CN107207607B - 抗-c5抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个目的是提供抗‑C5抗体及其使用方法。本发明提供抗‑C5抗体及其使用方法。在一些实施方案中，本发明的分离的抗‑C5抗体在中性pH下结合C5的β链内的表位的亲和力比在酸性pH下更高。本发明还提供分离的编码本发明的抗‑C5抗体的核酸。本发明还提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸。本发明还提供制备抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以制备所述抗体。本发明还提供制备抗‑C5抗体的方法，所述方法包括针对包含C5的β链的MG1‑MG2结构域的多肽免疫动物。本发明的抗‑C5抗体可以用作药物。

Description

抗-C5抗体及使用方法
技术领域
本发明涉及抗-C5抗体及其使用方法。
背景技术
补体系统在免疫复合物的清除和对传染物，外源抗原，病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫应答中起关键作用。存在约25-30种补体蛋白，其被发现是血浆蛋白和膜辅因子的复合物集合。补体组分通过在一系列复杂的酶切和膜结合事件中相互作用而实现其免疫防御功能。所产生的补体级联导致产生具有调理素、免疫调节和溶菌功能的产物。
目前，被广泛接受的是，补体系统可以通过三种不同的途径被激活：经典途径，凝集素途径和旁路途径。这些途径共有许多组分，并且虽然其初始步骤有不同，但其集中并共有相同的负责激活和摧毁靶细胞的晚期补体组分(C5至C9)。
经典途径通常通过形成抗原-抗体复合物而被激活。独立地，凝集素途径激活的第一步是具体凝集素如甘露聚糖-结合凝集素(MBL)，H-ficolin，M-ficolin，L-ficolin和C-型凝集素CL-11的结合。相反，旁路途径自发进行低水平的回转激活，这可以容易地在外源或其他异常表面(细菌，酵母，病毒感染的细胞，或损伤的组织)上被放大。这些途径会聚于一点，即补体组分C3被活性蛋白酶切割从而产生C3a和C3b。
C3a是一种过敏毒素。C3b结合细菌和其他细胞，以及某些病毒和免疫复合物，并且将其标记为自循环中除去(已知为调理素的作用)。C3b还与其他组分形成复合物从而形成C5转化酶，该酶将C5切割成C5a和C5b。
C5是在正常血清中发现的约80μg/ml(0.4μM)的190kDa的蛋白。C5中的约1.5-3％的归于碳水化合物的质量被糖基化。成熟的C5是二硫键连接的115kDaα链和75kDaβ链的异源二聚体。C5被合成为1676个氨基酸的单链前体蛋白(pro-C5前体)(见，例如，PTL1和PTL2)。pro-C5前体被切割从而产生作为氨基端片段的β链和作为羧基端片段的α链。α链和β链多肽片段经由二硫键彼此连接并且构成成熟的C5蛋白。
成熟的C5在补体途径的激活期间被切割成C5a和C5b片段。C5a被C5转化酶自C5的α链切割，其是作为包含α链的前74个氨基酸的氨基端片段。成熟的C5的剩余部分是片段C5b，其含有经二硫键连接的剩余的α链和β链。C5a的11kDa分子量中的约20％归于碳水化合物。
C5a是另一种过敏毒素。C5b与C6，C7，C8和C9组合而形成膜攻击复合物(MAC，C5b-9，在靶细胞表面处的最终补体复合物(TCC))。当足够数量的MAC插入靶细胞膜中时，形成MAC小孔从而介导靶细胞的快速渗透性溶胞作用。
如以上提及的，C3a和C5a是过敏毒素。其可以触发肥大细胞脱粒，这释放组胺和其他炎症介质，导致平滑肌收缩，血管透性增加，白细胞激活，及其他炎性现象，包括导致细胞过多的细胞增殖。C5a还充当趋化肽，其用于吸引粒细胞如嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，嗜碱性粒细胞和单核细胞至补体激活位点。
C5a的活性由血浆酶羧肽酶N调节，所述酶自C5a除去羧基端精氨酸，从而形成C5a-des-Arg衍生物。C5a-des-Arg显示仅未修饰的C5a的1％的过敏性活性和多形核趋化活性。
功能正常的补体系统提供有力的针对感染微生物的防御，而补体的不适当的调节或激活牵涉多种病症的发病，所述病症包括，例如，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)；狼疮性肾炎(lupus nephritis)；缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury)；阵发性夜间血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)；非典型溶血性尿毒症综合征(atypical hemolytic uremic syndrome，aHUS)；致密沉积物病(dense deposit disease，DDD)；黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(age-relatedmacular degeneration，AMD))；溶血(hemolysis)，肝酶升高(elevated liver enzymes)，和低血小板(HELLP)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura，TTP)；自发性流产(spontaneous fetal loss)；微量免疫脉管炎(Pauci-immunevasculitis)；大疱性表皮松解(epidermolysis bullosa)；再发性流产(recurrent fetalloss)；多发性硬化(multiple sclerosis，MS)；外伤性脑损伤(traumatic brain injury)；和由心肌梗死(myocardial infarction)，心肺分流术(cardiopulmonary bypass)和血液透析(hemodialysis)导致的损伤(见，例如，NPL1)。因此，抑制过度的或不受控的补体激活级联可以为患有所述病症的患者提供临床益处。
阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)是一种不常见的血液疾病，其中红血球受损并且因此比正常红血球更快地被破坏。PNH是由于具有位于X染色体上的PIG-A(磷脂酰肌醇聚糖A型)基因的体突变的造血干细胞的克隆扩增所致。PIG-A的突变导致糖基磷脂酰肌醇(GPI)合成的早期阻断，该分子是许多蛋白锚定到细胞表面所需要的。因此，PNH血细胞缺少GPI-锚定的蛋白，所述蛋白包括补体-调节蛋白CD55和CD59。在正常条件下，这些补体-调节蛋白阻断细胞表面上MAC的形成，由此阻止红血球溶胞。在PNH中，不存在GPI-锚定的蛋白导致补体-介导的溶血。
PNH被表征为溶血性贫血(红血球数量减少)，血红蛋白尿(尿中存在血红蛋白，睡眠后尤其明显)，和血红蛋白血症(在血流中存在血红蛋白)。已知受PNH所扰的个体具有突然发作，其在此处被定义为深色尿的发生。溶血性贫血是由于通过补体组分的红血球的血管内破坏所致。其他已知的症状包括言语障碍症，疲劳，勃起功能障碍，血栓形成和复发性腹痛。
依库珠单抗(Eculizumab)是针对补体蛋白C5的人源化单克隆抗体，并且是第一种被批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)的疗法(见，例如，NPL2)。依库珠单抗抑制C5转化酶将C5切割成C5a和C5b，这防止产生最终的补体复合物C5b-9。C5a和C5b-9都导致表征为PNH和aHUS的晚期补体介导的事件(也见，PTL3，PTL4，PTL5和PTL6)。
若干报道已经描述了抗-C5抗体。例如，WO 95/29697(PTL7)描述了结合C5的α链但是不结合C5a并且阻断C5的活化的抗-C5抗体，而WO 2002/30985(PTL8)描述了抑制C5a形成的抗-C5单克隆抗体。另一方面，WO 2004/007553(PTL9)描述了识别C5的α链上的C5转化酶的蛋白水解位点并抑制C5向C5a和C5b转化的抗-C5抗体。WO 2010/015608(PTL10)描述了亲和力常数为至少1x107M-1的抗-C5抗体。
抗体(IgG)结合新生儿Fc受体(FcRn)，并且具有长的血浆保留时间。典型地在酸性条件(例如，pH 6.0)下观察到IgG与FcRn的结合，并且在中性条件(例如，pH 7.4)下几乎观察不到。典型地，IgG经由胞吞作用非特异性地进入到细胞中，并且通过在酸性条件下结合内体中的内体FcRn而回到细胞表面。然后，在血浆中在中性条件下IgG与FcRn解离。没有结合FcRn的IgG在溶酶体中被分解。当通过向IgG的Fc区中引入突变来消除酸性条件下其FcRn结合能力时，IgG不从内体再循环到血浆中，这导致IgG的血浆保留的显著损害。为了提高IgG的血浆保留，增强其在酸性条件下的FcRn结合的方法已被报道。当通过向IgG的Fc区引入氨基酸置换来提高其在酸性条件下的FcRn结合时，IgG更有效地从内体再循环到血浆，并且由此显示提高的血浆保留。同时，还报道了，在中性条件下具有增强的FcRn结合的IgG在血浆中在中性条件下不与FcRn解离，即使是在其经由其在内体中在酸性条件下与FcRn结合而返回细胞表面时，并且之后其血浆保留保持不变，或者变差(见，例如，NPL3；NPL4；NPL5)。
最近，以pH依赖性方式结合抗原的抗体已被报道(见，例如，PTL11和PTL12)。这些抗体在血浆中性条件下强烈地结合抗原并且在内体酸性条件下与抗原解离。在与抗原解离后，所述抗体在经由FcRn再循环至血浆时变得能够再次结合抗原。因此，单个抗体分子可以重复地结合多个抗原分子。通常，抗原的血浆保留比具有上述FcRn介导的再循环机制的抗体的血浆保留短得多。因此，当抗原与抗体结合时，抗原通常显示延长的血浆保留，从而导致抗原血浆浓度的增加。另一方面，已经报道了，与典型的抗体相比，上述以pH依赖性方式结合抗原的抗体更快速地将抗原从血浆中消除，因为其在FcRn介导的再循环过程期间在内体内与抗原解离。WO 2011/111007(PTL13)还描述了计算机建模分析，所述分析显示具有针对C5的pH依赖性结合的抗体可以延伸抗原敲减(knockdown)。
引用列表
专利文献
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发明概述
本发明提供抗-C5抗体及其使用方法。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体结合C5的β链内的表位。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体结合C5的β链的MG1-MG2结构域内的表位。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体结合由C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸33-124组成的片段内的表位。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的片段：氨基酸47-57，70-76，和107-110。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基：SEQ ID NO:40的Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109，和His110。在另外的实施方案中，所述抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。在另一个实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体与表2中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合与表2中所述的抗体相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。在另一个实施方案中，本发明的抗-C5抗体与表7或8中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合与表7或8中所述的抗体相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(b)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(c)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(d)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(e)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(f)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(g)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(h)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(i)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；和(j)SEQ ID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体具有选自由以下组成的组的特征：(a)所述抗体接触C5(SEQ ID NO:39)的氨基酸D51和K109；(b)所述抗体对C5(SEQ ID NO:39)的亲和力大于所述抗体对由SEQ ID NO:39的E48A置换组成的C5突变体的亲和力；或(c)所述抗体在pH7.4下结合由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白，但是在pH7.4下不结合由具有H72Y置换的SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白。在另外的实施方案中，所述抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体抑制C5的活化。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体抑制C5变体R885H的活化。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体是人，人源化，或嵌合抗体。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体是结合C5的抗体片段。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体是全长IgG1或IgG4抗体。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含(a)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列DX1GYX2X3PTHAMX4X5，其中X1是G或A，X2是V，Q或D，X3是T或Y，X4是Y或H，X5是L或Y(SEQ ID NO:128)，(b)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)，和(c)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG，其中X1是C，A或G，X2是Y或F，X3是T，D或E，X4是Y，K或Q，X5是S，D或E，X6是A或V(SEQ ID NO:127)。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SSYYX1X2，其中X1是M或V，X2是C或A(SEQ ID NO:126)，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG，其中X1是C，A或G，X2是Y或F，X3是T，D或E，X4是Y，K或Q，X5是S，D或E，X6是A或V(SEQ ID NO:127)，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列DX1GYX2X3PTHAMX4X5，其中X1是G或A，X2是V，Q或D，X3是T或Y，X4是Y或H，X5是L或Y(SEQ ID NO:128)。在另外的实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1ASQX2IX3SX4LA，其中X1是Q或R，X2是N，Q或G，X3是G或S，X4是D，K或S(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列GASX1X2X3S，其中X1是K，E或T，X2是L或T，X3是A，H，E或Q(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1ASQX2IX3SX4LA，其中X1是Q或R，X2是N，Q或G，X3是G或S，X4是D，K或S(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列GASX1X2X3S，其中X1是K，E或T，X2是L或T，X3是A，H，E或Q(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一个的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一个的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137-139中任一个的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:140-141中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:142-143中任一个的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:144-145中任一个的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:146-147中任一个的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的本发明的抗-C5抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:10，106-110中任一具有至少95％序列同一性；(b)VL序列，所述VL序列与氨基酸序列SEQ ID NO:20，111-113中任一具有至少95％序列同一性；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:10，106-110中任一个的VH序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:20，111-113中任一个的VL序列。
本发明提供抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:10，106-110中任一个的VH序列和SEQID NO:20，111-113中任一个的VL序列。
本发明还提供分离的核酸，其编码本发明的抗-C5抗体。本发明还提供宿主细胞，其包含本发明的核酸。本发明还提供制备抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以制备所述抗体。
本发明还提供制备抗-C5抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括针对多肽免疫动物，所述多肽包含C5的β链的MG1-MG2结构域(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，所述方法包括针对多肽免疫动物，所述多肽包含对应于C5的β链(SEQ ID NO:40)的位置33至124处的氨基酸的区域。在一些实施方案中，所述方法包括针对多肽免疫动物，所述多肽包含至少一个选自C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸47-57，70-76和107-110的片段。在一些实施方案中，所述方法包括针对多肽免疫动物，所述多肽包含C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段，所述片段包含至少一个选自Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109和His110的氨基酸。
本发明还提供药物制剂，所述药物制剂包含本发明的抗-C5抗体和药用载体。
具体地，本发明涉及：
[1]结合C5的分离的抗体，其中所述抗体在中性pH下结合C5的β链内的表位的亲和力比在酸性pH下更高。
[2][1]的抗体，其中所述抗体具有选自由以下组成的组的特征：
(a)所述抗体接触C5(SEQ ID NO:39)的氨基酸D51和K109；
(b)所述抗体对C5(SEQ ID NO:39)的亲和力大于所述抗体对由SEQ ID NO:39的E48A置换组成的C5突变体的亲和力；和
(c)所述抗体在pH7.4下结合由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白，但是在pH7.4下不结合由具有H72Y置换的SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白。
[3][1]的抗体，其中所述抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：
(a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；
(b)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；
(c)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；
(d)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；
(e)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；
(f)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；
(g)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；
(h)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；
(i)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；和
(j)SEQ ID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL。
[4][1]至[3]中任一项的抗体，其中所述抗体结合C5的β链的MG1-MG2结构域内的表位。
[5][1]至[4]中任一项的抗体，其中所述抗体结合由C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸33-124组成的片段内的表位。
[6][1]至[5]中任一项的抗体，其中所述抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的片段：氨基酸47-57，70-76，和107-110。
[7][1]至[6]中任一项的抗体，其中所述抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109，和His110。
[8][1]至[7]中任一项的抗体，所述抗体结合与表2，7或8中所述的抗体相同的表位。
[9][1]至[8]中任一项的抗体，其抑制C5的活化。
[10][1]至[9]中任一项的抗体，其抑制C5变体R885H的活化。
[11][1]至[10]中任一项的抗体，其是单克隆抗体。
[12][1]至[11]中任一项的抗体，其是人，人源化，或嵌合抗体。
[13][1]至[12]中任一项的抗体，其是结合C5的抗体片段。
[14][1]至[13]中任一项的抗体，其中所述抗体包含(a)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列DX1GYX2X3PTHAMX4X5，其中X1是G或A，X2是V，Q或D，X3是T或Y，X4是Y或H，X5是L或Y(SEQ ID NO:128)，(b)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)，和(c)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG，其中X1是C，A或G，X2是Y或F，X3是T，D或E，X4是Y，K或Q，X5是S，D或E，X6是A或V(SEQ ID NO:127)。
[15][1]至[13]中任一项的抗体，其中所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SSYYX1X2，其中X1是M或V，X2是C或A(SEQ ID NO:126)，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG，其中X1是C，A或G，X2是Y或F，X3是T，D或E，X4是Y，K或Q，X5是S，D或E，X6是A或V(SEQ ID NO:127)，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列DX1GYX2X3PTHAMX4X5，其中X1是G或A，X2是V，Q或D，X3是T或Y，X4是Y或H，X5是L或Y(SEQ ID NO:128)。
[16][15]的抗体，其还包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1ASQX2IX3SX4LA，其中X1是Q或R，X2是N，Q或G，X3是G或S，X4是D，K或S(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列GASX1X2X3S，其中X1是K，E或T，X2是L或T，X3是A，H，E或Q(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)。
[17][1]至[13]中任一项的抗体，其包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1ASQX2IX3SX4LA，其中X1是Q或R，X2是N，Q或G，X3是G或S，X4是D，K或S(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列GASX1X2X3S，其中X1是K，E或T，X2是L或T，X3是A，H，E或Q(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QX1TX2VGSSYGNX3，其中X1是S，C，N或T，X2是F或K，X3是A，T或H(SEQ ID NO:131)。
[18][15]的抗体，其还包含：重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一个的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一个的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137-139中任一个的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:140-141中任一个的氨基酸序列。
[19][17]的抗体，其还包含：轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:142-143中任一个的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:144-145中任一个的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:146-147中任一个的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列。
[20][1]至[13]中任一项的抗体，其包含(a)VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQID NO:10，106-110中任一具有至少95％序列同一性；(b)VL序列，所述VL序列与氨基酸序列SEQ ID NO:20，111-113中任一具有至少95％序列同一性；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
[21][20]的抗体，其包含SEQ ID NO:10，106-110中任一个的VH序列。
[22][20]的抗体，其包含SEQ ID NO:20，111-113中任一个的VL序列。
[23]抗体，其包含SEQ ID NO:10，106-110中任一个的VH序列和SEQ ID NO:20，111-113中任一个的VL序列。
[24][1]至[23]中任一项的抗体，其是全长IgG1或IgG4抗体。
[25]分离的核酸，其编码[1]至[24]中任一项的抗体。
[26]宿主细胞，其包含[25]的核酸。
[27]制备抗体的方法，所述方法包括培养[26]的宿主细胞以制备所述抗体。
[28]制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含C5的β链的MG1-MG2结构域(SEQ ID NO:43)。
[29]制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含对应于C5的β链(SEQ ID NO:40)的位置33至124处的氨基酸的区域。
[30]制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含至少一个选自C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸47-57，70-76和107-110的片段。
[31]制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段，所述片段包含至少一个选自Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109和His110的氨基酸。
[32]药物制剂，其包含[1]至[24]中任一项的抗体和药用载体。
附图简述
[图1]
图1显示抗-C5抗体的表位框并(binning)，如实施例2.2中所述。被归类到相同表位框(bin)中的抗体被用粗线加框。
[图2A]
图2A显示用于评估pH-依赖性的抗-C5抗体在pH7.4(实线)和pH5.8(虚线)的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例3.2中所述。CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，和CFA0599是被分组到表位C中的抗体，如实施例2.2中所述。
[图2B]
图2B显示用于评估pH-依赖性的抗-C5抗体在pH7.4(实线)和pH5.8(虚线)的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例3.2中所述。CFA0666，CFA0672，和CFA0675是被分组到表位C中的抗体，CFA0330和CFA0341是被分组到表位B中的抗体，如实施例2.2中所述。305LO5是CFA0305的人源化抗体，如实施例2.3中所述。
[图3]
图3显示针对与GST-标签融合的C5β-链衍生的片段(SEQ ID NO:40的氨基酸19-180，161-340，321-500，和481-660)的蛋白印迹分析，如实施例4.1中所述。CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672，和CFA0675是被分组到表位C中的抗体。抗-GST抗体是阳性对照。融合有GST的C5片段(46-49kDa)的位置用箭头标记。
[图4]
图4显示抗-C5抗体对C5β-链的MG1-MG2结构域的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例4.3中所述。上图显示CFA0305(实线)，CFA0307(虚线)，CFA0366(点虚线)，和依库珠单抗(点线)的结果。中间的图显示CFA0501(实线)，CFA0599(虚线)，CFA0538(点虚线)，和依库珠单抗(点线)的结果。下面的图显示CFA0666(实线)，CFA0672(虚线)，CFA0675(点虚线)，和依库珠单抗(点线)的结果。CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672，和CFA0675是被分组到表位C中的抗体。依库珠单抗是对照抗-C5抗体。
[图5A]
图5A显示针对与GST标签融合的MG1-MG2结构域衍生的肽片段(SEQ ID NO:40的氨基酸33-124，45-124，52-124，33-111，33-108，和45-111)的蛋白印迹分析，如实施例4.4中所述。抗-GST抗体被用作反应用抗体。融合有GST的C5片段(35-37kDa)的位置用箭头标记。
[图5B]
图5B显示针对与GST-标签融合的MG1-MG2结构域衍生的肽片段(SEQ ID NO:40的氨基酸33-124，45-124，52-124，33-111，33-108，和45-111)的蛋白印迹分析，如实施例4.4中所述。CFA0305被用作反应用抗体。
[图5C]
图5C概述了抗-C5抗体与C5β-链衍生的片段的结合反应，如实施例4.4中所述。与被分组到表位C中的抗-C5抗体(CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672，和CFA0675)结合的片段以灰色显示，不与其结合的片段以白色显示。
[图6]
图6显示针对C5点突变体的蛋白印迹分析，在所述突变体中β-链的E48，D51，和K109被置换成丙氨酸(分别为E48A，D51A，和K109A)，如实施例4.5中所述。在左图中，依库珠单抗(抗-C5抗体，α-链结合剂)被用作反应用抗体，并且C5的α-链(约113kDa)的位置用箭头标记。在右图中，CFA0305(被分组到表位C中，β-链结合剂)被用作反应用抗体，并且C5的β-链(约74kDa)的位置用箭头标记。
[图7]
图7显示BIACORE(注册商标)感应图，该图显示依库珠单抗-F760G4(上图)或305LO5(下图)与C5突变体的相互作用，如实施例4.6中所述。感应图通过分别将C5-wt(粗实曲线)，C5-E48A(短虚曲线)，C5-D51A(长虚曲线)，和C5-K109A(细实曲线)注射在固定有依库珠单抗-F760G4或305LO5的传感器表面上获得。依库珠单抗是对照抗-C5抗体。305LO5是CFA0305人源化抗体(被分组到表位C中)，如实施例2.3中所述。
[图8]
图8显示用于评估pH-依赖性的显示305LO5与C5His突变体的相互作用的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例4.7中所述。感应图通过分别将C5-wt(粗实曲线)，C5-H70Y(长虚曲线)，C5-H72Y(短虚曲线)，C5-H110Y(点曲线)，和C5-H70Y+H110Y(细实曲线)注射在固定有305LO5的传感器表面上获得。允许抗体/抗原复合物在pH7.4解离，之后在pH5.8进一步解离(箭头所指)以评估pH-依赖性相互作用。
[图9A]
图9A显示通过抗-C5抗体的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例5.1中所述。显示被分组到表位C中的CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672，和CFA0675的结果，如实施例2.2中所述。
[图9B]
图9B显示通过抗-C5抗体的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例5.1中所述。显示被分组到表位B中的抗体CFA0330和CFA0341的结果，如实施例2.2中所述。
[图10A]
图10A显示通过抗-C5抗体的C5a生成的抑制，如实施例5.2中所述。在图9A中描述的脂质体溶解测定期间获得的上清中量化C5a浓度。
[图10B]
图10B显示通过抗-C5抗体的C5a生成的抑制，如实施例5.2中所述。在图9B中描述的脂质体溶解测定期间获得的上清中量化C5a浓度。
[图11]
图11显示通过抗-C5抗体的补体激活的溶血的抑制，如实施例5.3中所述。补体经由经典途径激活。
[图12]
图12显示通过抗-C5抗体的补体激活的溶血的抑制，如实施例5.4中所述。补体经由旁路途径激活。
[图13]
图13显示通过抗-C5抗体的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例8.1中所述。显示抗体305LO15-SG422，305LO16-SG422，305LO18-SG422，305LO19-SG422，305LO20-SG422，和305LO20-SG115的结果。
[图14]
图14显示通过抗-C5抗体的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例8.1中所述。显示抗体305LO15-SG115和305LO23-SG429的结果。
[图15]
图15显示通过抗-C5抗体的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例8.1中所述。显示抗体305LO22-SG115，305LO22-SG422，305LO23-SG115，和305LO23-SG422的结果。
[图16]
图16显示通过抗-C5抗体的C5a生成的抑制，如实施例8.2中所述。在图13中描述的脂质体溶解测定期间获得的上清中量化C5a浓度。
[图17]
图17显示通过抗-C5抗体的C5a生成的抑制，如实施例8.2中所述。在图14中描述的脂质体溶解测定期间获得的上清中量化C5a浓度。
[图18]
图18显示通过抗-C5抗体的猴血浆中的补体活性的抑制，如实施例8.3中所述。抗-C5抗体被施用到食蟹猴(cynomolgus monkey)中，并且在溶血测定中测量猴血浆中的补体活性。
[图19]
图19显示通过抗-C5抗体(依库珠单抗)的野生型C5(WT)和C5变体(V145I，R449G，V802I，R885H，R928Q，D966Y，S1310N，和E1437D)的生物学活性的抑制，如实施例8.4中所述。
[图20]
图20显示通过抗-C5抗体(305变体)的野生型C5(WT)和C5变体(V145I，R449G，V802I，R885H，R928Q，D966Y，S1310N，和E1437D)的生物学活性的抑制，如实施例8.4中所述。
[图21]
图21显示通过抗-C5抗体(BNJ441和305变体)的补体激活的脂质体溶解的抑制，如实施例8.5中所述。
[图22]
图22A和22B显示与人C5(hC5)-MG1结构域结合的305Fab的晶体结构，如实施例9.6中所述。图22A显示非对称单元。MG1以表面表示法显示而305Fab被显示为带状物(深灰色：重链，浅灰色：轻链)。图22B显示叠置的分子1和2(深灰色：分子1，浅灰色：分子2)。
[图23A]
图23A显示MG1结构域上的305Fab接触区的表位，如实施例9.6中所述。图23A显示MG1氨基酸序列中的表位定位(深灰色：接近度小于3.0埃，浅灰色：接近度小于4.5埃)。
[图23B]
图23B显示MG1结构域上的305Fab接触区的表位，如实施例9.6中所述。图23B显示晶体结构中的表位定位(深灰色球：接近度小于3.0埃，浅灰色棍：接近度小于4.5埃)。
[图24A]
图24A显示E48，D51和K109(棍表示法)与305Fab(表面表示法)的相互作用的特写视图，如实施例9.7中所述。
[图24B]
图24B显示E48及其环境(深灰色点线：与Fab的氢键，浅灰色点线：水介导的氢键)之间的相互作用，如实施例9.7中所述。
[图24C]
图24C显示D51及其环境之间的相互作用(深灰色点线：与Fab的氢键)，如实施例9.7中所述。
[图24D]
图24D显示K109及其环境之间的相互作用(深灰色点线：与Fab的氢键，浅灰色点线：与H-CDR3_D95的盐桥)，如实施例9.7中所述。
[图25A]
图25A显示H70，H72和H110(棍表示法)与305Fab(表面表示法)的相互作用的特写视图，如实施例9.8中所述，定向与图24A相同。
[图25B]
图25B显示H70及其环境之间的相互作用，如实施例9.8中所述。该组氨酸残基以棍和网表示法指示。氢键以点线指示。
[图25C]
图25C显示H72及其环境之间的相互作用，如实施例9.8中所述。该组氨酸残基以棍和网表示法指示。氢键以点线指示。
[图25D]
图25D显示H110及其环境之间的相互作用，如实施例9.8中所述。该组氨酸残基以棍和网表示法指示。H110和H-CDR3_H100c之间的距离以点线显示。
具体实施方案
本文中描述或引用的技术和方法是本领域技术人员使用常规方法学通常很好理解并且常规使用的，如，例如，以下中所述的广泛使用的方法Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等,eds.,(2003))；系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow和Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley&Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等,eds.,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley&Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)。
I.定义
除非另外限定，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)以及March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)给本领域技术人员提供了对本申请中所用众多术语的一般指导。本文中引用的所有文献(包括专利申请和出版物)通过引用完整地结合。
为了解释本申请，以下定义将适用并且当合适时，单数使用的术语也将包括复数并且反之亦然。要理解的是，本文中使用的技术仅是为了描述特别的实施方案，并且不意在是限制性的。如果以下给出的任何定义与通过引用结合在本文中的任何文献有冲突，以以下给出的定义为准。
用于本文中的目的的"受体人框架"是包含来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如以下所限定。"来源于"人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL受体人框架的序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
"亲和力"是指分子(例如，抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的力量总和。除非另外指出，如本文中使用的，"结合亲和力"是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)代表。亲和力可以通过本领域中已知的常规方法测量，所述方法包括本文中所述的那些。以下描述测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。
"亲和力成熟"抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变(相比于不具有此种改变的亲本抗体)的抗体，此种改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
术语"抗-C5抗体"和"结合C5的抗体"是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合C5以致所述抗体可用作用于靶向C5的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-C5抗体与不相关的、非C5蛋白的结合程度小于所述抗体与C5结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合C5的抗体的解离常数(Kd)为：≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗C5抗体结合C5的表位，所述表位在来源于不同物种的C5之间是保守的。
术语"抗体"在本文中以最广义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要其显示所需的抗原结合活性即可。
"抗体片段"是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参比抗体"结合相同表位的抗体"是指这样的抗体，所述抗体在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原的结合，和/或相反地，参比抗体在竞争测定中阻断所述抗体与其抗原的结合。示例性竞争测定提供在本文中。
术语"嵌合"抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的"分类"是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。主要有五类抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的一些可以被进一步划分成亚类(同种异型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。对应于不同的类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域被分别称为α，δ，ε，γ，和μ。
如本文中使用的，术语"细胞毒性剂"是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或毁坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamycin)，长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊甙(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌合剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶学活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
"效应子功能"是指可归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种异型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导性细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
试剂(例如，药物制剂)的"有效量"是指实现所需的治疗或预防结果所必要的剂量和时间的有效量。
术语"表位"包括任何能够被抗体结合的决定簇。表位是抗原的被靶向所述抗原的抗体结合的区域，并且包括与抗体直接接触的特定氨基酸。表位决定簇可以包括分子如氨基酸，糖侧链，磷酰基或磺酰基的化学活性表面簇集，并且可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。通常，对于特别的靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子的复合物混合物中的靶抗原上的表位。
在本文中，术语"Fc区"被用于限定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可能存在也可能不存在。除非本文中另外指出，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，其也被称为EU指数，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所限定的。
"框架"或"FR"是指不同于高变区(HVR)残基的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，在VH(或VL)中HVR和FR序列通常以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语"全长抗体"、"完整抗体"和"全抗体"在本文中被可交换地用于指示这样的抗体，所述抗体具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有含有如本文中所限定的Fc区的重链。
术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"被可交换地用于指示被引入外源核酸的细胞，包括此种细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化的细胞"，其包括转化的原代细胞及来源于其的后代(不考虑传代次数)。后代的核酸内容可以与亲本细胞不完全相同，并且可以含有突变。本文中包括具有与对于原始转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。
"人抗体"是这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
"人共有框架"是这样的框架，其代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH出版91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如以上Kabat等中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如以上Kabat等中那样的亚组III。
"人源化"抗体是指一种嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个(并且典型地，两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的"人源化形式"，例如，非人抗体，是指已经进行人源化的抗体。
如本文中使用的术语"高变区"或"HVR"是指抗体可变结构域中序列高变("互补决定区"或"CDR")和/或形成结构确定的环("高变环")和/或含有与抗原接触的残基("抗原触点")的各区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中示例性HVR包括：(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)处的高变环(Chothia,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)处的CDR(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,NIH,Bethesda,MD(1991))；(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另外指出，在本文中，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)根据以上Kabat等编号。
"免疫缀合物"是与一个或多个包括但不限于细胞毒性剂的异源分子缀合的抗体。
"个体"或"受试者"是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴子)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
"分离的"抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如由例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
"分离的"核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，所述核酸分子被包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但是所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
"编码抗-C5抗体的分离的核酸"是指一个或多个编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单个载体或在分开的载体中的此种核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此种核酸分子。
如本文中使用的术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，包括所述群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除可能的变体抗体以外，例如，含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的制备过程中产生，此种变体通常少量存在。对比于多克隆抗体制剂(通常包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。因此，定语"单克隆"指示抗体的性质为获得自基本上同源的抗体群体，并且不视为要求通过任何特定的方法制备所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA法，噬菌体展示法，以及利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这样的方法以及其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。
"裸抗体"是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
"天然抗体"是指天然存在的具有多种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由通过二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链组成。从N端到C端，各重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，各轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是轻链恒定(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配至两种类型之一，被称为κ(κ)和λ(λ)。
术语"包装插页"用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的使用说明，其含有关于此种治疗产品的适应证，用途，剂量，给药，组合疗法，禁忌证和/或使用警告。
相对于参比多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"被定义为在对序列进行比对并且在必要时引入空隙(gap)以实现最大百分比序列同一性，而不将任何保守置换认为是序列同一性的一部分后，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以在本领域中的技术内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本文来说，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech,Inc.，并且源代码已经与用户文件一起被提交于美国版权局,Washington D.C.,20559，其以美国版权登记号TXU510087被登记。公众可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California获得ALIGN-2程序，或者所述程序可自源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译为用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不需要改变。
在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A与或相对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地表述为给定氨基酸序列A与或相对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性)计算如下：100乘以分数X/Y；其中X是在A和B的程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中氨基酸残基的总数。要理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确指出，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语"药物制剂"是指这样的制剂，其具有的形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对将被施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
"药用载体"是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒性的。药用载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的术语"C5"包括来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如，人和猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的任何天然C5。除非另外指出，术语"C5"是指具有SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列并且含有SEQ ID NO:40中所示的β链序列的人C5蛋白。该术语包括"全长"未加工的C5以及来源于细胞中的加工的任何形式的C5。该术语还包括天然存在的C5的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例人C5的氨基酸序列显示在SEQ IDNO:39中("野生型"或"WT"C5)。人C5的示例的β链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:40中。人C5的β链的示例的MG1，MG2和MG1-MG2结构域的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:41，42和43中。示例的食蟹猴和鼠C5的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:44和105中。SEQ ID NO:39，40，43，44，和105的氨基酸残基1-19对应于信号序列，其在细胞中的加工期间被除去并且因此在相应的示例的氨基酸序列中找不到。
如本文中使用的，"治疗(treatment)"(及其语法上的变体如"治疗(treat)"或"治疗(treating)")是指尝试改变受治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，减轻症状，消除疾病的任何直接或间接的病理结果，防止转移，降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，以及消除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体被用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
术语"可变区"或"可变结构域"是指参与抗体抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中各结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman&Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以给予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以分别使用来自与所述抗原结合的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离。参见，例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
如本文中使用的，术语"载体"是指能够使与其相连的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及结合到引入有其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。此种载体在本文中被称为"表达载体"。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于抗-C5抗体及其用途。在某些实施方案中，提供结合C5的抗体。本发明的抗体可用于例如疾病的诊断或治疗。
A.示例的抗-C5抗体
在一个方面，本发明提供结合C5的分离的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5的β链内的表位。在某些实施方案中，抗-C5抗体结合C5的β链的MG1-MG2结构域内的表位。在某些实施方案中，抗-C5抗体结合由C5的β链的氨基酸19-180组成的片段内的表位。在某些实施方案中，抗-C5抗体结合C5的β链的MG1结构域(SEQ ID NO:40的氨基酸20-124(SEQ ID NO:41))内的表位。在某些实施方案中，抗-C5抗体结合由C5的β链(SEQ IDNO:40)的氨基酸33-124组成的片段内的表位。在另一个实施方案中，所述抗体不结合比由C5的β链的氨基酸33-124组成的片段短的片段，例如，由C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸45-124，52-124，33-111，33-108或45-111组成的片段。
在另一个方面，本发明提供抗-C5抗体，所述抗体显示pH依赖性的结合性质。如本文中使用的，表述"pH依赖性的结合"表示抗体"在酸性pH显示的与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"(对于本公开，两种表达可以可交换地使用)。例如，"具有pH依赖性的结合性质"的抗体包括在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体在中性pH下结合C5的亲和力是在酸性pH的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在一些实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4下结合C5的亲和力是在pH5.8的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。
对于本公开，抗体对C5的"亲和力"以抗体的KD表示。抗体的KD是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。抗体结合其抗原的KD值越大，其对所述具体抗原的结合亲和力越弱。因此，如本文中使用的，表述"在中性pH的亲和力比在酸性pH下更高"(或等价表述"pH依赖性的结合")是指在酸性pH抗体结合C5的KD高于在中性pH抗体结合C5的KD。例如，在本发明的语境中，如果在酸性pH抗体结合C5的KD是在中性pH抗体结合C5的KD的至少2倍高，则认为抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。因此，本发明包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合C5的KD是所述抗体在中性pH下结合C5的KD至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。
在另外的实施方案中，如果在pH5.8抗体结合C5的KD是在pH7.4抗体结合C5的KD的至少2倍高，则认为抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在一些实施方案中，提供的抗体在pH5.8结合C5的KD是所述抗体在pH7.4下结合C5的KD的至少3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M或更大。
抗体对特定抗原的结合性质也可以表示为抗体的kd。抗体的kd是指抗体关于特定抗原的解离速率常数并且以单位秒的倒数(即，sec-1)表示。kd值的增加指示抗体与其抗原的结合较弱。本发明因此包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合C5的kd值比在中性pH更高。本发明包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合C5的kd是所述抗体在中性pH下结合C5的kd的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的kd值可以为10-21/s，10-3 1/s，10-4 1/s，10-5 1/s，10-6 1/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的kd值可以为10-3 1/s，10-2 1/s，10-1 1/s以上。本发明还包括这样的抗体，所述抗体在pH5.8结合C5的kd值比在pH7.4更高。本发明包括这样的抗体，所述抗体在pH5.8结合C5的kd是所述抗体在pH7.4下结合C5的kd的至少3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的kd值可以为10-2 1/s，10-31/s，10-4 1/s，10-5 1/s，10-6 1/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的kd值可以为10-3 1/s，10-2 1/s，10-1 1/s以上。
在某些情况中，"在酸性pH与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"被表示为抗体在酸性pH结合C5的KD值与抗体在中性pH下结合C5的KD值之比(或反之亦然)。例如，对于本发明，如果抗体显示2以上的酸性/中性KD比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4KD比为2以上。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的酸性/中性KD比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10- 10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。在另外的情况中，对于本发明来说，如果抗体显示2以上的pH5.8/pH7.4KD比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4KD比可以为3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。
在某些情况中，"在酸性pH与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"被表示为抗体在酸性pH结合C5的kd值与抗体在中性pH下结合C5的kd值之比(或反之亦然)。例如，对于本发明，如果抗体显示2以上的酸性/中性kd比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与C5的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4kd比为2以上。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的酸性/中性kd比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另外的示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4kd比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的kd值可以为10-2 1/s，10-3 1/s，10-4 1/s，10-51/s，10-6 1/s以下。在另一个实施方案中，抗体在pH 7.4的kd值可以为10-21/s，10-3 1/s，10-4 1/s，10-5 1/s，10-6 1/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的kd值可以为10-3 1/s，10-2 1/s，10-1 1/s以上。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的kd值可以为10-3 1/s，10-2 1/s，10-1 1/s以上。
如本文中使用的，表述"酸性pH"是指4.0至6.5的pH。表述"酸性pH"包括4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5中任一个的pH值。在特别的方面，"酸性pH"是5.8。
如本文中使用的，表述"中性pH"是指6.7至约10.0的pH。表述"中性pH"包括6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9和10.0中任一个的pH值。在特别的方面，"中性pH"是7.4。
如本文中表示的，KD值以及kd值可以使用基于表面等离子共振的生物传感器来确定以表征抗体-抗原相互作用。(参见，例如，本文中的实施例3)。KD值和kd值可以在25℃或37℃确定。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合由C5的β链内MG1结构域(SEQ ID NO:41)组成的表位。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的片段：氨基酸47-57，70-76，和107-110。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Thr47，Glu48，Ala49，Phe50，Asp51，Ala52，Thr53，Lys57，His70，Val71，His72，Ser74，Glu76，Val107，Ser108，Lys109，和His110。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109，和His110。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与C5突变体的结合相比其与野生型C5的结合减弱，其中所述C5突变体具有至少一个在选自由以下组成的组的位置处的氨基酸置换：Glu48，Asp51，His72，和Lys109。在另一个实施方案中，本发明的抗-C5抗体与C5突变体的pH-依赖性结合相比其与野生型C5的pH-依赖性结合减弱，其中所述C5突变体具有至少一个在选自由以下组成的组的位置处的氨基酸置换：His70，His72，和His110。在另一个实施方案中，在C5突变体中，选自Glu48，Asp51和Lys109的位置处的氨基酸被置换成丙氨酸，并且选自His70，His72和His110的位置处的氨基酸被置换成酪氨酸。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(b)SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:26的VL；(c)SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:25的VL；(d)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(e)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(f)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(g)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(h)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(i)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(j)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(k)SEQID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；(l)SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；和(m)SEQID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5并且接触SEQ ID NO:39的氨基酸Asp51(D51)。在另外的实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5并且接触SEQ ID NO:39的氨基酸Lys109(K109)。在另一个实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合C5并且接触SEQ ID NO:39的氨基酸Asp51(D51)和氨基酸Lys109(K109)。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与C5突变体的结合相比其与野生型C5的结合减弱，其中所述C5突变体具有SEQ ID NO:39的Glu48Ala(E48A)置换。在另一个实施方案中，本发明的抗-C5抗体与C5突变体的pH-依赖性结合相比其与野生型C5的pH-依赖性结合减弱，其中所述C5突变体具有SEQ ID NO:39的Glu48Ala(E48A)置换。
在另一个实施方案中，抗-C5抗体结合由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白，但是不结合由具有H72Y置换的SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白，其中所述C5蛋白和具有H72Y置换的C5蛋白在相同条件下制备和筛选。在另一个实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的C5蛋白，但是在pH7.4下不结合具有H72Y置换的C5蛋白。
不受限于特定理论，可以预期的是，当C5上的一个氨基酸残基被置换成另一个氨基酸时抗-C5抗体与C5的结合减弱(或几乎丧失)，这意味着C5上的所述氨基酸残基对于抗-C5抗体和C5之间的相互作用是关键的，并且所述抗体可以识别C5上所述氨基酸残基周围的表位。
本发明中已经发现，一组彼此竞争或结合相同表位的抗-C5抗体可以显示pH-依赖性结合特征。在氨基酸中，pKa值为约6.0至6.5的组氨酸在中性和酸性pH之间可以具有不同的质子解离状态。因此，C5上的组氨酸残基可以助力于抗-C5抗体和C5之间的pH-依赖性相互作用。不受限于特定理论，可以预期的是，抗-C5抗体可以识别C5上的组氨酸残基附近的构象结构，所述结构根据pH而可变。该预期可以与以下描述的实验结果相一致：当C5上的组氨酸残基被置换成另一种氨基酸时，抗-C5抗体的pH-依赖性减弱(或几乎丧失)(即，在中性pH，具有pH-依赖性结合特征的抗-C5抗体以与野生型C5类似的亲和力结合C5的组氨酸突变体，而在酸性pH，相同的抗体以比野生型C5更高的亲和力结合C5的组氨酸突变体)。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体结合来自超过一种物种的C5。在另外的实施方案中，抗-C5抗体结合来自人和非人动物的C5。在另外的实施方案中，抗-C5抗体结合来自人和猴(例如，食蟹猴，猕猴，狨猴，黑猩猩或狒狒)的C5。
在一个方面，本发明提供抑制C5的活化的抗-C5抗体。在某些实施方案中，提供抗-C5抗体，其阻止C5切割以形成C5a和C5b，因此阻止产生与C5a相关的过敏毒素活性，并且阻止与C5b相关的C5b-9膜攻击复合物(MAC)的组装。在某些实施方案中，提供抗-C5抗体，其阻断通过C5转化酶的C5向C5a和C5b的转化。在某些实施方案中，提供抗-C5抗体，其阻止C5转化酶接近C5上的切割位点。在某些实施方案中，提供抗-C5抗体，其阻断由C5的活化引起的溶血活性。在另外的实施方案中，本发明的抗-C5抗体经由经典途径和/或旁路途径抑制C5的活化。
在一个方面，本发明提供抗-C5抗体，其抑制C5变体的活化。C5变体是指由于遗传变化如突变，多态性或等位变化所致的C5的遗传变体。遗传变化可以包括一个或多个核苷酸的缺失，置换或插入。C5变体可以包含在C5中的一个或多个遗传变化。在某些实施方案中，C5变体具有与野生型C5相似的生物学活性。此种C5变体可以包含至少一个选自由以下组成的组的改变：V145I，R449G，V802I，R885H，R928Q，D966Y，S1310N，和E1437D。在本文中，例如，R885H表示这样的遗传变化，其中位置885处的精氨酸被组氨酸置换。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体抑制野生型C5和至少一个选自由V145I，R449G，V802I，R885H，R928Q，D966Y，S1310N，和E1437D组成的组的C5变体两者的激活。
在一个方面，本发明提供抗-C5抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的高可变区(HVR)：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45-54中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55-64中任一个的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75-84中任一个的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45-54中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55-64中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，HVR-L3和HVR-H2，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95-104中任一个的氨基酸序列，所述HVR-H2包含SEQ IDNO:55-64中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45-54中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ IDNO:55-64中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75-84中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75-84中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45-54中任一个的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55-64中任一个的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75-84中任一个的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ IDNO:95-104中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:45-54中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55-64中任一个的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75-84中任一个的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗-C5抗体，所述抗-C5抗体包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，HVR-L3和HVR-H2，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个，或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，如以上所提供的抗-C5抗体中的任一个或多个氨基酸在以下HVR位置处被置换：(a)在HVR-H1(SEQ ID NO:45)中，在位置5和6处；(b)在HVR-H2(SEQ IDNO:55)中，在位置1，3，9，11，13和15处；(c)在HVR-H3(SEQ ID NO:65)中，在位置2，5，6，12和13处；(d)在HVR-L1(SEQ ID NO:75)中，在位置1，5，7和9处；(e)在HVR-L2(SEQ ID NO:85)中，在位置4，5和6处；和(f)在HVR-L3(SEQ ID NO:95)中，在位置2，4和12处。
在某些实施方案中，所述置换是保守置换，如本文中所述。在某些实施方案中，以下置换中的任一个或多个可以以任意组合进行：(a)在HVR-H1(SEQ ID NO:45)中，M5V或C6A；(b)在HVR-H2(SEQ ID NO:55)中，C1A或G，Y3F，T9D或E，Y11K或Q，S13D或E，或A15V；(c)在HVR-H3(SEQ ID NO:65)中，G2A，V5Q或D，T6Y，Y12H，或L13Y；(d)在HVR-L1(SEQ ID NO:75)中，Q1R，N5Q或G，G7S，D9K或S；(e)在HVR-L2(SEQ ID NO:85)中，K4T或E，L5T，或A6H，A6E，或A6Q；(f)在HVR-L3(SEQ ID NO:95)中，C2S，C2N，或C2T，F4K；或A12T或A12H。
以上置换的所有可能的组合分别被HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3，HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3的共有序列SEQ ID NO:126，127，128，129，130和131涵盖。
在任一以上实施方案中，抗-C5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗-C5抗体包含以上任一实施方案中的HVR，并且还包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗-C5抗体包含以上任一实施方案中的HVR，并且还包含VH或VL，所述VH或VL包含FR序列，其中所述FR序列如下。对于重链可变结构域，FR1包含SEQ IDNO:132-134中任一个的氨基酸序列，FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一个的氨基酸序列，FR3包含SEQ ID NO:137-139中任一个的氨基酸序列，FR4包含SEQ ID NO:140-141中任一个的氨基酸序列。对于轻链可变结构域，FR1包含SEQ ID NO:142-143中任一个的氨基酸序列，FR2包含SEQ ID NO:144-145中任一个的氨基酸序列，FR3包含SEQ ID NO:146-147中任一个的氨基酸序列，FR4包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-C5抗体包含与SEQ ID NO:1-10中任一个的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1-10中的任一个中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:1-10中任一个中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45-54中任一个的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55-64中任一个的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65-74中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:11-20中任一个的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:11-20中的任一个中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:11-20中的任一个中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:75-84中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:85-94中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95-104中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含以上提供的实施方案中的任一个中的VH和以上提供的实施方案中的任一个中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:1-10中的任一个和SEQ ID NO:11-20中的任一个中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一个方面，抗-C5抗体包含与SEQ ID NO:10，106-110中任一个的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10，106-110中任一中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:10，106-110中任一中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:10，106-110中任一个的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10，106-110中任一中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:10，106-110中任一中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:45，54，117，126中任一个的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:55，64，118-120，127中任一个的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:65，74，121，128中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:10。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:10中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:54，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:64，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:74。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:106具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:106。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:106中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:106中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQID NO:117，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:118，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:107具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:107。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:107中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:107中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQID NO:117(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:119，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:108具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:108。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:108中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:108中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQID NO:117(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:118，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:109具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:109。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:109中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:109中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQID NO:117(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:118，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121。
在另一个方面，抗-C5抗体包含VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ ID NO:110具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性。在某些实施方案中，VH序列是氨基酸序列SEQ ID NO:110。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:110中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:110中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQID NO:117(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:120，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:20，111-113中任一个的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:20，111-113中任一中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:20，111-113中任一中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:75，84，122，129中任一个的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ IDNO:85，94，123-124，130中任一个的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:95，104，125，131中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的VL。在某些实施方案中，VL序列是氨基酸序列SEQ ID NO:20。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:20中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:20中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ IDNO:84；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:94；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:104。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:111具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的VL。在某些实施方案中，VL序列是氨基酸序列SEQ ID NO:111。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:111中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:111中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:123；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:112具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的VL。在某些实施方案中，VL序列是氨基酸序列SEQ ID NO:112。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:112中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:112中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:123；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:113具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的VL。在某些实施方案中，VL序列是氨基酸序列SEQ ID NO:113。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守置换)，插入或缺失，但是包含所述序列的抗-C5抗体保持结合C5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:113中的总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换，插入，或缺失发生在HVR外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗-C5抗体包含SEQ ID NO:113中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:124；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含以上提供的任一实施方案中的VH和以上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:10，106-110中任一和SEQ ID NO:20，111-113中任一中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:20的VL序列。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:106的VH序列和SEQ ID NO:111的VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:107的VH序列和SEQ ID NO:111的VL序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:108的VH序列和SEQ ID NO:111的VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:109的VH序列和SEQ ID NO:111的VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:109的VH序列和SEQ ID NO:112的VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:109的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:110的VH序列和SEQ ID NO:113的VL序列。
在一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含包含以下的VH序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:54，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ IDNO:64，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:74，和包含以下的VL序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:84；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:94；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:104。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含包含以下的VH序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:117，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:118，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121，和包含以下的VL序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:123；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含包含以下的VH序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:117，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:119，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121，和包含以下的VL序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:123；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含包含以下的VH序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:117，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:118，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121，和包含以下的VL序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:124；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在另一个方面，提供抗-C5抗体，其中所述抗体包含包含以下的VH序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:117，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:120，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:121，和包含以下的VL序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:122；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:124；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:125。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体包含以上提供的任一实施方案中的VH和包含SEQ ID NO:33，34，35，114，115，和116中任一个的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体包含以上提供的任一实施方案中的VL和包含SEQ ID NO:36，37，和38中任一个的氨基酸序列的轻链恒定区。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体与本文中提供的抗-C5抗体结合相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与表2中所述的抗体结合相同的表位。如由以下工作实施例所证明的，表2中所述的所有抗-C5抗体都被分组到C5的相同的表位框中并且显示pH-依赖性结合特征。
在另外的方面，本发明提供抗体，所述抗体与本文中提供的抗体结合相同的表位。在另外的方面，本发明提供抗体，所述抗体与表7或8中所述的抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合由C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸33-124组成的片段内的表位。在某些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的片段：氨基酸47-57，70-76，和107-110。在某些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合C5的β链(SEQ ID NO:40)的片段内的表位，所述表位包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Thr47，Glu48，Ala49，Phe50，Asp51，Ala52，Thr53，Lys57，His70，Val71，His72，Ser74，Glu76，Val107，Ser108，Lys109，和His110。在另一个实施方案中，本发明的抗-C5抗体的表位是构象表位。
在本发明的另一个方面，根据任意以上实施方案的抗-C5抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗-C5抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab'，scFv，双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1或IgG4抗体或本文中限定的其他抗体类别或同种型。
在另一个方面，根据任意以上实施方案的抗-C5抗体可以结合以下1-7节中所述任意特征(单独地或组合地)。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有的解离常数(Kd)为：≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，利用目的抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下方式测量：在存在未标记抗原的滴定系列的情况下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定测定条件，将MICROTITER(注册商标)多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)过夜包被，并且随后用在PBS中的2％(w/v)胎牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以保证实现平衡。其后，将混合物转移至捕获平板用于室温孵育(例如，持续一小时)。然后除去溶液并将平板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册商标))洗涤八次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将平板在TOPCOUNTTMγ计数仪(Packard)上计数十分钟。选择导致小于或等于20％的最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，Kd使用BIACORE(注册商标)表面等离子共振测定测量。例如，在25℃利用固定化抗原CM5芯片以～10响应单位(RU)进行使用BIACORE(注册商标)-2000或BIACORE(注册商标)-3000(BIACORE(注册商标),Inc.,Piscataway,NJ)的测定。在一个实施方案中，根据提供者的使用说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE(注册商标),Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的约10个响应单位(RU)。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。使用简单一对一(one-to-one)朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE(注册商标)Evaluation Software版本3.2)通过同时拟合结合和解离感应图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为koff/kon之比计算平衡解离常数(Kd)。参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子共振测定测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过以下方式确定结合速率：如在分光计如配备有截流装置(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌室的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的，使用测量在存在增加浓度的抗原的情况下，在25℃，在PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减小的荧光猝灭技术(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2，Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见，WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中也描述了三元抗体和四元抗体。
单结构域抗体是这样的抗体片段，其包含抗体的全部或部分的重链可变结构域或全部或部分的轻链可变结构域。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516)。
抗体片段可以通过多种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的制备，如本文中所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体被描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体是"类型转换"抗体，其中类型或亚类已经由亲本抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)来源于非人抗体，和FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被置换成来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法被综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且被进一步描述于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了"表面再建(resurfacing)")；Dall'Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了"FR改组(shuffling)")；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)以及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的"定向选择"方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用"最佳匹配(best-fit)"方法选择的框架区(参见，例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟(体突变)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于FR文库筛选的框架区(参见，例如，Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备。人抗体被一般性地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharma.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人抗体可以通过向已被改良成生产完整人抗体或具有人可变区的完整抗体以响应抗原攻击的转基因动物施用免疫原来制备。此种动物典型地含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外部或被随机整合到动物的染色体中。在此种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于由转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述了HUMAB(注册商标)技术；美国专利号7,041,870，其描述了K-M MOUSE(注册商标)技术，和美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述了VELOCIMOUSE(注册商标)技术)。来自由此种动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已被描述。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.147:86(1991)。)。经由人B-细胞杂交瘤技术制备的人抗体也被描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括在例如美国专利号7,189,826(描述了由杂交瘤细胞系制备单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也被描述于Vollmers,Histology andHistopathology 20(3):927-937(2005)以及Vollmers,Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191(2005)中。
人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。此种可变结构域序列然后可以与所需的人恒定结构域组合。以下描述用于由抗体文库选择人抗体的技术。
5.来源于文库的抗体
本发明的抗体可以通过筛选具有所需一种或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域中已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并且针对具有所需结合性质的抗体筛选所述文库。此种方法被综述于例如Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并被进一步描述于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,Meth.Mol.Biol.,248:161-175(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以针对结合抗原的噬菌体筛选所述文库，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)中所述。噬菌体典型地将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自被免疫的来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然(naive)库(例如，由人)从而向多种非自身抗原以及自身抗原提供单一来源的抗体而不需要进行任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过以下方式合成制备天然文库：自干细胞克隆未重排的V-基因区段，并且使用含随机序列的PCR引物以编码高变CDR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373和美国公布号2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
在本文中，分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是这样的单克隆抗体，其对至少两个不同的位点具有结合特异性。在某些实施方案中，一个结合特异性是针对C5而另一个是针对另一种抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合C5的两个不同的表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达C5的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段被制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，和"突出-孔(knob-in-hole)"工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过工程改造用于制备抗体Fc-异源二聚分子的静电导向作用来制备(WO 2009/089004A1)；交联两个以上抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以制备双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用"双抗体"技术以用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所述。
本文中还包括具有三个以上功能抗原结合位点的经改造的抗体，包括"章鱼抗体"(参见，例如，US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括"双重作用FAb"或"DAF"，其包含结合C5以及另一种不同的抗原的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，理想的是提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码所述抗体的核苷酸序列引入合适的修饰或通过肽合成来制备。此种修饰包括，例如，自抗体氨基酸序列的缺失，和/或向抗体氨基酸序列中的插入和/或置换抗体氨基酸序列内的残基。可以进行缺失，插入和置换的任意组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所需的特征，例如，抗原-结合。
a.置换，插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守置换显示在表1中的"优选置换"的标题下。更多的改变被提供在表1中的"示例性置换"的标题下并且如以下关于氨基酸侧链分类进一步所述。氨基酸置换可以被引入目的抗体和进行所需活性(例如，保持的/提高的抗原结合，降低的免疫原性或提高的ADCC或CDC)筛选的产品中。
[表1]
最初残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
根据共有侧链性质可以将氨基酸分组为：(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)碱性：His，Lys，Arg；(5)影响链定向的残基：Gly，Pro；和(6)芳香性：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换需要将这些组之一的成员换成另一组的成员。
一种置换变体包括置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得的变体相对于亲本抗体将具有某些生物学性质(例如，增加的亲和力，减小的免疫原性)的改变(例如，提高)和/或将基本上保持亲本抗体的某些生物学性质。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文中描述的那些)常规制备。简言之，将一个或多个HVR残基突变并将变体抗体展示在噬菌体上并且筛选特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。
改变(例如，置换)可以在HVR中进行，例如，以提高抗体亲和力。此种改变可以在HVR"热点"中进行，所述HVR"热点"即在体细胞成熟过程期间以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基，测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并自其进行再选择的亲和力成熟已被描述于例如Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选所述文库以鉴定任何具有所需亲和力的抗体变体。引入多样性的另一种方法包括HVR定向方法，其中若干HVR残基(例如，同时4-6个残基)被随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，具体鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，CDR-H3和CDR-L3通常被靶向。
在某些实施方案中，置换，插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这样的改变不显著减小抗体结合抗原的能力。例如，不显著减小结合亲和力的保守改变(例如，本文中所述的保守置换)可以在HVR中进行。此种改变可以例如在HVR中接触抗原的残基的外部。在上述提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR是未改变的，或含不超过一个，两个或三个氨基酸置换。
可用于鉴定可被靶向用于诱变的抗体残基或区域的方法被称为"丙氨酸扫描诱变"，如Cunningham，Science 244:1081-1085(1989)所述。在该方法中，一个残基或一组目标残基(例如，带电荷的残基如arg，asp，his，lys和glu)被鉴定并被中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。备选地，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗体和抗原之间的接触点。此种接触残基及相邻残基可以被靶向或被排除作为用于置换的候选物。可以筛选变体以确定其是否具有所需的性质。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基至含一百个以上残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N端或C端与增加抗体血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
b.糖基化变体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体被改变成增加或减小抗体被糖基化的程度。向抗体添加糖基化位点或使其缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以致产生或除去一个或多个糖基化位点来容易实现。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含支链的，分两支的(biantennary)寡糖，所述寡糖通常通过N-连接连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及与分两支的寡糖结构的“茎”中的GlcNAc相连的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明抗体中的寡糖的修饰以产生具有特定改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺少与Fc区(直接或间接)相连的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此种抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算相对于与Asn 297相连的所有糖结构(例如复合物，杂合物和高甘露糖结构)的总和的Asn297处的糖链内的岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，如WO 2008/077546中所述，例如。Asn297是指位于Fc区的位置297(Fc区残基的Eu编号)附近的天冬氨酸残基；然而，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的约+/-3个氨基酸处，即，在位置294和300之间。此种岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及"去岩藻糖基化"或"岩藻糖缺陷型"抗体的公开的实例变体包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够制备去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷型Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108，Presta,L；和WO 2004/056312，Adams等，特别是实施例11)，以及敲除的细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还提供具有被二等分的寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区相连的分两支的寡糖被GlcNAc二等分。此种抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。此种抗体变体的实例被描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在与Fc区相连的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此种抗体变体可以具有提高的CDC功能。此种抗体变体被描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c.Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入到本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑这样的抗体变体，其具有一些但非全部效应子功能，这使其对于抗体体内半衰期是重要的而某些效应子功能(如补体和ADCC)非必要或有害的应用是理想的候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减小/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以保证抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保持FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达被概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例被描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom等Proc.Nat'l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom等,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。备选地，可以使用非放射性测定法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox 96(注册商标)非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于此种测定的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内，例如在如Clynes等Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所述的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg等,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg等,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova等,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减小的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此种Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个以上处具有置换的Fc突变体，包括所谓的残基265和297置换至丙氨酸的"DANA"Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有提高的或减少的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含Fc区，所述Fc区具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换，例如，Fc区的位置298，333和/或334(残基的EU编号)处的置换。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致改变的(即，提高的或减小的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 1999/51642，和Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934(Hinton等)中描述了这样的抗体，其具有增加的半衰期和提高的与负责将母体IgG转送至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合。所述抗体包含具有其中的一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。此种Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。
也参见，Duncan，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及涉及Fc区变体的其他实例的WO 1994/29351。
d.半胱氨酸工程改造抗体变体
在某些实施方案中，可能理想的是制备半胱氨酸工程改造抗体，例如，"thioMAb"，其中抗体的一个或多个残基被置换成半胱氨酸残基。在特别的实施方案中，置换的残基出现在抗体的接入位点处。通过将所述残基置换成半胱氨酸，反应性硫醇基团由此被置于抗体的接入位点处并且可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，从而产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，以下残基中的任意一个或多个可以被置换成半胱氨酸：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e.抗体衍生物
在某些实施方案中，本文中提供的抗体可以被进一步修饰从而含有本领域中已知的并且可容易获得的另外的非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧杂环戊烷，聚-1,3,6-三
Figure BDA0001356706070000601
烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制备中可以是有利的。聚合物可以具有任意分子量，并且可以是分支的或非分支的。与抗体相连的聚合物的数目可以变化，并且如果连接超过一个聚合物，其可以是相同或不同的分子。通常，由于衍生化的聚合物的数量和/或种类可以基于以下考虑确定，包括但不限于，要改善的抗体的具体性质或功能，抗体衍生物是否可用于限定条件下的治疗，等等。
在另一个实施方案中，提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体与非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。所述辐射可以具有任意波长，并且包括但不限于这样的波长，所述波长不损害正常细胞，但是将非蛋白部分加热至邻近抗体-非蛋白部分的细胞被杀死的温度。
B.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物制备，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供分离的核酸，其编码本文中所述的抗-C5抗体。此种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供一种或多种包含此种核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含此种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，转化有)：(1)载体，所述载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗-C5抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达如上所述的抗体的条件下培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组制备抗-C5抗体，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离并插入到一种或多种载体中用于在宿主细胞中的进一步克隆和/或表达。此种核酸可以使用常规方法容易地分离并测序(例如，使用能够特异结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还参见，Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊料分离到可溶级分中并且可以被进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母对于编码抗体的载体来说也是合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被"人源化"从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母株系。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以被用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以被用作宿主。例如，适合于悬浮培养的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(293或如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中制备多克隆抗体。可能有用的是使用双功能或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺基(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基，将相关抗原与在要被免疫的物种中具有免疫原性的蛋白(例如，钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合。
通过将例如100μg或5μg蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂合并并将溶液在多个位点进行皮内注射，使动物(通常是非人哺乳动物)针对抗原，免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过在多个位点处的皮下注射，用在弗氏完全佐剂中的1/5至1/10原有量的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7至14天后，给动物放血并且测定血清的抗体效价。对动物进行加强免疫直至效价平台。优选地，用与不同蛋白缀合和/或通过不同的交联剂缀合的相同抗原的缀合物对动物进行加强免疫。缀合物也可以作为蛋白融合物在重组细胞培养物中制备。此外，聚集剂如明矾适用于增强免疫应答。
单克隆抗体获得自基本上均质的抗体群体，即，构成所述群体的个体抗体除了可能少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化，酰胺化)以外是相同的。因此，定语"单克隆"指示不作为分立的抗体的混合物的抗体特征。
例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，所述方法首先由Kohler等，Nature256(5517):495-497(1975)描述。在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠)被如上文所述那样免疫以引起产生或能够产生与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。备选地，淋巴细胞可以在体外被免疫。
免疫试剂将典型地包括抗原蛋白或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)，或如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合试剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生的细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103)。
永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类，牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将因此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其是阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些细胞，所述细胞有效融合，支持所选择的抗体生产细胞稳定高水平的生产抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。其中，优选的是鼠骨髓瘤细胞系，如来源于可获得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可获得自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia USA)的SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系也被描述为用于生产人单克隆抗体(Kozbor等J Immunol.133(6):3001-3005(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63)。
对于针对抗原的单克隆抗体的生产，测定培养杂交瘤细胞的培养基。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此种技术和测定是本领域中已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson,Anal.Biochem.107(1):220-239(1980)的Scatchard分析确定。
在鉴定了产生具有所需特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可以通过有限稀释法被亚克隆并通过标准方法培养(Goding，同上)。适用于此目的的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为肿瘤在哺乳动物中体内培养。
通过常规免疫球蛋白纯化方法如，例如，蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳，透析，或亲和色谱合适地将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基，腹水或血清分离。
抗体可以通过针对抗原免疫合适的宿主动物来制备。在一个实施方案中，抗原是包含全长C5的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含C5的β链(SEQ ID NO:40)的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含C5的β链的MG1-MG2结构域(SEQ ID NO:43)的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含C5的β链的MG1结构域(SEQ ID NO:41)的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含对应于C5的β链的位置19至180处的氨基酸的区域的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含对应于C5的β链的位置33至124处的氨基酸的区域的多肽。在一个实施方案中，抗原是包含至少一个选自C5的β链(SEQ ID NO:40)的氨基酸47-57，70-76和107-110的片段的多肽。在一个实施方案中，抗原是这样的多肽，所述多肽包含C5的β链的片段，所述片段包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Thr47，Glu48，Ala49，Phe50，Asp51，Ala52，Thr53，Lys57，His70，Val71，His72，Ser74，Glu76，Val107，Ser108，Lys109，和His110。在一个实施方案中，抗原是这样的多肽，所述多肽包含C5的β链的片段，所述片段包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109，和His110。同样包括在本发明中的是通过针对所述抗原免疫动物制备的抗体。所述抗体可以结合以上"示例的抗-C5抗体"中所述的任何特征(单独地或组合地)。
C.测定
通过本领域已知的多种测定可以鉴定、筛选本文中提供的抗-C5抗体或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
1.结合测定和其他测定
在一个方面，例如，通过已知方法如ELISA，蛋白质印迹，BIACORE(注册商标)等来测试本发明的抗体的抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定可以用于鉴定与本文中所述的抗-C5抗体竞争结合C5的抗体。在某些实施方案中，当此种竞争抗体过量存在时，其阻断(例如，减少)参比抗体与C5的结合达至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％或更高。在一些情况中，结合被抑制达至少80％，85％，90％，95％或更高。在某些实施方案中，此种竞争抗体结合的表位(例如，线性或构象表位)与本文中所述的抗-C5抗体(例如，表2中所述的抗-C5抗体)结合的表位相同。用于将抗体结合的表位作图的详细的示例性方法提供在Morris"Epitope Mapping Protocols,"于Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press,Totowa,NJ)(1996)中。
在示例性竞争测定中，将固定的C5在溶液中孵育，所述溶液包含第一标记的(参比)抗体和第二未标记的抗体，所述第一标记的抗体结合C5，测试所述第二未标记的抗体与第一抗体竞争结合C5的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的C5在包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与C5结合的条件下孵育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定的C5结合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中，与固定的C5结合的标记的量显著减少，则这指示第二抗体与第一抗体竞争结合C5。参见，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1988)。
在另一个示例的竞争测定中，使用BIACORE(注册商标)分析来确定测试抗-C5抗体与第二(参比)抗-C5抗体竞争结合C5的能力。在根据生产商的推荐操作BIACORE(注册商标)仪器(例如，BIACORE(注册商标)3000)的另一个方面，使用本领域中已知的标准技术将C5蛋白捕获在CM5BIACORE(注册商标)芯片上从而产生C5涂覆的表面。典型地，将200-800个响应单位的C5偶联至芯片(所述量容易提供可测量水平的结合并且可容易地被使用的测试抗体的浓度饱和)。将要评估与彼此竞争能力的两种抗体(即，测试抗体和参比抗体)以1:1结合位点摩尔比混合在合适的缓冲液中以制备测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，测试或参比抗体的分子量被假定为将相应抗体的总分子量除以抗体上C5结合位点的数目。各抗体(即，测试抗体和参比抗体)在测试混合物中的浓度应当足够高以易于使结合位点对于捕获在BIACORE(注册商标)芯片上的C5分子上的所述抗体饱和。混合物中的测试和参比抗体处于相同的摩尔浓度(基于结合)，典型地为1.00至1.5μM(基于结合位点)。还制备单独的仅含测试抗体和仅含参比抗体的溶液。这些溶液中的测试抗体和参比抗体应当在与测试混合物中的相同的缓冲液中并且处于相同的浓度和条件。使含测试抗体和参比抗体的测试混合物在C5涂覆的BIACORE(注册商标)芯片上通过并且记录结合的总量。然后处理芯片以除去结合的测试或参比抗体而不破坏与芯片结合的C5。典型地，这通过用30mM HC1将芯片处理60秒进行。然后使单独的测试抗体的溶液在C5涂覆的表面上通过并且记录结合的量。再次处理芯片以去除所有结合的抗体而不破坏与芯片结合的C5。然后使单独的参比抗体的溶液在C5涂覆的表面上通过并记录结合的量。接下来计算测试抗体和参比抗体的混合物的最大理论结合，其是各抗体(即测试和参比)单独地在C5表面上通过时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则测试抗体和参比抗体彼此竞争结合C5。因此，通常，竞争测试抗-C5抗体是这样的，其在以上BIACORE(注册商标)封闭测定中结合C5以使得在测定期间并且在参比抗-C5抗体存在下，记录的结合为测试抗体和参比抗体的组合的最大理论结合(如以上所定义的)的80％至0.1％(例如，80％>至4％)，具体为最大理论结合的75％至0.1％(例如，75％至4％)，并且更具体地为最大理论结合的70％至0.1％(例如，70％至4％)。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自抗体CFA0341和CFA0330的VH和VL对的抗体竞争结合C5。在一些实施方案中，抗-C5抗体与选自以下的抗体竞争结合C5：CFA0538，CFA0501，CFA0599，CFA0307，CFA0366，CFA0675，和CFA0672。在一些实施方案中，抗-C5抗体与抗体CFA0329竞争结合C5。在一些实施方案中，抗-C5抗体与抗体CFA0666竞争结合C5。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含抗体CFA0305或305LO5的VH和VL对的抗体竞争结合C5。
在另外的实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：CFA0538，CFA0501，CFA0599，CFA0307，CFA0366，CFA0675，和CFA0672。在一些实施方案中，抗-C5抗体与抗体CFA0666竞争结合C5。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在另外的实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含抗体CFA0305或305LO5的VH和VL对的抗体竞争结合C5。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:26的VL，或SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:25的VL。在一些实施方案中，抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(b)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(c)SEQ IDNO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(d)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(e)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(f)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(g)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(h)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；和(i)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL。在一些实施方案中，抗-C5抗体与包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ IDNO:27的VL的抗体竞争结合C5。在一些实施方案中，抗-C5抗体与包含SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL的抗体竞争结合C5。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(b)SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:26的VL；(c)SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:25的VL；(d)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(e)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(f)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(g)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(h)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(i)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(j)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(k)SEQID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；(l)SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；和(m)SEQID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:26的VL；(b)SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:25的VL；(c)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(d)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(e)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(f)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(g)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(h)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(i)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(j)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；(k)SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在某些实施方案中，本发明的抗-C5抗体与包含选自SEQ ID NO:1的VH和SEQ IDNO:11的VL，或SEQ ID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL的VH和VL对的抗体竞争结合C5。
在另外的实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高。在某些实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高并且与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(b)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(c)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(d)SEQID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(e)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(f)SEQ IDNO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(g)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(h)SEQ ID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；(i)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL；和(j)SEQ ID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在一些实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高并且与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5：(a)SEQ ID NO:5的VH和SEQ ID NO:15的VL；(b)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:14的VL；(c)SEQ ID NO:6的VH和SEQ ID NO:16的VL；(d)SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:12的VL；(e)SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:13的VL；(f)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL；(g)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:19的VL；(h)SEQID NO:7的VH和SEQ ID NO:17的VL；和(i)SEQ ID NO:8的VH和SEQ ID NO:18的VL。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在一些实施方案中，抗-C5抗体在中性pH下结合C5的亲和力比在酸性pH下更高并且与包含选自SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:11的VL，或SEQ ID NO:10的VH和SEQ ID NO:20的VL的VH和VL对的抗体竞争结合C5。在另外的实施方案中，抗-C5抗体在pH7.4下结合C5的亲和力比在pH5.8更高。
在某些实施方案中，可以如下确定本发明的抗-C5抗体是否结合特定表位：将C5上的氨基酸(除丙氨酸外)被置换成丙氨酸的C5点突变体在293细胞中表达，并且经由ELISA，蛋白印迹或BIACORE(注册商标)测试抗-C5抗体与C5突变体的结合；其中抗-C5抗体与C5突变体的结合相对于其与野生型C5的结合显著减弱或消除指示抗-C5抗体结合C5上包含所述氨基酸的表位。在某些实施方案中，C5上要被置换成丙氨酸的氨基酸选自由以下组成的组：C5的β链(SEQ ID NO:40)的Glu48，Asp51，His70，His72，Lys109，和His110。在另外的实施方案中，C5上要被置换成丙氨酸的氨基酸是C5的β链(SEQ ID NO:40)的Asp51或Lys109。
在另一个实施方案中，可以如下确定具有pH-依赖性结合特征的抗-C5抗体是否结合特定表位：将C5上的组氨酸残基被置换成另一种氨基酸(例如，酪氨酸)的C5点突变体在293细胞中表达，并且经由ELISA，蛋白印迹或BIACORE(注册商标)测试抗-C5抗体与C5突变体的结合；其中抗-C5抗体在酸性pH与野生型C5的结合相对于其在酸性pH与C5突变体的结合显著减弱，指示抗-C5抗体结合C5上包含所述组氨酸残基的表位。在另外的实施方案中，抗-C5抗体与野生型C5在中性pH的结合相对于其与C5突变体在中性pH的结合没有显著减弱。在某些实施方案中，C5上要被置换成另一种氨基酸的组氨酸残基选自由以下组成的组：C5的β链(SEQ ID NO:40)的His70，His72，和His110。在另一个实施方案中，组氨酸残基His70被置换成酪氨酸。
2.活性测定
在一个方面，提供测定以用于鉴定具有生物学活性的抗-C5抗体。生物学活性可以包括，例如，抑制C5的活化，阻止C5被切割而形成C5a和C5b，阻止C5转化酶接近C5上的切割位点，阻断由C5的活化引起的溶血活性等。还提供具有所述体内和/或体外生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，针对所述生物学活性测试本发明的抗体。
在某些实施方案中，通过例如Isenman等,J Immunol.124(1):326-331(1980)中所述的方法来确定测试抗体是否抑制C5被切割成C5a和C5b。在另一个实施方案中，这通过用于特异性检测切割的C5a和/或C5b蛋白的方法(例如，ELISA或蛋白印迹)来确定。当在存在测试抗体的情况下(或在与测试抗体接触后)检测到C5的切割产物(即，C5a和/或C5b)的量减少，则测试抗体被鉴定为是能够抑制C5切割的抗体。在某些实施方案中，C5a的浓度和/或生理学活性可以通过方法，例如，趋化性测定，RIA或ELISA来确定(见，例如，Ward和Zvaifler J.Clin.Invest.50(3):606-616(1971))。
在某些实施方案中，通过用于检测C5转化酶和C5之间的蛋白相互作用的方法(例如，ELISA或BIACORE(注册商标))来确定测试抗体是否阻止C5转化酶接近C5。当在存在测试抗体的情况下(或在与测试抗体接触后)相互作用减弱时，测试抗体被鉴定为是能够阻止C5转化酶接近C5的抗体。
在某些实施方案中，C5活性可以作为其在受试者体液中的细胞溶解能力的函数而被测量。C5的细胞溶解能力或其减弱可以通过本领域中已知的方法测量，例如，常规溶血测定，如Kabat和Mayer(编辑),Experimental Immunochemistry,第2版,135-240,Springfield,IL,CC Thomas(1961),135-139页描述的溶血测定，或所述测定的常规变形，如例如Hillmen等,N.Engl.J.Med.350(6):552-559(2004)中描述的鸡红血球溶血方法。在某些实施方案中，使用CH50eq测定来量化C5活性或对其的抑制。CH50eq测定是用于测量血清中总的经典补体活性的方法。该测试是溶胞测定，其使用抗体敏化的红血球作为经典补体途径的激活物，并且使用测试血清的不同稀释液来确定产生50％溶胞作用(CH50)所需的量。溶血百分比可以例如使用分光光度计来确定。CH50eq测定提供对最终补体复合物(TCC)形成的间接测量，因为TCC自身直接对测量的溶血负责。抑制C5激活也可以使用工作实施例中给出并示例的方法检测和/或测量。使用这些或其他合适类型的测定，可以筛选出能够抑制C5活化的候选抗体。在某些实施方案中，抑制C5激活包括：与在类似条件下的阴性对照的作用相比，在测定中C5激活减少至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，或40％以上。在一些实施方案中，其是指抑制C5激活达至少45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％以上。
D.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文中的抗-C5抗体，所述抗体缀合于一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合于一种或多种药物，包括但不限于美坦生类化合物(参见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；auristatin如单甲基auristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)，紫杉醇(paclitaxel)，拉罗他赛(larotaxel)，替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文中所述的抗体，所述抗体缀合于酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲根毒素A链，α-八叠球菌，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素(dianthin)蛋白，美洲商陆(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单胞霉烯族毒素(tricothecene)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体，所述抗体缀合于放射性原子从而形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含放射性原子用于闪烁法研究，例如tc99m或I123，或自旋标记用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像，mri)，如碘-123(再一次)，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷盐酸盐(IT)，亚胺基酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸HCl)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，二叠氮基化合物(如二(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)，二-重氮基衍生物(如二-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和二-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是"可切割的接头"，其助力于细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确考虑，但不限于此种利用交联剂试剂制备的缀合物，所述交联剂包括，但不限于，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，硫代-EMCS，硫代-GMBS，硫代-KMUS，硫代-MBS，硫代-SIAB，硫代-SMCC和硫代-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任一抗-C5抗体都可用于检测生物学样品中C5的存在。如本文中使用的，术语"检测"包括定量检测或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织，如血清，全血，血浆，活检样品，组织样品，细胞悬液，唾液，痰，口腔液，脑脊液，羊水，腹水，乳汁，初乳，乳腺分泌，淋巴液，尿液，汗液，泪液，胃液，滑液，腹膜液，眼晶状体液和黏液。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗-C5抗体。在另一个方面，提供检测C5在生物学样品中存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物学样品与如本文中所述的抗-C5抗体在允许抗-C5抗体结合C5的条件下接触，并且检测在抗-C5抗体和C5之间是否形成复合物。此种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗-C5抗体用于选择适合于利用抗-C5抗体治疗的受试者，例如，其中C5是用于选择患者的生物标志物。
在某些实施方案中，提供标记的抗-C5抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光，发色团，电子密度，化学发光，和放射性标记)，以及间接检测的部分如酶或配体，例如，通过酶反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与利用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体如HRP，乳糖过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
F.药物制剂
如本文中所述的抗-C5抗体的药物制剂通过将具有所需程度的纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合而被制备成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在使用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括，但不限于：缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐，和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基的)多肽；蛋白，如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷酰胺，天冬氨酸，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(注册商标)，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，被描述于美国公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干的抗体制剂被描述于美国专利号6,267,958中。含水抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包含组氨酸-乙酸缓冲液。
当需要时，本文中的制剂还可以含有超过一种用于治疗的特定适应证的活性成分，优选地具有相互之间没有不利影响的互补活性的那些。此种活性成分合适地以对目的用途有效的量存在于组合中。
活性成分可以被包封在例如通过凝聚技术或通过分别界面聚合例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备的微胶囊中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体，清蛋白微球，微乳液，纳米粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此种技术被公开在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质，所述基质的形式为有形物品，例如，薄膜或微胶囊。
可用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如通过经由无菌过滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
本文中提供的任一抗-C5抗体都可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供用作药物的抗-C5抗体。在另外的方面，提供用于治疗疾病的抗-C5抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗-C5抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗-C5抗体，其用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗-C5抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任一以上实施方案的"个体"优选是人。
在另一个方面，本发明提供抗-C5抗体在制备或配制药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患病个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任一以上实施方案的"个体"优选是人。
在另一个的方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的抗-C5抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任一以上实施方案的”个体”可以是人。
在另一个方面，本发明提供例如用于任一上述治疗方法的包含本文中提供的任一抗-C5抗体的药物制剂。在一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的任一抗-C5抗体和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的任一抗-C5抗体和至少一种另外的治疗剂。
在另一个方面，所述药物制剂用于治疗疾病。在一个实施方案中，向患病个体施用所述药物制剂。根据任一以上实施方案的”个体”优选是人。
在另一个方面，本发明提供用于制备药物或药物制剂的方法，所述方法包括将本文中提供的任一抗-C5抗体与药用载体混合，例如，以用于任一上述治疗方法。在一个实施方案中，用于制备药物或药物制剂的方法还包括添加至少一种另外的治疗剂至药物或药物制剂。
本发明的抗体可以单独地用于治疗或与其他试剂组合地用于治疗。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述的此种组合治疗包括组合施用(其中两种以上治疗剂被包含在同一或分开的制剂中)和分开施用，在此种情况中，本发明的抗体的施用可以发生在另外的治疗剂或试剂的施用之前，同时，和/或之后。在一个实施方案中，抗-C5抗体的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月以内，或在约一周，两周或三周以内，或在约一天，两天，三天，四天，五天或六天以内。
本发明的抗体(以及任意另外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外施用，肺内施用，和鼻内施用，以及，如果局部治疗需要，病变内施用。肠胃外输注包括肌肉内施用，静脉内施用，动脉内施用，腹膜内施用，或皮下施用。用药可以是通过任何合适的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文中考虑多种用药方案，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲注入。
本发明的抗体可以与良好医学实践一致的方式配制，用药和施用。该语境中考虑的因素包括治疗的具体疾病，治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床状况，病因，药剂递送位点，给药方法，给药时间安排，以及医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗目标疾病的一种或多种药剂配制在一起。此种其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量，疾病或治疗的类型，以及以上讨论的其他因素。这些通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径使用，或为本文中所述剂量的约1至99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重度和病程，抗体的施用是为了预防目的还是为了治疗目的，之前的治疗，患者的临床史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。抗体被合适地一次性或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用至患者的初始候选剂量，不论是，例如，通过一次或多次分开的施用，还是通过连续注入。一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg以上，这取决于以上提及的因素。对于在若干天或更长的时间内的重复施用，根据条件，通常可以持续治疗直至出现所需的疾病症状的阻抑。抗体的一个示例性剂量为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以将一个或多个剂量，约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)施用于患者。此种剂量可以间歇施用，例如，每周一次或每三周一次(例如，使得患者接受约两个至约二十个，或例如，约六个剂量的抗体)。可以施用初始较高的加载剂量，继之以一个或多个较低的剂量。该治疗过程可以容易地通过常规技术和测定监测。
要理解的是，任何上述制剂或治疗方法都可以使用本发明的免疫缀合物(以代替抗-C5抗体或除了抗-C5抗体以外)进行。
H.制品
在本发明的另一个方面，提供制品，其包含可用于治疗，预防和/或诊断上述疾病的材料。所述制品包含容器和在容器上或与容器结合的标记或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器，IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器盛装组合物，所述组合物是单独的或与对于治疗，预防和/或诊断病症有效的另一种组合物组合，并且所述容器可以具有无菌接入端口(例如所述容器可以是具有可被皮下注射针刺破的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标记或包装插页指示组合物用于治疗所选的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中盛装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中盛装有组合物的第二容器，其中所述组合物还包含细胞毒性或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包含包装插页，所述包装插页指示组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含药用缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，林格溶液和右旋糖溶液。其还可以包含商业或用户需要的其他材料，包括其他缓冲液，稀释液，填料，针和注射器。
要理解的是，任何上述制品都可以包括本发明的免疫缀合物以替代抗-C5抗体，或者除了抗-C5抗体以外，任何上述制品还可以包括本发明的免疫缀合物。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解的是，已知以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1
制备C5
1.1.表达和纯化重组人和食蟹猴C5
使用FreeStyle293-F细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时表达重组人C5(NCBI GenBank登录号：NP_001726.2，SEQ ID NO:39)。将表达人C5的条件培养基用等体积的milliQ水稀释，然后施用至Q-sepharose FF或Q-sepharose HP阴离子交换柱(GEhealthcare，Uppsala，瑞典)，之后用NaCl梯度洗脱。汇集含人C5的级分，然后分别将盐浓度和pH调节至80mM NaCl和pH6.4。将所得的样品施用于SP-sepharose HP阳离子交换柱(GEhealthcare，Uppsala，瑞典)并用NaCl梯度洗脱。将含人C5的级分汇集并经过CHT陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)。然后将人C5洗脱物施加于Superdex200凝胶过滤柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)。将含人C5的级分汇集并存储在-150℃。
以与人对应物相同的方式进行重组食蟹猴C5(NCBI GenBank登录号：XP_005580972，SEQ ID NO:44)的表达和纯化。
1.2.自血浆纯化食蟹猴C5(cynoC5)
将来自食蟹猴的血浆样品施加于SSL7-琼脂糖(Invivogen，San Diego，CA，USA)，之后用100mM乙酸钠pH3.5洗脱。将含cynoC5的级分立即中和并且与肽M琼脂糖(Invivogen，San Diego，CA，USA)一起经过蛋白A HP柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)。然后将流穿级分施加于Superdex200凝胶过滤柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)。将含cynoC5的级分汇集并存储在-80℃。
实施例2
生成抗-C5抗体
2.1.抗体筛选
如下制备、选择和测定抗-C5抗体：
将12-16周龄NZW兔用人C5和/或猴C5皮内免疫(50-100μg/剂量/兔)。在2个月的时间里将该剂量重复4-5次。最终免疫后一周，自免疫的兔收集脾和血液。将抗原特异性B-细胞用标记的抗原染色，用FCM细胞分选仪(FACS aria III，BD)分选，并且以一个细胞/孔的密度与25,000个细胞/孔的EL4细胞(European Collection of Cell Cultures)和稀释20倍的活化的兔T-细胞条件培养基一起铺板在96-孔板中，并且培养7-12天。将EL4细胞用丝裂霉素C(Sigma，目录号M4287)处理2小时并且提前洗涤3次。通过在含植物凝集素-M(Roche，目录号1 1082132-001)，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma，目录号P1585)和2％FBS的RPMI-1640中培养兔胸腺细胞来制备活化的兔T-细胞条件培养基。在培养后，收集B-细胞培养物上清以用于进一步分析并且将细胞沉淀(pellet)冻存。
将ELISA测定用于测试B-细胞培养物上清中抗体的特异性。将在PBS中的50nM链霉亲和素(GeneScript，目录号Z02043)涂覆在384-孔MAXISorp(Nunc，目录号164688)上，在室温达1小时。然后将平板用稀释5倍的Blocking One(Nacalai Tesque，目录号03953-95)封闭。将人或猴C5用NHS-PEG4-生物素(PIERCE，目录号21329)标记并加入封闭的ELISA平板，孵育1小时并洗涤。将B-细胞培养物上清添加至ELISA平板，孵育1小时并洗涤。通过山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶(BETHYL，目录号A120-111P)和之后添加的ABTS(KPL，目录号50-66-06)来检测结合。
将ELISA测定用于评估抗体对C5的pH-依赖性结合。将用PBS(-)稀释至1μg/ml的山羊抗-兔IgG-Fc(BETHYL，目录号A120-111A)加入384-孔MAXISorp(Nunc，目录号164688)，在室温孵育1小时，并用稀释5倍的Blocking One(Nacalai Tesque，目录号03953-95)封闭。在孵育后，将平板洗涤并加入B-细胞培养物上清。将平板孵育1小时，洗涤，并加入500pM的生物素化的人或猴C5并孵育1小时。在孵育后，将平板洗涤并与pH7.4MES缓冲液(20mM MES，150mM NaCl和1.2mM CaCl2)或pH5.8MES缓冲液(20mM MES，150mM NaCl和1mM EDTA)在室温孵育1小时。在孵育后，通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Thermo Scientific，目录号21132)和之后加入的ABTS(KPL，目录号50-66-06)检测生物素化的C5的结合。
将Octet RED384系统(Pall Life Sciences)用于评估抗体对C5的亲和力和pH-依赖性结合。将B-细胞培养物上清中分泌的抗体上样到蛋白A生物传感器尖端(Pall LifeSciences)并且浸入在pH7.4MES缓冲液中的50nM人或猴C5中以分析结合动力学。在pH7.4MES缓冲液和pH5.8MES缓冲液中分析解离动力学。
筛选总计41,439个B-细胞系对人或猴C5的亲和力和pH-依赖性结合并且选择677个细胞系并且指定为CFA0001-0677。使用ZR-96Quick-RNA试剂盒(ZYMO RESEARCH，目录号R1053)由冻存的细胞沉淀纯化所选细胞系的RNA。将所选细胞系中的编码抗体重链可变区的DNA通过反转录PCR扩增并且与编码F760G4(SEQ ID NO:33)或F939G4(SEQ ID NO:34)重链恒定区的DNA重组。将编码抗体轻链可变区的DNA通过反转录PCR扩增并与编码k0MTC轻链恒定区(SEQ ID NO:36)的DNA重组。分开合成现有人源化抗-C5抗体依库珠单抗(EcuH-G2G4，SEQ ID NO:29和EcuL-k0，SEQ ID NO:30)的重链和轻链基因。将编码VH(EcuH，SEQ IDNO:31)的DNA与编码修饰的人IgG4CH(F760G4，SEQ ID NO:33)的DNA同框融合，并将编码VL(EcuL，SEQ ID NO:32)的DNA与编码k0轻链恒定区(SEQ ID NO:37)的DNA同框融合。还将各融合的编码序列克隆到表达载体中。将抗体在FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen)中表达并自培养物上清纯化以评估功能活性。通过使用脂质体溶解测定测试补体活性的抑制来评估抗体的中和活性，如实施例5.1中所述。
2.2.通过夹心ELISA的表位框并
选择具有高亲和力，pH依赖性或中和活性的抗-C5抗体用于进一步分析。使用夹心ELISA测定来将选择的抗体分组到结合C5蛋白的相同或重叠表位的不同的表位框中。将未标记的捕获抗体用PBS(-)稀释至1μg/ml并加入384-孔MAXISorp平板(Nunc，目录号164688)。将平板在室温孵育1小时并且用稀释5倍的Blocking One(Nacalai Tesque，目录号03953-95)封闭。将平板孵育1小时，洗涤，并加入2nM的人C5并孵育1小时。在孵育后，将平板洗涤并加入标记的检测抗体(1μg/mL，被NHS-PEG4-生物素生物素化)。1小时孵育后，通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Thermo Scientific，目录号21132)和之后加入的ABTS(KPL，目录号50-66-06)来检测生物素化的抗体的结合。
所有抗-C5抗体被用作捕获抗体和检测抗体两者，并且全面配对。如图1中所示，相互竞争的抗体被归类到7个表位框中：CFA0668，CFA0334和CFA0319被分组到表位A中，CFA0647，CFA0589，CFA0341，CFA0639，CFA0635，CFA0330和CFA0318被分组到表位B中，CFA0538，CFA0501，CFA0599，CFA0307，CFA0366，CFA0305，CFA0675，CFA0666和CFA0672被分组到表位C中，依库珠单抗和CFA0322被分组到表位D中，CFA0329被分组到表位E中，CFA0359和CFA0217被分组到表位F中，并且CFA0579，CFA0328和CFA0272被分组到表位G中。图1显示一些抗-C5嵌合抗体的表位框并。被分组到表位C中的抗-C5抗体的VH和VL序列列在表2中。
[表2]
分组到表位C中的抗-C5抗体
Figure BDA0001356706070000821
2.3.人源化和优化
对一些抗-C5抗体的可变区进行人源化以减小所述抗体的可能的免疫原性。使用常规CDR移植方法(Nature 321:522-525(1986))将抗-C5兔抗体的互补决定区(CDR)移植到同源人抗体框架(FR)上。合成编码人源化VH和VL的基因并将其分别与修饰的人IgG4CH(SG402，SEQ ID NO:35)和人CL(SK1，SEQ ID NO:38)组合，并将各组合的序列克隆到表达载体中。
检测若干突变和突变组合以鉴别提高前导抗体中的一些的结合性质的突变和突变组合。然后将多个突变引入到人源化可变区中以增强在中性pH对C5的结合亲和力或减小在酸性pH对C5的结合亲和力。由此由CFA0305产生一种优化的变体，305LO5(VH，SEQ ID NO:10；VL，SEQ ID NO:20；HVR-H1，SEQ ID NO:54；HVR-H2，SEQ ID NO:64；HVR-H3，SEQ ID NO:74；HVR-L1，SEQ ID NO:84；HVR-L2，SEQ ID NO:94；和HVR-L3，SEQ ID NO:104)。
将抗体在用重链和轻链表达载体的混合物共转染的HEK293细胞中表达并通过蛋白A纯化。
实施例3
抗-C5抗体的结合表征
3.1.重组抗体的表达和纯化
使用FreeStyle293-F细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时表达重组抗体。使用常规方法使用蛋白A进行自表达抗体的条件培养基的纯化。如果需要，则进一步进行凝胶过滤。
3.2.评估pH依赖性
在37℃使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)，在pH7.4和pH5.8，评估抗-C5抗体对重组人C5的动力学参数。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)根据GEHealthcare推荐的设置，将ProA/G(Pierce)固定在CM4传感器芯片上。将抗体和分析物稀释到相应的运行缓冲液ACES pH7.4和pH5.8(20mM ACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween 20，0.005％NaN3)中。通过ProA/G将各抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平典型地为60-90个响应单位(RU)。然后，以10和20nM或20和40nM的浓度注射重组人C5，之后解离。使用25mM NaOH将表面再生。通过利用1:1结合模型、使用BIACORE(注册商标)T200Evaluation软件，版本2.0(GE Healthcare)拟合感应图来确定两个pH条件下的动力学参数。所有抗体的感应图显示在图2A和2B中。抗体的结合速率(ka)，解离速率(kd)和结合亲和力(KD)列在表3中。除了CFA0330(VH，SEQ ID NO:21和VL，SEQ ID NO:25)和CFA0341(VH，SEQ ID NO:22和VL，SEQ ID NO:26)之外的所有抗体在pH 5.8显示的解离速率都比在pH7.4相对更快。
[表3]
抗-C5抗体在pH7.4和pH5.8条件下的动力学参数
Figure BDA0001356706070000841
3.3.交叉反应性检查
为了观察抗-C5抗体对人C5(hC5)和食蟹猴C5(cynoC5)的交叉反应性，进行BIACORE(注册商标)动力学分析。测定设定同实施例3.2中所述，将重组cynoC5以2，10和50nM的浓度注射。通过与实施例3.2中所述相同的数据拟合来确定动力学参数。在pH7.4的结合动力学和亲和力列在表4中。表4中给出的针对hC5的动力学参数是实施例3.2的结果。除了CFA0672以外的所有抗-C5抗体对hC5和cynoC5都显示相当的KD。CFA0672对cynoC5的KD是对hC5的KD的8倍弱。
[表4]
在pH7.4抗-C5抗体对hC5和cynoC5的结合动力学和亲和力
Figure BDA0001356706070000851
实施例4
抗-C5抗体的表位作图
4.1.抗-C5MAb与C5β-链衍生的肽的结合
在蛋白印迹分析中检测抗-C5单克隆抗体(MAb)与C5β-链衍生的肽的结合。将与GST-标签(pGEX-4T-1，GE Healthcare Life Sciences，28-9545-49)融合的C5肽：19-180，161-340，321-500和481-660在大肠杆菌(DH5α，TOYOBO，DNA-903)中表达。在与1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在37℃孵育5小时后收获大肠杆菌样品，并以20000x g离心1min以获得沉淀。将沉淀用样品缓冲溶液(2ME+)(Wako，191-13272)悬浮，并用于蛋白印迹分析。利用抗-GST抗体(Abcam，ab9085)确认各肽的表达(图3)。箭头指示融合有GST的C5肽(46-49kDa)。抗-C5MAb：CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672，和CFA0675，结合C5的19-180(图3)。
4.2.人C5的MG1-MG2结构域(1-225)的表达和纯化
使用FreeStyle293-F细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时表达人C5β-链的重组MG1-MG2结构域(SEQ ID NO:43)。将表达MG1-MG2结构域的条件培养基用1/2体积的milliQ水稀释，之后施加于Q-sepharose FF阴离子交换柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)。将来自阴离子交换柱的流穿级分调节至pH 5.0并且施加于SP-sepharose HP阳离子交换柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)并用NaCl梯度洗脱。自洗脱液收集含MG1-MG2结构域的级分并且随后经过用1x PBS平衡的Superdex 75凝胶过滤柱(GE healthcare，Uppsala，瑞典)。然后汇集含MG1-MG2结构域的级分并存储在-80℃。
4.3.与MG1-MG2结构域结合的能力
使用与实施例3.2中所述相同的测定设定来测量抗-C5抗体对MG1-MG2结构域的结合能力，不同之处在于仅在pH7.4条件下进行测量。将MG1-MG2结构域以20nM和40nM的浓度注射。如图4中所示，除了依库珠单抗-F760G4以外的所有抗体都显示增加的结合反应，这表明这些抗体是MG1-MG2结合剂。作为已知的α-链结合剂的依库珠单抗-F760G4不显示与MG1-MG2结构域的结合。
4.4.抗-C5MAb与C5MG1-MG2结构域衍生的肽的结合
在蛋白印迹分析中测试抗-C5MAb与MG1-MG2结构域衍生的肽的结合。将与GST-标签融合的C5肽：33-124，45-124，52-124，33-111，33-108，和45-111(SEQ ID NO:40)在大肠杆菌中表达。与1mM IPTG在37℃孵育5小时后收获大肠杆菌样品，并以20000x g离心1min以获得沉淀。将沉淀用样品缓冲溶液(2ME+)悬浮，并用于蛋白印迹分析。利用抗-GST抗体确认C5衍生的肽的表达(图5A)。CFA0305仅结合33-124的肽(图5B)。CFA0305结合重组人C5(rhC5)的β-链(约70kDa)，其用作对照。图5C概述了抗-C5MAb与C5衍生的肽的反应。
4.5.抗-C5MAb与C5突变体的结合
因为通过晶体结构分析预测C5β-链中的三个氨基酸残基：E48，D51和K109，参与C5和抗-C5-MAb之间的结合，所以在蛋白印迹分析中测试抗-C5MAb与人C5点突变体的结合。通过脂转染将E48，D51和K109中任一个被置换成丙氨酸的C5点突变体在FS293细胞中表达。脂转染后5天收获培养基，之后用于蛋白印迹法。在还原条件下进行SDS-PAGE。结果显示在图6中。依库珠单抗结合野生型(WT)C5和三个C5点突变体的α-链，而CFA0305强烈结合WT C5的β-链，与E48A C5突变体的β-链的结合弱，并且不结合D51A和K109A C5突变体的β-链，表明这3个氨基酸残基参与抗体/抗原相互作用。表5给出抗-C5MAb(CFA0305，CFA0307，CFA0366，CFA0501，CFA0538，CFA0599，CFA0666，CFA0672和CFA0675)的蛋白印迹分析的概述。抗-C5MAb被分组到相同的表位C中，但是抗体间的结合模式稍有不同，表明C5对于抗-C5MAb的结合区域彼此邻近而不相同。
[表5]
抗-C5MAb与C5突变体的反应的概述
Figure BDA0001356706070000871
4.6.抗-C5抗体与C5突变体的BIACORE(注册商标)结合分析
为了测试残基E48，G51和K109是否实际上参与抗体/抗原相互作用，进行BIACORE(注册商标)结合分析。制备三种C5突变体：E48A，G51A和K109A，如实施例4.5中所述。制备含有在FS293细胞中过表达的突变体C5的培养物上清样品，其中突变体C5为40μg/ml。对于BIACORE(注册商标)结合分析，将样品用BIACORE(注册商标)运行缓冲液(ACES pH7.4，10mg/ml BSA，1mg/ml羧甲基葡聚糖)稀释10x至突变体C5的最终样品浓度为4μg/ml。
在37℃利用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)，使用实施例3.2中描述的测定条件，评估三种C5突变体与抗-C5抗体的相互作用。将含10mg/ml BSA，1mg/ml羧甲基葡聚糖的ACES pH 7.4缓冲液用作运行缓冲液。通过单克隆小鼠抗-人IgG，Fc片段特异性抗体(GE Healthcare)将依库珠单抗-F760G4和305LO5捕获在不同的流动室上。流动室1被用作参比表面。以4μg/ml的浓度将野生型和突变体C5蛋白注射在传感器表面上以与捕获的抗体相互作用。在各分析循环的末尾，将传感器表面用3M MgCl2再生。利用Bia Evaluation软件，版本2.0(GE Healthcare)分析结果。将参比流动室(流动室1)和空白运行缓冲液注射的曲线从具有捕获的抗体的流动室的曲线中减去。
如图7中所示，相比于野生型C5，三种C5突变体都能够以类似的结合特征结合依库珠单抗。对于305LO5，三种突变体与野生型C5相比都显示较低的对305LO5的结合反应。D51A和K109A突变体使305LO5与C5的结合减弱至基线水平。
4.7.C5上助力于抗-C5抗体和C5之间的pH依赖性相互作用的His残基的鉴定
晶体结构分析揭示了人C5上的3个组氨酸残基位于抗体/抗原界面。已知具有典型的约6.0的pKa的组氨酸残基助力于pH依赖性蛋白-蛋白相互作用(Igawa等，BiochimBiophys Acta 1844(11):1943-1950(2014))。为了研究抗体/抗原界面上的哪个His残基助力于抗-C5抗体和C5之间的pH依赖性相互作用，进行BIACORE(注册商标)结合分析。如下制备具有单个His突变(H70Y，H72Y和H110Y)的三种人C5突变体和具有双His突变(H70Y+H110Y)的突变体：通过脂转染将H70，H72和H110中任一个被置换成酪氨酸的单个His突变体和H70和H110都被置换成酪氨酸的双His突变体在FS293细胞中表达。C5His突变体与305LO5(pH-依赖性抗-C5抗体)的抗原结合性质通过改进的BIACORE(注册商标)测定确定，如实施例4.6中所述。简言之，将在pH5.8的另外的解离阶段整合到BIACORE(注册商标)测定中，其紧接着在pH7.4的解离阶段之后，从而评估来自在pH7.4形成的复合物的抗体和抗原之间的pH-依赖性解离。在pH5.8的解离速率通过使用Scrubber 2.0(BioLogic Software)曲线拟合软件加工并拟合数据来确定。
如图8中所示，在H70或H110的C5单His突变和双His突变(H70+H110)不影响在中性pH C5与305LO5的结合。同时，在H72的单His突变显示C5与305LO5结合的显著受损。C5His突变体和C5-wt蛋白在pH5.8的解离速率显示在表6中。如表6中所示，在测试的C5抗原中，在pH5.8，C5-wt显示最快的自305LO5的解离。与C5-wt相比，在H70的单His突变在pH5.8显示几乎两倍慢的解离速率并且在H110的单His突变在pH5.8导致稍慢的解离速率。在H70和H110的双His突变导致对pH-依赖性结合的较大影响，其中在pH5.8的解离速率几乎是C5-wt的三倍慢。
[表6]
C5His突变体结合305LO5的pH5.8解离速率值
Figure BDA0001356706070000891
实施例5
抗-C5抗体对C5激活的抑制活性
5.1.抗-C5MAb抑制补体激活的脂质体溶解
通过脂质体溶解测定来测试抗-C5MAb的对补体活性的抑制。将30μL的正常人血清(6.7％)(Biopredic，SER018)与20μL的稀释的MAb在96-孔板中混合并在25℃在摇床上孵育30min。将用针对二硝基苯基的抗体(Autokit CH50，Wako，995-40801)敏化的脂质体转移到各孔中并在25℃将平板置于摇床上达2min。将50μL的底物溶液(Autokit CH50)加入各孔并在25℃振荡混合2min。将最终的混合物在37℃孵育40分钟，之后测量混合物在340nm的OD。脂质体溶解的百分比被定义为100x[(ODMAb-OD血清和脂质体背景)]/[(OD无MAb-OD血清和脂质体背景)]。图9A显示抗-C5Mab：CFA0305，0307，0366，0501，0538，0599，0666，0672，和0675，抑制脂质体溶解。两种非pH依赖性抗体：CFA0330和0341，还抑制溶胞作用(图9B)。
5.2.抗-C5MAb抑制C5a生成
测试抗-C5MAb的在脂质体溶解期间的C5a生成以确认抗-C5MAb抑制C5被切割成C5a和C5b。使用C5a ELISA试剂盒(R&D systems，DY2037)量化来自脂质体溶解测定的上清中的C5a水平。所有MAb都以剂量依赖性的方式抑制上清中的C5a生成(图10A和10B)。
5.3.抗-C5Mab抑制补体激活的溶血
在溶血测定中测试抗-C5MAb的经典补体活性的抑制。将鸡红血球(cRBC)(Innovative research，IC05-0810)用含0.5mM MgCl2和0.15mM CaCl2(GVB++)的明胶/巴比妥缓冲的盐水(Boston BioProducts，IBB-300X)洗涤，之后用1μg/ml的抗-鸡RBC抗体(Rockland 103-4139)在4℃敏化15分钟。然后将细胞用GVB++洗涤并以5x 107个细胞/ml悬浮在相同的缓冲液中。在单独的圆底96-孔微测试板中，将50μL的正常人血清(20％)(Biopredic，SER019)与50μL的稀释的Mab混合并在摇床上在37℃孵育30分钟。然后将60μL的敏化的cRBC悬浮液加入含血清的孔中，并将抗体混合物在37℃孵育30分钟。在孵育后，将平板以1000x g在4℃离心2分钟。将上清(100μL)转移至平底96-孔微测试板的孔中以用于测量在415nm的OD，参比波长为630nm。溶血的百分比被定义为100x[(OD MAb-OD血清和cRBC)]/[(OD无MAb-OD血清和cRBC背景)]。图11显示抗-C5Mab：CFA0305和305LO5，抑制cRBC的溶血。
5.4.抗-C5MAb抑制旁路补体途径
以与经典途径溶血测定类似的方式进行针对旁路途径的溶血测定。将收集自新西兰白兔(InVivos)的血液与相同体积的Alsever溶液(Sigma，A3551)混合，并将混合物用作兔RBC(rRBC)。将rRBC用补充有2mM MgCl2和10mM EGTA的GVB洗涤并以7x 108个细胞/ml悬浮在相同的缓冲液中。在圆底96-孔微测试板中，将40μL的正常人血清(25％)(Biopredic，SER019)与40μL的稀释的Mab混合并在摇床上在37℃孵育30分钟。然后将20μL的rRBC悬浮液加入至含血清的孔中，并将抗体混合物在37℃孵育60分钟。在孵育后，将平板以1000x g在4℃离心2分钟。将上清(70μL)转移至平底96-孔微测试板上的孔中以用于测量在415nm的OD，参比波长为630nm。图12显示抗-C5Mab：CFA0305和CFA0672，抑制rRBC的溶血，指示这些抗体抑制旁路补体途径。
实施例6
优化抗-C5单克隆抗体(305变体)
将若干突变引入到抗-C5抗体305LO5的优化的可变区以进一步改善其性质，并且产生优化的可变区305LO15，305LO16，305LO18，305LO19，305LO20，305LO22和305LO23。305变体的VH和VL的氨基酸序列分别列在表7和8中。将编码人源化VH的基因与修饰的人IgG1CH变体SG115(SEQ ID NO:114)，和修饰的人IgG4CH变体SG422(SEQ ID NO:115)或SG429(SEQID NO:116)组合。将编码人源化VL的基因与人CL(SK1，SEQ ID NO:38)组合。分别合成编码人源化抗-C5抗体BNJ441(BNJ441H，SEQ ID NO:149；BNJ441L，SEQ ID NO:150)的重链和轻链基因并将其各自克隆到表达载体中。
将抗体在用重链和轻链表达载体的组合共转染的HEK293细胞中表达，并通过蛋白A纯化。
[表7]
305变体的VH氨基酸序列
Figure BDA0001356706070000911
[表8]
305变体的VL氨基酸序列
Figure BDA0001356706070000921
实施例7
抗-C5抗体(305变体)的结合表征
在37℃使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)在三种不同的条件下评估抗-C5抗体对重组人C5的动力学参数；(1)结合和解离都在pH7.4，(2)结合和解离都在pH5.8，和(3)结合在pH7.4而解离在pH5.8。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)根据GEHealthcare推荐的设定将ProA/G(Pierce)固定到CM1传感器芯片上。将条件(1)和(3)的抗体和分析物稀释在ACES pH7.4缓冲液(20mM ACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween20，0.005％NaN3)中并将条件(2)的抗体和分析物稀释在ACES pH5.8缓冲液(20mM ACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween 20，0.005％NaN3)中。通过ProA/G将各抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平典型地为60-90个响应单位(RU)。然后，以3至27nM或13.3至120nM(通过三倍连续稀释制备)注射重组人C5，之后解离。将表面用25mM NaOH再生。条件(1)和(2)的动力学参数通过用1:1结合模型拟合感应图确定并且条件(3)的解离速率通过用针对MCK模型的1:1解离拟合感应图来确定，其中使用BIACORE(注册商标)T200Evaluation软件，版本2.0(GE Healthcare)。所有抗体的pH依赖性被显示为条件(2)和(1)的解离速率之比。
结合速率(ka)，解离速率(kd)，结合亲和力(KD)和pH依赖性列在表9中。所有抗体在pH 5.8显示的解离速率都比在pH7.4快并且其pH依赖性为约20倍。
[表9]
抗-C5抗体变体在pH7.4和pH5.8条件下的动力学参数
Figure BDA0001356706070000931
在pH7.4和pH5.8下抗-C5抗体(BNJ441，依库珠单抗和305变体)对重组人C5的结合亲和力在37℃使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)确定，以评估pH对抗原结合的作用。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)根据生产商推荐的设定，将山羊抗-人IgG(Fc)多克隆抗体(KPL#01-10-20)固定到CM4传感器芯片上。将抗体和分析物稀释在含20mMACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween 20和0.005％NaN3的ACES pH7.4缓冲液或ACES pH5.8缓冲液中。使用抗-Fc方法将抗体捕获在传感器表面上，捕获水平典型地为50-80个响应单位(RU)。自27nM(对于pH7.4测定条件)或135nM(对于pH 5.8测定条件)开始通过三倍连续稀释制备重组人C5。将表面用20mM HCl，0.01％Tween 20再生。使用BiaEvaluation 2.0软件(GE Healthcare)，将数据处理并用1:1结合模型拟合。
在pH7.4和pH5.8下的BNJ441，依库珠单抗和305变体对重组人C5的结合亲和力(KD)显示在表10中。305变体显示的(在pH 5.8的KD)/(在pH 7.4的KD)之比几乎为800，是显示(在pH 5.8的KD)/(在pH 7.4的KD)之比仅为93的BNJ441的8倍高。
[表10]
Figure BDA0001356706070000932
实施例8
抗-C5抗体(305变体)对C5激活的抑制活性
8.1.抗-C5MAb抑制补体激活的脂质体溶解
通过脂质体溶解测定测试抗-C5MAb的补体活性的抑制。将30μL的正常人血清(6.7％)(Biopredic，SER019)与20μL的稀释的MAb在96-孔板中混合并在室温在摇床上孵育30min。将用针对二硝基苯基的抗体(Autokit CH50，Wako，995-40801)敏化的脂质体溶液转移到各孔中并在37℃在摇床上放置2min。将50μL的底物溶液(Autokit CH50)添加至各孔并在37℃振荡混合2min。将最终的混合物在37℃孵育40分钟，之后测量在340nm的OD。脂质体溶解的百分比被定义为100x[(ODMAb-OD血清和脂质体背景)]/[(OD无MAb-OD血清和脂质体背景)]。图13显示抗-C5Mab：305LO15-SG422，305LO16-SG422，305LO18-SG422，305LO19-SG422，305LO20-SG422和305LO20-SG115，抑制脂质体溶解。两种具有Fc变体的抗体：305LO15-SG115和305LO23-SG429，还显示抑制脂质体溶解(图14)。
测试抗-C5MAb的重组人C5(SEQ ID NO:39)的抑制。将10μL的缺少C5的人血清(Sigma，C1163)与20μL的稀释的MAb和20μL的重组C5(0.1μg/mL)在96-孔板中混合并在摇床上在37℃孵育1小时。将脂质体(Autokit CH50)转移到各孔中并在37℃在摇床上放置2min。将50μL的底物溶液(Autokit CH50)添加至各孔并在37℃振荡混合2min。将最终的混合物在37℃孵育180分钟，之后测量在340nm的OD。脂质体溶解的百分比是以上所定义。图15显示抗-C5Mab：305LO22-SG115，305LO22-SG422，305LO23-SG115和305LO23-SG422，抑制脂质体溶解。
8.2.抗-C5MAb抑制C5a生成
测试抗-C5MAb的在脂质体溶解期间的C5a生成以确认抗-C5MAb抑制C5被切割成C5a和C5b。使用C5a ELISA试剂盒(R&D systems，DY2037)来量化来自脂质体溶解测定的上清中的C5a水平。所有MAb都以剂量依赖性的方式抑制上清中的C5a生成(图16和17)。
8.3.测量食蟹猴血浆中的补体活性
在食蟹猴血浆中测试抗-C5MAb的补体活性的抑制。将抗-C5MAb内施用于猴(20mg/kg)，并且定期收集血浆样品直至第56天。将鸡红血球(cRBC)(Innovative research，IC05-0810)用含0.5mM MgCl2和0.15mM CaCl2(GVB++)的明胶/巴比妥缓冲的盐水(BostonBioProducts，IBB-300X)洗涤，之后用1μg/ml的抗-鸡RBC抗体(Rockland 103-4139)在4℃敏化15分钟。然后将细胞用GVB++洗涤并以1x 108个细胞/ml悬浮在相同的缓冲液中。在单独的圆底96-孔微测试板中，将猴血浆与敏化的cRBC在37℃孵育20分钟。在孵育后，将平板以1000x g在4℃离心2分钟。将上清转移至平底96-孔微测试板上的孔中以用于测量在415nm的OD，参比波长为630nm。溶血百分比被定义为100x[(OD施用后-OD血浆和cRBC背景)]/[(OD施用前-OD血浆和cRBC背景)]。图18显示抗-C5Mab：305LO15-SG422，305LO15-SG115，305LO16-SG422，305LO18-SG422，305LO19-SG422，305LO20-SG422，305LO20-SG115和305LO23-SG115，抑制血浆中的补体活性。
8.4.抗-C5MAb抑制C5变体的生物学活性
测试抗-C5MAb的重组人C5变体：V145I，R449G，V802I，R885H，R928Q，D966Y，S1310N，和E1437D的抑制。据报道，在C5中具有R885H突变的PNH患者显示差的对依库珠单抗的反应(见，例如，Nishimura等,New Engl.J.Med.370:632-639(2014))。将各个人C5变体表达在FS293细胞中，并将上清用于接下来的研究。将10μL的缺少C5的人血清(Sigma，C1163)与20μL的稀释的MAb和20μL的含重组C5变体(2-3μg/mL)的细胞培养基在96-孔板中混合并在37℃在摇床上孵育0.5小时。将脂质体(Autokit CH50)转移到各孔中并在37℃在摇床上放置2min。将50μL的底物溶液(Autokit CH50)添加至各孔并在37℃振荡混合2min。将最终的混合物在37℃孵育90分钟，之后测量在340nm的OD。脂质体溶解的百分比如以上定义。图19显示抗-C5MAb(依库珠单抗)不抑制R885H C5变体，但是抑制测试的其他变体。图20显示抗-C5MAb(305变体)抑制所有测试的C5变体。
8.5.抗-C5MAb抑制补体激活的脂质体溶解
通过脂质体溶解测定测试抗-C5MAb的补体活性的抑制。将30μL的正常人血清(6.7％)(Biopredic，SER019)与20μL的稀释的MAb在96-孔板中混合并在室温在摇床上孵育30min。将用针对二硝基苯基的抗体(Autokit CH50，Wako，995-40801)敏化的脂质体溶液转移到各孔中并在25℃在摇床上放置2min。将50μL的底物溶液(Autokit CH50)添加至各孔中并在25℃振荡混合2min。将最终的混合物在37℃孵育45分钟，之后测量在340nm的OD。脂质体溶解的百分比抑制被定义为100x[(ODMAb-OD血清和脂质体背景)]/[(OD无MAb-OD血清和脂质体背景)]。图21显示抗-C5MAb，BNJ441和305变体抑制脂质体溶解，并且305变体的抑制活性强于BNJ441。
实施例9
305变体Fab和人C5-MG1结构域复合物的X射线晶体结构分析
9.1.人C5的MG1结构域(20-124)的表达和纯化
使用pGEX-4T-1载体(GE healthcare)，将经由凝血酶可切割的接头与GST-标签融合的MG1结构域(SEQ ID NO:39的氨基酸残基20-124)(GST-MG1)在大肠杆菌株系BL21DE3pLysS(Promega)中表达。在25℃用0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达达5小时。将细菌细胞沉淀用补充有lysonase(Merck)和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的Bugbuster(Merck)裂解，之后使用GSTrap柱(GE healthcare)根据生产者的说明从可溶级分进行对GST-MG1的纯化。用凝血酶(Sigma)将GST标签切除，并将所得的MG1结构域用Superdex 75凝胶过滤柱(GE healthcare)进一步纯化。将含MG1结构域的级分汇集并存储在-80℃。
9.2.制备305变体的Fab片段
来自305的优化的变体之一的Fab片段通过常规方法制备，使用利用木瓜蛋白酶(Roche Diagnostics，目录号1047825)的有限消化，之后加载到蛋白A柱(MabSlect SuRe，GE Healthcare)上以除去Fc片段，并且加载到阳离子交换柱(HiTrap SP HP，GEHealthcare)和凝胶过滤柱(Superdex20016/60，GE Healthcare)上。将含Fab片段的级分汇集并存储在-80℃。
9.3.制备305变体Fab和人C5-MG1结构域复合物
将纯化的重组人C5-MG1结构域与纯化的305变体Fab片段以1:1摩尔比混合。将复合物通过凝胶过滤色谱法(Superdex200 10/300增加，GE Healthcare)纯化，其使用用25mMHEPES pH 7.5，100mM NaCl平衡的柱。
9.4.结晶
将纯化的复合物浓缩至约10mg/mL，并且在4℃通过坐滴气相扩散法(drop vapordiffusion method)并结合种晶法进行结晶。母液由0.2M去水甲酸镁，15.0％w/v聚乙二醇3350构成。这在若干天内成功产生片状晶体。将晶体浸泡在0.2M去水甲酸镁，25.0％w/v聚乙二醇3350和20％甘油的溶液中。
9.5.数据收集和结构确定
通过BL32XU在SPring-8测得X射线衍射数据。在测量期间，晶体一直置于-178℃的氮流中以保持冷冻状态，并且使用与束线相连的MX-225HS CCD检测仪(RAYONIX)来收集总计180张X射线衍射图像，同时一次将晶体旋转1.0度。使用Xia2程序(J.Appl.Cryst.43:186-190(2010)，XDS软件包(Acta.Cryst.D66:125-132(2010))和Scala(Acta.Cryst.D62:72-82(2006))来进行细胞参数的确定，衍射点的指标化和获自衍射图像的衍射数据的加工，并且最后获得分辨率可达2.11埃的衍射强度数据。晶体学数据统计显示在表11中。
[表11]
X射线数据收集及精修统计
Figure BDA0001356706070000981
a；Rmerge＝ΣhklΣj|Ij(hkl)-<I(hkl)>|/Σhk/Σj|Ij(hkl)|，其中Ij(hkl)和<I(hkl)>分别是测量j的强度和具有指标hkl的反射的平均强度。
b；R因子＝∑hkl|Fcalc(hkl)|-|Fobs(hkl)|/∑hkl|Fobs(hkl)|，其中Fobs和Fcalc分别是观察的和计算的机构因子振幅。
c；Rfree利用随机挑取的5％的反射计算。
通过分子置换利用程序Phaser(J.Appl.Cryst.40:658-674(2007))确定结构。Fab结构域的查找模型来源于公布的人IgG4Fab晶体结构(PDB编码:1BBJ)，而MG1结构域的查找模型来自公布的人C5晶体结构(PDB编码：3CU7，Nat.Immunol.9:753-760(2008))。模型利用Coot程序(Acta Cryst.D66:486-501(2010))搭建并且利用程序Refmac5(Acta Cryst.D67:355-367(2011))进行精修。25-2.11埃衍射强度数据的晶体学可靠性因子(R)为20.42％，而Free R值为26.44％。结构精修统计显示在表11中。
9.6.305变体Fab和C5-MG1结构域复合物的总体结构
来自305的优化变体的Fab片段("305Fab")以1:1的比率结合人C5-MG1结构域("MG1")，并且晶体结构的非对称单元包含两个复合物，分子1和2，如图22A中所示。利用所有残基中的C-α原子位置可以将分子1和2以0.717埃RMSD很好地对齐，如图22B中所示。以下讨论的图使用分子1制备。
在图23A和23B中，305Fab接触区的表位分别在MG1氨基酸序列中和在晶体结构中作图。所述表位包括含有在晶体结构中位于距305Fab的任意部分4.5埃距离内的一个或多个原子的MG1的氨基酸残基。此外，3.0埃内的表位在图23A中被突出显示。
9.7.E48，D51和K109的相互作用
如实施例4.5和4.6中所述，通过蛋白印迹和BIACORE(注册商标)结合分析，测试包括305抗体系列的抗-C5MAb与三种人C5点突变体E48A，D51A和K109A的结合。尽管305变体强烈结合WT C5，但是它们仅较弱地结合E48A C5突变体并且不结合D51A和K109A突变体。305Fab和MG1复合物的晶体结构揭示了三个氨基酸E48，D51和K109都在距305Fab 3.0埃的距离内，与Fab形成若干氢键，如图24A中所示。根据更详细的研究，MG1的K109残基被包埋在Fab的重链的界面中形成的沟中并且通过与H-CDR3_G97，H-CDR3_Y100和H-CDR3_T100b的三个氢键以及与H-CDR3_D95的盐桥而与Fab紧密地相互作用(图24D)。D51位于MG1和305Fab的重链之间并且与H-CDR1_Ser32和H-CDR2_Ser54形成两个氢键从而充填空间(图24C)。这些指示，C5的K109和D51对于305抗体系列的结合都是关键的残基。另一方面，E48的位置紧邻表面并且仅与Fab形成一个氢键，表明其对抗体结合的贡献小于K109和E51的贡献(图24B)。这些关系与人C5突变体的蛋白印迹和BIACORE(注册商标)结合分析的结果(实施例4.5和4.6)一致。补充提示：Fab氨基酸的残基编号是基于Kabat编号方案。(Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991)
9.8.人C5的H70，H72和H110与305抗体系列的相互作用
晶体结构分析揭示了，人C5上的三个组氨酸残基，即，H70，H72和H110，被包含在305变体Fab的表位中，如图23A和图25A中所示。进行BIACORE(注册商标)结合分析以研究这些组氨酸残基对人C5和305变体Fab之间的pH依赖性蛋白-蛋白相互作用的贡献，其中使用人C5突变体H70Y，H72Y，H110Y和H70Y+H110Y(实施例4.7)。H72Y导致305变体Fab与C5结合的完全丧失。该C5残基位于由305Fab重链的CDR2环和MG1的环(L73，S74和E76)形成的口袋中并且将该空间紧密填充，如图25C中所示。此外，C5的H72残基与H-CDR2_Y58形成氢键。预期H72Y突变将不被容忍，因为没有足够的空间来容纳酪氨酸的体积更大的侧链。与H-CDR2_Y58的氢键也无法保持。关于H70和H110对pH依赖性的贡献，H70Y和H110Y突变导致在pH 5.8下305变体Fab自C5的解离较慢。H70与MG1的T53形成分子内氢键，据信在pH 5.8当C5的H70的质子化在MG1的相互作用界面的相应部分中引起构象改变时，所述氢键被破坏(图25B)。对于H110，该C5残基的质子化预期将引起对305Fab的电荷排斥，相邻的组氨酸残基H-CDR3_H100c的质子化可以增强所述排斥(图25D)。
虽然为了清楚理解通过例示和实施例描述了上述发明的一些细节，但是说明书和实施例不应被视为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地明确地结合。
序列表
<110> 中外制药株式会社
<120> 抗-C5抗体及使用方法
<130> C1-A1412P
<150> JP 2014-257647
<151> 2014-12-19
<160> 150
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 1
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Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
<400> 3
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<223> 人工合成的序列
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
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Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe
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Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Leu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Ala Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Val Gly Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 19
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 20
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Thr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn His Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 21
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Glu Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Trp Asn Ser Gly Tyr
20 25 30
Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Ala Asn Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Gly Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Asp Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 22
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile His Ser Phe Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Val
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Gly Trp Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 23
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Gly Thr Ile Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Pro Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Ser Tyr Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 24
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Asn Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Val Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Met Glu Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Tyr Phe
100 105 110
Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 25
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Pro Thr Leu Thr Asn Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Gly Val Gln Cys Ala Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Trp
85 90 95
Tyr Gly Asn Ser Tyr Val Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val
100 105 110
Val Lys
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 26
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Asn Tyr Asp Ser Thr Ser
85 90 95
Ser Ser Phe Gly Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 27
Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr
85 90 95
Ser Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu
325
<210> 34
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Tyr His Val Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu
325
<210> 35
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 36
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Cys
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 38
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 39
<211> 1676
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg
260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln
275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly
405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu
465 470 475 480
His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe
500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
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675 680 685
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690 695 700
Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu
705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser
725 730 735
Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu
740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr
755 760 765
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770 775 780
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850 855 860
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865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val
885 890 895
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Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro
945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile
965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu
980 985 990
Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala
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Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile
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Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn
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Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala
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Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg
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Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr
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Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr
1370 1375 1380
Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp
1385 1390 1395
Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu
1400 1405 1410
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1415 1420 1425
Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val
1430 1435 1440
Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly
1445 1450 1455
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu
1460 1465 1470
Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu
1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys
1490 1495 1500
Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys
1505 1510 1515
Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly
1520 1525 1530
Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg
1535 1540 1545
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1550 1555 1560
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1565 1570 1575
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1580 1585 1590
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1595 1600 1605
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
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1640 1645 1650
Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala
1655 1660 1665
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1670 1675
<210> 40
<211> 673
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
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130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
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Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg
260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln
275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly
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Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu
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His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
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500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
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545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser
565 570 575
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580 585 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala
595 600 605
Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe
610 615 620
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu
625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn
645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile
660 665 670
Leu
<210> 41
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg Val Gly Ala
1 5 10 15
Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu Ala Phe Asp
20 25 30
Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Ser Tyr Ser
35 40 45
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50 55 60
Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln Asn Pro Val
65 70 75 80
Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser Lys Ser Lys
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Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly
100 105
<210> 42
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Phe Leu Phe Ile His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser
1 5 10 15
Val Lys Val Arg Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys
20 25 30
Arg Glu Thr Val Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp
35 40 45
Met Val Glu Glu Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe
50 55 60
Lys Ile Pro Ser Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys
65 70 75 80
Tyr Lys Glu Asp Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys
85 90 95
Glu Tyr Val Leu Pro
100
<210> 43
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro
225
<210> 44
<211> 1676
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 44
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ser Ala Val Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Gln Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Ile Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Gln Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Phe Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Val Glu Pro Glu Ser Asn Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg
260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln
275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Glu Val Thr Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Tyr Ser Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ala Leu Asp Gln Leu Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Glu Pro Arg Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly
405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Val Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Asp Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu
465 470 475 480
Tyr Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe
500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp
545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser
565 570 575
Pro Asp Ala Asp Thr Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met
580 585 590
Val Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Val Asp Ser Ala
595 600 605
Val Tyr Gly Val Gln Arg Arg Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe
610 615 620
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu
625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn
645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile
660 665 670
Ile Arg Pro Arg Arg Met Leu Gln Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala
675 680 685
Lys Tyr Lys His Leu Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Val Arg
690 695 700
Ile Asn His Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Val
705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Val Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser
725 730 735
Gln Leu Arg Ala Asn Asn Ser His Lys Asp Leu Gln Leu Gly Arg Leu
740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr
755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys
770 775 780
Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Val Thr Thr Trp Glu Ile Gln
785 790 795 800
Gly Val Gly Ile Ser Asn Ser Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Ile Lys
805 810 815
Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser
820 825 830
Val Val Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr
835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly
850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser
865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Asn His Leu Val
885 890 895
Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu Gln Asn Ile Asn Phe
900 905 910
Ser Leu Glu Thr Ser Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Ser Leu Arg
915 920 925
Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Leu
930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro
945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile
965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu
980 985 990
Ser Arg Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala
995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His
1010 1015 1020
Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro
1025 1030 1035
Leu Ile Glu Lys Arg Asn Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met
1040 1045 1050
Val Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val
1055 1060 1065
Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu
1070 1075 1080
Arg Val Leu Gly Gln Val His Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn
1085 1090 1095
Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu
1100 1105 1110
Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys
1115 1120 1125
Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr
1130 1135 1140
Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile
1145 1150 1155
Cys Pro Leu Val Lys Ile Asn Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Thr
1160 1165 1170
Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro
1190 1195 1200
Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val
1205 1210 1215
Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Ser Leu Gln
1220 1225 1230
His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val
1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp
1250 1255 1260
Ile Asn Tyr Val Asn Pro Ile Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln
1265 1270 1275
Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala
1280 1285 1290
Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg
1295 1300 1305
Leu Asn Met Asp Ile Asp Val Ala Tyr Lys His Lys Gly Pro Leu
1310 1315 1320
His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val
1325 1330 1335
Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Val Val Ser Thr Gly Phe Gly
1340 1345 1350
Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr
1355 1360 1365
Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr
1370 1375 1380
Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp
1385 1390 1395
Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Lys Glu
1400 1405 1410
Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu
1415 1420 1425
Pro Thr Gly Ile Asn Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val
1430 1435 1440
Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly
1445 1450 1455
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu
1460 1465 1470
Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu
1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys
1490 1495 1500
Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys
1505 1510 1515
Val Cys Glu Gly Ala Thr Cys Lys Cys Ile Glu Ala Asp Cys Gly
1520 1525 1530
Gln Met Gln Lys Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg
1535 1540 1545
Lys Gln Thr Ala Cys Asn Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val
1550 1555 1560
Ile Ile Thr Ser Ile Thr Thr Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys
1565 1570 1575
Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu
1580 1585 1590
Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn
1595 1600 1605
Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu
1610 1615 1620
Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Thr Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro
1625 1630 1635
Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr
1640 1645 1650
Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala
1655 1660 1665
Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys
1670 1675
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 45
Ser Ser Tyr Tyr Met Cys
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 46
Asn Phe Tyr Tyr Ile Cys
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 47
Ser Ser Tyr Tyr Met Cys
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 48
Ser Ser Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 49
Ser Ser Tyr Tyr Met Asn
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 50
Asp Asn Thr Met Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 51
Thr Tyr Ala Met Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 52
Gly Asn Ala Ile Asn
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Thr Tyr Ala Met Gly
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
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Gly
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 56
Cys Ile Tyr Thr Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Ile Ile Ser Phe Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 62
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 62
Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 63
Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 64
Ala Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 65
Asp Gly Gly Tyr Val Thr Pro Thr His Ala Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 66
Asp Leu His Ala Gly Ile Thr Asn Leu
1 5
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 67
Tyr Pro Thr Tyr Gly Asp Gly Gly His Ala Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 68
Gln Ile Tyr Ser Gly Asp Asn Asn Asp Asn Phe
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 69
Gln Ile Tyr Ser Gly Asp Asn Asn Asp Asn Phe
1 5 10
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 70
Val Gly Ala Gly Asn Ile Phe Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 71
Asn Asp Gly Ser Val Tyr Asn Leu Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 72
Gly Ser Gly Leu
1
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 73
Asn Asp Gly Ser Val Tyr Asn Leu Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 74
Asp Gly Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 75
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 76
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 77
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Ser Asp Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 78
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 79
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 80
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 81
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 82
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 83
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 84
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Ser Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 85
Gly Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 86
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 87
Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 88
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 89
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 90
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 91
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 92
His Thr Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 93
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 94
Gly Ala Ser Lys Thr His Ser
1 5
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 95
Gln Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Ala
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 96
Leu Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Val Asp Asp Ala
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 97
Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Phe Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 98
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 99
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 100
Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Thr Asn Val His Asn Ser
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 101
Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser Val Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 102
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 102
Gln Cys Thr Ala Tyr Gly Ser Ser Asp Val Gly Gly Thr
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 103
Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser Val Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 104
Gln Ser Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn His
1 5 10
<210> 105
<211> 1680
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 105
Met Gly Leu Trp Gly Ile Leu Cys Leu Leu Ile Phe Leu Asp Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Leu Arg
20 25 30
Val Gly Ser Ser Glu Asn Val Val Ile Gln Val His Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Leu Ser Leu Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Val
50 55 60
Thr Phe Ser Ser Gly Tyr Val Asn Leu Ser Pro Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ala Ala Leu Leu Thr Leu Gln Pro Asn Gln Val Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Ser Pro Val Ser His Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asn Asn Gly Ile Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Ile Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Gly Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Ile Val Glu Glu
165 170 175
Asn Asp Tyr Thr Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Lys Tyr Gly Val Trp Thr Ile Lys Ala Asn Tyr Lys Lys Asp
195 200 205
Phe Thr Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Ile Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro Arg Phe Ser Val Ser Ile Glu Leu Glu Arg Thr Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Val Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Pro Asp Ala Glu Val Tyr Ala Phe Phe Gly Leu Arg
260 265 270
Glu Asp Ile Lys Asp Glu Glu Lys Gln Met Met His Lys Ala Thr Gln
275 280 285
Ala Ala Lys Leu Val Asp Gly Val Ala Gln Ile Ser Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Thr Glu Ser Ser Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Val Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Thr Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Phe Ser Ile Lys Ala Gln Val Lys Asp Ser Leu Glu Gln Ala Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Met Ala Gln Thr Val Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Glu Thr Lys Arg Ser Ile Thr His Asp Thr Asp Gly
405 410 415
Val Ala Val Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Asn Val Thr Val Leu Lys
420 425 430
Phe Glu Ile Arg Thr Asp Asp Pro Glu Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Ser Lys Glu Tyr Glu Ala Val Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Ile Tyr Ile Ala Trp Thr Glu Asn Tyr Lys Pro Met Leu Val Gly Glu
465 470 475 480
Tyr Leu Asn Ile Met Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Val Gln Tyr
500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Leu Phe Ser Ser Thr Tyr Gln Asn Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ala Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ala Asp Ala Val Trp
545 550 555 560
Ile Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser
565 570 575
Pro Asp Glu Tyr Val Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asp Met
580 585 590
Val Thr Glu Ala Asp Ser Trp Val Ala Leu Ser Ala Val Asp Arg Ala
595 600 605
Val Tyr Lys Val Gln Gly Asn Ala Lys Arg Ala Met Gln Arg Val Phe
610 615 620
Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly
625 630 635 640
His Asp Asn Ala Asp Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr
645 650 655
Asn Ala Asn Ala Asp Asp Ser His Tyr Arg Asp Asp Ser Cys Lys Glu
660 665 670
Ile Leu Arg Ser Lys Arg Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu
675 680 685
Glu Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr
690 695 700
Asp Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala
705 710 715 720
Arg Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys
725 730 735
Thr Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln
740 745 750
Leu Gly Arg Ile His Ile Lys Thr Leu Leu Pro Val Met Lys Ala Asp
755 760 765
Ile Arg Ser Tyr Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Ile His Arg Val
770 775 780
Pro Lys Arg Lys Gln Leu Gln Val Thr Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr
785 790 795 800
Trp Glu Ile Gln Gly Ile Gly Ile Ser Asp Asn Gly Ile Cys Val Ala
805 810 815
Asp Thr Leu Lys Ala Lys Val Phe Lys Glu Val Phe Leu Glu Met Asn
820 825 830
Ile Pro Tyr Ser Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr
835 840 845
Val Tyr Asn Tyr Met Thr Ser Gly Thr Lys Phe Cys Val Lys Met Ser
850 855 860
Ala Val Glu Gly Ile Cys Thr Ser Gly Ser Ser Ala Ala Ser Leu His
865 870 875 880
Thr Ser Arg Pro Ser Arg Cys Val Phe Gln Arg Ile Glu Gly Ser Ser
885 890 895
Ser His Leu Val Thr Phe Thr Leu Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His
900 905 910
Ser Ile Asn Phe Ser Leu Glu Thr Ser Phe Gly Lys Asp Ile Leu Val
915 920 925
Lys Thr Leu Arg Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ala
930 935 940
Gly Val Ile Leu Asp Pro Lys Gly Ile Arg Gly Ile Val Asn Arg Arg
945 950 955 960
Lys Glu Phe Pro Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Lys
965 970 975
Val Glu Arg Ile Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Phe Leu
980 985 990
Ser Thr Val Leu Ser Lys Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro
995 1000 1005
Lys Gly Ser Ala Glu Ala Glu Leu Met Ser Ile Ala Pro Val Phe
1010 1015 1020
Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu Ala Gly Asn His Trp Asn Ile Phe
1025 1030 1035
Tyr Pro Asp Thr Leu Ser Lys Arg Gln Ser Leu Glu Lys Lys Ile
1040 1045 1050
Lys Gln Gly Val Val Ser Val Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr
1055 1060 1065
Ser Tyr Ser Met Trp Lys Gly Ala Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr
1070 1075 1080
Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Val Ala Lys Tyr Val Lys
1085 1090 1095
Gln Asp Glu Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu
1100 1105 1110
Lys Cys Gln Leu Glu Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr
1115 1120 1125
Leu Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Ala Glu Ala Gln Glu
1130 1135 1140
Lys Thr Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Ser Val Ile Gly Ile Arg Lys
1145 1150 1155
Ala Val Asp Ile Cys Pro Thr Met Lys Ile His Thr Ala Leu Asp
1160 1165 1170
Lys Ala Asp Ser Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ser Lys Ser
1175 1180 1185
Thr Phe Thr Leu Ala Ile Val Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp
1190 1195 1200
Arg Thr His Pro Arg Phe Arg Leu Ile Val Ser Ala Leu Arg Lys
1205 1210 1215
Glu Ala Phe Val Lys Gly Asp Pro Pro Ile Tyr Arg Tyr Trp Arg
1220 1225 1230
Asp Thr Leu Lys Arg Pro Asp Ser Ser Val Pro Ser Ser Gly Thr
1235 1240 1245
Ala Gly Met Val Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Ala Ser Leu
1250 1255 1260
Lys Leu Lys Asp Met Asn Tyr Ala Asn Pro Ile Ile Lys Trp Leu
1265 1270 1275
Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp
1280 1285 1290
Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Leu
1295 1300 1305
Lys Gln Ile His Leu Asp Met Asp Ile Asn Val Ala Tyr Lys His
1310 1315 1320
Glu Gly Asp Phe His Lys Tyr Lys Val Thr Glu Lys His Phe Leu
1325 1330 1335
Gly Arg Pro Val Glu Val Ser Leu Asn Asp Asp Leu Val Val Ser
1340 1345 1350
Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Leu Ala Thr Val Tyr Val Lys Thr Val
1355 1360 1365
Val His Lys Ile Ser Val Ser Glu Glu Phe Cys Ser Phe Tyr Leu
1370 1375 1380
Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser Ser His Phe Arg Leu
1385 1390 1395
Ser Asp Ser Gly Phe Lys Arg Ile Ile Ala Cys Ala Ser Tyr Lys
1400 1405 1410
Pro Ser Lys Glu Glu Ser Thr Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met
1415 1420 1425
Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Gly Ala Asn Glu Glu Asp Leu
1430 1435 1440
Arg Ala Leu Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Leu Thr Asp Tyr Gln
1445 1450 1455
Ile Lys Asp Gly His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser
1460 1465 1470
Arg Asp Phe Leu Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Gln
1475 1480 1485
Val Gly Phe Leu Asn Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His
1490 1495 1500
Arg Pro Asp Lys Gln Cys Thr Met Ile Tyr Ser Ile Ser Asp Thr
1505 1510 1515
Arg Leu Gln Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Thr Cys Val Glu
1520 1525 1530
Ala Asp Cys Ala Gln Leu Gln Ala Glu Val Asp Leu Ala Ile Ser
1535 1540 1545
Ala Asp Ser Arg Lys Glu Lys Ala Cys Lys Pro Glu Thr Ala Tyr
1550 1555 1560
Ala Tyr Lys Val Arg Ile Thr Ser Ala Thr Glu Glu Asn Val Phe
1565 1570 1575
Val Lys Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Val Thr Tyr Lys Thr Gly Glu
1580 1585 1590
Ala Ala Asp Glu Asn Ser Glu Val Thr Phe Ile Lys Lys Met Ser
1595 1600 1605
Cys Thr Asn Ala Asn Leu Val Lys Gly Lys Gln Tyr Leu Ile Met
1610 1615 1620
Gly Lys Glu Val Leu Gln Ile Lys His Asn Phe Ser Phe Lys Tyr
1625 1630 1635
Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Ser Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Thr
1640 1645 1650
Asp Thr Thr Cys Pro Ser Cys Gln Ala Phe Val Glu Asn Leu Asn
1655 1660 1665
Asn Phe Ala Glu Asp Leu Phe Leu Asn Ser Cys Glu
1670 1675 1680
<210> 106
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 111
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 112
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 112
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 114
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 115
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 115
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 116
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 116
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 117
Ser Ser Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 118
Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 119
Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 120
Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 121
Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 122
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 123
Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 124
Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser
1 5
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 125
Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr
1 5 10
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Met或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Cys或Ala
<400> 126
Ser Ser Tyr Tyr Xaa Xaa
1 5
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys, Ala或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Thr, Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Tyr, Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Ser, Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是Ala或Val
<400> 127
Xaa Ile Xaa Thr Gly Ser Gly Ala Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Trp Xaa Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 128
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Gly或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Val, Gln或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Thr或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Leu或Tyr
<400> 128
Asp Xaa Gly Tyr Xaa Xaa Pro Thr His Ala Met Xaa Xaa
1 5 10
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Gln或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Asn, Gln或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Asp, Lys或Ser
<400> 129
Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Ser Xaa Leu Ala
1 5 10
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Lys, Glu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Leu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Ala, His, Glu或Gln
<400> 130
Gly Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ser, Cys, Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Phe或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是Ala, Thr或His
<400> 131
Gln Xaa Thr Xaa Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Xaa
1 5 10
<210> 132
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser His
20 25 30
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His
20 25 30
<210> 134
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His
20 25 30
<210> 135
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 135
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 136
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 137
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 138
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 138
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 139
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 139
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 140
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 141
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 142
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 143
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 143
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 144
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 145
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 146
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 146
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 147
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 147
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 148
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 149
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
420 425 430
Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (15)

1.制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫非人动物，其中所述多肽包含对应于C5的β链的位置33至124处的氨基酸的区域，其中所述抗-C5抗体在pH7.4处比在pH5.8处以更高的亲和力结合包含选自由β链内氨基酸47-57, 70-76,和107-110组成的组的至少一个片段的表位，其中所述C5的β链的氨基酸序列在SEQ ID NO:40中显示。
2. 制备抗-C5抗体的方法，所述方法包括针对多肽免疫非人动物，其中所述多肽包含至少一个选自C5的β链的氨基酸47-57、70-76和107-110的片段，其中所述抗-C5抗体在pH7.4处比在pH5.8处以更高的亲和力结合选自C5的β链的氨基酸47-57, 70-76,和107-110的至少一个片段，其中所述C5的β链的氨基酸序列在SEQ ID NO:40中显示。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多肽包含至少一个选自Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109和His110的氨基酸，其中所述抗-C5抗体在pH7.4处比在pH5.8处以更高的亲和力结合所述至少一个氨基酸。
4.权利要求3的方法，其中所述多肽包含His70，His72和His110，其中所述抗-C5抗体在pH7.4处比在pH5.8处以更高的亲和力结合His70，His72和His110。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体可以与包含选自以下的VH和VL对的抗体竞争结合C5或结合相同表位：
(a) SEQ ID NO: 1的VH和SEQ ID NO: 11的VL；
(b) SEQ ID NO: 5的VH和SEQ ID NO: 15的VL；
(c) SEQ ID NO: 4的VH和SEQ ID NO: 14的VL；
(d) SEQ ID NO: 6的VH和SEQ ID NO: 16的VL；
(e) SEQ ID NO: 2的VH和SEQ ID NO: 12的VL；
(f) SEQ ID NO: 3的VH和SEQ ID NO: 13的VL；
(g) SEQ ID NO: 9的VH和SEQ ID NO: 19的VL；
(h) SEQ ID NO: 7的VH和SEQ ID NO: 17的VL；
(i) SEQ ID NO: 8的VH和SEQ ID NO: 18的VL；和
(j) SEQ ID NO: 10的VH和SEQ ID NO: 20的VL。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其进一步包括确认所述抗-C5抗体在pH7.4是否比在pH5.8具有更高的亲和力。
7.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体的pH5.8/pH7.4 KD比为2或更高。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体是分离的单克隆抗体。
9.权利要求1至2中任一项的方法，其中所述抗-C5抗体抑制C5的活化。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体抑制C5变体R885H的活化。
11.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体是人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。
12.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体是与C5结合的抗体片段。
13.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体衍生自全长IgG1或IgG4抗体。
14.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体的pH5.8/pH7.4 KD比为5或更高。
15.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述抗-C5抗体的pH5.8/pH7.4 KD比为20或更高。
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