JP2019511199A - 新規の抗ｕｐｋ１ｂ抗体及び使用方法 - Google Patents

新規の抗ｕｐｋ１ｂ抗体及び使用方法 Download PDF

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Abstract

新規の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及び抗体薬物コンジュゲート並びに抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及び抗体薬物コンジュゲートを使用してがんを治療する方法が、提供される。

Description

本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年１２月２２日に出願された米国仮出願第６２／２７０，９９３号及び２０１６年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／４３０，１９１号の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１６年１２月５日に作成され、Ｓ６９６９７＿１３６０ＷＯ＿ｓｃ１１５０１ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、大きさが１０４ＫＢ（１０７，１０２バイト）である。
発明の分野
本出願は、一般に、がん及びがんの再発又は転移の治療、診断又は予防のための、新規の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片、及びそれを含む抗体薬物コンジュゲートを含む組成物に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞の頻度の減少を含むがんの治療のための、このような抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又は抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
幹細胞及び始原細胞の分化及び増殖は、器官形成、細胞修復及び細胞置換の間の組織成長を支援するために協調して働く通常の進行プロセスである。この機構は、生物の必要性に基づいて適切なシグナルのみが生成されることが確実となるように厳しく制御されている。細胞増殖及び分化は、通常、損傷のある若しくは瀕死の細胞の置換のため又は成長のために必要なときにのみ生じる。しかしながら、これらのプロセスの破壊は、様々なシグナル伝達化学物質の過小若しくは過剰な量、微小環境の変化の存在、遺伝子変異又はそれらの組合せなどの多くの要因によって引き起こされ得る。正常な細胞の増殖及び／又は分化の撹乱は、様々な障害、例えばがんのような増殖性疾患を導き得る。
がんに対する従来の処置療法としては、化学療法、放射線療法及び免疫療法が含まれる。これらの治療は効果を奏しないことも多く、外科的切除は有効な臨床的代替手段を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、第１選択治療を行った後に再発した患者の場合に特に明白である。このような場合に、不応性腫瘍は、侵襲性で不治であることが多く、頻繁に発生する。多くの腫瘍の全体的な生存率は、長年にわたり大きく変化しておらず、少なくともこの原因の１部は、既存の治療法が、再発、腫瘍の再発及び転移を防ぎそこなっていることによる。したがって、増殖性障害に対するより標的化された効能の高い治療法を開発することが依然として強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
（発明の要旨）
広い態様において、本発明は、ヒトＵＰＫ１Ｂ決定因子に特異的に結合する、単離抗体及び対応する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）若しくは抗体診断コンジュゲート、又はこれらの組成物を提供する。特定の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ決定因子は、腫瘍細胞上に発現するＵＰＫ１Ｂタンパク質であるが、他の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ決定因子は、腫瘍開始細胞上に発現する。他の実施形態において、本発明の抗体は、ＵＰＫ１Ｂタンパク質に結合し、ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質上のエピトープに結合する抗体との結合について競合する。
選択された実施形態において、本発明は、配列番号１を有するヒトＵＰＫ１Ｂを発現する細胞に結合する単離された抗体を含むか、又は結合についてこの単離された抗体と競合する抗体を含み、この単離された抗体は以下を含む：（１）配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は（２）配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ；又は（３）配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ；又は（４）配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ；又は（５）配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ；又は（６）配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ；又は（７）配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ；又は（８）配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ；又は（９）配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ；又は（１０）配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ；又は（１１）配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ；又は（１２）配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ；又は（１３）配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ；又は（１４）配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ；又は（１５）配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ；又は（１６）配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨ；又は（１７）配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨ；又は（１８）配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨ。
さらなる態様において、本発明は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＵＰＫ１Ｂに結合する抗体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５又は配列番号８９として示される軽鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有しており、該重鎖可変領域は、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７又は配列番号９１として示される重鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有する。
他の態様において、本発明は、配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１０３を含むＶＨ、又は配列番号１０５を含むＶＬ及び配列番号１０７を含むＶＨを有する、ヒト化抗体を含む。ある特定の実施形態において、これらのヒト化抗体は、部位特異的抗体を含む。
他の選択された実施形態において、本発明は、ｈＳＣ１１５．９（配列番号１１０及び１１１）、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１（配列番号１１０及び１１２）、ｈＳＣ１１５．１８（配列番号１１３及び１１４）及びｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１（配列番号１１３及び１１５）からなる群から選択されるヒト化抗体を含む。
本発明のいくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む。本発明の他の態様において、好ましくは前述の配列の全て又は一部を含めて、抗体は、内在化抗体である。さらに他の実施形態において、抗体は、部位特異的抗体を含む。他の選択された実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかを含む抗体薬物コンジュゲートを含む。
ある特定の態様において、本発明は、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体をコードする核酸、又はその断片を含む。他の実施形態において、本発明は、上記の核酸の１つ以上を含むベクター、又は前記核酸若しくはベクターを含む宿主細胞を含む。
上で言及したように、本発明はさらに、本明細書において開示されている抗体がペイロードにコンジュゲートされている、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートを提供する。ある特定の態様において、本発明は、ｈＵＰＫ１Ｂを免疫優先的に（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）会合する、又はｈＵＰＫ１Ｂに結合するＡＤＣを含む。本発明の適合抗ＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、以下の式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ、又は薬学的に許容されるその塩（式中、
ａ） Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、
ｂ） Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ） Ｄは、薬物を含み、
ｄ） ｎは、約１〜約２０の整数である）
を一般に含むことができる。
ある特定の態様において、本発明のＡＤＣは、上記のもののような抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はこの免疫反応性断片を含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、放射性同位体、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン誘導体、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、又は本明細書に記載されている追加の治療成分から選択される、細胞毒性化合物を含む。
ある特定の態様において、本発明は、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ、又は薬学的に許容されるこの塩（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、オーリスタチンを含み、
ｎは、約１〜約２０の整数である）
を一般に含むことができる。
他の態様において、本発明は、以下の式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ、又は薬学的に許容されるこの塩（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、ドラスタチンを含み、
ｎは、約１〜約２０の整数である）
を一般に含むことができる。
本明細書において開示されている抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを含む医薬組成物がさらに提供される。ある特定の実施形態において、本組成物は、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％又はさらには約９５％超の選択される薬物−抗体比（ＤＡＲ）を含む。いくつかの実施形態において、選択されたＤＡＲは２になる一方、他の実施形態において、選択されたＤＡＲは４になり、他の実施形態において、選択されたＤＡＲは６になり、さらに他の実施形態において、選択されたＤＡＲは８になる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているもののような医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法である。ある特定の態様において、がんは、例えば、急性骨髄性白血病又はびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫のような血液悪性腫瘍を含む。別の態様において、対象は、固形腫瘍に罹患している。このような実施形態に関すると、がんは、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、食道がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺がん及び神経膠芽腫からなる群から好ましくは選択される。ある特定の実施形態において、対象は、膵臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、胃がん、子宮がん又は子宮内膜がんに罹患している。いくつかの態様において、対象は、膵臓がんに罹患している。別の態様において、対象は、膀胱がんに罹患している。さらに、選択された実施形態において、上記のがんを治療する方法は、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣに加えて、少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することを含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞を減少させる方法であって、腫瘍開始細胞集団を明細書に記載されているＡＤＣと接触させる（例えば、インビトロ又はインビボ）ことを含み、これにより腫瘍開始細胞の頻度を減少させる、方法を含む。
一態様において、本発明は、細胞毒を細胞に送達する方法であって、細胞を上記ＡＤＣのいずれかと接触させることを含む、方法を含む。
別の態様において、本発明は、対象におけるがん（例えば肺がん又は血液悪性腫瘍）を検出、診断又は監視する方法であって、腫瘍細胞をＵＰＫ１Ｂ検出剤と（例えば、インビトロ又はインビボで）接触させること及び腫瘍細胞と会合したＵＰＫ１Ｂ剤を検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＵＰＫ１Ｂ遺伝子型決定因子と関連する核酸プローブを含む。関連実施形態において、診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含む。当業者は、このような薬剤は、以下に開示されており、かついくつかの標準技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）のいずれか１つを使用して検出される、エフェクター、マーカー又はレポーターにより標識されてもよく、又はこれらと会合されてもよいことを理解している。
同様に、本発明は、がんのようなＵＰＫ１Ｂ関連障害の診断、監視又は治療に有用であるキット又は装置及び関連する方法も提供する。この目的を達成するために、本発明は、好ましくは、ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを含むレセプタクルと、ＵＰＫ１Ｂ関連障害を治療、監視若しくは診断するために前記ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを使用するための取扱説明資料とを含むＵＰＫ１Ｂ関連障害を検出、診断若しくは治療するのに有用な製品、又はこのための投与レジメンを提供する。選択された実施形態において、装置及び関連する方法は、少なくとも１つの循環する腫瘍細胞を接触させることを含む。他の実施形態において、本開示のキットは、キット又は装置がＵＰＫ１Ｂに関連するがんの診断、監視又は治療のために用いられることを示す取扱説明書、ラベル、添付文書、読本などを含むか、又はこのための投与レジメンを提供する。
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化及び詳細の省略を含む。結果として、当業者は、この概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の主題の他の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載の教示から明らかになる。この概要は、以下で詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を紹介するために提供される。
ＵＰＫ１Ｂの、注釈つきアミノ酸配列（図１Ａ）を、略図（図１Ｂ）とともに提示する。 ＵＰＫ１Ｂの、注釈つきアミノ酸配列（図１Ａ）を、略図（図１Ｂ）とともに提示する。 ＳＯＬｉＤプラットフォームを使用して、患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）、がん幹細胞（ＣＳＣ）及び非腫瘍形成性（ＮＴＧ）細胞、並びに正常組織に由来するＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定により測定した、ＵＰＫ１Ｂの発現レベルを示す図である。 Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して、患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）、がん幹細胞（ＣＳＣ）及び非腫瘍形成性（ＮＴＧ）細胞、並びに正常組織に由来するＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定により測定した、ＵＰＫ１Ｂの発現レベルを示す図である。 正常組織及び様々なＰＤＸ腫瘍から単離されたＲＮＡ試料におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、ＵＰＫ１Ｂ転写産物の相対発現レベルを図示している図である。 正常組織及び様々なＰＤＸ細胞株における、マイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定された、ＵＰＫ１Ｂ転写産物発現の正規化済み強度値を示す図である。 公に入出可能なデータセットである、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの正常組織及び原発性腫瘍におけるＵＰＫ１Ｂ転写産物の発現を示す図である。 ＴＣＧＡデータセットからの原発性腫瘍において、ＵＰＫ１Ｂ転写の高発現及び低発現に基づく、カプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフであり、指標値の閾値は、ＴＰＭ値の相加平均を使用して決定される。 例示的な抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の抗体アイソタイプ、細胞殺傷及びビニングの特徴を表形式で示す図である。 例示的な抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の抗体アイソタイプ、細胞殺傷及びビニングの特徴を表形式で示す図である。 ビンの関数としてプロットした抗体の細胞殺傷活性をプロットした図である。 いくつかの例示的なＰＤＸ腫瘍細胞株における、ＵＰＫ１Ｂタンパク質発現のレベルを例示する図である。 図９Ａ及び図９Ｂは、免疫組織化学により決定した、操作された細胞株における、ＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を表形式で示した図である。 図９Ｃ及び図９Ｄは、免疫組織化学により決定し、腫瘍サブタイプの関数としてプロットした、膀胱がん組織アレイにおけるＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を示す図である。 様々な膵臓がんＰＤＸ細胞株の場合の、フローサイトメトリにより決定した、腫瘍細胞の表面におけるＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を示す図であり、本発明の例示的な抗体（黒色の線）を、アイソタイプ対照染色集団（灰色）と比較している。 様々な膀胱がんＰＤＸ細胞株の場合の、フローサイトメトリにより決定した、腫瘍細胞の表面におけるＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を示す図であり、本発明の例示的な抗体（黒色の線）を、アイソタイプ対照染色集団（灰色）と比較している。 マイクロアレイにより決定した、ＣＤＫＮ２Ａ変異状態の関数としての、ＵＰＫ１Ｂ ＲＮＡレベル（図１１Ａ）及びタンパク質レベル（図１１Ｂ）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、例示的なマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の軽鎖可変領域の連続したアミノ酸配列（配列番号２１〜９１、奇数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、例示的なマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の軽鎖可変領域の連続したアミノ酸配列（配列番号２１〜９１、奇数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、例示的なマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の重鎖可変領域の連続したアミノ酸配列（配列番号２１〜９１、奇数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、例示的なマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の重鎖可変領域の連続したアミノ酸配列（配列番号２１〜９１、奇数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、前述の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインの核酸配列を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、完全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、完全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 マウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ１１５．９マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。 マウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ１１５．９マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。 マウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ１１５．１８マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。 マウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の注釈のついたアミノ酸配列及び核酸配列を提示する図であり、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ１１５．１８マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。 親及びヒト化ＵＰＫ１Ｂ抗体クローンの抗体親和性を表形式で示している図である。 図１４Ａ及び図１４Ｂは、出所マウスＶＨ及びＶＬドメインを含むキメラ抗体と比較した、ヒト化ＵＰＫ１Ｂ抗体ｈＳＣ１１５．９及びｈＳＣ１１５．１８の細胞殺傷能力を例示している図である。 ヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣが、ＵＰＫ１Ｂタンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を内在化して殺傷する能力を示す図である。 抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、インビボにおいて、ＰＡ腫瘍に内在化して、様々な細胞毒の送達により、腫瘍体積の顕著かつ長期にわたる縮小を引き起こすことができることを示す図である。 抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、インビボにおいて、ＰＡ腫瘍に内在化して、様々な細胞毒の送達により、腫瘍体積の顕著かつ長期にわたる縮小を引き起こすことができることを示す図である。 抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、インビボにおいて、ＰＡ腫瘍に内在化して、様々な細胞毒の送達により、腫瘍体積の顕著かつ長期にわたる縮小を引き起こすことができることを示す図である。 ＵＰＫ１Ｂの発現レベルとインビボでの腫瘍成長阻害量との間の相関関係を例示している図である。
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、組織化を目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
驚くべきことに、ＵＰＫ１Ｂの表現型決定因子が、新形成を含む、様々な増殖性障害と臨床的に関連すること、並びにＵＰＫ１Ｂタンパク質及びその変異体又はアイソフォームが、関連する疾患の治療に利用することができる有用な腫瘍マーカーを提供することが見出された。この点において、本発明は、操作された抗ＵＰＫ１Ｂ抗体標的化剤と胞傷害性ペイロードとを含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。下記でより詳細に議論されかつ添付の実施例において示されるように、本開示の抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞を除去するのにとりわけ有効であり、したがって、特定の増殖性障害又はその進行若しくは再発の治療及び予防に有用である。さらに、本開示のＡＤＣ組成物は、比較的高いＤＡＲ＝２パーセンテージ及び予期しない安定性を示し得、それにより、同じ成分を含む従来のＡＤＣ組成物と比較した場合に改善された治療指数をもたらし得る。
さらに、細胞表面ＵＰＫ１Ｂタンパク質のようなＵＰＫ１Ｂマーカー又は決定因子が、がん幹細胞（腫瘍永続細胞としても公知）と治療上関連し、これを除去するか又は無症状にするために効果的に利用することができることが見出された。本明細書で開示するような抗ＵＰＫ１Ｂコンジュゲートの使用によるがん幹細胞を選択的に減少させる又は除去する能力は、このような細胞が一般的に多くの従来の治療に抵抗性であることが公知であることから、驚くべきことである。すなわち、伝統的及び最近の標的治療方法の有効性は、これらの多様な治療方法にもかかわらず腫瘍成長を永続させることができる抵抗性がん幹細胞の存在及び／又は発生によってしばしば制限される。さらに、がん幹細胞と会合している決定因子は、低いか若しくは一貫性のない発現、腫瘍形成性細胞と会合した状態に留まれないこと又は細胞表面上に存在できないことのために、しばしば不十分な治療標的である。従来技術の教示と極めて対照的に、本明細書に開示されたＡＤＣ及び方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服し、このようながん幹細胞の分化を特異的に除去するか、枯渇させるか、沈黙させるか又は促進することにより、潜在する腫瘍成長を持続させるか又は再誘発するがん幹細胞の能力を無効にする。
したがって、本明細書において開示されているもののようなＵＰＫ１Ｂコンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物）障害又はその進行若しくは再発の治療及び／又は予防に有利に使用され得ることを、特に、留意すべきである。本発明の好ましい実施形態は、とりわけ特定のドメイン、領域若しくはエピトープに関して又は神経内分泌機能を含むがん幹細胞若しくは腫瘍及び本開示の抗体薬物コンジュゲートとのそれらの相互作用に関連して下記に詳細に議論されるが、当業者が、本発明の範囲がこのような例示的実施形態によって限定されないことを理解することが、理解される。むしろ、本発明の最も広範囲の実施形態及び添付の特許請求の範囲は、いかなる特定の作用機序又は特に標的とされる腫瘍、細胞若しくは分子成分にかかわらず、本明細書において開示されているものを含めた抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及びコンジュゲート、並びに新生物障害又は細胞増殖性障害を含めた、様々なＵＰＫ１Ｂ関連障害若しくはＵＰＫ１Ｂ媒介障害の治療及び／又は予防におけるこれらの使用を、広く及び明示的に対象としている。
Ｉ． ＵＰＫ１Ｂ生理学
テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ）タンパク質ファミリーは、この名称が示唆するように、４回の膜貫通（４ＴＭ）螺旋を含有するタンパク質からなる。ヒトにおいて、３３の遺伝子が、このファミリーのタンパク質をコードする（Ｈｅｍｌｅｒ、２０１４年；ＰＭＩＤ：２４５０５６１９）。通常、テトラスパニンは、テトラスパニンが、細胞内アミノ酸と、短いことが予測されているカルボキシル尾部との両方を有すること、及び第２の細胞外ループの方が第１の細胞外ループよりも長いという点で、他の４ＭＴタンパク質（例えば、クローディン）とは区別される（Ｚｏｌｌｅｒ、２００９年；ＰＭＩＤ：１９０７８９７４）。興味深いことに、テトラスパニンファミリーメンバー間の保存は、ＴＭドメインそれ自体において最も高く、細胞外ループでは、より幅広い配列分岐となる。テトラスパニンは、形質膜を含む、細胞内部の様々な膜において見出され得るが、これらのタンパク質の機能は、多くの場合、十分に理解されていない。テトラスパニンは、膜タンパク質及び他のテトラスパニンと会合して、テトラスパニンウェブとも称される、テトラスパニンリッチなマイクロドメインを形成することができることが知られている。これらのマイクロドメイン内において、テトラスパニンは、これらに限定されないが、細胞接着、移動、シグナル伝達、ウイルス（がん誘発性ウイルスを含む）への感受性、浸潤、及び細胞−細胞融合によるものを含む、様々な細胞過程の一因となり得る（Ｈｅｍｌｅｒ、２０１４年）。様々なテトラスパニンが、これらの過程のそれぞれにおいて、又は腫瘍形成及びがん進行において果たす具体的な役割は、依然として不明瞭のままである。
ウロプラキン−１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ；ＴＳＰＡＮ２０又はＵＰＩｂとしても知られている）は、テトラスパニンのファミリーメンバーである。ＵＰＫ１Ｂタンパク質の代表的なオルソログには、以下に限定されないが、ヒト（ＮＰ＿００６９５２）、チンパンジー（ＸＰ＿５２６２７４）、マウス（ＮＰ＿８４９２５５）、ラット（ＮＰ＿００１０１９４２４）及びアカゲザル（ＸＰ＿００１１０８２１９）が含まれる。ヒトにおいて、ＵＰＫ１Ｂをコードする遺伝子は、約３１ｋＢｐにわたる８つのエクソンからなり、染色体３ｑ１３．３２に局在化している。座位の転写は、１つの知られた２０６０ｂｐ転写（ＮＭ＿００６９５２）を生じるが、交互のポリアデニル化部位が、この遺伝子に関して報告されている。続いて、この転写は、細胞膜に同時翻訳的に挿入された２６０のアミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００８８８３）に翻訳される。図１Ａは、ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質の一次アミノ酸配列を図示しており、４回膜貫通ドメインは、太字の小文字フォントで示されており、細胞外ドメインは、大文字フォントで示されており、短い細胞内ドメインは、標準の小文字フォントで示されている。図１Ｂは、ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質のトポロジーの概略図を提示している。
哺乳動物における尿路の上皮ライニングである尿路上皮は、いくつかの層：基底細胞層、中間層及び頂端層からなる。細胞の頂端層は、傘細胞と称される、大きな六角形の細胞により形成され、この傘細胞は、密着結合により強固に相互連結されて、結晶性プラークにより覆われている。これらのプラークは、この断面の外観により、非対称単位膜（ＡＵＭ）と称される超微細構造特徴を生じ、このプラークの外側のリーフレットは、内側リーフレットよりほぼ２倍厚い。この厚い外側のリーフレットは、結晶性タンパク質の２次元アレイからなり、この結晶性タンパク質のＵＰＫ１Ｂは、構成成分の１つである（Ｗｕら、１９９０年；ＰＭＩＤ：２２９０７０；Ｙｕら、１９９０年；ＰＭＩＤ：１６９７２９５）。この位置において、ＵＰＫ１Ｂは、膜透過性を調節して、膀胱ルーメンから血流への分子の細胞間フラックスを制御する一助となり、尿路上皮頂端表面を強化及び安定化する過程に関与し、膀胱が膨張している間の膜の破裂を回避していると考えられる。ＵＰＫ１Ｂは、他のウロプラキン、特にＵＰＫ３Ａ及びＵＰＫ３Ｂとヘテロ二量体を形成することができる。最後の２つのタンパク質はそれぞれ、生合成中に小胞体から逃れるために、ＵＰＫ１Ｂのシャペロン機能を必要とするように思われるが、ＵＰＫ１Ｂタンパク質は、異所的に過剰発現されると、「自己輸出」することができる（Ｔｕら、２００２年；ＰＭＩＤ：１２４７５９４７）。ＵＰＫ１Ｂはまた、尿エクソソームにおいて検出される（Ｇｏｎｚａｌｅｓら、ＰＭＩＤ：１９０５６８６７）。
ＩＩ． がん幹細胞
現在のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫無防備状態マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。本明細書において「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）とも称される腫瘍形成性細胞は、通常、０．０１〜１０％の腫瘍の細胞集団率を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。造血性悪性腫瘍の場合、ＴＩＣは、特に、急性骨髄性悪性腫瘍（ＡＭＬ）において、１：１０４〜１：１０７と非常に稀な範囲となり得、又は例えば、Ｂ細胞系列のリンパ腫において、非常に豊富となり得る。腫瘍形成性細胞は、交換可能にがん幹細胞（ＣＳＣ）とも呼ばれる腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と、腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）との両方を包含している。
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、無限に自己複製することができる。これに関して、ＣＳＣは、腫瘍形成性後代と非腫瘍形成性後代の両方を生成することができ、連続的単離と少数の単離されたＣＳＣの免疫無防備状態マウスへの移植とによって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。これらの「種細胞」が除去された腫瘍でない限り、腫瘍が転位するか又は再発して疾患の再発及び最終的な進行をもたらす可能性がはるかにずっと高いことを示す証拠がある。
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、一次移植片における腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、少数の高精製ＴＰｒｏｇの免疫無防備状態マウスへの連続移植により実証されるように、通常、限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇとに分けることができ、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）及び腫瘍細胞構造を再現する能力の差異によって区別され得る。いずれもＣＳＣと同程度に腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇの方が、後期ＴＰｒｏｇよりも、親腫瘍の特徴を再現する能力が高い。前述の区別にかかわらず、一部のＴＰｒｏｇ集団は稀に、ＣＳＣに通常属する性質である自己再生能力を獲得し、それ自体がＣＳＣになることができる。
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期及び後期ＴＰｒｏｇの両方）並びに（ｉｉ）最終分化腫瘍細胞及び腫瘍浸潤性細胞（例えば、ＣＳＣに由来し、通常、腫瘍バルクを含むことがある、線維芽細胞／間質、内皮及び造血性細胞のような非腫瘍形成性細胞）よりも、高い腫瘍形成性を示し、多くの場合、比較的より静止している。従来の治療及びレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、したがって、より急速に増殖するＴＰｒｏｇ及び他のバルクな腫瘍細胞集団、例えば非腫瘍形成性細胞よりも、従来の治療及びレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズム及び抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。このようなＣＳＣの特性は、進行した病期の新生物を有する患者に持続的な応答をもたらすための標準治療レジメンの失敗を示唆している。なぜなら、標準的化学療法では、継続的な腫瘍成長及び再発を実際に促進しているＣＳＣが、有効に標的とされていないためである。
驚くべきことに、ＵＰＫ１Ｂ発現が、様々な腫瘍形成性細胞小集団を本明細書に記載される治療に対して感受性にする形でこれらの細胞小集団と関連していることが分かった。本発明は、特に腫瘍形成性細胞を標的化するために有用であり、腫瘍形成性細胞を、鎮静するか、敏感にするか、中和するか、頻度を減少させるか、ブロックするか、破棄するか、干渉するか、減少させるか、妨害するか、抑制するか、制御するか、枯渇させるか、和らげるか、媒介するか、縮小させるか、再プログラムするか、消去するか、殺傷するか又は他の方法で阻害する（集約して、「阻害する」）ために使用することができ、したがって増殖性障害（例えば、がん）の治療、管理及び／又は予防を容易にする抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を提供する。有利には、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体は、対象に投与した際に、ＵＰＫ１Ｂの決定因子の型（例えば、表現型又は遺伝子型）にかかわらず、腫瘍形成性細胞の頻度又は腫瘍形成性を好ましくは減少させるように選択されてもよい。腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害若しくは根絶、（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大若しくは再発の制御、（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持又は増殖の中断又は（ｉｖ）これら以外の腫瘍形成性細胞の生存、再生及び／若しくは転移を妨げることの結果として生じ得る。いくつかの実施形態において、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害又は除去、腫瘍形成性細胞の能力の改変（例えば、分化若しくはニッチ破壊の誘導による）又は腫瘍環境若しくは他の細胞に影響を及ぼす腫瘍形成性細胞の能力に対する他の方法による干渉のうち、いずれによるものであっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持及び／又は転移並びに再発の阻害により、より有効にＵＰＫ１Ｂ関連障害を治療することを可能にする。本開示の抗体の同じ特徴は、標準治療レジメンに耐性又は不応性であることが立証された再発性腫瘍の治療で、抗体を特に有効にすることが、さらに理解される。
腫瘍形成性細胞の頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、限定されないが、細胞数測定又は免疫組織化学的分析、好ましくはインビトロ又はインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。
インビトロ限界希釈分析は、断片化又は非断片化腫瘍細胞（例えば、それぞれ処理又は未処理細胞）を固体培地で培養してコロニーを形成させ、成長したコロニーをカウントし、特徴付けることにより行ってもよい。又は腫瘍細胞を、液体培地を含有するウェルを有するプレート上に段階希釈し、各ウェルを、接種後、好ましくは接種から１０日より後の任意の時点において、コロニー形成について陽性であるか陰性であるかでスコア化してもよい。
インビボ限界希釈分析は、未処理対照又は選択した治療剤に曝露した腫瘍のいずれかからの腫瘍細胞を、免疫無防備状態マウスに段階希釈で移植し、この後、各マウスの腫瘍形成について陽性であるか陰性であるかをスコア化することによって実施される。スコア化は、移植した腫瘍が検出可能となった後の任意の時点で行ってよいが、好ましくは移植から６０日以上経過した後で行う。腫瘍形成性細胞の頻度を決定するための限界希釈実験の結果の解析は、好ましくは、ポアソン分布統計を使用して又は腫瘍がインビボで生成されるか否かの能力のような予め定義された確定事象の頻度を評価することにより（Ｆａｚｅｋａｓら、１９８２、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）、行われる。
フローサイトメトリ及び免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の頻度を決定するために使用され得る。両方の技術が、腫瘍形成性細胞を濃縮することが知られている、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質又はマーカーに結合する１つ以上の抗体又は試薬を利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリ（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を特徴付け、単離、精製、濃縮又は分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリは、細胞の混合集団が懸濁されている流体の流れを、秒あたり最大何千もの粒子の物理的及び／又は化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体又は試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。
したがって、本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化又はＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、特徴付け、監視、単離、薄片化又は集団若しくは小集団の富化に有用であり得る。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される、信頼性のある方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴付け及び操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６及び１２／７５７，６４９において見ることができる。
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離又は特徴付けるために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＬＤＨ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＣ１２Ａ、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＮＡＮＯＧ、ＮＢ８４、ＮＥＳ、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、ＯＳＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＭＡＲＣＡ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＦＲＣ、ＴＲＫＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１及びＣＴＮＮＢ１。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６及び２０１１／００２０２２１参照。
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋並びに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。本発明に関して特に関心がもたれるのは、固形腫瘍におけるＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型、及び白血病におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８−を含むＣＳＣ調製物である。
「正」、「低」及び「負」の発現レベルがマーカー又はマーカー表現型に適用されるとき、以下のように定義される。負（つまり、「−」）の発現を有する細胞は、本明細書において、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義される。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を引いた蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）」又は「ＦＭＯ」染色として参照されることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「＋」）と定義される。本明細書で定義するとき、様々な細胞集団が広範に「正」と定義される。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞は正として定義される。正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ｌｏ」）の細胞と称され得る。代替的に、正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができ、いくつかの実施形態において、パーセンタイルは９９％より大きくなり得る。
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−マーカー表現型及びすぐ上に例示された表現型は、標準的フローサイトメトリ解析並びにさらなる解析のためにＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を、特徴付け、単離、精製又は濃縮する細胞選別技術と組み合わせて使用され得る。
したがって、腫瘍形成性細胞の頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術及びマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体は、腫瘍形成性細胞の頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又はさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、腫瘍形成性細胞の頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性及び新生物の攻撃性の対応する減少をもたらし得ることが理解される。
ＩＩＩ． 抗体
Ａ．抗体の構造
抗体並びにそのバリアント及び誘導体は、承認されている命名法及び番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
「抗体」又は「無傷な（ｉｎｔａｃｔ）抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合にＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、可変長のプロリン及びシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（様々なＩｇＧサブクラスにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体（組換え産生ヒト抗体を含む）、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテイン及びバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖ及びＳｃＦｖＦｃ）並びにＦｃ融合及び他の修飾を含むそれらの誘導体、並びに決定因子との優先的会合又は結合を示す限り、あらゆる他の免疫反応分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、用語はさらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）並びに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γ及びμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。ＶＨ及びＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、又はより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨ及びＶＬ領域間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域及びＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；又はＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ又はＡｂＭ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されるスキームの１つに従い得る。当該技術分野で周知のように、可変領域残基の番号付けは、典型的にはＣｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔに示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウエブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）及びＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基を下の表１に示す。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを用いていることに注意されたい。
Figure 2019511199
抗体配列における可変領域及びＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）に従って、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されている又はこれらを通じてアクセスされ得る。
好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ ｂｏｏｋ ｃｈａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。ここに添付されている図１２Ｇ及び１２Ｈは、ＳＣ１１５．９及びＳＣ１１５．１８抗体の場合の例示的な重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）の注釈における、このような解析の結果を示している。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８〜８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」又は「Ｅｕインデックス」又は「Ｅｕ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１ Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ（配列番号５）及びラムダ（配列番号８）軽鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
Figure 2019511199
Figure 2019511199
同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
Figure 2019511199
当業者は、野生型（例えば、配列番号２、５又は８を参照）の、又は不対システイン（例えば、配列番号３、４、６、７、９又は１０を参照）を与えるように本明細書において開示されているとおりに操作されている、このような重鎖及び軽鎖定常領域配列が、本開示の重鎖及び軽鎖可変領域と、標準的な分子生物学技術を使用して操作可能に会合させられて、本発明のＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートに組み込まれ得る完全長抗体を提供することができることを理解する。本発明の選択された抗体を含む、完全長重鎖及び軽鎖の配列（ｈＳＣ１１５．９、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１、ｈＳＣ１１５．１８及びｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１）は、ここに添付されている図１２Ｆに示されている。
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋又は結合、つまり鎖間及び鎖内ジスルフィド結合がある。当該技術分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置及び数は、免疫グロブリンのクラス及び種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラス又は特定のサブクラスに限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンが、例示のために、本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合がある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖間に存在し、さらにそれぞれの重鎖からそれぞれの軽鎖に存在するジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に必須ではないことが実証された。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えとともにＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６及びＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパ又はラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
Ｂ．抗体生成及び産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；及びＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）を、抗原性タンパク質又は抗原性タンパク質を含む細胞若しくは調製物で免疫化する。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清を、動物を出血させるか又は屠殺することにより取得する。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、又は抗体を部分的若しくは完全に精製して免疫グロブリン分画若しくは単離された抗体調製物を得てもよい。
この点において、本発明の抗体は、免疫適格性の動物における、免疫応答を誘発するいかなるＵＰＫ１Ｂ決定因子からも生成することができる。本明細書において使用する場合、「決定因子」又は「標的」は、特定の細胞、細胞集団若しくは組織において又はこれらの上で、同定可能的に会合するか、又は特異的に見出される任意の検出可能な形質、特性、マーカー又は因子を意味する。決定因子又は標的は、形態的性質の場合もあり、機能的性質の場合もあり、又は生化学的性質の場合もあり、表現型であることが好ましい。好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型又はある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点又は特定の微小環境における細胞の間）によって異なって発現（過剰発現又は過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＵＰＫ１Ｂタンパク質又はそのスプライスバリアント、アイソフォーム、ホモログ若しくはファミリーメンバー、又はこれらの特異的ドメイン、領域若しくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」又は「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入された場合に、免疫応答を刺激することができ、そして免疫応答により生じる抗体によって認識される、任意のＵＰＫ１Ｂタンパク質又はこの任意の断片、領域若しくはドメインを意味する。本明細書において検討されるＵＰＫ１Ｂ決定因子の存在又は不在は、細胞、細胞小集団又は組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞又はＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
任意の形態の抗原又は抗原を含有する細胞若しくは調製物を、ＵＰＫ１Ｂ決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。本明細書に示す用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片又は選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一若しくは複数のドメイン又は全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、これらの表面上の抗原の少なくとも一部を発現する細胞により免疫化されている）又は可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分しか免疫化されていない）又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知であるように、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第１版 ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、第１版 ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ、第２版 １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマ及び生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の産生後、特に有効な抗体を、様々なスクリーニングプロセスを通じて、例えば、決定因子に対するそれらの親和性又は内在化速度に基づいて、選択してもよい。本明細書に記載されるように産生される抗体は「出所（ｓｏｕｒｃｅ）」抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的への親和性を改善するため、細胞培養における産生性を向上させるため、インビボでの免疫原性を減少させるため、多重特異的構築物を生成するために修飾してもよい。モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのより詳細な説明は、下記及び添付の実施例に示される。
３．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体及び／又は下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。技術の１つは、（好ましくはヒト）抗体のライブラリがファージ上に合成されている、ファージディスプレイであり、この技術において、ライブラリは、目的の抗原又はこの抗体結合部分を用いてスクリーニングされ、抗原に結合するファージが単離され、これらから免疫反応性断片を得ることができる。このようなライブラリを調製してスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用することができる他の方法及び試薬もある（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照）。
一実施形態において、組換えヒト抗体は、上記の通り調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリである。
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）により産生された抗体は、中程度の親和性（Ｋａは、約１０６〜１０７Ｍ−１）を有することができるが、親和性成熟は、当該技術分野において記載されている二次ライブラリから構築及び再選択することにより、インビトロにおいて模倣され得る。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、インビトロにおいてランダムに導入され得る（ＬｅｕｎｇらのＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）に報告されている）。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば、目的のＣＤＲにかかるランダム配列を有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して１種以上のＣＤＲをランダムに変異させることにより、及びより高次の親和性クローンをスクリーニングすることによって行われ得る。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。別の有効な手法は、未免疫ドナーから得た天然Ｖドメインバリアントのレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及びＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されている、数回のチェーンリシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ以下の解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
他の実施形態において、同様の手順は、これらの表面に結合ペアを発現する、真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリを使用して用いられ得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態において、ヒト結合ペアは、酵母のような真核細胞において生成するコンビナトリアル抗体ライブラリから単離され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技術により、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを有利なことに可能にし、候補配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリングによる）。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察される。この産生は、遺伝子再配列、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６並びにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４；並びにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得る又はインビトロで免疫化され得る）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（Ｉ）：８６−９５（１９９１）；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
出所が何であろうとも、ヒト抗体配列は、当該技術分野において公知の分子操作技術を使用して作製され、本明細書に記載されている発現システム及び宿主細胞に導入され得ることが理解される。このような非天然に組換えにより産生したヒト抗体（及び、対象組成物）は、本開示の教示と完全に適合し、本発明の範囲内に明示的に保持されている。ある特定の選択態様において、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、細胞結合剤として作用する、組換えにより産生したヒト抗体を含む。
４．誘導された抗体
出所抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＵＰＫ１Ｂ抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、出所抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように公知の分子操作技術を使用して修飾又は改変されてもよい。
４．１．キメラ及びヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＵＰＫ１Ｂに結合するマウスモノクローナル抗体を含み、この抗体は、「出所」抗体と考えることができる。選択された実施形態において、本発明の抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域及び／又はエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択の修飾を通じて誘導され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合又は組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ又はドメイン又は全重鎖及び軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるか又はアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導」抗体は、例えば、決定因子に対する親和性を改善するか、抗体安定性を改善するか、細胞培養物における産生及び収率を改善するか、インビボでの免疫原性を低減するか、毒性を低減するか、活性部分のコンジュゲーションを促進するか、又は多重特異的抗体を作製するなどのために、細胞を産生する抗体に由来する遺伝物質、及び下記に記載されている標準的な分子生物学的技術を使用して産生され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段又は翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターン又はペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種又はクラス由来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにこのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域に操作可能に連結されている選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全て又はほとんどを含んでもよい。他の選択された実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体は、本明細書において開示されているマウス抗体から「誘導」され得、重鎖及び軽鎖可変領域の全体未満を含む。
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しており、抗体の残りは別の種から大きく誘導されるか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナー又は出所抗体）に由来する１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のＦＲが、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性及び抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。出所抗体由来のマウス成分及びアクセプター抗体由来のヒト成分を含む、本発明に適合するＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体は、下記実施例に示すように提示され得る。
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明に従ってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂及びそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ １４：４６２８〜４６３８）に開示されている。ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３３；６７１〜６７４、２００５）を使用して適合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列も適合するアクセプター配列であり得、本教示に従って使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、出所抗体及びアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の誘導された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
例として、ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体並びに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０及び５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１及び７，０８７，４０９を参照。
ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性又はホモロジーは、本明細書で議論したように決定されそして本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
添付の図１２Ａ及び１２Ｂに示される注釈の付されたＣＤＲ及びフレームワーク配列は、専売のＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに従って定義されていることが理解される。しかしながら、本明細書で説明され、また図１２Ｇ及び１２Ｈに示されるように、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ又はＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される定義に従って、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらと同様に容易に同定し得る。このように、前述のシステムのいずれかに従って誘導された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＵＰＫ１Ｂヒト化抗体は、本発明の範囲内に明確に保持される。
４．２．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒又は他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製にとって、抗体上の細胞毒の位置及び薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」又は「部位特異的構築物」は、重鎖又は軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変又は（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体又はその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対又は遊離システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒又は他の化合物（例えば、レポーター分子）とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システインは、抗体のアミノ酸配列内（例えば、ＣＨ３ドメイン内）へと改変させてもよい。いずれにしても、部位特異的抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤであることができ；これらのクラス内で、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であることができる。ＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、Ｃ２１４がそれぞれ組み込まれたカッパ又はラムダのいずれかのアイソタイプを含んでもよく、選択された実施形態において、Ｃ２１４は、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であってもよい。
したがって、本明細書において使用する場合、用語「遊離システイン」又は「不対システイン」は、他に文脈により指示されていない限り、相互に交換可能に使用することができる用語であり、天然に存在しているか又は分子操作技術を使用して選択された残基位置に特別に組み込まれているかにかかわらず、生理学的条件下において天然に存在している（「又は未処理の」）ジスルフィド結合の部分ではない、抗体の任意のシステイン（又はチオール含有）成分（例えば、システイン残基）を意味するものとする。ある特定の選択された実施形態において、遊離システインは、天然の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋パートナーが置換されたか、除去されたか又は他の方法で変化したことにより生理学的条件下で天然に存在しているジスルフィド架橋が破壊され、それによって部位特異的コンジュゲーションに適切な不対システインとなっている、天然のシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは、抗体の重鎖又は軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されているシステイン残基を含む。コンジュゲーションの前に、遊離又は不対システインが、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングされたシステイン（酸化されている）として又は系の酸化状態に依存した同一又は異なる分子上の別のシステイン若しくはチオール基との非天然分子内又は分子間ジスルフィド結合（酸化されている）の一部として、存在してもよいことが認識される。下記でより詳細に説明するように、適切に操作された抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。したがって、特に好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは（天然に存在するものか又は組み込まれたものかにかかわらず）、選択的還元、及びこの後のコンジュゲーションを受けて、均一なＤＡＲ組成物をもたらす。
本開示の改変コンジュゲート調製物により示される好ましい特性は、コンジュゲーションの位置及び組成物の絶対的ＤＡＲ値の観点からコンジュゲーションを詳細に指定し、作製されたコンジュゲートを大きく限定する能力に基づき、少なくとも部分的に、予測されるものであることが理解される。従来の多くのＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、ランダムコンジュゲーション部位及び比較的制御されていないＤＡＲ種を生成する抗体の部分的又は完全な還元に完全に依拠する必要はない。むしろ、特定の態様において、本発明は、好ましくは、標的化抗体を改変して天然に存在する（つまり「未処理の（ｎａｔｉｖｅ）」）鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋の１つ以上を破壊することにより又は任意の位置にシステイン残基を導入することにより、１つ以上の所定の不対（又は遊離の）システイン部位を用意する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基は、標準的分子操作技術を使用して、抗体（又はそれらの免疫反応性断片）の重鎖若しくは軽鎖のいずれの場所に組み込まれてもよく又は付加されてもよいことが理解される。他の好ましい実施形態において、天然ジスルフィド結合の破壊は、後にコンジュゲーション部位として使用され得る非天然システインの導入（後に遊離システインを含む）との組合せで行われ得る。
ある特定の実施形態において、操作された抗体は、鎖内又は鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失又は置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖との間又は抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖又は軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失又は置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換又は欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖又は重鎖の単一のシステインの変異又は欠失によって、操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、スレオニン若しくはグリシン）又は親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン）残基での置き換えを生じ得る。選択された実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失又は置換システイン残基は、軽鎖（カッパ又はラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失又は置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリにおける無傷な抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかの単一システインの欠失又は置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
一実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパ又はラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失又は置換されている。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失又は置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位又は２２９位のシステインが欠失又は置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。このような部位特異的構築物は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されている。適合する部位特異的構築物の概要を直下の表２に示す。ここで、番号付けは一般的にＫａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」又は天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステイン残基が欠失していることを示す）。
Figure 2019511199
本発明の部位特異的構築物と適合可能な例示的な操作された軽鎖及び重鎖定常領域が直下に示されており、ここで、配列番号３及び４は、それぞれ、Ｃ２２０Ｓ ＩｇＧ１及びＣ２２０ΔＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、配列番号６及び７は、それぞれ、Ｃ２１４Ｓ及びＣ２１４Δカッパ軽鎖定常領域を含み、配列番号９及び１０は、それぞれ、例示的なＣ２１４Ｓ及びＣ２１４Δラムダ軽鎖定常領域を含む。各場合において、改変されたか又は欠失したアミノ酸の部位は（隣接残基と共に）、下線を付されている。
Figure 2019511199
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上で議論した通り、重鎖及び軽鎖バリアントはそれぞれ、本開示の重鎖及び軽鎖可変領域（又は、ヒト化若しくはＣＤＲグラフト化構築物のような、この誘導体）と操作可能に会合されて、本明細書において開示されている部位特異的抗ＵＰＫ１Ｂ抗体をもたらすことができる。このような操作された抗体は、開示されるＡＤＣにおける使用に、特に適合可能である。
システイン残基又は遊離システインを提供するための残基を（天然のジスルフィド結合の破壊とは対照的に）導入又は付加することに関して、抗体又は抗体断片上の適合する位置は、当業者によって容易に判別され得る。したがって、選択された実施形態において、システインは、所望のＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロード及び抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン又はそれらの任意の組合せに導入され得る。他の好ましい実施形態において、システインは、カッパ又はラムダＣＬドメイン内に導入されてもよく、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入されてもよい。それぞれの場合において、システインの挿入部位に近位の他のアミノ酸残基を変更、除去又は置換して、分子の安定性、コンジュゲーションの効率性を促進させてもよく又は一度付加されたペイロードに保護的環境を与えてもよい。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接触可能部位にある。このような表面残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が容易に接触可能な部位に位置づけられ、本明細書でさらに記載されているように選択的に還元され得る。ある特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接触可能部位にある。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が接触可能な部位に位置づけられ、抗体と選択的にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）。さらなる置換位置及び適合する部位特異的抗体の作製方法は、その全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，５２１，５４１に記載されている。
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジー及び薬物負荷の化学量論は、抗体の保存された定常領域の操作に主に関わるので、全ての抗ＵＰＫ１Ｂ抗体に広く適用可能である。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列及び天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々な抗体の操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。
４．３．定常領域の修飾又は改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換又は修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含んでもよく、この置換又は修飾により、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増強又は減少、糖鎖結合及び／又はジスルフィド結合の変化並びに結合特異性の変更を含むがこれらに限定されない特徴が、化合物にがたらされる。
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、血清半減期の延長のような細胞毒性の増加及び／又は薬物動態の変化が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５〜３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）を参照。
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長いか、１０日より長いか、１５日より長いか、好ましくは２０日より長いか、２５日より長いか、３０日より長いか、３５日より長いか、４０日より長いか、４５日より長いか、２カ月より長いか、３カ月より長いか、４カ月より長いか又は５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、したがって、抗体の投与頻度を減少させそして／又は投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイされ得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上した又は減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）を参照。
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低下が導かれ得る。当該技術分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親若しくは非修飾抗体又は天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強又は減少している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんど又は全く有さず、例えば、天然配列と比較してＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、本開示の抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合及び／若しくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加及び／又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターン又は改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０を参照。操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強又は減少、標的に対する抗体の親和性の増加又は抗体の産生促進のために有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０及び６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能又は改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又は二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、操作されたか又はバリアントの発現系統を使用し、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現によって様々な生物又は様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後、炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
４．４．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体で又は抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従って使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原又はこの免疫原性断片に免疫特異的に結合するか又は反応し、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。
例示的な免疫反応性断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の様式でそれらを修飾する（ただしおそらくはやや効率が劣る）、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、本明細書に記載されるような１つ以上の遊離システインを含むようにさらに操作されてもよい。
特に好ましい実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ結合ドメインは、ｓｃＦｖ構築物を含む。本明細書において使用する場合、「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗原に結合する能力を保持している抗体に由来する一本鎖ポリペプチドを意味する。ｓｃＦｖの例は、組換えＤＮＡ技術によって形成される抗体ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖断片及び免疫グロブリン軽鎖断片のＦｖ領域がスペーサー配列を介して連結されている。ｓｃＦｖを調製するための多様な方法は公知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６９４，７７８に記載された方法を含む。
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常伴われる少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子操作技術により又は無傷の若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理（例えばパパイン若しくはペプシン）を介するか又は組換え手段により、取得することができる。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
選択された実施形態において、本発明の抗体断片は、様々な立体構造において使用され得る、ＳｃＦｖ構築物を含む。例えば、このような抗ＵＰＫ１Ｂ ＳｃＦｖ構築物は、腫瘍を治療する、養子免疫遺伝子治療法において使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体（例えば、ＳｃＦｖ断片）が使用されて、ＵＰＫ１Ｂと免疫選択的に反応する、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を生成することができる。本開示によれば、抗ＵＰＫ１Ｂ ＣＡＲは、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片（例えば、ＳｃＦｖ断片）、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ ＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又は樹状細胞は、対象の免疫系を刺激するため、具体的にＵＰＫ１Ｂを発現する腫瘍細胞を標的とするため、がんに罹患している対象に導入され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞受容体複合体、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来する細胞内ドメインを介して、一次細胞質シグナル伝達配列を開始する細胞内ドメイン、すなわち、抗原依存性一次活性化を開始するための配列を含む。他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、二次又は共刺激シグナルを開始する細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ及びグルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体由来の細胞内ドメインを含む（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＵＳ／２０１４／０２４２７０１を参照）。
４．５．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体及びコンジュゲートは、一価又は多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子又は特異的位置若しくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置又はエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープ若しくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物及びそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５並びにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０及びＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合してもよく、又は異種性ポリペプチド若しくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合してもよい。選択された実施形態は２つの抗原にのみ結合する（つまり、二重特異的抗体である）ことができるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
５．抗体の組換え産生
抗体及びそれらの断片は、抗体産生細胞及び組換え技術から得られた遺伝子材料を使用して作製又は修飾されてもよい（例えば、Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照）。
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他の細胞核酸若しくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他のものを使用して分離されるとき、「単離される」又は実質的に純粋にされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びこの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖若しくは二本鎖又はＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。選択された実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記実施例に記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖及び重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸分子が、ライブラリから収集され得る。
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。例示的ＩｇＧ１定常領域は、配列番号２に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。例示的な適合性カッパ軽鎖定常領域は、配列番号５に示されている一方、例示的な適合性ラムダ軽鎖定常領域は、配列番号８に示されている。
各場合において、ＶＨ又はＶＬドメインは、これらの各定常領域（ＣＨ又はＣＬ）に操作可能に連結されることができ、この場合、定常領域は、部位特異的定常領域であり、部位特異的抗体をもたらす。選択された実施形態において、得られた部位特異的抗体は、重鎖に２つの不対システイン対を含む一方、他の実施形態において、部位特異的抗体は、ＣＬドメインに２つの不対システインを含む。
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原又は抗体）が検討される。例えば、誘導されたヒト化抗体ＶＨ又はＶＬドメインは、出所（例えば、マウス）又はアクセプター（例えば、ヒト）ＶＨ又はＶＬドメインと配列類似性を示し得る。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ・ウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
追加的に又は代替的に、本発明のタンパク質配列は、公的データベースに対して検索を行い、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用されてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセント又は類似度を上昇させるように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能又は活性を保持する。
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。
本発明は、プロモーターに操作可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節及びプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞及び宿主発現系も提供する。
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、又はポリペプチド及び抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））又は哺乳動物細胞若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターで同時トランスフェクトされていてもよい。
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１及び４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォーム又はＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれも使用することができ、例えば、選択された条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的又は部分的に、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７及びＥＰ０３３８８４１並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９及び５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の適合する発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
本発明の抗体が、組換え発現又は任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製又は単離されてもよく、これにより抗体は、同定され、それらの天然環境から分離されそして／若しくは回収され、抗体又は関連ＡＤＣの診断的又は治療的用途に干渉する混入物から分離される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション及び親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。下記の実施例において、適合する方法をより詳細に説明する。
６．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は選択され、クローニングされ、そして所望の特徴、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロで又は同系遺伝子免疫無防備状態動物においてインビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択、クローニング及び拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学及び生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作及び発現させてもよい。
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）及び抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージ又は酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体又はｓｃＦｖ断片のライブラリがファージ又は酵母で合成されるファージ又は酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージ又は酵母を単離して、これらから抗体又は免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージ又は酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用され得る他の方法及び試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
ＩＶ． 抗体の特徴
ある特定の実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローニングされ、並びに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物の接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＵＰＫ１Ｂアイソフォーム）又は標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、上記のように操作されて、免疫化学的特徴、例えば親和性又は薬物動態が増強又は洗練されてもよい。
Ａ．中和抗体
選択された実施形態において、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」又は「中和」抗体であってもよい。これは、この抗体が、決定因子と会合することができ、直接的に、又は前記決定因子とリガンド若しくは受容体のような結合パートナーとの会合を阻止することにより、前記決定因子の活性を遮断若しくは阻害することにより、これらがなければ、分子の相互作用に起因すると思われる生物学的応答を遮ることを意味する。中和抗体又はアンタゴニスト抗体は、過剰の抗体が、例えば、標的分子活性によって、又はインビトロでの競合結合アッセイにおいて測定すると、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超えて、決定因子に結合したパートナーの結合量を低下させる場合、このリガンド又は基質への決定因子の結合を実質的に阻害する。改変された活性は、当該技術分野で認識されている技術を直接使用して測定されてもよく、又は下流において改変された活性が有する影響（例えば、腫瘍発生又は細胞生存）によって測定されてもよいことが理解される。
Ｂ．内在化抗体
ある特定の実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞のような選択された標的細胞に内在化される（任意のコンジュゲートされた薬学的に活性な成分を伴う）ような、内在化抗体を含み得る。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体又は一部の場合には抗体薬物コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分であり得る。本発明に関連して、発現されたＵＰＫ１Ｂタンパク質の実質的な部分が腫瘍形成性細胞表面に会合して残り、それにより本開示の抗体又はＡＤＣの局在化及び内在化を可能にしているという証拠がある。選択された実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と会合される又はコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
本明細書で使用されるとき、「内在化する」抗体は、関連する決定因子に結合する際に、標的細胞によって（任意のコンジュゲートされた細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。このような内在化するＡＤＣの数は、決定因子発現細胞、特に、決定因子発現がん幹細胞を殺傷するのに十分であることが好ましい。細胞毒又はＡＤＣの全体としての効力に応じて、一部の場合には、抗体の数分子の細胞内への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤ又はカリチアマイシンのようなある特定の薬物は強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化が、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳類細胞に結合して内在化するかどうかは、以下の実施例で記載されるものを含む、当該技術分野で認識されている様々なアッセイ（例えば、Ｍａｂ−Ｚａｐ及びＦａｂ−Ｚａｐのようなサポリンアッセイ；アドバンストターゲティングシステム）により決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
Ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上又は細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導するか、促進するか又はもたらす抗体を指す。実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＵＰＫ１Ｂ発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を殺傷することができる。用語「見かけのＩＣ５０」とは、本明細書において使用する場合、毒素に連結している一次抗体が、この一次抗体によって認識された抗原を発現する細胞の５０パーセントを殺傷した濃度を指す。毒素は、一次抗体に直接コンジュゲートされてもよく、又は一次抗体を認識する二次抗体若しくは抗体断片を介して、一次抗体と会合してもよく、これらの二次抗体又は抗体断片は、毒素に直接コンジュゲートされている。枯渇抗体は、５μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するのが好ましい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、濃縮されたか、区分されたか、精製されたか又は単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料又はがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術に従って監視及び定量されてもよい。
Ｄ．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＵＰＫ１Ｂに対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数又は見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＵＰＫ１Ｂに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ（又はｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＵＰＫ１Ｂに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満又は１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数又はｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリを使用して決定され得る。
Ｅ．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）及びエピトープマッピング
本明細書に開示された抗体は、それらが会合する個別のエピトープの観点で特徴付けることができる。「エピトープ」は、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいて又はタンパク質及び／若しくは巨大分子の複雑な混合物における（例えば、競合アッセイにおける）その標的抗原の抗体による優先的な認識により、確認し、定義することができる。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続的アミノ酸により形成される。線状エピトープに優先的に結合する能力は、一般に、抗原が変性されたときでも維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列における非連続的アミノ酸であるが、抗原の二次的、三次的又は四次的構造の概念において、単一の抗体に同時に結合されるために十分に近接している非連続的アミノ酸を含む。立体エピトープを有する抗原が変性されたとき、通常、抗体はもはや抗原を認識しない。エピトープ（連続的又は非連続的）は、特有の空間的立体配置に、通常少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８〜１０個又は１２〜２０個のアミノ酸を含む。
本発明の抗体は、それらが属する群又は「ビン（ｂｉｎ）」の観点で特徴付けることもできる。「ビニング」は、免疫原性決定因子に同時に結合することができない抗体の対を同定し、それによって結合について「競合する」抗体を同定する、競合的抗体結合アッセイの使用を指す。抗体の競合は、試験される抗体又は免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を予防又は阻害するアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイは典型的には、固体表面又は細胞、非標識試験抗体及び標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＵＰＫ１Ｂ又はこのドメイン若しくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の実施例で提供される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、ＵＰＫ１Ｂ抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
一般に、ビニング又は競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；及びＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ参照）。
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；又は、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリビーズアレイが挙げられる。
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体とともに群分けする。検出因子ｍＡｂ及び捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じか又は密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（又はそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原及び／又は抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力及び解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明に適合する。本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、特異的相互作用のリアルタイム解析を可能にする光学的現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムのような市販の機器を使用して、選択された抗体が、定義された抗原に対する結合に関して互いに競合するか否かを容易に決定することができる。
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中又は異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１及びＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１及びＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメイン又はエピトープを決定するために、さらなる特徴付けを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコルを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージ又は酵母ディスプレイを使用して実施することができる。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）又はペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）も、タンパク分解酵素のような酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）；スクシンイミジルエステル及びそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離アミノ酸のような化学物質を使用して利用することができる。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類することができる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
Ｖ． 抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、薬学的に活性な又は診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）又は「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法にかかわらず、任意の薬学的に活性な又は診断的成分と本発明の抗体との共有結合的又は非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシン又はシステイン残基を通じて達成される。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な又は診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲートされ得る。開示されるＡＤＣは、治療及び診断目的のために使用され得る。
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒又は他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞及び／又はＵＰＫ１Ｂを発現している細胞）に送達し得る。本明細書で示される場合、用語「薬物」又は「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」は相互に交換可能に使用でき、生物学的に活性な又は検出可能な分子若しくは薬物、例えば、下記に記載された抗がん剤又は細胞毒を意味する。「ペイロード」は、任意選択のリンカー化合物と組み合わせた「薬物」又は「弾頭」を含み得る。コンジュゲート上の弾頭は、ペプチド、タンパク質又はインビボで代謝されて活性薬剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位体を含み得る。 好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロードを、弾頭の放出及び活性化の前に、比較的非反応性の非毒性状態で標的部位に向かわせる（例えば、本明細書において開示されているＰＢＤ１〜５）。弾頭のこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステインを介する）及び過剰にコンジュゲートされた毒性ＡＤＣ種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物を通じて達成される。弾頭を大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合されて腫瘍部位に送達されると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的な毒性を実質的に低減し得る。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞及び組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
本発明のいくつかの実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）が組み込まれたペイロードを含むが、診断剤及び生体適合性修飾剤が組み込まれた他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより、提供される標的化放出から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤又は生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的に又は非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。
本発明のコンジュゲートは一般的に、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
又はその薬学的に許容される塩によって表され得る。
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカー及び薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システイン又はリシン）と会合する任意の薬物又は薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対するコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、薬物又は薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーション及び混入物がより少なく、したがって毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
Ａ． 弾頭
１．治療剤
本発明の抗体は、治療成分又は抗がん剤のような薬物である、薬学的に活性な成分、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、融合又は他の方法で会合されてもよい。
例示的な抗がん剤（それらのホモログ及び誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリチアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１及びＤＭ−４（免疫原）のようなマイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカイン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、酸、若しくは誘導体が挙げられる。
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチン及びオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾若しくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体又は誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブ（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体及びチューブリシン、パクリタキセル及びＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシン及びエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン及び５−フルオロウラシル デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチン及びアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を含む。
特定の態様において、本発明のＡＤＣは、ドラスタチン弾頭を含む。適合ドラスタチンは、ドラスタチン１０とドラスタチン１５の両方を含み、これらはそれぞれ、モノメチルアナログ（例えば、モノメチルドラスチン１０）の形態とすることができる。ドラスタチン１０及びドラスタチン１５は、インド洋のウミウシであるドルラベラ・アウリクラリア（Ｄｏｌｌａｂｅｌｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）から単離された海洋天然産物である。小さな線状ペプチド分子であり、ドラスタチン１０及び１５は、様々な腫瘍に対して活性を示す有望な抗がん薬と考えられている。ドラスタチンは、微小管組み立てを妨げる有糸分裂阻害剤であり、これにより、チューブリン凝集体の形成及び有糸分裂の阻害をもたらす。この薬剤はまた、一部のがんにおいて過剰発現される腫瘍性タンパク質である、ｂｃｌ−２を含む機構により、腫瘍細胞アポトーシスも誘発する。適合弾頭であるモノメチルドラスタチン１０及びドラスタチン１５の構造は、直下に示されている：
Figure 2019511199
Figure 2019511199
ジメチルドラスタチン及びモノメチルドラスタチン弾頭のどちらも、本開示のＡＤＣと適合可能であり、本発明の範囲内（例えば、モノメチルドラスタチン１０、モノメチルドラスタチン１５、ジメチルドラスタチン１０及びジメチルドラスタチン１５）にあるものとして明示的に企図されていることが理解される。
ドラスタチンに加えて、本明細書における教示に適合可能な弾頭は、オーリスタチンを含むことができることがさらに理解される。当該技術分野において周知の通り、ドラスタチンは、構造的に修飾されて、密接に関連するオーリスタチンをもたらす。これは、ある特定の場合には、臨床的開発に適した、有効性が等価な誘導体である。これらの合成剤は、α−チューブリン上のビンカアルカロイド結合部位と相互作用して、この重合を遮断し、分裂装置の形成を防止する。特に、適合オーリスタチンは、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含み、これらの構造は直下に示されている：
Figure 2019511199
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ドラスタチンの場合と同様に、ジメチルオーリスタチン弾頭とモノメチルオーリスタチン弾頭のどちらも、開示されるＡＤＣと適合可能であり、本発明の範囲内（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、ジメチルオーリスタチンＥ及びジメチルオーリスタチンＦ）にあるものとして明示的に企図されていることが理解される。
上述のドラスタチン弾頭及びオーリスタチン弾頭のそれぞれが、標的細胞による内在化及びリンカーの破壊に際して放出されることが好ましいことが理解される。下記においてさらに詳細に記載されているように、ある特定のリンカーは、リンカーのいかなる部分も保持することなく、活性な弾頭（例えば、ＭＭＤ１０）の放出を可能にする自己崩壊部分を組み込むことができる切断可能リンカーを含む。
別の実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒａ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、２１１Ａｔ及び２２５Ａｃが挙げられる。他の放射性核種も診断剤及び治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を、弾頭として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７及びＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３及びＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。
他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体弾頭にコンジュゲートされる。本開示の抗体にコンジュゲートされ得る適合ベンゾジアゼピン誘導体（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２並びにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８及びＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。上述のＰＢＤと同様に、適合ベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの小さな溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告され、したがって、本発明のＡＤＣに用いるのにとりわけ適している。
前述の作用剤に加えて、本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にコンジュゲートされてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、薬物成分は、所望の生物活性を有するポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦα又はＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）及びＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
２．診断剤又は検出剤
他の実施形態において、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア又は放射性同位体であり得る診断剤若しくは検出剤、マーカー又はレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生若しくは進行を監視するのに、又は開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するための若しくは治療の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として有用であり得る。このようなマーカー又はレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合又は抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離若しくは単離するために又は前臨床的手法若しくは毒性研究においても、有用であり得る。
このような診断、解析及び／又は検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン及び特定の放射性同位体に放射標識又はコンジュゲートした分子にカップリングすることによって行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
他の実施形態において、抗体又はその断片は、マーカー配列又は化合物、例えば、ペプチド又はフルオロフォアに融合又はコンジュゲートされて、精製又は診断又は分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７６７）及び「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善又は緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又は融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量及び分子構造で取得され得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体若しくは抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じて又はリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーあり又はなしで、抗体又は抗体断片又は誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状又は分岐ポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体若しくは抗体断片をインビボでより安定にするために又はインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００及びＷＯ０１／７７１３７；及びＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示に従って容易に同定され得る。
Ｂ．リンカー化合物
上で示されているように、本発明に適合するペイロードは、１つ以上の弾頭、及び任意選択的に、弾頭を抗体標的剤と会合させるリンカーを含む。多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステイン又はリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的又はそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
適合リンカーは、求核性である還元されたシステイン及びリシンに有利に結合し得る。還元されたシステイン及びリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィド及びチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、この速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、及び抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失又は移行である。しかしながら、いくつかの実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、本明細書で下記の実施例に示される選択的還元及び部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィド及びピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン及びチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
選択された実施形態において、適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体及び単量体状態における自由な可溶性を保持する。細胞への移動又は送達の前に、ＡＤＣは、好ましくは安定であり、無傷のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断又は分解されるように設計され得る。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲート又は薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達又は輸送されるまで、安定及び無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；かつ（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果又は細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣ並びに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体及び薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。ＭＭＡＥ及び抗体のような、２つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分を結合するために有用な二価のリンカー試薬は公知であり、本明細書における教示と適合するそれらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されている。
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカー及び非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、オキシム及びヒドロゾン）プロテアーゼ切断可能リンカー及びジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出及び活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾン又はオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーマル−特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコール又はアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標及び抗体標的に依存する。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマル又はエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、この薬剤はコンジュゲートされると通常減弱化される薬剤であり、かつこのコンジュゲートの血清安定性が比較的高いことである。
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満で不安定（例えば、切断可能）である。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
本発明のある特定の態様において、選択されたリンカーは、式
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー単位及び任意選択的に切断可能リンカー単位を含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、好ましくは共有結合であり、Ｕは、存在していてもしていなくてもよく、腫瘍部位における弾頭からのリンカーの完全な分離を促進する自己崩壊性単位の全て又は一部を含み得る）の化合物を含む。
いくつかの実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される形態など）において、適合リンカーは、
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー及び任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、共有結合である又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊部分を形成する）を含み得る。
Ｌ１及びＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得ることが理解される。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸若しくは塩基不安定性）、温度の変化又は放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元又は酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
ある特定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含んでもよい。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ又はペプチダーゼである。
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン不安定性リンカーである。
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端及びＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
さらに、カルボキシル又はアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕ及びＬｙｓに対して、ＣＯ及びＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−又はＶａｌ−Ｃｉｔである。特定の選択された実施形態において、ジペプチドは、−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。ある特定の他の実施形態において、ジペプチドは、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−を含む。
一実施形態において、Ｌ２は、共有結合の形態で存在する。
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。
一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、これにより弾頭の放出を可能にする。
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来し得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来し得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来し得る。
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体及び天然に存在するアミノ酸の誘導体；並びに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態及びそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−及びＬ２は一緒になって基：
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは、薬物又は細胞毒性剤の位置に対する結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である）を形成する。フェニレン環は、１、２又は３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、アルキル又はヒドロキシアルキルで置換されていてもよい。
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
一実施形態において、ｎは０又は１である。好ましくは、ｎは０である。
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
他の実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカー及びジペプチドを含み、一緒になって、基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成してもよい。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記に示すＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ基を含んでもよい：
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、以下に示す流れに沿って進み、保護された化合物（つまり、細胞毒）の完全な放出を可能にする：
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、Ｌ＊は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である）。弾頭の完全な放出は、所望の毒性活性の維持を確実にする。
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
ある特定の実施形態において、Ｌ１及びＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ又は本明細書に記載の穏やかな還元剤での処理によってリンカー試薬とコンジュゲートするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖のヒドロキシル又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；及び（ｖ）アルデヒド、ケトン、及びカルボキシル基が挙げられる。
本発明と適合する例示的な官能基を、直下に示す：
Figure 2019511199
いくつかの実施形態において、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物−リンカー部分との間の結合は、リンカーに存在しているチオール残基及び末端マレイミド基を通じたものである。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、
Figure 2019511199
 （式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す）であってもよい。このような実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインに由来し得る。
他の適合可能なリンカーに関して、結合部分は、抗体上の活性化残基と反応し得る末端ブロモアセトアミド又はヨードアセトアミドを含んで、所望のコンジュゲートをもたらすことができる。いずれにしても、当業者は、本開示の薬物−リンカー化合物のそれぞれと、適合する抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートすることができる。
本開示によれば、本発明は、適合する抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を下記からなる群から選択される薬物−リンカー化合物（すなわち、本開示の式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ中の［Ｌ−Ｄ］）にコンジュゲートすることを含む方法を提供する：
Figure 2019511199
Figure 2019511199
Figure 2019511199
本出願の目的に関し、ＤＬは、「薬物−リンカー」（又は、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ中の「リンカー−薬物」）の略称として使用され、上記に示す薬物リンカー１〜８（つまり、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５、ＤＬ６、ＤＬ７及びＤＬ８）を含む。ＤＬ１〜ＤＬ５は、リンカーからの放出時に、放出される同一の弾頭（ＭＭＤ１０）を含むことに留意されたい。同一のパターンが、ＤＬ７及びＤＬ８にもやはり該当し、この場合、ＭＭＡＦが、それぞれの場合において、放出される。
末端マレイミド部分が付されたリンカーは、当該技術分野で認識されている技術を使用して、選択されたＵＰＫ１Ｂ抗体の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートしてもよいことが理解される。前述の化合物の合成経路は、当該技術分野において周知であるが、このような薬物リンカーの組合せをコンジュゲートする具体的な方法は、以下の実施例に示されている。
こうして、選択された態様において、本発明は、直下のＡＤＣ１〜８に実質的に示されている式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＵＰＫ１Ｂイムノコンジュゲートをもたらす、本開示のＤＬ部分（ＤＬ１〜ＤＬ８）にコンジュゲートされているＵＰＫ１Ｂ抗体に関する。したがって、ある特定の態様において、本発明は、以下からなる群から選択される構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣを対象としている：
Figure 2019511199
Figure 2019511199
Figure 2019511199
（式中、Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はこの免疫反応性断片を含み、ｎは、約１〜約２０の整数である）。
当業者は、上述の構造が式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎにより定義されること、及びこの中に図示されている１つより多い薬物−リンカー分子がＵＰＫ１Ｂ抗体に共有結合によりコンジュゲートされ得ること（例えば、ｎは約１〜約２０の整数とすることができる）を理解している。より詳細に、下記にさらに詳細に議論するように、１つより多いペイロードが各抗体にコンジュゲートされ得ること、及び上の概略図はそのように解釈されなければならないことが理解される。例として、ＡＤＣ１は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８又はそれ超のペイロードにコンジュゲートされているＵＰＫ１Ｂ抗体を含むことができ、このようなＡＤＣの組成物は、薬物対抗体比（ＤＡＲ）の化学種からなる混合物を一般に含む。
ある特定の態様において、直前に図示されているもののような、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、添付されている実施例に示されている抗ＵＰＫ１Ｂ抗体、又はこの免疫反応性断片を含む。特定の実施形態において、ＡＤＣ１は、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１（例えば、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１ ＭＭＤ１０）を含む。別の態様において、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１（例えば、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１ ＭＭＤ１０）を含む。
Ｃ．コンジュゲーション
いくつかの周知の反応を使用して、薬物部分及び／又はリンカーを選択された抗体に結合させ得ることが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。いくつかの実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニン及びセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて、本開示のペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るためにあつらえられる。
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミド及びヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよく又はリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件及び試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；及び（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性（又は二価）リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、及び化合物と共有又は非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオール又はリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬又は化合物−リンカー中間体又は薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物又はリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分又はリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
コンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホラミダイトが、一般に挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類又はハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８及び９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、イソシアネート及びイソチオシアネートを含むが、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできる。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
化合物をスレオニン又はセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリン又はスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的にかつ迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
いくつかの実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（又はその断片）に、１、２、３、４又はより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位及び／又は新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体又は改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性及び実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内又は鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全又は部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元及びそれに対する薬物リンカーの結合をさらに提供する。
これに関して、部位の改変及び選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなるのを可能にすることが理解される。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作及び選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物及び非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物及び本開示の新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態及び／又は薬力学並びに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、還元されると、上記で開示するようなリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる求核性チオール基を含む。上記のように、本発明の抗体は、還元可能な不対の鎖間若しくは鎖内システイン又は導入された非天然システイン、つまりこのような求核性基を提供するシステインを有してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミド又はハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にされてもよい。したがって、各遊離システインは、理論的には、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬は、本発明に特に適合するが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知の様々な反応、条件及び試薬を使用して行われ得ることが理解される。
さらに、操作された抗体の遊離システインは、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上及び望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内又は分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」又は「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、この選択的な還元は、ある特定の還元剤又はある特定の還元剤濃度の使用により行われ得る。他の実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒の存在下で選択的に還元されている、操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤（例えば、アルギニン）の使用は、抗体重鎖及び軽鎖のコンジュゲーションの程度並びに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。適合する抗体構築物並びに選択的コンジュゲーション技術及び試薬は、本明細書に詳細に組み込むＷＯ２０１５／０３１６９８においてこのような方法及び構築物に関して詳細に開示されている。
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節及び／又は立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を形成（水素結合及び静電相互作用を介して）することが知られており、好ましい立体配座変化を生じさせ得、そして／又は好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させる安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（及び分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、このような技術は、本開示に従って作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーション及び対応する望ましくないＤＡＲ種のレベルを相当に減少させるために使用され得る。
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミン又はグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン及びシステインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、安定化剤は、アルギニンを含む。さらに適合安定化剤は、グアニジン及び塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算又は決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションについて部位特異的な還元された遊離のシステインを生じさせる、任意の化合物を含み得る。好ましくは、このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤又は還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」又は「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（任意選択的に安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質又は条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤又は条件（好ましくは安定化剤との組合せ）は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、遊離システインを効果的に還元する（チオールを提供する）ことができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、いくつかの実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元技術に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば、各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上である。
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生又は保存されるときに、阻止又はキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることがさらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオン及びスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防又は阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じ又は異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、キャップ除去反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元又は選択的還元）中に生じることが理解される。
Ｄ．ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明に適合するコンジュゲーション及び精製方法は、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力を有利にもたらす。この点に関して、本開示の構築物（例えば、部位特異的構築物）及び／又は選択的コンジュゲーションは、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点及び毒素の位置に関して、試料内のＡＤＣ種に均質性を提供する。上記で簡単に述べたように、用語「薬物対抗体比」すなわち「ＤＡＲ」は、抗体に対する薬物のモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、ＡＤＣ調製物内で、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関しても均一である特定のＤＡＲ（例えば、２又は４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明の他のある特定の実施形態において、部位特異的抗体及び／又は選択的還元並びにコンジュゲーションの使用を通じて所望の均質性を達成することができる。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の実施形態において、適合する調製物は、所望の均質性を得るために分析的又は分取クロマトグラフィー技術を使用して精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）又はキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）又は混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
本開示のＡＤＣ及びその調製物は、抗体の立体構造に依存して、そしてコンジュゲーションを達成するために使用される方法に少なくとも部分的に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分及び抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、１つのＡＤＣあたりの薬物搭載量は、１〜２０のペイロード又は弾頭（すなわち、ｎは、１〜２０である）を含むことができる。他の選択された実施形態は、１から１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２の弾頭、又はより好ましくは１から１０の弾頭を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性及び弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物及び他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞８又は１０の薬物負荷は、ペイロードによって、ある特定の抗体薬物コンジュゲートの、凝集、不溶性、毒性又は細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７又は８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４又は６であり、いくつかの実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
本発明により提供される比較的高いレベルの均質性にかかわらず、本開示の組成物は、ある範囲の（ＩｇＧ１の場合は１から８の範囲の）薬物化合物を有するコンジュゲートの混合物を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成要素の抗体のほとんどは、１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（改変された構築物及び選択的還元によりもたらされる相対的なコンジュゲート特異性にもかかわらず、）薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合されていてもよい。つまり、以下の本発明のコンジュゲートＡＤＣ組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するコンジュゲートの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされるある特定の反応混入物を含む）。しかしながら選択的還元及び作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値又は特異度、平均値、範囲又は分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２、４、６又は８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された実施形態において、本発明は、２＋／−０．５又は４＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲又は偏差は、いくつかの実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６若しくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２若しくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、又はさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６又は８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２又はＤＡＲが４）は、組成物中に存在する他の全てのＤＡＲ種に対して測定すると、５０％超の濃度、５５％超の濃度、６０％超の濃度、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度又はさらに９７％超の濃度で存在する。
以下の実施例において詳述されているように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動法のような従来手段により特徴付けられ得る。抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も、決定され得る。ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値は、ＥＬＩＳＡによって決定され得る。しかし、抗体価あたりの薬物分布は、抗体−抗原結合、及びＥＬＩＳＡの検出限界によって認識されない。同様に、抗体−薬物コンジュゲートの検出向けのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体の（抗体の重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基などの）どこに結合しているかを決定しない。
ＶＩ． 診断及びスクリーニング
Ａ．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断又は監視するためのインビトロ及びインビボの方法並びに患者からの細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。このような方法は、がんを有する個体を治療のために特定すること又はがんの進行を監視する方法であって、患者又は患者から得られた試料を、ＵＰＫ１Ｂ決定因子を特異的に認識し、会合することができる検出剤（例えば、抗体又は核酸プローブ）と、（インビボ又はインビトロのいずれかで）接触させること及び試料における検出剤の存在若しくは不在又は会合のレベルを検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、本明細書に記載の検出可能な標識又はレポーター分子と会合した抗体を含む。特定の他の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ抗体は、投与され、二次標識抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出される。さらに他の実施形態（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション又はＩＳＨ）において、ゲノムＵＰＫ１Ｂ決定因子と反応する核酸プローブは、増殖性障害の検出、診断又は監視に使用される。
より一般的に、ＵＰＫ１Ｂ決定因子の存在及び／又はレベルは、タンパク質又は核酸解析のために当業者に利用可能ないくつかの任意の技術、例えば、直接的物理学的測定（例えば、質量分析）、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、凝集アッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ）技術、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術並びにインサイチュハイブリダイゼーション技術を使用して測定されてもよい。方法には、化学反応、例えば、光学的吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光若しくは電気化学発光の生成、反射率、屈折率若しくは光散乱の変化、検出可能標識の蓄積若しくは表面からの放出、酸化若しくは還元若しくは酸化還元種、電流若しくは電位、磁場の変化などから生じるシグナルの測定を含んでもよい。適切な検出技術は、光発光（例えば、蛍光、時間分解蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバート性リン、多光子蛍光の測定を介する）、化学発光、電気化学発光、光散乱、光吸収、放射能、磁場、酵素活性（例えば、光吸収若しくは蛍光の変化を生じさせる又は化学発光の放射を生じさせる酵素反応を通じた酵素活性の測定による）を介した標識の測定を通じて、標識された結合試薬の参加を測定することにより、結合事象を検出してもよい。代替的に、標識の使用を必要としない検出技術、例えば、質量（例えば、表面弾性波測定）、屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴測定）又は分析物の固有の発光の測定に基づく技術を使用してもよい。
いくつかの実施形態において、検出剤と試料中の特定の細胞又は細胞成分との会合は、試料が腫瘍形成性細胞を含む可能性があることを示しており、したがって、がんを有する個体を本明細書に記載の抗体又はＡＤＣを用いて効果的に治療し得ることを示している。
ある特定の好ましい実施形態において、アッセイには、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ若しくはこの変形（例えば、蛍光、色素生産性、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、免疫細胞化学若しくはこの変形（例えば、直接、間接、蛍光、色素生産性など）又はインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）若しくはこの変形（例えば、色素生産性インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）若しくは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨ又はＲＮＡ−ＦＩＳＨ］））が含まれてもよい。
この点に関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための標識されたＵＰＫ１Ｂの使用を含む。より詳細にはＵＰＫ１Ｂ ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断を補助するため及びＵＰＫ１Ｂ抗体療法を含む治療に対する潜在的な応答を監視するための診断ツールとして使用され得る。ある特定の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂは、１つ以上のレポーター分子にコンジュゲートされている。他の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ抗体（例えば、ＳＣ１１５．７）は、標識されておらず、１つ以上のレポーター分子に会合している個別の薬剤（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出される。本明細書で議論するように及び下記実施例において示されるように、適合する診断アッセイは、化学的に固定された組織（これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロム及びピクリン酸が挙げられる）並びに包埋された組織（これらに限定されないが、グリコールメタクリレート、パラフィン及び樹脂が挙げられる）、又は凍結を介して保存された組織に対して実施され得る。このようなアッセイは、治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメン及びタイミングを決定するために使用され得る。
他の特に適合する本発明の態様は、ＵＰＫ１Ｂ決定因子を検出又は監視するためのインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む。インサイチュハイブリダイゼーション技術又はＩＳＨは、当業者にとって周知である。簡潔には、細胞を固定し、特定のヌクレオチド配列を含有する検出可能なプローブを固定した細胞に加える。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合には、検出され得るプローブは、それらの配列にハイブリダイズする。本明細書に示す配列情報を使用して、遺伝子型ＵＰＫ１Ｂ決定因子を発現する細胞を特定するようにプローブを設計することができる。プローブは、好ましくは、そのような決定因子に対応するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、不完全な相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するように慣用的に最適化することができるが、好ましくは、プローブは、選択されたＵＰＫ１Ｂ決定因子に完全に相補的であることが好ましい。選択された実施形態において、プローブは、プローブに付された蛍光色素で標識されており、つまり標準的蛍光方法により容易に検出可能である。
インビボの診断治療又は診断に適合するアッセイには、当業者に公知の磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子放射断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波のような当該技術分野で認識されている画像化又は監視技術を含めてもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血漿又は血液）中の特定の決定因子（例えば、ＵＰＫ１Ｂタンパク質）のレベルを検出及び定量するために使用することができ、同様に、関連する決定因子が関与する増殖性障害を検出、診断又は監視するために使用することができる。例えば、血液及び骨髄試料は、フローサイトメトリと組み合わせて使用されて、ＵＰＫ１Ｂ発現（又は、別の共発現マーカー）を検出及び測定することができ、疾患の進行及び／又は治療への応答を監視することができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボ又はインビトロのいずれかで検出、監視及び／又は定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。
本発明のある特定の実施形態において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療又はレジメンのベースラインが確立される前に、本開示の抗体を使用して評価又は特徴付けされ得る。他の例において、腫瘍形成性細胞は、治療された対象に由来する試料から評価され得る。
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、がんの進行及び／又は病因のインビボでの解析は、腫瘍の進行の程度を決定することを含む。別の実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍の進行の解析が、原発性腫瘍に対して行われる。別の実施形態において、解析は、当業者にとって公知のように、がんの種類に応じて経時的に行われる。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移性細胞に起因する二次性腫瘍の解析が、さらにインビボで行われる。別の実施形態において、二次性腫瘍の大きさと形状が解析される。いくつかの実施形態において、さらにエクスビボの解析が行われる。
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで解析する方法であって、細胞の転移を決定すること又は循環腫瘍細胞のレベルを検出すること及び定量することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の解析は原発性腫瘍から不連続の部位において、細胞の進行性成長を測定することを含む。いくつかの実施形態において、手法は、血管、リンパ、体腔内又はそれらの組合せを通じて分散する腫瘍細胞を監視するために行うことができる。別の実施形態において、細胞転移解析は、細胞遊走、播種、血管外漏出、増殖又はそれらの組合せの結果として行われる。
ある特定の例において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療の前にベースラインを確立するために、本開示の抗体を使用して評価又は特徴付けてもよい。他の例において、試料は、治療された対象かに由来する。いくつかの例において、試料は、対象が治療を開始又は終了してから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６カ月、９カ月、１２カ月又は＞１２カ月後の対象から得られる。ある特定の実施例において、腫瘍形成性細胞は、一定数の投与の後（例えば、治療の２、５、１０、２０、３０回以上の投与の後）に、評価又は特徴付けされる。他の例において、腫瘍形成性細胞は、１回以上の治療を受けてから１週、２週、１カ月、２カ月、１年、２年、３年、４年以上後に、特徴付け又は評価される。
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、決定因子との相互作用により腫瘍細胞の機能又は活性を変化させる化合物又は作用因子（例えば、抗体又はＡＤＣ）を同定するために、試料のスクリーニングに使用することができる。一実施形態において、腫瘍細胞は、抗体又はＡＤＣと接触され、この抗体又はＡＤＣは、ある特定の標的（例えばＵＰＫ１Ｂ）を発現する細胞について腫瘍をスクリーニングするために使用され、このような細胞を、例えば限定されないが、診断目的などの目的のために同定すること、このような細胞を監視して治療の有効性を決定すること又はこのような標的発現細胞のための細胞集団を濃縮することができる。
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験薬剤又は化合物に直接的又は間接的に接触させることと、試験薬剤又は化合物が、決定因子会合腫瘍細胞の活性又は機能を調節するかどうか、例えば、細胞の形態又は生存性の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、細胞の呼吸作用、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟性、増殖性、生存性、アポトーシス又は細胞死を調節するかどうかを決定することとを含む。直接的相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方で、間接的相互作用としては、例えば、参照実体（例えば、細胞又は細胞培養物）に順に作用する中間的分子に対する組成物の作用が挙げられる。
スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングを含み、この方法は、例えば、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラボトル又はプレート上において、任意選択的に所定の位置に配置されたか又は置かれた、細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。ハイスループットのロボット又は手作業による方法は、化学的相互作用を調べ、短期間に多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナルを利用する、例えば、フルオロフォア又はマイクロアレイを介する技術（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）が開発され、さらに情報を非常に迅速に処理する解析（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）が自動化されてきた。スクリーニングされ得るライブラリは、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリ及びアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
ＶＩＩ． 医薬調製物及び治療的使用
Ａ．製剤及び投与経路
本発明の抗体又はＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまま又は最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で任意選択的に適切な薬学的に許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバント及び希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照）。
適切な薬学的に許容される担体は、比較的不活性であり、かつ抗体又はＡＤＣの投与を容易にすることができる物質又は活性化合物を加工して作用部位に送達するために薬学的に最適化された調製物にすることを補助し得る物質を、含む。
このような薬学的に許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集又は溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤及び皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びこれらの組合せを含む。全身投与のための抗体は、経腸的、非経口的又は局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的及び経口的薬物送達のための賦形剤及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。
経腸投与のために適切な製剤は、硬ゼラチン又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又は吸入剤及びこれらの制御放出形態を含む。
非経口投与（例えば、注射による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化又は他の方法で（例えば、リポソーム又は他の微小粒子系で）提供される水性又は非水性の、等張性発熱物質不含滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の薬学的に許容される抗体、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤及び製剤を、対象とするレシピエントの血液（又は他の関連する体液）と等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。
このような製剤に使用するための適切な等張の薬学的に許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液又は乳酸リンゲル注射剤を含む。
特に好ましい実施形態において、本発明の製剤化された組成物は、凍結乾燥して、投与前に再構成することができる粉末形態の抗体又はＡＤＣを提供することができる。注射用溶液の調製のための滅菌粉末は、有効成分を任意選択の共可溶化生体適合性成分と共に含む粉末を生成するために、本開示の抗体又はＡＤＣを含む溶液を凍結乾燥することによって得ることができる。一般的に、分散体又は溶液は、塩基性分散媒又は溶媒（例えば、希釈剤）及び任意選択的に他の生体適合性成分を含む滅菌媒体に、活性化合物を混入することによって調製される。適合する希釈剤は、薬学的に許容されるもの（ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）であり、凍結乾燥後に再構成される製剤のような、液体製剤の調製に有用である。例示的希釈剤は、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。代替的な実施形態において、希釈剤は、塩及び／又は緩衝剤の水溶液を含み得る。
特定の好ましい実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、薬学的に許容される糖と組み合わせて凍結乾燥される。「薬学的に許容される糖」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、保存時のタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を著しく予防する又は減少させる分子である。製剤が凍結乾燥され、次いで再構成されることが意図される場合。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される糖は、「乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」と称すこともできる。例示的糖及びそれらの対応する糖アルコールは、グルタミン酸一ナトリウム又はヒスチジンのようなアミノ酸；ベタインのようなメチルアミン；硫酸マグネシウムのようなリオトロピック塩；三価又はより高い分子量の糖アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールのようなポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；並びにそれらの組合せを含む。さらなる例示的乾燥保護剤は、グリセリン及びゼラチン並びに糖メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース及びスタキオースを含む。還元糖の例は、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロース及びラクツロースを含む。非還元糖の例は、糖アルコール及び他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドを含む。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、とりわけ、ラクトース、マルトース、ラクツロース及びマルツロースのような二糖の還元により得られる化合物である。グリコシド側基は、グルコシド側基又はガラクトシド側基であり得る。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール及びイソマルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖は、非還元糖トレハロース又はショ糖である。薬学的に許容される糖は、タンパク質が保存中の物理的及び化学的安定性及び完全性を（例えば、再構成及び保存後まで）本質的に保持することを意味する「保護量（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）」で、（例えば、凍結乾燥前に）製剤に添加される。
非経口投与（例えば、静脈内注射）向けの本開示の抗体又はＡＤＣの適合製剤は、凍結乾燥粉末から再構成される溶液であるか又は未処理（ｎａｔｉｖｅ）溶液であるかどうかにかかわらず、約１０／ｍＬμｇ〜約１００ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度又は抗体濃度を含むことができる。ある特定の選択された実施形態において、抗体又はＡＤＣの濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００、μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬを含む。他の実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬを含む。
ある特定の好ましい態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０において、１０ｍｇ／ｍｌのＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのスクロース、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む液状製剤を含む。一態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０において、１０ｍｇ／ｍｌのＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのスクロース、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。別の態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０において、１０ｍｇ／ｍｌのＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのスクロース、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。本明細書において議論されている通り、このような液状製剤は、凍結乾燥されて、使用前に、薬学的に適合可能な（例えば、水性）担体により再構成され得る粉末組成物を提供してもよい。液体溶液中の場合、このような組成物は、好ましくは−７０℃において保存すべきであり、光から保護されるべきである。ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ粉末製剤は、凍結乾燥された後、好ましくは２〜８℃において保管すべきであり、光から保護されるべきである。上述の溶液又は粉末はそれぞれ、好ましくは、適切な保管条件を示す標識を伴うガラス製滅菌バイアル（例えば、米国薬局方タイプＩ １０ｍｌ）中に入れられており、１０ｍｇ／ｍＬのＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ（未処理溶液又は再構成溶液中）となる設定体積（例えば、３又は５ｍｌ）を一貫してもたらすよう構成され得る。
凍結乾燥粉末から再構成したか否かにかかわらず、液体ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ製剤（例えば、直上に示した）は、投与前にさらに希釈する（好ましくは水性担体中）ことができる。例えば、前述の液体製剤は、投与のための所望の用量レベルを達成するために、０．９％塩化ナトリウム注射剤、ＵＳＰ又は同等物（必要な変更を加えた）を含む注入バッグ中にさらに希釈することができる。特定の態様において、十分に希釈されたＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ溶液は、ＩＶ装置を用いて静脈内注入により投与される。好ましくは、投与されるＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ薬物溶液（静脈内（ＩＶ）注入又は注射にかかわらず）は、透明、無色及び可視粒子状物質不含有である。
本発明の化合物及び組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮及びくも膜下内、又はそれ以外に移植若しくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルが挙げられる。適切な製剤及び投与経路は、意図する適用及び治療レジメンにより選択され得る。
Ｂ．投与量及び投与レジメン
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体並びに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態及び治療される状態の重症度、治療される対象の年齢及び全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能及び投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害若しくは状態のマーカーの評価に基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、評価は、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された抗原、増殖性又は腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少又は転移の発生の遅延の測定を含む。
本発明のＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重及び用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
選択された実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、用量あたりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内に）投与される。他の実施形態は、用量あたり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００又は２０００μｇ／ｋｇ体重での抗体又はＡＤＣの投与を含む。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり１２、１４、１６、１８又は２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察並びに標準的な医学及び生化学的技術及び測定に基づいて、様々なＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算され、彼又は彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投与量及び１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与され得る。当該技術分野で認識されておりかつ経験的な技術が、適切な投与量を決定するために使用され得ることも理解される。
抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、特別なスケジュールで投与されてもよい。一般に、ＵＰＫ１Ｂコンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、ＡＤＣの有効量は、対象に、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて又は１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年又は数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８週間）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８カ月間）またさらには１若しくは数年間が、本開示の抗体又はＡＤＣの投与の間に経過し得る。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート抗体を含む治療の過程は、数週間又は数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与することを含む。より詳細には、本発明の抗体又はＡＤＣは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月毎に１回、６週間毎に１回、２カ月毎に１回、１０週間毎に１回又は３カ月毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答及び診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。本発明には、不連続投与又は数回の部分投与に分割された１日用量も包含される。本発明の組成物及び抗がん剤は、交互に、隔日又は隔週で投与されてもよく又は一連の抗体治療を行った後に１つ以上の抗がん剤治療による処置を行ってもよい。いずれにしても、当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独で又は他の化学療法剤との併用で投与される臨床治療において既に採用されている用量程度である。
別の実施形態において、本発明のＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、疾患の初期症状後の腫瘍再発の確率を減少又は無くすための維持療法に使用されてもよい。好ましくは、障害は、治療されたことがあり、最初の腫瘍塊は除去、減少又は他の方法で緩和されており、患者は無症状である又は寛解状態にある。このような場合、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くない場合でも、対象は、薬学的に有効な量の本開示の抗体が１回以上投与されてもよい。
別の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターは、予防的に又は減量手法後の腫瘍転移の可能性を予防又は減少させるためのアジュバント療法として使用され得る。本開示で使用するとき、「減量手法」は、腫瘍塊を減少させるか又は腫瘍負荷若しくは腫瘍増殖を緩和させる任意の手法、技術又は方法を意味する。例示的減量手法としては、限定されないが、外科手術、放射線治療（つまり、ビーム照射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者により容易に決定される適切な時間に、本開示のＡＤＣは、臨床的、診断的又は治療診断的手法により示唆されるように腫瘍転移を低減させるために投与されてもよい。
本発明のさらに他の実施形態は、本開示の抗体又はＡＤＣを、無症状であるががんを発症するリスクのある対象に投与することを含む。つまり、本発明の抗体又はＡＤＣは、真に予防的な意味において使用することができ、検査若しくは試験を受けて１つ以上の認められた危険因子（例えば、ゲノム指標、家族歴、インビボ又はインビトロ試験結果など）を有するが新生物を発症していない患者に投与されてもよい。
投与量及びレジメンも、本開示の組成物を個体に１回以上投与して実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたか又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加又は減少又は減弱化されてもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。がんに関して、これらには、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された腫瘍形成性抗原、疼痛又は麻痺の減少、会話、視力、呼吸若しくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増加又は容認された試験若しくは生存の延長によって測定される生活の質の向上の測定が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移並びに過去及び現在に使用している治療に依存して変わることを認識する。
Ｃ．併用療法
上記において言及したように、併用療法は、望まない新生物細胞増殖を減少させるか若しくは抑制するため、がんの発生を減少させるため、がんの再発を低減させるか若しくは予防するため、又はがんの広がり若しくは転移を低減させるか若しくは予防するために、とりわけ有用であり得る。このような場合、本発明の抗体又はＡＤＣは、本発明の抗体又はＡＤＣがなければ出現しそして腫瘍塊を存続させるであろうＣＳＣを除去することにより、感作剤又は化学感作剤として機能し、これにより、現在の標準治療である減量剤又は抗がん剤のより有効な使用を可能にする。すなわち、本開示の抗体又はＡＤＣは、特定の実施形態において、別の投与された治療剤の作用機序を増強させる効果の増強（例えば、事実上相加又は相乗的）をもたらし得る。本発明の文脈において、「併用療法」は、広く解釈するものとし、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びに細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線治療剤、標的化抗がん剤（モノクローナル抗体及び小分子体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線治療及び抗転移剤並びに特異的及び非特異的アプローチを含む免疫療法剤を含むが、これらに限定されない１つ以上の抗がん剤の投与を単に意味する。
併用の結果が、各治療（例えば、抗体及び抗がん剤）が別個に行われる場合に認められる効果の相加的なものであるという要求は存在しない。少なくとも相加効果が一般的に望ましいが、単独療法の１つを上回る抗腫瘍効果の増大は有益である。さらに、本発明は、相乗効果を示すことを併用治療に要求しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む特定の選択された組合せにより、相乗効果が認められる可能性があることを理解する。
したがって、特定の態様において、併用療法は、がんの治療において、（ｉ）抗ＵＰＫ１Ｂ抗体若しくはＡＤＣの単独使用、（ｉｉ）治療成分の単独使用又は（ｉｉｉ）抗ＵＰＫ１Ｂ抗体もＡＤＣも含まない別の治療成分と組み合わせた治療成分の使用を、上回る治療的相乗効果を有するか又は測定可能な治療効果を改善する。用語「治療的相乗作用」は、本明細書で使用される場合、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せの相加的効果よりも大きい治療効果を有する、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せを意味する。
本開示の組合せの所望の転帰は、対照又はベースラインの測定に対する比較によって定量される。本明細書で使用される場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」又は「減少させる」は、対照、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体の測定値又は本明細書に記載の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体もＡＤＣも不在であるが、標準治療処置などの他の治療成分の存在下における対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定値に対する値を示す。代表的な対照個体は、治療されている個体と同じ形態のがんに罹患しており、治療されている個体とほぼ同じ年齢の個体である（治療される個体及び対照個体の疾患の病期が同等であることを確実にするため）。
治療に応答した変化又は改善は、一般的に、統計学的に有意である。本明細書で使用される場合、用語「有意性」又は「有意」は、２つ以上の実体の間に非ランダムな関係がある確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるか又は「有意性」を有するかどうかを決定するために「ｐ値」が計算され得る。ユーザー定義のカットオフ点を下回るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満又は０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。
相乗的治療効果は、単一の治療成分若しくは抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣにより誘発される治療効果よりも又は所与の組合せの抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ若しくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計よりも少なくとも約２倍大きい又は少なくとも約５倍大きい又は少なくとも約１０倍大きい又は少なくとも約２０倍大きい又は少なくとも約５０倍大きい又は少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。また相乗的治療効果は、単一の治療成分若しくは抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣにより誘発される治療効果又は所与の組合せの抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ若しくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％以上の治療効果の増加として観察され得る。相乗的効果は、組合せで使用したときに、治療剤の投与量の減少を可能にする効果でもある。
併用療法の実施において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び治療成分は、単一の組成物又は同じ若しくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物において、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣでの治療は、例えば、数分から数週間の間隔で、治療成分による治療に先行又は追随してもよい。一実施形態において、治療成分と、抗体又はＡＤＣとの両方が互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８）が、抗体の投与と治療成分の投与との間に経過してもよい。
併用療法は、状態が治療されるまで、緩和されるまで、又は治癒されるまで、様々なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回若しくは３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、投与されてもよく又は連続的に投与されてもよい。抗体及び治療成分は、１日おきに若しくは１週間おきに投与されてもよく、又は一連の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体若しくはＡＤＣ治療を行い、後に追加の治療成分で１回以上治療してもよい。一実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは１つ以上の治療成分と組み合わせて短期治療サイクルで投与される。他の実施形態において、組合せ治療は、長期治療サイクルで投与される。併用療法は、任意の経路によって投与することができる。
選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、ＰＤ−１阻害剤又はＰＤＬ−１阻害剤のようなチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用されてもよい。ＰＤ−１は、このリガンドＰＤ−Ｌ１と共に、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負の調節因子である。一実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ）、及び任意選択的に１種以上の他の治療成分と一緒に、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣの投与を含むことができる。別の実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、及び任意選択的に１種以上の他の治療成分と一緒に、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣの投与を含んでもよい。さらに別の実施形態において、併用療法は、チェックポイント阻害剤及び／又は標的化ＢＲＡＦ併用療法（例えば、ベムラフェニブ又はダブラフィニブ）による治療後に進行が続く患者に投与される抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１と一緒に、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣを投与することを含むことができる。
いくつかの実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、様々な第一選択がん治療と組み合わせて使用されてもよい。したがって、選択された実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、並びにイホスファミド、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン（ｉｒｏｎｉｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキセート及びペメトレキセドのような細胞毒性剤、並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。ある特定の新生物の症例（例えば、ＡＭＬ又は多発性骨髄腫のような血液学的症例）において、開示されるＡＤＣは、シタラビン（ＡｒａＣ）、及びアントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｙｌｉｎｅ）（アクラルビシン、アムサクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｘｃｉｎ）など）、又はミトキサントロン、フルダラビン；ヒドロキシ尿素、クロファラビン、クロレタジンのような細胞毒性剤と組み合わせて使用されてもよい。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、アザシチジン又はデシタビン、ＦＬＴ３選択的チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ミドスタウリン、レスタウルチニブ及びスニチニブ）、全てがトランスのレチノイン酸（ＡＴＲＡ）及び三酸化ひ素のような脱メチル化剤である、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦプライミングと組み合わせて投与されてもよい（最後の２つの組合せは、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に特に有効となり得る）。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬剤（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ビノレルビン；ゲムシタビン；例えばドセタキセル若しくはパクリタキセルのようなタキサン；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｉｃａｎ）；又はペメトレキセド）の使用を含む。
ある特定の実施形態において、例えば、ＢＲ−ＥＲＰＲ、ＢＲ−ＥＲ又はＢＲ−ＰＲがんの治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及び「ホルモン療法」として記載されている１種以上の治療成分の使用を含む。「ホルモン療法」とは、本明細書で使用する場合、例えば、タモキシフェン；性腺刺激ホルモン又は黄体形成放出ホルモン（ＧｎＲＨ又はＬＨＲＨ）；エベロリムス及びエキセメスタン；トレミフェン；又はアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン又はフルベストラント）を指す。
別の実施形態において、例えば、ＢＲ−ＨＥＲ２の治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及びトラスツズマブ又はアド−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）及び任意選択の１種以上の他の治療成分（例えば、ペルツズマブ及び／又はドセタキセル）の使用を含む。
いくつかの実施形態において、例えば、転移性乳がんの治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及びタキサン（例えば、ドセタキセル又はパクリタキセル）及び任意選択の追加の治療成分、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン）及び／又はエリブリンの使用を含む。
別の実施形態において、例えば、転移性若しくは再現性乳がん又はＢＲＣＡ変異体乳がんの治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及びメゲストロール、及び任意選択の追加の治療成分の使用を含む。
さらなる実施形態において、例えば、ＢＲ−ＴＮＢＣの治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及びポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブ及びベリパリブ）、及び任意選択の追加の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、及びＰＡＲＰ阻害剤、及び任意選択の１種以上の他の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、例えば乳がんの治療において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びにシクロホスファミド並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵ及び／又はメトトレキサート）の使用を含む。
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びにアファチニブ並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、エルロチニブ及び／又はベバシズマブ）の使用を含む。
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びエルロチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ベバシズマブ）の使用を含む。
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びセリチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びクリゾチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びにベバシズマブ並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドセタキセル若しくはパクリタキセルのようなタキサン；及び／又は白金アナログ）の使用を含む。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、並びにベバシズマブ及び任意選択的に１種以上の他の治療成分（例えばゲムシタビン及び／又は白金アナログ）の使用を含む。
一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）アナログ、及び任意選択的に１種以上の他の治療成分（例えば、例えばドセタキセル及びパクリタキセルタキサンのようなタキサン）の使用を含む。
一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）アナログ、及び任意選択的に１種以上の他の治療成分（例えば、例えばドセタキセル及びパクリタキセル及び／又はゲムシタビン及び／又はドキソルビシンのようなタキサン）の使用を含む。
特定の実施形態において、白金製剤耐性腫瘍の治療のための併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びにドキソルビシン及び／又はエトポシド及び／又はゲムシタビン及び／又はビノレルビン及び／又はイホスファミド及び／又はロイコボリン変調（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｃｉｌ）及び／又はベバシズマブ及び／又はタモキシフェン並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、並びにＰＡＲＰ阻害剤及び任意選択的に１種以上の他の治療成分の使用を含む。
別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ、並びにベバシズマブ及び任意選択的にシクロホスファミドの使用を含む。
併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び変異又は異常発現した遺伝子又はタンパク質（例えば、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ）を含む腫瘍（例えば、黒色腫）に有効な化学療法成分を含んでもよい。
Ｔリンパ球（例えば、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ））は、悪性腫瘍に対する宿主防御に重要な役割を果たす。ＣＴＬは、抗原提示細胞上の腫瘍関連抗原の提示によって活性化される。活性特異的免疫療法は、既知のがん関連抗原に由来するペプチドを患者にワクチン接種することによって、がんに対するＴリンパ球応答を増強するために使用することができる方法である。一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ並びにがん関連抗原（例えば、ＷＴ１）に対するワクチンを含んでもよい。他の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣの投与と共に、自己ＣＴＬ又はナチュラルキラー細胞のインビトロ拡大増殖、活性化及び養子性再導入を含んでもよい。ＣＴＬ活性化は、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を増強する戦略によっても促進され得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞の動員及び樹状細胞交差プライミングの活性化を促進する。一実施形態において併用療法は、抗原提示細胞の単離、このような細胞の刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）による活性化、腫瘍関連抗原を用いたプライミング並びにこの後の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び任意選択的に１つ以上の異なる治療成分の使用を組み合わせた患者への抗原提示細胞の養子性再導入を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、黒色腫の様々な第一選択治療との組合せで使用されてもよい。一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びダカルバジン及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。さらなる実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びテモゾロミド及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及び白金系治療成分（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びビンカアルカロイド治療成分（例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン又はビンデシン）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びインターロイキン２及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びインターフェロンα及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
他の実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、黒色腫のアジュバント治療及び／又は外科的手法（例えば、腫瘍切除）との組合せで使用されてもよい。一実施形態において、併用療法は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣ及びインターフェロンα及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
本発明は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣと放射線療法との組合せも提供する。用語「放射線療法」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを意味する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本明細書に開示の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体と組み合わせて又は抗ＵＰＫ１Ｂ抗体のコンジュゲートとして、使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。任意選択的に、放射線療法は、単独用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
他の実施形態において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、以下に記載されている１種以上の化学治療剤と組み合わせて使用されてもよい。
Ｄ．抗がん剤
用語「抗がん剤」は、本明細書で使用される場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり、「薬学的に活性な成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細には、「抗がん剤」は、細胞増殖性障害、例えば、がんを治療するために使用することができる任意の薬剤（又はその薬学的に許容される塩）を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤が挙げられる。抗がん剤の前述の分類は、互いに排他的なものではなく、選択された薬剤は、１つ以上のカテゴリーに分類され得ることに注意されたい。例えば、ある適合する抗がん剤は、細胞毒性剤でありかつ化学療法剤であると分類することができる。したがって、前述の用語のそれぞれは、本開示を考慮し、次に医療分野におけるそれらの使用に応じて解釈すべきである。
好ましい実施形態において、抗がん剤は、がん性細胞又はがん性になる可能性があるか若しくは腫瘍形成性後代（例えば、腫瘍形成性細胞）を発生する可能性がある細胞を、抑制するか若しくは除去する化学剤、又は抑制する若しくは除去するように設計されている化学剤（例えば、化学療法剤）を含み得る。これに関して、選択された化学剤（細胞周期依存性薬剤）は、しばしば細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスを対象とし、したがって、一般的に急速に成長し、そして分裂するがん性細胞対して、特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を解重合し、したがって、急速に分裂しつつある細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。他の場合において、選択された化学剤は、細胞のライフサイクルのあらゆる点における細胞生存を妨げる細胞周期非依存性薬剤であり、指向性療法（例えば、ＡＤＣ）に有効であり得る。例として、特定のピロロベンゾジアゼピンは、細胞ＤＮＡの副溝に結合し、核への送達により転写を阻害する。併用療法又はＡＤＣ成分の選択に関して、当業者は、本開示を考慮して適合する細胞周期依存性薬剤及び細胞周期非依存性薬剤を容易に同定できることが理解される。
いずれにしてもまた上記で言及したように、選択された抗がん剤は、本明細書で開示した抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及びＡＤＣに加えて互いに組み合わせて（例えば、ＣＨＯＰ療法）投与することができることが理解される。さらに、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことができ、投与前に抗体と会合していてもよいことがさらに理解される。特定の実施形態において、本開示の抗がん剤は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体と連結されて、本明細書に開示のＡＤＣを提供する。
本明細書で使用される場合、用語「細胞毒性剤」（又は細胞毒）は、一般的に、細胞の機能を減少若しくは阻害しそして／又は腫瘍細胞の破壊を引き起こすという点で細胞に毒性がある物質を意味する。特定の実施形態において、物質は、（天然源から精製された若しくは合成により調製された、）生存生物に由来する天然に存在する分子又はその類似体である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素又は酵素的に活性な細菌毒素（例えば、カリチアマイシン、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体内毒素及び菌体外毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モルデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質［ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ］、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン及びトリコテセン）又は動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片及び／又はバリアントを含む）が挙げられる。放射性同位体、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイトマイシン、アマニチン及びピロロベンゾジアゼピンを含むさらなる適合する細胞毒性剤を本明細書に示す。
より一般に本発明の抗体と組み合わせて（又はコンジュゲートして）使用され得る細胞毒性剤又は抗がん剤の例は、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミン及びメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カンフォスファミド、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、トルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン，ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファーニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリゴマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラパマイン、ロドルビシン、ゾラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎物質、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖錯体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロエチルアミン；トリコテシン類（Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａ阻害並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体を含む。腫瘍に対するホルモンの作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤並びに抗アンドロゲン剤並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体なども本定義に含まれる。
適合する細胞毒性剤又は抗がん剤は、商業的又は臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的又は臨床的に利用可能な抗がん剤は、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、ＡｂｂＶｉｅ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含み得る。
用語「薬学的に許容される塩」又は「塩」は、分子又は巨大分子の有機又は無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。薬学的に許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有し得る。
同様に「薬学的に許容される溶媒和物」又は「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子又は巨大分子との会合物を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。
他の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、現在臨床試験にある又は市販のいくつかの抗体（又は免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。本開示の抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、ドゥルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＤＸ−１１０５及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
他の実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
Ｅ．放射線療法
本発明は、抗体又はＡＤＣと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組合せも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本開示の抗体又はＡＤＣは、標的抗がん剤又は他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６〜７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
ＶＩＩＩ． 適応症
本発明は、本発明の抗体及びＡＤＣの、様々な障害、例えば、増殖性障害、新生物、炎症性、血管新生及び免疫学的障害並びに毒素によって引き起こされる障害の診断、診断治療、治療及び／又は予防のための使用を提供する。特定の実施形態において、治療される疾患は、固形腫瘍を含む新生物状態を含む。他の実施形態において、治療される疾患は、血液悪性疾患を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、ＵＰＫ１Ｂ決定因子を発現する腫瘍又は腫瘍形成性細胞を治療するために使用される。好ましくは、治療される「対象」又は「患者」はヒトであるが、本明細書で使用するとき、それらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むものとして表される。
本発明に従った例示的新生物状態の治療対象は、良性又は悪性；固形腫瘍又は血液悪性腫瘍であり得；限定されないが、以下の群から選択され得る：副腎腫瘍、ＡＩＤＳ−関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がん及び移行上皮がん）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ ｂｏｎｅ ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨格性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管がん、胃がん、胃腸、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫瘍症、多発性骨髄腫（例えば、形質細胞腫、限局性骨髄腫及び髄外性骨髄腫）、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患（例えば、骨髄線維症、真性赤血球増加症及び本態性血小板減少症）神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質性障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がん及び子宮がん（子宮頸部癌、子宮内膜癌及び平滑筋腫）。
本発明の化合物及び組成物は、疾患の様々な病期にあり、治療サイクルにおける種々の点にある対象を治療するために用いることができることが理解される。したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、セカンドライン患者及びサードライン患者（すなわち、同じ状態について以前にそれぞれ１及び２回治療を受けた対象）を治療するために用いられる。さらに他の実施形態は、本開示のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣにより又は異なる治療剤により３回以上同じ又は関連する状態について治療されたフォースライン患者又はこれより高次の患者（例えば、胃がん又は結腸直腸がん患者）の治療を含む。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体又はＡＤＣを用いて又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
ある特定の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、単剤として又は組合せとして、フロントライン治療又は導入治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、単剤として若しくは組合せとして強化療法又は維持療法の間に使用される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体若しくはＡＤＣを用いて、又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象、又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、幹細胞源として、骨髄、臍帯血又は動員末梢血液による自己造血幹細胞又は同種造血幹細胞の移植のどちらかを受ける準備に、コンディショニングレジメンの一部として使用される。
血液悪性腫瘍に関すると、本発明の化合物及び方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＦＡＢ命名体系（Ｍ０〜Ｍ７）、ＷＨＯ分類、分子マーカー／変異、核型、形態学及び他の特徴に基づき、その様々なサブタイプのものが認識されている）、系列急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）及び大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）を含む様々な白血病並びにホジキンリンパ腫（従来的なホジキンリンパ腫及び結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）を含む）、非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度リンパ腫／ＮＨＬ濾胞性細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、血管性免疫芽細胞性リンパ腺症、びまん性小型切れ込み細胞、大細胞型免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非切れ込み、バーキット及び非バーキット、濾胞性、大細胞優勢；濾胞性、小型切れ込み優勢；及び濾胞性混合小型切れ込み及び大細胞リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫の治療に特に有効となり得ることがさらに理解される。Ｇａｉｄｏｎｏら、「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ、２巻：２１３１〜２１４５頁（ＤｅＶｉｔａら（編）、第５版、１９９７年）を参照されたい。これらのリンパ腫は、分類体系が変わることにより、異なる名称を有することが多いこと、及び異なる名称に分類されているリンパ腫を有する患者は、本発明の組合せ治療レジメンから利益をやはり得ることができることは、当業者に明白であるはずである。
他の好ましい実施形態において、増殖性障害は、以下に限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞及び非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫及び様々な頭頸部の腫瘍を含めた、固形腫瘍を含む。ある特定の選択された態様において、及び以下の実施例に示されているように、開示されるＡＤＣは、膵臓がんを治療するのに、とりわけ有効である。一実施形態において、膵臓がんは、細胞毒性剤（例えば、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル及び／又はこれらの薬剤（例えば、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン及びオキサリプラチン）の組合せ）に対して不応性、再発性又は耐性である。
示されているように、本開示の抗体及びＡＤＣは、膵臓がんの治療にとりわけ有効である。選択された実施形態において、抗体及びＡＤＣは、限定された病期の疾患又は広範囲の病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、開示されたコンジュゲート抗体は、不応性患者（つまり、初期治療の全工程中又はこの完了の直後に再発する患者）、感受性のある患者（つまり、再発が一次治療から２〜３カ月後より長い患者）；又は細胞毒性剤（例えば、イリノテカン、ゲムシタビン、パクリタキセル）及び／又はこれらの薬剤（例えば、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン及びオキサリプラチン）の組合せに耐性を示す患者に投与される。特定の好ましい実施形態において、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、フロントライン患者に投与することができる。他の実施形態において、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、セカンドライン患者に投与することができる。さらに他の実施形態において、本発明のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、サードライン患者に投与することができる。
特に好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、膀胱がんを治療するために使用されてもよい。このような実施形態に関して、コンジュゲートモジュレーターは、限定された病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、広範囲の病期の疾患を示す患者に投与される。他の好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、不応性患者（つまり、最初の療法の過程中若しくはこの完了の直後に再発した患者）又は再発性の膀胱がん患者に投与される。さらに他の実施形態は、感受性患者（つまり、再発が一次治療から２〜３カ月後より長い患者）への本開示のＡＤＣの投与を含む。各場合において、適合ＡＤＣは、選択された投与レジメン及び臨床診断に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて用いることができることが理解される。
ＩＸ． 製品
本発明は、１つ以上の容器又はレセプタクルを含む医薬パック又はキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体又はＡＤＣを含み得る。このようなキット又はパックは、本質的に診断用又は治療用である。特定の実施形態において、パック又はキットは、１つ以上の追加の薬剤及び任意選択的に１つ以上の抗がん剤を含む又は含まない、例えば、本発明の抗体又はＡＤＣを含む組成物の所定の量を意味する、単位用量を含む。特定の他の実施形態において、パック又はキットは、がん性細胞の検出、定量化及び／又は視覚化のための結合レポーター分子及び任意選択的に１つ以上の追加の薬剤を含むか又は含まない、検出可能な量の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣを含む。
いずれにしても本発明のキットは、一般的に、薬学的に許容される製剤を含む適切な容器又はレセプタクル内に、本発明の抗体又はＡＤＣを含み、任意選択的に、同じ又は異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断又は併用療法用のいずれかのために、他の薬学的に許容される製剤又は装置を含んでもよい。診断装置又は機器の例としては、細胞又は増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化又はプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの完全な列挙について、上記参照）。いくつかの実施形態において、装置は、インビボ又はインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視、及び／又は定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体又はＡＤＣを抗がん剤又は診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９参照）。
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、典型的には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、又は適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の薬学的に許容されるバッファー又は他の希釈剤、例えば、注射用静菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含み得る。キットが、本発明の抗体又はＡＤＣをさらなる治療薬又は薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、又は一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体又はＡＤＣ及びいずれかの任意選択の抗がん剤又は他の薬剤（例えば、ステロイド）は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物を含む前述のキットは、キットの内容物ががんの治療、予防及び／又は診断のために使用され得ることを示すラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含む。他の好ましい実施形態において、キットは、キットの内容物が、がんを患う対象を治療するためのある特定の投与レジメン又は投与量レジメンに従って投与され得ることを示す、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含むことができる。特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の治療、予防及び／若しくは診断のために用いられ得ること、又はこの治療の投与量若しくは投与レジメンを提示することを表示する。他の特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、肺がん（例えば、腺癌）の治療、予防及び／若しくは診断、又はこの治療のための投与レジメンのために用いられ得ることを表示する。
適切な容器又はレセプタクルとしては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ＩＶバッグ）などが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又は薬学的に適合するプラスチックなどで形成することができる。特定の実施形態において、レセプタクルは、滅菌アクセスポートを含んでもよい。例えば、容器は、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、抗体及びいずれかの任意選択の成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射若しくは導入する又は身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針又はシリンジ（充填済又は空）、点眼器、ピペット又は他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアル又はそれと同様のもの、及び市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアル及び他の装置を配置及び保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
Ｘ． その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語及び技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点及び終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０及び２．０と３．０との間の全ての点を含む。
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及び化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の及び本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
ＸＩ． 参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願及び出版物並びに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込まれる」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かにかかわらず、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明及び以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
配列表のまとめ
表３は、本明細書に含まれているアミノ酸配列及び核酸配列のまとめを示している。
Figure 2019511199
腫瘍細胞株のまとめ
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０〜ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプ及びサブタイプの略称が以下の通り表４に示される：
Figure 2019511199
Figure 2019511199
［実施例１］
ＵＰＫ１Ｂ発現の特定
全トランスクリプトーム配列決定の使用
固形腫瘍ががん患者に存在するときの、固形腫瘍の細胞異種性を特徴付けて、臨床的関連性のある治療標的を特定するために、当該技術分野で認識されている技術を使用して、大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の個別の腫瘍細胞株を含む、ＰＤＸ腫瘍バンクを、元々、様々な固形悪性腫瘍に罹患しているがん患者から得られた腫瘍細胞の複数回の継代により、免疫無防備状態マウスにおいて増殖させた。継代の少ないＰＤＸ腫瘍は、この天然環境における腫瘍を代表しており、腫瘍成長を推進する根本的な機構及び現在の治療法に対する耐性への臨床的に関連する洞察を提供する。
先に言及したように、腫瘍細胞は、２つのタイプの細胞部分集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）及び腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）に広く分けることができる。ＴＩＣは、免疫無防備状態マウスに移植すると、腫瘍を形成する能力を有する。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、ＴＩＣのサブセットあり、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。ＮＴＧは、インビボにおいていくらか成長する能力を有しているが、移植されると、元の腫瘍の異種性を再現する腫瘍を形成しない。
全トランスクリプトーム解析を行うため、ＰＤＸ腫瘍を、これらが８００〜２，０００ｍｍ３に達した後、又はＡＭＬの場合には白血病が骨髄において確立された後（ヒトの元々の＜５％の骨髄細胞性）に、マウスから切除した。切除したＰＤＸ腫瘍を切り離して、当該技術分野で認識されている酵素消化技術を使用し、単一細胞懸濁液に入れた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照）。死滅細胞を検出するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、マウス細胞を特定するための抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体、及びヒト細胞を特定するための抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共に、切り離したバルク腫瘍細胞をインキュベートした。さらに、腫瘍細胞は、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ ＣＳＣ又はＣＤ４６ｌｏ／−ＣＤ３２４− ＮＴＧ細胞を特定するための、蛍光的にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４６及び／又はＣＤ３２４抗体と共にインキュベートし、次に、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ ２０１３／０２６０３８５、２０１３／００６１３４０及び２０１３／００６１３４２を参照）。
１％ ２−メルカプトエタノールを補足したＲＬＴｐｌｕｓ ＲＮＡ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で細胞を溶解することにより、腫瘍細胞からＲＮＡを抽出し、この溶解物を−８０℃において凍結し、次に、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出するため、溶解物を解凍した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。正常組織のＲＮＡは、様々な供給元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＢｉｏＣｈａｉｎ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。得られた全ＲＮＡ調製物は、遺伝配列決定及び遺伝子発現解析によって評価された。
より詳細に、高品質ＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定は、２つの異なるシステムを使用して行われた。一部の試料は、Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）４．５又はＳＯＬｉＤ５５００ｘｌ次世代配列決定システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）配列決定を使用して解析された。他の試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００又は２５００次世代配列決定システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して解析された。
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム解析を、低投入全ＲＮＡのために設計されたＡＢＩからの修正全トランスクリプトームプロトコル又はＯｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して、バルク腫瘍試料に由来する合計で１ｎｇのＲＮＡから生成したｃＤＮＡを用いて行った。得られたｃＤＮＡライブラリを断片化し、バーコードアダプターを付加して、配列決定の実行の間に、異なる試料からの断片ライブラリのプールを可能にした。公開されているヒトゲノムのＮＣＢＩバージョンｈｇ１９．２を使用して、ＲｅｆＳｅｑバージョン４７によって注釈のついた３４，６０９の遺伝子へとマッピングされたＳＯＬｉＤプラットフォームによりデータを生成し、大部分の試料中のＲＮＡレベルの検証可能な測定値をもたらした。ＳＯＬｉＤプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域へとマッピングされたＲＰＭ（１００万個あたりのリード数（ｒｅａｄ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ））計量又はＲＰＫＭ（１００万個あたりのキロ塩基あたりのリード数（ｒｅａｄ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ））計量を使用して、転写産物発現値として名目上、表されており、基礎的遺伝子発現解析を、ＲＰＭ＿Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ又はＲＰＫＭ＿Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔとして正規化し、計数することを可能にするものである。ＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡは、対応するＮＴＧ試料（白色棒）及び正常組織（灰色棒）と比較すると、ＰＡ ＣＳＣ集団（黒色棒）において向上していた（図２）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ全トランスクリプトーム解析を、上記の通りに単離された、ＮＴＧ又はＣＳＣ腫瘍部分集団のどちらか一方から抽出された、５ｎｇの全ＲＮＡを使用して生成したｃＤＮＡを用いて行った。ライブラリは、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して作成した。得られたｃＤＮＡライブラリは、断片化して、バーコードを付与した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域にマッピングしたＦＰＫＭ（百万あたりのキロ塩基あたりの断片数）計量を使用して、断片発現値として、名目上、表されており、これにより、基礎的遺伝子発現解析をＦＰＫＭ転写として正規化し、計数することが可能になる。図２Ｂに示されている通り、ＰＡ、ＬＵ及びＧＡ ＣＳＣがん幹細胞部分集団（黒色棒）におけるＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡ発現は、正常細胞（灰色棒）及びＮＴＧ細胞集団（白色棒）の両方の発現よりも一般に高い。さらに、ＢＬ５バルク腫瘍は、ＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの発現が高いことを示した（図２Ｂ）。
ＬＵ、ＰＡ及びＧＡ腫瘍ＣＳＣ集団における高いＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡ発現の同定は、ＵＰＫ１Ｂが、潜在的な診断標的及び免疫治療標的としてさらに評価するに値することを示している。さらに、ＬＵ、ＰＡ及びＧＡ ＰＤＸ腫瘍におけるＮＴＧと比べて、ＣＳＣにおけるＵＰＫ１Ｂの発現が向上していることは、ＵＰＫ１Ｂが、これらの腫瘍タイプにおいて、腫瘍形成性細胞の良好なマーカーとなることを示している。
［実施例２］
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する腫瘍中のＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの発現
腫瘍細胞におけるＵＰＫ１Ｂ ＲＮＡ発現を確認するため、業界の標準プロトコルに従い、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを使用して、様々なＰＤＸ細胞株に対してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡを、実施例１に記載されている通り、バルクＰＤＸ腫瘍細胞又は選別したＣＳＣ及びＮＴＧ部分集団から抽出した。１．０ｎｇのＲＮＡを、製造業者の指示に従い、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡに変換した。次に、ＵＰＫ１Ｂプローブ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して、予め増幅したｃＤＮＡ材料を、後続のｑＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
正常組織（ＮｏｒｍＴｏｘ又はＮｏｒｍ）中のＵＰＫ１Ｂ発現を、ＢＬ、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＯＶ及びＰＡＣ／ＰＤＡＣ ＰＤＸ腫瘍細胞株（図３；各ドットは、個々の組織又はＰＤＸ細胞株のそれぞれの平均相対発現を表し、小さな水平線は、幾何平均を表す）における発現と比較した。「ＮｏｒｍＴｏｘ」は、以下の様々な正常組織の試料を表す：副腎、結腸（全器官、選別した上皮細胞、間質線維芽細胞、脈管内皮及び血液細胞）、脊髄後根神経節、内皮細胞（動脈、静脈）、食道（全器官及び選別した上皮細胞、平滑筋細胞、基底細胞及び有限増殖細胞）、心臓、腎臓（全器官、並びに選別した上皮細胞、遠位及び近位尿細管、並びに前駆体）、肝臓、肺（全器官、並びに選別した上皮細胞及び血液細胞）、膵臓、筋骨格、皮膚（全器官、並びに選別した上皮細胞、分化上皮細胞、有限増殖細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト）、小腸、脾臓、胃、及び気管（全器官及び選別した上皮細胞）。「Ｎｏｒｍ」と表される、別の組の正常組織は、以下の正常組織の試料を表し、ＡＤＣ型薬物に関連する毒性のリスクが低いと推定される：末梢血単核球細胞及び様々な選別された部分集団（Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、好中球、Ｔ細胞）、脂肪、膀胱、脳、乳房、子宮頸、メラノサイト、正常骨髄及び様々な選別された部分集団、卵巣、前立腺、唾液腺、精巣、並びに胸腺。
図３を詳しく見ると、平均で、ＰＡ及びＯＶ−Ｓ／ＰＳ、並びにＢＬ、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ及びＯＶのサブセットにおいて、ＵＰＫ１Ｂ発現が向上しており、この幾何平均は、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣでは、総じてより低いことが示される。このデータは、ＰＡ、ＯＶ−Ｓ／ＰＳ、並びに選択されたＢＬ、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、並びに他のＯＶ ＰＤＸにおいて、大部分の正常組織と比較して、ＵＰＫ１Ｂの発現が向上するという早期の知見を支持するものである。
［実施例３］
マイクロアレイ解析を使用する、腫瘍におけるＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの発現の決定
様々な腫瘍細胞株におけるＵＰＫ１Ｂの発現レベルを決定するマイクロアレイ実験を行い、データを以下の通り解析した。１〜２μｇの全腫瘍の全ＲＮＡを、ＢＬ、ＥＭ、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＯＶ、ＰＡＣ／ＰＤＡＣ及びＰＲ細胞株から、実質的に実施例１に記載されている通りに抽出した。さらに、正常組織（例えば、膀胱、乳房、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、皮膚、脾臓、ＰＢＭＣ及び胃）の試料からＲＮＡを抽出した。ヒトゲノムにおいて、２７，９５８の遺伝子及び７，４１９のｌｎｃＲＮＡに対して設計された、５０，５９９の生物学的プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ＧＥヒト８ｘ６０ ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して、これらのＲＮＡ試料を解析した。標準的な業界の慣習を使用して、強度値を正規化して変換し、各試料に関する遺伝子発現を定量した。各試料におけるＵＰＫ１Ｂ発現の正規化後の強度が、図４にプロットされており、各腫瘍タイプについて誘導された幾何平均値は、水平の棒により示されている。
図４をより詳しく見ると、正常組織と比較して、ＵＰＫ１Ｂ発現が、大部分のＰＡ、ＢＬ及びＯＶ腫瘍細胞株、並びにＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＧＡ、ＥＭ及びＰＲの腫瘍試料のかなりのサブセットにおいて、上方調節されていることを示している。前述の腫瘍タイプにおける高いＵＰＫ１Ｂ発現の観察により、前の実施例の結果が確認される。特に、３つのプラットフォーム全てに関して解析されたＰＡ及びＯＶ腫瘍試料は、ＵＰＫ１Ｂ発現が実質的に向上したことを示している。さらに一般に、これらのデータは、ＵＰＫ１Ｂが、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＢＬ及びＧＡを含む、いくつかの腫瘍サブタイプの大部分において発現すること、およびこれらの症例において、抗体をベースとする治療の開発に対する良好な標的となり得ることを実証するものである。
［実施例４］
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓを使用する、腫瘍におけるＵＰＫ１Ｂ発現
様々な腫瘍におけるｈＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの過剰発現を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）として知られている原発性腫瘍及び正常試料の、公に入手可能な多量のデータセットを使用して確認した。
より具体的には、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからのｈＵＰＫ１Ｂ発現データは、ゲノムデータコモンズ（ＧＤＣ）レガシーアーカイブ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ−ｐｏｒｔａｌ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｅｇａｃｙ−ａｒｃｈｉｖｅ）からダウンロードし、ＲＳＥＭからのｓｃａｌｅｄ＿ｅｓｔｉｍａｔｅは、１，０００，０００を掛けて、百万あたりの転写物（ＴＰＭ）を得た［Ｌｉ及びＤｅｗｅｙ、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１１年］。図５は、ＵＰＫ１Ｂ発現が、正常組織と比べて、ＰＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＯＶ、ＢＬ、ＭＥＳＯ、ＨＮＳＣ及びＧＡの一次患者試料において向上することを示している。これらのデータにより、ＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡのレベル向上が、様々な腫瘍タイプにおいて見出され得ることがさらに確認され、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及びＡＤＣは、これらの腫瘍に対する有用な治療薬となり得ることを示している。
図６は、患者の生存データが入手可能であった、ＬＵ−Ａｄ ＴＣＧＡ腫瘍のサブセットに対するカプランマイヤー生存曲線を示している。ＬＵ−Ａｄ腫瘍において、ＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの発現が高いこと、すなわち指標値の閾値を超える発現であること、又はＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの発現が低いこと、すなわち指標値の閾値未満の発現であることに基づいて、患者を階層化した。指標値の閾値は、ＴＰＭ値のメジアンとして算出され、ＴＰＭ値のメジアンは、０．０６３であると算出された。
プロットの下に列挙されている「リスク数」とは、各患者が最初に診断されたその日（０日目）の後、１０００日毎のデータセットに留まっている生存患者の数を示すものである。２つの生存曲線は、ログ−ランク（マンテル−コックス）検定により、有意差がある（ｐ＝０．００３５）、又はゲーハン−ブレスロー−ウィルコクソン検定によりｐ＝０．００１４となる。これらのデータは、高い発現のＵＰＫ１Ｂを示すＬＵ−Ａｄ腫瘍を有する患者が、低い発現のＵＰＫ１Ｂを示すＬＵ−Ａｄ腫瘍を有する患者と比較して、生存期間がより短いことを示している。このことは、ＬＵ−Ａｄを治療するのに抗ＵＰＫ１Ｂ治療法が有用であること、及び予後バイオマーカーとしてＵＰＫ１Ｂ発現が有用であり、この予後バイオマーカーに基づいて治療判断を行うことができることを示唆している。
［実施例５］
組換えＵＰＫ１Ｂタンパク質のクローニング及び発現並びに細胞表面ＵＰＫ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株の操作
ヒトＵＰＫ１Ｂ（ｈＵＰＫ１Ｂ）のレンチウイルスＤＮＡ構築物
完全長ｈＵＰＫ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株を生成するため、コドン最適化合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）を、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位にサブクローニングして、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＵＰＫ１Ｂを得ることにより、ｈＵＰＫ１Ｂタンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６９５２に由来）をコードするオープンリーディングフレームを含有するレンチウイルスベクターを構築した。このデュアルプロモーター構築物は、ＣＭＶプロモーターを使用して、ｃｏｐＧＦＰ Ｔ２Ａ Ｐｕｒｏレポーター及び選択可能なマーカーの発現を推進する下流のＥＦ１プロモーターとは無関係のｈＵＰＫ１Ｂの発現を駆動する。Ｔ２Ａ配列は、ペプチド結合の縮合部のリボソームスキッピングを促進し、２つの独立したタンパク質：Ｔ２Ａペプチドの下流においてＰｕｒｏ選択可能なマーカータンパク質の共発現を伴う、Ｔ２Ａペプチドの上流においてレポーターｃｏｐＧＦＰの高レベル発現をもたらし、ピューロマイシンの存在下で、形質導入された細胞の選択が可能になる。
ｈＵＰＫ１Ｂ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物
ｈＵＰＫ１Ｂタンパク質のＥＣＤへの免疫反応性抗体を生成するために使用することができる免疫原を生成するため、ｈＵＰＫ１Ｂタンパク質（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８８３からのアミノ酸Ｔ１０８−Ｈ２２９）の第２の細胞外ドメインをコードするキメラ融合遺伝子を、以下の通り生成した。表示されているＵＰＫ１Ｂアミノ酸残基をコードするＰＣＲ産物を、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＵＰＫ１Ｂ鋳型から増幅し、得られた合成ＤＮＡ断片を、標準分子技術を使用して、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、インフレームで、免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）シグナルペプチド配列の下流に、並びに９ｘ−ヒスチジンタグ（ｐｈＵＰＫ１Ｂ（１０８−２２９）−Ｈｉｓを与える）又はヒトＩｇＧ２ Ｆｃタンパク質（ｐｈＵＰＫ１Ｂ（１０８−２２９）−Ｆｃを与える）のどちらか一方をコードするＤＮＡの上流にインフレームで、サブクローニングした。これらのＣＭＶ駆動発現ベクターにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞において、高いレベルの一過性発現が可能になる。
カニクイザルＵＰＫ１Ｂ（ｃＵＰＫ１Ｂ）及びラットＵＰＫ１Ｂ（ｒＵＰＫ１Ｂ）ＤＮＡ構築物
完全長ｃＵＰＫ１Ｂ又はｒＵＰＫ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株を生成するため、ｃＵＰＫ１Ｂ（ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００５４８０７５に由来）又はｒＵＰＫ１Ｂ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０２４２５３に由来）のコドン最適化合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）を、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位にサブクローニングし、それぞれ、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＵＰＫ１Ｂ又はｐＬＭＥＧＰＡ−ｒＵＰＫ１Ｂを得ることにより、ｃＵＰＫ１Ｂ又はｒＵＰＫ１Ｂタンパク質のどちらか一方をコードするオープンリーディングフレームを含むレンチウイルスベクターを構築した。
ｃＵＰＫ１Ｂ（例えば、Ｔ１０８−Ｈ２２９）又はｒＵＰＫ１Ｂ（例えば、Ｔ１０８−Ｈ２２９）タンパク質の第２の細胞外ドメインに関する可溶性組換えタンパク質を生成するため、これらの残基をコードするｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ断片（ＩＤＴ）を合成し、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、直接、インフレームでかつＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、及び９ｘ−ヒスチジンタグ又はヒトＩｇＧ２ Ｆｃ ｃＤＮＡのどちらか一方の上流に、サブクローニングした。得られた構築物を、それぞれ、ｐｃＵＰＫ１Ｂ−Ｈｉｓ、ｐｃＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃ、ｐｒＵＰＫ１Ｂ−Ｈｉｓ又はｐｒＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃと呼ぶ。
ＵＰＫ１Ｂ融合タンパク質生成
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は懸濁液ＣＨＯ−Ｓ細胞の懸濁液又は接着培養物に、トランスフェクト試薬として、ポリエチレンイミンポリマーを使用して、以下：ｐｈＵＰＫ１Ｂ（１０８−２２９）−Ｈｉｓ、ｐｈＵＰＫ１Ｂ（１０８−２２９）−Ｆｃ、ｐｃＵＰＫ１Ｂ−Ｈｉｓ、ｐｃＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃ、ｐｒＵＰＫ１Ｂ−Ｈｉｓ又はｐｒＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃのうちの１つから選択される発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトして３〜５日後に、製造業者の指示により、適宜、ニッケル−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムのどちらか一方を使用して、Ｈｉｓ又はＦｃ融合タンパク質を、清澄化した細胞−上清から精製した。
細胞株の操作
当業者に周知の標準レンチウイルス形質導入技術を使用し、３つのレンチウイルスベクター、すなわちｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＵＰＫ１Ｂ、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＵＰＫ１Ｂ又はｐＬＭＥＧＰＡ−ｒＵＰＫ１Ｂを用いて、それぞれ、ｈＵＰＫ１Ｂ ｃＵＰＫ１Ｂ又はｒＵＰＫ１Ｂタンパク質を過剰発現する、安定なＨＥＫ２９３Ｔをベースとする細胞株を作製した。形質導入された細胞は、ピューロマイシン、次いで、高発現ＨＥＫ２９３Ｔサブクローンの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、（例えば、ＧＦＰに強力に陽性となる細胞を）選別した。
［実施例６］
抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の生成
２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、２匹のＣＤ−１マウス及び２匹のＦＶＢマウスに、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｈ４ Ｔ２６８４−１ＭＬ、ロット＃ＭＫＢＴ７０１Ｖ）により乳化した、１０μｇのｈＵＰＫ１Ｂタンパク質を接種することにより、抗ＵＰＫ１Ｂマウス抗体を生成した。最初の接種後、これらのマウスに、等量のＩｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７７１６１）及び「ＣｐＧ」（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ＯＤＮ１８２６＃ｔｌｒ１−１８２６−１）により乳化した１０μｇのｈＵＰＫ１ｂタンパク質を、１週間の間隔で９回、注射した。融合前の最後の注射は、ＰＢＳ中の１０μｇのｈＵＰＫ１Ｂを用いた。
マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径及び内側腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を生成し、エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、非分泌ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）と１：１の比率で融合した（３００ｘ１０６個の細胞）。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＳＨ３００８０−０３）、１０％のＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ＃１０６６３５７３００１、ロット＃１０５５７５００）、１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０２５−ＣＩ）、１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０６０−ＣＩ）、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３０−００２−ＣＩ）、１００ＩＵのＬ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−００５−ＣＩ）を補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、１００ｍＬの選択培地を含有する３つのＴ２２５フラスコ中で培養した。これらのフラスコを、７％ＣＯ２及び９５％空気を含有する３７℃の加湿インキュベータ中に、６日間、置いた。
融合後の６及び７日目に、ハイブリドーマ細胞をフラスコから選別し、９０μＬの補足したハイブリドーマ選択培地（上記）中に、ウェルあたり細胞１個（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーターを使用）で、１２Ｆａｌｃｏｎ３８４ウェルプレートに蒔いた。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りは、今後のライブラリ試験及びスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
選別したクローナルハイブリドーマは、８日間、培養し、上清を採集して３８４−ウェルプレートに再度並べ、以下の通りフローサイトメトリを使用して、形質導入したＨＥＫ／２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）の表面に発現したｈＵＰＫ１Ｂ、ｃＵＰＫ１Ｂ及びｒＵＰＫ１Ｂに特異的な抗体をスクリーニングした。各ウェル中のｈＵＰＫ１Ｂ、ｃＵＰＫ１Ｂ及びｒＵＰＫ１Ｂが安定的に形質導入された２９３Ｔ細胞の混合物を、２５μＬのハイブリドーマ上清と一緒に３０分間、インキュベートし、次に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄した。試料あたり、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体２５μＬと共に、細胞を１５分間、インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回洗浄して、ここに再懸濁した。次に、これらの細胞をフローサイトメトリ（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）によって解析した。
いくつかのｈＵＰＫ１Ｂ／ｃＵＰＫ１Ｂ／ｒＵＰＫ１ｂ免疫特異的抗体を同定した。
［実施例７］
抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の特徴付け
様々な方法を使用して、アイソタイプに関して、実施例６において生成した抗ＵＰＫ１Ｂマウス抗体の特徴付け（エピトープビニング、及びヒトＵＰＫ１Ｂを発現する細胞を認識して殺傷する能力）を行った。図７Ａは、いくつかの例示的なマウス抗体に関する、上述の特徴をまとめた表を示している。図７Ａにおいて、ブランクのセル又は「Ｎ／Ａ」は、この場合にデータが生成しなかったことを示している。
いくつかの代表的な抗体のアイソタイプは、製造業者のプロトコルに従い、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘマウス免疫グロブリンアイソタイピングキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して決定した。例示的なＵＰＫ１Ｂ特異的抗体の結果が、図７Ａ中の「アイソタイプ」と見出しが付けられている列に示されている。
抗体を、多重化競合イムノアッセイを使用して、ビンに群分けした。１０μｇ／ｍＬの濃度の個々の固有の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（捕捉ｍＡｂ）１００μｌを、抗マウスカッパ抗体にコンジュゲートされている磁気ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）と共に１時間、インキュベートした（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。捕捉ｍＡｂ／コンジュゲートビーズ複合体をＰＢＳＴＡバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）により洗浄して、次に、プールした。残りの洗浄用バッファーを除去した後、上記のビーズを２μｇ／ｍＬのｈＵＰＫ１Ｂ−Ｈｉｓタンパク質と共に１時間、インキュベートし、次に、ＰＢＳＴＡ中において洗浄し、再懸濁した。プールしたビーズ混合物を９６ウェルプレートに分布させて、各ウェルに固有の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（検出ｍＡｂ）を含めて、振とうしながら、１時間、インキュベートした。洗浄工程後、ＰＥにコンジュゲートした抗マウスカッパ抗体（上において使用したものと同一）を、５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、１時間、インキュベートした。ビーズを再度、洗浄し、ＰＢＳＴＡ中で再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸ機器により測定した。抗体のペアリングを、抗体ペアのピアソン相関係数から算出した距離行列の樹状図として視覚化した。ビニングを、抗体ペアのＭＦＩ値の樹状図及び解析に基づいて決定した。ＵＰＫ１Ｂに対する親和性結合が低く、かつ特異的ビンに配置することができなかった抗体は、「ＮＡ」又は「ＮＤ」と表す。これらのデータは、「ビン」と見出しが付けられている列に示されており、この場合、図７Ａは、スクリーニングした抗ＵＰＫ１Ｂ抗体は、ｈＵＰＫ１Ｂタンパク質上の少なくとも５つの固有のビン（Ａ〜Ｅ）に群分けされ得ることを示している。
例示的な抗体もまたフローサイトメトリを使用して、細胞表面のｈＵＰＫ１Ｂと会合する能力のために試験した。この目的のため、ナイーブ対照細胞と一緒にしたｈＵＰＫ１Ｂを過剰発現する操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例５により調製）を、表示した抗体と共に３０分間、インキュベートし、製造業者の指示に従い、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータを使用するフローサイトメトリにより、ｈＵＰＫ１Ｂ発現があるかを解析した。抗原発現を、アイソタイプ対照抗体により染色された同一細胞と比較して、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体により染色された操作された細胞の表面に観察される、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量する。幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化もまた、操作した細胞と操作しなかった細胞との間でも観察した。平均蛍光強度に関するアッセイの結果が、図７Ａ中、ＦＣとラベルされている列に示されている。データを吟味すると、開示される抗体のいくつかが、細胞の表面においてｈＵＰＫ１Ｂに結合することを示している。
本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、生存腫瘍細胞に細胞毒性剤の送達を媒介するために内在化することができるかどうかを判定するため、例示的な抗ＵＰＫ１Ｂ抗体及びサポリンに連結している二次抗マウス抗体ＦＡＢ断片を使用して、インビトロでの細胞殺傷アッセイを行った。サポリンは、リボソームを非活性化する植物毒であり、これによって、タンパク質合成を阻害し、細胞が死に至る。サポリンは、細胞内部でしか毒性ではなく、細胞において、リポソームに接近するが、独立して、内在化することはできない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介性の細胞毒性は、会合した抗ＵＰＫ１Ｂマウス抗体が標的細胞に結合して内在化した際の、抗マウスＦＡＢ−サポリン構築物の内在化能力を示す。ｈＵＰＫ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例５に従い調製）の単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、２ｎＭに固定した濃度の抗マウスＩｇＧ ＦＡＢ−サポリン構築物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に、様々な濃度の精製抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を培養物に加えた。９６時間、インキュベートした後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。二次ＦＡＢ−サポリンコンジュゲートだけとインキュベートした細胞を含有する培養物を使用して、生の発光カウントを１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の割合として算出した。図７Ａにおいて、ＩＶＫと記されている列の結果は、生存細胞の百分率として表されている。
これらのデータは、２５０ｐＭの濃度の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体−サポリンコンジュゲートのサブセットは、様々な効力で、ｈＵＰＫ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を効果的に殺傷したことを実証している（図７Ａ）。
抗体が細胞殺傷を媒介する能力にエピトープの位置が役割を果たすかどうかを判定するため、ｈＵＰＫ１Ｂを発現する２９３種の細胞に関して、図７Ａに示されている殺傷データをビンによりプロットし、図７Ｂに示した。図７Ｂを詳しく見ると、ビンＤにマッピングしたこれらの抗体は、上において示されているサポリンと組み合わせて使用すると、より高い細胞殺傷活性を示すことが示される。これらのデータは、ビンＤにおける抗体が、本明細書において開示されている抗体薬物コンジュゲートの成分として使用すると、特に有効となり得ることを示している。
［実施例８］
ＵＰＫ１Ｂタンパク質は、ＰＤＸ腫瘍細胞株において発現する
実施例１〜３に記載されている様々な腫瘍と会合するＵＰＫ１Ｂ ｍＲＮＡの転写産物レベルが向上したことを考慮して、ＵＰＫ１Ｂタンパク質発現もまた、ＰＤＸ腫瘍において向上するかどうかを試験する検討を行った。ＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を検出して定量するため、ＭＳＤディスカバリープラットフォーム（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用する、エレクトロルミネッセンスＵＰＫ１ＢサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
ＰＤＸ腫瘍をマウスから切除し、ドライアイス／エタノール上で急速冷凍した。解凍した腫瘍片にタンパク質抽出用バッファー（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を加えて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して微粉砕した。溶解物を遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間、４℃）により清澄化し、各溶解物中の全タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量した。次に、このタンパク質溶解物を５ｍｇ／ｍＬに正規化し、使用するまで−８０℃において保管した。正常組織は、市販供給元から購入した。
ＭＳＤアッセイにおいて使用したＥＬＩＳＡサンドイッチ抗体のペアは、捕捉用のＳＣ１１５．２２及び検出用のＳＣ１１５．１８からなった。捕捉がＵＰＫ１Ｂ特異的であり、ＵＰＫ１Ｂタンパク質しかプルダウンしないはずなので、このペアは、依然としてｈＵＰＫ１Ｂに特異的なはずである。溶解試料に由来するＵＰＫ１Ｂタンパク質濃度は、実施例５に記載されている通り生成した、精製済み組換えｈＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃタンパク質を使用して生成した標準タンパク質濃度曲線からの値を内挿することにより決定した。ＵＰＫ１Ｂタンパク質標準曲線及びタンパク質定量アッセイは、以下のように行った：
ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの捕捉抗体ＳＣ１１５．２２を１５μＬを用いて、ＭＳＤ標準プレートを４℃で一晩、被覆した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、振とうしながら、３５μＬのＭＳＤ３％ブロッカーＡ溶液中で、１時間、ブロックした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再び洗浄した。１０％タンパク質抽出用バッファーを含有する、ＭＳＤ １％ブロッカーＡ中の１０×希釈溶解物（又は、段階的に希釈した組換えＵＰＫ１Ｂ標準品）１０μＬもウェルに加え、振とうしながら、２時間、インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再び洗浄した。次に、製造業者のプロトコルに従って、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ ＮＨＳエステルを使用して、ＳＣ１１５．１８検出抗体にスルホタグ付けした。洗浄済みプレートに、タグ付けしたＳＣ１１５．１８抗体１０μＬを、振とうしながら、ＭＳＤ １％ブロッカーＡ中、０．５μｇ／ｍＬで、室温で、１時間、加えた。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄した。界面活性剤を含むＭＳＤ読み取り用バッファーＴを水に１Ｘまで希釈し、３５μＬを各ウェルに加えた。標準曲線からの内挿により、ＰＤＸ試料中のＵＰＫ１Ｂ濃度を導く、統合ソフトウェア解析プログラムを使用して、プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ２４００で読み取った。次に、値を全タンパク質濃度により除算し、全溶解タンパク質１ミリグラムあたりのＵＰＫ１Ｂのナノグラム数を得た。
得られた濃度は図８に示されており、各点は、単一ＰＤＸ腫瘍株に由来するＵＰＫ１Ｂタンパク質濃度を表している。各点は、単一ＰＤＸ株に由来しているが、大部分の場合、複数の生物学的試料を同一ＰＤＸ株から試験して、値を平均し、データ点を得た。
図８は、ＢＬ、ＰＡ、ＮＳＣＬＣ及びＧＡ腫瘍試料の代表的な試料が、高いＵＰＫ１Ｂタンパク質発現を示すことを示している。各試料に関するＵＰＫ１Ｂタンパク質発現のレベルは、全タンパク質ｎｇ／ｍｇで与えられており、各腫瘍タイプについて誘導されたメジアンを、水平の棒により示している。試験した正常組織としては、副腎、動脈、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、末梢神経及び座骨神経、膵臓、筋骨格、皮膚、小腸、脾臓、胃、気管、赤血球及び白血球及び血小板、膀胱、脳、乳房、眼、リンパ節、卵巣、下垂体、前立腺及び脊髄が挙げられる。正常組織試料のいずれかにおいて、正常組織（気管）の１つしか、アッセイの定量限界値を超えるレベルで検出されなかった。上で説明されているＵＰＫ１Ｂ発現に関する、ｍＲＮＡ転写データと合わせると、これらのデータは、ＵＰＫ１Ｂが、抗体をベースとする治療的介入にとって魅力的な標的になるという主張を強化するものである。
［実施例９］
腫瘍中のＵＰＫ１Ｂタンパク質発現の免疫組織化学
腫瘍細胞中のＵＰＫ１Ｂの発現及び位置を評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）をＰＤＸ腫瘍及び患者の生検体に対して行った。対照としてＵＰＫ１Ｂ＋操作した細胞に対してもＩＨＣを行った。
ＩＨＣ−適合抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を同定するため、様々な本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を使用して、ＩＨＣをＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞ペレット又はＵＰＫ１Ｂ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットに対して行った。当該技術分野における標準にあるように、ホルマリンにより固定してパラフィンに包埋した（ＦＦＰＥ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットに対して、下記の通り、ＩＨＣを行った。
細胞ペレットの塊の平面切片を裁断し、顕微鏡のガラス製スライド上にマウントした。キシレンにより脱パラフィン化した後、５μｍの切片を抗原賦活溶液（Ｄａｋｏ）により、９９℃で２０分間、前処理し、７５℃まで冷却して、次に、ＰＢＳ中の３％過酸化水素、次いでアビジン／ビオチンブロック溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により処理した。次に、ＦＦＰＥスライドを、ＰＢＳバッファー中の３％ＢＳＡ中の１０％ウマ血清によりブロックし、本発明の一次抗ＵＰＫ１Ｂ抗体と共にインキュベートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳに、ヒト組織の場合７．５μｇ／ｍｌに、及びＰＤＸ株の場合１０μｇ／ｍｌに、室温で３０分間、希釈した。ＦＦＰＥスライドは、ビオチン−コンジュゲートウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、室温で３０分間、２．５μｇ／ｍｌに希釈し、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。発色による検出を３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温で５分間、展開し、組織をマイヤーヘマトキシリン（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ）により対比染色し、アルコールにより湿らせて、キシレン中に浸漬した。染色したスライドを、光学顕微鏡法によって分析した。染色を定量するために、Ｈスコアを利用した。Ｈスコアは、以下の式を利用することにより、染色程度を評価する方法である：３ｘ（強度が３＋で染色された腫瘍細胞の百分率）＋２ｘ（強度が２＋で染色された腫瘍細胞の百分率）＋１ｘ（強度が１＋で染色された腫瘍細胞の百分率）であり、０〜３００の範囲になる。
抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（ＳＣ１１５．７）は、試験した本発明の他の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体よりも効果的にＵＰＫ１Ｂ過剰発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットを特異的に検出することができた（データ示さず）。これらの抗体がＵＰＫ１Ｂを特異的に検出する能力は、競合実験により確認された。この実験において、関連抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を、５×モル比過剰のｈＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃ又は無関係のタンパク質（ＳＣＲｘ９１−Ｆｃ）と混合し、次に、ＵＰＫ１Ｂ発現ＨＥＫ２９３Ｔホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片と共にインキュベートした。陽性染色がないことは、ｈＵＰＫ１Ｂ−Ｆｃタンパク質は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体がＵＰＫ１Ｂ過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するのを妨害することを実証している（図９Ａ）。
次に、実質的に同じ方法論を使用して、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体であるＳＣ１１５．７を使用して、ｈＵＰＫ１Ｂが様々なＰＤＸモデルにおいて発現するかどうかを判定した。図９Ｂは、ＵＰＫ１Ｂが、膵臓ＰＤＸ株の１２／１４（８６％）において陽性であることを示している。
がん患者の一次生検体試料にも免疫組織化学を行い、図９Ｃは、ＵＰＫ１Ｂが、膀胱腺癌の１２／１７（７０％）、膀胱の扁平上皮癌の２／１０（２０％）、及び膀胱移行細胞癌の７８／９０（８７％）に発現することを示している。最後に、これらのデータを提供する同様の技術を使用すると、図９Ｄは、ＵＰＫ１Ｂが、膵臓腺癌の２０／４２（４８％）に発現することを示している。
いくつかの様々なＰＤＸ及び患者の一次腫瘍に対するこの陽性染色により、マーカーの発現が確認され、このことは、ＵＰＫ１Ｂを診断標的及び治療標的として使用する実現可能性を強力に示唆するものである。
［実施例１０］
腫瘍中のＵＰＫ１Ｂタンパク質発現のフローサイトメトリ検出
フローサイトメトリを使用して、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、膵臓及び膀胱のＰＤＸ腫瘍細胞株の表面において、ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質の存在を特異的に検出する能力を評価した。さらに、ＰＡ及びＢＬ ＣＳＣの表面におけるＵＰＫ１Ｂの発現も決定した。ＰＤＸ腫瘍を採取し、当該技術分野で認識されている酵素組織消化技術を使用して切り離し、ＰＤＸ腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を得た（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４２４を参照）。死滅細胞を検出するために４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を、マウス細胞を特定するために抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体を、及びヒト癌細胞を特定するために抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体を用い、これらと共に、ＰＤＸ腫瘍単一細胞懸濁液をインキュベートした。得られた単一細胞懸濁液は、ＮＴＧ細胞とＣＳＣの両方を含む、腫瘍細胞のバルク試料を含んでいた。ＮＴＧ及びＣＳＣ部分集団へのバルク腫瘍細胞集団を区分するために、ＰＤＸ腫瘍細胞を抗ヒトＣＤ４６及び又はＣＤ３２４及びＥＳＡ抗体と共にインキュベートした（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１３／０２６０３８５、２０１３／００６１３４０及び２０１３／００６１３４２を参照）。抗ＵＰＫ１Ｂ抗体であるＳＣ１１５．４６を用いて、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータを使用して、フローサイトメトリにより、ｈＵＰＫ１Ｂ発現についてバルク又は選別した腫瘍細胞を解析した。
図１０Ａは、抗ｈＵＰＫ１Ｂ抗体であるＳＣ１１５．４６が、バルクＰＡ ＰＤＸ腫瘍細胞の表面に、ｈＵＰＫ１Ｂの発現を検出したことを示している。全ての試料において、抗ｈＵＰＫ１Ｂ抗体（黒色線）は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色）と比較して、向上したＵＰＫ１Ｂ発現を検出した。ＰＤＸ腫瘍試料である、ＰＡ３、ＰＡ７６、ＰＡ１０９及びＰＡ１５１は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色）と比べて、ＣＳＣ（黒色実線）及びＮＴＧ部分集団ＰＡ ＰＤＸ腫瘍細胞（破線）において、ｈＵＰＫ１Ｂ発現が向上することを示した。このことは、ＵＰＫ１Ｂは、いくつかのＰＡ腫瘍サブタイプにおいて、ＣＳＣに発現することを実証している。さらに、発現は、アイソタイプ対照抗体により染色された同一腫瘍と比較して、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体により染色された腫瘍細胞の表面に観察された、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量することができる。解析された腫瘍細胞株のそれぞれに対するΔＭＦＩをまとめた表が、図１０Ａにおける挿入図として示されている。このデータは、図９ＢにおけるＩＨＣの結果を確認するものであり、この場合、膵臓がんＰＤＸ株ＰＡ２０、ＰＡ５２及びＰＡ７６も、ＩＨＣによって陽性染色されたことを示している。
図１０Ｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体であるＳＣ１１５．４６が、バルクＢＬ ＰＤＸ腫瘍細胞の表面に、ｈＵＰＫ１Ｂの発現を検出したことを示している。ＢＬ５２を除く全ての試料において、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（黒色線）は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色）と比較して、向上したＵＰＫ１Ｂ発現を検出した。ＰＤＸ腫瘍試料であるＢＬ１８及びＢＬ２８は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色）と比べて、ＣＳＣ（黒色実線）及びＮＴＧ部分集団ＰＡ ＰＤＸ腫瘍細胞（破線）において、ｈＵＰＫ１Ｂ発現が向上したことを示した。このことは、ＵＰＫ１Ｂは、いくつかのＢＬ腫瘍サブタイプにおいて、ＣＳＣに発現することを実証している。さらに、発現は、アイソタイプ対照抗体により染色された同一腫瘍と比較して、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体により染色された腫瘍細胞の表面に観察された、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量することができる。解析された腫瘍細胞株のそれぞれに対するΔＭＦＩをまとめた表が、図１０Ｂにおける挿入図として示されている。
まとめると、このデータは、ＵＰＫ１ＢがＰＡ及びＢＬ ＰＤＸ腫瘍細胞において発現すること、およびそれにより、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートを用いる標的治療法にとって良好な指標となることを示唆している。
［実施例１１］
ＵＰＫ１Ｂ発現状態及び体細胞変異
ＰＡ患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）株における、様々な遺伝子の変異状態は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の標的化再配列決定を行うことにより決定され得る。いくつかの実施形態において、膵臓がん関連遺伝子の変異状態をサロゲートバイオマーカー（以下に詳細に記載されている）として使用して、ＵＰＫ１Ｂの様々な遺伝的変異と発現との間に関連性があるかどうかを判定することができる。他の実施形態において、膵臓がん関連遺伝子の変異状態を、遺伝的変異と本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はＡＤＣによる治療への応答との間に相関関係があるかどうかを判定するために使用することができる。さらなる実施形態において、膵臓がん関連遺伝子の変異状態を、有効な併用療法となるかを判定するために使用することができる。
ＵＰＫ１Ｂの発現を予測し得る変異を判定するため、ＰＡ ＰＤＸ腫瘍からのｇＤＮＡを、Ｉｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑ及びＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ技術を使用して、主要ながんドライバー遺伝子の標的化再配列決定により解析した。手短に言えば、標準分子技術を使用してこれらの腫瘍からｇＤＮＡを採取し、Ｉｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑライブラリキット２．０を使用して、数百の主要ながんドライバー遺伝子のコード領域及び非コード領域に及ぶ、最大２５０ｂｐからなる３０００のアンプリコンを包含するＡｍｐｌｉＳｅｑプライマーのカスタムパネル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からライブラリを調製した。次に、ＰＤＸに由来するライブラリ試料をそれぞれ、固有のＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ Ｂａｒｃｏｄｅ Ａｄａｐｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にライゲーションし、各配列決定の実行内の複数のライブラリ試料をプールした。次に、製造業者の指示に従い、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ機器で配列決定を行った。
マイクロアレイ（上の実施例３）又はフローサイトメトリ（上の実施例１０）により決定した、一定範囲のＵＰＫ１Ｂの発現を有するＰＡ腫瘍を、変異データとＵＰＫ１Ｂ発現との相関関係について試験した。変異は、コドンのミスセンス非同義挿入又は欠失、アンプリコン欠失又はアンプリコン増幅、ナンセンス非同義フレームシフト、及び配列決定した遺伝子のスプライス部位バリアントの改変に至らしめる変異を含めた、配列決定した遺伝子のタンパク質コード領域に発生する任意の非同義改変により定義する。
ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子において変異を有するＰＡ ＰＤＸ腫瘍は、これらの遺伝子のどちらかにおいて変異を有していないＰＤＸ腫瘍と比べて、ＵＰＫ１Ｂの発現が有意に高い（ｐ＜０．０５、ウェルチのＴ検定）ことを実証することが観察され、この場合、ＵＰＫ１Ｂ発現は、マイクロアレイ（図１１Ａ）又はフローサイトメトリ（図１１Ｂ）のどちらか一方により決定した。これらのデータは、この遺伝子において検出された変異が、ＵＰＫ１Ｂの発現又はその発現がないことと相関していることを示唆している。この変異をバイオマーカーとして使用して、患者集団におけるＵＰＫ１Ｂの発現を予測しそしてこれらのサブセットの腫瘍に対する治療をより正確に導くことができる。
［実施例１２］
ＵＰＫ１Ｂ抗体の配列決定
実施例６において生成した抗ＵＰＫ１Ｂマウス抗体は、以下に記載されている通りに配列決定した。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から精製した。試料あたり１０４〜１０５個の間の細胞を使用した。単離されたＲＮＡ試料は、使用するまで−８０℃において保存した。
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した８６のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む２つの５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組合せて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した６４の５’Ｖκリーダー配列を含む２つのプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ＶＨ及びＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で４つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、２つはＶκ軽鎖について、２つはＶＨ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、１．５μＬのＲＮＡ、０．４μＬの１００μＭの重鎖又はカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ並びに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する０．６μＬの酵素ミックスを含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で６０分、９５℃で１５分、続いて３５サイクル×（９４．５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
抽出されたＰＣＲ産物を、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製及び配列決定サービスのための外部配列決定提供業者（ＭＣＬＡＢ）へと送付した。ヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを特定した。誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−及びＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
図１２Ａは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体に由来する、いくつかの新規のマウス軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している一方、図１２Ｂは、同一の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体に由来する新規のマウス重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している。マウス軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を一緒にして、配列番号２１〜９１（奇数）に示されている。
より詳細には、図１２Ａ及び図１２Ｂは、配列番号２１のＶＬ及び配列番号２３のＶＨを有するＳＣ１１５．１；配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨを有するＳＣ１１５．４；配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨを有するＳＣ１１５．７；配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨを有するＳＣ１１５．９；配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨを有するＳＣ１１５．１３；配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨを有するＳＣ１１５．１８；配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨを有するＳＣ１１５．１９；配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨを有するＳＣ１１５．２６；配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨを有するＳＣ１１５．３２；配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨを有するＳＣ１１５．３６；配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨを有するＳＣ１１５．４６；配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨを有するＳＣ１１５．４８；配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨを有するＳＣ１１５．５１；配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨを有するＳＣ１１５．５２；配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨを有するＳＣ１１５．６５；配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨを有するＳＣ１１５．８４；配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨを有するＳＣ１１５．９０及び配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨを有するＳＣ１１５．９４と称する、いくつかのマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の注釈のついた配列を提示している。
本開示の抗体（又は、これらを生成するクローン）を、それぞれの可変領域核酸又はアミノ酸の配列番号（図１２Ａ〜１２Ｃ）と一緒にまとめたものが、直下の表５に示されている。
Figure 2019511199
図１２Ａ及び図１２Ｂにおいて、ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列に注釈をつけて、Ｋａｂａｔらに準拠して定義される、フレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び相補性決定領域（すなわち、図１２Ａ中のＣＤＲＬ１〜ＣＤＲＬ３又は図１２Ｂ中のＣＤＲＨ１〜ＣＤＲＨ３）を同定する。可変領域配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売のバージョンを使用して解析し、ＣＤＲ及びＦＲの表示を得た。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従い定義されるが、当業者は、ＣＤＲ及びＦＲの表示はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は他の任意の許容された命名法システムに従って定義され得ることを理解する。さらに、図１２Ｃは、図１２Ａ及び１２Ｂに示されているアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２０〜９０、偶数）を提示している。
図１２Ａ及び１２Ｂ、並びに表５において分かる通り、特定のマウス抗体のそれぞれに対する重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の配列番号は、連続する奇数である。したがって、モノクローナル抗ＵＰＫ１Ｂ抗体であるＳＣ１１５．１は、軽鎖及び重鎖可変領域についてそれぞれ、アミノ酸配列番号２１及び２３を含む。ＳＣ１１５．４は、配列番号２５及び２７を含む。ＳＣ１１５．７は配列番号２９及び３１を含むなどである。さらに、マウス抗体アミノ酸配列（図１２Ｃに示されている）をコードする対応するアミノ酸配列は、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ１１５．１抗体のＶＬ及びＶＨの核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０及び２２となる。
図１２Ａ〜１２Ｃ中の注釈のついた配列に加えて、図１２Ｇ及び１２Ｈは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ１１５．９及びＳＣ１１５．１８の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲ表示を提示している。図１２Ｇ及び１２Ｈに図示されているＣＤＲ表示を、上で議論されているＡｂｙｓｉｓデータベースの専売バージョンを使用して誘導した。後の実施例に示されている通り、当業者は、開示したマウスＣＤＲは、本発明に従って、ヒトフレームワーク配列にグラフト化されて、ＣＤＲグラフト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を与えることができることを理解する。さらに、本開示を鑑みると、本明細書の教示に従って、作製及び配列決定された任意の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体のＣＤＲをも容易に決定して、この誘導されたＣＤＲ配列を、本発明のＣＤＲグラフト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を得るために使用することができると思われる。これは、図１２Ａ〜１２Ｂに示されている重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する抗体に特に当てはまる。
［実施例１３］
キメラ及びヒト化ＵＰＫ１Ｂ抗体の生成
キメラ抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を、当該技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。実施例１に記載されている方法を使用して、全ＲＮＡを抗ＵＰＫ１Ｂ抗体生成ハイブリドーマから抽出し、ＲＮＡをＰＣＲ増幅した。マウス抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータを、本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の核酸配列（図１２Ｃ）から得た。抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のフレームワーク配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＨ及びＶＬ消化ＰＣＲ産物を精製し、ＩｇＨ又はＩｇκ発現ベクターにそれぞれライゲーションした。ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物並びに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。コンピテントのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物を用いて形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンプレートの上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製及び消化後、ＶＨ断片を、ＨｕＩｇＧ１（ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１）を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ヒトカッパ軽鎖定常領域（ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ）を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＣＨＯ−Ｓ細胞に同時トランスフェクションすることにより発現させた。各２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、４００μＬ中１５μｇのＰＥＩトランスフェクション試薬に加えた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ。混合物を室温で１０分間インキュベートし、細胞に加えた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａビーズにより精製した。
さらに、専売の分析プログラム（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）及び以下の標準分子操作技術の手助けを受けて、選択したマウス抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（ＳＣ１１５．９及びＳＣ１１５．１８）を、ヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列及びＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列及びＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき選択／設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらの番号付けに従って行った。可変領域が選択されたら、それらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
ヒト化抗体ｈＳＣ１１５．９のＶＬ及びＶＨのアミノ酸並びに核酸配列（図１２Ｄ及び１２Ｅ；配列番号１０１及び１０３、ＡＡ及び配列番号１００及び１０２、ＮＡ）は、対応するマウス抗体ＳＣ１１５．９のＶＬ及びＶＨ配列（配列番号３３及び３５）に由来するが、他方で、ヒト化抗体ｈＳＣ１１５．１８のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列（図１２Ｄ及び１２Ｅ；配列番号１０５及び１０７、ＡＡ及び配列番号１０４及び１０６、ＮＡ）は、対応するマウス抗体ＳＣ１１５．１１８（配列番号４１及び４３）のＶＬ及びＶＨ配列に由来していた。以下の表６は、フレームワーク残基の変化がｈＳＣ１１５．１８構築物にあり、ヒト化抗体の結合親和性を維持していることを示している。より具体的に、重鎖における６９位及び軽鎖における７８位（Ｋａｂａｔの番号付け）が変化し、分子の好都合の特徴を保存している。
Figure 2019511199
以下の実施例１６において議論されている通り、表６はまた、本明細書に記載されている通り作製した、例示的な部位特異的抗体（ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１及びｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１）の組成も示している。
［実施例１４］
ヒト化ＵＰＫ１Ｂ抗体の特徴付け
ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質に対する抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の速度論的特徴及び親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴により決定した。抗ヒト抗体捕捉キットを使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップに抗ヒト抗体を固定した。次に、独立したフローセルにおいて、ＣＨＯを発現したＦｃ融合ヒトＵＰＫ１Ｂタンパク質を固定化した。各抗ＵＰＫ１Ｂ抗体Ｆａｂ断片の注射サイクルの前に、ヒトＦｃ融合タンパク質を、１２秒の接触時間及び流速２０μＬ／分で、表面に１μｇ／ｍＬの濃度で捕捉した。捕捉したヒトＵＰＫ１Ｂ Ｆｃ融合タンパク質のベースラインからの搭載量は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００で、平均１６６の応答単位（１４６〜１８６の応答単位の範囲）となった。ヒトＵＰＫ１Ｂ Ｆｃ融合タンパク質の捕捉後、パパインにより消化した抗ＵＰＫ１Ｂ抗体Ｆａｂ断片を、会合期の間、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００において２００ｎＭの濃度で、次いで、４０μＬ／分の流速で、１８０秒の解離期で表面上に流した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ヒトＵＰＫ１Ｂ Ｆｃ融合タンパク質を捕捉した後、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体Ｆａｂ断片を、高性能注入（単一濃度）法を使用して、濃度を向上して４回、連続して注入し（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）、次いで、１８０秒間の解離期とした。ＣＭ５抗ヒトチップ表面を、各サイクルの後に、１０μＬ／分、ｐＨ１．７で、１０ｍＭのグリシンの１分間の接触時間で再生成した。
これらのデータは、特異的ヒトＵＰＫ１Ｂ Ｆｃ融合タンパク質の表面応答から、対照の無関係なヒトＦｃ融合タンパク質の表面応答を減算することにより処理し、データを会合期及び解離期に切り出した。得られた応答曲線を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った実験に関する、抗体の速度論的特徴を評価した。会合及び解離データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。図１３に示されている通り、ヒト化抗ＵＰＫ１Ｂクローンへの親和性は、親のキメラ抗体の３倍以内であった。
［実施例１５］
ヒト化ＵＰＫ１Ｂ抗体は、インビトロにおいて細胞殺傷を媒介する。
本発明のヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、生存腫瘍細胞への細胞毒性剤の送達を媒介するために内在化することができるかどうかを判断するため、２種のヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ（ｈＳＣ１１５．９及びｈＳＣ１１５．１８）抗体、及びサポリンに連結した二次抗ヒト抗体ＦＡＢ断片を使用して、インビトロでの細胞殺傷アッセイを行った。サポリンは、リボソームを非活性化する植物毒であり、これによって、タンパク質合成が阻害され、細胞が死に至る。サポリンは、細胞内部でしか毒性ではなく、細胞において、リポソームに接近するが、独立して、内在化することはできない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介性の細胞毒性は、抗ヒトＦＡＢ−サポリン構築物が、会合した抗ＵＰＫ１Ｂヒト化抗体に結合して内在化したときに、標的細胞に内在化することができることを示している。
ｈＵＰＫ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、２ｎＭに固定した濃度の抗ヒトＩｇＧ ＦＡＢ−サポリン構築物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒にした培養物に、様々な濃度の精製抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を加えた。９６時間のインキュベート後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。二次ＦＡＢ−サポリンコンジュゲートとのみインキュベートした細胞を含有する培養物を使用して、生の発光カウントを１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の百分率として算出した。
１００ｐＭの濃度のヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体−サポリンコンジュゲートはどちらも、ｈＵＰＫ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、様々な効力で効果的に殺傷した一方（図１４Ａ、ｈＳＣ１１５．９及び図１４Ｂ、ｈＳＣ１１５．１８）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、同一濃度において、そうではなかった。ヒト化抗体は、これらが由来するキメラ抗体に対して同等の効力を示した。上述の結果は、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、コンジュゲートした細胞毒性ペイロードの内在化を媒介する能力があることを実証しており、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、ＡＤＣの標的部分として治療的利用性を有し得るという仮説を、支持するものである。
［実施例１６］
部位特異的ＵＰＫ１Ｂ抗体の生成
天然のヒト化ＩｇＧ１に加えて、軽鎖に不対システインをもたらすように変異されている天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域及び重鎖（ＨＣ）定常領域を含む、抗ＵＰＫ１Ｂ ｈＳＣ１１５．９及びｈＳＣ１１５．１８抗体を操作したヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＵＰＫ１Ｂ部位特異的抗体を構築した。この点において、天然のＩｇＧ１抗体中のＬＣにおいて、システイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を通常形成する、ＨＣの上部ヒンジ領域中のシステイン２２０（Ｃ２２０）をセリン（Ｃ２２０Ｓ）により置換した。組み立て時に、ＨＣ及びＬＣは、治療剤にコンジュゲートするのに好適な、軽鎖定常領域のｃ末端に２つの遊離システインを含む抗体を形成する。記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示されるＥＵ番号付けスキームに従っている。
天然のヒト化ＩｇＧ１抗体及び部位特異的構築物を生成するため、ＨＣ定常領域（例えば、配列番号２）又はこのＣ２２０Ｓ変異（例えば、配列番号３）を含有する発現ベクターに、ＶＨ核酸をクローニングした。天然のｈＳＣ１１５．９ ＨＣ（図１２Ｆ、配列番号１１１）又はｈＳＣ１１５．１８ ＨＣ（図１２Ｆ、配列番号１１４）、及びｈＳＣ１１５．９ｓｓ１（図１２Ｆ、配列番号１１２）又はｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１（図１２Ｆ、配列番号１１５）の変異体Ｃ２２０Ｓ ＨＣをコードするベクターに、ＣＨＯ−Ｓ細胞において、野生型ＩｇＧ１カッパＬＣ（配列番号５）に操作可能に会合している選択されたＶＬ（ｈＳＣ１１５．９、配列番号１０１又はｈＳＣ１１５．１８、配列番号１０５）をコードするベクターを同時トランスフェクトし、ｈＳＣ１１５．９ ＬＣ（図１２Ｆ、配列番号１１０）又はｈＳＣ１１５．１８ ＬＣ（図１２Ｆ、配列番号１１３）を得た。次に、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用して、哺乳動物の一過性発現システムを使用して発現させた抗体を得た。Ｃ２２０Ｓ変異体ＨＣを含有する、生じた抗ＵＰＫ１Ｂ部位特異的抗体をｈＳＣ１１５．９ｓｓ１及びｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１と呼ぶ一方、天然型をｈＳＣ１１５．９及びｈＳＣ１１５．１８と呼ぶ。この点に関すして、完全長ｈＳＣ１１５．９部位特異的抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が図１２Ｆ（天然ヒト化抗体ｈＳＣ１１５．９と共に）に示されており、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１は、それぞれ、配列番号１１０及び１１２のＬＣ及びＨＣを含み、ｈＳＣ１１５．９は、それぞれ、配列番号１１０及び１１１のＬＣ及びＨＣを含む。同様に、完全長ｈＳＣ１１５．１８部位特異的抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が図１２Ｆ（天然ヒト化抗体ｈＳＣ１１５．１８と共に）に示されており、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１は、それぞれ、配列番号１１３及び１１５のＬＣ及びＨＣを含み、ｈＳＣ１１５．１８は、それぞれ、配列番号１１３及び１１４のＬＣ及びＨＣを含む。
改変抗ＵＰＫ１Ｂ部位特異的抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在及び不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した（データ示さず）。還元条件下、遊離ＬＣ及び遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のＣ末端における遊離システインにより予測される。
本明細書において議論されている通り、部位特異的ＵＰＫ１Ｂ抗体を作製することができると、一層均質な組成物の調製が可能になり、標準的な従来技術のＡＤＣ組成物と比べて、治療指数の改善が実現し得る。
［実施例１７］
ＵＰＫ１Ｂ抗体−薬物コンジュゲートの調製
マウス可変領域及びヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１及びｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１の部位特異的構築物を含む）を有する様々なキメラ抗体を、遊離スルフィドリル基を有する末端マレイミド部分を介して、ＰＢＤ１又はＭＭＤ１０（ＤＬ１）にコンジュゲートし、ｈＳＣ１１５．９−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．９−ＭＭＤ１０、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＤ１０、ｈＳＣ１１５．１８−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．１８−ＭＭＤ１０、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１−ＭＭＤ１０及びｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＡＥと呼ぶ、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成した。これらのコンジュゲートは、適切なコンジュゲート対照及び非コンジュゲート対照と共に、後続の実施例において使用する。
天然の抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを、以下のように調製した。抗ＵＰＫ１Ｂ抗体のシステイン結合を、抗体１ｍｏｌあたりトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）の所定のモル数の添加により、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、室温で９０分間、部分的に還元した。次いで、得られた部分還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介して薬物リンカーにコンジュゲートした。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの調製は、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
例示的部位特異的ヒト化抗ＵＰＫ１ＢＡＤＣを、改変された部分還元プロセスを使用してコンジュゲートした。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（ｓｓ１構築物におけるＣ２１４）に最大限にコンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを最小化する一方で、ＤＡＲが２の（ＤＡＲ＝２）ＡＤＣを最大化する、ＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性をさらに改善するため、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）及び穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して抗体を選択的に還元し、この後、リンカー薬物を用いてコンジュゲーションを行い、次いで、ダイアフィルトレーション及び製剤化工程を行った。
各部位特異的抗体の調製は、所定濃度の還元済みグルタチオン（ＧＳＨ）を含む、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｌ−アルギニン／５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファー中、室温で最低２時間、選択的に還元した。次いで、全ての調製物を、３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のバッファーへとバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた選択的還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介して薬物リンカーにコンジュゲートした。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮＡＣを添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの得られた部位特異的調製物は、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた部位特異的抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
得られたコンジュゲートは、使用するまで保管した。
［実施例１８］
ＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートは、インビトロにおいて、細胞毒性剤の送達を促進する
本発明の抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣが、生存腫瘍細胞に細胞毒性剤の送達を媒介するために内在化することができるかどうかを判定するため、それぞれ上の実施例１８に記載されている通り生成した、抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．１８ｓｓ１−ＰＢＤ、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＤ１０（ＡＤＣ１）及びｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＡＥ（ＡＤＣ６）を使用して、インビトロで細胞殺傷アッセイを行った。
ヒトＵＰＫ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はナイーブなＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、様々な濃度の精製したＡＤＣ、又はＰＢＤ、ドラスタチン１０若しくはＭＭＡＥにコンジュゲートしたヒトＩｇＧ１対照抗体を培養物に加えた。この細胞を、９６時間、３７Ｃ／５％ ＣＯ２でインキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。未処理細胞を含有する培養物を使用した未処理の蛍光計数物を１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の百分率として算出した。図１５は、細胞がヒトＩｇＧ１対照抗体と比較して、抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣに対してかなり感受性が高かったことを示している。さらに、ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、ＵＰＫ１Ｂを過剰発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に比べて、ＵＰＫ１Ｂを過剰発現しなかったナイーブなＨＥＫ２９３Ｔ細胞に影響はほとんど及ぼさず、ＵＰＫ１Ｂ抗原に対するＡＤＣの特異性を実証した（図１５）。
上の結果は、抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣは、ＵＰＫ１Ｂを発現する細胞への内在化及び細胞傷害性ペイロード（ＰＢＤ、オーリスタチン及びドラスタチン）の送達を特異的に媒介する能力があることを実証している。
［実施例１９］
抗ＵＰＫ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長をインビボで抑制する
前述の結果に基づいて、本発明のコンジュゲートしたＵＰＫ１Ｂモジュレーターが、インビボにおいて、ヒト腫瘍を退縮させて、これを発現するＵＰＫ１Ｂの成長を抑制することを実証する検討を行った。この点において、選択したマウス抗体モジュレーター（ＳＣ１１５．９）を、ＰＢＤ細胞毒性剤に共有結合により会合させて、免疫不全マウスにおいて得られたＡＤＣを試験し、ヒトＰＤＸ腫瘍成長を抑制する能力があることを実証した。
この目的のため、当該技術分野で認識されている技術を使用して、患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスの脇腹において皮下で成長させた。腫瘍体積及びマウス重量を、毎週２回、監視した。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為に治療群に割り当て、腹腔内注射により、表示用量のＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣ又は抗ハプテン対照ＩｇＧ１−ＰＢＤ（それぞれ、実質的に実施例１８に記載されている通り生成した）を注射した。マウスに単回注射で投与した。治療後、腫瘍が８００ｍｍ３を超える、又はマウスが健康を害するまで、腫瘍体積及びマウス重量を監視した。全ての試験の場合に、治療したマウスは、免疫不全の腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて通常、観察されたものを超えた健康への悪影響を示さなかった。
図１６Ａは、ＵＰＫ１Ｂの発現を示す様々な膵臓腫瘍を有するマウスにおける、腫瘍成長に及ぼす、開示されるＡＤＣの影響を示している。この点において、膵臓導管腺癌であるＰＡ７６の、ＰＢＤにコンジュゲートした例示的なＵＰＫ１Ｂ抗体ＳＣ１１５．９による治療は、腫瘍が再成長し始めるまで４０日間という長い間、腫瘍収縮が続いた。ＰＡ２０腫瘍の治療は、約６０日の期間、腫瘍成長を遅延させた。最後に、膵臓導管腺癌であるＰＡ５２の、例示的な抗体ＳＣ１１５．９−ＰＢＤによる治療は、腫瘍収縮を生じ、１００日間にわたり、腫瘍の再成長を阻害した（図１４Ａ）。
先の実施例において、ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣによりもたらされた優れた結果を考慮して、インビボでの膵臓腫瘍の治療における、例示的なヒト化ＡＤＣモジュレーターの効力を実証する追加実験を行った。具体的に、選択したヒト化抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（ｈＳＣ１１５．９）（上の実施例１３に示されている通り生成した）を、本明細書に記載されているＰＢＤ及びＭＭＤ１０にコンジュゲートし、対照と共に、上で示したＰＤＸ腫瘍を移植した免疫不全マウスに投与した。ＭＭＤ１０にコンジュゲートしたヒト化抗体の試験において、非特異的抗体の結合部位を遮断するため、ＡＤＣ注射の３０分前に、マウスに非コンジュゲート抗ハプテン対照ｈＩｇＧ１を注射した。各検討において、腫瘍が８００ｍｍ３を超える、又はマウスが健康を害するまで、対照動物の腫瘍体積及びマウス重量を監視した。これらの実験の結果は、図１６Ｂ及び１６Ｃに示されている。
図１６Ｂ及び１６Ｃを詳しく見ると、１．６ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤ及び５ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＤ１０による治療後に、腫瘍体積の低下が達成されたことが示される。例えば、膵臓導管腺癌であるＰＡ７６ｘにおいて、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤ又はｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＤ１０による治療により、腫瘍収縮及び１００日間を超える持続的寛解がもたらされた。ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤによるＰＡ３の治療は、治療後、８０日間を超えて、腫瘍収縮の持続をもたらした（図１６Ｂ）。ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＰＢＤによるＰＡ５２の治療は、４０日間、持続した腫瘍収縮及び成長の抑制をもたらした（図１６Ｂ）。どちらも膵臓導管腺癌であるＰＡ４及びＰＡ２０における、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１−ＭＭＤ１０の治療は、治療後、それぞれ、５０日間及び８０日間、腫瘍収縮及び腫瘍成長の抑制をもたらした（図１６Ｃ）。
様々なコンジュゲートされているモジュレーターが、長期間、腫瘍体積をインビボで劇的に収縮させるという驚くべき能力は、増殖性障害の治療のための治療標的として、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体の使用の妥当性をさらに示すものである。
［実施例２０］
ＵＰＫ１Ｂ発現は、ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣによるＰＤＸ腫瘍成長抑制と相関関係がある
ｈＵＰＫ１Ｂの発現レベルを使用して、抗ＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣによる治療に対する応答を予測することができるかどうかを判定するため、ＰＡ ＰＤＸにおけるｈＵＰＫ１ＢのＲＮＡ及びタンパク質レベルを、これらのＰＤＸモデルをインビボで抗ｈＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣにより治療した場合に観察される、腫瘍進行までの期間（ＴＴＰ）に対してプロットした。ｈＵＰＫ１Ｂの発現レベルを、マイクロアレイ（上の実施例３に概説されている）又はＭＳＤ（上の実施例８に概説されている）によって決定した。マウス又はヒト化抗ｈＵＰＫ１Ｂ ＡＤＣのどちらかを投与した、各ＰＡ ＰＤＸに対する腫瘍進行までのデルタ期間（ｄＴＴＰ）を算出した。
図１７に示されている通り、腫瘍成長阻害の量とｈＵＰＫ１Ｂの発現レベルとの間に正の関係が存在する。
当業者はさらに、本発明が、本趣旨又は中心的な特性から逸脱することなく、他の特定の態様に具現化され得ることを理解している。本発明の上述の記載がこの例示的な実施形態しか開示していないという点において、他の変形が本発明の範囲内であることが企図されることが理解される。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、参照は、本発明の範囲及び内容の指標として添付の特許請求の範囲に対してなされるべきである。

Claims (44)

  1. ＵＰＫ１Ｂを発現する腫瘍開始細胞に結合する、単離された抗体。
  2. 配列番号１を含むヒトＵＰＫ１Ｂに結合する、単離された抗体。
  3. ＵＰＫ１Ｂに結合し、
    配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）、又は
    配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は
    配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ、又は
    配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ、又は
    配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ、又は
    配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ、又は
    配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ、又は
    配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ、又は
    配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ、又は
    配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ、又は
    配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ、又は
    配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ、又は
    配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ、又は
    配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ、又は
    配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ、又は
    配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨ、又は
    配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨ、又は
    配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨ
    を含む抗体を含むか、又は結合についてその抗体と競合する、単離された抗体。
  4. 内在化抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体。
  5. キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化若しくはヒト抗体、又はそれらの免疫反応性断片である、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体。
  6. 配列番号１０１のＶＬ及び配列番号１０３のＶＨを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体。
  7. 配列番号１０５のＶＬ及び配列番号１０７のＶＨを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の単離された抗体。
  8. 部位特異的抗体を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離された抗体。
  9. ペイロードにコンジュゲートされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
  11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体の全て又は一部をコードする核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸を含む、ベクター。
  13. 請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  14. 式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣであって、
    式中、
    ａ） Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体を含み、
    ｂ） Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
    ｃ） Ｄは、薬物を含み、
    ｄ） ｎは、約１〜約２０の整数である
    ＡＤＣ、又は薬学的に許容されるその塩。
  15. 抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化若しくはヒト抗体、又はそれらの免疫反応性断片を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
  16. Ａｂが、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＵＰＫ１Ｂ抗体である、請求項１４に記載のＡＤＣ。
  17. ｎが、約２〜約８の整数を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
  18. Ｄが、ドラスタチン、オーリスタチン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ベンゾジアゼピン誘導体、カリケアマイシン及びアマニチンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
  19. 請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む、医薬組成物。
  20. 請求項１０又は請求項１９に記載の医薬組成物を、投与を必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
  21. がんが血液悪性腫瘍を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 血液悪性腫瘍が、白血病又はリンパ腫を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. がんが固形腫瘍を含む、請求項２０に記載の方法。
  24. がんが、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、食道がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、肺がん（小細胞及び非小細胞の両方）、甲状腺がん及び神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. がんが膵臓がんを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. がんが膀胱がんを含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  28. 腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞を減少させる方法であって、腫瘍開始細胞及び腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、請求項１４〜１８に記載のＡＤＣと接触させることを含み、それによって腫瘍開始細胞の頻度を減少させる、方法。
  29. 接触がインビボで行われる、請求項２８に記載の方法。
  30. 接触がインビトロで行われる、請求項２８に記載の方法。
  31. 細胞を請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させることを含む、細胞に細胞毒を送達する方法。
  32. 対象におけるがんを検出、診断又は監視する方法であって、（ａ）腫瘍細胞を請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体と接触させる工程、及び（ｂ）腫瘍細胞における抗体を検出する工程を含む、方法。
  33. 接触が、インビトロで行われる、請求項３２に記載の方法。
  34. 接触が、インビボで行われる、請求項３２に記載の方法。
  35. 抗ＵＰＫ１Ｂ抗体（Ａｂ）に薬物（Ｄ）をコンジュゲートする工程を含む、請求項１４に記載のＡＤＣを生成する方法。
  36. 抗体が部位特異的抗体を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. （ａ）請求項１９に記載の医薬組成物を含有する１つ以上の容器、及び
    （ｂ）組成物が、がんを有する対象を治療するためのものであることを示す、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書
    を含む、キット。
  38. （ａ）請求項１９に記載の医薬組成物を含有する１つ以上の容器、及び
    （ｂ）がんを有する対象に対する投与レジメンを示す、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書
    を含む、キット。
  39. がんが膵臓がんである、請求項３７又は請求項３８に記載のキット。
  40. Figure 2019511199
    Figure 2019511199
    Figure 2019511199
    からなる群から選択される構造であって、式中、Ａｂは、抗ＵＰＫ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片を含み、ｎは、約１〜約２０の整数である構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣ。
  41. 抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が部位特異的抗体を含む、請求項４０に記載のＡＤＣ。
  42. 抗ＵＰＫ１Ｂ抗体が、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１（配列番号１１０及び１１２）を含む、請求項４１に記載のＡＤＣ。
  43. 各システインがペイロードにコンジュゲートされている２つの不対システインを含む、請求項４２に記載のＡＤＣ。
  44. 以下の構造：
    Figure 2019511199
     であって、式中、Ａｂは、ｈＳＣ１１５．９ｓｓ１（配列番号１１０及び１１２）を含み、ｎは、２である構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣ。
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