JP2024510184A - 治療用ｔ細胞毒性を減少させるための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

既製の免疫エフェクター細胞を自己活性化し、それによりＧＶＨＤをもたらし得るＴ細胞受容体（例えば、ＴＣＲαβ）の発現を減少させるように構成された、本明細書に開示される抗ＣＤ３抗体を発現するように操作された前記免疫エフェクター細胞が開示される。ドナー免疫エフェクター細胞を改変して、同種異系対象の既製の処置に適したものにするための方法も開示される。これらの方法は、前記細胞を活性化するように構成された抗ＣＤ３抗体を発現するように前記細胞を操作することを含む。いくつかの実施形態では、前記抗体は、免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体に結合する二重特異性抗体である。他の実施形態では、前記抗体は、前記免疫エフェクター細胞を自己活性化する膜結合抗ＣＤ３抗体である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１０日に出願された米国仮出願第６３／１５９，２２２号、２０２１年６月１０日に出願された米国仮出願第６３／２０９，０９４号、および２０２１年７月２６日に出願された米国仮出願第６３／２２５，７１５号の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、２２６，１６２バイトを有する、２０２２年３月８日に作成された「３２０８０３－２８００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表を含む。配列表の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。

背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などの自己Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍の治療状況を変化させた。それにもかかわらず、ドナー由来の同種異系Ｔ細胞の使用は、患者処置のための凍結保存バッチの即時利用可能性、Ｔ細胞産物の可能な標準化、複数の細胞改変のための時間、異なる標的に対するＴ細胞の再投与または組み合わせ、および工業化されたプロセスを使用したコスト削減など、自己アプローチを超える多くの潜在的な利点を有する。しかしながら、同種異系Ｔ細胞は、生命を脅かす移植片対宿主病を引き起こし得、宿主免疫系によって迅速に排除され得る。したがって、移植片対宿主病の可能性が低下した同種異系Ｔ細胞を改変するための方法が当技術分野で必要とされている。

概要
免疫エフェクター細胞を自己活性化し、それによりＧＶＨＤをもたらし得るＴ細胞受容体（例えば、ＴＣＲαβ）の発現を減少させるように構成された、本明細書に開示される抗ＣＤ３抗体を発現するように操作された既製の免疫エフェクター細胞が開示される。

ドナー免疫エフェクター細胞を改変して、同種異系対象の既製の処置に適したものにするための方法も開示される。これらの方法は、細胞を活性化するように構成された抗ＣＤ３抗体を発現するように細胞を操作することを含む。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにさらに操作される。他の実施形態では、免疫エフェクター細胞はＣＡＲを発現せず、代わりに標的化のために抗体に依拠する。

いくつかの実施形態では、抗体は、免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体を別の細胞に架橋する二重特異性抗体である。他の実施形態では、抗体は、免疫エフェクター細胞を自己活性化する膜結合抗ＣＤ３抗体である。他の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖなどの単一特異性抗体である。

したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作して単一特異性抗ＣＤ３抗体を分泌させることを含む、同種異系細胞移入のためにＣＡＲ－Ｔ細胞を増強するための方法も開示される。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、同種ドナーから得られる。したがって、対象のがんを処置するための方法であって、同種ドナーから免疫エフェクター細胞を得ること；免疫エフェクター細胞を、抗ＣＤ３多重特異性抗体を発現するように操作することであって、抗体は、免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体および別の細胞上の第２の抗原に、ＣＤ３複合体を活性化するのに十分な様式で結合するように構成される、操作すること；および、操作された免疫エフェクター細胞を、がんを処置するのに有効な量で対象に投与することを含む、方法も開示される。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、感染症および異物から身体を防御することに関与する任意のＣＤ３発現リンパ球を含む。

したがって、既製の免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体を別の細胞上の抗原と架橋することができる二重特異性分子も開示される。二重特異性分子は、１）標的細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の可変ドメインおよび２）ＣＤ３に特異的に結合する抗体の可変ドメインを含む融合ポリペプチドから操作することができる。二重特異性分子のいずれかまたは両方の成分は、ナノボディ、モノボディ、環状ペプチド、小分子、および設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｄａｒｐｉｎ）を含むがこれらに限定されない非抗体骨格から操作することもできる。

いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、例えば、以下の式を有する二重特異性Ｔ細胞係合（ＢｉＴＥ）抗体（融合ポリペプチド）である。
ＳＰ－Ｖ_ＬＲ－Ｖ_ＨＲ－／－Ｖ_Ｌ３－Ｖ_Ｈ３、
ＳＰ－Ｖ_ＨＲ－Ｖ_ＬＲ－／－Ｖ_Ｈ３－Ｖ_Ｌ３、
ＳＰ－Ｖ_ＬＲ－Ｖ_ＨＲ－／－Ｖ_Ｈ３－Ｖ_Ｌ３、
ＳＰ－Ｖ_ＨＲ－Ｖ_ＬＲ－／－Ｖ_Ｌ３－Ｖ_Ｈ３、
ＳＰ－Ｖ_Ｌ３－Ｖ_Ｈ３－／－Ｖ_ＬＲ－Ｖ_ＨＲ、
ＳＰ－Ｖ_Ｈ３－Ｖ_Ｌ３－／－Ｖ_ＨＲ－Ｖ_ＬＲ、
ＳＰ－Ｖ_Ｌ３－Ｖ_Ｈ３－／－Ｖ_ＨＲ－Ｖ_ＬＲ、または
ＳＰ－Ｖ_Ｈ３－Ｖ_Ｌ３－／－Ｖ_ＬＲ－Ｖ_ＨＲ、
式中、「ＳＰ」は、オプショナルのシグナルペプチドを表し、
式中、「Ｖ_ＬＲ」は、標的細胞表面受容体に特異的な軽鎖可変ドメインであり；
式中、「Ｖ_Ｈ３」は、ＣＤ３に特異的な重鎖可変ドメインであり；
式中、「Ｖ_Ｌ３」は、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変ドメインであり；
式中、「Ｖ_ＨＲ」は、標的細胞表面受容体に特異的な重鎖可変ドメインであり；
式中、「－」はペプチドリンカーまたはペプチド結合からなり；および
式中、「－／－」はペプチドヒンジ配列からなる。

いくつかの実施形態では、抗体は、完全な重鎖領域および軽鎖領域を含有する二重特異性抗体である。この実施形態では、抗体は、「ノブおよびホール」フォーマット（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６ ９（７）：６１７－２１）などの記載された方法によって生成され得る。

標的細胞表面受容体は、場合によっては、細胞によって発現される任意の他の細胞表面受容体、チャネルまたはトランスポーターであり得る。いくつかの実施形態では、受容体は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。追加の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然リガンドであり得る。さらなる抗原結合ドメインの選択は、処置されるがんの特定のタイプに依存する。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＣＳＰＧ４、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ ＬＸ、ＣＳ－１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＨＥＲ２、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ－１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ－４、ＬＣＫ、ＯＹ－ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ－１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６－ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸（plysialic acid）、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－Ｉａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ－４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座ブレークポイント、ＮＹ－ＢＲ－１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ－アセチル－ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ Ａｇ、Ｔｉｅ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２およびメソテリンが挙げられる。好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、葉酸受容体（ＦＲａ）、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ－１、ＣＡ－ＩＸ、ＭＵＣｌ、ＨＥＲ２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下：チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原およびＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｉ ５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの過剰発現癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座から生じる固有の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；およびウイルス抗原、例えばエプスタイン・バー・ウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が挙げられる。他の大きなタンパク質系抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１ ６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリン（cyclophilm）Ｃ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ－１、ＢＡＲＦ－１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴが挙げられる。

開示される融合ポリペプチドをコードする単離された核酸、ならびに発現制御配列に作動可能に連結されたこの単離された核酸を含有する核酸ベクターも開示される。これらのベクターでトランスフェクトされた細胞、および開示される融合ポリペプチドを産生するためのこれらの細胞の使用も開示される。

二重特異性抗原結合分子は、重鎖および軽鎖の二量体化から形成され得る。これらの実施形態では、Ｖ_ＬＲはＶ_ＨＲと二量体化して標的細胞表面受容体に対する抗原結合部位を形成し、Ｖ_Ｈ３はＶ_Ｌ３と二量体化してＣＤ３に対する抗原結合部位を形成する。

第１の抗原結合領域および第２の抗原結合領域を有する二重特異性抗体を含む単一ポリペプチド鎖である二重特異性抗体も開示される。場合により、第１の抗原結合領域は、細胞上の標的受容体に特異的に結合することができ；第２の抗原結合領域は、免疫エフェクター細胞上のＣＤ３に特異的に結合することができる。

第１および第２の部分の各々は、１、２、３またはそれを超える抗体可変ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、第１および第２の部分の各々は、２つの可変ドメイン、可変重（Ｖ_Ｈ）ドメインおよび可変軽（Ｖ_Ｌ）ドメインを含む。

いくつかの場合において、二重特異性抗体は、約１０^－７ Ｍ、１０^－８ Ｍ、１０^－９ Ｍまたはそれ未満のＫ_Ｄに対応する標的受容体およびＣＤ３に対する親和性を有する。

第１および第２の部分の各々は、モノクローナル抗体などの天然抗体に由来し得る。いくつかの場合において、抗体はヒトである。いくつかの場合において、二重特異性抗体は、ヒトに投与されたときに免疫原性を低下させるための改変を受けている。例えば、改変は、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、脱免疫、および、最も近いヒト生殖系列配列に対応するためのフレームワークアミノ酸の変異からなる群から選択される１またはそれを超える技術を含む。

薬学的に許容され得る担体中に本明細書に開示される分子を含む医薬組成物も開示される。治療有効量の開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における標的受容体の標的ユビキチン化のための方法も開示される。本明細書に開示される二重特異性抗体を含むキットも開示される。

発現制御配列に作動可能に連結された本明細書に開示される二重特異性抗体をコードする単離された核酸を含む発現ベクターも開示される。開示される発現ベクターを含む細胞も開示される。細胞は、初代細胞、形質転換細胞、細胞株などであり得る。いくつかの場合において、細胞は哺乳動物細胞株である。いくつかの場合において、細胞は非哺乳動物細胞株である。例えば、細胞は、細菌または昆虫細胞株であり得る。

本発明の１またはそれを超える実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

図１Ａ～１Ｃは、ＣＤ１９ ＢｉＴＥまたはＨｅｒ２ ＢｉＴＥ（図１Ａ）；Ｈｅｒ２ ＢＩＴＥ＋αＨｅｒ２ＢＢ、Ｈｅｒ２ ＣＡＲ＋αＣＤ３εＩＬ１５ＲＡ、またはＨｅｒ２ ＣＡＲ＋αＣＤ３ε ｓｃＦＶ（図１Ｂ）；およびＣＤ１９ ＢｉＴＥ＋４１ＢＢＬＣＤ８０、ＣＤ１９ ＴｒｉＫＥ１（ａＣＤ２８）、またはＣＤ１９ ＴｒｉＫＥ２（４１ＢＢＬ）（図１Ｃ）で処置した後のインビトロでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。 同上。 同上。

図２Ａおよび図２Ｂは、ＧｖＤＨモデル試験を示す。図２Ａは、全身照射および１ｅ７ Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－ＴまたはＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞で処置したＮＳＧマウスを示す。図２Ｂは、化学療法および１ｅ７ ＣＴＸ＋ＣＡＲ－ＴまたはＣＴＸ＋ＢｉＴＥ－Ｔ細胞で処置したＮＳＧマウスを示す。 同上。

図３は、抗原なしのインビボでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。ＮＳＧマウスは、照射を受け、次いでＴ細胞を受けた。末梢血中のドナーＴ細胞を特定の時点で評価した。Ｄ１２、Ｔ細胞注射後１２日目。

図４は、抗原ありのインビボでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。ＮＳＧマウスに腫瘍細胞を注射し、次いでＴ細胞処置を受けさせた。末梢血中または腫瘍中のドナーＴ細胞を特定の時点で評価した。

図５Ａ～５Ｌは、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞が産生するサイトカインがより少なく、宿主Ｔ細胞の存在下での有効性に関してＣＡＲ－Ｔと同等またはより良好であることを示す。３Ｔ３．ｈＣＤ１９細胞に対するＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性（図５Ａ）およびサイトカイン産生（図５Ｂ）。Ａ３７５．Ｈｅｒ２細胞に対するＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性（図５Ｃ）およびサイトカイン産生（図５Ｄ）。図５Ｅ～５Ｈは、宿主Ｔ細胞の存在でのインビボにおけるＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の比較研究を示す。図５Ｅは、研究デザインを示す。雄ＮＳＧマウスに１．２ Ｇｙの全身照射を行った後、１日後に７００万個のＨＬＡ－Ａ２＋活性化Ｔ細胞を移植した。０日目にＮａｌｍ６ＧＬ細胞を与えた。３日目にマウスをＨＬＡ－Ａ２－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。末梢血中の生存（図５Ｆ）、ドナーＴ細胞（図５Ｇ）、およびレシピエントＴ細胞（図６Ｈ）を経時的に監視した。図５Ｉ～５Ｌは、宿主Ｔ細胞の存在でのインビボにおけるＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の比較研究を示す。図５Ｉは、研究デザインを示す。雄ＮＳＧマウスに１．２ Ｇｙの全身照射を行った後、１日後に５００万個のＨＬＡ－Ａ２＋活性化Ｔ細胞を移植した。０日目にＡ３７５．Ｈｅｒ２細胞を与えた。８日目にマウスをＨＬＡ－Ａ２－Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。末梢血中の腫瘍成長（図５Ｊ）、ドナーＴ細胞（図５Ｋ）、およびレシピエントＴ細胞（図５Ｌ）を経時的に監視した。ＤＴＣ、ドナーＴ細胞；ＲＴＣ、レシピエントＴ細胞。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図６Ａ～６Ｏは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と匹敵またはそれを超える、共刺激またはサイトカイン増強ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の有効性を示す。図６Ａ～６Ｃは、Ａ３７５．Ｈｅｒ２細胞に対する連続殺傷アッセイを示す。図６Ａは、経時的なＴ細胞増殖を示す。図６Ｂは、経時的なＴＣＲαβ発現を示す。図６Ｃは、経時的なＣＤ３発現を示す。図６Ｄ～６Ｈは、共刺激増強Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞との有効性比較を示す。図６Ｄは、研究デザインを示す。図６Ｅは、腫瘍成長を示す。図６Ｆは、腫瘍浸潤Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図６Ｇは、経時的な末梢血中のドナーＴ細胞を示す。図７Ｈは、経時的な体重変化を示す。図６Ｉ～６Ｍは、共刺激増強ＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の比較研究からのデータを示す。図６Ｉは、研究デザインを示す。図６Ｊは生存を示す。小さい矢印は、白血病またはＧｖＨＤとは無関係の死亡事象を示す。図６Ｋは、体重変化を示す。図６Ｌは、末梢血におけるドナーＴの持続性を示す。図６Ｍは、ＷＫ ４血液Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。図６Ｎ（Ｈｅｒ２）および図６Ｏ（ＣＤ１９）は、インビトロでの連続殺傷アッセイにおけるＩＬ７およびＩＬ１５を過剰発現するＢｉＴＥ－Ｔ細胞の評価を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図７Ａ～７Ｉは、ＣＤ３係合誘導性ＴＣＲαβ／ＣＤ３ダウンレギュレーションおよびＢｉＴＥ操作Ｔ細胞のアロ反応性の低下を示す。図７Ａは、プレートにコーティングしたｍＣＤ３ε抗体で２４時間処理した後のマウスＴ細胞上のマウスＴＣＲ／ＣＤ３発現を示す。図７Ｂは、研究で使用したＢｉＴＥおよびＣＡＲ構築物の概略図を示す。図７Ｃは、ＴＣＲαβ抗体の２つの異なるクローンを使用した、ＵＴ、ＢｉＴＥ－ＴまたはＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＴＣＲαβ評価を示す。図７Ｄは、膜結合型または可溶性の分泌型ＣＤ３ε ｓｃＦｖで操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴＣＲαβ／ＣＤ３発現を示す。図７Ｅは、膜結合型または可溶性の分泌型ＣＤ３ε ｓｃＦｖで操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。図７Ｆは、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫表現型を示す。図７Ｇ～７Ｉは、化学療法を用いたＧｖＨＤリスク研究を示す。マウスを２５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）で処置し、次いで、１０００万個の形質導入Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞（ＵＴ）を与えた。図７Ｇは生存を示す。図７Ｈは、体重変化を示す。図７Ｉは、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞による長期の白血病保護を示す。同じ研究において、生存したマウスを、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の４．５ヶ月後にＮＡＬＭ６ＧＬ細胞でチャレンジした。チャレンジの３週間後に、末梢血中の白血病細胞を評価した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図８Ａは、ＨＬＡミスマッチドナーＴ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲαβダウンレギュレーションを誘導するＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の代表的なフロープロットを示す。図８Ｂは、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞が同種異系Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を減少させたことを示す。ＨＬＡ－Ａ２＋Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞を、サイトカインなしで５日間ＨＬＡ－Ａ２－ＰＢＭＣと共培養した。全細胞をフロー分析に供した。 同上。

図９Ａ～９Ｈは、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞ほど耐久性がないことを示す。図１０Ａは、ＣＤ１９連続殺傷アッセイにおけるＴ細胞拡大を示す。図９Ｂは、連続殺傷アッセイにおけるＮＡＬＭ６ＧＬ細胞殺傷を示す。図９Ｃは、Ａ３７５．Ｈｅｒ２連続殺傷アッセイにおけるＴ細胞拡大を示す。図９Ｄは、連続殺傷アッセイにおけるＡ３７５．Ｈｅｒ２細胞殺傷を示す。図１０Ｅ（生存）および図９Ｆ（Ｔ細胞持続性）は、ＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ有効性比較を示す。図９Ｇ（腫瘍成長）および図９Ｈ（Ｔ細胞持続性）は、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞とのインビボ有効性比較を示す。 同上。 同上。 同上。

図１０は、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した共刺激増強ＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の生物発光データを示す。

詳細な説明
本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、説明された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明確にそうでないと指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値は、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本開示内にも包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本開示に含まれる。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許は、あたかも各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されているものに関連して方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、本開示が先行開示によってそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。

本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載および図示された個々の実施形態の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。列挙された任意の方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。

本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者の技術の範囲内にある化学、生物学などの技術を使用する。

以下の実施例は、当業者に、本明細書に開示され、特許請求される方法を実行し、プローブを使用する方法の完全な開示および説明を提供するために記載される。数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な温度および圧力は、２０℃および１気圧として定義される。

本開示の実施形態を詳細に説明する前に、特に指示しない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料、製造プロセスなどに限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本開示では、論理的に可能な場合、異なる順序でステップを実行することも可能である。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的結合能力を維持するその誘導体、および免疫グロブリン結合ドメインと相同またはほぼ相同な結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然源に由来してもよく、または部分的もしくは全体的に合成的に産生されてもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれかを含む任意の種からの任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物で使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。

「抗体断片」という用語は、全長未満の抗体の任意の誘導体を指す。例示的な実施形態では、抗体断片は、全長抗体の特異的結合能の少なくとも有意な部分を保持する。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、ＦｃおよびＦｄ断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生されてもよく、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え産生されてもよく、または全体的または部分的に合成的に産生されてもよい。抗体断片は、必要に応じて、一本鎖抗体断片であってもよい。あるいは、断片は、例えばジスルフィド結合によって互いに連結された複数の鎖を含み得る。断片は、必要に応じて、多分子複合体であってもよい。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。

「抗原結合部位」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体の領域を指す。

「二重特異性抗体」という用語は、異なる抗体配列によって定義される２つの異なる抗原結合領域を有する抗体を指す。これは、異なる標的結合として理解することができるが、１つの標的中の異なるエピトープへの結合も含む。

「担体」という用語は、化合物または組成物と組み合わせた場合に、その意図する用途または目的のための化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、担体は、有効成分のあらゆる分解を最小限に抑え、対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限に抑えるように選択することができる。

「操作された抗体」という用語は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む抗体断片を少なくとも含み、Ｉｇクラスのいずれかに由来する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹ）の可変ドメインおよび／または定常ドメインの全体または一部を必要に応じて含む組換え分子を指す。

「エピトープ」という用語は、抗体が優先的かつ特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に定義することができる分子の単一の特異的エピトープに優先的に結合する。本発明では、多重特異性抗体によって複数のエピトープを認識することができる。

「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のポリペプチド部分を含むハイブリッドポリペプチドを指す。部分は、同じ生物のタンパク質に由来してもよく、その場合、融合タンパク質は、「種内」、「遺伝子内」などと言われる。様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドに連結された１またはそれを超えるアミノ酸配列を含み得る。１よりも多くのアミノ酸配列が第１のポリペプチドに融合される場合、融合配列は、同じ配列の複数のコピーであってもよく、あるいは異なるアミノ酸配列であってもよい。第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端に融合され得る。さらに、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの配列内に挿入され得る。

「Ｆａｂ断片」という用語は、ヒンジ領域においてＨ鎖間ジスルフィド結合に対してＮ末端側で切断して１つの抗体分子から２つのＦａｂ断片を生成する酵素パパインによる抗体の切断によって生成された抗原結合部位を含む抗体の断片を指す。

「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域においてＨ鎖間ジスルフィド結合に対してＣ末端側で切断する酵素ペプシンによる抗体分子の切断によって生成された２つの抗原結合部位を含む抗体の断片を指す。

「Ｆｃ断片」という用語は、その重鎖の定常ドメインを含む抗体の断片を指す。

「Ｆｖ断片」という用語は、その重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体の断片を指す。

「遺伝子構築物」は、ポリペプチドの「コード配列」を含むか、そうでなければ、生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンス、デコイ、リボザイムなど）に転写可能であり、細胞、例えば特定の実施形態では哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得、構築物でトランスフェクトされた細胞においてコード配列の発現を引き起こし得る核酸、例えばベクター、プラスミド、ウイルスゲノムなどを指す。遺伝子構築物は、コード配列に作動可能に連結された１またはそれを超える調節エレメント、ならびにイントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子などを含み得る。

「単離されたポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡから調製され得るか、または合成起源、それらの何らかの組み合わせであり得るか、または天然に存在するポリペプチドであり得、（１）通常自然界で会合しているタンパク質と会合していない、（２）通常存在する細胞から単離される、（３）同じ細胞源由来の他のタンパク質を本質的に含まない、（４）異なる種由来の細胞によって発現される、または（５）自然界では存在しないポリペプチドを指す。

「単離された核酸」という用語は、（１）「単離された核酸」が自然界で見出される細胞と関連していないか、または（２）自然界では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、ゲノム、ｃＤＮＡ、合成、もしくは天然起源またはそれらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを指す。

「リンカー」という用語は当技術分野で認識されており、２つの化合物、例えば２つのポリペプチドを接続する分子または分子群を指す。リンカーは、単一の連結分子から構成されてもよく、または連結分子と化合物とを特定の距離だけ分離することを意図した連結分子およびスペーサー分子を含んでもよい。

「多価抗体」という用語は、１よりも多くの抗原認識部位を含む抗体または操作された抗体を指す。例えば、「二価」抗体は２つの抗原認識部位を有するが、「四価」抗体は４つの抗原認識部位を有する。「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」などの用語は、多価抗体に存在する異なる抗原認識部位特異性の数を指す（抗原認識部位の数とは対照的に）。例えば、「単一特異性」抗体の抗原認識部位はすべて同じエピトープに結合する。「二重特異性」抗体は、第１のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位とを有する。「多価単一特異性」抗体は、すべて同じエピトープに結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異性」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのいくつかは第１のエピトープに結合し、そのいくつかは第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する。

「核酸」という用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、ならびに記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

「薬学的に許容され得る」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

本明細書で使用される場合、「ペプチド模倣体」は、正常なペプチド化学のいくらかの改変を含むペプチドの模倣体を意味する。ペプチド模倣体は、典型的には、元のペプチドのいくつかの特性を増強する（例えば安定性の増加、有効性の増加、送達の増強、半減期の延長など）。既知のポリペプチド配列に基づいてペプチド模倣体を作製する方法は、例えば、米国特許第５，６３１，２８０号；第５，６１２，８９５号；および第５，５７９，２５０号に記載されている。ペプチド模倣体の使用は、所与の位置に非アミド結合を有する非アミノ酸残基の組み込みを含み得る。本発明の一実施形態は、化合物が、適切な模倣物で置き換えられた結合、ペプチド骨格またはアミノ酸成分を有するペプチド模倣体である。適切なアミノ酸模倣物であり得る非天然アミノ酸のいくつかの非限定的な例としては、β－アラニン、Ｌ－α－アミノ酪酸、Ｌ－γ－アミノ酪酸、Ｌ－α－アミノイソ酪酸、Ｌ－ε－アミノカプロン酸、７－アミノヘプタン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｎ－ε－Ｂｏｃ－Ｎ－α－ＣＢＺ－Ｌ－リジン、Ｎ－ε－Ｂｏｃ－Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニンスルホン、Ｌ－ノルロイシン、Ｌ－ノルバリン、Ｎ－α－Ｂｏｃ－Ｎ－δＣＢＺ－Ｌ－オルニチン、Ｎ－δ－Ｂｏｃ－Ｎ－α－ＣＢＺ－Ｌ－オルニチン、Ｂｏｃ－ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｂｏｃ－ヒドロキシプロリンおよびＢｏｃ－Ｌ－チオプロリンが挙げられる。

「タンパク質」（一本鎖の場合）、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、例えばコード配列によってコードされ得るような遺伝子産物を指す場合、本明細書では互換的に使用される。本明細書で「ポリペプチド」に言及する場合、当業者は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、タンパク質を代わりに使用できることを認識する。「タンパク質」はまた、１またはそれを超えるポリペプチドの会合を指し得る。「遺伝子産物」とは、遺伝子の転写の結果として産生される分子を意味する。遺伝子産物には、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子、ならびにそのような転写物から翻訳されたタンパク質が含まれる。

「ポリペプチド断片」または「断片」という用語は、特定のポリペプチドに関して使用される場合、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が通常は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるポリペプチドを指す。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。断片は、典型的には、少なくとも約５、６、８もしくは１０アミノ酸長、少なくとも約１４アミノ酸長、少なくとも約２０、３０、４０もしくは５０アミノ酸長、少なくとも約７５アミノ酸長、または少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００またはそれを超えるアミノ酸長である。断片は、参照ポリペプチドの生物学的活性の１またはそれを超えるものを保持することができる。様々な実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの酵素活性および／または相互作用部位を含み得る。別の実施形態では、断片は免疫原性を有し得る。

「一本鎖可変断片またはｓｃＦｖ」という用語は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとが連結されているＦｖ断片を指す。１またはそれを超えるｓｃＦｖ断片を他の抗体断片（重鎖または軽鎖の定常ドメインなど）に連結して、１またはそれを超える抗原認識部位を有する抗体構築物が形成され得る。

ポリペプチド（抗体を含む）または受容体に言及する場合、本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質またはポリペプチドまたは受容体の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件下（例えば、抗体の場合ではイムノアッセイ条件）では、特定のリガンドまたは抗体は、試料中に存在する他のタンパク質に、またはリガンドもしくは抗体が生物において接触し得る他のタンパク質に、有意な量で結合しない場合、その特定の「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、その第２の分子と約１０^５ Ｍ^－１（例えば、１０^６ Ｍ^－１、１０^７ Ｍ^－１、１０^８ Ｍ^－１、１０^９ Ｍ^－１、１０^１０ Ｍ^－１、１０^１１ Ｍ^－１、および１０^１２ Ｍ^－１またはそれを超える）を超える親和定数（Ｋａ）を有する。

本明細書で使用される「特異的に送達する」という用語は、分子と、特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織との優先的な会合を指し、その標的分子を欠く細胞または組織との優先的な会合を指さない。もちろん、分子と非標的細胞または組織との間にある程度の非特異的相互作用が起こり得ることが認識されている。それにもかかわらず、特異的送達は、標的分子の特異的認識を介して媒介されるものとして区別され得る。典型的には、特異的送達は、送達された分子と標的分子を有する細胞との間に、送達された分子と標的分子を欠く細胞との間よりもはるかに強い会合をもたらす。

「対象」という用語は、投与または処置の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは獣医学患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば医師の処置を受けている対象を指す。

「治療有効」という用語は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１またはそれを超える原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。そのような改善は、必ずしも排除ではなく、減少または改変のみを必要とする。

「処置」という用語は、疾患、病理学的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防することを意図した患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的処置、すなわち、疾患、病理学的状態または障害の改善に特異的に向けられた処置を含み、また、原因処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態または障害の原因の除去に向けられた処置も含む。さらに、この用語は、緩和的処置、すなわち、疾患、病理学的状態または障害の治癒ではなく症状の緩和のために設計された処置；予防的処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限に抑えること、または部分的もしくは完全に抑制することを目的とした処置；および支持的処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態または障害の改善を目的とした別の特定の治療を補うために用いられる処置を含む。
既製の免疫エフェクター細胞

免疫エフェクター細胞を自己活性化し、それによりＧＶＨＤをもたらし得るＴ細胞受容体（例えば、ＴＣＲαβ）の発現を減少させるように構成された、本明細書に開示される抗ＣＤ３抗体を発現するように操作された既製の免疫エフェクター細胞が開示される。したがって、これらの細胞は、好ましくは健常ドナー対象から得られる。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。免疫エフェクター細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取した血液から得ることができる。例えば、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスによって得ることができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によるかまたは向流遠心分離溶出によって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特定の亜集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。例えば、免疫エフェクター細胞は、ポジティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用して、例えば、抗体コンジュゲートビーズと所望の免疫エフェクター細胞のポジティブ選択に十分な時間インキュベートすることによって単離することができる。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の富化は、ネガティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用するネガティブ選択によって達成することができる。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、感染症および異物から身体を防御することに関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むことができる。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。それらは胸腺で成熟するのでＴ細胞と呼ばれる（一部は扁桃でも成熟する）。Ｔ細胞のいくつかのサブセットが存在し、それぞれが異なる機能を有する。

Ｔヘルパー細胞（Ｔ_Ｈ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されると活性化される。活性化されると、それらは急速に分裂し、活性な免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、異なるタイプの免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌するＴ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_Ｈ９、またはＴ_ＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができる。

細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔ_Ｃ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８^＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞を不活性化してアネルギー状態にすることができ、これにより自己免疫疾患が予防される。

メモリーＴ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露されるとすぐに多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、したがって免疫系に過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリー細胞は、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介性免疫を遮断し、胸腺におけるネガティブ選択のプロセスを脱した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、すなわち天然に存在するＴ_ｒｅｇ細胞および適応Ｔ_ｒｅｇ細胞が記載されている。

ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同されるべきではない）は、適応免疫系と自然免疫系とを橋渡しする。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞表面発現に基づいて１またはそれを超えるサブセットが富化される。例えば、いくつかの場合において、Ｔは細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、α鎖およびβ鎖の代わりに１つのγ鎖および１つのδ鎖を有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するγδＴ細胞を含む。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染細胞および形質転換細胞を死滅させることができ、自然免疫系の重要な細胞サブセットを構成することができるＣＤ５６^＋ＣＤ３^－大型顆粒リンパ球である（Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２０１２ ５３：１６６６－１６７６）。細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は事前感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害性を開始し、ＭＨＣ－Ｉ陰性細胞も根絶することができる（Ｎａｒｎｉ－Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１ ２３：４２７－４３１）。ＮＫ細胞は、サイトカインストーム（Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０ １８：８４３－８５１）、腫瘍溶解症候群（Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１ ３６５：７２５－７３３）、およびオンターゲット、オフ腫瘍効果の潜在的に致死的な合併症を回避し得るので、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、がん細胞のキラー細胞として周知の役割を有し、ＮＫ細胞の機能障害は、ＭＭの進行にとって極めて重要であると広く記録されているが（Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２０１２ ５３：１６６６－１６７６；Ｆａｕｒｉａｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００６ ２０：７３２－７３３）、ＮＫ細胞媒介性の抗ＭＭ活性を増強し得る手段は、開示されたＣＡＲ以前にはほとんど調査されてこなかった。

エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）誘発リンパ増殖性疾患（ＥＢＶ－ＬＰＤ）および他のＥＢＶ関連がんは、同種造血細胞移植（ＨＣＴ）または固形臓器移植（ＳＯＴ）のレシピエント、特にＧＶＨＤを予防または処置するための特定のＴ細胞反応性Ａｂを受けたレシピエントについての罹患率および死亡率の重要な原因である。自己または同種ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の養子移入による予防および処置、およびその後のＥＢＶ関連リンパ増殖に対する免疫の長期回復は、同種組織移入のこれらの一様に致命的な合併症の管理において肯定的な結果をもたらした。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲポリペプチドの１またはそれを超えるものを含む開示の免疫エフェクター細胞は、同種異系または自己ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。例えば、ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生成は、ＥＢＶ血清陽性の自己または同種ドナーからＰＢＭＣを単離し、単球およびＮＫ細胞を枯渇させることによってＴ細胞についてそれらを富化することを含み得る。ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞はまた、ドナーＰＢＭＣまたは精製ドナーＴ細胞を、１またはそれを超えるＥＢＶ抗原を発現してＥＢＶ抗原（複数可）を非刺激Ｔ細胞に提示する「刺激（stimulator）」細胞と接触させ、それによってＥＢＶ特異的ＣＴＬの刺激および拡大を引き起こすことによっても産生され得る。ＥＢＶ抗原としては、例えば、潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）およびＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）タンパク質、例えば、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２ＡおよびＬＭＰ－２ＢならびにＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３ＣおよびＥＢＮＡ－ＬＰが挙げられる。１またはそれを超えるＥＢＶ特異的抗原を認識するＴ細胞受容体（複数可）を含む細胞傷害性Ｔ細胞は、これらのＥＢＶ抗原（複数可）に「感作」されたと見なされ、したがって本明細書では「ＥＢＶ感作細胞傷害性Ｔ細胞」と呼ばれる。本発明のＣＡＲポリペプチドのうちの１またはそれを超えるものを含み得る同種異系または自己ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞集団を作製するための公知の方法は、例えば、Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１０ １１６（２３）：５０４５－４９；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１２ １１９（１１）：２６４４－５６；Ｋｏｅｈｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００２ ９９（５）：１７３０－４０；およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２ ７２（５）：１１１６－２５に記載されており、これらはこれらの教示について参照により組み込まれる。
二重特異性抗体

二重特異性抗体は、１またはそれを超える可変領域を含む重鎖および／または１またはそれを超える可変領域を含む軽鎖を含み得る。二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのみを使用して構築することができる。かなり効率的で比較的単純な方法は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間のリンカー配列を、それらが折り畳まれて互いに結合することができないほど短くすることである。リンカー長を３～１２残基に減少させると、ｓｃＦｖ分子の単量体構成が妨げられ、６０ｋＤａの非共有結合性ｓｃＦｖ二量体「ダイアボディ」の形成を伴う分子間ＶＨ－ＶＬ対合が促進される。ダイアボディ形式は、短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに連結された１つの抗体由来のＶＨドメインからなる２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって得られる組換え二重特異性抗体の作製にも使用することができる。リンカーの長さをさらに３残基未満に減少させると、三量体（「トリアボディ」、約９０ｋＤａ）または四量体（「テトラボディ」、約１２０ｋＤａ）が形成され得る。操作された抗体、特に単一ドメイン断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６－１１３６を参照されたい。そのような操作された抗体のすべてが、本明細書中に提供される融合ポリペプチドにおいて使用され得る。

ｓｃＦｖ抗体の産生に適したペプチドリンカー（－）は、Ｋｕｍａｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００７ ３５（２）：１５８－１６５；Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６ ３１０（１－２）：１００－１６；Ｆｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ ２８２（１－２）：３３－４３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８ ９（１）：１０２－８；Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１ ２０３：４６－８８；Ｂｉｒｄ ＲＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ ２４２（４８７７）：４２３－６；Ｔａｋｋｉｎｅｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９１ ４（７）：８３７－４１；Ｓｍａｌｌｓｈａｗ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９９ １２（７）：６２３－３０；Ａｒｇｏｓ Ｐ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ ２１１（４）：９４３－５８；およびＷｈｉｔｌｏｗ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９３ ６（８）：９８９－９５に記載されており、これらのリンカーの教示、および様々なリンカーを使用して異なる標的に対するｓｃＦｖ抗体を産生する方法について参照により本明細書に組み込まれる。

四価Ｔａｎｄａｂ（登録商標）は、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）分子を作製する方法の教示について参照により組み込まれるＷＯ １９９９／０５７１５０ Ａ３またはＵＳ２００６／０２３３７８７に実質的に記載されているように調製され得る。

操作された抗体の抗原認識部位または可変領域全体は、目的の任意の抗原（例えば、標的受容体ＥＣＤまたはＴＭＵＬ ＥＣＤ）に対する１またはそれを超える親抗体に由来し得る。親抗体は、天然に存在する抗体または抗体断片、天然に存在する抗体から適合された抗体または抗体断片、目的の抗原に特異的であることが知られている抗体または抗体断片の配列を使用して新たに構築された抗体を含むことができる。親抗体に由来し得る配列には、重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはその他の部分が含まれる。

いくつかの場合においてＶ_Ｌ３は、アミノ酸配列
、または、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＤ３に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_Ｈ３は、アミノ酸配列
、または、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＤ３に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

他の抗ＣＤ３抗体配列（例えば、ＯＫＴ３）がこの技術分野では知られており、開示されるシステムにおいて使用され得る。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＨｅｒ２である。したがって、いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＥＧＦＲである。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＣＳＰＧ４である。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＣＤ２０である。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＣＤ２０である。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＰＳＭＡである。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＢＣＭＡである。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はメソテリンである。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＧＰＣ３である。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＥｐＣＡＭである。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

いくつかの場合において、標的細胞表面受容体はＧＤ２である。いくつかの場合においてＶ_ＨＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの場合においてＶ_ＬＲは、アミノ酸配列
、または、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアントを含む。

ｓｃＦｖ分子を一緒に結合するために使用されるペプチドリンカー（－－）の特定の長さは、構築物全体の半減期、免疫原性および活性を決定するのに重要である。いくつかの実施形態では、リンカー配列（－－）は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれを超えるアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、リンカー配列（－－）は、GGGGS（配列番号２５）を含む。いくつかの場合において、リンカーは、２、３、４、５またはそれを超えるGGGGS（配列番号２５）の配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒンジ配列（－／－）は、EPKSCDKTHTCP（配列番号２６）を含む。リンカーは、好ましくは、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ鎖の適切な折り畳みおよび会合を妨害しない十分な長さであるが、さらなる免疫原性を引き起こすほど長くない。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号２７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号２９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＰＳＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＰＳＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号３９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＢＣＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＢＣＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびメソテリンに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびメソテリンに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＰＣ３に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＰＣ３に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＤ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号４８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＤ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

いくつかの場合において、コードされた二重特異性抗体は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG（配列番号４９）。

したがって、いくつかの実施形態では、コードされる二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、コードされる二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＨｅｒ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥＧＦＲに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＳＰＧ４に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号５９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＰＳＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＰＳＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するＣＤ３およびＢＣＭＡ、に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＢＣＭＡに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびメソテリンに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびメソテリンに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＰＣ３に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＰＣ３に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号６９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号７０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＤ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、以下のアミノ酸配列を有する：
、または、配列番号７１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、ＣＤ３およびＧＤ２に結合することができるその断片もしくはバリアント。

融合ポリペプチドに含めるための候補の操作された抗体または融合ポリペプチド自体は、様々な既知のアッセイを使用して活性についてスクリーニングされ得る。例えば、結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当技術分野で日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８、第６章を参照のこと。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトに投与されたときに免疫原性を低下させるための改変に供され得る。そのような改変は、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、脱免疫、および／または、最も近いヒト生殖系列配列に対応するためのフレームワーク領域アミノ酸の変異（生殖系列化）として一般に知られている技術の１またはそれを超えるものを含み得る。したがって、改変された二重特異性抗体は、そのような改変（複数可）を受けていない対応する二重特異性抗体よりも免疫応答関連副作用が低減されているかまたは全くない状態でより長期間投与可能なままである。当業者は、抗体が望まれない宿主免疫応答を誘発することを防止するために、抗体をどの程度改変しなければならないかを決定する方法を理解するであろう。
医薬組成物

開示される分子を薬学的に許容され得る担体中に含む医薬組成物も開示される。医薬担体は当業者に公知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体である。例えば、適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｅｄ．）ｅｄ．ＰＰ．Ｇｅｒｂｉｎｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．２００５に記載されている。典型的には、製剤を等張性にするために、適切な量の薬学的に許容され得る塩が製剤に使用される。薬学的に許容され得る担体としては、食塩水、リンゲル液、デキストロース液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは約７～約７．５である。溶液はＲＮＡｓｅ不含であるべきである。さらなる担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出調製物が含まれ、このマトリックスは、成形物品、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明らかである。

薬学的に許容され得る担体としては、本発明の二重特異性抗体と生理学的に適合性である任意およびすべての適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤および吸収遅延剤が挙げられる。本発明の医薬組成物に使用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントゴム、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、および／または様々なバッファーが挙げられる。薬学的に許容され得る担体としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
処置方法

開示された既製のＴ細胞の養子移入を使用して、がん、自己免疫疾患、糖尿病、神経障害、慢性ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、アルツハイマー病、心疾患などの同種異系対象の様々な疾患および状態を処置することができる。開示された既製のＴ細胞はまた、１またはそれを超えるＣＡＲを発現するように遺伝子操作され得る。

開示された既製のＴ細胞は、単独で、または希釈剤および／またはＩＬ－２、ＩＬ－１５もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。簡潔には、医薬組成物は、１またはそれを超える薬学的または生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の標的細胞集団を含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。開示される方法で使用するための組成物は、いくつかの実施形態では、静脈内投与のために製剤化される。医薬組成物は、ＭＭを適切に処置する任意の様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患の重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定されてもよい。

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。本明細書中に記載されるＴ細胞を含む薬学的組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重の投与量、例えば、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内のすべての整数値を含む）で投与され得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）を使用することによって投与することができる。特定の患者に対する最適な投与量および処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定することができる。

開示される組成物の投与は、注射、輸血、または移植を含む任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、開示される組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施形態では、開示される組成物はｉ．ｖ．注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射され得る。

特定の実施形態では、開示された既製のＴ細胞は、それだけに限らないがサリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブおよびレナリドミドを含む任意の数の関連する処置法と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭ ＰＡＴＨなどの他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞除去治療と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去治療後に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受け、その後、末梢血幹細胞移植を受け得る。特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の拡大免疫細胞（expanded immune cell）の注入を受ける。さらなる実施形態では、拡大細胞は、手術の前または後に投与される。

いくつかの実施形態では、本方法は、同種異系対象におけるがんを処置するために使用される。いくつかの態様では、がんは、肉腫、リンパ腫、白血病、癌、芽細胞腫、または胚細胞腫瘍であり得る。開示される組成物を使用して処置することができるがんの代表的であるが非限定的なリストには、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓がん、肺がん、例えば小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口、喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮頸癌、乳がん、上皮がん、腎臓がん、尿生殖器がん、肺がん、食道癌、頭頸部癌、大腸がん、造血器がん；精巣がん；結腸および直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんが含まれる。

開示された既製のＴ細胞は、細胞傷害効果または細胞静止効果を有する任意の化合物、部分または基と組み合わせて使用することができる。薬物部分には、マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡインターカレーター、特にがん治療に使用されるものとして機能し得る化学療法剤が含まれる。

開示された既製のＴ細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。２つの既知の阻害性チェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）およびプログラム死１（ＰＤ－１）受容体を介したシグナル伝達を含む。これらのタンパク質は、Ｔ細胞機能のすべての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のＣＤ２８－Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１受容体（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化Ｔ細胞の表面に発現される。そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ；ＣＤ２７３）は、樹状細胞またはマクロファージなどのＡＰＣの表面に発現される。ＰＤ－Ｌ１が主なリガンドである一方で、ＰＤ－Ｌ２ははるかに制限された発現パターンを有する。リガンドがＰＤ－１に結合すると、阻害シグナルがＴ細胞に伝達され、サイトカイン産生が減少し、Ｔ細胞増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤には、以下を遮断する抗体：ＰＤ－１（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－Ｌ１（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５、２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）が含まれるが、これらに限定されない。

プログラム死１（ＰＤ－１）に対するヒトモノクローナル抗体および抗ＰＤ－１抗体を単独または他の免疫療法剤と組み合わせて使用してがんを処置する方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，５５２，１５４号に記載されている。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，６１７，５４６号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）などのＰＤＬ１に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤は、ラムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、またはＭＥＤＩ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）などのＰＤ１に特異的に結合する抗体を含む。ＰＤ－１に対するヒトモノクローナル抗体および抗ＰＤ－１抗体を単独または他の免疫療法剤と組み合わせて使用してがんを処置する方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，５５２，１５４号に記載されている。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，６１７，５４６号に記載されている。

開示された既製のＴ細胞は、他のがん免疫療法と組み合わせて使用することができる。２つの異なるタイプの免疫療法がある：受動免疫療法は、免疫系の成分を使用して、必ずしも患者において免疫応答を開始することなく、がん細胞に対する標的細胞傷害活性を指示するが、能動免疫療法は内因性免疫応答を能動的に誘発する。受動的戦略には、特定の抗原に応答してＢ細胞によって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用が含まれる。１９７０年代におけるハイブリドーマ技術の開発および腫瘍特異的抗原の同定は、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的化することができるｍＡｂの医薬開発を可能にした。これまでのところ、ｍＡｂは免疫療法の最大の成功ストーリーであった；２０１２年に最も売れた抗がん薬のトップ３はｍＡｂであった。それらの中には、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍の表面に高度に発現されるＣＤ２０タンパク質に結合するリツキシマブ（リツキサン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）がある。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたＮＨＬおよび慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置についてＦＤＡによって承認されている。別の重要なｍＡｂはトラスツズマブ（ハーセプチン；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、ＨＥＲ２の発現を標的とすることによってＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）陽性乳がんの処置に革命をもたらした。

最適な「キラー」ＣＤ８ Ｔ細胞応答を生成するには、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーのライゲーションによって提供することができるＴ細胞受容体活性化に加えて共刺激も必要である。ＯＸ４０は、活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ ｍＡｂによる処置がＴ細胞分化および細胞溶解機能を増強し、様々な腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強をもたらすので、特に興味深い。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンまたはクラドリビンなどの代謝拮抗薬から選択され得る。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンなどのアルキル化剤、およびカルボプラチンなどの他の白金誘導体から選択され得る。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、抗有糸分裂剤、例えばタキサン、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、ならびにビンカアルカロイド、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビンから選択され得る。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンもしくはイリノテカン、または細胞静止薬、例えばエトポシドおよびテニポシドから選択され得る。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、成長因子阻害剤、例えばＥｒｂＢｌ（ＥＧＦＲ）の阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ抗体、例えば、ザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブもしくはニモツズマブまたは他のＥＧＦＲ阻害剤、例えば、ゲフィチニブもしくはエルロチニブ）、ＥｒｂＢ２の別の阻害剤（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（例えばＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ、トラスツズマブ－ＤＭ ｌまたはペルツズマブ）またはＥＧＦＲとＨＥＲ２の両方の阻害剤、例えばラパチニブ）から選択され得る。

いくつかの実施形態では、そのような追加の治療剤は、イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ，Ｇｌｅｅｖｅｃ ＳＴＩ５７１）またはラパチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤から選択され得る。

したがって、いくつかの実施形態では、開示される抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ｈｕ８０６、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ）、および／またはリツキシマブと組み合わせて使用される。

いくつかの実施形態では、上記の障害を処置するための既製のＴ細胞と組み合わせて使用するための治療剤は、抗がんサイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせであり得る。適切なサイトカインおよび成長因子の例としては、ＩＦＮｙ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８ａ、ＩＬ－２８ｂ、ＩＬ－２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ（例えば、ＩＮＦａ２ｂ）、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチムおよびＴＮＦａが挙げられる。適切なケモカインとしては、ヒトＣＸＣおよびＣ－ＣケモカインファミリーからのＧｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（ＥＬＲ）陰性ケモカイン、例えばＩＰ－１０、ＭＣＰ－３、ＭＩＧおよびＳＤＦ－Ｉａが挙げられ得る。適切なサイトカインには、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカイン断片、およびサイトカイン融合タンパク質が含まれる。

いくつかの実施形態では、上記の障害を処置するための市販のＴ細胞の組み合わせで使用するための治療剤は、細胞周期制御／アポトーシス調節因子「調節剤」であり得る。細胞周期制御／アポトーシス調節因子は、細胞周期制御／アポトーシス調節因子を標的とし、モジュレートする分子、例えば（ｉ）ｃｄｃ－２５（例えばＮＳＣ ６６３２８４）、（ｉｉ）細胞周期を過剰刺激するサイクリン依存性キナーゼ（例えば、フラボピリドール（Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５）、７－ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ－０１、ＫＷ－２４０１）、およびロスコビチン（Ｒ－ロスコビチン、ＣＹＣ２０２））、ならびに（ｉｉｉ）テロメラーゼモジュレーター（例えば、ＢＩＢＲ１５３２、ＳＯＴ－０９５、ＧＲＮ１６３および例えば米国特許第６，４４０，７３５号明細書および米国特許第６，７１３，０５５号明細書に記載されている組成物）を含み得る。アポトーシス経路を妨害する分子の非限定的な例としては、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス－２リガンド（Ａｐｏ－２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮ、およびアンチセンスＢｃｌ－２が挙げられる。

いくつかの実施形態では、上記の障害を処置するための既製のＴ細胞と組み合わせて使用するための治療剤は、ホルモン調節剤、例えば抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン治療に有用な薬剤であり得る。そのようなホルモン調節剤の例は、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール／エチニル、抗アンドロゲン（フルタミド（flutaminde）／ユーレキシンなど）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシ－プロゲステロン／プロベラ、メゲストロールアセペート／メガス）、副腎皮質ステロイド（例えば、例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（およびその類似体、ならびにブセレリンおよびゴセレリンなどの他のＬＨＲＨアゴニスト）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストラゾール／アリミデックス、アミノグルテチミド／シトラデン、エキセメスタン）またはホルモン阻害剤（オクトレオチド／サンドスタチンなど）である。

いくつかの実施形態では、上記の障害を処置するための既製のＴ細胞と組み合わせて使用するための治療剤は、抗がん核酸または抗がん阻害ＲＮＡ分子であり得る。

上記のような併用投与は、同時、別個または逐次であり得る。同時投与のために、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物として、または別個の組成物として投与され得る。

いくつかの実施形態では、開示される既製のＴ細胞は、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は、放射線を含み得るかまたは放射性医薬品の患者への関連投与が提供される。放射線源は、処置されている患者の外部または内部のいずれかであり得る（放射線処置は、例えば、体外照射治療（ＥＢＲＴ）または近接照射療法（ＢＴ）の形態であり得る）。そのような方法を実施する際に使用され得る放射性元素としては、例えば、ラジウム、セシウム－１３７、イリジウム－１９２、アメリシウム－２４１、金－１９８、コバルト－５７、銅－６７、テクネチウム－９９、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１およびインジウム－１１１が挙げられる。

いくつかの実施形態では、開示される既製のＴ細胞は、手術と組み合わせて投与される。

本発明のいくつかの実施形態を説明した。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

実施例１：
図１Ａ～１Ｃは、ＣＤ１９ ＢｉＴＥまたはＨｅｒ２ ＢｉＴＥ（図１Ａ）；Ｈｅｒ２ ＢＩＴＥ＋αＨｅｒ２ＢＢ、Ｈｅｒ２ ＣＡＲ＋αＣＤ３εＩＬ１５ＲＡ、またはＨｅｒ２ ＣＡＲ＋αＣＤ３ε ｓｃＦＶ（図１Ｂ）；およびＣＤ１９ ＢｉＴＥ＋４１ＢＢＬＣＤ８０、ＣＤ１９ ＴｒｉＫＥ１（ａＣＤ２８）、またはＣＤ１９ ＴｒｉＫＥ２（４１ＢＢＬ）（図１Ｃ）で処置した後のインビトロでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。

図２Ａおよび図２Ｂは、ＧｖＤＨモデル試験を示す。図２Ａは、全身照射および１ｅ７ Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－ＴまたはＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞で処置したＮＳＧマウスを示す。図２Ｂは、化学療法および１ｅ７ ＣＴＸ＋ＣＡＲ－ＴまたはＣＴＸ＋ＢｉＴＥ－Ｔ細胞で処置したＮＳＧマウスを示す。

図３は、抗原なしのインビボでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。ＮＳＧマウスは、照射を受け、次いでＴ細胞を受けた。末梢血中のドナーＴ細胞を特定の時点で評価した。Ｄ１２、Ｔ細胞注射後１２日目。

図４は、抗原ありのインビボでのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を示す。ＮＳＧマウスに腫瘍細胞を注射し、次いでＴ細胞処置を受けさせた。末梢血中または腫瘍中のドナーＴ細胞を特定の時点で評価した。

実施例２：
次に、インビトロ連続殺傷アッセイを設定して、標的抗原の存在下でＢｉＴＥ－Ｔ細胞上のＴＣＲαβおよびＣＤ３を評価した。Ｔ細胞は、それらが標的細胞を殺傷できなくなるまで標的細胞で繰り返しチャレンジされた。ＴＣＲαβおよびＣＤ３εの発現を、この期間中４８時間ごとに評価した。ＣＤ１９標的およびＨｅｒ２標的の両方について、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＵＴ細胞とは対照的に、チャレンジアッセイを通して低いＴＣＲαβ／ＣＤ３を維持した。インビボでは、Ｈｅｒ２発現固形腫瘍モデルを使用してＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞を評価した。ＮＳＧマウスに、Ｈｅｒ２発現ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５（Ａ３７５．Ｈｅｒ２）を最初に接種し、次いで、ＢｉＴＥ－Ｔ処置またはＵＴ処置を行った。血液Ｔ細胞および腫瘍浸潤Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって評価した。末梢血では、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、低いＣＤ３εで限られた存在を示した。腫瘍浸潤Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞はまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低いＴＣＲαβ／ＣＤ３を示す。これらの結果は、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞が標的抗原の存在下で低いＣＤ３εおよびＴＣＲαβを維持していることを示している。

同種異系ＯＴＳ Ｔ細胞は、より長く持続し、それらの有効性を最大化するために、宿主拒絶を克服すると予想される。宿主拒絶の１つの重要な機構は、宿主Ｔ細胞がＴＣＲを介して非自己抗原を認識することである。ＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＨＬＡミスマッチＴ細胞とを７２時間共培養し、ＢｉＴＥ－ＴがレシピエントＴ細胞上のＣＤ３およびＴＣＲαβを減少させることを見出した。ＣＤ１９またはＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞をＨＬＡミスマッチＰＢＭＣと共培養することによってａｌｌｏＭＬＲアッセイを設定した場合にも、同様の結果が観察された（図８）。これらのデータは、ドナーＢｉＴＥ－Ｔ細胞が、宿主Ｔ細胞上のＴＣＲαβ／ＣＤ３に結合するＢｉＴＥを放出することによって宿主拒絶を克服する潜在力を有することを示唆している。

ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の抗がん活性は、他のグループによって実証されている（Ｉｗａｈｏｒｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５ ２３：１７１－１７８；Ｃｈｏｉ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１９ ３７：１０４９－１０５８；Ｌｉｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０１７ ８：５１４－５２６）。ここでは、ＢｉＴＥ－Ｔと第二世代ＣＡＲ－Ｔ細胞との間で、それらの抗がん活性について並べた比較を行った。同じｓｃＦｖを共有するＣＤ１９またはＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－ＴおよびＣＡＲ－Ｔ細胞を評価した。両方の標的について、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、インビトロでＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れていないにしても同等の殺傷を示す（図５Ａ、図５Ｃ）。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ６およびＴＮＦαを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞が産生したサイトカインの一部のみを産生した（図５Ｂ、５Ｄ）。これは、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞よりも安全であり得ることを示唆する。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、連続殺傷アッセイにおいてＢｉＴＥ－Ｔ細胞よりも優れており（図９Ａ～９Ｄ）、ＮＡＬＭ６またはＡ３７５．Ｈｅｒ２細胞を移植したＮＳＧモデルにおいてより良好な生存、持続性および有効性も提供した（図９Ｅ～９Ｈ）。第二世代ＣＡＲ－Ｔ細胞は、組み込まれた共刺激ドメインを有するので、これは驚くべきことではない。

ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の１つの潜在的な利点は、バイスタンダーまたは宿主Ｔ細胞を動員する能力である。したがって、既存の宿主Ｔ細胞を含む環境を模倣するためにマウスモデルを採用した（Ｍｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０２１ ３９：５６－６３）。ＮＳＧマウスに放射線照射し、次いで、活性化ＨＬＡ－Ａ２＋ヒトＴ細胞を移植した。次いで、マウスに腫瘍細胞を注射し、後にＨＬＡ－Ａ２－ＢｉＴＥ－ＴまたはＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した（図５Ｅ）。既存のＴ細胞を有するＮＳＧ ＮＡＬＭ６モデルでは、ＣＤ１９標的化ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、ＵＴ細胞と比較して同等の生存利益を示した（図５Ｆ）。ドナーＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大もこのモデルにおいて抑制されたが、宿主Ｔ細胞はＣＡＲ－Ｔ処置群において拡大を示した（図５Ｇ、５Ｈ）。既存の宿主Ｔ細胞（図５Ｉ）を有するＨｅｒ２＋腫瘍モデルでは、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍成長を阻害することができなかったが、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は依然として阻害することができた（図５Ｊ）。末梢血では、Ｈｅｒ２標的化ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、非常に限られた持続性を示した（図５Ｋ）。しかしながら、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大きな宿主Ｔ細胞拡大を誘導した（図５Ｌ）。

有効性を高めるために、共刺激をＢｉＴＥ－Ｔ細胞に加えた。Ｔ細胞にＢｉＴＥならびに４－１ＢＢＬおよびＣＤ８０の組合せ（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２０１７ ５：８６０－８７０）を共形質導入して、次世代ＢｉＴＥ－Ｔ細胞を作製した。これらの増強されたＨｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、低いレベルのＣＤ３／ＴＣＲαβを維持しながら、連続殺傷アッセイにおいてＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好な増殖を示す（図６Ａ～６Ｃ）。インビボ（図６Ｄ）では、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の腫瘍抑制、血液持続性、腫瘍浸潤および体重を示す（図６Ｅ～６Ｈ）。同様に、ＮＡＬＭ６モデル（図６Ｉ）では、増強されたＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の有効性およびおそらくより良好な血液持続性を有する（図６Ｊ～６Ｌ、図１０）。増強されたＣＤ１９ ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、インビボで低いＣＤ３／ＴＣＲαβを維持した（図６Ｍ）。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞はまた、ＩＬ７およびＩＬ１５遺伝子の組合せを用いて操作することによって増強された。サイトカインで操作されたＢｉＴＥ Ｔ細胞は、インビトロでの連続殺傷アッセイにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れていた（図６Ｎ、６Ｏ）。

この試験は、同種異系ＯＴＳ Ｔ細胞治療のための新しい戦略を提案する。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、現在、ＦＤＡによって承認された最も強力ながん治療薬の１つである。最近の臨床試験は、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞が、効力をいくらか犠牲にしながらではあるが、それらの自己対応物を潜在的に置き換え得ることを示している。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、同種異系ＯＴＳ ＣＡＲ－Ｔ細胞を超えるいくつかの利点を有し得る。第１に、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、産生するのにそれほど複雑ではなく、天然の「純粋な」産物である。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞産生は、自己ＣＡＲ－Ｔ産生と本質的に同じであるが、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞は、遺伝子編集およびＴＣＲαβネガティブ精製を必要とする。形質導入されていない「休眠」Ｔ細胞を有する現在のＣＡＲ－Ｔ産物とは異なり、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞産物は、形質導入されているかどうかにかかわらずＢｉＴＥを完全に備えるので、最終産物は１００％の活性を有する。第２に、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、リンパ球枯渇またはさらなる操作なしに宿主拒絶を克服する潜在力を有する。現在の同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞は、宿主Ｔ細胞を死滅させるために、より長い治療域または自己免疫防御レセプターなどのより多くの操作のための厳しいリンパ球枯渇レジメンを必要とする（Ｍｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０２１ ３９：５６－６３）。対照的に、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、拡大して宿主Ｔ細胞をび再標的化する潜在力を有するため、おそらくは、リンパ球枯渇を必要としないか、または軽度のリンパ球枯渇を必要とし、追加の殺傷力を提供する。第３に、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、標的を殺傷するときにサイトカインをより少なく放出するので、より安全である。ＴＣＲαβネガティブ精製を行わないＢｉＴＥ－Ｔ細胞産物に関する１つの懸念は、汚染された形質導入されていないＴ細胞がＧｖＨＤを引き起こす可能性があることである。しかしながら、適当な形質導入されていないＴ細胞混入を伴う高用量のヒトＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、免疫不全ＮＳＧマウスモデルにおいてＧｖＨＤを誘発しなかった。リンパ球枯渇がないかまたは少ない状況で使用される場合、ＢｉＴＥ－ＴがＧｖＨＤを引き起こすリスクはさらに低いであろう。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞の別の潜在的な欠点は、それらがＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強力でないことである。これは、共刺激またはサイトカインを添加することによってほぼ固定することができる。

要約すると、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞は、臨床試験におけるさらなる評価を正当化する「既製の」同種Ｔ細胞治療のための新規かつ簡単な方法を提供する。

方法
試験デザイン
この試験の目的は、新規の同種「既製」Ｔ細胞治療を開発することであった。ＣＤ１９およびＨｅｒ２標的化ＢｉＴＥ操作Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現について評価した。ＢｉＴＥ－Ｔ細胞のＧｖＨＤリスクを、化学条件付けされたまたは全身照射されたＮＳＧマウスを使用して評価した。宿主Ｔ細胞ありまたはなしで、細胞傷害性、サイトカイン、連続殺傷、およびインビボ有効性について、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞との間でも並べた比較を行った。２つの異種移植マウスモデルを使用して、血液腫瘍および固形腫瘍を含むＢｉＴＥ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞との間の有効性を比較した。操作されたＴ細胞を産生するために、様々な健常ドナーを使用した。すべての実験を独立して少なくとも２回繰り返した。

細胞および培地
ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼの両方を発現するＮＡＬＭ６ＧＬ細胞株をＡＴＣＣから購入し、１０％ ＦＢＳ、Ｌ－グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＲＰＭＩ１０）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ヒトメラノーマＡ３７５細胞株は、Ｃｅｃｉｌｉａ Ｒａｍｅｌｌｏ博士から寄贈され、１０％ ＦＢＳ、Ｌ－グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｈｅｒ２発現Ａ３７５（Ａ３７５．Ｈｅｒ２）を、切断型Ｈｅｒ２を発現するレトロウイルスを用いてＡ３７５細胞を形質導入することによって作製した。ヒトＴ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を補充したＲＰＭＩ１０中で培養した。

レトロウイルス構築物、γ－レトロウイルス産生およびＴ細胞形質導入
ヒトＨｅｒ２ ＣＡＲ、ヒトＣＤ１９ ＢｉＴＥ、Ｈｅｒ２ ＢｉＴＥ、４－１ＢＢＬ－ＣＤ８０、および他の構築物のＤＮＡを合成し、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によるＳＦＧレトロウイルスベクターにサブクローニングした。ヒトＣＤ１９ ＣＡＲは以前に記載されている（Ｌｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２０１８ ３）。Ｈｅｒ２ ＣＡＲおよびＨｅｒ２ ＢｉＴＥは、トラスツズマブ由来の同じｓｃＦｖを使用する。ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＢｉＴＥは、ＦＭＣ６３クローン由来の同じｓｃＦｖを使用する。組換えγ－レトロウイルス産生は以前に記載されている（Ｌｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１７ １５１４：１１１－１１８）。簡潔には、ＣＡＲまたはＢｉＴＥを含有するレトロウイルス構築物をＨ２９細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＨ２９からの上清を使用してＲＤ１１４細胞を形質導入し、安定な産生細胞株を作製した。ＲＤ１１４細胞からレトロウイルス上清を採取し、０．４５μｍ濾過し、将来の使用のために凍結保存した。Ｔ細胞形質導入のために、健常ドナーの白血球パックをＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）およびＡＬＬＣＥＬＬＳ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から購入した。ＰＢＭＣを標準的なＦｉｃｏｌｌ法を用いて単離し、将来の使用のために凍結保存した。０日目に、ヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、凍結保存されたＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。次いで、Ｔ細胞を、ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して活性化した。１日目および２日目に、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）被覆プレートにおいて新鮮なＢｉＴＥまたはＣＡＲレトロウイルスを用いて、２０００ｇ、３２℃で１時間、Ｔ細胞に形質導入した。３日目に、サイトカインを含む新鮮な培地を添加した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを６日目に除去し、Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ７および５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ１５を含む完全培地中でさらに拡大した。培地およびサイトカインを２～３日ごとに補充した。８～１４日目のＴ細胞をインビボ試験に使用した。

フローサイトメトリー
以下の抗体クローンをフローサイトメトリーに使用した。ＢＤ由来：ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＴＣＲαβ（クローンＴ１０Ｂ９．１Ａ－３１）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、ＰＤ１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０）、ＣＤ２５（クローン２Ａ３）．Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ由来：ＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＴＣＲαβ（クローンＩＰ２６）、ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ－５６）．Ｆｃ受容体結合阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を染色のために日常的に使用した。全血試料を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液を用いて溶解した。細胞数を測定するためにＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。ＢＤ ＬＳＲＩＩまたはＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターでフローデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０を使用してデータを分析した。

ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにはＥｌｌａ機（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を使用した。細胞傷害性またはＴＣＲ刺激アッセイからの２４～７２時間の上清をサイトカイン測定のためにＥＬＬＡカートリッジに添加した。

ＴＣＲ／ＣＤ３刺激アッセイ
ヒトＴ細胞刺激アッセイのために、非組織培養処理２４ウェルプレートを１μｇ／ｍｌヒトＴＣＲαβ抗体（クローンＩＰ２６）で一晩コーティングした。Ｔ細胞を添加し、プレート内で培養した。活性化マーカーについては、Ｔ細胞を５時間の刺激後にフロー分析に供した。２４時間の刺激後に上清を回収し、サイトカインをＥＬＩＳＡによって測定した。ＢｉＴＥ刺激のために、ヒトＣＤ１９ ＢｉＴＥ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）をＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｔ細胞を、ブリナツモマブ濃度を増加させながら、３Ｔ３．ｈＣＤ１９または３Ｔ３．ｍＣＤ１９細胞と共培養した。マウスＴ細胞刺激のために、Ｔ細胞を脾臓から単離し、マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５－２Ｃ１１）でコーティングした２４ウェルプレートに加えた。５時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

細胞傷害性および連続殺傷アッセイ
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を細胞傷害性アッセイに使用した。Ｔ細胞をＲＴＣＡ Ｅプレート中で様々なＥ：Ｔ比で標的細胞と共培養し、リアルタイム細胞殺傷を機器で記録した。連続殺傷アッセイのために、Ｔ細胞を、非組織培養処理２４ウェルプレートにおいて５：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共培養した。２日ごとまたはそれより長く、Ｔ細胞の小画分を表現型および細胞数についてフローサイトメトリーによって分析し、残りの細胞を新鮮な培地を含む新しいプレートに移し、標的細胞をチャレンジした。

マウス試験
すべてのマウスプロトコルは、サウスフロリダ大学の動物実験委員会によって承認された。ＮＳＧマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから購入し、ＵＳＦ動物施設で飼育した。８～１２週齢の雄ＮＳＧマウスをインビボ試験に使用した。ＧｖＨＤ評価のために、ＮＳＧマウスに２．５Ｇｙ全身照射または２５０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド（ＣＴＸ）を行い、次いで翌日にＴ細胞を１０００万用量で投与した。生存およびＧｖＨＤの任意の徴候（前屈みの姿勢、遅い運動性、体重減少など）についてマウスをモニターした。２０％を超える体重減少および他のＧｖＨＤ症状を有するマウスを屠殺した。血液腫瘍モデルに対する有効性試験のために、ＮＳＧマウスに５０万個のＮＡＬＭ６ＧＬ細胞を静脈内注射した。３日後、マウスに１０００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＵＴ細胞を静脈内注射した。生存を週に２回モニターした。固形腫瘍モデルについては、ＮＳＧマウスの右側腹部に５０万個のＡ３７５．Ｈｅｒ２細胞を皮下注射した。７～１０日後、マウスに１０００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞、ＢｉＴＥ－Ｔ細胞またはＵＴ細胞を静脈内注射した。血液を毎週採取し、腫瘍組織を終点で採取した。既存のＴ細胞を有するマウスについては、ＮＳＧマウスに１．２Ｇｙの全身照射を行い、その後、活性化Ｔ細胞を移植した。マウスに腫瘍細胞を注射し、ＨＬＡミスマッチＴ細胞で処置した。詳細については、図のタイムラインを参照されたい。腫瘍組織をｇｅｎｔｌＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理し、リベラーゼおよびＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で消化した。単離された腫瘍細胞をフロー分析に供した。

統計的方法
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を、図の凡例に示すように統計分析に使用した。データは平均±ｓ．ｄ．として提示した。対応のないパラメトリックｔ検定を２群比較に使用した。一元配置ＡＮＯＶＡを複数群比較のために使用した。生存を、ログランク検定を使用して比較した。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。

当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験以下を使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (10)

1. 対象のがんを処置するための方法であって、
   同種ドナーから免疫エフェクター細胞を得ること；
   前記免疫エフェクター細胞を、抗ＣＤ３多重特異性抗体を発現するように操作することであって、前記抗体は、前記免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体および別の細胞上の第２の抗原に、前記ＣＤ３複合体を活性化するのに十分な様式で結合するように構成される、操作すること；および
   前記操作された免疫エフェクター細胞を、前記がんを処置するのに有効な量で前記対象に投与すること、を含む方法。
2. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２の抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
4. 前記第２の抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ－２ ｎｅｕ、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_Ａｃ、ＭＵＣ５_Ｂ、ＭＵＣ７、ＤｈＣＧ、ルイス－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９－Ｏ－アセチル－ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ－アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカーおよびミュラー阻害物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ－７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳおよびＣＤ６３から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記免疫エフェクター細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにさらに操作される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記免疫エフェクター細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、制御性Ｔ細胞、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 同種異系細胞移入のためにＣＡＲ－Ｔ細胞を増強するための方法であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を、単一特異性抗ＣＤ３抗体を分泌するように操作することを含む方法。
8. 前記単一特異性抗ＣＤ３抗体が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項７に記載の方法。
9. 単一特異性抗ＣＤ３抗体を発現するように操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞。
10. 同種異系細胞移入のための免疫エフェクター細胞を増強するための方法であって、
    前記免疫エフェクター細胞を、膜結合抗ＣＤ３抗体を発現するように操作することを含み、
    前記抗ＣＤ３抗体が、前記免疫エフェクター細胞上のＣＤ３複合体に、前記ＣＤ３複合体を自己活性化するのに十分な様式で結合するように構成される、方法。