ES2339333T5 - Anticuerpos anti-CD30 recombinantes y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que (i) se enlaza immunoespecíficamente con CD30 y (ii) por sí mismo ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de una conjugación a un agente citostático o citotóxico, respectivamente, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.

Description

Anticuerpos anti.c030 recombinantes y usos de los mismos.

1. CAMPO DE LA INVENCiÓN

[0001) LB presente invención se refiere a anticuer~:)S y a corrflOSiciones para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, corTllrendiendo la administraci6n de un anticuerpo que enlaza con C030. Tales anticuerpos incluyen formas recombinanleslvariantes de los anticuerpos monoclonales AC10 y HeFi-1, y derivados de los mismos. Esta invención se refiere a una Clase nueva de anticuerpos monodonales dirigidos contra el receptor C030 los cuales, en forma no modificada, son capaces de inhibir el cleclmiento de las celulas de la enfermedad de Hodgkln que expresan C030.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

[00(2) Los regimenes de quimioterapia curativa para la enfermedad de HOdgkin representan uno de lOS avances más importantes en la oncologia clínica. Los reglmenes de quimioterapia mUltiagente han aumentado el indice de curación en más de un 80% para estos pacientes. Sin embargo, el 3% de los pacientes mueren por causas relacionadas con el tratamiento, y para los pacientes que no responden a la terapia estándar o recaen despuéS del tratamiento de primera linea, la única modalidad d·e tratamiento disponible es de dosis altas de quimioterapia en combinación con trasplantes de Células madre. Este tratamiento se asOCia a un 80% de incidencia de mortalidad, morbilidad significante y un nivel de supervivencia eje cinco anos inferior al 50"10 (véase p. ej .• Engert, et aJ., 1999, Seminars in Hematology 36:282-289).

[0003) La causa primaria de recaída tumoral es ElI desarrollo de dones de células tumorales resistentes a los agentes quimioterapéuticos. La inmunoterapia representa una estrategia alternativa que puede evitar potencialmente la resistencia. los anticuerpos monoclonales para lu focalización de células tumorales malignas han sido el foco de varios enfoques inmunoterapéuticos. Para diferentes malignidades, los programas terapéutiCos basados en anticuemos son ahora una parte reconocida de la ~erapja estándar. El anticuerpo anti-C020 creado genéticamente Rltuxan®, por ejemplo, se aprobó a finales de 1997 para el tratamiento del NHL recurrente de bajo grado.

[0004] C030 es una glicoproteina de membrana de 120 kilodaltons (Froese el al., 1987, J. Immunol. 139: 2081-87) y un elemento de la superfamiria de receptores de TrlIF. Esta familia incluye TNF-RI , TNF-RII, C030, C04Q, OX-40 y RANK, entre otros.

[0005) C030 es un marcador probado de células mllignas en la enfermedad de Hodgkln (HO) y ellinfoma de célula grande anaplástico (AlCl). un subconjunto de lin'fomas diferentes ele Hodgkin (NHl) (Oül1c:op el al., 1992. Cell 88:421-427). Originalmeme identificado en células cultivadas de Raed Stelnberg de Hodgkin (H-RS) usando el anticuerpo mOrloClonal Ki-1 (Schwab el al., 1982. Nature 299:65-67), C030 se expresa con gran frecuencia en la superficie de la célula de todos los linfomas de HO y de la mayoría de AlCl, aún tiene una expresión muy limitada en tejidos nonnales para pequenos números de células linfoides en las áreas pecifoliculares (Josimovie-Alasevic el al., 1989. Eur. J. Immunol. 19:157-162). Anticuerpos monodonales especificos para el antígeno C030 se han explorado como vehicuios para la adminlstracion de fármacos citostáticos, toxinas de planta y radiois6topos en ambos modelos preclinicos y estudios Clínicos (Ennert et al., 1990, Caneer Research 50:84-88; Barth el al., 2000. Bload 95:3909-3914). En pacientes con HO, la focéLlizaci6n del antlgeno C030 podria conseguirse con dosis bajas del mAb anti-C030. BerH2 (Falíni el al., 1 992, British Joumal of Haematology 82:38-45). Aún mAs. a pesar de la exitosa focalización in vivo de las células tumoral.es malignas. ninguno ele los paCientes experimento regresiOO tumoral. En una prueba clínica posterior, una toxiOlI (saporin) se conjuQÓ químicamente con el anticuerpo BerH2 y los cuatro pacientes demostraron reducciones rapil:tas y sustanciales de masa rumora! (Fatini el al., 1992, Lancet

339: 1195-1196).

10006] Estas observeciones recalcan la v;,1lidez del receptor C030 como un antigeno objetivo. No obstante. todos los pacientes tratados con el conjugado de toxina mAb desarrollaron anticuerpos para la toxina. Una de las limitaciones más importante de las inmunoloxinas es su inmunClgenicidad inherente que resulta en el desarrollo de anticuerpos para la molécula de la toxina y neutraliza sus efecb)s (Tsutsumi et al., 2000. Proc. Nafl Aced. Sci. U.S.A. 97:85458553). Adicionalmente, la toxicidad del hígado y el síndrome de fuga vascular asociado a las inmunotoxinas limita de forma potencial la capacidad para administrar dosis curativas de estos agentes (Tsutsumi et al. , 2000, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 97:8545-8553).

2,1 ANTICUERPOS MONOCLONAlES CD30

[0007] El C030 se identificó originalmente por el anticuerpo monoclonal Ki-1 y se refiri6 inicialmente como el antlgeno Ki-1 (Sc:hwab et aJ., 1982, Nature 299:65-67). Este mAb se desarrolló conlra las células de Hodgkin y de Raed Stemberg (H-RS), las células malignas de la enfermedad de Hodgkin (HD). Un segundo mAb, capaz de unir un epi topo resistente a la fo.'malina, diferente del reconocido por ~1 se describió posteriormente (Schwarting el al., 1989 Blood 74:1678-1689). La identificad6n de cuatro anticuerpos adicionales result6 en la creaciOn del grupo de

2

S

4S

SO

coJO en el Tercer Seminario sobre la ClasifICaCión de Leucocitos (Third Leucocyte Typing Workshop) en 1986 (McMichael, A .. , ed., 1987, Leukocyte Typing III (Oxford: Oxford University Press».

2.2 TERAPIAS BASADAS EN EL ANTICUERP() MONOCLONAL C030

{0008] La utilidad de los mAbs C030 en el diagn6sti,co y la estadificaci6n de la HO llevaron a su evaluaCiOO como herramientas potenciales para la inmunoterapia. En ~Iéldentes con HO, la focalizaCión especIfica del antigeno C030 se consiguió con dosis bajas (30-50 mg) del m.t\b anti-C030 BerH2 (Falini el al. , 1992. British Joumal of Haematotogy 82:38-45). A pesar de la exitosa focallzación in vivo de las células tumorales malignas H-RS. ninguno de los pacient9~ 9lCp9rirMntó r9greslol'l9s tumo~les.

(0009] En base a estos resultados. se concluyó qUl! la efICacia con la inmunoterapia prevista de mAb COJO no podrla conseguirse con anticuerpos ¡nmodificados (Fulini el al., 1992, Lancet 339:1195-1196). En una prueba clínica posterior, el tratamiento de cuatro paCientes con HO refractaria con una toxina, saporin, conjugada químicamente al mAb BerH2 demos1ró reducciones rapidas y sustanOiales. aunque transitorias, de masa tumoral (Fatini el al.• 1992, Lancet 339:1195-1196). En los últimos aflos, los invEtstigadores han traba)ado para refinar los enfoques para tratar las células neoplásicas que expresan el C030. Ejemplos incluyen el desarrollo de inmunotolCinas de cadena única recombinantes (Barth el al., 2000, 8100d 95:3909-39'14). mAbs bi-espeeificos anti C016/C030 (Renner el al., 2000, caneer Invnunol. Immunother. 49:17J..18O), y la identificación de nuevos mAbs anti-C030 que previenen la liberación de moléculas C030 de la superficie de la e{!lula (Hom-Lohren~ el al., 1995, Inl. J. cancer 60:539-544).

Este enfoque ha descartado el potencial de las mAbs anti-C030 oon actividad de señalización en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.

2.3 IDENTIFICACiÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI:CD30 CON ACTIVIDAD AGONISTA

(0010] En la clonación y caraderizaeión de la actividad biológica delliganclo C030 humano (C030l). se descr1bieron dos mAbs, M44 '1 M67, los cuales imitaban la activid~ld de la reticulación receptora inducida de C030L (Gruss et al., 1994, 610ad 83: 2045-2056). En ensayos in vitro, estos mAbs. en su forma inmovilizada, fueron capaces de estimular la proliferación de células T activadas y las líneas celulares de la enfermedad de Hodgkin de origen de células T. L540 y HOLM-2. Por otra parte. estos mAbs tuvieron poco efecto en las líneas celulares de Hoogkin con origen de célula B. L428 Y KM-H2 (Gruss el al.. 1994. BloOO 83:2045-2056). En todos estos ensayos. la unión del receptor de C030 por el mAb anti-C030 Ki-1 tuvo poco efecto.

{0011] La actividad proliferativa de estos mAbs anti-C030 agonistas en las lineas celulares de Hodgkin sugirió que las mAbs anti-C030 que poseen actividad de sel\aliz€lción no tendrian ninguna utilidad en el tratamiento de HO.

[0012J Por otra parte, se ha mostrado recientemente, qUé Io~ mAb~ anti-C030 puedan inhibir el crecimiento dG las células AlCl, induyendo Karpas-299, indudendo a la detención del ciclo celular y no induciendo a la apoptosis (Hubinger el at., 2001, Oncogene 20: 590-598). Además, la presencia de los mAbs M44 y M67 inmovilizados inhibe fuertemente la proliferacl6n de !as Ilneas celulares que representan el ALCL que expresa C030 (Gruss el at., 1994, Blood 83:2045-2056), Esta actividad inhlbltoria contrn las lineas celulares del AlCL también se eJdendi6 a estudios en animales in vivo. la supervivencia del ralón selo portando xenotransplantes tumorales de AlCL aumentó significativamente tras la administración del mAb M4<t Además, el mAb HeFi-1 anti-C030, reconociendo un epltopo similar al de M44, también prolongaba la supervivencia en este modelo de animal (Tian el al. , 1995, caneer Research 55:5335-5341).

2.3.1 ANTICUERPO MONOCLONAL AC10

{OO13] la mayoria de mAbs anti-C030 murinos conocidos en la técnica se han generado por Inmunización de ralones con lineas celulares de HD o antígeno CD:30 purificado_ El AC10. originalmente denominado como C10 (Bowen et at., 1993, J. Immunol. 151 :5896-5906), es diferente por el hecho de que este mAb anl! C030 se preparó contra una linea celular humana de tipo NK, YT (Bowen et al., 1993. J. Immunol. 151 :5896-5906). Inicialmente, la

actividad de señalización de este mAb se averiguó rTlediante la regulación a la baja de la expresión de la superfide celular de las moléculas C028 y C045, la regulación al alta de la super1icie celular de la expresión C025 y la inducción a una unión homotípica seguida de la adhe:sión de C10 a células YT.

2,3.2 ANTICUERPO MONOCLONAl HeFI·'

[0014] HeFi-1 es un mAb anti-C030 que se produjo inmunizando ralones con la linea celular de la enfermedad de HOOgkin L428 (Hecht st 8t" 1985, J. Immunol. 134:4:!31-423G). El cocultivo de HeFi-1 COn las lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin L428 o L540 no consiguiÓ revelar efecto directo alguno del mAb en la viabilidad de estas lineas celulares. la actividad anti tumoral in vitro e in vivo de HeFi-1 se describió por Tian et al contra la línea celular de AlCl Karpas 299 (TIan el al" 199.5, Canoar Researdl 55:.533.5-.5341 ).

SO

SS

2.3.3 ACTIVIDAD DIRECTA ANTITUMORAL DE SEÑALiZACIÓN DE LOS ANTICUERPQS C030

[0015) los anticuerpos monoclonales representan Uin enfoque atractivo para focalizar poblaciones espedficas de células ;n vivo. Los mAbs natillos y sus derivados plleden eliminar células tumorales mediante varios mecanismos incluyendo. pero no limitándose a. la activación de cclmplemento. la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (AOCC), la inhibtci6n de la progresión del ciclo celular y la induCCión a la apoptosis (Tutt el al., 1998, J. Immunol. 161 :3176-3185).

[0016] Como se ha descrito anteriormente, los rTlAbs para el antlgeno C030 tales como t(j·l y 8er-H2 no consiguieron demostrar actividad antitumoral directa, (Falini er al., 1992, British Joumal of Haematology 82:38-45; Gruss el al.• 1994, 81000 83:2045-2056). Mientras qlJ8 algunos mAbs de seflatizaci6n para C030, incluyendo M44, Me7 Y HeFi-1 han demostrado inhibir el crecimiento de las lineas AlCl in vitro (Gruss et al., 1994, 8100d 83:20452056) o In vivo (Tian et al.. 1995, Cancer Res. :55:5335-5341), los anticuerpos anti-C030 eonocidos no han demostrado ser eficaces en la inhibición de la proliferación de células de HO en cultivo. De hecho, dos mAbs de senalizací6n anti-CD30, M44 y M87, que Inhibieron el credmienlo de la línea de ALCl Karpas.-299, mostraron realzar la prollferaci6n de lineas de HO de lipo células T in vffro mientras Que no mostraron ningún efecto en Uneas de HO de tipo célula B (Gruss et al., 1994, Blood 832045-2056).

[0017} El conjugado del anticuerpo Ki-1 con la caderl8 A de Ricina conllevó mils bien a una inmunotoxlna ¡nefectiva y se concluyó que esta Inefectividad se debla mas bien a la baja afinidad del anticuerpo Ki-1 (Engert et al., 1990, Cancer Researcn 50:84-68). Otras dos razones también pueden explicar la toxicidad débil de los conjugados de cadena A Ki-1·Ridna: a) el anticuerpo Ki-1 mejora la liberación del SC030 de las lineas celulares derivadas de Hodgk.in l428 y l540 al igual que de la línea celular de un linfoma diferente al de Hodgkin C030+ Karpas 299 (Hansen el al., 1991, Immunobiol. 183:214); b) la distanCia relativamente grande del epltopo Ki-1 de la membrana celular tampoco es favorable para la construcción de inmunotoxinas potentes (Press et al., 1988, J. Immunol. 141:4410-4417; May et al., 1ggo, J. Immunol. 144:3637-3642).

[0018] La publicaci6n PCT WO 96/22384 describe UI' antiCuerpo que se enlaza al antígeno C030 'J a) libera sC030 a partir de células de la enfermedad de HOdgltin en u:na cantidad de, o menor de, el 10% 'J b) no enlaza con la célula B de un linfoma diferente al de Hodgkin o con células de plasma en una extensión considerable y es útil para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.

[0019] En el Cuarto Seminario sobre Antígenos de Diferenciadón de leucOCitos en Viena en febrero de 1989, los anticuerpos monoclonales se sometieron por tres laboratorios diferenles y finalmente se caracterizaron como pertenecientes al grupo C030. los experimentos de· cocultivo por los inventores de las células l540 con diferentes anticuerpos según el eslado de la técnica, seguidos del aislamiento de sCD30 a partir de fluidos sobrenadantes del OJltivo, revelaron que la liberación del sC030 se aumentO más fuertemente por el anticuerpo Ki-1 , Y se mejor6 débilmente por el anticuerpo HeFi-1, mientras que a la vez se inhIbe más fuertemente por el anticuerpo Ber-H2. Sín embargo, el anticuerpo Ber-H2 también categoriza una sUb-pOblaci6n de células de plasma (Schwarting et 8/., 1988, Blood 74:1678-1689) 'J G. Pallesen (G. Pallesen, 1990, HiSlopatology 16:409-413) describe, en la pégina 411, que Ber-H2 reacciona en cruce con un epilOpo de un anlrgeno no relacionado el cual se altera por formaldehido.

[0020] Existe una necesidad en la técnica de terapia con eficacia aumenlada para tratar o prevenir la enfermedad de Hodgkin, una necesidad proporcionada por la presente invendón. Ensayos clínicos y numerosas evaluaciones precllnicas no han conseguido demostrar actividad tumoral de ciertos mAbs anti-CD30 en forma ¡nmodificada contra células repreacntativ&s de la enfermedad de Hodgkin. Bajo condiciones sImilares a aquellas utilizadas por Gruss ef al. en sus evaluaciones de los mAbs Ki-1 , M44 Y M67 (Gruss el sI., 1994, Blood 83:2045-2056), los inventores presentes derruestran una clase de mAbs de C030· funcionalmente diferente a la previamente desaita. Esta clase de mAbs anti-C030 es capaz de inhibir el crecirriento in vffro de todas las lineas de HOdgkin evaluadas. Adamás, eetoe mAbs no modifi~dos poII:een actividad antiturnoral in vNO contra xenotransplantes tumorales de HO.

[0021) La alación o identificac;()n de cualquier refen:lnda aqul no debe interpretarlOS como una admisión de que tal referencia esta dispooible como técnica anterior a la presente invenciOrl.

3. SUMARIO pE LA INVENCiÓN

(0022] la presente invención se basa en el descutlrimiento sorprendente de una actividad nueva asociada a una clase determinada de anticuerpos antl-C030, comprendiendo dicha clase AC10 y HeFi-1 , incluyendo su capacidad para inhibir el credmento de las células de la enfemledad de Hodgkin (HO) de tipo T Y de tipo 8.

[0023] la presente invención proporciona un anticuerpo que (1) enlaza inmunoespeclficamente con C030 y (11) el mismo ejerce un efecto citoStático o dlotóxico en una linea celular de la enfermedad de Hodgkln, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto cítostátlco o dtotóxico el1 la linea celular de la enfennedad de Hodgkin en ausencia de conJug.adÓf' a un agente dtostático o dtot6xico. respectivamente. para el uso en el tratamiento de la enfennedad de

Hodgkin.

[00241 la presente invención también proporcionsl una composición fannacéutica para el tratamiento de la enfennedad de Hodgkin que comprende:

a) un anticuerpo humano, humanizado, o quiméricx) que (j) se enlaza inmunoespecíficamente con COlO, (ii) el mismo ejerce un efecto cítostético o citot6xico en uno linea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de la 5 conjugaclOn a un agente citostático o ci1otóxico, respectivamente, en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfennedad de Hodgkin; y

b) un soporte aceptable fannacéulicamente.

(OO25J la presente invención tambíén proporciona el uso de un anticuerpo que (i) se enlaza inmunoespecíficamente a C030 y (ii) el mismo ejerce un efedo citostético o citot6xico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin,

la donde dicho anticuerpo ejerce el efecto cltostático o citotóxico en la línea celular de la enfennedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente Citostático o Citotóxico. respectivamente. en la producción de un medicamento para ellralamiento de la enfermediKI de Hodgkin.

[0026J También se describe un método para el tratamiento o prevención de la enfennedad de Hodgkln en un sujeto comprendiendo la administración al sujeto, en una cantidad eficaz para dicho tratamiento o prevención, de un 15 anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a C030 y ejerce un efecto cilostático o citotóxico en una linea celular de la enfennedad de Hodgkin, donde dicho anticuerpo ejerce el efecto citostático o citot6xico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente citostatico o citotóxico. respectivamente; y un soporte farmacéuticamente aeeptable. También se desCfibe un método para el tratamiento o prevención de la enfennedad de Hodgkin en un sujetl) comprendiendo la administración al sujeto de una cantidad de 20 una protelna, la cual compile por enlazarse con C030 con el anticuerpo monoclonal AC10 o HeFi·1. y ejerce un efecto citostátlco o cltotóxlco en una linea celular d,e la enfennedad de Hodgkin, cuya cantidad es efICaZ para el tratamiento o prevenclón de la enfennedad de Hodg~tin. En una fonna de realizBCiÓfl , un anticuerpo de la invención se conjuga a una molécula citot6xica. En otra fonna ele realización, un anticu8fpo de la invención es una proteina de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de una segunda proteina tal como briodina o una enzima de

25 conversión a un profármaco. los anticuerpos de la invención, inCluyendo conjugados 'J proteinas de fusjón. pueden usarse conjuntamente con terapia de radiación, quimioterapia, terapia honnonal y/o inmunoterapia.

{0027] la presente invendón comprende además un ;anticuerpo que (1) se enlaza inmunoespecíficamente con COlO. (ji) ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin, y (íii) no es el anticuerpo monodonal AClo o HeFi·t 'J no resulta del clivaje de ACta o HeFí-t con papalna o pepsina. El

30 anticuerpo puede ejercer un efecto citostético o Cltot6xico en la linea celular de la enfennedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente citostático o citotóxico, respectivamente.

(0028J la presente Invención comprende ademas Ulfl anticuerpo comprendiendo la SEC ID NO:4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8. SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14 O SEC ID NO: 16, cuya protelna (i) se enlaza inmunoespecificaTlente COll C03o, y (ii) no es el anticuerpo monodonal AClo y no resulta del clivaje de AClo con

35 papalna o pepsina.

[0029] la presente invención comprende además un anticuerpo comprendiendo la SEC ID No:20, SEC ID NO:22, SEC ID NO:24, SEC ID NO:28, SEC ID NO:3o o SEC ID NO:32, cuya protelna (i) se enlaza inmunoespeclficamente con C030, y (ji) no es el anticuerpo monocfonal HeFi··1 'J no resulta del clivaje de HeFi-1 con papaina o pepsina.

[0030) la presente invención comprende además un anticuerpo comprendiendo una secuencia de amInoácidos que

40 tiene al menos un 95% de identidad con la SEC ID NO:2 o la SEC ID NO:lo, cuya proteína (i) se enlaza inmunoespeclficamente a C030: y (ii) no es el antic:uerpo monoclonal AClo y no resulta del clillaje de AClo con p:apain;:¡ Q pepsin;:¡.

(0031] la presente invención comprende además un anticuerpo comprendiendo una secuencia de aminoáCidos que tiene al menos un 95% de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO:26, cuya proteina (i) se enlaza 45 inmunoespecificamente a C030; 'J (ii) no es el anticuerpo monoclonal HeF¡"1 y no resulta del divaje de HeFl-l con papalna O pepsina, en una Céfltidad eficaz para el trammiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin.

[0032] la prasenta inllttneiÓfl comprende además una composición farmacéutica comprendiendo (a) un anticuerpo que (i) se enlaza inmunoespeclficamente a C030. (ti) ej8fce un efecto citostático o citotóxico en una linea celular de la enfennedad de Hodgkln. y {iii) no es el anticuerpo monodona! ACta o HeFi-t y no resulta del divaJe de AC10 o

50 HeFi-1 con papaina O pepsina, en una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfennedad de Hodgkin; y (b) un soporte farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo puede ejercer un efecto citostático o dtot6xico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de conjugación a un agente cilostatico o citotóxico. respectivamente .

[0033] la presente inllencl6n comprende además una composición farmacéutica Que comprende (a) una protelna, SS cuya proteina ro compite por enlazarse con C030 con el anticuerpo monoclonal AC10 o HeFt-.1 . (ii) ejerce un efecto

S

4S

citostático o citotbxico en una linea celular de la enfermedad de Hodgkin, y (jii) no es el anticuerpo monoclonal AC10

o HeFi-1 y no resulta del clivaje de AC10 o HeFi-1 con pepalna o pepsina, en una cantidad eficaz para el tratamiento

o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b) un soporte farmacéutica mente aceptable.

[0034) la presente invención comprende además une composición farmacéutica comprendiendo (a) una proteína que comprende la SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14 o SEC ID NO: 16, cuya proteina (i) se enlaza inrrrunoespeclficamente con C030, y (il) no es el anticuerpo monoclonal AC10 y no resulta del clivaje de ACtO con pepaína O pepsina, '911 una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b) un soporte farmacéutiCl:mente aceptable.

(00351 la presente invención comprende además una composición farmacéutica que comprende (a) una protelna comprendiendo la SEC ID NO:20, SEC ID NO:22, SEC ID NO:24, SEC ID NO:28, SEC ID NO:30 o SEC ID NO:32. cuya proteína O) se enlaza inmunoespecificamente con C030, y (ii) no es el anticuerpo monoclonal HeFi-1 y no resulta del clivaje de HeFi-1 con papaína o pepsina, en una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b) un soporte farmacéutic;:mente aceptable.

(0036) la presente invención comPl'"ende además una composición farmacéutica que canprende (a) una proteína comprendiendo una secuencia de aminoácidos que Ijene al menos un 95% de identidad con la SEC [O NO:2 o la SEC ID NO:10, cuya protelna (i) se enlaza inmunoespecíficamente con C030; y (U) no es el anticuerpo monoclonal AC10 y no resulta del Clivaje de AC10 con papaína o pepsina. en una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin; y (b) un soporte farmacéuticamente aceptable.

(0037) La presente Invención comprende además una composición fannacéutica que comprende: (a) una proteina comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con la SEC iD NO:18 o la SEC ID NO:26, cuya proteina (:> se enlaza inmunoespecífica'nente con C03O; y (ii) no es el antiCuerpo monoclonal HeFi-1 y no resuNa del clivaje de HeFi-t con papa.ína o pepsina, en una cantidad eficaz para altralamiento o prevención de la enfermedad de HOdgkin; y (b) un soporte farmacéuticamente aceptable.

[OO38} En una forma de realizaclón preferida. un anticuerpo de la invención es un andClJerpo humano, hlmanizado o quimérico. En otra forma de realización preferida, el ¡Inticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En otra forma de realización preferida más, el anticuerpo es una proteina de fusión que comprende la secuencia de afTjnoácidos de una segunda proteína que no es un anticuerpo.

[0039J A la hora de determinar el efecto citostatico de los anticuerpos de la invención en las lineas celulares de la enfermedad de HOdgkin, un CIJltivo de la linea celular de la enfermedad de Hodgkin se pone en contacto con la protelna, siendo dicho cultillO de aproximadamente ~i.OOO células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33

cm , el mismo poniéndose en contacto durante un p~~riodo de 72 horas; expuesto a 0,5 ¡JCi de 3H-timidina durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y s~! mide la incorporación de 3H-timidina en células del cultivo. El anticuerpo tiene un efecto citostático o citotóxico en la línea celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de 3H-timidina f!tn comparación con las células de la misma !tnea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivada bajo las mismas condiciones pero no estando en contacto con el antiClJerpo. Lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin adecuadas para determinar los efectos citostáticos o citot6x1cos de los anticuerpos de la invención son l428; L450, HOlM2 o KM-H2.

[0040] El anticuerpo de la invención es un anUcuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo recombinante. y de la forma más preferible es humano, humanizado. o quimérico.

(0041) También se deSCliben ácidos nucleicos aislados codificando una proteína, inCluyendo pero no limitándose a un anticuerpo, que compite por enlazarse con C030 con el anticuerpo monoclonal ACtO o HeFi-1, y ejerce un efecto citostálico o citotóxico en una linea celular de la enfermedad de Hodgkin. Tambien se describen métodos para aíslar ácidos nucleicos codificando anticuerpos que se enlazan inmunoespecificarnente con C030 y ejercen un efecto citostático o citotóxico en una línea celular de la enfermedad de Hodgkin. También se describen las proteinas

codificadas pOr cualquiera de los acidos nudeicos precedentes.

[00(2) También se describe un método para proiíucir una proteína comprendiendo hacer 0'"ec9f una célula contenlendo una secuenda de nudeótidos recomblnante codificando una proteina, cuya protelna compite por enlazarse con COJO con el anticuerpo monoclonal AC10 o HtlFi-1 y ejerce un efecto citOStátiUl o citotóxiUl en una linea celular de la enfermedad de Hodgkin. de martera que la protelna se expresa por la célula; y recuperar la proteina expresada.

[0043) También se describe un método para identificetr un anticuerpo anti-C030 útil para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin, comprendiendo determinar si el anticuerpo anti-C030 ejerce un efecto cltostético o cll0t6xico en una linea celular de la enfermedad de H::.dgkin poniendo en contacto un cultivo de la linea celular de la enfermedad de Hodgkin con la proteína, dicho QJlti'{o siendo de aproximadamente 5.000 células en un área de cultivo de aproximadamente 0,33 cm 2, dicho contacto realizándose durante un periodo de 72 horas; exponiendo el cultivo a 0,5 ~Ci de 3H-timid¡na durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y midiendo la incorporación SS

de 3H-timidina en células del cultivo. El anticuerpo anti-COlO tiene un efecto citostático o citotóxico en la Unea celular de la enfermedad de Hodgkin y es Lítil para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de :~_timidina en comparación con 18S células de la misma linea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto

S con el anticuerpo anti-CD30.

4. BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

[OO4A]

Fig. 1. Imibición del crecimiento de lineas celularns de la enfermedad de Hodgkin: las lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin HOLM-2, L540, L428 Y KM-H2 se cultivaron a 5x104 célulaslpocillo en presencia o en ausencia de 10 ~g..ml de AC10 inmovilizado. Se usó Ki-1 como un control en estos ensayos. La proliferación se

midió mediante la incorporaci6n de 3H_timidina tras n horas de cultivo.

Fig. 2. Inhibici6n del crecimiento de lineas celulan~s de la enfermedad de Hodgkin: las lineas celulares de la enfermedad de HOdgkin HDLM-2, L540, L428 y KM-H2 se rultivaron a 5x1 rJ células/pocillo en presencia o en ausencia de 10 ~I de AC10 inmovilizado. Se usó Ki·1 como un control en estos ensayos. La proliferación se

15 midió mediante la incorpcxación de 3H-timidina tras ;.~ horas de cultivo.

Fig. 3. Imibicl6n del crecimiento de líneas cetulan~s de la enfermedad de Hodgkin: las lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin HDLM-2, L540, L426 Y KM-H2 se cultivaron en 5xl0~ c61ulaslpOcillo en presencia o en ausencia de 0,1 ~wml AC10 o HeFi-l que se hatlla reticulado por la adici6n de 20 ~ml de anticuerpos IgG policlonales de cabra anti-ratón. La proliferación se ITlidió mediante la incorporación de lH-timidina pasadas las 72 horas de cultiVO.

Fig. 4. Inhibici6n del crecimiento de lineas celuJanes de la enfermedad de Hodgkin: las lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin HOLM-2, L540, L428 Y KM ... H2 se cultivaron en 5xl0J células!pocll1o en presencia o en ausencia de 0,1 ~gfml de AC10 o HeFi-l que se habla reticulado mediante la adK:ión de 20 ~lml de anticuerpos IgG policlonales de cabra anti-rat6n. La proliferación se midió mediante la incorporación de JH_timidina pasadas las

25 72 horas de cultivo.

Fig. 5. Actividad antitumoral de AC10 (circu!os) y HeFi ... l (cuadrados) en xenotransplantes de la enfermedad de HOdgkin de LS40cy diseminados (A) y subcutaneos (8). A) Se implantaron 1X1 07 células en ratones a través de la vena caudal el dia O y se les pusieron inyecciones intraperitoneales de anticuerpo en 1 mglk.:plinyecci6n usando un programa de administraci6n de 10 dosis en 2 dlas. B) Se implantaron subcutáneamente 2xl0 de células L540cy en ratones. Cuando los tumores eran palpables los ratones se trataron con inyecciones intrapentoneales de AC10 o HeFi-l en 2 mgJkglinyecci6n de 10 dosis en 2 dlas. En ambos experimentos los ratones no tratados (X) no recibieron terapia.

Fig. 6. Vector de expresión quimérico AC10. El ADN que codifica la reglón variable de cadena pesada (Vp) del mAb AC10 se unió a la secuencia que codifica la región constante gamma 1 humana, y la región variable de cadena 35 ligera (LV) AC10 se unió de fonna similar a la re9i6n constante de kappa humana en diferentes vectOf"es de clonación. las secuencias quiméricas de cadena pesada y ligera se donaron en el plasmldo pOEF14 para la expresi6n del anticuerpo monoclonal quimérico intacto en células CHO. pOEF14 utiliza el promotor del gen alfa 1 del factor de alargamiento del hamster chino que COI11jUce la transcripción de genes heter6logos (Patente U.S. n·.

5.888.809).

Flg. 7. Saturación de unión de AC10 y de AC10 quimérico (cAC10) para Karpas ... 299 positivo de C030. Se combinaron células con concentraciones en aumento de AC10 o cAC10 durante 20 mInutos, se lavaron con un 2% de PBSlPBS (medios de coloración) para eliminar el mAb libre y 5e incubaron con anticuerpol5 de cabra FITC antiratón o con anticuerpos de cabra FITe anU-humano, respectivamente. Las células marcadas se lavaron otra vez con medios de COloración y se examinaron mediante <:itometría de flujo. Las intensidades de fluorescencia medias 45 resultantes se representaron en un gráfico con respE!d.o a la concentración de mAb como se describe en la sección

9.1 .

Fig 8. Inhibición del crecimiento in vitro mediante I\C10 quimérico (cAC 10). Las lineas C030 positivas y la linea C030 negativa HL-60 se colocaron en placas de 5.000 células/pocillo. Se anadió AC10 quimérico en las COncentraciones registradas en presencia de un exc'Iso rT'lJltiplicado por 10 correspondiente de anticuerpo de cabra IgG anti-humano. La inhibici6n porcentual relativa a pocillos de control no tratados se representó en un grafico con relaci6n a la concentraciOn de cAC10.

Fig. 9. Efectos cíclicos celulares de AC1 O quimériCo I~ células de HO L54Ocy. Las células se trataron con 1 pgIml de cAC10 y 10 pglmI de antrcuerpo secundario de cabra anti-humano. En los momentos indicados se marcaron las células con BrdU, se penneabilizaron y se tintaron (:on anti-BrdU para detectar la slntesis de ADN naciente (panel

55 inferior), y se tintaron con yodo de propidio para detectar el contenido de ADN total (panel superior). Los paneles 7

so

SS

superiores muestran el perfil G,; la fase S y el contl;!nido de Gz tintado con P1 y los paneles inferiores muestran contenido y slntesis de AON seglJl se detecta medi;:¡nte la incorporacfón de BrdU. Las regiones 2, 5 Y 3 designan G" ~ fase S y G2 respectivamente. La regi6n 4, conteniendo ADN del sub-contenido de Gz no experimenta una sintesis de AON y la regiOn 6. el AON del sub<ontenido de G,. indica células con fragmentación de ADN apoptótico (Donaldson et el., 1997, J. Immunol. Meth. 203:25-33).

Fig 10. Eficacia del AC10 quiméricO en modelos de Ho. (A) Actividad antitumoral de cAC10 en L540cy diseminado de la enfennedad de Hodgkln en ratones SClo. Grupos de ratones (cinco/grupo) o bien quedaron sin tratarse (X) o reCibieron 1 (o), 2 (d), o 4 (.) mgJKg de cAC10 (5 dosis cada 4 dlas) desde el dla 1 después de ~ inOOJ~ción tumoral. (B) L540cy diseminado de la enftmnedad de Hodgkin en ratones SClo donde grupos de ratones (cinco/grupo) o bien quedaron sin tratarse (X) o recibieron terapia iniciada o bien el día 1 (o). el dla 5 (d), o el día 9 (.) por cAC10 administrado en 4 mglkg usando un prugrama de 5 dosis cada 4 dlas, (C) Modelo tumoral subcutáneo

L540cy de HO en ratones SCIO. A los ratones se II*> implantaron 2x10 células de L540cy de la enfennedad de HOdgkin en el flanco derecho. Grupos de ratones (cinco/grupo) o bien quedaron sin tratarse (X) o recibieron 1 (o), 2.

(d) o 4 (.) rngIkg de AC10 qUimérico (5 dosis cada 4 dlas; .) empezando cuando el tamano tumoral en cada grupo de 5 animales tenia un pfomedio de -50 mm 3•

Fig. 11. Actividad antitumoral de AC10 quimérico (cACO) en xenolransplantes subcutáneos de L540cy de la enfermedad de Hodgkin. A los ratones SCID se les implantaron subcutáneamente células de L540cy Ycuando k>s tumores alcanzaron un tamano medio de >150 mm 3 los ratones o bien quedaron sin tratarse (X) O se trataron con cAC 1 O(o) en 2 mglkg dos veces por semana mediante 5 inyecciones.

Fig. 12. AdministraciOn de AEB a células positivas COJO a través de AC10 quiménco. Las células de las lineas celulares indicadas se expusieron al AC10 quimériCCl' conjugada al agente cito16,oco AEB. un derivado de auristatin E (el conjugado se describe en la solicitud U.S_ n-09/845.786 soliCitada el 30 de abril de 2001). la viabilidad celular en porcentaje de control se representa en un gráfico frente a la concentraci6n del conjugado de fármaco cAC10 que se administró.

Fig. 13. Actividad de conjugado de AC1O-AEB quimérico en ratones portadores de xenotransplantes de la enfermedad de Hodgkin de L54Ocy. A los ratones se les implantaron células de ls.ocy subcUtáneamente. AC10 quimérico conjugadO al agente citotóxico AEB. un dertvado de auristatin E, se administró en dosis indicadas con un total de 4 dosis en intervalos de 40 días. El volumen tumoral en mm 3 se representa en el gráfico frente a los dlas después de la implantación tumoral.

DESCRIPC1ÓN DETALLAQA DE LA INVEMCIÓN

[0045) La presente invención se refiere a anticuerpos que enlazan con C030 y ejercen un efecto Citostático o dtot6xico en células de Ho. La invención se refiere además a anticuerpos que compiten con AC 10 o HeFi-1 por enlazarse con COJO y ejercen un efecto atostático o citotóxlco en células de HO. En una forma de realización preferida. el anticuerpo es AC10 o HeFi-1, de la forma más preferible un AC10 o HeFi--1 humanizado o quiménco.

[D048]la invención también se refiere a anticuerpos -codificados pory a secuencias de nude6tidos de genes AC10 y HeFi·1. la invención se refiere ademas a fragment10s y otros derivados y anélogos de tales anticuerpos AC10 y HeFi-1 . También se describen ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos o dertvados. Se describe la pfoducción de los anticuerpos anteriormente descritos, p. ej., por métodos recombinantes.

[0047} La in\lenciOn también se refiere a anticuel'pos AC10 y HeFI-1 y derivados inciuyendo anticuerpos de fusiónlquiméricos ft.rlcionalmente activos. es decir. capaces de mostrar un enlace con COJO y ejercer un efecto citostético o citotóxico en células de HO.

[0048] los anticuerpos para COJO comprendidos por la invenCión incluyen anticuerpos humanos. quiméricoS o humanizados. y artiCuerpos de este tipo conjugados a agentes cilotOxicos lales como fármacos quimioterapéutiCOl.

10049] También se describen metados para tratar o prevenir la HO comprendiendo la administratiiOn de una composici6n comprendiendo una proteina o acido nudelco SÓlo O en COmbinación con un agente CIt016xico, incluyendo pero no limitándose a un fármaco quimiOt1~péutico.

{005O] Para darificar la descripción, y no a modo de timitación, la desclipci6n detallada de la invención se divide en las subsecciones que siguen.

5.1 ANTICUI;RPOS DI; LA INVENCiÓN

10051] La presente invención comprende anticuerpos que enlazan con Co30 y ejercen efectos citoclaticos '110 citotóxicos en células HO. La invención también se refiere a anticuerpos que compiten con AC10 o HeFi-1 para enlaZarse con COJO y ejercer un efeCto cilostátlCo o t:;jtotóxiCO en celulas de Ho.

[0052] La presente invención comprende además anlicuerpos que comprenden, o de forma altemativa que consisten en, un CDR de HeFi-1 (SEC 10 NO:20, SEC ID NO:22. SEC 10 N024, SEC ID NO:28, SEC ID NO:3Q o SEC ID NO:32) o AC10 (SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8, SEC ID NO: 12, SEC ID NO:14, oSEe 10 NO:16).

[0053} La presente invención comprende ademas anticuerpos Que comprenden. o de forma alternativa Que consisten en. una región variable de HeFi-1 (SEC ID NO: 18 o SEC ID NO:26) o AC10 (SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 10). Abajo se proporciona una tabla Que indica la región de AC10 o HeFi-1 a la que correspOnde cada SEC ID NO:

TABLA 1

MOLECULA NUCLEOnOO O AMINOACIOC ¡SEC ID NO

Región Vañable de cadena pesada de AC10 Nucle6tido

Región Vañable de cadena pesada de )~C10 Aminoácido

CDR1(H1) de cadena pesada de AC·tO Nucle6tido

CDR1(H1) de cadena pesada de AC 10 Aminoácido

•

NucJe6tido CDR2(H2) de cadena pesada de AC 10

CDR2(H2) de cadena. pesada de AC 10 Aminoácido

CDR3(H3) de cadena pesada de AC 10 Nucle6tido

CDR3(H3) de cadena pesada de AC 10 AminoácidO

Región Variable de cadena ligera de AC 10 Nucle6tido

Región Variable de cadena ligera de AC 10

Aminoácido CDR1(L 1) de cadena ligera de AC1 O

Nucle6tldo

11 CDR1(L1) de cadena ligera de AC1 O

12 CDR2(l2) de cadena ~gera de AC1 O Aminoácido

Nucleótido

CDR2(l2) de cadena ligera de AC1 O Aminoácido

"

CDR3(l3) de cadena ligera de ACl O

Nucle6tido CDR3(L3) de cadena ligera de AC10

Aminoácido

16 egión Variable de cadena pesada de HeFi-1

Nucle6ticlo

egión Variable de cadena pesada de HeFi-1 Aminoécido

CDR1(H1) de cadena pesada de HeFi-1 NucJe6tido

CDR1(H1) de cadena pesada de HeFi-1

Aminoacido CDR2(H2) de cadena pesada de HeF·i-1

Nucle6tido

CDR2(H2) de cadena pesada de HeFi-1 Aminoácido

Nucle6tido

CDR3(H3) de cadena pesada de HeFi-1 Aminoácido

2.

CDR3(H3) de cadena pesada de HeFi-1

Nucle6tido ReglOn Variable de cadena ligera de H<eFi-'

Región Variable de cadena ligera de Ho&Fi-1 Aminoácido

Nucle6tido

27 CDR1(L 1) de cadena ligera de HeFi-1

CDR1 (L 1) de cadena ligera de HeFi-' Aminoácido

28 CDR2(L2) de cadena ligera de HeFi-1

NucJeótido

CDR2(l2) de cadena ligera de HeFi-1

Aminoécido CDR3(L3) de cadena "gara de HeFi-1

Nude6tido

CDR3(L3) de cadena ligera de HeFi-1 Aminoácido

s [0054] La presente invención además comprende derivados funcionales o análogos de AC10 y HeFi-1. Como se

utlllza en este caso, el ténnino "funcional" en el contexto de un anticuerpo de le invención Indica que el anticuerpo es

1) capaz de enlazarse con C030 y 2) ejerce un efecto citostático ylo citotóxico en células de HO.

S

lS

2S

SO

SS

(00551 Generalmente, los anticuerpos de la invenc~6n se enlazan inmunoespecíñcamente con COJO y ejercen efectos citostáticos y citot6xicos en células malignas en la HO. Los anticuerpos de la invenclón son preferiblemente monoclonales, y pueden ser anticuerpos multiespeclficos, humanos, humanizados o Quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de enlace de C030 de cualquieifa de 10$ anteriores. El término ~8nticuerpo·, como se usa aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes il'1lmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléoJlas que contienen un sitio de lIlión del :¡¡ntígeno que se enlaza inmunoespeclficamente con COJO. Las moléculas de inmunoglobulina de la invencióo pueó~n ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 1 Y 19A2) o sLJbclase de molécula de inmunoglobulina.

{0056] En determinadas formas de realización de la invención, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo humano de unión de antígenos de la presente iovandón e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab'h , Fd. Fvs monocatenario (scFv), antiOJarpos monocatenarios, Fvs enlazado de disulfuro (sdFv) y fragmentos comprendiendo un dominio o bien VL o VI(. Fragmentos de anticuerpo de unión de anUgenos. incluyendo anticuerpos monocatenarios, pueden comprender la(s) regl6n(e!§) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región de articulación, dominios CH1, CH2, CH3 y CL. También se incluyen en la invenci6n fragmentos de unión de antlgenos comprendiendo también cualquier combinación de región(es) variable{s) con una región de articulación, dominIOs CH1, CH2, CH3 y eL. Preferiblemente. los anticuerpos son humanos, munnos (p. ej .• rat6n y rata), de asno, oveja, conejo, cabra, l::obaya, camélido, caballo o polIO. Como se utiliza aqul, los anticuerpos "humanos' incluyen anticuerpos teniendo la secuenciéll de aminoácidos de un$ inmunoglobulina humana e induyen anticuerpos aislados de bibliotecas de imnunoglobulina humana, a partir de células B humanas, o a partir de animales transgénicos para una o más irvnunoglClbulinas humanas, como se desaibe abajo y, por ejemplo en la patente estadounidense n° 5.939.598 por Kucherlapslti et s/.

{OO57} Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespeclficos, biespeclficos, trlespecificos O de multiespedficidad supenor. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser espedficos para epitopos diferentes de COJO o pueden ser especificos tanto para CD30 corno para una protelna he!eróloge. Véase, p. ef., las pUblicaciones PCT WO 9311n15, WO 92108802, WO 91.00360, WO 92lO5793; Tutt, et al.. 1991, J. Immunol. 147:60-69; patentes

U.S. Nos. 4.474.893, 4.714.681 ,4.925.648,5.573.920,5.601.819; Kostelni er al., 1992. J. tmmynol. 148:1547-1553.

(0058] Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en cuanto a los COR particulares que estos comprenden. En determinadas fonnas de realizaci6n los anticuerpos de la invenci6n comprenden uno o más CDR de AC10 ylo HeFi-1. la invención canprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo un dominio variable de cadena pesada o ligera, COmPrendiendo dicho dominio variable (a) un conjunto de tres COR, en el cual dicho conjunto de COR proviene del anticuerpo monodonal AC10 o HeFi-1. y (b) un conjunto de cuatro regiones de armazón, en donde dicho conjunto de regiones de annaz6n difiere del conjunto de regiones de armaz6n en el anticuerpo monodonal AC10 o HeFI-1, respectivamente, y en el cual dicho anticuerpo o derivado del mismo se enlaza inmunoespedficamente con C030.

(0059] En una forma de realizadOR especifica, la invención comprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo un dominio variable de cadena pes;ada , comprendiendo dicho dominio variable (a) un conjunto de tres CDR, en el cual dicho conjunto de CDR comprende las SEC ID NO:4, 6 u 8 y (b) un conjunto de cuatro regiones de armazón, en donde dicho conjunto de regiones de armazón difiere del conjunto de regiones de armazOn en el anticuerpo monoclonal AC10, y '3n el cual dicho anti,cuerpo o derivado del mismo se enlaza inmunoespecíficamente con CD30.

{00601 En una forma de realización especifica. la inv'ención comprende un anticuerpo o derivado comprendiendo un dominio variable de cadena pesada, comprendielldo dicho dominio variable (a) un conjunto de tres CDR, en el cual dicho conjunto de COR comprende las SEC ID NO:~~O, 22 o 24 y (b) un conjunto de cuatro regiones de armaz6n, en el cual dichO conjunto de regiones de armazón difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo monoclonal HeFi-1 , y en el cual dicho anticuerpo o derivado del mismo se enlaza inmunoespecíficamente con CD30.

{Q061] En una forma de realización especifica, 1<1 invet'lCi6n comprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo un dominio variable de cadena ligem, comprendiendo dicho dominio variable (a) un conjunto de tres CDR. en el cual dicho conjunto de COR comprende lias SEC ID NO: 12,14 o 16, y (b) un conjunto de cuatro regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de regiones de armaz6n difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo monodonal AC 10, Y en el cual diCho ant1cuerpo o derivado del mismo se enlaza inmunoe;¡;peclflcamente con COJO_

(0062] En una forma de realización especifica, la invención comprende un anticuerpo o derivado del mismo comprendiendo un dominio variable de cadena liger~¡, comprendiendo dicho dominio variable (a) un conjunto de tres COR, en el cual dicho col)'unto de COR comprende las SEC ID NO: 28, 30, o 32, y (b) un conjunto de cuatro regiones de armazón, en el cual dicho conjunto de rE~iones de armazón difiere del conjunto de regiones de armazón en el anticuerpo monodonal HeFi-1 . y en el cual dicho antiOJerpo o derivado del mismo se enlaza inmunoespeclficamente con COJO.

10 5

so

(0063) Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en cuanto a sus estructuras primarias. Los anticuerpos que tienen al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70"k, al men<:liS un 75°/", al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% y de la forma más preferible al menos un 98% de identidad (calculado usando métodos conocidos en la técniCa Y descritos aqul) con las t1!giones variables y ACi0 o HeF¡"1 también se induyen en la presente invención. Los anticuerpos de la presente Invención también pueden describirse o especificarse en cuanto a su afinidad de enlace con CD30. Las afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 X 10.2 M, 10.2 M, 5 X 10-3 M, 10.3M, 5 X 10.4 M, 10'4 M, 5 X 10-.5 M, 10-.5 M, 5 X 10.0 M

10.6 M 5 X 10. 7 M, 10. 7 M. 5 X 10.8 M, 10-8 M, 5 X 10,9 M, 10. 9 M, 5 X 10,10 M, 10. 10 M, 5 X 10'" M, 10.11 M, 5 X lO'l~ M, 10·h M, 5 X 10.13 M, 10.13 M, 5 X 10.14 M, 10.14 M, 5 X 10. 15 M, o 10.,5 M.

[0064] Los alticuerpos de la invención incltyen derivadoS que son modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la unión covalente no previene al anticuerpo de enlazarse con C030 o de ejerce¡' un efecto citostático o citotóxico en células de HO. Por ejemplo, pero no a modo de limitaci6n, lOs derivados del anticuerpo induyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante gliCOsllacl6n, acetilacl6n, pegilad6n, fosfilación, amidaci6n, deriv;atizacJ6n por grupos de protecciónlbloqueo conocidos, rotura proteolítica, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se puede realizar cuak¡uiera de las diferentes modificaciones químicas por técnicas conocidas, induyendo, pero no limitándose a rotura química específica, acetilaciÓfl, fonnilaci6n, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. AdICionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoáCidos no tradicionales.

[0065] Los anticuerpos de la presente invención pueKien generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales para C030 pUel:!en producirse por diferentes procedimientos bien conoddos en la técnica. Por ejemplO, el C030 puede administrarse-a diferentes animales huésped incluyendo, pero no limitándose a, conejos, ratones, ratas, etc. para inducir la produQ;ión de sueros conteniendo anticuerpos poIiclonales especificas para la proteína. Pueden usarne diferentes adyuvantes para aumentar la respuesta írmunol6gica, dependiendo de las especies huesped, e incluyendo pero no limltandose a, el de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como 1l6Olecitina, polioles plurónicos, polianlones, péptidOs, emulsiones de aceites, hemocianinas de la lapa cerradura, dinitrofenol, y adyuvantes humanOS útiles de forma potencial tales como BCG (bacilo Catmette-Guerin) y corinebscterium parvum. Tales adyuvantes tambien son bien conocidos en la técnica,

[0066] Los anticuerpos monodonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica induyendo el uso de tecnologlas de hibridolTla, recombinantes, y de exposición en fago, o una combinacl6n de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica y ensenadas, por ejemplo, en Harlow el al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbar Laboratory Press, ~el:!., 1988); Hamrnerling, el al., en: Monoclonal Antlbodies and TCen Hybtidomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El tennino -anUcuerpo monodonal" como se utiliza aquí no esta limitado a los anticuerpos producidOS mediante te<::nologla de hibridoma. El termino "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, incluyendO cualquier don eucariótico, proeariótico o de fago. y no el método por el cual se produce.

[0067] Los métodos para producir y seleCCionar ;8nticuerpos especlficos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitativo, loS ratones pueden Inmunizarne con C030 o un C030 que se exprese en las células o un fraomanto o derivado del mismo. Una vez se ha detectado una respuesta inmunitaria, p. ej., se han detectado antiCUlerpos especificos para CD30 en el suero del ratón, se recoge el baZo del rat6n y se aislan los esplenocltos. Los esplenocitos se fusionan después por técnicas bien conocidas para cualquier célula de mieloma adeCUada, por ejemplo células de la linea celular SP20 disponibles a partir del ATCC. Los hlbridomas se seleCCIonan y Clonan por dilución limitada. Los Clones del hibrldoma se evaluan después por métodos conocidos en la técnIca para células que segregan antlcuelllOS capaCQW. de QnlaUlr~ con C030. El fluido a¡;cítico, que contiene generalmente niveles altos de! anticuerpos. puede genera~ inyectando clones de hibridoma positivos a los ratones.

[0068] También se describen métodos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el método que comprende el cultivo de una célula dle hibridoma que segrega un anticuerpo de la invenciOn donde, preferiblemente, eJ hibridoma se genera fusionando> esplenocitos aislados a partir de un ratón inmunizado con un antrgeno de la invención con celulas de mleloma y (iespués seleccionando los hibridomas que resultan de la fusión para los clones de hibridoma que segregan un anticuerpo capaz de enlazarse con C030.

[0069] Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopos espeelfieos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos de Fab y F(élb'h de la invend6n pueden producirse por rotura proteolitica de moléculas de inmunoglobullna, u¡;ando enzimas tall!!> como papaína (para producir fragmentos de Fab) o ¡l@psina (para producir fragmentos de F(ab'h). Los fragmentos de F(ab')1 contienen la región variable, la región consta"lte de caClene I¡gera y el Clominio CH 1 de cadena pesada.

s

ss

[0070J Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diferentes métodos de exposición en fago conocidos en la técnica. En los métodos de exposición en fago, se muestran domintos de anticuerpos flJlclonales en la superlicie de particulas de fago que llevan las secuencias de ;!ieidos nucleicos que las codifica. En una forma de realización particular, t.aI fago puede utilizarse para mostrar dominios de unión de antlgenos expresados a partir de un repertorio o IIbrerla de anticuerpos oombinatoria (p. ej., humanos o murinos). En métodos de exposición en fago, se muestran domioüos de anticuerpos funcionales en la superficie de partlculas de fago que nevan las secuencias de ;!ieidos nUC1eiCO!; que las codifican. En particula'", las secuencias de ADN que codifican los dominios VI1 y Vl se amplifican a partir de bibliotecas de ADNc animal (p. ej., de tejidos linfoides de bibliotecas de ADNc humano o murino). El ADN Que codifica los dominios VH y Vl se recombina junto con un enlazador scFv mediante PCR y se dona en un vector fagémido (p. ej., p CANTAB 6 °pComb 3 HSS). El vector se somete a etedroporación en E. coli y e!1 E. con se infecta con fago auxiliar. Los fagos usado en estos métodos son tipicamente fagos filamentoso induyeMlo dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con c\omlnios de anticuerpos de Fab, Fv o Fv de disulfun> estabilizado recombinanlemenle fusionados bien a la protelna del gen 111 o gen VIII de fago. El fago que expresa un dominiO de unión de antígenos que enlaza con C030 o una parte de unión de AC10 o HeFi del mismo puede selecdonarse o identificarse con antígeno, p. el. usando an1igeno marcajo o antlgeno enlazado o capturado en une superficie sólida o reborde. Ejemplos de métodos de exposición en fago que pueden utilizarse para hacer los anlticuerpos de la presente invención incluyen los descrftos en

Brinkman et aL, 1995, J. Immunol. Methods 182A1·50; Ames et al., 1995, J. ImmunoL Methods 184:177.186; Kettleborough el aJ., 1994, Eur. J. Immunol. 24:95:=~-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9--18: Burten el al., 1994, Advances in ImmunOlogy, 191·280; solicitUd de PCT nO PCT1GB91101 134; Publicadooes PCT WO 90102809, WO 91110737, WO 92101047, WO 92/18619, WO 0311 1236, WO 95115982, WO 95120401 ; y las patentes estadounidenses nO 5.698.426, 5.223.409, 5.403A84, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698,

5.427.908, 5.518.637,5.780.225,5.658.727,5.733.7-43 Y 5.969.108.

[0071] Corno se describe en las referencias de arrlbil, después de la selección del tago, las regiones codlficantes de antiCuerpos de fago pueden aislarse y usarse para g,enerar antiOJerpos enteros, induyendo anticuerpos humanos, o OJalquier otro fragmento enlazante de antigenos deseado. y expresado en OJalquier huésped deseado, incluyendo células de mamlfero, oiIlulas de insecto, células veg1etales, levadura, y bacterias. p. ej., como se describe en detalle más abajo. Por ejemplo, las técnicas para produdr de forma recombinant& fragmentos de Fab, Fab' y F(ab'h twntlien pueden emplearse usando métodos conocidos en la técrlica tales como los descritos en la pub~cación PCT WO 92/22324; Mullinax er aJ., BioTechniques 1992,12(6):864·869; y Sawai el al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better er al.. 1988. Science 240: 1041-1043.

(0072] Ejemplos de técnicas Que pueden usarse para producir Fvs monocatenarios y anticuerpos induyen los descritos en las patentes estadounidenses nO 4.946.778 y 5.258.498; Huston el al .. 1991, Methods in Enzymology 203:46-68; St.J er al., 1993, PNAS 90:7995-7999; y Sken"a el al, 1988. Science 240: 1038--1040. Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y en ensayos de citotoxicidad °de prOliferación in vitro, es preferible usar anticuerpos quiméricos, humaniza1oos, o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual las diferentes partes del anticuerpo se derivan .:ie distintas especies animales, tates como anticuerpos con una región variable derivada de un anticuerpo monodonol mulino y una regi6n constante de la inmunog\obulina humana. Se conocen en la técnica métodos para producir émticuerpos quiméricos. Véase p. ej., Morrison. Sdence, 1985, 229:1202; Oi el al., 1986, BioTechnlques 4:214; Gillies er al., 1989. J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes estadounidenses n~ 5.807.715, 4.816.567 Y 4.816.3517.

{0073] Los antiOJerpos humanizados son de moléculas de anticuerpos a partir de anticuerpos de eSpecies no

humanas Que enlazan con el antigeno deseado tenil!mdo uno o más coR a partir de las especies no humanas y las

regiones constantes y de armazón de una inmunoglobulina humana. Frecuentemente, los residuos de armazón en

las regIOnes de armazón humanas se sustituirán por el reskluo correspondiente del anticuerpo donante de COR para

alterar, preferiblemente mejorar, el enlace con el antigeno. Estas sustituciones del armazón se identifican por

métodos bien conOCidos en la técnica, p. el., modelando les interecciones de los reskluos de COA. Y del armazón

para identificar residuos de eslructuf3 importantes para el enlace de antlgenos y la comparación de secuencia para

identificar residuos del armazón ¡nusuales en p<)siciones partK:ulares. (Véase, p. ej., Queen el al., patente

estadounidense n° 5.585.089; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.

[0074] Los anticuerpos pueden humanizarse usandlJ una variedad de tecnicas conOCidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, injertos de COR (EP 239.4OO; publicación PCT WO 9 1109967; patentes estadounidenses nO 5.225.539, 5.530,101 Y 5.585.089), revistiendo o renovando ISI capa superficial (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular lmmunology, 1991,28(415):489-498; Studnicka et al., 1994, Protejn Engineering 7(6):8Q5..814; Roguska. el aJ., 1994, PNAS 91:969-973), y redistribuyendO la cadena (patente estadounidense n° 5.565.332).

(0075J los anticuerpos completamente humanos $Cln particularmente deseables para el tratemiento terapéutico de

pacientec humanos. L.os antICuerpos humanos pueden Cl"8arse por una variedad de métodos conocidos en la técnica

inCluyendO los métodos de exposiCión en fago anteliormente descritos usando bibliotecas de anticuerpos derivadas

de ~encias de la ínmunoglobulina humana. Véase también. las patenles estadounidenses nO 4.444.887 y

4.716.111, y las publicaciones PCT WO 98146645, \NO 98150433, WO 98124893, WO 98116654, WO 96134096, WO

96133735, y WO 91110741 .

[0076] Los anticuerpos humanos también pueden pro.:lucirse usando ratones transgénicos que expresen genes de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inm.moglobulina humana de cadena pesada y ligera pueden introducirse de forma aleatoria o por recontJinaci6n homóloga en células madre embrionarias de ratón . Los genes de inmunoglobulina de rat6n de ca<dena pesada y ligera pueden restituirse de forma no funcional 5 separadamente o sirnJltáneamenl6 a la introducción de lugares geométricos de la inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleci6n homocigota de la regi6n JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastodstos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se repmducen despues para producir descendencia hornocigota que exprese anticuerpos humanos. los ratones transgénicos se inmunizan de la forma normal con un antlgeno 10 seleccionado. p. ej .• todos o una parte de C030. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antlgeno pueden obtenerse a partir de los ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridoma convencional. los transgenes de inmunoglobulina humana albergados en los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de la célula B, y posteriormente experi'mentan un cambio de dase y mutaci6n somática. Así, usando tal tecnica. es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visi6n de conjunto 15 de esta tecnologla para producir anticuerpos humanos, ve&se, lonberg and Huszar, 1995. Inl. Rev. Immunol. 13:65

93. Para una discusión detallada sobre esta tecnol~lia para producir antiOJerpos humanos y anticuerpos hl.manos monoclonales y protocolos para producir anticuerpos de este tipo, véanse, p. ej .• las Publicaciones PCT WO 98124893, WO 92101047, WO 96/34096, WO 9W33735, la patente europea n° O 598 877; las patentes estadounidenses nO 5.413.923, 5.625.126. 5.633.425. 5.569.825. 5.661 .016, 5.545.806, 5.814.318, 5.885.793.

20 5.916.771. Además, compañías tales como Abgenbc, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden comprometerse a proporcionar anticuerpos humanos; dirigidos contra un antigeno seleccionado usando tecnologia similar a la anteriormente descrita.

[0077] los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epitopo seleccionado pueden generarse usando una técnica referida como -selección guiada·. En eslle enfoque un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado. 2S p. ej., un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano reconociendo el mismo epilopo. (Jespers el al., 1994, BiOl1echnology 12:899-903).

[0078] Además. los anticuerpos para C030 pueden, :sucesivamente, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo

que "imiten" a protelnas de la invendOn usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. (Véase. p.

ej.. Greenspan & Bana, 1989, FASES J. 7(5):437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).

30 Fragmentos de Fab de tales anti-Idiotipos pueden usarse en regimenes terapéuticos para suscitar una respuesta inmunitaria propia de un individuo contra el C030 y las células de HD.

[0079] la invención también comprende anticuerpos,. que inhiben competitivamente la uniórl de AC10 o HeFi-1 con C030 como se ha determinado por cualquier métodlO conocido en la técnica para determinar la uni6n competitiva. por ejemplO, 10$ inmunoensayos descritos aquí. En formas de realización preferidas. el anticuerpo inhibe

35 competitivamente la uni6n de AC10 o HeFi-1 con Ctl30 al menos en un 50%, mas preferiblemente al menos en un 60"'<', aun más preferiblemente al menos en un 700/i•• y de la forma más preferible al menos en un 75%. En otras formas de realizaciOn, el anticuerpo inhibe competW\lamente la uni6n de AC10 o HeFi-1 con C030 en al menos un 80%, al menos un 85%. al menos un 90%, o al menC1.~ un 95%.

(0080) Como se discute en mas detalle abajo, el anticuerpo de la presente invendórl puede usarse o bien sólo o en

40 combinación con otras composiciones en la prevención o lratarriento de la HD. los anticuerpos pueden además conjugarse quimicamente (Incluyendo conjugacione:~ de manera covalente y no covalente) a agentes citotóxicos, protelnas u otras compoSiCIones. Por ejemplo, los. antiCuerpos de la presente Invención pueóen fUsionarse o conjugarse recombinantemente a moléculas utilEIS como quimioterapéuticos o toxinas. o comprender un radionucleido para el uso ~un radioterapéutic:o. Véase. p. ej., las publicaciones PCT WO 92/08495, WO

45 91/14438. WQ 89/12624, la patente estadounidense n° 5.31 4.995, y EP 396.387.

[0081) Las proteínas pueden producirse recombin~ntemente fusionando la regi6n codificante de uno o más de los COR de un anticuerpo de la inllendOn en la estructura con una codificaciOn de secuencia para una proteina heter6loga. la proteina heter610ga puede proporcil:lnar una o más de las siguientes caracteristicas: benefidos terapéuticos anadidOS, promueven la expresión Er.stable de la proteina, proporcionan medios para facilitar la

SO expresión recombinante de rendimiento elevado de I~I protelna o proporcionan un dominio de multimerizad6n.

[0082] Adamas de las proteinas que comprenden uno o mas COR de un anticuerpo de la invenCión, las proIelnas pueden identificarse usando cualquier métOdo aljecoado de selección para interacciones proteína-proteina. Inicialmente, las proteínas se identifican por enlazars~ con C030, entonces se puede determinar su capaCidad para ejercer un efecto citostático o citotóxico en células d.e HD. Entre los métodos tradicionales que se pueden emplear 55 estén las técnicas de "donaCión por interaccrOn-las cuales Implican evaluar las bibliotecas de expresión con C030 mareado de modo oimilar a la técnice de la evaluación del anticuerpo de 13S bibliotecas de Ágt11, supra. A mOdo de ejemplO y no de limitaci6n, esto puede conseguirse .oe la siguiente manera: un don de AONc que oodifica C030 (o un dominio de unión de ACl0 o HeFi-1 del mismo) soS! modifica en el extremo insertando el sitio de fosforilaciOn para la quinasa del músculo del corazón (HMK) (Bbmar & Rutter, 1992 Science 256:1014-1018). la proteina

(Edery er al. , 1988, Gene 74:517· 525) y se marcn usando 132P.ATP y quinasa de músculo de corazón bovino (Sigma) a una actividad especifica de lX1cf cpm/~, y se usa para seleccionar una genoteca de ADNc de ;..gt11 de placenta humana en un -ensayo Far Westem-(Blsnan & Rutten, 1992 Science 256:1014-1018). las placas que interactúan con la SOllda CD30 se aislan. los insertos de ADNc de placas de ;.. positivas se liberan y se subclonan

en un vector adecuado para la secuenciación, tal como Ks pBlueSClipt (Stratagene).

[0083] Un método que datada interacciones de protl~inas in vivo, el sistema de dos hibridos, se describe en detalle con objetivos ilustrativos solamente y no a modo de limitación. Se ha descrito una versión de este sistema (Chien et al., 1991. Proc. NatL Acad. Sci. EEUU, 88:9578--958.'2) y está comercialmente disponible a través de Clontech (Pak> Alto, CA).

[oo64J Brevemente. utilizando tal sistema. los plásrridos se construyen de manera que codifican dos protelnas híbridas: una consiste en el dominio de enlace de ADN de una protelna activad ora de transcripción fusionada con CD30, y la otra consiste en el dominio de activ;:lciÓl'l de la proteina activadora fusionada con una prolelna desconocida que está codificada por un AONc que se ha recombinado en este piásmido como parte de una genoteca de AONc. Los plásmidos se transforman en una cadena de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen indicador (p. ej., lacZ) aJya regi6n reguladora contiene los sitios de unión del activador de la transcripción. Cualquier proteíne: híbrida por SI misma no puede activar la transcripción del gen indicador, el hibrido del dominio de enlace de AON no puede porque no ¡proporciona la función de activación, y el hibrido del dominio de activación no puede porque no PUede lOCalizar los sitios de unión del activador. La interaCCión de las dos protelnas hlbridas reconstruye la proteína funcional activadora y resulta en la expresión del gen indicador. que se detecta por un ensayo sobre el producto del gen indicador.

(0085] El sistema de dos híbridos o la metodologiel relacionada pueden utilizarse para seleccionar bibliotecas de dominios de activación para proteínas que interacWen con C030. que en este contexto es un producto genético "trampa-. las secuencias totalmente gen6mlcas o de AONc se fusionan con el AON codificando un dominio de activación. Esta librería y un plásmldo codificando un híbrido de una región de codificación CD30 (por ejemplo, una secuencia de nuCleótidos que codifica un dominio di;! C030 conocido por interactuar con HeF¡"1 o AC10) fusionado con el dominio de uni6n de ADN se cotransfonnan elO una cadena indicadora de la levadura, y de los uansformantes resultantes se seleccionan los que expresan el gen indicador. Por ejemplO, y no a modo de limitación. la región de COdificación de CD30 puede clooarse en un vector de manera que se fusiona traduccionalmente con el AON que codifica el dominio de enlace de AON de la protelna GALA. Estas colonias se purifican y los plásmidos de la libreña responsables de la expresión del gen indicador se aíslan la secuenciación de AON se usa después para identificar las proteinas codificadas por los plásmldos de la librmía.

[0086] Una vez se identifica una proteína de enlace, de CD30, sU capacidad (sola o al multimerizarse o fusionarse con un dominio de dimerizadón o multimerización) para producir un efecto citostático o citotóxico en células HD se determina pornendo en contacto un cultivo de una línea celular de HO, tal como l428. l450, HDLM2 o KM-H2, con la proteina. Las condiciones de cultivo son de la foma más preferible de aproximadamente 5.000 células en una área de cultivo de aproximadamente 0.33 cm2, y siendo el periodo de contacto de aproximadamente 72 horas. El cultivo se expone despues a 0.5 ¡JCi de \i~timidina I:lurante las 8 horas finaleS del periodo de 72 horas y se mide la incorporaci6n de 3H_tlmidina en las células de culW::>, la proteína tiene un efecto citosté.tico o citot6xico en la linea celular de HO si las células del aJltivo han reducido la inccrporactón de JH-timidina en comparaci6n con las células de la misma Ilnea celular cultivada bajo las mismas c:ondiciones pero no estando en contacto con la proteina.

(0087) Sin imitación en cuanto al meca'lismo de acción, una proteína tiene preferiblemente más de un sitio de unión de C030 y en consecuencia una capacidad para roticular moléculas de C030. Las protelnas que se enlazan con CD30 O compiten por enlazarse a CD30 con AC10 O HeFi-1 pueden adquirir la capacidad de inducir efectos cttostáticos o dtotóxicos en células de HO al dimeri¡~rse o mulllmerizarse. Donde la proteína de unión de C030 es una proteína monomérica, puede expresarse en l;eñe. dando de ese modo eomo resultado una pwtefna con mültlples sitios de unión do C03Q. Los sitios de unión de CD30 pueden separarse por una región del enlazador flexible. En otra forma de realización, las proteínas de unión de CD30 pueden re1icularse químiC3Tlente, por ejemplo usando gluteraldehido, antes de la administración. En una forma de realización preferida. la región de unión de CD30 se fusiona con una protelna heter6loga, dond,e la protelna heter6loga eomprende un dominio de dimerización y multimerizacián. Antes de la administración de la protelna a un sujeto con motivo de tratar o prevenir la HD. tal protelna es sometida a condiciones que permiten la formación de un horoodímero o heterodimero. Un helerodímero, como se utiliza en este caso, puede comprender !:lominias de dimerizad6n idéntiCO$ pero regiones de unión de CD30 diferentes, idénticas reglones de unión de C030 pero diferentes dominios de dimerización, o diferentes regiones de unión de C030 y dominios de dimerizaci6n.

[0088) Son dominios de dimerizaciÓl'l particularmente preferidos los que se originen 8 partir de factores de tranSCripclOn.

[0089] En una forma de realizaciÓn. el dominio de dimerización es el de un cierre de leucina de la región básico ("bZIP"). Las proteínas de bZIP poseen de f04'ma caracterlstica dos dominios: un dominio estructural de cierre de leudna y un dominio básico rioo en aminoácidos básicos, separados por un dominio "de horquilla-(C. Vinson et al..

2S

1989, Science, 246:911-916). Dos protelnas de bZlP se dimer\zan formando una región de la bobina el"lrollada en la cual se dimerizan los dominios de' cierre de leudna. Por consiguiente, estas regiones de la bobina enrollada pueden usarse como companeras de fusión para las proteínas.

[00901 Son dominios de cierre de leucina particularrnente utiles aquellos del factor de transcripción de la levadura GCN4, el factor de transcripción mamífera CCAAT/estimulador-proteina C de uniónlEBP, y la transformación nudear en productos de oncogenes, Fos y Jun (véase L~.ndschultz el el., 1988, Science 240:1759-1764; Baxevanis y Vinson, 1993, Curro Op. Gen. Oevel., 3:278-285; y O'Shea el al., 1989, Science, 243:538-542).

10091J En otra forma de realización, el dominio de di:menzación es el de una protelna de hélice-bUde-héUce de una regi6n básica rbHLHj (Murre el al., 1989, Cell, 56:777-783). Las protelnas bHLH también estan compuestas por dominios especlficos, cuya estructura les permite rEjCQnocer e interactuar con secuencias específicas de AON. La región de héltce-bucle-hélice promueve la dimelización a través de sus hélices amfipátlcas de un modo anák>go al de la regiOn de cierre de leucina de las protelnas bZIP (Oavis er at., 1990 Cell, 60:733-746; Voronova y Baltimore, 1990 Proc. NatL Atad. Sci. U.S.A., 87:4722-4726). S:m protelnas hHLH particularmente utiles myc, max, y maco

(0092] Los heterodimeros se conocen por formarsEl entre Fos y Jun (Bohmann st al., 1987, Science. 238:13861392), entre miembros de la familia de ATF/CREB (Hai et al.. 1989, Genes Oev., 3:2083-2090), entre miembros de la familia de CIEBP (Cae et al.. 1991 , Genes Oev., !j:1538-1552; Willlams et al., 1991, Genes Oev., 5:1553-1567; y Roman el al" 1990. Genes Oev" 4: t404-1415), y entre miembros de 18& familias de ATF/CREB '1 de FoS/Jun Hai y Curran, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. U.SA. 88:372().3724). En consecuencia, cuando se administra una protelna a un sujeto como un helerodimero comprendiendo dominios de dimerizacl6n diferentes, se pUede usar cualquier combinación de las anteriores.

5.2 ENSAYOS PE UNiÓN

[00931 Como se ha desaito anteriormente, los anticuerpos de la invenci6n se enlazan con C030 y ejercen un efecto citostático o citotóxico en cé!ules de HO. Métodos para demostrar la capacidad de un anticuerpo de la invención para enlazarse con C030 se describen aqui.

[00941 En los anlicuerpos de la invención se puede analizar su unión inmunoespecífica con C030 por cualqt,jer método conocido en la técnica. Los inmunoensayos, que pUeden usarse incluyen pero no se ¡imitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando tél::.nlcas tales como Westem bIots, radioinmunoanálisis, EU$A (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de "sandwich", ensayos de inmunopf'edpitaclón. reacc::iones de precipitina, reacciones de precípitinn de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinaci6n, ensayos de fijación de complemenlo, ensayos inmunorradiométricos. Inmunoensay05 fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, SólO por nombrar unos ~cos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Curren! Protocols in Molef:wr Biology. Vol. 1, John Wiley & sans, Inc., New York,). Inmunoensayos ejemplares se describen brevementl:! abajo (pero no se utilizan a modo de limitaciOn).

[0095) Los protocotos de inmunoprecipitaclón generalmente comprenden ellisado de una población de células en un tamp6n de lisis tal como el tampón RIPA (1% de NP-4Q o Tritón X-100, 1% de deoxicolato de sodio, 0,1% de SOS, 0,15 M de NaCl, 0,01 M de fosfato sódico a pH 7.2, 1% de Trasilol) suplementado con proteína fosfatasa y/o inhibidores de proteasa (p. ej .. EOTA, PMSF, aprotlnina, vanadato de sodio), añadiendo el anticuerpo allfsado de la célula, incubando durante un periodo de tiempo (p. ej. , de 1-4 horas) a 40· C, añadiendo miaoesferas de sefarosa de protelna A y/o protelna G al lisado de la célula, incubando durante aproximadamente una hora o más a 4crC, lavando las microesferas en ellampón de lisis y re~;uspendiendo las microesferas en SOSl tampón de muestra. La capacidad del anticuerpo para inmunoprecipitar CO~¡() puede analizarse mediante, p. ej., el analisis Westem blDt. Un experto en la técnica entenderla en cuanto a los parámetros que estos pueden modificarse para aumentar la unión del anticuerpo con COJO y reducir el fondo (p. ej., precompensando el tisado de la célula con microesferas de sefarosa). Para más información sobre protocolos de inmunoprecipitad6n véase, p. ej., Current Protocols in Molecular BiOIOgy, Vot. 1, John Wiley &. SOns, Inc., Nueva York en 10.16.' .

[00961 B análisis Westem blot generatmente comprende preparar muestras de proteína, la electrofo~s de las muestras de proteína en un gel de poIiacnlamida (p. ej., un 8°4-20% de $OS-PAGE dependiendo del peso molecular del anligeno), trant.ferir la muestra de protelna del gel de poijacnlamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVOF o nilón, Incubar la membruna en solución de bloqueo (p. ej., PBS con un 3% do BSA o loche no grasa), lavar la membrana en tampón de lavado (p. ej ., PBS-Tween 20), bloquear la membrana con anticuerpo primano (es decir, el antlruerpo antl-C030 putativo) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, incubar la membrana con un anticuerpo secundario (que recclOoce el anticuerpo primario, p. ej., un anticuerpo anti-humano) con~ada.gara un sustrato enzimático (p. ej., pero:x:ldasa de rabano o fosfatasa alcalina) o molécula radiactiva (p. ej., P o 1 51) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavadO, y detectar la presencia del anticuerpo secundario. Un experto en la técnica entenderla en cuanto a los parámetros que estos pueden modificarse para aumentar la senal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para mayor discusi6n sobre protocolos de Westem blot véase, p. ej., Ausubel el al., eds., 1994, Curren! ProtOC01S In Molecular 810109'1, Vol. t, John VViley & Sons, I~.. Nueva York en 10.8.1.

[0097] Los ELlSA comprenden preparar el antlgeno (es decir, C030), revestir el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el C030, afladir el anticuerpo oonjugado a un compuesto detectable tal oomo uno enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasn alcalina) al pocillO e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del anticuerpo. En tos EUSA el anticuerpo no liene que conjugarse a un compuesto detectable;

5 en cambio, un segundo anticuerpo (el cual reconoce el anticuerpo de interes) conjugado a 1.I'l compuesto detectable puede anadirse al pocillo. Además, en vez de revestir el pocillo con el antígeno, el anticuerpo puede revestirse por el pocillo. En este caso, un segundo anticuerpo conju~l9do a un compuesto detectable puede atladirse tras la adición de proteina C030 al pocillo revestido. Un experto el'l la técnica enlenderla que los parámetros pueden modificarse para aumentar la serial detectada al igual que otras variaciones de los EUSA conocidas en la téroica. Para mayor discusi6n relacionada con los EUSA véase, p. ej., AU5ubel et al., eds.• 1994, Curren! Protocols in Molecular Siology, Vol. 1, John Wlley & Sons, Inc .. Nueva York a 11.2.1

{009a] La afinidad de enlace de un anticuerpo con C030 y la velocidad de interac:ci6n de un anticuerpo C030 pueden determina~ por ensayos de unión compe'titivos. Un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoanálisls Que comprende la incubación dE! C030 marcado (p. ej., 3H o 1~1) con el anticuerpo de interés en

15 presencia de cantidades en aUr!'Ieoto de C030 no marcado, y la detección del enlace del anticuerpo con el C030 marcado. La afinidad del anticuerpo por C030 y las velocidades de unión pueden determinarse a partir de los datos mediante una gráfica característica de un análisis de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo (tal como AC10 O HeF¡~1) también puede determinarse usando radioinmunoanálisis. En este caso, el C030 se íncuba con el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto marcado (p. ej., 3H o 1~1) en presencia de cantidades en aumento de un segundo anticuerpo no marcado.

(0099] En los anticuerpos de la invención también puede analizarse su capacidad para enlazarse con CD30 mediante un ensayo estándar conocido en la técnica. Tales ensayos incluyen Far Westerns y el Sistema de dos híbridos de levadura. Estos ensayos se deSCriben en la sección 5.2. arriba. Otra variación en la técnica de Far Westem anteriormente descrita implica la medici~~ de la capaCidad de un anticuerpo candidato mercado para

2S enlal.8rse ron C030 en una \Nestem bIol En un ejEmplo no limitativo de UI'\8 Western blOt el C030 o el fragmenb de Interés del mismo se expresa como una proterna de fusión comprendIendo además gtutationa~5-transferasa (GSn y un sitio de reconocimiento de la proteína se,rina!treonina quinasa (tal como un sitio de reconocimiento de la quinasa dependiente de AMPc). La proteina de fusión se purifica en microesfecas de Sefarosa de 91ltationa (Pharmacia Biotech) y se marca con quinasa de cclrazOn bovino (Sigma) y 100 ¡.tCi de 32p~ATP (Amersham). Los anticuerpos de prueba de interés se separan mediante SOS.PAGE y se transfieren a una membrana de nitrOcelulosa, después se incuban con el C030 marcado. Luego. la membrana se lava y la radioactividad se cuantifica. A la inversa, el anticuerpo de interés puede marcarse por el mismo método y se usa para probar una membrana de nitrocelulosa sobre la que se ha transferido el CD30.

5.3 PRUESAS DE ACTIVIDADES CIIDTÓXIC.AS y CIIOSTÁTICAS

35 (0100] Por definición, un antiOJerpo de la invendón debe ejercer un efecto citostático o Cltot6xico en una célula de HO. Lineas cetulares HD adecuadas para este propÓSito Incluyen L428, L450, HDlM2 y KM-H2 (la totalidad de lOs cuales está disponible a través de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células (OMSZ: Deutsche Sammlung von Mkroorganismen uM Zell~:utturen GmbH».

[010t] Muchos métodos para determinar si un anticuerpo ejerce un efecto cltostático o citotóxlco en una célula se conocen por los expertos en la técnica, y pueden utilizarse para averiguar si una proteina en particular es una protelna de la invención. Ejemplo3 ilustrativos de mé10d0s de este tipo so describen abajO.

(01021 Una vez se ha identificado que un anticuerpo (i) se enlaza con C030 y (ii) ejerce un efecto dlostático o citotóxico en células de HD. su valor lerapéutico se valida en un modelo animal, como se describe en la Sección 6, abajo.

45 (0103] En una forma de realización preferida, se puede determinar si un anticuerpo ejerce un efecto citostático o citotóxico en una linea celular de HD poniendo en c;Ontacto un cultivo de 5.000 células de la linea celular de HD en un área del cultivo de aproximadamente 0,33 cm2 con el anticuerpo durante un periodo de 72 horas. Durante las

últimas 8 horas del periodo de 72 horas, el cultivCl se expone a 0,5 ~Ci de 3H~I¡midina. La incorporación de 3Htimidina en células del Wtivo se mide después. El anticuerpo tiene un efecto dtostatico o dtot6xico en la linea celular de HD y es útil para el tratamiento o prevenclOn de la HO sr las células del cullivo Que estuvieron en contacto con el antiQJerpo han reducido la incorporación de 3H~timidina en comparación con las células de la misma Unea celular de HO cuhlvada bajo las mismas condiciont~ pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo antiCDlO.

(0104) Hay muchos ensayos de citotoxicidad conocidos por los expertos en la técnica. AlglJlosde estos ensayos

55 miden la necrosis. mientras que olros miden la apoplosis (muerte programada de la célula). La necrosis va acompatla de una permeabilidad aumentada de [al membrana plasmática: las células se hinchan y la membrana plasmática se rompe en unos minutos. En camt:jo, la apoptosis se caracteriza por el blebbing de la membrana, la condensación del citoplasma y la activación de endi:>o"lucleasas endógenas. S610 uno de estos efectos en células de

HO es suficiente para mostrar que un anticuerpo de ,enlace de C03Q es útil en el tratamiento o prevención de la HO como una altemativa al los ensayos de medición de e'rectos citostáticos o citotóxlcos anterionnente desentos.

{0105) En una forma de realización, la necrosis e~i medida por la capacidad o incapacidad de una célula para aceptar un colorante tal como rojo neutral. azul de tlipán. o ALAMAR'"" (page et al., 1993. InH. J. Onoology 3:473476). En lal ensayo, las células se incuban en medios conteniendo el colorante. las células se lavan, y el colorante restante, reflejandO la aceptación celular del colorantE~, se mide espectrofotométricamente.

[0106] En otra forma de realización, el colorante es sulfomodamina B (SRB), cuya unión con anticuerpos puede usarne como una medida de cÍtotoxiCidad (Skehan el aJ., 1990. J. Nafl Cáncer Insl. 82:1107-12).

{0107] En otra fonna de realización mas, una sal dI;' tetrazolio, tal como MTT. se usa en un ensayo COIorimétrico cuantitativo de supervivencia y proliferación de células de mamfferos detectando células vivas, pero no muertas (véase. p. ej., Mosmann, 1983. J. Immunol. Métodos 65:55-63).

(0108] En otra fORna de realización más, las células apoptóticas se miden en el compartimento unido y en el "flotante-del cultivo. Ambos compartimentos se mcogen eWminando el sobrenadante, lripsinizando las células unidas. y combinando ambas preparaciones después de una fase de lavado de centrifugado (la minutos. 2000 r.p.m.). El protOcolo para tratar cultivos de células tumorales con suliooac y compuestos relacionados para obtener una cantidad significante de apoplosis se ha descrito en la bib60grafla (véase, p. ej .• PiazZa et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16). Las caracterfsticas de esh~ método inCluyen recoger las células flotantes y unidas, la Identif1cación de los tiempos de tratamiento y rango de dosis óptimos para observar la apoptosis. y la identificación de condiciones óptimas de cultivo celular.

(0109) En otra forma de realización más, la apoptosis se cuantifica midiendo la fragmentación de AON. Hay dispc> nibles métodos fotométricos comerciales para la dElterminaciOn cuantitativa in vitro de la fragmentación de AON . Ejemplos de ensayos de este tipo, incluyendo TUNEL (que detecta incorporación de nucle6tidos marcados en AON fragmentado) y ensayos basadOs en ELlSA. se describen en Biochemica. 1999, n02, págs. 34-37 (ROChe Molecular BioChemicaIS).

{0110] En otra forma de realización más, la apoptosis se puede observar morfolOgicamente. Tras el tratamiento con un anticuerpo de prueba. se pueden analizar cult.ivos para apoplosis y necrosis por microscopia fluorescente después del marcado con naranja de aaidina y bromuro de etidio. El método para medir el numero de células apoptóticas se ha descrito previamente por Ouke & Cohen, 1992, Current Protocols In Immunok>gy, Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.16. En otro modo de la fonna die realización, las células pueden marcarse COI1 el yoduro de propidio del colorante del AON, Y las células en las que se han observado cambios morfológicos tales como condensación de cromatina y maruinaClón a lo largo::l de la membrana nuClear intema, condensación citoplásmica, blebbing de membrana aumentado y contracción celular.

[01111 En otra fOlTTla de reaUzación más. los efectos citotóxicos y/o citostáticos pueden detenninarse midiendo el nivel de incorporación de bromodeoxiuridina. Las c:élulas se cultivan en medios completos con un anlicuerpo de prueba. En momentos diferentes, las células se marcan con bromodeoxiuridlna para detectar la sínlesis de AON naciente, y con yodo de propidio para detectar el oontenido de AON total. Las células marcadas se analizan para averiguar la posición del cido celular por citometria de flujo usando el programa infonnátlco Cellfil de BectonDick.inson tal y como se ha descrito anterionnentl~ (Donaldson el al.. 1997, J. Immunol. Melh. 203:25-33). Un ejemplO de uso de la incorporaclón de bromodeoXlurldina para detennlnar los efectos citostátloos y/o cltot6X1cos du los anticuerpos anti-C030 de la invención se describ'e en la Sección 9, abajo.

5.4 ÁCIQQS NUCLEICOS

(0112) También se describen ácidos nucleicos C()mprendiendo una secuencia de nude6tidos codificandO una

Pl"oteina, y fragmentos de la misma. los aodos nudlelcos preferiblemente codifican uno o más COR de anticuerpos

que enlazan con C030 y ejercen efectos citotóxico:s O citostáticos en células de HO. Addos rA.Jdeicos ejemplares

comprenden la SEC 10 NO:3. SEC 10 NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO: 11 , SEC JO NO:13, SEC 10 NO:15, SEC ID

NO:19, SEC ID NO:21, SEC ID NO:23, SEC ID NO:27. SEC 10 NO:29 o SEC 10 NO:31. Los ácidos nudeicos

preferidos compnmden la SEC ID NO:l , SEC ID N():9, $EC ID NO: 17, O SEC ID NO:25. (véase la Tabla 1 en las

páginas 9-10. arriba, para la identificación del dorninio de AC10 o HeFi-1 a los cuales estos identificadores de

secuencia corresponden).

[0113) También se describen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones de hibridación rigurosas, moderadas o poco rigurosas, para los ácidos nucleicos, preferiblemente, ácidos nucleicos codificando un anticuerpo de la invención.

(0114J A modo de ejemplo y no de limitación. a corltinuación hay procedimientos que usan taJes condiciones poco rigurosas para regiones de hibndación de alrededor de 90 nucleótidos (véase también Shilo and Weinberg, 1981,

Proc. Nat!. Aced. Sci. U.SA 78,; 6789-6792). Los filtros conteniendo AON se pretratan durante 6 horas a 4Q"C en una solución conteniendo un 35% de formamida, 5X de sse, 50 mM de tris-He! (a pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0,1% de PVp. 0,1% de Ficoll, 1 % de BSA, Y 500 ~glml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. las hibridaciones se realizan en la misma solución con las modificaciones siguientes: 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0.2% de BS~ 100 ~glml de AON de esperma de salmón, 1()O.k (pIVQ1) de sulfato de dextrano, y se usa una sonda marcada con P de 5-20 X 106 cpm. los filtros se incuban en una mezc~a de hibridación durante 18-20 h a 4O"C, y después se lavan durante 1,5 H a 5S"C en una solucibn que contiene 2X de sse, 25 mM de trls-Hel (a pH 7.4), 5 mM de EDTA, y 0,1 % de SDS. La solución de lavado se sustituye por una SOlución fresca y se incuba durante 1,5 h adicional a SO"C. Los filtros se transfieren secos y se exponen a autOfTadiografia. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 6&-68e C y se reexponen a una pellcula. Otras condiC~ones de poca rigurosidad que pueden usarse se conocen bien en la técnica (p. ej., como se emplea para las hibridaGiones de cruces de especies).

[0115J Además , a modo de ejemplo y no de limitador" los procedimientos que usan tales condiciones lTkJy rigurooas para regiones de hibridación dI:! más de 90 nucle6tidos son de la Siguiente manera. La prehibridación de filtros conteniendo ADN se realiza durante 8 h o durante toda la noche a 6S"C en un tampón compuesto por 6X de SSC, 50 mM de Tris-HCI (a pH 7.S), 1 mM de EDTA. 0,02% de PVP, 0,02"10 de Ficoll, 0,02% de BSA, y 500 tJglml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtl10s se hibridizan durante 48 H a 8SGC en una mezcla de prahibridación conteniendo 100 tJg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y una sonda marcada con 32p de 5-20 X 106cpm. El lavado de filtros se r9aliza a 3r C durante 1 h en una solución conteniendo 2X de sse. 0.01 % de pvp, 0,01% de FiCoIl, y 0,01% de aSA. Esto va :seguido por un lavado en O,1X de SSC a 50°C dUrante 45 mil'! antes de la autorradiografia.

[0116] Otras condiciones de alta astringencia que pueden usarse dependen de la naturaleza del ácido nudeico (p. ej. longitud, contenido de GC, etc.) y el propósito de i\a hibridación (detecciOn, amplificación. etc.) y se conocen en la técnica. Por ejemplo, la hibridación rigurosa de un ácido nucleico de aproximadamente 15-40 bases a una secuencia complementaria en la reacciOn en cadena de poIirt1erasa (PCR) se realiza bajo las condiciones siguientes: una concentración de sal de 50 mM de KCI , una concentraciOn de tampón de 10 mM de Tris-HCI , una concentración de Mrj· de 1,5 mM. un pH de 7-7.5 y una temperatura de anillado de 55-6Q°C.

(0117] En otra fonna de realización especifica, se provee un ácido nudeico hibridizable a un ácido nucleico, O su complemento, bajo condiciones de rigurosidad moderada. La selecciOn de condiciones apropiadas para este tipo de rigurosidades se conoce bien en la técnica (véase p. ej., Sambrook el al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-Ed., Cold Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harber, New York; véase también, Ausubelet e/., eds., en Current Protocols in Molecular Biology smies of laboratory technique manuals, ® 1987-1997, Current Protocols, O 1994-1997 John Wiley and Sons, Ine.).

[0118} Pueden obtene~e los ácidos nucleicos, y puede determinarse la secuencia de nuc\eótidos de los ácido& nucleicos determinados, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleOtidos de la protelna se conoce, un écido nuCleico codifican(4) el anticuerpo puede ensamblarse 8 partir de oIigonucleótidos quimicamente sintetizados (p. ej., como se descfi1be en Kutmeier el al. 1994, BIoTechniques 17:242), lo que, brevemente, Implica la síntesis de oligonucle6tidos de superposición conteniendo partes de la secuencia que codifican la proteina, el anillado y el ligado de estos oligonucle6tidos, y después la amplificación de los oligonucle6tidOS ligados por PCR.

[0119J De fonna altemativa, un ác:kIo nucleico que codifique una proteína puede generarse a partir de ácido nudeíco de una fuente adeo..aada. Si un don conteniendo un ácido nudeico Que Codifique una protelna particular no esta disponible, pero la 5eCUencia de la molécula de la proteína se conoce, un ácido nucleico que axlifique la proteina puede sintetiz.arse químicamente u obtenerse a pal11r de una fuente adecuada (p. ej., una genoteca de ADNc tal como una genoteca da ADNc de un anticuerpo o una genoteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente poli A+ ARN, aislaclo de cualquier tejido o célula que exprese la protelna. Si la protelna es un anticuerpo, la fuente de la IibreMa pueden ser célula:5 dal hibridom~ seJe&cionadas para expresar el anticuerpo de la invenciOn) por amplfficadOn de PCR usando cebadores sintétIcos hibridizables a los extremos 3' y 5' de la secuencia

o clonación usando una sonda de oligonucle6tidos Hspecíflca para la secuencia de genes particular a identificar, p. ej., un clon de ADNc a partir de una genoteca de A[)Nc que COdifique la proteína. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden donarse entonces en v'eClores de clonación replicab4es usando cualquier método bien conocido en la téalica.

[0120] Una vez se han determinado la secuencia de nucJaótidos y la secuencia de aminoacidos correspondientes de los anticuerpos, la secuencia de nucle6tidos de la prtlteina puede manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulacibn da secuencias de nUGIa6tidos, p. ej .. téCnicas de ADN recombinantes, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Clonlng. A Laboratory Manual, 2-Ed., Cold Spring Harbof Lal:!oratory, Cold Spr1ng HarbOr, NY y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar anticuerpos con una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplO para crear sustituciones de aminoácido, deleciones y/o inserciones.

18 S

lS

2S

3S

SO

SS

[012t1 En una forma de realización especifica, la pmteina es un antiruerpo, y la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera pueden inspeccionarse para identificar las secuencias de las CoR por métodos que se conocen bien en la técnica. p. e:i .. por comparaciOn con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de sacuencia. U$élnclo tecoicas de AON recomblnantes rutinarias, una o más de las CoR pueden insertarse dentro de regiones liPO, p. ej., en regiones tipo humanas para humanizar un anticuerpo no humallO, como se describe aniba. Las regiones tipo pueden tener origen natural o ser n~iones tipo consensuadas, y preferiblemente son regiones tipo humanas (véase, p. ej., Chothia el al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 para catalogar regiones de estructura humana). El addo nucleico generado por la combinalCi6n de las regiones tipo y CoR codifica un anticuerpo que se enlaza especificarnente con COJO y ejen::;e un efttelo citostático '110 citotóxico en células de HO. Preferiblemente. como se ha tratado anteriormente, poe(len realizarse una o más sustituciones del aminoácido dentro de las regiones lipo, '/, preferiblemente, las sustituciones del aminoáGido mejoran la unión del anticuerpo con COJO ,//0 para realzar el efecto citostático '110 citotóxico del anticuerpo. Adicionalmente. pueden usarse métodos de este tipo para hacer sustituciones de aminoácidos o deleciones de uno o más residuos de cisterna de regiOn variable participando en un enlace de disulfuro dentro de la cadena para genera.r moléculas de anticuerpos Cél'entes de uno o más enlaces de disulfuro dentro de la cadena. otras alteraciones al ácido nucleico están comprendidas en la experiencia en la técnica.

[0122] Además. pueden usarse técnicas desarrolladas para. la producci6n de "anticuerpos quiméricos" (Moniscn el 81., 1984, Proc. Nat!. Aced. SO. 81 :851-855; Neul).~rgen et al., 1984, Nature 312:604-608: Takeda et aJ., 1985, Nature 314:452-454) uniendo genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de una especiñcidad de antigeno apropiada junto con genes a partir de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológ ica apropiada. Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual partes diferentes se derivan de distintas especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región con$1ante de inm.moglobu]ina humana, Ip. ej., anticuerpos hwnanizados.

[0123] De forma altemativa. líocnlcas descritas para la producción de anticuerpos monocatenalios (patente U.S. n° 4.946.778; Bfrd. 1988. Science 242:423-42; Huston E,t si.. 1988. Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883: '/ Ward 8t al.. 1989, Nature 334:544-54) pueden adaptarsl~ para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarlos se forman conectando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de al'llinoácidos. dando como resultado una proleína monocatenaria. También pueden usarse técnicas para e{ ensamblaje de fragmentas funcionales de Fv en E. Co/i (Skerra et al.. 1988. Science 242: 1038·1041).

5.5 SECUENCIAS RELACIONADAS CON ACtO Y HEFI-1

[0124] la presente invención comprende además anllCUerpos comprendiendo una regiOn de homologia con las COR de AC10 '/ HeFi-t . o las regiones codlficantes de los mismos, respectivamente. En diferentes fOflTlas de realización , la reglón de homologia se caracteriza por al menos un 50%. al menos un 55%. al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 8()'Yo, al menos un 85°,{.. al menos un 900/0, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad con la región correspondliente de AC10 o HeFi-1 .

[0125) En una forma de realización. la presente IWI!nción comprende un anticuerpo con una región de homologra con una COR de HeF"'1 (SEC ID NO:20. SEC ID NO:22. SEC 10 NO:24, SEC ID NO:28, SEC 10 NO:30 o SEC ID NO:32). En otra forma de realización. la presente in\lención comprende un anticuerpo con una región de homotogla con un CoR de AC10 (SEC ID NO: 4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:8. SEC ID NO:12. SEC ID NO: 14, o SEC 10 NO:

16).

(0126] la presente invención comprende ademas a:nticuerpos que comprenden una regi6n de homologra con las regiones valiables de AC10 '/ HeFi-1 , o la región de codificación de tos mismos, respectivamente. En diferentes formas de realización, la reglOn de homologla se caL'aCtenza por al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%. al menos un 70%. al menus un 75%. al menos un 800/0. al menos un 85%, al menos un gOOk, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad con la regiOn correspondiente deAC100 HeF¡·1 .

(0127] En una forma de realización, la presente inv!!nciOn comprende un anticuerpo con una regiOn de homologla con una reglón variable de HeFi-t (SEC 10 NO: 18 o SEC ID NO: 26). En otra forma de realización, la presente invención comprende un anticuerpo con una región de homologfa con una región variable de AC10 (SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 10).

10128J Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos. p. ei. entre las secuencias de una región variable de AC1 O o HeFi·' y secuencias de otrOs anticuerpos con regiones de homologra con la regiOn variable de AC10 o HeFj.·1, las secuencias se alinean con propósitos de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de un primer aminoácido o secuencia de ácidos nucleicos para la alineación óptima con una aégunda secuencia de amino o de ácido nucletco). Después se coTJl)8ran los residuos aminoacidos o nucle6tidos en posiciones de aminOácidos o posiciones de nudeótides correspondientes. Cuando una pD5ición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo aminoácido o nucle6tido como la posición correspondiente en la ~!9Unda secuencia, entonces las mOléOJlas son idénticas en esa

'9

S

2S

3S

SS

posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una fu'ldón del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de iderltidad = ti de idénticas posicionesltotal ti de posiciones (p. ej., posiciones de superposici6n) x 100). En una forma dEl realizaCión, las dos secuenCias tienen la misma longitud.

{O129] La determinación de identidad porcentual E~ntre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitativo de un algQlitmo matematico utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Kanin y Altschul. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 87:2264-2268. modificado como en Kar1in y AttSChul. 1993, Proc. Nat!. Acad. Sd. U.S.A. 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altscnul. et at., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-<410. Las búsquedas de nucleOtidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST. puntuadÓll::; 100, longitud de palabra =12 para obtener secuenCias de nucle6tidos homólogas a un áCido nucleico codific:ando una proteína modificadora SCA-l . Las busquedas de proteína BLAST pueden realizarse con el programa )(BLAST, puntuación = 50, longitud de palabra =3 para obtener secuencias de aminoilddos homologas a una protelrla modificadora SCA-l . Para obtener alineaciones distanciadas con fines de comparación, se pUede utilizar BLAST distanciado como se describe en A1tschul 8t al., 1997. Nudeic Acids Res. 25:3389-3402. De forma altemativa. se puede utilizar PSl-BLAST para realizar una búsqueda repetida que detecte relaciones de distancia entre moléculas. (Id.). Al utilizar los programas BlAST, BLAST distanclado. y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respeaivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlln.nih.gov. Otro ejemplo prefl! rido y no limitador de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de MyElrs y Miller. CABlOS (1989). Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (verslón 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Utilizando el programa ALlGN para secuencias de aminoácidos ele comparación, se pueden usar una tabla de reSiduo de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12. y una penalización de espacio de 4. Se conocen en la tecnica algoritmos adicionales para el anillisis de secuencias e induyen ADVANCE y ADAM como se describe en Tore\lis y Robotti. 1994, Compul. Appt. BioSci_. 10: :3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es unel opción de control que configura la sensibilidad y velOCidad de la búsqueda. Si ktup=2. se obtienen regiones slmilanes en las dos secuencias que se comparan mirando en parejas de residuos alineados; si k1up""l , se examinan aminoácidos alineados únicos, ktup puede configurarse en 2 6 1 para secuencias protéicas, o entre 1 y 6 para secuencia:s de ADN. Por defecto si ktup no está especificado es 2 para protelnas y 6 para AON. Para una descripCión de parámetros de FASTA mils detallada, véase

http://bioweb.pasteur.fr/docslmanATIanlfasta.l .htmltl$E~

[0130] De forma altemativa, la .. lineadón de la $ecuencia proteica puede realizarse usando el Algoritmo Cl USTAl w, corno se describe por Higgins er al. , 1996, MeUlOCls Enzymol. 266:383-402.

[0131J la identidad porcentual entre dos SéClJe11cias puede detenninarse usando técnicas similares a las anteriormente descritas, permitiendo o sin permitir e:spad os. Al calcular la identidad porcentual, sólo se cuentan las coincidencias exactas.

MÉTOOOS PARA PRODUCIR LOS ANTICUERPOS CE LA INVENCIÓN

'.6

[0132] los anticuerpos. de la invenci6n se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica para la slntesls de protelnas, en particular. por slntesis qulmica o preferiblemente, por técnicas de expresión recombinante.

(0133] la expresi6n recombinante de un anticuerpo de la invención, incluyendo un fragmento, derivado o anak>go del mismo, (p. ej .• una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención) requiere la construcción de un vector de expresión eonteniendo un écido mJCIeieo que codifique el anticuerpo. Una. vez se ha obtenido un acido nuc\elco codificando un anticuerpo de la invención. ~~ vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnologia de ADN recombinante usnndo téalicas bien conocidas en la técnica. Asf, en la presente memoria se describen metados para preparar un anticuerpo expresando un ácido nuCleico que contiene una ~ecuenci9 de nUCle6tidos que codifica dicho anticuerpo. Métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir vectores do expresión conteniendo secuencias codificantes y senales de control transcripcionales y traduccionales aproplaclas. Estos métodos induyen, por ejemplo, técnicas de AON recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, y recomb~nadón gené~ca in vivo. Se desa1ben vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención operativamente enlazado a un promotor. La secuencia de nudeótidos puede o)(Jificar una cadena pesada o ligera relacionada, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, operativamente enlazado a un promotor. Vectores de este tipo pueden ind uir la secuencia de nuCle<ltldos que codifica la regioo constante de la molécula de anticuerpos (véase, p. ej.. la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89,.o1()36; y la patente U.S. n° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede donarse en tal vector para la exprE$lón de toda la cadena pesada o ligera.

[0134J El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante téC1icas convencionales y las células

modificadas se cultivan después por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. También

se describen células huésped que contienen un ácido nudeico codificando un anticuerpo de la invención,

operativamente enlazado a un promotor heter6Iog'o. En formas de realización preferidas para la expresión de

anticuerpos de dOble cadena, los vectores codifican,do tanto la cadena ligera como la pesada pueden coexpresarse

en la célula huésped para la expresión de la molécul;a de inmunoglobulina entera, como se detalla abajo.

(0135) Puede utilizarse una variedad de sistemas de vectores de expresión huésped para expresar lOs anticuerpos de la invención. Tales sistemas de expresión huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posterionnente purificarse, pero también representan células que pueden, al transformarse o transfectarse con las seclJencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresar un anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como baderias (p. ej. ,

E. colI, B. subtilis) transformadaS con AON bacteriól'ago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido conteniendo secuencias codificante:s de anticuerpos: levadura (p. ej .. Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes conteniendo secuencias codificantes de anticuerpos: sistemas de céllJas de insedos infectcldos con vectores de expresión de virus reccmbinante (p. ej. , baculovirus) ccnteniendo secuencias codificantes de antíruerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión recombinantes de virus (p. ~~j .. virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco. TMV) o transformados con vectores de expresiOn de Plásmido recombinantes (p. ej., plásmidO TI) conteniendo sewenclas codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (p. ej., las células COS, CHO. BHK, 293. 3T3) conteniendo constructos de e)qlresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamlferos (p. ej. , promotor de! la metalotiOnelna) O de virus de mamlferos {p. ej., el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinial. Preferiblemente, células bacterianas tales como Escherichia coli, y mas preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la expresIón de moléculas de anticuerpos enteras recombinantes, se usan para la expresión de una protelna recombinante de la invención. Por ejemPlo, células de mamiferos tales como células ováricas de hémstec chino (CHO) , conjuntamente con un vector tal como el elemento promotor más importante del glen temprano intermedio a partir del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para protell\8S de la ¡nvenc16n (FoecIting et el., 1986. Gene 45:101 ; Codc:ett et al., 1990, BioITechnology 8:2).

[0136) En sistemas bacterianos. varios vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso previsto para los requisitos de modificaci6r' del pliegue y la post-traducción del anticuerpo que se está expresando. Donde sea posible, cuando una gran cantidad de tal anticuerpo se va a producir, para la generación de composiCiones fannacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención. pueden ser deseables los vectores que dingen la expresiOn de altos niveles de ProduCb;¡ de proteina de fusión que se purifican t.\dlmente. Vectores de este tipo induyen, pero no se limitan a, el vector die expresión pUR278 de E. con (Ruther st al., 1983, EMBO 1.

2: 1791 l, en el que la secuencia cooficante del anticu.erpo puede ~garse inclividuamente en el vector en la estructura con la regiOn codificante lac Z de modo que se produce una proteina de fusiOn; vectores plN (Inouye & Inouye. 1985. Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schusler. 1989, J. BioL Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar proteínas de fusiOn con glutationa-S-transferasa (Gsn. En general. tales protelnas de fusión son solubles y pueden purificarse facilmente a partir de células lisadas por adsorci6n y uni6n con microesferas de glutatiooa-ag;3Irosa matricial segUida de la eluciÓfl en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX estén diset'iados para incluir trombina o sitios de rotura de trombina o de proteasa factor Xa de manera que el producto genético Objetivo Clonado puede liberarse a partir de la fracci6n GST.

[0137] En un sistema de insecto, se usa el virus de polihedrosis nuclear Autografa cafifomica (AcNPV) como U'I vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperoa. La secuencia codificante del anticuerpo puede donarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina).

[0138] En células huésped de mamíferos, se pued.en utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. En casos donde un adenovirus se usa como un vectm de expresiOn. la secuencla codificante del anticuerpo de la invención puede Hgarse a un complejO de control eJe la transcripci6nltraducciOn del adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia gula tripartita. Este gen quimériCO puede insertarse después en el genoma del adenovirus por recombinaelón in vitre o in vivo. La inserción en una regi6n no esencial del genoma vírico (p. ej. , la región E1 o E3) resultaiá en un virus recombinante via"'e y capaz dEl expresar la proteína de la invendón en huéspedes infectados, (véase, p. ej., Logan & Shenk, 1984, Proc. Nat!. A.cad. Sci. EE. UU. 8 1: 355-359). También pueden requerirse se/'la\es de inlciaci6n especificas para la traduCCión eficaz de secuencies codificantos insertadas. E¡¡¡bas &&l\al&s incluyen el COdOn iniciador ATG y secuencias contiguas. AdcmB3. el cod6n iniciador debe ester sincronizado con el marco de lectura de la seQJencia codificanle dese;ada para asegurar la traducción de la inserciÓl'l entera. Estas señales de control traduccionales exOgenas y codones de inielación pueden ser de una variedad de orígenes. ambos naturales y sintéticos. La eficiencia de 181 expresión puede mejorarse por la indusión de elementos intensificadores de la transcripción apropiados, t6\.'1"Oinadores de transcripciOn, etc. (véase Bittner el 81., 1987. Methods in Enzymol. 153:51-544).

[01391 Además, puede seleccionarse una cadena dl~ la célula huésped que module la expresión de las seOJenCias insertadas, o modifique y procese el producto genético de la forma especifica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glicosilaci6n) y tratamientos (P. ej., ruptura) de productos de proteina pueden ser importantes para la función del anticuerpo de la invención. Diferentes Células huésped tienen mecanismos coractelisticos y especificos para el tratamiento post-traducclonal y modificación de protainas y productos genéticos. Se pueden elegir lineas celulares apropiadas o sistemas huésped para asegurar la modificación y el tratamiento correctos de la proteina forénea exprasade. Con este fin, pueden usarse células huésped eucarióticas que posean la maquinaria celular para el tratamiento apropiado de la transcripción primaria, ~llieo!i!aci6n. y fosfol1lación del producto genético. Tales células huesped de mamiferos incluyen pero no se limitan a CHO. VERO. 8HK, Hela, Cos, MOCK, 293. 3T3, y W13B.

(0140] Para la producción a largo plazo y con allo rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las lineas celulares que expresan de forma estable el anticuerpo de la invención pueden crearse genirticamente. MejOr que usando vectores de expresión que contengan oñgenes víricos de replicación, las células huésped pueden transformarl>e con ADN controlado pOr elementos de control de expresión apropiados (p. ej., promotor, intensiflcador, secuem::ias, terminadores de tranSC"pci6n, sitios de poIiadenilaci6n, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, las cétulas creadas genéticamente pUeden dejarse crecer durante 1-2 dlas en unos medios ennqueddos, y después se trasladan a unos medios selectivos. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selecci6n y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus Cromosomas y crecer para formar focos que a su vez pueden donarse y expandirse en lineas celulares. Este méltodo puede usarse ventaJ~l't1Qnte para crear genéticamente lineas celulares que expresen el anticuerpo de la inve:nción.

(0141) Se pueden usar varios sistemas de selección, incluyendo pero no limitándose a los genes timidinquinasa del virus herpes simplex (WlQler et 8/., 1977, CeIl11:Wi), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Nat!. Acad. Sci. EE. UU. -48:2(2), y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy sr a/., 1980. Cel! 22:8-17), pueden emplearse en las células tk-, h~IPrt-o aprt-. respectivamente. También, la resistencia a los antimetabolitos puede usaf$e como la base de selecOón para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (VVigler er al., 1980, Proc. Nat!, Aced. Sci. U,S.A. 77:357; O'Hare el al.• 1981, PfQC. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 78:1527); gPl, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulljgan & Berg, 1981, Proc. Nat!. Acad. Sci. EE. UU. 78:20n); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G 418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann, Bav. Pharmacol. Toxico!. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ana. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11(5): 155215); e hygro, que confiere resistencia a la hi9romlcina (Santerre er a/., 1984, Gene 30:147). Métodos oomOnmenle conocidos en la técnica de la tecnologia del AON recombinante pueden aplicaf$e n.rtinariamente para seleccionar el don reccmbinante deseado, y se describen métodOos de este tipo, por ejemplo, en Ausu~ el al, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY (1993): Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stodcton Press, NY (1990); y en los Capitulos 12 y 13. Drac:opoli el al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John WitEry & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981. J. Mol. Biol. 150:1, que se incorpora por referencia aqui en sus totalidades.

(0142) Los niveles de expresión de un anticuerpo die la invención puede aumentarse por amplificación de vector (para una reviSión, véase Bebbington y Hentschel, "The Use of Vectors Based 01'1 Gene Ampliñcation tor the Expression 01 Clonad Genes in Mammallan Cells in ONY Cloning", Vol3. (Acaclemic Press, New VOri<, 1987» . Cuando un marcador en el sistema del vector que e:(presa el anticuerpo es amplificable, el aumenlO en el nivel del inhibidor presente en el cultivO de la célula huésped aumentará el numero de copias del gen marcador. Como la región amplificada se une con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo de la invención también aumentará (Crouse el al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

(0143] La célula huésped puede comodificarse con dos vectores de expresión, el pnmer vector codificando una proteína derivada de cadena pesada y el segundO vector codificando una proteína derivada de cadena ligera. Los doS vectores pueden contener marcadores selecciOl~ables idénticos que permiten igual expresión de proteínas de cadena pesada y ligera. De forma alternativa, puede usaf$e un único vector que codifique, y sea capaz de expresar, ambas proteínas de cadena pesada y ligera. En tales situaCiones, la cadena ligera deberla estar colocada delante de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada tóxica libre (Proudfoot, 1986. Nature 322:52 (1988); Kohler, 1980, Proc. Nat!. Acad. So. U.S.A. 72:2 1!17). laS secuenciaS codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden colTllrender AONc o AON genOmico.

¡0144] Una vez se ha producido un anticuerpo de la invenci6n por un animal, se ha sintetizado qulmicamente, o

expresado recombinantemente, puede purfficarse p:)( cualquier método conocido en la técnica de purificación de

protelnas, por ejemplo, por cromatografía (p. ej., intercambio iónico; afinidad, paniculannente por afinidad con el

antígeno especifico, Proteína A (para moléculas de ¡anticuerpos, o afinidad con un compat\ero de fusión heteróloga

donde el anticuerpo es una proteína de fusión; y calaJtar [a cromatografia de c:olumna), centrifugado, solubilidad

diferencial, o por cualquier otra técnica estándar paral la purmcación de proteínas.

(0145] Tarrbién se describen proteínas de unión con CD3 recombinantemenle fundidas o químicamente conjugadas (induyendo la conjugación covalente y la no covalente) a proteínas heterOlogas (preferiblemente de al menos 10, 20, 30,40,50,60,70,80, 90 o al menos 100 aminoédclos) de la presente ¡nvendOn para generar protelnas de fuslOn. La fusión no debe ser necesariamente directa, pero puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras.

[0146] También se describen composiciones comprendiendo proteínas fusionadas o conjugadas a otros dominios de anticuerpos diferentes de las regiones variables. Por ejemplo, las protelnas pueden fusionarse o conjugarse a una r9gión Fc del ~nticuerpo, o parte de la misma. La pélne del anticuerpo fusionada a una proteílla puede comprender la región constante, región de bisagra, dominio CH1 , dominio CR2, y dominio CH3 o cualquier combinación de dominios enleros o p9rtes de los mismos. Las prolelnas lambién pueden fusionarse o conjugarse con las partes del anticuerpo de arriba para formar multímeros. Por ejemplo, las partes de Fe fusionadas con las protelnas pueden formar dimeros a través de la unión de disulfuro entre las partes de Fe. Pueden hacerse formas multiméricas más

al1as fusionando las proteínas a partes de IgA y IgM. Se conocen en la técnica metodOs para fustonar o conjugar las protelnas a partes de antiruerpos. Véase, p. ej., las palentes estadounidenses nO 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112.946; EP 307.434: EP 367.166; publicaciones PCT WO 96104388; WO 9 1106570; Ashkenazi el al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. EE. UIJ. 88:10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590

S 5600; Y Vil et al., 1992, Proc. Nat!. Acad. Sci. EE: UU. 89:1 1337-11341 .

5.7 CONJUGADOS Y PROTEINAS PE FUSlOti

[0147} Como se ha tratado arriba, \os anticuerpos oe la invención comprenden protelnas que enlazan con CD30 y ejercen un efecto citost:.\tleo y/o citotóxico en células de HD. y estos se fusionan o oonjugan después con protelnas heterólogas o agentes citotóxicos.

[01481 la presente invención proporciona por tente) un tratamiento para la enfermedad de Hodgkin mediante la administración de un anticuerpo de la invención. lo~~ anticuerpos de la invención incluyen pero no se limitan a: los anticuerpos AC10 y HeFi-1 y análogos y derivados di! los mismos (p. ei., como se describe en este caso arriba);

[0149] En formas de realización deteminadas de la invención, Un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente para mejorar sus propiedades citot6xicas y/o citost~ticas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención

15 puede administrarse como ur, conjugado. Fracciones partlculam&nte adecuadas para la conjugación con anticuerpos de la invención son agentes quimiotElrapéuticos. enzimas de conversión a profármacos, isótopos radiactivos o compuestos, o loxlnas_ De forma alternativa, un acido nucleico puede modificarse para acoplar funcionalmente la secuencia codificante de una enzima de conversión a prof~nnaco con la secuencia codificante de un anticuerpo de la invención, de manera que una protelna de fusión que comprende la enzima de conversión a profámaco funcionalmente activa y el anticuerpo de, la invención se expresa en el sujeto bajo la administración del ~Cido nudeico conforme a los métodos de la terapia genética descritos en la sección 5.7. abajo.

[0150] En una foma de realización, un anticuerpo de la invención se fusiona con una secuencia marcadora, tal como un péptido, para faci~tar la purificaciÓfl. En formas de realización preferidas, la secuenda de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histldina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259

25 Eton Avenue. Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. A(~. Sci. EE. UU. 86:821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purlficacibn conveniente de la proteína de fusión . Otros KtenUficativos peptídicos útiles para la purificación incluyen, perO no se limitan a, la marQI "HA", que corresponde a un epllopo derivado de la pmtelna de hemagglutinin de la gópe (WilsOn et al., 1984, Cel! 37:767) y la marca "flag". Protelnas de fusión de este tipo pueden generarse por métodos recombinantes estándares CQnoddos por los de expertos en la técnica.

[01511 En otra foma de realización, los anticuerpos de la ¡nvendón se fusionan o conjugan con un agente

terapéutico. Por ejemplo. un anticuerpo de la invención puede conjug8f'S9 con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (~. ej., un agente citost81:ico o citocldal), o un radlonucleido (p. ej., alfaemisores tales como, por ejemplo, 2126i• 1'M, o betst-emisores tales como, por ejemplo, \JII, 'lOy, o 67CU).

35 [0152] Fármacos tales como metotrsxato (Endo et BI/., 1987, Cancer Research 47:1076-1080). daunomicin (Gallego et al., 1984. In\. J. Cancer. 33:737-744), mitomicina C (MMC) (Ohkawa el al., 1986, Canoer Immunol. Immunother. 23:81-66) y alcaloides vinca (Rowland et al. , 19f~. Csncer Immunol Immunothec 21 :1 83-18n se han unido a anticuerpos y los conjugados derivados se han uti!i¡tado en un estudio sobre actividades antitumorales. Se deberia tener cuidado en la generación de conjugados de agentes quimioterapéuticos para ase9urar que la actividad del fármaco y/o de anticuerpos no disminuye como resultado del proceso de la conjugación.

[0153] Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen las siguientes clases no mutuamente exClusivas de agentes qulmioterapéuticos: agentes alquilantes, antracidina.. antibióticos, antlfolatos, antimetabolitos, agentes de antitubulina, auristalinos. sensibilizadores a la quimioterapia, ligandos de unión al surco menor de ADN, inhibidores de replicación de AON, duocalmicinas, etoposidaS, pir'midinas fluorinadas, lexitIopsinas, nitrosoureas, platineles,

45 antimelabolitos de purina, puromicinas, senslbili'!adores a la radiación. esteroides, taxanos, inhibidores de tOpOisomerasa, y alcaloides de vinca. Ejemplos de quimioterapéuticos individuales que se pueden conjugar a un ácido nudeico O prote'lIla de la Invención IncJuy1en pero no se limitan a un andrógeno, artramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomiciml, busulfano, sulfoximina butionina, cam¡:totecina, carbOplatina, camusUna (BSNlJ), CC-1065, Cloralllbucil. cisplatina, colchlCina, cid ofosfamlda, citarabiOlS, arabinÓ3ido d" Citidina, cilochalasin B, dacarbazina, dactinomidna (antiguamente actinomicina), daunorubicina, decarbazlna, docetaxel, doxorubiclna, un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina, 5-11uorouradl, gramicidins D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamiela. irinotecan, lOmustlna (CCNIJ), meclore18mina, melfl~Ján, 6-mercaptopurlna. metotrexato, mltramlclna, mitomiClna C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, streptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán. vinblastina. vincristina. vinorelbina. VP-'I6 y VM-26. En una forma de realización preferida, el agente

SS quimioterapéutico es auristatin E. En una forma de realización más preferida, el agente qulmioterapéuticO es el AEB derivado de auris\atin E (como se descrtbe en la solicitud norteamericana n-Og/845.786 solicitada el 30 de abril de 2001).

SO

SS

[01541 los conjugados de la invención usados para aumentar el efecto terapéutico del anticuerpo de la invención inCluyen agentes terapéuticos no tradicionales tales como toxinas. las toxinas de este tipo incluyen, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina difbenca.

[01551 las téCnicas para conjugar tales fr~cciones terapéuticas con anticuerpos se Conocen bien, véase, p. ej., Amon el al., "MonocIonal Anlibodies For Immunotaq¡eling Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoctonal Antibodies And Canear Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 24¡l-56 (Alan R. Uss, lne., 1985); Hellstrom el al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a ed..), RQbinson el al. (eds.), págs. 623-53 (Mareel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody CarTiers Of Cytotoxic Agent~ In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pégs. 475-506 (1Q85): "Analysis, Results, And Future prospective Of The Therapeli:ic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Tllerapy·, in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therepy, Baldwin el al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

(0156] De forma alternativa, un anticuerpo de la inVE,nción puede conjugarse a un segundo antlcu8fPo para formar un anticuerpo heteroconJugado como se describe por Segal en la patente estadounidense n" 4.676.980.

[0157) Como se ha mencionado anterionnente, e'n formas de realización detenninadas de la invención, un anticuerpo de la invención puede coadministrarse con una enzima de conversión a profármaco. La enzima de converSión a profármaco puede expresarse como una protelna de fusión con o conjugada con un anticuerpo de la invención. Enzimas de conversión a profánnaoo ejemplares son carboxipeptidasa G2. beta-glucuronidasa. penicilina..V-amidasa, penicilina-G-amidasa, j)-lactamasa, j3-g1ucosidasa, nitroreduClasa y carboxipeptidasa A.

5 .• TERAPIA GENÉTICA

(0158J También se describen ácidos nucleicos que:se administran para tratar, inhibir o prevenir la HD. La terapia genética se refiere a la terapia realizada po( la administraCión a un sujeto de un ácido nudeieo expresado o expresable. Los 3cidos I'Jcleicos producen su proteina codificada que media un efecto terapéUtico.

(0159] Puede usarse cualquiera de los métodos paral terapia genética disponibles en la técnica. Abajo se describen métodos ejemplares. Para revisiones generales de ~os métodos de terapia genética, véase, Gotclspiel el al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; TOIstoshev, 1993. Ann. Rev. Phannacol. Toxico!. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191217; mayo de 1993, TIBTECH 1, 1(5):155-215. MétcKtos comünmente conocidos en la técnica de la tecnologia del AON recombinanle que pueden usarse se describen en Ausubel el al. (eds.), Current Protocols in MQ¡ecular Biology. John Wiley & Sons, NY (1993); YKriegler. Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY

(1990).

[0180] En un aspecto preferido, la terapia comprende secuencias de ácidos nudeicos codificando un anticuerpo. diChas secuencias de ácidos nuclelcos siendo pal1e de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o protelnas quiméricas o cadenas pesad::lS o ligeras del mismo en un huésped adecuado. En particular, tales Secuencias de ácidos nucleicos tienen promotores operativamente enlazados a la región codificante de anticuerpos, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, especifico para el tejidO. En otra fonna de realización particular, se usan moléculas de ;!lCido nucleico en las cuales las seweocias COdificantes de anticuerpos y cualquier otra secuencia deseada se nJdean de regiones que promueven la ~mbinación homóloga en un sitio deseado en el genoma. suministrando de este modo una expresión intracromosómica de loS écidos nucleicos coditicantes de anticuerpos (Katler y Smithiies, 1989, Proc. Nall. Acad. SO. EEUU 66:8932-8935; Zijl9tra et al., 1989, Nature 342:435-438. En fonnas de realiz<Elción especificas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo monocatenario; de forma altemativa, las s;ecuencias de acidos nucleicos incluyen secuencias codificando tanto la cadena pesada como la 1igera, o fragmenlos de los mismas. del anticuerpo.

[0161] La administración de los ácidos nucleico3 en un paciente puede ser o bien directa, en cuyo caSo el pacienle está directamente expuesto al ácido nucleico o a v~!Ctores portadOfes de acido nucleico, o bien indirecta, en cuyo caso, en primer lugar las células se transfOfTTlan con los t:lcidos nuc1eicos in vffro, y después se trasplantan en el paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respect.ivamente, como terapia genética in vNO o ex vivo.

[0162] En una fonna de realización e!!;pecífic:a, la!!; ~;ecuencias de acidos nuclelcos se admini!!;tran directamente in v;vo, donde se expresan para producir el producto coeificado. Esto se puede realizar por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica. por efemplo construyéndolos como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrando el vector de modo que las secuencias de ácidos nucleicos se vuelven intracelulares. Se pueden administrar vectores de te:rapia genética por infección usando retroviricos defectuosos o atenuados u otros vectores vincos (véase, p. ej., la patente esladounidense n· 4.980.286); la inyeGCión directa de AON desnuda; el uso del bombardeo de micropmtlculas (p. ej., una pistola de genes; 6iolisllc, Dupant); el revestimiento con lipldos o receptores de superficie c:elular o agentes transfectantes; la encapsulación en liposomas, micropartlculas, o microcápsulas; la administración en conexiÓn con un peptldo conocido por introducirse en el núcleo; la administración en conexión con un sujeto de ~gandO para una eodocitosis mediada por un receptor (véase.p. ej., Wu y Wu, 1987. J. Bici. Chem. 262:44:29-4432) (lo cual puede utilizarse para tipos de células objetivo

expresando específicamente los receptores); etc. En otra forma de realización, se pueden formar complejos de ligando de ácido nooeioo en lOs que el ligando comprende un péptido vllioo fusogénico para disgregar endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosOmica. En otra forma más de realización, el acido nucleico puede marcarse como objetivo in vivo para obtener una absorci6n y una expreSi6n celular especificas, marcando como objetivo un receptor especifico (véase, p. eL las publicaciones PCT WO 92106 180; WO 92122635; W092J20316; W093f14188, y WO 93f20221). DI~ forma alternativa, el ácido nUCleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión por recombinaclón hom6\Oga (KOner y Smithles, 1989, Proc. Nat!. Acild. sa. EE. UU. 86:8932-8935; Zi~stra et al., 1989, Nature 342:435-438).

[01631 En una forma de realización específica, se usan vectores viricos que contienen secuencias de ácidos nucleicos codificando un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, puede usarse un vector retrovírico (vease Miller ef a/., 1993, Meth. EnzymOl. 217:581-599). Estos vectores retroviricos contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma virico y la in'legración en el ACN de la ceula hJésped. las secuencias de acidos nuCleicos codificando el anticuerpo para su uso en terapia genética se donan en uno o mas vectores, facilitando de ese modo la administración del gen en un paciente. Se pueden encontroc más detalles sobre vectores retrovincos en Boesen el aJ., 1994, Biotherapy 6:;!9 1· 302, que describe el uso de un vector retrovirico para administrar el gen mdr 1 a células madre hemetopoyétlcas para hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectOres retroviricos en terapia genética sOn: Clowes et al., 1994, J. CUno Invesl 93:644-651; Klein el al.• Blood 63:1467-1473; $almons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141 ; y Grossman y Wilson, 1993. CurT'o Opin, en Genetics and Ceve!. 3:110-114.

[0164J otro enfoque hacia la terapia genética implica transferir un gen, p. ej. un gen AC10 o HeFi-1, a células en cultivo de tejidO por métodos tales como por electroporaci6n, lipofecci6n. transfeccl6n mediante fosfato cálcico, o infecci6n vírica. Normalmente, el métOdo de transferencia indUye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. las células se colocan despues bajo selecciÓn para aislar las células que han absorbido y están expresando el gen transferidO. Estas células se administran despuéS a un paciente.

[0165) En esta forma de realización, el ácido nuclelco se introduce en una célula antes de la administraci6n in 11;110 de la célula recombinante resuttante. Tal introc1Jcción puede llevarse a cabo por cualquier mékldo conocido en la tecnica, inCluyendo pero no limiténdose a la tra1sfPJjxión, electroporaci6n, míaninyec.ción, infecQ6n con un vector vírico o bacteriófago conteníendo las seeuencias de ácidos nudeiCOS, fusión celular, transferencia de gen mediante cromosoma, transferencia de gen mediante micr04:e1ula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas son conocidas en la técnica para la introducción de genes foráneos en células (véase, p. ej., Loeffler y 8ehr. 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618: Cohen ef al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Phannac. Ther. 29: 69-92) y pueden usarse a condiCIón de que las funciones deS<:vt'oUables y fisiológicas necesarias de las células receptoras no se interrumpan. la técnica deberla proveer la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico sea expresable por la célula y preferiblemente hereditable y expresable por su progenie celular.

[01661 Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente por diferentes métodos conocidos en la técnica. Los gl6bulos rojos recombinantes (p. ej., las células madre hematopoyéticas o progenitoras) se administran preferiblemente por via intravenosa. la cantidad de células previstas pllra el uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede determinarse por un experto en la técnica.

[01671 Las ce!ulas en las cuales puede introducirSEI un ácido nucleico con fines de terapia genética comprenden cualquier tipo de célula deseada y disponible, e InCluyen pero no se Ymltan a fibroblastos; glóbulos rojos tales como linfocitos T, linfocitos B. monocitos, macrófagos, nautrófilos, eosin6filos, megacar\oCitos, granulocitos: diferentes células madre o progenitoras, en particular células madre hematopoyéticas o progenitoras, p. ej., como se obtienen de la médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, higadO fetal. etc.

[01681 En una forma de realización preferida, la célul.a usada para terapia genética es aut610ga para el padente.

[0169] En una fol11la ele realizaC/lln en la cual se USi:Jn células recombinantes en terapia genética, se introducen en las células secuencias de ácidos nucleicos codificando un anticuerpo de manera que éstas son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantE~s se administran después in lIivo para conseguir un efecto terapéutico. En una forma de reeÜ8ción especifica. se usan células madre o progenitoras. Cua'quier célula madre '110 progenitora que se puede aislar y mantener in vitro pueda usarse de forma potencial conforme a esta "rma de realizacl6n de la presente invención (véase p. ej. la publicación PCT WO 94108598: Stemple y Anderson, 1992, Ce!!

71: 973-985: Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21 1:22.9; y PiHelkow y Seott, 1986, Mayo Clinic PTOC. 61 :n1).

[0170) En una forma de realización especifica. el. ácido nudeico a introducirse con fines de terapia genética comprende un promotor inducible operativamente enlazado a la región codificante. de manera que la expresión del ácido nudeico es controlable al cxmlrolar la Pfesenci~l o ausencia del inductor de transcripción apropiado.

[0171] Los anticuerpos o composiciones farmacéutic~ de la invención se analizan preferiblemente in vifro. y luego jn vivo para obtener la actividad terapéutica o profi~ictica deseada, antes del uso en seres humanos. Por ejemplO,

25

S

lS

3S

los ensayos in vffro para demostrar la utilldad terapéutica o profilactica de un anticuerpo o composici6n farmacéutica incluyen determinar et efecto del anticuerpo o com~~sici6n farmacéutica en una línea celular de Hodgkin o una muestra de tejido de un paciente con la enfermedad ~je Hodgkin. El efecto citotOxico ylo citostático dei anticuerpo o composición en la linea celular de Hodgkin ylo muestra de tejido puede determinarSe utilizando técnicas conocidas para los expertos en la téwica. Un método preferido, descrito en la sección 6 abajo, implica poner en contacto un cultivo de la linea celular de la enfermedad de Hodgkin desarrollada en una densidad de aproximadamente 5.000 células en 0,33 cm Z de área de cultivo durante un periodo de n horas con el anticuerpo o composici6n farmacéutica, exponer el cultivo a O,5jJCi de 3H_timidlna durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas, y medir la incorporaci6n de 1-t-timidina en células del cultivo. El anticuerpo o composición farmacéutica tiene un efecto citostático o citotóxico en la linea celular de la enfemledad de Hodgkin y es litll para el tratamiento o prevención de la enfennedad de Hodgkin si las células del cultivo ha.n reducido la incorporación de 3H-timidina en comparación con las células de la misma linea celular de la enfermeciarl de Hodgkin cultivadas bajo las mismas condiciones pero sin estar en contacto con el anticuerpo o composición farmacéutica. De forma alternativa, ensayos in wro que pueden usarse para determinar si está indicada la administra'Ción de un anticuerpo o composidón farmacéutica especlficos, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en los que se cultiva una muestra de tejido de un paciente con la enfermedad de Hodgkin, y se expone a o de otra maruera un anticuerpo o composición farmacéutica, y se observa el efecto de tal compuesto sobre la muestra de tejido de Hodgkin.

5.9 ADMINISTRACiÓN Y COMposICIONES TeiRApÉUTICASlPRoFILÁcncAS

(0172] También se describen métodos de tratamiento y profilaxis por la administración a un sUjeto de una cantidad eficaz de una proteina de antiaJerpo que se enlaza con CD30 que tiene un efecto citotóxico o citostético en células de la enfermedad de Hodgkin (es decir, un anticuerpo de la invención), una composici6n fannacéutica comprendiendo un anticuerpo de la invenciÓn (de ahora en adelante, un farmaco de la Invención). Según la presente Invenci6n. el tratamiento de la HD comprende el trat~lmiento de pacientes ya diagnosticados como portadores de la HD en cualquier fase clínica; tal tratamiento dando como resultado un retraso en el crecimiento del tumor, ylo promoviendO la regresión tumoral.

(0173] En una forma de realización preferida, el antticuerpo de la invención es el anticuerpo monOCional AC10 o HeFi-1 o un fragmento o derivado del mismo. En un aspecto preferido, un ftlnnaco de la invendón comprende un anticuerpo sustanCialmente pUrificadO de la invenci(XI (p. ej. , sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseadOS). El sujeto es preferiblemente un animal. incluyendo pero no IImlténdose a animales tales como vacas. cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamifero, y de la forma mas preferible un humano.

{01741 Formulaciones y métodos de administración que puede emplearse se describen arriba; pueden seleccionarse formulaciones y vias de administración adicionales apropiadas de entre las descritas aqul abajo.

{0175] Diferentes sistemas de administración son conocidos y pueden utilizarse para admInistrar un antiCuerpo de la invención, p. ej., encapsutaci6n en liposomas, micmpartlculas, microcápsutas, células recombinantes capaces de expresar endocitosis mediante el receptor del anticuerpo (véase, p. ej .. Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:44294432), construcciOn de un áddo nucleico como partl9 de un retrovirico u otro vector, etc. Métodos de introduo:i6n incluyen pero no se limitan a, vías íntradérmicas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutaneas, intranasales. epidurales. y orales. los anticuerpos de la invención pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo por Infusión o inyección de bolo, por abSOl'ción a través de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse Junto con otros agentes biológicamente activos tales como agentes quimioterapéuticos (véase la Sección). la administración puede ser sistémica o local.

[0176} En una forma de realización especifica, puede ser deseable administrar el anticuerpo de la invención por

inyección, mediante un catéter, medIante un supositorio, o mediante un Implante, siendo dicho implante de un

material poroso, no poroso, o gelatinoso, induyendo una membrana, tal como una membnma sialéstica, o una fibra.

Preferiblemente, al administrar un anticuerpo de la invención, se debe tener cuidado al usar materiales los cuales el

anticuerpo no absorbe.

(0117) En otra forma de realización, el anticuerpo o composición puede administrarse en una vesicula, en particular un liposoma (véase langer, 1990, Science 24g:15:27-1533: Tmat et aJ., 1989, en Uposomes in Ihe Therapy of Infectious Disease and Caneer, lopez-Berestein and: Fidler (eds.), Liss. Nueva York, pp. 353-365: Lopez-Berestein, ¡bid .. pp. 317-327; véase generalmente, ¡bid.)

(01781 En otra forma más de realizaciOn, el anticuerpo o composición puede administrarse en un sistema de

tiberaci6n controlada En una forma de malizaclOn, se puede usar una bomba (véase Langer. arriba; Sefton, 1989,

CRe Crtt. Ref. Blomed. Eng. 14:201; Buchwald el af., 1980, Surgery 88:507; Saudek el al., 1989, N, Engl. J. Med.

321:574). En otra fonna de Malización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applicatlons of

Control1ed Release, 1974, Langer and Wise (edS.), eRC Pres., Boca Raton, Florida; Control1ed Drug Bioavailability.

Drug Procluct Design ane! Performance, 1984, Smolen and Bal! (eds.), Wiley, Nueva York.; Ranger y Peppas, 1983,

26

Macromo1. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61: véase también levy el al., 1985, Science 228:190; Durlng el 81.,1989,

Ann . Neurol. 25:351: Haward el al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

[0179J Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por langer, 1990 Science 249:1527·1533.

[0180] Donde se administra un ácido nucleico, el ácido nudeico puede administrarse in vivo para promover la

S expresión de su proteína codificada, construyendola como parte de un vector de expresi6n del ácido nudeico apropiado y administrándola de modo que se vuelva intracelular. p. ej., usando un vector retrovírico (véase la patente estadounidense n° 4.980.286), o por inyecoión directa. o usandO el bombardeo de micropartículas (p. el. una pistola de genes; Bioastic. Dupont), o revistiendo con liP'dos o recaptores de superficie celular o agertes transfectantes, o administrándola en conexión con un péptido de tipo homeobox conocido por introducirse en el núcleo (véase p. ej., Joliot el al., 1991. Proc. Nat!. Acad. oo.EE. UU. 88:1864-1868), etc. De forma altemativa, un ácido nudeico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del ADN de la célula huésped para la expresión. por reoombinación hom6loga.

[0181J Como se alude a k> anterior, la presente invención también proporciona composiciones fannacéuticas (fánnaCOS de la invención). Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un 15 anticuerpo de la invención, y un soporte farmaceuü<;amente aceptable. En una forma de realizadón especifica, el ténnino "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobiemo Federal o de un gobierno estatal o catalogada en la Farmacopea estadounidense u otra farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. 8 termino ' soporte" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se adrninistra el terapéutico. Tales soportes de fármacos pueden ser IIquidos esteriles, tales como agua y aceites, induyendo los de origen de petróleo. animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite rnineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un SQporte prefeñdo cuando la composición del fármaco se administra por vía intravenosa. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como soportes liquidos, particulannente para soluciones inyectables. Excipientes para fánnaco~s adecuadOs incluyen almld6n, glucosa. lactosa, sacarosa, 25 gelatina, malta, arroz, harina. yeso. gel de sílice, este13rato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, teche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. la composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes hurnid¡ficantes o emulsionantes. o agentes amortiguadores de pH . Estas composiciones pueden adoptar la forma de, soluciones, suspensiones. emulsión, comprimidoS, p¡ldoras, capSUIaS, polvOS. fonnulac:iones de liberación sostE~ida y sim¡Iares. la composición puede formularse como un suposItorio, con ~gantes tradicionales y soportes talns como Uiglicérioos. la tormu1ación oral puede indulr soportes estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa. carbonato magnésico, etc. Ejemplos de soportes farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W . Martin, Composiciones de este tipo contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención, preferiblemente en forma purificada. Junto con una cantidad

35 adecuada de SQporte para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. la fonnulación deberla adaptarse al modo de administración.

(0182J En una forma de realización preferida, el fármaco de la invenciÓn se formula conforme a procedimiento", rutinarios como una composición fannaceutica adélptada para la administración intravenosa en seres humanos. Tlpicamente, las compos6ciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Donde sea necesario, el fármaco de la invl:mci6n también puede incluir un agente de soIubilización y un anestésico local tal como lignocalna para calmar el dolor en el lugar de la Inyección. Generalmente, k>s ingredientes se suministran bien separadamente o mezclados juntOQ en f0fT/'l8 de dosiflcaci6n unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentradO libre de agua en un contenedor hennéticamente senado tal como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente activo. Donde, se haya de administrar cl fármaco de la invención por infusi6n,

45 éste puede dispensarse con una botella de infusión conteniendo agua o SOlución salina de grado farmacéutico estéril. Donde el fannaco de la Invención se admini6.tre pOr inyección, puede proveerse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que lOS Ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

[0183) La cantidad de anticuerpo de la ¡nvendón que será eficaz en el trataniento o prevención de HD puede detenninarse por técnicas clínicas estándares. Ademéls, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitre para ayudar a identificar rangos de dosificación 6ptimos. La dosis precisa que se debe emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la fase de la HD, y deberla decidirse segun la decisión del profesional y las Circunstancias de cada paciente. Se pueden extrapolar dosis eficaces a partir de curvas de respuesta segun la dosis derivadas de sistemas de prueba in vitre o en un modelo animal.

5.10 EqUIPOS

55 [0164] Tambien se desctibe un paquete o equipo farmacéutico comprendiendo uno o más recipientes lk!nad06 con un anticuerpo de la invención y opclonalmente con uno o más soporte& formacéuticoa. Opcionalmente asOCiadO a tal (es) reeipiente(s) puede haber un aviso en la forma presaita por una agencia gubernamental QUe regule la fabricaciÓn, el uso o la venta de productos fannacéuticos o biológicos, cuyo aViso refleja la aprobación por la agencia, de la fabricación, el uso o venta para la adn,inistraci6n humana.

(0185J En una forma de realización, un equipo comprende un anticuerpo purificado de la Invención. El anticuerpo puede conjugarse a un agente radionudeido o quimioterapéutico. El equipo comprende además opcionalmente un soporte fannareutlco.

5.11 DOSIS EFECTIVA

(Ol86J La toxicidad y la eficacia terapéutica de 'los anticuerpos de la invención pueden detenninarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de oék.ilas o animales experimentales, p, ej" pa-a determinar el LD~ (la dosis letal para el 500/0 de la población) y el EDso (la dosis terapéutica mente eficaz en el 50% de la población). La proporción de la dosis entre los eft:~os tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y puede expresa~ como la proporción LDsoIEDso. Se prefieren los anticuerpos que exhiben índices terapéuticos grandes. A pesar de que se pueden usar antioJerpos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se deberia tener cuidado al diseñar un sistelT1;8 de admin:stración que fije como objetivo tales anticuerpos al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potendal hacia las células no infect;ldas y, de ese modo, reduzca los efectos secundarios.

(0187) Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios anImales pueden usarse en la formulación de Un rango de dosificación para el uso en seres humanos. La dosificación de tales anticuerpos se sitúa preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el EDso con toxicidad pequefia o nula. La dosificación puede variar dentro de este rar1!90 dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la via de administración utilizada. Para cualquier compuestO usado en el método, la dosis terapéuticamente efectiva puede estima~ inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un rango de concentraci,ón del plasma circulante que induye el IC~ (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición media-máxima de los síntomas) como se ha determinado en el cultivo celular. Tal información puede utiüarse para determinar con más precisión la dosis útil en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografia en fase liquida de alto rendimiento.

(0188J Generalmente, la dosificación de un anticuerpc~ de la invención en un fármaco de la invención administrado a un paciente con la enfermedad de HOdgkín es tlpicamente de 0,1 rng/kg para 100 mglkg de la masa corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificaciOn administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/1(g y 20 mglkg de la masa corporal del paciente, m~preferiblemente de 1 mglk'9 a 10 mglkg de la masa corporal del paciente. Generalmente. los anticuerpos humanos tienen una vida media més larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especieS debido a la respuesta Inmunitana a las proteínas foráneas. Asl, son frecuentemente posibles dosificaciones inferiores de anticuerpos humanizados, quiméricos o humanos y una administración menos frecuente.

5,12 FORMULACIONES

(01891 ComposiCiones farmacéuticas para el uso conforme a la preS4Nlte invención pueden formularse de manera convencional usando uno o rnés soportes o eXcipientE!S fisiológicamente aceptables.

(0190) Asi, los anticuerpos pueden formularse para la administración por inhalación o insuflación (bien a través de la boca o la nariz) o la administración oral, bucal, parent'eral o rectal.

[0191J Para la administraciÓn oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p. ej" almidón dI~ mafz pregelatiniZado, polivinilpirrolidona o meti1celulosa de hidroxipropilo); prodUctos de relleno (p. ej., lactosa. celuklsa microcristalina o fosfato de tidr6geno de cak:iO) lubricantes (p. ej. , estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (p. ej., almidón de patata o g1icolato de almidón de sodio); o agentes de humidificación (p. ej., sulfato de !aurll de sodio). Los comprimidos pueden revestirse por métodos bien conOCidos en la técnica. Preparacicmes liquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, solUCIones, jarabes o suspensiones., o éstas pueden presentarse como un producto seco para la constituci6n con agua u otros vehículos ad~dos ~Intes del uso_ Tales preparaciones líquid¡:¡¡s pueden prepar¡:¡¡rse por medios COnvencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensi6n (p. ej., jarabe de $OmitOI. derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina

o acacia); vehiculos no acuosos (p_ ej., aceite de almendras, ésteres oleagin~s, atcohol etllico o aceites vegetales fracciOflados): y conservantes (p. ej., metilo o prorpilo-P·hidroxibenzoatos o ;leido s6rbico). Las preparaciOnes también pueden contener sales de tampón. agentes alromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.

[0192} Las preparaciones para la administraci6n oral pueden formularse adecuademente para ofrecer una liberaCión controlada del compuesto activo.

[01931 Para la administración bucal las composicione's pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

[Ol94J Para la administración por inhalaci6n, los antic:uerpos para el uso según la presente Invención se administran convenIentemente en forma de una presentación en spray de aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej. , diclorodifluorometano. tridorofluororoetano, diclorotetrafluoroetano,

2.

S

2S

dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede detenninsrw mediante una valvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de. p. ej., gelatina J)ara el uso en un inhalador o insuflador pueden fOfTTlularse conteniendo \.I"Ia mezda de polvo del oompuesto y una base de polvo adecuado tal como lactosa o almidón.

{0195J Los anticuerpos pueden fonnularse para la adrninistrad6n parenteral por inyección, p. ej., por inyección de bolo o infusi6n continua. Las formulaciones para la in)/ección pueden presentarse en fonna de dosis únicas, p. ej. , en ampollas o en recipientes multidosis. con un consel'Jante anadido. las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehiculos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes formulatorlos tales como agentes de suspensión. estl~bllizaci6n y/o dispersión. De forma alternativa. la sustancia activa puede estar en fonna de polvo para la constitución con un vehiculo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógeno, antes de su uso.

{0196] los anticuerpos también pueden fonnularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, p. ej .. conteniendo bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicér1dos.

[0197] Además de las fonnulaciones descritas previamente, los anticuerpos también pueden fonnulaf$e como una J)reparación de depósito. Tales fonnulaciones de efecto duradero pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramusculannen1e) o pJf inyección intramuscular. Asi, por ejemplo, los anticuerpos J)ucden fonnularse con materialeS poIiméricos o hidmfóbicos adecuados (por ejemplO como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de cambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo. como LIl8 sal moderadamente soluble.

[0198] Las composiciones pueden, si se desea, pre54antarse en un paquete o dispositivo dispensador Que puede contener una o mas tonnas de dosificación unitarias conteniendo la sus1ancia activa. El paquete puede comprender por ejemplo metal u hoja plástica. tal como un blister. El paquete o dispositivo dispensador puede acompañarse por instrucciones para la administración preferiblemente p.lIra la administraclOn a un humano.

5.13 TERAPIA COMBINATORIA PARA EL TRATJ~IENto DE LA ENFERMEDAD DE HOQGKIN

[0199] Los anticuerpos de la invención pueden administrarse junIO con el tratamiento con irradiación o uno o més agentes quimioterapéuticos.

[0200] Para el tratamiento de irradiación, [a irradiación puede ser de rayos gamma o rayos X. Para una vista de perspectiva general de la terapia de radiación, véa.se Hellman, Capitulo 12: 'Principies of Radiation Therapy cancer-, en: ~Prindpies and Practice of Oncology', DeVita el al., eds., ~ Ed., J.B. Lippencott Company, Philadelphia.

[0201] Clases útiles de agentes QuimioteraJ)éuticos incluyen, pero no $8 limitan a, las siguientes clases no mutuamente exclusivas de agentes: agentes alquilslntes, antracidinas. antibióticos, antlfolatos, antimetabolito$, agentes de antitubulina, auristatinas, sensibilizadores ;01 la qulmioteraJ)ia, ligand06 de unión al surco menor de ADN, inhibidores de [a replicación de ADN. duocarmicinas, ettopósidos, pirimidinas fluorinadas, lexitropsinas, nitrosoureas, platino/es, anlimetabo11tos de puMna, J)uromicinas, senl;jbilizadores a la radiación, esteroldes, taxanos, inhibidores de lopoisomerasa. y alcaloides de vinca. la quimioterapia individual comprendida por la invención induye pero no se limita a un andrógeno, antramlcina (AMC), asparaginasa, S.azacitidina, azalioprina, bleomicina, busulfano, buüooina sulfoximina, camptotecina. carboplatino. cannustina. (BSNU), CC-1065. dorambucilo. cisplalino. coIchicina. ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosida, citochalasin S, dacarbazina, dactinomicina (antiguamente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, un estrógeno, S.fluordeoxiuridina, 5 fluorouracll, gramicidina D, hidroxiurea, idarublcino, ifosfamida. irinotacano, lomusUna (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6mercaptopurina. metotrexato. mitramidn, mitomidna C. mitoxantrona, nitroimidazol, pacrrtaxel. plicamicin. procarbizina, streplozotocina, tenoposido, 6-tioguaniml, tIoTEPA, topotecan, vinblastina, \/Inaistina, vlnorelblna. VP16 Y VM-26.

[0202] En una fonna de realización especifica. un anticuerpo de la invención se administra al mismo tiempo con terapia de radiación o uno O mas agentes quimioleraJ)éuticos. En otra fonna de realización especifica. la quimioterapia o terapia de radiación se administra anles o después de administrar un anticuerpo de la invención, durante al meno$ una hora y ha$ta varios me$es, por njemplo al menos una hora, cinco horas, 12 noras, un dia, una semana, un mes, o tres meses, antes o después de administrar un 3cido nucleico O una proteína de la invención.

[0203] En una forma de realización especifica en la qlJe un anticuerpo de la invención se conjuga a una enzima de conversión a profánnaco. el anticuerpo se administra con un protarmaco. La administración del profármaco puede ser simultanea a la administración del anticuerpo de la invención, o. más preferiblemente, pc»terior a la admlnistraclon elel anticuerpo (le la invenCloo tras al menos una hora hasta una semana, por ejemplo aproximadamente cinco horas, 12 horas, o lI"\ dia. DependiendO de la enzima de conversión a profármaco administrada, el profármaco puede ser una mostaza de ácido benzoico, una mostaza analftica. una mostaza de fenol, mostaza-glucuronida de p-hidroxianilina, e~~rubidn-glucuronida, fenoxiaceril de adriamicina-N, N-(4'

S

SO

hidroxlfenil acetil)-palitoxin doxorubicina, melfalán, CEffalosporina de mostaza de nitrOgeno, p..fenilenadiamina, cefalosporina derivada de vinblastina, mostaza de cefal()Sporina, ácido cianofenilmetil-p..O-gluco-piranosidur6nico, 5(adaridin-1 -il)2,4-dinitrobenzamida, o alanina de metotrexato,

[0204] La invención se describe posteriormente en los E!;emplos siguientes los cuales no pretenden limitar el ámbito de la invenci6n.

6.1 MATERIALES y MÉTODOS

[0205J Células y condiciones de cultivo: las Hneas cellJlares que expresan COJO, L540, HolM2; l428, KM-H2 '1 Karpas 299 se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de CélulaslOSMZ en Braunschweig, Alemania. la Unea celular de Hodgkin lfi40cy fue proporcionada por el or. V. olehl de la Universidad de Colonia, ColOnia, Alemania. las lineas celulares se mantuvieron en las fonnulaciones de medios recomendados y se subcultivaron cada 3-4 días.

(0206] Reactivos y antiCuerpos: la linea de hbridoma elel anticuerpo monOdonal Anti-C03O AC10 se describió por BoNen et al (Bowen sr al., 1993, J. ImmunO!. 151 :589&·5906) y se propol'cionó pa el Dr. E. Podack, Universidad de Miami. El anticuerpo purificado se aisl6 de los sobrenadantes sin suero usando una columna de Inmunoafinldad de protelna G. El anticuerpo AC10 resultante se determinii como > 97% monomérico por cromalografla por exclusi6n de tamai\o. El anticuerpo monodonal HeFi-1 se ha descrito previamenle y fue proporcionadO por el Dr. T. Hecht, NC1, Belhesda, MO. Se demostró por cromalografla por exdusión de tamal\o que el mAb de HeFI-1 era mayor del 98°,6 de monómero.

[0207] Ensayos de proliferación: las líneas celulares que expresan C030 se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano a una densidad de 50.000 o 5.000 células/pocillo en medios de crecimiento (RPMI con un 10% de suero fetal bovino (FBS) para las líneas celulares L428, KM-H2 Y Karpas 299, y RPMU20%FBS para las lineas celulares HolM-2 '1 l540. las lineas celulares se cultivaron M ausencia o en presencia de mAbs anti-C030 solubles reticulados o de mAbs anli-Co30 inmovilizados, como s«~ describe abajo.

[0208) Retículación de anticuerpos fin /a solución: Para reticular los anticuerpos anti.c030 en la solución, se titularon varias diluciones de AC10 " HeFi-1 en placas de cultivo de tejidO de fondo plano de 96 pocillos en ausencia o en presencia de 20 jJglml de anticuerpos IgG policlonales de cabra anti-ratón. Las lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin se añadieron después a lasflacas a obten 50.000 o 5.000 células/pocillo. las placas se incubaron a 37"C durenle 72 horas y se marcaron con H-timidina, 1 jJCi/pocillo, durante las 5 horas finales.

[0209) Inmovilización de anticuerpos: La inmovilización de anticuerpos se obtuvo revistiendo los poeiIJos con anticuerpo en tampón Tris de 50 mmolll (pH 8.5) durante 18 horas a 4e C. Antes de la adición de células, los pocjlos se lavaron dos veces con PBS para eliminar el mAb no unido. En cada pOCJHo se anadieron 50.000 o 5.000 células en un volumen total de 200 ¡JI. la proliferación se determin6 por la absorciOn de 3H-timldlna (0,5 jJCilpocillo) durante las 8 horas finales de un periodo de cultivo de 72 horas.

6.2 RESUL TAQOS

(0210] Para evaluar la actividad biológica de los mAbs .anli-CoJO, se cultivaron lineas celulares de Ho expresando CD30 (50.000 célulasJpocillo) en presencia del mAb anli-CoJO inmovilizado AC10. El rnAb AC10 demostró la inhibición del crecimiento celular de Uneas de HO del tipo de célula T (L540 '1 HoLM-2) o tipo de célula B (L428 '1 KM-H2) (Fig. 1). Ki-l. que mostrtl previamente no tener ningún efecto en las líneas celulares de HO (Gruss el al., 1996. BJood 83:2045-2056) . se usó corro un control.

[0211J Para seguir evaluando la actividad de AC10 se realizó una segunda serie de ensayoS. Para valorar la actividad de AC10 durante un periodo de crecimiento d'e la céltia tumorallogarltmico, se disminuyó la densidad de células de los cultivos para proporcionar condiciones dEl crecimiento más 6ptimas. Para ese fin, las lineas celulares de Ho se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano a una densidad de 5.000 células/pocillo en presencia o en ausencia del mAb AC10. AC10 demostrO una InhltllCl6n del aeclmiento de las cuatro lineas celulares de HQ evaluadas (L540, HolM-2, L428 y KM-H2; Fig. 2).

[0212J En otro conjunto de experimentos. las lineas cellJlares de HO se incubaron con AC10 o HeFi-1 solubles que se hablan reticulado en solución mediante la adición die anticuerpos IgG solubles de cabra ami-ratón. Bajo estas condIciones de reticulación. las cualro lineas cefuJares Ho. al colocarse en placas a 5x10· célulaSlpocillo. se les inhibió el crecimiento con AC10 y HeFi-1 (Fig. 3). Cuando las células se colocaron en placas a 5x1& células/pocillO. ACm irtllbió el crecimiento de HoLM-2: L540, y L428 11, en una extensi6n menor, la linea celular KM-H2, mientras que HeFi-1 inhibió el etedmiento de las líneas celUlares HOlM-2, l540, '1 L428 (FIg. 4).

{0213}los datos resultantes de los e)(perimentos quet prueban los efectos de AC10 y HeFi-1 en lineas celulares tumorales que expresan C030 se resumen en la Tabla 2. abajo. La Tabla 2 también proporciona una comparación de la actividad anti-tumoral de AC10 y HeFi-1 con la del mAb M44.

T.bla 2. Actividad citostatica 'l/o citot6xica de señali¡tación de los mAbs anti-CD30 en lineas celulares malignas S expre:sando C030

Inhibición del Crecimiento por

M44

HeFi-1

AC1Q

¡nea celular Tipo Celular

+

+

+

Karpas 299 AlCl

+

NO

NO

Michel AlCl

KM-H2 HO (fenotipo de célula B)

-

+

+

-

+

+

l428 HD (fenotipo de célula B)

+

HOLM-2 HD (fenotipo de célula T)

+

-

L540 HD (fenotipo de célula T)

-

+

+

Datos publicados por Gruss el al., Blood 83(8)2045-2056

[0214} Tomados juntos. estos datos indican que los mAbs AC10 y HeFi-1 se distinguen de los mAbs anti-CD3Q previamente descritos por su capaCidad para inhibir el aecimienlo de lineas de HD e)(presando Co30. Es de interés tener en cuenta que Hubinger el al. recientemente evaluó la actividad del mAb anti-COJO M44, en forma

10 inmovilizada, en un ensayo de prOliferación utilizando 5.000 células/pocillo. Bajo estas candciones. M44 inhibió el crecimiento de la linea ALCL expresando COJO, Karpals 299 pero no la linea celular de HO HOLM-2 (Hubinger et 8/., 1999, Exp. Hematol. 27(12): 1796-805).

7. AC10 AUMENTA EL EFECTO CITOTOXICO DE LA QUIMIOTERAPIA EN LAS LINEAS CELULARES DE LA ENFERMEDAD DE HOQGKIN

15 7.1 MATERIALES Y MÉTODOS

(0215) Las células L428 se cultivaron durante 24 hora:5 en presencia o en ausencia de 0.1 ~glml de anticuerpo antiC030, AC10. reticulado por la adición de 20 ~g/ml de anticuerpos IgG de cabra anti-ratón. Después del periodo de cultivo de 24 horas. las célUlas se coseroaron y lavaron con suero salino tamponado con fosfato (PBS). las células se colocaron después en placas de cultivo de tejido de 96 pocilloS de fondo plano en 5)(103 células/pocillo y se

20 mezclaron con diferentes diluciones de fánnacos quimioterapéuticos. DespuéS de 1 hora de exposición a lOs fármacos las células se lavaron dos veces, y d8$PIJOs se añadieron medios de cultivo nuevos. Las placas se incubaron entonces a 37GC durante 72 horas y segu~::Iam&nte se incubaron durante 4 horas can 0.5 ~Cilpocil!o de 3H-timiclina. La inhibici6n del a-ecimiento se determ InO comparandO la cantidad de ~-tim¡dina incorporada en células tratadas con la cantidad Incorporada en células de control no tratadas.

25 7.2 RESULTADOS

[02161 Para evaluar el efecto del mAb anti-CD30 en combinación con fármacos quimioterapéuticos, las células l428 se incubaron durante 24 horas o bien en ausencia del anticuerpo o en presencia de AC1 Oen O, 1 ~glml can 20 ~9tml de anticuerpos IgG de cabra ant\.ratOn para proporcionar la reticulacioo para el anticuerpo primario. Despucs de

esta IncubaciOn las C\!:lulas se culocaron en plaCCils de cultivo de tejidu de 96 pucill~ en 5x103 células/pocillo en

30 presencia de diluciones de fánnacos quimioterapéutic:os incluyendo doxorubicina, cisplatina, y etopósldo (Tabla 3). El EC50, concentración de fármaco necesario para inhj;bir la incorporación de ~-timidina en un 5Q"k en comparación con las células de contrOl no tratadas, se detenninó ef1Itonces para las células tratadas solamente con 'os fánnacos o con las combinaciones de fármaco y anticuerpo. Para la doxorubieina, la incubación con ACi0 disminuy6 el ECoo en dllulas L428 (es decir, dismiruy6 la cantidad de fámlaco necesario para Inhibir el 50% de la slntesis de AON) de

35 aprOximadamente 45 nm (do)(orubicina $Ola) hasta a'lroximadamente 9nM, para la cisplatina el AC10 disminuyó el EC~de -1 .500 nm hasta -500 nm, y para el etopósic!o el AC1Q dismlnuy6 el ECoo de -1 .500 nm hasta -600 nm.

Tabla 3: El AC10 aumenta la eficaCia de fármal~ quimioterapéuticos en la linea celular de HO L428

EC5Q, nM

ármaco

sin AC 10 con AC10

¡Ooxorubicina

45 9

isplatina

1.500 500

EtopósidO

1.S00 600

1021 nModelos de x6notransplsnt6 de tumor humano: Ratones SCID C.B-17 hembra, obtenidos a través de Taconic (Germantown, NY) con 4-6 semanas de edad, se usaron para tOdos los estudios de eficacia. Para establecer modelos de xenotranSplante de la enfermedad de Hodgkin, se recogieron células L540cy (HO) de un cuHivo celular, se lavaron en suero salino lamponado con fosfato helado (PBS), se resuspendieron en PBS, '1 se mantuvieron en

10 hielo hasta la implantación. Para modelOS de la enfermedad diseminados, a los ratones se les inyectó 107 celulas de L540cy por via intravenosa a través de la vena caudal. Se establecieron xenotransplantes de tumor sólidos inyectandoleS a los ratones Subcutáneamente (s.c.) 2 X 101 de células L540cy. Para la evaluación terapéutica se utilizaron las dosis y programas de tratamiento indicada.s.

[0218} Administración de AC10 y HeFi-1: Los ratones diseminado portadores del tumor L540cy diseminado

15 recibieron 107 células a través de la vena caudal en el da y seguidamente se inició una terapia en el d1. los ratones tratados recibieron inyecciones i.p. o bien de AC10 o de HeFi-l cada dos dias hasta un total de 10 inyeCCiones. 10 dosis cada 2 días, en 1 mglkglinyección.

[0219] Para el modelo L540cy subcutáneo, a los ratones se les inyectó s.e. con 2 X 107 células y se les observó a diario para analizar la formaCión tumoral SOlida. Cuando los tumores fueron palpables, los animales se distribuyeron 20 de forma aleatoria en grupos y rocibieron 10 dosis cada 10 dias de AC10 o HeFf-l en 2 mg/l<.g/inyecci6n.

8.2 RESULTAQOS

[0220] Se evaluaron AC 10 y HeF¡"1 efl ratones SCID :(enotransplantados con L540cy de la enfermedad de Hodgkln, como se ha descrito anteriormente. En la población de ratones con tumores L540cy diseminados, todos los animales de control no tratados desarrollaron signos de enfermedad severa diseminada tales como la parálisis de la pata

25 trasera o la formación de una masa I1Jmoral sólida y tuvieron que sacrificarse (tiempo de supervivencia medio'" 37 dlas). Por el contrario, todos los ratones que recibiere", o bien AC10 o HeFj-1 sobrevivieron durante > 46 dlas sin signos de la enfermedad (Fig. SA).

[0221] Con respecto a la población de ratones con tUlTlores L540cy subcutáneos, mientras los tumores de contrOl no tratados crecieron rápidamente hasta > 450 mm 3, ambos mAbs retrasaron significativamente el crecimiento del 30 tumor como se muestra en la Fig. S8.

[0222} l os inventores han identificado anticuerpos rnonoclonales de munna (mAbs) que tienen como objetivo el receptor C030 humano y exponen un perfil de awvidad no descrtto previamente para otros mAbs anti-C030. En forma no modificada. estos anticuerpos, AC10 y HeFi-1 inhiben el crecimiento de HO '1 la linea de ALCl Karpas 299 '1 muestran actividad antitumoral in vivo en un modelo del xenotransplante tumoral de la enfermedad de HOdgkin.

35 o. ACTIVIDADES IN ylTBO DE AC10 QUIMÉBI!Ql

0.1 MATERIAlES XMErODOS

[0223] Células y reactivos: el hibridoma AC10 se desarrolló en medios RPMI-1640 (Ufe Technologies lne. Gaithersburg. MO) suplementados con un 10% de, suero bovino fetal. El anticuerpo Se purificó a partir de sobrenadantes de rultivo por cromatografía de protelna A. Las líneas HO positivas de C030 L540, KM·H2, HDLM-2 40 y L428, al igual que la linea ALCL Karpas-299, se obtuvieron a partir de la Oeutsche Sammlung van Mikroorganismen und ZeUkulturen GmbH (8raunschweig, Alemania): L540cy estuvo proporcionada por el Dr. V. Oiehl; HL-60 y Daudi se obtuvieron a partir de ATCe (Manassas, VA). Se obtuvieron células CHO OG44 de Lawrence Chasm (Universidad de Colombia, Nueva York, NY). Los anticuerpos de cabra anti-rat6n FITC o cabra

anti-humano-FITC se obtuvieron de Jackson Immunoresearch, (West Grave, PA.). El mAb anti-CD30 Ki-1 se obtuvo de Accurakl ChemicalS (Westbury, NY).

[0224J Análisis FAC$: para evaluar la expresión de C030 en lineas celulares, se combinaron 3 x lOs células con niveles de saturación (4 ~glml) de o bien AC10 o AC10 Quimérico (cAC10) en un 2% de FBSIPBS helado (medios

S colorantes) durante 20 mM en hie{o y se lavaron 4jOS veces con medios de coloracibn enfriados en hielo para eliminar el mAb no lIll00. Las células se tiI'Ieron ,entonces con mAbs secundarios diluidos 1:50 en medios de coloración enfriados en hielo, anticuerpos de cabra-(lnti-rat6n FITC para AC10 o anticuerpos de cabra-anti-humano FITC para cAC 10, se incubaron durante 20 minutos en hielo, se lavaron como se ha desatto anterionnente y se resuspendieron en 5 ¡Jglml de yoduro de propidio (PI). Las células marcadas se examinaron por citometria de flujo en un citómetro de flu;o FACScan de BedOn DidtinsOl'l y se controlaron para excluir las células no viables. Los datos se analizaron usando la versión 3.3 del software CelUQuest de Becton DiCkinson y la intensidad de ftuorescenda del medio corregk:lo de fondo se determin6 para cada tipo célula.

[0225J Para la unión de saturación de anticuerpos, se combinaron 3 x lOS c6lulas Karpas 299 con concentraciones en aumento de AC10 o cAC10 diluido en medios di! coloración enfriados en hielo durante 20 minutos, se lavaron

15 dos veces con medios de coloradón enfriados en hielo para eliminar el mAb libre y se incubaron con 1:50 de anticuerpo de cabra anti-ratÓfl FITC o anticuerpo de cabra antH\Umano FITC, respectivamente. Las células marcadas se lavaron, se resuspendleron en PI y se nnalizaron como se ha desct1to anteriormente. Las intensidades de fluorescenda medias resultantes se representaron en un gráfico con respecto a la concentración de mAb.

{0226J Para el análisis de la posiCión del cido celular, se cultivaron células en medios completos y se marcaron en los tiempos indicados con bromodeoxiuridina (BrdU) (10 ~M final; Sigma, St. Loois, MO) durante 20 mm para detectar slntesis de ADN nacie~tes, y con PI para detectar el contenido de ADN total tal y como se ha descrito anteriormente (Donaldson el al., 1997, J. Immunol. Meth. 203:25-33). Las células marcadas se analizaron para obtener la pOSidbn del cido celular y la apoptosls por citometría de ftujo usando el programa CellQuest de Seeton OiCkinson tal y como se ha descrito anteriormente (Donaldson el al., 1 997, J. ImmunOl. Meth. 203:25-33).

25 [0227] Inhibición del crecimiento in vitro: La evaluación de la inhibición del creciniento por mAbs murino se efectuó Inmovilizando el mAb a 10 ¡Jglml en 50 mm de tris-·HCI a pH 8.5, en placas de cullivo de tejido de 96 pocillOs de plástico durante la noche a 4°C. Las placas se IC;lvaron dos veces COn PBS para eHminar el mAb no unido y seguidamente se añadieron células en 100 ~I de medios completos a 5.000 células/pocillo. Tras 48 h de incubaciÓfl a 37"C, 50M de CO2, las células se marcaron COI1 'H-·TdR por la adición de 50 ¡JL de medios completos conteniendo 0,5 jJCi de ' H_TdR durante 2 h Y el nivel de sintesil$ de ADN determinado en relación a las células en pocillos de control no tratados. La evaluación de la inhibiCión del crecimiento por cACl0 se efectuó usando mAb soluble y un retlculador secundario. Las células se colocaron en placas a 5.000 células/pocillo en 180 ~I de medios completos en un formato de 96 pocillos. Se ai\adió cAC10 en rnedios completos conteniendo un exceso multiplicado por 10 correspondiente de anticuerpo IgG de cabra anti'¡'urnano en las concentraciones anotadas, en 20 ¡JI. A las 96 h de

35 pOStinCUbación las células se marcaron con ~-TdR durante -4 n seguido de la recogida de cék.lIas y el recuento de escintilaciones para cuantificar el nivel de la slntes.is de! ADN naciente. Se representO en un gráfico la InhibiciOn porcentual en relación a los pocillos de control no tra'tados con respecto a la concentración de cAC 10.

[0228J Constrvcdón y expresión de AC10 quimérico (cActO): Para la construcción de cACl0, las regiones variab~ de cadena pesada y ele cadena Hgera se c\onaroo a partir del hibridoma de AC 10 usando los métodos de Gilliland er al., 1996, nssue Amigens 47;1-20. El ARN total se aisló del hibridoma de AC 10 y se generó el ADNc de las regiones variables usando kappa de ratón y cebadores especificas del gen IgG2b. El AON codificando la región variable (VH) de cadena pesada: de AC10 se uniO con la secuencia codifICando la región constante gamma humall8 l (huCyl, numero de acceso SwissProt P01857) en un vector ele Clonación y la región variable de cadena ligera (VL) de AC , O se unió de forma similar a la región constante kappa humana (huC/c, PIO G185945) en un vector de clonación

4S separado. Las secuencias Quiméricas tanto de cadena pesada como de cadena ligera se clonaron dentro de pDEF14 para la expresión de anticuerpo monoclona.1 quimérico intacto en células CHO. El plásmido pDEF14 utiliza el promotor del gen alfa del factor de alargamiento del hámster chino que conduce la transcripción de genes heterOlogos (patente estadounidense 5.888.809) resultando en niveles allos de la expresión de proteínas recomblnantes sin necesidad de amplificación géniCR El plásmido resultante se deSignó como pOEFl4-C3 (Fig. 6).

(0229) Para la generación de la línea celular de e:(presiOn de AC1Qc, pDEFl4-G3 se linealizó y modificó en las células CHO oG44 por electroporacl6n. Tras la eleetroporación. las células pudieron recuperarse durante dos días en medios comp4eto DMEMlF12 conteniendo 10% de FBS, después de lo cual los medios se sustituyeron por medios selectivos sin hipo;,tantina ni timidina. Sólo aQuellas células que Incorporaban el AON p1ásmido, lo cual induye el gen OUFR, pudieron desarrollarse en au:sencia de hipoxantina y timidina. Se seleccionarOn y cultivaron

55 Clones de titulo alto en biorreactores. Se purificó el anticuerpo de cAC10 por proteina A, intercambio jónico, y cromatografTas de interacción hidrofóbica, con el prc)C!uclo final determinado por hPLC-SEC en >99% de anticuerpo mon6mero.

9.2 RESULTADOS

Unión de AC10 murino y AC10 quimérico con lineas celulares de la enfermedad de Hodgkin

[0230] El AC10 se produjo originalmente inmunizando ratones oon la linea celular YT de linfoma granuloso grande positivo de C030 y se mostrO como especifica para COJO (Bowen et al.• 1993, J_ Immunol. 151 :5896-5906). Antes de valorar los efectos de AC10 y AC1Qc en el crecimiento de células HO, se compararon los niveles de la expresión de COJO en diferentes lineas celulares cultivadas. Las cuatro lineas de HO evaluadas se basaron en C030 positivo en prolXWdones de fluorescencia de citometria de flujo (Tabla 4). Las lineas colulares 1-10 da tipo cólulg T I-IOLM.2 Y L540 al igual que la linea ALCL Karpas-299 expresaron niveles altos cualitativamente similares a COJO mientras que la expresión en dos lineas HO de tipo célula B KM-H2 Y L428 fueron I1geramente inferiores. L540cy, un subcl6n de L54O, mostró un nivet intermedio de expresión de C030. Aunque la unión de cAC10 y AC10 con estas lineas celulares se detectó usando diferen1es anticuerpos secundarios (anticuerpo de cabra antl-humano o anticuerpo de cabra anll-ratón conjugado de F1TC, respectivamente') eslos datos demuestran que el proceso del qulmerización no disminuyó la unión espedfica de cAC10 con la superficie de la célula de C030. La linea de leucemia promielocitica Hl-60 y la linea del linfoma de Bur1c:itt Oaudi fueron ¡Imbas C030-negativas y sirvieron como controles en estudios posteriores.

[0231] Para seguir comparando la actividad de unlórl de los anticuerpos murinos y quiméricos, las células Karpas299 se incubaron con titulaciones de AC10 o cAC10 y despues se marcaron oon anticuerpo de cabra anti-ratón FITC

o anticuerpo de cabra anti-humano FITC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), respectivamente, para determinar los niveles requeridos para la saturación. Las células marcadas se examinaron por c:itometría de flujo y se representó en un gráfico la intensidad de fluoresct!!ncia media frente a la concentración de mAb. La saturación de unión para ambas formas de mA.b tuvo lugar en -0,5 jJglml (Fig. 7). La saturación fue consistente para todas las líneas celulares positivas de C030 examinadas (dat~$ no mostrados) demostrando que el cAC10 rettNo la actividad de unión del anticuerpo murino parental.

[0232] las células rnononucleares de sangre periféricas reciefltemenle aisladas no reaccionaron con cAC10 y no mostraron ninguna senal por encima de lo ya mendonado en este ensayo. Oe forma similar, las células B y las células T primarias humanas aisladas no se uniemn con cAC 1 O. las células T periféricas humanas primarias activadas con anti-C03 y anti-C028. y las células B activadas por el mitógeno de la hierba camin mostraron un nivel de unión bajo y transitorio de cAC10 tras 72 h de la activación, ef cual disminuyó después (datos no mostrados).

[0233] Actwidades in vitro de AC10 y cAC10: Los anticuerpos anti-C030 tales como M44 y M67 han mostrado tener efectos anti-proliferativos en las lineas AlCl, mientras que no tienen ningún efecto ni estimula el crecimiento de lineas HO (Gruss al a'., 1994, Bload 83:2045-2056: TIan el a'_, 1995, Cancer Res. 55:5335-5341). Para evaluar Inicialmente el efecto del mAb AC10 en la proliferación celular de HO, se comparó AC10 con el mAb Ki-1 bato condiciones de fase sólida proporcionadas previamente (Gruss el al., 1994, Blood 83:2045-2056). Para estos estudios se inmovilizaron rnAbs sobre placas de CUtti110 de tejido plástico antes de la adición de células HO como se describe en Materiales y Métodos. Tras la incubaci6n durante 48 H a 37°C, las células se marcaron con 3H_TdR yel nivel de síntesis de AON se determinó en relación 1:1 las células en pocillos de control no tratados. la Figura 3A muestra que la presenda del mAb inmovilizado Ki-1tenla efecto nominal en el aecimlento de las lineas HO. Por el contrario, la presencia de AC10 inmovilizado resultó E~n una inhibición del crecimiento significante.

[0234] Tras le quimerización, se realiló una titulacibn de cAC10 en las lineas celulares de HO 1540, l540cy y l428 al igual que la linea ALCL Karpas-299. Se anadió cJI¡.C1Q en solución a las concentraciones anotadas en presencia de exceso de 10 veces de anticuerpo 190 de cabra anti--humano. se anadló anticuerpo de reticulación para potenCiar los efectos de cAC10 y para aproximarse a los efectols de la reticulación mediada por FcR que podrla ocurrir in vivo. La linea de AlCl positiva de C030 fue altamente sensible al cAC10, con un ICso (concentración de mAb que inhibiO en un 50% el crecimiento celular) de 2 ng/ml. Las lineas de HO l428. l540 Y l540cy mostraron sensibilidades de lCso al cAC10 de 100 ng/ml, 80 ng/ml y 15 ng/ml res¡pectlvamente. En estudIOS paralelos estas células tratadas oon Ur'l mAb de control y enlazador no vinculante no mostraron nir'l9un;:¡ reducci6n en la sintesls de AON sobre el rango de concentradOn analizadO (datos no mostrados) y :ta. linea negativa de C030 Hl-60 mostró solamente una ligera

inhibición por cAC10 en el nivel maximo evaluado (Fin. 8).

[0235] Efectos del ciclo celular de cAC10: Hubinget~ et al. han mostrado recienlemente que los mAbs anti-C030 pueden inhibir el crecimiento de las células AlCl, incluyendo Karpas-299, a través de la Inducción de la detención del ciclo celular y sin inducción de la apoptosis (Hubinger M dI., 2001. Oncogene 2Q:SgQ.S98). No obstante, estos antlcuerpos no causaron ningún efecl:o inhibitorio I~n células de HO, y en algunos casos estos estimularon la

proliferación. Para examinar más de cerca los efecto!; del ciclo celular de cAC10 in vitro, se cultivó la linea celular de HO l540cy en medios completos cooteniendo 1,0 jJglml de cAC10 formando un complejO con anticuerpos 19G de cabra anli-humano en 10 jJglmI . En los tiempos indicados, las células se marcaroo con bromodeoxlurldina durante 20 min para detectar una sintesis de AON naciente,. y con yoduro de propidio para detectar el contenido de AON total. las células marcadas se analizaron para averiguar la posición del ciclo celular IXW citomelria de flujo usando el programa Cellfit de Secton Dlckinson tal y como $e' describe anteriormente (Oonaldson et al., 1997, J. Immunol: Meth. 203:25-33).

[0236] la Flg. 9 muestra un cambio representativo en el contenido de AON y la slntesis de ADN en las células de HO de L540cy tras la expoSición a cAC10. El poroentaje de la población en cada mgiOn se cuantificó como se describe en la secci6n 9.1 y se muestra en la Tablal 5. la exposición de l540cy a cAC10 resulta en una pérdida dependiente del tiempo de las células de la fase S desde un 40% en la poblaci6n no tratada hasta un 13% a los 2 5 dlas (tras la exposiciOn). De forma coordinada, el corulenido de G1 de esta poblaciOn aumentó de un 40% en células no tratadas a un 65% a los 3 dias (tras la exposición). la regiOn de menos del contenido de G, da una indicación precisa de las celulas apoptóticas que experimentan una fragmentación de AON (Donaldson st al., 1997, J. Immunol. Meth. 203:25-33) y esta pOblación aumentó de un 6°,4 en la población no tratada a un 29% a las 48 h tras la expOSici6n a cAC10. Estos estudios citométricos dl~ flujo fueron corroborados por un ensayo paralelo de exclusión 10 del colorante usando un hemocit6metro. Al medirlas por exclusión de colof"8nte, tas células l540cy no tratadas tuvieron un 93°k de viabilidad y ésta disminuyó a un 72% a las 48 h tras la exposición a cAC10. las células Karpas tratadas con cN:.10 mostraron una reducci6n similar 4~n la fase S desde el 40% al11 % a las 48 h post-cAC10 (Tabla 5). En estudios de control, la linea de células B negativa de CD30 Daudi sólo mostró la modulación nominal del ciclo celular y no mostró ningún aumerto en la apoptosi:; tras el tratamiento siguiente con cAC10 (Tabla 5). Estudios

15 previos diferentes en los cuales mAb inmovilizado pal·a CD30 indujo 8 la apoptosis en células ALCl (Mir el al., 2000, 8lood 96:4307--43 12.). se observó de pequei'la a ninguna apoptosis en estas células con cAC10 soluble y un anticuerpo seo.mdario de reticulooón. Tomados jUI1tos, estos datos demuestran una detención del a-ec:imiento inducida de cN:.10 y la aet.mulaci6n de la población de G, y la disminución de la fase S en ambas líneas positivas de C03O, y la induCCión de la apoptosis en las células HO l540cy in vitro.

20 Tabla 4: Unión de AC10y cAC10 con diferentes lineas celulares

10. EFICACIA IN VIVO DE AC10 QUIMÉRICO CONTRA XENQTRANSPLANTES DE LA ENFERMEDAD DE HOOGKIN

10.t . MATERialES Y MÉT0POS

5 (0237] Modelos de xenotronsp/antes de la enfennedad de Hodgkin humana: Para el modelo de la HD diseminada, se inyectaron 1)(101 de células L540cy a través de la v!~na caudal en ratones SCID C.8-17. El tratamiento con cACI0 se inició en los tiempos indicados y se administró mfldiante inyección intrapemoneal cada cuatro dlas hasta un lotal de 5 inyecciones. l os animales se evaluaron a dialrio para detectar slntomaS de la enfermedad diseminada, en particular la parálisIs en la extremidad posterior. Los ratones que desarrollaron estos u otros síntomas de la

10 enfermedad se sacrificaron después. Para el modelO localizado de HO, las células L540cy se implantaron con 2.x10células en el flanco derecho de los ratones SCIC. La terapia con cAC10 se inició cuando ellamailo tumoral en cada grupo de 5 animales alcanzó un promedio de -50 mm 3. El tratamiento consistió en inyecciones intraperitoneales de cAC10 cada 4 días hasta 5 inyecciones. El tamaño tu.mOfat se determinó usando la fórmula (l.:JNV'-)12.

10.2 RESULTADOS

lS (0238] la actividad in vivo de cAC10 se evaluó en [C>S ratones SCIO usando células L540cy. El establecimiento de modelos de HD humanos en ratones ha demostrado ser dificil. A diferencia de otras lineas celulares derivadas de la HO que dan un injerto muy pObre en ratones inmu.nodeficientes, pueden establecerse exitosamente modelOs de células tumorales de HO l540cy en ratones SCID (K.app el al., 1994, Ann Oncol. 5Suppl1 :121-126). Se usaron dos modelos diferentes de la enfermedad empleandO (:élulas L54Ocy, un modelo dsemnadO, y un modelO tumoral 20 subcutáneo localizado para evaluar la eficaCIa del cAC10;n vivo.

[02391 Los estudios previos han mostrado que las células l540cy inyectadas por vía intravenosa en ratones SCIO se extienden de forma comparable a la diseminación d!~ la HD humana y muestran una localización preferencial hacia los ganglios linfáticos (Kapp el al., 1994, Ann 00001. 5Suppl1:121-126). Para evaluar cACI0 en este modelo de HO diseminada, so inyectaron 1x107 células l540cy a tr~lvés de la vena caudal en ratones SCID C.8_17. Los ratones no 25 tratados, o los que se trataron con un mAb de control no vinculante, desarrollaron slntomas de la enfermedad diseminada, en particular parálisis de la extremidad pesteria, a los 30-40 dias de la inyección de células tumorales (Fig. 10A). los ratones que deSarrollaron estos u otros sintomas de la enfermedad se sacrificaron despUés conforme a las pautas IACUC. La terapia con cAC 10 se inició un dia después de la inyección de células tumorales y se

administró mediante inyección intraperitoneat cada cuatro dias hasta un total de 5 inyecciones. Todos los animales

(515) que recibieron un régimen de dosificación de 4 mglkglinyecci6n, y 4/5 que recibieron o bien 1 mglkglinyecciOn

o 2 mglkg~nyecdón, sobrevivieron durante más de 120 dias (la duración del estudio) sin slntomas de enfermedad.

[0240] En un estudio posterior se evalu61a eficacia de cACl Ovariando el dilll en el cual se inici6 la terapia. Para este

S estudio se inyectaron células L540cy en los ratones SCIO a través de la vena caudal el día O y la terapia se inició o bien el dia 1, el día 5, O el dla 9 (Fig. 10B). En todos los grupos tratados, se admiristró cAC10 en 4 mglkg usando una programación de 5 dosis cada 4 dias. Consecuentemente con el estudio anterior cAC10 impactó significativamente en la supervivencia de los animales que recibieron terapia comenzando el dia 1, oon 4/5 animales Sin enfermedad después de 140 días. Cuando el ínicio de la terapia se retrasó, cAC10 siguió demostrando una eficacia significante; 315 animales que recibieron terapia desde el dla 5, y 215 que empezaron el día 9, permanecieron sin la enfermedad durante todo el estu·dio.

(024t) cAC 10 también demostr6 eficacia en los modE!los tumorales de la HO de L540cy subcutáneos. A los ratones SCIO se les implantaron 2xl07 células en el flanco_ l a terapia con cACtO se inició cuando el tamaño tumoral en cada grupo de 5 animales alcanzó un promedio de 50 mmJ• El tratamiento consistió en inyecciones intraperitoneales

15 de cACl O cada 4 dias hasta 5 inyecciones usando las mismas dosis que en el modelo diseminado: es decir, 1, 2, y 4 mglkglinyección. Los tumores en los animales no trataldos crecieron rápidamenle y alcanzaron un promediO de >800 mm 3 en el día 34. El cAC10 produjo un retraso significante en el crecimiento tumoral en todas las concentraciones evaluadas de una manera dependiente de la dosis (F~~. tOC).

11.1 MATERIALES Y MÉTODOS

(0242] El AC10 quimérico (cAC 10) se generó mediante recomblnaci6n homóloga esencialmente como se ha descrito anteriormente usando vectores de conversiÓl1 Kappa de cadena pesada y ligera de IgGI humano (Yamold

25 and Fell, 1994 Cancer Res. 54: 506-512). Estos vectores se disel\aron de manera que los sitios de reglón constante de inmunoglobulina mulina de cadena pesada y ligera se cortan y se sustituyen por los sitios de región oonstante gamma 1 y kappa humana mediante recombinaci6n hom6loga. La linea celular de hibricloma quimerico resultante expresa un anticuerpo qUimériCO consistiendo en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal original y de las regiones constantes gamma 1 y kappa humanas.

11.2 RESULTADOS

[02043] Para evaluar la eficacla de cAC10 in vivo. se· les Implant6 células l540cy subcutáneamente 8 los ratones SC1D como se ha descrtto arterionnente. Cuando lo~; tumores alcanzaron un lamaf'io medio mayor de 150 mmJ se dividió a los ratones en grupOs que o bien no se habian tratado o se hablan tratado con 2 rng/kg de cAC 10 dos veces por semana hasta un total de cinco inyeoCiones. los tumores en los ratones no tratados crecieron

35 rápidamente hasta un tamano medio mayor de 600 mm1 (Fig. 11). Por el contrario , el tamaño tumoral medio en los animales tratados con cAC 10 permaneció más O menos igual.

12. ACTIVIDAD IN VlTRO DE CONJUGADO DE: FÁRMACO DE AC10 QUIMÉRICO

[0244) Se puede utilizar cAC1Q para administrar selectivamente un agente cltotóxioo a las células positivas de CD30. Como se muestra en la Fig. 12, Karpas positivo de C030 (AlCl) Y L540cy (HD), Y la línea de células B negativa de CD30 Daudi se examinaron para averiguar la sensibilidad relativa a un agente cit0t6xico administrado mediante un conjugado de fannacos del anticuerpo cAC10 (AOC). Las células se expusieron a CAC10 conjugado al agente cltolOldCO AEB (cAC1Q.AEB) durante 2 h, se lavtlron pare eliminar el AOC libre y se determinó la viabilidad celular a las 96 h. La citotoxicldad como se determina por el ,ensayo de reducción de colorantes de lelrazolio (Xm. Tanto Karpas 299 como L540cy fueron sensibles al con;ugado cAC10-AEB con vaklres de IC50 (concentración que mató al

45 50% de las células) de <0,1 microgramo/ml. Por el contrario, los valores de IC&. en las células Daudi fueron >10 microgramo/ml. Las tres lineas celulares fueron igUél1 de sensibles a la auristatina E no conjugada por si misma (datos no mostrados).

13. ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE CONJUGADOS DE FÁRMACO-AC10 QUIMéRICO

(0245) La actividad antltumoral del AC10 quimérico CClOjugado al derivado AEB de la auristatina E (como se describe en la solicitud estadounidense ne 09/8.45.786 pres'entada el 30 de abril de 2001, se evaluó en ratones SCID portadores de xenotransplantes l540cy de la enfemledad de Hodgkin (Fig. 13). A los retones se \es implantaron subcutáneamente células de L540cy y la terapia se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 75 mm:). La terapia consisti6 en lall administración de cACtO·AEB en o bien 3 mg/l(gldosls o 10 mglkgldosis con un total de 4 dosis administradas a intervalos de 4 días (q4dx4). Los tumores en todos los ratones SS que recibieron cAC1D-AEB en ambas dosis se reCUperaron completamente y estaban curados el dla 18 tras el implante tumoral, g dias después del inicio de la terapia. Estas recuperaciones completas mantuvieron su efecto

durante la duraCión del estudio. Estos resultados demuestran que un anticuerpo anti-CD30 quimériCO conjugado a un fármaco Quimioterapéutico, tal como la auristatina, E, puede tener una eficacia significante en la enfermedad de Hodgkin.

LISTADO DE SECUENCIAS

[02M3j

<110> Seattle Genetics, Ine.

<120> ANTICUERPOS ANTI-CDJO RECOMBINANTES y USOS DE LOS MISMOS

<1 30> 9632-022-228

<140> Por asignar <141'" Conjuntamente oon la presente memoria

<160> 32

<170> FastSEO para Windows Versión 3.0

<210.,.1 <211'" 351

<212> ADN

<213> Mus mlJsculus

<220>

<221> CDS <222"> (1)... (351)

<400>

ca. ate ca. et. c•• ca. tet ..a cct: .a. .t. oto aa. eet ••• oet .s

Gln lle Gln Le. GIn Gln Ser Gly Prc) GI.u val val Ly. Pro Gly Ala 1 5 10 15

tca .t. aag ata tcc tgc aag .ct tct; g.c tac acc ttc act gac tac 96 Su Val Ly. n. Ser Cys Ly. Ala Sel: Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 2'_." 30

tat ata ace tgg .t. aa. ca. aa. cct: • ga ca• gga 'ctt .a. tgo att 144 Tyr lle thr 'l'rp Val Lys Gln 'Lys Prc) Gly Gln Gly Leu Glu Trp !le 3S .0 'S

.ga tgg att tat cct oga agc ggt aat: act a•• tac aat gag aog ttc 192 Gly Trp na Tyr Pro ely Ser Gly Asn Thr Ly. Tyr Asn Glu Ly. Phe 50 55 60

saq ggc aag gcc ac. tt. act gta 9a(: aca tcc tcc aqc ¡lea gcc ttc 2.0 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr ValAsp Thr Ser Sor Ser Thr Ala Phe

6S

70 7S BO

atg ca. etc agc a.c ctg aea Her Gln Le. Ser Ser Leu Thr 85

tct CJac;r Ser Glu gac aet Asp Thr 90 qct qtc tat Ala val Tyr He tgtPhe ey. 95 2BB

gcg aac tat g~ aac tac tgq ttt gct: Ala Asn Tyr GIy Asn Tyr Trp Phe Al.. 100 lO!,

tac tgg gge ca. 909 act ca9 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln no 336

9tc act gtc tet gca val Thr Val Ser Al.

351

115

<210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus

S

<400> 2

Gln Uo Gln Leu 1 Ser vol Ly. Ue 20 Tyr Ue Thr Trp 35 Gly Trp ne TyrSO Ly. Gly Ly. Ala 65 Met Gln Leu Ser Gln S Ser val Pro Thr Ser 85 Al. Asn Tyr Gly Asn Val Thr 100 Val Ser Ala 115

Gln Ser Gy. Ly. Lys Gln Gly Ser 55 Leu Thr 70 Leu Thr Tyr Trp Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15 Al. Ser. Cly Tyr Thr Phe Thr Asp Ty:r:: 25 30 Lys Prol Cly Cln Cly Lau Glu Trp 11. .0 45 Gl y Asn, Thr Lys Tyr' Asn 60 Glu Ly. Ph. val Asp 'l'hr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 75 80 Ser Glu. Asp Thr Ala v.l Tyr Phe eyo 90 95 Phe Al. Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 105 110

10

<210> 3 <211>15 <212> AON <21 3> Mus musculu5

<40{»

3

gactactata taacc 15

15

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 4

ASp Tyr Tyr 1 .

Ile Thr 5

20

<210> 5 <211>51 <212> ADN <213> Mus musculus <40{»5

Iggatttatc ctggaagcgg taatactaag tacaatgaga agttcaaggg e 51

2S

<210> 6 <211"'17 <212> PRT <213> Mus musculus

<400>6

39

Trp 11e Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 S 10 15 Gly

S

<210> 7 <21 1> 24 <212> AON <213> Mus muscuJu&

<400> 7

tatggtaad actggtttgc ttac 24

10

<210> 8 <2 11> 8 <212> PRT <213> Mus rn.Jsculus

<400> 8

Tyr Gly ~n 'I'yr Trp Phe Ala Tyr15·

15

<210> 9 <211 >333 <212> ADN

<21 3> Mus rnuSQJlus

<220>

<221> cos

<222> (1).,,(333)

S <400> 9

gae att gt. ct. ,cc c•• tct cca get tct ttg oct .tg tct cta .90 48 ASp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Al.• S.r Leu Ala Val Ser Lau 'Gly 1 S 10 lS

eag agg oee aee ate tee tgc a'g qc:e 'Oc c•• agt .tt oat ·ttt ••t 96 Gln Ar. Ala lhr Ua Ser cy. Lys Al.a Ser eln Ser Val lUp Pha A.p 20 2'S JO

qqt qet ..gt tat at. a.c t •• tee cala co. aaa. cea ..a cag cea cee 144

Gly ASp Ser Tyr Het Asn Trp Tyc 'Gl.n Gln Ly. Pro Gly eln Pro Pro J5 .0 .5

... ;te etc ate ht get .ea tec aa,t eta ..a t et gg. ate cea gee 192

Lyo val Leu Ue Tyr , Al. Ala Ser A. n Lau elu Ser ely Ue Pro Ala 50 SS 60

ag. ttt aqt ggc a.t 9.' tet ••• . ea gae tte aee e te aae ate eat 2.0

Aro pha Ser Gly Ser Gly Ser ely Tltr A•• Pha lhr r.eu Asn na H19 65 70 75 80

cet ot. gag • ag ga• gat get .ea aee tat tac t9t ca. eaa agt .at 2S8

Pro Val elu Glu Glu Asp Ala Al. Tltr lyr Tyr Cys eln Cln Ser Asn SS 90 9S

gag gat ccg tg. ac. ttc 9gt 9g& 991c acc ••• ctq gaa O<e ..a 333

Glu lUp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gl.y Thr Ly. Leu Glu Il. Ly.100 '105 110

<21 0> 10

<211 > 111

<212> PRT 10 <213> Mus rrusculus

<400> 10

Asp lle Val Leu Thr Gln Ser Pr o Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15 Gln Arg Ala Tltr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Cln Ser val Asp Ph. ... p 20 Z5 JO eIy A3p Ser Tyr Het ASn TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 .0 45

Lys Val Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Cly Ue Pro Ala

50 55 60Ar. Pha Ser Gly Ser Gly Ser (ay Thr Asp ph_ Thr Leu Asn Ile Hi!l 65 70 75 80 Pro val Glu. Glu Glu Asp Ala ¡:Ua Thr 'ryr Tyr Cys eln Gln Ser Asn

00 .

8' os

. Glu Asp Pro Trp Thr Ph. Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu U. Lys

, 100 l O. 110

<210> 11

<211> 45

<212> ADN

<213> Mus musculus

5 <400> 1145 88ggCC8QCC aaagtgttga ttttgatgg1gatagttata tgaac 45

<210> 12 <:211> 15

<212> PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 12

Ly. Ala Ser Gln Ser Val Asp Pha Asp Gly ASp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15

<210> 13

<211> 21 15 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 13 gctgcatcca atctagaatc t 21

<210> 14 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Ala Ala Sel: Asn Leu Glu Ser 1 S

25 <210> 15

<211> 27

<212> ADN

<213> Mus mUSCI.Jlus

<400> 15 30 cagcaaagta atgaggatcC gtggacg

<21 0> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

5 <400> 16

Gl. Gln ser ~n Glu Asp ~ro Trp Thr 1 5

<210> 17

<211> 37!5

<212> AON 10 <213> Mus musculus

<220>

<221 > CDS

<222> (1) ... (375)

<400> 17

g.g qtg .ag ctg gtg g.g tct gga gga 99c ttg gta cag cct ggg ggt 48

Glu Val Lys Leu V.l Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gl. Pro Gly Gly 1 5 10 15

tct ctg .g. ctc tcc tgt gc' act tct ggg ttc acc ttc agt ga t t.ac

Sar Lau Arg Leu Sor Cy. Ala Thr Ser Gly Ohe 'hr Oh. Sor Asp Tyx •• 20 25 JO

tot atg .ac tgg gte cge ca, cet cc:a "a .., ,ct ctt gag tgq ttg 144 Tyr Met As. Trp Val Ar, Gl. Oro Px:o Gly Lys Ala Lou Glu Trp Leu ·35 40

'S

99t ttt att aga a.c a.a ,ct aat g~,t ttc agt gca 192

tac .Ca -c;:-gag

Gly Phe lle Ar9 Asn Ly. Ala As. Gly Tyo Thr Thr Glu Oh. Ser Ala 50 55 60

tet ,tg atg gqt cgg ttc aee ate tc:c a9a qat qat tec cea 'ge atc 240 Ser Val Met Gly Arg Oh. Thr lle SElr Arg Asp Asp Ser Gln Ser Il.8 65 70 75 80

etc tat ctt .caq atg a~c acc ctg .~a ,ct gag 9ac agt ,ce act tat 288 Leu Tyr Leu Gln Mot Asn Thr Lou Al::q Ala Glu Aop Sor Ala Thr Tyr 8S .0 .5

tac tqt ,ca aga 9at cce cee tot 99t a.c cec cat tat tat <Jet ~tg J36 Tyr Cyo Ala Ar9 ASp Pro Pro Tyo Gly As. Pro Mis Tyr !yr Ala Met 100 1QS 110

gac tac tgg ggt caa 0'-occ tca gtc _Ce otc tec tca 37S Aop Tyr Trp Gly Gl. Gly Thr Ser Val Thr V.l Sor Ser 115 120 125 15

<210> 16

<211> 125

<212> PRT

<213> Mus musculus

«400> 18

Gl. Val LyS Le. Vol Gl. ser Gl.y Gly Gly Le. Val ~ln Pro Gly Gly

1 5 Ser Leo Arq Le. Ser Cys Al. Tbr 20 Tyr Met Asn Trp Val Arq Gln Pr o

35 .0 Gly Phe n. Arg "'n Lys Ala A!1n

50 55

10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser ASp Tyr 25 30 Pro Gly Lys Ala Le. Gl. Trp Leu

45 Gly Tyr Thr Tbr GI. Phe Ser Ala 60

Ser Val Met Gly Arq Phe Thr lle Ser Arq ASp Asp Ser Gln Ser n. 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Het Asn Thr LEtu Arq Al. GI. Asp Ser Al. Thr Tyr

.5 90 95 TYr Cy. Alo Arq Asp Pro Pro Tl'C Gly Asn Pro Mis Tyr Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser ser

<210:> 19 5 <211> 15

<212> ADN <213:> Mus musculus

<400> 19 gattactata tgaac 15

10 <210:> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

«too> 20

<21 0> 21 <21 1>57

<212> AON <213:> Mus musculus

20 <400:> 21

115 120 . 125

Asp Tyr Tyr Met Asn

1

tttattagaa acaaagc1aa tggttacaca acagagttca gtgcatct~~

<210> 22 <211>19

<212> PRT 25 <213> Mus musculus

<400> 22

S

9al9991 57

Phe

Ile ArQ Asn Lys Ala ASn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Se::: Ala Ser

1

S 10 15

Val

Met G1y

<210> 23

<21 1> 42

<212> AON <213> Mus musculus

<400> 23 gatoccccct atggtaaccc ecattattet gctatggact se 42

5

<210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Mus muscukJs

<400> 24

10

A. p Pro Pro Tyr Gly Asn 1 5 Pro Mis Tyr Tyr Ala Met 10 Asp Tyr

<210> 25 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus

15

<220> <221> COS <222> (1 ) ... (333)

~OO>25

gae att gtg etg oee eag t·ct eet gc:t tcc tta oct ott tct etc;¡ 009 Aop Ile v.l Leu Thr Gln Ser Pro Al.• Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

46

cag ag9 gCC acc Gln Aro Ala Thr 20

ate tea toe ag9 gc:c: agc Ile Ser Cys ArO Ala Ser 2:5 oo. aot gtc agt gca tct Ly. Ser val Ser Ala Ser 30 96

ggc tat ••t tat atg Gly Tyr Asn Tyr Met 35

cac t99 tac ca.a ca9 ••• gca ggg ca9 cco cce Hh Trp Tyr Gln Gln Ly. Ala Gly Gln Pro Pro 40 45 14<

aaa ctc ctc atc cat ctt gc. tce aa.c ota O" tct 909 otc cct gcc Ly. Leu Leu ne Hi. Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser· Gly Val Pro Ala SO 55 60

192

aOg tte aot ggc agt 000 tet ggg ac:a ArO ph. Ser Gly Ser Gly Ser Gly TtI.r 65 70

9ae tte .ec Aop Phe Thr 75 ctc ••c Le. Asn .tc cat Ile His 60 240

eet oto gag gag gag gat gct tca ac:c Pr!3 Vol Glu Glu Glu A!sp Ala Ser Th.r 9S

tat t.e tgt eag cac Tyr Tyr Cy. Gln Ris 90 agt 009Ser Gly 9S 2SS

oa9 ctt eca ttc aeg Glu Leu pro Phe Thr 100

ttc 99C Phe Gly tcg 99:9 aca aao tt9 g.. at. .a. Ser Gly rhr Lys Leu Glu Ile Ly. 105 llO 333

20

<210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 26

45

Aop n_ Val Leu Thr Gln Ser P:tO Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Cln Arg Ala Thi I1. Ser cy. 1\;l:g Ala Ser Ly. Ser Val Ser Ala Ser 20 25 30 Gly Tyr Asn Tyr Het Hi. Trp T~yr Gln Gln Ly. Ala Gly Gln Pro Pro 35 45 Lys Leu Leu Ile His Leu Ala Sl~r 1\3n Leu Glu Ser Gly Val

'" Pro Ala

50 55 60 Aro Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aop Phe Thr Leu Aon n. His 65 70 75 60 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala SI!r Thr Tyr Tyr cy. GIn ais Ser Gly

95 90 95 Glu Leu Pro Phe Thr p~e Gly Sl~.r Gly Thr ~ys Leu Glu 11e Lys100 105 110

<210> 27

<211> 45

<212> ADN S <213> Mus musculus

<400> 27 agggccagca aaagtgtcag tgcatclggc tataattata tgcac 45

<210> 28

<211> 15 10 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

Arg Ala Ser Lys Ser val Se!: Ala Ser Gly Tyr Asn Tyr Met Ris

1 5 10 15

<210> 29 15 <211>21

<212> AON

<213> Mus musculus

<400> 29 2' cttgcatcca acctagaatc t 21

20 <210>30

<211>7

<212> PRT <21:);-Mus musculus

<400> 30

Leu Ala Se,!: Asn Leu Glu Ser

1 5 25

<210> 31

<211> 27

<212> ADN

<213> Mus musculus

5 <400> 31 cagcacagtg gggagcttcc atlcacg 27

<210> 32 <211>9

<212> PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 32

Gln His Ser Gl~( Glu Leu Pro Phe Thr l S

LISTADO DE SECUENCIAS

[0247]

15 <110> Seattle Genetics, Ine.

<120> ANTICUERPOS ANTI-CD3Q RECOMBlNANTE:S y USOS DE LOS MISMOS

<130> 9632-022-228

<140> Por asignar

<141> Conjuntamente con la presente memoria

20 <160> 32 "'170> FastSEQ para Windows VersIón 3.0 "'210> 1

"'211> 351

<212> ADN 25 <213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)".(351)

"'400> 1

c., .tc ca, ct, cag C019 tct ••a get

cct ."9 ,t9 9t. 'a9 cct ggg '8

eln Ue eln Leu GIn Gln Ser ely Pro elu Val Val Lys Pro Cly Ala 1 5 10 15

tca gt. a'9 .ta tcc tgc aa9 ,ct tct "c tae acc <te act g~c tole 96 Ser Val Lys Ue Ser Cys Lys Ala St~r Cly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

t.t ato • cc t9. 9tO .,.ca. a•• C(:t 99a c., ••• ctt ,a, t99 att Tyr Ue Thr Trp Val Lys Gln Lys PJ:O Gly Gln Gly Leu Clu Trp Ile "4

35 .0 4S

o,, to. att t.t cct 9.a aoc ggt ailt .ct ••• tac ••t gag a•• ttc 192Gly T<p n. Iyr pro Cly Ser Gly A~m Thr Ly. Tyr lIsn Clu Lys pheSO 55 60

ug 9gc .ag .cc aca tt. •ct .t• g¡.c aea tcc tcc agc aca gcc ttc 2'0 Lys Gly Ly. Alo Thr Leu Thr V.l k.p Thr Ser Sor Ser Thr Ala Phe 65 10 15 80

at, ca. ctc aOc '9c ct. aca tct gag gac aet .ct ,tc t.t ttc tgt 288Het Gl.. Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr lila V.l TYr Phe Cys 8~ 90 9S

ocg aae tat oot a.c t.c tOg ttt gct tae t99 99c caa ggg aet eaCjJ 336 lIl, Asn Tyr ely Asn Tyr T<p Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 lOs 110

gte act gtc tct gea 351 Val Thr Val Ser lila llS

<210> 2

<211 > 117

<212> PRT S <213> Mus musculus

<400> 2

Gln ne Gln Leu cln eln Ser Gly Pro Glu Val V., Lys Pro Gly lila 1 5 10 ·Ser Val Lys Ue Ser cy. Lys lila Ser Gly Tyr Thr Phe rhr ASP Tyr

"

20 25 30 Tyr Ile Thr Trp Val Lys Glo Lys Pro Gly Cln Cly Leu Glu Trp Ue 35 '0 4S Gly rrp ne Tyr Pro Gly Ser Gly Asn rhr Lys TYt Asn Glu Lys .he

,.

50 60 Lys Gly Lys lila Thr Leu Thr Val ASp 1"h't" Ser Ser Sor Thr Ala Ph. 65 10 15 80

Het eln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp thr Ala Val 't"yr Pbe Cys 85 90 .5 Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp rhe Al. Tyr Trp Cly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Vd Thr Val Ser Ala 115

<210> 3

<211> 15

10 <212> ADN

<213> Mus muscukJs

<400> 3 gactactala taaee 15

5

<210> 4 <211>5 <212> PRT <213> Mus musa.llus

<400> 4

~p 1

Tyr Tyr Ile Thr 5

10

<210> 5 <211>51 <212> AON <213> Mus rTklSWUS

<400> 5 tggatttatc ctggaagcgg taatactaag lacaatgaga agttcaaggg e 51

15

<210> 6 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 6

20

Trp 1 .'y Ile Tyr Pro Gly Ser Gly 5 ~5n Thr Lys Tyr Asn 10 Glu Ly. Ph. Ly. 15

<210> 7 <211> 24 <212>ADN <213> Mus muscu!us

25

<400> 7 tatggtaact actggtttgc ttac 24

30

<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 8

Tyr Gly Asn 'I'yr Trp Phe Ala Tyr 1 5

35

<210> 9 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus

<220> <221> CDS <222" (1)... (333)

40

<400,.9 ,.

,ac att oto cto acc caa tct cca g<::t tet ttg get gto tct eta gOO 48 Asp Il. v.l Leu Thr Gln Ser pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

cao ao, ,cc .cc atc tcc toc .a. gc,c agc caa 'ot ,tt g.t ttt get 96 Gln Aro Al. Thr Ile Ser Cys Ly. Ala Ser Gln Se< Val Asp Pne Asp 20 25 30

,..

Ogt O·t 'ot tat atO aac t .. tac c.ta e'g aa., cea Og· ea, ce. cee

Gly Asp Ser Tyr Mot Asn Trp Tyr Gln Gl. Lys Pro Gly eln Pro Pro 35 45

'0

a•• otc ctc ate tat oct gca tec aa,t ct. ga, tet 999 ate cea gcc 192 Lys val LeU Ile Tyt Ala Al. Ser As,n Leu Glu Ser Gly 119 Pro Ala 50 55 60

agg ttt agt gge agt 90g tet 999 ac:a oac tte .cc ctc aac .tc cat 2.0 ArO Phe Ser Gly Ser Gl, Se< Gly Th.r Asp Ph. The LeU ASn Ile His 65 70 75 80

cct otg gag g.g g.g g.t oet gca ac:c tat tac tgt eao caa agt aat 288 Pro Val Clu elu elu Asp Ala Ala Th.r Tyr Tyr Cy. Cln Gln Ser As. OS .0 .5

gag gat ceg tgg acg ttc 99t 99a 9t;l:c acc aag ctq g.a ate aa. 333 elu Asp Pro T.r;p Thr Phe Gly Gly Gly Tbr Lys Leu Glu Ile Ly.100 lCl5 llO

<210> 10 <211>111

<212> PRT S <213> Mus musculus

<400> 10

..... Ile vol Leo Thr GI• ser p,ro Ala Ser Leu Ala val Ser Leu Gly1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser ey. L:ys Ala Ser Gln Ser Val Asp Ph. Asp20 25 30 Gly A:5p Ser Tyr Met Asn Trp ~yr Gln oln LyS Pro Gly Gln pro Pro

35 .5

'0

Ly. val Leu ll. Tyr Ala Al. Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60 Arg Phe Ser Gl, Ser 01, Ser (:;ly Thr Asp Phe Thr Lao Asn Il. Hi. 65 70 7S 80

Pro Val Glu Glu elu Asp Al. l>.l. Thr Tyr Tyr ey. Gln cIn Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly (;ly Gly Th.J:: L,. Leu Glu ne L,s 100 lOS llO

..:210> 11 10 <211>45

<212>ADN

<213> Mus museulus

<400> 11 aaggccagcc aaaglgttga ttttgal99t gatagttata Igaac 45

5

<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 12

Lys Ala 1

ser Gln Ser 5 Val ASp Phe ASp Gly ASp Ser Tyr Met 10 Asn 15

10

<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 13 gctgcatcca atc1agaatc t 21

15

<210> 14 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 14

20

Ala 1 Ala Sel: Asn Leu 5 Glu Ser

<210> 15 <21 1> 27 <212> ADN <21:? Mus musculus

25

<400> 15 cagcaaagta atgaggatcc gtggaeg 27

30

<210> 16 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 16

Gln Gln Ser Asn Glu ASp 1 S

Pro Trp Thr

35

<21 0> 17 <211> 375 <212> ADN <213> Mus musculus

<220> <221> CDS <222> (1}... (375)

40

<400> 17

gag gtg • ag et. gto gag tet gg. gl:l~ ggc tto ota cao cet Og• oot 48 Glu Val Ly. Leu V.l Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 S 10 15

tet etg ••• ctc tcc tot gca act tct 90O tte aee tte aot oat tac 96 Ser Leu Aro Leu Ser Cy. Ala Thz Sler Gly Phe Thr Ph. Ser Asp Tyr

20 :25 30

tat • tg .ac tg• gtc cgc cag cct cICa 9Cj'1a aag oct ett 0'_ tgg tto 144 Tyr Het Asn Trp v.l p.rg Gln Pro EJ.ro Gly t,ys Ala L.u Glu Irp Leu 3S 40 45

Ogt ttt .tt ao· .ae aaa gct aat C)lgt tac aca aca gag tte agt oca 192 e ,y Ph. 11. ArO Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Ser Ala SO 55 60

tet gto atg oot cOO tte acc atc tee aga gat gat tcc ca. aOc atc 240 Ser Val He< Gly ArO Phe thr Ile S'er Arg Asp Asp Ser Gln Ser ne 65 10 15 80

ctc tat ctt cao ato aac acc ct. alga Oct _a_ gac aot _cc act tat 288 Leu Tyr Leu Gln Het-Asn Thr Leu Aro Ala Glu "p Ser Al. Thr Tyr es 90 95

tac tgt gc. aga gat ccc ccc tat glQ't aac ccc cat tat tat oct ato 336 Tyr Cys Ala ArO Asp Pro Pro Tyz Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 1'05 110

Oac tac tgg ggt caa 9ga acc tca gtc acc otc tcc tca 315 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Va.l t'hr Val Sor Ser llS 120 125

<210> 18

<211> 125

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 18

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser (ily Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 lO 15 Ser Leu Aro Leu Ser cys Al. ,rhr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tye 20 25 30 Tyr Met Asn Trp val Aeo Gln lEJro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Tep Leu 35 ·W 45 Gly Phe lle Arg ASn Lys Al. JUn Gly Tyr The Thr Glu Phe Ser Ala 'O 55 60

Se, val Met Gly Aro Phe Thr :Ue Ser ~rg ASp 'sp Sor Gln Sor n. 65 10 1S 80 Leu Tyr Leu G1n Het Asn Thr lt.eu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 8S 90 95 Tyr Cy. Ala ArO Asp Pro Pro ~ryr Gly Asn Pro His Tyr Tyr Ala Met 100 105 UO

ASp Tyr Trp Gly Gln Gly fhr Ser Val Thr 'Val Ser Ser 115 120 125

<210> 19 10 <211>15

<212> AQN

52

<213> Mus musculus

<400>19 gattactata tgaac 15

<210> 20 5 <211>5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5

10 <210> 21

<211> 57

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 21 15 tttattagss scaaagctaa tggttacaca acagagttca gtgcatctgt gatg991 57

<210> 22 <211>19

<212> PRT

<213> Mus musculus

20 <400> 22

Ph. Ue Arg Asn Lys Ala A3n Gly Tyx Thr Thr Glu Phe Ser Ala Ser 1 5 10 15

Val

Met Gly

25

<210> 23 <211> 42 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 23 gatcccccct slggtaaccc ccattat1at gctatggad se 42

30

<21(}> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Mus muSOJlus

Asp 1

Pro Pro Tye Gly Asn 5 Pro His Tyr Tyr Ala 10 Het ASp Tyr

35 40

<210> 25 <211> 333 <212> AON <213> Mus muscu\us <220> <221> CDS <222> (1 ) ... (333)

<4(}(»

25 53

g'e ate gtg etg aee eag tet eet get tcc tta get gtt tet etg ggg 46 Asp He Val Le. Thr Gln Ser Pro Al, Ser Leu Ala Val Sor Le. Cly 1 S 10 lS

.,. agt gte agt gca

eag a99 gcc occ .te tca tgc agg g'ce ogc tet 96

Cln "r9 Al, Thr Ile Ser Cyo Ar. Al. Ser Lyo Ser val Ser A¡a Ser 20 2S 30

99C tat aat t.t ato t:ac: tg9 tac c'aa cag .,. .c. 9•• ca• cca cec 144 Gl)' Tyr Asn Tyr Het His Trp Tyr G:ln Gln Lys Al, Gly Cln Pro Pro 3S 40 45

aaa ctc ctc atc cat ctt gea tcc a,ac cta gaa tct 9•• gtc cet gce 192 Lys Lo. Lo. no His Le. Ala Ser '~n Lo. Gl. Sor Gly v.l Pro Ah 50 55 60

'99 tte a9t 99C agt .99 tct ggg .c. gae ttc .cc etc aae atc cat 2.0 Arg Phe Sor Gly Ser Cly Ser Gly 'I'hr ASp Phe Thr Le. Asn ne Mis 6S 10 15 BO

cet 9t. g.g gag gag gat qet tca ace tat tac tot c'. cac aot 90g 2BB Pro Val Cl. Glu Glu ASp Ala Ser Thr Tyr Tyr ey. Cln His Ser Gly .S 90 95

gag c<t ce, ttc oe9 tte goe teO 999 aca aag tto gaa ,t. aa. 333 Gl. Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Cl. Ile Lys100 lOS llO

<210> 26

<211> 111

<212> PRT 5 <213:>-Mus musculu$

<400> 26

ASp Ile Vol Le. Thr Gln Ser lE?ro Ala Ser Le. Ala Val Ser Le. Gly l 5 10 15 Cln Arg Ala Thr Ile Ser Cys ;Ilrg Ala Sor Lys Ser V.l Ser Ala Ser 20 2S 30 Gly Tyr Asn Tyr Het Hh Trp 'ryr Gln Gln Lys Ala Cly Cln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Le. Ile His Le. Ala Ser Asn Le. Gl. Ser Gly Val Pro Ala

so ss 60 Arg Ph. Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ASn He H1s 65 10 15 90 Pro val Gl. Glu Glu Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr cys Gln Nis Ser Cly

85 90 95 Cl. Leu Pro Ph. Thr Phe Gly Sor Gly Thr Lys Leu Gl. ne Lys100 105 llO

<210> 27

<211;. 45

10 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 27 agggccagea aaag1gtcaQ tgcatctggc tataattata tgcac 45

<210> 28 15 <211 > 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

~r9 Ala ser Lys Ser Val Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Tyr Het His 1 5 10 15

<2 10> 29

<211>21 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 29 cttgcalcca acctagaalc 121

<210> 30 10 <2 11 >7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 ~

15 <210> 31 <211>27

<212> AON

<213> Mus musculus

<400> 31 20 cagcacaglg gggagcttcc attcacg 27

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

25 <400> 32

Gln His Ser Gly Glu Leu Pro Phe Thr

1 S

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo AC10 humanizado o quimérico que (i) se enlaza inmunoespecificamente con C030 y (Ii) ejerce por sí mismo un efecto citostático o Citotóxico en una l¡nEia celular de la enfermedad de Hodgkín, donde dicho anticuerpo

   S ejerce el efecto citostético o citotóxico en la tine¡1 celular de la enfermedad de Hodgkin en ausencia de una conjugación a un agente citostético o citotOxico, respectivamente, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin.

2. 2.

   El anti~rpo de la reivindicación 1, donde el llnticuerpo comprende una reglOn variable de cadena pesada comprendiendo regiones que determinan la complementariedad teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO:4, la SEC ID NO:6, y la SEC 10 NO:8, y comprende una regiOl"l variable de cadena ligera comprendiendo regiones que determinan la complementariedad teniendo las secuencias de amincacidos de la SEC 10 NO: 12, la SEC ID NO:14 y la SEC ID NO:16.

3. 3.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el antiQJerpo comprende una regiOn variable de cadena pesada que

   tiene al menos un 95% de Identidad con la secuencia de aminoácidos ele la SEC 10 NO: 2. y una regi6n variable de 15 cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC 10 NO:l0.

4. 4.

   El anticuerpo de la reivindicaciOn 3, donde el anticuerpo comprende una regi6n variable de cadena pe5ada y una regiOn variable de cadena ligera comprendiendo las secuencias de aminoécidos de la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO; 10, respectivamente.

5. 5.

   El antICuerpo de cualquiera de las reivinclicacione!; 2 a 4, donde el anticuerpo se conjuga a un agente citotó:dco.

6. 6.

   El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el efecto citostatico o citot6xico se exhibe al emplear un método comprendiendo:

   a) poner en contacto un cultivo de la linea celular de la enfermedad de Hodgkin con el anticueg'o, siendo dicho

   cultivo de aproximadamente 5.000 oeIulas en un [Irea de cultivo de aproximadamente 0,33 cm , dicho contacto

   siendo duranle un periodo de 72 horas;

   25 b) exponer el cultivo a 0,5 ~Ci de "H·timidina durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 hOras; y

   e) medir la incorporación de 3H.timidina en laa células del cultivo. donde el antiQJerpo tiene un efecto Citostatico o citotóxico en la linea celuJar de le enfermedad de He)dgkln si las células del cultivo han reducido la inoorporacl6n de 3H-timidina en comparaciOn con las células de la mls,ma linea celular de la enfermedad de Hodgkln cultivada bajo las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo.
7. 7. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkln comprendiendo:

   a) un anticuerpo AC10 humanizado o quimérico que (i) se enlaza inmunoespecificamente con C030. (ii) ejerce por si mismo un efecto citostático o citotOxioo en una linea celular de la enfermedad de Hodgk.in en ausencia de una conjugadón a un agenle citostático o citotóxico, reap8CÜ\lamenle. en una cantidad eficaz para el tratamiento de La enfermedad de Hodgkln; y

   3S b) un soporte farmacéuticamente aceptable.

8. 8.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 7, donde el anticuerpo comprende una regiOn variable de cadena pesada comprendiendo regiones que determinan la complementariedad teniendo las secuencias de aminoilcidos de la SEC ID NO: 4, la SEC 10 NO: 6. y la SEC 10 NO: 8, y comprende una regiOn variable de cadena ligera comprendiendo regiones que determinan la cclmplementariedad teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC 10 NO:12, la SEC 10 NO: 14 y la SEC 10 NO:1!i.

9. 9.

   La composici6n farmacéutica de la reivindicación 7. donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al mef106 un g5% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC 10 NO: 2, y una región variable de cadeaa!igera que tiene al meK1Q5 un 95% de identidad con 18 secuenQO de aminOécidos de la SEC 10 NO:10.

   4S 10. La CQTIpostción farmacéutica de la reivindicaciÓn 9, donde el anticuerpo comprenoe una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena lig'lra comprendiendO las secuencias de aminoácidos de la SEC 10 NO : 2 y la SEC ID NO:10, respectivamente.
10. 11 . La composidOn farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la cual el anticuerpo se conjuga a un agente citot6xlco.
11. 12. La composlciOn farmacéutica de una cualquiera de las raivindlcaCiones 7 a 10, donde el efecto citostauco o 56

    S

    2S

    citotÓlÓCO se exhibe al realizar un método comprendiMdo:

    a) poner en con~o un cultivo de la \lnea celular de la enf~edad de H~dgkin con el anticuerpo •. siendo dicho cultivo de aprO)omadamente 5.000 cékllas en un área de cultivo de aproxunadamente 0.33 cm • diCho contacto siendo por un periodo de 72 hOras;

    b) exponer el cultivo a 0.5 ~Ci de 3H·timidlna durante las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y

    e) medir la incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo, donde et anticuerpo tiene un efecto citostático o ciloloxico en la Unea celular de la enfermedad de Hcdgkin si las células del cultivo han reducido la incorporación de ~H-timi6na en comparación con las cékJlas de la mi:sma linea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas bajO las mismas condidones pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo.

12. 13.

    Uso de un anticuerpo AC10 humanizado o quimérico que (i) se enlaza inrrunoespecificamente a C030 y (ii) ejerce por sí mismo un efecto citosttl\ico o cilotóxico en una linea celular de la enfermedad de Hodgkin. donde dicho anticuerpo eterce el efecto dtoslático o citotóxico en la linea celular de la enfermedad de Hcdgkin en ausencia de una conjugaci6n a un agente citostático o citotOxico. respectivamente. en la producción de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de HodQkin.

13. 14.

    El uso de la reivindicación 13. donde el an·ticuerpo comprende una regiOn variable de cadena pesada comprendiendo regiones que determinan la complementaiedad teniendo las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO: 4, la SEC 10 NO: 6, y la SEC ID NO: 8, y comprende una regiOn variable de cadena ligera comprendiendo regiones que determinan la complementariedad teniendo las secuencias de amin08ddos de la SEG 10 NO: 12. la SEC ID NO: 14 y la SEC 10 NO: 16.

14. 15.

    El uso de la reivindicaciOn 13, donde el anticueJ1pO comprende una regiOn variable de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC 10 NO: 2. y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 10.

15. 16.

    El uso de la reivindicación 15. donde et anticw~rpo comprende una regi6n variable de cadena pesada y una regiOn variable de cadena ligera comprendiendo las secuencias de aminoácidos de la SEC 10 NO: 2 y la SEC 10 NO: 10. respectivamente.

16. 17.

    El uso de UI'\8 cualquiera de las reivindicaCiones 14 a 16. donde el anticuerpo se conjuga a un agente citotOxico.

17. 18.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaCiones 13 a 16. donde el efecto citostático o citotOxico se exhibe al emplear un método comprendiendo:

    a) poner en contacto un cultivo de la linea celular da la enfermedad de Hodgkin con el anticuerpo. siendo dicho cultivo de aproximadamente 5.000 célulaS en un ~Irea de cultivo de aproximaóamente 0,33 cm • dicho contacto siendo por un periodo de 72 horas;

    b) exponer el cultivo a 0,5 ~Ci de 3H-timidina durante-las 8 horas finales de dicho periodo de 72 horas; y

    c) medir la incorporación de ~H.timidina en las células del CUltivo, donde el anUcuerpo tiene un efecto cilostático o citotOxico en la linea celular de la enfermedad de Hodgkin si las células del cultivo han reducido la incorporaCiOn de 3H-timidina en comparación con las C(¡lulas de la mi:sma linea celular de la enfermedad de Hodgkin cultivadas ba)o las mismas condiciones pero no habiendo estado en contacto con el anticuerpo.