KR20240035846A - 기억 자연 살해 세포의 확장 - Google Patents

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우젠 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 일반적으로 특히 기억-유사 및 사이토카인-유도 기억 유사 (CIML) NK 세포를 포함한, 자연 살해 (NK) 세포, 그들을 제조하고, 예를 들어, 암의 치료에서 그들을 사용하고, NK 세포의 항-종양 성질을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

기억 자연 살해 세포의 확장
본 출원은 2021년 7월 15일 출원된 미국 가출원 제63/222,306호의 우선권의 이득을 청구하고, 이의 개시는 그 전문이 본 명세서에 기재된 바와 같이 참조로 편입된다.
본 개시는 일반적으로 특히, 기억/기억-유사 및 사이토카인-유도 기억 유사 (CIML) NK 세포를 포함하는 자연 살해 (NK) 세포, 그들을 제조하고, 예를 들어, 암의 치료에서 사용하고, NK 세포의 항-종양 성질을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
자연 살해 (NK) 세포는 그랜자임 및 퍼포린의 표적-유도 방출을 통해서 항체 의존적 세포 독성을 나타내는 세포독성 림프구로서 종종 특징규명되는, 선천성 면역 세포군을 구성한다. 대부분의 NK 세포는 다양한 활성화 및 억제성 수용체의 모음 이외에도, 특이적 세포 표면 마커 프로파일 (예를 들어, CD3, CD56+, CD16+, CD57+, CD8+)을 갖는다. 보다 최근에 NK 세포가 일정 암 치료의 중요한 성분이 되었지만, 상당한 분량의 NK 세포의 생성은 전체 혈액 중 NK 세포 분획이 상대적으로 낮기 때문에 상당한 장애물이 되었다.
기억 NK 세포를 생성시키는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고, 그들의 전부 또는 거의 전부는 다양한 단점, 예컨대 낮은 수율, 피더 세포, 및 값비싼 시약의 사용 등을 겪고 있다. 결론적으로, 상당한 분량으로 기억 NK 세포를 생산하는 개선된 시스템 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 명세서에서는 개념적으로 단순하고 효율적인 방식으로 기억/기억-유사 NK 세포를 생성시키고 확장시킬 수 있는 방법 및 조성물을 개시한다. 기억 NK 세포는 NK 세포를 동시에 프라이밍시켜서 기억 NK 세포를 형성하고 원하는 분량까지 확장시키는 방법으로 생성될 수 있다. 대안적으로, NK 세포는 원하는 분량으로 확장된 다음에 프라이밍되어서 기억 NK 세포를 형성한다.
서열의 간단한 설명
표 4 및 5의 SEQ ID NO: 1-48은 키메라 항원 수용체의 다양한 성분의 서열이다.
SEQ ID NO: 49-50은 EFP 7t15-21s를 구성하는 예시적인 확장 융합 단백질 (EFP) 사슬의 서열이다.
SEQ ID NO: 51-70은 예시적인 가교제 항-조직 인자 항체 ATF1의 서열이다.
SEQ ID NO: 71-72는 PFP 18t15-12s를 구성하는 예시적인 프라이밍 융합 단백질 (PFP) 사슬의 서열이다.
도 1은 확장제 및 프라이밍제의 소정 조합 (7t15-21s+ATF1, 18t15-12s)에 의해 생산된 기억 NK 세포에 대한, 소정 이펙터 대 표적 세포 비에서, 기억 NK 세포에 의한 6/7일에 시험관내 사멸된 암 세포 (K562)의 백분율을 도시한다.
도 2는 확장제 및 프라이밍제의 소정 조합 (7t15-21s+ATF1, 18t15-12s)에 의해 생산된 기억 NK 세포에 대한, 소정 이펙터 대 표적 세포 비에서, 기억 NK 세포에 의한 13일에 시험관내 사멸된 암 세포 (K562)의 백분율을 도시한다.
도 3은 확장제 및 프라이밍제의 소정 조합 (7t15-21s+ATF1, 18t15-12s)에 의해 생산된 기억 NK 세포에 대한, 소정 이펙터 대 표적 세포 비에서, 기억 NK 세포에 의한 17일에 시험관내 사멸된 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 4는 확장제 및 프라이밍제의 소정 조합 (7t15-21s+ATF1, 18t15-12s)에 의해 생산된 기억 NK 세포에 의한 암 세포 (K562) 사멸의 세포 비율에서 EC50을 도시한다.
도 5는 소정 세포 밀도의 배양에서 소정 일수 동안 자극된 NK 세포수의 누적 배수 변화를 도시한다.
도 6은 소정 시간 길이 동안 250 nM의 프라이밍제로 프라이밍된 확장된 세포에 의한 소정 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸된 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 7은 소정 시간 기간 종안 250 nM 프라이밍제 18t15-12s로 프라이밍된 확장된 세포에 대한, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일 및 16일에, 20:1의 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 8은 소정 시간 길이 동안 250 nM 프라이밍제 18t15-12s로 프라이밍된 확장된 세포에 대한, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 및 16일에, 4:1의 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸된 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 9는 소정 시간 길이 동안 250 nM 프라이밍제 18t15-12s로 프라이밍된 확장된 세포에 대한, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 및 16일에, 0.8:1의 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 10은 소정 기간 동안 250 nM 프라이밍제 18t15-12s로 프라이밍된 확장된 세포에 대한, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 및 16일에, 0.16:1의 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 11은 K562 표적 세포의 존재 하에서 또는 단독으로 배양 24시간 후에 세포 배양 (K562 단독, 확장된 NK 세포, 및 확장되고 소정 기간 동안 250 nM 프라이밍제 18t15-12s로 프라이밍된 NK 세포)에서 IFNg 생산을 도시한다.
도 12는 확장 단독, 프라이밍 후 확장, 및 확장 후 프라이밍에 의해 생산된 NK 세포의 확장 배수를 도시한다.
도 13은 단리되거나, 3시간 동안 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍 후 확장되거나, 확장 후 3시간 동안 프라이밍되거나, 확장 후 밤새 프라이밍되거나, 또는 단독 확장된 NK 세포에 대한 소정 이펙터:표적 비에서 시험관내 사멸된 암 세포 (K562) 백분율을 도시한다.
도 14는 단리되거나, 3시간 동안 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍 후 확장되거나, 확장 후 3시간 동안 프라이밍되거나, 확장된 후 밤새 프라이밍되거나, 단독 확장3된 NK 세포의 세포 K562 사멸 EC50을 도시한다.
도 15는 단리되거나, 3시간 동안 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍 후 확장되거나, 확장 후 3시간 동안 프라이밍되거나, 확장 후 밤새 프라이밍되거나, 또는 단독 확장된 NK 세포로부터의 세포 배양 (NK 세포 단독, 또는 K562 세포와 함께)에서 IFNg 생산을 도시한다.
도 16은 면역결핍 NSG 마우스의 혈액 중에서, 3시간 동안 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍되거나, 밤새 프라이밍 후 확장되거나, 단독 확장되거나, 또는 확장 후 3시간 동안 프라이밍되어서 생산된 NK 세포의 수의, t = 0에서 주사 후 7일에 배경값 대비, 배수 변화를 도시한다.
도 17은 확장 및 확장-후-프라이밍된 NK 세포에 의한 14일에 사멸된 K562-Luc를 도시한다.
도 18은 확장 및 확장-후-프라이밍된 NK 세포에 의한 K562-Luc 사멸에 대한 EC50을 도시한다.
본 명세서는 개념적으로 단순하고 효율적인 방식으로 기억/기억-유사 NK 세포를 생성 및 확장시킬 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다. 기억 NK 세포는 NK 세포를 동시에 프라이밍시켜서 기억 NK 세포를 형성하고 원하는 분량으로 확장시키는 과정에서 생성될 수 있다. 대안적으로, NK 세포는 원하는 분량으로 확장된 다음에 프라이밍되어서 기억 NK 세포를 형성한다.
따라서, 본 명세서는 순차적으로,
a) 정제된 NK 세포의 개체군을 확장시키는 단계; 및
b) NK 세포를 프라이밍시키는 단계에 의해서 생산된 기억 자연 살해 (NK) 세포를 제공한다.
또한 본 명세서는 정제된 NK 세포의 개체군을 동시에 프라이밍 및 확장시켜서 생산된 정제된 기억 자연 살해 (NK) 세포를 제공한다.
본 명세서는 또한 순차적으로,
a) NK 세포의 개체군을 정제시키는 단계;
b) NK 세포를 확장시키는 단계; 및
c) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
에 의해서 생산되는 기억 자연 살해 (NK) 세포를 제공한다.
본 명세서는 또한
a) NK 세포의 개체군을 정제시키는 단계; 및
b) NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시키는 단계
에 의해서 생산되는 기억 자연 살해 (NK) 세포를 제공한다.
본 명세서는 또한
a) NK 세포의 정제된 개체군을 확장시키는 단계; 및 이후
b) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
를 포함하는 기억 NK 세포를 제조하는 방법을 개시한다.
또한 본 명세서는 NK 세포의 정제된 개체군을 동시에 프라이밍 및 확장시키는 단계를 포함하는 기억 NK 세포를 제조하는 방법을 개시한다.
또한 본 명세서는
a) NK 세포의 개체군을 정제시키는 단계;
b) NK 세포를 확장시키는 단계; 및 이후
c) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
를 포함하는 기억 NK 세포를 제조하는 방법을 개시한다.
또한 본 명세서는
a) NK 세포의 개체군을 정제시키는 단계; 및
b) NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시키는 단계
를 포함하는 기억 NK 세포를 제조하는 방법을 개시한다.
또한 하기 구현예를 제공한다.
일부 구현예에서, NK 세포 개체군은 도너 혈액, 또는 신선하거나 또는 이전에 저온저장된 백혈구분리물로부터 출발하여 정제된다. 일부 구현예에서, 정제는 양성 선택 (예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy에서)을 통해서 수행된다. 일부 구현예에서, 정제는 음성 선택 (예를 들어, StemCell EasySep NK 세포 농후화 키트)을 통해 수행된다. 일부 구현예에서, 정제는 양성 및 음성 선택의 조합을 사용해 수행된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 림프계 전구체 세포로부터 분화된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 사이토카인의 조합, 또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합, 및 임의로 가교제를 포함하는 확장제에 노출을 통해서 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상, 또는 이의 기능성 단편; 또는
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질;
및 임의로 가교제; 또는
ㆍ NK-세포 가교 항체 및 확장 사이토카인으로 작용화된 미세구;
또는 임의의 전술한 것의 조합을 포함하는 확장제에 노출을 통해 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 IL-7, IL-21, 및 IL-15의 조합, 또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합을 포함하는 확장제에 노출을 통해서 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 IL-7, IL-21, 및 IL-15의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 확장제에 노출에 의해 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 7t15-21s를 포함하는 확장제에 노출에 의해 확장된다.
일부 구현예에서, 확장제는 가교제를 포함한다. 일부 구현예에서, 가교제는 가교 항체이다. 일부 구현예에서, 가교 항체는 ATF1이다.
일부 구현예에서, NK 세포는 7t15-21s 및 ATF1을 포함하는 확장제에 노출을 통해서 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 NK-세포 가교 항체 및 확장 사이토카인으로 작용화된 미세구를 포함하는 확장제에 노출을 통해서 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 1일 내지 40일 동안 확장제에 노출을 통해서 확장된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 7일 내지 21일 동안 확장제에 노출을 통해서 확장된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 약 14일 동안 확장제에 노출에 의해 확장된다.
일부 구현예에서, 확장제는 7t15-21s 및 ATF1을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장제는 0.1-300 nM 농도의 7t15-21s 및 0.01-200 nM 농도의 ATF1을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장제는 0.2-200 nM의 7t15-21s 및 0.01-100 nM 농도의 ATF1을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장제는 약 50 nM의 7t15-21s 및 약 25 nM 농도의 ATF1을 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포는 약 14일 동안 7t15-21s 및 ATF1에 노출에 의해 확장된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 약 14일 동안 약 50 nM 농도의 7t15-21s 및 약 25 nM 농도의 ATF1에 노출에 의해 노출된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 예를 들어, 사이토카인의 조합, 또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합으로부터 선택되는, 프라이밍제에 노출에 의해 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는
ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상;
또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합을 포함하는 프라이밍제에 노출에 의해 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18의 조합을 포함하는 프라이밍제에 노출에 의해 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 프라이밍제에 노출에 의해 프라이밍된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 융합 단백질 18t15-12s를 포함하는 프라이밍제에 노출에 의해 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 200-300 nM 농도의 18t15-12s로 프라이밍된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 250 nM 농도의 18t15-12s로 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 1분 내지 24시간 동안 프라이밍된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 0.5 내지 16시간 동안 프라이밍된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 1 내지 3시간 동안 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 저온저장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 먼저 확장되고 나서, 프라이밍된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 출발 개수의 10배 초과까지 확장된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 출발 개수의 100배 초과까지 확장된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 출발 개수의 1000배 초과까지 확장된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 동시에 확장 및 프라이밍된다.
일부 구현예에서, 세포는 기억-유사 (ML) NK 표현형을 갖는다.
일부 구현예에서, 기억-유사 표현형은 세포 표면 CD69, CD25, CD16, 및/또는 NKG2A의 발현 수준으로 나타난다.
일부 구현예에서, 기억 NK 세포는 프라이밍되지 않은 NK 세포와 비교하여,
a) 암 세포에 대해 개선된 세포독성;
b) 개선된 지속성;
c) 개선된 항-종양 활성; 및/또는
d) 증가된 사이토카인의 생산 중 하나 이상을 갖는다.
일부 구현예에서, 암 세포는 K562 세포이다.
일부 구현예에서, 생산되는 사이토카인은 IFNg, TNFa, GM-CSF, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 지속성은 1일-14일 동안 면역결핍 마우스에서 측정된다.
일부 구현예에서, 마우스는 NSG 마우스이다.
일부 구현예에서, 항-종양 활성은 면역결핍 마우스에서 K562 세포의 종양 성장 감소로서 측정된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 사이토카인-유도 기억-유사 (CIML) NK 세포이다.
일부 구현예에서, 기억 NK 세포는
a) 표적 세포 상의 항원을 표적화하는 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인;
b) 힌지 도메인;
c) 경막 도메인;
d) 임의로, 하나 이상의 공-자극성 도메인; 및
e) 세포질 신호전달 도메인
을 포함하는, 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함한다.
또한, 본 명세서는 증식성 악성종을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 구현예에 따른 기억 NK 세포, 또는 상기 구현예의 방법으로 만들어지는 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 신선하게 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 증식성 악성종은 암이다.
일부 구현예에서, 암은 혈액이다.
일부 구현예에서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수이형성 증후군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 혈액암은 B-세포 림프종이다.
일부 구현예에서, B-세포 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) /소형 림프구성 림프종 (SLL)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 혈액암은 T-세포 림프종이다.
일부 구현예에서, T-세포 림프종은 T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종 (T-ALL), 말초 T-세포 림프종 (PTCL), T-세포 만성 림프구성 백혈병 (T-CLL), 및 세자리 증후군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 혈액암은 백혈병이다.
일부 구현예에서, 백혈병은 급성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 혈액암은 형질 세포 악성종이다.
일부 구현예에서, 형질 세포 악성종은 림프형질세포성 림프종, 형질세포종, 및 다발성 골수종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 흑색종, 신경아세포종, 신경교종, 육종, 또는 암종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 뇌, 머리, 목, 유방, 폐 (예를 들어, 비-소세포 폐암, NSCLC), 생식기 (예를 들어, 난소), 상부 소화관, 췌장, 간, 신장계 (예를 들어, 신장), 방광, 전립선 또는 직결장의 종양이다.
열거 구현예
본 명세서는 또한 하기 구현예를 제공한다:
구현예 1. 순차적으로,
a) 정제된 NK 세포를 확장시키는 단계; 및
b) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
에 의해 생산된 정제된 기억 자연 살해 (NK) 세포의 개체군.
구현예 2. 정제된 NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시켜서 생산된 정제된 기억 자연 살해 (NK) 세포의 개체군.
구현예 3. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 신선하거나 또는 냉동된 백혈구분리물 또는 도너 혈액으로부터 농후화된다.
구현예 4. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 림프계 전구체 세포로부터 분화된다.
구현예 5. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 음성 또는 양성 선택, 또는 이의 조합에 의해 정제된다.
구현예 6. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는
ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상;
또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 7. 구현예 6에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 18t15-12s에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 1분 내지 24시간 동안 프라이밍된다.
구현예 9. 구현예 6에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 10. 구현예 9에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 1분 내지 24시간 동안 프라이밍된다.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 7t15-21s 및 ATF1에 노출에 의해서 확장된다.
구현예 12. 구현예 11에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 1일-40일 동안 확장된다.
구현예 13. 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 기억 NK 표현형은 미처리된 NK 세포와 비교하여, CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지를 나타낸다.
구현예 14. 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 기억 NK 세포는 미처리된 NK 세포와 비교하여
ㆍ 암 세포에 대해 개선된 세포독성;
ㆍ 개선된 지속성;
ㆍ 개선된 항-종양 활성; 및/또는
ㆍ 증가된 사이토카인의 생산 중 하나 이상을 갖는다.
구현예 15. 구현예 14에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 암 세포는 K562 세포이다.
구현예 16. 구현예 14에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 생산된 사이토카인은 IFNg, TNFa, GM-CSF, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
구현예 17. 구현예 14에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 지속성은 1일-14일 동안 면역결핍 마우스에서 측정된다.
구현예 18. 구현예 17에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 마우스는 NSG 마우스이다.
구현예 19. 구현예 14에 따른 기억 NK 세포에 있어서, 항-종양 활성은 면역결핍 마우스에서 암 세포의 종양 성장 감소로서 측정된다.
구현예 20. 임의의 전술한 구현예에 따른 기억 NK 세포에 있어서, NK 세포는 사이토카인-유도 기억-유사 (CIML) NK 세포이다.
구현예 21. 임의의 전술한 구현예에 따른 기억 NK 세포에 있어서,
a. 표적 세포 상의 항원을 표적화하는 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인;
b. 힌지 도메인;
c. 경막 도메인;
d. 임의로, 하나 이상의 공-자극성 도메인; 및
e. 세포질 신호전달 도메인을 포함하는, 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함한다.
구현예 22. 기억 NK 세포를 제조하는 방법으로서,
a) NK 세포의 농후화된 개체군을 정제하는 단계;
b) NK 세포를 확장시키는 단계; 및
c) NK 세포를 프라이밍시키는 단계를 포함한다.
구현예 23. 기억 NK 세포를 제조하는 방법으로서,
a) NK 세포의 농후화된 개체군을 정제하는 단계; 및
b) NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시키는 단계를 포함한다.
구현예 24. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 신선하거나 또는 냉동된 백혈구분리물 또는 도너 혈액으로부터 농후화된다.
구현예 25. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 림프계 전구체 세포로부터 분화된다.
구현예 26. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 음성 또는 양성 선택, 또는 이의 조합에 의해 정제된다.
구현예 27. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는
ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상;
또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 28. 구현예 27에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 18t15-12s에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 29. 구현예 28에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 1분-24시간 동안 프라이밍된다.
구현예 30. 구현예 27에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출에 의해서 프라이밍된다.
구현예 31. 구현예 28에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 2일-40일 동안 프라이밍된다.
구현예 32. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 7t15-21s 및 ATF1에 노출에 의해서 확장된다 .
구현예 33. 구현예 22 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, NK 세포는 1일-40일 동안 확장된다.
구현예 34. 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 기억 NK 표현형은 미처리된 NK 세포와 비교하여, CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지를 나타낸다.
구현예 35. 구현예 22 내지 34 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 기억 NK 세포는 미처리된 NK 세포와 비교하여,
ㆍ 암 세포에 대해 개선된 세포독성;
ㆍ 개선된 지속성;
ㆍ 개선된 항-종양 활성; 및/또는
ㆍ 증가된 사이토카인의 생산 중 하나 이상을 갖는다.
구현예 36. 구현예 35에 따른 방법에 있어서, 암 세포는 K562 세포이다.
구현예 37. 구현예 35에 따른 방법에 있어서, 생산된 사이토카인은 IFNg, TNFa, GM-CSF, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
구현예 38. 구현예 35에 따른 방법에 있어서, 지속성은 1일-14일 동안 면역결핍 마우스에서 측정된다.
구현예 39. 구현예 38에 따른 방법에 있어서, 마우스는 NSG 마우스이다.
구현예 40. 구현예 35에 따른 방법에 있어서, 개선된 항-종양 활성은 면역결핍 마우스에서 암 세포의 종양 성장 감소이다.
구현예 41. 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 세포는 사이토카인-유도 ML (CIML) NK 세포이다.
구현예 42. 증식성 악성종을 치료하는 방법으로서, 방법은 구현예 1-21 중 어느 하나에 따른 기억 NK 세포, 또는 구현예 22-41 중 어느 하나의 방법으로 제조된 기억 NK 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 43. 구현예 42의 방법에 있어서, 세포는 신선하게 환자에게 투여된다.
구현예 44. 구현예 42의 방법에 있어서, 증식성 악성종은 암이다.
구현예 45. 구현예 44의 방법에 있어서, 암은 혈액이다.
구현예 46. 구현예 44의 방법에 있어서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수이형성 증후군으로부터 선택된다.
구현예 47. 구현예 46의 방법에 있어서, 혈액암은 B-세포 림프종이다.
구현예 48. 구현예 47의 방법에 있어서, B-세포 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) /소형 림프구성 림프종 (SLL)으로부터 선택된다.
구현예 49. 구현예 46의 방법에 있어서, 혈액암은 T-세포 림프종이다.
구현예 50. 구현예 49의 방법에 있어서, T-세포 림프종은 T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종 (T-ALL), 말초 T-세포 림프종 (PTCL), T-세포 만성 림프구성 백혈병 (T-CLL), 및 세자리 증후군으로부터 선택된다.
구현예 51. 구현예 46의 방법에 있어서, 혈액암은 백혈병이다.
구현예 52. 구현예 51의 방법에 있어서, 백혈병은 급성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병으로부터 선택된다.
구현예 53. 구현예 46의 방법에 있어서, 혈액암은 형질 세포 악성종이다.
구현예 54. 구현예 53의 방법에 있어서, 형질 세포 악성종은 림프형질세포성 림프종, 형질세포종, 및 다발성 골수종으로부터 선택된다.
구현예 55. 구현예 44의 방법에 있어서, 암은 고형 종양이다.
구현예 56. 구현예 55의 방법에 있어서, 고형 종양은 흑색종, 신경아세포종, 신경교종, 육종, 또는 암종으로부터 선택된다.
구현예 57. 구현예 55의 방법에 있어서, 고형 종양은 뇌, 머리, 목, 유방, 폐 (예를 들어, 비-소세포 폐암, NSCLC), 생식기 (예를 들어, 난소), 상부 소화관, 췌장, 간, 신장계 (예를 들어, 신장), 방광, 전립선 또는 직결장의 종양이다.
면역 이펙터 세포를 확장하고 프라이밍하는 방법
시험관내에서 NK 세포의 확장은 사이토카인, 또는, 바람직하게, 사이토카인의 기능성 단편, 및 이의 다중사슬 복합체를 포함하는 확장 융합 단백질을 사용하는 농후화 과정으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 확장제는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상, 또는 이의 조합, 예를 들어, IL-7, IL-21, 및 IL-15의 칵테일을, 원하는 분량 또는 확장 배수의 NK 세포를 생산하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 이러한 사이토카인은 상업적으로 수득할 수 있거나 또는 당분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 또는, 예를 들어, 확장제는 NK 세포를 확장시키기에 충분한 양으로, 하나 이상의 확장 융합 단백질을 포함할 수 있거나, 또는 예를 들어, WO2020047299, WO202047473, 또는 WO 2020257639에 개시된 다중사슬 융합 단백질 복합체 중에서, 예를 들어, 7t15-21s에서 선택될 수 있다. 7t15-21s의 서열은 표 1에 개시된다.
표 1: 예시적인 확장 융합 단백질 사슬의 서열
Figure pct00001
확장은 가교제, 예컨대 상기 개시된 융합 단백질의 연결 도메인을 표적으로 하는 항체, 예를 들어, 항-조직-인자 항체의 사용을 통해서 추가적으로 촉진된다. 항-조직 인자 항체의 예는 당분야에 공지되어 있다. WO202047473 및 WO2020257639는 사용하려는 a-TF를 개시한다. 또한, US 8,007,795 및 WO2003037911, 특히 H36 하이브리도마의 CDR 및 인간화된 프레임워크 영역 LC-08 (도 12) 및 HC-09 (도 13)가 도입된 IgG1 인간화된 항체를 참조한다. 하기 표 X는 HCW Biologics에서 수득되고, 본 명세서에서 ATF1이라고 하는, 달리 명시하지 않으면, 하기 실험에서 사용되는, US'795 및 WO'911에 개시된 WO'473 및 WO'639에서 사용되는 것으로 여겨지는 a-TF Ab의 서열을 개시한다. ATF1 HCDR2는 하기 2개 서열 중 하나이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 확장제는 그 서열(들)이 표 2에 개시된, ATF1과 같은 가교제와 함께, 상기 개시된 바와 같은 EFP 또는 하나 이상의 사이토카인의 조합을 포함할 수 있다.
표 2: 예시적인 항-TF 항체 ("ATF1")의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
대안적인 가교 방법은 당분야에 공지되어 있고, 작용화된 미세입자 (비드), 피더 세포 및 원형질막 입자를 포함한다. 피더-무함유 시스템이 종종 바람직하다. 예를 들어, 항-CD2 및 항-NKp46 항체로 작용화된 용해성 소듐 알기네이트 미세구를 적용하는, R&D Systems Cloudz 인간 NK 세포 확장 키트는 미세입자를 신속하게 용해시켜서, 세포 수확을 촉진하기 위해 확장 후에 방출 완충액과 함께, 본 명세서에 개시된 바와 같은 확장 사이토카인 (또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 융합 단백질) 및 이의 조합과 사용된다.
기억 유사 특징을 수득하기 위한 프라이밍은 자극성 사이토카인, 예컨대 IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상; IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및 IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상의 조합을 포함하는 프라이밍제를 사용해 수행된다. 대안적으로, 프라이밍제은 사이토카인의 기능성 단편, 및 이의 다중사슬 복합체를 포함하는 프라이밍 융합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 WO2020047299, WO202047473, 또는 WO 2020257639에 개시된 다중사슬 융합 단백질 복합체, 예를 들어, 18t15-12s (HCW-9201)에서 선택될 수 있고, 이의 서열은 표 3에 개시된다.
표 3: 예시적인 프라이밍 융합 단백질 사슬의 서열
Figure pct00004
키메라 항원 수용체 (CAR) 및 CAR-보유 면역 이펙터 세포
본 명세서는 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 그를 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공한다. CAR은 전형적으로 1) 세포외 리간드-결합 도메인, 즉, 항원-인식 도메인, 2) 힌지 도메인, 3) 경막 도메인, 및 4) 세포질 신호전달 도메인, 5) 및 임의로, 공-자극성 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질이다.
CAR 디자인, 전달 및 발현, 및 임상-등급 CAR-발현 세포 개체군의 제조를 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. CAR 디자인은 일반적으로 각 세포 유형에 대해 재단된다.
키메라 항원 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 항원, 전형적으로 악성 세포의 표면-발현 항원을 인식하여서 특이적으로 결합한다. 세포외 리간드-결합 도메인은 약 0.1 pM과 약 10 μM 사이, 또는 약 0.1 pM과 약 1 μM 사이, 또는 약 0.1 pM과 약 100 nM 사이의 친화성 상수 또는 상호작용의 친화성 (KD)을 갖는 항원에 결합할 때, 항원에 특이적으로 결합한다. 상호작용의 친화성을 결정하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 세포외 리간드-결합 도메인은 또한 동일한 항원의 제2 다형성 변이체에 비해서 선택적으로 결합할 때 항원의 제1 다형성 변이체에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다.
CAR에서 사용에 적합한 세포외 리간드-결합 도메인은 임의의 항원-결합 폴리펩티드일 수 있고, 광범위한 이들이 당분야에 공지되어 있다. 일부 예에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 단쇄 Fv (scFv)이다. 다른 항체-기반 인식 도메인 (cAb VHH (낙타 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화된 형태, IgNAR VH (상어 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화된 형태, sdAb VH (단일 도메인 항체 가변 도메인) 및"낙타화" 항체 가변 도메인이 사용에 적합하다. 일부 예에서, T-세포 수용체 (TCR) 기반 인식 도메인 예컨대 단쇄 TCR (scTv, VαVβ를 함유하는 단쇄 2-도메인 TCR)이 또한 사용에 적합하다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 표적 항원에 대한 천연 결합 파트너, 또는 이의 기능성 단편으로부터 구축된다. 예를 들어, 일반적으로, CAR은 B-세포 성숙화 항원 (BCMA) 및 경막 활성인자 및 CAML 상호작용자 (TACI)에 대한 리간드를 표적화하는, APRIL 단백질의 일부로 구축될 수 있어서, 다발성 골수종의 치료를 위해, BCMA 및 TACI 둘 모두를 효과적으로 동시-표적화할 수 있다.
CAR이 이의 세포외 리간드-결합 도메인을 통해서 결합하는 표적화된 항원은 악성 골수성 (AML) 세포, T 세포, 또는 다른 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다. 악성 골수성 (AML) 세포 상에서 발현되는 항원은 CD33, FLT3, CD123, 및 CLL-1을 포함한다. T 세포 상에서 발현되는 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, TCRα (TRAC), 및 TCRβ를 포함한다. 악성 형질 세포 상에서 발현되는 항원은 BCMA, CS1, CD38, CD79A, CD79B, CD138, 및 CD19를 포함한다. 악성 B 세포 상에서 발현되는 항원은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD38, 및 CD45를 포함한다.
전형적으로, 세포외 리간드-결합 도메인은 경막 (TM) 도메인에 의해서 키메라 항원 수용체의 세포내 도메인에 연결된다. 펩티드 힌지는 세포외 리간드-결합 도메인을 경막 도메인에 연결시킨다. 경막 도메인은 세포막을 가로질러서, CAR을 T 세포 표면에 앵커링시키고, 세포외 리간드-결합을 세포질 신호전달 도메인에 연결시켜서, T 세포 표면 상에서 CAR의 발현에 영향을 미친다.
경막 도메인은 천연 유래이거나 또는 합성 공급원 유래일 수 있다. 공급원인 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 경막 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 경막 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예를 들어, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, 및 PAG/Cbp로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 이의 경막 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 경막 도메인은 합성일 수 있고, 주로 소수성 아미노산 잔기 (예를 들어, 류신 및 발린)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 합성 경막 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 경막 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬 이소폼 1 전구체 (NP_001139345.1) 또는 CD28로부터 유래된다. 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예컨대 2개와 10개 사이의 아미노산 길이는 CAR의 내형질 도메인과 경막 도메인 간에 연결부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 경막 도메인의 반복부일 수 있거나, 또는 상이한 경막 도메인일 수 있는, 1개 초과의 경막 도메인을 갖는다.
NK 세포는 활성화 수용체와 회합을 통해서 촉발되는, 활성화 신호전달하는 다수의 경막 (TM) 어댑터를 발현한다. 이것은 활성화 수용체로부터의 TM 도메인 조작을 통해서 NK 세포 특이적 신호 증강을 제공하고, 그리하여 내생성 어댑터를 활용한다. TM 어댑터는 활성화 신호를 전달할 수 있는 임의의 내생성 TM 어댑터일 수 있다. 일부 구현예에서, TM 어댑터는 FceR1γ (ITAMx1), CD3ζ(ITAMx3), DAP12 (ITAMx1), 또는 DAP10 (YxxM/YINM), NKG2D, FcγRIIIa, NKp44, NKp30, NKp46, actKIR, NKG2C, CD8α, 및 IL15Rb로부터 선택될 수 있다.
CAR은 세포외 리간드-결합 도메인 및 경막 도메인 사이에 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 용어 "힌지 영역" (동등하게, "힌지" 또는 "스페이서")은 일반적으로 경막 도메인을 세포외 리간드-결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 힌지 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대해 더 많은 가요성 및 접근성을 제공하기 위해 사용되고, 효율적인 CAR 발현 및 활성을 위해 안정성을 부여할 수 있다. 힌지 영역은 최대 300개 아미노산, 바람직하게 10 내지 100개 아미노산, 및 가장 바람직하게 25 내지 50개 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 예컨대 CD28, 4-1BB (CD137), OX-40 (CD134), CD3ζ, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD45, CD4, CD5, CD8, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, ICOS, CD154와 같은 천연 발생 분자의 전부 또는 일부 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 힌지 서열은 CD8a 분자 또는 CD28 분자로부터 유래된다. 대안적으로, 힌지 영역은 천연 발생 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나 또는 힌지 영역은 완전히 합성 힌지 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8α (SEQ ID NO: 2), FcγRIIIα 수용체, 또는 IgG1의 일부를 포함하고, 이와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
항원 인식 이후에, 세포질 신호전달 도메인은 신호를 면역 이펙터 세포에 전달하여서, 면역 이펙터 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화시킨다. NK 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함한, 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 일반적으로 전체 세포질 신호전달 도메인이 적용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용하는 것이 필요하지는 않다. 세포질 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절두된 부분은 이펙터 기능을 전환시키는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)로서 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. ITAM 함유 세포질 신호전달 서열의 예는 CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc 감마 RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB), 및 FcεRIγ (FCERIG)로부터 유래되는 것들을 포함한다.
1세대 CAR은 전형적으로 내생성 TCR로부터의 신호의 1차 전달자인, CD3 사슬의 세포질 신호전달 도메인을 갖는다. 2세대 CAR은 다양한 공-자극성 단백질 수용체 (예를 들어, CD28, 4-1BB, ICOS)로부터의 세포질 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 신호전달 도메인에 첨가하여 세포에 추가 신호를 제공한다.
"공자극성 도메인"은 사이토카인 생산, 증식, 세포독성, 및/또는 지속성을 생체내에서 증강시키는 공자극성 단백질의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된다. 전임상 연구들은 CAR 디자인의 2세대가 항종양 활성을 개선시킨다고 시사하였다. 보다 최근에, 3세대, 및 이후 세대 CAR은 다수의 공자극성 도메인을 조합하여 역가를 더욱 강화시킨다. 이들 CAR이 그라프트된 세포는 공자극성 수용체/리간드 상호작용과 독립적인 개선된 확장, 활성화, 지속성, 및 종양-박멸 효능을 입증하였다.
예를 들어, CAR의 세포질 신호전달 도메인은 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ)을 단독으로 또는 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 바람직한 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ) 사슬 부분 및 공자극성 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공-자극성 신호전달 영역은 공-자극성 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 의미한다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3, 및 NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 CD3 제타 (CD3ζ) 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공-자극성 도메인은 CD28, 4-1BB의 세포질 도메인, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 공-자극성 신호전달 영역은 하나 이상의 세포내 신호전달 및/또는 공-자극성 분자의 1, 2, 3, 또는 4개 세포질 도메인을 함유한다.
공-자극성 신호전달 도메인(들)은 신호전달을 증강시키는 CD28 및/또는 4-1BB의 세포질 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 Y206 및/또는 Y218에서 인산화가 변경된 CD28의 세포질 도메인의 돌연변이된 형태를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 Y206에 감쇠 돌연변이를 포함하여, CAR의 활성을 감소시키게 된다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 Y218에 감쇠 돌연변이를 포함하여서, CAR의 발현을 감소시키게 된다. 임의의 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 또는 페닐알라닌은 티로신으로 치환되어서 감쇠를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, Y206 및/또는 Y218의 티로신은 포스포모방 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 포스포모방 잔기로 Y206의 치환을 포함하여서, CAR의 활성을 증가시키게 된다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 포스포모방 잔기로 Y218의 치환을 포함하여서, CAR의 발현을 증가시키게 된다. 예를 들어, 포스포모방 잔기는 포스포티로신일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 CAR의 상이한 잔기에서 비-인산화가능 아미노산으로의 치환(들) 및 포스포모방 아미노산의 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어, CAR은 Y206 및/또는 Y218에서 포스포모방 치환에 더해서 Y209 및/또는 Y191에 알라닌 또는 페닐알라닌 치환을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 CAR은 특이적 TRAF 단백질, 예컨대 TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, 또는 이의 임의 조합에 대한 결합을 증강시키는 돌연변이를 갖는 하나 이상의 4-1BB 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 41BB 돌연변이는 예를 들어, NF-kB를 통해서, T-세포의 TRAF1- 및/또는 TRAF2-의존적 증식 및 생존을 증강시킨다. 일부 경우에, 4-1BB 돌연변이는 예를 들어, IRF7/INFβ를 통해서, TRAF3-의존적 항종양 효능을 증강시킨다. 그러므로, 개시된 CAR은 TRAF-결합을 증강시키고/시키거나 NF-kB 신호전달을 증강시키는 이들 강조된 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 4-1BB의 세포질 도메인(들)을 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에 개시된 바와 같이, TRAF 단백질은 일부 경우에, NF-kB 및 4-1BB와 독립적으로 CAR T 세포 기능을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, TRAF 단백질은 일부 경우에 T 세포에서 CD28 공-자극을 증강시킬 수 있다. 그러므로, 또한 본 명세서는 하나 이상의 TRAF 단백질, 예컨대 TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, 또는 이의 임의 조합과 함께 CAR을 공-발현하는 면역 이펙터 세포를 개시한다. 일부 경우에, CAR은 종양 항원을 표적화하는 임의의 CAR이다. 예를 들어, 1세대 CAR은 전형적으로 CD3 사슬로부터의 세포내 도메인을 갖는데 반해서, 2세대 CAR은 다양한 공자극성 단백질 수용체 (예를 들어, CD28, 4-1BB, ICOS)의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 신호전달 도메인에 첨가하여서 T 세포에 추가 신호를 제공하였다. 일부 경우에, CAR은 4-1BB 활성화가 증강된 개시된 CAR이다.
CAR 성분에 대한 변이는 CAR이 발현되는 세포 유형에 따라, 유리할 수 있다.
예를 들어, NK 세포에서, 일부 구현예에서, 경막 도메인은 NKG2D, FcγRIIIa, NKp44, NKp30, NKp46, actKIR, NKG2C, 또는 CD8α와 연관된 서열일 수 있다. 일정 구현예에서, NK 세포는 ML-NK 또는 CIML-NK 세포이고, TM 도메인은 CD8α이다. NK 세포에서 잘 작동하지 않는 일정 TM 도메인은 일반적으로, 서브세트에서 작동할 수 있는데, 예를 들어, CD8α는 ML-NK에서 작동하지만, 일반적으로 NK 세포에서는 작동하지 않는다.
유사하게, NK 세포에서, 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인(들)은 NK 세포에서 기능할 수 있는 임의의 공-활성화 수용체(들), 예컨대, 예를 들어, CD28, CD137/41BB (TRAF, NFkB), CD134/OX40, CD278/ICOS, DNAM-1 (Y-모티프), NKp80 (Y-모티프), 2B4 (SLAMF) :: ITSM, CRACC (CS1/SLAMF7) :: ITSM, CD2 (Y-모티프s, MAPK/Erk), CD27 (TRAF, NFkB), 또는 인테그린 (예를 들어, 다수 인테그린)일 수 있다.
유사하게, NK 세포에서, 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 NK 세포에서 기능할 수 있는 사이토카인 수용체일 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 수용체는 지속성, 생존 또는 물질대사와 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-2/15Rbyc :: Jak1/3, STAT3/5, PI3K/mTOR, MAPK/ERK일 수 있다. 다른 예로서, 사이토카인 수용체는 활성화와 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-18R :: NFkB일 수 있다. 다른 예로서, 사이토카인 수용체는 IFN-γ 생산과 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-12R :: STAT4일 수 있다. 다른 예로서, 사이토카인 수용체는 세포독성 또는 지속성과 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-21R :: Jak3/Tyk2, 또는 STAT3일 수 있다. 다른 예로서, 세포내 신호전달 도메인은 TM 어댑터, 예컨대 FceR1γ (ITAMx1), CD3ζ(ITAMx3), DAP12 (ITAMx1), 또는 DAP10 (YxxM/YINM)일 수 있다. 다른 예로서, CAR 세포내 신호전달 도메인 (엔도도메인이라고도 함)은 CD28 패밀리 (예컨대 CD28 및 ICOS) 또는 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 패밀리 유전자 (예컨대 4-1BB, OX40, 또는 CD27)로부터의 공자극성 분자로부터 유래될 수 있다. TNFR 패밀리 구성원은 TRAF 단백질의 동원을 통해서 신호를 전달하고, 세포 활성화, 분화 및 생존과 연관된다. 모든 NK 세포에서 잘 작동할 수 없는 일정 신호전달 도메인은 일반적으로 서브세트에서 작동할 수 있는데, 예를 들어, CD28 또는 4-1BB는 ML-NK에서 작동한다.
CAR의 임의 도메인은 또한 CAR의 항원 인식 모듈 및 핵심 신호전달을 분할할 목적의 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 기능성 CAR을 생성시키는 임의 조합으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 상기 언급된 도메인의 임의 부분 또는 일부를 포함하도록 디자인될 수 있다.
CAR 및 CAR-보유 세포를 제조하는 방법
키메라 수용체를 코딩하는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 구성체는 통상의 방식으로 제조될 수 있다. 대부분의 부분에 대해서, 천연 서열이 적용되므로, 다양한 성분의 적절한 연결을 허용하기 위해서, 적절하게, 천연 유전자를 단리하고, 조작한다 (예를 들어, II형 수용체를 적용하는 경우에, 면역 신호전달 수용체 성분은 반전되어야 할 수 있음). 따라서, 키메라 수용체의 N-말단 및 C-말단 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 유전자의 원치않는 부분의 결실을 일으키는 적절한 프라이머를 사용한, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 적용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 클로닝된 유전자의 제한효소 분해를 사용하여 키메라 구성체를 생성시킬 수 있다. 모든 경우에서, 서열은 블런트-말단이거나, 또는 상보성 중복부를 갖는 제한효소 부위를 제공하도록 선택될 수 있다.
키메라 구성체를 제조하기 위한 다양한 조작은 시험관내에서 수행될 수 있고, 특정 구현예에서, 키메라 구성체는 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 사용하여 적절한 숙주에서 클로닝 및 발현을 위해 벡터에 도입된다. 따라서, 각각의 조작 이후에, DNA 서열의 연결에 의한 최종 구성체를 클로닝하고, 벡터를 단리하며, 서열을 스크리닝하여서 서열이 원하는 키메라 수용체를 코딩하는 것을 보장한다. 서열은 제한효소 분석, 시퀀싱 등을 통해서 스크리닝될 수 있다.
키메라 구성체는 나형 DNA로서 또는 적합한 벡터로 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 나형 DNA를 사용한 전기천공에 의해서 면역 이펙터 세포를 안정하게 형질감염시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 나형 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 키메라 수용체를 코딩하는 DNA를 의미한다.
대안적으로, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)는 키메라 구성체를 면역 세포, 예를 들어, T 세포에 도입시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 대상체의 면역 이펙터 세포에서 비-복제성이다. 바이러스 기반의 많은 벡터들이 알려져 있고, 세포에서 유지되는 바이러스의 카피수는 세포의 생존능을 유지시킬 만큼 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 pFB-neo 벡터 (STRATAGENE™)를 비롯하여 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV 기반 벡터를 포함한다. 형질감염되거나 또는 형질도입된 면역 이펙터 세포가 원하는 수준 및 원하는 조절로 표면 막 단백질로서 키메라 수용체를 발현할 수 있다는 것이 확고해지면, 키메라 수용체가 숙주 세포에서 기능성이어서 원하는 신호 유도 (예를 들어, 적절한 리간드로 자극 시 Rantes, Mip1-알파, GM-CSF의 생산)를 제공하는지 여부를 결정할 수 있다.
조작된 CAR은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 표적 세포 게놈으로 효율적으로 안정하게 통합시키는, 레트로바이러스를 사용하여 CAR-보유 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 당분야에 공지된 다른 방법은 렌티바이러스 형질도입, 트랜스포존-기반 시스템, 직접 RNA 형질감염, 및 CRISPR/Cas 시스템 (예를 들어, 적합한 Cas 단백질 예컨대 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (또는 CasD), Cash, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas1 Od, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (또는 CasA), Cse2 (또는 CasB), Cse3 (또는 CasE), Cse4 (또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3,Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966 등을 사용하는 I형, II형, 또는 Ill형 시스템)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)가 사용될 수도 있다. 예를 들어, [Shearer RF and Saunders DN, "Experimental design for stable genetic manipulation in mammalian cell lines: lentivirus and alternatives", Genes Cells 2015 January; 20(1):1-10]을 참조한다. 염기-편집 단백질 예컨대 데아미나제에 융합된 Cas-CRISPR 단백질을 포함하는 염기-편집 CRISPR 시스템이 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, Beam Therapeutics의 것).
CAR을 구축하는데 사용될 수 있는 선택된 성분의 아미노산 서열은 하기 표 4 및 표 5에 개시된다.
표 4. 선택된 CAR 성분의 아미노산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
하기 표 5는 인용된 항원을 표적화하는 VH 및 VL 도메인의 서열을 개시한다. 이들 서열은 표 4 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 구성요소와 함께 CAR에 통합될 수 있다.
표 5. 선택된 scFv의 가변 중쇄 (V H ) 및 가변 경쇄 (V L )의 아미노산 서열.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
세포-특이적 변이
상기 개시된 CAR 성분 및 구축 방법은 일반적으로 T 세포 및 다른 면역 이펙터 세포에서 사용에 적합하지만, 완전한 것은 아니다. 세포의 서브세트에서 일정 변이가 유용할 수 있고, 당분야에서 공지되어 잇다.
예를 들어, NK 세포에서, TM 도메인은 NKG2D, FcγRIIIa, NKp44, NKp30, NKp46, actKIR, NKG2C, 또는 CD8α로부터 선택되거나 또는 적합화될 수 있다. NK 세포는 또한 활성화 수용체와 회합을 통해 촉발되는 다수의 경막 어댑터를 발현하여서, NK 세포 특이적 신호 증강을 제공한다. 예를 들어, TM 어댑터는 FceR1γ (ITAMx1), CD3ζ (ITAMx3), DAP12 (ITAMx1), 또는 DAP10 (YxxM/YINM)으로부터 선택되거나 또는 적합화될 수 있다. 일정 구현예에서, TM 도메인 및 어댑터는 예를 들어, NKG2D 및 DAP10, FcγRIIIa 및 CD3ζ 또는 FceR1γ, NKp44 및 DAP12, NKp30 및 CD3ζ 또는 FceR1γ, NKp46 및 CD3ζ 또는 FceR1γ, actKIR 및 DAP12, 및 NKG2C 및 DAP12로 쌍형성될 수 있다.
일정 구현예에서, NK 세포에서, 힌지 도메인은 예를 들어, NKG2, TMα 또는 CD8로부터 선택될 수 있거나 또는 적합화될 수 있다.
일정 구현예에서, NK 세포에서, 세포내 신호전달 및/또는 공자극성 도메인은 CD137/41BB (TRAF, NFkB), DNAM-1 (Y-모티프), NKp80 (Y-모티프), 2B4 (SLAMF) :: ITSM, CRACC (CS1/SLAMF7) :: ITSM, CD2 (Y-모티프s, MAPK/Erk), CD27 (TRAF, NFkB); 하나 이상의 인테그린 (예를 들어, 다수의 인테그린); 지속성, 생존 또는 물질대사와 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-2/15Rbyc :: Jak1/3, STAT3/5, PI3K/mTOR, 및 MAPK/ERK; 활성화와 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-18R :: NFkB; IFN-γ 생산과 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-12R :: STAT4; 세포독성 또는 지속성과 연관된 사이토카인 수용체, 예컨대 IL-21R :: Jak3/Tyk2, 또는 STAT3; 중 하나 이상 및 상기 개시된 바와 같은, TM 어댑터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, NK 세포 CAR은 3개 신호전달 도메인, TM 도메인, 및 임의로, TM 어댑터를 포함한다.
공자극성 도메인의 선택은 또한 NK 세포의 표현형 또는 아형에 의존적일 수 있고, 예를 들어, 일부 실험에서, 4-1BB는 기억-유사 (ML) NK 세포 (CIML 포함)에서 공자극성 도메인만큼 효과적이었지만, NK 세포에서는 덜 효율적일 수 있다. 추가적으로, ML NK 세포에서 보다 선택적으로 발현되는 활용할 수 있는 신호전달 도메인은 DNAM-1, CD137, 및 CD2를 포함한다.
면역 이펙터 세포
본 명세서에 개시된 바와 같은 면역 이펙터 세포는 NK 세포 및 이의 아형, 예컨대 기억 NK 세포, 기억-유사 (ML) NK 세포, 및 사이토카인-유도 기억-유사 (CIML) NK 세포, 및 이의 변이를 포함하고, 이들 모두는 말초 혈액 또는 제대혈 세포, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 불멸화 NK 세포 예컨대 NK-92 세포를 포함한, 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다.
NK 세포
자연 살해 (NK) 세포는 전통적으로 항원 인식 또는 사전 감작화에 의해서가 아니라, 활성화 및 억제성 수용체로부터의 신호의 통합을 통해서 비정상 또는 스트레스된 세포를 표적화하고 제거하여서 병원체에 대한 숙주 방어 및 항종양 면역 반응을 매개하는 선천성 면역 이펙터 림프구로서 여겨진다. 자연 살해 (NK) 세포는 그들이 주요한 독성없이 안전하게 투여되었고, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 초래하지 않으며, 천연적으로 악성 세포를 인식하여 제거시키고, 세포 조작이 가능하기 때문에 동종이계 세포 면역요법을 위한 T 세포의 대안이다.
기억, 기억-유사, 및 CIML NK 세포
그들의 선천성 세포독성 및 면역자극 활성이외에도, NK 세포는 강력한 회상 반응을 시작하는, 일부 경우에 기억-유사 또는 사이토카인-유도-기억-유사 (CIML) NK 세포라고도 불리는 지속성 기억 NK 개체군을 포함한, 불균질하고 다재다능한 세포 서브세트를 구성한다. 기억 NK 세포는 천연적으로 또는 인공적으로 ("프라이밍"), 수용체 경로를 활성화시키거나 또는 프로-염증성 사이토카인에 의한 자극에 의해 생산될 수 있다. 사이토카인 활성화에 의해 생산된 기억 NK 세포는 백혈병 면역요법의 환경에서 임상적으로 사용되어 왔다.
증가된 CD56, Ki-67, NKG2A, 및 증가된 활성화 수용체 NKG2D, NKp30, 및 NKp44가 생체내에서 분화된 기억 NK 세포에서 관찰되었다. 또한, 생체내 분화는 CD16 및 CD11b의 중간치 발현에서 완만한 감소를 보였다. TRAIL, CD69, CD62L, NKG2A, 및 NKp30-양성 NK 세포의 증가된 빈도가 ACT 및 BL NK 세포 둘 모두와 비교하여 ML NK 세포에서 관찰된 데 반해서, CD27+　및 CD127+　NK 세포의 빈도는 감소되었다. 최종적으로, 시험관내 분화된 ML NK 세포와 달리, 생체내 분화된 ML NK 세포는 CD25를 발현하지 않았다.
사이토카인-유도 기억-유사 자연 살해 세포 (CIML-NK)
NK 세포는 예를 들어, 사이토카인, 예컨대 인터루킨-12 (IL-12), IL-15, 및 IL-18의 조합에 의한 프라이밍 (사전활성화)에 의해서, 기억-유사 표현형을 획득하도록 유도될 수 있다. 이들 사이토카인-유도 기억-유사 (CIML) NK 세포 (CIML-NK 또는 CIML)는 사이토카인에 의해 재자극 또는 활성화 수용체를 통한 촉발 시에 증강된 반응을 나타낸다. CIML NK 세포는 사이토카인 예컨대 IL-12, IL-15, 및 IL-18 및/또는 그들 관련 패밀리 구성원, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질에 의한 활성화를 통해서 생산될 수 있다.
기억 NK 세포는 전형적으로 전통적인 NK 세포와 비교했을 때 차등적인 세포 표면 단백질 발현 패턴을 나타낸다. 이러한 발현 패턴은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, CIML NK 세포에서 (대조군 NK 세포와 비교해) 증가된 CD56, CD56 서브세트 CD56dim, CD56 서브세트 CD56bright, CD16, CD94, NKG2A, NKG2D, CD62L, CD25, NKp30, NKp44, 및 NKp46을 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Romee et al. Sci Transl Med. 2016 Sep 21;8(357):357). 기억 NK 세포는 또한 관찰된 시험관내 및 생체내 성질, 예컨대 불균질한 NK 세포 개체군과 비교했을 때, 증강된 이펙터 기능, 예컨대 세포독성, 개선된 지속성, 증가된 IFN-γ 생산 등을 통해서 확인할 수 있다.
약학 조성물
또한 약학적으로 허용가능한 담체에 개시된 분자를 포함하는 약학 조성물이 개시된다. 약학 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 가장 전형적으로 용액, 예컨대 멸균수, 염수, 및 생리적 pH의 완충 용액을 포함하여, 인간에게 약물의 투여를 위한 표준 담체일 것이다. 전형적으로, 약학적으로 허용가능한 염의 적절한 양이 제제에 사용되어서 제제를 등장성이게 만든다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게 약 5 내지 약 8이고, 보다 바람직하게 약 7 내지 약 7.5이다. 용액은 RNAse 무함유여야 한다. 추가 담체는 지속 방출 조제물, 예컨대 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 물품의 형태, 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 미세입자이다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라서 일정 담체가 더 바람직할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
약학 조성물은 선택 분자이외에도, 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분 예컨대 항미생물제, 항염증제, 마취제 등을 포함할 수도 있다.
비경구 투여를 위한 조제물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 염수 및 완충 매질을 포함하여, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스 기반의 것들) 등을 포함한다. 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 가스 등과 같은, 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
치료 적용
본 명세서에 개시되는 NK 세포는 증식성 질환 예컨대 암 및 골수이형성 증후군의 진행의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 암은 혈액학적 악성종일 수 있거나 또는 고형 종양일 수 있다. 혈액학적 악성종은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 이의 아형을 포함한다. 림프종은 호지킨 림프종 (종종 리드-스턴버그 세포의 암이지만, 또한 때때로 B 세포 기원; 모든 다른 림프종은 비-호지킨 림프종임), 비-호지킨 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 버킷 림프종, 소포성 림프종, 및 본 명세서에 정의되고 당분야에 공지된 바와 같은 다른 것들을 포함하여, 종종 악성 세포의 기본 유형을 기반으로 다양한 방식으로 분류될 수 있다. 골수이형성 증후군은 미성숙 백혈구 및/또는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 영향을 미치는 질환군을 포함하고; MDS는 AML로 진행될 수 있다.
B-세포 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) /소형 림프구성 림프종 (SLL), 및 본 명세서에 정의되고 당분야에 공지된 바와 같은 다른 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
T-세포 림프종은 T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종 (T-ALL), 말초 T-세포 림프종 (PTCL), T-세포 만성 림프구성 백혈병 (T-CLL), 세자리 증후군, 및 본 명세서에 정의되고 당분야에 공지된 바와 같은 다른 것들을 포함한다.
백혈병은 급성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 모발 세포 백혈병 (때때로 림프종으로 분류됨), 및 본 명세서에 정의되고 당분야에 공지된 바와 같은 다른 것들을 포함한다.
형질 세포 악성종은 림프형질세포성 림프종, 형질세포종, 및 다발성 골수종을 포함한다.
고형 종양은 흑색종, 신경아세포종, 신경교종 또는 암종 예컨대 뇌, 두경부, 유방, 폐 (예를 들어, 비-소세포 폐암, NSCLC), 생식기 (예를 들어, 난소), 상부 소화관, 췌장, 간, 신장계 (예를 들어, 신장), 방광, 전립선 및 직결장의 종양을 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 대상체에서 수행된다. 본 명세서에 기술된 치료적 방법을 필요로 하는 대상체는 암을 갖거나, 암으로 진단받았거나, 암을 가질 것으로 의심되거나, 또는 암이 발생될 위험성이 있거나, 또는 암의 후기 단계로 진행될 위험성이 있는 대상체일 수 있다. 치료 필요의 결정은 전형적으로, 문제의 질환 또는 병태와 일치되는 이력, 신체 검사, 또는 진단 검사를 통해서 평가될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법으로 치료가능한 다양한 병태의 진단은 당분야의 기술 내에 속한다. 대상체는 포유동물, 예컨대, 말, 소, 개, 고양이, 양, 돼지, 마우스, 래트, 원숭이, 햄스터, 기니피그, 인간, 또는 다른 동물 예컨대 닭을 포함한, 동물 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.
일반적으로, 요법, 예를 들어, 항체 또는 이의 기능성 항원-결합 단편, CAR-보유 면역 이펙터 세포, 또한 항체-약물 접합체의 안전하고 유효한 양은 예를 들어, 원치않는 부작용을 최소화하면서 대상체에서 원하는 치료적 효과를 일으키는 양이다.
본 명세서에 기술된 방법에 따라서, 투여는 비경구, 폐, 경구, 국소, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 종양내, 척수강내, 두개내, 뇌실내, 피하, 비강내, 경막외, 안구, 구강, 또는 직장 투여일 수 있다. 예를 들어, 제품이 생물제제 또는 세포 요법인 경우에, 투여 방식은 아마도 주사 또는 주입에 의할 것이다.
면역요법을 위한 치료 표준 및 조건화 용법
암, 예컨대 AML의 치료에 대한 치료 표준은 화학요법을 포함한 항암 약물 요법 및 표적화 요법을 포함할 수 있다.
예를 들어, 시타라빈 (시토신 아라비노시드 또는 ara-C) 및 안트라사이클린 예컨대 다우노루비신 (다우노마이신) 또는 이다루비신의 병용은 AML에 대한 제1선 화학요법이다. AML을 치료하는데 사용될 수 있는 다른 화학요법제는 클라드리빈 (Leustatin, 2-CdA), 플루다라빈 (Fludara), 미톡산트론, 에토포시드 (VP-16), 6-티오구아닌 (6-TG), 히드록시우레아, 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니손 또는 덱사메타손, 메토트렉세이트 (MTX), 6-머캅토푸린 (6-MP), 아자시티딘 (Vidaza), 및 데시타빈 (Dacogen)을 포함한다. 또한, 표적화 요법이 적절한 환자에서 사용될 수 있는데, 예컨대 FLT-3 돌연변이를 갖는 환자에서 미도스타우린 (Rydapt) 또는 길테리티닙 (Xospata); CD33-양성 AML에서 젬투주맙 오조가미신 (Mylotarg); BCL-2 억제제 예컨대 베네토클락스 (Venclexta); IDH 억제제 예컨대 이보시데닙 (Tibsovo) 또는 에나시데닙 (Idhifa); 및 헤지호그 경로 억제제 예컨대 글라스데깁 (Daurismo)이다. 초기 유도 화학요법 이후에 완전 관해율이 80%만큼 높을 수 있지만, 대부분의 AML 환자는 결국에 재발성 또는 난치성 (RR) 질환으로 진행되고, 5년 생존율이 60세 미만 환자에서 약 35%이고, 60세 이상의 환자에서 10%이다. 다음의 문헌을 참조한다: Walter RB et al., "Resistance prediction in AML: analysis of 4601 patients from MRC/NCRI, HOVON/SAKK, SWOG and MD Anderson Cancer Center," Leukemia 29(2):312-20 (2015) and Dohner, Het al., "Acute Myeloid Leukemia,"　NEJM　373　(12): 1136-52 (2015).
양자 세포 전달 (ACT) 요법은 조건화 용법과 함께 또는 없이 암의 치료에서 가능하다. 전형적으로, ACT 예컨대 HSCT가 악성 장애를 갖는 환자에서 수행될 때, 이식 거부를 예방하기 위한 면역제거를 실시하고, 종양 부담을 감소시키기 위한 절차의 일부로서 예비 또는 조건화 용법이 투여된다. 전통적으로, 이들 목표는 달리 소위 "고강도" 사전-ACT 조건화라고 불리는, 비중복 독성의 화학요법제 및 전신 조사 (TBI)의 치사 선량 이상 (supralethal dose)을 사용하여 달성되었다. 그러나, 악성 숙주 세포에 대한 도너 세포의 면역학적 반응 (즉, 이식편 대 종양 효과)이 실질적으로 ACT의 유효성에 기여한다는 것이 인식되면서, 경감-강도 및 비골수제거 조건화 용법을 개발하여서, 노령 및 의학적으로 허약한 환자를 포함하여, 더 광범위한 환자에게 ACT를 적용가능하게 만들었다.
조건화 용법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 다음의 문헌을 참조한다: Gyurkocza and Sandmaier BM, "Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all,", Blood 124(3): 344-353 (2014). 조건화 용법은 2006년 골수 이식 협력 회의 동안 국제 혈액 및 골수 이식 연구 센터 (Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR))에서 소집한, 경감-강도 조건화 용법 워크샵에 따라서, 고-용량 (골수제거), 경감-강도, 및 비골수제거로서 분류될 수 있다.
정의
달리 정의하지 않으면, 본 개시와 함께 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖게 된다. 또한, 달리 문맥에서 요구하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화의 기술, 및 그와 함께 이용되는 명명법은 당분야에서 충분히 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "항체"는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 구성요소를 포함하거나, 또는 예를 들어, 면역반응하고/하거나, 특정 표적 항원으로 유도되는 폴리펩티드를 의미한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 대로 온전한 항체는 일반적으로 "Y-형상" 구조라고 하는 것으로 서로 함께 회합되는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 (각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 (각각 약 25 kD)로 구성되는 대략 150 kD 사량체이다. 각각의 중쇄는 적어도 4개 도메인 (각각 약 110개 아미노산 길이) - 아미노-말단 가변 (VH) 도메인에 이어서, 3개 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3으로 구성된다. "스위치"로서 알려진 짧은 영역이 중쇄 가변 및 불변 영역을 연결시킨다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지에 연결시킨다. 이러한 힌지 영역의 2개 디술피드 결합은 온전한 항체에서 2개 중쇄 폴리펩티드를 서로에게 연결시킨다. 각각의 경쇄는 "스위치"에 의해서 서로 분리되어 있는, 2개 도메인- 아미노-말단 가변 (VL) 도메인에 이어서, 카르복시-말단 불변 (CL) 도메인으로 구성된다. 온전한 항체 사량체는 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되는데, 중쇄 및 경쇄는 서로 단일 디술피드 결합에 의해서 연결되고, 2개의 다른 디술피드 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결시켜서, 이량체가 서로에 연결되어 사량체가 형성된다. 천연 발생 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 천연 항체의 각 도메인은 압축된 역평형 베타 배럴로 서로에 대해서 팩킹된 2개 베타 시트 (예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성되는 "면역글로불린 폴드"를 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성-결정 영역"으로 알려진 3개 초가변 루프 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 폴딩될 때, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 CDR 루프 영역은 함께 3차원 공간에 모여서 Y 구조의 첨단에 위치된 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성시킨다. 천연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 구성요소에 결합하고, 또한 예를 들어, 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함한, 이펙터 세포 상의 수용체에 결합한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 몇몇 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 가변 단편 (scFv), 및 항체 단편으로 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항원-결합 단편이다.
항체 조작 및 개선을 위한 현행 방법의 고찰은 하기 문헌에서 확인할 수 있다: R. Kontermann and S. Dubel, (2010) Antibody Engineering Vols.1 and 2, Springer Protocols, 2nd Edition and W. Strohl and L. Strohl (2012) Therapeutic antibody engineering: Current and future advances driving the strongest growth area in the pharmaceutical industry, Woodhead Publishing. 항체 및 항원-결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당분야에 충분히 알려져 있고, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 5-8 and 15.
용어 "항원"은 가용성일 수 있거나 또는 세포막 결합될 수 있는 분자적 실체로서, 특히 항체 또는 TCR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적응성 면역계를 통해 인식될 수 있는 분자 실체, 또는 유전자이식 TCR, 키메라 항원 수용체 (CAR), scFv 또는 이의 다량체, Fab-단편 또는 이의 다량체, 항체 또는 이의 다량체, 단쇄 항체 또는 이의 다량체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 조작된 분자, 또는 높은 친화성을 갖는 구조에 대한 결합을 실행할 수 있는 임의의 다른 분자를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다.
CAR의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는 "항원 결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하는 (그리하여 항원을 함유하는 세포를 표적화할 수 있는) CAR의 영역을 의미한다. CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일반적으로, CAR 상의 표적화 영역은 세포외이다. 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 도메인은 예를 들어, 전체 길이 중쇄, Fab 단편, 단쇄 Fv (scFv) 단편, 2가 단쇄 항체 또는 디아바디를 포함할 수 있다. 소정 항원에 특이적으로 결합하는 임의 분자, 예컨대 아피바디 또는 천연 발생 수용체 유래 리간드 결합 도메인이 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 종종 항원 결합 도메인은 scFv이다. 보통, scFv에서, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분이 가요성 링커에 의해 융합되어서 scFv를 형성한다. 이러한 링커는 예를 들어, (GGGG4S)3 일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 도메인이 CAR을 사용하려는 동일 종으로부터 유래되는 것이 유리하다. 예를 들어, 인간에서 치료적으로 사용하려고 계획된 경우에, CAR의 항원 결합 도메인은 이의 인간 또는 인간화된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 단편은 당분야에 충분히 공지된 다양한 방법으로 만들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 친화성"은 분자 상의 부위에서 서로에 대한 한 분자의 결합 강도를 의미한다. 특정 분자가 다른 특정 분자에 결합하게 되거나 또는 특이적으로 회합하게 되는 경우에, 이들 2개 분자는 서로에 대해서 결합 친화성을 나타낸다고 한다. 결합 친화성은 분자 쌍에 대한 결합 상수 및 해리 상수와 관련되지만, 이들 상수를 측정하거나 또는 결정하는 것은 본 명세서의 방법에서 중요하지 않다. 오히려, 기술된 방법의 분자들 간에 상호작용을 설명하기 위해서 본 명세서에서 사용되는 친화성은 일반적으로 (달리 명시하지 않으면) 경험적 연구에서 관찰되는 겉보기 친화성이고, 한 분자 (예를 들어, 항체 또는 다른 특이적 결합 파트너)가 2개의 다른 분자 (예를 들어, 펩티드의 2개 형태 또는 변이체)에 결합하게 되는 상대 강도를 비교하는데 사용될 수 있다. 결합 친화성, 결합 상수, 해리 상수의 개념은 충분히 알려져 있다.
용어 암은 악성 신생물로서 의학적으로 알려져 있다. 암은 상향조절된 세포 성장을 포함한 광범위 질환군이다. 암에서, 세포 (암성 세포)는 비제어적으로 분열되고 성장되어서, 악성 종양을 형성하고, 신체의 근처 부분으로 침입한다. 암은 또한 림프계 또는 혈류를 통해서 신체의 보다 먼 부분으로 확산될 수 있다. 인간에서 발병되는 알려진 200가지가 넘는 상이한 암이 존재한다.
용어 "화학요법"은 표준화된 용법의 일부로서 하나 이상의 세포독성 항-신생물 약물 ("화학요법제" 또는 "화학요법 약물")로 암 (암성 세포)의 치료를 의미한다. 화학요법은 치료 의도로 제공될 수 있거나 또는 생명을 연장시키거나 또는 증상을 완화시키기 위한 목적일 수 있다. 이것은 종종 다른 암 치료, 예컨대 방사선 요법, 수술, 및/또는 온열 요법과 함께 사용된다. 전통적은 화학요법제는 대부분의 암 세포의 주요 성질 중 하나인, 빠르게 분열되는 세포를 사멸시켜서 작용한다. 이것은 화학요법이 또한 정상 상황에서 빠르게 분열되는 세포, 예컨대 골수, 소화관, 및 모낭의 세포에도 유해하다는 것을 의미한다. 이로 인한 화학요법의 가장 일반적인 부작용, 예컨대 골수억제 (혈액 세포의 생산 감소로 인한, 역시 면역억제), 점막염 (소화관 내막의 염증), 및 탈모증 (모발 손실)이 야기된다.
용어 "키메라 항원 수용체", 약칭 "CAR"은 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포에 항원 특이성을 이식시킨, 조작된 수용체를 의미한다. 본 명세서에 개시되는 CAR은 항원 표적화 영역으로도 알려진 항원 결합 도메인 (전형적으로 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 단쇄 가변 영역), 세포외 스페이서/링커 도메인 또는 힌지 영역, 경막 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 다른 구성요소, 예컨대 적어도 하나의 공-자극성 도메인을 포함할 수도 있다. 세포외 도메인은 또한 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 상응하는 항원에 대한 항원-특이적 영역의 결합 시, 신호전달 도메인은 숙주 세포에서 이펙터 세포 기능을 매개한다.
용어 "병용 면역요법"은 2개 요법 접근법, 예를 들어, 암과 같은 질환의 치료를 위해 당분야에 공지된 요법 병용법의 공동 적용을 의미한다. 용어 "병용 면역요법"은 또한 면역요법 예컨대 항원 인식 수용체를 사용한 치료 및 다른 요법 예컨대 조혈 세포 예를 들어, 항원 인식 수용체에 의한 인식에 내성인 조혈 세포의 이식의 공동 적용을 의미할 수도 있다. 세포 상에서 항원의 발현은 항원이 세포의 세포 표면에 충분히 존재하여서, 항원-인식 수용체에 의해 검출, 결합 및/또는 인식될 수 있다는 것을 의미한다.
"공자극성 신호전달 영역" (동등하게, 공자극성 또는 "공-자극" 도메인)은 공자극성 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 의미한다. 공자극성 분자는 면역 이펙터 세포의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그들 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극성 분자에 대한 예는 상기에 논의되고 당분야에 공지되어 있다. 전형적으로 2개와 10개 사이의 아미노산 길이인, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 세포내 신호전달 도메인의 구성요소 간에 연결부를 형성할 수 있다. 주요한 링커는 글리신-세린 이중항이다.
NK 세포와 관련하여, 용어 "사이토카인-유도 기억-유사", 또는 동등하게, "CIML"은 "기억" 또는 "기억-유사" 표현형을 갖고 프라이밍제를 사용해 생산되는 것을 의미한다.
기억 NK 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포독성"은 질환 세포를 표적화하여 사멸시키는 세포의 능력을 의미한다.
"질환 세포"는 정상 또는 건강한 상태에서 벗어나서, 병원체, 독성 물질, 조사, 또는 세포 내부 탈조절의 영향으로 인해 발생될 수 있는 세포, 조직 또는 유기체의 상태를 의미한다. "질환 세포"는 또한 병원성 바이러스로 감염된 세포를 의미한다. 또한 용어 "질환 세포"는 개체에서 암을 구성하거나 또는 발생시킬 수 있는 악성 세포 또는 신생물성 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조작된 세포" 및 "유전자 변형 세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 용어는 외래 유전자 또는 핵산 서열의 함유 및/또는 발현, 또는 이의 천연 형태 또는 기능에서 벗어나도록 유전자 변형 (예를 들어, 결실 또는 녹아웃 유전자)되어서 세포 또는 이의 자손의 유전자형 또는 표현형을 변형시키는 유전자의 함유를 의미한다. 세포는 천연 상태에서 이들 세포에서 발현되지 않는, 펩티드 또는 단백질을 안정하게 또는 일시적으로 발현하도록 충분히 공지된 재조합 방법을 통해서 변형될 수 있다. 세포를 유전자 변형시키는 방법은 형질감염, 전기천공, 뉴클레오펙션, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 비-통합 레트로- 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입, 트랜스포존, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR/Cas를 포함한 디자이너 뉴클레아제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
NK 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "농후화시키다"는 추가 분석 또는 사용을 위해서 농축, 정제 또는 단리하는 것을 의미한다. 농후화되고 정제된 세포 개체군은 대다수의 바람직한 세포, 및 무시할만한 분획의 다른 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배수 선택적"은 다른 표적에 대한 이의 친화성에 비해서 적어도 x-배 초과인 한 표적에 대한 친화성을 갖는 것을 의미하고, 여기서 x는 적어도 2이고, 더 높을 수 있는데, 예를 들어, 10, 20, 50, 100, 또는 1000일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 배수 선택성은 치료적으로 의미있는데, 즉 한 표적을 발현하는 세포를 사멸시키고, 나머지 표적을 보유하는 세포를 남겨두도록 허용하기에 충분하다.
용어 "유전자 변형" 또는 "유전적으로 변형"은 세포의 게놈 DNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 핵산 함량의 변형을 의미한다. 이것은 핵산 서열의 단일 뉴클레오티드 또는 단편의 교환 또는 결실을 도입시킨 세포 게놈 DNA 서열의 변경을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 또한 세포 게놈 DNA 서열의 직접 또는 간접 변경을 야기시키는지 여부와 무관하게 세포로 핵산의 임의 도입을 의미한다.
용어 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구체 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 조혈할 수 있는 (즉, 적혈구 세포, 림프구, 및 골수구를 포함한, 상이한 혈액 세포 유형을 증식시킬 수 있고 적어도 부분적으로 재구성할 수 있는) 조혈 계통 세포의 개체군을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조혈 세포"는 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구체 세포로부터 분화되어서 혈액 세포 (즉, 적혈구 세포, 림프구, 및 골수구를 포함한, 혈액 세포 유형)를 형성하는 세포를 포함한다.
항원-인식 수용체에 의한 항원의 인식에 내성인 도너 조혈 세포는 세포가 항원에 특이적인 항원-인식 수용체에 의해서 쉽게 검출, 결합 및/또는 인식될 수 없거나 또는 검출, 결합 및/또는 인식이 손상되어서, 세포가 면역요법 동안 사멸되지 않는 것을 의미한다.
용어 "면역 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"는 면역계의 일부일 수 있고 특정 이펙터 기능을 실행하는 세포, 예컨대 알파-베타 T 세포, NK 세포 (기억 NK, ML-NK, 및 CIML-NK 포함), NKT 세포 (iNKT 세포 포함), B 세포, 선천성 림프계 세포 (ILC), 사이토카인 유도 살해 (CIK) 세포, 림포카인 활성화 살해 (LAK) 세포, 감마-델타, T 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 기질 세포 (MSC), 단핵구 및 마크로파지를 의미한다. 바람직한 면역 세포는 세포독성 이펙터 기능을 갖는 세포 예컨대 알파-베타 T 세포, NK 세포 (기억 NK, ML-NK, 및 CIML-NK 포함), NKT 세포 (iNKT 세포 포함), ILC, CIK 세포, LAK 세포 또는 감마-델타 T 세포이다. "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 의미하는 것으로서, NK 세포에서 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다.
용어 "면역요법"은 "면역 반응의 유도, 증강, 또는 억제를 통한 질환의 치료"로서 정의되는 의학 용어이다. 면역 반응을 유발시키거나 또는 증폭시키도록 디자인된 면역요법은 활성화 면역요법으로서 분류되는 한편, 감소 또는 억제하는 면역요법은 억제 면역요법으로서 분류된다. 활성화 면역요법으로서 암 면역요법은 종양을 거부하여 파괴하도록 면역계를 자극시키고자 시도된다. 양자 세포 전달은 암 세포를 공격하기 위해 세포-기반 세포독성 반응을 사용한다. 환자의 암에 대해서 천연 또는 유전자 조작된 반응성을 갖는 면역 세포 예컨대 T 세포는 시험관내에서 생성된 다음에 암 환자에게 다시 전달된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 동물을 의미한다. 우선적으로, 개체는 포유동물 예컨대 마우스, 래트, 소, 돼지, 염소, 닭, 개, 원숭이 또는 인간이다. 보다 우선적으로, 개체는 인간이다. 개체는 질환 예컨대 암을 앓는 개체 (환자)일 수 있지만, 대상체는 또한 건강한 대상체일 수 있다.
CAR의 "세포내 신호전달 도메인" (동등하게, 세포내 또는 엔도도메인의 일부인, 세포질 신호전달 도메인 또는 이펙터 도메인)은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 의미하고, 예를 들어, NK 세포에서, 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고 CAR을 발현하는 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 의미한다.
세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 소정 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 임의의 완전하거나 또는 절두된 부분을 포함할 수 있다. CAR에서 사용을 위한 세포내 신호전달 도메인의 주요 예에는 항원 수용체 관여 이후에 신호 전달을 개시하도록 협력하여 작용하는 공-수용체 및 수용체의 세포질 서열이 포함된다.
일반적으로, 면역 이펙터 세포의 CAR 활성화는 2개 클래스의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개될 수 있는데, 첫번째로는 CAR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열), 및 두번째로 2차 또는 공-자극성 신호를 제공하도록 항원-독립적 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열, 공자극성 신호전달 도메인)이다. 그러므로, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포질 신호전달 도메인 및 임의로 2차 세포질 신호전달 도메인 (즉, 공자극성 또는 "공-자극" 도메인)을 포함할 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs signaling motif)을 함유할 수 있다. CAR에서 종종 사용되는 ITAM 함유 1차 세포질 신호전달 서열의 예는 본 명세서에 개시되고 당분야에 공지되어 있다.
용어 "악성" 또는 "악성종"은 신생물을 구성하거나, 신생물로부터 유래되거나, 또는 새로운 신생물성 세포의 기원일 수 있는, 세포, 세포군 또는 조직을 설명한다. 이 용어는 조직의 정상 또는 건강한 세포와 대조적으로 신생물성 세포를 설명하는데 사용된다. 악성종이 이의 성장에서 자기-제한적이지 않고, 인접한 조직으로 침입할 수 있고, 먼 조직으로 확산될 수도 있다는 점에서 악성 종양은 비-암성 양성 종양과 대조된다. 양성 종양은 그러한 특성을 전혀 갖지 않는다. 악성종은 역형성, 침입성, 및 전이를 비롯한 게놈 불안정성을 특징으로 한다. 용어 "전악성 세포"는 아직 악성은 아니지만 악성이 될 준비가 된 세포 또는 조직을 의미한다.
NK 세포와 관련하여, 용어 "기억" 또는 "기억-유사"는 NK 세포의 일반 개체군과 비교하여 개선된 세포독성 및 수명/지속성을 갖는 활성화된 표현형을 갖는 것을 의미하고, 전형적으로 NK 세포의 일반 개체군과 비교하여, CD69, CD25, 및 NKG2A의 증가된 세포 표면 발현, 및 CD16의 발현 유지를 나타낸다.
본 개시에서 기술되는 항체에 적용되는, 용어 "단일클론 항체" (mAb)는 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론으로부터의 단일 카피 또는 클론에서 유래되는 화합물이고, 이를 생산하는 방법이 아니다. 본 개시의 mAb는 균질하거나 또는 실질적으로 균질한 개체군으로 존재할 수 있다.
뵨 명세서에서 사용되는 용어 "지속성"은 계속 살아가는, 특히 대상체에게 양자적으로 전달된, 세포의 능력을 의미한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하고자 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체를 비롯하여, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
NK 세포와 관련하여, 용어 "프라이밍"은 프라이밍제를 사용하여 기억/기억-유사 표현형으로 자극되거나 또는 활성화되는 것을 의미한다. "프라이밍제"는 자극성 사이토카인의 조합, 예를 들어,
ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상,
또는 이러한 사이토카인의 기능성 단편, 또는 하나 이상의 이의 다중사슬 복합체를 포함하는 하나 이상의 "프라이밍 융합 단백질"을 포함한다. 이러한 단백질의 예는 본 명세서에 개시된다.
일반적으로, 용어 "수용체"는 가용성일 수 있거나 또는 세포 표면 막에 부착될 수 있고, 세포 표면 막에 부착될 수 있거나 또는 가용성일 수 있는 정의된 구조에 특이적으로 결합하는 생분자를 의미한다. 수용체는 항체 및 항체 유사 구조, 부착 분자, 유전자이식 또는 천연 발생 TCR 또는 CAR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-인식 수용체"는 막 결합 또는 가용성 수용체 예컨대 천연 TCR, 유전자이식 TCR, CAR, scFv 또는 이의 다량체, Fab-단편 또는 이의 다량체, 항체 또는 이의 다량체, 이중-특이적 T 세포 인핸서 (BiTE), 디아바디, 또는 높은 친화성으로 특이적 결합을 수행할 수 있는 임의의 다른 분자일 수 있다.
용어 "부작용 감소"는 항원 인식 수용체를 사용한 면역요법의 임의의 합병증, 원치않거나 또는 병리학적인 결과의 중증도, 예컨대 항원-발현 비-표적 세포에 대한 독성의 감소를 의미한다. "부작용 감소"는 또한 항원 인식 수용체를 사용한 면역요법 동안 환자에 대한 통증, 유해성 또는 사망 위험성을 감소시키거나 또는 피하는 조치를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 서열 일치를 최적화하도록, 즉 갭 및 삽입을 고려하여, 서열을 정렬했을 때 둘 이상의 서열의 상응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다. 동일성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 시험되는 서열들 간 최대 일치를 제공하도록 디자인된다. 게다가, 동일성을 결정하는 방법은 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 코드화된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman의 국소 상동성 알고리즘에 의해서, 상동성 정렬 알고리즘에 의해서, 유사성 방법에 대한 검색에 의해서, 또는 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (Accelrys, Inc. (San Diego, California, United States of America)에서 입수가능한, GCG 위스콘신 패키지의 GAP, BESTFIT, PASTA, 및 TFASTA)에 의해서, 또는 육안 조사에 의해서 수행될 수 있다. 일반적으로, 하기 문헌을 참조한다: Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) 및 Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997). 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 알고리즘이다.
CAR의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는, "신호 펩티드"는 세포 내에서, 예를 들어, 일정 세포 소기관 (예컨대, 소포체) 및/또는 세포 표면으로 단백질의 수송 및 국재화를 유도하는 펩티드 서열을 의미한다.
CAR의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "스페이서" 또는 "힌지"는 항원 결합 도메인과 경막 도메인 사이의 친수성 영역을 의미한다. 본 명세서에서 개시되는 CAR은 세포외 스페이서 도메인을 포함할 수 있지만, 또한 이러한 스페이서를 통과하는 것도 가능하다. 스페이서는 항체의 Fc 단편 또는 이의 단편, 항체의 힌지 영역 또는 이의 단편, 항체의 CH2 또는 CH3 영역, 보조 단백질, 인공 스페이서 서열 또는 이의 조합을 포함한다. 스페이서의 주요한 예는 CD8알파 힌지이다.
항원-인식 수용체와 관련하여 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인" 또는 "특이적으로 인식하다"는 항원의 특이적 다형성 변이체를 인식하여 결합하지만, 다른 변이체는 실질적으로 인식하거나 또는 결합하지 않는 항원-인식 수용체의 항원-결합 도메인을 의미한다.
용어 "부작용"은 바람직한 치료 결과 이외에도 발생되는 항원 인식 수용체를 사용한 면역요법의 임의의 합병증, 원치않거나 또는 병리학적 결과를 의미한다. 용어 "부작용"은 항원-발현 비-표적 세포이지만, 본 명세서에 기술된 바와 같은 질환 세포는 아닌, 세포 상에 표적 항원의 존재 경우에, 면역요법 동안 발생될 수도 있는 표적-적중 종양-이탈 독성을 우선적으로 의미한다. 면역요법의 부작용은 이식편 대 숙주 질환의 발생일 수 있다.
용어 "표적" 또는 "표적 항원"은 임의의 세포 표면 단백질, 당단백질, 당지질 또는 표적 세포의 표면에 존재하는 임의의 다른 구조를 의미한다. 이 용어는 또한 표적 세포 상에 존재하는 임의의 다른 구조, 특히 항체 또는 TCR, 이식유전자 TCR, CAR, scFv 또는 이의 다량체, Fab-단편 또는 이의 다량체, 항체 또는 이의 다량체, 단쇄 항체 또는 이의 다량체, 또는 높은 친화성으로 구조에 대한 결합을 실행할 수 있는 임의의 다른 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 조작된 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 적응성 면역계에 의해서 인식될 수 있는 구조를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 세포"는 개체에게 적용되거나 또는 적용될 항원-인식 수용체에 의해 인식되는 세포를 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 치료적 이득을 제공하는 양을 의미한다.
CAR의 "경막 도메인"은 이러한 도메인에 대한 임의의 바람직한 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연일 때, 도메인은 임의의 막-결합 또는 경막 단백질로부터 유래될 수 있다. 경막 도메인은 예를 들어, CD8알파, CD28, NKG2D, 또는 본 명세서에 개시되거나 또는 당분야에 공지된 다른 것들로부터 유래될 수 있다. 핵심 신호전달 및 항원 인식 모듈이 2개 (또는 그 이상) 폴리펩티드에 존재할 때, CAR은 2개 (또는 그 이상)의 경막 도메인을 가질 수 있다. 핵심 신호전달 및 항원 인식의 분할은 CAR의 각 폴리펩티드에서 소형 분자-의존적 이종이량체화 도메인으로 인해서 CAR 세포 발현에 대해 소형 분자-의존적, 적정가능 및 가역적 제어를 가능하게 한다 (Wu et al, 2015, Science 350: 293-303).
본 명세서에서 사용되는 용어 "이식하다"는 도너 세포, 예를 들어, 조혈 세포 또는 CAR-보유 면역 이펙터 세포의 개체군을 대상체에게 투여하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 예시된다.
실시예 1. 확장 단독, 확장 동안 프라이밍, 및 확장 후 프라이밍의 시험관내 배양 및 활성
재료 및 방법: NK 세포는 CD3 고갈 및 CD56 양성 선택을 사용하여 전체 혈액으로부터 단리되었다. 이어서 선택된 NK 세포는 NK MACS 배지 + 보충물 + 10% HI-HAB 중에 96-웰 플레이트에서 배양되었고, 하기 조건에서 프라이밍/배양되었는데, 1x 7t15-21s 및 ATF1은 각각 200 nM 및 100 nM이고, 1x 18t15-12s는 250 nM이고; 모든 희석은 표시된 바와 같은 이들 값으로부터 계산된다.
a) 확장 단독: 2일, 6일, 또는 10일 동안, 37deg, 5%CO2에서 표시된 농도로 + 7t15-21s 및 ATF1. 이후 2일 마다, 7t15-21s 및 ATF1은 표시된 농도까지 신선한 배지와 함께 보충되었다.
b) 확장 동안 프라이밍: 2일, 6일, 또는 10일 동안, 37deg, 5%CO2에서, 표시된 농도로 + 18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1. 이후 2일 마다, 18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1은 표시된 농도까지 신선한 배지와 함께 보충되었다.
c) 확장 후 프라이밍: 2일, 6일, 또는 10일 동안, 37deg, 5%CO2에서, 표시된 농도로 + 7t15-21s 및 ATF1. 이후 2일 마다, 7t15-21s 및 ATF1은 표시된 농도로 신선한 배지와 함께 보충되었다. 표시된 바와 같이 2일차, 6일차, 또는 10일차에, 18t15-12s는 표시된 농도로 밤새 첨가되었다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 표현형을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, NK 세포를 수확하고, 세척하였으며, 순도 및/또는 활성화 마커, 예를 들어, 항-CD56, 항-CD3, Live/Dead Yellow, 항-NKG2A, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-CD16을 포함하는 플로우 패널로 염색하여서 수용체 발현에 대해 평가되었다. 하기 클론을 사용하였다:
ㆍ 항-CD45 (HI30 클론)
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론)
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론)
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher)
ㆍ 항-NKG2A (REA110 클론)
ㆍ 항-CD69 (FN50 클론)
ㆍ 항-CD25 (CD25-4E3 클론)
ㆍ 항-CD16 (eBioCD16 클론)
Attune NXt 유세포측정계가 사용되었다. 이어서 데이터는 Flowjo v10.7에서 분석되어서, 생 CD56+CD3- 세포에 대해 게이팅되고, 상기 기술된 마커 각각의 중간 형광 강도를 평가하였다. CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지는 CIML-NK 세포 표현형을 나타낸다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 사멸 활성을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, 배양된 NK 세포를 수확 및 세척하였고, 이어서 10% 인간 AB 혈청 (Gibco) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, IL-2 (Miltenyi) 존재 또는 부재에서, 24-48시간에 표시된 이펙터 대 표적 (E:T) 비로 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 이후 루시퍼라제 활성 (생 K562 세포)은 루시퍼라제 판독 (Promega)을 통해 평가되었다. 데이터는 도시되지 않았다.
결과: 이 실시예는 상기 과정을 통해 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
결과는 표 6-11에 표시되고, 개별 유전자에 대한 표면 단백질 발현, 세포 크기, 및 중간 형광 강도의 누적 배수 변화를 보여준다.
표 6. 누적 배수 변화의 평균
Figure pct00011
표 7. 세포 크기 (FSC)
Figure pct00012
Figure pct00013
표 8. CD25 MFI
Figure pct00014
Figure pct00015
표 9. CD69 MFI
Figure pct00016
Figure pct00017
표 10. CD16 MFI
Figure pct00018
Figure pct00019
표 11. NKG2A MFI
Figure pct00020
Figure pct00021
대안적으로, 림프계 전구체 세포, 예컨대 iPSC 세포, 또는 제대혈 NK 세포를 적합한 배지에서 배양할 수 있고, NK 세포는 프라이밍 및/또는 확장될 수 있는 형태로 분화된다.
실시예 2. 시험관내 확장 및 중간 또는 종료 시 프라이밍으로 프라이밍
재료 및 방법: 정제된 NK 세포는 2일마다 다양한 농도의 확장제 7t15-21s 및 ATF1로 처리되었다. 6일차 및 14일차에, 200 nM 및 100 nM의 7t15-21s 및 ATF1로 확장된 세포는 250 nM의 18t15-12s로 활성화되었고, 200 nM 및 100 nM의 7t15-21s 및 ATF1과 함께 계속 확장되었다. 6일, 13일 및 17일 이후에, NK는 RPMI + 10% 열-불활성화된 FBS 중 K562-Luc2 세포 (ATCC)의 플레이트에 표시된 비로 첨가되었다. 이어서 플레이트를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. K562 세포의 사멸은 루시퍼라제 판독을 통해 측정되었다. EC:50이 낮을수록 더 양호한 사멸로 간주된다.
결과: 이 실시예는 대규모로 상기 과정에 의해 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
결과는 도 1-4에 도시된다.
실시예 3. 확장 단독, 확장 동안 프라이밍, 확장 후 프라이밍, 및 확장 후 프라이밍 및 확장의 시험관내 배양 및 활성
재료 및 방법: NK 세포는 CD3 고갈 및 CD56 양성 선택을 사용하여 전체 혈액으로부터 단리되었다. 이어서 선택된 NK 세포를 NK MACS 배지 + 보충물 + 10% HI-HAB 중에 96-웰 플레이트에서 배양하였고, 하기 조건으로 프라이밍/확장시켰는데, 1x 7t15-21s 및 ATF1는 각각 200 nM 및 100 nM이고, X/4는 각각 50 nM 및 25 nM이다:
a) 확장 단독: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 +1x 또는 X/4 7t15-21s 및 ATF1. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 7t15-21s 및 ATF1은 신선한 배지와 함께 1x 또는 X/4 까지 보충되었다.
b) 확장 동안 프라이밍: 6일 동안 37deg, 5%CO2에서 250 nM/1x, 250 nM/x/4, 62.5 nM/1x, 또는 62.5 nM/x/4의 +18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1은 신선한 배지와 함께 표시된 농도까지 보충되었다.
c) 확장 후 프라이밍: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 +1x 또는 X/4 7t15-21s 및 ATF1. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 7t15-21s 및 ATF1은 신선한 배지와 함께 1x 또는 X/4까지 보충되었다. 표시된 바와 같이 6일차 또는 14일차에, 18t15-12s는 250 nM 또는 62.5 nM로 3시간 동안 첨가되었다.
d) 확장 후 프라이밍 및 확장 3시간: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 +1x 또는 x/4 7t15-21s 및 ATF1. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 7t15-21s 및 ATF1은 신선한 배지와 함께 1x 또는 x/4까지 보충되었다. 6일차 또는 14일차에, 18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1은 250 nM/1x, 250 nM/x/4, 62.5/1x, 또는 62.5/x/4로 3시간 동안 첨가되었다.
e) 확장 후 프라이밍 및 확장 48시간: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 +1x 또는 x/4 7t15-21s 및 ATF1. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 7t15-21s 및 ATF1은 신선한 배지와 함께 1x 또는 x/4 까지 보충되었다. 6일차 또는 14일차에, 18t15-12s, 7t15-21s 및 ATF1은 48시간 동안 250 nM/1x, 250 nM/x/4, 62.5 nM/1x, 또는 62.5 nM/x/4로 첨가되었다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 표현형을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, NK 세포를 수확하고, 세척하였으며, 순도 및/또는 활성화 마커, 예를 들어, 항-CD56, 항-CD3, Live/Dead Yellow, 항-NKG2A, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-CD16을 포함하는 플로우 패널로 염색하여 수용체 발현에 대해 평가하였다. 하기 클론을 사용하였다:
ㆍ 항-CD45 (HI30 클론)
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론)
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론)
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher)
ㆍ 항-NKG2A (REA110 클론)
ㆍ 항-CD69 (FN50 클론)
ㆍ항-CD25 (CD25-4E3 클론)
ㆍ 항-CD16 (eBioCD16 클론)
Attune NXt 유세포측정계가 사용되었다. 이어서 데이터는 Flowjo v10.7에서 분석되어서, 생 CD56+CD3- 세포에 대해 게이팅되고, 상기 기술된 마커 각각의 중간 형광 강도를 평가하였다. CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지는 CIML-NK 세포 표현형을 나타낸다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 사멸 활성을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, 배양된 NK 세포를 수확 및 세척하였고, 이어서 10% 인간 AB 혈청 (Gibco)) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, IL-2 (Miltenyi) 존재 또는 부재에서, 24-48시간에 표시된 이펙터 대 표적 (E:T) 비로 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 이후 루시퍼라제 활성 (생 K562 세포)은 루시퍼라제 판독 (Promega)을 통해 평가되었다.
결과: 이 실시예는 상기 과정으로 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
결과는 표 12-17에 표시되고, NK 세포수의 누적 배수 변화, 개별 표면 단백질 발현에 대한 중간 형광 강도, 및 K562-Luc 사멸을 보여준다.
표 12. 누적 배수 변화
Figure pct00022
표 13. CD16 MFI
Figure pct00023
표 14. CD69 MFI
Figure pct00024
표 15. CD25 MFI
Figure pct00025
표 16. NKG2A MFI
Figure pct00026
표 17:
Figure pct00027
실시예 4. 확장 단독 및 확장 후 프라이밍의 대규모 시험관내 배양 및 활성
재료 및 방법: NK 세포는 CD3 고갈 및 CD56 양성 선택을 사용하여 MACS prodigy의 냉동 류코팩으로부터 단리되었다. 이어서 선택된 NK 세포는 0.25e6/mL의 초기 세포 농도로 NK MACS 배지 + 보충물 + 10% HI-HAB + 25 nM 7t15-21s + 50 nM ATF1의 생 고뱅 (St. Gobain) 백에서 6일 동안 37deg, 5%CO2 에서 배양되었다. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 세포를 계측하였고, 0.25e6/mL의 농도로 희석하였으며, 7t15-21s 및 ATF1은 최종 배지 부피에 대해 적절한 농도까지 보충되었다. 14일차에, 세포를 냉동 (확장 단독)하였거나 또는 세포를 50e6/mL로 농축하였고, 18t15-12s는 250 nM의 최종 농도까지 첨가되었다 (확장 후 프라이밍). 이렇게 프라이밍된 세포는 다양한 시간 동안 37deg, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 18t15-12s 첨가의 표시된 시간 길이 (30분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간 또는 밤샘) 이후에, 세포를 수확하였고, HBSS (-/-), 0.5% HSA로 2회 세척하였으며, 냉동 완충액 (90% 인간 혈청, 10% DMSO)에 재현탁하였다. 세포는 액체 질소의 증기상으로 옮기기 전에 속도 제어 냉동기를 사용하여 2e6 세포/mL 또는 20e6 세포/mL로 냉동하였다. 이어서 세포를 해동하였고, 세척하였으며, 계측하여서, 하류 어세이에서 이용하여 기능을 측정하였다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 표현형을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, NK 세포를 수확하고, 세척하였으며, 순도 및/또는 활성화 마커, 예를 들어, 항-CD56, 항-CD3, Live/Dead Yellow, 항-NKG2A, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-CD16을 포함하는 플로우 패널로 염색하여 수용체 발현에 대해 평가하였다. 하기 클론을 사용하였다:
ㆍ 항-CD45 (HI30 클론)
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론)
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론)
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher)
ㆍ 항-NKG2A (REA110 클론)
ㆍ 항-CD69 (FN50 클론)
ㆍ 항-CD25 (CD25-4E3 클론)
ㆍ 항-CD16 (eBioCD16 클론)
Attune NXt 유세포측정계가 사용되었다. 이어서 데이터는 Flowjo v10.7에서 분석되어서, 생 CD56+CD3- 세포에 대해 게이팅되고, 상기 기술된 마커 각각의 중간 형광 강도를 평가하였다. CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지는 CIML NK 세포 표현형을 나타낸다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 사멸 활성을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, 배양된 NK 세포를 수확 및 세척하였고, 이어서 10% 인간 AB 혈청 (Gibco)) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, IL-2 (Miltenyi) 존재 또는 부재로, 24-48시간에 표시된 이펙터 대 표적 (E:T) 비로, 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가되었고, 이후 루시퍼라제 활성 (생 K562 세포)은 루시퍼라제 판독 (Promega)을 통해 평가되었다.
상기 과정을 통해 생성된 NK 세포의 사이토카인 생산 능력을 평가하기 위해서, NK 세포를 해동한 다음에, 10% 인간 AB 혈청 (Gibco) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, 단독으로 또는 24시간 동안 1:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비로, 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 이후에 상청액을 수확하였고 IFNg 생산을 IFNg ELISA (R&D Systems)를 통해 평가하였다.
결과: 이 실시예는 대규모로 상기 과정에 의해 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
결과는 도 5-11에 도시된다.
실시예 5. 확장 단독, 프라이밍 후 확장, 및 확장 후 프라이밍의 대규모 시험관내 배양 및 활성
재료 및 방법: NK 세포는 CD3 고갈 및 CD56 양성 선택을 사용하여 MACS prodigy의 냉동 류코팩으로부터 단리하였다. 이어서 선택된 NK 세포는 0.25e6/mL의 초기 세포 농도로 NK MACS 배지 + 보충물 + 10% HI-HAB + 25nM 7t15-21s + 50nM ATF1의 생 고뱅 백에서 6일 동안 37deg, 5%CO2에서 배양되었다. 배양 6일차 및 이후 2일마다, 세포를 계측하였고, 0.25e6/mL의 농도로 희석하였으며, 7t15-21s 및 ATF1은 최종 배지 부피에 대해 적절한 농도까지 보충되었다. 14일차에, 세포를 다양한 밀도 (2e6, 5e6, 10e6, 25e6, 35e6 또는 50e6/mL)로 농축하였으며, 18t15-12s는 250 nM의 농도까지 첨가되었다. 세포를 37deg, 5%에서 인큐베이션하였다. 18t15-12s 첨가의 표시된 시간 길이 (3시간 또는 밤샘) 이후에, 세포를 수확하였고, HBSS (-/-), 0.5% HSA로 2회 세척하였고, 냉동 완충액 (90% 인간 혈청, 10% DMSO)에 재현탁하였다. 세포는 액체 질소의 증기상으로 옮기기 전에 속도 제어 냉동기를 사용하여 2e6 세포/mL 또는 20e6 세포/mL로 냉동하였다. 그 다음에 세포를 해동하였고, 세척, 계측하였으며, 하류 어세이에서 이용하여 기능을 측정하였다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 표현형을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, NK 세포를 수확하고, 세척하였으며, 순도 및/또는 활성화 마커, 예를 들어, 항-CD56, 항-CD3, Live/Dead Yellow, 항-NKG2A, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-CD16을 포함하는 플로우 패널로 염색하여 수용체 발현에 대해 평가하였다. 하기 클론을 사용하였다:
ㆍ 항-CD45 (HI30 클론)
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론)
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론)
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher)
ㆍ 항-NKG2A (REA110 클론)
ㆍ 항-CD69 (FN50 클론)
ㆍ 항-CD25 (CD25-4E3 클론)
ㆍ 항-CD16 (eBioCD16 클론)
Attune NXt 유세포측정계가 사용되었다. 이어서 데이터는 Flowjo v10.7에서 분석되어서, 생 CD56+CD3- 세포에 대해 게이팅되고, 상기 기술된 마커 각각의 중간 형광 강도를 평가하였다. CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지는 CIML-NK 세포 표현형을 나타낸다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 사멸 활성을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, 배양된 NK 세포를 수확 및 세척하였고, 이어서 10% 인간 AB 혈청 (Gibco)) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, IL-2 (Miltenyi) 존재 또는 부재에서, 24-48시간에 표시된 이펙터 대 표적 (E:T) 비로, 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가되었고, 이후 루시퍼라제 활성 (생 K562 세포)은 루시퍼라제 판독 (Promega)을 통해 평가되었다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 사이토카인 생산 능력을 평가하기 위해서, NK 세포를 해동한 다음에, 10% 인간 AB 혈청 (Gibco) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, 단독으로 또는 24시간 동안 1:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비로, 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)의 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 이후 상청액을 회수하고, IFNg 생산을 IFNg ELISA (R&D Systems)로 평가하였다.
상기 과정으로 생성된 NK 세포의 생체내 지속성을 평가하기 위해서, NK 세포를 해동하였고, HBSS에 20e6/mL로 재현탁하였다. 2e6과 5e6 사이의 세포 (예를 들어, 100 uL 중)를 면역결핍 NSG 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor Maine)에게 정맥내로 주사하였다. 마우스는 2일마다 인간 IL-2 (Miltenyi Biotec, 50,000IU)의 투약이 지원되었고, 7일차에 혈액을 채취하였고, 적혈 세포를 용해시키기 위한 고정 전에, NK 세포수는 하기로 이루어진 플로우 패널로 염색하여 측정하였다:
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론),
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론),
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher),
ㆍ 항-마우스 CD45 (30-F11 클론), 및
ㆍ 항-인간 CD45 (HI30 클론)
다음으로 세포는 생 huCD45+마우스CD45-CD3- 세포수에 대해서 Attune NXt 유세포측정계 상에서 분석되었다.
결과: 이 실시예는 대규모로 상기 과정에 의해 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
결과는 도 12-16에 도시된다.
실시예 6. 확장 단독 및 확장 후 프라이밍의 시험관내 배양 및 활성
재료 및 방법: NK 세포는 CD3 고갈 및 CD56 양성 선택을 사용하여 전체 혈액으로부터 단리되었다. 선택된 NK 세포는 다음으로 조직 배양 처리된 플라스크에서 배양된 다음에 NK MACS 배지 + 보충물 + 10% HI-HAB 중 세포 배양 백으로 옮겨지고, 하기 조건에서 확장되었다:
a) 확장 단독: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 50nM 7t15-21s 및 25nM ATF1. 배양 5일차 및 그후 2/3일마다, 7t15-21s 및 ATF1은 각각 50 nM 및 25 nM로 보충되었고, 세포는 신선한 배지로 적절한 농도까지 희석되었다. 14일차에 세포를 90% HAB, 10% DMSO 중에 냉동시켰다.
b) 확장 후 프라이밍: 4일 동안 37deg, 5%CO2에서 50 nM 7t15-21s 및 25 nM ATF1. 배양 5일차 및 이후 2/3일 마다, 7t15-21s 및 ATF1은 각각 50 nM 및 25 nM로 보충되었고, 세포는 신선한 배지로 적절한 농도까지 희석되었다. 14일차에, 18t15-12s를 250 nM로 3시간 동안 첨가하였다. 다음으로 세포를 90% HAB, 10% DMSO 중에 냉동시켰다.
상기 과정에 의해 생성된 NK 세포의 표현형을 평가하기 위해서, 냉동된 세포를 해동하였고, 순도 및/또는 활성화 마커, 예를 들어, 항-CD56, 항-CD3, Live/Dead Yellow, 항-NKG2A, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-CD16을 포함하는 플로우 패널로 염색하여서 수용체 발현에 대해 평가하였다. 하기 클론을 사용하였다:
ㆍ 항-CD45 (HI30 클론)
ㆍ 항-CD56 (CMSSB 클론)
ㆍ 항-CD3 (SK7 클론)
ㆍ Live/Dead Yellow (Thermo Fisher)
ㆍ 항-NKG2A (REA110 클론)
ㆍ 항-CD69 (FN50 클론)
ㆍ 항-CD25 (CD25-4E3 클론)
ㆍ 항-CD16 (eBioCD16 클론)
Attune NXt 유세포측정계가 사용되었다. 데이터는 이후 Flowjo v10.7에서 분석하여서, 생 CD56+CD3- 세포에 대해 게이팅하고, 상기 기술된 마커의 각각의 중간 형광 강도를 평가하였다. CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지는 CIML-NK 세포 표현형을 나타낸다. 결과는 하기 18-22에 표시된다.
표 18.1 CD16 MFI
표 19. CD69 MFI
Figure pct00029
표 20. CD25 MFI
Figure pct00030
표 21. NKG2A MFI
Figure pct00031
Figure pct00032
표 22. 세포 크기: FSC MFI
Figure pct00033
Figure pct00034
상기 과정을 통해서 생성된 NK 세포의 사멸 활성을 평가하기 위해서, 적절한 시점에, 배양된 NK 세포를 수확하고 세척한 다음에, 10% 인간 AB 혈청 (Gibco)) 존재의 NK MACS 배지에 재현탁하였고, IL-2 (Miltenyi) 존재 또는 부재로, 24-48시간에, 표시된 이펙터 대 표적 (E:T) 비로, 10,000 루시퍼라제 발현 K562 (K562-Luc) 인간 종양 세포 (ATCC)가 존재하는 96-웰 플레이트에 첨가하였으며, 이후에 루시퍼라제 활성 (생 K562 세포)는 루시퍼라제 판독 (Promega)에 의해 평가되었다. 결과는 도 17-18에 도시된다.
결과: 이 실시예는 상기 과정으로 생성된 NK 세포의 시험관내 활성 및 유세포측정 표현형을 입증한다.
실시예 7. CIML-NK 세포의 생체내 사멸 활성
생체내 사멸 효능을 평가하기 위해서, NSG 마우스에 K562-Luc (ATCC) 종양 세포를 이식한다. NK 세포 배양 종료 시에, 세포를 수확, 세척하고, 2-10e6 NK 세포를 종양 보유 동물에게 정맥내로 주사하고, 일부 대조군 마우스는 주사하지 않은 채로 둔다. 마우스는 인간 IL-2 (50,000IU)의 q2d 투약이 지원되고, 종양 성장은 마우스에게 루시페린을 주사하고 가능한 장비에서 루시퍼라제를 판독하여 매주 측정된다.
실시예 8. 임상 시험 프로토콜
상기 기새된 바와 같은 NK 세포는 저온저장된 경우라면, 해동될 수 있고, 암과 같은 질환의 치료를 위해서, 적합한 배지 중에서 환자에게 주입될 수 있다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군에서, NK 세포의 안전성 및 효능을 시험하는 예씨적인 방법은 임상 시험 프로토콜 번호 NCT04354025, NCT03068819, NCT01898793, NCT02782546 및 NCT04893915에 개시된다. 이들 프로토콜은 IL-12, IL-15, 및 IL-18의 칵테일, 또는 프라이밍 융합 단백질 복합체를 사용하여 프라이밍된 후에, 임의로 확장된 기억 NK 세포를 포함한다. 유사한 임상 시험은 확장 후 프라이밍되거나, 또는 동시에 확장 및 프라이밍된 기억 NK 세포를 사용하여 실행될 수 있다.
표 23. CTP NCT04893915
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
표 24. CTP NCT01898793
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
본 명세서에 개시된 방법에 따라서, 확장 후 프라이밍되거나, 또는 동시에 확장 및 프라이밍된 기억 NK 세포는 예를 들어 상기 임상 시험 프로토콜에 표시된 바와 같이, AML, MDS, 및 다른 질환의 치료에서 효과적인 것으로 기대된다.
상기 기재된 상세한 설명은 본 발명을 실행하는 당업자를 돕기 위해 제공된다. 그러나, 본 명세서에 기술되고 청구된 발명은 본 명세서에 개시된 특정 구현예에 의해 범주가 제한되지 않는데 이들 구현예가 본 발명의 몇몇 양태의 예시로서 의도되기 때문이다. 임의의 동등한 구현예는 본 발명의 범주 내에 두고자 의도된다. 실제로, 본 명세서에 표시되고 기술된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 본 발명의 발견의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고, 전술한 기술을 통해서 당업자에게 자명해 질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범주 내에 속하도록 의도된다.

Claims (57)

  1. 순차적으로,
    a) 정제된 NK 세포를 확장시키는 단계; 및
    b) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
    에 의해서 생산되는 정제된 기억 자연 살해 (NK) 세포의 개체군.
  2. 정제된 NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시켜서 생산된 정제된 기억 자연 살해 (NK) 세포의 개체군.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, NK 세포는 신선하거나 또는 냉동된 백혈구분리물 또는 도너 혈액로부터 농후화되는 것인 기억 NK 세포.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, NK 세포는 림프계 전구체 세포로부터 분화되는 것인 기억 NK 세포.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, NK 세포는 음성 또는 양성 선택, 또는 이의 조합에 의해 정제되는 것인 기억 NK 세포.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, NK 세포는
    ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
    ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
    ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상;
    또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합
    에 노출에 의해서 프라이밍되는 것인 기억 NK 세포.
  7. 제6항에 있어서, NK 세포는 18t15-12s에 노출에 의해서 프라이밍되는 것인 기억 NK 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, NK 세포는 1분 내지 24시간 동안 프라이밍되는 것인 기억 NK 세포.
  9. 제6항에 있어서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출에 의해서 프라이밍되는 것인 기억 NK 세포.
  10. 제9항에 있어서, NK 세포는 1분 내지 24시간 동안 프라이밍되는 것인 기억 NK 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, NK 세포는 7t15-21s 및 ATF1에 노출에 의해서 확장되는 것인 기억 NK 세포.
  12. 제11항에 있어서, NK 세포는 1일-40일 동안 확장되는 것인 기억 NK 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기억 NK 표현형은 미처리된 NK 세포와 비교하여, CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지를 나타내는 것인 기억 NK 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기억 NK 세포는 미처리된 NK 세포와 비교하여,
    ㆍ 암 세포에 대해 개선된 세포독성;
    ㆍ 개선된 지속성;
    ㆍ 개선된 항-종양 활성; 및/또는
    ㆍ 증가된 사이토카인의 생산
    중 하나 이상을 갖는 것인 기억 NK 세포.
  15. 제14항에 있어서, 암 세포는 K562 세포인 기억 NK 세포.
  16. 제14항에 있어서, 생산된 사이토카인은 IFNg, TNFa, GM-CSF, 및 이의 조합으로부터 선택되는 것인 기억 NK 세포.
  17. 제14항에 있어서, 지속성은 1일-14일 동안 면역결핍 마우스에서 측정되는 것인 기억 NK 세포.
  18. 제17항에 있어서, 마우스는 NSG 마우스인 기억 NK 세포.
  19. 제14항에 있어서, 항-종양 활성은 면역결핍 마우스에서 암 세포의 종양 성장 감소로서 측정되는 것인 기억 NK 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, NK 세포는 사이토카인-유도 기억-유사 (CIML) NK 세포인 기억 NK 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    a) 표적 세포 상의 항원을 표적화하는 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인;
    b) 힌지 도메인;
    c) 경막 도메인;
    d) 임의로, 하나 이상의 공-자극성 도메인; 및
    e) 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는, 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함하는 것인 기억 NK 세포.
  22. 기억 NK 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) NK 세포의 농후화된 개체군을 정제하는 단계;
    b) NK 세포를 확장시키는 단계; 및
    c) NK 세포를 프라이밍시키는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
  23. 기억 NK 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) NK 세포의 농후화된 개체군을 정제하는 단계; 및
    b) NK 세포를 동시에 프라이밍 및 확장시키는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는 신선하거나 또는 냉동된 백혈구분리물 또는 도너 혈액으로부터 농후화되는 것인 제조 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는 림프계 전구체 세포로부터 분화되는 것인 제조 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는 음성 또는 양성 선택, 또는 이의 조합에 의해 정제되는 것인 제조 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는
    ㆍ IL-12, IL-23, IL-27, 및 IL-35 중 하나 이상;
    ㆍ IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상; 및
    ㆍ IL-18, IL-1a, IL-1b, IL-36a, IL-36b, 및 IL-36g 중 하나 이상;
    또는 이의 기능성 단편, 및/또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 또는 임의의 전술한 것의 조합
    에 노출을 통해서 프라이밍되는 것인 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, NK 세포는 18t15-12s에 노출에 의해서 프라이밍되는 것인 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, NK 세포는 1분-24시간 동안 프라이밍되는 것인 제조 방법.
  30. 제27항에 있어서, NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출에 의해서 프라이밍되는 것인 제조 방법.
  31. 제28항에 있어서, NK 세포는 2일-40일 동안 프라이밍되는 것인 제조 방법.
  32. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는 7t15-21s 및 ATF1에 노출에 의해서 확장되는 것인 제조 방법.
  33. 제22항 또는 제23항에 있어서, NK 세포는 1일-40일 동안 확장되는 것인 제조 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기억 NK 표현형은 미처리된 NK 세포와 비교하여 CD69, CD25, 및 NKG2A 발현의 증가, 및 CD16 발현의 유지를 나타내는 것인 제조 방법.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기억 NK 세포는 미처리된 NK 세포와 비교하여,
    ㆍ 암 세포에 대해 개선된 세포독성;
    ㆍ 개선된 지속성;
    ㆍ 개선된 항-종양 활성; 및/또는
    ㆍ 증가된 사이토카인의 생산
    중 하나 이상을 갖는 것인 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 암 세포는 K562 세포인 제조 방법.
  37. 제35항에 있어서, 생산된 사이토카인은 IFNg, TNFa, GM-CSF, 및 이의 조합으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  38. 제35항에 있어서, 지속성은 1일-14일 동안 면역결핍 마우스에서 측정되는 것인 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 마우스는 NSG 마우스인 제조 방법.
  40. 제35항에 있어서, 개선된 항-종양 활성은 면역결핍 마우스에서 암 세포의 종양 성장 감소인 제조 방법.
  41. 제22항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포는 사이토카인-유도 ML (CIML) NK 세포인 제조 방법.
  42. 증식성 악성종을 치료하는 방법으로서, 방법은 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 따른 기억 NK 세포, 또는 제22항 내지 제41항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조되는 기억 NK 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 방법.
  43. 제42항에 있어서, 세포는 환자에게 신선하게 투여되는 것인 치료 방법.
  44. 제42항에 있어서, 증식성 악성종은 암인 치료 방법.
  45. 제44항에 있어서, 암은 혈액암인 치료 방법.
  46. 제44항에 있어서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수이형성 증후군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  47. 제46항에 있어서, 혈액암은 B-세포 림프종인 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, B-세포 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) /소형 림프구성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  49. 제46항에 있어서, 혈액암은 T-세포 림프종인 치료 방법.
  50. 제49항에 있어서, T-세포 림프종은 T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종 (T-ALL), 말초 T-세포 림프종 (PTCL), T-세포 만성 림프구성 백혈병 (T-CLL), 및 세자리 증후군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  51. 제46항에 있어서, 혈액암은 백혈병인 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서, 백혈병은 급성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (또는 골수구성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  53. 제46항에 있어서, 혈액암은 형질 세포 악성종인 치료 방법.
  54. 제53항에 있어서, 형질 세포 악성종은 림프형질세포성 림프종, 형질세포종, 및 다발성 골수종으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  55. 제44항에 있어서, 암은 고형 종양인 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 고형 종양은 흑색종, 신경아세포종, 신경교종, 육종, 또는 암종으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  57. 제55항에 있어서, 고형 종양은 뇌, 머리, 목, 유방, 폐 (예를 들어, 비-소세포 폐암, NSCLC), 생식기 (예를 들어, 난소), 상부 소화관, 췌장, 간, 신장계 (예를 들어, 신장), 방광, 전립선 또는 직결장의 종양인 치료 방법.
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