KR20130009784A - 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그중에서도 특히, 인간 보체의 억제제 및/또는 인터페론 알파의 억제제를 포함하는 조성물, 그리고 개체에서 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는 방법에서 이들 조성물의 용도에 관계한다. 일부 구체예에서, 억제제는 인간 보체 성분 C5 단백질 또는 C5의 생물학적 활성 단편, 예를 들면, C5a 또는 C5b에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 억제제는 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.

Description

악성 위축성 구진증을 치료하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DEGOS' DISEASE}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2010년 3월 1일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/309,393호에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다.

서열 목록

본원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 이것은 전체적으로 참조로서 본 발명에 편입된다. 2011년 2월 25일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 ALXN153.txt라 명명되며 61,625 바이트의 크기이다.

기술 분야

본 발명의 분야는 의학, 면역학, 분자 생물학 및 단백질 화학이다.

배경 기술

악성 위축성 구진증(일명, Kohlmeier disease 및 malignant atrophic papulosis (MAP))은 작은 혈관 내지 큰 혈관에서 혈전증(thrombosis)으로 특징되는 희귀 혈관병증(vasculopathy)(약 200건의 증례가 보고됨)이다(Lester and Rapini (2009) Curr Opin Gastroenterol 25:66-73 및 Englert et al. (1984) Br Med J 289:576 참고). 비록 병인이 미지인 것으로 일반적으로 간주되긴 하지만, 악성 위축성 구진증은 바이러스 감염(가령, B19 파보바이러스와 HIV) 및 자가면역 질환, 예를 들면, 홍반성 루푸스(LE), 피부근염, 그리고 원발성 항인지질 증후군(APS)과 연관된다(Crowson et al. (2002) J Cutan Pathol 29:596-601; Englert et al. (1984), supra; Heymann (2009) J Am Acad Dermatol 61:505-506; Durie et al. (1969) Arch Dermatol 100(5):575-581; Tsao et al. (1997) J Am Acad Dermatol 36:317-319; 그리고 Requena et al. (1998) J Am Acad Dermatol 38:852-856 참고). 악성 위축성 구진증의 일부 형태는 가족성이다(Katz et al. (1997) J Am Acad Dermatol 37:480-484 및 Penault et al. (2004) Ann Dermatol Venereol 131:989-993 참고). 악성 위축성 구진증은 대략 3:1의 비율로 여성보다 남성에게 우선적으로 영향을 주는 것으로 보이긴 하지만, 임의의 연령의 환자에서 발생할 수 있다(Katz et al. (1997), supra; Torrelo et al. (2002) Br J Dermatol 146:916-918; 그리고 Wilson et al. (2007) Pediatr Dermatol 24(1):18-24).

악성 위축성 구진증은 양성의 순전히 피부 형태로서, 또는 공격적인 다장기 전신성 형태로서 나타날 수 있는데, 후자는 일반적으로, 진단후 1 내지 12년 내에 사망에 이르게 된다(Scheinfeld (2007) Clin Exp Derm 32:483-487). 피부 악성 위축성 구진증의 표현형적 특징(phenotypic hallmark)은 피부 상에 하나 이상의 적색을 띠는 홍반성 구진의 출현인데, 이들 구진은 흰색의 위축성 중심을 갖는 흉터를 남긴다.

사망은 악성 위축성 구진증의 전신성 형태를 갖는 거의 모든 환자에서 발생하고, 이들 환자는 전신 침범(systemic involvement)후 약 2 내지 3년의 평균 기대 수명(average life expectancy)을 갖는다(Scheinfeld (2007), supra 참고). 환자는 일반적으로, 패혈성 합병증(septic complication)과 함께 또는 없이, 장 천공(intestinal perforation)으로 사망한다; 하지만, 사망은 장 경색(intestinal infarction), 심폐 허탈(cardiopulmonary collapse), 및/또는 신경 경색(neurological infarction)과 출혈(hemorrhage)에 대안적으로 기인할 수도 있다(Id). 또한, High et al. (2004) J Am Acad Dermatol 50(6):895-899를 참고한다.

악성 위축성 구진증에 대한 표준 의학적 치료제는 규정되지 않았다. 많은 치료제가 상기 질환의 치료에서 극히 미미한 및/또는 일관성이 없는 성공을 거두고 있을 뿐이다(Scheinfeld (2007), supra 참고). 가령, 일부 악성 위축성 구진증 환자는 정맥내 면역글로불린 요법으로부터 혜택을 보았지만, 현재 어떤 환자가 이런 요법에 반응할 것인 지를 예측할 만한 방법이 없다(Dyrsen et al. (2008) J Cutan Pathol 35(Suppl 1):20-25; Zhu et al. (2007) Br J Dermatol 157(1):206-207; 그리고 De Breucker et al. (2008) Acta Clin Belg 63(2):99-102 (Abstract) 참고).

상기에 비추어, 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하기 위한 새로운 접근법과 더욱 우수한 방법에 대한 요구가 존재하고 있음은 명백하다.

요약

본 발명은 적어도 부분적으로, 보체의 억제제, 다시 말하면, 인간화된 항-C5 항체 에쿨리주맙(eculizumab)이 악성 위축성 구진증의 전신성 형태를 앓는 환자의 치료에서 매우 유효하다는 본 발명자의 발견에 기초된다. 따라서 본 발명은 악성 위축성 구진증의 예방과 치료에 유용한 다양한 조성물과 방법을 특징으로 한다.

한 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 보체 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자에서 보체 활성의 감소된 수준을 유지시키는데 충분한 빈도와 양으로 보체 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 장기적으로 투여하여 상기 질환을 치료하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자를 악성 위축성 구진증을 앓거나, 또는 악성 위축성 구진증을 앓을 가능성이 높은 것으로 확인하는 단계; 그리고 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 보체 억제제를 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는(가령, 악성 위축성 구진증의 발생을 예방하거나, 또는 악성 위축성 구진증의 양성 피부 형태의 더욱 진전된 다장기 및/또는 전신성 형태로의 진행을 예방하는) 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 질환을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 보체 억제제를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 억제제는 치료의 지속 기간 동안 환자의 혈액에서 보체 활성화의 감소된 수준을 유지시키는 빈도와 양으로 장기적으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 B19 파로바이러스 감염 또는 인간 면역결핍 바이러스 감염과 연관된다. 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 특발성(idiopathic)이다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 위장관, 중추신경계, 그리고 심혈관계 중에서 하나 이상에 병리학적으로 영향을 준다. 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 다장기, 전신성 악성 위축성 구진증. 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 피부 형태이다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 소염제, 항응혈제, 항혈전제, 그리고 정맥내 면역글로불린으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 가지 요법에 불응성이다. 소염제는 예를 들어, 코르티코스테로이드, 페닐부타존, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 그리고, 미코페놀레이트 모페틸로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 항응혈제 또는 항혈전제는 예를 들어, 클로피도그렐, 아스피린, 그리고 디피리다몰로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 보체 억제제는 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 핵산, 핵산 유사체, 그리고 소분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 보체 억제제는 예를 들어, 가용성 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독액 인자, FUT-175, 컴플레스타틴, 그리고 K76 COOH로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 단백질의 발현을 억제한다. 일부 구체예에서, 보체 억제제는 보체 성분 C1s, 보체 성분 C1r, C3 전환효소, C5 전환효소, 또는 C5b-9를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 보체 단백질의 활성을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 C5, C4, C3, 또는 C2의 절단을 억제한다. 가령, 보체 억제제는 보체 성분 C5의 단편s C5a와 C5b로의 절단을 억제할 수 있다.

일부 구체예에서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 단백질(가령, C5 단백질)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 C5 단백질의 알파 쇄에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 C5의 베타 쇄에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 보체 성분 C5의 알파 쇄에 결합하고, 그리고 여기서 항체는 (i) 인간 체액에서 보체 활성화를 억제하고, (ii) 인간 보체 성분 C3b 또는 인간 보체 성분 C4b에 정제된 인간 보체 성분 C5의 결합을 억제하고, 그리고 (iii) 인간 보체 활성화 산물 없는 C5a에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:1-26 중에서 임의의 한 가지에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합한다. 일부 구체예에서, 억제제는 보체 성분 C5 단편 C5b에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 구체예에서, 항체는 단클론 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화 항체, 재조합 항체, 디아바디(diabody), 키메라화된 또는 키메라 항체, 탈면역화된 인간 항체, 완전한 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab’ 단편, 그리고 F(ab’)₂ 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 방법의 일부 구체예에서, 보체 억제제는 에쿨리주맙 또는 펙셀리주맙일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 제조 물품을 특징으로 하고, 이것은 라벨을 포함하는 용기; 그리고 보체 억제제를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 라벨은 조성물이 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 인간에게 투여된다는 것을 나타낸다. 억제제는 예를 들어, 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 억제제는 예를 들어, 인간 보체 성분 C5 단백질의 단편, 예를 들면, C5a 또는 C5b에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.

일부 구체예에서, 제조 물품은 소염제, 항응혈제, 또는 항혈전제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함한다.

본 발명자는 또한, 본 명세서에서 설명된 악성 위축성 구진증 환자가 생검된 피부 조직 내에서뿐만 아니라 혈청에서 상승된 수준의 인터페론 알파 수준을 갖는다는 것을 발견하였다. 임의의 특정 이론 또는 작용 기전에 한정됨 없이, 인터페론 알파가 적응 면역과 선천 면역을 상향조절하여 임의의 항원성 유인(trigger)의 효과를 강화시키고, 그리고 외인성 인터페론 알파의 투여가 피부 혈전증과 궤양화(ulceration)의 원인으로서 보고되었기 때문에, 본 발명자는 인터페론 알파의 억제가 악성 위축성 구진증을 치료하기 위한 유용한 전략이라고 생각한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 인터페론 알파의 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자에서 인터페론 알파 활성 또는 활성의 감소된 수준을 유지시키는데 충분한 빈도와 양으로 인터페론 알파의 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 장기적으로 투여하여 상기 질환을 치료하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자를 악성 위축성 구진증을 앓거나, 또는 악성 위축성 구진증을 앓을 가능성이 높은 것으로 확인하는 단계; 그리고 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 인터페론 알파의 억제제를 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는(가령, 악성 위축성 구진증의 발생을 예방하거나, 또는 악성 위축성 구진증의 양성 피부 형태의 더욱 진전된 다장기 및/또는 전신성 형태로의 진행을 예방하는) 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 질환을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 인터페론 알파의 억제제를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 억제제는 치료의 지속 기간 동안 환자의 혈액에서 인터페론 알파 발현 또는 활성화의 감소된 수준을 유지시키는 빈도와 양으로 장기적으로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 핵산, 핵산 유사체, 그리고 소분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 억제제는 예를 들어, 세포에 의한 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체의 발현을 억제할 수 있다. 억제제는 예를 들어, 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체 단백질의 활성을 억제할 수 있다.

일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파에 결합한다. 일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 수용체에 결합한다. 가령, 일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체에 결합하는 항체(또는 이의 항원-결합 단편)이다. 항체는 단클론 항체일 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 인간화된 항체, 재조합 항체, 디아바디, 키메라화된 또는 키메라 항체, 탈면역화된 인간 항체, 완전한 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 그리고 F(ab')₂ 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명은 제조 물품을 특징으로 하고, 이것은 라벨을 포함하는 용기; 그리고 인터페론 알파의 억제제를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 라벨은 조성물이 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 인간에게 투여된다는 것을 나타낸다. 인터페론 알파의 억제제는 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 인터페론 알파의 임의의 억제제, 예를 들면, 인터페론 알파 또는 인터페론 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.

일부 구체예에서, 제조 물품은 소염제, 항응혈제, 또는 항혈전제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 방법은 B 세포-표적화된 치료제의 투여(단일 작용제로서, 또는 보체 억제제 및/또는 인터페론 알파 억제제와 공동으로)를 포함할 수 있다. 가령, 본 발명은 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 환자에게 B 세포-표적화된 치료제의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. B 세포-표적화된 치료제는 예를 들어, 항-CD20 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 항-CD20 결합제일 수 있다. 임상적 이용을 위해 승인되었거나 임상 개발 중에 있고, 본 명세서에서 설명된 방법에 이용될 수 있는 예시적인 치료 항-CD20 항체는 제한 없이, 리툭시맙(rituximab)(Biogen Idec), ⁹⁰Y-이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Biogen Idec), ¹³¹I-토시투모맙(tositumomab)(GlaxoSmithKline), 오파투무맙(ofatumumab)(Genmab), TRU-015(Trubion), 벨투주맙(veltuzumab)(IMMU-106; Immunomedics), 오크렐리주맙(ocrelizumab)(Roche), 그리고 AME-133v(Applied Molecular Evolution)를 포함한다(Levene et al. (2005), supra; Burge et al. (2008) Clin Ther 30(10):1806-1816; Kausar et al. (2009) Expert Opin Biol Ther 9(7):889-895; Morschhauser et al. (2009) J Clin Oncol 27(20):3346-3353; 그리고 Milani and Castillo (2009) Curr Opin Mol Ther 11(2):200-207 참고).

다른 실례에서, 본 명세서에서 설명된 임의의 방법, 예를 들면, 보체 억제제 및/또는 인터페론 알파 억제제가 악성 위축성 구진증 환자에 투여되는 방법이 제시되고, 이들 방법은 또한, B 세포-표적화된 치료제, 예를 들면, 항-CD20 항체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

“폴리펩티드,” “펩티드” 및 “단백질”은 상호 호환되며, 그리고 길이 또는 전사후 변형과는 무관하게 임의의 아미노산의 펩티드-쇄를 말한다. 본 명세서에서 설명된 보체 성분 단백질(가령, 보체 성분 C2, C3, C4, 또는 C5 단백질)은 야생형 단백질을 포함하거나 야생형 단백질이거나, 또는 50개를 넘지 않는(가령, 많아야 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 또는 50개) 연속 아미노산 치환을 가지는 변이체일 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음의 군내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소루이신, 및 루이신; 아스파르트산 및 글루타민산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 그리고 페닐알라닌 및 티로신.

본 명세서에서 설명된 인간 보체 성분 단백질은 또한 단백질의 “항원성 펩티드 단편”을 포함하는데, 이들 단편은 전장, 미성숙(pre-pro) 단백질보다는 더 짧지만, 포유류에서 항원 반응을 유도하는 전장 단백질의 능력의 최소한 10%(가령, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 최소한 99.5%, 또는 100% 이상)를 유지한다. 가령, C5 단백질의 항원성 펩티드 단편은 전장 미성숙 단백질보다 작고 포유류에서 항원성 반응을 유도하는 전장 단백질의 능력의 최소한 10%를 유지하는 상기 단백질의 임의의 단편일 수 있다. 보체 성분 단백질의 항원성 펩티드 단편은 단백질의 말단 및 내부 결손 변이체를 포함한다. 결손 변이체들은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 아미노산 단편 (2개 이상의 아미노산의) 또는 비-연속 단일 아미노산이 부족하다. 항원성 펩티드 단편은 길이가 최소한 6개(가령, 최소한 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 또는 600개 이상)의 아미노산 잔기다(가령, 서열 번호:1-11중 임의의 하나에서 최소한 6개 연속 아미노산 잔기). 일부 구체예에서, 인간 보체 성분 단백질의 항원성 펩티드 단편은 길이가 500개 미만(가령, 450개 미만, 400개 미만, 350개 미만, 325개 미만, 300개 미만, 275개 미만, 250개 미만, 225개 미만, 200개 미만, 190개 미만, 180개 미만, 170개 미만, 160개 미만, 150개 미만, 140개 미만, 130개 미만, 120개 미만, 110개 미만, 100개 미만, 95개 미만, 90개 미만, 85개 미만, 80개 미만, 75개 미만, 70개 미만, 65개 미만, 60개 미만, 50개 미만, 49개 미만, 48개 미만, 47개 미만, 46개 미만, 45개 미만, 44개 미만, 43개 미만, 42개 미만, 41개 미만, 40개 미만, 39개 미만, 38개 미만, 37개 미만, 36개 미만, 35개 미만, 34개 미만, 33개 미만, 32개 미만, 31개 미만, 30개 미만, 29개 미만, 28개 미만, 27개 미만, 26개 미만, 25개 미만, 24개 미만, 23개 미만, 22개 미만, 21개 미만, 20개 미만, 19개 미만, 18개 미만, 17개 미만, 16개 미만, 15개 미만, 14개 미만, 13개 미만, 12개 미만, 11개 미만, 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 또는 7개 미만)(가령, 서열 번호:1-11중 임의의 하나에서 500개 미만의 연속 아미노산 잔기)일 수 있다. 일부 구체예에서, 전장의 미성숙 인간 보체 성분 단백질(prepro-C5 단백질)의 항원성 펩티드 단편은 길이가 최소한 6개 이상이지만 500개 미만이다.

일부 구체예에서, 인간 보체 성분 C5 단백질은 서열 번호:1에 나타난 아미노산 서열을 가지는 인간 C5 단백질에 70% 이상(가령, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가진다.

아미노산 서열의 동일성(%)은 기준 서열과 후보 서열을 나란히 배열한 후, 최대 비율의 서열 동일성을 얻기 위해 필요에 따라 갭을 도입시킨 후, 후보 서열의 아미노산이 기준 서열의 아미노산에 대해 동일한 비율로 나타낸다. 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 목적으로 서열의 배열은 당업계의 기술 범위 내의 다양한 방법으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 가령, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용한다. 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 배열을 얻기 위하여 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 배열을 측정하는 적절한 매개변수들은 공지의 방법에 의해 결정될 수 있다.

예시적인 인간 C5 단백질뿐만 아니라 이의 항원성 펩티드 단편에 대한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 하기에서 나타낸다.

본 명세서 전반에서 이용된 것과 같이, “항체”는 당업계에 공지된 그리고 본 명세서에서 설명된 다양한 방법중 임의의 방법에 의해 만들어진 전체 또는 고유 항체(가령, IgM, IgG, IgA, IgD, 또는 IgE) 분자를 말한다. “항체”는 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라화된 또는 키메라 항체, 인간화 항체, 탈면역화된 인간 항체, 그리고 완전한 인간 항체를 포함한다. 항체는 다양한 종들 내에서 만들어지거나 또는 이들로부터 유도될 수 있는데, 가령, 인간, 인간이 아닌 영장류(가령, 원숭이, 비비, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 토기, 기니아 피그, 게르빌루스 쥐, 햄스터, 쥐 및 마우스와 같은 포유류일 수 있다. 항체는 정제된 또는 재조합 항체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 “항체 단편”, “항원-결합 단편” 또는 유사한 용어는 항원(가령, 보체 성분 C5 단백질)에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 지칭하는 것으로서, 가령, 단일 쇄 항체, 단일 쇄 Fv 단편 (scFv), Fd 단편, Fab 단편, Fab’ 단편, 또는 F(ab’)₂ 단편이다. scFv 단편은 scFv가 유도된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 구역 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄다. 추가적으로, 보체 성분 단백질(가령, 보체 성분 C5)에 결합하는 디아바디(Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Hudson et al . (1999) J. Immunol . Methods 23(1-2):177-189, 각 문헌의 내용은 전문이 참고문헌으로 편입된다) 및 인트라바디(intrabody)(Huston et al . (2001) Hum . Antibodies 10(3-4):127-142; Wheeler et al . (2003) Mol Ther 8(3):355-366; Stocks (2004) Drug Discov . Today 9(22): 960-966, 각 문헌의 내용은 전문이 참고문헌으로 편입된다)는 본 명세서에서 설명된 조성물에 통합되고, 본 명세서에서 설명된 방법에 이용될 수 있다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 통상의 기술자들이 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 충돌이 되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 하기에서는 바람직한 방법 및 재료들이 설명되지만, 본 명세서에서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 방법 및 재료들이 현재 개시된 방법 및 조성물을 테스트 또는 실시하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 자료는 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

본 발명의 기타 특징 및 장점, 예를 들면, 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는 방법은 다음의 상세한 설명, 실시예 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.

상세한 설명

본 발명은 인간 보체의 억제제(가령, 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체)를 포함하는 조성물 및 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 이용하는 방법을 제시한다. 어떠한 방식으로든 한정시키려는 의도 없이, 예시적인 조성물(가령, 약학 조성물 및 제제) 그리고 이들 조성물을 이용하는 방법은 하기에서 상세하게 설명되고 작업 실시예에서 구현된다.

보체 경로

보체 시스템은 세포와 바이러스 병원체의 침입으로부터 방어하기 위해, 신체의 다른 면역학적 시스템과 함께 작동한다. 최소한 25가지 보체 단백질이 존재하는데, 이들은 혈장 단백질과 막 보조인자의 복합 수집물로서 관찰된다. 혈장 단백질은 척추동물 혈청에서 글로불린의 약 10%를 차지한다. 보체 성분은 일련의 복잡하지만 정확한 효소 절단과 막 결합 사건에서 상호작용함으로써 그들의 면역 방어 기능(immune defensive function)을 달성한다. 결과의 보체 캐스케이드는 옵소닌(opsonin) 기능, 면역조절 기능, 그리고 세포용해 기능을 갖는 산물의 생산을 유발한다. 보체 활성화와 연관된 생물학적 활성의 간결한 요약은 예로써, The Merck Manual, 16^th Edition에서 제공된다.

보체 캐스케이드는 고전적 경로, 대안적 경로, 또는 레시틴 경로를 거쳐 진행된다. 이들 경로는 많은 성분을 공유하고, 그리고 최초 단계에서 상이하긴 하지만, 그들은 수렴하고 표적 세포의 활성화와 파괴를 주도하는 동일한 "말단 보체" 성분(C5 내지 C9)을 공유한다.

고전적 보체 경로는 전형적으로, 표적 세포 상에 항원성 부위의 항체 인식, 그리고 상기 부위에 결합에 의해 개시된다. 대안적 경로는 항체 독립성일 수 있고, 그리고 병원체 표면 상에서 일정한 분자에 의해 개시될 수 있다. 부가적으로, 렉틴 경로는 전형적으로, 높은 만노오스 기질에 만노오스-결합 렉틴 (MBL)의 결합으로 개시된다. 이들 경로는 보체 성분 C3이 활성 프로테아제(이것은 각 경로에서 상이하다)에 의해 절단되어 C3a와 C3b가 산출되는 지점에서 수렴한다. 보체 공격을 활성화시키는 다른 경로는 보체 기능의 다양한 측면을 유발하는 연속된 사건에서 후기에 작용할 수 있다.

C3a는 아나필락시스독소(anaphylatoxin)이다. C3b는 박테리아 및 기타 세포뿐만 아니라, 일정한 바이러스와 면역 복합체에 결합하고, 그리고 순환으로부터 제거를 위해 이들을 태깅(tagging)한다(이러한 역할에서 C3b는 옵소닌으로 알려져 있다). C3b의 옵소닌 기능은 일반적으로, 보체 시스템의 가장 중요한 항-감염성 작용인 것으로 간주된다. C3b 기능을 차단하는 유전자 병소를 갖는 환자는 넓고 다양한 병원성 생물체에 의한 감염에 걸리기 쉬운 반면, 후기에 보체 캐스케이드 서열에서 병소를 갖는 환자, 다시 말하면, C5 기능을 차단하는 병소를 갖는 환자는 나이세리아(Neisseria) 감염에만 더욱 걸리기 쉽고, 그리고 이후에는 약간 더 걸리기 쉬운 것으로 관찰된다.

C3b는 또한, 각 경로에 독특한 다른 성분과 복합체를 형성하여 고전적 또는 대안적 C5 전환효소를 형성하고, 이것은 C5를 C5a와 C5b로 절단한다. 따라서 C3은 보체 반응 순서에서 중심 단백질로서 간주되는데, 그 이유는 이것이 대안적 경로와 고전적 경로 둘 모두에게 본질적이기 때문이다. C3b의 이러한 특성은 혈청 프로테아제 인자 I에 의해 조절되는데, 이것은 C3b에 작용하여 iC3b를 생산한다. 옵소닌으로서 여전히 기능하긴 하지만, iC3b는 활성 C5 전환효소를 형성할 수 없다.

C5는 대략 75 ㎍/㎖(0.4 μM)의 농도로 정상 혈청에서 관찰되는 190 kDa 베타 글로불린이다. C5는 당화되는데, 이의 질량 중에서 약 1.5 내지 3%가 탄수화물에 기인한다. 성숙 C5는 655개 아미노산 75 kDa 베타 쇄에 이황화 연결되는 999개 아미노산 115 kDa 알파 쇄의 이형이합체(heterodimer)이다. C5는 단일 사본 유전자의 단일 쇄 전구체 단백질 산물로서 합성된다(Haviland et al. (1991) J Immunol 146:362-368). 상기 유전자의 전사체의 cDNA 서열은 18개 아미노산 리더 서열과 함께, 1658개 아미노산의 분비된 프로-C5 전구체를 예측한다(가령, U.S. Patent No. 6,355,245 참고).

프로-C5 전구체는 아미노산 655와 659 뒤에서 절단되어 아미노 말단 단편(상기 서열의 아미노산 잔기 +1 내지 655)으로서 베타 쇄 및 카르복실 말단 단편(상기 서열의 아미노산 잔기 660 내지 1658)으로서 알파 쇄가 산출되고, 이들 사이에서 4개의 아미노산(상기 서열의 아미노산 잔기 656-659)이 결실된다.

C5a는 대안적 또는 고전적 C5 전환효소에 의해 C5의 알파 쇄로부터, 알파 쇄의 첫 74개 아미노산(즉, 상기 서열의 아미노산 잔기 660-733)을 포함하는 아미노 말단 단편으로서 절단된다. C5a의 11 kDa 질량의 대략 20%는 탄수화물에 기인한다. 전환효소 작용을 절단 부위는 상기 서열의 아미노산 잔기 733에 있거나, 또는 바로 인접한다. 이러한 절단 부위에 결합하거나, 또는 인접하는 화합물은 절단 부위에 C5 전환효소 효소의 접근을 차단하고, 따라서 보체 억제제로서 기능하는 잠재력을 가질 것이다.

C5는 또한, C5 전환효소 활성 이외의 수단에 의해 활성화될 수 있다. 제한된 트립신 가수분해(trypsin digestion)(가령, Minta and Man (1997) J Immunol 119:1597-1602 및 Wetsel and Kolb (1982) J Immunol 128:2209-2216 참고), 그리고 산 처리(Yamamoto and Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 및 Damerau et al. (1989) Molec Immunol 26:1133-1142) 역시 C5를 절단하고 활성 C5b를 생산할 수 있다.

C5의 절단은 강력한 아나필락시스독소와 화학주성 인자인 C5a를 방출하고, 그리고 세포용해 말단 보체 복합체, C5b-9의 형성을 결과한다. C5a와 C5b-9는 또한, 하류 염증 인자, 예를 들면, 가수분해 효소, 반응성 산소종(reactive oxygen species), 아라키돈산 대사물질(arachidonic acid metabolite) 및 다양한 사이토킨의 방출을 확대함으로써, 다면발현성(pleiotropic) 세포 활성화 특성을 갖는다.

C5b는 C6, C7, 그리고 C8과 결합하여 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 몇몇 C9 분자의 결합 시에, 막 공격 복합체(MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체-TCC)가 형성된다. 충분한 숫자의 MAC가 표적 세포 막 내로 삽입될 때, 이들이 발생시키는 구멍(MAC 포어)은 표적 세포의 신속한 삼투압 용해를 중재한다. 더욱 낮은 비-세포용해성 농도의 MAC는 다른 효과를 산출할 수 있다. 특히, 내피 세포와 혈소판 내로 작은 숫자의 C5b-9 복합체의 막 삽입은 유해한 세포 활성화를 유발할 수 있다. 일부 경우에, 활성화는 세포 용해에 선행할 수도 있다.

앞서 언급된 바와 같이, C3a와 C5a는 아나필락시스독소이다. 이들 활성화된 보체 성분은 비만 세포 탈과립화(mast cell degranulation)를 유발할 수 있고, 이것은 호염기구와 비만 세포로부터 히스타민, 그리고 염증의 기타 매개인자를 방출하여 평활근 수축(smooth muscle contraction), 증가된 혈관 침투성(vascular permeability), 백혈구 활성화, 그리고 과세포성(hypercellularity)을 결과하는 세포 증식을 비롯한 기타 염증 현상을 유발한다. C5a는 또한, 친-염증성 과립구를 보체 활성화 부위로 유인하는 역할을 하는 화학주성 펩티드로서 기능한다.

C5a 수용체는 기관지와 폐포 상피 세포 및 기관지 평활근 세포의 표면에서 관찰된다. C5a 수용체는 또한, 호산구, 비만 세포, 단핵구, 호중구, 그리고 활성화된 림프구에서 관찰되었다.

조성물

본 명세서에서 설명된 조성물은 인간 보체의 억제제를 포함할 수 있다. 인간 보체 성분에 결합하는 또는 이의 생성 및/또는 활성을 차단하는 임의의 화합물을 본 명세서에 따라 이용할 수 있을 것이다. 가령, 보체의 억제제는 가령, 소분자, 핵산 또는 핵산 유사체, 펩티드모방체, 또는 핵산 또는 단백질이 아닌 거대분자(macromolecule)일 수 있다. 이들 물질들은 작은 유기 분자, RNA 압타머, L-RNA 압타머, 스피에겔머(Spiegelmer), 안티센스 화합물, 이중 가닥 RNA, 작은 간섭 RNA, 잠긴(locked) 핵산 억제제, 그리고 펩티드 핵산 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 보체 억제제는 단백질 또는 단백질 단편일 수도 있다.

일부 구체예에서, 조성물은 인간 보체 성분에 특이적 항체를 포함한다. 일부 화합물은 보체 성분 C1, C2, C3, C4, C5 (또는 이의 단편; 하기 참고), C6, C7, C8, C9, 인자 D, 인자 B, 인자 P, MBL, MASP-1, 또는 MASP-2에 대항하는 항체를 포함하고, 따라서 C5a와 관련된 아나필락시스독소 생성을 예방하거나 및/또는 C5b와 관련된 막 공격 복합체(MAC)의 어셈블리를 예방한다. 일부 구체예에서, 보체 억제제는 C5b-9 복합체의 활성 및/또는 어셈블리를 억제한다. 가령, 일부 구체예에서, 억제제는 C6, C7, C8, C9, 또는 C5b 중에서 하나에 결합하고, 따라서 MAC의 어셈블리 및/또는 활성을 예방하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

조성물은 또한 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독액 인자, FUT-175, 컴플레스타틴, 및 K76 COOH와 같은 자연 발생성 또는 가용성 형태의 보체 억제성 화합물을 포함한다. 임의의 인간 보체 성분에게 결합하는 또는 이들의 생성 및/또는 활성을 차단하는데 이용될 수 있는 기타 화합물은 단백질, 단백질 단편, 펩티드, 소분자, ARC187 (Archemix Corporation, Cambridge, MA에서 시판하는)를 포함한 RNA 압타머, L-RNA 압타머, 스피에겔머, 안티센스 화합물, 세린 프로테아제 억제제, RNA 간섭 (RNAi)에 이용될 수 있는 분자들, 예를 들면, 작은 간섭 RNA (siRNA)를 포함하는 이중 가닥 RNA, 잠긴(locked) 핵산 (LNA) 억제제, 펩티드 핵산 (PNA) 억제제 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 보체 억제제는 보체의 활성화를 억제한다. 가령, 보체 억제제는 C1(가령, C1q, C1r, 또는 C1s)에 결합하여, 이들의 보체 활성화를 억제하거나 또는 보체 억제제는 C2, C3, 또는 C4에 결합하여 억제(가령, 이들의 절단을 억제)할 수 있다. 일부 구체예에서, 억제제는 보체의 대체 및/또는 고전 경로의 C3 전환효소 및/또는 C5 전환효소의 형성 또는 어셈블리를 억제한다. 일부 구체예에서, 보체 억제제는 말단 보체 형성, 예를 들면, C5b-9 막 공격 복합체의 형성을 억제한다. 가령, 항체 보체 억제제는 항-C5 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항-C5 항체는 C5 및/또는 C5b와 직접적으로 작용하여, C5b의 형성 및/또는 생리학적 기능을 억제한다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 조성물은 인간 보체 성분 C5의 억제제(가령, 인간 보체 성분 C5 단백질 또는 C5a 또는 C5b와 같은 생물학적 활성 단편에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편). 본 명세서에서 사용된 것과 같이, “보체 성분 C5의 억제제”는 (i) 세포에 의해 보체 성분 C5 단백질의 발현 또는 적절한 세포내 왕래(trafficking) 또는 분비를 억제하는; (ii) C5 절단 단편 C5a 또는 C5b의 활성(가령, C5a가 이의 고유 세포 수용체들에 결합 또는 C5b가 C6 및/또는 말단 보체 복합체의 기타 성분에 결합; 상기 참고)을 억제하는; (iii) 인간 C5 단백질의 절단에 의한 C5a 및 C5b의 형성; 또는 (iv) 세포에 의해 보체 성분 C5 단백질의 적절한 세포내 왕래(trafficking)를 억제하는 임의의 물질이다. 보체 성분 C5 단백질 발현의 억제는 인간 C5 단백질을 인코딩하는 유전자 전사의 억제; 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA 분해의 증가; 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA의 해독 억제; 인간 C5 단백질의 분해 증가; pre-pro 인간 C5 단백질의 적절한 프로세싱을 억제; 또는 세포에 의한 인간 C5 단백질의 적절한 왕래 또는 분비의 억제를 포함한다. 후보 물질이 인간 보체 성분 C5의 억제제인지를 결정하는 방법은 당업계에 공지된 것이며, 그리고 본 명세서에서 설명된다.

인간 보체 성분 C5의 억제제는 가령, 소분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드유사체, 핵산, 또는 핵산유사체일 수 있다.

본 명세서에서 설명된“소분자”는 분자량이 약 6 kDa 미만, 가장 바람직하게는 약 2.5 kDa 미만인 임의의 물질을 말한다. 많은 제약회사들은 소분자, 흔히 곰팡이, 세균성, 또는 조류 추출물 어레이를 포함하는 방대한 화학적 및/또는 생물학적 혼합물 라이브러리를 보유하고 있으며, 임의의 분석 방법으로 스크리닝될 수 있다. 본 출원은 다른 것들 중에서, 작은 화학적 라이브러리, 펩티드 라이브러리 또는 자연 산물 집합의 이용을 고려한다. Tan et al.은 소형화된 세포-계 분석에 양립가능한 이백만개의 합성 화합물의 라이브러리를 설명하였다(J. Am . Chem . Soc . (1998) 120:8565-8566). 이러한 라이브러리를 이용하여 인간 보체 성분 C5의 억제제를 스크리닝하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. Chembridge DIVERSet와 같은 시판되는 화합물 라이브러리들이 많다. 라이브러리는 또한 NCI 개발 치료 프로그램으로부터 Diversity set와 같은 학술적 연구자들이 이용가능하다. 합리적인 약물 기획이 이용될 수 있다. 가령, 합리적인 약물 기획은 인간 보체 성분 C5 단백질 상에 결정 또는 용액 구조 정보를 이용할 수 있다. 가령, Hagemann et al . (2008) J Biol Chem 283(12):7763-75 및 Zuiderweg et al . (1989) Biochemistry 28(1):172-85에서 설명된 구조. 합리적인 약물 기획은 공지의 화합물 가령, C5의 공지의 억제제(가령, 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 기초하여 이루어질 수 있다.

펩티드모방체는 해당 폴리펩티드의 최소한 일부분이 변형되고, 펩티드모방체의 3차원 구조는 해당 폴리펩티드의 것과 실질적으로 동일하게 유지된 화합물이다. 펩티드모방체는 명세서의 해당 폴리펩티드의 유사체일 수 있으며, 해당 폴리펩티드 자체는 해당 폴리펩티드 서열 내에 하나 이상의 치환 또는 기타 변형을 포함하는 폴리펩티드일 수도 있다. 대안으로, 해당 폴리펩티드 서열의 최소한 일부가 비-펩티드 구조로 대체되고, 해당 폴리펩티드의 3차원 구조는 실질적으로 유지될 수 있다. 환언하면, 해당 폴리펩티드 서열 내의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기가 비-펩티드 구조로 대체될 수 있다. 추가적으로, 해당 폴리펩티드의 다른 펩티드 부분은 반드시 그럴 필요는 없지만, 비-펩티드 구조 내에서 대체될 수 있다. 펩티드모방체(펩티드 및 비-펩티드 유사체 모두)는 개선된 성질(가령, 단백질 가수분해 감소, 증가된 체류 또는 증가된 생체이용성)을 가진다. 펩티드모방체는 일반적으로 개선된 경구 이용성을 가지며, 이 성질은 인간 또는 동물에서의 장애 치료에 펩티드모방체가 특히 적합하게 한다. 펩티드모방체는 유사한 2차원 화학 구조를 가지거나 가지지 않을 수도 있지만, 공통의 3차원 구조적 특징 및 기하학을 공유해야만 한다. 각 펩티드모방체는 하나 이상의 독특한 추가적인 결합 요소들을 가질 수 있다.

핵산 억제제는 내생성 유전자, 예를 들면, 인간 보체 성분 C5를 인코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는데 이용될 수 있다. 핵산 길항제는 가령, siRNA, dsRNA, 리보자임, 삼중-나선 형성자, 압타머, 또는 안티센스 핵산일 수 있다. siRNA는 오버행을 선택적으로 포함하는 작은 이중 가닥 RNA(dsRNA)다. 가령, siRNA의 듀플렉스 부분은 길이가 약 18개 내지 25개의 뉴클레오티드, 예를 들면, 약 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 또는 24개의 뉴클레오티드다. siRNA 서열은 일부 구체예에서, 표적 mRNA에 정확하게 상보적이다. dsRNA 및 siRNA는 특히 포유류 세포(가령, 인간 세포)에서 유전자 발현을 침묵시키는데 이용될 수 있다. 가령, Clemens et al . (2000) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 97:6499- 6503; Billy et al . (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:14428-14433; Elbashir et al . (2001) Nature 411 :494-8; Yang et al . (2002) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 99:9942-9947, 그리고 미국 특허 출원 공개. 20030166282, 20030143204, 20040038278, 및 20030224432 참고. 안티센스 물질은 예를 들어, 약 8개 내지 약 80개의 핵염기(가령, 약 8개 내지 약 80개의 뉴클레오티드), 예를 들면, 약 8개 내지 약 50개의 핵염기, 또는 약 12개 내지 약 30개의 핵염기를 포함한다. 안티센스 화합물은 리보자임, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드 (올리고자임), 및 표적 핵산에 혼성화되어, 표적 핵산의 발현을 조정하는 기타 짧은 촉매성 RNA 또는 촉매성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 화합물은 표적 유전자 내의 서열에 상보적인 최소한 8개의 연속 핵염기 스트레취를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화되는 이의 표적 핵산 서열에 반드시 100% 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 표적에 결합하여 표적 분자의 정상적인 기능을 간섭하여, 이의 용도를 상실하게 되면, 특이적으로 혼성화되는 것이며, 특이적 결합이 바람직한 조건, 예를 들면, 생체내 분석 또는 치료적 처치의 경우 생리학적 조건하에서, 또는 시험관 분석의 경우, 분석이 실행되는 조건하에서, 비-표적 서열에 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피할 수 있을 정도의 상보성이 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 mRNA(가령, 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA)와의 혼성화는 mRNA의 정상적인 하나 이상의 기능을 간섭할 수 있다. 간섭되는 mRNA의 기능은 예를 들어, RNA가 단백질 해독 부위로의 전좌(translocation), RNA로부터 단백질의 해독, RNA의 접목(splicing)에 의해 하나 이상의 mRNA 종의 생성, 그리고 RNA가 관여하는 촉매 활성과 같은 모든 주요 기능을 포함한다. 특이적 단백질의 RNA에 결합은 RNA에 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 간섭될 수 있다. 예시적인 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예를 들면, 인간 보체 성분 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA에 특이적으로 혼성화는 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 상보적 부분은 약 8개 내지 약 80개 사이의 핵염기가 될 수 있다. 화합물은 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다.

변형된 핵염기는 가령, 5-치환된 피리미딘 예를 들면 5-요오드우라실, 5-요오드시토신, 그리고 C₅-프로피닐 피리미딘, 예를 들면, C₅-프로피닐시토신 및 C₅-프로피닐우라실을 포함할 수 있다. 다른 적합한 변형된 핵염기는 가령, 7-치환된- 8-아자-7-데아자퓨린 및 7-치환된-7-데아자퓨린, 예를 들면, 7-요오드-7-데아자퓨린, 7-시아노-7-데아자퓨린, 7-아미노카르보닐-7-데아자퓨린을 포함한다. 이들의 예는 6-아미노-7-요오드-7-데아자퓨린, 6-아미노-7-시아노-7-데아자퓨린, 6-아미노-7-아미노카르보닐-7-데아자퓨린, 2-아미노-6-하이드록시-7-요오드-7-데아자퓨린, 2-아미노-6-하이드록시-7-시아노-7-데아자퓨린, 그리고 2-아미노-6-하이드록시-7-아미노카르보닐-7-데아자퓨린을 포함한다. 가령, 미국 특허 4,987,071; 5,116,742; 및 5,093,246; “Antisense RNA and DNA ,” D.A. Melton , Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene , C. (1991) Anticancer Drug D 6:569-84; Helene (1992) Ann . NY . Acad . Sci . 660:27-36; 그리고 Maher (1992) Bioanalysis 14:807-15.

압타머는 세포 표면 단백질을 포함하는 거의 모든 임의의 분자를 인지하고, 특이적으로 결합하는데 이용될 수 있는 짧은 올리고뉴클레오티드 서열이다. 지수 농축하여 리간드의 체계적 진화(SELEX) 프로세스는 강력하며, 이러한 프로세스는 압타머를 바로 확인하는데 이용될 수 있다. 압타머는 성장 인자 및 세포 표면 항원과 같은 치료 및 진단에 중요한 광범위한 단백질에 대해 만들 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 항체와 같이 유사한 친화력 및 특이성을 가지고 이들의 표적에 결합한다(가령, Ulrich (2006) Handb Exp Pharmacol . 173:305-326 참고).

일부 구체예에서, 인간 C5의 억제제는 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. (이후, 항체는 “항-C5 항체”로 명명될 수 있다)

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간의 프로-C5 전구체 단백질 내의 에피토프에 결합한다. 가령, 항-C5 항체는 서열 번호:1에 나타난 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 (NCBI Accession No. AAA51925 및 Haviland et al ., supra) 인간 보체 성분 C5 단백질 내의 에피토프에 결합할 수 있다.

“에피토프”는 항체가 결합하는 단백질(가령, 인간 보체 성분 C5 단백질) 상의 부위를 말한다. “중첩(overlapping) 에피토프”는 최소한 1개(가령, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 공통 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 리더 서열이 없는 인간의 프로-C5 전구체 단백질 내의 에피토프에 결합한다. 가령, 항-C5 항체는 서열 번호:2에 나타난 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 인간 보체 성분 C5 단백질 내의 에피토프에 결합할 수 있고, 서열 2는 아미노 말단 리더 서열이 없는 인간의 C5 단백질이다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 알파 쇄 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 가령, 항-C5 항체는 서열 번호:3에 나타난 아미노산 서열을 가진 단백질 내의 에피토프 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하며, 서열 3은 인간 보체 성분 C5 알파 쇄 단백질이다. C5의 알파 쇄에 결합하는 항체는 예를 들어, Ames et al . (1994) J Immunol 152:4572-4581에서 설명하고 있다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 베타 쇄 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 가령, 항-C5 항체는 서열 번호:4에 나타난 아미노산 서열을 가진 단백질 내의 에피토프 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하며, 서열 3은 인간 보체 성분 C5 베타 쇄 단백질이다. C5의 베타 쇄에 결합하는 항체는 가령, Moongkarndi et al . (1982) Immunobiol . 162:397; Moongkarndi et al . (1983) Immunobiol. 165:323; 그리고 Mollnes et al . (1988) Scand . J. Immunol . 28:307-312에서 설명하고 있다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 항원성 펩티드 단편 내의 에피토프에 결합하거나 또는 이와 중첩된 에피토프에 결합할 수 있다. 가령, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 항원성 펩티드 단편 내의 에피토프에 결합하거나 이와 중첩된 에피토프에 결합할 수 있고, 이때 단편은 다음의 아미노산 서열: VIDHQGTKSSKCVRQKVEGSS (서열 번호:5) 또는 KSSKC (서열 번호:6)을 포함하거나, 또는 서열 번호:5 또는 서열 번호:6으로 구성된다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 단편 내의 에피토프에 결합하거나, 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하며, 이때 단편은 다음의 아미노산 서열중 임의의 것을 포함하거나, 또는 이로 구성된다(서열 번호:1의 예시적인 항원 단편):

NFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSD (서열 번호:7);

SESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYRNADYSYS (서열 번호:8);

SHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEIRSYFPES (서열 번호:9);

SHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSLTTWEIQGIGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMNIPYSVVRGEQIQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYRNADYSYS (서열 번호:10); 그리고 DHQGTKSSKCVRQKVEG (서열 번호:11).

인간 보체 성분 C5의 추가 예시적인 항원 단편은 가령, 미국 특허 6,355,245에서 설명하고 있으며, 이 명세서는 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질(가령, 서열 번호:1에 나타난 아미노산 서열을 가지는 인간 C5 단백질)에 특이적으로 결합한다. “특이적 결합” 또는 “특이적으로 결합하는”는 생리학적 조건에서 상대적으로 적합한 복합체(가령, 항체와 보체 성분 C5 단백질 간의 복합체)를 형성하는 두 개의 분자를 말한다. 전형적으로, 결합은 결합 상수(K_a)가 10⁶ M^-1 이상일 때 특이적이라고 간주한다. 따라서, 항체는 최소한 10⁶ M^-1 (또는 이상)(가령, 최소한 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 또는 10¹⁵ 이상)의 K_a로 C5 단백질에 특이적으로 결합한다. 인간 보체 성분 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 예시적 항체는 가령, 미국 특허 6,355,245에서 설명하고 있으며, 이 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다.

항체가 단백질 항원에 결합하는지 및/또는 단백질 항원에 대한 항체의 친화력을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, 단백질 항원에 항체의 결합은 웨스턴 블랏, 도트 블랏, 플라스몬 표면 공명 방법(가령, BIAcore system ; Pharmacia Biosensor AB , Uppsala , Sweden and Piscataway , N.J.), 또는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술을 이용하여 검출되고 및/또는 정량화될 수 있다. 가령, Harlow and Lane (1988) “ Antibodies : A Laboratory Manual ” Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) “ Antibody Engineering : Methods and Protocols ,” Humana Press ( ISBN : 1588290921); Borrebaek (1992) “ Antibodies Engineering , A Practical Guide ,” W.H. Freeman and Co ., NY ; Borrebaek (1995) “ Antibody Engineering,” 2 nd Edition , Oxford University Press , NY , Oxford ; Johne et al . (1993) J. Immunol . Meth . 160:191-198; Jonsson et al . (1993) Ann . Biol . Clin . 51:19-26; 그리고 Jonsson et al . (1991) Biotechnology 11:620-627. 미국 특허 6,355,245 참고.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질 내의 에피토프에 결합하거나 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하는 또 다른 항체의 결합을 교차 차단할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-C5 항체는 인간 보체 성분 C5 단백질의 펩티드 단편 내의 에피토프에 결합하는 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체의 결합을 교차차단할 수 있다. 펩티드 단편은 서열 번호:1-11중 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 인간 보체 성분 C5 단백질의 단편일 수 있다. 가령, 펩티드 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 구성될 수 있다: VIDHQGTKSSKCVRQKVEGSS (서열 번호:5).

본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 “교차차단하는 항체”는 항체가 없을 경우 에피토프에 항-C5 항체가 결합하는 양과 비교하였을 때, 보체 성분 C5 단백질 상의 에피토프에 항-C5 항체가 결합하는 양을 낮추는 항체를 말한다. 제 1 항체가 에피토프에 제 2 항체의 결합을 교차-차단하는지를 결정하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, 교차-차단 항체는 테스트 항체 존재하에 그리고 테스트 항체 없을 때 5G1.1 항-C5 단클론 항체(하이브리도마 세포주 ATCC HB-11625에 의해 생산된; 미국 특허 6,355,245)의 결합을 비교하여 확인될 수 있다. 테스트 항체가 없을 때 5G1.1 항체의 결합과 비교하여, 테스트 항체가 있을 때, 5G1.1 항체의 결합이 감소된 것은 이 항체가 교차-차단 항체라는 것을 지시한다.

특정 항체(가령, 항-C5 항체)가 결합하는 에피토프를 확인하는 방법 또한 당업계에 공지되어 있다. 가령, 항-C5 항체의 결합 에피토프는 보체 성분 C5 단백질의 몇 가지(가령, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 또는 30개 이상) 중첩 펩티드 단편(가령, 서열 번호:1-11중 임의의 것에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 단백질의 몇 가지 중첩 단편)의 결합을 측정함으로써 확인될 수 있다. 각각의 상이한 중첩 펩티드들은 고형 지지대, 예를 들면, 다중 웰 분석 플레이트의 별도 웰 상의 고유한 영역에 결합한다. 그 다음, 항-C5 항체는 이의 에피토프에 항체가 결합되도록 허용하는 시간 및 조건하에서 분석 플레이트 내에 각 펩티드에 접촉함으로써 신호를 받는다. 각 웰을 세척하면 결합안된 항-C5 항체는 제거된다. 그 다음, 플레이트의 웰 내에 항-C5 항체가 존재한다면, 이 항체에 결합하는 검출가능하도록 라벨된 2차 항체가 각 웰에 접촉되며, 그리고 결합안된 2차 항체는 세척 단계에 의해 제거된다. 웰 안의 검출가능하도록 라벨된 2차 항체에 의해 생성되는 검출가능한 신호의 존재 및 그 양은 항-C5 항체가 웰에 있는 특정 펩티드 단편에 결합한다는 것을 지시한다. 가령, Harlow and Lane ( supra ), Benny K. C. Lo ( supra ), 및 미국 특허 출원 공개 20060153836 참고, 이들 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다. 항체가 결합하는 특정 에피토프는 BIAcore 크로마토그래피 기술(가령, Pharmacia BIAtechnology Handbook , “ Epitope Mapping ,” Section 6.3.2, ( May 1994); 그리고 Johne et al . (1993) J. Immunol . Methods 160:20191-8 참고)을 이용하여 확인될 수도 있다.

본 명세서에서 설명된 항-C5 항체는 보체 성분 C5 단백질(가령, 인간 C5 단백질)의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편의 활성 또는 생성을 차단하는데 있어서 활성을 가질 수 있다. 이러한 차단 효과를 통하여, 항-C5 항체는 세포의 표면에서 C5a의 사전-염증 효과를 억제하고, 그리고 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)의 생성을 억제한다. C5a의 생성을 차단할 수 있는 능력을 보유한 항-C5 항체는 가령, Moongkarndi et al . (1982) Immunobiol . 162:397 및 Moongkarndi et al . (1983) Immunobiol . 165:323에서 설명되고 있다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 C5 단백질이 인간 보체 성분 C3b(가령, AP 또는 CP C5 전환효소 복합체에 존재하는 C3b)에 결합하는 능력을 50% 이상(가령, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상) 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, C5 단백질에 결합할 때, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 C5 단백질이 인간 보체 성분 C4b(가령, CP C5 전환효소 복합체에 존재하는 C4b)에 결합하는 능력을 50% 이상(가령, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상) 감소시킬 수 있다. 항체가 보체 성분 C5 단백질의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편의 생성 또는 이의 활성을 차단시킬 수 있는지, 또는 보체 성분 C4b 또는 C3b에 결합하는 것을 차단시킬 수 있는지를 결정하는 방법은 당업계에 공지된 것들이며, 그리고 가령, 미국 특허 6,355,245 및 Wurzner et al . (1991) Complement Inflamm 8:328-340에서 설명되고 있다.

일부 구체예에서, 항-C5 항체는 보체 성분 C5 단백질의 알파 쇄의 아미노-말단 부분에 결합하지만, 유리 C5a에는 결합하지 않는다. 알파 쇄의 아미노-말단 부분 내에서 항-C5 항체에 대한 에피토프는 인간 서열 VIDHQGTKSSKCVRQKVEGSS (서열 번호:5)내의 에피토프를 포함한다.

일부 구체예에서, 조성물은 및/또는 항체는 에쿨리주맙을 포함하거나, 에쿨리주맙이다(Soliris?; Alexion Pharmaceuticals , Inc ., Cheshire , CT ). (가령, Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7):1017-23; Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(11):849-50; 그리고 Rother et al . (2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1488. 참고)

일부 구체예에서, 조성물 및/또는 항체는 펙셀리주맙(pexelizumab)을 포함하거나, 펙셀리주맙이다(Alexion Pharmaceuticals , Inc ., Cheshire , CT).(가령, Whiss (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(6):870-7; Patel et al . (2005) Drugs Today (Barc) 41(3):165-70; and Thomas et al . (1996) Mol Immunol . 33(17-18):1389-401. 참고)

일부 구체예에서, C5 억제제는 C5a에 결합하는 항체다(종종“항-C5a 항체”라고 칭하기도 함). 일부 구체예에서, 항체는 C5a에 결합하지만, 전장 C5에는 결합하지 않는다. 상기에서 논의된 것과 같이, C5의 프로폼(proform), 1676개의 아미노산 잔기 전구체 단백질은 일련의 단백질 가수분해성 절단 과정에 의해 가공된다. 첫 18개 펩티드(-18 내지 -1로 번호매김)는 전구체 단백질로부터 절단된 신호 펩티드를 구성한다. 나머지 1658개의 아미노산 단백질은 두 위치에서 절단되어, 알파 쇄와 베타 쇄를 만든다. 제 1 절단 과정은 아미노산 잔기 655와 656 사이에서 일어난다. 제 2 절단은 아미노산 잔기 659 내지 660에서 일어난다. 두 번의 절단 과정으로 세 개의 별개 폴리펩티드 단편이 형성된다: (i) 아미노산 1 내지 655를 포함하는 단편, 이 단편을 베타 쇄라고 함; (ii) 아미노산 660 내지 1658를 포함하는 단편, 이 단편을 알파 쇄라고 함; 그리고 (iii) 아미노산 656 내지 659로 구성된 테트라펩티드 단편. 알파 쇄와 베타 쇄 폴리펩티드 단편은 이황화결합에 의해 서로 연결되며, 그리고 성숙한 C5 단백질을 구성한다. CP 또는 AP C5 전환효소는 잔기 733과 734 사이의 알파 쇄를 절단하여 성숙한 C5를 활성화시켜, C5a 단편 (아미노산 660 내지 733)을 유리시킨다. 성숙C5의 나머지 부분은 단편 C5b이며, 이 단편은 베타 쇄에 이황화 결합된 알파 쇄의 잔기 734 내지 1658을 포함한다.

생체내에서, C5a는 혈청 효소, 카르복시펩티다제 B에 의해 신속하게 대사되어, 73개 아미노산 형태 “C5a des-Arg”가 되며, 이것은 카르복시말단 아르기닌 잔기가 없다. 따라서, 일부 구체예에서, C5a에 결합하는 항체는 또한 아르기닌이 제거된(desarginated) C5a에 결합한다. 일부 구체예에서, C5a에 결합하는 항체는 아르기닌이 제거된 C5a에 결합하지 않는다.

일부 구체예에서, C5 억제제는 C5a에 존재하는 네오에피토프, 예를 들면, 성숙C5의 알파 쇄 단편으로부터 C5a가 유리될 때 노출되는 에피토프에 결합하는 항체다. C5a(가령, C5a에 존재하는 네오-에피토프)에 결합하는 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 항체를 생산하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 가령, C5a에 결합하는 항체는 가령, PCT 공개 No . WO 01/15731; Ames et al . (1994) J Immunol 152(9):4572-4581; Inoue (1989) Complement Inflamm 6(3):219-222; 그리고 미국 특허 6,866,845에서 설명되는 것과 같은 C5a 네오에피토프 특이적 항체의 결합 특이성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, C5a에 결합하는 항체는 sc-52633 (Santa Cruz Biotechnology, Inc ., Santa Cruz , California), I52-1486 (BD Pharmingen / BD Biosciences), ab11877 (Abcam , Cambridge , Massachusetts), 및 HM2079 (클론 2952; HyCult Biotechnologies , the Netherlands)을 포함하나 이에 한정되지 않는 시판되는 C5a 네오에피토프-특이적 항체의 결합 특이성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, C5a에 결합하는 항체는 전술한 임의의 C5a 네오에피토프-특이적 항체의 결합을 교차 차단할 수 있다.

일부 구체예에서, C5 억제제는 포유류(가령, 인간) C5a 단백질에 결합하는 항체일 수 있다. 가령, 항체는 다음의 아미노산 서열을 가지는 인간 C5a 단백질에 결합할 수 있다:

TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDMQLGR (서열 번호:12). 항체는 다음 아미노산 서열 내의 또는 이와 중첩되는 에피토프에서 인간 C5a에 결합할 수 있다: CCYDGACVNNDETCEQRAAR (서열 번호:13); KCCYDGACVNNDETCEQR (서열 번호:14); VNNDETCEQR (서열 번호:15); VNNDET (서열 번호:16); AARISLGPR (서열 번호:17); CCYDGACVNNDETCEQRAA (서열 번호:18); CCYDGACVNNDETCEQRA (서열 번호:19); CCYDGACVNNDETCEQR (서열 번호:20); CCYDGACVNNDETCEQ (서열 번호:21); CCYDGACVNNDETCE (서열 번호:22); CYDGACVNNDETCEQRAAR (서열 번호:23); YDGACVNNDETCEQRAAR (서열 번호:24); 또는 CYDGACVNNDETCEQRAAR (서열 번호:25). 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:12-25중 임의의 하나에 나타난 최소한 4개(가령, 최소한 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개 이상)의 연속 아미노산을 포함하거나, 또는 이로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 인간 C5a 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 항체가 결합하는 추가적인 C5a 단백질 단편 및 적합한 C5a-특이적 항원 결합 부위를 만드는 방법은 가령, 미국 특허 4,686,100에서 제시하고 있으며, 이의 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, C5a에 항체의 결합으로 C5a의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. C5a 활성을 측정하는 방법은 가령, 주화성 분석, RIA, 또는 ELISA(가령, Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3):606-16 및 Wurzner et al . (1991) Complement Inflamm 8:328-340). 일부 구체예에서, C5a에 항체의 결합으로 C5a와 C5aR1 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. C5a와 C5aR1 (항체가 있을 때와 없을 때) 사이의 상호작용을 검출 및/또는 측정하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 가령, Mary and Boulay (1993) Eur J Haematol 51(5):282-287; Kaneko et al. (1995) Immunology 86(1):149-154; Giannini et al . (1995) J Biol Chem 270(32):19166-19172; 그리고 미국 특허 출원 공개 20060160726에서 설명하고 있다. 가령, C5aR1-발현하는 말초 혈액 단핵 세포에 검출가능하도록 라벨된(가령, 방사능활성 라벨된) C5a의 결합은 항체가 있을 때 그리고 없을 때 평가될 수 있다. 항체가 없을 때 결합의 양과 비교하였을 때, 항체가 존재할 때 C5aR1에 결합하는 검출가능하도록 라벨된 C5a의 양이 감소되었다는 것은 C5a와 C5aR1 사이의 상호작용이 억제됨을 나타내는 것이다. 일부 구체예에서, C5a에 항체의 결합으로 C5a와 C5L2 사이의 상호작용이 억제될 수 있다(하기 참고). C5a와 C5L2 사이에 상호작용을 검출 및/또는 측정하는 방법은 당업계에 공지된 것이며, 그리고 가령, Ward (2009) J Mol Med 87(4):375-378 및 Chen et al . (2007) Nature 446(7132):203-207에서 설명되고 있다(하기 참고).

일부 구체예에서, C5 억제제는 C5b에 결합하는 항체 (흔히, “항-C5b 항체”라고 칭함)이다. 일부 구체예에서, 항체는 C5b에 결합하지만, 전장 C5에 결합하지 않는다. C5b의 구조는 상기에서 설명하고 있으며, 그리고 가령, M(1985) Biochem Soc Symp 50:235-246; Yamamoto and Gewurz (1978) J Immunol 120(6):2008-2015; 그리고 Haviland et al . (1991), supra에서도 상세하게 설명하고 있다. 상기에서 설명된 것과 같이, C5b는 C6, C7, 및 C8와 복합하여, 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 일련의 복합을 통하여 형성된 단백질 복합체 중간생성물은 C5b-6(C5b 및 C6을 포함), C5b-7(C5b, C6, 및 C7을 포함), 그리고 C5b-8(C5b, C6, C7, 및 C8을 포함)을 포함한다. 몇 가지 C9 분자의 결합시에, 막 공격 복합체(MAC, C5b-9 말단 보체 복합체(TCC))가 형성된다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포 막으로 이입될 때, 이들이 만든 구멍(MAC 포어)은 표적 세포의 신속한 삼투압에 의한 용해를 매개한다.

일부 구체예에서, C5b에 항체의 결합으로 C5b와 C6 상의 상호작용을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, C5b에 항체의 결합으로 C5b-9 MAC-TCC의 어셈블리 또는 활성을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, C5b에 항체의 결합으로 보체-의존적 세포 용해(가령, 시험관내 및/또는 생체내에서)를 억제할 수 있다. 항체가 보체-의존적 용해를 억제하는지를 평가하는 적합한 방법은 가령, 용혈 분석 또는 가용성 C5b-9의 활성을 검출하는 다른 기능 분석을 포함한다. 가령, 항체 존재시에 보체의 세표-용해 능력의 감소는 Kabat and Mayer ( eds .), “ Experimental Immunochemistry , 2 nd Edition,” 135-240, Springfield , IL , CC Thomas (1961), pages 135-139에서 설명하고 있는 용혈 분석에 의해 측정되거나, 또는 가령, Hillmen et al . (2004) N Engl J Med 350(6):552에서 설명하는 닭의 적혈구 용혈 방법과 같은 통상적인 분석의 변형에 의해 측정될 수 있다.

C5b에 결합하는 항체뿐만 아니라 이와 같은 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, 미국 특허 6,355,245 참고. 가령, Hycult Biotechnology (카탈로그 번호: HM2080; 클론 568) 및 Abcam™ (ab46151 또는 ab46168)을 포함하는 여러 업주들로부터 시판되는 항-C5b 항체를 이용할 수 있다.

일부 구체예에서, C5 억제제는 포유류(가령, 인간)의 C5b 형에 결합하는 항체다. 가령, 항체는 다음의 아미노산 서열을 가지는 인간 C5b 단백질의 일부에 결합할 수 있다:

QEQTYVISAPKIFRVGASENIVIQVYGYTEAFDATISIKSYPDKKFSYSSGHVHLSSENKFQNSAILTIQPKQLPGGQNPVSYVYLEVVSKHFSKSKRMPITYDNGFLFIHTDKPVYTPDQSVKVRVYSLNDDLKPAKRETVLTFIDPEGSEVDMVEEIDHIGIISFPDFKIPSNPRYGMWTIKAKYKEDFSTTGTAYFEVKEYVLPHFSVSIEPEYNFIGYKNFKNFEITIKARYFYNKVVTEADVYITFGIREDLKDDQKEMMQTAMQNTMLINGIAQVTFDSETAVKELSYYSLEDLNNKYLYIAVTVIESTGGFSEEAEIPGIKYVLSPYKLNLVATPLFLKPGIPYPIKVQVKDSLDQLVGGVPVILNAQTIDVNQETSDLDPSKSVTRVDDGVASFVLNLPSGVTVLEFNVKTDAPDLPEENQAREGYRAIAYSSLSQSYLYIDWTDNHKALLVGEHLNIIVTPKSPYIDKITHYNYLILSKGKIIHFGTREKFSDASYQSINIPVTQNMVPSSRLLVYYIVTGEQTAELVSDSVWLNIEEKCGNQLQVHLSPDADAYSPGQTVSLNMATGMDSWVALAAVDSAVYGVQRGAKKPLERVFQFLEKSDLGCGAGGGLNNANVFHLAGLTFLTNANADDSQENDEPCKEIL (서열 번호:4). 일부 구체예에서, 항체는 다음의 아미노산 서열을 가지는 인간 C5b 단백질의 일부에 결합할 수 있다:

LHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSLTTWEIQGIGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMNIPYSVVRGEQIQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYRNADYSYSVWKGGSASTWLTAFALRVLGQVNKYVEQNQNSICNSLLWLVENYQLDNGSFKENSQYQPIKLQGTLPVEARENSLYLTAFTVIGIRKAFDICPLVKIDTALIKADNFLLENTLPAQSTFTLAISAYALSLGDKTHPQFRSIVSALKREALVKGNPPIYRFWKDNLQHKDSSVPNTGTARMVETTAYALLTSLNLKDINYVNPVIKWLSEEQRYGGGFYSTQDTINAIEGLTEYSLLVKQLRLSMDIDVSYKHKGALHNYKMTDKNFLGRPVEVLLNDDLIVSTGFGSGLATVHVTTVVHKTSTSEEVCSFYLKIDTQDIEASHYRGYGNSDYKRIVACASYKPSREESSSGSSHAVMDISLPTGISANEEDLKALVEGVDQLFTDYQIKDGHVILQLNSIPSSDFLCVRFRIFELFEVGFLSPATFTVYEYHRPDKQCTMFYSTSNIKIQKVCEGAACKCVEADCGQMQEELDLTISAETRKQTACKPEIAYAYKVSITSITVENVFVKYKATLLDIYKTGEAVAEKDSEITFIKKVTCTNAELVKGRQYLIMGKEALQIKYNFSFRYIYPLDSLTWIEYWPRDTTCSSCQAFLANLDEFAEDIFLNGC (서열 번호:26). 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:4 또는 서열 번호:26에 나타낸 최소한 4개(가령, 최소한 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 이상)의 연속 아미노산을 포함하거나, 또는 이들로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 인간 C5b 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있다.

C5 억제제 항체가 결합하는 인간 C5b 또는 C5a의 추가적인 예시적인 하위-단편은 가령, 미국 특허 6,355,245에서 설명되고 있으며, 이의 명세서는 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, 억제제는 C5폴리펩티드(가령, 서열 번호:12에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 인간 C5 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하는 항체다. 일부 구체예에서, 억제제는 C5b 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체다.

인간 보체 성분 C5의 억제제에 결합하는지를 판단하는 방법은 본 명세서에서 설명되며, 그리고 당업계에 공지된 것들이다. 가령, 체액내 C5a 및 C5b의 농도 및/또는 생리학적 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. C5a 농도 또는 활성을 측정하는 방법은 가령, 주화성 분석, RIA, 또는 ELISA(가령, Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest . 50(3):606-16 및 Wurzner et al . (1991) Complement Inflamm. 8:328-340)을 포함한다. C5b의 경우, 본 명세서에서 설명된 가용성 C5b-9에 대한 용혈 분석 또는 분석이 이용될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 분석들도 이용될 수 있다. 이러한 또는 다른 적합한 유형의 분석들을 이용하여, 항-C5 항체와 같은 인간 보체 성분 C5를 억제할 수 있는 후보 물질을 스크리닝하여, 본 명세서에서 설명된 방법에 유용한 화합물을 확인하고, 그리고 이와 같은 화합물의 적절한 투여량 수준을 결정할 수 있다.

mRNA 또는 단백질(가령, 인간 C5 단백질 발현의 억제 또는 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA의 발현을 억제)의 발현 억제를 검출하는 방법은 분자 생물학 분야에 공지되어 있으며, 그리고 가령, mRNA에 대한 노던 블랏 및 RT-PCR (또는 정량적 RT-PCR) 기술 그리고 단백질 검출의 경우, 웨스턴 블랏, 도트 블랏, 또는 ELISA 기술을 포함한다(가령, Sambrook et al . (1989) “ Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition ,” Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N.Y.)

인간 C5가 절단되어 C5a 및 C5b를 형성하는 것을 후보 화합물에 의해 억제될 수 있는 지를 판단하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 가령, Moongkarndi et al . (1982) Immunobiol . 162:397; Moongkarndi et al . (1983) Immunobiol. 165:323; Isenman et al . (1980) J Immunol . 124(1):326-31; Thomas et al. (1996) Mol. Immunol . 33(17-18):1389-401; 그리고 Evans et al . (1995) Mol . Immunol . 32(16):1183-95에서 설명하고 있다.

인간 보체 성분 C5의 억제로 인하여 개체의 체액내 보체의 세포-용해 능력이 감소될 수 있다. 보체의 세포-용해 능력의 이러한 감소는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는데, 예를 들어, Kabat and Mayer ( eds ), “ Experimental Immunochemistry, 2 nd Edition ,” 135-240, Springfield , IL , CC Thomas (1961), pages 135-139에서 설명하는 용혈 분석과 같은 통상적인 용혈 분석에 의해, 또는 가령, Hillmen et al . (2004) N Engl J Med 350(6):552에서 설명하고 있는 닭 적혈구세포 용혈 방법과 같은 분석의 통상적인 변형에 의해 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 조성물은 인터페론 알파의 억제제를 포함할 수 있다. 인터페론 알파에 결합하거나, 또는 인터페론 알파의 산출 및/또는 활성을 달리 차단하는 임의의 화합물이 본 발명에 따라서 이용될 수 있다. 가령, 인터페론 알파의 억제제는 예를 들어, 소분자, 핵산 또는 핵산 유사체(가령, siRNA, dsRNA, 리보자임, 삼중-나선 형성자, 압타머), 펩티드모방체, 또는 핵산 또는 단백질이 아닌 거대분자일 수 있다. 이들 작용제는 소형 유기 분자, RNA 압타머, L-RNA 압타머, 스피에겔머, 안티센스 화합물, 이중 쇄 RNA, 소형 간섭 RNA, 잠긴 핵산 억제제, 그리고 펩티드 핵산 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파가 결합하는 수용체(인터페론 알파 수용체)의 억제제이다. 인간 인터페론 알파 수용체는 가령, Novick et al. (1994) Cell 77(3):391-400; Chill et al. (2003) Structure 11(7):791-802; 그리고 Uze et al. (2007) Curr Top Microbiol Immunol 316:71-95에서 설명된다. 일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 또는 이의 수용체에 결합하고 인터페론 알파와 이의 수용체 사이에 상호작용을 억제한다.

일부 구체예에서, 인터페론 알파의 억제제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이것은 인터페론 알파 단백질에 결합한다(이후, 상기 항체는 때때로, "항-인터페론 알파 항체"로 지칭된다). 예시적인 항-인터페론 알파 항체는 당업계에 공지되어 있고 가령, U.S. 특허 출원 공개 공보 20090324605, 20070059309, 그리고 20080160030; U.S. 특허 7,087,726과 4,423,147에서 설명되고, 이들 각각의 내용은 본 발명에 전체적으로 참고문헌으로 편입된다.

본 명세서에서 설명된 조성물과 방법에 이용될 수 있는 추가의 예시적인 항-인터페론 알파 항체는 가령, MEDI-545 (MDX-1103; AstraZeneca/Medimmune)를 포함한다.

항체를 생산하는 방법

본 명세서에 따른 항체(가령, 항-C5 항체, 또는 항-인터페론 알파 항체), 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는데 적합한 방법은 당업계(가령, 미국 특허 6,355,245 참고)에 공지되어 있으며, 그리고 본 명세서에서 설명된다. 가령, 단클론 항-C5 항체는 면역원으로서 보체 성분 C5-발현 세포, C5 폴리펩티드, 또는 C5 폴리펩티드의 항원성 단편을 이용하여, 동물에서 항체-생산 세포로부터 면역 반응을 일으키고 생성시키고, 그리고 차례로 단클론 항체를 분리시킬 수 있다. 이러한 항체의 서열이 결정될 수 있고, 재조합 기술에 의해 항체 및 이의 변이체들이 생산될 수 있다. 단클론 항체의 서열 및 인간 보체 성분 C5에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 서열에 근거하여, 재조합 기술을 이용하여 키메라, CDR-접목된, 인간화 그리고 완전한 인간 항체를 만들 수 있다. 유사하게, 단클론 항-인터페론 알파 항체는 인터페론 알파 폴리펩티드, 또는 인터페론 알파 폴리펩티드의 항원성 단편을 면역원으로 이용하여 산출될 수 있고, 따라서 동물에서 면역 반응을 발생시키고, 이들 동물로부터 항체-생산 세포 및 차례로, 단클론 항체가 분리될 수 있다.

더욱이, 가령, 재조합 라이브러리로부터 유도된 항체(“파아지 항체”)는 항원성 폴리펩티드, 예를 들면, 보체 성분 단백질 또는 인터페론 알파를, 표적 특이성에 근거하여 항체 또는 폴리펩티드를 분리하기 위한 미끼(bait)로 이용하여 선별될 수 있다. 비-인간 항체 그리고 키메라 항체의 생산 및 분리는 당업계 기술자의 이해 범위내에 있다.

재조합 DNA 기술을 이용하여 인간이 아닌 세포에서 생산된 항체의 하나 이상의 성질을 변형시킬 수 있다. 따라서, 진단 또는 치료 용도에서 이들의 면역원성을 감소시키기 위하여 키메라 항체가 제조될 수 있다. 더욱이, CDR 접목 및 선택적으로 기본 틀 변형에 의해 항체를 인간화하여 면역원성을 최소화시킬 수 있다. 미국 특허 5,225,539 및 7,393,648 참고, 이들 각 내용은 참고문헌으로 편입된다.

항체는 동물 혈청으로부터 구할 수 있거나 또는, 단클론 항체 또는 이의 단편인 경우, 세포 배양물에서 만들 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 세균성 또는 바람직하게는 포유류 세포 배양물에서의 과정을 포함한, 확립된 과정에 따라 항체를 만들 수 있다. 선별된 세포 배양 시스템은 바람직하게는 항체 산물을 분비한다.

또 다른 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 항체 생산을 위한 공정은 숙주, 예를 들면, 대장균(E. coli) 또는 포유류 세포를 배양하고, 이때 숙주는 하이브리드 벡터에 의해 형질변환되었다. 벡터는 적절한 리딩 프레임 내에서 항체 단백질을 인코딩하는 제 2 DNA 서열에 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 제 1 DNA 서열에 작용가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 항체 단백질을 수거하고 분리하였다. 선택적으로, 발현 카세트는 항체 단백질을 인코딩하는 폴리시스트론(가령, 바이시스트론) DNA 서열에 작용가능하도록 연결된 프로모터를 포함하며, 각각의 프로모터는 적절한 리딩 프레임 내의 신호 펩티드에 작용가능하도록 연결된다.

하이브리도마 세포 또는 포유류 숙주 세포 시험관의 배가는 적절한 배양 배지에서 실시되는데, 이 배지는 포유류 혈청(가령, 태아 송아지 혈청), 또는 미량 요소들 그리고 성장 유지 보충제(가령, 정상적인 마우스 복막 삼출액 세포, 비장 세포, 골수 대식세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트란스페린, 저밀도 지방단백질, 올레산 또는 이와 유사한 사육자 세포)가 선택적으로 보충된 관례적 표준 배양 배지(예를 들면 Dulbecco 변형된 Eagle Medium (DMEM) 또는 RPMI 1640 배지)를 포함한다. 세균성 세포 또는 효모 세포가 되는 숙주 세포의 배가도 당업계에 공지된 적합한 배양 배지에서 실시된다. 가령, 세균의 경우, 적합한 배양 배지는 배지 LE, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 xYT, 또는 M9 최소 배지(Minimal Medium)를 포함한다. 효모의 경우, 적합한 배양 배지는 배지 YPD, YEPD, 최소 배지(Minimal Medium), 또는 완전 최소 드롭아웃 배지(Complete Minimal Dropout Medium)를 포함한다.

시험관내 생산은 상대적으로 순수한 항체 제조물을 제공하며, 원하는 항체를 다량으로 제공하는 증산도 허용한다. 세균성 세포, 효모, 식물, 또는 포유류 세포 배양에 관한 기술은 당업계에 공지된 것이며, 그리고 균일 현탁 배양(가령, 공수( airlift) 반응기내 또는 연속 교반 반응기내에서), 및 고정된 또는 포집된 세포 배양(가령, 동공 섬유내에서, 마이크로캡슐내, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트릿지 상에서)을 포함한다.

다량의 원하는 항체는 포유류 세포의 생체내에서 배가시켜 수득할 수도 있다. 이러한 목적을 위하여, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 조직적합성 포유류에 주사하여 항체를 생산하는 종양이 성장되도록 한다. 임의적으로, 주사에 앞서 포유류는 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸-펜타데칸)과 같은 광물성 오일로 프라이밍(priming)된다. 1주 내지 3주 후, 포유류의 체액으로부터 항체를 분리한다. 가령, Balb/c 마우스의 항체를 생산하는 비장 세포와 적합한 골수종 세포의 융합에 의해 수득된 하이브리도마 세포, 또는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0로부터 유도된 형질감염된 세포를 프리스탄으로 임의적으로 사전-처리된 Balb/c 마우스의 복막으로 주사한다. 1주 내지 2주 후, 동물로부터 복수를 뺀다.

전술한 기술 및 기타 기술들은 예를 들어, Kohler and Milstein , (1975) Nature 256:495-497; 미국 특허 제4,376,110호; Harlow and Lane , Antibodies : a Laboratory Manual , (1988) Cold Spring Harbor에서 논의되며, 이들의 명세서는 참고문헌으로 편입된다. 재조합 항체 분자를 제조하는 기술은 상기 문헌들 및 가령: WO97/08320; 미국 특허 제5,427,908호; 미국 특허 제5,508,717호; Smith (1985) Science 225:1315-1317; Parmley and Smith (1988) Gene 73:305-318; De La Cruz et al. (1988) Journal of Biological Chemistry 263:4318-4322; 미국 특허 제5,403,484호; 미국 특허 제5,223,409호; WO88/06630; WO92/15679; 미국 특허 제5,780,279호; 미국 특허 제5,571,698호; 미국 특허 제6,040,136호; Davis et al . (1999) Cancer Metastasis Rev . 18(4):421-5; 그리고 Taylor et al . (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Tomizuka et al . (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97(2): 722-727에서도 설명되며, 이들 각 내용은 전문이 참고문헌으로 편입된다.

면역블랏팅에 의해, 효소 면역분석, 예를 들면, 샌드위치 분석 또는 도트-분석에 의해, 또는 방사능면역분석에 의해 원하는 항체에 대해 세포 배양 상층액을 스크리닝한다.

항체 분리의 경우, 배양 상층액 또는 복수액에서 면역글로불린을 암모늄 설페이트를 이용하여 침전시키고, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 흡습성 재료에 대한 투석, 선택성 막을 통한 여과 또는 이와 유사한 것에 의해 농축된다. 필요에 따라, 및/또는 원하는 경우, 항체는 관례적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 상에서 크로마토그래피 및/또는 (면역-) 친화력 크로마토그래피, 가령 친화력 크로마토그래피 보체 성분 C5-발현 세포주로부터 유도된 하나 이상의 표면 폴리펩티드 또는 단백질-A 또는 -G에 대한 친화력 크로마토그래피에 의해 정제된다.

또 다른 구체예는 적합한 포유류에서 단백질(가령, 보체 단백질 또는 인터페론 알파)에 대한 항체를 분비하는 세균성 세포주를 준비하는 공정을 제시한다. 가령, 토끼를 C5-발현 조직 또는 세포 또는 C5 폴리펩티드 또는 이의 단편으로부터 모은 시료로 면역주사한다. 면역주사를 맞은 토끼로부터 생산된 파아지 전시 라이브러리를 작제하고, 당업계에 공지된 방법(가령, 참고문헌으로 편입된 다양한 문헌에서 공개된 방법)에 따라 원하는 항체에 대해 채취하였다.

단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포도 또한 공개한다. 바람직한 하이브리도마 세포는 유전적으로 안정적으로 원하는 특이성을 가진 본 명세서에서 설명된 단클론 항체를 분비하고, 그리고 심층 냉동 배양물을 해동 및 시험관내에서 번식 또는 생체내 복수로서 증식에 의해 확장될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 목적되는 단백질(가령, C5 단백질 또는 인터페론 알파)에 대한 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제조하는 공정이 제시된다. 이러한 공정에서, 적합한 포유동물, 예를 들면 Balb/c 마우스에게 하나 이상의 목적되는 폴리펩티드 항원 또는 이들의 항원성 단편으로 면역주사한다. 면역주사를 맞은 포유동물의 항체를 생산하는 세포를 배양물에서 간단하게 성장시키거나 또는 적합한 골수종 세포주의 세포에 융합한다. 융합에 의해 수득된 하이브리드 세포를 클론하고, 원하는 항체 배출하는 세포 클론을 선별한다. 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법은 목적되는 단백질 (또는 이의 면역원성 단편)을 포함하는 면역 조성물을 수개월 가령 2 내지 4개월 동안 여러 차례 가령, 4회 내지 6회의 피하 주사 또는 복막 주사하여 Balb/c 마우스를 면역화시키는 것을 포함한다. 최종 주사후 2 내지 4일 후 면역화된 마우스의 비장 세포를 얻고, 융합 촉진제, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 존재하에 골수종 세포주 PAI의 세포와 융합한다. 바람직하게는, 골수종 세포는 분자량이 약 4,000인 폴리에틸렌 글리콜 약 30% 내지 약 50%를 포함하는 용액 내에서 면역화된 마우스의 비장 세포 3 내지 24배 과량과 융합된다. 융합후, 예를 들어, HAT 배지와 같은 선택성 배지가 보충된, 상기에서 설명된 적합한 배양 배지에서 세포를 정기적으로 확장시켜 정상적인 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포를 과다 성장시키는 것을 막는다.

항체 및 이의 단편은 “키메라”일 수 있다. 키메라 항체 및 이의 항원-결합 단편은 두 가지 이상의 상이한 종(가령, 마우스 및 인간)의 부분을 포함한다. 키메라 항체는 인간 불변 도메인 유전자 단편 상에 접목된 원하는 특이성을 가진 마우스의 가변 부분을 가지도록 만들어진다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호). 이와 같은 방식에서, 인간이 아닌 항체는 인간의 임상 용도에 더 적합하도록 변형될 수 있다(가령, 인간 개체의 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는 방법).

본 명세서의 단클론 항체는 인간이 아닌(가령, 마우스) 항체의 “인간화” 형을 포함한다. 인간화 또는 CDR-접목된 mAb는 인간의 치료제로 특히 유용한데, 그 이유는 마우스 항체처럼 급격하게 순환계로부터 제거되지 않고, 그리고 전형적으로 역 면역 반응을 일으키지 않기 때문이다. 인간화 항체를 제조하는 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 가령, 인간화는 Winter 및 공동 작업자들의 방법(가령, Jones et al . (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al . (1988) Nature 332:323-327; and Verhoeyen et al . (1988) Science 239:1534-1536)의 방법에 따라 인간 항체의 대응하는 서열에 대해 설치류의 CDRs 또는 CDR 서열로 대체함으로써 기본적으로 실행될 수 있다. 또한, 가령, Staehumor et al . (2006) Mol Immunol 43:1243-1257을 참고한다. 일부 구체예에서, 인간이 아닌(가령, 마우스) 항체의 인간화 형태는 인간 항체(수령 항체)이며, 여기서 수령 항체의 초가변(CDR) 부위 잔기는 인간이 아닌 종(제공 항체) 가령, 마우스, 쥐, 토끼, 또는 원하는 특이성, 친화력 및 결합 능력을 보유하는 인간이 아닌 영장류의 초가변 부위 잔기로 대체된다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 골격 부분의 잔기도 대응하는 인간이 아닌 잔기 (“복귀 돌연변이”라고 함)로 대체된다. 게다가, 항체 서열 안에 선택된 위치에서 아미노산을 변화시키기 위하여 파아지 전시 라이브러리가 이용될 수 있다. 인간화 항체의 성질은 또한 인간 골격의 선택에 의해 영향을 받는다. 더욱이, 예를 들어, 친화력 또는 작동자(effector) 기능과 같은 항체 성질들을 더욱 개선시키기 위하여, 인간화 및 키메라화된 항체는 수령 항체 또는 제공 항체에서 볼 수 없는 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.

본 명세서에서는 완전한 인간 항체가 제시된다. 용어 “인간 항체”는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 부위 및 불변 부위 (존재한다면)를 가지는 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(가령, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어“인간 항체”는 또 다른 포유류 종, 예를 들면, 마우스의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 접목된 항체(가령, 인간화 항체)을 포함하지 않는다. 완전한 인간 또는 인간 항체는 인간 항체 유전자를 운반하는 유전자 전이된 마우스 (가변부(V), 다양부(D), 결합부(J), 및 불변부(C) 엑손을 운반하는) 또는 인간 세포로부터 유도될 수 있다. 가령, 면역주사시에 내생성 면역글로불린 생산 없이 인간 항체의 완전한 목록을 생산할 수 있는 유전자 전이 동물(가령, 마우스)를 생산하는 것이 가능하다.(가령, Jakobovits et al . (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:2551; Jakobovits et al . (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann et al . (1993) Year in Immunol . 7:33; 그리고 Duchosal et al . (1992) Nature 355:258). 유전자 전이 마우스 계통은 재배열안된 인간 면역글로불린 유전자로부터 유전자 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 인간 서열은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하고, 그리고 마우스 내에서 인간에서와 유사한 광범위한 항체 목록을 제시하기 위한 재배열을 정확하게 기능할 수 있다. 유전자 전이 마우스는 표적 단백질로 면역화되어 다양한 배열의 특이적 항체과 이들의 인코딩 RNA를 만든다. 그 다음 이러한 항체의 항체 쇄 성분을 인코딩하는 핵산은 동물로부터 전시 벡터로 클로닝될 수 있다. 전형적으로, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 별도의 핵산 집단이 클로닝되고, 별도의 집단들은 벡터 내의 삽입부에서 재조합되어, 임의의 벡터 카피는 경쇄 및 중쇄의 무작위 복합을 수용한다. 벡터는 항체 쇄들이 어셈블리되어, 벡터를 가지고 있는 전시 패키지의 외측 표면에 전시되도록, 항체 쇄를 발현하도록 기획된다. 가령, 항체 쇄는 파아지의 외측 표면으로부터 파아지 피복 단백질과 함께 융합 단백질로 발현될 수 있다. 그 다음, 전시 패키지는 표적에 결합하는 항체의 전시에 대해 스크리닝될 수 있다.

추가적으로, 인간 항체는 파아지-전시 라이브러리로부터 유도될 수 있다(Hoogenboom et al . (1991) J. Mol . Biol . 227:381; Marks et al . (1991) J. Mol. Biol ., 222:581-597; 그리고 Vaughan et al . (1996) Nature Biotech 14:309 (1996)). 합성 인간 항체 V-부위의 무작위 조합을 이용하는 합성 파아지 라이브러리가 만들어질 수 있다. 항원 상에서 선별에 의해 V-부위가 인간과 정말 유사한 완전한 인간 항체가 만들어질 수 있다. 가령, 미국 특허 제6,794,132호, 제 6,680,209호, 제4,634,666호 및 Ostberg et al . (1983), Hybridoma 2:361-367, 이들의 각 내용은 전문이 참고문헌으로 편입된다.

인간 항체의 생성에 대해서, Mendez et al . (1998) Nature Genetics 15:146-156, Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495을 또한 참고하며, 이들의 공개 내용은 전문이 참고문헌으로 편입된다. 인간 항체는 추가로 미국 특허 제5,939,598호; 제6,673,986호; 제6,114,598호; 제6,075,181호; 제6,162,963호; 제6,150,584호; 제 6,713,610호; 및 제6,657,103호뿐만 아니라 미국 특허 출원 공개 번호 2003-0229905 A1, 2004-0010810 A1, US 2004-0093622 A1, 2006-0040363 A1, 2005-0054055 A1, 2005-0076395 A1, 2005-0287630 A1에서 논의되고, 설명되고 있다. 국제 공개 번호 WO 94/02602, WO 96/34096, 및 WO 98/24893, 및 유럽 특허 EP 0 463 151 B1도 참고한다. 상기 언급된 특허, 출원 및 참고자료의 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다.

대안적 접근법에서, GenPharm International, Inc.을 포함한 다른 곳들은 “minilocus” 방법을 이용한다. “minilocus” 방법에서, 외생성 Ig 좌는 Ig 좌로부터 조각들(개별 유전자의)을 포함하도록 흉내를 내고 있다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 부위, 및 제 2 불변 부위 (바람직하게는, 감마 불변 부위)는 동물로 인입을 위한 구조체를 만든다. 이러한 방법은 가령, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,625,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 제5,770,429호; 제5,789,650호; 제5,814,318호; 제5,591,669호; 제5,612,205호; 제5,721,367호; 제5,789,215호; 제5,643,763호; 제5,569,825호; 제5,877,397호; 제6,300,129호; 제5,874,299호; 제6,255,458호; 및 제7,041,871호에서 개시되고 있으며, 이들의 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다. 유럽 특허 제0 546 073 B1호, 국제 특허 공개 번호 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 또한 참고하며, 이들의 각 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다. Taylor et al . (1992) Nucleci AcidRes . 20: 6287; Chen et al . (1993) Int . Immunol . 5: 647; Tuaillon et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90: 3720-4; Choi et al . (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg et al . (1994) Nature 368: 856-859; Taylor et al . (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon et al . (1995) J. Immunol . 154: 6453-65; Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845; 그리고 Tuaillon et al . (2000) Eur . J. Immunol. 10: 2998-3005 또한 참고하며, 이들의 각 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다.

특정 구체예에서, 탈-면역화된(de-immunized) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제시된다. 탈면역화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 주어진 종(가령 인간)에게 비-면역원성 또는 면역원성이 덜한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하기 위하여 변형된 항체이다. 당업계에 공지된 임의의 다양한 기술을 이용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 변형시켜 탈-면역화가 이루어진다(가령, PCT 공개 번호 WO 04/108158 및 WO 00/34317). 가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열내에 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하고, 그리고 재조합 기술을 이용하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 잠재적인 하나 이상의 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 제거하여 탈면역화될 수 있다. 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 원하는 생물학적 활성, 가령, 예를 들어, 결합 친화력은 유지하지만, 면역원성은 감소된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 확인하기 위하여 임의적으로 생산되고, 그리고 테스트될 수 있다. 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하는 방법은 당업계에 공지된 기술, 예를 들면, 자동화 방법(가령, PCT 공개 번호 WO 02/069232), 시험관 또는 컴퓨터 혹은 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 시행되는(in silico) 기술, 및 생물학적 분석 또는 물리적 방법(예를 들면, MHC 분자에 펩티드 결합의 확인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수용하는 종들로부터 T 세포 수용체들에 대한 펩티드:MHC 복합체의 결합을 확인, 유전자 전이 동물을 이용하여, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수용하는 종의 MHC 분자로 단백질 또는 이의 펩티드 부분들의 테스트, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수용하는 종으로부터 면역계 세포로 재구성된 유전자 전이 동물로 테스트, 등)을 이용하여 실시될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 명세서에서 설명되는 탈면역화된 항체는 탈면역화된 항원-결합 단편, Fab, Fv, scFv, Fab’ 및 F(ab’)₂, 단클론 항체, 뮤린 항체, 조작된 항체(예를 들면, 키메라, 단일 쇄, CDR-접목된, 인간화, 완전한 인간 항체, 그리고 인위적으로 선별된 항체), 합성 항체 및 반-합성 항체를 포함한다.

일부 구체예에서, 항체(예를 들면, 항-C5 항체 또는 항-인터페론 알파 항체)의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입부를 포함하는 재조합 DNA가 생산되고 항체의 발현을 위한 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 DNA는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA로 구성된 이중 가닥 DNA 그리고 이에 대한 상보적 DNA, 또는 이들 상보(단일 가닥) DNA를 포함한다.

더욱이, 항-C5 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인에 대한 진정성 DNA 서열, 또는 이의 돌연변이체를 포함하도록 효소적으로 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 진정성 DNA의 돌연변이체는 상기 언급한 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA이며, 여기서 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입되거나 또는 하나 이상의 다른 아미노산으로 교체된다. 바람직하게는 이러한 돌연변이는 인간화 및 발현 최적화 응용에서 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR 외부에 있다. 용어 “돌연변이 DNA”는 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 대체되어 동일한 아미노산을 코딩하는 새로운 코돈을 가지는 침묵 돌연변이를 또한 포함한다. 용어 “돌연변이 서열”은 축퇴 서열 또한 포함한다. 축퇴 서열은 무제한 수의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 대체되어 원래 인코딩된 아미노산 서열의 변화를 초래하지 않는 유전자 코드 의미의 축퇴다. 이러한 축퇴 서열은 중쇄 뮤린 가변 도메인 및/또는 경쇄 뮤린 가변 도메인의 최적 발현을 얻기 위하여 특정 숙주, 특히 대장균이 선호하는 특정 코돈의 빈도 및/또는 상이한 제한효소 부위로 인하여 유용하다.

용어 “돌연변이체”는 당업계에 공지된 방법에 따라 진정성 DNA의 시험관내 돌연변이생성에 의해 수득된 DNA 돌연변이체를 포함한다.

완전한 사량체 면역글로불린 분자의 어셈블리 및 키메라 항체의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 삽입체를 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 대응하는 DNA와 융합시키고, 그 다음 하이브리드 벡터에 통합시킨 후, 적절한 숙주 세포 내로 형질감염시킨다.

또 다른 구체예는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA에 관한 것으로, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 숙주 세포내에서 항체의 프로세싱을 실행하는 신호 서열 및/또는 항체의 정제를 실행하는 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열 및/또는 절단 부위 및/또는 펩티드 스페이스 및/또는 물질을 임의적으로 포함하는 다양한 스페이스 군에 의해 연결된다. 작용제를 코딩하는 DNA는 진단적 또는 치료적 적용에서 유용한 작용제를 코딩하는 DNA인 것으로 의도된다. 따라서, 독소 또는 효소, 특히 프로드럭의 활성화를 촉진할 수 있는 효소인 작용제 분자가 특히 지시된다. 이런 작용제를 인코딩하는 DNA는 자연 발생 효소 또는 독소 인코딩 DNA, 또는 이의 돌연변이체의 서열을 갖고, 그리고 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

따라서, 명세서의 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 다른 물질, 예를 들면, 치료제 또는 검출가능한 라벨에 접합되지 않은 나신 항체 또는 항원-결합 단편이 될 수 있다. 대안으로, 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 세포독성 물질, 소분자, 호르몬, 효소, 성장 인자, 사이토킨, 리보자임, 펩티드모방체, 화학물질, 프로드럭, 코딩 서열(가령, 안티센스, RNAi, 유전자-표적 구조체, 등)을 포함하는 핵산 분자, 또는 검출가능한 라벨(가령, NMR 또는 X-선 조영제, 형광 분자, 등)과 같은 물질에 접합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-C5 항체 또는 항원-결합 단편(가령, Fab, Fv, 단일-쇄 scFv, Fab’, 및 F(ab’)₂)은 항체 또는 항원-결합 단편 (상기 참고)의 반감기를 증가시키는 분자에 연결된다.

포유류 세포에서 클론된 중쇄 및 경쇄 유전자의 발현에 이용가능한 몇 가지 가능한 벡터 시스템이 있다. 한 종류의 벡터는 숙주 세포 게놈으로 원하는 유전자 서열의 통합에 의존한다. 안정적으로 통합된 DNA를 가진 세포는 대장균 gpt (Mulligan and Berg (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 78:2072) 또는 Tn5 neo (Southern and Berg (1982) Mol . Appl . Genet . 1:327)와 같은 약물 저항성 유전자를 동시에 도입시킴으로써 선별될 수 있다. 선별가능한 표식 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 연결되거나 또는 공동-형질감염에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수도 있다(Wigler et al . (1979) Cell 16:77). 두 번째 종류의 벡터는 염색체외의 플라스미드에 자체적 복제 능력을 부여하는 DNA 요소들을 이용한다. 이러한 벡터는 동물의 바이러스, 예를 들면, 소 파필로마바이러스 (Sarver et al . (1982) Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 79:7147), 폴리마 바이러스 (Deans et al . (1984) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 81:1292), 또는 SV40 바이러스 (Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)로부터 유래될 수 있다.

면역글로불린 cDNA는 항체 단백질을 인코딩하는 성숙 mRNA를 나타내는 서열만으로 구성되기 때문에, 면역글로불린 mRNA의 합성을 위하여 유전자의 전자를 조절하고, RNA의 프로세싱을 조절하는 추가적인 유전자 발현 요소들이 필요하다. 이러한 요소들은 스플라이스(splice) 신호, 유도성 프로모터를 포함하는 전사 프로모터, 인헨서, 및 종료 신호를 포함할 수 있다. 이러한 요소들을 포함하는 cDNA 발현 벡터는 Okayama and Berg (1983) Mol . Cell Biol . 3:280; Cepko et al . (1984) Cell 37:1053; 그리고 Kaufman (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:689에서 설명된 것들을 포함한다.

본 명세서의 치료 구체예에서, 이중특이적 항체가 고려된다. 이중특이적 항체는 단클론 항체, 최소한 두 가지 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체로, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 경우에서, 결합 특이성 중의 하나는 인간 보체 단백질 또는 인터페론 알파 단백질에 대한 것이며, 그리고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 결합 특이성이다.

이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계의 기술자들의 이해 범위 내에 속한다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합적 생산은 두 가지 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현에 기초하는데, 이때 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 가진다(Milstein and Cuello (1983) Nature 305:537-539). 원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 이러한 융합은 바람직하게는 힌지, C_H2, 및 C_H3 부위의 최소한 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 가진다. 면역글로불린 중쇄 융합과 바람직하게는, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터로 삽입되고, 그리고 적합한 숙주 기관으로 공동-형질감염된다. 이중특이적 항체를 만드는 현재 공지된 방법의 더 상세한 설명은 가령, Suresh et al . (1986) Methods in Enzymology 121:210; PCT 공개 No. WO 96/27011; Brennan et al . (1985) Science 229:81; Shalaby et al ., J. Exp . Med . (1992) 175:217-225; Kostelny et al . (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448; Gruber et al . (1994) J. Immunol . 152:5368; 그리고 Tutt et al . (1991) J. Immunol . 147:60.을 참고한다. 이중특이적 항체는 또한 교차-연결된 또는 이형 접합된 항체를 포함한다. 이형 접합 항체는 임의의 통상적인 교차-연결 방법에 의해 만들어질 수 있다. 적합한 교차-연결제는 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 다수의 교차-연결 기술과 함께 U.S. 특허 제4,676,980호에서 공개되고 있다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 만들고 분리시키는 다양한 기술들 또한 설명되어 있다. 가령, 이중특이적 항체는 루이신 지퍼를 이용하여 생산되었다.(가령, Kostelny et al . (1992) J. Immunol . 148(5):1547-1553). Fos 및 Jun 단백질의 루이신 지퍼 펩티드들은 유전자 융합에 의해 두 가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결될 수 있다. 항체 동종이량체는 힌지 부분에서 환원되어, 단량체를 만들고, 다시 재-산화되어 항체 이종이량체를 만들 수 있다. 이러한 방법을 항체 동종이량체를 생산하는데 이용할 수도 있다. Hollinger et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448에서 설명된“디아바디” 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 대안 기전을 제시하였다. 이단편은 동일한 쇄의 두 개 도메인 사이에 짝 이룸을 허용하기에는 짧은 링커를 통하여 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 짝을 이루게 되도록 강요되어, 두 개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (scFv) 이량체를 이용한 이중특이적 항체 단편을 만드는 또 다른 전략이 보고되었다.(가령, Gruber et al . (1994) J. Immunol. 152:5368.) 대안으로, 항체는 가령, Zapata et al . (1995) Protein Eng . 8(10):1057-1062에서 설명된 것과 같이 “선형 항체”일 수 있다. 간략하게 설명하면, 이러한 항체는 항원 결합 부위 쌍을 이루는 나란한 Fd 단편 (V_H-C_H1-V_H-C_H1) 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적이다.

본 발명은 또한 Wu et al . (2007) Nat Biotechnol 25(11):1290-1297에서 설명된 것과 같은 4가 이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자와 같은 이중 특이적 항체의 변이체 형도 포함한다. DVD-Ig 분자는 두 가지 상이한 부모 항체로부터 두 가지 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 재조합 DNA 기술에 의해 나란하게 연결되거나 또는 짧은 링커를 통하여 연결되고, 이어서 경쇄 불변 도메인이 있다. 두 가지 부모 항체로부터 DVD-Ig 분자 분자를 만드는 방법은 가령, PCT 공개 WO 08/024188 및 WO 07/024715에서 추가로 설명되고 있으며, 이들 각 공개는 전문이 참고문헌으로 편입된다.

약학 조성물 및 제제.

보체 억제제(가령, 인간 보체 성분 C5의 억제제, 예를 들면, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 인터페론 알파의 억제제)를 포함하는 조성물은 악성 위축성 구진증을 치료하기 위하여 개체로 투여될 수 있는 약학 조성물로 조제될 수 있다. 약학 조성물은 일반적으로 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이,“약학적으로 수용가능한 운반체”는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등장성 그리고 흡수 지연 물질 그리고 생리학적으로 양립가능한 이와 유사한 것들을 포함한다. 조성물은 약학적으로 수용가능한 염, 예를 들면, 산 첨가 염 또는 염기 첨가 염을 포함할 수 있다(가령, Berge et al . (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19).

조성물은 표준 방법에 따라 조제될 수 있다. 약학 제제는 잘-확립된 기술이며, 그리고 가령, Gennaro (2000) “ Remington : The Science and Practice of Pharmacy,” 20 th Edition , Lippincott , Williams & Wilkins ( ISBN : 0683306472); Ansel et al . (1999) “ Pharmaceutical Dosages and Drug Delievery Systems ,” 7 th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers ( ISBN : 0683305727); 그리고 Kibbe (2000) “ Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association,” 3 rd Edition ( ISBN : 091733096X)에서 더욱 설명되어 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 예를 들어, 적절한 농도에서 그리고 2-8℃에서 보관에 적합한 완충된 용액으로 조제될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 0℃ 이하의 온도(가령, -20℃ 또는 -80℃)에서 보관할 수 있도록 조제될 수 있다.

약학 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이와 같은 형태는 가령, 액체, 반-고체 그리고 고체 투약 형태, 예를 들면, 액체 용액(가령, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 바람직한 형태는 원하는 투여 방식 및 치료 용도에 따라 일부 달라진다. 가령, 전신 또는 국소 운반을 위한 항-C5 항체를 포함하는 조성물은 주사용 또는 주입용 용액 형태가 될 수 있다. 따라서, 조성물은 비경구 방식(가령, 정맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사)으로 투여되도록 조제될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, “비경구 투여(Parenteral administration)”, “비경구로 투여된” 그리고 다른 문법적으로 등가의 표현구들은 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 말하며, 그리고 정맥내, 비강내, 안구내, 폐, 근육내, 동맥내, 척수강내, 캡슐내, 안와내, 심장내, 피내, 폐내, 복막내, 피하내, 피하층, 관절내, 하위캡슐내, 지주막하, 척수내, 경막밖, 뇌내, 두개골내, 경동맥내, 그리고 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는다. (아래 참고).

조성물은 용액, 미소유제, 분산액, 리포좀, 또는 고농도에서 안정적 보관에 적합한 기타 정돈된 구조로 조제될 수 있다. 멸균된 주사용액은 필요에 따라 상기에서 열거된 하나의 성분 또는 복합된 성분과 함께, 적절한 용매의 필요한 양에 본 명세서에서 설명된 항체를 결합시키고, 그 이후에 여과에 의해 살균함으로써 조제될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산액 매질과 상기에서 열거된 다른 필요한 성분을 포함하는 멸균 비이클 내로 본 명세서에서 설명된 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체) 및/또는 인터페론 알파의 억제제를 통합시켜 제조한다. 멸균 주사용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 미리 살균-여과된 용액으로부터 원하는 추가 성분과 본 명세서에서 설명된 항체 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하여, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지시켜, 그리고 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 얻는다.

특정 구체예에서, 보체 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 또는 인터페론 알파의 억제제는 임플란트 및 미소포집된 운반계를 포함하는 방출 조절된 제제와 같은 신속 방출로부터 화합물을 보호할 수 있는 운반체로 조제될 수 있다. 생분해가능한, 생체적합한 폴리머, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 그리고 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이와 같은 제제를 조제하는 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다.(가령, J.R. Robinson (1978) “ Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ,” Marcel Dekker , Inc., New York .)

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 억제제는 인간과 같은 포유류에 폐내 투여(가령, 분무기를 통한 투여)하는데 적합한 조성물로 조제될 수 있다. 이러한 조성물을 조제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 가령, 미국 특허 출원 공개 No. 20080202513; 미국 특허 7,112,341 및 6,019,968; 그리고 PCT 공개 No. WO 00/061178 및 WO 06/122257에서 설명되고 있으며, 이들의 각 명세서는 전문이 참고문헌으로 편입된다. 건조 분말 흡입용 제제 및 이 제제의 투여에 적합한 시스템은 가령, 미국 특허 출원 공개 20070235029, PCT 공개 WO 00/69887; 및 미국 특허 5,997,848에서 설명된다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 또는 인터페론 알파의 억제제는 순환계에서, 예를 들면, 혈액, 혈청 또는 기타 조직에서 안정성 및 체류를 개선시키는 모이어티로 변형될 수 있다. 이러한 안정화 모이어티는 항체의 안정성 또는 체류를 최소한 1.5배(가령, 최소한 2배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 또는 50배 이상) 개선시킬 수 있다.

본 명세서에서 설명된 인간 보체의 핵산 억제제(가령, 안티센스 핵산 또는 siRNA)는 세포내에서 작용제를 발현하고 생산하는데 이용될 수 있는 핵산을 운반하기 위한 유전자 요법 프로토콜의 일부분으로 이용되는 유전자 구조체에 통합될 수 있다. 이러한 성분의 발현 구조체는 생물학적으로 유효한 운반체로 투여될 수 있는데, 가령 생체내에서 세포로 성분 유전자를 효율적으로 운반할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물로 투여될 수 있다. 접근법은 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스, 렌티바이러스 및 허피스 심플렉스 바이러스-1 (HSV-1)를 포함하는 바이러스 벡터, 또는 재조합 세균성 또는 진핵 플라스미드 안으로 해당 유전자의 삽입을 포함한다. 바이러스 벡터는 세포를 직접 형질감염시킬 수 있고; 플라스미드 DNA는 예를 들어, 양이온 리포좀 (리포펙틴) 또는 유도화된(가령, 항체 접합된), 폴리리신 접합, 그라미시딘 S, 인공 바이러스 외피 또는 기타 세포내 운반체의 도움으로 운반될 수 있고, 뿐만 아니라 유전자 구조체의 직접 주입 또는 생체내에서 실행되는 CaPO₄ 침전(하기 “생체외 접근법” 참고)에 의해 운반될 수 있다. 적합한 레트로바이러스의 예는 당업계에 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM를 포함한다(가령, Eglitis et al . (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:6460-6464; Wilson et al . (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:3014-3018; Armentano et al . (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:6141-6145; Huber et al . (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:8039-8043; Ferry et al . (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:8377-8381; Chowdhury et al . (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al . (1992) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al . (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10892-10895; Hwu et al . (1993) J. Immunol. 150:4104- 4115; 미국 특허 4,868,116 및 4,980,286; PCT 공개 WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, 및 WO92/07573 참고). 또 다른 바이러스 유전자 운반 시스템은 아데노바이러스-유도된 벡터(가령, Berkner et al . (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al . (1991) Science 252:431-434; 그리고 Rosenfeld et al . (1992) Cell 68:143-155)를 이용한다. 아데노바이러스 균주 Ad type 5 dl324 또는 다른 아데노바이러스 균주(가령, Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유도된 적합한 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 해당 유전자의 운반에 유용한 또 다른 바이러스 벡터는 아데노-관련된 바이러스(AAV)이다. 가령, Flotte et al . (1992) Am . J. Respir . Cell . Mol . Biol . 7:349-356; Samulski et al . (1989) J. Virol . 63:3822-3828; and McLaughlin et al . (1989) J. Virol 62: 1963-1973 참고.

일부 구체예에서, 하나 이상(가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상)의 억제제(들)(가령, 인간 C5의 하나 이상의 억제제)가 공동-조제될 수 있다. 가령, C5-특이적 siRNA와 항-C5 항체가 함께 조제될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 인간 보체의 억제제) 또는 인터페론 알파의 억제제는 악성 위축성 구진증을 치료하거나 이의 증상을 개선시키는데 유용한 하나 이상의 추가 활성제와 함께 조제될 수 있다. 가령, 항-C5 항체는 면역억제제와 함께 조제될 수 있다. 면역억제제는 예를 들어, 코르티코스테로이드, 페닐부타존, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 그리고, 미코페놀레이트 모페틸, 사이클로포스파미드, 그리고 항-CD2 작용제, 예를 들면, 리툭시맙(Rituxan^TM Biogen Idec, Cambridge, MA)을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 보체의 억제제는 정맥내 면역글로불린 요법(IVIG), 적혈구 수혈, 혈장 사열, 또는 혈장 교체와 함께 개체로 투여할 수 있도록 조제될 수 있다 (Dyrsen et al. (2008), supra and Zhu et al. (2007), supra).

일부 구체예에서, 인간 보체의 억제제는 항혈전제 및/또는 항응혈제, 예를 들면, 클로피도그렐, 아스피린, 디피리다몰, 와파린(Coumadin), 헤파린, 페닌디온, 폰다파리누스, 이드라파리누스, 그리고 트롬빈 억제제(가령, 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘 또는 다비가트란)와 함께 복합 요법(가령, 동시에 또는 병행으로)을 위해 조제될 수 있다. 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체)는 또한, 섬유소용해제(가령, 안크로드, ε-아미노카프론산, 항플라스민-a₁, 프로스타사이클린, 그리고 데피브로티드)과 함께 이용을 위해 조제될 수 있다.

일부 구체예에서, 가령, 악성 위축성 구진증이 감염과 연관되는 경우에, 인간 보체의 억제제 및/또는 인터페론 알파의 억제제는 감염을 치료하는데 이용되는 하나 이상의 작용제와 함께 조제될 수 있다. 가령, C5 억제제는 항생제 또는 항바이러스제와 함께 조제될 수 있다.

인간 보체의 억제제가 제 2 활성제와 복합하여 이용될 경우, 또는 인간 보체의 두 개 이상의 억제제(가령, 항-C5 항체 및 항-인자 B 항체)가 이용될 경우, 이들 작용제는 별도로 또는 함께 조제될 수 있다. 가령, 각 약학 조성물은 투여 직전에 혼합되고, 그리고 함께 투여되거나, 또는 동일한 시간 또는 상이한 시간에 별도로 투여될 수 있다(하기 참고).

유사하게, 인터페론 알파의 억제제(가령, 항-인터페론 알파 항체)가 제 2 활성제와 복합하여 이용될 경우, 또는 인터페론 알파의 두 개 이상의 억제제가 이용될 경우, 이들 작용제는 별도로 또는 함께 조제될 수 있다.

앞서 설명된 것과 같이, 조성물은 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 치료 유효량을 포함하도록 조제되거나, 또는 조성물은 치료량 이하의 억제제와 치료량 이하의 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함하여, 전체적으로 이들 성분이 악성 위축성 구진증의 치료에 유효하도록 조제될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 보체의 두 개 이상의 억제제를 각각 치료 약량 이하로 포함하여, 전체적으로 이들 억제제가 악성 위축성 구진증을 치료하는데 유효한 농도가 되도록 조제될 수 있다. 조성물은 인터페론 알파의 억제제(가령, 항-인터페론 알파 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 치료 유효량을 포함하도록 조제되거나, 또는 조성물은 치료량 이하의 억제제와 치료량 이하의 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함하여, 전체적으로 이들 성분이 악성 위축성 구진증의 치료에 유효하도록 조제될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 인터페론 알파의 두 개 이상의 억제제를 각각 치료 약량 이하로 포함하여, 전체적으로 이들 억제제가 악성 위축성 구진증을 치료하는데 유효한 농도가 되도록 조제될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간 보체의 억제제 및 인터페론 알파의 억제제를 포함한다. 치료에 유효한 농도(가령, 항-C5 항체 또는 항-인터페론 항체의 치료 유효량)를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 설명된다.

치료 방법

상기에서 설명된 조성물은 그중에서도 특히, 개체(가령, 인간)에서 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는 방법에 유용하다. 조성물은 투여 경로에 부분적으로 좌우되는 다양한 방법을 이용하여 개체, 예를 들면, 인간 개체에게 투여될 수 있다. 경로는 가령, 정맥내 주사 또는 주입 (IV), 피하 주사 (SC), 복막내 (IP), 또는 근육내 주사일 수 있다.

가령, 국소 주입, 주사, 또는 임플란트에 의해 투여될 수 있다. 임플란트는 실리콘(sialastic) 막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다. 임플란트는 개체에게 조성물이 지속적 또는 주기적으로 방출되는 형태일 것이다(가령, 미국 특허 출원 공개 번호 20080241223; 미국 특허 제5,501,856호; 제4,863,457호; 및 제3,710,795호; EP488401; 및 EP 430539 참고, 이들의 각 내용은 전문이 참고문헌에 통합된다). 조성물은 가령, 확산, 침식가능한, 또는 대류성 시스템, 가령, 삼투성 펌프, 생분해가능한 임플란트, 전기적확산 시스템, 전기침투 시스템, 증기압 펌프, 전기용해성 펌프, 비등성 펌프, 압전기 펌프, 부식-기반 시스템, 또는 전기기계 시스템에 기초한 이식가능한 장치에 의해 개체로 운반될 수 있다.

인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 단편) 또는 인터페론 알파의 억제제(가령, 항-인터페론 알파 항체)의 적합한 1회 투여량(1회 분량)(이는 개체에서 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방할 수 있는 양)은 치료되는 개체의 나이, 성별, 및 체중, 그리고 이용된 특정 억제제 화합물을 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 가령, 동일한 환자를 치료하는데 요구되는 항-C5 항체의 1회 투여량과 비교하여, 악성 위축성 구진증을 앓는 개체를 치료하기 위하여 인간 C5에 특이적인 siRNA의 상이한 1회 투여량이 요구될 수 있다. 개체에게 투여되는 1회 투여량에 영향을 주는 다른 인자는 가령, 악성 위축성 구진증의 유형 또는 중증도를 포함한다. 가령, 악성 위축성 구진증의 피부 형태를 앓고 있는 개체는 악성 위축성 구진증의 전신 형태를 앓고 있는 개체와는 상이한 용량의 억제제 투여를 요구할 수 있다. 다른 인자는 또한 개체가 현재 앓고 있는 또는 이전에 앓았던 기타 의학적 장애, 개체의 전반적인 건강, 개체의 유전적 소인, 식이, 투여 시간, 배출율, 약물 조합 및 개체로 투여되는 임의의 기타 추가 약물을 포함할 수 있다. 임의의 특정 개체에 대한 특정 용량 및 치료 섭생은 치료 담당의(가령, 의사 또는 간호사)의 판단에 따라 달라질 것이다.

억제제는 고정 투여량으로 투여되거나, 또는 (mg/kg) 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 1회 분량은 조성물 내의 하나 이상의 활성제에 대항하는 항체 또는 숙주의 다른 면역 반응을 감소 또는 회피하도록 선택될 것이다. 한정하는 의도는 아니지만, 보체 억제제(가령, 항-C5 항체) 및/또는 인터페론 알파의 억제제의 예시적인 용량은 가령, 1-100 ㎍/kg, 0.5-50 ㎍/kg, 0.1-100 ㎍/kg, 0.5-25 ㎍/kg, 1-20 ㎍/kg, 및 1-10 ㎍/kg, 1-100 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 0.1-100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, 및 1-10 mg/kg을 포함한다. 본 명세서에서 설명되는 항체의 예시적인 용량은 0.1 ㎍/kg, 0.5 ㎍/kg, 1.0 ㎍/kg, 2.0 ㎍/kg, 4 ㎍/kg, 및 8 ㎍/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4 mg/kg, 및 8 mg/kg을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 인간은 약 12일(가령, 약 10일, 11일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 28일, 30일, 42일, 또는 49일 이상) 마다 약 900 mg의 1회 분량에서 항-C5 항체(가령, 에쿨리주맙)가 정맥내 투여될 수 있다(Hill et al. (2005) Blood 106(7):2559 참고).

일부 구체예에서, 인간은 임의적으로, 2개월 이상(가령, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 또는 8개월 이상) 동안 매주 약 600 mg(가령, 약 625, 650, 700, 725, 750, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 또는 1,000 mg 이상)의 1회 분량에서 항-C5 항체(가령, 에쿨리주맙)가 정맥내 투여될 수 있다. 최초 치료 이후에, 인간은 가령, 유지 분량(maintenance dose)으로서, 약 14일(가령, 약 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 28일, 30일, 42일, 또는 49일 이상) 마다 약 900 mg의 1회 분량에서 상기 항체가 투여될 수 있다(Hillmen et al. (2004) N Engl J Med . 350(6):552-9 및 Dmytrijuk et al. (2008) The Oncologist 13(9):993 참고).

약제 조성물은 인간 보체 성분 C5의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 치료 유효량 및/또는 인터페론 알파의 억제제의 치료 유효량을 포함할 수 있다. 이러한 유효량은 투여되는 억제제의 효과, 또는 하나 이상의 추가적인 활성제(하나 이상의 작용제가 이용된 경우)와 항체의 복합 효과 등에 부분적으로 근거하여 당업계의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 인간 보체(가령, 항-C5 항체)의 억제제의 치료 유효량은 또한, 개인의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응, 예를 들면, 최소한 하나의 조건 매개변수의 개선, 예를 들면, 악성 위축성 구진증의 최소한 한 가지 증상의 개선을 유도하는 항체(및 하나 이상의 추가 활성제)의 능력과 같은 인자에 따라 변화될 수 있다. 가령, 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체)의 치료 유효량은 당업계에 공지되거나 본 명세서에서 설명되는 악성 위축성 구진증 및/또는 악성 위축성 구진증의 임의의 증상을 억제(중증도를 감소 또는 발생을 제거) 및/또는 예방할 수 있다. 치료 유효량은 또한, 치료에 의한 유익한 효과가 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다.

용어“치료 유효량” 또는 “치료에 유효한 1회 분량” 또는 본 명세서에서 사용된 유사한 용어는 원하는 생물학적 또는 의학적 반응(가령, 악성 위축성 구진증의 하나 이상의 증상의 개선)을 유도할 수 있는 작용제(가령, 인간 보체의 억제제)의 양을 의미한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명되는 조성물은 인간 보체 성분 C5의 억제제의 치료 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명되는 조성물은 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 조성물이 전체로서 치료에 유효하도록 2개 이상(가령, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개 이상)의 상이한 인간 보체 억제제를 포함한다. 가령, 조성물은 인간 C5 단백질에 결합하는 항체 및 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA에 결합하고 이의 분해를 촉진하는 siRNA를 포함할 수 있고, 여기서 항체와 siRNA는 각각, 복합될 때 치료에 유효한 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 조성물은 조성물이 전체로서 치료에 유효하도록 억제제 및 하나 이상의 두 번째 활성제를 포함한다. 가령, 조성물은 인간 C5 단백질에 결합하는 항체 및 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방하는데 유용한 다른 작용제를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 조성물은 항-인터페론 알파 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 포함한다.

이러한 조성물의 독성 및 치료 효과는 세포 배양물 또는 실험 동물에서 공지의 약제학적 절차에 의해 판단될 수 있다. 이러한 절차는 LD₅₀ (집단의 50%를 사망에 이르는 1회 분량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에 치료 효과를 주는 1회 분량)를 결정하는데 이용될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수(therapeutic index)이며, LD₅₀/ED₅₀ 비율로 나타낸다. 높은 치료 지수를 나타내는 조성물, 또는 조성물의 보체 억제제(가령, 항-C5 항체)가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 조성물이 이용될 수 있지만, 질병이 있는 조직 부위로 이러한 화합물을 표적화시키고, 정상 세포에 가해질 잠재적 손상을 최소화시켜, 부작용을 줄이는 운반 시스템을 설계하기 위해 주의가 요구된다.

세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터를 이용하여 인간에서 이용할 수 있는 용량 범위를 산정할 수 있다. 이러한 억제제의 용량은 일반적으로 독성이 거의 없는 또는 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는, 억제제(들)(가령, 항-C5 항체, 항-인터페론 알파 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편)의 순환 농도의 범위 내에 있다. 용량은 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 용도(가령, 악성 위축성 구진증을 치료 또는 예방)의 인간 보체 성분 C5의 억제제(가령, 항-C5 항체)의 경우, 치료 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 산정될 수 있다. 가령, 치료된 인간 또는 동물의 혈장에서 보체 억제제의 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체)의 요구되는 양은 개체의 혈액 내에서, 억제제가 지향되는 보체 단백질의 농도에 기초하여 결정될 수 있다. 가령, 더욱 높은 농도의 순환하는 인간 C5 단백질 수준을 갖는 개체는 더욱 낮은 수준의 순환하는 인간 C5를 갖는 개체보다 더욱 높은 분량의 인간 C5 억제제를 요구할 지도 모른다. 개체로부터 혈액-유래된 유체 샘플 내에 인간 보체의 농도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, 혈청 C5 수준을 결정하는 방법은 예를 들어, Rawal et al. (1998) J Biol Chem 273(27):16828-16835에서 설명된다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, “개체”는 임의의 포유동물일 수 있다. 가령, 개체는 인간, 비-인간 영장류(가령, 원숭이, 비비, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 게르빌루스 쥐, 헴스터, 쥐, 또는 마우스일 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 유아(가령, 인간의 유아)이다.

일부 구체예에서, 개체는 악성 위축성 구진증을 치료하기 위해 투여된 하나 이상의 추가적인 치료제에 불응하는 개체이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 치료에 "내성", 치료에 "불응성", 그리고 유사한 문법적 어구는 소정의 질환(가령, 악성 위축성 구진증)의 치료 또는 치유에서 소정의 요법의 효능에서 감소, 또는 상기 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 치료 또는 경감에서 효능의 감소가 나타나는 환자의 임상적 상태를 지칭한다. 가령, 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 IVIg의 치료적 이점은 시간의 흐름에서 줄어들고, 따라서 상기 질환은 존속하거나, 또는 IVIg 치료에도 불구하고 진행될 수 있다(De Breucker et al. (2008), supra 참고.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, “예방을 요하는”, “치료를 요하는” 또는 “이를 필요로 하는” 개체는 적합한 의학적 전문가(가령, 인간의 경우 의사, 간호사, 또는 간호 전문가; 인간이 아닌 포유동물인 경우 수의사)의 판단에 따라, 소정의 치료(가령, 인간 보체의 억제제 또는 인터페론 알파의 억제제를 포함하는 조성물로 치료)로부터 합당한 이익을 얻을 수 있는 개체를 말한다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, “악성 위축성 구진증의 발생 위험에 처한” 개체는 상기 장애의 발생에 대한 하나 이상(가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 이상)의 위험 인자를 가지는 개체다. 악성 위축성 구진증에 대한 위험 인자는 의학 분야에 잘 공지되어 있고, 그리고 예를 들어, 발병에 대한 소인, 다시 말하면, 장애의 가족력(family history), 또는 악성 위축성 구진증과 연관된 유전적 상태(genetic status), 예를 들면, 단백질 S 결함을 포함한다(Gileberte et al. (2005) Br J Dermatol 153(3):666-7). 악성 위축성 구진증에 대한 위험 인자는 또한, 바이러스 감염(가령, HIV 또는 B19 파보바이러스 감염), 응고원성 상태(procoagulant state)(가령, 인자 V Leiden), 또는 자가면역 질환, 예를 들면, LE, 피부근염, 경피증, 그리고 항인지질 증후군을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 악성 위축성 구진증과 연관된 장애를 포함한다. 이후, 악성 위축성 구진증의 이런 징후(manifestation)는 적절한 경우에, 예를 들어 "감염-연관된 악성 위축성 구진증" 또는 "자가면역-연관된 악성 위축성 구진증"으로 지칭된다. 상기로부터, “악성 위축성 구진증의 발생 위험에 처한” 개체가 목적되는 종 내에 모든 개체는 아니라는 것이 명백할 것이다.

“악성 위축성 구진증을 가지는 것으로 의심되는” 개체는 상기 질환의 하나 이상(가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상)의 증상을 가지는 개체다. 이러한 장애의 증상은 의약 업계의 기술자들에게 공지되어 있고, 그리고 예를 들어, 피부 병소(가령, 부풀어 오르고 피부색 또는 장미색을 띠는 하나 이상의 구진, 이들 구진은 중심과 주변 홍반과 모세관혈관확장(telangiectasias)을 갖는 함몰된 흉터로 진행된다), 소화관 출혈(gastrointestinal bleeding), 구토, 장피부 누공(terocutaneous fistula), 신경 증상(가령, 얼굴과 말단 감각이상, 두통, 현기증, 연하 불능, 대마비, 주시마비, 간질, 기억 상실, 또는 변화된 감각), 발작, 복시, 하수증, 시야결손, 쇠약, 숨가쁨, 그리고 흉통을 포함한다. 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 환자에서, 항-카이디올리핀 항체, 루푸스 항응혈제, 항인지질 항체, 또는 혈관 IgA 침착의 존재와 연관된다(Englert et al. (1984), supra; Crowson et al. (2002), supra; 그리고 Grattan and Burton (1991) Semin Dermatol 10(3):152-159 참고). 상기로부터, “악성 위축성 구진증을 가지는 것으로 의심되는” 개체가 목적되는 종 내에 모든 개체는 아니라는 것이 명백할 것이다.

일부 구체예에서, 이들 방법은 개체를 악성 위축성 구진증을 가지는, 악성 위축성 구진증을 가지는 것으로 의심되는, 또는 악성 위축성 구진증의 발생 위험에 처한 개체로 확인하는 것을 포함할 수 있다. 개체를 확인하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가령, Ackerman은 악성 위축성 구진증-연관된 피부 병소를 양성적으로 확인하는 조직학적 방법을 설명한다(Am J Dermatopathol (1985) 7(2):105-7). 앞서 설명된 바와 같이, 악성 위축성 구진증은 환자 내에서, 항-카이디올리핀 항체, 루푸스 항응혈제, 및/또는 항인지질 항체의 존재와 연관될 수 있다. 진단적 조직학적 방법 역시 작업 실시예에서 구현된다. 환자의 혈액 내에서 이들 항체의 존재를 검출하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, Caux et al. (1994) Ann Dermatol Venereol 121:537-542에서 설명된다. 일부 구체예에서, 악성 위축성 구진증은 피부 맥관구조(cutaneous vasculature) 내에서 IgA 침착과 연관될 수 있다. 이런 침착을 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Crowson et al. (2002), supra 참고).

추가적으로, 작업 실시예에서 설명된 바와 같이, 악성 위축성 구진증은 현저한 혈관 C5b-9 MAC 침착뿐만 아니라 상승된 혈청 C 반응성 단백질과 인자 VIII 수준과 연관될 수 있다. 이들 각 매개변수를 검출하는 방법은 본 발명에서 구현된다.

일부 구체예에서, 조성물은 악성 위축성 구진증의 양성 형태의 전신성 다장기 형태로의 진행을 예방하기 위해 예방적으로 개체에 투여될 수 있다. 가령, 악성 위축성 구진증의 피부 형태를 갖는 개체는 환자에서 악성 위축성 구진증의 치명적인 전신 형태의 발생을 예방하거나 발생의 가능성을 낮추기 위해 본 명세서에서 설명된 조성물이 투여될 수 있다. 유사하게는, 악성 위축성 구진증-연관된 B19 파보바이러스 감염, HIV 감염, 또는 자가면역 질환을 갖는 개체는 환자에서 악성 위축성 구진증의 발생을 예방하거나 발생의 가능성을 낮추기 위해 본 명세서에서 설명된 조성물이 투여될 수 있다.

용어 "예방하는"은 널리 인정되고, 그리고 장애와 관련하여 사용될 때, 당업계에서 충분히 이해되고, 그리고 조성물이 제공되지 않은 개체에 비하여 개체에서 의학적 장애의 빈도를 감소시키거나, 또는 의학적 장애의 증상의 발생을 지연시키는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 악성 위축성 구진증의 예방은 예를 들어, 통계학적으로 및/또는 임상적으로 유의한 양으로, 치료되지 않은 대조 집단에 비하여 예방적 처치를 받은 환자 집단에서 악성 위축성 구진증의 양성 형태의 전신성 다장기 형태로의 진행을 늦추고, 및/또는 치료되지 않은 대조 집단에 비하여 치료된 집단에서 하나 이상의 증상의 심각도를 감소시키고 및/또는 이들의 발생을 지연시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및/또는 인터페론 알파의 억제제를 단일요법으로 개체에 투여할 수 있다. 대안으로, 상기에서 설명한 것과 같이, 억제제는 다른 치료, 예를 들면, 악성 위축성 구진증을 위한 다른 치료와 복합 요법으로 개체로 투여될 수 있다. 가령, 복합 요법은 개체(가령, 인간 환자)에게, 악성 위축성 구진증을 가지는, 또는 발생 위험에 처한 개체에게 치료 효과를 제공하는 하나 이상의 추가적인 물질(가령, 항-응혈제 또는 소염제)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체) 또는 인터페론 알파의 억제제 및 하나 이상의 추가적인 활성제는 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 억제제가 먼저 투여되고, 하나 이상의 추가적인 활성제가 두 번째로 투여된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가적인 활성제가 먼저 투여되고, 억제제가 두 번째로 투여된다.

인간 보체의 억제제 또는 인터페론 알파의 억제제는 기존의 또는 현재 투여된 요법을 대체 또는 보강할 수 있다. 가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 처리할 때, 하나 이상의 추가적인 활성제의 투여는 더 낮은 수준으로 투여되거나 투여를 중단시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 기존 요법의 투여가 지속될 수 있다. 일부 구체예에서, 기존 요법은 인간 보체의 억제제(가령, 항-C5 항체) 또는 인터페론 알파의 억제제의 수준이 치료 효과를 제공하는데 충분한 수준이 될 때까지 유지될 수 있다. 두 가지 치료가 병용하여 투여될 수 있다.

악성 위축성 구진증의 개선에 대해 개체(가령, 인간 환자)를 모니터링하는 것은 질환 매개변수의 변화, 예를 들면, 질환의 하나 이상의 증상의 개선에 대해 개체를 평가하는 것이다. 가령, 의료 전문가는 본 명세서에서 설명된 보체 억제제를 이용한 치료 전후에 혈관 C5b-9 MAC 침착의 정도를 조사할 수 있다. 이러한 증상은 본 명세서에서 설명되는 악성 위축성 구진증의 임의의 증상을 포함한다. 일부 구체예에서, 평가는 투여 후 최소한 1시간, 예를 들면, 최소한 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 또는 48 시간, 또는 최소한 1일, 2일, 4일, 10일, 13일, 20일 이상 또는 최소한 1 주, 2 주, 4 주, 10 주, 13 주, 20 주 이상 동안 실행된다. 개체는 다음의 하나 이상의 기간에 평가된다: 치료 시작 전; 치료 동안; 하나 이상의 치료 요소들이 투여된 후. 평가는 추가 치료의 필요 여부를 평가하는 것을 포함할 수 있는데, 가령, 1회 투여량, 투여 빈도, 치료 기간을 변경해야 할 지의 판단을 포함할 수 있다. 또한, 선택된 치료 양식을 추가 또는 누락이 필요할 지에 대한 판단, 예를 들면, 본 명세서에서 설명되는 악성 위축성 구진증의 치료를 추가 또는 누락할 지를 판단하는 것을 포함할 수 있다.

생체외 접근법. 인간 보체의 억제제 또는 인터페론 알파의 억제제가 폴리펩티드(가령, 항체) 또는 핵산(가령, siRNA 또는 안티센스 핵산)인 경우에, 악성 위축성 구진증을 치료하거나 예방하기 위한 생체외 전략은 개체로부터 수득된 하나 이상의 세포를, 상기 단백질 또는 핵산을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 형질도입하는 것을 수반할 수 있다. 가령, 세포는 항-C5 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 단일 벡터로 형질감염될 수 있거나, 또는 세포는 항체의 중쇄를 인코딩하는 제 1 벡터와 항체의 경쇄를 인코딩하는 제 2 벡터로 형질감염될 수 있다.

형질감염된 또는 형질전환된 세포는 그 다음 개체로 되돌려보낸다. 세포는 다양한 유형의 세포, 예를 들면, 조혈 세포 (가령, 골수 세포, 대식세포, 단핵세포, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포, 케라틴세포, 또는 근육 세포를 포함하는 이에 한정되지 않는다. 이러한 세포는 개체에서 생존하기만 하면, 보체 억제제(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-C5 siRNA) 또는 인터페론 알파의 억제제의 공급원(가령, 지속적인 또는 주기적 공급원)으로 작용할 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터 및/또는 세포는 항체의 유도성 또는 억제성 발현을 위해 설정될 수 있다(가령, Schockett et al . (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 5173-5176 및 미국 특허 제7,056,897호).

바람직하게는, 세포는 개체(자가)로부터 수득되지만, 개체 이외의 동일 종(동종이계)의 개체로부터 수득할 수도 있다.

개체로부터 세포를 수득하고, 세포를 형질도입 또는 감염시키는 적합한 방법들은 분자 생물학 기술분야에 공지되어 있다. 가령, 형질도입 단계는 인산칼슘염, 리포펙틴, 전기천공, 바이러스 감염 (상기 참고), 및 유전자폭격(biolistic) 유전자 전달을 포함한 생체외 유전자 요법에 이용되는 임의의 표준 수단에 의해 실행될 수 있다(가령, Sambrook et al . ( supra ) 및 Ausubel et al . (1992) “ Current Protocols in Molecular Biology ,” Greene Publishing Associates .). 대안으로, 리포좀 또는 폴리머 미소입자들이 이용될 수 있다. 가령, 코딩 서열의 발현 또는 약물 저항성 유전자의 발현을 위하여 성공적으로 형질전환된 세포가 선택될 것이다.

키트

본 발명은 또한, 제조 물품 또는 키트를 특징으로 하고, 이들은 라벨이 달린 용기; 그리고 하나 이상(가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상)의 인간 보체 억제제(들)(가령, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및/또는 하나 이상(가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상)의 인터페론 알파 억제제(가령, 항-인터페론 알파 항체)를 내포하는 조성물을 포함한다. 라벨은 조성물이 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 개체(가령, 인간)에게 투여된다는 것을 나타낸다. 키트는 임의적으로, 조성물을 개체에게 투여하는 수단을 포함할 수 있다. 가령, 키트는 하나 이상의 주사기를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 키트는 2개 이상(가령, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상)의 상이한 유형의 인간 보체 억제제를 포함할 수 있다. 가령, 키트는 항-C5 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 및 인간 C5 단백질을 인코딩하는 mRNA에 결합하는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 항-C5 항체, siRNA, 그리고 보체의 소분자 억제제를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 키트는 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 임의의 하나 이상의 추가적인 활성제를 더욱 포함할 수 있다. 가령, 키트는 하나 이상의 항응혈제, 항혈전제, 또는 소염제를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 하나 이상의 B 세포-표적화된 치료제, 예를 들면, 항-CD20 항체를 포함할 수 있다. 키트는 임의적으로, 항-카이디올리핀 항체, 루푸스 항응혈제, 항인지질 항체, 및/또는 혈관 IgA 침착의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 수단을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위함이며 이에 한정시키고자 하는 의도는 없다.

실시예

실시예 1. 재료와 방법

일과적인 광 검경. 파라핀 포매되고 포르말린 고정된 조직의 5-마이크론 두께 박편은 헤마톡실린과 에오신으로 염색되고 전통적인 광 검경에 의해 조사되었다.

MxA 의 면역조직학적 평가. MxA 단백질을 검출하는데 이용하기 위한 슬라이드는 Tissue Tek Slide Holder 및 염색 접시(Miles, Elkhart, IL)에 배치되고 200 ㎖의 EDTA 완충액, pH 8.0(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)에 가라앉혀졌다. 일차 항체와 함께 30-분 배양 이후에, 프로토콜을 고수하는 상업적으로 가용한 Vision BioSystems Define Kit를 이용하여 염색이 수행되었다. 일차 항체와 함께 배양은 하기 희석도를 이용하여 수행되었다: 항-MxA 항체 1:1600. 반-정량적 평가(semi-qualitative assessment)가 특정 마커에 대해 염색된 세포의 근사한 백분율에 기초된 염색의 정도, 그리고 슬라이드 전역에서 염색의 분포에 관하여 실시되었다. 슬라이드는 Consul 자동 봉입기(cover-slipper)(ThermoShandon, Pittsburgh, PA)에서 Shandon Consul?-Mount Histology (Product No. 9990440) 시스템을 이용하여 커버-슬립(cover-slip)되었다. Magro et al. (2009) J Cutan Pathol (11월 4일, 인쇄물에 앞서 전자 공개; PMID: 19891658)를 참고한다.

조직에서 면역형광 연구. 하기 면역형광 연구(Crowson and Magro (1996) Human Pathol 27:15-19에서 설명된 바와 같이)는 Michael의 수송 배지(transport medium)에서 획득되고 -30℃에서 차후 보관된 피부 생검 재료에서 실행되었다. 면역글로불린 G(IgG), IgA, IgM, 피브린, 그리고 보체 성분 C3(DAKO, Carpinteria, CA, USA)에 대한 직접적인 면역형광(DIF) 연구는 개별 생검 박편에서 플루오레세인-접합된 일차 항체의 오버레이(overlay)에 의해 병소 피부에서 실행되었다. 플루오레세인-접합된 토끼 항-마우스 항체로 간접적인 면역형광(IF) 방법은 생검 박편에 초기에 접촉된 일차 항-C5b-9 항체에 이의 결합에 의해, C5b-9 MAC(DAKO)의 존재를 검출하는데 이용되었다.

전자 검경. 피부 생검 조직은 초미세구조 검사(ultrastructural examination)를 위해 글루타르알데히드 정착액에 배치되었다.

간접적인 면역형광과 웨스턴 블롯 연구를 위한 세포 배양. 신생아 인간 피부 혈액 미세혈관 내피 세포, HMVEC-dBlNeo(Lonza, Walkersville, MD)는 완전 배지(EGM?-2 MV BulletKit? 시약 및 5% Premium FBS로? 보충된 EGM?-2 Basal Medium)(Lonza)에서 5% CO₂와 37℃에서 배양되었다. 이들 세포는 배양 플라스크에서 75% 내지 80% 합류도(confluency)에 도달할 만큼 충분한 시간 동안 배양되었다. 이들 세포는 이후, 가온된 인산염-완충된 염수(PBS)로 세척되고 1X 트립신-EDTA 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 수확되었다. PBS로 추가 세척후, 세포는 조직 배양 챔버 슬라이드 위에서 미리 가온된 완전 배지(Nunc Lab-Tek™ Chamber Slide 시스템, Permanox™에서 2개 웰, Sigma-Aldrich)에 2 x 10⁴개 세포/㎖의 밀도로 재-도말되었다. 챔버 슬라이드는 5% CO₂와 37℃에서 24시간 동안 배양되고, 그 이후 배지가 폐기되었다. 배지의 제거 이후에, 각 챔버의 슬라이드는 이동되고, PBS에서 헹굼되고, 그리고 이후, 과잉의 PBS를 빨아들이기 위한 종이 수건과 함께 자연 건조되었다. 건조된 슬라이드는 이후, 면역형광 검경을 이용하여 조사될 때까지, 밀폐 용기 내에 -80℃에서 보관되었다.

웨스턴 블롯 연구. 배양된 HMVEC-dBlNeo 세포는 0.05M 나트륨 플루오르화물, 1% Triton X-100, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오르화물, 그리고 1:200 희석된 Calbiochem 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)로 구성되는 용해 완충액을 이용하여, 4℃에서 30분 동안 비정기적 와동으로 용해되었다. 용해물은 이후, 마이크로원심분리(microcentrifugation)에 의해 핵 및 기타 불용성 물질이 제거되었다. 그 다음, β-메르캅토에탄올(5% 최종 농도)을 내포하는 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 적하 완충액(loading buffer)이 2분 동안 끓임에 앞서, 세포 용해물(용해물 내로 5X 적하 완충액의 1:4 희석)에 첨가되었다. 용해물은 이후, 8% 내지 16% 구배 Tris-HCl SDS-PAGE 겔(BioRad, Hercules, CA)을 통한 전기영동에 의해 분해되고 Whatman Protran™ 니트로셀룰로오스 막(Sigma-Aldrich)으로 이전되었다. 막은 오비탈 쉐이커 위에서 0.1% Tween-20을 갖는 Tris-완충된 염수(TBS-T)에서 3% 탈지유(non-fat milk)의 차단 용액(blocking solution)과 함께 실온에서 6시간 동안 배양되고, 그리고 이후, Miniblotter 25 블롯팅 매니폴드(blotting manifold)(Immunetics, Cambridge, MA) 내로 적합되었다. 미니블롯터(miniblotter) 웰은 0.2% 소 혈청 알부민을 내포하는 TBS-T에서 1:250 희석된 환자 또는 건강한 대조 혈청으로 채워지고, 그리고 미니블롯터는 오비탈 쉐이커에서 4℃에서 하룻밤동안 부드럽게 진동되었다. 이후, 혈청은 제거되고, 웰은 TBS-T로 2회 세척되고, 그리고 막은 장치로부터 이동되었다. TBS-T로 추가의 광범위한 세척 이후에, 이들 막은 1:20,000 희석된 양고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-인간 Ig(중쇄와 경쇄) 이차 항체(SouthernBiotech, Birmingham, AL)로 실온에서 2시간 동안 염색되었다. TBS-T로 막의 광범위한 세척후, 항체 복합체는 Supersignal? West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific, Rockford, IL)를 이용하여 검출되었는데, 화학발광 띠가 HyBlot CL™ 방사능 사진 촬영(autoradiography) 필름(Denville Scientific, Inc., Metuchen, NJ)에서 가시화되었다.

항-내피 세포 항체의 존재를 검출하기 위한 간접적인 면역형광 연구. 혈청 샘플은 1:100의 희석 인자(dilution factor)로 희석되고 인간 피부 내피 세포와 함께 배양되었다. 항체 결합은 플루오레세인-접합된 염소 항-인간 IgG(PBS에서 1:100 희석됨; Caltag, Burlingame, CA)를 이용하여 검출되었다. 형광-항체 복합체는 Olympus 현미경을 이용하여 가시화되고, 그리고 이미지는 디지털 카메라로 기록되었다.

실시예 2. 결과

임상적 전력. 2년 기간에 걸쳐, 43세의 이전에 건강했던 한 남성에서 결국 함몰된 백색 흉터가 되는 부풀어 오른 구진 병소로 최초 정의되는, 증상이 없는 작은 피부 병소가 발생하였다. 2009년 7월 23일자에, 상기 환자는 심각한 복통과 녹색을 띠는 구토를 동반한 3일간의 간헐적인 낮은 등급 열병으로 응급실에 입원하였다. 예비 개복수술이 실행되었다 - 장의 작은 조각이 이동되었다. 피부와 장 표본 둘 모두 악성 위축성 구진증과 연관된 고전적인 변화를 보였다. 항카이디올리핀 항체, 항-베타 2 당단백질 항체, 또는 루푸스 항응혈제는 전혀 검출되지 않았다. 추가의 실험실 검사는 비정상적으로 상승된 혈청 인자 VIII 수준(정상에 비하여 199 초과), 상승된 von Willebrand 인자 (VWF) 수준(정상에 비하여 217 초과), 그리고 증가된 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 수준을 확증하였다. 보체 성분 단백질 C2, C3과 C4는 정상 수준 내에 있는 것으로 결정되는 반면, C5 수준은 상승되었다.

기흉(pneumothorax)을 경감시키기 위해, 상기 환자에서 흉막 천자(thoracocentesis)가 실행되었다. 상기 환자는 일일 490 mg에서 정맥내 감마 글로불린 및 Lovenox?로 시작되었다. 2009년 8월 12일자에 추적 방문 동안, 상기 환자는 지속적 복통에 기인한 감소된 식욕으로 인하여 체중이 15 파운드 감소하였다. 상기 환자의 호흡 검사는 양측 기저 영역(bibasilar region)에서 감소된 호흡음(breath sound)을 증명하였다. 상기 환자의 C 반응성 단백질, VWF, 그리고 VEGF 수준은 각각, 6.51, 177, 그리고 971에서 상승된 상태로 남아있었다. IVIG의 4회 치료후, 비록 상기 환자가 여전히 복통으로 고통받긴 했지만, 환자의 피부 병소에서 약간의 향상이 나타났다. 2009년 10월에, 상기 환자는 흉통 및 숨가쁨이 발생하였고, 이로 인하여 병원에 입원해야 했다. 상기 환자는 혈류역학적으로 대상 부전(decompensation)이 빠르게 발생하여 중환자실(medical intensive care unit)에 배치되었다. 상기 환자는 큰 심막(pericardial)과 흉막(pleural) 삼출액과 연관된 14%의 박출계수(ejection fraction)를 갖는 것으로 관찰되었다. 심막 생검이 획득되었고, 이것은 악성 위축성 구진증과 일치하는 심각한 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy)을 확증하였다. 혈관 C5b-9 침착 역시 관찰되었다. 이후, 에쿨리주맙이 상기 환자에 환자 투여되었다. 환자의 상태에서 거의 즉각적인 향상이 발생하였다. 가령, 환자의 박출 계수가 극적으로 향상되었다. 에쿨리주맙 투여후 24시간 이내에, 상기 환자는 관상기관(管狀器官)이 제거되고 내과 병동으로 옮겨졌다. 다음 수주에 걸쳐, 상기 환자는 증상적으로 호전되었고, 그리고 피부 병소의 외관에서 객관적인 향상이 나타났다.

병리. 3가지 세트의 피부 생검이 상기 환자로부터 획득되었다. 이들 생검이 수행되는 시점은 치료 개입(treatment intervention)에서 변동과 시간적으로 연관되었다. 첫 번째 세트는 환자에 IVIG 또는 에쿨리주맙의 투여에 앞서 상기 환자로부터 획득되고 피부 병소의 2가지 진화적 단계(evolutionary phase)를 포함하였다. 한 생검은 두드러진 간엽(mesenchymal) 점액소 침착을 드러내는 부풀어 오른 구진 병소로부터 유래되었는데, 이러한 형태학적 발견은 2년 전에 종창성 홍반성 루푸스(tumid lupus erythematosus)의 초기 오진단을 유발하였다. 맥관구조(vasculature)의 검사는 내피 세포 팽창, 괴사, 그리고 병소 막과 내강 피브린 침착으로 이탈을 비롯한 비정상을 노출시켰다. 고전적인 악성 위축성 구진증 연관된 도자기화 함몰된 구진 상처의 생검은 혈관 드롭 아웃(drop out)과 함께, 현저한 표피 얇아짐 및 피부 섬유증(dermal fibrosis)을 나타냈다. 이들 혈관은 내피 세포 변성/괴사 및 혈관 내강 내로 내피 세포 딱지형성(sloughing)과 함께, 광범위한 폐쇄성 혈전성 미세혈관병증(occlusive thrombotic microangiopathy)을 나타냈다. 모든 생검은 염증 세포의 결핍을 노출시켰다. 장 표본은 점막하 조직(submucosa)의 더욱 큰 직경 동맥에 영향을 주는 광범위한 말소성 맥관장애(obliterative vasculopathy)를 보였다.

IVIG를 시작하고 수주후, 다른 피부 생검이 획득되었는데, 이의 분석은 점액소, 섬유증 및 상피 얇아짐을 비롯한 계속적인 피부 허혈성 변화(ischemic change)를 노출시켰다. 하지만, 활성 혈관 손상의 정도에서 감소가 나타났다. 유의미한 내강과 벽 피브린 침착을 내포하는 혈관은 관찰되지 않았다.

추가 세트의 생검(세 번째 세트)는 에쿨리주맙 투여후 2주 시점에 상기 환자로부터 획득되었다. 생검된 조직의 분석은 혈관 드롭 아웃과 함께 표면 섬유증식증(superficial fibroplasias)을 노출시켰다. 이들 혈관은 두꺼워졌는데, 이것은 기저막 지구 배증(basement membrane zone reduplication)을 반영하였다. 극히 드문 혈관만 내피 세포 손상과 혈전증을 보였다.

조직 샘플에서 인터페론 알파 평가. 내피 세포, 염증 세포, 그리고 표피 케라틴생성세포(keratinocyte)에서 MxA 단백질의 광범위한 발현이 나타났다.

C5b -9 면역형광 연구. 간접적인 면역형광 연구는 IVIG 및/또는 에쿨리주맙을 시작하기에 앞서, 첫 번째 세트의 생검의 피부 맥관구조 내에서 C5b-9의 광범위한 침착물을 드러냈다. 침착 패턴은 내강내와 벽 둘 모두 이었다. 침착의 정도는 진피 전역의 여러 혈관에서 매우 현저하였다. 비록 IVIG가 C5b-9 침착을 어느 정도 감소시키긴 하지만, 에쿨리주맙 요법 이후에 상기 환자로부터 획득된 생검에서 관찰된 C5b-9 침착의 정도는 현저하게 감소하였다. 단지 3개의 혈관만 벽 C5b-9 침착을 보였다.

전자 검경. 처리전 획득된 생검된 조직의 초미세구조 분석은 표피 케라틴생성세포에서 및 진피 전역의 내피 세포에서 광범위한 관상 그물모양 구조를 증명하였다. 내층 내피 세포는 혈관 내강으로부터 세포의 이탈로 심한 퇴행성 변화를 보였다. 혈관 기저막 지구는 배증되고, 또한 콜라겐 침착에 의해 증명되었다.

항내피 세포 항체 검사. 에쿨리주맙 치료 이전에 획득된 환자 혈청, 그리고 에쿨리주맙 치료후 2주 시점에 획득된 혈청은 피부 내피 세포 및 플루오레세인-접합된 인간 항-IgG 항체와 함께 배양되었다. 과립상 핵 데코레이션(granular nuclear decoration)이 에쿨리주맙-처리전과 치료후 샘플 내에 대부분의 내피 세포에서 관찰되었다. 환자 혈청이 인간 탯줄 정맥(umbilical vein) 내피 세포에 접촉될 때, 염색은 전혀 관찰되지 않았다.

내피 세포 용해물을 이용한 웨스턴 블롯 연구. 치료전과 치료후 환자 혈청은 또한, 환자 혈청 내에 인간-항-인간 항체가 결합하는 단백질 또는 단백질들을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석에 이용되었다. 앞서 설명된 바와 같이, 치료전과 치료후 혈청은 크기-분해된 내피 세포 단백질을 내포하는 막과 함께 배양되고, 그리고 막의 단백질에 항체의 결합은 플루오레세인-접합된 이차 항체로 검출되었다. 92 kDa의 분자량에 상응하는 면역반응성(immunoreactivity)의 분명한 띠가 관찰되었다. 정상적인 대조 사례에서 또는 인간 탯줄 정맥 내피 세포의 용해물의 웨스턴 블롯에서 반응성의 유사한 띠가 확인되지 않았다.

혈청 인터페론 알파 수준의 평가. 환자의 말초혈에서 인터페론 알파 수준은 매우 높았다 - 20.56으로 측정, 이것은 홍반성 루푸스를 갖는 환자에 필적하고, 그리고 건강한 환자로부터 혈액 내에 인터페론 알파 수준보다 수배 높았다.

고찰. 본 명세서에서 설명된 환자는 심한 내피 세포 손상에 기인한, 다병소 장내, 심막, 심근과 피부 허혈이 발생하였다. 상기 환자의 증상은 악성 위축성 구진증과 일치하였다. 피부 내피 세포를 기질로서 이용하여, 간접적인 면역형광 및 웨스턴 블롯 기술에 의해 항-내피 세포 항체가 증명되었다. 우세한 항원성 에피토프는 비록 그 정체가 분명하진 않지만, 웨스턴 블롯 분석에 기초하여 분리되었다. 이들 항-내피 세포 항체가 인간 탯줄 정맥 세포와 반응하지 않는다는 조사 결과에 비추어, 아마도 상기 환자에서 관찰된 항-내피 세포 항체는 장기 선택성(organ selective)이고, 따라서 선택된 내피 세포 기초된 에피토프에 대한 면역원성(immunogenicity)은 부위 의존성(site dependent)인 것으로 생각된다.

본 명세서에서 설명된 연구 결과는 에쿨리주맙으로 치료된 악성 위축성 구진증 환자에서 개연적 작동자 기전으로서 보체-매개된 내피 손상을 암시한다. 상기 약물의 투여에 극적이고 객관적인 임상적 및 병리학적 반응이 나타났다.

인터페론 알파 발현은 상기 환자의 혈청에서뿐만 아니라 그의 조직 내에서 현저하게 증가하였다. 인터페론 알파는 적응 면역과 선천 면역을 상향조절하여 임의의 항원성 유인(antigenic trigger)의 효과를 강화시키는 것으로 알려져 있다. 외인성 인터페론 알파의 투여는 피부 혈전증과 궤양화의 원인으로서 보고되었다. 말초혈 내에서 상기 환자의 인터페론 알파 서명(interferon alpha signature)은 비록 그가 전신성 홍반성 루푸스의 특정한 임상적 특징을 나타내진 않았지만, SLE 환자에서 관찰된 것과 현저하게 유사하였다. 본 명세서에서 설명된 조사 결과는 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에서 인터페론 알파의 억제가 상기 질환을 치료하는데 유용할 수 있다는 결론을 뒷받침한다.

결론적으로, 에쿨리주맙은 만약 그렇지 않으면 치명적인 악성 위축성 구진증을 치료하는 중요한 치료 양식(therapeutic modality)을 규정한다. 보체 캐스케이드 서열의 활성화에 대한 정확한 유인은 불명확하다. 고전적인 보체 캐스케이드 서열의 활성화를 촉발하는 항-내피 세포 항체(가령, 내피 세포 상에 존재하는 92 kDa 항원에 결합하는 자기항체)가 C5b-9 침착의 원인이 될 수도 있지만, 조직 손상의 자연 과정에서 에피토프 확산(epitope spreading)의 역할은 이들 항체의 직접적인 인과 효과(causal effect)를 확립하는 것을 배제시킨다. 그럼에도 불구하고, 환자의 임상 경과(clinical course)의 일부 시점에서, 이들 항체의 생산을 감소시키는 추가의 B 세포 표적화된 치료제는 만약 이들 자기항체가 존속한다면, 악성 위축성 구진증의 치료에 유용할 것이다.

본 발명이 특정 구체예를 참고하여 설명되지만, 당업자는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 다양한 변화가 있을 수 있으며 등가물로 대체될 수 있음을 인지할 것이다. 추가적으로, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞게 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계를 개작하는 많은 변형이 있을 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC. <120> Methods and Compositions for Treating Degos' Disease <130> ALXN-153-WO1 <140> <141> <150> 61/309,393 <151> 2010-03-01 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1676 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr 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Ser Val 100 105 110 Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Gln Glu 115 120 125 Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala Glu 130 135 140 Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu Thr 145 150 155 160 Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys Gln 165 170 175 Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser Tyr 180 185 190 Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser 195 200 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys Thr Leu Leu 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro Glu Ser 20 25 30 <210> 10 <211> 325 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys Thr Leu Leu 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro Glu Ser Trp Leu 20 25 30 Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu Gln Phe Ala Leu 35 40 45 Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln Gly Ile Gly Ile Ser Asn 50 55 60 Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys Ala Lys Val Phe Lys Asp 65 70 75 80 Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Val Val Arg Gly Glu Gln 85 90 95 Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Thr Ser Gly Met Gln 100 105 110 Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly Ile Cys Thr Ser Glu Ser 115 120 125 Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Val Arg Gln 130 135 140 Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val Thr Phe Thr Val Leu Pro 145 150 155 160 Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe Ser Leu Glu Thr Trp Phe 165 170 175 Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg Val Val Pro Glu Gly Val 180 185 190 Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr 195 200 205 Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg Ile Pro Leu Asp 210 215 220 Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile Leu Ser Val Lys Gly Leu 225 230 235 240 Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Gln Glu Gly Ile Asn 245 250 255 Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala Glu Leu Met Ser 260 265 270 Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His 275 280 285 Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys 290 295 300 Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala 305 310 315 320 Asp Tyr Ser Tyr Ser 325 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 15 Arg Ala Ala Arg 20 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu 1 5 10 15 Gln Arg <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val Asn Asn Asp Glu Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg 1 5 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 15 Arg Ala Ala <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 15 Arg Ala <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 15 Arg <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 10 15 Ala Ala Arg <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 10 15 Ala Arg <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 10 15 Ala Ala Arg <210> 26 <211> 925 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Leu His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser 1 5 10 15 Tyr Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg 20 25 30 Lys Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile 35 40 45 Gln Gly Ile Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr 65 70 75 80 Ser Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn 85 90 95 Tyr Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu 100 105 110 Gly Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Ser Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu 130 135 140 Val Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn 145 150 155 160 Phe Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu 165 170 175 Arg Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr 180 185 190 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe 195 200 205 Pro Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg 210 215 220 Ile Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val 225 230 235 240 Leu Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser 245 250 255 Ala Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 260 265 270 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu 275 280 285 Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser 290 295 300 Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly 305 310 315 320 Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly 325 330 335 Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser 340 345 350 Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys 355 360 365 Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val 370 375 380 Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly 385 390 395 400 Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala 405 410 415 Leu Ile Lys Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln 420 425 430 Ser Thr Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp 435 440 445 Lys Thr His Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu 450 455 460 Ala Leu Val Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn 465 470 475 480 Leu Gln His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met 485 490 495 Val Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 500 505 510 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg 515 520 525 Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu 530 535 540 Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met 545 550 555 560 Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys 565 570 575 Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn 580 585 590 Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val 595 600 605 His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys 610 615 620 Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr 625 630 635 640 Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser 645 650 655 Tyr Lys Pro Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val 660 665 670 Met Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu 675 680 685 Lys Ala Leu Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile 690 695 700 Lys Asp Gly His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp 705 710 715 720 Phe Leu Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe 725 730 735 Leu Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys 740 745 750 Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val 755 760 765 Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met 770 775 780 Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr 785 790 795 800 Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser 805 810 815 Ile Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp 820 825 830 Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr 835 840 845 Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg 850 855 860 Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe 865 870 875 880 Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr 885 890 895 Trp Pro Arg Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn 900 905 910 Leu Asp Glu Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 915 920 925 Attorney Docket No.: ALXN-153-001 1

Claims (52)

1. 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 보체 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 환자에서 보체 활성의 감소된 수준을 유지시키는데 충분한 빈도와 양으로 보체 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 장기적으로 투여하여 상기 질환을 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   환자를 악성 위축성 구진증을 앓거나, 또는 악성 위축성 구진증을 앓을 가능성이 높은 것으로 확인하는 단계; 그리고
   상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 보체 억제제를 환자에 투여하는 단계.
4. 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 B19 파로바이러스 감염 또는 인간 면역결핍 바이러스 감염과 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 특발성인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 위장관에 병리학적으로 영향을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 중추신경계에 병리학적으로 영향을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 심혈관계에 병리학적으로 영향을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 1 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 다장기, 전신성 악성 위축성 구진증인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 소염제, 항응혈제, 항혈전제, 그리고 정맥내 면역글로불린으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 가지 요법에 불응성인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 소염제는 코르티코스테로이드, 페닐부타존, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 그리고, 미코페놀레이트 모페틸로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 항응혈제 또는 항혈전제는 클로피도그렐, 아스피린, 그리고 디피리다몰로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 1 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 보체 억제제는 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 핵산, 핵산 유사체, 그리고 소분자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 보체 억제제는 가용성 CR1, LEX-CR1, MCP, DAF, CD59, 인자 H, 코브라 독액 인자, FUT-175, 컴플레스타틴, 그리고 K76 COOH로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 1 내지 14중 어느 한 항에 있어서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 1 내지 14중 어느 한 항에 있어서, 보체 억제제는 보체 성분 C1s 또는 보체 성분 C1r의 활성화 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 1 내지 14중 어느 한 항에 있어서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 C5, C4, C3, 또는 C2의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 보체 억제제는 보체 성분 C5의 단편 C5a와 C5b로의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 1 내지 13 또는 15 내지 18중 어느 한 항에 있어서, 보체 억제제는 인간 보체 성분 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 항체는 보체 성분 C5 단백질의 알파 쇄에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 항체는 인간 보체 성분 C5의 알파 쇄에 결합하고, 그리고 여기서 항체는 (i) 인간 체액에서 보체 활성화를 억제하고, (ii) 인간 보체 성분 C3b 또는 인간 보체 성분 C4b에 정제된 인간 보체 성분 C5의 결합을 억제하고, 그리고 (iii) 인간 보체 활성화 산물 없는 C5a에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 항체는 서열 번호:1-26 중에서 임의의 한 가지에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 청구항 13에 있어서, 폴리펩티드는 보체 성분 C5 단편 C5b에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 청구항 19 내지 24중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 청구항 19 내지 25중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된 항체, 재조합 항체, 디아바디, 키메라화된 또는 키메라 항체, 탈면역화된 인간 항체, 완전한 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 그리고 F(ab')₂ 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 청구항 1 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 억제제는 에쿨리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 청구항 1 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 억제제는 펙셀리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 하기를 포함하는 제조 물품:
    라벨을 포함하는 용기; 그리고
    보체 억제제를 포함하는 조성물, 여기서 라벨은 조성물이 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 인간에게 투여된다는 것을 나타낸다.
30. 청구항 29에 있어서, 억제제는 인간 보체 성분 C5 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 제조 물품.
31. 청구항 29 또는 30에 있어서, 억제제는 인간 보체 성분 C5 단백질의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 제조 물품.
32. 청구항 31에 있어서, 인간 보체 성분 C5 단백질의 단편은 C5a 또는 C5b인 것을 특징으로 하는 제조 물품.
33. 청구항 29 내지 32중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 활성제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 물품.
34. 청구항 33에 있어서, 하나 이상의 추가적인 활성제는 소염제, 항응혈제, 그리고 항혈전제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 물품.
35. 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 인터페론 알파의 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 악성 위축성 구진증을 앓는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 환자에서 인터페론 알파 발현 또는 활성의 감소된 수준을 유지시키는데 충분한 빈도와 양으로 인터페론 알파의 억제제를 악성 위축성 구진증을 앓는 환자에 장기적으로 투여하여 상기 질환을 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    발현 또는 활성 환자에서 to thereby treat the disease.
37. 악성 위축성 구진증을 치료하는 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    환자를 악성 위축성 구진증을 앓거나, 또는 악성 위축성 구진증을 앓을 가능성이 높은 것으로 확인하는 단계; 그리고
    상기 질환을 치료하는데 충분한 양으로 인터페론 알파의 억제제를 환자에 투여하는 단계.
38. 청구항 35 내지 37중 어느 한 항에 있어서, 악성 위축성 구진증은 악성 위축성 구진증의 다장기, 전신성 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
39. 청구항 35 내지 38중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 폴리펩티드, 폴리펩티드 유사체, 핵산, 핵산 유사체, 그리고 소분자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 청구항 35 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 세포에 의한 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 청구항 35 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 또는 인터페론 알파 수용체의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 청구항 35 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 청구항 42에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 청구항 35 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 청구항 44에 있어서, 인터페론 알파의 억제제는 인터페론 알파 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 청구항 43 또는 45에 있어서, 항체는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 청구항 46에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된 항체, 재조합 항체, 디아바디, 키메라화된 또는 키메라 항체, 탈면역화된 인간 항체, 완전한 인간 항체, 단일 쇄 항체, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 그리고 F(ab')₂ 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 하기를 포함하는 제조 물품:
    라벨을 포함하는 용기; 그리고
    인터페론 알파의 억제제를 포함하는 조성물, 여기서 라벨은 조성물이 악성 위축성 구진증을 가지는, 가지는 것으로 의심되는, 또는 발생 위험에 처한 인간에게 투여된다는 것을 나타낸다.
49. 청구항 48에 있어서, 억제제는 인터페론 알파에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 제조 물품.
50. 청구항 48에 있어서, 억제제는 인터페론 알파 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 것을 특징으로 하는 제조 물품.
51. 청구항 48 내지 50중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 활성제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 물품.
52. 청구항 51에 있어서, 하나 이상의 추가적인 활성제는 소염제, 항응혈제, 그리고 항혈전제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 물품.