UA115641C2 - Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить - Google Patents

Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить Download PDF

Info

Publication number
UA115641C2
UA115641C2 UAA201612949A UAA201612949A UA115641C2 UA 115641 C2 UA115641 C2 UA 115641C2 UA A201612949 A UAA201612949 A UA A201612949A UA A201612949 A UAA201612949 A UA A201612949A UA 115641 C2 UA115641 C2 UA 115641C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
mesothelin
amino acid
acid sequence
sho
Prior art date
Application number
UAA201612949A
Other languages
English (en)
Inventor
Марк Денніс
Сюзанна Дж. Скейлс
Сьюзан Д. Спенсер
Інь Чжан
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45498116&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA115641(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дженентек, Інк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA115641C2 publication Critical patent/UA115641C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57442—Specifically defined cancers of the uterus and endometrial

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке зв’язує мезотелін, імунокон'югата та фармацевтичної композиції, що його містить.

Description

По даній заявці відповідно до 35 ОБС 119(е) заявляється пріоритет попередньої заявки Мо 61/459962, поданої 20 грудня 2010 року, повний опис якої включений в цей документ як посилання.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Дана заявка містить список послідовностей, який був поданий на розгляд в форматі АЗСІЇ за допомогою ЕР5-ММер і включений в повному обсязі як посилання в даний документ. Вказана копія АЗСІЇ, створена 29 листопада 2011 р., названа Р4532КІ-УЛ/О Хі і має розмір, який дорівнює 53169 байт.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується антитіл проти мезотеліну і імунокон'югатів, і способів їх застосування.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Мезотелін є глікопротеїном клітинної поверхні, який експресується в нормі в мезотелії (очеревині, перикарді і плеврі). Однак експресія мезотеліну значно підвищується в різних типах пухлин. Мезотелін взаємодіє із МОС16б (який називається ще СА125), муциноподібним глікопротеїном, раніше ідентифікованим як антиген пухлини яєчника. МОС16 має позаклітинний домен, що містить принаймні 14000 залишків і характеризується тандемними повторами, розміром 156 амінокислот кожний, які називають муциновими повторами (див., наприклад,
О'Віїєп еї а!., Титоиг Віо!. 22:348-366 (2001); Міп еї аї., у. Віої. Спет. 276:27371-27375 (2001).)
Передбачають, що взаємодія між мезотеліном і МОС16 грає роль в адгезії і метастазуванні гетеротипових клітин. (Див., наприклад, Киптр еї аї., у. Віої. Спет. 279:9190-9198 (2004)).
Мезотелін синтезується у вигляді білкового попередника розміром 71 кДа, зріла частина якого експресується на клітинній поверхні. Цей білковий попередник протеолітично розщеплюється фурином на компонент, що від'єднується, розміром 31 кДа (який називається мегакаріоцитарним потенціюючим фактором, або МРРЕ) і компонент мезотеліну розміром 40 кДа.
Останній компонент може залишатися пов'язаним із клітинною поверхнею через ОРІ-зв'язок, але також може бути відщеплений протеолітичним способом.
У даній галузі існує гостра необхідність в речовинах, дія яких націлена на мезотелін для діагностики і лікування пов'язаних із мезотеліном патологічних станів, таких як рак. Даний
Зо винахід заповнює цей пробіл і має інші переваги.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується антитіл проти мезотеліну і імунокон'югатів, і способів їх застосування.
У одному із аспектів представлено виділене антитіло, яке зв'язується з мезотеліном, де антитіло вибране із: (і) антитіла, яке зв'язує епітоп ЗЕО ІЮ МО:43, який містить Е153 і 0174, і яке в деяких випадках має одну або декілька наступних характеристик: (а) не виявляє зниженого зв'язування із глікозилованими формами мезотеліну; (Б) не блокує зв'язування мезотеліну із
МИиС16 і (с) зв'язує мезотелін із афінністю «5 нМ; (ії) антитіла, яке зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43, який містить Е2111, і яке в деяких випадках має одну або декілька наступних характеристик: (а) не блокує зв'язування мезотеліну із МОС19; і (Б) зв'язує мезотелін із афінністю «5 нМ; і (іїї) антитіла, яке зв'язує епітоп в межах амінокислот 1-131 5ЕО ІЮ МО:43 і зв'язує мезотелін із афінністю «5 НМ. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло є моноклональним антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло є антитілом людини, гуманізованим або химерним антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло є фрагментом антитіла, яке зв'язує мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу мезотелін є мезотеліном людини із послідовністю ЗЕО ІЮ МО:43.
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло містить: (а) () НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:22, (ії) НМК-1І-3, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО:19, і (ії) НМАК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:21; (Б) (ї) НМК-
НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО:39, (її) НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЕС ОО МО:35 і (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:37; або (с) НМАК-НЗ, НМУВ-ІЇ3 ї НМК-Н2 антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло містить (а) () НМАК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:20, (і) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність 562 10 МО:21, ї (Ні) НМК-НЗ що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:22; (Б) (ї) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО:З6, (ії) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:37, і (НТ) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО:39; або (с) НМЕ-НІ, НУВ-Н2 і
НМУВ-НЗ антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТС РТА- бо 11464. У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло містить (а) () НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО:20, (її) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:21, (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:22, (ім) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:17, (м) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО: 18, ї (м) НМЕК-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:19; (Б) () НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕ ІЮ
МО:З6, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕ ІЮ МО:37, (НІ) НМВА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:39, (ім) НМАК-І1, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:33, (м) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:34, і (мі) НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:35; або (с) НМЕ-НІ, НУВ-Н2,
НМВ-НЗ, НМУВ-І1, НМУВ-І2 і НМК-Ї3 антитіла, продукованого гібридомою 19023 |із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (ї) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:20, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:21, (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:22, (ім) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:17, (м) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:18, і (мі) НМК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:19, і додатково, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність ЕК2 каркасної ділянки ЗЕО ІЮО МО:25 і ЕКЗ послідовність ЗЕО ІЮ МО:27.
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло містить (а) () НМК-Ї1, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:17, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО 18, і (іїї) НМК-І 3, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:19; (Б) () НМЕА-
ЇЇ, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІО МО:33, (і) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО:34, і (її) НМК-ІЇЗ3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:35; або (с) НМК-І1, НМУНВ-І2 ї НМАК-ІЗ антитіла, продукованого гіоридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло містить НМК-11, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ
МО:17, НМВ-12, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:18, ії НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:19, і додатково містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність ЕК2 каркасної ділянки 5ЕО ІЮО МО: 25 і ЕКЗ послідовність
Коо) ЗЕО ІЮ МО:27.
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло містить (а) послідовність МН, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕО ІЮ МО:8; (Б) послідовність МІ, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності «ЕО ІЮ МО:4; (с) послідовність
МН, як в (а), і послідовність МІ, як в (Б); послідовність УН, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:16; (е) послідовність МІ, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 12; (Ї) послідовність МН, як в (9), і послідовність МІ, як в (е); послідовність УН, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності МН антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС
РТА-11464; (І) послідовність МІ, яка принаймні на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності
МІ. антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464; або (ї) послідовність МН, як в (9), і послідовність Мі, як в (п). У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло містить послідовність МН 5ЕО ІЮ МО:8, послідовність МН 5ЕО І
МО: 16 або послідовність МН антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТС РТА-11464. У іншому такому варіанті здійснення винаходу антитіло містить послідовність МІ ЗЕО ІО МО:4, послідовність МІ ЗЕО ІЮ МО:12, або послідовність МІ. антитіла, продукованого гібридомою 193 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить (а) послідовність МН 5ЕО ІЮО МО:8 і послідовність МІ 5ЕО ІЮ МО:4; (Б) послідовність МН ЗЕО ІЮ МО:16 і послідовність МІ ЗЕО ІЮ
МО:12; (с) послідовність МН і послідовність МІ. антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464; або (4) антитіло, продуковане гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за будь-яким із вищеперерахованих варіантів здійснення являє собою антитіло ІдО1, І(до2а або Ідса26.
У додатковому аспекті винахід являє виділену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло за будь-яким із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу. У одному із варіантів здійснення винахід стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту. У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу отримання антитіла, способу, що містить культивування клітини-хазяїна так, що відбувається продукція антитіла.
У іншому аспекті винахід стосується імунокон'югата формули АБ-(І-2)р, де: бо (а) Ар є антитілом, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу;
(5) Ї являє собою лінкер; (с) О є лікарським засобом, що має формулу ЮОє ві о в' сн. в? а : т і
М . ї 7в'в 4 це о Р А ве во п о Ок і де К2 і К9 кожна є метилом, ЕКЗ і ЕК" кожна є ізопропілом, Ко є Н, К" є втор-бутилом, кожна Є незалежно вибирається із СНз, О-СНз, ОН Н; К є Н; і КЕ є -С(Н8)»-С(Р8)»-арил; і (4) р приймає значення від 1 до 8.
У одному із варіантів здійснення винаходу лікарським засобом є ауристатин. У одному із таких варіантів здійснення винаходу лікарським засобом є ММАЕ. У іншому варіанті здійснення винаходу лінкер має сайт розщеплення протеазою. У одному із таких варіантів здійснення винаходу лінкер містить дипептид маї-сії.
У іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат має формулу:
АВ-ф5 (9) 9) он
Н пр ! о 99
Ман-сі-м т 9. о ; 9) де 5 є атомом сірки. У одному із таких варіантів здійснення винаходу р приймає значення від 2 до 5. В іншому такому варіанті здійснення винаходу антитіло містить () НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО:20, (її) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:21, (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:22, (ім) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:17, (м) НМЕК-І2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮО МО:18, ї (м) НМАК-ІЇЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:19. У іншому такому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (і)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО:36, (і) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕБЕО 10 МО:37, (ії) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:39, (ім) НМК-І/1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ
МО:33, (м) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:4, їі (м) НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО:35. У іншому такому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (а) послідовність МН 5ЕО ІЮО МО:8 і послідовність МІ ЗЕО ІЮ МО4. У іншому такому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (б) послідовність МН 5ЕО ІЮ МО:16 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:12.
У іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить імунокон'югат,
Зо як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення, і фармацевтично прийнятний носій.
У одному із варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція додатково містить додаткову терапевтичну речовину. У одному із таких варіантів здійснення винаходу терапевтичним засобом є гемцитабін. У іншому такому варіанті здійснення винаходу додатковим терапевтичним засобом є антитіла проти МОС16, кон'юговані із цитотоксичним агентом.
У додатковому аспекті винахід стосується імунокон'югата, як в будь-якому (із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу для застосування як лікарського засобу. У певних варіантах здійснення винахід стосується імунокон'югата, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу для застосування в лікуванні позитивних по мезотеліну ракових пухлин. У одному із таких варіантів здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення вибране із раку підшлункової залози, раку яєчників, раку легені, раку ендометрія і мезотеліоми. У іншому такому варіанті здійснення винаходу позитивний по мезотеліну рак є раком, позитивним по двох антигенах.
У додатковому аспекті винахід стосується застосування імунокон'югатів, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення, для отримання лікарського препарату. У одному із варіантів здійснення винаходу лікарський препарат призначений для лікування позитивного по мезотеліну раку. У одному із таких варіантів здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення вибране із раку підшлункової залози, раку яєчників, раку легені, раку ендометрія і мезотеліоми. У іншому із таких варіантів здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення є раком, позитивним по двох антигенах.
У іншому аспекті винахід стосується способу лікування індивідуума із позитивним по мезотеліну злоякісним новоутворенням, спосіб, що містить призначення індивідууму ефективної кількості імунокон'югату, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу.
У одному із варіантів здійснення позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення вибране із раку підшлункової залози, раку яєчників, раку легені, раку ендометрія і мезотеліоми. У іншому варіанті здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення є раком, позитивним по двох антигенах. У іншому варіанті здійснення винаходу спосіб додатково містить призначення додаткового терапевтичного засобу індивідууму. У одному із таких варіантів здійснення винаходу додатковим терапевтичним засобом є гемцитабін. У іншому такому варіанті здійснення винаходу додатковим терапевтичним засобом є антитіло проти МОС16, кон'юговане із цитотоксичним агентом.
У іншому аспекті винахід стосується способу інгібування проліферації позитивної по мезотеліну клітини, спосіб, що містить вплив на клітину імунокон'югату, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу в умовах, придатних для зв'язування імунокон'югату із мезотеліном на поверхні клітини, тим самим інгібуючи проліферацію клітини. У одному із варіантів здійснення винаходу такою клітиною є клітина підшлункової залози, яєчника, легені, мезотеліоми і ендометрія. У іншому варіанті здійснення винаходу ця клітина є позитивною по двох антигенах клітиною.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення, де антитіло кон'юЮповане із міткою. У одному із варіантів здійснення винаходу міткою є випромінювач позитронів. У одному із таких варіантів здійснення винаходу випромінювачем позитронів є 892у.
У іншому аспекті винахід стосується способу виявлення мезотеліну людини в біологічному зразку, спосіб, що містить взаємодію біологічного зразка з антитілом проти мезотеліну, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення в умовах, відповідних для зв'язування антитіла проти мезотеліну із природним мезотеліном людини, і детекцію наявності або відсутності комплексу, утвореного антитілом проти мезотеліну і природним мезотеліном людини в біологічному зразку. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну містить (а) НМАК-НІ, НУВ-Н2, НУВ-НЗ, НМУВ-І1, НУВ-І2 ї НМК-ІЗ3 антитіла, продукованого
Зо гібридомою 1903 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464; (р) послідовність МН і послідовність МІ. антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС
РТА-11464; або (4) антитіло, продуковане гібридомою 1943 із ідентифікаційним номером АТСС
РТА-11464. У іншому варіанті здійснення винаходу біологічним зразком є зразок раку підшлункової залози, зразок раку яєчника, зразок раку легені, зразок раку ендометрія або зразок мезотеліоми. У іншому варіанті здійснення винаходу спосіб містить проведення імуногістохімічного аналізу зрізу тканини. У іншому варіанті здійснення винаходу біологічним зразком є сироватка.
У додатковому аспекті винахід стосується способу виявлення позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення, спосіб, що містить призначення міченого антитіла проти мезотеліну, де антитіло проти мезотеліну, як в будь-якому із вищеперерахованих варіантів здійснення, призначене для індивіда, що має або у якого передбачають наявність позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення, і виявлення міченого антитіла проти мезотеліну у індивіда, де виявлення міченого антитіла проти мезотеліну вказує на позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення у індивіда. У одному із варіантів здійснення винаходу мічене антитіло проти мезотеліну містить антитіло проти мезотеліну, кон'юговане із випромінювачем позитронів.
У одному із таких варіантів здійснення винаходу випромінювачем позитронів є 892у.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
На фігурі 1 показано, що мезотелін утвориться шляхом протеолітичного розщеплення білкового попередника із відділенням 31 кДа компонента (званого мегакаріоцитарним потенціюючим фактором, або МРРЕ) і 40 кДа компоненти мезотеліну. Останній компонент може залишатися зв'язаним із клітинною поверхнею, але може також бути відділений. "СНО" означає чотири сайти глікозилування, один - в МРЕ і три - в мезотеліні.
На фігурі 2 показано графічне представлення рівнів експресії гена мезотеліну людини в різних тканинах, як описано в Прикладі А.
На фігурі З показані властивості моноклональних антитіл проти мезотеліну, виділених, як описано в Прикладі В.
На фігурі 4 показано поєднання мишачих послідовностей варіабельної області легкого ланцюга антитіла 709 (ти708) і їх гуманізованих варіантів (709.м1 і 709.м3).
На фігурі 5 показано поєднання мишачих послідовностей варіабельної області важкого бо ланцюга антитіла 709 (ти708) і їх гуманізованих варіантів (709.м1 і 709.м3).
На фігурі 6 показані властивості химерних і гуманізованих варіантів 709, як описано в
Прикладі С.
На фігурі 7 показано поєднання мишачих послідовностей варіабельної області легкого ланцюга антитіла 22А10 (22А10) і їх гуманізованих варіантів (пи22А10Одгай і 22А10 м83).
На фігурі 8 показано поєднання мишачих послідовностей варіабельної області важкого ланцюга антитіла 22А10 (22А10) і їх гуманізованих варіантів (пи22Ат10огай і 22А10.м83).
На фігурі 9А показаний аналіз Скетчарда гуманізованих варіантів 22А10 на стабільно трансфікованих мезотеліном клітинах ВАВ, як описано в Прикладі С.
На фігурі 98 показана імунопреципітація мезотеліну під дією гуманізованих варіантів 22А10 із тих же самих стабільно трансфікованих клітин ВУАВ, як описано в Прикладі С.
На фігурі 10А показані послідовності гіперваріабельних і каркасних областей гуманізованих варіантів 709.
На фігурі 108 показані послідовності гіперваріабельних і каркасних областей гуманізованих варіантів 22А10.
На фігурі 11 показана гомологія послідовностей мезотеліну із різних видів, як описано в
Прикладі Ю. На фігурі 11 представлені 5ЕО ІЮО МО: 43 ії 46-48, відповідно, в порядку їх представлення.
На фігурі 12 показана перехресна реактивність пП709.у3 і п22А10.м83 із мезотеліном із різних видів, як описано в Прикладі 0.
На фігурі 13 показана афінність зв'язування гуманізованих антитіл проти мезотеліну, як визначено аналізом Скетчарда трансфікованих клітинних ліній, стабільно експресуючих мезотелін, і клітинних ліній, експресуючих ендогенний мезотелін, як описано в Прикладі Е.
На фігурі 14 показані результати конкурентного аналізу антитіла 709 або 22А10 їі інших моноклональних антитіл, перерахованих на фігурі 3, як описано в Прикладі Р.
На фігурі 15 показані конструкти химерного мезотеліну, що використовуються для картування епітопу (накреслені в масштабі), як описано в Прикладі 5. На фігурі 15 показані "ЕМЕК", "ПАЕО" і "ОМЕК" у вигляді ЗЕО ІЮ МО:51-53, відповідно.
На фігурі 16 показані результати ЕАСЗ5 за оцінкою зв'язування 709 і 22А10 із клітинами, які експресують химерний мезотелін, як описано в Прикладі 6.
Зо На фігурі 17 показана мутаційна стратегія для ідентифікації амінокислот, з якими зв'язуються П709.у3 і п22А10.м83, як описано в Прикладі 0... На фігурі 17 представлена "ЕМЕК" у вигляді 5ЕО ІЮ МО:51; "Нитап 132-212", "СупоІ32-212", "Ва!32-212" і "Моизе 132-212" у вигляді
ЗЕО ІЮ МО:54-57, відповідно; людські і мишачі "МОТ1", "МОТЗ3", "МОТв6", "МОТ7", "МОТО", "МОТ10", "МОТ13" ї "ШОТ15" у вигляді БЕО ІЮ МО:58-73, відповідно; і "ЗТКО" ії "ЗМКО" у вигляді
ЗЕО ІЮ МО:73 і 74, відповідно.
На фігурі 18А показані результати РЕАС5 за оцінкою зв'язування пП709.м3 і п22А10.м83 з клітинами, які експресують мутантні білки мезотеліну людини, як описано в Прикладі 0.
На фігурі 188 показані результати ЕАС5 за оцінкою зв'язування пП709.м3 із клітинами, які експресують мутантні білки мезотеліну яванської макаки, як описано в Прикладі 0.
На фігурі 19 показані ключові амінокислотні залишки в межах епітопів, із якими зв'язуються 7109/п1709.у3 і 22А10/122А10.м83, як описано в Прикладі 5. На фігурі 19 представлені ЗЕО ІО
МО:54-57, відповідно, в порядку трапляння.
На фігурі 20 показано зв'язування пП709.у3 із глікозилованим мезотеліном, як описано в
Прикладі Н.
На фігурі 21 показані результати двох аналізів виявлення наявності або відсутності блокування зв'язування мезотеліну із МОС19 під дією антитіл 1923, 709 і 22А10 і навпаки, як описано в Прикладі І.
На фігурі 22 показана експресія мезотеліну в протоковій аденокарциномі підшлункової залози способом імуногістохімії (ІНС), як описано в Прикладі .).
На фігурі 23 показана експресія мезотеліну в серозній аденокарциномі яєчників способом імуногістохімії (ІНС), як описано в Прикладі у.
На фігурі 24 показана експресія мезотеліну в аденокарциномі недрібноклітинного раку легені (МЗС С) способом імуногістохімії (ІНС), як описано в Прикладі У.
На фігурі 25 показана експресія мезотеліну в тканинах яванської макаки (панелі праворуч) способом імуногістохімії (ІНС), як описано в Прикладі «).
На фігурі 26 показано, що імунокон'югат п1709.м3-м-сСММАЄЕ демонструє ефективність дії в ксенотрансплантаті підшлункової залози НР АС, як описано в Прикладі Г.
На фігурі 27 показано, що імунокон'югат п1709.м3--сСММАЄЕ демонструє ефективність дії в вихідному ксенотрансплантаті підшлункової залози, як описано в Прикладі М.
На фігурі 28 показано, що імунокон'югат п1709.м3-м-сСММАЄЕ демонструє ефективність дії в моделі ксенотрансплантата пухлини яєчника, як описано в Прикладі М.
На фігурі 29 показано, що імунокон'югат п1709.м3-м-сСММАЄЕ демонструє ефективність дії в моделі ксенотрансплантата плоскоклітинної карциноми легені, як описано в Прикладі 0.
На фігурі 30 показано, що ефективність дії імунокон'югату п1709.м3-мсММАЄЕ відносно мезотеліну людини подібно такому імунокон'югату п22А10.м83-мсММАЄЕ відносно мезотеліну яванської макаки в пухлинних моделях ксенотрансплантата трансфікованих клітин ВАВ, як описано в Прикладі Р.
На фігурі 31 показано, що ефективність дії імунокон'югату п709.м3-мМсСММАЕ подібна такому імунокон'югату пП22А10.м83-мМсММАЄЕ в мезотеліомі і моделях пухлини яєчника, як описано в
Прикладі Р.
На фігурі 32 показано, що МОС16 утворить комплекс із мезотеліном, і два білки спільно відділяються від клітинних ліній, позитивних по двох антигенах, як описано в Прикладі с).
На фігурі 33 показано, що 1923, але не 709, витісняє заздалегідь зв'язаний МОС16 від мезотеліну.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ "Акцепторна каркасна ділянка людини" в рамках цього документа є каркасною ділянкою, що містить амінокислотну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга (МУ) або каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга (МН) із каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, як вказано нижче.
Акцепторна каркасна ділянка людини, "отримана із" каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, може містити ту ж саму амінокислотну послідовність вищезгаданого, або вона може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах здійснення винаходу число амінокислотних замін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше, або 2 або менше. У деяких варіантах здійснення винаходу акцепторна каркасна ділянка людини
МІ. ідентична послідовності каркасної ділянки МІ імуноглобуліну людини або послідовності консенсусної каркасної ділянки людини.
Зо "Афінність" стосується сили сумарних нековалентних взаємодій між одиничним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і його партнером зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо не вказано інше, "афінність зв'язування" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується властивої афінності зв'язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом і антигеном).
Афінність молекули Х для її партнера М може загалом бути охарактеризована константою дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна загальноприйнятими способами, відомими в даній галузі техніки, включаючи такі, описані в цьому документі. Конкретні ілюстративні і типові варіанти здійснення для вимірювання афінності зв'язування описані нижче.
Антитіло із "дозрілою афінністю" стосується антитіла із однією або декількома змінами в одній або декількох гіперваріабельних ділянках (НУК) в порівнянні із вихідним антитілом, якому не властиві такі зміни, що приводять до поліпшення афінності зв'язування антитіла з антигеном.
Терміни "антитіло проти мезотеліну" і "антитіло, яке зв'язується з мезотеліном" стосуються антитіла, яке здатне зв'язувати мезотелін із достатньою афінністю, завдяки чому антитіло може бути ефективним як діагностичний і/або терапевтичний засіб при направленому впливі на мезотелін. У одному із варіантів здійснення винаходу ступінь зв'язування антитіла проти мезотеліну із білком, відмінним від мезотеліну, складає приблизно менше 10 95 зв'язування даного антитіла із мезотеліном згідно із вимірюваннями, наприклад, радіоїмуноаналізу (КІА). У певних варіантах здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з мезотеліном, має константу дисоціації (Ка) «1 мкМ, «100 НМ, «10 НМ, «1 НМ, «0,1 нМ, «0,01 нМ або «0,001 нМ (наприклад,
БО 108 М або менше, наприклад, від 108 М до 10-33 М, наприклад, від 109 М до 10-73 М). У певних варіантах здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну зв'язується з епітопом мезотеліну, який консервативний у мезотелінів із різних біологічних видів.
Термін "антитіло" використовується в цьому документі в самому широкому значенні слова і охоплює різні структури антитіла, включаючи, крім іншого, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіла за умови, що вони виявляють необхідну антигензв'язувальну активність. "Фрагмент антитіла" стосується молекули, відмінної від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла і зв'язує антиген, із яким зв'язується інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіла включають, крім іншого, Ем, Бар, Раб Рар'5Н, Р(аб)»; діатіла; лінійні (с;
антитіла; одноланцюжкові молекули антитіла (наприклад, 5сЕм); і мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіла. "Антитіло, яке зв'язується із тим же самим епітопом", що і контрольне антитіло, стосується антитіла, яке блокує зв'язування контрольного антитіла із його антигеном в конкурентному аналізі на 50 95 або більше, і навпаки, контрольне антитіло блокує зв'язування антитіла із його антигеном в конкурентному аналізі на 5095 або більше. Типовий конкурентний аналіз представлений в цьому документі.
Терміни "злоякісне новоутворення" або "рак" стосуються фізіологічного стану або його описують у ссавців, що звичайно характеризується нерегульованим клітинним зростанням/проліферацією. Приклади раку включають, крім іншого, карциному, лімфому (наприклад, лімфому Ходжкіна і неходжкінську лімфому), бластому, саркому і лейкемію. Більш приватні приклади таких злоякісних пухлин включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені, плоскоклітинну карциному легені, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, рак товстої і прямої кишок, карциному ендометрія або матки, карциному слинних залоз, рак нирки, рак печінки, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, печінкову карциному, лейкемію і інші лімфопроліферативні порушення, і різні типи раку голови і шиї.
Термін "химерне" антитіло стосується антитіла, в якому частина важкого і/або легкого ланцюга отримана із певного джерела або виду, в той час як частина важкого і/або легкого ланцюга, що залишилася, отримана із іншого джерела або виду. "Клас" антитіла стосується типу константного домену або константної області, що були у важкого ланцюга. Існує п'ять основних класів антитіл: ДА, ДО, ІДЕ, дос і ІДМ, їі деякі із них можуть бути додатково розділені на підкласи (ізотипи), наприклад, ІдСь ІдС»2, ІдСз, ІдСя, ІА: і
ІдАг. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються ос, 5, є, у і й, відповідно.
Термін "цитотоксичний агент" в тому значенні, в якому він тут використовується, стосується речовини, яка інгібує або запобігає клітинній функції і/або викликає загибель або руйнування
Ко) клітини. Цитотоксичні агенти включають, крім іншого, радіоактивні ізотопи (наприклад, А", 1191, 25, у, Ве"86, Ве 88, Зт!»з, Віг2!2, рзг, рр": і радіоактивні ізотопи Гц); хіміотерапевтичні засоби або лікарські препарати (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); інгібітори росту; ферменти і їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як низькомолекулярні токсини або токсини, які мають ферментативну активність, бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи фрагменти і/або варіанти вищезазначеного; і різні протипухлинні або протиракові засоби, розглянуті нижче.
Термін "позитивне по двох антигенах злоякісне новоутворення" стосується злоякісної пухлини, що містить клітини, які позитивні як по мезотеліну, так і по МОС16.
Термін "позитивна по двох антигенах клітина" стосується клітини, яка експресує як мезотелін, так і МОС16 на своїй поверхні. "Ефекторні функції" стосуються тієї біологічної активності, властивої області Ес антитіла, які варіюють залежно від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв'язування С14д і комплемент-залежну цитотоксичність (СОС); зв'язування рецептора Ес; антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮСС); фагоцитоз; зниження регуляції рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора); і В-клітинну активацію. "Ефективна кількість" речовини, наприклад, фармацевтичної композиції, стосується кількості, ефективної в дозуванні і протягом необхідних періодів часу для досягнення необхідного терапевтичного або профілактичного результату.
Термін "епітоп" стосується певної ділянки на молекулі антигену, з якою зв'язується антитіло.
Термін "Рс-область" в цьому документі використовується для визначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить принаймні частину константної області. Термін містить нативну послідовність Ес-областей і відмінні від неї Ес-області. У одному із варіантів здійснення винаходу Ес-область важкого ланцюга Ід людини простягається від Суз226, або від
Рго230, до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак С-кінцевий лізин (Гуз447) Ес-області може бути присутнім або відсутнім. Якщо інше не вказане в цьому документі, нумерацію амінокислотних залишків в Ес-області або константній області здійснюють відповідно до 60 нумераційної системи ЕМО, яка також називається індексом ЕЕ, як описано в Кабаї еї аї.,
Зедиеєпсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неанй 5егісе, Маїйопаї Іпвійшев ої
Неайн, Веїйезаа, МО, 1991. "Каркасна ділянка" або "БК" стосується залишків варіабельного домену, відмінних від залишків гіперваріабельної області (НУК). ЕЕ. варіабельного домену, в основному, складається із чотирьох доменів ЕК: ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. Відповідно, послідовності НМК і ЕК, як правило, з'являються в наступній послідовності в МН (або МІ): ЕК1-НІ1(11)-ЕН2-НаА(І2)-ЕВЗ-НЗІ(І 3)-ЕНАУ.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "іІнтактне антитіло" і "ціле антитіло" використовуються в цьому документі взаємозамінно відносно антитіла, що має структуру, значною мірою схожу із структурою нативного антитіла, або що має важкі ланцюги, які містять Ес-область, як указано в цьому документі.
Термін "глікозиловані форми мезотеліну" стосується природних форм мезотеліну, які модифікуються на пост-трансляційному рівні шляхом додавання вуглеводних залишків.
Терміни "клітина-хазяїн", "клітинна лінія-хазяїн' і "клітинна /культура-хазяїн" використовуються взаємозамінно і стосуються клітин, в які була введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають вихідну трансформовану клітину і потомство, отримане із неї без урахування числа пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним вихідній клітині за вмістом нуклеїнової кислоти, але може містити мутації. Мутантне потомство, яке має ті ж самі функції або біологічну активність, класифіковану або відібрану в спочатку трансформованій клітині, включене в цей документ. "Антитіло людини" являє собою антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає антитілу, продукованому людиною або клітиною людини або отримано із відмінного від людини джерела, яке використовує репертуар антитіл людини або інші кодуючі антитіло послідовності людини. Це визначення антитіла людини виключає гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язуючі залишки, відмінні від таких людини. "Консенсусна каркасна область людини" є каркасною областю, яка є амінокислотними залишками, що найчастіше зустрічаються при відборі послідовностей каркасної області МІ. або
МН імуноглобуліну людини. Як правило, відбір послідовностей МІ або МН імуноглобуліну людини здійснюють із підгрупи послідовностей варіабельного домену. Як правило, підгрупа послідовностей є підгрупою, як в Кабаї єї аІ., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодісаї! Іптегеві, Б
Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, Веїпезаа МО (1991), моїів. 1-3. В одному із варіантів здійснення винаходу для М, підгрупа є підгрупою каппа І, як в Кабаї еї аї., див. вище. У одному із варіантів здійснення винаходу для УН, підгрупа є підгрупою ІП, як в Кабаї еї аї., див. вище. "Гуманізоване" антитіло стосується химерного антитіла, що містить амінокислотні залишки із
НМК, відмінних від людських, і амінокислотні залишки із ЕК людини. У певних варіантах здійснення винаходу гуманізоване антитіло містить практично весь принаймні один, і звичайно два, варіабельні домени, де всі або практично всі НУК (наприклад, СОК) відповідають таким антитіла, відмінного від людського, і всі або практично всі ЕЕ відповідають таким антитілам людини. Гуманізоване антитіло в деяких випадках може включати принаймні частину константної області антитіла, отриманої із антитіла людини. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, відмінне від людини антитіло, стосується антитіла, яке піддавалось гуманізації.
Термін "гіперваріабельна ділянка" або "НМЕ" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується кожної із ділянок варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними по послідовності і/або утворюють задані структурою петлі ("гіперваріабельні петлі"). Як правило, нативні чотириланцюжкові антитіла включають шість НМЕК; три в МН (НІ, Н2,
НЗ) ії три в МІ (11, 12, 3). НМК, як правило, включають амінокислотні залишки із гіперваріабельних петель і/або із "областей, які визначають комплементарність" (СОМ), при цьому останні із згаданих мають найбільшу варіабельність послідовності і/або залучені до розпізнавання антигену. Типові гіперваріабельні петлі утворені амінокислотними залишками 26- 32 (11), 50-52 (12), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ). (Споїіа апа І езкК, 9. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)). Типові СОК (СОБК-І1, СОВ-І2, СОВ-13, СОВ-НІ, СОВ-Н2 ії СОБ-НЗ) утворені амінокислотними залишками 24-34 області І 1, 50-56 області 12, 89-97 області І 3, 31-
З35В області НІ, 50-65 області Н2 і 95-102 області НЗ. (Кабаї єї аїЇ., ЗХедпепсе5 ої Ргоївїпв5 ої
Іттипо|одіса! Іпіегевзі, Бій Ей. Рибріїс Неайй 5бегуїісе, Маїййопаї! Іпзійшев ої Неаїй, ВеїШезаа, МО (1991)). За винятком СОКІ в МН, СОК, як правило, включають амінокислотні залишки, утворюючі гіперваріабельні петлі. СОЖК також включають "залишки, які визначають специфічність" або "БОМ", які є залишками, взаємодіючими із антигеном. 5БОК знаходяться всередині областей СОК, умовно названими -СОК, або а-СОК. Типові а-СОВ (а-СОВ-11, а-
СОоВв-І2, а-СОВ-І3, а-СОВ-НІ, а-СОВ-Н2 і а-СОВ-НЗ) утворені амінокислотними залишками 31- 60 34 області 11, 50-55 області 12, 89-96 області І 3, 31-35В8 області НІ, 50-58 області Н2 і 95-102 області НЗ (див. АІтадго апа Егапе5оп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008)). Якщо не вказане інше, залишки НМК і інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) пронумеровані в цьому документі відповідно до КарБбаї еї а!., див. вище. "Імунокон'югат" є антитілом, кон'югованим із однією або декількома гетерологічними молекулами, включаючи, крім іншого, цитотоксичний агент. "Індивідуум" або "індивід" є ссавцем. Ссавці включають, крім іншого, домашніх тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак і коней), приматів (наприклад, людей і відмінних від людини приматів, як, наприклад, мавп), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і щурів). У певних варіантах здійснення, індивідуумом або індивідом є людина. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, яке було відділене від домішки його природного оточення. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло очищають до більше, ніж 95 95 або 99 95 ступеня чистоти, що визначається, наприклад, електрофоретичними (наприклад, 505-
РАСЕ, ізоелектричне фокусування (ІЕЕ), капілярний електрофорез) або хроматографічними (наприклад, іонно-обмінна або зворотно-фазова НРІ С) способами. Для детального розгляду способів оцінки чистоти антитіл див., наприклад, Біайтап еї аї., У. Спготаїйодг. В 848:79-87 (2007). "Виділена нуклеїнова кислота" стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка була відділена від домішки її природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота містить молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які, як правило, містять молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти знаходиться поза хромосомою або має хромосомну локалізацію, відмінну від її природної хромосомної локалізації. "Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти мезотеліну", стосується однієї або декількох молекул нуклеїнової кислоти, що кодують важкі і легкі ланцюги антитіла (або їх фрагменти), включаючи таку(ї) молекулу(и) нуклеїнової кислоти в складі одиничного вектора або окремих векторів, і таку(ї) молекулу(и) нуклеїнової кислоти, що має(ють) одну або декілька локалізацій в клітині-хазяїні.
Термін "мезотелін" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується будь-якого природного, зрілого мезотеліну, утвореного внаслідок процесингу білкового попередника мезотеліну в клітині. Термін містить мезотелін із будь-яких хребетних, включаючи
Зо ссавців, таких як примати (наприклад, люди і яванські макаки) і гризуни (наприклад, миші і щури), якщо не вказане інше. Термін також містить природні варіанти мезотеліну, наприклад, варіанти сплайсингу або алельні варіанти. Амінокислотна послідовність типового білкового попередника мезотеліну людини наведена в 5ЕО ІЮ МО:42, і типовий мезотелін людини наведена в 5ЕО ІО МО:43. Додаткові типові послідовності мезотеліну описані в цьому документі.
Термін "позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення" стосується злоякісної пухлини, що містить клітини, які експресують мезотелін на своїй поверхні.
Термін "позитивна по мезотеліну клітина" стосується клітини, якої експресує мезотелін на своїй поверхні.
Термін "моноклональне антитіло" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується антитіла, отриманого із популяції значною мірою гомогенних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що входять до складу популяції, ідентичні і/або зв'язують один і той же епітоп, за винятком можливих варіантних антитіл, наприклад, що містять мутації, що зустрічаються в природі або виникаючих під час виробництва препаратів моноклонального антитіла, при цьому такі варіанти антитіл в основному присутні в слідових кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклонального антитіла направлене проти однієї детермінанти антигену. Таким чином, визначення "моноклональне" вказує на властивість антитіла, отриманого із практично гомогенної популяції антитіл, і не повинно бути витлумачене як таке, що вимагає виробництва антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що підлягають використанню відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані різними методиками, включаючи, крім іншого, гібридомну технологію, біотехнологію на основі рекомбінантної ДНК, способи фагового дисплея і способи застосування трансгенних тварин, що містять всі або частину локусів імуноглобуліну людини, при цьому такі способи або інші типові способи створення моноклональних антитіл описані в цьому документі.
Термін "позитивне по МОС16 злоякісне новоутворення" стосується злоякісної пухлини, що містить клітини, які експресують МОС16 на своїй поверхні.
Термін "позитивна по МОСТ16 клітина" стосується клітини, яка експресу є МОС16 на своїй поверхні.
"Незахищене антитіло" стосується антитіла, яке не кон'юговане із гетерологічною молекулою (наприклад, цитотоксичним агентом) або радіоактивною міткою. Незахищене антитіло може входити до складу фармацевтичної композиції. "Нативні антитіла" стосуються молекул природних імуноглобулінів із різною структурою.
Наприклад, нативні антитіла ДС є гетеротетрамерними глікопротеїнами масою приблизно 150000 дальтон, що складаються із двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, які зв'язані між собою дисульфідними містками. Від М- до С-кінця кожний важкий ланцюг має варіабельну ділянку (МН), яка також називається варіабельним доменом важкого ланцюга, за яким йдуть три константні домени (СН, СН» і СНз). Подібним чином, від М- до С- кінця кожний легкий ланцюг має варіабельну ділянку (У), яка також називається варіабельним доменом легкого ланцюга, за яким йде константний легкий (СІ) домен. Легкий ланцюг антитіла може бути віднесений до одного із двох типів, званих каппа (к) і лямбда (5), на основі амінокислотної послідовності їх константного домену.
Термін "вкладиш" використовується відносно інструкцій, звичайно вкладених в комерційні упаковки терапевтичних продуктів, які містять інформацію про свідчення до застосування, використання, дозування, способи застосування, комбінованої терапії, протипоказаннях і/або запобіжних засобах, що стосуються використання таких терапевтичних продуктів. "Процент (95) ідентичності амінокислотної послідовності" в порівнянні із контрольною послідовністю поліпептиду визначають як процент амінокислотних залишків в послідовності, яка представляє інтерес, які ідентичні амінокислотним залишкам в контрольній послідовності поліпептиду, після поєднання послідовностей і внесення пропусків, у випадку необхідності, для досягнення максимального процента ідентичності послідовності, і не розглядаючи будь-які консервативні заміни як частину ідентичності послідовності. Поєднання з метою визначення процента ідентичності амінокислотної послідовності може бути досягнуто різними шляхами, які знаходяться в рамках знань в даній галузі техніки, наприклад, використовуючи загальнодоступні комп'ютерні програми, такі як ВГАЗТ, ВГА5ЗТ-2, АГІОМ або Медаїїдп (ОМА5ТАК) програми.
Фахівці в даній галузі техніки можуть визначити придатні параметри для поєднання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального поєднання по всій довжині послідовностей, що підлягають порівнянню. У рамках цього документа, однак, значення 95 ідентичності амінокислотної послідовності отримують, використовуючи комп'ютерну програму порівняння послідовностей АГ ЇОМ-2. Авторські права на комп'ютерну програму порівняння послідовностей АГІСМ-2 має Сепепіесн, Іпс., і текст програми був поданий разом із документацією по використанню у відомство з охорони авторського права
США, Умазпіпдюп 0.С., 20559, де він був зареєстрований під реєстраційним номером реєстрації авторського права США ТХИО510087. Програма АГІСМ-2 загальнодоступна в Сепепіесйп, Іпс.,
Боцій Зап Егапсізсо, Саїйогпіа або може бути скомпільована із тексту програми. Програма
АПІСИМ-2 може бути скомпільована для використання в операційній системі ОМІХ, включаючи цифровий ОМІХ М4.00. Всі параметри порівняння послідовностей задані в програмі АГІСМ-2 Її не змінюються.
У випадках, коли АГІСМ-2 застосовують для порівняння амінокислотних послідовностей, 90 ідентичності послідовності амінокислот даної амінокислотної послідовності А по відношенню, з або залежно від даної амінокислотної послідовності В (що альтернативно може бути сформульовано як дана амінокислотна послідовність А, яка має або містить певний 95 ідентичності послідовності амінокислот відносно, з або залежно від даної амінокислотної послідовності В) обчислюють таким чином: 100 помножити на частку Х/"У, де Х являє собою число амінокислотних залишків, розраховане як ідентичні пари програмою поєднання послідовностей АЇ ЇМ-2 при поєднанні А і В в даній програмі, і де М являє собою загальне число амінокислотних залишків в В. Слід розуміти, що у випадку, якщо довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 90 ідентичності послідовності амінокислот А відносно В не буде дорівнювати 95 ідентичності послідовності амінокислот В відносно А. Якщо спеціально не указано інше, всі значення 95 ідентичності послідовності амінокислот, що використовуються в цьому документі, отримують, як описано в попередньому абзаці, використовуючи комп'ютерну програму АГІСМ-2.
Термін "фармацевтична композиція" стосується препарату, який знаходиться в такій лікарській формі, щоб біологічна активність активного інгредієнта, що міститься в ній, була ефективною, і який не містить додаткових компонентів, які є недопустимо токсичними для індивіда, якому призначають дану композицію.
"Фармацевтично прийнятний носій" стосується інгредієнта в фармацевтичній композиції, відмінного від активного інгредієнта, який є нетоксичним для індивіда. Фармацевтично прийнятний носій містить, крім іншого, буфер, допоміжну речовину, стабілізатор або консервант. "Лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "що лікує") в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується клінічного втручання в спробі змінити природний хід хвороби індивідуума, що підлягає лікуванню, і може бути виконано або в профілактичних цілях, або під час протікання клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають, крім іншого, запобігання вияву або повторному вияву захворювання, часткове зняття симптомів, зменшення яких-небудь прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазуванню, зниження швидкості прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення стану захворювання, і ремісію або поліпшений прогноз.
У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла за винаходом використовуються для затримки розвитку захворювання або для сповільнення прогресування захворювання.
Термін "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" стосується домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який залучений до зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (МН і МІ, відповідно) природного антитіла, в основному, мають схожі структури, де кожний домен містить чотири консервативні каркасні області (ЕК) і три гіперваріабельні ділянки (НУК). (Див., наприклад, Кіпаїй еї аї. Кибі Іттипоїіоду, бій ед., М.Н. Ргеетап апа Со., раде 91 (2007).) Одиничний домен МН або Мі. може виявитися достатнім для придання антигензв'язуючої специфічності. Більш того антитіла, які зв'язують певний антиген, можуть бути виділені, використовуючи домен МН або Мі із антитіла, який зв'язує антиген для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів МІ. або МН, відповідно. Див., наприклад, Ропоїапо еї аї., У. Іттипої. 150:880-887 (1993); СіаїКвоп еї аї!., Майте 352:624-628 (1991).
Термін "вектор" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної розмножати іншу нуклеїнову кислоту, до якої вона приєднана. Термін містить вектор як структура нуклеїнової кислоти, яка самореплікується, а також вектор, вбудований в геном клітини-хазяїна, в яку він був введений. Певні вектори здатні керувати експресією нуклеїнової кислоти, із якою вони функціонально зв'язані. Такі вектори
Зо називаються в цьому документі "експресійними векторами".
І. КОМПОЗИЦІЇ І СПОСОБИ
У одному із аспектів, винахід оснований, частково, на антитілах, які зв'язуються з мезотеліном, і імунокон'югатах, які містять такі антитіла. Антитіла і імунокон'югати за винаходом придатні, наприклад, для діагностики або лікування позитивних по мезотеліну злоякісних пухлин.
А. Типові антитіла проти мезотеліну
У одному із аспектів, винахід являє виділені антитіла, які зв'язують мезотелін. Природний мезотелін з'являється внаслідок розщеплення білкового попередника мезотеліну в клітині, утворюючи мезотелін і мегакаріоцитарний потенціюючий фактор (МРРЕ), як показано на фігурі 1.
Мезотелін містить укорочення С-кінця відносно білка-попередника. Таке укорочення може зумовлювати зв'язування якоря СРІ. Мезотелін може залишатися пов'язаним із клітинною поверхнею, наприклад, через якір СРІ, або мезотелін може від'єднувати від клітини (наприклад, якір ОРІ може розщеплюватися досі не ідентифікованим ферментом) із утворенням мезотеліну, який відщепився, в клітинній культурі або сироватці крові тварин.
Типова послідовність білюового попередника природної мезотеліну людини представлена як
ЗЕО ІЮ МО:42, і відповідна послідовність мезотеліну представлена як 5ЕБЕО ІВ МО:43 (відповідаючи амінокислотам 296-580 5ЕО ІЮ МО:42). Альтернативна послідовність мезотеліну відповідає амінокислотам 296-598 5БЕО ІЮ МО:42. 5ЕО ІЮ МО:44 являє собою природний варіант
ЗЕО І МО:42, результатом процесинга якого є мезотелін, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:45.
ЗЕО ІЮО МО:45 містить вставку із восьми амінокислотних залишків в позиції 116 амінокислоти відносно 5ЕО ІЮ МО:43. Альтернативна форма мезотеліну, представлена в 5ЕО ІЮ МО:45, мабуть, становить «5 95 транскриптів мезотеліну в пухлинних клітинних лініях.
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну має щонайменше одну або декілька наведених нижче властивостей в будь-якому поєднанні: (а) зв'язує епітоп ЗЕО ІЮ МО:43, який містить (ї) Е153 і 0174 або (ії) Е211; (Б) виявляє або не виявляє змінене або зменшене зв'язування із різними глікозилованими формами мезотеліну; (с) блокує або не блокує зв'язування мезотеліну із МОС16; (а) зв'язує мезотелін з афінністю «5 НМ, або альтернативно «1 нМ, або альтернативно «0,5 60 НМ, або альтернативно «0,1 НМ, і в деяких випадках »0,0001 нМ. У будь-якому із вищенаведених варіантів здійснення винаходу антитіло, яке не блокує зв'язування мезотеліну із
МИиИС16, являє собою антитіло, яке посилює зв'язування мезотеліну із МОС16.
У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну зв'язує епітоп ЗЕО ІЮ
МО:43, який містить Е153 і 0174. У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну додатково має одну або декілька нижченаведених властивостей в будь-якому поєднанні: (а) не виявляє зменшене зв'язування із глікозилованими формами мезотеліну; (Б) не блокує зв'язування мезотеліну з МОС16; (с) зв'язує мезотелін із афінністю «5 НМ, або альтернативно «1 нМ, або альтернативно «0,5
НМ, і в деяких випадках 20,0001 нМ.
У таких варіантах здійснення винаходу антитіло, яке не блокує зв'язування мезотеліну із
МИС16, посилює зв'язування мезотеліну із МОС16 і/або антитіло зв'язується із афінністю «1 НМ.
Характерне антитіло, що має наведені вище властивості, є 709, і його гуманізовані варіанти, такі як 709.3, розглянуті в цьому документі. У будь-якому із вищезазначених варіантів здійснення винаходу мезотелін, з яким зв'язується антитіло проти мезотеліну, є мезотеліном людини.
У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну зв'язує епітоп ЗЕО ІЮ
МО:43, який містить Е211. У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну додатково має одну або декілька наведених нижче властивостей: (а) не блокує зв'язування мезотеліну із МОС16; (Б) зв'язує мезотелін з афінністю 55 НМ, або альтернативно «1 НМ, або альтернативно «0,5
НМ, і в деяких випадках 20,0001 нМ.
У таких варіантах здійснення винаходу антитіло, яке не блокує зв'язування мезотеліну із
МИиИС16, посилює зв'язування мезотеліну із МОС16, і/або антитіло зв'язується із афінністю «1
НМ. Характерним антитілом, що має вищезгаданими властивостями, є 22А10, і його гуманізовані варіанти, такі як 22А10.м83, розглянуті в цьому документі. У будь-якому із вищенаведених варіантів здійснення винаходу мезотелін, з яким зв'язується антитіло проти мезотеліну, є мезотеліном людини, мезотеліном яванської макаки і/або мезотеліном щура.
У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну:
Зо (а) зв'язується з епітопом в межах амінокислот 1-131 5БЕО ІЮ МО:43; і (Б) зв'язує мезотелін із афінністю 55 нМ, або альтернативно «1 нМ, або альтернативно «0,5
НМ, або альтернативно «0,1 нМ, і в деяких випадках 20,0001 нМ.
У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло блокує зв'язування мезотеліну із
МИиСТ16 і/або зв'язується із епітопом в межах амінокислот 1-64 або 1-70 5ЕО ІЮ МО:43. У одному із таких варіантів здійснення винаходу антитіло витісняє МОС16 із зв'язку з мезотеліном.
Характерним антитілом, що має вищезазначеними властивостями, є 1923, розглянуте в цьому документі. У будь-якому із вищенаведених варіантів здійснення винаходу мезотелін, з яким зв'язується антитіло проти мезотеліну, є мезотеліном людини.
Способи
Щоб визначити, "чи зв'язується з епітопом 5ЕО ІЮ МО:43, що містить Е153 і 0174" або "чи зв'язується з епітопом 5ЕО ІЮ МО:43, що містить Е211" антитіло проти мезотеліну, ці залишки піддаються мутуванню в поліпептиді, що містить ЗЕО ІЮ МО:43, і аналізують зв'язування антитіла з мутованим поліпептидом, який експресується в клітинах 293, способом ЕАС5, як описано в Прикладі б, де значне зниження (270 95 зниження) або усунення зв'язування антитіла із мутантним поліпептидом вказує на те, що антитіло зв'язується з епітопом 5ЕО ІЮ МО:43, що містить Е153 і 0174 або Е211.
Щоб визначити, чи дійсно антитіло проти мезотеліну "не виявляє ослабленої взаємодії із глікозидованими формами мезотеліну", міченого мезотелін людини експресується в клітинах
СНО, його очищають (за допомогою мітки) і додатково розділяють відповідно до заряду на колонці Мопо 5 на фракції з високою (фракція А11), середньою (А12), низькою (В1) і практично відсутнім (85) ступенем глікозилування мезотеліну, як описано в Прикладі Н. Кожну фракцію наносять на чип із заздалегідь зв'язаним антитілом проти мезотеліну і вимірюють швидкість асоціації і швидкість дисоціації для кожної фракції. Якщо значення афінності для кожної фракції знаходиться в межах 25 95 один від одного, це вказує на те, що антитіло не виявляє ослабленої взаємодії з глікозилованими формами мезотеліну.
Щоб визначити, чи дійсно антитіло проти мезотеліну "блокує зв'язування мезотеліну із
МИиИС16", "не блокує зв'язування мезотеліну із МОС16" або "посилює зв'язування мезотеліну із
МИС16", виконують аналіз зв'язування МИОС16б таким чином. Зокрема, біотинільований фрагмент МОС16 (що містить три муцинові повтори) інкубують із клітинами А431, стабільно бо експресуючих мезотелін в присутності або відсутності антитіла проти мезотеліну, і рівень зв'язування біотинільованого МИОС16 із клітинами визначають БАС5 за допомогою стрептавідину-«РЕ. Сайт зв'язування МОС16б в молекулі мезотеліну був експериментальним чином локалізований в перших 64 амінокислотних залишках мезотеліну (КапекКо еї аї.,». Віо!
Спет. 248:3739-49 (2009)). З іншого боку, клітини РСЗ, стабільно експресують МОС16, інкубують в присутності очищеного мезотеліну-піз8 ("пі8" представлений у вигляді ЗЕО ІЮ
МО:49), заздалегідь інкубованого із антитілами проти мезотеліну, і зв'язування очищених комплексів мезотелін-піз5: антитіло із МОС16б-експресуючими клітинами визначають способом
ЕАС5, використовуючи анти-Нізб антитіло, кон'юЮговане з АІеха-647 ("Нізб" представлений у вигляді ЗЕО ІЮ МО:50). Якщо в будь-якому із вищезгаданих способів, сигнал ЕАСЗ на 50 95 нижче в присутності антитіла проти мезотеліну, ніж в його відсутність, тоді вважають, що антитіло блокує зв'язування мезотеліну із МОС16. Якщо в будь-якому із вищезгаданих способів, сигнал ЕАС5 не знижується 250 9о в присутності антитіла проти мезотеліну, тоді вважають, що антитіло не блокує зв'язування мезотеліну із МОС16. Якщо в останньому із згаданих вище способів аналізу сигнал ЕАС5 збільшується в присутності антитіла проти мезотеліну, ніж в його відсутність, тоді вважають, що антитіло збільшує зв'язування мезотеліну з МОС16. "Чи зв'язується антитіло проти мезотеліну із афінністю «5 НМ, або альтернативно «1 нМ, або альтернативно «0,5 НМ, або альтернативно «0,1 нМ" визначають згідно з аналізом Віасоге, як описано в цьому документі в розділі П.А. 1. Зокрема, Ка вимірюють, використовуючи поверхневий плазмонний резонансний аналіз, використовуючи ВІАСОМКЕФ-2000 або
ВІАСОКЕФ-3000 (ВІАсоге, Іпс., Різсагамжау, МУ) при 25 "С застосовуючи чипи із іммобілізованим антигеном СМ5 при «10 одиницях відповіді (КО). Коротко, карбоксиметиловані декстранові біосенсорні чипи (СМ5, ВІАСОКЕ, Іпс.) активуються М-етил-М'-(З-диметиламінопропіл)- карбодііміду гідрохлоридом (ЕОС) і М-гідроксисукцинімідом (МН) відповідно до рекомендацій фірми-виробника. Антигеном, що підлягає дослідженню, є мезотелін, синтезований і виділений із Е.соЇї, як описано в Прикладі В. Антиген розводять 10 мМ ацетату натрію, рН 4,8 до концентрації 5 мкг/мл (х0,2 мкМ) до введення при швидкості потоку 5 мкл/хв. для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (КО) пов'язаного білка. Після ін'єкції антигену вводять 1М етаноламін для блокування груп, що не беруть участь в реакції. Для кінетичних вимірювань двократне серійне розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) вводить в РВ5 із 0,05 95 полісорбат
Зо 20 (ТМ/ЕЕМ-207м) сурфактантом (РВ5Т) при 25"С при швидкості потоку, який дорівнює приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Кол) ії швидкості дисоціації (Ко обчислюють, використовуючи просту взаємно-однозначну модель зв'язування Ленгмюра (ВІАСОКЕФ
Емаїнайоп Зоймаге мегбзіоп 3.2) шляхом одночасного вирівнювання сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Ка) обчислюють за відношенням Копй/ Коп. Див., наприклад, Спеп еї аї., у). Мої. ВіоїІ. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації перевищує 106
М" се", використовуючи вищезгаданий спосіб поверхневого плазмонного резонансного аналізу, тоді швидкість асоціації може бути визначена шляхом використання методики гасіння флуоресценції, яка вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження-295 нм; емісія-340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25 "С 20 нМ антитіла (Гар форма) проти антигену в РВ5, рН 7,2, в присутності збільшуваних концентрацій антигену згідно із вимірюваннями спектрофотометра, такого як обладнаний зупинкою потоку спектрофотометр (Амім Іпбігитепіб) або розрахованого на 8000 зразків 5ІМ-АМІМСО спектрофотометр (Тептозресігопіс) із обертовою кюветою.
Антитіло 7059 і інші варіанти здійснення винаходу
У одному із аспектів винахід стосується антитіла проти мезотеліну, що містить принаймні один, два, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибрані із (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:20; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ
МО:21; (с) НМЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5600 ІЮ МО:22; (4) НМК-І/1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 17; (є) НМК-І2, що містить амінокислотну
БО послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18; ії () НМАК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:19.
У одному із аспектів винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві, або всі три послідовності МН НМ, вибрані із (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:20; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ
МО:21; ї (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:22. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:22. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 562 1ЮО МО:22, і НМК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО:19. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМА- 60 НЗ, що містить амінокислотну послідовність «ЕЕ ІЮ МО:22, НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:19, ї НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:21. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:20; (Б) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:21; і (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:22.
У іншому аспекті, винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві, або всі три МІ НМ послідовності, вибрані із (а) НМА-Ї1, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:17; (Б) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО:18; і (с) НМАК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО:19. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить (а) НМАК-11, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО
ІО МО: 17; (Б) НУВ-1І2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:18; і (с) НМЕ-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:19.
У іншому аспекті антитіло за винаходом містить (а) МН домен, що містить принаймні одну, принаймні дві, або всі три послідовності МН НМ, вибрані із () НМЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:20, (ії) НМА-На2г, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:21, і (ії) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану із зФЕО ІЮ МО:22; і (Б) М. домен, що містить принаймні одну, принаймні дві, або всі три послідовності МІ НМК, вибрані із (ї) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:17, (ії) НМЕ-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО:18, ї (с) НМК-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:20; (Б) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:21; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:22; (94) НМА-І11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:17; (є) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО':18; і (У НМК-І 3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 19.
У будь-якому із вищезазначених варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну є гуманізованим. У одному із варіантів здійснення, антитіло проти мезотеліну містить НУК, як в будь-якому із вищезазначених варіантів здійснення, і додатково містить акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад, каркасна ділянка імуноглобуліну людини або консенсусна каркасна ділянка людини. У певних варіантах здійснення акцепторною каркасною ділянкою людини є консенсусна каркасна ділянка Мі каппа | людини (Мікі) і/або каркасна ділянка МН (МНадта), яка відрізняється від консенсусної послідовності підгрупи Ш МН людини (МНії) по З положеннях:
ЕЛЛА, М7ЗТ і І78А (Сапег еї аї!., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 89:4285 (1992)). У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну містить НУК, як в будь-якому із вищезазначених варіантів здійснення винаходу і додатково містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність каркасної ділянки ЕК2 5ЕО ІО МО:25, і послідовність ЕКЗ 5ЕО ІЮО МО:27. У одному із таких варіантів здійснення винаходу каркасною ділянкою варіабельного домену легкого ланцюга є модифікована консенсусна каркасна ділянка (Мі кі) МІ. каппа І, що має ЕК2 послідовність ЗЕО ІЮ МО:25 і ЕКЗ послідовність зЕО ІЮ МО:27.
У іншому аспекті антитіло проти мезотеліну містить послідовність варіабельного домену (УН) важкого ланцюга, яка принаймні на 90 95, 91 9Уо, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 Фо, 96 Фо, 97 Фо, 98 о, 9995 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:8. У певних варіантах здійснення винаходу послідовність УН, яка принаймні на 90 Фо, 91 У, 92 95, 93 95, 94 Уо, 95 Фо, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентична, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і/або делетовані в ЗЕО ІЮ МО:8. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза
НМЕ (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить УН послідовність БХЕО
ІЮ МО: 8, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу УН містить один, два або три НУК, вибрані із: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО:20, (Б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:21, і (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:22.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), який принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 94 9, 95 95, 96 9, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичний амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:4.
У певних варіантах здійснення винаходу послідовність МІ, яка принаймні на 90 95, 91 95, 92 Ор, 9395, 9495, 9596, 969, 9795, 9895 або 9995 ідентична, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло бо проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і або делетовані в ЗЕО ІЮО МО:4. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза НМ (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить МІ. послідовність БЕО ІЮ МО:4, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу Мі містить один, два або три НМК, вибрані із: (а) НМЕК-11, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО:17, (р) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО:18, ї (с) НМК-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:19.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить МН, як в будь-якому із вищеописаних варіантів здійснення винаходу і Мі, як в будь-якому із вищеописаних варіантів здійснення винаходу. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить послідовності МН і Мі в 5ЕО ІЮ МО:8 ії 5ЕО ІЮ МО:4, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
У додатковому аспекті винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, що і антитіло проти мезотеліну за даним винаходом. Наприклад, в певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, що і антитіло проти мезотеліну, що містить послідовність МН 5ЕО ІЮО МО:8 і послідовність МІ 5ЕО ІЮО МО:4. У певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43 із ділянки амінокислот 152-175, всередині нього або його охоплюючи. У певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43, який містить Е153 і 0174. У певних таких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язує амінокислотні залишки Е153 і 0174.
У додатковому аспекті винаходу антитіло проти мезотеліну за будь-яким із вищеописаних варіантів здійснення винаходу є моноклональним антитілом, включаючи химерне, гуманізоване антитіло або антитіло людини. У одному із варіантів здійснення винаходу антитілом проти мезотеліну є фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Раб, Раб", 5сЕм, діатіло або К(ав)2 фрагмент. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло є практично повнорозмірним антитілом, наприклад, антитілом ЇДО1 або іншим класом або ізотипом антитіл, як визначено в цьому документі.
У додатковому аспекті антитіло проти мезотеліну за будь-яким із вищеописаних варіантів
Зо здійснення винаходу може мати будь-яку характерну властивість, нарізно або в поєднанні, як описано в Розділах 1-7 нижче:
Антитіло 22А10 і інші варіанти здійснення винаходу
У одному із аспектів винахід стосується антитіла проти мезотеліну, що містить принаймні один, два, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних із (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:36; (р) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:37; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:38 або 39; (й) НМК-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:33; (є) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:34; їі () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ
МО:35.
У одному із аспектів винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МН НМ, вибрані із (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 36; (р) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 37; і (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 38 або 39. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5БЕО ІЮ МО:38 або 39. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло містить
НМУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:38 або 39, і НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:35. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:38 або 39, НМА-
ІЗ, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО:35, і НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:37. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить (а)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІЮ МО:36; (5) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ 10 МО:37; і (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:38 або 39.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МІ НУК, вибрані із (а) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:33; (р) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:34; і (с) НМК-І З, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:35. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:33; (б) НМВ-12, що містить амінокислотну послідовність БЕ ІЮ МО:34; і (с) НМК-І3, що містить 60 амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО:35.
У іншому аспекті антитіло за винаходом містить (а) домен УН, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МН НМК, вибрані із () НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:З6, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО:37, і (ії) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО:38 або 39; і (Б) домен МІ, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МІ. НУК, вибрані із () НМК-11, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:33, (ії) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО:34; і (с) НММК-ІЇЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:35.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 36; (б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:37; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:38 або 39; (а)
НМВ-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІЮ МО:33; (є) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО:34; їі (35 НМК-ІЇЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану із ФЕО ІЮ МО:З35.
У будь-якому із вищеописаних варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну є гуманізованим. У одному із варіантів здійснення, антитіло проти мезотеліну містить НМЕК, як в будь-якому із вищеописаних варіантів здійснення, і додатково містить акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад, каркасна ділянка імуноглобуліну людини або консенсусна каркасна ділянка людини. У певних варіантах здійснення винаходу акцепторною каркасною ділянкою людини є акцепторна каркасна ділянка М кі і/або МН.
У іншому аспекті, антитіло проти мезотеліну містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), яка принаймні на 90 95, 91 9Уо, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 Фо, 96 Фо, 97 Фо, 98 о, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:16. У певних варіантах здійснення винаходу послідовність УН, яка принаймні на 90 Фо, 91 У, 92 95, 93 95, 94 Уо, 95 Фо, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентична, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і/або делетовані в 5ЕО ІЮО МО: 16. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза
НМЕ (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить МН послідовність зЗЕО
ІЮ0 МО:16, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу УН містить один, два або три НУК, вибрані із: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО:З6, (Б) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:37, і (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:38 або 39.
У іншому аспекті, стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), який принаймні на 90 95, 91 Фо, 92 95, 93 9о, 94 95, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 9895, 9995 або 100 95 ідентичний амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 12. У певних варіантах здійснення винаходу послідовність МІ, яка принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Фо, 94 96, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентична, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і/або делетовані в
ЗЕО І МО: 12. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза НМК (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить МІ. послідовність ЗЕ ІЮ МО:12, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу МІ. містить один, два або три НУК, вибрані із: (а) НМА-
ЇЇ, що містить амінокислотну послідовність БО 10 МО:33; (Б) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО:34; і (с) НММК-ІЇЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:35.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить МН, як в будь-якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу і Мі, як в будь-якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить МН і МІ послідовності в з«ЕО ІЮ МО: 16 ії БЕО ІЮ МО:12, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
У додатковому аспекті винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, як антитіло проти мезотеліну за даним винаходом. Наприклад, в певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, як антитіло проти мезотеліну, що містить МН послідовність ЗЕО ІЮ МО:16 і МІ. послідовність 5ЕО ІЮ МО:12. У певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43 із ділянки амінокислот 60 211-327, всередині нього або його охоплюючи. У певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43, який містить Е211. У певних таких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язує амінокислотний залишок Е211.
У додатковому аспекті винаходу антитіло проти мезотеліну за будь-яким із вищеописаних варіантів здійснення винаходу є моноклональним антитілом, включаючи химерне, гуманізоване антитіло або антитіло людини. У одному із варіантів здійснення винаходу антитілом проти мезотеліну є фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Раб, Раб", зсЕм, діатіло або Е(ар)г2 фрагмент. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло є практично повнорозмірним антитілом, наприклад, антитілом Ідс2а або іншим класом або ізотипом антитіл, як визначено в цьому документі.
У додатковому аспекті антитіло проти мезотеліну за будь-яким із вищеописаних варіантів здійснення винаходу може мати будь-яку характерну властивість, нарізно або в поєднанні, як описано в Розділах 1-7 нижче:
Антитіло 193 і інші варіанти здійснення винаходу
У одному із аспектів винахід стосується антитіла проти мезотеліну, що містить принаймні один, два, три, чотири, п'ять або шість НМК антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У контексті даного розділу НМК обведені контуром у вигляді набору амінокислот, відповідних СОК, як визначено в цьому документі.
У одному із аспектів винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МН НУК антитіла, продукованого гібридомою 193 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить НМК-НЗ антитіла, продукованого гібридомою 193 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМАК-НЗ ї НМК-І З антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТС РТА-11464. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМК-НЗ, НМУВ-Ї3 ії НМК-Н2 антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло містить НМК-НІ, НУМВ-Н2 ії НМК-НЗ антитіла, продукованого гіоридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три послідовності МІ НМК антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить НМЕ-1 1,
НМВ-12 їі НМК-Ї3 антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТОС
РТА-11464. У іншому аспекті антитіло по винаходу містить (а) МН домен, що містить принаймні одну, принаймні дві або всі три МН НУК послідовності антитіла, продукованого гібридомою 1903 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464; і (Б) МІ домен, що містить принаймні одну, як мінімум дві або всі три МІ НМК послідовності антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла, що містить НМК-НІ, НУВ-Н2, НМК-НЗ, НУВ- 1, НМВ-І2 ї НМК-Ї3 антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером
АТСС РТА-11464.
У будь-якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу антитіла проти мезотеліну є гуманізованими. У одному із таких варіантів здійснення, антитіло є гуманізованою формою антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У додатковому варіанті здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну містить НМК, як в будь- якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу, і додатково містить акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад, каркасна ділянка імуноглобуліну людини або консенсусна каркасна ділянка людини.
У іншому аспекті антитіло проти мезотеліну містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (МН), що має принаймні 90 95, 91 9, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 95, 96 Фо, 97 95, 98 9о, 99 95 або 100 95 ідентичність МН антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У певних варіантах здійснення винаходу послідовність МН містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і/або делетовані в МН антитіла, продукованого гібридомою 19С3 із ідентифікаційним номером АТОС РТА-11464. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза НУК. (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить МН послідовність антитіла, продукованого гібридомою 19023 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу МН містить один, два або три НМК,
вибрані із НМК-НІ, НМВ-Н2 ії НМК-НЗ антитіла, продукованого гібридомою 19023 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), який принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 У, 94 9, 9596, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичний МІ. антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У певних варіантах здійснення винаходу послідовність МІ, яка принаймні на 90 95, 91 95, 92 9», 93 о, 94 95, 95 90, 96 Фо, 97 У», 98 96 або 99 95 ідентична, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції відносно контрольної послідовності, але антитіло проти мезотеліну, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язувати мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу всього від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені і/або делетовані в Мі антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464. У певних варіантах здійснення винаходу заміни, вставки або делеції здійснюють в ділянках поза НМК (тобто, в ЕК). У деяких випадках, антитіло проти мезотеліну містить МІ послідовність антитіла, продукованого гіоридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. У окремому варіанті здійснення винаходу МІ. містить один, два або три НУК, вибрані із НМК-1І 1, НМУВ-1І2 ї НМА-І3 антитіла, продукованого гібридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну, де антитіло містить УН, як в будь-якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу, і Мі, як в будь-якому із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу. У одному із варіантів здійснення винаходу антитіло містить послідовності МН і Мі антитіла, продукованого гібридомою 19023 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
У додатковому аспекті винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, як антитіло проти мезотеліну за даним винаходом. Наприклад, в певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язує той же самий епітоп, як антитіло, продуковане гіоридомою 1923 із ідентифікаційним номером АТСС РТА-11464.
У додатковому аспекті винаходу антитіло проти мезотеліну за будь-яким із розглянутих вище варіантів здійснення винаходу є моноклональним антитілом, включаючи химерне, гуманізоване антитіло або антитіло людини. У одному із варіантів здійснення винаходу антитілом проти мезотеліну є фрагментом антитіла, наприклад, Ем, Раб, Рар', 5сЕм, діатіло або
Каб)» фрагмент. У іншому варіанті здійснення винаходу антитіло є практично повнорозмірним антитілом, наприклад, антитілом Їде25 або іншим класом або ізотипом антитіл, як визначено в цьому документі.
У додатковому аспекті, антитіло проти мезотеліну за будь-яким із вищеописаних варіантів здійснення винаходу може мати будь-яку характерну властивість, нарізно або в поєднанні, як описано в Розділах 1-7 нижче: 1. Афінність антитіла
У певних варіантах здійснення винаходу константа дисоціації (Ка) антитіла за даним винаходом дорівнює (Ка) «1 мкМ, «100 НМ, «10 нМ, «1 НМ, «0,1 нМ, «0,01 нМ або «0,001 НМ, і в деяких випадках » 10-73 М (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 108 М до 10-33 М, наприклад, від 1079 М до 10-73 М).
У одному із варіантів здійснення винаходи Ка вимірюють способом аналізу зв'язування радіоактивно міченого антигену (КІА), що виконується із використанням Раб фрагмента антитіла, яке представляє інтерес, і його антигену, як описано представленим нижче способом.
Афінність зв'язування Рарзх для антигену в розчині вимірюють урівноваженням ЕРар мінімальною концентрацією (125І)-міченого антигену в присутності серій розведення неміченого антигену, потім виявляючи зв'язаний антиген за допомогою покритого антитілами до Раб планшета (див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881 (1999)). Для визначення умов проведення аналізу, багатоямкові планшети МІСКОТІТЕКФ (Тпегто Зсіепійіс) покривають протягом ночі 5 мкг/мл антитілами до Раб (Сарреї І арх) по виявленню зв'язаного антигену в 50 мМ карбонаті натрію (рН 9,6) і потім блокують 2 95 (вага/об'єм) бичачим сироватковим альбуміном в РВ5 протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У планшетах без адсорбенту (Мипс 2269620) 100 пкМ або 26 пкмМ Г2І|-антиген змішують із серійним розведенням
Еар, який представляє інтерес (наприклад, у випадку оцінки антитіл до МЕСЕ, Рар-12, в Ргезіа еї аІ., Сапсег Вев. 57:4593-4599 (1997)). Раб, який представляє інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак, інкубація може продовжуватися більш тривалий період (наприклад, приблизно 65 годин) для забезпечення досягнення рівноважного стану. Потім суміші переносять в фіксуючий бо планшет для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють і планшет промивають вісім разів 0,1 95 полісорбатом 20 (ТМУЕЕМ-20Ф)) в РВ5.
Як тільки планшети висихають, додають 150 мкл/ямка сцинтилятора (МІСКОЗСІМТ-20;
Раскаго), і планшети обраховують в лічильнику гамма-випромінювання ТОРСОШМТ "М (РаскКага) протягом 10 хвилин. Концентрації кожного Раб, які демонструють 20 95 або меншу величину від максимального зв'язування, вибирають для використання в конкурентному аналізі зв'язування.
Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходи Ка вимірюють шляхом використання поверхневого плазмонного резонансного аналізу, використовуючи ВІАСОКЕФ-2000 або
ВІАСОКЕФ-3000 (ВІАсоге, Іпс., Різсагамжау, МУ) при 25 "С, застосовуючи чипи із іммобілізованим антигеном СМ5 при -10 одиницях відповіді (КО). Коротко, карбоксиметиловані декстранові біосенсорні чипи (СМ5, ВІАСОКЕ, Іпс.) активуються М-етил-М'-(3- диметиламінопропіл)карбодіїміду гідрохлоридом (ЕЮБС) і М-гідроксисукцинімідом /(МНБ) відповідно до рекомендацій фірми-виробника. Антиген розводять 10 мМ ацетатом натрію, рн 4,8, до концентрації 5 мкг/мл (70,2 мкМ) до введення при швидкості потоку 5 мкл/ухвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (КО) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигену вводять 1М етаноламін для блокування груп, що не беруть участь в реакції. Для кінетичних вимірювань двократне серійне розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) вводить в РВ5 з 0,05 95 полісорбат (ТМЕЕМ-207М) сурфактантом (РВЗТ) при 25 "С при швидкості потоку, рівному приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Коп) і швидкості дисоціації (Кобє) обчислюють, використовуючи просту взаємно-однозначну модель зв'язування Ленгмюра (ВІАСОКЕФ Емаїцчайоп Зопймаге мегвіоп 3.2) 20 шляхом одночасного вирівнювання сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Ка) обчислюють по відношенню Кой/Коп. Див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації перевищує 105 М' с" використовуючи вищезгаданий спосіб поверхневого плазмонного резонансного аналізу, тоді швидкість асоціації може бути визначена шляхом використання методики гасіння флуоресценції, яка вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження-295 нм; емісія-340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25 "С 20 нМ антитіла (Габ форма) проти антигену в РВ5, рн 7,2, в присутності концентрацій антигену, які збільшуються згідно із вимірюваннями спектрофотометра, такого як обладнаний зупинкою потоку спектрофотометр (Амім Іпбігитепів) або розрахованого на 8000 зразків 5БІМ-АМІМСО М спектрофотометр (Пептозресігопіс) із
Зо обертовою кюветою. 2. Фрагменти антитіла
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за даним винаходом є фрагментом антитіла. Фрагменти антитіла включають, крім іншого, Раб, Рар', Рар-5ЗН, К(аб)г, Ем і 5сЕм фрагменти, і інші фрагменти, розглянуті нижче. Для огляду певних фрагментів антитіла див.
Нидзоп еї аї., Маї. Мей. 9:129-134 (2003). Для огляду фрагментів 5сЕм див., наприклад,
РінскІйип, іп Те Рпаптасоіоду ої Мопосіопа! Апіірбодіє5, мої. 113, Нозепригд апа Мооге еєдб5., (5ргіпдег/-Мепад, Мем МогК), рр. 269-315 (1994); див. також УМО 93/16185; і патенти США МоМо 5571894 і 5587458. Для обговорення фрагментів Раб і Е(аб)», що містять залишки зв'язування епітопу рецептора реутилізації і, що мають підвищений час життя іп мімо, див. патент США Мо 5869046.
Діатіла є фрагментами антитіла з двома антигензв'язуючими сайтами, які можуть бути бівалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 404097; УМО 1993/01161; Нидзоп еї аї.,
Маї. Меа. 9:129-134 (2003); і НоїПпдег еї аІ., Ргос. Майї). Асай. 5сі. ОБА 90: 6444-6448 (1993).
Триатіла і тетратіла також описані в Нидзоп еї а!., Маї. Меа. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла є фрагментами антитіла, що містять весь варіабельний домен важкого ланцюга антитіла або його частину або весь варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або його частину. У певних варіантах здійснення винаходу однодоменне антитіло є однодоменним антитілом людини (ботапії5, Іпс., УуУайкпат, МА; див., наприклад, патент США Мо 6248516 81).
Фрагменти антитіла можуть бути отримані різними способами, включаючи, крім іншого, протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також продукцію рекомбінантними клітинами- хазяїнами (наприклад, Е. соїї або фагами), як описано в цьому документі. 3. Химерні і гуманізовані антитіла
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за даним винаходом є химерним антитілом. Певні химерні антитіла описані, наприклад, в патенті США Мо4816567; і Моїтізоп еї аІ,, Рос. Май. Асад. осі. ОБА, 81:6851-6855 (1984)). В одному прикладі, химерне антитіло містить відмінний від варіабельної ділянки людини (наприклад, варіабельна ділянка, отримана із миші, щура, хом'яка, кролика або відмінного від людини примата, такого як мавпа) і константна ділянка людини. У додатковому прикладі, химерне антитіло є антитілом із
"переключеним синтезом класу", в якому клас або підклас був змінений при порівнянні із вихідним антитілом. Химерні антитіла включають їх антигензв'язуючі фрагменти.
У певних варіантах здійснення винаходу химерне антитіло є гуманізованим антитілом. Як правило, відмінне від людини антитіло гуманізують для зниження імуногенності для людини, при цьому зберігаючи специфічність і афінність вихідної відмінної від антитіла людини. У основному, гуманізоване антитіло містить один або декілька варіабельних доменів, в яких НМК, наприклад, СОЕ (або їх частини) отримані із відмінної від антитіла людини, і ЕК (або їх частини) отримані із послідовностей антитіла людини. Гуманізоване антитіло, в деяких випадках, також містить принаймні частину константної ділянки людини. У деяких варіантах здійснення винаходу деякі залишки ЕК в гуманізованому антитілі замінені відповідними залишками із відмінної від антитіла людини (наприклад, антитіло, із якого отримані залишки НУК), наприклад, із метою відновлення або поліпшення специфічності або афінності антитіла.
Гуманізовані антитіла і способи їх отримання розглянуті, наприклад, в АІтадго апа Егапе5оп,
Егопі. Віовзсі. 13:1619-1633 (2008) і додатково описані, наприклад, в Кіесптапп еї аї., Майте 332:323-329 (1988); Оцееп еї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патенті США
МоМо 5821337, 7527791, 6982321 і 7087409; Казптітгі еї аІ., Мешоа» 36:25-34 (2005) (що описує пересадку ЗОК (асСоОкК); Радіап, Мої. Іттипої. 28:489-498 (1991) (що описує "відновлення поверхні"); баІгАсдпа еї а!., Меї(оаз 36:43-60 (2005) (що описує "перестановку ЕК"); і ОзБоцгп еї аІ,, Меїнод5 36:61-68 (2005) і Кіїтка еї аї., Вг. У. Сапсег, 83:252-260 (2000) (описуючий спосіб "направленої селекції" відносно перестановки ЕК).
Каркасні області людини, які можуть бути використані для гуманізації, включають, крім іншого: каркасні області, вибрані, використовуючи спосіб "найкращої відповідності" (див., наприклад, 5ітз аї аї., 9. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні області, отримані із консенсусної послідовності антитіл людини певної підгрупи варіабельних ділянок легкого або важкого ланцюга (див., наприклад, Сагег еї аї., Ргос. Ма!й!. Асайд. 5сі. ОБА, 89:4285 (1992); і Ргезіа еї аї. ..
Ітітипої., 151:2623 (1993)); зрілі (соматично мутовані) каркасні ділянки людини або каркасні ділянки зародкової лінії людини (див., наприклад, Аітадго апа Егап5зоп, Егопі. Віозсі. 13:1619- 1633 (2008)); і каркасні ділянки, отримані із бібліотек скринінгу ЕК (див., наприклад, Васа еї аї.,
У. ВіоІ. Спет. 272:10678-10684 (1997) і Козокеї аї., 9. Віої. Спет. 271:22611-22618 (1996)). 4. Антитіла людини
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за даним винаходом є антитілом людини.
Антитіла людини можуть бути отримані, використовуючи різні методики, відому в даній галузі техніку. Антитіла людини описані в загальних рисах в статтях мап рі)кК апа мап де Умпкеї, Ситт.
Оріп. Рнаптасої. 5: 368-74 (2001) і Гопбрего, Ситгт. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Антитіла людини можуть бути отримані введенням імуногена трансгенній тварині, яка була модифікована з метою продукування інтактних антитіл людини або інтактних антитіл із варіабельними ділянками людини у відповідь на антигенний стимул. Такі тварини звичайно містять всі імуноглобулінові локуси людини або їх частину, які заміняють ендогенні імуноглобулінові локуси, або які знаходяться поза хромосомою або випадковим чином інтегровані в хромосоми тварин. У таких трансгенних мишах ендогенні імуноглобулінові локуси, в основному, інактивовані. Для огляду способів отримання антитіл людини із трансгенних тварин див. ІГопрего, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Див. також, наприклад, патенти США
МоМо 6075181 і 6150584, що описують технологію ХЕМОМОИЗЕ "М: патент США Мо 5770429, що описує технологію НиМаре; патент США Мо 7041870, що описує технологію К-М МООЗЕЄ, і публікацію патентної заявки США Мо 05 2007/0061900, що описує технологію Меіосімоивзеф)).
Варіабельні ділянки людини із інтактних антитіл, продуковані такими тваринами, можуть бути додатково модифіковані, наприклад, шляхом поєднання із іншою константною ділянкою людини.
Антитіла людини можуть бути також отримані основаними на гібридомній технології способами. Були описані мієломні і мишаче-людські гетеромієломні клітинні лінії людини для продукування моноклональних антитіл людини. (Див., наприклад, Ко?брог 9. Іттипої., 133:3001 (1984); Вгодеийг єї аїЇ., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіоп Тесппіднез апа Арріїсаїйоп5, рр. 51-63 (Магсе! ОекККег, Іпс., Мем/ МогК, 1987); і Воегпег еї аї, У. Іттипої., 147:86 (1991).) Людські антитіла, отримані за допомогою технології використання В-клітинної гібридоми людини, також описані в І і еї аї., Ргос. Маї. Асад. 5сі. ОБА, 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи включають такі, описані, наприклад, в патенті США Мо 7189826 (що описує продуковання моноклональних антитіл ІМ людини гібридомними клітинними лініями) і в статті Мі, Хіапдаї Міапуїхие, 26(4): 265- 268 (2006) (яка описує гібридоми людина-людина). Технологія застосування гібридоми людини (технологія Тгіота) також описана в статті МоПтег:5 апа Вгапаїеїп, НіхіоІоду апа Ніхораїйо!оду,
29(3):927-937 (2005) і МоПптег5 апа Вгапаїєїп, Меїпоаз апа Ріпаіпо5 іп Ехрегітепіаї! апа Сііпісаї
Рпаптасоіоду, 27(3): 185-91 (2005).
Антитіла людини можуть бути також отримані шляхом виділення послідовностей варіабельного домену клону Ес, вибраних із бібліотек фагового дисплея людського походження.
Такі послідовності варіабельного домену можуть потім бути комбіновані з необхідним константним доменом людини. Технології відбору антитіл людини із бібліотек антитіл описані нижче. 5. Антитіла, отримані із бібліотек
Антитіла за винаходом можуть бути виділені шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек для антитіл із необхідною активністю або активностями. Наприклад, цілий ряд способів відомі в даній галузі техніки для отримання бібліотек фагового дисплея і скринінгу таких бібліотек по виявленню антитіл, що мають необхідні характеристикам зв'язування. Такі способи розглянуті, наприклад, в Ноодепроот еї аї., Мейодз іп МоїІесшіаг Віоіоду 178:1-37 (О'"Віїєп еї а!., ед., Нитап
Рге55, Тоїомжа, МУ, 2001) і додатково конкретизовані, наприклад, в МеСайепу еї аї., Маїште 348:552-554; СІасквоп еї аї., Маште 352: 624-628 (1991); Магкз5 еї аї., 9. Мої. Віо! 222: 581-597 (1992); МаїК5 апа Вгадригу, іп Меїпод5 іп МоїІесшаг Віоіоду 248:161-175 (І о, ед., Нитап Ргевв,
Тоїоула, МУ, 2003); 5іапи еї аї., У. Мої. Віо! 338(2): 299-310 (2004); І ее еї аї., У. Мої. Віої. 340(5): 1073-1093 (2004); РеїІоизе, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 101(34): 12467-12472 (2004); ії ее еї аї,..
Іттипої. Меїйоавз 284(1-2): 119-132(2004).
У певних способах фагового дисплея, репертуари генів МН ії МІ. окремо клонують способом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і рекомбінують випадковим чином в фагових бібліотеках із подальшим їх скринінгом по виявленню антигензв'язуючого фагу, як описано в статті УМіптег еї., Апп. Нем. Іттипої., 12:433-455 (1994). В фазі, як правило, представлені фрагменти антитіла або у вигляді одноланцюжкових фрагментів Ем (5сЕм), або у вигляді фрагментів Раб. Бібліотеки із імунізованих джерел представляють високо афінні антитіла відносно імуногену без необхідності створення гібридом. Альтернативно, може бути клонований інтактний репертуар (наприклад, із людини) для забезпечення єдиним джерелом антитіл до широкого набору відмінних від власних і також власних антигенів без якої-небудь імунізації, як описано стій еї аІ.,, ЕМВО У, 12:725-734 (1993). І нарешті, інтактні бібліотеки можуть бути також отримані штучно
Зо шляхом клонування не перегрупованих У-генних сегментів із стовбурових клітин і використання
ПЛР-праймерів, що містять випадкову послідовність, для кодування високо варіабельних ділянок СОКЗ і виконання перегрупування іп міїго, як описано в статті Ноодепроот апа Ум/іптег, у.
Мої. Віо!., 227:381-388 (1992). Патентні публікації, що розглядають фагові бібліотеки антитіл людини, включають, наприклад: патент СІНА Мо 5750373 і патентні публікації США МоМо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237 764, 2007/0292936 і 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені із бібліотек антитіл людини, вважаються в цьому документі антитілами людини або фрагментами антитіл людини. 6. Мультиспецифічні антитіла
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за даним винаходом є мультиспецифічним антитілом, наприклад, біспецифічним антитілом. Мультиспецифічні антитіла є моноклональними антитілами, які мають специфічність зв'язування принаймні для двох різних сайтів. У певних варіантах здійснення винаходу одна із специфічностей зв'язування призначена для мезотеліну і інша - для будь-якого іншого антигену. У певних варіантах здійснення винаходу біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися із двома різними епітопами мезотеліну. Біспецифічні антитіла можуть також бути використані для локалізації цитотоксичних агентів на клітинах, яких експресують мезотелін. Біспецифічні антитіла можуть бути приготовані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.
Методики створення мультиспецифічних антитіл включають, крім іншого, рекомбінантну спільну експресію двох пар важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобуліну, що мають різні специфічності (див. Міїбієїп апа СцепПо, Маїиге 305:537 (1983)), ММО 93/08829 і Тгаипескег еї аї.,
ЕМВО 3. 10:3655 (1991) і техніку "виступ-у-заглиблення" (див., наприклад, патент США Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла можуть бути також отримані шляхом створення електростатичних ефектів регулювання для отримання Ес-гетеродимерних молекул антитіла (МО 2009/089004А1); перехресного зв'язування двох або більше антитіл або фрагменти (див., наприклад, патент США Мо 4676980 і Вгеппап еї аї., зсіепсе, 229: 81 (1985)); використання лейцинових блискавок для отримання біспецифічних антитіл (див., наприклад, КовзіеїІпу еї аї.,».
Іттипої!., 148(5): 1547-1553 (1992)); використання технології "діатіло" для створення фрагментів біспецифічного антитіла (див., наприклад, НоїЇйпдег еї аї., Ргос. Маї). Асай. бсі. ОБА, 90:6444- бо 6448 (1993)); і використання димерів одноланцюжкових Ем (5Ем) (див., наприклад, Оогибег еї аї.,
У. Іттипої., 152:5368 (1994)); і приготування триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, в
Тий еї а. у. Іттипої. 147:60(1991).
Сконструйовані антитіла з трьома або більше функціональними сайтами зв'язування антигену, включаючи "антитіла, що нагадують восьминога", також включені в цей документ (див., наприклад, ОЗ 2006/0025576А1).
Антитіло або фрагмент в цьому документі також містить "РАБ подвійної дії" або "ОАЕ", що містить сайт зв'язування антигену, який зв'язується з мезотеліном, а також із іншим, відмінним від нього антигеном (див., 05 2008/0069820, наприклад). 7. Варіанти антитіл
У певних варіантах здійснення винаходу розглядаються варіанти амінокислотної послідовності антитіл, представлених в цьому документі. Наприклад, бажано поліпшити афінність зв'язування і/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла можуть бути отримані шляхом внесення придатних модифікацій в нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу. Такі модифікації включають, наприклад, делеції і/або вставки, і/або заміни залишків всередині амінокислотних послідовностей антитіла. Будь-яка комбінація делеції, вставки або заміни може бути здійснена для отримання остаточного конструкта за умови, що остаточний конструкт має необхідні характеристики, наприклад, антигензв'язувальні. а) Варіанти заміни, вставки і делеції
У певних варіантах здійснення винаходу представлені варіанти антитіл, які мають одну або декілька амінокислотних замін. Сайти, що представляють інтерес для заміщувального мутагенезу включають НУК і ЕК. Консервативні заміни представлені в Таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Більш істотні зміни представлені в Таблиці 1 під заголовком "типові заміни" і, як додатково описано нижче, відносно класів бічних ланцюгів амінокислот. Амінокислотні заміни можуть бути внесені в антитіло, що представляє інтерес, і продукти піддають скринінгу на предмет необхідної активності, наприклад, збереженого/поліпшеного зв'язування антигену, зниженої імуногенності або поліпшеної АОСС або СОС.
Таблиця 1 ле) | Сеш Ма; МекАа;Рперснорлейцин.ї | їв: З ( 7711 цец( | ОНорлейцин. Не: Ма; МесАіа;РЛЄї | їв
Амінокислоти можуть бути об'єднані в групи відповідно до загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТАг, Азп, біп; (3) кислі: Авр, Си; (4) основні: Нів, Гуз, Аго; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: Су, Рго;
(6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.
Неконсервативні заміни можуть спричинити зміну членства в одному класі на таке в іншому класі.
Один тип замісного варіанта містить заміну одного або декількох залишків гіперваріабельної ділянки вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або антитіла людини). Як правило, варіант(и), які отримується(ються) в результаті, вибраний(ї) для подальшого дослідження, мають модифікації (наприклад, поліпшення) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищену афінність, знижену імуногенність) відносно вихідного антитіла і/або практично зберігають певні біологічні властивості вихідного здійснення варіантних послідовностей МН і МІ, розглянутих вище, кожний НУК або незмінений, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
Придатним способом ідентифікації залишків або ділянок антитіла, що є мішенню мутагенезу, є "аланін-скануючий мутагенез", як описано Сиппіпдапат апа М/еїІз (1989) Зсієпсе, 244:1081-1085. В цьому способі залишок або група цільових залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як аго, ар, Пів, Іуз і дІш) ідентифікують і замінюють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити чи змінилася взаємодія антитіла із антигеном. Додаткові заміни можуть бути внесені в місцях розташування амінокислот, демонструючи функціональну чутливість до первинних замін.
Альтернативно, або додатково, кристалічна структура комплексу антиген-антитіло використовується для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном. Такі контактуючі залишки і сусідні залишки можуть виступати як мішень або бути видалені як кандидати для заміни. Варіанти можуть бути піддані скринінгу з метою визначення можливої наявності у них необхідних властивостей.
Вставки амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбокси-кінцеві зчеплення, що варіюють по довжині від одного залишку до поліпептидів, що містять сотню або більше залишки, а також вставки всередині послідовності, що складаються із одного або множини амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіоніловим залишком. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають зчеплення М- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, для АОЕРТ) або поліпептидом, який збільшує
Зо час життя антитіла в сироватці. р) Глікозиловані варіанти
У певних варіантах здійснення винаходу антитіло за даним винаходом, змінено для збільшення або зменшення ступеня глікозилування даного антитіла. Внесення або делеція сайтів глікозилування в рамках антитіла можуть бути успішно виконані шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, що один або більше сайтів глікозилування створюється або видаляється.
У випадку, коли антитіло містить ділянку Ес, карбогідрат, до нього приєднаний, може бути змінений. Нативні антитіла, продуковані клітинами ссавців, звичайно включають розгалужений, 2-антенарний олігосахарид, який, як правило, приєднаний за допомогою М-зв'язку з А5п297 домену СН2 ділянки Ес. Див., наприклад, М/гідні еї аІ. ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Олігосахарид може включати різні карбогідрати, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СіІсМАс), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до сіІсСМАс у "стеблі" 2-антенарної олігосахаридної структури. У деяких варіантах здійснення винаходу модифікації олігосахариду антитіла за винаходом можуть бути створені з метою створення варіантів антитіла із певними поліпшеними властивостями.
У одному із варіантів здійснення винаходу представлені варіанти антитіла, що мають карбогідратну структуру, в якій відсутня фукоза, приєднана (напряму або опосередковано) до ділянки Ес. Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може складати від 1 95 до 80 95, від 1 95 до 65 905, від 5 95 до 65 95 або від 20 95 до 40 95. Кількість фукози визначають обчисленням середньої кількості фукози в сахаридному ланцюгу в положенні Азп297 відносно суми всіх глікоструктур, прикріплених до А5п297 (наприклад, комплексних, гібридних і високоманозних структур) згідно із вимірюваннями способом мас-спектрометрії МА! 0БІ-ТОЕ, як описано в УМО 2008/077546, наприклад Азп297 стосується аспарагінового залишку, розташованого приблизно в позиції 297 ділянки Ес (нумерація ЄЮ залишків ділянки Ес); однак А5п297 може бути також розташований приблизно 3 амінокислоти вище або нижче позиції 297, тобто між позиціями 294 і 300, внаслідок незначних варіацій послідовності антитіла. Такі фукозиловані варіанти можуть мати поліпшену функцію АЮСС. Див., наприклад, публікацію патенту США МоМо О5 2003/0157108 (Ргевіа, І.); 5 2004/0093621 (Куожа Накко Кодуо Со., ЦЯ). Приклади публікацій, що стосуються "дефукозилованих" або "позбавлених фукози" варіантів антитіла, включають: О5 60 2003/0157108; УМО 2000/61739; МО 2001/29246; 05 2003/0115614; 005 2002/0164328; 5
2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 005 2004/0110282; 005 2004/0109865; МО 2003/085119; М/о 2003/084570; УМО 2005/035586; МО 2005/035778; МО2005/053742;
УМО2002/031140; ОКа?лакі еї аї. У. Мої. Віої. 336:1239-1249 (2004); Матапе-ОНпикі еї аї. Віоїесн.
Віоепо. 87: 614 (2004). Приклади клітинних ліній, здатних продукувати дефукозиловані антитіла, включають І ее 13 СНО клітини, позбавлені фукозилування білків (КірКа еї аї!., Агсп. Віоспет.
Віорпув. 249:533-545 (1986); патентна заявка США Мо 5 2003/0157108 АЇ, Ргевіа, Ї., ії ММО 2004/056312 АТ, Адатз еї аї., зокрема в Прикладі 11), і нокаутні клітинні лінії, такі як нокаутні по гену альфа-1,6-фукозилтрансферази, ГОТ8, клітини СНО (див., наприклад, Хатапе-ОНпикі еї а!., Віоїесп. Віоепо. 87: 614 (2004); Капаа, У. еї а!., Віотесппої. Віоєпо., 94(4):680-688 (2006); і
МО2003/085107).
Додатково представлені варіанти антитіл із розрізаними пополам олігосахаридами, наприклад, в яких 2-антенарний олігосахарид, приєднаний до ділянки Ес антитіла, розрізаний пополам на сіІСМАс. Такі варіанти антитіла можуть мати знижене фукозилування і/або поліпшену функцію АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, в УМО 2003/011878 (еап-Маїгеї еї аІ.); патенті США Мо 6602684 (тапа еї аІ.); ії 05 2005/0123546 (Огаапа єї а). Варіанти антитіл принаймні із одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до ділянки Ес, також розглянуті. Такі варіанти антитіл можуть мати поліпшену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, в М/О 1997/30087 (Раїеї еї а); УМО 1998/58964 (Каїсч, 5.); і УМО 1999/22764 (Раї)иц, 5.). с) Варіанти ділянки Ес
У певних варіантах здійснення винаходу одна або декілька амінокислотних модифікацій можуть бути внесені в ділянку Ес антитіла, розглянутого в цьому документі, тим самим утворюючи варіант ділянки Ес. Варіант ділянки Ес може включати послідовність ділянки Ес людини (наприклад, ділянка Ес ІдС1, Ідс2, ІдДЗ3 або Ідс4 людини), що містить амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) в одній або декількох амінокислотних позиціях.
У певних варіантах здійснення винахід розглядає варіант антитіла, який має деякі, але не всі ефекторні функції, що робить його цільовим кандидатом для застосування, де час життя антитіла іп мімо важливий, незважаючи на те, що певні ефекторні функції (такі як комплемент і
АОСС) не є необхідними або шкідливо впливають. Аналізи цитотоксичності іп міго і іп мімо можуть бути виконані для підтвердження зменшення/падіння активності СОС і/або АОС.
Наприклад, аналізи зв'язування Ес рецептора (ЕСЕ) можуть бути виконані, щоб пересвідчитися в тому, що у антитіла відсутня зв'язуюча ЕсукК активність (тим самим, мабуть, відсутня активність АЮСС), але зберігається здатність зв'язування ЕсКп. Первинні клітини для опосередковування АЮСС, клітини МК, експресують тільки ЕсСКІїЇ, в той час як моноцити експресують ЕсСКІ, ЕсСКІІ ї ЕС. Дані по експресії СК у гематопоетичних клітинах зведені в
Таблицю З на сторінці 464 статті Камеїспй і Кіпеї, Аппи. Кем. Іттипої. 9:457-492 (1991).
Необмежені приклади аналізів іп міго за оцінкою активності АОСС являючої інтерес молекули описані в патенті США Мо 5500362 (див., наприклад, Неїї5ігоп, І. еї а). Ргос. Маг! Асад. зЗсі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) і НеїІ5ігот, І. еї аІ. Ргос. Маг! Асад. сі. ОБА 82:1499-1502 (1985); 5821337 (див. Вгиддетапп, М. еї аї., у. Ехр. Мед. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно можуть бути застосовані нерадіоактивні способи аналізу (див., наприклад, АСТІ"М нерадіоактивний аналіз цитотоксичності для проточної цитометрії (Сеї! Тесппооду, Іпс. Мошипіаїп Міему, СА; і СуютТох 96Ф нерадіоактивний аналіз цитотоксичності (Рготеда, Мадіхоп, УМ). Придатні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і клітини натуральних кілерів (МК). Альтернативно, або додатково, активність АОСС являючої інтерес молекули може бути оцінена іп мімо, наприклад, в тваринній моделі, такій як описано в Сіупез еї аІ. Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОБА 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування С14 можуть бути також виконані для підтвердження того, що антитіло не здатне зв'язувати С14 і, отже, у нього відсутня активність СОС. Див., наприклад, ЕГІЗА зв'язування Сід і СЗс в М/О 2006/029879 і УМО 2005/100402. Для оцінки активації комплемента може бути виконаний аналіз СОС (див., наприклад, Салапо-Запіого еї аї., у). Іттипої. Меїноде 202:163 (1996); Стадо, М.5. єї аї., Віосіа 101:1045-1052 (2003); і Стадд, М.5. і М.У. СІеппіє, Віоса 103:2738-2743 (2004)). Зв'язування БсКп і визначення кліренсу/час життя іп мімо можуть бути також виконані, використовуючи способи, відому в даній галузі техніки (див., наприклад, Реїкома, 5.В. еї аї., Тит. Іттипої. 18(12):1759- 1769 (2006)).
Антитіла із зниженою ефекторною функцією включають такі із заміною одного або декількох залишків ділянки Ес 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (патент США Мо 6737056). Такі мутанти Ес включають мутантів Ес із замінами в двох або більше амінокислотних позиціях 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий мутант Ес "ОАМА" із заміною залишків 265 і 297 на аланін (510) (патент США Ме7332581).
Описані певні варіанти антитіла з поліпшеною або зниженою активністю зв'язування Ес (див., наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312, і ЗПпіеїд5 еї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 9(2):6591-6604 (2001)).
У певних варіантах здійснення винаходу варіант антитіла містить ділянку Ес із однією або декількома амінокислотними замінами, які поліпшують АОСС, наприклад, заміни в позиціях 298, 333 і/або 334 ділянки Ес (нумерація Є залишків).
У деяких варіантах здійснення винаходу зміни внесені в ділянку Ес, що приводить до зміненого (тобто або поліпшеного, або зниженого) зв'язування С14 і/або комплемент-залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано в патенті США Мо 6194551, УМО 99/51642 і
Ідиводіє еї аї. У. Іттипої. 164:4178-4184 (2000).
Антитіла з підвищеними годинами життя і поліпшеним зв'язуванням із неонатальним рецептором Ес (РсКп), який відповідає за перенесення материнських до ембріону (Сиуег еї аї.,
У. Іттипої. 117:587 (1976) і Кіт еї аї., 9У. Іттипої. 24:249 (1994)) описані в О52005/0014934А1 (Ніпогп еї а/!.). Ці антитіла включають ділянку Ес із однією або декількома замінами в ньому, що поліпшує зв'язування ділянки Ес з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають такі із замінами в одному або декількох залишках ділянки Ес: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміна залишку 434 ділянки Ес (патент США Мо 7371826).
Див. також ЮОипсап 5 Уміптег, Майиге 322:738-40 (1988); патент США Мо 5648260; патент США
Мо 5624821; і УМО 94/29351 відносно інших прикладів варіантів ділянки Ес. а) Цистеїнові сконструйовані варіанти антитіла
У певних варіантах здійснення потрібно створити цистеїнові сконструйовані антитіла, наприклад, "(піомМАбБ»", в яких один або декілька залишків антитіла замінені залишками цистеїну.
У приватних варіантах здійснення винаходу заміщені залишки знаходяться в доступних ділянках антитіла. Шляхом заміни цих залишків цистеїном реактивні тіолові групи, тим самим, розташовані в доступних ділянках антитіла і можуть бути використані для кон'югування антитіла з іншими молекулами, такими як молекули лікарських препаратів або зв'язаними із лінкером молекулами лікарських препаратів, для створення імунокон'югату, як описано далі в цьому документі. У певних варіантах здійснення винаходу будь-якого або декілька із нижченаведених
Зо залишків можуть бути замінені на цистеїн: М205 (нумерація Кара) легкого ланцюга; А118 (нумерація Е)У) важкого ланцюга; і 5400 (нумерація Е)) ділянки Ес важкого ланцюга. Цистеїнові сконструйовані антитіла можуть бути створені, як описано, наприклад, в патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
У певних варіантах здійснення винаходу представлене в цьому документі антитіло може бути додатково модифіковане з метою вмісту небілковоподібних молекул, відомих в даній галузі техніки і загальнодоступних. Молекули, придатні для отримання похідних антитіла, включають, крім іншого, водорозчинні полімери. Необмежені приклади водорозчиннних полімерів включають, крім іншого, поліетиленгліколь (РЕС), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери), і декстран або полі(М- вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропропіленгліколю, співполімери поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетилування поліоли (наприклад, гліцерол), полівініловий спирт і суміші вищепереліченого. Пропіональдегід поліетиленгліколю може мати переваги у виробництві внаслідок його стабільності у воді. Полімер може бути будь-якої молекулярної маси і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Число полімерів, прикріплених до антитіла, може варіювати, і якщо більше одного полімера приєднано, вони можуть бути однаковими або різними молекулами. У основному, число і/або тип полімерів, що використовуються для отримання похідних, можуть бути визначені, керуючись факторами, включаючи, крім іншого, певні властивості або функції антитіла, що підлягають удосконаленню, чи буде похідне антитіла використовуватися в терапії при певних умовах і т. п.
У іншому варіанті здійснення винаходу розглянуті кон'югати антитіла і небілковоподібні молекули, які можуть бути селективно нагріті під дією радіаційного опромінення. У одному із варіантів здійснення винаходу небілковоподібною молекулою є вуглецева нанотрубка (Кат еї аї.,
Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 102:11600-11605 (2005)). Радіоактивне випромінювання може бути будь-якої довжини хвилі і містить, крім іншого, довжини хвиль, які не ушкоджують нормальні клітини, але які нагрівають небілковоподібні молекули до температури, при якій гинуть клітини, близькорозташовані до комплексу антитіло-небілковоподібна молекула. 60 В. Рекомбінантні способи і композиції
Антитіла можуть бути продуковані, використовуючи рекомбінантні способи і композиції, наприклад, як описано в патенті США Мо 4816567. У одному із варіантів здійснення винаходу представлена виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти мезотеліну, описане в цьому документі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить МІ. і/або амінокислотну послідовність, що містить УН антитіла (наприклад, легкий і/або важкий ланцюг антитіла). У додатковому варіанті здійснення винаходу представлений один або декілька векторів (наприклад, експресійні вектори), що містять таку нуклеїнову кислоту. У додатковому варіанті здійснення винаходу представлена клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту. У одному із таких варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить Мі. антитіла і амінокислотну послідовність, що містить
МН антитіла, або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить М. антитіла, і другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла. У одному із варіантів здійснення винаходу клітина-хазяїн є еукаріотичною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, МО, М5О, 5р20 клітиною). У одному із варіантів здійснення винаходу представлений спосіб створення антитіла проти мезотеліну, де спосіб містить культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, як розглянуто вище, в умовах, придатних для експресії антитіла, і в деяких випадках виділення антитіла із клітини-хазяїна (або із середовища культивування клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного продукування антитіла проти мезотеліну нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, наприклад, як описано вище, виділяють і вставляють в один або декілька векторів для подальшого клонування і/або експресії в клітині-хазяїні. Такі нуклеїнові кислоти можуть бути без особливих зусиль виділені і секвеновані, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, шляхом використання олігонуклеотидних зондів, які мають здатність специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкий і легкий ланцюг антитіла).
Придатні клітини-хазяїни для клонування або експресії кодуючих антитіло векторів включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані вище. Наприклад, антитіла можуть бути продуковані в бактеріях, зокрема, коли немає необхідності в глікозилуванні і ефекторних
Зо функціях Ес. Для експресії фрагментів антитіла і поліпептидів в бактеріях див., наприклад, патенти США МоМо 5648237, 5789199 і 5840523. (Див. також Спапшоп, Меїпод5 іп МоїІесшаг
Віоіоду, Мої. 248 (В.К.б. Го, єд., Нитапа Ргев5, Тоїоула, М), 2003), рр. 245-254, описуючі експресію фрагментів антитіла в Е. соїї) Після експресії антитіло може бути виділене із бактеріальної клітинної суспензії в розчинній фракції і може бути додатково очищено.
Крім прокаріот еукаріотичні мікроби, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, є придатними хазяїнами з точки зору клонування або експресії для кодуючих антитіло векторів, включаючи штами грибів і дріжджів, у яких шляхи глікозилування були "гуманізовані", зумовлюючи продукування антитіла із частково або повністю патерном глікозилування людини. Див.
Сегпдгов5, Маї. Віоїесн. 22:1409-1414 (2004), і | ї еї аї, Маї. Віотесі. 24:210-215 (2006).
Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла також отримують із багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можуть бути використані спільно з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин 5родорієега
Тгидірегаа.
Культури клітин рослин можуть також бути використані як хазяїни. Див., наприклад, патенти
США МоМо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (що описують технологію Рі
АМТІВОВІЕ5 М для продукування антитіл в трансгенних рослинах).
Клітини хребетних можуть бути також використані як хазяїни. Наприклад, клітинні лінії ссавців, адаптовані для росту в суспензії, можуть бути придатними. Іншими прикладами придатних клітинних ліній-хазяїнів ссавців є трансформована 5М40 лінія СМІ1 нирок мавпи (СО05-7); лінія ембріональних нирок людини (293 або 293 клітини, як описано, наприклад, в
Станат еї аї., у. Сеп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирок хом'ячків (ВНК); мишачі клітини Сертолі (ТМА клітини, як описано, наприклад, в Маїнпег, Віої. Кергод. 23:243-251 (1980)); клітини нирок мавпи (СМ); клітини нирок африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирок собаки (МОСК); клітини печінки сірого щура (ВК ЗА); клітини легені людини (М/138); клітини печінки людини (Неросг2); пухлина молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТКІ, як описано, наприклад, в Маїнег єї аї., Аппаї5 М.У. Асай. 5сі. 383:44- 68 (1982); клітини МКС5; і клітини Е54. Інші придатні клітинні лінії-хазяїни ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи клітини ОНЕК СНО (паць еї аї., Ргос. бо Май. Асад. сі. ОБА 77:4216 (1980)); і клітинна лінія мієломи, така як МО, М50 і 5р2/0. Для оглядового розгляду певних клітинних ліній-хазяїнів ссавців, придатних для продукування антитіл, див., наприклад, Хаакі апа Ууи, МеїШтоаз іп МоїІесшаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. 10, єдй.,
Нитапа Ргез5, Тоїожа, МУ), рр. 255-268 (2003).
С. Способи
Антитіла проти мезотеліну, представлені в цьому документі, можуть бути ідентифіковані, відібрані або охарактеризовані за їх фізичними/хімічними властивостях і/або біологічними активностями за допомогою різних способів, відомих в даній галузі техніки.
У одному із аспектів, антитіло за винаходом тестують на предмет його активності зв'язування антигену, наприклад, відомими способами, такими як ЕГІЗА, РАС5 або Вестерн- блот.
У іншому аспекті, конкурентний аналіз може бути використаний для ідентифікації антитіла, яке конкурує із будь-яким із антитіл, описаних в цьому документі, за зв'язуванням із мезотеліном. У певних варіантах здійснення винаходу таке конкуруюче антитіло зв'язується із тим же самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), з яким зв'язується антитіло, описане в цьому документі. Докладні ілюстративні способи картування епітопу, з яким зв'язується антитіло, представлені в статті Моїті5 (1996) "Ерйоре Марріпдо Ргоїосоїв5" Мейоз іп
Моїесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргев5, Тома, М).
У типовому конкурентному аналізі іммобілізований мезотелін інкубують в розчині, що містить перше мічене антитіло, яке зв'язується із мезотеліном (наприклад, будь-яке із антитіл, описаних в цьому документі), і друге немічене антитіло, яке підлягає тестуванню на предмет його здатності конкурувати із першим антитілом за зв'язування з мезотеліном. Друге антитіло може знаходитися в супернатанті гібридоми. Як контроль іммобілізований мезотелін інкубують в розчині, що містить перше мічене антитіло, але не друге немічене антитіло. Після інкубації в умовах, що допускають зв'язування першого антитіла з мезотеліном, надлишок незв'язаного антитіла видаляють, і вимірюють кількість мітки, зв'язаної із іммобілізованим мезотеліном. Якщо кількість мітки, зв'язаної з іммобілізованим мезотеліном, істотно знижена в тестованому зразку відносно контрольного зразка, тоді це означає, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з мезотеліном. Див. Нагіомжм апа Гапе (1988) Апіїбодієв: А І арогаюгу Мапаиаї сп.14 (Соїа 5ргіпд Наботг І арогайїюгу, Со 5рігіпуд Нагбог, МУ).
Зо О. Імунокон'югати
Винахід також являє імунокон'югати, що містять антитіло проти мезотеліну кон'юговане відповідно до цього документа із одним або декількома цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні засоби або лікарські препарати, інгібітори росту, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження або їх фрагменти) або радіоактивні ізотопи.
У одному із варіантів здійснення винаходу імунокон'югат являє собою кон'югат антитіла- лікарського препарату (АОС), в якому антитіло кон'юговане із одним або декількома лікарськими препаратами, включаючи, крім іншого, майтанзиноїд (див. патенти США МоМо 5208020, 5416064 і Європейський патент ЕР 0 425 235 ВІ); ауристатин, такий як ЮОє і Оє групи лікарського препарату монометилауристатину (ММАЕ і ММАБЕ) (див. патенти США МоМо 5635483 і 5780588 і 7498298); доластатин; каліхеаміцин або його похідне (див. патенти США МоМо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 і 5877296; Ніптап еї аї., Сапсег Ке5. 53:3336- 3342 (1993); і І оде еї аІ., Сапсег Ке5. 58:2925-2928 (1998)); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (див., Кгтаї? еї аЇ., Ситепі Мед. Спет. 13:477-523 (2006); Уентеу єї аї.,
Віоогдапіс 5 Мед. Спет. І ейег5 16:358-362 (2006); Тогдом еї аї., Віосопі Спет. 16:717-721 (2005); Мааду єї а!., Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 97:829-834 (2000); Биромснік еї аї!., Віоога. 5 Меа.
Спет. І енегз 12:1529-1532 (2002); Кіпо еї а!., У. Мед. Снет. 45:4336-4343 (2002); і патент О.5.
Мо 6630579); метотрексат; віндезин; таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел і ортатаксел; трихотецен і СС1065.
У іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат включає антитіло, як описано в цьому документі, кон'юговане із ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи, крім іншого, А-ланцюг дифтерійного токсину, які незв'язують активні фрагменти дифтерійного токсину, А-ланцюг екзотоксину (із Рхепдотопаб5 аегидіпоза), А-ланцюг рицини, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки АїІецшгіез гогаї, білки діантини, білки лаконосу американського (РАРІ, РАРП і РАР-5), інгібітор момордики харантської, курцин, кротин, інгібітор
Мильнянки лікарської, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени.
У іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить антитіло, як описано в цьому документі, кон'юговане із радіоактивним атомом з утворенням радіоактивного кон'югату. Цілий ряд радіоактивних ізотопів загальнодоступний для синтезу радіоактивних кон'югатів. Приклади 60 включають Аг, |191, (125, уз0 ВДе!86, Де"88, 5пз3, Віг212, рзг, Рре"2 і радіоактивні ізотопи и. Коли радіоактивний кон'югат використовується для детекції, він може включати радіоактивний атом для сцинтіографічних досліджень, наприклад, їс99т або І, або спінову мітку для ядерної магнітно-резонансної томографії (ММЕ) (також відомої як магнітно-резонансна томографія, тгі), таку як йод-123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати антитіла і цитотоксичного агента можуть бути створені, використовуючи біфункціональні білок-зшиваючі агенти, такі як М-сукцинімідил 3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат (5МСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-азидо сполуки (такі як біс-(п- азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-діазонійбензоїл)етилендіамін), діззоціанати (такі як толуол-2,6б-діїзоціанат) і біс-сполуки активного фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4- динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин можна отримувати, як описано в Міена єї аІ.,, Зсіепсе 238:1098 (1987). Ілюстративним хелатуючим агентом для кон'югації радіонукліда із антитілом є мічена по вуглецю-14 1-ізотіоціанатбензил-З-метилдіетилен триамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА). Див. УМО94/11026. Лінкер може бути "розщеплюваний лінкер", що полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського препарату в клітину. Наприклад, кислотний лабільний лінкер, пептидаза-чутливий лінкер, фотолабільний лінкер, диметильний лінкер або дисульфідвмісний лінкер (Спагі еї аіІ., Сапсег Ке5. 52:127-131 (1992); патент США Мо 5208020) можуть бути використані.
Імунокон'югати або АОС в цьому документі спеціально розглянуті, не обмежуючись такими кон'югатами, приготованими за допомогою перехресно-зшиваючих реагентів, включаючи, крім іншого, ВМР5, ЕМОС5, ЗМВ5, НВМУ5, І С-5МСС, МВ5, МРВН, ВАР, ІА, ЗІАВ, ЗМОС, 5МРВ,
ЗМРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМИО5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-
ЗМСОСС і сульфо-ЗМРВ і 5М5ЗВ (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, в Ріегсе Віоїесппоіоду, Іпс., Косктога, ІС., О.5.А). Імунокон'югати, які містять ауристатини і доластатини
У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат містить антитіло за винаходом, кон'юговане з доластатином або пептидним аналогом або похідним доластатину, наприклад,
Зо ауристатином (патенти США МоМо 5635483; 5780588). Показано, що доластатини і ауристатини перешкоджають динамічній активності мікротрубочок, гідролізу ГТФ і поділу ядра і клітини (М/оуке еї аї. (2001) Апіітістор. Адепів апа СпетоїНег. 45(12):3580-3584) і мають протипухлинну (патент США Мо 5663149)і протигрибкову активність (Ренії еї аї., (1998) Апійтпісгоб. Адепівб
Спетоїнег. 42:2961-2965). Молекула лікарського засобу доластатину або ауристатину може бути приєднана до антитіла через М(аміно)кінець або С(карбоксильний)кінець пептидної групи лікарського засобу (ММО 02/088172).
Ілюстративні варіанти здійснення ауристатину включають приєднані по М-кінцю групи ОЕ і
ОРЕ лікарського препарату монометилауристатину. (Див. патенти США МоМо 7659241, 7498298 і 7745394).
Пептидна група лікарського препарату може бути вибрана із нижченаведених Формул Оє і
Ок: ві о в' сн. в? кА Її Її ї . ї 7рв'в 2 вв в 8 8
Кк (в) Кк Кк (в) Кк (в) Ок ві о в' сн. в?
Н ку М М М Мови 4 5 це о й ве во по Ок де хвиляста лінія ЮОє і ЮОє вказує на ділянку ковалентного приєднання до антитіла або антитіла-лінкерного компонента, і незалежно, в кожному положенні:
В? вибраний із Н і С/-Св-алкілу;
ВЗ вибраний із Н, Сі-Св-алкілу, Сз-Св-карбоциклу, арилу, Сі-Св-алкілурилу, Сі-Св-алкіл-(Сз-
Св-карбоциклу), Сз-Св-гетероциклу і Сі-Св-алкіл-(Сз-Св-гетероциклу);
В" вибраний із Н, С:і-Св-алкілу, Сз-Све-карбоциклу, арилу, Сі-Св-алкілурилу, С1-Св-алкіл-(Сз-
Св-карбоциклу), Сз-Св-гетероциклу і Сі-Св-алкіл-(Сз-Св-гетероциклу);
В? вибраний із Н і метилу; або В" і ЕЗ» спільно утворюють карбоциклічну кільцеву систему і мають формулу -(СВ2ВУ)-, де 2 і ІБ? незалежно вибрані із Н, С1-Св-алкілу і Сз-Св-карбоциклу, і п вибраний із 2, 3,4, 51 6;
В? вибраний із Н і С/-Св-алкілу;
В" вибраний із Н, Сі-Св-алкілу, Сз-Св-карбоциклу, арилу, Сі-Св-алкілурилу, Сі-Св-алкіл-(Сз-
Св-карбоциклу), Сз-Св-гетероциклу і Сі-Св-алкіл-(Сз-Св-гетероциклу); кожний КЗ незалежно вибраний із Н, ОН, Сі-Св-алкілу, Сзе-Св-карбоциклу і О-( Сі-Св-алкілу);
В" вибраний із Н і С/-Св-алкілу;
В'Є вибраний із арилу або Сз-Св-гетероциклу; 7 являє собою О, 5, МН, або МА"2, де К!2 являє собою С:-Св-алкіл;
А" вибраний із Н, С1-Сго-алкілу, арилу, Сз-Св-гетероциклу, -(В'ЗО)т-А"", або -(В'ЗО)т-
СНІВ)»; т являє собою ціле число в діапазоні 1-1000;
В"З являє собою Се2-Св-алкіл;
В": являє собою Н або Сз-Св-алкіл; кожна поява КЗ» незалежно являє собою Н, СООН, -(СНг)п-М(В'9)», -«СНг)п-50ОзН або -(СНг)п-
ЗОз3-С1-Св-алкіл; кожна поява К/5 незалежно являє собою Н, С:1-Св-алкіл або -«СНг)--СООН;
А'З вибраний із -С(Н8)2-С(В8)»-арилу, -С(НЗ)2-С(НВ)2-(Сз-Св-гетероциклу) і -С(НУ)»-С(АВ)2-(Сз-
Св-карбоциклу); і п являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 6.
У одному із варіантів здійснення винаходу КЗ, В" і КЕ" незалежно являють собою ізопропіл або втор-бутил, і КЕ? являє собою Н або метил. У ілюстративному варіанті здійснення винаходу кожний із КЗ і Е" являє собою ізопропіл, 2? являє собою -Н, і КЕ" являє собою втор-бутил.
У ще іншому варіанті здійснення винаходу кожний із 2 і КУ являє собою метил, і КЕ? являє собою -Н.
У іншому варіанті здійснення винаходу кожна поява К являє собою -ОСН».
Зо У ілюстративному варіанті здійснення винаходу кожний із КЗ ії БЕ" являє собою ізопропіл, кожний із К? ії 5 являє собою метил, Б? являє собою -Н, В" являє собою втор-бутил, кожна поява ЕКЗ являє собою -ОСН», і 2? являє собою -Н.
У одному із варіантів здійснення винаходу 2 являє собою -О- або -МН-.
У одному із варіантів здійснення винаходу К': являє собою арил.
У ілюстративному варіанті здійснення КЗ являє собою феніл.
У ілюстративному варіанті здійснення, коли 7 являє собою -О-, В'Ї являє собою -Н, метил або трет-бутил.
У одному із варіантів здійснення винаходу, коли 7 являє собою -МН, В являє собою -
СН(В"У)», де ЕК» являє собою -(СНг)п-М(В'9)2, і К'Є являє собою - Сі1-Св-алкіл або -«СНг)-СООН.
У іншому варіанті здійснення, коли 7 являє собою -МН, В" являє собою -СН(В'5)», де В" являє собою -(СНг)-5ОзН.
Ілюстративний варіант здійснення ауристатину формули Ог являє собою ММАЕ (монометилауристатин Е), де хвиляста лінія вказує на ковалентний зв'язок із лінкером кон'югата антитіло-лікарський препарат: о он
М М М тт (в) (в) в) (в) (в) 7 В. ММАЕ,
Ілюстративний варіант здійснення ауристатину формули Ов являє собою ММАЕ (монометилауристатин Е, варіант ауристатину Е (ММАЕ) із фенілаланіном на С-кінці лікарського препарату), де хвиляста лінія вказує на ковалентний зв'язок із лінкером кон'югата антитіло- лікарський препарат (див. О5 2005/0238649 і Богопіпа еї аї. (2006) Віосопійдаєге Спет. 17:114- 124):
(в)
М М М
(в) (6) (в) (6) (в) то 7 о он ММАБЕ.
У одному із аспектів до молекули лікарського препарату по КЕ" можна приєднати гідрофільні групи, включаючи, крім іншого, складні ефіри триетиленгліколю (ТЕС), як показано вище. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією гідрофільні групи допомагають в інтерналізації і перешкоджають агломерації молекули лікарського препарату.
Ілюстративні варіанти здійснення АЮС, що містять ауристатин/доластатин або їх похідні, описані в 05 2005/0238649 АТ і ЮБогопіпа еї аїІ. (2006) Віосопіпдагєе Спет. 17:114-124, які спеціально включені в цей документ як посилання. Ілюстративні варіанти здійснення АОС, що містять ММАЕ або ММА і різні лінкерні компоненти, мають наступні структури і абревіатури (де "Ар" являє собою антитіло; р являє собою навантаження лікарським препаратом (середнє число молекул лікарського препарату на одне антитіло) і варіює приблизно від 1 до приблизно 8; "мс" являє собою "маї1-сії", тобто дипептид валін-цитрулін; і "5" являє собою атом сірки:
АЬ- 5 о о
Н прє ' У о охо а маі-си-м - 99 он ; о
Ар-МОС-мсо-РАВ-ММА Є
АБ-5 о (9) он н коки соні ? ме чи бо 5 Р
Ар-МОС-мсо-РАВ-ММАЕ
АВ- 5 (9) п АКА рак ; їй м М, Н праве;
Ге) (в) о (в) 5. ЩІ р
Ар-МС-ММАЕ
АВ- 55 (0) (9) (9)
Ї .. Ї М вав (в) (9) о (в) ше я он у
Ар-МС-ММАЕ
Ілюстративні варіанти здійснення АЮС, що містять ММАБЕ і різні лінкерні компоненти, додатково включають А6-МО-РАВ-ММАЕ ії АБ6-РАВ-ММАРЕ. Цікаво, що імунокон'югати, що містять
ММАРЕ, приєднаний до антитіла за допомогою лінкера, який протеолітично не розщеплюється, мають активністю, порівнянною із імунокон'югатами, що містять ММАЕ, приєднаний до антитіла за допомогою лінкера, який протеолітично розщеплюється. Див., Юогопіпа еї аї. (2006)
Віосопішдаїє Спет. 17:114-124. В таких випадках вважають, що вивільнення лікарського препарату діє за допомогою руйнування антитіла в клітині. 4.
Як правило, основані на пептидах молекули лікарських препаратів можуть бути приготовані шляхом утворення пептидного зв'язку між двома або більше амінокислотами і/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можуть бути отримані, наприклад, керуючись способом рідкофазного синтезу (див. Е. ЗсПпгодег апа К. І ибКе, "Пе Реріідев", моїште 1, рр.76-136, 1965,
Асадетіс Ргев55), який добре відомий в галузі хімії пептидів. Молекули лікарського препарату
Зо ауристатину/доластатину можуть бути отримані відповідно до способів: 05 2005/0238649 А1; патент ОЗ Мо 5635483; патент З Мо 5780588; Реції еї а! (1989) У. Ат. Спет. 5ос. 111:5463- 5465; Рецйі єї а! (1998) Апіі-Сапсег Огиа Оевзідп 13:243-277; Ренії, С.В., єї аІ. Зупіпезів, 1996, 719-725; Ренії еї аі (1996) У. Спет. бос. РегїКіп Тгап5. 15:859-863; і ЮБогопіпа (2003) Маї.
ВіоїесНпої. 21(7):778-784.
Зокрема молекули лікарського препарату ауристатину/удоластатину формули Ов, такі як
ММА і його похідні, можуть бути отримані, використовуючи способи, описані в 05 2005/0238649 А1 і Рогопіпа єї аї. (2006) Віосопіидагє Спет. 17:114-124. Молекули лікарського препарату ауристатину/доластатину формули Оє, такі як ММАЕ і його похідні, можуть бути отримані, використовуючи способи, описані в статті Юогопіпа еї аї. (2003) Маї. Віоїесй. 21:778- 184. Молекули зв'язаного з лінкером лікарського препарату МС-ММАЕ, МСОС-ММАЕ, МО-мо-РАВ-
ММАБЕ ії МОС-мс-РАВ-ММАЄЕ можуть бути успішно синтезовані загальноприйнятими способами, наприклад, як описано в статті Юогопіпа еї аїЇ. (2003) Маї. Віоїесп. 21:778-784 і в публікації патентної заявки Ме 05 2005/0238649 А1, і потім кон'юговані із антитілом, що представляє інтерес.
Е. Способи і композиції для діагностики і детекції
У певних варіантах здійснення винаходу будь-яке із антитіл проти мезотеліну, представлених в цьому документі, придатне для детекції наявності мезотеліну в біологічному зразку. Термін "детекція" в тому значенні, в якому використовується в цьому документі, охоплює поняття кількісної або якісної детекції. "Біологічний зразок" містить в собі, наприклад, клітину або тканину (наприклад, матеріал біопсії включаючи злоякісну або потенційно злоякісну тканину підшлункової залози, яєчника, легені або ендометрія, або мезотеліому) або сироватку.
У одному із варіантів здійснення винахід стосується антитіла проти мезотеліну для використання в способі діагностики або детекції. У додатковому аспекті представлений спосіб детекції наявності мезотеліну в біологічному зразку. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб містить взаємодію біологічного зразка із антитілом проти мезотеліну, як описано в цьому документі, в умовах, що допускають зв'язування антитіла проти мезотеліну з мезотеліном, і детекцію наявності або відсутності утворення комплексу між антитілом проти мезотеліну і мезотеліном в біологічному зразку. Такий спосіб може бути способом іп міго або іп мімо. У
Зо одному із варіантів здійснення винаходу антитіло проти мезотеліну використовується для відбору індивідів, відповідних для терапевтичного лікування з використанням антитіла проти мезотеліну, наприклад, де мезотелін є біомаркером для відбору пацієнтів. У додатковому варіанті здійснення винаходу біологічним зразком є сироватка, наприклад, де детектують мезотелін, який був виділений раковими клітинами в сироватку.
У додатковому варіанті здійснення винаходу іп мімо використовується антитіло проти мезотеліну для детекції, наприклад, шляхом візуалізації іп мімо, позитивної по мезотеліну злоякісної пухлини у індивіда, наприклад, з метою діагностики, прогнозування або визначення стадії злоякісного новоутворення, визначення відповідного курсу терапії або моніторингу відповіді злоякісної пухлини на терапію. Одним із способів, відомих в даній галузі техніки, для детекції іп мімо є імунно-позитронна емісійна томографія (імуно-РЕТ), як описано, наприклад, в статті мап Юопдеп еї аї., Тпе Опсоїодівбї 12:1379-1389 (2007) і Мегеї еї аї., У. Мисі. Меа. 44:1271- 1281 (2003). В таких варіантах здійснення винаходу представлений спосіб для детекції позитивної по мезотеліну злоякісної пухлини у індивіда, спосіб, що містить введення міченого антитіла проти мезотеліну індивіду, що має або потенційно має позитивну по мезотеліну злоякісну пухлину, і детекцію міченого антитіла проти мезотеліну у індивіда, де детекція міченого антитіла проти мезотеліну вказує на позитивну по мезотеліну злоякісну пухлину у індивіда. У деяких таких варіантах здійснення винаходу мічене антитіло проти мезотеліну містить антитіло проти мезотеліну, кон'юговане із випромінювачем позитронів, таких як 98Са, ве, бу, 86у, 76Ву, 892г і 1244. У окремому варіанті здійснення винаходу випромінювачем позитронів є 892.
У додатковому варіанті здійснення винаходу спосіб діагностики або детекції містить взаємодію першого антитіла проти мезотеліну, іммобілізованого на субстрат, із біологічним зразком, що підлягає тестуванню на предмет наявності мезотеліну, вплив на субстрат другого антитіла проти мезотеліну і детекцію наявності або відсутності зв'язку другого антитіла проти мезотеліну із комплексом між першим антитілом проти мезотеліну і мезотеліном в біологічному зразку. Як субстрат може виступати будь-яке підтримуюче середовище, наприклад, скло, метал, кераміка, полімерні кульки, предметні стекла, чипи і інші субстрати. У певних варіантах здійснення винаходу біологічний зразок містить клітину або тканину (наприклад, матеріал біопсії, включаючи злоякісну або потенційно злоякісну тканину підшлункової залози, яєчника, 60 легені або ендометрія, або мезотеліому) або сироватку, тобто сироватку, в яку був виділений мезотелін. У певних варіантах здійснення винаходу перше або друге антитіло проти мезотеліну є будь-яким антитілом, розглянутим в цьому документі. У таких варіантах здійснення винаходу другим антитілом проти мезотеліну може бути 1923 або можуть бути антитіла, отримані із 1923, як описано в цьому документі.
Ілюстративні порушення, які можуть бути діагностовані або детектовані за будь-яким із вищеперерахованих варіантів здійснення винаходу включають позитивні по мезотеліну злоякісні пухлини, такі як позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення підшлункової (включаючи протокову аденокарциному підшлункової залози), позитивний по мезотеліну рак легені (включаючи недрібноклітинну карциному легені (М5СІС)), мезотеліому і позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення ендометрія. У одному із варіантів здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення є злоякісною пухлиною, якій привласнюють антимезотеліновий імуногістохімічний (НС) бал більше "0", який відповідає дуже слабкому фарбуванню або його відсутності у »90 95 пухлинних клітин, в умовах, описаних в цьому документі в Прикладі У. У іншому варіанті здійснення винаходу в позитивній по мезотеліну злоякісній пухлині експресується мезотелін на рівні їж, 2- або З, як визначено в умовах, описаних в цьому документі в Прикладі У. Позитивна по мезотеліну злоякісна пухлина за будь- яким із вищезгаданих варіантів здійснення винаходу може бути позитивною по двох антигенах злоякісною пухлиною.
У певних варіантах здійснення винаходу представлені мічені антитіла проти мезотеліну.
Мітки включають, крім іншого, мітки або молекули, детекція яких відбувається напряму (такі як флуоресцентні, хромофорні, електронощільні, хемілюмінесцентні і радіоактивні мітки), а також молекули, такі як ферменти або ліганди, детекція яких відбувається опосередковано, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії. Типові мітки включають, крім іншого, радіоїзотопи З2Р, 7190, 7125І, ЗН Її 11І, флуорофори, такі як хелати рідкісноземельних елементів або флуоресцеїн і їх похідні, родамін і його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світляка і бактеріальну люциферазу (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, пероксидазу хрону (НКР), лужну фосфатазу, р-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидазу сахаридів, наприклад, оксидаза глюкози, оксидаза галактози і глюкозо-б6-фосфатдегідрогеназа, гетероциклічні оксидази, такі як уриказа і ксантиноксидаза, в поєднанні із ферментами, які використовують перекис водню для окислення вихідного барвника, такими як НЕР, лактопероксидазу, або мікропероксидазу, біотин/авідин, спінові мітки, стабільні вільні радикали і т. п. В іншому варіанті здійснення винаходу міткою є випромінювач позитронів. Випромінювачі позитронів включають, крім іншого, б8(3а, 78Е, 640у, 86, 76Ву, 892 і 12441. У окремому варіанті здійснення винаходу випромінювачем позитронів є 8927.
Е. Фармацевтичні композиції
Фармацевтичні композиції антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату, як описано в цьому документі, готують змішуванням такого антитіла або імунокон'югату, що має необхідний ступінь чистоти з одним або декількома додатковими фармацевтично прийнятними носіями (Кетіпдоп'5 Рпагтасешцшііса! 5сіепсе5 161 еййіоп, О5ої, А. Ей. (1980)), в формі ліофілізованих композицій або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії, в основному, нетоксичні для реципієнтів в дозах, що застосовуються і концентраціях, і включають, крім іншого: буфери, такі як фосфатний, цитратний, і інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензил хлорид амоній; хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенол, бутил або бензиловий спирт; алкіл-парабени, такі як метил- або пропіл-парабен; катехол; резорцинол; цикл оге ксанол; 3- пентанол; і т-крезол); низькомолекулярні поліпептиди (приблизно менше 10 амінокислотних залишків); білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди і інші вуглеводи, в тому числі глюкоза, маноза або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕОТА; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; утворюючі солі протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, 7п-білкові комплекси); іабо неіїонні сурфактанти, такі як поліетиленгліколь (РЕС). Ілюстративні фармацевтично прийнятні носії в цьому документі додатково включають засоби диспергування лікарських засобів в міжклітинному просторі, такі як розчинні нейтрально-активні глікопротеїни гіалуронідази (ЗНАБЕСР), наприклад, розчинні глікопротеїни гіалуронідази людини РН-20, такі як ГНиИРН2гО (НУТ ЕМЕХФ, Вахіег Іпіегпайіопаї, Іпс.). Певні ілюстративні ХЗНАБЕОР і способи застосування, включаючи гНиРН2О, описані в публікаціях патентів США МоМо 2005/0260186 і 2006/0104968. У одному із аспектів, -"НАЗЕСР комбінують із одним або декількома додатковими 60 глікозаміногліканазами, такими як хондроїтиназами.
Ілюстративні композиції ліофілізованого антитіла або імунокон'югату описані в патенті США
Мо 6267958. Водні композиції антитіла або імунокон'югату включають такі, описані в патенті
США Мо 6171586 і УУО2006/044908, де останні із згаданих композицій включають гістидин- ацетатний буфер.
Композиція в цьому документі може також містити більше одного активного інгредієнта по мірі необхідності лікування певного симптому захворювання, переважно такі із взаємодоповнюючими активностями, які не впливають негативним чином один на одного.
Наприклад, може додатково вимагати забезпечення гемцитабіном, наприклад, для лікування позитивної по мезотеліну злоякісної пухлини, такої як позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення підшлункової залози(аденокарцинома підшлункової залози). У іншому прикладі, може додатково бути потрібне антитіло проти МОС16, кон'юговане із цитотоксичним агентом, наприклад, для лікування позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення або позитивного по двох антигенах злоякісного новоутворення, такого як позитивний по мезотеліну раку яєчника (серозна аденокарцинома яєчника) або позитивний по двох антигенах раку яєчника. Такі активні інгредієнти переважно присутні в комбінації в кількостях, ефективних для цільового використання.
Активні інгредієнти можуть бути укладені в мікрокапсули, приготовані, наприклад, способом коацервації або полімеризацією на межі розділу фаз, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули і мікрокапсули із полі(метилметацилат)у, відповідно, в колоїдних системах доставки лікарського препарату (наприклад, ліпосомах, альбумінових мікросферах, мікроемульсіях, наночастинках і нанокапсулах) або в макроемульсіях. Такі способи розглянуті в
Ветіпдюп'5 РНаптасецшіїйса! Зсієпсез 161й едйіоп, Озої, А. Еа. (1980).
Можуть бути отримані препарати уповільненого вивільнення. Придатні приклади препаратів уповільненого вивільнення включають напівпроникні матриці із твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло або імунокон'югат, матриці яких представлені у вигляді профільованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул.
Композиції, що підлягають використанню для введення іп мімо, як правило, стерильні.
Стерильність може бути успішно досягнута, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні мембрани для фільтрації.
Зо б. Терапевтичні способи і композиції
Будь-які із антитіл проти мезотеліну або імунокон'югатів, представлених в цьому документі, можуть бути використані в способах, наприклад, терапевтичних способах.
У одному із аспектів антитіло проти мезотеліну або імунокон'югат, представлені в цьому документі, використовуються в способі інгібування проліферації позитивних по мезотеліну клітин, способі, що містить вплив на клітину антитілом проти мезотеліну або імунокон'югатом в умовах, що допускають зв'язування антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату із мезотеліном на поверхні клітини, тим самим інгібуючи проліферацію клітини. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб є способом іп міго або іп мімо. У додаткових варіантах здійснення винаходу клітина є клітиною підшлункової залози, яєчника, легені, мезотеліоми або ендометрія.
У додаткових варіантах здійснення винаходу клітина є позитивною по двох антигенах клітиною.
Інгібування клітинної проліферації іп міго може бути проаналізовано, використовуючи набір реактивів для люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СейПТйег-Сіо"м, комерційно доступного на фірмі Рготеда (Маадіхоп, УЛ). Цей аналіз визначає число живих клітин в культурі на базі оцінки кількості присутнього АТФ, який є ознакою метаболічно активних клітин. Див.
Стос еї аї. (1993) 9). Іттипої. Меїй. 160:81-88, патент США Мо 6602677. Аналіз може бути виконаний в 96- або 384-ямковому форматі, забезпечуючи можливість автомазованого скринінгу високої продуктивності (НТ5). Див. Стгее еї аїІ. (1995) АпіїСапсег Огид5 6:398-404.
Процедура аналізу містить додавання єдиного реагенту (СеїЇПіег-СсіоФ Кеадепі) безпосередньо в клітини, які культивуються. Це приводить до лізису клітин і генеруванню люмінесцентного сигналу, що породжується люциферазною реакцією. Люмінесцентний сигнал пропорційний кількості присутнього АТФ, який напряму пропорційний числу живих клітин, присутніх в культурі.
Дані можуть бути зареєстровані люмінометром або формуючим зображення пристроєм, оснащеним камерою із зарядовим зв'язком ССО. Люмінесценція на виході виражається у відносних світлових одиницях (КІ |).
У іншому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату для використання як лікарського засобу. У додаткових аспектах винахід стосується антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату для використання в способі лікування. У певних варіантах здійснення винахід стосується антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату для використання в лікуванні позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення. У певних варіантах бо здійснення винахід стосується антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату для використання в способі лікування індивідуума, що має позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення, способі, що містить призначення індивідууму ефективної кількості антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату. У одному із таких варіантів здійснення винаходу спосіб додатково містить призначення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче.
У додатковому аспекті винахід стосується антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату для використання у виробництві або приготуванні лікарського препарату. У одному із варіантів здійснення винаходу лікарський препарат призначений для лікування позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення. У додатковому варіанті здійснення винаходу лікарський препарат призначений для використання в способі лікування позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення, способі, що містить призначення індивідууму, що має позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення, ефективної кількості лікарського препарату. У одному із таких варіантів здійснення винаходу спосіб додатково містить призначення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче.
У додатковому аспекті винахід являє собою спосіб лікування позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення. У одному із варіантів здійснення винаходу спосіб містить призначення індивідууму, що має таке позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення, ефективної кількості антитіла проти мезотеліну або імунокон'югату. У одному із таких варіантів здійснення винаходу спосіб додатково містить призначення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного засобу, як описано нижче.
Позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення за будь-яким із вищезгаданих варіантів здійснення винаходу можливо, наприклад, позитивним по мезотеліну раком підшлункової (включаючи протокову аденокарциному підшлункової залози), позитивним по мезотеліну раком яєчника (включаючи серозну аденокарциному яєчника), позитивним по мезотеліну раком легені (включаючи недрібноклітинну карциному легені (М5СІС)), мезотеліомою і позитивним по мезотеліну раком ендометрія. У одному із варіантів здійснення винаходу позитивне по мезотеліну злоякісне новоутворення є злоякісною пухлиною, якій привласнюють антимезотеліновий імуногістохімічний (НС) бал більше "0", який відповідає дуже слабкому
Зо фарбуванню або його відсутності у 29095 пухлинних клітин, в умовах, описаних в цьому документі в Прикладі У. У іншому варіанті здійснення винаходу в позитивній по мезотеліну злоякісній пухлині експресується мезотелін на рівні їж, 2-4 або Зж, як визначено в умовах, описаних в цьому документі в Прикладі У. Позитивна по мезотеліну злоякісна пухлина за будь- яким із вищезгаданих варіантів здійснення винаходу може бути позитивною по двох антигенах злоякісною пухлиною. "Індивідуумом" відповідно до будь-якого вищезгаданого варіанта здійснення винаходу може бути людина.
У додатковому аспекті винахід являє фармацевтичні композиції, що містять будь-які антитіла проти мезотеліну і імунокон'югати, представлені в цьому документі, наприклад, для використання в будь-якому із вищезгаданих терапевтичних способів. У одному із варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-яке із представлених в цьому документі антитіл проти мезотеліну або імунокон'югатів і фармацевтично прийнятний носій. У іншому варіанті здійснення винаходу фармацевтична композиція містить будь-яке із представлених в цьому документі антитіл проти мезотеліну або імунокон'югатів і принаймні один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, як описано нижче.
Антитіла або імунокон'югати за винаходом можуть бути використані або окремо, або в комбінації із іншими засобами, що застосовуються в терапії. Наприклад, антитіло або імунокон'югат за винаходом можуть бути спільно призначені принаймні із одним додатковим терапевтичним засобом. У певних варіантах здійснення винаходу додатковим терапевтичним засобом є гемцитабін. У певних варіантах здійснення винаходу додатковим терапевтичним засобом є анти-МОС16 антитіло, кон'юговане із цитотоксичним агентом.
Така комбінована терапія, вказана вище, полягає в комбінованому застосуванні (де два або більше терапевтичних засобів включені в одну і ту ж або окремі композиції) і роздільному застосуванні, при цьому застосування антитіла або імунокон'югату за винаходом може мати місце до, одночасно з і/або після застосування додаткового терапевтичного засобу і/або ад'юванту. Антитіла або імунокон'юЮгтати за винаходом можуть також бути використані в комбінації із променевою терапією.
Антитіло або імунокон'югат за винаходом (і будь-який додатковий терапевтичний засіб) можуть бути застосовані будь-яким придатним способом, включаючи парентеральний, бо внутрішньолегеневий і інтраназальний, і, по мірі необхідності у випадку локального лікування -
що вводиться всередину уражених тканин спосіб застосування. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, інтраперитоніальне або підшкірне введення. Дозування може здійснюватися будь-яким придатним способом, наприклад, за допомогою ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, частково залежно від того, чи є застосування постійним або короткочасним. Різні схеми дозування, включаючи, крім іншого, одноразові або багаторазові застосування протягом різних часових періодів, болюсне введення і імпульсна інфузія розглянуті в цьому документі.
Антитіла або імунокон'югати за винаходом утворять лікарську суміш, дозують і призначають способом відповідно до належної медичної практики. Факторами для розгляду в даному контексті включають певне порушення, що підлягає лікуванню, певний ссавець, що підлягає лікуванню, клінічний стан індивідуального пацієнта, причина порушення, місце доставки засобу, спосіб призначення, схема призначення і інші фактори, відомий медичним працівникам.
Антитіло або імунокон'югат не обов'язково повинен бути, але в деяких випадках утворить суміш із одним або декількома засобами, в цей час, що використовуються для запобігання або лікуванню порушення, яке досліджується. Ефективна кількість таких інших засобів залежить від кількості антитіла або імунокон'югату, присутнього в композиції, типу порушення або лікування і інших факторів, обговореної вище. Вони звичайно використовуються в одних і тих же дозах і із застосуванням способів введення, як описано в цьому документі, або в кількості приблизно від 1 до 9995 доз, описаних в цьому документі, або в будь-якій дозі і будь-яким способом, які емпірично/клінічно визначають для цільового використання.
Для профілактики або лікування захворювання відповідна доза антитіла або імунокон'югату за винаходом (при використанні окремо або в комбінації з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними засобами) залежить від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіла або імунокон'югату, тяжкості і протікання захворювання, чи призначають антитіло або імунокон'югат для профілактичних або терапевтичних цілей, попередньої терапії, анамнезу пацієнта і відповіді на антитіло або імунокон'югат, і розсуду лікуючого лікаря. Антитіло або імунокон'югат належним чином призначають пацієнту в один час або протягом курсів лікування. Залежно від типу і тяжкості захворювання приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг) антитіла або імунокон'югату може бути початковою відповідною дозою для призначення пацієнту, або, наприклад, у вигляді одного або декількох окремих застосувань, або у вигляді безперервної інфузії. Одна стандартна щоденна доза може знаходитися в діапазоні приблизно від 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, залежно від факторів, згаданих вище. Для повторних застосувань протягом декількох днів або більше тривало залежно від стану пацієнта, лікування як правило підтримують до настання необхідного пригнічення симптомів захворювання. Одна ілюстративна доза антитіла або імунокон'югату знаходиться в діапазоні приблизно від 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Таким чином, одна або декілька доз величиною приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яка їх комбінація) можуть бути призначені пацієнту. Такі дози можуть бути призначені періодично, наприклад, кожний тиждень або кожні три тижні (наприклад, таким чином, що пацієнт отримує приблизно від двох до приблизно двадцяти, або, наприклад, приблизно шість доз антитіла).
Може бути призначена початкова більш висока навантажувальна доза із подальшим призначенням однієї або декількох більш низьких доз. Однак можуть бути придатні інші схеми дозування. Можна без великих зусиль здійснювати моніторинг ефективності цієї терапії стандартними методиками і способами аналізу.
Зрозуміло, що будь-яка із вищезгаданих композицій або будь-який із терапевтичних способів можуть бути здійснені, використовуючи як імунокон'югат за винаходом, так і антитіло проти мезотеліну.
Н. Вироби промислового виробництва
У іншому аспекті винаходу представлений виріб промислового виробництва, що містить матеріали, придатні для лікування, профілактики і/або діагностики порушень, описаних вище.
Виріб промислового виробництва містить контейнер і етикетку або вкладиш на контейнері або в одній упаковці із ним. Придатні контейнери включають, наприклад, пляшки, ампули, шприци, мішки для інфузійних розчинів. Контейнери можуть бути зроблені із різного матеріалу, такого як скло або пластик. Контейнер вміщує композицію, яка сама по собі або в комбінації з іншою композицією ефективна для лікування, профілактики і/або діагностики порушення і може мати стерильний доступ через порт (наприклад, контейнером може бути мішок для внутрішньовенного розчину або ампула, що має пробку, що піддається проколюванню голкою для підшкірних ін'єкцій). Принаймні однією активною речовиною в композиції є антитіло або імунокон'югат за винаходом. Етикетка або вкладиш вказують на те, що композиція бо використовується для лікування вибраного патологічного стану. Більше того виріб промислового виробництва може включати (а) перший контейнер із композицією, що міститься всередині, де композиція містить антитіло або імунокон'югат за винаходом, і (Б) другий контейнер із композицією, що міститься всередині, де композиція містить додатковий цитотоксичний або навпаки терапевтичний засіб. Виріб промислового виробництва в цьому варіанті здійснення винаходу може додатково включати вкладиш, вказуючий на те, що композиції можуть бути використані для лікування певного патологічного стану. Альтернативно або додатково, виріб промислового виробництва може додатково включати другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВУУРІ), фосфатно-сольовий буферний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози.
Воно може додатково включати інші матеріали, необхідні з комерційної і споживчої точки зору, включаючи інші буфери, розчинники, фільтри, голки і шприци.
І. Депонування біологічного матеріалу
Наведений нижче біологічний матеріал був відданий на зберігання в Американську колекцію типових культур, 10801 Опімегейу Вошемага, Мапаззав5, МА 20110-2209, ОБА (АТО):
Позначення гібридоми Мо АТОС Дата реєстрації
МРЕ:3542 (1903.1.2) РТА-11464 9 листопада 2010 р.
Віддана на зберігання гібридома, згадана вище, продукує антитіло 1923, на яку посилаються в цьому документі.
Це депонування було зроблене відповідно до положень Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури і його нормативним документам (Будапештського договору). Це гарантує підтримку життєздатної культури депонованого зразка протягом 30 років із моменту дати депонування і принаймні п'яти (5) років після самого останнього звертання за наданням депонованого зразка. Цей депонований зразок стане доступним в АТС С згідно з умовами Будапештського договору і предметом угоди між між Сепепіесі, Іпс. ії АТСС, яке гарантує, що всі обмеження, накладені депозитором, на доступність депонованого матеріалу необмеженому колу осіб будуть остаточно зняті після видачі відповідного патенту США, гарантує постійну і необмежену доступність потомства клітинної культури необмеженому колу осіб після видачі відповідного патенту США або після публікації будь-якої патентної заявки США або іншої країни, залежно від того, що станеться раніше, і гарантує доступність потомства клітинної культури особі, визначеній комісаром США по патентах і торгових знаках, для діставання прав на нього відповідно до 35 О.5.С 5 122 і правилами для комісарів згідно з ним (включаючи 37 СЕК 5 1.14 з конкретним посиланням на 886 ОС 638).
І. ПРИКЛАДИ
Нижче представлені приклади способів і композицій за винаходом. Відомо, що різні інші варіанти здійснення винаходу можуть бути використані на практиці, беручи до уваги загальний опис, наведений вище.
А. Експресія гена мезотеліну людини
Експресія гена мезотеліну людини була проаналізована, використовуючи відповідну базу даних, що містить інформацію про експресію генів (зепеЕхрге55Ф), Зепе І! одіс іпс., сзайпегериго,
МО). Графічний аналіз бази даних СепеЕхрге55Ф був виконаний, використовуючи пристрій візуалізації профілю мікроматриці. Фігура 2 є графічним представленням даних по експресії гена мезотеліну людини в різних тканинах, які перераховані зліва. Шкала у верхній частині графіка означає рівні експресії гена на основі інтенсивності сигналу гібридизації. Точки з'являються як вище, так і нижче за лінію, прилеглу до кожної перерахованої тканини. Точки, що з'являються вище за лінію, представляють експресію гена в нормальній тканині, і точки, що з'являються нижче лінії, представляють експресію гена в пухлині і ураженій тканині. Фігура 2 демонструє підвищену експресію гена мезотеліну в певній пухлині або уражених тканинах відносно відповідних для них норм. Зокрема, мезотелін демонструє значну підвищену експресію в пухлинах яєчника, підшлункової залози, ендометрія і легені, включаючи аденокарциному і мезотеліому. Експресія мезотеліну людини практично відсутня в нормальних тканинах, за винятком нормального мезотелію (очеревини, перикарда і плеври).
В. Синтез антитіла
Моноклональні антитіла проти мезотеліну людини були отримані, використовуючи наступні методики. Або МРР:мезотелін людини (амінокислоти 34-580 5ЕО ІЮ МО:42), або мезотелін людини (ЗЕО ІО МО:43, відповідна амінокислотам 296-580 5ЕО І МО:42), кожний приєднаний до М-кінцевому ипілгуте Ні (НО)-їі29, був експресований в Е.соїї 58Е3 і очищений на колонці Мо-
МТА (Сіадеп) з подальшою гель-фільтрацією на колонці Зирегаех 200 в 20 мМ МЕЗ рН 6,0, 6М сапнсі, як описано раніше (Кігспрпоїег еї аіІ., 2003) і подальшим діалізом в 1 мМ НСІ для зберігання при -80 "С.
П'ять мишей Ваї!р/с (Спагіез Кімег І арогайфгієв5, Ноїйївіег, СА) були гіперімунізовані шість разів 2 мкг суміші двох антигенів в ад'юванті Кібі (Кірі Іттипоспет Кезеагсі, Іпс., Натійоп, МО). Дві самі кращі миші були відібрані на основі високих титрів антитіл за допомогою прямого ЕЇГ ІА, і їх
В-клітини були пуловані і злиті з мишачими мієломними клітинами. (Х63.А98.653; Американська колекція типових культур, Мапазза5, МА), використовуючи модифікований протокол, аналогічний раніше описаному (Коепіег апа Міїсїеїп, 1975; Ноподо еї аї., 1995). Через 10-12 днів були зібрані супернатанти від гібридом і проведений скринінг на предмет зв'язування з обома антигенами (окремо), використовуючи прямий ЕГІЗБА. Для перевірки пізнавання правильно укладеного, глікозилованого, який експресується на клітинній поверхні мезотеліну, позитивні в
ЕІЗА супернатанти були додатково піддані скринінгу способом РАС5 на трансфікованих д0- мезотеліном клітинах 5МТ2 (90 являє собою М-кінцеву епітопну мітку, що використовується як позитивний контроль з анти-д0О0 антитілами). Позитивні гібридоми були субклоновані двічі способом граничного розведення, і одинадцять були розмножати, і антитіла були очищені способом хроматографії з протеїном А.
На фігурі З представлені виділені моноклональні антитіла нарівні з певними властивостями, описаними більш детально нижче.
С. Гуманізація 709 і 22А10
Моноклональні антитіла 709 ї 22А10 були гуманізовані, як описано нижче. Нумерація амінокислотних залишків відповідала Кабаї еї аІ., хедоепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипо|одісаї! Іпіегеві,
БП Еа., Рибіїс Неайй 5егмісе, Маїйопаї! Іпзійшез ої Неайй, Веїйезаа, МО, 1991. 1. Гуманізація 709 а) Клонування варіабельних доменів мишачого 709
Сумарна РНК була виділена із клітин гібридоми, які продукують мишаче 709, використовуючи стандартні способи. Варіабельні легкі (МІ) і варіабельні важкі (МН) домени були ампліфіковані, використовуючи ЗТ-ПЛР із вирожденими праймерами до важкого і легкого ланцюгів. Прямі праймери були специфічні для М-кінцевої амінокислотної послідовності ділянок
МІ. ї МН. Відповідно, зворотні праймери / С їі НС були сконструйовані для відпалу із ділянкою в константному легкому (СІ) і константному важкому домені 1 (СНІ), які високо консервативні серед видів. Полінуклеотидна послідовність вставок була визначена, використовуючи звичайні
Зо способи секвенування. Амінокислотні послідовності 709 МІ і МН показані на фігурах 4 і 5, відповідно.
Б) Прямі пересадки гіперваріабельної ділянки в акцепторну, консенсусну каркасну ділянку людини
Варіанти, сконструйовані при гуманізації 709, були проаналізовані у вигляді (До. Домени МІ. і МН із мишачого 709 були суміщені із консенсусними послідовностями МІ. каппа І людини (Мі кі) людини і підгрупи І МН (МНії) людини. Гіперваріабельні ділянки із мишачого 709 (ти709) антитіла були вставлені в акцепторні каркасні ділянки Мі кі і МНадата з утворенням 709м1.
Акцепторний МН каркасна ділянка УНата відрізняється від МНії по З позиціях: К/1А, М7ЗТ і Г7вА (Сапег єї аї, Ргос. Май). Асай. сі. ОБА 89:4285 (1992)). Із домену ти709 Мі в Мі кі були пересаджені позиції 24-34 (І 1), 50-56 (І 2) і 89-97 (І 3). Із домену ти709 МН були пересаджені в
МНата позиції 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (Фігури 1 і 2). Ці визначення СОК включали позиції, що визначаються гіперваріабельністю їх послідовності (Ми, Т.Т. 8. Кабваї Е.А. (1970), їх структурним розташуванням (Сіоїпіа, С. 8. І е5К, і їх залученням у взаємодію антигену-антитіла (МассСаїшт еї аї. 9. Мої. Віо!. 262:732-745 (1996)). 709.41 прямого пересаджування був отриманий шляхом мутагенезу по Кункелю, використовуючи окремий олігонуклеотид для кожної гіперваріабельної області. Три фосфорилованих олігонуклеотиди або для важкого ланцюга, або для легкого ланцюга були додані до 571 нг матриці КипКе! в 50 мМ Тті5 рН 7,5, 10 мМ Мосі»; в кінцевому об'ємі 40 мкл.
Суміш випалювали при 90 "С протягом 2 хв., 50 "С протягом 5 хв. і потім охолоджували на льоду. До 10 мкл випаленої матриці були додані 0,5 мкл 100 мМ АТФ, 0,5 мкл 25 мМ дНтТФ (25
ММ кожний із дАТФ, дЦТФ, дІТФ і дТТФ), 1 мкл 100 мМ ДТТ, 1 мкл 10Х ТМ буфера (0,5 М Ттгі5 рН 7,5, 01 М Масіг), 80 Од. лігази ТА і 4 Од. Т7-полімерази із утворенням кінцевого об'єму, який дорівнює 13,6 мкл, із інкубацією протягом 2 годин при кімнатній температурі. 10 мкл лігованого продукту було потім трансформовано в Хі 1-сині клітини (Згаїадепе). Придатні клони були ідентифіковані секвенуванням ДНК і експресовані у вигляді ідо. с) Оцінка варіантів
Варіанти 709 були експресовані у вигляді | шляхом тимчасової трансфекції СНО. Ід був очищений шляхом афінної хроматографії із протеїном б. Афінність кожного варіанта 709 до для мезотеліну людини була визначена способом поверхневого плазменного резонансу, бо використовуючи ВіАсоге"Мм-2000. На чипах Віасоге дослідницького класу СМ5 були іммобілізовані приблизно 110 КО рекомбінантного мезотеліну людини, отриманого із Е. соїїЇ, використовуючи набір реактивів Віасоге для з'єднання амінів. Серійні 2-кратні розведення кожного варіанта 709 (від 0,488 до 1000 нМ в РВ5, що містить 0,05 95 Гуееп-20) було ін'єктовані із швидкістю потоку 30 мкл/хв. Кожний зразок був проаналізований із 5-хвилинною асоціацією і
З,5-хвилинною дисоціацією. Після кожної ін'єкції чип був відновлений, використовуючи 10 мМ гліцин рН 1,7. Відповідь зв'язування була відкоректована шляхом віднімання КИ із проточної кювети з використанням, яке не стосується даного специфічного зв'язування /дсо, іммобілізованого з аналогічною щільністю. Модель Ленгмюра 1:1 одночасної обробки Коп і Кок була використана для кінетичного аналізу. а) Результати
Людська акцепторна каркасна ділянка, яка використовується для гуманізації 709, основана на МІ каппа людини | консенсусному (Мі кі) і акцепторному МН каркасної ділянки МНата, яка відрізняється від консенсусного УН людини підгрупи ЇЇ (МНім) по З позиціях: К71А, М7ЗТ і 1 78А (Сапег єї аї., Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА 89:4285 (1992)). Домени МІ і МН мишачого 709 були суміщені із доменами Мік і МНії людини; гіперваріабельні ділянки були ідентифіковані і пересаджені в акцепторну каркасну ділянку людини із утворенням 709.м1 (Фігури 4 і 5). Як Ід, афінність 709.м1 падала в -2 рази відносно ти709 (відформатованого як химерне 709), що було визначено способом Віасоге (фігура 6).
Для поліпшення афінності зв'язування 709.м1 позиції 36 і 87 в легкому ланцюгу і позиції 48, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 і 80 у важкому ланцюгу були замінені залишками, виявленими в цих позиціях в ти709. Комбінації цих змінених легких і важких ланцюгів з ланцюгами із 709.м1 були трансфіковані в СНО, експресовані у вигляді до і очищені, і оцінені на предмет зв'язування з мезотеліном людини способом Віасоге (фігура 6).
Варіанти 709.м2 і 709.м3, кожний із яких містить змінений легкий ланцюг, мають афінність, порівнянну із химерним 709. Варіант 709.м3 відрізняє від 7/09.м1 по 2 позиціях в легкому ланцюгу. Ніякої зміни окремо не було достатньо для поліпшення зв'язування, порівнянного з таким ти709 (фігура 6).
Висновки по змінах для гуманізованого 709.3: б мишачих 709 СОК (визначені як позиції 24- 34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (13), 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) ії 93-102 (НЗ)) були пересаджені в консенсусні акцепторні домени МІ-м Її МНдатла людини. Два додаткових амінокислотних залишки каркасної ділянки, 36 і 87 легких ланцюги, були замінені назад на мишачі амінокислотні залишки, приводячи до утворення 709.3 із зіставною афінністю ти709. 2. Гуманізація 22А10 а) Клонування варіабельних доменів мишачого 22А10
Сумарна РНК була виділена із клітин гібридоми, продукуючих мишаче 22А10, використовуючи стандартні способи. Варіабельні легкі (МІ) і варіабельні важкі (МН) домени були ампліфіковані, використовуючи ЗТ-ПЛР із виродженими праймерами до важкого ланцюга (НО) і легкого ланцюга (С). Прямі праймери були специфічні для М-кінцевої амінокислотної послідовності ділянок МІ. ії МН. Відповідно, зворотні праймери І С і НС були сконструйовані для відпалу із ділянкою в константному легкому (СІ) і константному важкому домені 1 (СНІ), які високо консервативні серед видів. Полінуклеотидна послідовність вставок була визначена, використовуючи звичайні способи секвенування. Амінокислотні послідовності 22А10 МІ. і МН показані на фігурах 7 і 8, відповідно. р) Прямі пересадки гіперваріабельної ділянки в акцепторну, консенсусну каркасну ділянку людини
Варіанти, сконструйовані при гуманізації 22А10, були проаналізовані у вигляді дО і відображені моновалентно у вигляді баб на фазі. Фагміда, яка використовується для даної роботи, була моновалентним дисплейним вектором ЕРар-93, який складається із двох відкритих рамок зчитування під контролем одного промотору рпоА. Перша відкрита рамка зчитування складається із сигнальної послідовності 51, з'єднаної із доменами МІ і СНІ акцепторного легкого ланцюга, і друга складається із сигнальної послідовності 5ЇІЇ, з'єднаної із доменами МІ і
СНІ акцепторного важкого ланцюга, за якими слідує мінорний фаговий білок оболонки РЗ.
Домени МІ їі МН із мишачого 22А10 були суміщені із консенсусними послідовностями Мі. каппа І людини (Мік) людини і підгрупи Ш МН (МНії) людини. Гіперваріабельні ділянки із мишачого 22А10 (ти22А10) антитіла були вставлені в акцепторні каркасні ділянки Мі кі ії МНі! з утворенням 22А10 трансплантата. Із домену МІ. ти22А10 в Мі кі були пересаджені позиції 24-34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (І 3). Із домену МН ти22А10 були пересаджені в МНі позиції 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) (Фігури 7 і 8). Ці визначення СОК включали позиції, що визначаються гіперваріабельністю їх послідовності (ММи, Т.Т. 4 Кара! Е.А. (1970), їх структурним розташуванням (Сіоїпіа, С. 8. І е5К, і їх залученням у взаємодію антигена-антитіла (МасСайПит еї 60 аІ. У. Мої. Вісі. 262:732-745 (1996)).
22А10 трансплантат був отриманий шляхом мутагенезу за Кункелем, використовуючи окремий олігонуклеотид для кожної гіперваріабельної області Три фосфориловані олігонуклеотиди або для важкого ланцюга, або для легкого ланцюга були додані до 571 нг матриці КипкКеї в 50 мМ Ттгі5 рН 7,5, 10 мМ Масі» в кінцевому об'ємі 40 мкл. Суміш випалювали при 90 "С протягом 2 хв., 50 "С протягом 5 хв. і потім охолоджували на льоду. До 10 мкл випаленої матриці були додані 0,5 мкл 100 мМ АТФ, 0,5 мкл 25 мМ днтФ (25 мМ кожний із дДАТФ, дЦІФ, дГТФ і дТТФ), 1 мкл 100 мМ ДТТ, 1 мкл 10Х ТМ буфери (0,5 М Ттгі5 рН 7,5,0,1 М
Масіг), 80 Од. лігази ТА і 4 Од. Т7-полімерази з утворенням кінцевого об'єму, який дорівнює 13,6 мкл, із інкубацією протягом 2 годин при кімнатній температурі. 10 мкл лігованого продукту було потім трансформовано в Хі. 1-сині клітини (Згаг(адепе). Придатні клони були ідентифіковані секвенуванням ДНК і експресовані у вигляді дз. с) Помірна рандомізація гіперваріабельних ділянок
Дозрівання афінності трансплантата 22А10 здійснювали, використовуючи стратегію помірної рандомізації. Варіабельність послідовності була внесена окремо в кожну гіперваріабельну ділянку таким чином, що перевагу на користь мишачої послідовності гіперваріабельної ділянки підтримували, використовуючи стратегію олігонуклеотидного синтезу із пошкодженнями (саїПор еї аі,, У Мей Спет 37:1233-51 (1994)). Для кожної диверсифікованої позиції кодон, що кодує амінокислоту дикого типу, ушкоджується сумішшю 70-10-10-140 нуклеотидів, приводячи в середньому до 50 процентів мутацій в кожній позиції. Варіабельність послідовності була внесена в гіперваріабельні ділянки 22А10-трансплантат, використовуючи мутагенез Кункеля з утворенням шести в легкому ступені рандомізованих фагових бібліотек, які були відсортовані окремо. Було зроблено шість бібліотек, кожна із яких містила одну рандомізовану в легкому ступені гіперваріабельну ділянку. а) Отримання фагових бібліотек
Олігонуклеотиди, сконструйовані для забезпечення різноманітності кожній гіперваріабельній ділянці, були фосфориловані окремо в 20 мкл реакційній суміші, що містить 660 нг олігонуклеотиду, 50 мМ Тіз рН 7,5, 10 мМ МосСіІ», 1 ММ АТФ, 20 мМ ДТ і 5 Од. полінуклеотидкінази, протягом 1 години при 37 "С.
Для кожної бібліотеки, 2 мкл фосфорилованого олігонуклеотиду було додано до 300 нг
Зо матриці Кункеля в 50 мМ Тті5 рН 7,5, 10 мМ Моаосі» в кінцевому об'ємі 10 мкл. Відпал суміші проводили при 90 "С протягом 2 хв., 50 "С протягом 5 хв. із подальшим охолоджуванням на льоду. До матриці після відпалу додавали 0,5 мкл 10 мМ АТФ, 0,5 мкл 10 мМ днтФ (10 мм
ДАТФ, дЦТФ, дГТФ і дТТФ кожний), 1 мкл 100 мМ ДТТ, 1 мкл 10 х ТМ-буфера (0,5 М Ттіз рн 7,5, 01 М Мас»), 80 Од. Т4-лігази і 4 Од. Т7-полімерази в кінцевому об'ємі 20 мкл протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім кожним лігованим продуктом були трансформовані ХІ 1- блакитні клітини, що культивуються в 0,5 мл 2УТ, що містить 5 мкг/мл тетрацикліну і М13/КО7 хелперний фаг (МОЇ 10), протягом 2 годин при 37 "С і потім пуловані і перенесені в 500 мл 2УТ, що містить 50 мкг/мл карбенациліну і культивовані 16 годин при 37 "С. е) Селекція фагів
Для твердофазної селекції фагів 293 мезотеліну людського походження або із яванської макаки було іммобілізовано в 50 мМ бікарбонату натрію рН 9,6 на планшетах для мікротитрування Махібогр (Мипс, Коспевіег, МУ) за ніч при 4 "С. Планшети були блоковані принаймні 1 годину, використовуючи казеїновий інгібітор Сазеїп ВіосКег (Ріегсе, Восісога, І).
Фаги були зібрані із клітинного супернатанта і суспендовані в РВ5З, що містить 5 95 порошкове молоко і 0,05 95 Гуееп-20 (РВЗВТ). Після додавання фагової бібліотеки і 1-годинної інкубації ямки планшета для мікротитрування були ретельно промиті РВ5, що містить 0,05 95
Тмееп-20 (РВ5Т) і зв'язані фаги були елюйовані шляхом інкубації ямок в 20 мМ НС, 500 мМ КСІ протягом 30 хвилин. Елюйовані фаги були нейтралізовані 1М Тгі5, рН 8 ї розмножені, використовуючи ХІ 1-блакитні клітини і М13/КО7 хелперні фаги, і культивовані протягом ночі при 37 "С в 2УТ, 50 мкг/мл карбенциліну. Титри фагу, елюйованого із мішеневмісної ямки, були порівняні із титрами фагу, витягнутого із ямки, яка не містить мішень, для оцінки збагачення.
Для селекції фагів 293 в рідкій фазі біотинільований мезотелін людського походження або із яванської макаки був доданий до фагів, суспендованим в РВ5, що містить 595 порошкове молоко і 0,0595 Тмеєп-20 (РВБЗВТ). Після інкубації фаг, зв'язаний із біотинільованим мезотеліном, фіксувався на планшеті для мікротитрування, покритої стрептавідином, протягом 5 хвилин. Ямки планшета для мікротитрування були ретельно промиті РВ5, що містить 0,05 95
Тмжееп-20 (РВ5Т), і фаги, які зв'язалися, були елюйовані шляхом інкубації ямок в 20 мМ НОСІ, 500
ММ КСІ протягом 30 хвилин. Елюйовані фаги були нейтралізовані 1М Ттгі5, рН 8, і розмножені, використовуючи Хі І-блакитні клітини і М13/КО7 хелперні фаги, і культивовані протягом ночі при
37 "С в 2УТ, 50 мкг/мл карбенциліну. Титри фагу, елюйованого із мішеневмісної ямки, були порівняні із титрами фагу, витягнутого із ямки, яка не містить мішень, для оцінки збагачення.
Для селекції фагів в рідкій фазі точність селекції була поетапно підвищена як шляхом захоплення фагу, який зв'язувався із концентраціями біотинільованого мезотеліну, які знижуються, в розчині з подальшим захопленням нейтравідином протягом 10 хвилин (селекція по швидкості асоціації), так і шляхом збільшення часу промивання і температури, зумовлюючи дисоціацію фагу, що слабко зв'язався (селекція по швидкості дисоціації) (Рип еї аї., у. Мої. Віо|. 340:1073-1093 (2004)).
У Виробництво дО
З метою скринінгу варіанти дО спочатку були продуковані в клітинах 293. Векторами, що кодують МІ. і МН (25 мкг), були трансфіковані клітини 293, використовуючи систему РОСЕМЕ (Коспе, Вазеї, Зм/йгегіапа). 500 мкл Рибепе змішували із 4,5 мл середовища ОМЕМ, яка не містить ЕВ, і інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Кожний ланцюг (25 мкг) додавали до цієї суміші і інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин і потім переносили в п'ять флаконів Т-150 для трансфекції протягом ночі при 37 "С в 595 СО». На наступний день, середовища, що містять суміш для трансфекції, видаляли і замінювали на 23 мл середовища РБЗО4, що містить 0,1 мл/л мікроелементів (АО934) і 10 мг/л інсуліну (А0940).
Клітини інкубували протягом додаткових 5 днів, після чого середовище відбирали при 1000 об./хв. протягом 5 хвилин і фільтрували в стерильних умовах, використовуючи 0,22 мкм фільтр із низьким зв'язуванням білка. Зразки могли зберігатися при 4 "С після додавання 2,5 мл 0,1 95
РМ5Е на кожні 125 мл середовища. до очищали афінною хроматографією з протеїном а. 9) Визначення афінності
Афінність варіантів 22А10 до для мезотеліну людини або яванської макаки була визначена способом поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи ВІіАсоге ТМ-2000. На чипах
Віасоге дослідницького класу СМ5 були іммобілізовані приблизно 110 КИ отриманого із Е. соїї рекомбінантного мезотеліну людини або яванської макаки, використовуючи набір реактивів
Віасоге для з'єднання амінів. Серійне 2-кратне розведення кожного варіанта 22А10 (від 0,488 до 1000 нМ в РВ5, що містить 0,05 95 Гмиееп-20) були ін'єктовані із швидкістю потоку 30 мкл/хв.
Кожний зразок був проаналізований з 5-хвилинною асоціацією і 3,5-хвилинною дисоціацією.
Зо Після кожної ін'єкції чип був відновлений, використовуючи 10 мМ гліцин рН 1,7. Відповідь зв'язування була відкоректована шляхом віднімання КИ із проточної кювети з використанням дб, що не стосується до даного специфічного зв'язування, іммобілізованого із аналогічною щільністю. Модель Ленгмюра 1:1 одночасної обробки Коп і Когн була використана для кінетичного аналізу.
І) Результати
У основі акцепторної каркасної ділянки людини, яка використовується для гуманізації 22А10, лежав консенсусний домен Мі. каппа І людини і консенсусний домен МН підгрупи ІП людини.
Домени МІ ї МН ти22А10 були суміщені із доменами каппа І людини і підгрупи І; кожна область, що визначає компліментарність (СОК), була ідентифікована і пересаджена в акцепторну каркасну ділянку людини з утворенням СОК-трансплантата, яка могла бути експресована у вигляді Ід або представлена як Раб на фазі (Фігури 7 і 8).
Були отримані шість бібліотек із рандомізацією в незначному ступені, в яких варіабельність була внесена окремо в кожну СОК трансплантата 22А10 СОК. Бібліотеки були відсортовані по взаємодії із мезотеліном людини і яванської макаки (отримані із клітин 293, з метою поліпшення зв'язування з глікозилованими формами мезотеліну яванської макаки або людини), використовуючи методичні підходи сортування в твердій фазі і в розчині. Спосіб сортування в розчині дозволяє відібрати високо афінні клони за допомогою маніпуляції концентрацією біотинільованої мішені і часом захоплення фагу, в той час як додавання неміченої мішені може бути використано для елімінації клонів із більш швидкими швидкостями дисоціації (Рий еї аї.,..
Мої. ВіоїІ. 340:1073-1093 (2004)). Клони із останнього раунду для кожної бібліотеки були відібрані для аналізу послідовності ДНК, і були виявлені зміни послідовності, заплановані для кожної
СОК, за винятком СОК-12 і СОК-Н2, передбачаючи багато можливих варіацій для поліпшення зв'язування антигену. Декілька клонів, вибраних або по мезотеліну людину, або мезотеліну яванської макаки, мали зміни в СОБ-НЗ, при цьому найбільш високо представлені мали заміну тирозину на ізолейцин в позиції 99. Цей варіант, нарівні із деякими іншими, експресувався у вигляді до і був охарактеризований на предмет зв'язування із мезотеліном способом Віасоге і аналізом Скетчарда (фігура 9А). У декількох клонів афінність перевищувала таку трансплантата 22А10.
Гуманізовані варіанти 22А10 були використані для імунопреципітації мезотеліну із клітинної бо лінії стабільно експресуючої мезотелін. Клітини ВОАВ, стабільно експресуючі дО-мічений мезотелін різних видів, були імунопреципітовані гуманізованими варіантами 22А10, як показано на фігурі 9В (Сг, трансплантат; мі (1), м17 (17) і м83 (83)) або п709.у3, п586 анти-40 або негативний контроль підС для порівняння. Імунопреципітати були промиті і проаналізовані
Вестерн-блотингом із використанням мишачих анти-д90 антитіл для визначення дО-мезотеліну. п2210.ми83 було найкращим із варіантів п22А10 по його здатності викликати імунопреципітацію всіх трьох видів мезотеліну (яванської макаки, верхній блот; людини, середнього блот; і щурячого, нижній блот). У самій правій ямці показано 2095 нанесеного лізату (без імунопреципітації) для порівняння рівнів загальної експресії. Маркери молекулярної ваги (кДа) вказані зліва.
Висновки по змінах для гуманізованого 22А10.м83: Починаючи з пересадки шести мишачих 22А10 СОК (визначено як позиції 24-34 (І 1), 50-56 (12), 89-97 (І 3), 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) і 95- 102 (НЗ)) в консенсусну МІ. людину каппа І і МН підгрупи І, була використана рандомізація СОК легкого ступеня для ідентифікації зміни в СОК НЗ (У99І), що поліпшувало зв'язування із мезотеліном людини і яванської макаки. У 22А10.м83 виявлена висока афінність зв'язування і також здатність дізнаватися більше сайтів зв'язування відносно інших гуманізованих варіантів.
У даній заявці мишачі моноклональні антитіла 709 і 22А10 альтернативно називають 709, т709 або ти709; і 22А10, т22А10 або ти22А10, відповідно. Гуманізовані моноклональні антитіла 709.43 і 22А10.м83 альтернативно називають 709.м3, п709.м3 або пи709.м3; і 22А10.м83, п22А10.м83 або пи22А10.м83, відповідно, якщо не вказане інше.
Ор. Видова перехресна реактивність
Моноклональні антитіла були протестовані з метою визначення можливої перехресної реактивності з мезотеліном із інших видів, відмінних від людини. На фігурі 11 показані гомологія послідовності між мезотеліном людини (ЗЕО ІЮО МО:43), яванської макаки (ЗЕО І МО:46), щури (ЗЕБЕО ІЮ МО:47) і миші (5ЕО ІЮ МО:48). Затемнені залишки ідентичні принаймні між двома видами. Незатемнені залишки відрізняються принаймні між двома із чотирьох видів. На фігурі 12 показані результати аналізу ГАСЗ клітин 293, стабільно трансфікованих міченим по епітопу 90 мезотеліном (мезотеліном людини, яванської макаки, щури або миші); забарвлених 10 мкг/мл п709.у3, п22А10.ум83 або анти-д00 п5В6б; і що виявляються анти-людським антитілом
АІеха 647. Нетрансфіковані клітини 293 не експресували нормально мезотелін ("М/1"). п709.му3 є
Зо специфічним для мезотеліну людини, в той час як пП22А10.м83 зв'язується з мезотеліном людини, яванської макаки і щура, але не з мезотеліном миші. Фарбування анти-д0 підтверджувало, що мишачий мезотелін дійсно експресується.
Е. Афінності антитіл
Для визначення відносних афінностей зв'язування пП709.м3 і п22А10.м83 був виконаний аналіз Скетчарда, слідуючи стандартній методиці (Ноїтез еї аї!., Зсіепсе 256:1205-1210 (1992)), коротко шляхом інкубації неприкріплених клітин міченими 29) антитілами п709.м3 або п22А10.и83 протягом 2 годин при кімнатній температурі в присутності збільшуваних концентрацій неміченого антитіла, промивання і кількісного визначення зв'язаної з клітинами радіоактивністю, вимірюючи активність сцинтиляційним способом. Дані були проаналізовані апроксимацією нелінійної кривої регресії в програмі Меж/ Гідапа (Сепеїесп, Іпс., зош зап
Егапсізсо, СА) для визначення значень Ка (Мипзоп еї а!., Апаї. Віоспет., 107:220-239 (1980)).
Як показано на фігурі 13, 709.3 зв'язувало дО0-мічений мезотелін людини, експресований в стабільно трансфікованих клітинних лініях 293, ВОАВ і НТ1080 (всі з яких не експресують ендогенний мезотелін), з афінністю 0,2, 0,25 і 0,97 нМ, відповідно. Ці значення Ка охоплювали діапазон, виявлений для ендогенного мезотеліну в чотирьох клітинних лініях підшлункової залози і двох клітинних лініях яєчника (0,41-14 нМ). Значення афінностей п22А10.м483 для мезотеліну людини, експресованого в тих же самих стабільних клітинних лініях, становили 2,7, 1,8 ї 6,2 нМ, відповідно, згідно їх афінностей для ендогенного мезотеліну людини (9-10 нМ). п22А10.му83 зв'язувало щурячий мезотелін, експресований в стабільно трансфікованих клітинах 293 і клітинах ВОАВ, із афінностями 7,3 нМ і 2,7 нМ, відповідно, що узгоджується з Ка, яка дорівнює 6,2 НМ, що спостерігається для ендогенного щурячого мезотеліну із нормальної плевральної клітинної лінії, 4/4-АМ (Агопзоп вї аї., п Міо 17:61-70 (1981)).
Е. Групи епітопів
Щоб визначити, чи розділяють ті ж самі епітопи 709 і 22А10, як і інші антитіла проти мезотеліну, перераховані на фігурі 3, картування епітопів моноклональних антитіла було виконано стандартним перехресним конкурентним ЕГІЗА. Дев'яностошестиямкові планшети
Мипс Іттипозогр (Маїде Мипс, ЮБА) були покриті протягом ночі при 4 "С 100 мкл 1 мкг/мл позаклітинним доменом мезотеліну людини в буфері для іммобілізації (50 мМ карбонат натрію, рН 9,5). Всі подальші етапи були виконані при кімнатній температурі. Після промивання три бо рази в 200 мкл промивального буфера (РВ5, що містить 0,05 95 Гмуееп-20, рН 7,4) планшети були блоковані буфером ЕГІ5А (РВ5, що містить 0,5 95 бичачий сироватковий альбумін (ВЗА) і 0,05 95 Гмуееп-20, рН 7,4) протягом 60 хвилин. Мишачі моноклональні антитіла 709 і 22А10 були потім додані в концентрації 20 мкг/мл в буфері ЕГІ5А протягом 2 годин (100 мкл на ямку). Без промивання були також додані біотинільовані варіанти всіх тестованих антитіл проти мезотеліну (100 мкл 2 мкг/мкл) до кінцевої концентрації 1 мкг/мл протягом 30 хвилин. Після відмивання три рази в 200 мкл промивального буфера, зв'язування будь-якого біотинільованого антитіла було виявлене шляхом додавання стрептавідину-пероксидази хрону (НРЕ) (7утеай; Сагізрай, СА) в розведенні 1:5000 протягом 30 хвилин. Після трьох промивань, як указано вище, 100 мкл хромогенного субстрату 3,3", 5,5'-т-етраметилбензидину (ТМВ) було додано (ВіоЕХ І арогаїогіє5;
Ом/іпд5 Мій5, МО) протягом 5 хвилин. Хромогенна реакція була зупинена шляхом додавання 100 мкл стоп-реагенту (ВіОЕХ І абогайогіє5), і показник поглинання був реєстрований при 620 нм на приладі ОКгатісгоріаФе Кеадег (Віоїек Іпбзігитепів; УмМіпоо5Кі, МТ). Максимальна ступінь можливого зв'язування кожного із біотинільованих антитіл була визначена паралельно шляхом їх інкубації із мезотеліном за відсутності небіотинільованих антитіл 709 і 22А10.
Результати представлені на фігурі 14. Сигнал будь-якого із дев'яти біотинільованих антитіл проти мезотеліну () вказує на відсутність конкуренції за перше антитіло (максимальне зв'язування кожним біотинільованим антитілом за відсутності першого антитіла для порівняння також показано в правій групі). 709 (яке називається 709.5.2 на фігурі 14) є єдиним антитілом, яке не може зв'язатися, коли 709 присутній (тобто, воно конкурує само з собою, другий стовпець зліва), в той час як 22А10 (яке називається 22А10.1.2 на фігурі 14) зв'язується стандартно (чорний стовпець в лівій групі). У свою чергу, коли 22А10 заздалегідь зв'язаний, 22А10 не може зв'язатися (останній стовпець середньої групи), в той час як 709 і інші антитіла можуть. Таким чином, не тільки 709 і 22А10 не конкурують один з одним, але також кожний зв'язує епітоп, відмінний від інших семи антитіл. 709 конкурував сам із собою, але не із будь- яким іншим антитілом (порівняй кожний стовпець із максимальним сигналом для кожного антитіла, зв'язуючого мезотелін на планшеті за відсутності ЕГІЗА покритого антитіла 709 або 22А10). Подібним чином, 22А10 тільки конкурувало само з собою і не із іншими антитілами, включаючи 709. Таким чином, 709 ії 22А10 мають різні епітопи відносно один одного і інших виділених моноклональних антитіл.
Зо С. Картування епітопів, використовуючи химери мезотеліну людина: миша і яванська макака:людина, і мутаційний аналіз
Були виконані експерименти по пептидному картуванню трипсином, в яких п709.у3 було зв'язано з іммобілізованим мезотеліном людини, який потім інкубували з трипсином, і захищені антитілом пептиди, що залишилися були елюйовані і ідентифіковані мас-спектрометрією. Ці експерименти залучали амінокислоти 133-183 5ЕО ІО МО:43 як сайту зв'язування пП709.м3. Для підтвердження цієї ділянки, ми скористалися 709, реагуючим із людським (конструкт Ж387, показаний на фігурі 15), але не з мишачим (конструкт 2385) або яванської макаки (конструкт й383) мезотеліном, щоб отримати химеру, яка за нашими припущеннями повинна укладатися краще укорочених мутантів. Ми сконструювали химеру мезотеліну людина:миша (2398 і Ж399), використовуючи сайт М'ієїЇ, що мовчить (який кодує О1), в позиції амінокислоти 131 і сайт ВОІЇ, що мовчить (який кодує 0), в позиції амінокислоти 213 для вбудування послідовностей людини в мишачий конструкт. Крім того, був створений конструкт яванської макаки (2400), в якому амінокислоти 131-178 були замінені такими мезотеліну людини за допомогою сайтів М'еї.
Кожний конструкт мав М-кінцеву 90-мітку (не показано) для перевірки експресії. 9О-мічені, СРІ-заякорені конструкти мезотеліну, показані на фігурі 15, були тимчасово експресовані в клітинах 293 і забарвлені 0,02 мкг/мл мишачим 709, 1 мкг/мл мишачим 22А10 або 1 мкг/мл антитілом проти 90-мітки (для нормування диференціальних рівнів експресії).
Після детекції антимишачим антитілом Аїеха 488, зразки були промиті і проаналізовані ГАС, і дана інтенсивність флуоресценції була нормована на сигнал анти-д40О0 після віднімання будь- якого фонового фарбування на клітинах 293 дикого типу, що служать як негативний контроль.
Як показано на фігурі 16, 709 зв'язується з химерою 2399 людина:миша (що має амінокислоти людини 1-213), але ні з повнорозмірним мишачим мезотеліном Ж385, ні з Ж398 (що має амінокислоти людини тільки з 1 по 131), вказуючи на те, що 709 зв'язує епітоп між 131 ї 213.
Його здатність зв'язувати химеру 400 яванська макака:людина (що має амінокислоти людини 131-176), але не повнорозмірну яванської макаки (5383), звузила межі епітопу між амінокислотами 131 і 178. (Відмітно, що відносно більш низький 95 зв'язування видний за участю 109, ніж 22А10, внаслідок використання в 50 разів більш низької концентрації антитіла для 709).
Та ж сама химера була використана для картування щурячого, яванської макаки і людського бо (але не мишачого) реактивного епітопу 22А10. Зв'язування спостерігали на клітинах,
експресуючих химеру ЖЗ399, але не Ж398. Таким чином, 22А10 зв'язується з епітопом з амінокислотним залишком, який має ключове значення, між амінокислотами 131-213 (фігура 16).
Оскільки 709 ї 22А10 не конкурують один з одним (фігура 13), вони імовірно зв'язують різні епітопи в межах амінокислот 131-213. Для ідентифікації цих різних епітопів 2-4 амінокислотних ділянки мезотеліну людини були мутовані з утворенням відповідних мишачих амінокислот в фоновій області химери 2399. Поєднання амінокислот 132-212 серед чотирьох видів показано на фігурі 17 із пронумерованими прямокутниками, які вказують позицію 15 мутантів. Для кожного із 15 мутантів, перерахованих в таблиці внизу фігури 17, показані послідовності людини (зверху), які були мутовані в мишачі послідовності (внизу). (Відмітно: отримання мутанта 411 не було успішно виконане).
Всі мутанти, за винятком мутанта 411 із фігури 17, були експресовані в клітинах 293 і піддані аналізу ЕАС5, як на фігурі 16, за винятком того, що 5 мкг/мл гуманізованих версій кожного антитіла (тобто, пП709.м3, п22А10.м83 і п586 антитіло проти 9О0-мітки (позитивний контроль)) були використані, із використанням антиантитіл людини АЇеха488 для детекції. Результати показані на фігурі 18А з даними флуоресценції, представлені як процент сигналу анти-дО для нормування рівнів експресії. (Відмітно: мутант Ж17 не експресувався в клітинах 293 і таким чином був виключений із набору даних). пП709.у3 зв'язувалося з усіма мутантами за винятком б і 29, в той час як пП22А10.у83 зв'язувало всі мутанти, за винятком мутанта 415 (стрілки).
Шляхом поєднання різних видів мезотеліну ключові залишки в епітопі П709.у3 були точно визначені у вигляді двох одиничних амінокислотних залишків, які відрізнялися між послідовністю людини і послідовністю яванської макаки, що не є перехресно-реактивною: Е153 в мутанті 46 і р174 в мутанті 29. Важливість цих залишків для зв'язування антитіла була підтверджена за допомогою мутування еквівалентних залишків в мезотеліні яванської макаки на придатні амінокислотні залишки людини (наприклад, К153 до Е і 3174 до 0). 709.3, яке в іншому випадку не зв'язується з мезотеліном яванської макаки, було здатне зв'язувати мутанти мезотеліну яванської макаки (фігура 188). Додаткові дослідження, в яких залишок Е152 послідовності мезотеліну людини був мутований до СО, привели до інгібування зв'язування пП709.м3, передбачаючи, що залишок Е152 також відіграє роль в зв'язуванні
Зо антитіла.
На основі нещодавно передбаченої армадило-подібної повторюваної структури мезотеліну (Заїіпуапагауапа еї аі.,, ВМС 5ігасішКа! Віоіоду 9:1 (2009)), антитіло 709, ймовірно, утворює містки між внутрішнім стеблом 4 і зовнішнім стеблом 5 мезотеліну. Аналогічно, оскільки п22А10.ми83 перехресно реагує із щурячою, але не з мишачою послідовністю, залишок Е211 в мутантові 415 (у зовнішньому стеблі 6, див. ЗаїййуапаКауапа еї аЇ. вище), мабуть, є критичною детермінантою його епітопу. Фігура 19 відображає залишки, зв'язані 709.3 і п22А10.м83.
Н. Зв'язування пП709.у3 не інгібується глікозилуванням
Щоб визначити, чи зв'язується пП709.м3 із глікозилованим мезотеліном, пПіб-мічений по С- кінцю мезотелін людини був експресований в клітинах СНО, очищений і додатково відділений відповідно до заряду на колонці Мопо 5 у вигляді фракцій з підвищеним (фракція А11), середнім (А12), низьким (В1) практично відсутнім (В5) рівнем глікозилування мезотеліну, як показано фарбуванням кумасі брильянтовим блакитним в 5О05-РАСЕ-гелі. (фігура 20, вгорі зліва). Кожна фракція була нанесена на чип із заздалегідь зв'язаним п709.м3, і швидкості асоціації і швидкості дисоціації були виміряні для виявлення ідентичних афінностей (1,5 нМ) для кожної фракції (фігура 20, знизу зліва), вказуючи на те, що зв'язування п709.у3 не інгібується глікозилуванням.
Ці дані були підтверджені, демонструючи, що п709.м3 може імунопреципітувати всі ті ж самі смуги, як гуманізоване анти-д0О0 п5В6 антитіло із клітин НТ1080, стабільно експресуючих д40- мезотелін людини (в епітопній мітці 90 якого відсутні сайти глікозилування), вказуючи на те, що п709.м3 може імунопреципітувати мезотелін людини незалежно від стану глікозилування.
Навпаки, гуманізоване 22А10 переважно імунопреципітує більше низькомолекулярні види (з нікчемним глікозилуванням), вказуючи на те, що на зв'язування 22А10 впливає глікозилування. (фігура 20, праворуч).
Щоб оцінити здатність контрольного антитіла зв'язувати глікозилований мезотелін в порівнянні із п709.у3, був виконаний аналіз ЕАС5, в якому зв'язування контрольного антитіла із клітинами ОМСАКЗ порівнюється зі зв'язуванням пП709.м3 з клітинами ОМСАКЗ. Придатні повторні антитіла використовуються для визначення зв'язування пП709.м3 і контрольного антитіла з клітинами ОМСАКЗ (наприклад, анти-людські антитіла Аіеха 647 використовуються для визначення зв'язування пП709.м3).
Ї. Моноклональне антитіло 1923 блокує взаємодію МОС16 з мезотеліном
Моноклональні антитіла були протестовані з метою визначити, чи здатні вони блокувати зв'язування МОС16 з мезотеліном. Зв'язування очищеного біотинільованого фрагмента МОС16б (МОС16-ВІ, що має три муцинові повтори) з мезотеліном, який стабільно експресується в клітинах А431 (які в нормі не експресують мезотелін) показано на фігурі 21 ("без АБ"), ліва панель. Попередня інкубація клітин з 5-кратним молярним відношенням 1923, але не 709, інгібувала зв'язування МОС16-ВІ з мезотеліном, що було визначено РАС із стрептавідином-РЕ, як показано на фігурі 21, ліва панель. Навпаки, зв'язування рекомбінантного піх8-міченого по С- кінцю мезотеліну (очищений з клітин 293) з клітинами РОЗ, які стабільно експресують МОС16б було оцінено за відсутності і у присутності 5-кратного молярного надлишку вказаних антитіл проти мезотеліну (фігура 21 права панель), які були детектовані способом БАС5З з антитілами
АІехаб47-анти-пізб. Попередня інкубація мезотеліну з 1933, але не 709 або 22А10, інгібувала зв'язування мезотеліну із експресуючими МОС16 клітинами (фігура 21, права панель). Дійсно, 109 і 22А10, мабуть, посилюють зв'язування мезотеліну з МОС16 в даному аналізі.
У. Переважання мезотеліну людини в різних типах злоякісного новоутворення
Експресія мезотеліну людини в різних злоякісних пухлинах була проаналізована, використовуючи імуногістохімію. Фіксовані в формаліні, взяті в парафін (БЕРЕ) пухлинні мікроматриці (із одним 1 мм ядром на пухлину) проточної аденокарциноми підшлункової залози (фігура 22), серозної аденокарциноми яєчника (фігура 23) і аденокарциноми недрібноклітинного раку легені (фігура 24) були нарізані на предметне скло мікроскопа, депарафінізовані і регідратували за допомогою використання серії розведеного спирту. Зрізи на предметному склі були заздалегідь оброблені для виявлення антигену, використовуючи Тагдеї Кеїгіема! БоЇшіоп (ОЮОако, СіІовзігир, ЮОептагк), екрановані, блоковані і забарвлені 10 мкг/мл мишачим моноклональним антитілом проти мезотеліну людини 1923 протягом 60 хвилин в приладі автоматичного фарбування Оако ашіобіаійпег Після промивання, 19С3 детектували біотинільованим антимишачим антитілом із подальшим застосуванням комплексу АВС (МЕСТА5ТАЇІМ АВС ЕїЇйе Кії, Месіог І арогашгіє5, Вигііпдате, СА) і візуалізували, використовуючи рАВ (Ріегсе І арогайогіе5) як хромоген. Потім зрізи були дофарбовані гематоксиліном Майера і зневоднені серією спиртів і ксилолів із подальшим покриттям покривними стеклами із застосуванням органічного заливного середовища (Рептамоипі, Різпег Зсіепійс, РІНб5риго, РА).
Зо Фарбування мезотеліну (коричневе) було виражене в балах досвідченим патоморфологом відповідно до наведеної нижче схеми, враховуючи інтенсивність (темний відтінок коричневого фарбування), а також об'єм фарбування. Репрезентативний приклад кожного бала фарбування мезотеліну показаний на фігурах 22-24 для кожного типу пухлини.
О (негативний): дуже слабке або ніякого фарбування в »90 95 пухлинних клітин; 1- (слабке): переважаючий патерн фарбування є слабо вираженим; 2 (помірне): переважаючий патерн фарбування є помірно вираженим в більшості (250 95) неопластичних клітин;
З (сильне): переважаючий патерн фарбування є понадміру вираженим в більшості (250 95) неопластичних клітин.
Фігура 22 показує, що 70 95 проточних аденокарцином підшлункові залози були позитивними по мезотеліну, демонструючи фарбування на рівні 1, 2-- або 3, причому 33 95 демонстрували фарбування 2 або Зк. На фігурі 23 показано, що 98 95 серозних аденокарцином яєчники були позитивними по мезотеліну, причому 74 95 демонстрували фарбування на рівні 2-- або Зк. Крім того, всі вісім проаналізованих метастазів із серозної аденокарциноми яєчника були позитивними по мезотеліну, передбачаючи, що первинні пухлини яєчника не втрачають експресію мезотеліну після метастазування. На фігурі 24 показано, що 44 95 недрібноклітинної карциноми легені (М5СІ С, підтип - аденокарцинома) є позитивними по мезотеліну, причому 2695 демонструють фарбування на рівні 2-4 або Зк. Крім того, три із восьми (38 95) проаналізованих відповідних метастазів із позитивних по мезотеліну первинних пухлин М5СІ С у пацієнта зберігали позитивне по мезотеліну фарбування.
Мезотелін також експресується в мезотеліомах і раку ендометрія, як визначено ІНС, використовуючи антитіло 19С3.
Експресія мезотеліну у яванської макаки також була вивчена. Зрізи мезотелію плеври легені і перикардія серця із людини (фіксовані в формаліні, укладені в парафін зрізи) і із яванської макаки (заморожені зрізи) були нарізані і забарвлені моноклональним антитілом 1923 або моноклональним антитілом 22А10, відповідно. Мезотелій людини специфічно забарвлювався антитілом 1923 (фігура 25, зліва), і мезотелій яванської макаки специфічно забарвлювався антитілом 22А10 (фігура 25, праворуч). Ці результати демонструють, що 22А10 може розпізнавати ендогенний мезотелін яванської макаки, який має розподіл, подібний такому у
Гс10) людини.
К. Виробництво кон'югатів антитіла проти мезотеліну-лікарського препарату
Кон'югати антитіло проти мезотеліну-лікарський препарат (АС) були отримані шляхом ковалентного зв'язування п709.у3 і п22А10.м83 із молекулою лікарського препарату МС-мо-РАВ-
МІМАЕ, що містить лінкер, яка представлена вище в Розділі І.О. Для зручності, молекулу лікарського препарату МОС-мо-ГРАВ-ММАЕ, що містить лінкер, по-іншому називають в цих
Прикладах і на фігурах ""СММАЕ" або "МСЕ". (Наприклад, п709.и3-МО-мс-РАВ-ММАЕ називають в цих Прикладах і на фігурах як п709.м3-мсСММАЄЕ або п709.м3-МСЕ). До ковалентного зв'язування антитіла були частково відновлені за допомогою ТСЕР, використовуючи стандартні способи відповідно до методології, описаної в УМО 2004/010957 А2. Частково відновлені антитіла утворювали ковалентний зв'язок із лінксервмісною молекулою лікарського препарату, використовуючи стандартні способи відповідно до методології, описаної в статті Юогопіпа еї аї. (2003) Маї. Віоїтесппої. 21:778-784 ії 005 2005/0238649 А1. Коротко, частково відновлені антитіла були об'єднані із лінкервмісною молекулою лікарського препарату для забезпечення можливості утворення ковалентного зв'язку молекули із цистеїновими залишками. Реакції утворення ковалентного зв'язку були зупинені, ії АОС були очищені. Навантаження лікарським препаратом (середнє число молекул лікарського препарату на одне антитіло) для кожного АЮС була визначена і її значення знаходилися в діапазоні від 3,33 до 4,0 у всіх випадках.
Г. Ефективність п709.м3-мсММАЕ в іп мімо моделі НРАС
Ефективність пП709.у3-мсММАЕ була досліджена, використовуючи модель ксенотрансплантата аденокарциноми підшлункової залози. П'ять мільйонів клітин НРАС (позитивних по мезотеліну (2) згідно із ІНС з використанням 1923) в НВ55 були ін'єктовані підшкірно у мишей ЗСІО з природженою відсутністю клітин-кілерів, і в пухлині були введені дози п709.у3-хсММАЕ в концентрації 1,1, 2,7, 5,5, 11 і 16,4 мг/кг (при 3,5 ММАЕ/антитіло) або п586 анти-400-мжсММАЕ в концентрації 5, 10 ії 15 мг/кг (з 3,03 ММАЕ на антитіло) або 15 мг/кг незахищеного п1709.у3 (без ММАЕ). Як показано на фігурі 26 значне інгібування пухлинного зростання було досягнуто при 5,5 мг/кг П709.м3-мсММАЕ, і регресія пухлини була досягнута при 11-16 мг/кг п1709.м3-мхсСММАЕ, але ніяких значущих ефектів не спостерігали при введенні незахищеного антитіла або контрольного 90-МУсММАЕ в дозі 15 мг/кг. Показаний змоделювати підбір кривих, основаних на загальній швидкості зростання. На нижній правій панелі фігури 26
Зо представлений аналіз ЕАСЗ і інтерналізація П709.м3 в клітинах НРАС і1їНнс.
М. Ефективність п709.у3-мсММАЕ в моделі первинної аденокарциноми підшлункової залози
Ефективність п709.м3-мсСММАЕ була досліджена в моделі первинної аденокарциноми підшлункової залози (Опсоїевзі, ЗМВН, Септапу). Шматки позитивних по мезотеліну первинних пухлин підшлункової залози людини (експресуючих мезотелін на рівні 1-2-- згідно з ІНС) були імплантовані підшкірно у самиць безтимусних мишей ММА, яким вводили дози п709.м3-
МСММАЕ в концентрації 5, 10 ї 20 мг/кг (3,р,5 ММАЕ/антитіло). На фігурі 27 відкладені середні значення об'єму пухлини х стандартне відхилення. Значне інгібування пухлинного зростання було виявлено при всіх дозах П709.м3-мсММАЕ. ІНС первинної пухлини підшлункової залози показана праворуч.
М. Ефективність п709.м3-мМсММАЕ в моделі раку яєчника
Ефективність пП709.у3-мсММАЕ була досліджена, використовуючи модель ксенотрансплантата раку яєчника. Мільйон клітин ОмСаг3х2.1 (позитивних по мезотеліну (2-3-) згідно з ІНС з використанням 19С3) були ін'єктовані в скупчення жирової тканини молочної залози мишей СВ17 5СІО із природженою відсутністю клітин-кілерів, якою послідовно вводили дози 1, 2,5, 5, 10 ї 15 мг/кг П709.м3-мсММАЕ (3,5 ММАЕ/антитіло) або п586 анти-90-у«СММАЕ (3,3
ММАЄЕ/антитіло). Як показано на фігурі 28, помірну активність спостерігали при 2,5 мг/кг п709.у3-мсММАЕ і регресію пухлини - при 5 мг/кг і вище, в той час як анти-д0-мсСММАЕ не виявляло активність в дозі нижче за 5 мг/кг (тільки помірна активність - при 10 мг/кг і зупинка зростання пухлини - при 15 мг/кг). Показаний змоделювати підбір кривих, основаних на загальній швидкості зростання. На правій панелі фігури 28 представлений аналіз ЕАСЗ5 і інтерналізація пП709.у3 в клітинах ОмСагЗ3х2.1 і ІНС.
О. Ефективність п709.м3-МмсММАЕ в моделі раку легені
Ефективність пП709.у3-мсММАЕ була досліджена, використовуючи модель ксенотрансплантата раку легені (плоскоклітинної карциноми). П'ять мільйонів клітин Н226х2 (позитивних по мезотеліну (З) згідно 53 ІНС) були ін'єктовані в суміші 50:50 Маїгіде!: НВ55 в здухвинну ділянку мишей СВ17 5СІЮ. На фігурі 29 відкладені середні значення об'єму пухлини ж стандартне відхилення. Виявлена помірна активність П709.м3-мсСММАЕ (3,5 ММАЕ/антитіло) в дозі 5 мг/кг і зупинка пухлинного зростання при 10 мг/кг, в той час як не було виявлено ніякої значущій активності контрольного кон'югата анти-д0-«сММАЕ (3,97 ММАЕ/антитіло) в будь-якій дозі. На правій панелі фігури 29 представлений аналіз ЕАСЗ і інтерналізація пП709.у3 в клітинах
Н2г26х2 і ІН.
Р. п709.у3-мсММАЕ і п22А10.у83-«сММАЕ мають схожу ефективність
Була досліджена ефективність п709.м3-мсММАЄЕ в порівнянні із п22А10.м83-"УсММАЕ.
Двадцять мільйонів клітин ВАВ, які стабільно експресують або дО-мезотелін людини (зліва) або дО-мезотелін яванської макаки (праворуч), були інокульовані підшкірно мишам СВ17 5СІО в буфері НВ55. Мишам вводили дози 0,5 або 2 мг/кг п709.м3-мсСмММАЄЕ (мишам, якому інокулювали В'АВ-дО-мезотелін людини) або пП22А10.м83-мМсСММАЕ (мишам, якому інокулювали
ВОАВ-4О-мезотелін яванської макаки) або 2 мг/кг анти-40-мсММАЕ, що використовується як позитивний контроль і для нормування будь-яких відмінностей в експресії між двома видами клітинної лінії. На фігурі 30 відкладені середні значення об'єму пухлини ж стандартне відхилення. Як пП709.и3-мсММАЕ, так і п22А10.«83-мсСММАЕ виявляли кращу активність в дозі 2 мг/кг в порівнянні із контролем 90-мсММАЕ відносно дії на В'"АВ-д0-мезотелінової пухлини людини і ВУАВ-40-мезотелінової пухлини яванської макаки, відповідно. Негативним контролем в цьому експерименті було антитіло, яке не має до даного впливу, кон'юговане із М'сСММАЕ, яке не виявляло ніякої значущої активності.
Для подальшої оцінки активності п22А10.м83-мМсММАЕ, в пухлині Н226х2 фігури 29 їі в пухлини ОмСагЗ3х2.1, вирощені як описано на фігурі 28, вводили дози із вказаними концентраціями п709.и3-х«сММАЕ і п22А10.м83-УсММАЕ (3,53 ММАЕ/антитіло), або апіі-40-
МСММАЕ як негативний контроль. На фігурі 31 відкладені середні значення об'єму пухлини ж стандартне відхилення. Незважаючи на значно більш слабке зв'язування незахищеного п22А10.му83 в порівнянні із П709.му3 із обома цими клітинними лініями згідно із РЕАС5 аналізом, п2г2А10 м83-мсСММАЕ мало схожу із п709.м3-мМсСММАЕ ефективність в моделі Н226х2 (верхня ліва панель) і лише трохи меншою активністю в моделі ОмСаг3х2.1 (верхня права панель), на що вказує більш швидка регресія пухлин після введення дози 6 мг/кг.
ОО. МОС16 і мезотелін утворюють комплекс на "позитивних по двох антигенах" клітинних лініях
Була досліджена взаємодія МОС16 і мезотеліну на клітинних лініях. Клітини ОмСагЗ, які експресують мезотелін і МОС16, були лізовані в 1 95 буфері МР40. Як показано на фігурі 32,
Зо лівої панелі, лізати були імунопреципітовані під дією т709 або ізотипним контрольним Іде і проаналізовані Вестерн-блотингом із використанням антитіл проти МОС16 (верхній блот) або 709 (нижній блот) для виявлення комплексів мезотелін:МОС16б або загального мезотеліну, відповідно. (20 95 неімунопреципітованого нанесеного лізату показано в лівій ямці). т/09 було здатне спільно імунопреципітувати МОС16 із мезотеліном із лізатів клітин ОмСаг3. Ці дані демонструють, що МОС16 утворить комплекс із мезотеліном в клітинних лініях, які експресують як мезотелін, так і МОС16 (тобто є "позитивними по двох антигенах" клітинними лініями).
Як показано на фігурі 32, правої панелі, антитіла або до мезотеліну, або до МОС16 були використані для імунопреципітації (ІР) цих білків із кондиціонованих середовищ, в яких культивували вказані клітинні лінії. Клітинні лінії експресували тільки мезотелін (НРАС), тільки
МИиИСІ16 (А431), жоден із даних антигенів (Н520) або обидва даних антигени (ОмСаг3, САРАМ-2,
ЕКУХ ї ОуСаг429 клітини). Або химерне антитіло проти мезотеліну Сп709 (верхня і нижня панелі), або антитіла проти МОС16 (середня панель) були використані для імунопреципітації.
Промиті імунопреципітати були проаналізовані способом Вестерн-блотингу (МВ) із використанням мишачого антитіла проти мезотеліну 2Е5 (верхня панель) або мишачим антитілом 1.8.823 проти В-домену МОС16 (МИ-подібного) (05 ВіоіодісаІм, Зулатр5осой, МА; середня і нижня панелі). Відповідно, на верхній панелі продемонстрований імунопреципітований мезотелін із клітинних ліній, які експресують мезотелін, на середній панелі продемонстрований імунопреципітований МОС16 із клітинних ліній, які експресують МОС16, і на нижній панелі продемонстровані спільно імунопреципітовані комплекси мезотелін:МОС16, які специфічні для клітинних ліній, експресуючих обидва білки (позитивних по двох антигенах клітинних ліній). Ці результати вказують на те, що мезотелін може виділятися в середовище в пов'язаному із
МИС16 вигляді. Відповідно, антитіла і імунокон'югати за винаходом придатні для лікування позитивного по мезотеліну злоякісного новоутворення, включаючи позитивні по двох антигенах злоякісні пухлини.
К. 1923, але не 709, витісняє попередньо зв'язаний із мезотеліном МОС16.
Було досліджено зв'язування 1923 із мезотеліном в присутності МОС16. МОС16-біотин (1 мкг/мл, або 9,2 нМ) був попередньо зв'язаний із клітинами НТ1080, експресуючими мезотелін. 1923 (5 мкг/мл) було додано, щоб визначити чи може воно витіснити попередньо зв'язаний
МИС16. МОС16-біотин виявляли за допомогою реагенту детекції ЗАРЕ, і зв'язане антитіло бо виявляли за допомогою антимишачого антитіла АІеха4-88. На фігурі 33 показано, що 19023 дійсно здатне витіснити МИОС16б і зв'язатися із мезотеліном. Антитіло 709 (33 нМ), яке зв'язується із ділянкою мезотеліну поза сайтом зв'язуванням МОС16, було використано як негативний контроль і, як і очікувалося, не було здатне витіснити заздалегідь зв'язаний МОС16.
Додаткові експерименти показали, що 1923 також витісняє МОС16 в концентрації 0,1 мкг/мл, в той час як антитіло 2Е5 може витісняти МОС16б тільки при концентрації »5 мкг/мл (дані не представлені).
Хоч вищевикладений винахід був описаний досить детально за допомогою ілюстрацій і прикладів із метою виключення двозначного тлумачення, описи і приклади не треба тлумачити як обмеження об'єму даного винаходу. Опубліковані дані про всі патенти і наукова література, яка цитується в цьому документі, навмисно включені як посилання в повному обсязі.
Перелік послідовностей «1105 СЕМЕМТЕСН, ІМО.; РЕ. НОРГЕМАММ-ІГА ВОСНЕ АС; Мак ОЕММІ5; Зигаппа У. ЗСАГЕ5;
Зивап О. БРЕМСЕВ; Міп -НАМаОа «120» АНТИТІЛА ПРОТИ МЕЗОТЕЛІНУ І ІМУНОКОН'ЮГАТИ -130» РА532Н81-ЖФЖО «140» «1415» -1505» 61/459,962 -1515» 2010-12-20 «160» 74 «170» Раїепінп мегвіоп 3.5
Зо «21051 «2115108 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 1
Жах жо ФУ ке хи ую т у ук Му оті сух си ЖсосМ Фен Ох си сю "ж
Усе І КЕ їх т 95 тТУх а дн а 3 г ж икх В З Я 23. Мт т ск Х дев жі із Ме Жах ів щвк Бо Бех беж Се; бах лів ех Ма су ї 5 хо ВЕ
Ха Моми ЖК жим т Ск ба Щи ТЯ Ха хх Шон Ко раю Мах Мн авю Ак Уві ТЕЖ сі Трек о СУув Аж Віа шеж сів ойежЖ був Беж о бапоїтЕ ух тк Б
КМ о СЕ хо шух чьк «есе бах ТІ де БАН Жук жу со ши и не Ж ккд Мо пох во дів шо УМ УМ осАВ МУ КО бу мух аа зх Бухж зем ом ке х ск Зк х ХО шк. уж схо пкт я Хек ВХ дк у Жим теж Мови чом фтшуу Мк тек Віз Біч Бех ек бен осів ек Ф1у баз Бжеа ек Ако вве БекКомау я их и
Заее 21 Ше (іх ва ще ШИ Смак те ак то Жах Мох гар Ту Б аату ща сш Зах шу БЕ Ор БЕН ЖУК О Мем КК рази ЖК, НК ДУБА ЗК АК то ПІ Зо ха ок дя КТ Ті шнУ Мих МУ пла па шо На шик ти КК Ух ую
ЧІ дао ве дів тн ТУХ ТуУук СУБ сіб в ЖУК Ба ОшеЖ бе БЕ кю цу Бе: З ту ВУ С ше СЕ я уд Міка То У У Ж Жди Дема тах ЕЕ ЗМУ ща ОКУ ТК БУВ УВ і св сіє Бр дже тай зв
КО МАТ
-21052 «2115 113 «213» Мив 5р. «40052 ан пон нн и и НН Но а НН ЕНН НА Че Че век іє Маве мес тТЬк біл бек Бе пек Вес їде бів Узі Векодів пає
ХМ 5 Же її
СИ Фо їй ЗИ мм дещо по ду тк хо Жде Му її ою ТО Ж Уа чу При
Зі був Уа ТВХ мМеЕЄ бек су ба Бек сх Філ сви Удю Бей бук БЕ
Мак дав пів бУв дено тек їец вів ТЕр Бе Зіз піз Пув хо пі З ща 5
Мар Жнте Лотуо Туак ТМ Ті шк ПКУ ббрчу; Вл Кун Св али рак шу с кю т
МжЖ БЖ му ме м он ЖУК ЖЖ я ек СКК лм аю Бак ОКУ М зі хо ще в
Бк Аж оАкЯ вне Жве сту век осьу Бе сфУ ЖЕ дар о ве ТВЖ бе ще жи ку ому ХЖаА Оу о их шум ог Кт тих туя ЖУЮ ню ммс ЖК жу. ме їіж БШшж щех баї Зі діа Зібс дав о бео Аа У) Тк Бе Сев ів ІЗ як зо з5 їух Ме Бек бек Тк ТВх бе іУ пі щу Тих цев зві пе їіє Сх що ї05 ї18 2105 З «2115113 5 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид -4005 З
ВЕр о їі Пік Меє Те Зфб беж БВко ШЗес бек бе Бех діва бех а Оу
Акрв одхш УА Жах же ЖОБх Сев о буз дек ек іх бек Уа їж Тех дах
Ка ня Зо
Хек Аве Зі був вва отТуює Без Віз Жже ТУЮ Зі ос Був Бжо сіУ Му ків Бо Пуж їм; їм; біб Тух їж)» Вів бек Тв Ак біз бек сь Мах
БЕ 5 ВЕ ро вех Зжо пе бек чі беж су Беж біУ ТВ оДею Бе ЖК їм ХВ «5 та тк но її бЗес бек ем 5105 уз 165 АввБ о ББпе Кіа Тв ТУЮ Теж Су Нів оо 35 За ЗЕ тує їо Бек беж Тую ТМе ББаА сі бій сі ТВЕ був ві Бі їїв Був
Ка «2105 4 «2115 113 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 4
Тк Коба І Мих смМкршх жМл Факс Ж вкя роде не І я о Но Фемочи ту жі те Ждтіе ба мМек ти З дек вже зах де бен о дежЖ Аза яжж УВА ше
К. 5 ка Не
Хе зе кож ПК Ж шу. У ме був Ж Ху б дуах Й и КН У оачшуї ба йух дух дав ана; Мч Тв Ще ТвК У БУВ ЗК ЮеЖж см На жЖ УЖ їн МУХ О ше «т жк ух
КК «З 3
Ко нач г 3 Ко Ще М яує. т я У ко стає ГУ, ж Ка ее жом чих А ешНАчЯ век давній Був да ТУЮ Ме АїЗ ТВОРІ щі бі зУвБ ВО Шу Був яка 5
ЗЕ І оч Яку Ж осуУХ жк тк ую пл ех СК Кіш Ж ня змрхах жі жк г
Аа вже Був ем о Бе їі Тек тк йіа Бех Та аз ім Бех сту ВХ
ЖИ дов -е
Фуко Жоця булюкт Жюічац Фиму С «рус СХ ки ку чи Мн сю ХУ жа Же Ли и хо пер мк! ві Бех су Бек су ек су ЖЖ аз БИе ЖВх їм ЖКХ жк ЖХаках ок мн МА Так КУ Хомує УК Що ях пф ую ХУ км КУ чан ЕК ах и до ма Бек щЩеХх іа сів вжОо са аю о бтме вже КК ОССУЮ ІМ Ст ВО сьМХх 85 ЗО 55 тм Ж оУ бю Фтишнм Жя смрвеж Кі а ОВ ху Між т ох Ку фл я Ло Ух
ТУЖ Без шеж Век тТук тк тре сі сів ошЕУу ТВ був ува са ге БУВ з ув яд Я
МІ МО Мо
Уже «21055 «2115112 «213» Ното зарієп5 «4005 5 мл ее а НИ ень «ее шк КУ яв мл ко жи дач Хм г Аля са Уні вів ей ува сла -даек Обі Шу ФУ їнем о і АК Бо У бу ї З ії НУ ен и НЯ нн нн Но и о и НН НК нн ЧНУ ох р ви са вк іл бак осуд іш да Мек ат Бе же БО ще ех ожух ву Кая За жо дує о нях сану хугу зош Ж уче Ух тиви Тк бо тую ут мим меж тех ЖЖжюЮ УВА жа ак ЖЕ ЕК БУ Му су Бвщо бою С гюЕВОУ ві 5 с в став У жЖ лу дах Ж щи В ко бук де Мою 0 ТЕЖ усуя он а нн й - з
Зег Уві Ме Бех У АЕрозсу пір бек Тбх ТуУЄ ТУЮ Мій Яво двух Ма
М 5 що
Му ЩЕ АкКЯ Вів Тк їі беж дк леє ба о шеє бе о йши Та Там; бус я та 75 во х с В ке Вих У І ФО же БК сяк ПТК. я мЯЯ Кох Кк «Кекс. "г щ я п нич я ст. АК. у.
Ккем оса мес ден век о бец Лев Ат і а о тТиЄ діз ві тТеУЮ ТУЮ СК ах КТ яв п Хх зи лах КУ ху Уран ож тв У я вх Ж осузу їх ОО Р ун чт ЧИ ча Ж У ОКЕМИО З Ї ЖК ЖК У АХ А БЕК їзип Уві Тк уві Бех ща ХО 116 «21056 «2115115 «212» Білок «213» Мив 5р. «4005 6
У тт ж Тахії ф ву З пок иак Ж щ Кіоюкуху Я хо Уххх Кекс ау ДТ щі сеї біт інь Зі щій вешЕ їх У щБів ів їса ід Гук Бк МАУ Зі
ХЕ в вя 15
Ки ОК си к- о. око де. ух за ких ТТ -х Фе С і У Тезе тус Ге Чую ну і я ЖК лює
Бек УА тв МЕЖ дек Су був ів пек спьу ех ЖК Бе КЕ ТВ ТУХ
Ткю Мек о Мів ТкЮв ові Буюш Й джу БЕК ОЗРе БМ Ку фев БМ тер Да
С Е х Р мих. Шчио Фбіжжеме брухту ШЕ хх Муху дк проек МУ уч тож тзічфи: пі Бек їі йка Бис дех ТЕ о спуЄ Фе ви ПЕОМ бує лав сан Був юне був дер був із ЖИ яма ТОК лів АВ ув Бех Зес щею о жвЕ жуа КУЄ
ВЕ в ух БИ
Ма сь ба беж Мек іа ТВкКовек чім зюр беж Бе УВА рух жжк Сук ще - ех . «жЖіляно мо Еоложа сен ЖЖ уже Мука їх ху их уч Мухи Мч тує То
Ві Ак беж бе Тхв бен Ме бвробтУує Те БУ спам оф ТЕ дек Зо
ТВ: Ущі беж
МІ
«2105 7 «2115115 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид
«400» 7 ен че НН А тик ша кру. мужа хі у У щи «сх уж Фе ек се зіч зі сів Бей Уа с Мо бек соте сіУ БУ ва бві піл о бко йіу ще беж Кох Пе х, ен Нм 5 Зх хо «Факс бе Чижова хіх М кі п 23; ТЕЖ жк лак вай ди і Бек Су дів Аза беж зе ТУЮ ТВ рве Те Так теж кО 5 3
У ака пил ЇВ сх б тт бо ге іх тещею Каювя дфожжке Маск. то хі Ач їх Мес пів св ові дк см бів БО зт Мов діє цем ЗО ТЕроУуві о З т «о ЖЖ СКЛ ут Салюк у не АН НА Я ІК у КЕ прю Я кт з нт
Пі тую жів хе Бхе Шах Тих Зі Тук Твк січ тТуУхХ Вам сів Бра БЕ о 5 5
Ж хе пику че сах сю ко КУН ке х не Ж и па ТУХф у у Я шк
Муз даю АтУу ОО ТМ біе вх бьа АЮ Тс Меж Шев За ТВ жа тек жо: ТЯ я яса В то Жклх Т схзх Ще Вау їі аз стен СА зу Ж Ма мух Сх уує ба вих
Ше сам Меб де Бек ев) Зо вів зі во тис іа ті бух ТУуЖ Сув віз вич дех пк жЕш цем Бей дав отТУк Тюродіє ів сф Тех бемо Ува тк Укі ех -2105» 8 5 «2115 115 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 8 ан Фу уми чол и хх оо прах Ж кю ту ж хр ук тогух жк Фут З и ВЕЖ ів бл о біж їем УВі пра Бек те Ж Зам шу їв; Зв Сів ВЕ Оу у шдиу ї х жа їх
Фа Кос беж М Єржче їххуєУ САТ х Жломо жук Я ку бра кує Кур, тку я грикух цех Без Ак ії ех СУув Лів Біз ех Фі Туює Тйх Бе бвк же Тех а 5 за ого хуєх че СІ Трусхя іч р нь ЧЕ Жученко Ж ожуку вд Ж духа ВА реж хх тЕЮ Ме Міф Тк о ЗУві жо піз Аів КО Зре СБУ су бла ЗМ ЖЕ Уві 38 40 «8 кл суч ча у днк Кожияє ох о Вк ах ХО Трюмо ПУ Ку че зе Стік куш оче я юною Ух
ЗУ ЖУЮ Ті де Бо бек Тк ойьу Тек отв Зв); тує Ба опаж фе ВК и 5 ее том МошуУє жи МУК хутко Тк с не и но НН в НН В ОН ог тиру Люк Тр ме пу ашЕо дющ БП ЖлпХ їх Бех Від м УЖ -аК ОБУ мМ БлаЖ ІВ жу х
Ух; ТЗ Ми УА АННИ Ту ахв. З 2 з о СЕТ де Ох хх фра СМ ух ПЗ вес ЗЕ Ме двв о се ОБ вкЗ АїВ ся Аве їв: ів УА Жух ЖтУхХ Су
Б що 5
З с йоеиу сбдух уче МУюу То ток базу ЖЖ глум Ж юю пу Ж я Кк ща аа о лЕЧч ек Кб ЖЖ нем сем но КУЄ ХК омАішЖ сома ЗУ Жах Мем да зт - ж пом
З НУ ії тека тн люк сцкоУКІ Бах «ак
КхІ «2105» 9 «2115108 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 9 км ум, Кн У ї ем м - Ер схе х. КУ Ск ие вне Кия Кк Сич ЯН КЕ х
Ми хе зів Ме Тл осо Бех Ко пек бах без Беж лів беж Уві (аку х ш Зм як
У 5 18 15 їжа щоку 22 т ї є "тру КМ мч щі М сн дя Кс ЄУді М хя тою
ЕЕ АБО УЮ ЗМ АЖ КЕ СУ важЕщ мае шк сію їв бів Яек Адваої ЖЕ луг ху в
М ж ак т сцзі ЗВ ану сам тю соч Жожже Дю Сл тами ОХ їх Жожх тохУ божа В ї-ча Вів їхЕ Жук СІВ о слКв м БжО ЗіУ Бук ДІВ БВжЕОо цу ре фам іє
ЕК аа я ах ко ж трєкує Ві Кл йоую бе У Фуєсх Й Уує (суд ча ях 42 хек ех Кг ТІВ Си Ук
ТУ ді а дій БЕЖ ше іму Б Дек що. У ЖяБА ВУЖ сх А ще Ка меж ОКА п шк «ва ше ККУ Зо сш їни щем лу Мр ща Він су Ті ТК Ж що ладу дя ЖошУуТЯ ФО жу жи век сі беж бу ТвжЖ дев Бне Те бе Тло жів ек беж бец бію5 КО «5 па 75 я
Ух Жоух о Ж оо гу ще ух Му кан ТК се нн НИ НН рутичу Ему пам ан БІЄе а КО ХЕ ГУ ОБУ хе шо ху ХЕ Зх УМХ Бо ЖЕ У що хх ще цЕ З З
Єр Ух жи ЕМ у г а Му фонем Ем ит Вже ушо Мусех
Їце Бозі У БМВ ЛУ ЧЕ цу Уа) зу їх му дк їз а ек Ж же лак тод Ка чн я гру Ж ку Ж сх ому МВ хе МУ пі Віа Шех їмбі ші др Ак Ууі Тв тів Бек сСУув бер ів ек ЗК ях «к КК ЗЕ х Не ТО 5
Мен г Ме Мк Мих Коко Мах Муусих Му ФМ га ен Кочур лук ен НН м
ЧК ії що МК СУ їжа дектОТЕ ВО ЖЕ САТ МКК мух Ку ІМ СЕУ СУТУХ во КЕ 50
ХУ ох Ж хх Ко СК аж ух Му Мч шк очи Хі ха о шує А Юм у поки т му з» це УЖ УЖ ВЕ ож АКЩ ша Ма жк Се У У аі ра чЕ я й «а
КО 5 яке
Січ ЖК ятки ха Те Фехиую КІ жи км Ж в вхо уж тк Ми у бощ Мн к веж Ак Бі шеж АВ Ошек Сак БЖ БАК т пода КОЖ УЖ МК юю КК КАЄ пк 2 - и 5 що
Фо екює М ха оку СИ ак сво М жо ще ох ці п 1 мк ла я їй
Пе Моска ле ОБІчА сю ЕХ ях сх їщ хлор проду У с ххх. Й Ук ТУ чу век ж ми оса За опа ВО тів Хі тв Ж Жов Є ЕМО АЯЮ аОЄ п ТО Т5 по
Да ТВу їяч; Шк Фик о пьк шфра сф сія ік рію стеж току гі т ух
ЕЕ ОТИХ ії БкОо УКОКЖ ІМ пі щі У ау Такої ща ОХ її ев щи ща Як
Мои
АК
«-2105 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 11
Авроціе зів Мек тТВх сю бех РЕо йех бек без бек Віз бек УВІ Ф1у
Х х її ї5 зва дк ува тах її. ХВх Су Ак бів век опа Зо тіє Бек о дав ту
В ЗО За пео дав Тю їУкК 015 а БУД Бр іт ев о Аве Бк Буш веб їм ів
З З Б
ТУЮ ЖУЖ ТЛ Щек Зк бе Ніз шек СУ Уаї схо бек дз Бе Бах су
Беж Зі бек Бі Тих ЗБОЮ бе Те ев о їбве їі ех бек Бе; Ба вка 55 о щ ва
Зіз вав Бра діз ТБк тТУК Туюк Сув бів ЗМУ 1 во» о ТВк Гео Веб Тек
ТВ Бін сл ж С СУ ТЕ Був Ві Є же БУВ АК «-2105 12 «2115108 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 12 даш Ті Зіо0з Мен жЖВк бів век ВЗ бек бех бе) бех Вів бек УФ ОК х
У 5 КЗ: М
У е пдооуктя чу Гаю Ж же нь Я НН ООН ФО Щи Ка рено Уч дух
Зав оса Уаі Тпх їі те Сув Аж дів ше Зі Аще її1в ву Зав отух що ї5 30
Токіо Утсжутьтх Їжулх ОЙ ух й м Чл куцких А же Кок КУ с З ож ма Ко их Сх зе ЗБ ТЕЖ ТУ сп Біб Був БО зу МУ Аді БЕ Беж їжа о Те
Кк МО Б
ВІ ххх
Мкру мух Бі баз ж кох зе Фа а 7 пк их ду Буду не ААУ
ХУЖ ЖЕЕ Те Бек люб їмо Між Ве зчеу тд вже ес БкЗ РНеБ дек пі дух Ж КІ Тх аю Ж х ре Ін кет ГУ ки 2: ре А з Я «ел ї- іч
Звк зву бах Ф1у ТУ аж; обке Тре беб бінж Т1і85 беж Бак бе» ЗЦу вк їх БУ бич Ж з Кі Ст Масу єбехщ УЛ у бак Щух ку уд ти трі чи сіє вве бе Мі СВК тТУЖ бук св с бів обі ви Те їм Бко Тух не за З5 ту: ЛУК, бу Та - може їз сера Ж рю чех
Ви об су Сію бе Так Був Узі паб Тіє Пуш Бе
М вав «2105 13 «2115113 5 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 13 ут и ж Тим жк ик Хан (1 хх кла тік там ск ЕЛ м бум у жа их сел Уві слів дес ува ско ек осі зу Фі їх УА бів вже сі У х щі В: ї5 ек жає км х ме ем о Ж х ча ж ше ЖУК ж ЇМ; и Мсхах Хом Їмуух
Бак інн У бен Вес СУБ іа Віз бек іє ЕіБб ТвЕ Бе Звк сек тех я ке Зо пк КН нь о ЛЬ боже ТУ З ке І г тку я жо ан т шок о ЯКУ вів Мек Бек ТЕ Уві вкч Зі дів Бо БЖ БУ СЕУ їБжо бай ТжОо Уві
Кк и 5 с о вк С ольче хи МУ дже мА ШНькУ Шіхує бе іму іа. Тл Моумує Її ую У пак УА Кі Бек Зі дер У сб Бек отТве ТУЮ Ту БЕЗ Ащр о бвх Уві соку ку кає Ж ен о ни А Но НК іх б ях фут ках
БУ озКУ ДхсЄр БО ТЇВУ те ек же дев о зню» Зак Був Ви ТИЖ бе ТУ
БА о та За ух Трою, ги ен ше и а СИ о не и ЧИНИ Не ВИ хім Скло бук їв ав оМеж БЖ же Е їі Ак щока ЖК М лав М у Жх ЖЖ рН У
ВЕ З З5 ее ому лож Мід Ме Хата М УЖ кю у т ка рух тую ТИ хмх ху Філе зів жа сЗіУ Ве дер отух ЖЕ оОЛЕьУ СЛУ ТОх Бей Узі тв Ма ее
КН зу хх
ЗИМ 1 МАЄ «2105 14 «2115117 «212» Білок «213» Мив 5р. «400» 14 иа ух чн жи Ка Соус: КЛ - се м мах Козу гін чн жи мо УйУ ее
БМ Бей бе зем Уві ска дек піу ЗУ щу їв; Уві Мт о бкО пьУ ЗУ ї х їй ї5 чек сем Був цем Бек Сух Віз ів бБекс щ1у Ре Жах ге дек о Зю тТеу
ФУ Кн на Музи М я Му жу Кен фожвих жускм тож КУ х тод ря кра Мек щек 7 КОЖ У АЖ ОК ТБх Вже с МЖЕ ХУ Фо с ОК У 35 В 5 х ш ус ШК ие ак ж уже УЗ ха Ж км. УК ж ва МУ жиє тяжка Му кю ких ке пог Су р віз ТЕЖ Кі бек Ав Зі бі Тк ТУє Так тує ТУуК Бжео дв дЕвЕ УВІ що 55 5 їде іх ща ак ск СХ Її шо шви: Тл 0 Ма М їх ву щи ї ківі Ср му вет КО ЕВ ОКХ І зе му сш ЯВИ ЗБЕ му ла Вп вк КУ в т ці
Жожза. (Ж. їж Су бух о не Си Ух мах трі у хо Му ся Мао г їв» бЗіп Меб Шев дек Пе був беж б1й др оїйх Аза Мек тую ТУЮ Су
Аів жо БК Лев Су Тую Тук Бр бер Тую Ткв і Ів біУ ТВ ТВу кову ТЕ жу соч аеЯ ем
Тер. ЖВЕ УвЕ пек шех «210515 «2115117 5 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «4005 15 шим чаї паз їн Мі са ех сла бі бАУ їі Уві пай БкоОо щь Оу
Я (Я кл з п ху и 7 сх по МЛ ки Муки Ху ж бе ку х ходуют Мак
Чеж бе); йущ бе. ех сбУув діа дів Зек СПУ Ве їх БНе Бех ато Тух ту пк соди Муха ТЕ зу р ке ВН пух гаях пос че З Я ТЗ тер; же бе меж Бек їв зві вх Бі Аа вхо Бу БУво Бі ев ОБУ тТЕЮ чаї
З 4 ж
Зк мм М их Фо ба КМТ ем грам сМм3нмо Уч ух о сиди ук 5 и. су
Зхе ВХ Те беж дай пу Бу тиж тТУуУ Тих тую ЩУК Буш АВ шаК ах щи шк а цУув осі Аг ББе ТЕ ї3е Бех Ахе Авройав беж цу бно ТЕ паб тую
Пес; пів мес дапобех без йтЗ Аза біз баб тв Аза УВІ ую тТук сув 35 Зо 5 віз Вт Бе дЗарвостфе тую Шфек Ве шо Тук Жкролує бів осьж ТБ бе ї50 1855 В су ста реч С сь,
Уві же Уві Бех Бах ї5 «210516 «2115117 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «4005 16
СОУ ВН о ен жа ох нь но і я нь и он и и ВШ Лу по лях Сх
Ми Уві пев бев тв ЗМ шек ЗУ ПЕ Зіе Ма ЗВУ юю ВкО ЧУ Зуу
М в ке 5 пек и ака їй Бек був біз Хьа Беж біу Бе Те Бе ех дво жу тУїхх и ух ях Ух же зе» Ку Бе РА Я Ки мя хх Ко почи виш Ех У ух дж тре Ммес дек їжею Уві йо зів вів Бо зт БУВ ж Бей ока жЖуюо Уві
Щло чу ж «лукум фу МР ря ТМ бхжяя ТІУМюмо бхжи сухо фу Тк «53 сш У вів їх хі пек дан сте ЗЕ ЖВх ТуУк ДК ТУХ Тух Бо Вар дек УВІ ща 5 Б тлу т Зі ом хі Тхір ж Ким. же шу бхскану Са Жозгхм укосу У нь сих
Мув МУ Ззжоа Кке ЩЕ ЗА пек АК аю дей Ме Му Бас жи Пе) Ту
Ка 70 75 ва їм; ПКіХЬ Майї: йаг бах їм Ак Ат із Взю ТВЖ із Узі тет тую Су
ЖОВ жо дних Ух хУще Ж фрі УЛ ди УК аю ко сМуах уд Уа хх лук Ті с Жжошх лів вкч Ре АюврошеуУ Тух СЮ Бе Ав о Тух ТЕЮ ЗУ бію о ЗфУ ТВ дви
УвБ так Укі Бек паж «210517 «211517 «212» Білок 213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 17
Муш Бех Сех Зів Зех УЮ ех жує Сех меж дав обаю бує яю тую МеВ щі «-2105 18 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 18 їкхр іа йвк Те ко Хв ЕЕ 1 У «-2105 19 «-2115 8 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 19
Ків ЗІБ уж ем) фшж Бек тує ЖБК «-210» 20 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 20 сі тех ЖВЕ Бе Звх тво ТукК Тв МВ оВів «-2105» 21 -211518 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 21
ЯКУ Тух (Ме йкз Бо ех ТЕ щі Тую ТвкоєМлю Вух йо їв Буюо Ба тв ММ «-2105» 22 «-21159 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005» 22
Аіа дко бах ту Тв ієнУ беу вавВороОоТух ї Кк «210» 23 «2115 23 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005» 23
Дар о їі1іє Зі Меж ТВ бла бек Бус бех Беж Цебз беж бів бе УЗВОЗУ беж да а ЖВх Ше ЖЛХ су «-210» 24 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 24
Тхв бух За сь був Бкс Сі Пуж дів РЕ був Ма бен тів Тук «210» 25 «-211515 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400525 І І Й
ЖЖжю вве пі ЗВО Бук БО ПЕу Без Кіа Бжо був бо бер; тіж тує
«210» 26 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 26 чаш Уах шо пвх ко жве ах б пек слі ех У Же ваю Біме: ук йез отак сів Зве век бе сів вхо під бар КП ів Тв Жук Жук Сув «-2105 27 «-2115 32 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 27
ЗКУ У Ву дек ВЕЗ Бе Бек СіУ бек сбуУ Бех бі Тв аАщИ ВБе ТЕ їеб тТве їїв Бек Бек бецосбм бхо біч ДвроБне дів тТееотТУю ЕБе Сун «210» 28 «2115 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 28
Бе пі зів і ТВ був Укі ах Те дув Бе «210» 29 «2115 25 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 29
Зі чаї зів це) УЮ Я: беж бі СР бу вен Ві зів ВУЄ 0іУ Шу ї Б ха Т5 еко йец дже бев бек був дів Аїв ву -2105 30 «-2115 13 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 30
Тр Уві дхе Зі віз Бко сі БУВ Щ1у рем За То Уві «2105» 31 «2115» 30 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 31 дк не теж бів ех Аїіз вве ЖВе бек був дав ТВ Ал Тек їжа БІВ
Мебодни Бех іє Ас Вів Зі АЩе Тк Віз Маі Тую Тух дущ щ а ТО «2105 32 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 32
Тк Му і Зі Тс бе; УА ЖВУ Уві ех ї і 10 -2105 33 «2115 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005» 33 дЕч дій Бек Зі Аво Хі йеж дав жук Бей Леві «-210» 34 -21157 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 34
Жуж Тих беж Ак їшні Мів Шве
У У
«2105 35 «-21159 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 35
ЗівосСів пу Аве Тв беюб Бує Тек ТВ «2105» 36 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005» 36
Зі Бое ТУ Бе бек бер тую Бе Ме Бек ї 5 то «-2105» 37 -211518 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 37
Кіз Тв їіє бек Ажко ск бу Тек тек ТвЕ ТУЮ Тую Бжо дво Бек Уві ї Ві б 5 -2105» 38 -211510 «212» Білок
213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 38
Віз асз вра дев ЗУ Трюх Тух Біж ЗБо ТУЮ «2105» 39 -211510 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 39 вій ка Бра Лю зі ЖУух Зі аа АвОо тує «210» 40 «-2115 30 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «400» 40 дже Бі Таж Хі Беж ду дшЮ дев беж БУВ Ав отТвх БеможУую Тена ЗА 1 В 16 їі
Мек дат йек цей коза Аїа Зі дев Тв дів У ТУЮ Жук Сув
Зо «2105» 41 «2115 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 41
Тв Зіж віп У ТБ Сем во ЖБиж Ущі беж дах і В Ж «-2105 42 «2115 622 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 42 ві М Ж Ем фуюум спр ДАЛЯ Же Ку т.к: Ж ря слемує сглювемо ЖХ ку Мих рух
Мес вія їец виз Тв Айова веб вхо Бемш о бе) сі Бек був сте ТВЕ БЕО ї Ж зх КК ї У ТО ї5
Тв. рахзї ТР чУ ба Та жом Хм ЖК ря Ко «Су Й кут пожити ше Шан
Вів їшич ЗКУ ех їм; Беб оБце Без о; Бе беж Бевз ПТ Тко тв Зм сту ек -уї
М 5 ЗО
Уа Жид бах м тех хо и дк т Ум Лях я и наше Фуко ж, а аа Уже ВИ Ка м с зе а М М У М ЕН С М В МВ Кіш піз вує Її 35 шо 45 міхи ги Я жил ба бхіжв Жуохих фізшию. М оду ЩО дю сш ут бомул Млумх сфудимо Жодитиж
Ав оЗзуіУ УВІ Бей лів ваБ ОБО Бу Аж бів шек Бек Бей Вшак Вуз Аку
За 5
Ух я ж ж гУух Ск ТВ ан Ь «чу ххх жен Я зим СИМ У шій б?ев ей осла Бе ве Є тв ов цю УВво ек су фо жах ж о її
Еч ку - шиї ев о: ї5 що
Мене г їхемм ЇХ вх Жду оно ко я ток КАК ще зе Жов тод ки З, ек Зої
МжЕч УМ Ах па би зів Уві лів Оео вів З) Муш АвО вже пи як зо 25
См тує КАЛ т (У тк: Мои ху Жихм. МЛ ох жом Мих Ж амя ти я Мем пе ум ежЖ ЖДЕ са Кл Дей А що Ст вам Ах г о КЕ З МА Се їх із БЕЗ бр я СА дощ ки
Ос Оп КК
ОКУ "кош фон Ах М госух уж Тоді ох М Жошхля ЮК оку тв Уч іх Ух
БА ми Бебя давЕ Хай Бей Ехо іш Вр іє дев о беб ве ф-но вва ово
М їх КК
У ше хни йзеж ух ЕВ хо ух пу лу гжки СВУ є очну Жук ну ЖЕ тим Жук М
Авродів ме бБею сут Бко сів віз Су Так Аюя БВіе Мч деж дка жів діт як я я а КЗ КИ пк Кок ОМ іму лю ТК Іхх ов Же КК бух їх ху Ах в Ух: с АННУ
ТцЕ Бук АВ А щі дин ін іа Бшс АХ ОМА У і: вжсо сі Ах «рос ї-О ТУ я о ЕК кН а З Жду ТУ я Зак сто М рах ХК ко А Я НИ дкб їжа бен вхо Вів Вів без бій Су ТК ЗУ ЧАК Бк ду ек вм
ЕЕ Аа з 155 я ОКО аж ЖЖ ми ках ЩО я од ху полки КМ г а о и нн Я НН и пжитую М сухе жаху їхма ЩшЖ с йо ЛЕ мо З ма ом У шк Мем АВ Буш ле захи ши ше сег ї18а ЇВ ї5О
Уч (1 же їни їх Кл Ук Фати ЖК м ЇХ" ЖК КК очух У сг уже жу ом
Бк і Акц Бе УВІ зів зів бетс дів ЗО УВІ їі Бей) Бо АК би де хутв чт їі ЗО их 32 гаку буки ру УЧ ка Єрки ож сб СК юн 0 Моди Кк Ку Бо не і ех и Шо
Уві Бек осуюв Вко шву БжБо ії дао» ПВ ово пів за сія ів дів АК ха з ще
КН ХО ко
Я хОвдожовх. Чу кт ди у оч фшнм дрвися бтхюичио кю Жана Кури пд РЕ М дику
Вів Бі Бейобсакт озьфУ і ЗВУ Бу Бо тую ОКУ Б Бо швВЕ ак ЖЕК пат міну Мч зах еВ ХО хх еВ) соду що дУю бух му о Ба що Ка з ША бод іт ХЛ У окуз СХ ек УщА ЩЕ ЖК Ме о АяюЮ ХК їз ба Вже У Щжмзі бі ВХ ЗА фена Сх У а ОК брисїх «КУ хіх Ж
МЛ им ло: ве ок НЕД ЖК УНК чКУ я з УЖ жж и ся що о хі хе. с ук с їх се їв усе т їх у и т ее і с Мр дове
Зі Бус Хі Ті де ж вак да БЖО сом обі ів Уді Вів Аа ТКко ВЕ в же ша ок : Я : й
ТЕ Ложч Міша кає ЗУ Мкух Хе с чем Ми МУ у іх Ля и Мем СИ д мк Еш МеЖ ок вич АвОо мук ох Сх МОодЕЗ чів Бус СТ ду ЩОСМЕК Ку ве сх тих уж х ше ХУ хі тс жом бен буку ЖУвим Же Же МУ ху ох яодвф ЖЕН Ку уки Жахи коки
АЖ АЖ КЖжО ЯК РІ АКЧЯ ОАКЧ с АЖ сла цесу Був су Бр се хх гу Ус мч що а За
Тая т та я Ме їла Ж куту г дк дух пт Ж що ЖИВ мух Ж тож пі му Бую Іза вЕщ іа Ко е ларосии Беж бен А Ба жуУю Ду бал
Бя туту ср дії Боже ая
За Зо 5 ки
Маха А Уя о Он що стежех ЕК г Ор ке и НЕ Я ше ем и КУ
ЖЕ АК бен ЗВО АЛЬ Ст чщ Бр о їж ід їнмі Їм Віз те їв Мак ад іа 33 бах Мих ж хіх що УС уки су и Яку Ми КТ Кот Ж ух ху ЖЖ ак ахч Ух ВН вів Кі БКОо Ре ОтТВЕ Ух сао сі б а Уа жа у У Кк
А ШКО Тк сам ку ек КУ теж У ух са не и о ОК «3 аа хх
Бук пл У Мем Лв СКМ їн ТУЮ БОЇ сьо БУ БО осв НЕ У
Ж Є у щу їла т У: Хі кі тс Жов Вело ке ЖЕ З їх хх
Її Зі Ново без ОЗ1У Жуж бевовня бев пу Ме беж Вко свв АВ Те спри кеу чих
З КУ ЕХ буку. Жоттамо СМеху Ж сх У пух схо Же трах трюк кі бю Бах ж Тая ах
Ако мує ЖЖ Б бе ТВ меж бе с ТО їою бе вав їни: Мен оз дра суті з гу кет
Я З ав зп жк ух Ух же вк СВ бу : про стаж МУ М їх Ох Трах Жоем жа Ва
СК ЗІ Ух 24 хх ТЕ Ех 5 Ж Си т т, УЖ п реч СЕ мя оку уні дац БУ ЗКУ НіВв Зі: Месє цех вес Зі: та ва ТВ дев їіє дво ас дз я хх щі Ех кожи іа З бле Ж коми Тік ал Тоді Ма божу іх СМЬах Жду Марує МУ у кч це Кі пу бу Ак сбаж що їни Вар Бук вер о тТвжЖ бев юю ЖТВх жк их 30 ток стаю КО у на см ух уми КЗ ду ках ток хау бик ху Ддюує о Мною ПА цес Та вів Ве Тек ви БУ Жуж їн) сбУуш Бак Пец Бек оБхю 3 с току х Ж біз ух у пі Фут Сем у» че СМ их ун М а ХУ ахиж о Мет ПИ Хо пеи ойек век бі пхОо бус ех Беж Мі Ти Азз аю Ах БЮ бів БЕ
КУ дО п
М Зх жо їх Жах Збьра бух бух Жрж Хе Зої Мем чию Же: хм бі жа ОКХ ел дар ТВх СУ даю оБхо дже іа фе йде За Бевз ттжЖ ВЕ Бу Вів зе з кт де з-д же АВ 5 за фрукти с ще Не ТУ У ожуг МоУук тушку. М жд и біс У ее жо ак Без діа Кв Зі ап Мас двк оба ШаекК сі ТСУюК ВБОе о сав БУув КІВ я ВС ож ях 55 о У
Тож саму Зах Бої ЖК ля суху В Тухля МУ 0 34 днем ож токах Я хо Ж жхту Ки ів омек Не і сКіу бе Віз ве Тв са дви іа Був о мі Хама Мене кА «ак а
Б БИ 510 о ож шу «Ж Текує Мі МУ Сх мл пр ен ПТ даже Ж У ге ще Кия щі Зі) ев Уві Бех Мех во баз Бі Тв Кіне Має муш їн и ТЕ шо шу ши
Бе За ши аж ла ху У ах зу Комо Мура ЯР Ж шу крат. тА уж ах жа жо то С ду
ТНК ЯК КОСМ З ХЕ їм ЕЖО їжа: ТЕ У ОН А Е МОЖЕ хи А Му ЕОМ ЯН Су ко рок ше
ОМ Ух т
Тому БФ я хх хх Ух Є Ж дж Ж хз іх Є яю М дух Ім ожечижю о Мудх «ж Жодних
ВХ Нів Узі йба ЗУ бен був дів 313 13 дуз Нів вк КО сві зхЗ ще поді ши май вав ЕЕ пах Бах
Жхзул Тихе М радио но ША о Ноя ру од Ходшхух. сМі УК уч Хо джк И К у Н хі ра от Їх їх т ї їх т г с Я тя х зх їх о ек ТЕ М Х ОО УК шо ЖАН МАХ ЛЬНІ ММ о МІК Ж ех б ЕХ
Ех КЕ Б'В хх Ж ку ЕХ ж пд Ж жи Ки фія Жіжує іму умо жо кл Уж тк дах, ке Сея мк Бе ос жу БУ їі Бко ви ОКУ Жую їдь МБО См дв фе дех ай В Зо он ШАНИ п скї ска тра М буки и ох тод шару нумо ЖЕ ду букаум
Ме с БІ Лів бе шеж З У ТВЕж Вже У З Б ПА ака В ШЕ шу муч ащя
Ва СБ 5 ух и ее Ше ве АН жо жає Мн хе пі жо М хх
Ущі цеб таж Узі бе ліз ії їм цей дів Бех Бе їм ЖЕ ся сук -уд ва І по «210» 43 «2115» 285 «213» Ното зарієп5 «400» 43 ха щи. сохжш МХруж 3 со беж дея «Зими Крюк Жди тож М азет тах Ж хх цій У бів Бу ТВ аБа Сув ово Бек пі був буд Лів Бжоч БЮ ТЕ : - зх Кк
Х БУ о з хаж МУЗ оче Мову Ж ХУУМшу. Малу Ж охусу фу беж рах боях Аа щі з феку ді як см шаК ве А КУБКУ Ку в мук МЕ Кох ї МОКАМ хх і МОАВ ЖЕ МІХ за зв зі чо ше те з Меч доші Зх рю С Ме Мох Зяест Х Тсую АТ з хи м
Ми Аїз Вів йей; без із ТВЕ СЕЗ Ме Бер ВЕЗ Уві ду Вів Хі БЕ ча й г В
ТА ще Ел
Язках ех сжхат її ж кА А І НШЬ Я т шо Ж Же Ж куг Ще КАТ ая сад х ве теж ТУЮ сіб ЗЗб5 їв дво Уві Бе цу Мів о сУув лм Авф І їни ди шк ще 5 З
М зх дю у КУТ я Ук Мак ММ, Лк ау вк АНЯ ТУЯ схожу Ми. сут
УЖЕ Ева сь Ой У Т УКХ ЖЕКО іп бак Уві їі Ба Нів їди З ХХ ї УЖ ХВ що ря «ре пох, іх КК г КУН хувкм Я зії Кк зе скдия Жщакаю. са що тр вав Кухуку паю мері ЖК СКУ бю
СЕ Щи Св мак Беж ЕЕ су А їі ЗКЩ БЖ Ки Аатю Уа дію теж 5 чо ж т. 215 нує тему То С тіше сту ху і дат ти пУбЯх Б і щі) Ме Ей шМОощаОМ КлХ Бе зу ва Мей вЕМм оса ва М Му шу В АЮ МЕ ї5а і ЕМ: дек ж 15 щі Аа рах. тих тії ву Мане Жах ЩО жу МУ мину Мах дек кс оп УВІ дів Ти їжа: їі дщх ОКО га Ух мив м Кр сі « зх як їх 159 їх
УЮ стоку ож Тухгх я тре Тл Мп МЕ Ку сф о Ду отче ж
АХ м М Оу ев ММК сема лак мем МК овжА Же Кук во 33 Х аск дух жк
ЩО ЕЕ о тру тех: йхквих Шішько Ко к оо их, ом шт ен їз я Ж ук ча Ж М г К и с - ке Тим хе а я ї Ху 513 г її яма: ще жо ря фу дея
ЕжЖЖ ЕК СУ вжи МЕМ ОСеЖ Еко Ба 0 ем пек беж Уві бу Бу ШЕ зах шк до жо а що 155 ї5О сСтлшчя СЯ кю туя ау жк рову ен хода т зх ем 2-х й т шшжЖ АВ Ер ль У в хо мак КВ Зк во шлж ств Ба жо САКЕ ке сохухх до 8 о 75
Піх ОпУХ МеХжких ї7тх ж оеМї ж ЖК том ВО ож хек Ж ех МЛ у жін гу Мо з же) аю ої Бей тує хе БУВ ща вкЗ бе дів БбВе сі два) Ме що М їв
Міхах ЇХ ху духух 073334 Мем Тв їх ї бл Ж ку Сбивчєє Жах Ж ох ху ха ки чу
ЖАБА маю ЗМК АБАА К'Ж ОО БІ УА ую ДОМ КАФ ХНН ОЮА ПУ ЗЕ У Вів як зум «щи ї55 «о ва ї-еух кує КУТ Малечо У шма Жлтш Що біда о хую дл у М що Жде Моно очух ехо жмлЕЖ са дар оба без ів ев век са біз дев УЗА феЕ Ме аю зх с г аа хо ХЕ РИ
Зо хл що ммн аку Ждн оваг КожУт Щошних МУ уз о В хту мАжнНе ж Жосжач о Же Ж ож хе їв Аза ти вве Ме Буд бе; Веч То Аа Дів УВі Бей ВО їм) ТВЖ гук «хх гл чат
КО Кеш хІМТ кА «а щі і в тах тля Би Там ж» їй іш а чаї лу тащі Жакщ чаї Віа сім Мак й МУК бен Беб су БЖО МІ У Ві шу їн Бе ав ай в
У ни но но нь нн КА я В НО Я ен Жду Му г Меч лів ші ль вка Міш ЖКЯ Ко Уві йжЗ Ав ТтЕжЮ Вів Ба АХ сів ДКЗ а КЕБи Ти
У м Турки. М км боях Тих тку чи о жа то Я ко фу ее ші же во зем ввр їм Без пу ТМ ос Хек паю ум я схх св
В що «На чн че Жоеха Ту» тож М ле Жуки Ж ож Хо Кк се жк Ву. а М ких
Ме лів їв ЕКО а лів ДАК ЖЖ сп ла я вах к ОК МЖК
Міщ:5 їз із тую оба їм Мих Їдма4 Ту ско шо їнам піс тую Ма о жрь у
Еш У ЮК ме мМ ЕшНе ем сша ке о ща мам бу ЖМЮ УЗА АТ щи 5 З ук Жде меж и то М я Мак СУТ ср да ку із ТТ ПО з Що Зх одтуї
МК Ж ЗА АТХ ме лів АЖ А ЖК ЗА АК КАМ В їз АЖ Бус ба
Зк а я
Жолуз іїе ЗІУ тошеі ММ Музи учи бін Ті чих Же шує тик сінаж Вчи пом а осзКЖ УВА Ми Мав АЖ во КЖжшса ЛяВК ДА сеК мк сажа ех еЕК ЖК пох ще се й ще ж
А Мо 5 гук Тожшує Хом хі ЖУМрке фруччо сбіше МЛ у Ера кн жхиучх ду ЖІ я Моя ккд п МО аж ІМ Ж КК ви -жщ яка М В ЗЕ ОХ КЗ їж аж БЖ шк вх зве жи ап о ТВ па "М, -кО чу З Лук ско яку х ї ох я, 4 сь -к Сл вч - - ач зу ж о ЕК сексу хх чу: ЩІ о о о кв ее я НА суки В ге Хдкщо лока
Вже ах жу Зав ої Аза уві віз їх Зі сій БУВ АВ ОЗАЮ Був Бе ух су що
МІЙ 0 З оче тв дк 2 е КУрУ отоц Золя. фжккюи Ж оту п не нн НА Хек же ж узи Дудл ек Тихо За З; Бей зх СуУув Бевз дів Нів дк їм ех ОЗРіа Сх вЕо зукх ж зу дж
ЗО 5 13 113 Мсжу Кодух У х по ТошУ; ЖУчЧ То шххх ря ча ота оду ЖЕ Хоащею Т Дня
ОК ОВ ОашМ ЗМ же з яЖЖжк зе Ве жа щей мем пе іа ЯМЖМУ КЕ бу Ж гоже НА АВ и а на НН НК НШЬе Фет жи РР
ШЕ МАВ ЖІ ХМ їх вЖжЖО щі ІВ СУБ Ул Ах гві МІВ УМ хи Ух с Х їв як соках дод їз МІВ та
Те стеки ЩО М:хух І тесж кі Годо слу КУН стоки ЕТ яю М во НОЯ дее
ТЕ Буш Біз дп о Ущі АБО Себе Ро вка пі За вже ЗО вк СЕ яв де ек КК
То 5 ї55 зи р не НА я Тр Ж мо Ах кум тт муки снах рю к ЗАТ лу КА Сколе Ж
УК КК КО лу ХО 3 АТ що оо й їх Кк Ж В'кЕ Е Ом Її М ві вич хх ї У МИ УМА в о 75 " ФК ПАЧКУ ик Кз чук кожи Мк у: мякі ОА ди СТЕ ж, пе як. Я не
Я у фата ві дув ЖК доз М х пд жі де зі. Що тА спеку РК ім веж с АХ зв У З оди Вів тами Щі шо КАМ ом ЯМА ШУ ЯММО мя зрив ет ЖК Ач ру на и о Не "М їж Ху У шу Таал Хіетз бучт од
Би У вжЕщ БІ ча 1 із сім ввЕ АТа зів Уаї бе); їни БК Ау МОХ «хх ри лак
ММ «Ми М я жук їжу жує гуму струм Ж ни в НН На ЕН НН З ее уче
У сдьВж КЕ ую З ОС ЕЖЕИ лВІМ МІ АХ АВК ХХ щі о кА А КК уж а ря ух
МеВ ВЕ «хх З. чн а а у КАЖУ ех жи Уєвиим Жудням жу Кри Мрвчих Жкучею хау Му ТИ хів Віз цем Зіхз; пі ПЗ сту БЕО Бхж ТУЮ Бу БВжоОо вк опе Лв тер хугут дю м «рух ее ах ко 5 ке
Сяву її Су МУ Ві. ох М щої м Хм ди тим. Хо Туніс бї мі БАХ
Пес сві ех їв мес Ар Лія ей; йджЗ бу їмо а Боб Узі мм ЗУ чу «жо чик
Се їх І Ко Її ке М они
ТЛ хе Жкулам Ж пе х -у Мах Ж ко Фут ШЕ жо ди ЖК хх що ру Ту
КА Вус лі т «ВОЛЕЮ ом Бач мах су дж кВ КОЗА ЛАВОК ВОоАКО пек Ши Ко НН Кк у туя Кіду ле пкук ки мо тру Б пожеж ач ів дк о ще Бек Аж Аерокиє Бек о жЖжю ло КО БЖ ска ДЕ ОТАжЖ КА пк УК КЕ «ЕХ «У У рек чути м о Ж дк У хи ЖУК ема НН о НН З, ЧИ чук Ж ух їм жа кб де Бра дже бкЗ са Уві па бев о жежЖ Хів сСбув ко ее чу божуве жЖоюаомо МО ле ско ух жк повхж МА ал джу ю жом КУ гіч тркаує жом тхх пу У му Май длЕЩ ЕД ЗО фл ОчЖ КЕ КАш ОК ВЕосрек муж КУВ ак на здх ту,
Я АЖ НК аао
Хек ЖК о Жоама «їм й бу Зв ях М у Бинт Боуї ак паю хх я їкЕ ав Бей спі Біз Су Уві Ве вів Аів бем Бей Ат жк сій Мет з їх 55
Мокмвм, ьо ме жу. їкх х щ с сю тя хх ку ха. Є же - я г г.
Ма Мних ХМ Живу я сх Є У кеди м ЕК птумф жує ХХ з Ух бод аж «ж. я
ЯК КК У АВ дів її їв БКо Іа сот Ко З 13 бу, вро ха ЕЕ тд) со и й ям, о 5 в ти Мі: Ти Там беж Суб БКохур чу БЖбрт (2 КТ жу сих сфужи в Стик В
Не В МАВ Оу ме о мжЕК С КН Гу Бжо Сх С ж ЖУК ВЕК СА шек У 53 ке слу вий я За жк р і Жах року у ух ж Жук У Улдух Фолеумо Дні о бу Мене Уа мок ОКР
Ті сш Яйів бем ЗХ Тук гео ба бо бу МебЄ йШекю Бо З10 дер їі ях аж хх
У Оу ЖК бЖоутж У жує Можу хх хе а А А ШК кру ує тод т мує ке шк боки Кк ди мБув Тк вав Уві Те ек їм: ЗО ТВ Без цув АЛ їн їмо ЗХ ке суки УК пог
В з М Я
БФ пошжу ЖК іх Ех су гаї кум бух Фу га Ж їни ен юуу Ку уу Жоехт
Уа А МУуВ уж НІВ БМ Мес дах БЕО со ів Ехо ДЕ дк Вже М
Зк дл ї суку
ЗЕ ЗМО зії
Ух ху чу у У ж Я ж ж х Ка ху ок пк що СИЛ мак уже жк ху ії Ск х ще - аю ри СУБ; щої Кос 48 де тУРрде ох я вже зів Уві ів ЖБК їь бів ВЕ ЮА ве УЗА БУВ ЗУ Ер шу їв
А хо лих
Ми ам ГОшК оп Хосе Жов г У Ж гуд Жозшамо у мк трюк о МК сажки Теж без дв будо оно ТБ обєею ВВЕ ОЖВе ба МОК Аа Бе Ху БЖО ру Жук зх ай й ах
ВІ а рн ку їхлиєт што и НИ Кая З шує бух о «саше Ху Ту жу Фени пам у
Без шув ще Сей меж о бхо са о фена Зак ек УВА БЕК БКО БЕЖ о мах 5 як
УЖ оо жк Лк ЕКО коди фу и ун Ко Моно ПІХВІ мо дббужио тодхж Мел им ВК ук
Тк ТЕ Мов Укра жу ЖЕК СІЮ ВДЕ В їх КУ пи ШЕ ОМНМУ КК ОА ах ше яке ди
С С 75 зва
Тохії Жшях ХхюЗ тех заду Же Жак Мо ж Кн ло Жим аХз Гала Му Хі Длугу
Мей и Уа ТС Ук жа ву льш Ах шу АВ ке ал Мей Аа
Ех ЩІ м зн щи я бр ех У ТМ х Му Жили ШО НЕО ой о и хх тосуї ЇХ хх Але М у уже щі ше А КОНІ Пе Уві КОКО БКЖВ жах ЕПе їж я аж у я КО с СК Можу Ток Фо жк о оо В. ди бе З щЯ Хі. кими 0 Мед ХУ ді
ВЕ Зіб Ве без пу із цей ек са сію дей щі Бек мес вер обеай 55 Що ще
ЩО но сучка Сбмну демо боями Жосуг жи ТИКМоує о жу кл. чи ож о АНЯ срвсях Ху
Аі: ЖвЕ БЕ Мек Ба їм) дже То ар діва Уві Сей Бо бер; обнж Уві ооо Ук зе и Не жом С фю жЖручу КЕІ ш хтн у У ся я жо Срок ді ЩИ УВі Зх їх У іме Ії аю ХО НЕ УВА ясла А о БУ ща 5 кг Зо чн Хучич ВК бе Шен З Жду» ек буку виш ше ша но Ше ШО
Ма Зах дх ЩОБ УЮ виз КО сві в же аеро КЕ да ме люМХ Кк ду АХ п почи ке
А ще пОЖЯ же вм ХЕ ХУ
Фу Меч То Ж спря Ж дух хо хо Ж жк у ую Кк хи чин чи вро ав іа ве ТЕ Мец слу їшак осоУ М ОХ чу Зі Її БО дей шої їх: шу
За ха а
Ту Уха дхе ГТ ока УК юю сх Зх сум. Кс кВ ум вх ше и нн НН НН сптУ тую Сей УВО Би Аво мез Бек МеЄ Зі піз ві їмі Бек 1 х ТНХ ща ЕУННЕВ ох вісь Есе Ок В НЯ Ти Жеих РА бхучи І Тосхуу ЇОває хух "ух ох т 2
Вт с УМА Бе ХЕ Ж жЖже А КжЖК Ж ії Б у КЕ Чві їж ів бла бер пі пай
УА нь СХ яви ТУ лю тож з ву щ їв дів Ж ТИХ Бам ІЗ дО поь їх я ВУ «2105» 45 «2115 293 «213» Ното зарієп5 «400» 45 т ху Ух яю Жокхих ще я Ж олаж Жду ен а жи нь ни ше Щи М Ж ях щі Ви ай аку тв іа С У окжо зах См му му ді вжЖщ ж є з 5 сь гу
Ку о ВЗ ї5 пе г а на и о НН ННЯ НЕ чи ре шини и ча НЕ
Авеошьм Мек їчма Тіе Би» Жбуж у фут бкУх СКМ їдмхі Сів Аів Суд о Уда зр ве роя чі я «МО
Мах ЗУ м ЩО зх та Ж дух: З: тумеах Ж У федео йшух Мофрех ху Му Ах чл іх аа ота із сені ех да ТМЖ бів Ме Авробко Уві дви во б вк ря ЗУ
УМ ру ав са Ше Фі її гот тож ДЯ Мох Ж сії Му тої ва жо ТУЮ біб сік фев) ев УА ев Був ЦІВ Був ем даю с бе що З ви тяж їж (3 шу М гітя ке Же появ в НК те Ті Ха ту ФЛ лу ач ТогМ
Ж шк СО М о МУжЖО ЕМ жа ЗЕ Ух 3 тів олій Вів бе С У УЖ Бе
Ех стр кі ху
З Бе Где: ще туф Ж хі бчкх Кіикі слух учня Хе КО Мет Жах сук Жату УЖ суху б бе їни БУЄ Мей Зек Бк ЗБ ЧЕ М ів Ак Я МУЗ ТК ЗВО ча їлЗк ож як г г
З ще шах току Уч коном Зк Му Жов Ж онук Га Ж Зі Єва брак ЩА хх сх Му йем В ЖАХ їмо фу 5із Бе без СЛ чаї вва Ммув СЕУ Нв сам мех.
ЕК Ач ЕЕ ни Ше и І нн НН в ки о КН З НВК НОЯ 7 КЛ о стаю фо ТЛ овя
Бавж Бко пі бів ВЕ да ДЕ вКЄ зем КК ам ув ії ді отв Бей бу їх їх їх пок Ще Ж уро Тк г и Дане и ся б одия нях. божа Му МКУ Ук ХУ дна ка ха Х жа ду ж су А вв Яке му Дар ЕК фам АЮ де чо зим ха 13 Ва
Нм Ж овуху я М яю Зі сх мує ЖУмчм о 3 ко си Кок їхати Кб кук Жду Маш фния її хх
ТЕЖ (ео ТВ бід ке бує Бк фе бю без ув бек ей век Бо зго ї45 МУ 155 МБО тт ху о феміх КЖдрью бдум Ж ти Жуухих Січ МЖджах 0 ХМ о ти хі . дв ож Уже лкх пуб вац ше век в ВкОо Бу Бес ощЧек її тТкр дів У) Ак Вуз їв їв у" 775
Зк бод й ЯТЬ о і с КИ ух ре не нн ЯН жилю Хо руках Ух жу хо
ЕК ОАК ЛЕК ОС ВЕ У ЗУ МОЕЖО ДЕ ща ще АЮ УВІ М Тек о Вус; бе
З Ех ї І: ше ж оОУх зх акме їв ї85 350
Мі х оесу Тов 35 п люк Км Де Мах о Мхуї їх она «ж КИ ЖІ ж ших вав Ат Бе ві ле (ЕВ ЛЕО МеЄ Алю ЗУ ех Зіз теє ве тах мук зх зп шу тощо т кому Ж Я ек лу м х Ко сим « їЄ - З с т 1 ж дух Уч де с хо М надути ТЕ де си у го щ- уж Ж що ож
Ай ЖАВ омеМК ЮЛ Ла жк сАУ ВАВ КЖжЕ УК ша дЕФ їм БУвоваа се
ККУ іх ах бу ТТ ФІ ху т ев Ват Мох бок г сті і Ж о Ж мух окт вк мів ЗІ оз УВІ Бех МК Ор Ме Віз Тих ЕБе ВС бУВ їн ДУ тих ку, ух - ке их яву м: зх її
УК -К ВІ Ж ее а Чи КУ окхх Фужеум бок трі чих сл пк ча Я чт ке жави м жи їн В щи В Уа їм бке бле Тв ті із січ ша а о У М
А ех ук к
У ЗО р їх Хкеуї ЇВ Уч ЗНУ АК ШИЯ Жах т сю у ее ху соус Жруєкх Ох УХ піМ БЖ Нів Уві ща У КА му о м і іш сао дЕч нів вдкЯ Ко Уві
НО 5 І фучю Муєх М'ж чо о жоихх уч пе уче (ле М Жкукх о Жщт Мане Ма ня Ох кю дк взрожжхв їі Око дюзЗ 33 дха Зі дев Ер без Бюро тТБе ей осі су «ат зе реа ї КОХ хх М жоащії ау жом су я
ММ УК у кам с оці У. «2105» 46 «2115 285 «213» Масаса їазсісціагів «400» 46
Хоішамо в КІЛ як Же МУКУ рух бле хш їз Круюя ЖЖ ук "жк Кт аї 37 щох тя. ТТ
МАВ З та пі ду У вх ТІК Є У КЕ КЕ їх їх щЩ одна шк Ти КАЛУ
Її їх о Ще я З таку ЕМ Мо божі СК ЖУМіих Межує У кам Жов Конт СК та їз ВР тя ЗК
Хв ос3о Аабп фа Ті ВЕБ ТУ фбуж бе Ак Зб іа Зізч бів Сув УВА
Уке ж ЕКО а оо кю
Хо АС І сечо яю Ми у Ті жу клем ах ет їв а М я тих жиру дав дів діа їн їн із вів Зі Ме баю дк Уві ве Віз її БО зе ще «хх ї5 зо о
Жівих Мі сема ах СХ жу Ж хузі Щомж. ХК Туші т.к ВУ шу Ж гм де Ту ХХ окВ3ї
ЖІмв ЖКЖ ЖУЖ СЕМИ М Бе ле че а ще Ба му Аню МБТ ТАМ ЕІ
КО 5 и ж ЗК а ШО іх Мах Жудестт 14 Хі щтдї Жак Мк З МАН КК
Тух ВЖО СІ паУ ТУЮ БЕ 10 шах Уві з АжЖеЯ Кіз Бей схе Вів цем «зх -ух мук ах «5 за Ух ав
Тхір Ж Фожтєно Мак о іх Сюкмих ля Машу в Жеку Тл бачу. Мала Зйщ Чі ю Вк хе Сер омук Ме зх жо Ав ою дж жо мБУуш ЖИ лама УщА Ха ОМмех
Ж За ве тож М х5 СМ ке Же тому. ЖИЛЕ я жом Ж осу Кжя хх їй дамою фокуе Ух як їжа ду лу вм цей Є лк бец бе Бі Бейлі бе М же Ма шЖеЕ боб спіуУу Ні За Ме
І. яея у"пиа Зче
НО МТУ КВ дк он в не ххх ВЗ сах тихі СМ ку Мі Мачку тв З щ Ех Ж кх сажу гі хх век лів бів Уві 5ів ТБх їж: їі Де вач Уві і Уа У ско у оц Же Зк
Я як М хі хх
Тл Ж бух Так Можу смМьУах ЗУ Му ру оця Му М жі аж жує яю звів їм Ар БУ Авю ТМжх ув) во Ту їмо ТВУ дія Бе бу бе СУ їх їх хх о ж У ж «ж ча ве хх ак ж Ба и он в у Стхучує Жухешм ОЇ бек Кому пару те Ху чих Фу сах шу що ба -Х жо ем жи мм Олі у т АВМ яхЕМХ З лУЖЖКО УЕК ие БУЄ Енч чо хх похо -ї ех чок
КУ їі, з і585 ча Жах ті хх А ху щем жує шо піша то ббтуко СВУ об'ект Зумеу чщк Аа СУ ек ха Ж КО Фі де побеа дат тах бує бе хх Мк тр. чех ЗЕ
КО КЕ АТ иа Ж Ж Ху 0 щу Туя Там Же МТВ Ми Соми КО тУмиу КАЛ ха Ме зів їм БОЮ Уві їм Тек Вже ев дія Де їз Віз Бе Зівз Бе Ме зов я КЕ ккд
КИ А АМО
Сом М у ах М Зажує Ум ЖІ Жохуєу СК Хоче ук УЄКку жЖосехлх СХ сука
Я-щЕ «(їі дек біз тух Бе УЗЕ БУВ Щі Ач ВЕо ББж бе; бу Зі Вже з Ж «ум чн 35 ми ККУ тку. Мхфкує КЗ оку о Жоежім божу Ж жо Уа С уч Ух м Зола Ж а о
КЖжЕ ща Ашю дей ой М інвМмо бек б АФ аа УВО ке Ме ВЕ км зх ке
ЕН і5 кі
Хом Ах су СИМ си Ж ху ги мух Ме ріг Вік ІК гру т ТУ
Бер оала ти пе Мек БУВ з(еа вк дЕЗ сіб дія Ма Ббем ке іа вх ях ж аа я тт що и я ви ши и На Кіш ХУ КІ тхі то не
ЧТвї Ат Зі Уві й був їжа Мей обі БКо Ні УВА За ШУ бе пух пе вже вх хиул слу сту м 5 Мах ух Хуг і па да КВ ТЗ Ех Там Тх сії т йжеї
ХВ А А М БУВ НК КК УК БКЦ УЖЕ З АЄ сама ЗуУВ сп вже гук ка зу а ке шЕ хшРМ
Ж ую аж ба Ж охи Тих ббню Ж чу смій Їж ти фах ху ій ЗВО Авр одеж дев ожТмаЕ Сей сі ем У а Те 5 сутки з «кре ша 55 Ка «2105 47 «2115 285 213» Найциз 5р. «4005» 47 пог сс У паж нен Аа рек ШЕ ьо АК Нв НН В НА веб жвж 3 пай їв дів Св шко жо йіж БУ сп бхо ден Угі Ах
Ж окау КУ то Жду СК Фа ПИ жує В у Аг ста КИ ри я щу КА чт
Мав біз два Бен лів Бе Тук Сб два отв осіб іа Ба Аз Св ва ху тку -е
З. що ЗМ де і м Ве їам3 їі іа пі ії. Ма Мак бе щі вату губ жа бе вам осду хмщУ зем мем яз жу см ех йзЗюЮ Бер; ува Ва о ще вк
СЯ 5 іх ЧТ си а я екз ау ях Шви. Ж лу Ж Жду Кох чан Ан
КЕве Тв о КУХЮ ПЕ зм бе Бек Її» Бве був Ків був без вве фев ДУ
За Б О
Тк ЖЕ ах жк стеж Кухня Маля и наши тини не а Я Крик ВА ук
Ежж Ко ші КУ ЖУух ВжОо За о шек Бенй се ев мл ої Зк Вів бе дЕ сур хх -к
ЗИ ЕК ВУ За
Хр Момиж сич ж шШуким фкуч МУК мим М Мои МЛ я Мних Мезух ХУ ТЕМесяє Ха важ Ажа Тк ТВі Бек Бе ФО даю хі Ах бКб ско Аво хаі Ме Бех вп ща зо хи аку Мр дан ха Мр Вик хода я Жозе фу ун оку я и Я стору щем вже Аве жпК Учі два ОТЕЖх бе; без Шу ЩУвь век обув Ку с бу МЕ ча зву 5 ха Мп Ма ек а ан Б М а "ді г що хх я Жогуїтх. лах Зно ТМ кю ях
Аве о лів Фі Стах Ав вв ба Уві Ві Су ТУує без ВК сю м зу
ЕЕ просту у
Мо Ух Ки Ах
Жоажух тома йоду КУМ зх Ж ау В НН веж МОм БУ холку ткі/х У туя фі кош Мам їх тихі В зЯ щої - їду б дІЕУ ТЗ свя тріо ех
Ззув бям двроБіз во її УВІ був біз цем АвюЮ Авто жі ко ем деу
З 135 їі сбЗжре Жодух бах джу ЖУв дому ке ЇХ же ФІ хо Жах ТЕ Кеш шШухетт плжжо КЖідинх
ТУЮ Бей Св МВ те ме Ж й Та ва оефп пз від З із Бус бек шах чек «ще Зо, ЗТ ї58 155 їх
ЧТ дм хни Топ ж й хо б ухах ДЖ шо Сувум Ж кі "Зуїчач о ожусі Клакін слух КМ му. Хучеру таі Ме ТтТЕв без аз Зі їм Мів аз ої; дв МУ Су Бек осів АКО за іо їт5 жа тя як ко Ж Мур (я бла Мо бно дах М ФУ сао же Ул ее ще т ко Жук Ми жа о г 5 м МЕМ гії х ух
Ву ми жу АК я СУК АТ мує уз Буш БшжЖж ка Кп Ба ОВ У ЩЕ тм чо Кум,
М Мах МУ сх В жу Жосжіх у гм БУ ну УМ Ж кю КТ зош Мр ух рам Журі хх ді хх
ЖК у Ед А У КІ В оС о МУ АВ КМ ЇМ шен Бех шк м у АЖ позі че есе їх во ЖЯКе
Фе Журн а Водхоя спот. уже МУ т ше і ФУ ах Ма МУ се ММ Мих шеш АЖО со ВВ Бей ла лів Бе шек бій за Аж осві Зк Ме во я шле о бл М Чткає рт х жк Ж. оку а ки бютххя М лу. Жов У "хх т Фк
Ті Азія тТнжЖ вва пев Буш Гео Зі Мі де ів їжи УВА ду Щеб Вже трв гум коч ех тим кій М хІхУТЕ кож чаї ів пів ві і їм феї їн і У Вус ців Ж г Аще фемі БУВ
Уа й СО що СК МЕ Бк МмжМому м АжА ВО Ж У ВВ. мМ Оу зав за ах тах У по нич Я є яку духо Зп Те Мет ен Ж дм ух боже ТМ А ж сі піз бно пу щех КО Уві ВЕЗ вв ЖжЕЮ сова Бів о дХа с Баг пром зушеце гіхрА ам «ХК КМ т що ЖК жк сх екшн а НН Ж хто хх Тфосуї ля хх пів бук ана іє ВО ен дез: м їм. СБУ жим АЮ му 5 «2105» 48 «2115 285 «213» Мивз 5р. «400» 48
Модуюи Ро тя в ле З до сжих сфудлих о фас КАЛ тав грає фан смуую уєш Ел
ВЕ піз аа Осії цУуш дід сСУую Бус Ка У ев с Бжо ТУЮ Був Уві і: Ж Ж І: КУ 7 « Ба : хм току «їх
АХ я їй її
Жодужх Не они я Ша Мих УЗ их жах уко ск Хуеиує БО Я сви КМ ре іт кА
БЕ КАХ А МО К дЕ кре ст УЖ ша яму жКЮ ба ем о Б Вів СУ Уда тк то чо
КЗ хх За
Мох філ Ст ми пух Ло ро а у З ШИ ВУАН Жошк края Ж рн рум вар оБіУ Тс МЕ бен Вів ке ма Меб дв їн. АЖ Бах мо бе Шк з п м.
Зх че ве тори стру беж (333 КУБ Ко же Ж ЖіМах жо їмо буки то пік токах рух
ЕНе ЖЕ Тух 03 13 її бек їїє БКе ув Нів Буш сом АВ БУВ ЧУЄ
ЩО на щи
З НЯ АЖ
СК ул г ке Лк Сх Же ПТК я ох. МТ СІ ЕМ. хе Жду ак жк хх щ. Кутя щі У в. З Ії ння ния щи ка М ках т рон УК ; а Дж
УЖ КЕ ша У БУХ км МАМ меж мех ле Сіль мах дес ів КНе
У хи зу пт
ХУ Ж КЕ реву
ЖІН Може ух ХУ «Фк Ж З КУН т я т ня Молгут «уко вив вх ТУ УЗ цех Вко із дво їі Нів ОЇ Тк; обак Уяі ТВО вех пе Зх тов
МІ ши ЩО
Тіни Кожух аю у хр ПИ іже У Тому Лін дж Жолу Ш жу БУ Стохуду дея во в Ка У і МЕ СКЖУЮ ди гема КУ УК хеЖж мвущ сам СЕ дуУЕ МЕ тр чт тк
Еш МИ ща а ше ї щ бі В гі у том хто і ді ст же Битва Дату ес сік Ах
ХМ ФА Їх я КЕ лаг ж ВА А У АшЖК МА АЖ ККУ У Бу з 5 ул и
Щх КМ хх В оч Ж бо Ж а шу НК ен ки Ше о не а и о нн НН і ТЕ А МУ КУ шалі АВ ром Ві. БУ АВ Бкил (с У вшЕЮ Аа ОКЖжО а КАК
Зв як чий т
КК ї35 Ка
Фижкай о Жомжеч о см укує А хм бах їні ЖУК У ХК жи Ж ож У о меха тут и: Мох пек їн Це КЕ шви СМ ОБЖ с с АЮ БЕ оОМмішЖ ше і шу ба Бех 4 Я ї: » їх як зи я як ж щи 45 НУ жу вищо мя СК ша че нь с о І ШО Фрсхух Тік бе би Зі п я чі Ве ЖЕ Бозам о Ух пу БЖ мА аа зай дво му СУБ ше ЗА ОКУ зак з вЕгу а ек ї55 Ма ЕІ чо Кл ІРАК тах томі ТМух Каф стуку СК сх гру лихах М рах 23 дукуу дтщ мів Іде) Щі МЕ МИМО Ес ДУЖЕ ях КОН У СЕМ У їз Біне сбху ваз ві зай ва зов
КИ АшМ ке
Сб А ха кож хх ох, На о стру т ких жид хо дж суміш ДЕ Тож КА Тк цпеж с пу пев ЗМ тТУЄ Ба зім му І був ТНК КББа бе фу зі Аїа 4 щих дю ї55 ВЖЕ ХА
Фе ТР Жоден Мои Йоду бач Ж стома бу Ля ті МЖосуи Ху 3 Фе Му Біт
Не тр пе щу 5зі3 8 тн жк с ШК ще ую МЕ Ба шевк Уві був дак без дуб ЗіБ цем пек с нів дав Узі ех Мек де
УНН зш кв
МО ХА ши М ет Ж их є ке Жду чегя «ех ан ша А Но ОН НН пес Ж
Те ів ТВ ЕНе пу ЗжО бек сю Заї ба Хек оф Зак У цем ех
З Ка ЗЕ шо чаї дію За Учі пів бе це) обео іш вхо Ан тіє М да Бе був
Твх ств біч Авр обу ек руб Уві Ак АБ о тТхр ої бе зе ЗІ ОнЖЕ зів був Авроїес Ач Ат Бе Бі Б; зі без ЗМ ЗТ уУ
ХВ ха за «210» 49 «-2115 8 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичная метка 8хХНів «400» 49
Ні Кіз Ні нів На Нів МОБ НІВ «2105 50 -21155 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: синтетичная метка бхНів «4005» 50
МНіз Біб Нів Вів Ніж Вів «-2105 51 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5
Ко) «400» 51 шк ах за Бе «-2105 52 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «400» 52 І
Зав лав и Мо 2105 53 «21154 «212» Білок
«213» Масаса їазсісціагів «4005 53 вав осі ЗИ дю
У
«2105» 54 «2115» 81 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 54 їув бБеротаву Бем о Аво ТЕ зеа ТВ Бі Бе тТУЖ Бк Яру Тук їж: СУВ
АХ Е ЩІ М цех демх Беж хо із «15 без ойеж дек УкЕ бко Бо Зак яеж її жо
Віа тав вхЗ Бо б вве баб о Аво ТЕ СУ дав ВБжО Аке бій ев Аве
Ті цем ТУуЖ Вхо ув Бів вюб без дів БОе паз дно Ме ло сту ВеЕ во ЗВ «о щі ТУЮ Бе Ві БеБ її Зі дж ББе о цец Зі се дів Бо чл ощім
Ба т 7 Б
Авр 2105 55 15 «2115» 81 «212» Білок «213» Масаса їазсісціагів «4005 55
ЕК 5 вен у оно Ко» ЧА Ук Ху М КІ а хх том тк
БУ де ТВкЕ оУді ват Же Бео їн дів КБе Сув Еко Сі Сузв беа Су ех їж: Беж ехо піз Аж їз пек беж Узі Бе БЕо Яежх Узі її СТУ що 25 з хів Са Вже Бк ЗМ баб о без бе Тих Су Зжу Бк ко ЗМО їн ва
ЗВ С а
Уві їм ТУЮ Вх5 Бе дів Аж Бер Вів ВБж оФії вам оМеє беж яру НВК
ОКУ Ух. х У ОЖАА ОО ЖУК МКМХ ОБКХ з Ку ув 5 ща
Зі бук Ве Сзі уже бів вже вже ВВЕ Бер; бі су дів Би ТВУ ОМ т ТВ Б
ЕВ
«2105» 56 «2115 81 «212» Білок 213» Найциз 5р. «400» 56 а не Не ах Ух о Жов Мих пи СИ о пек, тож сли Пчжає Хом є ща ар зе Уві БУЮ ль іи ДЛвровн жі вує им дн ТУЮ б фУд ї 5 їа ї5
Не Ми її. лк жи чл жу суша Ком ХЕ їх іх ло Же «ФМ. б веж о жя ТЕ ав ке шех вхо мія Авроіїм НІВ о діа 118 Бк Беж беж УФ Ме СТЮ оду хи кожи гудок в схм а у Не год МУ де Ме с я носи бва о Увь ЗУ їа нів зАвр ої бар обув сСув ех Фів вже нів без З КУ
З о м ж Я Теж СК я Ж ккд З божа ую М о Не в У ЕМ ох їжу її оку: іа Бе ЩТух бій був Вів СУв Бех Аа бр ліг дай ом Бех 1 У ай ща 55 що
Газ брхмух ЙВевМ 5331 їхУ ти ку ую Бвшо їм є г Зх що дує йому т 2, ша КУЄ ЖжМВ БАЛА БУХ З вже М І Бе У ст АВ сю ЗК СВ.
БЕ У и но ми
ЕЕ
«2105 57 «2115 81 «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005» 57
Ух Хауу Мих жу тлу Се том Тіз іє ТЗ теми ток бік б Ж Учя. г е хх ші: жав Ме увю бУв Вів Бе щЗАУ ваб її БжоОо Мем Бех жук бе Сух
Хомух 3 Ох ше п хх «УЖ аж МАЯ ок що Ки Сткза Же її хх Ок
МН не аж во зЗів вв цей Нів ЗвЕ ді бСкбБ Бек Хвеж Укі Ме ЖЕр тк хі хх ко Ж ТЗ У Ма Фо Же Фоєккр о тк п ММ во не но Не о ОВ вм Уві СЕУ Вко Зі зво бе бво» цу СУ шах 18 АХ Нхв бяль ЗКУ ог Фохх Кури КАЛ ух Ст ожуг пох тт Со о Жах г му Ми З ТС ЖЖ шу оду цеб омем Же па бує Аа сво сах жа Же за Ват УФ шах Оу Бех пк Меедому Жуфумх Жоджиую Ж ня Ту спн.я жур Тошзя чи т шк МЛ дк ЖЖ жк само ЖУК й Ма цув Ббіє ШУ бе Бе оБец бі ЩА Аа век Уа Сея -к шо «ЕЕ ще
З ТО 5 ай
ЕЕ
«2105» 58
«212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 58 зу АерожЕх без 2105 59 «21154 «212» Білок «213» Мив 5р. «4005» 59 ів дав мех УВІ -2105» 60 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 60
ТЕ хів БНа Тух ї -2105 61 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «400» 61 бі дв Те БО з0 ї «2105 62 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 62 1; пов Те; бек -2105» 63 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005» 63 с Аа ем Нів «2105» 64 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 64
Бо дах нако Хе «2105» 65 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005» 65 пак щек Мі МАХ «2105» 66 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 66
ЖЕ Сув дк ВЖо «2105 67 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «400» 67 пув був бек пав 7 «2105» 68 «-21155 «212» Білок
Коо) «213» Ното зарієп5 «4005 68.
Пе їжа вав У Бей «2105» 69 «-21155 «212» Білок «213» Мивз 5р. «400» 69
Кі Бе ЗКУ їм) (4 ії й -2105 70 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 70
Меїє Зап озкКу аж
«-2105 71 «212» Білок «213» Мивз 5р. «4005» 71
УВІ Кжж ЗУ фа ії «-2105 72 «21154 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 72 І
Бра тах бо ЛАВ
Х
«-2105» 73 «21154 «212» Білок «213» Мивз 5р. «400» 73 дек ЖБК бю 0 Аво
А
«-210» 74 «21154 «212» Білок
Зо «213» Мив 5р. «400» 74 ех УЗ шу Лю

Claims (28)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, де антитіло містить () НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:З6, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:37, (ії) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:39, (ім) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:33, (м) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО:34, і (мі) НМК-І 3, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:35.
2. Антитіло за п. 1, яке є моноклональним антитілом.
3. Антитіло за п. 1, яке є людським, гуманізованим або химерним антитілом людини.
4. Антитіло за п. 1, яке є фрагментом антитіла, який зв'язує мезотелін.
5. Антитіло за п. 1, де мезотелін є мезотеліном людини 5ЕО ІЮ МО:43.
6. Антитіло за п. 1, де антитіло зв'язує епітоп 5ЕО ІЮ МО:43, де епітоп містить Е211 відповідно до нумерації 5ЕО ІО МО:43, і яке в деяких випадках має одну або декілька наведених нижче характерних властивостей: (а) не блокує зв'язування мезотеліну з муцином 16 (МОС16); і/або (Б) зв'язує мезотелін з афінністю, яка менша або дорівнює 5 НМ.
7. Антитіло за п. 6, де антитіло не блокує зв'язування мезотеліну з МОС 16.
8. Антитіло за п. 1, де антитіло містить: (а) послідовність УН, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:16;
(р) послідовність МІ, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮ МО:12; (с) послідовність МН, як в (а), і послідовність МІ, як в (Б).
9. Антитіло за п. 1, яке містить послідовність МН 5ЕО ІЮ МО:16.
10. Антитіло за п. 1, яке містить послідовність МІ ЗЕО ІЮ МО:12.
11. Антитіло, яке містить послідовність МН 5ЕО ІО МО:16 і послідовність МІ 5ЕО ІЮ МО:12.
12. Антитіло за п. 1, яке є досі, ІЇуо2а або Ідс26р антитілом.
13. Імунокон'югат з формулою АБ-(І-О)р, де: (а) АБ є антитілом за п. 1; (Б) І. є лінкером; (с) О є лікарським засобом з формулою Оє в? о в" сн. в? а я х і ї ї вв 4 5 Кк во г б во в о іде К2 і К5 кожний є метилом, КЗ ії К"7 кожний є ізопропілом, БК» є Н, К" є втор-бутилом, кожний ЕКЗ незалежно вибраний з СНз, О-СНз3, ОНІН ЕЕ" єн, В'Є являє собою -С(Н8)2-С(Р8З)2-арил; і (4) р приймає значення від 1 до 8.
14. Імунокон'югат за п. 13, де лікарським засобом є ауристатин.
15. Імунокон'югат за п. 14, де лікарським засобом є монометилауристатин Е (ММАЕ).
16. Імунокон'югат за п. 13, де лінкер здатний до розщеплення протеазою.
17. Імунокон'югат за п. 16, де лінкер містить дипептид ма!1-сії.
18. Імунокон'югат за п. 13, що має формулу: АВ--д8 (в) (в) о н он су ра о коки ану о ше чи о. о Іі р де 5 є атомом сірки.
19. Імунокон'югат за п. 18, де р приймає значення від 2 до 5.
20. |Імунокон'югат за п. 18, який містить антитіло за п. 6.
21. Імунокон'югат за п. 18, який містить антитіло за п. 11.
22. Фармацевтична композиція, що містить імунокон'югат за п. 13 і фармацевтично прийнятний носій.
23. Фармацевтична композиція за п. 22, яка додатково містить додатковий терапевтичний засіб.
24. Фармацевтична композиція за п. 23, де додатковим терапевтичним засобом є гемцитабін.
25. Фармацевтична композиція за п. 23, де додатковим терапевтичним засобом є анти-МОС16 антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом.
26. Антитіло за п. 1, кон'юговане з міткою.
27. Антитіло за п. 26, де міткою є випромінювач позитронів.
28. Антитіло за п. 27, де випромінювачем позитронів є 892г.
й сова а. ЩЙ Н ОО ер ОКО У ее У В ОК ПОМ ЗОМ ОХ ; сх ЗХ х тус КЕ
1 . т її сх х хусмує ІЗ АК ОО І Х Е М тех сеноехвевоке му я сно 1 ПОООО ОО КВ о У А ОККО Ах ях ДУМУ ТВ міх як ура 4 но т. щу» ох ЕХ «дих з меж заз МН ще п ма зьна й СВІ ЗВ'язих; МІНА Ча ме (ОБ зК яю УТ) дам ідекумлнвана частин ; енер Вінок схеми ГоеКе КУТЯ ши ТЕЖ ХЕ и на ! рес Я по еле щи КЗ ня ЇМ ПОХ823 мое Кол і рев ММ 005823 меж й А що р НВЧ м рей кре ЗМЕН ході Ве зн вану ї 55 же нь ПСО т ГИ УНЧНН ЕЕ : зарнекя, кранеюринкв ТЕ У ваНи йк: у ве и МИ НН 1 ІІ Й Е Н ще : кі НЕ ЩЕ ВИН 1 ШЕ ЖИ ї трі Еш С ЕЕ НЕ З ШИ НІ шк ЕН ух Кі кї 1:55 НУ ЯН 1:31 . І ї і ЕН ЩЕ ПИ НЕ УНН ї НУ Бі ріка ВЕ ї Гі і ИМЕНИ НУ її їі КИШКУ рф Кр: ГУ т : НН ї БР ІІі НКУ ШЕ т РЕБЕР ЕН і Е рі Н КРБ РІ! Гі НУ їі ТЕР ЕМ НИШЕ НН рі ті У ПИШНЕ 3 - 11 1: Н ЕН ЕН ті Ех 11: Кр ї 51 н С 1: Рі: 7 РИМИ ІН КЕ, КНУ ОК : 1 БУ Як ШИНУ У ЕІ Он Я НН НУ НН Б: Е я З ІЕЕ ї : ЗЕ ЕНИЕ р ; | ШЕ ШЕ ШЕ КІ: ТЕ У ЕН ї ЗЕ УНЕ УЕ ННН Ге НИК Н ' Т ві: Еш 13 ЕН : ЕН НН і | М МЕН МЕН УМ МНН З в: ГУ 1: ЕК З ї ві ОН НИ НИ НН її їх хх ЕЕ ще Ж ШЕ ЕН: НИ НИ ЕНН ЕНН НЕННЯ їх ОМЕУНЕ ШЕ» ї ЕН 1131. ГНН ГОМ НИ З З з ТЕ КИ їх ШЕ ШИ ШЕ МЕНЕ НИ НЕ НЕ ЕНН БЕРЕ ОДНЕ ВИНЕН Її ТЕ НЕ УНЕ ШЕУ Е ДЕН НИ НИ НЕ Іі ГЕТЕ Я ВИНЕН НКУ її Ох МЕ ННІ ЕЕ яна ЩН ТЕРРІ ї хі БЕРЕ і м ЕЕ НН Е МЕН її ко їх ЕІ Я і З рі Ті ЕН ЗЕ ЕЕ ї ШЕУ 3 ї Е і Її із НИ НИМ ї Н та ГОМ НИ НИЗ її ГОМ її хі ЕЕ БЕБІ ї Н Кі Рі ж ЗЕ її: КІ ПІНННННННННННИИИНН ЗЕ МНК НИ З Н ї З ЕНН МНК 2 ї 3 ЯКУ Рі 3 НН ГЕ: ТЕ і 3 ОЇ НУ Я ТЕ УНН З ПИШЕ ЗІНННЕ НЕ: т ТК х У З ОЇ її ЩЕ М НИ УНН З рі ШЕ ЕН ЩЕ НЕ ТР ї ВЕ шНННННННН нининнини іно аЕ ЯН НУ ШУ НИ НЕ ШУ Н НЕ ШИ УН ІН : Н У З Ї ї ВБР і Не НИЗ 11 1: з У НН І м ж : ТЕРРІ Не НЕ ЗЕ МНЕ НН НИ У МНЕ ЧНУ 5 ІЗ ГИ І г У Н ЗМ НЕ НЕ Ж р 1:11 | НИ У УНН 1 ї: 13 : Ж НЕ НИ ВИК НЕ ! НЕ ЩЕ МЕНЕ НИ ЗЕ ТВі ЕІ. МЕ Я НЕ ЯН ЕЕ | ши шшшш З ШИ ШЕ пиши шшши БЕРЕ. і І ІЗ НІ хз ї Я 1 ІЗ ї Н З Е Ті ТВ ЕЕ ЕЕ МЕН ТЕ: ПИШЕ І і ГУ Н ї рень і і НН НЕ НУ Еш її ї Кві КІ І УшЕ ж 5) ЕН ПИШЕ ! ' ті її ЗНИК ГТ БЕ 1 ІННУ ШУ її ЕР м 3 пн 1 нини нинни Н ОВЕН НН ШЕ рії Р ОЕ НН У Ух Її 111 Н ГЕ НЕ ЕН 3: Рі ЕН БІТ ЗЕ ШЕ НЕ ШЕ ШЕ НЕ: З Н Н ї Ії кр: Я їх В НН Я ГУ ЕЕ 11 Ї НЕ т РЕ І1 ра і Н МЕРЕ: ТБЕЕТа ІЯщУ 14 НЕ З З НИК УНЕНЕ МН ЕН ра КРІТ: ТВЕР : я ГУ ПИШИ : НЕ СІ ЕН ІЗ ІІ: ; и З БРА і З Я І Н |: КИ РЕБРІ ВЕУ 31 НИМ: їх 3 Ії ї їх Ї ТР НИМИ и УНН ОНИ НЕ НИ ї ГЕ ї із ї 5 БР Ки НИ УННИШННУ ЕН І З ПИНИНАННН НИВИ х ї х х " К (З ї Н Є Ю НИ ІЗ Р: х х КЗ Б: НИ: ЕІ І НК НИ НН мини НН ї г х У її ЕН У НИ У ії ї жі НИ ії Н рі х З НЕ ТВ Рі УНІ НИ ІЗ ННЕЖИНННЕ ЦИ ї Ті Те ЕН Е ЗБ ра ї Не: ЗМ НЕ НН ЧИНА НИЗ Неш і МІПИНИВИНИеУНННИНИНИ ШК ГУ ЕН: Н 1 Кк рі ТЕ м Н р ЕІ ин нн ШЕ ЕЕ НН У 51 15:11 ЕВ ЗЕМ НИ НИ НН НЕСЕ УЕУ РОМ М ШУ ГУ її 1 3 МЕДИ НИ ї ЕЕ ШУ РК ЕЕ г Я НЕ ї ГНЕ 3 кі І ї , м НУ НК ЗНЕНЕ ї 1: 5:51 ЕН НН : ЕН Ві 1: і БР і шо 141 ШЕ Ш и нини Пенн ши ІЕЕ І НИ СиБеНННННЕ не 1: їі РЕ: ЕЕ НН НН ЗЕ НИ У НИКИ УНН ГУ МЕ кі НУ І ЕІ НЕ МЕН І НН Я ї Е ра ві НИ У З ЗНУ РОМ НУ їх ПН І БЕРЕ РОШННЕ Я ІНК К. ї КО ГУ У 3 ї ра пишне НИНІ ее М МН ТВЕР РБЕТІ І НЕ ШИ ЗИ М ІЩЕ ТІ» ЕМ ШЕ ЖЕ НЕ У з і я СН ШИН Кр ТЕБЕ | ТР Іще МЕН ННЯ КЕ НУ Ех ТТ Рь: ТЕ грі жі РІ її Ті ї НУ ре НИНІ НИ НЕ Н ЕН М ШЕ ВЕНИ ШЕ ШК ЩЕ Ш і РР ЗДЕЩЕ НН в: ИН и НН Шен З РЕВЕ Ева ее КОН А 1: НЕ ЖЕ І ЛК ие ниши КР НЕВИННЕ Не пиши ни БК Б ТУ Те Н ЕН І | Я КНУ хіх хОї і ние ША Я МЕРІ: ГУ МИ НІ ЯН ПИШЕУННН а Кі МІ З ТР ТЕ: кл Кі нина нене КН і а ше З і А ї вх 3 15 І ї ЩЕ: їх РЕ ШЕ ВЕ ЕЇ ВЕ КВУ ЕЕ о і сш ше я тА ЕНН НИ в КсЯМ Я СНУ Гея ге Ж ХЕ ЩЕ: -у 53 вакза На з 2 ОРЕ КУ М сх В. ГУ: З: ВИШ НС Як ЗК НЕ пише іх І ЗЕ ЇВ зи 5 Ко тв вади ви ЕВ ї БЕ КЕ з х ЗЛЕ ВОК І. с ЛО ОХ Пе КО Ко її 41 ж х НУ х. З. ЗВ КОХ ож м х що Є КІ Як 5 х СЕУ КЗ п В : а жш и. а АН НН зе йон о и У ЩО 5 Ох мо Не СК АХ В - ЯК Ж КОВОМ ОО ЖЕ ПОМ ОХ ж ощоо й в Б ож х МО Мох Я ЩО Ж М. у в Ж . ний; Си а сно б в я ош, ВВ ле г Ох ко ще ОВО па шо Ж Щщ Я ШІ КУ пе ВЕ В СДЩЕУ ї Б. шк а ОО В. еВ Же Но Жошео Ж ЩО поп СО К 5 х й БО ЕВ - І Ж Ол Ж х мо С У що ж ЖЕ ще х : ВЖЕ це: Х їх М жк 23 М ре ге і, 2 фіг.
Мфхнсаклоналим зе ім вм мех есму фетр ! й з ПИ упо нннях НИ Е в : Шнисих Груша кистаєве ІВіЯнІУПКИ СНУ Кок ХАКІ м гук Мо і ! ма З менНеНЯ ; КІВ мисицое кінчика шуму Н Ткя не о А Бічконю Її р їх Я КЕ Ані ч ее КЕ с : скажи жа ЖЖ снсттокюжькЙ в КК ВВ и й Я ТЕ ї їй Кк ; є В по Ї сн нн нн на нн нн В нн пн АНЯ КЗ о ! та шк и НИ Я ! нн он нен ни ни В нн нн ни нн оон вії З ТЕ 3 В ї 8-5 : НЯ ї «5Е ! І пінні інв ввнннннннн Зрннюннннн ння опннннннннн нон копвннннвввиююви Звинннннвв вк вч пнів Зпплонн нн вн вннвнннн кимн они Винні З з ЗАВ з МАЗІ З тім ЩО Тк емодичией з птн нин ши пи и пом нн пи ро з ТВ 1 ще ЩІ т-И Б з Навконжелих нн нн нн кн пн нн ох ие нон пишне У нини КЕ Гек ва Газ Зак 1 З посі ПО ПОД за и ЗНО Діл льнищищ до ПО Я ІЗ ці ЩО ІЗ да ІЗ її с. Н ЩЕ: -. УМ Я ї ЗНА : ее І ва ІК 5-АТІВ : 128 Н Медики Ж Н КН : сх З в М Зі Н клю Ко Мацечиечена Х о он нн нн і нн в : АЛЕ Я КО З ЕВ) Н ТОВ І Тішещикх Н 4.55 й ї з » Е І (535, Ії: ІЗ АКИЕИМ 1 КА й ах С І сх. ї ме се сетхя : ЗщеХ ; да Е Е І ПУ І М Ро ж вНоцачені : повно ново опи они вно НИ зона кових Но Зони зи ї і ЗБЕ З п КУ Ми сенячи ї Бе ммавахюунх гай х Тед арк еяних ліпних пегиєнчх онко МНН ту мВ АнНяНе КУ З-е з: сла кЕВЗВИНнНаБиИниавОнЕнмі вав вн Х пн и и ни Гн ув дитя тк АКККЕ КА АА Кант їкай кас в о ера прак вдень яку СА КИНЕ КК тету БІ Ж б я хв З ІК Бах ІС оК ІК Ві ТУ ЕВ ЯКІВ ОВ Ме вах ЕР ЕУХЕКЕКОЮК» ЖІ ов тс хат» ха ві фаТЕЖЕКВ А ЖУК ЕВ ВЕБ. ЗІБ кт є 503 5 А) т У КРОВО ІЗ Ся и помах песик МЕ вам вевевисеачпечсвсвесисиниачнпзавивонискнавІВнмімя лм 3555 й шик й ОКО
В. «кт? КІТ» ах» азяв ва как ване Кк жЕ І БЕЖ кв ТКА СЕК ср х М БА Ша жа 5 у В ВХ ВО ах Б КЕ АКиАЇ ТЕЕ ВІ: ВІ; І ху авВЕАТІЕКВХ ЛЯ ВЕБ ЕКЕЖЕЬ І ЖІ: МЕ: Кави ЕвО г Кк во 2 й к ІЗ ж і Кава ЗВ ВМ Ж А Ж З КУ ЖІН І ВО КОМ МЕНЕ ре К н на п в ВН гу у сви ЕЙ В ви їшу ЗВАНІ я КВ М ма зт уж і важ з ЗАЯВ МЕгіз 8815 з я кВ Коко. З КЗ НИ НЕ ЕВ ЗВУ | раре о х я от ж у ж їж ож Її, - м з У со. г, х че Фо х ча Та вк аз т: МКМ орні спинний вин ж М и В ь х у НВ ВОНО НИОИЙВ ВЯ ж Пе Вау аОпльнкХ ДіІЛаеК дажкьт пекаря атом: гуанін ВХ ше їі: іяУКОсвЗниВнивевив ваними ВЕ и вче НА ху внни нен ІЕМ ння ме курку кава кантати вжи» зи фі КК І КК са ня ще Не КВ ве ВЖЕ і фура женуть их це ке мак вв? Лу встати: ет я ЖЖ хх Я їх КУА МОМ Ко ЖОВожЖ КІЛЬ М ом У М БІ ОБУ ВЕ МТ БК ВЖК СТЕЖАТЬ Вр ІК ТУ ЛВ ЛУ ЖЕ я ДЯ Дня ТО Км Моне НИ й ренні тн тент Й Ваш зак ТБ ІЖНЕКЕКаХзіказазикихти оо и Я ЕК КТ Мер Вк ка ВЕ ж» хз ВВ ТК ЗЕ СКК ЦЕ МІ КІІІВ ВАВ КЕ АЖ ща ка Ж Зуккхя аж кої ж ох Ек ді хів т іс: 5235 ж М т фам 3 СЕННЯ ШЕ ІМЯ ДЕ В ВОК ТТ ВЕБ ус НОЯ МЕ пахне Ви М жі ва Зх ва Ва МІНИ МІК ИН: СН ВК ння Я Вей давити Шо Ку пцеагазаі хх титйя Б БМ ШК Масца ет НК КИ Пі реж ов 5 ТОМ У кВ М сх авх ет ГЕ ц ПЕРУ ЗРК ХК т у я хх Ме ЗХ Тк ЩІ А ПИ КЗ ді ЕН ВК МИ ШЕ ЯИ Ше РАХУЮТЬ УКХ КК ККУ дл МНАХАААКААААКХНААНАКАА ХУ У АААКН АХ КУКА КК Кт КК ФГ З Зорян і пев Зжаівнч Т МЕ ЦНЕ КУ ЕВУКУ ВІН УВУ з пе й мати з Ї І КУ ЦО ян Ж й ще у с Е; ; їж і но Я Мі мовиавано ї В Е 4 Що Фетеететтотсторнегесостесотсося пен нн дян ей ше ро ей ї пк Е о Жимерне Я | Химерні Химерна ї84 ! ї ; вх У» ях Кк Кк Е: : Е нн и п кі ко Я ; ї ж С " з . н у. чо ся і КЗ Мер транопламтяює КО Кутя УВанелантах 8 Е олоесоююттютнюнноях ; помах с иа ВИН іч п м км дах макро тати Я КОТА, ВЕ КУВВ, | ї7 : а я "ЗБК, ЧЕ ДЕЖЕМех хх вечаі РІЙ ІВ ВЕНИ НН В СН Ас Кескуедкннндінккннккикджкке скік від З бує кокер ; сечу Ко 3 ба ОК, ЖИВ УНата ВИНОМ Та АААККАККАККККАКАКАККАКККАКК кусок АЖКАА Я як по ав гата що КВ ї чи 5 декацтнмю ї ЯВИ, БУВ, ОБ, КУБ - ї пи ї Ж; Левове я що ! й й я КАК З З ї й Ме и Бі З і спр вркук -х со ди де : ТОВ жив УНага ПВаНСПЛаНТВУ КЕ ї нн нн І З З з ІЧ х жучки ех ІЗ звик К кс кум, уча І ї їх ее : ТК З МН та ЧанопИаНтЯК | В ся: ї ) Е ї фік. 5
Кроклднавня вапізсельних ділянок перкоре ззнукизімнишее і гуманінвано ЗА НИ Х-ей зір: «ссздипняавВеовизЗиххХВхпазскхгвинвкйняви дятел ЛЮК 1 КМ в ЕК Вк З З ДЕ В В ЕЕ З ВЕ ВЕ ВЕ ВО ДЕ ЕВ КУ ІК АЕУЙ БА рост сВЕ ВІД ВЕЖ ВІКЕ КАК В ННННН НН ви ха у Ей Ех ЕВ ХХІ ТЕ Б я Ж хе т У ми 53:95:55: 535555 5:15: ЖІ хв А Е й ж о ВИЙ Ша Ов З ЗРК Ж ЇВ МЕ ВІ БЕ Ж 29 БОМБА 3 8 ББ ЗЖК ЗТ З БЕ ЕР 83 Ж: 55 ЩЕ Бг Ба Б МЕ ОТ мож ЗБЕ реак ГК МВВ ще Зб»: х:вії ХЕ ЕХ ак їв: сів тк: как ЗХ Ух У Х Я УК я хх г я Б дуть я ЗЕ ВІВ 515 У ЖЕК ЕЕ ЕЕ я В В БОЇ вели І ХР Б АБ ІЗ ІВ КОНІ »У аб ЕВЕВ ЕТ ІК КОКО НИ ВН ПН НЕ уж ЕСЕ То БТІ БЕ ще: повинна кикима їі ВК НІМІ НЕ Конні - ВВС ВИК 00000 5 З В мех ік єв? З ЕЕ? «ЖЕ а ки жк я я жа В зиж ж ві а т КЕШ ФТО зр ерЬ я Пі), ее З х Пра т жк моМАМНІ Ії Ж сів ПІВНІ; ПЕЧЕ КЯ «Мет її н ШНВАЄЯ Б ОРЕ БЖ ж я сі БИКІВ М їі: ЕЕ НЕ З ЗЕ ЯН ЗИ ЗЕ КУ Є ддаоаттннннннтнн тентові Кдеоог ооо стссртю чек тт тн тт у ДАЕ тт тт синя подо єнтів обоє остетв Ода ья (Я ріг. ї Місця парах ВККЖНХМХ Млккатис» ЗАКаУюмеи іменна ) Качан ше і: зізнНЕпцВАВсВаВнаВинивлЕвЕининехкнигвваеВ кон НСБ У Звоїй з: 55уУ газ 5звзхаз ік івтзехв 5а І і з за ззвчмшваза5івка кр ТУ г ЕКО вони шмен у ні з 5аиУз»х ж А жЕ ККУ ЗУ ВБЕЕ ша хі? зві»: А»: УХЮВ» ЖЖОКШК 2553 6 Б оф 23 5225 В 52 Ж З Б ок ОЗ УРЕ ЗК БІ ЗБ 3 БУ ЗІ Зі ЗХ 5 ЖЕ ЗК ВООЗ ТІВ ОТ ЗОЗ 1 2» КЕ КО и ВН п НД ВН ОЗ я хати 55 УТІХ ЕЛ тТІЗЗВ АВТ А МЕ ЩОБ ях ж ува Тра 5 Між Зрт у зр: ха вік т то зі» віда кі» хх по шо ж х у У: 8 В Хіхіх іт с яв г т х вів т і: кова хт кі в ЕЕ и зва Щі іні т тів с вх І тікати ММ Фах мм ех М ММ МК ІК Ж В Оу хх Ко ох 1 2 КЛВІ ХМ МОІМІМ М КО ІК А МА КОМІ СО ВВ ВАН ння ка декор КАМ ення е щей гахусаджетасттовй 7 ПТК Ті: з з ка я в с В ЗМО В яБнм Ок в з ам у ік У ее крж в б я ГКУ 5 кв м о по З ВИ У ЕВ В КЕ КВ СНУ; Ж ЕС ВЕ ЗНЕЗВЕ ВК СИ ж ВИ ЗВТ ДМАБМЕЕЕ Й Ж КЕ ВК ЖОВ ОХ БУ УФ ХМК около З ВЕ ЖК ЖК В Хдпяппятттт тт тА тн та АЛ тя КАНТ тат тт тя Я ЛА ляжте КАЛ Ат ЛАД тая чия сплттт тт тн ост нед ттдттмнт тн Ко «ріг. 5 нан Сеча рла у маневуних МАВ ее ме ето их кат ІА, ТИВЕСВ НН ЯХ. вени ення НІ Нене ЗК Ку «скдуук В З СФизнесьиа ; т З ЗХЕНЕАНХ МСЕ В ЛАНВНСьиХ : Мвавська : 1 - - й К з уки уки І: З Її да МЕККА; змакаЕеежинка. Мак. з шо нні нн и НН ПОЛК п п, пуд с ЕЕ : с са Ва в; я 3 верея Таккдивчкю НЕ Рудні ж чно оч? ожаМо У во ке й БІ хтозна ци КЕ да я З З на Е зі З А чать с каНія | І БАН НЕК вх п на ЕК я сок, КК окис жижжжжжк КН Коскй огогсеетесеєююєст ху їй х Я ї ХМК КЕ тк з і їй З як Ж Б Б зи у АВМ ях 1. кс ЯЕ ВЕ МЕ ТК С В ЯЗ З МК СИ МК МК З На НН - Для 5 - 3 я Я для пс: х сс третужкх ; й З с и т скит и ие: я і ВІАЯ людини: 4 0 ВОК Я БЮ БА дО 18 3, поро нн ин м нн еру в "зання зве Х нн сект й «Я ОДУ хоттуне ках СК М ШКО ока Ех голи Зк чні Я ВАВ шжра: ЗАКО жо БК ЗА ЕКС ОР ОМНВ,
Фіг. ЗД м : х хх - їв Е Б її де Ко вОЗАяВ «і гу щ ща Ух ТЇХ ве ї г У сеееееекюєюх со і Руху М с зе з зе гав! й ще ен ши ше Я ж о ТК и и Мини КК кН ОО кн Мо в ОО п ОЗ 0 ерезуєвкв ПО М вансьКа Дане ОС В с ооо ОО пк й ПОХОХ МЕ КО ЕКО МЕТО ОВО М ДОМ КК, : й ЖЕНЯ С Я У Не о п Даня ша. в В в М МК ХХ о шо М ПК КО те А ОО я КОКО ЗЕ с 0000 ШО шк КО еВ ЕК Верн с п й ОО В КО о в ОСИ МОЖЕ ОК Я ден ВО ВБЕООВ КО В ВВ НН ВОВКИ Х ВОВК Кв ПК ОК о ОО М М ПН ВХ х з є с МЕЕНЯ Ох 5 5 че Ей» с СО. уд М ВАН В КЕ ВК ВК МК ОО МН п ріг. ЗВ пен нн нн он нн ння Дкіджнвох т Умнні 1 ТПослішавніть 000000 витка Е! посиевнеть КІ й же» ТУ Е ЩО хакі НВ й мимо днжненкттєнни КА, МА УВА "КВ У ВОМОКАчЬА щи «ЖЕ ке че я нн о нн він іні М В по НУ 0 МАБТАЕВ ни року Ше уко мн ЗИ и. жк ХАЖУАЖАЖХКААЖХХАХАХХВК й Е щі ТВА, ВТОВ АВ ниві На УшУт оклх ЖАКА ши с: - Аа аа па ЗШ НУ тет вда Ух нн вн ввнаннки стан ОБ нМвеа УВІ 00ООКТТИЖМН З Тх ПИ оо оон пт кАжажюютут я ку Ж УККЖАЮ Я Ух худ ук АААААН я клккААКККХ на у втОез, ВТПюма НУБеНе ОБЛЕБОТНУТЕУМОКЕКО Що м ре сект тт кет Ат оте Дт от ке уже дет АЙ з Е тю, МВ НЦВЬО шо унини нннн нннннннннннннннни як ГЕО, ктсвлю НУВЬЬВ :АВЕВАЯЬТЕ о КУРКУ, ІОАН Мін в нка дюн не СХ ЮРАІ 000 ПОЮМТОЮРЮВЬСАВАСОВИТО З Тихо зак ех нн нн нн нн гижкнк с ко оуя Ко тс нт пн ние: п нн З ОКРОКАРКИНТУ що З щі ТК У Ем ї о пе В М: ки пн пон що В; й ера аа У У Ух суку сем З ! З АЛ й ГОУРКНРОСЗОЄ ТОРТ ПЕВЬОКЕОКАТУКЄ ЗВ етики Я кн тк ттеинтннтет» оф юн от оте ОУРАНЕВС ОВЕН ПЕВ ОВЕС Ш НЕО, ПОВ ЯК Ми жа, ма пив Зес нен ванні АД Зк, ан УНІ шим и рен ие нккннн ен вам, БУВ УНеРВИ ІЕМСБУККОО УСНО ВСАА ЕЕ ВТС, ния АНЬ ЕВ 5 порно Сян ДОВ, З УНЕРНУ ПААВОВРОКОНЕ с пенні нин о нн в БЕ в КЕ ПВАТЕЗКВТ АСВ АКОТА КК ЕН ІК я МОЗ НЕ Ка ги дл ефе нн ни оскюсююскк со б М АКТИ КУ р ВИНЕН й: :
Фіг. вд с ІБ акікуути жені уко мо юн и НА З с х їо0ОЯВЖЕНКВ ГНЕ НУЕаКНЬ еко а 1 ЯКО. З : Ка" Зір КВ й Я в кни ! аехнтня АВ БЖ Коольхьк ак во ее ух зв ев З хм г: ПА ННИХ ВАТУ МУКИ У МАТОрІМТЬМ ї |і о А о Да КОМ с и ЗО: Кз кігу нн найк ту Я КН ах зм т за. 5 Іоан НОСОВЕ НУ ГЕТЕ З 4 тен ня шив нн А ЖК ук куки фа ші ви а ЗИ ї ЗЕ ІЗ нота несу Ва УКАЗ ОТО . З З Кон ово п пи си См о в и Ж оку а и уххти се пох ІЗ о Ід З ПЕЗАЛООЮ ПОЗА НЯ НУКУНІ | ОБТЕЗДУЄМО ЕД, ЕН ка а ПИ КЯИ що сіна ик ККУ валі юки Ки ок ее ї « тво пОФАОУ ВУ МУВАНО З АТАКУ УУО ВУ КИ й Е о о о о нок ВИОВНИВАВнв ен А Н Же диа мар . пок в З ТВА зи МИТОМ БЕКОНУ ЗИ екю ААУ яд тет тт во ЕНН ие кла ДК х ки -х В 1 езАТОСЯЯ НУК АДРЕС ОУ ОМ А А ПА УДК В НК он З ма ких М зер В. Уха ми сх тата ЗА у лає Г: ТПеКАТОЖИХ НКАУ УВІ ПОМ ООКОЕАВУЮМНУТНО ШЕ З: нн нн пок нн на кн нн зле ди рожі У у о кро ЮК уг Ж |: ОА НЕО М УЕНО 5 КОЗА ТОКАРКЬСЯ СК ОА кв он інн МАМ МОВ НН ИН : хе КН ЖУсю В ух рн до о уча ЕХ и В: ПОДАЛО ОНА МЕ ВУ ОУН ВО ЕТ ОЕМ Я ек а КД укла АХ ХА УК КК АКА АХ АКА КК КК АААКЮ Ж Кк їх? хом ву Кох, Шев х ї |. пох МЕККА КОЛО ТКУЄКА і ки вояка Ву ус хорт Кр в ик ща «ке НЕХАЛО Пе УМЕ КНЕУ УКВ ВЕБ ВИЩЕ МАК ААУ АКА А ААААН А АНАКАМАААААА ККУ А В УЧ МУКАНК КАК коуч кА В сп сор ка Ж лю гадати Ж хх К: ЕТАЛОН НЯ УКХ І АГУМКДАР ЗКУ Зв ІсУЗа їх де ОК о ж нн Канта поиск з; ків вав ке и, сх Е ВООАЛВОХ ОТАК УНЕМУ ЕЕ ПЕВОМОКМИ ЧОВЕН АТС СЕ АК і Й АЙ З ВА а Аа посдюсттнний вика ти кю цу З хи. ки М Уж Е х ПЕК хе Ще еВ УНН т щу МЕЖІ МУ ІЗ Уа в: яз, з ріг ЗОВ Гимелимти кислу нМХІ Моз нКу хр рЕЕХ ВМ еко КО в ВОК КОКО ВИ ДЕ ТЕ В ОО КИ ЕХ Ка В ОК ЗМІ Мк комук ка нкивюв Р ЕК ТВО МОВ ВЖЕ АЖ КОКО ВМО; Х КОРЖ Ж В ДВ ОК У ВХ М МАМИ ВВЕ Кін їх Б ЗЕ НА 5 М ЖК рес ру жу ЮЛ УВК АСОМ МИ МВА ЖИ ЗО тіло ВАВ МК Ух вх КН Кк В МЕ ше ка Люлюю: ДЖЕ КЮ ВЕК М УК Ки и МЕ пе реноме омкоукт ках ЯК МО БЕЖ ще яка УКИКиХ ЯРУМІВ КУ КОХ ГО х хів яму МУ яр хма Те НеЖИ ЕЕ Зорі хх ЖЕК Хв ж ЮК Е ФСК ЖЕ ЕІ ОКХ вх поВЖ мелвс ДНІВ КЕ КЬ аю Мк Ен казка КО й Зікхдкиа їх ВІ КЕ КАНА ІН ЖЕ мИмта З БІІХ шо яв ох ВИННІ Кв Ек ж ков УМ І А Мом хека Мовчи МОХ АБО ВАМИ ШОВ ДІМ ВІДНУ я МОХ ож У МЕЖА, ЯКИХ КВ МАТИ Р и Вк ігерів: М Оре ЗК ПЕ ЯНВ АВК КЮ Як УЮ КОХА. ЖИВ МО КОАПНО М ОЇ Я КУБ СКУ ВЕ ТЕ маш ММ В КАТЕТ К ЖИ КЕМЯ КОД Х КК ЖЖ ВЕК ВІК УК да в я КЕКВ оце нн фон щі СЮЖЕТ ДКЕЕСЮТМОВ В МІХУРІ Я Ж Кров КОН о УКВ» МІЙНМАЦЮ УВО Ко А Є дя НОВ Кн Ж Кік кюоехнихсма мохів 15Х МЕЖ ШИХ ХИБНА А ЗК ДИКУ В НЕ СИ ЮЮУ ВІКНАХ ХО СР АК ДОА КОЖ ВМОВЕ Я КК УК ДйУК 9 ІЕМ Ж ЗЕРБКВИК ох Ж ММ ЗА ВИ ВОІВ ДАННІ Я І, УКХ ЗЕ ЩА ВМ УКВМя Ж Ж МО ядико 153 БІЧНИХ 6 хЕдЮ М ЖУК В ОМ КК Ж ООН У ТЬМИ А МЕЖ ДІ ВИМ У КрНУ Ж пюхици Ох дта спря хх ори в. дер их і око во й нн Ме БР МУ ВИ ще Кия ззах и Вик зе пани АЖ Не Нв АН ВАНН ММ оІ НК в'я х АК ІІВІК о» КВ ж кеВ Ка хрла вки х иа кожкоя кі МХ Злюк ах ЗЕМ УНК В В ЖЕ Х КІ ВК ВЕЖ У БЖ ТУТ яуу ж вх У о в ДМ хом ВУЖ КІМ КВ УКВ НК Ка ее: З Пркововюнья Маму конноька моїх ІІ МО Ж ри ВІК КК Ж ІК КО КІ НК У ХУ А ді АХ Со Кеснурехцянях о З Інувіі ВАК во ВК Х ге зЕжшектьх: З | феорне КУ тних ша ІК ЗМ я кн У, о ТІ ОКА ДЕР УТУ: зма і МОХ ВАХ ЕВЕР ММА ВВ ВЖИВ
Фі. 1 а Ки КО а На Перекресни реажтивнієть МУК ника що ЯМ, ост ман подаття пттаатядич і ададттечинн нти тожжннн чити те чу Рог есннкеєтететтетеєєсвевеєтю і на В В Й Ну | клан В М нн С З мн щ їж Н же я Ї Ду каАА ХАН АКАНЮК У КК КААААКУХ АХ АХАЮМКАЖК. на я Хе Хор Б НН МОУ, - не 55 в 5 Ії Н ДК і й І ска КК пускові ї свя ОН Кк не ея КН Оуен мими КО нн зе хчклтнкА, - З ТОЖ дж СИ Ї КЕ ща - 5 р : я о КК що с ЖЕ ВВ хх ї я па КК ш х ери т ВВ МТ пох Ка УКВ, ї ї щи о фунт й с вними а й 0 -я п У РИисекеннкссоя СУ: М СЕ ящех м. ЗЕМ декором нн сендднні зпнкнодин нн кант о пен око вання щш НЕ ЩЕ ик З чо Б ха ве валі | ШЕ ви 5 її ож З з КИ хо КО Са ЗЕ її шо ЩХ пе тАш Кор о З Ї; нку ж о ок мн хх Ж ект тт Кой ОО НИ МЕ ГОйК ЗК СК я ж ! Я СОЯ ге КК ЕЕ Е Е; кВА я зах ШК НЕ Ва ой ЕК. Ян пишним сетер я З пут ооо Во Вк мепянимі суфчеу Рій т мкл си ся Ва пеІАНЕХ пУКО вити
ЯНГ. я
Анни внтев проти меюгелну ляалія Се чавла ня кАЕГИНХ ПЕН 2 сувоенУмох Тука В котам Є ВНС НН ее ДАК АлАМАААААНЯ ТАЛА ААУ Ї юю» Генсвоженій | БАЗАТЬУНЕ | Число
А.К КЯНЕЕ оре роки ин МН месоаснння ооо огегерсюветтстте нене чинни и їх мале ; ВЕ ДИНИ І на КЕ | 3 ЯК ЕАМК КУКА КАНАВ КАХ КА НАЖАКА ДАК КАХ АКА Ки тонн со о до КАК ААУ КК КАЛУ ААААТЛЮТ Й й ВАВ нив мжкнкн ТИ; вконеетнх | 33 їЗОЮ линии стік втече Кит тітки петстттт Ди нн пилки ї 1 ВАВ щури З Мевизначено | Кв ї ЩІ ! КЗ нездНН З 52 Ке вкзначневох | ії і ВО и нн З ані мінні інн понос нм ах зн ин Е ХК кВиеНа кої микеАк Е Крх Ну вНОВ ек Кі 1 ЗБ нава как іі іиінсвнв нн фото жи ж таль т т о Кьло лиж М пн нн Вина ї НК ВО воли я ТЗН Ка ЗМО неї ект Ще вкрав. й пи ше ВИ ЗВО КИ М СО кАКооепогеттотеок неон тттеттетінннй ЗАВ КВ вУчня: ЕЇ5е змужкву є | Що т У з Сесв пла їінта ще 10 м Ер вик оф ввів Зв ікон іс ів ідо ів зво ілі ово подавав сі оман Ко м : : нн кютемкчктнннй ЩО 11 Єврах Те 0 ЗЖОЮ | Я і. Ті МУ І Е ОВД ов і под ві вн пінні іє зни ово ор планів БИ позна: х | АЕС | я М ше ШИ
Фиг. 15
! в. в ї ї З й З КЕ . : во В КУ З Гх 1 Н (хі ху ху е Н СЕ ЕВ ; Хе ке ї р хх пн нн ДЖ Ко КА ЖЖ пре лях В п гаку З щу КЗ Ко і ї га БК СИ і те що ще ші і Я А снсшие Ан г ви ї КЕ З іЕ І КЕ З Ж» : С т СК З З КЕН і НЕК А МК КЕ УК пеЗ і МЕЖ ЕЕ НЕ Кая КК і 3 ОК З нон Ме і ЕН Еш: Я» КО ї Б й сус по ве ВН ТЕ ха є мен инканннні КМ Кон -К чини рот ЕН НН ИН А ЕЕ Ше КА КЕ ЗВУ МІК Н т В с ж Ку Би СМЯ ЧИ СОЯ ж ЕКО БІ я ї ЖК КОХ їі м. Ка З Р мене ин о яв о 5 КВ КЕ 4 хе БВ «ВВЕ Ту ЗК 1 ТЕ їй шина ШУ ТЗ КІМ Я Ше зем АН Кн ЯК» і етикетка ее В Ра еВ нина шин З СО ше Кік Кк Км Зак ух п 1 З БЕК ЕК у и КО Аа І ЕЕ ія Ка я «КУ: и КК ХХ І 7 ач і КОЗИ З щ ММ ІК М ЗЕ КЕ ве: ШВИ ща за ТЯ С ие не ше рон М ря Яр АЩЯ Я Я я. й КН. ІА и ШІ сх Ба е я КЕ зом А МАО КО КТ 00000000. КК КІ. я их щи ке ї КО ї ща спини ки ши шик що 1 С ПЕК оре Же як. т ХЕ. 1 І Я ОКХ я КТ 4 сини ни. КО БУКВ Б ях Ки Ку ! КЕ чо м с. К п Я РЕАК ИН ШЕ НИК я КЕ Я о ее: ЩЕ с, м ГЕТЕ Яни КА ке й Е. о. нка ж насоси МН Миски Й Зк Й задій я тв кл ки З Уа ВАХ М ВКМ Е БЕЖ рен ВІЛ ЯНВ. зи язавНя кожних фе степопеванеетевететнтютнкеткесесоаоікоейотв ЛК ку: АННИ : і ант я ном арія Ки ї ГУ й байт КВК о яка бик : ї х уж Ж хи : і Її чи Ю'ююзе ! Гж ак ІЗ м КІ ; "Кевозлює Мала ов се х ДК ЧИ фоток Її їх З ха Ка 1 : МЛ усю келих о сн ну
Фіг. 14 7 Нумерична з К віках Химарнх кепструвкм рей ІеомаювЕанахх фауювим івмасинамй п ї Зх КВ) дон х ІЗ пл п нин ни . ще ЗЕ реж, раю й Е ММвХ ЯИТЕ ЖИВ і я Кк! З-свемеа свт рвав ЗЕ УЗ ВАБУВ Ве? --г їй ІЗ Е я 0 ЖИ ис нн НН і В он В: зазна ВЖЖХ р. Кия «сві своїй МВ ому жара ню ! мне іже. хав : ! НЕО ї і зовн ГУД СЕКяме Її 1 БАХ кн и нн и п оп . вах БаНЕ ОБО М м, зна ТОБ акюнки ки я нн кн нив омани м Ко а А І В Мякі А зак ЖЕК ЗУ ГК З «кун еькВ МаХИЙ п В В нн сини » ; КРЖж г дути учив СРеаКИ не А НН ІНН Я деМа й тек
Фіг. 15
БАС ЗМР ЖАВ КІ КЛЕН. ЗХ КОВОМ ЕЕ ХВАНЕННІЙ : ВЕУ Зи'єхування ОХ меглнх пат З парк ААКТАХАВК КВК М АТАК КВК КК КК ТНК КК НЖВВ МВВ АВКВУ МУ ЖАКВАТАТЮ ЯН АКАЖАТ тт ТАКА Ж яння - Е і Ж З ти і Б Е УТ І ук а Я Б ; С ЗУ З Ка пон но ії КУ ; Ко а ї Тех их рий пи
Х З. плллллнлтктяляня Ка Кутики и ск Я я ай КК) ЗИ Ки ЩЕ як Фи КО ШУ З их Й и М Н м а Кий ше Гасжеч сексу п дик ле чи Й шій и щи Ян Є ле ЗЕ Пен, Мамехькві Миша Я ВО Я Ки мн НН УК Я РН про МУ ЖК ВО ше ша Та Без НЕЇ ТО ЖЕ і Ой З я ОС ВТ: х 3 У Здазеученевх Кежкеем е ато КО дути нААААААНАКАКААКААНККККАКА АННА КАКАКАКАККККККАКККАКАЮКАЖЖК КАК КАЖАН Е птоошкї Ку, нема нн хв щ- КЕ В ВООВ г : З БО р хх КЕ с ОО ення . пня ш. що І. с. о Ко Н МО З о. БУ ОО шо ОО - | ШЕ ЗО я КУ ; ОХ ОЗ ШІ СУ ШЕ. . і ОО 5. . о . Як ї о ДЕ З паном . шк що й СЕС пера ї нік, рун. - ЗІ мах ж: х (У Е ЖК ВИД: Якеває Мі ТИ Те ЕЕ ве й щі і ЕК жада | начка о зве Н НЕВАВО тБез ДНК 1 же | Ва о ЕОЯМ РОВНМЕ нин нин пп птн вні нір
Фіг. 15 дак МН Кіа ЗІЗ-ЗАЙ ще ся «МУКУ куту ТУ кх кдерукиф тету ттюесссхююєююсссюсфеюкюсссюй лі аЗВ І МИХ м СІКІ- як вино о с ов нн ва аа Зам: Дн жа ЗЕ й Й ик з ИЙ 1 Чкюоноуз ПЕНАЛИ ДИМ пак Комора В ПЕ Ко п лики птн ВО о и Ку Шев УМеЬще ЖІ В А Нд т Хе КОЯМ В кое я МЕ КОМ хх мах 132 Ен океан МВВ Ну її: ЗЕ 3 Ко КІЗ весні М КК ен А Люнох ІЗХОЗІМІХЯ ЩНЕеа КК КЕ ВЖК ВІК КК ШЕ бмокохе хом: ІЗлТХ певен у хека ке з КО о зінмі, ЕКО ЕХ ОО В Я пт тт тд р | оду хви мих хі вих ІБН т БО ТВАКИХ еВ ТЯ тЕЕ Я Б МКУ ТАТ ЛКЕДКК В: міна Вуж зносу, ї но шу МЕН ОК оон ляннялялнннянхй МК ВМ ВсКЛОдІМеДНМ ККУ ТЖХ ще ІМ й ТК ще 1 ї -е ВЕУ з. се - Й - ригетаденнн т Детннннн Д годи текти етррртткн ттеуутсттнннсннсої ува послі умихнтть хуя Ялта 1ВЖОКХ ТЖРУ ІАЕ Же ЗИ ВХ ! й о по ! дош : З 1 МЕХ. 1 МУЖУВАВУ 2 ВАЖКІ КЕНОНУВКЕ. пн о А НИЙ : : пас м НО ер осо зі ТЕча се ТО МОКЛІДННАКЛ І В ДУХА МТА Н ЗВ Я оо | кІЖ Й Й ЛО ВК ІАНКЧЕ ВКМ. й КНК ї я Фі сСханування єліовв мреннни о ЗАТ ВОК ияною КІфг точної Віаейки БАС Зкязувацня МОЯ МО сни и НН їх 1 ; ве, ех Б ях З те - Н ре ро - В « КЕ Я пив о ій сок Ви ие КА ма а вна винах кер дя Ї т-о ще ж ос ГЕН КЕ С ЕЕ ГЕЙ ря, мк І Я ОВ, о» й ни Кк нн ши У 1 т С г ке ТУ й і ве Х ту Кк Ве Кто, С и; сш о К во СА а ЗА С ДИ й Х ЖК К.
СИ ОК Ку Ки и з ЗК Б я хх й ер нове Мене р и Кнняяннсннятря не ен й хо В к а: й ГУ СОУ В і СД ЯЩЕ З с с У ш ен Ваза жи ше ви й зни жи йони ни сни ни ук де «Кк ж давши щі -- ге УЗ п ще с Я З й я а ша ак ши м о ши а ШЕ ДЕ ЕЕ ЗЕ заетннтВ , ее Пр ОКА шок ля винна и з ОС Ж сво х Е ро Еш ши у ше Ма о Ше о В Я К- хо Нд: жа ш ва р лина и нан ин зі ва и; ие я Ман и в снення Яд я шини Я Ки - ї Ки о Кн Бу не Хна м а Мк а тв ее шк Ще же ШКО йо ший; г ВО КИ Е СЕТИ ам НЕ ВИ НН а: НА НИ А НИ Я НААН я НИ о НИ ЗК 4 й У пер к жк жі жі жікж нт жнуюжіня і свналтнва нка еглваза жуки ке її ле сварлав лоно за лвай с сік сек кжки - ше М а МЕ з и пп Оп МЕ а В ВЕ В у, Я муть ; в мн сне А Зв'язування НУ 3 ЗУ мутантами яванської макажн і днк тином Я фр ретеетестееессесеессесевессееесесстеве ЩІ Ж З дм ш НК: ру ни о ни о М Роки І не нн пн Бе НН й ! ред ха их ве дон ренні ОКІМЕ СОМ т «ріг. 158
Женя МУЗ ХО, кщрхций й пВІХ СОЗГИУХ, уче р де ББА СУ полка вд т вав У поь й х. - БУ . ке Миоссано МТУ КК спо в ВО и пика кн ен В МВ ин ан о НВ бу хе Ах Ж а ЕК пе и и в дуахуа КОМ: пен С Кв Кк КЕ нт нн о в он ВЕ ван Ваза кілка ТОЙ вх КОМА ЕК ЯКЕ еще З АК М їх вени хо м т БОНУЗИВІ МАТЕРИКУ УАКІИКМ М МЖК ККУ. КУ Кей ї ну ї (жене вант хі. 1 щх.
КУ . - їся 55 хх кА. щота т ух 5 Ох кути жу в тегу му те. Ко Се крани ОЙ ВО нене ях х МЕ АК АОЩЯ ВЕ БОМ Люж що лЕ зах Й «т вх Ж. СЕ оо, хр . ЗЕ «В ВХ: Моя МЕх о. зв КО т 5 нка - Кос -- С ЗБ, Вс ме я ан; ЗБЕ оо. ВИЙ хай з яв г хутовоан ке цЯ засо Ка БКОТНКНЕВЕХ Етюд ар Ж сегізах сік тритр: ПЗ ЕЛХ 1х т мив 5 СНО віоднх неозит ВО ле с. ". Кк Кон . ; Н ко гом В і х п ш перев х сл ях СХ Ко ; Кон й БЕН КУ ЕІ в - Те "5 ; УМ Ос Е хх в Е Ме КИ вс 4 НО - 1 В, і й лероодосююююнккюю фе жк ІРАК ся р Й І фах й | і пежетсбссео ВК, ; о Елсняне дій з Х доллесннчне ЩІЗ хв лак жк у нн х іх под НОВА ран под псих Мк и НН че «КЕ 5 ЩЕ Бе ща КК що КН . Мас ішенї Й нн нн нн нн нн нн сік. А
М шеви Об або А, Тука ВО ЗЕЕВ ВМ зве ВХ то Анну еВ, ї «Б АХНОВ ще Їй й ї йо Її Ки ря й Вон вії Му ї є ШЕ ИН о В Я у і: Бу 1 НК я Ж Її: зх І Щ-3 ! ТЗ і ше: ц Н 4 : сх З Її Я Ж з
Ж. І Я ЕНН "Ж Кі Зк - їх й їй КЗ і у і Х "З іх Ж Я сх іє : КТ а і Е до Босеве хдноднняе зх а Й сяк 1. чу ще т ще Зв'язування Мі ЛЯХ каст : з Ковквеи в 19 «ле не Мі АВ; шо Ве Ж де ого вил НЯ З УКВ ОВ св Не ТНВ Е
Я . КОХ г ВН Я ра: ЯВИ М ЕІ Я т "М Ук ІЗ в ву В НЕ І Я Н ЖЕКу су РІ Я - я Щ пи Я Я Яких В : - чи щі КЕ і ї ще 7 т ї : 7-х ших ; ія КЕ т Я Ї. ІЗ Е ке я А іджд й її В у НН ШИ : : ХЕ Її " ЯК М в ц я ОщЕ т ЕЕи І ї ОЇ ; х с ме хм : її іже Е Ен и й ї уенниши нижня ре йо юю ЖЕ ВО) ккЮ Е жав а ТЕХЕн ТК г МВВ КлеХНВ. «Кинув я СЯ - ж БПоемлісвсв дієна ТК СО
Янг. 21 ВЗА зе виних В Віреуеков В ЗЛ кирчННеКм пізшхреввняХ зано УС ; Вали ЩЕ ! І я« В як оз Зк ек ніжннінінінініні кн кс кжнк согеюсогоднн Ж поні неніжі ніжно ж жін сні ж нм яю юні к тю ве пр пи аа я ІМТ Об. ї ЗИ БОМ 5 ОБ подане ИН СИМ НИМ МЕКННН Ж Кк т ВК Косово о зх о ван КУ о ВИ у ОК МК и МКК тяж ВУХ фе аомь о швАк о оо хе й виш ГУ же КК енер о ВІК Зх ВО Ух А тоядю вки Модне КВ м Р, ех ВО КО ше З пе ОН ОО ВК о ово нь й ее я МУ Ва я Вот Кн со НУ рек ТО пес: ав Ов Ин ну о КУ МВт ек и М ВК о», ВХ Я МО КК ось Бо СК сс ВН МЕН, бе Мі Б С п ут той М о АН В с в в и ВО с М а НО Нв и п нн. по с ПО ох 0 ВК ОХ МВВ и НК Он о вве Я 3 ПОН ПО В МО І В во БІ МІ А ВМО І 5 КК Хікиулнв МУ КАН ЯК Унів росою ФЧНЕ. и
ТС мозвішик В кан вка аНКу; тали ї вк її я» їде Її ОЇ плення ва пи пав ная ШУ п І рр В крвксконаююх Кая хе ОВ ЖЕО КАНВІ і й ! Ко ї Косюк жу я Ки т тости есе есе ЗРК Ок о вк одс ворс ее п З г БАН МКК БОЖ до, сем Ме м УМ ОН о ПАН НН КА ж СУ Кома о ит кох Б я Ка о ЗАВ в; ке У с ВВ З К ЕК боою»х щк М БІ ОКА, о в Ся. Ко п Ж В а І Я ов в В ай МК В КК сокир: ПИШНА а Ко ев і КК ж в ВАНН тех. о і и я п ВК ОК кн НН ШИН ВО ВХ ШК ОК кое в м В оо М о Он Ко ин М и І В їх Зо УК МЕ тку я ВО и ОВ Ко оф КК за В до ПИВ А В КО ох Же а що Кох КАТ ХУ с . о о Коник. МИ ние М ОМ ОК ЯК СКС о Ух, ТУ Ж ЗЕ щу МЕМ Ух сок ак і МО же МК Зх ВЕ йо і и КОКО од Ос Я ПО я у В М В В о ВА Я 1 Ше 5 М о СУ ММК Я ЖІ ОО по КМ Жук ох ОМ І а У ММ ві Кен У УК НИКА т хх мате ка ал ВОВК юю ЕМ пит В г ЗК фіесоктикці ВХ окружних; ТЯке хи ВЕ уклало псУК ЧЕН ЛЗ МежеКшвну МетИстячиМ Сх пухани ж з у птн дитяти теп нт тп пот пет тля тАт ЕЕ птн т ЕТ т ТЕ ТАТА А ТА А А ААААНКМ о НААААА АН НА А А АААА АК АК АН АНА АКААААААА А АНААААХ АН АКА З
Фіг. 3 ПАС зкоуетк в аденокмли он МЯСА сн и я і В бБатя В пн пустить ї ї. 4 ї І й ї Ех Ек еф Ж її ГБ МИНЕ МІХ - і оз й як зак Її векух 0 Ве | яв ОР ОБ |) 05: (ех В ; В й оон о Ї оніміння с чок свв оно уч ВК кни ой удав ау ся ау Я ї ви 4 У ПИТ ої ЩІ е е сеї У Ме ОН Ії Її ! ще - ж їх он НЯ Се сх и гля т вд м. тиху С Зою, ВУ ле МА в ще чо о ! ях че и ОО ее ее ма в я иа НЯ лю таку. М В в Е ня як їх хе я зх С І зок 7 Сех - У Я ча ах т Моя 1 ОК. А. АК р пав Ку ДА я СОЧІ зн Кк ЧИМ МОУ е ее ху КЕ тка ні ОКУ Я, сх У МАО В щи ВЕ ке ВЕК, «вка Же яв есе ВХ 53 Ед Б па ИН Ся пов, схо Дек Ко а Біх п ее Ж, вкл ами ух ЩА ж УЖ 8 вач У я хх ще и ДК Я я Е х Сг АЮ Якої ой: Ам КК у ди мс руд и ул МУ Ше ра фра ВЬ у ко ШНМ в НО. . бос, Как ка о КО уК шо хна ОО А ве год хр А, ав о ам А І М З МО а -к в БО те Я енд Да Кок с о ше ХО но Ж ВИ дос КМ ВЕ в М В о ЖЖ уд КВК же АН ни ВУ З ДИ с я "7 дес ки БІ ЗАМ и М с Б ня ша у ев ую У Я ОКО до и и В ши БО я Па Я ВК с Ки но ВИ и ВО У и В Б как Ол НВ. "ЕМО КЕ ОБО нь З. их ЯК» куми М, Ве ВИК ЗХ вінтраВг: гм нини ТО МЕЗаХоХ ме попим й І нн нн нн нн во:
Фіг. 24 го м БУС ле и сі нин ві КЕ му соку» НН ЕКО; с Засн й Е В я ОК КУ Здї що ки ха урни Кая ев КОЖ о ще 7 ОО ще о. п Жести М Не п хе о с КВ ЩЕ в оемВ ее З ХК МКК КК, КИ БО ДК: З ЗЕ Ц МК п щ ТОК зов) . о. о щ З У -. зе зреві зезечн о . с шо ї і М а ТЕ Ох о. у Щ. и Ох ЧУ ОК Аме ХХ о. й ЩІ й У с Ше ще Що ННЯ ОК Ж ПК хх Зоо под о о г па СО хх ях ї «Ж п ще окцеее -Х ХК о. ; ШУ н й. ї г 5 -е - . З ох ОХ ех Сх Я МЕ . о оо ЗУ ХХ ТЕ я Я ко у т с й К ша С КЕ МИ ОК ОО ух їх й ССС ПЕК
- . я Зх КУ п. КЕ хх ВК ем ето ша ОХ ДАЛА ОХ пе п се ЗОВ Мо ЯК с . о СУ / какокки у - КОКО ПОС ОБУ де ВХ ь» Пернкерх у Ме трикерА і. с - вк - ОО ТК С ше ПЕК ТО що КК
0 о. о оо с Ох с с З о о с ЗУ ВЕК о ЗУ о Ка З МОЖ с м -х с о. с дя . о . о Бош КК хх С ж ОО Сх ОК ОХ М с УКЯ о. в о. З Х 0 Я: о да ОО ши ОО ЗК г Шк ВХ Ж Се Я А с Ж п ся МеВ хх о шо о. . п -н-н. с ее що для зх с . о денннентссюю ій нн ОО о деттеееттннескх 1. . що г ОХ ОКУ шк по Шо Е досссеееете Й Фіг. 25 КПУ пет меми ІНОЯЩІ М ве гЕмемстрх ФКметВ КН Щ, М актом ЇВ: менАС хЖУтя НМахесачнх з зві МЕ Те М нене Мамай «ТЕ ЕК В аа ще : зві, ТЕРАС знахо ВКА т ок З ау підви. Шк Її: п п Я | т у; м ожуму Х. ук ЗУ хх -к пір т ни - не | ше | ! сяняжннню ск ті «МКК й мам: І | - я п | петлею КК шк ние сн ре вік кН. і; я Й
Є. жання і ги нен Я ож «Дуже кенкко ВЕУ о і ШИ Ві у КУ пенні жонфе ТО жен УК Ее Тих д Е Ж зву Я пи І: і пентняннд ун пк нв і - | ; у | і УЖ Кемхек, кемЕете - ; | ще ; т КЕ ши . сг і дис : нн ее ШИ ЩА БУ ї зентлннлннилнї Я КЯ пом З че Ве, пквнекся І ж ! пери кед. КЕ ме Дука ее Мк Ка ДеЙдмениння ЩЕ де ор сннннннни Не 3 ш Жк км, рон ий . х Е вн и пхтннжжях і аклятих Е ря сою ех КЕ ОК Те Ж юр т ДИ тя ренння т кетен лі ЩІ песен М з. и с Н иокекутияя і : їв ; | : : р й 7 : їй | ой шк | Еойклуминяьх ЕВ Я - з й ки ї КК одтв сах Мо Уа щ- А а, | : дМпУКИХ он ще вже о | кан. и ШИ ШК ШО кі ХЕ МК Я ех : ! х ги в с Я з М: рення ше я шо й п» ЩО пд їх т ХЕ ГЕ ов «ВУ Що ше іш : Й ї | 3 ж ко хо Яся ние Не ке й ТОВ сек ТР ВОМ з з кров як т : Й КЕ х ос линк Вт ТА с ЩІ і; і Б м
Чт. 2 ши
Вр «Зо де : ; ВГ «ес АК пкмовомтяє сяк вот сегув ер сут - ХІМІК ЛЕВИ трук сфевтвнанє ТОВ ОДНВЕаМуУ КОХЕУ ЯВИ ЕК т м - УВО КУ НИ ЗАХО І ї 1 у вАмР ут рю уро о Е й ї с : 4 з Що й ОО УНАННЯ Н тт зе сей Як Мустее рого С о сосодоосестсодросюсюросо Е 1 ЗА и ши НК Я НЯ З ІЗ і ук н ак а З З НИ
Є. 4 в їх я ї Бе а з маш о Ко шо Тк х В І. і ; І ЗК. а СН Ж -3 м ЕН КУ чН: іх Мис. ШОЕ Кейн ЖІ щі ЙО З НЕ В КІ Я ; І ще СВ Аз ПОКИ ШОВ МУ ІМК ЖК ЗК
М. ЦЕ я за В ЕК а ОК я КМ - ЕТ Ох ПЕК Вел АН ве ЖК я Ван НО СЕ Ман а ле Б і о І В Я сі нюзж шо пік вве ЗК сем ки Ж ї «и ООЖООЕ Ми ше В Ой пе о хе НК ше З ОВ ж Б і а у В В м Я Я п Ва по и х 7 В ЕКЗ Її й аа В ИН: : Ще ГЕ: І, і ЕН ВН ОО Н 5 В п в ішли ії хи ше НЕ ЯН Пи р Та жі мі щу КК ВЕЕЕЕЕ ХЛ нн 4 ДЖ ТА Ка Хе Я 4 ЗК С КЕ 1 Мах за: шт жі В МЖК 00 ува і Я Є 57 З з ВЕДЕ НЕ: ен роде г птвневй и: в сн я ай ся) ше РІК ту: : З й То: а Зішнєч Сухі хр уу Зк с» -20-й ів інн лк хкигатеаниЗ: вк» пити оС евро екнн о соснн р оооо кни сс вн пн в вини ов всввкнй КНУ Зиму о пу екВ и им ЯМИ КЕНсТЬ ШЕ КОТ ТВВНИЙ звопвія г же й їй М че ТКУ ке у Вк ки феБККЕТЕ БОДМАКЯ МЕККА ВСЕ ККТИ. ЖЕКИНКИ МАВ ЕЯ С везе СКМ. РК кс клони захаіумко пНТх фе КІБЗК НО НВКе ЗВАНЬ КМУ УКВ Шини вин нн он: ПДК сення енннннтеквеннннх У ПИ о М о ЦЕ | Я пиши НІ НН С ОВО ШЕ : Я Не й Й МІ М КК дн вен рефннннню З їякчиихі ЕР й ; ; 7 ин БА КВК й її: ї З З г хїЕ КН КК СКК - цу НН М Н ГАШУ ДЕ: ОК де ча 4 ; і: панни кана Ж ння і й з НН Х Є : т Кая Бі : щк ПН Ки Ж ща Д Н ВИЩА Я Ж Не ТЕ Е х Ж ВК ОО рт но ення нрав нин Її у пе ЕН Ж Я Н КУ МК З СУ ШЕ Та ПККККНК КК В і : СЕ ННЮЗ І Н ВО ж Н З Мити Кі Шо З : у х о ще о. ДИ. Щи Ще ЗК З у КК ї м | - ери Торф рт ет чі 7 рев ї Ме 8 Я хе м З Н ТЗ Бог Коля ВО Ка ща А одпллллтлляколо соту КН М шо ЦЕ бутик 5 Е ок ну око нн яння Ген ке і Шк : ке пт дані се. : 7 ДВ то пес си нини пи вин піно кЗзлюкаккя ї шия ме ї Н У ї з з що НИ З; Же Ка : | не а | | тнлнунии А Ми, ДК І КЕ ор вх її нини не: й Кит гемнюф о Ве мік, УВК се; « нос оре Й ТО нею щит Акта пдв док ія рн нин р скоеррє ім я НЕИКУКТЬ МНЕ КК ЩЕ і се тар ЦІ ОР нн й мук НЕМОВ вн й го зо Де ОДН пише ні - Ко ще ; ТЕ і - вик, ВИК ХКЕ В КІ за ШИ Си МЕЖІ ВИК День Ж. КЕиУют, ВН Хсоєалетюот окт от оюю С ення звана ЦК КК тт з мг. 28
UAA201612949A 2010-12-20 2011-12-19 Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить UA115641C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061459962P 2010-12-20 2010-12-20
PCT/US2011/065895 WO2012087962A2 (en) 2010-12-20 2011-12-19 Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA115641C2 true UA115641C2 (uk) 2017-11-27

Family

ID=45498116

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201309049A UA113838C2 (xx) 2010-12-20 2011-12-19 Антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат
UAA201612949A UA115641C2 (uk) 2010-12-20 2011-12-19 Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201309049A UA113838C2 (xx) 2010-12-20 2011-12-19 Антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат

Country Status (25)

Country Link
US (3) US8911732B2 (uk)
EP (2) EP3296321B1 (uk)
JP (2) JP6253987B2 (uk)
KR (1) KR20140014116A (uk)
CN (1) CN107098972A (uk)
AR (1) AR084356A1 (uk)
AU (1) AU2011349443B2 (uk)
BR (1) BR112013014527A2 (uk)
CA (1) CA2819269A1 (uk)
CL (2) CL2013001776A1 (uk)
CO (1) CO6720984A2 (uk)
CR (1) CR20130335A (uk)
EA (2) EA201790664A1 (uk)
EC (1) ECSP13012784A (uk)
IL (1) IL250764A0 (uk)
MA (1) MA34881B1 (uk)
MX (1) MX345519B (uk)
NZ (1) NZ610976A (uk)
PE (2) PE20141114A1 (uk)
PH (1) PH12018500046A1 (uk)
SG (2) SG10201510518TA (uk)
TW (2) TWI589589B (uk)
UA (2) UA113838C2 (uk)
WO (1) WO2012087962A2 (uk)
ZA (2) ZA201303765B (uk)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA34881B1 (fr) 2010-12-20 2014-02-01 Genentech Inc Anticorps et immunoconjugués anti-mésothéline
JP6088488B2 (ja) * 2011-04-21 2017-03-01 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 新規な結合剤−薬物複合体（ａｄｃ）およびそれらの使用
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2015032695A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 Ventana Medical Systems, Inc. Scoring method for mesothelin protein expression
ES2918501T3 (es) * 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
ES2928000T3 (es) * 2014-06-06 2022-11-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Receptores de antígeno quimérico dirigidos a mesotelina y usos de los mismos
US10626372B1 (en) 2015-01-26 2020-04-21 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
FI3298033T4 (fi) 2015-05-18 2023-09-22 Tcr2 Therapeutics Inc Koostumuksia ja lääkinnällisiä käyttöjä fuusioproteiineja käyttävälle tcr:n uudelleenohjelmoinnille
JP6841609B2 (ja) 2015-07-10 2021-03-10 ３スキャン インコーポレイテッド 組織学的染色の空間的多重化
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
RU2748281C2 (ru) * 2015-08-21 2021-05-21 Кафа Терапьютикс Лимитед Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин
KR101782487B1 (ko) * 2015-09-24 2017-09-27 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물
EP3356417A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
AU2017306432A1 (en) 2016-08-02 2019-03-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2018048975A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
AU2017341048A1 (en) 2016-10-07 2019-05-23 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for T-cell receptors reprogramming using fusion proteins
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018232020A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
MY197688A (en) 2017-07-24 2023-07-05 Regeneron Pharma Anti-cd8 antibodies and uses thereof
CN111741976A (zh) 2017-12-19 2020-10-02 F星贝塔有限公司 包括pd-l1抗原结合位点的fc结合片段
CN110507824A (zh) * 2018-05-21 2019-11-29 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种抗间皮素抗体及其抗体药物缀合物
JP2021529516A (ja) * 2018-06-18 2021-11-04 アンウィタ バイオサイエンシス， インク． サイトカイン融合タンパク質及びその使用
GB201811415D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-Mesothelin Anti bodies
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20210253666A1 (en) 2018-08-30 2021-08-19 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
BR112021025699A2 (pt) * 2019-06-19 2022-03-03 Silverback Therapeutics Inc Anticorpos anti-mesotelina e imunoconjugados dos mesmos
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
WO2022010798A1 (en) * 2020-07-06 2022-01-13 Kiromic BioPharma, Inc. Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof
WO2022026152A2 (en) * 2020-07-23 2022-02-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20240024502A1 (en) * 2020-10-18 2024-01-25 Ardeagen Corporation Anti-msln binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
CN113150128B (zh) * 2020-11-24 2023-01-31 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 流感病毒np蛋白的单克隆抗体及其应用
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
IL309937A (en) * 2021-07-09 2024-03-01 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and their uses for the treatment of dystrophinopathy
WO2023283624A2 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2023006391A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Ludwig-Maximilians-Universität München Anti-cd47 antibodies and use thereof
TW202321296A (zh) 2021-10-06 2023-06-01 美商鏈接免疫療法公司 抗間皮素抗原結合分子及其用途
CN114426582B (zh) * 2022-01-07 2022-11-25 陕西脉元生物科技有限公司 一种神经特异性烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69130224T2 (de) 1990-10-12 1999-05-06 Us Health Monoklonaler antikörper
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US7375183B1 (en) 1996-01-05 2008-05-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mesothelin, immunogenic peptides derived therefrom, and compositions comprising mesothelin, or immunogenic peptides thereof
DE69726404T2 (de) 1996-01-05 2004-09-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mesothelinantigen, verfahren und testsatz zur targetierung
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
CA2318576C (en) 1997-12-01 2009-04-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies, including fv molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7745159B2 (en) 1999-02-26 2010-06-29 Nathalie B Scholler Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
CA2374398C (en) 1999-05-27 2011-03-15 Ira Pastan Immunoconjugates having high binding affinity
US20110104675A1 (en) 1999-08-09 2011-05-05 Pacific Northwest Research Institute Methods and Compositions for Diagnosing Carcinomas
ATE303445T1 (de) 1999-10-04 2005-09-15 Medicago Inc Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
CA2411404A1 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002040545A2 (en) 2000-11-17 2002-05-23 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
AU3942202A (en) 2000-11-30 2002-06-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
AU2002258518A1 (en) 2001-03-14 2002-09-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
EP1517998A2 (en) 2001-06-18 2005-03-30 EOS Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US20060127894A1 (en) 2001-08-08 2006-06-15 Incyte Corporation Protein associated with cell growth, differentiation, and death
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
EP1482972A4 (en) 2001-11-20 2005-11-23 Seattle Genetics Inc TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS USING ANTI-CD30 ANTIBODIES
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
AU2003259109A1 (en) 2002-07-12 2004-02-02 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
SI1572744T1 (sl) 2002-12-16 2010-09-30 Genentech Inc Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20040180387A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Fujirebio Diagnostics, Inc. Detection of urinary mesothelin-/megakaryocyte potentiating factor-related peptides for assessment of ovarian cancer
WO2005014652A1 (en) 2003-08-05 2005-02-17 Morphotek, Inc. A variant cell surface molecule associated with cancer
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
DK1725249T3 (en) 2003-11-06 2014-03-17 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugating to ligands.
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
EP1716168A4 (en) 2004-01-21 2009-06-24 Fujirebio America Inc DETECTION OF PEPTIDES RELATING TO THE FACTOR FOR THE POTENTIATION OF URINARY MESOTHELIN- / MEGACARYOCYTES FOR THE EVALUATION OF MESOTHELIOMA
EP1714151A4 (en) 2004-01-21 2009-06-10 Fujirebio America Inc DETECTION OF PEPTIDES RELATED TO MESOTHELIN / MEGAKARYOCYTIC POTENTIAL FACTOR IN PERITONEAL LIQUID FOR THE ASSESSMENT OF THE PERITONEUM AND PERITONEAL CAVE
US7375078B2 (en) 2004-02-23 2008-05-20 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7662936B2 (en) 2004-04-07 2010-02-16 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
DE602005023488D1 (de) 2004-06-17 2010-10-21 Mannkind Corp Tumorassoziierte antigenprofile in der krebsdiagnostik und immuntherapie
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
WO2006060533A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Genentech, Inc. Conjugates of 1, 8-bis-naphthalimides with an antibody
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
JP2008523105A (ja) 2004-12-14 2008-07-03 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ポリマー連結シュードモナス外毒素免疫毒素
JPWO2006068204A1 (ja) 2004-12-21 2008-06-12 旭硝子株式会社 透明導電膜付き基板とそのパターニング方法
WO2006099141A2 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Morphotek, Inc. Anti-mesothelin antibodies
WO2006124641A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Anti-mesothelin antibodies useful for immunological assays
WO2007100385A2 (en) 2005-10-31 2007-09-07 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007112047A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Formulations containing immunotoxins targeted to the mesothelin tumor cell antigen
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
ES2549128T3 (es) 2006-05-19 2015-10-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Proteínas de fusión, usos de las mismas y procesos para producir las mismas
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
CA2671633C (en) 2006-12-08 2016-06-07 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Diagnostic agent for mesothelioma, diagnosis kit for mesothelioma, and diagnosis method for mesothelioma
US20100111852A1 (en) 2006-12-14 2010-05-06 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin 3 Monoclonal Antibody and Treatment and Diagnosis of Cancer Using the Same
AU2007342569A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Radioimmunotherapy and imaging of tumor cells that express viral antigens
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP5290276B2 (ja) * 2007-05-08 2013-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
KR101554848B1 (ko) 2007-10-01 2015-09-21 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 메소텔린에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
DK2215121T3 (en) * 2007-11-26 2016-05-02 Bayer Ip Gmbh ANTI-mesothelin ANTIBODIES AND USES THEREOF
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
EP2240495B1 (en) 2008-02-01 2015-07-15 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
EP2257572A1 (en) * 2008-03-27 2010-12-08 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Human anti-mesothelin monoclonal antibodies
US8900589B2 (en) 2008-07-15 2014-12-02 Genetech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
CA2752884A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
AU2010230063B2 (en) * 2009-03-24 2015-06-25 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies
UY32560A (es) * 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
US20130028917A1 (en) 2010-04-15 2013-01-31 Spirogen Developments Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2011156328A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012055019A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Urban Surface Solutions Inc. Jet heating device
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
MA34881B1 (fr) 2010-12-20 2014-02-01 Genentech Inc Anticorps et immunoconjugués anti-mésothéline
RU2013140685A (ru) 2011-02-04 2015-03-10 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
AU2012322607B2 (en) 2011-10-14 2017-02-16 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
SG191294A1 (en) 2013-07-31
WO2012087962A3 (en) 2012-09-13
CN103347897A (zh) 2013-10-09
UA113838C2 (xx) 2017-03-27
US8911732B2 (en) 2014-12-16
EP2655418B1 (en) 2017-10-04
CA2819269A1 (en) 2012-06-28
EP3296321B1 (en) 2020-07-15
ZA201303765B (en) 2014-11-26
ECSP13012784A (es) 2013-09-30
PH12018500046A1 (en) 2019-04-08
KR20140014116A (ko) 2014-02-05
MA34881B1 (fr) 2014-02-01
NZ610976A (en) 2015-07-31
US20170281792A1 (en) 2017-10-05
ZA201406196B (en) 2016-09-28
CL2013001776A1 (es) 2014-03-07
EP3296321A1 (en) 2018-03-21
EP2655418A2 (en) 2013-10-30
PE20141114A1 (es) 2014-09-15
US9719996B2 (en) 2017-08-01
AR084356A1 (es) 2013-05-08
PE20170917A1 (es) 2017-07-12
EA201390933A1 (ru) 2013-12-30
BR112013014527A2 (pt) 2017-03-07
CL2017000772A1 (es) 2017-11-03
TW201536807A (zh) 2015-10-01
JP2014509835A (ja) 2014-04-24
JP6311042B2 (ja) 2018-04-11
CN107098972A (zh) 2017-08-29
CR20130335A (es) 2013-08-12
US10022452B2 (en) 2018-07-17
US20150065388A1 (en) 2015-03-05
TWI589589B (zh) 2017-07-01
TW201302788A (zh) 2013-01-16
TWI477513B (zh) 2015-03-21
JP6253987B2 (ja) 2017-12-27
MX345519B (es) 2017-02-01
JP2017125022A (ja) 2017-07-20
US20120225013A1 (en) 2012-09-06
EA028744B1 (ru) 2017-12-29
AU2011349443A1 (en) 2013-05-09
EA201790664A1 (ru) 2017-07-31
SG10201510518TA (en) 2016-01-28
CO6720984A2 (es) 2013-07-31
AU2011349443B2 (en) 2015-12-24
WO2012087962A2 (en) 2012-06-28
IL250764A0 (en) 2017-04-30
MX2013006716A (es) 2013-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA115641C2 (uk) Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
JP6552621B2 (ja) 抗ｐｄ−１抗体およびその使用方法
DK3013861T3 (da) Anti-fcrh5-antistoffer
JP7274469B2 (ja) Ｃｄ３９／ｃｄ７３軸によるｔ細胞活性の回復
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
ES2841299T3 (es) Anticuerpos anti-CD38
BR112020023872A2 (pt) agentes de ligação de psma e seus usos
UA127961C2 (uk) Антитіло до латентного міостатину
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
SA517390140B1 (ar) أجسام مضادة علاجية واستخدامتها
UA120102C2 (uk) АНТИТІЛО ДО CD79b І ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
UA122395C2 (uk) Антитіло проти tigit
SA516371109B1 (ar) 1a أجسام مضادة خاصة لمركب ترابطي يشبه عامل تنكرز ورم وتركيباتها واستخدامها
EP3431103B1 (en) Targeting abcb5 for cancer therapy
UA128113C2 (uk) Анти-sirpa антитіла і способи їхнього застосування
CN108350505A (zh) 用于测定icos表达的基因标志
UA126561C2 (uk) Застосування антитіла проти с5
UA114814C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E
CN110267678A (zh) 抗mic抗体和使用方法
UA119571C2 (uk) Антитіло проти lag3 і його антигензв'язувальний фрагмент
EA017851B1 (ru) Prlr-специфическое антитело и его применения
JP5848737B2 (ja) 放射性金属標識抗カドヘリン抗体
TW200911285A (en) Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use