CN116615194A - 大环化合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物及其药学上可接受的盐、其免疫缀合物、放射性免疫缀合物，含有所述化合物及其免疫缀合物、放射性免疫缀合物的药物组合物，以及所述化合物及其免疫缀合物、放射性免疫缀合物在治疗肿瘤性疾病或障碍中的用途。

Description

大环化合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月10日提交的美国临时申请63/111,933的优先权的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文并且用于所有目的。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，文件名为“JBI6417WOPCT1_SeqListing.txt”并且创建日期为2021年10月26日，并且大小为26kb。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及化合物(大环化合物)及其药学上可接受的盐、其免疫缀合物、放射性免疫缀合物，含有所述化合物及其免疫缀合物、放射性免疫缀合物的药物组合物，以及所述化合物及其免疫缀合物、放射性免疫缀合物在治疗肿瘤性疾病或障碍中的用途。
背景技术
发射α粒子的放射性核素由于其高线性能量传递与短程作用的组合，对于癌症治疗显示出良好前景，提供了主要定位于肿瘤细胞的强效杀灭的可能性(Kim,Y.S.和M.W.Brechbiel,An overview of targeted alpha therapy.Tumour Biol,2012.33(3):p.573-90)。使用抗体、支架蛋白、小分子配体、核酸适配体或对癌症抗原具有特异性的其他结合部分靶向递送α发射体，提供了一种将放射性核素选择性递送至肿瘤以增强其效力并减轻脱靶效应的方法。在惯例上，结合部分附接到螯合剂，该螯合剂结合到发射α的放射性金属，以产生放射性络合物。许多此类示例使用单克隆抗体(mAb)作为靶向载体，以产生称为放射性免疫缀合物的化合物。
锕-225(225Ac)是用于医学应用的特别受关注的发射α的放射性同位素(Miederer等人，Realizing the potential of the Actinium-225radionuclide generator intargeted alpha particle therapy applications.Adv Drug Deliv Rev,2008.60(12):71-82)。225Ac的10天半衰期足够长以有利于放射性缀合物产生，但也足够短以匹配递送溶媒诸如抗体的循环药代动力学，并且因此225Ac放射性免疫缀合物特别受关注。另外，225Ac在一系列步骤中衰变，这些步骤在达到稳定同位素209Bi之前针对每个225Ac衰变共同发射4个α粒子，从而增加效能。另一种用于医学应用的受关注的放射性同位素为镥-177(177Lu)，其发射适用于成像的γ辐射和适用于放射疗法的中能β辐射两者。已显示177Lu标记的肽表现出减少的正常组织损伤，并且177Lu标记使得可以使用单一放射性标记剂进行治疗和成像两者(Kwekkeboom DJ等人，[177Lu-DOTA0,Tyr3]octreotate:comparison with[111In-DTPA0]octreotide in patients.Eur J Nucl Med.2001；28:p.1319-1325)。用于治疗应用的其他放射性同位素包括例如β发射体或α发射体，诸如例如32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm和227Th。用于成像应用的其他放射性同位素包括发射γ和/或正电子的放射性同位素，诸如62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
目前，用于锕-225和镧系元素的最广泛使用的螯合剂是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸；tetraxaten)，并且先前的临床和临床前程序主要使用1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)来进行锕螯合。然而，已知的是，锕的DOTA螯合可以是具有挑战性的(Deal,K.A.等人，Improved in vivo stability of actinium-225macrocyclic complexes.J Med Chem,1999.42(15):p.2988-92)。例如，DOTA在附接到靶向配体(诸如蛋白质或抗体)时允许最多>500:1DOTA:锕-225的螯合比率，并且通常需要苛刻的条件或每个抗体高含量的DOTA。镧系元素和锕-225的其他大环螯合剂已描述于例如国际专利申请公布WO 2018/183906；Thiele等人“An Eighteen-Membered Macrocyclic Ligandfor Actinium-225 Targeted Alpha Therapy”Angew.Chem.Int.Ed.(2017)56,14712-14717.；Roca-Sabio等人“Macrocyclic Receptor Exhibiting UnprecedentedSelectivity for Light Lanthanides”J.Am.Chem.Soc.(2009)131,3331-3341。
位点特异性已成为抗体药物缀合物(ADC)领域中的关键聚焦区域(Agarwal,P.和C.R.Bertozzi,Site-specific antibody-drug conjugates:the nexus ofbioorthogonal chemistry,protein engineering,and drug development,BioconjugChem,2015.26(2):第176-92页)，因为已证明，与随机缀合相比，用位点特异性方法可增加ADC的功效和安全性。据认为，放射性免疫缀合物可实现类似的安全性和功效有益效果。
发明内容
因此，本领域需要新型化合物，其结合放射性金属，优选地发射α的放射性金属，诸如锕-225(225Ac)，并且可用于产生具有高比活性和高收率的稳定放射性免疫缀合物。本发明通过提供能够结合放射性金属诸如发射α的放射性金属例如225Ac，而不考虑特定活性或最常见的金属杂质，以及具备螯合成像放射性金属例如134Ce的能力的大环化合物满足了这种需要。本发明的化合物可用于通过缀合到靶向配体(诸如抗体、蛋白质、核酸适配体等)，优选地以使用“点击化学”的位点特异性方式来产生在体外和体内具有高稳定性的放射性免疫缀合物。通过将本发明的化合物缀合到靶向配体而产生的放射性免疫缀合物可用于靶向放射疗法，诸如用于肿瘤性细胞的靶向放射疗法和/或肿瘤性疾病或障碍(包括癌症)的靶向治疗。
本发明涵盖能够与放射性金属形成络合物的化合物、放射性金属络合物和放射性免疫缀合物，如本文所述。
在本发明的一个实施方案中为式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种独立地选自由以下项组成的组的化合物：
其中
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在某些实施方案中，R4为-NH2、-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯。
在某些实施方案中，R4为环辛炔基或选自由以下项组成的组的环辛炔基衍生物：双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在某些实施方案中，R4为DBCO或BCN。
在某些实施方案中，R4包括靶向配体，其中靶向配体选自由以下项组成的组：抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)、结合肽、结合多肽(诸如含有多达50个氨基酸的选择性靶向寡肽)、结合蛋白、酶、含有核碱基的部分(诸如寡核苷酸、DNA或RNA载体或核酸适配体)和凝集素。
在某些实施方案中，靶向配体为抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明是放射性金属络合物，该放射性金属络合物包含与式I化合物络合的放射性金属离子。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I-M+)的放射性金属络合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在一些实施方案中，R4为-NH2、-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯。
在某些实施方案中，R4为环辛炔基或选自由以下项组成的组的环辛炔基衍生物：双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在某些实施方案中，R4为DBCO或BCN。
在某些实施方案中，发射α的放射性金属离子为锕-225(225Ac)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I-M+)的放射性免疫缀合物或其药学上可接受的盐，其中
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；并且
R4为靶向配体；其中靶向配体选自由以下项组成的组：抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)、结合部分、结合肽、结合多肽(诸如含有多达50个氨基酸的选择性靶向寡肽)、结合蛋白、酶、含有核碱基的部分(诸如寡核苷酸、DNA或RNA载体或核酸适配体)和凝集素。
在某些实施方案中，发射α的放射性金属离子为锕-225(225Ac)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含经由R4共价连接到靶向配体(优选地抗体或其抗原结合片段)的本发明的化合物。
在另一个实施方案中，放射性免疫缀合物包含经由三唑部分共价连接到抗体或其抗原结合片段的本发明的放射性金属络合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物的方法，该方法包括将本发明的化合物或放射性金属络合物与靶向配体共价连接，优选地经由化合物或放射性金属络合物的R4与抗体或其抗原结合片段共价连接。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物、免疫缀合物或放射性免疫缀合物以及药学上可接受的载体。该药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明还提供了组合物(例如，药物组合物)和药物，该组合物和药物包含如本文所述的化合物中的一种化合物(或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的载体或一种或多种赋形剂或填充剂中的任一者。在类似的实施方案中，本发明还提供了组合物(例如，药物组合物)和药物，该组合物和药物包含本文公开的本技术的经修饰的抗体、经修饰的抗体片段或经修饰的结合肽的实施方案中的一个实施方案和药学上可接受的载体或一种或多种赋形剂或填充剂中的任一者。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的放射性免疫缀合物和药物组合物进行靶向放射疗法的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在有需要的受试者中选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法的方法，该方法包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的肿瘤性疾病或障碍的方法，该方法包括向受试者施用本发明的药物组合物。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
在附图中：
图1A至图1B示出了来自使用La3+的螯合测试的HPLC色谱图；图1A示出了6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(TOPA-[C7]-苯基)在与La3+混合前(顶部)和混合后(中间)的HPLC色谱图；与La3+和Ac-225混合后保留时间从14.137分钟移至12.047分钟，表明La3+的快速螯合；图1B示出了TOPA-[C7]-异戊基在与La3+混合前(顶部)和混合后(底部)的HPLC色谱图；与La3+混合后保留时间从17.181分钟移至15.751分钟，表明La3+和Ac-225被TOPA-[C7]-异戊基快速螯合；
图2示出了通过随机缀合方法(例如，用于标记赖氨酸残基、半胱氨酸残基等的方法)或位点特异性缀合方法(例如，聚糖特异性方法、缀合标签方法或工程化半胱氨酸方法)放射性标记抗体以产生根据本发明的实施方案的放射性免疫缀合物的示意图；图2A示意性地示出了经由一步直接放射性标记的随机缀合；图2B示意性地示出了经由点击放射性标记的随机缀合；图2C示意性地示出了经由一步直接放射性标记的位点特异性缀合；并且
图2D示意性地示出了经由点击放射性标记的位点特异性缀合。
图3A至图3B示出了来自使用Ac-225的螯合测试的HPLC色谱图。图3A示出了与Ac-225螯合的6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(TOPA-[C7]-苯基)的HPLC色谱图(RA(放射性)迹线通过切割-计数-重建绘制)。图3B示出了与Ac-225螯合的6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-4-甲基戊基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(TOPA-[C7]-异戊基)的HPLC色谱图(RA(放射性)迹线通过切割-计数-重建绘制)。
图4A至图4B示出了来自使用Ac-225的螯合测试的HPLC色谱图。图4A示出了与Ac-225螯合的TOPA-[C7]-苯基硫脲-H11B6的HPLC色谱图(UV)。图4B示出了与Ac-225螯合的TOPA-[C7]-苯基硫脲-H11B6的HPLC色谱图，RA(放射性)迹线通过切割-计数-重建绘制)。
图5示出了瞬时薄层色谱法(iTLC)的扫描，其指示在金属杂质存在下与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图6示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图7示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图8示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图9示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与DOTA-h11b6螯合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图10示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与DOTA-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图11示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与DOTA-h11b6螯合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
图12示出了iTLC的扫描，其指示在金属杂质存在下与DOTA-h11b6结合的Ac-225的百分比，如实施例22中所述。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。
如下文所定义的，说明书全篇中使用以下术语。
如本文和所附权利要求书中所用，描述元素的上下文中(特别是下面的权利要求书的上下文中)的单数冠词诸如“一”、“一个”和“所述”以及类似的指示物应理解为覆盖单数形式和复数形式两者，除非在此另外指明或明显与上下文矛盾。除非本文另外指明，否则本文列举的数值范围仅旨在充当个别地指代落在所述范围内的每个独立值的简便方法，并且每个独立值就像在本文中个别地引用那样并入本说明书。除非本文另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以按照任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文所提供的任何和全部示例或示例性语言(如“诸如”)仅仅旨在更好地举例说明实施方案，而并不用来限制权利要求书的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何不受权利要求书保护的元素是必需的。
通常，对某种元素诸如氢或H的提及意在包括该元素的所有同位素。例如，如果将R基团定义为包括氢或H，则其还包括氘和氚。包含放射性同位素诸如氚、C14、P32和S35的化合物因此在本技术的范围内。基于本文的公开内容，将此类标记物插入本技术的化合物中的方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
术语“取代的”是指至少一个氢原子被非氢基团置换，前提条件是保持所有正常化合价并且取代产生稳定的化合物。当特定基团被“取代”时，该基团可具有一个或多个取代基，优选地一至五个取代基，更优选地一至三个取代基，最优选地一至二个取代基，这些取代基独立地选自取代基列表。例如，“取代的”是指如以下定义的有机基团(例如，烷基基团)，其中一个或多个与其中所含的氢原子的键被与非氢原子或非碳原子的键置换。取代的基团还包括其中一个或多个与碳原子或氢原子的键被一个或多个与杂原子的键(包括双键或三键)置换。因此，除非另有说明，否则取代的基团被一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，取代的基团被1、2、3、4、5或6个取代基取代。取代基基团的示例包括：卤素(即，F、Cl、Br和I)；羟基；烷氧基、烯氧基、芳氧基、芳烷氧基、杂环基、杂环基烷基、杂环氧基和杂环烷氧基基团；羰基(氧代)；羧酸盐；酯；氨基甲酸酯；肟；羟胺；烷氧基胺；芳烷氧基胺；硫醇；硫化物；亚砜；砜；磺酰基；五氟硫烷基(即SF)、磺酰胺；胺；N-氧化物；肼；酰肼；腙；叠氮化物；酰胺；脲；脒；胍；烯胺；酰亚胺；异氰酸酯；异硫氰酸酯；氰酸酯；硫氰酸酯；亚胺；硝基；腈(即，CN)；等。当参考取代基使用时，术语“独立地”是指当可能有多于一个此类取代基时，此类取代基可彼此相同或不同。
取代的环基团诸如取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基基团还包括环和环系，其中与氢原子的键被与碳原子的键置换。因此，取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基基团也可以被如以下定义的取代或未取代的烷基、烯基和炔基基团取代。
如本文所用，当在基团之前使用时，Cm-Cn诸如C1-C11、C1-C8或C1-C6是指含有m个至n个碳原子的基团。
烷基基团包括具有1个至12个碳原子，并且通常1个至10个碳，或在一些实施方案中，1个至8个、1个至6个或1个至4个碳原子的直链和支链烷基基团。直链烷基基团的示例包括诸如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基基团的基团。支链烷基基团的示例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2,2-二甲基丙基基团。烷基基团可为取代或未取代的。代表性的取代的烷基基团可以被诸如以上列出的那些的取代基取代一次或多次，并且包括但不限于卤代烷基(例如，三氟甲基)、羟烷基、硫代烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷氧基烷基、羧基烷基等。
环烷基基团包括单环、二环或三环烷基基团，其在环中具有3个至12个碳原子，或在一些实施方案中，3个至10个、3个至8个或3个至4个、5个或6个碳原子。示例性单环环烷基基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基基团。在一些实施方案中，环烷基基团具有3至8个环成员，而在其他实施方案中，环碳原子的数目范围为3至5、3至6或3至7。二环和三环环系包括桥环烷基基团和稠环，诸如但不限于二环[2.1.1]己烷、金刚烷基、十氢萘基等。环烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烷基基团可以被如以上所定义的非氢基团和非碳基团取代一次或多次。然而，取代的环烷基基团还包括被如以上所定义的直链或支链烷基取代的环。代表性的取代的环烷基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于可以被诸如以上所列那些的取代基取代的2,2-二取代的、2,3-二取代的、2,4-二取代的、2,5-二取代的或2,6-二取代的环己基基团。
环烷基烷基基团是如以上所定义的烷基基团，其中烷基基团的氢键或碳键被与如上定义的环烷基基团的键置换。在一些实施方案中，环烷基烷基基团具有4个至16个碳原子、4个至12个碳原子，并且通常4个至10个碳原子。环烷基烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烷基烷基基团可以在该基团的烷基部分、环烷基部分或烷基部分和环烷基部分两者处被取代。代表性的取代的环烷基烷基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。
烯基基团包括如以上所定义的直链和支链烷基基团，除了在两个碳原子之间存在至少一个双键。烯基基团具有2个至12个碳原子，并且通常2个至10个碳，或在一些实施方案中，2个至8个、2个至6个或2个至4个碳原子。在一些实施方案中，烯基可具有一个碳-碳双键或多个碳-碳双键，诸如2个、3个、4个或更多个碳-碳双键。烯基基团的示例包括但不限于次甲基、乙烯基、丙烯基、丁烯基等。烯基基团可为取代的或未取代的。代表性的取代的烯基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。
环烯基基团包括如以上所定义的环烷基基团，其在两个碳原子之间具有至少一个双键。环烯基基团可为在环中具有3个至12个、更优选地3个至8个碳原子并且在两个碳原子之间包含至少一个双键的单环或多环烷基基团。环烯基基团可为取代或未取代的。在一些实施方案中，环烯基基团可具有一个、两个或三个双键或多个碳-碳双键，诸如2个、3个、4个或更多个碳-碳双键，但不包含芳族化合物。环烯基基团具有3个至14个碳原子，或在一些实施方案中，5个至14个碳原子、5个至10个碳原子、或甚至5个、6个、7个或8个碳原子。环烯基基团的示例包括环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、环丁二烯基和环戊二烯基。
环烯基烷基基团是如以上所定义的烷基基团，其中烷基基团的氢键或碳键被与如上定义的环烯基基团的键置换。环烯基烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烯基烷基基团可以在该基团的烷基部分、环烯基部分或烷基部分和环烯基部分两者处被取代。代表性的取代的环烯基烷基基团可以被诸如以上所列那些的取代基取代一次或多次。
炔基基团包括如以上所定义的直链和支链烷基基团，除了在两个碳原子之间存在至少一个三键。炔基基团具有2个至12个碳原子，并且通常2个至10个碳，或在一些实施方案中，2个至8个、2个至6个或2个至4个碳原子。在一些实施方案中，炔基基团具有一个、两个或三个碳-碳三键。示例包括但不限于-C＝CH、-C＝CCH3、-CH2C＝CCH3、-C＝CCH2CH(CH2CH3)2等。炔基基团可为取代或未取代的。末端炔烃具有至少一个结合到三键碳原子的氢原子。代表性的取代的炔基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。“环状炔烃”或“环炔基”为在两个碳原子之间包含至少一个三键的环烷基环。环状炔烃或环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔、双环壬炔(BCN)、二氟化环辛炔(DIFO)、二苯并环辛炔(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)、单苯并环辛炔(MOBO)和四甲氧基DIBO(TMDIBO)。
芳基基团是不含杂原子的环状芳族烃。本文中的芳基基团包括单环、双环和三环环系。因此，芳基基团包括但不限于苯基、甘菊环基(azulenyl)、并环庚烯基(heptalenyl)、联苯基、芴基、菲基、蒽基、茚基、茚满基、并环戊二烯基(pentalenyl)和萘基基团。在一些实施方案中，芳基在基团的环部分中含有6-14个碳，并且在其他实施方案中含有6至12个或甚至6-10个碳原子。在一些实施方案中，芳基基团为苯基或萘基。芳基基团可为取代或未取代的。短语“芳基基团”包括含有稠环的基团，诸如稠合的芳族-脂族环系(例如茚满基、四氢萘基等)。代表性的取代的芳基基团可以是单取代的或被取代多于一次。例如，单取代的芳基基团包括但不限于可以被诸如以上所列那些的取代基取代的2-取代的、3-取代的、4-取代的、5-取代的或6-取代的苯基或萘基基团。芳基部分是熟知的，并且描述于例如Lewis,R.J.编辑，Hawley’s Condensed Chemical Dictionary，第13版，John Wiley&Sons,Inc.,NewYork(1997)。芳基基团可为单环结构(即单环)或包含为稠环结构的多环结构(即多环)。优选地，芳基基团为单环芳基基团。
烷氧基基团是其中与氢原子的键被与如以上所定义的取代或未取代的烷基基团的碳原子的键置换的羟基基团(-OH)。直链烷氧基基团的示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。支链烷氧基具有的示例包括但不限于异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基、异己氧基等。环烷氧基基团的示例包括但不限于环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。烷氧基基团可为取代或未取代的。代表性的取代的烷氧基基团可以被诸如以上所列那些的取代基取代一次或多次。
类似地，烷硫基或硫代烷氧基是指-SR基团，其中R为通过硫桥附接到母体分子的烷基，例如-S-甲基、-S-乙基等。烷硫基的代表性示例包括但不限于-SCH3、-SCH2CH3等。
本文所用的术语“卤素”是指溴、氯、氟或碘。相应地，术语“卤代基”是指氟代基、氯代基、溴代基或碘代基。在一些实施方案中，卤素为氟。在其他实施方案中，卤素为氯或溴。
术语“羟基(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”可互换使用并且是指-OH。
术语“羧基”是指-COOH。
术语“氰基”是指-CN。
术语“硝基”是指-NO2。
术语“异硫氰酸酯”是指-N＝C＝S。
术语“异氰酸酯”是指-N＝C＝O。
术语“叠氮基”是指-N3。
术语“氨基”是指-NH2。术语“烷基氨基”是指其中附接到氮的氢原子中的一个或两个氢原被烷基基团取代的氨基基团。烷基胺基团可表示为-NR2，其中每个R独立地为氢或烷基基团。例如，烷基胺包括甲胺(-NHCH3)、二甲胺(-N(CH3)2)、-NHCH-2CH3等。如本文所用，术语“氨基烷基”旨在包括被一个或多个氨基基团取代的支链饱和脂族烃基团和直链饱和脂族烃基团两者。氨基烷基基团的代表性示例包括但不限于-CH2NH2、-CH2CH2NH2和-CH2CH(NH2)CH3。
如本文所用，“酰胺”是指-C(O)N(R)2，其中每个R独立地为烷基基团或氢。酰胺的示例包括但不限于-C(O)NH2、-C(O)NHCH3和-C(O)N(CH3)2。
术语“羟基烷基”和“羟烷基”可互换使用，并且是指被一个或多个羟基基团取代的烷基基团。烷基可为支链或直链脂族烃。羟基烷基的示例包括但不限于羟甲基(-CH2OH)、羟乙基(-CH2CH2OH)等。
如本文所用，术语“杂环基”包括含有至少一个杂原子环成员(诸如硫、氧或氮)的稳定单环和多环烃。如本文所用，术语“杂芳基”包括含有至少一个杂原子环成员(诸如硫、氧或氮)的稳定单环和多环芳族烃。杂芳基可为单环或多环的，例如双环或三环的。含有杂原子的杂环基或杂芳基基团的每个环可含有一个或两个氧或硫原子和/或一个至四个氮原子，前提条件是每个环中的杂原子总数为四个或更少，并且每个环具有至少一个碳原子。多环(例如双环或三环)的杂芳基基团必须包括至少一个全芳环，但另一个或多个稠环可为芳族或非芳族的。杂环基或杂芳基基团可附接在杂环基或杂芳基基团的任何环的任何可用的氮或碳原子处。优选地，术语“杂芳基”是指在至少一个环中具有至少一个杂原子(O、S或N)的5元或6元单环基团和9或10元双环基团，其中含杂原子的环优选地具有选自O、S和/或N的1、2或3个杂原子、更优选地1或2个杂原子。杂芳基的氮杂原子可为取代或未取代的。另外，杂芳基的氮和硫杂原子可任选地被氧化(即，N→O和S(O)r，其中r为0、1或2)。
术语“酯”是指-C(O)2R，其中R为烷基。
术语“氨基甲酸酯”是指-OC(O)NR2，其中每个R独立地为烷基或氢。
术语“醛”是指-C(O)H。
术语“碳酸酯”是指-OC(O)OR，其中R为烷基。
术语“马来酰亚胺”是指具有化学式H2C2(CO)2NH的基团。术语“马来酰亚胺基”是指共价连接到另一基团或分子的马来酰亚胺基团。优选地，马来酰亚胺基团为N-连接的，例如：
术语“酰卤”是指-C(O)X，其中X为卤代基(例如Br、Cl)。示例性酰卤包括酰基氯(-C(O)Cl)和酰基溴(-C(O)Br)。
根据本领域中使用的惯例：
用于本文的结构式中以描述作为部分、官能团或取代基与核心、母体或主链结构诸如本发明的化合物或靶向配体的附接点的键。
当任何变量在化合物的任何成分或式中出现不止一次时，它在每次出现时的定义独立于它在其他每次出现时的定义。因此，例如，如果基团示出被0-3个R基团取代，则所述基团可任选地被至多三个R基团取代，并且在每次出现时，R独立地选自R的定义。
当与取代基连接的键显示为与连接环中两个原子的键交叉时，则此类取代基可结合到环上的任何原子。
如本文所用，术语“放射性金属离子(radiometal ion)”或“放射性金属离子(radioactive metal ion)”是指发射粒子和/或光子的元素的一种或多种同位素。根据本公开，本领域技术人员已知的任何放射性金属离子可用于本发明中。适用于本发明的放射性金属离子的示例包括但不限于：47Sc、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、111In、117Sn、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、177Lu、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、227Th和255Fm。优选地，放射性金属离子为“治疗发射体”，意指可用于治疗应用的放射性金属离子。治疗发射体的示例包括但不限于β发射体或α发射体，诸如132La、135La、134Ce、144Nd、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、177Lu、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、255Fm以及227Th、226Th、230U。优选地，本发明中使用的放射性金属离子为发射α的放射性金属离子，诸如锕-225(225Ac)。
本发明的化合物是指金属、优选地放射性金属可与其络合的大环化合物。在某些实施方案中，化合物为含有一个或多个杂原子(例如，氧和/或氮)作为环原子的大环(macrocycle/macrocyclic ring)。优选地，化合物为4,13-二氮杂-18-冠-6的衍生物的大环。
如本文所用，“放射性金属络合物”是指包含与大环化合物缔合的放射性金属离子的络合物。放射性金属离子经由配位键合与大环结合或配位。大环的杂原子可参与放射性金属离子与大环化合物的配位键合。大环化合物可被一个或多个取代基基团取代，并且除了大环的杂原子以外或另选地，该一个或多个取代基基团也可参与放射性金属离子与大环化合物的配位键合。
如本文所用，术语“TOPA”是指本领域已知为H2bp18c6的大环，并且可另选地被称为N,N'-双[(6-羧基-2-吡啶基)甲基]-4,13-二氮杂-18-冠-6。参见，例如，Roca-Sabio等人，“Macrocyclic Receptor Exhibiting Unprecedented Selectivity for LightLanthanides，”J.Am.Chem.Soc.(2009)131,3331-3341，其以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“点击化学”是指由Sharpless引入的化学理念，其描述了通过将包含反应性基团的小单元连接在一起而被调制为快速且可靠地生成共价键的化学(参见Kolb等人，Angewandte Chemie International Edition(2001)40:2004-2021)。点击化学不是指特定反应，而是指包括但不限于模拟自然界中存在的反应的反应的概念。在一些实施方案中，点击化学反应是模块化的，范围广泛，给出高化学收率，生成惰性副产物，是立体特异性的，表现出大的热力学驱动力以有助于与单一反应产物反应，和/或可在生理条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应可在简单的反应条件下进行，使用易得的起始材料和试剂，使用无毒溶剂或者使用良性或易于去除的溶剂，诸如水，和/或通过非色谱方法诸如结晶或蒸馏提供简单的产物分离。
点击化学反应利用很少存在于天然存在的生物分子中并且对生物分子呈化学惰性的反应基团，但当点击化学配偶体一起反应时，该反应可在生物相关条件下，例如在细胞培养条件下，诸如在不存在过量的热和/或苛刻试剂的情况下有效地发生。一般来讲，点击化学反应需要至少两个包含可彼此反应的点击反应配偶体的分子。彼此反应的此类点击反应配偶体有时在本文中称为点击化学柄对或点击化学对。在一些实施方案中，点击反应配偶体是叠氮化物和应变炔烃，例如环炔诸如环辛炔或环辛炔衍生物，或任何其他炔烃。在其他实施方案中，点击反应配偶体是反应性二烯和合适的四嗪亲双烯体。例如，反式环辛烯、降冰片烯或双环壬烯可与合适的四嗪亲双烯体配对作为点击反应对。在其他实施方案中，四唑可充当腈亚胺的潜在来源，该四唑可在紫外光的存在下与未活化的烯烃配对以产生点击反应对，称为“光点击”反应对。在其他实施方案中，点击反应配偶体是半胱氨酸和马来酰亚胺。例如，来自肽(例如，GGGC)的半胱氨酸可与和螯合剂(例如，NOTA)缔合的马来酰亚胺反应。其他合适的点击化学柄是本领域技术人员已知的(参见，例如，Spicer等人，Selective chemical protein modification.Nature Communications.2014；5:p.4740)。在其他实施方案中，点击反应配偶体是施陶丁格连接(Staudinger ligation)组分，诸如膦和叠氮化物。在其他实施方案中，点击反应配偶体是狄尔斯-阿尔德反应组分，诸如二烯(例如，四嗪)和烯烃(例如，反式环辛烯(TCO)或降冰片烯)。示例性点击反应配偶体描述于US20130266512和WO2015073746中，两者中对于点击反应配偶体的相关描述均以引用方式并入本文。
根据优选的实施方案，点击化学反应利用叠氮化物基团和炔烃基团，更优选地应变炔烃基团，例如环炔烃诸如环辛炔或环辛炔衍生物，作为点击化学对或反应配偶体。在此类实施方案中，点击化学反应是叠氮化物(-N3)与炔烃部分之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成，以形成1,2,3-三唑连接基。炔烃与叠氮化物之间的点击化学反应通常需要添加铜催化剂以促进1,3-环加成反应，并且称为铜催化的叠氮-炔环加成(CuAAC)反应。然而，环辛炔或环辛炔衍生物与叠氮化物之间的点击化学反应通常不需要添加铜催化剂，而是经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)进行(Debets,M.F.等人，Bioconjugation withstrained alkenes and alkynes.Acc Chem Res,2011.44(9):p.805-15)。
如本文所用，术语“靶向配体”是指对所选靶标(例如抗原、细胞、细胞类型、组织、器官、身体区域或区室(例如细胞、组织或器官区室)提供增强的亲和力的任何分子。靶向配体包括但不限于抗体或其抗原结合片段、核酸适配体、多肽和支架蛋白。优选地，靶向配体为多肽，更优选地为抗体或其抗原结合片段、工程化结构域或支架蛋白。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”广义地使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠科、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体)及其抗原结合片段。
一般来讲，抗体是对特定抗原(在本文中称为“靶”)表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本发明中使用的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。根据特定实施方案，本发明中使用的抗体包括来自小鼠抗体或人抗体的重链和/或轻链恒定区。四种IgG亚类中的每一种具有不同的生物功能，这些生物功能被称为效应子功能。这些效应子功能通常通过与Fc受体(FcγR)的相互作用或者通过结合C1q并固定补体来介导。结合FcγR可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而结合补体因子可导致补体介导的细胞裂解。可用于本发明的抗体可不具有效应子功能或具有最小效应子功能，但保留其结合FcRn的能力。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如例如双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含通过约15个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，这种单域抗体包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“支架”或“支架蛋白”是指具有靶结合结构域并且可结合到靶的任何蛋白质。支架含有“框架”，该框架在很大程度上是结构化的，以及“结合结构域”，该结合结构域与靶接触并提供特异性结合。支架的结合结构域不需要由支架的一个连续序列限定。在某些情况下，支架可为较大结合蛋白质的一部分，该较大结合蛋白本身可为含有多个支架的多聚体结合蛋白质的一部分。某些结合蛋白可为双特异性或多特异性的，因为其可结合到两个或更多个不同的表位。支架可来源于单链抗体，或支架可不来源于抗体。
如本文所用，术语“核酸适配体”是指可以高亲和力特异性地结合其靶的单链寡核苷酸(单链DNA或RNA分子)。核酸适配体可用作靶向各种有机和无机材料的分子。
本文所述的化合物的药学上可接受的盐在本技术的范围内并且包括酸加成盐或碱加成盐，其保留期望的药理学活性并且不是生物学上不期望的(例如，该盐不是过度毒性的、过敏性的或刺激性的，并且是生物可利用的)。当本技术的化合物具有碱性基团诸如例如氨基基团时，可与无机酸(诸如盐酸、氢硼酸、硝酸、硫酸和磷酸)、有机酸(例如藻酸盐、甲酸、乙酸、苯甲酸、葡糖酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸和对甲苯磺酸)或酸性氨基酸(诸如天冬氨酸和谷氨酸)形成药学上可接受的盐。当本技术的化合物具有酸性基团诸如例如羧酸基团时，其可与金属诸如碱金属和碱土金属(例如Na+、Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+)、氨或有机胺(例如二环己胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺)或碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)形成盐。此类盐可以在化合物的分离和纯化过程中原位制备，或者通过分别使游离碱或游离酸形式的纯化化合物分别与合适的酸或碱反应，并分离由此形成的盐来制备。
本领域技术人员将会知道，本技术的化合物可以表现出互变异构、构象异构、几何异构和/或立体异构的现象。由于说明书和权利要求书内的化学式图可以仅表示可能的互变异构、构象异构、立体异构或几何异构形式中的一种形式，因此应当理解，本技术涵盖具有本文所述的实用性中的一种或多种实用性的化合物的任何互变异构、构象异构、立体异构和/或几何异构形式，以及这些不同形式的混合物。
除非明确指示特定立体化学结构，否则化合物的立体异构体(也称为光学异构体)包括结构的所有手性、非对映异构和外消旋形式。因此，本技术中使用的化合物包括在任何或所有不对称原子处富集或拆分的光学异构体，如从描述中显而易见的。外消旋和非对映异构混合物以及单独的光学异构体都可以分离或合成，使得基本上不含其对映体或非对映异构配偶体，并且这些立体异构体全部在本技术的范围内。
本技术提供了比常规技术的那些显著更稳定的新大环络合物。因此，这些新的络合物可以有利地更有效地靶向癌细胞，与本领域的络合物相比，对非靶向组织的毒性显著更小。此外，与通常需要升高的温度(例如，至少80℃)用于与放射性核素络合的DOTA型络合物相比，新的络合物可有利地在室温下产生。本技术还特别使用发射α的放射性核素代替β放射性核素。发射α的放射性核素具有比发射β的放射性核素高得多的能量，因此显著更有效。
虽然已经说明和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员在阅读前述说明书后，可以对本技术的化合物或如本文所述的其盐、药物组合物、衍生物、前药、代谢物、互变异构体或外消旋混合物进行改变、等效物的取代和其他类型的改变。上述每个方面和实施方案还可以包括或并入关于任何或所有其他方面和实施方案所公开的此类变化或方面。
本技术还不限于本文所述的特定实施方案，其旨在作为本技术的各个方面的单个说明。本技术的许多修改和变型可在不脱离其实质和范围的情况下进行，这对于本领域的技术人员将是显而易见的。除了本文所列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法对本领域技术人员而言由上述描述将是显而易见的。此类修改和变型旨在落入所附权利要求书的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物、标记化合物或生物系统，它们当然可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在进行限制。因此，本说明书旨在被认为仅是示例性的，本技术的广度、范围和精神仅由所附权利要求书、其中的定义及其任何等效物指示。
本文示例性描述的实施方案可在无本文未具体公开的任何元素、限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛且无限制地理解。另外，本文采用的术语和表达已经用作描述而非限制性的术语，并且在此类术语和表达的使用中，无意排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，但应认识到，在受权利要求书保护的技术的范围内进行各种修改是可能的。另外，短语“基本上由……组成”将被理解为包括具体列举的那些元素和不实质上影响受权利要求书保护的技术的基本和新颖特性的那些另外的元素。短语“由……组成”排除了未指定的任何元素。
在本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文献(例如，期刊、文章和/或教科书)通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文献被具体地和单独地指示为通过引用以其整体并入。以引用方式并入的文本中所包含的定义被排除到它们与本公开中的定义相矛盾的程度。
本发明的化合物(大环化合物)
在一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在一些实施方案中，L1不存在。当L1不存在时，R4直接结合(例如，经由共价键联)到化合物。
在一些实施方案中，L1为连接基。如本文所用，术语“连接基”是指将本发明的化合物接合到亲核部分、亲电部分或靶向配体的化学部分。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中。连接基可具有例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、取代或未取代的芳基或杂芳基、聚乙二醇(PEG)连接基、肽连接基、基于糖的连接基或可裂解的连接基，诸如二硫键联或蛋白酶裂解位点，诸如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(PAB)。适用于本发明的示例性连接基结构包括但不限于：
其中m为0至12的整数。
在一些实施方案中，R4为亲核部分或亲电部分。“亲核部分”或“亲核基团”是指在化学反应中提供电子对以形成共价键的官能团。“亲电部分”或“亲电基团”是指在化学反应中接受电子对以形成共价键的官能团。亲核基团与亲电基团反应，并且反之亦然，以在化学反应中形成新的共价键。本发明的化合物的亲核基团或亲电基团与包含对应反应配偶体的靶向配体或其他化学部分(例如连接基)的反应允许靶向配体或化学部分共价键联到本发明的化合物。
亲核基团的示例性示例包括但不限于叠氮化物、胺和硫醇。亲电基团的示例性示例包括但不限于胺反应性基团、硫醇反应性基团、炔基和环炔基。胺反应性基团优选地与伯胺(包括存在于每个多肽链的N-末端和赖氨酸残基的侧链中的伯胺)反应。适用于本发明中的胺反应性基团的示例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、取代的NHS(诸如磺基-NHS)、异硫氰酸酯(-NCS)、异氰酸酯(-NCO)、酯、羧酸、酰卤、酰胺、烷基酰胺以及四氟苯基酯和全氟苯基酯。硫醇反应性基团与硫醇或巯基(优选地存在于多肽半胱氨酸残基侧链中的硫醇)反应。适用于本发明中的硫醇反应性基团的示例包括但不限于迈克尔受体(例如马来酰亚胺)、卤代乙酰基、酰卤、活化二硫化物和苯基噁二唑砜。
在某些实施方案中，R4为-NH2、-NCS(异硫氰酸酯)、-NCO(异氰酸酯)、-N3(叠氮基)、炔基、环炔基、羧酸、酯、酰氨基、烷基酰胺、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯，更具体地-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤(例如，-C(O)Cl、-C(O)Br)、四嗪或反式环辛烯，其中每个R13独立地为氢或烷基。
在一些实施方案中，R4为炔基、环炔基或叠氮基基团，从而允许使用点击化学反应将本发明的化合物附接到靶向配体或其他化学部分(例如，连接基)。在此类实施方案中，可进行的点击化学反应为叠氮基(-N3)与炔基或环炔基基团之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑连接基或部分。在一个实施方案中，本发明的化合物包含炔基或环炔基基团，并且靶向配体或其他化学部分包含叠氮基基团。在另一个实施方案中，本发明的化合物包含叠氮基基团，并且靶向配体或其他化学部分包含炔基或环炔基基团。
在某些实施方案中，R4为具体地经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)与叠氮化物基团反应的炔基基团，更优选地末端炔基基团或环炔基基团。可经由SPAAC与叠氮化物基团反应的环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔基或双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在某些实施方案中，R4为二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)，其具有以下结构：
在其中R4为DBCO的实施方案中，DBCO可直接或经由连接基间接地共价连接到化合物，并且优选地经由连接基间接地附接到化合物。
在某些实施方案中，R4为靶向配体。靶向配体可经由共价键联直接、或经由连接基间接连接到化合物。靶向配体可为多肽，例如抗体或其抗原结合片段、核酸适配体或支架蛋白等。在优选的实施方案中，靶向配体为抗体或其抗原结合片段，诸如抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其特异性结合与肿瘤性疾病或障碍相关的抗原，诸如癌症抗原，其可为前列腺特异性膜抗原(PSMA)、BCMA、Her2、EGFR、KLK2、CD19、CD22、CD30、CD33、CD79b或Nectin-4。
根据特定实施方案，靶向配体特异性结合前列腺特异性抗原(例如，PSMA或KLK2)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(II)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在本发明的另一个实施方案中涉及式(III)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，其中：R1为-L1-R4；R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基；L1不存在或为连接基；并且R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，其中R1为H；R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的5元或6元环烷基；L1不存在或为连接基；并且R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；或其药学上可接受的盐。
另外的实施方案包括其中R4为靶向配体的那些，其中靶向配体选自由以下项组成的组：抗体、抗体的抗原结合片段、支架蛋白和核酸适配体。
在一个实施方案中，本发明的化合物为独立地选自由以下项组成的组的任一种或多种化合物：
/>
/>
其中n为1至10。
所述化合物可共价附接到靶向配体(例如，抗体或其抗原结合片段)，以通过使化合物与叠氮化物标记的靶向配体反应以经由点击化学反应形成1,2,3-三唑连接基来形成免疫缀合物或放射性免疫缀合物(当与金属络合时)，如下文更详细地描述。
根据本公开，本发明的化合物可通过本领域已知的任何方法产生。例如，侧芳族/杂芳族基团可通过本领域已知的方法(诸如下文举例说明和描述的那些)附接到大环部分。
放射性金属络合物
在某些实施方案中，本发明涉及放射性金属络合物，该放射性金属络合物包含经由配位键合与本发明的化合物络合的放射性金属离子。本文所述的本发明的化合物中的任一种化合物可包含放射性金属离子。优选地，放射性金属离子为发射α的放射性金属离子，更优选地225Ac。本发明的化合物可在不考虑金属杂质的情况下以任何特定活性与放射性金属离子络合，特别是225Ac，从而形成在体内和体外具有高螯合稳定性并且对测试试剂(例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))稳定的放射性金属络合物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-M+)的放射性金属络合物结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(II-M+)的放射性金属络合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(III-M+)的放射性金属络合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种放射性金属络合物，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为-L1-R4；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种放射性金属络合物，其中
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为H；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及任一种或多种选自由以下项组成的组的放射性金属络合物：
/>
/>
其中n为1至10并且M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)。
根据本公开，放射性金属络合物可通过本领域已知的任何方法产生。例如，可将本发明的大环化合物与放射性金属离子混合，并将该混合物温育以允许形成放射性金属络合物。在一个示例性实施方案中，将化合物与225Ac(NO3)3的溶液混合以形成放射性络合物，该放射性络合物包含经由配位键合与该化合物结合的225Ac。如上所述，本发明中的化合物有效地螯合放射性金属，特别是225Ac。因此，在特定实施方案中，本发明的化合物与225Ac离子的溶液以本发明的化合物与225Ac离子的浓度比为1:1000、1:500、1:400、1:300、1:200、1:100、1:50、1:10或1:5、优选地1:5至1:200、更优选地1:5至1:100混合。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物与可用于形成放射性金属络合物的225Ac的比率远低于用其他已知的225Ac螯合剂(例如DOTA)可达到的比率。放射性络合物可通过瞬时薄层色谱法(例如，iTLC-SG)、HPLC、LC-MS等来表征。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。
免疫缀合物和放射性免疫缀合物
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫缀合物和放射性免疫缀合物。本发明的化合物和本发明的放射性金属络合物可缀合(即，共价连接)到靶向配体，诸如免疫物质，以产生适用于例如受试者(例如，人)的医学应用诸如靶向放射疗法的免疫缀合物和/或放射性免疫缀合物。使用本发明的大环化合物、放射性金属络合物和放射性免疫缀合物，尤其是可特异性结合感兴趣的靶标(诸如癌细胞)的抗体或其抗原结合片段，可用放射性金属离子进行位点特异性标记以产生放射性免疫缀合物。具体地，使用本发明的化合物和/或本发明的放射性金属络合物，可产生对放射性金属离子(特别是225Ac)具有高收率络合和期望化合物-抗体比(CAR)的放射性免疫缀合物。
根据特定实施方案，本发明的方法提供了小于10、小于8、小于6或小于4的平均CAR；或约2至约8之间、或约2至约6、或约2至约4、或约2至约3的CAR；或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7或约8的CAR。
如本文所用，“免疫缀合物”是缀合(例如，经由共价键结合)到第二分子诸如毒素、药物、放射性金属离子、放射性金属络合物等的抗体或其抗原结合片段。具体地，“放射性免疫缀合物”(也可被称为放射性缀合物)为其中抗体或其抗原结合片段用放射性金属标记或缀合到放射性金属络合物的免疫缀合物。
在本发明的某些实施方案中，免疫缀合物包含优选地经由连接基共价连接到抗体或其抗原结合片段的本发明的化合物，例如如本文所述的式(I)的化合物。根据式(I)的化合物和抗体或其抗原结合片段上的反应性官能团(即，亲核试剂和亲电试剂)，在本发明的化合物与抗体或其抗原结合片段之间具有不同键联的许多附接模式是可能的。
在本发明的某些实施方案中，放射性免疫缀合物包含优选地经由连接基共价连接到抗体或其抗原结合片段的本发明的放射性金属络合物，例如如本文所述的放射性金属络合物。
本文所述的本发明的化合物或放射性金属络合物中的任一者可用于产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物。
在某些实施方案中，本发明的放射性金属络合物或放射性免疫缀合物包含与放射性络合物的化合物部分配位的发射α的放射性金属离子。优选地，发射α的放射性金属离子为225Ac。
在某些实施方案中，本申请的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中的抗体或抗原结合片段可特异性结合肿瘤抗原。优选地，抗体或抗原结合片段特异性地结合癌症抗原。癌症抗原的示例包括但不限于前列腺特异性膜抗原(PSMA)、BCMA、Her2、EGFR、KLK2、CD19、CD22、CD30、CD33、CD79b和Nectin-4。
在一个实施方案中，抗体特异性结合PSMA。优选地，抗体为PSMB127。结合人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人IgG4抗体在本文中称为“抗PSMA mAb”，命名为“PSMB127”，具有SEQ ID NO:3的重链(HC)CDR1序列、SEQ ID NO:4的HC CDR2序列、SEQ ID NO:5的HC CDR3序列、SEQ ID NO:6的轻链(LC)CDR1序列、SEQ ID NO:7的LC CDR2序列和SEQ ID NO:8的LCCDR3序列，并且具有SEQ ID NO:9的HC序列和SEQ ID NO:10的LC序列。使用标准色谱方法表达并纯化抗PSMA mAb。抗体PSMB127、其生物活性、用途或其他相关信息在例如美国专利申请公布US 20200024360A1中有所描述，该专利的内容据此全文以引用方式并入。
在另一个实施方案中，抗体特异性结合人激肽释放酶-2(KLK2)。KLK2也可称为hK2。优选地，抗体为H11B6(也称为h11B6)。H11B6抗体、其生物活性、用途或其他相关信息在美国专利10,100,125中有所描述，该专利的内容据此全文以引用方式并入。如其中所述，H11B6抗体多肽包含含有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链(HC)可变区以及含有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链(LC)可变区。
因此，根据特定实施方案，本发明的放射性缀合物包含h11B6抗体，该抗体包含(a)重链可变区(VH)，该VH包含具有SEQ ID NO:11(SDYAWN)的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQID NO:12(YISYSGSTTYNPSLKS)的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列(GYYYGSGF)的VH CDR3；和(b)轻链可变区(VL)，该VL包含具有SEQ ID NO:14(KASESVEYFGTSLMH)的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:15(AASNRES)的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:16(QQTRKVPYT)的氨基酸序列的VL CDR3。
H11B6抗体还可具有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链可变区，或者具有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链恒定区，或者具有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
Kabat编号方案(Kabat等人，1991年)贯穿本说明书(“Sequences ofImmunological Interest”，第5版，NIH，Bethesda，Md，其公开内容以引用方式并入本文)。
根据特定实施方案，本发明的抗体包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，该重链可变区与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，该轻链可变区与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
根据特定实施方案，本发明的抗体具有重链恒定区和/或轻链恒定区，该重链恒定区与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，该轻链恒定区与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
根据特定实施方案，本发明的抗体包含重链和/或轻链，该重链与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，该轻链与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
根据特定实施方案，本发明的抗体(例如h11B6)包括完整的(即完全的)抗体(诸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM分子)，或由其组成。
根据特定实施方案，本发明的抗体(例如，h11B6)包括完整的IgG分子或其变体，或由其组成。IgG分子可具有任何已知的亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根据特定实施方案，本发明的抗体包括h11B6抗体，其为IgG1抗体。根据特定实施方案，本发明的抗体包括h11B6抗体，其为IgG1κ同种型。根据特定实施方案，本发明的抗体包括h11B6抗体，其为IgG1抗体或其变体，诸如Fc变体。
在本文所公开的实施方案的任一个实施方案中(为了简单起见，下文中记载为“在本文所公开的任何实施方案中”等)，抗体可包括但不限于贝利木单抗、莫格利珠单抗、博纳吐单抗、替伊莫单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、奥加伊妥珠单抗、莫塞妥莫单抗、本妥昔单抗、达雷木单抗、易普利姆玛、西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、帕尼单抗、迪妥昔单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、司妥昔单抗、西米普利单抗、纳武单抗、帕母单抗、奥拉妥单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、卡罗单抗喷地肽、依托珠单抗、地诺单抗、阿柏西普、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、托西莫单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、阿仑单抗、西妥木单抗、吉妥昔单抗、尼妥珠单抗、卡妥索单抗或埃达珠单抗。在本文所公开的任何实施方案中，可以的是，抗体片段包括以下项的抗原结合片段：贝利木单抗、莫格利珠单抗、博纳吐单抗、替伊莫单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、奥加伊妥珠单抗、莫塞妥莫单抗、本妥昔单抗、达雷木单抗、易普利姆玛、西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、帕尼单抗、迪妥昔单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、司妥昔单抗、西米普利单抗、纳武单抗、帕母单抗、奥拉妥单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、卡罗单抗喷地肽、依托珠单抗、地诺单抗、阿柏西普、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、托西莫单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、阿仑单抗、西妥木单抗、吉妥昔单抗、尼妥珠单抗、卡妥索单抗或埃达珠单抗。在本文所公开的任何实施方案中，结合肽可包括但不限于前列腺特异性膜抗原(“PSMA”)结合肽、促生长素抑制素受体激动剂、铃蟾肽受体激动剂、seprase结合化合物或其结合片段。
根据本公开，本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物可通过本领域已知的用于将配体(例如抗体)缀合到本发明的化合物的任何方法(包括化学和/或酶方法)来制备。例如，免疫缀合物和放射性免疫缀合物可通过偶联反应来制备，包括但不限于由活化的酸或酰卤形成酯、硫酯或酰胺；亲核置换反应(例如，诸如卤化物环的亲核置换或应变环系的开环)；叠氮-炔Huisgen环加成(例如，叠氮化物与炔烃之间的1,3-偶极环加成以形成1,2,3-三唑连接基)；巯基炔加成；亚胺形成；四嗪与反式环辛烯(TCO)之间的狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alderreaction)；以及迈克尔加成(Michael addition)(例如，马来酰亚胺加成)。根据所用的反应性官能团，具有不同键联的许多其他附接模式也是可能的。配体的附接可在与放射性金属离子配位的化合物上进行，或在不与放射性金属离子配位的化合物上进行。
在一个实施方案中，放射性免疫缀合物可通过例如点击化学反应将本发明的放射性金属络合物共价连接到抗体或其抗原结合片段来产生(参见例如图2B和图2D，称为“点击放射性标记”)。另选地，放射性免疫缀合物可通过以下方式产生：首先通过例如点击化学反应将本发明的化合物共价连接到抗体或其抗原结合片段来制备本发明的免疫缀合物；随后可用放射性金属离子标记免疫缀合物以产生放射性免疫缀合物(参见例如图2A和图2C，称为“一步直接放射性标记”)。缀合的残基特异性方法(例如，图2A和图2B)和位点特异性方法(例如，图2C和图2D)两者可用于产生本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物。
用于缀合到蛋白质的残基特异性方法已充分建立，并且最通常涉及使用活化的酯或异硫氰酸酯的赖氨酸侧链，或具有马来酰亚胺、卤代乙酰基衍生物或活化二硫化物的半胱氨酸侧链(BrinkleyBioconjugate Chem 1992:2)。由于大多数蛋白质具有多个赖氨酸和半胱氨酸残基，因此通常使用此类方法获得在多个氨基酸位置处具有不同数量的缀合分子的产物的异质混合物。已经建立了另外的方法，包括酪氨酸特异性缀合(Ban等人，Bioconjugate Chemistry 2013:520)，甲硫氨酸特异性方法(Lin等人，Science 2017(355)597)，另外的以半胱氨酸为重点的方法(Toda等人，Angew Chemie 2013:12592)，等等。
最近，已经建立了用于单克隆抗体和其他蛋白质的位点选择性和位点特异性缀合方法(Agarwal，P.和C.R.Bertozzi,Bioconjug Chem,2015.26(2):p.176-92；Rabuka等人，Curr Opin Chem Biol 2010:790)。这些方法包括掺入非天然氨基酸；将感兴趣的蛋白质融合至“自标记标签”诸如SNAP或DHFR，或被另一种酶诸如分选酶A、硫辛酸连接酶和甲酰基甘氨酸生成酶特异性识别和修饰的标签；对聚糖进行酶修饰以允许感兴趣的缀合的有效载荷(Hu等人，Chem Soc Rev 2016:1691)；使用微生物转谷氨酰胺酶选择性地识别抗体上限定的位置；以及使用分子识别和/或化学方法来影响选择性缀合的附加的方法(Yamada等人，2019:5592；Park等人，Bioconjugate Chem 2018:3240；Pham等人，Chembiochem 2018:799)。
在某些实施方案中，使用用于将本发明的化合物缀合到抗体或其抗原结合片段的残基特异性方法来产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物。此类残基特异性方法通常导致免疫缀合物或放射性免疫缀合物在抗体的多个位置处共价连接到本发明的化合物或放射性金属络合物。根据本公开，可使用本领域技术人员已知的用于形成蛋白质或抗体缀合物的任何残基特异性方法。可使用的用于缀合的残基特异性方法的示例包括但不限于使用包含例如活化酯或异硫氰酸酯基团的本发明的化合物或放射性金属络合物，将本发明的化合物或放射性金属络合物缀合到抗体的赖氨酸残基；使用包含例如马来酰亚胺、卤代乙酰基衍生物、酰卤、活化的二硫化物基团或甲基磺酰基苯基噁二唑基团的本发明的化合物或放射性金属络合物缀合到抗体的半胱氨酸残基；使用包含例如4-苯基-3H-1,2,4-三唑啉-3,5(4H)-二酮(PTAD)的本发明的化合物或放射性金属络合物缀合到抗体的酪氨酸残基；以及使用包含例如氧氮杂环丙烷衍生物的本发明的化合物或放射性金属络合物缀合到抗体的甲硫氨酸残基。还可在缀合到本发明的化合物或本发明的放射性金属络合物之前，使用上述方法中的一种或多种在特定残基处用双正交反应性官能团标记抗体。例如，可使用连接到双正交反应性官能团(例如叠氮基、炔基或环炔基)的氧氮杂环丙烷衍生物，用双正交反应性官能团对酪氨酸残基进行位点特异性标记，然后可使用带有相容的反应性官能团的本发明的化合物或放射性金属络合物将含有标记的酪氨酸残基的抗体缀合到本发明的化合物或本发明的放射性金属络合物。
在某些实施方案中，可使用用于将本发明的化合物缀合到抗体或其抗原结合片段的位点特异性或位点选择性方法来产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物。与残基特异性方法相比，“位点特异性”或“位点选择性”方法通常导致免疫缀合物或放射性免疫缀合物在抗体的指定位置处共价连接到本发明的化合物或放射性金属络合物。根据本公开，可使用本领域技术人员已知的用于形成蛋白质或抗体缀合物的任何位点特异性方法。例如，可使用突变型氨酰t-RNA合成酶将非天然氨基酸(例如叠氮基-或炔基-氨基酸)位点特异性地掺入到抗体中，该突变型氨酰t-RNA合成酶可用感兴趣的非天然氨基酸选择性地氨酰化其tRNA。突变型酰化tRNA与琥珀抑制tRNA一起然后可用于响应琥珀无义密码子而将非天然氨基酸位点特异性地掺入到蛋白质中。通过上述方法中的一种或多种进行位点特异性标记的抗体可随后缀合到带有相容反应性官能团的本发明的化合物或本发明的放射性金属络合物。
在某些实施方案中，本发明涉及一种产生放射性免疫缀合物的方法，该方法包括使其中R4为亲核或亲电部分的本发明的化合物或本发明的放射性络合物与包含亲核或亲电部分的抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法包括使本发明的化合物与包含亲核或亲电官能团的抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应，以形成在本发明的化合物与抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段之间具有共价键的免疫缀合物，然后使该免疫缀合物与放射性金属离子反应，使得该放射性金属离子经由配位键合与免疫缀合物的本发明的化合物结合，从而形成放射性免疫缀合物。该实施方案可被称为“一步直接放射性标记”方法(例如，如图2C中示意性地示出)，因为仅存在一个涉及放射性金属的化学反应步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法包括使本发明的放射性络合物与包含亲核或亲电官能团的抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应，从而形成放射性免疫缀合物。该实施方案可被称为“点击放射性标记”方法(例如，如图2D中示意性地示出)。根据本公开，经修饰的抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知的任何方法产生，例如通过使用上述方法中的一种或多种在特定残基处用双正交反应性官能团标记抗体，或通过使用上述方法中的一种或多种将非天然氨基酸(例如叠氮基-或炔基-氨基酸)位点特异性地掺入到抗体中。标记度(DOL)，有时称为取代度(DOS)，是用于表征和优化生物缀合物(诸如由非天然氨基酸修饰的抗体)的特别有用的参数。它被表示为偶联到蛋白质分子(例如抗体)的非天然氨基酸的平均数，或表示为标记/蛋白质形式的摩尔比。DOL可通过本领域已知的任何方法由标记抗体的吸收光谱确定。
在本发明的某些实施方案中，本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物使用点击化学反应来制备。例如，本发明的放射性免疫缀合物可使用被称为“点击放射性标记”的点击化学反应(参见例如图2B和图2D)来制备。点击放射性标记使用点击化学反应配偶体，优选地叠氮化物和炔烃(例如，环辛炔或环辛炔衍生物)以在放射性络合物(与本发明的化合物结合的放射性金属离子)与抗体或其抗原结合片段之间形成共价三唑键。抗体的点击放射性标记方法在例如名称为“Radiolabeling of Polypeptides”的国际专利申请PCT/US18/65913中有所描述，其相关描述以引用方式并入本文。在称为“一步直接放射性标记”的其他实施方案中，使用抗体或其抗原结合片段与本发明的化合物之间的点击化学反应来制备免疫缀合物；然后使免疫缀合物与放射性金属离子接触以形成放射性免疫缀合物(参见例如图2A和图2C)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种制备放射性免疫缀合物的方法，该方法包括使放射性金属离子与本发明的化合物结合(例如，经由配位键合)。
在一个实施方案中，制备放射性免疫缀合物的“一步直接放射性标记”方法，该方法包括使免疫缀合物(即，多肽-本发明的化合物络合物)与放射性金属离子接触，以形成放射性免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含本发明的化合物。根据特定实施方案，免疫缀合物由本发明的化合物与多肽之间的点击化学反应形成。根据特定实施方案，放射性免疫缀合物在有金属条件下(例如，没有从反应混合物中去除或主动排除常见金属杂质的任何步骤)形成。这与某些常规方法相反，在这些常规方法中，必须在严格的无金属条件下对抗体进行放射性标记，以避免常见金属诸如铁、锌和铜的竞争性(非生产性)螯合，这给生产过程带来了重大挑战。
在一个实施方案中，本发明涉及一种制备放射性免疫缀合物的方法(包括“一步直接放射性标记”方法)，该方法包括：
(i)使经修饰的多肽与本发明的化合物反应以产生免疫缀合物，其中经修饰的多肽是由叠氮基基团组成的抗体或其抗原结合片段；以及
(ii)使免疫缀合物与放射性金属离子反应以产生放射性免疫缀合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备放射性免疫缀合物的方法(包括“一步直接放射性标记”方法)，该方法包括：
(i)使经修饰的由叠氮基基团组成的抗体或其抗原结合片段与化合物式I反应以产生免疫缀合物；以及
(ii)使免疫缀合物与放射性金属离子反应以产生放射性免疫缀合物。
在某些实施方案中，本发明涉及一种制备放射性免疫缀合物的方法(包括“点击放射性标记”方法，例如，如图2D所示)，该方法包括：
(i)使经修饰的抗体或其抗原结合片段与放射性络合物在其中叠氮基基团与炔基基团或环炔基基团反应的条件下反应，以产生放射性免疫缀合物。
用于进行点击化学反应的条件是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的用于进行点击化学反应的任何条件可用于本发明中。条件的示例包括但不限于在4至10的pH和20℃至70℃的温度下以1:1至1000:1的比率温育经修饰的多肽和放射性络合物。
上述点击放射性标记方法允许放射性金属离子在低或高pH和/或高温条件下络合以使效率最大化，这可在没有使炔烃反应配偶体失活的风险的情况下实现。叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段与放射性络合物之间的有效络合和有效SPAAC反应允许以高放射性化学收率产生放射性免疫缀合物，即使叠氮化物:抗体比率低。必须排除痕量金属的唯一步骤是放射性金属离子与大环化合物部分的络合；抗体产生、纯化和缀合步骤不需要在无金属条件下进行。
本发明的化合物和本发明的放射性金属络合物还可用于产生位点特异性放射性标记多肽，例如抗体。本文所述的点击放射性标记方法通过利用已建立的方法将叠氮基团位点特异性地安装在抗体上来有利于放射性免疫缀合物的位点特异性产生(Li,X.等人，Preparation of well-defined antibody-drug conjugates through glycanremodeling and strain-promoted azide-alkyne cycloadditions.Angew Chem Int EdEngl,2014.53(28):p.7179-82；Xiao,H.等人，Genetic incorporation of multipleunnatural amino acids into proteins in mammalian cells.Angew Chem Int EdEngl,2013.52(52):p.14080-3)。以位点特异性方式将分子附接到蛋白质或抗体的方法是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的位点特异性标记抗体的任何方法可用于本发明中。适用于本发明中的位点特异性修饰抗体的方法的示例包括但不限于：掺入工程化半胱氨酸残基(例如，THIOMABTM)，使用非天然氨基酸或聚糖(例如，硒代半胱氨酸、p-AcPhe、甲酰甘氨酸生成酶(FGE、SMARTagTM)等)，以及酶促方法(例如，使用糖基转移酶、内切糖苷酶、微生物或细菌转谷氨酰胺酶(MTG或BTG)、转肽酶A等)。
在某些实施方案中，在产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中使用的经修饰的抗体或其抗原结合片段通过如下方式获得：用对抗体的Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1,4键具有特异性的细菌内切糖苷酶(诸如GlycINATOR(Genovis))修剪抗体或其抗原结合片段，这使最内的GlcNAc完整保留在Fc上，从而允许将叠氮基糖位点特异性掺入该位点处。然后，可在糖转移酶诸如GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶的存在下，使修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮化物标记的糖(诸如UDP-N-叠氮基乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAz)或UDP-6-叠氮基6-脱氧GalNAc)反应，从而获得经修饰的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，用于在产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中使用的经修饰的抗体或其抗原结合片段通过用酰胺酶使抗体或其抗原结合片段去糖基化来获得。然后，可使所得去糖基化抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺(优选地3-叠氮基丙胺、6-叠氮基己胺、或任何叠氮基-连接基-胺或任何叠氮基-烷基/杂烷基-胺，诸如叠氮基-聚乙二醇(PEG)-胺，例如O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)四乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)五乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-(2-叠氮乙基)三乙二醇等)反应，或在微生物转谷氨酰胺酶的存在下反应，从而获得经修饰的抗体或其抗原结合片段。
本文所述的任何放射性金属络合物均可用于产生本发明的放射性免疫缀合物。在特定实施方案中，放射性金属络合物具有式(I-M+)的结构。
在某些实施方案中，放射性免疫缀合物是独立地选自由以下项组成的组的任一种或多种结构：
其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；并且
mAb为抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，放射性免疫缀合物是选自由以下项组成的组的任一种或多种：
其中mAb为抗体或其抗原结合片段。
应当注意，在本文描述的包含“mAb”的放射性免疫缀合物结构中，这些结构未示出与放射性金属络合物连接的mAb的残余物(例如，mAb的赖氨酸残余物)。
本发明的一个实施方案提供了具有以下结构的放射性免疫缀合物：
(在本文中也被称为TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物)，
其中M+为锕-225(225Ac)，并且
其中mAb对hK2具有结合特异性；例如，
(i)其中mAb是包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的h11B6抗体多肽，该重链可变区含有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:13的氨基酸序列，该轻链可变区含有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:16的氨基酸序列；并且/或者
(ii)其中mAb包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，该重链可变区与SEQ IDNO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％、或100％序列同一性，该轻链可变区与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％、或100％序列同一性。
本发明的一个实施方案提供了具有以下结构的放射性免疫缀合物：
(i)其中mAb是包含重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的h11B6抗体多肽，该重链可变区含有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:13的氨基酸序列，该轻链可变区含有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:16的氨基酸序列；并且/或者
(ii)其中mAb包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，该重链可变区与SEQ IDNO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％、或100％序列同一性，该轻链可变区与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％、或100％序列同一性。
根据本公开，可使用本领域技术人员已知的方法分析通过本文所述的方法产生的放射性免疫缀合物。例如，LC/MS分析可用于测定化合物与标记的多肽(例如抗体或其抗原结合片段)的比率；分析性尺寸排阻色谱法可用于测定多肽和多肽缀合物(例如抗体和抗体缀合物)的低聚状态；放射性化学收率可通过瞬时薄层色谱法(例如iTLC-SG)测定，并且放射性化学纯度可通过尺寸排阻HPLC测定。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。
药物组合物及使用方法
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：本发明的化合物，本发明的放射性金属络合物、免疫缀合物或放射性免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。该药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的化合物以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的放射性金属络合物以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的放射性免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于基于抗体或基于放射性络合物的药物组合物中的任何药学上可接受的载体均可用于本发明中。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于胃肠外施用，例如静脉内、皮下、肌内或瘤内施用。
在某些实施方案中，本发明涉及选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和治疗肿瘤性疾病或障碍的方法。本文所述的任何放射性络合物或放射性免疫缀合物及其药物组合物可用于本发明的方法中。
“瘤”是当细胞分裂超过它们应分裂的程度或当它们应死亡而不死亡时产生的异常组织块。瘤可为良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。瘤也被称为肿瘤。肿瘤性疾病或障碍是与瘤相关的疾病或障碍，诸如癌症。肿瘤性疾病或障碍的示例包括但不限于播散性癌症和实体瘤癌症。
在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的前列腺癌(例如，转移性前列腺癌或转移性去势难治性前列腺癌)的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的免疫缀合物或放射性免疫缀合物，其中该免疫缀合物或放射性免疫缀合物包含缀合到H11B6的如本文所述的放射性金属络合物。
本发明的实施方案在治疗已被诊断患有前列腺癌的患者中特别有用；例如，患有晚期前列腺癌的患者。根据一个实施方案，该癌症是非限局性前列腺癌。根据另一个实施方案，该癌症是转移性前列腺癌。根据另一个实施方案，该癌症是去势难治性前列腺癌(CRPC)。根据另一个实施方案，该癌症是转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。根据另一个实施方案，该癌症是伴有腺癌的mCRPC。
通过本文所述的本发明的方法进行放射疗法的待治疗或靶向的疾病的其他示例包括但不限于肥大，冠状动脉疾病或血管闭塞性疾病，与受感染细胞、微生物或病毒相关的疾病或障碍，或者与炎性细胞相关的疾病或障碍，诸如类风湿性关节炎(RA)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗肿瘤性疾病或障碍的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
另外，本发明的实施方案涉及如本文所述的螯合剂(例如，式(I)、(II)或(III)的化合物或它们的药学上可接受的盐)，以制备用于治疗本文提及的疾病、障碍或医学病症中的任一种(诸如前列腺癌(例如，CRPC或mCRPC))的药物。
另外，本发明的实施方案涉及如本文所述的放射性金属络合物(例如，式(I-M+)、(II-M+)或(III-M+)的化合物或它们的药学上可接受的盐)，以制备用于治疗本文提及的疾病、障碍或医学病症中的任一种(诸如前列腺癌(例如，CRPC或mCRPC))的药物。
另外，本发明的实施方案涉及缀合到抗体的如本文所述的放射性免疫缀合物(例如，式(I-M+)、(II-M+)或(III-M+)的放射性金属络合物，其中M+为Ac225，并且其中放射性金属络合物缀合到h11B6)，以制备用于治疗本文提及的疾病、障碍或医学病症中的任一种(诸如前列腺癌(例如，CRPC或mCRPC))的药物。
另外，本发明的实施方案涉及如本文所述的放射性免疫缀合物(例如，式(I-M+)、(II-M+)或(III-M+)的放射性金属络合物，其中M+为Ac225，并且其中放射性金属络合物缀合到h11B6)，以用作治疗本文提及的疾病、障碍或医学病症中的任一种(诸如前列腺癌(例如，CRPC或mCRPC))的药物。
放射性免疫缀合物将辐射直接携带到例如由靶向配体靶向的细胞等。优选地，放射性免疫缀合物携带发射α的放射性金属离子，诸如225Ac。在靶向时，来自发射α的放射性金属离子的α粒子(例如225Ac及其子体)被递送至靶向细胞并对其产生细胞毒性作用，从而选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍。
本发明还包括用于选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法以及治疗肿瘤性疾病或障碍的预靶向方法。根据预靶向方法，给予叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段，其结合到携带抗体的靶抗原的细胞，并且允许随时间推移从循环中清除或用清洗剂去除。随后，施用本发明的放射性金属络合物，优选地包含环辛炔或环辛炔衍生物(例如DBCO)的放射性金属络合物，并且使该放射性金属络合物与在靶位点处结合的叠氮化物标记的抗体发生SPAAC反应，同时将其余未结合的放射性金属络合物从循环中快速清除。该预靶向技术提供了一种增强放射性金属离子在受试者中靶位点处的定位的方法。
在其他实施方案中，将经修饰的多肽(例如叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段)和本发明的放射性金属络合物以相同组合物或不同组合物的形式施用于需要靶向放射疗法或肿瘤性疾病或障碍治疗的受试者。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。基于若干因素的考虑，包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域的技术人员可确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。
如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与其中放射性金属离子的施用将会有益的疾病、障碍或病症，诸如肿瘤性疾病或障碍有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是在受试者中可识别的，但可能是在受试者中可识别的。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻与其中放射性金属离子的施用将会有益的疾病、障碍或病症，诸如肿瘤性疾病或障碍相关的一种或多种症状，预防该一种或多种症状的发展或发作，或者缩短该一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防肿瘤性疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有肿瘤性疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中肿瘤性疾病、障碍或病症的消除。
在一些实施方案中，将治疗有效量的本发明放射性免疫缀合物或药物组合物施用于受试者以治疗受试者的肿瘤性疾病或障碍，诸如癌症。
在本发明的其他实施方案中，本发明的放射性免疫缀合物和药物组合物可与有效治疗肿瘤性疾病或障碍的其他药剂组合施用。
在另外的实施方案中，本发明涉及如本文所述的放射性免疫缀合物和药物组合物，这些放射性免疫缀合物和药物组合物用于在选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍中使用；以及如本文所述的放射性免疫缀合物或药物组合物在制造用于选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍的药物中的用途。
虽然已经说明和描述了某些实施方案，但是本领域普通技术人员在阅读前述说明书后，可以对本技术的化合物或如本文所述的其盐、药物组合物、衍生物、前药、代谢物、互变异构体或外消旋混合物进行改变、等效物的取代和其他类型的改变。上述每个方面和实施方案还可以包括或并入关于任何或所有其他方面和实施方案所公开的此类变化或方面。
实施例
以下实施例是为了帮助理解本发明而示出的，并非旨在并且不应该被解释为以任何方式限制实施例之后的权利要求书中所示出的本发明。
在以下实施例中，列出了一些已经作为残余物分离出来的合成产物。本领域普通技术人员将理解，术语“残余物”不限制产物被分离时的物理状态，并且可包括例如固体、油状物、泡沫、胶状物、浆状物等。
用于本说明书，特别是方案和实施例中的缩写列于下表A：
表A：缩写
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如本文所用，除非另外指明，否则术语“分离的形式”应意指该化合物以与和另一化合物的任何固体混合物、与溶剂系统或与生物环境分开的形式存在。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的化合物中的任一种化合物都以分离的形式存在。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“基本上纯的形式”应是指分离的化合物中杂质的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选小于约2摩尔％，更优选小于约0.5摩尔％，最优选小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以基本上纯的形式存在。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“基本上不含相应盐形式”当用于描述式(I)的化合物时，应意指式(I)的分离碱基中的相应盐形式的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选地小于约2摩尔％，更优选地小于约0.5摩尔％，最优选地小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以基本上不含相应盐形式的形式存在。
实施例1
4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸
(TOPA-[C-7]-苯基-羧酸)
方案1
步骤1：在氮气下，于-78℃向500mL三颈圆底烧瓶中的6-甲酰吡啶羧酸甲酯(4.00g，24.2mmol)、(4-(叔丁氧基羰基)苯基)硼酸(10.7g，48.5mmol)、PdCl2(0.21g，1.2mmol)、三(萘-1-基)膦(0.50g，1.2mmol)和碳酸钾(10.0g，72.7mmol)的混合物中一次性加入四氢呋喃(100mL)。将混合物用氮气吹扫，并在室温下搅拌30分钟，然后于65℃加热24小时。将反应混合物冷却至室温，通过Celite垫过滤，并将滤液浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(0-50％EtOAc/石油醚)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为黄色油状物(2.5g，30％收率)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯(2.50g，7.30mmol)、PPh3(3.43g，13.1mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(2.13g，12.0mmol)和二氯甲烷(30mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应溶液加载到硅胶柱上并通过色谱(0-30％EtOAc/石油醚)，得到化合物6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.65g，56％收率)，为黄色油状物。
步骤3：在氮气气氛下，将搅拌子、6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.52g，3.69mmol)、6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.50g，3.69mmol)、Na2CO3(1.17g，11.1mmol)和乙腈(30mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并将所得异质混合物于90℃加热16小时。随后将反应混合物冷却至室温，通过celite垫过滤，并真空浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/二氯甲烷)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物(1.2g，44％收率)。
步骤4：将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.2g，1.6mmol)、TFA(0.62mL，8.1mmol)和DCM(20mL)于室温加入到100mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应混合物浓缩至干，并对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：0.1％TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到TOPA-[C-7]-苯基-羧酸(0.8g，72％)，为棕色油状物。LC-MS APCI：C35H44N4O10的计算值：680.31；实测值：m/z[M+H]+681.5。通过LC-MS测得的纯度：99.87％。通过HPLC测得的纯度：97.14％(在210nm处为97.01％，在254nm处为97.20％，在280nm处为97.21％；柱：Atlantis dC18(250×4.6mm)，5μm；流动相A：0.1％TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12-8.07(m,4H),8.00-7.98(m,2H),7.75-7.73(m,4H),6.10(s,1H),4.67(s,2H),3.96(s,3H),3.91(s,3H),3.82(s,8H),3.56(s,8H),3.52(s,8H)。
实施例2
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基 甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案2
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.40g，0.60mmol)、(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.60mmol)、三乙胺(0.18g，0.76mmol)、HATU(0.33g，0.90mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g，0.20mmol)、MeOH(1.8mL)和HCl的甲醇(4M，1.0mL，4.0mmol)溶液加入到10mL单颈圆底烧瓶中，然后升温至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.15g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)、三乙胺(37mg，0.37mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(14mg，0.18mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，然后依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到6-((4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(100mg)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)和HCl水溶液(6N，0.4mL，2.34mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)纯化，得到6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(5.0mg)。LC-MS APCI：C40H52N6O11S的计算值：824.34；实测值：m/z[M+H]+824.8。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.22–8.20(m,2H),8.14-8.05(m,2H),7.94(d,J＝8.00Hz,2H),7.79(d,J＝8.00Hz,2H),7.73 -7.67(m,2H),6.16(s,1H),4.77(s,2H),3.93-4.00(m,8H),3.59-3.70(m,27H),3.47–3.44(m,2H)。
实施例3
6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
和
实施例4
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1, 4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案3
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.12g，0.18mmol)、(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(38mg，0.18mmol)、三乙胺(54mg，0.54mmol)、HATU(0.10g，0.27mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。然后将反应混合物升至室温并搅拌过夜。然后将反应物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。将该油状物经由硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(70mg)，为粘性油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(70mg，0.080mmol)、MeOH(1.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.4mL，1.6mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，随后使其升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(30mg)，其不经纯化直接使用。
步骤3：于室温将搅拌子、6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(30mg，0.038mmol)、LiOH水溶液(1.1mL，0.1N，0.11mmol)和MeOH(1.0mL)加入到8mL反应小瓶中，并搅拌过夜。然后将反应混合物用乙酸处理直至pH约为6.5，随后于室温真空浓缩至干。对所得产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到实施例3：6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(10mg)。LC-MS APCI：C39H54N6O9的计算值：750.40；实测值：m/z[M+H]+751.3。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.22(d,J＝1.60Hz,2H),8.21-8.06(m,2H),7.92(d,J＝8.40Hz,2H),7.80(d,J＝8.40Hz,2H),7.75-7.69(m,2H),6.20(s,1H),4.70(s,2H),4.02-3.92(m,8H),3.76-3.62(m,14H),3.51-3.32(m,4H),2.93(t,J＝8.00Hz,2H),1.67-1.64(m,4H),1.46-1.45(m,4H)。
步骤4：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.13mmol)、三乙胺(39mg，0.38mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(15mg，0.19mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，并将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到6-((4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.1g)，其不经纯化直接使用。
步骤5：将搅拌子、6-((4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)和HCl水溶液(6N，0.4mL，2.4mmol)加入到10mL圆底烧瓶中，然后于50℃搅拌3小时。然后将该反应混合物冷却至室温，并真空浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，3.5μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：2.0mL/分钟)纯化，得到实施例4：6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(15mg)。LC-MS APCI：C40H52N6O9S的计算值：792.35；实测值：m/z[M+H]+792.8。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.23-8.20(m,2H),8.15-8.06(m,2H),7.92(d,J＝8.40Hz,2H),7.79(d,J＝8.40Hz,2H),7.74–7.68(m,2H),6.17(s,1H),4.77(s,2H),4.01-3.93(m,8H),3.75-3.56(m,16H),3.42-3.33(m,5H),1.74-1.64(m,4H),1.50-1.44(m,4H)。
实施例5
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)- 1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案4
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.25g，0.37mmol)、4-(2-氨基乙基)苯胺(60mg，0.37mmol)、TEA(0.11g，0.15mL，1.1mmol)、HATU(0.21g，0.55mmol)和DCM(5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物于室温搅拌过夜，然后用水(10mL)处理，用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到产物，将该产物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((4-氨基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((4-氨基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g，0.15mmol)、TEA(45mg，65μL，0.45mmol)、DCM(3mL)和CS2(17mg，0.23mmol)加入到10mL微波压力小瓶中。于90℃对该反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将该反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6-((4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：将搅拌子、6-((4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g，0.14mmol)和HCl水溶液(0.50mL，6N，2.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并对粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)，得到6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(30mg)。LC-MS APCI：C42H48N5O10S的计算值：812.32；实测值：m/z[M+H]+812.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.22(d,J＝0.80Hz,2H),8.06-8.21(m,2H),7.85(d,J＝8.40Hz,2H),7.68-7.78(m,4H),7.31(d,J＝8.40Hz,2H),7.21(d,J＝2.00Hz,2H),6.18(s,1H),4.77(s,2H),3.70-4.00(m,7H),3.60-3.67(m,16H),3.44-3.49(m,2H),2.90-3.10(m,3H)。
实施例6
(S)-6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮 杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案5
步骤1：于0℃将搅拌子、1(6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯)(0.10g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.6mL，4.0mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((2-氨基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(55mg)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-氨基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(50mg，0.10mmol)、三乙胺(24mg，0.24mmol)、DCM(2mL)和二硫化碳(12mg，0.16mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，并将该反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干，并进行硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)，得到6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯，为黄色固体(20mg)。
步骤3：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(20mg，0.030mmol)和HCl水溶液(6N，0.1mL，0.6mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于室温搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩至干，对所得残余物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)，得到(S)-6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(6mg)。LC-MS APCI：C30H41N5O8S2的计算值：663.24；实测值：m/z[M+H]+664.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.78(s,1H),8.10(s,4H),7.78(d,J＝6.00Hz,2H),4.69(s,4H),3.96-3.52(m,23H),2.85(t,J＝6.40Hz,2H),2.70(t,J＝8.00Hz,2H)。
实施例7
(S)-6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮 杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案6
步骤1：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.6mL，4.0mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，升至室温并搅拌2小时。然后真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg)，其不经纯化直接使用。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg，0.10mmol)、三乙胺(20mg，0.20mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(15mg，0.20mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。将小瓶升至室温，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤并浓缩至干，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)，得到6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(30mg)，为黄色固体。
步骤3：于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(30mg，0.040mmol)和HCl水溶液(6N，0.2mL，0.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩至干，并将浓缩物通过HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(12mg)。LC-MS APCI：C33H47N5O8S2的计算值：705.29；实测值：m/z[M+H]+706.2。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ13.40(s,1H),9.90(s,1H),8.17-8.09(m,4H),7.78(d,J＝6.80Hz,2H),4.70(s,4H),3.93-3.17(m,27H),2.68-2.67(m,2H),1.64-1.60(m,2H),1.53-1.49(m,2H),1.40-1.38(m,2H)。
实施例8
(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10, 13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案7
方案7a
方案7a，步骤1a：在氮气氛下，将搅拌子、(4-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.5g，22mmol)、1-溴-2-(2-溴乙氧基)乙烷(5.0g，22mmol)、K2CO3(4.6g，43mmol)和ACN(45mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气氛下将所得反应混合物于80℃加热16小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0-20％EtOAc/石油醚)纯化，得到产物(4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g)。/>
步骤2a：在氮气气氛下，将搅拌子、(4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g，5.6mmol)、硫基乙酸(0.42g，5.6mmol)、K2CO3(1.5g，11mmol)和ACN(50mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物于80℃搅拌2小时，然后冷却至室温，通过过滤并真空浓缩至干。浓缩物使用中性氧化铝色谱(0-50％EtOAc/石油醚)纯化，得到S-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(1.8g)。
步骤3a：在氮气下，将搅拌子、S-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(1.8g，5.1mmol)、乙醇(20mL)和一水合肼(0.24g，0.24mL，7.6mmol)加入到250mL单颈圆底烧瓶中，并于80℃搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至室温并真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物经由硅胶色谱(5％-10％EtOAc/石油醚)纯化，得到(4-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.5g)，为无色油状物。
方案7，步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(4-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.40g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.060g，60％矿物油溶液，1.5mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，就将反应混合物升温至室温并搅拌15分钟。将混合物再次冷却至0℃，并滴加由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.5g，0.7mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液。一旦添加完成，就将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌1.5小时。然后将反应物用饱和NH4Cl(0.2mL)缓慢处理，然后浓缩至干，得到油状物。将油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C1819×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g)，为棕色油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，0.16mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.80mL，3.2mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌3小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、三乙胺(46mg，0.46mmol)、无水DCM(3mL)和二硫化碳(17mg，0.22mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对该反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。将该反应混合物冷却至室温，并用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1MHCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)和HCl水溶液(6N，0.51mL，3.1mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并将浓缩物经由制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(40mg，37％)。LC-MS APCI：C38H49N5O10S2的计算值：799.29；实测值：m/z[M+H]+799.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.23-8.20(m,2H),8.15-8.09(m,2H),7.74-7.71(m,2H),7.19(d,J＝8.80Hz,2H),6.92(d,J＝9.20Hz,2H),4.81(s,2H),4.77(s,2H),4.09-4.11(m,4H),3.92-3.95(m,6H),3.79(t,J＝4.00Hz,3H),3.66-3.71(m,16H),2.70-2.76(m,4H)。
实施例9
(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲 基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案8
方案8a
方案8a，步骤1a：将搅拌子、(4-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(3.5g，17mmol)、1,2-双(2-溴乙氧基)乙烷(4.6g，17mmol)、K2CO3(4.6g，33mmol)和ACN(40mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，然后在氮气气氛下于80℃搅拌48小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物经由硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到(4-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g)，为棕色油状物。
步骤2a：在氮气气氛下，将搅拌子、(4-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g，9.9mmol)、硫基乙酸(0.75g，9.9mmol)、K2CO3(2.7g，20mmol)和ACN(50mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气气氛下将反应混合物于60℃加热2小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，并将浓缩物通过氧化铝色谱(0-50％EtOAc/石油醚)纯化，得到S-(2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(3.0g)，为棕色油状物。
步骤3a：在氮气下将搅拌子、S-(2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(3.0g，7.5mmol)、乙醇(50mL)和肼一水合物(0.36g，0.36mL，11mmol)加入到250mL单颈圆底烧瓶中，并于80℃搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并且将浓缩物通过硅胶色谱(5％-10％EtOAc/石油醚)纯化，得到(4-(2-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g)，为无色油状物。
方案7，步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(4-(2-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.40g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.060g，60％矿物油溶液，1.5mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并连续搅拌15分钟。将混合物再次冷却至0℃，并在10分钟内滴加由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.5g，0.7mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌1.5小时。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(0.2mL)缓慢处理，浓缩至干，得到油状物。将油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，21％)，为棕色油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15mg，0.16mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇(4M，0.80mL，3.2mmol)溶液加入到25mL单颈圆底烧瓶中。使反应混合物升温至室温，并搅拌3小时。真空除去挥发物，得到产物6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.14mmol)、三乙胺(44mg，0.43mmol)的无水DCM(5mL)溶液和二硫化碳(17mg，0.22mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对该反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将该反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤4：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12mg，0.14mmol)和HCl水溶液(6N，0.50mL，2.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm 5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(50mg)。LC-MS APCI：C40H53N5O11S2的计算值：843.32；实测值：m/z[M+H]+843.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.24-8.21(m,2H),8.21-8.11(m,2H),7.74(d,J＝7.60Hz,2H),7.23-7.20(m,2H),6.97-6.95(m,2H),4.84-4.79(m,5H),4.14-4.12(m,4H),3.97-3.94(m,6H),3.83-3.59(m,23H),2.75-2.67(m,4H)。
实施例10
6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡 啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案9
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.40g，0.60mmol)、(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.60mmol)、三乙胺(0.18g，0.76mmol)、HATU(0.33g，0.90mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将混合物于室温搅拌过夜，用水(10mL)稀释，用二氯甲烷(10mL×3)萃取。合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g，0.20mmol)、MeOH(1.8mL)和HCl的甲醇(4M，1.0mL，4.0mmol)溶液加入到10mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.15g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：于室温将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.1g，0.1mmol)、LiOH水溶液(3mL，0.1N，0.3mmol)和MeOH(1.0mL)加入到8mL反应小瓶中并搅拌过夜。用乙酸将反应混合物调节至pH～6.5，然后于室温真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(40mg)。LC-MS APCI：C39H54N6O11的计算值：782.39；实测值：m/z[M+H]+783.0。
实施例11
6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并 [b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
以及
实施例12
N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢- 4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲 基))吡啶二羧酸
方案10
步骤1：于0℃将搅拌子、环戊-3-烯-1-羧酸甲酯(25.0g，198mmol)、THF(600mL)、甲醇(12.6g，16.0mL，397mmol)和硼氢化锂(198mL，2.0M的THF溶液，397mmol)加入到3000mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物于70℃搅拌6小时。然后将反应混合物冷却至室温，用冰水(250mL)缓慢处理，进一步冷却至0℃，用1.5NHCl(pH～2)调节至pH～2，然后用DCM(1000mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(50％-80％EtOAc/石油醚)纯化，得到环戊-3-烯-1-基甲醇(13.8g)。
步骤2：在氮气气氛下，于0℃将由环戊-3-烯-1-基甲醇(13.7g，139mmol)和DMF(50mL)组成的溶液经30分钟滴加到含有氢化钠(6.69g，60％矿物油溶液，167mmol)的DMF(50mL)悬浮液的1000mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将该反应混合物缓慢升温至室温并继续搅拌30分钟。然后将混合物再次冷却至0℃，并用由苄基溴(19.8g，167mmol)和DMF(50mL)组成的溶液经15分钟逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温，然后搅拌16小时。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)缓慢处理，然后用乙酸乙酯(1000mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL×3)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物。将浓缩物通过硅胶色谱(0-20％EtOAc/石油醚)纯化，得到((环戊-3-烯-1-基甲氧基)甲基)苯(21.0g)。
步骤3：于0℃将搅拌子、NMO(38.0g，50％wt H2O溶液，158mmol)、THF(180mL)和四氧化锇(16.2g，3.21mL，2.5％wt％叔丁醇溶液，0.158mmol)加入到1000mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物升至室温，搅拌10分钟再冷却至0℃。一旦冷却，用((环戊-3-烯-1-基甲氧基)甲基)苯(20.0g，158mmol)和THF(180mL)的溶液经15分钟逐滴处理混合物。将反应物升至室温并搅拌16小时，然后用饱和NaHCO3水溶液(100mL)缓慢处理，并用DCM萃取(1000mL×3)。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0-20％EtOAc/石油醚)纯化，得到4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的异构体混合物，为无色油状物。异构体通过SFC(仪器：PIC 100；柱：Chiralpak OXH(250×30)mm，5μm；流动相：CO2:0.5％异丙胺的IPA溶液(60:40)；总流速:70g/min；背压：100巴；波长：220nm；循环时间：8.0min)分离，得到4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的顺式-1,2异构体：第1洗脱异构体(10g)和第2洗脱异构体(5g)两者。
步骤4：在氮气气氛下，于0℃将由4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的第1洗脱异构体(10.0g，45.0mmol)和DMF(60mL)组成的溶液在1小时内滴加到含有氢化钠(8.62g，60％矿物油溶液，225mmol)的DMF(60mL)悬浮液的250mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将该反应混合物升至室温并搅拌30分钟。然后将混合物再次冷却至0℃，并用由2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(47.0g，225mmol)和DMF(60mL)组成的溶液经15分钟逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌2小时。然后将混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)缓慢处理，然后用乙酸乙酯(500mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过硅胶色谱(0-30％EtOAc/石油醚)纯化，得到2,2'-((((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(四氢-2H-吡喃)(21.0g)。
步骤5：将搅拌子、2,2'-((((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(四氢-2H-吡喃)(29.0g，61.0mmol)、MeOH(200mL)和HCl的1,4-二噁烷溶液(4M，3.0mL，12.0mmol)加入到1000mL三颈圆底烧瓶中，然后加热回流1小时。然后将烧瓶冷却至室温，真空除去挥发物，得到2,2'-((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)(20.0g)作为残余物，其不经纯化直接使用。
步骤6：在氮气气氛下将搅拌子、2,2'-((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)(20.0g)、(20.0g，64.4mmol)、DCM(200mL)和三乙胺(32.6mL，322mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，并将所得混合物冷却至10℃。然后将混合物用分批加入的pTsCl(36.9g，193mmol)处理，接着升至室温。一旦添加完成，将反应混合物搅拌16小时，在此期间形成沉淀。然后将混合物用DCM(500mL)稀释，用冷HCl水溶液(1M，500mL×3)和冰冷水(500mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过硅胶色谱(0-30％EtOAc/石油醚)纯化，得到((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸酯)(26.0g)。
步骤7：在氮气气氛下将搅拌子、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(4-甲基苯磺酰胺)(21.0g，42.0mmol)、Cs2CO3(41.3g，126mmol)和无水DMF(250mL)加入到2000mL三颈圆底烧瓶中，并将所得异质混合物于室温搅拌1.5小时。然后用由((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸酯)(26.0g，42.0mmol)和DMF(250mL)组成的溶液经2小时的时间逐滴处理该混合物。继续搅拌20小时，然后将混合物真空浓缩至干，得到糊状固体。将糊状物悬浮于DCM(1000mL)中，搅拌30分钟，并通过真空过滤进行过滤。将过滤物真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0-40％EtOAc/石油醚)纯化，得到18-((苄氧基)甲基)-4,13-二对甲苯磺酰基十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷(24g)。
步骤8：在氮气气氛下将HBr(50％，112mL，695mmol)的HOAc溶液加入到含有搅拌子和18-((苄氧基)甲基)-4,13-二对甲苯磺酰基十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷(24.0g，32.8mmol)的500mL圆底烧瓶中。将混合物于室温搅拌直至均匀，然后用苯酚(16.3g，174mmol)处理。然后将该反应混合物于60℃加热6小时，之后冷却至室温并真空浓缩至干，得到浓缩物。将浓缩物通过反相柱色谱(柱：RevelriesC18-330g；流动相A：0.1％TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：60mL/min)纯化，得到(十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-18-基)乙酸甲酯(8.0g)。
步骤9：在氮气气氛下将搅拌子、(十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-18-基)乙酸甲酯(8.0g，21mmol)、6-(氯代甲基)吡啶羧酸甲酯(12.2g，53.2mmol)、Na2CO3(11.1g，106mmol)和乙腈(100mL)加入500mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气气氛下，于90℃将所得异质混合物加热16小时。然后将所得混合物冷却至室温，通过垫过滤，并将滤液真空浓缩至干，得到浓缩物。对浓缩物进行硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)，得到6,6'-((18-(乙酰氧基甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(5.0g)。
步骤10：在氮气气氛下将搅拌子、6,6'-((18-(乙酰氧基甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(5.0g，7.4mmol)、K2CO3(0.10g，0.74mmol)和甲醇(50mL)加入250mL圆底烧瓶中，并将所得混合物于室温搅拌10分钟。然后将混合物真空浓缩至干，并且将所得残余物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6,6'-((18-(羟甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(3.0g)。
步骤11：在氮气气氛下将搅拌子、6,6'-((18-(羟甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(2.0g，3.1mmol)、DCM(20mL)和三乙胺(1.2g，9.5mmol)加入到100mL三颈圆底烧瓶中，并将所得混合物冷却至10℃。将混合物用MsCl(0.48g，6.3mmol)分批处理，并且一旦添加完成，将反应容器升至室温并且搅拌30分钟，在此期间形成沉淀。然后将异质混合物用DCM(50mL)稀释，用冷HCl水溶液(1M，50mL×3)和冰冷水(50mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到胶状固体。胶状固体通过中性氧化铝柱色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6,6'-((18-(((甲磺酰基)氧基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(1.5g)。
步骤12：在氮气气氛下，于0℃将由6,6'-((18-(((甲磺酰基)氧基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.69g，3.2mmol)和DMF(5mL)组成的溶液经5分钟滴加到含有氢化钠(162mg，60％矿物油溶液，4.22mmol)的DMF(0.5mL)悬浮液的25mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并搅拌15分钟。然后将反应混合物再次冷却至0℃，并用由2-(2-巯基乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(1.50g，2.11mmol)和DMF(3mL)组成的溶液经5分钟逐滴处理。一旦添加完成，就使反应混合物缓慢升温至室温然后搅拌1小时。然后将反应物用饱和NH4Cl溶液缓慢处理，随后用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150m)5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(0.2g)。
步骤13：于0℃将搅拌棒、环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(0.20g，0.24mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇(4M，1.2mL，4.8mmol)溶液加入到25mL单颈圆底烧瓶中，并将所得混合物升至室温，搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(150mg)，其不经纯化直接使用。
步骤14：于室温将搅拌棒、6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(40mg，0.054mmol)、LiOH水溶液(1.6mL，0.1N，0.16mmol)和MeOH(0.5mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物的pH用乙酸调节至pH～6.5，然后于室温真空浓缩至干，将所得浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGEC18 19×150mm 5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到实施例11：6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(23mg)。LC-MS APCI：C34H51N5O9S的计算值：705.34；实测值：m/z[M+H]+706.4。
步骤15：在氮气气氛下，于0℃将搅拌棒、6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(70mg，0.95mmol)、11,12-二脱氢-γ-氧代二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-丁酸(29mg，0.95mmol)、三乙胺(29mg，0.76mmol)、HATU(54mg，0.14mmol)和DCM(0.5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将所得混合物升至室温并搅拌过夜。将反应混合物用水(10mL)稀释并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。油状物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(10mg)。
步骤16：于室温将搅拌棒、N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(10mg，0.01mmol)、LiOH水溶液(0.3mL，0.1N，0.03mmol)和甲醇(0.25mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物用乙酸调节至pH～6.5，于室温真空浓缩至干，将所得浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到
实施例12：N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(3mg)。LC-MS APCI：C53H64N6O11S的计算值：992.44；实测值m/z[M-H]-：991.4。
实施例13
6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-8-异硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二 氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案11
步骤1：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的500mL三颈圆底烧瓶中加入8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸(20.0g，77.1mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液、N,O-二甲基羟胺(7.0g，115mmol)、二异丙基乙胺(29.90g，231mmol)。这之后在0℃下，边搅拌边加入HATU(43.9g，115mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。然后通过添加200mL的水淬灭反应物。用二氯甲烷(100mL×2)萃取所得溶液。将合并的有机层依次用HCl(1M)(300mL×2)、NH4CO3水溶液(400mL×3)和盐水(400mL)洗涤。经无水Na2SO4干燥后，浓缩，得到(8-(甲氧基(甲基)氨基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(15.4g，66％收率)，为浅黄色油状物。
步骤2：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的500mL三颈圆底烧瓶中加入2,6-二溴吡啶(23.0g，927mmol)的THF(400mL)溶液。将其冷却至-78℃，并快速滴加n-BuLi(60.4mL，927mmol)。搅拌10分钟后，于-78℃搅拌下滴加加入(8-(甲氧基(甲基)氨基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(14.0g，463.5mmol)的THF(40mL)溶液。将所得溶液于室温搅拌30分钟。通过添加500mL的水淬灭反应物。将所得溶液用乙酸乙酯(200mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(400mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物。经硅胶色谱(0-10％乙酸乙酯/石油醚)得到(8-(6-溴吡啶-2-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(11.8g，50％收率)，为淡黄色固体。
步骤3：向在氮气的惰性气氛下维持的1L高压反应器中加入(8-(6-溴吡啶-2-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(11.5g，28.8mmol，1.0当量)的MeOH(500mL)溶液，随后加入Pd(dppf)Cl2(2.1g，2.88mmol)、TEA(8.7g，86.4mmol)。然后引入CO(20atm)。将所得溶液于100℃搅拌16小时。将反应溶液过滤并直接用于下一步骤。
步骤4：将从上面得到的MeOH溶液冷却至0℃并加入NaBH4(1.08g，28.8mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。然后将反应物通过加入500mL NH4CO3水溶液淬灭，并用乙酸乙酯(300mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(600mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-羟基辛基)吡啶羧酸甲酯(10g)，为棕色油状物。
步骤5：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的250mL三颈圆底烧瓶中加入6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-羟基辛基)吡啶羧酸甲酯(10g)的DCM(100mL)溶液。冷却至0℃后，加入TEA(7.9g，78.9mmol)和甲磺酰氯(3.6g，31.5mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。将混合物真空浓缩。加入MeCN(100mL)并真空浓缩。将粗产物6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((甲磺酰基)氧基)辛基)吡啶羧酸甲酯直接用于下一步骤。
步骤6：向上述粗产物6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((甲磺酰基)氧基)辛基)吡啶羧酸甲酯的ACN(100mL)溶液中加入NaI(4.3g，28.9mmol)。将所得溶液于80℃搅拌1小时。将混合物过滤并浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱C18；流动相，30分钟内H2O/ACN＝50％/50％至H2O/ACN＝20％/80％；得到4g 6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-碘辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤7：向6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-碘辛基)吡啶羧酸甲酯(3.0g，6.12mmol)的DCM(200mL)溶液中加入6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(3.0g，7.34mmol)、二异丙基乙胺(3.9g，30.61mmol)。将所得溶液于80℃搅拌16小时。浓缩反应物。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱C18；流动相，A：H2O(0.05％TFA)，B：CAN；20分钟内20％B至40％B。得到1.9g 6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤8：于0℃向搅拌的6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯(1.7g，2.19mmol，在LCMS上77％)的DCM(8.5mL)溶液中滴加HCl/二噁烷。将所得溶液于室温搅拌1小时。通过分批加入NH4CO3水溶液(20mL×3)淬灭反应物。用二氯甲烷(100mL×2)萃取所得溶液。将合并的有机层用盐水(400mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到1.3g 6-(8-氨基-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤9：在N2下，向6-(8-氨基-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯(1.0g，1.48mmol)的DCM(17mL)溶液中加入1,1'-硫代羰基双(吡啶-2(1H)-酮)(0.38g，1.63mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1h。浓缩，得到1.6g 6-((16-(1-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤10：向6-((16-(1-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.40g，1.42mmol)的ACN(4mL)溶液中加入HCl(6M)(7mL)。将所得溶液于50℃在油浴中搅拌5小时。用10mL H2O稀释。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱，C18；流动相，A：H2O(0.05％TFA)，B：ACN，20分钟内20％B至36％B；检测器UV@210nm。浓缩产物级分以除去ACN。用NaHCO3水溶液将水溶液调节至pH 7～8。再次在快速制备型HPLC上纯化：柱，C18；流动相，A：H2O，B：ACN，20分钟内95％B至100％B。将产物溶液浓缩以除去CAN，然后冻干。得到190mg 6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸，为棕色固体。1HNMR(300MHz,D2O)δ7.91(s,4H),7.54(s,2H),4.52(d,J＝17.9Hz,3H),3.77(d,J＝9.3Hz,8H),3.56–3.41(m,18H),2.11(s,2H),1.51(s,2H),1.17(s,7H),0.97(s,1H).MS(ES,m/z):688.3(M+H+)。
实施例14
6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案12
步骤1：在氮气气氛下，于0℃向2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-油酸(10.00g，37.98mmol)和二异丙基乙胺(14.73g，113.94mmol)的二氯甲烷(100mL)搅拌溶液中滴加[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(15.16g，39.88mmol)、N,O-二甲基羟胺(5.55g，56.97mmol)。将所得混合物于室温搅拌1小时后，将其倒入饱和NH4Cl(水溶液)中。将所得混合物用二氯甲烷(100mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度20％B至40％B；检测器：UV@210nm。得到(3-甲基-4-氧代-2,6,9-三氧杂-3-氮杂十一烷-11-基)氨基甲酸叔丁酯(9.90g，85％收率)，为淡黄色油状物。
步骤2：在氮气气氛下，于-78℃向500ml三颈圆底烧瓶中的2,6-二溴-吡啶(13.3g，56.1mmol)的THF(260mL)溶液中滴加n-BuLi(28.0mL，56.1mmol)。将溶液于-78℃搅拌10分钟。将(3-甲基-4-氧代-2,6,9-三氧杂-3-氮杂十一烷-11-基)氨基甲酸叔丁酯(7.0g，28.0mmol)的THF(30mL)溶液于-78℃滴加到反应溶液中，并将混合物于室温搅拌30分钟。通过加入0℃的水/冰(200mL)淬灭反应物。将水层用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相，流动相A：含0.05％TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度38％B至58％B；检测器：UV@210nm。得到(2-(2-(2-(6-溴吡啶-2-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.6g，50％收率)，为黄色固体。MS(ES,m/z):425,427(M+Na+)。
步骤3：向250mL高压反应器中加入(2-(2-(2-(6-溴吡啶-2-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g，18.1mmol)、三乙胺(5.5g，54.3mmol)、Pd(dppf)Cl2(1.3g，1.8mmol)和MeOH(40mL)。将反应溶液抽空并用N2回填。然后引入CO(10atm)。将所得溶液于100℃搅拌过夜。过滤反应混合物并将滤液浓缩至干。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度38％B至58％B；检测器：UV@210nm。得到6-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-酰基)吡啶羧酸甲酯(2.4g，63％收率)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):405(M+Na+)。
步骤4：在N2气氛下，于0℃向6-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-酰基)吡啶羧酸甲酯(2.30g，6.01mmol)的MeOH(46mL)溶液中加入NaBH4(0.23g，6.01mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时并通过加入50mL饱和NH4HCO3(水溶液)淬灭。将所得溶液用乙酸乙酯(30mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(60mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。得到2.2g粗产物6-(13-羟基-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤5：在0℃、N2气氛下，向6-(13-羟基-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(2.2g，5.72mmol)的二氯甲烷(22mL)溶液中加入三乙胺(1.74g，17.16mmol)和MsCl(0.79g，6.86mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时，用H2O(22mL)淬灭。将所得混合物用二氯甲烷(20mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。得到2.2g粗产物6-(2,2-二甲基-13-((甲磺酰基)氧基)-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤6：在N2气氛下，向6-(2,2-二甲基-13-((甲磺酰基)氧基)-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(2.2g，4.75mmol)的ACN(22mL)溶液中加入NaI(0.78g，5.23mmol)。将所得溶液于80℃搅拌1小时。将混合物过滤并浓缩。粗产物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN；30分钟内梯度50％B至80％B；检测器：UV@210nm。得到6-(13-碘-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(1.2g)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):517(M+Na+),495(M+H+)。
步骤7：在氮气气氛下，于80℃将6-(13-碘-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(840mg，1.69mmol)和6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(839mg，2.03mmol)的ACN(16.8mL)溶液搅拌过夜。过滤冷却的反应混合物，并将滤液减压浓缩。粗产物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN；20分钟内梯度40％B至60％B；检测器：UV@210nm。得到6-((16-(13-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(450mg)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):700(M+Na+),678(M+H+)。
步骤8：于0℃向6-((16-(13-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(450mg，579mmol)的二氯甲烷(2.5mL)溶液中加入HCl/二噁烷(2.5ml，4M)。将所得溶液于室温搅拌20分钟。通过添加饱和Na2CO3(水溶液)淬灭反应物。将水层用DCM:IPA(5:1)(30mL×2)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到粗产物6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(330mg)。将粗产物直接用于下一步骤。
步骤9：在氮气气氛下，于室温将6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(300mg，0.44mmol)和1-(2-氧代吡啶-1-硫代羰基)吡啶-2-酮(113.08mg，0.48mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液搅拌1小时。将所得混合物减压浓缩，得到粗产物6-(2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(380mg)。将粗产物直接用于下一步骤。
步骤10：在氮气气氛下，于50℃将6-(2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(380mg，0.52mmol)和HCl(1.9mL，6M)的二氯甲烷(1.9mL)溶液搅拌3小时。将所得混合物减压浓缩，用饱和NaHCO3(水溶液)碱化至pH 6-7。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％TFA的H2O，B：ACN，20分钟内梯度20％B至36％B；检测器：UV@210nm。然后，将产物级分真空浓缩以除去MeCN。将溶液再次通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN，20分钟内梯度95％B至100％B。浓缩溶液以除去大部分MeCN，冻干水溶液，得到6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(130mg)，为棕色固体。1H NMR(300MHz,D2O)8.03–7.84(m,2H),7.57(dd,J＝22.3,7.4Hz,1H),5.00(s,0H),4.59(s,1H),4.20(dd,J＝23.4,9.5Hz,1H),3.82(d,J＝15.4Hz,4H),3.70–3.58(m,6H),3.58–3.49(m,6H).MS(ES,m/z):692.3(M+H+)。
实施例15
6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基) 氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲 基))吡啶二羧酸
方案13
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(5-巯基戊基)氨基甲酸叔丁酯(0.30g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.07g，60％矿物油溶液，2mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并继续搅拌15分钟。将反应混合物再次冷却至0℃，并用由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.6g，0.9mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液经10分钟逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并持续搅拌1.5小时。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(1.0mL)小心地处理，浓缩至干，得到油状物。对油状物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)，得到6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.25g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.25g，0.32mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇溶液(4M，1.5mL，6.3mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，随后将其升至室温并将混合物搅拌3小时。然后真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.21g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，0.22mmol)、((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基4-硝基苯基碳酸酯(68mg，0.22mmol)、三乙胺(66mg，0.65mmol)以及DCM(2mL)和DMF(0.1mL)的混合物加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将所得混合物逐渐温热至室温并搅拌过夜。然后将混合物浓缩至干，得到6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.1g)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌棒、6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.10g，0.12mmol)、LiOH水溶液(3.5mL，0.1N，0.35mmol)和MeOH(0.5mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物于室温搅拌过夜。然后用乙酸将反应混合物处理直至pH～6.5，随后于室温真空浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm，5.0μm；流动相：0.1％甲酸的H2O溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(42mg)。
实施例16
N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂- 7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸
方案14
步骤1：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.75mL，3.0mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg)，其不经纯化直接使用。
步骤2：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(50mg，0.070mmol)、11,12-二脱氢-γ-氧代二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-丁酸(20mg，0.070mmol)、三乙胺(21mg，0.21mmol)、HATU(38mg，0.10mmol)和DCM(0.5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中，随后升至室温并搅拌过夜。将反应混合物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取，然后用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤合并的萃取物，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。该油状物通过硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(16mg)。
步骤3：将搅拌子、N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(16mg，0.016mmol)、LiOH水溶液(0.49mL，0.1N，0.049mmol)和MeOH(0.25mL)加入到8mL反应小瓶中，并将混合物于室温搅拌过夜。然后用乙酸将反应混合物处理直至pH～6.5，并于室温真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19×150mm5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸(5mg)，为灰白色固体。LC-MS APCI：C51H62N6O10S的计算值：950.42；实测值m/z[M+H]+951.4。1H NMR(400MHz,D2O):δ7.81-7.75(m,4H),7.52-7.17(m,10H),4.97-4.90(m,1H),4.80(s,4H),4.14(s,3H),3.77-3.46(m,16H),3.10(s,7H),2.83-2.80(m,2H),2.55-2.53(m,2H),2.42-2.38(m,3H),2.11-2.08(m,3H),1.39-1.35(m,2H),1.20-1.10(m,4H)。
实施例17
N-酰基-DBCO标记的6-((4-((6-氨基乙基)氨基甲酰基)苯基)16-((6-羧基吡啶- 2-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(TOPA-[C7]-苯亚 氨基-DBCO)
方案15
步骤1：在氮气下，于-78℃向500mL三颈圆底烧瓶中的6-甲酰吡啶羧酸甲酯(4.00g，24.2mmol)、(4-(叔丁氧基羰基)苯基)硼酸(10.7g，48.5mmol)、PdCl2(0.21g，1.2mmol)、三(萘-1-基)膦(0.50g，1.2mmol)和碳酸钾(10.0g，72.7mmol)的混合物中一次性加入四氢呋喃(100mL)。将混合物用氮气吹扫，并于室温搅拌30分钟，然后于65℃加热24小时。将反应混合物冷却至室温，通过垫过滤，并将滤液浓缩至干。对粗产物进行硅胶色谱(0-50％EtOAc/石油醚)，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为黄色油状物(2.5g，30％)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯(2.50g，7.30mmol)、PPh3(3.43g，13.1mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(2.13g，12.0mmol)和DCM(30mL)放入250mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应溶液上样到硅胶柱上并使用0-30％乙酸乙酯/石油醚纯化，得到化合物6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.65g，56％)，为黄色油状物。
步骤3：在氮气气氛下，将搅拌子、6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.52g，3.69mmol)、6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸酯(1.50g，3.69mmol)、Na2CO3(1.17g，11.1mmol)和乙腈(30mL)加入250mL三颈圆底烧瓶中，将所得异质混合物在氮气气氛下，于90℃加热16小时。随后将反应物料冷却至室温，通过垫过滤，并真空浓缩至干，得到粗产物。对粗产物进行硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物(1.2g，44％收率)。
步骤4：将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.2g，1.6mmol)、TFA(0.62mL，8.1mmol)和DCM(20mL)于室温加入到100mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应混合物浓缩至干，并对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：0.1％TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)，得到4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.8g，72％)，为棕色油状物。LC-MS APCI：C35H44N4O10的计算值：680.31；实测值：m/z[M+H]+681.5。通过LC-MS测得的纯度：99.87％。通过HPLC测得的纯度：97.14％(在210nm处为97.01％，在254nm处为97.20％，在280nm处为97.21％；柱：AtlantisdC18(250×4.6mm)，5μm；流动相A：0.1％TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12-8.07(m,4H),8.00-7.98(m,2H),7.75-7.73(m,4H),6.10(s,1H),4.67(s,2H),3.96(s,3H),3.91(s,3H),3.82(s,8H),3.56(s,8H),3.52(s,8H)。
步骤5：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.25g，0.37mmol)、DBCO(0.10g，0.37mmol)、三乙胺(0.16mL，1.1mmol)、HBTU(0.21g，0.55mmol)和DCM(10mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中并于室温搅拌16小时。反应物用水(20mL)淬灭，并用DCM(3×20mL)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到粗产物，为油状物。对粗产物进行硅胶色谱(0-10％MeOH/DCM)，得到TOPA二甲酯-[C7]-苯基-DBCO(0.12g，35％)，为无色粘性油状物。
步骤6：于室温将搅拌子、TOPA二甲酯-[C7]-苯基-DBCO(0.1g，0.1mmol)、LiOH.H2O水溶液(3mL，0.1N，0.3mmol)和THF/MeOH/H2O(4:1:1v/v/v，2mL)加入到8mL反应小瓶中，并搅拌2小时。将反应混合物用HCl水溶液(1N)中和至PH约为6.5。将反应混合物于室温真空浓缩至干，对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19×150mm)5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到TOPA-[C7]-苯基-DBCO(20mg，21％)，为灰白色固体。LC-MS APCI：C51H54N6O10的计算值：910.39；实测值：m/z[M-H]+909.3。通过LC-MS测得的纯度：92.47％。通过HPLC测得的纯度：90.68％(在210nm处为88.04％，在254nm处为90.43％，在280nm处为93.56％；柱：XBRIDGE C8(50×4.6mm)，3.5μm；流动相A：10mM碳酸氢铵水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.84-7.82(m,4H),7.60-7.29(m,12H),7.13-7.10(m,2H),5.12-5.02(m,2H),3.97(s,2H),3.59-3.44(m,20H),2.85(s,4H),2.73-2.68(m,6H)。
实施例18
TOPA-[C7]-苯亚氨基-DBCO-三唑-PSMB-127抗体缀合物
步骤1.mAb的叠氮化物修饰和点击反应：于37℃用100x摩尔过量的3-叠氮基丙胺和微生物转谷氨酰胺酶(MTG；活化TI)对PSMB127进行位点选择性修饰。通过Agilent G224仪器上的完整质量ESI-TOF LC-MS监测mAb的重链上两个叠氮化物的添加。除去过量的3-叠氮基丙胺和MTG，并使用1mL GE Healthcare MabSelect柱纯化叠氮化物修饰的mAb(叠氮基-mAb)。将叠氮基-mAb使用100mM柠檬酸钠(pH 3.0)从树脂上洗脱，随后使用7K脱盐柱交换到20mM Hepes、100mM NaCl(pH7.5)中。使10x摩尔过量的TOPA-[C7]-苯基-DBCO与位点特异性叠氮化物-PSMB127(DOL＝2)在37℃在不振荡的情况下反应1小时。通过完整质谱监测DBCO-叠氮化物点击反应的完成。通过在/>7K脱盐柱上将缀合物脱盐到20mMHepes、100mM NaCl(pH 7.5)中，然后使用30KMWCO Amicon浓缩装置通过以3800×g旋转在20mM Hepes、100mM NaCl(pH 7.5)中进行三个连续的15x稀释和浓缩步骤来去除过量的游离螯合剂。这提供了最终位点特异性TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127缀合物，其中CAR＝2。通过在Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8mm×30cm，5u柱上使用以下条件的分析性尺寸排阻色谱法确认最终缀合物为单体；柱温：室温；将柱用DPBS缓冲液(1x，不含钙和镁)洗脱；流速：0.7mL/min；18Min运行；进样容量：18μL。
步骤2.螯合：在纯水中制备下列金属盐的储备溶液：
盐 目录号 浓度
氯化铈(III) Sigma Cat#429406 10mM
氯化钕(III)六水合物 Sigma Cat#289183 10mM
氯化铽(III) Sigma Cat#451304 10mM
氯化镥(III) Sigma Cat#450960 10mM
氯化铥(III) Sigma Cat#451304 10mM
氯化钇(III) Sigma Cat#451363 10mM
氯化钬(III) Sigma Cat#450901 10mM
将金属溶液加入到在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)中的5x摩尔过量的TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127(6.8μM抗体，34μM金属离子)中，并于37℃温育2小时。通过用柱脱盐，随后在50K MWCO Amicon浓缩器(EMD/>)中进行两个10x稀释和浓缩循环来除去过量金属。通过完整和简化质量的LC-MS评估螯合。
步骤3.稳定性测定：为了测定螯合物的稳定性，进行DTPA测试。将50μL样品(6.3μM抗体)与50μL 10mM DTPA pH 6.5混合，并于37℃温育过夜。通过完整和简化质量的LC-MS评估螯合。LC-MS在连接到Agilent G6224 MS-TOF质谱仪的Agilent 1260HPLC系统上进行。LC在Agilent RP-mAb C4柱(2.1×50mm，3.5微米)上以1mL/分钟的流速运行，其中流动相为0.1％甲酸的水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(Sigma-Aldrich，目录号34688)(B)，并且梯度为20％B(0至2分钟)、20％-60％B(2至3分钟)、60％-80％B(3至5.5分钟)。仪器以正电喷雾电离模式操作，并从m/z 600至6000扫描。使用最大熵算法对质荷比谱进行解卷积，并且通过解卷积质量的峰高估计相关物质的相对量。仪器设置包括：毛细管电压3500V；碎裂电压175V；撇渣器电压65V；气体温度325C；干燥气体流速5.0L/min；喷雾器压力30psig；采集模式范围100-7000，扫描速率0.42。
对于铈和钕样品，观察到相对于TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127的MW变化。与铈一起温育的缀合物的完整质量显示MW增加139(20％，按峰面积计)或276(77％)。Da对应于1或2个铈离子的添加。在DTPA测试后，质量保持相似，具有相似的丰度(对于+138物质和+274物质为30％和67％)。
实施例19
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-异硫氰基苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16- 二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(H2bp18c6-苄基-苯基)(TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸 酯和钠盐形式
化合物2以与现有文献方法类似的方式制备，参见J.Org.Chem；1987，52，5172。
化合物3以与现有文献方法类似的方式制备，参见Chemistry–a EuropeanJournal；2015，21，10179。
化合物4的制备：
在N2气氛下，于15℃-20℃将1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷(494g，1.88mol，2.5当量)、NaCl(44.1g，0.75mol，1.0当量)、H2O(140mL，相对于化合物3为1体积)和乙腈(2.1L，15体积)装入10L反应器中，加热至65℃。于65℃经1小时向所得混合物中滴加化合物3(140g，0.75mol)的乙腈(280ml，2体积)溶液。于65℃将溶液老化0.5小时。混合物的LCMS分析显示反应已完成。将混合物冷却至室温并真空浓缩。向混合物中加入丙酮(700ml，5体积)并将悬浮液再搅拌1小时。将混合物过滤(过滤的固体是未反应的化合物2)。将滤液真空浓缩，然后溶解于DCM(1.4L，10体积)中。将有机相用水(3×750mL)洗涤，并将有机相用Na2SO4干燥，然后真空浓缩，得到化合物4，212g(63％收率，测定：85％w/w)。LCMS:(ES,m/z):412.15[M+H]+1H-NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.98–7.87(m,2H),7.81(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),3.87(s,3H),3.81(s,2H),3.61–3.38(m,16H),2.77(dt,J＝19.0,5.2Hz,8H)。
化合物7的制备：
在N2气氛下，于15℃-20℃将6-甲酰吡啶羧酸甲酯5(250g，1.0当量)、(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)硼酸6(538g，1.5当量)和脱气的THF(6.5L，相对于5为26体积)加入10L反应器中。然后加入PdCl2(14.0g，0.05当量)、三(萘-1-基)-磷烷(31g，0.05当量)和K2CO3(650g，3.1当量)。将所得溶液于20°搅拌0.5小时。然后将混合物加热至65℃并老化17小时。LCMS的分析显示该反应已完成。将所得溶液于室温冷却并用冰水(2.5L，10体积)和乙酸乙酯(5L，20体积)稀释。搅拌混合物，然后通过Celite垫过滤。使溶液分离，并弃去含水下层。用水(2×1.5L，12体积)洗涤有机相。分离各层，并将有机层经Na2SO4干燥，真空浓缩。将所得残余物用庚烷(1.25L，5体积)处理并将所得悬浮液搅拌0.5小时。过滤混合物，用正庚烷(500ml，2体积)洗涤滤饼，得到530g(98％收率，LCAP纯度：90％)期望产物7，为黄色固体，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。LCMS:(ES,m/z):381.10[M+Na]+1H-NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.27(s,1H),8.03–7.85(m,2H),7.79(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),6.13(d,J＝4.0Hz,1H),5.72(d,J＝3.9Hz,1H),3.87(s,3H),1.46(s,9H)。
化合物8的制备；
在氮气气氛下，于15℃-20℃将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯7(310g，1.0当量)、三乙胺(219g，2.5当量)和DCM(6.2L，相对于7为20体积)装入10L反应器中，并将溶液冷却至0℃。在30分钟内滴加甲磺酰氯(99.2g，1.0当量)，保持温度为0℃。除去冷却浴，使温度达到环境温度，然后在该温度下老化1小时。将溶液在10℃-15℃真空浓缩，然后将残余物溶于乙腈(438ml，2体积)中。将所得溶液真空浓缩，得到518g(粗制)期望产物8。将该粗产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
化合物9的制备：
在氮气气氛下，于室温将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-((甲磺酰基)氧基)甲基)吡啶羧酸甲酯8(212g，1.0当量，通过Q-NMR测得纯度为85％)、Na2CO3(137.6g，3.0当量)和乙腈(3.56L，相对于8为20体积)装入10L反应器中，然后将混合物加热至65℃并老化1小时。于65℃经0.5小时内滴加6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯4(377.8g，2.0当量)的乙腈(3L，10体积)溶液。将混合物在该温度下老化直至HPLC分析显示该反应完成。将所得溶液于室温冷却，然后过滤，滤饼用MeOH(2×1体积)洗涤。将滤液真空浓缩并将所得残余物溶于EA(700mL)中，然后加入硅胶(800g，型号：ZCX-2，100-200目，2.11w/w)。真空浓缩混合物，同时保持温度低于35℃。将硅胶(9.6kg，型号：ZCX-2，100-200目，26.3w/w)装入柱中，随后装入所制备的含有吸附的粗产物9的干燥硅胶。用乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷(3:3:1)/甲醇:二氯甲烷(1:1)洗脱柱(梯度为100:0至90:10，每4L±0.5L收集样品)。通过TLC(乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇＝4:4:1:1)分析级分。合并含产物的级分并浓缩，得到260g化合物9，为黄色固体(HPLC：94％，QNMR：92％)。得到另外70g化合物9，为黄色油状物(HPLC；75％，QNMR：60％)。LCMS(ES,m/z):752.30[M+H]+实测值m/z 1H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ7.53–7.32(m,3H),7.28–7.18(m,3H),6.86(d,J＝8.4Hz,2H),6.76(d,J＝8.4Hz,2H),6.09(s,1H),4.63(s,1H),3.48(s,3H),3.44(bs,5H),3.17–2.92(m,16H),2.38(dq,J＝25.0,7.2,6.8Hz,8H),0.97(s,9H)。
化合物10的制备：
在氮气气氛下，于15℃-20℃将化合物9(260g，QNMR：92％，1.0当量)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA，6.0当量)和乙腈(4L，15体积)加入到10L反应容器中。将混合物于20℃搅拌40分钟。经0.5小时滴加TMSOTf(212.9g，3.0当量)的乙腈(1.3L，5体积)溶液，内部温度维持在15℃-20℃之间。将溶液于15℃-20℃老化1小时。当过程分析(样品制备0.1mL体系+0.9mL ACN+一滴二异丙基乙胺)显示起始材料完全转化时，将混合物用二异丙基乙胺(617g，15.0当量)淬灭，温度维持在5℃-10℃之间。将混合物于5℃-10℃搅拌20分钟，然后加入饱和NH4Cl水溶液(2.6L，10体积)，温度维持在5℃-10℃之间。将混合物于该温度再老化30分钟。收集水相(含有固体)并用2-MeTHF(520ml，2体积)萃取。合并有机相并用KF(KF：9.18％)检查水含量，然后用无水Na2SO4(500g，10.0当量)干燥。过滤除去固体，滤饼用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤。然后用无水Na2SO4(500g，10.0当量)干燥滤液。过滤后，用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤滤饼，并用KF(KF：8.15％)检查水含量。将10的乙腈/2-MeTHF流直接用于下一步骤。(产物在LCMS条件下不稳定)。
化合物14(游离酸)的制备
在氮气气氛下，于室温将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(6.0g，1.0当量)、BSA(9.7g，6.0当量)和MeCN(120mL，相对于9为20体积)加入到500mL反应器中。于室温经30分钟滴加TMSOTf(5.4g，2.3当量)的MeCN(120mL，20体积)溶液。将混合物于室温老化过夜。混合物的分析(样品制备0.1mL体系+0.9mL ACN+一滴二异丙基乙胺)显示反应已经完成。将混合物用二异丙基乙胺(15.4g，15.0当量)淬灭，温度维持在0℃-5℃之间。将混合物于0℃-5℃搅拌5分钟，然后滴加饱和NH4Cl水溶液(60mL，10体积)，温度维持在0℃-5℃之间。通过萃取除去水相，收集有机相并直接用于下一步骤。将有机相装入500mL三颈圆底烧瓶中，于室温将LiOH(1.15g，6.0当量)的水(60mL，10V)溶液加入到该溶液中。将溶液于该温度搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有完全转化。加入另一部分LiOH(576mg，3.0当量)并将溶液于室温再搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示反应已经完成。然后加入TCDI(5.6g，3.9当量)并将溶液于室温搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有完全转化。加入另一部分TCDI(2.8g，2.0当量)并将溶液于室温再搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示反应已经完成。通过反相Combi-Flash分离反应溶液。方法：柱C18，A溶液H2O(含有0.01％甲酸)，B溶液ACN。40分钟内5％至35％，流速(100mL/min)，产物在20分钟-25分钟。收集溶液。将该溶液浓缩以除去ACN并再次通过反相Combi-Flash分离。方法：柱C18，A溶液H2O，B溶液ACN。流速：5％10分钟，5％至35％5分钟，95％10分钟，流速(100mL/分钟)，产物在13分钟-25分钟。收集溶液。将溶液在<20℃下真空浓缩并通过冷冻干燥进行干燥。这得到2.5g(3步收率为47％)的化合物14，为黄色固体。化合物14(6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-异硫氰基苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸)需要储存在-80℃。LCMS:(ES,m/z):666.3[M+H]+1H-NMR:(400MHz,D2O,ppm):7.94-7.84(m,4H),7.56-7.40(m,4H),7.16-7.14(m,2H),5.83(s,1H),4.56(s,2H),3.80-3.75(m,8H),3.60-3.49(m,14H),3.36-3.33(m,2H)。
制备化合物11(钠盐)：
将制备的化合物10在ACN和2-MeTHF中的溶液加入到10L四颈反应器中，并将溶液冷却至5℃-10℃。加入粉末状NaOH(56.9g，4.5当量)，温度维持在5℃-10℃之间。将溶液于15℃-20℃搅拌0.5小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有转化。于5℃-10℃加入另外的粉末状NaOH(25.3g，2.0当量)。将溶液于15℃-20℃再老化0.5小时。分析第二次IPC并显示50％的转化率。于5℃-10℃加入最终量的粉末状NaOH(25.3g，2.0当量)。将混合物于15℃-20℃再搅拌0.5小时。分析显示起始材料10完全转化。过滤混合物，并用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤滤饼。将最终溶液(约7.5L，28.8体积)浓缩至1-2体积，温度维持在15℃-20℃之间。然后将残余物用乙腈(2L，7.7体积)处理，并用KF(KF：5.7％)检查水含量。过滤混合物，并用ACN(2×520ml，2体积)洗涤滤饼。然后将溶液于15℃-20℃真空浓缩至1V-2V。再次用KF(KF：5.5％)检查水含量。用乙腈(390ml，1.5体积)稀释该溶液，并经0.5小时将其滴加到MTBE(2.6L，10体积)中，温度维持在15℃-20℃之间。倾出溶剂，留下粘稠的油状物，将其再溶解于乙腈(520ml，2体积)中并加入到MTBE(2.6L，10体积)中。该过程再重复四次。得到粘稠的油状物，将其最终溶解于乙腈(520ml，2体积)中并干燥，然后于15℃-20℃减压浓缩。然后于15℃-20℃用油泵蒸发除去残余溶剂。干燥后，得到335g化合物11，为浅黄色固体(QNMR：70％，两步总收率87％)。LCMS(ES,m/z):624.3[M-TfONa-2Na+3H]+1H-NMR(300MHz，甲醇-d4,ppm):δ7.97(dd,J＝7.8,2.1Hz,2H),7.84(t,J＝7.7Hz,1H),7.75(t,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.23(d,J＝7.7Hz,1H),7.11(d,J＝8.5Hz,2H),6.72(d,J＝8.5Hz,2H),3.96(s,1H),3.83-3.36(m,18H),3.03–2.62(m,6H),2.55(d,J＝14.3Hz,2H)。
制备化合物12(TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐)：
在氮气气氛下，于15℃-20℃将TCDI(68.7g，1.4当量)和乙腈(2.6L，8体积)加入到10L反应器中。经30分钟滴加化合物11(330g，Na+盐，QNMR：70％，1.0当量)的乙腈(660mL，2体积)溶液，温度维持在15℃-20℃之间。将混合物于15℃-20℃老化0.5小时。混合物的分析(样品制备：30μL体系+300μL ACN+一滴水)显示反应已经完成。用KF(KF：0.19％)检查水含量。将该体系干燥并于15℃-20℃减压浓缩。将所得残余物溶解于乙腈(945ml，2.9体积)中并用KF(KF：0.34％)测量水含量。于15℃-20℃经40分钟将乙酸异丙酯(660ml，2体积)加入到溶液中。没有观察到成核现象，并且于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加另外的乙酸异丙酯(6.6L，18体积)，导致产物12沉淀，通过过滤收集产物，为浅黄色固体。将固体溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加IPAc(6.6L，20体积)。过滤混合物，得到230g产物，为浅黄色固体(LCAP：80.99％，QNMR：59％，10％IPAc)。将湿滤饼于15℃-20℃真空干燥2小时，得到224g粗产物12，为浅黄色固体(LCAP：80.9％，QNMR：60.4％，约6％IPAc)。将粗产物12再溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加乙酸异丙酯(412ml，1.25体积)。过滤所得混合物，并收集12(30.5g，HPLC＝60.9％，测定：25.5％)。用15℃-20℃经40分钟加入的乙酸异丙酯(6.6L，20体积)稀释母液。过滤混合物，干燥滤饼，得到173.5g粗产物12，为浅黄色固体(LCAP：85.4％，QNMR：66％，3.9％IPAc，RRT1.19＝3.9％)。将190g粗产物12溶解于760mL乙腈:乙酸异丙酯(2:1)中，并使混合物通过硅胶柱(380g，2x)。用乙腈:乙酸异丙酯(2:1，5.7L)冲洗二氧化硅，然后用12L乙腈冲洗(非常少的产物)。浓缩含产物的级分，得到118g产物12，为浅黄色固体(LCAP：95％)。然后用MeCN/H2O(12L，10:1)冲洗二氧化硅垫。真空除去溶剂，得到另外的60g粗产物12，为浅黄色固体，将其溶解于乙腈(1.5L)中，搅拌30分钟，然后过滤。然后浓缩母液，得到24g粗产物12，为淡黄色固体(LCAP＝92％)。将如上制备的粗产物12(118g)和粗产物12(24g)溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃经40分钟滴加乙酸异丙酯(6.6L，20体积)。然后过滤混合物，得到133g产物12，为合适纯度的浅黄色固体(LCAP：95％，QNMR：60.8％，7.8％IPAc)。注意，化合物12需要储存在-20℃。LCMS:(ES,m/z):666.61[M-TfONa-2Na+3H]+1H-NMR:(400MHz，甲醇-d4,ppm):δ8.00(ddd,J＝13.8,7.7,1.0Hz,2H),7.84(dt,J＝20.4,7.7Hz,2H),7.58–7.49(m,2H),7.40(dd,J＝7.6,1.0Hz,1H),7.36–7.28(m,2H),7.28–7.20(m,1H),4.96(hept,J＝6.3Hz,1H),3.96–3.88(m,1H),3.83(d,J＝15.1Hz,1H),3.70–3.52(m,11H),3.55–3.39(m,4H),3.07–2.73(m,6H),2.62(dt,J＝15.1,3.6Hz,2H)。
实施例20
TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物
(在上述TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物中，结构未显示与苯基硫脲部分连接的h11b6的赖氨酸残基。)
mAb的TOPA-[C7]-苯基硫脲修饰：
将h11b6 mAb(10.2mg/ml)在10mM乙酸钠(pH 5.2)缓冲液中稀释至1mg/ml。在即将缀合之前，用碳酸氢钠缓冲液(VWR 144-55-8)将pH调节至pH 9。用pH试纸确认pH。然后，将10x摩尔过量的二钠盐TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐(溶解于水中的50mM储备液)加入到h11b6mAb，并且将抗体和TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐的混合物于室温不振摇培养大约1小时。在G224仪器上通过完整质量ESI-TOF LC-MS监测TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐的添加，直至CAR值为1.5-2.0。然后立即通过加入1M Tris pH 8.5(Teknova T1085)至100mM的最终浓度来淬灭混合物。通过使用7K/>脱盐柱将反应物脱盐到10mM乙酸钠(pH 5.2)中来除去过量的游离螯合剂。为了确认不存在过量螯合剂，使用50,000MWCOAmicon浓缩器设备进行了3轮样品稀释至15ml，然后浓缩至1ml。然后将样品浓缩至其用于放射性标记的最终浓度。通过在Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8mm×30cm，5u柱上使用以下条件的分析性尺寸排阻色谱法确认最终缀合物为单体；柱温：室温；柱用0.2M磷酸钠pH 6.8洗脱；流速：0.8mL/min；18Min运行；注射体积：18μL。
实施例21
Ac-225标记的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物
(在上述Ac-225标记的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物中，结构未显示与苯基硫脲部分连接的h11b6的赖氨酸残基。)
(i)在3MNaOAc缓冲液中用Ac-225标记TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，60μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，15μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(1.13mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.5，441μL，0.5mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA(pH 5-6)显影。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.7％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
在PD10柱上纯化：
通过使5mL×3的NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％PS-20，pH 5.5)通过柱并弃去洗涤液，在NaOAc缓冲溶液中调节PD-10树脂。将整个标记反应混合物施加到柱的贮存器上，并将洗脱液收集于预先编号的塑料管中。用0.2mL×3NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％PS-20，pH 5.5)洗涤反应小瓶，并将洗涤液移取到PD-10柱的贮存器中并收集洗脱液。每管含有约1mL洗脱液。继续向PD-10柱的贮存器中施加NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％PS-20，pH5.5)直至达到10mL的总洗脱体积。收集的级分的放射性化学纯度通过iTLC检查：将10μL每种收集的级分点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。纯级分应当在iTLC-SG的溶剂前沿没有放射性信号。
纯化的225Ac-TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的DTPA测试：
将PD-10柱后收集的10μL级分#3与15μL 10mM DTPA溶液(pH 6.5)混合，并温育30分钟。将10μL混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显影并干燥过夜。将其在BioscanAR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在iTLC-SG的溶剂前沿没有观察到放射性信号，表明级分#3中不存在游离的Ac-225。
纯化的225Ac-TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的HPLC分析：
通过HPLC分析在PD-10柱后收集的级分#3。HPLC方法：Tosoh TSKgel G3000SWxl7.8mm×30cm，5μm柱；柱温：室温；将柱用DPBS缓冲液(X1，不含钙和镁)洗脱；流速：0.7mL/min；20min运行；进样量：40μL。HPLC后，以30秒或1分钟的时间间隔收集级分。将收集的HPLC级分在室温处放置过夜。在γ计数器中对每个收集的级分中的放射性进行计数。HPLC放射迹线由每个HPLC级分中的放射性构建。HPLC放射迹线显示出对应于HPLC UV迹线上的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6峰的放射性峰。
(ii)在1.5M NaOAc缓冲液中用Ac-225标记更高浓度的TOPA-[C7]-苯基硫脲- h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的1.5M H2O溶液，63μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，10μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(9.36mg/mL的10mMNaOAc溶液，pH＝5.2，0.04％PS-20，36μL，337μg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
(iii)在1M NaOAc缓冲液中用Ac-225标记更高浓度的TOPA-[C7]-苯基硫脲- h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的1.0M H2O溶液，63μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，10μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(9.36mg/mL的10mMNaOAc溶液，pH＝5.2，0.04％PS-20，36μL，337μg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
在含0.4％tween-20的25mM NaOAc(pH 5.5)中用Ac-225标记更高浓度的TOPA- [C7]-苯基硫脲-h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的25mM H2O溶液，pH 5.5，10μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，5μL)、TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(10.4mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.2，16μL，166μg)和NaOH(0.1M，5μL)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.0。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.8％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
用Ac-225标记TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的反应条件
实施例22
进行以下一组实验以检查伴随锕源的非放射性金属污染物的存在对TOPA和DOTA螯合大环的影响。通过ICP-MS在225Ac(NO3)3的ORNL源中发现的四种最常见的污染物；Al3+、Ca2+、Zn2+、Mg2+用作与h11b6缀合的DOTA和TOPA的螯合反应中的掺加标准。用iTLC监测螯合结果，然后用DTPA测试。
在金属杂质(较低水平的杂质)的存在下用Ac-225螯合TOPA-[C7]-苯基硫脲- h11b6。
(在上述Ac-225标记的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物中，结构未显示与苯基硫脲部分连接的h11b6的赖氨酸残基。)
将Ac-225溶解于0.1M HCl中，并与AlCl3、CaCl2、ZnCl2和MgCl2混合，以形成5mCi/mL溶液。铝、钙、锌和镁的浓度分别为9.76μg/mCi、3.83μg/mCi、0.61μg/mCi和0.27μg/mCi。向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，20μL)中依次加入Ac-225(5mCi/mL，0.1N HCl，10μL，含有加入的金属杂质)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6(1.17mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.5，143μL，0.167mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶置于37℃保持2小时。
标记反应混合物的iTLC：
继而将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，并将其用10mM EDTA溶液显影。使iTLC-SG在室温处干燥过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合，Ac-225将保留在TLC的原点(基线)，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.5％的Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合(扫描1，示于图5中)。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并在10mM EDTA洗脱液中显影。使iTLC-SG经空气干燥，并将其在室温处放置过夜，然后在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6螯合的Ac-225将保留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.4％的Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合(扫描2，示于图6中)。
金属掺加实验：在金属杂质(较高水平的杂质，与较低水平的杂质相比浓度增加5 倍)的存在下用Ac-225标记TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6。
将Ac-225溶解于0.1M HCl中，并与AlCl3、CaCl2、ZnCl2和MgCl2混合，以形成5mCi/mL溶液。铝、钙、锌和镁的浓度分别为45.0μg/mCi、17.3μg/mCi、3.01μg/mCi和1.15μg/mCi。向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，20μL)中依次加入Ac-225(5mCi/mL，0.1N HCl，10μL，含有加入的金属杂质)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6(1.17mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.5，143μL，0.167mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶置于37℃保持2小时。
标记反应混合物的iTLC：
继而将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，并将其用10mM EDTA溶液显影。使iTLC-SG在室温处干燥过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合，Ac-225将保留在TLC的原点(基线)，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示98.9％的Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合(扫描3，示于图7中)。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并在10mM EDTA洗脱液中显影。使iTLC-SG经空气干燥，并将其在室温处放置过夜，然后在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6螯合的Ac-225将保留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.8％的Ac-225与TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11b6结合(扫描4，示于图8中)。
在金属杂质(较低水平的杂质)的存在下用Ac-225标记DOTA-h11b6。
将Ac-225溶解于0.1M HCl中，并与AlCl3、CaCl2、ZnCl2和MgCl2混合，以形成5mCi/mL溶液。铝、钙、锌和镁的浓度分别为9.76μg/mCi、3.83μg/mCi、0.61μg/mCi和0.27μg/mCi。向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，20μL)中依次加入Ac-225(5mCi/mL，0.1N HCl，10μL，含有加入的金属杂质)和DOTA-h11b6(10mg/mL的25mM NaOAc溶液，pH＝5.5，16.7μL，0.167mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶置于37℃保持2小时。
标记反应混合物的iTLC：
继而将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，并将其用10mM EDTA溶液显影。使iTLC-SG在室温处干燥过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，Ac-225与DOTA-h11b6结合，Ac-225将保留在TLC的原点(基线)，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示43.6％的Ac-225与DOTA-h11b6螯合(扫描5，示于图9中)。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并在10mM EDTA洗脱液中显影。使iTLC-SG经空气干燥，并将其在室温处放置过夜，然后在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，DOTA-h11b6螯合的Ac-225将保留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示18.1％的Ac-225与DOTA-h11b6螯合(扫描6，示于图10中)。
金属掺加实验：在金属杂质(较高水平的杂质，与较低水平的杂质相比浓度增加5 倍)的存在下用Ac-225标记DOTA-h11b6。
将Ac-225溶解于0.1M HCl中，并与AlCl3、CaCl2、ZnCl2和MgCl2混合，以形成5mCi/mL溶液。铝、钙、锌和镁的浓度分别为45.0μg/mCi、17.3μg/mCi、3.01μg/mCi和1.15μg/mCi。向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，20μL)中依次加入Ac-225(5mCi/mL，0.1N HCl，10μL，含有加入的金属杂质)和DOTA-h11b6(10mg/mL的25mM NaOAc溶液，pH＝5.5，16.7μL，0.167mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶置于37℃保持2小时。
标记反应混合物的iTLC：
继而将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，并将其用10mM EDTA溶液显影。使iTLC-SG在室温处干燥过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，Ac-225与DOTA-h11b6结合，Ac-225将保留在TLC的原点(基线)，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示52.7％的Ac-225与DOTA-h11b6螯合(扫描7，示于图11中)。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并在10mM EDTA洗脱液中显影。使iTLC-SG经空气干燥，并将其在室温处放置过夜，然后在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，DOTA-h11b6螯合的Ac-225将保留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示14.0％的Ac-225与DOTA-h11b6螯合(扫描8，示于图12中)。
尽管上述说明通过提供的实施例进行说明来指出了本发明的原理，但应当理解，本发明的实践涵盖以下权利要求书及其等同形式的范围内的所有一般变型形式、改变形式和/或修改形式。
在整篇本申请中，引用了多篇出版物。由此将这些出版物的公开内容以引用方式并入本申请中，以更全面描述本发明所属技术领域的现状。
序列表
<110> Janssen Biotech, Inc.
<120> 大环化合物及其使用方法
<130> JBI6417WOPCT1
<150> US 63/111933
<151> 2020-11-10
<160> 22
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照mAb HC
<400> 1
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Phe Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照mAb LC
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Asn Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr
20 25 30
Asn Gly Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) HC CDR1
<400> 3
Ser Asp Ala Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) HC CDR2
<400> 4
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) HC CDR3
<400> 5
Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) LC CDR1
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) LC CDR2
<400> 7
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) LC CDR3
<400> 8
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) HC
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PSMA mAb (PSMB127) LC
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 11
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 12
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 13
Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 14
Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe Gly Thr Ser Leu Met His
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 15
Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 CDR序列
<400> 16
Gln Gln Thr Arg Lys Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 HC可变区序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 LC可变区序列
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 HC恒定区序列
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 LC恒定区序列
<400> 20
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 21
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 HC序列
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H11B6 LC序列
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (47)

1.一种式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
2.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(II)：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
3.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(III)：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R1为-L1-R4；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中
R1为H；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐：
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R4选自由以下项组成的组：-NH2、-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪和反式环辛烯。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R4选自由以下项组成的组：环辛炔基、双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R4为DBCO或BCN。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中R4包含靶向配体，其中所述靶向配体选自由以下项组成的组：抗体、抗体的抗原结合片段、支架蛋白和适配体。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中L1选自由以下项组成的组：
其中m为0至12的整数。
11.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物选自由以下项组成的组：
其中n为1至10。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物与放射性金属离子结合形成放射性金属络合物。
13.一种式(I-M+)的放射性金属络合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
14.根据权利要求13所述的放射性金属络合物，所述放射性金属络合物具有式(II-M+)：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
15.根据权利要求13所述的放射性金属络合物，所述放射性金属络合物具有式(III-M+)：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体。
16.根据权利要求13所述的放射性金属络合物，其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为-L1-R4；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐。
17.根据权利要求13所述的放射性金属络合物，其中
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为H；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电子部分或靶向配体；
或其药学上可接受的盐。
18.根据权利要求13所述的放射性金属络合物，所述放射性金属络合物选自由以下项组成的组：
其中n为1至10；
并且M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)。
19.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含缀合到抗体或其抗原结合片段的根据权利要求9所述的化合物。
20.根据权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段经由三唑部分连接到R4。
21.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物选自由以下项组成的组：
其中：
L1不存在或为连接基；并且
mAb为抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述mAb为h11B6或PSMB-127。
23.根据权利要求21所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物选自由以下项组成的组：
以及
其中mAb为抗体或其抗原结合片段。
24.根据权利要求23所述的免疫缀合物，其中所述mAb为h11B6或PSMB-127。
25.一种放射性免疫缀合物，其中根据权利要求13所述的放射性金属络合物缀合到抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的放射性免疫缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段经由三唑部分连接到所述放射性金属络合物的R4。
27.根据权利要求25所述的放射性免疫缀合物，其中所述抗体为h11B6或PSMB-127。
28.一种放射性免疫缀合物，所述放射性免疫缀合物选自由以下项组成的组：
其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；并且
mAb为抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求28所述的放射性免疫缀合物，其中所述mAb为h11B6或PSMB-127。
30.根据权利要求28所述的放射性免疫缀合物，所述放射性免疫缀合物选自由以下项组成的组：
以及
其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；并且
mAb为抗体或其抗原结合片段。
31.根据权利要求30所述的免疫缀合物，其中所述mAb为h11B6。
32.一种制备根据权利要求25所述的放射性免疫缀合物的方法，所述方法包括：使根据权利要求19所述的免疫缀合物与放射性金属离子反应。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述靶向配体为抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体为h11B6或PSMB-127。
35.一种制备式(I-M+)的放射性免疫缀合物的方法，
其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为炔基或环炔基；
所述方法包括：
(i)使经修饰的多肽与根据权利要求1所述的化合物反应以产生免疫缀合物，其中所述经修饰的多肽是由叠氮基基团组成的抗体或其抗原结合片段；以及
(ii)使所述免疫缀合物与放射性金属离子反应以产生式(I-M+)的放射性免疫缀合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体为h11B6。
37.一种制备式(I-M+)的放射性免疫缀合物的方法，
其中：
M+为选自由以下项组成的组的放射性金属离子：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为炔基或环炔基；
所述方法包括：
(i)使经修饰的由叠氮基基团组成的抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1所述的化合物反应以产生免疫缀合物；以及
(ii)使所述免疫缀合物与放射性金属离子反应以产生式(I-M+)的放射性免疫缀合物。
38.根据权利要求25所述的方法，其中R4选自由以下项组成的组：环辛炔基、双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体为h11B6或PSMB-127。
40.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求19所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
41.一种在有需要的受试者中选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40所述的药物组合物。
42.一种治疗有需要的受试者的肿瘤性疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40所述的药物组合物。
43.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40所述的药物组合物。
44.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求25所述的放射性免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
45.一种在有需要的受试者中选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求44所述的药物组合物。
46.一种治疗有需要的受试者的肿瘤性疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求44所述的药物组合物。
47.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求44所述的药物组合物。
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