a libertação do SCD30 era mais fortemente aumentada pelo anticorpo Ki-1, e fracamente pelo anticorpo HeFi-1, ao mesmo tempo que era mais fortemente inibida pelo anticorpo Ber-H2. No entanto, o anticorpo Ber-H2 também marca uma subpopulação de células plasmáticas (Schwarting et al., Blood 74: 1678-1689, 1988) e G. Pallesen (G. Pallesen, Histopathology 16: 409-413, 1990) descreve, na página 411, que Ber-H2 reage de forma cruzada com um epítopo de um antigénio não relacionado que é alterado por formaldeído.

Existe a necessidade na especialidade de agentes terapêuticos com maior eficácia para tratar ou prevenir a Doença de Hodgkin, uma necessidade satisfeita pelo presente invento. Ensaios clínicos e numerosas avaliações pré-clínicas não conseguiram demonstrar actividade antitumoral de vários mAb anti-CD30 na forma não modificada contra células representativas da Doença de Hodgkin. Sob condições semelhantes às utilizadas por Gruss et al. nas suas avaliações dos mAb Ki-1, M44 e M67 (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1994), os presentes inventores demonstram uma classe de mAb contra CD30 que é funcionalmente distinta das anteriormente descritas. Esta classe de mAb anti-CD30 é capaz de inibir o crescimento In vitro de todas as linhas de Hodgkin testadas. Para além disso, estes mAb não modificados possuem actividade antitumoral in vivo contra xenoenxertos de tumores da DH. A citação ou identificação de qualquer referência aqui não deverá ser entendida como uma admissão de que tal referência esteja disponível como anterioridade do presente invento.

3. SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento baseia-se na surpreendente identificação de uma nova actividade associada a uma certa classe de anticorpos anti-CD30, compreendendo a referida classe AC10 e HeFi-1, nomeadamente a sua capacidade para 8 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ inibir ο crescimento de células da Doença de Hodgkin tanto semelhantes a células T como semelhantes a células B. 0 presente invento proporciona um anticorpo que (i) se liga imuno-especificamente a CD30 e (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, em que o referido anticorpo exerce o efeito citostático ou citotóxico sobre a linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, para utilizar no tratamento da Doença de Hodgkin. 0 presente invento proporciona também uma composição farmacêutica para o tratamento da Doença de Hodgkin compreendendo: a) um anticorpo humano, humanizado ou quimérico que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, numa quantidade eficaz para o tratamento da Doença de Hodgkin; e b) um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 presente invento proporciona também a utilização de um anticorpo que (i) se liga imuno-especif icamente a CD30 e (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico sobre uma linha celular da Doença de Hodgkin, em que o referido anticorpo exerce o efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, no fabrico de um medicamento para o tratamento da Doença de Hodgkin. É também divulgado um método para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin num indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo, numa quantidade eficaz para o referido tratamento ou prevenção, de um anticorpo que se liga imuno-especificamente a CD30 e exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, em que o referido anticorpo exerce o efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de 9 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente; e um transportador farmaceuticamente aceitável. É também divulgado um método para o tratamento ou prevenção de Doença de Hodgkin num indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade de uma proteína, proteína esta que compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1, e exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, quantidade esta que é eficaz para o tratamento ou a prevenção de Doença de Hodgkin. Numa concretização, um anticorpo do presente invento é conjugado com uma molécula citotóxica. Noutra concretização, um anticorpo do presente invento é uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de uma segunda proteína tal como briodina ou uma enzima conversora de um pró-fármaco. Os anticorpos do presente invento, incluindo conjugados e proteínas de fusão, podem ser utilizados em conjunto com terapia de radiação, quimioterapia, terapia hormonal e/ou imunoterapia. 0 presente invento engloba também um anticorpo que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, (ii) exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, e (iii) não é o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1 e não resulta da clivagem de AC10 ou HeFi-1 com papaína ou pepsina. 0 anticorpo pode exercer um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de um agente citostático ou citotóxico, respectivamente. 0 presente invento engloba ainda um anticorpo compreendendo SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 ou SEQ ID N0:16, proteína esta que (i) se liga imuno-especif icamente a CD30, e (ii) não é o anticorpo monoclonal AC10 e não resulta da clivagem de AC10 com papaína ou pepsina. 0 presente invento engloba ainda também um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ id N0:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32, proteína esta que (i) se liga imuno-especif icamente a CD30, e (ii) não é o anticorpo monoclonal HeFi-1 e não resulta da clivagem de HeFi-1 com papaína ou pepsina. 10 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ Ο presente invento engloba ainda também um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:10, proteína esta que (i) se liga imuno-especificamente a CD30; e (ii) não é o anticorpo monoclonal AC10 e não resulta da clivagem de AC10 com papaína ou pepsina. O presente invento ainda engloba também um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO:26, proteína esta que (i) se liga imuno-especificamente a CD30; e (ii) não é o anticorpo monoclonal HeFi-1 e não resulta da clivagem de HeFi-1 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou prevenção de Doença de Hodgkin. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) um anticorpo que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, (ii) exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, e (iii) não é o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1 e não resulta da clivagem de AC10 ou HeFi-1 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou prevenção de Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. O anticorpo pode exercer um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma proteína, proteína esta que (i) compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1, (ii) exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, e (iii) não é o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1 e não resulta da clivagem de AC10 ou HeFi-1 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma proteína compreendendo SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 11 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ ou SEQ ID NO:16, proteína esta que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, e (ii) não é o anticorpo monoclonal AC10 e não resulta da clivagem de AC10 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32, proteína esta que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, e (ii) não é o anticorpo monoclonal HeFi-1 e não resulta da clivagem de HeFi-1 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:10, proteína esta que (i) se liga imuno-especificamente a CD30; e (ii) não é o anticorpo monoclonal AC10 e não resulta da clivagem de AC10 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção de Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente invento engloba ainda uma composição farmacêutica compreendendo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:26, proteína esta que (i) se liga imuno-especif icamente a CD30; e (ii) não é o anticorpo monoclonal HeFi-1 e não resulta da clivagem de HeFi-1 com papaína ou pepsina, numa quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável.

Numa concretização preferida, um anticorpo do presente invento é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico. Noutra concretização preferida, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Ainda noutra concretização preferida, o anticorpo 12 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ é uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de uma segunda proteína que não é um anticorpo.

Na determinação do efeito citostático dos anticorpos do presente invento na linhas celulares da Doença de Hodgkin, uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin é colocada em contacto com a proteína, sendo a referida cultura de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o referido contacto durante um período de 72 horas; expostas a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido período de 72 horas; e é medida a incorporação de 3H-timidina nas células da cultura. O anticorpo tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com as células da mesma linha celular da Doença de Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem serem colocadas em contacto com o anticorpo. Linhas celulares da Doença de Hodgkin adequadas para determinar os efeitos citostáticos ou citotóxicos dos anticorpos do presente invento são L428, L450, HDLM2 ou KM-H2. O anticorpo do presente invento é um anticorpo monoclonal, de preferência um anticorpo recombinante, e de maior preferência é humano, humanizado ou quimérico. São também divulgados ácidos nucleicos isolados codificando uma proteína incluindo, mas não se limitando a um anticorpo, que compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1, e exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin. São também divulgados métodos de isolamento de ácidos nucleicos codificando anticorpos que se ligam imuno-especificamente a CD30 e exercem um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin. As proteínas codificadas por qualquer um dos ácidos nucleicos anteriores são também divulgadas. É também divulgado um método de produção de uma proteína compreendendo a criação de uma célula contendo uma sequência nucleotídica recombinante codificando uma proteína, proteína esta que compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1 e exerce um efeito citostático ou 13 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, de modo a que a proteína seja expressa pela célula; e a recuperação da proteína expressa. É também divulgado um método para identificação de um anticorpo anti-CD30 útil para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin, compreendendo a determinação de se o anticorpo anti-CD30 exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin através do contacto de uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin com a proteína, sendo a referida cultura de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o referido contacto durante um período de 72 horas; a exposição da cultura a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido período de 72 horas; e a medição da incorporação de 3H-timidina em células da cultura. O anticorpo anti-CD30 tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin e é útil para o tratamento ou a prevenção da Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular da Doença de Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem serem colocadas em contacto com o anticorpo anti-CD30 .

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1. Inibição do crescimento de linhas celulares da

Doença de Hodgkin: as linhas celulares da Doença de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 e KM-H2 foram cultivadas a 5xl04 células/

poço na presença ou ausência de 10 pg/ml de AC10 imobilizado. Foi utilizado Ki-1 como controlo nestes ensaios. A proliferação foi medida através da incorporação de 3H-timidina após 72 horas de cultura. FIG. 2. Inibição do crescimento de linhas celulares da

Doença de Hodgkin: as linhas celulares da Doença de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 e KM-H2 foram cultivadas a 5xl03 células/

poço na presença ou ausência de 10 pg/ml de AC10 imobilizado. Foi utilizado Ki-1 como controlo nestes ensaios. A proliferação foi medida através da incorporação de 3H-timidina após 72 horas de cultura. 14 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ FIG. 3. Inibição do crescimento de linhas celulares da Doença de Hodgkin: as linhas celulares da Doença de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 e KM-H2 foram cultivadas a 5xl04 células/ poço na presença ou ausência de 0,1 gg/ml de AC10 ou HeFi-1 que tinham sido ligados de forma cruzada através da adição de 20 gg/ml de anticorpos policlonais igG de cabra anti-ratinho. A proliferação foi medida através da incorporação de 3H-timidina após 72 horas de cultura. FIG. 4. Inibição do crescimento de linhas celulares da Doença de Hodgkin: as linhas celulares da Doença de Hodgkin HDLM-2, L540, L428 e KM-H2 foram cultivadas a 5xl03 células/ poço na presença ou ausência de 0,1 pg/ml de AC10 ou HeFi-1 que tinham sido ligados de forma cruzada através da adição de 20 pg/ml de anticorpos policlonais IgG de cabra anti-ratinho. A proliferação foi medida através da incorporação de 3H-timidina após 72 horas de cultura. FIG. 5. Actividade antitumoral de AC10 (círculos) e

HeFi-1 (quadrados) em xenoenxertos L540cy da Doença de Hodgkin disseminados (A) e subcutâneos (B). A) Os ratinhos foram implantados com lxlO7 células através da veia caudal no dia 0 e receberam injecções intraperitoneais de anticorpo a 1 mg/kg/injecção utilizando um programa de administração de q2dxl0. B) Os ratinhos foram implantados subcutaneamente com 2xl07 células L540cy. Quando os tumores eram palpáveis os ratinhos foram tratados com injecções intraperitoneais de AC10 ou HeFi-1 a 2 mg/kg/injecção q2dxl0. Em ambas as experiências os ratinhos não tratados (X) não receberam terapia. FIG. 6. Vector de expressão de AC10 quimérico. O ADN codificando a região variável da cadeia pesada (Vp) do mAb AC10 foi unido à sequência de codificação da região constante gama 1 humana, e a região variável da cadeia leve de AC10 (VL) foi unida de modo semelhante à região constante da capa humana em vectores de clonagem separados. As sequências quiméricas da cadeia pesada e leve foram clonadas no plasmídeo pDEFl4 para expressão do anticorpo monoclonal quimérico intacto em células CHO. O pDEFl4 utiliza o promotor do gene do factor de alongamento 1 alfa de hamster chinês que dirige a transcrição de genes heterólogos (Patente U.S. N.° 5888809). 15 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ FIG. 7. Saturação da ligação de AC10 e AC10 quimérico (cAClO) a células Karpas-299 positivas para CD30. As células foram combinadas com concentrações crescentes de AC10 ou cAClO durante 20 minutos, lavadas com FBS a 2%/pbs (meio de coloração) para remover o mAb livre e incubadas com cabra-anti-ratinho-FITC ou cabra-anti-humano-FITC, respectivamente. As células marcadas foram lavadas novamente com meio de coloração e examinadas através de citometria de fluxo. As intensidades médias de fluorescência resultantes foram representadas versus a concentração do mAb tal como descrito na Secção 9.1. FIG 8. Inibição do crescimento in vitro pelo AC10 quimérico (cAClO). Linhas positivas para CD30 e a linha negativa para CD30 HL-60 foram plaqueadas a 5000 células/poço. O AC10 quimérico foi adicionado às concentrações observadas na presença de um correspondente excesso de 10 vezes de IgG de cabra anti-humana. A percentagem de inibição relativa aos poços de controlo não tratados foi representada versus a concentração de cAClO. FIG. 9. Efeitos no ciclo celular do AC10 quimérico em células L540cy de DH. As células foram tratadas com 1 pg/ml de cAClO e 10 pg/ml de anticorpo secundário de cabra anti-humano. Nos momentos indicados as células foram marcadas com BrdU, permeabilizadas e coradas com anti-BrdU para detectar a síntese de ADN nascente (painel de baixo), e coradas com iodeto de propídio para detectar o teor de ADN total (painel de cima) . Os painéis de cima mostram o perfil do conteúdo de Gi, fase S e G2 através de coloração com IP e os painéis de baixo mostram o conteúdo e a síntese de ADN detectada através da incorporação de BrdU. As regiões 2, 5 e 3 designam Gi, fase S e G2, respectivamente. A região 4, contendo ADN do conteúdo de sub-G2 não sujeito a síntese de ADN e a região 6, ADN do conteúdo de sub-Gi indicam células com fragmentação apoptótica de ADN (Donaldson et al., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997). FIG 10. Eficácia do AC10 quimérico em modelos de DH. (A) Actividade antitumoral de cAClO em Doença de Hodgkin L540cy disseminada em ratinhos SCID. Grupos de ratinhos (cinco/grupo) foram deixados sem tratamento (x) ou receberam 1 (□), 2, (Δ) 16 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ ou 4 (·) mg/kg de cAClO (q4dx5) a começar no dia 1 após inoculação do tumor. (B) Doença de Hodgkin L540cy disseminada em ratinhos SCID onde os ratinhos dos grupos (cinco/grupo) foram deixados sem tratamento (χ) ou receberam terapia iniciada no dia 1 (□), dia 5 (Δ), ou dia 9 (·) através de cAClO administrado a 4 mg/kg utilizando um programa de q4dx5. (C) Modelo de tumor de DH L540cy subcutâneo em ratinhos SCID. Os ratinhos foram implantados com 2xl07 células de Doença de Hodgkin L540cy no flanco direito. Grupos de ratinhos (cinco/grupo) foram deixados sem tratamento ou (x) ou receberam 1 (□), 2, (Δ) ou 4 (·) mg/kg de AC10 quimérico (q4dx5; À) a começar quando o tamanho do tumor em cada grupo de 5 animais tinha em média ~50 mm3. FIG. 11. Actividade antitumoral de AC10 quimérico (cAClO) em xenoenxertos L540cy de Doença de Hodgkin. Ratinhos SCID foram implantados subcutaneamente com células L540cy e quando os tumores alcançaram um tamanho médio de >150 mm3 os ratinhos foram deixados sem tratamento (X) ou tratados com cAClO (□) a 2 mg/kg duas vezes por semana durante 5 injecções. FIG. 12. Entrega de AEB a células positivas para CD30 através de AC10 quimérico. As células das linhas celulares indicadas foram expostas a AC10 quimérico conjugado com o agente citotóxico AEB, um derivado de auristatina E (o conjugado é descrito no Pedido U.S. N.° 09/845786 apresentado a 30 de Abril de 2001). A viabilidade celular em percentagem do controlo é representada ao longo da concentração de conjugado cAClO-fármaco que foi administrada. FIG. 13. Actividade do conjugado AC10 quimérico-AEB em ratinhos possuindo xenoenxertos L540cy da Doença de Hodgkin. Os ratinhos foram implantados subcutaneamente com células L540cy. O AC10 quimérico conjugado com o agente citotóxico AEB, um derivado de auristatina E, foi administrado nas doses indicadas com um total de 4 doses a intervalos de 4 dias. O volume tumoral em mm3 está representado ao longo dos dias após implantação do tumor.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se a anticorpos que se ligam a CD30 e exercem um efeito citostático ou citotóxico em células 17 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ de DH. Ο presente invento refere-se também a anticorpos que competem com AC10 ou HeFi-1 pela ligação a CD30 e exercem um efeito citostático ou citotóxico em células de DH. Numa concretização preferida, o anticorpo é AC10 ou HeFi-1, de preferência um AC10 ou HeFi-1 humanizado ou quimérico. 0 presente invento refere-se também às sequências nucleotídicas dos genes de AC10 e HeFi-1 e aos anticorpos por eles codificados. O presente invento refere-se também a fragmentos e outros derivados e análogos de tais anticorpos AC10 e HeFi-1. São também divulgados ácidos nucleicos codificando tais fragmentos ou derivados. É divulgada a produção dos anticorpos anteriores, p.ex., através de métodos recombinantes. 0 presente invento refere-se também a anticorpos AC10 e HeFi-1 e derivados incluindo anticorpos de fusão/quiméricos que são funcionalmente activos, i.e., que são capazes de apresentar ligação a CD30 e exercer um efeito citostático ou citotóxico em células de DH.

Os anticorpos para CD30 englobados pelo presente invento incluem, anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados, e tais anticorpos conjugados com agentes citotóxicos tais como fármacos quimioterapêuticos. São também divulgados métodos de tratamento ou prevenção de DH compreendendo a administração de uma composição compreendendo uma proteina ou ácido nucleico sozinho ou em combinação com um agente citotóxico, incluindo mas não se limitando a um fármaco quimioterapêutico.

Para clareza da divulgação e não como limitação, a descrição detalhada do presente invento é dividida nas subsecções que se seguem.

5.1 ANTICORPOS DO INVENTO 0 presente invento engloba anticorpos que se ligam a CD30 e exercem efeitos citostáticos e/ou citotóxicos em células de DH. 0 presente invento refere-se também a anticorpos que competem com AC10 ou HeFi-1 pela ligação a CD30 e exercem um efeito citostático ou citotóxico em células de DH. 18 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ Ο presente invento engloba também anticorpos compreendendo, ou alternativamente consistindo numa CDR de HeFi-1 (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32) ou AC10 (SEQ ID NO:4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; ou SEQ ID NO:16). O presente invento engloba ainda anticorpos compreendendo, ou alternativamente consistindo numa região variável de HeFi-1 (SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:26) ou AC10 (SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 10). É proporcionada abaixo uma tabela indicando a região de AC10 ou HeFi-1 à qual corresponde cada SEQ ID NO.

Tabela 1 MOLÉCULA NUCLEÓTIDO OU AMINOÁCIDO SEQ ID NO Região Variável da Cadeia Pesada de AC10 Nucleótido 1 Região Variável da Cadeia Pesada de AC10 Aminoácido 2 CDR1 da Cadeia Pesada (Hl) de AC10 Nucleótido 3 CDR1 da Cadeia Pesada (Hl) de AC10 Aminoácido 4 CDR2 da Cadeia Pesada (H2) de AC10 Nucleótido 5 CDR2 da Cadeia Pesada (H2) de AC10 Aminoácido 6 CDR3 da Cadeia Pesada (H3) de AC10 Nucleótido 7 CDR3 da Cadeia Pesada (H3) de AC10 Aminoácido 8 Região Variável da Cadeia Leve de AC10 Nucleótido 9 Região Variável da Cadeia Leve de AC10 Aminoácido 10 CDRl da Cadeia Leve (Ll) de AC10 Nucleótido 11 CDRl da Cadeia Leve (Ll) de AC10 Aminoácido 12 CDR2 da Cadeia Leve (L2) de AC10 Nucleótido 13 CDR2 da Cadeia Leve (L2) de AC10 Aminoácido 14 CDR3 da Cadeia Leve (L3) de AC10 Nucleótido 15 CDR3 da Cadeia Leve (L3) de AC10 Aminoácido 16 Região Variável da Cadeia Pesada de HeFi-1 Nucleótido 17 Região Variável da Cadeia Pesada de HeFi-1 Aminoácido 18 CDRl da Cadeia Pesada (Hl) de HeFi-1 Nucleótido 19 CDRl da Cadeia Pesada (Hl) de HeFi-1 Aminoácido 20 CDR2 da Cadeia Pesada (H2) de HeFi-1 Nucleótido 21 CDR2 da Cadeia Pesada (H2) de HeFi-1 Aminoácido 22 HeFi-1 CDR3 da Cadeia Pesada (H3) Nucleótido 23 CDR3 da Cadeia Pesada (H3) de HeFi-1 Aminoácido 24 Região Variável da Cadeia Leve de HeFi-1 Nucleótido 25 Região Variável da Cadeia Leve de HeFi-1 Aminoácido 26 19 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ MOLÉCULA NUCLEÓTIDO OU AMINOÁCIDO SEQ ID NO CDR1 da Cadeia Leve (Ll) de HeFi-1 Nucleótido 27 CDRl da Cadeia Leve (Ll) de HeFi-1 Aminoácido 28 CDR2 da Cadeia Leve (L2) de HeFi-1 Nucleótido 29 CDR2 da Cadeia Leve (L2) de HeFi-1 Aminoácido 30 CDR3 da Cadeia Leve (L3) de HeFi-1 Nucleótido 31 CDR3 da Cadeia Leve (L3) de HeFi-1 Aminoácido 32 Ο presente invento compreende ainda derivados ou análogos funcionais de AC10 e HeFi-1. Tal como aqui se utiliza, o termo "funcional" no contexto de um anticorpo do presente invento indica que o anticorpo é 1) capaz de se ligar a CD30 e 2) exerce um efeito citostático e/ou citotóxico em células de DH.

Geralmente, os anticorpos do presente invento ligam-se imuno-especificamente a CD30 e exercem efeitos citostáticos e citotóxicos em células malignas em DH. Os anticorpos do presente invento são de preferência monoclonais e podem ser anticorpos multiespecificos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por expressão de uma biblioteca de Fab, e fragmentos de ligação a CD30 de qualquer um dos de cima. 0 termo "anticorpo", tal como aqui se utiliza, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um local de ligação ao antigénio que se ligam imuno-especificamente a CD30. As moléculas de imunoglobulina do presente invento podem ser de qualquer tipo (p.ex., IgG, igE, IgM, IgD, igA e igY), classe (p.ex., IgGl, IgG2, IgG3, lgG4, IgAl e lgA2) ou subclasse de moléculas de imunoglobulina.

Em certas concretizações do presente invento, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de ligação ao antigénio humano do presente invento e incluem, mas não se limitam a Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fv de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fv ligados por dissulfureto (sdFv) e fragmentos compreendendo um dominio VL ou VH. Os fragmentos de anticorpo de ligação ao antigénio, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender a região ou 20 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ regiões variáveis sozinhas ou em combinação com a totalidade ou uma porção do seguinte: região charneira, domínios CHl, CH2, CH3 e CL. Estão também incluidos no presente invento fragmentos de ligação ao antigénio compreendendo também qualquer combinação da região ou regiões variáveis com a região charneira e os domínios CHl, CH2, CH3 e CL. De preferência, os anticorpos são humanos, de murideo (p.ex., ratinho e rato), burro, ovelha, coelho, cabra, cobaia, camelídeo, cavalo ou galinha. Tal como aqui se utiliza, anticorpos "humanos" incluem anticorpos possuindo a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulinas humanas, a partir de células B humanas ou a partir de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, tal como descrito infra e, por exemplo, na Patente U.S. N.° 5939598 por Kucherlapati et al.

Os anticorpos do presente invento podem ser não específicos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de CD30 ou podem ser específicos tanto para CD30 como para uma proteína heteróloga. Ver, p.ex., publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147: 60-69, 1991; Patente U.S. Nos 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 5601819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992.

Os anticorpos do presente invento podem ser descritos ou especificados em termos das CDR particulares que compreendem. Em certas concretizações os anticorpos do presente invento compreendem uma ou mais CDR de AC10 e/ou HeFi-1. O presente invento engloba um anticorpo ou derivado deste compreendendo um domínio variável da cadeia pesada ou leve, compreendendo o referido domínio variável (a) um conjunto de três CDR, em que o referido conjunto de CDR são do anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1, e (b) um conjunto de quatro regiões estruturais, em que o referido conjunto de regiões estruturais difere do conjunto de regiões estruturais no anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1, respectivamente, e em que o referido anticorpo ou derivado deste se liga imuno-especificamente a CD30. 21 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Numa concretização específica, o presente invento engloba um anticorpo ou derivado deste compreendendo um domínio variável da cadeia pesada, compreendendo o referido domínio variável (a) um conjunto de três CDR, em que o referido conjunto de CDR compreende SEQ ID NO: 4, 6 ou 8 e (b) um conjunto de quatro regiões estruturais, em que o referido conjunto de regiões estruturais difere do conjunto de regiões estruturais no anticorpo monoclonal AC10, e em que o referido anticorpo ou derivado deste se liga imuno-especificamente a CD30.

Numa concretização específica, o presente invento engloba um anticorpo ou derivado deste compreendendo um domínio variável da cadeia pesada, compreendendo o referido domínio variável (a) um conjunto de três CDR, em que o referido conjunto de CDR compreende SEQ ID NO:20, 22 ou 24 e (b) um conjunto de quatro regiões estruturais, em que o referido conjunto de regiões estruturais difere do conjunto de regiões estruturais do anticorpo monoclonal HeFi-1, e em que o referido anticorpo ou derivado deste se liga imuno-especif icamente a CD30.

Numa concretização específica, o presente invento engloba um anticorpo ou derivado deste compreendendo um domínio variável da cadeia leve, compreendendo o referido domínio variável (a) um conjunto de três CDR, em que o referido conjunto de CDR compreende SEQ ID NO: 12, 14 ou 16, e (b) um conjunto de quatro regiões estruturais, em que o referido conjunto de regiões estruturais difere do conjunto de regiões estruturais no anticorpo monoclonal AC10, e em que o referido anticorpo ou derivado deste se liga imuno-especificamente a CD30.

Numa concretização específica, o presente invento engloba um anticorpo ou derivado deste compreendendo um domínio variável da cadeia leve, compreendendo o referido domínio variável (a) um conjunto de três CDR, em que o referido conjunto de CDR compreende SEQ ID NO:28, 30 ou 32, e (b) um conjunto de quatro regiões estruturais, em que o referido conjunto de regiões estruturais difere do conjunto de regiões estruturais no anticorpo monoclonal HeFi-1, e em que o 22 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ referido anticorpo ou derivado deste se liga imuno-especificamente a CD30.

Adicionalmente, os anticorpos do presente invento podem também ser descritos ou especificados em termos das suas estruturas primárias. Anticorpos possuindo pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e de preferência pelo menos 98% de identidade (calculado utilizando métodos conhecidos na especialidade e descritos aqui) com as regiões variáveis e AC10 ou HeFi-1 estão também incluídos no presente invento. Os anticorpos do presente invento podem também ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação a CD30. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5xlCT2 M, 1CT2 M, 5χ10“3 Μ, ΙΟ"3 Μ, 5χ10"4 Μ, 10“4 Μ, 5χ10“5 Μ, 10“5 Μ, 5xl0“6 M, 10' 6 M, 5xl0"7 Μ, ΙΟ"7 Μ, 5χ10"8 Μ, ΙΟ"8 Μ, 5χ10"9 Μ, IO"9 M, 5xlO~10 Μ, ΙΟ"10 Μ, 5xl0"n Μ, 10"11 Μ, 5χ10"12 Μ, 10"12 M, 5x"13 Μ, 10"13 M, 5χ10"14 Μ, ΙΟ"14 Μ, 5χ10"15 M ou 10"15 M.

Os anticorpos do presente invento incluem derivados que estão modificados, i.e., através da ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de forma a que a ligação covalente não impeça o anticorpo de se ligar a CD30 ou de exercer um efeito citostático ou citotóxico em células de dh. Por exemplo, mas não como limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, p.ex., através de glicosilação, acetilação, PEGuilação, fosforilação, amidação, derivação através de grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma de numerosas modificações químicas pode ser realizada através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Os anticorpos do presente invento podem ser gerados através de qualquer método adequado conhecido na especialidade. Anticorpos policlonais para CD30 podem ser produzidos através de vários procedimentos conhecidos na 23

ΕΡ 1 347 730/PT especialidade. Por exemplo, pode ser administrado CD30 a vários animais hospedeiros incluindo, mas não se limitando a, coelhos, ratinhos, ratos, etc. para induzir a produção de soro contendo anticorpos policlonais específicos para a proteína. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira e incluem mas não se limitam a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias activas na superfície tais como lisolecitina, polióis Pluronics, polianiões, péptidos, emulsões em óleo, hemocianinas da lapa, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bem conhecidos na especialidade.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na especialidade incluindo a utilização de tecnologias de hibridomas, recombinantes e de apresentação fágica ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma incluindo as conhecidas na especialidade e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988); Hammerling, et al., em: "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza não está limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fágico e não ao método através do qual é produzido.

Os métodos para produção e pesquisa de anticorpos específicos utilizando tecnologia de hibridoma são rotina e bem conhecidos na especialidade. Num exemplo não limitante, os ratinhos podem ser imunizados com CD30 ou uma célula que expresse CD30 ou um fragmento ou derivado deste. Uma vez detectada uma resposta imunitária, p.ex., são detectados anticorpos específicos para CD30 no soro do ratinho, o baço é colhido e os esplenócitos são isolados. Os esplenócitos são então fundidos através de técnicas bem conhecidas com 24 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo células da linha celular SP20 disponível em ATCC. Os hibridomas são seleccionados e clonados através de diluição limitante. Os clones do hibridoma são então ensaiados através de métodos conhecidos na especialidade quanto a células que segregam anticorpos capazes de se ligar a CD30. 0 líquido das ascites, que contém geralmente elevados níveis de anticorpos, pode ser gerado através de injecção de ratinhos com clones positivos do hibridoma. São também divulgados métodos de criação de anticorpos monoclonais bem como de anticorpos produzidos através do método compreendendo a cultura de uma célula de hibridoma que segrega um anticorpo do presente invento, de preferência, o hibridoma é gerado através da fusão de esplenócitos isolados de um ratinho imunizado com um antigénio do presente invento com células de mieloma e depois pesquisa dos hibridomas resultantes da fusão quanto a clones de hibridomas que segreguem um anticorpo capaz de se ligar a CD30.

Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 do presente invento podem ser produzidos através de clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

Por exemplo, os anticorpos do presente invento podem também ser gerados utilizando vários métodos de apresentação fágica conhecidos na especialidade. Em métodos de apresentação fágica, os domínios funcionais do anticorpo são apresentados à superfície de partículas fágicas que possuem as sequências de ácido nucleico codificando-os. Numa concretização particular, tal fago pode ser utilizado para apresentar domínios de ligação ao antigénio expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de domínios (p.ex., humana ou de murídeo). Em métodos de apresentação fágica, os domínios funcionais do anticorpo são apresentados à superfície de partículas fágicas que possuem as sequências de ácido nucleico 25 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ codificando-os. Em particular, sequências de ADN codificando os domínios VH e VL são amplificadas a partir de bibliotecas de ADNc animais (p.ex., bibliotecas de ADNc humanas ou de murideo de tecidos linfóides). Os adn codificando os domínios VH e VL são recombinados com um ligante scFv através de PCR e clonados num vector fagemideo (p.ex., pCANTAB 6 ou pComb 3 HSS) . O vector é electroporado em E. coli e a E. coli é infectada com fago ajudante. 0 fago utilizado nestes métodos é tipicamente um fago filamentoso incluindo os domínios de ligação fd e M13 expressos a partir do fago com os dominios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizado com dissulfureto fundidos de forma recombinante com a proteína do gene III ou do gene VIII do fago. 0 fago que expressa um domínio de ligação ao antigénio que se liga a CD30 ou uma porção de ligação de AC10 ou HeFi a este pode ser seleccionado ou identificado com antigénio p.ex., utilizando antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado numa superfície sólida ou conta. Exemplos de métodos de apresentação fágica que podem ser utilizados para produzir os anticorpos do presente invento incluem os divulgados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology, 191-280, 1994; Pedido PCT N.° PCT/GB91/01134; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes U.S. N.os 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 e 5969108.

Tal como descrito nas referências de cima, após a selecção fágica, as regiões de codificação do anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antigénio e expressos em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insecto, células vegetais, levedura e bactérias, p.ex., tal como descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, técnicas para produzir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregues utilizando métodos conhecidos na especialidade tais como os divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869, 26 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 1992; e Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; e Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988.

Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fv e anticorpos de cadeia simples incluem os descritos nas Patentes U.S. Nos 4946778 e 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88, 1991; Shu et al., PNAS 90: 7995-7999, 1993; e Skerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988. Para algumas utilizações, incluindo utilização in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de proliferação ou citotoxicidade in vitro, é preferível utilizar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos possuindo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murídeo e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na especialidade. Ver, p.ex., Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986;

Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202, 1989;

Patentes U.S. Nos 5807715, 4816567 e 4816397. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas que se ligam ao antigénio desejado possuindo uma ou mais CDR das espécies não humanas e regiões estruturais e constantes de uma molécula de imunoglobulina humana. Frequentemente, resíduos estruturais nas regiões estruturais humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo dador da CDR para alterar, de preferência melhorar, a ligação ao antigénio. Estas substituições estruturais são identificadas através de métodos bem conhecidos na especialidade, p.ex., através de modelação das interacções dos resíduos de CDR e estruturais para identificar resíduos estruturais importantes para a ligação ao antigénio e comparação de sequências para identificar resíduos estruturais invulgares em posições particulares (ver, p.ex., Queen et al., Patente U.S. N.° 5585089; Riechmann et al., Nature 332: 323, 1988). Os anticorpos podem ser humanizados utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na especialidade incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239400; Publicação PCT WO 91/09967; Patentes U.S. N.os 5225539, 5530101 e 5585089), disfarce ou remodelação da superfície (EP 592106; EP 519596; Padlan, Molecular Iimunology 28(4/5): 489-498, 1991; Studnicka et al., 27 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Protein Engineering 7(6): 805-814, 1994; Roguska. et al., PNAS 91: 969-973, 1994), e baralhamento de cadeias (Patente U.S. N. 0 5565332).

Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos conhecidos na especialidade incluindo os métodos de apresentação fágica descritos acima utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulina humanas. Ver também, Patentes U.S. N.os 4444887 e 4716111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741.

Anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos que expressem genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de genes da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulina podem ser introduzidos aleatoriamente ou através de recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de ratinho. Os genes da cadeia pesada e leve da imunoglobulina de ratinho podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução dos loci de imunoglobulina humanos através de recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpos endógenos. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e micro-injectadas em blastocistos para produzir ratinhos quiméricos. São então criados ratinhos quiméricos para produzir descendência homozigótica que expresse anticorpos humanos. Os ratinhos transgénicos são imunizados de um modo normal com um antigénio seleccionado, p.ex., todo ou uma porção de CD30. Anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos a partir dos ratinhos transgénicos imunizados utilizando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana ancorados pelos ratinhos transgénicos rearranjam-se durante a diferenciação das células B e sofrem subsequentemente mudança de classe e mutação somática. Assim, utilizando uma tal técnica, é possível produzir anticorpos igG, IgA, igM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma revisão desta tecnologia para produção de anticorpos humanos, ver, Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93, 1995. Para uma 28 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ discussão detalhada desta tecnologia para produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produção de tais anticorpos, ver, p.ex., publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europeia N.° 0598877; Patentes U.S. N.os 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318, 5885793, 5916771. Adicionalmente, empresas tais como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA) podem ser contratadas para proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado utilizando tecnologia semelhante à descrita acima.

Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo seleccionado podem ser gerados utilizando uma técnica referida como "selecção orientada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não humano seleccionado, p.ex., um anticorpo de ratinho, é utilizado para orientar a selecção de um anticorpo completamente humano que reconheça o mesmo epitopo (Jespers et al., Bio/technology 12: 899-903, 1994).

Mais, os anticorpos para CD30 podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipicos que "imitem" proteínas do presente invento utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade (ver, p.ex., Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444, 1989; e Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438, 1991). Os fragmentos Fab destes anti-idiotipos podem ser utilizados em regimes terapêuticos para desencadear uma resposta imunitária do próprio indivíduo contra CD30 e células de DH. O presente invento engloba também anticorpos que inibem competitivamente a ligação de AC10 ou HeFi-1 a CD30 tal como determinado através de qualquer método conhecido na especialidade para determinação de ligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios aqui descritos. Em concretizações preferidas, o anticorpo inibe competitivamente a ligação de AC10 ou HeFi-1 a CD30 em pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, ainda de preferência pelo menos 70%, e de maior preferência pelo menos 75%. Noutras concretizações, o anticorpo inibe competitivamente a ligação de AC10 ou HeFi-1 a CD30 em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%. 29 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Tal com discutido em mais detalhe abaixo, o anticorpo do presente invento pode ser utilizado sozinho ou em combinação com outras composições na prevenção ou tratamento de dh. Os anticorpos podem ainda ser quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a agentes citotóxicos, proteínas ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos do presente invento podem ser fundidos de forma recombinante ou conjugados com moléculas úteis como quimioterapêuticos ou toxinas, ou compreendendo um radionuclídeo para utilizar como radioterapêutico. Ver, p.ex., publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente U.S. N.° 5314995; e EP 396387.

As proteínas podem ser produzidas de forma recombinante através de fusão da região de codificação de uma ou mais CDR de um anticorpo do presente invento enquadradas com uma sequência de codificação para uma proteína heteróloga. A proteína heteróloga pode proporcionar uma ou mais das seguintes características: benefícios terapêuticos acrescentados; promover a expressão estável da proteína; proporcionar um meio de facilitar a expressão recombinante de elevado rendimento da proteína; ou proporcionar um domínio de multimerização.

Para além das proteínas compreendendo uma ou mais CDR de um anticorpo do presente invento, as proteínas podem ser identificadas utilizando qualquer método adequado para pesquisa de interacções proteína-proteína. Inicialmente, são identificadas as proteínas que se ligam a CD30, depois pode ser determinada a sua capacidade para exercer um efeito citostático ou citotóxico em células de DH. Entre os métodos tradicionais que podem ser empregues estão técnicas de "clonagem de interacção" que implicam a sondagem de bibliotecas de expressão com CD30 marcado de um modo semelhante à técnica de sondagem de anticorpos de bibliotecas Xgtll, supra. Como exemplo e não como limitação, isto pode ser alcançado como se segue: um clone de ADNc codificando CD30 (ou um domínio de ligação de AC10 ou HeFi-1 a este) é modificado no terminal através de inserção do local de fosforilação para a quinase do músculo cardíaco (HMK) (Blanar & Rutter, Science 256: 1014-1018, 1992). A proteína recombinante é expressa em 30 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ Ε. coli e purificada numa coluna de afinidade de GDP até à homogeneidade (Edery et al., Gene 74: 517-525, 1988) e marcada utilizando γ -P-ATP e quinase do musculo cardíaco bovina (Sigma) até uma actividade especifica de ΙχΙΟ8 cpm/yg e utilizada para pesquisar uma biblioteca Àgtll de ADNc de placenta humana num "ensaio far-Western" (Blanar & Rutter, Science 256: 1014-1018, 1992). As placas fágicas que interagem com a sonda de CD30 são isoladas. As inserções de ADNc das placas fágicas λ positivas são libertadas e subclonadas num vector adequado para sequenciação, tal como pBluescript KS (Stratagene).

Um método que detecta interacções proteicas in vivo, o sistema de dois híbridos, é descrito em detalhe apenas para fins de ilustração e não como limitação. Uma versão deste sistema foi descrita (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9578-9582, 1991) e está comercialmente disponível em Clontech (Paio Alto, CA).

Resumidamente, utilizando um tal sistema, são construídos plasmídeos que codificam duas proteínas híbridas: uma consiste no domínio de ligação ao ADN de uma proteína activadora da transcrição fundido com CD30, e a outra consiste no domínio de activação da proteína activadora fundido com uma proteína desconhecida que é codificada por um ADNc que foi recombinado neste plasmídeo como parte de uma biblioteca de ADNc. Os plasmídeos são transformados para uma estirpe da levedura Saccharomyces cerevisiae que contém um gene receptor (p.ex., lacZ) cuja região reguladora contém os locais de ligação ao activador da transcrição. Nenhuma das proteínas híbridas pode activar sozinha a transcrição do gene repórter, o híbrido do domínio de ligação ao ADN não pode porque não proporciona a função de activação, e o híbrido do domínio de activação não pode porque não se pode localizar nos locais de ligação do activador. A interaeção das duas proteínas híbridas reconstitui a proteína activadora funcional e resulta na expressão do gene repórter, que é detectada através de um ensaio para o produto do gene repórter. O sistema de dois híbridos ou uma metodologia aparentada pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas de domínios de activação quanto a proteínas que interajam com CD30, que neste 31 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ contexto é um produto génico "isco". As sequências de ADN genómico total e ADNc são fundidas com o ADN codificando um dominio de activação. Esta biblioteca e um plasmideo codificando um híbrido de uma região de codificação de CD30 (por exemplo, uma sequência nucleotídica que codifica para um domínio de CD30 que se saiba interagir com HeFi-1 ou AC10) fundida com o domínio de ligação ao ADN são co-transformados numa estirpe de levedura repórter, e os transformantes resultantes são pesquisados quanto àqueles que expressam o gene repórter. Por exemplo, e não como limitação, a região de codificação de CD30 pode ser clonada num vector de modo a que seja fundida na tradução com o ADN codificando o domínio de ligação ao ADN da proteína GAL4. Estas colónias são purificadas e os plasmídeos da biblioteca responsáveis pela expressão do gene repórter são isolados. É então utilizada sequenciação do ADN para identificar as proteínas codificadas pelos plasmídeos da biblioteca.

Uma vez identificada a proteína de ligação ao CD30, a sua capacidade (sozinha ou quando multimerizada ou fundida com um domínio de dimerização ou multimerização) para desencadear um efeito citostático ou citotóxico em células de DH é determinada através do contacto de uma cultura de uma linha celular da DH, tal como L428, L450, HDLM2 ou KM-H2 com a proteína. As condições de cultura são de preferência de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o período de contacto de aproximadamente 72 horas. A cultura é então exposta a 0,5 yCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do período de 72 horas e é medida a incorporação de 3H-timidina em células da cultura. A proteína tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular de DH se as células da cultura tiverem uma reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com as células da mesma linha celular cultivadas sob as mesmas condições mas serem terem contacto com a proteína.

Sem limitação em relação ao mecanismo de acção, uma proteína tem de preferência mais de um local de ligação a CD30 e por essa razão uma capacidade para se ligar de forma cruzada a moléculas de CD30. As proteínas que se ligam a CD30 ou competem pela ligação a CD30 com AC10 ou HeFi-1 podem adquirir a capacidade para induzir efeitos citostáticos ou citotóxicos 32 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ em células de DH se dimerizadas ou multimerizadas. Quando a proteína de ligação a CD30 é uma proteína monomérica, pode ser expressa em cadeia, resultando deste modo numa proteína com múltiplos locais de ligação a CD30. Os locais de ligação a CD30 podem ser separados através de uma região ligante flexível. Noutra concretização, as proteínas de ligação a CD30 podem ser quimicamente ligadas de forma cruzada, por exemplo utilizando glutaraldeído, antes da administração. Numa concretização preferida, a região de ligação a CD30 é fundida com uma proteína heteróloga, em que a proteína heteróloga compreende um domínio de dimerização e multimerização. Antes da administração da proteína a um indivíduo para fins de tratamento ou prevenção de DH, uma tal proteína é sujeita a condições que permitem a formação de um homodímero ou heterodímero. Um heterodímero, tal como aqui se utiliza, pode compreender domínios de dimerização idênticos mas diferentes regiões de ligação a CD30, regiões de ligação a CD30 idênticas mas diferentes domínios de dimerização ou diferentes regiões de ligação a CD30 e domínios de dimerização.

Domínios de dimerização particularmente preferidos são aqueles originários de factores de transcrição.

Numa concretização, o domínio de dimerização é o de um fecho de leucina de região básica ("bZIP"). As proteínas bZIP possuem caracteristicamente dois domínios - um domínio estrutural de fecho de leucina e um domínio básico que é rico em aminoácidos básicos, separados por um domínio "forquilha" (C. Vinson et al., Science 246: 911-916, 1989). Duas proteínas bZIP dimerizam através da formação de uma região e dupla espiral (coiled-coil) na qual os domínios de fecho de leucina dimerizam. Assim, estas regiões em dupla espiral podem ser utilizadas como parceiros de fusão para as proteínas.

Domínios de fecho de leucina particularmente úteis são os do factor de transcrição de levedura GCN4, do factor de transcrição de mamífero CCAAT/proteína de ligação ao estimulador C/EBP, e da transformação nuclear nos produtos oncogenes, Fos e Jun (ver Landschultz et al., Science 240: 1759-1764, 1988; Baxevanis e Vinson, Curr. Op. Gen. Devei. 3: 278-285, 1993; e 0'Shea et al., Science 243: 538-542, 1989). 33 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Noutra concretização, ο domínio de dimerização é o de uma proteína de hélice-volta-hélice de região básica ("bHLH") (Murre et al., Cell 56: 777-783, 1989). As proteínas bHLH são também compostas por domínios discretos, cuja estrutura lhes permite reconhecer e interagir com sequências específicas de ADN. A região hélice-volta-hélice promove a dimerização através das suas hélices anfipáticas de um modo análogo ao da região do fecho de leucina das proteínas bZIP (Davis et al. Cell 60: 733-746, 1990; Voronova e Baltimore, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4722-4726, 1990). Proteínas bHLH particularmente úteis são myc, max e mac.

Sabe-se que se formam heterodímeros entre Fos e Jun (Bohmann et al., Science 238: 1386-1392, 1987), entre membros da família ATF/CREB (Hai et al., Genes Dev. 3: 2083-2090, 1989), entre membros da família C/EBP (Cao et al., Genes Dev. 5: 1538-1552, 1991; Williams et al., Genes Dev. 5: 1553-1567, 1991; e Roman et al., Genes Dev. 4: 1404-1415, 1990), e entre membros das famílias ATF/CREB e Fos/Jun (Hai e Curran, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3720-3724, 1991). Por essa razão, quando uma proteína é administrada a um indivíduo como um heterodímero compreendendo diferentes domínios de dimerização, pode ser utilizada qualquer combinação dos anteriores.

5.2 ENSAIOS DE LIGAÇÃO

Tal como descrito acima, os anticorpos do presente invento ligam-se a CD30 e exercem um efeito citostático ou citotóxico em células de DH. Os métodos que demonstram a capacidade de um anticorpo do presente invento para se ligar a CD30 são aqui descritos.

Os anticorpos do presente invento podem ser ensaiados quanto a ligação imuno-específica a CD30 através de qualquer método conhecido na especialidade. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem mas não se limitam a sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente enzimático), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reacções de precipitina, reacções de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, 34 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ imunoensaios de proteína A, para nomear apenas alguns. Tais ensaios são rotina e são bem conhecidos na especialidade (ver, p.ex., Ausubel et al., eds., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", Vol.. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York) . Imunoensaios exemplares são descritos resumidamente abaixo (mas não se pretende que sejam limitantes).

Os protocolos de imunoprecipitação compreendem geralmente a lise de uma população de células num tampão de lise tal como tampão RIPA (NP-40 ou Triton X-100 a 1%, desoxicolato de sódio a 1%, SDS a 0,1%, NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M a pH 7,2, Trasilol a 1%) suplementado com proteína fosfatase e/ou inibidores de proteases (p.ex., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adição do anticorpo ao lisado celular, incubação durante um período de tempo (p.ex., 1-4 horas) a 40°C, adição de contas de Sepharose de proteína A e/ou proteína G ao lisado celular, incubação durante cerca de uma hora ou mais a 40°C, lavagem das contas em tampão de lise e ressuspensão das contas em SDS/tampão de amostra. A capacidade do anticorpo para imunoprecipitar CD30 pode ser avaliada através, p.ex., de análise Western blot. Um perito na especialidade conhecerá os parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo a CD30 e diminuir o fundo (p.ex., pré-clarificação do lisado celular com contas de Sepharose). Para mais discussão em relação a protocolos de imunoprecipitação ver, p.ex., Ausubel et al., eds., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York em 10.16.1. A análise Western blot compreende geralmente a preparação de amostras proteicas, electroforese das amostras proteicas num gel de poliacrilamida (p.ex., SDS-PAGE a 8%-20% dependendo do peso molecular do antigénio), transferência da amostra proteica do gel de poliacrilamida para uma membrana tal como nitrocelulose, PVDF ou nylon, incubação da membrana em solução de bloqueio (p.ex., PBS com BSA a 3% ou leite magro), lavagem da membrana em tampão de lavagem (p.ex., PBS-Tween 20), bloqueio da membrana com anticorpo primário (i.e., o putativo anticorpo anti-CD30) diluído em tampão de bloqueio, lavagem da membrana em tampão de lavagem, incubação da membrana com um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo primário, p.ex., um anticorpo anti-humano) conjugado com um substrato 35 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ enzimático (p.ex., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) ou molécula radioactiva (p.ex., 32P ou 125I) diluído em tampão de bloqueio, lavagem da membrana em tampão de lavagem, e detecção da presença do anticorpo secundário. Um perito na especialidade saberá quais os parâmetros que poderão ser modificados para aumentar o sinal detectado e reduzir o ruído de fundo. Para mais discussão em relação aos protocolos de Western blot ver, p.ex., Ausubel et al., eds., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", vol. 1, John wiley & Sons, Inc., New York em 10.8.1.

Os ELISA compreendem a preparação do antigénio (í.e., CD30), revestimento do poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com o CD30, adição ao poço do anticorpo conjugado com um composto detectável tal como uma enzima (p.ex., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e incubação durante um período de tempo, e detecção da presença do anticorpo. Em ELISA o anticorpo não tem de ser conjugado um composto detectável; em vez disso, pode ser adicionado ao poço um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo de interesse) conjugado com um composto detectável. Mais, em vez de revestir o poço com o antigénio, o poço pode ser revestido com o anticorpo. Neste caso, um anticorpo secundário conjugado a um composto detectável pode ser adicionado após a adição da proteína CD30 ao poço revestido. Um perito na especialidade saberá quais os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado bem como as outras variações de ELISA conhecidas na especialidade. Para mais discussão em relação a ELISA ver, p.ex., Ausubel et al., eds., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York a 11.2.1. A afinidade de ligação de um anticorpo a CD30 e a taxa de dissociação de uma interacção anticorpo-CD30 podem ser determinadas através de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de CD30 marcado

(p.ex., 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de CD30 não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao CD30 marcado. A afinidade do anticorpo para CD30 e as taxas de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados através de análise gráfica Scatchard. A 36 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ competição com um anticorpo secundário (tal como AC10 ou HeFi-1) pode também ser determinada utilizando radioimunoensaios. Neste caso, CD30 é incubado com o anticorpo de interesse conjugado com um composto marcado (p.ex., 3h ou 125I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

Os anticorpos do presente invento podem também ser ensaiados quanto à sua capacidade para se ligarem a CD30 através de um ensaio padrão conhecido na especialidade. Tais ensaios incluem far-Western e o sistema de dois híbridos de levedura. Estes ensaios são descritos na Secção 5.2, supra. Outra variação na técnica far-Western descrita acima implica a medição da capacidade de um anticorpo candidato marcado para se ligar a CD30 num Western blot. Num exemplo não limitante de um far-Western blot, CD30 ou o fragmento deste de interesse é expresso como uma proteína de fusão compreendendo ainda glutationa-S-transferase (GST) e um local de reconhecimento de proteína serina/treonina-quinase (tal como um local de reconhecimento de quinase dependente de AMPc). A proteína de fusão é purificada em contas de glutationa-Sepharose (Pharmacia Biotech) e marcada com quinase cardíaca bovina (Sigma) e 100 pCi de 32P-ATP (Amersham) . Os anticorpos de teste de interesse são separados através de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose, depois incubados com o CD30 marcado. A partir daí a membrana é lavada e a radioactividade quantificada. Inversamente, o anticorpo de interesse pode ser marcado através do mesmo método e utilizado para sondar uma membrana de nitrocelulose sobre a qual foi transferido o CD30.

5.3 ENSAIOS PARA ACTIVIDADES CITOTÓXICAS E CITOSTÁTICAS

Por definição, um anticorpo do presente invento tem de exercer um efeito citostático ou citotóxico numa célula de DH. Linhas celulares de DH adequadas para este fim incluem L428, L450, HDLM2 e KM-H2 (todas disponíveis na Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DMSZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)).

Muitos métodos de determinação de se um anticorpo exerce um efeito citostático ou citotóxico numa célula são conhecidos dos peritos na especialidade e podem ser utilizados para 37 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ elucidar se uma determinada proteína é uma proteína do presente invento. Exemplos ilustrativos de tais métodos são descritos abaixo.

Uma vez identificado que um anticorpo (i) se liga a CD30 e (ii) exerce um efeito citostático ou citotóxico em células de DH, o seu valor terapêutico é validado num modelo animal, tal como descrito na Secção 6, infra.

Numa concretização preferida, a determinação de se um anticorpo exerce um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular de DH pode se feita através do contacto de uma cultura de 5000 células da linha celular de DH numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2 com o anticorpo durante um período de 72 horas. Durante as últimas 8 horas do período de 72 horas, a cultura é exposta a 0,5 pCi de 3H-timidina. A incorporação de 3H-timidina nas células da cultura é então medida. O anticorpo tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular de DH e é útil para o tratamento ou a prevenção de DH se as células da cultura colocadas em contacto com o anticorpo tiverem reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular de DH sob as mesmas condições de cultura mas sem serem colocadas em contacto com o anticorpo anti-CD30.

Existem muitos ensaios de citotoxicidade conhecidos dos peritos na especialidade. Alguns destes ensaios medem necrose, enquanto outros medem apoptose (morte celular programada). A necrose é acompanhada de permeabilidade da membrana plasmática; as células incham e a membrana plasmática rompe-se em pouco minutos. Por outro lado, a apoptose é caracterizada por ondulação da membrana, condensação do citoplasma e a activação de endonucleases endógenas. Apenas um destes efeitos em células de DH é suficiente para mostrar que o anticorpo que se liga a CD30 é útil no tratamento ou prevenção de DH como alternativa aos ensaios que medem efeitos citostáticos ou citotóxicos descritos acima.

Numa concretização, a necrose é medida pela capacidade ou incapacidade de uma célula para tomar um corante tal como vermelho neutro, azul de tnpano ou azul ALAMAR (Page et al., Intl. J. of Oncology 3: 473-476, 1993). Num tal ensaio, 38 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ as células são incubadas em meio contendo o corante, as células são lavadas, e o corante restante, reflectindo a tomada celular do corante, é medido espectrofotometricamente.

Noutra concretização, o corante é sulfo-rodamina B (SRB), cuja ligação aos anticorpos pode ser utilizada como uma medida de citotoxicidade (Skehan et al., 1990, J. Nat '1 Câncer Inst. 82: 1107-12).

Ainda noutra concretização, um sal de tetrazólio, tal como MTT, é utilizado num ensaio colorimétrico quantitativo de sobrevivência e proliferação de células de mamífero através da detecção de células vivas mas não das mortas (ver, p.ex., Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983).

Ainda noutra concretização, as células apoptóticas são medidas tanto nos compartimentos aderentes como "flutuantes" das culturas. Ambos os compartimentos são colhidos através de remoção do sobrenadante, tripsinização das células aderentes e combinação de ambas as preparações após um passo de lavagem por centrifugação (10 minutos, 2000 rpm). O protocolo para tratamento de culturas de células tumorais com sulindac e compostos aparentados para obter uma quantidade significativa de apoptose foi descrito na literatura (ver, p.ex., Piazza et al., Câncer Research 55: 3110-16, 1995). As características deste método incluem a colheita de células flutuantes e aderentes, a identificação dos tempos óptimos de tratamento e o intervalo de doses para observação de apoptose, e a identificação das condições óptimas de cultura celular.

Ainda noutra concretização, a apoptose é quantificada através da medição da fragmentação do ADN. Estão disponíveis métodos fotométricos comerciais para a determinação quantitativa in vitro da fragmentação do ADN. Exemplos de tais ensaios, incluindo TUNEL (que detecta a incorporação de nucleótidos marcados em ADN fragmentado) e ensaios baseados em ELISA, são descritos em "Biochemica", 1999, n.° 2, pág. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

Ainda noutra concretização, a apoptose pode ser observada morfologicamente. Após tratamento com um anticorpo de teste, as culturas podem ser ensaiadas quanto a apoptose e necrose 39 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ através de microscopia de fluorescência após marcação com laranja de acridina e brometo de etídio. O método para medição do número de células apoptóticas foi anteriormente descrito por Duke & Cohen, 1992, "Current Protocols In Immunology", Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.16. Noutro modo da concretização, as células podem ser marcadas com o corante de ADN iodeto de propidio, e as células observadas quanto a alterações morfológicas tais como condensação da cromatina e marginação ao longo da membrana nuclear interna, condensação citoplasmática, aumento da ondulação membranar e encolhimento celular.

Ainda noutra concretização, os efeitos citotóxicos e/ou citostáticos podem ser determinados através da medição da taxa de incorporação de bromodesoxiuridina. As células são cultivadas em meio completo com um anticorpo de teste. Em momentos diferentes, as células são marcadas com bromodesoxiuridina para detectar a síntese de ADN nascente e com iodeto de propidio para detectar o teor de ADN total. As células marcadas são analisadas quanto à posição no ciclo celular através de citometria de fluxo utilizando o programa Becton-Dickinson Cellfit tal como anteriormente descrito (Donaldson et al., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997). Um exemplo da utilização da incorporação de bromodesoxiuridina para determinar o efeito citostático e/ou citotóxico dos anticorpos anti-CD30 do presente invento é descrito na Secção 9, Infra.

5.4 ÁCIDOS NUCLEICOS São também divulgados ácidos nucleicos compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína, e fragmentos destes. Os ácidos nucleicos codificam de preferência uma ou mais CDR dos anticorpos que se ligam a CD30 e exercem efeitos citotóxicos ou citostáticos em células de DH. Ácidos nucleicos exemplares compreendem SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31. Os ácidos nucleicos preferidos compreendem SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:25 (ver Tabela 1 nas páginas 18-19, supra, para identificação do domínio de AC10 ou HeFi-1 ao qual correspondem estes identificadores de sequência). 40 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ São também divulgados ácidos nucleicos que hibridam sob condições de hibridação de rigor elevado, moderado ou baixo, com ácidos nucleicos, de preferência, ácidos nucleicos codificando um anticorpo do presente invento.

Como exemplo e não como limitação, procedimentos utilizando tais condições de baixo rigor para regiões de hibridação de mais de 90 nucleótidos são como se segue (ver também Shilo e Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 6789-6792, 1981). Filtros contendo ADN são pré-tratados durante 6 horas a 40°C numa solução contendo formamida a 35%, SSC 5x, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP a 0,1%, Ficoll a 0,1%, BSA a 1% e 500 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. As hibridações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,2%, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão, sulfato de dextrano a 10% (p/vol) e são utilizadas 5-20xl06 cpm de sonda marcada com 32P. Os filtros são incubados em mistura de hibridação durante 18-20 h a 40°C, e depois lavados durante 1,5 h a 55°C numa solução contendo SSC 2x, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM e SDS a 0,1%. A solução de lavagem é substituída com solução fresca e incubada mais 1,5 h a 60°C. Os filtros são secos em papel de filtro e expostos para autorradiografia. Se necessário, os filtros são lavados uma terceira vez a 65-68°C e re-expostos a película. Outras condições de baixo rigor que podem ser utilizadas são bem conhecidas na especialidade (p.ex., tal como empregue para hibridações entre espécies).

Também, como exemplo e não como limitação, procedimentos utilizando condições de elevado rigor para regiões de hibridação de mais de 90 nucleótidos são como se segue. A pré-hibridação de filtros contendo ADN é realizada durante de 8 h a de um dia para o outro a 65°C em tampão composto por SSC 6x, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,02% e 500 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridados durante 48 h a 65°C em mistura de pré-hibridação contendo 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 5-20xl06 cpm de sonda marcada com 32P. A lavagem dos filtros é feita a 37°C durante 1 h numa solução contendo SSC 2χ, PVP a 0,01%, Ficoll a 0,01% e BSA a 0,01%. 41 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Isto é seguido de uma lavagem em SSC Ο,ΐχ a 50°C durante 45 min antes da autorradiografia.

Outras condições de elevado rigor que podem ser utilizadas dependem da natureza do ácido nucleico (p.ex., comprimento, teor em GC, etc.) e do objectivo da hibridação (detecção, amplificação, etc.) e são bem conhecidas na especialidade. Por exemplo, a hibridação rigorosa de um ácido nucleico de aproximadamente 15-40 bases com uma sequência complementar na reacção em cadeia da polimerase (PCR) é feita sob as seguintes condições: uma concentração salina de KC1 50 mM, uma concentração de tampão de Tris-HCl 10 mM, uma concentração de Mg2+ de 1,5 mM, um pH de 7-7,5 e uma temperatura de ligação de 55-60°C.

Noutra concretização especifica, é proporcionado um ácido nucleico que é hibridável com um ácido nucleico, ou o seu complemento, sob condições de rigor moderado. A selecção das condições apropriadas para tais rigores é bem conhecida na especialidade (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; ver também, Ausubel et al., eds., na série "Current Protocols in Molecular Biology" dos manuais de técnicas laboratoriais, © 1987-1997, "Current Protocols", © 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

Os ácidos nucleicos podem ser obtidos e a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos determinada, através de qualquer método conhecido na especialidade. Por exemplo, se a sequência nucleotídica da proteína for conhecida, pode ser montado um ácido nucleico codificando o anticorpo a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (p.ex., tal como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17: 242, 1994), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleótidos sobreponíveis contendo porções da sequência codificando a proteína, união e ligação desses oligonucleótidos e depois amplificação dos oligonucleótidos ligados através de PCR.

Alternativamente, pode ser gerado um ácido nucleico codificando uma proteína a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada. Se não estiver disponível um clone contendo um ácido nucleico codificando uma determinada proteína, mas for 42 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ conhecida a sequência da molécula proteica, um ácido nucleico codificando a proteína pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (p.ex., uma biblioteca de ADNc tal como uma biblioteca de ADNc de anticorpos ou uma biblioteca de ADNc gerada a partir de, ou um ácido nucleico ou de preferência de ARN poliA+ isolado a partir de, qualquer tecido ou células que expressem a proteína. Se a proteína for um anticorpo, a biblioteca fonte pode ser células de hibridoma seleccionadas para expressar o anticorpo do presente invento) através de amplificação por PCR utilizando iniciadores sintéticos hibridáveis com as extremidades 3' e 5' da sequência ou através de clonagem utilizando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência do gene particular a identificar, p.ex., um clone de ADNc de uma biblioteca de ADNc que codifique a proteína. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem então ser clonados em vectores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido na especialidade.

Uma vez determinada a sequência nucleotídica e a correspondente sequência de aminoácidos do anticorpo, a sequência nucleotídica da proteína pode ser manipulada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade para a manipulação de sequências nucleotídicas, p.ex., técnicas de ADN recombinante, mutagénese dirigida ao local, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., eds., 1998, "Current Protocols in Molecular Biology",

John Wiley & Sons, NY), para gerar anticorpos possuindo uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo para criar substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções.

Numa concretização específica, a proteína é um anticorpo e a sequência de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia pesada e/ou leve pode ser inspeccionada para identificar as sequências das CDR através de métodos que são bem conhecidos na especialidade, p.ex., através da comparação com sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeias pesadas e leves para determinar as regiões de hipervariabilidade da sequência. Utilizando técnicas de ADN recombinante de rotina, uma ou mais das CDR podem ser 43 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ inseridas dentro de regiões estruturais, p.ex., em regiões estruturais humanas para humanizar um anticorpo não humano, tal como descrito supra. As regiões estruturais podem ser de ocorrência natural ou regiões estruturais de consenso, e são de preferência regiões estruturais humanas (ver, p.ex., Chothia et ai., J. Mol. Biol. 278: 457-479, 1998 para uma listagem das regiões estruturais humanas). 0 ácido nucleico gerado através da combinação das regiões estruturais e CDR codifica um anticorpo que se liga especificamente a CD30 e exerce um efeito citostático e/ou citotóxico em células de DH. De preferência, tal como discutido supra, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas dentro das regiões estruturais, e, de preferência, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo a CD30 e/ou estimulam o efeito citostático e/ou citotóxico do anticorpo. Adicionalmente, tais métodos podem ser utilizados para tornar as substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteina da região variável participantes numa ligação dissulfureto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo sem uma ou mais ligações dissulfureto intracadeia. Outras alterações ao ácido nucleico estão dentro da perícia na especialidade.

Adicionalmente, podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 851-855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314: 452-454, 1985) através da junção de genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de especificidade do antigénio apropriada com genes de uma molécula de anticorpo humana de actividade biológica apropriada. Tal como descrito supra, um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles possuindo uma região variável derivada de um mAb de murídeo e uma região constante de imunoglobulina humana, p.ex., anticorpos humanizados.

Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. N.° 4946778; Bird, Science 242: 423-42, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 85: 5879-5883, 1988; e Ward et al., Nature 334: 544-54, 1989) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de 44 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples são formados através da ligação dos fragmentos das cadeias pesadas e leves da região Fv através de uma ponte de aminoácidos, resultando numa proteína de cadeia simples. Podem também ser utilizadas técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., Science 242: 1038-1041, 1988). 5.5 SEQUÊNCIAS RELACIONADAS COM AC10 E HeFi-1 O presente invento engloba também anticorpos compreendendo uma região de homologia com as CDR de AC10 e HeFi-1, ou as regiões de codificação destas, respectivamente. Em várias concretizações, a região de homologia é caracterizada por pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a região correspondente de AC 10 ou HeFi-1.

Numa concretização, o presente invento engloba um anticorpo com uma região de homologia com uma CDR de HeFi-1 (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32). Noutra concretização, o presente invento engloba um anticorpo com uma região de homologia com uma CDR de AC10 (SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; ou SEQ ID NO:16). O presente invento engloba também anticorpos compreendendo uma região de homologia com as regiões variáveis de AC10 e HeFi-1, ou a região de codificação destas, respectivamente. Em várias concretizações, a região de homologia é caracterizada por pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com a região correspondente de AC10 ou HeFi-1.

Numa concretização, o presente invento engloba um anticorpo com uma região de homologia com uma região variável de HeFi-1 (SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:26). Noutra concretização, o presente invento engloba um anticorpo com uma região de homologia com uma região variável de AC10 (SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:10). 45 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, p.ex., entre as sequências de uma região variável de AC10 ou HeFi-1 e sequências de outros anticorpos com regiões de homologia com a região variável de AC10 ou HeFi-1, as sequências são alinhadas para fins de comparação óptima (p.ex., podem ser introduzidos intervalos na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou ácido nucleico para alinhamento óptimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos nas posições de aminoácido ou posições de nucleótidos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (i.e., % de identidade = n.° de posições idênticas/n.° total de posições (p.ex., posições sobreponíveis) xlOO). Numa concretização, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser alcançada utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990, modificado como em Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877, 1993. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990. As pesquisas de nucleótidos por BLAST podem ser efectuadas com o programa NBLAST, registo = 100, comprimento da palavra = 12 para obter sequências nucleotídicas homólogas a um ácido nucleico codificando uma proteína modificadora SCA-1. As pesquisas de proteína em BLAST podem ser efectuadas com o programa XBLAST, registo = 50, comprimento da palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína modificadora SCA-1. Para obter alinhamentos com intervalos para fins de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST tal como descrito em Altschul et al.r Nucleic Acids Res. 25: 3389— 3402, 1997. Alternativamente, pode ser utilizado PSl-Blast 46 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ para efectuar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, podem ser utilizados os parâmetros por defeito dos respectivos programas (p.ex., XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlln.nih.gov. Outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989) . Um tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de suportes lógicos de alinhamento de sequências de GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos, pode ser utilizada uma tabela de resíduos ponderada PAM120, uma penalidade do comprimento do intervalo de 12, e uma penalidade de intervalo de 4. Algoritmos adicionais para análise de sequências são conhecidos na especialidade e incluem ADVANCE e ADAM tal como descrito em Torellis e Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5, 1994; e FASTA descrito em Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-8, 1988. Dentro de FASTA, ktup é uma opção de controlo que estabelece a sensibilidade e a velocidade da pesquisa. Se ktup=2, regiões semelhantes nas duas sequências a comparar são verificadas através da observação de pares de resíduos alinhados; se ktup=l, são examinados aminoácidos alinhados de forma simples, ktup pode ser estabelecido a 2 ou 1 para sequências proteicas, ou de 1 a 6 para sequências de ADN. 0 defeito se ktup não for especificado é 2 para proteínas e 6 para ADN. Para mais descrição dos parâmetros de FASTA, ver http://bioweb.pasteur.fr/does/man/man/fasta.1.html#sect2.

Alternativamente, o alinhamento de sequências proteicas pode ser realizado utilizando o algoritmo CLUSTAL W, tal como descrito por Higgins et al., Methods Enzymol. 266: 383-402, 1996 . as A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes às descritas acima, com ou sem permissão de intervalos. No cálculo da percentagem de identidade, apenas são contadas coincidências exactas. 47 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

5.6 MÉTODOS DE PRODUÇÃO DOS ANTICORPOS DO INVENTO

Os anticorpos do presente invento podem ser produzidos através de qualquer método conhecido na especialidade para a síntese de proteínas, em particular, através de síntese química ou de preferência, através de técnicas de expressão recombinante. A expressão recombinante de um anticorpo do presente invento, incluindo um fragmento, derivado ou análogo deste (p.ex., uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo do presente invento) requer a construção de um vector de expressão contendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo. Uma vez obtido um ácido nucleico codificando um anticorpo do presente invento, o vector para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido através de tecnologia de ADN recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade. Assim, são aqui descritos métodos para a preparação de um anticorpo através da expressão de um ácido nucleico contendo a sequência nucleotídica codificando o referido anticorpo. Métodos que são bem conhecidos dos peritos na especialidade podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo sequências de codificação e sinais de controlo da transcrição e da tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. São divulgados vectores replicáveis compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo do presente invento operativamente ligada a um promotor. A sequência nucleotídica pode codificar uma cadeia pesada ou leve deste, ou um domínio variável da cadeia pesada ou leve, operativamente ligado a um promotor. Tais vectores podem incluir a sequência nucleotídica codificando a região constante da molécula de anticorpo (ver, p.ex., Publicação PCT WO 86/05807; Publicação PCT WO 89/01036; e Patente U.S. N.° 5122464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado num tal vector para expressão da cadeia pesada ou leve inteira. O vector de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo do presente invento. São também divulgadas células hospedeiras contendo um ácido 48 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ nucleico codificando um anticorpo do presente invento, operativamente ligado a um promotor heterólogo. Em concretizações preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vectores codificando tanto a cadeia pesada como a leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina inteira, tal como detalhado abaixo.

Uma variedade de sistemas hospedeiro-vector de expressão pode ser utilizada para expressar os anticorpos do presente invento. Tais sistemas hospedeiro-expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação nucleotídicas apropriadas expressar um anticorpo do presente invento in situ. Estas incluem mas não se limitam a microrganismos tais como bactérias (p.ex., E. coli, B. subtilis) transformadas com vectores de expressão de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico, ou ADN cosmidico contendo sequências de codificação de anticorpos; leveduras (p.ex., Saccharomyces, Pichia) transformadas com vectores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão virais recombinantes (p.ex., baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de virus recombinantes (p.ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão plasmídicos recombinantes (p.ex., plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamífero (p.ex., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) ancorando construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (p.ex., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (p.ex., o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vacínia). De preferência, são utilizadas células bacterianas tais como

Escherichia coli e, de maior preferência, células eucarióticas, especialmente para a expressão de moléculas de anticorpo recombinantes inteiras, para a expressão de uma proteína recombinante do presente invento. Por exemplo, 49 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ células de mamífero, tais como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em conjunto com um vector tal como o elemento promotor do gene inicial intermédio principal do citomegalovírus humano são um sistema de expressão eficaz para as proteínas do presente invento (Foecking et al., Gene 45: 101, 1986; Cockett et al., Bio/Technology 8: 2, 1990).

Em sistemas bacterianos, vários vectores de expressão podem ser vantajosamente seleccionados dependendo da utilização pretendida para os requisitos de dobragem e modificação pós-tradução do anticorpo a expressar. Onde possível, quando se pretende que seja produzida uma grande quantidade de um tal anticorpo, para a criação de composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo do presente invento, podem ser desejáveis vectores que dirijam a expressão de elevados níveis de produtos proteicos de fusão que sejam facilmente purificados. Tais vectores incluem, mas não se limitam ao vector de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983), no qual a sequência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente no vector enquadrada com a região de codificação de lacZ para que seja produzida uma proteína de fusão; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509, 1989); e semelhantes. Podem também ser utilizados vectores pGEX para expressar proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST) . Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas através de adsorção e ligação a contas de glutationa-agarose da matriz seguida de eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são desenhados para incluir trombina ou locais de clivagem por proteases do factor Xa para que o produto do gene alvo clonado possa ser libertado da porção GST.

Num sistema de insecto, o vírus da poli-hedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é utilizado como vector para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene da poli-hedrina) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor da poli-hedrina). 50 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Em células hospedeiras de mamífero, podem ser utilizados vários sistemas de expressão baseados em vírus. Em casos onde é utilizado um adenovírus como vector de expressão, a sequência de codificação do anticorpo do presente invento pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução de adenovírus, p.ex., o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (p.ex., região El ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a proteína do presente invento em hospedeiros infectados (ver, p.ex., Logan & Shenk, Proc. Natl. Acâd. Sei. USA 8 1: 355-359, 1984). Sinais de iniciação específicos podem também ser necessários para uma tradução eficiente das sequências de codificação inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Para além disso, o codão de iniciação tem de estar em fase com o enquadramento de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução da inserção inteira. Estes sinais de controlo da tradução exógenos e codões de iniciação podem ter uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser estimulada através da inclusão de elementos estimuladores da transcrição apropriados, terminadores da transcrição, etc. (ver Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544, 1987).

Adicionalmente, pode ser escolhida uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto do gene no modo específico desejado. Tais modificações (p.ex., glicosilação) e processamentos (p.ex., clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função do anticorpo do presente invento. Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas e produtos génicos. Linhas celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a correcta modificação e processamento da proteína estranha expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento correcto do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto 51 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ génico. Tais células hospedeiras de mamífero incluem mas não se limitam a CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3 e W138.

Para produção de elevado rendimento a longo prazo de anticorpos recombinantes é preferida expressão estável. Por exemplo, podem ser desenhadas linhas celulares que expressem estavelmente o anticorpo do presente invento. Em vez de se utilizarem vectores de expressão que contêm origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo da expressão apropriados (p.ex., sequências promotoras, estimuladoras, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. Após a introdução do ADN estranho, as células modificadas podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e serem depois mudadas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem estavelmente o plasmideo nos seus cromossomas e cresçam para formar foci que podem por sua vez ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente utilizado para desenhar linhas celulares que expressem o anticorpo do presente invento.

Podem ser utilizados vários sistemas de selecção, incluindo mas não se limitando aos genes da timidina-quinase (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), hipoxantina-guanina- fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 202, 1992) e adenina- fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22: 8-17, 1980) do virus herpes simplex que podem ser empregues em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Pode também ser utilizada resistência anti-metabolitos como base da selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 357, 1980; 0'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527, 1981); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072, 1981); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, Biotherapy 3: 87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, 1993; Mulligan,

Science 260: 926-932, 1993; e Morgan e Anderson, Ann. Rev. 52 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Biochem. 62: 191-217, 1993; ΤΙΒ TECH 11(5): 155-215, Maio, 1993); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Métodos vulgarmente conhecidos na especialidade da tecnologia de adn recombinante podem ser rotineiramente aplicados para seleccionar o clone recombinante desejado e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), "Current Protocols in Human Genetics", John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1, 1981, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Os níveis de expressão de um anticorpo do presente invento podem ser aumentados através de amplificação do vector (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, "The Use of

Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNY Cloning", Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema vector que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo do presente invento também aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257, 1983). A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vectores de expressão, o primeiro vector codificando uma proteína derivada da cadeia pesada e o segundo vector codificando uma proteína derivada da cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que permitam uma expressão igual das proteína da cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser utilizado um único vector que codifique, e seja capaz de expressar, ambas as proteínas da cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52, 1986 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72: 2 197, 1980). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico. 53 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Uma vez produzido um anticorpo do presente invento por um animal, quimicamente sintetizado ou expresso de forma recombinante, este pode ser purificado através de qualquer método conhecido na especialidade para purificação de proteínas, por exemplo, através de cromatografia (p.ex., permuta iónica; afinidade, particularmente por afinidade para o antigénio especifico, Proteína A (para moléculas de anticorpo, ou afinidade para um parceiro de fusão heterólogo em que o anticorpo é uma proteína de fusão; e cromatografia em coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. São também divulgadas proteínas de ligação a CD3 fundidas de forma recombinante ou conjugadas quimicamente (incluindo conjugação tanto covalente como não covalente) com proteínas heterólogas (de preferência pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) do presente invento para gerar proteínas de fusão. A fusão não necessita necessariamente de ser directa, mas pode ocorrer através de sequências ligantes. São também divulgadas composições compreendendo proteínas fundidas ou conjugadas com domínios de anticorpo diferentes dos das regiões variáveis. Por exemplo, as proteínas podem ser fundidas ou conjugadas com uma região Fc do anticorpo, ou porção desta. A porção de anticorpo fundida com uma proteína pode compreender a região constante, a região charneira, o domínio CHI, o domínio CR2, e o domínio CH3 ou uma qualquer combinação de domínios inteiros ou porções destes. As proteínas podem também ser fundidas ou conjugadas com as porções de anticorpo de cima para formar multímeros. Por exemplo, porções Fc fundidas com as proteínas podem formar dímeros através de ligações dissulfureto entre as porções Fc. Formas multiméricas superiores podem ser feitas através da fusão das proteínas com porções de igA e igM. Os métodos para fusão ou conjugação das proteínas com porções de anticorpo são conhecidos na especialidade. Ver, p.ex., Patentes U.S. N.os 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946, EP 307434, EP 367166, publicações PCT WO 96/04388, WO 91/06570, Ashkenazi et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 88: 54 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 10535-10539, 1991; Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-5600, 1995; e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 11337- 11341, 1992.

5.7 CONJUGADOS E PROTEÍNAS DE FUSÃO

Tal como discutido supra, os anticorpos do presente invento englobam proteínas que se ligam a CD30 e exercem um efeito citostático e/ou citotóxico em células de DH, e que são ainda fundidas ou conjugadas com proteínas heterólogas ou agentes citotóxicos. O presente invento proporciona assim o tratamento da Doença de Hodgkin através da administração de um anticorpo do presente invento. Os anticorpos do presente invento incluem mas não se limitam a: anticorpos AC10 e HeFi-1 e análogos e derivados destes (p.ex., tal como descrito aqui acima).

Em certas concretizações do presente invento, um anticorpo do presente invento pode ser quimicamente modificado para melhorar as suas propriedades citotóxicas e/ou citostáticas. Por exemplo, um anticorpo do presente invento pode ser administrado como conjugado. Porções particularmente adequadas para conjugação com anticorpos do presente invento são agentes quimioterapêuticos, enzimas conversoras de pró-fármacos, isótopos ou compostos radioactivos, ou toxinas. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser modificado para ligar funcionalmente a sequência de codificação de uma enzima conversora de pró-fármaco com a sequência de codificação de um anticorpo do presente invento, para que uma proteína de fusão compreendendo a enzima conversora de pró-fármaco funcionalmente activa e o anticorpo do presente invento seja expressa no indivíduo após administração do ácido nucleico de acordo com os métodos de terapia génica descritos na Secção 5.7, infra.

Numa concretização, um anticorpo do presente invento é fundido com uma sequência marcadora, tal como um péptido, para facilitar a purificação. Em concretizações preferidas, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado num vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Tal 55 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ como descrito em Gentz et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 821-824, 1989, por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores peptídicos úteis para purificação incluem, mas não se limitam ao marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et ai., Cell 37: 767, 1984) e o marcador "Flag". Tais proteínas de fusão podem ser geradas através de métodos recombinantes padrão conhecidos dos peritos na especialidade.

Noutra concretização, os anticorpos do presente invento são fundidos ou conjugados com um agente terapêutico. Por exemplo, um anticorpo do presente invento pode ser conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma toxina (p.ex., um agente citostático ou citocida), ou um radionuclídeo (p.ex., emissores alfa tais como, por exemplo, Bi, At, ou emissores beta tais como, por exemplo, I, 90Y, ou 67Cu) . Fármacos tais como o metotrexato (Endo et al., Câncer Research 47: 1076-1080, 1987), daunomicina (Gallego et al.,

Int. J. Câncer. 33: 737-744, 1984), mitomicina C (MMC) (Ohkawa et al., Câncer Immunol. Immunother. 23: 81-86, 1986) e alcaloides de vinca (Rowland et al., Câncer Immunol. Immunother. 21: 183-187, 1986) foram ligados a anticorpos e os conjugados derivados foram investigados quanto a actividades antitumorais. Deve haver cuidado na criação de conjugados de agentes quimioterapêuticos para assegurar que a actividade do fármaco e/ou anticorpo não diminui em resultado do processo de conjugação.

Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem as seguintes classes não mutuamente exclusivas de agentes quimioterapêuticos: agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, antifolatos, anti-metabolitos, agentes anti-tubulina, auristatinas, sensibilizadores à quimioterapia, ligantes ao sulco menor de adn, inibidores da replicação do ADN, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, lexitropsinas, nitrosureias, platinóis, anti-metabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores à radiação, esteróides, taxanos, inibidores da topoisomerase e alcaloides vinca. Exemplos de quimioterapêuticos individuais que podem ser 56 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ conjugados com um ácido nucleico ou proteína do presente invento incluem mas não se limitam a um androgénio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, bussulfano, butionina-sulfoximina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, dacarbazina, docetaxel, doxorrubicina, um estrogénio, 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazole, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, teniposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, VP-16 e VM-26. Numa concretização preferida, o agente quimioterapêutico é auristatina E. Numa concretização mais preferida, o agente quimioterapêutico é o derivado da auristatina E AEB (tal como descrito no Pedido U.S. N.° 09/845,786 apresentado a 30 de Abril de 2001).

Os conjugados do presente invento utilizados para aumentar o efeito terapêutico do anticorpo do presente invento incluem agentes terapêuticos não clássicos tais como toxinas. Tais toxinas incluem, por exemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria.

As técnicas para conjugação de tais porções terapêuticas com anticorpos são bem conhecidas, ver, p.ex., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy", Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em "Controlled Drug Delivery" (2a ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em "Monoclonal Antibodies" de 1984; "Biological And Clinicai Applications", Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy", 57 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al.f Immunol. Rev. 62: 119-58, 1982.

Alternativamente, um anticorpo do presente invento pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado tal como descrito por Segai na Patente U.S. N.° 4676980.

Tal como discutido acima, em certas concretizações do presente invento, um anticorpo do presente invento pode ser co-administrado com uma enzima conversora de pró-fármacos. A enzima conversora de pró-fármacos pode ser expressa como uma proteína de fusão com, ou conjugada com, um anticorpo do presente invento. Enzimas conversoras de pró-fármacos exemplares são a carboxipeptidase G2, beta-glucuronidase, penicilina-V-amidase, penicilina-G-amidase, β-lactamase, β-glucosidase, nitro-redutase e carboxipeptidase A.

5.8 TERAPIA GENICA São também divulgados ácidos nucleicos que são administrados para tratar, inibir ou prevenir DH. A terapia génica refere-se a terapia efectuada através da administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou expressável. Os ácidos nucleicos produzem a sua proteína codificada que medeia um efeito terapêutico.

Pode ser utilizado qualquer um dos métodos de terapia génica disponíveis na especialidade. Métodos exemplares são descritos abaixo.

Para revisões gerais dos métodos de terapia génica, ver, Goldspiel et al., Clinicai Pharmacy 12: 488-505, 1993; Wu e

Wu, Biotherapy 3: 87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, 1993; Mulligan, Science 260: 926-932, 1993; Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191— 217, 1993; TIBTECH 1 1(5): 155-215, Maio de 1993. Os métodos vulgarmente conhecidos na especialidade de tecnologia de ADN recombinante que podem ser utilizados são descritos em Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY (1990) . 58 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Num aspecto preferido, o terapêutico compreende sequências de ácido nucleico codificando um anticorpo, sendo as referidas sequências de ácido nucleico parte dos vectores de expressão que expressam o anticorpo ou fragmentos ou proteínas quiméricas ou cadeias pesadas ou leves destes num hospedeiro adequado. Em particular, tais sequências de ácido nucleico têm promotores operativamente ligados à região de codificação do anticorpo, sendo o referido promotor indutível ou constitutivo e, opcionalmente, específico do tecido. Noutra concretização particular, são utilizadas moléculas de ácido nucleico em que as sequências de codificação do anticorpo e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando assim expressão intracromossómica dos ácidos nucleicos codificando o anticorpo (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935, 1989; Zijlstra et al., Nature 342: 435-438, 1989). Em concretizações específicas, a molécula de anticorpo expressa é um anticorpo de cadeia simples; alternativamente, as sequências de ácido nucleico incluem sequências codificando tanto a cadeia pesada como a leve, ou fragmentos destas, do anticorpo. A introdução dos ácidos nucleicos num paciente pode ser directa, caso em que o paciente é directamente exposto ao ácido nucleico ou vectores transportando o ácido nucleico, ou indirecta, casos em que as células são primeiro transformadas com os ácidos nucleicos in vitro, depois transplantadas para o paciente. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia génica in vivo ou ex vivo.

Numa concretização específica, as sequências de ácido nucleico são directamente administradas in vivo, onde são expressas para produzir o produto codificado. Isto pode ser alcançado através de qualquer um de numerosos métodos conhecidos na especialidade, por exemplo através da sua construção como parte de um vector de expressão de ácido nucleico apropriado e administração do vector de modo a que as sequências de ácido nucleico se tornem intracelulares. Os vectores de terapia génica podem ser administrados através de infecção utilizando vectores retrovirais deficientes ou atenuados ou outros vectores virais (ver, p.ex., Patente U.S. 59 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ Ν.° 4980286); injecção directa de ADN nu; utilização de bombardeamento de microparticulas (p.ex., uma pistola de genes; Biolistic, Dupont); revestimento com lipidos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção; encapsulamento em lipossomas, microparticulas ou microcápsulas; administração em ligação com um péptido que se saiba que entra no núcleo; administração em ligação com um ligando sujeito a endocitose mediada por receptores (ver, p.ex., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, 1987) (que pode ser utilizado para alvejar tipos celulares que expressam especificamente os receptores); etc. Noutra concretização, podem ser formados complexos ácido nucleico-ligando nos quais o ligando compreende um péptido virai fusogénico para destruir endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossómica. Ainda noutra concretização, o ácido nucleico pode ser direccionado in vivo para tomada celular específica e expressão, através de direccionamento para um receptor específico (ver, p.ex., Publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316 ; W093/14188 e WO 93/20221) .

Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do ADN da célula hospedeira para expressão através de recombinação homóloga (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935, 1989; Zijlstra et ai., Nature 342: 435-438, 1989).

Numa concretização específica, são utilizados vectores virais que contêm sequências de ácido nucleico codificando um anticorpo do presente invento. Por exemplo, pode ser utilizado um vector retroviral (ver Miller et ai., Meth. Enzymol. 217: 581-599, 1993). Estes vectores retrovirais contêm os componentes necessários para o correcto empacotamento do genoma virai e integração no ADN da célula hospedeira. As sequências de ácido nucleico codificando o anticorpo a utilizar em terapia génica são clonadas num ou mais vectores, facilitando deste modo a entrega do gene num paciente. Mais detalhes acerca dos vectores retrovirais podem ser encontrados em Boesen et ai., Biotherapy 6: 29 1-302, 1994, que descreve a utilização de um vector retroviral para entregar o gene mdrl a células estaminais hematopoiéticas para tornar as células estaminais mais resistentes a quimioterapia. Outras referências ilustrando a utilização de vectores retrovirais em terapia génica são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644- 60 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 651, 1994; Klein et al., Blood 83: 1467-1473, 1994; Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141, 1993; e Grossman e Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3: 110-114, 1993.

Outra abordagem à terapia génica envolve a transferência de um gene, p.ex., um gene de AC10 ou HeFi-1, para células em cultura de tecidos através de métodos como electroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção virai. Habitualmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador seleccionável para as células. As células são então colocadas sob selecção para isolar as células que tomaram e expressam o gene transferido. Essas células são então introduzidas num paciente.

Nesta concretização, o ácido nucleico é introduzido num numa célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser efectuada através de qualquer método conhecido na especialidade, incluindo mas não se limitando a transfecção, electroporação, micro-injecção, infecção com um vector virai ou bacteriófago contendo as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomas, transferência de genes mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. São conhecidas na especialidade numerosas técnicas para a introdução de genes estranhos em células (ver, p.ex., Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618, 1993; Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644, 1993; Clin., Pharmac. Ther. 29: 69-92, 1985) e podem ser utilizadas desde que as funções de desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células receptoras não sejam destruídas. A técnica deve proporcionar a transferência estável do ácido nucleico para a célula, para que o ácido nucleico seja expressável pela célula e de preferência herdável e expressável pela sua descendência celular.

As células recombinantes resultantes podem ser introduzidas num paciente através de vários métodos conhecidos na especialidade. Células sanguíneas recombinantes (p.ex., células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas) são de preferência administradas intravenosamente. A quantidade de células considerada para utilizar depende do efeito desejado, 61 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ do estado do paciente, etc. e pode se determinada por um perito na especialidade.

As células nas quais pode ser introduzido um ácido nucleico para fins de terapia génica englobam qualquer tipo celular desejado disponível e incluem mas não se limitam a fibroblastos; células sanguíneas tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, p.ex., tal como obtidas a partir da medula óssea, de sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.

Numa concretização preferida, a célula utilizada para terapia génica é autóloga ao paciente.

Numa concretização em que as células recombinantes são utilizadas em terapia génica, as sequências de ácido nucleico codificando um anticorpo são introduzidas nas células de modo a que sejam expressáveis pelas células ou a sua descendência, e as células recombinantes são então administradas in vivo para efeito terapêutico. Numa concretização especifica, são utilizadas células estaminais ou progenitoras. Quaisquer células estaminais e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem potencialmente ser utilizadas de acordo com esta concretização do presente invento (ver p.ex., Publicação PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, Cell 71: 973-985, 1992; Rheinwald, Meth. Cell Βίο. 21A: 229, 1980; e

Pittelkow e Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771, 1986).

Numa concretização especifica, o ácido nucleico a introduzir para fins de terapia génica compreende um promotor indutivel operativamente ligado à região de codificação, para que a expressão do ácido nucleico seja controlável através do controlo da presença ou ausência do indutor de transcrição apropriado.

Os anticorpos ou composições farmacêuticas do presente invento são de preferência testados in vitro e depois in vivo quanto à actividade terapêutica ou profilática desejada, antes da utilização em humanos. Por exemplo, ensaios in vitro para 62 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ demonstrar a utilidade terapêutica ou profilática de um anticorpo ou uma composição farmacêutica incluem a determinação do efeito do anticorpo ou da composição farmacêutica numa linha celular de Hodgkin ou numa amostra de tecido de um paciente com Doença de Hodgkin. 0 efeito citotóxico e/ou citostático do anticorpo ou da composição na linha celular de Hodgkin e/ou na amostra de tecido podem ser determinados utilizando técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. Um método preferido, descrito na Secção 6 infra, implica o contacto de uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin criada a uma densidade de aproximadamente cerca de 5000 células em 0,33 cm2 de área de cultura durante um período de 72 horas com o anticorpo ou composição farmacêutica, exposição da cultura a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido período de 72 horas, e medição da incorporação de 3H-timidina em células da cultura. O anticorpo ou composição farmacêutica tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin e é útil para o tratamento ou a prevenção de Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular da Doença de Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem terem tido contacto com o anticorpo ou a composição farmacêutica. Alternativamente, ensaios in vitro que podem ser utilizados para determinar se a administração de um anticorpo específico ou uma composição farmacêutica é indicada, incluem ensaios de cultura celular in vitro em que uma amostra de tecido de um paciente de Doença de Hodgkin é criada em cultura e exposta ou o equivalente a um anticorpo ou composição farmacêutica, e é observado o efeito de tal composto na amostra de tecido de Hodgkin.

5.9 ADMINISTRAÇÃO TERAPÊUTICA/PROFILÁCTICA E COMPOSIÇÕES São também divulgados métodos de tratamento e profilaxia através da administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma proteína anticorpo de ligação a CD30 que tem um efeito citotóxico ou citostático em células da Doença de Hodgkin (i.e., um anticorpo do presente invento), uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo do presente invento (daqui em diante, um produto farmacêutico do presente invento). De acordo com o presente invento, o tratamento de DH engloba o tratamento de pacientes já diagnosticados com DH em 63 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ qualquer estádio clínico; tal tratamento resultando em atraso do crescimento tumoral; e/ou promovendo regressão tumoral.

Numa concretização preferida, o anticorpo do presente invento é o anticorpo monoclonal AC10 ou HeFi-1 ou um fragmento deste. Num aspecto preferido, um produto farmacêutico do presente invento compreende um anticorpo substancialmente purificado do presente invento (p.ex., substancialmente livre de substâncias que limitem o seu efeito ou produzam efeitos secundários indesejados). 0 indivíduo é de preferência um animal, incluindo mas não se limitando a animais tais como vacas, porcos, cavalos, galinhas, gatos, cães, etc., e é de preferência um mamífero e de maior preferência um humano.

As formulações e métodos de administração que podem ser empregues são descritos acima; formulações adicionais e vias de administração apropriadas podem ser seleccionadas entre as aqui descritas abaixo. Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser utilizados para administrar um anticorpo do presente invento, p.ex., encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo, endocitose mediada por receptores (ver p.ex., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, 1987), construção de um ácido nucleico como parte de um vector retroviral ou outro vector, etc. Os métodos de introdução incluem mas não se limitam às vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. Os anticorpos do presente invento podem ser administrados através de qualquer via conveniente, por exemplo através de infusão ou injecção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (p.ex., mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) e podem ser administrado juntamente com outros agentes biologicamente activos tais como agentes quimioterapêuticos (ver Secção). A administração pode ser sistémica ou local.

Numa concretização específica, pode ser desejável administrar o anticorpo do presente invento através de injecção, por meio de um cateter, por meio de um supositório 64 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo uma membrana, tal como uma membrana silástica ou uma fibra. De preferência, quando se administra um anticorpo do presente invento, tem de haver cuidado para utilizar materiais nos quais o anticorpo não seja absorvido.

Noutra concretização, o anticorpo ou composição pode ser entregue numa vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, Science 249: 1527-1533, 1990; Treat et al., em "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer", Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353- 365; Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; ver geralmente, ibid.)

Ainda noutra concretização, o anticorpo ou composição pode ser entregue num sistema de libertação controlada. Numa concretização, pode ser utilizada uma bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201, 1989;

Buchwald et al., Surgery 88: 507, 1980; Saudek et al., N.

Engl. J. Med. 321: 574, 1989). Noutra concretização, podem ser utilizados materiais poliméricos (ver "Medicai Applications of Controlled Release", 1974, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida; "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance", 1984, Smolen e Bali (eds.), Wiley, New York; Ranger e Peppas, Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61, 1983; ver também Levy et al., Science 228: 190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25: 351, 1989;

Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105, 1989).

Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão de Langer, Science 249: 1527-1533, 1990.

Quando é administrado um ácido nucleico, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão da sua proteína codificada, através da sua construção como parte de um vector de expressão de ácido nucleico apropriado e da sua administração de modo a que se torne intracelular, p.ex., através da utilização de um vector retroviral (ver Patente U.S. N.° 4980286), ou através de injecção directa, ou através da utilização de bombardeamento de micropartículas (p.ex., uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou revestindo com 65 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ lípidos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, ou através da sua administração em ligação com um péptido semelhante a homeobox que se sabe que entra no núcleo (ver, p.ex., Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1864-1868, 1991), etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do ADN da célula hospedeira para expressão, através de recombinação homóloga.

Tal como aludido acima, o presente invento proporciona também composições farmacêuticas (produtos farmacêuticos do presente invento). Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo do presente invento e um transportador farmaceuticamente aceitável. Numa concretização específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou Estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilizar em animais, e mais particularmente em humanos. 0 termo "transportador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o produto terapêutico é administrado. Tais transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem em petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um transportador preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregues como transportadores líquidos, particularmente para injecções injectáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite magro em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, pode também conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustida e semelhantes. A composição pode ser formulada como supositório, com ligantes e transportadores tradicionais tais como triglicéridos. A formulação oral pode 66 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ incluir transportadores padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo do presente invento, de preferência na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de transportador de modo a proporcionar a forma para administração correcta ao paciente. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.

Numa concretização preferida, o produto farmacêutico do presente invento é formulado de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, o produto farmacêutico do presente invento pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como lidocaina para aliviar a dor no local da injecção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados uns com os outros numa forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado livre de água num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de agente activo. Quando o produto farmacêutico do presente invento é para administrar através de infusão, pode ser dispensado com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o produto farmacêutico do presente invento é administrado através de injecção, pode ser proporcionada uma ampola de água ou solução salina estéril para injecção de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. A quantidade do anticorpo do presente invento que será eficaz no tratamento ou prevenção de DH pode ser determinada através de técnicas clinicas padrão. Adicionalmente, ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregues para ajudar a identificar intervalos de dosagem óptimos. A dose exacta a empregar na formulação também dependerá da via de administração, e do estádio da DH, e deve ser decidida de 67 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ acordo com a avaliação do médico e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelos animais.

5.10 ESTOJOS É também divulgada uma embalagem ou estojo farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um anticorpo do presente invento e opcionalmente um ou mais transportadores farmacêuticos. Opcionalmente associado a um tal recipiente ou recipientes pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental reguladora do fabrico, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso esse que reflecte a aprovação pela agência do fabrico, utilização ou venda para administração humana.

Numa concretização, um estojo compreende um anticorpo purificado do presente invento. O anticorpo pode estar conjugado com um radionuclídeo ou um agente quimioterapêutico. O estojo compreende ainda opcionalmente um transportador farmacêutico.

5.11 DOSE EFICAZ A toxicidade e a eficácia terapêutica dos anticorpos do presente invento podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, p.ex., para determinação da DL50 (a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico e pode ser expresso como a razão DL50/DE50. São preferidos os anticorpos que exibam grandes indices terapêuticos. Embora possam ser utilizados anticorpos que exibam efeitos secundários tóxicos, deve haver cuidado para desenhar um sistema de entrega que direccione tais anticorpos para o local do tecido afectado para minimizar potenciais danos em células não infectadas e, deste modo, reduzir os efeitos secundários.

Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilizar em humanos. A dosagem de 68 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ tais anticorpos reside de preferência dentro de um intervalo de concentrações em circulação que inclui a DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para se alcançar um intervalo de concentrações plasmáticas em circulação que inclua a CI50 (i.e., a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semi-máxima dos sintomas) conforme determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar mais precisamente doses úteis em humanos. Os niveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia liquida de elevada resolução.

Geralmente, a dosagem de um anticorpo do presente invento num produto farmacêutico do presente invento administrado a um paciente de Doença de Hodgkin é tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. De preferência, a dosagem administrada a um paciente é de entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, de maior preferência de 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma semivida maior dentro do corpo humano que anticorpos de outras espécies devido à resposta imunitária às proteínas estranhas. Assim, são frequentemente possíveis doses inferiores de anticorpos humanizados, quiméricos ou humanos e uma administração menos frequente.

5.12 FORMULAÇÕES

As composições farmacêuticas para utilizar de acordo com o presente invento podem ser formuladas de um modo convencional utilizando um ou mais transportadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Assim, os anticorpos podem ser formulados para administração através de administração por inalação ou insuflação (através da boca ou do nariz) ou oral, bocal, parentérica ou rectal.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas 69 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (p.ex., amido de milho pré-gelatinisado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose); cargas (p.ex., lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio), lubrificantes (p.ex., estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (p.ex., amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentes molhantes (p.ex., laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem conhecidos na especialidade. As preparações liquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outros veículos adequados antes da utilização. Tais preparações liquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (p.ex., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas edíveis); agentes emulsionantes (p.ex., lecitina ou acácia); veículos não aquosos (p.ex., óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (p.ex., metil- ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes conforme apropriado.

As preparações para administração oral podem ser formuladas de modo adequado para dar libertação controlada do composto activo.

Para administração bocal as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de um modo convencional.

Para administração através de inalação, os anticorpos para utilizar de acordo com o presente invento são convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação de spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, p.ex., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma 70 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ quantidade medida. As cápsulas e cartuchos, p.ex., de gelatina para utilizar num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

Os anticorpos podem ser formulados para administração parentérica através de injecção, p.ex., através de injecção de bolo ou de infusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, p.ex., em ampolas ou em recipientes multi-doses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veiculo adequado, p.ex., água estéril apirogénica, antes da utilização.

Os anticorpos podem também ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, p.ex., contendo bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Para além das formulações descritas anteriormente, os anticorpos podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de acção longa podem ser administradas através de implantação (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou através de injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os anticorpos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados ligeiramente solúveis, por exemplo, como um sal ligeiramente solúvel.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente activo. A embalagem pode por exemplo compreender folha metálica ou plástica, tal como uma embalagem de bolhas. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado de instruções para administração de preferência para administração a um ser humano. 71 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

5.13 TERAPIA DE COMBINAÇÃO PARA TRATAMENTO DA DOENÇA DE HODGKIN

Os anticorpos do presente invento podem ser administrados juntamente com tratamento com irradiação ou com um ou mais agentes quimioterapêuticos.

Para tratamento de irradiação, a irradiação pode ser de raios gama ou raios X. Para uma perspectiva geral da terapia de radiação, ver Hellman, Capítulo 12: "Principies of Radiation Therapy Câncer", em: "Principies and Practice of Oncology", DeVita et al.r eds., 2a. Ed., J.B. Lippencott Company, Philadelphia.

Classes úteis de agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam às seguintes classes de agentes não mutuamente exclusivas: agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, antifolatos, anti-metabolitos, agentes anti-tubulina, auristatinas, sensibilizadores à quimioterapia, ligantes do sulco menor de ADN, inibidores da replicação do ADN, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, lexitropsinas, nitrosureias, platinóis, anti-metabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores à radiação, esteróides, taxanos, inibidores da topoisomerase e alcaloides vinca. Exemplos de quimioterapêuticos individuais englobados pelo presente invento incluem mas não se limitam a um androgénio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, bussulfano, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, dacarbazina, docetaxel, doxorrubicina, um estrogénio, 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazole, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, teniposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, VP-16 e VM-26. 72 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Numa concretização específica, um anticorpo do presente invento é administrado concorrentemente com terapia de radiação ou um ou mais agentes quimioterapêuticos. Noutra concretização específica, a quimioterapia ou terapia de radiação é administrada antes ou subsequente à administração de um anticorpo do presente invento, pelo menos uma hora até vários meses, por exemplo pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês ou três meses antes ou subsequente à administração de um ácido nucleico ou proteína do presente invento.

Numa concretização específica em que um anticorpo do presente invento é conjugado com uma enzima conversora de pró-fármaco, o anticorpo é administrado com um pró-fármaco. A administração do pró-fármaco pode ser concorrente com a administração do anticorpo do presente invento, ou, de preferência, segue-se à administração do anticorpo do presente invento pelo menos uma hora até uma semana, por exemplo cerca de cinco horas, 12 horas ou um dia. Dependendo da enzima conversora de pró-fármacos administrada, o pró-fármaco pode ser uma mostarda de ácido benzóico, uma mostarda de anilina, uma mostarda de fenol, mostarda de p-hidroxianilina-glucuronido, epirrubicina-glucuronido, adriamicina-N-fenoxiacerilo, N-(4'-hidroxifenilacetil)-palitoxina doxorrubicina, melfalano, mostarda de azoto-cefalosporina, β-fenilenodiamina, derivado de vinblastina-cefalosporina, mostarda de cefalosporina, ácido cianofenilmetil-p-D-gluco-piranosidurónico, 5-(adaridin-l-il-)2,4-dinitrobenzamida ou metotrexato-alanina. 0 presente invento é ainda descrito nos seguintes exemplos que de modo algum se pretende que limitem o âmbito do presente invento. 6. EXEMPLO: OS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CD30 AC10 e HeFi-1 INIBEM O CRESCIMENTO DE LINHAS CELULARES DA DOENÇA DE HODGKIN QUE EXPRESSAM CD30

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS Células e condições de cultura: As linhas celulares que expressam CD30, L540, HDLM2, L428, KM-H2 e Karpas 299 foram obtidas na Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas 73 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Celulares/DSMZ em Braunschweig, Alemanha. A linha celular de Hodgkin L540cy foi proporcionada pelo Dr. V. Diehl da Universidade de Colónia, Colónia, Alemanha. As linhas celulares foram mantidas nas formulações de meio recomendadas e subcultivadas cada 3-4 dias.

Reagentes e anticorpos: A linha de hibridoma do anticorpo monoclonal anti-CD30 AC10 foi descrita por Bowen et al. (Bowen et al., J. Immunol. 151: 5896-5906, 1993) e foi proporcionada pelo Dr. E. Podack, Universidade de Miami. O anticorpo purificado foi isolado a partir de sobrenadantes livres de soro utilizando uma coluna de imunoafinidade de proteína G. O anticorpo AC10 resultante foi determinado ser >97% monomérico através de cromatografia de exclusão de tamanho. O anticorpo monoclonal HeFi-1 foi anteriormente descrito e foi proporcionado pelo Dr. T. Hecht, NCI, Bethesda, MD. O mAb HeFi-1 foi demonstrado através de cromatografia de exclusão de tamanho ser mais de 98% um monómero.

Ensaios de proliferação: As linhas celulares que expressam CD30 foram cultivadas em placas de 96 poços de fundo raso a uma densidade de 50000 ou 5000 células/poço em meio de crescimento (RPMI com soro fetal bovino (FBS) a 10% para as linhas celulares L428, KM-H2 e Karpas 299, e RPMI/FBS a 20% para as linhas celulares HDLM-2 e L540. As linhas celulares foram cultivadas na ausência ou presença de mAb anti-CD30 solúveis ligados de modo cruzado ou mAb anti-CD30 imobilizados, tal como descrito abaixo.

Ligação cruzada dos anticorpos em solução: Para ligar de modo cruzado os anticorpos anti-CD30 em solução, foram tituladas várias diluições de AC10 ou HeFi- 1 em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo raso na ausência ou presença de 20 pg/ml de anticorpos policlonais igG de cabra anti-ratinho. As linhas celulares da Doença de Hodgkin foram então adicionadas às placas a 50000 ou 5000 células/poço. As placas foram incubadas a 37°C durante 72 horas e foram marcadas com 3H-timidina, 1 pCi/poço, durante as 5 horas finais.

Imobilização do anticorpo: A imobilização do anticorpo foi obtida através do revestimento dos poços com anticorpo em 74 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ tampão Tris 50 mmol/1 (pH 8,5) durante 18 horas a 4°C. Antes da adição das células, os poços foram lavados duas vezes com PBS para remover o mAb não ligado. Foram adicionadas a cada poço 50000 ou 5000 células num volume total de 200 μΐ. A proliferação foi determinada através da tomada de 3H-timidina (0,5 pCi/poço) durante as 8 horas finais de um periodo de cultura de 72 horas.

6.2 RESULTADOS

Para avaliar a actividade biológica dos mAb anti-CD30, as linhas celulares de DH que expressam CD30 (50000 células/poço) foram cultivadas na presença do mAb anti-CD30 AC10 imobilizado. O mAb AC10 demonstrou inibição do crescimento celular das linhas de DH semelhantes a células T (L540 e HDLM-2) ou semelhantes a células B (L428 e KM-H2) (FIG. 1) . Ki-1, que se mostrou anteriormente não ter efeito em linhas celulares de DH (Gruss et al., Blood 83: 2045-2056, 1996), foi utilizado como controlo.

Para melhor avaliar a actividade de AC10, foi efectuada uma segunda série de ensaios. Para avaliar a actividade do AC10 durante um periodo de crescimento logarítmico de células tumorais, a densidade celular das culturas foi diminuída para proporcionar condições de crescimento mais próximas do óptimo. Para esse fim, linhas celulares de DH foram cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade de 5000 células/poço na presença ou ausência do mAb AC10. O AC10 demonstrou inibição do crescimento de todas as quatro linhas celulares de DH testadas (L540, HDLM-2, L428 e KM-H2; FIG. 2).

Noutro conjunto de experiências, linhas celulares de DH foram incubadas com AC10 ou HeFi-1 solúvel que foram ligados de forma cruzada em solução através da adição de anticorpos IgG de cabra anti-ratinho solúveis. Sob estas condições de ligação cruzada, todas as quatro linhas celulares de DH, quando plaqueadas a 5xl04 células/poço, foram inibidas no crescimento por AC10 e HeFi-1 (FIG. 3) . Quando as células foram plaqueadas a 5χ103 células/poço, o AC10 inibiu o crescimento de HDLM-2, L540, e L428 e, numa menor extensão, a linha celular KM-H2, enquanto HeFi-1 inibiu o crescimento das linhas celulares HDLM-2, L540, e L428 (FIG. 4). 75 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Os dados resultantes das experiências testando os efeitos de AC10 e HeFi-1 nas linhas celulares tumorais que expressam CD30 estão resumidos na Tabela 2, infra. A Tabela 2 proporciona ainda uma comparação da actividade antitumoral de AC10 e HeFi-1 com a do mAb M44.

Inibição do Crescimento Através de Linha Tipo Celular Celular M44â HeFi-1 AC10 Karpas 299 LAGC Michel LAGC KM-H2 HD (fenótipo de células B) L428 HD (fenótipo de células B) HDLM-2 HD (fenótipo de células T) L540 HD (fenótipo de células T) + + + + ND ND - + + - + + - + + - + + a Dados publicados em Gruss et al., Blood 83(8): 2045-2056

Tabela 2. Actividade citostática e/ou citotóxica de sinalização de mAb anti-CD30 em linhas celulares malignas que expressam CD30

Tomados em conjunto, estes dados indicam que os mAb AC10 e HeFi-1 são distinguidos dos mAb anti-CD30 anteriormente descritos através da sua capacidade para inibir o crescimento de linhas de DH que expressam CD30. É interessante observar que Hubinger et al. avaliaram recentemente a actividade do mAb anti-CD30 M44, na forma imobilizada, num ensaio de proliferação utilizando 5000 células/poço. Sob estas condições, M44 inibiu o crescimento da linha de LAGC que expressa CD30, Karpas 299 mas não da linha celular de DH HDLM-2 (Hubinger et al., Exp. Hematol. 27(12): 1796-805, 1999) .

7. AC10 AUMENTA O EFEITO CITOTÓXICO DOS QUIMIOTERAPÊUTICOS EM LINHAS CELULARES DA DOENÇA DE HODGKIN

7.1 MATERIAIS E MÉTODOS Células L428 foram cultivadas durante 24 horas na presença ou ausência de 0,1 pg/ml de anticorpo anti-CD30, AC10, ligado de forma cruzada através da adição de 20 pg/ml de anticorpos igG de cabra anti-ratinho. Após o periodo de cultura de 24 horas, as células foram colhidas e lavadas com 76 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram então plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo raso a 5xl03 células/poço e misturadas com várias diluições de fármacos quimioterapêuticos. Após uma exposição de 1 hora aos fármacos as células foram lavadas duas vezes, seguida da adição de meio de cultura fresco. As placas foram então incubadas a 37°C durante 72 horas seguido de um período de incubação de 4 horas com 3H-timidina a 0,5 pCi/poço. A inibição do crescimento foi determinada através da comparação da quantidade de 3H-timidina incorporada em células tratadas com a quantidade incorporada em células de controlo não tratadas.

7.2 RESULTADOS

Para avaliar o efeito do mAb anti-CD30 em combinação com fármacos quimioterapêuticos, células L428 foram incubadas durante 24 horas na ausência de anticorpo ou na presença de AC10 a 0,1 pg/ml com 20 pg/ml de IgG de cabra anti-ratinho para proporcionar ligação cruzada com o anticorpo primário. Após esta incubação as células foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de 96 poços a 5xl03 células/poço na presença de diluições de fármacos quimioterapêuticos incluindo doxorrubicina, cisplatina e etoposido (Tabela 3). A CE50, concentração de fármaco necessária para inibir a incorporação de 3H-timidina em 50% em comparação com as células de controlo não tratadas, foi então determinada para células tratadas com os fármacos sozinhos ou as combinações de fármaco com anticorpo. Para doxorrubicina, a incubação com AC10 diminuiu a CE5o em células L428 (í.e. diminuiu a quantidade de fármaco necessária para inibir 50% da síntese de ADN) de aproximadamente 45 nM (apenas doxorrubicina) para aproximadamente 9 nM, para cisplatina o AC10 diminuiu a CE50 de -1500 nM para -500 nM, e para etoposido o AC10 diminuiu a CE50 de -1500 nM para -600 nM. CE50, nM Fármaco sem AC10 com AC10 Doxorrubicina 45 9 Cisplatina 1500 500 Etoposido 1500 600 Tabela 3: AC10 aumenta a eficácia de fármaco quimioterapêuticos na linha celular de DH L428, 77 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

8. ACTIVIDADE ΑΝΤITUMORAL DE AC10 e HeFi-1 EM XENOENXERTOS DISSEMINADOS E LOCALIZADOS (SUBCUTÂNEOS) DA DOENÇA DE HODGKIN L540CY

8.1 MATERIAIS E MÉTODOS

Modelos de xenoenxerto de tumor humano: Ratinhos fêmeas C.B-17 SCID, obtidos em Taconic (Germantown, NY) às 4-6 semanas de idade, foram utilizados para todos os estudos de eficácia. Para estabelecer modelos de xenoenxerto da Doença de Hodgkin, células L540cy (DH) foram colhidas de cultura celular, lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada, ressuspensas em PBS, e mantidas em gelo até à implantação. Para modelos de doença disseminada, os ratinhos foram injectados intravenosamente através da veia caudal com 107 células L540cy. Xenoenxertos de tumores sólidos foram estabelecidos através da injecção de ratinhos subcutaneamente (s.c.) com 2xl07 células L540cy. Para avaliação terapêutica foram utilizadas as doses e os programas de tratamento indicados.

Administração de AC10 e HeFi-1: Os ratinhos possuindo tumores L540cy disseminados receberam 107 células através da veia caudal em dO seguido de terapia iniciada em dl. Os ratinhos tratados receberam injecções i.p. de AC10 ou HeFi-1 de dois em dois dias num total de 10 injecções, q2dxl0, a 1 mg/kg/injecção.

Para o modelo de L540cy subcutâneo, os ratinhos foram injectados s.c. com 2χ107 células e foram observados diariamente quanto à formação de tumores sólidos. Quando os tumores eram palpáveis, os animais eram distribuídos aleatoriamente em grupos e recebiam AC10 ou HeFi-1 q2dxl0 a 2 mg/kg/injecção.

8.2 RESULTADOS AC10 e HeFi-1 foram testados em ratinhos SCID xenoenxertados com Doença de Hodgkin L540cy, tal como descrito acima. Na população de ratinhos com tumores L540cy disseminados, todos os animais de controlo não tratados desenvolveram sinais de doença disseminada grave tal como 78 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ paralisia dos membros posteriores ou a formação de uma massa tumoral sólida e tiveram de ser sacrificados (tempo de sobrevivência médio = 37 dias). Em contraste, todos os ratinhos que receberam AC10 ou HeFi-1 sobreviveram durante >46 dias sem sinais de doença (FIG. 5A).

Em relação à população de ratinhos com tumores L540cy subcutâneos, ao mesmo tempo que os tumores de controlo não tratados cresceram rapidamente até >450 mm3, ambos os mAb atrasaram significativamente o crescimento tumoral tal como mostrado na FIG. 5B.

Os inventores identificaram anticorpos monoclonais de murideo (mAb) que alvejam o receptor CD30 humano e apresentam um perfil de actividade não descrito anteriormente para outros mAb anti-CD30. Na forma não modificada, estes anticorpos, AC10 e HeFi-1 inibem o crescimento da DH e da linha de LAGC Karpas 299 e apresentam actividade antitumoral ín vivo num modelo de xenoenxerto tumoral da Doença de Hodgkin.

9. ACTIVIPAPES IN VITRO DO AC10 QUIMÉRICO 9.1 MATERIAIS E MÉTODOS Células e reagentes: O hibridoma AC10 foi criado em meio RPMI-1640 (Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD) suplementado com soro fetal bovino a 10%. O anticorpo foi purificado a partir dos sobrenadantes da cultura através de cromatografia de proteína A. As linhas de DH positivas para CD30 L540, KM-H2, HDLM-2 e L428, bem como a linha de LAGC, Karpas-299, foram obtidas em Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Alemanha); L540cy foi proporcionada pelo Dr. V. Diehl; HL-60 e Daudi foram obtidas em ATCC (Manassas, VA) . As células CHO DG44 foram obtidas em Lawrence Chasm (Columbia University, New York, NY). O cabra-anti-ratinho-FITC ou cabra-anti-humano-FITC foram de Jackson Immunoresearch, (West Grove, PA.). O mAb anti-CD30 Ki-1 foi de Accurate Chemicals (Westbury, NY).

Análise FACS: Para avaliar a expressão de CD30 em linhas celulares, 3χ105 células foram combinadas com níveis saturantes (4 pg/ml) de AC10 ou de AC10 quimérico (cAClO) em FBS/PBS a 2% gelado (meio de coloração) durante 20 min em gelo 79 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ e lavadas duas vezes com meio de coloração gelado para remover o mAb não ligado. As células foram então coradas com mAb secundários diluídos 1:50 em meio de coloração gelado, cabra-anti-ratinho-FITC para AC10 ou cabra-anti-humano-FITC para cAClO, incubados durante 20 minutos em gelo, lavados tal como descrito acima e ressuspensos em 5 pg/ml de iodeto de propídio (IP) . As células marcadas foram examinadas através de citometria de fluxo num citómetro de fluxo Becton Dickinson FACScan e foram presas para excluir as células não viáveis. Os dados foram analisados utilizando suporte lógico Becton Dickinson CellQuest versão 3.3 e a intensidade média de fluorescência corrigida para o fundo foi determinada para cada tipo celular.

Para ligação de saturação do anticorpo, 3xl05 células Karpas 299 foram combinadas com concentrações crescentes de AC10 ou cAClO diluídos em meio de coloração gelado durante 20 minutos em gelo, lavadas duas vezes com meio de coloração gelado para remover o mAb livre e incubadas com cabra-anti-ratinho-FITC ou cabra-anti-humano-FITC 1:50, respectivamente. As células marcadas foram lavadas, ressuspensas em IP e analisadas tal como descrito acima. As intensidades médias de fluorescência resultantes foram representadas versus a concentração do mAb.

Para análise da posição no ciclo celular as células foram cultivadas em meio completo e nos tempos indicados foram marcadas com bromodesoxiuridina (BrdU) (10 μΜ final; Sigma, St.Louis, MO) durante 20 min para detectar a síntese do ADN nascente, e com IP para detectar o teor de ADN total tal como anteriormente descrito (Donaldson et al., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997). As células marcadas foram analisadas quanto à posição no ciclo celular e apoptose através de citometria de fluxo utilizando o programa Becton-Dickinson CellQuest tal como anteriormente descrito (Donaldson et al., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997) .

Inibição do crescimento in vitro: A avaliação da inibição do crescimento através de mAb de murídeo foi realizada através da imobilização do mAb a 10 pg/ml em Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, em placas de cultura de tecidos de 96 poços de plástico de um dia para o outro 4°C. As placas foram lavadas duas vezes com 80 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ PBS para remover ο mAb não ligado seguido da adição das células em 100 μΐ de meio completo a 5000 células/poço. Após uma incubação de 48 h a 37°C, CO2 a 5%, as células foram marcadas com 3H-TdR através da adição de 50 μΐ de meio completo contendo 0,5 pCi de 3H-TdR durante 2 h e o nivel de sintese de ADN foi determinado relativamente a células nos poços de controlo não tratados. A avaliação da inibição do crescimento por cAClO foi realizada utilizando mAb solúvel e um ligante cruzado secundário. As células foram plaqueadas a 5000 células/poço em 180 μΐ de meio completo num formato de 96 poços. O cAClO em meio completo contendo um correspondente excesso de 10 vezes de igG cabra-anti-humano foi adicionado nas concentrações observadas, em 20 μΐ. 96 h pós-incubação as células foram marcadas com 3H-TdR durante 4 h seguido de colheita das células e contagem de cintilações para quantificar o nivel de sintese de ADN nascente. A percentagem de inibição relativamente aos poços de controlo não tratados foi representada versus a concentração de cAClO.

Construção e expressão do AC10 quimérico (cAClO): Para construção de cAClO, as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve foram clonadas a partir do hibridoma de AC10 utilizando os métodos de Gilliland et ai., Tissue Antigens 47: 1-20, 1996. O ARN total foi isolado a partir do hibridoma de AC10 e o ADNc das regiões variáveis foi gerado utilizando iniciadores específicos dos genes de capa e IgG2b de ratinho. O ADN codificando a região variável da cadeia pesada (VH) de AC10 foi unido à sequência codificando a região constante da gama I humana (huCYl, SwissProt número de entrada P01857) num vector de clonagem e a região variável da cadeia leve (VL) de AC10 foi unida de modo semelhante à região constante da capa humana (huCx, PID G185945) num vector de clonagem separado. Tanto as sequências quiméricas da cadeia pesada como da leve foram clonadas em pDEFl4 para expressão do anticorpo monoclonal quimérico intacto em células CHO. O plasmídeo pDEF14 utiliza o promotor do gene do factor de alongamento 1 alfa de hamster chinês que dirige a transcrição de genes heterólogos (Patente U.S. N.° 5888809) conduzindo a níveis elevados de expressão de proteínas recombinantes sem necessidade de amplificação do gene. O plasmídeo resultante foi designado pDEF14-C3 (FIG. 6) . 81 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Para criação da linha celular expressando cAClO, pDEFl4-C3 foi linearizado e transfectado em células CHO DG44 através de electroporação. Após electroporação, as células foram deixadas a recuperar durante dois dias em meio completo DMEM/F12 contendo FBS a 10%, após o que o meio foi substituído por meio selectivo sem hipoxantina e timidina. Apenas as células que incorporaram o ADN plasmidico, que inclui o gene DLIFR, foram capazes de crescer na ausência de hipoxantina e timidina. Os clones de titulo elevado foram seleccionados e cultivados em biorreactores. O anticorpo cAClO foi purificado através de cromatografias de Proteina A, permuta iónica e interacção hidrófoba, sendo o produto final determinado através de HPLC-SEC como >99% de anticorpo monomérico.

9.2 RESULTADOS

Ligação de AC10 de murídeo e AC10 quimérico a linhas celulares da Doença de Hodgkin: O AC10 foi originalmente produzido através da imunização de ratinhos com a linha celular de linfoma granular grande positiva para CD30 YT e mostrou-se ser especifico para CD30 (Bowen et al., J. Immunol. 151: 5896-5906, 1993). Antes da avaliação dos efeitos de AC10 e cAClO no crescimento de células de DH, foram comparados os niveis de expressão de CD30 em várias linhas celulares em cultura. Todas as linhas de DH testadas foram positivas para CD30 com base nas razões de fluorescência de citometria de fluxo (Tabela 4). As linhas celulares de DH semelhantes a células T HDLM-2 e L540 bem como a linha de LAGC Karpas-299 expressaram quantidades qualitativamente semelhantes, níveis elevados de CD30 ao mesmo tempo que a expressão em duas linhas de DH semelhantes a células B, KM-H2 e L428, foi de algum modo inferior. L540cy, um subclone de L540, apresentou um nível intermédio de expressão de CD30. Embora a ligação de cAClO e AC10 a estas linhas celulares tenha sido detectada utilizando diferentes anticorpos secundários de cabra anti-humano ou de cabra anti-ratinho conjugados com FITC, respectivamente, estes dados demonstram que o processo de quimerização não diminuiu a ligação específica de cAClO ao CD30 da superfície celular. A linha de leucemia promielocítica HL-60 e a linha de linfoma de Burkitt Daudi foram ambas negativas para CD30 e serviram como controlos em estudos subsequentes. 82 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

Para ainda comparar a actividade de ligação dos anticorpos de murideo e quimérico, células Karpas-299 foram incubadas com titulações de AC10 ou cAClO seguido de marcação com cabra-anti-ratinho-FlTC ou cabra-anti-humano-FlTC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), respectivamente, para determinar os niveis necessários para saturação. As células marcadas foram examinadas através de citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência representada contra a concentração de mAb. A saturação da ligação para ambas as formas do mAb ocorreu a ~0,5 pg/ml (FIG. 7). A saturação foi consistente para todas as linhas celulares positivas para CD30 examinadas (dados não mostrados), demonstrando ainda que cAClO mantinha a actividade de ligação do anticorpo de murideo parental.

As células mononucleares de sangue periférico isoladas de fresco não reagiram com cAClO e não mostraram sinal acima do fundo neste ensaio. Semelhantemente, as células B e células T primárias humanas isoladas não se ligaram a cAClO. Células τ periféricas humanas primárias activadas com anti-CD3 e anti-CD28, e células B activadas por mitogénio de tintureira mostraram ambas ligação transiente de baixo nível de cAClO 72 h pós-activação, que diminuiu a partir daí (dados não mostrados).

Actividades in vitro de AC10 e cAClO: Mostrou-se que anticorpos anti-CD30 tais como M44 e M67 têm efeitos anti-proliferativos em linhas de LAGC, ao mesmo tempo que não possuem efeito ou estimulam o crescimento de linhas de DH (Gruss et ai., Blood 83: 2045-2056, 1994; Tian et ai., Câncer Res. 55: 5335-5341, 1995). Para avaliar inicialmente o efeito do mAb AC10 na proliferação de células de DH, AC10 foi comparado com o mAb Ki-1 sob condições de fase sólida anteriormente relatadas (Gruss et ai., Blood 83: 2045-2056, 1994). Para estes estudos os mAb foram imobilizados em placas de cultura de tecidos de plástico antes da adição das células de DH tal como descrito em Materiais e Métodos. Após incubação durante 48 h a 37°C, as células foram marcadas com 3H-TdR e o nível de síntese de ADN foi determinado relativamente a células em poços de controlo não tratados. A Figura 3A mostra que a presença do mAb Ki-1 imobilizado teve um efeito nominal no crescimento das linhas de DH. Em contraste, a presença de 83 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ AC10 imobilizado resultou numa significativa inibição do crescimento.

Após quimerização, foi efectuada uma titulação do cAClO nas linhas celulares de DH L540, L540cy e L428 bem como na linha de LAGC Karpas-299. O cAClO foi adicionado em solução nas concentrações observadas na presença de um excesso de 10 vezes de IgG cabra-anti-humano. O anticorpo de ligação cruzada foi adicionado para potenciar os efeitos de cAClO e para aproximar os efeitos da ligação cruzada mediada por FcR que podem ocorrer in vivo. A linha de LAGC positiva para CD30 foi altamente sensível a cAClO, com uma CI50 (concentração de mAb que inibia 50% do crescimento celular) de 2 ng/ml. As linhas de DH L428, L540 e L540cy mostraram sensibilidades de CI5o a cAClO de 100 ng/ml, 80 ng/ml e 15 ng/ml, respectivamente. Em estudos paralelos estas células tratadas com um mAb de controlo que não se liga e um ligante cruzado não mostraram diminuição na síntese de ADN ao longo de um intervalo de concentrações testadas (dados não mostrados) e a linha negativa para CD30 HL-60 mostrou apenas uma ligeira inibição através de cAClO ao nível mais elevado testado (FIG. 8).

Efeitos no ciclo celular de cAClO: Hubinger et al. mostraram recentemente que os mAb anti-CD30 podem inibir o crescimento de células de LAGC, incluindo Karpas-299, através da indução de paragem do ciclo celular e sem indução de apoptose (Hubinger et al.r Oncogene 20: 590-598, 2001). No entanto, estes anticorpos não tiveram um efeito inibidor em células de DH, e nalguns casos estimularam a proliferação. Para examinar mais de perto os efeitos in vitro de cAClO no ciclo celular, a linha celular de DH, L540cy, foi cultivada em meio completo contendo 1,0 pg/ml de cAClO complexado com IgG cabra-anti-humano a 10 pg/ml. Nos tempos indicados, as células foram marcadas com bromodesoxiuridina durante 20 min para detectar a síntese de ADN nascente, e com iodeto de propídio para detectar o teor de ADN total. As células marcadas foram analisadas quanto à posição no ciclo celular através de citometria de fluxo utilizando o programa Becton-Dickinson Cellfit tal como anteriormente descrito (Donaldson et al., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997). 84 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ A FIG. 9 mostra uma mudança representativa no teor de ADN e síntese de ADN nas células de DH L540cy após exposição ao cAClO. A percentagem da população em cada região foi quantificada tal como descrito na secção 9.1 e mostrado na Tabela 5. A exposição de L540cy a cAClO resulta numa perda dependente do tempo das células em fase S de 40% na população não tratada para 13% 2 dias após a exposição. Coordenadamente, o teor em Gi desta população aumentou de 40% nas células não tratadas para 65% 3 dias após a exposição. A região de teor menor que Gi dá uma indicação exacta das células apoptóticas sofrendo fragmentação do ADN (Donaldson et ai., J. Immunol. Meth. 203: 25-33, 1997) e esta população aumentou de 6% na população não tratada para 29% 48 h após a exposição a cAClO. Estes estudos de citometria de fluxo foram corroborados por um ensaio paralelo de exclusão de corante utilizando um hemocitómetro. Medido através de exclusão de corante, as células L540cy não tratadas eram 93% viáveis e estas diminuíram para 72% 48 h após a exposição a cAClO. As células Karpas tratadas com cAClO mostraram uma diminuição semelhante na fase S de 40% para 11% 48 h após cAClO (Tabela 5) . Em estudos de controlo, a linha de células B negativas para CD30 Daudi mostraram apenas modulação nominal do ciclo celular e nenhum aumento na apoptose após tratamento com cAClO (Tabela 5) . Ao contrário de estudos anteriores em que o mAb para CD30 imobilizado induzia apoptose em células de LAGC (Mir et al.r Blood 96: 4307-4312, 2000), foi observada pouca ou nenhuma apoptose nestas células com cAClO solúvel e um anticorpo secundário de ligação cruzada. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que cAClO induziu paragem do crescimento e acumulação da população em Gi e diminuição da fase S em ambas as linhas positivas para CD30, e indução de apoptose em células de DH L540cy in vitro. 85 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ MFIb Razões de Ligaçãoc Linha Celular Linhagem® AC10 CAClO AC10 cAClO HDLM2 Doença de Hodgkin (semelhante a células T) 507,2 591, 8 156 176 L540 Doença de Hodgkin (semelhante a células T) 435, 8 582,5 183 251 L540cy Doença de Hodgkin (semelhante a células T) 363,3 495, 9 120 156 Karpas Linfoma anaplásico de grandes células 399, 9 579,2 158 176 KM-H2 Doença de Hodgkin (semelhante a células B) 102, 0 105, 8 33 41 L428 Doença de Hodgkin(semelhante a células B) 174, 4 186,0 67 67 HL60 Leucemia Mielogenosa Aguda 1,0 3, 8 1 2 Daudi Células B de Linfoma de Burkitt -0,6 0,9 1 1 aGruss et al.r 1994 bIntensidade Média de Fluorescência cAs razões de ligação foram determinadas dividindo a média geométrica da intensidade de fluorescência de células coradas com conjugado primário (AC10 ou cAClO a 4 pg/ml) e secundário apropriado (Ig de cabra anti-ratinho ou de cabra anti-humano, respectivamente)-FITC, pela média geométrica da intensidade de fluorescência de células coradas apenas com o respectivo anticorpo secundário.

Tabela 4: Ligação de AC10 e cAClO a diferentes linhas celulares. L540cy Não tratado 24 h 48 h 72 h

Tabela 5: Efeitos de cAClO no ciclo celular. 86

ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 10. EFICÁCIA IN VIVO DO AC10 QUIMÉRICO CONTRA XENOENXERTOS DA DOENÇA DE HODGKIN

10.1. MATERIAIS E MÉTODOS

Modelos de xenoenxerto da Doença de Hodgkin humana: Para o modelo de DH disseminada, lxlO7 células L540cy foram injectadas através da veia caudal em ratinhos SCID C.B-17. O tratamento com cAClO foi iniciado nos tempos indicados e administrado através de injecção intraperitoneal de quatro em quatro dias num total de 5 injecções. Os animais foram avaliados diariamente quanto a sinais de doença disseminada, em particular paralisia dos membros posteriores. Os ratinhos que desenvolveram estes ou outros sinais de doença foram então sacrificados. Para o modelo localizado de DH, as células L540cy foram implantadas com 2xl07 células no flanco direito de ratinhos SCID. A terapia com cAClO foi iniciada quando o tamanho do tumor em cada grupo de 5 animais tinha em média ~50 mm3. O tratamento consistiu em injecções intraperitoneais de cAClO de 4 em 4 dias até 5 injecções. O tamanho do tumor foi determinado utilizando a fórmula (CxL2)/2.

10.2 RESULTADOS A actividade in vivo de cAClO foi avaliada em ratinhos SCID utilizando células L540cy. O estabelecimento de modelos de DH humana em ratinhos provou ser difícil. Ao contrário de outras linhas celulares derivadas de DH que dão uma enxertia muito fraca em ratinhos imunodeficientes, modelos de células tumorais de DH L540cy podem ser estabelecidos com sucesso em ratinhos SCID (Kapp et ai., Ann Oncol. 5 Supl 1: 121-126, 1994). Foram utilizados dois modelos de doença separados empregando células L540cy, um modelo disseminado e um modelo de tumor subcutâneo localizado, para avaliar a eficácia in vivo de cAClO.

Estudos anteriores mostraram que as células L540cy injectadas intravenosamente em ratinhos SCID se disseminaram de um modo comparável à disseminação da DH humana e mostraram uma localização preferencial nos nódulos linfáticos (Kapp et al., Ann Oncol. 5 Supl 1: 121-126, 1994). Para avaliar cAClO neste modelo de DH disseminada, foram injectadas lxlO7 células L540cy através da veia caudal em ratinhos SCID C.B-17. Os 87 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ ratinhos não tratados, ou os que foram tratados com um mAb de controlo que não se liga, desenvolveram sinais de doença disseminada, em particular paralisia dos membros posteriores, 30-40 dias após a injecção das células tumorais (FIG. 10A). Os ratinhos que desenvolveram estes e outros sinais de doença foram então sacrificados de acordo com as orientações de IACUC. A terapia com cAClO foi iniciada um dia após a injecção de células tumorais e administrada através de injecção intraperitoneal de quatro em quatro dias num total de 5 injecções. Todos os animais (5/5) que receberam o regime de 4 mg/kg/injecção, e 4/5 que receberam 1 mg/kg/injecção ou 2 mg/kg/injecção, sobreviveram durante mais de 120 dias (a duração do estudo) sem sinais de doença.

Num estudo subsequente a eficácia de cAClO foi ainda avaliada variando o dia em que a terapia era iniciada. Para este estudo células L540cy foram injectadas em ratinhos SCID através da veia caudal no dia 0 e a terapia foi iniciada no dia 1, dia 5 ou dia 9 (FIG. 10B). Em todos os grupos tratados, cAClO foi administrado a 4 mg/kg utilizando um programa de q4dx5. Consistente com o estudo anterior cAClO teve um impacto significativo na sobrevivência dos animais que receberam terapia iniciada no dia 1, com 4/5 dos animais livres da doença após 140 dias. Quando a iniciação da terapia era atrasada, cAClO demonstrava ainda uma eficácia significativa; 3/5 dos animais que receberam terapia iniciada no dia 5, e 2/5 dos que iniciaram no dia 9, permaneceram livres de doença durante a duração do estudo. cAClO também demonstrou eficácia em modelos de tumores de DH L540cy subcutâneos. Ratinhos SCID foram implantados com 2xl07 células no flanco. A terapia com cAClO foi iniciada quando o tamanho do tumor em cada grupo de 5 animais tinha em média 50 mm3. O tratamento consistiu em injecções intraperitoneais de cAClO de 4 em 4 dias até 5 injecções utilizando as mesmas doses que no modelo disseminado: i.e., 1, 2 e 4 mg/kg/injecção. Os tumores nos animais não tratados cresceram rapidamente e alcançaram em média >800 mm3 no dia 34. O cAClO produziu um atraso significativo no crescimento tumoral em todas as concentrações testadas de um modo dependente da dose (FIG. 10C). 88 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

11. ACTIVIDADE ΑΝΤITUMQRAL DE AC10 QUIMÉRICO PRODUZIDO NUMA LINHA CELULAR DE HIBRIDOMA CONTRA XENOENXERTOS SUBCUTÂNEOS L540CY DA DOENÇA DE HODGKIN

11.1 MATERIAIS E MÉTODOS O AC10 quimérico (cAClO) foi gerado através de recombinação homóloga essencialmente tal como anteriormente descrito utilizando vectores de conversão da cadeia pesada capa e leve de IgGl (Yarnold e Fell, Câncer Res. 54: 506-512, 1994). Estes vectores foram desenhados para que os loci da região constante da cadeia pesada e leve da imunoglobulina de murideo sejam excisados e substituídos por loci da região constante de gama 1 e capa humanas através de recombinação homóloga. A linha celular de hibridoma quimérica resultante expressa um anticorpo quimérico consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal original e nas regiões constantes de gama 1 e capa humanas.

11.2 RESULTADOS

Para avaliar a eficácia de cAClO in vivo, foram subcutaneamente implantadas em ratinhos SCID células L540cy tal como descrito acima. Quando os tumores alcançaram um tamanho médio superior a 150 mm3 os ratinhos foram divididos em grupos que não foram tratados ou foram tratados com 2 mg/kg de cAClO duas vezes por semana num total de cinco injecções. Os tumores nos ratinhos não tratados cresceram rapidamente até um tamanho médio de mais de 600 mm3 (FIG. 11). Em contraste, o tamanho médio do tumor nos animais tratados com cAClO permaneceu cerca do mesmo tamanho.

12. ACTIVIDADE IN VITRO DE CONJUGADOS AC10 QUIMÉRICQ-FÁRMACO O cAClO pode ser utilizado para entregar selectivamente um agente citotóxico a células positivas para CD30. Tal como mostrado na FIG. 12, as linhas positivas para CD30 Karpas (LAGC) e L540cy (DH) e a de células B negativa para CD30 Daudi foram examinadas quanto à sensibilidade relativa a um agente citotóxico entregue através de um conjugado anticorpo cAClO-fármaco (ADC). As células foram expostas a cAClO conjugado com o agente citotóxico AEB (cAC10-AEB) durante 2 h, lavadas para remover ADC livre e a viabilidade celular foi determinada às 96 h. A citotoxicidade foi determinada através do ensaio de 89 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ redução do corante tetrazólio (XTT). Tanto Karpas 299 como L540cy foram sensíveis ao conjugado cAC10-AEB com valores de CI50 (concentração que matava 50% das células) de <0,1 micrograma/ml. Em contraste, os valores de CI50 em células Daudi foi >10 micrograma/ml. Todas as três linhas celulares foram igualmente sensíveis a auristatina E não conjugada por si própria (dados não mostrados). 13. ACTIVIDADE ANTITOMORAL DE CONJUGADOS AC10 QUIMERICQ- 90 90 cag ate cag ctg cag cag tet gga cct gag gtg gtg aag cct ggg gct 48 Gin Ile Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tet ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata acc tgg gtg aag cag aag cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Thr Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gee aca ttg act gta gac àca tcc tcc age aca gee ttc 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cag etc age age ctg aca tet gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aac tat ggt aac tac tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act cag 336 Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110 gtc act gtc tet gea 351 Vai Thr Vai Ser Ala 115

Gin Ile Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

<210 > 1 <211> 351 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 >

<221> CDS <222> (1)...(351) < 4 0 0> 1 <210> 2 <211> 117 < 212 > PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 2

Vai Thr Vai Ser Ala 115 91 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

<210> 3 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 3 gactactata taacc 15

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 4

Asp Tyr Tyr Ile Thr 1 5

<210> 5 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 O O > 5 tggatttatc ctggaagcgg taatactaag tacaatgaga agttcaaggg c 51

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 O O > 6

Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 7 tatggtaact actggtttgc ttac 24

<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr 1 5 ' 92 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ <210 > 9 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 > < 2 21 > CDS < 2 2 2 > (1) . , . . (333) < 4 0 0 > 9 gac att gtg ctg acc caa tet cca gct tet ttg gct gtg tet cta ggg 48 Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ate tcc tgc aag gcc age caa agt gtt gat ttt gat 96 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Phe Asp 20 25 30 ggt gat agt tat atg aac tgg tac caa cag aaa. cca gga cag cca ccc 144 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 aaa gtc ctc ate tat gct gea tcc aat cta gaa tet ggg ate cca gcc 192 Lys Vai Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca gàc ttc acc ctc aac ate cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct gea acc tat tac tgt cag caa agt aat 288 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95 gag gat ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 333 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Phe Asp 20 25 30 Gly 1 Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 Lys Vai Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 11 <211> 45 <212> ADN <213> Mus musculus 93 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 Ο Ο > 11 aaggccagcc aaagtgttga ttttgatggt gatagttata tgaac 45

<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15

<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 13 gctgcatcca atctagaatc t 21

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 14

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 15 cagcaaagta atgaggatcc gtggacg 27

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 16

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5

<210> 17 <211> 375 <212> ADN <213> Mus musculus 94 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ <2 2 0 > <221> CDS <222> (1) · · . (375) < 4 0 0 > 17 gag gtg aag ctg gtg gag tct gga gga ggc ttg gta cag cct ggg ggt 48 Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctc tcc tgt gca act tct ggg ttc acc ttc agt gat tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 tat atg aac tgg gtc cgc cag cct cca gga aag gct ctt gag tgg ttg 144 Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 ggt ttt att aga aac aaa gct aat ggt tac aca aca gag ttc agt gca 192 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala 50 55 60 tct gtg atg ggt cgg ttc acc ate tcc aga gat gat tcc caa age ate 240 Ser Vai Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Ile 65 70 75 80 ctc tat ctt cag atg aac acc ctg aga gct gag gac agt gee act tat 288 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 tac tgt gca'aga gat ccc ccc tat ggt aac ccc cat tat tat gct atg 336 Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga acc tea gtc acc gtc tcc tea 375 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

< 210 > 18 <211> 125 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 18

Glu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Vai Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

< 210 > 19 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus 95 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 Ο Ο > 19 gattactata tgaac 15 <210> 20 <211> 5

< 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 20

Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5

<210> 21 <211> 57 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 21 tttattagaa acaaagctaa tggttacaca acagagttca gtgcatctgt gatgggt 57

<210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala Ser 1 5 10 15

Vai Met Gly

<210> 23 <211> 42 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 23 gatcccccct atggtaaccc ccattattat gctatggact ac 42

<210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24

Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro Hls Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1.5 10

<210> 25 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus 96 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ <22 0> <221> CDS <222> (D < 4 0 0 > 25 gac att gtg ctg acc cag tet cct gct tcc tta gct gtt tet ctg ggg 48 Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ate tea tgc agg gcc age aaa agt gtc agt gea tet 96 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser 20 25 30 ggc tat aat tat atg cac tgg tac caa cag aaa gea ggg cag cca ccc 144 Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc ate cat ctt gea tcc aac cta gaa tet ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile His Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser' Gly Vai Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc acc ctc aac ate cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct tea acc tat tac tgt cag cac agt ggg 288 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95 • gag ctt cca ttc acg ttc ggc teg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 333 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser 20 25 30 Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 27 <211> 45 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 27 agggccagca aaagtgtcag tgcatctggc tataattata tgcac 45 97 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

<210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 28

Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Tyr Met His 15 10 15

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 29 21 cttgcatcca acctagaatc t 21

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 31 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 31 cagcacagtg gggagcttcc attcacg 27

<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Gin His Ser Gly Glu Leu Pro Phe Thr 1 5 98 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Seattle Genetics, Inc.

<120> ANTICORPOS RECOMBINANTES ANTI-CD30 E SUAS UTILIZAÇÕES <130> 9632-022-228 <140> a atribuir <141> Concorrente com este <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0

<210> 1 <211> 351 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(351) < 4 0 0 > 1 cag ate cag ctg cag cag tet gga cct gag gtg gtg aag cct ggg gct 48 Gin Ile Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Vai Vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tet ggc tac acc ttc act gac tac 96 Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat ata acc tgg gtg aag cag aag cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Tyr Ile Thr Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tgg att tat cct gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gee aca ttg act gta gac aca tcc tcc age aca gee ttc 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cag ctc age age ctg aca tet gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95 gog aac tat ggt aac tac tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg act cag 336 Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110 gtc act gtc tet gea 351 Vai Thr Vai Ser Ala 115

<210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus 99 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 Ο Ο > 2

Gin Ile Gin leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Vai Vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ala 115

<210> 3 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 3 gactactata taacc 15

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Asp Tyr Tyr Ile Thr 1 5 < 210 > 5 <211> 51

< 212 > ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 5 tggatttatc ctggaagcgg taatactaag tacaatgaga agttcaaggg c 51

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 6

Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus 100 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 0 0 > 7 tatggtaact actggtttgc ttac 24 < 210 > 8 < 211 > 8 <212> PRT < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 8 Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 9 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> CDS <222> (D . . . . (333) A O O 9 gac att gtg ctg acc caa tet cca gct tet ttg gct gtg tet cta ggg 48 Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ate tcc tgc aag gcc age caa agt gtt gat ttt gat 96 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Phe Asp 20 25 30 ggt gat agt tat atg aac tgg tac caa cag aaa. cca gga cag cca ccc 144 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 asa gtc ctc ate tat gct gea tcc aat cta gaa tet ggg ate cca gcc 192 Lys Vai Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc acc ctc aac ate cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct gea acc tat tac tgt cag caa agt aat 288 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95 geg gat ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 333 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus 10 101 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 0 0 >

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Phe Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 B0

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 11 <211> 45 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 11 aaggccagcc aaagtgttga ttttgatggt gatagttata tgaac 45

< 210 > 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 13 gctgcatcca atctagaatc t 21 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 14 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus 102 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 0 0 > 15 cagcaaagta atgaggatcc gtggacg <210> 16 <211> 9 < 212 > PRT < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 16 Gin ι Ξΐη Ser Asn Glu Asp Pro Trp 1 5 <210> 17 <211> 375 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> CDS <222> (D · . . . (375) < 4 0 0 > 17 gag gtg aag ctg gtg gag tct gga gga ggc ttg gta cag cct ggg ggt 48 Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctc tcc tgt gca act tct ggg ttc acc ttc agt gat tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 tat atg aac tgg gtc cgc cag cct cca gga aag gct ctt gag tgg ttg 144 Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 ggt ttt att aga aac aaa gct aat ggt tac aca aca gag ttc agt gca 192 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala 50 55 60 tct gtg atg ggt cgg ttc acc ate tcc aga gat gat tcc caa age ate 240 Ser Vai Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Ile 65 70 75 80 ctc tat ctt cag atg aac acc ctg aga gct gag gac agt gee act tat 288 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 tac tgt gca aga gat ccc ccc tat ggt aac ccc cat tat tat gct atg 336 Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga acc tea gtc acc gtc tcc tea 375 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 18 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus 103 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 0 0 > 18

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Vai Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr ; Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 19 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 19 gattactata tgaac 15 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 21 <211> 57 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 21 tttattagaa acaaagctaa tggttacaca acagagttca gtgcatctgt gatgggt 57 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala Ser 15 10 15

Vai Met Gly 104 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ <210> 23 <211> 42 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 23 gatcccccct atggtaaccc ccattattat gctatggact ac 42 < 210 > 24 < 211 > 14 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 24 Asp Pro Pro Tyr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10 <210> 25 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus <220> < 2 21 > CDS < 2 2 2 > (D , . . . (333) < 4 0 0 > 25 gac att gtg ctg acc cag tet cct gct tcc tta gct gtt tet ctg ggg CD •*r Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ate tea tgc agg gcc age aaa agt gtc agt gea tet 96 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser 20 25 30 ggc tat aat tat atg cac tgg tac caa cag aaa gea ggg cag cca ccc 144 Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc ate cat ctt gea tcc aac cta gaa tet ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile His Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc acc ctc aac ate cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct tea acc tat tac tgt cag cac agt ggg 288 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95 gag ctt cca ttc acg ttc ggc teg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 333 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus 105 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ <400> 26

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser 20 25 30 Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Vai Glu Glu Glu Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 45 <212> ADN < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 27 agggccagca aaagtgtcag tgcatctggc tataattata tgcac 45 <210> 28 <211> 15 <212> PRT < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 28

Arg Ala Ser Lys Ser Vai Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Tyr Met His 15 10 15 <210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 29 cttgcatcca acctagaatc t 21 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 31 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus 106 ΕΡ 1 347 730/ΡΤ < 4 0 0 > 31 cagcacagtg gggagcttcc attcacg 27

<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Gin His Ser Gly Glu Leu Pro Phe Thr 1 5

Lisboa, 2010-02-25

Claims (29)

1. ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que (i) se liga imuno-especificamente a CD30 e (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, em que o referido anticorpo exerce o efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, para utilizar no tratamento da Doença de Hodgkin.
2. 2. Anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo é humano, humanizado ou quimérico.
3. 3. Anticorpo da reivindicação 2, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10.
4. 4. Anticorpo da reivindicação 2, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal HeFi-1.
5. 5. Anticorpo da reivindicação 3, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 8, e compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 e SEQ ID N0:16.
6. 6. Anticorpo da reivindicação 3, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, e uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.
7. 7. Anticorpo da reivindicação 6, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:10, respectivamente. ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 2/6
8. 8. Anticorpo da reivindicação 4, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ id NO:20, SEQ id NO:22 e SEQ ID NO:24, e compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32.
9. 9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico.
10. 10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o efeito citostático ou citotóxico é exibido após a realização de um método compreendendo: a) o contacto de uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin com o anticorpo, sendo a referida cultura de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o referido contacto durante um período de 72 horas; b) a exposição da cultura a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido período de 72 horas; e c) a medição da incorporação de 3H-timidina em células da cultura, em que o anticorpo tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem uma reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular da Doença de Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem terem contacto com o anticorpo.
11. 11. Composição farmacêutica para o tratamento da Doença de Hodgkin compreendendo: a) um anticorpo humano, humanizado ou quimérico que (i) se liga imuno-especificamente a CD30, (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, numa quantidade eficaz para o tratamento da Doença de Hodgkin; e b) um transportador farmaceuticamente aceitável. ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 3/6
12. 12. Composição farmacêutica da reivindicação 11, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10.
13. 13. Composição farmacêutica da reivindicação 11, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal HeFi-1.
14. 14. Composição farmacêutica da reivindicação 12, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8, e compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 e SEQ ID N0:16.
15. 15. Composição farmacêutica da reivindicação 12, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, e uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.
16. 16. Composição farmacêutica da reivindicação 15, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:10, respectivamente.
17. 17. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, e compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32.
18. 18. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 14 a 17, na qual o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 4/6
19. 19. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 11 a 17, em que o efeito citostático ou citotóxico é exibido após a realização de um método compreendendo: a) o contacto de uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin com o anticorpo, sendo a referida cultura de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o referido contacto durante um período de 72 horas; b) a exposição da cultura a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido período de 72 horas; e c) a medição da incorporação de 3H-timidina em células da cultura, em que o anticorpo tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem uma reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular da Doença de Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem terem contacto com o anticorpo.
20. 20. Utilização de um anticorpo que (i) se liga imuno-especificamente a CD30 e (ii) exerce ele próprio um efeito citostático ou citotóxico numa linha celular da Doença de Hodgkin, em que o referido anticorpo exerce o efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin na ausência de conjugação com um agente citostático ou citotóxico, respectivamente, no fabrico de um medicamento para o tratamento da Doença de Hodgkin.
21. 21. Utilização da reivindicação 20, em que o anticorpo é humano, humanizado ou quimérico.
22. 22. Utilização da reivindicação 21, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal AC10.
23. 23. Utilização da reivindicação 21, em que o anticorpo compete pela ligação a CD30 com o anticorpo monoclonal HeFi-1.
24. 24. Utilização da reivindicação 22, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8, e compreende uma região variável da cadeia leve ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 5/6 compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:16.
25. 25. Utilização da reivindicação 22, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, e uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.
26. 26. Utilização da reivindicação 25, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:10, respectivamente.
27. 27. Utilização da reivindicação 23, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, e compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade possuindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32.
28. 28. Utilização de qualquer uma das reivindicações 24 a 27, em que o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico.
29. 29. Utilização de qualquer uma das reivindicações 20 a 27, em que o efeito citostático ou citotóxico é exibido após a realização de um método compreendendo: a) o contacto de uma cultura da linha celular da Doença de Hodgkin com o anticorpo, sendo a referida cultura de cerca de 5000 células numa área de cultura de cerca de 0,33 cm2, sendo o referido contacto durante um periodo de 72 horas; b) a exposição da cultura a 0,5 pCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do referido periodo de 72 horas; e c) a medição da incorporação de 3H-timidina em células da cultura, em que o anticorpo tem um efeito citostático ou citotóxico na linha celular da Doença de Hodgkin se as células da cultura tiverem uma reduzida incorporação de 3H-timidina em comparação com células da mesma linha celular da Doença de ΕΡ 1 347 730/ΡΤ 6/6 terem Hodgkin cultivadas sob as mesmas condições mas sem contacto com o anticorpo. Lisboa, 2010-02-25