UA114814C2 - ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E - Google Patents

ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E Download PDF

Info

Publication number
UA114814C2
UA114814C2 UAA201412476A UAA201412476A UA114814C2 UA 114814 C2 UA114814 C2 UA 114814C2 UA A201412476 A UAA201412476 A UA A201412476A UA A201412476 A UAA201412476 A UA A201412476A UA 114814 C2 UA114814 C2 UA 114814C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
gube
amino acid
cancer
sequence
Prior art date
Application number
UAA201412476A
Other languages
English (en)
Inventor
Пітер Чанг
Чіе Саканака
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Інк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA114814C2 publication Critical patent/UA114814C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла, яке зв’язується з Ly6E, виділеної нуклеїнової кислоти, що його кодує, клітини-хазяїна, способу одержання даного антитіла. Винахід також стосується імуноконюгата, який містить заявлене антитіло, фармацевтичного складу, способу лікування індивідуума з Ly6E-позитивною формою раку, способу інгібування проліферації в Ly6E-позитивній клітині, способу виявлення Ly6E людини в біологічному зразку та способу виявлення Ly6E-позитивної злоякісної пухлини.

Description

опис
Посилання на родинні заявки
Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США з серійним номером 61/649775, поданої 21 травня 2012 р., повний зміст якої включено в даний документ за допомогою посилання.
Область техніки
Даний винахід відноситься до антитіл й імунокон'югатів до І убЕ та способів їх застосування.
Рівень техніки
Комплекс 6 антигену лімфоцитів, локус Е (ГУбЕ), також відомий як індукований ретиноєвою кислотою ген Е (КІС-Е) й антиген 2 стовбурних клітин (ЗСА-2). Він являє собою пов'язаний з
СРІ, що становить у довжину 131 амінокислоту, розміром -- 8,4 кДа білок з невідомою функцією без яких-небудь відомих партнерів по зв'язуванню. Спочатку він був ідентифікований як транскрипт, що експресується у незрілому тимоциті, тимусних серцевинних епітеліальних клітинах у мишей. КІС-Е, людський гомолог сімейства Гу-6 миші, індукується ретиноєвою кислотою при диференціації клітини гострої промієлоцитарної лейкемії. Мао М., и М., Топа «.-
Н., Хе 9., 2пи 9., Ниапд О.-Н., Ри С, Ми Г., 2Нао 5.-У., Махтап 5., І апойе М., Мапа 2.-У., Тап 9.- 27., Спап 5.-У., Спеп 7. Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0.5.А. 93:5910-5914 (1996).
У даній області техніки існує необхідність у засобах, які націлено впливають на ГубЕ для діагностики та лікування пов'язаних з ГубЕ станів, таких як злоякісна пухлина. Даний винахід задовольняє цій потребі та забезпечує інші переваги.
Сутність винаходу
Даний винахід відноситься до антитіл, імунокон'югатів до ГубЕ та способів їх застосування.
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене виділене антитіло, що зв'язується з
ГУбЕ. Відповідно до інших варіантів здійснення антитіло, що зв'язується з І УубЕ, зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в БЕО ІЮ МО: 1. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло зв'язується з ГуУбЕ з афінністю х 4 НМ, виміряною за допомогою аналізу
Скетчарда. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло зв'язується з ГУбЕ з афінністю х 7 НМ, виміряною за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК).
Відповідно до ще одного варіанта здійснення таке антитіло застосовують як лікарський засіб.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, або зв'язується з І убЕ з афінністю х 7 нМ, виміряною за допомогою 5РК, являє собою моноклональне антитіло. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло являє собою людське, гуманізоване або химерне антитіло.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, і інтерналізується в експресуючі І убЕ клітини при зв'язуванні із зазначеним епітопом у межах амінокислот 21-131 в БЕО ІЮ МО: 1. Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІО МО: 1, зв'язується з
ГУбЕ з афінністю «х 7 нМ, виміряною за допомогою ЗРК, і інтерналізується в експресуючі ГубЕ клітини при зв'язуванні із зазначеним епітопом у межах амінокислот 21-131 в БЕО ІЮО МО: 1.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, або зв'язується з І убЕ з афінністю х 7 нМ, виміряною за допомогою 5РК, причому антитіло містить (а) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12, (б) НМВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 9, ї (с) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 11. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло містить (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 10, (5) НМЕ-
Н2г, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮ МО: 11, ї (с) НМК-НЗ, що містить
БО амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 12. Відповідно до ще одного варіанта здійснення описане вище антитіло додатково містить (а) НМВ-І11, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО: 7; (Б) НУВ-1І2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8; ї (с) НМК-І З, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 9. Відповідно до ще одного варіанта здійснення таке антитіло містить (а) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 7; (р) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8; ї (с) НМЕ-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, яке містить (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 10, (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 11, ї (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: бо 12, їі (4) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 10, (е) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 11, ії () НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12, додатково містить послідовність ЕМК2 каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга в ЗЕО ІЮ МО: 20, або ЕКЗ каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга в ЗЕО ІЮ МО: 21, або ЕК1 каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга або 5ЕО ІЮ МО: 23, або ЕРК2 каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга в 5ЕО ІЮ МО: 24.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, або зв'язується з ГубЕ з афінністю х 7 НМ, виміряною за допомогою 5РЕ, і містить (а) послідовність МН, що характеризується щонайменше 95595 ідентичністю послідовності стосовно амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 5; (Б) послідовність МІ, що характеризується щонайменше 9595 ідентичністю послідовності стосовно амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 3; або (с) послідовність МН, як в (а) і послідовність МІ, як в (б).
Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло містить послідовність МН 5ЕО ІЮ МО: 5.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення таке антитіло додатково містить послідовність МІ.
ЗЕОІЮ МО: 3.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, містить послідовність МН 5ЕО ІЮО МО: 5 і послідовність МІ ЗЕО ІЮО МО: 3.
Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 7 НМ, виміряною за допомогою
ЗРЕ, містить послідовність МН в 5ЕО ІЮО МО: 5, і послідовність МІ в 5ЕО ІЮО МО: 3.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО: 1, зв'язується з афінністю х 4 нМ, виміряною за допомогою аналізу Скетчарда, що являє собою Ідс1, дС2а або Іде2Б. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІО МО: 1, зв'язується з афінністю х 7 НМ, виміряною за допомогою 5РЕ, що являє собою Ідс1, ІЇдДо2а або
Ідсуер.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачені виділені нуклеїнові кислоти, що кодують описане в даному документі антитіло. Відповідно до іншого варіанта здійснення також передбачена клітина-хазяїн, що містить таку виділену нуклеїнову кислоту. Відповідно до ще одного варіанта здійснення також передбачений спосіб одержання антитіла, що включає культивування клітини-хазяїна, що містить описану в даному документі виділену нуклеїнову кислоту, у такий спосіб одержуючи антитіло.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачений імунокон'югат, що містить описане в даному документі антитіло та цитотоксичний засіб. Відповідно до іншого варіанта здійснення такий імунокон'югат характеризується формулою АБ-(І0)р, де: (а) АБ являє собою описане в даному документі антитіло, (Б) Ї являє собою лінкер; (с) ЮО являє собою лікарський засіб, вибраний з майтанзиноїду, ауристатину, каліхеаміцину, піролобензодіазепіну та похідної неморубіцину; і (4) р перебуває в межах від 1 до 8. Відповідно до деяких варіантів здійснення такий імунокон'югат містить як ОО ауристатин. Відповідно до інших варіантів здійснення, такий імунокон'югат містить О, що характеризується формулою Ок: во є) в' СНУ в?
Я Н и М М М М. дів 4 5 до о А А в во в 0 о де ВК? і КУ кожний являє собою метил, КЗ і КЕ" кожний являють собою ізопропіл, Б? являє собою Н, ВЕ" являє собою втор-бутил, кожний КЗ незалежно вибраний з СНз, О-СНз, ОН і Н; Б? являє собою Н і КЗ являє собою -С(Н8)2-С(В8)»2-арил.
Відповідно до інших варіантів здійснення описаний у даному документі імунокон'югат містить як свій лікарський засіб ММАЕ, що характеризується структурою: о Н он й чі М М
М те М о Ї о.о о. о
Відповідно до одного варіанта здійснення описаний у даному документі імунокон'югат містить О, що являє собою піролобензодіазепін, який характеризується:
Формулою А: ли до до | ов"
М . М шт х х - се р ро С М в! в! М А Кот. в вок о б вро Ге! д: де пунктирні лінії вказують на необов'язкову присутність подвійного зв'язку між С1 і С2 або
С2 і С3; 2 незалежно вибирають з Н, ОН, 50, СН, СМ, К, ОК, -СН-НО, -С(В8О)», О-502-8,
СО і СОР, і необов'язково додатково вибирають з галогену або дигалогену, причому ВК? незалежно вибирають з Е, СО2НВ, СОН, СНО, СОН і галогену; РУ і В? незалежно вибирають з Н,
В, ОН, ОВ, 5Н, 5Н, МН», МНА, МАН", МО», Мезоп і галогену; К7 незалежно вибирають з Н, К, ОН,
ОВ, 5, 5Н, МН, МНА, МАН", МО», Меззп і галогену; О незалежно вибирають з О, 5 і МН; В" являє собою або Н, або ЕК, або, де О являє собою О, 5ОзМ, де М являє собою катіон металу; К і
Е" кожний незалежно вибирають з необов'язково заміщеного Сі-в алкілу, Сз-я гетероциклічних і
Св-го арильних груп, і, необов'язково, стосовно групи МК, К і Е" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7-членне гетероциклічне кільце; Кг, 6, ІВ» ії К"7 являють собою те саме, що визначено для Кг, Не, В? і КК", відповідно; К" являє собою Сз-і2 алкіленову групу, ланцюг якої може бути перерваний одним або декількома гетероатомами й/або ароматичними кільцями, які являють собою необов'язково заміщені; і Хі х" незалежно вибрані з О, 5 і М(Н). Відповідно до деяких варіантів здійснення Ю описаного в даному документі імунокон'югату характеризується структурою:
Уч ! Мор - о. Ден
Н г, | п Н
М ОМе ОомМе М о о де п дорівнює 0 або 1.
Відповідно до одного варіанта здійснення ЮО описаного в даному документі імунокон'югату являє собою похідну неморубіцину. Відповідно до іншого варіанта здійснення Ю характеризується структурою, вибраною з: и"
АН о он М
І он
ОСС ев бо он б
З м , МУ
Ото о і о он (Ф) :
ОСС чн рулони) он о
З
У , . "я
ОК о ран І
Відповідно до одного варіанта здійснення описаний у даному документі імунокон'югат містить лінкер, який розщеплюється за допомогою протеази. Відповідно до інших варіантів здійснення лінкер містить дипептид маІ-сї або дипептид Ріпе-ІГу5. Відповідно до ще одного варіанта здійснення імунокон'югат містить лінкер, який являє собою кислотно-лабільний.
Відповідно до інших варіантів здійснення лінкер містить гідразон.
Відповідно до одного варіанта здійснення імунокон'югат характеризується формулою, вибраною з:
Ар/5 (о) (о) (Ф) АХ М. Н Фін! пи овлеваиетвони
М. икои уарсі- м о 900 оо о Н р в якій 5 являє собою атом сірки; мо чн (е) их Н Н о;
АБ Беру Н го о (е) ра в) о. (о)
М т он н,/ Отут н
М 7 Зо М е) (ев) р
(в) Ген! в) Н (в)
Ге) (Ф) Мт 5
Фвоогаованам
І (в) ло о он г аа і-ї, б. р о ; о он Її сю» схрдст мо о он б ям. о г
МН ек КВ зе А х о б. о Й
Мн» (в;
М во АЬ р ;
о р | (в) он он о » вового
З моли нн Ан о о з О он 0 /оме чн - С о7 мн, чно
ОоМе р
В.
І
Ге) М о он о й йо / о ме "он А ї (є; о ро) в) Фін! б г
Ух ме Нм. 20 ни н МН од Де (в)
МН Нм й оз
Мне (в) о 5-АБ (в)
ІФ) Фін! о)
Ф о 5- АБ -,, МН оте ву ло о он в в
С хе - ме і Фе б. р
Відповідно до деяких варіантів здійснення р перебуває в діапазоні від 2 до 5.
Відповідно до одного варіанта здійснення описаний у даному документі імунокон'югат згідно з даним винаходом містить антитіло, яке містить (ах НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 10, (Б) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 11, (с) НМА-НУЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 12, (4) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 7; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 8; і (І) НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9. Відповідно до іншого варіанта здійснення описаний у даному документі імунокон'югат згідно з даним винаходом містить послідовність МН 5ЕО ІЮ МО: 5 і послідовність МІ ЗЕО ІО МО: 3.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачений фармацевтичний склад, що містить описаний у даному документі імунокон'югат згідно з даним винаходом, і фармацевтично прийнятний носій. Відповідно до деяких варіантів здійснення фармацевтичний склад додатково містить додатковий терапевтичний засіб. Відповідно до деяких варіантів здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою хіміотерапевтичний засіб, такий як, наприклад, комплекс платини.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачені способи лікування індивідуума, що характеризується наявністю І убЕ-позитивного раку. Відповідно до деяких варіантів здійснення такі способи включають введення фармацевтичної композиції, яка містить описаний у даному документі імунокон'югат згідно з даним винаходом, що містить антитіло, яке зв'язується з І убЕ, наприклад, як описано в даному документі. Відповідно до інших варіантів здійснення ГУбЕ- позитивний рак вибирають з раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишок, меланоми, раку яєчників, не дрібноклітинного раку легені або раку шлунка. Відповідно до деяких варіантів здійснення спосіб згідно з даним винаходом включає введення індивідуумові додаткового терапевтичного засобу. Відповідно до деяких варіантів здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою хіміотерапевтичний засіб, такий як, наприклад, комплекс платини.
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачені способи інгібування проліферації
ГубЕ-позитивних клітин. Відповідно до одного варіанта здійснення такі способи включають експонування І убЕ-позитивних клітин з описаним у даному документі імунокон'югатом згідно з даним винаходом, що містить антитіло, яке зв'язується з ГубЕ в умовах, що дозволяють зв'язування імунокон'югату з ГубЕ на поверхні клітини. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло, що зв'язується з І убЕ, являє собою описане в даному документі антитіло.
Відповідно до деяких варіантів здійснення проліферація ГубЕ-позитивної клітини, таким чином, інгібується. Відповідно до деяких варіантів здійснення клітина являє собою злоякісну клітину молочної залози, злоякісну клітину підшлункової залози, злоякісну клітину товстої кишки, злоякісну клітину товстої та прямої кишок, клітину меланоми, злоякісну клітину яєчника, клітину
Зо не дрібноклітинного раку легені або злоякісну клітину шлунка.
Відповідно до одного варіанта здійснення описане в даному документі антитіло, що зв'язується з І убЕ, кон'юговане з міткою. Відповідно до деяких варіантів здійснення, така мітка являє собою позитронний емітер. Відповідно до деяких варіантів здійснення позитронний емітер являє собою 897т.
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачений спосіб виявлення людського І УбЕ у біологічному зразку. Відповідно до деяких варіантів здійснення такий спосіб включає контактування біологічного зразка з антитілом до ГуУбЕ в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла до ГубЕ з людським ГубЕ, що зустрічається у природі, і виявлення того, чи утвориться комплекс між антитілом до ГубЕ і людським ГубЕ, що зустрічається у природі, у біологічному зразку. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло до ГубЕ являє собою описане в даному документі антитіло. Відповідно до деяких варіантів здійснення біологічний зразок являє собою зразок раку молочної залози, зразок раку підшлункової залози, зразок раку товстого кишечнику, зразок раку товстої та прямої кишок, зразок меланоми, зразок раку яєчників, зразок не дрібноклітинного раку легені або зразок раку шлунка.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачений спосіб виявлення І убЕ-позитивного раку. Відповідно до таких варіантів здійснення спосіб включає (ї) введення міченого антитіла до
ГубЕ суб'єкта, який характеризується наявністю або можливою наявністю ІГубЕ-позитивного раку, і (ї) виявлення міченого антитіла до І убЕ у суб'єкта, причому виявлення міченого антитіла до ГубЕ вказує на наявність І убЕ-позитивного раку в суб'єкта. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло до ГубЕ являє собою описане в даному документі антитіло. Відповідно до інших варіантів здійснення ГубЕ-позитивний рак вибирають з раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку товстого кишечнику, раку товстої та прямої кишок, меланоми, раку яєчників, не дрібноклітинного раку легені або раку шлунка. Відповідно до одного варіанта здійснення описаного в даному документі способу описане в даному документі антитіло, що зв'язується з І убЕ, кон'югують з міткою. Відповідно до деяких варіантів здійснення, така мітка являє собою позитронний емітер. Відповідно до деяких варіантів здійснення позитронний емітер являє собою 897т.
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене виділене антитіло, що зв'язується з
ГУбЕ, для використання як лікарський засіб. Відповідно до інших варіантів здійснення винаходу бо антитіло, що зв'язується з І убЕ, зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІО
МО: 1. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло зв'язується з ГубЕ з афінністю х 4
НМ, вимірюваної за допомогою аналізу Скетчарда. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке антитіло зв'язується з І убЕ з афінністю х 7 НМ, вимірюваної за допомогою 5РЕ. Відповідно до ще одного варіанта здійснення таке антитіло використовується для лікування ГУубЕ- позитивного раку. Відповідно до деяких варіантів здійснення таке антитіло використовують для інгібування проліферації в клітині ГубЕ-позитивного раку. Відповідно до деяких варіантів здійснення клітина ІГубЕ-позитивного раку являє собою клітину раку молочної залози, клітину раку підшлункової залози, клітину раку товстого кишечнику, клітину раку товстої та прямої кишок, клітини меланоми, клітину раку яєчника, клітину не дрібноклітинного раку легені або клітину раку шлунка. Відповідно до деяких варіантів здійснення використання такого описаного в даному документі антитіла застосовується у виробництві лікарського засобу. Відповідно до іншого варіанта здійснення таке застосування для лікарського засобу використовується для лікування ГубЕ-позитивного раку. Відповідно до ще одного варіанта здійснення винаходу таке застосування використовується для інгібування проліферації в клітині ГуУбЕ-позитивного раку.
Відповідно до деяких варіантів здійснення клітина ГубЕ-позитивного раку являє собою злоякісну клітину молочної залози, злоякісну клітину підшлункової залози, злоякісну клітину товстої кишки, злоякісну клітину товстої та прямої кишок, клітину меланоми, злоякісну клітину яєчника, клітину не дрібноклітинного раку легені або злоякісну клітину шлунка.
Короткий опис креслень
На фіг.1 показане порівняння вирівнювання послідовностей ортологів І уУбЕ від видів людини (ЗЕО ІЮО МО:1), макаки (ЗЕО ІО МО:2), макаки-резусу (ЗЕО ІЮ МО:35), миші (ЗЕО ІЮ МО:36) та пацюка (5ЕО ІО МО:37). Показано, що відсоток ідентичності на амінокислотному рівні між цими послідовностями у позаклітинному домені (ЕСО) становить -- 96 95 між ГубЕ людини та макаки і - Б2 90 між ГубЕ людини та пацюка.
На фіг. 2 показаний профіль Сепеїодіс експресії мРНК ГубЕ, як додатково описано у прикладі 1. Вимірювання проводилися на чипі АПутеїгіх О13З3Р і виражаються як розходження масштабованих середніх в експресії ГубЕ у тканинах людини. Кожна точка представляє нормальний (зелений), пухлинний (червоний) або патологічний не пухлинний (синій) зразок тканини людини. Прямокутники охоплюють діапазон від 25 до 75 процентилей для кожного
Зо розподілу. М/УВС - лейкоцити. Надекспресія І уУбЕ видна при раку молочної залози, підшлункової залози, товстої та прямої кишок, легенів, меланоми й яєчників, серед інших.
На фіг. За зображена відносна кратна зміна ПЛР у реальному часі експресії транскрипта
ГУбЕ, нормована до експресії контрольного гена КРІ 19 у панелі нормальних тканин людини та вибраних клітинних ліній і тканин злоякісних пухлин, як описано у прикладі 2. Отримані результати свідчать про те, що експресія транскрипта ГубЕ у нормальних тканинах низька, у порівнянні з експресією ГубЕ при раку молочної залози та підшлункової залози.
На фіг. 4 показане вирівнювання послідовності варіабельного домена легкого ланцюга гуманізованого антитіла до ГУбЕ (пи9812.м12), у порівнянні з химерним антитілом до І УбЕ (хубЕ ти9В12) і консенсусною послідовністю каппа І людини (Карра І сопзепзи5). Положення амінокислот, які відрізняються від людських консенсусних кістяків, зафарбовані сірим кольором.
Області, які були передані для утворення щеплення СОК, обведені. Положення нумеруються відповідно до Кабаї.
На фіг. 5 показане вирівнювання послідовності варіабельного домена важкого ланцюга гуманізованого антитіла до ГУбЕ (пи9812.м12), у порівнянні з химерним антитілом до І УбЕ (хубЕ ти9В12) і консенсусною послідовністю МН2 людини (МН2 сопзепзи5). Положення амінокислот, які відрізняються від людських консенсусних кістяків, зафарбовані сірим кольором.
Області, які були передані для утворення щеплення СОК, обведені. Положення нумеруються відповідно до Кабаї.
На фіг. 6 показане вирівнювання послідовності варіабельного домена важкого ланцюга гуманізованого антитіла до ГубЕ (пи9812.м12), у порівнянні з химерним антитілом до ГубЕ (хубЕ ти9В12) і консенсусною послідовністю МНЗ людини (МНЗ сопзепз5и5). Положення амінокислот, які відрізняються від людських консенсусних кістяків, зафарбовані сірим кольором.
Області, які були передані для утворення щеплення СОК, обведені. Положення нумеруються відповідно до Кабаї.
На фіг. 7 показана ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у ксенотрансплантній мишачій моделі, як описано у прикладі 7. На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей, щеплених клітинами НСС1569 х 2 раку молочної залози. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100-250 мм: (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-ус-ММАЕ), або гуманізованих АОС (МС-МС-РАВ-ММАЄЕ) до ІГУубЕ (М12) пи9812 у 60 зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями були визначені від 9 тварин на групу (зазначено на графіку). На панелі В показана поверхнева експресія білка ГубЕ у живих клітинах НСС1569 х 2, як видно за допомогою проточної цитометрії, де сірий пік показує клітини, оброблені тільки вторинним реагентом для виявлення, а чорний пік показує клітини, оброблені з З мкг/мл І УубЕ антитіла (пи9812 м12) АОС з наступною обробкою з АїІехайцог 488, кон'югованим з ДО людини як вторинний реагент виявлення. Експресія ГубЕ як значення
СеоМеап відображається у правій частині гістограми. На панелі С показана загибель клітин за допомогою титрування АОС пи9В12 м12 для клітинної лінії НСС1569 х 2 раку молочної залози.
Зазначені концентрації АОС пи9В12 м12, контрольних ІдС-мсо-ММАЕ або еквівалентна кількість контрольного несучого розчину РВ5 інкубували з клітинами протягом 5 днів, і відносну життєздатність клітин (у-вісь) оцінювали з використанням СейПТйег-(с1о.
На фіг. 8 показана ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у ксенотрансплантній мишачій моделі.
На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей, щеплених клітинами злоякісної пухлини підшлункової залози 50.86.86. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100-250 мм: (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-мс-ММАЕ), або АОС у зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями були визначені від 9 тварин на групу (зазначено на графіку). На панелі В показане порівняння загальної білкової експресії ГубЕ у клітинних лізатах НСС1569 х 1 і 50.86.86 за допомогою імуноблоттингу. Білковий вміст усього В-актину вимірювали у паралелі для забезпечення контролів, що вводять. На панелі С показана загибель клітин за допомогою титрування АОС ГубЕ для клітинної лінії раку підшлункової залози 50.86.86. Зазначені концентрації АОС до ГубЕ, контрольних І(9)06-УС-ММАЕ або еквівалентну кількість контрольного несучого розчину РВ5 інкубували з клітинами протягом 5 днів, і відносну життєздатність клітин (у-вісь) оцінювали з використанням СеїЇПіег-сіо. На панелі ЮО показане фарбування 1-4 убЕ на клітинному осаді 50.86.86 за допомогою імуногістохімії.
На фіг. 9 показана ефективність іп мімо АОС до ГУубЕ у первинній ксенотрансплантній моделі раку молочної залози НВСхХ-9, установлена на ХептТесі (Емгу, Франція). На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей з імплантованим пухлинним матеріалом від пацієнта з раком молочної залози. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100- 250 мм3 (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-мс-
Зо ММА), або АЮС до ГубЕ у зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями визначали від 9 тварин на групу (зазначено на графіку). На панелі В показане порівняння загальної білкової експресії ГубЕ у різних первинних пухлинних моделях ХептТесі й у клітинних лізатах НСС1569 х 1 і 50.86.86 за допомогою імуноблоттингу. Білковий вміст усього рВ-актину вимірювали у паралелі для забезпечення контролів, що вводять. На панелі С показане фарбування І убЕ на пухлинах НВСх-9 за допомогою імуногістохімії. Незалежне фарбування множинних зразків пухлин показало гетерогенні паттерни фарбування. Зазначено відсоток фарбування пухлинних клітин на рівні 1-- для І убЕ.
На фіг. 10 показана ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у первинній ксенотрансплантній моделі раку молочної залози НВСх-8, установлена на ХепТесіп (Емгу, Франція). На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей з імплантованим пухлинним матеріалом від пацієнта з раком молочної залози. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100- 250 мм3 (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-мс-
ММА), або АБС до ГубЕ у зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями визначали від 10 тварин на групу (зазначено на графіку). На панелі В показане порівняння загальної білкової експресії І убЕ у різних первинних пухлинних моделях ХептТесії й у клітинних лізатах НСС1569 х 1 і 50.86.86 за допомогою імуноблоттингу. Білковий вміст усього рВ-актину вимірювали у паралелі для забезпечення контролів, що вводять. На панелі С показане фарбування ГубЕ на пухлинах НВСх-8 за допомогою імуногістохімії. Незалежне фарбування множинних зразків пухлин показало гетерогенні паттерни фарбування. Зазначено відсоток фарбування пухлинних клітин на рівні 1-4 або 2.
На фіг. 11 показана ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у первинній ксенотрансплантній моделі раку молочної залози МАХЕ-1162, установлена на Опсоїезі Стр (Егеіригд, Сегтапу). На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей з імплантованим пухлинним матеріалом від пацієнта з раком молочної залози. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100-250 мм" (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-мс-ММАЕ), або АОС до ГубЕ у зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями визначали від 10 тварин на групу (зазначено на графіку). На панелі
В показане порівняння загальної білкової експресії І уУбЕ у різних первинних пухлинних моделях
Опсоїевбі й у клітинних лізатах за допомогою імуноблоттингу. Білковий вміст усього САРОН бо вимірювали у паралелі для забезпечення контролю завантаження. На панелі С показане фарбування І убЕ на пухлинах МАХЕ-1162 за допомогою імуногістохімії. Незалежне фарбування множинних зразків пухлин показало гетерогенні паттерни фарбування. Зазначено відсоток фарбування пухлинних клітин на рівні 1-- або 2-- для І убЕ.
На фіг. 12 показана ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у первинній ксенотрансплантній моделі раку підшлункової залози РАХЕ-1657, установлена на Опсоїезі Стр (Егеіригу, Септапу).
На панелі А показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей з імплантованим пухлинним матеріалом від пацієнта зі злоякісною пухлиною підшлункової залози. Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100-250 мм" (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ або контрольних АОС (контроль-хс-ММАЕ), або АОС до ГубЕ у зазначених дозах. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями визначали від 10 тварин на групу (зазначено на графіку).
На панелі В показане порівняння загальної білкової експресії ГубЕ у різних первинних пухлинних моделях Опсоїезі й у клітинних лізатах за допомогою імуноблоттингу. Білковий вміст усього САРОН вимірювали у паралелі для забезпечення контролів, що вводять. На панелі С показане фарбування ГубЕ на пухлинах РАХЕ-1657 за допомогою імуногістохімії. Незалежне фарбування множинних зразків пухлин показало гетерогенні паттерни фарбування. Зазначено відсоток фарбування пухлинних клітин на дуже слабкому (-/-) рівні для ГубЕ.
На фіг. 13 показане порівняння ефективності іп мімо різних кон'югатів АОС до ГубЕ у мишачій ксенотрансплантній моделі. На всіх панелях А, В і С показані підшкірні пухлини, встановлені в імунодефіцитних мишей з клітинною лінією злоякісної пухлини підшлункової залози 50.86.86.
Коли об'єми пухлин досягали приблизно 100-250 мм? (день 0), тваринам вводили однократну ін'єкцію ІМ ТтпрК або контрольних АОС (контроль-ус-ММАЕ), або АОС до І убЕ, як показано на графіках. Середні об'єми пухлин зі стандартними відхиленнями були визначені від 10 тварин на групи (зазначено на графіку). На панелі ОО показане фарбування ГІ УубЕ 1 на клітинному осаді 51.86.86 за допомогою імуногістохімії.
Докладний опис винаходу
І. Визначення "Акцепторна каркасна область людини" для цілей даного винаходу являє собою каркасну область, що містить амінокислотну послідовність каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга (МІ) або каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга (МН),
Зо отриманої з каркасної області людського імуноглобуліну або консенсусної каркасної області людини, як це визначено нижче. Акцепторна каркасна область людини "отримана з" каркасної області людського імуноглобуліну або консенсусної каркасної області людини, може містити ту саму амінокислотну послідовність або вона може містити зміни амінокислотної послідовності.
Відповідно до деяких варіантів здійснення кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше, або 2 або менше. Відповідно до деяких варіантів здійснення акцепторна каркасна область людини Мі ідентична по послідовності МІ. послідовності каркасної області людського імуноглобуліну або послідовності консенсусної каркасної області людини. "Афінність" відноситься до сили сукупності всіх не ковалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитілом) і його партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо не зазначено інше, використовувана в даному документі "афінність зв'язування" відноситься до внутрішньої афінності зв'язування, що відображає взаємодію 1:1 між представниками єднальної пари (наприклад, антитілом й антигеном). Афінність молекули Х до свого партнера У у загальному випадку може бути представлена константою дисоціації (Ка).
Афінність може бути виміряна за допомогою звичайних методів, відомих у даній області техніки, у тому числі за допомогою тих, які описані в даному документі. Конкретні ілюстративні та зразкові варіанти здійснень для вимірювання афінності зв'язування описані нижче.
Антитіло з "дозрілою афінністю" відноситься до антитіла з одним або декількома змінами в одній або декількох гіперваріабельних областях (НУК), у порівнянні з вихідним антитілом, що не має такі зміни, такі зміни призводять до поліпшення афінності антитіла до антигену.
Терміни "антитіло до ГубЕ" й "антитіло, що зв'язується з І уУбЕ" відносяться до антитіла, яке здатне зв'язуватися з І убЕ з достатньою афінністю, такою, що антитіло являє собою застосовне в якості діагностичного та/або терапевтичного засобу для цілеспрямованого впливу на І УбЕ.
Відповідно до одного варіанта здійснення ступінь зв'язування антитіла до І убЕ з неспорідненим не-ГубЕ білком становить менше ніж приблизно 10 95 від зв'язування антитіла з ГубЕ, що виміряне, наприклад, за допомогою радіоіїмуноаналізу (КІА) або аналізу Скетчарда, або за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, такого як, наприклад, Віасоге. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло, яке зв'язується з ГубЕ, характеризується константою дисоціації (Ка) «1 мкМ, «100 нМ, х 10 нМ, «1 НМ, х 0,1 нМ, «0,01 нМ, або «0,001 нМ (наприклад, 60 108 М або менш, наприклад, від 108 М до 10-73 М, наприклад, від 109 М до 1073 М). Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло до І убЕ зв'язується з епітопом ГубЕ, що являє собою консервативний серед ГГ УбЕ від різних видів.
Термін "антитіло" у даному документі використовується в самому широкому сенсі й охоплює різні структури антитіл, що включають у себе без обмеження моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіл за умови, що вони проявляють бажану антигенсполучну активність.
Використовуваний у даному документі термін "кон'югат антитіла з лікарським засобом" (АБС) еквівалентний терміну "імунокон'югат". "Фрагмент антитіла" відноситься до молекули, відмінної від інтактного антитіла, що містить частину інтактного антитіла, що зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло.
Приклади фрагментів антитіл містять у собі без обмеження Ем, Бар, Рар', Бар'-5Н, Е(арЗ2; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл (наприклад, 5сЕм) і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. "Антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом" як еталонне антитіло відноситься до антитіла, що блокує зв'язування еталонного антитіла зі своїм антигеном у конкурентному аналізі на 50 95 або більше, і, навпаки, еталонне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі на 50 95 або більше. Ілюстративний конкурентний аналіз передбачений у даному документі.
Терміни "злоякісна пухлина" та "злоякісний" відносяться або описують фізіологічний стан у ссавців, що зазвичай характеризується нерегульованим клітинним ростом/проліферацією.
Приклади злоякісної пухлини містять у собі без обмеження карциному, лімфому (наприклад, хворобу Ходжкіна та неходжкінську лімфому), бластому, саркому та лейкоз. Більш конкретні приклади таких злоякісних пухлин містять у собі злоякісну пухлину, при якій відбувається надекспресія ГубЕ, що може містити в собі, наприклад, рак молочної залози і/або метастатичний рак молочної залози, у тому числі Нег2-негативний рак молочної залози і/або потрійний негативний рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак товстої кишки, рак товстої та прямої кишок, меланому, рак яєчників, не дрібноклітинний рак легені (або плоскоклітинний і/або не плоскоклітинний), рак шлунка, плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легенів, аденокарциному легенів, плоскоклітинний рак легенів, рак черевної порожнини,
Зо гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, гліому, рак шийки матки, рак печінки, рак сечового міхура, гематому, карциному ендометрію або матки, карциному слинних залоз, рак нирок, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, лейкоз і інші лімфопроліферативні порушення, а також різні типи раку голови та шиї.
Термін "химерне" антитіло відноситься до антитіла, в якому частина важкого та/або легкого ланцюга походить з певного джерела або виду, у той час як частина, що залишилася, важкого та/або легкого ланцюга походить від іншого джерела або виду.
Використовуваний у даному документі термін "цитотоксичний засіб" відноситься до речовини, що інгібує або запобігає клітинній функції та/або викликає загибель клітин або руйнування. Цитотоксичні засоби містять у собі без обмеження радісактивні ізотопи (наприклад,
АТ, 81, 25, у, Ве!86, Де88. пт! Віг12, раг2, рр! і радіоактивні ізотопи Гц); хіміотерапевтичні засоби або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі засоби); інгібуючі ріст засоби; ферменти та їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; такі токсини, як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження, що включають у себе їхні фрагменти та/або їхні варіанти; і різні протипухлинні або протиракові засоби, описані нижче. "Ефекторні функції" означають ті біологічні активності, що відносяться до Ес-області антитіла, які змінюються з ізотипом антитіл. Приклади ефекторних функцій антитіла містять у собі: зв'язування С14 і комплемент-залежну цитотоксичність (СОС); зв'язування Ес рецептора; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮСС); фагоцитоз; понижуючу регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецепторів В-клітин) й активацію В-клітин.
Термін "ефективна кількість" засобу, наприклад, фармацевтичної композиції, відноситься до кількості, ефективній в дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату.
Термін "епітоп" відноситься до конкретного сайту на молекулі антигену, з яким зв'язується антитіло.
Термін "Бс-область" у даному документі використовується для визначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить щонайменше частину константної області. 60 Цей термін містить у собі нативну послідовність Ес областей і варіантні Ес області. Відповідно до одного варіанта здійснення Ес-область важкого ланцюга дб людини простягається від
Сувз226 або від Рго230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Проте, С-кінцевий лізин (Гуз447) області Ес може бути присутнім чи ні. Якщо в даному документі не зазначено інше, нумерація амінокислотних залишків в області Ес або в константній області відповідає системі нумерації ЕМ, також називаній як індекс Є), як описано в КарБбаї єї аїІ., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої
Іттипоіодіса! Іпієгеві, Бій Ей. Рибріїс Неацй 5егуісе, Маїйопаї! Іпвійшев ої Неайй, Веїпезаа, МО, 1991. "Каркасна область" або "РЕ" відноситься до залишків варіабельного домена, відмінним від залишків гіперваріабельної області (НУК). ЕЕ. варіабельного домена, як правило, складається з чотирьох доменів ЕК: ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ ії ЕК4. Відповідно, послідовності НМК і ЕК, як правило, з'являються у наступній послідовності в МН (або М): ЕК1-НІ(І11)-ЕН2-Н2(І2)-ЕНЗ-НЗІ(І 3)-ЕВА.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "Інтактне антитіло" та "ціле антитіло" використовуються в даному документі взаємозамінно для позначення антитіла, що характеризується структурою, по суті аналогічній структурі нативного антитіла, або містить важкі ланцюги, які містять певну в даному документі Ес-область.
Терміни "клітина-хазяїн", "клітинна лінія-хазяїн' і "клітинна /культура-хазяїн" використовуються взаємозамінно та відносяться до клітин, у які вводять екзогенну нуклеїнову кислоту, що включають у себе потомство таких клітин. Клітини-хазяїни містять у собі "грансформанти" і "трансформовані клітини", які містять у собі первинні трансформовані клітини та потомство, отримане від них, незалежно від числа пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним за вмістом нуклеїнових кислот стосовно батьківської клітини, але може містити мутації. Мутантне потомство, що характеризується наявністю тієї самої функції або біологічної активності, як піддане скринінгу або вибране у первісно трансформованій клітині, включено в даний документ. "Людське антитіло" являє собою те, яке має амінокислотну послідовність, що відповідає такій антитіла, продукованого в організмі людини або клітині людини, або отриманого з відмінного від людського джерела, який використовує репертуар антитіл людини або інші кодуючі антитіла людини послідовності. Це визначення людського антитіла спеціально виключає гуманізоване антитіло, що містить відмінні від людини антигенсполучні залишки.
Зо "Консенсусна каркасна область людини" являє собою каркасну область, що являє собою амінокислотні залишки, що найбільше часто зустрічаються, у виборі послідовностей каркасної області МІ або МН імуноглобуліну людини. Як правило, вибір послідовностей Мі або УН імуноглобуліну людини походить з підгрупи послідовностей варіабельного домена. Взагалі, підгрупа послідовностей являє собою підгрупу, як в Кабраї єї аЇ., Зедиепсе5 ої Ргоїеїп5 ої
Іттипоїіодіса! Іпіегев5і, Рій Еайіоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, ВеШезаа МО (1991), моїв5. 1-3.
Відповідно до одного варіанта здійснення для Мі. підгрупа являє собою підгрупу каппа Ї, як в
Кабаї єї аІ., вище. Відповідно до одного варіанта здійснення для МН підгрупа являє собою підгрупу І, як в Кабаї еї а!., вище. "Гуманізоване" антитіло відноситься до химерного антитіла, що містить амінокислотні залишки з відмінних від людських НМК й амінокислотні залишки від людських ЕК. Відповідно до деяких варіантів здійснення гуманізоване антитіло буде містити по суті всі з щонайменше одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі з НМЕ (наприклад, СОК) відповідають таким з відмінного від людського антитіла, і всі або по суті всі ЕЕ відповідають таким з людського антитіла. Гуманізоване антитіло необов'язково може містити щонайменше частину константної області антитіла, отриманої від людського антитіла. "пГуманізована форма" антитіла, наприклад, відмінна від людського антитіла, відноситься до антитіла, що піддалося гуманізації.
Використовуваний у даному документі термін "гіперваріабельна область" або "НМА" відноситься до кожної з областей варіабельного домена антитіла, які являють собою гіперваріабельні у послідовності й/або утворюють структурно визначені петлі ("тіперваріабельні петлі"). Як правило, нативні чотириланцюгові антитіла включають шість НМЕ; три в МН (НІ, Н2,
НЗ) і три в МІ (11, 12, І 3). НМК зазвичай містять амінокислотні залишки від гіперваріабельних петель і/або з "визначальних компліментарність областей" (СОК), причому останні характеризуються найвищою мінливістю послідовності та/або беруть участь у розпізнаванні антигену. Ілюстративні гіперваріабельні петлі відбуваються в амінокислотних залишках 26-32 (1), 50-52 (12), 91-96 (І 3), 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ), (Споївпіа апа І езкК, 9. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)). Ілюстративні СОК (СОК-11, СОВ-І2, СОВ-І 3, СОВ-НІ, СОВ-Н2 і СОБ-НЗ) відбуваються в амінокислотних залишках 24-34 в 11, 50-56 в 12, 89-97 в І 3, 31-35В у НІ, 50-65 у
Н2, 95-102 у НЗ. (Кабаї єї аІ., Зедоепсез ої Ргоїеїпз ої Іттипо!одісаї Іптегеві, БП Ед. Рибіїс Неайй 60 Зегмісе, Маїйопаї Іпвійшев5 ої Неакй, Веїйезаа, МО (1991).) За винятком СОКІ в УН, СОК, як правило, містять амінокислотні залишки, які утворюють гіперваріабельні петлі. СОК також містять "залишки, що визначають специфічність" або "ЗОМ", які являють собою залишки, які контактують з антигеном. ЗОК містяться в областях СОК, називаних скорочено СОК або а-СОВ.
Ілюстративні а-СОВ (асСОВ-І1-а-СОВ-12,.а-СОВ8-1Ї3,а-СОВ-НІа-СбОВ-Н?2 й 0 а-СОВ-НЗ) відбуваються в амінокислотних залишках 31-34 в І 1, 50-55в 12, 89-96 в І 3, 31-35В у НІ, 50-58 у
Не ї 95-102 у НЗ. (Дивитеся АЇІтадго апа Егапозоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008).). Якщо не зазначено інше, залишки НМК й інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) нумеруються в даному документі відповідно до КарБбаї еї аї., вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юговане з однією або декількома гетерологічними молекулами, що включають у себе без обмеження цитотоксичний засіб. Імунокон'югат являє собою синонімом терміна "кон'югат антитіла з лікарським засобом" (АОС). "Індивідуум" або "суб'єкт" являє собою ссавця. Ссавці містять у собі без обмеження свійських тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак і коней), приматів (наприклад, людиноподібних і не людиноподібних приматів, таких як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і пацюків). Відповідно до деяких варіантів здійснення індивідуум або суб'єкт являє собою людину. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, що було відділено від компонента його природного навколишнього середовища. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло очищають більш ніж на 95 95 або на 99 95 чистоти, як визначено, наприклад, електрофоретично (наприклад, за допомогою СДС-ПААГ, ізоелектричного фокусування (ІЕФ), капілярного електрофорезу) або хроматографічно (наприклад, за допомогою іонообмінної або зворотнофазової ВЕРХ). Для огляду способів оцінки чистоти антитіл, дивитеся, наприклад,
Наїтап евї а!., У. Спготаїйодг. В 848:79-87 (2007). "Виділена" нуклеїнова кислота відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що була відділена від компонента її природного навколишнього середовища. Виділена нуклеїнова кислота містить у собі молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти присутня поза хромосомою або в хромосомній локації, яка відрізняється від своєї природної хромосомної локації. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до ГУбЕ" відноситься до однієї або декількох молекул нуклеїнової кислоти, що кодує важкі та легкі ланцюги антитіл (або їхні фрагменти), що включають у себе таку молекулу(и) нуклеїнової кислоти в одному векторі або окремих векторах, і така молекула(и) нуклеїнової кислоти присутня в одній або декількох локаціях у клітині-хазяїні.
Використовуваний у даному документі термін "ГубЕ" відноситься до будь-якому нативному, зрілому ГубЕ, що виходить у результаті процесингу білка-попередника ГУубЕ у клітині. Цей термін містить у собі ГГ убЕ з будь-якого джерела хребетних, що включають у себе таких ссавців, як примати (наприклад, людиноподібні й макаки або макаки-резуси) і гризуни (наприклад, миші та пацюки), якщо не зазначено інше. Термін також містить у собі варіанти ГубЕ, що зустрічаються у природі, наприклад, сплайс-варіанти або алельні варіанти. Амінокислотна послідовність ілюстративного білка-попередника ГуУбЕ людини з сигнальною послідовністю (амінокислоти 1-20-сигнальної послідовності) показана в 5ЕО ІЮ МО: 1. Амінокислотна послідовність ілюстративного дозрілого людського ГубЕ показана в 5ЕБО ІЮ МО: 38.
Послідовність амінокислот 1-131 ілюстративного ГуУбЕ макака показана в 5ЕБО ІЮО МО: 2.
Амінокислотна послідовність ілюстративного дозрілого ГубЕ макака показана в 5ЕО ІО МО: 39.
Амінокислотна послідовність для ілюстративного попередника ГубЕ пацюка (з сигнальною послідовністю, амінокислоти 1-26) і дозрілі послідовності показані в 5ЕО ІЮ МО: 37 ї 42, відповідно. Амінокислотні послідовності для ілюстративного попередника ГубЕ миші (з сигнальною послідовністю, амінокислоти 1-26) і дозрілі послідовності показані в ЗЕО ІО МО: 36 і 41, відповідно.
Термін "ГУбЕ-позитивний рак" відноситься до форми раку, що містить клітини, які експресують ГубЕ на своїй поверхні. Для цілей визначення того, чи експресує клітина ГубЕ на поверхні, експресію мРНК ГубЕ розглядають як корелюючу з експресією ГубЕ на поверхні клітини. Відповідно до деяких варіантів здійснення експресію мРНК ГубЕ визначають способом, вибраним із гібридизації іп 5йи й ЗТ-ПЛР (у тому числі кількісну ЗТ-ПЛР). Альтернативно, експресія І убЕ на клітинній поверхні може бути визначена, наприклад, з використанням антитіл до ГубЕ у такому способі, як імуногістохіміяї, РАС і т.п. Відповідно до деяких варіантів здійснення ГубЕ-позитивний рак означає рак молочної залози, метастатичний рак молочної залози, що включає в себе Нег2 негативний рак молочної залози і/або потрійний негативний рак 60 молочної залози, рак підшлункової залози, рак товстої кишки, рак товстої та прямої кишок,
меланому, рак яєчників, не дрібноклітинний рак легені (або плоскоклітинний і/або не плоскоклітинний) або рак шлунка, кожний з яких демонструє високий рівень експресії І УбЕ.
Термін "ГУбЕ-позитивні клітини" відноситься до клітини злоякісної пухлини, що експресує
ГУбЕ на своїй поверхні.
Використовуваний у даному документі термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що містять популяцію, являють собою ідентичні та/або зв'язують один і той самий епітоп, за винятком можливих варіантних антитіл, наприклад, що містять мутації, що зустрічаються у природі, або виникаючі у процесі виробництва препарату моноклональних антитіл, такі варіанти, як правило, є присутніми у незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклонального антитіла спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. Таким чином, "моноклональний" модулятор указує на характер антитіла як отриманого по суті з гомогенної популяції антитіл, і не повинне бути витлумачене як потребуюче одержання антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, які будуть використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути виготовлені за допомогою різних технік, що включають у себе без обмеження способи гібридом, способи рекомбінантних ДНК, способи фагового дисплея, а також способи, що використовують трансгенних тварин, що містять всі або частину локусів людського імуноглобуліну, такі способи й інші ілюстративні способи одержання моноклональних антитіл описуються в даному документі. "Голе антитіло" відноситься до антитіла, що не кон'юговане з гетерологічним фрагментом (наприклад, цитотоксичним фрагментом) або радіоактивною міткою. Голі антитіла можуть бути присутніми у фармацевтичному складі. "Нативні антитіла" відносяться до молекул, що зустрічаються у природі, імуноглобуліну з різними структурами. Наприклад, нативні антитіла ІдсС являють собою гетеротетрамірні глікопротеїни розміром приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, які зв'язані дисульфідним містком. Від М- до С-кінця кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МН), також називану варіабельним важким доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, а потім три константних домена (СНІ,
СН2г ї СНЗ). Аналогічним чином, від М- до С-кінця кожний легкий ланцюг містить варіабельну ділянку (МІ), також називану варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, з наступним константним легким доменом (СІ). Легкий ланцюг антитіла може бути віднесений до одного з двох типів, називаних каппа (к) і лямбда (ХА) на підставі амінокислотної послідовності їх константного домена.
Термін "листок-вкладиш" використовується для позначення інструкцій, терапевтичних продуктів, що включають зазвичай в комерційні впакування, які містять інформацію про показання, використання, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання та/або попередження, що стосуються використання таких терапевтичних засобів. "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" стосовно еталонної послідовності поліпептиду визначається як відсоток амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, які ідентичні амінокислотним залишкам в еталонній поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей і введення пробілів, якщо це необхідно, щоб досягти максимального відсотка ідентичності послідовностей, і без обліку будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотних послідовностей може бути досягнуто різними способами, які відомі фахівцям у даній області техніки, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як ВІ А5Т, ВІ А5БТ-2, АІОСМ або програмне забезпечення Медаїїдп (ОМАЗТАК). Фахівці в даній області техніки можуть визначити відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, що включають у себе будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання повної довжини порівнюваних послідовностей. Для цілей даного винаходу, однак, значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують з використанням комп'ютерної програми порівняння послідовностей
АПСМ-2. Комп'ютерна програма порівняння послідовностей АГІОМ-2 була розроблена
Сепепіеси, Іпс., і вихідний код був поданий з користувальницькою документацією в ОЗ Соругідні
ОпПсе, УМмазпіпдаїоп ОС, 20559, де він зареєстрований під 0.5. Соругіднї Кедівігайоп Мо.
ТХОИ510087. Програма АГІСМ-2 загальнодоступна від Сепепіесп, Іпс., Зоцій Зап Егапсівзсо,
Саїїогпіа, або може бути складена з вихідного коду. Програма АГІСМ-2 повинна бути складена для використання на операційній системі ОМІХ, що включає в себе цифрову ОМІХ М4.00. Всі бо параметри порівняння послідовностей встановлюються програмою АГІОМ-2 ї не змінюються. У ситуації, коли АГІМ-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей, 90 ідентичності амінокислотної послідовності даної амінокислотної послідовності А у порівнянні з або стосовно послідовності В наведені амінокислоти (які альтернативно можуть бути сформульовані як дана амінокислотна послідовність А, що містить певний 95 ідентичності амінокислотної послідовності у порівнянні з або стосовно даної амінокислотної послідовності В) розраховують у такий спосіб: 100 кратна фракція Х/У, де Х являє собою кількість амінокислотних залишків, оцінених як ідентичні збіги програмою вирівнювання послідовностей АГ ЇМ-2 у вирівнюванні цією програмою А і В, і де У являє собою загальну кількість амінокислотних залишків у В. Зрозуміло, що, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 905 ідентичності амінокислотної послідовності А до В не буде дорівнювати 95 ідентичності амінокислотної послідовності В до А. Якщо спеціально не зазначено інше, всі значення 9о ідентичності амінокислотної послідовності, використовувані в даному описі, отримані, як описано у попередньому параграфі, з використанням комп'ютерної програми АСІСМ-2.
Термін "фармацевтичний склад" відноситься до препарату, що перебуває в такій формі, щоб дозволити біологічній активності активного інгредієнта, що міститься в ньому, бути ефективним, і який не містить додаткових компонентів, які неприйнятно токсичні для суб'єкта, якому склад буде вводитися. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта у фармацевтичному складі, відмінному від активного інгредієнта, що нетоксичний для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій містить у собі без обмеження буфер, наповнювач, стабілізатор або консервант.
Використовуваний у даному документі "комплекс платини" відноситься до протиракових хіміотерапевтичних лікарських засобів, таких як, наприклад, але без обмеження, цисплатин, оксаліплатин, карбоплатин, іпроплатин, сатраплатин, СІ-973, А20О473, ОМУА2114Е, недаплатин і спріоплатин, які роблять ефективність проти пухлин на основі їхньої здатності ковалентно зв'язуватися з ДНК.
Використовуване в даному документі "лікування" (і такі граматичні варіанти, як "лікувати" або "лікування") відноситься до клінічної інтервенції в спробі змінити природний хід індивідуума,
Зо якого лікують, і може бути виконане або для профілактики, або у процесі клінічної патології.
Бажані ефекти лікування містять у собі без обмеження запобігання виникнення або повторення захворювання, ослаблення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазування, зменшення швидкості прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення патологічного стану та ремісію або поліпшення прогнозу. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіла згідно з даним винаходом використовуються для затримки розвитку захворювання або вповільнення прогресування захворювання.
Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домену антитіла важкого або легкого ланцюга, що бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН і МІ, відповідно) нативного антитіла, як правило, характеризуються аналогічними структурами, при цьому кожен домен містить чотири консервативні каркасні області (ЕК) і три гіперваріабельні області (НУК). (Дивитеся, наприклад,
Кіпаї еї аІ. Кибу Іттипої!оду, 61Ій ейд., М.Н. Егеетап апа Со., раде 91 (2007)). Єдиного домена УН або Мі. може бути досить для надання антигенсполучної специфічності. Крім того, антитіла, які зв'язуються з конкретним антигеном, можуть бути виділені з використанням доменів УН або МІ. з антитіла, що зв'язується з антигеном для скринінгу бібліотеки комплементарних доменів МІ. або МН, відповідно. Дивитеся, наприклад, Рогіоїапо еї аїЇ., У. Іттипої. 150:880-887 (1993);
Сіаікзоп еї аї., Майте 352:624-628 (1991).
Використовуваний у даному документі термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної до поширення іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Цей термін містить у собі вектор як самореплікуючу структуру нуклеїнових кислот, а також вектор включений у геном клітини-хазяїна, в яку він був уведений. Певні вектори здатні регулювати експресію нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори називаються в даному документі "експресуючі вектори".
Термін "алкіл" означає С1-Сів вуглеводень, що містить нормальні, вторинні, третинні або циклічні атоми вуглецю. Приклади являють собою метил (Ме, -СНз), етил (Еї, -«СНеСнНаз), 1-пропіл (п-Рг, н-пропіл, -«СНаСНеСН»з), 2-пропіл (іІ-Рг, ізопропіл, -СН(СНз)г), 1-бутил (п-Ви, н-бутил, -
СНеСнН.сСНснН»), 2-метил-1-пропіл (і-Ви, ізобутил, -СНаСН(СНвЗз)2), 2-бутил (5-Ви, втор-бутил, - снН(Снз)СнНосСнН»), 2-метил-2-пропіл (Ї-Ви, трет-бутил, -С(СНз)з), 1-пентил (н-пентил, - 60 0 СНСнН.СНсСНеснН»), 2-пентил (-СН(СНз)СН.СНесСнН»), З-пентил (-СН(СНеСНЗ)»2), 2-метил-2-бутил
(-С(СНнз)2СНеснН»), З-метил-2-бутил (-СН(СНЗІСН(СНВЗ)г), З-метил-1-бутил (-СНаСНоСН(СнНЗз)»2), 2- метил-1І-бутил (-СНаСН(СНаз)СН»СН:І), ї1-гексил о (-СНа.СНа.СНо.СНоСНоСН»), 2-гексил о /(- сн(СНз)СнНесСнНсСНнеснН З), З-гексил (ісСн(сСнсСНнІуХсСНнсСНнесН)), 2-метил-2-пентил (- с(Снз)28СНаСНоСН:), З-метил-2-пентил о (-СН(СНз)СнН(СНз)СнНоСІ:з), 4-метил-2-пентил о /(- СнН(СНЗСН.сН(СН З) »), З-метил-3-пентил (С(СНзуСНнеСН з) 2), 2-метил-3-пентил (-
СснН(СН.СНз)СН(СНЗзі)г6), 0 2,3-диметил-2-бутил о (-С(СНз)»СН(СНз)г6), З,З-диметил-2-бутил /(-
СН(СНаІС(СН з).
Використовуваний у даному документі термін "С1і-Св алкіл" відноситься до прямого або розгалуженого ланцюга, насиченого або ненасиченого вуглеводня, що містить від 1 до 8 атомів вуглецю. Типові "С1-Св алкільні" групи містять у собі без обмеження -метил, -етил, н-пропіл, н- бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-ноніл і н-децил; у той час як розгалужені С1-Св- алкіли містять у собі без обмеження -ізопропіл, втор-бутил, -ізобутил, трет-бутил, -ізопентил, 2- метилбутил, ненасичені Сі-Св алкіли містять у собі без обмеження -вініл, -аліл, -1-бутеніл, -2- бутеніл, -ізобутеніл, -1-пентеніл, -2-пентеніл, З-метил-1-бутеніл, -2-метил-2-бутеніл, -2,3- диметил-2-бутеніл, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, -ацетиленіл, -пропініл, -1-бутиніл, -2-бутиніл, -1- пентиніл, -2-пентиніл, -З-метил-1-бутиніл. Алкільна група Сі-Св може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, що включають у себе без обмеження -С1-Св-алкіл, -
О-(С1-Св-алкіл), арил, -С(О)В", -ОС(О)В", -С(О)ОВ", -«С(О)МН», -«С(О)МНЕ", -«С(О)М(В)2-МНОС(ОВ, -
ЗОЗ -5(0)28", -5(О)НВ", -ОН, галоген, -Мз, -МНег, -МН(В"), -М(А)» і -СМ; де кожний ЕК незалежно вибирають з Н, -С1-Св-алкілу й арилу.
Використовуваний у даному документі термін "С1-С12 алкіл" відноситься до прямого або розгалуженого ланцюга, насиченого або ненасиченого вуглеводня, що містить від 1 до 12 атомів вуглецю. С1-С1і2 алкільна група може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, що включають у себе без обмеження -С1-Св-алкіл, -0-(С1-Св-алкіл), арил, -
Ф(О)В, -ОФ(О)В -С(О)0Н, -С(О)МН»:, -С(О)МНА -С(О)М(А)2-МНО(О)В, -5О38, -550)28", -
З(О)В", -ОН, галоген, -Мз, -МН», -«МН(В'), -М(А)» і -СМ; де кожний ЕК" незалежно вибраний з Н, -С1-
Св алкілу й арилу.
Використовуваний у даному документі термін "Сі-Сє алкіл" відноситься до прямого або розгалуженого ланцюга, насиченого або ненасиченого вуглеводня, що містить від 1 до 6 атомів
Зо вуглецю. Типові "Сі-Св алкільні" групи містять у собі без обмеження -метил, -етил, -н-пропіл, -н- бутил, -н-пентил і -н-гексил; у той час як розгалужені С1-Св алкіли містять у собі без обмеження -ізопропіл, втор-бутил, -ізобутил, -трет-бутил, -ізопентил і 2-метилбутил; ненасичені Сі-Св алкіли містять у собі без обмеження -вініл, -аліл, -1-бутеніл, -2-бутеніл і -ізобутеніл, -1-пентеніл, -2- пентеніл, -З-метил-1-бутеніл, -2-метил-2-бутеніл, -2,3-диметил-2-бутеніл, 1-гексил, 2-гексил і 3- гексил. Сі-С6є алкільна група може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, як описано вище для С.:-Св-алкільної групи.
Використовуваний у даному документі термін "Сі-С4 алкіл" відноситься до прямого або розгалуженого ланцюга, насиченого або ненасиченого вуглеводня, що містить від 1 до 4 атомів вуглецю. Типові "С1-Са алкільні" групи містять у собі без обмеження -метил, -етил, -н-пропіл, -н- бутил; у той час як розгалужені Сі-С4-алкіли містять у собі без обмеження -ізопропіл, -втор- бутил, -ізобутил, -трет-бутил; ненасичені Сі-С4-алкіли містять у собі без обмеження -вініл, -аліл, -1-бутеніл, -2-бутеніл і -ізобутеніл. Сі-С4-алкільна група, може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, як описано вище для С.:-Св-алкільної групи.
Термін "алкокси" являє собою алкільну групу, окремо приєднану до атома кисню.
Ілюстративні алкоксигрупи містять у собі без обмеження метокси (ОСНз) і етокси (-ОСНеСН5З). "Сі-Свалкокси" являє собою алкоксигрупу, що містить від 1 до 5 атомів вуглецю. Алкоксигрупи можуть бути не заміщеними або заміщеними однією або декількома групами, як описано вище для алкільних груп.
Термін "алкеніл" являє собою С2-Сів вуглеводень, що містить нормальні, вторинні, третинні або циклічні атоми вуглецю щонайменше з одним сайтом не насиченості, тобто з вуглець- вуглецевим, 5р? подвійним зв'язком. Приклади містять у собі без обмеження: етилен або вініл (-
СН-СН»), аліл -СНЕСН-СНа»), циклопентеніл (-СвіН?7), і 5-гексеніл (-ЄНеЕСНа.СнН.СнНСН-СН»). "Сео-
Св алкеніл" являє собою вуглеводень, що містить від 2 до 8 нормальних, вторинних, третинних або циклічних атомів вуглецю щонайменше з одним сайтом не насиченості, тобто з вуглець- вуглецевим, 5р2 подвійним зв'язком.
Термін "алкініл" являє собою С2-Сів вуглеводень, що містить нормальні, вторинні, третинні або циклічні атоми вуглецю щонайменше з одним сайтом не насиченості, тобто з вуглець- вуглецевим, 5р потрійним зв'язком. Приклади містять у собі без обмеження: ацетилен (-СЕСН)і пропаргіл (-СНаСЕСН). " Со-Св алкініл" являє собою вуглеводень, що містить від 2 до 8 нормальних, вторинних, третинних або циклічних атомів вуглецю щонайменше з одним сайтом не насиченості, тобто з вуглець-вуглецевим, 5р потрійним зв'язком. "Алкілен" відноситься до насиченого, розгалуженого або прямого ланцюга або циклічного вуглеводневого радикалу, що містить 1-18 атомів вуглецю, і містить два одновалентних радикальних центри, отриманих шляхом видалення двох атомів водню з того самого або двох різних атомів вуглецю вихідного алкану. Типові алкіленові радикали містять у собі без обмеження: метилен (-СНе-) 1,2-етил. (-СНаСНе-), 1,3-пропіл. (-СНаСНеСнН»-), 1,4-бутил (-
СНСНеСНеСН,»-) і тому подібне. "Сі-Сіо-алкілен" являє собою прямий ланцюг, насичену вуглеводневу групу з формулою - (СНг)і-ло-. Приклади С1-Сіо алкілену містять у собі метилен, етилен, пропілен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, оцитилен, нонілен і декален. "Алкенілен" відноситься до ненасиченого, розгалуженого або прямого ланцюга або циклічного вуглеводневого радикалу з 2-18 атомів вуглецю, і містить два одновалентних радикальних центри, отриманих видаленням двох атомів водню з того самого або двох різних атомів вуглецю вихідного алкену. Типові алкеніленові радикали містять у собі без обмеження: 1,2-етилен (-СН-СН-). "Алкінілен" відноситься до ненасиченого, розгалуженого або прямого ланцюга або циклічного вуглеводневого радикалу з 2-18 атомів вуглецю, і містить два одновалентних радикальних центри, отриманих шляхом видалення двох атомів водню з того самого або двох різних атомів вуглецю вихідного алкіну. Типові алкініленові радикали містять у собі без обмеження: ацетилен (-СЕС-), пропаргіл (-СНгСЕС) і 4-пентиніл (-ЄНа2СНаСНгСЕС-).
Термін "арил" відноситься до карбоциклічної ароматичної групи. Приклади арильних груп містять у собі без обмеження феніл, нафтил й антраценіл. Карбоциклічна ароматична група або гетероциклічна ароматична група може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, що включають у себе без обмеження -С1-Св алкіл, -0-(С1-Св алкіл), арил, -
СО, -ОС(О)В', -С(О)ОВ -С(О)МН», -С(О)МНА", -С(О)М(А)2-МНОС(ОВ, -5(0)28", -5(О)8", -ОН, галоген, -Мз, -МН», -МН(В), -М(А)» ії -СМ; де кожний ЕК" незалежно вибирають з Н, -С1-Св алкілу й арилу. "бС5-Сго арил" являє собою арильну групу з 5-20 атомами вуглецю в карбоциклічних
Зо ароматичних кільцях. Приклади С5-Сго арильних груп містять у собі без обмеження феніл, нафтил й антраценіл. С5-Сго арильна група може бути заміщеною або не заміщеною, як описано вище для арильних груп. "С5-С1і4 арил" являє собою арильну групу з 5-14 атомами вуглецю в карбоциклічних ароматичних кільцях. Приклади С5-Сі4 арильних груп містять у собі без обмеження феніл, нафтил й антраценіл. С5-Сі4 арильна група може бути заміщеною або не заміщеною, як описано вище для арильних груп. "Арилен" являє собою арильну групу, що містить два ковалентні зв'язки та може бути в орто- , мета- або пара-конфігурації, як показано на наступних структурах: т й ; » з з у яких фенільна група може бути не заміщеною або заміщеною до чотирьох груп, містячи в собі без обмеження -С1-Св алкіл, -0-(С1-Св алкіл), -арил, -С(О)В", -ОС(О)В", -С(О)ОНВ", -С(О)МН», -
С(ОМНЕА", -«С(ОМ(А)2-МНО(О)В", -5(0)28", -5(0) 8", -ОН, галоген, -Мз, -МН», -МН(В), -М(А)» і -СМ; де кожний К" незалежно вибирають з Н, -С:1-Св алкілу й арилу. "Арилалкіл" відноситься до ациклічного алкільного радикалу, в якому один із атомів водню, пов'язаних із атомом вуглецю, зазвичай кінцевим або 5р3 атомом вуглецю, заміщений арильним радикалом. Типові арилалкільні групи містять у собі без обмеження бензил, 2-фенілетан-1-іл, 2- фенілетен-1-іл, нафтилметил, 2-нафтилетан-і-іл, 2-нафтилетен-1-іл, нафтобензил, 2- нафтофенілетан-1-іл і тому подібне. Арилалкільна група містить від б до 20 атомів вуглецю, наприклад, алкільний фрагмент, що включає в себе алканільні, алкенільні або алкінільні групи, арилалкільна група становить від 1 до 6 атомів вуглецю й арильний фрагмент становить від 5 до 14 атомів вуглецю. "Гетероарилалкіл" відноситься до ациклічного алкільного радикалу, в якому один із атомів водню, пов'язаних із атомом вуглецю, зазвичай термінальним або 5р3 атомом вуглецю, заміщений гетероарильним радикалом. Типові гетероарилалкільні групи містять у собі без обмеження 2-бензімідазолілметил, 2-фурилетил і тому подібне. Гетероарилалкільна група містить від б до 20 атомів вуглецю, наприклад, алкільний фрагмент, що включає в себе алканільну, алкенільну або алкінільну групи, гетероарилалкільна група становить від 1 до 6 атомів вуглецю та гетероарильний фрагмент становить від 5 до 14 атомів вуглецю та від 1 до З гетероатомів, вибраних із М, 0, Р і 5. Гетероарильний фрагмент гетероарилалкільної групи можуть являти собою моноцикл, що містить від З до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю) або біцикл, що містить від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю та від 1 до З гетероатомів, вибраних із М, ОС, Р, і 5), наприклад: біцикло |4,51, (5,51, (5,6) або 6,6) система.
Термін "заміщений алкіл", "заміщений арил" і "заміщений арилалкіл" означає алкіл, арил й арилалкіл, відповідно, в яких один або декілька атомів водню, кожний незалежно замінений замісником. Типові замісники містять у собі без обмеження -Х, -В, -О", -ОВ, -58, -5, -МА», -МАз, -МА, -СХз, -СМ, -ОСМ, -5СМ, -М-0-0, -МО5, -МО, -МО», -М»2, Мз, МС(-О)В, -С(-О)8, -С(-О)МН, -
Оз, -5О3Н, -5(-0)28, -05(-О)гог, -5(-0)2МА, -5(-0)8, -«ОР(-ОХОР)», -РІ-ОХОВ)», -РОз, -РОзН», -Ф(-0)8, -ФК(-ОХ, -С(-5)8, -СО28, -бО2, -0(-530О8, -С0(-0)58, -С(-5)58, -С(-О)МА», -С(-5)МН», -С(-МА)МВ», де кожний Х незалежно являє собою галоген: Е, СІ, Вг або І; і кожний К незалежно являє собою Н, С2-Сів алкіл, Св-Сго арил, Сз-Сі4 гетероцикл, захисну групу або фрагмент проліків. Описані вище алкіленова, алкеніленова й алкініленова групи можуть також бути заміщені аналогічно.
Термін "гетероарил" і "гетероцикл" відноситься до кільцевої системи, в якій один або декілька атомів у кільці являють собою гетероатом, наприклад азот, кисень та сірку.
Гетероциклічний радикал містить від З до 20 атомів вуглецю та від 1 до З гетероатомів, вибраних із М, О, Р і 5. Гетероцикл може являти собою моноцикл, що містить від З до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю та від 1 до З гетероатомів, вибраних із М, О, Р, і 5), або біцикл, що містить від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю та від 1 до З гетероатомів, вибраних із М, О, Р і 5), наприклад: біцикло І4,51, (5,51, 5,61 або І|б,6) система.
Ілюстративні гетероцикли описані, наприклад, в Радиейе, Гео А., "Ргіпсіріез ої Модегп
Неїегосусіїс Спетівігу" (М.А. Вепіатіп, Мем МогКк, 1968), зокрема, у главах 1, 3, 4,6, 7 і 9; "Те
Спетівігу ої Неїегосусіїс Сотроипавз, А зегієз ої Мопоагарнв" (Чонп У/Іеу 5 5оп5, Мем ХОоїК, 1950 о ргезепі), іп рапісшаг МоЇитез 13, 14,16, 19, апа 28; апа». Ат. Спет. бос. (1960) 82:5566.
Приклади гетероциклів містять у собі як приклад без обмеження піридил, дигідропіридил, тетрагідропіридил (піперидил), тіазоліл, тетрагідротіофеніл, окислений сіркою тетрагідротіофеніл, піримідиніл, фураніл, тієніл, піроліл, піразоліл, імідазоліл, тетразоліл, бензофураніл, тіанафталеніл, індоліл, індоленіл, хінолініл, ізохінолініл, бензімідазоліл, піперидиніл, 4-піперидоніл, піролідиніл, 2-піролідоніл, піролініл, тетрагідрофураніл, біс- тетрагідрофураніл, тетрагідропіраніл, біс-тетрагідропіраніл, тетрагідрохіноліл, тетрагідроізохінолініл, декагідрохінолініл, октагідроізохінолініл, азоциніл, триазиніл, 6Н-1,2,5- тіадіазиніл, 2Н, бН-1,5,2-дитіазиніл, тієніл, тіантреніл, піраніл, ізобензофураніл, хроменіл, ксантеніл, феноксатиніл, 2Н-піроліл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, піразиніл, піридазиніл, індолізиніл, ізоїіндоліл, ЗН-індоліл, 1Н-індазоліл, пуриніл, 4Н-хінолізиніл, фталазиніл, нафтиридиніл, хіноксалініл, хіназолініл, циннолініл, птеридиніл, 4анН-карбазоліл, карбазоліл, ДВ-карболініл, фенантридиніл, акридиніл, піримідиніл, фенантролініл, феназиніл, фенотіазиніл, фуразаніл, феноксазиніл, ізохроманіл, хроманіл, імідазолідиніл, імідазолініл, піразолідиніл, піразолініл, піперазиніл, індолініл, ізоіндолініл, хінуклідиніл, морфолініл, оксазолідиніл, бензотриазоліл, бензизоксазоліл, оксіндоліл, бензоксазолініл й ізатиноїл.
Як приклад і без обмеження зв'язані з вуглецем гетероцикли приєднані у положенні 2, 3, 4, 5 або 6 піридину, у положенні 3, 4, 5 або 6 піридазину, у положенні 2, 4, 5 або 6 піримідину, у положенні 2, 3, 5 або 6 піразину, у положенні 2, 3, 4 або 5 фурану, тетрафурану, тіофурану, тіофену, піролу або тетрагідропіролу, у положенні 2, 4 або 5 оксазолу, імідазолу або тіазолу, у положенні 3, 4 або 5 ізоксазолу, піразолу або ізотіазолу, у положенні 2 або З азиридину, у положенні 2, З або 4 азетидину, у положенні 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 хіноліну або у положенні 1, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 ізохіноліну. Ще більш типово гетероцикли, з'єднані з вуглецем, містять у собі 2- піридил, З-піридил, 4-піридил, 5-піридил, б-піридил, З-піридазиніл, 4-піридазиніл, 5-піридазиніл, б-піридазиніл, 2-піримідиніл, 4-піримідиніл, 5-піримідиніл, б-піримідиніл, 2-піразиніл, З-піразиніл,
Б-піразиніл, б-піразиніл, 2-тіазоліл, 4-тіазоліл або 5-тіазоліл.
Як приклад і без обмеження зв'язані з азотом гетероцикли приєднані у положенні 1 азиридину, азетидину, піролу, піролідину, 2-піроліну, З-піроліну, імідазолу, імідазолідину, 2- імідазоліну, З-імідазоліну, піразолу, піразоліну, 2-піразоліну, З-піразоліну, піперидину, піперазину, індолу, індоліну, 1 Н-індазолу, у положенні 2 ізоіндолу або ізоіндоліну, у положенні 4 морфоліну та положенні У карбазолу або В-карболіну. Ще більш типово, зв'язані з азотом гетероцикли містять у собі 1-азиридил, 1-азетедил, 1-піроліл, 1-імідазоліл, 1-піразоліл і 1- піперидиніл. "Сз-Св гетероцикл" відноситься до ароматичного або не ароматичного Сз-Св карбоциклу, в бо якому від одного до чотирьох атомів вуглецю в кільці незалежно заміщені гетероатомом із групи, що складається з 0, 5 і М. Репрезентативні приклади Сз-Св гетероциклу містять у собі без обмеження бензофураніл, бензотіофен, індоліл, бензопіразоліл, кумариніл, ізохінолініл, піроліл, тіофеніл, фураніл, тіазоліл, імідазоліл, піразоліл, триазоліл, хінолініл, піримідиніл, піридиніл, піразиніл, піридоніл, піридазиніл, ізотіазоліл, ізоксазоліл і тетразоліл. Сз-Св гетероцикл може бути не заміщеним або заміщеним аж до семи груп, містячи в собі без обмеження -С.1-Св алкіл, -
О-(С1-Св алкіл), -арил, -С(О)В, -ОС(О)В -С(О)ОВ, -С(О)МН», -«С(О)МНА", -«С(ОМ(А)2-МНО(ОВ, -(0)28 -5(0)8, -ОН, галоген, -Мз, -МНг, -МН(В), -М(В')2 і -СМ; де кожний К' незалежно вибирають з Н, -С1-Св алкілу й арилу. "Сз-Св гетероцикло" відноситься до визначеної вище Сз-Св гетероциклічної групи, в якій один із атомів водню гетероциклічної групи заміщений зв'язком. Сз-Св гетероцикло може бути не заміщеним або заміщеним аж до шести груп, містячи в собі без обмеження -С1-Св алкіл, -О-(С1-
Св алкіл), -арил, -С(О)В -ОС(О)В -С(О)ОВ -С(О)МН», -С(О)МНЕА", -С(О)М(А)2-МНОС(ОВ, -
З(О)28 -5(0)8, -ОН, галоген, -Мз, -МНег, -МН(В"), -М(А)»2 ії -СМ; де кожний К' незалежно вибирають з Н, -С1-Св алкілу й арилу. "Сз-Сго гетероцикл" відноситься до ароматичного або не ароматичного Сз-Св карбоциклу, в якому від одного до чотирьох атомів вуглецю в кільці незалежно заміщені гетероатомом із групи, що складається з 0, 5 і М. Сз-Сго гетероцикл може бути не заміщеним або заміщеним аж до семи груп, містячи в собі без обмеження -С1-Св алкіл, -0-(С1-Св алкіл), -арил, -С(О)В", -
ОС(О)В', -С(ООВ, -С(О)МН», -С(О)МНЕА", -«С(ОМ(А)2-МНО(О)В", -5(0)28, -5(О)НВ, -ОН, галоген, -
Мз, -МН»е, -МН(РЕ"), -М(А)» і -СМ; де кожний ЕК" незалежно вибирають з Н, -С1-Св алкілу й арилу. "Сз-Сго гетероцикло" відноситься до визначеної вище Сз-Сго гетероциклічної групи, в якій один із атомів водню гетероциклічної групи замінений зв'язком. "Карбоцикл" означає насичене або ненасичене кільце, що містить від З до 7 атомів вуглецю як моноцикл або від 7 до 12 атомів вуглецю в якості біцикла. Моноциклічні карбоцикли містять від З до 6 кільцевих атомів, ще більш типово від 5 до 6 атомів у кільці. Біциклічні карбоцикли містять від 7 до 12 атомів у кільці, наприклад, розташовані як біцикло І4,51, (5,51, І5,61| або (6,6) система або 9, або 10 кільцевих атомів, розташовані як біцикло І5,6)| або Іб,б| система.
Приклади моноциклічних карбоциклів містять у собі циклопропіл, циклобутил, циклопентил, 1- циклопент-1-еніл, 1-циклопент-2-еніл, 1-циклопент-З-еніл, циклогексил, 1-циклогекс-1-еніл, 1-
Зо циклогекс-2-еніл, 1-циклогексо-3-еніл, циклогептил і циклооктил. "Сз-Св карбоцикл" являє собою 3-, 4-, 5-, 6-, 7- або 8--ленне насичене або ненасичене неароматичне карбоциклічне кільце. Репрезентативні Сз-Св карбоцикли містять у собі без обмеження -циклопропіл, -циклобутил, -циклопентил, -циклопентадієніл, -циклогексил, - циклогексеніл, -1,3-циклогексадієніл, -1,4-циклогексадієніл, -циклогептил, -1,3-циклогептадієніл, -1,3,5-циклогептатриєніл, -циклооктил і -циклооктадієніл. Сз-Св карбоциклічна група може бути не заміщеною або заміщеною однією або декількома групами, що включають в себе без обмеження -С1-Св алкіл, -О-(С1-Св алкіл), арил, -С(О)В8 -ОС(О)В -С(0О)ОВ, -С(О)МН», -
С(ОМНЕА", -«С(ОМ(А)2-МНО(О)В", -5(0)28", -5(0) 8", -ОН, галоген, -Мз, -МН», -МН(В), -М(А)» і -СМ; де кожний К" незалежно вибирають з Н, -С:1-Св алкілу й арилу. "Сз-Св карбоцикло" відноситься до визначеної вище Сз-Свя карбоциклічної групи, в якій один із атомів водню карбоциклічних груп заміщений зв'язком. "Лінкер" відноситься до хімічного фрагмента, що містить ковалентний зв'язок або ланцюг атомів, які ковалентно прикріплюють антитіло до фрагмента лікарського засобу. Відповідно до різних варіантів здійснення лінкери містять у собі такий двовалентний радикал, як алкілдіїл, арилдіїл, гетероарилдіїл, такі фрагменти, як: -(САг)0О(СКг)», що повторюються одиниці алкілокси (наприклад поіетиленокси, ПЕГ, поліеєтилененокси) і алкіламіно (наприклад поліетиленаміно, Чейатіпе"М); і складні ефіри й аміди двоосновних кислот, що включають у себе сукцинат, сукцинамід, дигліколеву кислоту, малонову кислоту та капроамід. Відповідно до різних варіантів здійснення лінкери можуть містити один або декілька амінокислотних залишків, таких як валін, фенілаланін, лізин, і гомолізин.
Термін "хіральний" відноситься до молекул, які мають властивість несумісності дзеркального зображення партнера, у той час як термін "ахіральний" відноситься до молекул, які сполучаються з їхнім дзеркальним відображенням партнера.
Термін "стереоіїзомери" відноситься до сполук, які характеризуються однаковим хімічним складом, але відрізняються відносно розташування атомів або груп у просторі. "Діастереомер" відноситься до стереоіїзомера з двома або більше центрами хіральності, і чиї молекули не являють собою дзеркальні відображення один одного. Діастереомери характеризуються різними фізичними властивостями, наприклад, точками плавлення, точками кипіння, спектральними властивостями й реактивностями. Суміші діастереомерів можна розділити за допомогою аналітичних процедур із високим дозволом, таких як електрофорез і хроматографія. "Енантіомери" відносяться до двох стереоізомерів сполуки, які не являють собою дзеркальні відбиття один одного.
Стереохімічні визначення й угоди, які використовують в даному документі, як правило, випливають з 5. Р. РаїКкег, Ед., МеОгам"-НІЇ Оістопагу ої Спетіса! Тепт5 (1984) МсаСтгам-НІЇ ВоокК
Сотрапу, Мем МогкК; і Еїеї, Е. апа Уміеп, 5., Зегеоспетівігу ої Огдапіс Сотрошипазх (1994) допп
УМіеу 5 Боп5, Іпс., Мем/ МогК. Багато органічних сполук існують в оптично активних формах, тобто вони мають здатність обертати площину плоскополяризованого світла. В описі оптично активної сполуки префікси ОО і Її або К і 5 використовуються для позначення абсолютної конфігурації молекули відносно її хірального центра (центрів). Префікси й і І або (ю) і (-) використовуються для позначення знака обертання плоскополяризованого світла сполукою, причому (-) або 1 означає, що сполука є лівообертальною. Сполука з префіксом (8 або а є правообертальною. Для даної хімічної структури ці стереоїзомери характеризуються ідентичністю, за винятком того, що вони являють собою дзеркальні відбиття один одного.
Конкретний стереоіїзомер може також згадуватися як енантіомер, і суміш таких ізомерів часто називають енантіомерною сумішшю. Суміш енантіомерів 50:50 називають рацемічною сумішшю або рацематом, яка може бути там, де не було стереоселекції або стереоспецифічності в хімічній реакції або процесі. Терміни "рацемічна суміш" і "рацемат" відносяться до еквімолярної суміші двох енантіомерних видів, позбавлених оптичної активності. "Заміщувана група" відноситься до функціональної групи, яка може бути замінена іншою функціональною групою. Деякі заміщувані групи, добре відомі в даній області техніки, і приклади містять у собі без обмеження галогенід (наприклад, хлорид, бромід, йодид), метансульфонілхлорид (мезил), п--олуолсульфоніл (тозил), трифторметилсульфоніл (трифлат) і трифторметилсульфонат.
Термін "захисна група" відноситься до замісника, який зазвичай використовують для блокування або захисту конкретної функціональності у процесі взаємодії інших функціональних груп на сполуці. Наприклад, "аміно-захисна група" являє собою замісник, приєднаний до аміногрупи, який блокує або захищає функціональну аміногрупу в сполуці. Підходящі
Зо амінозахисні групи містять у собі без обмеження ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбоніл (ВОС), бензилоксикарбоніл (СВ) і 9-флуоренілметиленоксикарбоніл (Етос). Для загального опису захисних груп та їх використання дивитеся Т. МУ. Сгеепе, Ргоїесіїме Ссгоцирз5 іп Огдапіс
Зупіпеві5, дхопп Уміеу 5 5оп5, Мем/ ХогК, 1991, або більш пізніше видання.
ІІ. Композиції та способи
Відповідно до одного аспекту даний винахід заснований, частково, на антитілах, які зв'язуються з І убЕ, і імунокон'югатах, що містять такі антитіла. Антитіла й імунокон'югати згідно з даним винаходом застосовні, наприклад, для діагностики або лікування ГубЕ-позитивних злоякісних пухлин.
А. Приклади антитіл до І убЕ
Відповідно до деяких варіантів здійснення в даному винаході передбачені виділені антитіла, які зв'язуються з ІубЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло до ІУбЕ характеризується наявністю щонайменше однієї або декількох із наступних характеристик у будь-якій комбінації: (а) зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в ЗЕО ІЮО МО: 1ЇЇ (Б) зв'язується з ГГ убЕ з афінністю х 7 нМ або «х 6 нМ, або «х 5 нМ, або х 4 нМ, або «х З нМ, або «2 НМ, або х 1 нМ, і, необов'язково, 2 0,0001 нМ, або 2 0,001 нМ, або 2 0,01 нМ, що виміряне за допомогою аналізу або 5РЕ, або Скетчарда.
Не обмежуюче ілюстративне антитіло згідно з даним винаходом являє собою мишаче 9812, як показано на фіг. 4-6, і такі його гуманізовані варіанти, як, наприклад, пи9812.м12, як показано на фіг. 4-6. Відповідно до деяких варіантів здійснення ГубЕ являє собою людський ІУбЕ.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ГУбЕ вибирають з ГубЕ людини, макаки, макаки- резусу, миші або пацюка.
Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло до І убЕ зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5БЕО ІО МО: 1. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення даного винаходу антитіло до ГубЕ зв'язується з ГубЕ з афінністю х 7 нМ, або «х 6 нМ, або «х 5 нМ, або х 4 НМ, або х З НМ, або х 2 нМ, або х 1 нМ, і, необов'язково, 2 0,0001 нМ або 2 0,001 нМ, або » 0,01 нМ, що виміряне за допомогою аналізу або ЗРК, або Скетчарда. Не обмежуюче ілюстративне антитіло згідно з даним винаходом являє собою мишаче 9812, як показано на фіг. 4-6, і такі його гуманізовані варіанти, як, наприклад, пи9В12.м12, як показано на фіг. 4-6.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ГубЕ являє собою людський ГубЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення І убЕ являє собою людський І убЕ або І убЕ макаки.
Відповідно до одного аспекту в даному винаході передбачене антитіло до ГубЕ, що містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУЕ, вибраних із: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕС 10 МО: 10; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 11; (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 12; (8) НМВА-І1, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 7; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 8; ії (3 НМА-І 3, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ПО МО: 9.
Відповідно до одного аспекту в даному винаході передбачене антитіло, яке містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НУК УН, вибрані з: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 10; (Б) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 11; ї (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 12. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 12. Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло містить НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО: 12, ї НМК-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9. Відповідно до додаткового варіанта здійснення антитіло містить НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 12, НМАК-І 3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО МО: 9, Її НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 11. Відповідно до додаткового варіанта здійснення антитіло містить (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІО МО: 10; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕБЕО ІО МО: 11; ї (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12.
Відповідно до іншого аспекту в даному винаході передбачене антитіло, яке містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НУК МІ, вибрані з: (а) НМА-11, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 7; (Б) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 8; і (с) НМА-І-3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло містить (а) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 7; (в) НМАК-12, що містить амінокислотну послідовність
Зо ЗЕО ІЮО МО: 8; і (с) НМА-І-3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до іншого аспекту антитіло згідно з даним винаходом містить (а) домен МН, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМК УН, вибрані з (і)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІО МО: 10, (ії) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ І МО: 11, і (її) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕБЕО ІЮО МО: 12; і (Б) домен МІ, що містить щонайменше одну, щонайменше дві або всі три послідовності НМА Мі, вибрані з (ї) НМА-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7, (ії) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 8, і (с) НМА-І-3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до іншого аспекту в даному винаході передбачене антитіло, яке містить (а) НМЕ-
НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО І МО: 10; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕБЕО 10 МО: 11; (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12; (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 7; (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІО МО: 8; і () НМА-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 9.
Відповідно до деяких варіантів здійснення будь-яка одна або декілька амінокислот передбаченого вище антитіла до І убЕ заміщається в наступних положеннях НМЕ:
Відповідно до будь-якого зі зазначених вище варіантів здійснення антитіло до ГубЕ є гуманізованим. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до ГубЕ містить НМЕ, як у будь-якому зі зазначених вище варіантів здійснення, і додатково містить акцепторну каркасну область людини, наприклад, каркасну область імуноглобуліну людини або консенсусну каркасну область людини. Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло до І убЕ містить НУК, як у будь-якому зі зазначених вище варіантів здійснення, і воно додатково містить послідовність ЕК2 каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 20 або ЕКЗ каркасної області варіабельного домена легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 21, або ЕКІ каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 23, або ЕК2 каркасної області варіабельного домена важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 24.
Відповідно до іншого аспекту антитіло до ГубЕ містить послідовність варіабельного домена (МН) важкого ланцюга, що характеризується ідентичністю послідовності, рівною щонайменше 90 9, 91 Фо, 92 95, 93 У, 94 95, 95 У, 96 95, 97 ФУ, 98 У, 99 9о або 100 95, стосовно амінокислотної 60 послідовності 5хЕО ІЮ МО: 5. Відповідно до деяких варіантів здійснення послідовність МН, що характеризується ідентичністю, рівною щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 Уо, 93 Уо, 94 95, 95 Фо, 96 9о, 97 95, 98 95 або 99 95, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції, стосовно еталонної послідовності, але антитіло до І убЕ, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з ГубЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот замінені, вставлені та/або вилучені в 5ХЕО ІЮ МО: 5. Відповідно до деяких варіантів здійснення заміни, вставки або делеції відбуваються в областях поза НМК (тобто в ЕК).
Необов'язково, антитіло до ГуУбЕ містить послідовність МН в ЗЕБЕО ІЮ МО: 5, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. Відповідно до конкретного варіанта здійснення
МН містить одну, дві або три НМЕК, вибрані з: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 10, (Б) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 11, ї (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 12.
Відповідно до іншого аспекту передбачене антитіло до ГубЕ, причому антитіло містить варіабельний домен (МІ) легкого ланцюга, що характеризується ідентичністю послідовності, що становить щонайменше 90 92, 91 9», 92 9, 93 У, 94 Фо, 95 9, 96 Фо, 97 9Уо, 98 9», 99 95, або 100 95, стосовно амінокислотної послідовності зЕО ІО МО: 3. Відповідно до деяких варіантів здійснення послідовність МІ, що характеризується ідентичністю, що становить щонайменше 90 95, 91 об, 92 96, 93 Ус, 94 95, 95 Уо, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95, містить заміни (наприклад, консервативні заміни), вставки або делеції, стосовно еталонної послідовності, але антитіло до ГУубЕ, що містить таку послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з І убЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот замінені, вставлені та/або вилучені в ЗЕО
ІО МО: 3. Відповідно до деяких варіантів здійснення заміни, вставки або делеції відбуваються в областях поза НМК (тобто в ЕК). Необов'язково, антитіло до ІГУубЕ містить послідовність МІ. в
ЗБО ІЮ МО: 3, у тому числі посттрансляційні модифікації цієї послідовності. Відповідно до конкретного варіанта здійснення МІ. містить одну, дві або три НУК, вибрані з (а) НМА-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ОО МО: 7; (Б) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 8; і (с) НМК-1І 3, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до іншого аспекту передбачене антитіло до ГубЕ, причому антитіло містить МН, як у будь-якому з наведених вище варіантів здійснення, і МІ, як у будь-якому з наведених вище варіантів здійснення. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло містить послідовності
Ко) МНІіМ в ЗЕО ІЮО МО: 5 і 5ЕО ІО МО: 3, відповідно, що включають у себе посттрансляційні модифікації цих послідовностей.
Відповідно до додаткового аспекту в даному винаході передбачене антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом, що й представлене в даному документі антитіло до ГубЕ. Наприклад, відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом, що й антитіло до ГубЕ, що містить послідовність МН в ЗЕО ІЮО МО: 5 і послідовність МІ. в ЗЕО ІЮ МО: 3. Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене антитіло, що зв'язується з епітопом у межах фрагмента ГГ УуУбЕ, що складається з амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ
МО: 1.
Відповідно до додаткового аспекту антитіло до ГубЕ відповідно до будь-якого зі зазначених вище варіантів здійснення являє собою моноклональне антитіло, що включає в себе химерне, гуманізоване або людське антитіло. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до І уУбЕ являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Бар, Рар', 5сЕм, діатіло або Е(ар')2-фрагмент.
Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло являє собою повнорозмірне антитіло, наприклад, інтактне антитіло Ідс1 або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному документі.
Відповідно до додаткового аспекту антитіло до ГубЕ відповідно до будь-якого зі зазначених вище варіантів здійснення може включати будь-яку з ознак окремо або в комбінації, як описано в розділах 1-7 нижче.
Аналізи
Щоб визначити, чи зв'язується антитіло до І убЕ з епітопом у межах амінокислот 21-131 в
ЗБОЮ МО: 1, ГубЕ поліпептиди з М- і С-кінцевими делеціями експресують у клітинах 293 і зв'язування антитіла з усіченими поліпептидами перевіряють за допомогою ЕАС5, причому істотне зниження (зниження 2 70 95) або усунення зв'язування антитіла з усіченим поліпептидом стосовно зв'язування з повнорозмірним ГІ убЕ, експресованим у клітинах 293, указує на те, що антитіло не зв'язується з цим усіченим поліпептидом.
Визначення того, що антитіло до І убЕ "зв'язується з афінністю х 6 нМ або «х 5 нМ, або «х 4
НМ, або х З НМ, або х 2 нМ, або х 1 нМ" проводять відповідно до аналізу Скетчарда, як описано в даному документі у прикладі 4. Альтернативно, афінність антитіла до ГубЕ може бути визначена у відповідності, наприклад, з аналізом ВіАсоге. Зокрема, Ка вимірюють з бо використанням поверхневого плазмонного резонансу з використанням ВіасогеФ-3000 (ВіІАсоге,
Іпс., Різсаїаулау, МО). Чипи СМ5 класу дослідження ВіАсоге "мМ активуються з реагентами 1-етил- 3-(З-диметиламінопропіл) карбодімід (ЕЮБС) і М-гідроксисукцинімід (МН) відповідно до інструкцій постачальника. Козячі (ДО до людських Ес приєднують до чипів, щоб досягти приблизно 10000 одиниць відгуку (КО) у кожному осередку потоку. Непрореагувавші з'єднані групи блокуються 1М етаноламіном. Для вимірів кінетики антитіла до ГубЕ захоплюються для досягнення приблизно 300 КИ. Дворазові серійні розведення людського ГубЕ (наприклад, амінокислоти 21-131, злиті з Ес-Ні5, експресовані в системі бакуловірусу, або амінокислоти 21- 131, злиті з Ес, експресовані в клітинах СНО; від 125 нМ до 0,49 нМ) вводять у буфер НВ5-Р (0,01 М НЕРЕЗ рн 7,4, 0,15 М Масі, 0,005 95 поверхнево-активна речовина Р20) при 25 С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв. Швидкості асоціації (Коп) і швидкості дисоціації (Кох) розраховуються з використанням моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 (програмне забезпечення оцінка ВіАсоге "м версії 3.2). Рівноважна константа дисоціації (Ка) розраховується як відношення Кок/Коп. Якщо швидкість асоціації перевищує 1056 М'с7, визначена за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу вище, тоді швидкість асоціації може бути визначена за допомогою техніки гасіння флуоресценції що вимірює збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флуоресценції (порушення -295 нм; емісія -340 нм, смуга пропущення 16 нм) при 2570 20 нМ антитіла до антигену (Гар-форма) в РВ5, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигену, що виміряне на спектрофотометрі, такому як спектрофотометр із зупинкою потоку (Амім Іпбігитепіх) або спектрофотометр 8000-й серії 5 М-Атіпсо?Ф (Тептозресігопіс) з коветою, що перемішує.
У будь-якому зі зазначених вище варіантів здійснення антитіло до ГубЕ є гуманізованим.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до ГубЕ містить НМЕК, як у будь-якому зі зазначених вище варіантів здійснення, і додатково містить акцепторну каркасну область людини, наприклад, каркасну область імуноглобуліну людини або консенсусну каркасну область людини. Відповідно до деяких варіантів здійснення акцепторна каркасна область людини являє собою людську консенсусну МГ. каппа ІМ каркасну область (Мі кім) і/и'або МН каркасну область МНІ.
Відповідно до додаткового аспекту даного винаходу антитіло до І убЕ відповідно до будь- якого зі зазначених вище варіантів здійснення являє собою моноклональне антитіло, у тому числі химерне, гуманізоване або людське антитіло. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до ГуУбЕ являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Раб, Рар', зсЕм, діатіло, або
Е(ав)г2-фрагмент. Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло являє собою, по суті, повнорозмірне антитіло, наприклад, антитіло Їдс1 або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному документі.
Відповідно до додаткового аспекту антитіло до ГубЕ відповідно до будь-якого зі зазначених вище варіантів здійснення може включати будь-яку з ознак, окремо або в комбінації, як описано в розділах 1-7 нижче.
Відповідно до додаткового аспекту даного винаходу антитіло до І убЕ відповідно до будь- якого зі зазначених вище варіантів здійснення являє собою моноклональне антитіло, що включає в себе людське антитіло. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до І убЕ являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Ем, Бар, Рар', 5сЕм, діатіло або Е(ар')2-фрагмент.
Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло являє собою, по суті, повнорозмірне антитіло, наприклад, антитіло ІдсС2а або антитіло іншого класу або ізотипу, як визначено в даному документі.
Відповідно до додаткового аспекту антитіло до ГубЕ відповідно до будь-якого зі зазначених вище варіантів здійснення може включати будь-яку з ознак, окремо або в комбінації, як описано в розділах 1-7 нижче. 1. Афінність антитіл
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло характеризується константою дисоціації (Ка), що становить «1 мкМ, «100 нМ, «10 нМ, «21 нМ,
БО 0,1 НМ, «0,01 нМ або «0,001 нМ, і, необов'язково, що становить 2 10-73 М. (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 1039 М до 1073 М, наприклад, від 1079 М до 10-13 М).
Відповідно до одного варіанта здійснення Ка вимірюють за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого антигену (КІА), виконаного з версією Бар антитіла, що представляє інтерес, і його антигену, за допомогою описаного наступного аналізу. Афінність зв'язування в розчині Бар для антигену вимірюється шляхом врівноважування Бар з мінімальною концентрацією (725І) міченого антигену в присутності серії титрування неміченого антигену, а потім захоплення зв'язаного антигену на покритій антитілом до Бар пластини (дивитеся, наприклад, Спеп еї аї., У. Мої. Віої. 293:865-881(1999)). Щоб створити умови для аналізу, мульти-луночні планшети МІСКОТІТЕКФ (Тпепгто Зсіепійіс) покривають на ніч захоплюючим бо антитілом до Раб у кількості 5 мкг/мл (Сарреї І ар) в 50 мМ карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокують 2 95 (маса/об'єм) бичачим сироватковим альбуміном в РВ5 протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 7С). На не адсорбуючому планшеті (Мипс й269620) 100 пМ або 26 пм ГІ) антигену змішують з серійними розведеннями Раб, що представляє інтерес (наприклад, відповідно до оцінки антитіла до МЕСЕ, Рар-12, в Ргезіа еї аї.,
Сапсег Рез. 57:4593-4599 (1997)). Раб, що представляє інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак, інкубація може тривати протягом більш тривалого періоду (наприклад, близько 65 годин), щоб гарантувати досягнення рівноваги. Після цього суміші переносять на захоплюючі планшети для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів з 0,1 95 полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-208) у РВ5.
Коли пластини висихають, додають 150 мкл/лунку сцинтилятору (МІСКОЗСІМТ-20 М: РаскКаго), і планшети розраховують на гамма-лічильнику ТОРСОШМТ" М (РаскКага) протягом десяти хвилин.
Концентрації кожного Бар, які дають менше або рівне 20 95 від максимального зв'язування, вибирають для використання в аналізах конкурентного зв'язування.
Відповідно до іншого варіанта здійснення Ка вимірюють з використанням аналізу Скетчарда, як описано у прикладі 4. Відповідно до іншого варіанта здійснення Ка вимірюють з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу з використанням ВІАСОКЕФ-2000 або ВІАСОКЕФ-3000 (ВіАсоге, Іпс., Різсаїажау, МУ) при 25"С з чипами з іммобілізованим антигеном СМ5 при «- 10 одиницях відгуку (КО). Коротенько, карбоксиметильовані декстранові біосенсорні чипи (СМ5, ВІАСОКЕ, Іпс.) активуються З М-етил-М'(3- диметиламінопропіл)карбодіммідом (ЕОС) і М-гідроксисукцинімідом (МНЗ) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють ацетатом натрію в концентрації 10 мМ, рн 4,8, до 5 мкг/мл (7 0,2 мкм) перед введенням при швидкості потоку 5 мкл/хвилину для досягнення приблизно 10 одиниць відгуку (КИ) зв'язаного білка. Після введення антигену 1М етаноламін впорскується для блокування непрореагувавших груп. Для вимірів кінетики дворазові серійні розведення Раб (0,78 нМ до 500 нМ) вводять у РВ5 з 0,05 95 полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-20Т М) поверхнево-активною речовиною (РВ5Т) при 25 "С при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв.
Швидкості асоціації (Кол) і швидкості дисоціації (Код розраховуються з використанням моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 (програмне забезпечення оцінка ВіАсоге"мМ версії 3.2), одночасно використовуючи припасування сенсограм асоціації та дисоціації. Рівноважна константа дисоціації (Ка) розраховується як відношення Конк/Коп. Дивитеся, наприклад, Спеп еї аї., 9. Мої.
Віої. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації перевищує 105 М'с", визначена за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу вище, тоді швидкість асоціації може бути визначена за допомогою техніки гасіння флуоресценції, що вимірює збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флуоресценції (порушення -295 нм; емісія -340 нм, смуга пропущення 16 нм) при 25 "С 20 нМ антитіла до антигену (Гар-форма) в РВ5, рН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій антигену, що виміряне в спектрометрі, такому як спектрофотометр із зупинкою потоку (Амім Іпбігитепів) або спектрофотометр 8000-й серії БІ М-
Атіпсоб (Тептозресігопіс) з коветою, що перемішує. 2. Фрагменти антитіл
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіл містять у собі без обмеження Раб, Рар', Бар'-5Н,
Кар), Рм і зсЕм фрагменти, а також інші фрагменти, описані нижче. Для огляду деяких фрагментів антитіл дивитеся Ниазоп еї аї. Маї. Меа. 9:129-134 (2003). Для огляду фрагментів 5СЕм, дивитеся, наприклад, Рійскіпйп, іп Те РПагтасоїоду ої Мопосіопа! Апіїродіє5, мої. 113,
Возепригу апа Мооге еав., (Зргіпдег-Мепад, Мем Мої), рр. 269-315 (1994); дивитеся також УМО 93/16185 і патент США Мо 5571894 і 5587458. Для обговорення фрагментів Бар і Е(аб)», що містять сполучні рецептор реутилізації залишки епітопу та характеризуються збільшеним періодом напівжиття іп мімо, дивитеся патент США Мо 5869046.
Діатіла являють собою фрагменти антитіл із двома антигенсполучними сайтами, які можуть
БО бути бівалентними або біспецифічними. Дивитеся, наприклад, ЕР 404097; МО 1993/01161;
Ниазоп єї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003); і Ноїїїпдег еї аї., Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 90: 6444- 6448 (1993). Триатіла та тетратіла також описані в Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, що містять всі або частину варіабельного домена важкого ланцюга або всі або частину варіабельного домена легкого ланцюга антитіла. Відповідно до деяких варіантів здійснення однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (Юотапіїєх, Іпс., Умакйат, МА; дивитеся, наприклад, патент США Мо 6248516 У1).
Фрагменти антитіл можуть бути отримані за допомогою різних технік, що включають у себе без обмеження протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також одержання за допомогою рекомбінантних клітин-хазяїнів (наприклад, Е.соїї або фага), як описано в даному документі. 3. Химерні та гуманізовані антитіла
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло являє собою химерне антитіло. Деякі химерні антитіла описані, наприклад, у патенті США Мо 4816567;
Могїтізоп еї аї!., Ргос. Май. Акад. зЗсі. США, 81: 6851-6855 (1984)). В одному прикладі химерне антитіло містить відмінну від людської варіабельну область (наприклад, варіабельну область, отриману від миші, пацюка, хом'яка, кролика або не людиноподібного примата, такого як мавпа) і людську константну область. У додатковому прикладі, химерне антитіло являє собою антитіло "з перемиканням класу", в якому клас або підклас був змінений стосовно такому у вихідного антитіла. Химерні антитіла містять у собі їх антигенсполучні фрагменти.
Відповідно до деяких варіантів здійснення химерне антитіло являє собою гуманізоване антитіло. Як правило, відмінне від людського антитіло являє собою гуманізоване, щоб зменшити імуногенність для людини, зберігаючи при цьому специфічність й афінність вихідного відмінного від людського антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або декілька варіабельних доменів, у яких НУК, наприклад, СОК (або їх частини) походять від відмінного від людського антитіла, і ЕК (або їх частини) походять від послідовностей людського антитіла.
Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину людської константної області. Відповідно до деяких варіантів здійснення деякі залишки ЕК у гуманізованому антитілі заміщені на відповідні залишки від відмінного від людського антитіла (наприклад, антитіла, від якого беруть походження залишки НУК), наприклад, для відновлення або поліпшення специфічності або афінності антитіла.
Гуманізовані антитіла та способи їх одержання розглядаються, наприклад, в АІтадго апа
Екгапззоп, Егопі. Віовсі. 13:1619-1633 (2008), і більш докладно описані, наприклад, в Кіесптапп еї а!І., Майте 332:323-329 (1988); Оцеєп еї аї., Ргос. Маг! Асайд. осі. ОБА 86:10029-10033 (1989); патенті США Мо 5821337, 7527791, 6982321 і 708,409; Кахптіїі еї аі., Метод» 36:25-34 (2005) (опис трансплантації БОБ (а-СОВ)); Радіап, Мої. Іттипої. 28: 489-498 (1991) (опис "зміни поверхні"); БаІгАсдца еї а!., Меїпоаз 36:43-60 (2005) (опис "перестановки ЕК"); і О5роицгп еї аї.,
Меїподе 36:61-68 (2005) апа КіїтКа єї аї., Вг. У. Сапсег, 83:252-260 (2000) (опис підходу
Зо "спрямованого відбору" до перестановки ЕК).
Людські каркасні області, які можуть бути використані для гуманізації, містять у собі без обмеження: каркасні області, вибрані з використанням способу "найкращої відповідності" (дивитеся, наприклад, біт5 еї аїЇ. 9У. Іттипої. 151:2296 (1993)); каркасні області, отримані з консенсусної послідовності антитіл людини конкретної підгрупи варіабельних областей легких або важких ланцюгів (дивитеся, наприклад, Сагег еї аІ. Ргос. Май. Асай. сі. ОБА, 89:4285 (1992); апа Р'гевіа еї аї. У. Іттипої., 151:2623 (1993)); людські дозрілі (соматично мутували) каркасні області або каркасні області зародкової лінії людини (дивитеся, наприклад, АІтадго апа Егапвзоп, Егопі. Віозсі. 13:1619-1633 (2008)); і каркасні області, що беруть походження від скринінгу бібліотек ЕК (дивитеся, наприклад, Васа еї аї., у. ВіоЇ. Спет. 272:10678-10684 (1997) і
Возок єї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 271:22611-22618 (1996)). 4. Людські антитіла
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло являє собою людське антитіло. Людські антитіла можуть бути отримані з використанням різних відомих у даній області техніки. Людські антитіла описані в цілому в мап ріЇкК апа мап де Уміпкеї,
Сит. Оріп. Рпаптасої. 5: 368-74 (2001) і Ї опрего, Ситгт. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Людські антитіла можуть бути отримані шляхом введення імуногена в трансгенну тварину, яка була модифікована, для виробництва інтактних людських антитіл або інтактних антитіл з людськими варіабельними областями у відповідь на антигенну стимуляцію. Такі тварини, як правило, містять всі або частину локусів імуноглобуліну людини, які заміщають ендогенні локуси імуноглобуліну або які присутні поза хромосомою або інтегровані у випадковому порядку в хромосоми тварини. У таких трансгенних мишах ендогенні локуси імуноглобуліну, як правило, інактивовані. Для огляду способів одержання людських антитіл із трансгенних тварин, дивитеся
Гопрегу, Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Дивитеся також, наприклад, патенти США Мо 6075181 і 6150584, що описують технологію ХЕМОМОИОБЕ"М: патент США Ме 5770429, що описує технологію НОМАВФ); патент США Мо 7041870, що описує технологію К-М МОШЗЕЄФ,, і попередню заявку на патент США Ме Ш52007/0061900, що описує технологію МЕГОСІМОИЗЕФ).
Варіабельні області людини від інтактних антитіл, вироблені такими тваринами, можуть бути додатково модифіковані, наприклад, шляхом об'єднання з іншою людською константною областю.
Людські антитіла можуть також бути отримані заснованими на гібридомі способами. Були описані клітинні лінії мієломи людини та гетеромієломи миші-людини для одержання людських моноклональних антитіл. (Дивитеся, наприклад, Ко2бог .-). Іттипої., 133: 3001 (1984); Вгодеиг еї аІ,, Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіюп Тесппідне5 апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (Магсе! Оеккег, Іпс.,
Мем МогКк, 1987); і Воегпег еї аї., У. Іттипої., 147: 86 (1991)). Людські антитіла, отримані за допомогою технології В-клітинних гібридом людини, також описані в Гі еї аЇ., Ргос. Маїй!. Асай. сі. ОБА, 103:3557-3562 (2006). Додаткові способи містять у собі ті, які описані, наприклад, у патенті США Мо 7189826 (описує виробництво моноклональних антитіл ДМ людини з гібридомних клітинних ліній) і Мі, Хіападаї Міапуїхие, 26(4):265-268 (2006) (описує гібридоми людина-людина). Технологія людських гібридом (технологія триоми) також описана у МоїПтег5 апа Вгапаїеіп, Нізюіоду апа Ніхіораїйпоіоду, 20(3):927-937 (2005) і МоїІтегв апа Вгапаїєїп, Ме(одзь апа Ріпаїпдз іп Ехрегітепіа! апа Сіїпіса! Рнаптасоіоду, 27(3):185-91 (2005).
Людські антитіла можуть також бути отримані шляхом виділення послідовностей варіабельного домена Еу-клону, вибраних із бібліотек фагового дисплея людського походження.
Такі послідовності варіабельного домена можуть бути потім об'єднані з бажаною людською константною областю. Техніки відбору антитіл людини з бібліотек антитіл описані нижче. 5. Отримані з бібліотек антитіла
Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути виділені шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек антитіл з бажаною активністю або активностями. Наприклад, у даній області техніки відомі різні способи для виробництва бібліотек фагового дисплея та скринінгу таких бібліотек на антитіла, що мають бажані характеристики зв'язування. Такі способи розглядаються, наприклад, в Ноодепроот еї аї. іп Мейод5 іп МоїІесшаг Віоїоду 178:1-37 (О'Віїєп єї аї., єд., Нитап Ргезв,
Тоїомжа, МУ, 2001) і додатково описані, наприклад, в МоСайепу еї аї., Майшге 348:552-554;
Сіаскзоп еї аї., Маїшге 352: 624-628 (1991); Магїкз5 евї аї!., уУ. Мої. Вісі. 222: 581-597 (1992); Маїк5 апа Вгадригу, іп Меїпод»5 іп Моїесшіаг Віоіоду 248:161-175 (10, єд., Нитап Ргев5, Тоїожа, МУ, 2003); Біани єї аї., у). Мої. Віо!. 398(2): 299-310 (2004); І еє еї аї., 9). Мої. Віо!. 340(5): 1073-1093 (2004); РеіПоизе, Ргос. Май. Асайд. 5сі. ОБА 101(34): 12467-12472 (2004); і І ее еї аї., 9. Іттипої.
Меїтоаз 284(1-2): 119-132(2004).
У деяких способах фагового дисплея репертуари генів МН і Мі окремо клонують за
Зо допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і рекомбінують у випадковому порядку у фагових бібліотеках, які потім можуть бути піддані скринінгу на антиген-сполучний фаг, як описано у У/іпієг еї аї., Апп. Кем. Іттипої., 12: 433-455 (1994). Фаги, як правило, відображають фрагменти антитіл або як одноланцюгові фрагменти Ем (зсЕм), або як фрагменти Гар.
Бібліотеки з імунізованих джерел забезпечують високоафіннні антитіла до імуногена без необхідності побудови гібридом. Альтернативно, наївний репертуар може бути клонований (наприклад, від людини), щоб забезпечити єдине джерело антитіл до широкого спектра невласних, а також власних антигенів без імунізації, як описано сгіййн5 еї аІ., ЕМВО ., 12: 725- 734 (1993). Нарешті, наївні бібліотеки також можуть бути отримані синтетично шляхом клонування нереаранжированих сегментів МУ-гена зі стовбурних клітин, і з використанням ПЛР- праймерів, що містять випадкову послідовність для кодування високо варіабельних областей
СОКЗ ї для виконання перестановки іп мій, як описано Ноодепроот апа Уміпіег, У. Мої. Віої., 227: 381-388 (1992). Патентні публікації, що описують людські фагові бібліотеки антитіл містять у собі, наприклад: патент США Мо 5750373 й опублікований патент США Мо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, і 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек антитіл людини, вважаються в даному документі людськими антитілами або фрагментами людських антитіл. 6. Мультиспецифічні антитіла
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло, наприклад, біспецифічне антитіло. Мультиспецифічні антитіла являють собою о моноклональні антитіла, які мають специфічність зв'язування щонайменше з двома різними сайтами. Відповідно до деяких варіантів здійснення одна зі специфічностей зв'язування призначена для ГубЕ, а інша - для будь-якого іншого антигену.
Відповідно до деяких варіантів здійснення одна зі специфічностей зв'язування призначена для
ГУбЕ, а інша - для СОЮЗ. Дивитеся, наприклад, патент США Мо 5821337. Відповідно до деяких варіантів здійснення біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами
ГУбЕ. Біспецифічні антитіла можуть бути також використані для локалізації цитотоксичних засобів у клітини, які експресують ГУубЕ. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.
Техніки одержання мультиспецифічних антитіл містять у собі без обмеження рекомбінантну коекспресію двох пар важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобуліну, що характеризуються різними специфічностями (дивитеся Міїбівіп апа Спцеїйо, Маїиге 305: 537 (1983)), УМО 93/08829 і
ТгаипесКег еї аІ., ЕМВО .. 10: 3655 (1991)), і конструювання "виступ-в-западину" (дивитеся, наприклад, патент США Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла також можуть бути отримані шляхом конструювання з використанням електростатичної взаємодії для одержання молекули
Ес-гетеродимерних антитіл (МО 2009/089004А1); зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (дивитеся, наприклад, патент США Мо 4676980 і Вгеппап еї аї., 5сіепсе, 229: 81 (1985)); з використанням лейцинових блискавок для виробництва біспецифічних антитіл (дивитеся, наприклад, КобзівїІпу еї аї., 9У. Іттипої., 148(5):1547-1553 (1992)); з використанням технології "діатіло" для фрагментів біспецифічних антитіл (дивитеся, наприклад, Ноїіпдег ін,
Ргос Маї! Асай 5сі ОБА, 90: 6444-6448 (1993)); і з використанням одноланцюгових Ем (5Ем) димерів (дивитеся, наприклад, Сгибег еї аї., 9. Іттипої., 152:5368 (1994)); і підготовку триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, у Татт ін. У). Іттипої. 147:60 (1991).
Також у даний документ включені сконструйовані антитіла з трьома або більше функціональними антигенсполучними сайтами, що включають у себе "антитіла восьминоги" (дивитеся, наприклад, 5 2006/0025576А1).
Антитіло або його фрагмент у даному документі також містить у собі "Раб з подвійною дією" або "рАЕ", що містить антигенсполучний сайт, що зв'язується з І убЕ, а також з іншим, відмінним антигеном (дивитеся, 5 2008/0069820, наприклад). 7. Варіанти антитіл
Відповідно до деяких варіантів здійснення розглядаються варіанти амінокислотних послідовностей передбачених у даному документі антитіл. Наприклад, може бути вимагатися поліпшення афінності зв'язування й/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можуть бути отримані шляхом внесення відповідних модифікацій у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу.
Такі модифікації містять у собі, наприклад, делеції та/або вставки в і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Будь-яка комбінація делеції, вставки та заміни може бути зроблена для досягнення кінцевого конструкта, за умови, що кінцевий конструкт має
Зо бажані характеристики, наприклад, антигенсполучні. а) Варіанти замін, вставок і делецій
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачені варіанти антитіл, що містять одну або декілька амінокислотних замін. Сайти, що представляють інтерес, для замісного мутагенезу містять у собі НМК і ЕК. Консервативні заміни показані в таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Більш істотні зміни наведені в таблиці 1 під заголовком "ілюстративні заміни" і, як додатково описано нижче, з посиланням на класи бічних ланцюгів амінокислот. Амінокислотні заміни можуть бути введені в антитіло, що представляє інтерес, а також продукти, піддані скринінгу на бажану активність, наприклад, збережене/поліпшене зв'язування антигену, зменшену імуногенність або поліпшені АОСС або СОС.
Таблиця 1
Ше() 71111111 |СешоМа;МесАа;РАе Норлейцин.//// Пе 777771 цец(3) 77711111 |Мопешсіпео/е;Ма;МесАа;РНєїЗ Пе 77777771
Амінокислоти можуть бути згруповані відповідно до загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТАг, Азп, Сп; (3) кислотні: Ар, СМ; (4) основні: Ні, Г ув, Ага; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: су, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.
Неконсервативні заміни спричинять заміну представника одного з цих класів на інший клас.
Один тип варіанта замін містить у собі заміну одного або декількох залишків гіперваріабельної області вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Як правило, отриманий у результаті варіант(и), вибраний для подальшого вивчення, буде містити модифікації (наприклад, поліпшення) певних біологічних властивостей (наприклад, збільшену афінність, знижену імуногенність) щодо вихідного антитіла та/або буде характеризуватися по суті збереженими певними біологічними властивостями вихідного антитіла. Ілюстративний варіант із замінами являє собою антитіло з дозрілою афінністю, яке може бути легко створено, наприклад, з використанням заснованих на фаговому дисплеї технік дозрівання афінності, таких як ті, які описані в даному документі. Коротко, один або декілька залишків НУК мутують, і варіантні антитіла відображаються на фаге та піддаються скринінгу на конкретну біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування).
Зміни (наприклад, заміни) можуть бути зроблені в НМЕК, наприклад, для поліпшення афінності антитіл. Такі зміни можуть бути внесені в "гарячі точки" НМК, тобто, залишки, кодовані кодонами, які піддаються мутації на високій частоті протягом соматичного процесу дозрівання (дивитеся, наприклад, Споулапигу, Меїпосз Мої. Віої. 207:179-196 (2008)), і/або 5ОК (а-50Б), з отриманим у результаті варіантним МН або Мі, досліджуваним на афінність зв'язування.
Дозрівання афінності шляхом побудови та повторного відбору з вторинних бібліотек було описано, наприклад, в Ноодепроот еї аї. іп Меїнодз іп Моїесшціаг Віоіоду 178:1-37 (О'Вгівп вї аї., ед., Нитап Ргез5, Тоїомжа, МУ, (2001).) Відповідно до деяких варіантів здійснення дозрівання афінності, розмаїтість вводиться у варіабельні гени, вибрані для дозрівання, за допомогою будь-якого з множини способів (наприклад, ПЛР, що допускає помилки, перестановкою ланцюгів або олігонуклеотид-спрямованим мутагенезом). Потім створюється вторинна бібліотека. Потім цю бібліотеку піддають скринінгу, щоб ідентифікувати будь-які варіанти антитіл з бажаною афінністю. Інший спосіб введення розмаїтості містить у собі НМАК-спрямовані підходи, в яких декілька залишків НУК (наприклад, 4-6 залишків одночасно) рандомізовані. НМК залишки, що беруть участь у зв'язуванні антигену, можуть бути специфічно ідентифіковані, наприклад, з використанням скануючого аланіном мутагенезу або моделювання. СОБК-НЗ ії СОК-Ї 3, зокрема, часто стають мішенню.
Відповідно до деяких варіантів здійснення заміни, вставки або делеції можуть відбуватися в межах одного або декількох НУЕ доти, поки такі зміни істотно не зменшують здатність антитіла зв'язувати антиген. Наприклад, консервативні зміни (наприклад, передбачені в даному документі консервативні заміни), які істотно не знижують афінність зв'язування, можуть бути зроблені в НМК. Такі зміни можуть бути поза "гарячими точками" НУК або 5ОК. Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачених вище послідовностей варіантних МН і Мі, кожний
НМЕК або не змінюється, або містить не більше ніж одну, дві або три амінокислотні заміни.
Застосовний спосіб для ідентифікації залишків або областей антитіла, які можуть бути націлені для мутагенезу, називається "скануючий аланіном мутагенез", описаний Сиппіпапат апа М/еїІз (1989) бсієпсе, 244:1081-1085. У цьому способі залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як Аго, А5р, Гуз, Ніз і Сім) ідентифікують і заміщають нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити, чи впливає це на взаємодію антитіла з антигеном. Подальші заміни можуть бути введені в амінокислотні локації, що показують функціональну чутливість до початкових замін. Альтернативно або додатково, кристалічна структура комплексу антиген- антитіло використовується для ідентифікації точок контакту між антитілом й антигеном. Такі контактні залишки та сусідні залишки можуть бути націлені або ліквідовані як кандидати на заміну. Варіанти можуть бути піддані скринінгу для визначення того, чи містять вони бажані властивості.
Вставки амінокислотних послідовностей містять у собі аміно- і/або карбоксильні-кінцеві злиття довжиною від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також вставки всередині послідовностей єдиних або множинних амінокислотних залишків.
Приклади кінцевих вставок містять у собі антитіло з М-кінцевим залишком метіоніну. Інші вставні варіанти молекули антитіла містять у собі злиття М- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, для АОЕРТ) або поліпептидом, що збільшує час напівжиття в сироватці антитіла.
Юр) Варіанти глікозилування
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло змінене для збільшення або зменшення ступеня, в якому антитіло глікозильоване. Додавання або видалення сайтів глікозилування до антитіла може бути зручно здійснене шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, що один або декілька сайтів глікозилування створюється або видаляється.
Там, де антитіло містить Ес область, прикріплені до нього вуглеводи можуть бути змінені.
Нативні антитіла, вироблені клітинами ссавців, зазвичай містять розгалужений, двухантенарний олігосахарид, що, як правило, прикріплений за допомогою М-зв'язку до Азп297 домена СН2 області Ес. Дивитеся, наприклад, Умгідні еї аІ. ТІВТЕСН 15:26-32 (1997). Олігосахарид може містити в собі різні вуглеводи, наприклад, маннозу, М-ацетилглюкозамін (сІсМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фукозу, прикріплену до СІСМАс в "стовбурі" з двухантенарної структури олігосахариду. Відповідно до деяких варіантів здійснення модифікації олігосахаридів в антитілі згідно з даним винаходом можуть бути отримані для того, щоб створити варіанти антитіл з певними поліпшеними властивостями.
Відповідно до одного варіанта здійснення передбачені варіанти антитіл, що характеризуються вуглеводною структурою, в якій відсутня фукоза, приєднана (безпосередньо або побічно) до області Ес. Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може становити від 195 до 8095, від 195 до 6595, від 595 до 6595 або від 2095 до 40 95. Кількість фукози визначається шляхом обчислення середньої кількості фукози в цукровому ланцюзі в А5п297, стосовно суми всіх глікоструктур, прикріплених до Азп297 (наприклад, комплексні, гібридні та з
Зо високим вмістом маннози структури), що виміряне за допомогою МАСОІ-ТОЕ мас-спектрометрії, описаної у УМО 2008/077546, наприклад. А5п297 відноситься до залишку аспарагіну, розташованому приблизно у положенні 297 в області Ес (Ечи нумерація залишків області Ес); однак, А5п297 також може бути розташований приблизно в 5-3 амінокислотах до або після положення 297, тобто між положеннями 294 і 300, через мінорні варіації послідовності в антитілах. Такі варіанти фукозилування можуть характеризуватися поліпшеною функцією
АрСС. Дивитеся, наприклад опублікований патент США Мо 05 2003/0157108 (Ргевіа, І); 05 2004/0093621 (Куосула Накко Кодуо Со., 14). Приклади публікацій, пов'язаних (із "дефукозильованими" або "фукозо-дефіцитними" варіантами антитіл містять у собі: 5 2003/0157108; УМО 2000/61739; МО 2001/29246; 05 2003/0115614; 005 2002/0164328; 5 2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 005 2004/0110282; 05 2004/0109865; МО 2003/085119; М/о 2003/084570; МО 2005/035586; МО 2005/035778; МО2005/053742;
МО2002/031140; ОКалакі еї а). У. Мої. Вісі. 3361 239-1249 (2004); Матапе-ОНпикі еї аї. Віоїесн.
Віоєпа. 87: 614 (2004). Приклади клітинних ліній, здатних робити дефукозильовані антитіла, містять у собі клітини СНО І ес13 з дефіцитом фукозилування білка (КірКа еї а. Агсн. Віоспет.
Віорпув. 249:533-545 (1986); попередня заявка на патент США Ме 05 2003/0157108 АТ, Ргезіа, І; і УМО 2004/056312 А1, Адатв єї а!., особливо на прикладі 11), і нокаутні клітинні лінії, такі як нокаутні за геном альфа-1,6-фукозилтрансферази, БОТ8, клітини СНО (дивитеся, наприклад,
Матапе-ОНпикКі еї аї. Віоїесни. Віоепд. 87: 614 (2004); Капада, У. еї аї., Віотесппої. Віоепо., 94(4):680-688 (2006); і УМО2003/085107).
Варіанти антитіл додатково передбачені з розділеними навпіл олігосахаридами, наприклад, у яких двухантенарний олігосахарид, приєднаний до Ес-області антитіла, розділений навпіл
СІСМАс. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися зниженим фукозилуванням і/або поліпшеною функцією АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, у УМО 2003/011878 (еап-Маїгеї еї аІ.); патенті США Мо 6602684 (тапа еї аІ.); ії 05 2005/0123546 (Штапа єї аІ.). Також передбачені варіанти антитіл щонайменше з одним залишком галактози в олігосахариді, прикріпленому до області Ес. Такі варіанти антитіл можуть характеризуватися поліпшеною функцією СОС. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, у ЛО 1997/30087 (Раїеї еї а); МО 1998/58964 (Каїмй, 5.); і УМО 1999/22764 (Каїсм, 5.). с) Варіанти області Ес
Відповідно до деяких варіантів здійснення одна або декілька модифікацій амінокислот можуть бути введені в область Ес передбаченого в даному документі антитіла, тим самим утворюючи варіант області Ес. Варіант області Ес може містити послідовність Ес області людини (наприклад, Ес-область ІдС1, Ідс2, ДОЗ або Ідс4 людини), що містить амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) в одному або декількох положеннях амінокислот.
Відповідно до деяких варіантів здійснення в даному винаході передбачений варіант антитіла, що має деякі, але не всі ефекторні функції, які роблять його бажаним кандидатом для заявок, у яких важливий час напівжиття антитіла іп мімо, але деякі ефекторні функції (такі як комплемент і АОСС) не потрібні або шкідливі. Аналізи цитотоксичності іп міго та/або іп мімо можуть бути проведені для підтвердження зменшення/виснаження активностей СОС і/або
АрСС. Наприклад, аналізи зв'язування Ес-рецептора (БСК) можуть бути проведені, щоб гарантувати, що зазначене антитіло не характеризується зв'язуванням Есук (отже, швидше за все, не характеризується АОСС активністю), але зберігає єднальну здатність ЕсКп. Первинні клітини для опосередкування АОСС, МК клітини, експресують тільки ЕСУуКІІ, тоді як моноцити експресують ЕсукКІ, ЕсуКІІ ї ЕсукІ. Експресія Ес на гематопоетичних клітинах представлена в таблиці З на сторінці 464 в Камеїсп апа Кіпеї, Аппи. ВНем. Іттипої. 9:457-492 (1991). Не обмежуючі приклади аналізів іп міго для оцінки АОСС активності молекули, що представляє інтерес, описані у патенті США Мо 5500362 (дивитеся, наприклад, НеїЇбігот, І. еї аїЇ. Ргос. Ма?!
Асад. бсі. ОБА 83:7059-7063 (1986)) і Неїйбігот, І еї аІ., Ргос. Маї! Асад. сі. ОБА 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (дивитеся Вгиддетапп, М. еї аїІ., У. Ехр. Мей. 166:1351-1361 (1987).
Альтернативно, можуть бути використані способи нерадіоактивних аналізів (дивитеся, наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІМ для проточної цитометрії (СеПтесппо!поду, Іпс., Іпс. Мошипіаійп Мем, СА; і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуЇтТохХ 962 (Рготеда, Мадізоп, УМ). Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів містять у собі мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і клітини-натуральні кілери (МК).
Альтернативно або додатково, АОСсС-активність молекули, що представляє інтерес, може бути оцінена іп мімо, наприклад, у такій тваринній моделі, як розкрита в Сіупез єї а. Ргос. Маг! Асад.
Зсі. ОБА 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування Сід можуть також бути виконані, щоб підтвердити, що антитіло не може зв'язувати С14 і, отже, відсутня активність СОС. Дивитеся,
Зо наприклад, зв'язування Стд і СЗс ЕГІБА у УМО 2006/029879 і МО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу може бути виконаний аналіз СОС (дивитеся, наприклад, Са7апо-
Запіого еї аї., У. Іттипої. Меїтоаз 202:163 (1996); Стадо, М.5. еї а!., Віоса 101:1045-1052 (2003); і Стадд, М.5. апа М.у. СІеппіве, Віоса 103:2738-2743 (2004)). Зв'язування ЕсоКп і визначення кліренсу/часу напівжиття іп мімо можна також проводити з використанням способів, відомих у даній області техніки (дивитеся, наприклад, Реїкома, 5.В. еї аї., ІП. Іттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією містять у собі антитіла з заміною одного або декількох із залишків Ес-області 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (патент США Мо 6737056). Такі мутанти Ес включають мутантів Ес із замінами у двох або більше з амінокислотних положень 265, 269, 270, 297 і 327, що включають у себе так званий Ес-мутант "САМА" з заміною залишків 265 і 297 на аланін (патент США Мо 7332581).
Описані деякі варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням з Ес. (Дивитеся, наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312, і ЗПпіеїд» еї аї., 9. ВіоЇ. Снет. 9(2): 6591- 6604 (2001)).
Відповідно до деяких варіантів здійснення варіант антитіла містить Ес-область з однією або декількома амінокислотними замінами, які поліпшують АОСС, наприклад, заміни у положеннях 298, 333 і/або 334 області Ес (ЄО нумерація залишків).
Відповідно до деяких варіантів здійснення зміни виробляються в області Ес, які призводять до зміненого (тобто або поліпшеного, або зменшеного) зв'язування С1д та/або комплемент- залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано у патенті США Мо 6194551, МО 99/51642 і Ідизодіє еї аї. 9. Іттипої. 164: 4178-4184 (2000).
Антитіла зі збільшеним періодом напівжиття та поліпшеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Ес (РсоКп), що відповідає за перенос материнських дО до плода (Сиуег еї аї., 9.
Іттипої. 117:587 (1976) і Кіт еї аї., У. Іттипої. 24:249 (1994)), описані в 052005/0014934А1 (Ніпюп есеї а).). Ці антитіла містять Ес-область з однією або декількома замінами, які поліпшують зв'язування Ес-області з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають такі з замінами в одній або декількох із залишків області Ес: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміною залишку 434 області Ес (патент США
Мо 7371826).
Зо
Див. також Юипсап 5 Уміптег, Маїште 322:738-40 (1988); патент США Мо 5648260; патент США
Мо 5624821 і УМО 94/29351 відносно інших прикладів варіантів області Ес. а) Варіанти антитіл зі сконструйованим цистеїном
Відповідно до деяких варіантів здійснення може бути бажано створити антитіла зі сконструйованим цистеїном, наприклад, "піоМАбБ", у яких один або декілька залишків антитіла замінені залишками цистеїну. Відповідно до конкретних варіантів здійснення замінені залишки зустрічаються в доступних сайтах антитіла. Заміняючи ці залишки на цистеїн, реактивні тіольні групи, таким чином, розташовуються в доступних сайтах антитіла та можуть бути використані для кон'югування антитіла з іншими фрагментами, такими як фрагменти лікарського засобу або фрагменти лінкера- лікарського засобу, щоб створити імунокон'югат, описаний далі в даному документі. Відповідно до деяких варіантів здійснення один або декілька з наступних залишків може бути замінений цистеїном: М205 (нумерація Кабаї) легкого ланцюга; А118 (нумерація ЕМ) важкого ланцюга та 5400 (нумерація БЕ) важкого ланцюга Рс-області. Антитіла зі сконструйованим цистеїном можуть бути отримані, як описано, наприклад, у патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачене в даному документі антитіло може бути додатково модифіковано, щоб містити додаткові небілкові фрагменти, які відомі в даній області техніки та легкодоступні. Фрагменти, придатні для дериватизації антитіла містять у собі без обмеження водорозчинні полімери. Необмежуючі приклади водорозчинних полімерів містять у собі без обмеження поліетиленгліколь (ПЕГ),, співполімери етиленгліколя/пропіленгліколя, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімери етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або статистичні співполімери) і декстран або полі(н-вінілпіролідон)полієтиленгліколь, гомополімери пропіленгліколя, співполімери поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші. Пропіоновий альдегід поліетиленгліколя може характеризуватися перевагами у виробництві через його стабільність у воді. Полімер може характеризуватися будь-якою молекулярною масою та може бути розгалуженим або
Зо нерозгалуженим. Кількість полімерів, прикріплених до антитіла, може варіюватися, і, якщо приєднано більше ніж один полімер, вони можуть бути однаковими або різними молекулами.
Загалом, кількість та/або тип полімерів, які використовують для дериватизації, може бути визначене на основі міркувань, що включають у себе без обмеження конкретні властивості або функції антитіла, які будуть поліпшені, чи буде використовуватися похідна антитіла в терапії за певних умов тощо.
Відповідно до іншого варіанта здійснення передбачені кон'югати антитіла та небілкового фрагмента, які можуть бути селективно нагріті за допомогою впливу випромінюванням.
Відповідно до одного варіанта здійснення небілюювий фрагмент являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 102: 11600-11605 (2005)). Випромінювання може бути будь-якої довжини хвилі, і містить у собі без обмеження довжини хвиль, які не шкодять звичайним клітинам, але які нагрівають небілковий фрагмент до температури, при якій гинуть проксимальні до небілкового фрагменту антитіла клітини.
В. Рекомбінантні способи та композиції
Антитіла можуть бути отримані з використанням рекомбінантних способів і композицій, наприклад, як описано у патенті США Мо 4816567. Відповідно до одного варіанта здійснення передбачена виділена нуклеїнова кислота, що кодує описане в даному документі антитіло до
ГУбЕ. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, що містить МІ., і/або амінокислотну послідовність, що містить УН антитіла (наприклад, легкі та/або важкі ланцюги антитіла). Відповідно до додаткового варіанта здійснення передбачений один або декілька векторів (наприклад, експресуючі вектори), що містять такі нуклеїнові кислоти. Відповідно до додаткового варіанта здійснення передбачена клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту. Відповідно до одного такого варіанта здійснення клітина-хазяїн містить (наприклад, була трансформована 3): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і амінокислотну послідовність, що містить МН антитіла або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить МІ. антитіла, і другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що містить УН антитіла. Відповідно до одного варіанта здійснення клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, наприклад, клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лімфоїдну клітину (наприклад, ХО, М50О, 5Р20 клітину). Відповідно до одного варіанта здійснення бо передбачений спосіб одержання антитіла до ГуУбЕ, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує передбачене вище антитіло в умовах, що підходять для експресії антитіла, і, необов'язково, витягання антитіла з клітини-хазяїна (або середовища культури клітини-хазяїна).
Для рекомбінантного одержання антитіла до ГубЕ нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, наприклад, як описано вище, виділяють та вбудовують в один або декілька векторів для подальшого клонування й/або експресії в клітині-хазяїні. Така нуклеїнова кислота може бути легко виділена та секвенована з використанням традиційних процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла).
Підходящі клітини-хазяїни для клонування або експресії векторів, що кодують антитіла, містять у собі прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані в даному документі. Наприклад, антитіла можуть бути отримані у бактерій, зокрема, коли не потрібні глікозилування та Ес- ефекторна функція. Для експресії фрагментів антитіл і поліпептидів у бактеріях, дивитеся, наприклад, патент США Мо 5648237, 5789199 і 5840523. (Спашоп, Меїнподз іп Моїіесшціаг Віоіоду,
Мої. 248 (В.К.С. Іо, єд., Нитапа Ргезв, Тоїоула, М), 2003), рр. 245-254, що описують експресію фрагментів антитіл в Е.соїї). Після експресії антитіла можуть бути виділені з бактеріальної клітинної пасти в розчинній фракції та можуть бути додатково очищені.
На додаток до прокаріотів, еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, являють собою підходящі клонуючі або експресуючі хазяїни для векторів, що кодують антитіло, які включають в себе гриби та дріжджові штами, чиї шляхи глікозилування були "гуманізовані", приводячи до виробництва антитіла з частково або повністю людським паттерном глікозилування. Дивитеся Сегподго55, Маї. Віоїесп. 22:1409-1414 (2004) ї її еї аї., Маї. Віоїеси. 24:210-215 (2006).
Підходящі клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла також одержують з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних містять у собі клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можуть бути використані в сполученні з клітинами комах, зокрема, для трансфекції клітин бродорієта
Тгидірегаа.
Культури рослинних клітин також можуть бути використані як хазяїни. Дивитеся, наприклад,
Зо патенти США Мо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 і 6417429 (описи технології
РІ АМТІВООІЕ5"М для одержання антитіл у трансгенних рослинах).
Клітини хребетних можуть також бути використані як хазяїни. Наприклад, можуть бути застосовні клітинні лінії ссавців, пристосовані для росту в суспензії. Інші приклади підходящих клітинних ліній-хазяїнів ссавців являють собою лінію СМ1 нирки мавпи, трансформовану 540 (СО05-7); лінію ембріональної нирки людини (клітини 293 або 293, як описано, наприклад, в
Станат еї аї., у). Сеп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирок дитинчати хом'яка (ВНК); клітини Сертолі миші (клітини ТМ4, як описано, наприклад, в МаїПег, Віо!Ї. Рергод. 23:243-251 (1980); клітини нирки мавпи (СМІ1); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини цервікальної карциноми людини (НЕГА); клітини нирки собаки (МОСК); клітини печінки пацюка риїаїо (ВВ.
ЗА); клітини легенів людини (М/138); клітини печінки людини (Нер 02); пухлина молочної залози миші (ММТ 060562); клітини ТК, описані, наприклад, в Маїпег еї аї., АппаЇ5 М.У. Асай. 5сі. 383:44-68 (1982); клітини МКС 5 і клітини Е5-4. Інші застосовні клітинні лінії ссавців-хазяїнів містять у собі клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), що включають у себе клітини СНО
ОНЕВ (Опаць еї а!., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 77:4216 (1980), і такі клітинні лінії мієломи, як МО,
М50 ії 5Р2/0. Для огляду певних клітинних ліній-хазяїнів ссавців, що підходять для виробництва антитіл, дивитеся, наприклад, Уалакі апа Ууи, Меїнодз іп МоїІєсшіаг Віоіоду, Мої. 248 (В.К.С. 10, ед., Нитапа Ргез5, Тоїома, МУ), рр. 255-268 (2003).
С. Аналізи
Передбачені в даному документі антитіла до ГубЕ можуть бути ідентифіковані, піддані скринінгу або охарактеризовані за фізичними/хімічними властивостями та/або біологічною активністю за допомогою різних аналізів, відомих у даній області техніки.
Відповідно до одного аспекту антитіло згідно з даним винаходом досліджують на антигенсполучну активність, наприклад, за допомогою відомих способів, таких як ЕГІЗА, ЕАС5
ВіасогефФ або Вестерн-блоттинг.
Відповідно до іншого аспекту можуть бути використані конкурентні аналізи для ідентифікації антитіла, що конкурує з будь-яким із описаних у даному документі антитіл за зв'язування з І убЕ.
Відповідно до деяких варіантів здійснення таке конкуруюче антитіло зв'язується з тим самим епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), що зв'язується з описаним у даному документі антитілом. Докладні ілюстративні способи для картування епітопу, 3 яким зв'язується антитіло, передбачені в Моїтіз (1996) "Ерйоре Марріпуд Ргоїосої5, " іп Меїноадв іп
Моїесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргев5, Тоїоула, МУ).
В ілюстративному конкурентному аналізі іммобілізовані І убЕ інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, що зв'язується з ГубЕ (наприклад, будь-яке з описаних у даному документі антитіл) і друге немічене антитіло, що досліджують на його здатність конкурувати з першим антитілом у зв'язуванні з ГубЕ. Друге антитіло може бути присутнім у супернатанті гібридоми. Як контроль іммобілізовані ГубЕ інкубують у розчині, що містить перше мічене антитіло, але не друге мічене антитіло. Після інкубації в умовах, що дозволяють зв'язування першого антитіла з ГубЕ, надлишок незв'язаного антитіла видаляється, а кількість мітки, пов'язаної з іммобілізованим ГубЕ, вимірюється. Якщо кількість мітки, пов'язаної з іммобілізованим ГубЕ, істотно знижена в досліджуваному зразку, у порівнянні з контрольним зразком, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом за зв'язування з
ГубЕ. Дивитеся Нагіом/ апа І апе (1988) Апііродієв: А І арогаюгу Мапиаї сп.14 (Сода ріпу Наїбог
І арогайогу, Соїа бргіпу Набог, МУ).
О. Імунокон'югати
У даному винаході також передбачені імунокон'югати, які містять антитіло до ГУбЕ, кон'юговане з одним або декількома цитотоксичними засобами, такими як хіміотерапевтичні засоби або лікарські засоби, інгібуючі ріст засоби, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження або їхні фрагменти) або радіоактивні ізотопи (наприклад, радіокон'югат).
Імунокон'югати дозволяють націлену доставку фрагмента лікарського засобу до пухлини та, у деяких варіантах здійснення, внутрішньоклітинне накопичення в ній, де системне введення некон'югованих лікарських засобів може призвести до неприйнятних рівнів токсичності відносно нормальних клітин (Роїаків Р. (2005) Сцтепі Оріпіоп іп Рнапптасоіоду 5:382-387).
Кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) являють собою націлені хіміотерапевтичні молекули, які сполучають у собі властивості як антитіл, так і цитотоксичних лікарських засобів шляхом націлювання потенційних цитотоксичних лікарських засобів на експресуючі антиген пухлинні клітини (Теіспег, В.А. (2009) Сцтепі Сапсег Ога Тагоєї5 9:982-1004), тим самим підвищуючи терапевтичний індекс шляхом максимізації ефективності та мінімізації нецільової токсичності (Сагіег, Р.). апа Зепіег Р.О. (2008) Тне Сапсег дошг. 14(3):154-169; СНаїі, В.М. (2008)
Асс. Спет. ВНезв. 41:98-107.
Сполуки АОС згідно з даним винаходом містять у собі такі з протипухлинною активністю.
Відповідно до деяких варіантів здійснення сполуки АОС містять у собі антитіло, кон'юговане, тобто ковалентно приєднане, до молекули лікарського засобу. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло ковалентно приєднане до молекули лікарського засобу через лінкер.
Кон'югати антитіла з лікарським засобом (АЮС) згідно з даним винаходом селективно доставляють ефективну дозу лікарського засобу до пухлинної тканини за допомогою більшої вибірковості, тобто більш низька ефективна доза може бути досягнута при збільшенні терапевтичного індексу ("терапевтичне вікно").
Фрагмент лікарського засобу (0) кон'югатів антитіла з лікарським засобом (АЮС) може містити в собі будь-яку сполуку, фрагмент або групу, що характеризується цитотоксичною або цитостатичною дією. Фрагменти лікарських засобів можуть передавати свої цитотоксичні та цитостатичні ефекти за допомогою механізмів, що включають у себе без обмеження зв'язування тубуліну, зв'язування або інтеркаляцію ДНК й інгібування РНК-полімерази, синтез білка та/"або топоїзомерази. Ілюстративні фрагменти лікарських засобів містять у собі без обмеження майтанзиноїд, доластатин, ауристатин, каліхеаміцин, піролобензодіазепін (РВО), неморубіцин і його похідні, РМО-159682, антрациклін, дуокарміцин, алкалоїд барвінку, таксан, трихотецен, СС1065, камптотецин, елінафід і стереоізомери, ізостери, аналоги і їхні похідні, які мають цитотоксичну активність. Не обмежуючі приклади таких імунокон'югатів обговорюються
БО більш докладно нижче. 1. Ілюстративні кон'югати антитіла з лікарським засобом
Ілюстративний варіант здійснення сполуки кон'югату антитіла з лікарським засобом (АОС) включає антитіло (АБ), що націлено впливає на пухлинну клітину, фрагмент лікарського засобу (О) і лінкер (), що прикріплює АБ до 0. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло прикріплюється до лінкерного фрагмента (І) через один або декілька амінокислотних залишків, таких як лізин і/або цистеїн.
Ілюстративний АОС характеризується формулою І:
АРр-(І-О)р Формула де р становить від 1 до приблизно 20. Відповідно до деяких варіантів здійснення кількість 60 фрагментів лікарського засобу, які можуть бути кон'юговані з антитілом, обмежено числом вільних залишків цистеїну. Відповідно до деяких варіантів здійснення вільні залишки цистеїну вводяться в амінокислотні послідовності антитіла за допомогою способів, описаних у даному документі. Ілюстративний АОС формули І містять у собі без обмеження антитіла, які містять 1, 2, З або 4 сконструйовані амінокислоти цистеїн (Гуоп, КЕ. еї а! (2012) Меїйодз іп Еплут. 502:123- 138). Відповідно до деяких варіантів здійснення один або декілька вільних залишків цистеїну вже присутні в антитілі без використання конструювання, і в цьому випадку існуючі вільні залишки цистеїну можуть бути використані для кон'югації антитіла з лікарським засобом.
Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло піддається відновлювальним умовам до кон'югації антитіла для того, щоб одержати один або декілька вільних залишків цистеїну. а) Ілюстративні лінкери "Лінкер" (О) являє собою біфункціональний або багатофункціональний фрагмент, який може бути використаний, щоб зв'язати один або декілька фрагментів лікарського засобу (0) з антитілом (АБ) для утворення кон'югату антитіла з лікарським засобом (АОС) формули |.
Відповідно до деяких варіантів здійснення кон'югати антитіла з лікарським засобом (АОС) можуть бути отримані з використанням лінкера, що містить реакційноздатні функціональні групи для ковалентного приєднання до лікарського засобу та до антитіла. Наприклад, відповідно до деяких варіантів здійснення тіол цистеін антитіла (АБ) може утворювати зв'язок з реакційноздатною функціональною групою лінкера або лікарський засіб-проміжна сполука лінкера для одержання АОС.
Відповідно до одного аспекту лінкер характеризується функціональністю, яка здатна вступати в реакцію з вільним цистеїном, присутнім на антитілі, з утворенням ковалентного зв'язку. Необмежуючі приклади таких реакційноздатних функціональних груп містять у собі малеїмід, галогенацетаміди, а-галогенацетил, такі активовані складні ефіри, як складні ефіри сукциніміду, складні ефіри 4-нітрофенілу, складні ефіри пентафторфенілу, складні ефіри тетрафторфенілу, ангідриди, хлорангідриди, сульфонілхлориди, ізоціанати й ізотіоціанати.
Дивитеся, наприклад, спосіб кон'югації на сторінці 766 в Кіи55тап, еї а! (2004), Віосопішдаїє
Спетівігу 15(4):765-773, і наведені в даному документі приклади.
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкер характеризується функціональністю, що здатна вступати в реакцію з електрофільною групою, що є присутньою на антитілі. Приклади таких електрофільних груп містять у собі без обмеження карбонільні групи альдегідів і кетонів.
Відповідно до деяких варіантів здійснення гетероатом реактивної функціональності лінкера може вступати в реакцію з електрофільною групою на антитілі й утворювати ковалентний зв'язок з одиницею антитіла. Необмежуючі приклади таких реакційноздатних функціональних груп містять у собі без обмеження гідразид, оксим, аміно, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат й арилгідразид.
Лінкер може містити один або декілька лінкерних компонентів. Ілюстративні лінкерні компоненти містять у собі б-малеїімідокапроїл ("МС"), малеімідопропаноїл ("МР"), валін-цитрулін ("умаі-сй" або "мс", аланін-фенілаланін ("аіа-рпе"), п-амінобензилоксикарбоніл ("РАВ"), М- сукцинімідил-4-(2-піридилтіо)пентаноат С5РР") і 4-(М-малеімідометил)циклогексан- 1- карбоксилат ("МОСС"). Різні лінкерні компоненти відомі в даній області техніки, деякі з яких описані нижче.
Лінкер може являти собою "розщеплюваний лінкер", що полегшує вивільнення лікарського засобу. Необмежуючі приклади розщеплюваного лінкера містять у собі кислотно-лабільні лінкери (наприклад, що містять гідразон), чутливі до протеази (наприклад, чутливі до пептидази) лінкери, фотолабільні лінкери або дисульфідовмісні лінкери (Спагі еї а!Ї., Сапсег
Везеєагсі 52:127-131 (1992); О5 5208020).
Відпдвідно (Кудеяких варіантів здійснення лінкер характеризується наступною формулою ІІ: а М У Формула ІІ де А являє собою "одиницю поперечного зв'язку" й являє собою ціле число від 0 до 1; М/ являє собою "амінокислотну одиницю" й являє собою ціле число від 0 до 12; М являє собою "спейсерну одиницю" й являє собою 0, 1 або 2; і АБ, 0 і р визначаються як зазначено вище для формули І. Ілюстративні варіанти здійснення таких лінкерів описані у патенті США Мо 7498298, що спеціально включений у даний опис за допомогою посилання.
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкерний компонент містить "одиницю поперечного зв'язку", що зв'язує антитіло з іншим лінксерним компонентом або з молекулою лікарського засобу. Не обмежуючі приклади "одиниць поперечного зв'язку" наведені нижче (причому хвиляста лінія вказує ділянки ковалентного прикріплення до антитіла, лікарського засобу або додаткових лінкерних компонентів):
) сти в) о Ме о о : | я (в); МР о (в) о Кз
Н в) о) МПЕГ (6)
ААУ о .
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінксерний компонент містить "амінокислотну одиницю". Відповідно до деяких таких варіантів здійснення амінокислотна одиниця дозволяє розщеплення лінкера за допомогою протеази, тим самим полегшуючи вивільнення лікарського засобу з імунокон'югату при впливі внутрішньоклітинних протеаз, таких як лізосомальні ферменти (Рогопіпа еї а. (2003) Маї. Віоїесппої!. 21:778-784). Ілюстративні амінокислотні одиниці містять у собі без обмеження дипептиди, трипептиди, тетрапептиди та пентапептиди.
Ілюстративні дипептиди містять у собі без обмеження валін-цитрулін (мс або маї-сі), аланін- фенілаланін (аї або аїа-рпе); фенілаланін-лізин (їК або рпе-іуз5); фенілаланін-гомолізин (рпе- пПотоїу5) і М-метил-валін-цитрулін (Ме-маІ-сід). Ілюстративні трипептиди містять у собі без обмеження гліцин-валін-цитрулін (діу-маІ-сі) і гліцин-гліцин-гліцин (діу-діу-ЧІу). Амінокислотна одиниця може містити амінокислотні залишки, які характеризуються природним походженням і/або мінорні амінокислоти та/або аналоги амінокислот, що не зустрічаються у природі, такі як цитрулін. Амінокислотні одиниці можуть бути розроблені й оптимізовані для ферментативного розщеплення за допомогою конкретного ферменту, наприклад, асоційованої з пухлиною протеази, катепсину В, С і О або протеазою плазміну.
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкерний компонент містить "спейсерну" одиницю, що зв'язує антитіло з молекулою лікарського засобу або безпосередньо, або через одиницю поперечного зв'язку й/або амінокислотну одиницю. Спейсерна одиниця може бути "саморозщеплювальною" або "не саморозщеплювальною". "Не саморозщеплювальна" спейсерна одиниця являє собою одиницю, в якій частина або всі спейсерні одиниці залишаються зв'язаними з фрагментом лікарського засобу після розщеплення АОС. Приклади не саморозщеплювальних спейсерних одиниць містять у собі без обмеження спейсерну одиницю гліцину та спейсерну одиницю гліцин-гліцин. Відповідно до деяких варіантів здійснення ферментативне розщеплення АОС, що містить спейсерну одиницю гліцин-гліцин, пов'язану з
Зо пухлинною клітиною протеазою призводить до вивільнення гліцин-гліцин-фрагмента лікарського засобу із залишку АОС. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення гліцин-гліцин-фрагмент лікарського засобу піддають стадії гідролізу в пухлинній клітині, таким чином, відщеплюючи гліцин-гліцин спейсерну одиницю від фрагмента лікарського засобу. "Саморозщеплювальна" спейсерна одиниця дозволяє вивільняти фрагмент лікарського засобу. Відповідно до деяких варіантів здійснення спейсерна одиниця лінкера містить п- амінобензилову одиницю. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення п-амінобензиловий спирт прикріплюють до амінокислотної одиниці за допомогою амідного зв'язку, і виходить карбамат, метилкарбамат або карбонат між бензиловим спиртом і лікарським засобом (Натапп еї аі. (2005) Ехреп Оріп. Тег. Раїепів (2005) 15:1087-1103). Відповідно до деяких варіантів здійснення спейсерна одиниця п-амінобензилоксикарбоніл (РАВ). Відповідно до деяких варіантів здійснення АОС, що містить саморозщеплювальний лінкер характеризується наступною структурою:
От т|-
Ар дам 0-00 в, р де О представляє -С1-Св алкіл, -0О-(С1-Св алкіл), галоген, нітро або ціано; т являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 4; і р дорівнює числу від 1 до приблизно 20. Відповідно до деяких варіантів здійснення р являє собою число в діапазоні від 1 до 10, від 1 до 7, від 1 до 5 або від 1 до 4.
Інші приклади саморозщеплювальних спейсерів містять у собі без обмеження ароматичні сполуки, які в електронному відношенні схожі на групу РАВ, такі як похідні 2-аміноіїмідазол-5- метанол (патент США Мо 7375078; Нау еї а. (1999) Віоога. Мед. СНет. І ей. 9:2237) і орто- або пара-амінобензилацетати. Відповідно до деяких варіантів здійснення можуть бути використані спейсери, які піддають циклізації при гідролізі амідного зв'язку, такі як заміщені та не заміщені аміди 4-аміномасляної кислоти (Коагідие5 еї а! (1995) Спетівігу Віоїоду 2:223), відповідно заміщені біциклої|2.2.11 і біциклоЇ2.2.21 кільцеві системи (Зіогт еї а! (1972) 9. Атег. Спет. 50с. 94:5815) і аміди 2-амінофенілпропіонових кислот (Ат5рбеггу, еї а! (1990) 9. Ога. Спет. 55:5867).
Зв'язування лікарського засобу з с-вуглецем залишок гліцину являє собою ще один приклад саморозщеплювального спейсера, який може бути корисний в АОС (Кіпод5Бигу еї а! (1984) У.
Мед. Спет. 27:1447).
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкер Ї. може являти собою лінкер дендритного типу для ковалентного прикріплення більше ніж одного фрагмента лікарського засобу до антитіла через розгалужений, багатофункціональний фрагмент лінкера (З!ип еї аї (2002)
Віоогдапіс 5 Меадісіпа! Спетівігу І ейеге 12:2213-2215; Би!ип сеї а! (2003) Віоогдапіс б Медісіпа!
Спетівігу 11:1761-1768). Дендритні лінкери можуть збільшити молярне співвідношення лікарського засобу до антитіла, тобто завантаження, яке пов'язане з ефективністю АОС. Таким чином, де антитіло несе тільки одну реакційноздатну тіольну групу цистеїну множини фрагментів лікарського засобу може бути прикріплене через дендритний лінкер.
Необмежуючі ілюстративні лінкери показані нижче в контексті АОС формули І:
Н (о);
Ар Я»; -- й
Аа-М Е Ху
Х о МН» ма!-сії і) (в) Н 6)
Ар М. чи Ж М р 5 М а о) Н о й
Г і
Х
ОО МмН МО-ма-сії
Зб
) і)
Н - (в) г Н р
АХ о Мн МО-ма!-сі-РАВ
Крім того, необмежуючі ілюстративні АОС містять у собі структури: о о) о) схо ЇЇ
Ар в Ар зЗ- сн - У -« -0 о, р. р. (6) (в) в) П
І) 4 Ду бо
Ар--5--сН»о-- о З (в) р, Р, (в) тн Її
Ар-5-С0НьО--М сб--р р з де Х являє собою: або -- т(бНают 0 (СНеСНеО)Д (в); -- (ї ра - сн Сб-М-(СНо)н- дики жи ЛЕ в (в); -Х На Ї хх / ог т (Снав о М (Нав 1 д
У являє собою: або
НО оу-ь 5! шк Кк І
ХО ого -МА-(СНо)д, кожний Е незалежно являє собою Н або С.1-Свє алкіл; і п становить від 1 до 12.
Як правило, лінкери пептидного типу можуть бути отримані шляхом утворення пептидного зв'язку між двома або більше амінокислотами і/або пепгидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можуть бути отримані, наприклад, у відповідності зі способом синтезу в рідкій фазі
(наприклад, Е. 5спгодег апа К. ГиБбКе (1965) "пе Реріідев5", моїште 1, рр 76-136, Асадетіс
Ргев5).
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкер являє собою заміщений групами, які модулюють розчинність та/або реакційну здатність. Як необмежуючий приклад такий заряджений замісник, як сульфонат (-50з3-) або амоній, може збільшувати розчинність у воді лінкерного реагенту та полегшувати реакцію сполуки лінкерного реагенту з антитілом і/або лікарським фрагментом, або полегшувати реакцію сполуки АВ-Ї. (антитіло-проміжна сполука лінкера) з О або 0-І (лікарський засіб-проміжна сполука лінкера) з антитілом, залежно від шляху синтезу, який використовується для одержання АОС. Відповідно до деяких варіантів здійснення частину лінкера з'єднують з антитілом і частину лінкера з'єднують з лікарським засобом, а потім
Ар-(частину лінкера)г з'єднують з лікарським засобом-(частина лінкера)", щоб утворити АОС формули І. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення антитіло містить більше ніж один замісник (частина лінкера)г, такий, що більше ніж один лікарський засіб з'єднаний з антитілом в
АС формули І.
Сполуки згідно з даним винаходом явно розглядають, але без обмеження АОС, отримані з такими наступними лінкерними реагентами, як: біс-малеімідотриоксіетиленгліколь (ВМРЕО), М- (В-малеімідопропілокси)-М-гідроксисукцинімідний складний ефір (ВМРБ), М-(6- малеїімідокапроїлокси)сукцинімідний складний ефір (ЕМСО5), М-Їу- малеіїмідобутирилокси|сукцинімідний складний ефір (ОМВ5), 1,6-біс-гексан-вінілеульфон (НВУ5), сукцинімідил-4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксі-(б-амідокапроат) (І С-5МОС), т-малеїімідобензоїл-М-гідроксисукцинімідний складний ефір (МВ5), гідразид /4-(4-М- малеімідофеніл)масляної кислоти (МРВН), сукцинімідил-3-(бромоацетамідо)пропіонат (ЗВАР), сукцинімідилиодацетат (5ІА), сукцинімідил(4-йодацетил)амінобензойна кислота (5ІАВ), М- сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), М-сукцинімідил-4-(2-піридилтіо)пентаноат (РР), сукцинімідил-4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС), сукцинімідил-4-(п- малеімідофеніл)бутират (5МРВ), сукцинімідил-6-К(бета-малеімідопропіонамідо)гексаноат (ЗМРН), імінотіолан (ІТ), сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМИ5, сульфо-МВ5, сульфо-
ЗІАВ, сульфо-5МСС і сульфо-5МРВ, і сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензойна кислота (5У5В), що включає в себе бісмалеїмідні реагенти: дитіобісмалеіїмідоетан (ОТМЕ), 1,4-
Ко) бісмалеіїмідобутан (ВМВ), 1,4-бісмалеіїмідил-2,3-дигідроксибутан (ВМОВ), Ббісмалеімідогексан (ВМН), бісмалеімідоетан (ВМОЕ), ВМ(ПЕГ)2 (показаний нижче) і ВМ(ПЕГ)з (показаний нижче); біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), біс-азидо сполуки (такі як біс-(п-азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі, як біс-(п- діазонійбензоїл)етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,б-діізоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Відповідно до деяких варіантів здійснення реагенти біс-малеіїміду дозволяють прикріплення тіольної групи цистеїну в антитілі до тіолвмісного фрагмента лікарської сполуки, лінкера або проміжної сполуки лінкера-лікарського засобу. Інші функціональні групи, які реагують з тіольною групою, містять у собі без обмеження йодацетамід, бромацетамід, вінілпіридин, дисульфід, піридилдисульфід, ізоціанат й ізотіоціанат. (о) (е) х () 9) митом митом
М о) М / е) |) в)
ВМ(РЕС)» ВМ(РЕС)»
Деякі корисні лінкерні реагенти можуть бути отримані з різних комерційних джерел, таких як
Ріегсе Віотесппоіоду, Іпс. (Коскога, ІС), Моїесціаг Віозсіепсез Іпс. (Воцідег, СО) або синтезовані відповідно до процедур, описаних в даному рівні техніки; наприклад, в Токі еї а! (2002) 9. Ога.
Спет. 67:1866-1872; Оиромснік, єї аї. (1997) Теіганедгтоп І ецегв, 38:5257-60; МаїКег, М.А. (1995)
У. Ог9. Спет. 60:5352-5355; Нгізсп єї а! (1996) Віосопіндаїє Спет. 7:180-186; 005 6214345; МО 02/088172; 05 2003130189; ШШ52003096743; УМО 03/026577; УМО 03/043583 і УМО 04/032828.
Мічена вуглецем 14 1-ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилентриамінопентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) являє собою приклад хелатуючого засобу для кон'югації радіонукліда з антитілом.
Дивитеся, наприклад, М/О94/11026. р) Ілюстративні фрагменти лікарських засобів (1) Майтанзин і майтанзиноїди
Відповідно до деяких варіантів здійснення імунокон'югат містить антитіло, кон'юговане з однією або декількома молекулами майтанзиноїдів. Майтанзиноїди являють собою похідні майтанзину й являють собою інгібітори мітозу, які діють, інгібуючи полімеризацію тубуліну.
Майтанзин уперше був виділений зі східно-африканського чагарнику Мауїепих5 з5еїтайга (патент
США Мо 3896111). Згодом було виявлено, що деякі мікроорганізми також продукують майтанзиноїди, такі як майтанзинол і С-3 майтанзиноловий ефір (патент США Мо 4151042).
Синтетичні майтанзиноїди описані, наприклад, у патентах США Мо 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 і 4371533.
Фрагменти майтанзиноїдного лікарського засобу являють собою привабливі фрагменти лікарського засобу в кон'югатах антитіла з лікарським засобом, тому що вони являють собою: (і) відносно доступні для одержання шляхом ферментації або хімічної модифікації або дериватизації продуктів ферментації, (ії) що піддаються дериватизації з функціональними групами, які підходять для кон'югації через не-дисульфідні лінкери до антитіл, (ії) стабільні у плазмі й (ім) ефективні проти різних ліній пухлинних клітин.
Деякі майтанзиноїди, що підходять для використання як фрагменти майтанзиноїдного лікарського засобу, відомі в даній області техніки та можуть бути виділені з природних джерел відповідно до відомих способів або отримані з використанням способів генної інженерії (дивитеся, наприклад, Ми еї аІ (2002) РМАБ5 99:7968-7973). Майтанзиноїди також можуть бути отримані синтетичним шляхом відповідно до відомих способів.
Ілюстративні фрагменти майтанзиноїдного лікарського засобу містять у собі без обмеження ті, які містять модифіковане ароматичне кільце, таке як: С-19-дехлоро (патент США Мо 4256746) (отриманий, наприклад, за допомогою відновлення антазоміцину Ра2 гідридом літію-алюмінію);
С-20-гідрокси (або С-20-деметил) ж/- С-19-дехлоро (патенти США Мо 4361650 і 4307016) (отриманого, наприклад, шляхом деметилування з використанням бігеріотусе5 або
Асііпотусезв, або дехлоруванням за допомогою І АН); і С-20-деметокси, С-20-ацилокси (ОСОК), -/- дехлоро (патент США Мо 4294757) (отриманого, наприклад, ацилуванням за допомогою ацилхлоридів), і ті, які характеризуються модифікаціями в інших положеннях ароматичного кільця.
Ілюстративні фрагменти майтанзиноїдного лікарського засобу містять у собі ті, які характеризуються такими модифікаціями, як: С-9-5Н (патент США Мо 4424219) (отриманий,
Зо наприклад, шляхом реакції з майтанзинолу з Н25 або Роб»); С-14-алкоксиметил (деметокси/СНгОК) (патент США Мо 4331598); С-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (СНгОН або СНгОАс) (патент США Мо 4450254) (отриманий, наприклад, з Мосагаіа); С-15- гідрокси/ацилокси (5 4364866) (отриманий, наприклад, шляхом перетворення майтанзинолу за допомогою Зігеріотусе5); С-15-метокси (патенти США Мо 4313946 і 4315929) (наприклад, виділений з Тгтем/іа пийШога); С-18-М-деметил (патенти США Мо 4362663 і 4322348) (отриманий, наприклад, шляхом деметилування майтанзинолу за допомогою 5ігеріотусев) і 4,5-дезокси (05 4371533) (отриманий, наприклад, шляхом відновлення майтанзинолу трихлоридом титану/! АН).
Багато положень на сполуках майтанзиноїдів застосовні як положення зв'язку. Наприклад, ефірний зв'язок може бути утворений за допомогою реакції з гідроксильною групою з використанням звичайних способів зв'язування. Відповідно до деяких варіантів здійснення реакція може відбуватися у положенні С-3, що містить гідроксильну групу, положенні С-14, модифікованому гідроксиметилом, положенні С-15, модифікованому гідроксильною групою та положенні С-20, що містить гідроксильну групу. Відповідно до деяких варіантів здійснення зв'язок утворюється у положенні С-3 майтанзинолу або аналогу майтанзинолу.
Фрагменти майтанзиноїдного лікарського засобу містять у собі ті, які характеризуються структурою:
НІС 00 САедт-85-3 ге) м- х-
Ніс, о о
СІ М о
Сн (в) рн
НО
СснЗо Н де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання атома сірки фрагмента майтанзиноїдного лікарського засобу до лінкера АЮС. Кожний К може незалежно один від одного являти собою Н або Сі-Свє алкіл. Алкіленовий ланцюг, що прикріплює амідну групу до атома сірки, може являти собою метаніл, етаніл або пропіл, тобто, т являє собою 1, 2 або З (5 633410, 5 5208020; Спагі еї а! (1992) Сапсег Ве5. 527127-131; Пи еї а! (1996) Ргос. Маї|!. Асад.
Зсі ОБА 93:8618-8623).
Всі стереоіїзомери фрагмента майтанзиноїдного лікарського засобу розглядаються для АОС згідно з даним винаходом, тобто будь-яка комбінація конфігурацій К і 5 у хіральних атомів вуглецю (05 7276497; 05 6913748; ШШ5 6441163; 05 633410 (ВЕ39151); О05 5208020; М/ідаівоп єї а! (2006), У. Мей Сет 49: 4392-4408, які повністю включені за допомогою посилання).
Відповідно до деяких варіантів здійснення фрагмент майтанзиноїдного лікарського засобу характеризується наступною стереохімією:
Но, (СВо)т-5--
Ге) М- -А о нс о о
СІ М :
КУ
СНнзо (6) ас ТЕ о
ЕНО
Сн Н
Ілюстративні варіанти здійснення фрагмента майтанзиноїдного лікарського засобу містять у собі без оомеження ЮОМ1; ОМ3З і ОМА, що характеризуються структурами: нас, снесної--8 о) М-й -А о не о 9
СІ М ко)
Ко ом
СнЗо (о) й й ТЕ но
ЕНО
Фін) Н
Г нос, оніснив 78 9 о) м- Н ін нс оооое о
СІ М Я
КО сно рмз (в)
У й - Е но
ЕНО сно Н
Ї нас, сноснос-8--5 о М-ЙУк
А (в; СНз нс оо о
СІ М І
КУ рм4 сно (в)
ХО й - Е ко
ЕНО
Сн Н де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання атома сірки лікарського засобу до лінкера (І) кон'югату антитіла з лікарським засобом.
Інші ілюстративні майтанзиноїдні кон'югати антитіла з лікарським засобом характеризуються наступними структурами й абревіатурами (при цьому АБ являє собою антитіло та р становить від 1 до приблизно 20. Відповідно до деяких варіантів здійснення р становить від 1 до 10, р становить від 1 до 7, р становить від 1 до 5 або р становить від 1 до 4): (в)
М АБ
8-8 й
НзС о М о
Не о о
СІ М ШКО)
КУ
Нзо (Ф) роя сно пн й
З АБ-5РР-ОМІ
(); о т Ар
Н
М нс о Є о нс оо »
СІ М рак)
КУ сНнЗо (в) речи мо
Х НО, р
СНзо Ар-5МСС-ОМІ
Ілюстративні кон'югати антитіла з лікарським засобом, де ЮОМІ зв'язаний через лінкер
ВМРЕО з тіольною групою антитіла, характеризуються структурою й абревіатурою: 5
Ф)
Ге) 5 А нтоорлот- п (Ф) і)
НС (іс
Ге) М
У і) нс оо
СІ З М ро)
ККУ
Сснзо (в) ян Ух м'о
АНО р сно нн де Ар являє собою антитіло; п становить 0, 1 або 2; і р становить від 1 до приблизно 20.
Відповідно до деяких варіантів здійснення р становить від 1 до 10, р становить від 1 до 7, р становить від 1 до 5 або р становить від 1 до 4.
Імунокон'югати, які містять майтанзиноїди, способи їх одержання та їх терапевтичне застосування описані, наприклад, у патентах США Мо 5208020 і 5416064; 05 2005/0276812 А1 й європейському патенті ЕР 0 425 235 В1, розкриття яких таким чином, спеціально включено за допомогою посилання. Дивитеся також І ім еї аїЇ. Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. ОБА 93:8618-8623 (1996) і
СНаїі ета). Сапсег Незеагсй 52:127-131 (1992).
Відповідно до деяких варіантів здійснення кон'югати антитіла з майтанзиноїдом можуть бути отримані шляхом хімічного зв'язування антитіла з молекулою майтанзиноїду без значного зниження біологічної активності або антитіла, або молекули майтанзиноїду. Дивитеся, наприклад, патент США Мо 5208020 (розкриття якого включено в даний документ за допомогою посилання). Відповідно до деяких варіантів здійснення АОС у середньому з 3-4 молекулами майтанзиноїду, кон'юЮгованих з молекулою антитіла, показав ефективність у підвищенні цитотоксичності клітин-мішеней без негативного впливу на функцію або розчинність антитіла. У деяких випадках навіть одна молекула токсину/антитіла, як очікується, буде підсилювати цитотоксичність, у порівнянні з використанням голого антитіла.
Ілюстративні сполучні групи для одержання кон'югатів антитіла з майтанзиноїдом містять у собі, наприклад, ті, які описані в даному документі, і ті, які розкриті у патенті США Мо 5208020; патенті ЕР 0 425 235 ВІ1; Спагі еї аЇ. Сапсег Везвагсй 52:127-131 (1992); 5 2005/0276812 А1 й 5 2005/016993 А1, описи яких включені в даний документ за допомогою посилання. (2) Ауристатини та доластатини
Зо Фрагменти лікарського засобу містять у собі доластатини, ауристатини та їхні аналоги і похідні (5 5635483; 05 5780588; 005 5767237; 05 6124431). Ауристатини являють собою похідні сполуки доластатину-10 морського молюска. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, було показано, що доластатини й ауристатини впливають на динаміку мікротрубочок, гідроліз ГТФ й ядерний і клітинний розподіл (МуоуКе еї а! (2001) Апійтістор. Адепібв апа
Спетоїйег. 45(12):3580-3584) і характеризуються протипухлинною (05 5663149) і протигрибковою активністю (Рей еї а! (1998) Апіійтістор. Адепів Спетоїйег. 42:2961-2965).
Фрагмент доластатинового/ауристатинового лікарського засобу може бути приєднаний до антитіла через М (аміно) кінець або на С (карбоксильний) кінець фрагмента пептидного лікарського засобу (ММО 02/088172; Ррогопіпа еї а! (2003) Маїшге Віоїесппоіоду 21(7):778-784;
Егапсівсо єї а! (2003) Віоса 102(4):1458-1465).
Ілюстративні ауристатинові варіанти здійснення містять у собі М-кінець, зв'язаний фрагментами монометилауристатинового лікарського засобу Оє і Ов, розкритий в Ше 7498298 і 5 7659241, розкриття яких повністю включено за допомогою посилання: ві в) в' СНз Во н ит М. дів в.о АВ дод о во ре дз є) д' Сн В о
Я ко М М М в'
Й Д г во А РТ дово до д'о Оє де хвиляста лінія Оє і Оє вказує на сайт ковалентного прикріплення до компонента антитіла або антитіла-лінкера, і незалежно в кожному положенні:
Вг? вибирають з Н і С:-Св алкілу;
ВЗ вибирають з Н, С1і-Св алкілу, Сз-Св карбоциклу, арилу, С1і-Св алкіл-арилу, Сі-Св алкілу (Сз-
Св карбоциклу), Сз-Св гетероциклу та Сі-Св алкіл-(Сз-Св гетероциклу);
В" вибирають з Н, Сі-Св алкілу, Сз-Св карбоциклу, арилу, Сі-Св алкіл-арилу, Сі-Св алкіл-(Сз-
Св карбоциклу), Сз-Св гетероциклу та Сі-Св алкіл-(Сз-Св гетероциклу);
В" вибирають з Н і метилу; або В" ії Е5 разом утворюють карбоциклічне кільце та характеризуються формулою (СВУ), де Кг і Р? незалежно вибирають з Н, С1і-Св алкілу та Сз-Св карбоциклу і п вибирають з 2, 3,4, 51 6;
В вибирають з Н і С:-Св алкілу;
В" вибирають з Н, Сі-Св алкілу, Сз-Св карбоциклу, арилу, Сі-Св алкіл-арилу, Сі-Св алкіл-(Сз-
Св карбоциклу), Сз-Св гетероциклу та Сі-Св алкіл-(Сз-Св гетероциклу); кожний КУ незалежно вибирають з Н, ОН, С1-Св алкілу, Сз-Св карбоциклу й О-(С1-Св алкілу);
ЕР? вибирають з Н і С:-Св алкілу;
В"? вибирають з арилу або Сз-Св гетероциклу; 7 являє собою О, 5, МН або МЕ", де В"? являє собою Сі-Св алкіл;
А" вибирають з Н, Сі-Сго алкілу, арилу, Сз-Св гетероциклу, -(В'ЗО)т-А"" або -(В'ЗО)т-
СН(В)»; т являє собою ціле число в діапазоні від 1-1000;
ВЗ являє собою Се2-Св алкіл;
В!" являє собою Н або С.|-Св алкіл; у кожному випадку К"» незалежно являє собою Н, СООН, -(СНг)н-М(В'9)», -«СНг)и-50зН або - (СНег)п-503-С1-Св алкіл; у кожному випадку К'Є незалежно являє собою Н, С1-Св алкіл або -«СНг)-СООН;
ВЗ вибирають з -С(В8)2-С(ВВ)»-арилу, -С(НВ)2-С(8В)2-(Сз-Св гетероциклу) і -«С(ВУ)2-С(ВА8)»-(Сз-
Св карбоциклу) і п являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 6.
Відповідно до одного варіанта здійснення КУ, В" і КЕ" незалежно один від одного являють собою ізопропіл або втор-бутил і КЕ? являє собою -Н або метил. Відповідно до ілюстративного варіанта здійснення ЕЗ і В" кожний являє собою ізопропіл, 2? являє собою -Н і В" являє собою втор-бутил.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення КЗ: і КУ кожний являє собою метил і КЕ? являє собою -Н.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення в кожному випадку КЗ являє собою -ОСН».
Відповідно до ілюстративного варіанта здійснення КЗ і К7 кожний являє собою ізопропіл, КЗ і
ВУ кожний являє собою метил, К? являє собою -Н, В" являє собою втор-бутил, у кожному випадку ЕКЗ являє собою -ОСН: і Е? являє собою -Н.
Відповідно до одного варіанта здійснення 7 являє собою -О- або -МН-.
Відповідно до одного варіанта здійснення Б'? являє собою арил.
Відповідно до ілюстративного варіанта здійснення Б'? являє собою феніл.
Відповідно до ілюстративного варіанта здійснення, коли 7 являє собою -О-, В" являє собою -Н, метил або трет-бутил.
Відповідно до одного варіанта здійснення, коли 7 являє собою -МН, ЩВ' являє собою -
СН(В»)», де "5 являє собою -(СНг)п-М(А'5)» і Кб являє собою -С1-Св алкіл або -«СНг)-СООН.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, коли 7 являє собою -МН, В" являє собою -
СН(В"5)», де В!5 являє собою -(СНг)п-5ОзН.
Ілюстративний ауристатиновий варіант здійснення формули Ює являє собою ММАЕ, де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання до лінкера (І) кон'югату антитіло-лікарський засіб: й нї М М 1
М. пра ще
Од о (в) о. о - ММАЕ
Ілюстративний ауристатиновий варіант здійснення формули ЮОє являє собою ММАБЕ, де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання до лінкера (І) кон'югату антитіло-лікарський засіб: о Н
Я Н
Кк М, М М (в) (в) о о. о Ол Тон ММАЕ
Інші ілюстративні варіанти здійснення містять у собі сполуки монометилваліну, що містять фенілаланінкарбоксильні модифікації на С-кінці фрагмента пентапептидного ауристатинового лікарського засобу (МУО 2007/008848), і сполуки монометилваліну, що містять модифікації фенілаланінового бічного ланцюга на С-кінці фрагмента пентапептидного ауристатинового лікарського засобу (ММО 2007/008603).
Необмежуючі ілюстративні варіанти здійснення АЮС формули І, що містять ММАЄЕ або
ММАЕ і різні лінкерні компоненти, характеризуються наступними структурами й абревіатурами (де "АБ" являє собою антитіло; р становить від ї до приблизно 8, "МаІ-Сй" являє собою дипептид валін-цитрулін і "5" являє собою атом сірки: 6) нЕ о
Ар--5 Н ї о о су
Микити марс-м о о.д0 60 ваг
Н р
Зо о
Ар-МОС-мсо-РАВ-ММА Є в) но
Ар---5 нен
М. кит зуансі-М о 9одо 00 о Н р
Ар-МОС-мсо-РАВ-ММАЕ вія (о) о но но он
Мои то М МЖК Ф (6) д.д о (в); Я що) р
Ар-МС-ММАЕ
Ар в! ї о о но Н
Мои м то НА ) о о. о ще о 7 о о утон р
Ар-МС-ММАЕ
Не обмежуючі ілюстративні варіанти здійснення АЮС формули І, що містять ММАБЕ і різні лінкерні компоненти, додатково містять у собі АБ-МСО-РАВ-ММАЕ і АБ-РАВ-ММАБЕ.
Імунокон'югати, що містять ММАБЕ, прикріплені до антитіла за допомогою лінкера, який, як було показано, не розщеплюється протеолітично, мають активність, порівняну з імунокон'югатами, що містять ММАРЕ, прикріплені до антитіла за допомогою протеолітично розщеплювального лінкера (Юогопіпа еї аїЇ. (2006) Віосопіпдає Спет. 17:114-124). Відповідно до деяких таких варіантів здійснення вивільнення лікарського засобу, як думають, здійснюється шляхом деградації антитіл у клітини.
Як правило, засновані на пептидах фрагменти лікарського засобу можуть бути отримані шляхом утворення пептидного зв'язку між двома або більше амінокислотами й/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можуть бути отримані, наприклад, у відповідності зі способом синтезу в рідкій фазі (дивитеся, наприклад, Е. Зспгбаег апа К. І аБКе, "пе Реріідев", моїште 1, рр 776-136, 1965, Асадетіс Ргез55). Фрагменти ауристатинових/доластатинових лікарських засобів відповідно до деяких варіантів здійснення можуть бути отримані у відповідності зі способами: ОЗ 7498298; 05 5635483; 5 5780588; Реції єї а! (1989) У. Ат. Спет. ос. 111:5463-5465; Рейії еї а! (1998) Апіі-Сапсег Огид Оевзідп 13:243-277; Ренії, с.В., еї аї.
Зупіпезіз, 1996, 719-725; Реції єї а! (1996) У. Спет. бос. РегїКіп Тгап5. 1 5:859-863 й Ррогопіпа (2003) Маї. Віоїтесппої. 21(7):778-784.
Відповідно до деяких варіантів здійснення фрагменти ауристатинових/доластатинових лікарських засобів формул Ов, такі як ММАЕ, і Ок, такі як ММАБЕ, ії проміжних сполук лікарського засобу-лінкера і їх похідні, такі як МС-ММАЕ, МО-ММАЕ, МО-мс-РАВ-ММАЕ їі МОС-мс-РАВ-ММАЕ, можуть бути отримані з використанням способів, описаних в 5 7498298; Богопіпа еї аї. (2006)
Віосопідаїе Спет. 17:114-124 і Оогопіпа еї аї. (2003) Маї. Віоїесн. 21:778-784, і потім кон'юговані з антитілом, що представляє інтерес. (3) Каліхеаміцин
Відповідно до деяких варіантів здійснення імунокон'югат містить антитіло, кон'юговане з однією або декількома молекулами каліхеаміцину. Каліхеаміцинове сімейство антибіотиків й їх
Зо аналогів здатні робити розриви дволанцюгових ДНК у субпікомолярних концентраціях (Ніптап еї аї., (1993) Сапсег Везєагси 53:3336-3342; І оде еї аї., (1998) Сапсег Везєагсі 58:2925-2928).
Каліхеаміцин характеризується внутрішньоклітинними сайтами дії, але, у деяких випадках, не легко проходять через плазматичну мембрану. Таким чином, захоплення клітинами цих засобів через антитіло-опосередковану інтерналізацію відповідно до деяких варіантів здійснення може значно підсилювати їх цитотоксичну дію. Необмежуючі приклади способів одержання кон'югатів антитіла з лікарським засобом із фрагментом каліхеаміцинового лікарського засобу описані, наприклад, у патенті 05 5712374; 05 5714586; 05 5739116 й 05 5767285. (4) Піролобензодіазепіни
Відповідно до деяких варіантів здійснення АОС містить піролобензодіазепін (РВО).
Відповідно до деяких варіантів здійснення димери РОВ розпізнають та зв'язуються зі специфічними послідовностями ДНК. Про природний продукт антраміцин, РВО, уперше повідомлялося в 1965 році (І еійтодгирег, еї аїЇ.,, (1965) У. Ат. Спет. 5бос., 87:5793-5795;
Ї еітдгибег, єї аї., (1965) У. Ат. Спет. бос., 87:5791-5793). З тих пор повідомлялося про множину РВО, що як зустрічаються у природі, так й аналогів (Тпигеюп, еї аї., (1994) Спет. Кем. 1994, 433-465 що включають димери трициклічного РВО кістяка (05 6884799; 005 7049311; 05 7067511; 05 7265105; 005 7511032; 05 7528126; 05 7557099). Без наміру бути зв'язаними якою- небудь теорією, думають, що структура димера надає відповідну тривимірну форму для ізоспіральної структури з малою борозенкою В-форми ДНК, що призводить до щільного прилягання в сайті зв'язування (Копп, Іп Апіібіоїїсв ІП. Зргіпдег-Мепад, Мем Мо, рр. 3-11 (1975);
Нипеу апа Меєднат-МапОемапієг, (1986) Асс. Спет. Вев., 19:230-237). Було показано, що димерні сполуки РВО, які несуть С2 арильні замісники, застосовні в якості цитотокКсичних засобів (Напшеу еї а! (2010) Сапсег Вев. 70(17):6849-6858; Апіопому (2010) У. Мед. Спет. 53(7):2927-2941; Ноуага єї а! (2009) Віоогдапіс апа Мед. Спет. І енег5 19(22):6463-6466).
Відповідно до деяких варіантів здійснення сполуки РВО можуть бути використані в якості проліків, захищаючи їх у положенні М10 з азотною захисною групою, що являє собою іп мімо, що видаляється (ММО 00/12507; УМО 2005/023814).
РВО димери були кон'юговані з антитілами, і було показано, що отримані АОС мають протиракові властивості (05 2010/0203007). Необмежуючі ілюстративні сайти зчеплення на димері РВО містять у собі п'ятичленне піроло кільце, прив'язь між одиницями РВО і групу іміну
М10-С11 (М/о 2009/016516, 5 2009/304710, 5 2010/047257, 5 2009/036431; 05 2011/0256157; МО 2011/130598).
Не обмежуючі ілюстративні компоненти димерних РВО АОС являють собою формулу А: в'я ве ллле
Ов" дп М х. х М
М 17 В" М рук рен й да о діб во Го) А і солі та сольвати, в якій: хвиляста лінія вказує на місце ковалентного прикріплення до лінкера; пунктирні лінії вказують на можливу присутність подвійного зв'язку між С1 і С2 або С2 і С3;
В? незалежно вибирають з Н, ОН, 50, СН», СМ, В, ОБ, - СН-ВО, -С(ВО)», О-5028, СО і
СОР, і необов'язково додатково вибирають з галогену або дигалогену, причому ЕО незалежно вибирають з К, СОН, СОВ, СНО, СОН і галогену;
НЯ ї 2? незалежно вибирають з Н, Б, ОН, ОВ, 58, 5Н, МН2, МНА, МАВ, МО», Мезоп і галогену;
В'"незалежно вибирають з Н, ЕК, ОН, ОК, 5, ЗН, МНег, МНА, МАВ", МО», Мезоп і галогену;
О незалежно вибирають з 0, 5 і МН;
В" являє собою або Н, або РЕ, або, де О являє собою О, 5ОзМ, де М являє собою катіон металу;
Кі кожний незалежно вибирають з необов'язково заміщеного С-в алкілу, С1-і2 алкілу, Сз-
Св гетероциклілу, Сзго гетероциклу та С5го арильних груп, і, необов'язково, стосовно групи
МЕ, К і КЕ разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7-членне гетероциклічне кільце;
В"2, В", ВД"» ї КЕ!" являють собою те, що визначено для Кг, Не, В?" і В" відповідно;
КЕ" являє собою Сз-12 алкіленову групу, чий ланцюг може бути перерваний одним або декількома гетероатомами, наприклад, ОО, 5, М(Н), ММе й/або ароматичними кільцями,
Зо наприклад бензолу або піридину, чиї кільця необов'язково заміщені; і
Х і Х незалежно вибирають з 0, 5 і М(Н).
Відповідно до деяких варіантів здійснення К і К кожний незалежно вибирають з необов'язково заміщеного С-12 алкілу, Сз-го гетероциклу та Св-го арильних груп, і, необов'язково, стосовно групи МКК, К ії КЕ разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7-ч-ленне гетероциклічне кільце.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ЕЗ і В"? являють собою Н.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ЕК і Б'Є являють собою Н.
Відповідно до деяких варіантів здійснення В" і Е"7 обидва являють собою ОВ", де В"А являє собою необов'язково заміщений С'.-4 алкіл. Відповідно до деяких варіантів здійснення 7" являє собою Ме.
Відповідно до деяких варіантів здійснення Х являє собою 0.
Відповідно до деяких варіантів здійснення К"' являє собою Н.
Відповідно до деяких варіантів здійснення існує подвійний зв'язок між С2 і СЗ3 у кожної мономерної одиниці.
Відповідно до деяких варіантів здійснення КЗ і К"2 незалежно вибирають з Н і ЕК. Відповідно до деяких варіантів здійснення К2 і КК"? незалежно являють собою К. Відповідно до деяких варіантів здійснення Р: і ЕК"? незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщені
С5го арил або С57 арил, або Св-о арил. Відповідно до деяких варіантів здійснення К2 і Кк: незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщений феніл, тієніл, нафтил, піридил, хінолініл або ізохінолініл. Відповідно до деяких варіантів здійснення КЗ і В'? незалежно вибирають з 50, «СНо, «СН-ВО і «С(В)». Відповідно до деяких варіантів здійснення В? і В? являють собою «СН». Відповідно до деяких варіантів здійснення Р: і В"? кожний являє собою Н.
Відповідно до деяких варіантів здійснення КЗ і К'2 кожний являє собою -О. Відповідно до деяких варіантів здійснення К2 і ВК? кожний являє собою ї-СЕ». Відповідно до деяких варіантів здійснення К2 і/або К!?2 незалежно являють собою С-(КО)». Відповідно до деяких варіантів здійснення Ез2 і/або Б!2 незалежно являють собою - СН-ВО.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, коли К2 і/або В"? являє собою «СН-НЄ, кожна група може незалежно мати будь-яку конфігурацію, показану нижче: о. о (Ф) р (Ф) Н В () (1)
Відповідно до деяких варіантів здійснення, «СН-В?О перебуває в конфігурації (1).
Відповідно до деяких варіантів здійснення К" являє собою Сз алкіленову групу або С5 алкіленову групу.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ілюстративний димерний компонент РВО АОС характеризується структурою формули А(І): шщ-- (Ф) о) н, шо ох Н «, | п
М ОМе омМе М о о АК); в якій п становить 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ілюстративний димерний компонент РВО АОС характеризується структурою формули А (І):
Уч
Х он ну оо дДедняо Кн г, | п
М ОМе омМе М в) о АЦІЇ); в якій п становить 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ілюстративний димерний компонент РВО АОС характеризується структурою формули АЦП):
Уч . он
М о о н/т Аня Н я, | п ве М ОМе ОМе Мо Ве о о А); в якій ВЕ і ВЕ" кожний незалежно вибирають з Н або ЕС, причому ЕК? являє собою визначений вище та причому п становить 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення п дорівнює 0. Відповідно до деяких варіантів здійснення п дорівнює 1. Відповідно до деяких варіантів здійснення Бе і/або ВУ являє собою Н.
Відповідно до деяких варіантів здійснення КЕ і БЕ" являють собою Н. Відповідно до деяких варіантів здійснення КЕ і/або ВЕ являють собою КО, причому КЕ? необов'язково заміщений Сч-12 алкілом. Відповідно до деяких варіантів здійснення КЕ і/або КЕР являє собою КО, причому КО являє собою метил.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ілюстративний димерний компонент РВО АОС характеризується структурою формули А(ІМ):
Уч м о о М он стей діжа М ОМе оМе М - ді? о о А(ІМ); в якій Аг' ії Аі7 незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщений Св5-2о арил; причому Аг! і Аі- можуть бути однаковими або різними та причому п дорівнює 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ілюстративний димерний компонент РВО АОС характеризується структурою формули А(М): лях
Х он н М оди М й | п Н г ОМе во
Аг! ді? о о АК); в якій Аг! і Аг- незалежно один від одного, необов'язково заміщений Сз-го арил; у якому Аг і
АІ? можуть бути однаковими або різними; і в якому п дорівнює 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення Аг і Аг кожний незалежно вибирають з необов'язково заміщеного фенілу, фуранілу, тіофенілу та піридилу. Відповідно до деяких варіантів здійснення Аг і Аг незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщений феніл. Відповідно до деяких варіантів здійснення Аг і АІ?7 незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщений тієніл-2-іл або тієн-3-іл. Відповідно до деяких варіантів здійснення Аг і Аг- незалежно один від одного являють собою необов'язково заміщений хінолініл або |ізохінолініл. Хінолінільна або ізохінолінільна група може бути пов'язана з сердечником РВО через будь-яке доступне кільцеве положення. Наприклад, хінолініл може являти собою хінолін-2-іл, хінолін-з-іл, хінолін-4-іл, хінолін-5-іл, хінолін-б-іл, хінолін-7-іл і хінолін- 8-іл. Відповідно до деяких варіантів здійснення хінолініл вибирають з хінолін-3-ілу та хінолін-6- ілу. Ізохінолініл може являти собою ізохінолін-1-іл, ізохінолін-3-іл, ізохінолін-4-іл, ізохінолін-5-іл, ізохінолін-б-іл, ізохінолін-7-іл й ізохінолін-8-іл. Відповідно до деяких варіантів здійснення ізохінолініл вибирають з ізохінолін-З-ілу й ізохінолін-б-ілу.
Додаткові необмежуючі ілюстративні димерні компоненти РВО в АОС являють собою формулу В:
Уч м Це он шо е) о) ню | Я Н ву З с М ОМе ОоМе М ра їй рУг в) в) в і солі та сольвати, в якій: хвиляста лінія вказує на місце ковалентного прикріплення до лінкера; хвиляста лінія, з'єднана з ОН, вказує на конфігурацію 5 або г;
Зо ВАМ ї Уг незалежно вибирають з Н, метилу, етилу та фенілу (де феніл може бути необов'язково заміщений фтором, зокрема, у положенні 4) і Со гетероциклілу та п становить 0 або 1.
Відповідно до деяких варіантів здійснення ВИ і Кг? незалежно вибирають з Н, фенілу та 4- фторфенілу.
Відповідно до деяких варіантів здійснення лінкер може бути прикріплений в одному з різних сайтів фрагмента лікарського засобу димера РВО, що включає в себе М10 імін В-кільця, 0-2 ендо/екзо положення С кільця або одиницю розтяжки, що зв'язує кільця А (дивитеся структури
СОЇ) ї СІ) нижче).
Не обмежуючі ілюстративні димерні компоненти РВО АОС містять у собі формули СІ) і С(І):
ва Я
М Міс
Н, поши н п ' СМ ' М 2
КУ дЕ й, їх 7 7 Ц 4 щ-- Кк 1 З З
КА
-М о) ге) Мас
НН, аву 10 Н в п
Ве М 7 7 М гі В
О з з о Р 2 СІ)
Формули С(І) ії С(ІІ) показані у своїй М10-С11 іміновій формі. Ілюстративні фрагменти лікарського засобу РВО також містять у собі карбіноламін і форми захищеного карбіноламіну, як показано в таблиці нижче:
Н в
М | (он! ч2 ОВ и 11
Імін Карбіноламін Захищений карбіноламін в яких:
Х являє собою Сі? (п: від 1 до 5), М або 0; 2 ії 2 незалежно вибирають з ОК і МК», де ЕК являє собою первинний, вторинний або третинний алкільний ланцюг, що містить від 1 до 5 атомів вуглецю;
Ви, Ач, Р» і Е2 незалежно один від одного вибирають з Н, С1і-Св алкілу, Се-Св-алкенілу, Со-
Св-алкінілу, Свого арилу (включаючи заміщені арили), С5-го гетероарильних груп, -МН»е, -МНМе, -
ОН ії -5Н, де відповідно до деяких варіантів здійснення алкільні, алкенільні й алкінільні ланцюги містять до 5 атомів вуглецю;
Вз і Кз незалежно один від одного вибирають з Н, ОК, МНЕ і МК», де К являє собою первинний, вторинний або третинний алкільний ланцюг, що містить від 1 до 5 атомів вуглецю;
Ва і К'«х незалежно вибирають з Н, Ме, ОМе і;
В5 вибирають з С1-Св алкілу, Сго-Св алкенілу, С2-Св алкінілу, Св-го арилу (що включає в себе арили, заміщені галогеном, нітро, ціано, алкокси, алкілом, гетероциклілом) і Св-го гетероарильних груп, де відповідно до деяких варіантів здійснення алкільні, алкенільні й алкінільні ланцюги містять до 5 атомів вуглецю;
А" являє собою Н, С1-Св алкіл або захисну групу (наприклад, ацетил, трифторацетил, трет- бутоксикарбоніл (ВОС), бензилоксикарбоніл (СВ2), 9-флуоренілметиленоксикарбоніл. (Гтос) або фрагмент, що містить саморуйнівну одиницю, таку як валін-цитрулін-РАВ);
В": являє собою Н, С1-Св алкіл або захисну групу; причому водень одного 3 Кі, Вч, А», А», 5, Ві2 або водень спейсера -
ОоСнНесСНнУХпенеснНео- між кільцями А заміщений зв'язком, з'єднаним із лінксером АОС.
Ілюстративні частини димера РОВ АОС містять у собі без обмеження (хвиляста лінія
Зо означає сайт ковалентного приєднання до лінкера): лл ! урн
Н, т | аа а Н
М о о М іо) (в) РВО димер;
Необмежуючі ілюстративні варіанти здійснення АС, що містять димери РВО, характеризуються наступною структурою:
до
Ти ях Н п Н
М М
АБ бе я
ЕІ Н
0) як 0) о в (о) о)
М Т он н,/ бити н
М 07 Зо М (0) (о) р
РВО димер-ма!-сйі-РАВ-АБ;
Мне о о "но Н н Е н і) в) в) "З о-ио он
Н, -М о. ит М Н
М о то М і) (в) р
РВО димер-Рне-І уз-РАВ-АБ, в якому: п становить від 0 до 12. Відповідно до деяких варіантів здійснення п становить від 2 до 10.
Відповідно до деяких варіантів здійснення п становить від 4 до 8. Відповідно до деяких варіантів здійснення п вибирають з 4 і 8.
Лінсери РВО димера-Маі-сй-РАВ-АБ і РВО димера-РНе-Їує-РАВ-АБ являють собою розщеплювальні протеази, у той час як лінкер РВО димера-малеіміду-ацеталему являє собою кислотолабільний.
Димери РВО ії АБС, що містять димери РВО, можуть бути отримані у відповідності зі способами, відомими в даній області техніки. Дивитеся, наприклад, ММО 2009/016516; 05 2009/304710; 05 2010/047257; 005 2009/036431; 05 2011/0256157; МО 2011/130598. (5) Антрацикліни
Відповідно до деяких варіантів здійснення АОС містить антрациклін. Антрацикліни являють собою антибіотичні сполуки, які проявляють цитотоксичну активність. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь конкретною теорією, дослідження показали, що антрацикліни можуть працювати, щоб знищувати клітини за допомогою ряду різних механізмів, що включають в себе: 1) інтеркаляцію молекул лікарського засобу в ДНК клітини, тим самим інгібуючи ДНК-залежний синтез нуклеїнової кислоти; 2) виробництво за допомогою лікарського засобу вільних радикалів, які потім вступають у реакцію з клітинними макромолекулами, щоб призвести до ушкодження клітин і/або 3) взаємодії молекул лікарського засобу з клітинною мембраною (дивитеся, наприклад, С. Реїегзоп еї аї., "Тгап5рогі Апа Зіюогаде ОЇ Апінгасусіїпе Іп Ехрегітепіа! Зузіет5
Апа Нитап І еикетіа" іп Апінгасусіїпе Апіїбіоїіс5 Іп Сапсег ТНегару; М.В. Васпиг, "Егеє Вадісаї!
Ратаде" ід. аї рр.97-102). Через їх цитотоксичний потенціал антрацикліни були використані в лікуванні численних ракових захворювань, таких як лейкемія, карцинома молочної залози, карцинома легені, аденокарциноми та саркоми яєчників (дивитеся, наприклад, Р.Н-МіетікК, іп
Апінгасусіїпе: Сиштепі 2іайи5 Апа Мем ОємеІортепів р 11).
Не обмежуючі ілюстративні антрацикліни містять у собі доксорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин, дауноміцин, неморубіцин та їх похідні Імунокон'югати та проліки даунорубіцину та доксорубіцину були підготовлені та вивчені (Кгаї; еї а! (2006) Ситепі Мед. Спет. 13:477-523;
Уейтеу сеї а! (2006) Віоогдапіс 5 Мед. Спет. І ейег5 16:358-362; Тогдом еї а! (2005) Віосоп). Спет. 16:717-721; Мааду єї а! (2000) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 97:829-834; Виромстнік евї а! (2002) Віоога. а Мед. Спет. І енег5 12:1529-1532; Кіпа еї а! (2002) У. Мед. Спет. 45:4336-4343; ЕР 0328147; 05 6630579). Кон'югат антитіла з лікарським засобом ВКУб-доксорубіцин специфічно реагує з асоційованим з пухлиною антигеном Г ем/і5-У, і його оцінювали в дослідженнях фази І і Її (Заїеп еї а! (2000) 9. Сіп. ОпсоІоду 18:2282-2292; Афапі еї а! (2000) Сапсег дошг. 6:78-81; ТоїІсНег евї аї (1999) 9. Сііп. Опсоіоду 17:478-484).
РМИ-159682 являє собою потужний метаболіт (або похідну) неморубіцину (Оціпіегі, еї аї. (2005) Сіїпіса! Сапсег Везеагсіп 11(4):1608-1617). Неморубіцин являє собою напівсинтетичний аналог доксорубіцину з групою 2-метоксиморфоліно на глікозиді аміну доксорубіцину та піддається клінічній оцінці (гапаї еї а! (1990) Сапсег Тгєаї. Вем. 17:133; Віратопії єї а! (1992)
Вії. У. Сапсег 65:703;), містячи в собі випробування фази ПЛІ!Ї для гепатоцелюлярної карциноми (бБип еї аї (2003) Ргосеєдіпов ої Ше Атегісап босієїу їог Сіїпіса! Опсоіоду 22, Арев1448; Опціпіеті (2003) Ргосеєдіпов ої Шїе Атеїгісап Азвзосіайоп ої Сапсег Везеєагсп, 447151 Ед, АБз 4649; Рассіагіпі еї а! (2006) Чдошг. Сіїп. Опсоіоду 24:14116).
Не обмежуючий ілюстративний АОС, що містить неморубіцин або похідні неморубіцину, показаний на формулі Іа: (в) он (в) (в) чевверишии он
А, о он о (Іг) (в)
М ь- а (в) я, на якій ЕК: являє собою атом водню, гідрокси- або метоксигрупу та Ко являє собою Сі1-Св5- алкоксигрупу або її фармацевтично прийнятну сіль;
Її ї 7 разом являють собою описаний у даному документі лінкер (І);
Т являє собою описане в даному документі антитіло (АБ) та т становить від 1 до приблизно 20. Відповідно до деяких варіантів здійснення т становить від 1 до 10, від 1 до 7, від 1 до 5 абовід ї до 4.
Відповідно до деяких варіантів здійснення К. і К2 обидва являють собою метокси (-ОМе).
Додатковий не обмежуючий ілюстративний АБС, що містить неморубіцин або похідні
Зо неморубіцину, показаний на формулі ІБ: пами щі в) он 2 он
ОС ея в о оно (Ів) ро!
М і в) в, т на якій ЕК: являє собою атом водню, гідрокси- або метоксигрупу та Ко являє собою Сі1-Св5- алкоксигрупу або її фармацевтично прийнятну сіль;
Ї» і 2 разом являють собою описаний у даному документі лінкер (І);
Т являє собою описане в даному документі антитіло (АБ) та т становить від 1 до приблизно 20. Відповідно до деяких варіантів здійснення т становить від 1 до 10, від 1 до 7, від 1 до 5 або від 1 до 4.
Відповідно до деяких варіантів здійснення КІ і К2 обидва являють собою метокси (-ОМЄе).
Відповідно до деяких варіантів здійснення неморубіциновий компонент АОС, що містить неморубіцин, являє собою РМИ-159682. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення частина лікарського засобу АОС може характеризуватися однією з наступних структур: и
АН о он М і он
ОСС о до он б о
Хе и МТУ ою уо або о он (в) :
ОСТ он ло 0 он б г хе , . "У,
Око б 7 , де хвиляста лінія вказує на прикріплення до лінкера (|).
Антрацикліни, що включають в себе РМИ-159682, можуть бути кон'юговані з антитілами через декілька сайтів зв'язування та різні лінксери (5 2011/0076287; М/О2009/099741, 05 2010/0034837, УМО 2010/009124), що включають в себе описані в даному документі лінкери.
Ілюстративні АОС, що містять неморубіцин і лінкер, містять у собі без обмеження: о он (в) Н о оду) Митні в т о ло о он
С
Кн
З- У б р
РМИ-159682 малеїмід ацеталь-Аб;
(о) о оон (о) г
Я- її озон ло о он 5 мо г
МН хе - М КВ я- А Т о д МН б. оз
Мне (в) ве (в) З-АЬ р
РМИ-159682-маІ-сі-РАВ-АБ; о | о он он о ваза оногов з КААДХ ж, о Ге! і о оно ОМе
М о МНо Са
ОМе р
РМИ-159682-маІ-сй-РАВ-спейсер-АбБ;
Шк
І
Ге) М о он (о) з у вв? "он
Е оо ро) Ге) он о го о ат (в) я й мн
Геж Ж о. Ан О нм »о 50 Мч
Мне вве з АБ (в) р
РМИ-159682-маІ-сПі-РАВ-спейсер(К182)-АБ, де:
В: і КЕ» незалежно вибирають з Н і Сі-Св алкілу та в) он Ге) о 8-АЬ -,, МН вовни ло о онб в
З мах і-ї о р
РМИ-159682-малеімід-АбБ.
Лінкер РМО-159682 малеїмід ацеталь-АБб являє собою кислотолабільний, у той час як лінкери РМИ-159682-маІ-сП-РАВ-АБ, РМИО-159682-маІ-сП-РАВ-спейсер-Ар і РМО-159682-ма!1-сії-
РАВ-спейсер(К'В2)-АБ являють собою розщеплювальні протеази. (6) Інші фрагменти лікарських засобів
Фрагменти лікарського засобу також містять у собі гелданаміцин (Мапаїег еї а! (2000) 9. Маї.
Сапсег Іпві. 92(19):1573-1581; Мапайег єї а! (2000) Віоогдапіс 4. Мед. Спет. І ейеге 10:1025-1028;
Мапаїйег єї а! (2002) Віосопішдаїє Спет. 13:786-791);. і їх ферментативно активні токсини та фрагменти, що включають у себе без обмеження ланцюг А дифтерії, не зв'язуючі активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг А екзотоксину (з Рзеидотопавх аеєгидіпоза), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг А модецину, альфа-сарцин, білки АїІешигнез гогаї, діантинові білки, білки Рпуюіаса Атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ії РАР-5), інгібітор тотогаїса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трихотецени. Дивитеся, наприклад, УМО 93/21232.
Фрагменти лікарських засобів також містять у собі сполуки з нуклеолітичною активністю (наприклад, рибонуклеазу або ДНК-ендонуклеазу).
Відповідно до деяких варіантів здійснення імунокон'югат може містити високо радіоактивний атом. Множина радіоактивних ізотопів доступна для одержання радіокон'югованих антитіл.
Приклади містять у собі Афе, 181, 125, у, Ве!86, Дев88, 5пт/»з, Віг2!2, рзг, ррет: і радіоактивні ізотопи и. Відповідно до деяких варіантів здійснення, коли імунокон'югат використовується для виявлення, він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад
Тео99 або 123, або спінову мітку для ядерного магнітного резонансу (ЯМР) томографії (також відомої як магнітно-резонансна томографія, МРТ), таку як цирконій-89, йод-123, йод-131, індій- 111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо. Цирконій-89 може бути об'єднаний у комплекс із різними метал-хелаторами та кон'югований з антитілами, наприклад, для ПЕТ (МО 2011/056983).
Радіоактивні або інші мітки можуть бути включені в імунокон'югат відомими способами.
Наприклад, пептид може бути біосинтезований або хімічно синтезований з використанням підходящих попередників амінокислот, що містять, наприклад, один або декілька атомів фтор- 19 замість одного або декількох атомів водню. Відповідно до деяких варіантів здійснення такі мітки, як Те99, 1123, Ве"86, Де!'88 | |, можуть бути приєднані через залишок цистеїну в антитілі.
Відповідно до деяких варіантів здійснення іттрій-90 може бути приєднаний через залишок лізину антитіла. Відповідно до деяких варіантів здійснення спосіб ІЮОСОСЕМ (ЕРгакег еї а! (1978)
Віоспет. Віорпуз. Нез. Соттип. 80: 49-57 може бути використаний для включення йоду-123. "Мопосіопа! Апіїбодіе5 іп Іттипобзсіпідгарпу" (Спаа, СКС Рге5з5 1989) описує деякі інші способи.
Відповідно до деяких варіантів здійснення імунокон'югат може містити антитіло, кон'юговане з активуючим проліки ферментом. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення активуючий проліки фермент перетворює проліки (наприклад, хіміотерапевтичний засіб пептидил, дивитеся
УМО 81/01145) в активний лікарський засіб, такий як протираковий лікарський засіб. Такі імунокон'югати застосовні відповідно до деяких варіантів здійснення в антитіло-залежній фермент-опосередкованій терапії проліків ("АОЕРТ"). Ферменти, які можуть бути кон'юговані з антитілом, містять у собі без обмеження лужні фосфатази, які застосовні для перетворення фосфатовмісних проліків у вільні лікарські засоби; арилсульфатази, які можуть бути застосовні для перетворення сульфатовмісних проліків у вільні лікарські засоби; цитозиндеаміназу, яка застосовна для перетворення нетоксичного 5-фторцитозину в протираковий лікарський засіб, 5- фторурацил; такі протеази, як протеази серратії, термолізин, субтилізин, карбоксипептидази та катепсини (такі як катепсини В ії ГУ), які придатні для перетворення пептид-вмісних проліків у вільні лікарські засоби; О-аланілкарбоксипептидази, які застосовні для перетворення проліків, які містять замісники ЮО-амінокислоти; ферменти, що розщеплюють вуглеводи, такі як |Д- галактозидаза та нейрамінідаза, які застосовні для перетворення глікозилованих проліків у вільні лікарські засоби; р-лактамази, які застосовні для перетворення лікарських засобів, дериватизованих з В-лактамами у вільні лікарські засоби; і такі пеніцилін амідази, як пеніцилін-
М-амідаза та пеніцилін-с-амідаза, які застосовні для перетворення лікарських засобів, дериватизованих за їх амінними атомами азоту або феноксіацетильними фенілацетильними групами, відповідно, у вільні лікарські засоби. Відповідно до деяких варіантів здійснення ферменти можуть бути ковалентно зв'язані з антитілами за допомогою технік рекомбінантних
ДНК, які добре відомі у даній області техніки. Дивитеся, наприклад, Меибегдег еї аї., Маїшйге 312:604-608 (1984). с) Завантаження лікарських засобів
Завантаження лікарського засобу представлене р, середнім числом фрагментів лікарського засобу на антитіло в молекулі формули І. Завантаження лікарського засобу може бути в діапазоні від 1 до 20 фрагментів лікарського засобу (О) на антитіло. АОС формули І містять у собі набори антитіл, кон'югованих з діапазоном фрагментів лікарського засобу від 1 до 20.
Середнє число фрагментів лікарського засобу на антитіло у препаратах від АОС із реакцій кон'югації може бути охарактеризоване за допомогою звичайних засобів, таких як мас- спектроскопія, аналіз ЕГІЗА та НРІ С. Кількісний розподіл АОС у термінах р також може бути визначено. У деяких випадках поділ, очищення та характеристика гомогенного АОС, де Р являє собою певне значення від АЮС з іншими завантаженнями лікарського засобу може бути досягнуте за допомогою, наприклад, НРІ С зі зверненою фазою або електрофорезу.
Для деяких кон'югатів антитіла з лікарським засобом р може бути обмежено кількістю сайтів прикріплення на антитілі. Наприклад, якщо прикріплення являє собою тіол цистеїн, як у деяких запропонованих вище ілюстративних варіантах здійснення, антитіло може містити тільки одну або декілька цистеїнових тіольних груп або може містити тільки одну або декілька досить
Зо реакційноздатних тіольних груп, через які може бути прикріплений лінкер. Відповідно до деяких варіантів здійснення більш високе завантаження лікарського засобу, наприклад, р» 5, може призводити до агрегації, нерозчинності, токсичності або втраті клітинної проникності певних кон'югатів антитіла з лікарським засобом. Відповідно до деяких варіантів здійснення середнє завантаження лікарського засобу для АОС перебуває в діапазоні від 1 до приблизно 8; від приблизно 2 до приблизно 6 або від приблизно З до приблизно 5. Справді, було показано, що для деяких АОС оптимальне співвідношення фрагментів лікарського засобу на антитіло може становити менше 8, і може становити приблизно від 2 до 5 (5 7498298).
Відповідно до деяких варіантів здійснення менше ніж теоретичний максимум фрагментів лікарського засобу кон'югований з антитілом протягом реакції кон'югації. Антитіло може містити, наприклад, залишки лізину, які не вступають у реакцію з проміжною сполукою лікарський засіб- лінкер або реагентом лінкера, як описано нижче. Як правило, антитіла не містять багато вільних і реакційноздатних тіолових груп цистеїну, які можуть бути пов'язані з фрагментом лікарського засобу; дійсно, найбільше цистеїнові тіольні залишки в антитілах існують як дисульфідні містки.
Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіло може бути поставлено з відновлюючим засобом, таким як дитіотреїтолом (ОТТ) або трикарбонілетилфосфіном (ТСЕР), при часткових або повних відновлювальних умовах, для одержання реакційноздатних тіольних груп цистеїну.
Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіла піддають денатуруючим умовам, щоб показати реактивні нуклеофільні групи, такі як лізин або цистеїн.
Завантаження (співвідношення лікарський засіб/антитіло) АОС може управлятися різними способами, і, наприклад, шляхом: () обмеження молярного надлишку проміжної сполуки лікарський засіб-лінкер або реагенту лінкера стосовно до антитіла, (ії) обмеження часу реакції кон'югації або температури та (ії) часткових або обмежуючих відновлювальних умов для модифікації тіолу цистеїну.
Варто розуміти, що там, де більше ніж одна нуклеофільна група реагує з проміжною сполукою лікарський засіб-лінкер або реагентом лінкера, отриманий потім продукт являє собою суміш сполук АБС з розподілом одного або декількох фрагментів лікарського засобу, прикріплених до антитіла. Середнє число лікарських засобів на антитіло може бути розраховане з суміші шляхом подвійного аналізу ЕГІ5А антитіла, яке специфічно до антитіла та специфічно до лікарського засобу. Окремі молекули АОС можуть бути ідентифіковані в суміші за допомогою бо мас-спектроскопії та розділені за допомогою НРІ С, наприклад, хроматографії гідрофобної взаємодії (дивитеся, наприклад, Месбопасді еї а! (2006) Ргої. Епог. Оеєзідп 5 ЗеІесіоп 19(7):299- 307; Натрбіеїйї єї а! (2004) Сіїп. Сапсег Невз. 10:7063-7070; Натбієйн, К./., еї аІ. "ЕЄМесі ої агид
Іюсадіпд оп Ше рНаптасоіоду, рПпагтасокКіпеїісв, апа їохісйу ої ап апі-СОЗ30 апііроду-дгид сопішдаїе, " Арзігасі Мо. 624, Атегісап Авб5осіайоп ог Сапсег Везєагси, 2004 Аппиа! Мееїіпа, Магесйп 27-31, 2004, Ргосеєдіпдв ої (пе ААСВЕ, Моїште 45, Магсй 2004; АїІеу, 5.С., еї а). "Сопігоїїпу
Ше Іосайоп ої агид абйасптенпі іп апііроду-агид сопіидаїез, " АБзігасі Мо. 627, Атегісап Авзосіайоп
Тог Сапсег Незеєагсі, 2004 Аппиа! Мееїїпдо, Магсйп 27-31, 2004, Ргосевєдіпд5 ої Ше ААСВ, Моїште 45, Магсп 2004). Відповідно до деяких варіантів здійснення гомогенний АОС з одним значенням завантаження може бути виділений з суміші кон'югування за допомогою електрофорезу або хроматографії. а) Деякі способи одержання імунокон'югатів
АС формули І може бути отриманий за допомогою декількох способів, які використовують реакції органічної хімії умови та реагенти, відомі фахівцям у даній області техніки, що включають в себе: (1) реакцію нуклеофільної групи антитіла з двовалентним лінкерним реагентом для утворення АВ-І за допомогою ковалентного зв'язку, з наступною взаємодією з фрагментом лікарського засобу 0; ії (2) реакцію нуклеофільної групи фрагмента лікарського засобу з двовалентним лінкерним реагентом для утворення Ю-Ї за допомогою ковалентного зв'язку, з наступною реакцією з нуклеофільною групою антитіла. Ілюстративні способи одержання АОС формули І останнім способом описані в Ш5 7498298, що спеціально включений у даний документ за допомогою посилання.
Нуклеофільні групи на антитілах містять у собі без обмеження: (ії) М-кінцеві аміногрупи, (ії) аміногрупи бічних ланцюгів, наприклад, лізин, (ії) тіольні групи бічних ланцюгів, наприклад, цистеїн, і (ім) гідроксильні або аміногрупи цукру, де антитіло глікозильоване. Аміно, тіольні та гідроксильні групи являють собою нуклеофільні та здатні вступати в реакцію з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами на лінкерних фрагментах і лінкерних реагентах, що включають в себе: (ї) активні складні ефіри, такі як складні ефіри МН5, складні ефіри НОВІ, галогенформіати та галогеніди кислот; (її) алкіл- і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; і (ії) альдегіди, кетони, карбоксильні та малеїмідні групи. Деякі антитіла містять відновлювані міжланцюгові дисульфіди, тобто мости цистеїну. Антитіла можуть бути
Зо отримані реактивно для кон'югації з лінксерним реагентом шляхом обробки відновлювальним засобом, таким як ОТТ (дитіотреїтол) або трикарбонілетилфосфін (ТСЕР), таким чином, що антитіло повністю або частково відновлюється. Кожний цистеїновий міст буде, таким чином, утворювати, теоретично, два реактивних тіолові нуклеофіла. Додаткові нуклеофільні групи можуть бути введені в антитіла за допомогою модифікації залишків лізину, наприклад, шляхом взаємодії залишків лізину з 2-імінотіоланом (реагент Траута), приводячи до конверсії аміну в тіол. Реактивні тіолові групи також можуть бути введені в антитіло шляхом введення одного, двох, трьох, чотирьох або більше залишків цистеїну (наприклад, шляхом підготовки варіантних антитіл, що містять один або декілька ненативних залишків амінокислоти цистеїну).
Кон'югати антитіла з лікарським засобом згідно з даним винаходом можуть також бути отримані за допомогою реакції між електрофільною групою на антитілі, такою як карбонільна група альдегіду або кетону, з нуклеофільною групою на лінкерному реагенті або лікарському засобі. Застосовні нуклеофільні групи на лінкерному реагенті містять у собі без обмеження гідразид, оксим, аміно, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат й арилгідразид.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло модифікується для введення електрофільних фрагментів, які здатні вступати в реакцію з нуклеофільними замісниками на лінкерному реагенті або лікарському засобі. Відповідно до іншого варіанта здійснення цукри глікозилованих антитіл можуть бути окислені, наприклад, окисним реагентом періодатом для утворення груп альдегіду або кетону, які можуть реагувати з аміногрупою лінкерного реагенту або фрагментами лікарського засобу. Отримані в результаті імінові групи основи Шиффа можуть утворювати стабільний зв'язок, або можуть бути відновлені, наприклад, боргідридним реагентом з утворенням стабільних амінних зв'язків. Відповідно до одного варіанта здійснення реакція вуглеводної частини глікозилованого антитіла з галактозооксидазою або метаперіодатом натрію може дати карбонільні групи (альдегід і кетон) в антитілі, що може реагувати з відповідними групами на лікарському засобі (Нептапзоп, Віосопійдаїе Тесппідцев).
Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіла, що містять М-кінцеві залишків серину або треоніну, можуть вступати в реакцію з метаперіодатом натрію, приводячи до виробництва альдегіду замість першої амінокислоти (сеодпедап 5 Зігой, (1992) Віосопіпдаїє Спет. 3:138- 146; 005 5362852). Такий альдегід може взаємодіяти з фрагментом лікарського засобу або лінкерним нуклеофілом.
Ілюстративні нуклеофільні групи на фрагменті лікарського засобу містять у собі без обмеження: амін, тіол, гідроксил, гідразид, окКсим, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат й арилгідразидні групи, здатні реагувати з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами на лінкерних фрагментах і лінкерних реагентах, що включають в себе: (ії) активні складні ефіри, такі як складні ефіри МН5, складні ефіри НОВІ, галогенформіати та галогеніди кислот; (ії) алкіл- і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; (ії) альдегіди, кетони, карбоксильні та малеїімідні групи.
Необмежуючі ілюстративні зшиваючі реагенти, які можуть бути використані для одержання
АРрС, описані в даному документі в розділі "Ілюстративні лінкери". Способи використання таких зшиваючих реагентів для з'єднання двох фрагментів, що включають в себе білковий фрагмент і хімічний фрагмент, відомі в даній області техніки. Відповідно до деяких варіантів здійснення злитий білок, що містить антитіло та цитотоксичний засіб, можуть бути отримані, наприклад, за допомогою рекомбінантних способів або пептидним синтезом. Рекомбінантна молекула ДНК може містити області, що кодують антитіла та цитотоксичні частини кон'югату або суміжних один з одним, або розділених областю, що кодує лінкерний пептид, який не порушує необхідні властивості кон'югату.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення антитіла можуть бути кон'юговані з "рецептором" (таким як стрептавідин) для використання у попередньому націленому впливі на пухлину, причому кон'югат антитіло-рецептор уводять пацієнту з наступним видаленням незв'язаного кон'югату з циркуляції, використовуючи освітлюючий засіб, і потім введенням "ліганду" (наприклад, авідину), який кон'югований з цитотоксичним засобом (наприклад, лікарським засобом або радіонуклідом).
Е. Способи та композиції для діагностики та виявлення
Відповідно до деяких варіантів здійснення будь-яке з передбачених у даному документі антитіл до І1УубЕ застосоване для виявлення наявності ІУубЕ у біологічному зразку.
Використовуваний у даному документі термін "виявлення" охоплює кількісне або якісне виявлення. "Біологічний зразок" включає, наприклад, клітину або тканину (наприклад, біопсію матеріалу, що включає в себе злоякісні або потенційно злоякісні тканини товстої кишки, товстої та прямої кишок, ендометрію, підшлункової залози або яєчників).
Відповідно до одного варіанта здійснення включаються антитіла до І убЕ для застосування в способі діагностики або виявлення. Відповідно до додаткового аспекту передбачений спосіб виявлення наявності ГуУбЕ у біологічному зразку. Відповідно до деяких варіантів здійснення спосіб включає контактування біологічного зразка з описаним у даному документі антитілом до
ГУбЕ в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла до ГубЕ з ГубЕ, і виявлення того, чи утворюється комплекс між антитілом до І УбЕ і УубЕ у біологічному зразку. Такий спосіб може являти собою спосіб іп міто або іп мімо. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло до
ГубЕ використовується для вибору суб'єктів, допущених до терапії з антитілом до ГУбЕ, наприклад, де ГубЕ являє собою біомаркер для відбору пацієнтів. Відповідно до додаткового варіанта здійснення біологічний зразок являє собою клітину або тканину (наприклад, біопсійний матеріал, що включає в себе злоякісні або потенційно злоякісні тканини товстої кишки, товстої та прямої кишок, ендометрію, підшлункової залози або яєчників).
Відповідно до додаткового варіанта здійснення антитіло до ГубЕ використовується іп мімо для виявлення, наприклад, за допомогою візуалізації іп мімо ГубЕ-позитивної злоякісної пухлини в суб'єкта, наприклад, для цілей діагностики, при прогнозуванні або стадії злоякісної пухлини, визначення відповідного курсу терапії або моніторингу реакції злоякісної пухлини на терапію.
Один спосіб виявлення іп мімо, відомий у даній області техніки, являє собою імуно-позитронно- емісійну томографію (імуно-ПЕТ), як описано, наприклад, в мап Юопдеп еї аїЇ., Те Опсоіодіві 12:1379-1389 (2007) Метге! еї аї., У. Мисі. Мед. 44:1271-1281 (2003). Відповідно до таких варіантів здійснення передбачений спосіб для виявлення ІГубЕ-позитивної злоякісної пухлини в суб'єкта, спосіб, який включає введення міченого антитіла до ГубЕ суб'єкта, що характеризується наявністю або підозрою на наявність І убЕ-позитивної злоякісної пухлини, і виявлення міченого антитіла до ГубЕ у суб'єкта, причому виявлення міченого антитіла до ГубЕ вказує на ГУбЕ- позитивну злоякісну пухлину в суб'єкта. Відповідно до деяких таких варіантів здійснення мічене антитіло до ГубЕ містить антитіло до ГубЕ, кон'юговане з позитронним емітером, наприклад, бв(За, 9, 64биу, 86у, 76Ву, 892у і 124Ї1, Відповідно до конкретного варіанта здійснення позитронний емітер являє собою 892г.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення спосіб діагностики або виявлення включає контактування першого антитіла до ГубЕ, іммобілізованого на основі з досліджуваним на наявність ГубЕ біологічним зразком, вплив на основу другим антитілом до ГУубЕ, і виявлення, чи бо зв'язується друге антитіло до ГУбЕ з комплексом між першим антитілом до ГубЕ і ГубЕ у біологічному зразку. Основа може являти собою будь-яке підтримуюче середовище, наприклад, скло, метал, кераміку, полімерні гранули, покривні стекла, стружки й інші субстрати. Відповідно до деяких варіантів здійснення біологічний зразок містить клітину або тканину (наприклад, біопсійний матеріал, що включає в себе злоякісні або потенційно злоякісні тканини товстого кишечнику, прямого кишечнику, ендометрію, підшлункової залози або яєчників). Відповідно до деяких варіантів здійснення перше або друге антитіло до ГубЕ являє собою будь-яке з описаних у даному документі антитіл. Відповідно до таких варіантів здійснення друге антитіло до ІГУбЕ може являти собою 603 або 7С9; або антитіла, отримані з 603 або 7С9, як описано в даному документі.
Ілюстративні порушення, які можуть бути діагностовані або виявлені відповідно до будь- якого зі зазначених вище варіантів здійснення, містять у собі ГубЕ-позитивні форми раку, такі як
ГубЕ-позитивний рак товстої кишки (у тому числі аденокарцинома), ГубЕ-позитивний рак яєчників (у тому числі серозна аденокарцинома яєчників), ГУбЕ-позитивний рак підшлункової залози (у тому числі аденокарциному протоки підшлункової залози) і !УбЕ-позитивний рак ендометрію. Відповідно до деяких варіантів здійснення ГубЕ-позитивна злоякісна пухлина являє собою злоякісну пухлину, яка одержує оцінку анти-!Г убЕ імуногістохімії (ІНС) або гібридизації іп 5йи (ІЗН) більше, ніж "0", що відповідає дуже слабкому фарбуванню або відсутності фарбування в » 90 95 пухлинних клітин в умовах, описаних у даному документі у прикладі В. Відповідно до іншого варіанта здійснення ГубЕ-позитивна злоякісна пухлина експресує ГУбЕ на рівні їж, 2 або 3, як визначено в умовах, описаних у даному документі у прикладі В. Відповідно до деяких варіантів здійснення ГубЕ-позитивна злоякісна пухлина являє собою злоякісну пухлину, що експресує ГубЕ відповідно до ПЛР зі зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР), що виявляє МРНК
ГУбЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення ЗТ-ПЛР являє собою кількісну ЗТ-ПЛР.
Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачені мічені антитіла до ГубЕ. Мітки містять у собі без обмеження мітки або фрагменти, які виявляються безпосередньо (наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електронно-щільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також такі фрагменти, як ферменти або ліганди, які виявляються побічно, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії. Ілюстративні мітки містять у собі без обмеження радіоізотопи З2Р, 120, 1251, ЗН і 1911, такі флуорофори, як рідкі земельні хелати
Зо або флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люциферазу світлячка та бактеріальну люциферазу (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, пероксидазу хрону (НКР), лужну фосфатазу, В- галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, сахаридоксидази, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу і глюкозо-б-фосфатдегідрогенази, такі гетероциклічні оксидази, як уриказу та ксантиноксидазу, у сполученні з ферментом, який використовує пероксид водню для окислювання попередника барвника, такий як НЕР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/авідин, спінові мітки, мітки бактеріофага, стабільні вільні радикали і тому подібне.
Відповідно до іншого варіанта здійснення мітка являє собою позитронний емітер. Позитронний емітер містить в собі без обмеження 98(з3а, 8Е, 5бу, 86у, 76Ву, 892 і 124ї1. Відповідно до конкретного варіанта здійснення позитронний емітер являє собою 897г.
Е. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади описаних у даному документі антитіл або імунокон'югатів до ГубЕ одержують шляхом змішування такого антитіла або імунокон'югату, що характеризується бажаним ступенем чистоти, з одним або декількома необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями (НКетіпдіоп'є Рнаптасецшііса! бсіепсез 161п ейайіоп, О5ої, А. Еа. (1980)), у вигляді ліофілізованих складів або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії, як правило, являють собою нетоксичні для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях і містять в собі без обмеження: такі буфери, як фосфатний, цитратний й інших органічних кислот; антиоксиданти, що включають в себе аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметилбензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; такі алкілларабени, як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; і м-крезол); низькомолекулярні (менше ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; такі білки, як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; такі гідрофільні полімери, як полівінілпіролідон; такі амінокислоти, як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, що включають в себе глюкозу, маннозу або декстрини; такі хелатуючі засоби, як ЕДТА; такі цукри, як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; протиїони, що утворюють сіль, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, 2п-білкові комплекси); і/або неїіонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ). Ілюстративні фармацевтично прийнятні носії в 60 даному документі додатково містять в собі інтерстиціальні засоби дисперсії лікарських засобів,
такі як розчинні нейтрально-активні глікопротеїни гіалуронідази (ЗНАБЕСР), наприклад, розчинні глікопротеїни гіалуронідази РН-20 людини, такі як гНнНиИРН2гО (НМ ЕМЕХФО, Вахег
Іпепаїййопаї, Іпс.). Певні ілюстративні ЗНА5БЕСР і способи їх використання, що включають в себе
ГНиРНІ2О, описані в опублікованому патенті США Мо 2005/0260186 і 2006/0104968. Відповідно до одного аспекту 5НАБЕОР комбінується з одним або декількома додатковими глікозаміногліканами, такими як хондроїтинази.
Ілюстративні ліофілізовані склади антитіл або імунокон'югатів описані у патенті США Мо 6267958. Водні склади антитіл або імунокон'югатів містять в собі ті, які описані у патенті США Мо 6171586 і УМО2006/044908, останні склади, що включають в себе гістидин-ацетатний буфер.
Склад в даному документі може також містити більше ніж один активний інгредієнт, як необхідно для конкретного показання, що підлягає лікуванню, переважно ті, з комплементарною активністю, які не роблять негативного впливу один на одного. Наприклад, у деяких випадках, може бути бажано додатково забезпечити комплекс платини, наприклад, для лікування І УубЕ- позитивного раку, такого як, наприклад, ГубЕ-позитивного раку молочної залози, або ІУубЕ- позитивного раку підшлункової залози, або І убЕ-позитивного раку товстого кишечнику, або
ГубЕ-позитивного раку товстої та прямої кишок, або І убЕ-позитивної меланоми, або ІУбЕ- позитивного раку яєчників, ГубЕ-позитивного не дрібноклітинного раку легенів, або ІУубЕ- позитивного раку шлунка.
Активні інгредієнти можуть бути розміщені в мікрокапсули, отримані, наприклад, способами коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозних або желатинових мікрокапсул і полі--метилметакрилату) мікрокапсул, відповідно, у колоїдні системи доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або в макроемульсії. Такі техніки описані в Ветіпаїоп'
Ріпаптасеціїіса! бсіепсез 161 єайіоп, Озої, А. Ес. (1980).
Можуть бути отримані препарати з уповільненим вивільненням. Підходящі приклади препаратів з уповільненим вивільненням містять в собі напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло або імунокон'югат, де матриці перебувають у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул.
Склади, які будуть використовуватися для введення іп мімо, як правило, стерильні.
Зо Стерильність може бути легко здійснена, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани. б. Терапевтичні способи та композиції
Будь-яке з представлених у даному документі антитіл або імунокон'югатів до ГУбЕ може використовуватися в способах, наприклад, терапевтичних способах.
Відповідно до одного аспекту передбачене в даному документі антитіло або імунокон'югат до ГубЕ використовується в способі інгібування проліферації І убЕ-позитивної клітини, спосіб, який включає вплив на клітину антитілом або імунокон'югатом до ГубЕ в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла або імунокон'югату до ГубЕ з їубЕ на поверхні клітини, тим самим інгібуючи проліферацію клітини. Відповідно до деяких варіантів здійснення спосіб являє собою спосіб іп міо або іп мімо. Відповідно до додаткових варіантів здійснення клітина являє собою клітину злоякісної пухлини молочної залози, або клітину злоякісної пухлини підшлункової залози, або клітину злоякісної пухлини товстої кишки, або клітину злоякісної пухлини товстої та прямої кишок, або злоякісну клітину меланоми, або клітину злоякісної пухлини яєчників, або клітину не дрібноклітинного раку легені, або клітину злоякісної пухлини шлунка.
Інгібування проліферації клітин іп мйго може бути проаналізоване з використанням люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СеїїТйег-Сіо"М, що комерційно доступний від
Рготеда (Мадізоп, УМ). Цей аналіз визначає число життєздатних клітин у культурі на основі кількісного аналізу присутнього АТФ, що являє собою показник метаболічно активних клітин.
Дивитеся Стоисп еї аї. (1993) 9. Іттипої. Меїй. 160:81-88, 05 Раї. Мо. 6602677. Аналіз може бути проведений в 96- або 384-ямковому форматі, роблячи його таким, що піддається автоматизованому високопродуктивному скринінгу (НТ). Дивитеся Стгее еї аї. (1995) АпіїСапсег
Огид5 6:398-404. Процедура аналізу містить в собі додавання одного реагенту (реагент СеїПТйег-
СіІоФ) безпосередньо в культивовані клітини. Це призводить до лізису клітин і генерації люмінесцентного сигналу, отриманого за допомогою реакції люциферази. Люмінесцентний сигнал пропорційний присутній кількості АТФ, що прямо пропорційно кількості життєздатних клітин, які є присутніми у культурі. Дані можуть бути записані за допомогою фотометра або пристрою зображення камери ССО. Вихід люмінесценції виражають у вигляді відносних світлових одиниць (КІ 0).
Відповідно до іншого аспекту передбачені антитіло або імунокон'югат до ГубЕ для 60 використання як лікарський засіб. Відповідно до додаткових аспектів передбачені антитіло або імунокон'югат до ГубЕ для використання в способі лікування. Відповідно до деяких варіантів здійснення передбачені антитіло або імунокон'югат до ГубЕ для використання в лікуванні І уУбЕ- позитивної злоякісної пухлини. Відповідно до деяких варіантів здійснення в даному винаході передбачені антитіло або імунокон'югат до ГУубЕ для використання в способі лікування індивідуума з ГУубЕ-позитивною злоякісною пухлиною, спосіб, який включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла або імунокон'югату до ГубЕ. Відповідно до одного такого варіанта здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче.
Відповідно до додаткового аспекту в даному винаході передбачене застосування антитіла або імунокон'югату до ГуУбЕ у виробництві або одержанні лікарського засобу. Відповідно до одного варіанта здійснення лікарський засіб призначений для лікування ІУбЕ-позитивної злоякісної пухлини. Відповідно до додаткового варіанта здійснення лікарський засіб призначений для використання в способі лікування І убЕ-позитивної злоякісної пухлини, спосіб, який включає введення індивідууму з ГубЕ-позитивною злоякісною пухлиною ефективної кількості лікарського засобу. Відповідно до одного такого варіанта здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, наприклад, як описано нижче.
Відповідно до додаткового аспекту в даному винаході передбачений спосіб лікування І убЕ- позитивної злоякісної пухлини. Відповідно до одного варіанта здійснення спосіб включає введення індивідууму з такою ГубЕ-позитивною злоякісною пухлиною ефективної кількості антитіла або імунокон'югату до ГУбЕ. Відповідно до одного такого варіанта здійснення спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного засобу, як описано нижче.
ГубЕ-позитивний рак відповідно до будь-якого з наведених вище варіантів здійснення може являти собою, наприклад, ГубЕ-позитивний рак молочної залози, або І убЕ-позитивний рак підшлункової залози, або ГубЕ-позитивний рак товстого кишечнику, або ГубЕ-позитивний рак товстої та прямої кишок, або ГубЕ-позитивну меланому, або І убЕ-позитивний рак яєчників, або
ГубЕ-позитивний не дрібноклітинний рак легенів, або ГубЕ-позитивний рак шлунка. Відповідно до деяких варіантів здійснення І убЕ-позитивна злоякісна пухлина являє собою злоякісну
Зо пухлину, що одержує оцінку анти-і убЕ імуногістохімії (ІНС) або гібридизації іп 5йи (ІЗН) більше, ніж "0", що відповідає дуже слабкому фарбуванню або відсутності фарбування в » 9095 пухлинних клітин в умовах, описаних у даному документі. Відповідно до іншого варіанта здійснення ГубЕ-позитивна злоякісна пухлина експресує ГУбЕ на рівні їж, 2- або Зж, як визначено в умовах, описаних у даному документі. Відповідно до деяких варіантів здійснення
ГубЕ-позитивна злоякісна пухлина являє собою злоякісну пухлину, що експресує ГУбЕ відповідно до ПЛР зі зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР), що виявляє МРНК ГУбЕ. Відповідно до деяких варіантів здійснення ЗТ-ПЛР являє собою кількісну ЗТ-ПЛР. "Індивідуум" відповідно до будь-якого з вищеописаних варіантів здійснення може являти собою людину.
Відповідно до додаткового аспекту в даному винаході передбачені фармацевтичні склади, які містять будь-яке з передбачених у даному документі антитіл або імунокон'югатів до ІГУбЕ, наприклад, для застосування в будь-якому зі зазначених вище терапевтичному способі.
Відповідно до одного варіанта здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке з представлених у даному документі антитіл або імунокон'югатів до ГубЕ і фармацевтично прийнятний носій. Відповідно до іншого варіанта здійснення фармацевтичний склад містить будь-яке з представлених у даному документі антитіл або імунокон'югатів до ГУбЕ і, щонайменше, один додатковий терапевтичний засіб, наприклад, як описано нижче.
Антитіла або імунокон'югати згідно з даним винаходом можуть бути використані окремо або в комбінації з іншими засобами в терапії. Наприклад, антитіло або імунокон'югат згідно з даним винаходом може бути введене спільно щонайменше з одним додатковим терапевтичним засобом. Відповідно до деяких варіантів здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою комплекс платини, наприклад, для лікування ГубЕ-позитивного раку, такого як, наприклад, ГуУбЕ-позитивного раку молочної залози, або ГубЕ-позитивного раку підшлункової залози, або ГубЕ-позитивного раку товстої кишки, або ГубЕ-позитивного раку товстої та прямої кишок, або ІубЕ-позитивної меланоми, або ІУубЕ-позитивного раку яєчників, або ІУбЕ- позитивного не дрібноклітинного раку легенів, або І убЕ-позитивного раку шлунка.
Такі відзначені вище комбіновані терапії охоплюють комбіноване введення (де два або більше терапевтичних засоби включені в ті самі або різні склади) і роздільне введення, і в цьому випадку, введення антитіла або імунокон'югату згідно з даним винаходом може мати місце до, 60 одночасно з і/або після введення додаткового терапевтичного засобу й/або ад'юванту. Антитіла або імунокон'югати згідно з даним винаходом також можуть бути використані в комбінації з променевою терапією.
Антитіло або імунокон'югат згідно з даним винаходом (і будь-який додатковий терапевтичний засіб) може бути введене за допомогою будь-яких підходящих засобів, що включають в себе парентеральне, внутрішньолегеневе й інтраназальне, і, якщо бажано для місцевого лікування, внутрішньоосередкове введення. Парентеральні інфузії містять в собі внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревинне або підшкірне введення. Дозування може здійснюватися будь-яким підходящим шляхом, наприклад, шляхом ін'єкцій, наприклад, внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, у залежності почасти від того, чи являє собою введення коротке або хронічне. Різні схеми дозування, що включають в себе без обмеження одне або декілька введень у різні тимчасові точки, болюсне введення й імпульсну інфузію, розглядаються в даному документі.
Антитіла або імунокон'югати згідно з даним винаходом будуть складені, дозовані й уведені відповідно до гарної медичної практики. Фактори, які підлягають розгляду в цьому контексті, містять в собі конкретне порушення, що підлягає лікуванню, конкретного ссавця, що підлягає лікуванню, клінічний стан конкретного пацієнта, причину порушення, місце доставки засобу, спосіб введення, схему введення й інші фактори, відомі практикуючим лікарям. Антитіло або імунокон'югат не має потреби, але може необов'язково бути складений з одним або більше засобами, які використовують в цей час для запобігання або лікування розглянутого порушення.
Ефективна кількість таких інших засобів залежить від кількості антитіла або імунокон'югату, присутнього в складі, типу порушення або лікування й інших факторів, описаних вище. Як правило, вони використовуються в тих самих дозах і тих самих шляхах введення, як описано в даному документі, або приблизно від 1 до 99 95 від використовуваних доз, описаних у даному документі, або в будь-якому дозуванні та будь-яким шляхом, що емпірично/клінічно визначається як підходящий.
Для профілактики або лікування захворювання підходяща доза антитіла або імунокон'югату згідно з даним винаходом (при використанні окремо або в сполученні з одним або декількома іншими додатковими терапевтичними засобами) буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, типу антитіла або імунокон'югату, тяжкості та плину захворювання, від того,
Зо вводять антитіло або імунокон'югат для профілактичних або терапевтичних цілей, що передує терапії, історії хвороби пацієнта та реакції на антитіло або імунокон'югат і за розсудом лікаря.
Антитіло або імунокон'югат відповідним чином уводять пацієнту один раз або у вигляді серії впливів. Залежно від типу та тяжкості захворювання приблизно від 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг-10 мг/кг) антитіла або імунокон'югату може бути початковою кандидатною дозою для введення пацієнту, наприклад, за допомогою одного або декількох окремих введень або шляхом безперервної інфузії. Одна типова добова доза може варіюватися від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, залежно від зазначених вище факторів. У випадку багаторазових введень протягом декількох днів або більше залежно від стану, лікування, як правило, буде стійким до бажаного придушення симптомів захворювання. Одне ілюстративне дозування антитіла або імунокон'югату являють собою варіювання в діапазоні від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Таким чином, одна або декілька доз від приблизно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг або 10 мг/кг (або будь-яка їх комбінація) можуть бути введені пацієнту. Такі дози можуть бути введені з перервами, наприклад, щотижня або кожні три тижні (наприклад, так, що пацієнт одержує від приблизно двох до приблизно двадцяти, або, наприклад, приблизно шість доз антитіла). Може бути введена початкова підвищена введена доза з наступними однією або декількома більш низькими дозами. Проте, можуть бути застосовні інші режими дозування.
Прогрес цієї терапії легко контролювати звичайними способами й аналізами.
Варто розуміти, що будь-який зі зазначених вище складів або терапевтичних способів може бути здійснений з використанням як імунокон'югату згідно з даним винаходом, так й антитіла до
ГУбЕ.
Н. Вироби
Відповідно до іншого аспекту даного винаходу передбачений виріб, що містить речовини, придатні для лікування, профілактики та/або діагностики описаних вище порушень. Виріб містить контейнер й етикетку або вкладиш, поміщений в або пов'язаний з контейнером.
Підходящі контейнери містять в собі, наприклад, пляшки, флакони, шприци та пакети розчину ЇМ тощо. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, таких як скло або пластик.
Контейнер містить композицію, яка сама по собі або в сполученні з іншою композицією ефективна для лікування, профілактики та/або діагностики порушення та може містити стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою пакет або флакон для бо внутрішньовенного розчину, що містить пробку, яку проколюють голкою для підшкірної ін'єкції).
Щонайменше один активний засіб у композиції являє собою антитіло або імунокон'югат згідно з даним винаходом. На етикетці або вкладиші в упакуванні вказується, що композиція використовується для лікування вибраного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, що міститься в ньому, причому композиція містить антитіло або імунокон'югат згідно з даним винаходом; і (Б) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, причому композиція містить додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний засіб.
Виріб у даному варіанті здійснення згідно з даним винаходом може додатково містити інструкцію-вкладиш, яка вказує, що композиції можуть бути використані для лікування конкретного стану. Альтернативно або додатково, виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВМУРІ), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин декстрози або розчин Рінгера. Він може додатково містити в собі інші матеріали, бажані з комерційної та споживчої точки зору, що включають в себе інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки та шприци.
Ї. Послідовності згідно з даним винаходом
Відповідно до іншого аспекту даного винаходу передбачені наступні послідовності, застосовні для лікування, профілактики та/або діагностики описаних вище порушень.
МКІБІ РМ ААГГОМЕВАБІІ МСЕЗСІ МОКОМ пмінокислотна. ВЕ ПЮДИНИ ! І УСІ КРТІСЗООЮМУСУТУЗАВАСІОМІ ТЕО з сипальною поді овністю
НОЗІ ЗКТОЗРАСРІРЕУММИамМмАЗМИаІССО5НЕІ. (амінокислоти 1-20
СМЕБААрИСІ ВАЗМТ САС І БІГ РАІ ВГСР й - підкреслені)
МКІБІ РМ ААГГОМЕВАБІІ МСЕЗСІ МОКОМ посиідовність БЕ макаки з 2 ГУСГ КРТІСБРООМУСУТУЗТБАСІСМІ МТРа сигнальною послідовністю
НОЗІ 5КТОЗРАСРІ РЕСІММаМАЗМИІ5ССОБНІ (амінокислоти 1-20
СМЕБААрИСІ ВАЗАТІ САС БІГ РАІ ВРаР й - підкреслені)
Гуманізована
РІОМТО5РБОБІ БАБМОаО ВМТ ОЗАБОСІЗММІ МУ амінокислотна
З УООокКРОКТУК ПИМТЗМІ НИ МРЗьНЕЗОаВОБИтТ послідовність
РУТ ТІББГОРЕОРАТУУСООМУ5ЕЇ РМУТРООСТК варіабельного легкого
МЕІК ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до ГубЕ
ОІОМТОТТО5І ЗАБІ СОВМТІЗСЗАВОСІВММІ ММ кимерна амінокислотна
А УдвОокКРєРрОЯатТУКИ ІМУТЗМІ НЗСУМРЗАНЕЗОЗОБИтТ варіабельного пегкого
ОУБІ ТІЗМ ЕРЕОІАТУУСООМ5ЕЇ РУТРСССИТК
МЕїК ланцюга клону ХГ УбЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Гуманізована
ЕМО МЕЗОаРАЇ МКРТОТІ ТІ ТСТУЗОББІ ТаМБУМ амінокислотна 5 МІВОРРОКАЇГ ЕМ сМІМс,аравзториумМзА| кьні ТІ послідовність
ЗКОТЗ5КМОУМІ ТМІТІММОРМОТАТУМСАВОУМ ЕМ варіабельного важкого
УА5БМЕАУМмаОатіІ МТУ55 ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
ОМОЇІ КЕБОРСЇ МАРБОЗВІ 5І ТСТУБО БІ ТОУБУМ пні м ен
МУВОРРОКаГгеЕмМІ сМмІімаравзтриумМзАІ кА варіабельного важкого
ТІЗКОМЗКЗОМ РІ КММ5І ОТОЮТАВУУСАВОМУ ланцюга клону хі убЕ
ЕММАБУГАУМУС РОТІ МТУБА ти9В12 антитіла до ГувЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність СОК 1 1 ЗАЗОВІБЗМУМ варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
ЗЕО Ю МО:
Гуманізована амінокислотна послідовність СОЄ 2
УТЗМІНЗ варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність СОЄ З
ОСУЗЕІ РУТ варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність СОЕ 1
ОЕВІ-ТОУБУМ варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність СОЄ 2
Щ МІувоО5ТОУМБА!К5 варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність СОЄ З 12 ОУУЕМУАВМРАУ варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Химерна амінокислотна послідовність СОЕ 1 13 ЗАБОСІЗМУЇ М варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність СОЄ 2 14 УтМІ нь варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність СОЄ З
ООУ5ЕЇ РУТ варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність СОЕ 1 16 ОЕБІ-ТОУВУМ варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність СОЄ 2 17 мімаравтоммМ5АІ Кк варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
5ЕО І МО:
Химерна амінокислотна послідовність СОЄ З 18 ОУМЕМУАБМЕАУ варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕМУ 1 19 РІОМТО5РБОБІ БАБМООЮВМТІТС варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕУМ 2
МУУВОоКРОКТУКШУ варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕУМ З 21 СМРОНЕБЗИОаБИаБаИтомтІ ТІ ОРЕОБАТУМС варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до ГубЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕУУ 4 22 РассткУвК варіабельного легкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕМУ 1 23 ЕМОЇ МЕБОРАЇ МКРТОТІ ТІ ТСТУ5 варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна 24 |МІВОРРОКАГ ЕМ С послідовність ГРМ/ 2 варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна
ВІ ТІЗКОТЗКМОУМІ ТМТММОРУОТАТУУСАВ послідовність ЕМ З варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Гуманізована амінокислотна послідовність ЕУУ 4 265 МОСТІ Туз варіабельного важкого ланцюга клону пи9812 м12 антитіла до І убЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕМУ 1 27 РІОМТОТТ55І ЗАБІ аОВМТтІЗС варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУМ 2 28 МУУООКРєРОИаТУКСИМ варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУМ З 23 СуРЗАЕЗОаБИаБИатТОМ5І ТІЗМІ ЕРЕПІАТУМС варіабельного легкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГуУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУУ 4 гаааткмєЕїк варіабельного легкого ланцюга клону хі уУбЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕМУ 1
З ОМОІЇ КЕЗИаРОЇ МАРБОБІ 5ІТСТУ5 варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУМ 2 32 МУВОРРИОаКаї ЕМ С варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУМ З
З3 ВІТІЗКОМЗКБОМРІ КММУ5І ОТООТАВУМСАН варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Химерна амінокислотна послідовність ЕУУ 4 34 МаРИТІ МТУ5А варіабельного важкого ланцюга клону хі УбЕеЕ ти9В12 антитіла до ГУбЕ
Амінокислотна
МКІБІ РУ АХА ЯМЕВА5Б5І МСЕБСІ МОКОМІ. послідовність ГУубЕ макаки-
УСІ КРТІСЗРООМУСУТУТЗАСІСМІ УтТРань резусу з сигнальною
І ЗКТОЗРАСРІ РЕСІММИАМАЗМИаІ5ССОРІ МЕ послідовністю
ЗААрааці ВАЗАТІИЇ САС І ІІ РАІ АРГО Р (амінокислоти 1-20 підкреслені)
МЗАТ5ОЗММАМУРІ РМ Г ААГГ ЯМЕОМН5І МСЕЗС Амінокислотна
ТООКММІМСЇ МРУЗБСОЕКОНУСІТІ БААДАСгаИ послідовність І убЕ миші з 36 МУМІ СМТ МКасСеРІСРБЕММУМІ М МАБУМОУ сигнальною послідовністю
ССОББЗЕСМЕБЗААИЇ СІ ВАБІРІ СІ СП І БІ ГАС. (амінокислоти 1-26
ОР підкреслені)
МОААЗОМВАМЕЇ РМ АЛ СМЕОУНВІ МСЕЗСТО поспідовність ГУвЕ пацюка 37 ОКММІМСІЇ МРУЗСОСЗОТОММУСІТІ БАДАСЕБИМУМІ. з сигнальною послідовністю
СМТ МКасСеРТСРАЕМІМІМ аМАБУМЗУССОБОЕ (амінокислоти 1-26
СМЕБЗТАСІ СІ ВАБІРІ ! С СІ ЗИ АМІ ВІ 5Р й - підкреслені)
ІГМСЕЗСІ МОКЗМІ УСІ КРТІСЗРОЮММСУТУБА Дозріла амінокислотна з8 БАСІСМІ МТЕЯН5І БКТОЗРАСРІРЕСУММОаМА5 послідовність ГУбЕ людини
МаІі5ССО5РІ СМЕЗААраці ВАЗМТИ САС. (без сигнальної
ЗГРАЇ АБО Р послідовності)
ІГМСЕБСІ МОК5М Дозріла амінокислотна 39 І МСГ КРТІСБРООМУСУТУТ5АСІСМІ МТЕС послідовність ГубЕ макаки
НОЗІ 5КТОЗРАСРІ РЕСІММаМАЗМИІ5ССОБНІ (без сигнальної
СМЕБААрасі ВАЗАТІ САС ЗІ РАС АВЕРС Р послідовності)
ІГМСЕБСЇ МОКЗМІ. Дозріла амінокислотна 40 МСГ КРТІСБВООММСУТМ5ТБАСІСМІ МТЕСаН5 послідовність ГубЕ макаки-
І ЗКТОЗРАСРІ РЕСІММИАМАЗМИаІ5ССОРІ МЕ резусу (без сигнальної
ЗААрааі ВАЗАТІ ЇЇ САС І ЗІ РАІ ВЕаР послідовності) пф Дозріла амінокислотна
ТООКММІМСЇ МРУЗБСОЕКОНУСІТІ БААДАСгаИ послідовність ГУВЕ миші 41 МУМ ат МКасеРІСРЗЕМУМІ М МАБУМОУ (без сигнальної
ССОББЗЕСМЕБЗААИЇ СІ ВАБІРІ СІ СП І БІ ГАС. . .
ОЇ Р послідовності)
ІГМСЕБСТО Дозріла амінокислотна до ОКММІМСІЇ МРУЗСОСЗОТОММУСІТІ БАДАСЕБИМУМІ. послідовність ГубЕ пацюка
СМТ МКасСеРТСРАЕМІМІМ аМАБУМЗУССОБОЕ (без сигнальної
СМЕБЗТАСІ СІ ВАБІРІ СГ СГ І З АМІ ВІ ЗР послідовності)
Гуманізована
ЕМОЇ МЕЗО, МОРОСБІ ВІ БСААБОББІ ТОаМБУМ амінокислотна 43 МУВОАРОаКаггеємуМамімаравтримМзАІкеАЕТ послідовність
ІЗАОМЗКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВОМУМ ЕМ варіабельного важкого
УА5БМЕАУМмаОатіІ МТУ55 ланцюга трансплантата пи9812 УНЗ
ОМОЇІ КЕБОРСЇ МАРБОЗВІ 5І ТСТУБО БІ ТОУБУМ кимерна амінокислотна 44 МУВОРРОКаГгеЕмМІ сМмІім,аравтоммМ5АІ КАТ варіабельного важкого
ІЗКОМЗКЗОМРІ КММ'ОТОРТАВУУСАВОММЕМ панцюга хі увЕ ти9ВІ12
ХАЗМЕАУМОРОТІ МУТУЗА В ув! У трансплантаті МНЗ
ПІОМТО5РББІ БАБУСОВУТІТСВАБОСІБОХІ АМ/У посидіти 45 ООКРОКАРКІ ГІМААББІ ОБЕаМРЗАЕЗОаЗОБаТОБТ консенсусного легкого
ГТІЗЗГОРЕОРАТУМСООУУ5МУРЕТРООСТКМЕБІК ланцюга каппа І людини
ЕМОЇ МЕЗОРАЇ МКРТОТІ ТІ ТСТЕБаЕ5І ТИМИ Амінокислотна 46 МБУІВОРРОКАГЕУЛ АПОМ/МООКАМУЗТ5І КОНАІ. послідовність
ТІЗКОТ5КМОУМІ ТМІТММОРМОТАТУУСАВОТА консенсусного важкого
АУХЕОММСсОСТІ МТУ55 ланцюга МН2 людини
ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААБОЕТЕЗБУАМ5 Амінокислотна 47 МУВОАРИаКаі ЕєУМалІівЗЗазотиУАрзуУкавЕт послідовність
ІЗАОМЗКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕОС УМ СУ консенсусного важкого ості МТУ55 ланцюга МНЗ людини
І. ПРИКЛАДИ
Нижче наведені приклади способів і композицій згідно з даним винаходом. Зрозуміло, що різні інші варіанти здійснення можуть застосовуватися на практиці, даний загальний опис зазначений вище.
Приклад 1. Генна експресія ГубЕ людини
Профіль Сепеї одіс: Для аналізу експресії МРНК ГубЕ у множинній людській пухлині та нормальних зразках біопсії дані АПутеїйіх одержували з Сепеї! одіс Іпс. Аналіз, показаний для набору зондів ІЮ 202145 аї, проводили з використанням СепеСпір НОШІ1Т33 Ріиб5 м2 на 3879 нормальних зразках тканин людини (зелені символи), на 1605 зразках тканини злоякісної пухлини людини (червоні символи: 1291 первинні та 314 метастатичні) і на 3872 зразках тканин з незлоякісним захворюванням людини (сині символи). Дані мікрочипів нормували з використанням програмного забезпечення АПутеїгіх МАЗ (Місгоаітау Апаїувхі5 Бийе) версія 5.0, зі значеннями експресії зразків, масштабованих до вирівняного середнього 500.
Цей аналіз показав, що І убЕ був специфічно гіперекспресований при формах раку молочної залози, підшлункової залози, товстого кишечнику, легенів й яєчників з низьким/не виявлюваним вмістом ГубЕ у нормальних тканинах (фіг. 2).
Гібридизація іп 5йи (ІЗН): Гібридизацію іп 5йи виконували на мікрочипах злоякісної тканини яєчників (ТМА) для оцінки превалювання ГубЕ у способах, установлених в Меїпод5 Мої! ВіоЇ!. 2006; 326: 255-64.
Прямий праймер СТО ССТ САТ СТО ТОС ССТ ТОб-5ЕО ІЮ МО: 48
Зворотній праймер ССС ОСА АСТ БОС АСА ААС СС-5ЕО ІЮ МО: 49
Послідовність зонда: стасСтадтотатасссттаатоСсСАасатосАаавСССАСССССстасСсАССТоСАССТаСССсСАаСс сестасстотассСсдлдатасасСАа,астассстоАСсттотТаскатасвАтадтатаАссттостта савасА;астасапАдасалссвсАасаасттсосставАаТсТТАСаатТСсСААСАТСАЧАССААаИатосСсСА тааАСсСАТаСтТаАСсАаасатоСсСсСАаасАсАсСсататсАаатаасаатататасстаастататАс ставататасдатасСАаСсатадсАаасСсАасатаассастстасасвсасСАатаТаттаавсесцдАасадоа статасСсАда,аСАаасстеасАасАаасстоадатосостатласосостассстасвсСАСАаСТасАТасА
СТТСААвоОСАоСсСстТТ Товт ООТ ТТ СсТОССАСТТОСООО Не - БЕО І МО: 50.
Результати показали, що 47/65 (72 95) аналізованих пухлин яєчників показали експресію
ГУбЕ (дані не показані).
Імуногістохімія (ІНС): Імуногістохімію проводили на фіксованих формаліном розміщених у парафін (БЕРЕ) зрізах тканин товщиною 4 мкм, установлений на стеклах. Слайди депарафінували в ксилолі та регідратували через градуйовані спирти до дистильованої води.
Стекла попередньо обробляли буфером для демаскування (Оако, Сагріпіегіа, СА, О5А) протягом 20 хвилин при 99 "С. Стекла потім обробляли блокуючим розчином КРІ. (Кіегкедаага апа Регїгу І арогайогіе5, Сайпегериго, МО, О5А) і блоком авідину/біотину (Месіог І арогайогіев,
Випіпдате, СА, О5БА), відповідно. Неспецифічне зв'язування дО блокували 10 95 кінською сироваткою (Іїе Тесппоіодіех, Сагізрай, СА, ОБА) у бичачому сироватковому альбуміні з концентрацією З 95 (Коспе, Вазеї, Зм/йлепПапа) у фосфатно-сольовому буфері. Первинне антитіло, мишаче до ГубЕ, клон 10037.7.8 (дивитеся приклад 3) розводили 10 мкг/мл й інкубували на покривних стеклах протягом 60 хвилин при кімнатній температурі.
Стекла промивали, інкубували з кінським вторинним біотинільованим антитілом до мишачого Ідс (Месіог І арх) з наступною інкубацією в реагенті Месіазіаіп АВС ЕїЇйе (Месіог І абз).
Стекла потім інкубували у Ріегсе теїа! еппапсей ЮАВ (Тпепто Зсіепійіс; Егетопі, СА), контрастно зафарбовували, дегідратували та заклеювали покривними стеклами.
З досліджень ІНС поширеність ГубЕ виявляли в 27-36 9о при раку молочної залози, -«-40 95 при раку підшлункової залози, я 26 90 при раку товстого кишечнику, 17-26 9о при меланомі, 29 96 при МЗС С (дані не показані).
Імуногістохімія на нормальних тканинах: На панелі нормальних тканин людини та макаки,
Зо низька та середня експресія ГубЕ виявляється в шлунку та слинних залозах як у людини, так й у макак, від низької до середньої експресії ГубЕ виявляється в субпопуляції клітин у корі наднирників у макаки й у меншому ступені в людини та помірна експресія ГубЕ виявляється у перехідному епітелії сечового міхура (розглянуті тільки собакоподібні мавпи). У таблиці 2 нижче представлена імуногістохімічна (ІНС) експресія ГубЕ у комплексній панелі нормальних тканин людини та макак. Експресія ГубЕ від низької (І ОМ) до помірної (МОБ) обмежується виділеними в сірий колір тканинами (кора наднирників, шийка матки, слинні залози, шлунок і сечовий міхур).
МО - не зроблено. МО - немає експресії.
Таблиця 2 ее | лоти нн 0 реютнятання | Роли | не тканина
Черевна Підшлункова прожи 00000 000оаю 00 рю
Паращитоподібна
Зеднини 0 фомсвумою | ода Мор
Спинниймогю | 000 00180100 (пф 001000
Передміхурова
Мозок Щі МО МО запоза МО МО (Молочназалоза | МО МО 0 |Слинназалоза / |мор |моо
Шийкамати | |морсолумо 0000 |Котяковиймяз | |Мо |Мо
Товстийкишечник| Мо (мо | 0 |шфФа 010 Щко
Стравохд | Мо Мо 0000 |Селезна.д/// 0 |мо ( бю | |мо |мо 000 |Шшлюю 0 Пом (ом
Сеге | 10018000 |Наонняко 01000000
Тонкий кишечнис| Мо 1800100 (тиме 0101 10о яшеи | Геннефнот, ренекетнннн | ложе Пн тканина
Зира 00100600 18000000 /Щитовидназалоз|) МО 000МОС
Тортань 01016000 1801000 Мидаляо | 0800
Печна 1 мо Мо | 0 Сечовийміур. | мо моб
Левня. 01 |хо (бо | 0 (мта 00 | 010601 С
Приклад 2. Кількісна ПЛР (ОКТ ПЛР)
Масив кКПЛР основних тканин людини, що містить першу нитку ДНК із панелі 48 нормальних тканин від Огідепе, КосКміШе, МО (НМКТ 102), аналізували на експресію РНК ГУубЕ. Експресія
ГУубЕ у панелі окремих ліній злоякісних клітин і тканин (молочної залози та підшлункової залози) аналізували паралельно. Аналізи Тадтап установлювали з використанням реагентів, приладів і програмного забезпечення від Арріїед Віозузіетв (АВІ, Ровієег Сйу, СА). Набори праймер-зондів розробляли з праймерами, що фланкують флуорогенний зонд, з подвійною міткою репортерного барвника РАМ і барвника-гасника ТАМЕА.
Набір праймер-зондів для ЕРІ 19:
Прямий праймер -5 АОС ОСА ТТС ТСА ТО ААС А (ЗЕО ІЮ МО: 51); зворотній праймер-5'
СТО СТО АОС САС БАС СТ (ЗЕО ІЮ МО: 52) і зонд-5 ТСС АСА АОС ТОА ОО САС АСА АСО (ЗЕО ІО МО: 53).
Набір праймер-зондів для ГГ убЕ:
Прямий праймер -5 АБА Ас СОТ САА ТОТ ТО Т (ЗЕО ІО МО: 54); зворотній праймер-5'
САС ТОА ААТ ТОС АСА САА ДОС (ЗЕО ІЮ МО: 55) і зонд-5" ТТО САТ ас САТ САС Ста Ста (ЗЕО ІО МО: 56).
Результати показують, що експресія транскрипта ГубЕ у нормальних тканинах низька, у порівнянні з експресією ГубЕ у злоякісних пухлинах молочної залози та підшлункової залози (фіг. 3).
Приклад 3. Одержання та гуманізація антитіл
Для виробництва клонів 408, 1007 і 9812 моноклональних антитіл до ГубЕ, 5 самок ВАЇ В/з мишей імунізували або бактеріальною (Еб5сПпегіспіа Соїї) створеною ГубЕ з тегами Ні, або створеним білком ГубЕ, позначеним С-Тегт Мус Ні 6Х ссавців (СНО-К15) наступним чином:
Створення кКДНК ГУбЕ людини: І УбЕ людини від Огідепе, КосКміШе, МО і ГубЕ КкДНК макаки з
Ореп Віозузіетв5, І агауене, СО клонували в ретровірусний вектор, мічений 90 на М-кінці. Ці конструкти використовували для створення пулів клітин РОЗ, що стабільно експресують ІГУбЕ людини та макаки, відповідно.
Крім того, ГУбЕ з тегом Ніх людини клонували у промотор СММ, керуючий системою
Зо експресії ссавців і в бактеріальній системі експресії, щоб генерувати секретований білок із суспензії клітин СНО-К'І і з ЕеПНетісніа Соїї.
Імунізація мишей: Мишей імунізували 6 разів на два тижні у подушечку лапи ін'єкцією 2 мкг білка, ресуспендованого в ад'юванті монофосфорилліпід А/гтрегалозодикориноміколат (РІБі
Іпптипоспетіса!5). Через три дні після останнього введення клітини підколінних лімфатичних вузлів зливали з клітинами, отриманими з мишачої мієломної клітинної лінії РЗ х 63Ад.1 (СК 1597; Американська колекція типових культур) з використанням 50 95 поліетиленгліколя.
Гібридоми відбирали з використанням середовища гіпоксантинаміноптеринтимідину (НАТ) в 96- ямкових планшетах. Через десять - 14 днів культуральні супернатанти збирали та піддавали скринінгу шляхом прямого аналізу ЕГІЗА проти імуногена та за допомогою аналізу проточної цитометрії на зв'язування з ІГУубЕ на трансфікованих клітинних лініях НТ1080, а потім субклонували за допомогою обмеженого розведення.
Виробництво трансплантатів СОК пи9В16 - Декілька трансплантатів СОК мишачого 9812 (ти98В12) вироблялися за допомогою КипКеі! мутагенезу, використовуючи окремий олігонуклеотид для кожної гіперваріабельної області. Конструкти одержували в контексті векторів тимчасової до експресії. Правильні клони оцінювали шляхом секвенування ДНК. Ід експресували й очищали, як описано (дивитеся І іапоу, М/.-С. єї аІ. Гипсійоп БіосКіпу апіїродієв їо пешймгоріїїп-1 депегаїед їтот а дезідпед питап 5упінеїйс апіїроду ргпаде Іргагу. Чоштаї ої МоІесшіаг
Віоіоду 366, 815-829 (2007)).
Заснований на клітинах аналіз конкурентного зв'язування ГубЕ - Культивовані людські клітини РОЗ трансфіковані з ГубЕ збирали з 5мММ ЕДТА, що містить РВ5. Клітини промивали
РВ5 і наносили на 384-ямковий високо сполучний планшет (Мезо Зсаїіе Ррізсомегу ТесппоЇІоду (М50); Сайпегзриго, МО). Планшет витримували при кімнатній температурі протягом 1 години, щоб дозволити клітинам адгезувати до пластини, як описано (дивитеся І и, М., МУопо, М.І. в
Меп, мУ.а. А підп (пгопдприї еіестоспетіїштіпевзсепі сеїІ-Ббіпаіпд аззау їог Шегареціїс апіі-СО20 апіїроду зеїІесіїоп. Уоштаї ої Іттипоїіодіса!І Меїйподв5 314, 74-79 (2006)). Пластину з клітинами блокували ембріональною бичачою сироваткою, що містить РВ5, протягом 1 год., а потім охолоджували на льоді. Серійно розведені зразки варіантів антитіл змішували з рівним об'ємом фіксованої концентрації антитіла 9812 миші. Суміші додавали на планшети й інкубували при 4 "С при обережному струшуванні протягом 1 години.
Потім планшет промивали холодним РВ5, і специфічне антитіло до мишачого Ес Ід (Часкзоп ІттипоКезегасі; Уме5і Сгоме, РА), мічене сульфо-рутенієвим тегом, додавали до планшета як реагент для виявлення. Планшет інкубували при 4 "С при обережному струшуванні протягом 1 години. Після інкубації планшет промивали знову, і буфер зчитування М5О (М50;
Сайпетгериго, МО) додавали в ямки. Планшет зчитували за допомогою томографа М50О зЗесіог 6000. Дані представляли графічно й аналізували з використанням програмного забезпечення
КаІєїдадгарн (Зупегду Зоїмаге; Кеадіпод, РА), щоб визначити значення ІСво.
Визначення афінності 5РЕК - Визначення афінності виконували за допомогою поверхневого плазмонного резонансу з використанням кінетики одиночного циклу на ВІАсоге "М-Т100. Ни ГубЕ іммобілізували через хімію ЕЮОС/МН5 відповідно до інструкцій постачальника (ї 20 одиниць відповіді (КО)) на чипі СМ5. Для кінетичного вимірювання трикратне серійне розведення дос до
ГУбЕ (від 5 до 405 нМ) у РВ5Т вводили 200 с для об'єднання та 300 с для дисоціації при швидкості потоку ЗО мкл/хв при 25 "С. Відповідь зв'язування коректували шляхом вирахування як КО з чистого осередку, так і від буферного пробігу в тій самій проточній кюветі. Модель
І апдиіг 1:1 одночасного припасування Коп і Ком використовували для вимірювання очевидної КО.
Гуманізація 9812 (до І УбЕ)
З метою гуманізації мишачого 9812 гіперваріабельні області (НМК) прищеплювали або каппа І-МНео, або каппа І-МНЗ консенсусною каркасною областю, щоб створити декілька СОМ щеплень, які містять різні комбінації потенційних положень верньєр. Послідовності варіабельного домена варіантів 9812, вирівняних з консенсусними каркасними областями варіабельного домена каппа І (фіг. 4) ії МНео (фіг. 5) або МНз (фіг. 6) людини. Положення амінокислот, які відрізняються від людських консенсусних каркасних областей, виділені сірим кольором; області, які були передані для формування трансплантата СОК, обведені в рамку.
Положення нумеруються відповідно до Кабаї, Е.А., Ми, Т.Т., Рету, Н.М., боНевзтап, К.5. в
Еоеїег, С. бедиепсез ої ргоївіпв ої іттипоіодісаї іпіегеві, Едп. БІЙ. (Рибіїс Неайцй 5егуісе, Майопаї!
Іпзійшевз ої Неанй, Веїйезаа, МО; 1991). Області НМК, використані в домені МІ. являли собою: положення 24-34 (І 1), 50-56 (І 2) ї 89-97 (І З) (фіг. 4). У домені МН положення 26-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) прищеплювали (фіг. 5 і 6).
Деякі положення, які потенційно впливають на конформацію НУК (положення верньєр) у новій людській каркасній області були скасовані у послідовності миші в спробі досліджувати їх роль на афінність зв'язування ГГ убЕ. У домен каппа | включали комбінації положень 43, 44 і 71. У домені МН2 вивчали комбінації положень 24, 37, 49, 73 і 76, у той час як у домені МНЗ3 досліджували комбінації положень 24, 48, 67, 71, 76 і 78. Всі разом 25 варіантів були побудовані й експресувалися як Ід (таблиця 3). Очищені до потім піддавали скринінгу в заснованому на клітинах аналізі конкурентного зв'язування ГубЕ. Більшість конструктів НМК зв'язувалися з І УубЕ незалежно від того, чи використався консенсусний варіабельний важкий домен УН2 або УНЗ.
Кращий клон з найменшою кількістю додаткових змін, пи9812.м12, одержували за допомогою домена МНАа, і він містив З положення верньєр у каппа І (43, 44 і 71) і2 в МНЗ2 (24 і 49). У таблиці
З показана матриця гуманізованих варіантів з відновленими каркасними областями НМК, які були побудовані й оцінені з використанням заснованого на клітинах аналізу конкурентного зв'язування ГІ УбЕ.
Таблиця З
Легкий ланцюг
КІ щеплення | КІ щеплення | КІ щеплен-
Унг щеплення Мт (немає 54 (82
МН2 щеплення 149 зв изуван НМ)
МНа2 щеплення -. 24-49 мб (немає м22 (59
МН2 щеплення «т 2443749 в'зування) зв'язуван- КМ) (15,16 НМ)
МНа2 щеплення «т 244-49-73 у? (28 37 НМ) ня) м7 (24, м16 (27 нм) м23 (54 важкий МН2 щеплення «т 2444947376 ' 36 нм) м17 (29 нм) НМ)
МНа2 щеплення «т 24437-4973576 м24 (53 ланцю м18 (22 НМ) нм) м19 (28 НМ)
МІЗ (немає
МНЗ щеплення УЗ (немає у8 (немає зв'язуван-
МНЗ щеплення 24 зв'язування) зв'язуван- |/ня) мі4 (39, м25 (56
МНЗ щеплення «з 71-78 ма (98, 70 НМ) ня) м9 (30, 156 нм) нм)
МНЗщепленнят24ж48-67 717678 ув (70 нм) 44 НМ) мі5 (42, 52
М10 (61 нМ) | нм) м20 (26 нм)
Химерна 9812 (3, 6, 5 нм)
Цей клон характеризувався приблизно 3-5-кратним зменшенням афінності до людського
ГуУбЕ у заснованому на клітинах аналізі конкурентного зв'язування ГубЕ, але аналогічною афінністю за ЗРК й аналізу Скетчарда (таблиця 4), де сСп9В812 означає химерний варіант і 9812.м12 означає гуманізований варіант.
Таблиця 4 конкурентного зв'язування І убЕ
КО (нм НМ КО (нм НМ
Спевіа | 7/0 /л44777777777717 Ї711171716111711111136 | 157
Приклад 4 - Зв'язування антитіла до ГУбЕ з ГубЕ людини та макаки
Аналіз Скетчарда виконували для визначення афінності та сайтів зв'язування на клітину для антитіл. Антитіло Ни.9812м12 йодували декілька разів із використанням способу Іододеп.
Радіоактивно мічене антитіло Ни.9812м12 очищали від вільного 725І1-Ма за допомогою гель- фільтрації з використанням колонки МАР-5 і діапазону специфічної активності 11,14-16,01 мкКі/мкг. Конкурентні реакційні суміші 50 мкл, що містять фіксовану концентрацію йодованого антитіла й спадні концентрації неміченого антитіла, поміщали в 96-ямкові планшети. Клітини
РОЗ, стабільно трансдуковані ретровірусом для експресії рекомбінантного міченого дО І убЕ або людини, або макаки відокремлювали від колб із використанням розчину для клітинної дисоціації 5ідта та промивали буферним розчином (ОМЕМ з 2 95 ЕВ5, 50 мМ НЕРЕ5, рН 7,211 0,1 95 азид натрію). Промиті клітини додавали при приблизній щільності 200000 клітин в 0,2 мл буферного розчину в 96-ямкові планшети, що містять 50-мкл конкурентних реакційних сумішей. Кінцева концентрація йодованого антитіла в кожній реакції конкуренції з клітинами становила 200 пМ і кінцева концентрація неміченого антитіла в реакції конкуренції з клітинами варіювала, починаючи з 500 нМ, а потім знижуючись до 1:2-кратного розведення для десяти концентрацій, і включала нульовий доданий з буфера -тільки зразок. Реакції конкуренції з клітинами для кожної концентрації неміченого антитіла аналізували в трьох екземплярах. Реакції конкуренції з клітинами інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після 2-годинної інкубації реакції конкуренції переносили на фільтрувальний планшет МіПіроге Мийізсгееп і промивали чотири рази буфером для зв'язування, щоб відокремити вільне від зв'язаного йодованого антитіла. Фільтри розраховували на гамма-лічильнику Умаїїас Умігага 1470 (РегкіпЕІтег І їе апа
Апапуїса! Зсіепсе5; УмеПезієеу, МА). Дані зв'язування оцінювали з використанням програмного забезпечення Мем І ідапа (Сепепіесі)), що використовує алгоритм підбора Мипзоп апа Кодбага (1980) для визначення афінності зв'язування антитіла. Як показано на фіг. 6, панель А іВ, і в таблиці 5, афінність зв'язування Ни9812м12 у людини та макаки оцінювали при 4,0 нМ і 7,9 нМ, відповідно.
Таблиця 5 0111 Антитло | Вид | | АФфінність | СайтиЖКліина.дЗ/ ння 11111111111бупо// | 2венм | 777771 1600011С нини 11111111111було// | т7енм | 77716000 ння 90111111 Нитаї///// | линм | 777771 1300077/ 11111111бупо// | 7 2нм/ | 7777771 53000
Приклад. Одержання кон'югатів антитіла з лікарським засобом
Для більшого масштабу виробництва антитіл, антитіла одержували в клітинах СНО.
Вектори, які кодують МН і МІ, трансфікували в клітини СНО, і їЇдДО очищали від клітинного культурального середовища за допомогою афінної хроматографії білка А.
Одержання «смММАЕ АОС: Кон'югати антитіла до ГГ убЕ з лікарським засобом (АОС) робили за допомогою кон'югування пи9812.м12 або контрольні АОС до до кон'югували з фрагментом лікарського засобу-ліннера МС-мс-РАВ-ММАЕ, що зображений у даному документі. Для зручності, фрагмент лікарський засіб-лінксер МС-мсе-РАВ-ММАЕ іноді називають у цих прикладах і на фігурах як "ИСММАЕ" або "МСЕ". До кон'югації антитіла частково відновлювали з ТСЕР з використанням стандартних способів відповідно до методології, описаної у публікації УМО 2004/010957 А2. Частково відновлені антитіла кон'югували з фрагментом лікарський засіб- лінкер з використанням стандартних способів відповідно до методології, описаної, наприклад, у
Рогопіпа сеї аї. (2003) Маї. Віоїеснпої. 21:778-784 й 05 2005/0238649 А1. Коротенько, частково відновлені антитіла комбінували з фрагментом лікарський засіб-лінкер, щоб дозволити кон'югацію фрагмента лікарський засіб-лінкер з відновленими залишками цистеїну антитіла.
Реакції кон'югації гасили, і очищали АОС. Кількість лікарського засобу (середнє число фрагментів лікарського засобу на антитіло) для кожного АОС визначали, і вона становила від 3,3 і до 4,0 для антитіл до ГубЕ і контрольних антитіл до 40.
Приклад 6: Зв'язування гуманізованого АОС до ГубЕ з І убЕ людини та макаки
Аналіз знищення іп міо: Для оцінки впливу Ни9812м12-АЮС на життєздатність клітин, клітини висіювали в кількості 1500 на ямку в 50 мкл нормального ростового середовища в 96- ямкові світлодонні чорні планшети. Через двадцять чотири години додатково 50 мкл культурального середовища з серійними розведеннями концентрацій Ни9812м12-АОС додавали до трьох ямок. П'ять днів через виживаність клітин визначали з використанням люмінесцентного реагенту на життєздатність клітин Се Пйетг-сїІо (57572; Рготеда Согрогаїййоп) і з Епмізіоп 2101
Мийабе! Неадег (Реїкіп-ЕІтег). Для двох досліджених клітинних ліній ефективність знищення клітин іп міго проявлялася пропорційно експресії ГубЕ на поверхні клітин (фіг. 6, Панелі А і В).
Проточна цитометрія: Для активованого флуоресценцією сортування клітин (ЕАС5) клітини збирали у РВ5 з 2,5 ммоль/л ЕДТА і промивали у РВ5-буфері, що містить 1 95 ЕВ5. Всі наступні стадії проводили при 40 "С. Клітини інкубували протягом 1 години з первинними антитілами в концентрації 3-5 мкг/мл, а потім відповідними вторинними антитілами. Потім клітини аналізували за допомогою проточного цитофлуориметра РАС5 Саїїбиг (ВО Віозсіепсев5) і одержували значення СеоМеап. Використовували первинні антитіла Ни.9812м12 для виявлення
ГУбЕ на клітинній поверхні, створене внутрішнє моноклональне антитіло до 9800 для виявлення тега М-Тепт 90. Використовували кон'юговані з АІеха 488 флуоресцентний реагент виявлення до мишачого або до людського до (Іпимйгодеп А11017, А11013).
Приклад 7: Ефективність іп мімо АОС до ГубЕ у ксенотрансплантній мишачій моделі
Клітинну лінію злоякісної пухлини молочної залози, НСС1569 (СКІ -2330), клітинну лінію злоякісної пухлини підшлункової залози 50.86.86 (СКІ-1837), клітинну лінію яєчника китайського хом'ячка СНО-КІ (ССІ-61) і клітинну лінію злоякісної пухлини передміхурової залози
РОЗ (СВІ -1435) одержували з американської колекції типових культур (АТСС, Мапаззав, МА).
СНО-КІ15 являє собою похідну суспензію клітинної лінії СНО-К1. Клітинна лінія НСС1569 х 2 являє собою похідну від вихідної клітинної лінії НСС1569 (АТСС, СКІ -2330), оптимізованої для росту іп мімо. Вихідні клітини НСС1569 вводили підшкірно у правий бік самок голих мишей
Тасопіс МСт, одну пухлину збирали, подрібнювали та вирощували іп мій, приводячи до клітинної лінії НСС1569 х 1. Лінію НСС1569 х 1 вводили знову підшкірно у правий бік самок голих мишей Тасопіс МСтг з метою поліпшення росту клітинної лінії. Пухлину з цього дослідження збирали та знову адаптували до росту іп міт, щоб виробити клітинну лінію
НСОСІ1569 х 2. Ця клітинна лінія та пухлини, що походять від цієї лінії, експресують ГГ УубЕ.
Ксенотрансплантні моделі: Ефективність кон'югатів антитіла до І уУбЕ з лікарським засобом (АБС) оцінювали в ксенотрансплантних моделях, отриманих із клітинних ліній, описаних вище, або отриманих від первинних пацієнтів моделях пухлин, останні експерименти проводилися в
Опсоїезві, Егеіригуд, септапу та в ХепТесії, зепороїе, Егапсе.
Всі дослідження, проведені в сепепіесії, Зоцій Зап Егапсі5со, СА, відповідали Посібнику з догляду та використання лабораторних тварин (Кеї: Іпзійше ої І арогагу Апітаї! Кезоигсез (МІН рибіїсайоп по. 85-23), Мавзпіпдіюп, ОС: Маїопа! Асадетієз Ргез5; 1996). Всі експерименти, проведені в Опсоїезі були схвалені місцевою владою, і проводяться відповідно до керівних принципів німецького закону про захист тварин (Тіег5спиї2дезеї?7). Дозвіл на використання тварин в СЕКЕЕ ГТасіїйе5з ої ХепТтеспй одержували за допомогою Тпе Оігесіоп де5 5егмісе5
Меїегіпаігев5, Міпівієтге де ГАдіісипиге єї де Іа Ресне, Егапсе (адгеетепі Мо. А 91-228-107). Догляд за тваринами та вміст відповідає Європейській конвенції 5ТЕ 123. Всі експерименти в ХепТесп будуть виконуватися відповідно до французького законодавства, що стосується захисту лабораторних тварин, і відповідно до діючих норм ліцензії для експериментів на хребетних тваринах, виданим Егепсі Міпівзігу Ттог Адгісийиге апа Різпегієз То Ог. Тгиопд-Ап ТВАМ (Мо. А 91- 541 даїєд 21 Оесетбрег 2010; маїайу: 5 уваг5). 6-9-тижневих самок імунодефіцитних мишей прищеплювали підшкірно в дорсальний правий бік, і середні об'єми пухлини з 50 визначали в 9- 10 мишей у групі.
Для дослідження ефективності з ксенотрансплантатами, отриманими з клітинних ліній, голих
Зо мишей МСЕ від Тасопіс інокулювали 5 мільйонами клітин у НВ55 з Маїгіде!І, або С.В-17 5010 (інбредних) мишей від СПпапех Кімег інокулювали 2 млн клітин в НВ5З5 з Маїгідеї.
Використовували 0,36 мг імплантати естрогена для ксенотрансплантатної моделі НСС1569 х 2.
Для дослідження ефективності з пухлинними експлантами на ХепТесп й Опсоїеві, атимічним голим або ММКІ пи/пи мишам від Нагіап ог Спагієх РБімег імплантували отримані від пацієнтів матеріали первинних злоякісних пухлин молочної залози або підшлункової залози, від моделей
НВСхХ-8, НВСХ-9, МАХЕ-1162 і РАХЕ-1657. Коли об'єми пухлини досягали приблизно 80-200 мм (день 0), тварин випадковим чином розділяли на групи по 9-10 в кожній та вводили однократну внутрішньовенну (ІМ) ін'єкцію або контрольного несучого розчину, або АОС у відповідній дозі.
Об'єми пухлин вимірювали два рази на тиждень до кінця дослідження.
Хоча попередній винахід був описаний у деяких деталях як ілюстрація та приклад для цілей ясності розуміння, описи та приклади не повинні бути витлумачені як обмежуючі обсяг винаходу. Розкриття всієї патентної та наукової літератури, наведеної в даному документі, явно повністю включено за допомогою посилання.
Перелік послідовностей " «110» СЕМЕМТЕСН, ІМС, ек вії. «1285 Антитіла й імумокон'югати до Суб та способи застосування «1305 РАОЛОНІ-МО «1415 «150у 5 61/6495,775 «ї515 2812-05-91 «1585. 56 «2109 1 «?1їз 131 «2125 РА «з135 Ното «арівпх «400» 1
Меї уз Ті Рпе фей Рго Маї Гео Сеш Аза Аза фей 1їво БІУ Маї 1 5 18 15 біч Аги дів бес бегоіву Межї Суз Ре бе" Суб їец деп біп Гуз Я 29 25 за бек да їву Туг Суз ен бу5 Рго ТвгоІ1е бух 5ег А5р біп Азо 35 4а НУ
Ап тує Су уаї ТВг Уві бе Аза обего Аза с1у Т1е б1у Дей Ге 50 55 ва уаї Тег о Рве біу Ні бек Гвеис5ек Суб ТЙг о Суз бек Рго Ата Су 70 75 рРго Ії1їе Рго бі біу Маї Азо маї 5іу Уві Аїд бег Меї біу Те за 85 ав бек бу Суз бій зер ре (ей Суб Аєй Ре бег діа ліа Ар 01у 95 тав 185 біу їєм Аг АТїа 5ег о уаї Те Ге ге об1іу Аїв Бу гбец сер геу 116 115 та,
Зег цей гу Бго діа Геу беч дов Ре б1у Вго 125 130 - «8185 2 «1» 13У «212У РЕТ «2135 Масаса Тазсісніагів
«рез 2 меж ру Т1іе Ре Бе Рго Маї Єви Гей Ата АТа беу фен б1у МУв1 ї 5 18 15
АгРЕ Аїа бЗек бек Ге Мебє Суб Вре бе Су5х Гей А5п біп у» 2а 25 38 бек А5п Цен Туг Суз Ген вух Рго Те К1е Суз бек Азро обіг Ахр 35 ча 45
А5в о Туг Суб уаі ТНг оМаї бер ТП беб Ата б1у Тіе біу Ал Геї 5а 55 ей
Уаї Тс Ре біу Ні бег-Їец бек Ту5 Те оСух бег рго Ата Су 05 7 75
Рго гейш Рго бій сб1у Ї1е А5п о Ма1 б1у Маї АтТа его Мет біу їїа за У За бек сСуз Су бій 5ес РБе ївео Су5 АБ орйе зег А1а Аза дер б1у 95 189 ї1а5 б1Уу Гей АгЕоАТа зег А1а ТВ (ей іен б51у Аза б1у Сей Тем цер 16 115 178 бег Тео Гец Рго діа їез їси дгв Ре біу рео 125 138 «210х З «211» 187 «218 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2285 «2235 Гуманізована «пабу 3 дер їі біп Меє Тве обій 5ес о рго бег 5ек Гви бек Аза 5ег Уві і 5 19 15 біу А5р Асв Маії Твгої1е ТігоСуз бег о Аїв бек біп біу їїе 5ег за
Авпотук бе А5а Тер оТуєб бій біп бує Рго біу Суб Те Уаї Гу
Ах
Кен їец Кі Тук Ту Таг обе" АбпоГе) Ні 5ес біу Маї Рро бек 5а 55 бо
Агв о РНе баг біу 5ес б1у ес біу Тр Ар оТме ТАБ Бен Тве тів 65 а 75 ес бек (ец бій ге біб А вВпе Аїа Те тує Тує Суб віл біп ва ца за
Тує б5ег бі Сїеш ро Тер Те Рпе біу Бій сту ТБ Гуз мМаї бій а5 тай 185 ї1е гух «210» 4 «115 107 «212 ВВ «2135 Штучна послідовність « «22а» «сг23У Химерна «Ва» 4
АБр ї1е бів Меб Тс обіп Те Те 5ег о бег оїву 5ег Аа зег ей 1 5 18 ІВ біу А5роАге Уаї Те Те б5егоСуб бег АТа бБегобіп 01у Тіє бе 29 25 за дей Тук о сеу Ап тТеротує бій бій ув Рго А5р бу ТВ уУаії Суб 46 45 мен Сей ЇЗіе Туб Туг Тг бег А5п гей Ні бег б1у Маї Рго 5ег 58: 55 бо
АгЕ рРпе бег біу бег бі Хек біу Те Ар Туг бер о бви ТИР Оці во 70 75
Ба" Ай Ген біу Ргосб1и Абр 112 АТа Тве Туб Туб Сує бів б1п ве 85 ща
Тут 5ег Би Гец Рро Тер ТНК Ре біу. біу б1у Те ух маї бТВ 95 189 195 тре цу «від» з «й1їз 120 «2125 ЕТ «213» Штучна послідовність «2295 «2239 Гуманізована «вах 5 шо біз Уаї біп іец о Уаії біц бек б1у Рго Азїа Гео Маії зу Рго ТВг 1 5 18 15 біп Тег Гео Тйб Гей ТнеоСух ТВеоМа! бег о біу Ре 5ег бе Тиг 28 25 з біу Туг 5ег Уаї Азп ТРр Пе Аге біп Рго Рго б1у губ Аа Ге 35 48 45 сіш твор Бей б1іу Меї Ше теробіу Ахр б1у 5ег Тиг Авр Туг Ави 59 55 ва зек Аїа Ге) бує Бек дев ів Те ї1їе Бе губ Абр тб Бай губ 55 70 75
Ап біп Узі Уфі беш тТве Меб ТАгоАБи МЕЖ Дер РО Маї Дер Те 8 85 9 діа тео Тує Туг Суб діа Ася Азротує тує Ре Аєп Туб діа бе 95 189 195.
ТгеоРве АТа Туг Тер біу біп біу ТЬгоГео Маї Так Уві 5ег бег 115 12а «2185 6 «2115 178 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «2235 Химерна «ва» 6 біп Маї бій їец бу біц Зек б1у Рго біу їеи Маї Діва рго 5ег ї 5 18 15 біп б5ег ієн бек Гец ТЯг о Сух ТпгбоУаї багобіу Ре бег ген Те 270 25 3 б1у Туб бек маї А5б Тер Уві Ак бій Рго Рго біу губ біу Гец 43 сій Тероівеь біу Меє їТ1е Теробіу А5р біу 5ес ТгоАхр Тує Ах 58 55 ве бек А1їа їец фу бЗег АгЕ їео ТВг І1є бег Куб д5р о Абп о беє Гу 65 70 75 бБегобіп маї Риє бе Гуз Меб Д5й бек ге бій ТИг дер Ар ТА 8 55 за діа де Туг тує Суз Аїа АгЕ Ар тує Тук Рпе Ап оТуг діа зек 95 189 185
Тео Ре Аїа Туг Тер біу Рго бу Трг Гео Уві ТгоУаї бег Діаз те 115 128
«2185 7 «21135 1 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «22ах «23» Гуманізована «кавах 7
Баг Аїа бег біп б1у Пе бес А5й Тук Ге. АБИ 19 «2105 8 «а1їх 7 «212» РЕ каї3» Штучна послідонність «Ед» «223» Гуманізована «кава» 8
Ту ТигР обег деп Кей Нія 5ег 5 «2185 85 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність кита» «223» Гуманізована «41805 95 біб бій Туг бек бід Бе Рго Тер Тйг 5 «2185 18 «215 18 «ій» РЕТ «213» Штучна послідовність «2» «223» Гуманізована «400» 16 со1у Риб баб сви те біу Тус Бек Уаї Ап 5 15 «710» 11 «21 16 «212х РКТ «213» Штучна послідовність
«223» Гуманізована «4005 11
Меї ї1е ТРр. б1у Ар біу бБег Тиг А5р Туг о А5п веб Аза цец Гує 1 5 18 15 зег «219» 12 «11 1? жейй» РЕТ «213» Штучна послідовність «йду «223» Гуманізована «два» 12
Азр о Туг Тує Не Доп Тує Аїа бЗег Тор о Рпе Аа Туг 19 си185 1 «2115 11 «2125 РТ «3135 Штучна послідовність «2205 «2753» Химерна. «3805 13 5ек Аїа Зег б18 б1у Ті6 Бег о Аєп тує Свч. Аби 5 18 «2185 їй «2315 7 «2125 РКТ «2135 Штучна послідовність «2205 «2243» Химерна «ща» 18
Тук Тйб бек одбп Кей Ні баг
Б
«їх 15 «2115 З «21» РТ «213» Штучна послідовність «228У
«2235. Химерняа «4095 15 біпобій Тук обеб бій Кей Рко Тер оте «-218х 16 «211» їй «2125 РЕ «213» Штучна послідовнусть «2205 . каз химерна кАОа» 16 б1у вп бег ів Те бБІу Туг ве МУа1ї деп 5 18 «210» 17 «?211У 16 «-212х РК «9135 Штучна послідовність кий «223» Химерна кедах 17
Меї ТІ1е Тгр бБіу Азр біу бек Тйб Азр тує деп о зеб Аїв Те ув 1 5 19 їз
Баг «3185 18 " «85115 12 хиїа» РяТ «2135 Штучна послідовність «айх «223з Химерна «4095 18
Ар тує туго рпе дп Тує Аза бег ТрробНе Ат отувє 5 18 «вій» 19 «2115 23 «512х ВЕ «213» Штучна послідовність «тах «273» Гуманізована
«по» 13 дер їі бій МеЄ Те сій бег о Рео 5ег бег іви 5ег АтТа бег Уаї 1 Ь: ї6 15
ЄТу Абр АгЕ Уві Тие 16 Тве Су 2а «га» га «2112 І5 «їй» РЕТ. х?137 Штучна посвідовність
ИЙ» «723 Туманізована «йо» 20
Тер Туб бій віп уз Рбо біу Гуз Те оМаї у фец тей Ке Туг 1 5 16 15 «210з 21 «2115 32 «72125 РЕТ «2135 Штучна нослідовність «а» «223» Гуманізованяа, «дах 71
Оу Уаї Рго ЗЕєК АкЕ Ре бе біу 5ег о біу бег біу Те Ар тує 1 5 ї1а 15
Те їеу таб Ті бек бек бец бій го бій дер Ре с Аїа тТибОотуг 28 Ко: за
Тук Суб «2430» 22 «2115 їй « «21» РКТ «2513» штучна послідовність «2292 235 Гуманізована «аа» 22 не біу бій Біу Тпб оїух Маїі Бі) Іі Сує 16 т21йх 23 «211» 25 «Ез2х.РЕТ «2135 Штучна послідовність
«2285 І «223У Гуманізована. «ада» 23 вій Узі біп бен Маї бід 5ебобіу Рго А1іа ге) Ма Суб вго Тег 1 5 18 15 біп Те гец ТНгоїео Те Су Тйг Маї 5ег 28 25 «21ах 24 «її» 14 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «22їУ Гуманізована. «аро» 24
Тер 112 Агро обіп Рго Рго біу Суб Аїа Гец біо Тер без Б1у
З ї1а «2185 25 «2115 33 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність кїах «723» Гуманізована «або» 25
АРЕ їеи Твг ої1їе 5еб о руз Ар таб 5ег о сує Абп бій Узі Маї Сей 1 С т 15
ТНе Меї Тк Ал о Меї Ар о Рго Уаї Азр ТВг о АТа Те Туб Тугє Сух 20 25 за ліа Аге «2185 26 «21їх 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність " «2205 «2235 Гуманізована «апез 28
Тсо б1у бій біу ТС бе) Маї Тпб УЗ бег 5ег 19 х218» 27 «219 РЯТ «етїх Штучна послідовність «270» «223» Химерна «аа 27
Ар 15 піп Має Тве бій ТогоТве его обек еу беб АТ 5ег гу 1 5 15 ї5
С1у дер АгЕ Майї ТНР Ті1е 5ег Сух «атах 28 «211» 15 «212У РТ «213У Штучна послідовність «220» «23 Химерна «ах 28
Тер Тук біп бій бух рго Ар біу Те уві суб іви гео їі16 Туг 3 5 18 15. «3105 29 «2112 32 «212 РЕ «8135 Штучна послідовність «22 «2235 Химерна «дай» 23 сіу Уві Бго бЗег Аге РНеЄ бег біу бег бБіу бек біу ТВе др тус 1 5 10 15
Зег іей Твг ж3іє бек деп іев бій вро 01 Ар 116 АТа ТАгс Тус 29 З за тук сСух «аа» за «2115 18 «2125 РВТ | х «2135 Штучна послідовність «295 й «2523» Химерна в2 ха» зо
Ре бі біу п1у Тйгобуз Маї біч Те 1у5
З 16 «2ійх 33 «3313 уУ5 «41» РЕ «233» Штучна послідовність «228 «223» химерна «4005 31 сій Ууаї бів бен уз бій Зен біу вго бТу Гей Маі Аїа РКО бек 1 5 18 15 біп бег беу бек їецв ТВ оСує Таб о Уаї бог 28 25 «2105 32 «23їз 14 «2123 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2905 «2235 Химерна «48а» 35
Тер Уаії Абе біп реко Рго бБіу у б1у Геу бід Тер бен бІіу 38 «2102 33 х «231з 32 «252» ВТ «92135 Штучна послідовність «шах «223» Химерна «аа» 33:
ДрЕ Гей тпг ї12 5ег огуз д5р Ап о5Зег бух Бек бій Уві Ре Гей ї 5 16 15 йуз Меї Абп бБег Гви 218 ТВгоАвр Авр ТБ оАТа АбвоТує Туг о Сух 28 25 за
АТа Аге: «25183 34 «213їз 11 «2125 РА «2135 Штучна послідовність
«223» химерна «пах За
Тер біу Рео біу Тпг мес маї Тк Уаї ет А18 18 «2105 25 «а1ї5 131 «2125 РАТ «2135 Масаса тизатта «а0ох 35
Мет уз Т1е Ре фей о рго Уаї їейоГец Аза Аїа Гей гей вату Уві і 5 16 15 біб АР о АТа его бес се) Меї Суб Рле бег Сує іеци АБ бій Су 28 25 за й
Зеб аз сен Тує Суб цец бує Рго тТле Тте Су 5его Абр ота А5В 46 45
Ап туго Суб уаї ТвРоМаї бе Те 5ег Аза о1у Т1е Ту Ап рей 58 55 ва уаї тйБ бле біу Ні 5ег о Геци бег бує Те бує бе Рго Аїа Су 65 79 75
Фео цей Рго бій біу Ще Аєп ма! біу Ма! Аіїа бег Меї б1у Те а 55 ща
Бег Су5 бух бів о бег Ре Іеи Суз Абр Рпе зЗег Аза Аїв Ар біу 95 196 185 сіу їви Абе діа бе дів ТБ оїе) гео а1у іа Я1у бер їв) Сем їй її5 128. зег їеу Ген Рго Ата Ген їецз Аге Ве б1у Рго 125 130 : «210йУ Зб «211 ії36 «2125 РЕ «2135 Ми тисни а5 «Абе» 36
Меж бек Аїа Пе беє деп МЕК дев уаї Рне Гео Рго чаї гей Ге ії 5 18 15
АтТа Аїа іец іецобіу Меї бій сій Уві Нія 5ес рей Метє бує Рне 28 25 а
Бег осСує Таб дзр бій губ Ап АБ гі Ап о Су5 Гец Теробго Уді 35 4а 45 бек Суз біп біч Гу5 Ар Ні Туг Суз Т16є Тб Гео б5еБ Ата Аї1а 5а 55 5а
АТ біу Ре б1іу А5п о Уаї Авп Бей б1у Туб Ти? обем А5пог ув б1у 65 70 75
Сух бек рРго Пе Су5 Рго Бег бій Депо Уаі А5в Ме дл бе ТУ та 85 да
Уаі діа чек узі Ап бег Тут бух Суб бІп бег баг Рне Сує Ап 95 198 185
Ре бе А1а Аза біу зіву О1у ей АгРЕ А1а бег ї1е Рго їеу ву 118 115 120 сіу ей біу сез Те іей бек бе ієу АТа їви їв біб гей 5ег 125 138 135
Рго І «2185 37 «911» 136 «2125 РТ «213 Каїтиє погУуевісив «ба» 37
Меж Зеб Аза Аза 5ек зег МебЄ АДгя Уаї Ре Гей Рго Уяї іен Бе ї 5 10 15
АБа Аїа їбецй ге зіу Уаї біз бій чаї Ні5 б5ег о їву Мет Су Рпе 28 25. 38
Зег бує Твге до 614 1іу5 Авт Аби Т1е Аа Суб їеи Тер оРро Уві 39 за 35 бек Суб бег бек ТР Ар АБ Туг Су5 І1е ТР оїео 5еб Аза Аїв 5 ва
АТа біу Рре біу Аяп Уді АБИ Геу біу Туг Тйг оМеу дп ух б1У ве 78 75
Суз бек Рго ТНг обу Рго Аг бій Аби зе Ап т16є Ап Геу б1у - во 85 зе чаї Аїз бек уаї Аа бЗек Тує Суб Сує біп зак 5ег Ре Су Ав 95 198 185
РМе бес Тве дів біу іви оіу бе» Агро Аїа бек Ще Рго Геи Гей ща 115 129 біу геи біу їеу ем 1іеп бек рез гей діа Маї зей Агро Ге ес 125 139 135 го г «2105 38 «211 1 «2125 РЕТ «213» Нето б5арієпь «аа» 38
Кец Меї Су Рпе бек Су бер Ап бів їує Зег А5поївуи Туг Суб 1 З та 15
Кеш іух Рео Трг І1їе Суб 5ег одер біп Ар Ап Тус Сує Уаї Те а 25 за
Уаї бег Аїа бег Аїа біу їі біу депогез уаї Те Ре біу Ні 35 де д5
Зак ген обес ух ТВе губ бек РКО дів Суз Рго тів Рго бій о1у за 55 ва уах Ав маї біу Маї Аїз ес Меї бі І118 Бек Суб Суб бій бег 65 76 75.
Рне реч Суб Ап вве Бек Аї3 Аа А5р Бі біУу їеб Агро АТа 5ег но 85 9 і уаї Те рей лев біу Аїа б1у Гео їеи ї2о Зег іеу їеб Рео діа 95 186 125 їец рей Агв Ре біу рго 16 «218» за «2115 111 «г12» РЕТ «віЗ3» Масаса Тазсісцівагів «йо» 39
Гео Мей Суз РВе бег Суз бев Ап біт уз Зег деп Се Тує Су 1 5 10 15 іеи бух Рео ТБ Т1е Сух бег Д5робіп Абр Депо Тук бух Майї таг за
Уаї 5ег Тип 5Бес А1іа біу 11е біу Абп Ген уаї тоб РБе біу Ні да 45 бак гей беб бує Те Суз ббе Рго діа Су РРО іеб о рро бій ТУ
5а 55 50
Ііє деп Маї 01Уу Маї Аїз 5ег Меї сіу І16 бер оСує Сух біл бе 53 79 75
Ре ев Суб дбп Рпе Зек А1а Аіа Ар С1у б1у фей Аг дів 5ег яо 85 за діа таб бен їв; бі Аза біу сей ей ви 5ег їв Беи РКО АТа 99 189 185, ей Ге Аг РНе біу рго
То. «21» 46 «зі» 1її «212 РВТ «2132 Масаса туїаїїз «00» да бе Мет Сух Ріє бег Суз (ем Або сій Гуз 5ег Або Тем Туб Су їх 5 19 18
Іеч у ро ТР от1е Суб бег Добро бій Або Аби Ту Суб Ма1ї Те 29 25 за
Уаі 5ег Тнг обег діа б1у Т1е СІу Абап Гец Маї Тие Рве біу Ніє 48 м его Гец бек рує Те о буз бег рго ДІВ Суб Рего Геи бго бій біу 22) 55 Ба тів Азп маї 51у мМаї Аїа Зег Мей біу ї1е бег Су Сув біп бер 63 76 75 рРМе Бей Суб дви РНе 5ег АТа АТа дер Є1у б1у 1їеи Агя АТа бег ча 85 за
Аїа Тне Сей геу біу Аїа біу їв Тез сем бегоїво зви рго АТа 95 1їа8 195 і веб Аг Рпе СТУ Рго ї19 «165 41 «23115 118 «2125 ВТ «8135 Му5 ти5сціч5 «4005 4
Гей Мек Суб Ре 5ег Суб Тк о АбБор осоій Суз' Ап деп Т1е А5п Суя 1 5 18 15 бе Тер обро Маї 5ег Суб біп бін іу5 Абзр Ні Туб Су5 Ше Те 28 25 за еп бег АтТа А1з Ата б1у Рае сіу Ап Маї АзпоБец 61у Тук Те д5
Гео АБа Ку5 б1у Су 5егорко т16 Сух рго 5еб 019 А5п Уві Аби а 55 ва беш Азп сен обіу Ма) Аїа бег Маї деп беє Ту Сух Су« віп бег 65 78 75 зеє Ре Су5 Депо Ре Зег Лія АтТа б1у Сей бБіу Гей Аг Аза зеє 39 85 за
Те вго сви тер о1у гео біу Гей їв іен бек їец Геш Аза вед 95 18585 185 їец біп Сен беб Рг це «210У 42 «21 ТІЙ «2125 РЕТ «213» Каєти5 погруерісив «лайх 42
Ге Мек Су Рие зеб сСує Ти дер біп Ту5 Ап Ап Т31е Ап оСув 1 5 18 15
Гец Терорго Уві Беб бує баг обеє ТИб дер Аз о Туб Су5 ще тв 26 25 за цей зек АтТа Аїа діа бту Ме Ту Ав Уа! дей Сей о1у Тук Твг 35 де 45
Се дя Гу біу Суз 5егорго ТВ Сух Бго Дгробій Аа Т1е Аза - 5О 55. БО
І1е А5я Геу біу Уз1 д1я бегб маї Ав бег о Тук Суб Суб біл 5ес 65 7е 75 5аг РНе Суя яп Ре бег Ти АТа біу є біу Без Ас оА1В 5ег о 85 а
ІТ Ргб ів; оївеи біу гей б1у Це Сей іо Зеб без 1їей Аі1а Ма) щу 199 ї65
Ме дгд без Бек го 118 «210хУ 43 «21ї» 128
«2183 РТ «2х13х Штучна послідовність «22023 «223» Гуманізована «488» 45 бін Маї сій се) Уві Бій ве біу бу віу Бей оуаї біп Рео біу ї 5 18 15 біу 5ег Іво Агро оїви бек Су Аїа АтТа бек біу Ре бег Геу ТНг за біу Туг б5ег Маї Аєпт Тер Маї Ага біп діа Рго сім Гу СТУ Ге а 45 бі тТкроуаї бі1у Меї її2 Тер обі1у дер сіу бек тТйг одер Туг деп а 55 ва бек АТа Геи Гбуя« Зак АРЕ ле ТОг 16 его дер оАЗродеп 5Вг гу» 65 79 ваш
Ахпотве ред Туб рем бів Ме Аби 5ег і2и Агро А1а вій А5р Отит 8 85 аа діва Уві Туг Ту Схж5 АТа Агро Абр о Туг Туг Ре дб Тує діа Заг 95 109 105
Тер орпе дія Тут То біу 515 біу Тр оїец Маї ТНК Уві бек 5ег 118 115 128 «р105 ай «8115 328 «2195 РЕ «213» Штучна послідовність «220 «223» Химерна «1005 44 іп Уві боїй Бео Гу Бій бЗег біу Рго Біу їец Уаї Аїа бго Бер 1 5 19 15. бій бероіви бес Гео ТвгоСує ТВе Маї 5вє БІу Рпє 5ег гей Тнге 28 25 за сіу тук 5ег Маї АБИ ТкроУаї Агв біп Рго Рго 1у їу5 біу Геч 35 4 5 біш Тер осей біу Мей Ті тео бІу Ар біу бес ТНе Ази Туг Ап за 55 Бе аб Аіа без губ бек АБЕ цей ТР ОЇ)іе 5ег уз д5род5п 5ег Туз
65 70 З зек' їй Маї Рне бе) їу5 Мек АБИ бег оїву бів Таг Ар Ар таге що 85 ча
Аїа Агф Тує тує бу5 АТа Агро Ар о Тує Туг Ре Ах Тук А1а бек 95 196 15
Тер Ре Аза тує теробІіу Ро оту таб фен омМаї Тис маї 5ег А1а 118 115 120 «2104» 45 к2Т15 187 «12У РЕТ «213» Ното заріейх «двах 45
А5р Т1є біп Меї Твгб бій бек о Рро беб бебі) бег Аїа бек Маї 1 5 15 15
О1у Абр Агв Уаії тб Ще Твб Суб Агв Аїз бег біп біу Щіе бек 28 25 за 5еє туб меш Ата ТероТує бів бій губ Рго б1у Бу5 АТа ре у 35 ай де
Бей ген Ше туг АтТа Аїа бег о бег бер бій бек сФ1у Уві Рго бег й 50 55 5о
Аве Ре бЗег біу бЗег б51у бег біу Тпг о Абр Ре Таб гей Те ТІв бо 7 їЗ
Ззег зебг Гей бій Рко біз Або РБе АТтТа ТйгоТує тує Суб бів би 88 85 98
Тус тус бер тур Рео Ре ТВгс Рве сіу ста біу Те губ Уаї 1; зща0 185 118 фу х?лаУ 46. «2115 118 «12 РВТ «213» нОоМо сарієеп5 «а0е5 аб - бій Уві бій є) Узі бій 5ек біу рго Аза фе маї фує рго Те - 1 5 19 15 біп Те оіви ТР огед Тйб Су Тйг Вйе бЗеб біу Рбе баг їв бе а 25 за
ТВеобек віу Узі сіу Маї 5ег Тгр Те Ак біп Рго Рго у ух 35 48 45
Аа їей бій Тер огец Аїя беш Тіе А5р Тир Ай АБО Або Був АРЕ за 55 ва
Тугобег Тиг о бБег 16 Гуз бе Аг Гей Тк 112 5ег тує Авр тик
БУ 78 75
Зег Туз Ази бій Маї Меї Ге їн Меї Тнб Аби Меї Ав бро маї о за 85 за
Ар Те Аза Тйс Туб Тук Сує Аїа Абе Дер Те Аза Аза Туб Рпє 35 196 185
Ар Тут Тгр азу бій біу Тбг оре) Маї Тис узі бек 5есг 118 115 «10» 47 «аБ1У 112 «212 РЕ «13» Ното 5арієпе «а00» 47 1 мМаї бів без Уаії 610 бек бі біу біу ївцп Маї б1йп Рго Біу 1 5 18 15 біу бег іє АБя Беи бек Су діа Аїа бег о біу рве Те Ре бег 28 25 за бег Туг діа Меї баг Тер омМаі Аг бів АТа го б1у Гуз біу Ге 35 за а бі те уа1ї б1у Аза Тіе бек б5ег бБегб б1у бек бег Тйг о Тує тує за 55 ев
АтТа А5робег ма1ї Су б1у Аг вне тб ЇТе Зег Аг Ар Ап о Зесг
ББ а 75
Муз Ап Тк ке Тук гбеу бій Меї Ай бег і6б Ак АТа бі Або ва 85 зо таб одіа Маї Туг тує бує Ат1а АгЕ Рйе Авр Туєс Тер ФШ1у б1п бу тав 185
Те Ген уаї Тс Уві бек б5ег їла «ках ав «їі» «2125 ОМА «2135 Ното: зарієпе5
«00» 48
ВтЕССТНаїтс ТВЕВЄСсТТЕ 81 «2185 49 «211» 28 «212У ОМА «213» Нето. «арівйх «400х 49 сбсввазнтв всаксаасес 78 «2і1йу 50 «21їх 423 «2122: ОМА «213» Нощо 5801еп5 я «а0дз 50
ВЕНССЕВатс ТРІВСесСТТв вЕсссВЕвСс аввкссассс сствнсассте 5 сасствсссє авсесетвсс Тсбесссвая тврЕссавсЕ всссбсасії 1885 стренеівва свати срасс СТсССттвввв ваствсвраа рерасравня 159 тЕссстввав Кстсасвріс саасвісара ссаавтїссса Сррасатвоех зва васаврвїсс ссавевавас свівісавта врраїсвіртв сетрестівєв 258 тесвЕввЕТе Бесавтвсас віварвавсає вівВсЕВетТ сІвВЕвЕсса ЗНО твТЕтврена вЕварвтЕци ссарсавссї рраравсстс авіссствтїа 250 вссссствсс стрЕсасадс тЕсаївсаст ссаввевсав сСЕТтрЕВНя 409
ТІБВеВЕТЕс трссВстКсс др 423 «ків Зі «ії» 19 н «к212з ОМА «7135 Нощо зарієпь «адах 51 авсвваїїсЕ сахвраасв 15 «2ї1аз 57 «2135 18 «217У ОМА «213х Ново завів «4805 53 ствЕвссавсс вЕвавстє 15 «21аз 53 «2115 28
«2125 ОМА «2135 Ното заріепь5 «ва» 53 тссасававсї ваарисанас зарв 24 «210» ча «ах 19 «2125 ОМА «733» Ното зеріене «дййх 54 акзависеїс вас 15 «10» 55 «231» 21 «2125 ОМА «2135 Ното заріепв5 «-400У 55 састрадаїї дсасавадав с 21 «21йх 55 ка1їх «212» ОМА «213У Ното зарієп5 «дао» 56 тхссатрввс аїсавстдсє ві

Claims (55)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло, яке зв'язується з 1УубЕ, причому антитіло містить (а) НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮ МО:10; (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:11; с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12; (ад) НМВ-11, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7; (е) НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:8, і (3 НМА-1І-3, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО:9.
2. Антитіло за п. 1, яке являє собою моноклональне антитіло.
3. Антитіло за п. 1, яке являє собою гуманізоване або химерне антитіло.
4. Антитіло за п. 1, причому антитіло інтерналізовано в експресуючих ГубЕ клітинах при зв'язуванні.
5. Антитіло за п. 1, яке являє собою фрагмент антитіла, що зв'язується з епітопом у межах амінокислот 21-131 в 5ЕО ІЮ МО:1.
6. Антитіло за п. 1, яке додатково містить послідовність ЕК2 каркасної області варіабельного домену легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:20 або ЕКЗ каркасної області варіабельного домену легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:21, або ЕК!1 каркасної області варіабельного домену важкого ланцюга ЗЕО ІО МО:23 або ЕРКЗ2 каркасної області варіабельного домену важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:24.
7. Антитіло за п. 1, яке містить (а) послідовність МН, що характеризується ідентичністю послідовності, яка становить щонайменше 95 95 стосовно до амінокислотної послідовності 5ХЕО ІО МО:5; (Б) послідовність МІ, що характеризується ідентичністю послідовності, яка становить щонайменше 95 95 стосовно до амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:3; або (с) послідовність МН в (а) і послідовність МІ. в (Б).
8. Антитіло за п. 1, яке містить послідовність МН ЗЕО ІЮО МО:5.
9. Антитіло за п. 1, яке містить послідовність МІ 5ЕО ІЮО МО:3.
10. Виділене антитіло, яке зв'язується з І убЕ, причому антитіло містить послідовність МН 5ЕО ІО МО:5 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:3.
11. Антитіло за будь-яким із пп. 1-10, причому антитіло є антитілом зі сконструйованим цистеїном.
12. Антитіло за п. 11, причому антитіло зі сконструйованим цистеїном містить заміщений цистеїн в константному домені легкого ланцюга.
13. Антитіло за п. 11, причому антитіло зі сконструйованим цистеїном містить заміщений цистеїн в константному домені важкого ланцюга.
14. Антитіло за п. 1, яке являє собою ІдС1, І|дога або Ідс26.
15. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за будь-яким із пп. 1-14.
16. Виділена клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту за п. 15.
17. Спосіб одержання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 16 з одержанням антитіла.
18. Імунокон'югат, який містить антитіло за будь-яким із пп. 1-14 і цитотоксичний засіб.
19. Імунокон'югат за п. 18, який характеризується формулою АБ-( Ср, де: (а) АБ являє собою антитіло; (Б) І. являє собою лінкер; (с) О являє собою лікарський засіб, вибраний з майтанзиноїду, ауристатину, каліхеаміцину, піролобензодіазепіну та похідної неморубіцину; і (а) р знаходиться в межах від 1-8.
20. Імунокон'югат за п. 18, у якому цитотоксичний засіб являє собою ауристатин.
21. Імунокон'югат за п. 19, у якому О характеризується формулою Оє в є) в" СНз ве Я Н ск М ї М М. дів во АР Во доо в о Ок, де В: і К5 кожний являє собою метил, ЕКЗ і Е" кожний являє собою ізопропіл, Е? являє собою Н, В' являє собою втор-бутил, кожний РУ незалежно вибирають з СНз, О-СНз, ОН і Н; Е? являє собою Н і В"З являє собою -С(НЗ)2-С(В8)2-арил.
22. Імунокон'югат за п. 18, у якому цитотоксичний засіб являє собою ММАЕ. Зо 23. |Імунокон'югат за п. 19, у якому О являє собою піролобензодіазепін формули А: д'я во ллє ов" де М х Хх М х т В -ї М 17 7 М др во 5 й й оан о р! де Го) А, де пунктирні лінії вказують на необов'язкову присутність подвійного зв'язку між С1 і С2 або С2 і С; В? незалежно вибирають з Н, ОН, 50, «СНе, СМ, Є, ОБ, «СН-ВО, -С(ВО)», О-502-8, СО» і СОВ, і необов'язково додатково вибирають з галогену або дигалогену, причому КО незалежно вибирають з К, СОН, СОВ, СНО, СОН і галогену; Ве ї Е? незалежно вибирають з Н, К, ОН, ОК, 5, ЗН, МН», МНА, МАВ", МО», Меззп і галогену; В? незалежно вибирають з Н, К, ОН, ОК, ЗЕ, 5Н, МН»г, МНЕ, МАВ", МО», Меззп і галогену; О незалежно вибирають з 0, 5 і МН; В" являє собою або Н, або РЕ, або, де О являє собою О, 5ОзЗМ, де М являє собою катіон металу; Кі кожний незалежно вибирають з необов'язково заміщеного Сз-в алкілу, Сз-в гетероциклічних і Сво-го арильних груп, і, необов'язково, стосовно до групи МАК, К і Е" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7-членне гетероциклічне кільце; В"2, В", Д"» ії К!" являють собою те ж, що визначено для ВЗ, Не, В? і ЕК", відповідно; Е" являє собою Сз.і2 алкіленову групу, ланцюг якої може бути перерваний одним або декількома гетероатомами й/або ароматичними кільцями, які являють собою необов'язково заміщені; і
Х і Х незалежно вибрані з О, 5 і М(Н).
24. |мунокон'югат за п. 23, у якому О характеризується структурою: Уч м | он -- (е) о) Н, Аня Н ї, | п М ОМе оме М о о ! в якій п становить 0 або 1.
25. |Імунокон'югат за п. 18, у якому цитотоксичний засіб являє собою похідну неморубіцину.
26. Імунокон'югат за п. 19, у якому О характеризується структурою, вибраною з: й АН о он М і он до он б о М , МУ си /о і о он (в) : 90 он ло 0 он б г хе , . "У, Око / І
27. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 19, 21, 23, 24 і 26, у якому лінкер розщеплюється за допомогою протеази.
28. Імунокон'югат за п. 27, у якому лінкер містить дипептид валін-цитрулін, дипептид аланін- фенілаланін, дипептид фенілаланін-лізин, дипептид фенілаланін-гомолізин або дипептид М- метил-валін-цитрулін.
29. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 19, 21, 23, 24 і 26 у якому лінкер являє собою кислотолабільний.
30. Імунокон'югат за п. 29, у якому лінкер містить гідразон.
31. Імунокон'югат, який характеризується формулою: дь/В (в) но ОН Нн в мновлевчатоо Мити манси-м о оо оо о Н р , В якій 5 являє собою атом сірки; АБ являє собою антитіло за будь-яким з пунктів 1-14, а р знаходиться в межах від 1-8.
32. ІЇмунокон'югат за п. 31, в якому антитіло містить послідовність МН ЗЕО ІЮ МО:5 і послідовність МІ. ЗЕО ІЮ МО:3.
33. Імунокон'югат за п. 24, який характеризується формулою: до МН о Н б Н М М АБ? ит р ва Х Я, (о) ра (о) Ге)
о. о) М Т он н,/х о или то н М о о М (в) в) р,
34. Імунокон'югат за п. 26, який характеризується формулою, вибраною з: о оон (в) Н (в) 7 в) (Ф) обу 5 : ІФ) ро) о он б г хм Ме ни о)
б. р А о оон (9) ог (Фін! о 0 Ф он е ра Ге) НМ в) (в) У МН і. хе - ме й-ї- Стин| ІФ) (6) - в) у НМ Ге!
б. щей Мне (в) в (в) 5Я-АЬ р з
Х | о он он о о) о о о панна мів и МИ ли Ж 8 МН У ТМн (2) (») ві О он о /Оме " ве он, Се о. чно ОМе р (й (о) о он "щей у ввгогшва що (він! : ото ре) (Ф) он о г М МТУ Нм- 270 они ї МН о Де (в) МН нки () (е) зо 8АЬ (о) р з де К: і Е2 незалежно вибрані з Н і Сі-Свалкілу; і (9) Фін! о Ф о 5-АБ -;, МН Су ло о оно в г хи ме ОСОте( 0 б. р
35. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 19, 21, 23, 24 і 26-34, у якому р знаходиться в діапазоні від 2 до 5.
36. Імунокон'югат за будь-яким із пп. 18-31 і 33-35, який містить антитіло за п. 10.
37. Фармацевтичний склад, який містить імунокон'югат за будь-яким із пп. 18-36, і фармацевтично прийнятний носій.
38. Фармацевтичний склад за п. 37, який додатково містить додатковий терапевтичний засіб.
39. Фармацевтичний склад за п. 38, у якому додатковий терапевтичний засіб являє собою комплекс платини.
40. Спосіб лікування індивідуума з ГубЕ-позитивною формою раку, який включає введення індивідууму ефективної кількості імунокон'югату за будь-яким із пп. 18-36.
41. Спосіб за п. 40, при якому ГуУбЕ-позитивний рак вибирають з раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишок, меланоми, раку яєчників, недрібноклітинного раку легенів, раку голови та шиї і раку шлунка.
42. Спосіб за п. 41, який додатково включає введення додаткового терапевтичного засобу індивідууму.
43. Спосіб за п. 42, при якому додатковий терапевтичний засіб являє собою комплекс платини.
44. Спосіб інгібування проліферації в ГубЕ-позитивній клітині, який включає вплив на клітину імунокон'югатом за будь-яким із пп. 18-36 в умовах, що дозволяють зв'язування імунокон'югату з ГУбЕ на поверхні клітини, тим самим інгібуючи проліферацію клітини.
45. Спосіб за п. 44, при якому клітина являє собою злоякісну клітину молочної залози, підшлункової залози, товстої кишки, товстої та прямої кишок, меланоми, яєчників, недрібноклітинного раку легенів, раку голови та шиї або шлунка.
46. Антитіло за будь-яким із пп. 1-14, кон'юговане з міткою.
47. Антитіло за п. 46, в якому мітка являє собою позитронний емітер.
48. Антитіло за п. 47, в якому позитронний емітер являє собою 897т.
49. Спосіб виявлення ГубЕ людини в біологічному зразку, який включає контактування біологічного зразка з антитілом до ГУбЕ за будь-яким із пп. 1-14 в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла до ГубЕ з природним ГубЕ людини, і виявлення того, чи утворюється комплекс між антитілом до ГубЕ і природним ГГ УбЕ людини в біологічному зразку.
50. Спосіб за п. 49, при якому антитіло до І уУбЕ являє собою антитіло за п. 10.
51. Спосіб за п. 50, при якому біологічний зразок являє собою зразок раку молочної залози, зразок раку підшлункової залози, зразок раку товстої кишки, зразок раку товстої та прямої кишок, зразок меланоми, зразок раку яєчників, зразок недрібноклітинного раку легенів, зразок раку голови та шиї або зразок раку шлунка.
52. Спосіб виявлення І убЕ-позитивної злоякісної пухлини, який включає (ї) введення міченого антитіла до І убЕ суб'єкта, що характеризується наявністю або з підозрою на наявність ІГубЕ- позитивної злоякісної пухлини, причому мічене антитіло до ГубЕ містить антитіло до ГубЕ за Зо будь-яким із пп. 1-14, і (ії) виявлення міченого антитіла до ГубЕ у суб'єкта, причому виявлення міченого антитіла до ГубЕ вказує на І убЕ-позитивну злоякісну пухлину в суб'єкта.
53. Спосіб за п. 52, при якому мічене антитіло до ГубЕ являє собою антитіло за п. 10, що являє собою мічене антитіло.
54. Спосіб за п. 52 або п. 53, при якому мічене антитіло до ГубЕ містить антитіло до ГУбЕ, кон'юговане з позитронним емітером.
55. Спосіб за п. 54, при якому позитронний емітер являє собою 8927. Ілептичнність БОС Нодина Людица Макак Мища ню чай 55 Сигналкна посліЗОВНІСТЬ ВМО Я Макак ії я ля яв я рере У А ЩО їх ве Кі; з Є к ВК сх з. т я ЗЕО УНСО. Махаюреєї нс - КК І ктуАвк сів: кв сво ЕН, її ення вка е м Мита і ий с. хи я щи У К зи ці Ще Че і г, і; іх рН ср ї. впж ШО юМО М 0 Пвшюк З кещеее сне Уа АННА кант во Й що я . . ж а - Людина 35 ІНКІВ КК уки ре ефер рсех ен з (Р - Ку» уяв рено тре 5 8; пре т о, зе нене й о з НЕ мен ее НЯ НН Ж і за КН Ех ле НЕ НЕ Ж КВК ДЕ рН КА 3. чех ІДЕ ЕТ ЕТ Уахавстезке ЗА ; р 3 їй ха сл х : ди Е -Е х Ф ї і: з, чн ! т "Миша б ке ЗБерОІННИВеНя КО ВАТИ вне о ье де в ОВ СП овракіррозчшеняаєння 00000000
Фіг.1
Рівень 1рансекрипта а краматричиніх аналіз) тк - -к як ли та - ек я- ст Оу -х а дош в ваш в ш ж а ж ЗЕ ш ж В а 8 я 5 в Ж опо б 5 8-5 в С2. БО 5 с8 шу Об ої ба хх 05 сел лиш и и а І НИ І С В НС ВЛ позов пози до Ов В ЗО ВВ о В ЗО ВНОГО ВО ОО ПИ НО ОС ЗКирока-каніика тя вича о и в в ПОВ В Во емо : Назнирник квест т Крованисна судина РУК воль утекти зн туя пу нт ння Жуки ит жк етРЛ І КАК У учи ня нути ил Кт нтнтнт п ук чнисьх Зсістка Кбейлех ква а В В В ВДВ Кіссконкй мозок кіт Молочна залоза квотою чеку уд ж ру тур тя ек т ж кт тк ки т уч уд и тт соту теж во туту нт Культура клітни «раку «ЕК тей кленів клея Доля ме зйеінттиті» Мітки (пк слдіти пені оте МК лорі М ж я печу янь тод моженюю сх тіні Кайниві лінії ун укудвчююйк тя я клини нн нн т в п п а о он ІНийка матка "ГедДнармкаю рт лалаотттнтттттня тп ун т я ЯКЕ У А тя нт петанк тп они тки Ек и сви пн ни пиниин пого пове ти спи п співав ки и ки вп вени Говсти і орюма кіпика Тео тт тт нн тут тт Бедомотрій ТОВ юю тур тан каяття тин аа я тт тент ян ати тин тних Й зтрявохі р АЖ учен» емо п о по по пп пп о п в п о о о п п в п п п п ов о о ов Жовчний міхур ря Мдочфенютунт ніня е т п утк кажу нти ук кутах кункАнж Утккк кутю теля жи кж лік ік кю и Ат Кк я я кехжжужежехтя кант золожа сно меми тя тт тт тил а в в пп в п в и и Нарка РКфВННВаннхно сно. содеютекя ітюиюі ки кю ніх вні де тк тюки а ож і ні Нд пк Пк кож ке екю ві тіж ік ккметях т Печінка "пасе руту тя нет тет твою ВЗеген рН тд тт ун т тут тт Лімфоїдня тканміз "НІВВМВВ ткати ту тт тили ГК с спінювання вра нон нини донна нені ново він вин ин нин не нанні Місметрій ТРАН брутто ут ті тінь кістою рт яті тісті авт кет жеєка тет обов тю тн тт кбесквветб жа чевнютіюття тні стю Мер» нфЛчлкткфтюЕювєнкНТвВнитнннсвчснинннннниии Нейриенлюкюриногї тракт туту тут тен ЕЕ ук туту тт Ясиник ЧЕК восє ів юютуюєтььсо с зни «він нн нн т нні нн німі ин нини Підшлункова алу твоєю т Гівофитт поп п пп п п п п о п п поп о п п о п пп п опи . Плапсита шлалий щ - т паю тт тккнютюкх Гередміхурони хализасраюудюиттттт тт тт тити виття тт тт Влити тт тил тт тих ПИ кій: рот - - птн тт тт тт цяятттттня "зика. кіпиха Вт пет тету туту Кент и оо кіт то тунелі усе жітті тет іі ее тт ее лют т бетон ті тет юттнк нин ме а м мн и НК п Ттуткок "НВ юров т ект з лиття ти ит пул тяти тет яктятитя тих Кайінинк За хе нити Тяізує НеДусккснчкуєнккнуюи сккюютню ке скіни кн ккжері жа іттилікюєв сті кжннінік ллє жимі рн джікх кн нкт інн кнні ку хіх кнжкміккжх Інтецеаієна залоза Кдднутєт тихе кт тина ктняя уктичютх як ук зх тт нлотття тятю тя динннтя жил тн мя ятки зактекятяняікутняня кни Сецовий ТОК Р юю тт тт няття тіж тя тити тт тт тт, Левкіном г ЗККЯВНВ Кент тр уж мет тя тут ти М Кути терте ктуднитт тт яжктятитянтя
Фіг.2 Відносна експресія РАК Со Охагуя Злоекісні клітини! ОаВтТАПЛЕ Й Й Й Й лінії ВХ пінні тхутя почту кети НН ТЕ ЕК нт тт Те т ет ЕК Такт нт я т я інт ноти нт Кт тет вія ікс ет с Дн дідтедттентятитя нти тити тести ак як о Нормальні уканини. І «Рак підцетун: І м нин п в залечи жк ї- Дорн тн княжни КЕ ж тт ятки кюжня т зиттрр во; ин в в в в п В В ренні - в нн В в в в в в в в Вин Б-й і ки нн а и ни ей Ії : -- Форт т нт тт тт НН Іри ЕЕ ЕПІаІЛЕнИТЕ т ВЕБ ВЕ БІС ОКА ЕЕ В ДЕМО В Явно я ЕЕ 5 Біуві- я 8 5235 005 ЕН БОБИЯ Е Е Е ЕЕ во В Е Б вв От що - - В ж я ж я Во Е С. г - б Ж 5 я в х х жов Ен шк ї8 ї ВЕ КУ еВ г: - я й Ук Дуже низвкий рівень КРІ.39, ймовірна; черея цизьку якість РНК , Ноеркальні тканини. перераховики сище (печу: лесені: наднеренк: печівка. селезінка: мийкх матюю: прамдатка, молозна залоза, пголоеней мозок. ппаненіо, насіннцко; нирки, ззилок. перенміххрива зйпазаь прямо кишка; матка; пішилунвово залозе, трахех, онктоцюзнію. залози. оікіра, тонкий киїечвни: яйце пзлуною, нюфіз, миєлалини, ліснруточний кузл. симиний мозок горовий мере. лімфюцітн нориферичної крокі». перикард. юстконой очок: тимує. сеча; блчова оболонка носа: явутрішньсмореоні зріерй: стрявомій, сітківка. сім'яві пухирі товбсуй кишка, жир. порожниста весь серпеєтівви, хи. пеніс, ніскідна частина аванадоятийаної киінки, м'яз ссчовий міхур ШО Я Ж нпчякинях Кк ему ин й о фіг. 3 лЛогхне ланцем. ахлиж ЩО Нужеена ки 38385 51 КИ ОХ ОЙ ХО БОЄМ В ОЖИЛА О допоннн ДОВ Я ОЗ Окис НН: и З В В В ПИ В В ТВ Во В В у о о о В М и С МОБИКІХ а ВК ВОД ОНеВР М З В В ВИ НВП ВНС УНІ ПИ ПН В ДЕ З МН С МОм ос В чи ПМ ВД А ШИ ВИ В п ЗЕ В ЗВ Я УЗИ З І ПН В ЯК НЕ Я хе і Низка ки Я ОБ ФІ ЗЕ ря В КО МО МОХ вними кафтпвкікоцтнхя 1 КІ? 0х5393117 хх... 22:88 дж оМаЙХ хо ОВО У хх ої з фут ТИ Че 17:88 7 вав я ву ЄВ УКХ У ІМ юю В Бе хМуабтагсвоови Корені Й а и ли лк ле и М Мумовхиім ца ВТК ЛО МТМ ВХ Ото ЩІ ЗУ ЗК КОТ ДУ У ОБ СКЗ 0оооннютеветн Май ЗА ЖОТИ ХПІ МУ МЯ ЦІ кмемівскикути с ТІ ДВ Я Кри КТ а о лисеня ви НН в В ЕСЕ МИС ВЕ Та ж М Ол НН З а и и А ЕЕ ОК С ВИ р М В Я ЗВІТУ у 17:11 В Стр ЕХ. КВ тях х - : Просимо пс нини пн постити сі нн пн ні інн нн пп пінні пон сит внивнн
«г. 4 Жажкий лак:
Б. ПАНИ Н Мумсрга Канни 12 2 4 3 Кт їх З Кліп нови мим пи сМмапм сб нцмН ни їх з БВ зар ЗІБ УНожекою Зі: ха хтів пігулка МОБИБУК од УМ цИУ їх ІБК ОА В МБО М Б пот М МІУ КІ ОП ІД я фо овот кій УНК Маг уз Тв ху ьЬ т тп? 0 п ВІВ у ре їх 815 тяж Пот я ПІІЦІІУ КТ дну ту Нумоіаот юн МК ІбО Е ММА ді вк в ім и м ут те кі І М х 2 бій кльов ХАТУ КА ЕЛ УТ о лк ух аву ух как ІН яю СІК. Є ДЯ ТОР ЖІК ХХІ ОА БІ З 107 й ЕОВІЩрУ КОЮ ЗІБ СОТ ВІ В ВНІ? во Об ІМ:. 0152 825 ВІ з т в ІК 5 1:12 Кк вх ях Ж Тк Мою паААААМ А ДА А джААН НААН ААКАА АКА ААУ АКА СОС АТ Мухерююва кн: і МО шк г, жк ОО М ЗМ пу. МЕБІМ хх Ів ПІР МНоєрмссювоких її ТА Є КВК АТ ТИТтТІТУ т 5 в я тт хг вшити у Пр ВР ЖК Є ВТЕ А лоя юн КОМІ ЖІ 5 Пре т 5 тот реа м ж в ВЕ М ВЕ Я УЗ ДН З МЕ ПЕВ ПЕ ПЕ ПЕ ДЕ НВ І В З З В ПИ В В х Ж. нн в сріг. 5 Мажкни ланок: З доле ннтет А нметнютю ння Неосртчокаши 3 ЗЕ м рикв»лвВЗавиипниВнимив м мож жаром
МОЮ. Уціконхю ЗУБІ ка кр ТАКА р вхо мм мУКТНЕ ЛИ АК В ПІК в ох с кж В У ЕТ Іф І ЕІ ЮК ТЯ зх Кама гок ос ее но МОВ В ЧИ МВ ЗА НИ М ЗК М В З Я ЕК В В НЕ З ДС НЕ У НН нн ролу ду т Нумихоїй Киї ЗІВІТ ЯВИ ДІЇ Мом м тав сів а ВУ Мом ТІМ Всі А В сві ж УНІ мосокуин МАКИ Ви БЕ А ст ли: ху ЗМЕН уд ки ТИ ТЕ и ЖІ ПИТ ВКА а тт свід Р ОЕІОу ОІВ ОХ БО пес люмат їх б пі. 100 б хх 5 МІ с 153 п55 11155 Г й о; ИЙ Е Н І шше нш яш сн Ши нш ШИ Ше Я Я Нумерюдя Кицайт Я пов вкл злет хо ше п НЕ Не т НУ Не Мо мир конемехоія ГЛ тя Р. ШИЯ з - -- я іже р ЛИ НИ ноша ее Ко У Вова я КОМ В В в А А тя БР ра т тт ецу зага: тт тр 0 В КК їх. п з ЗІ НЕ ЗВ НН с І В - погроми па В а , нен нн нн нн пон ТВі ь
Опади естрогену, що вводяться під час дослінження щи СПАВ гтре МК г т и ше ши ! Її 2 ' рт Кт к і шт в У т БЕ» к Зди ее ОМВО ОК. Ї т Умертвя. хання | і Май Ї і 7 -- 15005 і Мт Месумоуюеин - ї Я. 1 я бий | Я зн г | а Е Си ! я що ї. й и7оСеОпхов «тре - 0005 і щі а жд; . З се : ій ї
Іле. г ке ж ! ів : Ми Е | ж 8 в | з ТЯ Ії й в ай з х я ще , , ії : 5 85 до : Гн х ря мк «г Мн за ще 7 ї : ОБСЄ тре пн и ВИМИ | ит увЕчеЕ. Ятрк фенняннкуе нн б етяфннчнин В ЕВ) З 10 їх 0 о День
Фік. ТА Нисока поверхнева екопресія КУБ В аназізі проточної цитометрії - 2ї р оряянинккина ДІХОЩИМ ЯНА У т ільки її ЕЕ ШК ! ! й 80-3 її ЙО нення Змкг/мл Ни ЗВ12УТИ Ї Е З и сіоікороктедктнніжініннінн дбкінінілн нні нію інкоісіни ж ікнсняньв Я її її -е 1 Її Е Ж м З у Біне СОщ , Я З чех бо вій макс. : ще : : Сеої Теат: -4 не і Е- 24 я 1 і ко З 5 Ж ІЗ ; : в і кої і ї Й 2а- гої й Е е Я Е у Х 0 нина хан: ММ М ЕЕ: піні яд вес тій, с НЯ Ж «п! де зи «й це 1 1 НЕ ЛАН: РСЯ-Мет
Фіг. 7 з
5.х й аа ' жо - і ї т ме шиє ї Х і: Ж од ! х с. т жи ; ях . ож дово 002ОХНу си усе п ! ча іх є сво ше Ап ВЕ ВІТА Я Мб ніУка з Вільн. ММАЕ Вот со ОХ п 1 ІЮ Концентрація вититіла (мкг/мл)
Фіг. 7о 50 іо х ня їх оБтОК. Несучиїї рон й і й ; м ї - 1 і Ї жк ШІ! я голосно сенси нні й а стем тю кл ленстту - й к І і зй
Е р. Умертвл. мини І сяк ок З р - й ї и А я зв зу і у 4 У як- М Е і я я і с Ж ої Й х : Не лі ТИ ПО АУВЕУЄК й НО ку ОВ - В т ; х и кі В, о що е " Кз; й ти, - | Ж у ї ШИ и не ; Я сни нотку УСЕ і і ан ра з ? да Гак Ей М іа хі пн у Ї Зтрк
Ь. п НН в 5, 5 т їв 2 зе за ЗЕ День Чиг, ЗА
БОВЕНВ КЕ оїінка за дапаморою ІНС й -е т в НЕ че ї пн Не до нн ня 0 - шин ен о в ше 00: її Не ох Кх й НН ІМ У р 1 Кі ошчай Ж Тит. Ме ох ОО о Ше но а и в НН п вн НВ оон спі нен іяян п Не п пот и Я В о Ко д я ОТ той а о Сн о Лажтян РОДИ. нн ее и : х ЗОДрня пи Кк фунт но | ВОМ в о о НЯ ; еще Фіг. я Фів, 88 Й яна тах у» - Е 5 се дк с В. Усе Ан я ;. ее і З хз у і тя 3 ах ї Ж - і і пот ї - Її ях. 5 що ох х он ої-я н Х Е оон ях 5 пе ува жо ; : х З 5, ох» й що й зах ПАЮ од пі 1 іх; Кинцентрація антитіла (мкгумл)
5. що я в Чиг С т ІЗ КУ : песумй ротнни й до вБая у ИСОепЬЕ іотрк са я; ж р Я Н їй. . Кя х ій сис, ек В поуВЕ А, вир Бо з г | гак ЕЕ Ї и Ак шу ве Во ; Мя КОЗеСТоЕ Вр Нв ! ра я й зн м Й С Я ї Ж м ся і І їй и их Ко с х зей до Я Ф 300 ке май г. її тя піс Агок не чи Ки: т ГА тя ; их дея жк с ик ВН ШЕ о ЕЕ ТК фен: 5 иа дя ш в 4 я гай Ех ша ев ме сви У " ї 3 чну я неї З ЕУВЕНАЙ толк й «ду кйнух : зіжако й я ЕУВЕЮ ТЯ б В; 10 15 що 2 Зо 35 фіг. ЗА. Дві і а З таКх Н й Я оо -- Я ву ж довж Я в з В ї Кк ї ' І сш сли ее они Зо ШЕ) оо
Фіг. 98 кеш с а пи а: кВ ЖОФФ ше. у сніннс піні кп інн ні пінні ен і оф сн нон біоло дна я щуее нов, пні ЙАННЬ не й : че . Вести й Ед сб ши ше й тот Й і " Кі іх й я й КОВО не 24 ді ; нює: ес З рова» Е о о. СУБ УХЛННИ з і . - В ВАН о В Й т о. й ! Ко а я Е
Несучий розчнняку 35000 , : х ль; Й спьков ток Н | КЕ Їй ї ех ї в мо. Я , ! ід з УВУ, тре 150 ни вне си р у; і я . ; и ак та УВЕ УСЕ. ето Ех нешнй Е | рак: І ШІ х Я кі їі 4 ГИ 1 ! шк 8. ї ї : кт Ї / Я. ; - Га КЕ ї: Я и / |; ' Ії й жк І | 1 / Во нив. вок п "у Йх т ЕЗ от Є ПД яю. митті Тон с ах я 7 ря «1 уВЕ-Уєю, йтре вай г а; і я БУ Які дк й шо із -Е НЯ Яні фея в С нє тина у Щі Ь, він зносі З -- ув Я, апр й З 19 415 20 То о ча у Дні
Фіг. А й г ІЗ ї Фо ою ов Во бо о я Ї кн: З А Но НН: т. В і шк ок КО ФіМі0В ли нак ИН АУВЕ (08) Г ее век вактнн щ М т о я 0: с Бон
Фіг. С нн ши Й п ти в кре В НЕД се ода о
000. І ян СН СК, Ме рК Годдотетттт , щи ; и Умертіви. міниа БО о! Коляка пе, ! нн Несучий роззин ше й КУ х тк гу ї лай - ї ВУ ї . сх Н х ще 010 ОО ЩЬоЄ Яток Е Об ! ря Н їй по КЕ і ой : со ер УВЕУСЕ отр не к ї.
Х у до Ї І: |. У " я х ї А як Н ї Це ий обняв збтрк «в СИ и ке Бе НК м жа: у Е рах мА во Я дах Я дя пе пі й бук ее с з КАК в - ЦО хв. в ! т иш-УВЕЮЄ, Як сонні МК.
І т хї Я 5 т і - 1. і ге щ Й тю - гони, янв р Е я пон Й - Твін щ фревзев ятр, сани ом ки ежокяо адм ВК офуєтнох ві нав ев і КЕНЕ ние Й фати ге як . х й рн да сеуче до Тер 05 30 45 20 95 3 35 «8 ФА День с НН же Ж я- БМ, в ее що м Ю зо І що ОО і БЕ о: РИ ще о Жду оон Не я По ск кн ЯН Я -що о 5 МОМ г А 5 я м ша и и Фіг ів ї 2 3 4 5 в 7 ваш пн 4ра : ек ! іжу СлейКечНХ сна В НН І іі УВЕ) ! Що | І ЩЕ 00 ЗАРОН ! ен и в - мкс ззату налинно, Блот 305 (омкглил) вий. т Опсобни МАХЕМ1Б2 зт ме Є Кк У и Ал СЯ а ; ч я ' Хижі у М ВВ У; ду, А : Мои ну я а 0 15606 пухливи ук зе 17 пе коса в Ме ЖЮб пухлини ж Фіг ІС пп пушнни М . ОО 1096 пухлини : ХРО дру й 00000000 бббпуйнни б п с ма ло А
UAA201412476A 2012-05-21 2013-05-20 ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E UA114814C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261649775P 2012-05-21 2012-05-21
PCT/US2013/041848 WO2013177055A2 (en) 2012-05-21 2013-05-20 ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS OF USE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA114814C2 true UA114814C2 (uk) 2017-08-10

Family

ID=49624486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201412476A UA114814C2 (uk) 2012-05-21 2013-05-20 ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E

Country Status (25)

Country Link
US (2) US9724427B2 (uk)
EP (1) EP2852404B1 (uk)
JP (2) JP6192022B2 (uk)
KR (1) KR101718200B1 (uk)
CN (1) CN104540519B (uk)
AR (1) AR091098A1 (uk)
AU (2) AU2013266604B2 (uk)
BR (1) BR112014028366A2 (uk)
CA (1) CA2872327A1 (uk)
CL (1) CL2014003140A1 (uk)
CO (1) CO7151531A2 (uk)
CR (1) CR20140529A (uk)
EA (1) EA201491947A1 (uk)
HK (2) HK1208167A1 (uk)
IL (1) IL235542A0 (uk)
MA (1) MA37538B1 (uk)
MX (1) MX352581B (uk)
NZ (1) NZ702195A (uk)
PE (1) PE20150025A1 (uk)
PH (1) PH12014502601A1 (uk)
SG (1) SG11201407561UA (uk)
TW (1) TWI614265B (uk)
UA (1) UA114814C2 (uk)
WO (1) WO2013177055A2 (uk)
ZA (1) ZA201408236B (uk)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
CN105658237B (zh) 2013-10-21 2021-03-09 基因泰克公司 抗Ly6E抗体及使用方法
EP3082874A2 (en) * 2013-12-16 2016-10-26 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
EA033456B1 (ru) * 2013-12-16 2019-10-31 Genentech Inc Конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие пептидомиметические линкеры
BR112016013861A2 (pt) 2013-12-16 2017-10-10 Genentech Inc conjugados de droga e anticorpo, compostos, método de tratamento e composição farmacêutica
CN107108724A (zh) 2014-09-12 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 半胱氨酸改造抗体和缀合物
JP6752204B2 (ja) * 2014-12-03 2020-09-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 四級アミン化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2016102679A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Nbe-Therapeutics Ag Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
EP3458101B1 (en) 2016-05-20 2020-12-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Protac antibody conjugates and methods of use
WO2017214024A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
JP7304846B2 (ja) 2017-07-24 2023-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ８抗体およびその使用
US20210198636A1 (en) * 2017-10-20 2021-07-01 Genethon Use of Syncytin for Targeting Drug and Gene Delivery to Lung Tissue
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
CA3115110A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CA3188649A1 (en) 2020-07-21 2022-01-27 Genentech, Inc. Antibody-conjugated chemical inducers of degradation of brm and methods thereof
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
AR128330A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpo y métodos de estos
AR128331A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpos y métodos de estos
TW202406934A (zh) * 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
US5856136A (en) 1996-07-03 1999-01-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human stem cell antigens
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6913756B1 (en) * 1998-04-29 2005-07-05 The Uab Research Foundation Monoclonal antibodies specific for anthrax and peptides derived from the antibodies thereof
US7387772B1 (en) * 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
PT1545613E (pt) 2002-07-31 2011-09-27 Seattle Genetics Inc Conjugados de auristatina e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infecciosa
MXPA05001933A (es) * 2002-08-19 2005-04-28 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
AU2003271186A1 (en) 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
SG10201701737XA (en) 2003-11-06 2017-04-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
RU2401277C2 (ru) 2004-01-07 2010-10-10 Чирон Корпорейшн Не мышиное анти-m-csf-антитело (варианты), его получение и использование
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
JP4679513B2 (ja) * 2004-04-28 2011-04-27 パナソニック株式会社 階層符号化装置および階層符号化方法
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
US20100111856A1 (en) * 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US20060094676A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Ronit Lahav Compositions and methods for treating cancer using compositions comprising an inhibitor of endothelin receptor activity
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
EP1817059A2 (en) 2004-12-01 2007-08-15 Genentech, Inc. Conjugates of 1,8-bis-naphthalimides with an antibody
EP1942944A2 (en) 2005-10-31 2008-07-16 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
AU2007227195A1 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and Ly6 E: targets for cancer diagnosis and therapy
US20070269442A1 (en) 2006-05-19 2007-11-22 Robert J. Webber Chimeric monoclonal antibody recognizing iNOS
CA2727915C (en) * 2008-07-15 2016-04-26 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
EP2400992B1 (en) 2009-02-27 2015-07-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
US20110256157A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA3220104A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20120121615A1 (en) 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
CN105658237B (zh) * 2013-10-21 2021-03-09 基因泰克公司 抗Ly6E抗体及使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150013318A (ko) 2015-02-04
NZ702195A (en) 2016-09-30
TW201406780A (zh) 2014-02-16
KR101718200B1 (ko) 2017-03-21
MA37538A2 (fr) 2016-11-30
AU2013266604B2 (en) 2016-09-08
WO2013177055A2 (en) 2013-11-28
HK1208167A1 (en) 2016-02-26
CR20140529A (es) 2015-02-12
WO2013177055A3 (en) 2014-03-06
CN104540519B (zh) 2018-06-01
US20160199508A1 (en) 2016-07-14
PH12014502601A1 (en) 2015-02-02
CL2014003140A1 (es) 2015-02-27
JP2015528692A (ja) 2015-10-01
AR091098A1 (es) 2015-01-14
EA201491947A1 (ru) 2015-05-29
MX2014014085A (es) 2015-02-04
JP2017169572A (ja) 2017-09-28
US20180015177A1 (en) 2018-01-18
MA37538B1 (fr) 2017-11-30
PE20150025A1 (es) 2015-02-09
MX352581B (es) 2017-11-29
HK1209373A1 (en) 2016-04-01
TWI614265B (zh) 2018-02-11
EP2852404A2 (en) 2015-04-01
EP2852404A4 (en) 2015-12-02
ZA201408236B (en) 2016-01-27
JP6192022B2 (ja) 2017-09-06
AU2016259286A1 (en) 2016-12-01
IL235542A0 (en) 2015-01-29
BR112014028366A2 (pt) 2017-06-27
AU2013266604A1 (en) 2015-01-15
US10653792B2 (en) 2020-05-19
US9724427B2 (en) 2017-08-08
CA2872327A1 (en) 2013-11-28
CO7151531A2 (es) 2014-12-29
CN104540519A (zh) 2015-04-22
SG11201407561UA (en) 2014-12-30
EP2852404B1 (en) 2017-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA114814C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З Ly6E
US11352431B2 (en) Anti-FCRH5 antibodies
US11230600B2 (en) Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
KR20170066421A (ko) 항-cll-1 항체 및 면역접합체
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
MX2014011006A (es) Anticuerpos anti - lgr5 e inmunoconjugados.
KR20150006000A (ko) 항-pmel17 항체 및 면역접합체
UA118251C2 (uk) Кон'югат антитіло-лікарський засіб (adc), який зв'язується з білком 158p1d7
EP3046940B1 (en) Methods of using anti-lgr5 antibodies