UA126561C2 - Застосування антитіла проти с5 - Google Patents

Застосування антитіла проти с5 Download PDF

Info

Publication number
UA126561C2
UA126561C2 UAA201810992A UAA201810992A UA126561C2 UA 126561 C2 UA126561 C2 UA 126561C2 UA A201810992 A UAA201810992 A UA A201810992A UA A201810992 A UAA201810992 A UA A201810992A UA 126561 C2 UA126561 C2 UA 126561C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
sequence
amino acid
antibodies
acid sequence
Prior art date
Application number
UAA201810992A
Other languages
English (en)
Inventor
Йосінао Руіке
Йосинао Руике
Дзендзіро Сампеі
Дзендзиро Сампеи
Original Assignee
Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся, Чугаи Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся
Publication of UA126561C2 publication Critical patent/UA126561C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід cтосується антитіла проти С5 та способу його застосування як лікарський засіб.

Description

1006- че. 3061. 015-80422. г яко ЗО О16-56499.
В код, «ве ЗОБІ О18-96423. - 85004. у «жк. ЗОБІ О1О-5042 о 400. | ше а МОМОТ т | чих че мой о й К то їх ту З. дал налллалдиллллднк ьААААЧ МА ААА МК ут учити - 200» Е, х Е МАК
Ж ; "еВкее, ВВ
В оо в і 10100 -200- ав лірпант івиюйн кенцентрвація антитіла (мкм
Фіг. 18
Цей винахід стосується антитіл проти С5 та способів їх застосування. Попередній рівень техніки
Система комплементу відіграє центральну роль у кліренсі імунних комплексів та в імунних реакціях на інфекційні агенти, сторонні антигени, інфіковані вірусом клітини та пухлинні клітини.
Існує приблизно 25-30 білків комплементу, які зустрічаються як зібрання комплексів білків плазми та мембранних кофакторів. Компоненти комплементу досягають своїх імунних захисних функцій внаслідок взаємодії у ряді розгалужених ферментативних розщеплень та подій мембранного зв'язування. Внаслідок каскадів реакцій комплементу відбувається виробництво продуктів з опсонічними, імунорегуляторними та літичними функціями.
У цей час загальновизнано, що систему комплементу можна активувати трьома відмінними шляхами: класичним шляхом, лектиновим шляхом та альтернативним шляхом. Ці шляхи мають багато спільних компонентів, та, незважаючи на те, що вони мають різні початкові етапи, вони сходяться та мають спільні однакові кінцеві компоненти комплементу (від С5 до С9), які відповідають за активацію та руйнування клітин-мішеней.
Класичний шлях зазвичай активується внаслідок утворення комплексів антиген-антитіло.
Незалежно від цього, перший етап активації лектинового шляху - це зв'язування специфічних лектинів, таких як лектин, що зв'язує манан (МВ), Н-фіколін, М-фіколін, І -фіколін та лектин С- типу, СІ-11. На відміну від цього, альтернативний шлях спонтанно зазнає низького рівня зворотної активації, яку можна легко ампліфікувати на сторонніх або інших аномальних поверхнях (бактеріях, дріжджах, інфікованих вірусом клітинах або пошкоджених тканинах). Ці шляхи сходяться у точці, де компонент комплементу СЗ розщеплюється активною протеазою, внаслідок чого утворюються СЗа та СЗр.
СЗа - це анафілатоксин. СЗБЬ зв'язується з бактеріальними та іншими клітинами, а також з певними вірусами та імунними комплексами, та мітить їх для видалення з обігу (роль, відома як опсонін). СЗОЮ також утворює комплекс з іншими компонентами, внаслідок чого утворюється конвертаза С5, яка розщеплює С5 на С5а та С5р.
С5 - це білок у 190 кДа, який зустрічається у здоровій сироватці у концентрації приблизно 80 мкг/мл (0,4 мкМ). С5 глікозилований на приблизно 1,5-3 95 від його маси, що відносяться до вуглеводу. Зрілий С5 - це гетеродимер альфа-ланцюга у 115 кДа, який має дисульфідний
Зо зв'язок з бета-ланцюгом у 75 кДа. С5 синтезується як одноланцюговий білок-попередник (попередник про-С5) у 1676 амінокислот (дивись, наприклад, патентний документ 1 та патентний документ 2). Попередник про-С5 розщеплюється, внаслідок чого утворюються бета- ланцюг, як аміно-термінальний фрагмент, та альфа-ланцюг, як карбоксил-термінальний фрагмент. Ці поліпептидні фрагменти, альфа-ланцюг та бета-ланцюг, з'єднуються один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку, та вони складають зрілий білок С5.
Зрілий С5 розщеплюється на фрагменти С5ба та С56р під час активації шляхів комплементу.
Сб5а відщеплюється від альфа-ланцюга С5 С5-конвертазою як аміно-термінальний фрагмент, який включає перші 74 амінокислоти альфа-ланцюга. Решта зрілого С5 - це фрагмент С5Б, який містить решту альфа-ланцюга, зв'язаного дисульфідним зв'язком з бета-ланцюгом. Приблизно 20 95 маси у 11 кДа С5а відноситься до вуглеводу.
Сба - це інший анафілатоксин. С5Б об'єднується з Сб, С7, С8 та С9, утворюючи мембраноатакуючий комплекс (МАС, С5р-9, термінальний комплекс комплементу (ТСС)) на поверхні клітини-мішені. Коли достатня кількість МАС вставляється у мембрани клітин-мішеней, тоді утворюються пори МАС, які опосередковують швидкий осмотичний лізис клітин-мішеней.
Як згадується вище, СЗа та Сб5а - це анафілатоксини. Вони можуть започатковувати дегрануляцію тучних клітин, внаслідок чого вивільняються гістамін та інші медіатори запалення, що спричиняє скорочення гладкої мускулатури, підвищення проникності судин, активацію лейкоцитів та інші запальні явища, включаючи клітинну проліферацію, наслідком якої є підвищення вмісту паренхіматозних клітин. Сб5а також функціонує як хемотаксичний пептид, який притягує гранулоцити, такі як нейтрофіли, еозинофіли, базофіли та моноцити, до місця активації комплементу.
Активність Сба регулюється ферментом плазми карбоксипептидазою М, що видаляє карбокси-термінальний аргінін з Сба, утворюючи при цьому похідне Сба-дез-Агу. Сба-дез-Аг9 демонструє лише 195 анафілактичної активності та поліморфноядерної хемотаксичної активності немодифікованого Са.
Незважаючи на те, що належним чином функціонуюча система комплементу спричиняє потужний захист проти інфікуючих мікробів, передбачається, що невідповідна регуляція або активація комплементу є причиною патогенезу різноманітних розладів, які включають, наприклад, ревматоїдний артрит (НА); вовчаковий нефрит; ішемічно-реперфузійне бо пошкодження; пароксизмальну нічну гемоглобінурію (РМН); атиповий гемолітично-уремічний синдром (аНниб); хворобу щільного осаду (000); макулярну дегенерацію (наприклад, пов'язану з віком макулярну дегенерацію (АМО)); синдром гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГІ Р-синдром)); тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР)); спонтанну втрату плоду; малоімунний васкуліт; булезний епідермоліз; рецидивну втрату плоду; множинний склероз (М); черепно-мозкову травму; та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу (дивись, наприклад, непатентний документ 1). Отже, інгібування надмірної або неконтрольованої активації каскаду реакцій комплементу може надати клінічних переваг пацієнтам з такими розладами.
Пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН) - це рідкісне захворювання крові, при якому еритроцити є пошкодженими та внаслідок цього руйнуються більш швидко, ніж здорові еритроцити. РМН є наслідком клонального розмноження кровотворних стовбурових клітин з соматичними мутаціями у гені РІС-А (фосфатидилінозитол глікан класу А), який розташовується на Х-хромосомі. Мутації у РІШ-А спричиняють раннє блокування синтезу глікозилфосфатидилінозитолу (СІРІ), молекули, яка є необхідною для фіксації багатьох білків на клітинних поверхнях. Отже, кров'яні клітини при РМН мають дефіцит СРІ-фіксованих білків, які включають білки, що регулюють комплемент, СО55 та СО59. За нормальних обставин ці білки, що регулюють комплемент, блокують утворення МАС на клітинних поверхнях, тим самим запобігаючи лізису еритроцитів. Відсутність РіІ-фіксованих білків спричиняє опосередкований комплементом гемоліз при РМН.
РМН характеризується гемолітичною анемією (знижена кількість еритроцитів), гемоглобінурією (присутність гемоглобіну у сечі, особливо очевидну після сну) та гемоглобінемією (присутність гемоглобіну у кров'яному потоці). Відомо, що індивідууми, які страждають на РМН, мають напади хвороби, які визначаються тут як випадки з сечею темного кольору. Гемолітична анемія є наслідком внутрішньосудинного руйнування еритроцитів компонентами комплементу. Інші відомі симптоми включають дисфазію, втому, імпотенцію, тромбоз та періодичний біль в животі.
Екулізумаб - це гуманізоване моноклональне антитіло, спрямоване проти білка С5 комплементу, та він є першим терапевтичним засобом, ухваленим для лікування пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН) та атипового гемолітично-уремічного синдрому
Зо (анив) (дивись, наприклад, непатентний документ 2). Екулізумаб інгібує розщеплення С5 С5- конвертазою на С5ба та С5р, що запобігає утворенню кінцевого комплексу комплементу С5р-9.
Як Сба, так і С55-9 викликають опосередковані кінцевим комплементом події, які є характерними для РМН та анизх (дивись також патентний документ 3, патентний документ 4, патентний документ 5 та патентний документ 6).
У декількох повідомленнях описано антитіла проти С5. Наприклад, у патентному документі 7 описано антитіло проти С5, яке зв'язується з альфа-ланцюгом С5, але не зв'язується з С5а, та яке блокує активацію С5, проте у патентному документі 8 описано моноклональне антитіло проти С5, яке інгібує утворення С5а. З іншого боку, у патентному документі 9 описано антитіло проти С5, яке розпізнає протеолітичний сайт для С5-конвертази на альфа-ланцюгу С5 та яке інгібує перетворення С5 на С5а та С5р. У патентному документі 10 описано антитіло проти С5, яке має константу афінності, яка становить принаймні 1 х 107 М".
Антитіла (ІдС) зв'язуються з неонатальним Ес-рецептором (ЕсВп) та мають тривалий час утримання у плазмі. Зв'язування дб: з РсАп зазвичай спостерігається за кислотних умов (наприклад, рН 6,0), та його рідко спостерігають за нейтральних умов (наприклад, рН 7,4).
Зазвичай, Іс неспецифічно включаються у клітини шляхом ендоцитозу, та вони повертаються до клітинних поверхонь внаслідок зв'язування з ендосомним ЕсАп за кислотних умов в ендосомах. Після цього ЇдДсї дисоціюються від ЕсАп за нейтральних умов у плазмі. дДС, яким не вдалося зв'язатися з ЕсАп, руйнуються в лізосомах. Коли спроможність зв'язування Ідс з ЕсВп за кислотних умов скасовується внаслідок здійснення мутацій у його Ес-ділянці, тоді (ДС не повертається з ендосом назад у плазму, що спричиняє помітне погіршення утримання ІдСс у плазмі. Для того, щоб покращити утримання ІдС;ь у плазмі, повідомлялося про спосіб, який підвищує їх зв'язування з ГсАп за кислотних умов. Коли зв'язування Ід(Сї з ЕсАп за кислотних умов покращується внаслідок здійснення амінокислотного заміщення у його Ес-ділянці, тоді да ефективніше повертається з ендосом назад у плазму, тим самим демонструючи покращене утримання у плазмі. Між тим, також повідомлялося, що Ідас з підсиленим зв'язуванням з ЕсВАп за нейтральних умов не дисоціюється від ЕсАп за нейтральних умов у плазмі, навіть коли він повертається до клітинної поверхні внаслідок його зв'язування з РсНАп за кислотних умов в ендосомах, та, як слідство, його утримання у плазмі залишається незмінним або іноді погіршується (дивись, наприклад, непатентний документ 3; непатентний документ 4; бо непатентний документ 5).
Нещодавно повідомлялося про антитіла, які зв'язуються з антигенами залежним від рн чином (дивись, наприклад, патентний документ 11 та патентний документ 12). Ці антитіла сильно зв'язуються з антигенами за нейтральних умов у плазмі та дисоціюються від антигенів за кислотних умов в ендосомах. Після дисоціації від антигенів антитіла набувають спроможності ще раз зв'язуватися з антигенами, коли вони повертаються з ендосом назад у плазму за допомогою ЕсАп. Отже, єдина молекула антитіла може повторно зв'язуватися з численними молекулами антигенів. Взагалі, утримання антигену у плазмі є набагато коротшим, ніж утримання антитіла, яке має вищезгаданий механізм опосередкованої ЕсНАп рециркуляції. Отже, коли антиген зв'язується з антитілом, тоді антиген зазвичай демонструє подовжене утримання у плазмі, внаслідок чого відбувається підвищення концентрації антигену у плазмі. З іншого боку, повідомлялося, що вищеописані антитіла, які зв'язуються з антигенами залежним від рН чином, усувають антигени з плазми швидше, ніж звичайні антитіла, оскільки вони дисоціюються від антигенів усередині ендосом під час процесу опосередкованої ЕсНАп рециркуляції. У патентному документі 13 також описано аналіз за допомогою комп'ютерного моделювання, який демонструє, що антитіло із залежним від рН зв'язуванням, спрямоване проти С5, може подовжувати нокдаун-ефект стосовно антигену.
Перелік цитувань
Патентні документи
Патентний документ 1 - Патент США Мо 6,355,245
Патентний документ 2 - Патент США Мо 7,432,356
Патентний документ 3-МО 2005/074607
Патентний документ 4-40 2007/106585
Патентний документ 5-40 2008/069889
Патентний документ 6--МО 2010/054403
Патентний документ 7-МО 95/29697
Патентний документ 8-МО 02/30985
Патентний документ 9-0 2004/007553
Патентний документ 10-М/О 2010/015608
Патентний документ 11-М/О 2009/125825
Патентний документ 12-М/О 2011/122011
Патентний документ 13-М/О 2011/111007
Непатентні документи
Непатентний документ 1-Ноїегз еї аї!., Іттипої. Нем. 223:300-316 (2008)
Непатентний документ 2-ЮОтуйіЦик еї аЇ., Те Опсоіодіві 13(9):993-1000 (2008)
Непатентний документ 3-Уеипа еї аї!., / Іттипої. 182(12): 7663-7671 (2009)
Непатентний документ 4-Оана-Маппап еї а!., У Віої. Снет. 282(3): 1709-1717 (2007)
Непатентний документ 5-ОаїГАсдпа еї аї., у. Іттипої. 169(9):5171-5180 (2002)
Суть винаходу
Технічна задача
Завдання винаходу - отримати антитіла проти С5 та способи їх застосування.
Вирішення задачі
Винаходом пропонуються антитіла проти С5 та способи їх застосування.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С 5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах домену МС21-М(2 бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга (5ЕО ІЮО МО: 40) С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5, який включає принаймні один амінокислотний залишок, вибраний з групи, що складається з (11048, Азро1, Нів70, Нів72, І узІООУ та Ніві 10 послідовності ФЕО ІЮО МО: 40. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8. В іншому варіанті здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 2. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 2, з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8. У бо подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 7 або 8. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у Таблиці 7 або 8, з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С 5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН 5ЕО ІО МО: І та МІ 5ЕО ІЮО МО: 11; (Б) МН 5ЕО ІЮО МО: 5 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 15; (с) МН 5ЕО ІО МО: 4 та МІ 5ЕО ІЮО МО: 14; (4) МН 5ЕО
ІО МО: 6 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 16; (є) МН 5ЕО ІО МО: 2 та МІ 5ЕО ІО МО: 12; (І) МН 5ЕО ІЮ МО: З та
МІ ЗЕО ІО МО: 13; (9) МН 5ЕО ІО МО: 9 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 19; (п) МН 5ЕО ІО МО: 7 та МІ 5ЕО ІЮ
МО: 17; (Ї) МН БЕО ІО МО: 8 та МІ 5ЕО ІО МО: 18; та () МН 5ЕО ІО МО: 10 та МІ 5ЕО ІО МО: 20.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу має характеристику, вибрану з групи, що складається з: (а) антитіло контактує з амінокислотами 051 та КІ09 С5 (5ЕБО ІО МО: 39); (р) афінність антитіла до С5 (5ЕО ІЮ МО: 39) є вищою, ніж афінність антитіла до мутанта С5, який включає заміщення Е48А в 5ЕО ІО МО: 39; або (с) антитіло зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО: 39, при рН 7,4, проте не зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІО МО: 39 із заміщенням Н72У, при рН 7,4. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рН, ніж при кислотному рН. У подальших варіантах здійснення антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при рН 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію
С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію варіанта НВ85Н С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це антитіло людини, гуманізоване антитіло або химерне антитіло. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це фрагмент антитіла, який зв'язується з С5. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу - це повнорозмірне антитіло да або Ід.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С 5 цього винаходу включає (а) НУВ-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність ОХІС1УХ» х з РТІНАМХАа х 5, де Хі - це С або А, Х» - це
М, О або 0, Хз - це Т або У, Ха - це М або Н, Х5 - це Ї або мМ (ЗЕО І МО: 128), (5) НУВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність ОХ ТХ2Ма55УСМХ», де Х, - це 5, С, М або Т, Х» - це Е або
К, Хз - це А, Т або Н (5ЕО ІО МО: 131), та (с) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність
ХИХгТаБОАХзЗУХАХ5МХКа, де Хі - це С, А або С, Х» - це У або Е, Хз - це Т, О або Е, Ха - це У,
К або О, Х5 - це 5, О або Е, Хв - це А або М (5ЕО ІО МО: 127).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С 5 цього винаходу включає (а) НУВ-
НІ, яка включає амінокислотну послідовність 55УУХ1 х 2, де Хі - це М або У, Х» -цне Сабо А (5БО 10 МО: 126) (Б) НМВА-Н2, яка включає амінокислотну послідовність
ХИХгТаБОАХзЗУХАХ5МУХвКа, де Х, - це С, А або С, Хо - це У або ЕК, Хз - це Т, О або Е, Ха - це У,
К або О, Х5 - це 5, О або Е, Хв - це А або М (5ЕО ІЮ МО: 127), та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність ОХ УХ»2 х зРТНАМХАа х 5, де Хі - це С або А, Хе - це М, О або 0, Хз - це Т або У, Ха - це У або Н, Хв - це Ї або мМ (5ЕО ІО МО: 128). У подальших варіантах здійснення антитіло включає (а) НМВ-1 1, яка включає амінокислотну послідовність ХІАБОХ»ІХзохХаї А, де Хі - це О або НЕ, Хг - це М, О або С, Хз - це С або 5, Ха - це О, К або 5 (5ЕО ІЮ МО: 129); (в) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність САУ х 2Хз5, Де Хі - це К, Е або Т, Хо» - це І або Т, Хз - це А, Н, Е або О (5ЕО ІО МО: 130); та (с) НУВ-І3, яка включає амінокислотну послідовність
ОХІТХх2Уа55УСМХ», де Хі - це 5, С, М або Т, Х» - це Е або К, Хз - це А, Т або Н (5ЕО ІО МО: 131).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С 5 цього винаходу включає (а) НУВ-
Ї1, яка включає амінокислотну послідовність ХІАБОХ»ІХзохХаі А, де Хі - це О або В, Хг-цеМ, о або С, Хз - це би або 5, Ха - це 0, К або 5 (5ЕО ІО МО: 129); (Б) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність САБХ І х 2Хз5, де Хі - цеК, Е або Т, Х»- цеЇ або Т, Хз- цеА, Н, Е або ОО (5ЕБО ІО МО: 130); та (с) НМУВ-І3, яка включає амінокислотну послідовність
ОХІТХх2Уа55УСМХ», де Хі - це 5, С, М або Т, Х» - це Е або К, Хз - це А, Т або Н (5ЕО ІО МО: 131).
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає каркасну ділянку ЕНТ варіабельного домену важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність 60 за будь-якою з БЕО ІО МО: 132-134; ЕН2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 135-136; ЕВЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ
МО: 137-139; та ЕН4, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 140- 141. У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає каркасну ділянку ЕВІТ варіабельного домену легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БО І МО: 142-143; ЕВ2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БЕО І МО: 144-145; БЕВЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБЕО ІО МО: 146-147; та ЕВ4, яка включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 148.
У деяких варіантах здійснення виділене антитіло проти С5 цього винаходу включає (а) послідовність УН, яка є принаймні на 95 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь- якою з 5ЕО ІО МО: 10, 106-110; (5) послідовність МІ, яка є принаймні на 95 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 20, 111-113; або (с) послідовність УН, як у (а), та послідовність МІ, як у (Б). У подальших варіантах здійснення антитіло включає послідовність МН за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У подальших варіантах здійснення антитіло включає послідовність МІ. за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 20,111-113.
Винаходом пропонується антитіло, яке включає послідовність МН за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 10,106-110, та послідовність МІ за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 20,111-113.
Винаходом також пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, які кодують антитіло проти С5 цього винаходу. Винаходом також пропонуються клітини-хазяїни, які містять нуклеїнову кислоту цього винаходу. Винаходом також пропонується спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна цього винаходу, так щоб вироблялося антитіло.
Винаходом далі пропонується спосіб отримання антитіла проти С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає домен Ма1-
МОа2г (5ЕБЕО ІЮ МО: 43) бета-ланцюга С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 33 до 124 бета-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 40) С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110 бета-ланцюга (ЗЕО ІО МО: 40) С5. У деяких варіантах здійснення спосіб включає імунізацію тварини проти поліпептиду, який включає
Зо фрагмент бета-ланцюга (5ЕО І МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з Сіш48, Азробі1, Ні 70, Ні 72, узІО9Таніво.
Винаходом також пропонується фармацевтичний склад, який включає антитіло проти С5 цього винаходу та фармацевтично прийнятний носій.
Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування як лікарського засобу. Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування у лікуванні опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. Антитіла проти С5 цього винаходу можуть бути призначені для застосування у підвищенні кліренсу С5 з плазми.
Антитіла проти С5 цього винаходу можна застосовувати у виробництві лікарського засобу. У деяких варіантах здійснення лікарський засіб призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. У деяких варіантах здійснення лікарський засіб призначений для підвищення кліренсу С5 з плазми.
Винаходом також пропонується спосіб лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 цього винаходу. Винаходом також пропонується спосіб підвищення кліренсу
С5 з плазми у індивідуума. У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 цього винаходу для підвищення кліренсу С5 з плазми.
Стислий опис ілюстративного матеріалу
Фіг. 1
Фігура 1 ілюструє епітоп-специфічне сортування антитіл проти С5, як описано у Прикладі 2.2. Антитіла, згруповані в одну епітопну групу, окреслено жирною лінією.
Фіг. 2А
Фігура 2А ілюструє сенсограми ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 при рн 7,4 (суцільна лінія) та при рН 5,8 (штрихова лінія) для оцінки залежності від рН, як описано у Прикладі 3.2. СРАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАО538 та СЕАОБ599 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, як описано у Прикладі 2.2.
Фіг. 28
Фігура 28 ілюструє сенсограми ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 при рн 7,4 (суцільна лінія) та при рН 5,8 (штрихова лінія) для оцінки залежності від рН, як описано у Прикладі 3.2. СЕАОбб6б, СЕАОбЄ72 та СЕАОб675 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗ330 та СЕАОЗ41 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у
Прикладі 2.2. 305І 05 - це гуманізоване антитіло СЕАОЗО5, як описано у Прикладі 2.3.
Фіг. З
Фігура З ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів, які походять від бета-ланцюга
С5 (амінокислоти 19-180,161-340, 321-500 та 481-660 5ЕО ІО МО: 40) та які злиті з СОТ -міткою, як описано у Прикладі 4.1. СЕАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАОБ5З38, СЕАОБ99,
СЕАОббб, СЕАОб72 та СЕАОбБ75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С Антитіло проти СТ - це позитивне контрольне антитіло. Позицію злитих з ОТ фрагментів С5 (46-49 кДа) позначено стрілкою.
Фіг. 4
Фігура 4 ілюструє сенсограми ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти
С5 стосовно домену Ма21-МО2 бета ланцюга С5, як описано у Прикладі 4.3. Верхня панель демонструє результати СЕАОЗО5 (суцільна лінія), СЕА0ОЗО7 (штрихова лінія), СЕАОЗбб (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія), Середня панель демонструє результати СЕАОБО1 (суцільна лінія), СЕАО599 (штрихова лінія), СЕАО538 (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія). Нижня панель демонструє результати СЕАОб66 (суцільна лінія), СЕАО672 (штрихова лінія), СЕАОбЄ75 (штрихпунктирна лінія) та екулізумабу (пунктирна лінія). СЕАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАОБ38, СЕАОБ99, СЕАОббб, СЕАОб672 та
СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С Екулізумаб - це контрольне антитіло проти
С5.
Фіг. БА
Фігура 5А ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів пептиду, які походять від домену Ма1-Ма2 (амінокислоти 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 та 45-111 5ЕО ІЮО МО: 40) та які злиті з міткою 251, як описано у Прикладі 4.4. Антитіло проти 451 застосовується як антитіло для реакції. Позицію злитих з 51 фрагментів С5 (35-37 кДа) позначено стрілкою.
Фіг. 5В
Зо Фігура 5 В ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно фрагментів пептиду, які походять від домену Ма1-Ма2 (амінокислоти 33-124,45-124, 52-124, 393-111, 33-108 та 45-111 5ЕО І МО: 40) та які злиті з міткою 25, як описано у Прикладі 4.4. СЕАОЗО5 застосовується як антитіло для реакції.
Фіг. 5С
Фігура 5С підсумовує реакції зв'язування антитіл проти С5 з фрагментами, що походять від бета-ланцюга С5, як описано у Прикладі 4.4. Фрагменти, з якими зв'язуються антитіла проти С5, згруповані в епітопну групу С (СЕАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕАОЗб6б, СЕАОБО1, СЕАОБ538, СЕАОБ99,
СЕАОббб, СЕАОб72 та СЕАОб75), зображено сірим кольором, фрагменти, з якими вони не зв'язуються, зображено білим кольором.
Фіг. 6
Фігура 6 ілюструє вестерн-блот аналіз стосовно точкових мутантів С5, у яких Е48, 051 та
К109 бета-ланцюга заміщені аланіном (Е484А, 051А та К1О9А, відповідно), як описано у Прикладі 4.5. На лівій панелі екулізумаб (антитіло проти С5, яке зв'язується з альфа-ланцюгом) застосовується як антитіло для реакції, а положення альфа-ланцюга С5 (приблизно 113 кДа) позначено стрілкою. На правій панелі СЕАОЗО5 (згруповане в епітопну групу С, воно зв'язується з бета-ланцюгом) застосовується як антитіло для реакції, а положення бета-ланцюга
С5 (приблизно 74 кДа) позначено наконечником стрілки.
Фіг. 7
Фігура 7 представляє сенсограми ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка), які демонструють взаємодію екулізумаб-Р76004 (верхня панель) або 305 05 (нижня панель) з мутантами С5, як описано у Прикладі 4.6. Сенсограми отримали внаслідок впорскування С5-м/ї (товста суцільна крива), С5-Е48А (крива з короткими штрихами), С5-Ю51А (крива з довгими штрихами) та С5-КІО9А (тонка суцільна крива), відповідно, уздовж сенсорної поверхні з іммобілізованим екулізумабом-Р76004 або 3051 05. Екулізумаб - це контрольне антитіло проти
С5. 305І 05 - це гуманізоване антитіло СЕАОЗОБ5 (згруповане в епітопну групу С), як описано у
Прикладі 2.3.
Фіг. 8
Фігура 8 представляє сенсограми ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка), які демонструють взаємодію 305 05 з мутантами С5 із заміщеним Ні для оцінки залежності від бо рН, як описано у Прикладі 4.7. Сенсограми отримали внаслідок впорскування С5-м/ї (товста б суцільна крива), С5-Н7ОМ (крива з довгими штрихами), С5-Н72У (крива з короткими штрихами),
С5-НІТ1ОМ (пунктирна крива) та С5-Н7ОМ--НІТОМ (тонка суцільна крива), відповідно, уздовж сенсорної поверхні з іммобілізованим 305105. Щоб оцінити залежні від рН взаємодії, комплексам антитілолантиген дозволили дисоціюватися при рН 7,4 з наступною додатковою дисоціацією при рН 5,8 (вказано стрілкою).
Фіг. ЗА
Фігура 9А ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 5.1. Показано результати для антитіл СЕАОЗО5, СЕАОЗ07,
СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАО5З38, СЕАОБ99, СЕАОббб, СЕАОб72 та СЕАОб75, згрупованих в епітопну групу С, як описано у Прикладі 2.2.
Фіг. 98
Фігура 9В ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 5.1. Показано результати для антитіл СЕАОЗЗ3ЗО та
СЕАОЗА1, згрупованих в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фіг. 10А
Фігура 10А ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5ба, як описано у
Прикладі 5.2. Концентрації С5а кількісно визначили в надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 9А.
Фіг. 108
Фігура 108 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5ба, як описано у
Прикладі 5.2. Концентрації С5а кількісно визначили в надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 98.
Фіг. 11
Фігура 11 ілюструє інгібування антитілами проти С5 активованого комплементом гемолізу, як описано у Прикладі 5.3. Комплементи активували, застосовуючи класичний шлях.
Фіг. 12
Фігура 12 ілюструє інгібування антитілами проти С5 активованого комплементом гемолізу, як описано у Прикладі 5.4. Комплементи активували, застосовуючи альтернативний шлях.
Фіг. 13
Зо Фігура 13 ілюструє часову динаміку концентрації С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення тільки С5 людини або С5 людини та антитіла проти С5 людини під час оцінювання кліренсу С5 у мишей, як описано у Прикладі 6.2. СЕАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕАОЗ66,
СЕАОБОї, СЕАОБ538, СЕАОБ99, СЕАОббб, СЕАОб72 та СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗЗО та СЕАОЗ341 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фіг. 14
Фігура 14 ілюструє часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення С5 людини та антитіла проти С5 людини під час оцінювання фармакокінетики антитіла у мишей, як описано у Прикладі 6.3. СЕАОЗО5, СЕАОЗО7, СЕдДОЗ66,
СЕАОБОї, СЕАОБ538, СЕАОБ99, СЕАОббб, СЕАОбЄ7Т2 та СЕАОб75 - це антитіла, згруповані в епітопну групу С, та СЕАОЗЗ3О та СЕАОЗ41 - це антитіла, згруповані в епітопну групу В, як описано у Прикладі 2.2.
Фіг. 15
Фігура 15 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл 3051 015-5І(2422, 305 016-52х422, 305І 018-5Ш0422, 305І 019-52:422, 3051 020-512422 та 3051 О20-512:1115.
Фіг. 16
Фігура 16 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл З305І015- за115Та305І 023-51(3429.
Фіг. 17
Фігура 17 ілюструє інгібування антитілами проти С5 лізису ліпосом, активованого комплементом, як описано у Прикладі 9.1. Показано результати для антитіл 305І О22-5(2115, 305 022-5Ц12422, 305І О23-51231115 та 305І 023-5123422.
Фіг. 18
Фігура 18 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5а, як описано у Прикладі 9.2. Концентрації Сба кількісно визначили у надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 15.
Фіг. 19
Фігура 19 ілюструє інгібування антитілами проти С5 генерування С5а, як описано у Прикладі 9.2. Концентрації Сба кількісно визначили у надосадових рідинах, отриманих під час аналізу лізису ліпосом, показаного на Фігурі 16.
Фіг. 20
Фігура 20 ілюструє інгібування активності комплементу у мавпячій плазмі антитілами проти
С5, як описано у Прикладі 9.3. Антитіла проти С5 вводили яванським макакам, а активність комплементу у плазмі мавп вимірювали за допомогою аналізу гемолізу.
Фіг. 21
Фігура 21 ілюструє інгібування біологічної активності природного С5 (М/Т) та варіантів С5 (МІ451, 844920, М802І, В885Н, ВЗ280, 0966, 51310М та Е1437О0) антитілом проти С5 (екулізумабом), як описано у Прикладі 9.4.
Фіг. 22
Фігура 22 ілюструє інгібування біологічної активності природного С5 (М/Т) та варіантів С5 (М145І, 84490, М802І, вВ885Н, 9280, 0966, 51310М та Е1437О0) антитілом проти С5 (варіантом 305), як описано у Прикладі 9.4.
Фіг. 23
Фігура 23 ілюструє інгібування антитілами проти С5 (ВМО441 та варіантом 305) активованого комплементом лізису ліпосом, як описано у Прикладі 9.5.
Фіг. 24
Фігура 24 ілюструє часову динаміку концентрації С5 яванських макак у плазмі після внутрішньовенного введення антитіла проти С5 людини під час оцінювання кліренсу С5 у яванських макак, як описано у Прикладі 10.2.
Фіг. 25
Фігура 25 ілюструє часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення антитіла проти С5 людини під час оцінювання фармакокінетики антитіла у яванських макак, як описано у Прикладі 10.3.
Фіг. 26
Фігури 26А та 26В ілюструють кристалічну структуру Раб 305, зв'язаного з доменом (ПС5)-
Ма С5 людини, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 26А ілюструє асиметричну одиницю. Ма
Зо зображено як поверхню, а Раф 305 зображено як стрічки (темно-сірі - важкий ланцюг, світло-сірі - легкий ланцюг). Фігура 268 ілюструє молекули 1 та 2, накладені одна на одну (темно-сіра - молекула 1, світло-сіра - молекула 2).
Фіг. 27А
Фігура 27А ілюструє епітоп контактної ділянки стосовно Раб 305 на домені МО, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 27А ілюструє картування епітопів в амінокислотній послідовності МО (темно-сірі - ближче, ніж 3,0 ангстрема, світло-сірі - ближче, ніж 4,5 ангстрема).
Фіг. 278
Фігура 27В ілюструє епітоп контактної ділянки стосовно Раб 305 на домені МО, як описано у Прикладі 11.6. Фігура 27В ілюструє картування епітетів у кристалічній структурі (темно-сірі кульки - ближче ніж 3,0 ангстрема, світло-сірі гілки - ближче ніж 4,5 ангстрема).
Фіг. 28А
Фігура 28А ілюструє крупний план взаємодій Е48, 051 та К109 (представлені як гілки) з Гар 305 (представлений як поверхня), як описано у Прикладі 11.7.
Фіг. 28831
Фігура 288 ілюструє взаємодії між Е48 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раб, світло-сіра пунктирна лінія - опосередкований водою водневий зв'язок), як описано у Прикладі 11.7.
Фіг. 28С
Фігура 28С ілюструє взаємодії між 051 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раф), як описано у Прикладі 11.7.
Фіг. 280
Фігура 280 ілюструє взаємодії між КІ109 та його оточенням (темно-сіра пунктирна лінія - водневий зв'язок з Раб, світло-сіра пунктирна лінія - сольовий місток з НН СОНЗ095), як описано у Прикладі 11.7.
Фіг. 29А
Фігура 29А ілюструє крупний план взаємодій Н7О, Н72 та Н110 (представлені як гілки) з бар 305 (представлене як поверхня), як описано у Прикладі 11.8, у такій самій орієнтації, як на Фігурі 28А.
Фіг. 298
Фігура 298 ілюструє взаємодії між Н7О та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8.
Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Водневий зв'язок вказано пунктирною лінією.
Фіг. 29С
Фігура 29С ілюструє взаємодії між Н72 та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8.
Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Водневий зв'язок вказано пунктирною лінією.
Фіг. 290
Фігура 290 ілюструє взаємодії між НІ 10 та його оточенням, як описано у Прикладі 11.8.
Залишок гістидину зображено гілками та решітками). Відстань між НІ 10 та Н-СОВЗ НІТООс зображено пунктирною лінією.
Опис варіантів здійснення
Способи та процедури, які описані у цьому описі або на які посилаються у цьому описі, взагалі є добре зрозумілими, та вони зазвичай застосовуються із використанням традиційної методології фахівцями у галузі, такої як, наприклад, методології, які широко застосовуються та які описано у Затогоок еї а!., МоїІесшціаг Сіопіпд: А Гарогаїюгу Мапиаї За еайоп (2001) Соїа бргіпд
Нарог Іарогаюгу Ргев55, Соїй бргіпуд Нагброг, М.М.; Сцтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду (Г.М.
А!йзибеї, еї аї. едв., (2003)); у серії Мешоавз іп Епгутоїоду (Асадетіс Ргевз5, Іпс.): РСВ 2: А
Ргасіїса! Арргоасі (М.У. МасРНегзоп, В.О. Натез апа а.В8. Тауїог еав5. (1995)), Напоуму апа ГІ апе, едз5. (1988) Апііродієвз, А І арогаїюгу Мапиаї, апа Апіта! Сеї!Ї Сийиге (В.І. ЕгезНпеу, єйд. (1987));
Оїїдописієоїіде Зупіпевів (М... Саї, єд., 1984); МеїШоодв іп Моїесшіаг Віооду, Нитапа Ргезв; Сеї
Віоіоду: А І арогаїогу Моїероок (У.Е. Сеї5, єд., 1998) Асадетіс Ргев5; Апіта! Се! Сийитге (В.І.
ЕгезПпеу), єд., 1987); Іподисійоп о СеїЇ апа Тіввиє СиПиге (У. Р. МашШег апа Р.Е. Нобетгів, 1998)
Ріепит Ргев5; СеїЇ апа Тізвиє СийПиге: І арогаюгу Ргоседигез (А. Ооуїє, У.В. Стіййнв5, апа О.а.
Мемеї, еадв., 1993-8) У. ММІеу апа бопв; Напабсок ої Ехрегітепіа! Іттипоіоду (О.М. М/вїг апа б.б.
ВіасКууеїЇ, ед5.); Сепе Тгапеоїег Месюг5 г Маттаїйап СеїЇв (9У.М. МіПег апа М.Р. Сапов, єадв., 1987);
РСВ: Те Роїутегазе СНаіп Реасійп, (Миїїїв єї аї!., єдв., 1994); Ситепі Ргоюсої5 іп Іттипоіоду (У.Е. Соїїдап єї аї., єдв5., 1991); поп РгоїосоЇв іп Моїесшіаг Віооду (М/Пеу апа бопв, 1999);
Ітітипобіоіоду (С.А. дапежау апа Р. Тгамег5, 1997); Апіїродієвз (Р. Ріпси, 1997); Апіїродієв: А
Зо Ргасіїсаї Арргоасп! (0. Сацу., єд., ІВ Ргев5, 1988-1989); Мопосіопа! Апііродієв: А Ргасіїсаї
Арргоаси (Р. 5перпега апа С. Оєап, єадв., Охіога Опімегейу Ргез55, 2000); Овіпд Апіїродієв: А
Гарогаїогу Мапиа! (Е. Напйом апа 0. Гапе (Со брііпуд Нагрог Іарогаїогу Ргевзв, 1999); Те
Апііродієз (М. 7апейі апа 9. 0. Сарга, ед5., Нагплоод Асадетіс РибіїзНегв, 1995); та Сапсег:
Ргіпсірієх апа Ргасіїсе ої Опсоіоду (МУ.Т. Оеміа єї а)., єдв., У.В. І Ірріпсой Сотрапу, 1993).
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
Якщо інше не визначається, технічні та наукові терміни, які застосовуються у цьому описі, мають таке саме значення, яке є зазвичай зрозумілим для звичайного фахівця у галузі, до якої належить цей винахід. 5іпдієїоп еї аї., Оісіопагу ої Місторіооду апа МоїІесшіаг Віоіоду 2па єд., у.
МуУйеу 4 опе (Мем Мої, М.М. 1994), та Мас, Адмапсей Огдапіс СНетівзнгу Веасійопв,
Меспапізтв апа бігисіиге 4 єд., допп УМІеу 5 оп (Мем Хогк, М.У. 1992) пропонують фахівцю у галузі загальну інструкцію для багатьох термінів, які застосовуються у цій заявці. Усі посилання, процитовані у цьому описі, включаючи патентні заявки та публікації, включено до посилань у їхньому повному обсязі.
З метою тлумачення цього опису винаходу будуть застосовуватися наступні визначення там, де це є доречним, терміни, які застосовуються в однині, будуть також застосовуватися у множині, та навпаки. Слід розуміти, що термінологія, яка застосовується у цьому описі, призначена для опису тільки особливих варіантів здійснення, та вона не призначена для обмеження. У випадку, коли будь-яке запропоноване нижче визначення конфліктує з будь-яким документом, включеним у цей опис шляхом посилання, запропоноване нижче визначення буде переважним. "Акцепторна каркасна ділянка людини" для цілей цього опису - це каркасна ділянка, яка включає амінокислотну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга (М) або каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга (МН), що походять від каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, як визначається нижче. Акцепторна каркасна ділянка людини, "яка походить від" каркасної ділянки імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної ділянки людини, може включати таку саму її амінокислотну послідовність, або вона може мати зміни в амінокислотній послідовності. У деяких варіантах здійснення кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше або 2 бо або менше. У деяких варіантах здійснення акцепторна каркасна ділянка варіабельної ділянки легкого ланцюга людини є ідентичною за своєю послідовністю послідовності каркасної ділянки варіабельної ділянки легкого ланцюга імуноглобуліну людини або послідовності консенсусної каркасної ділянки людини. "Афінність" означає силу сукупності нековалентних взаємодій між єдиним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) та її партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо інше не вказано, як застосовується у цьому описі, "афінність зв'язування" означає притаманну афінність зв'язування, яка відображає взаємодію 1:11 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом та антигеном). Афінність молекули Х до її партнера М можна взагалі представити константою дисоціації (Ка). Афінність можна вимірювати за допомогою звичайних відомих у галузі способів, включаючи способи, описані у цьому описі. Специфічні ілюстративні приклади варіантів здійснення вимірювання афінності зв'язування описано далі.
Антитіло "зі зрілою афінністю" означає антитіло з однією або більше змінами в одній або більше гіперваріабельних ділянках (НМВ), порівняно з початковим антитілом, яке не має таких змін, при цьому такі зміни зумовлюють покращення афінності антитіла до антигену.
Терміни "антитіло проти С5" та "антитіло, яке зв'язується з С5" означають антитіло, яке є спроможним зв'язуватися з С5 з достатньою афінністю, так що антитіло є корисним як діагностичний та/або терапевтичний агент, коли воно націлене на С5. В одному варіанті здійснення ступінь зв'язування антитіла проти С5 з неспорідненим білком, який не є С5, становить менш ніж 10 95 від зв'язування антитіла з С5, що вимірюється, наприклад, за допомогою радіоіїмунологічного аналізу (НІА). У певних варіантах здійснення антитіло, яке зв'язується з С5, має константу дисоціації (Ка), яка становить 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше або 0,001 нм або менше (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 103 М до 10-33 М, наприклад, від 109 М до 10-33 М). У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом С5, який є консервативним серед С5 від інших видів тварин.
Термін "антитіло" у цьому описі застосовується в найширшому сенсі, та він охоплює різні структури антитіл, включаючи, проте не обмежуючись ними, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл, доки вони демонструють бажану антигензв'язувальну активність. "Фрагмент антитіла" означає молекулу, відмінну від інтактного антитіла, яка включає частину інтактного антитіла, яка зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло.
Приклади фрагментів антитіла включають, проте не обмежуються ними, Ем, Раб, Бар", Бар-5н,
Каб)»; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгового антитіла (наприклад, 5сЕм) та мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіла. "Антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом", що і посилальне антитіло, означає антитіло, яке блокує зв'язування посилального антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі, та/або навпаки, посилальне антитіло блокує зв'язування цього антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі У цьому описі запропоновано приклад аналізу конкурентного зв'язування.
Термін "химерне" антитіло означає антитіло, у якому частина важкого та/або легкого ланцюга походить від певного джерела або виду, тоді як решта важкого та/або легкого ланцюга походить від іншого джерела або виду. "Клас" антитіла означає тип константного домену або константної ділянки, притаманний його важкому ланцюгу. Існує п'ять головних класів антитіл: ІА, 40, І9ЗЕ, да та ІОМ, та декілька з них можна далі розподілити на підкласи (ізотипи), наприклад, Ідс, ІДС», ІдСз, а, ІА: та ІддА».
Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються альфа, дельта, іпсилон, гамма та мю, відповідно.
Термін "цитотоксичний агент", як застосовується у цьому описі, означає речовину, яка інгібує або перешкоджає клітинній функції талабо призводить до загибелі або руйнування клітини.
Цитотоксичні агенти включають, проте не обмежуються ними, радіоактивні ізотопи (наприклад,
А", 191, 125, 90, Ве"86, Ве88 т!» Ві2!2, рЗг, рр та радіоактивні ізотопи и); хіміотерапевтичні агенти або ліки (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти); агенти інгібування росту; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеотичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як токсини з дрібними молекулами, або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти та/або варіанти; та різні протипухлинні та протиракові агенти, описані нижче. "Ефекторні функції" означають ті біологічні види активності, притаманні Ес-ділянці антитіла, бо які різняться залежно від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають:
зв'язування Сід та комплементзалежну цитотоксичність (СОС); зв'язування з рецептором Ес; антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (А0СС); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора В-клітин) та активацію В-клітин. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичного складу, означає кількість, яка є ефективною при дозуванні та протягом необхідних періодів часу, щоб досягти бажаного терапевтичного або профілактичного результату.
Термін "епітоп" включає будь-яку детермінанту, яка має властивість бути зв'язаною антитілом. Епітоп - це ділянка антигену, яка зв'язується антитілом, яке улучає в антиген, та яка включає специфічні амінокислоти, які безпосередньо контактують з антитілом. Епітопні детермінанти можуть включати хімічно активні поверхневі угрупування молекул, такі як амінокислоти, цукрові бічні ланцюги, фосфорильні або сульфонільні групи, та вони можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні характеристики заряду.
Взагалі, антитіла, специфічні для певного антигену-мішені, будуть переважно розпізнавати епітоп на антигені-мішені у складній суміші білків та/або макромолекул.
Термін "Рс-ділянка" у цьому описі застосовується для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, який містить принаймні частину константної ділянки. Термін включає
Ес-ділянки нативної послідовності та варіантні Ес-ділянки. В одному варіанті здійснення Ес- ділянка важкого ланцюга дс людини простягається від Суб226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак, С-кінцевий лізин (І уз447) Ес-ділянки може бути присутнім або відсутнім. Якщо інше не вказується у цьому описі, нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі Європейської номенклатури, яка також називається ЕМО-індекс, як описано у Караї еї аї., бедцепсе5з ої Ргоївїй5 ої
Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неацй бегмісе, Маїйопа! Іпзійшев ої Неапйй, ВеїШезаа, МО, 1991. "Каркасна ділянка" або "ЕВ" означає залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок (НУК). ЕВ варіабельного домену взагалі складається з чотирьох доменів ЕВ: ЕВ, ЕН2, ЕВЗ та ЕН4. Отже, послідовності НУА та ЕК зазвичай розташовані у наступному порядку у МН (або МІ): ЕВ1-НІ(11)-ЕН2-Н2(І2)-ЕВЗ-НЗІІ 3)-ЕВА.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" та "повне антитіло" застосовуються у
Зо цьому описі взаємозамінним чином, та вони означають антитіло, яке має структуру, по суті подібну до структури нативного антитіла, або яке має важкі ланцюги, які містять Ес-ділянку, як визначається у цьому описі.
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" та "культура клітин-хазяїнів" застосовуються взаємозамінним чином, та вони означають клітини, у які було введено екзогенну нуклеїнову кислоту, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформанти" та "трансформовані клітини", які включають первинні трансформовані клітини та потомство, що походить від них, незважаючи на кількість пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним початковій клітині щодо нуклеїновокислотного вмісту, проте воно може містити мутації. У цей опис включено мутантне потомство, яке має таку саму функцію або біологічну активність, що встановлено шляхом скринінгу або відбору для первинно трансформованої клітини. "Антитіло людини" - це антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності антитіла, яке вироблено людиною або клітиною людини, або яке походить від джерела, яке не є людиною, та яке використовує спектри антитіл людини або інші послідовності, що кодують антитіло людини. Це визначення антитіла людини специфічно виключає гуманізоване антитіло, яке включає залишки, які зв'язуються з антигеном і не є людськими. "Консенсусна каркасна ділянка людини" - це каркасна ділянка, яка представляє найчастіше виникаючі амінокислотні залишки при відборі послідовностей каркасної ділянки МІ або МН імуноглобуліну людини. Взагалі, відбір послідовностей МІ або МН імуноглобуліну людини відбувається з підгрупи послідовностей варіабельного домену. Взагалі, підгрупа послідовностей - це підгрупа, як вказано у Кабаї єї аЇ., Зедиепсев ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві, Ей
Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, Вешезаа МО (1991), мої!5. 1-3. В одному варіанті здійснення, для
МІ, підгрупа - це підгрупа каппа І, як вказано у Кабаї єї аЇ., див. вище. В одному варіанті здійснення, для МН, підгрупа - це підгрупа ПІ, як вказано у Кабаї єї а!., див. вище. "Гуманізоване" антитіло означає химерне антитіло, яке включає амінокислотні залишки
НМУ, які не є людськими, та амінокислотні залишки з ЕВ людини. У певних варіантах здійснення гуманізоване антитіло включатиме по суті усі з принаймні одного або зазвичай двох варіабельних доменів, у яких усі або по суті усі НМА (наприклад, СОВА) відповідають 60 гіперваріабельним ділянкам антитіла, яке не є людським, та усі або по суті усі ЕК відповідають каркасним ділянкам антитіла людини. Гуманізоване антитіло довільно може включати принаймні частину константної ділянки антитіла, яка походить від антитіла людини. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, антитіла, яке не є людським, означає антитіло, яке зазнало гуманізації.
Термін "гіперваріабельна ділянка" або "НМА", як застосовується у цьому описі, означає кожну з ділянок варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними у послідовності (ділянки, що визначають комплементарність" або "СОВ"), та/або утворюють структурно визначені петлі ("гіперваріабельні петлі"), та/або містять залишки, що контактують з антигеном ("контакти антигену"). Взагалі, антитіла включають шість НМЕ: три у МН (НІ, Н2, НЗ) та три у МІ. (І1, 12, 13). Приклади НМЕ у цьому описі включають: (а) гіперваріабельні петлі, які виникають на амінокислотних залишках 26-32 (І 1), 50-52 (І 2), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) та 96-101 (НЗ) (Споїпіа, у. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)); (Б) СОВА, які виникають на амінокислотних залишках 24-34 (І 1), 50-56 (12), 89-97 (13), 31-35Б6 (НІ), 50-65 (Н2г) та 95-102 (НЗ) (Кабаї еї аї,
Зедиєпсез ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неацй Зегуісе, МІН, Веїйпезаа, МО (1991)); (с) антигенні контакти, які виникають на амінокислотних залишках 2706-36 (11), 46-55 (12), 89-96 (І 3), 30-356 (НІ), 47-58 (Н2) та 93-101 (НЗ) (МасСаїшт еї аї. 9). Мої. Віої. 262:732-745 (1996)); та (4) комбінації (а), (Б) та/або (с), які включають амінокислотні залишки НУА 46-56 (І 2), 47-56 (І 2), 48-56 (І 2), 49-56 (12), 26-35 (НІ), 26-35Б (НІ), 49-65 (Н2г), 93-102 (НЗ) та 94-102 (НЗ).
Якщо інше не вказано, залишки НМЕ та інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕР) нумеруються у цьому описі згідно з Кабаї єї а!ї., див. вище. "Імунокон'югат" - це антитіло, кон'юговане з однією або більше гетерологічною (гетерологічними) молекулою (молекулами), включаючи, проте не обмежуючись ним, цитотоксичний агент. "Індивідуум" або "суб'єкт" - це ссавець. Ссавці включають, проте не обмежуються ними, свійських тварин (наприклад, корів, овець, котів, собак та коней), приматів (наприклад, приматів-людей та приматів, які не є людьми, таких як мавпи), кролів та гризунів (наприклад, мишей та щурів). У певних варіантах здійснення індивідуум або суб'єкт - це людина. "Виділене" антитіло - це антитіло, яке відокремили від компонентів його природного оточення. У деяких варіантах здійснення антитіло очищують більш ніж до 95 95 або 99 95
Зо чистоти, як визначається за допомогою, наприклад, електрофорезу (наприклад, на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505-РАСЕ)), ізоелектричного фокусування (ІЕЕ), капілярного електрофорезу) або хроматографії (наприклад, іонообмінної або зворотно-фазової ВЕРХ (НРІС)). Для огляду способів оцінювання чистоти антитіла дивись, наприклад, Ніаїтап еї аї!., у). Спготаїйод"г. В 848:79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота означає молекулу нуклеїнової кислоти, яку відокремили від компонентів її природного оточення. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься у клітинах, які зазвичай містять цю молекулу нуклеїнової кислоти, проте існує молекула нуклеїнової кислоти, присутня назовні хромосоми або на хромосомній позиції, яка є відмінною від природної хромосомної позиції. "Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти С5" означає одну або більше молекул нуклеїнової кислоти, які кодують важкий та легкий ланцюги антитіла (або їх фрагменти), включаючи таку (такі) молекулу (молекули) нуклеїнової кислоти у єдиному векторі або окремих векторах та таку (такі) молекулу (молекули) нуклеїнової кислоти, які присутні у одному або більше місцях у клітині-хазяїні.
Термін "моноклональне антитіло", як застосовується у цьому описі, означає антитіло, отримане з популяції по суті гомогенних антитіл; тобто окремі антитіла, які містяться в популяції, є ідентичними та/або зв'язуються з одним і тим же епітопом, за виключенням можливих варіантів антитіл, наприклад тих, які мають природні мутації або які виникають під час отримання препарату моноклонального антитіла, при цьому такі варіанти зазвичай присутні у незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл спрямоване проти єдиної детермінанти на антигені. Отже, визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, як його отримують з по суті гомогенної популяції антитіл, та воно не інтерпретується як необхідне виробництво антитіла за допомогою будь-якого певного способу. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування згідно з цим винаходом, можна отримати за різноманітними способами, включаючи, проте не обмежуючись ними, спосіб гібридом, способи рекомбінантної ДНК, способи фагового дисплея та способи, у яких застосовуються трансгенні тварини, які містять всі або частину локусів імуноглобуліну людини, при цьому такі способи та приклади інших способів 60 отримання моноклональних антитіл описуються у цьому описі винаходу.
"Голе антитіло" означає антитіло, яке не кон'юговане з гетерологічною складовою (наприклад, цитотоксичною складовою) або радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути присутнім у фармацевтичному складі.
Термін "нативні антитіла" означає природні молекули імуноглобуліну з різними структурами.
Наприклад, нативні антитіла ДС; - це гетеротетрамерні глікопротеїни масою біля 150000 дальтонів, які складаються з двох ідентичних легких ланцюгів та двох ідентичних важких ланцюгів, які мають дисульфідний зв'язок. Від М- до С-кінця кожен важкий ланцюг має варіабельну ділянку (МН), яка також називається варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, з наступними трьома константними доменами (СНІ,
СНІ та СНЗ). Подібно до цього, від М- до С-кінця кожен легкий ланцюг має варіабельну ділянку (МУ), яка також називається варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, з наступним константним легким (Сі!) доменом. Легкий ланцюг антитіла можна віднести до одного з двох типів, які називаються к (каппа) та Х (лямбда), на основі амінокислотної послідовності його константного домену.
Термін "аркуш-вкладиш в упаковці" застосовується для посилання на інструкції, які традиційно вкладаються у комерційні упаковки терапевтичних виробів та які містять інформацію щодо показань, застосування, дозування, способів введення, комплексної терапії, протипоказань та/або попереджень щодо застосування таких терапевтичних виробів. "Ідентичність амінокислотної послідовності у відсотках (96)" стосовно посилальної поліпептидної послідовності визначається як відсоткове відношення амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишкам у посилальній поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей та введення проміжків, якщо необхідно, щоб досягти максимальної ідентичності послідовностей у відсотках, при цьому будь- які консервативні заміщення не розглядаються як частина ідентичності послідовностей.
Вирівнювання з метою визначення ідентичності амінокислотних послідовностей у відсотках можна досягти за різними способами, які знаходяться у межах фахових знань у цій галузі, наприклад, застосовуючи публічно доступне комп'ютерне програмне забезпечення, таке як програмне забезпечення ВІ АТ, ВІ А5ЗТ-2, АПОМ або Медаїїдп (ОМА5ЗТАР). Фахівці у цій галузі можуть визначити відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання на повній довжині послідовностей, які порівнюються. Проте, для цілей цього винаходу значення ідентичності амінокислотних послідовностей у відсотках (90) генеруються із застосуванням комп'ютерної програми порівнювання послідовностей А СМ-2.
Комп'ютерна програма порівнювання послідовностей АГ ІСМ-2 була розроблена Сепепієси,
Іпс., та початкову програму було подано разом з документацією для користувачів у Відомство
Сполучених Штатів з авторських прав (05 Соругпдні Ойісе), УМазпіпдіоп О0.С., 20559, де її зареєстровано за номером 05 Соругпідні ВНеадівігайоп Мо. ТХО510087. Програма АГІСЯМ-2 є публічно доступною від Сепепієсп, Іпс., бошій бап Егапсізсо, Каліфорнія, або її можна завантажити з початкової програми. Програму А'СМ-2 слід завантажувати для застосування на операційну систему МІХ, зокрема цифрову ШОМІХ М4.00. Усі параметри порівнювання послідовностей задаються програмою АГІСМ-2, та вони не змінюються.
У випадках, коли програма АГІС2М-2 застосовується для порівнювання амінокислотних послідовностей, ідентичність амінокислотних послідовностей у відсотках даної амінокислотної послідовності А щодо, проти або з даною амінокислотною послідовністю В (яку можна альтернативно перефразувати як "дана амінокислотна послідовність А", яка має в цілому або в своїй частині певну ідентичність амінокислотних послідовностей у відсотках щодо, проти або з даною амінокислотною послідовністю В) розраховується наступним чином: помножений на 100 дріб Х/У; де Х - це кількість амінокислотних залишків, які враховано як ідентичні збіги програмою вирівнювання послідовностей А Ї2М-2 у цьому програмному вирівнюванні А та В, та де М - це загальна кількість амінокислотних залишків у В. Зрозуміло, що там, де довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, ідентичність амінокислотних послідовностей А та В у відсотках не буде дорівнювати ідентичності амінокислотних послідовностей В та А у відсотках. Якщо інше специфічно не вказується, усі значення ідентичності амінокислотних послідовностей у відсотках, які застосовуються у цьому описі, отримують із застосуванням комп'ютерної програми АГІСМ-2, як описано в попередньому абзаці.
Термін "рармацевтичний склад" означає препарат, який має таку форму, яка дозволяє біологічній активності активного інгредієнта, що міститься у ньому, бути ефективною, та який не містить додаткових компонентів, які Є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому склад буде 6о0 вводитися.
"Фармацевтично прийнятний носій" означає інгредієнт у фармацевтичному складі, відмінний від активного інгредієнта, який є нетоксичним для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає, проте не обмежується ними, буфер, наповнювач, стабілізуючий агент або консервант.
Термін "С5", як застосовується у цьому описі, охоплює будь-який нативний С5 від будь-якого джерела: хребетних, включаючи ссавців, таких як примати (наприклад, люди та мавпи) та гризуни (наприклад, миші та щури). Якщо інше не вказано, термін "С5" означає білок С5 людини, який має амінокислотну послідовність, наведену у 5ЕО ІЮО МО: 39 та який містить послідовність бета-ланцюга, наведену у 5ЕО І МО: 40. Термін охоплює "повнорозмірний" необроблений С5, а також будь-яку форму С5, отриману внаслідок процесингу у клітині. Термін також охоплює природні варіанти С5, наприклад, сплайсовані варіанти або алельні варіанти.
Амінокислотну послідовність прикладу С5 людини наведено у 5ЕО ІЮ МО: 39 ("природний тип" або "М/УТ" С5). Амінокислотну послідовність прикладу бета-ланцюга С5 людини наведено у БЕО
ІО МО: 40. Амінокислотні послідовності прикладів доменів МС, МО2 та МЕ1-МО2 бета-ланцюга
С5 людини наведено у 5ЕО ІЮО МО: 41, 42 та 43, відповідно. Амінокислотні послідовності прикладів С5 яванських макак (супотоЇди5 топКеу) та мишей наведено у 5ЕО ІО МО: 44 та 105, відповідно. Амінокислотні залишки 1-19 5ЕО ІО МО: 39, 40, 43, 44 та 105 відповідають сигнальній послідовності, яка видаляється під час процесингу у клітині, внаслідок чого вона не міститься у відповідному прикладі амінокислотної послідовності.
Як застосовується у цьому описі, термін "лікування" (та відповідні йому граматичні форми, такі як "лікувати" або "піддавати лікуванню") означає клінічне втручання з метою спроби змінити природний хід хвороби індивідуума, якого лікують, та його можна здійснювати або з метою профілактики, або під час перебігу клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають, проте не обмежуються ними, попередження появи або рецидиву хвороби, зменшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби, попередження метастазу, зниження швидкості розвитку хвороби, покращення або полегшення стану хвороби та ремісію або покращення прогнозу. У деяких варіантах здійснення антитіла цього винаходу застосовуються для затримки розвитку хвороби або уповільнення розвитку хвороби.
Термін "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" означає домен важкого або легкого
Зо ланцюга антитіла, який залучається у зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН та МІ, відповідно) нативного антитіла звичайно мають подібні структури, при цьому кожен домен включає чотири консервативні каркасні ділянки (ЕВ) та три гіперваріабельні ділянки (НМН). (Дивись, наприклад, Кіпаї еї а!., Кибу Іттипоіоду, 6" єд.,
М.Н. Егеєтап апа Со., раде 91 (2007).) Єдиного домену УН або Мі може бути достатньо для надання антигензв'язувальної специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язуються з певним антигеном, можна виділити, застосовуючи домен МН або МУ від антитіла, яке зв'язується з цим антигеном, для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів МН або Мі, відповідно. Дивись, наприклад, Ропоїапо еї аї., У. Іттипої. 150:880-887 (1993); СіаїКквоп еї аї!., Майте 352:624-628 (1991).
Термін "вектор", як застосовується у цьому описі, означає молекулу нуклеїнової кислоти, спроможну породжувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона з'єднана. Термін включає вектор як нуклеїновокислотну структуру, що самореплікується, а також вектор, включений у геном клітини-хазяїна, у яку його було введено. Певні вектори спроможні спрямовувати експресію нуклеїнових кислот, до яких вони оперативно приєднані. Такі вектори називаються у цьому описі "вектори експресії".
І. КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ
В одному аспекті винахід базується, частково, на антитілах проти С5 та їх застосуванні. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла, які зв'язуються з С5. Антитіла винаходу є корисними, наприклад, для діагностики або лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
А. Приклади антитіл проти С5
В одному аспекті винаходом пропонуються виділені антитіла, які зв'язуються з С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета- ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах домену М21-МОс2 бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 19-180 бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах домену Ма (амінокислоти 20-124 5ЕО ІЮ МО: 40 (5ЕО ІО МО: 41)) бета-ланцюга С5. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який 60 складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5 (5ЕО І МО: 40). В іншому варіанті здійснення антитіло не зв'язується з фрагментом, який є коротшим за фрагмент, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5, наприклад, з фрагментом, який складається з амінокислот 45-124, 52-124, 33-111, 353-108 або 45-111 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ
МО: 40).
В іншому аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які демонструють характеристики залежного від рН зв'язування. Як застосовується у цьому описі, вираз "залежне від рН зв'язування" означає, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН, порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" (для цілей цього опису обидва вирази можна застосовувати як взаємозамінні). Наприклад, антитіла "з характеристиками залежного від рН зв'язування" включають антитіла, які зв'язуються з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіла цього винаходу зв'язуються з С5 з афінністю при нейтральному рн, яка принаймні у 2, 3, 5,10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує афінність при кислотному рН. У деяких варіантах здійснення антитіла зв'язуються з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8. У подальших варіантах здійснення антитіла цього винаходу зв'язуються з С5 з афінністю при рнН 7,4, яка принаймні у 2,
З, 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує афінність при рН 5,8. "Афінність" антитіла до С5 для цілей цього опису виражається як КО антитіла. КО антитіла означає рівноважну константу дисоціації взаємодії антитіла з антигеном. Чим вище значення КО для зв'язування антитіла з його антигеном, тим слабкішою є його афінність зв'язування до цього певного антигену. Отже, як застосовується у цьому описі, вираз "вища афінність при нейтральному рН, ніж при кислотному рН" (або еквівалентний вираз "залежне від рн зв'язування") означає, що КО для зв'язування антитіла з С5 при кислотному рН є більшою, ніж
КО для зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. Наприклад, у контексті цього винаходу, вважають, що антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, якщо КО зв'язування антитіла з С5 при кислотному рН принаймні у 2 рази перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. Таким чином, цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при кислотному рН з КО, яка принаймні у 2, 3, 5, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при нейтральному рН. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при нейтральному рН може становити 10-77 М, 108 М, 109 М, 1070 М, 10-17 М, 10-72 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при кислотному рН може становити 10 М, 108 М, 10-7 М, 105 М або більше.
У подальших варіантах здійснення вважають, що антитіло зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, якщо КО зв'язування антитіла з С5 при рН 5,8 принаймні у 2 рази перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при рН 7,4. У деяких варіантах здійснення запропоновані антитіла зв'язуються з С5 при рН 5,8 з КО, яка принаймні у 3,5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує КО зв'язування антитіла з С5 при рН 7,4. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 7,4 може становити 10- М, 109 М, 109 М, 1079 М, 107
М, 1072 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 5,8 може становити 107 М, 103 М, 10 М, 105 М або більше.
Зв'язувальні властивості антитіла стосовно певного антигену можна також виразити як Ка антитіла, КО антитіла означає константу швидкості дисоціації антитіла відносно певного антигену, та вона визначається у обернених секундах (тобто секунда"). Підвищення значення
Ка вказує на слабкіше зв'язування антитіла з його антигеном. Отже, цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 з вищим значенням Ка при кислотному рн, ніж при нейтральному рН. Цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при кислотному рН з Ка, яка принаймні у 2,3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує Ка антитіл, які зв'язуються з С5 при нейтральному рН. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при нейтральному рН може становити 10-1/с, 103 1/с, 102 1/с, 105 1/с, 105 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при кислотному рН може становити 10-1/с, 1072 1/с, 107 1/с або більше. Винахід також включає антитіла, які зв'язуються з С5 з вищим значенням Ка при рн 5,8, ніж при рН 7,4. Цей винахід включає антитіла, які зв'язуються з С5 при рН 5,8 з Ка, яка принаймні у 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 200,400, 1000, 10000 або більше разів перебільшує Ка антитіл, які зв'язуються з С5 при рН 7,4. В іншому варіанті здійснення значення
Ка антитіла при рН 7,4 може становити 1072 1/с, 103 1/с, 102 1/с, 105 1/с, 106 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 5,8 може становити 103 1/с, 102 1/с, 107 1/с або більше.
У певних випадках "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" виражається як відношення значення КО антитіла, яке зв'язується з С5 при кислотному рН, до значення КО антитіла, яке зв'язується з С5 при нейтральному рН (або навпаки). Наприклад, для цілей цього винаходу, можна вважати, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення КО в кислотних умовах / КО в нейтральних умовах, яке становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО при рН 5,5 / КО при рнН 74 для антитіла цього винаходу становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО в кислотних умовах / КО в нейтральних умовах для антитіла цього винаходу може становити 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при нейтральному рН може становити 10- М, 108 М, 109 М, 1079 М, 10-7 М, 10-72 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при кислотному рН може становити 107 М, 108 М, 107 М, 105 М або більше. У подальших випадках, для цілей цього винаходу, можна вважати, що антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення КО при рН 5,8 / КО при рН 7,4, яке становить 2 або більше.
У певних прикладах варіантів здійснення відношення КО при рН 5,8 / КО при рН 7,4 для антитіла цього винаходу може становити 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 7,4 може становити 10- М, 108 М, 109 М, 10-79 М, 10-77 М, 10-72 М або менше. В іншому варіанті здійснення значення КО антитіла при рН 5,8 може становити 109 М, 108 М, 10- М, 10-6 М або більше.
У певних випадках "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН" виражається як відношення значення Ка антитіла, яке зв'язується з С5 при кислотному рН, до значення Ка антитіла, яке зв'язується з С5 при нейтральному рН (або навпаки). Наприклад, для цілей цього винаходу, можна вважати, що
Зо антитіло демонструє "ослаблене зв'язування з С5 при кислотному рН порівняно з його зв'язуванням при нейтральному рН", якщо антитіло демонструє відношення Ка в кислотних умовах / Ка в нейтральних умовах, яке становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення Ка при рН 5,5 / Ка при рн 7,4 для антитіла цього винаходу становить 2 або більше. У певних прикладах варіантів здійснення відношення Ка в кислотних умовах / Ка в нейтральних умовах для антитіла цього винаходу може становити 2, З, 5, 10,15, 20,25, 30, 35,40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше.
У подальших прикладах варіантів здійснення відношення Ка при рН 5,8 / Ка при рН 7,4 для антитіла цього винаходу може становити 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 або більше. В іншому варіанті здійснення значення
Ка антитіла при нейтральному рН може становити 1072 1/с, 103 1/с, 1072 1/с, 105 1/с, 105 1/с або менше. У подальшому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 7,4 може становити 102 1/с, 103 1/с, 102 1/с, 105 1/с, 105 1/с або менше. В іншому варіанті здійснення значення Ка антитіла при кислотному рН може становити 103 1/с, 102 1/с, 107 1/с або більше. У подальшому варіанті здійснення значення Ка антитіла при рН 5,8 може становити 10 1/с, 1072 1/с, 107 1/с або більше.
Як застосовується у цьому описі, вираз "кислотне рн" означає рН від 4,0 до 6,5. Вираз "кислотне рН" включає значення рН за будь-яким з 4,0, 4,1,4,2,4,3,4,4,4,5,4,6,4,7,4,8,4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 61, 6,2, 6,3, 6,4 та 6,5. В особливих аспектах "кислотне рН" становить 5,8.
Як застосовується у цьому описі, вираз "нейтральне рН" означає рН від 6,7 до приблизно 10,0. Вираз "нейтральне рН" включає значення рН за будь-яким з 6,7, 6,8,6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 та 10,0. В особливих аспектах "нейтральне рН" становить?7,4.
Значення КО та значення Ка, як виражено у цьому описі, можна визначити, застосовуючи біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу, щоб характеризувати взаємодії антитіла-антигену. (Дивись, наприклад, Приклад З у цьому описі). Значення КО та значення Ка можна визначити при 25 "С або при 37 "С.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5, який складається з домену МОЕ1Т(ЗЕО ІО МО: 41). У певних варіантах бо здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга
(ЗЕО ІО МО: 40) С5, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (5ЕО ІО МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з ТНг47, С1Іши48, АІа49,
Рпеб5о, Азр5б1, АІаб2, ТНг53, І уз57, Нівз70, Ма171, Ніз72, бег74, СіІши76, Маі107, 5е108, І ує109 та
Ніз110. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга (5ЕО І МО: 40) С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з С1/ш48, Авр5б1, Нів70, Нів72, І уз109 та Нівє110.
У певних варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його зв'язуванням з природним С5, де мутантний С5 має принаймні одне амінокислотне заміщення на позиції, вибраній з групи, що складається з С1Іш48, Авро1,
Нібт72 та Гу5109. В іншому варіанті здійснення залежне від рН зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його залежним від рН зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має принаймні одне амінокислотне заміщення на позиції, вибраній з групи, що складається з Нів70, Нібз72 та Нібз110. У подальшому варіанті здійснення у мутанті
С5 амінокислота на позиції, вибраній з Сіш48, А5р51 та Гу5109, заміщена аланіном, а амінокислота на позиції, вибраній з Ніз70, Ніз72 та Ніз110, заміщена тирозином.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі, вибрану з наступного: (а) МН 5ЕО ІО МО: 1 та МІ
ЗЕО ПО МО: 11; (Б) МН 5ЕО ІО МО: 22 та МІ 5ЕО ІО МО: 26; (с) МН 5ЕО ІО МО: 21 та МІ 5ЕО ІО
МО: 25; (4) МН 5ЕО ІО МО: 5 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 15; (е) МН 5ЕО ІЮ МО: 4 та МІ 5ЕО ІЮО МО: 14; (1)
МН 5ЕО ІО МО: 6 та МІ 5ЕО ІО МО: 16; (9) МН 5ЕО ІЮ МО: 2 та МІ 5ЕО ІЮ МО: 12; (п) МН 5ЕО І
МО: З та МІ 5ЕО ІО МО: 13; () МН 5ЕО ІО МО: 9 та МІ 5ЕО ІО МО: 19; () МН 5ЕО ІО МО: 7 та МІ
ЗЕО ІО МО: 17; (К) МН 5ЕО ІО МО: 8 та МІ 5ЕО ІО МО: 18; (1) МН 5ЕО ІО МО: 23 та МІ 5ЕО І
МО: 27 та (т) МН 5ЕО ІО МО: 10 та МІ 5ЕО І МО: 20.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою А5рб5і (051) 5ЕО ІО МО: 39. У додаткових варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою І уз109 (К 109)
ЗЕО ІО МО: 39. У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 та контактує з амінокислотою Авр5бі1 (051) та амінокислотою І уз109 (К109) БЕО ІЮ МО: 39.
У певних варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має заміщення
Сиін48АЇа (Е48А) в 5ЕО ІО МО: 39. В іншому варіанті здійснення залежне від рН зв'язування антитіла проти С5 цього винаходу з мутантом С5 є ослабленим, порівняно з його залежним від рН зв'язуванням з природним С5, де мутант С5 має заміщення Сс1іш48Аїа (Е48А) в 5ЕО ІЮ МО: 39.
У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності 5ЕСО ІО МО: 39, проте не зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮО МО: 39 із заміщенням Н72У, де білок
С5 та білок С5 із заміщенням Н72МУ готують та піддають скринінгу в однакових умовах. У подальшому варіанті здійснення антитіло проти С5 зв'язується з білком С5, який складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО: 39 при рН 7,4, проте не зв'язується з білком С5 із заміщенням Н72У при рН 7,4.
Не обмежуючись якоюсь певною теорією, можна передбачити, що зв'язування антитіла проти С5 з С5 ослаблюється (або майже втрачається), коли амінокислотний залишок в С5 заміщений іншою амінокислотою, що означає, що цей амінокислотний залишок в С5 є вирішальним для взаємодій між антитілом проти С5 та С5 та що антитіло може розпізнавати епітоп навколо цього амінокислотного залишку в С5.
У цьому винаході було визначено, що група антитіл проти С5, які конкурують один з одним або зв'язуються з однаковим епітопом, можуть демонструвати характеристики залежного від рН зв'язування. Серед амінокислот гістидин, значення рКа якого становить приблизно від 6,0 до 6,5, може мати різні стани протонної дисоціації між нейтральним та кислотним рН. Отже, залишок гістидину в С5 спроможний сприяти залежним від рН взаємодіям між антитілом проти
С5 та С5. Не обмежуючись якоюсь певною теорією, можна передбачити, що антитіло проти С5 може розпізнавати конформаційну структуру навколо залишку гістидину в С5, яка є варіабельно залежною від рН. Таке передбачення може узгоджуватися з експериментальними результатами, описаними нижче, що залежність від рН антитіла проти С5 знижується (або майже втрачається), коли залишок гістидину в С5 заміщений іншою амінокислотою (тобто антитіло проти С5 з характеристиками залежного від рН зв'язування зв'язується з мутантом С5 бо із заміщеним гістидином з афінністю, подібною до афінності природного С5 при нейтральному рН, при цьому таке саме антитіло зв'язується з мутантом С5 із заміщеним гістидином з вищою афінністю, порівняно з афінністю при зв'язуванні з природним С5 при кислотному рН).
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу зв'язується з С5 від більш ніж одного виду тварин. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 від людини та тварини, яка не є людиною. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 від людини та мавпи (наприклад, яванської макаки (супотоїЇдив5), макаки резус, мартишки, шимпанзе або павіана).
В одному аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які інгібують активацію С5.
У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які попереджають розщеплення С5, внаслідок якого утворюються Сба та С5Ь, що, у свою чергу, попереджає генерування анафілатоксичної активності, пов'язаної з Сба, а також попереджає зборку мембраноатакуючого комплексу С5р-9 (МАС), пов'язаного з С5р. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують перетворення С5 на С5ба та С5Б конвертазою С5.
У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують доступ конвертази
С5 до сайту розщеплення в С5. У певних варіантах здійснення пропонуються антитіла проти С5, які блокують гемолітичну активність, яка є наслідком активації С5. У подальших варіантах здійснення антитіла проти С5 цього винаходу інгібують активацію С5 класичним шляхом та/або альтернативним шляхом.
В одному аспекті винаходом пропонуються антитіла проти С5, які інгібують активацію варіанта С5. Термін "варіант С5" означає генетичний варіант С5, який є наслідком генетичної варіації, такої як мутація, поліморфізм або алельна варіація. Генетична варіація може включати делецію, заміщення або вставку одного або більше нуклеотидів. Варіант С5 може мати одну або більше генетичних варіацій у С5. У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до біологічної активності природного С5. Такий варіант С5 може мати принаймні одну варіацію, вибрану з групи, що складається з М145І, 84492, М802І, ВА885Н,
В8О280, 0966, 51310М та Е14370. У цьому описі В885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу інгібує активацію як природного С5, так і принаймні одного варіанта С5, вибраного з групи, що складається з М145І, 4492, М802І, В885Н, 9280, 0966,
З1310М Таг14370.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло проти С5, яке включає принаймні одну, дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок (НУР), вибраних з наступного: (а)
НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮО МО: 45-54; (в) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55-64; (с) НМВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 65-74; (8) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 75-84; (є) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 85-94; та (ї) НУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МН, вибрані з наступного: (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 45-54; (р) НУМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 55-64; та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65-74. В одному варіанті здійснення антитіло включає НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65-74. В іншому варіанті здійснення антитіло включає НУН-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 65-74, та НМВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 95-104. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 65-74,
НМВ-Ї 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 95-104, та НУВ-
БО Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БЕО ІО МО: 55-64. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 45-54; (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь- якою з 5ЕО ІО МО: 55-64; та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 65-74.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА Мі, вибрані з наступного: (а) НМВ-І71, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 75-84; (р) НМУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 85-94; та (с) НМВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 95-104. В одному варіанті здійснення 60 антитіло включає (а) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ
МО: 75-84; (р) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 85- 94; та (с) НМВ-ІЇ 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІО МО: 95-104.
В одному аспекті антитіло винаходу включає (а) домен МН, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МН, вибрані з наступного: (ї) НУМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 45-54, (ії) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55-64, та (ії) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 65-74; та (р) домен МІ, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМЕ МІ, вибрані з наступного: (ї) НУВ-
Ї1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 75-84, (ії) НМВ-І 2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 85-94, та (с) НМВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 95-104.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 45-54; (р) НУМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 55-64; (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65-74; (а) НМВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 75-84; (є) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 85-94; та (ї) НУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло проти С5, яке включає принаймні одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМА, вибраних з наступного: (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (5) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 55, 64, 118-120, 127; (с) НУВ-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128; (а)
НМВА-Ї1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 75, 84, 122, 129; (є) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 85, 94, 123- 124, 130; та (ї) НМВ-ІЇ 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮО МО: 95, 104, 125, 131.
В одному аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МН, вибрані з наступного: (а) НУВ-НІ, яка включає
Зо амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (5) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120,127; та (с)
НМУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74121, 128.
Водному варіанті здійснення антитіло включає НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 65, 74, 121, 128. В іншому варіанті здійснення антитіло включає НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65, 74, 121, 128, та НМРВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95, 104, 125, 131. У подальшому варіанті здійснення антитіло включає НМВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 65, 74, 121, 128, НМВ-Ї 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 95, 104, 125, 131, та НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 55, 64, 118-120, 127.
У подальшому варіанті здійснення антитіло включає (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБЕО ІО МО: 45, 54, 117, 126; (Б) НМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІО МО: 55, 64, 118-120,127; та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121,128.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА Мі, вибрані з наступного: (а) НМВ-І71, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 75, 84, 122, 129; (5) НМУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 85, 94, 123-124, 130; та (с)
НМВ-Ї 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮО МО: 95, 104, 125, 131.
В одному варіанті здійснення антитіло включає (а) НМА-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 75, 84, 122, 129; (р) НМУВ-1І2 яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 85, 94, 123-124, 130; та (с) НМВ-Ї 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95,104,125,131.
В одному аспекті антитіло винаходу включає (а) домен МН, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НУВ МН, вибрані з наступного: (ї) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 45, 54, 117, 126, (її) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 55, 64, 118-120, 127, та (іїї)
НМУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 65, 74, 121, 128; та (б) домен МІ, який включає принаймні одну, принаймні дві або усі три послідовності НМА МІ, 60 вибрані з наступного: (ї) НМУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕСО
ІО МО: 75, 84, 122, 129, (її) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з
ЗЕО ІЮО МО: 85, 94, 123-124, 130, та (с) НМВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95, 104, 125,131.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке включає (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 45, 54, 117, 126; (5) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55, 64, 118-120,127; (с) НУВ-
НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 65, 74121128; (а)
НМВА-Ї1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 75, 84, 122, 129; (є) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 85, 94, 123- 124, 130; та (ї) НМВ-ІЇ 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮО МО: 95, 104, 125, 131.
У певних варіантах здійснення будь-яка одна або більше амінокислот антитіла проти С5, як запропоновано вище, заміщені на наступних позиціях НМЕ: (а) у НУВ-НІ (5ЕО ІО МО: 45) на позиціях 5 та 6; (В) у НУВ-Н2 (ЗЕО ІО МО: 55) на позиціях 1, 3, 9, 11, 13 та 15; (с) у НУВ-НЗ (5ЕО
ІО МО: 65) на позиціях 2, 5, 6, 12 та 13; (4) у НМВ-І1 (ЗЕО ІО МО: 75) на позиціях 1, 5, 7 та 9; (є) у НУВ-І2 (ЗЕО ІО МО: 85) на позиціях 4, 5 та 6 та () у НМВ-І З (5ЕО ІО МО: 95) на позиціях 2,4 та 12.
У певних варіантах здійснення заміщення - це консервативні заміщення, як запропоновано у цьому описі. У певних варіантах здійснення будь-яке одне або більше з наступних заміщень можна виконати у будь-якій комбінації: (а) у НМА-НІ (ЗЕО ІО МО: 45) МОМ або СбА; (5) у НУВ-Н2 (ЗЕО ІЮО МО: 55) СІ А або с, ЗЕ, Т90 або Е, Мі ІК або О, 5130 або Е, або АТ5У; (с) у НУВ-НЗ (ЗЕО І МО: 65) С2А, М5О або 0, Т6У, М12Н, або І 13; (4) у НМА-І1 (5ЕО І МО: 75) ОТ1В, МО або с, 75, БОК або 5; (є) у НУВ-І2 (ЗЕО ІО МО: 85) КАТ або Е, І 571 або АБбН, АбЕ або АбО; (1) у НУВ-ІЗ (ЗЕО ІО МО: 95) Сб25, С2М або С2Т, Е«4К; або А12Т або А12Н.
Усі можливі комбінації вищезгаданих заміщень охоплюються консенсусними послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 126, 127, 128, 129, 130 та 131 для НУВ-НІ, НУВ-Н2, НМУВ-НЗ,
НМВ-І1, НМВ-12 та НМР-1 3, відповідно.
У будь-якому з вищезгаданих варіантів здійснення антитіло проти С5 є гуманізованим.
В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 включає НМВ, як у будь-якому з вищезгаданих
Зо варіантів здійснення, та також включає акцепторну каркасну ділянку людини, наприклад, каркасну ділянку імуноглобуліну людини або консенсусну каркасну ділянку людини. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 включає НМР, як у будь-якому з вищезгаданих варіантів здійснення, та також включає МН або МІ, які включають послідовність ЕВ, де послідовності ЕВ є наступними. Для варіабельного домену важкого ланцюга ЕВ! включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 132-134, ЕВ2 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 135-136, ЕАЗ включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО
ІО МО: 137-139, ЕН4 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 140-141.
Для варіабельного домену легкого ланцюга ЕРНІ включає амінокислотну послідовність за будь- якою з 5ЕО ІЮО МО: 142-143, ЕН2 включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ
МО: 144-145, ЕВЗ включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 146-147, ЕВ4 включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 148.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (УН), яка є принаймні на 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 У, 94 95, 95 Уо, 96 У, 97 Уо, 98 Фо, 99 90 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 1-10. У певних варіантах здійснення послідовність УН, яка є принаймні на 90 95, 91 Фо, 92 Фо, 93 Фо, 94 Фо, 95 95, 9695, 9796, 9895 або 9995 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-які з
ЗЕО ІЮ МО: 1-10. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМНК (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність
МН у будь-якій з 5ЕО ІО МО: І-10, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності.
В особливому варіанті здійснення УН включає одну, дві або три НМУЕ, вибрані з наступного: (а)
НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 45-54, (р) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 55-64, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО І МО: 65-74.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ), яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 Ув, 93 У, 94 Ор, 95 9, 96 9», 97 У, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою 60 з 5ЕО ІО МО: 11-20. У певних варіантах здійснення послідовність Мі, яка є принаймні на 90 95,
9195, 92 95, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з
С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з ФЕО ІЮО МО: 11-20. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМА (наприклад, у ЕН). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у будь-якій з ФЕО ІО МО: 11-20, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три
НУВ, вибрані з наступного: (а) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з
ЗЕО І МО: 75-84, (р) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5БЕО 10
МО: 85-94, та (с) НМВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 95-104.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає МН, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та Мі, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовності МН та МІ. у будь-якій з 5БЕО 10 МО: 1-Ю та у будь-якій з 5БО І МО: 11-20, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації таких послідовностей.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність варіабельного домену важкого ланцюга (УН), яка є принаймні на 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 У, 94 95, 95 Уо, 96 У, 97 Уо, 98 Фо, 99 90 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 10, 106-110.
У певних варіантах здійснення послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5.
У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з ФЕО ІЮ МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМА (наприклад, у ЕН). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у будь-якій з ФЕО ІЮО МО: 10, 106-110, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає
Зо одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕБЕО ІО МО: 45, 54, 117, 126, (Б) НМВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 55, 64, 118-120, 127, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 65, 74, 121, 128.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 9о, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО 10 МО: 10, 106-110. У певних варіантах здійснення послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 о, 94 Фо, 95 У, 96 Фо, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з 5ЕО 10 МО: 10, 106-110.
У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМУВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність УН у будь- якій з ЗЕО ІЮ МО: 10, 106-110, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності.
В особливому варіанті здійснення УН включає одну, дві або три НМУЕ, вибрані з наступного: (а)
НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 45, 54, 117, 126, (б) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 55, 64, 118- 120, 127, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 65, 74, 121128.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО І МО: 10. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за ЕС ІО МО: 10. У певних варіантах здійснення послідовність УН, яка є принаймні на 90 9, 91 9», 92 Ов, 93 У, 94 Фо, 95 У, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІО МО: 10. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМУВ (наприклад, у ЕВ). 60 Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 10, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 54, (Б) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 64, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 74.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5БЕО І МО: 106. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 106. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 106. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 106, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 118, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5БЕО І0О МО: 107. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 107. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у БЕО ІЮ МО: 107. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад,
Зо у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 107, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 119, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5БЕО І МО: 108. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 108. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 108. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 108, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 118, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5БЕО І МО: 109. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 109. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 109. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, 60 у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 109, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 118, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
В іншому аспекті антитіло проти С5 включає послідовність МН, яка є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 95, 95 96, 96 Уо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5БЕО І0О МО: 110. У певних варіантах здійснення послідовність МН - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 110. У певних варіантах здійснення послідовність
МН, яка є принаймні на 90 95, 9195, 9295, 9395, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 110. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МН у 5ЕО ІЮ МО: 110, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МН включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 117, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 120, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 121.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність варіабельного домену легкого ланцюга (МІ), яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 Ув, 93 У, 94 Ор, 95 9, 96 9», 97 У, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 20, 111-113. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 Фо, 91 95, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 90, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з
С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у будь-якій з ФЕО ІЮ МО: 20, 111-113. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМА (наприклад, у ЕН). Довільно,
Зо антитіло проти С5 включає послідовність МІ у будь-якій з ФЕО ІЮО МО: 20, 111-113, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО І МО: 75, 84122, 129, (Б) НМУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 85, 94, 123-124, 130, та (с) НМВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 95,104, 125,131.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі, яка є принаймні на 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІО МО: 20. У певних варіантах здійснення послідовність МІ. - це амінокислотна послідовність за 5ЕО ІО МО: 20. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 У, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 20. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕН). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІЮО МО: 20, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за ФЕО ІЮ МО: 84, (5) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за ЗЕО І
БО МО: 94, та (с) НМВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО 10 МО: 104.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі, яка є принаймні на 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за ЕС ІЮО МО: 111. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ - це амінокислотна послідовність за 5ЕО І МО: 111. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 У, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 111. У певних варіантах 60 здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад,
у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІО МО: 111, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 122, (р) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за ФЕО
ІО МО: 123, та (с) НУВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі, яка є принаймні на 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за 5ЕО ІЮО МО: 112. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ - це амінокислотна послідовність за 5ЕО І МО: 112. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 У, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 112. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІО МО: 112, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 122, (р) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за ФЕО
ІО МО: 123, та (с) НУВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає Мі, яка є принаймні на 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 9995 або 100 95 ідентичною амінокислотній послідовності за ЕС ІЮО МО: 113. У певних варіантах здійснення послідовність
МІ - це амінокислотна послідовність за 5ЕО І МО: 113. У певних варіантах здійснення послідовність МІ, яка є принаймні на 90 95, 91 9», 92 95, 93 У», 94 У, 95 9», 96 9, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичною, містить заміщення (наприклад, консервативні заміщення), вставки або делеції відносно посилальної послідовності, проте антитіло проти С5, яке включає таку послідовність, зберігає спроможність зв'язуватися з С5. У певних варіантах здійснення загалом від 1 до 10 амінокислот було заміщено, вставлено та/або стерто у 5ЕО ІЮ МО: 113. У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції відбуваються у ділянках за межами НМВ (наприклад, у ЕВ). Довільно, антитіло проти С5 включає послідовність МІ у 5ЕО ІЮО МО: 113, включаючи посттрансляційні модифікації цієї послідовності. В особливому варіанті здійснення МІ включає одну, дві або три НМА, вибрані з наступного: (а) НМУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 122, (р) НУВ-1І2, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО
ІО МО: 124, та (с) НУВ-І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає МН, як описано у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та Мі, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовності
МН та МІ у будь-якій з 5ЕО ІО МО: 10, 106-110 та у будь-якій з 5ЕО ІЮ МО: 20, 111-113, відповідно, включаючи посттрансляційні модифікації цих послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 10 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 20. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІО МО: 106 та послідовність МІ за 5БО ІО МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 107 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮО МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІО МО: 108 та послідовність МІ за 5ЕО І
МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ за 5БО ІО МО: 111. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮО МО: 112. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІО МО: 109 та послідовність МІ за 5ЕО І
БО МО: 113. В одному варіанті здійснення антитіло включає послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 110 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮО МО: 113.
В одному аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 54, (р) НУВ-Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 64, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 74, та послідовність МІ, яка містить (а) НУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО: 84; (5) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 94; та (с) НМВ-ІЇ 3, яка включає амінокислотну послідовність за ЕС
ІО МО: 104.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, 60 яка містить (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 117, (р) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 118, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 121, та послідовність МІ, яка містить (а) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО 10 МО: 122; (р) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 123; та (с) НУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 117, (р) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 119, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 121, та послідовність МІ, яка містить (а) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО 10 МО: 122; (р) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 123; та (с) НУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО І МО: 117, (р) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І МО: 118, та (с) НУВ-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 121, та послідовність МІ, яка містить (а) НУВ-11, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО 10 МО: 122; (р) НУВ-І2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 124; та (с) НУВ-ІЗ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 125.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти С5, де антитіло включає послідовність УН, яка містить (а) НУВ-НІ, яка включає амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 117, (р) НУВ-
Н2, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 120, та (с) НМА-НЗ, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 121, та послідовність МІ, яка містить (а) НУВ-І1, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО І
МО: 122; (в) НУВ-12, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 124; та (с) НУВ-
І 3, яка включає амінокислотну послідовність за 5БЕО ІЮ МО: 125.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу включає МН, як у будь- якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та константну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з 5ЕО ІО МО: 33, 34, 35, 114115 та 116.
Зо У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу включає МІ, як у будь-якому з варіантів здійснення, запропонованих вище, та константну ділянку легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за будь-якою з БЕО ІЮ МО: 36, 37 та 38.
В іншому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і запропоноване у цьому описі антитіло проти С5. Наприклад, у певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у
Таблиці 2. Як продемонстровано нижче робочими прикладами, усі наведені у Таблиці 2 антитіла проти С5 згруповані в одну й ту ж епітопну групу стосовно С5, та вони демонструють характеристики залежного від рН зв'язування.
У додатковому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується з таким самим епітопом, що і запропоноване у цьому описі антитіло. У подальшому аспекті винаходом пропонується антитіло, яке зв'язується 3 таким самим епітопом, що і антитіло, наведене у
Таблиці 7 або 8. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах фрагмента, який складається з амінокислот 33-124 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ
МО: 40). У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах бета-ланцюга С5 (5ЕО ІО МО: 40), який включає принаймні один фрагмент, вибраний з групи, що складається з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло, яке зв'язується з епітопом у межах фрагмента бета-ланцюга С5 (5ЕО І
МО: 40), який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з ТНг47,
СіІш48, АІа49, Рнеб5О, Азр5б1, АІаб2, Тиг53, І ув57, Нів70, Ма!71, Нібз72, бЗег74, Сішуб, Ма1ІО7,
Зепов, І узіО» та Ніві 10. В іншому варіанті здійснення епітоп антитіла проти С5 цього винаходу - це конформаційний епітоп.
У подальшому аспекті винаходу антитіло проти С 5 згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це моноклональне антитіло, включаючи химерне антитіло, гуманізоване антитіло та антитіло людини. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 - це фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Раб, Раф 5сЕм, діатіло або фрагмент Е(аб)2. В іншому варіанті здійснення антитіло - це повнорозмірне антитіло, наприклад, інтактне антитіло да або Ідс4, або інший клас або ізотип антитіла, як визначається у цьому описі.
У подальшому аспекті антитіло проти С5 згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення може включати будь-які ознаки, окремо або у комбінації, як описано у Розділах 1-7 бо нижче.
1. Афінність антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло має константу дисоціації (Ка), яка становить 1 мкМ або менше, 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 1 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,01 нМ або менше або 0,001 нМ або менше (наприклад, 10"ЗМ або менше, наприклад від 10"ЗМ до 102ЗМ, наприклад, від 10""М до 10" 13 М).
В одному варіанті здійснення Ка вимірюється за допомогою аналізу зв'язування міченого ізотопом антигену (ВІА). В одному варіанті здійснення НІА виконується з версією Рабр антитіла, яке представляє інтерес, та його антигеном. Наприклад, афінність зв'язування розчину ЕРар з антигеном вимірюється за допомогою урівноваження Бар мінімальною концентрацією міченого (І) антигену у присутності титрацшних серій неміченого антигену з наступним захопленням зв'язаного антигену планшетом, на який нанесено антитіло проти Раб (дивись, наприклад, Спеп еї аї., у). Мої. Віої. 293:865-881 (1999)). Для того, щоб задати умови аналізу на планшети з багатьма комірками МІСВОТІТЕВ (зареєстрована торговельна марка) (ТПепто
Зсіепійіс) нанесли на ніч 5 мкг/мл захоплюючого антитіла проти Раб (Сарреї! абз) у 50 мМ карбонаті натрію (рН 9,6), а потім блокували за допомогою 2 95 (маса/об'єм) бичачим сироватковим альбуміном у РВ5 протягом від 2 до 5 годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У неадсорбуючому планшеті (Мипс 2269620) 100 пМ або 26 пм Г25Ц-антигену змішали з серійними розведеннями Рар, що представляє інтерес (наприклад, який узгоджується з оцінкою антитіла проти МЕСЕ, Рар-12, у Ргеєвзіа єї а!., Сапсег Вев. 57:4593-4599 (1997)). Раб, який представляє інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак, інкубація може тривати протягом тривалішого періоду (наприклад, приблизно 65 годин), щоб переконатися, що урівноваження досягнуто. Після цього суміші переносять до захоплюючого планшета для інкубування при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють та планшет промивають вісім разів 0,195 полісорбатом 20 (ПМ/ЕЕМ-20 (зареєстрована торговельна марка) у РВ5. Коли планшети висушено, тоді додають 150 мкл/комірку сцинтилятору (МІСВО5СІМТ-20; РасКага) та планшети рахують на гамма- лічильнику ТОРСОШМТ "м (РасКага) протягом 10 хвилин. Концентрації кожного Раб, які дають менш, ніж 20 95 від максимального зв'язування або рівно 2095 від нього, вибирають для застосування в аналізі конкурентного зв'язування.
Зо Згідно з іншим варіантом здійснення Ка вимірюється за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка). Наприклад, аналіз із застосуванням ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка)-2000 або ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка)-3000 (ВІАСОРВЕ (зареєстрована торговельна марка), Іпс.,
Різсаїаулау, МУ) виконується при 25 "С з чипами іммобілізованого антигену СМ5 при приблизно 10 одиницях відповіді (ВШ) В одному варіанті здійснення біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (СМ5, ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка), Іпс.) активуються за допомогою М-етил-М'-(З-диметиламінопропіл)-карбодіїміду гідрохлориду (ЕС) та М-гідроксисукциніміду (МН) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розводять 10 мМ ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (приблизно 0,2 мкМ) перед впорскуванням з витратою потоку 5 мкл/хвилину, щоб досягти приблизно 10 одиниць відповіді (ВІ) зв'язаного білку. Після впорскування антигену 1 М етаноламін впорскується, щоб блокувати групи, які не вступили в реакцію. Для вимірювання кінетики двократні серійні розведення Раб (від 0,78 до 500 нм) впорскуються у РВ5 з поверхнево-активною речовиною (РВ5Т) 0,05 95 полісорбату 20 (ТМ/ЕЕМ- 207м) при 25"С із витратою потоку приблизно 25 мкл/хвилину. Константи асоціації (Коп) та константи дисоціації (Кої розраховуються за допомогою моделі зв'язування один-до-одного
Іапдтиїг (ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) ЕмаЇнайоп боїймаге версія 3.2) шляхом одночасного зіставлення сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Ка) розраховують як відношення кой/коп. Дивись, наприклад, Спеп еї аї., у. Мої. Вісі. 293:865-881 (1999). Якщо константа асоціації перебільшує 105 М" с" у вищезгаданому аналізі поверхневого плазмонного резонансу, то константу асоціації можна визначити за допомогою способу гасіння флюоресценції при якому вимірюється підвищення або зниження інтенсивності флуоресцентного випромінювання (збудження - 295 нм; випромінювання - 340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25 "С 20 нМ антитіла проти антигену (форма Раб) у РВЄ, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигену, що вимірюється у спектрометрі, такому як спектрофотометр, спроможний вимірювати за методом зупинки потоку (Амім Іпвігитепів), або спектрофотометр 5ІМ-АМІМСО "м серії 8000 (Тнептобресігопіс) з кюветою, де здійснюється перемішування. 2. Фрагменти антитіл
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це фрагмент бо антитіла. Фрагменти антитіл включають, проте не обмежуються ними, фрагменти Раб, Раб",
Еар-5Н, К(ар)2, Ем та 5сЕм та інші фрагменти, описані нижче. Для огляду певних фрагментів антитіл дивись Ниазоп еї аї., Маї. Мей. 9:129-134 (2003). Для огляду фрагментів 5сЕм дивись, наприклад, РійсКійп, у Те РІПаптасоіоду ої Мопосіопа! Апііроадіє5, мої. 113, Нозеприга апа
Мооге еєав., (Зргіпдег-Мепад, Мем Мої), рр. 269-315 (1994); дивись також У/О 93/16185 та патенти США МоМо 5,571,894 та 5,587,458. Обговорення фрагментів Бар та Е(ар)2, які включають залишки епітопу зв'язування з рецептором реутилізації та які мають подовжене напівжиття іп мімо, дивись у патенті США Мо5,869,046.
Діатіла - це фрагменти антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, які можуть бути двовалентними або біспецифічними. Дивись, наприклад, ЕР 404,097; М/О 1993/01161; Ниазоп єї а!І., Маї. Мед. 9:129-134 (2003); та Ноїїподег єї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90:6444-6448 (1993).
Триатіла та тетратіла також описано у Нидзоп еїаї., Маї. Мед. 9:129-134(2003).
Однодоменні антитіла - це фрагменти антитіл, які включають увесь або частину варіабельного домену важкого ланцюга або увесь або частину варіабельного домену легкого ланцюга антитіла. У певних варіантах здійснення однодоменне антитіло - це однодоменне антитіло людини (Юотапії5, Іпс., ММайнат, МА; дивись, наприклад, патент США Моб,248,516).
Фрагменти антитіл можна отримати за різними способами, включаючи, проте не обмежуючись ними, протеолітичне перетравлення інтактного антитіла, а також продукування рекомбінантними клітинами-хазяїнами (наприклад, Е. соїї або фаг), як описується у цьому описі. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це химерне антитіло.
Певні химерні антитіла описано, наприклад, у патенті США Мо 4,816,567; та Могтізоп еї аї!., Ргос.
Май. Асад. Осі. ОБА 81:6851-6855 (1984)). В одному прикладі химерне антитіло включає варіабельну ділянку, яка не є людською (наприклад, варіабельну ділянку, яка походить від миші, щура, хом'яка, кроля або примата, який не є людиною, такого як мавпа), та константну ділянку людини. У подальшому прикладі химерне антитіло - це антитіло з "перемкнутим класом", у якому клас або підклас початкового антитіла змінено. Химерні антитіла включають їх антигензв'язувальні фрагменти.
У певних варіантах здійснення химерне антитіло - це гуманізоване антитіло. Зазвичай, антитіло, яке не є людським, гуманізують з метою зниження імуногенності для людей, при цьому
Зо зберігаються специфічність та афінність початкового антитіла, яке не є людським. Взагалі, гуманізоване антитіло включає один або більше варіабельних доменів, у яких НУН, наприклад,
СОВ (або їх частини) походять від антитіла, яке не є людським, та ЕВ (або їх частини) походять з послідовностей антитіла людини. Гуманізоване антитіло довільно також включатиме принаймні частину константної ділянки людини. У деяких варіантах здійснення деякі залишки
ЕК у гуманізованому антитілі заміщені відповідними залишками з антитіла, яке не є людським, (наприклад, антитіла, з якого походять залишки НУР), наприклад, щоб відновити або покращити специфічність або афінність антитіла.
Огляд гуманізованих антитіл та способів їх отримання наведено, наприклад, у АІтаадго апа
Екапв5зоп, Егопі. Віовсі. 13:1619-1633 (2008), та вони далі описуються, наприклад, у Віесптапп єї аІ,, Майте 332:323-329 (1988); Ойеєп еї аї., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патентах США МоМо 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 та 7,087,409; Кавптітгі єї а!., Меїтйоа» 36:25- 34 (2005) (де описується трансплантація ділянки, що визначає специфічність (50НА)); Радіап,
МОЇ. Іттипої. 28:489-498 (1991) (де описується "перекладання" ("езипасіпад")); Ба! Асдпа еї аї.,
Меїподз 36:43-60 (2005) (де описується "перестановка ЕВ" ("ЕВ зп!Шйіїпа")); та О5рошпт еї аї.,
Меїнподз 36:61-68 (2005) та КіїткКа еї аї., Вг. У. Сапсег. 83:252-260 (2000) (де описується підхід "керованої селекції" ("Зиїдеа зеїІесіоп") до перемішування ЕВ).
Каркасні ділянки людини, які можна застосовувати для гуманізації, включають, проте не обмежуються ними: каркасні ділянки, які вибираються із застосуванням способу "найкращої відповідності" ("беві-їйї") (дивись, наприклад, 5бітв5 еї аї.,.). Іттипої!. 151:2296 (1993)); каркасні ділянки, які походять від консенсусної послідовності антитіл людини певної підгрупи варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюга (дивись, наприклад, Сапег єї аї., Ргос. Маї).
Асад. бсі. ОБА 89:4285 (1992); та Ргезіа евї аї., У. Іттипої. 151:2623 (1993)); зрілі (соматично мутовані) каркасні ділянки людини або каркасні ділянки зародкової лінії людини (дивись, наприклад, АІтадгто апа Егапозоп, Егопі. Віовсі. 13:1619-1633 (2008)); та каркасні ділянки, які отримані внаслідок скринінгу бібліотек ЕК (дивись, наприклад, Васа еї аї., у. Віої. Спет. 272:10678-10684 (1997) та Розок вї а!., 9. ВіоЇ. Снет. 271:22611-22618(1996)). 4. Антитіла людини
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це антитіло людини.
Антитіла людини можна отримати, застосовуючи різні відомі у цій галузі способи. Антитіла людини описано взагалі у мап БіЇК апа мап де УіпКеї, Си. Оріп. Рнаптасої. 5:368-374 (2001) та
Гопрего, Сит. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Антитіла людини можна отримати шляхом введення імуногену трансгенній тварині, яку модифікували, щоб отримати інтактні антитіла людини або інтактні антитіла з варіабельними ділянками людини у відповідь на щеплення антигеном. Такі тварини зазвичай містять усі або частину локусів імуноглобуліну людини, які заміщують локуси ендогенного імуноглобуліну, або які присутні назовні хромосом або довільно інтегровані у хромосоми тварини. У таких трансгенних мишей локуси ендогенного імуноглобуліну зазвичай інактивовані. Огляд способів отримання антитіл людини від трансгенних тварин дивись у І опрего, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Дивись також, наприклад, патенти США МоМо 6,075,181 та 6,150,584, які описують технологію ХЕМОМОИБЕ "М: патент США Мо 5,770,429, який описує технологію НОМАВ (зареєстрована торговельна марка); патент США Мо 7,041,870, який описує технологію К-М
МОБЕ (зареєстрована торговельна марка) та публікацію патентної заявки США
Мо 2007/0061900, яка описує технологію МЕГОСІМОО5БЕ (зареєстрована торговельна марка).
Варіабельні ділянки людини від інтактних антитіл, вироблених такими тваринами, можна далі модифікувати, наприклад, шляхом поєднання з відмінною константною ділянкою людини.
Антитіла людини можна також отримати за способами на основі гібридом. Було описано клітинні лінії мієломи людини та гетеромієломи миші-людини для отримання моноклональних антитіл людини. (Дивись, наприклад, Ко?рог У. Іттипої., 133:3001 (1984); Вгодейг еї аї.,
Мопосіопа! Апіїроду Ргодисіюп Тесппіднез апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (ОекККег, Іпс., Мем/ мок, 1987); та Воєтег евї аї., ). Іттипої. 147:86 (1991)). Антитіла людини, одержані за допомогою технології з використанням гібридоми В-клітин людини також описано у і єї аї!., Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 7,189,826 (який описує отримання моноклональних антитіл (ЯМ людини від гибридомних клітинних ліній) таМо, Хіапдаії Міапуїхие 26(4)265-268 (2006) (де описуються гібридоми типу "людина-людина"). Технологію з використанням гібридоми людини (технологія
Триоми) (Тіота їесппоЇоду) також описано у МоїІтег5, Нізіоіоду апа НізіораїноЇоду 20(3): 927-93 7 (2005) та МоПтегв, Меїнодз апа Ріпаіпд5 в Ехрегітепіаї апа Сіїпіса! Рнаптасоіоду 27(3): 185- 191 (2005).
Антитіла людини можна також генерувати шляхом виділення послідовностей варіабельного домену клону Ем, вибраних з бібліотек фагового дисплея, які походять від людини. Такі послідовності варіабельного домену можна потім поєднувати з бажаним константним доменом людини. Способи вибору антитіл людини з бібліотек антитіл описано нижче. 5. Антитіла, які походять з бібліотек
Антитіла винаходу можна виділити шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек щодо антитіл з бажаною активністю або видами активності. Наприклад, у цій галузі відомі різноманітні способи генерування бібліотек фагового дисплея та скринінгу таких бібліотек щодо антитіл, яким притаманні бажані характеристики зв'язування. Огляд таких способів наведено, наприклад, у Ноодепроот есеї аї., Меїйподз» іп МоїІесшаг Віооду 178:1-37 (О'Вгієп єї аї., ед., Нитап Ргезв5,
Тоїоула, МУ, 2001), та вони також описані, наприклад, у МсСанепу еї аї., Маїшге 348:552-554;
Сіаскзоп еї аї., Майте 352:624-628 (1991); Маїкз еї аї., У. Мої. Вісі. 222:581-597 (1992); МаїКкв,
Меїй.МоОЇ. Віої. 248:161-175 (Го, єд., Нитап Ргев55, Тоїомжа, МУ, 2003); Бідни еї аї., У. Мої. Віої. 338(2):299-310 (2004); І ее еї аї., 9. Мої. Віої. 340(5):1073-1093 (2004); РеПоиве, Ргос. Маї!. Асад. зЗсі. ОБА 101(34)12467-12472 (2004); І ее ев! аї., 9У. Іттипої. Меїнодз» 284(1-2):119-132 (2004).
У певних способах фагового дисплея репертуари генів МН та МІ окремо клонуються за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСА) та довільно рекомбінуються у фагові бібліотеки, які потім можна піддати скринінгу щодо антигензв'язу вального фагу, як описано у
Муіпіег єї а. Апп. Веум. Іттипої. 12:433-455 (1994). Фаг зазвичай відображує фрагменти антитіла або як одноланцюгові фрагменти Ем (з5сЕм), або як фрагменти Рар. Бібліотеки з імунізованих джерел пропонують високоафінні до імуногену антитіла без необхідності побудови гібридом.
Альтернативно, нативний репертуар можна клонувати (наприклад, від людини), щоб отримати єдине джерело антитіл для широкого діапазону як аутоантигенів, так і не-аутоантигенів без будь-якої імунізації, як описано у Сиіййне єї аІ., ЕМВО 3. 12:725-734 (1993). Зрештою, нативні бібліотеки можна також отримати за допомогою синтезу шляхом клонування сегментів нереаранжированого У-гена зі стовбурових клітин із застосуванням праймерів РОС, які містять довільну послідовність, щоб кодувати гіперваріабельні ділянки СОВЗ3, та виконати реаранжирування іп міо, як описано у Ноодепроот, .). Мої. Віої. 227:381-388 (1992). Патентні публікації, у яких описано фагові бібліотеки антитіл людини, включають, наприклад: патент
США Ме 5,750,373 та патентні публікації США МоМео 2005/0079574,2005/0119455, 2005/0266000, 60 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 та 2009/0002360.
Вважають, що антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек антитіл людини, - це описані у цьому описі антитіла людини або фрагменти антитіл людини. 6. Мультиспецифічні антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло - це мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла - це моноклональні антитіла, які мають специфічність зв'язування з принаймні двома різними сайтами. У певних варіантах здійснення одна зі специфічностей зв'язування - це специфічність до С5, а інша - специфічність до будь-якого іншого антигену. У певних варіантах здійснення біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами С5. Біспецифічні антитіла можна також застосовувати для локалізації цитотоксичних агентів стосовно клітин, які експресують С5.
Біспецифічні антитіла можна отримати як повнорозмірні антитіла або як фрагменти антитіл.
Способи отримання мультиспецифічних антитіл включають, проте не обмежуються ними, рекомбінантну спільну експресію двох імуноглобулінових пар важкого ланцюга та легкого ланцюга, які мають відмінну специфічність (дивись Міївівїп апа Сцеїо, Маїшгте 305:537 (1983)),
МО 93/08829 та ТгайпесКег єї аі., ЕМВО .. 10:3655 (1991)), та конструкцію типу "виступ-у- западину" (дивись, наприклад, патент США Мо 5,731,168). Мультиспецифічні антитіла можна також отримати шляхом інженерії ефектів електростатичного регулювання для отримання гетеродимерних Ес-молекул антитіла (М/02009/089004А1); шляхом перехресного зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (дивись, наприклад, патент США Мо 4,676,980 та
Вгеппап вї а!., Зсієпсе, 229:81 (1985)); шляхом застосування лейцинової застібки для отримання біспецифічних антитіл (дивись, наприклад, Ковзіє!пу еї аї., у. Іттипої. 148(5):1547-1553 (1992)); шляхом застосування технології "діатіла" для отримання фрагментів біспецифічних антитіл (дивись, наприклад, НоїЇїпадег єї аї!., Ргос. Маї!Ї. Асад. 5сі. ОБА 90:6444-6448 (1993)); та шляхом застосування одноланцюгових димерів Ем (5СсЕм) (дивись, наприклад, Ссгибрег єї аї., у). Іттипої. 152:5368 (1994)); та шляхом приготування триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, у
Тий еї аї., у. Іттипої. 147:60 (1991).
У цей опис також включено отримані шляхом побудови антитіла з трьома або більше функціональними антигензв'язувальними сайтами, включаючи "антитіла-восьминоги" ("осіориб апіїродієв") (дивись, наприклад, О5 2006/0025576).
Зо У цьому описі антитіло або фрагмент також включає "ЕАБ подвійної дії" (Юа! Асіїпу ЕАБ) або "АР", що включає антигензв'язувальний сайт, який зв'язується з С5, а також з іншим, відмінним, антигеном (дивись, наприклад, О52008/0069820). 7. Варіанти антитіл
У певних варіантах здійснення передбачаються варіанти амінокислотних послідовностей запропонованих у цьому описі антитіл. Наприклад, може бути бажаним покращити афінність зв'язування та/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можна отримати шляхом здійснення відповідних модифікацій нуклеотидної послідовності, яка кодує антитіло, або шляхом синтезу пептидів. Такі модифікації включають, наприклад, делеції з, та/"або вставки в, та/або заміщення залишків у межах амінокислотних послідовностей антитіла. Будь-яку комбінацію делеції, вставки та заміщення можна виконати, щоб отримати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевій конструкції притаманні бажані характеристики, наприклад, зв'язування з антигеном. а. Варіанти заміщень, вставок та делецій
У певних варіантах здійснення пропонуються варіанти антитіла, які мають одне або більше амінокислотних заміщень. Сайти, які представляють інтерес для замісного мутагенезу, включають НМА та ЕВ. Консервативні заміщення наведено у Таблиці 1 під заголовком "переважні заміщення". Найбільш суттєві зміни запропоновані у Таблиці 1 під заголовком "типові заміщення", та вони описуються нижче з посиланням на класи амінокислотних бічних ланцюгів. Амінокислотні заміщення можна зробити в антитілі, яке представляє інтерес, та продукти можна піддати скринінгу щодо бажаної активності, наприклад, стосовно збереження / покращення зв'язування з антигеном, зниження імуногенності або покращення АОСС або СОС.
Таблиця 1
Амінокислоти можна згрупувати згідно із загальними властивостями бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, І еи, Не; (2) нейтральні гідрофільні: Сув, Зег, ТНг, Азп, Сіп; (3) кислотні: Авр, Си; (4) лужні: Нів, І ув, Агу; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга:
СТУ, Рго; та (6) ароматичні: Тгр, Туг, Рне.
Неконсервативні заміщення будуть передбачати обмін члена одного з цих класів на інший клас.
Один тип варіанта, отриманого внаслідок заміщення, залучає заміщення одного або більше залишків гіперваріабельної ділянки початкового антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Взагалі, отриманий (отримані) варіант (варіанти), вибраний (вибрані) для подальшого дослідження, будуть мати модифікації (наприклад, покращення) певних біологічних властивостей (наприклад, підвищення афінності, зниження імуногенності) порівняно з початковим антитілом та/або матиме (матимуть) по суті збережені певні біологічні властивості початкового антитіла. Приклад варіанта, отриманого внаслідок заміщення, - це антитіло зі зрілою афінністю, яке можна отримати зручним способом, наприклад, застосовуючи способи визрівання афінності на основі фагового дисплея, такі як способи, описані у цьому описі. Стисло кажучи, один або більше залишків НМА мутують, та варіанти антитіл відображаються на оболонці фага, та їх піддають скринінгу стосовно певної біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування).
Зміни (наприклад, заміщення) можна здійснювати у НМУВ, наприклад, щоб покращити афінність антитіла. Такі зміни можна здійснювати у варіативних точках ("поївзроїв") НМЕА, тобто на залишках, які кодуються кодонами, які зазнають мутації з високою частотою під час процесу соматичного визрівання (дивись, наприклад, Спомжанигу, Меїпоаз» Мої. Вісі. 207:179-196 (2008)), та/або на залишках, які контактують з антигеном, при цьому отриманий варіант МН або МІ тестується щодо афінності зв'язування. Визрівання афінності внаслідок побудови та повторного відбору з вторинних бібліотек описано, наприклад, у Ноодепроот есеї аї., у Мейоз іп МоїІєсшіаг
Віооду 178:1-37 (О'"Віїєп еї аїЇ., єд. Нитап Ргев5, Тоїоула, МУ, (2001). У деяких варіантах здійснення визрівання афінності роблять різноманітні зміни у мінливих генах, вибраних для
Зо визрівання, за будь-яким з численних способів (наприклад, РСР, що припускає помилки, переміщування ланцюгів або олігонуклеотид-спрямований мутагенез). Потім створюється вторинна бібліотека. Цю бібліотеку потім піддають скринінгу, щоб ідентифікувати варіанти антитіла з бажаною афінністю. У іншому способі досягнення різноманітності застосовуються
НМВ-спрямовані підходи, при яких рандомізуються декілька залишків НМА (наприклад, 4-6 залишків одночасно). Залишки НМА, що залучаються у зв'язування з антигеном, можна
Зо специфічно ідентифікувати, наприклад, застосовуючи аланін-скануючий мутагенез або моделювання. Зокрема, СОВ-НЗ та СОВ-Ї З часто вибирають мішенями.
У певних варіантах здійснення заміщення, вставки або делеції можуть здійснюватися у межах однієї або більше НМР, доки такі зміни суттєво не зменшують спроможність антитіла зв'язуватися з антигеном. Наприклад, консервативні зміни (наприклад, консервативні заміщення, як запропоновано у цьому описі), які суттєво не зменшують афінність зв'язування, можна здійснити у НМА. Такі зміни можуть бути, наприклад, у НМА поза залишків, що контактують з антигеном. У певних варіантах здійснення варіантних послідовностей УН та МІ, запропонованих вище, кожна з НМК або не змінена, або містить не більш ніж одне, два або три амінокислотні заміщення.
Корисний спосіб ідентифікації залишків або ділянок антитіла, які можуть бути мішенями мутагенезу, називається "аланін-скануючий мутагенез", як описано у Сиппіпдпат, 5сієпсе 244:1081-1085 (1989). У цьому способі залишок або група залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, таких як агу, азр, Пів, Іуз та діш) ідентифікують та заміщують нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити, чи здійснюється вплив на взаємодію антитіла з антигеном. Подальші заміщення можна зробити на амінокислотних позиціях, демонструючи функціональну чутливість до початкових заміщень. Альтернативно або додатково, за кристалічною структурою комплексу антиген-антитіло ідентифікують точки контакту між антитілом та антигеном. Такі контактні залишки або сусідні залишки можуть бути мішенями, або їх можна видалити як кандидатів на заміщення. Варіанти можна піддати скринінгу, щоб визначити, чи містять вони бажані властивості.
Вставки амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбоксил-кінцеві злиття, довжина яких змінюється у діапазоні від одного залишку до поліпептидів, які містять сто або більше залишків, а також вставки в послідовності одного або численних амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком.
Інші варіанти вставок молекули антитіла включають злиття М- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, АЮЕРТ) або поліпептидом, який подовжує напівжиття антитіла у сироватці.
Зо р. Варіанти глікозилування
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому винаході антитіло змінюють, щоб підвищити або знизити ступінь, до якого антитіло глікозиловане. Додавання сайтів глікозилування до антитіла або їх делецію можна традиційно виконати шляхом зміни амінокислотної послідовності, так щоб утворити або видалити один або більше сайтів глікозилування.
Там, де антитіло включає Ес-ділянку, можна змінити приєднаний до неї вуглевод. Нативні антитіла, що виробляються клітинами ссавців, зазвичай включають розгалужений 2-антенарний олігосахарид, який зазвичай приєднується шляхом М-зшивання з А5зп297 домену СН2 Ес- ділянки. Дивись, наприклад, МУгідні єї аі., ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Цей олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СісМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, приєднані до СісМАс у "стовбурі" структури 2-антенарного олігосахариду. У деяких варіантах здійснення модифікації олігосахариду в антитілі винаходу можна виконати для того, щоб утворити варіанти антитіла з певними покращеними властивостями.
В одному варіанті здійснення пропонуються варіанти антитіла, які мають вуглеводневу структуру, якій бракує фукози, приєднаної (безпосередньо або опосередковано) до Ес-ділянки.
Наприклад, кількість фукози у такому антитілі може становити від 1 905 до 80 9б, від 1 95 до 65 95, від 595 до 65965 або від 2095 до 40 95. Кількість фукози визначається шляхом розрахунку середньої кількості фукози у межах цукрового ланцюга на Авзп297 відносно суми усіх глікоструктур (наприклад, складних, гібридних та високоманозних структур), приєднаних до
Авп297, що вимірюється за допомогою мас-спектроскопії МА! 0І-ТОЕ, як описано, наприклад, у
МО2008/077546. А5зп297 позначає аспарагіновий залишок, розташований на приблизно позиції 297 у Ес-ділянці (Європейська номенклатура залишків Ес-ділянок); проте, Азп297 може також розташовуватися приблизно на -7- З амінокислоти праворуч або ліворуч від позиції 297, тобто, між позиціями 294 та 300, що є наслідком незначних варіацій послідовностей в антитілах. Такі варіанти фукозилування можуть мати покращену функцію АЮОСОС. Дивись, наприклад, патентні публікації США МоМе 05 2003/0157108 (Ргезіа, І.); 5 2004/0093621 (Куожша Накко Коауо Со., 4). Приклади публікацій, пов'язаних з "дефукозилованими" або "фукоза-дефіцієнтними" варіантами антитіла включають: 5 2003/0157108; УМО 2000/61739; УМО 2001/29246; 60 О52003/0115614; 005 2002/0164328; 005 2004/0093621; 005 2004/0132140; 05 2004/0110704;
О52г004/0110282; 005 2004/0109865; УМО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586;
МО 2005/035778; МО 2005/053742; МО 2002/031140; ОкКа?лакі еї аї., У. Мої. Віої. 33671 239-1249 (2004); Матапе-ОНпикі еї аї., Віоїесн. Віоепуд. 87:614 (2004). Приклади клітинних ліній, спроможних виробляти дефукозиловані антитіла, включають клітини Геє 13 СНО з дефіцитом фукозилування білка (ВірКа єї аї., Аг. Віоспет. Віорпуз. 249:533-545 (1986); опублікована патентна заявка США 2003/0157108, Ргезіа, І; та М/О2004/056312, Адатвз єї аї., особливо у
Прикладі 11), та нокаутні клітинні лінії, такі як клітини СНО, що є нокаутними щодо гену альфа- 1,6-фукозилтрансферази, РОТ8, (дивись, наприклад, Уатапе-ОПпикі єї аї., Віоїєсн. Віоепд. 87:614 (2004); Капаа евї а/!., ВіоїесНпої. Віоепд. 94(4):680-688 (2006); та МО 2003/085107).
Далі пропонуються варіанти антитіл з розділеними навпіл олігосахаридами, наприклад, олігосахаридами, у яких 2-антенарний олігосахарид, приєднаний до Рс-ділянки антитіла, розділяється навпіл М-ацетилглюкозаміном (С1ісМАс). Такі варіанти антитіл можуть мати зменшене фукозилування та/або покращену функцію АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описано, наприклад, у УУО 2003/011878 (Уеап-Маїгеї єї аІ.); патенті США Мо 6,602,684 (Штапа єї а!) та у 05 2005/0123546 (Отапа еї аІ.). Також пропонуються варіанти антитіл з принаймні одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до Ес-ділянки. Такі варіанти антитіл можуть мати покращену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описано, наприклад, у
МО 1997/30087 (Раїє! єї аІ.); УУО 1998/58964 (Раїи, 5.) та МО 1999/22764 (Вас, 5.). с Варіанти Ес-ділянок
У певних варіантах здійснення одну або більше амінокислотних модифікацій можна зробити у Ес-ділянці запропонованого у цьому описі антитіла, тим самим генеруючи варіант ЕРс-ділянки.
Варіант ЕРс-ділянки може включати послідовність Ес-ділянки людини (наприклад, Ес-ділянки
ІС, Ідс2, ДОЗ або Ідс4 людини), яка має амінокислотну модифікацію (наприклад, заміщення) на одній або більше амінокислотних позиціях.
У певних варіантах здійснення винахід передбачає варіант антитіла, якому притаманні деякі, але не всі ефекторні функції, які роблять його бажаним кандидатом для застосування, при якому напівжиття антитіла іп мімо є важливим, при цьому певні ефекторні функції (такі як СОС та
АОСС) є необов'язковими або шкідливими. Аналізи цитотоксичності іп міїго та/або іп мімо, можна виконувати, щоб підтвердити зниження/виснаження активності СОС та/"або АОСС. Наприклад,
Зо аналізи зв'язування з рецептором Ес (Ес!) можна виконувати, щоб переконатися, що антитілу бракує зв'язування з Ес-гаММа-Е (внаслідок цього ймовірна недостатня активність АОСС), але воно зберігає спроможність зв'язування з ЕсАп. Первинні клітини для опосередковування
АРСС, клітини МК, експресують тільки Ес-таМмМа-ВІЇЙЇ, тоді як моноцити експресують Ес-гамма-
ВІ, Рс-тамМа-ВІЇ та Ес-гтамМа-ВІ. Експресію ЕсА на кровотворних клітинах узагальнено у
Таблиці З на сторінці 464 в статті Намеїсн апа Кіпеї, Аппи. Нем. Іттипої. 9:457-492 (1991).
Необмежувальні приклади аналізів іп міо для оцінювання активності АЮСС молекули, яка представляє інтерес, описано у патенті США Мо 5,500,362 (дивись, наприклад, НеїЇвігот еї аї.,
Ргос. Маг! Асад. сі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) та НеїЇбтот еї аї., Ргос. Маг! Асад. осі. ОБА 82:1499-1502 (1985); у патенті США Мо 5,821,337 (дивись Вгиддетапп еї аї., У. Ехр. Мед. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно, можна застосовувати способи нерадіоактивних аналізів (дивись, наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІ"М для проточної цитометрії (СеПТесНпо|оду, Іпс. Мошпіаїп Міему, СА); та нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуїюТох 96 (зареєстрована торговельна марка) (Рготеда, Мадізхоп, УМІ)). Корисні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеари периферійної крові (РВМС) та клітини-природні кілери (МК). Альтернативно або додатково, активність АЮСС молекули, що представляє інтерес, можна оцінювати іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, так, як описано у Сіупез еї аї., Ргос.
Маг! Асад. бсі. ОБА 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування з Сід можна також здійснювати, щоб підтвердити, що антитіло не спроможне зв'язуватися з Сід, та, як наслідок, йому бракує активності СОС. Дивись, наприклад, ЕГІ5ЗА зі зв'язуванням з Сід та СЗс у М/О2006/029879 та
МО2005/100402. Щоб оцінити активацію комплементу, можна виконувати аналіз СОС (дивись, наприклад, Саапо-Запіого еї аїЇ., )У. Іттипої. МеїШосдв 202:163 (1996); Стадд єї аї., Віоса 101:1045-1052 (2003); та Стадо еї аї., Віоса 103:2738-2743 (2004)). Визначення зв'язування з
ЕсНАп та кліренсу/напівжиття іп мімо можна також виконувати, застосовуючи відомі у цій галузі способи (дивись, наприклад, Реїкома вії аї., ІП. Іттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла із заміщенням одного або більше залишків Ес-ділянки: 238, 265, 269, 270, 297, 327 та 329 (патент США Мо 6,737,056). Такі мутанти Ес включають мутанти Ес із заміщеннями на двох або більше з наступних амінокислотних позицій: 265,269, 270, 297 та 327, включаючи, так званий, мутант Ес "САМА" із заміщенням залишків 265 та 297 на аланін (патент США Мо 7,332,581).
Описані певні варіанти антитіл із покращеним або ослабленим зв'язуванням з ЕсВп. (Дивись, наприклад, патент США Мо 6,737,056; МО 2004/056312 та 5пПівєїа5 еї аї., 9. Віо!ї. Спет. 9(2): 6591-6604 (2001)).
У певних варіантах здійснення варіант антитіла включає Ес-ділянку з одним або більше амінокислотними заміщеннями, які покращують АЮОСС, наприклад, заміщеннями на позиціях 298, 333 та/або 334 Ес-ділянки (Європейська номенклатура залишків).
У деяких варіантах здійснення у Ес-ділянці здійснюють зміни, які призводять до зміни (тобто покращення або ослаблення) зв'язування з Сід та/або комплементзалежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано у патенті США Мо 6,194,551, М/О1999/51642 та Ідизодіє єї аї.,
У. Іттипої. 164:4178-4184 (2000).
Антитіла з подовженим напівжиттям та покращеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Ес (ЕРсВп), який відповідає за перенесення материнських Ідеї плоду (Сишуег еї аї., у).
Іттипої. 117:587 (1976) та Кіт еї аї., У. Іттипої. 24:249 (1994)), описуються у 052005/0014934 (Ніпюп єї аї.). Ці антитіла включають Ес-ділянку з одним або більше заміщеннями в ній, які покращують зв'язування Ес-ділянки з ЕсНп. Такі варіанти Ес включають варіанти із заміщеннями на одному або більше залишках Ес-ділянки: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, із заміщенням залишку 434
Ес-ділянки (патент США Мо 7,371,826).
Дивись також Юипсап, Майте 322:738-40 (1988); патент США Мо 5,648,260; патент США
Мо 5,624,821 та МО 1994/29351, які розглядають інші приклади варіантів Ес-ділянки. й. Варіанти антитіл, сконструйовані з використанням цистеїну
У певних варіантах здійснення може бути бажаним створити антитіла, сконструйовані з використанням цистеїну, наприклад, "ШіомМАБр", у яких один або більше залишків антитіла заміщені залишками цистеїну. В особливих варіантах здійснення заміщення залишків здійснюють на доступних сайтах антитіла. Внаслідок заміщення цих залишків цистеїном реакційноздатні тіолові групи розташовуються на доступних сайтах антитіла, та їх можна застосовувати, щоб з'єднати антитіло з іншими складовими, такими як складові-ліки або складові "лінкер-ліки", щоб утворити імунокон'югат, як описано далі у цьому описі. У певних варіантах здійснення будь-який один або більше з наступних залишків можна замістити
Зо цистеїном: М205 (номенклатура Кебота) Ес-ділянки легкого ланцюга; А118 (Європейська номенклатура) Ес-ділянки важкого ланцюга та 5400 (Європейська номенклатура) Ес-ділянки важкого ланцюга. Антитіла, сконструйовані з використанням цистеїну, можна отримувати, як описано, наприклад, у патенті США Ко 7,521,541. е. Похідні антитіла
У певних варіантах здійснення запропоноване у цьому описі антитіло можна далі модифікувати так, щоб воно містило додаткові небілковоподібні складові, які відомі у цій галузі та легко доступні. Складові, придатні для отримання похідних антитіл, включають, проте не обмежуються ними, водорозчинні полімери. Необмежувальні приклади водорозчинних полімерів включають, проте не обмежуються ними, поліетиленгліколь (ПЕГ), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену і малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери), та декстран або полі(п-вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімери поліпропілен оксиду/етиленоксиду, поліоксиетиловані поліоли (наприклад, гліцерини), полівініловий спирт та їх суміші. Поліетиленгліколь-пропіональдегід може мати переваги під час виробництва завдяки його стійкості у воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу, та він може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до антитіла, може різнитися, та, якщо приєднаний більш ніж один полімер, вони можуть бути однаковими або різними молекулами. Зазвичай, кількість та/або тип полімерів, які застосовуються для отримання похідних, можна визначити на основі міркувань стосовно властивостей, які включають, проте не обмежуються ними, особливі властивості або функції антитіла, призначеного для покращення, щоб похідне антитіло застосовувалося під час терапії за визначених умов, тощо.
В іншому варіанті здійснення пропонуються кон'югати антитіла та небілковоподібної складової, яку можна вибірково нагрівати, піддавши опромінюванню. В одному варіанті здійснення небілюовоподібна складова - це вуглецева нанотрубка (Кат єї аї!., Ргос. Маї!. Асад. зЗсі. ОБА 102:11600-11605 (2005)). Опромінювання може мати будь-яку довжину хвилі, та воно має, проте не обмежується нею, довжину хвилі, яка не є шкідливою для звичайних клітин, але нагріває небілковоподібну складову до температури, при якій клітини, наближені до 60 небілковоподібної складової антитіла, гинуть.
В. Рекомбінантні способи та композиції
Антитіла можна отримати, застосовуючи рекомбінантні способи та композиції, наприклад, як описано у патенті США Мо 4,816,567. В одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло проти С5, описане у цьому описі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, яка включає УМ антитіла, та/або амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла (наприклад, легкий та/або важкий ланцюги антитіла). У подальшому варіанті здійснення пропонуються один або більше векторів (наприклад, вектори експресії), які включають таку нуклеїнову кислоту. У подальшому варіанті здійснення пропонується клітина-хазяїн, яка містить таку нуклеїнову кислоту. В одному такому варіанті здійснення клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована ними): (1) вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає Мі. антитіла, та амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла, або (2) перший вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає Мі. антитіла, та другий вектор, який включає нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка включає МН антитіла. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн - це еукаріотична клітина, наприклад, клітина яєчника китайського хом'яка (СНО), або лімфоїдна клітина (наприклад, клітина МО, М50, 5р20). В одному варіанті здійснення пропонується спосіб отримання антитіла проти С5, де спосіб включає культивування клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, як запропоновано вище, в умовах, придатних для експресії антитіла, та, довільно, отримання антитіла від клітини-хазяїна (або культурного середовища клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного отримання антитіла проти С5 нуклеїнову кислоту, яка кодує це антитіло, наприклад, як описано вище, виділяють та вставляють в один або більше векторів для подальшого клонування та/або експресії у клітині-хазяїні. Таку нуклеїнову кислоту можна легко виділити та секвенувати, застосовуючи традиційні способи (наприклад, застосовуючи олінуклеотидні зонди, які спроможні специфічно зв'язуватися з генами, які кодують важкий та легкий ланцюги антитіла).
Придатні клітини-хазяїни для клонування або експресії векторів, що кодують антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані у цьому описі. Наприклад, антитіла можна виробляти в бактеріях, особливо, коли глікозилування та ефекторні функції Ес не є
Зо потрібними. Стосовно експресії фрагментів антитіла та поліпептидів в бактеріях дивись, наприклад, патенти США МоМо 5,648,237, 5,789,199 та 5,840,523. (Дивись також Спапоп,
Метод іп Моїесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. І о, єд., Нитапа Ргев5, Тоїома, МУ, 2003), рр. 245- 254, де описується експресія фрагментів антитіла у Е. соїї). Після експресії антитіло можна виділити з бактеріальноклітинної пасти у вигляді розчинної фракції та далі очистити.
Окрім прокаріотичних, еукаріотичні мікроби, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, є придатними хазяїнами для клонування або експресії векторами, що кодують антитіло, та вони включають штами грибів та дріжджів, чиї каскади глікозилування "гуманізували", внаслідок чого отримують антитіло з частковим або повним профілем людського глікозилування. Дивись
Сегпдгов5, Маї. Віоїесн. 22:1409-1414 (2004), та | і єї а!., Маї. Віоїєсн. 24:210-215 (2006).
Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла також походять від багатоклітинних організмів (безхребетних та хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин та комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можна застосовувати у зв'язку з клітинами комах, особливо для трансфекції клітин 5родорієга
Тгидірегаа.
Як хазяїнів можна також застосовувати культури рослинних клітин. Дивись, наприклад, патенти США МоМо 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 та 6,417,429 (де описано технологію РІ АМТІВООІЕ5" для отримання антитіл у трансгенних рослинах).
Як хазяїнів можна також застосовувати клітини хребетних. Наприклад, можна застосовувати клітинні лінії ссавців, які адаптовані до росту у суспензії. Інші приклади корисних ліній клітин- хазяїнів ссавців - це лінія СУТ нирки мавпи, трансформована за допомогою 5У40 (СО5-7); лінія ембріональної нирки людини (293 або клітини 293, як описано, наприклад, у Стапат 6ї аї.,
У. еп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК); мишачі клітини
Сертолі (клітини ТМА4, як описано, наприклад, у Маїнег, Віої. Нергойд. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ1); клітини нирки африканської зеленої мартишки (МЕНВО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки сірого щура (ВА ЗА); клітини легеня людини (М/138); клітини печінки людини (Нер а2); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТВІ, як описано, наприклад, у Маїнег єї аІ,, Аппаї5 М.М. Асай. сі. 383:44-68 (1982); клітини МАС 5 та клітини Е54. Інші корисні лінії клітин-хазяїнів ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи бо клітини ОНЕВ" СНО (па еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 77:4216 (1980)); та мієломні клітинні лінії, такі як МО, М5О та 5рг2/0. Для огляду певних ліній клітин-хазяїнів ссавців, придатних для виробництва антитіла, дивись, наприклад, Магакі апа Ми, Меїнодз іп Моієсшціаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. Іо, єд., Нитапа Ргевз5, Тоїоула, МУ), рр. 255-268 (2003).
Поліклональні антитіла переважно утворюються у тваринах внаслідок численних підшкірних (5с) або внутрішньочеревних (ір) ін'єкцій відповідного антигену та ад'юванту. Може бути корисним кон'югувати відповідний антиген з білком, який є імуногенним для того виду тварин, що підлягає імунізації, наприклад, з гемоціаніном лімфи равлика, сироватковим альбуміном, бичачим тироглобуліном або соєвим інгібітором трипсину, застосовуючи при цьому біфункціональний або дериватизуючий агент, наприклад, малеімідобензоїл- сульфосукцинімідний естер (кон'югування через цистеїнові залишки), М-гідроксисукцинімід (через лізинові залишки), глютаральдегід, бурштиновий ангідрид, 5ОСІ» або В'М-С-МЕ, де В та
В! - це різні алкільні групи.
Тварин (зазвичай ссавців, які не є людиною) імунізують проти антигену, імуногенних кон'югатів або похідних шляхом поєднання 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кролів або мишей, відповідно) з З об'ємами повного ад'юванту Фрейнда та введення цього розчину шляхом крізьшкірної ін'єкції в численних місцях. За один місяць після цього тварин повторно стимулюють від 1/5 до 1/10 від оригінальної кількості пептиду або кон'югату у повному ад'юванті
Фрейнда шляхом підшкірної ін'єкції в численних місцях. За 7-14 днів після цього у тварин беруть кров, а сироватку аналізують щодо титру антитіла. Тварин стимулюють, поки титр не стабілізується. Переважно тварину стимулюють кон'югатом такого ж самого антигену, проте кон'югованого з відмінним білком та/або через інший реагент перехресного зшивання. Кон'югати можна також отримати у культурі рекомбінантних клітин як білки злиття. Крім того, агенти, які сприяють агрегації, такі як галун, придатним чином застосовуються для підсилення імунної реакції.
Моноклональні антитіла отримують з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, які складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій та/або посттрансляційних модифікацій (наприклад, ізомеризації, амідування), які можуть бути присутніми у незначних кількостях. Отже, термін "моноклональне" вказує на такий характер антитіла, коли воно не є сумішшю різних антитіл.
Наприклад, моноклональні антитіла можна отримати, застосовуючи спосіб гібридом, який вперше було описано Копіег єї аї!., Маште 256(5517):495-497 (1975). У способі гібридом мишу або іншу придатну тварину-хазяїна, таку як хом'як, імунізують, як описано вище у цьому описі, щоб утворити лімфоцити, які або виробляють, або спроможні виробляти антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, який застосовується для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можна імунізувати іп міїго.
Імунізуючий агент буде зазвичай включати антигенний білок або його варіант злиття.
Взагалі, застосовуються будь-які з лімфоцитів периферійної крові (РВІ), якщо бажаними є клітини, які походять від людини, або застосовуються клітини селезінки або клітини лімфатичних вузлів, якщо бажаними є джерела-ссавці, які не є людьми. Лімфоцити потім зливаються з безсмертними клітинними лініями із застосуванням придатного для злиття агенту, такого як поліетиленгліколь, щоб утворити гібридомну клітину (Сщдіпуд, Мопосіопа! Апііродіев:
Ргіпсірієз апа Ргасіїсе, Асадетіс Ргез5 (1986), рр. 59-103).
Безсмертні клітинні лінії - це зазвичай трансформовані клітини ссавців, зокрема, мієломні клітини, які походять від гризунів, великої рогатої худоби та людей. Зазвичай, застосовуються лінії мієломних клітин щурів або мишей. Отримані в такий спосіб гібридомні клітини сіють та вирощують у придатному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або більше речовин, які інгібують ріст або виживання незлитих початкових мієломних клітин. Наприклад, якщо початковим мієломним клітинам бракує ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (НОРАТ або НРАТ), то культуральне середовище для гібридом зазвичай включатиме гіпоксантин, аміноптерин та тимідин (середовище НАТ), які є речовинами, що попереджають ріст клітин з дефіцитом НОРЕТ.
Переважні безсмертні мієломні клітини - це клітини, які ефективно зливаються, підтримують стійке виробництво антитіла на високому рівні вибраними клітинами, що виробляють антитіло, та які є чутливими до середовища, такого як середовище НАТ. Серед них переважними є мієломні лінії мишей, наприклад, які походять від пухлин мишей МОРС-21 та МРО-11, доступних від ЗаїЇК Іпзійше Сеї! Оізтібшіоп Сепієг, Зап Оієдо, Са погпіа О5А, та клітин 5Р-2 (та їх похідних, наприклад, Х63-Аа8-653), доступних від Атегісап Туре Сийште СоППесіюп, Мапаззав, Мігаіпіа
БА. Лінії мієломних клітин людини та гетеромієломних клітин миші-людини для виробництва моноклональних антитіл людини також було описано (Когбог вї аї. У. Іттипої. 133(6):3001-3005
(1984); Вгодеиг єї а)., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіп Тесппіднез апа Арріїсайоп5, Магсе! Оеккег",
Іпс., Мем ХОІК, рр. 51-63 (1987)).
Культуральне середовище, у якому зростають гібридомні клітини, аналізується щодо виробництва моноклональних антитіл проти антигену. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, вироблених гібридомними клітинами, визначають за допомогою імунопреципітаційного аналізу або за допомогою аналізу зв'язування іп мійго, такого як радіоїмунологічний аналіз (ВІА) або твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІБЗА). Такі способи та аналізи відомі у цій галузі. Наприклад, афінність зв'язування можна визначити за допомогою аналізу Скетчарда, див. Мип5оп, Апаї. Віоспет. 107(1):220-239(1980).
Після ідентифікації гібридомних клітин, які виробляють антитіла бажаної специфічності, афінності та/або активності, ці клони можна субклонувати за допомогою способів обмежувального розведення та вирощувати за стандартними способами (Сюадіпд, вище).
Придатні культуральні середовища для цієї мети включають, наприклад, середовище О-МЕМ або ВРМІ-1640. Крім того, гібридомні клітини можна вирощувати іп мімо як пухлини у ссавця.
Моноклональні антитіла, які виділяються субклонами, придатним способом виділяють з культурального середовища, рідини асцитів або сироватки за допомогою традиційних способів очищення імуноглобуліну, таких як, наприклад, хроматографія на сефарозі з білком А, хроматографія на гідроксіапатиті, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія.
Антитіла можна отримати шляхом імунізації відповідної тварини-хазяїна проти антигену.
В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає повнорозмірний С5.
В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає бета-ланцюг (5ЕО ІЮ МО: 40) С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає домен Ма1-мМа2 (ЗЕО ІЮ МО: 43) бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає домен Ма (ЗЕО ІЮ МО: 41) бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 19 до 180 бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає ділянку, яка відповідає амінокислотам на позиціях від 33 до 124 бета-ланцюга С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає принаймні один фрагмент, вибраний з амінокислот 47-57, 70-76 та 107-110 бета-ланцюга (5ЕО ІЮ МО: 40) С5. В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає фрагмент бета-ланцюга С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з ТНг47, с1ши48, АІа49, Рпебо,
А5р5б1, АіІаб2, ТАг53, І уз57, Ніз70, Ма171, Ніз72, Зег74, Сіши76, МаІ107, Зет08, І уз109 та Нів110.
В одному варіанті здійснення антиген - це поліпептид, який включає фрагмент бета-ланцюга С5, який включає принаймні одну амінокислоту, вибрану з групи, що складається з С1Іш48, Авзро1,
Ніз70, Нів72, Гуз109 та Ніб110. У цей винахід також включено антитіла, отримані внаслідок імунізації тварини проти антигену. Ці антитіла можуть включати будь-які ознаки, окремо або у комбінації, як описано вище у розділі "Приклади антитіл проти С5".
С. Аналізи
Запропоновані у цьому описі антитіла проти С5 можна ідентифікувати, піддавати скринінгу або характеризувати щодо їх фізичних/хімічних властивостей та/або різних видів біологічної активності за допомогою різноманітних аналізів, відомих у галузі. 1. Аналізи зв'язування та інші аналізи
В одному аспекті антитіло винаходу тестують щодо його активності зв'язування з антигеном, наприклад, за допомогою відомих способів, таких як ЕЇГІ5БА, вестерн-блотинг, ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) тощо.
В іншому аспекті конкурентні аналізи можна застосовувати для того, щоб ідентифікувати антитіло, яке конкурує за зв'язування з С5 з антитілом проти С5, описаним у цьому описі.
У певних варіантах здійснення, коли таке конкуруюче антитіло присутнє у надмірній кількості, воно блокує (наприклад, ослаблює) зв'язування посилального антитіла з С5 принаймні на 10 95, 15 96, 20 то, 25 то, Зо то, 35 то, 40 то, 45 то, 50 Зо, 25 о, 6о0 то, 65 то, 70 то, 75595 або більше.
У деяких випадках зв'язування інгібується принаймні на 80 95, 85 95, 90 95, 9595 або більше.
У певних варіантах здійснення таке конкуруюче антитіло зв'язується з таким самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), який зв'язується антитілом проти С5, описаним у цьому описі (наприклад, антитілом проти С5, наведеним у Таблиці 2). Докладні приклади способів картування епітопу, з яким зв'язується антитіло, наведено у Моіїтів, "Еріоре
Марріпа Ргоюсої!в5, " в Меїтоавз іп Моїесшаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргезз, Тоїоуа, МУ) (1996).
У прикладі конкурентного аналізу іммобілізований С5 інкубується у розчині, який містить перше мічене (посилальне) антитіло, яке зв'язується з С5, та друге немічене антитіло, яке тестується щодо його спроможності конкурувати з першим антитілом за зв'язування з С5. Друге бо антитіло може бути присутнім у надосадовій рідині гібридоми. Як контрольний, іммобілізований
С5 інкубується у розчині, який включає перше мічене антитіло, проте не включає друге немічене антитіло. Після інкубування в умовах, які сприяють зв'язуванню першого антитіла з С5, решта незв'язаного антитіла видаляється та вимірюється кількість міток, асоційованих із іммобілізованим С5. Якщо кількість міток, асоційованих з іммобілізованим С5, є суттєво зниженою у випробовуваному зразку порівняно з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з С5. Дивись Напом апа ІГапе,
Апіїродієв: А І арогаїогу Мапиаї! сп.14 (Соїд Зргіпуд Нагбог І арогаїгу, Соїй 5ргіпд Набог, МУ) (1988).
В іншому прикладі конкурентного аналізу застосовується аналіз ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) для визначення спроможності випробовуваного антитіла проти С5 конкурувати за зв'язування з С5 з другим (посилальним) антитілом проти С5. У подальшому аспекті, у якому прилад ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) (наприклад, ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) 3000) застосовується згідно з рекомендаціями виробника, білок С5 захоплюється на чип СМ5 ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) за допомогою стандартного відомого у галузі способу для того, щоб отримати поверхню з нанесеним С5.
Зазвичай 200-800 резонансних одиниць С5 зчіплюються з чипом (це така кількість, яка дозволяє легко вимірювати рівні зв'язування, але яку можна легко насичити при концентраціях випробовуваного антитіла, що застосовуються). Два антитіла (тобто, випробовуване та посилальне антитіла), які слід оцінювати стосовно їх спроможності конкурувати одне з одним, змішують при молярному співвідношенні 1:11 сайтів зв'язування у придатному буфері, щоб утворити суміш, що тестується. Коли концентрації розраховують на основі сайту зв'язування, тоді вважають, що молекулярна маса випробовуваного або посилального антитіла є загальною молекулярною масою відповідного антитіла, поділеною на кількість сайтів зв'язування з С5 на антитілі. Концентрація кожного антитіла (тобто, випробовуваного та посилального антитіл) у суміші, що тестується, мусить бути достатньо високою, щоб легко насичити сайти зв'язування для цього антитіла на молекулах С5, захоплених на чипі ВІАСОРНЕ (зареєстрована торговельна марка). Випробовуване та посилальне антитіла у суміші мають однакову молярну концентрацію (на основі зв'язування), яка зазвичай становить від 1,00 до 1,5 мікромоль (на основі сайту зв'язування). Також готують окремі розчини, які містять тільки випробовуване антитіло та тільки
Зо посилальне антитіло. Випробовуване антитіло та посилальне антитіло у цих розчинах мають бути в однаковому буфері та мати однакову концентрацію та однакові умови з умовами для суміші, що тестується. Суміш, яка тестується та яка містить випробовуване антитіло та посилальне антитіло, пропускається над чипом ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) з нанесеним С5, та реєструється загальна кількість зв'язувань. Чип потім обробляють таким
З5 чином, щоб видалити зв'язане випробовуване антитіло або посилальне антитіло, не пошкоджуючи при цьому зв'язаний з чипом С5. Зазвичай, це виконується шляхом обробки чипа мМ НС протягом 60 секунд. Розчин тільки випробовуваного антитіла потім пропускають над поверхнею з нанесеним С5 та реєструють кількість зв'язувань. Чип знов обробляють так, щоб видалити усе зв'язане антитіло, не пошкоджуючи при цьому зв'язаний з чипом С5. Розчин тільки посилального антитіла потім пропускають над поверхнею з нанесеним С 5 та реєструють кількість зв'язувань. Потім розраховують максимальне теоретичне зв'язування суміші випробовуваного антитіла та посилального антитіла, та це є сумою зв'язування кожного антитіла (тобто, випробовуваного та посилального), коли їх окремо пропускають над поверхнею з С5. Якщо дійсно зареєстроване зв'язування суміші є меншим, ніж цей теоретичний максимум, то випробовуване антитіло та посилальне антитіло конкурують один з одним за зв'язування з
С5. Отже, взагалі, конкуруюче випробовуване антитіло проти С5 - це антитіло, яке буде зв'язуватися з С5 у вищеописаному аналізі блокування ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка), так що під час аналізу та у присутності посилального антитіла проти С5 зареєстроване зв'язування становить від 80 95 до 0,1 95 (наприклад, між 80 95 » до 4 95) від максимального теоретичного зв'язування, специфічно від 75595 до 0,195 (наприклад, 75595 - 4905) від максимального теоретичного зв'язування та більш специфічно від 70 95 до 0,1 95 (наприклад, 7095 - 45905) від максимального теоретичного зв'язування (як визначається вище) випробовуваного антитіла та посилального антитіла у комбінації.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з антитіла СЕАОЗ341 та СЕАОЗЗО. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, вибраним з:
СЕАОБ538, СЕРАОБО1, СЕРАОБ99, СЕАОЗО7, СЕАОЗбб, СЕАОб75 та СЕАОбЄ72. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕАОЗ29. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕАОб66.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ антитіла СЕАОЗО5 або 3051 05.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару УН та МІ, вибрану з:
СЕАОБ538, СЕРАОБО1, СЕРАОБ99, СЕАОЗО7, СЕАОЗб6б, СЕАОбЄ75 та СЕАОб672. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом СЕРАОб66б6. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн. У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі антитіла
СЕАОЗО5 або 3051 05. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІО МО: 26, або МН за 5ЕО ІО МО: 21 та МІ за 5ЕО ІО МО: 25. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 15; (5) МН за 5ЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 14; (с) МН зазЕО1ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 16; (8) МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 12; (є) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; (І) МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО І МО: 11; (9) МН за 5ЕОІЮ МО: 9 та МІ за 5ЕО ІО МО: 19; (п) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІО МО: 17; та (ї)
МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО ІО МО: 18. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає МН за 5ЕО ІО МО: 23 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 27. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 конкурує за зв'язування з С5 з антитілом, яке включає МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за БЕО ІО МО: 17.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО І
МО: 11; (5) МН за 5ЕО ІО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІО МО: 26; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 21 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 25; (4) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за 5ЕО ІО МО: 15; (є) МН за 5ЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 14; () МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІО МО: 16; (9) МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 12; (п) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; (Ї) МН за 5ЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЗЕО
ІО МО: 19; Ю) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІО МО: 17; (К) МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО
ІО МО: 18; (1) МН за 5ЕО ІО МО: 23 та МІ за 5ЕО ІО МО: 27; та (т) МН за 5ЕО ІО МО: 10 та МІ за
ЗЕО І МО: 20.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з (а) МН за 5ЕО ІО МО: 22 та МІ за 5ЕО ІЮ
МО: 26; (5) МН за 5ЕО ІО МО: 21 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 25; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за 5ЕО І
МО: 15; (8) МН за 5ЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 14; (є) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО Ір
МО: 16; ()) МН за 5ЕО ІО МО: 2 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 12; (9) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО Ір
МО: 13; (п) МН за 5ЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЕО ІО МО: 19; (ї) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО Ір
МО: 17; (Ї) МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО ІО МО: 18; (К) МН за 5ЕО ІО МО: 23 та МІ за 5ЕО Ір
МО: 27.
У певних варіантах здійснення антитіло проти С5 цього винаходу конкурує за зв'язування з
С5 з антитілом, яке включає пару МН та Мі, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО І МО: 11, або МН за 5ЕО ІО МО: 10 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 20.
У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рН. У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рн, ніж при кислотному рн, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за БЕО І МО: 1 та Мі за 5ЕО ІЮ МО: 11; (5) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за 5ЕО ІО МО: 15; (с) МН за 5ЕО ІЮО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 14; (8) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 16; (є) МН за 5ЕО ІЮ МО: 2 та МІ за БЕО ІО МО: 12; (У) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; (9) МН за 5ЕО ІЮ МО: 9 та МІ за 5ЕО ІО МО: 19; (п) МН за 5ЕО ІО МО: 7 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 17; (ї) МН за 5ЕО І МО: 8 та МІ за 5ЕО ІО МО: 18; та () МН за 5ЕО ІЮО МО: 10 та МІ за 5ЕО ІО МО: 20. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке 60 включає пару МН та МІ, вибрану з: (а) МН за 5ЕО ІО МО: 5 та МІ за 5ЕО ІО МО: 15; (В) УН за
ЗЕО ІО МО: 4 та МІ за 5ЕО ІЮО МО: 14; (с) МН за 5ЕО ІО МО: 6 та МІ за 5ЕО ІО МО: 16; (а) МН за
ЗЕО ІЮО МО: 2 та МІ за 5ЕО ІО МО: 12; (є) МН за 5ЕО ІО МО: З та МІ за 5ЕО ІО МО: 13; (У МН за
ЗЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІО МО: 11; (4) МН за 5ЗЕО ІО МО: 9 та МІ за 5ЕО ІО МО: 19; (п) МН за
ЗЕО ІЮ МО: 7 та МІ за 5ЕО ІО МО: 17; та () МН за 5ЕО ІО МО: 8 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 18. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7.4, ніж при рН 5,8.
У деяких варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при нейтральному рнН, ніж при кислотному рН, та конкурує за зав'язування з С5 з антитілом, яке включає пару МН та МІ, вибрану з МН за 5ЕО ІО МО: 1 та МІ за 5ЕО ІО МО: 11 або МН за 5ЕО Ір
МО: 10 та МІ за 5ЕО ІЮ МО: 20. У подальших варіантах здійснення антитіло проти С5 зв'язується з С5 з вищою афінністю при рн 7,4, ніж при рН 5,8.
У певних варіантах здійснення, чи зв'язується антитіло проти С5 цього винаходу з певним епітопом, можна визначити наступним чином: точкові мутанти С5, у яких амінокислота (за виключенням аланіну) в С5 заміщена аланіном, експресують у клітинах 293, та зв'язування антитіла проти С5 з мутантами С5 тестують за допомогою ЕГІ5А, вестерн-блотингу або
ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка); де суттєве ослаблення або припинення зв'язування антитіла проти С5 з мутантом С5 відносно його зв'язування з природним С5 вказує на те, що антитіло проти С5 зв'язується з епітопом, який включає таку амінокислоту в С5. У певних варіантах здійснення амінокислота в С5, яку слід замістити аланіном, вибирається з групи, що складається з С1Іш48, Авроб1, Нів70, Нів72, І у«109 та Ніз110 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІЮ
МО: 40). У подальших варіантах здійснення амінокислота в С5, яку слід замістити аланіном, - це
Азр51 або І угІО9 бета-ланцюга С5 (ЗЕО ІЮ МО: 40).
В іншому варіанті здійснення, чи зв'язується антитіло проти С5 з характеристиками залежного від рН зв'язування з певним епітопом, можна визначити наступним чином: точкові мутанти С5, у яких залишок гістидину в С5 заміщений іншою амінокислотою (наприклад, тирозином), експресують у клітинах 293, та зв'язування антитіла проти С5 з мутантами С5 тестують за допомогою ЕГІЗА, вестерн-блотингу або ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка); де суттєве ослаблення зв'язування антитіла проти С5 з природним С5 при кислотному рН відносно його зв'язування з мутантом С5 при кислотному рН, вказує на те, що антитіло проти
С5 зв'язується з епітопом, який включає такий залишок гістидину в С5. У подальших варіантах здійснення зв'язування антитіла проти С5 з природним С5 при нейтральному рН суттєво не ослаблюється відносно його зв'язування з мутантом С5 при нейтральному рН. У певних варіантах здійснення залишок гістидину в С5, який слід замістити іншою амінокислотою, вибирається з групи, що складається з Нів70, Ніз72 та Ніб110 бета-ланцюга С5 (5ЕО ІО МО: 40).
У подальшому варіанті здійснення залишок гістидину Ніб70 заміщений тирозином. 2. Аналізи активності
В одному аспекті пропонуються аналізи для ідентифікації антитіл проти С5, які мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, інгібування активності
С5, перешкоджання розщепленню С5, внаслідок якого утворюються Сба та С5р, блокування доступу конвертази С5 до сайту розщеплення в С5, блокування гемолітичної активності, спричиненої активацією С5, тощо. Також пропонуються антитіла, які мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міїко.
У певних варіантах здійснення антитіло винаходу тестується щодо такої біологічної активності.
У певних варіантах здійснення, чи інгібує випробовуване антитіло розщеплення С5 на С5ба та С5р, визначається за способами, описаними у, наприклад, Ізєптап єї аї., У Іттипо). 124(1):326-331 (1980). В іншому варіанті здійснення це визначається за способами специфічного виявлення розщеплених білків Сба та/або С5Ь, наприклад, за допомогою ЕГІЗА або вестерн-блотингу. Там, де знижена кількість продукту розщеплення С5 (тобто С5ба та/або
С5рЬ) виявляється у присутності випробовуваного антитіла (або внаслідок контакту з ним), випробовуване антитіло ідентифікують як антитіло, яке спроможне інгібувати розщеплення С5.
У певних варіантах здійснення концентрацію та/або фізіологічну активність Сба можна виміряти за допомогою способів, наприклад, хемотаксичних аналізів, ВІА або ЕГІ5А (Дивись, наприклад,
Мага апа 7чуашек 4. Сііп. Іпмеві. 50(3):606-616 (1971)).
У певних варіантах здійснення, чи блокує випробовуване антитіло доступ конвертази С5 до
С5, визначається за способами виявлення білкових взаємодій між конвертазою С5 та С5, наприклад, ЕГІЗА або ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка). Там, де взаємодії ослаблюються у присутності випробовуваного антитіла (або внаслідок контакту з ним), випробовуване антитіло ідентифікується як антитіло, яке спроможне блокувати доступ 60 конвертази С5 до С5.
У певних варіантах здійснення активність С5 можна виміряти як функцію його спроможності лізу вати клітини у рідинах організму суб'єкта. Спроможність С 5 лізувати клітини або зменшувати їх кількість можна виміряти за добре відомими у галузі способами, наприклад, за допомогою традиційного гемолітичного аналізу, такого як аналіз гемолізу, описаний Кабаї апа
Мауєг (єдз), Ехрегітепіа! Іттипоспетівігу, 2па Еайоп, 135-240, 5ргіпрдтєЇїа, 1, Сб Тнпотав (1961), сторінки 135-139, за допомогою традиційного варіанта такого аналізу, такого як спосіб гемолізу еритроцитів курчати, як описано у, наприклад, Нійтеп еї аї., М. Епаї. У. Меа. 350(6): 552-559 (2004). У певних варіантах здійснення активність С5 або її інгібування кількісно визначається за допомогою аналізу СН5бед. Аналіз СН5Оєд - це спосіб вимірювання загальної класичної активності комплементу у сироватці. Цей тест - це аналіз лізису, при якому застосовуються сенсибілізовані антитілом еритроцити як активатор класичного шляху комплементу та різні розведення випробовуваної сироватки для визначення кількості, необхідної для того, щоб відбувся 50 95 лізис (СН5О). Відсоткове відношення гемолізу можна визначити, наприклад, застосовуючи спектрофотометр. Аналіз СН5ООєд дозволяє виконувати непряме вимірювання утворення комплексу кінцевого комплементу (ТСС), оскільки самі по собі
ТСС безпосередньо відповідають за гемоліз, який вимірюється. Інгібування активації С5 можна також виявити та/або виміряти, застосовуючи способи, які описані далі, та приклади яких наведено у робочих прикладах. Застосовуючи аналізи цих або інших придатних типів, можна зробити скринінг антитіл-кандидатів, спроможних інгібувати активацію С5. У певних варіантах здійснення інгібування активації С5 включає зниження активації С5 в аналізі принаймні на 5 95, 10 96, 1595, 20 95, 2595, З0 90, 35 95 або 40 95 або більше порівняно з ефектом негативного контрольного антитіла в подібних умовах. У деяких варіантах здійснення це стосується інгібування активації С5 принаймні на 45 95, 50 95, 55 95, 60 Зо, 65 Ус, 70 90, 75 о, 80 95, 85 9, 90 95 або 95 95 або більше. р. Імунокон'югати
У деяких варіантах здійснення винаходом пропонуються імунокон'югати, які включають розкрите у цьому описі антитіло проти С5, кон'юговане з одним або більше цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти або ліки, агенти інгібування росту, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового,
Зо рослинного або тваринного походження, або їх фрагменти), або радіоактивні ізотопи.
В одному варіанті здійснення імунокон'югат - це кон'югат антитіло-ліки (АОС), у якому антитіло кон'юговано з одним або більше ліками, включаючи, проте не обмежуючись ними, майтанзиноїд (дивись патенти США МоМо 5,208,020, 5,416,064 та європейський патент ЕР 0 425 235 ВІ); ауристатин, такий як складові ОЕ та ОРЕ лікарського засобу монометилауристатин (ММАЕ та ММАБЕ) (дивись патенти США МоМо 5,635,483, та 5,780,588, та 7,498,298); доластатин; каліхеміцин або його похідне (дивись патенти СШАМоМо 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 та 5,877,296; Ніптап єї аї!., Сапсег Нез. 53:3336-3342 (1993); та І оде єї а)І., Сапсег Вев. 58:2925-2928 (1998)); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (дивись Кгаї? єї а!., Ситепі Мед. Спет. 13:477-523 (2006); Уейнтеу евї а!., Віоогдапіс а Мед. Спет. І ейеге 16:358-362 (2006); Тогдом евї аї., Віосопі. Снет. 16:717-721 (2005); Маду еї а!І., Рос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 97:829-834 (2000); Виромснік еї аї!., Віоога. 2 Мед. Снет. І ейетв 12:1529-1532 (2002); Кіпд єї аїЇ.,, 9. Мей. Спет. 45:4336-4343 (2002); та патент США
Мо 6,630,579); метотрексат; віндезин; таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел та ортатаксел; трихотецен; та СС1065.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат включає антитіло, як описано у цьому описі, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи, проте не обмежуючись ними, А-ланцюг дифтерії, незв'язувальні активні фрагменти токсину дифтерії, А- ланцюг екзотоксину (з Рзепдотопах аєгидіпоза), А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки АїІешпіез огаї, діантинові білки, білки Рнуюїіаса Атегісапа (РАРІ,
РАРП та РАР-5), інгібітор, одержаний з гіркого огірка (тотогаїса сНагапійа), курцин, кротин, інгібітор, одержаний з мильнянки лікарської (зараопагла оНісіпа|і5), гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трикотецен.
В іншому варіанті здійснення імунокон'югат включає описане у цьому описі антитіло, кон'юговане з радіоактивним атомом, щоб утворити радіоактивний кон'югат. Для виробництва радіоактивних кон'югатів доступні різноманітні радіоактивні ізотопи. Приклади включають А", 91, 25, мо Де!86, Ве88,. пз, Віг12, рзг, Ррг!2 та радіоактивні ізотопи І и. Коли радіоактивний кон'югат застосовується для виявлення, тоді він може включати радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад їс99т або 1123, або спін-мітку для здійснення ядерної магнітно-резонансної (ММА) томографії (також відома як магнітно-резонансна томографія, тії),
таку як йод-123 ("іодіпе-123 адаїп"), йод 131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, магній та залізо.
Кон'югати антитіла та цитотоксичного агента можна отримати, застосовуючи різноманітні агенти зшивання біфункціональних білків, такі як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), сукцинімідил-4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоестерів (такі як диметиладипімідат НС), активні естери (такі як дисукцинімідил суберат), альдегіди (такі як глютаральдегід), біс-азидні сполуки (такі як біс(р- азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(р-діазонійбензоїл)-етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол 2,6-діїзоціанат) та біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4- динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин можна отримати, як описано у МіїеНа 6вї аї.,
Зсіепсе 238:1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилен- триамінопентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) - це приклад хелатуючого агента для кон'югування радіоактивного нуклеотиду з антитілом. Дивись УУ094/11026. Лінкер може бути "лінкером, який може розщеплюватися" та який сприяє вивільненню цитотоксичних ліків у клітині. Наприклад, можна застосовувати нестійкий до кислоти лінкер, чутливий до пептидази лінкер, нестійкий до світла лінкер, диметиловий лінкер або лінкер, що містить дисульфід (СпНаїгі єї а!., Сапсег Везв.
Б2:127-131 (1992); патент США Мо 5,208,020).
Імунокон'югати або кон'югати антитіло-ліки (АОС), описані у цьому описі, які особливо передбачаються, проте не обмежуються ними, - це такі кон'югати, які отримані за допомогою реагентів перехресного зшивання, які включають, проте не обмежуються ними, ВМР5, ЕМСО5,
СМВ5, НВУБ5, І 0-5МСС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, 5ІАВ, МОСС, 5МРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМО5, сульфо-С2МВ5, сульфо-КМИ5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-5МОС, та сульфо-5МРВ, та
ЗУЗВ (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від
Рієгсе Віотеснпоіоду, Іпс., Восктога, ІС., 0.5. А).
Е. Способи та композиції для діагностики та виявлення
У певних варіантах здійснення будь-яке запропоноване у цьому описі антитіло проти С5 є корисним для виявлення присутності С5 у біологічному зразку. Термін "виявлення", як застосовується у цьому описі, охоплює кількісне та якісне виявлення. У певних варіантах здійснення біологічний зразок включає клітину або тканину, таку як сироватка, суцільна кров, плазма, зразок біопсії, зразок тканини, клітинна суспензія, слина, мокротиння, ротова рідина, спинномозкова рідина, навколоплідна рідина, асцитна рідина, молоко, молозиво, виділення молочної залози, лімфа, сеча, піт, слізна рідина, шлунковий сік, синовіальна рідина, рідина черевної порожнини, внутрішньоочна рідина та слиз.
В одному варіанті здійснення пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі діагностики або виявлення. У подальшому аспекті пропонується спосіб виявлення присутності
С5 у біологічному зразку. У певних варіантах здійснення спосіб включає контактування біологічного зразка з антитілом проти С5, як описано у цьому описі, в умовах, які дозволяють антитілу проти С5 зв'язуватися з С5, та виявлення того, чи утворився комплекс між антитілом проти С5 та С5. Такий спосіб може бути способом іп мйто або іп мімо. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 застосовується для вибору суб'єктів, придатних для лікування антитілом проти С5, наприклад коли С5 є біологічним маркером вибору пацієнтів.
В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб вибору індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, та який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, та (Б) вибір індивідуума, що є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума. В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб вибору терапії для індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, та (Б) вибір терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, для індивідуума, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення спосіб включає (а) виявлення генетичної варіації у С5, що походить від індивідуума, (Б) вибір індивідуума, який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, коли ця генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума, та (с) введення антитіла проти С5 цього бо винаходу індивідууму.
В іншому варіанті здійснення пропонується антитіло проти С5 цього винаходу для застосування під час лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення індивідуума лікують антитілом проти С5 цього винаходу, коли генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
В іншому варіанті здійснення пропонується застосування іп міїго генетичної варіації у С5 для вибору індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, та який є придатним для терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу. У певних варіантах здійснення індивідуум вибирається як такий, що є придатним для терапії, коли ця генетична варіація виявляється у
С5, що походить від індивідуума. В іншому варіанті здійснення пропонується застосування іп міо генетичної варіації у С5 для вибору терапії для індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5.
У певних варіантах здійснення терапія, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, вибирається для індивідуума, коли генетична варіація виявляється у С5, що походить від індивідуума.
Повідомлялося, що деякі пацієнти, які мають генетичну варіацію у С5, демонструють слабку реакцію на терапію, яка включає існуюче антитіло проти С5 (Мібпітига еї аї., М. Епді. У. Мед. 370:632-639 (2014)). Рекомендується, щоб такого пацієнта лікували за допомогою терапії, яка включає антитіло проти С5 цього винаходу, оскільки таке антитіло має інгібуючу активність на активацію варіантів С5, а також природного С5, як показано у робочих прикладах далі.
Виявлення генетичної варіації у С5 можна здійснювати, застосовуючи спосіб, відомий з попереднього рівня техніки. Такий спосіб може включати секвенування, ПЛР (РСР), ПЛР зі зворотною транскриптазою (ВТ-РСЕ) та спосіб на основі гібридизації, такий як саузерн-блотинг або нозерн-блотинг, проте спосіб не обмежується ними. Варіанти С5 можуть включати принаймні одну генетичну варіацію. Генетичну варіацію можна вибрати з групи, яка складається з МІ451, 84492, У802І, В885Н, 9280, 096бМ, 51310М та Е14370. У цьому описі А885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином.
У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до біологічної
Зо активності природного С5.
Приклади розладів, які можна діагностувати із застосуванням антитіла винаходу, включають ревматоїдний артрит (ВА); системний червоний вовчак (5ІЕ); вовчаковий нефрит; ішемічне реперфузійне пошкодження (ІІ); астму; пароксизмальну нічну гемоглобінурію (РМН); гемолітично-уремічний синдром (НО) (наприклад, атиповий гемолітично-уремічний синдром (аниб5)) хворобу щільного осаду (000); оптикомієліт (ММО); багатофокальну моторну невропатію (МММ); множинний склероз (М); системний склероз; макулярну дегенерацію (наприклад, пов'язану з віком макулярну дегенерацію (АМО)); синдром гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГ І Р); тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР); спонтанну втрату плоду; бульозний епідермоліз; рецидивну втрату плоду; пре- еклампсію; черепно-мозкову травму; важку міастенію; хворобу холодової аглютинації; синдром
Сегрена; дерматоміозит; бульозний пемфігоїд; фототоксичні реакції; гемолітичний уремічний синдром, пов'язаний з токсином Шига Е. соїї; типовий або інфекційний гемолітичний уремічний синдром (НО); гломерулонефрит С3З3; васкуліт, пов'язаний з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморальне та васкулярне відторгнення трансплантату; опосередковане антитілом гостре відторгнення (АМЕА); дисфункцію трансплантації; інфаркт міокарду; алогенний трансплантат; сепсис; ішемічну хворобу серця; вроджений ангіоневротичний набряк; дерматоміозит; хворобу Грейвса; атеросклероз; хворобу
Альцгеймера (Аб); хворобу Гантінгтона; хворобу Крейцфельда-Якоба; хворобу Паркінсона; різні види раку; поранення; септичний шок; пошкодження спинного мозку; увеїт; пов'язані з діабетом очні хвороби; ретролентальну фіброплазію; гломерулонефрит; мембранний нефрит; ІдА- нефропатію; синдром гострої респіраторної недостатності у дорослих (АНВОБ); хронічне обструктивне захворювання легенів (СОР); муковісцидоз; гемолітичну анемію; пароксизмальну холодову гемоглобінурію; анафілактичний шок; алергію; остеопороз; остеоартрит; аутоїмунний тиреоїдит; діабет типу І; псоріаз; звичайну пузирчатку; аутоїмунну гемолітичну анемію (АІНА); ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ІГР); синдром Гудпасчера; хворобу Дегоса; антифосфоліпідний синдром (АРБ); катастрофічний АР5 (САРБ); серцево-судинний розлад; міокардит; церебрально-судинний розлад; розлад периферійних судин; вазоренальний розлад; мезентеральний/ентеральний судинний розлад; васкуліт; нефрит пурпури Шенлейна-Геноха; хворобу Такаясу; дилатаційну кардіоміопатію; діабетичну ангіопатію; хворобу Кавасакі (артрит); бо венозний газовий ембол (МОЄ); рестеноз після встановлення стента; ротаційну атеректомію;
мембранну нефропатію; синдром Гійена-Барре; синдром Фішера; індукований антигеном артрит; синовіальне запалення; вірусні інфекції; бактеріальні інфекції; грибкові інфекції та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу.
У певних варіантах здійснення пропонуються мічені антитіла проти С5. Мітки включають, проте не обмежуються ними, мітки або складові, які виявляються безпосередньо (такі як флуоресцентні, хромофорні мітки, непроникні для електронів мітки, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також складові, такі як ферменти або ліганди; які виявляються опосередковано, наприклад, через ферментативну реакцію або молекулярну взаємодію.
Приклади міток включають, проте не обмежуються ними, радіоіїзотопи З2Р, 140, 1251 ЗН та "1, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних елементів або флюоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, данзил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люцифераза світлячка та бактеріальна люцифераза (патент США Мо 4,737,456), люциферин, 2,3- дигідрофталазиндіони, пероксидазу хріну (НАР), лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази сахаридів, наприклад, оксидазу глюкози, оксидазу галактози та глюкоза-б6-фосфат дегідрогеназу, гетероциклічні оксидази, такі як уриказа та ксантиноксидаза, зчеплені з ферментом, який застосовує пероксид водню, щоб окислити початковий барвник, такий як НАР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/авідин, спін-мітки, бактеріофагові мітки, стійкі вільні радикали та їм подібне.
Е. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади антитіла проти С5, як описано у цьому описі, отримують шляхом змішування такого антитіла, яке має бажаний ступінь чистоти, з одним або більше довільними фармацевтично прийнятними носіями (Кетіпдіоп'є Рнаптасешіса! Зсієпсез 161й еайіоп, Озвої, А.
ЕЯ9. (1980)), у формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії є зазвичай нетоксичними для реципієнтів у дозах та концентраціях, що застосовуються, та вони включають, проте не обмежуються ними: буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; антиоксиданти, які включають аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол; бутил або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол та т-крезол); низькомолекулярні (менш ніж
Зо приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕОТА; цукри, такі як цукроза, маніт, трегалоза або сорбіт; противоіїони, що утворюють сіль, такі як натрій; металеві комплекси (наприклад, комплекси 2п-білок) та/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (РЕС). У цьому описі приклади фармацевтично прийнятних носіїв також включають агенти диспергування ліків у міжклітинному просторі, такі як розчинні нейтрально- активні гіалуронідазні глікопротеїни (5зНАБЕСР), наприклад, розчинні гіалуронідазні глікопротетни людини РН-20, такі як "НиРН2гО (НМІ ЕМЕХ (зареєстрована торговельна марка),
Вахієг Іпіегаїйопаї, Іпс.). Певні приклади 56НАБЕСР та способи їх застосування, включаючи
ІНиРН2О, описано у публікаціях США МоМо 2005/0260186 та 2006/0104968. В одному аспекті 5НАБЕСР поєднується з однією або більше додатковими глікозамінгліканазами, такими як хондроїтинази.
Приклади ліофілізованих фармацевтичних складів антитіла описано у патенті США
Мо 6,267,958. Водні фармацевтичні склади антитіла включають склади, описані у патенті США
Мо 6,171,586 та М/О 2006/044908, при цьому фармацевтичні склади з останнього посилання включають гістидин-ацетатний буфер.
У цьому описі фармацевтичний склад може також містити більш ніж один активний інгредієнт, якщо це необхідно для особливого показання лікування, переважно ті інгредієнти, що мають сумісні види активності, які не впливають шкідливо один на одного. Такі активні інгредієнти придатним чином присутні у комбінації у кількості, яка є ефективною для призначеної мети.
Активні інгредієнти можуть бути поміщені у мікрокапсули, отримані, наприклад, за способами коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, мікрокапсули з гідроксиметилцелюлози або желатинові мікрокапсули та мікрокапсули з полі-(метил- метакрилату), відповідно, у колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікрокульки, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або у макроемульсії. Такі способи описано у Ветіпдіоп'є Рнаппасешіса! бсіепсез 161 еайіоп, Оз5ої, А. Еа. (1980).
Можна отримати препарати з уповільненим вивільненням. Придатні приклади препаратів з бо уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів,
що містять антитіло, при цьому матриці - це сформовані вироби, наприклад, плівки або мікрокапсули.
Фармацевтичні склади, які призначені для введення іп мімо, є зазвичай стерильними.
Стерильності можна легко досягти, наприклад, за допомогою фільтрування крізь стерильні фільтраційні мембрани. а. Терапевтичні способи та композиції
Запропоноване у цьому описі антитіло проти С5 можна застосовувати у терапевтичних способах.
В одному аспекті пропонується антитіло проти С5 для застосування як лікарського засобу. У подальших аспектах пропонується антитіло проти С5 для застосування під час лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У певних варіантах здійснення пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі лікування. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі лікування індивідуума, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
Коли антиген - це розчинний білок, тоді внаслідок зв'язування антитіла зі своїм антигеном може подовжитися напівжиття антигену у плазмі (тобто, може знизитися кліренс антигену з плазми), оскільки само антитіло має триваліше напівжиття у плазмі та воно слугує носієм для антигену. Це відбувається внаслідок рециркуляції комплексу антиген-антитіло за допомогою
ЕсАп через ендосомальний шлях у клітині (Ноорепіап, Маї. Неум. Іттипої. 7(9):715-725 (2007)).
Проте очікується, що антитіло з характеристиками залежного від рН зв'язування, яке зв'язується зі своїм антигеном у нейтральному зовнішньоклітинному середовищі, при цьому вивільняючи його у кислотні ендосомальні компартменти після потрапляння у клітини, має неперевершені властивості з точки зору нейтралізації та кліренсу антигену порівняно з його аналогом, який зв'язується незалежним від рН чином (Іамжа єї аї., Маї. Віоїесп... 28(11):1203-1207 (2010);
Зо Ремапабоуїпа єї аї!., тАбБз 5(6):851-859 (2013); МО 2009/125825).
У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С 5 для застосування у підвищенні кліренсу С5 з плазми. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі підвищення кліренсу С5 з плазми у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген- антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рн зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальших варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування для інгібування активації С5. У певних варіантах здійснення винаходом пропонується антитіло проти С5 для застосування у способі інгібування активації С5 у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується застосування антитіла проти С5 у виробництві або приготуванні лікарського засобу. В одному варіанті здійснення лікарський засіб призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які бо залучається надмірна або неконтрольована активація С5. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5, при цьому спосіб включає введення індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, ефективної кількості лікарського засобу. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для підвищення кліренсу
С5 з плазми. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі підвищення кліренсу С5 з плазми у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для підвищення кліренсу С5 з плазми.
В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген-антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти
С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення -це переважно людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для інгібування активації С5. У подальшому варіанті здійснення лікарський засіб призначений для застосування у способі інгібування активації С5 у індивідуума, при цьому спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості лікарського засобу для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність,
Зо опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. "Індивідуум" згідно з будь- яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, ефективної кількості антитіла проти С5. В одному такому варіанті здійснення спосіб також включає введення індивідууму ефективної кількості принаймні одного додаткового терапевтичного агента. "Індивідуум" згідно з будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб підвищення кліренсу С 5 з плазми у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. В одному варіанті здійснення "Індивідуум" - це людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб пригнічення акумулювання С5 у плазмі у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген- антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рн зв'язування. В одному варіанті здійснення "індивідуум" -це людина.
Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому аспекті винаходом пропонується спосіб інгібування активації С5 у індивідуума. В одному варіанті здійснення спосіб включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти С5 для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення "індивідуум" - це людина.
У подальшому аспекті винаходом пропонуються фармацевтичні склади, які включають будь- бо які запропоновані у цьому описі антитіла проти С5, наприклад, для застосування у будь-якому із вищезгаданих терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке із запропонованих у цьому описі антитіл проти С5 та фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення фармацевтичний склад включає будь-яке із запропонованих у цьому описі антитіл проти С 5 та принаймні один додатковий терапевтичний агент.
У подальшому аспекті фармацевтичний склад призначений для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація
С5. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для підвищення кліренсу С5 з плазми. В одному варіанті здійснення антитіло проти С5 підвищує кліренс С5 з плазми порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для пригнічення акумулювання С5 у плазмі. В одному варіанті здійснення акумулювання С5 у плазмі - це результат утворення комплексу антиген-антитіло. В іншому варіанті здійснення антитіло проти С5 пригнічує акумулювання С5 у плазмі порівняно з традиційним антитілом проти С5, яке не має характеристик залежного від рН зв'язування. Антитіло проти С5 цього винаходу може інгібувати активацію С5. У подальшому варіанті здійснення фармацевтичний склад призначений для інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення цитотоксичність, опосередкована С5, пригнічується внаслідок інгібування активації С5. В одному варіанті здійснення фармацевтичний склад вводиться індивідууму, який має опосередковану комплементом хворобу або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5. "Індивідуум"' за будь-яким з вищезгаданих варіантів здійснення - це переважно людина.
В одному аспекті індивідуум має природний С5. В іншому аспекті індивідуум має варіант С5.
У певних варіантах здійснення варіант С5 має біологічну активність, подібну до активності природного С5. Такий варіант С5 може включати принаймні одну варіацію, вибрану з групи, що складається з М145І, 84492, М802І, В885Н, 29280, 0966, 51310М та Е14370. У цьому описі
В885Н, наприклад, позначає генетичну варіацію, де аргінін на позиції 885 заміщений гістидином.
У подальшому аспекті винаходом пропонуються способи отримання лікарського засобу або фармацевтичного складу, при цьому способи включають змішування будь-якого із запропонованих у цьому описі антитіл проти С5 з фармацевтично прийнятним носієм,
Зо наприклад, для застосування у будь-якому з вищезгаданих терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення способи приготування лікарського засобу або фармацевтичного складу також включають додавання принаймні одного додаткового терапевтичного агента до лікарського засобу або фармацевтичного складу.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, вибирається з групи, що складається з ревматоїдного артриту (ВА); системного червоного вовчака (5ІЕ); вовчакового нефриту; ішемічного реперфузійного пошкодження (ІВІ); астми; пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН); гемолітично-уремічного синдрому (НИ) (наприклад, атипового гемолітично-уремічного синдрому (анНиб5)); хвороби щільного осаду (000); оптикомієліту (ММО); багатофокальної моторної невропатії (МММ); множинного склерозу (МБ); системного склерозу; макулярної дегенерації (наприклад, пов'язаної з віком макулярної дегенерації (АМО)); синдрому гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕЇ Р); тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР); спонтанної втрати плоду; бульозного епідермолізу; рецидивної втрати плоду; пре-еклампсії; черепно-мозкової травми; важкої міастенії; хвороби холодової аглютинації синдрому Сегрена; дерматоміозиту; бульозного пемфігоїду; фототоксичних реакцій; гемолітичного уремічного синдрому, пов'язаного з токсином Шига Е. соїї; типового або інфекційного гемолітичного уремічного синдрому НИ); гломерулонефриту
С3; васкуліту, пов'язаного з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморального та васкулярного відторгнення трансплантату; опосередкованого антитілом гострого відторгнення (АМА); дисфункції трансплантації; інфаркту міокарду; алогенного трансплантату; сепсису; ішемічної хвороби серця; вродженого ангіоневротичного набряку; дерматоміозиту; хвороби Грейвса; атеросклерозу; хвороби Альцгеймера (АБ); хвороби
Гантінгтона; хвороби Крейцфельда-Якоба; хвороби Паркінсона; різних видів раку; поранення; септичного шоку; пошкодження спинного мозку; увеїту; пов'язаних з діабетом очних хвороб; ретролентальної фіброплазії; гломерулонефриту; мембранного нефриту; ІдА-нефропатії; синдрому гострої респіраторної недостатності у дорослих (АНОБ); хронічного обструктивного захворювання легенів (СОРО); муковісцидозу; гемолітичної анемії; пароксизмальної холодової гемоглобінурії; анафілактичного шоку; алергії; остеопорозу; остеоартриту; аутоімунного тиреоїдиту; діабету типу І; псоріазу; звичайної пузирчатки; аутоімунної гемолітичної анемії бо (АІНА); ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури (ІТР); синдрому Гудпасчера; хвороби Дегоса;
антифосфоліпідного синдрому (АРБ); катастрофічного АРБ (САРБ); серцево-судинного розладу; міокардиту; церебрально-судинного розладу; розладу периферійних судин; вазоренального розладу; мезентеральноголоентерального судинного розладу; васкуліту; нефриту пурпури Шенлейна-Геноха; хвороби Такаясу; дилатаційної кардіоміопатії; діабетичної ангіопатії; хвороби Кавасакі (артриту); венозного газового емболу (МОЄ); рестенозу після встановлення стента; ротаційної атеректомії; мембранної нефропатії; синдрому Гійена-Барре; синдрому Фішера; індукованого антигеном артриту; синовіального запалення; вірусних інфекцій; бактеріальних інфекцій; грибкових інфекцій та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарду, штучного кровообігу та гемодіалізу.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це стан офтальмологічної хвороби. У подальших варіантах здійснення офтальмологічний стан - це макулярна дегенерація. У подальших варіантах здійснення макулярна дегенерація - це АМО. У подальших варіантах здійснення АМО - це суха форма АМО.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН).
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це інфаркт міокарда.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це ревматоїдний артрит (ВА).
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це остеопороз або остеоартрит.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це запалення.
У певних варіантах здійснення опосередкована комплементом хвороба або стан - це рак.
Антитіла цього винаходу можна застосовувати або окремо, або у комбінації з іншими агентами під час лікування. Наприклад, антитіло цього винаходу можна вводити разом з принаймні одним додатковим терапевтичним агентом.
Такі зазначені вище комбіновані терапії охоплюють комбіноване введення (де два або більше терапевтичних агентів включено в один і той же або окремий фармацевтичний склад) та
Зо окреме введення, у випадку якого введення антитіла цього винаходу може відбуватися до, одночасно та/або після введення додаткового терапевтичного агента або агентів. В одному варіанті здійснення введення антитіла проти С5 та введення додаткового терапевтичного агента здійснюють одне відносно іншого у межах приблизно одного місяця, або у межах приблизно одного, двох або трьох тижнів, або у межах приблизно одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести днів.
Антитіло винаходу (та будь-який додатковий терапевтичний агент) можна вводити за будь- якими придатними способами, включаючи парентеральне, внутрішньолегеневе та внутрішньоносове введення та, якщо це бажано для місцевого лікування, введення в осередок ураження. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Введення дози можна здійснювати за будь-яким придатним способом, наприклад шляхом ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, частково залежно від того, чи введення є короткочасним або постійним. У цьому описі передбачаються різні схеми введення препаратів, включаючи, проте не обмежуючись ними, одноразове або багаторазові введення через проміжки часу, болюсне введення або імпульсну інфузію.
Антитіла цього винаходу будуть включатися до фармацевтичного складу, дозуватися та вводитися за способом, що відповідає гарній медичній практиці. Фактори, які слід враховувати у цьому контексті, включають специфічний розлад, який слід лікувати, специфічного ссавця, якого слід лікувати, клінічну умову окремого пацієнта, причину розладу, ділянку доставки агента, спосіб введення, режим введення та інші фактори, відомі медикам-практикам. Антитіло не обов'язково, проте довільно входить до фармацевтичного складу з одним або більше агентами, які у цей час застосовуються для попередження або лікування даного розладу. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, присутнього у фармацевтичному складі, типу розладу або лікування та інших факторів, що обговорюються вище. їх зазвичай застосовують у таких самих дозах та зі способами введення, описаними у цьому описі, або приблизно від 1 95 до 99 95 від доз, описаних у цьому описі, або будь-якій дозі або за допомогою будь-якого способу введення, які емпірично/клінічно визначено як доречні.
Для профілактики або лікування хвороби відповідне дозування антитіла цього винаходу (коли воно застосовується окремо або у комбінації з одним або більше додатковими бо терапевтичними агентами) залежатиме від типу хвороби, яку слід лікувати, типу антитіла,
суворості та протікання хвороби, а також від того, чи вводиться антитіло з метою профілактики або з метою лікування, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта, та реакції на антитіло, та розсудливості лікаря, який веде пацієнта. Антитіло придатним чином вводиться пацієнтові одноразово або протягом сеансів лікування. Залежно від типу та суворості хвороби приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг) антитіла може бути початковою дозою- кандидатом для введення пацієнтові, чи то, наприклад, шляхом одного або більше окремих введень, чи то шляхом тривалої інфузії. Одна звичайна щоденна доза може становити діапазон від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, що залежить від вищезгаданих факторів. Для багаторазового введення протягом декількох днів або тривалішого часу, залежно від стану, лікування буде зазвичай продовжуватися, доки не відбудеться бажане пригнічення симптомів хвороби. Один приклад дозування антитіла буде становити діапазон від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Отже, одну або більше доз, які становлять приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію), можна вводити пацієнтові. Такі дози можна вводити с проміжками, наприклад, кожного тижня або кожні три тижні (наприклад так, щоб пацієнт отримував від приблизно двох до приблизно двадцяти або, наприклад, шести доз антитіла). Можна вводити початкову вищу ударну дозу з наступними однією або більше нижчими дозами. Прогрес цього лікування легко відстежується за допомогою традиційних способів та аналізів.
Зрозуміло, що будь-які з вищезгаданих складів та терапевтичних способів можна здійснювати, застосовуючи імунокон'югат винаходу замість або на додаток до антитіла проти
С5.
Н. Промислові вироби
В одному аспекті винаходом пропонується промисловий виріб, що містить матеріали, корисні для лікування, профілактики та/або діагностики розладів, описаних вище. Промисловий виріб включає контейнер та етикетку або листок-вкладиш, що або супроводжує контейнер, або розміщений на контейнері. Придатні контейнери включають, наприклад, пляшки, ампули, шприци, мішечки з розчином для внутрішньовенних ін'єкцій тощо. Контейнери можна виготовити з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер містить композицію, яка самостійно або у комбінації з іншою композицією є ефективною для лікування, профілактики або
Зо діагностики стану, та він може мати засіб для стерильного доступу (наприклад, контейнер може бути мішечком з розчином для внутрішньовенних ін'єкцій або ампулою, які мають пробку, що проколюється голкою для підшкірної ін'єкції). Принаймні один активний агент у композиції - це антитіло винаходу. На етикетці або у листку-вкладиші вказується, що композиція застосовується для лікування стану за вибором. Крім того, промисловий виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, яка міститься в ньому, де композиція містить антитіло винаходу; та (Б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, де композиція містить додатковий цитотоксичний агент або терапевтичний агент іншої дії. Промисловий виріб у цьому варіанті здійснення винаходу може також включати листок-вкладиш, на якому вказується, що композиції можна застосовувати для лікування певного стану. Альтернативно або додатково промисловий виріб може також включати другий (або третій) контейнер, який містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВМУРІ), сольовий розчин з фосфатним буфером, розчин Рінгера та розчин декстрози. Він може також включати інші матеріали, бажані з комерційної та споживчої точки зору, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки та шприци.
Зрозуміло, що будь-які з вищезгаданих промислових виробів можуть включати імунокон'югат винаходу замість або на додаток до антитіла проти С5.
Приклади
Далі описуються приклади способів та композицій винаходу. Зрозуміло, що на практиці можна застосовувати інші різноманітні варіанти здійснення, беручи до уваги запропонований вище загальний опис.
Приклад 1
Отримання С5 1.1. Експресія та очищення рекомбінантного С5 людини та яванської макаки Рекомбінантний
С5 людини (МСВІ СепВапкК номер доступу: МРО0О1726.2, 5ЕО ІЮО МО: 39) транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію Егеесзіуіеє293-Е (Тнепто РівзНег, Сапізрад, СА, США).
Кондиційовані середовища, які експресують С5 людини, розвели рівним об'ємом води пі), потім нанесли на аніонообмінну колонку О-зерпагозе ЕЕ або О-зерпагозе НР (СЕ Неайнсагеє,
Оррзаїа, Швеція) з наступним елююванням в градієнті Масі. Зібрали фракції, що містили С5 людини, а потім довели концентрацію солі МасСі та рН до 80 мМ та рН 6,4, відповідно. 60 Отриманий зразок нанесли на катіонообмінну колонку 5Р-зерпагозе НР (СЕ Неайнсаге, Оррзаїа,
Швеція) та елюювали в градієнті Масі. Фракції, що містили С5 людини, зібрали та завантажили у керамічну гідроксіапатітову колонку СНТ (Віо-РНаай І абогайтіев, Негсшез, СА, США). Елюат С5 людини потім завантажили до гель-фільтраційної колонки 5ирегаех 200 (СЕ пеайнсаге, Оррзаїа,
Швеція). Фракції, що містили С5 людини, об'єднали та зберігали при -150 "С.
Експресію та очищення рекомбінантного С5 яванської макаки (МСВІ СепВапкК номер доступу: ХРО0О5580972, 5ЕО ІЮО МО: 44) виконували за таким самим способом, як і людський аналог. 1.2. Очищення С5 яванської макаки (супоС5) від плазми
Зразок плазми яванської макаки нанесли на агарозу 551 7 (Іплімодеп, Зап Оівєдо, СА, США) з наступним елююванням 100 мМ ацетатом натрію, рН 3,5. Фракції, що містили супоС5, одразу нейтралізували та піддали обробці на колонці НР з Білком А (СЕ Неайнсаге, Оррзаїа, Швеція), а потім агарозою з Пептидом М (Іплімодеп, Зап Оівєдо, СА, США). Потік крізь фракцію потім спрямували до гель-фільтраційної колонки Зирегдех 200 (СЕ Неайнсаге, Оррзаїа, Швеція).
Фракції, що містили супоС5, об'єднали та зберігали при -80 "С.
Приклад 2
Отримання антитіл проти С5 2.1. Скринінг антитіл
Антитіла проти С5 отримали, вибрали на проаналізували наступним чином.
Кролів МАМУ (новозеландських білих кролів) віком від 12 до 16 тижнів імунізували С5 людини та/або С5 мавпи (50-100 мкг/дозу/кроля) шляхом інтрадермальної ін'єкції. Цю дозу повторювали 4-5 разів протягом 2 місяців. За один тиждень після кінцевої імунізації у імунізованих кролів узяли селезінку та кров. Антиген-специфічні В-клітини забарвили міченим антигеном, сортували за допомогою клітинного сортера ЕСМ (БАСБ5 апйа Ш, ВО) та помістили у планшети з 96 комірками із щільністю по одній клітині/комірку разом з 25000 клітинами/комірку клітин ЕЇ/ 4 (Ентореап СоїПесійп ої СеїЇ Сийтгев) та активованим кондиційованим середовищем кролячих Т- клітин, розведеним у 20 разів, а потім культивували протягом 7-12 днів. Клітини ЕІ 4 обробляли мітоміцином С (БЗідта, Саї Мо. М4287) протягом 2 годин та заздалегідь промили тричі.
Активоване кондиційоване середовище кролячих Т-клітин отримали шляхом культивування кролячих тимоцитів у ВРМІ-1640, що містило фітогемаглютинін-М (Воспе, Саї Мо. 1 1082132-
Зо 001), форбол 12-міристат 13-ацетат (бідта, Саї Мо. РІ585) та 2 95 ЕВ5. Після культивування культуральні надосадові рідини В-клітин зібрали для подальшого аналізу, а дебрис зберігали при низьких температурах.
Аналіз ЕП ІБА застосовували для тестування специфічності антитіл у культуральній надосадовій рідині В-клітин. Шар стрептавідину (Сепебсгірі, Саї Мо. 7202043) нанесли на
МАХІЗОгр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688) при 50 нМ у РВ5 на 1 годину при кімнатній температурі. Планшети потім блокували ВіосКіпяа Опе (Масаїаі Тездиє, Саї Мо. 03953-95), розведеним у 5 разів. С5 людини або мавпи мітили МНО-РЕС4-Віосііп (РІЕВСЕ, Саї Мо. 21329) та додали до заблокованих планшетів ЕЇГІ5БА, інкубували протягом 1 години та промили.
Культуральні надосадові рідини В-клітин додали до планшетів ЕГІ5А, інкубували протягом 1 години та промили. Зв'язування виявили за допомогою кон'югату пероксидази хріну з антитілом кози проти кролячого ІС (ВЕТНМУЇ, Саї Мо. АТ20-11 ІР), а потім додали АВТ5 (КРІ, Саї Мо. 50- 66-06).
Аналіз ЕГІЗА застосовували для оцінки залежного від рН зв'язування антитіл проти С5.
Ес козла проти ДС кроля (ВЕТНМІ, Саї Мо. А120-111 А), розведену до 1 мкг/мл РВБ(-) додали до МАХІ5огр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688), інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі та блокували ВіосКіпяа Опе (Масаіаії Тездие, Саї Мо. 03953-95), розведеним у 5 разів. Після інкубування планшети промили та додали культуральні надосадові рідини В-клітин. Планшети інкубували протягом 1 години, промили, та додали 500 пМ біотинілованого С5 людини або мавпи, та інкубували протягом 1 години. Після інкубування планшети промили та інкубували з буфером МЕ5 рН 5,8 (20 мМ МЕ5, 150 мМ Масі та 1,2 мМ
Сас12) або буфером МЕ5 рН 5,8 (20 мМ МЕЗ5, 150 мМ Масі та 1 мМ ЕОТА) протягом 1 години при кімнатній температурі. Після інкубування виявили зв'язування біотинілованого С5 за допомогою кон'югату пероксидаза хріну-стрептавідин (ТПепто 5сієпійіс, Саї Мо. 21132), а потім додали АВТ5 (КРІ., Саї Мо. 50-66-06).
Систему Осієї ВЕЮОЗ384 (РаїЇ І їе Зсієпсе5) застосовували для оцінювання афінності та залежного від рН зв'язування антитіл проти С5. Антитіла, секретовані у культуральну надосадову рідину В-клітин, завантажили на кінчик біосенсора Білка А (Раї! І їе бсіепсев5) та занурили у 50 нМ С5 людини або мавпи у буфері МЕ5 рН 7,4, щоб проаналізувати кінетику зв'язування. Кінетику дисоціації проаналізували як у буфері МЕ5 рН 7,4, так і у буфері МЕ5 рН бо 5,6.
Загалом 41439 ліній В-клітин піддали скринінгу щодо афінності та залежного від рн зв'язування з С5 людини або мавпи та 677 ліній відібрали та позначили СЕАО0О0О1-0677. РНК вибраних ліній очистили від дебрису кріоконсервованих клітин, застосовуючи набори 28-96
Ойіск-АМА (2УМО ВЕЗЕАВСН, Саї Мо. А1053). ДНК, яка кодує варіабельні ділянки важкого ланцюга антитіла, у вибраних лініях ампліфікували за допомогою РСЯА зі зворотною транскрипцією та рекомбінували за допомогою ДНК, яка кодує константну ділянку важкого ланцюга Е760с214 (5ЕО І МО: 33) або 939234 (5ЕО ІО МО: 34). ДНК, яка кодує варіабельні ділянки легкого ланцюга антитіла, ампліфікували за допомогою РОСА зі зворотною транскрипцією та рекомбінували за допомогою ДНК, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга КОМТОС (5ЕО ІО МО: 36). Окремо синтезували гени важкого та легкого ланцюгів існуючого гуманізованого антитіла проти С5, екулізумабу (ЕсиНн-с2с4, 5ЕО ІО МО: 29 та Есиї -
КО, 5ЕО ІО МО: 30). ДНК, яка кодує МН (ЕсиН, 5ЕО ІО МО: 31), злили у рамці з ДНК, яка кодує модифіковану СН ІдДа4 людини (Е760С214, 5ЕО ІО МО: 33), а дНК, яка кодує МІ (Есиї, 5ЕО ІО МО: 32), злили у рамці з ДНК, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга КО (ЗЕО ІО МО: 37).
Кожну зі злитих кодувальних послідовностей також клонували у вектор експресії. Антитіла експресували у клітинах РЕгеебіує"М 293-Е (Іпийгтодеп) та очищали від культуральної надосадової рідини, щоб оцінити функціональну активність. Нейтралізуючу активність антитіл оцінювали шляхом тестування інгібування активності комплементу, застосовуючи аналіз лізису ліпосом, як описано у Прикладі 5.1. 2.2. Аналіз зв'язування епітопу за допомогою сендвіч-ЕЇ ІБА
Для подальшого аналізу вибрали антитіла проти С5 з високою афінністю, залежністю від рН та нейтралізуючою активністю. Аналіз сендвіч-ЕГ ІЗА застосовували, щоб згрупувати вибрані антитіла у різні епітопні групи, що зв'язуються з однаковими епітопами білка С5 або епітопами, що перекриваються. Немічені захоплені антитіла розвели РВ5 (-) до 1 мкг/мл та додали до планшетів МАХІБОогр з 384 комірками (Мипс, Саї Мо. 164688). Планшети інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі та блокували розведеним у 5 разів ВіосКіпд Опе (Масаїаї
Тездиє, Саї Мо. 03953-95). Планшети інкубували протягом 1 години, промили, додали 2 нМ С5 людини та інкубували протягом 1 години. Після інкубування планшети промили та додали мічені антитіла для виявлення (1 мкг/мл, біотиніловані за допомогою МНе-РЕСА-Віоїіп). Після
Зо інкубування протягом 1 години виявили зв'язування біотинілованого антитіла за допомогою кон'югату пероксидаза хріну-стрептавідин (ТПепто 5бсіепійіс, Саї Мо. 21132), після чого додали
АВТЗ5 (КРІ, Саї Мо. 50-66-06).
Усі антитіла проти С5 застосовували як антитіло захоплення і як антитіло виявлення та їх спарували у повному обсязі. Як показано на Фігурі 1, антитіла, що взаємно конкурують, згрупували у 7 епітопних груп: СЕАОб668, СЕАОЗ334 та СЕАОЗ319 згрупували в епітопну групу А,
СЕАОб47, СЕРАОБ589, СЕРАОЗ41, СЕРАОб6З39, СЕАОб6З35, СРАОЗЗО та СЕАОЗ18 згрупували в епітопну групу В, СЕАО538, СЕАОБОЇ, СЕРАОБ99, СЕАОЗО7, СЕАОЗбб, СЕАОЗО5, СЕАОб75, СЕАОббб та
СЕАОб72 згрупували в епітопну групу С, екулізумаб та СЕАОЗ322 згрупували в епітопну групу 0,
СЕАОЗ329 згрупували в епітопну групу Е, СЕАОЗ359 та СЕАО217 згрупували в епітопну групу Е, та
СЕАОБ579, СЕРАОЗ328 та СЕАО272 згрупували в епітопну групу С. Фігура 1 демонструє зв'язування з епітопом деяких химерних антитіл проти С5. Послідовності МН та Мі антитіл проти С5, згрупованих в епітопну групу С, наведено у Таблиці 2.
Таблиця 2
Антитіла проти С5, згруповані в епітоп С 01 8БОЮМОої 77777711
СЕАОЗО? | 2 | 12 | 46 | 56 | 66 | 76 | 86 | яВг96
СЕАоОБОї | 4 | 14 | 48 | 58 | 68 | 78 | 88 | Ю Г(98
СЕАО»38 | 5 | 15 | 49 | 59 | 69 | 79 | 89 | 99
СЕдоОБ99 | 6 | 16 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 00
СЕАОб7а | 8 | 18 | 52 | 62 | 72 | 82 | 92 | 102 сСЕАоОб75 | 9 | 19 | 53 | 6з | 73 | 83 | 93 | 03 2.3. Гуманізація та оптимізація
Гуманізацію варіабельної ділянки деяких антитіл проти С5 виконували з метою зниження можливої імуногенності антитіл. Гіперваріабельні ділянки (СОР) антитіла кроля проти С5 трансплантували на гомологічні каркасні ділянки (ЕН) антитіла людини, застосовуючи традиційний для трансплантації СОВА підхід (Маїшге 321:522-525 (1986)). Гени, які кодують гуманізовані МН та МІ, синтезували та поєднали з модифікованою СН людини (52402, 5ЕО ІЮ
МО: 35) та Сі Ідб людини (5КІ, 5ЕБО 10 МО: 38), відповідно, та кожну з комбінованих послідовностей клонували у вектор експресії.
Ряд мутацій та комбінацій мутацій досліджували, щоб ідентифікувати мутації та комбінації мутацій, які покращили властивості зв'язування деяких антитіл-лідерів. Численні мутації потім зробили в гуманізованих варіабельних ділянках, щоб підвищити афінність зв'язування з С5 при нейтральному рН або щоб знизити афінність зв'язування з С5 при кислотному рН. Внаслідок цього з СЕАОЗО5 отримали один з оптимізованих варіантів, 305 05 (МН, 5ЕО ІО МО: 10; МІ,
ЗЕО ІЮ МО: 20; НУМВ-НІ, 5ЕО І МО: 54; НУВ-Н2, 5ЕО ІО МО: 64; НУВ-НЗ, 5ЕО І МО: 74; НУВ-
ІТ, БЕО ІЮ МО: 84; НМВ-12, 5ЕО ІО МО: 94; та НМВ-І 3, 5ЕО ІО МО: 104).
Антитіла експресували у клітинах НЕК293, спільно трансфектованих сумішшю векторів експресії важкого та легкого ланцюгів, та очистили Білком А.
Приклад З
Характеристика зв'язування антитіл проти С5 3.1. Експресія та очищення рекомбінантних антитіл
Рекомбінантні антитіла транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію Егеезіуіє293-
Е (ТНепто Рівзпег, Сагпізрадй, СА, США). Очищення від кондиційованих середовищ, які експресують антитіла, виконували, застосовуючи традиційний спосіб з використанням Білка А.
За необхідністю, далі виконували гель-фільтрацію. 3.2. Оцінка залежності від рН
Кінетичні параметри антитіл проти С5 стосовно рекомбінантного С5 людини оцінювали при рН 7,4 та рН 5,8 при 37 "С, застосовуючи прилад 1200 ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка) (СЕ Неайнсагє). Ргод/а (Ріегсє) іммобілізували на сенсорному чипі СМА4, застосовуючи набір амінного зчеплення (ЖбЕ Неайнсаге) згідно з рекомендованими налаштуваннями СЕ
Неайнсаге. Антитіла та аналіти розвели у відповідних рухомих буферах, АСЕ5 рн 7,4 та рН 5,8
Зо (20 мМ АСЕ5, 150 мМ Масі, 1,2 мМ Сасі», 0,05 95 Тжшеєп 20, 0,005 95 Мам»). Кожне антитіло захопили на сенсорну поверхню за допомогою РгоА/(й. Рівні захоплення антитіла становили зазвичай 60-90 резонансних одиниць (ВИ). Після цього рекомбінантний С5 людини впорскували при концентраціях 10 нМ та 20 нМ або 20 нМ та 40 нМ, після чого відбувалася дисоціація.
Поверхню регенерували за допомогою 20 мМ Маон. Кінетичні параметри в умовах обох рн визначили шляхом узгодження сенсограм з моделлю зв'язування 1:1 із застосуванням програмного забезпечення для оцінки, 1200 ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка), версія 2.0 (СЕ Неайнсагє). Сенсограми усіх антитіл наведено на Фігурах 2А та 28. Швидкість асоціації (ка), швидкість дисоціації (Ка) та афінність зв'язування (КО) антитіл наведено у Таблиці 3. Усі антитіла, за виключенням СЕАОЗЗО (МН, 5ЕО ІО МО: 21 та МІ, 5ЕО ІЮ МО: 25) та СЕАОЗА (МН, ЗЕО ІО МО: 22 та МІ, 5ЕО ІО МО: 26), демонстрували відносно вищу швидкість дисоціації при рН 5,8, ніж при рН 7,4.
Таблиця З
Кінетичні параметри антитіл проти С5 при рН 7,4 та рн 5,8 антитла | ка | ка | КО | ка | ка | ко (
3.3. Перевірка перехресної реактивності
Для того, щоб спостерігати перехресну реактивність антитіл проти С5 стосовно С5 людини (пС5) та С5 яванської макаки (супоС5), виконували кінетичний аналіз ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка). Налаштування аналізу були такими самими, як описано у Прикладі 3.2.
Рекомбінантний супоС5 впорскували при концентраціях 2, 10 та 50 нМ. Кінетичні параметри визначили за допомогою такого ж узгодження даних, як описано у Прикладі 3.2. Кінетичні параметри та афінність зв'язування при рН 7,4 наведено у Таблиці 4. Кінетичні параметри стосовно ПС5, наведені у Таблиці 4, - це результати з Прикладу 3.2. Усі антитіла проти С5, за виключенням СЕАОб672, демонстрували порівнянне КО стосовно Со та супоС5. КО антитіла
СЕАОб672 стосовно супоС5 було у 8 разів слабшим, ніж стосовно ПС.
Таблиця 4
Кінетичні параметри та афінність зв'язування антитіл проти С5 стосовно пС5 та супо Сб при рН 74 антитла | ка | ка | КО | ка | ка | ко
Приклад 4
Картування епітопів стосовно антитіл проти С5 4.1. Зв'язування МАБ проти С5 з пептидами, що походять від бета-ланцюга С5
Моноклональні антитіла проти С5 (МАБ) тестували щодо їх зв'язування з пептидами, що походять від бета-ланцюга С5, з використанням вестерн-блот аналізу. Пептиди С5: 19-180, 161- 340, 321-500 та 481-660,- злиті з міткою 5Т (раЕХ-41-І, аЕ Неайнсаге І Ме Зсієпсе5, 28-9545- 49), експресували у Е. соїї (ОНбаїрна, ТОМОВО, ОМА-903). Зразки Е. соїї зібрали після інкубування з 1 мМ ізопропіл-бета-О-і-тіогалактопірано-зидом (ІРТС) протягом 5 годин при 37 "С та центрифугували при 20000 х 9 протягом 1 хвилини, та отримали осад. Осад суспендували у буферному розчині для зразків (2МЕ ж) (У/ако, 191-13272) та застосовували для вестерн-блот аналізу. Експресію кожного пептиду підтвердили антитілом проти 51 (Абєат, ар9085) (Фігура 3). Стрілка вказує на пептиди С5, злиті з 451 (46-49 кДа). МАБ проти С5: СЕАОЗО5, СЕАОЗО7,
СЕАОЗбб, СЕАОБО1, СЕАОБ538, СЕАОБ99, СЕАОббб, СЕАОб672 та СЕАОб75, - зв'язані з пептидом 19-180 С5 (Фігура 3). 4.2. Експресія та очищення домену Ма1-МОа2 (1-2253 С5 людини Рекомбінантний домен
Ма1-ма2 (5ЕО ІОЮ МО: 43) бета-ланцюга С5 людини транзієнтно експресували, застосовуючи клітинну лінію Егеебіуіе293-Е (ТНепто РівзНег, Сапзрад, СА, США). Кондиційовані середовища,
Зо які експресують домен М(1-М(2, розвели 72 об'єму води тіїїйО, а потім завантажили у аніонообмінну колонку О-зерпагозе ЕЕ (СЕ Неаййнсаге, Оррзаїа, Швеція). Потік крізь фракцію з аніонообмінної колонки довели до рН 5,0 та завантажили у катіонообмінну колонку 5Р- зерпагозе НР (СЕ Пеаййсагеє, Оррзаіїа, Швеція) та елюювали в градієнті Масі. Фракції, що містили домен МО1-М(2, одержали з елюенту та потім завантажили у гель-фільтраційну колонку Зирегдех 75 (СЕ Пеайнсагє, Оррзаїа, Швеція), урівноважену 1 х РВ5. Фракції, що містили домен Ма1-Магг, потім об'єднали та зберігали при -80 "С. 4.3. Спроможність зв'язування з доменом МС1-Ма2
Спроможність зв'язування антитіл проти С5 з доменом МаИ1-Ма2 вимірювали, застосовуючи такі самі налаштування для аналізу, як описано у Прикладі 3.2, за виключенням того, що вимірювання виконувалися тільки при рН 7,4. Домен Ма1-Ма2 впорскували при концентраціях 20 НМ та 40 нМ. Як показано на фігурі 4, усі антитіла, за виключенням екулізумаб-76004, демонстрували підсилення реакції зв'язування, вказуючи на те, що ці антитіла зв'язуються з
Ма1-Ма2. Екулізумаб-Р76004, відоме як антитіло, що зв'язується з альфа-ланцюгом, не демонструвало зв'язування з доменом МС1-Ма2.
4.4. Зв'язування МАБ проти С5 з пептидами, що походять з домену МЕ1-МОС2 С5 МАБ проти
С5 тестували щодо їх зв'язування з пептидами, що походять з домену
Ма1-мег, із застосуванням вестерн-блот аналізу. Пептиди С5: 33-124, 45-124, 52-124, 33- 111, 33-108 та 45-111 (5ЕО ІЮ МО: 40),- злиті з міткою С5Т, експресували у Е. соїї. Зразки Е.соїї зібрали після інкубування з імМ ІРТа протягом 5 годин при 37 "С, та центрифугували при 20000 х 9 протягом 1 хвилини, та отримали осад. Осад суспендували у буферному розчині для зразків (2МЕ хх та застосовували для вестерн-блот аналізу. Експресію кожного пептиду, що походить з
С5, підтвердили антитілом проти 51 (Фігура 5А). СЕАОЗО5 зв'язалося тільки з пептидом 33-124 (Фігура 58). СЕАОЗО5 зв'язалося з бета-ланцюгом рекомбінантного С5 людини (С5) (приблизно 70 кДа), який застосовувався як контрольний. На Фігурі 5С узагальнено реакцію МАБ проти С5 з пептидами, що походять з С5. 4.5. Зв'язування МАБ проти С5 з мутантами С5
Оскільки внаслідок аналізу кристалічної структури було передбачено, що три амінокислотні залишки у бета-ланцюгу С5 - Е48, 051 та К109 - залучаються у зв'язування між С5 та МАБ проти
С5, то МАБ проти С5 тестували щодо їх зв'язування з точковими мутантами С5 людини з використанням вестерн-блот аналізу. Точкові мутанти С5, у яких будь-який з Е48, 051 та КТ109 був заміщений аланіном, експресували у клітинах Е5293 за допомогою ліпофекції. Культуральні середовища зібрали за 5 днів після ліпофекції, а після цього застосовували для вестерн- блотингу. 505-РАСЕ виконували при відновлювальних умовах. Результати наведено на Фігурі 6. Екулізумаб зв'язалося з альфа-ланцюгом природного (М/Т) С5 та трьома точковими мутантами С5, тоді як СЕАОЗ3О5 сильно зв'язалося з бета-ланцюгом М/Т С5, слабо зв'язалося з мутантом С5 Е48А та не зв'язалося з бета-ланцюгом мутантів С5 05О1А та КІ1ТО9А, що вказує на те, що ці три амінокислотні залишки залучаються до взаємодії антитіло/антиген. У Таблиці 5 наведено узагальнені результати вестерн-блот аналізу МАБ проти С5 (СЕАОЗО5, СЕАОЗО07,
СЕАОЗбб, СЕАОБОЇ, СЕАОБЗ38, СЕАОБбБ99, СЕАОббб, СЕАОб2 та СЕАОб75). МАБ проти С5 згруповано в одну епітопну групу С, проте профілі зв'язування незначно різняться між антитілами, що дозволяє припустити, що ділянки зв'язування С5 з МАЬ проти С5 розташовані близько одна до одної, проте вони не є ідентичними.
Таблиця 5
Узагальнення реакції МАБ проти С5 з мутантами С5 1111111111ММТ11 11111 БВА | ОА | КовА
СЕАОЗОЄ СЇ1117яю1Ї11111ю11-11
СЕАОЗО? СЇ71117жю1 11111711
СЕАОЗВЄ СЇ11171яю 11111111
СвАОБОТ СГ! 71117жю1 11117111
СЕАОБЗВ С Ї711717яю 11111711
СЕАОБЯЯ /Ї7771717яю 11111711
СЕАОббЄ С Ї717117яю 11111711
СЕАОбУа С Ї117яю 11111711 -1111х (СЕАОбЯ» Їж Ї71717171юк1 1111-11
Зо 4.6. Аналіз зв'язування ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) антитіл проти С5 з мутантами С5
Для того, щоб здійснити тест того, чи дійсно залишки Е48, (551 та К1І09 залучаються у взаємодію антитілолантиген, виконували аналіз зв'язування ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка). Приготували три мутанти С5 - Е48А, (251А та КІТО9А, - як описано у
Прикладі 4.5. Зразки культуральних надосадових рідин, що містили мутантний С5, який надмірно експресувався у клітинах Е5293, приготували у концентрації 40 мкг/мл мутантного С5.
Для аналізу зв'язування ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) зразок розвели 10 х рухомим буфером ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) (АСЕ5 рн 7,4,10 мг/мл В5А, 1 мг/мл карбоксиметилдекстрану) до кінцевої концентрації 4 мкг/мл зразка мутантного С5.
Взаємодії трьох мутантів С5 з антитілами проти С5 оцінювали при 37 "С за допомогою приладу 1200 ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) (сЕ Неайнсагє), застосовуючи умови аналізу, описані у Прикладі 3.2. Буфер АСЕ5 рН 7,4, що містив 10 мг/мл В5А, 1 мг/мл карбоксиметилдекстрану, застосовували як рухомий буфер. Екулізумаб-?Р76004 та 305І 05 захопили на різні потокові комірки за допомогою моноклонального мишачого антитіла проти дес людини, яке є специфічним до фрагмента Ес (СЕ НеайнНсагє). Потокову комірку 1 застосовували як посилальну поверхню. Білки природного та мутантного С5 впорскували на сенсорну поверхню у концентрації 4 мкг/мл, щоб вони взаємодіяли із захопленими антитілами. Наприкінці кожного циклу аналізу сенсорну поверхню регенерували за допомогою ЗМ МосСб. Результати проаналізували за допомогою програмного забезпечення Віа Емаїцайо, версія 2.0 (СЕ
Неайнсаге). Криві посилальної потокової комірки (потокова комірка 1) та холостих впорскувань рухомого буферу відняли від кривих потокової комірки із захопленими антитілами.
Як показано на Фігурі 7, усі три мутанти С5 змогли зв'язатися з екулізумабом з подібним до природного С5 профілем зв'язування. Для 305 05 усі три мутанти продемонстрували нижчу реакцію зв'язування з 305 05, порівняно з природним С5. Мутанти Ю5ТА та КІ09А знизили зв'язування С5 з 305І 05 до початкового рівня. 4.7. Ідентифікація залишків Ніб5 в С5, які сприяють залежній від рН взаємодії між антитілом проти С5 та С5
Аналіз кристалічної структури дозволив виявити, що три гістидинові залишки в С5 людини розташовані в зоні взаємодії антитіло/антиген. Відомо, що залишок гістидину зі звичайним рКа, що становить приблизно 6,0, сприяє залежній від рН взаємодії білок-білок (Ідама еєї аї., Віоспіт
Віорпуз Асіа 1844(11):1943-1950 (2014)). Для того, щоб дослідити, які із залишків Ніб в зоні взаємодії антитіло/"антиген сприяють залежним від рН взаємодіям між антитілом проти С5 та
С5, виконували аналіз зв'язування ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка). Три мутанти
С5 людини з єдиною мутацією Нів (Н7ОУ, Н72У та НІ 10У) та мутанта з подвійною мутацією Нівб (Н7ОМ їх НІ 10У) отримали наступним чином: мутантів з єдиним Нів, у яких будь-який з Н7О, Н72 та НІ 10 заміщений тирозином, та мутанта з подвійним Нізх, у якому обидва Н7О та НІ 10 заміщені тирозином, експресували у клітинах Е5293 за допомогою ліпофекції. Властивості антигенного зв'язування мутантів С5 із заміщеним Ніх з 30505, що є залежним від рн антитілом проти С5, визначили за допомогою модифікованого аналізу ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка), як описано у Прикладі 4.6. Стисло кажучи, додаткову фазу дисоціації при рН 5,8 здійснювали в аналізі ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) одразу після фази дисоціації при рН 7,4 для того, щоб оцінити залежну від рН дисоціацію утворених при рН 7,4 комплексів антитіла та антигену. Швидкість дисоціації при рН 5,8 визначили шляхом обробки та
Зо узгодження даних, застосовуючи програмне забезпечення узгодження кривих бсгтиррег 2.0 (Віої одіс 5оймаге).
Як показано на Фігурі 8, єдина мутація Ніз у С5 на Н7О або НІ 10 та подвійна мутація Ніб (Н7О я НІ 10) не вплинули на зв'язування С5 з 305І 05 при нейтральному рН. Між тим, єдина мутація Ніз на Н72 демонструвала суттєве порушення зв'язування С5 з 305 05. Константи дисоціації при рН 5,8 мутантів С5 із заміщеним Ні та білка природного С5 (С5-мі) наведено у
Таблиці 6. Як показано у Таблиці 6, природний С5 демонстрував найшвидшу дисоціацію від 30505 при рН 5,8 серед антигенів С5, що тестувалися. Єдина мутація Ніз на Н7О0 демонструвала майже у два рази нижчу швидкість дисоціації при рН 5,8, а єдина мутація Ні на
НІ 10 спричинила незначно нижчу швидкість дисоціації при рН 5,8 порівняно з природним С5.
Подвійна мутація на обох Н7О та НІ 10 зумовила більший вплив на залежне від рН зв'язування, при цьому швидкість дисоціації при рН 5,8 майже у три рази нижча, ніж у природного С5.
Таблиця 6
Значення констант дисоціації при рН 5,8 для мутантів Ніз С5, що зв'язуються з 305І 05
Приклад 5
Інгібувальна активність антитіл проти С 5 стосовно активації С 5 5.1. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 випробовували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 9с) (Віоргедіс, ЗЕНО18) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при 25 "С. Ліпосоми, сенсибілізовані антитілами проти динітрофенілу (АшоКії СН5БО,
Ммако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 25 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшіоКкії СН5О) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 25 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин, після цього виміряли оптичну щільність (00) суміші при 340 нм.
Відсоток лізису ліпосом визначили як 100 х ОО мль-ОО дон сироватки та ліпосом))!)ХОЮ без мль-ОЮ фон сироватки та ліпосом)|- Фігура ЗА демонструє, що МАЬ проти С5: СЕАОЗ305,0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672 та 0675 - інгібували лізис ліпосом. Два не залежні від рН антитіла СЕДОЗ30 та 0341 також інгібували лізис (Фігура 9В). 5.2. Інгібування утворення С5а антитілами МАЬ проти С5
МАБ проти С5 випробовували щодо утворення Сб5а під час лізису ліпосом, щоб підтвердити, що МАБ проти С5 інгібують розщеплення С5 на С5а та С5Б. Рівень С5а в надосадових рідинах з аналізу лізису ліпосом кількісно визначили, застосовуючи набір Сб5а ЕГІБА (На зувієтв, ругоз7). Усі МАЬ інгібували утворення Сба в надосадових рідинах залежним від дози чином (Фігури 10А та 108В). 5.3. Інгібування активованого комплементом гемолізу антитілами МАБ проти С5 МАБ проти
С5 тестували щодо інгібування класичної активності комплементу у гемолітичному аналізі.
Еритроцити курчати (СсВВС5) (Іппомаїїме гезеагсп, ІС05-0810) промили забуференим сольовим розчином з желатином/вероналом, який містив 0,5 мМ МаОсі»г та 0,15 мМ Сасіг (СМВ---) (Вовіоп
ВіоРгодисів, ІВВ-З00Х), а потім сенсибілізували антитілом проти АВС курчати (КосКіапа 103- 4139) у концентрації 1 мкг/мл протягом 15 хвилин при 4 "С. Клітини потім промили СУВик та суспендували в такому ж самому буфері зі щільністю 5 х 107 клітин/мл. В окремому планшеті з 96 круглодонними комірками для мікротесту змішали 50 мкл сироватки здорової людини (20 9бо) (Віоргедісє, ФЕНО19) з 50 мкл розведеного МАБ та інкубували на шейкері при 37 "С протягом 30 хвилин. 60 мкл суспензії сенсибілізованих СВВС потім додали до комірок, що містили сироватку, та суміш антитіла інкубували при 37 "С протягом 30 хвилин. Після інкубування планшет центрифугували при 1000 х 4 протягом 2 хвилин при 4 "С. Надосадові рідини (100 мкл) перенесли до комірок на планшеті з 96 комірками з пласким дном для мікротесту для вимірювання ОО при 415 нм з посилальною довжиною хвилі 630 нм.
Відсоток гемолізу визначали як 100 х ОО мдь-ОО сироватка та сввс))/ КОЮ без маль-ЮОЮ фон сироватки та сввс)|.
Приклад 6
Дослідження фармакокінетики моноклональних антитіл проти С5 з С5 людини у мишей 6.1. Тест іп мімо із застосуванням мишей С57ВІ /6
Кінетику іп мімо С5 людини (Саїріоспет) та антитіла проти С5 людини оцінювали після введення тільки С5 людини або С5 людини та антитіла проти С5 людини мишам С57ВІ/6 (Іп
Мімо5 ог Віоіодіса! Кезоцгсе Сепіге, Зіпдароге). Розчин С5 людини (0,01 мг/мл) або розчин суміші, що містить С5 людини та антитіло проти С5 людини (0,01 мг/мл та 2 мг/мл (СЕАОЗ305-
Е760с24, СЕАОЗО7-Е760024, СЕАОЗб66-Е76004, СЕАОБО1-Е760с24, СЕАО538-Е76004, СЕАОБ599-
Е760с24, СЕАОббб-Е760024, СЕАОб72-Е760054 та СЕАОб75-Е76004) або 0,2 мг/мл (СЕАОЗ330-
Е76004 та СЕАОЗ341-Е76004), відповідно), вводили один раз у дозі 10 мл/кг у хвостову вену.
У цьому випадку антитіло проти С5 людини є присутнім у надмірній кількості порівняно з С5 людини, та, внаслідок цього, передбачається, що майже кожен С5 людини зв'язується з антитілом. Кров узяли через 5 хвилин, сім годин, один день, два дні, три дні та сім днів після введення. Узяту кров потім одразу центрифугували при 14000 обертах за хвилину та при 4 С протягом 10 хвилин, щоб відокремити плазму. Відокремлену плазму зберігали у морозильнику при -80 "С до аналізу. Антитіла проти С5 людини, що застосовувалися, - це вищеописані
СЕАОЗО5-Е760с4, СЕАОЗО7-Е760024, СЕАОЗЗ30О-Е760024, СЕАОЗ41-Е760с24, СЕАОЗб66-Е760С4,
СЕАОБО1-Е760с4, СЕАОБ38-Е76004, СЕАОБ599-Е76004, СЕАОбб6б-Е76004, СЕАОб72-Е76064 та
СЕАОб75-Е760С4. 6.2. Вимірювання концентрації у плазмі сумарного С5 людини за допомогою аналізу електрохемілюмінесценції (ЕСІ)
Концентрацію сумарного С5 людини у мишачій плазмі вимірювали за допомогою ЕСІ.
Наступний спосіб застосовували у присутності СЕАОЗ330-Е76004, СЕАОЗ41-Р760054 або тільки С5 людини у зразку плазми. Антитіло проти С5 людини (Запіа Сги7) розподілили. у незакритий планшет з 96 комірками МОЇ ТІ-АККАМ (Мезо Зсаїе бізсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4 "С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом проти
С5 людини. Зразки для калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше, з 1 мкг/мл впорскнутого антитіла отримали та інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали бо мічене БОЇ РО-ТАС антитіло проти до людини (Мезо Зсаїе Оізсомегу), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Вийег Т (х4) (Мезо Зсаієе Оібзсомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи Зесіог Ітадег 2400 (Мезо зсаїе бізсомегу).
Наступний спосіб застосовували у присутності СЕАОЗ305-Е760024, СЕАОЗО7-Е760С4,
СЕАОЗб66-Р760с4, СЕАОБО1-г760с24, СЕАО538-Р760с4, СЕАОБ599-Е76004, СРАОбб6-Е760С4,
СЕАОб72-Е760054 або СЕАОбЄ75-Е76004 у зразку плазми. Антитіло проти С5 людини (СЕАОЗ329-
Е93904; МН, 5ЕО ІЮО МО: 23 та МІ, 5ЕО ІЮО МО: 27) розподілили у незакритий планшет з 96 комірками МОГ ТІ-АККАМ (Мезо Зсаіе Оізсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4 "С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини.
Зразки для калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше кислотним розчином (рН 5,5), отримали та інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С. Після цього ці зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти С5 людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене
ЗИ РО-ТАС антитіло проти С5 людини (СЕАОЗ300-Е939054; МН, 5ЕО ІЮО МО: 24 та М, 5ЕО ІЮ
МО: 28), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Вийег Т (х4) (Мезо зЗсаІе Оізсомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи з5есіог Ітадег 2400 (Мезо зсаїе Різсомегу).
Концентрацію С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїесшаг Оемісе5). Часову динаміку концентрації С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на Фігурі 13. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією С5 людини у плазмі через 5 хвилин. 6.3. Вимірювання концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі за допомогою аналізу
ЕС
Концентрацію антитіла проти С 5 людини у мишачій плазмі вимірювали за допомогою ЕС.
Фрагмент антитіла Е(ар)2 проти (дб людини (специфічний до гамма-ланцюга) (Зідта) або антитіло проти каппа-ланцюга ІдсС людини (Апібоду Зоїшщіоп5) розподілили у незакритий планшет з 96 комірками МОСТІ-АККАМ (Мезо 5Зсаіе Оібсомегу) та залишили стояти протягом ночі при температурі 4"С, щоб отримати планшети з іммобілізованим антитілом або
Зо фрагментом антитіла проти (390 людини. Приготували зразки калібрувальної кривої та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом або фрагментом антитіла проти ЇД0 людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали біотиніловане антитіло проти дО людини (БоціПпегпріоїесп) або мічене ЗОГРО-ТАС антитіло проти Ес ІдС людини (ЗошїПегпріоїесі)), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього тільки, коли застосовували біотиніловане антитіло проти ДО людини, додали мічений ЗШ РО-ТАС стрептавідин (Мезо ЗсаІе Оібзсомегу), та залишили реагувати протягом однієї години при кімнатній температурі, та виконали промивання. Одразу після цього розподілили Кеай Випйег Т (х4) (Мезо ЗсаїІе Оіз5сомегу) та виконували вимірювання, застосовуючи Бесіог Іптадег 2400 (Мезо зЗсаіє Оізсомегу). Концентрацію антитіла проти С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення 5ОЕТтах РКО (Моїесшаг Оемісе5). Часову динаміку концентрації антитіла проти С5 людини у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на Фігурі 14. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією антитіла проти С 5 людини у плазмі через 5 хвилин. 6.4. Вплив залежного від рН зв'язування антитіла проти С5 людини на кліренс С5 людини іп мімо
Залежні від рН антитіла проти С5 людини (СЕАО305-Е760214, СЕАОЗО7-Е760с4, СЕАОЗбб-
Е76004, СЕРАОБ501-Р76004, СЕАО538-Р760с04, СЕРАОБ599-Е760с4, СЕАОбб6б-Р760с4, СЕАОб72-
Е76004 та СЕАО675-Е7606054) та не залежні від рН антитіла проти С5 людини (СЕАО330-Е760.4 та СЕАОЗ341-Е760с4) тестували іп мімо та порівняли отриману концентрацію у плазмі антитіла проти С5 людини та концентрацію у плазмі С5 людини. Як показано на Фігурі 14, вміст антитіла в плазмі був порівняним. Між тим, кліренс С5 людини, введеного одночасно з залежними від рН антитілами проти С5 людини, прискорився порівняно з кліренсом С5 людини, введеного з не залежними від рН антитілами проти С 5 людини (Фігура 13).
Приклад 7
Оптимізація моноклональних антитіл проти С5 (варіанти 305)
Зробили ряд мутацій в оптимізованій варіабельній ділянці антитіла проти С5 3051 05, щоб далі покращити його властивості, та отримали оптимізовані варіабельні ділянки 3051 015, 60 305І 016, 305І 018, 3051 019, 3051 020, 3051 022 та 3051 023. Амінокислотні послідовності МН та
МІ. варіантів 305 наведено у Таблицях 7 та 8, відповідно. Гени, які кодують гуманізовану УН, поєднали з модифікованим варіантом СН ІдсСІ людини - 505115 (5ЕБЕО ІЮО МО: 114) та модифікованими варіантами СН ІдсС4 людини -565422 (5ЕО ІЮ МО: 115) або 565429 (5ЕО ІО МО: 116). Гени, які кодують гуманізовану МІ, поєднали з Сі людини (ЗКІ, 5ЕО ІЮ МО: 38). Окремо гени важкого та легкого ланцюгів, які кодують гуманізоване антитіло проти С5, ВМО441 (8МО441Н, 5ЕО ІО МО: 149; ВМО4411, 5ЕО ІЮО МО: 150), синтезували та кожен ген клонували у вектор експресії.
Антитіла експресувалися у клітинах НЕК 293, трансфектованих спільно комбінацією векторів експресії важкого та легкого ланцюгів, та їх очистили Білком А.
Таблиця 7
НУВ-НІ НУВ-Нг НУВ-НЗ , ЗЕО ІО МО: 54 ЗЕО ІО МО: 64 ЗЕО ІЮ МО: 74 3051-05 ЗЕСІОМО:10 ЗЗУММА АІУтТаваАТУКАБМАКОИ | ОСОаМОМРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІО МО: 118 ЗЕО ІО МО: 121 3051015 | ЗБОЮ МО: 106 З8УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЕМАКО ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІЮ МО: 119 ЗЕО ІО МО: 121 3051016 | ЗБОЮ МО: 107 З8УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЄМУКО | ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІО МО: 118 ЗЕО ІО МО: 121 305018 | ЗБОЮ МО: 108 З8УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЕМАКО ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІО МО: 118 ЗЕО ІО МО: 121 3051019 | ЗБОЮ МО: 109 З8УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЕМАКО ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІО МО: 118 ЗЕО ІО МО: 121 3051020 | ЗБОЮ МО: 109 З8УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЕМАКО ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕОІО МО: 118 ЗЕО ІО МО: 121 3051022 | ЗБОЮ МО: 109 З5УУМА // ІДІЕТОЗСАЕУКАЕМАКСО ОАСУОУРТНАМНУ , ЗЕО ІО МО: 117 ЗЕО ІЮ МО: 120 ЗЕО ІО МО: 121 3051023 ) ЗБОЮ МО: 110 З5УУМА // |ДІЕТО5ОАТУКАЕМАКО| ОАСУСУРТНАМНУ
Таблиця 8
Амінокислотні послідовності МІ варіантів 305
НУВ-І НУВІ2 НУВ-З , ЗЕО ІЮ МО: 84 ЗЕО ІО МО: 94 ЗЕОІЮ МО: 104 3055 ЗБОІОМО20 | ОАВОМІСВБІА САБКТНУ О5ТКУС85УОМН , ЗЕОІЮМО 122 ЗЕО ІЮ МО: 123 ЗЕО ІЮ МО: 125 305-015 | ЗЕОТО МО: 111) ВАБОСІБ55ІА САБЕТЕВ ОМТКУС55УСМТ , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 123 ЗЕО ІЮ МО: 125 305-016 | ЗЕОЇО МО: 111) ВАБОСІВ5ВІА САБЕТЕВ ОМТКУС55УСМТ , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 123 ЗЕО ІЮ МО: 125 305-018 | ЗЕОЇО МО: 111) ВАБОСІВ5ВІА САБЕТЕВ ОМТКУС55УСМТ , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 123 ЗЕО ІЮ МО: 125 305-019 | ЗЕОЇО МО: 111) ВАБОСІВ5ВІА САБЕТЕВ ОМТКУС55УСМТ , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 123 ЗЕО ІЮ МО: 125 3051020 | ЗЕОІО МО: 112 ) вВАБОСІ555ІА САБЕТЕВ ОМТКУС55УСМТ , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 124 ЗЕО ІЮ МО: 125 3051022 ) ЗЕОІО МО: 113 | ВАБОСІЗ5БІА САЗТТО5 ОМтКУс55ХОМт , ЗЕО ІО МО: 122 ЗЕО ІЮ МО: 124 ЗЕО ІЮ МО: 125 3051023 | ЗБОІО МО:113 | вВАБОСІ555ІА СА5ТТО5 ОМТКУС55УСМТ
Приклад 8
Характеристика зв'язування антитіл проти С5 (варіантів 305) Кінетичні параметри антитіл проти С 5 стосовно рекомбінантного С 5 людини оцінювали при 37 "С із застосуванням приладу
Т200 ВІАСОНЕ (зареєстрована торговельна марка) (СЕ Неайнсагє) при трьох різних умовах: (1) асоціацію і дисоціацію вимірювали при рн 7,4, (2) асоціацію і дисоціацію вимірювали при рН 5,8 та (3) асоціацію вимірювали при рН 7,4, а дисоціацію вимірювали при рН 5,8. Ргод/а (Рієгсе) іммобілізували на сенсорному чипі СМІ, застосовуючи набір для амінного зчеплення (СЕ
НеайНсагеє) згідно з рекомендованими СЕ Неєайнсаге налаштуваннями. Антитіла та аналіти для умов (1) та (3) розвели у буфері АСЕ5 рН 7,4 (20 мМ АСЕ5, 150 мМ Масі, 1,2 мМ Сасі», 0,05 95
Тмееп 20, 0,005 95 Мам»), а для умови (2) їх розвели у буфері АСЕ5 рН 5,8 (20 мМ АСЕ5, 150
ММ масі, 1,2 мМ Сасі», 0,05 95 Тмєеп 20, 0,005 95 МаМ»з). Кожне антитіло захопили на сенсорну поверхню за допомогою РгоА/й. Рівні захоплення антитіла становили зазвичай 60-90 резонансних одиниць (ВИ). Після цього рекомбінантний С5 людини впорскували при від З НМ до 27 НМ або від 13,3 нМ до 129 нМ, отриманими внаслідок трикратного серійного розведення, а потім відбулася дисоціація. Поверхню регенерували, застосовуючи 25 мМ Маон. Кінетичні параметри при умовах (1) та (2) визначили шляхом узгодження сенсограм з моделлю зв'язування 1:1, а константу дисоціації при умові (3) визначили шляхом узгодження сенсограм з дисоціацією 1:11 для моделі МОСК, застосовуючи програмне забезпечення Т200 Емаїшйайоп
ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка), версія 2.0 (СЕ НеаййНсагє). Залежність від рН усіх антитіл показано як відношення констант дисоціації для умов (2) та (1).
Константу асоціації (ка), константу дисоціації (Ка), афінність зв'язування (КО) та залежність від рН наведено у Таблиці 9. Усі антитіла демонстрували більшу швидкість дисоціації при рн 5,8, ніж при рН 7,4, та їх залежність від рН була приблизно 20-кратною.
Таблиця 9
Кінетичні параметри варіантів антитіла проти С5 за умов рН 7,4 та рн 5,8 00 Бепмотлю ет ком аптекою заловість ка (1/0. |залежність
Афінність зв'язування антитіл проти С5 (ВМ.О441, екулізумаб та варіант 305) з рекомбінантним С5 людини при рН 7,4 та рН 5,8 визначили при 37 "С, застосовуючи прилад
Т200 ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) (СЕ НеєайнНсаге), щоб оцінити вплив рН на зв'язування антигену. Поліклональне антитіло козла проти Ес дб людини (КРІ 201-10-20) іммобілізували на сенсорному чипі СМ4, застосовуючи набір для амінного зчеплення (СЕ
Неайнсаге) згідно з рекомендованими виробником налаштуваннями. Антитіла та аналіти розвели буфером АСЕ5 рН 7,4 або буфером АСЕ5 рН 5,8, які містили 20 мМ АСЕ5, 150 ММ
Масі, 12 мМ Сасі», 0,0595 Тмееп 20 та 0,00595 МамМ». Антитіла захопили на сенсорну поверхню, застосовуючи спосіб анти-Ес, рівні захоплення зазвичай становили 50-80 резонансних одиниць (2КШ). Рекомбінантний С5 людини отримали внаслідок трикратного серійного розведення, починаючи з умов аналізу 27 нМ для рн 7,4 або з умов аналізу 135 нм для рН 5,8. Поверхню регенерували, застосовуючи 20 мМ НС, 0,01 95 Гуееп 20. Дані обробили
Зо та узгодили з моделлю зв'язування 1:1, застосовуючи програмне забезпечення ВіаЕма|ІЧайоп 2.0 (СЕ Неаїййсагє).
Афінність зв'язування (КО) ВМОУ441, екулізумабу та варіанта 305 з рекомбінантним С5 людини при рН 7,4 та рН 5,8 наведено у Таблиці 10. Варіант 305 демонстрував відношення (КО при рН 5,8) / (КО при рН 7,4), яке становить майже 800, що у 8 разів перебільшує таке відношення для ВМО441, яке продемонструвало відношення (КО при рн 5,8) / (КО при рН 74), яке становило лише 93.
Таблиця 10 щи Ден р - й ЖИ при рн 5,8/рН 7,4
Приклад 9
Інгібувальна активність антитіл проти С5 (варіанти 305) на активацію С5 9.1. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 Фо) (Віоргедісє, БЕНО19) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Розчин ліпосом, сенсибілізований антитілами проти динітрофенілу (Ашокії СН5ЬО, УУако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшШОКіїЇ СН5БО) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 40 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток лізису ліпосом визначили як 100 х МОО маь-ОО фон сироватки та ліпосом) |/ МО без мАН-ОЮ фон сироватки та ліпосом) |.
Фігура 15 демонструє, що МАБ проти С5: 305І 015-5І0422, 305І 016-52:422, 305І 018-5Д12422, 305 019-523422, 3051 020-52:422 та 3051 020-52:115 - інгібували лізис ліпосом. Антитіла з варіантами Ес, 305 015-5(121115 та 305І О23-5Ц2:1429, також інгібували лізис ліпосом (Фігура 16).
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування рекомбінантного С5 людини (5ЕО ІО МО: 39). 10 мкл сироватки людини з дефіцитом С5 (5ідта, СІ 163) змішали з 20 мкл розведеного МАБ та 20 мкл рекомбінантного С5 (0,1 мкг/мл) у планшеті з 96 комірками та планшет інкубували на шейкері протягом 1 години при 37 "С. Ліпосоми (АшоКії СН5О) перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (Ашокії
СН5О) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 180 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток лізису ліпосом визначили, як описано вище. Фігура 17 демонструє, що МАБ проти
С5: 305 022-502115, 3051 022-512422, 3051 023-50115 та 305 023-52:422 - інгібували лізис ліпосом. 9.2. Інгібування утворення С5ба антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо утворення Сб5а під час лізису ліпосом, щоб підтвердити, що
МАБ проти С5 інгібують розщеплення С5 на Сба та С5БЬ. Рівні Сб5а в надосадових рідинах кількісно визначили з аналізу лізису ліпосом, застосовуючи набір Сба ЕПІЗА (НО в5увієтв, ругоз7). Усі МАБ інгібували утворення Сба в надосадових рідинах залежним від дози чином (Фігури 18 та 19). 9.3. Вимірювання активності комплементу у плазмі яванської макаки
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу у плазмі яванської макаки. Мавпам ввели МАБ проти С5 (20 мг/кг) та зразки плазми брали періодично до 56 дня.
Еритроцити курчати (СВВС) (Іппомаїїме гезєагсі, ІСО5-0810) промили забуференим сольовим розчином з желатином/вероналом, який містив 0,5 мМ МаОсі»г та 0,15 мМ Сасіг (СМВ---) (Вовіоп
ВіоРгодисіх, ІВВ-З300Х), та після цього сенсибілізували антитілом проти еритроцитів курчати (НосКіапа 1033-4139) у концентрації 1 мкг/мл протягом 15 хвилин при 4 "С. Клітини потім промили
СУВая та суспендували у такому ж самому буфері із щільністю 1 х 1089 клітин/мл. В окремому планшеті для мікротесту з 96 круглодонними комірками плазму мавпи інкубували з сенсибілізованими сАВС при 37 "С протягом 20 хвилин. Після інкубування планшет центрифугували при 1000 х уд протягом 2 хвилин при 4 "С. Надосадові рідини перенесли до комірок на планшетах для мікротесту з 96 комірками з пласким дном для вимірювання ОО при 415 нм з посилальною довжиною хвилі 630 нм. Відсоток гемолізу визначили як 100 х КОО після введення 7 оо фон плазми та сввс)|/ МО до введення 7 ор фон плазми та свВс)|.
Фігура 20 демонструє, що МАБ проти С5: 305І 015-5(2422, 305 015-5Х1:2115, 305І 016-512422, 305018-52:422, 3051 019-52:422, 3051 020-52:422, 3051 020-52115 та 3051023-512115 - інгібували активність комплементу у плазмі. 9.4. Інгібування біологічної активності варіантів С5 антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування варіантів рекомбінантного С5 людини: М145І, 84492, У802І, В885Н, 29280, 0966У, 51310М та Е14370. Повідомлялося, що пацієнти з РМН, які мають мутацію В885Н в С5, демонструють низьку реакцію на екулізумаб (дивись, наприклад,
МівПпітигта еї аї., Мем/ Епаді. у. Мей. 370:632-639 (2014)) Кожен з варіантів С5 людини експресували у клітинах Е5Б293 та надосадові рідини застосовували для наступного дослідження. 10 мкл сироватки людини з дефіцитом С5 (Зідта, СІ 163) змішали з 20 мкл розведеного МАБ та 20 мкл культурального середовища клітин, яке містило варіант рекомбінантного С5 (2-3 мкг/мл), у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 0,5 години при 37 "С. Ліпосоми (АшіоКкії СН5БО) перенесли у кожну комірку та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 37 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшШОКіїЇ СН5БО) бо додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 37 "с.
Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 90 хвилин, а після цього виміряли ОО при 340 нм.
Відсоток лізису ліпосом визначили, як описано вище. Фігура 21 демонструє, що МАБ проти С5 (екулізумаб) не інгібував варіант С5 В885Н, проте інгібував інші варіанти С5, що тестувалися.
Фігура 22 демонструє, що МАБ проти С5 (варіант 305) інгібував усі варіанти С5, що тестувалися. 9.5. Інгібування активованого комплементом лізису ліпосом антитілами МАБ проти С5
МАБ проти С5 тестували щодо інгібування активності комплементу за допомогою аналізу лізису ліпосом. 30 мкл сироватки здорової людини (6,7 Фо) (Віоргедісє, БЕНО19) змішали з 20 мкл розведеного МАБ у планшеті з 96 комірками та інкубували на шейкері протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Розчин ліпосом, сенсибілізований антитілами проти динітрофенілу (Ашокії СН5ЬО, УУако, 995-40801), перенесли до кожної комірки та планшет розташували на шейкері на 2 хвилини при 25 "С. 50 мкл субстратного розчину (АшШОКії СН5БО) додали до кожної комірки та змішували шляхом збовтування протягом 2 хвилин при 25 "С. Кінцеву суміш інкубували при 37 "С протягом 45 хвилин, а потім виміряли ОО при 340 нм. Відсоток інгібування лізису ліпосом визначили як 100 х МО МмАЬ-ОЮ фон сироватки та ліпосом) |/ МОо без МАЬ-ОЮ фон сироватки та ліпосом) |.
Фігура 23 демонструє, що МАЬ проти С5-8МОУ441 та варіант 305 - інгібували лізис ліпосом та що варіант 305 має сильнішу активність зв'язування, ніж ВМО441.
Приклад 10
Дослідження фармакокінетики моноклональних антитіл проти С5 (305 варіантів) у яванського макака 10.1. Тест іп мімо із застосовуванням яванського макака
Кінетику іп мімо антитіла проти С5 людини оцінювали після введення антитіла проти С5 людини яванському макаку (піп Мірроп Віотеваіса! І арогаюгієз, Ца., Японія). Розчин антитіла проти С5 людини (2,5 мг/мл) вводили один раз у дозі, яка становила приблизно 8 мл/кг, у головну вену передпліччя шляхом інфузії протягом 30 хвилин. Кров узяли перед введенням та через 5 хвилин, сім годин, один день, два дні, три дні, сім днів, чотирнадцять днів, двадцять один день, двадцять вісім днів, тридцять п'ять днів, сорок два дні, сорок дев'ять днів та п'ятдесят шість днів після введення. Узяту кров одразу піддали центрифугуванню при 1700 х а та 4 "С протягом 10 хвилин, щоб відокремити плазму. Відокремлену плазму до аналізу
Зо зберігали у морозильнику при -70 "С або нижче. Антитіла проти С5 людини отримали, як описано у Прикладі 7. 10.2. Вимірювання концентрації сумарного С5 у плазмі яванського макака за допомогою аналізу ЕГІЗА
Концентрацію сумарного С5 яванського макака у плазмі яванського макака вимірювали шляхом ЕГІБА. Антитіло проти С5 людини (антитіло, отримане у лабораторних умовах із застосуванням способу, описаного у Прикладі 2) розподілили у планшет Мипс-ІттипоРіаїє
Махізогр (МаЇде Мипс Іпієегпайопаї) та залишили стояти протягом ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізованим анти-С5 яванського макака. Зразки для калібрувальної кривої та зразки плазми яванського макака, розведені у 20000 разів 0,4 мкг/мл впорскнутого антитіла, приготували та інкубували протягом 60 хвилин при 37 "С. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим анти-С5 яванського макака та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене НРЕ антитіло проти де людини (5оційпегпВіоїесі), та дозволили реагувати протягом тридцяти хвилин при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього додали субстрат для пероксидази хріну
АВТО ЕПІЗА НАР Зибзігаїє (КРІ). Сигнал вимірювали за допомогою планшет-ридера при довжині хвилі 405 нм. Концентрацію С5 яванського макака розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення 5ОЕТтах РО (МоїІесшаг Оемісе5). Часову динаміку концентрації С5 яванського макака у плазмі після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено у фігурі 24. Дані нанесено на графік як відсоткове відношення залишку порівняно з концентрацією С5 яванського макака у плазмі перед введенням. Залежні від рН антитіла проти С5 людини (3051 015-5023422, 305І 015- зЗа115, 305 016-5125422, 305І 018-5201422, 305І 019-5245422, 305І 020-5102:422, 305І 020-5(021115, 305 022-513422, 3051 023-5(12422 та 3051 023-5(21115) демонстрували нижче акумулювання С5 у плазмі порівняно з не залежними від рН антитілами проти С5 людини. 10.3. Вимірювання концентрації у плазмі антитіла проти С5 людини за допомогою аналізу
ЕПЗА
Концентрацію антитіла проти С5 людини у плазмі яванського макака вимірювали за допомогою ЕГІ5А. Антитіло проти каппа-ланцюга Ідсї людини (Апіїроду боішіопв) розподілили у планшет Мипс-ІттипоРіаїє Махізогр (Маде Мипс Іпіегпаййопаї) та залишили стояти протягом бо ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізованим антитілом проти Ід людини. Приготували зразки для калібрувальної кривої та зразки плазми яванського макака, розведені у 100 разів або більше. Після цього зразки розподілили у планшети з іммобілізованим антитілом проти Ід; людини та залишили стояти протягом однієї години при кімнатній температурі. Потім додали мічене НРА антитіло проти дб людини (5ошпетвВіоїесі), та дозволили реагувати протягом тридцяти хвилин при кімнатній температурі, та виконали промивання. Після цього додали субстрат для пероксидази хріну АВТО ЕГІЗА НАР Зибрвігаїє (КРІМ. Сигнал вимірювали за допомогою планшет-ридера при довжині хвилі 405 нм.
Концентрацію антитіла проти С5 людини розрахували на основі реакції за калібрувальною кривою, застосовуючи аналітичне програмне забезпечення БХОЕТтах РО (Моїесшіаг ЮОемісев).
Часову динаміку концентрації у плазмі антитіла проти С5 людини після внутрішньовенного введення, виміряну за цим способом, наведено на фігурі 25. Залежні від рН антитіла проти С5 людини (3051 015-52422, 305 015-512:115, 305І 016-505422, 305І 018-52:422, 3051 019-5103422, 305і020-52:422, 3051020-52(2115, 3051022-5:2422, 3051023-512422 тазо5Іі 023-5:1115) демонстрували триваліше напівжиття порівняно з незалежними від рН антитілами проти С5 людини.
Приклад 11
Рентгенівський аналіз кристалічної структури комплексу Раф варіанта 305 та домену МИ С5 людини 11.1. Експресія та очищення домену Ма (20-124) С5 людини
Домен Ма (амінокислотні залишки 20-124 5ЕО І МО: 39), злитий з міткою 25 за допомогою лінкера, що розщеплюється тромбіном (2451-МаИ1), експресували у штамі В 21 СЕЗ ріузе Е. соїї (Рготеда), застосовуючи вектор раєЕХ-4Т-І (сбЕ ПНеайнсагє). Експресію білка індукували 0,1 мМ ізопропіл-бета-О-і-тіогалактопіранозидом (ІРТС) при 25 "С протягом 5 годин.
Дебрис бактеріальних клітин піддали лізису із застосуванням коктейлю Видбривіег (МегсК) з доданими лізоназою (Мег"скК) та повним коктейлем інгібіторів протеаз ("сотрієїе ргоїєазе іппіріюг соскКіаї") (Воснеє), а потім 45Т1-МИ1 очищували від розчинної фракції, застосовуючи колонку азТгар (СЕ НеайНсагеє) згідно з інструкцією виробника. Мітку а5Т відщепили тромбіном (бідта) та отриманий домен МО далі очищували за допомогою гель-фільтрації на колонці Зирегадех 75 (СЕ Неайсаге). Фракції, що містили домен МИ, об'єднали та зберігали при -80 "С.
Зо 11.2. Отримання фрагмента Раф варіанта 305
Фрагменти Бар одного з оптимізованих варіантів, що походять від 305, отримали за традиційним способом, застосовуючи граничне перетравлення папаїном (Косне Оіадпозвіїсв, Саї
Мо. 1047825), а потім завантажили на колонку Білка А (Марбіесі 5ийе, СЕ НеайнНсагє), щоб видалити фрагменти Ес, катіонообмінну колонку (Ніїтар 5Р НР, СЕ Неайнсагє) та гель- фільтраційну колонку (Зирегаєх200 16/60, СЕ НеайнНсаге). Фракції, що містили фрагмент Раб, об'єднали та зберігали при -80 "С. 11.3. Отримання комплексу Раб варіанта 305 та домену МЕТ С5 людини Очищений домен
Ма рекомбінантного С5 людини змішали з очищеним фрагментом Рар варіанта 305 у молярному відношенні 1:11. Комплекс очистили шляхом гель-фільтраційної хроматографії (Зирегдех200, збільшення 10/300, (СЕ Неєайнсагє), застосовуючи колонку, урівноважену 20 мМ НЕРЕЗ рН 7,5, 100 мМ Масі. 11.4. Кристалізація
Очищені комплекси концентрували до приблизно 10 мг/мл та виконували кристалізацію за способом дифузії пари у сидячій краплі у комбінації зі способом посіву при 4 "С. Розчин резервуару складався з 0,2 М дегідрату форміату магнію, 15,0 95 мас/об, поліетиленгліколю 3350. За декілька днів це перетворилося у пласкі кристали. Кристал занурили у розчин 0,2 М дегідрату форміату магнію, 25,0 95 мас/об, поліетиленгліколю 3350 та 20 95 гліцерину. 11.5. Збір даних та визначення структури
Дані рентгенівської дифракції вимірювали на виводі опромінювання ВІ З32ХИО з джерела
ЗРгіпд-8. Під час опромінювання кристал постійно знаходився у потоці азоту при -178 "С, щоб підтримувати заморожений стан, та загалом зібрали 180 рентгенівських дифракційних зображень, застосовуючи детектор МХ-225Н5 ССО (ВАМОМІХ), приєднаний до виводу опромінювання, при цьому кристал обертався на 1,0 градус за один раз. Визначення параметрів комірки, індексування дифракційних плям та обробку дифракційних даних, отриманих з дифракційних зображень, виконували, застосовуючи програму Хіа2 (У. Аррі. Стуві. 43:186-190 (2010), ХО5 РасКкаде (Аста. Стуві. О66:125-132 (2010)) та б5саїа (Асіа. Стуві. О62:72-82 (2006)) та зрештою отримали дані інтенсивності дифракції аж до 2,11 ангстрема розрізнення. Статистичні кристалографічні дані наведено у Таблиці 11.
Таблиця 11
Сукупність даних рентгенівського аналізу та характеристики узгодження
Елементарнакомірдкаї 11111111
Завершеність (оболонка найвищого розрізнення) (95)
Втеюег (оболонка найвищого розрізнення) (95) (Середньоквадратичне відхилення відідеальногод/-/:/ | (7777771
Довжина зв'язків (А) а) Втеше - УПКІХІ | (ПК) - «1 (йК)» Т/хАКІх)И І) (АК), де Ц(НКІ) та «І (НКІ)) - це інтенсивність вимірювання | та середня інтенсивність для рефлексу з індексами ПКІ, відповідно.
Р) В-фактор - УПКІ | Есаіс(ПКІ) |- | сь (КІ) Ї/ХАКІЇ сь (АК)!Ї, де сь та Есас -це амплітуди структурного фактора, які спостерігаються та розраховані, відповідно. с) Неее Є розрахованим з 5 95 відхиленням випадково заданого рефлексу.
Структуру визначили шляхом молекулярного заміщення за допомогою програми РНазег (9. Аррі. Стгуві. 40:658-674 (2007)). Модель дослідження домену Раб отримали з опублікованої кристалічної структури Раб Ідс4 людини (РОВ код: ІВВ))), та модель дослідження домену МС 1 походить від опублікованої кристалічної структури С5 людини (РОВ код: ЗСИ7, МаїІттипої. 9:753-760 (2008)). Модель побудували за допомогою програми Соої (Асіа Стузі. 066:486-501 (2010)) та узгодили за допомогою програми Нейтасо (Асіа Стгубі. 0О67:355-367 (2011),
Кристалографічний фактор достовірності (А) для різних даних інтенсивності дифракції від 25- 2,11 ангстрема становив 20,42 9о зі значенням вільного Н-фактора у 26,44 до. Характеристики узгодження структури наведено у Таблиці 11. 11.6. Загальна структура комплексу Раб варіанта 305 та домену С5-МОИ
Фрагмент Бар оптимізованого варіанта ("305 Рар") що походить від 305, зв'язаний з доменом С5-М(1 людини ("МО1") у відношенні 1:11, та асиметрична одиниця кристалічної структури містила два комплекси, Молекули 1 та 2, як зображено на фігурі 26А. Молекули 1 та 2 можна взаємно зорієнтувати належним чином при 0,717 ангстрема ВМ50, використовуючи позицію атома С-альфа в усіх залишках, як показано на Фігурі 268. Фігури, що обговорюються нижче, отримали із застосуванням Молекули 1.
На Фігурах 27А та 27В епітоп контактної ділянки Бар 305 картований в амінокислотній послідовності МС1 та кристалічній структурі, відповідно. Епітоп включає амінокислотні залишки
МИ, які містять один або більше атомів, розташованих у межах відстані 4,5 ангстрема від частини Раб 305 у кристалічній структурі. Крім того, епітоп у межах 3,0 ангстрема виділено на
Фігурі 27А. 11.7. Взаємодії Е48, 051 та КТ109
Як описано у Прикладах 4.5 та 4.6, МАБ проти С5, які включають серію, що походить від антитіла 305, тестували щодо зв'язування з трьеома точковими мутантами С5 людини - Е48А,
О51А та КІ0О9А - за допомогою аналізів зв'язування з використанням вестерн-блотингу та
ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка). У той час, коли варіанти 305 зв'язувалися сильно з природним С5, вони тільки слабо зв'язувалися з мутантом С5 Е48А та не зв'язувалися з
Зо мутантами ОБ5БІА та КІ0О9А. Кристалічна структура комплексу Рар305 та МИ1 дозволила виявити, що три амінокислоти: Е48, 051 та К109 -усі знаходяться у межах відстані 3,0 ангстрема від Рар305, утворюючи ряд водневих зв'язків з Бар, як показано на Фігурі 28А. Після докладнішого дослідження залишок КТ09 МО1 заглиблюється у канавку, утворену на поверхні взаємодії важкого ланцюга Раб, та щільно взаємодіє з Раб за допомогою трьох водневих зв'язків з Н-СОНЗОИЗ97, Н-СОВНЗМ100 та Н-СОВЗ Т1005 та за допомогою сольового містка з ННСОНЗОУ5 (Фігура 280). 051 розташований між МС1 та важким ланцюгом Рабз3о5 та утворює два водневі зв'язкиз Н-СОВІ бег32 та Н-СОВ2 5ег54, заповнюючи простір (Фігура 28С). Це вказує на те, що як К109, так і 051 С5 є вирішальними залишками для зв'язування антитіл серії 305. З іншого боку, Е48 розташований ближче до поверхні та утворює тільки один водневий зв'язок з баб, що дозволяє припустити, що його внесок у зв'язування антитіла буде меншим, ніж внесок К109 та
О51 (Фігура 288). Ці взаємозв'язки відповідають результатам аналізів зв'язування з використанням вестерн-блотингу та ВІАСОВЕ (зареєстрована торговельна марка) мутантів С5 людини (Приклади 4.5 та 4.6). Додаткове зауваження: нумерація залишків для амінокислот бар базується на схемі номенклатури Кебота. (КабБбаї есеї аЇ., Зедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї!
Іптегеві, ІП Ед. Рибіїс Неацй З5егуісе, Майопаї! Іпвійшез ої Неайнй, ВеШезаа, Ма., 1991). 11.8. Взаємодії Н7О, Н72 та НІ 10 С5 людини та антитіл серії 305
Аналіз кристалічної структури дозволив виявити, що три залишки гістидину в С5 людини, а саме Н7О, Н72 та НІ 10, включені в епітоп Раб варіантів 305, як показано на Фігурі 27А та Фігурі 29А. Аналіз зв'язування ВІАСОНВЕ (зареєстрована торговельна марка) виконували для того, щоб дослідити внесок цих залишків гістидину до залежної від рН взаємодії білок-білок між С5 людини та ЕРар варіантів 305, застосовуючи мутантів С5 людини: Н7ОМ, Н72М, НІ ТОМ та
Н7ОМ--НІТОУ (Приклад 4.7). Н72У зумовив повну втрату зв'язування Раб варіантів 305 з С5. Цей залишок С5 розташований у гаманці, утвореному петлею СОВ2 важкого ланцюга Раб 305 та петлею Ма (І 73, 574 та Е76), та щільно заповнює цей простір, як показано на фігурі 29С. Крім того, залишок Н72 С5 утворює водневий зв'язок з Н-«СОВ2У58. Не очікується, що мутація Н72гУ буде допускатися, оскільки немає достатнього простору для розташування більш громіздкого бічного ланцюга тирозину. Також не може підтримуватися водневий зв'язок з Н-СОВН2У58. Щодо внеску Н7О та НІ 10 у залежність від рН, то внаслідок мутацій Н7ОМ та НІ 10У уповільнилася дисоціація Раб варіантів 305 від С5 при рН 5,8. Н7О утворює внутрішньомолекулярний водневий зв'язок 3 Т53 МИ, який, як вважають, обірветься при рН 5,8, коли протонування Н70О С5 спричиняє конформаційну зміну у відповідній частині поверхні взаємодії МО1 (Фігура 29В).
Зо Очікується, що для НІ 10 протонування цього залишку С5 спричинить відштовхування заряду від Рар 305, що може бути підсиленим протонуванням сусіднього залишку гістидину Н-
СОВЗ НТООс (Фігура 290).
Незважаючи на те, що вищезазначений винахід було описано детально шляхом ілюстрацій та наведенням прикладів з метою сприяння розумінню, описи та приклади не слід розглядати як такі, що обмежують обсяг винаходу. Зміст усієї патентної та наукової літератури, процитованої у цьому описі винаходу, особливо включено у повному обсязі шляхом посилань.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ЧУГАЇ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ (СНОСАЇ 5ЕЇМАКИ КАВИЗНІКІ КАІБНА) «120» АНТИТІЛА ПРОТИ С5 ТА СПОСОБИ ЗАСТОСУВАННЯ «130» С1-АТ16бОбР -1505 УР 2016-120325 -1515» 2016-06-17 -1605 150 «170» Раїепіїп мегвіоп 3.5 «21051 «2115 121 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 1
«ев Вех Зм: 030 Се Бек СБУ З3У Мар іх Уа3і їв Бо і 5ів ЯЗехк їн Вів Уві Твх СУв Тих Аа Бек сі Кре бек бак бек бе Бек ТУЮ бук Меї Су їхюв Уві Ак ів Аів Кко лу Був 0» Щжмз М Же Хе ці ств її ЖУух ХВе бі Явк З3У Аїв тТВс ТУх Тую ЗВ Зах тТкр ія
Ктз ЗА Ако бе Тих їЗіз бе був ТАК беж бек тТвх тах Уві жЖВЖх бика а о ТЕ во пів Ммек Твх ех ївма ТК Уві Абе дев ТВХх Аза ТВж Теж Би Су Вів
Зо ЗЕ
Жех Аве Бі СіЖ Тух УВУ ТБж бло Твж Ніз Аіва Меб бух За ТЮЕЮ ОЦЕ бхо ШЕУ Тих їв; Уві Зх Уві йву Ше «-21052 «2115 117 5 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «40052 із ек Ма іє Ма бек су Я1уУ БІ їжи УВА бу рБжО у Аїв ВВЕ ї В та ї5 ей Таж ЗМ) ЗВ Су ув зала бек СУ Хі Авр МОж йек ваз Бе Тух
Тек Зі Сбув Тв Узі вже бів Вів БВко БУ Був БЕ їЖні Аве їнза їв 5 о 45
Зі був іє Жух ЖВе Уві Зех Шу Теж ТВ Жх Ск Ді бдех ТСЕр віх
Мт БАЛУ АкЯ їж ЖВх ЖХієс Зах Був ТБ» Бех век бвхи Жвже Уа ЖЕ бе ків Ме: Тв Вех бе ТвВх Вів Аза взюв ТВе Вів Же Тек бе Сув Біа ха За без Нів Аів бе Хі ЖВкЕ бан їі бер пі Вко Зі Твж Ха стві Тих Уві йех вх «2105 З «2115 122 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» З їі» дек із се ма Бек сіє паж бар ої Уві був вже КУ ів Бах їжи: ШЖеж їм). ТВж су Ж Дів Ал р бмнз бею ББе Зах бак Бек бут бек Мах Су їтв Оз) Ех же» Аів Рхо Оу був ПУ бе біб тую фе
За за 45
Мі Сув її Тує йів біт бе дек шу» жів 316 Тух ТУЮ Аів дев тер
Зів БУ і» Ах Бе ТБж їів беж АкО Вес бек Бех ТВх ТЕ Уві. ТвЕ кВ а 7 но
Бай ОА Ме Твх Зак о Бже Тв АТ вів дер ТвВж Аїв ТВЕ бее Бе був ла Жвк тую Бе Те тес ЗУ Аве спів СТ» Між Ав бе За їжа ТЕр о ке 110
МУ Еко СЕУ ТОВ їх Уа Тех Уві бек ЯвЕ 115 КІ 7 «2105 4 «2115117 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 4 ів бе УВА Бін іє ех Зі ж вх Ба УвМ Жвк обко с3іу Твх Бко ї 5 10 ма їн Тв Мей Тв Сбуз Тех біз йеє Бі бе бех Без в Ява Теж ТУЮ
Ма Ава бр УВь аку пів із Бо іт Без ЗБ їжа Сх Же Кі ЗУ
Ма: біз беЕ піж ех Бі Віз ЇТВБУ Тек ТУЮ Вів ех Те Вів Був СУ вАха Кве їх їі бек ба Тв бе Беж їТвВу їх Уві Ар без Був Ме
Тв Жак їзма Ще вх сп вв те із Тве тує Ма сСув бів Еш Сів
Тіз Ту ех КУ Ар Ав дай Азова Бе бю о піж ко КУ СВЕ їжк) м їз ща тві Тв Уві Беж ах чі «-21055 «2115117 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 5
Щі» бек Увф Ба щі) Бек іо іт Абе ев УВІ Зах рю бів ТвЕ БЖ ї 5 15 їв
Її ТЇБЕ бе) Тв Суз Тв ліз ес З1У БВе ех бео бес ех бує Тух а 5 ха
Ме Авт Ткр о Увь Ах бів Вів Бе Бі Був іт Оеб са вВжр бів ЗМУ
Меб бів ТуУуж Суб Бек оз Аза ТВе Жук Ту Аза веж ТО Ай ев Піх
Акт Бе ТБх їі Ве Був ТїТвх бек Бюве Твж о ТБЕ Уві вв бео ев Меб
МЕ бек їеб ТВ Тв піч Бер Тв ді Тв Тух Бе був ів дк 1 ще за з
Хі Же Бех СЕУ евро дав лез Заю ав КВеа Жжр сі ве сю Же ж ема ца «2105 6 «2115117 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 6 пів дек Уві із Зв бек Бу ау кб її УВА тв бю сіж ТВж Бк їв Тк їх ЖВх Ста ТВж УВА. Бек біб їн бек фа Ж йаю даве Ве
Мет їТвУ Тв Уві дже зів вів вхо БУ Був КУ ївма Бій ТжЮ бі 015
Зк 40 45
Хіз Се бах ВКБе Біт (ЗУ дев АХ Тек Жух ів ех Жжкр дів був ЩУ
Ха Ей го Ї3іе бек бує їТБк беж ТБ Твх Уві дер бен вхо ів тве
Жах рхо їх ТВе біб дев ТБ вів Тв Тук Бе о Сув Аза о бхо Уві БЕХ ків ШЩіУ Ав Ті Бе Тв Теж Бо)е Аве о бе ШЖкр обі вх Фу ТвЖж їз чві ТУ Ук хек бак -2105 7 «2115116 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 7 піз Зах Уві Біб ці Бек ші зу вх ба Узі Твжх о бко БУЄ їв БО
З) ТвБх Без Зк ств жЖве Ужю беж СУ Каже фбае ех Же бек Б
Меї 5 Тхв Уві да зійз бів йко Сб був зер ба зів ЖЕ Сів СУу ївх їі Авою тах сіт бер» Аа Зех Бе Тек віз бяв ТЕ бів Буз Ех
Зез ЕБа тТиве її. Беж Без ТИВ бек їж ТвЕ ові во Бей був Же Тве г ЗВ Ж во
Мех Вже жи Аза біо дев тн вів Тв Жук Бе був і вка а вав
МаЖ бежє Уві ТуУжю Ав їн: Бе Аєрв їм Тев ЗУ Рко Же ТБх без тва
Тих Уві бек Звж щі «-2105 8 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 8 ж В ше ом -к п ххїа жк зує Ж оха ХК бі Же З у Кен їЗомия щі Важ узвь баз збо пек осуУ Фі Вк без Уві ТВжЕ Бхо БУ Твх йжо їзма Тих ее Тек був ТБ Аїв вк ККУ бе Жак бер Зек Б3У дек МІВ їїв ви Вже УЗі зе б ів Бко щьу був ЗА Її ба ЖЖ бів СУ цту« Сів ЖУжЄ Спо БЕ Зеве баров Тве жвж Тек о Тббук лів ХВ жЖЖО Аза Був ко ща 50
ЗУ дк: Бе ТЕ Кіз бек БУ ТНх ЗЕ ТВ ТБ УЗ Ав їжа ев Те дів теж Бо Тв ТБ о ша ев Тв Аа Твх бух Бе Сум Жув йх су.
В ЩІ З
Мек ЗМУ їв Ткр Біу йхо БУ Тих без Уві Твх бвь Бех Вех «2105 9 «2115116 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 9 що дек Уві сів 3» Бех і Бі ве без УМ ТВх Ббжо Бі тн все ї В 18 КВ їі ТВх їні ТВх був СВБЕ Уві Зех Сі Бе деж їні Бек ЖЕ бе Вів мес ку ЖЖ УВЬ Ах За ів Вуо Же був БУ їмо с Жхю їає їх
КУ и «В
ТВЕ їі Хвев ТВК са бер бав Бак бе бух Вів Аве ЖкЕв Аів бує У
Вже Бе ЖВж ї3Зв5 бек Вкщ ЗБЕ бах ТВЖ ТВе бі Вер їй Севз Хе ТВЕ вк та 75 що іт бек ТВі Жук дав їжа Бе АБЗ їв бжЖю Сіу Бжо СУЖ ТВж Лав УВУ
Твх Уві Зах Бах 210510 «2115 123 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 10 шій УЖ із їх Уі Бо Бек біт БУ БЬуУ баз Увх сію ке се Бе
Х 5 їй 15
Мах ве Вже їх беж Су Віз із ех бі Бве БЕ Бех Ків Беж пек бчеж ев ві бів їко5 Зві йже бів дів Вхо Щі беУв ща їжмз ШО туз уж ЖЕЖ УШш лька Ж жа ЗК АХ ЗАВ БЖ БУ мЕв БУ ше БА ОК ЮЮ ві ЗрУ ів аа беУю ВВЕ шу Бек С Вів Тв ТУЮ БУ вів Бех Те із їша ші АБ Ба ТВЕ їі6 Беж був Ба Тих йех Св вав зів У ті їм: СТБ меж ТБх дво Ме Ве Бо Уві беюв Їж діа ТЕ бух жує я За 5 туз щі ів є Зе їм: УВІ Те Уа беж їах
М 185 «2105 11 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 11
Мав уві Уві Меб ЇТВх сів їбх Бко Азіз Бех Уві бек Аіз Аїв уві сіу ії 5 10 ї8 сЗіуУу їТвж Уві Тву їі був Сув бів Азз бах зма баап біз Бфу бек Ащр й й ще 2 85 За їз Вів Тхр Тух шів Бій був Бк пі бів Бко Бко Акб Її їжмз їіз
З 48 45
ЖУх Бі Вів Ввжх МУЗ Би Ліз ЯЗвжх бі Увь беж беж ЗхУу РБз ех сію ща 85 53
Бах зіу Зак сіу Був зи Рнье ТВх їні ТВЕ Їіб беж бвав їж із Сув 55 - ТВ во із Аво Аїіз Уві ТВвкЕ ТУк бук Сув біз СУуш Жаж бе Уві сі беж За 85 5 з
Ту ЩіУ Авв Айів Ве Бі біт ші ТвВж Бі); Уві Уві Увх Був 105 ок ма «2105 12 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 12 іа їі піз мех Тих сію» їТвж бхо Ббе бак Уві Бех Аза Вів Уві пу ї В 10 15
Бу ЖБжЕ Уві Тйх їіз їв Сув піз Аіїв бек ів Аво їі Тк Вех Два о 25 За ївс Аів Тжев Тух ів ів Був Рхо Бі Сів ху Бжо Му Беб їм: Хіа 35 40 45
ТФтх пі Аза Зеах Авв ої Зіз Зех сі УЗ) Бко ек Аху Бе бу су
Зак У Вес ХУ ТВХ сії УЖ ТВХ Мей ТВ Хі беж бер без с сша дів ав» бів із ТВ ТУЮ Тух Се ів бів (У тТужх Зак Хуж Бех Ав ті дав дав Ліз Кіа фе бі 15 ТБ 03 Уві зві Уві Був 210513 «2115112 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 13 кіз пів Бі їні Тв 03 ТВЕ Бе Беб ев УВА бек Аїв Кіз ча Бе ї 5 о 15 мат Твх УВА ЖВжЖ Жіз два Сув Б Вес Зак ів беж УВІ ЖеЖ Шах век
Кар ТУк іже бек Тр о бук Ма ів Бе бхо Зі аю ко Бека Ма бе
Май їі ТУжЖ сіб Вів бек був Бен Віз йех сі ті Ко Вже де ББа
БО Б що
Шах У Бех шу ех у БЖ ж) Бе Тжх Би ТВ бів Бех Біє УщХ мів су Авю аю лів Вів ТвКЕ бУк тую СУ їв сі Тв Ттж Турю ЗвЕ
Беж ЗМУ ТК ТК вве вів ББе бі бі БУ ТВх За) Уві Уві ба Був
М ї85 ща «2105 14 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 14
Зіз тТух Авзр має Тк Бі Твх Бо АЗв ех ві спів ві Аів ті БА пу ТвжЕ Уві Тюх їіз дво оСуя ів Ав бек аз бек Хі Бек баки Ткр ів: Вів Тжр о ТУук дів ЗіБ Був Рко Бі бів Як ко був їм бе Те
ЗБ 4 «Е
Тух йхе Аза беж Тк їжа Аза Бех 51 бі Беж бес Ахч Бе Був 1У 5 ве ва ех пі ех сі Твжх бів Бе ЖВх їм ТВ 16 бек біт Ов Був Сую «й та 75 во
Авор аво» дів іа ТБжх Тук Тух Сув зів йію бар Тух йеж Зак йеж ді я що ЗЕ чі даю два ТЕ бе щу СБК о БЕУ ТБх був Уві Увь Ух а
«2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 15
Мі Жуж Авор Меї Твх а Тв вхо Аза Бех Уві Ба Уві Аза че шу ї в 10 15 іт ТВвЖ Узі ТВх Ї3Зіз дв о Сув сій Аза бек бій бек Ків бек Ав ТкВ о 8 Зо ке Аза Ткр Тух бів пів Муз Бк б3іУу бів Аже Бко Гув Хемі Їм Хе зв 45 45
ТУх Аку Але бек Тех Бе зів Бех йіУу Уві Зах Беж Акч Ббз їв 51 55 Ва 5
Зах Бі бек 03У Тю»жх бієя ББе ТВх іє ТЕЖ ЖХіз Звк Бі Уві 10 був 85 та 75 но дво Аз» Аівз Аіїз Тр Тук Тух Сув бі» біз Авр о Тух Жах Бех бех йях 85 Зо ЗВ
Уві дав Ана Тв рве сі сіу сі Твху ТнжЕ Узі Уві УЩі Іа ї0б0 105 118 «210516 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 16 дів Бех дар ме ТВх БЕ) тах Бо із йежЖ Узі бів У) Як Узі су ї В ї8 15 ще ТвЕ Уві ЖЕ Ті бе був ЗіБ Вів вк о б3а8о йеж їі ббж Зек Зі в жо за їжи. дів ТЕе ЖЖ зів Бі був ре Б Ь Бо вже був їн їн Те
Тех Бех Ада бек Твх Її; Аз бах СТУ Уві бує Бек дхе Бе же ЗКУ пвЕ У Важ Зі ЖЖ ша ЖУК Тв ще ВУ Хе бек деюв дев кам Ух ів Ана 5ів А бак Туш бек Св бе Хв жує феЕ Бех бе ЖЕ дат ті нів вав Вк бе сі щі Бі ЗВж тВвУ ТВі МвЕ ов цю МБ Та «210517 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 17 аю уві чаї Меїє ТВ бів Тк вхо Азіз Вех Узі бек Аз Аза УВУ озу 1 5 10 15 щіу Твжх Узі Жах ї3Зіє був Сув піб Аіз беж 538 Ав» їіз ТУух Бех Аів їні ех Тхр Ту сів ів бує Во 01 бе Ах Рхє кб фен їм: ї4е 35 35 35 бу тТуУух Віз Вес ТВ»х Мей віз Бех пі Уві вхо Зех Ас Бе був ЩІ
ЯЗвЕ Ажоч бек піу Твх Біз ббБе Тв без ТВх Хівз Бех АЮ бе ій Сев 55 73 75 па вів ажо Аіз Аіїз ТвЕ Тух Тух Сув Бі 0Мз Жук Тух Авр о Ті Ава ак ва за 5 чаї авЕ баз ТвВх ре Щіу Щі б1іУу Тих був Уві УВУ Уві шу 105 105 119 «2105 18 «2115 111 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 18
Вво уві Уві Ме ТБж ЗМз Те Бжо ва Бехс Узі Бек Аіз Бжо Уві БУ ї В ки ї5
Фе Твк Уві Зве Ті» був без 33із Вів беж ЩЕ) бав її їж беж СаО їше Дів Жею бук ба Зі б хо СУ Філ Бюз Брз Бу БУ Земна: Ка 35 щи 485
Тек Вів ТВХ Беж Ваю обвоа Вів ек бу Уві хо бас Аа Юа ку У кВ о яв во діз дзе дів Аів Тех Жує Жтк Сув бів Сув Жвх Вів Же Сію бег Яве
Зо З
Зав Уві БЕ У Тв Ве Бі Зб У жЖвж ТвВЕ та УВІ ЗВ 5 «2105 19 «2115 110 «2125» РАТ 5 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 19 дАвр уві Уві Меї Твх 535 ЗБ хо Азія бек Уві Бех дів Вів Уві зу 1 5 10 15 піт Твх Уві Тв їа3з йуз був Бі Бій бах Оз Авв о їЗе Тух Вехсх Аіз а -5 30 їмні Бех Тхр о Тух бів Ма Муз Бо пі бевои Аха рко Аже їз Її Те
ЗЕ 45 4і5
Тух Тух Аїв Зах ЖЖ ієна Аїз Бек сі Уві рже бек Ах Бе був 01У
Зах Ак Зак сіу Твк осіб Ве тТвжх їее ТВе ї3е бек Авр об Біб був
Ба та За во
Хіз Аве Азія Аза Ве Тк Ту Суз Пів сію ТуУух Тух бер їіз Вам ах ва зо ЗБ
Ф8і бр Ав Жвж бе бі пут 03» ТБ був чві чаж Уві о «-2105» 20
«2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 20 зв Уві Уві Ме ТВ сів; Бах ВжоО Зех Зах без бек Аів бах Уа їжу ї В 10 ів
Зео» Ак Уві Твж Її Твх о СУув Сів Аізіз Вех біз АвБ їіз БіУу ех беж 20 еВ зв
Їїве Аза Ткр о Тух бів б3)ю Муз рхо в3іУ пів ів ко Аже Замах їх) Хі
Зв 45 45
Тух Бі вів Бек був ївх Ні бек бБіу Уві хо йек Ах Бе бек Бі
БО ве що йШек ЩіУ Вех Щ3іУ Тих Аво» Ре ТВ їве ТВх Хі бех Зак їм біз Ре
Б 7 75 й із Аве Уві Вів Тв ТУжЖ Тух Сув 53 бех ТВ йУуз Уві ЗіУ Как Беж яв зо За
Тек ШіУ Ави МНіз бе 03У пі Щі Тк був УВІХ б їзі був іп 105 їїа «2105 21 «2115117 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 21 бів бах ік із біз дек бі Щ1Уу бю обев УВА біб хо іу Аза бах ї 5 15 15 їжа ТМх їх ТВж Сую Твж лів йеж 01У Бе бак Тр Ав беж 5іУу Тух 28 5 38 авЮ Меї Су« Тхр Узі Аха бів бів Руб сіу був пі їні Біб Тур ів 35 40 45
Вів сСув їі Ту ТВ Зі Бех беж діз Ави Твх Аз Тк АВ Дав» Тер дів ше КУ ку Бе Те Хіз бек бе ТвжЖ бек бек ТЕ Тв Уві ке кВ то т чо
Хе Се Мет ївБж су без Тех ів вів вв Тв дів Тк ТУ КВе Сув зв я
Щіз Бл Мхв баю дае ТУ Бе бе дво їж ее БЕ Бко яку ЖВх Без 115 «2105 22 «2115115 «2125» РАТ 5 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 22 шків век ув) піз сіз бек Зі БШіуУу Ах без УА Тахо без Бі Тв ре
Х 5 10 15 їве Те ма Тв Суаз Тех Уві ех З3іУ Іі Авр обейї бек Бех Тук ТЇВЕ 9 8 за
Ме бі їх УК Аку зів із вхо сі Був б3іу їємі щі Севз їі ЄїуУ
ТУж Хіз Вів Беж Бюаз ж А ЯЗех ЖЕЖ ТУук Тух Аз Зак їЖжр Аів був сі дхч бе ТВх їіз ех Суз ТВ бек Тахо Тх Узі Авр оїм3 се Хе Ве
Щеж ВО ТВЕ Жвх із аву» ТВЖ Бі ТїТве ТУЄ ББз був Кіз вже аю УВА й ЩО че сі Мі Век Бех ЗБу ТЕЮБ ЗВ їж їкв БУЄ зЗАб КУ ЖОВ бе УВА ЗКЖ її5 «2105» 23 «2115116 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220»
«223» Штучно синтезована послідовність «4005» 23 как мак фМенх м зе аж ЗА ше Зі бе Уві Був бЕо Бі Вів Важ 3 ня ЇВ її бак ЖЖ ев Теж Сув ТВжх Абе бех ЗМУ Бе йевЕ Бе беж бе зи Теж
Жуж Важ Сув Ткв Уві ку Біб Абв Бу Фів був се Бео біз ЖЕ Ка
З ря 85
МУ Сук За сії Твж їі Бек де» йех ТВж ТУ» бух Вів бек ТкЮБ дів 50 кк що їв Ку дже Ба ЖБже Хе бек ее їв беж Зак ТВЕ ТВ базі Бю їжа
ТВ 5 во па Же ЖЖ дек їз ТВ Біз дів дво Звж Аз Жах ТУж Бе СУув Аіж 5 5 ЗВ ду аЕюв Бо Тук Щек ЖеЕ Ст Ар ії ТЖев зві бо і Же без Уві
Тих Уві Бех йве
З5 «210» 24 5 «2115 125 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 24 пів біз бів їж бів ім бек пу 03у Авр ої УЗВі був ко баз Ху
Язж бво ТВк їжи ТвУу Сув ТВх Азїз бак бі бе бах Бе бек бак пі дав їв їі Суз їхр У8і Аз Сів Аза бо піу був 35У Бей) зів Те хів віз Су їі Бук 01іу біб бек Уві Бі сі» ТВх Авр о Тух Аів Беж
Б ще БО
Тке лів Був 21у Ака Бе Те Уві бек бух Твх бех Важ Тв ТвВх Уві що 75 ВЗ во
ЖХвх іємх сів Меж ТВж Бех Зх ТВжЖ із Аза Авв ТВх Алв ТвЕ Тук Біб
В за 5 сук Аіа Аку Меб зі Аврор о У Тух 1 Тк бі ТК Дво Тве ТУух рве 3855 105 ї50 бух баз Тв пу ро пу ТВ їх Уві Твх Уві Зех ВВЕ 115 ї2хо 125 «2105 25 «2115 114 «2125» РАТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 25 ввв Уві УВі Ме Тк біз ТЖВе рко Вів бек Уві бек піз йех Уві Ку
У 5 ії 15 ку Тих Уві Твх біз дав Сув сів Азів бек бів бак їі 01 Ав дав 20 25 за їні Вів Тгр бух бів Сів УЗ хв Зіу із Бжз Бко був бе Їм Її 5 40 45 їтУук Аве Аіз беж Ав іі із Бех Зі Узі рює Зех Абе Бва Був ПЩУ ко па БО
Шаж аж ВЗек Су Тк бів ко ТВ ва Те Аве ТВж їни Те Же Зах ї за 75 во пу Уві зіз Св Аівз Авр УВі Вів ЇЖБх Тух ТуУух Суз Пів бек У ТЕр
ВЕ за ВЕ тТух БіУ Аве Вех Тух Уві Зіз Азія Ре піу Бі ПТУ ТЮВжх Ша Уві Укі 105 1305 119 тві Був «2105» 26 «2115112 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 26
Аярв Уві Узі Меї Тржх бів Тех Рхо бек Бех Уві бек Аз Ат Уві піу ї 5 19 15
Бі Те Уві ТвВжх їі був Сув Піо Аза беж 03 Аза Ї3е бух Бех Дам й 25 Зо їве Віз Тв о Тук бів зів Був Вжо і пів Бхз Бхо був Аху їж її 35 30 45
ТУух Вар Аів бек бар ба Віз Бех 51 УзЮ Бжео Зак Ах Рез Зех ЗУ ва 5ь БО дек сфуУу Тух іУ ТВ Сів Бе ТБ ої Те їі бек сіу уві сію був а 70 та ва па Аве о Аів Аза Тк о Тух Тух Св пів Аза Аза Тух Авр оЗех ТВх Зех
Зо з5 дак аж Бе сіУу Ав Уві Ре сіуУу сі біуУу Тих піз Уві УВУ Уві ув ї109 ї05 19 -2105» 27 «2115110 5 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 27
Ажр їз Уві Мак Твх са Те реке Азв бек Узі бек спін Бжо Уві бі 3 5 10 15 віт тиж Уві ТвЕ їЇіз був Суз ів» Аз Зек пів Беж їів бще Таж Тек жо 5 Зо їв: Аївз Жср о Тук сію біз уз Рко бі біб Ро Вже Мт ес Зма Т1в 35 ВО 45
ТУух Акт Азв Зв ТВжх їн: Аз Зех бі Уві Рко ех Аку Ве був БУ о Б БО
Ззк біт бек біу ТвВж сів Бе ТВх без ТВ о їЇіз Бе Аве ее із Сузв кВ то 75 чо ів Аве Віз Афв Тих Тек бує Сев їм ЄВУ Біт ТУуж Бру БУ Бе Вех
В що 5
Ттж пі Ази зв Бе січ бі 035У Тв бів Узі Уві УВЕ Був 105 105 11
«2105» 28 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 28
Кер їі Уві Має Тьх бів Твх Бжо Азів Бех Узі Біб вів зів Уві піу ї В 19 ї8
КУ їТвжх Уві ТвВх Ха Муз Сув Біб Азіз Беж 31 йех Їіз ТВ Жах хо а ий за
Занз вів Ж Тех бак бів Був Беб пі бів ко Бжз БУ без беаа бів
Тух уз Аіїв Зак ТВ Бей Азів Бек Бі Уві Зак Вежи Ач Бін їше 01У
ВЕ 55 БО бек бі бек Сіу Тв із Бе ТЮВЕк їм: ЖВжЖ ї1іе Бес Аяр їі За Су в 70 тв во віз вав Аів Аза ТвВУ Тух ТуУух Сув бів бі Тук ТУх Авю бах Бек ЖВЕ 5 о 5 ех йажк Тух Узі Без Сі сі ОБУ ТвВх біз Увь Уві Узі Був що 05 118 «2105» 29 «2115 448 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 29
Пік Уві бів їєнз УВА бій бек ШЩіуУу ів шхв Уві Був був ко ЩАу Аїа
Шах Ві уз Уві бве Суб ж Айва Бек МУ тТух Сів бе Бех вен Тех а аа Зо
Тхв Ге вів Ткр Уві Яку ів Аза ко Бі ів 01у беб біз тТкр Мей 35 48 5
СКУ ші Хі без хо 1 Бе біУ Бек ТБжх біз ТУює Трж бах Аве Вірш уз Аа» Аху Уві Твх Меаї Тв Абу Авзр ТБ беж Тк Вес ТЮк Уві уж 70 75 во
Меб Зіз баб йвж Зех ве ко ЯвЕ 03о Азов ТБх Аз Уві ТУук Тух Суб в во з5 ів ко бук б вБе сіу бек Зех ро Азов о Тхв о ТУух Ре Аво Уві Жхр 395 195 Мо
Зі зів су ЖВвх во ві тТвЕ Уві Беж бек Зі Вех Тйжх був Пі1у Бхе 115 щ2о 125
Зак Узі Біюх Бжо Зв Аіз Кко Св бек Аху беж Твх Веб Зб Бек ТВе ізо їз 130
Зіаз Вів їх 03 був без УВА був бар Туж Бе ко» ші фуз Уві ТВБЖ 155 і58 і155 їКа
Узі Зак ТЕв Ав бек зЗіУ Аза Без Ти беж Оу ЗЗІї Бів ТВж БВ» Вже 165 Мо 175 із Уві ба Зіз бесє бах піу без Тух бак Пе) бек дак Уві ува тТвЕ їв їв ї50 тТві Вус Беж Бек Аве Ра сі То ойів Трх БТУук Таж Сув Ав Узі Авр ї95 255 205
Нів Су БЕо бах Ав ТВх Був Уві Вер о був ТВх Уві 535 Аже їше Сув ів 215 228
Сув Узі Бі сСуз хе бжо Су вхо 3івз Вже Бко Уві Аза сіу Бриз бак аа За 235 240
Уві БОез ї5во Бе Бжо бе Був бкО БУ Аве Тв їн; Ме ів Бе дж жа БО 255
ЖЕ Бко й: Уві ТВкЕ Сез УВА Уві ТВ Бер Уві беж бів БО Авюо о ркО
БО 85 ке січ Уві 015 рі дво ТжЖр бує Уві Ларосбіт Уві білі Уві Мів дай АВ
ТВ «в и
Ку Тих ув Вхо Аку сім Біб Бі бнз зво Бех ТВ ТУє Ака ві Уві що ЗБ по
Беж Уві їй Тїйж Уві іїммз Нів біз Ар Тко їжі Ави СУ Був ШЕ ТУк 31 зів Зо їтв Су уз Уві Бех Авв був З1У їні Бхо беж беж Її із був ТБЕ ли 338 335 їіїз бах був біз Був Зіх бів Рхо ху піз вхо оз Уві Тух ТВх бе 340 345 з5а хо хо Беж сіб са де Мей ТВжЖ був бяв біб УЗ важ Зм Твх Сув
ЗБЕ 365 зе їева УВі буз Сіу бе Тух Бко Вес Авр її» Азїв Узі БМ Тер 3 ех зт ЗВ зво
Аз Фі сів Вк Зіз Азвролав Теж був ТВе жЖВвжЖ о бко вхе Уві Сез Аерв
ЗА що Зк 488
Зах Авр Шу беж Рі Ме їх ТУжЖ Зак Ак Бей ТВх Уві вв Був Вес апа 4316 315
Зх ТЇїхр бів віз 01Уу Ав Узі Бе Бех Суз Важ Узі Мей Мія Піо Атїа ха ав 4339
Її Віз Аз» Нів ТуУух Твж са був ВЗех фі беж Зм Беж Зах 015 Був 435 130 45 «2105» 30 «2115 214 5 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 30
Авр жів іп Мей ТВ сів бЗег бо бех бех без беж дів Зак Уві 0іуУ 1 5 10 15
Дав вх Уві ТВх їіз Твх Суз пі Аїв бек Б вв» їж Жук СУ Віа ви 5 за ін: Айва Те бух зіпй ів був бю сі МеВ вала Вже фе їм) Зв Те 35 43 48
Теж бі Ліз Твх Зв о Віз Авр Су Уві жо бек хо Ре ек С31х й І
Веж Біт Бах су ЗБЕ ве БВе ВЕ Без ТВ іє Бек бех ее Бі Вко 55 ТО Я ща
Бін барв КВе віз Ти Жую Теж Су БМ Ява Уві Зк аз ЖЖ би Феах
Зо а
Твж Бізе бу іп Бі Жвх Бевз Уві біз їів був Ах Же сві аа Ж
Кхо Бак Уві ббе їі5 Бе Без Бо бек Ар ка Сів без був бек су
Жвх Ай Бак сві Ущі СУБ бо Ме Аве база бе Бук вхо Аха Ба; Вів
Був Уві ЗМ; ТЕв БУВ УВі дво дев Біб Бей Зав ба Зі Аве» Веж а 145 15 ї55 їі віз дек Уві Жах се бій дер ех їЇтв Вер беж ЗБ Теж ее їмка ЯвЕ йеж ЗМве Лема Жфє бе меж цу Аж ею ТУух сам о Жув Мав Сез Уві бек ії їн М
Вів сСув вів Ві ТЕ Мів їв БЕ бе) бек Важ Бо УВЕ ВЕ Був Вавхе
Ме люв вка ші Щі був -2105 31 «2115 122 5 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 31 ців Уві біо їжез Уві сів Яек йіУу ів Б ті був був ко йіУ діа ах Уві ії Чаї Бех Су був дія Бак У ТУЖ Зіє Ба Зех Ав тує 29 ЕВ я тк; хів спів Тув уві ака бів йіз Рхо бі біз су їх Зб жЖер мес 5 40 35 ві 03 Хі їж ржо піу бек йіу беж Тв пін Тух Твж бів Авв Ре: 55 БО їхав Авр Ах чаї ТВ: Меї ТВжх ха Авю ТВ Зех ТВжх бек ТЕ Уві ТУух
БЕ то 75 во
Ме: біз Мцеб Зах бек іа Аку Вех біз Аве Тих Азв ві ТУх Тухк Сущ 5 зо за
Аїа Ако Тух Ре Ре спьу Зех Вах жо Аве ЖкроТух Ре Авю Уві ТЕкр зво 105 110 зі бів Бі ТВх бев УВА ТВ Уві бак бе 115 120 «2105 32 «2115107 «2125» РАТ 5 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 32 ви бів шів Беж Твх пів ех Бжхо йеаЕ Зех їева ех Лів Бех Уві бі ї 5 18 15 звр Ако Узі ТвВх ЇМе ТВх Сув 03У Аіз йек Сі Зав ї3Зе Тух ЗБу Аза хо й За їв двпоТхв о ТУхК Б зів був Вхо Бі був Азїв Бже Муз їн Змі іє 35 40 48 тТук пПіу Аів Тк ев їец Аіз Авропіу Уві рхо Зеж Ак Без Зех сту
Ба 55 БО вх сіу бек піу ТВвх Авр о бве ТБх Мео ТВх біз бзж беж ба Біб Бко
ЩЕ "а 75 во іс дво» КБе Азз о Твх ТУжЖ Тух Су Біб Аза Уві їні Акжз Тв»х Вжо їі в о за
Те Бра сіу зів су Твж о буз Уві бМ3 бів Був 390 105 -2105» 33 «2115 325 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 33 ів бет Те о Був СКУ Бкз ех Уві Бе Рюз Її; дів Бо Су бек ху 1 В 18 15
Дах ТВ бак сій бек Таж Азв Аіїв без 0О1У Сук їні Уві був Авр жує 2 25 зо
Ве вхо Сів Бжо Уві ТВж Уві баж Тжр деп Беж ЗМу Ав Їзкі ТВх ех 35 30 45 сіу Уві Нівз Тех Бе Бо Аза Уві без» бів бек бек сі без Тух Беж а що їшч бек бек сві Уві Твж Узі ро йок Вех бак ем Сі Тк був ТНЕ ке 7о ти що
ЧУуж ТВх Суз Ав» ві Ав Ні Гуз хо беж Ава Твх СУув Укі Ав о Був ве за 55 дже Уві біз Беє був ТУх БУ со Бхо Су Ехо реко Св Буо зів ро 1058 105 119 біз кПа дка Бі Біу Бжз був Уві без їзе Без орто Бже їв ржо був 115 128 155
Авр Тк іні МебЄ Ті Бех АХхЯ ТВ о гхо піз Уві Тв Сув Уві Уві ва їз 135 148
Азр уві Бех пів Біб Аврв Вже 51) Уві 210 Ббе Аве Те ТУжх Уві Ар 145 150 55 160
Зі Уві Фів Уві Вів ав Діз Їжа ТОЖ Му Вжз Ажху Піч бін о сіавз Рре 155 іо КВ
Ав бех Ту Тугх дк Уві Уві Бех Узі Їм Тх ві Пес Нів Зівз Авр іо і85 188
Тжвр без б» бі Був Шо Тух Муз Су муз Уві йех Ав Був ШУ о. ї85 а 5 їж Зак о бех із 034 Без ТВХ Кіз бек був Аїіз Був Зі Бі бе АкЗ ій їй ко січ бхо бів Уві Тух ТБ без Бо хо йвк Ав Сі сів Ме Твх Був ша хо 38 24 ваз піз Уві Бех без) Тнх Сув бо Уві їв сіу Ре Туж хо бак Авр 245 250 255 їіз Аза Узі біш ТтТжр з бек Ави біу піз Бко сіб вп о Ав» ТеХ Був о 255 «70 тних бвж о бхо Бкс Уві Їм Азр Зах Авр Сі Вех Рівз бе іже; ТУхк Яви: 78 во еВ
Ажч без ТВх Узі Авр Га Бех ка їхр сів 51 піу вав Уві бБаеа Вес аа 55 За
Стув бек Уаї Меї Нів біз ліз Без Пів Ана Нів Тук ТВ Зі Гуз цех
ЗБ 510 315 Зо
Її бек бе Бек пе зЗи5 «2105» 34 «2115 325 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 34 лів йех ЖЖ Му ет Бо Зв ві БОе Бу іжн Лів бе Се бек ДЕ ї В ї8 15
Щек ТВЕж ех Хо Веж ТВ Аз ів Бей БУЄ Сббв без УВЕ оз Авю бою
Ве бке св) Вжо Уві ЗвЖ ві Бек То Заяв век ук Аз Сз-авб ТБЖ вх т ВА Бі ЖЕ Ме бхо ів УВі їх пев Щек бак сСф5 Жені Туш Важ їж; Зак беж Уві Уві ТвВе ТВі Бо За: Жех Беж бе ЗМУ ХвЕ бу ЖБе бук Тв Сув даю уві Авю Ні Був бхо Бес Аве Тв (ев УВЕ ер їжа
Ка Уві СБ) бвж Був Жук 15 Вже Бко Суз БЕо бохо Су Бке Вів рее
МО 185 316 5 Бе ке Сі бі бюо був УВА Ббеб беб б» Бо БЕЗ бе Бу ув
ТВ хо 145 даю Тв без; ТрЕ іє Зах Акб Те бхе сів Тв Же СУ Укі ТВі Ух
М ай ха
Кер Уві бак ів Біб ав о бхо сн бві зів БР бю Тк Же сві дар паж Уві щій Уві нів Ав Аза їв ТБ уз Бе Ак в сію дів ББе їі 170 УТ
Зам щас Же Тех вхо Уві Зві бек Увь Їжа Тьх Уві їв Мія За Аве тва ївЕ 15
Ткв їма Ал сі їв Зі Жух буз Суз бух У Бех з» був «3» Та ї55 а а
Же ах ке НВ р че 3 з ба бою Ві тав хи ХУ ху па бЗке Бек ек іє із Муз ТБЖ бі Мах без Зі Був З бів Вко БЕЗ 15 кА вий бів БЕо біб Уві Теж ТЖох їмо БкОо риб бек зів ше св Ме ТвБх Муз
К. ех У. й м: ях ох, У м. - й ж: км, - з
Зв паю Узі Бех бее ТвЕ Суз бами Уві ее ПМ Бе Жухю Бе ех дар хи З а 55555 сМечюу Са ка Мох с» ша, Мк їж ха хх : вк баку ЖК
Ав Аа УВА сама тжю ШО дес йаа ЗУ (іт вхо Біо ва бав ТрЕ ев
ВО ТК М
ЖХвЕ ТВж Вхо Буб5 Уві Мем Аво; Зак Авр бів Бе Бе Бо баб беж ее йко їі ЇБх Уві Вар Муз Зех вже Тхр бів 03 03б дев ща Ба дає сСув Бех УВА Меї МКів С» Абз бен Нів Тек Ніз Уві ТвЕ Бі був Чех
Ва За ЗіБ ЗкЕо їжні щеж Же Беж Те «2105 35 «2115 325 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 35
Віз Ве Твх Був Пі хо Бех Узі Бо: Вжо Змі лів хо Сувзв Зах Аку ї 5 18 15
Зах Жвх Явже о Бех ТВ зів Аз Змі Біу Ста фїяюз Уві Був Вавю Туш й 5 Зо
Ве го біз Рко Уві ТВ УВА) Вехк Ткр о Авв о бак зу із ба Твх Важ о 45 січ ві Ніж Тх Рів Рхо Аїв Уві їні Бій бах Звх Січ їм Тух Бах
Бо ЗЕ «а їж Жах Яек Уві Узі Ти Узі Рхз дех бек Бех во піуУу ТВж Був ТБЕ 5 7а 5 во
ТУхк ТВХх Сув Аза Уві Аве Ні був роз бак Аяв ТЕ був Уві дяр був 55 за а5 вка уві сіб Зак бух Тук Щіу жо РЕ Сув бхо Бхо Сув Вже йіа ко ай 185 10 ші); Бр Бе Бі піу ко Був УВА Ббе їжею ББе жо Бко був Бкю Був їх 125 дае Тв»Х їм Мей їі ех Ах ТВих Реб З3з Уві Тв о Суз УВА Узі Уві їі ї35 340 азр Уві бак вів БМ Ар Бк ваз Уві сів ББе ве о жЖжр Тух Уві Ар 145 ї5о 155 їБ5О пі Уві бі) Уві Нів Ав Віз Був ТЕ був ро Ак піз Б бів Бе ї85 іо 175
Зав» беж Тих ТУкК Аха Уві Уві Зах Уві йез ТВж Уві Ба Ні Щ3ух Ар во ї85 ї85
Тк їні вази сі був біз ТУх буз Сув був Уві йек Авв був 3 У їжа ї95 208 ОВ тхо Беж ек Хів аа був ТБх тів Вес муз зів зу О3Уу а» жо Аха хі жів зо бів Рхо сів уві бук ТВх Гей Бко Бк дак зів сій б3із Ме Тах Бук жа За 2-35 2-40 вав пів» уві йех їви ТБх був бее Уві був З1іУу Бе Тух бко ех дар ке 256 «55 їі ліз бві піз Тер Біз ех Аза Зі Оів Бхо 03 Ав дав Тук Буд
Жиж Жаж ро бе Уві їж Аз» бах Ар осі бех Бе Бе бос Тух бах 275 ВО ВЕ їУз Мма3 ЖВх Уві Авр був Бах Ака їв бів сій сі дев Уві Бе бах ке Вк зоб
СУує ВЗех Уві мех Нів сво) Азв беи Ні Аве Нів Ту ТВвх пів був Как
З05 Зо ЗІ15 зга їм» Зех ївив Зах ха зе -2105» 36 «2115107 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 36 дхз Твх Узі 5із й3ів йхо бвк Уві бба» ї3з ББа Бже Ко беж Аве осв
Ж 5 їг ї5
ЗіБ їм) Був ем Зку Жеж дів ек Уа Уві се іме бе бю ва Ве
Туж рхо ху із ів Був УВЮ ОЇ ТкКо бух Уві АЮ дав вів їм ЗК
Вах ЗІ дво Веж біб баз Важ УвіА Тв см ба аю бек Бу двж су
ЩО 5 о тв бук бах їжа вх Щек ТВ бе СВж ва Бех Був Зіз Бвю бує ФО
КО зо 7 во ув Ніз Був Уві ТУ лів Су Кз Оз тв Віз Бе ЗУ Бо ех бе 5 Зо за їжо УЗі ТБ Був Веж Бе дар бю ще і Сук
Мо Мих -2105 37 «2115107 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 37 вхо ТвВе ві Аів Аза Бжо бех УВІ ЖБе Х3іє БКбе бжо Бже бах Ае5ю Ма а їх був ек у Тв Айфа ек Уві ВА (ув ма Сжиз ду» бах Бена
Же ко вка дів вія Був УВА ків тко ПУБ Уві двю» Бай дів бебв ща
Зак ЗК зо Бвж о бів с3а Зек Че ТБе сі» щік ве Беж СУ Авю щеЕ ща 5 що
Твж Жук бак їемі Бек Бек жилих Щек ВЖЕ їм) йеб Був Аів Ва» ЖУК и
Ма Ні бю5з Уві бух віз Сев За УВА ТВЕ Вів Віз БЕУ Сей беж ех
Вк зо ЗЕ
Бхе УВА ЖЕ їв бах Бе двез бхе СУ ем сув ї38 Мов «2105 38 «2115 107 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 38 йиз Твх Уі Аїа Ас Бко беж УВі Бе біз Ра Бхо Бюо Беж Авю Фі
Пій їжа бує Бех ЗУ ТВ Аза беж Уві ЗА СуУуз Мей бек аа бах Бех
ТУух Вес вка сім Аа ба УБі сів Тв їшв Уві Аею обжю Мав Зао Сх
Зак ШЕ» Ав» беж сіб Зх бек УВА Тв щі с) бар аж бе Аво бех
Жик Теж ех їв веж Зак ТВжЖ дев ТВ без бек бу вів Авю ТУЖ ЩО їтв Нів дув Зваі Тую Аза був БО УВУ ЖвВжх Міз бів зКу Зк: Бек век ща зо З тхо ТВЖ ЖвЕ Був Бест Ббе Аве Ак ЗУ М Сув
«2105» 39 «2115 1676 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 39
Ме ЗУ їні іа ЗУ Хв беб буж Бе їх Же Ба фен СУ Був ТВЕ х 5 10 їх тв іх із біз 35 ТВ Тух Зах ів бек Ві ко мук Хі Ба Ах та У Вів Зех Сім дав хів УВА. їїв (ів ВЕ тую фу Тужх ТВжх ХО ді Же дар вів Ти їі бек Сов Був ех Тех ко Аве ув Бде БВе деж Тук Жах щеж ЗА Ніж УЗ МНів їж Зак Беж Біо Лем був Бе З дав бек азів жів без БЕ бі бе Бо ба Щі» без Бе Бі БКУ іа два» ко Уві бек бух Уа бе бе сів УВІ Уві хек тв ів Ба ес що М її їв Ек їжв ба Ме Бо їі бе бек Аве Ав Сі Бе бах ВВ Же щі5 ха 15
Зів ТБи да СУ Бко УВА ТУЮ ЖЖ бо дю сів бе» Уві ух Уві Аж тв) Жук йвж ее Авий дар Зю Зео беж Вко Віз уж Вк БЖ ЖВх УВУ 145 і50 155 їв їв ТВ: Бе Біб даю Бк Біб Бір Бех З Уві йзю Ма Ух Ба ж їб5 кла їз з Я зум й Ка Зх хх ук дак шву Міхих хи Ж Ж Ху
Тіз зе Вів біз Зб Ж3іе Ті ек ББе ре Авро Бе Був бі бВЕО Ве
Жак рхо ах Тух Чіу Ме Те Жйх Гі був дів уз жує ув Бію Авр че «ПО Ох
МЖре Бек Так ТВЕ ЗіУ ТВх дів ТУю Бра а Уві Був БМ феж УВА Таж
Ху ї я ке Сич Зах Жив ГАК ху САН ШИ 4 ХК Ж Мі чх х. хе Нів Б бек УЗ Бех Сів зіз бо 5 Тех дев Бе бо 1 тує жа 38 хай 245 їжв Ав бе їув АБО БЕЖ сів їі ТЕЖ Сі бух бів й бек Ба бух щі зв Уві Уві ТбВх ша Ліз дв очі) ух Ті тлюЕ бе зт Ка дя хе ск ту 53 и В
ММ хо сухе ххх ЖЕ З Ж ке а У КО Уже. ме ГЕ Кз з Як їх ж із Зевю бези був дев вав ів БУ піз меж меж 5із Жве Вів Ме Бе шт еВ НВ ав Тв» Беж без їв Без їж їі зів зів уз ТВ Бе Звробех зав жк кх Зх 5 чек Ех. «а Зх хх Ху Х лу ск ЕХ хе се ост Босх шу їх вів Уі Був ж фмі Беж тТух ТуУж Мак їмнх КМЗ бю Зак ан Авв - - у. Ж стуя со ек х З ях ко Кл ж вх зе їх пух я їм ЖУх Ба Чую Хі дів Уві Жвх Уві ів 5 Вес бТБе БУ КУ Ве
Жаеаж се а їв Ма Жов ее ве Ще Бу Ту ВЕ бе Бею бюро тТух
МУ бец Ав без Уві із ЖВх Бжо Зх Вів о Ббев іа жо БУ дів Бе
ЖтУЖ ВЕ їі Му УВІ 5 УВА Му Аж ак Змі Авр Б їла Уві ЗКУ и з хуя я Тх е г. . М Зх т ху же. у я Я Ух Ул ох її з я
Щі Уві Бо Уві ве їм» Аве й БІ ТвЕж її дер ве вав Бі С ах кю ЗЕ що х. З УЖ ака ук кн уж Жовтих з ху її о ША Жах х сх я
ТїТвЕ Ябве Аве іні двр бхО Мак Му Беж Узі ТМ Деу Уві дев аю Бе 05 Я 15
ФТві вів йеж Бе Уві їмні Ват їн: БЖжо Зак са УВУ жЖвЕ Мал им мм з , . 4 се Фк. 4 К од у хо усу Ух сх я се Ж
Кве дав аз уз ТЗЖ дво о Аів кб Аврв їх Вже 10 Хе Ав паж фа 335 440 445 - кн сх Зжс ре Бе З св. чу Мафк пюжх Кола Шуухм ті их пух
Ха П3з сі» бух Зке Ліз їі Аза ТоУє Бвх ех Гм; Бек вів Зах Тух ик. КК ях зо а 50 ух. : з Ху ММ шко Кос з вМмх їде Сава) бі біо
Мас ТУк їв Аве о Жюр Тв бер Аза Нів був Аз їх із вх су» 8 ї. ч
Нео 470 ях зво
За ОО - ке : жа ж ОО ку Же їх ехус ка Є-к бе бе З дах Теж тіж
Мі бен бшв із Се УЖЕ ТВх Бжеа Був бак же тую МА ВЕ я Ух й хе ях за за ; Р Ж кох КЗ жу ік фр чи Жак Че Тая НІ в Ба
ЖвЕ Ні Тек Аве» Тех ії Їїіє їх ВЕ Був БАЖ Був Же кт Ніж РЕ що що ще сук й Зі За йех Ва йіз беж теє бів Важ біз дви їїЗ паж ЖМих Вк5 із без Мб бек Зав Азів бек бух Ба те Кк Ще . ІВ пга ах
БІВ ем (3. З хх щ. хх г. Е міх ЗІ ку Ями
Х жк ху их тек 3 о ем Ж Еу се хх ну щі Ух й
Бже ТвВЬ Же ів Ав Ме Уві КЕ беж Жак ке ба з Тез УВА Ту З 3 ай ) із а ів тах із щі без тУві баб вав Бех Мвї пух їі УА Тв сі Що 0 вх Аз піч без Уві ек дар Беж ба в . -. 7 се жк КЕ в ва щ5 БО 5
Зесб дае із Бе БМ ев був в Ав ка їні Сі У яна Х ща вза вух хх з Мах хх хакі Я ж ЇїЗ хх» Зі Хр З зі ее її хау ме. хо АЮ Віз Аяв Аза ТУЮ Вве Ву ВМ щівз ТВ Уві у щі З ку У дух че із МЗві Бах Ж щі
Н т спі Ме Азо» йах хо Уві Зі зо дів дів Уві Авю Зеж із дів Те сію Мей АшБю ех ЖЖЮ і Аза без дів ЛА а ї
А: Її 15
М хе: г їв БУ Бе БХхо ії піз виб ЗЕ БКае ча Ук У Уві іх хе щу вів без Бу Бк аа дме Ак ; ; зо) їв ев вав їво і Сбев і бів йо біз іо бе а Кіма ізн; 3 У Бек аю бе) Бі су ЗУ Ав оз ю БЕЖ кх св ; : . Ва Мі їз Віз ре безе ЖВЕ Бр їм ВНХю Да зв Авт дів йяв У Біез Мі бек Аїіа жу То Ба Бена ; ще :
І ях їх ох їк- КЕ В 5
Ба і Е їх х ке г бак Жхух (іх тіж
З діз Ав ; девж Щі біб дз вав Зі бо був Межа сФМз ТЕ ків Бши із Авю Девю що М СКМ ва Аа сх тв ув
В ЩЕ ТО
БО ї чу Жве Бех Бі» був БУВ Хіз з б) їже дів БЖ їєз джеа ско Аж вка ЖЖ бен Бі Був БУВ Хі Є й і. й З т . нм у их х х 5 НО «НВ : Че ек УВІ Уві ув бе Сов Су Тех вв С Аів ух
Її ЖеУж Був нія ек УВІ Ух Му же су ЖЕ сте щу З У 7 Ки с " зе ух ТЕ З т
ВО 55 и у х т Ха ху : З з Ви Сев фа Зі чу вів бів хз Ха вже Та тії ав в ев ж ЗБе Св Б ів Ве Ма Аів аж І Те ек є ЗЕ їЯ ЕЕ
ЗЕ І ТЕ
; с сх р кт тд душ тля був же ЗКоя яжея жже во
Ж рко вку Су із Моз Аіа Бе Твх біз Су Сув Чаї ові ів Зак " 7 хх т «ех . ес у тав То ТЗ с 2. 4 що сх т сх хх Ж о хв Ж я КУ Фома У ко Кох ко
Пів Ме аку Аза Анни ЇХ Яех Нів тв Азрв Ме Фів їні 03у ду їж сх Ук са 48 745 ТщО щі ; доки ях СК оврдахо ау шк ву жі же во яку
На меж Сев ЖЕ Зм: їж БЕО ТВі бек без Вхз Пів ї18 жо Бек Же ек тр «жк їО БО Не
І г х. - н з ей с жк 5 т одмої о ХХ суку М чех В п Км
Же Риб іа Бек Ткр ої: Тер осів Уві Мав Мем Уві ко ду Вк був за та 7 хи 5 Б КЕ - сх Же За Тащі бок ую Міухню хх СКЗ хз пів без ші» Бе Афа їхмі Вже дер Вех їн ТЕ ТВу тк бі: ї3е біо ча зх ех щ
ЗВ ТІ ТО ов х, С хе х. к оо ж джик Ж Фуко пе. ЩЕ жохкгу щі Уві щу Сі Беж дав Зк БУ їіз Су вії Аїв бер Те зі Сув
Ох " ск ух Б сх їх щі ЩО 15 н «а в ; пі Ша їжи йіо Мав кщи її6 Вує Жук Бак ів був Уві Бе був Авр Уві Бе Зам сСіз Меб Зав сте хе бтух Зек
БІО ви ВО ще піт піз бів їзіз бів їяч уз йі Тве бві тую Вау бує тзь Уві йхе шу віз 53 із Зх бем Був Ку ЖВж о ук Ба Ту сх щих й 35 над Ма с х сх ях жк А с «хх же бак жів За ща ІЗ вхо ТВУ Звук Зі Ме бів ВБе був Ві Був Мат Бах дів УВІ ва ау х Ук кв
БО в ко ж єни ко, У ах суху МЕ охх 3 же А я ТИ хе ЗА х чи
Їїіз СУ ТК Как осма ак бхо Узі і Аве хв БО ОЖУ ЖВх Був Бех ши ДЕ З пла
УЖ В Зх сих ско се Щі дує іс їв бзі йіз щі беж Бев Вах Бі їш МВА
Мак їже Се Уві жо жав фрав УВК Ма Зіу Зак йек Зах ж в з вих за ВВ вях х ; ; тадхох Ко Кутя Ж ху Жахії З х і Зі: АБ ШЕ твЕ ББеа їв Уві їм3 БВкое фа За ше БК Занві Мія За їх ав Б що Ок ВАВ ті Кук ух У шко теж Й кх ЛИ ж т з ХК З Ж тк МУ ше Ж З ех ей із Таж їхЮ бое біт їшв Сів Її Зав Уві Б ЖЕ Ба аж 7 вх Й вус зе 5 ЗО З : с мя си Жак док ЕХ ху ху у. Зак щі МВі тв Її та Уві Вже зв пж УВУ Був вка Кз бек Теж бах Му УВЕ ЖВа бла з ЗЕ ЗО
Зо За5 с : з т Шеохах Сх Му Жак кодек їхуж 15 ба БЕ
Аве Бо хе СУ їіє їв БУ ТБХУ Св бек дк же фе аз века тто
ЗЕ т є мих а Кк 5 Ва В й
За Б ВО зу і В їз їв Уві Бу був Щи піз Те Сув Аюе Кл
Теж Ак Хе Бжео їма вро оЖемі Уа КБже був ббх аа же Був ев х Й о пов у Фу п ЖІ І їи Беж УА Був зіУ фі: ес Уві зі Бан Бієз без беж Вів ві їду
Е м «с -е КК ду Ко г ЯК х Я ж зу. - ож якх ж в Хм ж
Мах пав се бує Хе ва ХА їх; ЖЕ Віз ба БЖо Її бі беж Аха
ЗО Ще 15 ск - ей ж р НН х шо Кт ЗУ; Мк ххх КУ: га іо Бі біб ев Ме бек УВА Чі рже Уві Бе об б КБа Ні в 1015 То Та О «уки - тех і де У ж з с ЧК ї о сокуюч зу ї У. як кої УЖ з іх
ТїтУК із 0316 ТВвЕ Біб де Вів їв Аве біз Бе Маз бек ав БКО мох ще ч ех ї0-5 МЕ МБ 7, у " у. о. КЛ жа ;х. ЯЗ ви Фа ому у т і с хх Я Ж . їх и к хх с
Ме їі бі БУ ША СУ за без БУВ Був їі Ст шіч ЗМУ Меж а ща аа
ЗУ а ЖК долу іп 1053 їв55
ТЕ же Бі Щі ех дів ву Же бо бе Так вів Ве ща Хом
МАТИ ТВ ово
К 7 смів ж У ОТ Же й ще дз ук У. й кс се, Ух Я -х і
ЗЕ Ні фе ЩАшЖ 54 чай Ба бе ЖУК ВМ біз с ва жа дав
Бех їае мух бах ех беюе ень фев і Уві Біб дам о беж де бе с є с ях а ча ЗК ЯМ ща -х й шоку у Кун У ух се кеш Жди
Заю Важ щіУ Бек Бе Був ЩіМ ео Меаж сім бю Бі Бк Ще Був 115 1150 їх
КУ Ж ах З жо з ж ЖК охкуч куки Мк Кк хх х пу Кі х жк Ким у ку
Без са Бі ТЕ іх рхо Зв) із Зі ака Біб ав о беж Їмпа тує ож й с сш аж бах ХК Кг: га Ж ке и і Вод 4 5 їн) ТВ Аз Ба Жвж УВА ЖлЄе Бе Тіз Аж бжа Або Бе Аве Те
СУ БЕЗ фе Ва дув Ж ев ЖВвх Аіз а їж дев 3 Ве ав
УК в ках пу у ч не же ЖК ож ти Кн дих я ха УЖ ож
ЗХВе їні Зжкх із ень Бк За Бхо Біб Біб ех Же Бе тех бо 375 Ко ї1855 хх й с ко с у по х ОО до Уже а і жожею У чи НИ уч жим із їі. Бех Аів бує біз Без бак без Зі» дев був СТВ бів бЕе 1383 ТК зи
Хо зх Ту ук. В Жіхх ОО жк з яке и Ж Б хі тата Ж шій сне Ес бек бів Уві дах Аіа би Був Ак Бін о ВАа Хамва Ух
З З З я ЗО «у Жушн Е пах Жуки УМ Міахух Жхух жу бах жому З 5
МУув БА АВ Вхо РЕ Зі їж ку Бе тТжо був Ба вва беб су т с ій ї ох чо Ук іа їх Ми
Вів бе Ав одеак Беж УВА Бжо Аз ТБх сі Тв ів Ву Ме Уві я ку - ч ж 1535 1540 їжа се тк тТвж іа ТУух Аза фам: бюм) Тахо Жехм їм общин Буює Зав їх 155 Та
Хі Хв» бек Узі барв БВжо УВК жі бее ТЕБ беб беж ва соль Б м й сук я оту. їй ї2а 1875
У КЗ Ж я уже їм Б у Ж ух ск ЗЕ КЛ х се іх
Вкч ТУє шу Біт У Ба Тує беж ТВ Ба дво ТВх жів Ав пів ї й жу З їхвО їси Та ; сх х с ХУ я шижех щИ сах Ж оаожа ук мк п ху. божу
Ще сі) сі ба ТУ шал бух жах іє із Уві був біз Ме вх
КУ. тю Кожух, - СЯч ТУ ах ох 2 Я
Ме: де» мес во» Се Ав Уві Бек бУюЮ бух Ні уз Зі Аа їм тя хх зл
ВО їі їз сх х. г м, : Кожжа ; ши Ж хх Ж Жоажаж Жккеш ую
Мівз дав ТУю Був Ма ЖВе вав бе вве ББеБ їжмз 5) Аке Бко Угі маш т Ж, че А з с с Жук х ях 1385 З 355 ох си ж х с Кок луку, Чак Маск Я ях За. Ук Ди 15 ув бяМі беб ан АвОо Зв о Її її УЩі Зак ЖАВ бах Ма ку 1-8 ї345 о ; щ и ; Ха з хх. аю ПЛ хх т бе жк Ж
Мах Щі бе із їв Уві Вів Уві ТВк Тк Узі я ха Був ЖВЕ я КУ «у їЗБ55 їз За і : ху Ух т ух. дує Мах Ме о Же Коко аа з ах
Бек ЖВхи ше мів сма УВІ Су о бек ЖБе ЖуУує емх Мув же дв шт
В ї575 зво ще ку ж. з К- зу тд а кох уче КО кож Са рха вокх хх жк секти схе ів Аве Хі За бів ек Нів Тех ху сі ТУє Сі Ав» ех Аве шк щу ги ос гу 1385 З ї385 х зи «ОЗ су фхути ЗК з «Заїче Моках о Жах Ж Сх у ен бек бує ве бів Уа віз Су із Бех Теж Му хо Бех Ахщ шо ї ск з . дню Ж М и чи Ж ех бух Ж із Веж Бак йеж ЗУ веж бак Ні Вів чаї Ме бе о Жляб ек Ме се Й «в я а 1415 145 145 хх с тк Ж буую пік им З бл Ах їз Що Віз Їдюмз Уві ко їпжх бі Се Беж вів ва ве ба Аве бе муз ВОоа ; є х 7 соду зай
Та ха ва х Фо 4 Р ую Жак КК 5 х пу Му її Кк їв Би іч пз щі Уві Взв обів Цеб Вбе оТьх Ав оТую Бі їіє обтз Аз» у ж же де о заших 445 тащі 1455
М»а УВУ Жіе бемз сю їжа вв о бак б Бо Мех Бе Вар. Бех Зане ї450 ї455 їз.
Се Ві кО Бе дкЗ іє Бе о Зіз бен ББз бій Уві ке Бе Зав
РТВ Її ТАНЕ
Щах БЕжО Ав ТЕ Бі: Те Уві ЖЕюКю 53 ЖУх Нів Ах Бк Бо Був 1458 ї455 ї50О зів сже ЖеОх Ме Бе бек Бех ЖОВ Ве Ави ГЗіе БУ бів се їв
М 1518 ї51К
Уві Св пі щі віз ів Су бУз СУ ві БО Ва вв сувз ЩІУ
ІБ ї535 БІО щіп Ме бів Зіз баб без аю Бей Те біз беж Аза З тп Ах 1535 ії і555 те ів ЖнЕ Діз Сув уж Бюзо би аз Віз Туж Ада бук Був о Мах
Мах її бївж о бех із Тве Уа біз ве УВІ бе УВУ бе Ух був іх КВ БУВ ів ТВжЖ фЇюз ба баю Хї165 Щбж бе ЖВЖ і шіз ів тва) Вів ФАЗ в МНЕ іа їма вав беж бі жів БУ бе її Був Бу Уві ТЕ був ТВЖ дев і555 КО їх ків жа без Уві Муз БіуУ Зк зів бух Зав. Же Ме БК бух Са 1516 ї515 їх
Вів їз дів біз буз Тук йва Бе ек б» ку ТУх їі ТЕ РБЕО 1858 КЗ ї5л
Хе» ав о Зах ба ТВ ЖЕО сів щі Тух Тр хо Аж дбав ов ЖХВх їщ5о ї545 їв ств беж о бех Сех бів Аіз Бе бе) йів Алю їх аеро шШжеа ве Аїв
Її їв їББ5 ах Ва ї3е Ве Бе; За зу суд 157 РТВ «2105» 40 «2115 673 «2125» РАТ
«213» Ното зарієп5 «400» 40 с а х чу «чу же у Ух хіх А х Те її Вк з Жах їх п бкх
ЕЕ У бо ему а Її Без Се Бе Ббев її Ве Бех МУ Був Тве ї ве 16 ї5
Ж хх
З г гру - рах ж ск ч ХК дж зх схружж кир їжжв Бі із іа заз Тв Жух Уві біз Бех віз хе був жів Біб Ах ше І т и ху а 5 «9 т з Ка їжак Ж Фі ху Вк екв ух фр КУ тай ж Азв Зак хіо дей біс Уві Сів бів тв) Жую шу ТУх ЖБх Фі
З У В; ТЕ с «. 7 щи с ХХ кл о ЖЕ Ж: їхУх тт МКУ із Бе бер Віз ЗМ: їі Беж їі ев Зах Жух Бкз Зв ев Був Бе що ще БО дою бум М Зак нау Ні Уві Яів без Бех йах Бі Ав бе Бе св деЕ Су бекс Зак 53 Ні Уві Я3а Зх беж ах За їх Ж ща я ТО ТВ 55 у с. х г Зоя з с Ток ж У Хі Муки пе жи рах З т дав ше ів Хе бо ТбвЕ ав Біб Ку Був щі Змі СхО У і Ба ще за 25 і ба Мк Жим її: Феао му Ха Жди 5 а Юм бує
Мав БЕЗ УБі бек Жук Ува Ух ме БЕ Уві Тек веж Бу ів бю ех ех «хх цю 1-45 10
Був Беж Муз ху Ме ВЕ» щі ТБЖжЖ Же дев вав Зі Бе бо Се ї3іе 115 їЗО 125 4 ї г : с ік суку фе їі ко а ж хм Зі би
Мі ТБ де їв ко щі ую Ж ко дер ах Зек ТВ ев ві Кхх т т ЧК а їх ї30 ї38 ї4й є х ко Зошех Кока ххх Жук їі: кум уч (35 ек в
Уві бух Зак їз Аза» Авробаю Зо був БЕЗ Ав БУВ о Ах М ЖЕ та ї55 їі Її 5 : їх х т пе хи Же Ж «З ох ща За 35 «345 їла ТВ б біз зе Вже ів Зі Бех баз Уві Зею Беж ве ба С 155 70 175 х де т фун ов Ме жі Їй їде тією ее Веде їіз йвв Ні Жів ее біз 535 бек КОе Бо Аве Бе МУЗ із Вк ек хо ІЗ З
Ж. хх ко джу Ж ючум Арка Кк їх і блю Мк С хе ЯК дае гу ев БкоО хе ЖУжх в БеБ отже ЖвЕ Хі був Віз Був сЖх тв їх дае
Я т яка Ех ї55 що ХМ х с чу за Ж З р же хе Мшяує Камо 1 ж У хх 5535 грек хе Ж з кі
Ве Ве їв ТвВе йіу БЕ АЛ ТУЮ Б і УВІ Ку в'сма ух та. бе хе ТК КТК 1 хх км : 25 Зв Уві Вес Зіз піз бБко с: ТУхХ да ББбе їі» Се Зує
Бже Ніз Бо бек Уві Бех бів БМ Вже ел Тужк айва Бе У ще ко й о ж 5 й У 7. З Сх; Тіз ба ск ю З о бо Їх Же ау м Чо
Ммув Ва Ве обов йеа» Бе сь ї3іє ТБеЕ їіїі65 без із ж бух вве Ттх 45 що В в хе - ї н сх З з Тхх Зх Мк чує ік Шк Баш іч Ж35 жу дав оду Увь Уві ТБЕ щіз ліз вер Уві Тух Ті Тпж Ре ЗУ Ще Душ ши " СЯ куски
ЕЕ ж з ї Її й З хх КУ Ху пе М їі у, ре ві ик р ав ще і бтз аю» дер Зі БУ 516 Мей Меб із ТЕ із веж З 7 т . пух ок
В Ва еВ з Я ТУ, я ху Мід ХЕ « Ж: фа КУ нак Шах де ох вах ев Тв Ме Їм: Ха Зак сіб іє ів Бе Уві їВж Бре лев бак Фа 85 а ЗО
З г : «оби Ж гян МЖиузо фі (ух ех Ко х сф
ТЕ Аів Узі їж сіб бе Бек бує Туж бек фе СОЯ даю ема дак два ; як ях зе х їжа ух Хі віз ті Твх Узі їїє Зі) Веб Твх пі» Бу ШБе
Пт Же Бай бук хів ів УВА жвх УВА зе б веж тТВх З ВК я Зо зах с - до х як С З Зах ЖК чує Ех сах ев Шиерої шк їж вам см Вів вже бі жо зу Ті був УЮ ЧА їх Беж Бжє ТуХ
За 5 ща
Тв З се Уві Віз ЖЖ бо без Єве ен був Ву ів хі Бо
Бра із Дав Зіем» Увь Віз ЖБж БЕе Їм) Бе їхях Був Бу Ку і 7 Ж Ух Зк
За 355 Зав х Бо : х УЖ жо а, у хау Ж нжую одку «й Ху жк зе ча г х
Хек вже Кіз їв УВі сів Уві їбя Аве Бек Ба даю Ав Хе о в СК т с -х. ук тег
ЗО ЗВ ЗО ї «я у гом : хх ее Ж іху ще ЗР хви пі щі Уві Був Ущмі ЖвЕ їжи) дав Аїв 01 ТВО Щі дав Уві дав сів веж ні 2. х бу хх а ГУ В; З Є
ЗБ З ЗБ 305 с х 4 г сх го Жду ж ки о же 3 ках В мух іх
ТНК Зак Зав ба Зеюв бо беж їее бак Уві ЖБе вже УВА дав дер У
Й х Кс ч а аа 18 ВІЗ ; : с ск 4 ху Туз Ух» Ше ху а бьх З Тим З. чУві вів Же Жве Ува» без даю ба Ко щеж БУ УВА ЖВЕ - зе Мамі 53 ак ак 28 зих5 аа з " ; з жк же му з Ше и КН Не ШИ В
Жвеа заяв УВІ Був ТвЕ дав лів БкоОо Авю без вже Зо мах Ав ща ів
КУ я 448 45 а ЖЕ
З ча Б Є че Ат діа ів Жук шви вж її ВЕЖ Ба ес ТУЖЕ ака щіч 5 ЖУх Акч Аза бі Вів тує бви Беж г щах 5 шо с 7 й 7 «Ех дя їх є ФУ 25 ху Жду ту сх Тахіі У їх г Я їж: Жук їв аю Тк» ТВЖ дав Аа Нів беж Ай іні За Уві су тя как т кт я СЯ аз
ЕВ й ТИ а АХ ІМ : й : чу іш 2 Му Жахи Жавд Же Же беж Хі ЖатУ їде ТТ
Нів іє: вай Хі їі УВБЬ ЖвжЖ БЕо був Бак Бу ТУЖ ТівБ Ар х й ж: зп5 щи 485
Жвх ів Тек два бук бе біб Мем йеж ув БжЖу Був бзіе Же Нв Ра що Б Ів
Ст м ва аз Бу бе бек бер лів бек Тух Сів Бе Щі вню Та
Бко тв) ЖвкЕ біб дво Меб Уз5 Буз ЯЗвк Бех Бо бе іє УЗХ Жух Туш
ЗО вів БАЗ бів Уа ЖЕ ЗБу біз с ТЕ Вів 038 бе ФВ) бек Мар Бех УВІ Тко
ІВ ББО За ще їви аа Тіз а с) їв Сув ЗХУу Аа бів їж ів УЗА нів їні ех
Бжо АвюЮ дів дар ів Тух беж юс зі пів Те Уві бек сем) Бех» МЕ ків їв бі Меї вв ех То Уві біз Бей ія ів Уві де бак АїВ
Бак БНО ща
Уві Тк ШІУ Уві біб вже ще Аїв БУВ ба Кже їм Б дув Уа Бех вів Бе мес Сіз БУ Беж бо би Пі Суз У Вл ЗМе СУ Ша ав
БЕ 3 ах ЩО
Ваз Ави ів вав УВА Бе Ме ем. Ав аж ей Же БЕ Хаму ЖЖ лав заБ ВО Б
Вів дев бів йо Авор бех Біб із ва дае о Бо бко Су Му 1 б
Бека «2105 41 «2115105 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 41
ХК кт Уже лох. т х ххх ху Кат КА сх ху 2-х пах іх із яв Тїве ТУ Уві їїіе Звк вав ко Бе щіз ББе Аве УВЕ ЗБ АїВ. ї 5 18 їх
Зах БЕЗ дав Хі МВА їЗ5 ів Уві Тек сь ТУ ТВ щ3з Ве Бе АВ ей ак Ко
Вів ТВ Хе бе Се був бек Туж Бо дев о буз ев Ве беагв ТУх ех бак Щі Ніз УВІ Мів їз Зек еж із Ав був Бе бів Аве» Зеж дів
ВЕ ЕВ її без ТвВж Же 33» Вже Бевз Пій Без бо СБУ 03 ів Ав» Буз Узі 5 за ТВ ва даже Теж УВА ЖТух Бей із Уві УЗЇ Беж МУ Мі Ббе ех Сев Звх їдшв вх З В. ка Мет Бе Хіз ТВ БЕ Жзе зво У що ї05 «2105 42 «2115101 «2125» РАТ 5 «213» Ното зарієп5 «400» 42 ве сам КБе Кіз Ні їв ве Без Бк Уві) ЖУХ ТБ о бЕо Бр ів Бек ї 5 10 15
Уві був Уві дко УВА ЖЕ Бак Бей; дев Баею дер їжа МУ Бе вів Був хе Бі Же УЗ їн ЖЕ Бе Хі ав ОБО Шах ЗУ ЯЗее сб УВУ ще
Мас Уві за са Же дер Ніж Кі Бу ЖАБ Хі йеж бів БО Звюе ББа їв іа Бжо ех Аза» БЕБ Ах Жуж ку Ма Те Ти Сів був іш еВ
Ко зо ТБ во беж бе б Ажю Бе Вес ТВ ТВж сів Твк Аів бук Біб с УК Тв ші Жек во Зм ке 1-90 2105» 43 «2115 225 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 43
Мак біб Зб ба сі біз бе був Бе ба жів Бе ої СУ ев ЖВе
Тхв щі бік сів сіб Тк Жук УВІ їі Бех Віз Бжо бу Хіз Ббе ЗК
УВІ іт Зіз Бек С Ави Хі: Уві із їв» Уві бук ХУ бук ТБ шу 35 зо 45
Кз ек ох: 5 я зх ту ох Я х. Ся ск ОчЧЯ МК свя Ж. оз чі н ів ве АБ Афв ЖВЕ дів ек Хе бе ех Жує Бко Ам був був Ба
ХХ дух ФС ха по З як че сах ен с к: пока па ч му ще їх йек Тех Зек Бех ЗКУ Нів Уві Мав Сбеє бек беж 030 вам бу Вре Ба х ях ке З ах р ЛК оазухи Ух ех Зк М жи, Жжх я оо хі ок, КУ чу Як дв ех Вів іє ба ЖВУ із біз БЕиб5 БУ ОБ ії хо БІ» Ку В я що за ва Бе Уві Бех ЖшжжЖ УВА Жух зей спа Уві Уві) Бех Був Мів Бе бах ща 155 те мук ех Був Ах вк бо ї3з8 Тв ТУх Бр вав жУут іже бе ва Хе
Ні Те ер Був БЖжОо бві жЖеУж ТБх бо дво» сів век УВА Був У Ак 330 ІЗ ї30 їх Зк хи: ОК езука Же Же В ос ж у. Зх сх біс 1 тк їх чаї Жук дек бе Люз даю деБ іа зу Бко ів Був ка са Твж Уві
Кок с ще - ж пу пк У с їх г Й с. КН поря їх ях ба ЖАЖ бе Її Ав г сів У ББЖ біз тв АЮ Ме Уві жи БВ їіє Во Мі їі ЗУ їі ЇХ Вюж Бе Бхб бзЮ Се Ббуз хів Бо вх хх зщк ЇМ 15 155 зо
Зав бко бкч жує Зі Меж тт» ЖЖ бів бу Аза БУ ТжЖЕ був сю Аа
І ОВ ха їВе бек Твж їв Бі Жиж Вів ЖУуж Бе с; Уві Муз ше Бех Уа Зв писк их ту се 10 ж ех за
Ж
«210» 44 «2115 1676 «2125» РАТ «213» Масаса їазсісціагів «400» 44 їх м ти з. - Я ТЯ ж и 5 ЗК. китк і беж х. ША ше. з з. Кох І х. чу. ша
Ме су без ої Зі їі їз Су Бе їмо Кіз Бе їхні МУ МеВ ТЕ їв очАж ся ша «аа тТвЕ беж Уві Зі бек Вів Бо був Їіз Оз Аа 28 В З с ж їди зх Р Ж Бо ий сх З ма их НН Я нкдя . УА су сей
Же щі віз бек сіб Аве бів УВі ів 015 УВі бук 0іу Же Твх 310
ЗВ Я 45 ік Уа. аку. Ви т Ж їх леж аку Ж Ямижх Хе ч саму Кох Же. хх ко ів Біб Авюр Але ТБж Хі ее їі Був Бех ТУх Буз дво» Шев був Ба дах . пешмя с з ххх І дж пк хо НО е 4 од о ск. как їшжж Вак ек пі На УВА Ма іа бек Зах са без бе Бе Бах бе ше юю М Зх я жому ее ях . дк ик Я дж Ж ЖК, . з Хе й ж ЕТ -ь бак віз Уві бен жвжЖ ба пам бже Був аю їм) Бже ФУ щі БЕ
Фо їх - суху Хоч М ех 557 Ураюж ХК хо Ух ху Ко ХХ ух. ож КУ ужив Уха
Ззе пів УВУ Бех ТУх УВА ЖтЖж їз сіб Уві Уві йехє Бе Ма БІ Бех 306 108 що
СЯ - аж У ще и шо ня ж К У я Жак с хи сх Фо ря м чу ее бах БУ Ббуз їі БВко ХА ТО бУх Ав Ав фу ББе їи Ба її
У зКОоВХу кох. є хх їЕ їщо іх
Мав ТВ Аве був Бо Уві ТУЮ ТЕ Без Авр осів Бе Узі Буж УВУ Ак я ех ЗЕ їх ка су хи с Ж аж Кк. Ук с тех - с 5. сх, же тож як СТ же їж її тві бук Бек без аю Звр обер без їж хе віз Буз дк ша ВХ Уві 145 ї5О ї55 і80
Жозе ш-- тк - зу - «о Кк ях. Ж дев зу є. СЯ кс се ау ЯК ою жа їжи ЖЕ Бе їі во схе сіб ХУ щеж б) жів Аве Ме УВА ща а ж ще вх За ж ха ЖК Сак МЕМ уже св Жим Жата К Уж З
Хі Зав Мів Хі 1У Хі бів бек бе ко вв Сб ба Кі Кто пек їпо 15 АВ хх х. ся кусок з. ех Ку ЇВ Ок, жо Ка з сш Мох Жан 3 ухилу
Мав бо ха ЖеУю ЗЕ ВЖЕ бке Твж Кіз іа Аа бу беж Жак ша ща ї55 30 ОБ
Бе Беж ТВх їв Щі1У Тв 5із бе бе сф: Уві їше 03 бує ві Хе
Уж и ке о . жо г. . Уж шо упо ува дя З ода су БУЛ ш ке ж дк ее Мія ВБе бек ЗБ шах Уві ім Бе 51 Зв Зв бе бів Бі тТУх «ек т ЗЕ аг ке ЗО 235 ав ії бле Бін Муз Аа Бе із (ів їж біє був Вів Ак жу бе Ту ща Би мо
Хв у - їте ху Ям хх ах За Я ж З Яма Ж Зх сх БО З хх ел дав Був Увь УВІ ЩТВЕ 035 Аів дев УВА ЖЖе Сів Тв Бе Зі Її дк іа йо беє му ба аю Біб Мт із Ме Ме Зі бе Аїв Меб а аб ЖЖ МОБ їхМі Ба ав Бі Ба Вів Зі Маі ТБ Бе бве Бех Бін щі ав зо
ТвжЖ Адв УВІ Був па зе Зак Туж Туює бак їз БІО Вер ви аж Вих
Був бух пес Тухє Мі вій Узі ТВх Уві Тіз Бій: йех ТВвх щі іж Бе за з30 Зх
Бах «3 ши Азів Б їіє бко Біт Хі Без ХУ УвБь Без дек Бжхеа теє 345 За
Муз Мао) дак ес УВі лів ТБ Бжо їз Кі без їша Без піж бле БЕ уж ик Ж ск схУх В ще . з жк схе я су Же МЕ М зх 23 ух
Тух ЗежЕ їі Бу УЖЕ ЗО; УВА Був зв Віа без даю сало заз УВУ КУ сь УВО Бже Уві Те (ее вав Аз сів ЖЖ жів дав Уві вва Зів Со жи Бек Бею їі Ма КхО вка б Беж УВІ ТВ ов УВА Ваз Квю КУ
ЗО а 315 чі Вів век рве УВА УВУ аз їм: Без ек по УЗА ТВЖ УВУ Ба Са
Ое ХК аз я ВЕ ЗВ
Ве Ап о УВі МУ Тк вав Вів Бк Авюр їв Бо дев о Бі дез бів дід дж см ве уж вх вів Сі Аз бук Бех Кер без беж пів Щек туЕ їв їбУую аз Аве бЕЮв їв бев ЗБ Мі Був за без Мей УВА Бе Ка
Зк ат ТВ зо
ТУК Ми дав їі їже УЗ ТВБЖ Бхо це бек Бк Жук Її Авю Зуж Се
ТЕ Вів Теж вно» ТУЮ реє 5 цей Яеж Бу ЗУ Був ЇХ біз Я Ба ща БНО м соку ст Їх Ж ки Ж ска «ся дж. о я х «дач КК х Зк хм щі ЖнжЖ вже жа дев іні Мек дв одія бек Тух мів Бек їі Авй Хі "У з . м Х ун, Ж ї с: кт сах ї жук Жуки Кок ож 5 ж У їж
Ко Уві Жиж біб Зав Ме Ужі Бжо ех За: дк За беи Уві ую ТЕ
Хів Узі Тих 5іУу а ща Тв дів 01 беб Зі ех дво зе УЗА Тер ха БО В 5 х ож иа т-хжок Як гу З сечу бує чт жу Ж духу сх ух м уд о Ж очах бля із ве жів Бі Бівз їв був БІ ав Бі цей бів УЗЬ МНівз без беж
ЕЕ 7 БУВ
ХУ х з ї хх че о НЯ уч і Уа ТЯ ж Пух ух Ж Жак КК жа
Буо дае ів Вер ЖВжх Жрх Бек бхо пу 035 Се Уві Бек їз ВВ ВЕ
АВ Зв5 5
ЧУ Же. У уж я с с а К х г т г ХМ хх У. ї Клея ХХ дике хх
Фві Тв іт МО Аве о Яеах Хв Уа Айва зе тах Аїв Уві Азю ЗвУ Мі ж: ху ях Уго ох с чн Ж Мою дж ее и Се кнук ф туї тУві ЖтУх пу Уві біб бе вх Азв їжа був Кко би Буз вхе Уві Бе
ІЗ Бі вий
КЕ Хм Жду 234 жо Жах дух зможе хх ат КЗ шо Бах ххх дк й
Аа Біне Ме і КУБ ек бю бе) іш Сув Біт Аів (зе міх ОКУ Бе
Кам Вже Вів йзо Уві ББе Міз Бей Аїв щі ізо ТБЖжЖ о РОБ бе БОЖЕ ба дів дав Аза Авр вер Бек а із Аве» Зав а Бо Сув Буб БО тт
Хізвз жа бго» Аж дка Ве б паю о Бів Муз Жіз Ав шал жів За Ві х з « "жу ЩА 5 и «Ж . ї «Кк Ха ж Мч ся хе З є
Зв Жук У Ні бен УВА УВУ Ззув БУз був Сув Тк Вию Са УВА Ах
ЗО ва зао
Кіз вав Ні даю Зх Зв Суб зво ць вка вів Аз Ах їз Бах Уві іт їко йху Сув Узі Був Вів Ме ТВи Пій Сув Су Жжі Ві Аза Важ
ОК с. ре З: с сх М ему «г хекІх жк ос Кз позу т жу Кон
Зіз ев Ах Аів дев Ма Зех Нів Був Ар Бема са фамз т Ажу Бе 746 745 15О сх сей ще ЗО сх ек У бар со Кб її Ж хх ах точ
Мі Важ був ТВЕ їн дев хо Мзі Бех був Бубз БіІЄ 55 бу Неж тТух бїбе Бко піз ба» Був без їх Біб Уві Мі Безе зі Бко йо Аку Був та В ща сів Бе зів ЕВе Аза їв жо вею бек ві Тв Жве тив лах Кі ав
ТУ аж Ж ша я Ск ж сах км Їж СК їх - сах. лик: ку Мох ці Уву се із зе Ав беЕ Бі Щїіє Суб Уві Аз за ЗВк Хіе ех ва яв в ів Був 783 Кін уз ав Уві БВ без Ще Меї Ав їі Бо Теж Вес
ВІВ щи що чвь Уві Ах Бу сіа Бів УВІ Ме Без Суз Бу Тк зі Жеж дев обшЕ ваз 435
ВЕУ тах Бек су Ме Зав Бе Су УВІ) Зв Ве Вас Азв Уві Зі БУ;
ЩО яв я
ЧУЛУ мое гі і У с СУ дк. Ух чи о чу її К ж СК Ре я. жк: х се 2 о їіз Су Тв Беж сіб беж боб ті Зі ве Ніз БІБ Біб Твх та Ва
Ех 7 щТх во
Шеак був сСуз Уві Ак Бав муз УВА Ма ху Же бек бав Нів бе Уві вв во вав
Тївжх Бе Твх Узі ве Буз їв ЩО іє У фам Бій ве Бі вк ЮЕне ща ЯН вів ще у їж їх 3 Я Ж хх шк Х ХЕ ТЕ се Тех С Е їх ТЯ я НУ же Тих дек Тука КЗ. Ка йюж без ема ТВ Бек бе зі Уж ЗМО св бе Уві буж бек їжка дк щі за вих
Уві бе ха біз СБУ Щі Зв Аж Бі Зах Тук Зах 3 Жіє Жвх ба
ЗО За АВ
Ве Бко дк біт Ків Ттж СіуУу Твж обі Ввх Аз бку Бета ЗБ» Бе Бюз ав з5 ЗБ Зо
Тек дк її Був йеб аа їв УА Бко МУ Жак біб ї3ю був же ЖОВ за ВХ ЗУ х о су а жк З я Уа Йо ск 7 КУї ее З за. КЛ ххх Жах Зах рев їні йевж СВЬ ба Сі іЇєва С; Уві ЗУ се бів й; бек вів Уві Бей
І За ЗВ йвж дже ів шк ів ее Кі бе Же ів сема бю їже БУ ЯеЕ Ай вав що МОБ па А 15 ем мес ех УЗ УЮ БкоОо Уві пе ТУЮ Уві юВе МНЕ ще що ї1п023 їчУуж ес Зав ЖВе Бі Азв Між тТЕр ба зе бе Нів Зек бер Вже їж: Їїв св Був вх дев бе Бів Буш Буз їм Був а ЗУ Ве її За ОБО чві ех із Меї Бех Жук Ах Ав: АЬа АзВо Тух беж жУЖ йех УвЕ
МБ їЧчев ща
ТквБівв У с ек вів беж тве ТХхе бвзоа ТБ ів ББе дів ви їз Мат МО
Акз Уві во ХУ Спа УВА нів бу Жуж Зі Бе ЗЕ бю СБ ВВ
ЗОВ ОО їавБ бах Хі був дай бак їема ве Тбхв же УВУ Бк Бав Жук а дев 14359 305 ї1о аю Аа: У йеж Бе фев Ма Аза Зеав Сів ек ів бхо її Бух їжа щі 55У ЖвЕ Сем Бе ува 0 азів вх Зіз зав бек бі їтУш
АВ ща ї14о
Мал Же із КБе бе Уві її5 У із Ак бує Ва бе Аве Ха 11345 БІБ 1355
Ст Бо бїеє; Уві був ї3е Аве ТВх Віа їхні ів був Ада вер ТвЕ ї368 МБ що бре іні бе Біб Авбо ТВ без о Буо Азів бів бек ТВх ббаеа ТВх бах 1175 во ї185 із їі бер дів Тк Аїв Її беж шо Бу Авроїшже ЖБе нів Ве 135 її55 ї258 ців Бе ку Бех б)ієе Уві аж Аїв Бей був Аку з віз їм Уві 1585 1210 1535 їв Шіу дв» Бжо Бжо Мі Тух Ах БЬе їхр Му Ар о беж йо «ів їхо їжа Ти
Нів був Авр Бех ех УДіА Во Аєв тТйк 3іУу Тру Азв Ак Меї Уві їж 1549 1545 із їЖнНЕ Твх вів Тук Аза їз їжю ТОх беж їні Ашю о Зенх був Авр із ї555 аа е : зак ЖЕ ізн» із ів ті вав Без ї1ї6 бі буз Тв ва Беж ЗБіЗ біб в ж козаку Уа Ко МОЖ жк ж хо Ж Коакоуму не їівз даз бух Узі Бак хз ув 15
СА КЕ їв ще їх ще хх . пак Ко ом пр Ме Ав хв щі Щі Біт Бе ТУх беж ТВХ Бі две ТЕ бів АБЗ джу бух БУ ЗУ ау Рі я пе З
ОХ я
ТЕН 7 : 5 ша ЖУК ж пів ї-е ха зіУ іама бвж 3 Тук о бах За беє Ві був ще беб АЖ шк Ж же г Я х А Ж я х ів пі ші Зема ЖЖ зав їЗ05 т 3588 ї05 ве Ух. - Мів ев іє Бро ба ; жає кажи х ХУжЖ уз Бі БУ Ку Бке ж ес дав їі йзо УБі вів ТУжЖ ув й іннх Ава Мек дер Хів вар ві і 1322 1315 Аа ; см Ме Зима їх ТЕХ Бко Уві м чу Бук бо Меж Тв Ао їв Ажю бе ема жу ВЕ
Щів Аве фею бе Ме ТВ сш т 1355 и 7
КЕ п Ма іа со хх т бю пк Мі Ка « с тТві Без Оео да Ар о дяюв о бей Уві Уві Зак ЖХБЕ ЗК еВ у щі УВХ фев без Ав Лех зак їЗ5
Зав ї345
КУМ
. ху я ід мав ФВ
Віз Сх Узв5 Ніж ув бве Тв УВІ Зв Мав ев сх му чи сах о ХВ ІА ХО Ка ак БУ ема ів СВ З шо 388 тк їх х у тк бі даю Ве х. г - Брих ху Жамї ев Ха Ар Ух
ЖБе вк Біб біб Ві Сев о Зех Вів Фк яма у ж З БК
Бак жМЖж ббвж У с іча
МВ с її 3е біц Аз бах Нів бук Акт СУ Тух ЧУ я ! ме ар ОА БА ЗМК З ж 3355 «ке и ак
УЗ 7 їх . гуща Шкуки Жде Тих ЩІ окт Кен мав Вар бю був ВЕ Ж МУ кх. т дк ївз'єзв ді ех Тк бує З щ х Яких Її М Ж Ж - Ще
Тук Був ху їів уві дів тва 14 х хе Ко с Може хе КМ з : 4 дк гою у: Хіїсз Беж ба х віє ек пах Чів вів УВЬ Ме а ак ВЕ у щщ: щеЖ беж беж Зі щежЖ Беж ів АВ 5 а
УМО НаЖ ОО ОжКО г з зв 1425 1815 1555 си Жак Ів : із жа» їж: Жов Аїв їжих Уві ; іс Її зв Аїв вва із 03ю Звю ої Муз Ав бе " бта ж Бу Біжойво Кі дво 1845 ча ЯЗ
А
Ж уж 2 хх ие Как Ту Ждое ПТУ х чаї Аве ше бев бів Жвжх Авр оТую Б жів Се Авю СКУ - се хх Кх Ки ж З й Є з . де із Зі Уві бер с таки защк 1445 ДАК : є з ек Же Двух Ме їні пато х ж ївща Щі Її вва Бех їів Бузх йек ВЕ УМ х щік са її їн СХЕМ ІК я по 4 в за и ж 1485 б
ЗК пл
К дж ам БВ: ТдУуд х яко Те Шіз Уві ші ба Ту тві ке ЮБз» Аж Се обіе са бео Бе ша Уві щу е
УВ чві АжФ Юа АЖЗ «ав зав сов ук ОМ зав - ; Мет й Те ; ух туш ех Ж АВ У мів тЖнЕ ве тних Уві бук бів Ту біз Ак бек АеюБо Бу
МЖаже БЖО дів Ще Бе шт е еко тва з48а шк ща Су жне МебЄ МБбе Теж век жЖих Бек одев дае Же Хуз БМ ув чві Сев шіз ві із БЕ Сев о бу був їз Бі ві ев осв ПУ хо їі ЗО
Б Ма Ба МеВ озіз Земх баю їх ТВ їі вх біз біз бТБх йжхЗ їі зай їі555 їв ів Жнх Дів був бал Бо БК ї3і6 їз бух Аіз о Жбую був Уві 1558 їщ5 і
Хе її. Жве Жвке біє ТВ ТВО Б Яка Узі Бе Уві Був беЕ їв
МаКЕ 157 і5Б75
Вів Твх веб Їззма дев оба їжи Був ТВ бБажЖ Шо дів ві ВМ щи
ЗНО 1555 ї855
Бу Ажю шек ім бів Твж бе із ЗУ був Уві Жах без ТВх Аква 1558 дО МІ хів Біз ем УВі БУ БУ дже сіб бек їж біз Ме шу Бу БМ
Віз ім щі її був Трх ви бОе ХВЖжЖ Бе дк уж жа Тек БЖе ії Вар о Щек іма Бах їхрв їів Біз бух ТЕ обо вх Аво» Те ЖВвх св Бех Бек Су сів ів ББе без вів дае бе) же Б вва щі й даю жі б бе Зав зує Сув ї1575 їБт5 «2105» 45 «-21156 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 45 дек бак Кук ух Мей Сув «2105» 46 «-21156 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220»
«223» Штучно синтезована послідовність «400» 46 «-2105» 47 -21155 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 47 «-210» А8 «21156 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 48 «-210» 49 -21155 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 49
Шк БЖ Жуж бук МЕЖ Авт « к «210» 50 -21155
Зо «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 50 дар вже ЖВЕ Має ЖВе
ЗБ Х ш «-2105 51 -21155 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 51
Жве бек Азїв Ме БУ «-2105 52 -21155 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність
БО «400» 52 міш дав дів Ті Ав
Х В
2105 53 -21155 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 53 вх Жух ів Вб о шаЕж «-2105» 54 -21155 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 54
Бек Бек Теж Фук Уві Аз у 5 «2105 55 -211517 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 55 сжа ЗА ех вжи бі ве сх Б ЖЕ бух ЖУж дів вже фев ів Був
КЕ
! «2105 56 -211517 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 56
Сув Це тек Те Уві Зак сфе Ту Те Тує ЖУх ів Бех кв Аїв їде
СЕ
«-2105 57 -211518 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 57 му сЩу «-2105 58
«212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 58
Ме їіз бук і беж зів Вів ТВж Тех Жух Аів бах жк ів бтв ЗКУ «2105 59 -211516 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 59
Ме Хі Тк ось беж Сі» із Жье Буш Жук Вів бек Тв 5із Був ще ї 5 їі їв «2105» 60 -211516 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 60
Хів ів бве Без СУ ЗКУ дер Аів бек Теж віз Бек хо дів Був 5 ї В 15 135 «-2105» 61 -211516 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність
Зо «4005 61
Тв їіз бво ЗВх Зі дев дав беж бе ТУух дів вав ТЖЮЬ Вів Був ЩІ і 5 та 18 «-2105 62 -211517 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 62 був їз бУх Зх Бу Бве Вею Ми ТВ тУХ ТУХ Вів Тож тТКв бів Сов
У
-2105» 63 -211516 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 63
ТвВж біє Ве» Теж зі бе два Зеж Ве Те ів аю юр» Аів Муз СА 3 5 35 ї5 «2105» 64 -211517
«212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 64 да їі Жухж Же су ек пі лів ТвВе Ту ев дів Звк Тхю Аа ув
Ж
«2105 65 «-2115 13 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 65
Аве ЗМУ бі Тух Уві Зх хо їВБЖ Ні дів ес бек без «2105» 66 «-21159 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 66 даю їмма Ні віз У іє ЖВх Аз диво
Х 5 «-2105» 67 «-2115 13 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 67
Тех Бо Тв Теж ЧУ авр Зі б ів Ав Біюх аю Хе -2105» 68 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність -400» 68 пі бе Тух йех ЗЖУ дев ев Зав Авр два ЮК ії їх 10 «2105» 69 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 69
Зі; біе ТУ Жак Бу вроди Аз зав оАву ве «-210» 70 «-211512 «212» РВАТ
213» Штучна послідовність «223» Штучно синтезована послідовність «400» 70
Уві Бі Вів БУ йвв їЗе Бве ЖЕр тую рве Бер їнща «-2105 71 «211511 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 71 ав йАвр щіУ Бех Уві уж дев без Бе Кам Без ї к 1 «-2105 72 «-21154 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 72 паж Бех МУ Же: ї «-2105» 73 «211511 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 73 фани йо Зі Зах Уві ТтУж беж їн Кіа Дек фам їх 5 ї6
Зо «2105» 74 «-2115 13 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 74 вав пі БУ ТУкх барв бух Бе ТВ Мі 5ів Меє бів Тож ї 5 18 «-2105 75 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 75 ів 3із беж Біз Зав біс БМУу йеах аю без ВАВ ї 5 її «-2105» 76 «211511 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 76 цієй дів йек сів Аве ї15 Тує Бах дв їж ака -2105 77 «-2115 13 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 77 «Ма Жак Бех бі Шах Уві бу йеЕж Зає Аве фук їх ех «-210» 78 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 78
Ще із ех за Беж Же мех дат Жхре де Ва «-210» 79 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 79 пай Аха Щек сі бак їів Ба дви Тхев фемі Ба
Х Б 18 -2105» 80 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 80
ЗМ вів Бех БМ ек жів Тех Бек дів ії КЕ «-210» 81 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 81
Ав Аа вх БА дай їі Су Бек Вів без бах «-2105» 82 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 82 ів ів бек С3о без їі бук Вес ее Мев ВАВ -2105» 83 «211511
«212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 83 щі Зі Бех 5 зав Її Теж Бех ів бе Зае «-210» 84 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 84 пів ів беж бів зви сів 335 Бек Беж бе Дав -2105» 85 -21157 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 85 сіт ів бак був без вів йве «-2105» 86 -21157 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність
Зо «400» 86 пі Аіз бек Ащи Їжа С Мах «-210» 87 -21157 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 87 пам в Зак ую бе Аа Бах -2105» 88 -21157 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність -400» 88 ка піз йех ТБЖ ви вів бах ї я -2105» 89 -21157 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність
«400» 89 ї В «210» 90 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 90
Зак Аів ох Ту їз лів да ї ї 5 «210» 91 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 91
ТУ Вів бак ТВж Зав Аж Зах ї В «-2105» 92 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 92
Маьз Жах Ввж Абр Зев ів ЯвЕ
З 5 «210» 93 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 93 бек Аїв Бах ЗБЕ без із Бек «-210» 94 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 94
ЗУ Аів Бах бе ЖЕ Нав бек «210» 95 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 95 пів Суув Твж Бе бі біз Бек Зак Те Щі» Взз ів
БО ї 5 ї5
«-2105» 96
«212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 96 їні Ба» Бі Жук Бех Туш Бех ба Уві Аве Ав бів ї В ї5 «-210» 97 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 97 зів Бе ТвкЕ Тух Жух бах Зек сьу Жжю тек ба дз -2105» 98 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 98 ів із бев ТУЮ Бах Бех Бех лаяв Мах Ав ва ТБЕ 2105» 99 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 99 ів із Ар Жук Явех Беж МвЕ Аз Узі Авр Ав ЖВХ -2105100 «-211512 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 100 іп ощів бек ЖуУую бес бех ТВх ба» Уві Ні виз ве ї ве 10 «2105101 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 101 спать ів ух ТУує Вер ї3іє дви бе Уві Авюв Ас ТЕ ї К 15 «2105102 «-2115 13 «212» РВТ 213» Штучна послідовність
«223» Штучно синтезована послідовність «4005 102 ів Су ТВх Аіз Тух «Кі Вес бек Аве УВА Зі шу Тве «2105 103 «211512 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 103 щі 15 бух Жух Ав» їі дае дес Уві Аврв два ТБе «2105» 104 «211512 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 104 зів Яак ТВ був стві 1 бек Бек бук СТУ Ва віх ї В що -2105 105 «2115 1680 «2125» РАТ «213» Ми5 тивсши5 «4005» 105
Мав аю їн Жжв обу аз Яемі Суб Як) фена Жіє КК. ее бар офуз ТВЖ
Тхв щіу віп ші зів ТБх бек Уві їі Бах ліз вк Був Же дез вже чі щіУ ЗежЕ Важ бі» Ае-ь УВУ уві їз кіз Уві Ні 5 бївЕ тТвУ шХв
Мі Со ав вів ЗВУ із бек ба був бак ЗУ бе Анр МУ Бук УВА
ТнХх Бе ех бе СЕУ Тух Уві Аву фема Жеє Бо См Аве Бевз Бюе БЖ
Щ КЕ - Х ме ДЯ Е КО зх іт с У се вв осів ща Бу у За щі жо ох хх Дому ух м Кок ік г г ДЗ ИН Уж х як дав вів Аів їв фе Зах Ба Був Беє ча Є ще х с ях в зи
З З ах «Жах МА Ока ЖЖ ів бві за Шіз Уа Узі бек Був Нів Бе ех
Зак бко Уві бек Мів Узі ТУуж їм Шіз Уві Уві Бек дув
Ме Ко УВА ек жів УзЗаО УЖ БЕ ка па
КЕ щих КЗ
І хжи іх т їнмі Бе жів : а був був їіз йо їз ТВЕ Тк Веб йже БУ Ж Хм ре Же іа ЗЕ без вув Яків ж Та ТЗ че се к «9 ї що ложу в же як хо я Жхкиш Зк з а ВЕ Би баое по Зак ві МУ Хі БЕ ск - ххх «се Бех Я ФрвЕ фа ВЕ ЗО БУК ою Х
Нів ТБЕ Аве був рю вх Ж і я Ї 14 - ЧЕ У : соду йбрне ЗА х й НИ с З чі ех а зве У : с є КУ У жк хо Мах з КА ї 5 ж ЕН ї: г Же і чаї Бех Зах Зм) ау даю ер жна БУХ : ох їх ука соалїЕ 7 15 55 145 М - ще "а ві ів 3 ; аз ЗУ Бюж 01 Уві дев ків Тві са аа г « За Тк же вхо Ба У беж са Ук да Ж їв ТК бе Тіз дар окжє аз жу мо «Ук
Ех 175 ї5 я чу су іме бок ж; Мет» бур : : їз їів Вес ББео Ржо дав бе був бів хо Ваш чу ве обі 23 з Бек Ве бо аю БбВаеа БУ
За Аво бю ЖВХ зфУ Хі бів веж вое Вже Аа ува її 155 і їі уз із дав ТУх Шув Був вв . , тк Укл Зб хе ЗЕ ів їжа Ав дав КшЖ МУ МУ Х
Яви обжо Муз ЖЖ ЯМ УВК жхр о їнт Ме мує ХА зак зе Зо М 1955 хі жМА
ВЕ ве Аіз бУж ВЗ би жів Був Ма б Уа Хаемх
У зх бу МК пек ех «В же х А ОМ Оу кої у х. вве їни ТВе Жах бе ТВЕ З са че ШЕ те тва м щі хх У ком А хм пог У ко ад і Хек КО ва осі Яка Тве Бе ів пу тре - ско Жук Ж що ферюо Х х її в їм ГАННІ Ж ЗЕ Ж Ки й З хо Ажо Бе беж Уві Бех Те Ба беви 5 як оно ер Б шах
Же х сії їв вів Же Жеож фе ТЕ я я й ва 3 Хі їке бві був Вів аЗкщ УК КЕ Є
МУ вав бе Був ба Кене ів Се ТВ с З ок
У я с сеЖ КК еВ я ; я ска чу віз Ка Шфмв іш ТМ) Б в Уві Уві вхо Аве Вів пі Уві тех лів бо Ба се Я
Аве був Уві Уві хо Ав» ЕВ єо ей х зу й Зк ЕВ «ТМ
ВО Ж З і сі Меб меж Між ее А ж Бе х св й Ша СМ Був 33 Ме меж Ні ее ів ВЕ т Аве Сів Був аж ме Сх Був їхіх3 Ба і в
Щ ту ах ща «ХО
АН і | ВА Аів ші» із Зех Кз бар «ех Ж ; із їв їжа Уві бшю 05» ві Віз піз із йдем Ба бю ек Є ків аіа МУ Б УВУ Взю БУ УА ів ша жа зо З за чи х г Ух ск ЖК босу х «в м їні Зк Жук дат фе ема б даю» Сем дах Аве фр З : св Ме ж ЖУжх дат жах ема Ма АЯЕ
Твх ваз ув був ша зей ек Жук Авт ха пев Ї ча ід КУ АК а жи ща
: Ї що Уві ВЕ Са дек ЯвЕ се ше Ва . ще Ї. и В ХЕ Тв Ук тв ша баеє Важ АВ іш ТУХ без тую ї1із ів Уві ТБх Уві ЖвЕ їй Важ З Є У
КН 335 З «ай ; сві Зав йвк Вже док
Ї з ді х їїв ВБжо щі СвВ3 був Тех Уві їж ВЗаК ВЕ ОХ ви іч 3 вів а бе БЖ У Зві Був Тек УВА За дек іх 38 45 КЗ
КИМ ча А з жу Бу Щі їїш Бу
Зувні і вів ЗБЕ Без їж Б» ові ев Без сіє Хе Бо
ЖЕ їае Аве оїмні УВі ів Тв Бже Беб БВеБв отв щує їх З З яв ЗО 655
Я Зо зів чі Був йаю аж же: пів зів ів уві «їх
Ма Зах ів Ба азів ів В Був вав з я зхе с ск т у 3 ЗІ зе їх век а, є ї «З х же тра беж Ух ех ХУ сухе Св щх Ух іт Ах піт Уві Бхб УБі ТВХ Сей Мей із заз вх УваА АЮ Увь Авт с щаж УВА КО БА ХМК ик хо ку жве за За па
ЗЕ а ї ї із ЇТвВе Був Вхш йеЕж Кі ВХ нів Ваш Тв Авро Бу
Е ? у? М с. З г Ку З хо ЖАХ Я яд Кх жк й лю У
Твх дек КАвр обер аа ТВх Був Вк М о з яв це Ж я
КМ
: жа щі фе Ма ЗЇащі їх - Уж. х хо Бу Важ дев ві бвж У Ж Беж му ві зв Увь Бе Уві їні за Гео Бхо Зах дез УВА ЩВу і че ж му й ххх ав І
Ку у АК с - ще гот сх лях ах дав щі в віз о ін Же ДЕ ТвБЕ вах зе» ВкоОз ша Її хе аб си два Ба Ав
Ве Віз Же Аве ТВ баев» бю Во БМ їж З іх
Як Я 85 хх 358
ІЗ «і із УМ Кіа їУє Бех ех іо ех «35 Зв Жех
Жак БУВ Са Жук Б5іЗ діз Уві ів ТУює Бех Ве та ре ї ж " КО УЖ м г Е Зк «50 55 г:
У з З як дк За хх ік г с Ж . М дме іх зх Оу у. їжа З жх Ма їх УВУ су же
Ха ЖуУю ї1із ліз Тхю» ТЇТвБЕ щі дао Трх їде Е хе я ще св ех ай МІВ я 85 х Б ак бує бек жів фею їв Ті ї ск ТЕ. я Жук я Зах Кв ха. Жду ВЕ сх ж Ка ВАМ ТАТЕ З
ТУЖ Ма дах їі Ме УЗ ЗБ Бхо зв беж КЕ ТУ ЕХ Х се 455 аз 45 , , їх фаз жі ЩА т вк
Я З ке Аза бУх Без їі бе; ех був Біу Був жів ЗМ сів теж
ТЕ Віа Тух дво ТУх Бей Їіє бе чех був зму Бу сто у що ща БІВ о
І зв їжі Бе ж бек Твж Жек спів Аша Хі Ав Се
Щі ве Ди Ме дав бен Ем Яр Бек жви Жуш с в 7 Ще Ж
БК Іо щи
ЗБЕ. Б зей Уві Бке бек біз вка Мем їв; Уві ТеЕ ЖУж шко Уві тТвх Щі бав Мет Уві Бже Зак Вів Аа м Се 5 і мн о Що ххх ща: а 55 ав хх шк У. с с Кодучи с ї ді в как дів ві вер
Тіз ба фве Біо 5 бе тк Вів їла Їжиз. Уву дів лає Е їіз ТвЬ ТВ: бів соаз Се ЖВж ів сів кох їКе ав ВО Ба КО ма ХУ ; їх й Зк бай Бі Уві Ні їн; бах ; В Те бів же був Се бі дже ав мі ав Уа Ніз їм; Ваз їів аз БМ Бі ша Був Сея Зі дае ща їі Та
ВЕБ У З
Вже взв о шів БУХ УА Туж бак без Біт Шев о ТВБж Уві веж фен Ав» Має «ва кВ За б. т ц з са з нау с Уїх ехух, и КЕ - Кі Фев Бі -о вм ох фе ее
Уві Твж Бі. Аїв авр бек ТЕр Уві дії Заві дек дів У аю вк БІВ
БІО ОБ є « щу з К З хх - Зх сх се па уми КК я Жжчу хм ї хз
Уві ТУЖ був УВА зів Ба вав бів був Аха Ліз Мб в Ахз Узі Ба чів віз Мне Звр Ба МУ Бек зер їв; Зі Су сф АЛ ЗКУ КУ Су щ-5 83 вах 5ЗО
Зк с х н кю Соя ше Ж х мл У тя Зах У з ях: х
Мі вав яв Аза Авр Уві бе Мав ія АїВ і Бе) Тв Вбе їж) ХБЕ
УМХ ; Її кі Б В
Ж КУ х 4 т Я с ще о вхо, пхашк с хв два Аза вай із вер вв бек Ні Тух Ак вав Ар Ех Су був сх «во ЩЕ ТВ чо х 4 В пк . х : хх Х сшуж. Кох Ж чужа зжеж Ким КА ож ка Кок КТ хо ї1ів без дха беж Був Ах вав ін Мі Сем Сея дже Ха бу їЗе ВВ ге хе ЗУ КАЧКУ Жхулух Же Ко яж зе га КО уко . Фоаштук ск фах Мосуля віч Ма із вів Був тую був Вів Беж Уві Бе Був іш Су Сув ТУх суое З. м, ВВ ху Ж жЖМке аа бу х с Зх Ме а му чук
Ве тах їнЕ Тіз пі рко бе був її Аез Віз Бі зво са сСув СУВ зи що та
Бк ЗсбриМ хх Ку тах щу мк 3 а 2 дух хе ж Ух у ксуж ую сук ГО жи
Хвж їі АїЗ ев Був їж Вжу Мт із бек Бу Ніж Сов Бто 8 в 74 7488 тка їв: Біт Ах їі Нів їі був ТВЕ Зам: без ко Уві МО: Був Дів Аво 755 ТВО ТЕБЕ їів аку Бех Тух Біюв Рує заз ех ЖЕр Їм) бер оса ів ів Бк Уві та ТІВ тва бЕв МУ АК БУ ШЬКБ Тема ба ові Жах без бке вер ех їм: ТЕ ФТВЕ ху як гу СУ яЖ ж пк уж с з ях Як дя Ех, ххх ЗА
Жкв пав хів се Бе Мі БУ хів бве бе два ЩіУ Тіз Сб Уві Бі
ВОК вів ІЗ
Ж х; ше ШО жа сх Жхх ем й ї Кок її сх сах Ко ХХ не с -; ав ТЕХ Зв Був бів це УВА Ме БУВ ЗМ УВА ВМ. їм) А Мем ев с щ че Же Жах феї ж з сет ЖЖ х У поко Ух Зо т ж ХХ жк У х. хів вто Жук Зак УВУ ТВі дк БУ ЗМ За жі із фін був ШУ ТЕ сх хх те й - я 35 49 ві5
УВА ТуЖ баз ТУх Ме ТВ бек СКУ Зх Сов Ве осСув Зві був Мевж- бах яко ле Вк
ХО З ог. сх ау "З яз Звання Шижу їх Ху Кук За Ку же Жиж Ж із У зів У із СУБ Же беж бу Яви Жах ліз дів Же Ге На ще Ва ВВ во тБе ех бах Вто баз ду Сув УВІ Бе Біб аж біз па ЗУ беж За вах ва зе
Важ Бів По Уві Щвх БбБе ЖвЕ без бе Бу бе Ба б1із БК баб Ніз
ОВ зо
Ще хів Ваз Бе беж фа Со їж бек Роз Базу їз Авюв о ХюБ ей вії
ВІВ вий Ва їв ТВх бОеи Зх Уві Уві вже са ші Уві Був лез Ух бек Теж ЛЕВ
З ; З х З і:
БВ ЗВ що
Та у лю З ах духи Теж х ОО З ж вах. Яах ж ХК пу Ту х я -іК УВА Жіє фей бвую ко Був зфУу їієе АБ БМ Же Уві Аве дкж Ва за Зо 55 55
Му БО Бе бо ТУхХ АКУ бів ШКО Змі Ао Бе Уві Во Буе ЖЖ Тлуж
ЗЕ З ТА та СМ Ах Тіз їм. Беж Уві те Сі їм; їв Уві Бі Зі) Бе їмо)
За ана З ож с ЖЕ ох з том 253 за Ук сх шк СКК « Ух ха зх -. чу.
Жах Тех Укі їз Як Був За ОАЮЖ сів Жяй Кіз їм; фе Ніж їх Вхо аа Оп МН ках ж ах їх с хх з як п С хо КОЖ с Фк, д Й мув Му йек Аів ща Жів жи без мес яви їі. Аїв о Бжео Уфа фе я тю ях я УУ зх огуху
КПІ 18915 іо жЖеж УВА Ббе Між Же Бас оЗіз зів сі Аве жа ЖКО ав бів Бе 3835 заза МОЗ ші Женя до о тоди фе тав ше Ро фам фо 3 тих ще жЖУужш БЖжОе АВ ТВ МеЗз Жак Бе Ах аю ех фе із бе ее Са ще Ма ТОБ іїше БЕ Бі Ві Щі Зах Уві Ме Зеє ТУЄ ху Ав біз Бо ТУЄ
Ме зо зав
Вес Ттж дак Меб Ск; о буз бі Аїв Бех вів беж Тк ЖЕже їм: ТВБЕ ато МТА МОВО ів це віз їв ка УВА їм Бім паб зві ів уз Же вах ув їси5 МН ав щів щу іє дав бек їз о Суз Аве бе Зам) без Тео о без ЧЕ ЗАВ їжа Су БІ їм с3 Ба Зі Вех Ве їжа чі бав БвЕ ові Ту чн х чия як, 3335 1150 її їні же жі бев о йеоз Щі 035 ЖВе Бво Бк» Лів 3) діз аю щі 1135 38 1138 їше ТЕ бе) ТУух бе Тнх біз бе йех Уві їїів 6їУ Жі5 вка Був ів УВА дв їіз Суз Бко ТВ Ме пев Ав Вів ТвЕ Біж бен Аве
Муз із Авр Зах Біе земні Без Се Аве Тв іїєб руб бек був Вж
ТВх Бе Тбве Їм: Ліз бе Уві Аза Жук Дів бе бек Бе су дев
Аже їм бів Бо Бу ів бку їз» Ків Уві Бшж Вів їм) Бу ув іс дів ББе УВА їз У Взв бжо рко їі Тух й бек Тюев бе каре Жах яма бу Ак БЖ Лев Бех Бек Уві Бхоз ех бак Біу ЖВе
Ав важ Меб Уві зро бе ТВ Аїз Ту із їж Бей ке дек Бе бев їж Бу аю МОХ Аа ЗУ АТа бзв ККе її ї3іеа був ТюЕюв без дек а Біб 055 Бех ТУЮ 15 Бі 035 Бе Тбж о йеє ЖЕ ЗУ Да
ТВХх із Аж Аз же жан сь бео Жвх бів Тех ве о бей без бе їх В За та Біб бів Ніз бе зе Ме вв їі бев Уві дів Тех був Віа їх ВА зей піз піт ев ВНа оМНаа Був бук о ба Уві Жах 03 їше Мав Біне Їм хе а їз55 іт до Буз УБі віз Узі вх беб дав Авю дво Змі Уві бі аж
Хна У бух бек Зеж СУ ех Абе Же Уві Тек Уві бе Же Уві
ТІ ів був Кі беж Уві щЩеж б біз Бе Ста беж о бе бух Без їз їїів аю ТВвх пів» Зв жів БУ Аів дак Зех Мів бе Ак о
Зах Ввр о бвх 03іУ бе був ВЕУ бієе їі лів Се Ав Бех ТЕ Був
Мао ї305 1315 бує Зех їв біз ЯБо Беж ТВ бас Зжу бек о Зес Мая дів Уві меж хе Ж х ах жи Мем В гу НК хі тя КЗ сер кю вх кошт вер хів Зак їжа Бо ТВх У ЖХів 035» Аз зва бій біз вв бе
З 155 КЕ ко 5 с дже ЖЕ З яке ЖК жи ми Ж уж ОЗ су че Л. де Х х х кл жк Аза ма Уві Щі Бім ві Ав біз їеєй Її ТБх Ашю Тух а за 1455 Б
УЗ Ж Зквужх КЗ ІК ОК Ж ам й Ж зує боку хз У ха:
Хіє Був вросіУ Нів Узі Жієз Чамі Б3ю їж баз йех бів Вко вк їі455 Кк ї47
Ж. дхучх о М дух У Зою м зе З ухох. кох дк -х 5 м ж сук я аж ба» бБе без сСуз Уві Аха3 ББе Аж їі ба осіб їз бе БІВ
У НШЬ У ху сх Мате Зх Шрам і :х пек Ху З ха мя їх чаї БУ Ббе бео Аве Бко Аза о ЖТБх Бін» Жех Узі Жух БО ТУЮ Вів «ат в хо 1458 14555 35
Же Же Іза тк ЇВ Ух бух ГУ же Фев С с ух Ж Жах З , х Пух
Вк Бо АввБ ів зів Суб бВх Мбеб бі Тк Бех їзе Веб вдвр отв ож Ж Ж ще 0 ХК г У. жу. и у її СЕУ х ж ве ту ОК кб дев вів Був УВв. су Ба мі віз із Ст Ту без Уві 1 оду Ж ЕІ а оду
Ба 153
Ко 2 ГТатк як Ж ох Ех Ко ах с Ки се ск Я ох Ж ещ хх ліз аю СУ Аів бів о аа зав о Аів Бі УЩі що їні ів Хі БУ ча ЇВ 1545
Кіз кр ех Ат Був вій муж Ліз Суз був Кхо 53 ТвУ ів ЖУЄ
МО І 1550 жи ку Ж хз її Фе СК я ве Х шує В су КИ У жду УЖ: Мо з Ух
Вів ТтУк Був Узі Аж біє« Твж Бех Аза ТБЖ Б ЩаВ бвв Уві КБ їде ї575 15 аж дуг деки я ж ко уки су - І г. т сх тк жд ЕКЗ де
Уа бе ЖеХ Же Аза ЖБи ба беб Уві ТВ Тех Був жЖВЕ сіб Ба о І гу ,, Ха їУ те Я Ух ЖК Жак ге ік вів із ве жів вав Зак Б ва ТвЖж Бе їі без бе Ме ек ї5О5 ї50о ї5аВ уз ТЕ бвв оваіз Аз ін Уві Був бу Був са тую бер КЕ мех хи З ох сх вх сх вх ско се Ж ск Кб хх зу ЯХібех флуах сх Жах пк хуя
ЩІ Був БЦ Уві ем бів її їжа Вів ба» ббБе беж Ббе бе ТУ хек дв кт і їз ї535
З сх Каси Тк су дже диму ВК ее жі га ух Нечує Жахи Бу
Її Туж Бко їн; Вев бе»: бек жЖвЕ ТевБ се ій Жух отбюЕв о БкО Жне
Я а кед 1548 їБІ5 «БО 4 сх. 5. са лож, фикжоє Скажу ук ще ФуУгах їх ТЯ і тку жк кар ТвЕ Жве Су Бжо Зах Сув ав Віз Ов УВА щі: вав Бе дат
Зав Рв Аз Б ав бе Бе бео; вай Бех Ст УЗ ї575 ВУ ї555 «2105» 106 «2115 123 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 106 сів Уві бій без Уві що ех ШУ У КУ їжа УМі Ба Шхо ПТУ АКкя ї 5 10 5
Бек бю Ак би Бек Су дів віз Беж сіб юКБе ТнНЕ Уві Ніз бак Бех
Жук Жук Ме Бі кр отв Мке сь із хз зьу був Пі бас Бо ТкКр 38 48 їх
Уі чіт Аіз із КВе ЖЖ бір ве іт Вів Зо ТУю був Аза па Тхве що й БИ
Віз беж Сі вк УВА Ве жів ех беж Аво Сх беж Був Ба сб УВІ «В 7О пе ва че без ЗВх Ме ве Аз» Меб дер о Вже Уві Брю Те Аів СвЕ бурю Уж був 5) Зак дев Міа ККУ ЖЕ вею тТУж Бу» ре бив Акв Ме Нів Ух 55 кежКя 115 тв Бі Ав БУ ЖОУ Ба тво ТВ УБі Бех ще 2105107 «2115 123 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 107 «ів Уві Щі їн УЗ ЩІ Зек і Біу ББЖ без Уві ЩЕ Бко ПУ АКу 3 к і 15
Зак їм вх їні бек Су Віз Аів бек СіУ Бе Ж» Уві Нав Бек бек за ЗВ З ва «Мол м
Тук Тук МвЕ Аз Тк ТВі Вк Біб Аз Бко бі бу ЗЛУ беа іо ТЕв
З зо 45
Уві іт АїЗ бів Ббе тбж Оу ех пі вів са Жук цу Зі БМ тТко тв Ббуз У джу Бе б)У біз ех Ах бЕю дей беж Був дв» ТВ без
Жук ве 0105 Ме Ба ех їз ле бів «їі взв ТвЕ лів тва бух ук я зо з ств ів Беж да» біз щ1У ТУ АвробУю Вже ФТВЕ Щівз Бівз Ме Віз Теж їЕв ву Ах ЗУ ТБ беу; УЗА ЖЕ Узі Бек даю -2105 108 «2115 123 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 108 -Бо зві щі єв тва Со бек Бу Бі са ба Уві ів Бо С. ку
З В іо їй ек ії БЖ їн Важ Су Аз Аїв Бех (ж бе ЖЕ ЗКЬ Ма де. БЕ
Жук ТУук Меж Ай тТЕБ Уві Вже са ів Бо ФСУ бує Зб ба БЕХ жКе тУщі пі дів Хіз бін ТЕ ську Бе сі ліж ЩО Тух це Б са Бер із без Кі дже Уві бе іє ве був Авю ТБх Бек бев даю сія ув стві їм Же Ме ть дав Ме вв бо Уві безе ве Аі ТВЕ беж Тож
ТВі їхм; Твх Ме Тк йво Меб дзр без Уві бас Тв віз ТЕ Тех бук я о 5
СУув із Явк Авр Вів пі бух Ар обУх Бхе ТВУ Ків Аква ме Ні тех в 105 їз
Тв Чі дк Сіу Же їжа тах Таж УВІ Бех дек ож УкКІЇ 8 їще
«2115 123 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 109
Ов ові Єв їе ві біз бек бі Зі бі ев Уаї бів Бо зу пу
Мак зам йо іх Бех ев Лів Аза ек ХУ Ка твВЕ твВі Мав беж Зах
Тук Жук Меї Аїв ТхвБ Уві Ах сів і Бко пу був 01У їжа Б бЖе тУві і ів їівз Бра Тв СТУ йеж 015 йіз віз їж ев біз іє Тхю ів ев 5іт ха Уві ТВ бів ес був во ТВ йо бух Ваз щів УВІ т Бей тм Мак їв дев Ме дев Бе Уві Бе ЖБК дів ТВ Туж беж тк є З хо
ЩЕ щи о
СУ вів шах дер віз 5» ТУ дав ТУ бко ТБ пів із меш Вів рух їпа ї-5 що
Тїхв іт Сава жу ТВЕ бен Уві ЖАЄ Уві ву ек 115 їхе «2105 110 «2115 123 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 110 «ів УМ Зів їз Узі біз Зах Бі бі щі без Ух пів Бк Зі Оу
Жах Їж йко їз Зах Су Аза дів беж ЦІ ББе Те 3 Ба веж ЗВУ
Ка ж ЗО
Тух Ту Ме Аїв Тв» ТВ) ху ів Аів Ру 03 Був КУ фе МО ТеБ че бек У Кіз Бе ЇВ: СБУ Звае спіу йіз ТВ Жук фа Аіз Фіз тю що ЕН 5 дів Муз (У Ахч Уві ТВЖжЖ їі Бех Ббуз дво» ТВ Бех муз зв бів Уві
КЕ 7 п БО ча яма ТАЖ Мак Те»Ж ви Мей зр орхоОо т8і ваю ТВ іа Ве тую ТУК ста Аза Бех давю» Вів 01 ТУК Авр обох Бує Жве Віз Вів Ме Нів Ту а 195 Що
ЖХке віч па О3У Тео бе Уві ТБх Уві аж Звук «2105 111 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 111 вв ів св Ме Твх 1» ех Бхо бек Бех без бех Аів Бех УВУ ЗЧАХ 1 В і8 їв дйво Ах УВА ЖВж Хі Тк Сув же Ай» йевж Се ку бе Беж Беж Бек
Ка я З бе із Же бек іо Зі іш Вже СУ Був Аіз ВЕБ Був фа Жемі ЇЛ
ТРЕ іт Ві бек біз ЖЕ із бек БбУу Уві Бко Важ Аку Бе ЗвЕ Фі ка в ка
Жах У беж ЗужЖ Ще бер о ББе ТБ їн Тв біє беж веж бе БО Бке
В 7 Та в піз Авр рів дів ТВх Тух Ту Сув бів Аве Те був УВУ іУ ех Яех й ни з бек сьУ Авв ТвВе Бе сіб 03» ЗУ Жве без Уві біз і ув «2105 112 «2115 110 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 112 зер» Св бів Веб Те бів бек Бо Ме беж єю ех хів бах ва сі ї В їй їх дер о аху Уві ЖВх їі їн Суб хе вів бах сів сіє їзіє Зв бас йеЕ года Ж М ох Ух у Я У Жук Зк КО Ук іх З . гос Б се їм ів Тко Тух сів Пі» бує Бе Зіу ів вів Бк дк Бей їв її
ЗВ 4 4Б
Жук ЗХУ йіз Зек «Біо ТЬЕ біз бек Сі Уві Бю5 Вес Ак ББа Яех ді
Шок Сі ЯвЕ Бі ТВ Аа бе ТБх Бе ТВ їі бек беж їм пав бха с-м вве КВ ів їх фтж ТУух був бЗб5 бвр) ТВжЖ Був УВК сі Бек ек 85 За 55
Жужх БУ йо ТБж БВаМ сі ПТУ ЗУ Жвх Був Уві Бе Же дув «2105 113 «2115110 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 113 кер Ге Сів Маїс ТВжх Бі Бех жо Зах Чек бе: бек Віз Бек УВУ ФУ
ВВ» дк Уві Жве їїі6 Ти Ку Ак Аз Кек о сїа БіУ іє Вес Хек Бек
Ку В 35 їже Ві Жже тую щі зіва їж Бко Зі Зі дів Бо дю їм бмз Ха 35 40 ак
ТУук ШіУ вів Бех ТВЖХ Тих Біт ех Бу Узі Бко Бех Ах Ева бюашже Бу йех ці» бек Піж ТБх Бер Бін Хв Земні Зв Же Вес Бех бе ща ВКо
В Авр вве хів ТВ ТУкЕ бек Сез бів Аве ТВх їв Уві 1 ЗЕ беж «2105 114 «2115 328
«212» РАТ 213» Штучна послідовність «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 114 віз Бек ЇВ був Бі Бо Бех Узі Бе БжЖе їмні Ажїя ко Жвж Зах тв
М 5 хо їв
Зак Твх Бех іє БУ Жпх Аів Аз бе: У Су їв Уві Був вяю Ту що 5 За ва чем Же Хо бу що ку б: й ЖШежж (і1 ко вух: іх ку
Ве бе Зі БЕо 3 ТВ» Уві дех їжи Вко Зах С3У Віз без Жвх Зах іт Уві Ніз Тв Бе Бхо Аїз Уві їм Біб» Я Важ Сім без їж йдех
Ява Беж бек Уві Уві ТвВх Уві Бу ех бек ех Ццеєб Є ЖМх ах тВЕ
ТУух ХМ Сув дво» Уві Авв» Вів був Бо Зах» Аве ТВУ БУз Узі АвюЮ Був ще ЗО во жа Уві ів Бе Буз Бах Суз вве обуз ТБу із ТВБх Сув буб5 Вко бух ву ЖОВ МВ
Бко дів Бхб Пі їв Ажо Ах Зі ко був Уа БВж їх Бе бюб Вже їва ркб їшая йев ТВ без МБ їз бес Ав ТБЖ Бус св оУЩЬ ТВх Сув
ТВі УВА Уві вав УБЕ Бек Ніж біз Аве БЕ Бе УВЕ ре Бе Аве Жхю 145 що ї55 15
Тех Уві Ба сі Бі із УВІ Нв Ав дів Був ТЕ Був МЕ же м
У. УЖ ж і то Ії із дів ТУ бев Зх БвВЕж Тк Ах УВА Зв. Бек отв ей тех в Бе
Між ів зво» ТхВ їх Зав Зі Був БАЗ ТУк та Ста БУВ УВБЬ Бех вар ща по жи їжа пі Меєб хо бек о бвх Сі із бу ТБ Хіз Зак обев Віз був ПУЄ вай Ка КВ пів Бко вка піз Бжо Св Уві фуж ЖЖ ема Жжо Ки ек де зма ша ша КУ ЗВ 40
Ммек тв Був дви ав УФХ Беж Бе Хв Се їн і без СУ Бе ТУ ах ак БЕ
Вис Же Ав» їі Аве УВІ із ТЕБ ЄСВ Бас вав ОЇ Б Бко Би два ка жу уз ТВХ ТВвЕ рхе БВкоОо і їжа дев Беж дво» У Беж ба рЕме їжа Тех бах Ба ех ТЕ Ві Бар ее важ ха т зів ів Біб ЗЕ
У ббе бек був дек Уві ем Нав о зів із Севеа Ніз Аів Вів жТУх ТЕ дка муж ЗАЗ дев ке їжмх Щек КО «2105115 «2115 325 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 115 із бах Твх Був ПУ Бко беж УВО КББе БЖжОо бен Вів Кко Сув ех Ак
Зак ТВ Бех БУ ЛУ ТБЕ Аз Віз їм ж був бе) Уві Був аа» ТК тва бус бів Зк Уві ВЕ Уві Ввие ТжЖв ази беж СПУ Аїв бе ЖЕ БЕ
Я ао 35 піс узі Між Те бе ВЕОо Аів У і і» бек бек фу Ба ух Явке х М сх Я «і хх г ч дм , СЮ я «Ху ХЖухх СУ. -кх ще жк я БУ - же - - Фк Ек жк у у ХУ ех А до Ве хз буд К. У ЯЗ у іїжка Зак Беж У ві Тех Уві Бко ех бех бех т
То т М
У 2 Ж ол
НУ т аа ї Зах дав Ти Був Уві Баю фу
Мк У ку Че Нав бу бо Зах аб ТВ Був Узі Аяю ї5
Тук Твж Су Авю УЗВЖ Авю Нав бух БКО Чех дат У се ях ха З Су жо бко Су хе із хе ша ак му Жук У Бже Бо Ку жо ко був Ск Аа З
Ії Уві БЮ Бе Буш шк шк Же ке Ку іх 115
МО 05 КА
Уа в се бе БЕ БЖ Му Бо ув щМ Аж Ак шу Бко же Уві ББе їн Ббе Бе БЕ був Бо їз ма Кінз ака дха Му Ба без Уві Бе фа 5 їжа х і й с йОЖУ М її МВ
З хи а ме жвж пух ва а Уж
НЕ Же В із Бех дк Тв БЕО ів Уві таж СУ УВА ЗРК
Бар ЖЕ Кен Веб Бі Бех дк твЕ ВО ШО їв ї Жахи ї З їх я 4 їх КЗ - г дк п со ЖУМ о й жу ду йкук в Дах
У зак ніж сій За БхЄє Бах Уві ЗМУ Кі дев Жжв бук Уж Е ее УА Бах Ні ЗА Зв КЕ Бе УЗ у а в 345 Мох з оз ТК вк їрсгужх ) М їжа Вже Бк паб з заз Ух ! ті І КА Зі о: зе ТЕ Ух жа ЖК хх ДАЛА ОК З
ЗМ Уві Би УМА Мі зво дав Буж ВЕ Му З стю 65 ї73 175
Уві бі Ва УБі фев тн УКХ Зі Мав я Аве аг дек тТвЕ Ух виє АХ А ОХ Уа ї пе 53й їв ії
НО ї85 ї уа Уві Же вав був віу ре ях жа СК ах ак ках до чу бака хи Ще. Ва вив З й
Тхв За ав СУ БУВ сів ЖУЖ Бу Сбуж був УВІ ех зав а ;
Що Що | " ай «М її еВ жав : Ж іа 1 ех. Жанр ї. з. бе Тих ків Бек бе АК пе А КОЖ БЕ КК бБюо Беж Бех бе іє ву ТВжх бів Бек був АїВ Ту восуж ша ке
МКК АК О ЗК. З З пік не зі щі Кз х я ж х ай ЛК хе Їх хх ) ; : фо Жзж Бк із Сів МеБе ТЕ Був с Ву С бі тТуж ЩЖВЖ Са Бжо Бо йвке Вже іш Зв Є У щів Вхе баз ва уж ЖЖ Сем; Вже я ва лих 7 З и Ка 35 ж х х з Зжанух Жукух ; : ; і був ХУ кра тТук Бжа ек Авр
З а Уві Бек бе жах СУБ їн) Узі бук схе МББае ТУЮ БКО ба ват ощав Уві Век ії бах Ста дей Ві ву з МУ Яех ах що 55 : ке БМ Ко жі вав на бУЖ Був і іа УВІ Ма тую с) Ж вв ке щі вхо йіб ар ба бУЖ їв
ХЇіе вів УВІ 1 тую с аж За ї ТУ З а ії ОЇ око ви 55
А. жк ко зе Кол сх гМїх тек Яке.
Ї Бхо УВі їжа дар Бех зав Бі шШеж бе без їєма Ху;
Звж Же Кжо ВЕБ УВА іа аю Зах Ащро сю Же З се
ЗВ во ЗЕ шУВ М їх т су с СУ : зів піз Бі дав За бі Я ; 5 Уві баю Се бас БкУ Тюз «ів піз Бі ба ота Ве Ве
Їж За ЖЖ УВі бяю був бек лка тюрошХ вому ух ; нів бок ве вВут ев ЩШіВ
Уві ів а ів З Ні А ів бек Ще ду бе
Кев Зах Уві їм. Ні сій Бі зи Нів льш А хв Ку З зе ще їв Зх зеО 305 ам Ж ее бек ії: Зах Бео
ЗВ
«2115 325 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 116 ів дек бТве дев сі КЕ ех ФаЕ ВВе КО їн біз бує су ВевЖЕ дих їх 5 її ВЕ
Щек ЗВж бек ШУ Бі ТБ дів Аз бо САУ Суз бе) Уві Муз Ар Туш о а ЗИ
Бе Ме са бе Уві Тв Узь ех бер яв Бек сію Ав жена ЖЕ ЕЕ ке Ко 45 іт Уві Мі Же Бе Бжо Зі Уві бе Сію бек бек зів бен тю ех що 55 БО їв бах Зак Зі Узі ТБЖ Св БжЖо бах бах йех їж ж Жв бує ББЖ
БЕ то Я що бУкК Твх Сук Бе» ЗВ Авю Ме Муз Бкб беж дав ЖЖ був ТВі дав Буз в Зі 5 дж УВІ «Кіз бах бе бек щі Бо Бе Св хо БЕОо Кув ШКО Ав Бе ї95 МОВ ке щі ше дка хз ЗУ БО Мув УБЬ Бе їх Бе Бе жо Був Бхо Був 15 що їх ка зви без; Меж ів Бех дже Тв хо біз Уві Таж Св УВі Узі У
АО ї38 148 йер Узі Бек Мів БМ Ар рхо 3: Узі Гук БВ Аз тжр тує УЗ Авю ї45 її 155 їво
Зі Уві під Уві Нівз Бе ів був Те без БЕ Аже С БК Се тУух 65 за 175
Баю бах ТЬ»х Тух дк У Уві Важ Уві їмо Щи Ж жен Мав аю Брю іч 155 Аа
Жїко бе: зв» бі їв За бух ба Су ев ОВА дек ее Муз ку Мем
ЖОВ 5
Бже Беж ек жі зи Му ЖОВ їіє веж був зів Був же пав Бе Ве міч Бе сів УВЕ бук Тв бео бе Вко бек Ах із з Мей жвж бух вав сію Зі Хек Зам3 Три Сув їжа Уві бе паУ БКбе Жухю Бко Яввж ще хів ав Уві бла їже іч бек вав піт Ба Вже 023 Ав ба» Жуж їж
Твж ЖнЕ Бжо Беб Уві Мей бав бах Зв се Вас Вне БОБ без ТужЖ Вес дкч і Жах Уві бвюе був Шах Ажу бю Ак Зі У Ав) МВ Бба Янже су ех Уві без ав чів Азв без На Аіз На Туж ТВ»Е Ак Був ща
ЗОВ З ЗЕ ЗО їі ех їжа бек БЕ
ЗВ
«2105 117 «-21156 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 117 «2105 118 «211517 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 118 віз їі Бе ТБ бі бек бі ів біз тТук муз МІВ а жо Абе був ска
АХ
«2105» 119 «211517 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 119 ів біз Бе ТВжх ЗЕ Зех ЗУ із Зі тТУук Бу Аів Ба Тв Узі був ї 5 16 15
МКУ
«2105» 120 -211517 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 120
Щі Жіє Рі» Тв БУ Зек (їі Аза ТЬЕ Же Був вів їж бер ів Був под «2105 121 «-2115 13 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 121
Зав вів СУ Тех Аве о буж бо ТвВх Нів Біз Ме Мів Туж «2105» 122 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 122 ху азів бек ів Му ї3є Зве беж бек беб дів 3 5 ї6 «2105» 123 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 123 3 в «210» 124 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 124 мі Вів ЗежЕ їТВх їБЕж Бі Зах «-2105 125 «-211512 «212» РВТ
213» Штучна послідовність «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 125 із йаво їБЕ Бевз УВУ) бі ВвЕ Бек Тек Бі без ЖЕ «2105» 126 -21155 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «2020» «221» інша ознака «222» (5)...(5) «223» Хаа є Меї або Маї «2020» «221» інша ознака «222» (6)...(6) «223» Хаа є Суз або Аа «4005 126 «-2105 127 -211517 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «2020» «221» інша ознака
Зо «222» (1)...(1) «223» Хаа є Сув, Аа або Спу «2020» «221» інша ознака «222» (3)... (3) «223» Хаа є Туг або Рне «2020» «221» інша ознака «222» (9)...(9) «223» Хаа є ПТнг, А5р або Сіи «2020» «221» інша ознака «222» (11)...411) «223» Хаа є Туг, І уз або СіІп «2020» «221» інша ознака «222» (13)...(13) «223» Хаа є 5ег, Азр або Сі «2020» «221» інша ознака «222» (15)...(15) «223» Хаа є Аа або Маї «4005» 127
Хва Кіз Хза ТВ ЗМУ Бех пі біж Хе бок Хв5 діз Ха бив Ха бе
«2105» 128 «-2115 13 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «2020» «221» інша ознака «222» (2)... (2) «223» Хаа є Сіу або Аіа «2020» «221» інша ознака «222» (5)...(5) «223» Хаа є Маї, Сіп або А5р «2020» «221» інша ознака «222» (6)...(6) «223» Хаа є Тнг або Туг «2020» «221» інша ознака «222» (12)... (12) «223» Хаа є Туг або Ніб «2020» «221» інша ознака «222» (13)...(13) «223» Хаа є І єи або Туг «4005» 128 дав Хаз Зі Тух Хав ЖХва Бе ЖВБ» Вів Аів Меб Хва Хва «210» 129 «211511 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «2020» «221» інша ознака «222» (1)...(1) «223» Хаа є Сіп або Ага «2020» «221» інша ознака «222» (5)...(5) «223» Хаа є Авп, Сіп або Спу «2020» «221» інша ознака «222» (1)... (1) «223» Хаа є Сіу або 5ег «2020» «221» інша ознака «222» (9)... (9) «223» Хаа є Авр, І уз або 5ег «400» 129
ЖХав Азів Зек ів Хав Хе Хва Бек Хаз їжа ів «-2105 130 -21157 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020»
«223» Штучно синтезована послідовність «221» інша ознака «222» (4)...(4) «223» Хаа є І уз, Сім або ТНг «2020» «221» інша ознака «222» (5)...(5) «223» Хаа є І єи або ТНг «2020» «221» інша ознака «222» (6)...(6) «223» Хаа є Аа, Ніз, Сіи або Сіп «4005 130
Кя З «2105 131 «-211512 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «2020» «221» інша ознака «222» (2)... (2) «223» Хаа є Зег, Суз, Абвп або ТНг «2020» «221» інша ознака «222» (4)... (4) «223» Хаа є РНє або І уз «2020» «221» інша ознака «222» (12)... (12) «223» Хаа є Аа, ТНг або Ніб «4005 131 «ів Хав їТвЕ Ха Уві Біт ех бек бух зЗМт ее ках «2105132 «-2115 30 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 132 зів Уві ів бе) Ві (Зо Бек іт же сіжЖ фев Уві св Бжео ст у
ЖЕ зм: без їм ше Ст Аіз дів йвБж ЗЕе Бе Те двЕ Вів -2105 133 «-2115 30 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність
БО «400» 133 шій УЩі зЗіб Зенх Уа ша) ек опе 3 САбЖ З Уві піз Єжхе сі ЗЕ беж Бев бко фам бек беж Дів Дів ек сбіж кре Же Уві Вів «2105 134 «-2115 30 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 134 щ-в Уві ій Оео Уві що бек щіУ Беж шу Бей УЖ сів Бжхо БУ зу
Зах їв: Аж бдемо беж Ст вів із Бех 03Уу Ре Жак ва ів «2105 135 «-2115 14 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 135 бкр о Узі Ах бів їв Бхо Б3у Був БУ без м Жхю УВХУ ку «2105» 136 «-2115 14 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 136 їх» Уві Ах ія вла Бее щік був 019 Зх Се Тв: Май ах
Х В 18 » «-2105 137 «-2115 32 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 137 дез Бе Же Же вже Бех бею Твх Бех їв ба пів Уві Уві Хеі ЗБЕ
Ве ТМЖ Аа Ме зво Бк УВІ ев ТВ Аіз Тих бе Їек Су дів Ва м жа За «2105» 138 «-2115 32 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 138 дка УЗА ТвкЕ їіз бек Був» Азю СТиж Зак був Ав Сів Уві Уві їж УВе
Її В ха ї5
Меї тах дай Мей барв жо тва Авю Та Аїа Жах Тею Жук Сех Аа Ве «2105» 139 «-2115 32 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 139 ака Бе Тве Хле бек дже Бер; же Бек мує Лех Ст емо бух фею Ма
Меї зви Бех Ле ака Аз щЩів Аво ТВх Аїйв Уві Тк Тех Сез Аіз ЯвЕ 2105» 140 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 140 жк Сі св СКУ хх їз; БЕ Тех УБі йо деЕжх «2105 141 «211511 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 141 тжв піт ДкУ аж ЖВж Зе Уві Тювк УВА Зак Зах «2105 142 «2115 23 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 142 ав УВК УВА Межї ТВж зів Важ ко бе Беж їх Зах із веж Узі сі дав вка УВА ЖБЕ Мі ТВ Св 2105» 143 «2115 23 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 143 йве хів сів Мах ТБ 0355 беж ро бек беж Беб Веє дів беж Уві сх
ХЕ 5 те ї5
Зав аа Уві ТВ ще ЖЖ Сук «2105» 144 -211515 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 144
Жкв жу ів Зі Був Бко (3 Зі Аів Бжо Ак їмиз ва Жівз Тех х о т г хх
Ж сх ТО їх «210» 145 -211515 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучко синтезована послідовність «400» 145 їжхв тех 50 пів бета Бжо см був дів БЕЗ Був їні Її Хе тех «2105» 146 «-2115 32 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «4005» 146 піб ові Бо бах хе ББе бве сію бек слу Бек слу ТВжЖ баю Ве ТЕ
Мен ТБ ів йех Жах Се) бів хо с3з Аве Узі Афв Бе ТУх ТУух Сув «-2105» 147 «-2115 32 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «2020» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 147
У стві БЕз бек Аке боб беж Бі бек Бі ек ЗУ Тк Авюв бе ТБЖ
Мені фнжЖ біз Хек бек їн ів йжо сіб Ваю Бе Аів ТвВЕ жує бук СУБ -2105» 148 -211510 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 148 ре слу бів щу Тв бе Уві За С без
«2105» 149 «2115 448 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «400» 149
Мік Уа С феї Ужі Св ек СУ біз са Уві СУ їв Бека Біу Вів ї 5 10 ї15 бах УВА уз ві Бек Сеув бе Ай йеж Бі» Мі іє Кіюв Зак Лют ТЕ
Фк Ж о ко НЕ о т чо уж я іду В о ке ох ту М джує га бкев ів сів Тв УВА Ахе БЕЗ Аів Бже Б» ій пі фен ЗРО Жжюе Має паж а їі Зм Бко ЗКУ бах зі Вів Твх ЗА фух Твж сМох Має Брох їжа АВ дже УВМ Жне Ме Те Ака Бо Же о Яеах ЖЖ Зек ТВ У ТУ
В а ТВ що
Мен са бек) ех бек їм АкЗ Яех біз дер ТвЕ Аів Уві Жех Тух СУ ків же тТук Бе Бе Бі Зак беж бує дзе Те ту беж Бер УА кр їв їс05 ха піт бів СБУ ЖВх бес ВЕ ЖВх Уві Веве Хек Аїв Бек Тв Зре МУ Во
Зак Зв Бе ко без дів Бжз Св беж Асз бех ТКУ бек біз Зає Же ів Аз бо бік Сув зи Уа муз АвроТух Бе Бюо Зіз жхе мі швах 145 во 155 іо
У йде їв Ав бек ПУ Аіз їжа ТЕ бек Сбьу Узі Нів Жвие Ва жо
Те кН ї75 із Увь ік: СМ бек Бек СУ із Тек ех і бек Бех Уві уві ТВ
З М що
УМ Ве Важ бек дев Бе Сіе Тв осів ТВх ТУує ТвБЕ Су Ввв Уа йо
Вів цу Веб Жек баз Теж фе Уві Жвр Був Те УЗі бі БО цу Су ств Уві піз був ко Бюз був БЕ Азв о бко Бхо Уві Віз Кі Бюж5 йвжх тУЩі бібе іє: Ме Бо вже Був Вже Буз ЗЕ ЖЖ Без МеБ їів Беж хх
ЖХБх Бу й: УЗі Жвх Суз Узі) У Узі др уві ех Біб (а бвю бо щі УВвЕ ів Бе айви їж бує УВУ Ваз» Баж УаЬ ші Уві Мівз Аве Аза
Муз ТНж Був без Вку із Щі) 33 Ба айви беж ТБЕ ЖУуж дк Уві Уві
У су ххх : у. Жах чує г шу В тку Кох 1 їжу дих їЗ туя
Беж Узі іні) ЖЖ УЗВЕ беви бав зав даю Тер о бео Ваз зу муж са ЖеЖ ща ЗО ЗВ Зо їв Су їде УВі ек Ави був ЗАЛУ їзма Бо бек Ме їі БМ був ЗВ за5 З ЗБ
Ха йюх був Віз Був БУ Сів бу» Ах св Бу бав УВУ феуж ЗЕ Ха
За Зав аа шко Кхо ВвЕ бі пи ба Мет ЗВ: Муз Аж б в Беж зей ХВ СжВ
ЗВ зво ЗВ ее ! й - су що г - духи с ке Фр м с Р уя й со у я х їжв Уві та Піт бе ТуУх Вко Вевх бю Сів Аза Узі Зію Тр із Бах
Зо В ЗО
Ма піт біб Бе 010 вав Ава бух Був Твж Те йхо Вже Уві їм бер
Щежх Ар ку фею Рів Се б Тук бек Аже ее ТвЕ УВІ дав їжв ех 430 й дЕУ ТЕжЕв ші біз ЗКУ Ав» УВА Ка Явк Сук бек Узі їж Мі Вів дів ху дв ко за5 ЗО ам Ні ес Ні бує Тах АБ ув бек їжнх Беж ема Яаж Зам) Фі ув 5 «2105» 150 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Штучно синтезована послідовність «4005 150
Бею Се йо» Меб Тех бів Чек Бже бек Яех їжа бах біз ех Ува Мор девю о аха Уві ЩЕ Сів Хе Се сі вав Яви (32 дез 3 ТУ Бі» АїВ че їв зо
Бач дай їхв бук Біб Сів бує Бк Сье Був Аіз бко Був їм: Бе Хв з
ТбФк БУ Аа Тк Ав беєб зів Аню ББе Уві хо мех Бк Бе бек Су я ХЕ БО.
Зак ЗКУ Бах БКУ ТВУ КвЮю БВе ТВ Її ТВе Кіз ех Веж ма Б ву» спів ваю Бе вів ТВ Тех ТУх Сувзв із баб Уві Бей ав Жвх бю Тема ве во За
Жве Брж осіе зі С.У жвж їж Уві Б ЖІ був уз ТБ сбві Аів АВ ткКко бек Уві бе Тіб Бе Бе хо беж Авр о бів За Був бах 3
Звх дів дек бві Уві Св ба їз; Аши ба СБ о бТуж Би АкУ БМВ Аз їж УВА бі Тюрм Буз сві Бвр» ба» Аз бео сію бек єму фам Беж а іє бак ті ТВкК ЗО Зі бер бах був Аве бек ожвж бук феж ема аж її ХТО 175
Яавк ТБжх без ТВ З бек був Дів дво: о Тує бів був Вів Був УВА ук
Віз СУБ БМ У Тв Віз сів БУ Зам Бек дах Вже в ЖЖ був бак
ББе дав о Аже ЗУ ви Сже ее

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Фармацевтичний склад для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, який містить антитіло проти С5 як активний інгредієнт, який відрізняється тим, що антитіло включає:
(а) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 106 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (р) послідовність МН за 5ЕО І МО: 107 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (с) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 108 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (4) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (є) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮ МО: 112; () послідовність МН за ЗЕО ІЮО МО: 109 та послідовність МІ за ЗЕО ІЮО МО: 113, або (9) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 110 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 113, та тим, що опосередкована комплементом хвороба або стан, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5, вибрані з групи, що складається з: ревматоїдного артриту (БА); системного червоного вовчака (5ІЕ); вовчакового нефриту; ішемічного реперфузійного пошкодження (ІК); астми; пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН); гемолітично-уремічного синдрому (НИ5Б); атипового гемолітично-уремічного синдрому (аниз); хвороби щільного осаду (000); оптикомієліту (ММО); багатофокальної моторної невропатії (МММ); множинного склерозу (М5); системного склерозу; макулярної дегенерації; пов'язаної з віком макулярної дегенерації (АМО); синдрому гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГІ Р); тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР); спонтанної втрати плоду; бульозного епідермолізу; рецидивної втрати плоду; прееклампсії; черепно-мозкової травми; важкої міастенії; хвороби холодової аглютинації; синдрому Сегрена; дерматоміозиту; бульозного пемфігоїду; фототоксичної реакції; гемолітичного уремічного синдрому, пов'язаного з токсином Шига Е. соїї; типового або інфекційного гемолітичного уремічного синдрому (НИЗ); гломерулонефриту С3; васкуліту, пов'язаного з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморального та васкулярного відторгнення трансплантату; опосередкованого антитілом гострого відторгнення (АМК); дисфункції трансплантації; інфаркту міокарда; алогенного трансплантату; сепсису; ішемічної хвороби серця; вродженого ангіоневротичного набряку; дерматоміозиту; хвороби Грейвса; атеросклерозу; хвороби Альцгеймера (АБ); хвороби Гантінгтона; хвороби Крейцфельда-Якоба; хвороби Паркінсона; різних видів раку; поранення; септичного шоку; пошкодження спинного мозку; увеїту; пов'язаних з діабетом очних хвороб; ретролентальної фіброплазії; гломерулонефриту; мембранного нефриту; ІдА-нефропатії; синдрому гострої респіраторної недостатності у дорослих (АКО5Б); Зо хронічного обструктивного захворювання легенів (СОРБО); муковісцидозу; гемолітичної анемії; пароксизмальної холодової гемоглобінурії; анафілактичного шоку; алергії; остеопорозу; остеоартриту; аутоїмунного тиреоїдиту; діабету типу І! псоріазу; звичайної пузирчатки; аутоїмунної гемолітичної анемії (АІНА); ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури (ІТР); синдрому Гудпасчера; хвороби Дегоса; антифосфоліпідного синдрому (АР); катастрофічного АРЗ (САР5Б); серцево-судинного розладу; міокардиту; церебрально-судинного розладу; розладу периферійних судин; вазоренального розладу; мезентерального або ентерального судинного розладу; васкуліту; нефриту пурпури Шенлейна-Геноха; хвороби Такаясу; дилатаційної кардіоміопатії; діабетичної ангіопатії; хвороби Кавасакі (артриту); венозного газового емболу (МОЕ); рестенозу після встановлення стента; ротаційної атеректомії; мембранної нефропатії; синдрому Гійена-Барре (585); синдрому Фішера; індукованого антигеном артриту; синовіального запалення; вірусних інфекцій; бактеріальних інфекцій; грибкових інфекцій та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарда, штучного кровообігу та гемодіалізу.
2. Фармацевтичний склад за п. 1, який відрізняється тим, що антитіло включає константну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 114, та константну ділянку легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:
38.
3. Фармацевтичний склад за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що антитіло є повнорозмірним антитілом ІДС1 або повнорозмірним антитілом Ідсаі.
4. Застосування антитіла проти С5, яке включає: БО (а) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 106 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (р) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 107 та послідовність МІ за 5ЕО ІЮ МО: 111; (с) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 108 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (4) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 109 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 111; (є) послідовність МН за 5ЕО ІЮО МО: 109 та послідовність МІ. за БЕО ІЮ МО: 112; () послідовність МН за ЗЕО ІЮО МО: 109 та послідовність МІ за ЗЕО ІЮО МО: 113, або (9) послідовність МН за 5ЕО ІЮ МО: 110 та послідовність МІ. за 5ЕО ІЮО МО: 113, як активного інгредієнта фармацевтичного складу для лікування опосередкованої комплементом хвороби або стану, у які залучається надмірна або неконтрольована активація С5 та які вибрані з групи, що складається з: ревматоїдного артриту (КА); системного червоного бо вовчака (ЗЕ); вовчакового нефриту; ішемічного реперфузійного пошкодження (ІКІ); астми;
пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН); гемолітично-уремічного синдрому (НИЗБ); атипового гемолітично-уремічного синдрому (аНИ5З); хвороби щільного осаду (0ОБ); оптикомієліту (ММО); багатофокальної моторної невропатії (МММ); множинного склерозу (М5); системного склерозу; макулярної дегенерації; пов'язаної з віком макулярної дегенерації (АМО); синдрому гемолізу, збільшення активності печінкових ферментів та тромбоцитопенії (НЕГІ Р); тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР); спонтанної втрати плоду; бульозного епідермолізу; рецидивної втрати плоду; прееклампсії; черепно-мозкової травми; важкої міастенії; хвороби холодової аглютинації; синдрому Сегрена; дерматоміозиту; бульозного пемфігоїду; фототоксичної реакції; гемолітичного уремічного синдрому, пов'язаного з токсином Шига Е. сої; типового або інфекційного гемолітичного уремічного синдрому (НИЗ); гломерулонефриту С3; васкуліту, пов'язаного з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АМСА); гуморального та васкулярного відторгнення трансплантату; опосередкованого антитілом гострого відторгнення (АМК); дисфункції трансплантації; інфаркту міокарда; алогенного трансплантату; сепсису; ішемічної хвороби серця; вродженого ангіоневротичного набряку; дерматоміозиту; хвороби Грейвса; атеросклерозу; хвороби Альцгеймера (АБ); хвороби Гантінгтона; хвороби Крейцфельда-Якоба; хвороби Паркінсона; різних видів раку; поранення; септичного шоку; пошкодження спинного мозку; увеїту; пов'язаних з діабетом очних хвороб; ретролентальної фіброплазії; гломерулонефриту; мембранного нефриту; ІдА-нефропатії; синдрому гострої респіраторної недостатності у дорослих (АКО5Б); хронічного обструктивного захворювання легенів (СОРБО); муковісцидозу; гемолітичної анемії; пароксизмальної холодової гемоглобінурії; анафілактичного шоку; алергії; остеопорозу; остеоартриту; аутоїмунного тиреоїдиту; діабету типу І; псоріазу; звичайної пузирчатки; аутоїмунної гемолітичної анемії (АІНА); ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури (ІТР); синдрому Гудпасчера; хвороби Дегоса; антифосфоліпідного синдрому (АРБ); катастрофічного АРБ (САРЗ); серцево-судинного розладу; міокардиту; церебрально-судинного розладу; розладу периферійних судин; вазоренального розладу; мезентерального або ентерального судинного розладу; васкуліту; нефриту пурпури Шенлейна-Геноха; хвороби Такаясу; дилатаційної кардіоміопатії; діабетичної ангіопатії; хвороби Кавасакі (артриту); венозного газового емболу (МОЕ); рестенозу після встановлення стента; ротаційної атеректомії; мембранної нефропатії; Зо синдрому Гійена-Барре (585); синдрому Фішера; індукованого антигеном артриту; синовіального запалення; вірусних інфекцій; бактеріальних інфекцій; грибкових інфекцій та пошкодження, що є наслідком інфаркту міокарда, штучного кровообігу та гемодіалізу.
5. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що антитіло включає константну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 114, та константну ділянку легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 38.
6. Застосування за п. 4 або 5, яке відрізняється тим, що антитіло є повнорозмірним антитілом 901 або повнорозмірним антитілом Іде.
саме є ВИМ пак КАН КІМ пі Ии и НиКмиК с у Я ха ПОМЕЛУ КІМ МІК УК КИ ЧА ВИЛКИ МИ Ся АХ КАМЕНЕМ МЕККА МН А ПІ М КЕ НВ МК ХВ ПЕВ нт : я я 15 АВНОНВИ НИМ МЕ т скучили меми ХТЗ ОТИТІ КЕ КЕ И Мен певна ники КУ ВО НК МІВ І В ян : МАК ЗА ИУХ ОКО В А МАК КМ КІМ УК МИ их фе прірву: ЗО АВК ВА КН Ки НИ т ОРАНКИ: МИ КИ ВОВК БЕК НЕОН КН В В КІВ НА ВИ ПІ МОМ ККД нення Ку ОВ ВВ В ЦИ ВЕН ЕЕ ? мі адестстедх. ММ АМІАК НА МАК АНА ХВ ТЕНи сЕДОВЕВвЕМНИМ ОЇ МОМ ВКМ МИНА ДК КИ ДИ КК ТОНИ ЖИ КЕ : Пе НО ЕНН В НА НОЯ р МНЕ НТ тА мн ПК ре ШАЦЬК МН ЕК ОК ВОНО ПКТ НН МН ВВА М в Оу Ки Ні Кр З НІМ Мк я 2.1 ге . х ПІКОВІ ВЕНИ КИ "рапдзаі тм БАН КАНА МАК АКВА КН М Аа її САВЕНКО ВК НК ВК В СО ВВ ВН ВЕ я салати тд: МИНЕ а де с с лСЕдДОДДІВЕТАТИ І МІК КУКИ Ман А ВВІВ КЕ АЖ В ВИНА НИВИ їз СЕАДВЖКЕ ТМ ОТ КВ ЕМ КВК НН КЕН КОНЕМ КОКОН НАЕ і мевилак ство ТТ КЕ ет Я і ПО ТЕ КІВІ ВІККА КВ МВА МИ НАВИ КК ВАВ нянні СЕМЖО ЕК ВВЕ НЕЮ НОВ БІ КВН В ВЕК ЕН ЕК я я і жд моди: МУХА ВИК АХА КМ КА АТАКА Ти жот х УЕДОВКМЕТМЮМ МІНИ АК ІКІ КН Н НА : ПАКЕТ ОВО ВК В КК ПНІ ик В пт УХИТАТМТИ ВАТИ МАТ А АВК К у тт 7 Ти о рн ї ств УНК: ПИВОМ АВВИ НИВІ ІА ЕН МАК КТК Щи МИ КАМ А М 7 сри ЕК ПЕ ПМ З ВК ЕК В М М ОН КВН і ткдодле г МІНА не и КАК о ТІ З МА М ПЕДА РІВПОЯ СПИНИ ИНВАМИ КК ИН НА чне ХАН ТИНУ ПО ПЕОМ АВК АК ВИ БНВО ВМ ОКО ВВЕ М 7 полу птиця 00 КУЩИКИ МАК МАМА АК МКМ АК В ї СПЕКУ ЕТ У БО КВУ ВЕН І ПОЛ Н ВВ ОХ ВОМ НЯ ЕТО АВ 2 ! для т ДЕК в НК Н 2 ЛЕДШНКМЕІВИ МИ ЗВАНІ ЕХ хи ВИКИДИ МАН В ВТ і - хе КТ АКА ОНИ МКК АВ КА ЗА ВМ ЗМ ЕІ і : щ стики етику ЕМП ММК Ох т ТИ 5 ї : я ЧАСИ ЕТ БМК Мі З ВМІВ НВ А НАХ 4 : ї ге ДРАМ ЕТ ВОМУ КУ МКМ ГЕН ОА ОК МВ ОВ т рі Ж птзмадад тва ММК КІМ МІ МАТИ АКА МІЖ ІТК а ІН Яся хі і Н що СТАИЗВМЕТЯе І КОП КК КОВО КЕКВ М МЕ КЕКВ їі х ке ЕК КВ М КА ТКУ и Ла МК НАДАНИХ ХУ їх ї Ж птддовоєминщі НВО ММ НІВ У І З : - СпедОЖКМеЕТНН І КА МКК КОНИК ПКУ М КВ З КК НМ КІН Н : НИ В в Хр ЛЕВ Ж 1 У ЕЗдек тик. ММК і А Ан м ММА КЕЙ Ї і т стеми тм МНВК ПИ МИ І КІ ПЕ ОН ВИ ВИ І ИН 1 : Ж ОБМАН ее ЕН хи Анні 1 : - пгллкдд му ММ МЕНЕ Транс Кк Ві АТ и А : х ПІДВІВ ОПОВ І НК ЛО СУК ПЕН МІН і ї Е й БЕХ МІХ ММА МІУ МЛ ЕХ дае КМ І нкннннння ц : скали ктииння її ММК МН Ніс Еш а и ! аЙКУМИТНОгЯ І МАКИ І МИ КВК КЕ Ле А МИ КО ян і ф УЄМАН Я ЛЮК М БАНАН НЕ ЕН КН ЗАНОВО ЗЛИВИ і Ющук МІК ке я МПа ни : бобри ЕТщИМЯ Є БОМ КІМ МІИЦК МОНАКО НКИ ЗБК ТО М КВ З ІМЯ МЕТ УМ ИТЬ кет : ОМ ЖЕ ХуМа ЕН ЗНАК К М ЕВЕ ИХ ВИМ м В НЕ ЦК ЗНІ М. : т ел тала ЛІТ АКТА МІХ ТІТКА КА І КО МІ ТЯ ОТ І ї х ДЕАМНЬЕТЯЮМ І. Я Пен і с КИ МВ ЕН НАМІ ІК В Моя і ТОБІ: МЕМ ДН ЕХ ММ КВ КО МТ ЕХ АЛ АКН ВМ І мІМЛАМ ДМК Х у Н . ОО ЖАТОК Елі Ки КІ КК їх: ї пет судиоі ОКУ Мен Я їі : ПЕДОВДЕЕМИНИІ ОПН МЛИН ІВІ ВИ и ЖІВНИ КИ сИ ІІ си : Ме нак ПЕВ ЖЕН І ПАМ МЛК МІЯ КК МО щ- ' ПпЕДОДОМЕТИВДА І ПИ ВЕНТИМН МА МАМА ЕВ НІК Іф В ТЕН ння 3 ї М о ВМ НУ КВ М филнннй 4 Н шодо уд 0 шу ОТ ТАТИ т з с, Пен ї р НН НК ОН КН пптиииК 1 і БАД ЕК КІВКО З ПОВЕ НО БК ВВ МН ОВ С ОА МО ВК ВІН рен селодтаи стилі ДИКУ АМИИІН КІ І АМІАК ет 7 чи ї сеДВАРЕТВДОВ КЕКВ МКНПК МИКИТА ї МУ МУ ДЕКО щУХ ПЕН АХ МНМА ВЕ филннну і кгдп ств Мухи ах ЗК и ТАТ о ТИЖ шляяй ї ї стАодВ рю КІШОК ВЕ ПМК МІ ЖАВ ЗК КІ КВ ї і : ковдра М МеВ НО МНК кі в ОК М КЕ КІ ВН Я ; з пЕДООТІ КІМ РМ МОХ ХХ КП еВ ЕН НЕК КТК Мих І стєняхтєттсяй УА Ми ми І МАЛІ МІ І І КА І ТІ МН ОВ ПК ПИ М ІВ МІХ тт ї мі фс р МАМУ НІМ ЕММА КЛІК ЛИ М КК БО МІ М ВАВ ВВ ЦЕ ВУ МЕ АН ВД па і А А ни и и и и ХРОШІ ТИ ЩЕ КО МИ КУ С у п оо ур КО КІ ОО ДЗ І ЩО 5 Х З ШУ 8 ХУ сок фу до 20-Х Ше и Ов Ж ОО со ФО85 КО 0 85 о се ХОЧ ЗУ Це Ох З омЬ ФУ У п) «Кк КОМУ З х 0 М п ШУ ЧУ дп ЄМ У пи (ВОЮ ЩЕ БОМОбоге Бе ТО ФО Же МОЇХ Може моїх Мом о мокОУ КОЮ УОТІ О МІЗМОМ пон ит прі ж Ме Б КУ о Ж Мо Ом Ж БЖ ЇМО що ПТ мМахі КА ОХ ок щу т ВОМ) си УМ хи «Мої охр ох ШУ 2 у б ОКОМ В ж ся тлу щи ухва, Гм а ща б МО ша 3 що ОО ХУ 2 бод що шошл ЄМ сУ ха Ол МТ й ж оз с вв В шов е ш Б ВВ Пінннетняй ви ик ких -- М. МО МО жк Мох М. МОВ МО ої ше ОБУ МО мк ОО Ох тю ОБО ПО ЕЙ вве; вах - ши З ох з МК а ше КК ши . ух /
"ду. суді мо В суму хх захо чнавньне антянли Не о
З ве ; ххх сімох вувкк В Узевиажана сенсу бю: Унодженасенсограма 08000000 Боающо СбОдженасеномраМа о. Овну ВМ Ж 00 беавщн ит ях уряді ТАКЕ пллІВНЕВ бан МЛ вне, я й ке НТ нотки щі о і ве " Ки ї ко: я ОЗУЕЇ жо В й ш : й 5 дети І у дпятетнанттестеетотосстосогоседесосоооототоосонох ШО члихлттшилитииа ї ї федуинтови А А АКА У и ЖК УК ККД ЖЕ ЛА Реве же же жк жк же ол ї У г х ро : м : рез : Ж і Я дріт сни донна онк он пднкенклннм Ж артриту ред рент дент ую ж лм Я 2. 50008 ОЗАБОЗ385 Ме ЗО ОО Зо З щу Мас тнваатк знач Є - Чвехбсепочатк знач Є
ОВ. ОБ дарує ско ; ууслюжкух же; УЗТДЖенасяансогтрама гля й жи УЗОоДдДЖжЖена сенсограма пошти о. І в НЯ і р вт А Знаї БРАОЖ; мене вв, Ж схе ДЕЛІ титвНВ, хе Дн --5 КИ я У і т 1 В а 3 дат оттіккну ї «5 Н пт ю с тсжлвскяу, БІ х сОМАЙ я я. Пн ан о мінпнкюннинн Же ші Ка ЩО є 5 жи як - І я люк т жк, З Н я т. - | одбжжт че тп ; дж ж в Є МК м ж ве то те ее чо пеоте є в в не Ук ж дже А АКА ХАЙ ля ло яки Ж Ж Н т-ї-О Ву диполя ж У ди у пд ТАКА ТТ тн тА НТ нт ЖТ тт вт ж -в оо їде сю жо ще о у як ме аю МОЖ 0 в Б ве Часте атк знач Є оз во Часіїйспочатю знач Є Фо г по що ло сл й щ КЗ 5 що Мед у ех еа учаи ча й ху сухих мк й . к , р о УМОДЖеНа ОеНСОгаМА сслеосуи 96 Узгоджена сенсогяма , с к. меди Кошш вея Ор о рт ВЕ Жаіві СРАНКО ПТО божі СЕВОБОВ іже ВВ; о! | ОАЕ ци й су я вояж мене - , 2 і 5 і пики в |і я и Ж кд . Е З оз ай ЩО пе 5 є ЩО днях чу я нд пюяжиж шк ткжня - З Ї ш 5 жо жж ляє че ХКОСЖЖ ж яких х Но Кфровнввво рило рос ось пись цим упр ом ИЙ о Дб дент тент дннтінні днтететя тату - а шої їм Зж Зо яю 25 я жо що 80 З б 5 Час початко ана є Часібс почате знаної Ю
Фіг. 2А
ОБ у, иа сих хД: Те ВКА ; 5» Узгоджена сенсагродма інн» мя, щей Узгоджена сенсеграма пд 5 1 зн і Я 7 рт т Же них Ж бвавжв тва 00 ОННк м т : ОРУЗЕКК о.
М З от ААКАТ ІТС то я г В щх і нн У ! в Ж ненні шк І З Ше : ц . с 1 т ож АТО РТ ТАКА ОСЬ АТО О кс з і з з вон Бо М і дви ж Ро яв я дю молю пкт дуюттосюті З ов Шй Тк во Тож т де : ва ЧИ Ж ВЗ іде Яр що хе и Ех і пед рт ї Хек дсжжкт уки кю і х х За х їх ї реження КЗ ре З т А ке же т ї х 3 патттуда ри да З Си я ід ій ІВТК.
ЗАМ.
Кессетттт щ ув іп ля о 8 о КУ че Ка Удо 0 х почате знач ї я най дар гр шо нене х нам - іже цю ке УЧдо ї ОТЧЕ К. жна) ст й пд кг ї СВ - д в.
Ужчоджена сенсоговма ---- х г : х. сеї тРУХ ФО дення КО є т Й Б Узпукена сенсотрама ХУ ВНТ БЕ дрон не Же ку онеяк їк лю до сх вотяся ЩОЖЖКІ й Тен рН 00 ОЕАВВ ях поетика АННА восттнсттетян, З і щі нед: п 7 дннюстектюсеввовсе ау Топ пот овгогіюкк па АА ОТО ТОіеекюкнтнннн шк )| Кк -Щ і Ії : і ЕКО и ЯХ ві 4 ок т ш і Щ і рай пон Б Зв Ко сеї і з дж ма щ- щі : ОО дих Же хжжвлтих я ії хи ії их пал чю жи ІЙ я На в ов і пт нн ЕО педннннтддннннння у нд ре ою р 5 У х Бур рих РО ян 5 о в педівоу знач і с жо В КЕ ЗУ з дн її Має ЧОПА ух.
ЯЗ пішли т Чде Я ш УНІВ ТК.
ЗАМ. ж Її" че КЕ я т пе со з . Глелютих ФА в ака бо, Узгоджена сеноограма слон, Ф Узоджена свиссгамМа митну щі Ма голкою вжив с БІ СЛ ЕДАКУВ рення ВН ях і ТЕКУ уродж тт юка тля ти мя х 1 Клея із щі Ж ідцаі У ск зт ККАААКААКАТАРРРР ТО с четоюючччіччіною» -- 00 ОРАВЄ СІЯ щи кан ся ше І кі ан Ес сне я "А | жетон кккорогооооотііоге рення з : х я ої М птн ше зашя реч і жи Пк В і я щі ик сежжажюня і щі і в в Я х Ко їх і в шо птн Ж я ати те рю зе за Я Ж і Оп а3а з ЩО То юде б почат. знач с ОК шоу род я і о ЗЕ Яд Ме ібо: початк. нам Шк х часі ствах нач М «фіг. 28 дит САДЕН К у дев СЕАОЗОВ САНУ СЕДОЗЯБ Сов « меми сх 8 вх яв АВ аю «й ей року в ан 5 ка коня ка 5 а Мк ке аМ, Й Ме хо шк щи ша Ше во ше НЕ Б; ше айв У дше СЛОВ НЕН ПОД, то ше о ВЕ ее КД перо ще ЕЕ ВН 15 - с я ШО Вар ее ще ОО ВЕ ох ОО шо : о вії В: я г вт ши 000 вт о щ т 5 за юс пвх в он ЗУ й ШЕ ШИ з чіт зк МОВ ШЕ Мп М я ДО ФМ ак МВ ВОЗ ни М 0 ПОКЛВХ ше 5 Шо ши ж . вт г пн. по НН во вн ши В - МН о с ши ШО як НН о ян СЕДОБЗЯ САУ КЕ СВ ; Я З их ЩЕ ; п З СЕДОЄВВ СЕВОЄТІ СЕАОВІВ б КВ сх т Оу Є хе 5 Є Дек КЗ в ре «й - М як МО т Ай «Ав шлМ У ТЕ А кр ше о Зк ЯР М бої дао Є йо обо ер ка ПТш и КЕ кр Юда 0 ба ше ОС 253 - ШМІДТ ПЕКИ йо пух ДЕШЕВЕ й ПИШИ КОХ певен Бе МЕХІКО МОДЕМ ДУ пе квлкЙ По КІН вн МО - ОМП ма М У ПЕВ ан ВО сподео ва Ви МО ЕЕ: ща тод шва ЕЕ С НЕО - шов и «ЕВ Зно ПЕК ОК т 5-05 Ко мо з. ОБОВ 0 шНШИ ук и лав кН в іш БшЕ и шк с шк Б ЕЕ : ж ВОК ЗА што «ЖОВ АВМ ДК я т о. у т - вв: 5 ШЕ за хо о Пд ОД я ве шо ни пен о о за ОН що т вн В во г я НЯ МИХ п вон
Фіг. з
"ЗУ окр ку сх уч куда и тил ж с узгоджена сенсограма Ге ВЕЛО ВО р-н СЕАОО? Бе зв п ОБАМИ шк , тане Екупізумий СТВО що не вона ЧИЙ Ї. пла А А А АЛЛА ля рю уитетилт. ї й м хе жу як ок хм. ою рен "ох з 5 и подаю ГУ Ж сля реак же скухезякох сем е мохи жк ху В Я: учахжвухсуктАхаУсоУкОчк Мовне снисожстктулсохкОкооккокумАКИК Ока Кеди їй 3 сю Бо їй її М сю 3 5 б З 36 4 т Чав О е початкове значення) М 7 З з. Є й с к. х петля г де Узгоджена ренсоповма рес СК А ВИ 1 С о ДЕАОВОЮ ! ОЗ й и ОКАОВІВ - ї . люсоюх ом мо улов ме Й і лсекмк Уурлоіж каз КУДИ ОО ублвжт тя жк ж УТ Влізуюає ЕУВОСЯ вози Ф онкюокессто хе хх я м і бою ва чи Ме ожж жк ох х і осюмеюове ожоже о і ооо У дж Ж їз ок о ж 5 35 одекмьх ях 15 5 В ь о ї чхкохкоокозхокхоскучАЖеО октовчофія соус вому овемокеко» хтвкогусиА У 18 У 18 ОО, Ж 1 її і Кк ДО антен ан м тн Кт нт сан в 0 що 150 таб Уяя0 003006 о 820 т Часіб х початкове значення 7 с: Я 7заджена сенсограма Б СЕАВОВЕ ! г п СЕАОВТЄ ! ф пен я ККАНБТВ са фотон ЖИ Шк тм фионк вв ку Ие Екупізумай КУШОСЯ, БО у я вом ол 5 ча Б по й я й 5 В їх пня кон ненні незнанні понекнчокнкиктенон» 1 - З х пе і й і жов 5 то ЩО 2 ОЗ 0950
Ж є. гам «В; УаЄ ОО г початкове значення) 7
Фіг. 4
Анти-05Т дк пів і м сф м ВС (05 мкг сймаркори лю лю, МИарке «а о щЕ ія Кіа он о ванн 258 а і: 0 я ша. її 6 с ше М ан Ме о В НО НО че я зх . о же -т ЕН ОН Є НН М В 29 п - знос
Фіг. 5А . . й ЗЕ; А Ж Ж АЙ як кю В СВО 5мкг фара КК у «Марке у з С а - га З У 5 що М УК ю. їж т. ш- то ка т у ЖЖ т ЕТ ТЕ С І ВАК 5 се зн ! ' Я ши. й с щ-ь о ва ; п ве СПУ от т КК ши п Фіг, 55
1 Бета-панцюг 05 людини БО ПОЇ-161 кт ння БЕТЗсттст ВОЮ ссея ОД ВО домен МОЗМ Я і 225 ща 1:54 Б СОС 24 зай СО 1-4 ОС Ві за С 108 я ОС мі
Фіг. 5С Екупізумав СЕАВЗОЬ я зд хі | Як бе бе в пот во 5 я Олю «КЕ ОЗ - Ко. Я «Ко НВ 1: с -
БО. що по шо ! ї ' - В ня МО 000 веж р шою оо її в -е- : що ; Бе : ше ше с оон ї я ши о ото в з» й че шо. по В Бо о В а Фіг, 5
В Іво І Скулівума Узгоджена сенсої рама т са вд. Бо зн няню СЕМА В зннт док нн сн хоснтдвня в СТ ККТОВА, тя у В тт ятятанния зу З тя "і ЗВ: 85 і Шо 13 З 2 бю є В бю ХЕ І у ва 12 о мо Зоо заб 32 Час о з початкове значення) Є зу ех гру яких пу уми в да рн одннннненнняяя - Узодженасенсограма 0 г СЮ ФОТО зов знконястн С КАНА Є ця і рено мое СВУ в. Мт СЬКоВА, ВЕ Фі п ої8О! шенні ню, рожекр НИ фени оо сонне вою зооеооосо я. ря шення нем дк де ва и і ЖЕ З й Бо ві ує ї З х о осо. она ККУ ке пл ЛАЛААЖЮЮЮ КАНА Ко «мдкк ЦО фа ее Ку чн тин Поч чну т А А НААН нн АКА нку бу во 120 ті) За Зо Зо 40 Мас о зх початкове значення) У
Фіг. 7 то Ву ; . воду ВЕТЕТ курех КоДИиия хуутувй з В зво Уазгоджена сенсограма ож ен б. у Козар рон ри-НІУ Я незннн ротом де В он НВ В ее т С НАВ Х зо я |; ку хх а і Я А, ОО Гн хх » в й Ме в те Ба сш: хі зм, хо фетр ж з 1 : р У уч яку кияни пуху ут нути, Яд яо ще 246 326 ам яв 5 8 ле Мво 0 ех початкове значення) б 3
Фіг. 8
-а- СЕАОЗОВ 128 ча СЕАОЗОЇ яв «ко СЕАЙЗОВ Пефефв ке СЕАОМИ в во- а. їй ча СКАЗ Ах «5. СЕДОБ5 - ВО- х В, рн СЕ лОКОВ - чий «в: СЕАОБОЄ Б 404 Ще. Як. СЕАОВУЗ «в жи че СРАООУВ тях Шу бтя и ви її 10 Концентрація антитіла( мкгуми )
Фіг. ЗА тво. тя ж зай ов «в. СЕДОЗИ: с чо Ах є що | й ох З м г 605 Е ре ; ри М ай У З ах у во ви і 18 100 Концентрація антитіла мкг/мл у
Фіг. 88 о ге ЕЕ СУ я СЕАОЗОЇ Е ож Дж СЕАозВЕ. ре з0во вжи но ско СЕАОВБОЇ в пр КАХ | -а СЕДОВОВ я Ж. МНЕ СЕДОВЕВ І т на С СЕАОВУВ с ж о п 0 ' нІ Канцентрація антитіпа( мкиумл
Фіг. 10А -- 20004 : СЕАОЗІО. У і ОКА хо 18005 сх : ЕВ ща ШІ а | в ф.. ча а 3000 ше ях к ; Ме С
У. Ес Є хи ої й БО0- х я ; т. : Вейн» 5 0001 В 0 Її то 190 Концентрація антитіла( мкг/мл
Фіг. 108
1203 хо З да ее ібн «В я с Кх | їй Її ж у кун чн по ВО і . 5 : Янв я їх м 40 хх Ж зв. і ї у й в Ну й ї 1 380 108 Концентрація антитіла ( мкглил у
Фіг. 11 А КЇ ГК дл -щг ак СЕАОЗИО ї ів. - ак СЕАОВІЗ
18. «Д- ЩЕ нене гу З Щи ех б | ' і. у З ях х 105 х Її ма х Ж. о : щ "Й. її о х в за т зойк ВВ
Д.О давня етеру ща В ї 18 10 но Концентрація антитіпай( мкг/мл у
Фіг. 12 ж З в ах х у ЕЕ зв ШИ а МИмНН п ех пон сне СРАДКОЕТВКЯ У в Ге СЕАІЕ ТЯ в | гне СЕМИ шо оре ПЕДА с 14 ппетоготе ет чопогогтост овен гене СЕАОВИЕ ТИКИ, Б сах ОЕАСОІОЕТВВОЄ м ре СЕАИВН ЕК й 4 З З (4 5 в фон часідні!
Фіг. 13 не ! Мп оон сосок х зе СРАОВОБК ТВОЮ БО племен Б реяне СТВО ЕРООЄ що ін МАО ТИКИ х ; рнне СЕЛ рн СТАТ ТВОЯ о. не СЕАТЕЕТКЯ щ зх СЕАФАВЕВІКУ 4 фону ринок, НВК 0 3 2 З й в В т час (дні)
Фіг. 14
1204 як ЗК О15-554 ше ак ЗО5ЦОТ8-90422 в КУ я ЗОБЦОТ8-50422. З во і не. За о19-55422 Ж во | щі ВО 3051 020-904 «5 00 - ! дощияо ч шх дд де | ї ой МЕ ОО 5. 5 40» "
зо. у а ши ссдодеу в дос «ен Метт дес аа пої 0 п 1 10 то Концентрація антитіла( мкг/мл )
Фіг. 15 1204 | -а. 305І.О15-50115 100 ж яке БІ 0223-5649 вк шщ ш- "Іде, Км денненнюттннннннн нецке е ВО. " 5 805 Б еЕ Бе 2-5 405 ча З 204 й 0 у | о 0 і 70 100 Концентрація антитіла мкг/мл
Фіг. 16
1204 око ЗОБІ О22-5О115 100 | б... На ОО | "ч рек З05ЦО23-5О115 З 80. ОО Зок Оо23-56422 т БО ! у ж 0. З. КН І -- ех Шо де . 7 у Же Зввае особ 2000 ооо во 00 і 10 Концентрація антитіла( мкг/мл )
Фіг. 17 чо я КО ООА2, є | ча 305 018-50422 ж Ю- яз на ЗОБІ О18-5О422 - 5004 щи р яко МО 19-54 Ма і хе ; тт зу вер ит в я, ще 406. пес «Ї т че МЕМ СОЯ їЕ ж М Ше шк зл й суха як с: ШШ Б а ОО 15, 5 200 г
Є Б. з 0 дня ІН неннннн І 0 0 1 10 109 00 Концентрація антитійа (мкглмл)
Фіг. 18
15003 зе ЗОБЦО15-9115 ж о- 305023-50459 ж і | оонетяннннннксткснннносткнннкчнккнккннчсччкчнчнкктн те ; Би п10003 Вр. РУ | | КЕ. : щш ох
8. 500 и і ї в Х | о х | То -к і Й реечиеетьтьям я дер р од ккккки ді уро сософоооооороровор ор пої 0 0 1 то 10 Концентрація антитіпа (мк ми)
Фіг. 19 0 ою 7 | ее вам Ом кону цю 5 І же ЗОВ ВСЕ Ге ЩІ ЗвЯІ се ВО З нене ЗОБЦОМО- ОЗ ще | не ВОВІООЮ КО В КУ в. оче ВОВЕО ІВ ооо і І нео І С во і нн В і «зе 7 З р КО В ЙО доннннна інно нанні для в? 20 40 БО Дні після введниня
Фіг. 20
120 нини а У УЗІУЗ Ух Шо лам - чо ку, | -к. ВАС : ря ж УВО в во 5 -- ВЯВ5Н ЕЕ о жк НОВО -е 80 З на що оо що З (8. ВІЗІ о ї е- БЕ14370 ні 5 нин 20- і в. овен во: о 0 1 чо чо Концентрація антитіпа( мкм )
Фіг. 21 120- пи ее УТ «о я УМ з | бод, о ває 9 | ша ' ЩЕ. Киї шоОВо- 5 ое- ВЯВБНО т ЩО І. ОВ побву У а БОМ 23 3 ра о в 1 40 чо Концентрація зититілай мкг/мл у
Фіг. 22
1205 я ВМІМЯ 1004 в.з. | ок. варіант 305 ЕК ; То, 804 ї х т БО : х . й | х х о 40. щі че хе х ; - У т 285 ех «я | . совкяк Концентрація антитіла мкм у
Фіг. 23 : соофох ОО Х в : в | як еВ О35-54115 Є ска В 5 до "їК - ке А дденнни Куди тм т имя ння Й Й от іч в о яко ОНИ з бо че З Ма с дв Ге ЗХ одеюовювднь Код ай НН и НН Я дрож т же бе, а Ка с ЧИ ни НВ, леді | ОВ й цю ЗУ й Б ь о дужкой дехннння ГО ДУ тд нн о НЕ де збе ї зв Ка Ки ЗНО косо ою панно Б : діви ЙО0ояишке НУІЯВОЮЯІУ М і 7 бе кА преення ик на ефе 5115 не ! Е З ? 4 25 я 35 З 85 56 до ктанц 5 З й 14 і я 35 45 З зе ке оз а час (дні
Фіг. 24 Е Ж вим МУ Коше Я. ВМІНЬ м КВ ую мтлтлния Н ж | нн фе КВК ЗВЮХ 5 ш : оо у о: жк УЖ: Проект о , дк Просо шо НН пат шо Коренева Ж В : Спо 0 ВЕНЬ ща : «ве рТОСМХ Ж од» ! я : «я МюЗЗВиЗ т ДО фаил хо тиру А то ит т У КА КА М хисту мес а т 14 в зво го яв шо час (дні) соя УМ ЖОВ
Фіг. 25.
А манеакула-я ВЕрККиВ ЛаНцих Б -к Яр ше той ке ВС МОї у ли о Може ВегКНИ ЯУННцКУ Дрисєя ше я. еко Е З УЧНЯ. Х ли А код в и я слу» ше вСОМФЇ же ОХ ЗК се, З КВ МК хи і ї є АХ ка У му й зв ОН - Бе Я у леви ванцюх до ее і С У СО ще хх за Я її ХВ, Є Че й АК ий . важкНй лакцю Бозрізмавьна здтнют ЗА і І айва ряд, в мопекупаі и псом ва : ї й раком ей ж А важкий ей Ма мі й легкнй йвнцюг 5 а ь г т ще лавцює я 3 й о, В о чу ОК га я теме юне: мопекулаї й ж ові Во оювИ: мопекула КОМ 00 (евнааьно 7 А, С
Фіг. 26 ідомен (З лама домен с й-198 Б ПЕН уМмазкаВ і Ї | ПИ А а 1 виш отут ГО дегоен, Бі БО пише їх те; лах СТ ; : р ! НИ ШИ в ї Ту - фе вкеннн З. нн РОБ ВО гі рі рр і ї пого т ге МекеКуя ро. одіокюювієстнях.
БОБ Бі НЕ зум Вр ем феод совок пів Берк НК шк - -- п СА юнь пік Іл є 7 ? : ММК ТЕ Я БІВ ренні пон 7 : і Т ск і І т ВАЯ КЕ: В ХМ ВВ ; ТЕТ : т Ян І зерня ПТ Уа: щи зоодододок вів сферу Ро. прото ; Мале нн Ї ! ВІКІВ софосоовоооодоі ой З: Мед ї ї х т сф і 1 і ' ок нти вокюснсюя і 1 х МУ КД Ї і У ' сосок Ь с ; : їх М яее т вен НИК МК Окре ЩЕЯНК НН і її сіння 1 її осефеосю юс сесію НИ Ві ІХ В я ЯК нев: шк 7 ТЛ ж нн ннннниня і Фк БЕТА : Т | : : п о | | С ее сосіккк ї ж ев нен - що і Є Е т шт к , ї ех ВН МОХУ і КУ ною 51817 тут ЩІ ТТ я по : зак іх, НСД Я офсет ТИ пове я ОВ З151311КІ15 покою 13 Ї 3 руку КЕН Пн в т МОМ КОНЯ іа ЩІ и ' сх 151815 т Манежі Кох рр ! : БЮ ОУВВвва ша їх ВеВеНЬНЬ ід ЕЕ і і т фун фен нн ШЕ НН ЖІБІЖ: 55 й ння КК ї фер етння сне ВІЖ БІВ ВІН ЖЕК й кер тя НН тен ШК т ян ГЕ рт ІЩЕ п ше вон З М ен рЕтт сфері -В Ще во еру нер сфере с попе чт сн ЩІ ОК дерен НИ «В он мн вень Б ше п няня шо тт вана ана еосроссстьооо, Ж : пед що - сет їх ; ср вв гі 81 815 ї короні Я.
ІВ КОВ. в нжх Ж пк ве ЕНН віз, ОТЕЕТ ц вен для Ї 1 і Є ї і ' т «Пр яу ' 1 ; пк, се Н Н а їз ї та пк їні і Фр НИ фагокїснов, ї вав і ву. обеіннйн «й м Не МИШКИ пакфуакікчнкн чно т РОЇ Ух ак ТУ с не нт : ! і вет МІК Ж. іона РУ во ГОРБОК. пфосесінр ! НИ гі 7 древня Е і ія вк п ї і ! Дн долядллнй Е 7 у ! ої не ОХ ї "КЕ : | - -о - : ; Е диф ї я ї : СКККна п ня т ни ОКОМ фев її «ОО ІН Е:Е есе ІІІ фен. рр ринех ША пень ГНЕ шк нам пор по ї ванн А ї Ії ях є ск - З їх 8 Ти ях ; і і НИ | - що ші УЖЕ ЩО Я ие і | ренрняння шия М - і рост Бі рення і ши пк дак кА кАждж днк Кон ИН: пенфнвннЯ сш ши ТЕТ перев «ВЗ А попка рн ни А ВАЗА і ре ' ТКА І ! СТЕ . уко ннх С г що сен
: ях се у оку ох ж век о, Вс5-Мв1 НМ шт Кк хо о Хкколекнх,
З. В вв МИ о, ши шо а и о У ДК сю ї шо Зак МИ Нв ОО -х и у щу ХВ ее, Я е ж охо а ЛО су я С МН доски х у ОК кн В - з БЕК нн 1 ВРУ я пе Я і З з ВО», Х щу Е КОКО ж 5 їх Й зехикея ВО ї Її 7 ї ". ї их зер ; еЖ Я Ще вно дос ь 5 Я З а нини о Я ще У ; о 5 Її чо. я Щи сяй ще че ЩО 5 М 7 вен ТЬМИ олепив лавщке ще В М ОО М ланцюг Ей я а х я Осно дх че? М, днк ЩЕ Ж жим, 3 Ач, в с 2 5 Ж і мк ке ООЯ й: ТК жк п с сожкю ху С сх хх Я лк, о са Я. шк ЧИ. » а М ЧУ нив не в ки З М ма сення ШО їн 0 її - дюни В «щит я У о.
МО... чи о Мн ЕС ше ШЬ а Іф ш--щ м я В. ши Бай и. їх Кк В ПО КО но ОВ ему фіг. 278 Її ШЕ ВК щей
Х. ШЕ яр боаняє ї дя о Кк. -й Є ту З Х дій М КЕ - БМ ї Я , - Ко ї и в КЗ кВ . Бо ДЕ й у х в дінн у од сх Ср ОКО й Во М в Я сон а, Її шко не я її сени б ве всей оо с ка що шу п ше у с у бо КОХ ОО в о с о и и З а; с 3 ДТП З ПОКИ с ОН я НЯ а Б ООН ОО т ОК. дики ню 0 а лану ! уховнавнвавн ОООМ НН о
Фіг. 28А нн м з ДЛ М а а а р а ТТ тт кт і по Ох а - т : 7 по ах т . ко К ок, х з , т « І У ши ; ркенюнннн і - о ВВ аб Ї й і р сх пф я й и ог н-сряз СЯ нІбоє і 5 а т, і ши ше щи т і і шо і: . КУ ой М р х Б чх я хрх й », » ЩЕ. ро нсон сови, ов в МВ Зунічяй бм а і хме ех Ак з Я і ї й й "Кезевев х і Ї Я х КО ОК й х ; ї Її ьщьі Б і ! хюакжкой З Є не - ! і Ж х х ї - а | і ' У Бо Ж : ! Х г : і Ж 7 ї і я мо ї Ї денні «катети ченні ОВК оон тттттттюмтте ту утаооттхчуккттччтчной фіг. 288 ! воеч сщК ї ше . 1 Меч (А р і я че ! вх 5 с с ' - ДВ дер Ка : и ще 43 Коня до т о ; р КО ей оо і І Ко х й ; ще св, Я ьсові : о я х щко х о їх з
Ро . ду Ов шу а нннь і ек ужни Ктя ШИ 5 8 З здав ов ми я колос - з че їз х о т Ка у я ув М сон : х Є З ща о г а пе. ! ї Зо 5 5
Фіг. 28с п «до Ж : -е в м я і ї том, хе Я ! : х боб пи ОХ ї ! джен 5 АГ я ! ек з зе М Б ЩЕ б я Вони й І й ДН я кову - е ск щі й їз 13 Я Рой сх щу СО М ; Ов и Котов ГУ 5 Б он че ек : Б це вв чи 1 У ке У Зварні і . М Я ПОН Ди он : К У осей ! ' н«врнї ча і і І З см : Я. ї ро неон; а : Е ва й :
Фіг. 280 г ОВ сш г Щ й х с 7 і й де Е й ен й З я й 3 З в Р ОВ, УВК Ка В с у КО ну АХ її ФУ ши ОН М о Шк є шт ОА бля 0 НН Ко а і. їн вх х КІ З ж ОК о у КО В о НКИ НК М с ЛОогкий . НО 1111пажнии с в оланцює и 5 Оу 0 щщщ саме - ен о
Фіг. 29А рен путч фо внвван і М КЕ ММ... ОО ООН Ма і Щи щі Шо Я і В С5- М Ї ге їз Я іх щі ! її ОО 0. і ва ще п,» і хх КО с ЕХ і їх ОО с ' У 5 с і А хе о с 5 в м ; ССС. і о З НКУ Х а. п ї ХО я ЗУ а.с Я на їн
ЗВО. МК Я я З С с НІВ ва - по КК ВОК ов КК піде ПК сорок В М ПЕ з п. ОО зн я КУ Х ОК В ПК о Х З Ме о М о
2 . З ах ке КК с ОВ ЗХ Ма В ЗМК о : я ОО о . я г о в о ах КЕ НОВ я і Ка Я ВВЕ БЕХ о ж ХХХ ж 5-3 пов МОВ Кен М МОМ ВО МВ оо о МК ОКО Б в КК а о ОО Ес ЩО А 5 КО о й ОО ТОК ОК ВОК нн щ. 5 с . МОМ ХК У са СН с ВК с 0000. ОК с В я хх с Тоой ОВ о ша: й. ПЕ 11111 ше. з ' З о ЕФ .к. - і 0000000. 3 : пон Й Й с с: с ППбб3/о/
Фіг. 298 Тит сект юююи юю І в дев ща Ше а о: се З щ І ві ВМ ПО МН: о. вом са Ох Б ОЙ ОКХ ов г о. о Я ВК я. са во ОО ОО по і : КО ЗХ ши й .: зи М; ! в Н А о ! З МО ОК а УМ х Зо М ! х КО М у о В То СО БО Бо МУ 3. і о: Ма ща г 3 ї с і ях У а І ПООБО де М ОО ях ою ВО я - с с В, Ох 5 п Б ОХ п я ОХ ОО М С СУ в ее с МО С В У МО о шо с;
її. п Е її. 5 с ПЕНЮ МО ПО ДО ВК ЩО Б с ВХ Те ПО НН У
В с. я. Ох и ; 5 с в. нс м 00000000 ЕС і яв Бе а; ! ВК. ОЛЮВ ЕН я Ве ВН ПЕН
: М. СКК ОО во а о. А 1 ' а а. Он і ко осай ня В І Я Ж КЯ 5
5 я. ОВО вн с ва;ЖжКкИИВ й ан я Ша с ПН НН ДЕН
Фіг. 295
UAA201810992A 2016-06-17 2017-06-16 Застосування антитіла проти с5 UA126561C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016120325 2016-06-17
PCT/JP2017/022253 WO2017217524A1 (en) 2016-06-17 2017-06-16 Anti-c5 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126561C2 true UA126561C2 (uk) 2022-11-02

Family

ID=59969459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201810992A UA126561C2 (uk) 2016-06-17 2017-06-16 Застосування антитіла проти с5

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP3472316A4 (uk)
JP (3) JP6202774B1 (uk)
KR (2) KR101852739B1 (uk)
CN (3) CN109312326B (uk)
AU (1) AU2017285763B2 (uk)
BR (1) BR112018075688A2 (uk)
CA (1) CA3021956A1 (uk)
CL (1) CL2018003573A1 (uk)
CR (1) CR20190013A (uk)
EA (1) EA201990018A1 (uk)
IL (2) IL300611A (uk)
MX (2) MX2018015030A (uk)
MY (1) MY187848A (uk)
PE (2) PE20190394A1 (uk)
PH (1) PH12018502354A1 (uk)
SG (2) SG10201800265UA (uk)
TW (4) TWI807666B (uk)
UA (1) UA126561C2 (uk)
WO (1) WO2017217524A1 (uk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4001409A1 (en) 2006-03-31 2022-05-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
EP3521311A1 (en) 2008-04-11 2019-08-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
CA2819356C (en) 2010-11-30 2023-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
ES2899894T3 (es) 2014-12-19 2022-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
WO2017218515A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibodies and uses thereof
SG10201800265UA (en) * 2016-06-17 2018-02-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN109689099B (zh) 2016-08-05 2023-02-28 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
CN111278857A (zh) * 2017-10-04 2020-06-12 亚力兄制药公司 抗c5抗体治疗患有膜增生性肾小球肾炎的患者的剂量和施用
CA3083113A1 (en) 2017-12-13 2019-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody combinations and uses thereof
US20220177556A1 (en) * 2018-09-06 2022-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Humanized anti-c5 antibodies and uses thereof
MX2021012997A (es) * 2019-04-24 2022-03-04 Univ Pennsylvania Anticuerpos anti-c5 humanizados bifuncionales y proteínas de fusión del factor h y usos de los mismos.
CN113563467A (zh) * 2020-04-28 2021-10-29 上海普铭生物科技有限公司 针对人补体蛋白c5的抗体及其应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0230985Y2 (uk) 1985-07-08 1990-08-21
US6074642A (en) * 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
ATE495618T1 (de) 2001-06-12 2011-01-15 Ericsson Telefon Ab L M Synchronisation in einem terrestrischen umts- funkzugriffsnetzwerk (utran)
BRPI0211953B8 (pt) 2001-08-17 2021-05-25 Genentech Inc anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a c5 e c5a sem a prevenção da formação de c5b, linhagem celular, composição farmacêutica, bem como método in vitro para inibir a atividade de c5a e método de diagnóstico in vitro
JP4333939B2 (ja) 2001-08-27 2009-09-16 ロード・コーポレーション トロリ線の吊架装置
DE10253331A1 (de) 2002-11-14 2004-06-03 Symrise Gmbh & Co. Kg Verwendung von trans-Pellitori als Aromastoff
US7267849B2 (en) 2004-03-02 2007-09-11 Nitto Denko Corporation Compensator for liquid crystal display
KR20080069889A (ko) 2007-03-20 2008-07-29 (주)화도 폴리에틸렌 관
KR20100015773A (ko) * 2007-03-22 2010-02-12 노파르티스 아게 Ｃ５ 항원 및 그의 용도
JP5336846B2 (ja) 2007-04-11 2013-11-06 積水化学工業株式会社 架橋ポリビニルアセタール樹脂の製造方法及び架橋ポリビニルアセタール樹脂
EP3521311A1 (en) * 2008-04-11 2019-08-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
MY159396A (en) * 2008-08-05 2016-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c5
KR20100054403A (ko) 2008-11-14 2010-05-25 삼성전자주식회사 온라인 공동 작문 장치 및 방법
BR112012022917A2 (pt) * 2010-03-11 2017-01-10 Pfizer anticorpos com ligação a antígeno dependente de ph
TW201206466A (en) * 2010-03-11 2012-02-16 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with pH dependent antigen binding
KR20110111007A (ko) 2010-04-02 2011-10-10 이화여자대학교 산학협력단 Ｌ／ｄ 광학변환 및 광학분할을 위한 옥타하이드로-바이나프톨 유도체
KR20110122011A (ko) 2010-05-03 2011-11-09 황보철종 매장 포인트 통합 관리 시스템 및 그 방법
KR20150041662A (ko) * 2012-08-13 2015-04-16 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｐｈ-의존적 결합 특성을 갖는 항-ｐｃｓｋ9 항체
BR112015018438A2 (pt) * 2013-01-31 2017-07-18 Seoul Nat Univ R&Db Foundation anticorpo contra c5 e método para prevenir e tratar doenças relacionadas a complemento
EP3473272A1 (en) * 2013-03-29 2019-04-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
ES2899894T3 (es) * 2014-12-19 2022-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-C5 y métodos de uso
RU2742606C2 (ru) * 2015-12-18 2021-02-09 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к с5 и способы их применения
SG10201800265UA (en) * 2016-06-17 2018-02-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
PH12018502354A1 (en) 2019-09-23
RU2019100222A3 (uk) 2020-11-05
TW202239766A (zh) 2022-10-16
EP3472316A1 (en) 2019-04-24
EA201990018A1 (ru) 2019-08-30
TWI807666B (zh) 2023-07-01
CA3021956A1 (en) 2017-12-21
KR101852739B1 (ko) 2018-04-30
IL300611A (en) 2023-04-01
KR20190009273A (ko) 2019-01-28
MX2023001360A (es) 2023-02-27
CR20190013A (es) 2019-03-05
JP7032077B2 (ja) 2022-03-08
WO2017217524A1 (en) 2017-12-21
MX2018015030A (es) 2019-04-22
RU2019100222A (ru) 2020-07-17
AU2017285763A1 (en) 2018-11-08
CN115960223A (zh) 2023-04-14
JP2022091748A (ja) 2022-06-21
CN115925922A (zh) 2023-04-07
TW201808996A (zh) 2018-03-16
SG11201705584VA (en) 2018-05-30
IL263657A (en) 2019-01-31
SG10201800265UA (en) 2018-02-27
CN109312326B (zh) 2022-09-09
JP2018009021A (ja) 2018-01-18
PE20190394A1 (es) 2019-03-13
TWI789369B (zh) 2023-01-11
KR102226975B1 (ko) 2021-03-11
JP6202774B1 (ja) 2017-09-27
JP2017226655A (ja) 2017-12-28
PE20240825A1 (es) 2024-04-18
TW201809000A (zh) 2018-03-16
MY187848A (en) 2021-10-26
EP3472316A4 (en) 2020-01-08
CN109312326A (zh) 2019-02-05
AU2017285763B2 (en) 2024-02-01
TW202337903A (zh) 2023-10-01
BR112018075688A2 (pt) 2019-04-02
TWI610941B (zh) 2018-01-11
CL2018003573A1 (es) 2019-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126561C2 (uk) Застосування антитіла проти с5
UA123774C2 (uk) Антитіла проти c5 та способи застосування
CN107207607B (zh) 抗-c5抗体及使用方法
JP7070932B2 (ja) Ｂａｆｆ－ｒ標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞及びその使用
UA127961C2 (uk) Антитіло до латентного міостатину
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
CN107743495A (zh) 抗ceacam6抗体及其用途
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
UA115641C2 (uk) Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить
UA123390C2 (uk) Терапія і діагностика на основі білків тау-опосередковуваної патології при хворобі альцгеймера
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
JP2022070921A (ja) Ｂａｆｆ－ｒ抗体及びその使用
RU2789788C2 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
Stewart Molecular Characterization and Inhibition of Antibodies Elicited Against Galactosyltransferase Knockout Pig Xenografts
BR122024004392A2 (pt) Anticorpos anti-c5 e métodos de uso