BR112020023872A2 - agentes de ligação de psma e seus usos - Google Patents

Abstract

''AGENTES DE LIGAÇÃO A PSMA E USOS DOS MESMOS''. A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a PSMA ou PSMA e CD3, polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou fragmentos e métodos de preparação e utilização dos anteriores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTES DE LIGAÇÃO A PSMA E USOS DOS MESMOS".

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e está no presente documento incorporada a título de referência, em sua totalidade. A dita cópia em formato ASCII, criada em 30 de abril de 2019, foi nomeada como JBIS156WOPCT1 SL.txt e tem um tamanho de 272.443 bytes.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A presente invenção refere-se aos anticorpos monocionais que se ligam imunoespecificamente ao antígeno de membrana especí- fico da próstata (PSMA, "prostate specific membrane antigen"), aos anticorpos multiespecíficos que se ligam imunoespecificamente ao PSMA e ao agrupamento de diferenciação 3 (CD3), e aos métodos para produzir e usar os anticorpos descritos.

ANTECEDENTES

[0003] O câncer de próstata é o segundo câncer mais comum em homens em todo o mundo, e a sexta causa principal de morte relacio- nada com o câncer. Globalmente, há aproximadamente 1.100.000 no- vos casos e 300.000 mortes todo ano, compreendendo 4% de todas as mortes por câncer. Estima-se que | em cada 6 homens será diag- nosticado com a doença durante a vida. Nos Estados Unidos, mais de 90% dos cânceres de próstata são encontrados em estágios local ou regional. Nestes estágios iniciais, a taxa de sobrevida de 5 anos é pró- xima de 100%. Quando o câncer tem metástase, entretanto, a taxa de sobrevida de 5 anos cai para 28%, e existe uma necessidade de tra- tamentos eficazes para câncer de próstata de estágio avançado.

[0004] O antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) é uma proteína de membrana tipo Il que é altamente expressa em neo- plasia intraepitelial prostática (PIN, "prostatic intraepithelial neoplasia"),

uma condição na qual algumas células de próstata começam a pare- cer anormais e se comportar anormalmente, e em cânceres de prósta- ta primários e metastáticos, [Bostwick DG, Pacelli A, Blute M, Roche P, Murphy GP. Expressão de antígeno de membrana específico da prós- tata em neoplasia intraepitelial prostática e adenocarcinoma: Um estu- do de 184 casos. Cancer 1998;82 (11):2256-2261.]. A expressão de PSMA em tecidos cancerosos se correlaciona com o estágio da doen- ça e o escore de Gleason [Kawakami M, Nakayama J. Enhanced ex- pression of prostate-specific membrane antigen gene in prostate can- cer as revealed by in situ hybridization. Cancer Res 1997;57(12):2321-

2324.]. A expressão de PSMA é também mais alta em células de cân- cer de próstata de pacientes hormônio-refratários [Wright GL Jr, Grob BM, Haley C, Grossman K, Newhall K, Petrylak D, Troyer J, Kon- chubaA, Schellhammer PF, Moriarty R. Upregulation of prostate- specific membrane antigen after androgen- deprivation therapy. Uro- logy 1996;48(2):326-334.] e a expressão aumentada de PSMA tem mostrado ser um marcador independente de reincidência da doença [Mitsiades CS, Lembessis P, Sourla A, Milathianakis C, TsintavisA, Koutsilieris M. Molecular staging by RT-pCR analysis for PSA and PSMA in peripheral blood and bone marrow samples is an independent predictor of time to biochemical failure followingradical prostatectomy for clinically localized prostate cancer. Clin Exp Metastasis 2004;21(6): 495-505.]. O nível elevado de expressão de PSMA está correlaciona- do com a recorrência precoce do antígeno específico da próstata (PSA) em câncer da próstata tratado cirurgicamente. Os níveis de ex- pressão de PSMA se correlacionam com a agressividade da doença e, portanto, suportam fortemente o uso de PSMA como um alvo excelen- te para a caracterização de câncer de próstata e subsequente terapia.

[0005] Os tratamentos atuais para câncer de próstata incluem ci- rurgia, radioterapia e terapias hormonais. Quando os cânceres da próstata crescem mesmo com redução dos níveis de testosterona por terapia hormonal, as opções de tratamento são limitadas. Tipicamente, a vacina contra o câncer sipuleucel-T, um agente radiofarmacêutico (como cloreto de rádio-223), terapias hormonais secundárias (como abiraterona ou enzalutamida) e/ou quimioterapias (docetaxel e cabazi- taxel) são adicionados em sequência à terapia hormonal. Embora cada um destes tratamentos possa atrasar o crescimento do câncer por vá- rios meses e aliviar sintomas produzidos pela doença, a doença por fim se torna resistente a eles. Isso salienta a necessidade de um tra- tamento mais aprimorado e de terapias mais eficazes para câncer de próstata avançado com expressão de PSMA.

SUMÁRIO

[0006] São no presente documento fornecidos anticorpos que se ligam imunoespecificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpan- zé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou hu- mano, e seus fragmentos de ligação ao antígeno. São, também, des- critos polinucleotídeos relacionados capazes de codificar anticorpos específicos para PSMA e os fragmentos de ligação ao antígeno, célu- las que expressam os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos assim como vetores associados e anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno detectavelmente marcados. Além disso, méto- dos de uso dos anticorpos fornecidos e fragmentos de ligação a antí- geno são descritos. Por exemplo, os anticorpos específicos para PSMA e os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser usados para diagnosticar ou monitorar a progressão, a regressão, ou a estabilidade de um câncer que expressa PSMA; para determinar se um paciente deve ou não ser tratado para o câncer ou para determinar se um indi- víduo está ou não afligido com um câncer que expressa PSMA e pode, dessa forma, ser suscetível ao tratamento com um agente terapêutico anticâncer específico para PSMA, como os anticorpos multiespecíficos

(bispecífico, triespecífico, etc.) contra PSMA e CD3 no presente docu- mento descritos.

[0007] São adicionalmente no presente documento fornecidos an- ticorpos multiespecíficos que se ligam imunoespecificamente ao PSMA e ao CD3 e fragmentos multiespecíficos de ligação ao antígeno dos mesmos. São, também, descritos polinucleotídeos relacionados capa- zes de codificar os anticorpos multiespecíficos para PSMA x CD3 for- necidos, células que expressam os anticorpos fornecidos assim como vetores associados e anticorpos multiespecíficos detectavelmente marcados. Além disso, métodos de uso de anticorpos fornecidos são descritos. Por exemplo, os anticorpos multiespecíficos para PSMA x CD3 podem ser utilizados para diagnosticar ou monitorar a progres- são, a regressão, ou a estabilidade de um câncer que expressa PSMA; para determinar se um paciente deve ou não ser tratado para o câncer ou para determinar se um indivíduo está ou não acometido com um câncer que expressa PSMA e, dessa forma, pode ser suscetível ao tratamento com um agente terapêutico anticâncer específico para PSMA, como os anticorpos multiespecíficos para PSMA x CD3 no pre- sente documento descritos. Anticorpos específicos para PSMA

[0008] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente.

[0009] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respecti-

vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 12e 13, respectivamente.

[0010] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respecti- vamente.

[0011] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respecti- vamente, e uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente.

[0012] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respecti- vamente.

[0013] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respecti- vamente, e uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente.

[0014] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respecti- vamente, ou SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

[0015] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respecti- vamente, e uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente.

[0016] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 38, respecti- vamente.

[0017] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 38, respecti- vamente, e uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 39, 40 e 41, respectivamente.

[0018] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR?2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respec- tivamente.

[0019] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR?2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respec- tivamente, e uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente.

[0020] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes

(chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente.

[0021] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respecti- vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 46, 29 e 27, respectivamente.

[0022] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 48, respectivamente.

[0023] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 48, respecti- vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 49, 50 e 51, respectivamente.

[0024] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 52, respectivamente.

[0025] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37 e 52, respecti- vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 49, 50 e 51, respectivamente.

[0026] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente.

[0027] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectiva- mente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 12e 13, respectivamente.

[0028] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33, respectivamente.

[0029] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33, respecti-

vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 34, 12 e 35, respectivamente.

[0030] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes (chimpanzé), Macaca fascicularis (macaco cinomolgo, macaca, cino) e/ou humano, que compreendem uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54 e 55, respectivamente.

[0031] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem uma HCDR1, uma HCDR2 e uma HCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54 e 55, respecti- vamente, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 23, 12 e 35, respectivamente.

[0032] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem certas sequên- cias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme descrito na presente invenção.

[0033] A invenção fornece um anticorpo isolado e fragmentos do mesmo, que se ligam especificamente ao PSMA de Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano, que compreendem certas sequên- cias de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) conforme descrito na presente in- venção.

[0034] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado que se liga especificamente a Pan troglodytes, Macaca fascicularis e/ou humano e fragmentos dos mesmos, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente ao PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente ao CD3.

[0035] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado que se liga especificamente ao PSMA de Pan tro- glodytes, Macaca fascicularis e/ou humano e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente ao PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, que compreendem certas sequências de aminoácidos de cadeia pesa- da ou de cadeia leve HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR?, LCDR3, VH, VL, conforme descrito na presente invenção.

[0036] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respecti- vamente.

[0037] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respecti- vamente.

[0038] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respecti-

vamente.

[0039] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respecti- vamente.

[0040] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respecti- vamente.

[0041] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, res- pectivamente.

[0042] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respecti- vamente.

[0043] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico

PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respecti- vamente.

[0044] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50 e 51, respecti- vamente.

[0045] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respecti- vamente.

[0046] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respecti- vamente.

[0047] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respecti- vamente.

[0048] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 29 e 30, respec- tivamente.

[0049] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, res- pectivamente.

[0050] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133 e 132, res- pectivamente.

[0051] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a

LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 30, respec- tivamente.

[0052] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 136, res- pectivamente.

[0053] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 30, respec- tivamente.

[0054] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, res- pectivamente.

[0055] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 133 e 132, res- pectivamente.

[0056] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 136, res- pectivamente.

[0057] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, res- pectivamente.

[0058] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133 e 132, res- pectivamente.

[0059] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreendem um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LOCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133 e 132, res- pectivamente.

[0060] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri-

meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 61, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0061] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 61, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0062] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 66 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 67, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0063] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 66 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 67, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0064] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0065] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0066] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 62 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 63, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0067] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 62 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO:

63, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0068] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 75 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 76, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0069] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 75 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 76, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0070] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do- mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 160 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

[0071] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico PSMA/CD3 isolado e fragmentos do mesmo, que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, sendo que o primeiro do-

mínio compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 160 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 152 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0072] A invenção fornece também um imunoconjugado que com- preende o anticorpo da invenção, ou sua porção de ligação a antígeno, ligado a um agente terapêutico ou a um agente de imageamento.

[0073] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo da invenção e um veículo farmaceutica- mente aceitável.

[0074] A invenção também fornecer um polinucleotídeo que codifi- ca a VH do anticorpo, ou a VL do anticorpo, ou a VH do anticorpo e a VL do anticorpo da invenção.

[0075] A invenção também fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo, a VL do anticorpo ou a VH e a VL do anticorpo da invenção.

[0076] A invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor da invenção.

[0077] A invenção também fornece um método de produção do anticorpo da invenção, que compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção em condições nas quais o anticorpo é expresso, e a recu- peração do anticorpo produzido pela célula hospedeira.

[0078] A invenção também fornece um método para tratar uma doença que superexpressa PSMA e/ou um câncer em um indivíduo, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção ao indivíduo que necessita do mes- mo durante um tempo suficiente para tratar o câncer.

[0079] A invenção também fornece um kit que compreende o anti- corpo da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0080] A Figura 1 mostra as curvas de titulação para acertos de seleção ("panning") de fagos anti-PSMA que se ligam a células LNCaP.

[0081] A Figura 2 mostra as curvas de titulação para acertos de seleção ("panning") de fagos anti-PSMA que se ligam a células HEK que expressam PSMA de chimpanzé.

[0082] A Figura 3 mostra as curvas de titulação para acertos de seleção ("panning") de fagos anti-PSMA que se ligam a células HEK que expressam PSMA de macaco cinomolgo.

[0083] A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos de SP34 com numeração sequencial. CDRs em definição de mAb (K.R. Abhi- nandan e A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839) são subli- nhadas. Ser230 é o último resíduo HC presente no Fab clivado por papaína. Os resíduos de 231 a 455 são de IGHG3 MOUSE (IgG3 de camundongo, isoforma 2).

[0084] A Figura 5 mostra as variantes de adaptação do arcabouço humano ("HFA", human framework adaptation") para V4 (SEQ ID NOs: 104, 102, 115 e 116, respectivamente, por ordem de aparência) e V. (SEQ ID NOs: 103, 117 e 105, respectivamente, por ordem de aparên- cia). A numeração é sequencial; CDRs na definição de mAb são subli- nhados; os resíduos que diferem de SP34 são realçados em negrito; as retromutações nas variantes HFA estão em negrito e sublinhadas. A figura descreve as sequências de VH e VL de sp34 como as SEQ ID NOs 128 e 129, respectivamente.

[0085] A Figura 6 mostra a ligação das variantes SP34 HFA de células T primárias humanas.

[0086] A Figura 7 mostra a ligação das variantes SP34 HFA a cé- lulas T primárias de macacos cinomolgos.

[0087] A Figura 8 mostra que as variantes SP34 HFA ativam as células T primárias humanas in vitro. Os controles negativos são mos-

trados em branco e os controles positivos são mostrados em preto.

[0088] A Figura 9 mostra que as variantes SP34 HFA ativam as células T primárias de macacos cinomolgos in vitro. Os controles ne- gativos são mostrados em branco e os controles positivos são mostra- dos em preto. O anticorpo não reativo cruzado com CD3e, G11, serviu como um controle negativo adicional.

[0089] As Figuras 10A e 10B mostram a correlação da ligação e ativação pelas variantes SP34 HFA. Os valores de ligação média e de intensidade de fluorescência média (MFI, "mean fluorescence intensi- ty") de CD69 para humanos (Figura 10A) e cinomolgos (Figura 10B) são comparados um com o outro.

[0090] As Figuras 11A a 11F mostram as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 que se ligam a células de LNCaP.

[0091] A Figura 12 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 que se ligam a células HEK que expres- sam PSMA de chimpanzé.

[0092] A Figura 13 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 que se ligam a células HEK que expres- sam PSMA de macaco cinomolgo.

[0093] A Figura 14 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 que se ligam a células HEK que expres- sam PSMA humano.

[0094] A Figura 15 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 para células HEK que expressam PSMA humano em um ensaio de toxicidade envolvendo a liberação de cromo mediada por células T.

[0095] A Figura 16 mostra a comparação entre braços de CD3 de média e alta afinidade em anticorpos biespecíficos PSMA e CD3 em um ensaio de toxicidade de liberação de cromo mediada por células

HEK que expressam PSMA humano.

[0096] A Figura 17 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 para células LNCaP em um ensaio de toxi- cidade envolvendo a liberação de cromo mediada por células T.

[0097] A Figura 18 mostra as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 para células HEK que expressam PSMA de macaco cinomolgo em um ensaio de toxicidade envolvendo a libe- ração de cromo mediada por células T.

[0098] As Figuras 19A, 19B e 19C mostram as curvas de titulação para anticorpos biespecíficos PS3B27 e de controle para células HEK que expressam PSMA de macaco cinomolgo e humano e células LNCaP em um ensaio de toxicidade de caspase 3/7 mediada por célu- las T.

[0099] A Figura 20 mostra a ativação de células T por PS3B27.

[0100] A Figura 21 mostra a prevenção da tumorigênese de xeno- enxertos de HEK293-PSMA tratados com anticorpos biespecíficos PS3B27 e de controle em camundongos NSG humanizados com célu- las mononucleares do sangue periférico (PBMC, "peripheral blood mo- nonuclear cells")

[0101] A Figura 22 mostra os pesos corporais médios de camun- dongos NSG humanizados com PBMC portando xenoenxertos de HEK293-PSMA tratados com anticorpos biespecíficos PS3B27 e de controle.

[0102] A Figura 23 mostra a eficácia de anticorpos biespecíficos PS3B27 e de controle na prevenção de tumorigênese de mistura de xenoenxertos de células T/HEK293-PSMA em camundongos CD1 ma- chos nus.

[0103] A Figura 24 mostra o peso corporal de camundongos CD1 machos nus portando de xenoenxertos de células T/HEK293-PSMA em mistura tratados com anticorpos biespecíficos PS3B27 e de contro-

le.

[0104] A Figura 25 mostra a estrutura geral do Fab de PSMB83 (também conhecido como " PSMMB84") ligado ao homodímero de ECD de PSMA humano.

[0105] A Figura 26 mostra uma vista de perto das principais intera- ções de PSMA com a cadeia leve de PSMB83 (também conhecido como "PSMMB84").

[0106] A Figura 27 mostra uma vista de perto das principais intera- ções de PSMA a cadeia pesada de PSMB83 (também conhecido co- mo "PSMMB84").

[0107] A Figura 28 mostra a comparação de resíduos de epítopo de PSMB83 (também conhecido como "PSMMB84") nas sequências de PSMA humano (SEQ ID NO: 3), de camundongo (SEQ ID NO: 157) e de macaco cinomolgo (cino) (SEQ ID NO: 2) PSMA. Os resíduos do epítopo são sombreados e a divergência das sequências é mostrada em sublinhado.

[0108] A Figura 29 mostra os resíduos de parátopo de PSMB83 (também conhecido como "PSMMB84"). As CDRs são sublinhadas e os resíduos de parátopo são sombreados. A figura descreve as SEQ ID NOS 158 e 159, respectivamente, em ordem de aparição.

[0109] A Figura 30 mostra um mapa da interação com os contatos diretos feitos entre PSMA e PSMB83 (também conhecido como "PSMMB84"). As interações de van der Waals são mostradas como |i- nhas tracejadas e as ligações de hidrogênio como linhas contínuas com setas apontando para os átomos da cadeia principal.

[0110] A Figura 31 mostra os níveis de expressão de clones de Fab anti-PSMA derivados de PSMB83 em comparação com a expres- são de PSMB83 parental. Os números brutos de luminescência foram plotados contra a concentração em log.

[0111] A Figura 32 mostra a ligação ao PSMA humano de clones de Fab anti-PSMA derivados de PSMB83 em comparação com a liga- ção ao PSMBB83 parental. Os números brutos de luminescência foram plotados contra a concentração em log.

[0112] A Figura 33 mostra ligação ao PSMA de macaco cinomolgo de clones de Fab anti-PSMA derivados de PSMB83 em comparação com a ligação de PSMB83 parental. Os números brutos de lumines- cência foram plotados contra a concentração em log.

[0113] A Figura 34 mostra a ligação ao PSMA humano de clones de Fab anti-PSMA derivados de PSMB83 em comparação com a liga- ção de PSMBB83 parental. Os números brutos de luminescência foram normalizados por níveis de expressão de Fab.

[0114] A Figura 35 mostra a ligação ao PSMA de cino de clones de Fab anti-PSMA derivados de PSMB83 em comparação com a liga- ção de PSMBB83 parental. Os números brutos de luminescência foram normalizados por níveis de expressão de Fab.

[0115] A Figura 36 mostra a ligação de células LNCAP de um sub- conjunto de anticorpos biespecíficos PSMAxCD3 maturados por afini- dade.

[0116] A Figura 37 mostra a ligação de células LNCAP de um sub- conjunto de anticorpos biespecíficos PSMAxCD3 maturados por afini- dade.

[0117] A Figura 38 mostra os resultados de ligação de células PC3 PSMA-negativa de anticorpos biespecíficos PSMA e CD3 maturados por afinidade.

[0118] A Figura 39 mostra os resultados de anticorpos biespeciífi- cos PSMA x CD3 maturados por afinidade em um ensaio de morte de células funcionais.

[0119] A Figura 40 mostra a eficácia antitumoral de PS3B79 em xenoenxertos de próstata humano LnCAP AR.TB em células T de ca- mundongos NSG humanizados. Os tumores subcutâneos LnCAP

AR.TB foram medidos duas vezes por semana e os resultados apre- sentados como a média do volume tumoral, expresso em mm? + EPM (*, p<0,0001).

[0120] A Figura 41 mostra a eficácia antitumoral de PS3B90 em xenoenxertos de próstata humano LnCAP AR.TB em células T de ca- mundongos NSG humanizados. Os tumores subcutâneos LnCAP AR.TB foram medidos duas vezes por semana e os resultados apre- sentados como a média do volume tumoral, expresso em mm? + EPM (*, p<0,001).

[0121] A Figura 42 mostra o efeito de PS3B72 (PSMA x CD3) no modelo de tumor de próstata estabelecido de xenoenxerto derivado de paciente LuCaP 86.2 em células T camundongos NSG humanizados. Os tumores subcutâneos LuCaP 86.2 foram medidos duas vezes por semana e os resultados apresentados como a média do volume tumo- ral, expresso em mm? + EPM (*, p<0,0001).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0122] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, patentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão no presente documento incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.

[0123] Deve-se entender que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de apenas descrever modalidades particula- res e não pretende ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence.

[0124] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles no presente documento descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos no presente documento materiais e métodos exemplificadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usa- da.

[0125] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "um", "o" e "a" incluem refe- rências no plural a menos que o teor claramente determine de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células, e similares.

[0126] "Ligação específica" ou "que se liga especificamente" ou "liga-se", se refere a um anticorpo que se liga a um antígeno ou a um epítopo dentro do antígeno com maior afinidade que a outros antíge- nos. Tipicamente, o anticorpo se liga ao antígeno ou ao epítopo no an- tígeno com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de cerca de 5x108 M ou menos, por exemplo cerca de 1x10º M ou menos, cer- ca de 1x10-*º M ou menos, cerca de 1x10* M ou menos, ou cerca de 1x102 M ou menos, tipicamente com a Kp que é ao menos dez vezes menor que sua Kp para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). A constante de dissociação pode ser medida com o uso de procedimentos-padrão. Anticorpos que se ligam especi- ficamente ao antígeno ou epítopo no antígeno podem, no entanto, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogas), como humanos ou macacos, por exemplo Macaca fascicularis (cino- molgo, cino) ou Pan troglodytes (chimpanzé). Enquanto um anticorpo monoespecífico se liga especificamente a um antígeno ou a um epíto- po, um anticorpo biespecífico se liga especificamente a dois antígenos diferentes ou dois epítopos distintos.

[0127] "Anticorpos" significa em um sentido amplo e inclui molécu- las de imunoglobulina que incluem anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais de murinos, humanos, humanizados e quimé- ricos, fragmentos de anticorpos, anticorpos biespecíficos ou multies-

pecíficos, anticorpos diméricos, tetraméricos ou multiméricos, anticor- pos de cadeia única, anticorpos de domínio e qualquer outra configu- ração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação a antígeno da especificidade requerida. As "moléculas de anticorpo completo" são compreendidas de duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC) interconectadas por ligações de dissul- feto, bem como por multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pe- sada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (compreendida dos domínios CH1, dobradiça CH2 e CH3). Cada cadeia leve é com- preendida de uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de- terminantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões de framework (ou de arcabouço) (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro segmentos de FR, dispostos do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR?2, FR3, CDR3 e FRA.

[0128] "Regiões determinantes de complementaridade (CDR)" são "sítios de ligação ao antígeno" em um anticorpo. As CDRs podem ser definidas com o uso de vários termos: (i) Regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três na VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) se baseiam na variabilidade da sequência (Wu e Kabat, (1970) J Exp Med 132:211-50; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regi- ões hipervariáveis", "HVR", ou "HV", três na VH (H1, H2, H3) e três naVL (L1, L2, L3) se referem às regiões dos domínios variáveis de an- ticorpos que têm estrutura hipervariável, conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia e Lesk, (1987) Mol Biol 196:901-17). O banco de da-

dos da International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www imgt org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas de sítios de ligação ao antígeno. A correspondência entre as delineações de CDRs, HVs e IMGT é descrita em Lefranc et a/., (2003) Dev Comparat Immunol 27:55-77. Os termos "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" e "LCDR3", conforme utilizados no presente do- cumento, incluem as CDRs definidas por qualquer um dentre os méto- dos descritos acima, Kabat, Chothia ou IMGT, a menos que explicita- mente indicado de outro modo no relatório descritivo.

[0129] As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequên- cia de aminoácidos de domínio constante da cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distin- tos, a saber, kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0130] Os termos "fragmentos de anticorpo" ou "fragmentos de ligação ao antígeno" se referem a uma porção de uma molécula de imunoglobulina que retém o sítio de ligação do antígeno da cadeia pe- sada e/ou cadeia leve, como regiões determinantes de complementa- ridade da cadeia pesada (HCDR) 1, 2 e 3, regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1, 2 e 3, uma região variá- vel da cadeia pesada (VH) ou uma região variável da cadeia leve (VL). Os fragmentos de anticorpo ou de ligação ao anticorpo incluem Fabs bem conhecidos Fab, como fragmentos F(ab')2, Fd e Fv, assim como anticorpos de domínio (dAb) consistindo em um domínio VH. Os domí- nios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domí- nios VH/VL podem emparelhar de forma intramolecular ou intermole-

cular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos separados de anticorpo de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno monovalente, como a cadeia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, nas publicações de patente internacionais nºs WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 e WO1992/01047.

[0131] "Anticorpo monoclional" se refere a uma população de anti- corpos com uma única composição de aminoácidos em cada cadeia pesada e cada cadeia leve, exceto por possíveis alterações bem co- nhecidas como remoção de lisina C-terminal da cadeia pesada do an- ticorpo. Os anticorpos monoclonais se ligam tipicamente a um epítopo antigênico, exceto os anticorpos monoclonais biespecíficos que se |i- gam a dois epítopos antigênicos distintos. Os anticorpos monoclionais podem ter glicosilação heterogênea dentro da população de anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser monoespecífico ou multiespecífico, ou monovalente, bivalente ou multivalente. Um anticorpo biespecífico é incluído no termo anticorpo monoclonal.

[0132] O termo "anticorpo isolado" se refere a um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que é substancialmente isento de outros anti- corpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a PSMA é substancial- mente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes do PSMA). No caso de anticorpos biespecíficos para PSMA X CD3, o anticorpo biespecífico se liga especificamente tanto ao PSMA como ao CD3, e é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de PSMA e CD3. O termo "anticorpo isolado" abrange anticorpos que são isolados para uma pureza maior, como anticorpos que são 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% puros.

[0133] "Anticorpos humanizados" se refere a anticorpos em que os sítios de ligação ao antígeno são derivados de espécies não humanas, e os arcabouços de região variável são derivados das sequências da imunoglobulina humana. Os anticorpos humanizados podem incluir substituições na estrutura de modo que a estrutura pode não ser uma cópia exata da imunoglobulina humana expressa ou das sequências gênicas da linhagem germinativa de imunoglobulina humana.

[0134] O termo "anticorpo humano" se refere a um anticorpo tendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve nas quais tanto a estrutura quanto as regiões de sítio de ligação ao antígeno são derivadas das sequências de origem humana. Se o anticorpo tiver uma região cons- tante ou uma porção da região constante, a região constante também é derivada dessas sequências de origem humana.

[0135] O anticorpo humano compreende regiões variáveis da ca- deia pesada ou leve que são "derivadas de" sequências de origem humana se as regiões variáveis do anticorpo são obtidas de um siste- ma que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa huma- na ou da imunoglobulina com rearranjo. Esses sistemas exemplificado- res são bibliotecas de genes de imunoglobulina humana, expostas em fago, e animais transgênicos não humanos, como camundongos ou ratos, carregando loci de imunoglobulina humana, conforme no pre- sente documento descrito. Um "anticorpo humano" pode conter dife- renças de aminoácidos quando comparado aos genes de imunoglobu- lina de linhagem germinativa humana ou de imunoglobulina com rear- ranjo devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natu- ral ou introdução intencional de substituições na estrutura ou nos sítios de ligação a antígeno, ou ambos. Tipicamente, "anticorpo humano" são ao menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos à sequência de aminoácidos com a sequência de ami-

noácidos codificada por genes de imunoglobulina de linhagem germi- nativa humana ou genes de imunoglobulina rearranjados. Em alguns casos, o "anticorpo humano" pode conter sequências de consenso do arcabouço derivadas da análise da sequência do arcabouço humano, por exemplo, como descrito em Knappik et a/., (2000) J Mol Biol 296:57-86, HCDR3 sintético incorporado a bibliotecas de gene da imu- noglobulina humana expresso em fago, por exemplo, como descrito em Shiet a/l., (2010) J Mol Biol 397:385-96, e na publicação de patente internacional nº WO2009/085462.

[0136] Os anticorpos humanos derivados de sequências de imu- noglobulina humana podem ser gerados com o uso de sistemas como apresentação em fago, incorporando CDRs sintéticas e/ou estruturas sintéticas, ou podem ser submetidos à mutagênese in vitro para me- lhorar as propriedades do anticorpo, resultando em anticorpos que não são expressos pelo repertório de linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

[0137] Anticorpos nos quais os sítios de ligação ao antígeno são derivados de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anticorpo humano".

[0138] "Recombinante" se refere ao DNA, anticorpos e outras pro- teínas que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes quando segmentos de diferentes fontes são unidos pa- ra produzir DNA, anticorpos ou proteínas recombinantes.

[0139] "Epítopo" se refere a uma porção de um antígeno a qual um anticorpo se liga especificamente. Os epítopos tipicamente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos (como polares, não polares ou hidrofóbicos) de porções como aminoácidos ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tri- dimensionais específicas, e também características de carga específi- cas. Um epítopo pode ser composto por aminoácidos contíguos ou descontíguos que formam uma unidade espacial conformacional. Para um epítopo não contíguo, aminoácidos de porções diferentes da se- quência linear do antígeno ficam em estreita proximidade no espaço tridimensional por meio do enovelamento da molécula de proteína. O "epítopo" do anticorpo depende da metodologia usada para identificar o epítopo.

[0140] O termo "parátopo" se refere a uma porção de um anticorpo à qual um antígeno se liga especificamente. Um parátopo pode ser linear em natureza ou pode ser descontínuo, formado por uma relação espacial entre aminoácidos não contíguos de um anticorpo em vez de uma série linear de aminoácidos. Um "parátopo de cadeia leve" e um "parátopo de cadeia pesada" ou "resíduos de aminoácidos do parátopo de cadeia leve" e "resíduos de aminoácidos do parátopo de cadeia pe- sada" referem-se a resíduos de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo em contato com um antígeno, respectivamente, ou em geral, "resíduos do parátopo de um anticorpo" se refere aos aminoácidos do anticorpo que estão em contato com o antígeno.

[0141] "Biespecífico" se refere a um anticorpo que se liga especifi- camente a dois antígenos distintos ou a dois epítopos distintos dentro do mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cru- zada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como humanos ou maca- cos, por exemplo, Macaca fascicularis (cinomolgo, cino) ou Pan troglo- dytes, ou pode se ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.

[0142] O termo "multiespecífico" se refere a um anticorpo que se liga especificamente a dois ou mais antígenos distintos ou a dois ou mais epítopos distintos no mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos),

como humanos ou macacos, por exemplo, Macaca fascicularis (cino- molgo, cino) ou Pan troglodyte, ou pode se ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.

[0143] "Variante" se refere a um polipeptídeo ou um polinucleotí- deo que difere de um polipeptídeo de referência ou de um polinucleo- tídeo de referência por uma ou mais modificações, por exemplo, uma ou mais substituições, inserções ou deleções.

[0144] "Vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser duplicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido entre tais sis- temas. Polinucleotídeos de vetores contêm tipicamente elementos, como origens de replicação, sinal de poliadenilação ou marcadores de seleção que funcionam para facilitar a duplicação ou a manutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico, como uma célula, vírus, animal, planta e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotí- deo de vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido dos mesmos, de filamento único ou de filamento duplo.

[0145] "Vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utili- zado em um sistema biológico ou em um sistema biológico reconstituí- do para direcionar a tradução de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo presente no vetor de expressão.

[0146] O termo "polinucleotídeo" se refere a uma molécula que compreende uma cadeia de nucleotídeos ligados covalentemente por uma cadeia principal de açúcar-fosfato ou outra ligação química cova- lente equivalente. DNA e RNA de cadeia dupla e cadeia simples são exemplos típicos de polinucleotídeos.

[0147] "Polipeptídeo" ou "proteína" se refere a uma molécula que compreende ao menos dois resíduos de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica para formar um polipeptídeo. Pequenos polipeptí- deos com menos de 50 aminoácidos podem ser chamados de "peptí-

deos".

[0148] A "citometria de fluxo" é uma tecnologia que é usada para analisar as características físicas e químicas de partículas em um flui- do conforme ele passa através de ao menos um laser. Componentes celulares são marcados fluorescentemente e então excitados com o laser para emitir luz em diferentes comprimentos de onda (Adan, et al., Critical Reviews in Biotechnology (2016) 1549-7801).

[0149] Um anticorpo anti-idiotípico (anti-ld) é um anticorpo que re- conhece os determinantes antigênicos (por exemplo, o parátopo ou as CDRs) do anticorpo. É de conhecimento geral na técnica o processo de produção ou preparação de um anticorpo anti-idiotípico. (Lathey, J. et al. Immunology 1986 57(1):29-35). O anticorpo anti-ld pode ser blo- queador ou não bloqueador de antígeno. O anticorpo anti-ld de blo- queio do antígeno pode ser usado para detectar o anticorpo livre em uma amostra (por exemplo, anticorpo anti-PSMA, anti-CD3 ou o anti- corpo biespecífico para PSMACD3 da invenção no presente documen- to descrito). O anticorpo anti-ld de não bloqueio pode ser usado para detectar o anticorpo total (livre, parcialmente ligado ao antígeno, ou totalmente ligado ao antígeno) em uma amostra. Um anticorpo anti-ld pode ser preparado por imunização de um animal com um anticorpo ao qual um anticorpo anti-ld está sendo preparado. Em algumas mo- dalidades no presente documento descritas, o anticorpo anti-idiotípico é usado para detectar o nível dos anticorpos terapêuticos (por exem- plo, anticorpos anti-PSMA, anti-CD3 ou os anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3 da invenção no presente documento descritos) em uma amostra.

[0150] Um anticorpo anti-ld pode também ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imunológica em ainda um ou- tro animal, produzindo um chamado anticorpo anti-anti-ld. Um anti- anti-ld pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original que induziu o anticorpo anti-ld. Dessa forma, por meio do uso dos anticorpos para os determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clo- nes idênticos que expressam anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-ld podem ser variados (produzindo, deste modo, vari- antes de anticorpo anti-ld) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, como aquelas descritas em outro lugar na presente inven- ção com relação aos anticorpos que se ligam especificamente a PSMA ou CD3 ou os anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3.

[0151] O PSMA se refere a antígeno de membrana específico da próstata. A sequência de aminoácidos do PSMA de Pan troglodytes (também chamado de chimpanzé) PSMA é mostrada na SEQ ID NO:

1. O domínio extracelular abrange os resíduos 44 a 750, o domínio transmembranar abrange os resíduos 20 a 43, e o domínio citoplasmá- tico abrange os resíduos 1 a 19 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos do PSMA de Macaca fascicularis (também chamado de macaco cinomolgo, macaca ou cino) é mostrada na SEQ ID NO: 2; O domínio extracelular abrange os resíduos 44 a 750, o domínio trans- membranar abrange os resíduos 20 a 43, e o domínio citoplasmático abrange os resíduos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2; A sequência de amino- ácidos do PSMA humano é mostrada na SEQ ID NO: 3; O domínio ex- tracelular abrange os resíduos 44 a 750, o domínio transmembranar abrange os resíduos 20 a 43, e o domínio citoplasmático abrange os resíduos 1 a 19 da SEQ ID NO: 3.

[0152] CD3 se refere ao receptor de antígeno de células T. Ao longo do relatório descritivo, "específico de CD3" se refere a anticorpos que se ligam especificamente ao complexo de receptor de célula T. Mais especificamente, os anticorpos se ligam ao polipeptídeo de CD3- épsilon, que juntamente com CD3-gama, CD3-delta e CD3-zeta, e os heterodímeros alfa/beta e gama/delta do receptor de célula T, forma o complexo CD3-receptor de células de T. Esse complexo desempenha um papel importante no acoplamento do reconhecimento do antígeno a várias rotas intracelulares de transdução de sinal. O complexo CD3 medeia a transdução de sinal, resultando na ativação e proliferação de células T. O CD3 é necessário para a resposta imune.

[0153] "Em combinação com" significa que duas ou mais terapias são administradas a um indivíduo juntas em uma mistura, simultanea- mente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.

[0154] Os termos "superexpressar", "superexpresso" e "superex- pressão" se referem de forma intercambiável a uma amostra, como uma célula cancerosa, célula maligna ou tecido canceroso, que tem níveis mensuravelmente mais altos de PSMA, quando comparada a uma amostra de referência. A superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por transcrição ou tradução aumentada. A expressão e a superexpressão da proteína na amostra podem ser me- didas usando-se ensaios bem conhecidos, por exemplo, ELISA, imu- nofluorescência, citometria de fluxo ou radioimunoensaio em células vivas ou lisadas. A expressão e a superexpressão de um polinucleotí- deo na amostra podem ser medidas, por exemplo, com o uso de hibri- dização in situ fluorescente, Southern blotting, ou técnicas de PCR. Uma proteína ou um polinucleotídeo é superexpresso quando o nível da proteína ou do polinucleotídeo na amostra é ao menos 1,5 vezes maior quando comparado com o nível na amostra de referência. A se- leção da amostra de referência é bem conhecida.

[0155] "Amostra" se refere a uma coleção de fluidos, células ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células ou tecidos presentes em um indivíduo. Amostras exemplificadoras são fluidos biológicos como sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfa, urina, saliva, fluido cístico, lágrimas, fezes, escarro, secreções muco- sas dos tecidos e órgãos secretórios, secreções vaginais, líquidos de ascite, como os associados com tumores não sólidos, fluidos das cavi- dades pleurais, pericárdicas, peritoneais, abdominais e outras, fluidos coletados por lavagem brônquica, soluções líquidas em contato com um indivíduo ou fonte biológica, por exemplo, meio de cultura de célu- las e órgãos, incluindo meio condicionado para células ou órgãos, lí- quidos de lavagem e semelhantes, biópsias de tecidos, aspirações por agulha fina ou tecido tumoral ressecado cirurgicamente.

[0156] Uma "célula de câncer" ou uma "célula tumoral" como usa- do no presente documento se refere a uma célula cancerosa, pré- cancerosa ou transformada, in vivo, ex vivo, e em cultura de tecidos, que tem alterações fenotípicas induzidas ou espontâneas. Essas alte- rações não envolvem necessariamente a absorção de novo material genético. Embora a transformação possa provir de infecção com um vírus transformante e incorporação de novo ácido nucleico genômico, ou absorção de ácido nucleico exógeno, ela também pode ocorrer es- pontaneamente ou após exposição a um carcinógeno, mutando assim um gene endógeno. A transformação/o câncer é exemplificada (exem- plificado) por alterações morfológicas, imortalização de células, contro- le de crescimento aberrante, formação de focos, proliferação, maligni- dade, modulação dos teores de marcadores específicos para tumores, invasividade, crescimento tumoral em hospedeiros animais adequados como camundongos nus, e semelhantes, in vitro, in vivo, e ex vivo (Freshney, Culture of animal Cells: A Manual of Basic Technique" (3º ed. 1994)). Exceto onde especificado de outra forma, quaisquer valo- res numéricos, como uma concentração ou uma faixa de concentração no presente documento descrita, deve ser entendido como sendo mo- dificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipicamente inclui + 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,4 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v)

inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possí- veis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, inclu- indo números inteiros dentro dessas faixas, e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0157] "Antígenos efetores" são antígenos de células do sistema imune que podem estimular ou desencadear citotoxicidade, fagocitose, apresentação de antígeno, liberação de citoquina. Tais antígenos efe- tores são, por exemplo, mas não se limitam a, células T e células natu- ral killer (NK). Exemplos de especificidades adequadas de antígenos efetores incluem, mas não se limitam a, CD3 ou subunidades de CD3, como CD3e para células T e CD16 para células NK. Tais moléculas de superfície celular de células efetoras são adequadas para mediar a morte celular. As células efetoras são células do sistema imune que podem estimular ou desencadear citotoxicidade, fagocitose, apresen- tação de antígeno, liberação de citoquina. Tais células efetoras são, por exemplo, mas não se limitam a, células T, células natural killer (NK), granulócitos, monócitos, macrófagos, células dendríticas e célu- las apresentadoras de antígeno. Exemplos de especificidades ade- quadas para células efetoras incluem, mas não se limitam a, as subu- nidades CD2, CD3 e CD3 como CD3e, CD5, CD28 e outros compo- nentes do receptor de células T (TCR) para células T; CD16, CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336, (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C e NKG2D, DNAM, NCRs para células NK; CD18, CD64 e CD89 para granulócitos; CD18, CD32, CD64, CD89 e receptor de manose para monócitos e macrófagos; CD64 e receptor de manose para células dendríticas; bem como CD35. Em certas modalidades da invenção, aquelas especificidades, isto é, moléculas da superfície celular, das células efetoras são ade- quadas para mediar a morte celular mediante ligação de moléculas biespecíficas ou multiespecíficas a tal molécula de superfície celular e, desse modo, induzir a citólise ou apoptose.

[0158] "Anticorpo biespecífico para PSMA/CD3", "anticorpo para PSMA/CD3", "anticorpo anticPSMA/CD3" ou "anticorpo anti- PSMA/CD3" se refere a uma molécula que compreende ao menos um domínio de ligação que se especificamente a PSMA e ao menos um domínio de ligação que se liga especificamente a CD3. Os domínios que se ligam especificamente a PSMA e CD3 são, tipicamente, pares VH/VL. O anticorpo biespecífico anti-c-PSMA/CD3 pode ser monovalen- te em termos de sua ligação a PSMA ou CD3.

[0159] "Valente (que tem valência(s))" se refere a um número es- pecífico de sítios de ligação para um antígeno em uma molécula. Co- mo tais, os termos "monovalente", "bivalente", "tetravalente", e "hexa- valente" referem-se à presença de um, dois, quatro e seis sítios de li- gação, respectivamente, específicos para um antígeno em uma molé- cula. "Multivalente" se refere à presença de dois ou mais sítios de liga- ção específicos para um antígeno em uma molécula.

[0160] "Uma célula T CD4* ou CD8* antígeno-específica" se refere a uma célula T CD4* ou CD8* ativada por um antígeno específico, ou epítopo imunoestimulatório do mesmo.

[0161] "Indivíduo" inclui qualquer ser humano ou animal não- humano. "Animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exem- plo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ove- Ilhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. Exce- to onde observado, os termos "paciente" ou "indivíduo" são usados de maneira intercambiável.

[0162] A numeração dos resíduos de aminoácidos na região cons- tante de anticorpo ao longo do relatório descritivo está de acordo com o Índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Insti-

tutes of Health, Bethesda, MD. (1991), salvo indicação explicitamente em contrário.

[0163] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras con- vencionais são usados na presente invenção conforme mostrado na Tabela 1.

Tabela 1.

me eo RR span fr No seo fe po gema e a ssa fe ear fe para Ro E Composições de matéria

[0164] A presente invenção fornece anticorpos e fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a PSMA e anticorpos multies- pecíficos que se ligam especificamente ao PSMA e CD3 e fragmentos dos mesmos. A presente invenção fornece polipeptídeos e polinucleo- tídeos que codificam os anticorpos da invenção ou ácidos nucleicos complementares dos mesmos, vetores, células hospedeiras e métodos de produzir e usar os mesmos.

[0165] Os anticorpos e fragmentos dos mesmos que se ligam ao PSMA se ligam ao antígeno alvo de chimpanzé. Em uma modalidade, os anticorpos e fragmentos dos mesmos se ligam aos antígenos-alvo de PSMA humano e de macaco com afinidades dentro de 5 vezes um do outro. Em outras palavras, a diferença na ligação do anticorpo é menor que um múltiplo de 5. Nesse caso, a molécula de anticorpo idêntica pode ser usada tanto para avaliação pré-clínica da segurança, atividade e/ou perfil farmacocinético de PSMA em primatas como em seres humanos. Em outras palavras, a mesma molécula específica para PSMA pode ser usada nos estudos pré-clínicos em animais bem com em estudo clínicos em humanos. Isto leva a resultados altamente comparáveis e um poder preditivo muito maior dos estudos de animais em comparação com moléculas substitutas específicas para a espécie. Uma vez que o domínio de PSMA é específico entre espécies, isto é, reativo com os antígenos humano e de macaca, o anticorpo ou seus fragmentos da invenção podem ser, ambos, usados para avaliação pré-clínica do perfil de segurança, atividade e/ou farmacocinético des- ses domínios de ligação em primatas e, na forma idêntica, como fár- macos em humanos.

[0166] A presente invenção também fornece anticorpos multiespe- cíficos que se ligam especificamente ao PSMA. De acordo com a in- venção, um anticorpo biespecífico, isto é, bifuncional, pode ser usado para engajar dois alvos terapêuticos diferentes ou realizar duas fun- ções distintas. Tais anticorpos podem ser usados, por exemplo, para recrutar uma célula efetora imune, por exemplo célula T ou célula NK, direcionada a uma célula-alvo específica. Várias moléculas à base de fragmento de anticorpo são conhecidas e estão sob investigação, por exemplo, para terapia de câncer. Um anticorpo multiespecífico da in- venção pode ser um anticorpo triespecífico para direcionamento duplo de células tumorais - esses são estruturas trifuncionais que podem ser projetados para direcionar dois alvos/epítopos diferentes na célula tu- moral com a terceira funcionalidade se ligando com alta afinidade a células T ou a células NK. Anticorpos triespecíficos que direcionam dois epítopos tumorais distintos e acoplam a lise de células T ou células NK de células tumorais que expressam ambos os alvos. Tais moléculas po- dem ser geradas pelos formatos de anticorpos conhecidos na técnica e são completamente descritos. (WO20151842071, WO2015158636, WOZ2010136172, WO2013174873). Em uma modalidade de anticorpo triespecífico modalidade da invenção, o anticorpo multiespecífico pode ser específico para PSMA e um segundo antígeno distinto na mesma ou em uma outra célula tumoral e adicionalmente, específico para uma célula efetora, particularmente uma célula T ou uma célula NK.

[0167] A presente invenção também fornece um anticorpo especí- fico para PSMA X "antígeno efetor". Em uma modalidade, o antígeno efetor do anticorpo biespecífico para PSMA X "antígeno efetor" é CD3. Foi descoberto na presente invenção que é possível gerar um anticor- po biespecífico para PSMA X CD3 em que a molécula idêntica pode ser usada em ensaios pré-clínicos em animais, bem como em estudos clínicos e mesmo em terapia em humanos. Isto é devido à identifica- ção do anticorpo biespecífico PSMA X CD3, que, além de se ligar ao PSMA humano e ao CD3 humano, respectivamente, também se liga aos homólogos de antígenos de chimpanzé e macacos. O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da invenção pode ser usado como um agente terapêutico contra várias doenças, incluindo, mas não se limi- tando, câncer. Em vista do exposto acima, a necessidade de se cons- truir um anticorpo biespecífico PSMA X CD3 alvo substituto para tes-

tagem em uma espécie filogeneticamente distante (de humano) desa- parece.

Como resultado, a molécula idêntica pode ser usada em testes pré-clínicos em animais bem como se destina a ser administrada a se- res humanos em testes clínicos após a aprovação do mercado e a administração do fármaco terapêutico.

A capacidade de se usar a mesma molécula para testes pré-clínicos em animais bem como para a administração posterior em seres humanos, elimina, ou pelo menos reduz significativamente, o risco de que os dados obtidos em ensaios pré-clínicos em animais apresentariam limitada aplicabilidade ao caso humano.

Em suma, a obtenção de dados de segurança pré-clínicos em animais com o uso da mesma molécula que será administrada a humanos ajuda a garantir a aplicabilidade dos dados em um cenário relevante para humano.

Em contraste, em abordagens convencionais que usam moléculas substitutas, as ditas moléculas substitutas preci- sam ser molecularmente adaptadas ao sistema de teste animal usado para avaliação de segurança pré-clínica.

Dessa forma, a molécula pa- ra ser usada em terapia humana de fato difere na sequência e também provavelmente na estrutura a partir da molécula substituta usada em testes pré-clínicos em parâmetros farmacocinéticos e/ou atividade bio- lógica, com a consequência de que os dados obtidos em ensaios pré- clínicos em animais têm aplicabilidade/transferabilidade limitada ao caso humano.

O uso de moléculas substituta exige a construção, pro- dução, purificação e caracterização de um construto completamente novo.

Isto leva a necessidade de custos de desenvolvimento e tempo adicionais de obtenção daquela molécula.

Em suma, os substitutos precisam ser desenvolvidos separadamente além do próprio fármaco a ser usado em terapia humana, de modo que duas linhas de desenvol- vimento para duas moléculas precisam ser executadas.

Portanto, uma vantagem principal do anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da inven- ção que apresenta a especificidade entre espécies no presente docu-

mento descrita é que a molécula idêntica pode ser usada para agentes terapêuticos em seres humanos e em testes pré-clínicos em animais.

[0168] Uma outra vantagem principal do anticorpo e anticorpo mul- tiespecífico da invenção é sua aplicabilidade para o teste pré-clínico em vários primatas. O comportamento de um candidato a fármaco em animais deve ser idealmente indicativo do comportamento esperado deste candidato a fármaco após administração a seres humanos. Co- mo resultado, os dados obtidos a partir de tais testes pré-clínicos de- verão, portanto, geralmente ter um poder altamente preditivo para o caso humano. No entanto, conforme aprendido do trágico resultado da recente fase | do teste clínico em TGN1412 (um anticorpo monocional CD28), um candidato a fármaco pode agir de maneira diferente em uma espécie de primata do que em seres humanos: Enquanto que em testes pré-clínicos do dito anticorpo, nenhum ou apenas limitados efei- tos adversos foram observados em estudos animais realizados com macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desenvolveram falência múltipla de órgãos após a administração do dito anticorpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Os resultados destes eventos dramáticos negativos, não desejados sugerem que pode não ser suficiente limitar o teste pré- clínico a apenas uma espécie (primata não chimpanzé). O fato de o anticorpo e o anticorpo multiespecífico descrito se ligar especificamen- te ao PSMA de chimpanzé e macaco cinomolgo pode ajudar a sobre- pujar os problemas enfrentados no caso mencionado acima. Conse- quentemente, a presente invenção fornece meios e métodos para mi- nimizar diferenças em efeitos entre espécies quando fármacos para terapia humana estão sendo desenvolvidos e testados.

[0169] Com o anticorpo e o anticorpo multiespecífico da invenção também já não necessário adaptar o teste animal para o candidato a fármaco destinado para administração a seres humanos, como por exemplo a criação de animais transgênicos. A especificidade entre es-

pécies do anticorpo ou anticorpo multiespecífico para o PSMA da in- venção permite que o anticorpo seja diretamente usado em testes pré- clínicos em primatas não chimpanzés, sem qualquer manipulação ge- nética dos animais. Conforme é bem conhecido pelos versados na técnica, as abordagens nas quais o teste animal é adaptado ao fárma- co candidato sempre sofrem o risco de que os resultados obtidos nos ensaios de segurança pré-clínicos sejam menos representativos e preditivos para seres humanos devido à modificação do animal. Por exemplo, em animais transgênicos, as proteínas codificadas pelos transgenes são, muitas vezes, altamente superexpressas. Dessa for- ma, os dados obtidos para a atividade biológica de um anticorpo con- tra esse antígeno de proteína podem ser limitados em seu valor predi- tivo para seres humanos nos quais a proteína é expressa em níveis fisiológicos muito mais baixos.

[0170] Uma vantagem adicional dos usos do anticorpo da inven- ção que apresentam especificidade entre espécies é o fato de que se evita que o chimpanzé, uma espécie em risco de extinção, seja usado para testes animais. Os chimpanzés são os animais mais próximos em relação aos seres humanos e foram recentemente agrupados na famí- lia de hominídeos com base nos dados de sequenciamento de geno- ma (Wildman et a/., PNAS 100 (2003), 7181). Portanto, os dados obti- dos com chimpanzés são, em geral, considerados altamente preditivos para seres humanos. Entretanto, devido a sua situação de espécies ameaçadas, o número de chimpanzés que pode ser usado para expe- rimentos médicos é altamente restrito. Conforme estabelecido anteri- ormente, a manutenção de chimpanzés para experimentação animal é, portanto, custosa tanto quanto eticamente problemática. Os usos do anticorpo da invenção evitam as objeções éticas e sobrecargas finan- ceiras durante o teste pré- clínico sem prejudicar a qualidade, isto é, a aplicabilidade, dos dados do teste animal obtidos. À luz disto, os usos do anticorpo ou anticorpo multiespecífico que se liga especificamente ao PSMA da invenção fornecem uma alternativa razoável para estudos em chimpanzés.

[0171] Ainda uma outra vantagem do anticorpo ou anticorpo multi- específico que se liga especificamente ao PSMA da invenção é a ca- pacidade de extrair múltiplas amostras de sangue ao usá-las como parte do teste pré-clínico animal, por exemplo, durante os estudos animais farmacocinéticos. As múltiplas extrações de sangue podem ser mais rapidamente obtidas com um primata não chimpanzé do que com animais menores, por exemplo, um camundongo. A extração de múltiplas amostras de sangue permite teste contínuo de parâmetros sanguíneos para a determinação dos efeitos biológicos induzidos pelo anticorpo ou anticorpo multiespecífico que se liga especificamente ao PSMA da invenção. Além disso, a extração de múltiplos amostras de sangue permite que o pesquisador avalie o perfil o perfil farmacocinéti- co do anticorpo ou anticorpo multiespecífico que se liga especifica- mente ao PSMA da invenção conforme no presente documento defini- do. Além disso, efeitos colaterais potenciais, que podem ser induzidos pelo dito anticorpo ou anticorpo multiespecífico que se liga especifica- mente ao PSMA da invenção refletidos nos parâmetros sanguíneos podem ser medidos em diferentes amostras de sangue extraídas du- rante o curso da administração do dito anticorpo.

[0172] Isso permite a determinação do perfil de toxicidade poten- cial do anticorpo ou anticorpo multiespecífico que se liga ao PSMA da invenção, conforme no presente documento definido.

[0173] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo isolado ou seu fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao PSMA tem uma, duas, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades:

a) se liga ao ECD de PSMA de Pan trogolodyte com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 25 nM ou menos, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema ProteOn XPR36 a +25ºC, b) se liga a células LNCaP com uma ECrso calculada de 20 NM ou menos e se liga a células HEK que expressam PSMA de Maca- ca fascicularis com uma ECrso calculada de 40 nM ou menor, sendo que a diferença na ECs5o calculada entre a ligação a células LNCaP e a ligação a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis é menor que 5 vezes, e sendo que a ECso calculada é medida em um ensaio de ligação de células inteiras a O ºC com o uso de citometria de fluxo, c) se liga ao ECD de PSMA recombinante humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de 12 nM ou menos, sendo que a Kp é medida com o uso do ensaio de resso- nância de plásmon de superfície ProteOn, sistema ProteOn XPR36 a +25ºC; d) apresenta morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK que expressam PSMA humano ou células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis, quando emparelhado em um anticorpo biespecífico com o anticorpo anti-CD3, CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou pelo ensaio de ativação de caspase 3/7, ou e) reconhece um epítopo conformacional, sendo que o epí- topo compreende os resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307, e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO:3).

[0174] Exemplos de tais anticorpos ou fragmentos dos mesmos são os anticorpos para PSMA PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128,

PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, e PSMB365 no presente documento descritos.

[0175] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo PSMA isolado ou fragmento de anticorpo do mesmo que se liga especificamente ao PSMA se liga ao ECD de PSMA de chimpanzé com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de cerca de 30 nM ou menos, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema XPR36 de ProteOn a +25ºC con- forme descrito no Exemplo 8. Ensaios para medir a afinidade por SPR com o uso de Proteon incluem ensaios nos quais o ensaio é realizado à temperatura ambiente (por exemplo, em ou próximo a 25ºC), sendo que o anticorpo capaz de se ligar ao ECD de PSMA de chimpanzé é capturado no chip sensor do Proteon por um anticorpo anti-Fc (por exemplo, (Jackson ImmunoResearch Laboratory, cattt109-005-098) para um nível próximo de 100 RUs, seguido de injeção do ECD de PSMA recombinante e a coleta de dados de associação e dissociação em uma taxa de fluxo de 50 uL/minuto.

[0176] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo PSMA isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao PSMA se liga a células LNCaP com uma ECso de 20 nM ou menos e se liga às células HEK que expressam PSMA de cino com uma ECso de 40 nM ou menos, sendo que a diferença da ECso calculada entre a ligação das células LNCaP e a ligação das células HEK que expres- sam PSMA de cino é menor que 5 vezes, sendo que a ligação celular é medida com o uso de FACS conforme descrito no Exemplo 7. Os ensaios para medir a ligação de células inteiras por FACS são realiza- dos a uma densidade de 200.000 células por poço durante 1 hora em gelo. A quantidade de anticorpo ligado às células inteiras é detectada com um anticorpo secundário marcado, por exemplo, com um anticor- po kKkappa-RPE anti-humano de camundongo (Life Technologies catit MH10514) por um citômetro de fluxo FACS Array.

[0177] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo isolado ou seu fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao PSMA se liga ao ECD de PSMA humano, de chimpanzé e cino com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de cerca de 12 nM ou menos, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema XPR36 de ProteOn a +25ºC conforme descrito no Exemplo 8. Ensaios para medir a afinidade por SPR com o uso de Proteon incluem ensaios nos quais o ensaio é rea- lizado à temperatura ambiente (por exemplo, em ou próximo a 25ºC), sendo que o anticorpo capaz de se ligar ao ECD de PSMA de chim- panzé é capturado no chip sensor do Proteon por um anticorpo anti-Fc (por exemplo, (Jackson ImmunoResearch Laboratory, cattt109-005- 098) para um nível próximo de 100 RUs, seguido de injeção do ECD de PSMA recombinante e a coleta de dados de associação e dissocia- ção em uma taxa de fluxo de 50 uL/minuto.

[0178] A afinidade medida de uma interação entre um anticorpo específico/PSMA pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação (por exemplo, Kp, Kia, Kdesi) São tipica- mente realizadas sob condições padronizadas e um tampão padroni- zado, como o tampão no presente documento descrito. O versado na técnica vai entender que o erro interno das medições de afinidade, por exemplo, usando Biacore 3000 ou ProteOn (medido como desvio pa-

drão, DP) pode tipicamente estar dentro de 5 a 33% para as medições dentro dos limites de detecção típicos. Portanto, o termo "cerca de" no contexto de Kp reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico para uma Kp de 1x10º M é de até +0,33x10º M.

[0179] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo isolado ou seu fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao PSMA mostra morte mediada por células T de células LNCaP que expressam PSMA humano, C42cells, células HEK que expressam PSMA humano ou cé- lulas HEK que expressam PSMA de cino, quando emparelhado em um anticorpo biespecífico com o anticorpo anti-CD3, CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida pela liberação de cromo-51 e células-alvo são cultivadas com células T ativadas em uma razão de 5:1 durante 18 a 24 horas por ensaio de ativação de caspase 3/7 como no Exemplo 6. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento de anticorpo que se liga especificamente a PSMA mostra morte mediada por células T de células LNCaP que expressam PSMA humano e células C42 com uma ECrso de cerca de 0,3 a 0,5 nM ou menos e 0,12 a 0,03 nM ou menos, respectivamente, quando empare- lhado em um anticorpo biespecífico com anticorpo anti-CD3, CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida por en- saio de ativação de caspase 3/7 como no Exemplo 9. Células-alvo que expressam PSMA são cultivadas com células T pré-ativadas na razão de 1:3 durante 18 a 24 horas e a clivagem do substrato de caspase 3/7 adicionado resulta em um corante fluorescente de DNA, com fluores- cência restrita ao núcleo das células.

[0180] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo isolado ou seu fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao PSMA reco- nhece um epítopo conformacional, sendo que o epítopo é compreen- dido dos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, 0303, K304, E307, e K324-P326 conforme determinado por cristalografia de raio X, conforme descrito no Exemplo 13.

[0181] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, HCDR?2, a HCDR3, e a HCDR3 contida em uma região variá- vel de cadeia pesada (VH) das SEQ ID NOs: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79, 160, 138, 139, ou 140, sendo que a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 são definidas por Chothia, Kabat, ou IMGT.

[0182] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo ou seus fragmen- tos que se ligam especificamente ao PSMA da invenção compreen- dem a LCDR1, a LCDR2, e a LCDR3 contidas em uma região variável de cadeia leve (VL) das SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 142, 143, ou 144, sendo que a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR são definidas por Chothia, Kabat, ou IMGT.

[0183] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1 das SEQ ID NOs: 8, 14, 20, 25, 31, 36, 46, 53 ou 122; a HCDR2 das SEQ ID NOs: 9, 15, 21, 26, 32, 37, 42, 44, 54, 123, 130, 134, 135 ou 137; e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 16, 22, 27, 33, 38, 43, 45,

48, 52, 55, 124.

[0184] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a LCDR1 das SEQ ID NOs: 11, 17, 23, 28, 34, 39, 46, 49 ou 131; a LCDR2 das SEQ ID NOs: 12, 18, 29, 40, 50 ou 133; e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 13, 19, 24, 30, 35, 41, 47, 51, 132 ou 136.

[0185] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1 das SEQ ID NOs: 8, 14, 20, 25, 31, 36, 53 ou 122; a HCDR2 das SEQ ID NOs: 9, 15, 21, 26, 32, 37, 42, 44, 54, 123, 130, 134, 135 ou 137; a HCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 16, 22, 27, 33, 38, 43, 45, 48, 51, 52, 55 ou 124; a LCDR1 das SEQ ID NOs: 11, 17, 23, 28, 34, 39, 46, 49 ou 131; a LCDR2 das SEQ ID NOs: 12, 18, 29, 40, 50 ou 133; e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 13, 19, 24, 30, 35, 41, 47, 51, 132 ou 136.

[0186] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das

SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente; SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente; SEQ ID NOs: 25, 130 e 27, respectivamente; SEQ ID NOs: 25, 134 e 27, respectivamente; SEQ ID NOs: 25, 135 e 27, respectivamente; SEQ ID NOs: 25, 137 e 27, respectivamente; SEQ ID NOs: 31, 32 e 33, respectivamente; SEQ ID NOs: 36, 37 e 38, respectivamente; SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente; SEQ ID NOs: 36, 37 e 48, respectivamente; SEQ ID NOs: 36, 37 e 52, respectivamente; SEQ ID NOs: 53, 54 e 55, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respectivamente.

[0187] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a LCDR1, a LCDR2Q e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente; SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; SEQ ID NOs: 28, 29 e 136, respectivamente; SEQ ID NOs: 28, 133 e 132, respectivamente; SEQ ID NOs: 34, 12 e 35, respectivamente; SEQ ID NOs: 39, 40 e 41, respectivamente; SEQ ID NOs: 46, 29 e 47, respectivamente;

SEQ ID NOs: 49, 50 e 51, respectivamente; SEQ ID NOs: 23, 12 e 35, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 131, 29 e 132, respectivamente.

[0188] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente.

[0189] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente.

[0190] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente.

[0191] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente.

[0192] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

[0193] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente.

[0194] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente.

[0195] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 49, 50 e 51, respectivamente.

[0196] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31,42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente.

[0197] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente.

[0198] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50 e 51, respectivamente.

[0199] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente.

[0200] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

[0201] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

[0202] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133 e 132, respectivamente.

[0203] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

[0204] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

[0205] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 136, respectivamente.

[0206] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

[0207] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

[0208] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 136, respectivamente.

[0209] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

[0210] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133 e 132, respectivamente.

[0211] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamente. Em algumas modalida- des da invenção no presente documento descritas, e em algumas mo- dalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção compreende a região variável de cadeia pesada (VH) das SEQ ID NOs: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79, 160, 138, 139, ou 140.

[0212] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende uma região variável de cadeia leve (VL) ou as SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 142, 143 ou 144.

[0213] As sequências VH, VL, HCDR e LCDR dos anticorpos exemplificadores que se ligam especificamente ao PSMA da invenção são mostradas na Tabela 2.

[0214] A Tabela 2 fornece um resumo dos exemplos de alguns an- ticorpos específicos para PSMA no presente documento descritos:

fe Ss 2 à Â ã = ã É uu O E E & z = S & > o O E r o r Q 5 = = u — O 2 n o o o oO [. O a q = " & > >= o >= E PD x O PR s o DÓ Z $ 2 E 28 ZE 28 E EE 2 8 a 4 Só Ss So st Só sá Sia ” olm 2 | 2/ô 2/6 Lo So Só SG "o

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PD > Z 8 >= o | z E 6 5 = = = oO na Oo a oO a uu a ú E ã E — E sc Ee o o o Z o Ss ES o > Pa & > DZ x>X = OS Xl In >> 4X SS 20 <X-U FO —) y Xl 4) ss > N) O = |X $/ 0 SE > (6 FT O [OO oe << / 02 ne coentros 5 05 Ss oo Q o - g | je Oo o o = = rá rá rá (7 6 o x o O o a = [. < < o < o >= > > > > Zz || Z Á 2 1a - ar EK & E E SCE a n 5 (o & o O |&£|O ss & jE | 3 | 3 |) 8/88 = A OX E = o nl O O a sê |=8 fg sgés=ta 2 32 Oo e EC TT ir CjE LD Dj w | Gjlu = Fo = 2 =z - Zz Zz < 8 à = = 7 g) lá ão 8 D Fá Co) >= >> DP DP > —|) |Z oO n=Z o oO o XE N|E O =X Z ox DP o << nO = ol= Sa g=góssEgegs Seçgãçes 0/06 Tá QXÃX 6 Lo 2X Il6 DE Jo IX O o o o o o o o Tx o = o ND Tv Tv o ns a 8 m m ma = = = = = < o o o o o X f. f. f. E E ã& ã& 8 kg |ê = = = e = 5 5 5 5 5 a a o = o a 2 sc IB << |g/Z gg: 2 |& || E 3/82 3/8 2/8) 3|& õ SG | ol 3 o des) od / od oo o o 3 6) 5 | 682) 5 | 6) 5 | 6) 5 |O 8 3 8 8 2 o o o o ú x = = Ss Ss Ss o o D D D

O O O O O << < < < > > x > > ad >= Z | &| Z & Z SS Z &$S| ZS É | &E| Ê nã | ÉÊ |NJÊ Na) Ê | 2 ld giE sl e sa EB E se < 8 E 6 gs 8 se sl 8 XY x XY XY XY XY NI Z Bl 8 Zz BG ZE XZ| 8 |zZ X/S/6 2) 9 | 6) O 6 2 [6/0 SG) O |% Aa iá 2! O <á<| O < DO << O OS<| O |á oito 9) uu o) à o wu Ow TO) wu |O = õ& Fo Fo Fo Fo õ& o = à à à à = = a S S S S S S = > >= >= >= >= > o Z on on on on Z 8 a a 8, a, 8, o O IX DI O |X N|X NIX o Ex. 2 2 2222 2 2 oa çõEço oo 4 a E << 60 E << 5 E<Z 6 E << 6 E 4 Ojo X o IlXjo IA) º jo IJ lX o Jirjo IX

O O O O O o MN o co o Tv Tx Tx o o o o o o o o =) mo mo mo mo mo m = = = = = < o o o o o & o o o o o

S 8 S S S

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O O O O O < À) < < < - < 2 O XX a> => nl > Z O) Z2 [SIZ DIZ Ol Z É | 2) É I8É |8É |É) É O ko Ho j|éE O I|&) O |k& 9 | e) 92 elo x 2 Xl 2 jm ll 8 >=) 6 Z 6 ZE = 8 x x, O já) O 6/0 FT 6/0 FG] O á S&S o) O | á<|) O </0 OS <[0 o á| 2 | á<O o) uu |5) uu |jolu E oju E o) uu jo E = Fo Fo õ& Fo Fo o à à = à à = < < < < < o Hs H sn H Hs = = = > = = o o o Z o o 3 d. 8, e, Lo e IL DIE DIE DIE DI n EEZ 82 82 262 çãEç aolo E 45 ES < 6o SE 4 o ES << o E) 4 0/0 /o IJlix jo IJlxlo Jix o IJlIX o II) &

O O O O O

ININININIAR o bx ao [) o o o o o o o o o o o o =) mo mo mo mo mo nm = = = = = <q Ó Ó Ó Ó Ó u a a a a a

[0215] Em algumas modalidades é fornecido um anticorpo especií- fico para PSMA, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, uma CDR?2, e uma CDR3 de qualquer um dentre os anticorpos descritos na Tabela 2. Em algumas modalidades é fornecido um anticorpo especiífi- co para PSMA, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, uma CDR?2, e uma CDR3 de qualquer um dentre os anticorpos descritos na Tabela 2 e uma cadeia leve compreendendo uma CDR1, uma CDR?2, e uma CDR3 de qualquer um dentre os anticorpos descritos na Tabela

2. Em algumas modalidades no presente documento descritas, o anti- corpo específico para PSMA, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compete pela ligação a PSMA com um anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de qualquer um dos anticorpos descritos na Tabela 2 e uma cadeia leve compreen- dendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 de qualquer um dos anti- corpos descritos na Tabela 2.

[0216] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente.

[0217] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0218] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 85.

[0219] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente.

[0220] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0221] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 86 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 87.

[0222] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31,42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente.

[0223] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0224] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 96 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 83.

[0225] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 26, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

[0226] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0227] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 88 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 89.

[0228] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 122, 123, 124, 23, 12, e 24, respectivamente.

[0229] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0230] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 125 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 91.

[0231] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 8, 9, 10, 11, 12, e 13, respectivamente.

[0232] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 60 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0233] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 82 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 83.

[0234] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 31, 32, 33, 34, 12, e 35, respectivamente.

[0235] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 70 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0236] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 92 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 93.

[0237] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 36, 37, 38, 39, 40, e 41, respectivamente.

[0238] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 72 e a VL da SEQ ID NO: 73.

[0239] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 94 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 95.

[0240] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 31, 44, 45, 46, 29, e 47, respectivamente.

[0241] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76.

[0242] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 97 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 98.

[0243] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 36, 37, 48, 49, 50, e 51, respectivamente.

[0244] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 77 e a VL da SEQ ID NO: 78.

[0245] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 100.

[0246] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 36, 37, 52, 49, 50, e 51, respectivamente.

[0247] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 79 e a VL da SEQ ID NO: 78.

[0248] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 101 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 100.

[0249] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 53, 54, 55, 23, 12, e 35, respectivamente.

[0250] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 68 e a VL da SEQ ID NO: 69.

[0251] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 90 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 91.

[0252] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 130, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

[0253] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0254] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 145 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 89.

[0255] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 130, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

[0256] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 142.

[0257] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 145 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 148.

[0258] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 130, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

[0259] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0260] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 145 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 149.

[0261] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 134, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

[0262] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0263] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 146 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 89.

[0264] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 135, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

[0265] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 144.

[0266] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 147 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 150.

[0267] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 135, 27,

28, 29, e 30, respectivamente.

[0268] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0269] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 147 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 89.

[0270] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 135, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

[0271] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0272] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 147 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 148.

[0273] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 135, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

[0274] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0275] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 147 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 149.

[0276] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali-

dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 134, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

[0277] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 144.

[0278] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 146 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 150.

[0279] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 134, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

[0280] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0281] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 139 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 142.

[0282] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 134, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

[0283] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0284] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 146 e uma cadeia leve (LC) da

SEQ ID NO: 149.

[0285] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs 25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

[0286] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 141 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0287] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 151 e uma cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 149.

[0288] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao ECD de PSMA humano com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) menor que cerca de 100 nM, opcionalmente menor que cerca de 50 NM, por exemplo menor que cerca de 12 nM, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema ProteOn XPR36 a +25ºC.

[0289] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao ECD de PSMA de cino com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) menor que cerca de 100 nM, opcionalmente menor que cerca de 50 NM, por exemplo menor que cerca de 12 nM, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema ProteOn XPR36 a +25ºC.

[0290] Em algumas modalidades, o anticorpo é do isótipo IgGA4, que compreende opcionalmente uma substituição de cadeia pesada S228P, F234A, e L235A quando comparado com a IgG4 de tipo selva- gem.

[0291] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61, e é do isótipo IgG4/, que compreende opcionalmente uma substituição de cadeia pesada S228P, F234A, e L235A quando comparado com a IgG4 de tipo selva-

gem.

[0292] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo bies- pecífico, como um anticorpo biespecífico para PSMA/CD3.

[0293] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um câncer.

[0294] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um tumor sólido.

[0295] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um câncer de próstata ou de um câncer de próstata resistente à castração.

[0296] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de uma neoplasia intraepitelial prostática.

[0297] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de câncer colorretal.

[0298] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de carcinoma renal de células claras.

[0299] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de câncer gástrico.

[0300] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um carcinoma de células renais (RCC) (por exemplo, um carcinoma renal de células claras ou um carcinoma renal de célu- las papilares), ou uma lesão metastática do mesmo.

[0301] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um câncer pancreático.

[0302] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um câncer de mama.

[0303] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um câncer renal.

[0304] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um distúrbio neovascular como, por exemplo, um câncer caracterizado pelo crescimento de tumor sólido.

[0305] O anticorpo é adequado para uso em terapia, por exemplo no tratamento de um distúrbio neovascular como, por exemplo, carci- noma renal de células claras (CCRCC), câncer colorretal, câncer de mama, câncer de Bexiga, câncer de pulmão, e câncer pancreático e vários outros cânceres não prostáticos, incluindo, mas não se limitan- do a, câncer dos rins, urotelial, pulmonar, de cólon, mama, e adeno- carcinoma no fígado.

[0306] A classe de IgG é dividida em quatro isótipos: I9G1, IgG2, IgG3, e IgG4 em humanos. Elas compartilham mais de 95% de homo- logia nas sequências de aminoácidos das regiões Fc, mas mostram importantes diferenças na composição de aminoácidos e na estrutura da região de dobradiça. A região Fc é mediadora das funções efetoras, como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citoto- xicidade dependente de complemento (CDC). Em ADCC, a região Fc de um anticorpo se liga a receptores de Fc (FcgRs) na superfície de células efetoras imunes, como exterminadoras naturais (natural killers) e macrófagos, levando à fagocitose ou lise das células-alvo. Em CDC, os anticorpos exterminam as células-alvo desencadeando a cascata de complemento na superfície celular. Os anticorpos no presente do- cumento descritos incluem anticorpos com as características descritas dos domínios variáveis em combinação com quaisquer dos isótipos de IgG, incluindo versões modificadas nas quais a sequência de Fc foi modificada para executar diferentes funções efetoras.

[0307] Para muitas aplicações de anticorpos terapêuticos, as fun- ções efetoras mediadas por Fc não fazem parte do mecanismo de ação. Essas funções efetoras mediadas por Fc podem ser prejudiciais e apresentar potencialmente um risco de segurança, causando toxici- dade fora do mecanismo. As funções efetoras modificadoras podem ser obtidas através da engenharia das regiões Fc para reduzir sua |li-

gação ao FcgRs ou aos fatores do complemento. A ligação de IgG pa- ra a ativação (FcgRI, FegRlla, FegRllla e FegRilIb) e inibição (FcgRiIb) de FcgRs ou o primeiro componente do complemento (C1g) depende dos resíduos localizados na região de dobradiça e do domínio CH2. Mutações foram introduzidas em IgG1, IgG2 e IgG4 para reduzir ou silenciar as funcionalidades de Fc. Os anticorpos no presente docu- mento descritos podem incluir essas modificações.

[0308] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais das seguintes propriedades: (a) função efetora reduzida quando comparada ao Fc parental; (b) afinidade reduzida com Fcg RI, Fcg Rlla, Fcg RiIlb, Fcg Rlllb e/ou Fceg Rllla; (c) afinidade reduzida com FcgRI; (d) afinidade reduzida com FegRlla; (e) afinidade reduzida com FcgRiIlb; (f) afinidade reduzida com Fcg Rlllb ou (g) afi- nidade reduzida com FcgRlilla.

[0309] Em algumas modalidades, os anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno, são IgG, ou derivados da mesma, por exemplo, isótipos I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em algumas modalidades em que o anticorpo tem um isótipo IgG4, o anticorpo contém substituições S228P, L234A e/ou L235A na sua região Fc. Em algumas modalida- des em que o anticorpo tem um isótipo IgG1, o anticorpo contém subs- tituições S228P, L234A e/ou L235A na sua região Fc. Os anticorpos no presente documento descritos podem incluir essas modificações. Em algumas modalidades, o anticorpo tem um isótipo IgG1.

[0310] Em algumas modalidades, o anticorpo é do isótipo IgGA4, que compreende opcionalmente uma substituição de cadeia pesada S228P quando comparado com a IgG4 de tipo selvagem.

[0311] Em algumas modalidades, o anticorpo é de isotipo I9G1, que compreende opcionalmente as substituições de cadeia pesada L234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S e P331S, quando com- parado à IgG1 de tipo selvagem.

[0312] Adicionalmente aos anticorpos específicos para PSMA e aos fragmentos de ligação ao antígeno descritos, são também forneci- das sequências de polinucleotídeo capazes de codificar os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno descritos. São também forne- cidos vetores que compreendem os polinucleotídeos descritos, e, tam- bém, células que expressam os anticorpos específicos para PSMA ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento fornecidos. São também descritas células capazes de expressar os vetores descri- tos. Essas células podem ser células de mamíferos (como células 293F, células CHO), células de insetos (como células Sf7), células de levedura, células vegetais ou células bacterianas (como E. coli). Os anticorpos descritos podem também ser produzidos por células de hi- bridoma. Anticorpos homólogos

[0313] As variantes dos anticorpos que se ligam especificamente ao PSMA da invenção no presente documento descritas, e em algu- mas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencio- nadas abaixo, que compreendem a VH, a VL ou as sequências de aminoácidos de VH e de VL mostradas na Tabela 3, estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, as variantes podem compreender uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos no VH e/ou no VL, contanto que os anticorpos homólogos retenham ou tenham pro- priedades funcionais melhoradas quando comparados aos anticorpos parentais. Em algumas modalidades, a identidade da sequência pode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma sequência de aminoácidos da VL ou VH da invenção. Opcionalmente, qualquer variação da variante em comparação ao an- ticorpo parental não está dentro das CDRs da variante.

[0314] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79, 160, 138, 139 ou 140, sendo que a VH tem, opcionalmente, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, se- te, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácido. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0315] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VL das SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 76, 78, 142, 143, ou 144, sendo que a VL tem, opcionalmente, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, no- ve, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de amino- ácido. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0316] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 60 e a VL da SEQ ID NO: 61, sendo que a VH, a VL, ou ambas, a VH e a VL, opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0317] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs:

62 e a VL da SEQ ID NO: 63, sendo que a VH, a VL, ou ambas, a VH e a VL, opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0318] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0319] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0320] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 68 e a VL da SEQ ID NO: 69, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs-

tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0321] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 70 e a VL da SEQ ID NO: 71, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0322] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 72eaVWVL da SEQ ID NO: 73, sendo que a VH, a VL, ou ambas, a VH e a VL, opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0323] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0324] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0325] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 77 e a VL da SEQ ID NO: 78, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0326] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 79 e a VL da SEQ ID NO: 78, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0327] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs:

160 e a VL da SEQ ID NO: 65, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0328] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 138 e a VL da SEQ ID NO: 67, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0329] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 138 e a VL da SEQ ID NO: 142, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0330] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 138 e a VL da SEQ ID NO: 143, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0331] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 139 e a VL da SEQ ID NO: 67, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0332] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 140 e a VL da SEQ ID NO: 144, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0333] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 140 e a VL da SEQ ID NO: 67, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subs- tituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0334] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 140 e a VL da SEQ ID NO: 142, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0335] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 140 e a VL da SEQ ID NO: 143, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0336] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 139 e a VL da SEQ ID NO: 144, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0337] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs:

139 e a VL da SEQ ID NO: 142, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0338] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 139 e a VL da SEQ ID NO: 143, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0339] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da invenção compreende a VH das SEQ ID NOs: 141 e a VL da SEQ ID NO: 143, sendo que a VH, a VL, ou ambas (a VH e a VL), opcionalmente compreende(m) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmente, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0340] Os anticorpos homólogos que se ligam especificamente ao PSMA da invenção no presente documento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, têm uma, duas, três, quatro ou cinco das seguintes proprieda- des: a) se ligam ao ECD de PSMA de Pan trogolodyte com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de 25 nM ou menos, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema ProteOn XPR36 a +25ºC, b) se ligam a células LNCaP com uma ECso calculada de nM ou menos e se liga a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis com uma ECso calculada de 40 nM ou menor, sendo que a diferença na ECso calculada entre a ligação a células LNCAaP e a ligação a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis é menor que 5 vezes, e sendo que a ECs5o calculada é me- dida em um ensaio de ligação de células inteiras a 0ºC com o uso de citometria de fluxo, c) se ligam ao ECD de PSMA recombinante humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 12 NM ou menos, sendo que a Kp é medida com o uso do ensaio de res- sonância de plásmon de superfície ProteOn, sistema ProteOn XPR36 a +25ºC; d) apresentam morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK que expressam PSMA humano ou células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis quando emparelhados em um anticorpo biespecífico com o anticorpo anti-CD3, CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou pelo ensaio de ativação de caspase 3/7, ou e) reconhecem um epítopo conformacional, sendo que o epítopo é compreendido dos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, 0303, K304, E307, e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO:3). Anticorpos com modificações conservativas

[0341] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção compreende a VH compreendendo as sequências da HCDR1, da HCDR2 e da HCDR3, e a VL compreendendo as se- quências da LCDR1, da LCDR2 e da LCDR3, sendo que uma ou mais das sequências de CDR compreendem sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos no presente documento descri- tos (por exemplo, os anticorpos mostrados na Tabela 2, ou modifica- ções conservativas dos mesmos, e sendo que os anticorpo retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos parentais que se ligam especificamente ao PSMA da invenção.

[0342] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0343] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0344] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0345] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0346] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0347] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0348] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0349] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi-

ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0350] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respectivamente, e modificações conservativas do mesmao.

[0351] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50 e 51, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0352] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente, e modificações conservativas do mesmo.

[0353] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:

25, 130, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e modificações conservati- vas do mesmo.

[0354] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0355] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0356] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e modificações conservati- vas do mesmo.

[0357] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 136, respectivamente, e modificações conservati- vas do mesmo.

[0358] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e modificações conservati- vas do mesmo.

[0359] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0360] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0361] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 136, respectivamente, e modificações conservati- vas do mesmo.

[0362] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali-

dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0363] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0364] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0365] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o anticorpo que se liga especi- ficamente ao PSMA da presente invenção compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente, e modificações conserva- tivas do mesmo.

[0366] Os anticorpos com modificações conservativas da invenção no presente documento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, têm uma, du- as, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades:

a) se ligam ao ECD de PSMA de Pan trogolodyte com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de 25 nM ou menos, sendo que a Kp é medida usando-se o sistema ProteOn XPR36 a +25ºC, b) se ligam a células LNCaP com uma ECso calculada de nM ou menos e se liga a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis com uma ECso calculada de 40 nM ou menor, sendo que a diferença na ECso calculada entre a ligação a células LNCAaP e a ligação a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis é menor que 5 vezes, e sendo que a ECs5o calculada é me- dida em um ensaio de ligação de células inteiras a 0ºC com o uso de citometria de fluxo, c) se ligam ao ECD de PSMA recombinante humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 12 NM ou menos, sendo que a KD é medida com o uso do ensaio de res- sonância de plásmon de superfície, sistema XPR36 ProteOn a +25ºC; d) apresentam morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK que expressam PSMA humano ou células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis, quando emparelhados em um anticorpo biespecífico com anticorpo anti-CD3 CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou pelo ensaio de ativação de caspase 3/7, ou e) reconhecem um epítopo conformacional, sendo que o epítopo é compreendido dos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, 0303, K304, E307, e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO:3).

[0367] O termo "modificações conservativas" se refere a modifica- ções do aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo as sequências de aminoácidos. Modificações conservativas incluem substituições, adi-

ções e deleções de aminoácidos. Substituições conservativas são aquelas em que o aminoácido é substituído por um resíduo de amino- ácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de ami- noácido tendo cadeias laterais similares são bem definidos e incluem aminoácidos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspárti- co, ácido glutâmico), cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, ar- ginina, histidina), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glu- tamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, triptofano), cadeias laterais aromáticas (por exemplo, fenilalanina, triptofano, histidina, tirosina), cadeias laterais alifáticas (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), amida (por exemplo, asparagina, glutami- na), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais contendo enxofre (cisteína, metionina). Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo pode também ser substituído por alanina, conforme foi previamente descrito para muta- gênese por varredura de alanina (MacLennan et a/l., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55 a 67; Sasaki et al/., (1988) Adv Biophys 35:1-24). Substituições de aminoácido para os anticorpos da invenção podem ser realizadas por meio de métodos conhecidos, por exemplo, pela mutagênese por PCR (patente U.S. nº 4.683.195). Alternativa- mente, as bibliotecas de variantes podem ser geradas, por exemplo, usando códons aleatórios (NNK) ou não aleatórios, por exemplo, có- dons DVK, que codificam 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). As variantes de anticorpo resultantes po- dem ser avaliadas quanto as suas características usando-se os ensai- os no presente documento descritos.

Imunoconjugados

[0368] Um "imunoconjugado" se refere ao anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas.

[0369] Em algumas modalidades, o anticorpo da invenção no pre- sente documento descrito, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é conjugado a um ou mais agentes citotóxicos. Exemplos de tais agentes citotóxicos in- cluem agentes ou fármacos quimioterapêuticos, agentes inibitórios de crescimento, toxinas (por exemplo, proteínas de toxinas, toxinas enzi- maticamente ativas bacterianas, fúngicas, vegetais, ou de origem ani- mal, ou fragmentos dos mesmos), e isótopos radioativos.

[0370] Em algumas modalidades, um imunoconjugado é um con- jugado anticorpo-fármaco (ADC "antibody-drug conjugate") no qual o anticorpo da invenção é conjugado a um ou mais fármacos, como a um maitansinoide (consulte, por exemplo, as patentes US nºs

5.208.020, 5.416.06)); uma auristatitna, como porções DE e DF de um fármaco monoetilaurstatina (MMAE e MMAF) (consulte, por exemplo, as patentes US nºs 5.635.483, 5.780.588 e 7.498.298), uma caliquea- micina ou derivado da mesma (consulte, por exemplo, as patentes US nºs 5.712.374., 5.714.586, 5.739, 116, 5.767.285, 5.770.701,

5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et a/., (1993) Cancer Res 53:3336-3342; e Lode et a/., (1998) Cancer Res 58:2925-2928); uma antraciclina como daunomicina ou doxorrubicina (consulte, por exem- plo, Kratz et al., (2006) Current Med. Chem 13:477-523; Jeffrey et al., (2006) Bioorganic & Med Chem Letters 16:358-362; Torgov et al. (2005) Bioconj Chem 16:717-721; Nagy et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:829-834; Dubowchik et a/., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et a/., (2002) J Med Chem 45:4336-4343; e a patente US nº 6.630.579 e), metotrexato, vindesina, um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, e ortataxel.

[0371] Em algumas modalidades, o imunoconjugado compreende o anticorpo da invenção no presente documento descrito conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, cadeia À de difteria, fragmentos ativas não ligantes de toxina de difteria, exoto- xina de cadeia A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca america- na (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restric- tocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[0372] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o anticorpo é conjugado a um átomo radi- oativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos ra- dioativos estão disponíveis para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconju- gado é usado para a detecção, ele pode compreender um átomo radi- oativo para estudos cintigráficos, por exemplo, Tc-99m ou 1123, ou um marcador de spin para imageamento por ressonância magnética nu- clear (RMN) (também conhecido como imageamento por ressonância magnética, IRM), como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-l |, flúor- 19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[0373] Os conjugados do anticorpo da invenção e o agente citotó- xico são preparados com o uso de uma variedade de agentes de aco- plamento de proteína bifuncionais, como propionato de N-succinimidil- 3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidol-4-(N-maleimidometol) coclo- hexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados biofucnio- nais de imidoésteres (como adipimidato de dimetila HQ), ésteres ativos (como suberato de dissuccinimidila) aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), deri-

vados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flú- or bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098. O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metil- ietilenotriaminopenta acético (MX-DPTA) rotulado com carbono-14 é um agente quelante exemplificador para a conjugação de radionucleo- tídeos ao anticorpo. Consulte, por exemplo, WO094/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante pepti- dase-sensível, ligante fotolábil, ligante dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et a/., (1992) Cancer Res 52: 127-131; patente US nº

5.208.020) pode ser usado.

[0374] Os imunoconjugados ou ADCs podem ser preparados com reagentes reticuladores como BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC- SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo- EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo- SMPB, e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona) os quais estão comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, Il., EUA).

[0375] Uma modalidade da invenção, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um imunoconjugado que compreende o anticorpo que se liga especifica- mente ao PSMA da invenção ligado a um agente terapêutico ou um agente de imageamento.

[0376] Uma outra modalidade da invenção, e em algumas modali- dades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abai- xo, é um imunoconjugado que compreende o anticorpo que se liga es- pecificamente ao CD3 da invenção ligado a um agente terapêutico ou um agente de imageamento.

[0377] Uma outra modalidade da invenção, e em algumas modali- dades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abai- xo, é um imunoconjugado que compreende o anticorpo biespecífico PSMA/CD3 da invenção ligado a um agente terapêutico ou um agente de imageamento. Geração dos anticorpos monoespecíficos da invenção

[0378] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, os anticorpos antagonistas que se ligam especificamente ao PSMA da invenção são humanos.

[0379] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, os anticorpos antagonistas que se ligam especificamente ao PSMA da invenção são humanizados.

[0380] Os anticorpos monoespecíficos da invenção no presente documento descritos (por exemplo, anticorpos que se ligam especifi- camente a PSM) podem ser gerados com o uso de várias tecnologias. Por exemplo, o método do hibridoma de Kohler e Milstein, Nature 256:495, 1975, pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais. No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro, como um hamster, rato ou macaco, é imunizado com PSMA ou CD3 humano, de chimpanzé ou de macaca ou fragmentos de PSMA ou CD3, como o domínio extracelular de PSMA ou CD3, seguido pela fu- são de células de baço dos animais imunizados com células de mi- eloma com o uso de métodos-padrão para formar células de hibridoma (Gooding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas de 59 a 103 (Academic Press, 1986)). As colônias produzidas a partir de células de hibridoma únicas imortalizadas são selecionadas quanto à produção de anticorpos com propriedades desejáveis, como especifi- cidade de ligação, reatividade cruzada ou falta da mesma, e afinidade pelo antígeno.

[0381] Vários animais hospedeiros podem ser usados para produ- zir os anticorpos para o PSMA da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo. Por exemplo, camundongos Balb/c podem ser usados para gerar anticorpos anti-PSMA humano de ca- mundongo. Os anticorpos produzidos em camundongos Balb/c e ou- tros animais não humanos podem ser humanizados usando-se várias tecnologias para gerar sequências similares às humanas.

[0382] Técnicas de humanização exemplificadoras, incluindo a se- leção de arcabouços do aceptor humano, são conhecidas e incluem enxerto de CDR (patente US nº 5.225.539), enxerto de SDR (patente US nº 6.818.749), Resurfacing (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489 a 499), Specificity Determining Residues Resurfacing (publicação de pa- tente US nº 2010/0261620), adaptação da estrutura humana (patente U.S. nº 8.748.356) ou super-humanização (patente U.S. nº 7.709, 226). Nesses métodos, as CDRs de anticorpo parentais são transferi- das para estruturas humanas que podem ser selecionadas com base em sua homologia total para as estruturas parentais, com base na si- milaridade do comprimento da CDR, na identidade da estrutura canô- nica ou uma combinação dos mesmos.

[0383] Os anticorpos humanizados podem ser adicionalmente oti- mizados para melhorar sua seletividade ou afinidade para um antígeno desejado através da incorporação dos resíduos de suporte de estrutu- ra alterada para preservar a afinidade da ligação (retromutações) por técnicas, como aquelas descritas nas publicações de patentes interna- cionais nºs. WO1090/007861 e WO1992/22653, ou pela introdução de variação em qualquer uma das CDRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo.

[0384] Animais transgênicos, como camundongos ou ratos, carre-

ando loci da imunoglobulina (Ig) humana no seu genoma podem ser usados para gerar anticorpos humanos contra uma proteína-alvo e são descritos, por exemplo, na patente US nº 6.150.584, na publicação de patente internacional nº WO99/45962, nas publicações de patentes internacionais nºs WO2002/066630, WO2002/43478, WO2002/043478 e WO1990/04036, Lonberg et a/. (1994) Nature 368:856-9; Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jakobovits (1998) Exp. Med. 188: 483, -95; Lonberg e Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65-93; Brugge- mann et a/., (1991) Eur J Immunol 21:1323- 1326; Fishwild et a/., (1996) Nat Biotechnol 14:845-851; Mendez et a/., (1997) Nat Genet 15:146-156; Green (1999) J Immunol Methods 231:11-23; Yang et a/., (1999) Cancer Res 59:1236-1243; Brúggemann e Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458. Os loci de imunoglobulina endógenos nesses animais podem ser interrompidos ou deletados, e ao menos um locus de imunoglobulina humana completo ou parcial pode ser inserido no genoma do animal usando recombinação homóloga ou não homóloga, usando transcro- mossomos ou usando minigenes. Empresas, como Regeneron (http:// www regeneron com), Harbour Antibodies (http:// www harbouranti- bodies com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http:// www omtinc net), KyMab (http:// www kymab com), Trianni (http:// www. trianni com) e Ablexis (http:// www ablexis com) podem ser encarre- gadas de fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antí- geno selecionado usando tecnologias como descritas acima.

[0385] Os anticorpos humanos podem ser selecionados de uma biblioteca de apresentação em fago, onde o fago é manipulado para expressar imunoglobulinas humanas ou porções das mesmas, como Fabs, anticorpos de cadeia única (scFv) ou regiões variáveis de anti- corpo não emparelhadas ou emparelhadas (Knappik et a/., (2000) J Mol Biol 296:57-86; Krebs et al., (2001) J Immunol Meth 254:67-84; Vaughan et a/., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314; Sheets et al.,

(1998) PITAS (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter (1991) J Mol Biol 227:381; Marks et a/., (1991) J Mol Biol 222:581). Os anticor- pos da invenção podem ser isolados, por exemplo, da biblioteca de apresentação em fago expressando as regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve do anticorpo, como proteínas de fusão, com a proteína de revestimento do bacteriófago plX, conforme descrito em Shi et al. (2010) J Mol Biol 397:385-96, e na publicação de patente internacional nº WO09/085462). As bibliotecas podem ser triadas para a ligação de fagos ao PSMA ou CD3 humano e/ou de cinomolgo e os clones positivos obtidos podem ser adicionalmente caracterizados, os Fabs são isolados dos lisados do clone, e expressos como IgGs de comprimento total. Tais métodos de apresentação em fago para isolar anticorpos humanos são descritos em, por exemplo: Patentes U.S. nºs. 5.223.409, 5.403.484,

5.571.698, 5.427.908, 5. 580.717, 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793;

6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081.

[0386] A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpos monoclonais podem ser realizadas com o uso de qualquer técnica adequada, como produção de proteína recombinante. Os antí- genos imunogênicos podem ser administrados a um animal na forma de proteína purificada, ou misturas de proteína incluindo células totais ou extratos de células ou tecidos, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal a partir de ácidos nucléicos que codificam o dito antígeno ou uma porção do mesmo. Geração dos anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3 da invenção

[0387] Os anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3 da invenção (por exemplo, os anticorpos biespecíficos que compreendem um pri- meiro domínio que se liga especificamente ao PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3) podem ser gerados pela combinação de domínios VH/VL de ligação a PSMA com domínios VH/VL de ligação a CD3 isolados e caracterizados no presente docu-

mento. Alternativamente, os anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3 podem ser manipulados com o uso de domínios VH/VL a partir de an- ticorpos monoespecíficos anti-PSMA e anti CD3 publicamente disponí- veis, e/ou pela combinação mista dos domínios VH/VL de ligação a PSMA ou CD3 no presente documento identificados com os domínios VH/VL de ligação ao PSMA ou CD3 publicamente disponíveis.

[0388] Anticorpos anti-PSMA exemplificadores que podem ser usados para manipular as moléculas biespecíficas para PSMA /CD3 são, por exemplo, aqueles no presente documento descritos e na Ta- bela 2. Por exemplo, os domínios VH/VL dos anticorpos PSMA da in- venção podem ser incorporados em anticorpos biespecíficos que com- preendem domínios VH/VL de ligação a CD3 no presente documento descritos e na Tabela 5. Por exemplo, os domínios VH/VL dos anticor- pos para CD3, CD3B217 e CD3B219, apresentados na presente in- venção podem ser usados para gerar anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3. Além da descrição e caracterização dos anticorpos CD3B217 e CD3B219 no presente documento fornecidos, uma descri- ção mais detalhada dos anticorpos pode ser encontrada na publicação de pedido de patente US nº 2016-0068605 A1, que está no presente documento incorporada a título de referência.

[0389] De modo similar, anticorpos anti-CD3 que podem ser usa- dos para manipular as moléculas biespecíficas para PSMA/CD3 são, por exemplo, aqueles descritos nas publicações de patentes internaci- onais nºs WO2005/048935, WO2004/106380 e WO2015095392. Es- ses domínios VH/VL de CD3 podem ser incorporados a anticorpos bi- específicos que compreendem os domínios VH/VL de ligação a PSMA descritos na presente invenção e na Tabela 2. Por exemplo, os domínios VH/VL dos anticorpos PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127,

PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, e PSMB365 descritos na presente invenção podem ser usados para gerar anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3.

[0390] Os anticorpos biespecíficos para PSMA/CD3 gerados po- dem ser testados quanto a sua ligação a PSMA e a CD3, e a suas ca- racterísticas funcionais desejadas, morte mediada por células T de cé- lulas que expressam PSMA (por exemplo, LNCaP).

[0391] Os anticorpos biespecíficos da invenção compreende anti- corpos que têm uma estrutura de anticorpo de comprimento total.

[0392] "Anticorpo de comprimento total" se refere a um anticorpo tendo duas cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total e duas cadeias leves de anticorpo de comprimento total. Uma cadeia pesada (HC) de anticorpo de comprimento total consiste nos domínios variável e constante de cadeia pesada VH, CH1, dobradiça, CH2 e CH3, bem conhecidos. Uma cadeia leve (LC) do anticorpo de comprimento total consiste nos domínios variável e constante de cadeia leve VL e CL, bem conhecidos. O anticorpo de comprimento total pode não ter a lisi- na (K) C-terminal em uma ou ambas as cadeias pesadas.

[0393] O termo "braço Fab" ou "meia molécula" se refere a um par de cadeia pesada-cadeia leve que se liga especificamente a um antí- geno.

[0394] Os anticorpos biespecíficos de comprimento total da inven- ção no presente documento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, podem ser gerados, por exemplo, usando-se uma permuta do braço Fab (ou troca de meia molécula) entre dois anticorpos bivalentes monoespecií- ficos por meio da introdução de substituições na interface CH3 de ca- deia pesada em cada metade da molécula para favorecer a formação de heterodímero das duas metades de moléculas do anticorpo tendo especificidade distinta ou no ambiente isento de células in vitro ou usando coexpressão. A reação de troca do braço Fab é o resultado de uma reação de isomerização de ponte dissulfeto e dissociação- associação de domínios CH3. As pontes dissulfetos de cadeia pesada nas regiões de dobradiça dos anticorpos monoespecíficos parentais são reduzidas. As cisteínas livres resultantes de um dos anticorpos monoespecíficos parentais formam uma ponte de dissulfeto interca- deias-pesadas com resíduos de cisteína de uma segunda molécula de anticorpo monoespecífico parental, e, simultaneamente, domínios CH3 dos anticorpos parentais liberam e reformam por dissociação- associação. Os domínios CH3 dos braços Fab podem ser manipulados para favorecer a heterodimerização em relação à homodimerização. O produto resultante é um anticorpo biespecífico tendo dois braços Fab ou metades de moléculas que, se ligam, cada um(a), a um epítopo di- ferente, isto é, um epítopo em PSMA e um epítopo em CD3.

[0395] "Homodimerização" se refere a uma interação de duas ca- deias pesadas tendo sequências de aminoácidos de CH3 idênticas. "Homodímero" se refere a um anticorpo tendo duas cadeias pesadas com sequências de aminoácidos de CH3 idênticas.

[0396] "Heterodimerização" se refere a uma interação de duas ca- deias pesadas tendo sequências de aminoácidos de CH3 não idênti- cas. "Heterodímero" se refere a um anticorpo tendo duas cadeias pe- sadas com sequências de aminoácidos de CH3 não idênticas.

[0397] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos in- cluem designs como Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Bio- tech), Knob-in-Hole (Genentech), CrossMAbs (Roche) e o "electrosta- tically-matched" (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), o LUZ-Y (Genentech), o "Strand Exchange Engineered Domain body" (SEED- body)(EMD Serono), o Biclonic (Merus) e o DuoBody (Genmab A/S).

[0398] A tecnologia Triomab quadroma pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção. A tecnolo- gia Triomab promove a troca de braço Fab entre dois anticorpos qui- méricos parentais, um mAb parental tendo IgG2a e o segundo mAb parental tendo regiões constantes de IgG2b de rato, produzindo anti- corpos biespecíficos quiméricos.

[0399] A estratégia "knob-in-hole" (consulte, por exemplo, a publi- cação internacional nº WO 2006/028936) pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção. Resumi- damente, os aminoácidos selecionados que formam a interface dos domínios CH3 na IgG humana podem ser mutados em posições que afetam as interações do domínio CH3 para promover a formação de heterodímero. Um aminoácido com uma cadeia lateral (orifício) é intro- duzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especifi- camente a um primeiro antígeno e um aminoácido com uma cadeia lateral grande (botão) é introduzido em uma cadeia pesada de um an- ticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno. Após a coexpressão dos dois anticorpos, um heterodímero é formado como resultado da interação preferencial da cadeia pesada com uma "hole" (cavidade) com a cadeia pesada com uma "knob" (protuberância). Pa- res de substituição de CH3 exemplificadores que formam uma "knob" (protuberância) e uma "hole" (cavidade) são (expressos como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/ Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S e T366W/T366S L368A Y407V.

[0400] A tecnologia CrossMAb pode ser usada para gerar anticor- pos biespecíficos de comprimento total da invenção. CrossMAbs, em adição ao uso da estratégia de "knob-in-hole" para favorecer a troca de braço Fab, têm em um dos meios-braços o domínio CH1 e o domínio

CL trocados para assegurar o correto emparelhamento das cadeias leves do anticorpo biespecífico resultante (consulte por exemplo a pa- tente US nº 8.242.247).

[0401] Outras estratégias de entrecruzamento ("cross-over") po- dem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção pela troca de domínios variáveis ou constantes, ou de ambos os domínios, entre a cadeia pesada e a cadeia leve ou dentro da cadeia pesada nos anticorpos biespecíficos, em um braço ou em am- bos os braços. Estas permutações incluem por exemplo VH-CH1 com VL-CL, VH com VL, CH3 com CL e CH3 com CH1 conforme descrito nas publicações de patentes internacionais nº WOZ2009/080254, WO2009/ 080251, WO2009/018386 e WO2009/080252.

[0402] Podem ser utilizadas outras estratégias, como favorecimen- to da heterodimerização da cadeia pesada com o uso de interações eletrostáticas pela substituição de resíduos positivamente carregados em uma superfície CH3 e de resíduos negativamente carregados em uma segunda superfície CH3, conforme descrito na publicação de pa- tente US nº US2010/0015133; publicação de patente US nº US2009/0182127; publicação de patente US nº US2010/028637, ou publicação de patente US nº US2011/0123532. Em outras estratégias, a heterodimerização pode ser favorecida pelas seguintes substituições (expressas como posição modificada no primeiro domínio CH3 da pri- meira posição da cadeia pesada/posição modificada no segundo do- mínio CH3 da segunda cadeia pesada): L351Y F405A Y407V/ T394W, T366l K392M T394W/F405A Y407V, T366L K392M T394 W/F405A Y407V, —L351Y Y407A/T366A K409F, L351Y Y407A/ T366V K409F, Y407A/T366A K409F, ou T350V L351Y F405A Y407 V/T350V T366L K392L T394W conforme descrito na publicação de patente US nº US2012/0149876 ou publicação de patente US nº US2013/0195849.

[0403] A tecnologia LUZ-Y pode ser utilizada para gerar anticorpos biespecíficos da invenção. Nesta tecnologia, um zíper de leucina é adicionado ao terminal C dos domínios CH3 para direcionar a monta- gem do heterodímero a partir dos mAbs parentais, que é removido após a purificação, conforme descrito em Wranik et a/l., (2012) J Biol Chem 287(52): 42221-9.

[0404] A tecnologia SEEDbody pode ser utilizada para gerar anti- corpos biespecíficos da invenção. SEEDbodies têm, em seus domínios constantes, resíduos de IgG selecionados substituídos por resíduos de IgA para promover a heterodimerização conforme descrito no pedido de patente US nº US20070287170.

[0405] A presente invenção também fornece um anticorpo multies- pecífico, multifuncional, que se liga especificamente ao PSMA.

[0406] De acordo com a invenção tal anticorpo multiespecífico, multifuncional que se liga especificamente ao PSMA pode ser um anti- corpo triespecífico para direcionamento duplo de células tumorais - esses são estruturas trifuncionais que podem ser projetados para dire- cionar dois alvos/epítopos diferentes na célula tumoral com a terceira funcionalidade se ligando com alta afinidade a células T ou a células NK. Anticorpos triespecíficos que direcionam dois epítopos tumorais distintos e acoplam a lise de células T ou células NK de células tumo- rais que expressam ambos os alvos. Tais moléculas podem ser gera- dos pelos formatos de anticorpos conhecidos na técnica e são comple- tamente descritos. (WO20151842071, WO2015158636, WO2010 136172, WO2013174873). Em uma modalidade triespecífica da inven- ção, o polipeptídeo de ligação ao antígeno é biespecífico para PSMA e um segundo antígeno distinto em uma célula tumoral e adicionalmente específico para uma célula efetora, particularmente uma célula T ou uma célula NK.

[0407] Os anticorpos biespecíficos da invenção no presente do-

cumento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das mo- dalidades numeradas mencionadas abaixo, podem ser gerados, in vi- tro, em um ambiente livre de células, pela introdução de mutações as- simétricas nas regiões de CH3 de dois anticorpos homodiméricos mo- noespecíficos e formação do anticorpo heterodimérico biespecífico a partir de dois anticorpos homodiméricos monoespeciíficos parentais em condições redutoras para permitir a isomerização da ligação de dissul- feto, de acordo com os métodos descritos na publicação de patente internacional nº WO2011/131746 (DuoBody Technology). Nos méto- dos, o primeiro anticorpo bivalente monoespecífico (por exemplo, anti- corpo anti-BCMA) e o segundo anticorpo bivalente monoespecífico (por exemplo, anticorpo anti-CD3) são modificados para terem deter- minadas substituições no domínio CH3 que favorecem a estabilidade do heterodímero; os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região da do- bradiça sofram isomerização da ligação de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As condições de incubação param ser idealmente restauradas para não redutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2- mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), gluta- tiona, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercapto- etanol. Por exemplo, a incubação durante pelo menos 90 min, a uma temperatura de pelo menos 20ºC na presença de 25 mM de 2-MEA ou na presença de pelo menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.

[0408] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o anticorpo biespecífico isolado que com- preende um primeiro domínio que se liga especificamente ao PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente ao CD3 compreende ao menos uma substituição em um domínio constante CH3 do anticor- po.

[0409] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, a ao menos uma substituição no domínio constante CH3 do anticorpo é a substituição 409R, F405L ou F405L e R409K, sendo que a numeração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

[0410] Os domínios de anticorpo e a numeração são bem conhe- cidos. "Assimétrica" se refere a substituições não idênticas nos dois domínios CH3 em duas cadeias pesadas separadas em um anticorpo. Uma região CH3 do isótipo I9gG1 tipicamente consiste nos resíduos 341 a 446 em IgG1 (numeração dos resíduos de acordo com o índice EU).

[0411] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o anticorpo biespecífico isolado PSMA X CD3 compreende uma substituição F405L em uma primeira cadeia pesada (HC1) do anticorpo e uma substituição 409R em uma segunda cadeia pesada (HC2).

[0412] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o anticorpo biespecífico isolado PSMA X CD3 compreende uma substituição S228P na HC1 e as substituições S228P, F405L e R409K na HC2, sendo que o anticorpo é do isótipo I9G4.

[0413] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o HC1 contém o primeiro domínio que se liga especificamente ao PSMA e o HC2 contém o segundo domínio que se liga especificamente ao CD3.

[0414] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o anticorpo biespecífico da invenção compreende ao menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito substituições assimétricas nas HC1 e na HC2 nas posições dos resíduos 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 ou 409, quando a numeração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

[0415] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o anticorpo biespecífico da invenção compreende ao menos uma, duas, três ou quatro substituições assimétricas na HC1 e na HC2 nas posições dos resíduos 350, 370, 405 ou 409, quando a numeração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

[0416] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o anticorpo biespecífico da invenção compreende ao menos uma substituição assimétrica na HC1 e na HC2 nas posições dos resíduos 405 ou 409, quando a numeração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

[0417] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a substituição compreende uma substituição 409R ou uma substi- tuição F405L na HC1 e uma substituição 409R ou uma substituição F405L na HC2, sendo que a numeração dos resíduos é de acordo com o Índice UE.

[0418] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o anticorpo biespecífico da invenção compreende a substituição F405L na HC1 e a substituição 409R na HC2.

[0419] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o anticorpo biespecífico da invenção compreende ao menos uma substituição assimétrica na HC1 e na HC2 nas posições dos resíduos 366, 368, 370, 399, 405, 407 ou 409, sendo que a numeração dos re- síduos está de acordo com o índice EU.

[0420] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a posição 409 em HC1 tem uma substituição de aminoácido dife- rente de Lys, Leu ou Met e a posição 405 em HC2 tem uma substitui- ção de aminoácido diferente de Phe.

[0421] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a posição 405 em HC1 tem uma substituição de aminoácido dife- rente de Phe e a posição 409 em HC2 tem uma substituição de ami- noácido diferente de Lys, Leu ou Met.

[0422] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a posição 409 em HC1 tem uma substituição de aminoácido dife- rente de Lys, Leu ou Met e a posição 405 em HC2 tem uma substitui- ção de aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly.

[0423] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a posição 405 em HC1 tem uma substituição de aminoácido dife- rente de Phe, Arg ou Gl e a posição 409 no domínio CH2 de HC2 tem uma substituição de aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met.

[0424] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o CH3 da HC1 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e o CH3 tem um aminoácido dife- rente de Phe na posição 405 e Lys na posição 409.

[0425] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Phe na posição 405 e Lys em 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0426] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a HC2 tem uma substituição diferente de Phe, Arg ou Gly na posição 405 e Lys na posição 409.

[0427] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem uma substituição diferente de Peh, Ar ou Gly na posi-

ção 405 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0428] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a HC2 tem Leu na posição 405 e Lys na posição 409.

[0429] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Leu na posição 405 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0430] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Phe na posição 405 e Arg na posição 409 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly na posição 405 e Lys na posição 409.

[0431] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly na posi- ção 405 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e Arg na posição 409.

[0432] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Phe na posição 405 e Arg na posição 409 e a HC2 tem Leu na posição 405 e Lys em posição 409.

[0433] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Leu na posição 405 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e Arg na posição 409.

[0434] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Phe na posição 405 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Leu na posição 405 e Arg na posição 409.

[0435] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Leu na posição 405 e Arg na posição 409 e a HC2 tem Phe na posição 405 e Lys na posição 409.

[0436] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posi- ção 409 e a HC2 tem Leu na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posição 405.

[0437] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Lys na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posi- ção 405 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0438] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Arg na posição 409 e a HC2 tem Lys na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posição 405.

[0439] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Lys na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posi- ção 405 e a HC2 tem Arg na posição 409.

[0440] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Lys em posição 370, Phe na posição 405 e Arg na po- sição 409 e a HC2 tem Lys na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posição 405.

[0441] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Lys na posição 409, Thr na posição 370 e Leu na posi- ção 405 e a HC2 tem Lys na posição 370, Phe na posição 405 e Arg na posição 409.

[0442] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posi- ção 409 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, GlIn, Arg, Ser ou Thr na posição 407.

[0443] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e a HC2 tem um aminoácido dife- rente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0444] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posi- ção 409 e a HC2 tem Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407.

[0445] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem de Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posi- ção 407 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Lis, Leu ou Met na posição 409.

[0446] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posi- ção 409, e a HC2 tem Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407.

[0447] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407, e a HC2 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0448] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e Lys na posição 409.

[0449] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0450] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a HC2 tem Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e Lys na posição 409.

[0451] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição

407 e Lys na posição 409 e o domínio C3 de HC2 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0452] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o domínio CH3 de HC1 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a HC2 tem Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e Lys na posição 409.

[0453] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e Lys na po- sição 409 e a HC2 tem Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0454] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409 e a HC2 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e Lys na posição 409.

[0455] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409.

[0456] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409 e a HC2 tem Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e Lys na posição 409.

[0457] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409.

[0458] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o domínio CH3 de HC1 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409 e o CH3 de HC2 tem Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e Lys na posição 409.

[0459] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Gly, Leu, Met, Asn or Trpanti na posição 407 e Lys na posição 409 e a HC2 tem Tyr na posição 407 e Arg na posição 409.

[0460] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HOC1 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posi- ção 409, e a HC2 tem (i) um aminoácido diferente de Phe, Leu e Met na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um aminoácido diferente de Asp, Cys, Pro, Glu ou Gln na posição 399.

[0461] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem (i) um aminoácido diferente de Phe, Leu e Met na posi- ção 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (ili) um aminoácido diferen- te de Asp, Cys, Pro, Glu ou Gln na posição 399 e a HC2 tem um ami- noácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409.

[0462] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Arg, Ala, His ou Gly na posição 409, e a HC2 tem (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) Trp na posição 370, ou (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399.

[0463] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem (i) Lys, GIn, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) Trp na posição 370, ou (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na po- sição 399 e a HC2 tem Arg, Ala, His ou Gly na posição 409.

[0464] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 tem Arg na posição 409, e a HC2 tem (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) Trp na posição 370, ou (iii) Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399.

[0465] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o HC1 tem (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na po- sição 368, ou (ii) Trp na posição 370, ou (iii) Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399 e a HC2 tem Ar na posição 409.

[0466] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 compreende uma substituição 409R ou uma substituição F405L e a HC2 compreende uma substituição 409R ou uma substitui- ção F405L, sendo que a numeração dos resíduos está de acordo com o Índice EU.

[0467] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a HC1 compreende a substituição F405L e a HC2 compreende a substituição 409R.

[0468] As substituições são tipicamente feitas ao nível de DNA em uma molécula como o domínio constante do anticorpo com o uso de métodos-padrão.

[0469] Os anticorpos da invenção podem ser manipulados em vá- rias formas de anticorpo bem conhecidas.

[0470] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico da pre- sente invenção é um diacorpo ou um corpo transversal.

[0471] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos in- cluem moléculas de direcionamento dual do tipo IgG recombinantes, nas quais cada um dos dois lados da molécula, contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de ao menos dois anticorpos diferen- tes; moléculas de fusão com IgG, sendo que os anticorpos IgG de comprimento total são integrados a um fragmento Fab extra ou partes do fragmento Fab; moléculas de fusão Fc, em que as moléculas Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fusionados a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; mo- léculas de fusão Fab, sendo que diferentes fragmentos Fab são fusio- nados juntos; anticorpos com base em ScFv e diacorpos e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que di- ferentes moléculas Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou dife- rentes anticorpos de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domí-

nio, nanocorpos) são fusionados entre si ou a uma outra proteína ou molécula carreadora.

[0472] Em algumas modalidades, as moléculas de direcionamento duplo semelhantes a IgG recombinantes incluem direcionamento duplo (DT)-lg (GSK/Domantis), anticorpo Two-in-one (Genentech) e mAb2 (F-Star).

[0473] Em algumas modalidades, as moléculas de fusão de IgG incluem Dual Variable Domain (DVD)-lg (Abbott), IgG-like Bispecific (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (Medimmune/AZ) e BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) e TvAb (Roche).

[0474] Em algumas modalidades, as moléculas de fusão incluem as Fusões ScFv/Fc Fusions (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Dual Affinity Re- targeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics) e Dual(ScFv).sub.2- Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China).

[0475] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos de fusão Fab incluem F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dual-Action ou Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), Bivalent Bispeci- fic (Biotecnol) e Fab-Fv (UCB-Celltech). Anticorpos baseados em ScFv, anticorpos baseados em diacorpo, e anticorpos de domínio in- cluem engajador de células T biespecífico (BITE) ("Bispecífic T Cell Engager, BiTE") (Micromet), diacorpo em tandem (Tandab) (Affimed), tecnologia de redirecionamento de dupla afinidade (DART) (MacroGe- nics), diacorpo de cadeia simples (Academic), anticorpos similares a TCR (AIT, ReceptorLogics), fusão de ScFv de albumina sérica humana (Merrimack) e COMBODY (Epigen Biotech), nanocorpos de direcio- namento duplo (Ablynx), anticorpos de domínio apenas de cadeia pe- sada de direcionamento duplo. Diferentes formatos de anticorpos bi- específicos foram descritos e foram recentemente analisados por Chames e Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276 e em Nunez-

Prado et a/., (2015) Drug Discovery Today 20(5):588-594. Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

[0476] São também descritos polinucleotídeos isolados que codifi- cam os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam imunoespecificamente a PSMA. Os polinucleotídeos isolados capazes de codificar os segmentos do domínio variável no presente documento fornecidos podem ser incluídos nos mesmos vetores ou em vetores diferentes para produzir anticorpos ou fragmentos de ligação a antíge- no.

[0477] Os polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação a antígeno também estão dentro do escopo da invenção. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos descritos (e os peptídeos que codifi- cam) incluem uma sequência líder. Qualquer sequência líder conheci- da da técnica pode ser usada. A sequência líder pode incluir, mas não se limita a, um sítio de restrição ou um sítio de início de tradução.

[0478] Os anticorpos específicos para PSMA ou fragmentos de ligação ao antígeno específicos para PSMA no presente documento descritos, incluem variantes tendo substituições, deleções, ou adições de aminoácidos únicas ou múltiplas, que retêm as propriedades bioló- gicas (por exemplo, afinidade de ligação ou atividade imune efetora) dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno específicos para PSMA, descritos. No contexto da presente invenção, as seguintes no- tações são, salvo indicação em contrário, usadas para descrever uma mutação; i) substituição de um aminoácido em uma dada posição é escrita como, por exemplo, K409R, que significa uma substituição de uma Lisina na posição 409 por uma Arginina; e ii) para variantes espe- cíficas, os códigos de três letras ou uma letra específicos são usados, incluindo os códigos Xaa e X, para indicar qualquer resíduo de amino- ácidos. Dessa forma, a substituição de Arginina por Lisina na posição 409 é designada como: K409R, ou a substituição de qualquer resíduo de aminoácidos por Lisina na posição 409 é designada como K409X. No caso da deleção da Lisina na posição 409, é indicada por K409”*. Onde um determinado resíduo de aminoácido pode variar entre os iso- tipos de peptídeo ou variantes, e uma substituição afeta aquele resí- duo em cada isotipo ou variante ou quaisquer dos isótipos ou varian- tes, a substituição é designada como, por exemplo, 409R, o que signi- fica que o aminoácido correspondente à posição 409 é substituído com arginina. O versado na técnica pode produzir variantes tendo substitui- ções, deleções ou adições de aminoácidos múltiplas ou únicas.

[0479] Essas variantes podem incluir: (a) variantes nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por aminoácidos conservadores ou não conservadores, (b) variantes nas quais um ou mais aminoácidos são adicionados a ou deletados do polipeptídeo, (c) variantes nas quais um ou mais aminoácidos incluem um grupo substi- tuinte e (d) variantes nas quais o polipeptídeo é fusionado a um outro peptídeo ou polipeptídeo, como um parceiro de fusão, um marcador de proteína ou outra porção química que pode conferir propriedades úteis ao polipeptídeo, como, por exemplo, um epítopo para um anticorpo, uma sequência de poli-histidina, uma porção de biotina e similares. Os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno no presente documen- to descritos podem incluir variantes nas quais os resíduos de aminoá- cidos de uma espécie são substituídos pelo resíduo correspondente em uma outra espécie, nas posições conservadas ou não conserva- das. Em outras modalidades, os resíduos de aminoácidos em posições não conservadas são substituídos por resíduos conservadores ou não conservadores. As técnicas para obter essas variantes, incluindo téc- nicas genéticas (deleções, mutações, etc.), químicas e enzimáticas, são conhecidas de pessoas tendo conhecimentos comuns da técnica.

[0480] Os anticorpos específicos para PSMA ou fragmentos de ligação ao antígeno, no presente documento descritos, podem incorpo-

rar vários isótipos de anticorpo, como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Em al- gumas modalidades, o isótipo de anticorpo é I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4, de preferência, o isótipo IgG1 ou IgG4. A especificidade do anti- corpo, ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é ampla- mente determinada pela sequência de aminoácidos e a disposição das CDRs. Portanto, as CDRs de um isótipo podem ser transferidas para um outro isótipo sem alterar a especificidade do antígeno. Alternativa- mente, foram estabelecidas técnicas para fazer com que os hibrido- mas alterem a produção de um isótipo de anticorpo para um outro (al- teração de isótipo) sem alterar a especificidade do antígeno. Conse- quentemente, esses isótipos de anticorpos estão dentro do escopo dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação a antígeno descritos.

[0481] São também fornecidos vetores que compreendem os poli- nucleotídeos no presente documento descritos. Os vetores podem ser vetores de expressão. Os vetores de expressão recombinantes con- tendo uma sequência codificando um polipeptídeo de interesse são, dessa forma, contemplados como dentro do escopo desta invenção. O vetor de expressão pode conter uma ou mais sequências adicionais, como, mas não se limitando a, sequências reguladoras (por exemplo, promotor, enhancer), um marcador de seleção e um sinal de poliadeni- lação. Os vetores para transformar uma ampla variedade de células hospedeiras são bem conhecidos e incluem, mas não se limitam a, plasmídios, fagemídios, cosmídios, baculovírus, bacmídios, cromos- somos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de leve- dura (YACs), bem como outros vetores bacterianos, de levedura e vi- rais.

[0482] Os vetores de expressão recombinantes dentro do escopo da descrição incluem fragmentos de ácido nucleico sintético, genômico ou derivado de cDNA que codificam ao menos uma proteína recombi- nante que podem ser funcionalmente ligados aos elementos regulado-

res adequados. Tais elementos reguladores podem incluir um promo- tor de transcrição, sequências que codificam os sítios de ligação ribos- somal de mRNA adequados e sequências que controlam a terminação da transcrição e da tradução. Os vetores de expressão, especialmente os vetores de expressão de mamíferos, podem também incluir um ou mais elementos não traduzidos, como uma origem de replicação, um promotor e enhancer adequados ligados ao gene a ser expresso, ou- tras sequências não transcritas flanqueadoras 5' ou 3', sequências não traduzidas 5' ou 3' (como sítios de ligação ao ribomossoma necessá- rios), um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores de spli- cing ou sequências de término de transcrição. Uma origem de replica- ção que confere a capacidade de replicar em um hospedeiro pode também ser incorporada.

[0483] As sequências de controle transcricional e de tradução nos vetores de expressão a serem usadas na transformação de células de vertebrados podem ser fornecidas por fontes virais. Vetores exemplifi- cadores podem ser construídos, conforme descrito por Okayama e Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).

[0484] Em algumas modalidades, a sequência de codificação do anticorpo, ou do fragmento de ligação ao antígeno, é colocada sob controle de um promotor constitutivo potente, como os promotores dos seguintes genes: hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), adeno- sina desaminase, piruvato quinase, beta-actina, miosina humana, he- moglobina humana, creatina muscular humana e outros. Além disso, muitos promotores virais funcionam constitutivamente em células eu- carióticas, e são adequados para uso com as modalidades descritas. Esses promotores virais incluem, mas não se limitam a, o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), os promotores precoces e tardios de SV40, o promotor do vírus do tumor mamário do camun- dongo (MMTV), as repetições terminais longas (LTRs) do vírus da leu-

cemia de Moloney, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus Eps- tein-Barr (EBV), vírus do sarcoma de Rous (RSV) e outros tipos de re- trovírus, e o promotor da timidina quinase do vírus da herpes simples. Em uma modalidade, o anticorpo específico para PSMA ou seu frag- mento de ligação ao antígeno que codifica o anticorpo específico para GITR ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é colocada sob o controle de um promotor induzível, como o promotor metalotioneína, o promotor induzível por tetraciclina, o promotor induzível por doxicicli- na, promotores que contêm um ou mais elementos de resposta esti- mulada por interferon (ISRE, "Interferon-Stimulated Response Ele- ments"), como a proteína quinase R 2',5'-oligoadenilato-sintetases, ge- nes Mx, ADAR1, e similares.

[0485] Os vetores no presente documento descritos podem conter um ou mais sítios de entrada ribossomais internos (IRES). A inclusão de uma sequência de IRES nos vetores de fusão pode ser benéfica para a expressão aumentada de algumas proteínas. Em algumas mo- dalidades, o sistema de vetores inclui um ou mais sítios de poliadeni- lação (por exemplo, SV40), que podem ser a montante ou a jusante de qualquer das sequências de ácidos nucleicos anteriormente mencio- nadas. Os componentes do vetor podem ser continuamente ligados ou dispostos de modo que forneça espaçamento ótimo para a expressão dos produtos gênicos (isto é, pela introdução de nucleotídeos espaça- dores entre os ORFs) ou posicionados de um outro modo. Elementos reguladores, como o motivo IRES, também podem ser dispostos para fornecer espaçamento ótimo para a expressão.

[0486] Os vetores podem compreender marcador de seleção, que são bem conhecidos da técnica. Os marcadores de seleção incluem marcadores de seleção positiva e negativa, por exemplo, genes de re- sistência a antibióticos (por exemplo, um gene de resistência à neomi- cina, um gene de resistência à higromicina, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à tetraciclina, um gene de resis- tência à penicilina), genes da glutamato sintase, HSV-TK, derivados de HSV-TK para seleção por ganciclovir ou gene da purina nucleosídeo fosforilase bacteriana para seleção por 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um marcador de seleção ou o sítio de clonagem podem estar a montante ou a jusante de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de interesse ou sítio de clonagem.

[0487] Os vetores no presente documento descritos podem ser usados para transformar várias células com os genes que codificam os anticorpos, ou os fragmentos de ligação a antígeno, descritos. Por exemplo, os vetores podem ser usados para gerar as células produto- ras de anticorpos específicos para PSMA ou fragmentos de ligação ao antígeno. Dessa forma, um outro aspecto abrange as células hospe- deiras transformadas com vetores que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao PSMA, como os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno no pre- sente documento descritos e exemplificados.

[0488] Várias técnicas são conhecidas na técnica para a introdu- ção de genes externos nas células e podem ser usadas para construir as células recombinantes para fins de executar os métodos descritos, de acordo com as várias modalidades no presente documento descri- tas e exemplificadas. A técnica usada deve proporcionar a transferên- cia estável da sequência gênica heteróloga à célula hospedeira, de modo que a sequência gênica heteróloga seja herdável e expressável pela progênie da célula, e de modo que as funções necessárias de de- senvolvimento e fisiológicas das células recipientes não sejam inter- rompidas. As técnicas que podem ser usadas incluem, mas não se li- mitam a, transferência de cromossomo (por exemplo, fusão celular,

transferência de gene mediada por cromossomo, transferência de ge- ne mediada por microcélulas), métodos físicos (por exemplo, transfec- ção, fusão de esferoplastos, microinjeção, eletroporação, carreadores lipossômicos), transferência por vetor viral (por exemplo, vírus de DNA recombinante, vírus de RNA recombinante) e similares (descritos em Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). A precipitação por fosfato de cálcio e a fusão induzida por polietilenoglicol (PEG) de protoplastos bacterianos com células de mamíferos também podem ser usadas pa- ra transformar as células.

[0489] Células adequadas para uso na expressão de anticorpos específicos para PSMA ou fragmentos de ligação ao antígeno, no pre- sente documento descritos são, de preferência, células eucarióticas, com mais preferência, células vegetais, de roedores, ou de origem humana, por exemplo, mas não se limitando às, células NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, células HEK293, COS-7, T98G, CV- 1/EBNA, células L, C127, 3T3, HeLa, NS1, células de mieloma Sp2/0, e linhagens celulares BHK, dentre outras. Além disso, a expressão de anticorpos pode ser feita com o uso de células de hibridoma. Os méto- dos para a produção de hibridomas são bem estabelecidos na técnica.

[0490] As células transformadas com os vetores de expressão no presente documento descritos podem ser selecionadas, ou pode ser feita uma triagem para expressão recombinante dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação a antígeno no presente documento descritos. Células recombinantes positivas são expandidas e são selecionados os subclones que exibem um fenótipo desejado, como expressão de alto nível, propriedades de crescimento melhoradas ou a capacidade de produzir proteínas com características bioquímicas desejadas, por exemplo, devido à modificação na proteína ou às modificações altera- das pós-tradução. Esses fenótipos podem ser devidos às propriedades inerentes de um dado subclone ou a uma mutação. As mutações po-

dem ocorrer através do uso de produtos químicos, luz de comprimento de onda UV, radiação, vírus, mutagênese de inserção, inibição do re- paro de mau pareamento do DNA ou uma combinação desses méto- dos.

Composições farmacêuticas/Administração

[0491] A invenção fornece composições farmacêuticas que com- preendem os anticorpos da invenção no presente documento descritos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para uso terapêutico, os anticorpos da invenção podem ser preparados na forma de composi- ções farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do anticorpo co- mo um ingrediente ativo em um carreador farmaceuticamente aceitá- vel. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual o anticorpo da invenção é administrado. Tais ve- ículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amen- doim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, solução salina a 0,4% e glicina a 0,3% podem ser usadas. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particula- da. Elas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composi- ções podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitá- veis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, de estabilização, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração dos anticor- pos da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar, isto é, de menos de cerca de 0,5%, usualmente até ao menos cerca de 1%, até ou 20%, em peso, e pode ser selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administração selecionado. Veículos ade- quados e formulações adequadas, inclusive de outras proteínas hu-

manas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" páginas 691 a 1092, consulte especialmente as páginas 958 a 989.

[0492] O modo de administração para uso terapêutico dos anticor- pos da invenção pode ser qualquer via adequada que libere o anticor- po ao hospedeiro, como administração parenteral, por exemplo, intra- dérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, pulmonar, transmucosa(oral, intranasal, intravaginal, retal), usando uma formulação em comprimido, cápsula, solução, pó, gel, partícula; e contida dentro de uma seringa, um dispositivo implantado, uma bomba osmótica, um cartucho, uma microbomba; ou outro meio reconhecido pela pessoa versada na técnica, como é bem conhecido na técnica. À administração sítio-específica pode ser realizada, por exemplo, por aplicação intratumoral, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebe- lar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra- hepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, in- traperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, in- trarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrau- terina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

[0493] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, podem ser administrados a um indivíduo por qualquer rota adequada, por exemplo parenteralmente por infusão intravenosa (i.v.) ou injeção de bolus, infusão por via intravenosa (i.v.). intramuscular ou subcutânea ou intraperitoneal pode ser administrada por exemplo durante 15, 30, 60, 90, 120, 180, ou 240 minutos, ou de 1,

2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ou 12 horas.

[0494] A dose dada a um indivíduo é suficiente para aliviar ou ao menos parar parcialmente a doença sendo tratada ("quantidade tera- peuticamente eficaz") e pode ser, algumas vezes, ser de 0,005 mg a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, de cerca de 0,05 mg a cerca de 30 mg/kg ou de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg/kg, ou cerca de 4 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 16 mg/kg ou cerca de 24 mg/kg, ou, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg, mas pode ser ainda maior, por exemplo, cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg.

[0495] Uma dose de unidade fixa pode também ser administrada, por exemplo, 50, 100, 200, 500 ou 1000 mg, ou a dose pode ser com base na área superficial do paciente, por exemplo, 500, 400, 300, 250, 200 ou 100 mg/m2. Normalmente, entre 1 e 8 doses (por exemplo, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 ou 8) podem ser administradas para tratar o paciente, mas 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais doses podem ser dadas.

[0496] A administração dos anticorpos da invenção no presente documento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, pode ser repetida após um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma se- mana, duas semanas, três semanas, um mês, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses ou mais. Cursos de tratamento repetidos também são possíveis, assim como a administração crônica. A administração repetida pode ser na dose igual ou em uma dose diferente. Por exem- plo, os anticorpos da invenção no presente documento descritos po- dem ser administrados a 8 mg/kg ou a 16 mg/kg em intervalo semanal durante 8 semanas, seguido pela administração a 8 mg/kg ou a 16 mg/kg a cada duas semanas durante mais 16 semanas, seguido pela administração a 8 mg/kg ou a 16 mg/kg a cada quatro semanas por infusão intravenosa.

[0497] Por exemplo, os anticorpos nos métodos da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, podem ser fornecidos como uma dosagem diária em uma quantidade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em ao menos dentre o dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente, ao menos uma dentre a semana 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 após o início do tratamento, ou qualquer combinação dos mesmos, com o uso de doses únicas ou divididas a cada 24, 12, 8, 6, 4, ou 2 horas, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0498] Os anticorpos nos métodos da invenção no presente docu- mento descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, podem também ser adminis- trados profilaticamente de modo a reduzir o risco do desenvolvimento de câncer, retardar o início da ocorrência de um evento na progressão do câncer, e/ou reduzir o risco de recaída quando um câncer está em remissão.

[0499] Os anticorpos da invenção podem ser liofilizados para ar- mazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica mostrou-se eficaz com preparações de proteínas conven- cionais e as técnicas de reconstituição e de liofiização bem conheci- das na técnica podem ser utilizadas. Métodos de uso de anticorpos específicos para PSMA

[0500] PSMA é um antígeno de membrana celular relacionado ao câncer de próstata frequentemente superexpresso em neoplasia intra- epitelial prostática (PIN), uma condição em que algumas células da próstata começaram a parecer e se comportar anormalmente; em cân- ceres de próstata primário e metastático; e na neovasculatura de ou- tros tumores sólidos (por exemplo, de mama, de pulmão, de bexiga, de rim). A expressão de PSMA se correlaciona com a progressão da do- ença, e o escore de Gleason. A expressão de PSMA é aumentada na doença metastática, casos de refratário a hormônio, e em lesões de maior grau, e é ainda regulada positivamente em tumores insensíveis a andrógeno.

[0501] O bloqueio do PSMA pode inibir ou diminuir o crescimento de células cancerosas e tumores que expressam PSMA em um indiví- duo. Ele pode também ter atividade antiangiogênica devido a expres- são de PSMA em neovasculatura tumoral (Milowsky, et al. 2007). O PSMA é altamente expresso em neoplasia intraepitelial prostática, o precursor de carcinoma prostático mais estabelecido e, portanto, o bloqueio de PSMA pode modular a progressão de PIN para o câncer de próstata.

[0502] Uma modalidade da invenção no presente documento des- crita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nu- meradas mencionadas abaixo, é um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção.

[0503] Uma outra modalidade da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um método para inibir a formação ou crescimento de neovasculatura de um tumor em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da inven-

ção.

[0504] Uma outra modalidade da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um método para inibir a progres- são de um estado pré-canceroso em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção.

[0505] Uma modalidade da invenção no presente documento des- crita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nu- meradas mencionadas abaixo, é um método para tratar um câncer por administração ao indivíduo que necessita do mesmo do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção no presente documento descrita.

[0506] Uma modalidade da invenção no presente documento des- crita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nu- meradas mencionadas abaixo, é um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo bies- pecífico que se liga especificamente ao PSMA X CD3 da invenção.

[0507] Uma outra modalidade da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um método para inibir a formação ou crescimento de neovasculatura de um tumor em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA X CD3 da invenção.

[0508] Uma outra modalidade da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um método para inibir a progres- são de um estado pré-canceroso em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo que se liga especificamente ao PSMA X CD3 da invenção.

[0509] Uma outra modalidade da invenção no presente documento descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas mencionadas abaixo, é um método para câncer mediante a administração ao indivíduo que precisa do mesmo do anticorpo bies- pecífico que se liga especificamente ao PSMA X CD3 da invenção.

[0510] Anticorpos exemplificadores que podem ser usados nos métodos da invenção são os anticorpos que se ligam especificamente ao PSMA e os anticorpos] biespecíficos PSMA X CD3 conforme des- crito na presente invenção.

[0511] Os anticorpos de PSMA exemplificadores que podem ser monoespecíficos ou podem ser parte de um anticorpo biespecífico de CD3 são os anticorpos biespecíficos PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, e PSMB365, tendo a sequência de aminoácidos de VH e VL e as características conforme descrito na presente inven- ção.

[0512] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita é PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, e PSMB365. As sequências de aminoácidos de VH e VL desses anticorpos são mostradas na Tabela 2.

[0513] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0514] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 79 e a VL da SEQ ID NO: 78.

[0515] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 77 e a VL da SEQ ID NO: 78.

[0516] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76.

[0517] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0518] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 72 e a VL da SEQ ID NO: 73.

[0519] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0520] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do-

cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0521] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0522] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 60 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0523] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 68 e a VL da SEQ ID NO: 69.

[0524] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 70 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0525] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0526] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 142.

[0527] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 138 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0528] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0529] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0530] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 144.

[0531] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0532] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 142.

[0533] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 140 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0534] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 144.

[0535] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do-

cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 142.

[0536] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 139 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0537] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente ao PSMA usado nos métodos da invenção no presente do- cumento descrita compreende a VH da SEQ ID NO: 141 e a VL da SEQ ID NO: 143. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especifi- camente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descri- ta, compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0538] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/ CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especificamen- te a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descrita, compreende a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0539] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/ CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especificamen- te a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descrita, compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0540] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/ CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especificamen- te a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descrita, compreende a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0541] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/ CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especificamen- te a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descrita, compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0542] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico PSMA/ CD3 que compreende um primeiro domínio que se liga especificamen- te a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 usado nos métodos da invenção no presente documento descrita, compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65 no primeiro domínio, e a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 no segundo domínio.

[0543] O câncer pode ser uma condição ou distúrbio hiperprolifera- tivo, um tumor sólido, uma neovasculatura, um tumor de tecido mole, ou uma lesão metastática.

[0544] O termo "câncer" destina-se a incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastá- ticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, independentemente do tipo de histopatologia ou estágio de invasivida- de. Exemplos de cânceres incluem tumores sólidos, malignidades he- matológicas, tumores de tecido mole e lesões metastáticas. Os tumo-

res sólidos exemplificadores incluem malignidades, por exemplo, sar- comas e carcinomas (incluindo adenocarcinomas e carcinomas de cé- lulas escamosas) dos vários sistemas de órgãos, como aqueles que afetam o fígado, pulmões, mama, linfoide, trato gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato genitourinário (por exemplo, células renais, uro- teliais), próstata e faringe. Os adenocarcinomas incluem malignidades, como a maioria dos cânceres de cólon, câncer retal, carcinoma de cé- lulas renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer do esôfago. Os carcino- mas de células escamosas incluem malignidades, por exemplo, nos pulmões, esôfago, pele, região da cabeça e pescoço, cavidade oral, ânus e colo do útero.

[0545] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de prósta- ta.

[0546] As lesões metastáticas dos cânceres anteriormente menci- onados podem também ser tratadas ou impedidas com o uso dos mé- todos e anticorpos da invenção no presente documento descrita.

[0547] Os cânceres exemplificadores cujo crescimento pode ser inibido ou reduzido com o uso dos anticorpos da invenção no presente documento descrita incluem cânceres que podem superexpressar PSMA. Cânceres exemplificadores incluem um câncer de próstata ou neoplasia intraepitelial prostática, um câncer colorretal, um câncer gás- trico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células escamosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer renal, um distúrbio neovascular, um carcinoma renal de células claras (CCRCC), e um câncer pancreático e vários outros cânceres não prostáticos, incluindo, mas não se limi- tando a, um câncer renal, um câncer urotelial ou um adenocarcinoma no fígado. As malignidades refratárias ou recorrentes podem ser trata- das com o uso dos anticorpos da invenção no presente documento descritos.

[0548] Outros cânceres exemplificadores que podem ser tratados com os anticorpos da invenção no presente documento descrita são câncer anal, um carcinoma basocelular, um câncer do trato biliar, cân- cer de bexiga, câncer ósseo, cânceres cerebrais e do SNC, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, me- lanoma cutâneo ou intraocular maligno, câncer astro-esofágico, câncer testicular, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer retal, câncer uterino, linfoma do SNC primário; uma neoplasia do sistema nervoso central (SNC), câncer cervical, coriocarcinoma, câncer retal, câncer de tecido conjuntivo, câncer do sistema digestivo, câncer endometrial, câncer de olho; uma neoplasia intra-epitelial, câncer renal, câncer de laringe, câncer de fígado; câncer de pulmão de pequenas células, neu- roblastoma, câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe), câncer nasofaríngeo, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer do sistema respiratório, sarcoma, câncer de tireoide, câncer do sistema urinário, hepatocarcinoma, câncer da região anal, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, uma angiogênese tumoral, um tumor do eixo espinhal, um glioma do tronco cerebral, um adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer de células de Merkel, um câncer epidermoide, câncer de células escamo- sas, cânceres induzidos ambientalmente, incluindo os induzidos por asbesto, bem como outros carcinomas e sarcomas e combinações dos referidos cânceres.

[0549] Os pacientes que têm câncer incluindo câncer metastático que expressam PSMA podem ser tratados com os anticorpos da in- venção no presente documento descrita. O câncer pode ser um câncer de próstata ou uma neoplasia intraepitelial prostática, um câncer color- retal, um câncer gástrico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células es- camosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer renal, um dis- túrbio neovascular, um carcinoma renal de células claras (CCRCC), e um câncer pancreático e vários outros cânceres não prostáticos, inclu- indo, mas não se limitando a, um câncer renal, um câncer urotelial ou um adenocarcinoma no fígado.

[0550] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o indivíduo tem um tumor só- lido.

[0551] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o indivíduo tem um tumor da próstata.

[0552] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer colorretal.

[0553] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer gástrico.

[0554] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer de pulmão.

[0555] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali-

dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer de bexiga.

[0556] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um carcino- ma de células escamosas.

[0557] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o câncer é carcinoma renal de células claras (CCRCC).

[0558] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer de mama.

[0559] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é glioma.

[0560] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é câncer de próstata ou câncer de próstata resistente à castração.

[0561] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer renal.

[0562] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer pancreático.

[0563] Em algumas modalidades da invenção no presente docu-

mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um adeno- carcinoma do fígado.

[0564] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades nume- radas mencionadas abaixo, o câncer é um neovascular.

[0565] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o câncer é câncer renal.

[0566] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer urotelial.

[0567] Em algumas modalidades da invenção no presente docu- mento descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modali- dades numeradas mencionadas abaixo, o tumor sólido é um câncer cerebral.

[0568] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o indivíduo tem um tumor que expressa PSMA.

[0569] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o indivíduo tem linfócitos T infiltrantes de tumor (TILs) no tecido tumoral.

[0570] "Maior aumentado" se refere a um aumento estatisticamen- te significativo em um indivíduo quando comparado a um controle. "Número aumentado", por exemplo, se refere a um aumento estatisti- camente significativo no número de TlLs em um indivíduo (por exem- plo, paciente) pré e pós-tratamento com um anticorpo para PSMA ou outro agente terapêutico.

[0571] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o indivíduo tem maior expressão ou atividade de interferon gama

(IFN-y).

[0572] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o indivíduo foi tratado com um anticorpo anti-PSMA.

[0573] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, o indivíduo é refratário ao tratamento com o anticorpo anti-PSMA.

[0574] Qualquer um dos anticorpos para PSMA ou biespecíficos para PSNA X CD3 da invenção no presente documento descritos pode ser usado nos métodos da invenção.

[0575] Os anticorpos e fragmento dos mesmos, conforme no pre- sente documento descritos, podem também ser administrados em te- rapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes terapêu- ticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequen- temente, em uma modalidade, o medicamento contendo o anticorpo é para combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, como um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é um agente radiofármaco (como cloreto de rádio- 223), terapias hormonais secundárias (como abiraterona ou enzaluta- mida), e/ou quimioterapias (docetaxel e cabazitaxel). Essa administra- ção combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial, em qualquer ordem. Para administração simultânea, os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições sepa- radas, conforme adequado, um agente quimioterápico (por exemplo, docetaxel, carboplatina, fludarabina), abiraterona, terapia hormonal (por exemplo, flutamida, bicalutamida, nilutamida, acetato de ciprote- rona, cetoconazol, aminoglutetimida, abarelix, degarelix, leuprolida, goserelina, triptorelina, buserelina, ARN-509), inibidor de serina- quinase ou de tirosina-quinase (por exemplo, inibidor de Pl3-quinase SF1126) (por exemplo, lapatanibe), inibidor de multiquinase (por exemplo, sorafenibe, sunitinibe), inibidor de VEGF (por exemplo, be- vacizumabe), TAK-700, vacina contra câncer (por exemplo, BPX-101,

PEP223), vacina à base de Listeria, lenalidomida, TOK-001, inibidor do receptor de IGF-1 (por exemplo, cixutumumabe), TRC105, inibidor da Aurora quinase A (por exemplo, MLN8237) inibidor de proteassomas (por exemplo, bortezomibe), OGX-011, radioimunoterapia (por exem- plo, HuJ591-GS), inibidor de HDAC (por exemplo, ácido valproico, SB939, LBH589), hidroxicloroquina, inibidor de mMTOR (por exemplo, everolimo), lactato de dovitinibe, di-indolilmetano, efavirenz, OGX-427, genisteína, IMC-3G3, bafetinibe, CP-675206, radioterapia, cirurgia ou uma combinação dos mesmos.

[0576] Em uma modalidade, é fornecido um método para o trata- mento de um distúrbio envolvendo células que expressam PSMA em um indivíduo, sendo que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmen- to multiespecífico, como um anticorpo biespecífico para PSMA x CD3 no presente documento descrito, e radioterapia, a um indivíduo que necessita da mesma. Em uma modalidade, é fornecido um método pa- ra o tratamento ou a prevenção de câncer, sendo que o método com- preende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento multiespecífico, como um anticorpo para PSMA x CD3 no presente documento descrito, e radioterapia a um in- divíduo que necessita da mesma. A radioterapia pode compreender radiação ou a administração associada de radiofármacos a um pacien- te é fornecida. A fonte de radiação pode ser externa ou interna para um paciente sendo tratado (o tratamento por radiação pode, por exemplo, ser sob a forma de radioterapia de feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Os elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem rádio, césio-137, irídio-192, amerí- cio-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo- 131 e índio-111.

[0577] Os anticorpos da invenção no presente documento descri-

tos podem ser administrados em combinação com uma vacina.

[0578] As vacinas exemplificadoras são agentes imunogênicos, como células cancerosas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas recombinantes, epítopos de antígeno, peptídeos e moléculas de carboidrato), antígenos tumorais liberados a um paciente através de terapia gênica, células e células transfectadas com genes que codi- ficam citocinas estimuladoras do sistema imune. As vacinas exemplifi- cadoras que podem ser usadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, como peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células tumorais transfectadas para ex- pressar a citocina GM-CSF, vacinas à base de DNA, vacinas à base de RNA, vacinas à base de Listeria e vacinas baseadas em transdu- ção viral, peptídeos ou antígenos de próstata (por exemplo, PSMA, STEAP1, PSCA), a vacina contra câncer, sipuleucel-T ou peptídeos de antígenos de câncer de pulmão. A vacina contra o câncer pode ser profilática ou terapêutica.

[0579] Foram concebidas muitas estratégias experimentais para a vacinação contra tumores (ver Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, Livro educativo ASCO Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, Li- vro educativo ASCO Spring: 414-428; Foon, K. 2000, Livro educativo ASCO Spring: 730-738; consulte também Restifo, N. e Sznol, M., Can- cer Vaccines, Cap. 61, p. 3023-3043 em DevVita, V. et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Quinta edição). Em uma dessas estratégias, uma vacina é preparada com o uso de células tu- morais autólogas ou alogênicas. Essas vacinas celulares mostraram- se mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. Foi mostrado que GM-CSF é um potente ativador da apresentação de antígeno para vacinação contra o tumor (Dranoff et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90: 3539-43).

[0580] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos podem ser administrados em combinação com um ou uma coleção de proteínas recombinantes e/ou peptídeos expressos em ou sobre um tumor para gerar uma resposta imunológica a essas proteínas. Es- tas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imune como auto- antígenos e são, portanto, tolerantes a elas. O antígeno tumoral pode também incluir a proteína de telomerase, que é necessária para a sín- tese de telêmeros de cromossomos e que é expressa em mais de 85% dos cânceres humanos e em apenas um número limitado de tecidos somático (Kim et a/., (1994) Science 266: 2011-2013). Os antígenos tumorais podem também ser "neo-antígenos" expressos em ou sobre células cancerosas como resultado de mutações somáticas que alte- ram a sequência de proteínas ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (por exemplo, bcr-abl no cromossomo Filadélfia), ou idiotipo de tumores de célula B. Os antígenos tumorais podem ser epítopos antigênicos do antígeno específico da próstata (PSA), mesotelina, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), sarcoma sinovial X2 (SSX2), NKX3.1, fosfatase ácida prostá- tica (PAP) ou receptores do fator de crescimento epidérmico, ou peptí- deos específicos para variantes de EGFR, como o bem conhecido EGFRvIII superexpresso em células tumorais.

[0581] Outras vacinas tumorais podem incluir as proteínas de vírus implicados em cânceres humanos como vírus de papiloma humano (HPV), vírus da hepatite (HBV e HCV) e herpes vírus do Sarcoma de Kaposi (KHSV) e vírus Epstein Barr (EBV). Uma outra forma de antí- genos específicos de tumor que podem ser usados em combinação com os anticorpos da invenção no presente documento descritos são as proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. As HSP contêm fragmentos de proteínas das células tu- morais e são altamente eficientes na liberação a células apresentadoras de antígenos para induzir imunidade tumoral (Suot e Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et a/., (1997) Science 278:117-120).

[0582] As células dendríticas (DC) são potentes células apresen- tadoras de antígeno que podem ser usadas para iniciar respostas es- pecíficas para o antígeno. As células dentríticas podem ser produzidas ex vivo e carregadas com vários antígenos de proteína e peptídeo bem como extratos de célula tumoral (Nestle et a/., (1998) Nature Medicine 4: 328-332). As células dentríticas podem também ser transduzidas por meios genéticos para expressar esses antígenos tumorais. As cé- lulas dentríticas foram também diretamente fundidas às células tumo- rais para os propósitos de imunização (Kugler et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como um método de vacinação, a imunização com células dentríticas pode ser efetivamente combinada com os anti- corpos da invenção no presente documento descritos para ativar res- postas antitumorais mais potentes.

[0583] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos que se ligam especificamente ao PSMA da invenção ou os anticorpos biespecíficos para PSMA X CD3 da invenção são administrados em combinação com uma vacina tumoral que compre- ende um fragmento de peptídeo de antígeno específico da próstata, ou um vetor que codifica o fragmento de peptídeo do antígeno específico da próstata.

[0584] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos podem ser administrados em combinação com um tratamento de câncer como padrão de cuidado.

[0585] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos podem ser administrados em combinação com um tratamento pa- drão de regime quimioterápico para o câncer. Nesses casos, pode ser possível reduzir a dose do reagente quimioterápico administrado (Mokyr et a/., (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).

[0586] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combina- ção com uma ou mais de outras moléculas de anticorpo, quimiotera- pia, outra terapia anti-câncer (por exemplo, terapias anti-câncer direci- onadas, ou fármacos oncolíticos), agentes citotóxicos, citocinas, pro- cedimentos cirúrgicos e/ou de radiação.

[0587] Os agentes citotóxicos exemplificadores que podem ser administrados em combinação com os anticorpos da invenção no pre- sente documento descritos incluem inibidores hormonais, agentes an- timicrotúbulos, inibidores de topoisomerase, antimetabólitos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcalóides da vinca, agentes intercalantes, agentes capazes de interferir com uma rota de transdução de sinal, agentes que promovem a apoptose, inibidores de proteossoma e radi- ação (por exemplo, irradiação de corpo local ou total).

[0588] Agentes terapêuticos com padrão de cuidado incluem anas- trozol (ArimidexO), bicalutamida (CasodexO), sulfato de bleomicina (BlenoxaneO), bussulfano (MyleranO), injeção de bussulfano (Busul- fexO), capecitabina (Xeloda&), N4-pentoxicarbonil-5-deoxi-5-fluorociti- dina, carboplatina (Paraplatin&O), carmustina (BICNUG), clorambucil (LeukeranO), cisplatina (PlatinolO), cladribins (LeustatinO), ciclofosfa- mida (CytoxanO ou NeosarO), citarabina, citosina-arabinosídeo (Cyto- sar-UO), injeção de citarabina lipossomal (DepoCytO), dacarbazina (DTIC-DomeO), dactinomicina (Actinomycin D, Cosmegan), cloridrato de daunorubicina (CerubidineO), imjeção de citrato de daunorubicina lipossomal (DaunoXomeGO), dexametasona, docetaxel (TaxotereO), cloridrato de doxorubicina (AdriamycinO, RubexO), etoposideo (Vepe- sidO), fosfato de fludarabina (FludaraO), 5-fluorouracil (AdrucilO, Efu- dexO), flutamida (EulexinO), tezacitibina, gemcitabinea(difluorodeoxi- citidinae), hidroxiureia (HydreaO), idarubicina (IdamycinO), ifosfamida (IFEXO), irinotecano (CamptosarO), L-asparaginase (ELSPARO), leu-

covorina cálcica, melfalano (Alkeran&O), 6-mercaptopurina (Purine- tholO), metotrexato (Folex6&), mitoxantrona (NovantroneO), milotarg, paclitaxel (TaxolO), phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, poli- feprosano 20 com implante de carmustina (GliadelO), citrato de tamo- xifeno (NolvadexO), teniposídeo (VumonO), 6-tioguanina, tiotepa, tira- pazamina (TirazoneO), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamp- tin&), vinblastina (VelbanO), vincristina (OncovinO), vinorelbina (Na- velbineO), ibrutiniba, idelalisibe, e brentuximabe vedotina.

[0589] Agentes alquilantes exemplificadores incluem, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila, nitrosou- reias e triazenos: mostarda uracila (Aminouracil MustardO, Chloretha- minacilêO, Demethyldopan&, Desmethyldopano, Haemanthamine€&, NordopanG, Uracil Nitrogen MustardO, UracillostO&, UracilmostazaO, UramustinO, UramustineG), (MustargenO), ciclofosfamida (CytoxanO, NeosarO, ClafenO, EndoxanO, Procytox&, RevimmuneTY), ifosfamida (Mitoxana€), melfalano (Alkeran&O), Chlorambucil (LeukeranO), pipo- bromano (AmedelG, VercyteO), trietilenomelamina (Hemel6O, Hexa- lenO, HexalenO, HexastatO), trietilenotiofosforamina, Temozolomida (TemodarO), tiotepa (ThioplexO&O), bussulfano (Busilvex6&, MyleranO), carmustina (BICNUG), lomustina (CeeNUGO), estreptozocina (Zano- sarO), e dacarbazina (DTIC-DomeO). Agentes alquilantes exemplifica- dores adicionais incluem oxaliplatina (Eloxatin&O); temozolomida (Te- modar? e TemodalO); dactinomicina(também conhecido como actino- micina-D, Cosmegen6); melfalano (também conhecido como L- Pamela, L- sarcolisina, e mostarda fenilalanina, AlkeranO); altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenO); carmustina (BICNUG); bendamustina (TreandaO); bussulfano (Busul- fex6 e MyleranO); carboplatina (ParaplatinaO); lomustina (também co- nhecido como CCNU, CeeNUG); cisplatin (tambfem conhecido como CDDP, Platinol& e Platinol&-AQ); clorambucil (LeukeranGO); ciclofos-

famida (CytoxanO e NeosarO); dacarbazina (também conhecida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC-DomeG6); altretamina (tam- bém conhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenGO); ifosfami- da (Ifex6&); prednumustina; procarbazina (MatulaneO6); mecloretamina (também conhecido como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridrato de mecloroetamina, MustargenO); estreptozocina (ZanosarO); tiotepa (também conhecido como tiofosfamida, TESPA e TSPA, ThioplexO); ciclofosfamida (EndoxanO, Cytoxano, NeosarO, ProcytoxO, Re- vimmune6O); e bedamustina HCI (Treanda€).

[0590] As antraciclinas exemplificadoras incluem, por exemplo, doxorrubicina (Adriamycin& e RubexO); bleomcina(LenoxaneO); dau- norrubicina (cloridrato de dauorrubicina, daunomicina, e cloridrato de rubidomicina, Cerubidine&); daunorubicina lipossomal (citrato de dau- norubicina lipossomal, DaunoXomeG6); mitoxantrona (DHAD, Novan- troneO); epirubicina (Ellence'”); idarubicina (IdamycinO&O, Idamycin PFSQO); mitomicina C (MutamycinO); geldanamicina; herbimicina; ravi- domicina; e desacetilravidomiíicina.

[0591] Alcaloides da vinca exemplificadores que podem ser usa- dos em combinação com os anticorpos da invenção incluem tartarato de vinorelbina (NavelbineO), Vincristine (OncovinO), e Vindesina (Eldi- sineG); vinblastina (também conhecida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina e VLB, Alkaban-AQO e VelbanO); e vinorelbina (NavelbineO).

[0592] Os inibidores de proteossoma exemplificadores que podem ser usados em combinação com os anticorpos da invenção sozinhos ou em combinação com um outro imunomodulador são bortezomibe (VelcadeO); carfilzomibe (PX-171-007, (S)-4-metil-N—((S)-1-(((S)-4- metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-0x0-3- fenilpropan-2-y1)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)- pentanamida); marizomibe (NPI-0052); citrato de ixazomibe (MLN-

9708); delanzomibe (CEP-18770); e O-metil-N-[(2-metil-5-tiazolil) car- bonil]-L-seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-0x0-1-(fenil- metil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

[0593] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de serina-quinase ou de tirosina-quinase (por exemplo, um inibidor do receptor de tirosina-quinase (RTK)). O inibidor de tirosina quinase exemplificador inclui um inibidor da via do fator de crescimen- to epidérmico (EGF) (por exemplo, um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)), um inibidor da via do fator de cres- cimento endotelial vascular (VEGF) (por exemplo, um inibidor do re- ceptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) (por exemplo, um inibidor de VEGFR-1, um inibidor de VEGFR-2, um inibi- dor de VEGFR-3), um inibidor da via do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (por exemplo, um inibidor do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) (por exemplo, inibidor de PDGFR-B), um inibidor de RAF-1, um inibidor de KIT e um inibidor de RET. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é axiti- nibe (AG013736), bosutinibe (SKI-606), cediranibe (RECENTIN 7Y, AZD2171), dasatinibe (SPRYCELGO, BMS-354825), erlotinibe (TAR- CEVAG), gefitinibe (IRESSAGO), imatinibe (Gleevec&, CGP57148B, STI-571), lapatinibe (TYKERBO, TYVERBO), lestaurinibe (CEP-701), neratinibe (HKI-272), nilotinibe (TASIGNAG), semaxanibe (semaxinibe, SUB5416), sunitinibe (SUTENTO, SU11248), toceranibe (PALLADIAG), vandetanibe (ZACTIMAG, ZD6474), vatalanibe (PTK787, PTK/ZK), trastuzumabe (HERCEPTINO), bevacizumabe (AVASTINO), rituxima- be (RITUXANO), cetuximabe (ERBITUX O), panitumumabe (VECTI- BIXO), ranibizumabe (LucentisO), nilotinibe (TASIGNAG), sorafenibe (NEXAVARO), alentuzumabe (CAMPATHO), gemtuzumabe ozogami- cina (MYLOTARGO), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, lactato de dovi-

tinibe (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOKTY), SGX523, PF- 04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEFO), AP24534, JNJ-26483327, MGCDZ265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, tivozanibe (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, XL228, AEE788, AG-490, AST-6, BMS- 599626, CUDC-101, PD153035, pelitinibe (EKB-569), vandetanibe (zactima), WZ3146, WZ4002, WZ8040, ABT-869 (linifanibe), AEE7T88, AP24534 (ponatinibe), AV-951 (tivozanibe), axitinibe, BAY 73-4506 (regorafenibe), alaninato de brivanibe (BMS-582664), brivanibe (BMS- 540215), cediranibe (AZD2171), CHIR-258 (dovitinibe), CP 673451, CYC116, E7080, Ki8751, masitinibe (AB1010), MGCD-265, difosfato de motesanibe (AMG-706), MP-470, OSI-930, cloridrato de pazopani- be, PD173074, tosilato de Sorafenibe (Bay 43-9006), SU 5402, TSU- 68 (SU6668), vatalanibe, XL880 (GSK1363089, EXEL-2880). Os inibi- dores de tirosina quinase selecionados são escolhidos dentre sunitini- be, erlotinibe, gefitinibe ou sorafenibe. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é um anticorpo biespecífico para EGFRc-Met (mAb EM-1) que compreende as cadeias leves e as cadeias leves das SEQ ID Nos:249, 250, 251 e 252 (US2014/0141000).

[0594] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com os inibidores do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo (AvastinO), axiti- nibe (InlytaG); alaninato de brivanibe (BMS-582664, (S)—((R)-1-(4-(4- fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-S-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6- iloxi)propan-2-il)2-aminopropanoato); sorafenibe (NexavarO); pazopa- nibe (Votrient&); malato de sunitinibe (SutentO); cediranibe(AZD2171, CAS 288383-20-1); vargatef (BIBF1120, CAS 928326-83-4); foretinibe (GSK1363089); telatinibe (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); apatinibe (YN968D1, CAS 811803-05-1); imatinibe (Gleevec6); ponatinibe (AP24534, CAS 943319-70-8); tivozanibe (AV951, CAS 475108-18-0);

regorafenibe (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); dicloridrato devatala- nibe (PTK787, CAS 212141-51-0); brivanibe (BMS-540215, CAS 649735-46-6); vandetanib (Caprelsa& ou AZD6474); difosfato de mo- tesanibe (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-di-hidro-3,3-dimetil-1H- indol-6-i1)-2-[(4-piridinilmetil)amino]-3-piridinocarboxamida, descrito na publicação PCT nº WO 02/066470); Ácido dilático de dovitinibe (TKI258, CAS 852433-84-2); linifanibe (ABT869, CAS 796967-16-3); cabozantinibe (XL184, CAS 849217-68-1); lestaurtinibe (CAS 111358- 88-4); N-[5-[[[5-(1,1-Dimetiletil)-2-oxazolil]metil]Jtio]-2-tiazolil]-4-piperidi- nacarboxamida (BMS38703, CAS 345627-80-7); (38R,4R)-4-Amino-1- ((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)|metil )piperidin-3- ol (BMS690514); N-(3,4-Dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[((3aa,5B8,6aa) -octa-hidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]Jmetoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); 4-Metil-3-[[1-metil-6-(3-piridinil)-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidin-4-ilJamino]-N-[3-(trifluorometil)fenil]-benzamida (BHG712, CAS 940310-85-0); e aflibercept (EyleaO).

[0595] Os inibidores de VEGF exemplificadores incluem um anti- corpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo mono- clonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709; um anticorpo monoclonal recombinante anti-VEGF humanizado gerado de acordo com Presta et al., (1997) Cancer Res 57: 4593-4599. Em uma modalidade, o anticorpo anti-VEGF é bevacizumabe (BV), tam- bém conhecido como rhuMAb VEGF ou AVASTINO. Ele compreende regiões framework de IgG1 humana mutadas e regiões de determina- ção de complementaridade de ligação ao antígeno do anticorpo mono- clonal anti-hnVEGF de murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação do VEGF humano aos seus receptores. O bevacizumabe e outros anticorpos anti- VEGF humanizados são descritos com mais detalhes na patente US nº 6.884.879. Anticorpos anti-VEGF adicionais incluem os anticor- pos da série G6 ou B20 (por exemplo, G6-31, B20-4.1), conforme des-

crito nas publicações de patentes internacionais nºs WO2005/012359 e WO2005/044853. Para anticorpos adicionais consulte as patentes US nºs 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020, 6.054.297, WO98/45332, WO 96/30046, WOS94/10202, EP 0666868B1, as publicações de patentes internacionais nºs US2006009360, US20050186208, US20030206899, US20030190317, US20030203409, e US20050112126; e Popkov et al., (2004) Journal of Immunological Methods 288: 149-164. Outros anticorpos incluem aqueles que se ligam a um epítopo funcional em VEGF compreendendo os resíduos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103, e C104 ou, alternativamente, compreendendo os re- síduos F17, Y21, 022, Y25, D63, 183 e Q89.

[0596] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de PISK. Em uma modalidade, o inibidor de PI3K é um ini- bidor das isoformas delta e gama de PI3K. Em uma outra modalidade, o inibidor de PI3SK é um inibidor das isoformas beta de PI3K. Exemplos de inibidores de PI3SK que podem ser usados são descritos, por exem- plo, em WO 2010/036380, WO 2010/006086, WO 09/114870, WO 05/113556, GSK 2126458, GDC-0980, GDC-0941, Sanofi XL147, XL756, XL147, PF-46915032, BKM 120, CAL-101, CAL 263, SF1126, PX-886, e um inibidor de PISK duplo (por exemplo, Novartis BEZ235).

[0597] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de mMTOR, por exem- plo, um ou mais inibidores de MTOR escolhidos a partir de um ou mais dentre rapamicina, temsirolímus (TORISELO), AZD8055, BEZ235, BGT226, XL765, PF-4691502, GDC0980, SF1126, OSI-027, GSK1059615, KU-0063794, WYE-354, Palomid 529 (P529), PF- 04691502, ou PKI-587, ridaforolimus (anteriormente conhecido como deferolimus, (1R,2R,48)-4-[(2R)-2 [(1R,98,128,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,287Z,30S,32S,35R)-1,18-di-hidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,

21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo [30.3.1.04,9] dimetilfosfinato de hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12- illpropil]-2-metoxiciclo-hexila, também conhecido como AP23573 e MK8669, e descrito na publicação PCT nº WO 03/064383); everolimus (Afinitor& ou RADO01); rapamicina (AY22989, SirolimusO); simapimo- de (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-(2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4- illpirido[2,3-d]pirimidin-7-il)-2-metoxifenil) metanol (AZD8055); 2-Amino- 8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclo-hexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-piri- do[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PFO4691502, CAS 1013101-36-4); E N2- [1 ,4-diox0-4-[[4-(4-0x0-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il) morfolínio-4-il] me- toxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-serina- (SEQ ID NO: 237), sal inter- no (SF1126, CAS 936487-67-1), e XL765.

[0598] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de BRAF, por exemplo, GSK2118436, RG7204, PLX4032, GDC-0879, PLX4720, e tosilato de sorafenibe (Bay 43-9006).

[0599] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um agente imunomodulatório. Ponto de verificação imunológico de di- recionamento como morte celular programada proteína 1 (PD1), ligan- te 1 de morte celular programada 4 (PDL1) e antígeno de linfócito-T citotóxicos 4 (CTLA4) tem alcançado notável benefício em múltiplos cânceres mediante o bloqueio de sinais imunoinibitórios e permitindo que os doentes produzam uma resposta antitumoral eficaz. Em algu- mas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um anti-PD1i(por exemplo, nivolumabe), anti-PDL (por exemplo, MDX-1105) ou anti-CTLA4 (por exemplo, ipilimumabe). A capacidade de anticorpos agonísticos CD40 (chamados de a CD40) ou de ligante CD40 para estimular respostas imunes e direcionar tu- mores sugere que tais reagentes têm promessa como agentes imuno-

terapêuticos contra câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um anti-CD40 (por exemplo, SGN-40, CP-870.893) ou anti-CD40L (por exemplo, BG9588).

[0600] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de MEK.

[0601] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção administrados em combinação com o inibidor de MEK são usados no tratamento de um câncer de próstata, um melanoma, um câncer colorretal, um câncer de pulmão de células não pequenas, um câncer de ovário, um câncer de mama, um câncer de próstata, um câncer pancreático, uma malignidade hematológica ou um carcinoma de células renais. Em certas modalidades, o tecido tu- moral ou célula cancerosa tem uma mutação BRAF (por exemplo, uma mutação BRAF V600E), uma mutação de BRAF de tipo selvagem, uma mutação de KRAS de tio selvagem ou uma mutação KRAS ativa- dora. O câncer pode estar em um estágio inicial, intermediário ou final. Qualquer inibidor de MEK pode ser usado em combinação incluindo ARRY-142886, G02442104 (também conhecido como GSK1120212), RDEA436, RDEA119/BAY 869766, AS703026, G0O0039805 (também conhecido como AZW-6244 ou selumetinibe), BIX 02188, BIX 02189, CI-1040 (PD-184352), PDO325901, PD98059, U0 126, GDC-0973 (Me- tanona, [3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodofenil)amino]fenil][3-hidroxi-3- (25)-2-piperidinil-1-azetidinil]-), G-38963, G02443714 (também conhe- cido como AS703206), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo. Exemplos adicionais de inibidores de MEK são descri- tos em WO 2013/019906, WO 03/077914, WO 2005/121142, WO 2007/04415, WO 2008/024725 e WO 2009/085983.

[0602] Em algumas modalidades no presente documento descri-

tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um inibidor de JAK2, por exemplo, CEP-701, INCB18424, CP-690550 (tasocitinibe).

[0603] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com paclitaxel ou um agente de paclitaxel, por exemplo, TAXOLO, paclita- xel ligado à proteína (por exemplo, ABRAXANEOG). Agentes de paclita- xel exemplificadores incluem paclitaxel ligado à albumina em nanopar- tículas (ABRAXANE, comercializado por Abraxis Bioscience), paclita- xel ligado ao ácido docosa-hexaenóico (DHA-paclitaxel, Taxoprexin, comercializado por Protarga), paclitaxel ligado ao poliglutamato (PG- paclitaxel, paclitaxel poligiumex, CT-2103, XYOTAX, comercializado por Cell Therapeutic), o pró-fármaco ativado por tumor (TAP), ANG105 (Angiopep-2 ligado a três moléculas de paclitaxel, comercializado por ImmunoGen), paclitaxel-EC-1 (paclitaxel ligado ao peptídeo EC-1 re- conhecedor de erbB2-1; consulte Li et al., Biopolymers (2007) 87:225- 230), e paclitaxel conjugado à glicose (por exemplo, metil 2-glucopira- nosil succinato de 2'-paclitaxel, consulte Liu et a/., (2007) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 17:617-620).

[0604] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com imunoterapia celular (por exemplo, Provenge (por exemplo, Sipuleu- cel)) e, opcionalmente, em combinação com ciclofosfamida.

[0605] Outros agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usados em combinação com os anticorpos da invenção para tra- tamento de um câncer de próstata incluem um agente quimioterápico (por exemplo, docetaxel, carboplatina, fludarabina), abiraterona, tera- pia hormonal (por exemplo, flutamida, bicalutamida, nilutamida, aceta- to de ciproteronae, cetoconazole, aminoglutetimida, abarelix, degarelix, leuprolida, goserelina, triptorelina, buserelina, inibidor de tirosina-

quinase (por exemplo, inibidor de quinase dupla (por exemplo, lapata- nibe), inibidor de multiquinase (por exemplo, sorafenibe, sunitinibe), inibidor de VEGF (por exemplo, bevacizumabe), TAK-700, vacina con- tra câncer (por exemplo, BPX-101, PEP223), lenalidomida, TOK-001, inibidor do receptor de IGF-1 (por exemplo, cixutumumabe), TRC105, inibidor da Aurora quinase A (por exemplo, MLN8237) inibidor de pro- teassomas (por exemplo, bortezomibe), OGX-011, radioimunoterapia (por exemplo, HuJ591-GS), inibidor de HDAC (por exemplo, ácido val- proico, SB939, LBH589), hidroxicloroquina, inibidor de mMTOR (por exemplo, everolimo), lactato de dovitinibe, di-indolilmetano, efavirenz, OGX-427, genisteína, IMC-3G3, bafetinibe, CP-675206, ARN-509, ra- dioterapia, cirurgia ou uma combinação dos mesmos.

[0606] Os agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usados em combinação com os anticorpos da invenção para tratamen- to de câncer pancreático incluem um agente quimioterápico, por exemplo, paclitaxel ou um agente de paclitaxel como TAXOL, uma formulação de paclitaxel de nanopartículas estabilizadas por albumina (por exemplo, ABRAXANE) ou uma formulação de paclitaxel liposso- mal); gencitabina (por exemplo, gencitabina sozinha ou em combina- ção com AXP107-11); outros agentes quimioterápicos como oxaliplati- na, 5-fluorouracila, capecitabina, rubitecano, cloridrato de epirrubicina, NC-6004, cisplatina, docetaxel (por exemplo, TAXOTERE), mitomicina C, ifosfamida; interferon inibidor de tirosina quinase (por exemplo, ini- bidor de EGFR (por exemplo, erlotinibe, panitumumabe, cetuximabe, nimotuzumabe); inibidor do receptor de HER2/neu (por exemplo, tras- tuzumabe); inibidor de quinase dupla (por exemplo, bosutinibe, saraca- tinibe, lapatinibe, vandetanibe); inibidor de multiquinase (por exemplo, sorafenibe, sunitinibe, XL184, pazopanibe); inibidor de VEGF (por exemplo, bevacizumabe, AV-951, brivanibe); Radioimunoterapia (por exemplo, XR303); vacina contra o câncer (por exemplo, GVAX, peptí-

deo de survivina); Inibidor da COX 2 (por exemplo, celecoxibe); Inibi- dor do receptor de IGF-1 (por exemplo, AMG 479, MK-0646); inibidor de mTOR (por exemplo, everolímus temsirolímus); inibidor de IL-6 (por exemplo, CNTO 328); inibidor de quinase dependente de ciclina (por exemplo, P276-00, UCN-01); composto direcionado ao metabolismo com alteração de energia (AEMD) (por exemplo, CPI-613); Inibidor de HDAC (por exemplo, vorinostato); Agonista do receptor de TRAIL 2 (TR 2) (por exemplo, conatumumabe); Inibidor de MEK (por exemplo, ASTO3026, GSK1120212); inibidor de quinase dupla Raíf/MEK (por exemplo, RO5126766); inibidor de sinalização de entalhe (por exem- plo, MK0752); proteína de fusão de anticorpo-anticorpo monoclional (por exemplo, L19IL2); curcumina; inibidor de HSP90 (por exemplo, tanespimicina, STA-9090); riL-2; denileucina diftitox; inibidor de to- poisomerase 1 (por exemplo, irinotecano, PEPO02); estatina (por exem- plo, sinvastatina); inibidor de fator Vila (por exemplo, PClI-27483); ini- bidor de HDAC (por exemplo,RX-0201); pró-fármaco ativado hipóxia (por exemplo, TH-302); cloridrato de metformina, inibidor de gama- secretase (por exemplo, R04929097); inibidor de ribonucleotídeo redu- tase (por exemplo, 3-AP); imunotoxina (por exemplo, HuC242-DM4); inibidor de PARP (por exemplo, KU-0059436, veliparibe); inibidor de CTLA-4 (por exemplo, CP-675.206, ipilimumabe); terapia de AdV-tk; inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe (Velcade), NPI- 0052); tiazolidinediona (por exemplo, pioglitazona); NPC-1C); Inibidor aurora-quinase (por exemplo, R763/AS703569), inibidor de CTGF (por exemplo, FG-3019); siG12D LODER; e radioterapia (por exemplo, to- moterapia, radiação estereotática, terapia de próton), cirurgia, e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma combinação de paclitaxel ou um agente de paclitaxel, e gencitabina pode ser usada com os anticorpos da invenção.

[0607] Agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usa-

dos em combinação com os anticorpos da invenção para o tratamento de câncer de pulmão de pequenas células incluem um agente quimio- terápico, por exemplo, etoposídeo, carboplatina, cisplatina, oxaliplati- na, irinotecano, topotecano, gencitabina, SN-38 lipossomal, benda- mustina, temozolomida, belotecan, NK012, FR901228, flavopiridol); inibidor de tirosina-quinase (por exemplo, inibidor de EGFR (por exemplo, erlotinibe, gefitinibe, cetuximabe, panitumumabe); inibidor de multiquinase (por exemplo, sorafenibe, sunitinibe); inibidor de VEGF (por exemplo, bevacizumabe, vandetanibe); vacina anticâncer (por exemplo, GVAX); inibidor de Bcl-2 (por exemplo, oblíqumersen sódico, ABT-263); inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe (Velca- de), NPI-O0052), paclitaxel ou um agente paclitaxel; docetaxel; inibidor do receptor de IGF-1 (por exemplo, AMG 479); Inibidor de HGF/SF (por exemplo, AMG 102, MK-0646); cloroquina; inibidor de aurora qui- nase (por exemplo, MLN8237); radioimunoterapia (por exemplo, TF2); inibidor de HSP90 (por exemplo, tanespimicina, STA-9090); inibidor de mTOR (por exemplo, everolimus); anticorpo biespecífico para Ep- CAM/CD (por exemplo, MT110); inibidor da CK-2 (por exemplo, CX- 4945); Inibidor de HDAC (por exemplo, belinostat); antagonista de SMO (por exemplo, BMS 833923); vacina peptídica anticâncer, e tera- pia de radiação (por exemplo, terapia de radiação de intensidade mo- dulada (IMRT), radioterapia hipofracionadas, radioterapia guiada por hipoxia), cirurgia, e combinações dos mesmos.

[0608] Agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usa- dos em combinação com os anticorpos da invenção para o tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas incluem um agente quimioterápico, por exemplo, vinorelbina, cisplatina, docetaxel, peme- trexede dissódico, etoposídeo, gencitabina, carboplatina, SN-38 lipos- somal, TLK286, temozolomida, topotecano, pemetrexede dissódico, azacitidina, irinotecano, tegafur-gimeracil-oteracil potássio, sapacitabi-

na); inibidor de tirosina-quinase (por exemplo, inibidor de EGFR (por exemplo, erlotinibe, gefitinibe, cetuximabe, panitumumabe, necitumu- mabe, PF-00299804, nimotuzumabe, RO5083945), inibidor de MET (por exemplo., PF-02341066, ARQ 197), inibidor de PlI3K-quinase XL147, GDC-0941), inibidor de quinase dupla Raf/MEK (por exemplo, RO5126766), inibidor de quinase dupla PISK/IMTOR (por exemplo, XL765), inibidor de SRC (por exemplo, dasatinibe), inibidor duplo (por exemplo, BIBW 2992, GSK1363089, ZD6474, AZDO530, AG-013736, lapatinibe, MEHD7945A, linifanibe), inibidor de multiquinase (por exemplo, sorafenibe, sunitinibe, pazopanibe, AMG 706, XL184, MGCD265, BMS-690514, R935788), inibidor de VEGF (por exemplo, endostar, endostatina, bevacizumabe, cediranibe, BIBF 1120, axitinibe, tivozanibe, AZD2171), vacina contra o câncer (por exemplo, vacina lipossomal BLP25, GVAX, DNA recombinante e adenovírus expres- sando a proteína L523S), inibidor de Bcl-2 (por exemplo, oblimersen sódico), inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe, carfil- zomibe, NPI-O0052, MLN9708), paclitaxel ou um agente de paclitaxel, docetaxel, inibidor do receptor de IGF-1 (por exemplo, cixutumumabe, MK-0646, OSI 906, CP-751.871, BIIBO22), hidroxicloroquina, inibidor de HSP90 (por exemplo, tanespimicina, STA9090, AUY922, XL888), inibidor de mMTOR (por exemplo, everolimus, temsirolimus, ridaforoli- mus), anticorpo biespecífico para Ep-CAM/CD3 (por exemplo, MT110), inibidor de CK-2 (por exemplo, CX-4945), inibidor de HDAC (por exemplo, MS 275, LBH589, vorinostat, ácido valpróico, FR901228), inibidor de DHFR (por exemplo, pralatrexato), retinoide (por exemplo, bexaroteno, tretinoína), conjugado anticorpo-fármaco (por exemplo, SGN-15), bisfosfonato (por exemplo, ácido zoledrônico), vacina contra câncer (por exemplo, belagenpumatucel-L) peso de heparina (LMWH) (por exemplo, tinzaparina, enoxaparina), GSK1572932A, melatonina, talactoferrina, dimesna, inibidor de topoisomerase (por exemplo, anr-

rubicina, etoposídeo, karenitecina), nelfinavir, cilengitide, inibidor de ErbB3 (por exemplo, MM-121, U3-1287), inibidor de survivina (por exemplo, YM155, LY2181308), mesilato de eribulina, inibidor de COX- 2 (por exemplo, celecoxibe), pegfilgrastim, inibidor da quinase 1 tipo Polo (por exemplo, BI 6727), agonista do receptor TRAIL 2 (TR-2) (por exemplo, CS-1008), peptídeo CNGRC (SEQ ID NO: 225)-TNF alfa conjugado, dicloroacetato (DCA), inibidor de HGF (por exemplo, SCH 900105), SAR240550, agonista de PPAR-gama (por exemplo, CS- 7017), inibidor de gama-secretase (por exemplo, RO4929097), terapia epigenética 5-azacitidina), nitroglicerina, inibidor de MEK (por exemplo, AZD6244), inibidor de quinase dependente de ciclina (por exemplo, UCN-01), colesterol-Fus1, antitubulina (por exemplo, E7389), inibidor da farnesil-OH-transferase (por exemplo, lonafarnibe), imunotoxina (por exemplo, BB-10901, SS1 (dsFv) PE38), fondaparinux, agente dis- ruptor vascular (por exemplo, AVE8062), inibidor de PD-L1 (por exem- plo, MDX-1105, MDX-1106), beta-glucano, NGR -hTNF, EMD 521873, inibidor de MEK (por exemplo, GSK1120212), análogo da epotilona (por exemplo, ixabepilona), inibidor do fuso da cinesina (por exemplo, 4SC-205), agente de direcionamento de telômeros (por exemplo, KML- 001), inibidor da via de P70, LY2584702), inibidor de AKT (por exem- plo, MK-2206), inibidor de angiogênese (por exemplo, lenalidomida), inibidor de sinalização de Notch (por exemplo, OMP-21M18), anticorpo biespecífico EM-1 para EGFR/c-Met como descrito em US2014/ 0141000A1, radioterapia, cirurgia e combinações dos mesmos.

[0609] Agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usa- dos em combinação com os anticorpos da invenção para o tratamento de câncer de ovário incluem um agente quimioterápico (por exemplo, paclitaxel ou um agente de paclitaxel; docetaxel; carboplatina; gencita- bina; doxorubicina; topotecan; cisplatina; irinotecano, TLK286, ifosfa- mida, olaparibe, oxaliplatina, melfalano, pemetrexedo dissódico, SJG-

136, ciclofosfamida, etoposídeo, decitabina); antagonista de grelina (por exemplo, AEZS-130), imunoterapia (por exemplo APC8024), ore- govomabe, OPT-821) inibidor de tirosina-quinase (por exemplo, inibi- dor de EGFR (por exemplo, erlotinibe), inibidor dual (por exemplo, E7080), inibidor de multiquinase (por exemplo, AZDO530, JI-101, sora- fenibe, sunitinibe, pazopanibe), ON 01910.Na), inibidor de VEGF (por exemplo, bevacizumabe, BIBF 1120, cediranibe, AZD2171), inibidor de PDGFR (por exemplo, IMC-3G3), paclitaxel, inibidor de topoisomerase (por exemplo, carenitecina, irinotecano), inibidor de HDAC (por exem- plo, valproato, vorinostato), inibidor do receptor de folato (por exemplo, farletuzumabe), inibidor de angiopoietina (por exemplo, AMG 386), análogo da epotilona (por exemplo, ixabepilona), inibidor de proteas- soma (por exemplo, carfilzomibe), inibidor do receptor de IGF-1 (por exemplo, OSI 906, AMG 479), inibidor de PARP (por exemplo, velipa- ribe, AGO14699, iniparibe, MK-4827) inibidor de quinase (por exemplo, MLN8237, ENMD-2076), inibidor de angiogênese (por exemplo, lenali- domida), inibidor de DHFR (por exemplo, pralatrexato), agente radioi- munioterapêutico (por exemplo, Hu3S193), estatina (por exemplo, lo- vastatina), inibidor de topoisomerase 1 (por exemplo, NKTR -102), va- cina contra câncer (por exemplo, vacina peptídica longa sintética para p53, vacina autóloga OC-DC), inibidor de MTOR (por exemplo, temsi- rolimus, everolimus), inibidor de BCR/ABL (por exemplo, imatinibe), antagonista do receptor ET-A (por exemplo, ZD4054), agonista do re- ceptor TRAIL 2 (TR-2) (por exemplo, CS-1008), inibidor de HGF/SF (por exemplo, AMG 102), EGEN-001, inibidor da quinase Polo 1 (por exemplo, BI 6727), inibidor de gama-secretase (por exemplo, RO4929097), inibidor de Wee-1 (por exemplo, MK-1775), agente anti- tubulina (por exemplo, vinorelbina, E7389), imunotoxina (por exemplo, denileucina diftitox), SB-485232, agente disruptor vascular (por exem- plo, AVE8O062), inibidor da integrina (por exemplo, EMD 525797), inibi-

dor do fuso da cinesina (por exemplo, 48SC-205), inibidor de HER2 (por exemplo, MGAH22), inibidor de ErrB3 (por exemplo, MM-121), radiote- rapia e combinações dos mesmos.

[0610] Agentes terapêuticos exemplificadores que podem ser usa- dos em combinação com os anticorpos da invenção para tratamento de um câncer renal, por exemplo, um carcinoma de células renais (RCC) ou metastático incluir uma estratégia de base imunológica RCC (por exemplo, interleucina-2 ou interferon-a), um agente alvo (por exemplo, um inibidor de VEGF como anticorpo monoclonal ao VEGF, por exemplo, bevacizumabe (Rini et al. (2010) J Clin Oncol 28(13):2137-2143)); um inibidor de tirosina-quinase de VEGF como o sunitinibe, sorafenibe, axitinibe e pazopanibe (revista em Pal et al, (2014) Clin Advances in Hematology & Oncology 12(2):90-99); um ini- bidor de RNAi, ou um inibidor de um mediador a jusante de sinalização fr VEGF, por exemplo, um inibidor do alvo mamífero de rapamicina (MTOR), por exemplo, everolimus e temsirolímus (Hudes et a/., (2007) N Engl J Med 356(22):2271-2281, Motzer et a/., (2008) Lancet 372: 449-456). Kits de anticorpos específicos para PSMA

[0611] São no presente documento descritos kits que incluem os anticorpos específicos para PSMA ou seus fragmentos de ligação ao antígeno descritos. Os kits descritos podem ser usados para executar os métodos de uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antí- geno específicos para PSMA no presente documento fornecidos, ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica. Em algumas modalidades os kits descritos podem incluir os anticorpos ou os frag- mentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos e re- agentes para uso na detecção da presença de PSMA em uma amostra biológica. Consequentemente, os kits descritos podem incluir um ou mais dos anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mes-

mos, no presente documento descritos e um recipiente para conter o anticorpo ou fragmento quando não em uso, instruções para uso do anticorpo ou fragmento, o anticorpo ou fragmento fixos a um suporte sólido e/ou formas marcadas de forma detectável do anticorpo ou fra- gmento, conforme no presente documento descrito.

[0612] Uma modalidade da invenção é um kit que compreende o anticorpo que se liga especificamente ao PSMA da invenção.

[0613] Uma outra modalidade da invenção é um kit que compre- ende o anticorpo biespecífico PSMA X CD3 que compreende um pri- meiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3 da invenção.

[0614] O kit pode ser usado para usos terapêuticos e como kits de diagnóstico.

[0615] O kit pode ser usado para detectar a presença de PSMA, CD3, ou PSMA e CD3 em uma amostra biológica.

[0616] Em algumas modalidades, o Kit compreende o anticorpo da invenção no presente documento descrito e reagente para detectar o anticorpo. O kit pode incluir um ou mais outros elementos incluindo: instruções de uso; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico, ou um agente útil para quelação, ou para acoplar de outro modo, um anticorpo a um marcador ou a um agente terapêu- tico, ou uma composição radioprotetora; dispositivos ou outros materi- ais para preparar o anticorpo para administração; carreadores farma- ceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para admi- nistração a um indivíduo.

[0617] Em algumas modalidades, o Kit compreende o anticorpo da invenção em um recipiente e instruções para uso do kit.

[0618] Em algumas modalidades, o anticorpo no kit está marcado.

[0619] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo anti-PSMAPSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123,

PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, e PSMB365.

[0620] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo biespecífico para PSMA X CD3, PS3B22, PS3B23, PS3B25, PS3B27, PS3B28, ou PS3B30. Métodos de detecção de PSMA ou PSMA e CD3

[0621] Uma modalidade da invenção no presente documento des- crita é um método para detectar PSMA em uma amostra, que compre- ende obter a amostra, colocar a amostra em contato com o anticorpo antagonista que se liga especificamente ao PSMA da invenção, e de- tectar o anticorpo ligado ao PSMA na amostra.

[0622] Uma modalidade da invenção no presente documento des- crita é um método para detectar PSMA e CD3 em uma amostra, que compreende obter a amostra, colocar a amostra em contato com o an- ticorpo biespecífico que compreende um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especifi- camente a CD3 da invenção, e detectar o anticorpo ligado a PSMA e CD3 na amostra.

[0623] Em algumas modalidades no presente documento descri- tas, a amostra pode ser derivada de urina, sangue, soro, plasma, sali- va, ascite, células circulantes, células de tumor circulantes, células que não estão associadas a tecidos (isto é, células livres), tecidos (por exemplo, tecido de tumor cirurgicamente removido, biópsias, incluindo aspiração por agulha fina), preparações histológicas e similares.

[0624] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos ligados a PSMA ou PSMA e CD3 podem ser detectados com o uso de métodos conhecidos. Métodos exemplificadores incluem marcação direta dos anticorpos com o uso de marcadores fluorescentes ou qui- mioluminescentes, ou radiomarcadores, ou fixação aos anticorpos da invenção de uma porção que é prontamente detectável, como biotina, enzimas ou etiquetas de epítopo. Marcadores e porções exemplifica- dores são rutênio, 111INn-DOTA, 111In-ácido dietilenotriaminapenta- acético (DTPA), peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina e beta- galactosidase, poli-histidina (etiqueta HIS), corantes de acridina, co- rantes de cianina, corantes de fluorona, corantes de oxazina, corantes de fenantridina, corantes de rodamina, corantes Alexa Fluor€.

[0625] Os anticorpos da invenção podem ser usados em uma vari- edade de ensaios para detectar PSMA ou PSMA e CD3 na amostra. Ensaios exemplificadores são análise por transferência de Western (Western blot), radioimunoensaio, ressonância de plasmon de superfí- cie, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, imunoen- saio de eletroquimioluminescência (ECL), imuno-histoquímica, separa- ção de células ativadas por fluorescência (FACS) ou ensaio ELISA. Modalidades 1) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (i) se liga a células que expressam PSMA de Pan troglodytes recombinante, sendo que a ligação a células é medida por citometria de fluxo e (ii) se liga ao domínio extracelular de PSMA de Pan troglodytes (SEQ ID NO:4) com uma afinidade de cerca de 30 NM ou menos, sendo que a afinidade é medida pelo ensaio de resso- nância de plásmon de superfície Proteon XPR36.

2) O anticorpo da modalidade 1, sendo que o anticorpo tem uma, duas, três ou quatro das seguintes propriedades: a) se liga a células LNCaP com uma ECrso calculada de nM ou menos e se liga a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis com uma ECso calculada de 40 nM ou menor,

sendo que a diferença na ECso calculada entre a ligação a células LNCAaP e a ligação a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis é menor que 5 vezes, e sendo que a ECs5o calculada é me- dida em um ensaio de ligação de células inteiras a O ºC com o uso de citometria de fluxo, b) se liga ao ECD de PSMA recombinante humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 12 NM ou menos, sendo que a Kp é medida com o uso do ensaio de res- sonância de plásmon de superfície ProteOn, sistema ProteOn XPR36 a +25ºC; c) apresenta morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK que expressam PSMA humano ou células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis, quando emparelhado em um anticorpo biespecífico com o anticorpo anti-CD3, CD3B219, sendo que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou pelo ensaio de ativação de caspase 3/7, ou d) reconhece um epítopo conformacional, sendo que o epítopo é compreendido dos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, 0303, K304, E307, e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO:3). 3) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente. 4) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente. 5) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

6) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente.

7) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42,43, 11, 12 e 13, respectivamente.

8) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente.

9) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respectivamente.

10) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50 e 51, respectivamente.

11) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente.

12) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente.

13) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente.

14) O anticorpo da modalidade 2, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente.

15) O anticorpo da modalidade 2, que compreende uma re- gião variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79 ou 160.

16) O anticorpo da modalidade 15, que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) das SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, 69, 71,73, 61,76 ou 78.

17) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63.

18) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65.

19) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

20) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 72 e a VL da SEQ ID NO: 73.

21) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61.

22) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76.

23) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 77 e a VL da SEQ ID NO: 78.

24) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 79 e a VL da SEQ ID NO: 78.

25) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65.

26) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 60 e a VL da SEQ ID NO: 61.

27) O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 68 e a VL da SEQ ID NO: 69.

O anticorpo da modalidade 15, que compreende a VH da SEQ ID NO: 70 e a VL da SEQ ID NO: 71.

28) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:

31,42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente.

29) O anticorpo da modalidade 28, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61.

30) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente.

31) O anticorpo da modalidade 30, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63.

32) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

33) O anticorpo da modalidade 32, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

34) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente.

35) O anticorpo da modalidade 34, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 72 e a VL da SEQ ID NO: 73.

36) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente.

37) O anticorpo da modalidade 36, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65.

38) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID

NOs:8, 9, 10, 11, 12, e 13, respectivamente.

39) O anticorpo da modalidade 38, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:60 e a VL da SEQ ID NO:61.

40) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:20, 21, 22, 23, 12, e 24, respectivamente.

41) O anticorpo da modalidade 40, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:64 e a VL da SEQ ID NO:65.

42) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34, 12, e 35, respectivamente.

43) O anticorpo da modalidade 42, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:70 e a VL da SEQ ID NO:71.

44) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 44, 45, 46, 29, e 47, respectivamente.

45) O anticorpo da modalidade 44, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:75 e a VL da SEQ ID NO:76.

46) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:36, 37, 48, 49, 50, e 51, respectivamente.

47) O anticorpo da modalidade 46, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:77 e a VL da SEQ ID NO:78.

48) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID

NOs:36, 37, 52, 49, 50, e 51, respectivamente.

49) O anticorpo da modalidade 48, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:79 e a VL da SEQ ID NO:78.

50) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:53, 54, 55, 23, 12, e 35, respectivamente.

51) O anticorpo da modalidade 50, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:68 e a VL da SEQ ID NO:69.

52) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

53) O anticorpo da modalidade 52, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:67.

54) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

55) O anticorpo da modalidade 54, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:142.

56) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

57) O anticorpo da modalidade 56, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:143.

58) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID

NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

59) O anticorpo da modalidade 58, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:167.

60) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

61) O anticorpo da modalidade 60, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:144.

62) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

63) O anticorpo da modalidade 62, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:167.

64) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

65) O anticorpo da modalidade 64, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:142.

66) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

67) O anticorpo da modalidade 66, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:143.

68) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID

NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

69) O anticorpo da modalidade 68, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:144.

70) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

71) O anticorpo da modalidade 70, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:142.

72) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

73) O anticorpo da modalidade 72, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:143.

74) Um anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

75) O anticorpo da modalidade 74, sendo que o anticorpo compreende a VH da SEQ ID NO:141 e a VL da SEQ ID NO:143.

76) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali- dades 1 a 75, sendo que o anticorpo é humano ou humanizado.

77) O anticorpo da modalidade 76, sendo que o anticorpo é do isótipo IgG4 ou IgG1.

78) O anticorpo da modalidade 77, que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições no Fc do anticorpo.

79) O anticorpo da modalidade 77, que compreende a) substituições de L234A, L235A, G237A, P238S,

H268A, A330S e P331S; b) substituições de V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S e P331S.

c) substituições de F234A, L235A, G237A, P238S e Q268A; d) substituições de L234A, L235A ou L234A e L235A; e) substituições de F234A, L235A ou F234A e L235A; ou f) substituição de V234A, sendo que a numeração de re- síduos está de acordo com o índice EU.

80) O anticorpo da modalidade 79, que compreende as substituições S228P, F234A e L235A, sendo que a numeração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

81) O anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 80, sendo que o anticorpo é biespecífico.

82) O anticorpo da modalidade 76, sendo que o anticorpo se liga especificamente ao PSMA e se liga especificamente a CD3, CD5, CD28, CD16, CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336, (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C and NKG2D, DNAM, NCRs, CD18, CD89, CD18, CD32, CD64, CD64 e CD35.

83) Uma composição farmacêutica compreendendo o anti- corpo de qualquer uma das modalidades 1 a 82 e um veículo farma- ceuticamente aceitável.

84) Um polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo da modalidade 15, a VL do anticorpo da modalidade 16, ou a VH do anti- corpo e a VL do anticorpo da modalidade 15 ou 16.

85) Um polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo, ou a VL do anticorpo, ou a VH do anticorpo e a VL do anticorpo de qualquer uma das modalidades 28 a 75.

86) Um vetor que compreende o polinucleotídeo da modali-

dade 84.

87) Um vetor que compreende o polinucleotídeo da modali- dade 85.

88) Uma célula hospedeira que compreende o vetor da mo- dalidade 86.

89) Uma célula hospedeira que compreende o vetor da mo- dalidade 87.

90) Um método de produção do anticorpo da modalidade 1, que compreende cultivar a célula hospedeira da modalidade 89, em condições em que o anticorpo é expresso, e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira.

91) Um método para tratar um câncer em um indivíduo, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado de qualquer uma das modalidades 1 a 82 ao indiví- duo que precisa do mesmo, durante um tempo suficiente para tratar o câncer.

92) O método da modalidade 91, em que o câncer é um tumor sólido, malignidade, ou uma neovaculatura tumoral.

93) O método, da modalidade 92, em que o tumor sólido é um câncer de próstata, um câncer colorretal, um câncer gástrico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células escamosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer de rim, um distúrbio neovascular, um carcinoma renal de células renais (CCRCC), um câncer pancreático, um câncer renal, um câncer urotelial ou um adenocarcinoma no fígado.

94) O método da modalidade 93, em que o câncer de prós- tata é um câncer de próstata refratário, uma neoplasia intraepitelial prostática, um câncer de próstata independente de androgênio ou um câncer de próstata maligno.

95) O método de qualquer uma das modalidades 90 a 94,

em que o anticorpo é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

96) O método da modalidade 95, em que o segundo agente terapêutico é um fármaco como padrão de cuidado para tratamento do tumor sólido ou malignidade ou uma neovaculatura tumoral.

97) O método da modalidade 96, em que o segundo agente terapêutico é um inibidor de hormônio, um agente antimicrotúbulo, um inibidor de quinase, um agente imunomodulador, um inibidor de to- poisomerase, um anti metabólito, um inibidor mitótico, um agente al- quilante, uma antraciclina, um alcaloide de vinca, um agente de inter- calação, um agente capaz de interferir com uma rota de transdução de sinal, um agente que promove apoptose, um inibidor de proteassoma ou radiação.

98) O método da modalidade 96, em que o segundo agente terapêutico é uma vacina.

99) O método da modalidade 98, em que a vacina é um po- lipeptídeo ou seu fragmento, ou um DNA ou um RNA que codifica o polipeptídeo ou seu fragmento expresso em células tumorais.

100) O método da modalidade 99, em que o polipeptídeo é PSMA, mesotelina, EGFR ou EGFRvIIL.

101) O método da modalidade 95, em que o segundo agen- te terapêutico é administrado simultaneamente, sequencialmente ou separadamente.

102) O método de qualquer uma das modalidades 91 a 101, em que o indivíduo é tratado ou está sendo tratado com terapia de radiação.

103) O método de qualquer uma das modalidades 91 a 101, em que o indivíduo foi ou será submetido a cirurgia.

104) O método de qualquer uma das modalidades 46 a 58, em que o anticorpo isolado compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a

VL da SEQ ID NO: 67.

105) O anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 82 para o uso em terapia.

106) Um anticorpo anti-idiotípico que se liga ao anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 82.

107) Um anticorpo biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga especificamente ao PSMA e um segundo domí- nio que se liga especificamente ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende: a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente; b) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente; c) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente; d) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente; e) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamen- te; f) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:8, 9, 10, 11, 12, e 13, respectivamente; g) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:14, 15, 16, 17, 18, e 19, respectivamente; h) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:20, 21, 22, 23, 12, e 24, respectivamente; i) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34, 12, e 35, respectivamente; j) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 44, 45, 46, 29, e 47, respectivamente;

k) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:36, 37, 48, 49, 50, e 51, respectivamente;

1) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:53, 54, 55, 23, 12, e 35, respectivamente;

m) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 29, e 30, respectivamente;

n) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 131, 29, e 132, respectivamen- te;

o) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te;

p) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 30, respectivamente;

q) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 136, respectivamen- te;

r) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 30, respectivamente;

s) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 131, 29, e 132, respectivamen- te;

t) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te;

u) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 136, respectivamen- te;

v) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 131, 29, e 132, respectivamen-

te; w) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te; ou x) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te.

108) O anticorpo biespecífico da modalidade 107, em que o primeiro domínio compreende: a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61; b) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63; c) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; d) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO: 72 e a VL da SEQ ID NO: 73; e) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamen- te, a VM da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65; f) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:8, 9, 10, 11, 12, e 13, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:60 e a VL da SEQ ID NO:61; g) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:14, 15, 16, 17, 18, e 19, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:62 e a VL da SEQ ID NO:63;

h) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:20, 21, 22, 23, 12, e 24, respectivamente, e VH da SEQ ID NO:64 e a VL da SEQ ID NO:65;

i) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34, 12, e 35, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:70 e a VL da SEQ ID NO:71;

j) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:31, 44, 45, 46, 29, e 47, respectivamente, a VH da SEQ ID NO:75 e a VL da SEQ ID NO:76;

k) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:36, 37, 48, 49, 50, e 51, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:77 e a VL da SEQ ID NO:78;

1) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:53, 54, 55, 23, 12, e 35, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:68 e a VL da SEQ ID NO:69;

m) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 29, e 30, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:67;

n) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29, e 132, respectiva- mente, e a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:14?2;

o) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 130, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te, e a VH da SEQ ID NO:138 e a VL da SEQ ID NO:143;

p) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 30, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:167;

q) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 136, respectivamen- te, e a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:144;

r) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 29, e 30, respectivamente, e a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:167; s) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 131, 29, e 132, respectivamen- te e a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:142; t) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 135, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te, e a VH da SEQ ID NO:140 e a VL da SEQ ID NO:143; u) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 29, e 136, respectivamen- te; e a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:144; v) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 131, 29, e 132, respectivamen- te, e a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:142; w) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 134, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te, e a VH da SEQ ID NO:139 e a VL da SEQ ID NO:143; ou x) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs:25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamen- te e a VM da SEQ ID NO:141 e a VL da SEQ ID NO:143.

109) Um anticorpo biespecífico para PSMA/CD3 isolado que compreende um primeiro domínio que (i) se liga a células que ex- pressam PSMA de Pan troglodytes recombinante, sendo que a ligação a células é medida por citometria de fluxo e (ii) se liga ao domínio ex- tracelular de PSMA de Pan troglodytes recombinante (SEQ ID NO:4) com uma afinidade de cerca de 30 nM ou menos, sendo que a afinida- de é medida pelo ensaio de ressonância de plásmon de superfície Pro- teon, e um segundo domínio que se liga especificamente ao CD3.

110) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade

109, sendo que o anticorpo a) se liga a células LNCaP com uma ECrso calculada de nM ou menos e se liga a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis com uma ECso calculada de 40 nM ou menor, sendo que a diferença na ECso calculada entre a ligação a células LNCAaP e a ligação a células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis é menor que 5 vezes, e sendo que a ECs5o calculada é me- dida em um ensaio de ligação de células inteiras a O ºC com o uso de citometria de fluxo, b) se liga ao ECD de PSMA recombinante de humano (SEQ ID NO:7), Pan troglodytes (SEQ ID NO:4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO:5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 12 nM ou menos, sendo que a KD é medida com o uso do ensaio de ressonância de plásmon de superfície Proteon, sistema ProteOn XPR36 a +25ºC; c) apresenta morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK que expressam PSMA humano ou células HEK que expressam PSMA de Macaca fascicularis, sendo que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou pelo ensaio de ativação de caspase 3/7, ou d) reconhece um epítopo conformacional, sendo que o epítopo é compreendido dos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, 0303, K304, E307, e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO:3).

111) | anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, sendo o anticorpo se ligar a células T. 112) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, em que o primeiro domínio compreende a) a região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 1 (HCDR), a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; e a região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 de SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; b) a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente, e a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nos: 23, 12 e 24, respectivamente; c) a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente, e a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nos: 28, 29 e 30, respectivamente; d) a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente, e a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nos: 46, 29 e 47, respectivamente; e) a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente, e a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nos: 11, 12 e 13, respectivamente; ou f) a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respectivamente, e a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nos: 23, 12 e 24, respectivamente.

113) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, em que o primeiro domínio compreende a HCDR1, a HCDR2Qe a HCDR3 das a) SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente; ou f) SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respectivamente.

114) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, em que o primeiro domínio compreende a LCDR1, a LCDR2Qe a LCDR3 das a) SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 46, 29 e 47, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; ou f) SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente.

115) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, em que a) o primeiro domínio compreende a região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 62 e uma região variável de ca- deia leve (VL) da SEQ ID NO: 63, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105 b) o primeiro domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105; c) o primeiro domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105; d) o primeiro domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105; e) o primeiro domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105; f) o primeiro domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 160 e a VL da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e a VL da SEQ ID NO: 105.

116) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, que compreende uma primeira cadeia pesada (HC1), uma primei- ra cadeia leve (LC1), uma segunda cadeia pesada (HC2) e uma se-

gunda cadeia leve (LC2), sendo que a HC1 e a LC1 compreendem as sequências de aminoácidos de: a) SEQ ID NOs: 84 e 85, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 86 e 87, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 88 e 89, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 125 e 91, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 94 e 95, respectivamente; ou f) SEQ ID NOs: 96 e 83, respectivamente.

117) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 116, em que a HC2 e a LC2 compreender as SEQ ID NOs: 110 e 111, respectivamente.

118) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 109, que compreende a HC1, a LC1, a HC2 e a LC2 das a) SEQ ID NOs: 84, 85, 110 e 111, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 86, 87, 110 e 111, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 88, 89, 110 e 111, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 125, 91, 110 e 111, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 94, 95, 110 e 111, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 96, 83, 110 e 111, respectivamente.

119) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 de qualquer uma das modalidades 109 a 118, sendo o anticorpo é humano ou hu- manizado.

120) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 119, sendo que o anticorpo é do isótipo I9gG1, IgG2, I9gG3 ou I9G4.

121) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 120, sendo que o anticorpo é de isótipo IgG1 ou do isótipo Ig9G4.

122) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 120 ou 121, tendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições no Fc do anticorpo.

123) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade

121, compreendendo: a) substituições de L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S e P331S; b) substituições de V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S e P331S.

c) substituições de F234A, L235A, G237A, P238S e Q268A; d) substituições de L234A, L235A ou L234A e L235A; e) substituições de F234A, L235A ou F234A e L235A; f) a substituição V234A; ou g) as substituições S228P, F234A e L235A, sendo que a numeração de resíduos está de acordo com o Índice EU.

124) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 de qualquer uma das modalidades 109 a 123, compreendendo ao menos uma substituição em um domínio constante CH3 do anticorpo.

125) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3 da modalidade 124, em que a substituição no domínio constante CH3 do anticorpo é uma substituição 409R, F405L ou F405L/R409K, sendo que a nume- ração dos resíduos está de acordo com o índice EU.

126) O anticorpo biespecífico PSMA X CD3, da modalidade 124, sendo que o anticorpo compreende: a) substituição F405L na HC1 e substituição 409R na HC2, sendo que o anticorpo é do isótipo I9G1;b) substituições V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S e F405L na HC1 e substituições V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S e 409R na HC2, sendo que o anticorpo é do isótipo I9gG1; ou b) substituição S228P na HC1 e substituições S228P, F405L e R409K na HC2, sendo que o anticorpo é do isótipo I9G4.

127) Uma composição farmacêutica que compreende o an- ticorpo biespecífico para PSMA X CD3 de qualquer uma das modali-

dades 109 a 126 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 128) Um polinucleotídeo que codifica o anticorpo biespeciífi- co para PSMA X CD3 HC1, LC1, HC2 ou LC2 da modalidade 118. 129) Um vetor compreendendo o polinucleotídeo que codi- fica a HC1, a LC1, a HC2, a LC2, a HOC1 e a LC1 ou a HC2 e a LC2 da modalidade 128. 130) Uma célula hospedeira isolada que compreende o ve- tor da modalidade 129. 131) Um método para produzir o anticorpo biespecífico para PSMA X CD3 da modalidade 118, que compreende cultivar a célula hospedeira da modalidade 130, em condições em que o anticorpo seja expresso, e recuperar e purificar o anticorpo biespecífico para PSMA X CD3 produzido pela célula hospedeira. 132) Um método para produzir o anticorpo biespecífico para PSMA X CD3 da modalidade 118, que compreende: a) combinar um anticorpo monoespecífico bivalente PSMA tendo duas HC1 idênticas e duas LC1 idênticas, e um anticorpo monoespecífico bivalente CD3 tendo duas HC2 idênticas e duas LC2 idênticas em uma mistura com uma razão molar de cerca de 1:1; b) introduzir um agente redutor na mistura; c) incubar a mistura cerca de noventa minutos a cerca de seis horas; d) remover o agente redutor; e e) purificar o anticorpo biespecífico PSMA X CD3 que compreende a HC1, a LC1, a HC2 e a LO2. 133) O método da modalidade 132, em que o agente redu- tor é 2-mercaptoetanolamina (2-MEA). 134) O método da modalidade 133, em que: h) a 2-MEA estar presente a uma concentração de cerca de 25 mM a cerca de 75 mM; e i) a etapa de incubação ser realizada a uma temperatura de cerca de 25ºC a cerca de 37ºC.

135) Um método para tratar um câncer em um indivíduo, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo biespecífico isolado para PSMA X CD3 de qualquer uma das modalidades 109 a 126 ao indivíduo que precisa do mesmo, du- rante um tempo suficiente para tratar o câncer.

136) O método, da modalidade 135, em que o câncer é um tumor sólido, malignidade, ou uma neovaculatura tumoral.

137) O método, da modalidade 136, em que o tumor sólido é um câncer de próstata, um câncer colorretal, um câncer gástrico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células escamosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer de rim, um distúrbio neovascular, um carcinoma renal de células claras (CCRCC), um câncer pancreático, um câncer renal, um câncer urotelial ou um adenocarcinoma no fígado.

138) O método da modalidade 137, em que o câncer de próstata é um câncer de próstata refratário, uma neoplasia intraepiteli- al prostática, um câncer de próstata independente de androgênio ou um câncer de próstata maligno.

139) O método de qualquer uma das modalidades 135 a 138, em que o anticorpo é administrado em combinação com um se- gundo agente terapêutico.

140) O método da modalidade 139, em que o segundo agente terapêutico é um fármaco como padrão de tratamento para tra- tamento do tumor sólido ou malignidade ou uma neovaculatura tumo- ral.

141) O método da modalidade 139, em que o segundo agente terapêutico é um inibidor de hormônio, um agente antimicrotú- bulo, um inibidor de topoisomerase, um anti metabólito, um inibidor mitótico, um agente alquilante, uma antraciclina, um alcaloide de vinca, um agente de intercalação, um agente capaz de interferir com uma rota de transdução de sinal, um agente que promove apoptose, um inibidor de proteassoma ou radiação.

142) O método da modalidade 139, em que o segundo agente terapêutico é uma vacina.

143) O método da modalidade 142, em que a vacina é um polipeptídeo ou seu fragmento, ou um DNA ou um RNA que codifica o polipeptídeo ou seu fragmento expresso em células tumorais.

144) O método da modalidade 143, em que o polipeptídeo é PSMA, mesotelina, EGFR ou EGFRvIII.

145) O método da modalidade 139, em que o segundo agente terapêutico é administrado simultaneamente, sequencialmente ou separadamente.

146) O método de qualquer uma das modalidades 135 a 145, em que o indivíduo é tratado ou está sendo tratado com terapia de radiação.

147) O método de qualquer uma das modalidades 135 a 145, em que o indivíduo foi submetido ou será submetido a cirurgia.

148) O método de qualquer uma das modalidades 135 a 145, em que o primeiro domínio do anticorpo biespecífico para PSMA X CD3 compreende a VH da SEQ ID NO:66 e a VL da SEQ ID NO:67, e o segundo domínio do anticorpo biespecífico para PSMA X CD3 compreende a VH da SEQ ID NO:104 e a VL da SEQ ID NO: SEQ ID NO:105.

149) O anticorpo de qualquer uma das modalidades 109 a 126 para uso em terapia.

150) Um anticorpo anti-idiotípico que se liga ao anticorpo de qualquer uma das modalidades 109 a 126.

Exemplo 1: Materiais

Geração de linhagens celulares que expressam PSMA

[0626] Vetores de expressão que apresentam PSMA de chimpan- zé de comprimento total (H203K5 PANTR, SEQ ID NO: 1) ou PSMA de macaco cinomolgo de comprimento total (EHH56646.1, SEQ ID NO: 2) foram gerados para uso como ferramentas de triagem para avaliar os leads de PSMA com o uso de um vetor de expressão interno com o promotor de CMV com o uso de técnicas padrão de biologia molecular. Os vetores foram transfectados transientemente em células HEK293F em suspensão com o uso de métodos padrão. As células 293F em suspensão transfectadas foram plaqueadas em meio de crescimento mais soro para se tornarem aderentes e selecionadas pa- ra a integração estável do plasmídeo. As populações de célula única foram selecionadas por diluição em série e a expressão de PSMA na superfície do receptor foi quantificada por FACS usando-se o anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade (PSMAL antibody (Center) (catálogo tt OAABO02483, Aviva Systems Biology) como o anticorpo primário com um anticorpo secundário anti-coelho R-PE (catálogo t111-116-144, que Jackson ImmunoResearch Labs, Inc.) e uma IgG policlonal de coelho (catálogo %& SC-532, Santa Cruz Biotechnology) como o controle de isótipo).

[0627] A linhagens celulares que expressam PSMA humano foram geradas usando-se lentivírus (Genecopoeia, cat % EX-GO0050-Lv105- 10) contendo PSMA humano de comprimento total (FOLH1 HUMAN, SEQ ID NO:3) e puromicina para seleção de células positivas para PSMA. Células HEK293F (ATCC), negativas para PSMA o, foram transduzidas com partículas Lentiviral para superexpressar PSMA hu- mano. Após a transdução, células que expressam positivamente PSMA e o marcador de resistência foram selecionados por tratamento das células agrupadas, cultivadas em DMEM + 10% de HI FBS (soro fetal bovino, inativado por calor) (Life Technologies) e suplementadas com diferentes concentrações de puromicina (Life Technologies).

[0628] Além das linhagens celulares geradas por HEK, várias |i- nhagens celulares comerciais foram usadas para ensaios de seleção ("panning") e ligação de fago e de toxicidade celular. Células do clone FGC de LNCaP (ATCC cat %& CRL-1740) são linhagens celulares de câncer de próstata humano comercialmente disponíveis. Células C4- 2B foram originalmente desenvolvidas na MD Anderson e são deriva- das da cultura de FGC- LNCAaP in vivo e metástase para a medula ós- sea (Thalmann, et a/ 1994, Cancer Research 54, 2577-81). Geração de proteínas solúveis de ECD de PSMA

[0629] A proteína recombinante do ECD (domínio extracelular) do PSMA de chimpanzé (Chimp PSMA ECD, SEQ ID NO:4) foi gerada para seleção e para avaliar os leads anti-PSMA com o uso de um vetor de expressão interno com o promotor de CMV usando-se técnicas pa- drão de biologia molecular. O fragmento do gene ECD PSMA de chim- panzé (aminoácidos 44 a 750 da SEQ ID NO:1) com a tag de sequên- cia de sinal do terminal N (SEQ ID NO:56), a Avi-tag do terminal N (SEQ ID NO:57) e as 6-His-tag (SEQ ID NO:58) foi clonado com o uso de um vetor de expressão interno com o promotor de CMV usando-se técnicas padrão de biologia molecular e transientemente expresso em células 293Expi (Invitrogen). O cDNA foi preparado com o uso de téc- nicas de síntese gênica (patente US nº 6.670.127; patente US nº

6.521.427). Os sobrenadantes foram coletados e clarificados por cen- trifugação. As proteínas foram purificadas usando um processo de pu- rificação em duas etapas: 1) Purificação por IMAC com uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare) e 2) purificação por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) onde o tampão de eluição é o tampão de eluição é a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, cálcio, magnésio (Thermofisher, t14040) contendo 0,5 mM de ZnCl2 para estabilizar a dimerização de PSMA. As frações contendo a prote-

ína de interesse foram agrupadas e a concentração de proteína foi de- terminada pela A280. Esse material também foi usado para medições de ligação e afinidade e é chamado de PÇSMG8.

[0630] O ECD de PSMA de chimpanzé foi também biotinilado para seleção ("panning"). O plasmídeo BirA que foi co-transfectado em célu- las de mamífero para proteínas de biotinilato contendo a Avi-tag foi criado in-house. A região de codificação de BirA (SEQ ID NO:59) foi fundida ao peptídeo de sinalização da cadeia pesada de IgG de ca- mundongo (SEQ ID NO:80), e um sinal de retenção de ER (KDEL ("KDEL" descrito como SEQ ID NO: 156) foi adicionado ao terminal C para gerar o BirA (SEQ ID NO:112). O gene construído foi clonado em um vetor de expressão sob o controle do promotor de CMV. Para pro- duzir o antígeno PSMA biotinilado, o DNA do plasmídeo PSMA foi adi- cionado em um excesso de 4 vezes (em peso) ao plasmídeo BirA na mistura de transfecção.

[0631] A biotinilação da proteína de ECD de PSMA de chimpanzé foi feita através da Avi-tag por cotransfecção de um construto de ex- pressão de BirA, e a proteína secretada resultante foi purificada atra- vés de um processo de purificação de duas etapas: 1) Purificação por IMAC com uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare) e 2) purificação por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) onde o tam- pão de eluição é o tampão de eluição é a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, cálcio, magnésio (Thermofisher, f%14040) contendo 0,5 mM de ZnCl2 para estabilizar a dimerização de PSMA. À proteína foi testada quanto à presença de endotoxina antes do uso nos estudos de seleção ("panning") de fagos.

[0632] A proteína recombinante do ECD (domínio extracelular) de PSMA de macaco cinomolgo (ECD de PSMA de cino, SEQ ID NO:5), que corresponde aos aminoácidos 44 a 750 da SEQ ID NO:2 com a tag de sequência de sinal do terminal N (SEQ ID NO:56), a Avi-tag do terminal N (SEQ ID NO:57) e a 6-His-tag (SEQ ID NO:58), foi clonada e expressada conforme descrito anteriormente para o ECD de PSMA de chimpanzé. A biotinilação da proteína de ECD de PSMA de cino foi feita através da Avi-tag por cotransfecção de um construto de expres- são de BirA, e a proteína secretada resultante foi purificada através de um processo de purificação de duas etapas com o uso de uma coluna HisTrap Hp e IMAC ("immobilized metal affinity chromatography") e colunas MonoAvidin. A proteína foi testada quanto à presença de en- dotoxina antes do uso nos estudos de seleção ("panning") de fagos. Esse material foi também usado para medições de ligação e afinidade e é chamado de PSMG1.

[0633] A segunda proteína recombinante de ECD de PSMA de ci- no (Fc de PSMA de cino, SEQ ID NO:6) com um Fc de IgG1 (SEQ ID NO:81) foi clonada e expressada com o uso de um vetor de expressão interno com o promotor CMV usando-se técnicas padrão de biologia molecular. A proteínas Fc de PSMA de cino foi expressa transiente- mente em células 293HEK-expi. A transfecção transiente de PSMG3 em células HEK293-expi foi coletada 5 dias após a transfecção, clarifi- cada por centrifugação (30 min, 6000 rpm) e filtrada (membrana de poliétersulfona (PES) e tamanho médio de poro de 0,2 1, Corning). À quantidade relativa de IgG foi determinada com o instrumento Octeto (ForteBio) usando-se uma IgG purificada conhecida (mesmo isotipo) adicionada ao meio gasto para gerar a curva padrão.

[0634] O sobrenadante clarificado de Fc de PSMA foi carregado em uma colna HiTrap MabSelect Sure Protein A equilibrada (dPBS, pH 7,2) (GE Healthcare) em uma concentração relativa de -30 mg de pro- teína por mL de resina. Após o carregamento, a coluna foi lavada com dPBS, pH7,2 e a proteína eluída com 10 volumes de coluna de 0,1 M de acetato de sódio, pH 3,5. As frações de pico foram agrupadas, neu- tralizadas com 2 M de Tris, pH 7, e filtradas (0,2 uy). A amostra de pro-

teína neutralizada foi dialisada contra 3 alterações de dPBS contendo Ca2+, Mg2+, e 0,5 mM de ZnCl2, pH 7,2, de um dia para o outro a 4ºC. No dia seguinte, a amostra foi removida da diálise, filtrada (0,2 u) e a concentração de proteína determinada por absorbância a 280 nm em um espectrofotômetro BioTek SynergyHTTM. A qualidade das pro- teínas purificada foi avaliada por SDS-PAGE e HPLC de exclusão de tamanho analítico (sistema Dionex HPLC). Os níveis de endotoxina foram medidos com o uso de um ensaio LAL (Pyrotell-T, Associates of Cape Cod). As proteínas purificadas foram armazenadas a 4ºC.

[0635] A proteína recombinante de domínio extracelular (ECD) de PSMA humano (ECD de PSMA humano, SEQ ID NO:7), correspon- dente aos aminoácidos 44 a 750 da SEQ ID NO:3 com as tags Avi e a 6His do terminal N (SEQ ID NO: 58) foi clonada, expressa e purificada conforme descrito anteriormente para as proteínas de ECD de PSMA de chimpanzé e cino. Exemplo 2: Identificação de Fabs de PSMA anti-chimpanzé e anti- humano

[0636] Seleção ("panning") com proteína recombinante. Uma primeira solução de seleção ("panning") das bibliotecas Fab-plX hu- manas de novo [Shi, L., et al J Mol Biol, 2010. 397(2): p. 385 a 396. WO 2009/085462], que consiste em bibliotecas de cadeia pesada VH1 a 69, 3a 23 e 5a 51 emparelhadas com quatro bibliotecas de genes de linhagem germinativa de VL humana (A27, B3, L6, O12), foi reali- zada com o uso de uma abordagem de seleção ("panning") alternada com uma rodada de captura de fagos sobre microesferas de estrepa- vidina (Invitrogen Catit 112.05D, Lote ft 62992920) revestidas com ECD de PSMA bionitilado de chimpanzé de acordo com o protocolo do fabricante, seguido de captura de fagos sobre microesferas de ProtG (Invitrogen, Cat&10003D) revestidas com Cino-PSMA-Fc de acordo com o protocolo do fabricante seguido de captura de fagos sobre mi-

croesferas de Sera-mag Double Speed magnetic Neutravidin (Thermo, Cat t7815-2104-011150) revestidas com ECD de PSMA biotinilado de chimpanzé de acordo com o protocolo do fabricante. Esta seleção ("panning") produziu dois acertos ("hits"): PSMB18 e PSMB25.

[0637] Seleção ("panning") de células inteiras para Fabs anti- PSMA. Experimentos de seleção ("panning") adicionais foram realiza- dos em células inteiras usando-se a Rodada t1 de saída obtida dos experimentos de panning de ECD de chimpanzé descritos acima ou de bibliotecas de fagos de novo frescas, como entrada. Resumidamente, o fago foi produzido por infecção de um fago auxiliar e concentrado por precipitação com PEG/NaCl de acordo com protocolos padrão conhe- cidos na técnica. As bibliotecas de fagos foram pré-limpas em células HEK293F parentais durante a noite a 4ºC com agitação suave. Após a precipitação com PEG/NacCl, as bibliotecas pré-limpas foram incuba- das cm células HEK293 que expressam PSMA de chimpanzé ou célu- las LNCAP com agitação suave durante 2 horas a 4ºC. A remoção de fago não ligado e a recuperação das células ligadas a fago foram rea- lizadas por meio do gradiente de Ficoll e após várias etapas de lava- gem, as células que transportante fago ligado foram ligadas com 1 mL de cultura de E. Coli TG-1 a 37ºC durante 30 minutos sem agitação. À mistura resultante foi plaqueada em placas de LB-Carbenicilina-1% de glicose e cultivadas de um dia para outro a 37ºC. O processo foi, en- tão, repetido para rodadas de seleção ("panning") subsequentes.

[0638] Conversão de Fab-pIX de fago em Fab-His para gerar sobrenadantes de E. coli. Os acertos Fab-plX de fago resultantes foram convertidos em Fab-His com o uso de um procedimento padrão. O DNA plasmidial foi isolado da E. coli selecionada do fago (kit Plas- mid Plus Maxi, Qiagen catit12963) e submetido a digestão pelas enzi- mas de restrição Nhel/Spel. Os fragmentos 5400 e 100 bp resultantes foram separados em um gel de agarose a 0,8% e o fragmento 5400 bp foi purificado em gel (kit de purificação MinElute, Qiagen catt28006). À banda 5400 bp purificada foi autoligada com o uso de ligase T4 e o produto resultante (que codifica a fusão Fab-his) foi transformado de volta na cepa de E. coli TG-1 e clonalmente isolada. Os sobrenadantes de Fab-His foram gerados a partir de clones por indução de um dia para o outro de culturas com 1 mM de IPTG. Após a centrifugação da cultura de um dia, os sobrenadantes clarificados estavam prontos para uso em ensaios a jusante. Para determinar os níveis de expressão re- lativos de diferentes sobrenadantes de Fab-his, um ensaio de ELISA anti-kappa (Southern Biotech cat t2061-05) em sobrenadantes serial- mente diluídos foi realizado. Todos os clones testados apresentaram expressão de Fab-his similar) (dados não mostrados).

[0639] Ligação celular de fusões Fab-his de E. coli. Um ensaio de ligação à base de células foi projetado para avaliar as capacidades de ligação de fusões Fab-his individuais de sobrenadantes de E. coli em células que expressam PSMA. Clones de Fab individuais foram isolados da saída da rodada 3 de todos os experimentos de "panning" após a excisão plX. Os clones de Fab foram testados quanto à ligação a células HEK que expressam PSMA de chimpanzé e cino, bem como a PSMA humano em células LNCaP. Brevemente, as células que ex- pressam PSMA foram distribuídas por alíquotas em uma placa de fun- do em V (CoStar 3357) em uma densidade de 200.000 por poço e in- cubadas com sobrenadantes (100 uL) que expressam fragmentos Fab durante 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 2% de FBS, e coradas com um anticorpo kappa-RPE anti-humano de camundongo (Life Technologies cattt MH10514) du- rante 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 2% de FBS e ressuspensas em 100 ul do mesmo tampão de lavagem. As placas foram lidas através de citometria de fluxo com um BD FACS array. Os dados de FACS foram analisados em um sof-

tware FlowJo por separação em grupos ("gating") da população sau- dável de células vivas com o uso de dispersão frontal e dispersão late- ral, e então análise das células neste grupo com coloração PE. A in- tensidade média de fluorescência (MFI, "mean fluorescence intensity") foi calculada e exportada para o Microsoft Excel. Os clones de Fab que apresentaram background de ligação 2 3 vezes para todas as três espécies de PSMA (cino, humano e chimpanzé), e não apresentaram nenhuma ligação com a linhagem celular HEK293, foram identificados como "positivo preliminar". Os Fabs foram sequenciados e movidos adiante para clonagem em vetor de expressão em mamífero para re- triagem. Os positivos verdadeiros foram selecionados a partir da liga- ção de sobrenadantes de Fab expressos em células de mamífero com a linhagens celulares que expressam PSMA.

[0640] Preparação de Fabs de mamíferos. Para a conversão de Fab de E. coli em Fab expresso em mamífero, foi utilizado clonagem In-Fusion HD (ClonTech catt%638918) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as sequências de nucleotídeos de clones que passaram pela triagem primária e devem ser movidas para o for- mato Fab de mamífero, são carregadas no programa "InFu Primer Fin- der v1.2.3" (software desenvolvido in-house), que gera uma lista de iniciadores ("primers") de PCR específicos de isótipo usados para ge- rar fragmentos de PCR para clonagem In-Fusion nos vetores de ex- pressão de Fab, huKappa mulgGSP e huG1. Esses vetores são veto- res internos com promotores de CMV baseados em pcDNA3.1. Após o processo In-fusion, clones de E. coli foram isoladas, as sequências verificadas e transfectadas em células HEK293 usando-se protocolos padrão. Fabs de PSMA de mamíferos para confirmar a ligação a linha- gens celulares que expressam PSMA foram preparados por coleta de mL de sobrenadantes a partir da transfecção após 5 dias.

[0641] Nova triagem de acertos da seleção ("panning") de cé-

lulas inteiras no formato sobrenandante de mamífero. A confirma- ção de sobrenadantes de Fab expressos em mamífero foi realizada com o ensaio de ligação de célula inteiras descrito anteriormente. À ligação de Fabs ao PSMA de chimpanzé, macaco cinomolgo e huma- no (células LNCaP) foi testada, bem como contra-triagem sem ligação à linhagem celular HEK parental. A Tabela 3 mostra o perfil de acertos da ligação dos sobrenadantes de Fab de mamífero às células que ex- pressam PSMA. Muitos dos acertos dos sobrenadantes de E. coli não se confirmaram com proteínas expressas em mamíferos. PSMB47 mostrou forte ligação com células que expressam PSMA de cino, al- guma ligação com células que expressam PSMA de chimpanzé, e ne- nhuma ligação com células LNCaP que expressam PSMA humano. PSMB55 mostrou um perfil similar, mas com alguma ligação a células LNCaP. PSMB68 a PSMB79 se ligaram a células LNCaP, mas não a células que expressam PSMA de chimpanzés ou cino. Os sobrenadan- tes de Fab de mamífero PSMB51, PSMB55 e PSMBB56, se ligaram a todas as três linhagens celulares. PSMB49, PSMBB50, e PSMB53 mos- tram mais ligação em chimpanzés ou cinos. M58 mostrou fraca ligação em chimpanzés e cinos.

Tabela 3. Perfil de acertos da ligação de proteína de Fab de mamífero a células que expressam PSMA medido por Geo-MFI (intensidade média de fluorescência) ID de proteína de Fab (ID de psveto esmo Ta are a pes et Em pavão — e e o es pe et pauta rena ss o er pevets penas a Ts e ste rio rs o a pe E FETO o a pe Rr e ir po E ass im FTSE BR a e pra Rr a Fa PES e es tr pe Tr ir is FT PTE RR E a im pre E se FPS 7 as ig FE PE Rr a FEET E is FTSTRST Rr o ag

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ID de proteína de Fab (ID de peuss trees o e isa Tm TT Er ir ia

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ID de proteína de Fab (ID de

[0642] Curvas de resposta à dose de Fabs expressos em ma- míferos. Após os clones de Fab expressos em mamíferos confirma- rem ligação positiva como sobrenadantes de Fab puros com linhagens celulares que expressam PSMA, os sobrenadantes foram normaliza- dos para a concentração de proteína por Octeto ou gel de proteínas, e as curvas de resposta à dose foram concluídas para confirmar a liga- ção ao PSMA com o uso do protocolo descrito anteriormente. As Figu- ras | a 3 mostram as curvas de titulação para acertos que demonstra- ram ligação a todos as três células que expressam PSMA. A Figura 1 mostra as curvas de titulação para os acertos de seleção ("panning") anti-PSMA em função das células LNCaP. A Figura 2 mostra as curvas de titulação para os acertos de seleção ("panning") anticPSMA em fun- ção de células HEK de PSMA de chimpanzé. A Figura 3 mostra as curvas de titulação para os acertos de seleção ("panning") anti-PSMA em função de células HEK de PSMA de cino. PSMGB5 (PSMA de cino, GenBank: EHH56646.1) ou PSMG9 (PSMA de chimpanzé, sequência de referência do NCBI: XP 016777253.1) foram clonados em um vetor de expressão de mamífero entre os sítios Hindll e EcoRI sob controle do promotor CMV para geração de linhagem celular. DNA modificado foi transfectado em células 293F com o uso de reagente lipofectamina LTX seguido de seleção com geneticina para selecionar células positi- vas para PSMA (PSMGB5 ou PSMG9). Após a seleção, as células fo- ram triadas e classificadas com o uso de anticorpo anti PSMA (Aviva

Cat %& OAABO02483- PSMG9) ou Fab anti-PSMA (PSMB18-Janssen Internal) com o uso de FACS. Os clones PSMG5 11,23, 25e 32 e os clones PSMG9 2, 10, 11, 12, 20 e 24 classificados por FACS foram selecionadas e transferidos para a triagem. As sequências de PSMG5 e PSMG9 são fornecidas abaixo. Perfis de ligação entre os acertos foram comparados entre linhagens celulares que expressam diferentes espécies de PSMA. O sobrenadante de PSMB51 foi usado como um controle positivo nos experimentos. Vários acertos foram desprioriza- dos devido aos de sítios de glicosilação ligados a N em CDRs se liga- rem à linhagem celular HEK parental negativa para PSMA ou à falta de ligação às linhagens celulares positivas para PSMA. Onze acertos de Fab permaneceram e 10 acertos foram clonados em construtos de ca- deia pesada de IQgG4-PAA humana e usados para gerar anticorpos bi- específicos para PSMAXCD3. Estes acertos mostraram ligação entre espécies dentre 3 vezes umas das outras e foram movidos para um formato de anticorpo biespecífico para serem testados quanto à morte por redirecionamento de células T de alvos positivos para PSMA. Os antígenos de seleção ("panning") para cada acerto são mostrados na Tabela 4. PSMGSB5 (SEQ ID NO:126)

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSS EATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQ! QSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFE PPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERD MKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGV KSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMA EAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVG PGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHR DSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAE EFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMY SLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSG NDFEVFFORLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKF YDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIY

NISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILL RMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGI|

YDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA PSMG9 (SEQ ID NO:127)

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSS NEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAK QIASQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSL FEPPPPGYENVLDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLER DMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPG VKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIA EAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVG PGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHR DSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEE FGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYS LVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGN DFEVFFORLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFY DPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNI SMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFTERLQDFDKSNPILLR MMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIY

DALFDIESKVDPSKAW GDVKRQISVAAFTVQAAAETLSEVA Tabela 4. Antígeno para cada um dos acertos de panning Rodada 2-3 de cino de chimpanzé PSMB58, PSMB109, PSMB5B55, PSMB84, PSMB83 de chimpanzé

[0643] Preparação de MABs anti-PSMA. Um total de 12 clones que demonstraram ligação com todas as três células que expressam PSMA foram finalmente convertidos em IgG4 de mAb tendo as substi- tuições de Fc isótipos S228P, F234A e L235A (PAA) por clonagem de restrição. Brevemente, construtos que corresponderam a clones de Fab que passaram as triagens iniciais foram digeridos com Hindlll e Apal. Os fragmentos purificados com gel foram ligados em um vetor de expressão interno com o promotor de CMV para geração de expressão de IQgG4-PAA humana. Isso permitiu a geração rápida de anticorpos biespecíficos. O vetor de expressão interno anteriormente descrito foi usado para expressar as cadeias pesadas e leves para cada mAb de PSMA, onde ambos os vetores foram cotransfectados transientemente em linhagens celulares 293Expi ou CHO para expressão do mAb. As sequências de CDR dos Fabs de PSMA positivos entre espécies gera- das da seleção ("panning") de fagos são mostradas abaixo na Tabela

5. As sequências VH e VL dos Fabs selecionados são mostradas abaixo na Tabela 6. As sequências de cadeias pesadas e leves de mAbs geradas dos Fabs são mostradas na Tabela 7.

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[0644] Um anticorpo monoespecífico anti-PSMA, PSMB119, foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 79 e a VL da SEQ ID NO: 78 e uma região constante de I9gG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecifi- co anti-PSMA, PSMB120, foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 77 e a VL da SEQ ID NO: 78 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico para anti-CD3 PSMB121 foi ge- rado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 75 e a VL da SEQ ID NO: 76 e uma região constante de I9gG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico para anti-CD3 PSMB122 foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 61 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico para anti-CD3 PSMB123 foi ge- rado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 72eaVL da SEQ ID NO: 73 e uma região constante de I9G4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico para anti-CD3 PSMB124 foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 70 e a VL da SEQ ID NO: 71 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico para anti-CD3 PSMB126 foi ge- rado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 68 e a VL da SEQ ID NO: 69 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico anti-PSMA, PSMB127, foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespecífico anti-PSMA, PSMB128 (Alt.

ID de Fab: PSMB384) foi gerado compreendendo as regiões de VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 64 e a VL da SEQ ID NO: 65 e uma região cons- tante de I9gG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anti-

corpo monoespecífico anti-PSMA, PSMB129, foi gerado compreen- dendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 60 e a VL da SEQ ID NO: 61 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

Um anticorpo monoespeciífico anti-PSMA, PSMB130, foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO: 62 e a VL da SEQ ID NO: 63 e uma região constante de IgG4 com as substituições S228P, F234A e L235A.

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[0645] As interações dos mAbs de PSMA parentais PSMB123 (Fab PSMB55), PSMB127 (Fab PSMB83), e PSMB130 (Fab PSMB86) com ECDs de PSMA humano, de chimpanzé e de cino foram medidas por ressonância de Plasmon de superfície (SPR) com o uso de um sis- tema XPR36 ProteON (BioRad) conforme descrito anteriormente para ECD de PSMA recombinante de chimpanzé. O resumo das afinidades de ligação de cada um desses mAbs ao ECD de PSMA humano, de chimpanzé, e de cino é mostrado na Tabela 18. Estas mAbs se ligam a alvos com afinidades similares aos anticorpos biespeciíficos. Tabela 18. Ligação de anticorpos monoclonais a ECD de PSMA re- combinante humano, de chimpanzé e de cino por Proteon Humano Chimpanzé —|Cynomolgus mr EE OU E Exemplo 3: Adaptação do arcabouço humano do anticorpo anti-CD3 SP34

[0646] O anticorpo de murino anti-CD3 SP34 foi humanizado pelo método de adaptação do arcabouço humana (Fransson, et a/., JMB, 2010 398(2):214-31). As sequências de VH e VL de SP34 são mostra- das abaixo e na Figura 4, com os resíduos de 1 a 215 da cadeia leve e os resíduos de 1 a 230 da cadeia pesada derivados diretamente do mapa de densidade de elétrons e com os resíduos de 231 a 455 deri- vados do IGHG3 MOUSE (IgG3 de camundongo, isoforma 2). VH de SP34 (SEQ ID NO:128)

EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLE WVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTA

MYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA VL de SP34 (SEQ ID NO:129)

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[0647] Quatro cadeias pesadas diferentes foram combinadas com três cadeias leves diferentes para produzir 12 variantes humanizadas. Humanização de SP34 e maturação por afinidade Seleção de linhagens germinativas humanas

[0648] Uma matriz de quatro sequências humanas de região pe- sada e três de região leve foram selecionadas para teste. A seleção de linhagens germinativas foi baseada apenas na similaridade entre se- quência total com SP34 na região do arcabouço (FR). Nem as se- quências de CDR, nem seu comprimento ou estruturas canônicas, fo- ram consideradas nessa seleção.

[0649] As correspondências mais próximas da cadeia pesada são GLs humanas IGHV3-72 e IGHV3-73. Uma outra GL, IGHV3-23, foi selecionada por sua alta frequência de ocorrência no repertório de cé- lula B humana.

[0650] As correspondências mais próximas da cadeia leve são as GLs lambda humanas IGLV7-43 (ou 7a), IGLV7-46 (ou 7b) e IGLV1-51 (ou 1b). IGLV7-46 é virtualmente idêntica a IGLV7-43, mas tem uma vantagem de uma Ala na posição 2, isto é, como em SP34.

[0651] As regiões J selecionadas são as seguintes: IGHJ1 para a cadeia pesada; IGLJ3 para a cadeia leve lambda.

Retromutações

[0652] Para preservar a conformação de CDR-H3, os resíduos em várias posições do arcabouço em VL, principalmente nas posições Val38, GIy48 e GlIy51, precisam ser mantidos. Essas "retromutações" foram adicionadas ao plano de humanização.

[0653] O Asn na posição 57 da cadeia pesada ficou truncado na Gly no plano de maturação para permitir a flexibilidade necessária e potencialmente melhorar a estabilidade (reduzindo a tensão estrutural local não relacionada à glicina) embora sem afetar a ligação.

[0654] Há várias outras considerações feitas no design de huma- nização. Primeiro, as GLs humanas IGLV7-46 e IGLV7-43 introduzem um Trp na posição 59 com um potencial de oxidação indesejado. As outras GLs têm Gly nessa posição, que correspondem à sequência de camundongo. Portanto, GlIy59 foi preservada em ambas as variantes IGLV7-46 e IGLV7-43. Finalmente, Ala na posição 49 da VH pode ser essencial. Além disso, o resíduo na posição 99 (Val em SP34) pode impactar na ligação do antígeno. Para testar essas posições, foram introduzidas retromutações em algumas variantes (Figura 5). Matriz HFA

[0655] A matriz HFA (Tabela 8) é composta de quatro variantes de VH e três variantes de VL (Figura 5). Com o propósito de HFA, a defi- nição de CDR do AbM (K.R. Abhinandan e A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839) é usada.

[0656] As variantes da VH: CD3H141 (SEQ ID NO:104): IGHV3-72*01 com CDRs de camun- dongo + GIy49Ala

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTED

TAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3H142 (SEQ ID NO:102): IGHV3-23*01 com CDRs de camundongo + Ser49Ala

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3H143 (SEQ ID NO:115): IGHV3-23*01 com CDRs de camundongo + Ser49Ala, Ala99Val

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3H144 (SEQ ID NO:116): IGHV3-73*01 com CDRs de camundongo + Asn57Gly

EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGL EWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTED

TAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS As variantes da VL: CD3L63 (SEQ ID NO:103): IGLV7-46*01 com CDRs de camundongo + F38V,A48G,Y51G,W59G

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAP RGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCAL

WYSNLWVFGGGTKLTVL CD3L64 (SEQ ID NO:117): IGLV1-51*01 com CDRs de camundongo + Y38V, L48G, Y51G

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVTTSNYANWVQQLPGTAP KGLIGGTNKRAPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQOTGDEADYYCALW

YSNLWVFGGGTKLTVL CD3L66 (SEQ ID NO:105): IGLV7-43*01 com CDRs de camundongo + F38V,A48G,Y51G,W59G

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAP RGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAL

WYSNLWVFGGGTKLTVL Tabela 8 Matriz das cadeias pesadas e leves de CD3 (Todas foram preparadas com Fc de IGG1-AA contendo L234A, L235A e F405L) a EO PER. SO, (LV7-46NV59G) |(LV1-51) (LV7-43NW59G) SEQ ID NO:103 |SEQ ID NO:117 |/[SEQ ID NO: 105 CcD3H141 SEQ ID NO: 104

CD3L63 CD3L64 CD3L66 (LV7-46/V59G) |(LV1-51) (LV7-43/V59G) SEQ ID NO:103 |[SEQ ID NO:117 |(SEQ ID NO: 105 CcD3H142 (HV3-23 + S49A) CD3B147 CD3B148 CD3B150 SEQ ID NO:102 CcD3H143 (HV3-23 +S49A,A99V) CD3B151 CD3B152 CD3B154 SEQ ID NO: 115 CcD3H144 (VH3-73 com G49) CD3B155 CD3B156 CD3B158 SEQ ID NO:116

[0657] As sequências de aminoácidos foram retrotraduzidas para DNA e o cDNA foi preparado usando técnicas de síntese gênica (pa- tente US nº 6.670.127; patente US nº 6.521.427). As regiões variáveis de cadeia pesada (HC) foram subclonadas em Fc IgG1-AA humano contendo as mutações L234A, L235A e F405L com o uso de um vetor de expressão in-house com o promotor de CMV por meio de técnicas convencionais de biologia molecular. As regiões variáveis de cadeia leve (LC) foram subclonadas em regiões constantes de Lambda (A) humanas usando um vetor de expressão produzido internamente com o promotor CMV por meio de técnicas convencionais de biologia mole- cular. Os plasmídios resultantes foram transfectados em células Ex- pi293F (Invitrogen) e os anticorpos monoclionais foram expressos. A purificação foi feita por métodos convencionais usando uma coluna de Proteína A (coluna (hiTrap MAbSelect SuRe). Após a eluição, os agru- pamentos foram dialisados em D-PBS pH 7,2. A sequência de VH e VL dos anticorpos são mostradas na Tabela 9.

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Exemplo 4: Ligação de célula endógena dos anti-CD3 humanizados positivos a células T primárias

[0658] O painel resultante de anticorpos anti-CD3 foi testado quan- to à ligação contra CD3e na superfície celular em células T primárias humanas. Para fazer isso, a ligação de anticorpos dos sobrenadantes de expressão foi visualizada usando um anticorpo secundário anti- humano policlonal e analisada por citometria de fluxo. Resumidamen- te, a ligação dos anticorpos anti-CD3 à CD3e na superfície celular foi avaliada por citometria de fluxo usando linfócitos T primários humanos purificados por seleção negativa (Biological Specialty, Colmar, EUA). Os sobrenadantes da expressão ou os anticorpos purificados foram normalizados para 10 pg/ml em meio ou tampão (BD BioSciences), respectivamente. 2x10º células foram aliquotadas em poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços (CoStar) para marcação. Os anti- corpos na expressão da expressão foram adicionados às células e in- cubados durante 45 min a 4 ºC. Após a centrifugação a 1.300 rpm du- rante 3 min e remoção do sobrenadante, 50 ul de anticorpo secundário IgG anti-humano (H+L) Alexa Fluor 647 (Life technologies Inc.) foram incubados com as células a uma concentração final de 10 ug/ml duran- te 30 minutos a 4 ºC longe de luz direta. Depois, foram lavados e res- suspensos em 30 ul de tampão de FACs (BD BioSciences). A coleta da amostra foi feita em um sistema HTFC Intellicyt usando o software ForeCyt. As células únicas viáveis foram selecionadas antes da análi- se de ligação usando corantes fixáveis verde ou vermelho Live/Dead (Life Technologies, Inc.) e área de espalhamento para frente/lateral e parâmetros de altura, respectivamente. Foram gerados gráficos com o GraphPad Prism versão 5, usando valores de intensidade de fluores- cência médios.

[0659] Embora uma série de titulação tenha sido executada, uma concentração intermediária está presente na Figura 6 para fins de cla-

reza. Dois anticorpos derivados de fago internos com a mesma região Fc que os anticorpos terapêuticos foram usados como controles: G11 (HC SEQ ID NO:118, LC SEQ ID NO:119), um anticorpo agonista de reação cruzada não cino foi usado como controle positivo e um anti- corpo não aglutinante / não agonista CD3B94 (HC-SEQ ID NO:120, LC — SEQ ID NO:121) foi usado para avaliar a ligação não específica. O anticorpo SP34 comercial não foi usado como comparação neste en- saio já que é um anticorpo de camundongo e o uso de um reagente de detecção secundário diferente teria impedido a comparação direta com as variantes testadas.

[0660] Os dados demonstram uma matriz de potencial de ligação dentro do painel de anti-CD3 humanizados positivos, com dois anticor- pos (CD3B144, CD3B152) mostrando perda total de ligação às células T humanas. Os anticorpos restantes mostraram uma faixa de potencial de ligação que poderia ser amplamente dividida em aglutinantes fortes e fracos usando a ligação G11 como um limiar arbitrário. Usando-se esses parâmetros, sete aglutinantes fortes e sete aglutinantes fracos foram identificados no painel de variantes (Figura 6).

[0661] A análise de ligação dos acertos anti-CD3 às células T CD4+ primárias de cinomolgos foi, então, testada para avaliar a reten- ção da reatividade cruzada. Células T CD4* T purificadas do sangue periférico de macacos cinomolgos (Zen Bio, Triangle Research Park, EUA) foram usadas. Os protocolos do ensaio foram similares àqueles descritos acima. Como G11 não apresenta reação cruzada com o CD3e de cinomolgo, CD3B124, um anticorpo quimérico interno deriva- do de SP34 tendo a VH e a VL de SP34 com arcabouço murino e Fc de IgG1 humano foi usado como um controle positivo nesse ensaio (Figura 7). É interessante observar que várias variantes mostraram potencial de ligação reduzido em comparação com células humanas. Isso incluiu os aglutinantes fontes CD3B150, CD3B151 e CD3B154,

nos quais a ligação foi reduzida, e vários aglutinantes fracos onde a ligação não podia ser mais detectada sobre o fundo. A perda de liga- ção não foi relacionada a uma cadeia de imunoglobulina específica, sugerindo que a combinação de cadeias pesada e leve tem uma fun- ção na perda de reatividade cruzada. Juntos, esses ensaios permiti- ram a identificação de variantes que retiveram a reatividade cruzada de espécies entre CD3e humano e de macacos cinomolgos.

Exemplo 5: Análise funcional de anti-CD3 humanizados positivos em células T primárias

[0662] A análise de ligação demonstrou que o painel de acertos anti-CD3 humanizados mostrou uma faixa de potencial de ligação a células T humanas e de cinomolgos. Para investigar a capacidade de cada variante de induzir a ativação através de ligação cruzada ("cross- linking") de CD3£, células T primárias foram cultivadas de um dia para o outro na presença de anticorpo conjugado a microesferas. No dia seguinte, as células foram coletadas e marcadas com um anticorpo anti-CD69 para medir a ativação (Figura 8). Anticorpos anti-CD3 hu- manizados foram ligados a microesferas magnéticas revestidas com proteína A (SpheroTech, Lake forest, EUA) por incubação de um dia para outro com anticorpo a 10 ug/ml. No dia seguinte, 2x10º células T primárias humanas foram colocadas em placas de cultura celular de fundo redondo em triplicata e 2x10º microesferas revestidas foram adi- cionadas. Após a cultura de um dia para o outro a 37 ºC, as células foram coletadas e marcadas com anticorpo anti-CD69 Alexa FluorO&O 488 (clone FN50; Biolegend) para avaliar a regulação positiva desse marcador de ativação. A coleta e análise da amostra foram feitas con- forme descrito acima para a ligação. Vários controles negativos foram usados, incluindo células T apenas, células T com microesferas não revestidas e células T com microesferas revestidas do isótipo controle (CD3B94). Todos eles mostraram valores de intensidade de fluores-

cência média similar comparável a células T não coradas indicando que o meio de fundo era baixo nesse ensaio. Vários controles positivos foram usados para comparação, incluindo OKT3 (US5929212) e o an- ticorpo SP34-2 disponível comercialmente.

[0663] Os acertos anti-CD3 humanizados foram testados quanto a sua capacidade de ativar células T CD4+ primárias de cinomolgo (Zen Bio, Triangle Research Park, EUA) no mesmo ensaio (Figura 9). O an- ticorpo anti-CD69 FN50 foi descrito como apresentando reação cruza- da com a proteína não humana e poderia, portanto, ser usado para testar a ativação dessas células.

[0664] Os dados de ativação humana de macacos cinomolgos fo- ram correlacionados aos dados de ligação no sentido de que o painel de positivos exibiu uma faixa de potenciais de ativação. Vários agluti- nantes fortes mostraram a capacidade de ativar células T humanas de modo equivalente ou maior quando comparados ao SP34-2 comerci- almente disponível. Várias variantes mostraram potencial de ativação que foi menor em comparação com SP34-2, enquanto alguns agluti- nantes não mostraram evidência de estímulo de CD69. A incapacidade de ativar foi observada apenas nas variantes que não mostraram ne- nhuma ligação ou ligação fraca e todos os aglutinantes fortes mostra- ram algum nível de ativação, sugerindo uma correlação entre os po- tenciais de ligação e ativação para humanos (Figura 10A) e cinomol- gos (Figura 10B).

[0665] Dois anticorpos anti-CD3, CD3B146 e CD3B147, com afini- dade alta e média respectivamente, foram selecionados para a prepa- ração de anticorpos biespecíficos com os anticorpos específicos para PSMA. Esses dois anticorpos anti-CD3 foram preparados no formato IgG4 PAA GenMab (Labrijn et a/., 2013) onde o parental de direciona- mento (PSMA) contém a mutação 409R GenMab (aminoácido nativo para IgG4), enquanto o parental de morte (CD3) contém a mutação

F405L GenNab e R409K. Um dos anticorpos anti-CD3 monoespecifi- cos foi expresso como IgG4, tendo as substituições de Fc S228P, F234A, L235A F405L e R409K (braço CD3) (numeração de acordo com o índice EU) nas suas regiões Fc. As regiões variáveis de cadeia pesada (HC) foram subclonadas em Fc IgG4-AA humano contendo as mutações S228P, F234A, F234A, L235A e R409K com o uso de um vetor de expressão interno com um promotor de CMV por meio de téc- nicas padrão de biologia molecular. As regiões variáveis de cadeia le- ve (LC) foram subclonadas em regiões constantes de Lambda (A) hu- manas usando um vetor de expressão produzido internamente com o promotor CMV por meio de técnicas convencionais de biologia molecu- lar. Os plasmídios resultantes foram transfectados em células Ex- pi293F (Invitrogen) e os anticorpos monoclonais foram expressos. Os anticorpos anti-CD3 foram purificados com o uso de métodos de purifi- cação padrão: uma coluna de proteína A com um tampão de eluição de 100 mM de NaAc pH3,5 em um tampão de neutralização de 2M de Tris, pH 7,5 e 150 mM de NaCl. Os mabs foram dessalinizados com o uso de coluna PD10 (Sephadex G25M) e os agrupamentos foram dia- lisados em D-PBS, pH 7,2.

[0666] Um anticorpo anti-CD3 monoespecífico, CD3B217, foi ge- rado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO:102 e a VL da SEQ ID NO:103 e uma região constante de I9G4 com as substituições S228P, F234A, L235A, F405L e R409K. CD3B217 compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 108 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:109. Um anticorpo anti-CD3 monoespecifi- co, CD3B219, foi gerado compreendendo as regiões VH e VL tendo a VH da SEQ ID NO:104 e a VL da SEQ ID NO:105 e uma região cons- tante de IgG4 com as substituições S228P, F234A, L235A, F405L e R409K. CD3B219 compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 110 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:111.

Exemplo 6. Preparação de anticorpos biespecíficos para PSMA X CD3

[0667] A formação de anticorpos biespecíficos para PSMAXCD3 exige dois mAbs parentais, um específico para o braço de direciona- mento (por exemplo PSMA) e um específico para o braço efetor (por exemplo CD3). Os mAbs de PSMA foram recombinados com um braço CD3 de afinidade média CD3B217 (VH SEQ ID NO:102, VL SEQ ID NO:103) e um braço CD3 de afinidade alta CD3B219 (VH SEQ ID NO:104, VL SEQ ID NO:105). Esses mAbs parentais estão no formato GenMab (Labrijn et a/., 2013) onde o parental de direcionamento (PSMA) contém a mutação 409R GenMab (aminoácido nativo para IgG4), enquanto o parental de morte (CD3) contém a mutação F405L GenNab e a mutação R409K. Um dos anticorpos anti-CD3 monoespe- cíficos foi expresso como IgG4, tendo as substituições de Fc S228P, F234A, L235A F405L e R409K (braço CD3) (numeração de acordo com o índice EU) nas suas regiões Fc. Os anticorpos monoespecíficos foram expressos em linhagens celulares HEK sob promotores de CMV.

[0668] Os anticorpos PSMA e CD3 parentais foram purificados usando-se uma coluna de proteína A com um tampão de eluição de 100 mM de NaAc pH3,5 em um tampão de neutralização de 2M de Tris, pH 7,5 e 150 mM de NaCl. Os mabs foram dessalinizados usan- do-se coluna de PD-10 (Sephadex G25M) e dialisados em tampão D- PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), pH 7,2.

[0669] Após a purificação, os anticorpos PSMA parentais foram misturados com o anticorpo CD3 parental desejado sob condições re- dutoras em 75 mM de cisteamina-HCl a 31ºC e incubados por 4 h. As reações de recombinação foram baseadas em razões molares, onde uma quantidade definida de PSMA (por exemplo, 10 mg, ou -67,8 na- nomols) foi combinada com o anticorpo CD3 (por exemplo, —71,8 na- nomols), onde o anticorpo CD3 foi adicionado em um excesso de 6%

do anticorpo PSMA. As concentrações das soluções de estoque de anticorpo PSMA estavam na faixa de 0,8 a 6 mg/mL, e os volumes das reações de recombinação variaram para cada pareamento. As recom- binações foram subsequentemente dialisadas contra PBS para remo- ver o redutor. As reações dos anticorpos biespecíficos foram realiza- das com um excesso do anticorpo CD3 (razão) para minimizar a quan- tidade de anticorpo PSMA parental não reagido remanescente após a recombinação. Após a redução parcial dos mAbs parentais, o redutor foi removido por diálise de um dia para o outro em PBS.

[0670] Os anticorpos biespecíficos finais produzidos, junto com os mAbs parentais (isto é, PSMA, CD3, ou nulo) usados nas reações de recombinação são mostrados na Tabela 10, com as sequências men- cionadas nas Tabelas 11 e 12.

[0671] Os acertos de PSMA selecionadas foram também empare- lhados com um braço não morte (Nulo) para criar controles negativos para fins de teste. Para anticorpos biespecíficos de controle, B2M1, e um anticorpo RSV no formato IgG4 PAA (VH SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO:107 de VL) foi gerado, purificado e, combinado com o braço de CD3 CD3B219 -F405L, R409K para gerar CD3B288 (CD3 X nulo) ou os braços de PSMA, PSMB162, PSMB126, PSMB130 para gerar PS3B37, PS3B39 e PS3B40 respectivamente (PSMA X nulo).

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[0673] O anticorpo biespecífico PS3B2 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB120. O anticorpo biespecífico PS3B3 compre- ende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB121, -R409. O anticorpo bies- pecífico PS3B4 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB122, -R409. O anticorpo biespecífico PS3B5 compreende o bra- ço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb I3RB217, - PSMB123- R409. O anticorpo bi- específico PS3B7 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB58, -R409. O anticorpo biespecífico PSSB8 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de |li- gação a PSMA do mAb PSMB126, -R409. O anticorpo biespecífico PS3B9 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B217, - F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB127, - R409. O anticorpo biespecífico PS3B10 compreende o braço de liga- ção a CD3 do mAb CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB128, -R409. O anticorpo biespecífico PS3B11 com- preende o braço de ligação a CD3 de CD3B217, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB129 -R409. O anticorpo biespe- cífico PSSB12 compreende o braço de ligação a CD3 de CD3B217, - F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB130 - R409.

[0674] O anticorpo biespecífico PSS3B19 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB119-R409. O anticorpo biespecífico PS3B20 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB120-R409. O anti- corpo biespecífico PSS3B21 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb

PSMB121-R409. O anticorpo biespecífico PS3B22 compreende o bra- ço de ligação CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a CD123 do mAb PSMB122-R409. O anticorpo biespecífico PS3B23 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, - F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB123-R409. O anticorpo biespecífico PS3B24 compreende o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB124-R409. O anticorpo biespecífico PS3B25 compreen- de o braço de ligação a CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB165-R409. O anticorpo bies- pecífico PS3B26 compreende o braço de ligação CD3 do mAb CD3B219, -F405L, R409K, e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB126-R409. O anticorpo biespecífico PS3B27 compreende o bra- ço de ligação a CD3 de CD3B219 -F405L, R409K e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB127-R409. O anticorpo biespecífico PS3B28 compreende o braço de ligação a CD3 de CD3B219 -F405L, R409K e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB128-R409. O anticorpo bi- específico PS3B29 compreende o braço de ligação a CD3 de CD3B219 -F405L, R409K e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB129-R409. O anticorpo biespecífico PSS3B30 compreende o bra- ço de ligação a CD3 de CD3B219 -F405L, R409K e o braço de ligação a PSMA do mAb PSMB130-R409.

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SSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCAO NS INS In O [O jo [O Jo [O o o o o jo jo = |E E |2 |2 |2 |2 |2 2 |2 | |2 | [2 | NI Ia Ia a Ia a a a Ia Ja Ia ja Ia ja mM jm imM mM A já IM mM já mM à à mM à jà CI 6 106 |O |O |O |O |O |O jo |O |O |O |O jo O O JA jOó JA JO JA IO JO JA IO JO IO JO [O o lo jo lo jo lo jo lo jo Jo jo Jo jo Jo jo co O | |O |O |& |O = |O = |O MN O | jO o RNNNNNNAAANA| o x a JO |& O | 1 jo |O x o = E A RR e me e SA JO |O |O [10 OS = |O |O |- JO JM | JO |O CO | O = |N | <& |O |O |O joo jo jo jo | jco mM jm à jà à jà à à à 1 à mM à mM à == |=>=|> >= > >= > >= é > > > > |> O O O jo já lá jo lá o E lá o já 6 já Q IA AX jà |& j& | AQ | | MO |O jQ | n Q | m Im am jm a am dm dm dm & já dm em a < |< < |< < |< |< |< < ja |< < |< < |< & e e e e e e e e E E e LL LL co O» O o o = QN o | 7 o | o O o A Ia IO e | Io o Io ao IS Ja Ia Ja Ja jo vw E E e E E E | e lo E E E E é mM jm já MM à já IM mM já mM à à IM à jà == |=>=|>= >= > >= > >= > >= > > > |> O O O jO | O jO jO O jO | O IM |O IO |O |O OQ A jA |Q |A A |Q | ja |Q | jA A | AQ O mr IN JO O = |N O | |O |O |té jo O JO Tv Ee me = [QN a oa aaa Ia ja Ia jo mM jm im mM à jà IM mM já IM à à IM à jà OI 6 O O |O O |O |O |O j6O |O j6O jo |O jo O O O jO |O jO JO O jO | O IM JO IO |O |O O QN jan |AQN |A jA |jQ | jA |Q | ja jan | jQ

Exemplo 7. Caracterização por ligação celular

[0675] Anticorpos biespecíficos PSMA X CD3 foram testados quanto a ligação às linhagens celulares positivas para PSMA, LNCAP, HEK-PSMA humano, PSMA-HEK de chimpanzé e PSMA-HEK de ma- caco cinomolgo. Para avaliar as capacidades de ligação dos anticor- pos biespecíficos para PSMA, o ensaio de ligação celular foi utilizado (descrito anteriormente). Brevemente, as células tumorais que expres- sam PSMA são ligadas por anticorpos biespecíficos em concentrações conhecidas e o anticorpo ligado é detectado por um reagente de de- tecção conjugado de PE de cadeia leve anti-kappa anti-humana (Invi- trogen). A intensidade média de fluorescência (MFI) é a medida de an- ticorpo biespecífico ligado. O MFI é convertido em uma ECro relativa. À ECs5o é uma curva de resposta à dose, em que a metade da concentra- ção máxima efetiva ou o ponto da ECso é definido como o ponto de inflexão da curva. As EC5o s foram determinados por medição da célu- la ligada biespecífica e das concentrações conhecidas. Altas concen- trações resultaram em ligação máxima ao antígeno-alvo, isto é, com- pleta saturação de ligação. As curvas de resposta à dose foram então diluídas até aquela do background ou nenhuma ligação biespecífica. O ponto de inflexão dessa curva reflete o ponto da EC5o. A EC5o calcula- da é determinada mediante conversão da quantidade do anticorpo bi- específico em ug/mL no ponto de ECso em valor de molaridade com base no peso molecular do anticorpo biespecífico. Os anticorpos bies- pecíficos foram normalizados para a concentração de proteína e, en- tão, incubados com o mesmo número de células que expressam PSMA humano ou de cino. O MFI em cada concentração foi coletado por citometria de fluxo e plotado como uma função da concentração. Os dados foram transformados em log10 e então plotados. A regres- são linear das curvas de ligação foi feita para determinar as ECrso. Es- tes valores relativos foram usados para classificação da ligação a

PSMA a células-alvo. A Tabela 12 contém os valores de ligação de ECs5o relativos para estudos de ligação de células inteiras usando-se linhagens celulares LNCaP, de expressão de PSMA de cino e chim- panzé.

[0676] A Figura 11 mostra a ligação de LNCAP de todos os anti- corpos biespecíficos preparados. Os dados de ligação sugerem que 3 populações de ligação são observadas: 1) ligação forte, 2) ligação mé- dia e 3) ligação fraca/sem ligação. Os anticorpos biespecíficos PSMA X braço nulo mantêm a ligação a células LNCAP (Figura 11E), mas não foi observada nenhuma ligação para os anticorpos biespecífico nulo braço CD3 (Figura 11F). Os anticorpos biespecíficos braço CD3 de média afinidade e de alta afinidade com o mesmo braço PSMA se ligam similarmente. Para os ensaios restantes, apenas anticorpos bi- específicos que eram ligantes LNCaP positivos foram usados para avaliar a atividade de ligação a PSMA-HEK de chimpanzé (Figura 12), PSMA-HEK de cino (Figura 13), PSMA-HEKhumano (Figura 14), ou HEK293 parental (dados não mostrados). Para cada linhagem celular, os ligantes CD3 de alta afinidade ou de média afinidade foram testa- dos. Os dados de ligação hPSMA-HE sugerem que pode haver dife- renças sutis entre LNCaP e esta linhagem celular; entretanto, a mes- ma ordem geral de ligação é evidente. PS3B19, derivado de seleção ("panning") de LNCaP, parece se ligar tão fortemente às células hPSMA-HEK. Os anticorpos biespecíficos mostram uma ampla gama de perfis de ligação em HEK de PSMA de chimpanzé. Curiosamente, os acertos que foram selecionados na linhagem de células HEK de PSMA de chimpanzé têm um perfil de ligação mais forte, enquanto que aqueles que foram selecionados na linhagem de LNCaP mostraram ligação mais fraca. Nenhuma ligação foi observada com as células HEK parentais neste experimento (dados não mostrados).

[0677] Após a recombinação em anticorpos biespecíficos, vários clones superam consistentemente os outros e se ligam a interespé- cies. Esses anticorpos biespecíficos são PS3B21, PS3B22, PS3B26, PS3B27, PSS3B28 e PS3B30 que correspondem aos mAbs PSMB121, PSMB122, PSMB126, PSMB127, PSMB128 e PSMB130. As ECs5o de ligação com base em célula e as EC5o calculadas são mostradas na Tabela 13. Tabela 13: EC5o de ligação com base em célula. bão eng 85 SEI, piscina fr 5] ECso calculada/ECso ECso calcu- ECso calcu- ECs5o (ng/mL) ECs5o (ng/mL) (nM) (ng/mL) lada (nM) lada (nM) |sanaz aços rea sra ae raso | per e ass a as

[0678] Todos os anticorpos biespecíficos mantiveram a capacida- de de se ligarem às linhagens celulares positivas para PSMA. Vários dos anticorpos se ligaram bem a células que expressam PSMA de chimpanzé e cino, mas apenas fracamente a células LNCaP. As ECs5so de ligação para LNCaP estavam na faixa de 0,5 nM a 864 nM de nM a, enquanto as ECso de ligação para HEK que expressam PSMA de cino estavam na faixa de 0,9 a 128 nM e na faixa de 36 a 0,3 nM (Tabela 12) para ligação de HEK que expressam PSMA de chimpanzé. Com base nas várias ECso de ligação celular, vários dos anticorpos biespe- cíficos anti-PSMA atenderam aos critérios de ligação de 20 nM ou su- perior para PSMA humano e de ligação de 50 nM ou superior para PSMA de cino.

Exemplo 8. Caracterização de afinidade por proteon e biacore

[0679] Para avaliar adicionalmente os anticorpos, as taxas de as- sociação e dissociação do ECD de PSMA de chimpanzé foram medi- das para os acertos que foram levados adiante a partir dos ensaios de ligação celular. As interações de mAbs biespecíficos PSMAXCD3 com o alvo (PSMA recombinante de chimpanzé) foram estudadas por res- sonância de plásmon de superfície (SPR) usando-se um sistema XPR36 de ProteOn (BioRad). A superfície do biossensor foi preparada acoplando-se o Fc de IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratory, cattt109-005-098) à superfície da camada de polímero de alginato modificado de um chip GLC (BioRad, Cattt176-5011) segundo as instruções do fabricante para a química de acoplamento de amina. Aproximadamente 4400 RU (unidades de resposta) de anticorpos Fc de IgG anti-humana foram imobilizadas. Os experimentos cinéticos foram realizados a 25ºC em tampão de corrida (DPBS+0,03%de P20+100 upg/mL de BSA). Para realizar experimentos cinéticos, 100 RU de anticorpos biespecíficos foram capturados seguido de injeções de analitos (ECD de PSMA recombinante de chimpanzé) em concen- trações na faixa de 3,7 nM a 300 nM (em uma diluição em série de 3 vezes). A fase de associação foi monitorada durante 3 minutos a 50 uL/min, então seguidos por 15 minutos de fluxo de tampão (fase de dissociação). A superfície do circuito integrado foi regenerada com dois pulsos de 18 segundo de 100 mM de ácido fosfórico (H3PO;., Sigma, cattt7961) a 100 uL/min.

[0680] Os dados coletados foram processados usando-se o sof- tware ProteOn Manager. Primeiro, os dados foram corrigidos para o fun- do (background) com o uso de inter-pontos (inter-spots). Então, a subtra- ção dos dados de referência dupla foi realizada usando a injeção de tampão para injeções de analito. A análise cinética dos dados foi realiza- da como uso de um modelo de ligação 1:1 de Langmuir. O resultado pa-

ra cada anticorpo biespecífico foi registrado no formato de ka (taxa de associação), ka (taxa de dissociação) e Kp (constante de dissociação em equilíbrio). Os resultados são mostrados nas Tabelas 14 a 18. Resultados: Tabela 14: Resumo de cinética e afinidade para ligação de PS3B25 e PS3B27 a PSMA recombinante humano (3,7 a 300 nM). Os parâme- tros registrados nesta tabela foram obtidos de um modelo de ligação de Langmuir 1:1. Afinidade, Kp = Kd/Ka.

ID da proteína de anti-| corpo bioespecífico — ka (1/Ms) 10º |ka (1/s) 10º PSMB87 x CD3B219 jpsssa5 = 1,88:0,13 1,01+0,05 — [5,38+0,55 PSMB127 x CD3B219 |PS3B27 2,87+0,36 —/2,89+0,70 |[10,3+3,2 n= 3 experimentos independentes com 2 réplicas.

Resultados mostra- dos como média + desvio padrão.

Tabela 15: Resumo de cinética e afinidade para ligação de PS3B25 e PS3B27 a PSMA recombinante de chimpanzé (3,7 a 300 nM). Os pa- râmetros registrados nesta tabela foram obtidos de um modelo de liga- ção de Langmuir 1:1. Afinidade, Kp = Ka/Ka.

ID da proteína de anti-| corpo bioespecífico — ka (1/Ms) 105 |ka (1/s) 10º? PSMB87 x CD3B219 jPssB25 = UU /281+x0,08 lo99:0,04 |3,54+0,25 PSMB127 x CD3B219 PS3B27 2,08+0,38 —/1,56+0,37 —|7,48+0,97 n= 3 experimentos independentes com 2 réplicas.

Resultados mostra- dos como média + desvio padrão.

Tabela 16: Resumo de cinética e afinidade para ligação de PS3B25 e PS3B27 a PSMA recombinante de cino (3,7 a 300 nM). Os parâmetros registrados nesta tabela foram obtidos de um modelo de ligação de Langmuir 1:1. Afinidade, Kp = Ka/Ka.

ID da proteína de anti-| corpo bioespecífico — ka (1/Ms) 105 |ka (1/s) 10º?

PSMB87 x CD3B219 |jPsaB25' == UU loosro04 [7,97+x0,34 | 81,133 PSMB127 x CD3B219 [PS3B27 1,59+0,12 —|1,10+0,04 — /7,00+0,68 n= 3 experimentos independentes com 2 réplicas.

Resultados mostra-

dos como média + desvio padrão.

Tabela 17: Comparar a afinidade de ligação de PS3B25 e PS3B27 humano, de chimpanzé e de cino.

Afinidade, Kp = Ka/ka. mostra To Famano FW) To cRimpans (HH). To sa PM | passas anoss — asas — brisa Tabela 18: Resumo de cinética e afinidade para ligação de mAbs bies- pecíficos a PSMA recombinante de chimpanzé (3,7 a 300 nM). Os pa- râmetros registrados nesta tabela foram obtidos de um modelo de liga- ção de Langmuir 1:1. Afinidade, Kp = ka/kKa.

ID da proteína de PR a semícação | FR eissã | FE esissã | RR essa | RR O eeviso Pe ses |

[0681] Na maior parte, a ligação da Proteon é paralela à ligação celular. Entretanto, um dos anticorpos biespecíficos não mostrou ne- nhuma ligação ao ECD de PSMA recombinante de chimpanzé embora ele se ligou ao PSMA de chimpanzé expresso na superfície celular de células HEK. Este anticorpo, PS3B26, é um ligante apenas celular e foi eliminado dos experimentos de ligação subsequentes. Um dos ligantes positivos, PS3B23 mostrou ligação bifásica e não se ajustou bem ao modelo de ligação de 1:1. Dez dos anticorpos biespecíficos foram |i- gantes positivos para o ECD de PSMA recombinante de chimpanzé por Proteon e sua afinidade foi adicionalmente perfilada por BIACORE.

[0682] Ligação ao PSMA recombinante de chimpanzé por Bia- core. As medições de afinidade com o uso de ressonância de plásmon de superfície (SPR) foram realizadas com o uso de um biossensor óp- tico Biacore 3000 (Biacore GE Healthcare). A superfície do biossensor foi preparada acoplando-se o Fc de IgG anti-humana (Jackson Immu- noResearch Laboratory, cattt109-005-098) à superfície de dextrano carboximetilado de um chip CM-5 (BioRad, cattBR-1000-12) segundo as instruções do fabricante para a química de acoplamento de amina. Aproximadamente 16.000 RU (unidades de resposta) de anticorpos anti-humanos de Fc de IgG foram imobilizados em cada uma das qua- tro células de fluxo. Os experimentos cinéticos foram realizados a 25ºC em tampão de corrida (DPBS + 0,03% de P20 + 100 ug/mL de BSA). Diluições de antígeno (PSMA recombinante de chimpanzé, con- centração de 1,2 a 300 nM ou de 3,7 a 900 nM em uma diluição em série de 3 vezes) foram preparadas em tampão de corrida. Cerca de 100 RUs de mAbs biespecíficos para PSMAXCD3 foram capturados na célula de fluxo 2 para 4 do chip de sensor. A célula de fluxo 1 foi usada como superfície de referência. A captura do anticorpo biespecífico PSMAxCDS3 foi seguida de uma injeção de 3 ou 5 minutos (fase de as-

sociação) de antígeno (PSMA recombinante de chimpanzé) a 50 uL/min, seguida de 15 ou 20 minutos de fluxo de tampão (fase de dis- sociação). A superfície do circuito integrado foi regenerada por duas injeções de 18 segundos de 100 mM de ácido fosfórico (H3POa,a, Sig- ma, cat&7961) a 50 uL/min.

[0683] Os dados coletados foram processados usando-se o sof- tware BlAevaluation (Biacore). Primeiro, a subtração de referência du- pla dos dados foi realizada subtraindo-se as curvas geradas pela inje- ção de tampão a partir das curvas subtraídas de referência para inje- ções de analito. A análise cinética dos dados foi feita com o uso do modelo de ligação de Langmuir 1:1 com ajuste global. O resultado pa- ra cada mAb biespecífico PSMAxCD foi registrado no formato de ka (taxa de associação), ka (taxa de dissociação) e Kp (constante de dis- sociação em equilíbrio). Tabela 19: Resumo de cinética e afinidade para ligação de mAbs bies- pecíficos a ECD de PSMA recombinante de chimpanzé por Biacore o ES ema or

[0684] Todos os anticorpos biespecíficos que se ligaram ao ECD de PSMA de chimpanzé por Proteon, também se ligaram através de

Biacore. As afinidades de ligação foram um pouco mais fracas por Bi- acore. Exemplo 9. Avaliação de Abs biespecíficos para PSMA x CD3 em en- saio de morte celular funcional

[0685] Ensaios de citotoxicidade mediada por células T foram usa- dos como uma triagem funcional da atividade de anticorpos biespecífi- cos. Anticorpos biespecíficos foram testados quanto a sua capacidade de lisar células HEK que superexpressam PSMA humano, bem como a linhagem celular de câncer de próstata humano, LNCAP. Além disso, os anticorpos bisespecíficos foram testados quanto à capacidade de matar células HEK de PSMA de cino para confirmar a reatividade cru- zada das espécies.

[0686] Um ensaio de liberação de cromo-51 foi usado para medir a citotoxicidade de anticorpos biespecíficos individuais. A citotoxicidade é medida pela quantidade de liberação de cromo dentro do meio de cultura como resultado de lise celular na presença de células T ativa- das. A quantidade de liberação é comparada com a liberação espon- tânea de cromo em células-alvo apenas e a liberação máxima através da lise de células-alvo totais com Triton X.

[0687] Células pan-T humanas (CD3+) de múltiplos doadores fo- ram pré-ativadas de um dia para o outro com frascos revestidos com OKT3 (1 ug/mL) e IL-2 a 20 U/mL. As células T foram lavadas 2x. À linhagem celular alvo foi marcada por 1 hora com cromo-51. As células Te as células-alvo foram cultivadas a uma razão de 5:1 durante 18 a 24 horas antes do sobrenandante da cultura ser coletado e analisado. Todos os pontos foram executados em triplicata e relatados como uma média de citotoxicidade das triplicatas e EPM. Foram usadas diluições de anticorpo biespecífico de 10 ug/mL a 0,00001 ug/mL.

[0688] A Figura 15 mostra a morte mediada por células T para to- dos os anticorpos biespecíficos para PSMA x CD3 contra células hPSMA-HEK. Para este experimento, os anticorpos biespecíficos do CD3 de média e alta afinidade foram testados. A morte celular é evi- dente para a maioria das moléculas do braço CD3 de alta afinidade, com vários dos anticorpos biespecíficos mostrando morte na concen- tração mais baixa testada. PS3B9 foi o único anticorpo biespecífico de média afinidade que mostrou significativa morte celular em concentra- ções mais baixas. A Figura 16 mostra morte mediada por células T pa- ra vários pares de anticorpos biespecíficos. A partir desses dados é evidente que os anticorpos biespecíficos de ligação a CD3 de alta afi- nidade geraram mais morte celular e estas foram o objeto de experi- mentos de morte celular adicionais.

[0689] A Figura 17 mostra dados de morte celular de anticorpos biespecíficos para PSMAXxCD3 com o braço CD3 de alta afinidade ge- rados contra células LNCAP. Todos os anticorpos PS3B25, PS3B27, PS3B28, PS3B30, PS3B23 e PSB22 apresentaram atividade de redi- recionamento de células T. PS3B29 mostrou atividade em células hPSMA-HEK nas concentrações mais elevadas, mas não em LNCAPs sugerindo que devido a ser um ligante de PSMA fraco, ele não é capaz de se ligar bem quando os níveis de expressão de PSMA são baixos. Em contraste, PS3B25, PS3B27 e PS3B28 mostraram a lise mais ele- vada de células tumorais LNCAP. Um anticorpo biespecífico PS3B38 que consiste em PSMB125 e um braço nulo contra a proteína RSV não têm atividade citolítica conforme esperado devido à incapacidade de se ligar a células T.

[0690] Para confirmar a função de redirecionamento de células T de PSMA de cino, anticorpos biespecíficos foram testados quanto à lise de células PSMA-HEK de cino, mostrados na Figura 18. Todos os anticorpos biespecíficos testados foram capazes de matar células que expressam PSMA de cino, sendo que PS3B27 e PS3B28 apresenta- ram a maior atividade. A partir de estudos anteriores de ligação celu-

lar, esses braços anti-PSMA apresentaram maior afinidade para PSMA de cino do que para PSMA humano e essa observação foi também refletida na morte de células-alvo de PSMA de cino. PS3B27 e PS3B30 foram testados quanto à morte da linhagem de células HEK parentais e não causaram lise da linhagem parental de células HEK (dados não mostrados).

[0691] Os anticorpos anti-PSMA, PSMB127 e PSMB130, que ge- ram os anticorpos biespecíficos para PSMAXCD3, PS3B27 e PS3B30 respectivamente, foram selecionados para análise adicional. PS3SB27 e PS3B30 mataram PSMA-alvos humano e cino e apresentaram alta afi- nidade do braço CD3. O PS3B27 se ligou a linhagens celulares que expressam PSMA humano com substancialmente as mesmas EC50s de —-14,6 nM e de PSMA de cino de -9,9 nM. PS3B30 se ligou a PSMA humano com uma diferença de afinidade de aproximadamente a 6 vezes, com ECrs5o de —8 a 8,5 nM e PSMA de cino a -37,8 a 57 nM. Embora a diferença entre a ligação de humano e de cino possa ser maior do que 5 vezes, PS3B27 mostrou morte funcional de ambos os alvos, isto é, humano e cino.

[0692] As interações PS3B27 com ECD de PSMA recombinante de chimpanzé foram repetidas e as interações com ECD de PSMA re- combinante de cino e ECD de PSMA recombinante humano foram es- tudadas por ressonância de plásmon de superfície (SPR) com o uso de um sistema XPR36 ProteOn (BioRad), conforme descrito anterior- mente, ECD de PSMA recombinante humano. Resumo de cinética e afinidade para ligação a ECD de PSMA de chimpanzé, de cino e hu- mano são mostrados na Tabela 20. Este anticorpo biespecífico se liga a todos os alvos com substancialmente a mesma afinidade.

Tabela 20: Sumário de cinética e afinidade para ligação de PS3B25 e PS3B27 a ECDs de PSMA-alvo recombinante pros E EST E pesa pesso Psssas Pssar essas psasz7 |

[0693] Avaliação do anticorpo biespecífico, PS3B27 em um ensaio de caspase. A morte mediada por células T de PS3B27 foi medida com o uso de um segundo ensaio de toxicidade celular. O en- saio de citotoxicidade de caspase mede indiretamente a morte celular através da clivagem de um substrato fluorescente pela caspase ativa 3/7. A clivagem do substrato resulta em um corante de DNA fluores- cente, com fluorescência restrita ao núcleo celular. As medições de fluorescência repetidas são feitas em cada poço durante todo o curso do teste, usando-se uma objetiva de 10X motorizada, capaz de formar imagens precisas dos poços nas mesmas coordenadas. Populações de células-alvo são identificadas com base em restrições de tamanho definidas e/ou através do uso de um rótulo secundário.

[0694] Células pan-T CD3+ congeladas (adquiridas junto à biológi- ca especialidade Corporation, Colmar, PA, EUA) foram isoladas por seleção negativa de doadores saudáveis normais. As células de cân- cer de próstata que expressam PSMA (LNCaP, C42) foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de HI FBS + suplementos (adquiridos junto à Life Technologies).

[0695] As células T e as células alvo foram combinadas em uma razão entre efetor e alvo (E: T) de 3:1 em meio RPMI sem vermelho de fenol + 10% de FBS (Life Technologies), sem reagentes de seleção, e 0,6 uL de reagente de caspase NucView (Essen Bioscience) foi adici- onado a cada mL de células, de acordo com as instruções de fabrica- ção. Um volume total de 0,1 mL de células foi adicionado a poços adequados de uma placa de fundo plano transparente de 96 poços (BD Falcon). Anticorpos biespecíficos para PS3B27 (CD3xPSMA), CD3B288 (CD3xNulo) ou PS3B46 (PSMAxNulo) foram preparados em uma concentração final 2XK em TPMI sem vermelho de fenol livre RPMI, preparados conforme indicado acima, e 0,1 mL de compostos foram adicionados a cada poço. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente para minimizar a agregação celular na borda dos poços, as placas foram transferidas para o instrumento Zoom |n- cucyte (Essen Bioscience). O instrumento Incucyte está em uma incu- badora umidificada ajustada para 37ºC e 5% de CO?2.

[0696] As definições de processamento no Incucyte foram projeta- das para cada linhagem de células testada, de acordo com as instru- ções de fabricação. As medições foram feitas a cada seis horas, até um platô no sinal da caspase ser observado, seguido de três ou mais diminuições sucessivas a partir do sinal máximo nos poços contendo a concentração mais alta dos compostos de teste.

[0697] Após o teste ser completado, cada placa foi analisada usando-se a definição de processamento adequada. Os dados fluo- rescentes brutos foram exportados do software Incucyte Zoom, e cola- dos no GraphPad Prism (software GraphPad, Inc., La Jolla, CA, EUA). A atividade de caspase 3/7 foi determinada pelo cálculo da área sob a curva (AUC) para cada poço em GraphPad. Os valores de AUC foram plotados como uma função de Log10 em nM do composto. À ECso pa- ra cada curva de dose, em nanomolares (nM), foi anotada após a aná- lise de regressão no seguimento de uma análise de regressão não |i- near (ajuste de 4 parâmetros, mínimos quadrados ordinários). Cada teste continha um mínimo de três réplicas biológicas, e cada linhagem celular foi testada com cinco doadores saudáveis. Os dados foram adicionalmente analisados por estatísticas não clínicas com o uso de um modelo de regressão não linear. Exemplos de gráficos são mos-

trados na Figura 19. A Tabela 21 mostra os resultados calculados. Tabela 21. Sumário de valores de ECs5o para ensaio de citotoxicidade dependente de células T Exemplo 10. Ativação de células T por PS3B27 em linhagens celulares positivas para PSMA

[0698] Células pan-T CD3+ purificadas foram obtidas de doadores saudáveis normais por Biological Specialty Corporation por seleção negativa de células brancas do sangue submetidas a leucaferese, e armazenadas congeladas a -80ºC ou em nitrogênio líquido até esta- rem prontas para o uso. Células T naive, não ativadas foram combina- das com células alvo e anticorpos biespecíficos para CD3xPSMA ou controles nulos (CD3xNulo ou PSMAxNulo) em uma razão de efe- tor:alvo de 3:1. Após uma incubação de 48 horas, os sobrenadantes foram analisados quanto à secreção de citocina por ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima (ELISA, "Enzyme-Linked Immunosorbent As- say") sanduíche (Meso Scale Discovery). A expressão do marcador de ativação celular T, CD25, foi medida por citometria de fluxo através da coloração das células de T para CD45, CD8, CD25, e um corante per- to do infravermelho (IR) Live/Dead. As populações de CD8+ / CD25+ foram determinadas pelo primeiro agrupamento de células ou "gating" em uma população de células brutas (FSC-A vs. SSC-A) para remover detritos e agregados celulares. O subconjunto do gate de células foi adicionalmente estreitado para células determinadas como vivas, por exclusão do corante Live/Dead. As células vivas foram então agrupa-

das em células CD45+ / CD8+. Finalmente, o subconjunto positivo de CD8+ / CD25+ foi identificado. A EC5so de PS3B27 ou controle foi deri- vada pela plotagem da porcentagem de CD8+/CD25+ contra Log10 nM de anticorpo biespecífico ou controlo, seguido por uma regressão não linear (ajuste de 4 parâmetros, método dos mínimos quadrados) (Figura 20). Toda a análise dos dados foi realizada em GraphPad Prism. Exemplo 11. Eficácia antitumoral na prevenção de tumorigênese de xenoenxertos de HEK293-PSMA em camundongos NSG humanizados com células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[0699] Todos os experimentos in vivo foram realizados de acordo com o The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e apro- vados pelo Institutional animal Care and Use Committee of Janssen R & D, Spring House, PA, EUA.

[0700] A eficácia doPS3B27 (anticorpo biespecífico PSMA X CD3) foi avaliada por prevenção de tumorigênese (modelo profilático) de xe- noenxertos humanos HEK293-PSMA utilizando células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de doador humano inoculadas em ca- mundongos NSG machos (NOD.Cg-Prkdc*“* [IL2rgí"Wi/SzJ ou NOD SCID Gamma, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, EUA). Os ca- mundongos foram injetados por via intravenosa (i.v.) na veia caudal lateral, com 1 x 10" PBMCs humanas, 7 dias antes da implantação das células tumorais. Os camundongos foram subsequentemente implan- tados por via subcutânea (s.c.) com 1 x 107 células de HEK293-PSMA no flanco posterior direito. Começando no dia da implantação do tu- mor, PBS (solução salina tamponada com fosfato) controle, PS3B27, CD3B288 (CD3 x nulo) ou PS3B46 (PSMA x nulo) foram administra- dos por via intravenosa (i.v.) a O 0,4 mg/kg em g2d-g3d até um total de doses nos dias 0, 3, 5, 7 e 10.

[0701] O volume do tumor foi calculado com o uso da fórmula: Vo-

lume tumoral (mm?) = (a x b?/2); onde 'a' representa o comprimento, e 'wb' a largura do tumor, como determinada por medições de calibre, e monitorado duas vezes por semana ao longo do estudo. A porcenta- gem de inibição do crescimento tumoral (TG, "tumor growth inhibition") foi definida como a diferença entre os volumes médios de tumor dos grupos (PBS) de controle e tratado, calculado como TGI = [((TVc- TVtY/TVc)*100], em que TVc é o volume médio de tumor de um dado grupo de controle e TVt é o volume médio de tumor do grupo tratado. Conforme definido pelos critérios do NCI (National Cancer Institute), uma TGI 2 60% é considerada biologicamente significativa (Johnson, et al., (2001) Br J Cancer 84(10) 1424-31). Os animais foram removi- dos dos estudos quando um volume máximo de tumor de 1500 mm foi atingido.

[0702] O enxerto de PBMCs humanas após algum tempo leva a doença de enxerto contra-hospedeiro (GvHD, "graft-versus-host di- sease") em camundongos nos camundongos, onde as células T doa- doras de enxerto se ativam e infiltram os tecidos do hospedeiro, levan- do a perda de peso corporal, falência de órgãos e, inevitavelmente, morte. Para monitorar o início e a gravidade da GvHD, o peso corporal foi registrado duas vezes por semana e expresso em gramas (g). À alteração percentual no peso corporal foi calculada usando a fórmula: Alteração de peso corporal = [((Bt Bo)/Bo)* 100] onde Bt é o peso corpo- ral em um determinado dia de estudo e Bo é o peso corporal no início do tratamento. Animais com perda de peso corporal prolongada supe- rior a 20% do peso corporal inicial foram consideradas moribundos e removidos do estudo.

[0703] A significância estatística foi avaliada usando-se um teste ANOVA monodirecional com múltiplas comparações que usa um teste de comparações múltiplas de Dunnett com o uso do programa Graph Pad Prism (versão 6). O tratamento com PS3B27 adiou eficazmente a tumorigênese e o crescimento tumoral de HEK293-PSMA (Figura 21). Tumores HEK293-PSMA pequenos mas palpáveis foram detectáveis em sete dos oito camundongos no grupo tratado com PBS no dia de estudo 16 (6 dias após o último tratamento terapêutico), enquanto que apenas um camundongo dos oito no grupo tratado com PS3B27 apre- sentou um tumor. Cinco dos oito camundongos apresentaram tumores palpáveis no grupo de tratamento com CD3B288 e dois dos camun- dongos apresentaram pequenos tumores no grupo PS3B46. A inibição do crescimento tumoral foi avaliada 27 dias após a cessação do trata- mento (dia 37 após o implante tumoral), quando ainda havia um míni- mo de 7 animais em cada grupo. O crescimento tumoral no grupo tra- tado com anticorpo biespecífico PSMA X CD3 (PS3B27) foi inibido em 90% em comparação com os controles tratados com (n=8/grupo, p<0,001). O anticorpo biespecífico PSMA x nulo (PS3B46) também inibiu a tumorigênese e o crescimento de uma forma estatisticamente significativa (TGI=42%, n=7) em comparação como o controle de PBS (p<0,05), embora não tenha sido considerado um efeito biologicamen- te significativo com base nos critérios NCI [1].

[0704] Os grupos de animais que receberam PBMCs eventual- mente sucumbiram a GvHD progressiva, no entanto, a perda de peso corporal foi leve no presente estudo. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os pesos corporais médios dos animais tratados com 0,4 mg/kg de PS3B27vs PBS conforme mostrado na Figura 22 até o dia 37 após o implante tumoral (p>0,05). Portanto, o redirecio- namento de células de T mediado por PS3B27 não contribuiu adicio- nalmente para a perda de peso corporal relacionada à GvHD.

[0705] Apesar da perda de peso menor no estudo atual, foram ob- servadas mortes esporádicas relacionadas à GvHD. Um camundongo no grupo PS3B46 de anticorpos biespecíficos PSMA x nulo foi eutana- siado devido à perda excessiva de peso corporal (>20%) relacionada à

GvHD no dia 30 após o implante tumoral. No dia 42 após o implante do tumor, foram observadas mortes relacionadas à GvHD adicionais nos grupos PBS (n=1) e PS3B46 de anticorpos biespecíficos PSMA x nulo (n=2), e vários camundongos adicionais foram removidos do es- tudo quando o ponto final do volume do tumor atingiu 1.500 mmº, tem- po no qual todo o estudo foi encerrado. Exemplo 12. Eficácia de PS3B27 na prevenção de tumorigênese de xenoenxertos de células T/HEK293-PSMA em mistura em camundon- gos CD1 machos nus

[0706] A eficácia de PS3B27 foi avaliada em um modelo de xeno- enxerto de mistura no qual células humanas pan-T CD3+ e células tu- morais foram coinjetadas em camundongos CD machos nus (NU- Foxn1nu, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA).

[0707] O anticorpo biespecífico PSMA x CD3 humano, PS3B27, ou os anticorpos biespecíficos de controle foram administrados por via intravenosa (i.v.) a cada 2 a 3 dias (92d ou 93d) até um total de 5 do- ses como indicado. Os camundongos foram monitorados (medição do peso corporal e do calibre do tumor) duas vezes por semana durante os estudos. As doses de fármaco expressas em ug/animal foram con- vertidos em mg/kg com base em um peso corporal de 25 g (exemplo: ug/animal = 0,4 mg/kg). As doses de fármaco administradas como mg/kg foram dosadas 10 mLkg com base no peso corporal (exemplo: g de camundongo = 0,25 mL).

[0708] O volume do tumor foi calculado com o uso da fórmula: Vo- lume de tumor (mMm3)=(A x b2/2); onde 'a' representa o comprimento, e 'wb' a largura do tumor, como determinada por medições de calibre, e monitorado duas vezes por semana ao longo do estudo. A porcenta- gem de inibição do crescimento do tumor (TG) foi definida como a di- ferença entre os volumes médios de tumor dos grupos (PBS) de con- trole e tratado, calculado como TGI = [((TVc-TVt)/TVc)*100], em que

TVc é o volume médio de tumor de um dado grupo de controle e TVt é o volume médio de tumor do grupo tratado. Conforme definido pelos critérios do NCI, TGI 2 60% é considerada biologicamente significativa

[1]. Os animais foram removidos dos estudos quando um volume má- ximo de tumor de 1.500 mm foi atingido.

[0709] A tolerabilidade de PS3B27 não pode ser avaliada em rela- ção à ligação CD3 em tecidos do hospedeiro devido à falta de reativi- dade cruzada do braço CD3 aos correspondentes antígenos de ca- mundongo. A célula T injetada com as células tumorais expressam, entretanto, CD3 humano e podem ser ligar a PSS3B27 e CD3X contro- les nulos. A alteração percentual no peso corporal foi calculada usan- do a fórmula: Alteração de peso corporal = [((Bt BO)/BO)*100] onde Bt é o peso corporal em um determinado dia de estudo e BO é o peso corporal no início do tratamento.

[0710] A significância estatística foi avaliada usando-se um teste ANOVA monodirecional com múltiplas comparações que usa um teste de comparações múltiplas de Dunnett com o uso do programa Graph Pad Prism (versão 6).

[0711] A eficácia de PS3B27 foi avaliada mediante a prevenção da tumorigênese de xenoenxertos de mistura contendo células HEK293- PSMA e ativou e expandiu as células pan-T positivas para CD3 em uma razão efetor:alvo de 1:5 em camundongos CD1 machos nus (ELN ref: CD3-PSMA-2013-00003). As células T foram atividas e expandi- das in vitro usando-se o kit de ativação/expansão de células T em IL-2 contendo o meio (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, EUA, catálogo ft 130- 091-441, 130-097-743) durante 12 dias. Os camundongos foram im- plantados por via subcutânea (s.c.) com uma mistura de 5 x 10º célu- las HEK293-PSMA e 1 x 106 células T atividades e expandidas por camundongo em meio de 50% de Cultrex (Trevigen, Gaithersburg, DM, EUA catálogo f3433-005-01) e 50% de RPMI 1640 sem soro no flanco direito posterior. Começando no mesmo dia da implantação do tumor, PBS, PS3B27 a 0,005 a 0,5 mg/kg, CD3B288 (anticorpo bies- pecífico CD3 x nulo) a 0,5 mg/kg ou PS3B46 (anticorpo biespecífico PSMA x nulo) a 0,5 mg/kg foram administrados por via intravenosa (i.v.), por peso corporal, q2d-g3d até um total de 5 doses nos dias 0, 2, 4,7 e 9. (n = 10/grupo). O tratamento com PS3B27 foi também avalia- do com administração intraperitoneal (i.p.) (dados não mostrados). Um animal foi removido a cada dia nos dias 46 e 49 no grupo de controle com PBS por apresentar excesso de carga tumoral. Os dados de vo- lume de tumor foram plotados até o dia 64 após metade dos animais de controle serem removidos do estudo devido ao excesso de volume tumoral.

[0712] Conforme mostrado na Figura 23, a tumorigênese e o cres- cimento foram avaliados por 55 dias após a cessação do tratamento (até o dia 64). O tratamento com PS3B27 inibiu significativamente a tumorigênese e retardou o crescimento em comparação com o contro- le de PBS em todas as doses (0,005, 0,05 ou 0,5 mg/kg) resultando em 73%, 81% w 82%, respectivamente (P<0,001, P<0,0001, P<0,001, respectivamente) no dia 64. O tratamento de PS3B27 pela administra- ção intraperitoneal mostrou eficácia semelhante à do tratamento intra- venoso (dados não mostrados). Os animais tratados com CD3B288 (anticorpo biespecífico CD3 x nulo) ou PS3B46 (anticorpo biespecífico PSMA x nulo) mostraram alguma atividade antitumoral com 51% e 38% de TG), respectivamente no dia 64 (p<0,05, p=ns, respectivamen- te), entretanto, isso não é considerado biologicamente significativo com base nos critérios do NCI de 60% de TGO, demonstrando o re- quisito para ligação de CD3 e de PSMA do anticorpo biespecífico para a obtenção de eficácia.

[0713] Não houve perda de peso corporal ao longo do estudo, en- tretanto, os animais tratados com PS3B27 a 0,5 e 0,005 mg/kg apre-

sentaram aumento de peso significativamente menor em comparação com PBS (p<0,001, p<0,0001, respectivamente, Figura 24), entretanto, isso poderia ser devido a uma carga tumoral menor nesses animais. Exemplo 13. Estrutura cristalina do ECD de PSMA humano ligado ao braço Fab anti-PSMA do anticorpo biespecífico PS3B27

[0714] O PSMA é uma proteína homodimérica expressa na super- fície da célula. O PSMA é uma glicoproteína integral de tipo Il de 750 resíduos por monômero, compreendida de um domínio ECD grande (705 resíduos) com atividade de peptidase, um único domínio de pas- sagem TM, e um domínio intracelular curto de 19 resíduos. A estrutura cristalina da região extracelular (ECD) de PSMA humano ligada ao braço Fab PSMA do anticorpo biespecífico PS3B27 foi determinada a 3,15 À de resolução para melhor compreender o sítio de combinação entre PSMA e o anticorpo.

[0715] A região extracelular do PSMA humano (resíduos 44 a 750) foi expressa em células de insetos High Five"" com um peptídeo de sinalização gp67 N-terminal seguido de uma tag de clivagem de hexa- histidina (SEQ ID NO: 158). A proteína secretada foi purificada do so- brenadante através de um processo de três etapas compreendendo de uma captura de afinidade inicial de NI*-NTA, clivagem mediada por TEV da tag histidina seguido de uma etapa de cromatografia de afini- dade inversa, e uma última etapa de cromatografia de exclusão por tamanho. O ECD de PSMA purificado foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ºC em 10 mM de HEPES em pH 7,4, 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 0,1 mM de ZnCl2.

[0716] O Fab de PSMB83, que é o braço de Fab anti-PSMA paren- tal no anticorpo biespecífico PS3B27, foi expresso em células Epi- HEK293 com um tag de hexa-histidina (SEQ ID NO: 158) e purificado com o uso de cromatografia por afinidade (HisTrap, GE Healthcare) e por exclusão de tamanho (SEC-300, Phenomenex Yarra). O Fab foi armazenado a 4 ºC em 50 mM de NaCl, 20 mM de Tris e pH 7,4.

[0717] O complexo humano de ECD de PSMA e Fab de PSMB83 foi preparado por um procedimento de três etapas. Primeiro, o Fab foi trocado com tampão em 20 mM de MES, pH 6,0, 150 mM de NaCl. Então, o Fab e o PSMA foram misturados (Fab em excesso molar de 1,5 em relação ao monômero PSMA) e incubados durante a noite a 4 ºC e submetido a diálise em 20 mM de MES, pH 6,0. Finalmente, o complexo foi ligado a uma coluna monoS 5/50 em 20 mM de MES pH 6,0 e eluído com um gradiente de NaCl.

[0718] Cristais adequados para difração X raios foram obtidos usando-se o método de difusão de vapor em gota sentada a 20 ºC em um robô Mosquito LCP (TTP Labtech). Cristais de Fab PSMBB83 liga- dos ao ECD de PSMA humano foram cultivados a partir de 18% de PEG 3 kDa, 0,2 M de (NH4)2SO4, 0,1 M de Tris, pH 8,5 com microsse- mentes e o complexo PSMA/FAb inicialmente a 7,3 mg/mL. Cristais de Fab PSMBB83 livres foram obtidos a partir de 25% de PEG 3 kDa, 0,2 M de LiCI, 0,1 M de acetato pH 4,5 com Fab inicialmente a 8,8 mg/mL.

[0719] As estruturas foram resolvidas por substituição molecular (MR, "molecular replacement")) com Phaser (Phaser Crystallographic Software, Universidade de Cambridge). O modelo de busca MR para a estrutura de Fab PSMB83 foi PDB código 4M60O. A estrutura do com- plexo PSMA/Fab foi resolvida usando-se as estruturas cristalinas de PSMA (PDB código: 2C6G) e a estrutura PSMB83 Fab a 1,93 À de resolução; dados não mostrados) como modelos de busca MR. As es- truturas foram refinadas com PHENIX (Adams et a/l., 2004) e os ajus- tes de modelo foram executados usando-se COOT (Emsley & Cowtan, 2004). Todos os outros cálculos cristalográficos foram realizados com a suíte de programas CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Todos os gráficos moleculares foram gerados com PyMol (PyMol Molecular Graphics System, versão 1.4.1, Schródinger,

LLC) e as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram determinadas com o uso da definição de Kabat.

[0720] A estrutura PSMA/estrutura inclui os resíduos de Fab de cadeia leve 1 a 211, os resíduos de Tab de cadeia pesada 1 a 224 (exceto os resíduos 138 a 146, que são desordenados) e os resíduos de PSMA 56 a 750, o que corresponde aos domínios de protease (re- síduos 56 a 116 e 352 a 590), apicais (117 a 351) e helicais (resíduos 591 a 750), sete dos 10 glicanos -N-ligados possíveis (em Asn-76, - 121, -140, -195, -459, -476, e -638) por subunidade de dímero de PSMA. O sítio ativo de PSMA está localizado na interface entre os três domínios e contém dois átomos de zinco coordenados por histidina (H377 e H553) e resíduos de glutamato/aspartato (D387, E424, E425 e D453 catalíticos) e uma molécula de água. A unidade cristalina as- simétrica contém um dímero de PSMA com cada subunidade ligada de uma maneira similar a um Fab de PSMBB83. O sítio de combinação Fab/PSMA é bem definido pelo mapa de densidade eletrônica, que permite o posicionamento confiável dos resíduos de ligação. As molé- culas de Fab e PSMA são enumerados sequencialmente nas Figuras a 30.

[0721] O epítopo, o parátopo e as interações de PSMB83. O PSMB38, que é o braço Fab anti-PSMA parental no anticorpo biespecí- fico PS3B27, reconhece um epítopo conformacional e descontínuo no domínio apical do PSMA (Figura 25). A área superficial do PSMA en- terrada pelo Fab é de cerca de 700 À?. Especificamente, os resíduos PSMB83 de epítopo são 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307 e K324-P326. A hélice a7 (resíduos Y299 a E307) é uma região do epítopo prevalente e se liga através de CDRs de Fab de cadeia pesada e leve. Em uma extremidade da hélice, Y299 e Y300 formam um agrupamento aromático com os resíduos de Fab Y57", W94" e os resíduos de PSMA F235 e P237, enquanto E307, na outra extremidade da hélice, forma uma ponte salina com R91! e ligações de hidrogênio Y32!. As Figuras 26 e 27. mostram as principais interações de PSMA com as cadeias pesada e leve de PSMB83. Os resíduos de epítopo PSMB83 são conservados entre PSMA humano e de macaco cinomolgo (Figura 28) e foi demonstrado que o anticorpo biespecífico PS3B27 se liga com afinidade semelhante ao PSMA humano e de ci- no. Em contraste, é esperado que as mutações G238A humano a ca- mundongo e, especialmente, as mutações de epítopo Y300D reduzam a afinidade de ligação de PSMB83 ao PSMA de camundongo em comparação com o PSMA humano. A mutação Y300D perturbem um contato de ligação de hidrogênio com N59" e um a interação de empi- lhamento mm com W94. O parátopo PSMB83 é composto de resíduos de todas as CDRs exceto CDR-L2 e CDR-H1 (Figura 29). Especifica- mente, os resíduos de parátopo são Y32"!, R91!, S92!, W94! de cadeia leve, e G56"-N59", K65", G66"5, Y101", V107", e D109" de cadeia pe- sada. A Figura 30 mostra os contatos de interação entre PSMA e PSMB83. O local acessível do epítopo facilita a ligação do braço Fab de PS3B27 no anticorpo biespecífico PSMB83 ao PSMA ligado à membrana, enquanto o outro braço Fab está ainda ligado ao CD3 na membrana de células T. Não é esperado que PSMB83 iniba a ativida- de enzimática de PSMA uma vez que o anticorpo se liga longe do sítio Ativo e não causa quaisquer alterações estruturais significativas em PSMA que poderiam afetar a função enzimática, como movimentos de laço que fecham o sítio ativo ou o deslocamento de resíduos catalíti- cos (RMSD de 0,3 À para superposição Ca de moléculas PSMA em estruturas de Fab ligado e não ligado (Barinka et a/., 2007) estruturas). Exemplo 14. Maturação de afinidade anti-PSMA

[0722] A maturação de afinidade foi realizada em clones de fago de Fab anti-PSMA de duas bibliotecas de maturação de afinidade de PSMA para identificar um anticorpo com afinidade de ligação aumen-

tada em comparação com o PSMB127 parental (Fab ID=PSMB83). Duas bibliotecas foram geradas para a maturação de afinidade de PSMB127. Na primeira biblioteca de cadeia pesada, CDR1 e CDR2 foram selecionadas aleatoriamente de acordo com o design na Tabela 22 (PH9H9L1). O fragmento H-CDR3 foi amplificado por PCR a partir de pDROO00024032 e digerido com Sacll + Xhol. Esse fragmento foi clonado na biblioteca PH9H9L1/PH9L3. Isto foi transformado em célu- las MC1061F' de E.coli e o fago foi gerado apresentando esta bibliote- ca de Fabs. Na segunda biblioteca de cadeia leve, CDRs foram seleci- onadas aleatoriamente de acordo com o design na Tabela 25 (PH9L3L3). A cadeia pesada de PSMB83 (PSMH360) foi amplificada por PCR e digerida com Ncol + Xhol. Esse fragmento foi clonado no DNA de biblioteca PH9L3L3 (ELN: biblioteca de fagos De Novo 2010 SRI-021). Isto foi transformado em células MC1061F' de E.coli e o fa- go foi gerado apresentando esta biblioteca de Fabs.

Tabela 22: Design da biblioteca PH9H9L1

Tabela 23: Design da biblioteca PH9L3L3 E Pp beswy Bo peer | E E ese —

[0723] A seleção ("panning") da solução das bibliotecas de Fab- plX de maturação de afinidade de PSMA foi realizada contra ECD de PSMA biotinilado humano durante três rodadas. O antígeno ligado ao fago foi capturado em microesferas de neutravidina (GE HealthCare Life Science Cat %78152104011150) de acordo com o protocolo do fabrican- te, seguido de lavagens extensivas em PBST 1x (0,05% tween 20) e uma incubação de uma hora com ECD de PSMA não marcado em excesso molar de 500 vezes do antígeno biotinilado. Esta seleção produziu os clones, PSMXP46R3 59H09, PSMXP46R3 59H06, PSMXP46R3 59E03, PSMXP46R3 59CO9, PSMXP46R3 59H01, PSMXP46R3 59F11, e PSMXP46R3 59F07.

[0724] Para determinar o nível de expressão dos clones de Fab anti-PSMA, placas Maxisorb de 96 poços foram revestidas de um dia para outro a 4C com IgG Fd anti-humana, e bloqueadas com 3% de lite-PBS-0,05% de Tween por 1 hora. As amostras de sobrenadante de fago foram diluídas em série 2 vezes para 11 diluições em tampão de bloqueio com o poço não revestido final. 100 ul dessas soluções fo-

ram capturados nas placas revestidas por 1 hora. As placas foram la- vadas e 100 uL de anticorpo anti-F(ab')2-HRP foram adicionados du- rante 1 hora. As placas foram lavadas e desenvolvidas com 100 uL de reagente peroxidase e a luminescência foi lida no Envision (Figura 31).

[0725] Para determinar a ligação dos clones de Fab anti-PSMA à proteína recombinante humana e de cinomolgos, placas Maxisorb de 96 poços foram revestidas com 100 uL de 5 ug/mL de neutravidina de um dia para o outro a 4C. As placas foram lavadas e bloqueadas com 3% de leite-PBS-0,05% de Tween por 1 hora. Proteínas de PSMA bio- tinilado recombinante humano e de cinomolgo foram capturadas em 2,5 ugumL por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lava- das e 100 uL de sobrenadante de Fab diluído em série 2 vezes foram capturados durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada e a seguir incubada por 2,5 horas com 200 ul de 0,3% de leite em PBST para remover alguns dos Fabs de fraca afinidade. Uma outra incubação de 30 minutos foi realizada com 200 ul de 0,3% de leite fresco em PBST para remover mais Fabs de fraca afinidade. As placas foram lavadas e 100 uL de anticorpo anti-F(ab')2-HRP foram adiciona- dos durante 1 hora. As placas foram lavadas e desenvolvidas com 100 ul de reagente peroxidase e a luminescência foi lida no Envision (Fi- gura 33). A Figura 31 demonstra que a expressão proteica do Fab pa- rental e dos Fabs maturados por afinidade foram similares. Os valores no eixo x representam a luminescência do reagente de detecção que equivale à abundância da proteína de Fab na curva de diluição; quanto maior a leitura de luminescência, maior a quantidade de proteína no poço que diminui com diluições sucessivas duas vezes. Havia mais proteína nos poços com Fabs maturados por afinidade, mas o aumen- to em relação ao parental é no máximo cinco vezes maior conforme demonstrado pelos valores de ECs5o (que é a concentração de proteína que fornece a metade de resposta máxima). Estes dados demonstram que a diferença nos perfis de ligação de PSMA nas Figuras 32 e 33 não é devido a uma diferença na concentração de Fab.

[0726] A Figura 32 demonstra a ligação aprimorada dos Fabs ma- turados por afinidade ao antígeno recombinante humano em relação ao Fab anti-PSMA parental (PSMB83). Novamente, o eixo y do gráfico representa valores de luminescência. Nesse caso, quanto maior o va- lor, maior a quantidade de Fab ligada à proteína de PSMA humano. Esta é uma medida da ligação uma vez que concentrações aumenta- das do Fab (ao longo do eixo x) geram valores superiores de lumines- cência. A ligação do Fab parental nessas condições foi desprezível conforme demonstrado pela ausência de sinal mesmo em altas con- centrações (círculos abertos ao longo do eixo x). A ligação dos Fabs maturados por afinidade foi observada nas concentrações testadas, o que equivale a capacidade de ligação mais forte à proteína de PSMA humano. Uma vez que a ligação de Fab parental à proteína de PSMA humano foi zero, nenhuma ECso pode ser gerada.

[0727] A Figura 33 demonstra a ligação aprimorada dos Fabs ma- turados por afinidade ao antígeno recombinante de cinomolgo em re- lação ao Fab anti-PSMA parental (PSMB83r). Novamente, o eixo y do gráfico representa valores de luminescência. Nesse caso, quanto mai- or o valor, maior a quantidade de Fab ligada à proteína de PSMA de cinomolgo. Esta é uma medida da ligação uma vez que concentrações aumentadas do Fab (ao longo do eixo x) geram valores superiores de luminescência. A ligação do Fab parental nessas condições foi des- prezível conforme demonstrado pela ausência de sinal mesmo em al- tas concentrações (círculos abertos ao longo do eixo x). A ligação dos Fabs maturados por afinidade foi observada nas concentrações testa- das, o que equivale a capacidade de ligação mais forte à proteína de PSMA humano. Uma vez que a ligação de Fab parental à proteína de

PSMA humano foi zero, nenhuma ECso pode ser gerada para compa- ração direta.

[0728] De modo geral, os perfis de ligação de Fab dos fagos de- monstram ligação aprimorada ao antígeno recombinante humano e cinomolgo em relação ao mAb anti-PSMA parental (PSMB127). Esta melhoria não é um resultado das diferenças nos perfis de expressão de Fab, conforme demonstrado pela Figura 34 e a Figura 35, que mos- tram ligação de Fabs maturados por afinidade normalizados para ní- veis de expressão de Fab. Os cinco candidatos principais de Fab iden- tificados a partir da triagem por ELISA foram produzidos no formato de anticorpo monoclonal em IgG4 PAA. A Tabela 24 mostra os identifica- dores de Mab subsequentes e as Tabelas 25 e 26 fornecem informa- ções de sequência. Tabela 24: Cinco anticorpos principais amadurecidos por afinidades identificados com base em ELISA HC Le ID do poço SEQ ID NO SEQID IDs de proteína MAB PSMXP46R3 59CO9 PSMH859 PSML160 PSMB346 PSMXP46R3 59E03 PSMH859 PSML159 PSMB345 PSMXP46R3 59FO07 PSMH862 PSML158 PSMB349 PSMXP46R3 59H01 PSMH860 PH9L3 PSMB347 PSMXP46R3 59H06 PSMH859 PH9L3 PSMB344

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[0732] Esses mAbs parentais estão no formato GenMab (Labrijn et al., 2013) onde o parental de direcionamento (PSMA) contém a muta- ção 409R GenMab (aminoácido nativo para IgG4), enquanto o parental de morte (CD3) contém a mutação F405L GenNab e a mutação R409K. Um dos anticorpos anti-CD3 monoespeciíficos foi expresso como IgG4, tendo as substituições de Fc S228P, F234A, L235A F405L e R409K (braço CD3) (numeração de acordo com o índice EU) nas suas regiões Fc. O parental de direcionamento (PSMA) está no Ig9gG4 humano com as substituições de Fc S228P, F234A, L235A. Os anti- corpos monoespecíficos foram expressos em linhagens celulares HEK sob promotores de CMV.

[0733] Os anticorpos PSMA e CD3 parentais foram purificados usando-se uma coluna de proteína A com um tampão de eluição de 100 mM de NaAc pH3,5 em um tampão de neutralização de 2,5 M de Tris, pH 7,2. Os mAbs parentais neutralizados foram usados para pro- duzir anticorpos biespecíficos para PSMAXxCD3. Uma porção dos mabs parentais foi adicionalmente trocada em tampão em tampão D- PBS, pH 7,2 para medições e ensaios analíticos.

[0734] Após a purificação, a permuta de braço Fab controlada foi realizada para produzir anticorpos biespecíficos conforme descrito no Exemplo 6.

[0735] Os anticorpos biespecíficos finais produzidos, juntamente com os mAbs parentais (isto é, PSMA, CD3, ou nulo) usados nas rea- ções de recombinação são mostrados nas Tabelas 27 e 28.

[0736] Os acertos de PSMA selecionadas foram também empare- lhados com um braço não morte (Nulo) para criar controles negativos para fins de teste. Para os anticorpos biespecíficos de controle, B2M1, um anticorpo de RSV no formato I9gG4 PAA foi gerado, purificado e, combinado com o braço CD3, CD3B219 -F405L, R409K para gerar CD3B288 (CD3 x nulo) ou com o braço PSMA, PSMB122, PSMB126,

cos foram normalizados para a concentração de proteína e, então, in- cubados com o mesmo número de células que expressam PSMA hu- mano ou de cino. O MFI em cada concentração foi coletado por cito- metria de fluxo e plotado como uma função da concentração. Os da- dos foram transformados em log10 e então plotados. A regressão não linear das curvas de ligação foi realizada para determinar as ECs5o S.

[0738] Estes valores relativos foram usados para classificar a liga- ção de PSMA a células-alvo. As Figuras 36 a 38 mostram a ligação de LNCAP de todos os anticorpos biespecíficos preparados. Na Figura 38, nenhum dos construtos demonstrou ligação à linhagem celular ne- gativa para PSMA. Na Figura 36 e na Figura 37, todos os acertos ma- turados por afinidade demonstraram afinidade de ligação aumentada através das curvas deslocadas para a esquerda e cMax aumentada em comparação com o Mab parental, PS2B27.

[0739] As interações dos anticorpos biespecíficos maturados por afinidade com o ECD de PSMA recombinante de cino e o ECD de PSMA humano foram estudadas por ressonância de plásmon de su- perfície (SPR) com o uso de um sistema de ProteOn XPR36 (BioRad) conforme descrito anteriormente para o ECD de PSMA recombinante de chimpanzé. Todos os anticorpos biespecíficos se ligam a ambos os alvos com substancialmente a mesma afinidade, KDs na faixa de 0,05 nM a 0,27 nM para ECD de PSMA humano e de 0,05 nM a 0,23 nM para ECD de PSMA de cino. Exemplo 16. Avaliação de Abs biespecíficos para PSMA x CD3 matu- rados por afinidade em ensaio de morte celular funcional

[0740] Com base nos dados acima, nas medições de afinidade e na identidade de sequência, três anticorpos PSMB347, PSMB360 e PSMB365 como bisespecíficos com CD3B219 ou CD3B376, foram adicionalmente caracterizados pela capacidade de mediar a citotoxici- dade de células T redirecionada, específica para PSMA. A morte me-

diada por células T foi medida com o uso de um ensaio de citotoxici- dade de caspase e mede indiretamente a morte celular através da cli- vagem de um substrato fluorescente pela caspase ativa 3/7. A cliva- gem do substrato resulta em um corante de DNA fluorescente, com fluorescência restrita ao núcleo celular. As medições de fluorescência repetidas são feitas em cada poço durante todo o curso do teste, usando-se uma objetiva de 10X motorizada, capaz de formar imagens precisas dos poços nas mesmas coordenadas. Populações de células- alvo são identificadas com base em restrições de tamanho definidas e/ou através do uso de um rótulo secundário. Células pan-T CD3+ congeladas (adquiridas junto à biológica especialidade Corporation, Colmar, PA, EUA) foram isoladas por seleção negativa de doadores saudáveis normais. Células de câncer de próstata, que expressam PSMA, (LNCaP, C42) foram cultivadas em RPMI 1640 com 10% de HI FBS ("Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum", soro fetal bovino inativa- do por calor) + suplementos (adquiridos junto à Life Technologies).

[0741] As células T e as células alvo foram combinadas em uma razão entre efetor e alvo (E: T) de 3:1 em meio RPMI sem vermelho de fenol + 10% de FBS (Life Technologies), sem reagentes de seleção, e 0,6 uL de reagente de caspase NucView (Essen Bioscience) foi adici- onado a cada mL de células, de acordo com as instruções de fabrica- ção. Um volume total de 0,1 mL de células foi adicionado a poços adequados de uma placa de fundo plano transparente de 96 poços (BD Falcon). Anticorpos biespecíficos para PS3B27 (CD3xPSMA), CD3B288 (CD3xNulo) ou PS3B46 (PSMAxNulo) foram preparados em uma concentração final 2XK em TPMI sem vermelho de fenol livre RPMI, preparados conforme indicado acima, e 0,1 mL de compostos foram adicionados a cada poço. Após 30 minutos de incubação à tem- peratura ambiente para minimizar a agregação celular na borda dos poços, as placas foram transferidas para o instrumento Zoom Incucyte

(Essen Bioscience). O instrumento Incucyte está em uma incubadora umidificada ajustada para 37ºC e 5% de CO?2.

[0742] As definições de processamento no Incucyte foram projeta- das para cada linhagem de células testada, de acordo com as instru- ções de fabricação. As medições foram feitas a cada seis horas, até um platô no sinal da caspase ser observado, seguido de três ou mais diminuições sucessivas a partir do sinal máximo nos poços contendo a concentração mais alta dos compostos de teste. Como os dados mos- tram na Figura 39, as curvas para PS3B80, PS3B79, PS3B89, PS3B90, PS3B63 e PS3B72 são deslocadas para a esquerda indican- do uma potência aumentada em relação a PS3B27. Os controles do braço não induziram morte celular conforme esperado. Exemplo 17. Eficácia antitumoral na prevenção da tumorigênese de xenoenxertos de LnCaP em camundongos NSG humanizados

[0743] A eficácia de PS3B79 e PS3B90 foi avaliada em xenoen- xertos estabelecidos de câncer de próstata humano 3D LnCaP AR.TB em camundongos machos NOD.Cg-Prkde*º* II2rgimWivSzJ (NSG) hu- manizados por via intraperitoneal (ip) com células T humanas. PS3B79 e PS3B90 a 2,5 e 5 mg/kg ou controle de anticorpo Nu- loxCD3B376 foram dosados g3d-g4d nos dias 36, 39, 43, 47, 50, 53, 56, 60, e 63 em um total de 8 doses. No dia 53 após o implante de tu- mor, que foi a última data do estudo em que nove (9) animais perma- neceram por grupo, foi calculada a inibição do crescimento tumoral (% de TGI). Inibição do crescimento tumoral estatisticamente significativa foi observada para PS3B79 a 5 mg/kg com 42% de TGI (ANOVA bidi- recional com teste de Bonferroni, *p<0,0001, Figura 40), e para PS3B90 a 2,5 e 5 mg/kg com 53% e 33% respectivamente compara- dos com o controle NuloxCD3 (ANOVA bidirecional com teste de Bon- ferroni, *p<0,001, Figura 41). Dessa forma, CD3B376 é capaz de indu- zir a ativação de células T e a citotoxicidade in vivo resultando em ini-

bição do crescimento tumoral em um formato biespecífico com os bra- ços de ligação de PSMA de alta afinidade, PSMB360 e PSMB365. Exemplo 18. Eficácia de PSMAXCD3 no modelo de tumor de próstata de derivado de xenoenxertos estabelecidos derivados de paciente LnCaP 86.2 em células T de camundongos NSG humanizados

[0744] A eficácia antitumoral de PS3B72 foi avaliada Antitumor no modelo de tumor de próstata de xenoenxertos estabelecidos derivadas de paciente (PDX) LuCaP 86.2 em camundongos machos NOD.Cg- Prkde*se I12rgtmiWiVSzJ (NSG) humanizados por via intraperitoneal (i.p.) com células pan-T humanas. PS3B72 a 0,5 e 5 mg/kg ou controle de anticorpo NuloxCD3 foi dosado g3d-g4d nos dias 45, 49, 52, 56, 59, 63, 66, 70, 73 e 77 após a implantação do tumor para um total de 10 doses. No dia 83 após o implante tumoral, que foi a última data do es- tudo quando todos os dez animais permaneceram por grupo, calculou- se a inibição do crescimento tumoral (% de TG). Inibição do cresci- mento tumoral estatisticamente significativa foi observada para PSMAxCD3 em 0,5 e 5 mg/kg, com 108% e 101% ATGI (análise de efeito mista linear usando-se ajuste FDR, p<0,0001, Figura 42), res- pectivamente em comparação com o controle NuloxCD3. No final do período de dosagem de 5 semanas, 9 de 10 regressões completa (RC) foram observadas no PSMAXCD3 no grupo 0,5 mg/kg. Esses 9 ca- mundongos permaneceram livres de tumor até o término do estudo. No final do estudo, 4 de 10 RC foram observados na PS3B72 no grupo mg/kg. Quando os camundongos foram dosados com PS3B72 a 5 mg/kg na ausência de humanização celular de T, nenhuma eficácia antitumoral foi observada.

Claims (150)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (i) se liga às células que expressam o Pan troglodytes PSMA recombinante, em que a liga- ção às células é medida por citometria de fluxo e (ii) se liga domínio extracelular de PSMA Pan troglodytes recombinante (SEQ ID NO: 4) com uma afinidade de cerca de 30 nM ou menos, em que a afinidade é medida pelo ensaio de ressonância de plasmão de superfície Proteon XPR36.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo tem uma, duas, três ou quatro das se- guintes propriedades: e) liga as células LNCaP com um ECrso calculado de 20 nM ou menos e liga as células HEK que expressam PSMA Macaca fasci- cularis com um ECrs5o calculado de 40 nM ou menos, em que a diferen- ça no ECso calculado entre a ligação de células LNCaP e a ligação de Macaca fascicularis que expressa PSMA As células HEK são menores que 5 vezes, e em que o ECso calculado é medido em um ensaio de ligação de células inteiras a O ºC usando citometria de fluxo, f) liga ECD de PSMA recombinante de humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de 12 nM ou menos, em que o Kp é medido usando o ensaio de ressonância de plasmon de superfície Proteon sistema ProteOn XPR36 a + 25ºC; g) exibe morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK expressando PSMA humano ou células HEK expressando PSMA de Macaca fascicularis quando emparelhadas em um anticorpo biespecífico com anticorpo anti-CD3 CD3B219, em que a morte mediada por células T é medido por Chromium-51 ou por ensaio de ativação de caspase 3/7 ou h) reconhece um epítopo conformacional em que o epítopo é composto pelos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307 e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO: 3)

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 21, 22,23, 12e 24, respectivamente.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza-

do pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respectivamente.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50 e 51, respectivamente.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 126 35, respectivamente.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 126 35, respectivamente.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12e 24, respectivamente.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pe- sada (VH) da SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79 ou

160.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 61, 76 ou 78.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 62 e o VL da SEQ ID NO: 63.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 64 e o VL da SEQ ID NO: 65.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 66 e o VL da SEQ ID NO: 67.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 72 e o VL da SEQ ID NO: 73.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 74 e o VL da SEQ ID NO: 61.

22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 75 e o VL da SEQ ID NO: 76.

23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 77 e o VL da SEQ ID NO: 78.

24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 79 e o VL da SEQ ID NO: 78.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 160 e o VL da SEQ ID NO: 65.

26. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 60 e o VL da SEQ ID NO: 61.

27. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 68 e o VL da SEQ ID NO: 69.

anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende o VH da SEQ ID NO: 70 e o VL da SEQ ID NO: 71.

28. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente.

29. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 74 e o VL da SEQ ID NO: 61.

30. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente.

31. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 30, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 62 e o VL da SEQ ID NO: 63.

32. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente.

33. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 32, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 66 e o VL da SEQ ID NO: 67.

34. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o

LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente

35. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 72eoVL da SEQID NO: 73.

36. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12, e 24, respectivamente.

37. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 36, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 160 e o VL da SEQ ID NO: 65.

38. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente.

39. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 38, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 60 e o VL da SEQ ID NO: 61.

40. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12, e 24, respectivamente.

41. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 64 e o VL da SEQ ID NO: 65.

42. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente.

43. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 42, caracteri-

zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 70 e o VL da SEQ ID NO: 71.

44. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29, e 47, respectivamente.

45. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 44, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 75e o VL da SEQ ID NO: 76.

46. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50, e 51, respectivamente.

47. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 46, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 77 eoVLdaSEQID NO: 78.

48. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 52, 49, 50, e 51, respectivamente.

49. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 48, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 79 e o VL da SEQ ID NO: 78.

50. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente.

51. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 50, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 68 e o VL da SEQ ID NO: 69.

52. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

53. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 138 e o VL da SEQ ID NO: 67.

54. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

55. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 54, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 138 e o VL da SEQ ID NO: 142.

56. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

57. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 138 e o VL da SEQ ID NO: 143.

58. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

59. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 58, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 167.

60. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

61. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 60, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 144.

62. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29, e 30, respectivamente.

63. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 62, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 167.

64. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29, e 132, respectivamente.

65. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 64, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 142.

66. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

67. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 66, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 143.

68. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29, e 136, respectivamente.

69. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 144.

70. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, respectivamente.

71. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 142.

72. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

73. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 72, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 143.

74. Anticorpo anti-PSMA recombinante isolado ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133, e 132, respectivamente.

75. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 74, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo compreende o VH da SEQ ID NO: 141 e o VL da SEQ ID NO: 143.

76. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 75, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humano ou humanizado.

77. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 76, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo é do isotipo IgG4 ou IgG1.

78. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 77, caracteri-

zado pelo fato de que compreende uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições no anticorpo Fc.

79. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado pelo fato de que compreende a) substituições L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S e P331S; b) substituições V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S e P331S; c) substituições F234A, L235A, G237A, P238S e Q268A; d) substituições L234A, L235A ou L234A e L235A; e) substituições F234A, L235A ou F234A e L235A; ou f) Substituição de V234A, em que a numeração de resíduos está de acordo com o índice da UE.

80. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 79, caracteri- zado pelo fato de que compreende as substituições S228P, F234A e L235A, em que a numeração de resíduos está de acordo com o Índice EU.

81. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 80, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é biespecífico.

82. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 76, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente a PSMA e se liga especificamente a CD3, CD5, CD28, CD16, CD16A, CD?25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336, (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C e NKG2D, DNAM, NCRs, CD18, CD89, CD18, CD32, CD64, CD64 e CD35.

83. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 82, e um carreador farmaceuticamente aceito.

84. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo VH da reivindicação 15, o anticorpo VL como definido na reivindicação 16, ou o anticorpo VH e o anticorpo VL como definido na reivindicação 15 e 16.

85. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo VH, o anticorpo VL ou o anticorpo VH e o anticorpo VL, como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 75.

86. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo, como definido na reivindicação 84.

87. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o po- linucleotídeo, como definido na reivindicação 85.

88. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor, como definida na reivindicação 86.

89. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor, como definido na reivindicação 87.

90. Método de produção do anticorpo, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 89, nas condi- ções em que o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira.

91. Método de tratamento de um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 82 ao indivíduo em necessi- dade do mesmo por um tempo suficiente para tratar o câncer.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é um tumor sólido, malignidade ou uma neovasculatura tumoral.

93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracteriza- do pelo fato de que o tumor sólido é um câncer de próstata ou um câncer colorretal, um câncer gástrico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células escamosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer renal, um distúrbio neovascular, um carcinoma renal de células claras (CCRCC), um câncer pancreático, um câncer renal, um câncer uroteli- al e um adenocarcinaoma do fígado.

94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata re- fratário, uma neoplasia intraepitelial prostática, um câncer de próstata independente de andrógeno, um câncer de próstata maligno.

95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 90 a 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administra- do em combinação com um segundo agente terapêutico.

96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um medicamento padrão de cuidado para o tratamento do tumor sólido ou malignidade ou uma neovasculatura tumoral.

97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor de hormônio, um agente antimicrotúbulo, um inibidor de quinase, um agente imunomodulador, um inibidor de topoisomerase, um antimeta- bolito, um inibidor mitótico, um agente alquilante, uma antraciclina, um alcaloide de vinca, um agente intercalante, um agente capaz de inter- ferir com uma via de transdução de sinal, um agente que promove apoptose, um inibidor de proteossoma ou radiação.

98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico é uma vacina.

99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracteriza- do pelo fato de que a vacina é um polipeptídeo ou fragmento do mes- mo, ou um DNA ou um RNA que codifica o polipeptídeo ou fragmento do mesmo expresso em células tumorais.

100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri-

zado pelo fato de que o polipeptídeo é PSMA, mesotelina, EGFR ou EGFRvIII.

101. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é administrado simultaneamente, sequencialmente ou separadamente.

102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado ou está sendo tratado com radioterapia.

103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o indivíduo teve ou será submetido a uma cirurgia.

104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado com- preende o VH da SEQ ID NO: 66 e o VL da SEQ ID NO: 67.

105. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

106. Anticorpo anti-idiotípico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que se liga ao anticorpo.

107. Anticorpo biespeciífico, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio que se liga especificamente a PSMA e um segundo domínio que se liga especificamente a CD3, em que o primeiro domínio compreende: a) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente; b) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente; c) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente; d) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o

LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente;

e) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente;

f) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente;

g) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente;

h) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente;

i) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente;

j) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente;

k) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respectivamente;

1) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente;

m) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 29 e 30, respectivamente;

n) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente;

o) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133 e 132, respectivamente;

p) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 das SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 30, respectivamente;

q) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 136, respectivamente;

r) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 30, respectivamente;

s) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2e o

LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente; t) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 133 e 132, respectivamente; u) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 136, respectivamente; v) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, respectivamente; w) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133 e 132, respectivamente; ou x) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133 e 132, respectivamente.

108. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio compreende: a o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 42, 43, 11, 12 e 13, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 74 e o VL da SEQ ID Nº: 61; b) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 62 e o VL da SEQ ID Nº: 63; c) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 66 e o VL da SEQ ID Nº: 67; d) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40 e 41, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 72 e o VL da SEQ ID Nº: 73; e) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 122, 123, 124, 23, 12 e 24, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 160 e o VL da SEQ ID NO: 65; f) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o

LCDR3 de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 e 13, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 60 e o VL da SEQ ID NO: 61;

g) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 62 e o VL da SEQ ID NO: 63;

h) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 12 e 24, respectivamente, e VH de SEQ ID NO: 64 e o VL da SEQ ID Nº: 65;

i) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34, 12 e 35, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 70 e o VL da SEQ ID NO: 71;

j) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 44, 45, 46, 29 e 47, respectivamente, o VH de SEQ ID NO: 75 e o VL da SEQ ID Nº: 76;

k) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 37, 48, 49, 50 e 51, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 77 e o VL da SEQ ID NO: 78;

1) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 23, 12 e 35, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 68 e o VL da SEQ ID NO: 69;

m) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 138 e o VL da SEQ ID Nº: 67;

n) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 138 e o VL de SEQ ID NO: 142;

o) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 130, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 138 e o VL de SEQ ID NO: 143;

p) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o

LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 167; q) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 136, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 144; r) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 29 e 30, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID NO: 167; s) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 131, 29 e 132, respectivamente e o VH de SEQ ID NO: 140 e o VL da SEQ ID Nº: 142; t) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 135, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 140 e o VL de SEQ ID NO: 143; u) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 29 e 136, respectivamente; e o VH da SEQ ID NO: 139 e o VL da SEQ ID NO: 144; v) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 131, 29 e 132, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 139 e o VL de SEQ ID NO: 142; w) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 134, 27, 28, 133 e 132, respectivamente, e o VH de SEQ ID NO: 139 e o VL de SEQ ID NO: 143; ou x) o HCDR1, o HCDR2, o HCDR3, o LCDR1I, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 137, 27, 28, 133 e 132, respectivamente e o VH de SEQ ID NO: 141 e o VL da SEQ ID NO: 143.

109. Anticorpo biespecífico PSMA / CD3 isolado, caracteri- zado pelo fato de que compreende um primeiro domínio que (i) se liga a células que expressam Pan troglodytes PSMA recombinante, em que a ligação às células é medida por citometria de fluxo e (ii) se liga ao domínio extracelular de PSMA Pan troglodytes recombinante (SEQ ID NO: 4) com uma afinidade de cerca de 30 nM ou menos, em que a afinidade é medida por ensaio de ressonância de plasmon de superfí- cie Proteon que se liga especificamente a PSMA e um segundo domí- nio que se liga especificamente a CD3.

110. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o anticorpo e) liga as células LNCaP com um ECB50 calculado de 20 nM ou menos e liga as células HEK que expressam PSMA Macaca fasci- cularis com um ECB50 calculado de 40 nM ou menos, em que a dife- rença no EC50 calculado entre a ligação de células LNCaP e a ligação de Macaca fascicularis que expressa PSMA As células HEK são me- nores que 5 vezes, e em que o EC50 calculado é medido em um en- saio de ligação de células inteiras a 0 ºC usando citometria de fluxo, f) liga ECD de PSMA recombinante de humano (SEQ ID NO: 7), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 4) e Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 12 nM ou menos, em que o KD é medido usando o ensaio de ressonância de plasmon de superfície Proteon sistema ProteOn XPR36 a + 25ºC; g) exibe morte mediada por células T de células LNCaP, células C42, células HEK expressando PSMA humano ou células HEK expressando PSMA de Macaca fascicularis, em que a morte mediada por células T é medida por cromo-51 ou por ativação de caspase 3/7 ensaio ou h) reconhece um epítopo conformacional em que o epítopo é composto pelos resíduos 1138, F235, P237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, E307 e K324-P326 de PSMA humano (SEQ ID NO: 3).

111. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a células T.

112. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio compreende g) a região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1), um HCDR2 e um HCDR3 de SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; e a região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (LCDR1), um LCDR2 e um LCDR3 de SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; h) o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente, e o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente; i) o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente, e o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; j) o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente, e o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 46, 29 e 47, respectivamente; k) o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente, e o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; ou 1) o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respectivamente, e o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente.

113. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio compreende o HCDR1, o HCDR2 e o HCDR3 de g) SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente;

j) SEQ ID NOs: 31, 44 e 45, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 31, 42 e 43, respectivamente; ou 1) SEQ ID NOs: 122, 123 e 124, respectivamente.

114. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio compreende o LCDR1, o LCDR2 e o LCDR3 de g) SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 46, 29 e 47, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente; ou 1) SEQ ID NOs: 23, 12 e 24, respectivamente.

115. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que g) o primeiro domínio compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 62 e uma região variável da ca- deia leve (VL) da SEQ ID NO: 63, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105 h) o primeiro domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 64 e o VL da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105; i) o primeiro domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 66 e o VL da SEQ ID NO: 67, e o segundo domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105; j) o primeiro domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 75 e o VL da SEQ ID NO: 76, e o segundo domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105; k) o primeiro domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 74 e o VL da SEQ ID NO: 61, e o segundo domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105;

1) o primeiro domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 160 e o VL da SEQ ID NO: 65, e o segundo domínio compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105.

116. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira cadeia pesada (HC1), uma primeira cadeia leve (LC1), uma segunda cadeia pesada (HC2) e uma segunda cadeia leve (LC2), em que o HC1 e o LC1 compreende as sequências de aminoácidos de g) SEQ ID NOs: 84 e 85, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 86 e 87, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 88 e 89, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 125 e 91, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 94 e 95, respectivamente; ou 1) SEQ ID NOs: 96 e 83, respectivamente.

117. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o HC2 e o LC2 com- preendem SEQ ID NOs: 110 e 111, respectivamente.

118. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que compreende o HC1, o LC1, o HC2 e o LOC? de g) SEQ ID NOs: 84, 85, 110 e 111, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 86, 87, 110 e 111, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 88, 89, 110, 111, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 125, 91, 110 e 111, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 94, 95, 110 e 111, respectivamente; 1) SEQ ID NOs: 96, 83, 110 e 111, respectivamente.

119. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humano ou humanizado.

120. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do iso- tipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

121. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do iso- tipo I9gG1 ou I9G4.

122. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 120 ou 121, caracterizado pelo fato de que possui uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições em um anticorpo Fc.

123. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que compreende: a) substituições L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S e P331S; b) substituições V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S e P331S; c) substituições F234A, L235A, G237A, P238S e Q268A; d) substituições L234A, L235A ou L234A e L235A; e) substituições F234A, L235A ou F234A e L235A; f) substituição de V234A; ou g) Substituições S228P, F234A e L235A, em que a nume- ração dos resíduos está de acordo com o Índice EU.

124. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 123, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição em um domínio cons- tante CH3 de anticorpo.

125. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que a substituição no domínio constante do anticorpo CH3 é 409R, F405L ou substituição F405L / R409K, em que a numeração de resíduo está de acordo com o Índice EU.

126. Anticorpo biespecífico PSMA X CD3, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compre- ende a) Substituição F405L no HC1 e substituição 409R no HC2, em que o anticorpo é do isotipo I9G1; b) V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S e substituições F405L no HC1 e V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A3S30S, P331S e substituições 409R no tipo HC2, em que o anticorpo é de IgG1; ou b) Substituição S228P no HC1 e substituição S228P, F405L e R409K no HC2, em que o anticorpo é do isotipo Ig9G4.

127. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo biespecífico PSMA X CD3, como definido em qualquer uma das reivindicações 109 a 126, e um carreador far- maceuticamente aceitável.

128. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifi- ca o anticorpo biespecífico PSMA X CD3 HC1, LC1, HC2 ou LC2, co- mo definido na reivindicação 118.

129. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo que codifica o HC1, o LC1, o HC2, o LOC2, o HC1 e o LC1 ou o HC2 e o LC2, como definido na reivindicação 128.

130. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 129.

131. Método de produção do anticorpo biespecífico PSMA X CD3, como definido na a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 130, em condições em que o anticorpo é expresso, e a recuperação e purificação do anticorpo biespecífico PSMA X CD3 pro- duzido pela célula hospedeira.

132. Método de produção do anticorpo biespecífico PSMA

X CD3, como definido na reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que compreende: a) combinação de um anticorpo PSMA bivalente monoes- pecífico tendo dois HC1 idênticos e dois LC1 idênticos e um anticorpo CD3 bivalente monoespecífico tendo dois HC2 idênticos e dois LC2 idênticos em uma mistura de razão molar de cerca de 1: 1; b) introdução de um agente redutor na mistura; c) incubar a mistura cerca de noventa minutos a cerca de seis horas; d) remoção do agente redutor; e e) purificar o anticorpo biespecífico PSMA X CD3 que com- preende o HC1, o LC1, o HC2 e o LO?2.

133. Método, de acordo com a reivindicação 132, caracteri- zado pelo fato de que o agente redutor é 2-mercaptoetanolamina (2- MEA).

134. Método, de acordo com a reivindicação 133, caracteri- zado pelo fato de que h) o 2-MEA está presente em uma concentração de cerca de 25 mM a cerca de 75 mM; e i) a etapa de incubação é realizada a uma temperatura de cerca de 25 º C a cerca de 37 º C.

135. Método de tratamento de um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo biespecífico PSMA X CD3 isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 109 a 126, ao indivíduo em necessidade do mesmo por um tempo sutficien- te para tratar o câncer.

136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido, malignidade ou uma neovasculatura tumoral.

137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracteri- zado pelo fato de que o tumor sólido é um câncer de próstata ou um câncer colorretal, um câncer gástrico, um carcinoma renal de células claras, um câncer de bexiga, um câncer de pulmão, um carcinoma de células escamosas, um glioma, um câncer de mama, um câncer renal, um distúrbio neovascular, um carcinoma renal de células claras (CCRCC), um câncer pancreático, um câncer renal, um câncer uroteli- al e um adenocarcinaoma do fígado.

138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracteri- zado pelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata refratário, uma neoplasia intraepitelial prostática, um câncer de prósta- ta independente de andrógeno, um câncer de próstata maligno.

139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 135 a 138, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é adminis- trado em combinação com um segundo agente terapêutico.

140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é uma droga pa- drão de cuidado para o tratamento do tumor sólido ou malignidade ou uma neovasculatura tumoral.

141. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor de hormônio, um agente antimicrotúbulo, um inibidor de topoisomerase, um antimetabolito, um inibidor mitótico, um agente alquilante, uma an- traciclina, um alcalóide de vinca, um agente intercalante, um agente capaz de interferir com uma via de transdução de sinal, um agente que promove apoptose, um inibidor de proteossoma ou radiação.

142. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é uma vacina.

143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracteri- zado pelo fato de que a vacina é um polipeptídeo ou fragmento do mesmo, ou um DNA ou um RNA que codifica o polipeptídeo ou frag- mento do mesmo expresso em células tumorais.

144. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo é PSMA, mesotelina, EGFR ou EGFRvIII.

145. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é administrado simultaneamente, sequencialmente ou separadamente.

146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 135 a 145, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado ou está sendo tratado com radioterapia.

147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 135 a 145, caracterizado pelo fato de que o indivíduo teve ou se- rá submetido a uma cirurgia.

148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 135 a 145, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio do anticorpo biespecífico PSMA X CD3 compreende o VH da SEQ ID NO: 66 e o VL ou SEQ ID NO: 67, e o segundo domínio do biespecífico O anticorpo PSMA X CD3 compreende o VH da SEQ ID NO: 104 e o VL da SEQ ID NO: 105.

149. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 109 a 126, caracterizado pelo fato de que é para uso em tera- pia.

150. Anticorpo anti-idiotípico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 126, caracterizado pelo fato de que se liga ao anticorpo.