KR20220130100A - 키메라 t 세포 지속성 향상을 위한 akt 억제제 - Google Patents

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KR20220130100A
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마르코 엘. 다비라
사이드 엠. 세브티
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에이치 리 모피트 캔서 센터 앤드 리서어치 인스티튜트 아이엔씨
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Abstract

CAR-T 세포의 입양 세포 전달의 재발은 종종 CAR-T 세포의 소실의 결과이다. 본원은 Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 치료적 CAR-T 세포의 입양 세포 전달을 겪는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CAR-T 세포 요법을 향상시키는 방법을 개시한다. 결과적으로, CAR-T 세포 및 Akt 억제제의 조합으로 치료된 대상체는 재발할 가능성이 적다. 따라서, 본원은 CAR-T 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 입양적으로 전달하고, Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 또한 개시한다.

Description

키메라 T 세포 지속성의 향상을 위한 AKT 억제제
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019 년 11 월 18 일에 출원된 미국 가출원 제62/937,028호, 2019 년 11 월 19 일에 출원된 미국 가출원 제62/937,359호, 2019 년 12 월 2 일에 출원된 미국 가출원 제62/942,662호, 2019 년 12 월 5 일에 출원된 미국 가출원 제62/944,295호 및 2020 년 2 월 27 일에 출원된 미국 가출원 제62/982,480호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 원용된다.
배경
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 불충분한 지속성 및 이펙터 기능은 입양 T 세포 요법에 대한 도전적인 문제였다. CAR-T 세포의 입양 세포 전달의 재발은 종종 CAR-T 세포의 소실의 결과이다.
개요
본원은 Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 치료적 CAR-T 세포의 입양 세포 전달을 겪는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CAR-T 세포 요법을 향상시키는 방법을 개시한다. 결과적으로, CAR-T 세포 및 Akt 억제제의 조합으로 치료된 대상체는 재발할 가능성이 적다. 따라서, 본원은 또한 CAR-T 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 입양적으로 전달하고(adoptively transfering), Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, Akt 억제제는 단백질 키나제 B (Akt)의 ATP-결합 포켓을 표적화하는 오르토스테릭 억제제(orthosteric inhibitor)이다. 예는 이소퀴놀린-5-설폰아미드 (예컨대, H-8, H-89, NL-71-101); 아제판 유도체 (예컨대, (-)-발라놀로부터 유래된 시리즈 구조물), 아미노푸라잔 (예컨대, GSK690693); 헤테로사이클릭 고리 (예컨대, 7-아자인돌, 6-페닐퓨린 유도체, 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체, CCT128930, 3-아미노피롤리딘, 아닐리노트리아졸 유도체, 스피로인돌린 유도체, AZD5363, 이파타세르팁 (GDC-0068, RG7440), A-674563, A-443654); 페닐피라졸 유도체 (예컨대, AT7867, AT13148); 티오펜카복사미드 유도체 (예컨대, 아푸레세르팁 (GSK2110183), 2-피리미딜-5-아미도티오펜 유도체 (DC120), 우프로세르팁 (GSK2141795))를 포함한다.
일부 실시양태에서, Akt 억제제는 더 큰 특이성, 감소된 부작용 및 더 적은 독성을 제공하는 오르토스테릭 억제제보다 우수할 수 있는 알로스테릭 억제제(allosteric inhibitor)이다. 예는 유사체 (예컨대, MK-2206); 알킬인지질 (예컨대, 에델포신 (1-O-옥타데실-2-O-메틸-라크-글리세로-3-포스포콜린, ET-18-OCH3) 일모포신 (BM 41.440), 밀테포신 (헥사데실포스포콜린, HePC), 페리포신 (D-21266), 에루실포스포콜린 (ErPC), 에루포신 (ErPC3 및 에루실포스포호모콜린); 인돌-3-카비놀 유사체 (예컨대, 인돌-3-카비놀, 3-클로로아세틸인돌, 디인돌릴메탄, 디에틸 6-메톡시-5,7-디하이드로인돌로[2,3-b]카바졸-2,10-디카복실레이트 (SR13668), 및 OSU-A9); 설폰아미드 유도체 (예컨대, PH-316, PHT-427); 티오우레아 유도체 (예컨대, PIT-1, PIT-2, DM-PIT-1, N-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)카보닐]-N'-(3-브로모페닐)-티오우레아); 퓨린 유도체 (예컨대, 트리시리빈 (TCN, NSC 154020), 트리시리빈 모노-포스페이트 활성 유사체 (TCN-P), 4-아미노-피리도[2,3-d]피리미딘 유도체 API-1, 3-페닐-3H-이미다조[4,5-b]피리딘 유도체, ARQ 092); 및 기타 구조물, 유도체 (예컨대, BAY 1125976, 3-메틸-크산틴, 퀴놀린-4-카복사미드 및 2-[4-(사이클로헥사-1,3-디엔-1-일)-1H-피라졸-3-일]페놀, 3-옥소-티루칼산, 3α- 및 3β- 아세톡시-티루칼산, 및 아세톡시-티루칼산)를 포함한다.
일부 실시양태에서, Akt 억제제는 비가역적 억제제, 예컨대, 자연 생성물, 항생제, L 액토퀴노마이신, 프레놀리신 B, 칼라펀긴, 메데르마이신, Boc-Phe-비닐 케톤, 4-하이드록시노네날 (4-HNE), 1,6-나프티리디논 유도체 및 이미다조-1,2-피리딘 유도체이다.
특정 실시양태에서, Akt 억제제는 퓨린 유도체, 예컨대, 트리시리빈 (TCN, NSC 154020)이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부 도면 및 하기 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a 내지 1g는 TCN이 중추 기억 CAR T 세포 집단을 증가시킨다는 것을 도시한다. T 세포는 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리되었다. TCN은 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가되었다. 7 일차에 세포는 유세포 분석을 위해 염색되고, LSRII으로 실행되었다.
도 2a 및 2b는 TCN이 m1928z CAR T 세포에서 p-Akt를 억제한다는 것을 도시한다. T 세포는 음성 선택을 사용하여 C57BL6 비장세포로부터 단리되었다. TCN은 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가되었다. 5 일차에 CAR T 세포는 24 시간 동안 3T3-mCD19 표적으로 자극되었다. 자극 후 세포는 용해되고, 웨스턴 블롯으로 실행되었다.
도 3a 내지 3n은 TCN이 h19BBz CAR 살해 및 사이토카인 분비를 감소시킨다는 것을 도시한다. T 세포는 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리되었다. TCN은 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가되었다. 실시간 세포 살해를 측정하기 위해 xCelligence RTCA 기계를 사용하여 3T3-hCD19 표적 세포로 CAR T 세포를 자극하였다. 사이토카인 분비를 측정하기 위해 CAR T 세포를 24 시간 동안 표적 세포로 자극하였다. 그런 다음, 상층액을 수집하고, Ella를 사용하여 실행하여, 사이토카인을 측정하였다.
도 4는 TCN이 이펙터 기억 CAR T 세포 집단을 증가시킨다는 것을 도시한다. T 세포는 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리되었다. TCN은 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가되었다. 7 일차에 세포를 유세포 분석을 위해 염색하고, LSRII에서 실행하였다.
도 5는 m19dz, m19z, m19hBBZ 및 m1928z 작제를 예시한다.
도 6은 h19BBZ 및 h1928z 작제물을 예시한다.
본 개시내용이 더 상세하게 설명되기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않고, 당연히 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범주가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한 및 하한, 및 해당 언급된 범위에서의 임의의 기타 언급된 또는 개재 값 사이에서 하한 유닛의 10 분의 1까지의 각각의 개재 값이 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 개시내용 내에 포함된다. 언급된 범위가 하한 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 개시내용에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질 또한 본 개시내용의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에 인용된 모든 공개물 및 특허는 각각의 개별 공개물 또는 특허가 참조로 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 참조로 원용되며, 공개물이 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 원용된다. 임의의 공개물의 인용은 출원일 이전의 이의 개시내용을 위한 것이며, 본 개시내용이 이전 개시내용으로 인해 이러한 공개물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 독립적으로 확인할 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
본 개시내용의 판독시 당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 각각의 개별적인 실시양태는 본 개시내용의 범주 또는 정신을 벗어나지 않으면서 다른 몇몇의 실시양태 중 임의의 것의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 열거된 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 화학 및 생물학 등의 기술을 사용할 것이다.
다음의 실시예는 본원에 개시되고 청구된 프로브를 사용하고 방법을 수행하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자 (예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력이 이루어졌지만, 일부 오류 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 온도 및 압력은 20℃ 및 1 기압으로서 정의된다.
본 개시내용의 실시양태를 상세하게 기재하기 전에, 달리 지시하지 않는 한, 본 개시내용은 특정 물질, 시약, 반응 물질 또는 제조 공정 등으로 제한되지 않으며, 이에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다. 논리적으로 가능한 경우 단계가 상이한 순서로 실행될 수 있다는 것이 본 개시내용에서 또한 가능하다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
용어 "아미노산 서열"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 문자, 부호 또는 단어의 목록을 지칭한다. 본원에 사용된 아미노산 약어는 아미노산에 대한 종래의 한 글자 코드이며, 다음과 같이 표현된다: A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신; Z, 글루타민 또는 글루탐산.
용어 "항체"는 면역글로불린, 특이적 결합 능력을 유지하는 이의 유도체, 및 면역글로불린 결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 단백질을 지칭한다. 이들 단백질은 자연 공급원으로부터 유래되거나 부분적으로 또는 전체적으로 합성 생산될 수 있다. 항체는 단클론 또는 다클론일 수 있다. 항체는 인간 클래스 중 임의의 것인, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 종으로부터의 임의의 면역글로불린 클래스의 구성원일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용된 항체는 IgG 클래스의 유도체이다. 온전한 면역글로불린 분자에 더하여, 용어 "항체"는 또한 이들 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 표적 항원에 선택적으로 결합하는 면역글로불린 분자의 인간 또는 인간화된 버전을 포함한다.
용어 "항체 단편"은 전장 미만인 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, 항체 단편은 전장 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 유의한 부분을 보유한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디, Fc 및 Fd 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있거나, 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 쇄 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 단편은 예를 들어, 디설파이드 연결에 의해 함께 연결되는 다중 쇄를 포함할 수 있다. 단편은 또한 선택적으로 다중분자 복합체일 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 약 50 개 이상의 아미노산을 포함할 것이고, 보다 전형적으로는 약 200 개 이상의 아미노산을 포함할 것이다.
용어 "항원 결합 부위"는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 영역을 지칭한다.
용어 "압타머"는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩티드 분자를 지칭한다. 이들 분자는 일반적으로 무작위 서열 풀로부터 선택된다. 선택된 압타머는 고유한 3차 구조를 적용하고 높은 친화도 및 특이성으로 표적 분자를 인식할 수 있다. "핵산 압타머"는 이의 입체형태를 통해 표적 분자에 결합하여, 이러한 분자의 기능을 억제하거나 억압하는 DNA 또는 RNA 올리고핵산이다. 핵산 압타머는 DNA, RNA 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. "펩티드 압타머"는 불변 스캐폴드 단백질 내에 삽입된 가변 펩티드 서열을 갖는 조합 단백질 분자이다. 펩티드 압타머의 식별은 전형적으로 엄격한 효모 디하이브리드 조건 하에서 수행되며, 이는 선택된 펩티드 압타머가 세포내 맥락에서 안정적으로 발현되고 올바르게 접힐 확률을 향상시킨다.
용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 조합될 때, 의도된 용도 또는 목적을 위한 화합물 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 임의의 다른 특징을 돕거나 용이하게 하는 화합물, 조성물, 물질(substance) 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해 부작용을 최소화하기 위해 담체를 선택할 수 있다.
용어 "키메라 분자"는 천연 상태에서 별도로 존재하는 2 개 이상의 분자를 접합함으로써 생성된 단일 분자를 지칭한다. 단일 키메라 분자는 모든 구성적 분자의 원하는 기능성을 가지고 있다. 키메라 분자의 하나의 유형은 융합 단백질이다.
용어 "조작된 항체"는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 항체 단편을 포함하고 선택적으로 Ig 클래스 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY) 중 임의의 것으로부터의 항체의 가변 및/또는 불변 도메인의 전체 또는 일부를 포함할 수 있는 재조합 분자를 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체가 우선적으로 및 특이적으로 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 단클론 항체는 분자적으로 정의될 수 있는 분자의 단일 특이적 에피토프에 우선적으로 결합한다. 본 발명에서, 다중 에피토프는 다중특이적 항체에 의해 인식될 수 있다.
용어 "융합 단백질"은 하나의 폴리펩티드의 아미노 말단 및 다른 폴리펩티드의 카복실 말단 사이에 형성된 펩티드 결합을 통한 2 개 이상의 폴리펩티드의 접합에 의해 형성된 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 구성적 폴리펩티드의 화학적 커플링에 의해 형성될 수 있거나, 단일 인접 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열로부터의 단일 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 단일 쇄 융합 단백질은 단일 인접 폴리펩티드 골격을 갖는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 분자 생물학의 종래의 기술을 사용하여 프레임의 두 유전자를 단일 핵산으로 접합한 다음, 융합 단백질이 생산되는 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 핵산을 발현하도록 제조될 수 있다.
용어 "Fab 단편"은 H-쇄-간 디설파이드 결합에 대해 N-말단의 힌지 영역에서 컷팅하고 하나의 항체 분자로부터 2 개의 Fab 단편을 생성하는 효소 파파인을 이용한 항체의 절단에 의해 생성되는 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "F(ab')2 단편"은 H-쇄-간 디설파이드 결합에 대해 C-말단의 힌지 영역에서 컷팅하는 효소 펩신을 이용한 항체 분자의 절단에 의해 생성되는 2 개의 항원-결합 부위를 함유하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "Fc 단편"은 항체의 중쇄의 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "Fv 단편"은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
"유전자 작제물"은 폴리펩티드에 대한 "암호화 서열"을 포함하거나, 달리 생물학적으로 활성인 RNA (예컨대, 안티센스, 디코이(decoy), 리보자임 등)로 전사가능하고, 예컨대, 특정 실시양태에서, 포유동물 세포인, 세포 내로 형질주입될 수 있고, 작제물로 형질주입된 세포에서 암호화 서열의 발현을 유발할 수 있는 핵산, 예컨대, 벡터, 플라스미드 또는 바이러스 게놈 등을 지칭한다. 유전자 작제물은 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소뿐만 아니라 인트론 서열, 폴리아데닐화 부위, 복제 원점, 마커 유전자 등을 포함할 수 있다.
용어 "동일성"은 2 개의 핵산 분자 또는 폴리펩티드 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기에 의해 점유될 때, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 매칭하는 뉴클레오티드의 수의 함수이다. GCG 서열 분석 패키지(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학)의 일부로서 이용가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2 개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있으며, 예컨대, 기본 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 특이적 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖고 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 달리 지시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용에 기반할 것이다. BLASTP를 사용하는 경우, 퍼센트 유사성은 BLASTP 양성 점수를 기반으로 하며, 퍼센트 서열 동일성은 BLASTP 동일성 점수를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 동일한 높은 점수의 서열 쌍에서 총 잔기의 수 및 분율을 보여주며; BLASTP "양성"은 정렬 점수가 양의 값을 가지며 서로 유사한 잔기의 수 및 분율을 보여준다. 본원에 개시된 아미노산 서열에 대한 이러한 동일성 또는 유사성 정도, 또는 임의의 중간 정도의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열이 본 개시내용에 의해 고려되고 포함된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전암호를 사용하여 추론되고, 종래의 수단에 의해, 특히 유전암호를 사용하여 이의 아미노산 서열을 역번역함으로써 수득될 수 있다.
용어 "링커"는 당업계에 인식되어 있으며, 2 개의 화합물, 예컨대, 2 개의 폴리펩티드를 연접하는 분자 또는 분자 그룹을 지칭한다. 링커는 단일 연결 분자를 포함할 수 있거나, 연결 분자 및 화합물을 특이적 거리만큼 분리하도록 의도된 연결 분자 및 스페이서 분자를 포함할 수 있다.
용어 "다가 항체"는 하나 초과의 항원 인식 부위를 포함하는 항체 또는 조작된 항체를 지칭한다. 예를 들어, "2가" 항체는 2 개의 항원 인식 부위를 갖는 반면에, "4가" 항체는 4 개의 항원 인식 부위를 갖는다. 용어 "단일특이적", "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적" 등은 다가 항체에 존재하는 (항원 인식 부위의 수가 아니라) 상이한 항원 인식 부위 특이성의 수를 지칭한다. 예를 들어, "단일특이적" 항체의 항원 인식 부위는 모두 동일한 에피토프에 결합한다. "이중특이적" 항체는 제1 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위 및 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 갖는다. "다가 단일특이적" 항체는 모두 동일한 에피토프에 결합하는 다중 항원 인식 부위를 갖는다. "다가 이중특이적" 항체는 다중 항원 인식 부위를 가지며, 이 중 일부는 제1 에피토프에 결합하고, 이 중 일부는 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합한다.
용어 "핵산"은 하나의 뉴클레오티드의 3' 위치에서 다른 뉴클레오티드의 5' 단부에 포스페이트 기에 의해 연결된 단일 뉴클레오티드 또는 2 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 합성 분자를 지칭한다. 핵산은 길이에 의해 제한되지 않으므로, 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산과 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 다른 신호 서열은 다른 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 제어 요소에 대한 DNA의 작동가능한 연결은 이러한 DNA의 전사가 DNA를 특이적으로 인식하고, 이에 결합하고, 이를 전사하는 RNA 중합효소에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA 및 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 지칭한다.
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 하나의 아미노산의 카복실 기에 의해 다른 아미노산의 알파 아미노 기에 연결된 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 자연 또는 합성 분자를 지칭하도록 상호교환적으로 사용된다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
특정 폴리펩티드에 관련하여 사용되는 경우, 용어 "폴리펩티드 단편" 또는 "단편"은 아미노산 잔기가 참조 폴리펩티드 그 자체와 비교하여 결실되지만, 나머지 아미노산 서열이 통상 참조 폴리펩티드의 서열과 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 결실은 참조 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카복시-말단, 또는 대안적으로 둘 모두에서 발생할 수 있다. 단편은 전형적으로 적어도 약 5, 6, 8 또는 10 개의 아미노산 길이, 적어도 약 14 개의 아미노산 길이, 적어도 약 20, 30, 40 또는 50 개의 아미노산 길이, 적어도 약 75 개의 아미노산 길이, 또는 적어도 약 100, 150, 200, 300 또는 500 개의 아미노산 길이이다. 단편은 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 보유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단편은 참조 폴리펩티드의 효소 활성 및/또는 상호작용 부위를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 단편은 면역원성 특성을 가질 수 있다.
용어 "단백질 도메인"은 단백질의 일부, 단백질의 일부들 또는 구조적 온전성을 나타내는 전체 단백질을 지칭하며; 이 결정은 단백질의 일부, 단백질의 일부들 또는 전체 단백질의 아미노산 조성물을 기반으로 할 수 있다.
용어 "단일 쇄 가변 단편 또는 scFv"는 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인이 연결된 Fv 단편을 지칭한다. 하나 이상의 scFv 단편은 다른 항체 단편 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 불변 도메인)에 연결되어, 하나 이상의 항원 인식 부위를 갖는 항체 작제물을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "스페이서"는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 접합시키는 펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 스페이서는 단백질을 접합시키거나 이들 사이의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외의 특이적인 생물학적 활성을 갖지 않는다. 그러나, 스페이서의 구성적 아미노산은 분자의 일부 특성, 예컨대, 분자의 접힘, 순전하 또는 소수성에 영향을 주도록 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는 폴리펩티드 (항체 포함) 또는 수용체를 지칭할 때, 이종의 단백질 집단 및 다른 생물학적 제제(biologic)에서 단백질 또는 폴리펩티드 또는 수용체의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예컨대, 항체의 경우 면역검정 조건) 하에서, 명시된 리간드 또는 항체는 샘플에 존재하는 다른 단백질에, 또는 리간드 또는 항체가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 단백질에 유의한 양으로 결합하지 않는 경우, 이의 특정 "표적"에 "특이적으로 결합한다" (예컨대, 항체는 내피 항원에 특이적으로 결합한다). 일반적으로, 제2 분자와 "특이적으로 결합하는" 제1 분자는 제2 분자와 약 105 M-1 초과의 (예컨대, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 및 1012 M-1 이상의) 친화도 상수 (Ka)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 전달한다"는 특정 표적 분자 또는 마커를 보유하는 세포 또는 조직과 분자가 우선적으로 회합하며, 해당 표적 분자가 결여된 세포 또는 조직과는 우선적으로 회합하지 않는 것을 지칭한다. 물론, 이는 분자 및 비-표적 세포 또는 조직 사이에서 특정 정도의 비-특이적 상호작용이 발생할 수 있음이 인식된다. 그럼에도 불구하고, 특이적 전달은 표적 분자의 특이적 인식을 통해 매개되는 것으로서 구별될 수 있다. 전형적으로 특이적 전달은 전달된 분자 및 표적 분자가 결여된 세포 사이보다 전달된 분자 및 표적 분자를 보유하는 세포 사이에서 훨씬 더 강력한 회합을 초래한다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유류일수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의학적 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예컨대, 의사의 치료 하의 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 효과적인"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 호전시키기에 충분한 양인 것을 지칭한다. 이러한 호전은 감소 또는 변경만을 필요로 하며, 제거를 반드시 필요로 하지는 않는다.
용어 "형질전환" 및 "형질주입"은 상기 세포의 염색체 DNA로의 핵산의 도입을 포함하는, 수여자 세포로의 핵산, 예컨대, 발현 벡터의 도입을 의미한다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 병태 또는 장애를 치유하거나, 호전시키거나, 안정화하거나 예방할 의도를 갖는 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉, 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선을 위해 특별히 지시된 치료를 포함하며, 원인 치료, 즉, 연관된 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 원인의 제거를 위해 지시된 치료를 또한 포함한다. 게다가, 이 용어는 완화 치료, 즉, 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 치유보다는 증상의 경감을 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉, 연관된 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 발달을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하도록 지시된 치료; 및 지지적 치료, 즉, 연관된 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선을 위해 지시된 다른 특이적 요법을 보충하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.
용어 "변이체"는 보존적 아미노산 치환, 비-보존적 아미노산 치환 (즉, 축퇴성 변이체), 아미노산을 암호화하는 각각의 코돈 (즉, DNA 및 RNA)의 워블(wobble) 위치 내의 치환, 펩티드의 C-말단에 첨가된 아미노산, 또는 참조 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 갖는 아미노산 또는 펩티드 서열를 지칭한다.
용어 "벡터"는 벡터 서열이 연결된 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 (예컨대, 전사 제어 요소에 연결된) 세포에 의한 발현에 적합한 형태로 유전자 작제물을 함유하는 임의의 벡터 (예컨대, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 염색체)를 포함한다.
CAR T 세포 확장
기억 T 세포는 이전에 이의 동족 항원과 마주하고 이에 반응한 감염- 및 암과 싸우는 T 세포 (T 림프구로서 또한 알려짐)의 서브세트이며; 따라서, 용어 항원-경험 T 세포가 종종 적용된다.
역사적으로, 기억 T 세포는 각각 이들 자신의 구별되는 세포 표면 마커 세트를 갖는 이펙터 또는 중추 기억 서브타입에 속하는 것으로 생각되었다. 후속적으로, 수많은 추가적인 기억 T 세포 집단이 발견되었다. 모든 기억 T 세포 서브타입에 대한 단일 단일화된 주제는 수명이 길고 동족 항원에 재-노출시 다수의 이펙터 T 세포로 빠르게 확장될 수 있다는 것이다. 이 메커니즘에 의해 이들은 면역계에 이전에 마주한 병원체에 대한 "기억"을 제공한다. 기억 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있으며, 통상 CD45RA가 결여된 동안 CD45RO를 발현한다.
이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포)는 CD45RO를 발현하지만 C-C 케모카인 수용체 유형 7 (CCR7) 및 L-셀렉틴 (CD62L)의 발현은 결여되어 있다. 이들은 또한 CD44의 중간 정도의 높은 발현을 가지고 있다. 이들 기억 T 세포는 림프절-귀소 수용체가 결여되어, 말초 순환 및 조직에서 발견된다.
중추 기억 T 세포 (TCM 세포)는 CD45RO, CCR7 및 L-셀렉틴 (CD62L)을 발현한다. 중추 기억 T 세포는 또한 CD44의 중간 내지 높은 발현을 가지고 있다. 이 기억 서브집단은 일반적으로 림프절 및 말초 순환에서 발견된다.
바이러스 또는 기타 미생물 분자에 대한 항원-특이적 기억 T 세포는 TCM 및 TEM 서브세트 둘 모두에서 발견될 수 있다. 현재 대부분의 정보는 세포독성 T 세포 (CD8-양성) 서브세트의 관찰을 기반으로 하지만, 유사한 집단이 헬퍼 T 세포 (CD4-양성) 및 세포독성 T 세포 둘 모두에 존재하는 것으로 보인다. 기억 세포의 주요 기능은 관련 병원체를 체내로 재도입하여 이들 세포가 재활성화된 후 면역 반응을 증강시키는 것이다. 이 분야는 집중적으로 연구되고 있으며 일부 정보는 아직 이용가능하지 않을 수 있음을 주목하는 것이 중요하다.
CAR 폴리펩티드
개시된 방법은 CAR 폴리펩티드를 함유하는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다. CAR 폴리펩티드는 일반적으로 엑토도메인(ectodomain), 막관통 도메인 및 엔도도메인(endodomain)의 3 개의 도메인으로 구성된다. 엑토도메인은 항원 인식을 담당한다. 이는 또한 CAR이 글리코실화되고 면역 이펙터 세포의 세포막에 고정될 수 있도록 신호 펩티드 (SP)를 임의로 함유한다. 막관통 도메인 (TD)은 명칭에서 알 수 있듯이 엑토도메인을 엔도도메인에 연접하고 세포에서 발현될 때 세포막 내에 상주한다. 엔도도메인은 항원 인식 후 면역 이펙터 세포에 활성화 신호를 전송하는 CAR의 주요 부분(business end)이다. 예를 들어, 엔도도메인은 세포내 시그널링 도메인 (ISD) 및 임의로 공동-자극 시그널링 영역 (CSR)을 함유할 수 있다. CAR 폴리펩티드는 일반적으로 림프구 활성화에 관여하는 막관통 시그널링 모티프를 갖는 단클론 항체 (mAb)의 단일-쇄 가변 단편 (scFv)으로부터의 항원 인식 도메인을 통합한다 (Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45).
"시그널링 도메인 (SD)"은 일반적으로 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프 (ITAM)가 인산화될 때 시그널링 캐스케이드를 활성화하는 ITAM을 함유한다. 용어 "공동-자극 시그널링 영역 (CSR)"은 T-세포 수용체에 의한 T-세포 활성화를 향상시킬 수 있는 공동자극 단백질 수용체로부터의 세포내 시그널링 도메인, 예컨대, CD28, 41BB 및 ICOS를 지칭한다.
추가적인 CAR 작제물은 예를 들어, Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81에 기재되어 있으며, 이는 이들 CAR 모델의 교시를 위해 그 전체가 참조로 원용된다.
예를 들어, CAR은 TRUCK, 범용(universal) CAR, 자가-구동 CAR, 아머(armored) CAR, 자가-파괴 CAR, 조건부 CAR, 마킹된 CAR, TenCAR, 듀얼 CAR, 또는 sCAR일 수 있다.
면역억압에 대한 저항성이 있도록 조작된 CAR T 세포 (아머 CAR)는 면역 체크포인트 스위치 수용체와 함께, 다양한 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, 세포독성 T 림프구-연관된 항원 4 (CTLA4) 또는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD1))를 더 이상 발현하지 않도록 유전적으로 변형될 수 있거나, 면역 체크포인트 시그널링을 차단하는 단클론 항체와 함께 투여될 수 있다.
자가-파괴 CAR은 CAR을 암호화하기 위해 전기천공에 의해 전달된 RNA를 사용하여 설계될 수 있다. 대안적으로, T 세포의 유도성 아폽토시스는 유전자-변형된 림프구의 티미딘 키나제에 대한 간시클로비르(ganciclovir) 결합 또는 소-분자 이합체화제(dimerizer)에 의한 인간 카스파제 9의 보다 최근에 기재된 활성화 시스템을 기반으로 달성될 수 있다.
조건부 CAR T 세포는 기본적으로 무반응성이거나, 회로를 완성하기 위해 소 분자를 첨가할 때까지 스위치 '오프(off)'되어, 신호 1 및 신호 2 둘 모두의 전체 전달을 가능하게 함으로써, CAR T 세포를 활성화시킨다. 대안적으로, T 세포는 표적 항원에 대해 지시된 후속적으로 투여되는 이차 항체에 대해 친화도를 갖는 어댑터-특이적 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다.
탠덤 CAR (TanCAR) T 세포는 세포내 공동-자극 도메인(들) 및 CD3ζ 도메인에 융합된 상이한 친화도를 갖는 2 개의 연결된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 단일 CAR을 발현한다. TanCAR T 세포 활성화는 표적 세포가 표적 둘 모두를 공동-발현할 때만 달성된다.
이중 CAR T 세포는 상이한 리간드 결합 표적을 갖는 2 개의 별도의 CAR을 발현하며; 하나의 CAR은 CD3ζ 도메인을 단독으로 포함하고 다른 CAR은 공동-자극 도메인(들)을 단독으로 포함한다. 이중 CAR T 세포 활성화는 표적 둘 모두의 공동-발현을 필요로 한다.
안전성 CAR (sCAR)은 세포내 억제 도메인에 융합된 세포외 scFv로 이루어진다. 표준 CAR을 공동-발현하는 sCAR T 세포는 표준 CAR 표적을 보유하지만 sCAR 표적이 결여된 표적 세포를 마주할 때만 활성화된다.
개시된 CAR의 항원 인식 도메인은 통상 scFv이다. 그러나, 많은 대안이 있다. 천연 T-세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인은 단순한 엑토도메인 (예컨대, HIV 감염 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인) 및 더 많은 외래의 인식 구성요소, 예컨대, 연결된 사이토카인 (이는 사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 야기함)을 갖는 것으로서 기재되어 있다. 사실상, 주어진 표적과 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다.
엔도도메인은 항원 인식 후에 신호를 면역 이펙터 세포에 전송하여 면역 이펙터 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 하나 이상을 활성화시키는 CAR의 주요 부분이다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 엔도도메인은 T 세포 수용체 (TCR) 및 임의로 공동-수용체의 "세포내 시그널링 도메인"을 포함할 수 있다. 통상 전체 세포내 시그널링 도메인을 사용할 수 있지만, 많은 경우 전체 쇄을 사용할 필요는 없다. 세포내 시그널링 도메인의 절삭된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절삭된 부분은 이것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 세포질 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프 (ITAM)로서 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. ITAM 함유 세포질 시그널링 서열의 예는 CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc 감마 RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB), 및 FcεRIγ (FCERIG)로부터 유래된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (CD3ζ) (TCR 제타, GenBank 수탁 번호 BAG36664.1)로부터 유래된다. T-세포 수용체 T3 제타 쇄 또는 CD247 (분화 클러스터 247)로서 또한 알려진 T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 (CD3ζ) 쇄는 인간에서 CD247 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다.
제1-세대 CAR은 전형적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 일차 전송기인 CD3ζ 쇄로부터의 세포내 도메인을 가졌다. 제2-세대 CAR은 T 세포에 추가적인 신호를 제공하기 위해 다양한 공동자극 단백질 수용체 (예컨대, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 시그널링 도메인을 CAR의 엔도도메인에 첨가한다. 보다 최근에, 제3-세대 CAR은 다중 시그널링 도메인을 조합하여, 효능을 더욱 증강시킨다. 이들 CAR이 이식된 T 세포는 공동자극 수용체/리간드 상호작용과 무관하게 개선된 확장, 활성화, 지속성 및 종양-박멸 효율이 입증되었다 (Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5).
예를 들어, CAR의 엔도도메인은 그 자체로 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하거나 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 쇄 부분 및 공동자극 시그널링 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 시그널링 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD123, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3 및 NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 따라서, CAR은 공동-자극 시그널링 요소로서 주로 CD28과 함께 예시되지만, 다른 공동자극 요소가 단독으로 또는 다른 공동-자극 시그널링 요소와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 힌지 서열을 포함한다. 힌지 서열은 항체 가요성을 용이하게 하는 짧은 아미노산 서열이다 (예컨대, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004) 참고). 힌지 서열은 항원 인식 모이어티 (예컨대, scFv) 및 막관통 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자로부터 유래되거나 수득된 임의의 적합한 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 힌지 서열은 CD8a 분자 또는 CD28 분자로부터 유래된다.
막관통 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 막관통 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예컨대, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, 및 PAG/Cbp로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 이의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 우세하게 포함할 것이다. 일부 경우에, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각각의 단부에서 발견될 것이다. 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예컨대, 2 내지 10 개의 아미노산 길이는 CAR의 막관통 도메인 및 세포질(endoplasmic) 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 동일한 막관통 도메인의 반복체일 수 있거나 상이한 막관통 도메인일 수 있는 하나 초과의 막관통 도메인을 갖는다.
일부 실시양태에서, CAR은 WO2015/039523호에 기재된 바와 같은 다중-쇄 CAR이며, 이는 이 교시를 위해 참조로 원용된다. 다중-쇄 CAR은 상이한 막관통 폴리펩티드에서 개별 세포외 리간드 결합 및 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 시그널링 도메인은 막곁 위치에서 조립되도록 설계될 수 있으며, 이는 최적의 신호 전달을 부여하는 자연 수용체에 더 가까운 가요성 아키텍처를 형성한다. 예를 들어, 다중-쇄 CAR은 FCERI 쇄가 함께 자발적으로 이합체화되어 CAR을 형성하도록 FCERI 알파 쇄의 일부 및 FCERI 베타 쇄의 일부를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 항체이다. scFv의 친화도/특이성은 대부분 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 상보성 결정 영역 (CDR) 내의 특이적 서열에 의해 구동된다. 각각의 VH 및 VL 서열은 3 개의 CDR (CDR1, CDR2, CDR3)을 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 자연 항체, 예컨대, 단클론 항체로부터 유래된다. 일부 경우에, 항체는 인간이다. 일부 경우에, 항체는 인간에 투여될 때 이것이 덜 면역원성이 되도록 변경을 겪는다. 예를 들어, 변경은 키메라화, 인간화, CDR-이식, 탈면역화, 및 가장 가까운 인간 생식계열 서열에 상응하는 프레임워크 아미노산의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기술을 포함한다.
또한, 2 개의 항원을 표적화하는 이중-특이적 CAR을 개시한다. 또한, 상이한 항원에 결합하는 다른 CAR과 연계하여서만 작용하도록 설계된 CAR을 개시한다. 예를 들어, 이들 실시양태에서, 개시된 CAR의 엔도도메인은 시그널링 도메인 (SD) 또는 공동-자극 시그널링 영역 (CSR)을 단독으로 함유할 수 있지만, 둘 모두를 함유할 수는 없다. 제2 CAR (또는 내인성 T-세포)은 활성화되는 경우 누락된 신호를 제공한다. 예를 들어, 개시된 CAR은 SD를 함유하지만 CSR은 함유하지 않는 경우, 이 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 CSR을 함유하는 다른 CAR (또는 T-세포)이 이의 각자의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다. 마찬가지로, 개시된 CAR이 CSR을 함유하지만 SD는 함유하지 않는 경우, 이 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 SD를 함유하는 다른 CAR (또는 T-세포)이 이의 각자의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다.
면역 이펙터 세포
또한 개시된 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (본원에서 "CAR-TEM 세포"로서 또한 지칭됨)를 개시한다. 이들 세포는 바람직하게는 치료될 대상체로부터 수득된다 (즉, 자가유래임). 그러나, 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포주 또는 공여자 이펙터 세포 (동종이계)가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 면역 효과 세포는 HLA-매칭되지 않는다. 면역 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 비롯한 많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술, 예컨대, Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심성 세포분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. 면역 이펙터 세포의 특이적 서브집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 예컨대, 원하는 면역 이펙터 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간 동안 항체-컨쥬게이션된 비드와 함께 항온처리함으로써 양성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합을 사용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 면역 이펙터 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합을 사용하여 음성 선택에 의해 달성될 수 있다.
치료적 방법
개시된 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 TAA-발현 암 세포에 대한 항-종양 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포가 이끌어낸 항-종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있다. 게다가, CAR-매개 면역 반응은 CAR-변형된 면역 이펙터 세포가 TAA에 특이적인 면역 반응을 유도하는 입양 면역요법 접근법의 일부일 수 있다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 입양 전달은 유망한 항-암 치료제이다. 환자의 면역 이펙터 세포의 수집 이후, 세포를 유전자 조작하여 개시된 CAR을 발현한 다음, 환자에게 다시 주입할 수 있다.
개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 구성요소, 예컨대, IL-2, IL-15 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합하여 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대, 중성 완충된 식염수 및 포스페이트 완충된 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트 (예컨대, 알루미늄 하이드록시드); 및 보존제를 포함할 수 있다. 개시된 방법에 사용하기 위한 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된 일부 실시양태에 있다. 약학 조성물은 MM을 치료하기에 적절한 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 병태 및 환자 질환의 중증도와 같은 이러한 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량" 또는 "치료량"이 표시된 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 환자 (대상체)의 병태에서의 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약학 조성물은 이들 범위 내의 모든 정수 값 포함하여, 104 내지 109 개의 세포/체중 kg, 예컨대, 105 내지 106 개의 세포/체중 kg의 투여량으로 투여될 수 있다고 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다중 회 투여될 수 있다. 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용함으로써 세포를 투여할 수 있다 (예컨대, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참고). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법(treatment regime)은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체에 활성화된 T 세포를 투여한 다음, 후속적으로 혈액을 재-채취하고 (또는 성분채집술을 수행하고), 개시된 방법에 따라 그로부터 T 세포를 활성화하고, 이들 활성화되고 확장된 T 세포로 환자를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 방법은 몇 주마다 다중 회 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc 또는 100 cc의 채혈로부터 활성화된다. 이 다중 채혈/다중 재주입 프로토콜을 사용하면 특정 T 세포 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.
개시된 조성물의 투여는 주사, 수혈 또는 체내이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에 투여된다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 조성물은 또한 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
특정 실시양태에서, 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 비제한적으로 탈리도마이드, 덱사메타손, 보르테조밉 및 레날리도마이드를 포함하는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 (예컨대, 전에, 동시에 또는 이후에) 환자에 투여된다. 추가 실시양태에서, CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 화학요법, 방사선, 면역억압제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대, CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 방사선조사와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 골수 이식, 화학요법제, 예컨대, 플루다라빈을 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예컨대, 전에, 동시에 또는 이후에) 환자에 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대, CD20과 반응하는 약제, 예컨대, 리툭산 이후에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 고 용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식으로 표준 치료를 겪을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 이후, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가적인 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 이후에 투여된다.
개시된 방법의 암은 조절되지 않은 성장, 침습 또는 전이를 겪고 있는 대상체에서 임의의 TAA-발현 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 암은 현재 방사선요법이 사용되는 임의의 신생물 또는 종양일 수 있다. 대안적으로, 암은 표준 방법을 사용하는 방사선요법에 충분히 민감하지 않은 신생물 또는 종양일 수 있다. 따라서, 암은 육종, 림프종, 백혈병, 암종, 모세포종 또는 생식 세포 종양일 수 있다. 개시된 조성물이 치료에 사용될 수 있는 대표적인 암의 비-제한적인 목록은 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨 질환, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두경부 편평 세포 암종, 콩팥암, 폐암, 예컨대, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 신경모세포종/교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암, 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도 암종, 두경부 암종, 대장암, 조혈암; 고환암; 결장 및 직장암, 전립선암 및 췌장암을 포함한다.
개시된 CAR은 세포독성 또는 세포정지 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 그룹과 조합하여 사용될 수 있다. 약물 모이어티는 미세소관 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라제 억제제 또는 DNA 삽입제로서 기능할 수 있는 화학요법제, 특히 암 요법에 사용되는 것들을 포함한다.
개시된 CAR은 체크포인트 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 2 개의 알려진 억제 체크포인트 경로는 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 및 프로그래밍된-사멸 1 (PD-1) 수용체를 통한 시그널링을 포함한다. 이들 단백질은 T 세포 기능의 모든 단계에 걸쳐 중요한 역할을 하는 공동시그널링 분자의 CD28-B7 패밀리의 구성원이다. PD-1 수용체 (CD279로서 또한 알려짐)는 활성화된 T 세포의 표면 상에 발현된다. 이의 리간드인 PD-L1 (B7-H1; CD274) 및 PD-L2 (B7-DC; CD273)는 APC, 예컨대, 수지상 세포 또는 대식세포의 표면 상에 발현된다. PD-L1이 우세한 리간드인 반면, PD-L2는 훨씬 더 제한된 발현 패턴을 가지고 있다. 리간드가 PD-1에 결합하는 경우, 억제 신호는 T 세포로 전송되어, 사이토카인 생산을 감소시키고 T-세포 증식을 억압한다. 체크포인트 억제제는 PD-1 (니볼루맙 (BMS-936558 또는 MDX1106), CT-011, MK-3475), PD-L1 (MDX-1105 (BMS-936559), MPDL3280A, MSB0010718C), PD-L2 (rHIgM12B7), CTLA-4 (이필리무맙 (MDX-010), 트레멜리무맙 (CP-675,206)), IDO, B7-H3 (MGA271), B7-H4, TIM3, LAG-3 (BMS-986016)을 차단하는 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
프로그래밍된 사멸 1 (PD-1)에 대한 인간 단클론 항체 및 항-PD-1 항체를 단독으로 또는 다른 면역치료제와 조합하여 사용하여 암을 치료하는 방법은 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,008,449호에 기재되어 있다. 항-PD-L1 항체 및 이들의 용도는 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,552,154호에 기재되어 있다. 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 항암제는 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,617,546호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, PDL1 억제제는 PDL1에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대, BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) 또는 MPDL3280A (Roche)를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD1 억제제는 PD1에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대, 람브롤리주맙 (Merck), 니볼루맙 (Bristol-Myers Squibb) 또는 MEDI4736 (AstraZeneca)을 포함한다. PD-1에 대한 인간 단클론 항체 및 항-PD-1 항체를 단독으로 또는 다른 면역치료제와 조합하여 사용하여 암을 치료하는 방법은 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,008,449호에 기재되어 있다. 항-PD-L1 항체 및 이들의 용도는 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,552,154호에 기재되어 있다. 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 항암제는 이들 항체에 대해 참조로 원용되는 미국 특허 제8,617,546호에 기재되어 있다.
개시된 CAR은 다른 암 면역요법과 조합하여 사용될 수 있다. 다음의 면역요법의 2 개의 뚜렷한 유형이 있다: 수동 면역요법은 반드시 환자의 면역 반응을 개시하지 않고 암세포에 대한 표적화된 세포독성 활성을 지시하기 위해 면역계의 구성요소를 사용하는 반면, 능동 면역요법은 내인성 면역 반응을 능동적으로 촉발한다. 수동 전략은 특이적 항원에 대한 반응으로 B 세포에 의해 생산되는 단클론 항체 (mAb)의 사용을 포함한다. 1970 년대 하이브리도마 기술의 개발 및 종양-특이적 항원의 식별은 면역계에 의한 파괴를 위해 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 mAb의 약학적 개발을 허용하였다. 지금까지, mAb는 면역요법의 가장 큰 성공 사례였다. 2012 년에 가장 많이 팔린 상위 3 개의 항암 약물은 mAbs였다. 이들 중 리툭시맙 (리툭산, Genentech)은 B 세포 악성종양, 예컨대, 비-호지킨 림프종 (NHL)의 표면 상에 고도로 발현되는 CD20 단백질에 결합한다. 리툭시맙은 화학요법과 조합하여 NHL 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료에 대해 FDA에 의해 승인되었다. 다른 중요한 mAb는 HER2의 발현을 표적화함으로써 HER2 (인간 표피 성장 인자 수용체 2)-양성 유방암의 치료에 혁명을 일으킨 트라스투주맙 (허셉틴; Genentech)이다.
최적의 "킬러" CD8 T 세포 반응을 생성하는 것은 또한 OX40 (CD134) 및 4-1BB (CD137)를 포함하는 종양 괴사 인자 수용체 패밀리 구성원의 결찰을 통해 제공될 수 있는 T 세포 수용체 활성화에 더하여 공동-자극을 필요로 한다. OX40은 활성화 (작용제) 항-OX40 mAb를 이용한 치료가 T 세포 분화 및 세포용해 기능을 증강시켜 다양한 종양에 대한 항-종양 면역성을 향상시키기 때문에 특히 관심이 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 항대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 젬시타빈 또는 클라드리빈으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 알킬화제, 예컨대, 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카바진 (DTIC), 프로카바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 기타 백금 유도체, 예컨대, 카보플라틴으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 유사분열 방지제, 예컨대, 탁산, 예를 들어, 도세탁셀 및 파클리탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 토포이소머라제 억제제, 예컨대, 토포테칸 또는 이리노테칸, 또는 세포정지 약물, 예컨대, 에토포시드 및 테니포시드로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 성장 인자 억제제, 예컨대, ErbB1 (EGFR)의 억제제 (예컨대, EGFR 항체, 예컨대, 잘루투무맙, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 니모투주맙 또는 기타 EGFR 억제제, 예컨대, 게피티닙 또는 에를로티닙), ErbB2 (HER2/neu)의 다른 억제제 (예컨대, HER2 항체, 예컨대, 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM I 또는 페르투주맙) 또는 EGFR 및 HER2 둘 모두의 억제제, 예컨대, 라파티닙)로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 추가적인 치료제는 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 이마티닙 (글리벡, Gleevec STI571) 또는 라파티닙으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 항체는 오파투무맙, 자놀리무맙, 다라투무맙, 라니비주맙, 니모투주맙, 파니투무맙, hu806, 다클리주맙 (Zenapax), 바실릭시맙 (Simulect), 인플릭시맙 (Remicade), 아달리무맙 (Humira), 나탈리주맙 (Tysabri), 오말리주맙 (Xolair), 에팔리주맙 (Raptiva) 및/또는 리툭시맙과 조합하여 사용된다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 CAR과 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항-암 사이토카인, 케모카인 또는 이들의 조합일 수 있다. 적합한 사이토카인 및 성장 인자의 예는 IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (예컨대, INFa2b), IFN, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀 및 TNFa를 포함한다. 적합한 케모카인은 인간 CXC 및 C-C 케모카인 패밀리로부터의 Glu-Leu-Arg (ELR)-음성 케모카인, 예컨대, IP-10, MCP-3, MIG 및 SDF-la를 포함할 수 있다. 적합한 사이토카인은 사이토카인 유도체, 사이토카인 변이체, 사이토카인 단편 및 사이토카인 융합 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 CAR과 조합하여 사용하기 위한 치료제는 세포 주기 제어/아폽토시스 조절인자 (또는 "조절제")일 수 있다. 세포 주기 제어/아폽토시스 조절인자는 세포 주기 제어/아폽토시스 조절인자, 예컨대, (i) cdc-25 (예컨대, NSC 663284), (ii) 세포 주기를 과잉자극하는 사이클린-의존적 키나제 (예컨대, 플라보피리돌 (L868275, HMR1275), 7-하이드록시스타우로스포린 (UCN-01, KW-2401) 및 로스코비틴 (R-로스코비틴, CYC202)), 및 (iii) 텔로머라제 조정인자 (예컨대, BIBR1532, SOT-095, GRN163 및 예를 들어, US 6,440,735호 및 US 6,713,055호에 기재된 조성물)를 표적화하고 조정하는 분자를 포함할 수 있다. 아폽토시스 경로를 방해하는 분자의 비-제한적인 예는 TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드 (TRAIL)/아폽토시스-2 리간드 (Apo-2L), TRAIL 수용체를 활성화하는 항체, IFN, 및 안티-센스 Bcl-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 CAR과 조합하여 사용하기 위한 치료제는 호르몬 조절제, 예컨대, 항-안드로겐 및 항-에스트로겐 요법에 유용한 약제일 수 있다. 이러한 호르몬 조절제의 예는 타목시펜, 이독시펜, 풀베스트란트, 드롤록시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 디에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올/에스티닐, 항안드로겐 (예컨대, 플루타민드/유렉신), 프로게스틴 (예컨대, 예컨대, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시- 프로게스테론/프로베라, 메게스트롤 아세페이트/메가스), 부신피질스테로이드 (예컨대, 하이드로코르티손, 프레드니손), 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (및 이의 유사체 및 기타 LHRH 작용제, 예컨대, 부세렐린 및 고세렐린), 아로마타제 억제제 (예컨대, 아나스트라졸/아리미덱스, 아미노글루테티미드/시트라덴, 엑세메스탄) 또는 호르몬 억제제 (예컨대, 옥트레오티드/산도스타틴)이다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 CAR과 조합하여 사용하기 위한 치료제는 항-암 핵산 또는 항-암 억제 RNA 분자일 수 있다.
위에 기재된 바와 같이 조합 투여는 동시, 개별 또는 순차적일 수 있다. 동시 투여의 경우, 약제는 적절하게 하나의 조성물 또는 별도의 조성물로서 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 CAR은 방사선요법과 조합하여 투여된다. 방사선요법은 방사선을 포함할 수 있거나 환자에 대한 방사성의약품의 연관 투여가 제공될 수 있다. 방사선 공급원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부일 수 있다 (방사선 치료는 예를 들어, 외부 빔 방사선 요법 (EBRT) 또는 근접요법 (BT)의 형태일 수 있음). 이러한 방법을 실시하는 데 사용할 수 있는 방사성 원소는 예컨대, 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 아이오다이드-123, 아이오다이드-131 및 인듐-111을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 CAR은 수술과 조합하여 투여된다.
CAR-T 세포는 종양 세포독성 및 특이성을 향상시키고, 종양 면역억압을 회피하고, 숙주 거부를 피하고, 이들의 치료적 반감기를 연장하는 여러 방식으로 설계될 수 있다. TRUCK (범용 사이토카인 살해를 위해 재지시된 T-세포) T 세포는, 예를 들어, CAR을 보유하지만 종양 살해를 촉진하는 사이토카인, 예컨대, IL-12를 방출하도록 또한 조작된다. 이러한 세포는 일단 종양 환경에 국소화된 CAR의 활성화 시 분자 페이로드를 방출하도록 설계되었기 때문에, 이러한 CAR-T 세포는 때때로 '아머 CAR'로서 또한 지칭된다. 암 요법으로서 여러 사이토카인이 전-임상 및 임상적으로 조사되고 있으며, 또한 TRUCK 형태의 CAR-T 요법에 유사하게 통합될 때 유용할 수 있다. 이들 중에는 IL-2, IL-3. IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, M-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, FLT3 리간드, 림포탁틴 및 TGF-β (Dranoff 2004)이 포함된다. "자가-구동" 또는 "귀소" CAR-T 세포는 CAR 외에 케모카인 수용체를 발현하도록 조작된다. 특정 케모카인이 종양에서 상향조절될 수 있기 때문에, 케모카인 수용체의 통합은 입양 T-세포로의 종양 트래피킹 및 이에 의한 침윤을 도와, CAR-T의 특이성 및 기능성 둘 모두를 향상시킨다 (Moon 2011). 범용 CAR-T 세포는 또한 CAR을 보유하지만, 내인성 TCR (T-세포 수용체) 또는 MHC (주요 조직적합성 복합체) 단백질을 발현하지 않도록 조작된다. 입양 T-세포 요법의 시그널링 레퍼토리로부터의 이들 2 개의 단백질의 제거는 이식편-대-숙주-질환 및 거부반응을 각자 예방한다. 아머 CAR-T 세포는 추가적으로 종양 면역억압 및 종양-유도된 CAR-T 기능저하를 회피하는 능력으로 인해 그렇게 명명되었다. 이러한 특정 CAR-T는 CAR을 보유하고 체크포인트 억제제를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 대안적으로, 이러한 CAR-T를 체크포인트 시그널링을 차단하는 단클론 항체 (mAb)와 공동-투여할 수 있다. 항-PDL1 항체의 투여는 CAR TIL (종양 침윤 림프구)의 살해 능력을 유의하게 회복시켰다. PD1-PDL1 및 CTLA-4-CD80/CD86 시그널링 경로가 조사되었지만, LAG-3, Tim-3, IDO-1, 2B4 및 KIR을 비롯하여, 아머 CAR-T의 설계에서 기타 면역 체크포인트 시그널링 분자를 표적화하는 것이 가능하다. TIL의 기타 세포내 억제제는 포스파타제 (SHP1), 유비퀴틴-리가제 (즉, cbl-b) 및 키나제 (즉, 디아실글리세롤 키나제)를 포함한다. 아머 CAR-T는 또한 종양-분비된 사이토카인의 영향에 대해 보호하거나 저항성을 갖도록 하는 단백질 또는 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, TGF-β 수용체의 이중 음성 형태로 형질도입된 CTL (세포독성 T 림프구)은 TGF-β를 분비하는 림프종에 의한 면역억압에 대해 저항성이 있다. 이러한 형질도입된 세포는 대조군 상대물과 비교할 때 생체내에서 현저하게 증가된 항종양 활성을 나타냈다.
탠덤 및 이중 CAR-T 세포는 2 개의 별개의 항원 결합 도메인을 보유한다는 점에서 고유하다. 탠덤 CAR은 세포내 공동자극 및 자극 도메인에 연접된 세포외 환경에 직면하는 2 개의 순차적 항원 결합 도메인을 함유한다. 이중 CAR은 하나의 세포외 항원 결합 도메인이 세포내 공동자극 도메인에 연접되고 제2의 별개의 세포외 항원 결합 도메인이 세포내 자극 도메인에 연접되도록 조작된다. 자극 및 공동자극 도메인이 2 개의 별도의 항원 결합 도메인 사이에 분할되기 때문에, 이중 CAR은 "분할 CAR"로서 또한 지칭된다. 탠덤 및 이중 CAR 설계 둘 모두에서, T-세포에서 CAR 회로의 시그널링을 허용하기 위해 두 항원 결합 도메인의 결합이 필요하다. 이들 2 개의 CAR 설계는 상이한 별개의 항원에 대한 결합 친화도를 갖기 때문에, 이들은 "이중-특이적" CAR로서 또한 지칭된다.
"살아 있는 치료제"의 형태로서 CAR-T 세포에 대한 하나의 주요 관심사는 생체내에서의 이들의 조작성 및 이들의 잠재적인 면역-자극 부작용이다. CAR-T 요법을 보다 잘 제어하고 원치 않는 부작용을 예방하기 위해, 오프-스위치, 안전성 메커니즘 및 조건부 제어 메커니즘을 포함한 다양한 특징이 조작되었다. 예를 들어, 자가-파괴 및 마킹된/태깅된 CAR-T 세포 둘 모두는 CAR-발현 T-세포의 클리어런스를 촉진하는 "오프-스위치(off-switch)"를 갖도록 조작된다. 자가-파괴 CAR-T는 CAR을 함유하지만, 외인성 분자의 투여시 유도성인 아폽토시스-유도 자살 유전자 또는 "제거 유전자"를 발현하도록 조작된다. HSV-TK (단순 포진 바이러스 티미딘 키나제), Fas, iCasp9 (유도성 카스파제 9), CD20, MYC 태그 및 절삭된 EGFR (내피 성장 인자 수용체)을 포함하여 다양한 자살 유전자가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, HSK는 전구약물 간시클로비르 (GCV)를 GCV-트리포스페이트로 전환시킬 것이며, 이는 복제 DNA 내에 자체 혼입되어 궁극적으로 세포 사멸을 야기한다. iCasp9는 소분자 AP1903에 결합하여 카스파제 9 이합체화 및 아폽토시스를 야기하는 FK506-결합 단백질의 구성요소를 함유하는 키메라 단백질이다. 그러나, 마킹된/태깅된 CAR-T 세포는 CAR을 보유하지만 또한 선택 마커를 발현하도록 조작된 것이다. 이 선택 마커에 대한 mAb의 투여는 CAR-T 세포의 클리어런스를 촉진할 것이다. 절삭된 EGFR은 항-EGFR mAb에 의한 이러한 하나의 표적화가능한 항원이며, 세툭시맙의 투여는 CAR-T 세포의 제거를 촉진하도록 작용한다. 이러한 특징을 갖도록 생성된 CAR은 '스위치가능한(switchable) CAR'에 대해 sCAR 및 '조절가능한 CAR'에 대해 RCAR로서 또한 지칭된다. "억제 CAR" (iCAR)로서 또한 알려진 "안전성 CAR"은 2 개의 항원 결합 도메인을 발현하도록 조작된다. 이들 세포외 도메인 중 하나는 종양 관련 항원에 대해 지시되고 세포내 공동자극 및 자극 도메인에 결합된다. 그러나, 제2 세포외 항원 결합 도메인은 정상 조직에 특이적이고, 세포내 체크포인트 도메인, 예컨대, CTLA4, PD1 또는 CD45에 결합된다. 다중 세포내 억제 도메인의 iCAR로의 혼입이 또한 가능하다. 이들 억제 도메인을 제공할 수 있는 일부 억제 분자는 B7-H1, B7-1, CD160, PIH, 2B4, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, TIGIT, BTLA, LAIR1, 및 TGFβ-R을 포함한다. 정상 조직의 존재 하에, 이 제2 항원 결합 도메인의 자극은 CAR을 억제하도록 작용할 것이다. 이 이중 항원 특이성으로 인해, iCAR은 또한 이중-특이적 CAR-T 세포의 형태라는 점에 주목해야 한다. 안전성 CAR-T 조작은 종양 조직에 대한 CAR-T 세포의 특이성을 향상시키고, 특정 정상 조직이 표준 CAR로 표적 외 효과를 야기할 것인 종양 연관된 항원의 매우 낮은 수준을 발현할 수 있는 상황에서 유리하다 (Morgan 2010). 조건부 CAR-T 세포는 세포내 공동자극 도메인 및 개별 세포내 공동자극인자에 연접된 세포외 항원 결합 도메인을 발현한다. 공동자극 및 자극 도메인 서열은 외인성 분자의 투여시 생성된 단백질이 세포내에서 함께 모여 CAR 회로를 완성할 것인 방식으로 조작된다. 이러한 방식에서, CAR-T 활성화가 조정될 수 있으며, 아마도 심지어 특이적 환자에 대해 '미세-조율(fine-tuned)'되거나 개인화될 수도 있다. 이중 CAR 설계와 유사하게, 자극 및 공동자극 도메인은 조건부 CAR에서 비활성일 때 물리적으로 분리되며; 이러한 이유로 이들은 또한 "분할 CAR"로서 또한 지칭된다.
일부 실시양태에서, 이들 조작된 특징 중 2 개 이상이 조합되어 향상된 다기능적 CAR-T를 생성할 수 있다. 예를 들어, TRUCK과 같은 사이토카인을 또한 방출하는 이중- 또는 조건부- CAR 설계로 CAR-T 세포를 생성하는 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, 이중-조건부 CAR-T 세포는 2 개의 별개의 암 항원에 대해 2 개의 별도의 항원 결합 도메인을 갖는 2 개의 CAR을 발현하도록 제조될 수 있으며, 각각은 이들의 각자의 공동자극 도메인에 결합된다. 공동자극 도메인은 활성화 분자가 투여된 후에만 자극 도메인과 함께 기능하게 될 것이다. 이 CAR-T 세포가 효과적이려면, 암이 암 항원 둘 모두를 발현해야 하고 활성화 분자가 환자에 투여되어야 하며; 이로 인해, 이 설계는 이중 및 조건부 CAR-T 세포 둘 모두의 특징을 통합한다.
전형적으로, CAR-T 세포는 α-β T 세포를 사용하여 생성되지만, γ-δ T 세포가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR-T 세포를 생성하는 데 사용되는 기재된 CAR 작제물, 도메인 및 조작된 특징은 NK (자연 킬러) 세포, B 세포, 비만 세포, 골수-유래된 식세포 및 NKT 세포를 포함하는 다른 유형의 CAR-발현 면역 세포의 생성에 유사하게 사용될 수 있다. 대안적으로, CAR-발현 세포는 T-세포 및 NK 세포 둘 모두의 특성을 갖도록 생성될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, CAR로 형질도입된 것은 자가유래 또는 동종이계일 수 있다.
레트로바이러스 형질도입 (γ-레트로바이러스 포함), 렌티바이러스 형질도입, 트랜스포존/트랜스포사제 (슬리핑 뷰티 및 PiggyBac 시스템) 및 메신저 RNA 전달-매개된 유전자 발현을 포함하는, CAR 발현을 위한 여러 상이한 방법이 사용될 수 있다. CAR-T 세포 조작 가능성과 관련하여 유전자 편집 (유전자 삽입 또는 유전자 결실/붕괴)이 점점 더 중요해지고 있다. CRISPR-Cas9, ZFN (아연 핑거 뉴클레아제) 및 TALEN (이펙터 뉴클레아제와 같은 전사 활성화제) 시스템은 CAR-T 세포가 생성될 수 있는 3 개의 잠재적 방법이다.
본 발명의 다수의 실시양태가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태는 다음의 청구범위의 범주 내에 있다.
실시예
실시예 1:
도 1a 내지 1g는 TCN이 중추 기억 CAR T 세포 집단을 증가시킨다는 것을 도시한다. T 세포를 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리하였다. TCN을 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가하였다. 7 일차에 세포를 유세포 분석을 위해 염색하고, LSRII에서 실행하였다.
항-인간 CD19 작제물의 경우, SFG 백본을 CD8α 막관통 및 힌지 도메인에 이어 CD28 또는 4-1BB, 및 CD3ζ를 갖는 FMC63 ScFv를 포함하도록 변형하였다. 모든 SFG 작제물은 H29 세포로 형질주입된 칼슘 포스페이트였다. 형질주입된 H29의 레트로바이러스 상층액을 수확하고, Phoenix E 또는 RD114 세포를 형질도입하는 데 사용하였다. 생산자 세포의 레트로바이러스 상층액을 수확하고, 0.45μm로 여과하고, 기재된 바와 같이 T 세포를 형질도입하는 데 사용하였다. 생존력을 트립판 블루 염색으로 측정하고, 자동화된 세포 계수기 (Bio-Rad)에서 계수하였다. 형질도입 효율을 유세포 분석에 의해 단백질 L+ 생 세포의 백분율로서 추정하였다. 다운스트림 실험의 경우, CAR T 세포 용량을 CAR 유전자 전달을 기반으로 정규화하였지만, CAR-음성 T 세포를 배제하도록 분류하지 않았다. 그 결과, 총 T 세포 용량이 변화하였다.
도 2a 및 2b는 TCN이 m1928z CAR T 세포에서 p-Akt를 억제한다는 것을 도시한다. T 세포를 음성 선택을 사용하여 C57BL6 비장세포로부터 단리하였다. TCN을 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가하였다. 5 일차에 CAR T 세포를 24 시간 동안 3T3-mCD19 표적으로 자극하였다. 자극 후 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯을 실행하였다.
도 3a 내지 3n은 TCN이 h19BBz CAR 살해 및 사이토카인 분비를 감소시킨다는 것을 도시한다. T 세포를 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리하였다. TCN을 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가하였다. 실시간 세포 살해를 측정하기 위해 xCelligence RTCA 기계를 사용하여 3T3-hCD19 표적 세포로 CAR T 세포를 자극하였다. 사이토카인 분비를 측정하기 위해 CAR T 세포를 24 시간 동안 표적 세포로 자극하였다. 그런 다음, 상층액을 수집하고, Ella를 사용하여 실행하여, 사이토카인을 측정하였다.
도 4는 TCN이 이펙터 기억 CAR T 세포 집단을 증가시킨다는 것을 도시한다. T 세포를 음성 선택을 사용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단리하였다. TCN을 제1 스핀 형질도입 전 2 일차에 첨가하였다. 7 일차에 세포를 유세포 분석을 위해 염색하고, LSRII에서 실행하였다.
실시예 2: CAR T 세포 생산 동안 주어질 때 TCN의 효과를 평가한다.
이전 연구에서는 CAR T 세포 생산 동안 주어진 약물이 이들의 기능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. TCN의 효과를 결정하기 위해 건강한 인간 공여자 T 세포를 CAR 형질도입 전에 TCN으로 처리하였다. 10μM의 TCN이 T 세포에 대한 가장 높은 무-독성 용량이기 때문에 사용된다. 배양물에서의 형질도입 및 증식 후 CAR T 세포 기능을 결정하기 위해 생체외 검정을 수행하였다. 이들은 세포독성, 사이토카인 분비, RNA-seq, 다기능적 강도 지수 및 CAR T 세포 표현형을 포함한다. 다음으로 본 발명자들은 생체내에서의 생산하는 동안 TCN이 주어진 CAR T 세포의 기능을 평가하였다. 총 60 마리의 NSG 마우스에 -7 일차에 루시퍼라제를 함유하는 인간 B 세포 종양 세포주 NALM6을 제공하였다. 0 일차에, 그룹당 10 마리의 마우스에 TCN이 있거나 없이 생산된 형질도입되지 않은, h1928z 또는 h19BBz CAR T 세포를 제공할 것이다. 생물발광 이미징을 종양 부담을 결정하고 전체 생존을 측정하는 데 사용하였다.
실시예 3: CAR T 세포 주입 후 주어진 TCN의 효과를 평가한다.
TCN이 이미 생체내에서 CAR T 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 총 60 마리의 NSG 마우스에 0 일차에 NALM6을 제공하였다. 0 일차에, 20 마리의 마우스에 형질도입되지 않은, h1928z 또는 h19BBz CAR T 세포를 제공하였다. 각각의 그룹의 마우스 절반에 또한 실험 지속기간 동안 일주일에 한 번 TCN과 함께 i.p. 주사하였다. 생물발광 이미징을 종양 부담을 결정하고 전체 생존을 측정하여 TCN 및 CAR이 주어진 마우스와 CAR만 주어진 마우스를 비교하는 데 사용하였다. 그런 다음, 이 실험을 루시퍼라제가 또한 혼입된 상이한 인간 B 세포 종양주인 Raji를 사용하여 한 번 반복하였다. 이는 결과가 상이한 B 세포 종양 간에 일치함을 입증하였다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 공개물 및 이들이 인용된 자료는 참조로 구체적으로 원용된다.
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 일상적인 실험만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (19)

  1. 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) CAR-T 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에 입양적으로 전달(adoptively transfering)하는 단계, 및
    (b) Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Akt 억제제가 트리시리빈 (TCN)인 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CAR-T 세포가 종양 연관된 항원 (TAA) 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 시그널링 도메인 및 공동-자극 시그널링 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포가 αβT 세포, γδT 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, B 세포, 선천성 림프 세포 (ILC), 사이토카인 유도된 킬러 (CIK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 림포카인 활성화된 킬러 (LAK) 세포, 조절 T 세포 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  5. 대상체에서 CAR-T 세포 요법을 향상시키는 방법으로서,
    Akt 억제제를 CAR-T 세포의 지속성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 치료적 CAR-T 세포의 입양 세포 전달을 겪는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 Akt 억제제가 트리시리빈 (TCN)인 것인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 CAR-T 세포가 종양 연관된 항원 (TAA) 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 시그널링 도메인 및 공동-자극 시그널링 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포가 αβT 세포, γδT 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, B 세포, 선천성 림프 세포 (ILC), 사이토카인 유도된 킬러 (CIK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 림포카인 활성화된 킬러 (LAK) 세포, 조절 T 세포 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  9. 입양 세포 요법에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 이펙터 기억 T (CAR-TEM) 세포로서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 CD45RO+/CCR7-/CD62L- T 세포의 정제된 집단을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 이펙터 기억 T (CAR-TEM) 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 CAR 폴리펩티드가 CD28 공동-자극 도메인을 포함하지 않는 것인, CAR-TEM 세포.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 CAR 폴리펩티드가 41BB 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, CAR-TEM 세포.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CAR-TEM 세포를 생산하는 방법으로서,
    (a) 공여자로부터 PBMC를 단리하고, 상기 PBMC로부터 T 세포를 단리하는 단계,
    (b) CD3/CD28 비드로 상기 T 세포를 자극하는 단계,
    (c) CAR 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스 벡터로 상기 활성화된 T 세포를 형질도입하는 단계,
    (d) Akt 억제제를 이펙터 기억 T 세포의 비율을 증가시키기에 효과적인 양으로 함유하는 배양 배지에서 상기 CAR-T 세포를 확장하는 단계, 및
    (e) 상기 CAR-T 세포를 분류하여, CD45RO+/CCR7-/CD62L- CAR-TEM 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 CAR-TEM 세포가 CD8+/CD4- T 세포인 것인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 Akt 억제제가 트리시리빈 (TCN)인 것인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (e) 상기 CAR-T 세포를 분류하여, CD45RO+/CCR7-/CD62L- CAR-TEM 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지가 1 내지 10 μM의 Akt 억제제를 함유하는 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 배양 배지가 3 μM의 Akt 억제제를 함유하는 것인, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR 폴리펩티드가 CD28 공동-자극 도메인을 포함하지 않는 것인, 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR 폴리펩티드가 41BB 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, 방법.
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