CN117729928A - 记忆自然杀伤细胞的扩增 - Google Patents

记忆自然杀伤细胞的扩增 Download PDF

Info

Publication number
CN117729928A
CN117729928A CN202280050056.0A CN202280050056A CN117729928A CN 117729928 A CN117729928 A CN 117729928A CN 202280050056 A CN202280050056 A CN 202280050056A CN 117729928 A CN117729928 A CN 117729928A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
memory
primed
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280050056.0A
Other languages
English (en)
Inventor
R·P·沙利文
K·M·克罗巴克
M·库珀
M·E·马蒂尔
J·L·戈维罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wujing Co ltd
Original Assignee
Wujing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wujing Co ltd filed Critical Wujing Co ltd
Publication of CN117729928A publication Critical patent/CN117729928A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本披露总体上尤其涉及包括记忆样和细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞在内的自然杀伤(NK)细胞，其制备和使用方法，例如用于治疗癌症、增加NK细胞的抗肿瘤特性。

Description

记忆自然杀伤细胞的扩增
本申请要求于2021年7月15日提交的美国临时专利申请号63/222,306的优先权权益，该美国临时专利申请的披露内容通过引用并入，就像完整地写在本文中一样。
本披露总体上尤其涉及包括记忆/记忆样和细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞在内的自然杀伤(NK)细胞，其制备和使用方法，例如用于治疗癌症以及增加NK细胞的抗肿瘤特性。
自然杀伤(NK)细胞构成一组先天免疫细胞，其常常表征为经由颗粒酶和穿孔素的靶标定向释放而表现出抗体依赖性细胞毒性的细胞毒性淋巴细胞。大多数NK细胞除了具有各种活化性和抑制性受体外还具有特异性的细胞表面标记谱(例如，CD3、CD56+、CD16+、CD57+、CD8+)。尽管最近NK细胞已经成为某些癌症治疗的重要组成部分，但是由于全血中NK细胞的比例相对较低，因此产生大量NK细胞一直非常困难。
本领域已知产生记忆NK细胞的各种方法，所有或几乎所有这些方法都有各种缺点，如产率低、使用饲养细胞和昂贵的试剂。因此，需要提供大量产生记忆NK细胞的改进的系统和方法。
本文披露了能够以概念上简单且高效的方式产生和扩增记忆/记忆样NK细胞的组合物和方法。记忆NK细胞可以在这样的过程中产生，其中NK细胞被同时引发以形成记忆NK细胞并扩增至所需数量。可替代地，将NK细胞扩增至所需数量，然后引发以形成记忆NK细胞。
序列简要说明
表4和5中的SEQ ID NO:1-48是嵌合抗原受体中各种组分的序列。
SEQ ID NO:49-50是构成EFP 7t15-21s的示例性扩增融合蛋白(EFP)链的序列。
SEQ ID NO:51-70是示例性交联剂抗组织因子抗体ATF1的序列。
SEQ ID NO:71-72是构成PFP 18t15-12s的示例性引发融合蛋白(PFP)链的序列。
附图说明
图1显示了对于由给定的扩增剂和引发剂组合(7t15-21s+ATF1、18t15-12s)产生的记忆NK细胞，在给定的效应细胞与靶细胞比率下，记忆NK细胞在第6/7天的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图2显示了对于由给定的扩增剂和引发剂组合(7t15-21s+ATF1、18t15-12s)产生的记忆NK细胞，在给定的效应细胞与靶细胞比率下，记忆NK细胞在第13天的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图3显示了对于由给定的扩增剂和引发剂组合(7t15-21s+ATF1、18t15-12s)产生的记忆NK细胞，在给定的效应细胞与靶细胞比率下，记忆NK细胞在第17天的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图4显示了由给定的扩增剂和引发剂组合(7t15-21s+ATF1、18t15-12s)产生的记忆NK细胞的癌细胞(K562)杀伤的细胞比率的EC50。
图5显示了在给定的细胞密度下培养的给定天数内刺激的NK细胞数量的累积倍数变化。
图6显示了在给定的时长内用250nM引发剂引发的扩增细胞在给定的效靶比下的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图7显示了在给定的时长内用250nM引发剂18t15-12s引发的扩增细胞在第2、4、6、8、10、12、14和16天效靶比为20:1时的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图8显示了在给定的时长内用250nM引发剂18t15-12s引发的扩增细胞在第2、4、6、8、10、12、14和16天效靶比为4:1时的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图9显示了在给定的时长内用250nM引发剂18t15-12s引发的扩增细胞在第2、4、6、8、10、12、14和16天效靶比为0.8:1时的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图10显示了在给定的持续时间内用250nM引发剂18t15-12s引发的扩增细胞在第2、4、6、8、10、12、14和16天效靶比为0.16:1时的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图11显示了在单独培养或在K562靶细胞存在下培养24小时后，细胞培养物(仅K562，扩增的NK细胞，以及扩增并用250nM引发剂18t15-12s引发给定持续时间的NK细胞)中的IFNg产生。
图12显示了通过仅扩增、引发后扩增和扩增后引发产生的NK细胞的扩增倍数。
图13显示了在给定的效靶比下，分离的、引发3小时、引发过夜、引发过夜然后扩增、扩增然后引发3小时、扩增然后引发过夜或仅扩增的NK细胞的体外癌细胞(K562)杀伤百分比。
图14显示了分离的、引发3小时、引发过夜、引发过夜然后扩增、扩增然后引发3小时、扩增然后引发过夜或仅扩增的NK细胞的细胞K562杀伤EC50。
图15显示了来自如下NK细胞的细胞培养物(单独的NK细胞，或与K562细胞一起)中的IFNg产生：分离的、引发3小时、引发过夜、引发过夜然后扩增、扩增然后引发3小时、扩增然后引发过夜或仅扩增的NK细胞。
图16显示了在t＝0注射后第7天NK细胞数量相对于背景的倍数变化，这些NK细胞通过在免疫缺陷NSG小鼠的血液中引发3小时、引发过夜、引发过夜然后扩增、仅扩增、或扩增然后引发3小时而产生。
图17显示了在第14天扩增的和扩增然后引发的NK细胞的K562-Luc杀伤。
图18显示了扩增的和扩增然后引发的NK细胞的K562-Luc杀伤的EC50。
具体实施方式
本文提供了能够以概念上简单且高效的方式产生和扩增记忆/记忆样NK细胞的组合物和方法。记忆NK细胞可以在这样的过程中产生，其中NK细胞被同时引发以形成记忆NK细胞并扩增至所需数量。可替代地，将NK细胞扩增至所需数量，然后引发以形成记忆NK细胞。
因此，本文提供了记忆自然杀伤(NK)细胞，其通过以下依序地产生：
a)扩增纯化的NK细胞群体；并且
b)引发这些NK细胞。
本文还提供了纯化的记忆自然杀伤(NK)细胞，其通过同时引发和扩增纯化的NK细胞群体产生。
本文还提供了记忆自然杀伤(NK)细胞，其通过以下依序地产生：
a)纯化NK细胞群体；
b)扩增这些NK细胞；并且
c)引发这些NK细胞。
本文还提供了记忆自然杀伤(NK)细胞，其通过以下产生：
a)纯化NK细胞群体；并且
b)同时引发和扩增这些NK细胞。
本文还披露了一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)扩增纯化的NK细胞群体；以及然后
b)引发这些NK细胞。
本文还披露了一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括同时引发和扩增纯化的NK细胞群体。
本文还披露了一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化NK细胞群体；
b)扩增这些NK细胞；以及然后
c)引发这些NK细胞。
本文还披露了一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化NK细胞群体；以及
b)同时引发和扩增这些NK细胞。
还提供了以下实施例。
在一些实施例中，NK细胞群体从供体血液、或新鲜的或先前冷冻保存的白细胞分离液开始纯化。在一些实施例中，纯化通过阳性选择进行(例如在美天旎公司(Miltenyi)CliniMACS Prodigy上进行)。在一些实施例中，纯化通过阴性选择进行(例如，通过StemCell公司EasySep NK细胞富集试剂盒进行)。在一些实施例中，纯化使用阳性选择和阴性选择的组合进行。在一些实施例中，NK细胞由淋巴祖细胞分化而来。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂来扩增，该扩增剂包含细胞因子组合或其功能片段、和/或包含其功能片段的融合蛋白、或任何前述的组合，以及任选地交联剂。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含以下的扩增剂来扩增：
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种，或其功能片段；或者
·包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种的功能片段的融合蛋白；
以及任选地交联剂；或者
·用NK细胞交联抗体和扩增细胞因子功能化的微球；
或任何前述的组合。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂来扩增，该扩增剂包含IL-7、IL-21和IL-15的组合，或其功能片段和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂来扩增，该扩增剂包含含有IL-7、IL-21和IL-15的功能片段的融合蛋白。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含7t15-21s的扩增剂来扩增。
在一些实施例中，扩增剂包含交联剂。在一些实施例中，交联剂是交联抗体。在一些实施例中，交联抗体是ATF1。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含7t15-21s和ATF1的扩增剂来扩增。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂来扩增，该扩增剂包含用NK细胞交联抗体和扩增细胞因子功能化的微球。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂1天至40天来扩增。在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂7天至21天来扩增。在一些实施例中，NK细胞通过暴露于扩增剂约14天来扩增。
在一些实施例中，扩增剂包含7t15-21s和ATF1。在一些实施例中，扩增剂包含浓度0.1-300nm的7t15-21s和浓度0.01-200nm的ATF1。在一些实施例中，扩增剂包含浓度0.2-200nm的7t15-21s和浓度0.01-100nm的ATF1。在一些实施例中，扩增剂包含浓度约50nm的7t15-21s和浓度约25nm的ATF1。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于7t15-21s和ATF1约14天来扩增。在一些实施例中，NK细胞通过暴露于浓度约50nm的7t15-21s和浓度约25nm的ATF1约14天来扩增。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于引发剂来引发，该引发剂例如选自细胞因子组合或其功能片段、和/或包含其功能片段的融合蛋白、或任何前述的组合。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含以下的引发剂来引发：
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或其功能片段，和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含IL-12、IL-15和IL-18的组合的引发剂来引发。
在一些实施例中，NK细胞通过暴露于引发剂来引发，该引发剂包含含有IL-12、IL-15和IL-18的功能片段的融合蛋白。在一些实施例中，NK细胞通过暴露于包含融合蛋白18t15-12s的引发剂来引发。
在一些实施例中，NK细胞用浓度200-300nM的18t15-12s引发。在一些实施例中，NK细胞用浓度250nm的18t15-12s引发。
在一些实施例中，将NK细胞引发1分钟至24小时。在一些实施例中，将NK细胞引发0.5至16小时。在一些实施例中，将NK细胞引发1至3小时。
在一些实施例中，NK细胞冷冻保存。
在一些实施例中，NK细胞先扩增、再引发。
在一些实施例中，NK细胞扩增至大于起始数量的10倍。在一些实施例中，NK细胞扩增至大于起始数量的100倍。在一些实施例中，NK细胞扩增至大于起始数量的1000倍。
在一些实施例中，NK细胞同时扩增并引发。
在一些实施例中，细胞具有记忆样(ML)NK表型。
在一些实施例中，记忆样表型由细胞表面CD69、CD25、CD16和/或NKG2A的表达水平指示。
在一些实施例中，与未引发的NK细胞相比，记忆NK细胞具有以下一项或多项：
a)改善的针对癌细胞的细胞毒性；
b)改善的持久性；
c)改善的抗肿瘤活性；和/或
d)细胞因子的产生增加。
在一些实施例中，癌细胞是K562细胞。
在一些实施例中，产生的细胞因子选自IFNg、TNFa、GM-CSF及其组合。
在一些实施例中，持久性在免疫缺陷小鼠中测量1-14天。
在一些实施例中，小鼠是NSG小鼠。
在一些实施例中，抗肿瘤活性测量为免疫缺陷小鼠中K562细胞的肿瘤生长减少。
在一些实施例中，NK细胞是细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞。
在一些实施例中，记忆NK细胞另外包含至少一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含：
a)至少一个靶向靶细胞上抗原的细胞外配体结合结构域；
b)铰链结构域；
c)跨膜结构域；
d)任选地，一个或多个共刺激结构域；以及
e)细胞质信号传导结构域。
本文还提供了一种治疗增殖性恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据上述实施例的记忆NK细胞或通过上述实施例的方法制备的细胞。
在一些实施例中，将细胞新鲜施用给患者。
在一些实施例中，增殖性恶性肿瘤是癌症。
在一些实施例中，癌症是血液学癌症。
在一些实施例中，血液学癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。
在一些实施例中，血液学癌症是B细胞淋巴瘤。
在一些实施例中，B细胞淋巴瘤选自弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
在一些实施例中，血液学癌症是T细胞淋巴瘤。
在一些实施例中，T细胞淋巴瘤选自T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。
在一些实施例中，血液学癌症是白血病。
在一些实施例中，白血病选自急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。
在一些实施例中，血液学癌症是浆细胞恶性肿瘤。
在一些实施例中，浆细胞恶性肿瘤选自淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施例中，癌症是实体瘤。
在一些实施例中，实体瘤选自黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或癌。
在一些实施例中，实体瘤是脑、头颈、乳腺、肺(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如卵巢)、上消化道、胰腺、肝脏、肾系统(例如肾脏)、膀胱、前列腺或结直肠的肿瘤。
列举的实施例
本文还提供了以下实施例：
实施例1.一种纯化的记忆自然杀伤(NK)细胞群体，其通过以下依序地产生：
a)扩增纯化的NK细胞；以及
b)引发这些NK细胞。
实施例2.一种纯化的记忆自然杀伤(NK)细胞群体，其通过同时引发和扩增纯化的NK细胞产生。
实施例3.根据实施例1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞从新鲜或冷冻的白细胞分离液或供体血液中富集。
实施例4.根据实施例1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞由淋巴祖细胞分化而来。
实施例5.根据实施例1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过阴性或阳性选择或其组合来纯化。
实施例6.根据实施例1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于以下来引发：
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或其功能片段，和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
实施例7.根据实施例6所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于18t15-12s来引发。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞引发1分钟至24小时。
实施例9.根据实施例6所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于IL-12、IL-15和IL-18来引发。
实施例10.根据实施例9所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞引发1分钟至24小时。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于7t15-21s和ATF1来扩增。
实施例12.根据实施例11所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞扩增1-40天。
实施例13.根据前述实施例中任一项所述的记忆NK细胞，其中与未经处理的NK细胞相比，记忆NK表型由CD69、CD25和NKG2A表达增加，以及CD16表达维持不变来指示。
实施例14.根据前述实施例中任一项所述的记忆NK细胞，其中与未经处理的NK细胞相比，这些记忆NK细胞具有以下一项或多项：
·改善的针对癌细胞的细胞毒性；
·改善的持久性；
·改善的抗肿瘤活性；和/或
·细胞因子的产生增加。
实施例15.根据实施例14所述的记忆NK细胞，其中这些癌细胞是K562细胞。
实施例16.根据实施例14所述的记忆NK细胞，其中产生的细胞因子选自IFNg、TNFa、GM-CSF及其组合。
实施例17.根据实施例14所述的记忆NK细胞，其中持久性在免疫缺陷小鼠中测量1-14天。
实施例18.根据实施例17所述的记忆NK细胞，其中该小鼠是NSG小鼠。
实施例19.根据实施例14所述的记忆NK细胞，其中抗肿瘤活性测量为免疫缺陷小鼠中癌细胞的肿瘤生长减少。
实施例20.根据任一前述实施例所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞是细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞。
实施例21.根据任一前述实施例所述的记忆NK细胞，其另外包含至少一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含：
a.至少一个靶向靶细胞上抗原的细胞外配体结合结构域；
b.铰链结构域；
c.跨膜结构域；
d.任选地，一个或多个共刺激结构域；以及
e.细胞质信号传导结构域。
实施例22.一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化富集的NK细胞群体；
b)扩增这些NK细胞；以及
c)引发这些NK细胞。
实施例23.一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化富集的NK细胞群体；以及
b)同时引发和扩增这些NK细胞。
实施例24.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞从新鲜或冷冻的白细胞分离液或供体血液中富集。
实施例25.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞由淋巴祖细胞分化而来。
实施例26.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过阴性或阳性选择或其组合来纯化。
实施例27.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于以下来引发：
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或其功能片段，和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
实施例28.根据实施例27所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于18t15-12s来引发。
实施例29.根据实施例28所述的方法，其中将这些NK细胞引发1分钟-24小时。
实施例30.根据实施例27所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于IL-12、IL-15和IL-18来引发。
实施例31.根据实施例28所述的方法，其中将这些NK细胞引发2-40天。
实施例32.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于7t15-21s和ATF1来扩增。
实施例33.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中将这些NK细胞扩增1-40天。
实施例34.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中与未经处理的NK细胞相比，该记忆NK表型由CD69、CD25和NKG2A表达增加，以及CD16表达维持不变来指示。
实施例35.根据实施例22至34中任一项所述的方法，其中与未经处理的NK细胞相比，这些记忆NK细胞具有以下一项或多项：
·改善的针对癌细胞的细胞毒性；
·改善的持久性；
·改善的抗肿瘤活性；和/或
·细胞因子的产生增加。
实施例36.根据实施例35所述的方法，其中这些癌细胞是K562细胞。
实施例37.根据实施例35所述的方法，其中产生的细胞因子选自IFNg、TNFa、GM-CSF及其组合。
实施例38.根据实施例35所述的方法，其中持久性在免疫缺陷小鼠中测量1-14天。
实施例39.根据实施例38所述的方法，其中该小鼠是NSG小鼠。
实施例40.根据实施例35所述的方法，其中该改善的抗肿瘤活性为免疫缺陷小鼠中癌细胞的肿瘤生长减少。
实施例41.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中这些细胞是细胞因子诱导ML(CIML)NK细胞。
实施例42.一种治疗增殖性恶性肿瘤的方法，该方法包括向有需要的患者施用根据实施例1-21中任一项所述的记忆NK细胞或通过根据实施例22-41中任一项所述的方法制备的记忆NK细胞。
实施例43.根据实施例42所述的方法，其中将细胞新鲜施用给患者。
实施例44.根据实施例42所述的方法，其中该增殖性恶性肿瘤为癌症。
实施例45.根据实施例44所述的方法，其中该癌症是血液学癌症。
实施例46.根据实施例44所述的方法，其中该血液学癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。
实施例47.根据实施例46所述的方法，其中该血液学癌症是B细胞淋巴瘤。
实施例48.根据实施例47所述的方法，其中该B细胞淋巴瘤选自弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
实施例49.根据实施例46所述的方法，其中该血液学癌症是T细胞淋巴瘤。
实施例50.根据实施例49所述的方法，其中该T细胞淋巴瘤选自T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)和塞扎里综合征。
实施例51.根据实施例46所述的方法，其中该血液学癌症是白血病。
实施例52.根据实施例51所述的方法，其中该白血病选自急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。
实施例53.根据实施例46所述的方法，其中该血液学癌症是浆细胞恶性肿瘤。
实施例54.根据实施例53所述的方法，其中该浆细胞恶性肿瘤选自淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
实施例55.根据实施例44所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
实施例56.根据实施例55所述的方法，其中该实体瘤选自黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或癌。
实施例57.根据实施例55所述的方法，其中该实体瘤是脑、头颈、乳腺、肺(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如卵巢)、上消化道、胰腺、肝脏、肾系统(例如肾脏)、膀胱、前列腺或结直肠的肿瘤。
免疫效应细胞的扩增和引发方法
NK细胞的体外扩增可以在富集过程中进行，该过程使用扩增剂，该扩增剂包含细胞因子或者优选地含有细胞因子的功能片段的扩增融合蛋白及其多链复合物。例如，扩增剂可包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种，或其组合，例如IL-7、IL-21和IL-15的混合物，其量足以产生所需数量或倍数扩增的NK细胞。此类细胞因子可以商业获得或通过本领域已知的方法制备。或者，例如，扩增剂可包含一种或多种扩增融合蛋白，例如，可选自WO 2020047299、WO202047473或WO 2020257639中披露的多链融合蛋白复合物，例如7t15-21s，其量足以扩增NK细胞。7t15-21s的序列披露于表1。
表1：示例性扩增融合蛋白链的序列
另外，通过使用交联剂(例如靶向上文披露的融合蛋白的连接结构域的抗体，例如抗组织因子抗体)可促进扩增。抗组织因子抗体的实例是本领域已知的。WO 202047473和WO2020257639披露了所使用的a-TF Ab。还参见US 8,007,795和WO 2003037911，特别是掺入H36杂交瘤的CDR和人源化框架区LC-08(图12)和HC-09(图13)的IgG1人源化抗体。下文表X披露了a-TF Ab的序列，a-TF Ab据信在WO’473和WO’639中使用、在US’795和WO’911中披露、获自HCW Biologics公司、并在下文的实验中使用(除非另有陈述)，在本文称为ATF1。ATF1HCDR2是以下两个序列之一。因此，如本文披露的扩增剂可以包含一种或多种细胞因子的组合或如上披露的EFP与交联剂例如ATF1(其一个或多个序列披露于表2)。
表2：示例性抗TF抗体(“ATF1”)的序列
/>
可替代的交联方法是本领域已知的，并且包括功能化微粒(珠)、饲养细胞和质膜颗粒。无饲养细胞系统通常是优选的。例如，R&DSystems公司Cloudz人NK细胞扩增试剂盒(采用用抗CD2和抗NKp46抗体功能化的可溶性海藻酸钠微球)可以与如本文披露的扩增细胞因子(或其片段，或包含其片段的融合蛋白)及其组合一起使用，并在扩增后与释放缓冲液一起用于快速溶解微粒，促进细胞收获。
为获得记忆样特征而进行的引发是用引发剂进行的，该引发剂包含刺激性细胞因子的组合，例如IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种。可替代地，引发剂可包含含有细胞因子的功能片段的引发融合蛋白及其多链复合物。例如，融合蛋白可以选自WO 2020047299、WO 202047473或WO 2020257639中披露的多链融合蛋白复合物，例如18t15-12s(HCW-9201)，其序列披露于表3。
表3：示例性引发融合蛋白链的序列
/>
嵌合抗原受体(CAR)和携带CAR的免疫效应细胞
本文还提供了如本文披露的包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)，以及表达它们的免疫效应细胞。CAR是重组融合蛋白，其典型地包含：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)铰链结构域，3)跨膜结构域，和4)细胞质信号传导结构域，5)以及任选地共刺激结构域。
用于CAR设计、递送和表达以及制造临床级别的CAR表达细胞群体的方法是本领域已知的。CAR设计通常针对每种细胞类型进行定制。
嵌合抗原受体的细胞外配体结合结构域识别并特异性结合抗原，典型地是恶性细胞的表面表达抗原。例如，当细胞外配体结合结构域以约0.1pM至约10μM、或约0.1pM至约1μM、或约0.1pM至约100nM的亲和常数或相互作用亲和力(KD)结合抗原时，该细胞外配体结合结构域特异性结合该抗原。用于确定相互作用亲和力的方法是本领域已知的。当细胞外配体结合结构域相对于抗原的第二多态性变体选择性结合相同抗原的第一多态性变体时，也可以说该细胞外配体结合结构域特异性结合该抗原的第一多态性变体。
适合用于CAR的细胞外配体结合结构域可以是任何抗原结合多肽，本领域已知非常多的抗原结合多肽。在一些情况下，细胞外配体结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域))及其人源化形式、lgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化形式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)及“骆驼化”抗体可变结构域也适合使用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域，如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适合使用。在一些实施例中，从与靶抗原的天然结合配偶体或其功能片段构建细胞外配体结合结构域。例如，CAR通常可以用APRIL蛋白的一部分构建，其靶向B细胞成熟抗原(BCMA)以及跨膜激活物和CAML相互作用物(TACI)的配体，有效地共同靶向BCMA和TACI两者以治疗多发性骨髓瘤。
CAR经由其细胞外配体结合结构域结合的靶向抗原可以是在恶性髓性(AML)细胞、T细胞或其他细胞上表达的抗原。恶性髓性(AML)细胞上表达的抗原包括CD33、FLT3、CD123和CLL-1。T细胞上表达的抗原包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRα(TRAC)和TCRβ。恶性浆细胞上表达的抗原包括BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19。恶性B细胞上表达的抗原包括CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38和CD45。
典型地，细胞外配体结合结构域通过跨膜(TM)结构域与嵌合抗原受体的细胞内结构域连接。肽铰链将细胞外配体结合结构域连接至跨膜结构域。跨膜结构域穿过细胞膜，将CAR锚定到T细胞表面，并将细胞外配体结合结构域连接至细胞质信号传导结构域，从而影响CAR在T细胞表面的表达。
跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自(即包括以下中的至少一个或多个跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8(例如，CD8α、CD8β)，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Ly108)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR和PAG/Cbp。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，并且主要包含疏水性氨基酸残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。在一些情况下，将在合成的跨膜结构域的每一末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施例中，跨膜结构域源自T细胞表面糖蛋白CD8α链同种型1前体(NP_001139345.1)或CD28。短的寡肽或多肽接头(如长度为2至10个氨基酸)可以在CAR的跨膜结构域与内质网结构域之间形成连接。在一些实施例中，CAR具有多于一个跨膜结构域，其可以是相同跨膜结构域的重复，或者可以是不同的跨膜结构域。
NK细胞表达许多发出激活信号的跨膜(TM)衔接子，这些衔接子经由与激活受体的缔合而触发。这经由从激活受体并从而利用内源性衔接子对TM结构域进行工程化而提供NK细胞特异性信号增强。TM衔接子可以是任何能够发出激活信号的内源性TM衔接子。在一些实施例中，TM衔接子可以选自FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)、或DAP10(YxxM/YINM)、NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C、CD8α、和IL15Rb。
CAR可以进一步包含细胞外配体结合结构域与跨膜结构域之间的铰链区。术语“铰链区”(相当于“铰链”或“间隔子”)通常意指任何发挥作用以将跨膜结构域连接至细胞外配体结合结构域的寡肽或多肽。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更多的灵活性和可及性，并且可以为高效CAR表达和活性赋予稳定性。铰链区可以包含多达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，并且最优选地25至50个氨基酸。铰链区可以源自天然存在的分子的全部或部分，这些分子如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、CD3ζ、T细胞受体α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154；或源自抗体恒定区的全部或部分。在一些实施例中，例如，铰链序列源自CD8a分子或CD28分子。可替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者铰链区可以是完全合成的铰链序列。在一个实施例中，铰链结构域包含人CD8α(SEQ ID NO:2)、FcγRIIIα受体或IgGl的一部分，并且与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。
在抗原识别后，细胞质信号传导结构域向免疫效应细胞传递信号，从而激活免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。例如，NK细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括分泌细胞因子)。虽然通常可以使用整个细胞质信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞质信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用来代替完整的链，只要其转导效应功能。
以刺激方式起作用的细胞质信号传导序列可以含有被称为免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)的信号传导基序。含ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括源自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的那些。
第一代CAR典型地具有来自CD3链的细胞质信号传导结构域，其是来自内源性TCR的信号的主要传递者。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、4-1BB、ICOS)的细胞质信号传导结构域添加至CAR的细胞质信号传导结构域，以向细胞提供另外的信号。
“共刺激结构域”源自共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域，其增强细胞因子在体内的产生、增殖、细胞毒性和/或持久性。临床前研究已表明第二代CAR设计改善了抗肿瘤活性。最近，第三代和更晚一代的CAR结合了多个共刺激结构域以进一步增强效力。移植有这些CAR的细胞已经表现出不依赖于共刺激受体/配体相互作用的改善的扩增、激活、持久性和肿瘤根除效率。
例如，CAR的细胞质信号传导结构域可以被设计为包含信号传导结构域(例如CD3ζ)自身，或者与在CAR的背景下有用的一个或多个任何其他希望的细胞质结构域的组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含信号传导结构域(例如CD3ζ)链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR中包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3和NKG2D特异性结合的配体。
在一些实施例中，细胞质信号传导结构域是CD3 zeta(CD3ζ)信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28、4-1BB或其组合的细胞质结构域。在一些情况下，共刺激信号传导区含有一种或多种细胞内信号传导和/或共刺激分子的1、2、3或4个细胞质结构域。
一个或多个共刺激信号传导结构域可以在CD28和/或4-1BB的细胞质结构域中含有一个或多个增强信号传导的突变。在一些实施例中，所披露的CAR包含含有CD28的细胞质结构域的突变形式的共刺激信号传导区，该突变形式在Y206和/或Y218处具有改变的磷酸化。在一些实施例中，所披露的CAR包含在Y206处的减弱突变，其将降低该CAR的活性。在一些实施例中，所披露的CAR包含在Y218处的减弱突变，其将降低该CAR的表达。任何氨基酸残基(如丙氨酸或苯丙氨酸)都可以取代酪氨酸以实现减弱。在一些实施例中，用拟磷酸残基取代Y206和/或Y218处的酪氨酸。在一些实施例中，所披露的CAR包含拟磷酸残基对Y206的取代，其将增加该CAR的活性。在一些实施例中，所披露的CAR包含拟磷酸残基对Y218的取代，其将增加该CAR的表达。例如，拟磷酸残基可以是磷酸酪氨酸。在一些实施例中，CAR可以含有拟磷酸氨基酸和在同一CAR的不同残基中用不可磷酸化氨基酸进行的一个或多个取代的组合。例如，CAR可以含有Y209和/或Y191中的丙氨酸或苯丙氨酸取代加上Y206和/或Y218中的拟磷酸取代。
在一些实施例中，所披露的CAR包含一个或多个具有增强与特异性TRAF蛋白结合的突变的4-1BB结构域，这些TRAF蛋白如TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6或其任何组合。在一些情况下，41BB突变例如通过NF-kB增强T细胞的TRAF1和/或TRAF2依赖性增殖和存活。在一些情况下，4-1BB突变例如通过IRF7/INFβ增强TRAF3依赖性抗肿瘤功效。因此，所披露的CAR可以包含4-1BB的一个或多个细胞质结构域，该一个或多个细胞质结构域在这些带下划线的序列中具有增强TRAF结合和/或增强NFκB信号传导的至少一个突变。
同样如本文所披露的，TRAF蛋白在一些情况下可以增强CAR T细胞的功能，而不依赖于NFκB和4-1BB。例如，TRAF蛋白在一些情况下可以增强T细胞中的CD28共刺激。因此，本文还披露了共表达CAR和一种或多种TRAF蛋白(如TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、或其任何组合)的免疫效应细胞。在一些情况下，CAR是任何靶向肿瘤抗原的CAR。例如，第一代CAR典型地具有来自CD3链的细胞内结构域，而第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、4-1BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域添加至CAR的细胞质信号传导结构域以向T细胞提供另外的信号。在一些情况下，CAR是所披露的具有增强的4-1BB激活的CAR。
CAR组分的变化可以是有利的，这取决于表达CAR的细胞的类型。
例如，在NK细胞中，在一些实施例中，跨膜结构域可以是与NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C或CD8α相关的序列。在某些实施例中，NK细胞是ML-NK或CIML-NK细胞，并且TM结构域是CD8α。不能在NK细胞中运作良好的某些TM结构域通常可以在亚群中运作；例如，CD8α在ML-NK中运作，但通常不在NK细胞中运作。
类似地，在NK细胞中，在一些实施例中，一个或多个细胞内信号传导结构域可以是能够在NK细胞中发挥作用的任何一种或多种共激活受体，例如像CD28、CD137/41BB(TRAF、NFkB)、CD134/OX40、CD278/ICOS、DNAM-1(Y基序)、NKp80(Y基序)、2B4(SLAMF)::ITSM、CRACC(CS1/SLAMF7)::ITSM、CD2(Y基序、MAPK/Erk)、CD27(TRAF、NFkB)、或整合素(例如多种整合素)。
类似地，在NK细胞中，在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以是能够在NK细胞中发挥作用的细胞因子受体。例如，细胞因子受体可以是与持久性、存活或代谢相关的细胞因子受体，如IL-2/15Rbyc::Jak1/3、STAT3/5、PI3K/mTOR、MAPK/ERK。作为另一实例，细胞因子受体可以是与激活相关的细胞因子受体，如IL-18R::NFkB。作为另一实例，细胞因子受体可以是与IFN-γ产生相关的细胞因子受体，如IL-12R::STAT4。作为另一实例，细胞因子受体可以是与细胞毒性或持久性相关的细胞因子受体，如IL-21R::Jak3/Tyk2、或STAT3。作为另一实例，细胞内信号传导结构域可以是TM衔接子，如FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)或DAP10(YxxM/YINM)。作为另一实例，CAR细胞内信号传导结构域(也称为内结构域)可以源自CD28家族(如CD28和ICOS)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因家族(如4-1BB、OX40或CD27)的共刺激分子。TNFR家族成员通过募集TRAF蛋白而发出信号，并与细胞激活、分化和存活相关。不能在所有NK细胞中运作良好的某些信号传导结构域通常可以在亚群中运作；例如，CD28或4-1BB在ML-NK中运作。
CAR的任何结构域也可以包含异二聚化结构域，目的是拆分CAR的关键信号传导模块和抗原识别模块。
可以将CAR设计为包含如本文所述的上述结构域的任何部分(portion或part)的任何组合，以产生功能性CAR。
制备CAR和携带CAR的细胞的方法
编码嵌合受体的嵌合抗原受体(CAR)构建体能以常规方式制备。由于在大多数情况下使用天然序列，因此视情况分离和操作天然基因(例如，当使用II型受体时，免疫信号传导受体组分可能必须是反向的)，以允许各种组分的适当连接。因此，可以通过采用聚合酶链反应(PCR)，使用导致不希望的基因部分缺失的适当引物来分离编码嵌合受体的N-末端和C-末端蛋白质的核酸序列。可替代地，克隆的基因的限制性酶切物可用于产生嵌合构建体。在任一情况下，可以选择序列以提供钝端的或具有互补重叠的限制性位点。
用于制备嵌合构建体的各种操作可以在体外进行，并且在特定的实施例中，使用标准转化或转染方法将嵌合构建体引入载体中用于在适当的宿主中克隆和表达。因此，在每次操作之后，克隆从DNA序列的连接所得的构建体，分离载体，并且筛查序列以确保序列编码所希望的嵌合受体。可以通过限制性分析、测序等筛查序列。
可以将作为裸DNA或在合适的载体中的嵌合构建体引入免疫效应细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染免疫效应细胞的方法是本领域已知的。裸DNA通常是指编码嵌合受体的DNA，其以适当的取向包含在质粒表达载体中用于表达。
可替代地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫细胞(例如，T细胞)中。合适的载体在受试者的免疫效应细胞中是非复制性的。已知大量基于病毒的载体，其中保持在细胞中的病毒拷贝数低到足以维持细胞的生存力。说明性载体包括pFB-neo载体(STRATAGENETM)以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。一旦确立了转染或转导的免疫效应细胞能够以希望的调节并以希望的水平表达作为表面膜蛋白质的嵌合受体，就可以确定嵌合受体在宿主细胞中是否发挥作用以提供所希望的信号诱导(例如，在用适当的配体刺激时产生Rantes、Mip1-α、GM-CSF)。
可以使用逆转录病毒将工程化CAR引入携带CAR的免疫效应细胞中，这些逆转录病毒有效且稳定地将编码嵌合抗原受体的核酸序列整合到靶细胞基因组中。本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接RNA转染和CRISPR/Cas系统(例如，使用合适的Cas蛋白的I型、II型或Ill型系统，该Cas蛋白如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas1 Od、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等)。也可以使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。参见例如，Shearer RF和Saunders DN,“Experimental design for stable geneticmanipulation in mammalian cell lines:lentivirus and alternatives[哺乳动物细胞系中稳定基因操作的实验设计：慢病毒和替代物],”Genes Cells[基因到细胞]2015年1月；20(1):1-10。还可以使用包含与碱基编辑蛋白(例如脱氨酶)融合的Cas-CRISPR蛋白的碱基编辑CRISPR系统(例如，来自Beam Therapeutics公司的那些)。
选择的可用于构建CAR的组分的氨基酸序列在下文披露于表4和表5。
表4.选择的CAR组分的氨基酸序列。
/>
/>
/>
/>
下表5披露了靶向所述抗原的VH和VL结构域的序列。这些序列可以与来自表4或如本文所披露的元件一起整合到CAR中。
表5.选择的scFv的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列。
/>
/>
/>
细胞特异性变化
上文披露的CAR组分和构建方法适合用于T细胞和其他免疫效应细胞，但并不是穷尽的。某些变体可用于细胞的亚群，并且是本领域已知的。
例如，在NK细胞中，TM结构域可以选自或改编自NKG2D、FcγRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C或CD8α。NK细胞还表达许多跨膜衔接子，这些衔接子经由与激活受体缔合而触发，从而提供NK细胞特异性信号增强。例如，TM衔接子可以选自或改编自FceR1γ(ITAMx1)、CD3ζ(ITAMx3)、DAP12(ITAMx1)或DAP10(YxxM/YINM)。在某些实施例中，可以将TM结构域和衔接子配对，例如：NKG2D和DAP10、FcγRIIIa和CD3ζ或FceR1γ、NKp44和DAP12、NKp30和CD3ζ或FceR1γ、NKp46和CD3ζ或FceR1γ、actKIR和DAP12、以及NKG2C和DAP12。
在某些实施例中，在NK细胞中，铰链结构域可以选自或改编自例如NKG2、TMα或CD8。
在某些实施例中，在NK细胞中，细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域可以包含以下中的一种或多种：CD137/41BB(TRAF、NFkB)、DNAM-1(Y基序)、NKp80(Y基序)、2B4(SLAMF)::ITSM、CRACC(CS1/SLAMF7)::ITSM、CD2(Y基序、MAPK/Erk)、CD27(TRAF、NFkB)；一种或多种整合素(例如多种整合素)；与持久性、存活或代谢相关的细胞因子受体，如IL-2/15Rbyc::Jak1/3、STAT3/5、PI3K/mTOR、和MAPK/ERK；与激活相关的细胞因子受体，如IL-18R::NFkB；与IFN-γ产生相关的细胞因子受体，如IL-12R::STAT4；与细胞毒性或持久性相关的细胞因子受体，如IL-21R::Jak3/Tyk2、或STAT3；以及如上所披露的TM衔接子。在一些实施例中，NK细胞CAR包括三个信号传导结构域、一个TM结构域和任选地一个TM衔接子。
共刺激结构域的选择也可取决于NK细胞的表型或亚型；例如，在一些实验中，4-1BB在记忆样(ML)NK细胞(包括CIML)中作为共刺激结构域可以是有效的，但在NK细胞中功效较低。另外，可以利用的在ML NK细胞中更为选择性地表达的信号传导结构域包括DNAM-1、CD137和CD2。
免疫效应细胞
如本文披露的免疫效应细胞包括NK细胞及其亚型，例如记忆NK细胞、记忆样(ML)NK细胞和细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞及其变体，其中任何一种可以源自多种来源，包括外周血或脐带血细胞、干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)和永生化NK细胞，例如NK-92细胞。
NK细胞
传统上认为自然杀伤(NK)细胞是通过靶向和消除异常或应激细胞而介导针对病原体的宿主防御和抗肿瘤免疫反应的先天免疫效应淋巴细胞，该靶向和消除不是通过抗原识别或先前的致敏，而是通过整合来自激活和抑制性受体的信号。自然杀伤(NK)细胞是用于同种异体细胞免疫疗法的T细胞替代物，因为它们施用安全而没有重大毒性，不会引起移植物抗宿主病(GvHD)，其自然地识别和消除恶性细胞，并且可用于细胞工程。
记忆、记忆样和CIML NK细胞
除了其固有的细胞毒性和免疫刺激活性外，NK细胞还构成异质且多功能的细胞亚群，包括持久记忆NK群体，在一些情况下也称为记忆样或细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞，它们产生强烈的回忆反应。记忆NK细胞可以通过促炎细胞因子或激活受体通路的刺激自然或人工产生(“引发”)。通过细胞因子激活产生的记忆NK细胞已在临床上用于白血病免疫疗法的情况中。
在体内分化的记忆NK细胞中已观察到CD56、Ki-67、NKG2A增加以及活化受体NKG2D、NKp30和NKp44增加。另外，体内分化显示CD16和CD11b的中值表达轻度降低。与ACT和BL NK细胞两者相比，在ML NK细胞中观察到TRAIL、CD69、CD62L、NKG2A和NKp30阳性NK细胞的频率增加，而CD27+和CD127+NK细胞的频率降低。最后，与体外分化的ML NK细胞不同，体内分化的ML NK细胞不表达CD25。
细胞因子诱导记忆样自然杀伤细胞(CIML-NK)
例如通过用细胞因子的组合(例如白细胞介素-12(IL-12)、IL-15和IL-18)引发(预激活)可以诱导NK细胞以获得记忆样表型。这些细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞(CIML-NK或CIML)在用细胞因子再刺激或经由激活受体触发时表现出增强的反应。CIML NK细胞可通过用细胞因子(如IL-12、IL-15和IL-18)和/或其相关家族成员、或其功能片段、或包含其功能片段的融合蛋白激活而产生。
与传统NK细胞相比，记忆NK细胞典型地表现出差异性细胞表面蛋白表达模式。此类表达模式是本领域已知的，并且可以包含例如CIML NK细胞中增加的CD56、CD56亚群CD56暗、CD56亚群CD56亮、CD16、CD94、NKG2A、NKG2D、CD62L、CD25、NKp30、NKp44和NKp46(与对照NK细胞相比)(参见例如Romee等人Sci Transl Med.[科学转化医学]2016年9月21日；8(357):357)。记忆NK细胞也可以通过与异源NK细胞群体相比时观察到体外和体内特性(这些特性例如增强的效应功能(例如细胞毒性)、改善的持久性、增加的IFN-γ产生等)来识别。
药物组合物
还披露了药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的披露的分子。药物载剂是本领域技术人员已知的。这些最典型地将是用于向人施用药物的标准载剂，包括溶液如无菌水、盐水和生理pH缓冲溶液。典型地，在配制品中使用适当量的药学上可接受的盐以赋予该配制品等渗性。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选地为约7至约7.5。溶液应不含RNA酶。另外的载剂包括缓释制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，这些基质呈成形制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员来说将显而易见的是，某些载剂可以是更优选的，这取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度。
除了选择的分子之外，药物组合物还可以包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
治疗应用
本文披露的NK细胞可用于治疗增殖性疾病(例如癌症和骨髓增生异常综合征)或预防其进展。癌症可以是血液恶性肿瘤或实体瘤。血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、及其亚型。淋巴瘤可以通过各种方式进行分类，通常基于潜在的恶性细胞类型进行分类，包括霍奇金淋巴瘤(通常是里德-斯滕伯格(Reed-Sternberg)细胞的癌症，但有时也起源于B细胞；所有其他淋巴瘤均是非霍奇金淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及如本文定义的和本领域已知的其他淋巴瘤。骨髓增生异常综合征包含一组影响未成熟的白细胞和/或造血干细胞(HSC)的疾病；MDS可能进展为AML。
B细胞淋巴瘤包括但不限于弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、以及如本文定义的和本领域已知的其他B细胞淋巴瘤。
T细胞淋巴瘤包括T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)、塞扎里综合征、以及如本文定义的和本领域已知的其他T细胞淋巴瘤。
白血病包括急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(有时被分类为淋巴瘤)、以及如本文定义的和本领域已知的其他白血病。
浆细胞恶性肿瘤包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
实体瘤包括黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或癌，例如脑、头颈、乳腺、肺(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如卵巢)、上消化道、胰腺、肝脏、肾系统(例如肾脏)、膀胱、前列腺和结直肠的肿瘤。
本文所述的方法通常在有需要的受试者上进行。需要本文所述的治疗性方法的受试者可以是患有、诊断出患有、怀疑患有癌症，或有发展为癌症的风险，或有进展到癌症后期的风险的受试者。治疗需求的确定将典型地通过病史、身体检查或与具有争议的疾病或病况相符的诊断测试来评估。通过本文所述的方法可治疗的各种病况的诊断在本领域的技术范围内。受试者可以是动物受试者，包括哺乳动物，如马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和人，或者其他动物，如鸡。例如，受试者可以是人受试者。
通常，疗法(例如抗体或其功能性抗原结合片段、携带CAR的免疫效应细胞或抗体-药物缀合物)的安全有效量是例如将在受试者中引起希望的治疗效果同时最大程度减少不希望的副作用的量。
根据本文所述的方法，施用可以是肠胃外、肺、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、肿瘤内、鞘内、颅内、侧脑室内、皮下、鼻内、硬膜外、眼、口腔或直肠施用。例如，在产品是生物疗法或细胞疗法的情况下，施用方式将可能是经由注射或输注。
用于免疫疗法的护理标准和调理方案
癌症(如AML)的标准护理治疗可以涉及抗癌药物疗法(包括化疗和靶向疗法)。
例如，阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷或ara-C)和蒽环类如柔红霉素(道诺霉素)或伊达比星的组合是AML的一线化疗。可用于治疗AML的其他化疗剂包括克拉屈滨(Leustatin、2-CdA)、氟达拉滨(Fludara)、米托蒽醌、依托泊苷(VP-16)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、羟基脲、皮质类固醇如泼尼松或地塞米松、甲氨蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)、阿扎胞苷(Vidaza)和地西他滨(Dacogen)。另外，靶向疗法可用于适当的患者，如米哚妥林(Rydapt)或吉瑞替尼(Xospata)用于具有FLT-3突变的患者；吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)用于CD33阳性AML；BCL-2抑制剂，如维奈托克(Venclexta)；IDH抑制剂，如艾伏尼布(Tibsovo)或恩西地平(Idhifa)；以及hedgehog通路抑制剂，如格拉吉布(Daurismo)。尽管初始诱导化疗后的完全缓解率可高达80％，但大多数AML患者将最终进展为复发性或难治性(RR)疾病，并且60岁以下的人的五年存活率为约35％，并且超过60岁的人的五年存活率为10％。参见Walter RB等人,“Resistanceprediction in AML:analysis of 4601patients from MRC/NCRI,HOVON/SAKK,SWOG andMD Anderson Cancer Center[AML中的抗性预测：来自MRC/NCRI、HOVON/SAKK、SWOG和MD安德森癌症中心的4601名患者的分析],”Leukemia[白血病]29(2):312-20(2015)以及H等人,“Acute Myeloid Leukemia[急性髓性白血病],”NEJM[新英格兰医学杂志]373(12):1136–52(2015)。
过继细胞转移(ACT)疗法也可能与或不与调理方案一起治疗癌症。典型地，当在患有恶性病症的患者中进行ACT(如HSCT)时，施用预备方案或调理方案作为实现免疫消融的程序的一部分，以预防移植物排斥并减轻肿瘤负荷。传统上，这些目标已通过以其他方式使用超致死剂量的全身辐照(TBI)和具有非重叠毒性的化疗剂(所谓的“高强度”前ACT调理)来实现。然而，由于认识到供体细胞针对恶性宿主细胞的免疫反应(即移植物抗肿瘤作用)实质上促成ACT的有效性，因此已经开发出强度降低且非清髓性的调理方案，使ACT适用于更广泛的患者，包括老年和医学上体弱的患者。
调理方案是本领域已知的。参见例如，Gyurkocza和Sandmaier BM,“Conditioningregimens for hematopoietic cell transplantation:one size does not fit all[用于造血细胞移植的调理方案：一种方案无法适合所有人],”Blood[血液]124(3):344–353(2014)。根据国际血液和骨髓移植研究中心(CIBMTR)在2006年骨髓移植串联会议期间召开的强度降低调理方案研讨会，调理方案可分类为高剂量(清髓性)的、强度降低的和非清髓性的。
定义
除非另有定义，否则结合本披露使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。总体而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡聚体或多核苷酸化学及杂交学结合使用的命名法及其技术是本领域中熟知并且常用的那些。
如本文所用，术语“抗体”是指包括经典免疫球蛋白序列元件(足以赋予特异性结合或例如免疫反应)和/或针对特定靶抗原的多肽。如本领域所知，天然产生的完整抗体是大约150kD的四聚体药剂，该四聚体药剂由彼此缔合成通常称为“Y形”结构的两条相同的重链多肽(各约50kD)和两条相同的轻链多肽(各约25kD)构成。每条重链由至少四个结构域(各长约110个氨基酸)构成：氨基末端可变(VH)结构域，随后是三个恒定结构域：CH1、CH2、以及羧基末端CH3。被称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接至抗体的其余部分。该铰链区的两个二硫键将完整抗体中的两条重链多肽连接至彼此。每条轻链由两个结构域构成：氨基末端可变(VL)结构域，随后是羧基末端恒定(CL)结构域，它们由另一“开关”彼此隔开。完整的抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中重链和轻链由单个二硫键连接至彼此；其他两个二硫键将重链铰链区连接至彼此，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也经糖基化，典型地在CH2结构域上。天然抗体中每个结构域的结构特征在于由两个β片(例如，3-、4-或5-链片)形成的“免疫球蛋白折叠”，这些β片在压缩的反平行β桶中相对彼此封装。每个可变结构域含有三个被称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构性框架的β片，并且使来自重链和轻链的CDR环区域在三维空间中聚集在一起，使得它们在Y结构的尖端产生单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体结合。
“抗体片段”是指并非为完整抗体的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的几个实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单链可变片段(scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施例中，抗体片段是抗原结合片段。
当前用于抗体工程化和改善的方法的综述可见于R.Kontermann和S.Dubel,(2010)Antibody Engineering[抗体工程化]第1卷和第2卷,Springer Protocols[施普林格方案],第2版以及W.Strohl和L.Strohl(2012)Therapeutic antibody engineering:Current and future advances driving the strongest growth area in thepharmaceutical industry[治疗性抗体工程化：驱动制药工业中的最强增长区域的当前和未来进展],Woodhead Publishing[伍德海德出版社]。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法在本领域是熟知的，并且可以见于Harlow和Lane(1988)Antibodies: A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,第5-8和15章。
术语“抗原”是指可以是可溶性或特别地细胞膜结合的分子实体，但不限于可通过适应性免疫系统识别的分子实体，该系统包括但不限于抗体或TCR，或工程化分子，这些工程化分子包括但不限于转基因TCR、嵌合抗原受体(CAR)、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或任何其他能够以高亲和力与结构实现结合的分子。
如本文所用，在CAR的语境下，“抗原结合结构域”是指CAR中与抗原特异性结合(并从而能够靶向含有抗原的细胞)的区域。CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域。通常，CAR上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。任何与给定抗原特异性结合的分子(如亲和体或来自天然存在的受体的配体结合结构域)都可以用作抗原结合结构域。抗原结合结构域通常是scFv。正常情况下，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合以形成scFv。这样的接头可以是例如(GGGG4S)3。在一些情况下，有益的是，抗原结合结构域源自将使用CAR的同一物种。例如，当计划在人中治疗性地使用CAR时，可能有益的是，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段。人或人源化抗体或其片段可以通过本领域熟知的多种方法制备。
如本文所用，术语“结合亲和力”是指一个分子在该分子上的一个位点处结合到另一个分子上的强度。如果特定的分子将结合到另一个特定的分子上或者与之特异性地缔合，则这两个分子被称为对彼此表现出结合亲和力。结合亲和力与一对分子的缔合常数和解离常数有关，但这些常数单独测量或确定对于本文的这些方法不是关键的。相反，用来描述在这些所述方法的分子之间的相互作用的如本文所用的亲和力通常是在经验研究中观察到的表观亲和力(除非另有说明)，其可以用来比较一个分子(例如，抗体或其他特异性结合配偶体)将藉此结合两个其他分子(例如，肽的两种形式或变体)的相对强度。结合亲和力、缔合常数、和解离常数的概念是熟知的。
术语“癌症”在医学上被称为恶性赘生物。癌症是涉及细胞生长上调的一组广泛的疾病。在癌症中，细胞(癌性细胞)不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，并侵入身体附近部位。癌症也可能通过淋巴系统或血流扩散到体内更远的部位。已知有200多种不同的影响人的癌症。
术语“化疗”是指使用一种或多种细胞毒性抗瘤药物(“化疗剂”或“化疗药物”)作为标准化方案的一部分治疗癌症(癌性细胞)。化疗的给予可以具有治愈性意图，或者其可以旨在延长寿命或减轻症状。它通常与其他癌症治疗(如放疗、手术和/或高温热疗)结合使用。传统的化疗剂通过杀伤快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。这意味着化疗也会伤害在正常情况下快速分裂的细胞，如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化疗最常见的副作用，如骨髓抑制(减少血细胞的产生，因此也导致免疫抑制)、黏膜炎(消化道衬里的炎症)和脱发(毛发损失)。
术语“嵌合抗原受体”(缩写为“CAR”)是指将抗原特异性移植到细胞(例如T细胞或NK细胞)上的工程化受体。本文披露的CAR包含也称为抗原靶向区的抗原结合结构域(典型地是由抗体重链和轻链可变区构成的单链可变区)、细胞外间隔子/接头结构域或铰链区、跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域；它可以任选地包含其他元件，例如至少一种共刺激结构域。细胞外结构域还可以包含信号肽。在抗原特异性区域与对应的抗原结合后，信号传导结构域在宿主细胞中介导效应细胞功能。
术语“组合免疫疗法”是指共同应用两种治疗方法，例如本领域已知的用于治疗疾病(如癌症)的治疗方法。术语“组合免疫疗法”也可指共同应用免疫疗法(如使用抗原识别受体进行治疗)和另一种疗法，如造血细胞(例如对抗原识别受体的识别具有抗性的造血细胞)的移植。抗原在细胞上的表达意指抗原充分存在于细胞的细胞表面上，使得其可以被抗原识别受体检测、结合和/或识别。
“共刺激信号传导区”(相当于共刺激或“co-stim”结构域)是指CAR中包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是免疫效应细胞的高效反应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。上文讨论的共刺激分子的实例是本领域已知的。典型地长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可以在细胞内信号传导结构域的元件之间形成连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
涉及NK细胞的术语“细胞因子诱导记忆样”(或相当于“CIML”)意指具有“记忆”或“记忆样”表型并且是使用引发剂产生的。
如本文所用，涉及记忆NK细胞的术语“细胞毒性”是指细胞靶向并杀伤患病细胞的能力。
“患病细胞”是指细胞、组织或生物体的状态与正常或健康状态不同，并且可由病原体、有毒物质、辐照或细胞内部失调的影响导致。“患病细胞”也可以指已感染致病性病毒的细胞。此外，术语“患病细胞”可以指在个体中可能构成或引起癌症的恶性细胞或瘤细胞。
如本文所用，术语“工程化细胞”和“基因修饰的细胞”可以互换地使用。该术语意指含有和/或表达外来基因或核酸序列，或含有已被基因修饰以偏离其天然形式或功能的基因(例如缺失或敲除的基因)，该基因进而修饰基因型或细胞或其后代的表型。可以通过本领域熟知的重组方法来修饰细胞，以稳定地或瞬时地表达肽或蛋白质，在天然状态下这些肽或蛋白质在这些细胞中不表达。细胞的基因修饰方法可以包括但不限于转染，电穿孔，核转染，使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、非整合逆转录病毒或慢病毒载体的转导，转座子，设计核酸酶(包括锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas)。
如本文所用，与NK细胞相关的术语“富集”意指浓缩、纯化或分离以供进一步分析或使用。富集和纯化的细胞群体包含大部分所需细胞和可忽略不计的其他细胞。
如本文所用，术语“选择性倍数”意指对一种靶标的亲和力比其对另一靶标的亲和力大至少x倍，其中x至少是2，并且可以更高，例如10、20、50、100或1000。在优选的实施例中，选择性倍数在治疗上是有意义的，即，足以允许杀伤表达一种靶标的细胞而保留携带另一种靶标的细胞。
术语“基因修饰”或“基因修饰的”是指核酸(包括但不限于细胞的基因组DNA)含量的改变。这包括但不限于通过引入、交换或缺失核酸序列的单个核苷酸或片段来改变细胞基因组DNA序列。该术语还指将核酸向细胞内的任何引入，其与是否导致细胞基因组DNA序列的直接或间接改变无关。
术语“造血细胞”是指能够造血的造血谱系的细胞群体，包括但不限于造血干细胞和/或造血祖细胞(即，能够增殖并至少部分重构不同的血细胞类型，包括红系细胞、淋巴细胞和骨髓细胞)。如本文所用，术语“造血细胞”还包括从造血干细胞和/或造血祖细胞分化以形成血细胞(即血细胞类型，包括红系细胞、淋巴细胞和骨髓细胞)的细胞。
对抗原识别受体识别抗原具有抗性的供体造血细胞意指该细胞不能那么容易地被对该抗原具有特异性的抗原识别受体检测、结合和/或识别，或者检测、结合和/或识别受损，因此该细胞在免疫疗法期间不会被杀伤。
术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞(包括记忆NK、ML-NK和CIML-NK)、NKT细胞(包括iNKT细胞)、B细胞、先天淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞和巨噬细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒性效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞(包括记忆NK、ML-NK和CIML-NK)、NKT细胞(包括iNKT细胞)、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。“效应功能”意指细胞的特殊功能，例如在NK细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“免疫疗法”是定义为“通过诱导、增强或遏制免疫反应来治疗疾病”的医学术语。经设计以引发或放大免疫反应的免疫疗法被分类为激活免疫疗法，而减少或遏制免疫反应的免疫疗法则被分类为遏制免疫疗法。作为激活免疫疗法的癌症免疫疗法试图刺激免疫系统以排斥和破坏肿瘤。过继细胞转移使用基于细胞的细胞毒性反应来攻击癌细胞。在体外产生对患者的癌症具有天然或基因工程化反应性的免疫细胞(如T细胞)，然后将其转移回癌症患者体内。
如本文所用，术语“个体”是指动物。优先地，个体是哺乳动物，如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、狗、猴或人。更优先地，个体是人。个体可以是患有疾病(如癌症)的个体(患者)，但是受试者也可以是健康受试者。
CAR的“细胞内信号传导结构域”(相当于细胞质信号传导结构域或效应结构域；其是细胞内或内结构域的一部分)负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。“效应功能”意指细胞的特殊功能，例如在NK细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。细胞内信号传导结构域是指蛋白质中转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞执行特殊功能的部分。
细胞内信号传导结构域可以包括足以转导效应功能信号的给定蛋白质的细胞内信号传导结构域的任何完整或截短部分。用于CAR的细胞内信号传导结构域的突出实例包括受体和辅助受体的细胞质序列，它们共同作用以在抗原受体接合后启动信号转导。
通常，免疫效应细胞的CAR激活可以由两类细胞质信号传导序列介导，首先是通过CAR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)，其次是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列、共刺激信号传导结构域)。因此，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞质信号传导结构域和任选地次级细胞质信号传导结构域(即，共刺激或“co-stim”结构域)。
以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序信号传导基序)。常用于CAR中的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例在本文中披露并且是本领域已知的。
术语“恶性”或“恶性肿瘤”描述了构成赘生物的细胞、细胞群或组织，其源自赘生物或者可能是新的瘤细胞的来源。该术语用于描述与组织的正常或健康细胞形成对比的瘤细胞。恶性肿瘤与非癌性良性肿瘤的对比在于，恶性肿瘤的生长不受自身限制，能够侵入相邻组织，并可能能够扩散到远端组织。良性肿瘤没有这些特性。恶性肿瘤的特征是间变、侵袭性和转移以及基因组不稳定性。术语“癌前细胞”是指尚非恶性但即将变为恶性的细胞或组织。
术语“记忆”或“记忆样”涉及NK细胞时意指与一般NK细胞群体相比，具有激活的表型(该表型具有改善的细胞毒性和寿命/持久性)，并且与一般NK细胞群体相比通常表现出细胞表面CD69、CD25和NKG2A表达增加且CD16表达维持不变。
如应用于本披露中所述的抗体的术语“单克隆抗体”(mAb)是源自任何真核、原核或噬菌体克隆的单个拷贝或克隆的化合物，而不是其产生方法。本披露的mAb能以均质或基本上均质的群体存在。
本文所用的术语“持久性”是指细胞(尤其是过继转移到受试者中的细胞)持续存活的能力。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语还应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物，并且应用到天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物上。
涉及NK细胞的术语“引发”意指使用引发剂刺激或激活记忆/记忆样表型。“引发剂”包含刺激性细胞因子的组合，例如，
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或一种或多种包含此类细胞因子的功能片段的“引发融合蛋白”，或其一种或多种多链复合物。本文披露了此类蛋白的实例。
通常，术语“受体”是指如下生物分子，其可以是可溶性的或附接至细胞表面膜上，并特异性结合限定的结构，该结构可附接至细胞表面膜上或是可溶性的。受体包括但不限于抗体和抗体样结构、黏附分子、转基因或天然存在的TCR或CAR。特别地，如本文所用，术语“抗原识别受体”可以是膜结合受体或可溶性受体，如天然TCR、转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、双特异性T细胞增强物(BiTE)、双抗体或任何其他能够以高亲和力实现特异性结合的分子。
术语“减少副作用”是指降低使用抗原识别受体的免疫疗法的任何并发症、不想要的或病理性结果的严重程度，如对表达抗原的非靶细胞的毒性。“减少副作用”还指在使用抗原识别受体的免疫疗法期间，减少或避免患者的疼痛、伤害或死亡风险的措施。
如本文所用，术语“序列同一性”表示当将序列进行比对使得序列匹配最大化时(即，考虑空位和插入)，在两个或更多个序列中的相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。通过已知的方法可以容易地计算同一性。用于确定同一性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。此外，确定同一性的方法被编篡在可公开获得的计算机程序中。例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法，通过同源性比对算法，通过相似性捜索方法，或者通过这些算法的计算机化执行(在GCG威斯康星软件包(Wisconsin Package)中的GAP、BESTFIT、PASTA、和TFASTA，可获自阿森尼克斯公司(Accelrys，Inc.)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州，美国)，或者通过目测检查，可以进行用于比较的最佳序列比对。通常参见Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol[分子生物学杂志]215:403-410(1990)和Altschul等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402(1997)。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法。
如本文所用，在CAR的语境下，“信号肽”是指指导蛋白质在细胞内转运和定位(例如至某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面)的肽序列。
如本文所用，在CAR的语境下，术语“间隔子”或“铰链”是指在抗原结合结构域与跨膜结构域之间的亲水性区域。本文披露的CAR可以包含细胞外间隔子结构域，但也可能跳过这样的间隔子。间隔子可以包括抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔子序列、或其组合。间隔子的突出实例是CD8α铰链。
关于抗原识别受体，术语“特异性结合”或“对……具有特异性”或“特异性识别”是指该抗原识别受体的抗原结合结构域，其识别并结合抗原的特异性多态性变体，但基本上不识别或结合其他变体。
术语“副作用”是指除所希望的治疗结果外，使用抗原识别受体的免疫疗法出现的任何并发症、不想要的或病理性结果。术语“副作用”优先是指在细胞上存在靶抗原的情况下，在免疫疗法期间可能发生的中靶脱肿瘤毒性，该细胞是表达抗原的非靶细胞，但不是如本文所述的患病细胞。免疫疗法的副作用可能是移植物抗宿主病的发展。
术语“靶标”或“靶抗原”是指任何细胞表面蛋白、糖蛋白、糖脂或任何其他存在于靶细胞表面上的结构。该术语还指特别地存在于靶细胞上任何其他结构，但不限于可通过适应性免疫系统识别的结构，该适应性免疫系统包括但不限于抗体或TCR，或工程化分子，这些工程化分子包括但不限于转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或任何其他能够以高亲和力与结构实现结合的分子。
如本文所用，术语“靶细胞”是指由应用或将应用于个体的抗原识别受体识别的细胞。
术语“治疗有效量”意指提供治疗性益处的量。
CAR的“跨膜结构域”可以源自这样的结构域的任何希望的天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域可以源自例如CD8α、CD28、NKG2D或本文披露的或本领域已知的其他结构域。当关键信号传导和抗原识别模块在两个(或甚至更多个)多肽上时，则CAR可能具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异二聚化结构域，拆分关键信号传导和抗原识别模块使得能够对CAR细胞表达进行小分子依赖性、可滴定和可逆的控制(Wu等人,2015,Science[科学]350:293-303)。
如本文所用，术语“移植”意指向受试者施用供体细胞群体，例如造血细胞或携带CAR的免疫效应细胞。
如本文所用，术语“治疗”意指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
实例
本发明进一步通过以下实例说明。
实例1.仅扩增、引发同时扩增、扩增然后引发的体外培养和活性
材料与方法：使用CD3耗竭和CD56阳性选择从全血中分离NK细胞。然后将选择的NK细胞在96孔板中在NK MACS培养基+补充剂+10％ HI-HAB中培养，并在以下条件下引发/扩增，其中1x 7t15-21s和ATF1分别为200nM和100nM，且1x 18t15-12s为250nM；所有稀释度均根据所示的这些值计算。
a)仅扩增：+7t15-21s和ATF1在37度、5％ CO2和指定浓度下持续2、6或10天。随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至指定浓度。
b)引发同时扩增：+18t15-12s、7t15-21s和ATF1在37度、5％ CO2和指定浓度下持续2、6或10天。随后每2天，用新鲜培养基将18t15-12s、7t15-21s和ATF1补充至指定浓度。
c)扩增然后引发：+7t15-21s和ATF1在37度、5％ CO2和指定浓度下持续2、6或10天。随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至指定浓度。在所指示的第2、6或10天，按指定浓度添加18t15-12s过夜。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的表型，在适当的时间点，将NK细胞收获、洗涤，并通过使用包含纯度和/或激活标记(例如抗CD56、抗CD3、Live/Dead Yellow、抗NKG2A、抗CD69、抗CD25和抗CD16)的流式板(flow panel)染色来评估受体表达。使用以下克隆：
·抗CD45(HI30克隆)
·抗CD56(CMSSB克隆)
·抗CD3(SK7克隆)
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))
·抗NKG2A(REA110克隆)
·抗CD69(FN50克隆)
·抗CD25(CD25-4E3克隆)
·抗CD16(eBioCD16克隆)
使用Attune NXt流式细胞仪。然后在Flowjo v10.7中分析数据，对活CD56+CD3-细胞进行门控并评估每个上述标记的中值荧光强度。CD69、CD25和NKG2A表达增加以及CD16表达维持不变表明存在CIML-NK细胞表型。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的杀伤活性，在适当的时间点，将培养的NK细胞收获并洗涤，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司(Gibco))的NK MACS培养基中，并以指定的效靶(E:T)比添加到96孔板中24-48小时，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，含或不含IL-2(美天旎公司)，之后通过荧光素酶读数(普洛麦格公司(Promega))评估荧光素酶活性(活K562细胞)。数据未显示。
结果：本实例展示了通过上述过程产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
结果显示在表6-11中，其中显示表面蛋白表达的累积倍数变化、细胞大小和各个基因的中值荧光强度。
表6.累积倍数变化的平均值
/>
/>
表7.细胞大小(FSC)
/>
/>
表8.CD25 MFI
/>
/>
表9.CD69 MFI
/>
/>
表10.CD16 MFI
/>
表11.NKG2A MFI
/>
可替代地，可以在合适的培养基中培养淋巴祖细胞，例如iPSC细胞或脐带血NK细胞，并且NK细胞分化成可以引发和/或扩增的形式。
实例2.中途或结束时引发的体外扩增和引发
材料与方法：每2天用不同浓度的扩增剂7t15-21s和ATF1处理纯化的NK细胞。在第6天和第14天，用200nM和100nM的7t15-21s和ATF1扩增的细胞用250nM的18t15-12s激活，并继续用200nM和100nM的7t15-21s和ATF1扩增。6、13和17天后，将NK以指定的比率添加到于RPMI+10％热灭活FBS中的K562-Luc2细胞(ATCC)板中。然后将板在37℃和5％ CO2下孵育24小时。K562细胞的杀伤通过荧光素酶读数来衡量。EC:50越低被认为杀伤效果越好。
结果：本实例展示了通过上述过程大规模产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
结果示于图1-4中。
实例3.仅扩增、引发同时扩增、扩增然后引发以及扩增然后引发和扩增的体外培养和活性
材料与方法：使用CD3耗竭和CD56阳性选择从全血中分离NK细胞。然后将选择的NK细胞在96孔板中在NK MACS培养基+补充剂+10％ HI-HAB中培养，并在以下条件下引发/扩增，其中1x 7t15-21s和ATF1分别为200nM和100nM，且X/4分别为50nM和25nM：
a)仅扩增：+1x或X/4 7t15-21s和ATF1，在37度、5％ CO2下持续4天。在培养第6天及随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至1x或X/4。
b)引发同时扩增：+18t15-12s、7t15-21s和ATF1，在250nM/1x、250nM/x/4、62.5nM/1x或62.5nM/x/4下以及37度、5％ CO2下持续6天。在培养第6天及随后每2天，用新鲜培养基将18t15-12s、7t15-21s和ATF1补充至指定浓度。
c)扩增然后引发：+1x或X/4 7t15-21s和ATF1，在37度、5％ CO2下持续4天。在培养第6天及随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至1x或X/4。在所指示的第6天或第14天，按250nM或62.5nM添加18t15-12s 3小时。
d)扩增然后引发和扩增3h：+1x或x/4 7t15-21s和ATF1，在37度、5％CO2下持续4天。在培养第6天及随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至1x或x/4。在第6天或第14天，以250nM/1x、250nM/x/4、62.5/1x或62.5/x/4添加18t15-12s、7t15-21s和ATF1 3小时。
e)扩增然后引发和扩增48h：+1x或x/4 7t15-21s和ATF1，在37度、5％CO2下持续4天。在培养第6天及随后每2天，用新鲜培养基将7t15-21s和ATF1补充至1x或x/4。在第6天或第14天，以250nM/1x、250nM/x/4、62.5nM/1x或62.5nM/x/4添加18t15-12s、7t15-21s和ATF148小时。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的表型，在适当的时间点，将NK细胞收获、洗涤，并通过使用包含纯度和/或激活标记(例如抗CD56、抗CD3、Live/Dead Yellow、抗NKG2A、抗CD69、抗CD25和抗CD16)的流式板染色来评估受体表达。使用以下克隆：
·抗CD45(HI30克隆)
·抗CD56(CMSSB克隆)
·抗CD3(SK7克隆)
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司)
·抗NKG2A(REA110克隆)
·抗CD69(FN50克隆)
·抗CD25(CD25-4E3克隆)
·抗CD16(eBioCD16克隆)
使用Attune NXt流式细胞仪。然后在Flowjo v10.7中分析数据，对活CD56+CD3-细胞进行门控并评估每个上述标记的中值荧光强度。CD69、CD25和NKG2A表达增加以及CD16表达维持不变表明存在CIML-NK细胞表型。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的杀伤活性，在适当的时间点，将培养的NK细胞收获并洗涤，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以指定的效靶(E:T)比添加到96孔板中24-48小时，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，含或不含IL-2(美天旎公司)，之后通过荧光素酶读数(普洛麦格公司)评估荧光素酶活性(活K562细胞)。
结果：本实例展示了通过上述过程产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
结果显示在表12-17中，其中显示NK细胞数量的累积倍数变化、各个表面蛋白表达的中值荧光强度和K562-Luc杀伤。
表12.累积倍数变化
表13.CD16 MFI
/>
表14.CD69 MFI
表15.CD25 MFI
/>
表16.NKG2A MFI
表17：
/>
实例4.仅扩增和扩增然后引发的大规模体外培养和活性
材料与方法：使用CD3耗竭和CD56阳性选择，在MACS prodigy上从冷冻的leukopak分离NK细胞。然后将选择的NK细胞放入圣戈班公司(St.Gobain)袋中，在NK MACS培养基+补充剂+10％ HI-HAB+25nM 7t15-21s+50nM ATF1中以初始细胞浓度0.25e6/mL在37度、5％CO2下培养6天。在培养的第6天和随后每2天，对细胞进行计数并稀释至0.25e6/mL的浓度，并将7t15-21s和ATF1补充至最终培养基体积的适当浓度。在第14天，将细胞冷冻(仅扩增)或者将细胞浓缩至50e6/mL，并添加18t15-12s至250nM的终浓度(扩增然后引发)。如此引发的细胞在37度、5％ CO2下孵育不同时间。在指定时长(30min、1h、2h、3h、5h或过夜)的18t15-12s添加后，收获细胞，用HBSS(-/-)、0.5％ HSA洗涤两次，并重悬于冷冻缓冲液(90％人血清，10％ DMSO)。使用受控速率冷冻机将细胞以2e6个细胞/mL或20e6个细胞/mL冷冻，然后转移到液氮的气相中。然后将细胞解冻、洗涤、计数并用于下游测定以测量功能。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的表型，在适当的时间点，将NK细胞收获、洗涤，并通过使用包含纯度和/或激活标记(例如抗CD56、抗CD3、Live/Dead Yellow、抗NKG2A、抗CD69、抗CD25和抗CD16)的流式板染色来评估受体表达。使用以下克隆：
·抗CD45(HI30克隆)
·抗CD56(CMSSB克隆)
·抗CD3(SK7克隆)
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司)
·抗NKG2A(REA110克隆)
·抗CD69(FN50克隆)
·抗CD25(CD25-4E3克隆)
·抗CD16(eBioCD16克隆)
使用Attune NXt流式细胞仪。然后在Flowjo v10.7中分析数据，对活CD56+CD3-细胞进行门控并评估每个上述标记的中值荧光强度。CD69、CD25和NKG2A表达增加以及CD16表达维持不变表明存在CIML NK细胞表型。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的杀伤活性，在适当的时间点，将培养的NK细胞收获并洗涤，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以指定的效靶(E:T)比添加到96孔板中24-48小时，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，含或不含IL-2(美天旎公司)，之后通过荧光素酶读数(普洛麦格公司)评估荧光素酶活性(活K562细胞)。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的细胞因子产生能力，将NK细胞解冻，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以1:1的效靶(E:T)比持续24小时或单独添加到96孔板中，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，之后收获上清液并通过IFNg ELISA(R&D Systems公司)评估IFNg产生。
结果：本实例展示了通过上述过程大规模产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
结果示于图5-11中。
实例5.仅扩增、引发然后扩增、和扩增然后引发的大规模体外培养和活性
材料与方法：使用CD3耗竭和CD56阳性选择，在MACS prodigy上从冷冻的leukopak分离NK细胞。然后将选择的NK细胞放入圣戈班公司袋中，在NK MACS培养基+补充剂+10％HI-HAB+25nM7t15-21s+50nM ATF1中以初始细胞浓度0.25e6/mL在37度、5％ CO2下培养6天。在培养的第6天和随后每2天，对细胞进行计数并稀释至0.25e6/mL的浓度，并将7t15-21s和ATF1补充至最终培养基体积的适当浓度。在第14天，将细胞浓缩至不同密度(2e6、5e6、10e6、25e6、35e6或50e6/mL)，并添加18t15-12s至终浓度250nM。将细胞在37度、5％下孵育。在指定时长(3h或过夜)的18t15-12s添加后，收获细胞，用HBSS(-/-)、0.5％ HSA洗涤两次，并重悬于冷冻缓冲液(90％人血清，10％ DMSO)。使用受控速率冷冻机将细胞以2e6个细胞/mL或20e6个细胞/mL冷冻，然后转移到液氮的气相中。然后将细胞解冻、洗涤、计数并用于下游测定以测量功能。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的表型，在适当的时间点，将NK细胞收获、洗涤，并通过使用包含纯度和/或激活标记(例如抗CD56、抗CD3、Live/Dead Yellow、抗NKG2A、抗CD69、抗CD25和抗CD16)的流式板染色来评估受体表达。使用以下克隆：
·抗CD45(HI30克隆)
·抗CD56(CMSSB克隆)
·抗CD3(SK7克隆)
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司)
·抗NKG2A(REA110克隆)
·抗CD69(FN50克隆)
·抗CD25(CD25-4E3克隆)
·抗CD16(eBioCD16克隆)
使用Attune NXt流式细胞仪。然后在Flowjo v10.7中分析数据，对活CD56+CD3-细胞进行门控并评估每个上述标记的中值荧光强度。CD69、CD25和NKG2A表达增加以及CD16表达维持不变表明存在CIML-NK细胞表型。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的杀伤活性，在适当的时间点，将培养的NK细胞收获并洗涤，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以指定的效靶(E:T)比添加到96孔板中24-48小时，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，含或不含IL-2(美天旎公司)，之后通过荧光素酶读数(普洛麦格公司)评估荧光素酶活性(活K562细胞)。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的细胞因子产生能力，将NK细胞解冻，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以1:1的效靶(E:T)比持续24小时或单独添加到96孔板中，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，之后收获上清液并通过IFNg ELISA(R&D Systems公司)评估IFNg产生。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的体内持久性，将NK细胞解冻并以20e6/mL重悬于HBSS中。将2e6至5e6个细胞(例如以100uL)静脉内注射到免疫缺陷的NSG小鼠(杰克森实验室(Jackson Laboratories)，缅因州巴尔港(Bar Harbor Maine))。每两天向小鼠给药人IL-2(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec)，50,000IU)支持，并在第7天抽血并通过使用流式板染色来测量NK细胞的数量，该流式板由以下组成：
·抗CD56(CMSSB克隆),
·抗CD3(SK7克隆),
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司)
·抗小鼠CD45(30-F11克隆)，和
·抗人CD45(HI30克隆)
然后固定以裂解红细胞。然后在Attune NXt流式细胞仪上分析细胞中活huCD45+小鼠CD45-CD3-细胞的数量。
结果：本实例展示了通过上述过程大规模产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
结果示于图12-16中。
实例6.仅扩增和扩增然后引发的体外培养和活性
材料与方法：使用CD3耗竭和CD56阳性选择从全血中分离NK细胞。然后将选择的NK细胞在组织培养处理过的烧瓶中培养，然后转移到含有NK MACS培养基+补充剂+10％ HI-HAB的细胞培养袋中，并在以下条件下扩增：
a)仅扩增：50nM 7t15-21s和25nM ATF1，在37度、5％ CO2下持续4天。在培养第5天及随后每2/3天，将7t15-21s和ATF1分别补充至50nM和25nM，并用新鲜培养基将细胞稀释至适当的浓度。在第14天，将细胞冷冻在90％ HAB、10％ DMSO中。
b)扩增然后引发：50nM 7t15-21s和25nM ATF1，在37度、5％ CO2下持续4天。在培养第5天及随后每2/3天，将7t15-21s和ATF1分别补充至50nM和25nM，并用新鲜培养基将细胞稀释至适当的浓度。在第14天，按250nM添加18t15-12s 3小时。然后将细胞冷冻在90％HAB、10％ DMSO中。
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的表型，将冷冻的细胞解冻，并通过使用包含纯度和/或激活标记(例如抗CD56、抗CD3、Live/Dead Yellow、抗NKG2A、抗CD69、抗CD25和抗CD16)的流式板染色来评估受体表达。使用以下克隆：
·抗CD45(HI30克隆)
·抗CD56(CMSSB克隆)
·抗CD3(SK7克隆)
·Live/Dead Yellow(赛默飞世尔公司)
·抗NKG2A(REA110克隆)
·抗CD69(FN50克隆)
·抗CD25(CD25-4E3克隆)
·抗CD16(eBioCD16克隆)
使用Attune NXt流式细胞仪。然后在Flowjo v10.7中分析数据，对活CD56+CD3-细胞进行门控并评估每个上述标记的中值荧光强度。CD69、CD25和NKG2A表达增加以及CD16表达维持不变表明存在CIML-NK细胞表型。结果示于以下表18-22中。
表18.1CD16 MFI
表19.CD69 MFI
表20.CD25 MFI
表21.NKG2A MFI
表22.细胞大小：FSC MFI
为了评估通过上述过程产生的NK细胞的杀伤活性，在适当的时间点，将培养的NK细胞收获并洗涤，然后重悬于含有10％人AB血清(吉博科公司)的NK MACS培养基中，并以指定的效靶(E:T)比添加到96孔板中24-48小时，板中含有10,000个荧光素酶表达K562(K562-Luc)人肿瘤细胞(ATCC)，含或不含IL-2(美天旎公司)，之后通过荧光素酶读数(普洛麦格公司)评估荧光素酶活性(活K562细胞)。结果示于图17-18中。
结果：本实例展示了通过上述过程产生的NK细胞的体外活性和流式细胞术表型。
实例7.CIML-NK细胞的体内杀伤活性
为了评估体内杀伤功效，向NSG小鼠植入K562-Luc(ATCC)肿瘤细胞。在NK细胞培养结束时，收获、洗涤细胞，并将2-10e6个NK细胞静脉内注射到荷瘤动物体内，一些对照小鼠未注射。向小鼠给予人IL-2(50,000IU)q2d给药支持，每周通过向小鼠注射荧光素并在功能齐全的仪器上读取荧光素酶来测量肿瘤生长。
实例8.临床试验方案
如果冷冻保存的话，可将如上披露的NK细胞解冻，并在合适的介质中输注到患者体内，用于治疗诸如癌症的疾病。测试NK细胞在例如急性髓性白血病和骨髓增生异常综合征中的安全性和功效的示例性方法披露于临床试验方案编号NCT04354025、NCT03068819、NCT01898793、NCT02782546和NCT04893915中。这些方案涉及记忆NK细胞，这些细胞已使用IL-12、IL-15和IL-18的混合物或引发融合蛋白复合物引发，然后任选地进行扩增。类似的临床试验可以使用已扩增然后引发，或同时扩增和引发的记忆NK细胞进行。
表23.CTP NCT04893915
/>
/>
/>
/>
/>
表24.CTP NCT01898793
/>
/>
/>
/>
/>
根据本文披露的方法已扩增然后引发、或同时扩增并引发的记忆NK细胞预计可有效治疗AML、MDS和其他疾病，例如如上文临床试验方案表明。
提供上文列出的详细描述是为了帮助本领域技术人员实践本发明。然而，本文描述和要求权利的本发明的范围并不受本文所披露的特定实施例的限制，因为这些实施例旨在阐明本发明的几个方面。任何等同实施例旨在处于本发明的范围之内。事实上，除了本文所示和所述的那些，本发明的各种修改根据前面描述对于本领域技术人员而言也将变得清楚，这些修改并不偏离本发明性发现的精神或范围。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。

Claims (57)

1.一种纯化的记忆自然杀伤(NK)细胞群体，其通过以下依序地产生：
a)扩增纯化的NK细胞；并且
b)引发这些NK细胞。
2.一种纯化的记忆自然杀伤(NK)细胞群体，其通过同时引发和扩增纯化的NK细胞产生。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞从新鲜或冷冻的白细胞分离液或供体血液中富集。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞由淋巴祖细胞分化而来。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过阴性或阳性选择或其组合来纯化。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于以下来引发：
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或其功能片段，和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
7.根据权利要求6所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于18t15-12s来引发。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞引发1分钟至24小时。
9.根据权利要求6所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于IL-12、IL-15和IL-18来引发。
10.根据权利要求9所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞引发1分钟至24小时。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞通过暴露于7t15-21s和ATF1来扩增。
12.根据权利要求11所述的记忆NK细胞，其中将这些NK细胞扩增1-40天。
13.根据前述权利要求中任一项所述的记忆NK细胞，其中与未经处理的NK细胞相比，记忆NK表型由CD69、CD25和NKG2A表达增加，以及CD16表达维持不变来指示。
14.根据前述权利要求中任一项所述的记忆NK细胞，其中与未经处理的NK细胞相比，这些记忆NK细胞具有以下一项或多项：
·改善的针对癌细胞的细胞毒性；
·改善的持久性；
·改善的抗肿瘤活性；和/或
·细胞因子的产生增加。
15.根据权利要求14所述的记忆NK细胞，其中这些癌细胞是K562细胞。
16.根据权利要求14所述的记忆NK细胞，其中产生的细胞因子选自IFNg、TNFa、GM-CSF及其组合。
17.根据权利要求14所述的记忆NK细胞，其中持久性在免疫缺陷小鼠中测量1-14天。
18.根据权利要求17所述的记忆NK细胞，其中该小鼠是NSG小鼠。
19.根据权利要求14所述的记忆NK细胞，其中抗肿瘤活性测量为免疫缺陷小鼠中癌细胞的肿瘤生长减少。
20.根据任一前述权利要求所述的记忆NK细胞，其中这些NK细胞是细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞。
21.根据任一前述权利要求所述的记忆NK细胞，其另外包含至少一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)至少一个靶向靶细胞上抗原的细胞外配体结合结构域；
b)铰链结构域；
c)跨膜结构域；
d)任选地，一个或多个共刺激结构域；以及
e)细胞质信号传导结构域。
22.一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化富集的NK细胞群体；
b)扩增这些NK细胞；以及
c)引发这些NK细胞。
23.一种制备记忆NK细胞的方法，该方法包括：
a)纯化富集的NK细胞群体；以及
b)同时引发和扩增这些NK细胞。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞从新鲜或冷冻的白细胞分离液或供体血液中富集。
25.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞由淋巴祖细胞分化而来。
26.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过阴性或阳性选择或其组合来纯化。
27.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于以下来引发：
·IL-12、IL-23、IL-27和IL-35中的一种或多种；
·IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或多种；以及
·IL-18、IL-1a、IL-1b、IL-36a、IL-36b和IL-36g中的一种或多种；
或其功能片段，和/或包含其功能片段的融合蛋白，或任何前述的组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于18t15-12s来引发。
29.根据权利要求28所述的方法，其中将这些NK细胞引发1分钟-24小时。
30.根据权利要求27所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于IL-12、IL-15和IL-18来引发。
31.根据权利要求28所述的方法，其中将这些NK细胞引发2-40天。
32.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中这些NK细胞通过暴露于7t15-21s和ATF1来扩增。
33.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中将这些NK细胞扩增1-40天。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未经处理的NK细胞相比，该记忆NK表型由CD69、CD25和NKG2A表达增加，以及CD16表达维持不变来指示。
35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中与未经处理的NK细胞相比，这些记忆NK细胞具有以下一项或多项：
·改善的针对癌细胞的细胞毒性；
·改善的持久性；
·改善的抗肿瘤活性；和/或
·细胞因子的产生增加。
36.根据权利要求35所述的方法，其中这些癌细胞是K562细胞。
37.根据权利要求35所述的方法，其中这些产生的细胞因子选自IFNg、TNFa、GM-CSF及其组合。
38.根据权利要求35所述的方法，其中持久性在免疫缺陷小鼠中测量1-14天。
39.根据权利要求38所述的方法，其中该小鼠是NSG小鼠。
40.根据权利要求35所述的方法，其中该改善的抗肿瘤活性为免疫缺陷小鼠中癌细胞的肿瘤生长减少。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些细胞是细胞因子诱导ML(CIML)NK细胞。
42.一种治疗增殖性恶性肿瘤的方法，该方法包括向有需要的患者施用根据权利要求1-21中任一项所述的记忆NK细胞或通过根据权利要求22-41中任一项所述的方法制备的记忆NK细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中将这些细胞新鲜施用给患者。
44.根据权利要求42所述的方法，其中该增殖性恶性肿瘤为癌症。
45.根据权利要求44所述的方法，其中该癌症是血液学癌症。
46.根据权利要求44所述的方法，其中该血液学癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。
47.根据权利要求46所述的方法，其中该血液学癌症是B细胞淋巴瘤。
48.根据权利要求47所述的方法，其中该B细胞淋巴瘤选自弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
49.根据权利要求46所述的方法，其中该血液学癌症是T细胞淋巴瘤。
50.根据权利要求49所述的方法，其中该T细胞淋巴瘤选自T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)和塞扎里综合征。
51.根据权利要求46所述的方法，其中该血液学癌症是白血病。
52.根据权利要求51所述的方法，其中该白血病选自急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。
53.根据权利要求46所述的方法，其中该血液学癌症是浆细胞恶性肿瘤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中该浆细胞恶性肿瘤选自淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
55.根据权利要求44所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
56.根据权利要求55所述的方法，其中该实体瘤选自黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或癌。
57.根据权利要求55所述的方法，其中该实体瘤是脑、头颈、乳腺、肺(例如非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如卵巢)、上消化道、胰腺、肝脏、肾系统(例如肾脏)、膀胱、前列腺或结直肠的肿瘤。
CN202280050056.0A 2021-07-15 2022-07-14 记忆自然杀伤细胞的扩增 Pending CN117729928A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163222306P 2021-07-15 2021-07-15
US63/222,306 2021-07-15
PCT/US2022/037178 WO2023288007A2 (en) 2021-07-15 2022-07-14 Expansion of memory natural killer cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117729928A true CN117729928A (zh) 2024-03-19

Family

ID=84920491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280050056.0A Pending CN117729928A (zh) 2021-07-15 2022-07-14 记忆自然杀伤细胞的扩增

Country Status (5)

Country Link
KR (1) KR20240035846A (zh)
CN (1) CN117729928A (zh)
AU (1) AU2022312462A1 (zh)
CA (1) CA3226688A1 (zh)
WO (1) WO2023288007A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116875548B (zh) * 2023-09-08 2024-01-02 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种nk细胞活性培养管及其生产工艺
CN117143815B (zh) * 2023-10-30 2024-01-26 再少年(北京)生物科技有限公司 工程化记忆样nk细胞的制备方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200392457A1 (en) * 2016-07-25 2020-12-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use
CN114269903A (zh) * 2019-06-21 2022-04-01 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240035846A (ko) 2024-03-18
WO2023288007A9 (en) 2023-06-08
AU2022312462A1 (en) 2024-01-25
CA3226688A1 (en) 2023-01-19
WO2023288007A2 (en) 2023-01-19
WO2023288007A3 (en) 2023-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11026975B2 (en) Chimeric antigen receptor (CAR) binding to BCMA, and uses thereof
EP3194432B1 (en) Ror1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
US20180002427A1 (en) Cll1-specific multi-chain chimeric antigen receptor
EP3564266A1 (en) Novel chimeric antigen receptor and use thereof
US20180134795A1 (en) Cd123 specific multi-chain chimeric antigen receptor
EP3436479A1 (en) Chimeric receptors to flt3 and methods of use thereof
US20190359680A1 (en) Cs1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
CA2958553A1 (en) Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
JP2020513839A (ja) Ｔｉｍ−１を標的とするキメラ抗原受容体
KR20200120939A (ko) 변형된 만능성 줄기 세포, 및 제조 및 사용 방법
CN105392888A (zh) 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症
CA3059444A1 (en) Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment
CN117729928A (zh) 记忆自然杀伤细胞的扩增
WO2020018695A1 (en) Chimeric receptors to steap1 and methods of use thereof
CN117136071A (zh) 多肽及其在治疗疾病中的用途
EP4141028A1 (en) Personalized vnar-based chimeric antigen receptors (vnar-car) for the treatment of clonal b-and t cell malignancies, and methods for producing vnar-cars
US20230226109A1 (en) Method for differentiating innate lymphoid cells for immunotherapy
AU2015295348B2 (en) ROR1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
WO2024059733A2 (en) Chimeric antigen receptors binding nectin-4
TW202342507A (zh) 抗ｓｔｅａｐ２嵌合抗原受體及其用途
KR20220110199A (ko) 태반-유래 동종이계 car-t 세포 및 이의 용도
JP2023537104A (ja) シグレック６結合ポリペプチド
WO2023201288A1 (en) Cd70 binding car-t cells comprising cd33 binding t-cell engaging antibody molecules
WO2024059227A2 (en) Chimeric antigen receptor and cell including chimeric antigen receptor
AU2015295348A1 (en) ROR1 specific multi-chain chimeric antigen receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication