TW202216764A - 抗ctla-4抗體及其之用途 - Google Patents
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Abstract
本公開提供一種抗CTLA-4抗體及其製造方法及使用方法。本公開亦提供編碼該抗CTLA-4抗體的核酸及包含該核酸的宿主細胞。本公開亦提供包含突變Fc區域的多肽及其製造方法及使用方法。
Description
本發明關於抗CTLA-4抗體及其使用方法。
在活體內因基因突變等原因而突變的細胞被免疫監視系統監視並被排除。另一方面,持續的過度免疫反應則因自體免疫而傷害正常組織等,對自身也會有害。於是,免疫系統中具備用於抑制被暫時活化的免疫反應之負回饋機制(免疫查核點)(例如參照非專利文獻1)。免疫查核點被認為在維持免疫系統之恆定性中扮演重要的角色。另一方面,在一部分的腫瘤中,已得知利用免疫查核點進行免疫逃脫(immune escape)。現在,正廣泛地發展透過主要的免疫查核點分子亦即cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4(CTLA-4)或programmed cell death 1(PD-1)、programmed cell death ligand 1(PD-L1)等之免疫抑制功能的研究。
CTLA-4是在1987年從源自小鼠的殺手T細胞株的cDNA庫選殖基因而得之屬於免疫球蛋白超家族的醣蛋白(例如參照非專利文獻2)。已知透過CTLA-4抑制T細胞的免疫反應。從抑制CTLA-4的功能且促進T細胞的活化與癌的衰退相關之想法發想,在1996年報導藉由對荷瘤小鼠投予抗CTLA-4抗體而觀察到腫瘤的衰退效果(例如參照非專利文獻3)。從2000年起,發展人類中之抗CTLA-4抗體的有效性的評價,在2011年,抗人類CTLA-4單株抗體(伊匹單抗(ipilimumab))被美國Food and Drug Administration(FDA,食品醫藥局)承認為世界首個免疫活性化抗體醫藥。除了伊匹單抗以外,也製作了多種抗CTLA-4單株抗體(例如參照專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4),並正嘗試開發其等的醫藥品。藉由抑制免疫查核點而解除其免疫抑制機制,結果提高免疫活性,此種藥劑被稱為免疫查核點抑制劑。
另一方面,過往已知T細胞中存在一部份具有免疫抑制功能的細胞,但其在1995年被辨識作為CD25陽性CD4陽性的T細胞,並被取名為調節性T細胞(例如參照非專利文獻4)。在2003年,辨識到Foxp3基因,其係在調節性T細胞中特異性表現且控制調節性T細胞的發生及功能之主控基因(master gene)。Foxp3作為轉錄因子而控制各種的免疫反應相關基因的表現。其中,Foxp3特別與調節性T細胞中之CTLA-4的恆定表現相關,其被認為在由調節性T細胞所導致之免疫抑制功能中扮演重要的角色(例如參照非專利文獻5)。
藉由調節性T細胞浸潤在腫瘤組織中,其被認為會造成減弱或抑制對於腫瘤之免疫監視機制的結果。實際上,已得知在人類的許多惡性腫瘤中,調節性T細胞會增加(例如參照非專利文獻6),並已報導調節性T細胞對於腫瘤局部的浸潤會成為癌症患者的預後不良因子。相反地,若可從腫瘤組織去除或減少調節性T細胞,則能期待造成抗腫瘤免疫的增強。現在,正致力於開發將調節性T細胞作為標的之癌症免疫療法。
藉由投予為抗CTLA-4抗體之伊匹單抗,雖會增強抗腫瘤免疫,但另一方面,已報導因全身性地增強免疫活性而使自體免疫疾病發病。在一臨床試驗中,投予伊匹單抗的患者有60%觀察到不良事件,其多數為與皮膚或者消化道相關的自體免疫疾病。在另一臨床試驗中,亦報導投予伊匹單抗的患者之中,約半數發病同樣的自體免疫疾病。為了抑制此種副作用,也有對於已投予伊匹單抗的患者再投予免疫抑制劑的病例。正期望開發能一邊如此抑制免疫查核點抑制劑的副作用一邊維持抗腫瘤免疫反應之嶄新藥劑。
作為有希望用於藉由抗體而獲得抗腫瘤效果的手段,IgG抗體的細胞毒性效應(effector)功能亦即抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞吞噬活性(ADCP)正受到注目(例如參照非專利文獻7、非專利文獻8)。IgG抗體的Fc區域與存在於自然殺手細胞或巨噬細胞等效應細胞(effector cell)的表面之抗體受體(FcγR)或者各種補體成分結合,藉此誘發此等的效應功能。至今已進行與Fc區域的變異體相關之許多研究,已取得具有比野生型更高的FcγR結合活性等各種特性之變異體(例如參照專利文獻5、專利文獻6、非專利文獻9、非專利文獻10)。又,已報導抗體的Fc區域係與FcγR以1:1結合,並在lower hinge及CH2區域非對稱地辨識FcγR(例如參照非專利文獻11)。由此,亦已報導在構成抗體的Fc區域之二條多肽鏈施加不同的改變,製作非對稱的Fc區域變異體,藉此將與FcγR的交互作用最佳化的方法(例如參照專利文獻7、專利文獻8、專利文獻9、專利文獻10)。
在將治療用抗體投予至活體內之情形,期望成為其標的之抗原僅在病變部位特異性表現,但多數情形,在非病變部位之正常組織中,所述抗原也會表現,由治療的觀點而言,其會成為不期望的副作用的原因。例如,對於腫瘤抗原之抗體,能藉由ADCC等而發揮對於腫瘤細胞之傷害活性,另一方面,在正常組織中也會表現相同抗原的情形中,也有會傷害正常細胞的可能性。為了解決如上述般的問題,著眼於在成為標的之組織(例如腫瘤組織)中大量地存在特定的化合物之現象,已開發一種創作抗原結合分子的技術,所述抗原結合分子,其對於抗原之結合活性會因應所述化合物的濃度而變化(例如參照專利文獻11)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO 2000/037504
[專利文獻2]WO 2001/014424
[專利文獻3]WO 2012/120125
[專利文獻4]WO 2016/196237
[專利文獻5]WO 2000/042072
[專利文獻6]WO 2006/019447
[專利文獻7]WO 2012/058768
[專利文獻8]WO 2012/125850
[專利文獻9]WO 2013/002362
[專利文獻10]WO 2014/104165
[專利文獻11]WO 2013/180200
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Pardoll, Nat Rev Cancer(2012)12: 252-264
[非專利文獻2]Brunet et al., Nature(1987)328: 267-270
[非專利文獻3]Leach et al., Science(1996)271: 1734-1736
[非專利文獻4]Sakaguchi et al., J Immunol(1995)155: 1151-1164
[非專利文獻5]Takahashi et al., J Exp Med(2000)192: 303-310
[非專利文獻6]Nishikawa & Sakaguchi, Int J Cancer(2010)127: 759-767
[非專利文獻7]Clynes et al., Proc Natl Acad Sci U S A(1998)95: 652-656
[非專利文獻8]Clynes et al., Nat Med(2000)6: 443-446
[非專利文獻9]Lazar et al., Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103: 4005-4010
[非專利文獻10]Chu et al.,Mol Immunol(2008)45: 3926-3933
[非專利文獻11]Radaev et al., J Biol Chem(2001)276: 16469-16477
[發明所欲解決的課題]
本發明提供抗CTLA-4抗體及其之使用方法。本發明亦提供包含突變Fc區域之多肽及製造其等之方法。
[用於解決課題的手段]
更具體而言,本發明提供以下的[1]~[47]。
[1]一種抗體,其係具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性的抗CTLA-4抗體,且具有選自以下的(a)至(i)之至少1個特徵:
(a)在存在100μM之含有腺苷的化合物時的結合活性比不存在含有腺苷的化合物時的結合活性高2倍以上;
(b)存在100μM之含有腺苷的化合物時的KD值為5×10
-7M以下;
(c)不存在含有腺苷的化合物時的KD值為1×10
-6M以上;
(d)與含有腺苷的化合物及CTLA-4一起形成三元複合體(ternary complex);
(e) 結合於人類CTLA-4(細胞外域(extracellular domain),序列識別號:28)的第97個胺基酸至第106個胺基酸的區域;
(f)關於對於CTLA-4的結合,與ABAM004(VH,序列識別號:10;及VL,序列識別號:11)競爭;
(g)結合於與ABAM004(VH,序列識別號:10;及VL,序列識別號:11)相同的抗原決定位(epitope);
(h)對於表現CTLA-4細胞顯示細胞毒性;及
(i)結合於源自人類及小鼠的CTLA-4。
[2]如[1]所記載之抗體,其係單株抗體。
[3]如[1]或[2]所記載之抗體,其係人類抗體(human antibody)、人源化(humanized)抗體、或嵌合抗體。
[4]如[1]至[3]中任一項所記載之抗體,其係結合於CTLA-4的抗體片段。
[5]如[1]至[4]中任一項所記載之抗體,其包含:(a)HVR-H1(序列識別號:223),其包含胺基酸序列SX
1TMN,X
1為H、A、R、或K;(b)HVR-H2(序列識別號:224),其包含胺基酸序列SISX
1X
2SX
3YIYYAX
4SVX
5G,X
1為S或T,X
2為R或Q,X
3為G或H,X
4為D、E、或R,X
5為K或R;及(c)HVR-H3(序列識別號:225),其包含胺基酸序列YGX
1REDMLWVFDY,X
1為K或A。
[6]如[5]所記載之抗體,更包含:(a)HVR-L1(序列識別號:226),其包含胺基酸序列X
1GX
2STX
3VGDYX
4X
5VX
6,X
1為T、D、Q、或E,X
2為T或P,X
3為D或G,X
4為N或T,X
5為Y或W,X
6為S或H;(b)HVR-L2(序列識別號:227),其包含胺基酸序列X
1TX
2X
3KPX
4,X
1為E、F、或Y,X
2為S或I,X
3為K或S,X
4為S、E、或K;及(c)HVR-L3(序列識別號:228),其包含胺基酸序列X
1TYAAPLGPX
2,X
1為S或Q,X
2為M或T。
[7]如[5]所記載之抗體,更包含:包含序列識別號:229~232中任一胺基酸序列之重鏈可變域(domain)FR1、包含序列識別號:233的胺基酸序列之FR2、包含序列識別號:234的胺基酸序列之FR3、及包含序列識別號:235的胺基酸序列之FR4。
[8]如[6]所記載之抗體,更包含:包含序列識別號:236~238中任一胺基酸序列之輕鏈可變域FR1、包含序列識別號:240~241中任一胺基酸序列之FR2、包含序列識別號:242~244中任一胺基酸序列之FR3、及包含序列識別號:245~246中任一胺基酸序列之FR4。
[9]如[1]至[4]中任一項所記載之抗體,其包含:(a)VH序列,其與序列識別號:83~86、98、135~141中任一胺基酸序列具有至少95%的序列一致性;(b)VL序列,其與序列識別號:88~95、97、99、134、144~149中任一胺基酸序列具有至少95%的序列一致性;或(c)具有序列識別號:83~86、98、135~141中任一胺基酸序列之VH序列、及具有序列識別號:88~95、97、99、134、144~149中任一胺基酸序列之VL序列。
[10]如[1]至[3]、及[5]至[9]中任一項所記載之抗體,其係全長IgG1抗體。
[11]如[10]所記載之抗體,其中,Fc區域為包含胺基酸改變的突變Fc區域,相較於天然型Fc區域,該突變Fc區域對於選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa所組成之群組的至少1個Fcγ受體之結合活性增強。
[12]一種被分離的核酸,其編碼如[1]至[11]中任一項所記載之抗體。
[13]一種宿主細胞,其包含如[12]所記載之核酸。
[14]一種方法,其係製造抗體的方法,包含以製造抗體之方式培養如[13]所記載之宿主細胞。
[15]一種藥學性製劑,其包含如[1]至[11]中任一項所記載之抗體及藥學上所容許的載體。
[16]如[15]所記載之藥學性製劑,其中,抗體為免疫共軛物。
[17]如[15]或[16]所記載之藥學性製劑,其能與選自由免疫查核點抑制劑、EGFR抑制劑、HER2抑制劑、及化學治療劑所組成之群組的至少一種組合使用。
[18]如[15]至[17]中任一項所記載之藥學性製劑,其係用於腫瘤的治療之用途。
[19]如[18]所記載之藥學性製劑,其中,腫瘤為調節性T(Treg)細胞浸潤的固形腫瘤。
[20]如[15]至[17]中任一項所記載之藥學性製劑,其係用於細胞的傷害之用途。
[21]如[15]至[17]中任一項所記載之藥學性製劑,其係用於Treg細胞的傷害之用途。
[22]如[20]所記載之藥學性製劑,其細胞的傷害係由ADCC活性、CDC活性、或ADCP活性所導致。
[23]如[20]或[21]所記載之藥學性製劑,其藉由Treg細胞的傷害而使免疫活性化。
[24]如[15]至[17]中任一項所記載之藥學性製劑,其係用於免疫的活性化之用途。
[25]如[24]所記載之藥學性製劑,其中,免疫的活性化為T細胞的活性化。
[26]如[24]或[25]所記載之藥學性製劑,其使腫瘤組織中之免疫活性化。
[27]如[24]至[26]中任一項所記載之藥學性製劑,其相較於成為對照之包含抗CTLA-4抗體的藥學性製劑,在非腫瘤組織中之免疫的活性化的程度低。
[28]如[24]至[27]中任一項所記載之藥學性製劑,其相較於成為對照之包含抗CTLA-4抗體的藥學性製劑,副作用的程度低。
[29]如[24]至[28]中任一項所記載之藥學性製劑,其中,成為對照之抗CTLA-4抗體為不具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性的抗CTLA-4抗體。
[30]如[29]所記載之藥學性製劑,其副作用為自體免疫疾病。
[31]如[18]、[19]、[26]至[30]中任一項所記載之藥學性製劑,其中,腫瘤為乳癌或肝癌。
[32]一種多肽,其係在親代Fc區域中包含突變Fc區域之多肽,所述突變Fc區域包含胺基酸改變,親代Fc區域係藉由二條多肽鏈所構成,且突變Fc區域包含以下的位置中之胺基酸改變:
(i)親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、及326;以及
(ii)親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、及334。
[33]如[32]所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。
[34]如[32]或[33]所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。
[35]如[32]至[34]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置330中之胺基酸改變。
[36]如[32]至[35]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置356中之胺基酸改變。
[37]如[32]至[36]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置366中之胺基酸改變。
[38]如[32]至[37]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置439中之胺基酸改變。
[39]如[32]至[38]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置366、368、及407中之胺基酸改變。
[40]如[32]至[39]中任一項所記載之多肽,其包含選自以下所記載之胺基酸改變中的至少1個胺基酸改變:
(i)親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234中之Tyr、或者Phe、位置235中之Gln、位置236中之Trp、位置239中之Met、位置250中之Val、位置268中之Asp、位置270中之Glu、位置298中之Ala、位置307中之Pro、位置326中之Asp、位置332中之Glu、位置349中之Cys、位置356中之Lys、及位置366中之Trp;以及
(ii)親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236中之Ala、位置250中之Val、位置270中之Glu、位置298中之Ala、位置307中之Pro、位置326中之Asp、位置330中之Met、Lys、位置332中之Asp、或者Glu、位置334中之Glu、位置356中之Cys、位置366中之Ser、位置368中之Ala、位置407中之Val、及位置439中之Glu。
[41]如[32]至[40]中任一項所記載之多肽,其突變Fc區域更包含親代Fc區域的第一多肽及/或第二多肽中之以下的(a)~(d)中任一種胺基酸改變:
(a)由EU編號所表示之位置434中之Ala;
(b)由EU編號所表示之位置434中之Ala、位置436中之Thr、位置438中之Arg、位置440中之Glu;
(c)由EU編號所表示之位置428中之Leu、位置434中之Ala、位置436中之Thr、位置438中之Arg、位置440中之Glu;
(d)由EU編號所表示之位置428中之Leu、位置434中之Ala、位置438中之Arg、位置440中之Glu。
[42]如[32]至[41]中任一項所記載之多肽,其相較於親代Fc區域,在突變Fc區域中,對於選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa所組成之群組的至少1個Fcγ受體之結合活性增強。
[43]如[42]所記載之多肽,其相較於親代Fc區域,在突變Fc區域中,對於FcγRIIa及FcγRIIIa之結合活性增強。
[44]如[32]至[43]中任一項所記載之多肽,其相較於親代Fc區域,在突變Fc區域中,活性型Fcγ受體與抑制型Fcγ受體之間的選擇性提升。
[45]如[44]所記載之多肽,其中,活性型Fcγ受體為選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa所組成之群組的至少1個Fcγ受體,抑制型Fcγ受體為FcγRIIb。
[46]如[32]至[45]中任一項所記載之多肽,其中,包含突變Fc區域的多肽為抗體。
[47]一種方法,其係包含在親代Fc區域中導入胺基酸改變的步驟之製造包含突變Fc區域的多肽之方法,親代Fc區域係由二條多肽鏈所構成,且在以下的位置導入胺基酸改變:
(i)親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、及326;以及
(ii)親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、及334。
[用於實施發明的形態]
本說明書所記載或引用之手法及流程大致已被充分理解,例如,使用Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel, et al. eds.,(2003));the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach(M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds.(1995)), Harlow and Lane, eds.(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed.(1987));Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed., 1998)Academic Press; Animal Cell Culture(R. I. Freshney), ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998)Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8)J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan et al., eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999);Immunobiology(C. A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies(P. Finch, 1997);Antibodies: A Practical Approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995);及Cancer: Principles and Practice of Oncology(V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993)所記載之廣泛地利用的技法等以往技法,且被本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般地使用。
I.定義
只要未被另外定義,本說明書所使用之技術用語及科學用語具有與被本發明所屬技術領域之具有通常知識者所一般理解者相同的意義。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, N. Y. 1994)、及March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons(New York, N. Y. 1992)將本申請中所使用之許多用語的一般指南提供給本發明所屬技術領域中具有通常知識者。藉由參照,將包含專利申請及刊物在內之本說明書所引用之全部參考文獻的整體併入本說明書。
為了解釋本說明書之目的,應用以下的定義,符合的情形中,以單數形使用之用語亦包含複數形,相反亦同。應理解地,本說明書所使用之用語,僅將說明特定態樣作為目的,並不意圖進行限定。下述的定義之任一者與藉由參照而併入本說明書之任意的內容產生矛盾之情形時,以下述的定義為優先。
本說明書的精神中的「人類接受者框架(acceptor human framework)」係包含下述定義之源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架(human consensus frameworks)之輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的胺基酸序列之框架。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之人類接受者框架,可包含其等的相同胺基酸序列,或亦可包含胺基酸序列的變更。在一些態樣中,胺基酸的變更的數目為10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、或2以下。在一些態樣中,VL人類接受者框架與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列係序列相同。
「抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性」或「ADCC」(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)係所分泌之免疫球蛋白與存在於特定的細胞毒性細胞(例如,NK細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)結合,藉此,此等細胞毒性效應細胞可與具有抗原之標的細胞進行特異性結合,而且之後可藉由細胞毒性殺傷所述標的細胞,稱為細胞毒性的一形態。媒介ADCC的初代細胞(Primary Cell)之NK細胞僅表現FcγRIII,單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上的FcR的表現被統整在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92(1991)的第464頁的表3。為了評價目標分子的ADCC活性,能實施活體外ADCC測定法,例如美國專利第5,500,362號或者第5,821,337號或美國專利第6,737,056號(Presta)所記載者。在此種測定法中有用的效應細胞包含PBMC及NK細胞。或者再加上,目標分子的ADCC活性,在例如如Clynes et al. PNAS(USA)95: 652-656(1998)所公開之動物模式般的動物模式中,亦可在活體內進行評價。
作為「細胞毒性」,可列舉例如上述之抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)活性、後述之補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)活性、及由T細胞所致之細胞毒性等。所謂CDC活性,意指由補體系統所致之細胞毒性。另一方面,所謂ADCC活性,意指抗體與存在於標的細胞之細胞表面的抗原結合,效應細胞再與該抗體結合,藉此該效應細胞對標的細胞造成傷害之活性。目標抗體是否具有ADCC活性、或是否具有CDC活性,能藉由公知的方法進行測定(例如,Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans、Coligan等人編(1993)等)。
所謂「中和活性」,係指抗體與一些關於生物學活性的分子進行結合,藉此抑制該生物學活性之活性。在一些態樣中,生物學活性係由配體與受體的結合所造成。在特定的態樣中,藉由抗體與該配體或受體進行結合,而抑制該配體與受體的結合。此種具有中和活性的抗體被稱為中和抗體。某一受驗物質的中和活性係能藉由在存在配體時、比較存在或不存在所述受驗物質時的條件之間的生物學活性而測定。
所謂「抗體依賴性細胞性吞噬作用」或「ADCP」的用語,意指已被抗體包覆之細胞的整體或一部分之任一者,被納入與免疫球蛋白Fc區域結合之吞噬作用性免疫細胞(例如,巨噬細胞、嗜中性球、及樹突細胞)的內部之過程。
用語「結合活性(binding activity)」係指分子(例如,抗體)的1個或1個以上的結合部位與分子的結合夥伴(例如,抗原)之間的非共價結合的相互作用的總計強度。於此,「結合活性(binding activity)」未被嚴格地限定成某一結合對的成員(例如,抗體與抗原)之間的1:1相互作用。例如,在結合對的成員反映在1價的1:1相互作用之情形,結合活性係指固有的結合親和性(「Affinity」)。在結合對的成員能為在1價的結合及在多價的結合這兩者之情形,結合活性成為此等結合力的總和。分子X對於其夥伴Y的結合活性,一般而言,可由解離常數(KD)或「每單位配體量之分析物結合量」表示。結合活性能藉由包含本說明書所記載者在內之該技術領域中已知的通常方法進行測定。針對用於測定結合活性之具體實例及例示態樣,於以下敘述。
「親和性成熟」抗體係指以下抗體:相較於不具備改變的親代抗體(parent antibody),在1個或多個超可變區(hypervariable region,HVR)中,具有造成抗體對於抗原之親和性的改善之1個或多個改變。
用語「抗CTLA-4抗體」或「結合於CTLA-4的抗體」係以下抗體:能夠以充分地親和性與CTLA-4結合之抗體,其結果,所述抗體在將CTLA-4標的化時,能夠用於作為診斷劑及/或治療劑。在一態樣中,抗CTLA-4抗體對於無關係的非CTLA-4蛋白質的結合程度,在進行測定(例如,藉由放射免疫測定法(radioimmunoassay,RIA))時,是抗體對於CTLA-4的結合約小於10%。在特定的態樣中,與CTLA-4結合的抗體具有≦1μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM、或≦0.001 nM(例如10
-8M以下,例如10
-8M~10
-13M、例如10
-9M~10
-13M)的解離常數(KD)。在特定的態樣中,抗CTLA-4抗體與在來自不同種的CTLA-4間所保留之CTLA-4的抗原決定位結合。
本說明書中的用語「抗體」,係使用最廣泛的定義,只要顯示所期望的抗原結合活性,則不受限於此等,但包含單株抗體、多株抗體、多重特異性抗體(例如,雙重特異性抗體)及抗體片段在內,包含各種抗體結構。
「抗體片段」係指包含與完整抗體所結合的抗原結合之該完整抗體的一部分在內之該完整抗體以外的分子。抗體片段的例子,不受限於此等,但包含Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2;雙功能抗體(diabody);線狀抗體;單鏈抗體分子(例如,scFv);及、由抗體片段所形成之多重特異性抗體。
參照抗體與「結合於相同抗原決定位的抗體」是指,在競爭分析中,所述參照抗體係指將本身對於抗原的結合例如阻止50%以上的抗體,及/或參照抗體係在競爭分析中將前述的抗體本身對於抗原的結合阻止例如50%以上。本說明書中提供例示的競爭分析。
「自體免疫疾病」係指由所述個體本身的組織產生且對於所述個體本身的組織造成的非惡性疾病或障礙。本說明書中,自體免疫疾病係明確地排除惡性或癌性的疾病或狀態者,尤其排除B細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)、毛細胞白血病、及慢性骨髓母細胞性白血病。自體免疫疾病或障礙的例子,不受限於此等,但包含以下:包含乾癬及皮膚炎(例如,異位性皮膚炎)之發炎性皮膚疾病等發炎性反應;全身性硬皮症及硬化症;發炎性腸疾病相關反應(例如,克隆氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性大腸炎);呼吸窘迫症候群(包含成人呼吸窘迫症候群,adult respiratory distress syndrome,ARDS);皮膚炎;腦膜炎;腦炎;眼色素層炎;大腸炎;腎絲球小管性腎炎;例如濕疹及氣喘以及伴隨T細胞的浸潤及慢性炎症反應之其他狀態等過敏性狀態;動脈粥樣硬化;白血球黏附不全症;類風濕性關節炎;全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)(包含狼瘡性腎炎、紅斑狼瘡,但不受限於此等);糖尿病(例如,第I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病);多發性硬化症;雷諾氏綜合症;自體免疫性甲狀腺炎;橋本甲狀腺炎;過敏性腦脊椎炎;休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome);青年發症糖尿病;以及在典型的結核病、結節病、多發性肌炎、肉芽腫症、及血管炎中可見之藉由細胞激素及T淋巴球媒介之急性及延遲型過敏症相關免疫反應;惡性貧血(艾迪生氏病);伴隨白血球的漏出之疾病;中樞神經系統(central nervous system,CNS)發炎性障礙;多臟器損傷症候群;溶血性貧血(包含冷凝球蛋白血症或庫姆氏陽性溶血性貧血但不受限於此等);重症肌無力症;抗原‐抗體複合體介在性疾病;抗腎絲球基底膜疾病;抗磷脂質症候群;過敏性神經炎;格雷氏病;藍伯- 伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome);水疱性類天疱瘡;天疱瘡;自體免疫性多腺性內分泌障礙;萊特氏病(Reiter’s disease);僵體症候群(stiff-man syndrome);貝歇氏症(Behcet’s disease );巨大細胞動脈炎;免疫複合體性腎炎;IgA腎症;IgM多發性神經病變;免疫性血小板減少性紫斑病(immune thrombocytopenic purpura,ITP)或自體免疫性血小板減少症。
用語「癌」及「癌性」係指稱或說明將不受調節的細胞成長/增殖作為典型的特徵之哺乳動物中之生理學的狀態。癌的例子包含乳癌及肝癌。
所謂「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」的用語,意指與標的結合之抗體的Fc效應域將一連串的酵素反應進行活性化,結果使標的細胞的膜形成孔洞而誘導細胞死亡用之機制。典型而言,形成於標的細胞上之抗原-抗體複合體係與補體成分C1q結合並活性化,接著,補體成分C1q將補體級聯(cascade)反應活性化,造成標的細胞的死亡。又,補體的活性化有造成補體成分往標的細胞的表面沉澱之情形,藉此,藉由與白血球上的補體受體(例如CR3)結合而促進ADCC。
「化學治療劑」係指對於癌的治療有用的化學性化合物。化學治療劑的例子包含以下:塞替派(thiotepa)及環磷酸醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN(註冊商標))等烷基化劑;硫酸布他卡因、英丙舒凡(improsulfan)、及畢保釋芬(Piposulfan)等磺酸烷基;苯唑多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)、及尤利多巴(uredopa)等氮丙啶(aziridine);包含六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺、及三甲密胺(trimethylolomelamine)之伸乙亞胺及羥甲基三聚氰胺;乙醯原素(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone));四氫大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL(註冊商標));β-拉帕酮(beta-Lapachone);拉帕酚;秋水仙鹼;樺木酸;喜樹鹼(包含合成類似物之拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN(註冊商標))、CPT-11(伊立替康(irinotecan,CAMPTOSAR(註冊商標)))、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、東莨若素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼);苔蘚蟲素(bryostatin);海洋抑素(callystatin);CC-1065(包括其合成類似物阿多來新(adozelesin))、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin));鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(Podophyllic acid);替尼泊甙(teniposide);念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);尾海兔素(dolastatin);倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);盤克斯塔叮(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海綿抑素(spongistatin);苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(chlorophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、依弗醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、鹽酸甲氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)等氮芥類(nitrogen mustard);卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)等亞硝基脲(nitrosourea);烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin),尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ΩI1(例如參照Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186(1994));為口服α-4整合素抑制劑之CDP323;包含達內黴素A之達內黴素(dynemicin);艾斯帕米辛(esperamicin);以及新抑癌蛋白(neocarzinostatin)呈色基團及相關色蛋白烯二炔抗生素呈色基團、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素d(dactinomycin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)(包含ADRIAMYCIN(註冊商標))、嗎啉基(morpholino)-阿黴素、氰基嗎啉基-阿黴素、2-吡咯啉基-阿黴素(2-pyrrolino-doxorubicin)、阿黴素HCl脂質體注射劑(DOXIL(註冊商標))、脂質體阿黴素TCL D-99(MYOCET(註冊商標))、聚乙二醇化脂質體阿黴素(CAELYX(註冊商標))、及去氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素C等絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)等抗生素;胺甲喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR(註冊商標))、替加氟(tegafur)(UFTORAL(註冊商標))、卡培他濱(capecitabine)(XELODA(註冊商標))、埃博霉素(epothilone)、及5-氟尿嘧啶(5-FU)等代謝拮抗物質;迪諾特寧(denopterin)、胺甲蝶呤、蝶羅昤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)等葉酸類似物;氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌昤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)等嘌呤類似物;安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)等嘧啶類似物;卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)等雄激素;胺魯米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)等抗腎上腺物質(anti-adrenals);亞葉酸(frolinic acid)等葉酸補充物質;乙醯葡醛酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);貝斯布西(bestrabucil);比生群(bisantrene);艾達曲克(edatraxate);得弗伐胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);艾弗鳥胺酸(elfornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);埃坡黴素(epothilone);依託格魯(etoglucid);硝酸鎵(gallium nitrate);羥基脲(hydroxyurea);蘑菇多醣(lentinan);羅尼達寧(lonidainine);美登素(maytansine)及胺沙托辛(ansamitocins)等美登素類(maytansinoids);丙脒腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫比達摩(mopidanmol);硝拉維林(nitraerine);噴司他丁(pentostatin);凡那明(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK(註冊商標)多醣複合物(JHS Natural Products,尤金,俄勒岡);雷佐生(razoxane);根黴菌素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺鍺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2’,2’-三氯三乙基胺;新月毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE(註冊商標)、FILDESIN(註冊商標));達卡巴嗪(dacarbazine);甘露氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);甲托辛(gacytosine);阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」);沙奧特帕(thiotepa);類紫杉醇(taxoid),例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL(註冊商標));經白蛋白改造之太平洋紫杉醇奈米粒子製劑(ABRAXANETM)及多西他賽(doxetaxel)(TAXOTERE(註冊商標));苯丁酸氮芥(chloranbucil);6-硫鳥嘌呤(6- thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);胺甲蝶呤;順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如,ELOXATIN(註冊商標))、及卡鉑(carboplatin)等鉑劑;包含長春鹼(vinblastine)(VELBAN(註冊商標))、長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN(註冊商標))、長春地辛(vindesine)(ELDISINE(註冊商標)、FILDESIN(註冊商標))、及長春瑞賓(Vinorelbine)(NAVELBINE(註冊商標))之防止微管蛋白聚合而形成微管的長春花類;依託泊苷(VP-16);依弗醯胺;米托蒽醌(mitoxantrone); 甲醯四氫葉酸(leucovorin);諾凡特龍(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾黴素(daunomycin);胺基蝶呤(aminopterin);伊班膦酸鹽(ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine,DMFO);包含貝瑟羅汀(Bexarotene)(TARGRETIN(註冊商標))之視黃酸(retinoic acid)等類視色素;氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如,BONEFOS(註冊商標)或OSTAC(註冊商標))、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL(註冊商標))、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA(註冊商標))、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX(註冊商標))、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA(註冊商標))、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID(註冊商標))、或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL(註冊商標))等雙膦酸鹽;曲沙他濱(troxacitabine)(a 1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,尤其是抑制牽涉異常細胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現者,例如PKC-alpha、Raf、H-Ras、及上皮成長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGF-R);THERATOPE(註冊商標)疫苗及基因療法用疫苗(例如,ALLOVECTIN(註冊商標)疫苗、LEUVECTIN(註冊商標)疫苗、及VAXID(註冊商標)疫苗)等疫苗;拓樸異構酶1抑制劑(例如,LURTOTECAN(註冊商標));rmRH(例如,ABARELIX(註冊商標));BAY439006(索拉非尼(Sorafenib);Bayer);SU-11248(舒尼替尼(Sunitinib)、SUTENT(註冊商標)、Pfizer);哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑(例如,塞內昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白酶體抑制劑(例如,PS341);硼替佐米(Bortezomib)(VELCADE(註冊商標));CCI-779;替吡法尼(tipifarnib)(R11577);索拉非尼(Sorafenib)、ABT510;奧利默森鈉(oblimersen sodium)(GENASENSE(註冊商標))等Bcl-2抑制劑;匹蒽醌(pixantrone);EGFR抑制劑(參照後述定義);酪胺酸激酶抑制劑(參照後述定義);雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus),RAPAMUNE(註冊商標))等絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑;洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636、SARASAR(商標))等法呢基轉移酶(farnesyl transferase)抑制劑;以及上述的任意者的藥學可容許鹽、酸、或衍生物;以及上述2個或2個以上的組合,例如為環磷酸醯胺、阿黴素、長春新鹼及去氫皮質醇(prednisolone)的併用療法的簡稱之CHOP;及由組合5-FU及甲醯四氫葉酸之奧沙利鉑(oxaliplatin)(ELOXANTIN(商標))所致之治療方案簡稱亦即FOLFOX。
用語「嵌合」抗體係指以下抗體:重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定的供給源或種,且另一方面,重鏈及/或輕鏈的殘餘部分源自不同的供給源或種。
抗體的「種類(class)」係指抗體的重鏈所具備之恆定域或恆定區的類型。抗體中具有5個主要種類:IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。而且,其中一些亦可進一步被分成次種類(subclass)(同型)。例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。將對應於不同種類的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。
本說明書中的用語「細胞毒性劑」,係指抑制或妨礙細胞的功能、及/或成為細胞的死亡或破壞的原因之物質。細胞毒性劑不受限於此等,但包含放射性同位素(例如,
211At、
131I、
125I、
90Y、
186Re、
188Re、
153Sm、
212Bi、
32P、
212Pb及Lu的放射性同位素);化學治療劑或化學療法藥(例如,胺甲喋呤、阿得力黴素(adriamycin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)類(長春新鹼、長春鹼、依托泊(etoposide))、阿黴素、美法侖、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥、道諾魯比辛 (daunorubicin)、或其他嵌入劑(intercalating agents));增殖抑制劑;核酸分解酵素等酵素及其片段;抗生素;例如,低分子毒素或細菌、真菌、植物、或動物起源的酵素性活性毒素(包含其片段及/或變異體)等毒素;及上述所公開之各種化學治療劑。
「效應細胞」係指表現1個或多個FcR,且發揮效應功能之白血球。在特定的態樣中,此細胞至少表現FcγRIII且發揮ADCC效應功能。媒介ADCC之白血球的例子,包含周邊血液單核球(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性球。效應細胞能由天然的供給源,例如由血液被分離。在特定的態樣中,效應細胞能為人類效應細胞。
「效應功能」係指起因於抗體的Fc區域之依據抗體的同型而異的生物學活性。在抗體的效應功能的例子中,包含下述者:C1q結合及補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC);抗體依賴性細胞媒介的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP);細胞表面受體(例如,B細胞受體)的下游調控;及B細胞活性化。
用語「抗原決定位」包含能被抗體結合之任意的決定基。抗原決定位係被以抗原為標的之抗體結合的該抗原的區域,包含與抗體直接接觸之特定胺基酸。抗原決定位決定基可包含胺基酸、醣側鏈、磷醯基或磺醯基等化學性活性的表面分子群,且可具備特異性三維結構特性及/或特定的電荷特性。一般而言,對於特定標的抗原呈特異性的抗體,在蛋白質及/或巨大分子的複雜混合物中,會優先辨識所述標的抗原上的抗原決定位。
「Fc受體」或「FcR」係指與抗體的Fc區域結合之受體。在一些態樣中,FcR為天然型人類FcR。在一些態樣中,FcR為與IgG抗體結合者(γ受體),包含FcγRI、FcγRII、及FcγRIII次種類的受體,並包含由此等受體的等位基因變異體及選擇性切割(splicing)變異體所致之形態。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活性化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」),此等主要在其細胞質域具有相異之類似胺基酸序列。活性化受體FcγRIIA,在其細胞質域(cytoplasmic domain)包含免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)。抑制受體FcγRIIB,在其細胞質域包含免疫受體酪胺酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,ITIM)(例如,參照Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234(1997))。FcR例如在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492(1991);Capel et al., Immunomethods 4: 25-34(1994);及de Haas et al., J. Lab. Clin.Med 126: 330-341(1995)中已被概要內容。包含未來所辨識之其他FcR亦被包含在本說明書的用語「FcR」中。
用語「Fc受體」或「FcR」亦包含負責母體的IgG往胎兒的移動(Guyer et al., J. Immunol. 117: 587(1976)及Kim et al., J. Immunol. 24: 249(1994))以及免疫球蛋白的恆定的調節之新生兒型受體FcRn。測定對於FcRn的結合之方法為公知(例如,參照Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598(1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640(1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216(2004); WO2004/92219(Hinton et al.))。
在活體內之對於人類FcRn的結合及人類FcRn高親和性結合多肽的血清半衰期,例如能在表現人類FcRn之基因轉殖小鼠或者經轉染的人類細胞株中,或在投予伴隨突變Fc區域的多肽之靈長類中進行測定。WO2000/42072(Presta)記載有已改善或已減少對於FcR之結合的抗體變異體。例如,亦參照Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)。
本說明書中的用語「Fc區域」係被用於定義至少包含恆定區的一部分之免疫球蛋白重鏈的C端區域。此用語包含天然型序列的Fc區域及變異體Fc區域。在一態樣中,人類IgG重鏈Fc區域係從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羧基末端為止。但是,Fc區域的C端的離胺酸(Lys447)或甘胺酸‐離胺酸(Gly446-Lys447)可存在亦可不存在。本說明書中只要未特別特定,則Fc區域或恆定區中的胺基酸殘基的編號方式係遵循Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991所記載之EU編號系統(亦稱為EU索引)。
用語「含有Fc區域的抗體」係指包含Fc區域之抗體。Fc區域的C端離胺酸(若遵循EU編號系統則為殘基447)或Fc區域的C端甘胺酸-離胺酸(殘基446-447),例如能在抗體的精製期間、或藉由編碼抗體之核酸的重組操作而去除。因此,包含由本發明所致之具有Fc區域的抗體之組合物,能包含伴隨G446-K447的抗體、伴隨G446且不伴隨K447的抗體、已完全去除G446-K44的抗體、或上述3個類型的抗體的混合物。
用語「可變區」或「可變域」係指參與使抗體結合至抗原之抗體的重鏈或輕鏈的結構域(domain)。天然型抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH及VL),通常具有類似結構,在各結構域包含4個被保留的框架區(FR)及3個超可變區(HVR)(例如,參照Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007))。藉由1個VH或VL域,便能給予充分的抗原結合特異性。再者,與某一特定的抗原結合之抗體可使用來自與該抗原結合之抗體的VH或VL域,分別篩選VL或VH域的互補庫,並進行分離。例如參照Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887(1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628(1991)。
「框架」或「FR」係指超可變區(HVR)殘基以外之可變域殘基。可變域的FR通常由4個FR域:FR1、FR2、FR3、及FR4所構成。相應於此,HVR及FR的序列通常係以下述順序在VH(或VL)中出現:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用語「全長抗體」、「完整抗體」、及「全部抗體」在本說明書能互換使用,係指具有與天然型抗體結構實質類似之結構的抗體,或具有包含本說明書所定義的Fc區域之重鏈的抗體。
「機能性Fc區域」具備天然型序列Fc區域的「效應功能」。例示的「效應功能」包含:C1q結合、CDC、Fc受體結合、ADCC、吞噬作用、細胞表面受體(例如,B細胞受體,B cell receptor,BCR)的下游調控等。此種效應功能,一般而言需要將Fc區域與結合域(例如,抗體可變域)進行組合,而且,能使用例如本說明書的定義中所公開之各種的測定法進行評價。
「人類抗體」係以下抗體:具備胺基酸序列,所述胺基酸序列對應於源自由人類或者人類細胞所產生之抗體或人類抗體庫(repertoire)或者使用其他人類抗體編碼序列的非人類供給源之抗體的胺基酸序列。此人類抗體的定義,明確排除包含非人類的抗原結合殘基之人源化抗體。
「人類共有框架」係顯示在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇群組中最共通產生的胺基酸殘基之框架。通常,人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇,係選自可變域序列的亞群。通常,序列的亞群係Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3中之亞群。在一態樣中,針對VL,亞群係由上述的Kabat等人所致之亞群κI。在一態樣中,針對VH,亞群係由上述的Kabat等人所致之亞群III。
「人源化」抗體係指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基及來自人類FR的胺基酸殘基之嵌合抗體。在一態樣中,人源化抗體包含至少1個、典型為2個可變域的實質整體,在該可變區中,整體或者實質整體的HVR(例如CDR)對應於非人類抗體的HVR,並且,整體或者實質整體的FR對應於人類抗體的FR。人源化抗體可可選地包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如,非人類抗體)的「經人源化的形態」係指已經過人源化之抗體。
本說明書所使用之用語「超可變區」或「HVR」,係在序列中為超可變(「互補決定區」或「CDR」(complementarity determining region))、及/或形成結構已定之環(「超可變環」)、及/或包含抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之抗體的可變域的各區域。通常,抗體包含6個HVR:VH中3個(H1、H2、H3)、及VL中3個(L1、L2、L3)。本說明書中的例示HVR包含以下者:
(a)在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)處產生之超可變環(Chothia and Lesk, J.Mol. Biol. 196: 901-917(1987));
(b)在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)處產生之CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991));
(c)在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及93-101(H3)處產生之抗原接觸(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996));以及、
(d)包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、及94-102(H3)之(a)、(b)、及/或(c)的組合。
只要未特別揭示,HVR殘基及可變域中的其他殘基(例如,FR殘基)在本說明書中係遵循上述的Kabat等人進行編號。
「免疫共軛物」係與1個或多個不同種的分子進行共軛的抗體(不同種的分子不受限於此,但包含細胞毒性劑)。
「經分離的」抗體係已從其原本的環境的成分分離者。在一些態樣中,抗體係利用例如,電泳(例如,SDS-PAGE、等電點分離法(isoelectric focusing,IEF)、毛細管電泳)或層析法(例如,離子交換或逆相HPLC)進行測定,且被精製直到超過95%或99%的純度。作為用於評價抗體的純度之方法的概要內容,例如參照Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87(2007)。
「經分離的」核酸,係指已從其原本的環境的成分分離之核酸分子。經分離的核酸包含在通常包含所述核酸分子的細胞中所含之核酸分子,所述核酸分子存在於染色體外或存在於與本來的染色體上的位置不同的染色體上的位置。
「編碼抗體之經分離的核酸」係指編碼抗體的重鏈及輕鏈(或其片段)之1個或多個核酸分子,包含:1個載體或各個載體所乘載的核酸分子、及存在於宿主細胞中的1個或多個位置的核酸分子。
本說明書所使用之用語「載體」,係指可再增加與其連結的另1個核酸之核酸分子。此用語包含作為自我複製核酸結構之載體、及被納入已導入其之宿主細胞的基因庫中之載體。某一載體可引導本身以可操作地連接之核酸的表現。此種載體在本說明書中亦被稱為「表現載體」。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及「宿主細胞培養物」能被互換使用,係指已導入外來核酸之細胞(包含此種細胞的子代)。宿主細胞包含「轉形(transformation)體」及「轉形細胞」,其中包含不論初代的轉形細胞及繼代數之源自所述細胞的子代。子代與親代細胞的核酸內容可不完全相同,也可包含突變。本說明書中包含變異體子代,其具有與在篩選或選擇原始轉形細胞之際能使用者相同的功能或生物學活性。
本說明書中的用語「單株抗體」,係指得自實質上均一的抗體群集之抗體。亦即,構成所述群集之各個抗體,除了能產生之突變抗體(例如,包含自然產生的突變之突變抗體、或在單株抗體調製物的製造中發生的突變抗體。此種變異體通常以些許量存在)以外為相同、及/或與相同抗原決定位結合。對照典型包含對於不同決定基(抗原決定位)之不同抗體的多株抗體調製物,單株抗體調製物的各單株抗體係針對抗原上的單一決定基。因此,修飾語「單株」表示由實質上均一的抗體群集所得之抗體的特徵,不應被解釋為要求由某些特定方法製造抗體。例如,遵循本發明而使用之單株抗體,不受限於此等,但可藉由包含融合瘤法、重組DNA法、噬菌體顯示法、利用人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分之基因轉殖動物的方法之各種手法而作成,用於製作單株抗體之此種方法及其他例示的方法,被記載於本說明書。
「裸抗體」係指未與不同種的部分(例如,細胞毒性部分)或放射性標記共軛之抗體。裸抗體亦可存在於藥學性製劑中。
「天然型抗體」係指伴隨著天然產生之各種結構的免疫球蛋白分子。例如,天然型IgG抗體係由雙硫鍵結合之2個相同輕鏈與2個相同重鏈所構成之約150,000道耳頓的異質四聚體醣蛋白質。從N端朝向C端,各重鏈具有亦被稱為可變重鏈域或重鏈可變域之可變區(VH),其接續3個恆定域(CH1、CH2、及CH3)。同樣地,從N端朝向C端,各輕鏈具有亦被稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域之可變區(VL),其接續恆定輕鏈(CL)域。抗體的輕鏈可基於其恆定域的胺基酸序列而歸屬於被稱為卡帕(κ)及拉目達(λ)的2個類型之1個。
「天然型序列Fc區域」包含與在自然界發現之Fc區域的胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然型序列人類Fc區域包含:天然型序列人類IgG1 Fc區域(非A及A同種異型)、天然型序列人類IgG2 Fc區域、天然型序列人類IgG3 Fc區域、及天然型序列人類IgG4 Fc區域、以及天然存在之其等的變異體。
「突變Fc區域」包含因至少1個胺基酸修飾(改變),較佳為1個或多個胺基酸取代而與天然型序列Fc區域相異的胺基酸序列。較佳為,相較於天然型序列Fc區域或親代多肽的Fc區域,突變Fc區域在天然型序列Fc區域中或親代多肽的Fc區域中具有至少1個胺基酸取代,例如約1~約10個胺基酸取代,較佳為約1~約5個胺基酸取代。本說明書的突變Fc區域較佳為具備與天然型序列Fc區域及/或親代多肽的Fc區域至少約80%的同源性,更佳為具備與其等至少約90%的同源性、最佳為具備與其等至少約95%的同源性。
對於參照多肽序列之「百分比(%)胺基酸序列一致性」被定義成:以獲得最大的百分比序列一致性之方式使序列整列,且若需要則導入間隙之後,且不考慮任何保留性取代為序列一致性的一部分時,與參照多肽序列中的胺基酸殘基相同之候補序列中的胺基酸殘基的百分率。用於決定百分比胺基酸序列一致性之比對(alignment),可藉由使用該技術領域中之技術範圍內所具有的各種方法,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體、或GENETYX(註冊商標)(GENETYX股份有限公司)等能公開取得之電腦軟體而達成。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可決定用於獲得序列的比對之適當的參數,其包含為了橫跨進行比較之序列的全長而達到最大的比對所需要的任意演算法。
ALIGN-2序列比較電腦程式係Genentech公司的著作,其原始碼也在美國著作權局(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)中與使用說明一併被提出,並被註冊為美國著作權登錄號TXU510087。ALIGN-2程式能從Genentech公司(Genentech, Inc., South San Francisco, California)公開取得,亦可由原始碼進行編輯。ALIGN-2程式係為了在包含Digital UNIX V4.0D的UNIX操作系統上使用而被編輯。所有的序列比較參數皆依據ALIGN-2程式而設定,不會變動。
在胺基酸序列比較中使用ALIGN-2之狀況中,具有或包含預先規定的胺基酸序列A之、對於預先規定的胺基酸序列B之、或與其之、或相對於其之%胺基酸序列一致性(或者,亦可為對於預先規定的胺基酸序列B之、或與其之、或相對於其之某%胺基酸序列一致性之預先規定的胺基酸序列A)係如以下般計算:分式X/Y的100倍。於此,X係藉由序列比對程式ALIGN-2而在該程式的A及B的比對中為相同之被評為一致的胺基酸殘基的數,Y為B中的胺基酸殘基的全部數。胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等之情形,能理解為A對於B之%胺基酸序列一致性與B對於A之%胺基酸序列一致性不相等。只要未特別明確記載,本說明書中能使用之所有的%胺基酸序列一致性值係如同先前段落所述,能使用ALIGN-2電腦程式而獲得。
用語「藥學性製劑」係指以下調製物:呈現其中所含之有效成分的生物學活性能發揮效果之形態的調製物,且不包含對於投予製劑之對象而言為無法容許的程度之具毒性的附加要素。
「個體」或「對象」為哺乳動物。哺乳動物不受限於此等,但包含豢養動物(例如,牛、羊、貓、狗、馬)、靈長類(例如,人類、及猴等非人類靈長類)、兔、以及、囓齒類(例如,小鼠及大鼠)。在特定的態樣中,個體或對象為人類。
「藥學上所容許之載體」係指對於對象為無毒之藥學性製劑中的有效成分以外的成分。藥學上所容許之載體不受限於此等,但包含緩衝液、賦形劑、穩定化劑、或保存劑。
某劑(例如,藥學性製劑)的「有效量」係指為了達成所期望之治療結果或預防結果而有效之必須用量中之量、及經過必須期間之量。
用語「使用說明書」通常被包含在治療用品的商用包裝中,係用於指包含以下資訊的使用說明書:關於此種治療用品的使用之適應症、用法、用量、投予方法、併用療法、禁忌、及/或警告。
本說明書中的用語「CTLA-4」,只要未被特別揭示,則係指來自包含靈長類(例如,人類)及囓齒類(例如,小鼠及大鼠)等哺乳動物之任意的脊椎動物供給源之任意的天然型CTLA-4。此用語亦包含未受到「全長」的加工(processing)之CTLA-4,亦包含在細胞中的加工結果所產生之任何形態的CTLA-4。此用語又亦包含自然產生之CTLA-4的變異體,例如,剪接變異體或等位基因變異體。將例示的人類CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:214,將小鼠CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:247,將猴CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:248,將人類CTLA-4的細胞外域的胺基酸序列表示為序列識別號:28。在本說明書中,CTLA-4亦被標記成CTLA4。
用語「調節性T(Treg)細胞」係調節免疫系統且維持對於自我抗原之寬容度並抑制自體免疫疾病之T細胞的亞群集。此等細胞通常會抑制效應T細胞的誘導及增殖,或進行負調控(downregulation)。作為Treg細胞,最被理解的是表現CD4、CD25、及Foxp3者(CD4
+CD25
+Treg細胞)。此等Treg係與輔助T細胞不同。在Treg細胞的辨識與監測中,使用幾個不同方法。藉由CD4及CD25表現而規定之情形(CD4
+CD25
+細胞),Treg細胞構成小鼠及人類中之成熟CD4
+T細胞亞群集的約5~10%,另一方面,Treg的約1~2%能在全血中進行測定。有時亦追加測定Foxp3的表現(CD4
+CD25
+Foxp3
+細胞)。又,作為別的標記,CD127的不存在或低程度表現有時亦與CD4及CD25的存在進行組合而使用。再者,在Treg細胞中,亦表現高程度的CTLA-4及GITR。藉由後述的實施例所記載之方法,亦能辨識Treg。
本說明書所使用之用語「實質上類似的」、「實質上相等的」、或「實質上相同的」係指2個數值之間(例如,關於本發明的抗體與關於參照/比較用抗體之間)的相似性充分高至以下程度:其等2個數值之間的差在藉由該數值(例如,KD值)所測定之生物學特徵之觀點下,本發明所屬技術領域中具有通常知識者認為幾乎或完全沒有生物學及/或統計學上的顯著性。
本說明書所使用之「治療」(及其文法上的衍生語,例如「進行治療」、「進行治療一事」等)係意指企圖改變受治療之個體的自然經過之臨床性介入,亦能為了預防而實施,亦能在臨床病態的經過期間實施。治療所期望的效果不受限於此等,但包含疾病的發生或復發之防止、症狀之減輕、由疾病所致之任意的直接或間接性病理的影響之減弱、轉移之防止、疾病的進行速度之減低、疾病狀態之恢復或緩和、及經緩解或改善之預後。在一些態樣中,本發明的抗體係使用於使疾病的發症延遲,或減緩疾病的進行。
用語「腫瘤」係指不論是惡性或良性,所有的贅生細胞(neoplastic cell)成長及增殖以及所有的癌前性及癌性細胞及組織。用語「癌」、「癌性」、「細胞增殖性障礙」、「增殖性障礙」、及「腫瘤」在本說明書中之情形,互相不具排他性。
所謂用語「腫瘤組織」,意指至少包含一個腫瘤細胞之組織。腫瘤組織通常係由成為腫瘤主體之腫瘤細胞的群集(實質)與存在於此等之間並支撐腫瘤的結締組織及血管(間質)而成立。有兩者的區分明確者,也有兩者混合者。在腫瘤組織內中,有時免疫細胞等會浸潤。另一方面,所謂「非腫瘤組織」,意指在活體內之腫瘤組織以外的組織。非疾病狀態之健康正常組織/正常組織為非腫瘤組織的代表例。
II.組合物及方法
在一態樣中,本發明係部分基於抗CTLA-4抗體及其等的使用。在特定的態樣中,提供與CTLA-4結合的抗體。本發明的抗體例如用於癌的診斷或治療是有用的。
A.例示的抗CTLA-4抗體
在一態樣中,本發明提供與CTLA-4結合且經分離的抗體。在特定的態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性。在一些態樣中,相較於不存在含有腺苷的化合物,在存在含有腺苷的化合物時對於CTLA-4的結合活性更高。或者,在另一態樣中,相較於存在低濃度的含有腺苷的化合物,在存在高濃度的含有腺苷的化合物時對於CTLA-4的結合活性更高。在另外的態樣中,對於CTLA-4的結合活性之差,例如為2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×10
3倍以上、2×10
3倍以上、3×10
3倍以上、5×10
3倍以上、1×10
4倍以上、2×10
4倍以上、3×10
4倍以上、5×10
4倍以上、或1×10
5倍以上。
在一些態樣中,抗CTLA-4抗體的結合活性可以KD(Dissociation constant:解離常數)值表示。在另外的態樣中,相較於不存在含有腺苷的化合物,在存在含有腺苷的化合物時抗CTLA-4抗體的KD值更小。或者,在另一態樣中,相較於存在低濃度的含有腺苷的化合物,在存在高濃度的含有腺苷的化合物時抗CTLA-4抗體的KD值更小。在另外的態樣中,抗CTLA-4抗體的KD值之差,例如為2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×10
3倍以上、2×10
3倍以上、3×10
3倍以上、5×10
3倍以上、1×10
4倍以上、2×10
4倍以上、3×10
4倍以上、5×10
4倍以上、或1×10
5倍以上。在存在含有腺苷的化合物時、或者存在高濃度的含有腺苷的化合物時之抗CTLA-4抗體的KD值,例如可為9×10
-7M以下、8×10
-7M以下、7×10
-7M以下、6×10
-7M以下、5×10
-7M以下、4×10
-7M以下、3×10
-7M以下、2×10
-7M以下、1×10
-7M以下、9×10
-8M以下、8×10
-8M以下、7×10
-8M以下、6×10
-8M以下、5×10
-8M以下、4×10
-8M以下、3×10
-8M以下、2×10
-8M以下、1×10
-8M以下、9×10
-9M以下、8×10
-9M以下、7×10
-9M以下、6×10
-9M以下、5×10
-9M以下、4×10
-9M以下、3×10
-9M以下、2×10
-9M以下、1×10
-9M以下、9×10
-10M以下、8×10
-10M以下、7×10
-10M以下、6×10
-10M以下、5×10
-10M以下、4×10
-10M以下、3×10
-10M以下、2×10
-10M以下、或1×10
-10M以下。在不存在含有腺苷的化合物、或者存在低濃度的含有腺苷的化合物時之抗CTLA-4抗體的KD值,例如可為1×10
-8M以上、2×10
-8M以上、3×10
-8M以上、4×10
-8M以上、5×10
-8M以上、6×10
-8M以上、7×10
-8M以上、8×10
-8M以上、9×10
-8M以上、1×10
-7M以上、2×10
-7M以上、3×10
-7M以上、4×10
-7M以上、5×10
-7M以上、6×10
-7M以上、7×10
-7M以上、8×10
-7M以上、9×10
-7M以上、1×10
-6M以上、2×10
-6M以上、3×10
-6M以上、4×10
-6M以上、5×10
-6M以上、6×10
-6M以上、7×10
-6M以上、8×10
-6M以上、或9×10
-6M以上。
在另一態樣中,亦可以kd(Dissociation rate constant:解離速度常數)值取代KD值,表示抗CTLA-4抗體的結合活性值。
在另一態樣中,抗CTLA-4抗體的結合活性亦可以每單位抗體量之CTLA-4的結合量表示。例如,在表面電漿共振分析中,已固定於感測晶片上之抗體的結合量、及再結合於抗體之抗原的結合量係分別以反應單位(resonance unit,RU)的形態被測定。可將此處的抗原的結合量除以抗體的結合量而得之值定義作為每單位抗體量之抗原的結合量。如此進行之結合量的測定及計算的具體方法被記載於後述實施例。在一些態樣中,相較於不存在含有腺苷的化合物,在存在含有腺苷的化合物時之CTLA-4的結合量更大。或者,在另一態樣中,相較於存在低濃度的含有腺苷的化合物,在存在高濃度的含有腺苷的化合物時之CTLA-4的結合量更大。在另外的態樣中,CTLA-4的結合量之差,例如為2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×10
3倍以上、2×10
3倍以上、3×10
3倍以上、5×10
3倍以上、1×10
4倍以上、2×10
4倍以上、3×10
4倍以上、5×10
4倍以上、或1×10
5倍以上。在存在含有腺苷的化合物、或者存在高濃度的含有腺苷的化合物時之CTLA-4的結合量之值,例如可為0.01以上、0.02以上、0.03以上、0.04以上、0.05以上、0.06以上、0.07以上、0.08以上、0.09以上、0.1以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、或1以上。不存在含有腺苷的化合物,或者存在低濃度的含有腺苷的化合物時之CTLA-4的結合量之值,例如可為0.5以下、0.4以下、0.3以下、0.2以下、0.1以下、0.09以下、0.08以下、0.07以下、0.06以下、0.05以下、0.04以下、0.03以下、0.02以下、0.01以下、0.009以下、0.008以下、0.007以下、0.006以下、0.005以下、0.004以下、0.003以下、0.002以下、或0.001以下。
在一些態樣中,本說明書所表示之KD值及kd值、結合量之值等係藉由在25℃或37℃實施表面電漿共振分析而測定或者計算(例如,參照本說明書的實施例3)。
作為含有腺苷的化合物的濃度,只要在抗CTLA-4抗體的結合活性檢測到差異,則可選擇任意的濃度。在特定的態樣中,作為高濃度,可列舉例如1 nM或更高的濃度、3 nM或更高的濃度、10 nM或更高的濃度、30 nM或更高的濃度、100 nM或更高的濃度、300 nM或更高的濃度、1μM或更高的濃度、3μM或更高的濃度、10μM或更高的濃度、30μM或更高的濃度、100μM或更高的濃度、300μM或更高的濃度、1 mM或更高的濃度、3 mM或更高的濃度、10 mM或更高的濃度、30 mM或更高的濃度、100 mM或更高的濃度、300 mM或更高的濃度、1M或更高的濃度。或者,亦可將各抗CTLA-4抗體顯示最大的結合活性之充分量作為此處的高濃度。在一態樣中,可將1μM、10μM、100μM、1 mM、或者各抗CTLA-4抗體顯示最大的結合活性之充分量選擇作為此處的高濃度。在特定的態樣中,作為低濃度,可列舉例如1 mM或更低的濃度、300μM或更低的濃度、100μM或更低的濃度、30μM或更低的濃度、10μM或更低的濃度、3μM或更低的濃度、1μM或更低的濃度、300 nM或更低的濃度、100 nM或更低的濃度、30 nM或更低的濃度、10 nM或更低的濃度、3 nM或更低的濃度、1 nM或更低的濃度、300 pM或更低的濃度、100 pM或更低的濃度、30 pM或更低的濃度、10 pM或更低的濃度、3 pM或更低的濃度、1 pM或更低的濃度等。或者,亦可將各抗CTLA-4抗體顯示最小的結合活性時的濃度作為此處的低濃度。亦可將實質的濃度為零(不存在含有腺苷的化合物)之情形選擇作為低濃度的一態樣。在一態樣中,可將1 mM、100μM、10μM、1μM、各抗CTLA-4抗體顯示最小的結合活性時的濃度、或者不存在腺苷化合物選擇作為此處的低濃度。在另一態樣中,作為高濃度與低濃度之比,可選擇例如3倍或以上、10倍或以上、30倍或以上、100倍或以上、300倍或以上、1×10
3倍或以上、3×10
3倍或以上、1×10
4倍或以上、3×10
4倍或以上、1×10
5倍或以上、3×10
5倍或以上、1×10
6倍或以上、3×10
6倍或以上、1×10
7倍或以上、3×10
7倍或以上、1×10
8倍或以上、3×10
8倍或以上、1×10
9倍或以上、3×10
9倍或以上、1×10
10倍或以上、3×10
10倍或以上、1×10
11倍或以上、3×10
11倍或以上、1×10
12倍或以上之值。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體即使對於含有腺苷的化合物亦具有結合活性。使用上述的方法,計算每單位抗體量之含有腺苷的化合物的結合量,可將其作為抗CTLA-4抗體對於含有腺苷的化合物之結合活性。如此進行之結合量的測定及計算的具體方法被記載於後述實施例。本發明的抗CTLA-4抗體的每單位抗體量之含有腺苷的化合物的結合量之值,例如可為0.0001以上、0.0002以上、0.0003以上、0.0004以上、0.0005以上、0.0006以上、0.0007以上、0.0008以上、0.0009以上、0.001以上、0.002以上、0.003以上、0.004以上、0.005以上、0.006以上、0.007以上、0.008以上、0.009以上、或0.01以上。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係與含有腺苷的化合物及CTLA-4一起形成三元複合體。在一態樣中,抗CTLA-4抗體係透過重鏈CDR1、CDR2、CDR3而與含有腺苷的化合物結合。在一態樣中,抗CTLA-4抗體具有對於含有腺苷的化合物之結合模體(binding motif)。對於含有腺苷的化合物之結合模體,例如能由存在於由Kabat編號所表示之33位、52位、52a位、53位、56位、58位、95位、96位、100a位、100b位、100c位的至少1個胺基酸所構成。在另外的態樣中,抗CTLA-4抗體例如透過選自由由Kabat編號所表示之33位、52位、52a位、53位、56位、58位、95位、96位、100a位、100b位、100c位所組成的群組之至少1個胺基酸而與含有腺苷的化合物結合。在特定的態樣中,抗CTLA-4抗體具有選自由由Kabat編號所表示之33位的Thr、52位的Ser、52a位的Ser、53位的Arg、56位的Tyr、58位的Tyr、95位的Tyr、96位的Gly、100a位的Met、100b位的Leu、100c位的Trp所組成的群組之至少1個胺基酸。對於抗CTLA-4抗體與含有腺苷的化合物結合所形成之複合體,可進一步結合CTLA-4。又,含有腺苷的化合物亦可存在於抗CTLA-4抗體與CTLA-4進行相互作用之界面並與其等兩者結合。抗CTLA-4抗體與含有腺苷的化合物及CTLA-4一起形成三元複合體一事,例如可藉由後述的結晶結構分析等手法而確認(參照實施例)。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係與選自由人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第3個胺基酸(Met)、第33個胺基酸(Glu)、第35個胺基酸(Arg)、第53個胺基酸(Thr)、第97個胺基酸(Glu)、第99個胺基酸(Met)、第100個胺基酸(Tyr)、第101個胺基酸(Pro)、第102個胺基酸(Pro)、第103個胺基酸(Pro)、第104個胺基酸(Tyr)、第105個胺基酸(Tyr)、及第106個胺基酸(Leu)所組成的群組之至少1個胺基酸結合。此等胺基酸能構成本發明的抗CTLA-4抗體的抗原決定位。在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係與人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第97個胺基酸(Glu)至第106個胺基酸(Leu)的區域結合。在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係與人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第99個胺基酸(Met)至第106個胺基酸(Leu)的區域結合。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體,關於對於CTLA-4的結合,係與ABAM004(VH、序列識別號:10;VL、序列識別號:11;HVR-H1、序列識別號:100;HVR-H2、序列識別號:101;HVR-H3、序列識別號:102;HVR-L1、序列識別號:113;HVR-L2、序列識別號:114;HVR-L3、序列識別號:115)競爭。在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體結合至與ABAM004相同的抗原決定位。抗CTLA-4抗體存在過量之情形,可使ABAM004對於CTLA-4的結合降低例如10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上。本說明書中提供例示的競爭分析。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體對於表現CTLA-4細胞顯示細胞毒性。在成為標的之細胞的表面表現CTLA-4,且在該處結合抗CTLA-4抗體之情形,能傷害該細胞。對於細胞的傷害,可為抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬活性(antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)等藉由與抗體結合之效應細胞所引起者,亦可為補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)等藉由與抗體結合之補體所引起者。或者,如免疫共軛物等般,可為藉由與抗體結合之細胞毒性劑(例如,放射性同位素及化學治療劑等)所引起者。此處的細胞毒性能包含誘導細胞死亡的作用、抑制細胞增殖的作用、造成細胞功能障礙的作用等。抗CTLA-4抗體存在充分的量之情形,例如可對10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上的表現CTLA-4細胞引起傷害。此種細胞毒性之測定,可與不存在抗體或者在陰性對照抗體的存在下之測定進行比較而進行。本說明書中提供例示的細胞毒性分析。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體顯示對於CTLA-4的中和活性。CTLA-4已知藉由與為其配體之CD80(B7-1)或者CD86(B7-2)進行相互作用而發揮功能。在特定的態樣中,抗CTLA-4抗體抑制CTLA-4與CD80(B7-1)或者CD86(B7-2)之相互作用。在抗CTLA-4抗體存在充分的量之情形,能將CTLA-4與CD80(B7-1)或者CD86(B7-2)之相互作用抑制例如10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上。此種抑制活性之測定,可與不存在抗體或者在陰性對照抗體的存在下之測定進行比較而進行。本說明書中提供測定中和活性的具體方法。
在另一態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係與源自多種動物種類之CTLA-4結合。作為例示的動物種類,可列舉哺乳動物、例如人類、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、豬、牛、山羊、馬、羊、駱駝、狗、貓等。在特定的態樣中,抗CTLA-4抗體係與源自人類及非人類(例如,猴、小鼠、大鼠等)之CTLA-4結合。人類CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:214,猴CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:247,小鼠CTLA-4的胺基酸序列表示為序列識別號:248。源自其他動物種類之CTLA-4的胺基酸序列,亦可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者所公知的方法而適當決定。
在特定的態樣中,作為本發明中之含有腺苷的化合物,可列舉例如,腺苷(ADO)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、單磷酸腺苷(AMP)、環狀單磷酸腺苷(cAMP)、去氧腺苷(dADO)、去氧三磷酸腺苷(dATP)、去氧二磷酸腺苷(dADP)、去氧單磷酸腺苷(dAMP)、γ硫代三磷酸腺苷(ATPγS)等。
在一態樣中,本發明提供包含以下序列的抗體:選自(a)包含序列識別號:223的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:224的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:225的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:223的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:224的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:225的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下序列的抗體:選自(a)包含序列識別號:226的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:227的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:228的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:226的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:227的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:228的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:223的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:224的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:225的胺基酸序列之HVR-H3選擇之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:226的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:227的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:228的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:223的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:224的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:225的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:226的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:227的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:228的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:101的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:101的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:113的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:114的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:113的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:114的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:101的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:113的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:114的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:101的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:113的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:114的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:104的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:104的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:116的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:116的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:104的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:116的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:104的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:116的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:105的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:106的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:105的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:106的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:105的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:106的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:105的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:106的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:108的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:108的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:121的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:123的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:153的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:121的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:123的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:153的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:108的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:121的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:123的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:153的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:108的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:121的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:123的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:153的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:110的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:110的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:110的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:110的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:122的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:128的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:112的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:111的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:152的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:129的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:109的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:109的胺基酸序列之HVR-H2;及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:選自(a)包含序列識別號:130的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列。在一態樣中,抗體包含(a)包含序列識別號:130的胺基酸序列之HVR-L1;(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中,本發明的抗體包含(a)為VH域且包含選自(i)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含序列識別號:109的胺基酸序列之HVR-H2、及(iii)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之至少1個、至少2個、或3個全部的VH HVR序列的VH域;及(b)為VL域且包含選自(i)包含序列識別號:130的胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之至少1個、至少2個、或3個全部的VL HVR序列的VL域。
在另一態樣中,本發明提供包含以下者的抗體:(a)包含序列識別號:107的胺基酸序列之HVR-H1;(b)包含序列識別號:109的胺基酸序列之HVR-H2;(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3;(d)包含序列識別號:130的胺基酸序列之HVR-L1;(e)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2;及(f)包含選自序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3。
在特定的態樣中,在以下的HVR位置處,上述的抗CTLA-4抗體的任意1個或多個胺基酸被取代:
-HVR-H1(序列識別號:223)中之:位置2
-HVR-H2(序列識別號:224)中之:位置4、5、7、13、及16
-HVR-H3(序列識別號:225)中之:位置3
-HVR-L1(序列識別號:226)中之:位置1、3、6、11、12、及14
-HVR-L2(序列識別號:227)中之:位置1、3、4、及7
-HVR-L3(序列識別號:228)中之:位置1、及10
在特定的態樣中,本說明書所提供之取代為保留性取代。在特定的態樣中,以下任1個或多個取代可以任意的組合進行:
-HVR-H1(序列識別號:100)中:H2A、R或K
-HVR-H2(序列識別號:101)中:S4T;R5Q;G7H;D13E或R;K16R
-HVR-H3(序列識別號:102)中:K3A
-HVR-L1(序列識別號:113)中:T1D、Q或E;T3P;D6G;N11T;Y12W;S14H
-HVR-L2(序列識別號:114)中:E1F或Y;S3I;K4S;S7E或K
-HVR-L3(序列識別號:115)中:S1Q;M10T
上述取代的所有可能組合,關於HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及HVR-L3,分別被包含在序列識別號:223、224、225、226、227、及228的共通序列中。
在上述的態樣之任意者中,抗CTLA-4抗體被人源化。在一態樣中,抗CTLA-4抗體包含上述的態樣的任意者中之HVR,且更包含人類接受者框架(例如,人類免疫球蛋白框架或人類共有框架)。在另一態樣中,抗CTLA-4抗體包含上述的態樣的任意者中之HVR,且更包含含有FR序列之VH或VL。在另外的態樣中,抗CTLA-4抗體包含以下的重鏈及/或輕鏈可變域FR序列:針對重鏈可變域,FR1包含序列識別號:229~232中任一胺基酸序列,FR2包含序列識別號:233的胺基酸序列,FR3包含序列識別號:234的胺基酸序列,FR4包含序列識別號:235的胺基酸序列。針對輕鏈可變域,FR1包含序列識別號:236~238中任一胺基酸序列,FR2包含序列識別號:240~241中任一胺基酸序列,FR3包含序列識別號:242~244中任一胺基酸序列,FR4包含序列識別號:245~246中任一胺基酸序列。
在另一態樣中,抗CTLA-4抗體包含相對於序列識別號:10的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在特定的態樣中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的一致性之VH序列,相對於參照序列,包含取代(例如,保留性取代)、插入、或缺失,但包含該序列的抗CTLA-4抗體保持與CTLA-4結合的能力。在特定的態樣中,總計1個至10個、11個、12個、13個、14個、或15個的胺基酸係在序列識別號:10中被取代、插入、及/或缺失。在特定的態樣中,取代、插入、或缺失發生在HVR的外側的區域(亦即,FR之中)。可選地,抗CTLA-4抗體包含序列識別號:10中之VH序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在某特定態樣中,VH包含選自(a)包含序列識別號:100的胺基酸序列之HVR-H1、(b)包含序列識別號:101的胺基酸序列之HVR-H2、及(c)包含序列識別號:102的胺基酸序列之HVR-H3之1個、2個、或3個HVR。轉譯後修飾包含由重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸的焦麩胺醯化所致之修飾為焦麩胺酸,但不受限於此。
在另一態樣中,提供抗CTLA-4抗體,其包含相對於序列識別號:11的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在特定的態樣中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的一致性之VL序列,相對於參照序列,包含取代(例如,保留性取代)、插入、或缺失,但包含該序列之抗CTLA-4抗體保持與CTLA-4結合的能力。在特定的態樣中,總計1個至10個、11個、12個、13個、14個、或15個的胺基酸係在序列識別號:11中被取代、插入、及/或缺失。在特定的態樣中,取代、插入、或缺失發生在HVR的外側的區域(亦即,FR之中)。可選地,抗CTLA-4抗體包含序列識別號:11中之VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在某特定態樣中,VL包含選自(a)包含序列識別號:113的胺基酸序列之HVR-L1、(b)包含序列識別號:114的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:115的胺基酸序列之HVR-L3之1個、2個、或3個HVR。轉譯後修飾包含由重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸的焦麩胺醯化所致之修飾為焦麩胺酸,但不受限於此。
在另一態樣中,提供抗CTLA-4抗體,其包含相對於序列識別號:149的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在特定的態樣中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的一致性之VL序列,相對於參照序列,包含取代(例如,保留性取代)、插入、或缺失,但包含該序列之抗CTLA-4抗體保持與CTLA-4結合的能力。在特定的態樣中,總計1個至10個、11個、12個、13個、14個、或15個胺基酸係在序列識別號:149中被取代、插入、及/或缺失。在特定的態樣中,取代、插入、或缺失發生在HVR的外側的區域(亦即,FR之中)。可選地,抗CTLA-4抗體包含序列識別號:149中之VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在某特定態樣中,VL包含選自(a)包含序列識別號:130的胺基酸序列之HVR-L1、(b)包含序列識別號:117的胺基酸序列之HVR-L2、及(c)包含序列識別號:133的胺基酸序列之HVR-L3之1個、2個、或3個HVR。轉譯後修飾包含由重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸的焦麩胺醯化所致之修飾為焦麩胺酸,但不受限於此。
在另一態樣中,提供抗CTLA-4抗體,其包含上述的態樣的任意者中之VH、及上述的態樣的任意者中之VL。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:10及序列識別號:11中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:98及序列識別號:99中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:83及序列識別號:97中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:86及序列識別號:134中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:136及序列識別號:95中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:140及序列識別號:146中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:141及序列識別號:146中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:140及序列識別號:147中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:141及序列識別號:147中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:136及序列識別號:149中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在另外的態樣中,提供異質的抗CTLA-4抗體,其包含至少2個不同的可變區,所述可變區係選自包含上述的VH及VL序列的可變區。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:140及序列識別號:146中的VH及VL序列、以及序列識別號:141及序列識別號:146中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。在一態樣中,抗體分別包含序列識別號:140及序列識別號:147中的VH及VL序列、以及序列識別號:141及序列識別號:147中的VH及VL序列,包含該序列的轉譯後修飾者亦被包含在內。轉譯後修飾包含由重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸的焦麩胺醯化所致之修飾為焦麩胺酸,但不受限於此。
本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的重鏈或輕鏈N端的胺基酸為麩醯胺酸之情形,該胺基酸可被取代成麩胺酸。本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的重鏈或輕鏈N端的胺基酸為麩胺酸之情形,該胺基酸可被取代成麩醯胺酸。
在另外的態樣中,本發明提供抗體,其結合至與本說明書所提供之抗CTLA-4抗體相同的抗原決定位。例如,在特定的態樣中,提供抗體,其結合至與表4、表9、表14、及表19所記載之抗體相同的抗原決定位。在特定的態樣中,提供抗體,其結合至CTLA-4的片段中的抗原決定位,所述CTLA-4的片段中的抗原決定位包含選自由序列識別號:28的第3個胺基酸(Met)、第33個胺基酸(Glu)、第35個胺基酸(Arg)、第53個胺基酸(Thr)、第97個胺基酸(Glu)、第99個胺基酸(Met)、第100個胺基酸(Tyr)、第101個胺基酸(Pro)、第102個胺基酸(Pro)、第103個胺基酸(Pro)、第104個胺基酸(Tyr)、第105個胺基酸(Tyr)、及第106個胺基酸(Leu)所組成的群組之至少1個胺基酸。在特定的態樣中,提供抗體,其結合至CTLA-4的片段中的抗原決定位,所述CTLA-4的片段中的抗原決定位係由序列識別號:28的第97個胺基酸(Glu)至第106個胺基酸(Leu)所構成。在特定的態樣中,提供抗體,其結合至CTLA-4的片段中的抗原決定位,所述CTLA-4的片段中的抗原決定位係由序列識別號:28的第99個胺基酸(Met)至第106個胺基酸(Leu)所構成。
本發明的在另外的態樣中,由上述的態樣的任意者所致之抗CTLA-4抗體係包含嵌合、人源化、或人類抗體之單株抗體。在一態樣中,抗CTLA-4抗體例如係Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體、或F(ab')
2片段等的抗體片段。在另一態樣中,抗體例如係完全IgG1抗體、完全IgG4抗體、本說明書所定義之其他抗體種類或同型等的全長抗體。
在另外的態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體包含Fc區域。在另外的態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體包含恆定區。恆定區可為重鏈恆定區(包含Fc區域)、輕鏈恆定區、或者此兩者。在一些態樣中,Fc區域為天然型序列的Fc區域。作為源自天然型抗體之例示的重鏈恆定區,可列舉例如人類IgG1(序列識別號:249)、人類IgG2(序列識別號:250)、人類IgG3(序列識別號:251)、人類IgG4(序列識別號:252)等的重鏈恆定區。又,作為其他例示的重鏈恆定區,可列舉序列識別號:82、序列識別號:158等的重鏈恆定區。作為源自天然型抗體之例示的輕鏈恆定區,可列舉例如人類κ鏈(序列識別號:33、序列識別號:63、序列識別號:159)、人類λ鏈(序列識別號:53、序列識別號:87)等的輕鏈恆定區。
在另一態樣中,Fc區域係在天然型序列的Fc區域中加上胺基酸改變所製作之突變Fc區域。在特定的態樣中,相較於天然型序列的Fc區域,突變Fc區域對於選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa所組成的群組之至少1個Fcγ受體的結合活性增強。在另外的態樣中,相較於天然型序列的Fc區域,突變Fc區域對於FcγRIIa及FcγRIIIa之結合活性增強。作為包含此種突變Fc區域之重鏈恆定區的例子,可列舉例如表26~表30所記載之重鏈恆定區、序列識別號:31、32、41~46、65、66、81、207、239、253~271、276、277、278所記載之重鏈恆定區等。
天然型序列的Fc區域通常被由二條相同的多肽鏈所形成的同型二聚體所構成。在特定的態樣中,突變Fc區域亦可為由相同序列的多肽鏈所構成之同型二聚體,亦可為由序列互異的多肽鏈所構成之異型二聚體。同樣地,包含Fc區域之重鏈恆定區亦可為由相同序列的多肽鏈所構成之同型二聚體,亦可為由序列互異的多肽鏈所構成之異型二聚體。作為異質的重鏈恆定區的例子,可列舉例如包含序列識別號:31的多肽鏈及序列識別號:32的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:43的多肽鏈及序列識別號:44的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:45的多肽鏈及序列識別號:46的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:254的多肽鏈及序列識別號:256的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:257的多肽鏈及序列識別號:258的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:259的多肽鏈及序列識別號:260的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:261的多肽鏈及序列識別號:263的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:262的多肽鏈及序列識別號:264的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:265的多肽鏈及序列識別號:267的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:266的多肽鏈及序列識別號:268的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:269的多肽鏈及序列識別號:270的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:271的多肽鏈及序列識別號:81的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:65的多肽鏈及序列識別號:66的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:239的多肽鏈及序列識別號:207的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:259的多肽鏈及序列識別號:276的多肽鏈之重鏈恆定區,包含序列識別號:65的多肽鏈及序列識別號:278的多肽鏈之重鏈恆定區等。
在另外的態樣中,由上述的態樣的任意者所致之抗CTLA-4抗體可為單獨或組合,且可併入以下項目1~7所記載之任意的特徵。
1.抗體的結合活性
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體的結合活性(binding activity)為≦10μM、≦1μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM、或≦0.001 nM(例如,10
-8M以下、例如10
-8M~10
-13M、例如10
-9M~10
-13M)的解離常數(KD)。
在一態樣中,抗體的結合活性係藉由放射性標記抗原結合測定法(radiolabeled antigen binding assay,RIA)而測定。在一態樣中,RIA係使用目標抗體的Fab版本及其抗原而實施。例如,Fab對於抗原的溶液中結合親和性係在非標記抗原的漸增量系列的存在下藉由最小濃度的(
125I)標記抗原而使Fab平衡化,接著藉由已披覆(coating)抗Fab抗體的盤捕捉已結合的抗原,藉此進行測定(例如,參照Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881(1999))。為了構築測定條件,將MICROTITER(註冊商標)多孔盤(Thermo Scientific)利用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中5μg/ml的捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)披覆一晚,之後在室溫(約23℃)以2~5小時、PBS中2%(w/v)牛血清白蛋白進行阻斷。在非吸附盤(Nunc #269620)中,將100 pM或26 pM的[
125I]-抗原(例如,如與Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)中之抗VEGF抗體、Fab-12的評價相同般)與目標Fab的階段稀釋物進行混合。接著,將目標Fab培養一晩,但此培養為了確實達到平衡,能持續更長時間(例如,約65小時)。之後,為了在室溫的培養(例如,1小時),將混合物移至捕捉盤。接著,去除溶液,將盤以在PBS中0.1%的聚山梨醇酯20(TWEEN-20(註冊商標))清洗8次。將盤乾燥後,添加150μl/孔的閃爍體(scintillant)(MICROSCINT-20(商標)、Packard),在TOPCOUNT(商標)加馬計數器(Packard)中將盤計數10分鐘。選擇造成最大結合的20%以下之各Fab的濃度用於使用在競爭結合分析中。
在一態樣中,抗體的結合活性能使用配體捕捉法,其將表面電漿共振分析法作為測定原理,例如BIACORE(註冊商標)T200或BIACORE(註冊商標)4000(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)。設備操作中能使用BIACORE(註冊商標)Control Software。在一態樣中,遵循供應商的指示使用胺偶合套組(GE Healthcare, Uppsala, Sweden),在已披覆羧甲基糊精的感測晶片(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上將配體捕捉用分子、例如抗標籤抗體、抗IgG抗體、蛋白質A等固相化。配體捕捉分子係使用適當的pH的10 mM醋酸鈉溶液進行稀釋,並以適當的流速及注入時間進行注入。結合活性測定係使用含有0.05%聚山梨醇酯20(其他名稱為Tween(註冊商標)-20)的緩衝液作為測定用緩衝液,流速為10-30μL/分鐘,測定溫度較佳為在25℃或37℃進行測定。使配體捕捉用分子將抗體作為配體進行捕捉而實施測定之情形,注入抗體使其捕捉目標量後,注入使用測定用緩衝液所製備之抗原或Fc受體的階段稀釋物(分析物)。使配體捕捉用分子將抗原或Fc受體作為配體進行捕捉而實施測定之情形,注入抗原或Fc受體使其捕捉目標量後,注入使用測定用緩衝液所製備之抗體的階段稀釋物(分析物)。
在一態樣中,測定結果係使用BIACORE(註冊商標)Evaluation Software進行解析。動力學參數(kinetics parameter)的計算係使用1:1 Binding的模式,藉由將結合及解離的傳感圖同時進行擬合(fitting)而實施,能計算結合速度(kon或者ka)、解離速度(koff或者kd)、平衡解離常數(KD)。結合活性弱、尤其是解離快難以計算動力學參數之情形,可使用穩定狀態模式計算平衡解離常數(KD)。作為結合活性的其他參數,亦可將特定濃度的分析物的結合量(RU)除以配體的捕捉量(RU),「每單位配體量的分析物結合量」。
2.抗體片段
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體為抗體片段。抗體片段不受限於此等,但包含Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2、Fv、及 scFv片段、以及後述之其他片段。作為針對特定的抗體片段的概要內容,係參照Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134(2003)。作為scFv片段的概要內容,例如參照Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315(1994);以及WO93/16185;以及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。作為針對包含補救(salvage)受體結合抗原決定位殘基且活體內(in vivo)之半衰期變長的Fab及F(ab')
2片段之論述,係參照美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體可為二價或雙重特異性之伴隨2個抗原結合部位的抗體片段。例如參照EP404,097號; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134(2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)。三功能抗體(triabody)及四功能抗體(tetrabody)亦被記載於Hudson et al., Nat.Med. 9: 129-134(2003)。
單域抗體係包含抗體的重鏈可變域的全部或者一部分、或輕鏈可變域的全部或者一部分之抗體片段。在特定的態樣中,單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA;例如參照美國專利第6,248,516號B1)。
抗體片段不受限於此等,但可藉由各種手法製作,包含本說明書所記載之完整抗體的蛋白質分解的消化、由重組宿主細胞(例如,大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)產生。
3.嵌合及人源化抗體
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體為嵌合抗體。特定的嵌合抗體,例如被記載於美國專利第4,816,567號;及Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855(1984)。在一例中,嵌合抗體包含非人類可變區(例如,源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或猴等非人類靈長類之可變區)及人類恆定區。在另一例中,嵌合抗體為從親代抗體者變更種類或次種類(subclass)而成之「種類轉換(class switch)」抗體。嵌合抗體亦包含其抗原結合片段。
在特定的態樣中,嵌合抗體為人源化抗體。典型而言,非人類抗體為了維持著親代非人類抗體的特異性及親和性且減少對於人類的免疫原性,而被人源化。通常,人源化抗體包含1個或多個可變域,該可變域中,HVR(例如CDR(或其部分))源自非人類抗體,FR(或其部分)源自人類抗體序列。人源化抗體可選地包含人類恆定區的至少一部分。在一些態樣中,人源化抗體中的幾個FR殘基,例如為了恢復或改善抗體的特異性或親和性,而被來自非人類抗體(例如,成為HVR殘基的來源之抗體)之對應的殘基所取代。
人源化抗體及其製作方法係在Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633(2008)中被概述,又,例如,在Riechmann et al., Nature 332: 323-329(1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033(1989);美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號、及第7,087,409號;Kashmiri et al., Methods 36: 25-34(2005)(記載特異性決定區域(specificity determining region,SDR)接枝);Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498(1991)(記載重塑(resurfacing)); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60(2005)(記載FR shuffling);以及Osbourn et al., Methods 36: 61-68(2005)及Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260(2000)(記載用於FR shuffling的「選擇指南」方法)中被進一步記載。
能使用於人源化之人類框架區並不受限於此等,但包含:使用「最佳擬合(best-fit)」法(參照Sims et al. J. Immunol. 151: 2296(1993))所選擇之框架區;源自輕鏈或重鏈可變區的特定亞群的人類抗體的共通序列之框架區(參照Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285(1992)及 Presta et al. J. Immunol., 151: 2623(1993));人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖細胞系框架區(例如參照Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633(2008));及源自FR庫的篩選之框架區(參照Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684(1997)及 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體為人類抗體。人類抗體能藉由在該技術領域中已知的各種手法而製造。人類抗體係被描述於van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374(2001)及 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459(2008)。
人類抗體可藉由將免疫原投予至已經修飾以回應於抗原攻擊(負荷)而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的基因轉殖動物而製備。此種動物,典型而言包含人類免疫球蛋白基因座的全部或者一部分,人類免疫球蛋白基因座的全部或者一部分係以取代內因性的免疫球蛋白基因座、或隨機併入染色體外或者該動物的染色體內的狀態存在。在此種基因轉殖小鼠中,內因性的免疫球蛋白基因座通常被惰性化。作為從基因轉殖動物獲得人類抗體的方法的概要內容,係參照Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125(2005)。又,例如合併參考記載XENOMOUSE(商標)技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號;記載HUMAB(註冊商標)技術之美國專利第5,770,429號;記載K-M MOUSE(註冊商標)技術之美國專利第7,041,870號;以及、記載VELOCIMOUSE(註冊商標)技術之美國專利申請公開第2007/0061900號。來自藉由此種動物所生成的完整抗體之人類可變區,例如,亦可與不同的人類恆定區組合等,進一步修飾。
利用根據融合瘤的方法亦可製作人類抗體。用於製造人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠‐人類異質骨髓瘤細胞株已有被記載(例如參照Kozbor J. Immunol., 133: 3001(1984);Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及Boerner et al., J. Immunol., 147: 86(1991))。透過人類B細胞融合瘤技術所生成之人類抗體亦被敘述於Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562(2006)。作為追加的方法,例如包含美國專利第7,189,826號(記載來自融合瘤細胞株之單株人類IgM抗體的製造)、及Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268(2006)(記載人類-人類融合瘤)所記載者。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦被記載於Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937(2005)及Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-191(2005)。
將由人類來源噬菌體顯示庫所選擇之Fv殖株可變域序列進行分離,亦可生成人類抗體。其次、此種可變域序列可與所期望的人類恆定區組合。以下敘述從抗體庫選擇人類抗體的手法。
5.庫來源抗體
本發明的抗體可藉由針對伴隨所期望的1個或多個活性的抗體篩選組合庫而進行分離。例如,用於針對噬菌體顯示庫的生成、具備所期望的結合特性的抗體篩選此種庫之各種方法,在該技術領域中為已知。此種方法係在Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)中被概要內容,再者,例如被記載於McCafferty et al., Nature 348: 552-554;Clackson et al., Nature 352: 624-628(1991);Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992);Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175(Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003);Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004);Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004);及Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。
在特定的噬菌體顯示法中,VH及VL基因的庫(repertoire)係藉由聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)而被各別選殖,隨機地在噬菌體庫中再結合,該噬菌體庫係如Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)所述般進行,能針對抗原結合噬菌體進行篩選。噬菌體典型而言係作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段之任一者提示抗體片段。來自經免疫化的供給源之庫,不需構築融合瘤便可提供對於免疫源具高親和性之抗體。或者,如Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734(1993)所記載,選殖初始庫(repertoire)(例如,從人類),不進行免疫化,亦可提供對於廣範圍的非自體及自體抗原之抗體的單一供給源。最後,如Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)所記載般,選殖從幹細胞進行再編成前的V-基因區段,使用包含用於將超可變CDR3區域進行編碼且在活體外(in vitro)達成再構成之隨機序列的PCR引子,藉此亦可合成製作初始庫。記載人類抗體噬菌體庫之專利文獻,例如包含:美國專利第5,750,373號、以及美國專利申請公開第2005/0079574號、2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。
從人類抗體庫所分離之抗體或抗體片段,在本說明書中視為人類抗體或人類抗體片段。
6.多重特異性抗體
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體為多重特異性抗體(例如,雙重特異性抗體)。多重特異性抗體係與至少2個不同部位具有結合特異性之單株抗體。在特定的態樣中,結合特異性之一為對於CTLA-4,另一結合特異性為對於其他任意的抗原。在特定的態樣中,雙重特異性抗體可與CTLA-4的2個不同的抗原決定位結合。雙重特異性抗體可被使用在用於將細胞毒性劑侷限在表現CTLA-4之細胞。雙重特異性抗體能被製備作為全長抗體或抗體片段。
用於製作多重特異性抗體的手法並不受限於此等,但包含具有不同特異性之2個免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對的重組共表現(參照Milstein and Cuello, Nature 305: 537(1983)、WO93/08829、及Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655(1991))、及knob-in-hole技術(例如參照美國專利第5,731,168號)。多重特異性抗體可藉由以下方式製作:為了製作Fc異型二聚體分子而操作靜電操縱效應(electrostatic steering effects)(WO2009/089004A1);將2個以上的抗體或片段進行交聯(參照美國專利第4,676,980號及Brennan et al., Science, 229: 81(1985));使用白胺酸拉鍊製作具有2個特異性之抗體(參照Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553(1992));使用「雙功能抗體」技術製作雙重特異性抗體片段(參照Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993));及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參照Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368(1994));及如例如Tutt et al. J. Immunol. 147: 60(1991)所記載般製備三重特異性抗體。
包含「章魚抗體(octopus antibody)」之伴隨3個以上的功能性抗原結合部位之改變抗體亦被包含在本說明書中(例如參照美國專利申請公開第2006/0025576號A1)。
本說明書中,抗體或片段包含結合至與CTLA-4不同的抗原之1個抗原結合部位,亦包含「雙動Fab(dual-acting Fab)」或「DAF」(例如參照美國專利申請公開第2008/0069820號)。
7.抗體變異體
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體的胺基酸序列變異體亦在考慮內。例如,亦期望改善抗體的結合親和性及/或其他生物學特性。抗體的胺基酸序列變異體可藉由在編碼抗體的核苷酸序列中導入適當修飾或肽合成而製備。此種修飾例如包含來自抗體的胺基酸序列之缺失、及/或抗體的在胺基酸序列中之插入、及/或抗體的在胺基酸序列中的殘基之取代。以最終構築物具備所期望的特徵(例如,抗原結合性)為前提,能進行缺失、插入、及取代之任意組合以完成最終構築物。
a)取代、插入、及缺失變異體
在特定的態樣中,提供具有1個或多個胺基酸取代之抗體變異體。取代的變異導入之目標部位包含HVR及FR。將保留性取代揭示於表1的「較佳的取代」的標題下方。將更實質的變更提供於表1的「例示的取代」的標題下方,且提及胺基酸側鏈的種類並在以下進行詳述。胺基酸取代可被導入目標抗體,產物可例如針對經保持/改善的抗原結合性、已減少的免疫原性、或已改善的ADCC或CDC等之所期望活性而被篩選。
胺基酸可根據共同的側鏈特性分組:
(1)疏水性:正白胺酸、甲硫胺酸(Met)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile);
(2)中性的親水性:半胱胺酸(Cys)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、天冬醯胺酸(Asn)、麩醯胺酸(Gln);
(3)酸性:天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu);
(4)鹼性:組胺酸(His)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg);
(5)影響鏈配向的殘基:甘胺酸(Gly)、脯胺酸(Pro);
(6)芳香族性:色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)。
非保留性取代係指將此等種類之1個成員交換成其他種類。
取代變異體的1個類型,包含親代抗體(例如,人源化或人類抗體)的1個或多個超可變區殘基的取代。通常,其結果所產生且為了進一步研究而被選擇之變異體,相較於親代抗體,具有特定的生物學特性中之修飾(例如,改善)(例如,已增加之親和性、已減少之免疫原性),及/或能實質地保持親代抗體的特定生物學特性。例示的取代變異體為親和性成熟抗體,此例如能使用基於噬菌體顯示的親和性成熟技術(例如本說明書所記載者)而適當製作。若簡潔地說明,使1個或多個HVR殘基突變,然後使突變抗體提示於噬菌體上,針對特定的生物學活性(例如,結合親和性)進行篩選。
改變(例如,取代)例如為了改善抗體的親和性而能在HVR中進行。此種改變能在HVR的「熱點」中,亦即在藉由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變之密碼子所編碼之殘基(例如參照Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196(2008))及/或與抗原接觸之殘基中進行,所得之突變VH或VL能針對結合親和性進行試驗。由來自二次庫之構築及再選擇所致之親和性成熟例如被記載於Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ,(2001))。親和性成熟在一些態樣中,多樣性係藉由任意的各種的方法(例如,易錯PCR(error-prone PCR)、鏈替換(chain shuffling)或寡核苷酸定向突變導入)而導入為了成熟所選擇之可變基因。接著,製作二次庫。接著,為了辨識具有所期望的親和性之任意的抗體變異體,而篩選此庫。導入多樣性之別的方法,包含使幾個HVR殘基(例如,一次4~6殘基)隨機化之HVR定向方法。參與抗原結合之HVR殘基,例如能使用丙胺酸掃描突變導入或建立模型,而被具體特定。尤其,CDR-H3及CDR-L3常常被標的化。
在特定的態樣中,取代、插入、或缺失只要此種改變不使與抗原結合之抗體的能力實質地減少,則能在1個或多個HVR內進行。例如,不使結合親和性實質地減少之保存性改變(例如,如本說明書所提供般的保留性取代)能在HVR中進行。此種改變,例如,能為HVR的抗原接觸殘基的外側。上述的變異VH及VL序列在特定的態樣中,各HVR未被改變,或僅包含1個、2個、或者3個胺基酸取代。
對於辨識為了突變導入而能被標的化之抗體的殘基或區域而言,有用的方法係被記載於Cunningham and Wells(1989)Science, 244: 1081-1085之被稱為「丙胺酸掃描突變導入」者。在此方法中,辨識一殘基或一群之標的殘基(例如,帶電殘基、例如精胺酸、天冬胺酸、組胺酸、離胺酸、及麩胺酸),且被中性或帶負電之胺基酸(例如,丙胺酸或者聚丙胺酸)取代,而決定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。對於此初期取代,能在顯示功能性感受性之胺基酸位置進一步導入取代。又或者,為了辨識抗體與抗原之間的接觸點,可解析抗原抗體複合體的結晶結構。可將此種接觸殘基及附近的殘基作為取代候補而進行標的化,或可從取代候補排除。變異體能為了決定此等是否包含所期望的特性而進行篩選。
胺基酸序列的插入,與對於序列內部之單一或多個胺基酸殘基的插入同樣地,亦包含在包含胺基末端及/或羧基末端中之1殘基至100殘基以上之多肽的長度範圍中的融合。末端的插入的例子,包含在N端伴隨甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其他插入變異體,包含在抗體的N-或C-端融合酵素(例如,用於ADEPT)或使抗體的血漿半衰期增加之多肽者。
b)醣基化變異體
在特定的態樣中,以增加或減少將抗體醣基化之程度的方式改變本說明書所提供之抗體。對於抗體之醣基化部位的追加或刪除,係以製作或去除1個或多個醣基化部位之方式改變胺基酸序列,藉此能簡便地達成。
抗體包含Fc區域之情形,可改變加成於該處的碳水化合物。藉由哺乳動物細胞所產生之天然型抗體,典型而言,包含已被分支的二支鏈的寡醣,該寡醣通常係藉由N端連結(N-linkage)而加成於Fc區域的CH2區的Asn297。例如,參照Wright et al. TIBTECH 15: 26-32(1997)。寡醣例如包含甘露糖、N‐乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖、及唾液酸等各種碳水化合物,又,包含加成於二支鏈的寡醣結構的「主幹」中的GlcNAc之岩藻醣。在一些態樣中,本發明的抗體中的寡醣的修飾,可為了製作伴隨已進行特定改善的特性之抗體變異體而進行。
在一態樣中,提供抗體變異體,其具有欠缺(直接或間接地)加成於Fc區域之岩藻醣的碳水化合物結構物。例如,此種抗體中之岩藻醣的量,可為1%~80%、1%~65%、5%~65%或20%~40%。岩藻醣的量,例如如WO2008/077546所記載般藉由MALDI-TOF質量分析所測定,計算相對於加成於Asn297之全部的醣結構物(例如,複合、雜交、及高甘露糖結構物)的和,Asn297中之醣鏈內的岩藻醣的平均量,藉此而定。Asn297表示位於Fc區域的297位附近之天冬醯胺酸殘基(Fc區域殘基的EU編號)。但是,由於多個抗體間的些許序列多樣性,Asn297亦能位於297位的±3胺基酸上游或下游,亦即位於294位~300位之間。此種岩藻醣基化變異體能具有經改善的ADCC功能。例如,參照美國專利申請公開第2003/0157108號(Presta, L.);第2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。關於「去岩藻醣基化」或「岩藻醣欠缺」抗體變異體之刊物的例子,包含US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki et al. J.Mol. Biol. 336: 1239-1249(2004)、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)。可產生去岩藻醣基化抗體之細胞株的例子,包含欠缺蛋白質的岩藻醣基化之Lec13 CHO細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545(1986);美國專利申請公開第US2003/0157108號A1、Presta, L;及WO2004/056312A1、Adams et al.,尤其實施例11)及剔除細胞株,例如alpha-1,6-岩藻醣基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(例如參照Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614(2004);Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688(2006);及WO2003/085107)。
例如,再提供抗體變異體,其加成於抗體的Fc區域之二支鏈型寡醣係藉由GlcNAc而被二分,而具有經二分的寡醣。此種抗體變異體能具有經減少的岩藻醣基化及/或經改善的ADCC功能。此種抗體變異體的例子,例如被記載於WO2003/011878(Jean-Mairet et al.);美國專利第6,602,684號(Umana et al.);及US2005/0123546(Umana et al.)。亦提供在加成於Fc區域之寡醣中具有至少1個半乳糖殘基之抗體變異體。此種抗體變異體能具有經改善的CDC功能。此種抗體變異體,例如被記載於WO1997/30087(Patel et al.);WO1998/58964(Raju, S.);及WO1999/22764(Raju, S.)。
c)Fc區域變異體
在特定的態樣中,可在本說明書所提供之抗體的Fc區域導入1個或多個胺基酸修飾,藉此生成Fc區域變異體。Fc區域變異體可包含在1個或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如,取代)之人類Fc區域序列(例如,人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc區域)。
在特定的態樣中,雖非全部但具備幾個效應功能之抗體變異體亦在本發明的考慮內,該效應功能係將抗體作為應用於下述情形之較佳候補:在所述活體內的半衰期雖重要,但不需要特定的效應功能(補體及ADCC等)或所述特定的效應功能為有害之情形。為了確認CDC及/或ADCC活性的減少/缺乏,可進行活體外及/或活體內的細胞毒性測定。例如,Fc受體(FcR)結合測定能為了確認抗體缺乏FcγR結合性(因此欠缺ADCC活性的可能性高)且維持FcRn結合能而進行。為媒介ADCC的初級細胞之NK細胞雖僅表現FcγRIII,但另一方面,單核球表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII。造血細胞上的FcR的表現係被統整在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492(1991)的第464頁的Table 3。用於評價目標分子之ADCC活性的活體外測定法(分析)之非限定的例子,被記載於美國專利第5,500,362號(例如參照Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063(1986))及Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502(1985);美國專利第5,821,337號(參照Bruggemann, M. et al., J. Exp.Med. 166: 1351-1361(1987))。或者,亦可使用非放射性的測定法(例如參照ACT1(商標)non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);及CytoTox 96(註冊商標)non-radioactive cytotoxicity assays 法(Promega, Madison, WI))。在此種測定法中為有用的效應細胞包含周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及自然殺手(natural killer,NK)細胞。或者,再加上,目標分子之ADCC活性例如可在如Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656(1998)所記載般的動物模式中,在活體內進行評價。又,為了確認因抗體無法與C1q結合而欠缺CDC活性,可進行C1q結合測定。例如參照WO2006/029879 及 WO2005/100402之C1q及C3c結合ELISA。又,為了評價補體活性化,可進行CDC測定(例如參照Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163(1996);Cragg, M. S. et al., Blood 101: 1045-1052(2003);及Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103: 2738-2743(2004))。再者,FcRn結合性及在活體內的清除/半衰期的測定,亦能使用在該技術領域中已知的方法而進行(例如參照Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769(2006))。
伴隨已減少的效應功能之抗體,包含伴隨Fc區域殘基238、265、269、270、297、327、及329的1個或多個取代者(美國專利第6,737,056號)。此種Fc變異體包含伴隨胺基酸位置265、269、270、297、及327的2個以上的取代之Fc變異體,其包含伴隨對於殘基265及297的取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc變異體(美國專利第7,332,581號)。
伴隨已增加或減少對於FcRs的結合性之特定的抗體變異體已被記載(參照美國專利第6,737,056號;WO2004/056312、及Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001))。
在特定的態樣中,抗體變異體包含伴隨改善ADCC之1個或多個胺基酸取代(例如,在Fc區域的位置298、333、及/或334(EU編號的殘基)處的取代)的Fc區域。
在一些態樣中,例如,如美國專利第6,194,551號、WO99/51642、及Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)所記載般,在Fc區域中進行造成經改變的(亦即,已增加或已減少之任一者)C1q結合性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之改變。
伴隨已增加的半衰期、及相對於新生兒型Fc受體(FcRn:負責使母體的IgG類移動至胎兒(Guyer et al., J. Immunol. 117: 587(1976);Kim et al., J. Immunol. 24: 249(1994)))之已增加的結合性之抗體被記載於美國專利申請公開第2005/0014934號A1(Hinton et al.)。此等抗體包含Fc區域,所述Fc區域之中,伴隨增加Fc區域對於FcRn的結合性之1個或多個取代。此種Fc變異體包含伴隨在Fc區域殘基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、或434之1個或多個處的取代(例如,Fc區域殘基434的取代(美國專利第7,371,826號))者。
針對Fc區域變異體的其他例子,亦參照Duncan & Winter, Nature 322: 738-740(1988);美國專利第5,648,260號;美國專利第5,624,821號;及WO94/29351。
d)半胱胺酸改變抗體變異體
在特定的態樣中,期望製作抗體的1個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代之半胱胺酸改變抗體(例如,「thioMAbs」)。在特定的態樣中,接受取代的殘基係在抗體的可達位點部位發生。藉由以半胱胺酸取代其等殘基,反應性的硫醇基被配置在抗體的可達位點部位,該反應性的硫醇基係將該抗體與其他部分(藥劑部分或連接子‐藥劑部分等)進行共軛,如本說明書中進一步詳述般,可使用於製作免疫共軛物。在特定的態樣中,以下的殘基的任意1個或多個可被取代成半胱胺酸:輕鏈的V205(Kabat編號);重鏈的A118(EU編號);及重鏈Fc區域的S400(EU編號)。半胱胺酸改變抗體例如可如美國專利第7,521,541號所記載般生成。
e)抗體衍生物
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗體,可以包含在該技術領域中為已知,且亦容易取得的追加的非蛋白質部分之方式被進一步修飾。抗體的適合衍生物化的部分,不受限於此但包含水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限定的例子,不受限於此等,但包含聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖(dextran)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚1, 3二噁烷(poly 1,3-dioxolane)、聚1,3,6三噁烷(poly 1,3,6-trioxane)、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物的任一者)、及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷(propylene oxide) /環氧乙烷(ethylene oxide)共聚物、聚氧乙烯化多元醇類(例如甘油)、聚乙烯醇、及此等的混合物。聚乙二醇丙醛因其對於水的穩定性,故在製造中為有利。聚合物可為任何分子量,且可分支亦可不分支。加成於抗體之聚合物的數目的範圍可大,若加成1個以上的聚合物則其等可為相同分子,亦可為不同分子。一般而言,使用於衍生物化之聚合物的數目及/或類型,不受限於此等,但可基於以下考慮而確定:應改善之抗體的特定特性或功能、抗體衍生物是否使用於規定條件下的療法等。
在另一態樣中,提供抗體與能藉由曝露放射線而被選擇性加熱的非蛋白質部分之共軛物。在一態樣中,非蛋白質部分為奈米碳管(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605(2005))。放射線可為任何波長,且不受限於此等,但包含如將非蛋白質部分進行加熱至雖不對一般細胞有害但使靠近抗體‐非蛋白質部分的細胞死亡的溫度為止的波長。
B.重組的方法及構成
例如,如同美國專利第4,816,567號所記載,抗體可使用重組的方法及構成而製造。在一態樣中,提供編碼本說明書所記載之抗CTLA-4抗體之經分離的核酸。此種核酸可編碼抗體之包含VL的胺基酸序列及/或包含VH的胺基酸序列(例如,抗體的輕鏈及/或重鏈)。在另外的態樣中,提供包含此種核酸之1個或多個載體(例如,表現載體)。在另外的態樣中,提供包含此種核酸之宿主細胞。在此種態樣之一中,宿主細胞包含(1)包含載體,所述載體包含編碼抗體之包含VL的胺基酸序列及抗體之包含VH的胺基酸序列之核酸;或(2)包含第一載體與第二載體,所述第一載體包含編碼抗體之包含VL的胺基酸序列之核酸,所述第二載體包含編碼抗體之包含VH的胺基酸序列之核酸(例如,被轉形)。在一態樣中,宿主細胞為真核性(例如,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)或淋巴系的細胞(例如,Y0、NS0、Sp2/0細胞))。在一態樣中,提供製作抗CTLA-4抗體的方法,其在適合抗CTLA-4抗體的表現的條件下,包含:如上述般培養包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞;及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養培養基)回收該抗體。
為了抗CTLA-4抗體的重組製造,分離編碼(例如,上述等)抗體之核酸,為了進一步的選殖及/或在宿主細胞中的表現,插入於1個或多個載體。此種核酸係使用以往流程而被輕易地分離及序列決定(例如,藉由使用寡核苷酸探針,其可特異性結合至編碼抗體的重鏈及輕鏈之基因)。
適合選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞,包含本說明書所記載之原核細胞或真核細胞。例如,尤其在不需要醣基化及Fc效應功能之情形,抗體可利用細菌進行製造。關於在細菌中的抗體片段及多肽的表現,例如參照美國專利第5,648,237號、第5,789,199號、及第5,840,523號(再者,亦參照已記載大腸桿菌中之抗體片段的表現之Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254)。表現後,抗體可從細菌細胞糊被分離至可溶性溶離份中,又可進一步進行精製。
除了原核生物之外,包含造成伴隨部分或完全的人類的醣基化模式之抗體的產生且醣基化路徑被「人源化」的菌類及酵母的株之絲狀菌或酵母等真核微生物,為抗體編碼載體的適合的選殖或表現宿主。參照Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414(2004)及 Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215(2006)。
源自多細胞生物(無脊椎生物及脊椎生物)者,亦為適合經醣基化的抗體的表現之宿主細胞。無脊椎生物細胞的例子,包含植物及昆蟲細胞。與昆蟲細胞的接合,已有許多桿狀病毒株被辨識,所述桿狀病毒株尤其被用於Spodoptera frugiperda細胞的轉形。
植物細胞培養物亦可被利用作為宿主。例如參照美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號、及第6,417,429號(記載用於利用基因轉殖植物產生抗體之PLANTIBODIES(商標)技術)。
脊椎動物細胞亦可被使用作為宿主。例如,在浮遊狀態下進行增殖之經適應的哺乳動物細胞株為有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株的其他例子為由SV40所轉形之猴腎CV1株(COS-7);人類胎兒性腎株(Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59(1977)等所記載之293或293細胞);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞特利氏細胞(Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)等所記載之TM4細胞);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);狗腎細胞(MDCK);Buffalo系大鼠肝細胞(BRL 3A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳癌(MMT 060562);TRI細胞(例如,Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982)所記載);MRC5細胞;及FS4細胞等。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包含:包含DHFR-CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980))之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞;及Y0、NS0、及Sp2/0等骨髓瘤細胞株。作為適合抗體產生之特定的哺乳動物宿主細胞株的概要內容,例如參照Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)。
多株抗體,較佳為藉由將相關抗原及佐劑(adjuvant)多次皮下(sc)或腹腔內(ip)注射而在動物中產生。例如使用匙孔螺血氰蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑、雙官能性物質或衍生物化劑例如順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺酸琥珀亞胺基酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl
2、或R
1N=C=NR(於此R及R
1為不同的烷基),能有用地將相關抗原與在被免疫化的種中為免疫原性之蛋白質進行共軛。
動物(通常為非人類哺乳動物),例如(針對兔或小鼠分別)將100μg或5μg的蛋白質或共軛物與3倍容量的傅氏完全佐劑進行組合,將其溶液皮內注射至多個部位,藉此對於抗原、免疫原性共軛物、或衍生物進行免疫化。1個月後,在多個部位進行皮下注射,藉此利用最初量的1/5~1/10之傅氏完全佐劑中的肽或共軛物,將該動物進行追加免疫。7~14日後,從該動物進行採血,將血清進行抗體效價的分析。將動物進行追加免疫直到效價到達平線區(plateau)為止。較佳為,使用雖為同一抗原但與別的蛋白質共軛及/或透過別的交聯試劑共軛之共軛物,將該動物進行追加免疫。亦能在重組細胞培養物中,以蛋白質融合體的形態製備共軛物。又,為了增強免疫反應,亦適合使用明礬等凝聚劑。
單株抗體係由實質上均一的抗體群集而得,亦即,構成該群集的各個抗體,除了些許存在之自然產生的潛在突然突變及/或轉譯後修飾(例如,異構化、醯胺化)以外均相同。因此,修飾語「單株」表示不為離散抗體之混合物的抗體特徵。
例如,單株抗體可使用Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497(1975)中最初記載之融合瘤法而製作。在融合瘤法中,將小鼠或其他適當的宿主動物,例如倉鼠,如本說明書中上述般進行免疫化,而誘導淋巴球,所述淋巴球會製造或具有能力製造與使用於免疫化之蛋白質特異性結合的抗體。或者,亦可在活體外將淋巴球進行免疫化。
免疫化劑,典型而言,包含抗原蛋白質或其融合變異體。一般而言,在期望人類來源的細胞之情形中,使用周邊血液淋巴球(PBL),在期望非人類哺乳動物源之情形中,使用脾臟細胞或淋巴結細胞。之後,淋巴球係使用聚乙二醇等適當的融合劑而與不死化細胞株進行融合,形成融合瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press(1986), pp. 59-103)。
不死化細胞株通常為經轉形的哺乳動物細胞,尤其為囓齒類、牛及人類來源的骨髓瘤細胞。通常利用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞株。將如此製作之融合瘤細胞播種在較佳含有抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的增殖或生存之1種以上的物質之適當培養培養基中,使其增殖。例如,親代骨髓瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核醣基轉移酶(HGPRT或HPRT)之情形,融合瘤用的培養培養基,典型而言,包含為妨礙HGPRT缺損細胞的增殖的物質之次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)。
所謂較佳的不死化骨髓瘤細胞係指以下細胞:有效率地進行融合,輔助利用經選擇的抗體產生細胞穩定地高程度地製造抗體,且對於如HAT培養基般的培養基具感受性。此等之中,較佳為小鼠骨髓瘤株,例如,可取自美國加利福尼亞州聖地亞哥的Salk Institute Cell Distribution Center之源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤者,以及可取自美國維吉尼亞州馬納薩斯的American Type Culture Collection之SP-2細胞(及其衍生物,例如X63-Ag8-653)。關於人類單株抗體的製造以及人類骨髓瘤細胞株及小鼠-人類異質骨髓瘤細胞株亦已被記載(Kozbor et al., J Immunol. 133(6): 3001-3005(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63(1987))。
將融合瘤細胞增殖的培養培養基,針對對於抗原之單株抗體的製造進行分析。較佳為,藉由融合瘤細胞所製造之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沉澱或活體外結合測定法,例如放射免疫測定法(RIA)或者酵素結合免疫吸附測定法(ELISA)而決定。此種技術及測定法在該技術領域中為公知。例如,結合親和性可藉由Munson, Anal Biochem. 107(1): 220-239(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)而求取。
在特定製造所期望的特異性、親和性、及/或活性的抗體之融合瘤細胞後,可將該殖株藉由限制稀釋法(limiting dilution method)進行次選殖,並藉由標準方法(Goding,前述)使其增殖。作為此目的用的適當培養培養基,可列舉例如,D-MEM或RPMI-1640培養基。又,融合瘤細胞可作為哺乳動物內的腫瘤而使其在活體內增殖。
藉由亞株(subclone)所分泌之單株抗體,可從培養培養基、腹水、或血清,藉由例如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和力層析法等以往的免疫球蛋白精製法而被適當分離。
抗體可藉由將適當宿主動物對於抗原進行免疫化而產生。在一態樣中,抗原為包含全長CTLA-4的多肽。在一態樣中,抗原為包含可溶型CTLA-4的多肽。在一態樣中,抗原為包含對應於人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第97個胺基酸(Glu)至第106個胺基酸(Leu)之區域的多肽。在一態樣中,抗原為包含對應於人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第99個胺基酸(Met)至第106個胺基酸(Leu)之區域的多肽。本發明中,亦包含藉由對於抗原將動物進行免疫化而產生的抗體。抗體可將上述例示的抗CTLA-4抗體所記載之任意的特徵單獨或組合後併入。
C.測定法(分析)
本說明書所提供之抗CTLA-4抗體可藉由在該技術領域中已知的各種測定法而被辨識、被篩選、或使物理性/化學性特性及/或生物學活性明確。
1.結合測定法及其他測定法
在一態樣中,本發明的抗體例如藉由ELISA、西方墨點法、表面電漿共振分析等公知方法而針對其抗原結合活性進行試驗。
在另一態樣中,關於對CTLA-4的結合,為了辨識與本說明書所記載之抗CTLA-4抗體(例如,表4、表9、表14、及表19所記載之抗CTLA-4抗體)進行競爭之抗體,能使用競爭分析。在特定的態樣中,此種競爭抗體過量存在之情形,會阻止(例如,降低)至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或以上之參照抗體對CTLA-4的結合。在幾個例子中,結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或以上。在特定的態樣中,此種競爭抗體與本說明書所記載之抗CTLA-4抗體(例如,表4、表9、表14、及表19所記載之抗CTLA-4抗體)結合至相同抗原決定位(例如,線狀或立體結構抗原決定位)。Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)中提供將抗體所結合之抗原決定位進行製圖之詳細例示方法。
在例示的競爭分析中,經固定化的CTLA-4係在包含第一經標記抗體及第二未標記抗體的溶液中進行培養,所述第一經標記抗體係與CTLA-4結合,關於所述第二未標記抗體對於CTLA-4的結合,係針對與第一抗體進行競爭的能力進行試驗。第二抗體能存在於融合瘤上清液中。作為對照,經固定化的CTLA-4係在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中進行培養。在容許對CTLA-4結合的條件下培養第一抗體後,去除多餘的未結合的抗體,測定與經固定化的CTLA-4結合之標記的量。在試驗樣本中,相較於對照樣本,與經固定化的CTLA-4結合之標記的量實質上減少之情形,表示關於對CTLA-4的結合,第二抗體與第一抗體進行競爭。參照Harlow and Lane(1988)Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
2.活性測定法
在一態樣中,提供用於辨識具有生物學活性之抗CTLA-4抗體的測定法。生物學活性例如可包含細胞增殖抑制活性、細胞毒性(例如,ADCC/CDC活性、ADCP活性)、免疫賦活化活性、CTLA-4抑制活性。又,提供在活體內及/或活體外具有此種生物學活性之抗體。
在特定的態樣中,本發明的抗體係針對此種生物學活性進行試驗。
在特定的態樣中,本發明的抗體係針對在活體外抑制細胞成長或增殖之能力進行試驗。抑制細胞成長或增殖之測定法,在該技術領域中為周知。藉由本說明書所記載之「細胞殺傷」測定法所例示之特定細胞增殖測定法係測定細胞生存度。此種測定法之一係由Promega(Madison, WI)所市售之CellTiter-Glo(商標)Luminescent Cell Viability Assay。此測定法係基於為代謝性活性的細胞的指標之ATP的存在量而決定培養物中的活細胞數。參照Crouch et al(1993)J. Immunol. Meth. 160: 81-88、美國專利第6,602,677號。能夠以能對應於自動高通量篩選(high-throughput screening,HTS)之96或384孔形式進行測定法。參照Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6: 398-404。分析流程包含在培養細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo(註冊商標)試劑)。藉此使細胞溶解,並藉由螢光素酶反應而產生發光訊號。發光訊號係與ATP的存在量呈比例,ATP的存在量係與存在於培養物中之活細胞數呈正比例。數據能藉由光度計或CCD攝影攝像裝置進行記錄。發光值係藉由相對發光量(relative light unit,RLU)表示。
別的細胞增殖測定法係「MTT」分析,其係利用線粒體還原酶測定從溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓鹽成為甲臢(formazan)的氧化之比色測定法。與Cell Titer-Glo(商標)分析同樣地,此測定法揭示存在於細胞培養物中之代謝性活性的細胞的數量。例如參照Mosmann(1983)J. Immunol. Meth. 65: 55-63及Zhang et al.(2005)Cancer Res. 65: 3877-3882。
在上述的活體外測定法的任意者中使用的細胞,包含天然表現CTLA-4或經過操作而使表現CTLA-4之細胞或細胞株。此種細胞亦包含表現CTLA-4的細胞株及通常雖不表現CTLA-4但被編碼CTLA-4的核酸轉染的細胞株。
在一態樣中,抗CTLA-4抗體係針對在活體內抑制細胞成長或增殖之能力進行試驗。在特定的態樣中,抗CTLA-4抗體係針對在活體內抑制腫瘤成長之能力進行試驗。異種移植模式等活體內模式系統能被使用於此種試驗。在例示的異種移植系統中,將人類腫瘤細胞導入經適當免疫不全化之非人類動物,例如無胸腺「裸」小鼠。將本發明的抗體投予至此動物。測定抑制或減少腫瘤成長之抗體能力。上述異種移植系統在特定的態樣中,人類腫瘤細胞為源自人類患者的腫瘤細胞。此種異種移植模式係由Oncotest GmbH(Frieberg, Germany)所市售。在特定的態樣中,人類腫瘤細胞係藉由皮下注射或對乳房脂肪墊等適當部位的移植,而被導入經適當免疫不全化的非人類動物。
上述測定法之任一者皆可被理解為能使用本發明的免疫共軛物以取代抗CTLA-4抗體或再加上抗CTLA-4抗體而實施。
用於測定治療用抗體的ADCC活性之代表性分析,係基於
51Cr釋放分析者,包含以下步驟:將標的細胞以[
51Cr]Na
2CrO
4進行標記之步驟;將在細胞表面上表現抗原之標的細胞藉由抗體而調理素化(opsonization)之步驟;在受驗抗體的存在下或不存在下,在微滴定盤中,以適當比例組合經調理素化之放射性標記標的細胞與效應細胞之步驟;將細胞的混合物較佳為在37℃下培養較佳為16~18小時之步驟;回收上清液之步驟;及分析上清液樣本中的放射活性之步驟。之後,將受驗抗體的細胞毒性例如藉由下式而決定:比細胞毒性率(%)=(存在抗體時的放射活性-不存在抗體時的放射活性)/(最大放射活性-不存在抗體時的放射活性)×100。能夠藉由標的細胞:效應細胞比或改變抗體濃度而製作圖表。
為了評價補體的活性化,例如可如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163(1996)所記載般實施補體依賴性細胞毒性(CDC)分析。簡而言之,利用緩衝液,將多肽變異體與人類補體稀釋成各種濃度。將表現多肽變異體所結合的抗原之細胞稀釋至~1×10
6細胞/ml的密度。將多肽變異體、稀釋人類補體及抗原表現細胞的混合物添加至平底組織培養96孔盤,以37℃與5%的CO
2培養2小時,促進補體媒介細胞溶解。接著,將50μl的Alamar Blue(Accumed International)添加至各孔,在37℃培養一晩。使用伴隨在530nm的激發與在590nm的發光之96孔的螢光計測定吸光度。結果,以相對螢光單位(RFU)表現。試料濃度可由標準曲線計算,針對對於相較於非變異體多肽之活性百分比感興趣的多肽變異體進行報告。
ADCP活性的例示的分析法可包含以下:以受驗抗體披覆大腸桿菌-標記FITC(Molecular Probes)或金黃色葡萄球菌-FITC等標的活體粒子;形成已調理素化的粒子;以1:1、10:1、30:1、60:1、75:1、或100:1的比例將上述調理素化粒子添加至THP-1效應細胞(單核球細胞系,能由ATCC取得),使FcγR媒介吞噬作用發生;較佳為將該細胞與大腸桿菌-FITC/抗體在37℃培養1.5小時;培養後,在細胞中添加台盼藍(較佳為室溫且2~3分鐘),使未併入內部且附著於細胞表面的外側之細菌的螢光消失;將細胞移至FACS緩衝液(例如,PBS中的0.1% BSA、0.1%疊氮化鈉)中,使用FACS(例如,BD FACS Calibur)分析THP-1細胞的螢光。為了分析ADCP的程度,較佳為將閘(gate)設定在THP-1細胞上,測定螢光強度的中央值。在最佳的實施形態中,使用培養基中的大腸桿菌-FITC(對照)、大腸桿菌-FITC及THP-1細胞(使用作為FcγR非依賴性ADCP活性)、大腸桿菌-FITC、THP-1細胞及受驗抗體(使用作為FcγR依賴性ADCP活性)而實施ADCP分析。
在由抗體所致之細胞毒性中,通常伴隨抗體對細胞表面的結合。抗原是否在成為標的之細胞的表面表現,可藉由FACS等本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的手法進行適當確認。
免疫的活性化可將細胞性免疫反應或者體液性免疫反應作為指標而進行檢測。具體而言,包含細胞激素(例如,IL-6、G-CSF、IL-12、TNFα及IFNγ等)或者其等受體的表現量的增大、免疫細胞(例如,B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核球等)的增殖促進、活性化狀態的亢進、功能亢進、或細胞毒性的增強等。尤其,T細胞的活性化能藉由測定CD25、CD69及ICOS等活性化標記的表現亢進而檢測。例如,已投予抗CTLA-4抗體之ipilimumab的患者,已知在投予後周邊血液中的ICOS
+CD4
+T細胞會增加,此被認為係由抗CTLA-4抗體投予所致之全身的免疫狀態的活性化的影響(Cancer Immunol. Res.(2013)1(4): 229-234)。
在T細胞的活性化中,不僅透過抗原受體(TCR)的刺激,透過CD28的補助刺激亦為必要。T細胞表面的CD28若與存在於抗原呈現細胞的表面之B7-1(CD80)或者B7-2(CD86)結合,則補助訊號被傳至T細胞內,T細胞被活性化。另一方面,在已活性化的T細胞的表面會表現CTLA-4。CTLA-4具有比CD28更強的親和性而與CD80、CD86結合,因此比CD28更優先與CD80、CD86進行相互作用,結果抑制T細胞的活性化。
由此種作用機制,對於CTLA-4的抑制活性可作為抑制CTLA-4與CD80或者CD86之結合的活性而測定。在一態樣中,用於測定對於CTLA-4的抑制活性之分析包含以下步驟:使精製CTLA-4蛋白質與微滴定盤、磁性珠粒等支持體結合之步驟;添加受驗抗體及已標記的可溶性CD80或CD86之步驟;洗去未結合成分之步驟;及將已結合的標記CD80或CD86進行定量之步驟。受驗抗體是否與CD28進行交叉反應,可實施與將CTLA-4取代成CD28之同樣的分析而確認。又,在另一態樣中,使用如前述般之檢測T細胞的活性化之功能分析,亦可測定對於CTLA-4的抑制活性。例如,在利用表現CD80或CD86的細胞刺激T細胞群集而測定T細胞的活性化之系統中,在其中已添加具有CTLA-4抑制活性的受驗抗體之情形,會造成T細胞的活性化的再增強。
D.免疫共軛物
本發明又提供免疫共軛物,其包含已與1個或多個細胞毒性劑(例如化學治療劑或化學療法藥、增殖抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或者動物來源的蛋白質毒素、酵素性活性的毒素、或者其等的片段)或放射性同位素)共軛之本說明書的抗CTLA-4抗體。
在一態樣中,免疫共軛物係抗體與不受限於此等但包含以下之1個或多個藥劑進行共軛的抗體-藥劑共軛物(antibody-drug conjugate,ADC):美登醇(maytansinoid)(參照美國專利第5,208,020號、第5,416,064號、及歐洲專利第0,425,235號B1);例如單甲基奧瑞他汀(Mono Methyl auristatin)藥劑部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參照美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)等有絲分裂抑制劑(auristatin);尾海兔素(dolastatin);卡奇黴素或其衍生物(參照美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、及第5,877,296號;Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342(1993);以及Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928(1998));道諾黴素(daunomycin)或阿黴素等蒽環類藥物(anthracycline)(參照Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523(2006);Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362(2006);Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721(2005);Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834(2000);Dubowchik et al., Bioorg. &Med. Chem. Letters 12: 1529-1532(2002);King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343(2002);及美國專利第6,630,579號);胺甲喋呤;長春地辛;多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替西他賽(tesetaxel)、及沃塔紫杉醇(ortataxel)等紫杉烷(taxane);新月毒素;以及CC1065。
在另一態樣中,免疫共軛物包含已與不受限於此等但包含以下之酵素性活性的毒素或其片段進行共軛的本說明書所記載之抗體:白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(源自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、離胺酸A鏈、雞母珠毒素A鏈(Abrin A chain)、蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、核醣毒素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、痲瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、衣諾黴素(enomycin)、以及新月毒素。
在另一態樣中,免疫共軛物為了形成放射性共軛物而包含已與放射性原子進行共軛的本說明書所記載之抗體。各種的放射性同位素能利用於製造放射性共軛物。包含例如
211At、
131I、
125I、
90Y、
186Re、
188Re、
153Sm、
212Bi、
32P、
212Pb及Lu的放射性同位素。將放射性共軛物使用於檢測之情形,放射性共軛物能包含閃爍圖術(scintigraphy)檢查用的放射性原子(例如Tc-99m或者
123I)、或核磁共振(NMR)顯影(磁共振顯影,亦稱為MRI)用的自旋標記(例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳、或鐵)。
抗體及細胞毒性劑的共軛物能使用各種雙官能性蛋白質連結劑進行製作。例如,N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane- 1-carboxylate,SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(iminothiolane,IT)、亞胺基酯(imidoester)的雙官能性衍生物(例如,二亞胺代己二酸二甲酯HCl(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(例如,二琥珀醯亞胺辛二酸酯(Disuccinimidyl Suberate))、醛(例如,戊二醛)、二疊氮化合物(例如,雙(p-疊氮苯甲醯基)己烷二胺)、雙重氮(bisdiazonium)衍生物(例如,雙-(p-重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(例如,甲苯2,6-二異氰酸酯)、及二活性氟化合物(例如,1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,離胺酸免疫毒素能如Vitetta et al., Science 238: 1098(1987)所記載般進行製備。已被碳-14標記之1-異氰酸基苯基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於對抗體進行放射性核種的共軛連接之例示的螯合劑。參照WO94/11026。連接子(linker)能為促進細胞內的細胞毒性藥的釋放之「能剪切的連接子」。例如,能使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子、或含有二硫化物的連接子(Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131(1992);美國專利第5,208,020號)。
本說明書的免疫共軛物或ADC明示考慮使用以下交聯試劑所製備之共軛物,但不受限於此等,所述交聯試劑包含(例如,由Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)所市售之BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸-EMCS、磺酸-GMBS、磺酸-KMUS、磺酸-MBS、磺酸-SIAB、磺酸-SMCC、及磺酸-SMPB、以及SVSB(琥珀醯亞胺-(4-乙烯碸)苯甲酸酯,Succinimidyl-(4-vinylsulfonyl) benzoate),但不受限於此等。
E.用於診斷及檢測的方法及組合物
在特定的態樣中,本說明書所提供之抗CTLA-4抗體之任一者皆能有用於檢測生物學的樣本中之CTLA-4的存在。本說明書所使用之用語「檢測」包含定量或定性地檢測。在特定的態樣中,生物學的樣本包含細胞或組織,例如,血清、全血、血漿、生檢樣本、組織樣本、細胞懸浮液、唾液、痰、口腔液、腦脊椎液、羊水、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、淋巴液、尿、汗、淚液、胃液、關節液、腹水、眼液、或黏液。
在一態樣中,提供用於在診斷方法或檢測方法中使用的抗CTLA-4抗體。在另外的態樣中,提供檢測生物學的樣本中的CTLA-4的存在之方法。在特定的態樣中,此方法包含:在容許抗CTLA-4抗體對CTLA-4結合的條件下,使本說明書所記載之抗CTLA-4抗體與生物學樣本進行接觸;及檢測在抗CTLA-4抗體與CTLA-4之間是否形成複合體。此種方法可為活體外的方法或活體內的方法。在一態樣中,例如在CTLA-4為用於選擇患者的生物標記之情形,抗CTLA-4抗體被用於選擇對象,所述對象適於使用抗CTLA-4抗體的治療。
能將本發明的抗體使用於例如免疫反應的狀態的檢核或免疫系統的功能不全的診斷等。
在特定的態樣中,提供已被標記的抗CTLA-4抗體。標記包含被直接地檢測之標記或部分(例如,螢光標記、呈色標記、高電子密度標記、化學發光標記、及放射性標記),以及例如通過酵素反應或分子間相互作用而被間接地檢測之部分(例如酵素或配體),但不受限於此等。例示的標記不受限於此等,但包含以下:放射性同位素
32P、
14C、
125I、
3H及
131I、稀土類螯合等發螢光團或螢光素(fluorescein)及其衍生物、羅丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯氯(dansyl)、繖形酮(umbelliferone)、螢火蟲螢光素酶(luciferase)及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)等螢光素酶、螢光素(luciferin)、2,3-二氫酞肼二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase;HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、溶菌酶(lysozyme)、單醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、尿酸酶(uricase)、及黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)等雜環氧化酶、連結於使用過氧化氫使色素前驅物氧化的酵素(例如HRP、乳過氧化酶(lactoperoxidase)、或微過氧化酶(microperoxidase))者、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定的自由基類、及類似此等者。
F.藥學性製劑
本說明書所記載之抗CTLA-4抗體的藥學性製劑係藉由將具有所期望的純度之抗體與1個或多個任意的藥學上所容許之載體(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980))進行混合,以冷凍乾燥製劑或水溶液的形態進行製備。藥學上所容許之載體,一般而言在使用時的用量及濃度下對於接受者而言為非毒性,不受限於此等,但包含以下:磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸等的緩衝液;包含抗壞血酸及甲硫胺酸之抗氧化劑;防腐劑(十八烷基二甲基苄基氯化銨;氯化六氫季銨(hexamethonium chloride);氯化芐二甲烴銨(benzalkonium chloride);氯化苯索寧(benzethonium chloride);酚基、丁基、或苯甲醇;羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯等對羥苯甲酸烷基酯(paraben);鄰苯二酚(catechol);間苯二酚(resorcinol);環己醇;3-戊醇;及m-甲酚等);小分子(少於約10個殘基)多胜肽;血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等的蛋白質;聚乙烯吡咯啶酮等的親水性聚合物;甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸等的胺基酸;包含葡萄糖、甘露糖、或糊精之單糖、雙糖、及其他碳水化合物;EDTA等的螯合劑;蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇等砂糖類;鈉等形成鹽類的對離子類;金屬錯合物(例如,Zn-蛋白質錯合物);及/或聚乙二醇(PEG)等非離子系表面活性劑。本說明書的例示的藥學上所容許之載體,更包含可溶性中性活性型透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)(例如,rHuPH20(HYLENEX(註冊商標)、Baxter International, Inc.)等人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白)等間質性藥劑分散劑。特定的例示的sHASEGP及其之用途方法(包含rHuPH20)被記載於美國專利申請公開第2005/0260186號及第2006/0104968號。在一態樣中,sHASEGP係與軟骨素分解酵素(chondroitinase)等1個或多個追加的糖胺聚多糖(glycosaminoglycan)組合。
例示的冷凍乾燥抗體製劑被記載於美國專利第6,267,958號。水溶液抗體製劑包含美國專利第6,171,586號及WO2006/044908所記載者,後者的製劑包含組胺酸-乙酸酯緩衝液。
只要對於所治療之特定適應症而言是必要的,則本說明書的製劑可包含超過1個的有效成分。較佳為伴隨不會互相造成不良影響之互補的活性。此種有效成分係以對於所意圖之目的而言為有效的量被適當組合。
有效成分,例如可被裝入藉由液滴形成(凝聚作用(coacervation))手法或界面聚合所製備之微膠囊(分別例如,羥甲基纖維素或明膠微膠囊、及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊),亦可被裝入膠體狀藥劑送達系統(例如,微脂體、白蛋白小球體、微米乳液、奈米粒子、及奈米膠囊),亦可被裝入微乳液(microemulsion)。此種手法被公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。
可製備緩釋性製劑。緩釋性製劑的較佳例包含含抗體的固體疏水性聚合物之半透性基質,該基質例如為薄膜或微膠囊等造型物的形態。
用於使用於活體內(in vivo)投予之製劑通常為無菌。無菌狀態例如係藉由通過滅菌過濾膜進行過濾等而輕易地達成。
G.治療的方法及治療用組合物
本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的任一者皆可使用在治療的方法中。
在一態樣中,提供用於作為醫藥品的用途之抗CTLA-4抗體。在另外的態樣中,提供用於腫瘤的治療中之用途之抗CTLA-4抗體。在特定的態樣中,提供用於治療方法中之用途之抗CTLA-4抗體。在特定的態樣中,本發明為治療具有腫瘤的個體之方法,其提供用於包含對該個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟的方法中之用途之抗CTLA-4抗體。在此種態樣之一中,方法進一步包含對該個體投予至少1個(例如如後述般的)追加治療劑的有效量之步驟。在另外的態樣中,本發明提供用於細胞的傷害中之用途之抗CTLA-4抗體。在特定的態樣中,本發明為在個體中傷害細胞的方法,其提供用於在為了傷害細胞而包含對該個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟的方法中之用途之抗CTLA-4抗體。在另外的態樣中,本發明提供用於免疫的活性化中之用途之抗CTLA-4抗體。在特定的態樣中,本發明為在個體中將免疫進行活性化之方法,其提供用於在為了將免疫進行活性化而包含對該個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟的方法中之用途之抗CTLA-4抗體。利用上述態樣的任意者之「個體」,較佳為人類。
在一些態樣中,腫瘤為固形腫瘤。在固形腫瘤中,通常,腫瘤細胞會增殖而成為群集,其等會成為主體而形成腫瘤組織。又,在活體內的腫瘤組織中,多數情形,淋巴球等免疫細胞會浸潤,其等亦會構成腫瘤組織的一部分。在一些態樣中,在腫瘤組織內,免疫細胞尤其調節性T(Treg)細胞會浸潤。在一態樣中,對於細胞的傷害係由ADCC活性、CDC活性、或ADCP活性而引起。在一態樣中,傷害在細胞表面表現CTLA-4之細胞。在另外的態樣中,受傷害的細胞為Treg細胞。在特定的態樣中,傷害在腫瘤組織內浸潤的Treg細胞。在一態樣中,藉由傷害Treg細胞而將免疫進行活性化(解除由Treg細胞所致之免疫抑制)。在另外的態樣中,將腫瘤組織中之免疫(尤其抗腫瘤免疫)進行活性化。在一些態樣中,免疫的活性化為T細胞的活性化。
在另外的態樣中,藉由本發明的抗CTLA-4抗體所造成之作為醫藥品的效果的程度係依個體內的組織而異。在特定的態樣中,其程度係因應組織內的含有腺苷的化合物的濃度而變化。在另外的態樣中,相較於含有腺苷的化合物的濃度低的組織,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,其效果增大。作為含有腺苷的化合物的濃度高的組織,可列舉例如腫瘤組織。作為含有腺苷的化合物的濃度低的組織,可列舉例如正常組織等非腫瘤組織。在一些態樣中,相較於非腫瘤組織,在腫瘤組織中活性化更強的免疫。此種反應的差異,不需要觀察抗CTLA-4抗體的全部用量,只要觀察某特定範圍的用量即可。在另一態樣中,相較於非腫瘤組織,在腫瘤組織中以更低的用量將免疫進行活性化。又,在另一態樣中,以低於觀察到副作用的用量觀察到治療效果。在特定的態樣中,所謂治療效果,係指抗腫瘤效果(例如,腫瘤的衰退、對於腫瘤細胞之細胞死亡的誘導或者增殖抑制等)的表現,所謂副作用,係指自體免疫疾病(包含由過度的免疫反應所導致之對於正常組織的傷害)的發作。
在另外的態樣中,藉由本發明的抗CTLA-4抗體所造成之作為醫藥品的效果的程度,係依據是否具有含有腺苷的化合物依賴性地(亦即,因應含有腺苷的化合物的濃度而變化)對於CTLA-4的結合活性而異。在一些態樣中,本發明的抗CTLA-4抗體係隨著含有腺苷的化合物的濃度升高而對於CTLA-4之結合活性增大的抗體。在一些態樣中,成為對照的抗CTLA-4抗體係不具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性的抗體。在特定的態樣中,所謂不具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性的抗體,意指該化合物的存在下與不存在下之CTLA-4結合活性的差為例如小於2倍、小於1.8倍、小於1.5倍、小於1.3倍、小於1.2倍、或小於1.1倍的抗體。在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,期望在充分量的含有腺苷的化合物的存在下之CTLA-4結合活性為互相實質上相等。
在特定的態樣中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,藉由各抗體所造成之作為醫藥品的效果不同。在特定的態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度低的組織中,作為醫藥品的效果不同。作為含有腺苷的化合物的濃度低的組織,可列舉例如正常組織等非腫瘤組織。抗CTLA-4抗體亦能作為包含其之藥學性製劑而被提供。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度低的組織中,相較於成為對照之抗CTLA-4抗體,在本發明的抗CTLA-4抗體中,免疫的活性化的程度低。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度低的組織中,相較於成為對照之抗CTLA-4抗體,在本發明的抗CTLA-4抗體中,用於將免疫進行活性化的必要用量高。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度低的組織中,相較於成為對照之抗CTLA-4抗體,在本發明的抗CTLA-4抗體中,副作用的程度低。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度低的組織中,相較於成為對照之抗CTLA-4抗體,在本發明的抗CTLA-4抗體中,觀察副作用時的用量高。此種反應的差異,不需要觀察全部組織(例如,含有腺苷的化合物的濃度低的全部組織),只要觀察幾個組織即可。在特定的態樣中,副作用為自體免疫疾病(包含由過度的免疫反應所致之對於正常組織的傷害)。
在特定的態樣中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,藉由各抗體所造成之作為醫藥品的效果實質上相等。在特定的態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,作為醫藥品的效果實質上相等。作為含有腺苷的化合物的濃度高的組織,可列舉例如腫瘤組織。抗CTLA-4抗體能作為包含其之藥學性製劑而被提供。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,免疫的活性化的程度實質上相等。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,為了將免疫進行活性化所必要的用量實質上相等。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,治療效果的程度實質上相等。在一些態樣中,在含有腺苷的化合物的濃度高的組織中,在本發明的抗CTLA-4抗體與成為對照之抗CTLA-4抗體中,觀察到治療效果時的用量實質上相等。在特定的態樣中,所謂治療效果,係指抗腫瘤效果(例如,腫瘤的衰退、對於腫瘤細胞之細胞死亡的誘導或者增殖抑制等)的表現。
在特定的態樣中,腫瘤選自由乳癌及肝癌所組成的群組。
在另外的態樣中,本發明提供醫藥品的製造或製備中之抗CTLA-4抗體的用途。在一態樣中,醫藥品是用於腫瘤的治療。在另外的態樣中,醫藥品為治療腫瘤的方法,且為用於包含在對具有腫瘤的個體投予醫藥品的有效量之步驟的方法中之用途者。在此種態樣之一中,方法進一步包含對該個體投予至少1個(例如如後述般)之追加治療劑的有效量之步驟。在另外的態樣中,醫藥品為用於細胞的傷害者。在另外的態樣中,醫藥品為在個體中傷害細胞的方法,係用於在為了傷害細胞而包含對該個體投予醫藥品的有效量之步驟的方法中之用途者。在另外的態樣中,醫藥品是用於免疫的活性化。在另外的態樣中,醫藥品為在個體中將免疫進行活性化的方法,係用於在為了將免疫進行活性化而包含對該個體投予醫藥品的有效量之步驟的方法中之用途者。利用上述態樣的任意者之「個體」,可為人類。
在另外的態樣中,本發明提供治療腫瘤的方法。在一態樣中,方法包含對具有此種腫瘤的個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟。在此種態樣之一中,方法更包含對該個體投予至少1個(如後述般)之追加治療劑的有效量之步驟。利用上述態樣的任意者之「個體」,可為人類。
在另外的態樣中,本發明提供用於在個體中傷害細胞的方法。在一態樣中,方法包含為了傷害細胞而對個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟。在另外的態樣中,本發明提供用於在個體中將免疫進行活性化的方法。在一態樣中,方法包含為了將免疫進行活性化而對個體投予抗CTLA-4抗體的有效量之步驟。在一態樣中,「個體」為人類。
在另外的態樣中,本發明提供包含本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的任意者之藥學性製劑(例如,用於上述治療的方法的任意者中之用途)。在一態樣中,藥學性製劑包含本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的任意者、與藥學上所容許之載體。在一態樣中,本發明提供用於在腫瘤的治療中之用途之藥學性製劑。在一態樣中,本發明提供用於在細胞的傷害中之用途之藥學性製劑。在一態樣中,本發明提供用於免疫的活性化中之用途之藥學性製劑。在另一態樣中,藥學性製劑包含本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的任意者、與至少1個(例如如後述般)之追加治療劑。
在另外的態樣中,本發明提供用於製備醫藥品或藥學性製劑的方法(例如用於上述治療的方法的任意者中之用途),其包含將本說明書所提供之抗CTLA-4抗體的任意者與藥學上所容許之載體進行混合的步驟。在一態樣中,用於製備醫藥品或藥學性製劑的方法,更包含將至少1種追加治療劑添加至醫藥品或藥學性製劑。
本發明的抗體,在療法中,能單獨使用或亦能與其他劑組合使用。例如,本發明的抗體可與至少1個追加治療劑同時投予。在特定的態樣中,追加治療劑為免疫查核點抑制劑、EGFR抑制劑、HER2抑制劑、或化學治療劑。作為免疫查核點抑制劑,可列舉例如抗CTLA-4抑制劑、抗PD-1抑制劑、抗PD-L1抑制劑、抗PD-L2抑制劑、抗TIM-3抑制劑、抗LAG-3抑制劑、抗TIGIT抑制劑、抗BTLA抑制劑、抗VISTA抑制劑等。作為抗CTLA-4抑制劑,可列舉例如ipilimumab、tremelimumab等。作為抗PD-1抑制劑,可列舉例如nivolumab、pembrolizumab等。作為抗PD-L1抑制劑,可列舉例如atezolizumab、durvalumab、avelumab等。作為抗PD-L2抑制劑,可列舉例如抗PD-L2抑制抗體。作為抗TIM-3抑制劑,可列舉例如抗TIM-3抑制抗體。作為抗LAG-3抑制劑,可列舉例如抗LAG-3抑制抗體。作為抗TIGIT抑制劑,可列舉例如抗TIGIT抑制抗體。作為抗BTLA抑制劑,可列舉例如抗BTLA抑制抗體。作為抗VISTA抑制劑,可列舉例如抗VISTA抑制抗體。作為EGFR抑制劑,可列舉例如cetuximab、panitumumab、nimotuzumab、necitumumab、zalutumumab等。作為HER2抑制劑,可列舉例如trastuzumab、trastuzumab emtansine、pertuzumab等。
如上述般的併用療法,能包含併用投予(2個以上的治療劑被包含在相同或各製劑中)及個別投予,在個別投予之情形,本發明的抗體的投予能在追加治療劑的投予之前、與追加治療劑的投予同時、及/或在追加治療劑的投予之後進行。在一態樣中,抗CTLA-4抗體的投予及追加治療劑的投予係分別在約1個月以內、或約1、2、或3週以內、或約1、2、3、4、5、或6日以內進行。本發明的抗體亦可與放射線療法組合使用。
本發明的抗體(及任意的追加治療劑)能藉由任意的合適手段進行投予,所述任意的合適手段包含非經口投予、肺內投予、及經鼻投予、在期望局部處理之情形為病灶內投予。非經口注入包含肌肉內、靜脈內、動脈內、腹腔內、或皮下投予。投藥能部分因應投予為短期或長期,例如,利用靜脈內注射或皮下注射等注射等,藉由任意的合適路徑而完成。不受限於此等,但包含單次投予或經過各種時間點的反覆投予、單次快速(bolus)投予及脈衝注入之各種投藥時間表都在本說明書的考慮內。
本發明的抗體係以與優良醫療規範(good medical practice)一致的做法,被製劑化、被投藥、及被投予。由此觀點而言,應考慮的因素包含:被治療之其特定的障礙、被治療之其特定的哺乳動物、各個患者的臨床症狀、障礙的原因、送達劑的部位、投予方法、投予的時間表、及醫療從事者所公知的其他因素。抗體並非一定如此,但可選地,與現在被使用於預防或治療問題的障礙之1個或多個劑一起被製劑化。此種其他劑的有效量,依賴於存在於製劑中之抗體的量、障礙或治療的類型、及上述之其他因子。此等通常以與本說明書所述者相同的用量及投予路徑、或本說明書所述的用量的約1至99%、或經驗上/臨床上被判斷為適當的任意的用量及任意的路徑而使用。
為了疾病的預防或治療,本發明的抗體的適當用量(單獨使用時或與1個或多個其他追加治療劑一起使用時)依賴於被治療之疾病的類型、抗體的類型、疾病的重症度及病程、抗體是以預防性目的被投予或以治療目的被投予、藥物歷史、患者的臨床病歷及對於抗體的反應、以及主治醫生的考量。抗體較佳地對於患者投予1次、或經過連續的處理而投予。因應疾病的類型及重症度,例如,不論是利用1次或多次的個別投予,或利用連續注入,皆能將約1μg/kg至15 mg/kg(例如,0.1 mg/kg~10 mg/kg)的抗體設為用於對於患者之投予的最初候補用量。1個典型的1日用量,係依賴於上述的因素,且可為約1μg/kg至100 mg/kg以上的大範圍。在經過數日或更久的重複投予之情形,因應狀況,治療通常維持直到疾病症狀被抑制到期望狀態。抗體的1個例示的用量,為約0.05 mg/kg至約10 mg/kg的範圍內。因此,約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg、或者10 mg/kg的1個或多個用量(或此等的任意的組合)可被投予至患者。此種用量可斷續地,例如每1週或每3週(例如,以患者接受約2至約20、或例如約6用量的抗體之方式)投予。在高的初回負荷用量之後,可投予1次或多次的低用量。此療法的經過係藉由以往的手法及測定法而被輕易地監測。
能理解地,針對上述的製劑或治療方法之任一者,可使用本發明的免疫共軛物以取代抗CTLA-4抗體或再加上抗CTLA-4抗體而實施。
H.產品
本發明的在另一態樣中,提供包含對於上述障礙的治療、預防、及/或診斷為有用的器材之產品。產品包含容器、及該容器上的標籤或該容器所附的說明書。作為較佳的容器,例如包含瓶罐、小玻璃瓶、注射器、IV(intravenous)溶液包等。容器類可由玻璃或塑膠等各種材料所形成。容器可將組合物以單體的形式保持,亦可與對於症狀的治療、預防、及/或診斷為有效的其他組合物進行組合而保持,又,可具有無菌的連接端口(例如,容器可為可藉由皮下注射針進行穿刺之具有塞子的靜脈內投予用溶液包或小玻璃瓶)。組合物中的至少1個有效成分為本發明的抗體。標籤或使用說明書揭示組合物為被使用於治療所選症狀者。再者,產品可包含(a)第一容器,其為伴隨收納於其中之包含本發明的抗體之組合物之第一容器;及、(b)第二容器,其為伴隨收納於其中之更包含細胞毒性劑或其以外的治療劑之組合物之第二容器。本發明的此態樣中之產品,可更包含使用說明書,所述使用說明書揭示組合物能被使用於治療特定的症狀。或者,再加上,產品可更包含第二(或第三)容器,所述第二(或第三)容器包含注射用殺菌水(BWFI)、磷酸緩衝生理食鹽水、連接子溶液、及右旋糖溶液等藥學上所容許的緩衝液。由其他商業觀點或使用者的立場而言,亦可包含其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、及注射器等期望器材。
能理解地,上述產品的任一者皆可包含本發明的免疫共軛物以取代抗CTLA-4抗體或再加上抗CTLA-4抗體。
<包含突變Fc區域的多肽>
在一態樣中,本發明提供包含突變Fc區域之經分離的多肽。在一些態樣中,多肽為抗體。在一些態樣中,多肽為Fc融合蛋白質。在特定的態樣中,相較於天然型序列或參照變異體序列(本說明書中,有時統稱為「親代」Fc區域)的Fc區域中之對應序列,突變Fc區域包含至少1個胺基酸殘基改變(例如取代)。天然型序列的Fc區域通常被構成為由二條相同的多肽鏈所構成的同型二聚體。本發明的突變Fc區域中之胺基酸改變可被導入親代Fc區域的二條多肽鏈中之任一者,亦可被導入二條多肽鏈的雙方。
在一些態樣中,本發明提供相較於親代Fc區域已改變功能之突變Fc區域。在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域,相較於親代Fc區域,對於Fcγ受體之結合活性增強。在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域、相較於親代Fc區域,對於選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa所組成的群組之至少1個Fcγ受體之結合活性增強。在一些態樣中,本發明的突變Fc區域對於FcγRIIa之結合活性增強。在一些態樣中,本發明的突變Fc區域對於FcγRIIIa之結合活性增強。在另外的態樣中,本發明的突變Fc區域對於FcγRIIa及FcγRIIIa之結合活性增強。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由EU編號所表示之位置234、235、236、298、330、332、及334所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。或者,在本發明中亦能同樣地使用國際公開WO2013/002362、WO2014/104165所記載之胺基酸改變等。
在特定的態樣中,親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性可由KD(Dissociation constant:解離常數)值表示。在一態樣中,[對於FcγRIIa之親代Fc區域的KD值]/[對於FcγRIIa之突變Fc區域的KD值]之比的值,例如為1.5以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、40以上、或50以上。在另外的態樣中,FcγRIIa可為FcγRIIa R,亦可為FcγRIIa H。又可為其兩者。在一態樣中,[對於FcγRIIIa之親代Fc區域的結合活性]/[對於FcγRIIIa之突變Fc區域的結合活性]之比的值,例如為2以上、3以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上、200以上、300以上、500以上、1×10
3以上、2×10
3以上、3×10
3以上、或5×10
3以上。在另外的態樣中,FcγRIIIa可為FcγRIIIa F,亦可為FcγRIIIa V。又可為其兩者。
在一態樣中,對於FcγRIIa之突變Fc區域的KD值,例如為1.0×10
-6M以下、5.0×10
-7M以下、3.0×10
-7M以下、2.0×10
-7M以下、1.0×10
-7M以下、5.0×10
-8M以下、3.0×10
-8M以下、2.0×10
-8M以下、1.0×10
-8M以下、5.0×10
-9M以下、3.0×10
-9M以下、2.0×10
-9M以下、或1.0×10
-9M以下。在另外的態樣中,FcγRIIa可為FcγRIIa R,亦可為FcγRIIa H。又可為其兩者。在一態樣中,對於FcγRIIIa之突變Fc區域的KD值,例如為1.0×10
-6M以下、5.0×10
-7M以下、3.0×10
-7M以下、2.0×10
-7M以下、1.0×10
-7M以下、5.0×10
-8M以下、3.0×10
-8M以下、2.0×10
-8M以下、1.0×10
-8M以下、5.0×10
-9M以下、3.0×10
-9M以下、2.0×10
-9M、1.0×10
-9M以下、5.0×10
-10M以下、3.0×10
-10M以下、2.0×10
-10M、或1.0×10
-10M以下。在另外的態樣中,FcγRIIIa可為FcγRIIIa F,亦可為FcγRIIIa V。又可為其兩者。
在另一態樣中,亦可由kd(Dissociation rate constant:解離速度常數)值取代KD值表示親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性值。
在另一態樣中,親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性亦可由每單位量的Fc區域對於Fcγ受體之結合量表示。例如,在表面電漿共振分析中,將固定於感測晶片上之Fc區域的結合量、及再結合於該處之Fcγ受體的結合量分別以反應單位(resonance unit,RU)的形式進行測定。將此處的Fcγ受體的結合量除以Fc區域的結合量,可將所得的值定義作為每單位量的Fc區域對於Fcγ受體的結合量。如此進行的結合量的測定及計算的具體方法被記載於後述的實施例。在一些態樣中,[突變Fc區域對於FcγRIIa的結合量]/[親代Fc區域對於FcγRIIa的結合量]之比的值,例如為1.5以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、40以上、或50以上。在一些態樣中,[突變Fc區域對於FcγRIIIa的結合量]/[親代Fc區域對於FcγRIIIa的結合量]之比的值,例如為2以上、3以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上、200以上、300以上、500以上、1×10
3以上、2×10
3以上、3×10
3以上、或5×10
3以上。
在特定的態樣中,本說明書所表示之KD值、kd值、結合量的值等,係藉由在25℃或37℃實施表面電漿共振分析而測定或計算(例如,參照本說明書的實施例6)。
在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域,相較於親代Fc區域,活性型Fcγ受體與抑制型Fcγ受體之間的選擇性提升。換言之,本發明的突變Fc區域,相較於親代Fc區域,比起對於抑制型Fcγ受體的結合活性,對於活性型Fcγ受體的結合活性更大幅增強。在特定的態樣中,活性型Fcγ受體為選自由FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa F、FcγRIIIa V所組成的群組之至少1個Fcγ受體,抑制型Fcγ受體為FcγRIIb。在一些態樣中,本發明的突變Fc區域,其FcγRIIa與FcγRIIb之間的選擇性提升。在一些態樣中,本發明的突變Fc區域,其FcγRIIIa與FcγRIIb之間的選擇性提升。在另外的態樣中,本發明的突變Fc區域,其FcγRIIa與FcγRIIb之間的選擇性及FcγRIIIa與FcγRIIb之間的選擇性提升。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由EU編號所表示之位置236、239、268、270、及326所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。或者,在本發明中亦能同樣地使用國際公開WO2013/002362、WO2014/104165所記載之胺基酸改變。
在特定的態樣中,親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性可由KD(Dissociation constant:解離常數)值表示。關於對於FcγRIIa及FcγRIIIa之結合活性的態樣,係如同上述。在一態樣中,[對於FcγRIIb之親代Fc區域的KD值]/[對於FcγRIIb之突變Fc區域的KD值]之比的值,例如為10以下、5以下、3以下、2以下、1以下、0.5以下、0.3以下、0.2以下、或0.1以下。在另一態樣中,亦可由kd(Dissociation rate constant:解離速度常數)值表示親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性,以取代KD值。
在另一態樣中,親代Fc區域及突變Fc區域的結合活性,亦可由上述之每單位量的Fc區域對於Fcγ受體的結合量表示。在一些態樣中,[突變Fc區域對於FcγRIIb的結合量]/[親代Fc區域對於FcγRIIb的結合量]之比的值,例如為10以下、5以下、3以下、2以下、1以下、0.5以下、0.3以下、0.2以下、或0.1以下。在一些態樣中,突變Fc區域對於FcγRIIb的結合量,例如為0.5以下、0.3以下、0.2以下、0.1以下、0.05以下、0.03以下、0.02以下、0.01以下、0.005以下、0.003以下、0.002以下、或0.001以下。
在特定的態樣中,相較於親代Fc區域,本發明的突變Fc區域的穩定性提升。在特定的態樣中,穩定性為熱力學的穩定性。多肽的熱力學的穩定性,例如可將Tm值等作為指標而判斷。Tm值例如可使用CD(圓二色性)、DSC(微差掃描型熱量計)、DSF(微差掃描型螢光定量法)等本發明所屬技術領域中具有通常知識者所公知的手法進行測定。在一態樣中,本發明的突變Fc區域,相較於親代Fc區域,CH2區域的Tm值上升0.1度以上、0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由EU編號所表示之位置250及307所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。或者,在本發明中亦能同樣地使用國際公開WO2013/118858所記載之胺基酸改變。
在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域係由序列互異的二條多肽鏈所構成。在另外的態樣中,本發明的突變Fc區域促進第一多肽與第二多肽之間的異型二聚化。使用重組的方法製造異型二聚體蛋白質之情形,相較於相同的多肽鏈會合而形成同型二聚體,較佳為互異的肽鏈優先會合而形成異型二聚體。是否促進突變Fc區域的異型二聚化,例如能從所製造之突變Fc區域之中,藉由層析法等手法分離同型二聚體與異型二聚體,求取各成分比,藉此而進行判斷。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由由EU編號所表示之位置349、356、366、368、407、及439所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。或者,在本發明中亦能同樣地使用國際公開WO2006/106905或WO1996/027011所記載之胺基酸改變。
在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域在酸性pH下之對於FcRn的結合活性會增強。在一些態樣中,酸性pH意指pH 4.0~6.5。在另外的態樣中,酸性pH係選自由pH 4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、及6.5所組成的群組之至少1個。在特定的態樣中,酸性pH為pH 5.8。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由由EU編號所表示之位置428、434、436、438、及440所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。或者,在本發明中亦能同樣地使用國際公開WO2016/125495所記載之胺基酸改變。
在一態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、407、428、434、436、438、439、及440所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。
在特定的態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、及334中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、及326、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、及334中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置356中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置356中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置366中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置366中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置349中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置349中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置332中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置330中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置330中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置439中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置439中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置366、368、及407中之胺基酸改變。
在另一態樣中,本發明的突變Fc區域更包含由EU編號所表示之位置356中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置356中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、334、349、356、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、334、356、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、334、356、及439中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、356、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、334、及439中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、356、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、356、及439中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、及356、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、及439中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、349、356、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、349、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、332、334、356、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、356、及439中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、及356、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、332、334、及439中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、332、334、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、356、366、368、及407中之胺基酸改變。
在一些態樣中,本發明的突變Fc區域包含由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、349、356、366、368、及407中之胺基酸改變。在另外的態樣中,包含(i)在親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、349、及366、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、332、334、356、366、368、及407中之胺基酸改變。
在另外的態樣中,本發明的突變Fc區域包含選自由(i)親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234中之Tyr、Phe;位置235中之Gln;位置236中之Trp;位置239中之Met;位置250中之Val;位置268中之Asp;位置270中之Glu;位置298中之Ala;位置307中之Pro;位置326中之Asp;位置332中之Glu;位置349中之Cys;位置356中之Lys;及位置366中之Trp、以及(ii)在親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236中之Ala;位置250中之Val;位置270中之Glu;位置298中之Ala;位置307中之Pro;位置326中之Asp;位置330中之Met、Lys;位置332中之Asp、Glu;位置334中之Glu;位置356中之Cys;位置366中之Ser;位置368中之Ala;位置407中之Val;位置439中之Glu所組成之群組的至少1個胺基酸改變。
在另外的態樣中,本發明的突變Fc區域更包含以下的(a)~(d)中任一胺基酸改變:
(a)由EU編號所表示之位置434中之Ala;
(b)由EU編號所表示之位置434中之Ala、位置436中之Thr、位置438中之Arg、位置440中之Glu;
(c)由EU編號所表示之位置428中之Leu、位置434中之Ala、位置436中之Thr、位置438中之Arg、位置440中之Glu;
(d)由EU編號所表示之位置428中之Leu、位置434中之Ala、位置438中之Arg、位置440中之Glu。
在另外的態樣中,本發明提供包含序列識別號:43~46、65、66、81、207、239、253~271、276、277、278中任一胺基酸序列之多肽。
所謂「Fcγ受體」(在本說明書中,稱為Fcγ受體、FcγR、或FcgR),係指能與IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4單株抗體的Fc區域結合之受體,事實上意指Fcγ受體基因所編碼之蛋白質家族的任意成員。在人類中,在此家族中,包含:包含同型體FcγRIa、FcγRIb、及FcγRIc之FcγRI(CD64);包含同型體FcγRIIa(包含同種異型H131(H型)與R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1與FcγRIIb-2)、及FcγRIIc之FcγRII(CD32);以及包含同型體FcγRIIIa(包含同種異型V158與F158)及FcγRIIIb(包含同種異型FcγRIIIb-NA1與FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)、以及未發現之所有人類FcγR、FcγR同型體或同種異型,但不受限於此等。FcγRIIb1及FcγRIIb2被報導作為人類FcγRIIb的切割變異體。再者,已報導稱為FcγRIIb3之切割變異體(J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385)。此等的切割變異體之外,人類FcγRIIb亦包含登錄於NCBI之全部切割變異體、NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、及NP_003992.3。再者,FcγRIIb之外,人類FcγRIIb亦包含過去所報導之全部遺傳性多型(Arthritis Rheum. 48: 3242-3252(2003);Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14: 2881-2892(2005);及Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46: 1242-1254(2002))與將來被報導之全部遺傳性多型。
FcγRIIa中存在2個同種異型(allotype),其中之一的FcγRIIa的位置131的胺基酸為組胺酸(H型),另一者的位置131的胺基酸被精胺酸取代(R型)(Warrmerdam, J. Exp. Med. 172: 19-25(1990))。
FcγR包含源自人類、小鼠、大鼠、兔、及猴之FcγR,但不受限於此等,亦可源自任意生物體。小鼠FcγR包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、及FcγRIII-2(CD16-2)、以及任意的小鼠FcγR或FcγR同型體,但不受限於此等。
人類FcγRI的胺基酸序列被記載於序列識別號:131(NP_000557.1);人類FcγRIIa的胺基酸序列被記載於序列識別號:132(AAH20823.1)、序列識別號:142、序列識別號:143、或序列識別號:150;人類FcγRIIb的胺基酸序列被記載於序列識別號:151(AAI46679.1)、序列識別號:169、或序列識別號:172;人類FcγRIIIa的胺基酸序列被記載於序列識別號:174(AAH33678.1)、序列識別號:175、序列識別號:176、或序列識別號:177;且人類FcγRIIIb的胺基酸序列被記載於序列識別號:178(AAI28563.1)。
與屬於免疫球蛋白超家族之Fcγ受體不同,人類FcRn係與主要組織適合性複合體種類I(MHC class I)的多肽結構性類似,與種類I的MHC分子具有22~29%的序列一致性(Ghetie等人,Immunol. Today(1997)18(12), 592-598)。FcRn係以由可溶性β鏈或輕鏈(β2微米球蛋白)與經複合體化的膜貫通α鏈或重鏈而成之異二聚體的形式表現。如同MHC,FcRn的α鏈係由3個細胞外域(α1、α2、α3)而成,短的細胞質域係將蛋白質繫留在細胞表面。α1及α2域係與抗體的Fc區域中的FcRn結合域進行相互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1, 303-315)。人類FcRn的胺基酸序列被記載於序列識別號:179(NP_004098.1),β2微米球蛋白的胺基酸序列被記載於序列識別號:180。
本說明書所使用之所謂「親代Fc區域」,係指導入本說明書所記載之胺基酸改變前的Fc區域。在一些態樣中,親代Fc區域為天然型序列的Fc區域(或者天然型抗體的Fc區域)。抗體例如包含IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、及IgM等。抗體能源自人類或猴(例如,食蟹獼猴、恆河猴、新世界猴、黑猩猩、或狒狒)。天然型抗體亦可包含天然存在的突變。由基因多型所導致之IgG的多個同種異型序列被記載於「Sequences of proteins of immunological interest」、NIH Publication No. 91-3242,但其任一者皆能被使用於本發明。尤其,針對人類IgG1,位置356~358(EU編號)的胺基酸序列能為DEL或EEM之任一者。在特定的態樣中,親代Fc區域為源自人類IgG1(序列識別號:249)、人類IgG2(序列識別號:250)、人類IgG3(序列識別號:251)、或人類IgG4(序列識別號:252)的重鏈恆定區之Fc區域。在另一態樣中,親代Fc區域為源自序列識別號:82或序列識別號:158的重鏈恆定區之Fc區域。在另外的態樣中,親代Fc區域可為藉由將本說明書所記載之胺基酸改變以外的胺基酸改變加至天然型序列的Fc區域所製作之Fc區域(參照變異體序列的Fc區域)。天然型序列的Fc區域通常作為由二條相同的多肽鏈所形成的同型二聚體而構成。
再者,可將為了其他目的所實施之胺基酸改變組合至本說明書所記載之突變Fc區域中。例如,可添加使FcRn結合活性增強之胺基酸取代(Hinton et al., J. Immunol. 176(1): 346-356(2006);Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33): 23514-23524(2006);Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769(2006);Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-159(2010);WO2006/019447; WO2006/053301;及WO2009/086320)、及用於改善抗體的異質性或穩定性之胺基酸取代(WO2009/041613)。或者,可將WO2011/122011、WO2012/132067、WO2013/046704、或WO2013/180201所記載之具有促進抗原清除的特性之多肽、WO2013/180200所記載之具有對於標的組織的特異性結合特性之多肽、WO2009/125825、WO2012/073992、或WO2013/047752所記載之具有對於多個抗原分子進行重複結合的特性之多肽,與本說明書所記載之突變Fc區域進行組合。或者,以賦予對於其他抗原的結合能為目的,可將EP1752471及EP1772465所公開之胺基酸改變組合至本說明書所記載之突變Fc區域的CH3中。或者,以使血漿中滯留性增大為目的,可將使恆定區的pI降低之胺基酸改變(WO2012/016227)組合至本說明書所記載之突變Fc區域中。或者,以促進進入細胞為目的,可將使恆定區的pI上升之胺基酸改變(WO2014/145159)組合至本說明書所記載之突變Fc區域中。或者,以促進標的分子從血漿消失為目的,可將使恆定區的pI上升之胺基酸改變(WO2016/125495)組合至本說明書所記載之突變Fc區域中。在一態樣中,此種改變,例如可包含在選自由EU編號所表示之位置311、343、384、399、400、及413所組成的群組之至少1個位置的取代。在另外的態樣中,此種取代能為由各位置的胺基酸的Lys或Arg所導致之取代。
再加上,亦可使用WO2011/028952所記載之使用抗體CH1與CL的結合及VH與VL的結合之異型二聚化抗體製作技術。
與WO2008/119353及WO2011/131746所記載之方法同樣地,亦能使用異型二聚化抗體製作技術,其預先製作二種類的同型二聚化抗體,將該抗體在還原條件下進行培養並使其解離,使其等再度結合。
再者,與WO2012/058768所記載之方法同樣地,亦能使用異型二聚化抗體製作技術,其在CH2及CH3域加上改變。
為了製作包含非相同突變Fc區域之多肽而使包含具有不同胺基酸序列的突變Fc區域之2個多肽同時表現之情形,通常亦會製作出作為不純物的包含相同突變Fc區域之多肽。此種情形,藉由使用公知技術,從包含相同突變Fc區域之多肽進行分離及精製,而可又效率地取得包含非相同突變Fc區域之多肽。已報導一種方法,其用於將會在同型二聚化抗體與異型二聚化抗體之間產生等電點差異的胺基酸改變導入該二種類的抗體重鏈的可變區,藉此使用離子交換層析法,從同型二聚化抗體有效率地分離及精製異型二聚化抗體(WO2007/114325)。已報導另一種方法,其用於構築包含源自與蛋白質A結合的小鼠IgG2a及不與蛋白質A結合的大鼠IgG2b之二種類重鏈的異型二聚化抗體,藉此使用蛋白質A層析法,精製異型二聚化抗體(WO1998/050431及WO1995/033844)。
再者,以造成不同的蛋白質A結合親和性之方式,將位於抗體重鏈的蛋白質A結合部位之位置435及436(EU編號)的胺基酸殘基取代成Tyr或His等胺基酸,藉此可使用蛋白質A層析法,有效率地精製異型二聚化抗體。
在本發明中,所謂胺基酸改變,意指任意的取代、缺失、加成、插入、及修飾、或其等的組合。在本發明中,胺基酸改變可改稱為胺基酸突變。
導入Fc區域之胺基酸改變的數量未被限定。在特定的態樣中,能為1、2以下、3以下、4以下、5以下、6以下、8以下、10以下、12以下、14以下、16以下、18以下、或20以下。
在一態樣中,本發明提供製造多肽的方法,所述多肽包含突變Fc區域。在另外的態樣中,本發明提供製造多肽的方法,所述多肽包含已改變功能的突變Fc區域。在一些態樣中,多肽為抗體。在一些態樣中,多肽為Fc融合蛋白質。在特定的態樣中,其等方法包含在親代Fc區域中導入至少1個胺基酸改變之步驟。在特定的態樣中,其等方法包含(i)提供包含親代Fc區域的多肽之步驟;及(ii)在親代Fc區域中導入至少1個胺基酸改變之步驟。在特定的態樣中,其等方法可更包含(iii)測定包含突變Fc區域的多肽的功能之步驟。天然型的Fc區域通常係由二條相同的多肽鏈所構成。對於親代Fc區域之胺基酸改變,可導入親代Fc區域的二條多肽鏈中任一者,亦可導入二條多肽鏈的兩者。
在另一態樣中,製造包含突變Fc區域的多肽之方法,包含(i)提供編碼包含親代Fc區域的多肽之一個以上的核酸之步驟;(ii)在編碼該核酸的親代Fc區域之區域中導入至少1個突變之步驟;(iii)將由(ii)所製作之核酸導入宿主細胞之步驟;及(iv)以包含突變Fc區域的多肽會表現之方式培養(iii)所記載之細胞之步驟。在特定的態樣中,前述的方法可更包含(v)從(iv)所記載之宿主細胞培養物回收包含突變Fc區域的多肽之步驟。
在特定的態樣中,由(ii)所製作之核酸可被包含在一個以上的載體(例如,表現載體等)。
在一些態樣中,能使用於本製造方法之胺基酸改變係選自上述突變Fc區域所能包含之胺基酸改變中之任意的單一改變、單一改變的組合、或選自表26~表30所記載之組合改變。
Fc區域可藉由在使用胃蛋白酶等蛋白酶將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等部分地消化後,將已吸附於蛋白質A管柱之溶離份再度溶出而得。蛋白酶只要其可消化全長抗體,藉此,藉由適當地設定pH等酵素反應條件而以限制的樣式產生Fab及F(ab')2,則未被特別限定,作為例子,包含胃蛋白酶及木瓜酵素。
本發明之包含突變Fc區域的多肽,除了上述製造方法以外,亦可藉由該技術領域中公知的其他方法而製造。藉由本說明書所記載之製造方法所製造之包含突變Fc區域的多肽亦被包含在本發明中。
以辨識或者篩選本說明書所提供之突變Fc區域為目的、或者以明確其物理或者化學特性、或生物學活性為目的,亦可使用本說明書所記載之測定法或該技術領域中公知的各種測定法。
用於決定包含突變Fc區域的多肽之對於1個或多個FcR家族成員的結合活性之測定法,被記載於本說明書或者在該技術領域中為已知。此種結合測定法不受限於以下,但包含表面電漿共振分析、放大螢光親合均相檢測(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,ALPHA)篩選、ELISA、及螢光活化細胞篩選(FACS)等(Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2006)103(11): 4005-4010)。
在一態樣中,可使用表面電漿共振分析,測定包含突變Fc區域的多肽對於FcR家族成員的結合活性。例如,使用公知的方法及試劑(例如蛋白質A、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質G、抗λ鏈抗體、抗κ鏈抗體、抗原肽、抗原蛋白質等),對於已固定化或已被捕捉在感測晶片上之包含突變Fc區域的多肽,作為分析物,使各種的FcR相互作用。或者,亦可將FcR固定化或捕捉在感測晶片上,將包含突變Fc區域的多肽使用作為分析物。取得此種相互作用的結果、結合的傳感圖(sensorgram),將其等進行分析,藉此可計算該結合的解離常數(KD)值。又,亦可將在供應至與FcR的相互作用之前與之後的傳感圖中之共振單位(RU)值之差(亦即,FcR的結合量),作為包含突變Fc區域的多肽對於該FcR的結合活性之指標。再者,亦可將前述FcR的結合量除以在包含突變Fc區域的多肽被固定化或捕捉在感測晶片上之前與之後的傳感圖中之RU值之差(亦即,包含突變Fc區域的多肽的結合量)所得之修正值(亦即,包含突變Fc區域的多肽每單位量之FcR的結合量)作為結合活性的指標。
在另外的態樣中,本發明提供藥學性製劑,其包含本說明書所提供之包含突變Fc區域的多肽。在一態樣中,前述藥學性製劑更包含藥學上所容許之載體。
[實施例]
以下為本發明的方法及組合物的實施例。可理解能參照上述一般的記載而實施各種其他態樣。
[實施例0]僅在癌微小環境下發揮對於調節性T細胞的細胞表面標記之抗體依賴性細胞毒性的開關抗體的概念
伊匹單抗被認為藉由抑制由表現於效應T細胞表面的CTLA4所致之效應T細胞的活性化抑制而發揮抗腫瘤效果,但最近報導對於CTLA4表現T細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC活性)亦重要,發現腫瘤中的調節性T細胞的去除與ADCC活性為抗CTLA4抗體的抗腫瘤效果的重要作用機制。
又,由IgG1抗體所致之ADCC活性係藉由抗體的恆定區與NK細胞或巨噬細胞的FcγR結合而誘導細胞毒性,具有已添加增強此結合的改變之恆定區的抗體,亦已知會誘導更強的細胞毒性並發揮抗腫瘤效果。
另一方面,亦已報導藉由去除全身中的調節性T細胞,會引起類自體免疫疾病的全身反應,而認為用於發揮抗腫瘤效果的細胞毒性與全身反應的控制平衡係非常重要。
亦即,在癌微小環境中,穩固地與調節性T細胞或者耗竭性T細胞結合,藉由細胞毒性而去除調節性T細胞或者耗竭性T細胞,藉此可發揮強的抗腫瘤效果,且若將所述反應僅限制於癌微小環境下,則發揮更強的細胞毒性,期待可抑制全身反應。此種作用機制的抗體至今為止並未被報導。於是,本發明人等實際製作以下抗體進行驗證:僅在腫瘤部位對於CTLA4發揮作用的抗體(CTLA4開關抗體),且具有已增強對於NK細胞及巨噬細胞上所表現之FcγR的結合之恆定區的抗體。
[實施例1]從使用噬菌體顯示技術之初始庫及循理設計(rational design)抗體庫取得在ATP或其代謝物存在下與抗原結合之抗體
(1-1)用於取得在低分子存在下與抗原結合之抗體的抗原製備
作為抗原,製備經生物素化的小鼠CTLA4細胞外域(mCTLA4)、人類CTLA4細胞外域(hCTLA4)、阿巴西普(Abatacept)。具體而言,將在hCTLA4細胞外域的C端融合His標籤及BAP標籤之hCTLA4-His-BAP(序列識別號:1)進行基因合成,並插入動物表現用質體。抗原蛋白質係使用以下方法而表現、被精製。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)中以1.33×10
6細胞/mL的細胞密度被懸浮並被播種至細胞培養瓶之源自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen),藉由脂質體法(lipofection)將所製備之質體導入。質體導入後3小時後,以最終濃度成為100μM之方式添加生物素,在CO
2培養箱(incubator)(37℃、8% CO
2、125 rpm)培養4日,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,從所培養之培養上清液精製抗原。使用分光光度計,測定所精製之抗原溶液在280 nm的吸光度。使用由PACE法所算出之吸光係數,從所得之測定值計算所精製之抗原的濃度(Protein Science(1995)4, 2411-2423)。另一方面,已在mCTLA4的細胞外域融合His標籤之mCTLA4-His(Sino Biologics Inc. 50503-M08H, Accession No. NP_033973.2)及已在hCTLA4融合人類IgG1恆定區之阿巴西普(Alfresa股份有限公司),係藉由胺偶合法而被生物素化(PIERCE Cat.No.21329)。
(1-2)利用珠粒淘選從初始人類抗體庫取得在低分子存在下與小鼠CTLA4結合之抗體
將由人類PBMC所作成之polyA RNA、市售之人類polyA RNA等作為模板,依循本發明所屬技術領域中具有通常知識者所公知的方法,構築顯示互異的人類抗體序列的Fab域之多個噬菌體所構成之人類抗體噬菌體顯示庫。
由所構築之初始人類抗體噬菌體顯示庫,篩選在低分子存在下及不存在下對於小鼠CTLA4細胞外域(mCTLA4)的結合活性會變化的抗體。亦即,收集顯示以下抗體的噬菌體:對於被珠粒捕捉的mCTLA4,在低分子存在下顯示結合活性的抗體。在低分子不存在的條件下,從已從珠粒溶出之噬菌體溶出液回收噬菌體。在本取得方法中,作為抗原,能使用經生物素標記的mCTLA4(mCTLA4-His-Biotin)。
由保持所構築之噬菌體顯示用噬菌粒的大腸桿菌所產生之噬菌體係藉由一般的方法被精製。其後,獲得由TBS進行透析處理的噬菌體庫液。實施淘選,所述淘選使用已固定化在磁珠的抗原。作為磁珠,能使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或者Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
為了有效率地取得在癌組織中可負責開關之依賴於低分子之低分子開關抗體,係參考先前專利WO2013/180200所示之方法實施淘選,所述淘選係將在三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate,ATP)及ATP代謝物存在下與抗原結合且在ATP不存在下不與抗原結合之抗體進行濃縮。
(1-3)利用噬菌體ELISA之在低分子存在下及不存在下之結合活性的評價
從由(1-2)所得之大腸桿菌的單一群落,依循常法(Methods Mol. Biol.(2002)178, 133-145),回收含有噬菌體的培養上清液。將使用NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL)所回收之培養上清液進行超過濾。培養上清各100μL被供應至NucleoFast 96的各孔,進行4,500 g、45分鐘離心分離,去除上清液(flow through)。添加H
2O 100μL,再次藉由4,500 g、30分鐘離心分離而進行清洗。之後,添加TBS 100μL,在室溫靜置5分鐘後,回收上清液所含之噬菌體液。
已添加TBS之精製噬菌體係利用以下流程被供應至ELISA。利用包含mCTLA4-His-Biotin之100μL的TBS,將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)披覆一晩。利用TBST清洗該盤的各孔,藉此去除未與盤結合之mCTLA4-His-Biotin後,利用250μL之2 %脫脂牛奶-TBS,將該孔阻斷(blocking)1小時以上。去除2 %脫脂牛奶-TBS,之後,在各孔中添加所製備之精製噬菌體,將該盤在室溫靜置1小時,藉此使提示抗體的噬菌體與存在於各孔之mCTLA4-His-Biotin在ATP不存在或者存在下進行結合。在已利用TBST或者ATP/TBST清洗的各孔中,添加已藉由TBS或者ATP/TBS所稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech),將該盤培養1小時。利用TBST或者ATP/TBST清洗後,藉由添加硫酸而使已添加TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的呈色反應停止後,藉由450 nm的吸光度,測定該呈色。其結果,對於mCTLA4,確認到多個僅在ATP存在下進行結合的抗體。將噬菌體ELISA的結果揭示於表2。於此,將ATP存在下之吸光度比0.2高的殖株判定為陽性,將ATP存在下/不存在下之吸光度的比高於2者判定為具有ATP依賴性的抗原結合能之殖株(開關殖株)。此外,在本實施例中,SM有時被使用於簡稱ATP等小分子/低分子(Small Molecule)。
(1-4)從利用ATP或其代謝物之循理設計庫在低分子存在下與抗原結合之抗體的取得
從在先前專利WO2015/083764中所構築之循理設計抗體噬菌體顯示庫,取得在ATP或ATP代謝物(例如ADP、AMP、腺苷(ADO)等)存在條件下顯示對於抗原的結合活性之抗體。為了取得,回收噬菌體,所述噬菌體提示在ATP或ATP代謝物存在下對於被珠粒捕捉的抗原顯示結合能之抗體,其後,從溶出液回收噬菌體,所述溶出液係在ATP或ATP代謝物的不存在條件下從珠粒溶出之溶出液。
利用一般的方法,從保有所構築之噬菌體顯示用噬菌粒的大腸桿菌產生噬菌體。將藉由在進行噬菌體產生之大腸桿菌的培養液中添加2.5M NaCl/10 % PEG而沉澱的噬菌體的群集,利用TBS進行稀釋,藉此能獲得噬菌體庫液。接著,以最終濃度成為4%之方式,在該噬菌體庫液中添加BSA。使用以固定化在磁珠的抗原,實施淘選。作為磁珠,能使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或者Streptavidin coated beads(DynabeadsM-280 Streptavidin)。作為抗原,能使用經生物素化的阿巴西普(Abatacept-Biotin)。
為了有效率地取得在癌組織中可負責開關之依賴於低分子之低分子開關抗體,係參考先前專利WO2015/083764所示之方法實施淘選,所述淘選係將在三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate,ATP)或者ATP代謝物存在下與抗原結合,且在ATP或者ATP代謝物不存在下不與抗原結合之抗體進行濃縮。
(1-5)利用噬菌體ELISA之在ATP或者其代謝物的存在下及不存在下之結合活性的評價
從藉由上述方法所得之大腸桿菌的單一群落,依循常法(MethodsMol. Biol.(2002)178, 133-145),回收含有噬菌體的培養上清液。使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL),將所回收的培養上清液進行超過濾。將已在各孔中供應培養上清液各100μL之NucleoFast 96進行離心分離(4,500 g、45分鐘),藉此去除上清液(flow through)。將已在各孔中添加100μL的H
2O之該NucleoFast 96,藉由再次離心分離(4,500 g、30分鐘)而進行清洗。最後添加TBS 100μL,在室溫靜置5分鐘,回收該NucleoFast 96的各孔的上清液所含之噬菌體液。
添加TBS、或含有ATP或者其代謝物的TBS(SM/TBS)之精製噬菌體,能利用以下流程而被供應至ELISA。利用包含由實施例1-1所製作之生物素標記抗原(Abatacept-Biotin)之100μL的TBS,將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)披覆一晩。利用TBST清洗該盤的各孔,藉此去除自由的Abatacept-Biotin後,利用250μL之2 % SkimMilk-TBS,將該孔阻斷1小時以上。去除2 % SkimMilk-TBS,之後,在各孔中添加所製備之精製噬菌體,將該盤在37℃靜置1小時,藉此使已提示抗體的噬菌體與存在於各孔之Abatacept-Biotin在ATP或者其代謝物的不存在下及存在下進行結合。在已利用TBST或含有ATP或者其代謝物的TBST(SM/TBST)進行清洗之各孔中,添加已藉由TBS或SM/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech),使該盤培養1小時。利用TBST或SM/TBST清洗後,藉由添加硫酸而使已添加TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的呈色反應停止後,藉由450 nm的吸光度,測定該呈色。其結果,對於Abatacept,確認到多個在ATP或其代謝物存在下及不存在下結合活性會變化的抗體。將噬菌體ELISA的結果揭示於表3。於此,將ATP或其代謝物的存在下之吸光度的S/N比高於2的殖株判定為陽性,在ATP或其代謝物的存在下/不存在下之吸光度的比高於2者被判定為具有依賴於ATP或其代謝物的抗原結合能之殖株(開關殖株)。
(1-6)依據ATP及其代謝物的有無而對於抗原的結合活性會變化之開關抗體的序列解析
噬菌體ELISA的結果,由被判斷在ATP及其代謝物存在的條件下具有對於抗原的結合活性殖株,解析使用特異性引子lacPF(序列識別號:2)、G1seqR(序列識別號:3)所增幅之基因的鹼基序列。解析的結果,取得被判斷在ATP及其代謝物存在下具有對於生物素標記阿巴西普的結合活性之殖株ABADh11-4_020、ABADh11-4_086、ABADh12-4_014、ABADh12-5_001、ABADh12-5_046、ABADh5-5_041,分別再賦予ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006的殖株名(表4)。
(1-7)依據ATP及其代謝物的有無而對於抗原的結合活性會變化之開關抗體的表現與精製
編碼由人類循理設計(rational design)噬菌體庫所取得之ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006的可變區之基因被插入人類IgG1/Lambda的動物表現用質體。使用以下方法,使抗體表現。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)中以1.33×10
6細胞/mL的細胞密度被懸浮且被播種至6well plate的各孔各3 mL之源自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen),藉由脂質體法導入所製備的質體。在CO
2培養箱(37℃、8 % CO
2、90 rpm)中培養4日,使用 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,從培養上清液精製抗體。使用分光光度計,測定所精製之抗體溶液在280 nm的吸光度。使用藉由PACE法所計算的吸光係數,由所得之測定值計算所精製之抗體的濃度(Protein Science(1995)4, 2411-2423)。
(1-8)利用IgG ELISA之在AMP的存在下及不存在下之所取得的抗體對於hCTLA4的結合活性評價
將所取得之ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006這6個抗體供應至IgG ELISA。又,適當製備表5所示之Buffer。作為抗原,能使用經生物素標記之人類CTLA4(hCTLA4-His-Biotin)。
首先,利用包含hCTLA4-His-Biotin之100μL的TBS,將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)在室溫下披覆1小時以上。利用清洗緩衝液(Wash buffer)清洗該盤的各孔,藉此去除未與盤結合之hCTLA4-His-Biotin後,利用阻斷緩衝液(Blocking Buffer) 250μL將該孔阻斷1小時以上。在已去除阻斷緩衝液的各孔中,將利用最終濃度為1 mM且包含AMP之樣本緩衝液(Sample Buffer)製備成2.5μg/mL之精製IgG各添加100μL,將該盤在室溫靜置1小時,藉此使各IgG與存在於各孔之hCTLA4-His-Biotin結合。利用最終濃度為1 mM且包含AMP之清洗緩衝液進行清洗後,將藉由樣本緩衝液所稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)添加至各孔,將該盤培養1小時。利用包含各低分子之清洗緩衝液清洗後,藉由硫酸的添加而使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中的溶液的呈色反應停止後,藉由450 nm的吸光度,測定該呈色。此外,作為緩衝液,使用包含表5所記載之構成的緩衝液。
將所測定之結果揭示於表6。此外,關於值已Overflow的孔,假定為5.00。在ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006的所有殖株中,相較於AMP存在下之吸光度,AMP不存在下之吸光度獲得顯著降低的結果。由此結果確認到,ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006的所有殖株具有依據低分子的有無而與抗原的結合會變化的性質。
(1-9)利用表面電漿共振之對於人類CTLA4的結合之ATP及其代謝物的影響的評價
以ABAM004作為CTLA4開關抗體,進行進一步評價。
使用Biacore T200(GE Healthcare),解析ABAM004與hCTLA4-His-BAP之抗原抗體反應的相互作用。利用胺偶合法,使已適當固定化protein A/G(Pierce)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)捕捉ABAM004,並使之與作為抗原之由實施例1-1所製備之hCTLA4-His-BAP進行相互作用。泳動緩衝液中能使用TBS,作為再生溶液,能使用10 mM 甘胺酸-HCl(Glycine-HCl)(pH 1.5)。
在捕捉懸浮於TBS之1μg/mL的ABAM004後,將包含500 nM的hCTLA4-His-BAP、從4000μM開始以公比4稀釋10次之各濃度的ATP、ADP或AMP、及2 mMMgCl
2之溶液,以流速10μL/min耗費3分鐘注入至各flow cell。此3分鐘被設為hCTLA4-His-BAP的結合相,結合相結束後,切換成泳動緩衝液的2分鐘被設為hCTLA4-His-BAP的解離相。解離相結束後,以流速30μl/min耗費30秒鐘注入再生溶液。以上被設為ABAM004的結合活性測定循環。在結合相中,將與ABAM004進行相互作用之hCTLA-4-His-BAP的結合量對於被捕捉的抗體量進行修正。數據的解析及作圖中,使用Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0及Microsoft Excel 2013(Microsoft)。
將由此測定所取得之在ATP及其代謝物存在下之ABAM004與hCTLA4-His-BAP的結合量揭示於圖1。
如圖1所示,ABAM004被確認到具有不僅將ATP作為開關亦將ATP代謝物作為開關而與hCTLA4結合的性質。又,其中揭示,特別是在AMP存在下的結合活性為最強的抗體。
(1-10)對於人類CTLA4表現細胞的抗體結合性的評價
使用流式細胞儀,評價ABAM004與人類CTLA4的抗原抗體相互作用在AMP存在下、不存在下會有何種變化。準備適當的濃度之穩定表現人類CTLA4的CHO細胞(hCTLA4-CHO細胞)。此時,懸浮中能使用含有0.1 % BSA的PBS(FACS Buffer)。對於該細胞溶液100μL,以最終濃度成為10 mg/mL之方式添加抗體後,以最終濃度成為0、0.4、4、40、200、1000μM之方式添加AMP,在4℃靜置30分鐘。其後,使用將以最終濃度成為0、0.4、4、40、200、1000μM之方式在FACS Buffer中添加AMP作為清洗緩衝液,清洗該細胞株後,添加經FITC標記之二次抗體(Goat F(ab'2)Anti-Human IgG Mouse ads-FITC、Beckman 732598),再次在4℃靜置30分鐘並遮光。再次進行清洗操作後,利用流式細胞儀(FACS CyAn
TMADP)進行測定、解析。將結果揭示於圖2。
由以上的結果可知,ABAM004顯示AMP的濃度依賴性的對於hCTLA4表現細胞的結合活性,不僅可溶型抗原,對於膜型抗原亦顯示AMP濃度依賴性的結合活性。
(1-11)將人類周邊血液單核球使用作為效應細胞之受驗抗體的ADCC活性
ATP依賴性地與抗原結合之抗體係遵循以下方法而測定抗體濃度依賴性的ADCC活性。此時,將人類周邊血液單核球(以下稱為人類PBMC)使用作為效應細胞,並如以下般測定受驗抗體的ADCC活性。
首先,製備人類PBMC溶液。使用已預先注入200μL之1000單位/mL的肝素溶液(Novo-Heparin注5千單位、Novo Nordisk)的注射器,並由健康正常人志願者(成人男性)採取周邊血液50 mL。將已使用PBS(-)稀釋成2倍之該周邊血液分成4等分,添加至已預先注入15 ml的Ficoll-Paque PLUS並已進行離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)中。將已分注該周邊血液的分離管藉由2150 rpm的速度在室溫進行10分鐘離心分離操作後,分取單核球部分(fraction)層。藉由包含10 % FBS之RPMI-1640(Nacalai Tesque)(以下稱為10 % FBS/RPMI),將該部分層所含之細胞清洗一次後,以細胞密度成為1×10
7細胞/mL之方式,將該細胞懸浮於10 % FBS/ RPMI中。將該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液並供應至後續實驗。
接著,作為標的細胞之使CHO細胞強制表現人類CTLA4細胞外域之hCTLA4-CHO細胞係以成為2×10
5細胞/mL之方式被懸浮在10 % FBS/ RPMI中而被製備。再者,將已使用RPMI稀釋成4 mM之AMP(sigma)作為AMP溶液並供應至後續試驗。
ADCC活性係利用LDH(lactate dehydrogenase,乳酸脫氫酶)釋放法進行評價。首先,已製備成各濃度(0、0.04、0.4、4、40μg/mL)之抗體溶液被添加至96孔U底盤的各孔中各50μL,各播種50μL的標的細胞(1×10
4cells/孔)。再者,添加AMP溶液各50μl,在室溫靜置15分鐘。在各孔中添加人類PBMC溶液各50μL(5×10
5cells/孔),將該盤進行離心操作後,在5 %碳酸氣體培養箱中以37℃靜置4小時。反應結束後,回收100μL的培養上清液,並移至測定用的96孔盤後,添加100μL之以1:45混合LDH detection Kit(TaKaRa)所附的Catalyst(C)及Dye solution(D)者。在室溫反應15分鐘後,添加50μL之1N的HCl使反應停止。測定492 nm的吸光度,設定由LDH釋放所致之ADCC活性。ADCC活性係基於下式所求取。
ADCC活性(%)={(A-D)-(C-D)}×100/{(B-D)-(C-D)}
上式中,A表示已添加各受驗抗體之孔中的LDH活性(OD492nm)的平均值。又,B表示已在反應後的孔中添加10μL之20 % Triton-X水溶液之孔中的LDH活性(OD492nm)的平均值。再者,C表示已在標的細胞中添加150μL之10 % FBS/RPMI或100μL之10 % FBS/RPMI 及50μL之AMP溶液之孔中的LDH活性(OD492nm)的平均值。D表示已僅裝入10 % FBS/ RPMI之孔中的LDH活性(OD492nm)的平均值。試驗係利用duplicate進行實施,計算反映受驗抗體的ADCC活性之前述試驗中之ADCC活性(%)的平均值。將結果揭示於圖3。
由以上結果可知,該抗體ABAM004在AMP存在下具有抗原結合活性,且具有藉由發揮ADCC活性而殺害標的細胞的能力。
[實施例2]具有ATP依賴性結合特性之抗CTLA4抗體的結晶結構解析
(2-1)將AMP作為開關之抗CTLA4結合抗體ABAM004的X射線結晶結構解析
解析將在實施例1中由庫所取得之以AMP作為開關之hCTLA4結合抗體ABAM004的Fab片段單獨、ABAM004的Fab片段與AMP之複合體、以及ABAM004的Fab片段與AMP、hCTLA4的細胞外域之複合體的結晶結構。
(2-2)用於結晶化之ABAM004全長抗體的製備
用於結晶化之ABAM004全長抗體的製備及精製係藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法進行。
(2-3)用於ABAM004 Fab片段的結晶結構解析之Fab片段的製備
將ABAM004的Fab片段利用rLys-C(Promega、目錄編號V1671)進行限制消化,接著藉由以往的方法進行製備,所述以往的方法中,使用用於去除Fc片段之對於蛋白質A管柱(MabSelect SuRe、GE Healthcare)、陽離子交換管柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare)、及凝膠過濾管柱(Superdex200 16/60、GE Healthcare)的上料(loading)。收集包含Fab片段的部分,並保存在-80℃。
(2-4)ABAM004 Fab片段的結晶的製作
將由2-3的方法所精製之用於結晶化之ABAM004的Fab片段濃縮成約13 mg/mL,藉由坐滴蒸氣擴散法(sitting drop vapor diffusion method),在20℃進行結晶化。儲存(reservoir)溶液係由0.1M MES pH 6.5、25 %w/v 聚乙二醇4000所構成者。將藉此所得之結晶浸漬在0.08M MES pH 6.5、20% w/v 聚乙二醇4000、20% 乙二醇的溶液中。
(2-5)來自ABAM004 Fab片段的結晶之X光繞射數據的收集及結構決定
利用高能量加速器研究機構的放射線設備光子工廠的BL-17A測定X光繞射數據。測定中,將結晶持續放置在-178℃的氮流下維持冷凍狀態,使用連接於射線之Quantum 270 CCD檢測器(ADSC),一邊使結晶每次旋轉0.5°,一邊收集總計360個的X光繞射影像。使用Xia2程式(J. Appl. Cryst. 43: 186-190(2010))、XDS PACKAGE(Acta. Cryst. D66: 125-132(2010))、及Scala(Acta. Cryst. D62: 72-82(2006)),進行晶胞參數(cell parameter)的決定、索引繞射點、及由繞射影像所得之繞射數據的處理,最終取得分解能1.70Å為止的繞射強度數據。結晶學的數據統計值被揭示於表7。
使用程式Phaser(J. Appl. Cryst.(2007)40, 658-674),並藉由分子取代法而決定結構。Fab片段的搜尋模型係源自已公開Fab的結晶結構(PDB編碼:4NKI)。利用Coot程式(Acta Cryst. D66: 486-501(2010))構築模式,並利用程式Refmac5(Acta Cryst. D67: 355-467(2011))進行精密化。來自52.92-1.70Å之繞射強度數據的結晶學的信頼度因子(R)為16.92%,Free R值為21.22%。結構精密化統計值被揭示於表7。
(2-6)用於ABAM004 Fab片段與AMP複合體以及與AMP、hCTLA4複合體的結晶結構解析之來自全長抗體的ABAM004 Fab片段的製備
將ABAM004的Fab片段藉由木瓜酵素(Roche Diagnostics、目錄編號1047825)進行限制消化,接著藉由以往的方法進行製備,所述以往的方法中,使用用於去除Fc片段之對於蛋白質A管柱(MabSelect SuRe、GE Healthcare)、陽離子交換管柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare)、及凝膠過濾管柱(Superdex200 16/60、GE Healthcare)的上料。收集包含Fab片段的部分,並保存在-80℃。
(2-7)ABAM004 Fab片段與AMP複合體之結晶的製作
對於已利用2-6的方法所精製之用於結晶化之ABAM004的Fab片段濃縮成約13 mg/mL者,以最終濃度成為2 mM之方式,添加AMP,藉由坐滴蒸氣擴散法(sitting drop vapor diffusion method),在20℃進行結晶化。儲存溶液係由0.1M Morpheus buffer 2 pH 7.5、37.5% w/v MPD_P1K_P3350、10% Morpheus Carboxylic acids(Morpheus、Molecular Dimensions)所構成者。
(2-8)來自ABAM004 Fab片段與AMP複合體的結晶之X光繞射數據的收集及結構決定
利用高能量加速器研究機構的放射線設備光子工廠的BL-1A測定X光繞射數據。測定中,將結晶持續放置在-178℃的氮流下維持冷凍狀態,使用連接於射線之Pilatus 2M 檢測器(DECTRIS),一邊使結晶每次旋轉0.25°,一邊收集總計720個的X光繞射影像。使用Xia2程式(J. Appl. Cryst. 43: 186-190(2010))、XDS PACKAGE(Acta. Cryst. D66: 125-132(2010))、及Scala(Acta. Cryst. D62: 72-82(2006)),進行晶胞參數的決定、索引繞射點、及由繞射影像所得之繞射數據的處理,最終取得分解能1.70Å為止的繞射強度數據。結晶學的數據統計值被揭示於表7。
使用程式Phaser(J. Appl. Cryst.(2007)40, 658-674),並藉由分子取代法,決定結構。Fab片段的搜尋模型係源自已公開的Fab的結晶結構(PDB編碼:4NKI)。利用Coot程式(Acta Cryst. D66: 486-501(2010))構築模式,並利用程式Refmac5(Acta Cryst. D67: 355-367(2011))進行精密化。來自47.33-2.89Å之繞射強度數據的結晶學的信頼度因子(R)為19.97%,Free R值為25.62%。結構精密化統計值被揭示於表7。
(2-9)hCTLA4細胞外域的製備
hCTLA4的細胞外域係將阿巴西普利用Endoproteinase Lys-C(Roche、目錄編號11047825001)進行制限消化,接著藉由以往的方法進行製備,所述以往的方法中,使用用於去除Fc片段之對於蛋白質A管柱(MabSelect SuRe、GE Healthcare)、及凝膠過濾管柱(Superdex200 10/300、GE Healthcare)的上料。收集包含hCTLA4的細胞外域的部分,並保存在-80℃。
(2-10)ABAM004 Fab片段與AMP及hCTLA4細胞外域複合體的製備
將由2-9的方法所精製之hCTLA4細胞外域與由2-6的方法所精製之ABAM004的Fab片段以1.5:1的莫耳比進行混合,以最終濃度成為2 mM之方式添加AMP。藉由使用已利用25 mM HEPES pH7.5、100 mM NaCl、2 mM AMP進行平衡化的管柱之凝膠過濾層析法(Superdex200 10/300、GE Healthcare),精製複合體。
(2-11)ABAM004 Fab片段與AMP及hCTLA4細胞外域複合體之結晶的製作
將已精製之複合體濃縮成約8 mg/mL,藉由與播晶種法組合之坐式蒸氣擴散法(sitting drop vapor diffusion),在20℃進行結晶化。儲存溶液係由0.1M Morpheus buffer 1 pH 6.5、37.5% w/v M1K3350、10% halogens(Morpheus、Molecular Dimensions)所構成者。
(2-12)來自ABAM004 Fab片段與AMP及hCTLA4細胞外域複合體的結晶之X光繞射數據的收集及結構決定
利用SPring-8的BL32XU測定X光繞射數據。測定中,將結晶持續放置在-178℃的氮流下維持冷凍狀態,使用連接於射線之MX-225HS CCD檢測器(RAYONIX),一邊使結晶每次旋轉1.0°,一邊收集總計180個的X光繞射影像。使用Xia2程式(J. Appl. Cryst. 43: 186-190(2010))、XDS PACKAGE(Acta. Cryst. D66: 125-132(2010))、及Scala(Acta. Cryst. D62: 72-82(2006)),進行晶胞參數的決定、索引繞射點、及由繞射影像所得之繞射數據的處理,最終取得分解能1.70Å為止的繞射強度數據。結晶學的數據統計值被揭示於表7。
使用程式Phaser(J. Appl. Cryst.(2007)40, 658-674),並藉由分子取代法,決定結構。Fab片段的搜尋模型係來自已公開之Fab的結晶結構(PDB編碼:4NKI),hCTLA4的細胞外域的搜尋模型係來自已公開之人類CTLA4的結晶結構(PDB編碼:3OSK, J. Biol. Chem. 286: 6685-6696(2011))。利用Coot程式(Acta Cryst. D66: 486-501(2010))構築模式,利用程式Refmac5(Acta Cryst. D67: 355-367(2011))進行精密化。來自52.81-3.09Å之繞射強度數據的結晶學的信頼度因子(R)為23.49%,Free R值為31.02%。結構精密化統計值被揭示於表7。
(2-13)ABAM004與AMP之相互作用部位的辨識
由本結晶結構,可知AMP主要是藉由該抗體的重鏈而被辨識。
AMP的腺嘌呤環部分係藉由重鏈CDR1、3而被辨識,核糖部分及磷酸基部分係藉由CDR1、2而被辨識。
具體而言,如圖4所示,AMP的腺嘌呤環部分係藉由該抗體之屬於重鏈CDR1的T33、屬於CDR3的Y95、L100B、W100C的各側鏈以及G96、M100A的各主鏈而被辨識。尤其,已知G96以及M100A的主鏈的羰基氧會與AMP的6位的N形成氫鍵,W100C的主鏈醯胺NH基會與1位的N形成氫鍵,Y95、L100B、W100C的側鏈會形成利用腺嘌呤環部分所具有之派電子的相互作用,藉此該抗體會牢固地辨識腺嘌呤環部分。核糖部分係藉由屬於重鏈CDR1的T33、屬於CDR2的Y56以及Y58的各側鏈,並藉由凡得瓦爾力相互作用、由Y56所具有的派電子所致之相互作用而被辨識。又,磷酸基部分係藉由屬於重鏈CDR1的T33、屬於CDR2的S52、S52A、R53的各側鏈以及、S52A的主鏈而被辨識。尤其,T33的側鏈、及S52A的主鏈醯胺NH基與磷酸基部分形成的氫鍵、以及由S52與R53所致之凡得瓦爾力相互作用,被認為在磷酸基部分的辨識上負責重要角色。此外,Fab的胺基酸的殘基編號係基於賦予Kabat編號的格式。
(2-14)ABAM004之抗原決定位的辨識
在圖5及、圖6中,ABAM004 Fab接觸區域的抗原決定位,分別在hCTLA4結晶結構中及胺基酸序列中被製圖。抗原決定位包含hCTLA4的胺基酸殘基,所述hCTLA4的胺基酸殘基包含1個以上的非氫原子,所述非氫原子係在結晶結構中位於離ABAM004 Fab或AMP的任一部分4.2Å以內的距離。
至少,由結晶結構已知,抗原的M3、E33、R35、T53、E97、M99、Y100、P101、P102、P103、Y104、Y105、L106係藉由該抗體的重鏈CDR2、CDR3、輕鏈CDR1、CDR3、以及AMP而被辨識。尤其,由抗原的M99至Y104所組成的環圈(loop),以被包埋在該抗體的CDR環圈中之方式,被該抗體強力辨識,被認為在由抗體所致之抗原辨識中負責重要角色。
(2-15)AMP依賴性的抗原結合的機制
圖7係從ABAM004 Fab單獨的結晶結構、ABAM004 Fab與AMP之複合體的結晶結構、以及由ABAM004 Fab與AMP及CTLA4所組成之三元複合體的結晶結構,萃取該抗體的可變區,並將重鏈作為中心進行重合之圖。AMP依賴性的抗原結合,不僅由實施例2-14所示之AMP與CTLA4之間的直接相互作用,亦認為伴隨AMP的結合之該抗體的結構變化為重要。
如圖7所示,藉由將該抗體的單獨的結晶結構與AMP已結合在該抗體之結晶結構進行比較,可知重鏈CDR3與輕鏈CDR3之環圈結構、以及該抗體的可變區中之重鏈與輕鏈之間的扭轉角亦變化。再者,若將已在該抗體結合AMP之結晶結構與由該抗體、AMP及CTLA4所組成之三元複合體的結晶結構進行比較,則重鏈CDR3以及輕鏈CDR1係藉由抗原的結合而進一步使結構變化,亦見到抗原依賴性的結構變化。另一方面,因輕鏈CDR3的環圈結構及重鏈與輕鏈之間的扭轉角並無變化,故認為AMP的結合並不使該抗體的結構變化成與抗原結合時的結構相近的狀態。因此,伴隨AMP的結合之結構變化,對於形成抗原的結合所具備之適當結構而言為必要的,被認為在AMP依賴性的抗原結合負責重要角色。
[實施例3]經改變的CTLA4抗體的製作、及其活性評價
(3-1)ABAM004抗體的CTLA4結合活性增強改變體的製作
由實施例1所記載之從人類循理設計噬菌體庫所取得之ABAM004(VH序列識別號:10、VL序列識別號:11),其胺基酸序列被改變,該序列與ATP類似體不存在下的CTLA4結合活性被降低,在ATP類似體存在下的人類CTLA4結合活性被提升,對於ATP及ATP類似體的結合被提升。因此,以由實施例2所記載之方法所取得之ABAM004與AMP的共結晶結構及ABAM004與AMP、人類CTLA4的共結晶結構為基礎,製作預期參與該結合之殘基的點變異體。再者,亦製作將CDR所含之全部胺基酸取代成Ala或者Pro之改變體。該點變異體係藉由Biacore T200或者Biacore 4000(GE Healthcare)而測定在ATP不存在下及ATP、ADP或者AMP存在下的人類CTLA4(Abatacept與hCTLA4-His-BAP)結合活性,篩選使該結合活性提升之突變。製作將使結合活性提升的突變進行組合之變異體,藉由Biacore進行KD值計算。其結果,可知若將ABAM004的重鏈取代成H32A、S52aT,將輕鏈取代T24D、T26P、E50F(編號為Kabat編號),則會使ABAM004的該結合特性提升。將該變異體稱為04H0150/04L0072(VH序列識別號:47、VL序列識別號:48)。
(3-2)利用表面電漿共振之ABAM004及04H0150/04L0072對於人類CTLA4結合活性的ATP及其代謝物的影響的測定
首先,製作Biacore T200測定用的晶片。Biacore T200的設定溫度為25℃,流速被設為10μL/min。泳動緩衝液中,能使用HBS-EP+。對於Sensor chip CM5(GE Healthcare),以流速10μL/min,耗費10分鐘添加NHS(N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide))與EDC(N-乙基-N'-(二甲基胺基丙基)碳二亞胺(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide))的等量混合液,將flow cell進行活性化。接著,以10μL/min,耗費30分鐘添加已懸浮於10 mM 醋酸鈉 pH 4.0之25μg/mL的Protein A/G(Pierce),並使其結合。之後,以10μL/min,耗費10分鐘添加1M 乙醇胺-HCl,使其與flow cell上的過剩活性基進行阻斷。
接著,測定目標抗體對於人類CTLA4的結合中之ATP及其代謝物的影響。設定溫度為25℃,泳動緩衝液能使用TBS。再生溶液能使用10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)。在捕捉已懸浮於TBS之抗體後,將包含500 nM的hCTLA4-His-BAP、從4000μM開始以公比4稀釋10次之各濃度的ATP、ADP或AMP、及2 mM MgCl
2之TBS溶液,以流速10μL/min耗費3分鐘注入至各flow cell。將此3分鐘設為hCTLA4-His-BAP的結合相。結合相結束後,將切換成泳動緩衝液的2分鐘設為解離相。解離相結束後,以流速30μL/min耗費30秒鐘注入再生溶液,將以上設為結合活性測定循環。在結合相中,對於ABAM004及04H0150/04L0072進行相互作用之hCTLA4-His-BAP的結合量係以被捕捉的抗體量進行修正,並揭示於圖8。又,在ABAM004及04H0150/04L0072的結合測定中,結合相中之小分子濃度被保持在62.5μM或者1 mM,從2000 nM開始以公比2所稀釋之8次的濃度的hCTLA4-His-BAP能被用於結合相。由hCTLA4-His-BAP的結合量的解析所得之KD值被揭示於表8。數據的解析及作圖中,使用Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0及Microsoft Excel 2013(Microsoft)。KD值的計算能使用穩定狀態親和模式。
(3-3)由全面地改變的導入所致之結合能的增強
為了製作更優異的抗CTLA4抗體,對於在實施例3-1中所製作之抗人類CTLA4抗體的可變區亦即04H0150/04L0072,全面地導入胺基酸改變。藉由PCR等本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,對於04H0150及04L0072的全部CDR,除了半胱胺酸之外,製作對於全18胺基酸的取代體。所製作之約1200個改變體對於人類CTLA4之結合測定係使用Biacore 4000而實施。對於已在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)固定化Protein A/G(Thermo Fisher Scientific)之晶片,使抗體改變體的培養上清液進行相互作用,捕捉抗體。接著,使已添加小分子(ATP、ADP、或者AMP)的人類CTLA4溶液、或者未添加小分子的人類CTLA4溶液進行相互作用,評價在小分子存在下及小分子不存在下的抗體與人類CTLA4之結合能。作為泳動緩衝液,使用Tris buffered saline、0.02% PS20,在25℃進行測定。
使用上述的方法,組合在小分子存在下對於人類CTLA4之結合進行增強的改變、及在小分子不存在的條件下對於人類CTLA4之結合進行降低的改變,製作顯示更優異的概貌之抗人類CTLA4抗體。對於作為重鏈可變區具有04H0150、作為重鏈恆定區具有已去除人類IgG1的C端的Gly及Lys之G1m(序列識別號:82)的抗體重鏈04H0150-G1m(序列識別號:209)的基因,將藉由導入全面地改變所發現之改變及對於框架(Framework)之改變進行組合,製作抗體重鏈基因。又,對於作為輕鏈可變區具有04L0072、作為輕鏈恆定區具有人類λ鏈lam1(序列識別號:87)的抗體輕鏈04L0072-lam1(序列識別號:208),組合所發現之改變,製作抗體輕鏈基因。再者,亦一併製作將輕鏈可變區的框架及恆定區取代成人類κ鏈的序列之改變體。又,作為比較對象,製作具有WO0114424所記載之既存的抗人類CTLA4抗體的重鏈可變區MDX10D1H(序列識別號:154)的抗體重鏈MDX10D1H-G1m(序列識別號:210)的基因、與具有輕鏈可變區MDX10D1L(序列識別號:155)的抗體輕鏈MDX10D1L-k0MT(序列識別號:211)的基因。組合此等基因,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,抗體被表現、被精製,製作目標的抗CTLA4抗體。表9展示所製作之抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈恆定區、及超可變區(Hyper Variable Region)的序列識別號。
此外,本說明書中之抗體係依循以下的規則進行命名:(重鏈可變區)-(重鏈恆定區)/(輕鏈可變區)-(輕鏈恆定區)。例如,若為所謂04H0150-G1m/04L0072-lam1的抗體名,則意指本抗體的重鏈可變區為04H0150,重鏈恆定區為G1m,輕鏈可變區為04L0072,輕鏈恆定區為lam1。
所製作之抗體對於人類CTLA4的結合測定係使用Biacore T200而實施。作為泳動緩衝液,能使用對於20 mM ACES(pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mM MgCl
2、0.05% Tween20添加目標濃度之ATP者,在37℃進行測定。首先,對於在Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)固定化Protein G(CALBIOCHEM)之晶片,使由不包含ATP的泳動緩衝液所製備之抗體溶液進行相互作用,藉此捕捉抗體。接著,使由以成為目標濃度之方式添加ATP的泳動緩衝液所製備之人類CTLA4溶液、或者由不包含ATP的泳動緩衝液所製備之人類CTLA4溶液進行相互作用,藉此評價在ATP存在下及ATP不存在下的抗體與人類CTLA4之結合能。晶片係藉由25 mM NaOH與10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)而被回收再利用,重複捕捉抗體而進行測定。各抗體對於CTLA4的解離常數係使用Biacore T200 Evaluation Software 2.0而計算。具體而言,將藉由測定所得之傳感圖以1:1 Langmuir結合模式(Langmuir binding model)使其整體擬合(global fitting),藉此計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s),並由該值計算解離常數KD(mol/L)。或者,藉由穩定狀態模式(steady state model)計算解離常數KD(mol/L)。又,將藉由測定所得之從傳感圖所求取的CTLA4的結合量以晶片表面所捕捉之抗體的量進行修正,藉此計算每單位抗體量之CTLA4的結合量。表10揭示此等的測定結果。
表中的「對於人類CTLA4的結合」之值,表示在所記載之各ATP濃度條件中,使人類CTLA4以1000 nM進行相互作用時的每單位抗體量之人類CTLA4的結合量,「對於人類CTLA4的KD(M)」表示各ATP濃度條件中之對於人類CTLA4的解離常數。表中附有*符號的KD值係利用穩定狀態模式計算。相較於04H0150-G1m/04L0072-lam1,將04H0150-G1m/04L0072-lam1作為親代抗體所製作之改變體在ATP存在下的結合皆增強。又,04H0150-G1m/04L0072-lam1及此等改變體,比起在ATP存在1μM的條件下,在10μM存在下之結合量更多,在100μM存在下之結合量又更多,因此顯示ATP濃度依賴性地與人類CTLA4結合。另一方面,為比較對象之MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT未顯示此種ATP濃度依賴性之對於人類CTLA4的結合。相較於04H1077-G1m/04L1086-lam1,將04H1077-G1m/04L1086-lam1的輕鏈框架及恆定區取代成人類κ鏈之04H1077-G1m/04L1305-k0MT在ATP不存在下對於人類CTLA4的結合增強,且ATP濃度依賴性的結合亦增強。由此等結果,顯示即使進行對於人類κ鏈序列的取代,亦維持ATP依賴性地與人類CTLA4結合的性質。於此所製作之抗體中,04H1077-G1m/04L1066-lam1、04H1077-G1m/04L1305-k0MT、04H1207-G1m/04L1086-lam1在ATP存在100μM的條件中顯示與既存的抗人類CTLA4抗體亦即MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT幾乎同等的結合活性,04H1208-G1m/04L1407-k0MT在ATP存在10μM以上的條件下顯示比MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT更強的結合活性。
接著,評價在表10中所製作之抗體之中04H1077-G1m/04L1086-lam1與04H1208-G1m/04L1407-k0MT對於小鼠CTLA4的結合。作為比較對象,製作具有抗小鼠CTLA4抗體的重鏈可變區hUH02(序列識別號:156)之抗體重鏈hUH02-G1d(序列識別號:212)的基因、與具有輕鏈可變區hUL01(序列識別號:157)之抗體輕鏈hUL01-k0(序列識別號:213)的基因,並使其表現、進行精製而使用。以與對於人類CTLA4的結合測定同樣的條件,作為樣本,使用小鼠CTLA4,使用Biacore T200而實施測定(表11)。小鼠CTLA4的製備係如以下般進行。
將在小鼠CTLA4細胞外域連結His標籤者(mCTLA4-His)(序列識別號:49)進行基因合成,插入動物表現用質體。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)中以1.33×10
6細胞/mL的細胞密度被懸浮且被播種至細胞培養瓶之源自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen),藉由脂質體法導入所製備之質體。使用分光光度計,測定所精製之抗原溶液在280 nm的吸光度。使用藉由PACE法所計算之吸光係數,由所得之測定值計算所精製之抗原的濃度(Protein Science(1995)4, 2411-2423)。
表中的「對於小鼠CTLA4的結合」之值,表示在所記載之各ATP濃度條件中使小鼠CTLA4以1000 nM進行相互作用時的每單位抗體量之小鼠CTLA4的結合量,「對於小鼠CTLA4的KD(M)」表示各ATP濃度條件中之對於小鼠CTLA4的解離常數。hUH02-G1d/hUL01-k0不論ATP的濃度為何皆對於小鼠CTLA4同程度地結合,相對於此,04H1077-G1m-04L1086-lam1與04H1208-G1m/04L1407-k0MT皆顯示ATP濃度依賴性地與小鼠CTLA4結合。若與表10所示之對於人類CTLA4的結合能進行比較,在100μM之ATP存在下,4H1077-G1m-04L1086-lam1對於小鼠CTLA4的結合能比起對於人類CTLA4的結合能弱約5倍,04H1208-G1m/04L1407-k0MT對於小鼠CTLA4的結合能比起對於人類CTLA4的結合能弱約2倍。
(3-4)抗mCTLA4對照組抗體及抗mCTLA4開關抗體的製作
製作抗mCTLA4對照組抗體(hUH02-mFa55/hUL01-mk1 簡稱:mNS-mFa55)及抗CTLA4開關(04H1077-mFa55/04L1086-ml0r 簡稱:SW1077-mFa55、04H1208-mFa55/04L1407s-mk1 簡稱:SW1208-mFa55)。mNS-mFa55抗體使用重鏈可變區hUH02(序列識別號:16)及輕鏈可變區hUL01(序列識別號:17),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
SW1077-mFa55抗體使用重鏈可變區04H1077(序列識別號:20)及輕鏈可變區04L1086(序列識別號:21),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區ml0r(序列識別號:22)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
SW1208-mFa55抗體使用重鏈可變區04H1208(序列識別號:23)及輕鏈可變區04L1407s(序列識別號:24),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
(3-6)CTLA4開關抗體的中和活性評價
由實施例3-4所製備之抗CTLA4開關抗體(SW1077-mFa55)的中和活性係藉由競爭ELISA法而評價。以0.1M NaHCO
3、0.05% NaN
3將已在mCTLA4連結人類恆定區的mCTLA4-Fc(序列識別號:25)稀釋成5μg/mL(55 nM),將所製作之mCTLA4-Fc溶液各100μL地添加至96孔盤中,在4℃靜置一晩,固定於盤表面。以TBS、0.1% Tween20清洗3次後,在各孔中各添加250μL之已以TBS稀釋成2%的BSA溶液,將盤表面進行阻斷。之後,清洗3次。將以最終濃度成為55 nM之方式在已以TBS稀釋的小鼠CD86中融合人類恆定區及His標籤而成之mCD86-Fc-His(Sino Biologics Inc. 50068-M03H, Accession No. NP_062261.3)、以最終濃度成為6.25、1.56、0.390、0.0977、0.0061、0μg/mL之方式稀釋之SW1077-mFa55抗體溶液、及以最終濃度成為0、1、10、100μM之方式稀釋之ATP溶液,以分別成為總計100μL之方式進行混合,添加至各孔,在37℃靜置1小時。之後,利用以包含與添加至各孔之溶液的ATP濃度相同的ATP濃度之方式所製備的TBS、0.1% Tween20,將各孔清洗3次。以包含與添加至各孔之溶液的ATP濃度相同的ATP濃度之方式,將利用阻斷緩衝液稀釋成10000倍之anti-His-tag mAb-HRP-Direct(MBL life science)各100μL地添加至各孔,在37℃靜置1小時。之後,利用以包含與添加至各孔之溶液的ATP濃度相同的ATP濃度之方式所製備的TBS、0.1% Tween20,將各孔清洗3次。再將TMB溶液各100μL地添加至各孔,在37℃靜置1小時,在各孔添加50μL之1M H
2SO
4,使反應停止,利用吸光微量盤分析儀(Wako Sunrise)檢測450 nm的吸光度。
將在同ATP濃度條件下之未添加抗體的孔的吸光度的值設為mCTLA4-mCD86結合率100%,評價藉由抗體添加而其結合率降低至何等程度。將其結果揭示於圖9。
由此結果可知,SW1077抗體顯示對於mCTLA4-mCD86的相互作用之中和活性是在分析中之ATP濃度愈高則變得愈強。由此結果可確認,SW1077抗體具有ATP依賴性的中和活性。
(3-7)同系腫瘤細胞移植小鼠模式中之抗CTLA4開關抗體的藥效、腫瘤內的調節性T(Treg)細胞的增減、及脾臟中之全身反應標記的動向
(3-7-1)細胞株及同系腫瘤株移植小鼠模式的製作
細胞係使用由理化學研究所所購入之小鼠乳癌株FM3A細胞。FM3A細胞係利用包含10% 牛血清(Thermo Fisher Scientific)之RPMI1640培養基(SIGMA)進行維持繼代。小鼠係使用由CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN公司所購入之C3H/HeN小鼠(7週齡,♀)。將FM3A細胞移植至小鼠的腹部皮下,將在移植腫瘤的體積成為約150 mm
3至300 mm
3的時間點設定為模式成立。
移植腫瘤的體積係利用以下公式計算。
腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2
(3-7-2)投予藥劑的製備
對於FM3A細胞移植模式的投予藥劑,設為由實施例3-4所製備之抗小鼠CTLA4對照組抗體(mNS-mFa55)及抗CTLA4開關抗體(SW1208-mFa55)。mNS-mFa55係以成為0.0005 mg/mL、0.005 mg/mL、0.0125 mg/mL、0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、5 mg/mL之方式,SW1208-mFa55係以成為0.005 mg/mL、0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、5 mg/mL、25 mg/mL之方式,分別使用His-buffer(20 mM His-HCl、150 mM NaCl,pH 6.0)製備。
(3-7-3)在抗腫瘤效果測定時的藥劑投予
在移植後第9日,mNS-mFa55係以0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、0.25 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg的用量,SW1208-mFa55係以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg的用量,分別投予至小鼠。投予係將所製備之投予液以20 mL/kg的用量由尾靜脈進行。
將關於抗腫瘤效果測定時的藥劑配方的詳細內容揭示於表12。
(3-7-4)抗腫瘤效果的評價
針對抗腫瘤效果,以利用(3-7-1)所記載之計算式所計算的腫瘤體積進行評價。
針對腫瘤增殖抑制率(TGI:Tumor Growth Inhibition)值,係由以下的計算式進行計算。
TGI(%)=(1-(測定時中之注目群組的腫瘤體積的平均值-初次投予時中之注目群組的腫瘤體積的平均值)÷(測定時中之對照群組的腫瘤體積的平均值-初次投予時的對照群組的腫瘤體積的平均值))×100
結果,mNS-mFa55係在0.1 mg/kg以上的用量中,SW1208-mFa55係在1 mg/kg以上的用量中,在投予後第13日顯示TGI=60%以上的藥效(圖10及圖11)。
(3-7-5)腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑投予
在移植後第7日,將抗小鼠CTLA4對照組抗體(mNS-mFa55)以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg由尾靜脈進行投予,將抗CTLA4開關抗體(SW1208-mFa55)以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。將關於腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑配方之詳細內容揭示於表13。
(3-7-6)來自FM3A細胞移植模式小鼠之腫瘤、脾臟的摘出
在抗體投予後第6日,在麻醉下將小鼠進行安樂死處理,摘出腫瘤與脾臟。由所摘出之脾臟,使用包含10% FBS(SIGMA)之RPMI-1640培養基(SIGMA)製備細胞懸浮液後,使用小鼠紅血球裂解套組(Mouse Erythrocyte Lysing kit)(R&D)進行溶血處理,製備脾臟細胞。所摘出之腫瘤係使用腫瘤解離套組、小鼠(Tumor dissociation kit, mouse)(miltenyi)進行破碎。基於已將脾臟細胞、腫瘤進行破碎者,使其與以下的抗體進行反應,藉由FACS解析,將存在之免疫細胞的部分(fraction)進行解析。抗CD45抗體(BD、殖株:30-F11)、抗CD3抗體(BD、殖株:145-2C11)、抗CD4抗體(BD、殖株:RM4-5)、抗FoxP3抗體(eBioscience、殖株:FJK-16s)、抗ICOS抗體(eBioscience、殖株:7E17G9)、抗KLRG1抗體(Biolegend,殖株:2F1/KLRG1)。FACS解析係利用BD LSRFortessa X-20(BD)進行。
(3-7-7)在FM3A細胞移植模式的腫瘤的Treg評價
評價抗小鼠CTLA4對照組抗體(mNS-mFa55)及抗CTLA4開關抗體(SW1208-mFa55)投予時之腫瘤內的effector Treg細胞(CD4
+FoxP3
+KLRG1
+)的變化。結果,mNS-mFa55及SW1208-mFa55在1 mg/kg以上的劑量中,effector Treg的比例皆減少至小於CD45陽性細胞的0.2%(圖12)。
(3-7-8)在FM3A細胞移植模式的脾臟的全身作用評價
將mNS-mFa55及SW1208-mFa55投予時之脾臟內的活性化輔助T細胞(helper T cell)(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)的變化,利用FACS解析進行評價。結果,在mNS-mFa55投予時,在脾臟的活性化輔助T細胞相對於CD45陽性細胞之比例顯著增加,但SW1208-mFa55即使投予劑量提升,亦不會使在脾臟的活性化輔助T細胞相對於CD45陽性細胞之比例顯著增加(圖13)。該開關抗體顯示與對照組抗體同等的藥效,另一方面,確認在腫瘤以外的組織中未引起反應,在小鼠活體內證明僅侷限在腫瘤顯示活性的概念。
[實施例4]經改變的CTLA4抗體的製作、及其活性評價
實施在實施例3中所製作之抗CTLA4開關抗體的進一步改變與評價。
(4-1)由對於ATP的結合增強改變所致之對於CTLA4的結合能的增強
由在實施例2-1中所實施之結構解析的結果,顯示抗體重鏈的CDR2與AMP的磷酸基進行相互作用。在小分子為ATP之情形中,認為γ磷酸基可能與重鏈CDR2發生立體阻礙,因此探討將此區域的胺基酸進行取代,增強與ATP的結合能。具體而言,對於在實施例3中所製作之04H1207-G1m/04L1086-lam1及04H1208-G1m/04L1086-lam1的重鏈可變區,導入R53Q與G55H的改變,製作04H1389-G1m/04L1086-lam1與04H1382-G1m/04L1086-lam1。又,將04H1389-G1m/04L1086-lam1的輕鏈取代成人類κ鏈的序列,製作04H1389-G1m/04L1305-k0MT。表14展示此等抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈恆定區、及超可變區(Hyper Variable Region)的序列識別號。
利用Biacore T200評價所製作之改變體對於ATP的結合及對於人類CTLA4的結合。對於ATP的結合測定,作為泳動緩衝液,能使用20 mM ACES(pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mM MgCl
2、0.05% Tween20,在37℃實施。首先,對於在Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)固定化Sure Protein A(GE Healthcare)之晶片,使由泳動緩衝液所製備之抗體溶液進行相互作用,藉此捕捉抗體。接著,使由泳動緩衝液所製備之ATP溶液進行相互作用,藉此評價與抗體的結合能。晶片係使用25 mM NaOH與10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)而被回收再利用,重複捕捉抗體並進行測定。各抗體對於ATP的結合量係藉由將以100 nM的濃度注入ATP時的結合量利用已捕捉在晶片表面的抗體的量進行修正,藉此計算每單位抗體量之ATP的結合量。對於人類CTLA4的結合測定係以實施例3-3所記載之方法並使用Biacore T200而實施。表15揭示此等測定結果。
相較於R53Q/G55H導入前之親代抗體04H1207-G1m/04L1086-lam1及04H1208-G1m/04L1086-lam1,04H1389-G1m/04L1086-lam1與04H1382-G1m/04L1086-lam1對於ATP的結合能增強。相較於R53Q/G55H導入前之親代抗體04H1207-G1m/04L1086-lam1及04H1208-G1m/04L1086-lam1,04H1389-G1m/04L1086-lam1與04H1382-G1m/04L1086-lam1對於人類CTLA4的結合能在10μM之ATP存在下增加約10倍。由利用結合量的比較可知,在更低的ATP濃度之對於人類CTLA4的結合能增強。將04H1389-G1m/04L1086-lam1的輕鏈取代成人類κ鏈的序列而成之04H1389-G1m/04L1305-k0MT,亦顯示具有與04H1389-G1m/04L1086-lam1同等的ATP結合能、及ATP依賴性的對於人類CTLA4的結合能。
(4-2)抗人類CTLA4對照組抗體及抗CTLA4開關抗體的製作與結合能的評價
製作抗人類CTLA4對照組抗體(MDX10D1H-mFa55/MDX10D1L-mk1 簡稱:hNS-mFa55)及抗CTLA4開關抗體(04H1389-mFa55/04L1305-mk1 簡稱:SW1389-mFa55)。hNS-mFa55抗體使用重鏈可變區MDX10D1H(序列識別號:26)及輕鏈可變區MDX10D1L(序列識別號:27),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
SW1389-mFa55抗體使用重鏈可變區04H1389(序列識別號:29)及輕鏈可變區04L1305(序列識別號:30),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
評價所製作之hNS-mFa55、SW1389-mFa55對於人類CTLA4的結合。作為泳動緩衝液,能使用對於20 mM ACES(pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mM MgCl
2、0.05% Tween20以成為目標濃度之方式添加ATP而成者,在37℃進行測定。首先,對於在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)固定化Rabbit Anti-Mouse IgG(Thermo Fisher Scientific)之晶片,使由不包含ATP的泳動緩衝液所製備之抗體溶液進行相互作用,藉此捕捉抗體。接著,使由以成為目標濃度之方式添加ATP而成之泳動緩衝液所製備之人類CTLA4溶液、或者由不包含ATP的泳動緩衝液所製備之人類CTLA4溶液進行相互作用,藉此評價在ATP存在下及ATP不存在下的抗體與人類CTLA4之結合能。晶片係藉由25 mM NaOH與10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)而被回收再利用,重複捕捉抗體並進行測定。各抗體對於CTLA4的解離常數係使用Biacore T200 Evaluation Software 2.0而計算。具體而言,藉由測定,將所得之傳感圖以1:1 Langmuir結合模式使其整體擬合,藉此計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s),由該值計算解離常數KD(mol/L)。表16揭示此等測定結果。
由小鼠恆定區所製作之2抗體皆被確認到與人類CTLA4結合。又,與由表15所記載之相同的可變區與人類恆定區所製作之04H1389-G1m/04L1305-k0MT同等地,SW1389-mFa55顯示ATP依賴性地與人類CTLA4結合。
(4-3)在使用人類CTLA4基因敲入(knock-in)、人類CD3基因轉殖小鼠之同系腫瘤細胞移植模式中之抗CTLA4開關抗體、抗CTLA4非開關(non-switch)抗體各自的藥效、腫瘤內的Treg細胞的增減、及在脾臟中之全身反應標記的動向
(4-3-1)細胞株
使用Hepa1-6/hGPC3細胞。此細胞株係由ATCC購入之小鼠肝癌株Hepa1-6細胞,藉由轉染使人類 Glypican 3(hGPC3、序列識別號:181)基因恆常表現而殖株化者。利用包含10% FBS(SIGMA)及600μg/mL GENETICIN(gibco)之D-MEM(高葡萄糖)培養基(SIGMA),將Hepa1-6/hGPC3細胞進行維持繼代。
(4-3-2)同系腫瘤株移植小鼠模式的製作
使用人類CTLA4基因敲入小鼠(Blood(2005)106(9): 3127-3133)與本公司所製作之人類CD3 EDG取代鼠(Sci Rep(2017)7: 45839)的雜交系統亦即人類CTLA4 KI、人類CD3 EDG取代小鼠(hCTLA4 KI hCD3 EDG取代小鼠)。將Hepa1-6/hGPC3細胞移植至hCTLA4 KI hCD3 EDG取代小鼠的皮下,將移植腫瘤的體積的平均成為約200 mm
3至400 mm
3的時間點設定為模式成立。
移植腫瘤的體積係利用以下公式計算。
腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2
(4-3-3)投予藥劑的製備
作為對於Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的投予藥劑,將由實施例4-2所製備之抗CTLA4開關抗體(SW1389-mFa55)或抗人類CTLA4對照組抗體(hNS-mFa55),以分別成為0.01、0.1、1、5、10、20 mg/mL、0.01、0.1、1、3 mg/mL之方式,使用His緩衝液(150 mM NaCl/ 20 mM His-HCl buffer pH 6.0)進行製備。
(4-3-4)抗腫瘤效果測定時的藥劑投予
在移植後第7日,將SW1389-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg,將hNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg由尾靜脈投予至小鼠。將關於抗腫瘤效果測定時的藥劑配方之詳細內容揭示於表17。
(4-3-5)抗腫瘤效果的評價
針對抗腫瘤效果,以利用(4-3-2)所記載之計算式計算腫瘤體積進行評價。統計解析中,使用JMP 11.2.1(SAS Institute Inc.)。
針對TGI(tumor growth inhibition)值,由以下的計算式進行計算。
TGI=(1-(測定時中之注目群組的腫瘤體積的平均值-在抗體投予前的時間點之腫瘤體積的平均值)÷(測定時之對照群組的腫瘤體積的平均值-在抗體投予前的時間點之腫瘤體積的平均值))×100
結果,hNS-mFa55、SW1389-mFa55雙方皆在1 mg/kg以上的劑量,在投予後第18日顯示TGI=60以上的藥效(圖14及圖15)。
(4-3-6)腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑投予
在移植後第7日,將SW1389-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈投予至小鼠,將hNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg由尾靜脈進行投予。將關於腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑配方之詳細內容揭示於表18。
(4-3-7)來自Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式小鼠之腫瘤、脾臟的摘出
在抗體投予後第6日,在麻醉下將小鼠進行安樂死處理,摘出腫瘤與脾臟。由所摘出之脾臟,使用包含10% FBS(SIGMA)之RPMI-1640培養基(SIGMA)製備細胞懸浮液後,使用小鼠紅血球裂解套組(R&D)進行溶血處理,製備脾臟細胞。所摘出之腫瘤係使用腫瘤解離套組、小鼠(miltenyi)進行破碎。基於已將脾臟細胞、腫瘤進行破碎者,使其與以下的抗體進行反應,藉由FACS解析,將存在之免疫細胞的部分(fraction)進行解析。抗CD45抗體(BD、殖株:30-F11)、抗CD3抗體(BD、殖株:UCHT1)、抗CD4抗體(BD、殖株:RM4-5)、抗FoxP3抗體(eBioscience、殖株:FJK-16s)、抗ICOS抗體(eBioscience、殖株:7E17G9)、抗CCR7抗體(Biolegend,殖株:4B12)、抗KLRG1抗體(Biolegend,殖株:2F1/KLRG1)。FACS解析係利用BD LSRFortessa X-20(BD)進行。
(4-3-8)在Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的腫瘤的Treg評價
評價SW1389-mFa55投予時及hNS-mFa55投予時之腫瘤內的effector Treg細胞(CD4
+FoxP3
+CCR7
lowKLRG1
+)的變化。結果,hNS-mFa55 及SW1389-mFa55在1 mg/kg以上的劑量中,effector Treg的比例皆減少至小於CD45陽性細胞的0.2%(圖16)。
(4-3-9)在Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的脾臟的全身作用評價
將hNS-mFa55或SW1389-mFa55投予時之脾臟內的活性化輔助T細胞(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)的變化,利用FACS解析進行評價。結果,在hNS-mFa55投予時,在脾臟的活性化輔助T細胞相對於CD45陽性細胞之比例顯著增加,但SW1389-mFa55投予時,即使投予劑量提升,亦不會見到脾臟中之活性化輔助T細胞的顯著增加(圖17)。該開關抗體顯示與對照組抗體同等的藥效,另一方面,確認在腫瘤以外的組織中未引起反應,在人類CTLA4 KI小鼠活體內證明僅在腫瘤部位顯示活性的概念。
(4-4)供應至食蟹獼猴毒性試驗之抗CTLA4對照組抗體及抗CTLA4開關抗體的製作
製作抗CTLA4對照組抗體(MDX10D1H-Kn125/MDX10D1L-k0MT// MDX10D1H-Hl076/MDX10D1L-k0MT 簡稱:NS-ART1)及抗CTLA4開關抗體(04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-Hl076/04L1305-k0MT 簡稱:SW1389-ART1)。NS-ART1抗體使用重鏈可變區MDX10D1H(序列識別號:26)及輕鏈可變區MDX10D1L(序列識別號:27),恆定區使用先前專利WO2013/002362所記載之人類重鏈恆定區Kn125(序列識別號:31)及人類重鏈恆定區Hl076(序列識別號:32)、人類輕鏈恆定區k0MT(序列識別號:33)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的人類重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
SW1389-ART1抗體使用重鏈可變區04H1389(序列識別號:29)及輕鏈可變區04L1305(序列識別號:30),恆定區使用人類重鏈恆定區Kn125(序列識別號:31)及人類重鏈恆定區Hl076(序列識別號:32)、人類輕鏈恆定區k0MT(序列識別號:33)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的人類重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
此外,本說明書中之異型二聚化抗體(具有二條不同的重鏈多肽及/或二條不同的輕鏈多肽之抗體)係依循以下的規則進行命名:(第一重鏈可變區)-(第一重鏈恆定區)/(第一輕鏈可變區)-(第一輕鏈恆定區)//(第二重鏈可變區)-(第二重鏈恆定區)/(第二輕鏈可變區)-(第二輕鏈恆定區)。例如,若為所謂04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-Hl076/ 04L1305-k0MT之抗體名,則本抗體的第一重鏈可變區意指04H1389,第一重鏈恆定區意指Kn125,第一輕鏈可變區意指04L1305,第一輕鏈恆定區意指k0MT,第二重鏈可變區意指04H1389,第二重鏈恆定區意指Hl076,第二輕鏈可變區意指04L1305,第二輕鏈恆定區意指k0MT。
(4-5)食蟹獼猴毒性試驗的實施
將以全身反應為首之毒性進行評價、比較作為目的,將由實施例4-4所製備之NS-ART1抗體及SW1389-ART1抗體分別對於雄性食蟹獼猴(各3例)投予60 mg/kg,毎週1次,總計5次。投予係使用注射泵進行低速靜脈內投予,實施一般狀態觀察、體重測定、血液・血液化學性檢查、骨髓檢查、病理學檢查及血漿中藥物濃度測定。
兩抗體皆在投予期間中確認到抗藥物抗體的表現,但維持暴露直到投予期間結束為止。藉由NS-ART1抗體投予,確認到自體抗體的表現、發炎性變化(血管炎、發炎性細胞浸潤)、貧血性變化、T細胞的活性化等全身性的自體免疫疾病樣變化,另一方面,在SW1389-ART1抗體投予中,未確認到前述變化。因此,由此等結果可知,SW1389-ART1抗體減輕活體中之毒性。
[實施例5]經改變的CTLA4抗體的製作、及其活性評價
實施在實施例4中所製作之抗CTLA4開關抗體的進一步改變與評價。
(5-1)由全面性改變的導入及框架(Framework)的取代所致之抗體的最適化
對於04H1389-G1m/04L1086-lam1的CDR,全面性地導入胺基酸改變,探索具有更優異的概貌(profile)之改變。胺基酸改變的全面性導入及評價係使用實施例3-3所記載之方法進行。於此,製作已取代所發現之改變的組合及框架之改變體。表19展示此等抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈恆定區、及超可變區(Hyper Variable Region)的序列識別號。表19中的輕鏈04L1594-lam1、04L1581-lam1、04L1610-lam1、04L1612-lam1、04L1610-lam1係對於親代抗體的輕鏈04L1086-lam1導入對於CDR及框架的改變,而具有人類λ鏈的生殖細胞(germline)序列的框架與恆定區。又,04L1615-k0MT、 04L1616-k0MT、 04L1617-k0MT對於04L1086-lam1導入對於CDR的改變,且具有人類κ鏈的生殖細胞序列的框架與恆定區。重鏈可變區04H1389v373係已導入對於親代抗體的重鏈可變區04H1389的CDR之改變者,04H1637、04H1643、04H1654、04H1656、04H1642、04H1735係在04H1389的CDR導入改變,且將框架的序列取代成不同的生殖細胞之重鏈可變區。
利用實施例3-3所記載之方法,評價所製作之改變體對於人類CTLA4的結合活性(表20)。
表中附有*符號的KD值係利用穩定狀態模式所計算。將04H1389-G1m/04L1086-lam1作為親代抗體所製作之改變體任一皆ATP依賴性地與人類CTLA4結合,在ATP存在10μM的條件下顯示具有比顯示3.7×10
-8M的KD之親代抗體更強的結合能。又,此等抗體任一皆在ATP存在10μM的條件下顯示具有比既存的抗人類CTLA4抗體MDX10D1H-G1m/MDX10D1L- k0MT更強的結合能。
利用Biacore T200評價所製作之改變體在ADP、AMP存在下對於人類CTLA4的結合能,並與在ATP存在下的結合能進行比較。在ADP、AMP存在下對於人類CTLA4的結合能,係與在ATP存在下的結合能的評價相同地使用實施例3-3所記載之方法進行,使用ADP或者AMP取代ATP而實施(表21)。
既存的人類CTLA4抗體亦即MDX10D1H-G1m/MDX10D1L- k0MT不論小分子的種類、有無,皆顯示同程度的動力學參數(kinetic parameter),相對於此,ATP依賴性抗CTLA4抗體,不僅ATP,在ADP、AMP存在下亦皆對於人類CTLA4進行結合,在此等的小分子存在的條件下的結合能,比在表20所示之小分子不存在的條件下的結合能更高。因此,顯示此等抗體係ATP、ADP、AMP依賴性地與CTLA4結合之抗體。此等抗體在ATP存在下的結合能最高,接著是在ADP存在下的結合能高,在AMP存在下的結合能最低。任一皆為比起在AMP存在下的結合能,在ADP存在下的結合能強了約3倍,比起在AMP存在下的結合能,在ATP存在下的結合能強了約5倍。在任一小分子存在下,ka的值皆為同程度,但在kd的值可見到差異,比起在ATP存在下,在ADP存在下的解離更快,再者比起在ADP存在下,在AMP存在下的解離更快,因此顯示由小分子的種類所致之KD值的差係源自解離速度的差。
接著,針對幾個改變體,評價對於小鼠CTLA4及食蟹獼猴CTLA4的結合能。利用實施例3-3所記載之方法,使用Biacore T200,評價對於人類CTLA4、小鼠CTLA4、食蟹獼猴CTLA4的結合活性(表22)。食蟹獼猴CTLA4係利用以下方法進行製備。
將在食蟹獼猴CTLA4細胞外域C端融合His標籤及BAP標籤者亦即cyCTLA4-His-BAP(序列識別號:50)進行基因合成,並插入動物表現用質體。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)中以1.33×10
6細胞/mL的細胞密度被懸浮且被播種至細胞培養瓶之源自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen),藉由脂質體法導入所製備之質體,在質體導入後3小時後,以最終濃度成為100μM之方式添加生物素,在CO
2培養箱(37℃、8% CO
2, 125 rpm)中培養4日。由各檢體的培養上清液,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法精製抗原。使用分光光度計,測定所精製之抗原溶液在280 nm的吸光度。使用藉由PACE法所計算之吸光係數,由所得之測定值計算所精製之抗原的濃度(Protein Science(1995)4, 2411-2423)。
顯示所評價之6種類的小分子依賴性CTLA4抗體,不僅人類CTLA4,對於小鼠CTLA4及食蟹獼猴CTLA4亦皆ATP依賴性地結合。
(5-2)經改變的抗CTLA4開關抗體及陰性對照組抗體的製作
製作經改變的抗CTLA4開關抗體(04H1654-mFa55m2P1/04L1610-ml0r// 04H1656-mFa55m2N1/04L1610-ml0r 簡稱:SW1610-mFa55、04H1654-mFa55m2P1/04L1612-ml0r//04H1656-mFa55m2N1/04L1612-ml0r 簡稱:SW1612-mFa55、及04H1389-mFa55/04L1615-mk1 簡稱:SW1615-mFa55)、及陰性對照組抗體(IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1 簡稱:KLH-mFa55)。
SW1615-mFa55抗體使用重鏈可變區04H1389(序列識別號:29)及輕鏈可變區04L1615(序列識別號:34),恆定區使用小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18)及野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19)。此時使用已添加為了增強對於Fcγ受體的結合的改變的小鼠重鏈恆定區,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現,並精製。
SW1610-mFa55抗體,其中之一的重鏈可變區04H1654(序列識別號:35)連結作為恆定區之小鼠重鏈恆定區mFa55m2P1(序列識別號:36),另一重鏈可變區04H1656(序列識別號:37)連結小鼠重鏈恆定區mFa55m2N1(序列識別號:38),再者,輕鏈可變區04L1610(序列識別號:39)使用野生型小鼠輕鏈恆定區ml0r(序列識別號:22),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現並精製。
SW1612-mFa55抗體,其中之一的重鏈可變區04H1654(序列識別號:35)連結作為恆定區之小鼠重鏈恆定區mFa55m2P1(序列識別號:36),另一重鏈可變區04H1656(序列識別號:37)連結小鼠重鏈恆定區mFa55m2N1(序列識別號:38),再者,輕鏈可變區04L1612(序列識別號:40)使用野生型小鼠輕鏈恆定區ml0r(序列識別號:22),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現並精製。
陰性對照組抗體,重鏈可變區IC17Hdk(序列識別號:51)連結作為恆定區之小鼠重鏈恆定區mFa55(序列識別號:18),再者,輕鏈可變區IC17L(序列識別號:52)使用野生型小鼠輕鏈恆定區mk1(序列識別號:19),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法使其表現並精製。
(5-3)具有小鼠恆定區之抗體對於人類CTLA4之結合能的評價
具有小鼠恆定區之抗CTLA4抗體對於抗原之結合能係利用實施例4-2所記載之方法進行評價(表23)。顯示具有小鼠恆定區之此等抗體、皆具有與表22所記載之具有相同可變區且具有人類恆定區之抗體同樣的ATP依賴性的對人類CTLA4的結合能。
(5-4)在使用人類CTLA4基因敲入、人類CD3基因轉殖小鼠之同系腫瘤細胞移植模式中之抗CTLA4開關抗體的藥效、腫瘤內的Treg細胞的增減、及脾臟中之全身反應標記之動向
(5-4-1)細胞株
使用Hepa1-6/hGPC3細胞。此細胞株係由ATCC購入小鼠肝癌株Hepa1-6細胞,藉由轉染(transfection)使人類Glypican 3(hGPC3)基因恒常表現,而殖株化者。Hepa1-6/hGPC3細胞係利用包含10% FBS(SIGMA)及0.6 mg/mL G418(Nacalai Tesque)之D-MEM(高葡萄糖)培養基(SIGMA)維持繼代。
(5-4-2)同系腫瘤株移植小鼠模式的製作
使用人類CTLA4基因敲入小鼠(Blood(2005)106(9): 3127-3133)與在本公司所製作之人類CD3 EDG取代鼠(Sci Rep(2017)7: 45839)的雜交系統之人類CTLA4 KI、人類CD3 EDG取代小鼠(hCTLA4 KI hCD3 EDG取代小鼠)。在hCTLA4 KI hCD3 EDG取代小鼠的皮下移植Hepa1-6/hGPC3細胞,將移植腫瘤的體積平均成為約200 mm
3至400 mm
3的時間點設為模式成立。
移植腫瘤的體積係利用以下公式計算。
腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2
(5-4-3)投予藥劑的製備
對於Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的投予藥劑,設為由實施例5-2所製備之抗CTLA4開關抗體(SW1610-mFa55、SW1612-mFa55、SW1615-mFa55)。投予藥劑係以成為0.03 mg/mL、0.1 mg/mL、0.3 mg/mL之方式,使用His-緩衝液(20 mM His-HCl、150 mM NaCl,pH 6.0)進行製備。
(5-4-4)在抗腫瘤效果測定時的藥劑投予
在移植後第8日,將抗CTLA4開關抗體3檢體分別以0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg由尾靜脈投予至小鼠。將關於抗腫瘤效果測定時的藥劑處置之詳細內容顯示於表24。
(5-4-5)抗腫瘤效果的評價
針對抗腫瘤效果,以利用(5-4-2)所記載之計算式所計算的腫瘤體積進行評價。
針對腫瘤增殖抑制率(TGI:Tumor Growth Inhibition)值,係由以下的計算式進行計算。TGI(%)=(1-(測定時中之注目群組的腫瘤體積的平均值-初次投予時中之注目群組的腫瘤體積的平均值)÷(測定時中之對照群組的腫瘤體積的平均值-初次投予時的對照群組的腫瘤體積的平均值))×100
結果,SW1610-mFa55及SW1612-mFa55係在1 mg/kg以上的劑量中,SW1615-mFa55係在3 mg/kg以上的劑量中,在投予後第16日顯示TGI=60%以上的藥效(圖18~圖20)。
(5-4-6)腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑投予
在移植後第10日,將SW1610-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,將SW1612-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,將SW1615-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400mg/kg由尾靜脈投予至小鼠。又,控制組中,將作為陰性對照組抗體之IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1(簡稱:KLH-mFa55)以400 mg/kg由尾靜脈進行投予。將關於腫瘤內的Treg細胞的評價及在脾臟的全身性作用驗證時的藥劑配方之詳細內容揭示於表25。
(5-4-7)來自Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式小鼠之腫瘤、脾臟的摘出
在抗體投予後第6日,在麻醉下將小鼠進行安樂死處理,摘出腫瘤與脾臟。由所摘出之脾臟,使用包含10% FBS(SIGMA)之RPMI-1640培養基(SIGMA)製備細胞懸浮液後,使用小鼠紅血球裂解套組(R&D)進行溶血處理,製備脾臟細胞。所摘出之腫瘤係使用腫瘤解離套組、小鼠(miltenyi)進行破碎。基於已將脾臟細胞、腫瘤進行破碎者,使其與以下的抗體進行反應,藉由FACS解析,將存在之免疫細胞的部分進行解析。抗CD45抗體(BD、殖株:30-F11)、抗CD3抗體(BD、殖株:UCHT1)、抗CD4抗體(BD、殖株:RM4-5)、抗FoxP3抗體(eBioscience、殖株:FJK-16s)、抗ICOS抗體(eBioscience、殖株:7E17G9)、抗CCR7抗體(Biolegend,殖株:4B12)、抗KLRG1抗體(Biolegend,殖株:2F1/KLRG1)。FACS解析係利用BD LSRFortessa X-20(BD)進行。
(5-4-8)在Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的腫瘤的Treg評價
評價抗CTLA4開關抗體投予時在腫瘤內的effector Treg細胞(CD4
+FoxP3
+CCR7
lowKLRG1
+)的變化。結果,SW1610-mFa55、SW1612-mFa55及SW1615-mFa55在進行投予的所有劑量中,effector Treg的比例皆減少至小於CD45陽性細胞的0.2%(圖21)。
(5-4-9)在Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式的脾臟的全身作用評價
將抗CTLA4開關抗體投予時之脾臟內的活性化輔助T細胞(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)的變化,利用FACS解析進行評價。結果,SW1610-mFa55及SW1612-mFa55係在進行評價的劑量中之50 mg/kg的劑量中,SW1615-mFa55係在進行評價的劑量中之200 mg/kg以下的劑量中,未使在脾臟的活性化輔助T細胞對於CD45陽性細胞之比例有顯著意義地增加。有顯著差異檢定係使用JMP 11.2.1(SAS Institute Inc.),對於KLH-mFa55投予群組進行Dunnett的檢定(圖22)。該開關抗體任一皆顯示藥效,另一方面,確認在腫瘤以外的組織中未引起反應,確認到具有僅在腫瘤部位顯示活性的性質。
[實施例6]使ADCC/ADCP活性能夠增強之改變Fc的製作
為了製作能將細胞毒性效應功能亦即ADCC及ADCP增強之抗體,探討製作已增強對於活性型FcγR亦即FcγRIIIa及FcγRIIa的結合能之Fc區域改變體。
(6-1)已增強對於FcγR的結合之改變體的製作與評價
製作異型二聚化抗體亦即04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1,其具有WO2013/002362所記載之已增強對於FcγR的結合能之重鏈恆定區Kn125及Hl076,具有04H1637作為重鏈可變區,具有04L1610-lam1作為輕鏈。具體而言,製作抗體重鏈04H1637-Kn125(序列識別號:162)的基因,其具有04H1637(序列識別號:138)作為其中之一的重鏈可變區,對於已去除人類IgG1重鏈恆定區的C端的Gly及Lys之G1d(序列識別號:158)導入L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A,再在CH3區域中具有促進異型二聚化的改變Y349C/T366W。同樣地,製作抗體重鏈04H1637-Hl076(序列識別號:163)的基因,其具有04H1637(序列識別號:138)作為另一方的重鏈可變區,對於人類IgG1重鏈恆定區G1d(序列識別號:158)導入D270E/K326D/A330M/K334E,再在CH3區域中具有促進異型二聚化的改變D356C/T366S/L368A/Y407V。作為抗體輕鏈,使用04L1610-lam1(序列識別號:161),並藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法,製作異型二聚體04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1。於此,在導入CH2區域的改變中,除了L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、S298A、K326D、K334E之外,將在WO2013/002362中作為使對於FcγR的結合變化之改變而報導之L234F、A330K及Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527及WO2004/029207所報導之G236A、I332E、I332D及WO2013/118858中作為使穩定性提升的改變而報導之T250V、T307P進行組合,製作抗體重鏈04H1637-Kn462(序列識別號:164)、04H1637-Hl441(序列識別號:165)、04H1637-Hl445(序列識別號:166)、04H1637-Kn461(序列識別號:167)、04H1637-Hl443(序列識別號:168)的基因。又,製作抗體重鏈04H1654-KT462(序列識別號:182)的基因,其去除人類IgG1(IGHG1*03)的C端的Gly及Lys,在CH2區域具有與Kn462相同的改變,在CH3區域中具有WO2006/106905所記載之促進異型二聚化的改變E356K,具有04H1654(序列識別號:140)作為重鏈可變區。同樣地,製作抗體重鏈04H1656-HT441(序列識別號:170)的基因,其去除人類IgG1(IGHG1*03)的C端的Gly及Lys,在CH2區域中具有與Hl441相同的改變,在CH3區域中具有WO2006/106905所記載之促進異型二聚化的改變K439E,具有04H1656(序列識別號:141)作為重鏈可變區。以下同樣地,製作04H1656-HT445(序列識別號:171)、04H1654-KT461(序列識別號:183)、04H1656-HT443(序列識別號:173)的基因。再者,探討Mabs, 2017, 9, 844-853所記載之改善抗體的血中動態之改變的組合。具體而言,對於04H1654-KT462(序列識別號:182)的CH3區域,導入在酸性條件下增強對於人類FcRn的結合之改變及降低對於類風濕因子(Rheumatoid factor)的結合之改變的組合亦即N434A/Y436T/Q438R/S440E,製作04H1654-KT473(序列識別號:184)的基因。同樣地,對於04H1656-HT445(序列識別號:171),導入N434A/Y436T/Q438R/S440E,製作04H1656-HT482(序列識別號:185)的基因。同樣地,對於04H1654-KT461、04H1656-HT443導入相同改變,分別製作抗體重鏈04H1654-KT481(序列識別號:186)、抗體重鏈04H1656-HT498(序列識別號:187)。將此等重鏈進行組合,使用04L1610-lam1或者04L1612-lam1(序列識別號:188)作為輕鏈,製作目標的異型二聚化抗體。
FcγR的細胞外域係利用以下方法進行製備。首先,FcγR的細胞外域的基因的合成係利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法進行實施。此時,各FcγR的序列係基於登綠於NCBI之資訊進行製作。具體而言,針對FcγRI係基於NCBI的accession # NM_000566.3的序列、針對FcγRIIa係基於NCBI的accession # NM_001136219.1的序列、針對FcγRIIb係基於NCBI的accession # NM_004001.3的序列、針對FcγRIIIa係基於NCBI的accession # NM_001127593.1的序列而製作,並在C端加成His標籤。又,針對FcγRIIa的多型部位係參考J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25而製作,針對FcγRIIIa的多型部位係參考J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070而製作。藉由將所得之基因片段插入動物細胞表現載體,而製作表現載體。所製作之表現載體被一次性地導入源自人類胎兒腎癌細胞的FreeStyle293細胞(Invitrogen),表現目標蛋白質。回收培養上清液後,通過0.22μm過濾器,原則上利用下述4步驟進行精製。第一步驟實施陽離子交換管柱層析法(SP Sepharose FF),第二步驟實施對於His標籤之親和性管柱層析法(HisTrap HP),第三步驟實施凝膠過濾管柱層析法(Superdex200),第四步驟實施無菌過濾。但是,針對FcγRI,在第一步驟中實施使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析法。所精製之蛋白質的濃度,係使用分光光度計測定在280 nm的吸光度,並藉由PACE等方法由所得之值算出吸光係數,並使用此吸光係數進行計算(Protein Science, 1995, 4, 2411-2423)。人類FcRn係利用WO2010/107110所記載之方法進行製備。
所製作之抗體與人類FcγR之相互作用解析係使用Biacore T200並利用以下方法而實施。在泳動緩衝液中,能使用50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20(pH 7.4),在25℃實施測定。在感測晶片中,能使用對於Series S SA(GE Healthcare)固相化CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(Thermo Fisher Scientific)之晶片。對於此晶片,捕捉目標抗體,已以泳動緩衝液稀釋之各FcγR進行相互作用。晶片係使用10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)與25 mM NaOH而被回收再利用,重複捕捉抗體並進行測定。各抗體對於FcγR之解離常數KD(mol/L),係使用Biacore T200 Evaluation Software 2.0計算,對於FcγRIa與FcγRIIIa之解離常數係使用1:1 Langmuir結合模式計算,對於FcγRIIa之解離常數係使用穩定狀態親和模式(Steady state affinity model)計算。又,對於FcγRIIb,將藉由測定所得之從傳感圖所求取的FcγRIIb的結合量以晶片表面所捕捉之抗體的量進行修正,藉此計算每單位抗體量之FcγRIIb的結合量。
所製作之抗體與人類FcRn之相互作用解析係使用Biacore T200並利用以下方法而實施。在泳動緩衝液中,能使用50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20(pH 6.0),在25℃實施測定。在感測晶片中,能使用對於Series S SA(GE Healthcare)固相化CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(Thermo Fisher Scientific)之晶片。對於此晶片,捕捉目標抗體,已以泳動緩衝液稀釋之FcRn進行相互作用。晶片係使用10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)與25 mM NaOH而被回收再利用,重複捕捉抗體並進行測定。各抗體對於FcRn之解離常數係使用Biacore T200 Evaluation Software 2.0計算並利用穩定狀態模式計算。
表26揭示此等測定結果。
表中的「對於hFcRn的KD(M)」及「對於hFcγRs的KD(M)」之值係分別表示對於hFcRn及各FcγR的解離常數,「結合量」表示使FcγRIIb以1000 nM進行相互作用時的每單位抗體量之FcγRIIb的結合量。「對於G1m與hFcRn的KD之相對值」及「對於G1m與hFcγRs的KD之相對值」係分別表示將對於hFcRn及各FcγR之04H1637-G1m/04L1610-lam1的KD值除以各改變體的KD值而得之值,「相對的結合量」係表示將對於FcγRIIb的各改變體的結合量除以04H1637-G1m/04L1610-lam1的結合量之值。將抗體重鏈04H1637-G1m及抗體輕鏈04L1610-lam1的胺基酸序列分別揭示於序列識別號:160及161。相較於具有天然型人類IgG1的恆定區之04H1637-G1m/04L1610-lam1,所製作之異型二聚化抗體皆顯示對於FcγRIIa、FcγRIIIa的結合增強。又,相較於WO2013/002362中所報導之具有Fc區域改變體的04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1,04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl441/04L1610-lam1、04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1、04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1皆顯示對於FcγRIIa的結合增強。又,04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1對於FcγRIIIa的結合能係與04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1同等,04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1對於FcγRIIIa的結合能顯示比04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1更增強。同樣地,在IGHG1*03的恆定區及CH3區域具有不同的異型二聚化改變之04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1及04H1654-KT462/04L1612-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1係顯示04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1、與04H1654-KT461/04L1610-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1及04H1654-KT461/04L1612-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1具有與04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1同等的對於FcγR的結合概貌。又,已導入改善血中動態的改變之04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1、04H1654-KT481/04L1610-lam1//04H1656-HT498/04L1610-lam1、04H1654-KT473/04L1612-lam1//04H1656-HT482/04L1612-lam1、04H1654-KT481/04L1612-lam1//04H1656-HT498/04L1612-lam1,相較於導入改善血中動態的改變前的抗體,對於人類FcRn的結合能提升,且對於FcγR的結合能顯示為同等。
再者,製作04H1656-HT451(序列識別號:272)的基因,其對於04H1656-HT441,導入將在酸性條件下對於人類FcRn的結合進行增強的改變及將對於類風濕因子的結合進行降低的改變之組合亦即N434A/Y436T/Q438R/S440E。將抗體重鏈HT451的胺基酸序列揭示於序列識別號:276。將04H1654-KT473與04H1656-HT451進行組合,使用04L1610-lam1作為抗體輕鏈,製作異型二聚化抗體。將所製作之抗體與人類FcRn及人類FcγR之相互作用解析結果揭示於表27。
顯示所製作之異型二聚化抗體04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1、及04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1,相較於具有天然型人類IgG1的恆定區之04H1656-G1m/04L1610-lam1,對於為活性型FcγR之FcγRIIa與FcγRIIIa的結合皆增強。又,此等抗體對於抑制型FcγR之FcγRIIb的結合皆維持與04H1656-G1m/04L1610-lam1同程度。顯示對於04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1導入N434A/Y436T/Q438R/S440E之04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1,相較於導入前,對於人類FcRn的結合能增強。
接著,針對使用Nat. Biotechnol., 1998, 16, 677-681所記載之不同的異型二聚化改變所製作之FcγR結合增強改變體,評價對於人類FcRn及FcγR的結合活性。製作04H1389-Km462(序列識別號:199)的基因,其具有04H1389(序列識別號:136)作為重鏈可變區,作為重鏈恆定區,在已去除人類IgG1(IGHG1*03)的C端的Gly及Lys之恆定區的CH2區域導入與KT462相同的改變,在CH3區域中導入作為異型二聚化改變的T366W之抗體重鏈04H1389-Ks462(序列識別號:191)、作為異型二聚化改變係能使用Y349C/T366W。又,製作04H1389-Hm445(序列識別號:200)的基因,其在CH2區域中導入與HT445相同的改變,在CH3區域中導入作為異型二聚化改變之T366S/L368A/Y407V之抗體重鏈04H1389-Hs445(序列識別號:192)、作為異型二聚化改變係能使用E356C/T366S/L368A/Y407V。同樣地,製作作為CH2區域的改變而具有與KT461及HT443相同的改變之04H1389-Ks461(序列識別號:193)、04H1389-Km461(序列識別號:201)、04H1389-Hs443(序列識別號:194)、04H1389-Hm443(序列識別號:202)。又,製作對於此等抗體重鏈恆定區Ks462、Hs445、Ks461、Hs443、Km462、Hm445、Km461、Hm443導入改善血中動態的改變N434A/Y436T/Q438R/S440E,作為可變區具有04H389之抗體重鏈04H1389-Ks473(序列識別號:195)、04H1389-Hs482(序列識別號:196)、04H1389-Ks481(序列識別號:197)、04H1389-Hs498(序列識別號:198)、04H1389-Km473(序列識別號:203)、04H1389-Hm482(序列識別號:204)、04H1389-Km481(序列識別號:205)、04H1389-Hm498(序列識別號:206)的基因。04L1615-k0MT(序列識別號:190)能被使用作為輕鏈,製作目標的異型二聚體。又,作為比較對象,製作具有04H1389-G1m(序列識別號:189)之同型二聚體04H1389-G1m/04L16150k0MT。所製作之抗體與人類FcγR之相互作用解析係使用Biacore T200而實施。在泳動緩衝液中,能使用50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20(pH 7.4),在25℃實施測定。在感測晶片中,能使用對於Series S SA(GE Healthcare)固相化CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate(Thermo Fisher Scientific)之晶片。對於此晶片,捕捉目標抗體,已以泳動緩衝液稀釋之各FcγR進行相互作用。晶片係使用10 mM 甘胺酸-HCl(pH 1.5)與25 mM NaOH而被回收再利用,重複捕捉抗體而進行測定。各抗體對於FcγR之解離常數KD(mol/L)係使用Biacore T200 Evaluation Software 2.0計算,對於FcγRIa與FcγRIIIa之解離常數係使用1:1 Langmuir結合模式計算,對於FcγRIIa之解離常數係使用穩定狀態親和模式計算。又,對於FcγRIIb,將藉由測定所得之從傳感圖所求取的FcγRIIb的結合量以晶片表面所捕捉之抗體的量進行修正,藉此計算每單位抗體量之FcγRIIb的結合量。對於FcRn的結合測定,作為泳動緩衝液,能使用50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20(pH 6.0),並藉由穩定狀態模式而計算解離常數KD(mol/L)(表28)。此外,表28中對於FcγRIIIa的解離常數中,以「*」表示的值係利用穩定狀態親和模式所計算的值。
於此,相較於04H1389-G1m/04L1615-k0MT,所製作之異型二聚化抗體對於FcγRIIa、FcγRIIIa的結合活性皆增強。又,相較於改變導入前的親代抗體,已導入改善抗體的血中動態的改變之04H1389-Ks473/04L1615-k0MT//04H1389-Hs482/04L1615-k0MT、04H1389-Ks481/04L1615-k0MT//04H1389-Hs498/04L1615-k0MT、04H1389-Km473/04L1615-k0MT//04H1389-Hm482/04L1615-k0MT、04H1389-Km481/04L1615-k0MT//04H1389-Hm498/04L1615-k0MT對於人類FcRn的結合活性皆增強,針對FcγR結合活性,係與親抗體同等的結合概貌。
再者,製作04H1389-Hm441(序列識別號:273)的基因,其具有04H1389(序列識別號:136)作為重鏈可變區,在重鏈CH2區域中導入與HT441相同的改變,在CH3區域中能使用Y349C/T366W作為異型二聚化改變。相對於此,製作04H1389-Hm451(序列識別號:274),其導入將在酸性條件下對於人類FcRn的結合進行增強之改變,及將對於類風濕因子的結合進行降低之改變的組合亦即N434A/Y436T/Q438R/S440E。將抗體重鏈Hm441及Hm451的胺基酸序列分別揭示於序列識別號:277及278。作為抗體重鏈係使用04H1389-Km473、04H1389-Hm451或者04H1389-Hm482,作為抗體輕鏈係使用04L1305-k0MT,而製作異型二聚化抗體。將所製作之抗體與人類FcRn及人類FcγR之相互作用解析結果揭示於表29。
相較於具有天然型人類IgG1的恆定區之04H1389-G1m/04L1305-k0MT,所製作之異型二聚化抗體04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT、及04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT皆顯示對於活性型FcγR亦即FcγRIIa與FcγRIIIa的結合增強。又,相較於04H1389-G1m/04L1305-k0MT,此等抗體皆顯示對於人類FcRn的結合能增強。
接著,將於此發現之已增強對於FcγR的結合之恆定區改變體、與既存的FcγR結合增強改變體進行比較。製作具有MDX10D1H(序列識別號:154)作為重鏈可變區且具有表26所記載之重鏈恆定區之抗體重鏈MDX10D1H-Kn125(序列識別號:217)、MDX10D1H-Hl076(序列識別號:218)、MDX10D1H-Kn462(序列識別號:219)、MDX10D1H-Hl445(序列識別號:220)、MDX10D1H-Kn461(序列識別號:221)、MDX10D1H-Hl443(序列識別號:222)、及具有天然型人類IgG1的CH2區域之MDX10D1H-G1m(序列識別號:210)的基因。作為已使對於FcγRIIa的結合增強之改變體,製作在CH2區域中具有Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527所記載之改變G236A/S239D/I332E之抗體重鏈MDX10D1H-GASDIE(序列識別號:215)的基因。又,作為已使對於FcγRIIIa的結合增強之改變體,製作在CH2區域中具有J. Struct. Biol., 2016, 194, 78-89所記載之G236A/S239D/A330L/I332E之抗體重鏈MDX10D1H-GASDALIE(序列識別號:216)的基因。能使用MDX10D1L-k0MT(序列識別號:211)作為抗體輕鏈,製作目標的抗體。此等對於人類FcγR的結合活性係藉由使用前述CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate的方法而測定(表30)。
表中的「對於hFcγR的KD(M)」之值係表示對於所記載之各FcγR的解離常數,「結合量」係表示使FcγRIIb以1000 nM進行相互作用時的每單位抗體量之FcγRIIb的結合量。「對於G1m與hFcγRs的KD之相對值」係表示將對於各FcγR的MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT的KD值除以各改變體的KD值而得之值,「相對的結合量」係表示將對於FcγRIIb的各改變體的結合量除以MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT的結合量之值。
相較於既存的FcγR結合增強抗體亦即MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT,所製作之異型二聚體、MDX10D1H-Kn125/MDX10D1H-Hl076/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MT對於FcγRIIIa的結合皆增強。又,相較於既存的FcγRIIa增強抗體亦即MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT,MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT皆顯示對於FcγRIIaH的結合增強約2倍。
(6-2)具有經改變的恆定區之各種抗體的活體外ADCC活性的評價
在活體外ADCC活性測定中,能使用hFcγRIIIaV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit(Promega)。在96孔盤的各孔中,將藉由培養基製備成2×10
6/mL的濃度之hCTLA4-CHO細胞作為標的細胞,各添加25μL,在培養基中使用分析緩衝液(Assay Buffer)(90% RPMI1640, 10% FBS)。接著,將已以最終濃度成為0、0.001、0.01、0.1、1μg/mL之方式利用分析緩衝液稀釋之各抗體溶液分別添加25μL,最後,作為效應細胞溶液,將藉由培養基而製備成6×10
6/mL之表現hFcγRIIIaV的Jurkat細胞(附屬於套組)添加25μL,以總計成為75μL之方式進行混合後,在5% CO
2培養箱內以37℃靜置一晩。其後,將盤在室溫下靜置15分鐘,在各孔中各添加75μL的Bio-Glo試劑。在Bio-Glo試劑中,使用Bio-glo螢光素酶分析系統(Bio-glo Luciferase Assay System)(緩衝液及基質)。其後,各孔的發光係利用盤式儀(plate reader)進行測定。將各孔的發光的值除以未添加抗體的孔的發光的值,將所得之值設為倍性變化(Fold induction),作為評價各抗體的ADCC之指標。將所得之結果揭示於圖23。在圖中,將倍性變化(Fold induction)以相對發光量(RLU)表示。
由此結果可知,相較於野生型的人類IgG1恆定區,具有經改變的Fc之抗體對於hCTLA4-CHO細胞的ADCC活性具有強的ADCC活性。
(6-3)具有經改變的恆定區之各種抗體的活體外ADCP活性的評價
在活體外ADCC活性測定中,使用hFcγRIIaH ADCP Reporter Bioassay, Core Kit(Promega)。在96孔盤的各孔中,將藉由培養基而製備成1×10
6/mL的濃度之hCTLA4-CHO細胞作為標的細胞,各添加25μL,在培養基中,使用分析緩衝液(4% 低IgG血清於RPMI1640)。接著,將已以最終濃度成為0、0.001、0.01、0.1、1μg/mL之方式利用分析緩衝液稀釋之各抗體溶液分別添加25μL,最後,作為效應細胞溶液,添加25μL之附屬於套組之表現hFcγRIIaH之Jurkat細胞,以總計成為75μL之方式進行混合後,在5% CO
2培養箱內以37℃靜置一晚。表現hFcγRIIaH Jurkat細胞的細胞液密度為8.25×10
5/mL。其後,將盤在室溫下靜置15分鐘,在各孔中各添加75μl之Bio-Glo 試劑。在Bio-Glo 試劑中,使用Bio-glo螢光素酶分析系統(緩衝液及基質)。其後,各孔的發光係利用盤式儀(plate reader)進行測定。將各孔的發光的值除以未添加抗體的孔的發光的值,將所得之值設為倍性變化(Fold induction),作為評價各抗體的ADCP之指標。將所得的結果揭示於圖24。在圖中,將倍性變化(Fold induction)以相對發光量(RLU)表示。
由此結果可知,相較於野生型的人類IgG1恆定區,具有經改變的Fc之抗體對於hCTLA4-CHO細胞的ADCP活性具有強的ADCP活性。
(6-4)具有經改變的Fc之抗CTLA4開關抗體的活體外ADCC活性的評價
製作具有經改變的Fc之抗CTLA4開關抗體(04H1654-Kn462/04L1610-lam1//04H1656-Hl445/04L1610-lam1 簡稱:SW1610-ART6、04H1654-Kn462/04L1612-lam1//04H1656-Hl445/04L1612-lam1 簡稱:SW1612-ART6、及04H1389-Kn462/04L1305-k0MT//04H1389-Hl445/04L1305-k0MT 簡稱:SW1389-ART6)。
SW1610-ART6抗體,其中之一的重鏈可變區04H1654(序列識別號:35)連結作為恆定區之人類重鏈恆定區Kn462(序列識別號:43),另一重鏈可變區04H1656(序列識別號:37)連結人類重鏈恆定區Hl445(序列識別號:44),再者,輕鏈可變區04L1610(序列識別號:39)使用野生型人類輕鏈恆定區lam1(序列識別號:53),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1612-ART6抗體,其中之一的重鏈可變區04H1654(序列識別號:35)連結作為恆定區之人類重鏈恆定區Kn462(序列識別號:43),另一重鏈可變區04H1656(序列識別號:37)連結人類重鏈恆定區Hl445(序列識別號:44),再者,輕鏈可變區04L1612(序列識別號:40)使用野生型人類輕鏈恆定區lam1(序列識別號:53),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1389-ART6抗體,其二個重鏈可變區04H1389(序列識別號:29)作為恆定區分別連結人類重鏈恆定區Kn462(序列識別號:43)及人類重鏈恆定區Hl445(序列識別號:44),再者,輕鏈可變區04L1305(序列識別號:30)使用野生型人類輕鏈恆定區k0MT(序列識別號:33),並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
在活體外ADCC活性測定中,能使用hFcγRIIIaV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit(Promega)。在96孔盤的各孔中,將藉由培養基製備成2×10
6/mL的濃度之hCTLA4-CHO細胞作為標的細胞,各添加12.5μL,在培養基中使用分析緩衝液(4% 低IgG血清於RPMI1640)。接著,依序添加已以最終濃度成為0、100μM之方式利用分析緩衝液稀釋之ATP溶液、已以最終濃度成為0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL之方式利用分析緩衝液稀釋之SW1389-ART6、SW1610-ART6及SW1612-ART6 的抗體溶液,最後,作為效應細胞溶液,將藉由培養基而製備成3×10
6/mL之表現hFcγRIIIaV之Jurkat細胞(附屬於套組)添加25μL,以總計成為75μL之方式進行混合後,在5% CO
2培養箱內以37℃靜置6小時。其後,將盤在室溫下靜置15分鐘,在各孔中各添加75μL的Bio-Glo 試劑。在Bio-Glo 試劑中,使用Bio-glo螢光素酶分析系統(緩衝液及基質)。其後,各孔的發光係利用盤式儀(plate reader)進行測定。將各孔的發光的值除以未添加抗體的孔的發光的值,將所得之值設為倍性變化(Fold induction),作為評價各抗體的ADCC之指標。將所得之結果揭示於圖25(SW1389-ART6)、圖26(SW1610-ART6)、及圖27(SW1612-ART6)。在圖中,將倍性變化(Fold induction)以相對發光量(RLU)表示。
由此結果確認到,具有經改變的Fc之抗CTLA4開關抗體對於hCTLA4-CHO細胞的ADCC活性,在ATP存在下、不存在下不同,且存在ATP依賴性的對於hCTLA4-CHO細胞之細胞毒性。
(6-5)抗CTLA4開關抗體之活體外中和活性的評價
作為經改變的抗CTLA4開關抗體,製作具有SW1389、SW1610、SW1612、SW1615的可變區之人類抗體。
SW1389抗體,使用04H1389(序列識別號:29)作為重鏈可變區,使用04L1305(序列識別號:30)作為輕鏈可變區,在與人類恆定區連結後,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1610抗體,使用04H1654(序列識別號:35)及04H1656(序列識別號:37)作為重鏈可變區,使用04L1610(序列識別號:39)作為輕鏈可變區,在與人類恆定區連結後,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1612抗體,使用04H1654(序列識別號:35)及04H1656(序列識別號:37)作為重鏈可變區,使用04L1612(序列識別號:40)作為輕鏈可變區,在與人類恆定區連結後,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1615抗體,使用04H1389(序列識別號:29)作為重鏈可變區,使用04L1615(序列識別號:34)作為輕鏈可變區,在與人類恆定區連結後,利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
在活體外中和活性測定中,能使用CTLA-4 Blockade Bioassay(Promega)。在96孔盤的各孔中,將藉由培養基製備成1×10
6/mL的濃度之套組附屬的aAPC-Raji細胞作為標的細胞,各添加25μL,在培養基中使用分析緩衝液(10% FBS於RPMI1640)。接著,依序添加已以最終濃度成為0、100μM之方式利用分析緩衝液稀釋之ATP溶液、已以最終濃度成為0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL之方式利用分析緩衝液稀釋之具有SW1389、SW1610、SW1612及SW1615的可變區之抗體溶液,最後,作為效應細胞溶液,將藉由培養基而製備成2×10
6/mL之IL2-luc2-CTLA4-Jurkat細胞(附屬於套組)添加25μL,以總計成為75μL之方式進行混合後,在5% CO
2培養箱內以37℃靜置6小時。其後,將盤在室溫下靜置15分鐘,在各孔中各添加75μL的Bio-Glo 試劑。在Bio-Glo 試劑中,使用Bio-glo螢光素酶分析系統(緩衝液及基質)。其後,各孔的發光係利用盤式儀(plate reader)進行測定。將各孔的發光的值除以未添加抗體的孔的發光的值,將所得之值設為倍性變化(Fold induction),作為評價各抗體的中和活性之指標。將所得之結果揭示於圖28(SW1389)、圖29(SW1610)、圖30(SW1612)及圖31(SW1615)。在圖中,將倍性變化(Fold induction)以相對發光量(RLU)表示。
由此結果確認到,抗CTLA4開關抗體對於hCTLA4表現細胞的中和活性,在ATP存在下、不存在下不同,且存在ATP依賴性的中和活性。
(6-6)抗CTLA4開關抗體對於CTLA4陽性調節性T細胞的活體外細胞毒性評價
製作具有經改變的Fc之抗CTLA4開關抗體(04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1 簡稱:SW1610-ART5+ACT1、04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1 簡稱:SW1610-ART6+ACT1、04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT 簡稱:SW1389-ART5+ACT1、04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT 簡稱:SW1389-ART6+ACT1)。
SW1610-ART5+ACT1抗體,使用04H1654-KT473(序列識別號:184)作為其中之一重鏈,使用04H1656-HT451(序列識別號:272)作為另一重鏈,再者,使用04L1610-lam1(序列識別號:161)作為輕鏈,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1610-ART6+ACT1抗體,使用04H1654-KT473(序列識別號:184)作為其中之一重鏈,使用04H1656-HT482(序列識別號:185)作為另一重鏈,再者,使用04L1610-lam1(序列識別號:161)作為輕鏈,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1389-ART5+ACT1抗體,使用04H1389-Km473(序列識別號:203)作為其中之一重鏈,使用04H1389-Hm451(序列識別號:274)作為另一重鏈,再者,使用04L1305-k0MT(序列識別號:275)作為輕鏈,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
SW1389-ART6+ACT1抗體作為輕鏈04H1389-Km473(序列識別號:203)作為其中之一重鏈,使用04H1389-Hm482(序列識別號:204)作為另一重鏈,再者,使用04L1305-k0MT(序列識別號:275)作為輕鏈,並利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者公知方法使其表現並精製。
評價具有經製作的改變Fc之抗CTLA4開關抗體對於CTLA4陽性調節性T細胞(CD3
+CD4
+CD25
+CD45RA
-CTLA4
+)的活體外細胞毒性。首先,將人類PBMC(CTL Cryopreserved Human PBMC, CTL)冷凍溶解,使其在50 U/ml介白素2(IL-2)/ RPMI/ 10 % FBS中,以細胞密度成為2×10
6細胞/mL之方式懸浮,在5 % CO
2培養箱內以37℃培養4日。4日後,回收細胞,以RPMI/ 10 % FBS清洗2次後,在96孔U底盤的各孔中各播種100μL(8×10
5cells/孔、或者5×10
5cells/孔)、在各孔中各添加25μL之已以RPMI/ 10 % FBS調整成8 mg/ml之KLH-G1m溶液,接著,在96孔U底盤的各孔中各添加25μL之已以RPMI/ 10 % FBS製備成各濃度(0、2.4、8、24、80μg/mL、或者0、0.8、8、80、800μg/mL)之抗體溶液。再者,各添加50μL之已以RPMI/ 10 % FBS調整成0或者400μM的ATP溶液,在良好懸浮後,在CO
2培養箱內以37℃靜置6小時(相隔2小時共計2次,各添加5μL已調整成0或者4000μM的ATP溶液)。6小時後,回收PBMC,以auto MACS Rinsing Solution(Milteny)清洗2次後,使其與以下的抗體進行反應,藉由FACS解析,解析存在之免疫細胞的部分(fraction)。判斷生死用試劑(Biolegend,Zombie Aqua)、抗CD3抗體(BD、殖株:UCHT1)、抗CD4抗體(BD、殖株:RPA-T4)、抗CD8抗體(BD、殖株:SK1)、抗CD45RA抗體(Biolegend,殖株:HI100)、抗CD25抗體(BD、殖株:2A3)、抗CD16抗體(Biolegend,殖株:3G8)、抗CD56抗體(Biolegend,殖株:HCD56)、抗CTLA4抗體(Biolegend,殖株:BNI3)。FACS解析利用BD LSR Fortessa X-20(BD)進行。計算在各抗體濃度下的活細胞中的CTLA4陽性調節性T細胞之比例,將抗體濃度0時之值設為100 %,將相對值定義為CTLA4陽性調節性T細胞的生存率(%),作為評價各抗體的細胞毒性時之指標。將所得之結果揭示於圖32(SW1389-ART5+ACT1)、圖33(SW1389-ART6+ACT1)、圖34(SW1610-ART5+ACT1)及圖35(SW1610-ART6+ACT1)。
由此結果確認到,具有經改變的Fc之抗CTLA4開關抗體對於CTLA4陽性調節性T細胞的細胞毒性,在ATP存在下、不存在下不同,且存在ATP依賴性的對於CTLA4陽性調節性T細胞的細胞毒性。
前述發明係基於幫助明確理解之目的而使用實例及例示進行詳細記載,但本說明書中之記載及例示不應被解釋為是限定本發明範圍者。本說明書所引用之所有專利文獻及科學文獻的公開,係藉由參照而整體明示地併入本說明書。
[產業可利用性]
本公開的抗CTLA-4抗體及使用其等的方法,具有免疫細胞的活性化作用、細胞毒性、及/或抗腫瘤活性,且對於正常組織等非腫瘤組織的作用低,能利用於副作用少的醫藥的開發、製造、提供、使用等。又,本公開之包含突變Fc區域的多肽及其製造方法及使用方法,能利用於此醫藥的開發、製造、提供、使用等。
無。
[圖1]係顯示如實施例1-9所記載般為抗CTLA-4抗體之ABAM004依賴於ATP、ADP或AMP濃度之對於CTLA-4的結合活性之圖。
[圖2]係顯示如實施例1-10所記載般為抗CTLA-4抗體之ABAM004依賴於AMP濃度之對於表現CTLA-4細胞的結合活性之圖。
[圖3]係顯示如實施例1-11所記載般為抗CTLA-4抗體之ABAM004在存在AMP時及不存在AMP時對於表現CTLA-4細胞的ADCC活性之圖。
[圖4]係顯示如實施例2-13所記載般ABAM004 Fab片段與AMP之結合樣式之圖。圖中,以黑色表示該抗體的重鏈,以灰色表示輕鏈,以球棒模式表示AMP。以棒模式表示與AMP形成相互作用之胺基酸殘基。虛線與其數值表示各胺基酸殘基與AMP之間的距離(Å)。
[圖5]係顯示如實施例2-14所記載般ABAM004 Fab片段與AMP、人類CTLA4(hCTLA4)的結合樣式之圖。圖中圖中,以黑色表示該抗體的重鏈,以灰色表示輕鏈,以白色表示hCTLA4,以球棒模式表示AMP。將包含1個以上之位於離該抗體或AMP的任一部分4.2Å以內的距離的非氫原子之hCTLA4的胺基酸殘基作為抗原決定位,並以棒模式表示。
[圖6]係如實施例2-14所記載般將ABAM004 Fab片段的抗原決定位在hCTLA4的胺基酸序列中進行製圖之圖。圖中,以黑色表示之胺基酸殘基表示在結晶結構中包含1個以上之位於離ABAM004或AMP的任一部分4.2Å以內的距離的非氫原子之hCTLA4的胺基酸殘基。以灰色表示之胺基酸殘基表示在結晶結構中因已無序(disorder)故未構築模式之殘基。
[圖7]係如實施例2-15所記載般將已從ABAM004 Fab片段單獨與AMP之複合體、及與AMP、CTLA4之三元複合體的結晶結構萃取該抗體與AMP之結構重疊之圖。圖中,以黑色表示該抗體的重鏈、以灰色表示輕鏈、以球棒模式表示AMP。以細線表示ABAM004 Fab片段單獨的結構,以中粗線表示與AMP之2者複合體的結構,以粗線表示三元複合體的結構。
[圖8]係顯示如實施例3-2所記載般抗CTLA-4抗體ABAM004及其改變體之04H0150/04L0072的依賴於ATP、ADP或AMP濃度之對於CTLA-4的結合活性之圖。作為圖中的標記,WT表示ABAM004,H150L072表示04H0150/04L0072。
[圖9]係顯示如實施例3-6所記載般抗CTLA-4抗體SW1077依賴於ATP濃度之對於CTLA-4的中和活性之圖。
[圖10]圖10係顯示如實施例3-7-4所記載般在已移植FM3A細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體mNS-mFa55(對照組抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、0.25 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=4 的腫瘤體積的平均值。
[圖11]係顯示如實施例3-7-4所記載般在已移植FM3A細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體SW1208-mFa55(開關(switch)抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=4的腫瘤體積的平均值。
[圖12]係顯示如實施例3-7-7所記載般在已移植FM3A細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體mNS-mFa55(對照組抗體)及SW1208-mFa55(開關抗體(switch antibody))投予時的腫瘤內effector Treg細胞的比例變化之圖。將mNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg由尾靜脈進行投予,將SW1208-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取腫瘤,利用FACS分析,評價effector Treg的增減。縱軸係effector Treg(CD4
+FoxP3
+KLRG1
+)相對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖13]係顯示如實施例3-7-8所記載般在已移植FM3A細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體mNS-mFa55(對照組抗體)及SW1208-mFa55(開關抗體)投予時的脾臟中活性化輔助T細胞的比例變化之圖。將mNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg由尾靜脈進行投予,將SW1208-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取脾臟,利用FACS分析,評價活性化輔助T細胞的增減。縱軸係活性化輔助T細胞(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)相對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖14]係顯示如實施例4-3-5所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體SW1389-mFa55(開關抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=4的腫瘤體積的平均值。
[圖15]係顯示如實施例4-3-5所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體hNS-mFa55(對照組抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=4的腫瘤體積的平均值。
[圖16]係顯示如實施例4-3-8所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體hNS-mFa55(對照組抗體)及SW1389-mFa55(開關抗體)投予時的腫瘤內effector Treg細胞的比例變化之圖。將hNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg且將SW1389-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取腫瘤,利用FACS分析,評價effector Treg的增減。縱軸係effector Treg(CD4
+FoxP3
+CCR7
lowKLRG1
+)之對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖17]係顯示如實施例4-3-9所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體hNS-mFa55(對照組抗體)及SW1389-mFa55(開關抗體)投予時的脾臟中活性化輔助T細胞的比例變化之圖。將hNS-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg且將SW1389-mFa55以0.1 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、500 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取脾臟,利用FACS分析,評價活性化輔助T細胞的增減。縱軸係活性化輔助T細胞(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)之對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖18]係顯示如實施例5-4-5所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體SW1610-mFa55(開關抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=5的腫瘤體積的平均值。
[圖19]係顯示如實施例5-4-5所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體SW1612-mFa55(開關抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=5的腫瘤體積的平均值。
[圖20]係顯示如實施例5-4-5所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之抗CTLA-4抗體SW1615-mFa55(開關抗體)的抗腫瘤效果之圖。抗體係以0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg由尾靜脈進行投予。各點表示一組n=5的腫瘤體積的平均值。
[圖21]係顯示如實施例5-4-8所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體SW1610-mFa55、SW1612-mFa55及SW1615-mFa55(皆為開關抗體)投予時的腫瘤內effector Treg細胞的比例變化之圖。將SW1610-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg且將SW1612-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg且將SW1615-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg且將陰性對照組抗體KLH-mFa55以400 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取腫瘤,利用FACS分析,評價effector Treg的增減。縱軸係effector Treg(CD4
+FoxP3
+CCR7
lowKLRG1
+)相對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖22]係顯示如實施例5-4-9所記載般在已移植Hepa1-6/hGPC3細胞株的小鼠模式中之在抗CTLA-4抗體SW1610-mFa55、SW1612-mFa55及SW1615-mFa55(皆為開關抗體)投予時的脾臟中活性化輔助T細胞的比例變化之圖。將SW1610-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg且將SW1612-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg且將SW1615-mFa55以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg且將陰性對照組抗體KLH-mFa55以400 mg/kg由尾靜脈進行投予。在投予後第6日採取脾臟,利用FACS分析,評價活性化輔助T細胞的增減。縱軸係活性化輔助T細胞(CD4
+Foxp3
-ICOS
+)相對於CD45
+細胞的比例。表示n=3的平均值。
[圖23]係顯示如實施例6-2所記載般已增強對FcγR的結合之具有各種改變恆定區的抗體在活體外的ADCC活性的比較之圖。作為圖中的標記,IgG1表示MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT,GASDALIE表示MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT,ART6表示MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT,ART8表示MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MT。於此,IgG1係具有控制組的恆定區之抗體,GASDALIE係具有先前文獻所記載的恆定區之抗體,ART6及ART8係具有由實施例6-1所製作的改變恆定區之抗體。
[圖24]係顯示如實施例6-3所記載般已增強對FcγR的結合之具有各種改變恆定區的抗體在活體外的ADCP活性的比較之圖。IgG1表示MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT,GASDIE表示MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT,ART6表示MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT,ART8表示MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MT。於此,IgG1係具有控制組的恆定區之抗體,GASDIE係具有先前文獻所記載的恆定區之抗體,ART6及ART8係具有由實施例6-1所製作的改變恆定區之抗體。
[圖25]係顯示如實施例6-4般具有已增強對FcγR的結合之改變恆定區的抗CTLA4開關抗體SW1389-ART6在活體外的ADCC活性之圖。
[圖26]係顯示如實施例6-4般具有已增強對FcγR的結合之改變恆定區的抗CTLA4開關抗體SW1610-ART6在活體外的ADCC活性之圖。
[圖27]係顯示如實施例6-4般具有已增強對FcγR的結合之改變恆定區的抗CTLA4開關抗體SW1612-ART6在活體外的ADCC活性之圖。
[圖28]係顯示如實施例6-5所記載般抗CTLA4開關抗體SW1389對於CTLA4的中和活性(解除對於效應細胞的活性化進行抑制性作用之CTLA4的訊號之活性)之圖。
[圖29]係顯示如實施例6-5所記載般抗CTLA4開關抗體SW1610對於CTLA4的中和活性(解除對於效應細胞的活性化進行抑制性作用之CTLA4的訊號之活性)之圖。
[圖30]係顯示如實施例6-5所記載般抗CTLA4開關抗體SW1612對於CTLA4的中和活性(解除對於效應細胞的活性化進行抑制性作用之CTLA4的訊號之活性)之圖。
[圖31]係顯示如實施例6-5所記載般抗CTLA4開關抗體SW1615對於CTLA4的中和活性(解除對於效應細胞的活性化進行抑制性作用之CTLA4的訊號之活性)之圖。
[圖32]係顯示如實施例6-6所記載般抗CTLA4開關抗體SW1389-ART5+ACT1對於CTLA4陽性調節性T細胞的活體外細胞毒性之圖。
[圖33]係顯示如實施例6-6所記載般抗CTLA4開關抗體SW1389-ART6+ACT1對於CTLA4陽性調節性T細胞的活體外細胞毒性之圖。
[圖34]係顯示如實施例6-6所記載般抗CTLA4開關抗體SW1610-ART5+ACT1對於CTLA4陽性調節性T細胞的活體外細胞毒性之圖。
[圖35]係顯示如實施例6-6所記載般抗CTLA4開關抗體SW1610-ART6+ACT1對於CTLA4陽性調節性T細胞的活體外細胞毒性之圖。
Claims (10)
- 一種抗體,其係具有依賴於含有腺苷的化合物的濃度之CTLA-4結合活性的抗CTLA-4抗體,且具有選自以下的(a)至(i)之至少1個特徵: (a)存在100μM之含有腺苷的化合物時的結合活性比不存在含有腺苷的化合物時的結合活性高2倍以上; (b)存在100μM之含有腺苷的化合物時的KD值為5×10 -7M以下; (c)不存在含有腺苷的化合物時的KD值為1×10 -6M以上; (d)與含有腺苷的化合物及CTLA-4一起形成三元複合體(ternary complex); (e)結合於人類CTLA-4(細胞外域,序列識別號:28)的第97個胺基酸至第106個胺基酸的區域; (f)關於對於CTLA-4的結合,與ABAM004(VH,序列識別號:10;及VL,序列識別號:11)競爭; (g)結合於與ABAM004(VH,序列識別號:10;及VL,序列識別號:11)相同的抗原決定位(epitope); (h)對於表現CTLA-4細胞顯示細胞毒性;及 (i)結合於源自人類及小鼠的CTLA-4。
- 如請求項1之抗體,其中,包含:(a)HVR-H1(序列識別號:223),其包含胺基酸序列SX 1TMN,X 1為H、A、R、或K;(b)HVR-H2(序列識別號:224),其包含胺基酸序列SISX 1X 2SX 3YIYYAX 4SVX 5G,X 1為S或T,X 2為R或Q,X 3為G或H,X 4為D、E、或R,X 5為K或R;及(c)HVR-H3(序列識別號:225),其包含胺基酸序列YGX 1REDMLWVFDY,X 1為K或A。
- 如請求項2所述之抗體,其中,更包含:(a)HVR-L1(序列識別號:226),其包含胺基酸序列X 1GX 2STX 3VGDYX 4X 5VX 6,X 1為T、D、Q、或E,X 2為T或P,X 3為D或G,X 4為N或T,X 5為Y或W,X 6為S或H;(b)HVR-L2(序列識別號:227),其包含胺基酸序列X 1TX 2X 3KPX 4,X 1為E、F、或Y,X 2為S或I,X 3為K或S,X 4為S、E、或K;及(c)HVR-L3(序列識別號:228),其包含胺基酸序列X 1TYAAPLGPX 2,X 1為S或Q,X 2為M或T。
- 如請求項1所述之抗體,其中,包含:(a)VH序列,其與序列識別號:83~86、98、135~141中任一胺基酸序列具有至少95%的序列一致性;(b)VL序列,其與序列識別號:88~95、97、99、134、144~149中任一胺基酸序列具有至少95%的序列一致性;或(c)具有序列識別號:83~86、98、135~141中任一胺基酸序列之VH序列,及具有序列識別號:88~95、97、99、134、144~149中任一胺基酸序列之VL序列。
- 一種藥學性製劑,其包含如請求項1至4中任一項所述之抗體及藥學上所容許之載體。
- 如請求項5所述之藥學性製劑,其用於治療腫瘤之用途。
- 如請求項6所述之藥學性製劑,其相較於非腫瘤組織,在腫瘤組織中以更低的用量使免疫活性化。
- 一種多肽,其係在親代Fc區域中包含突變Fc區域之多肽,該突變Fc區域包含胺基酸改變,該親代Fc區域係藉由二條多肽鏈所構成,且該突變Fc區域包含在以下位置中之胺基酸改變: (i)在該親代Fc區域的第一多肽中之由EU編號所表示之位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、及326;以及 (ii)在該親代Fc區域的第二多肽中之由EU編號所表示之位置236、250、270、298、307、326、及334。
- 如請求項8所述之多肽,其相較於該親代Fc區域,在該突變Fc區域中,對於選自由FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa所組成之群組的至少1個Fcγ受體之結合活性增強。
- 如請求項8或9所述之多肽,其相較於該親代Fc區域,在該突變Fc區域中,提升活性型Fcγ受體與抑制型Fcγ受體之間的選擇性。
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