CN107278155B

CN107278155B - 放射性药物络合物

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Publication number: CN107278155B
Application number: CN201580069545.0A
Authority: CN
Inventors: A·卡斯伯特森
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: EP3233137A1; TN2017000255A1; TW201627286A; PE20171181A1; JP7160961B2; PH12017501125A1; JOP20150319B1; AU2021202665A1; US20170340759A1; CU20170082A7; JP2018506513A; WO2016096843A1; CU24493B1; CR20170256A; JP2021063108A; ECSP17038089A; CO2017005975A2; MA41176A; SG11201704917XA; NI201700076A

Abstract

本发明提供一种形成组织靶向的钍络合物的方法，所述方法包括：a)形成包含四个在N位被C₁‑C₃烷基取代的羟基吡啶酮(HOPO)部分和末端为羧酸基团的偶联部分的八齿螯合剂；b)通过至少一种酰胺偶联剂将所述八齿螯合剂偶联到至少一种包含至少一个胺部分的组织靶向的肽或蛋白质上，从而产生组织靶向的螯合剂；以及c)将所述组织靶向的螯合剂与包含至少一种发射α的钍同位素离子的水溶液接触。还提供一种治疗肿瘤性或增生性疾病的方法，其包括给予这类组织靶向的钍络合物；以及该络合物和相应的药物制剂。

Description

放射性药物络合物

技术领域

本发明涉及形成钍同位素的络合物——特别是钍-227与某些缀合至组织靶向的部分的八齿配体的络合物——的方法。本发明还涉及该络合物，并且涉及疾病——特别是肿瘤性疾病——的治疗，其包括给予这类络合物。

发明背景

在哺乳动物受试者中，特异性细胞杀伤对于成功治疗各种疾病可能是必要的。其常用实例为恶性疾病如肉瘤和癌的治疗中。然而，某些细胞类型的选择性消除还可在治疗其他疾病——特别是增生性和肿瘤性疾病——中起关键作用。

目前，选择性治疗的最常见的方法为手术、化疗和外束照射。然而，靶向放射性核素疗法是一个有前景和正在发展的领域，其具有特异性针对与疾病有关的细胞类型递送高细胞毒性辐射的潜力。目前授权用于人体中的放射性药物的最常见形式使用发射β和/或发射γ的放射性核素。然而，由于发射α的放射性核素对更特异性的细胞杀伤的潜力，人们对在治疗中使用发射α的放射性核素有一些兴趣。

在生理环境中常用的α发射体的辐射范围通常小于100微米，相当于只有几个细胞直径。这使得这些源很好地适用于治疗肿瘤，包括微转移瘤，因为它们具有到达肿瘤内的相邻细胞的范围，但是如果它们具有良好的靶向性，则很少的辐射能量将穿过靶细胞。因此，不需要靶向每个细胞，但是可将对周围健康组织的损伤最小化(参见Feinendegen et al.,Radiat Res 148:195-201(1997))。相反，β粒子在水中具有1mm以上的范围(参见Wilbur,Antibody Immunocon Radiopharm 4:85-96(1991))。

与β粒子、γ射线和X-射线携带的能量相比，α粒子辐射的能量高，通常为5-8MeV，或为β粒子的能量的5至10倍并且为γ射线的能量的20倍以上。因此，在非常短距离上的大量能量的这种沉积使α-辐射与γ和β辐射相比具有特别高的线性能量转移(LET)、高的相对生物功效(RBE)和低的氧增强比(OER)(参见Hall,"Radiobiology for the radiologist",第五版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia PA, USA,2000)。这解释了发射α的放射性核素的特殊的细胞毒性，并且还对这类同位素的生物靶向以及对发射α的放射性核素分布的控制水平和研究提出严格的要求，这是必需的，以便避免不可接受的副作用。

下述表1示出文献中广泛提出的可能具有治疗功效的α发射体的物理衰变性质。

表1

候选核素	T<sub>1/2</sub>*	对以下的临床试验
			<sup>225</sup>Ac	10.0天	白血病
<sup>211</sup>At	7.2小时	成胶质细胞瘤
			<sup>213</sup>Bi	46分钟	白血病
<sup>223</sup>Ra	11.4天	骨骼转移瘤
			<sup>224</sup>Ra	3.66天	强直性脊柱炎

*半衰期

迄今为止，关于在放射免疫治疗中的应用，主要注意力集中在²¹¹At、²¹³Bi和²²⁵Ac，并且这三种核素已在临床免疫治疗试验中探究过。

已建议的几种放射性核素的存在时间短，即半衰期小于12小时。这种短的半衰期使得难以以商业方式生产和分配基于这些放射性核素的放射性药物。给予存在时间短的核素还增加在达到靶位点前在体内发射的辐射剂量的比例。

在许多情况下，来自α发射的反冲能量将导致从母体衰变的位置释放子体核素。该反冲能量足以使许多子体核素脱离可保持母体的化学环境——例如其中母体通过配体如螯合剂络合。即使子体与相同的配体化学相容(即可通过相同的配体络合)也会发生这种情况。同样地，当子体核素为气体特别是惰性气体如氡时，或者与配体化学不相容时，该释放效应将会更大。当子体核素的半衰期大于数秒钟时，它们可扩散到血液系统中，不受保持母体的络合剂的限制。然后，这些游离的放射性子体可引起不期望的全身毒性。

几年前，提出在保持对²²³Ra子体同位素的控制的条件下使用钍 -227(T_1/2＝18.7天)(参见WO 01/60417和WO 02/05859)。这是在使用载体系统的情况下，这使得子体核素被保留在密闭环境中。在一种情况下，将放射性核素放置在脂质体内，并且脂质体的实质尺寸(与反冲距离相比)有助于保留脂质体内的子体核素。在第二种情况下，使用放射性核素的趋骨性(bone-seeking)络合物，其结合至骨基质中，从而限制子体核素的释放。这些均是潜在的非常有利的方法，但在一些情况下给予脂质体不是期望的，并且存在许多软组织疾病，其中放射性核素不能被矿化基质包围以便保留子体同位素。

最近，已确定的是，在哺乳动物体内，当²²⁷Th衰变时释放的²²³Ra 子体核素的毒性可被耐受的程度比由对可比较的核的先前测试所预测的毒性耐受程度大得多。在缺少保留上述钍-227的镭子体的具体方法的情况下，有关镭毒性的公开可用信息清楚地表明，不可能使用钍-227 作为治疗剂，因为实现来自钍-227衰变的治疗效果所需的剂量将导致来自镭子体衰变的高毒性和可能致死剂量的辐射，即没有治疗窗口期。

WO 04/091668记载了意想不到的发现，即确实存在治疗窗口期，其中可向受试者(通常为哺乳动物)给予治疗有效量的靶向钍-227放射性核素而不产生足以导致不可接受的骨髓毒性的镭-223的量。因此，这可以用于治疗和预防骨和软组织部位的所有类型的疾病。

鉴于上述发展，现在可在内放射性核素治疗中使用发射α的钍-227 核，而没有由所产生的²²³Ra引起的致死性骨髓毒性。尽管如此，治疗窗口期仍然相对狭窄，并且在所有情况下都需要给予受试者不多于绝对需要量的发射α的放射性同位素。因此，如果发射α的钍-227核络合并靶向的可靠程度高，则对这种新的治疗窗口期的有用开发将大大增强。

因为放射性核素不断地衰减，在分离和给予至受试者之间处理材料所用的时间是非常重要的。如果发射α的钍核可以以快速且方便制备的形式(优选需要很少的步骤、短温育期和/或非不可逆地影响靶向实体的性质的温度)进行络合、靶向和/或给药，则其也是相当有价值的。此外，在施用前不需要除去的溶剂中(基本上在水溶液中)可进行的方法具有避免溶剂蒸发或透析步骤的重要优点。

如果可开发钍标记的药物产品制剂，其展示出显著提高的稳定性，也将被认为是具有重要价值。确保坚持稳定的产品质量标准，同时使物流途径能够递送患者剂量是至关重要的。因此，优选在1-4天的时间内具有最小辐射分解的制剂。

含有羟基吡啶酮基团的八齿螯合剂之前已表明适用于配位α发射体钍-277，用于随后结合至靶向部分(WO2011098611)。记载了八齿螯合剂，其包含四个通过接头基团连接至基于胺的支架上的3,2-羟基吡啶酮基团，其具有用于缀合至靶向分子的单独反应基。上述发明的优选结构包含3,2-羟基吡啶酮基团，并将异硫氰酸酯部分作为优选的抗体组分的偶联化学物质，如化合物ALG-DD-NCS中所示。异硫氰酸酯广泛地用于通过胺基将标记连接至蛋白质上。异硫氰酸酯基团与蛋白质中的氨基末端和伯胺反应，并已被用于标记许多蛋白质(包括抗体)。尽管在这些缀合物中形成的硫脲键相当地稳定，但已报道由荧光性异硫氰酸酯制备的抗体缀合物随时间衰减[Banks PR,Paquette DM., Bioconjug Chem(1995)6:447-458]。通过荧光素异硫氰酸酯与胺反应形成的硫脲在碱性条件下也易于转化为胍[Dubey I,Pratviel G,Meunier BJournal:Bioconjug Chem(1998)9:627-632]。由于钍-227的衰变半衰期长(18.7天)，结合单克隆抗体的长生物半衰期，希望使用更稳定的连接部分，以便产生在体内以及储存方面化学上更加稳定的缀合物。

在WO2013/167754中公开了关于羟基吡啶酮配体缀合的最相关的早前工作，并公开了具有包含羟烷基官能度的水溶性部分的配体。由于这种螯合类型的羟基的反应性，作为活化酯的活化是不可能的，因为多个竞争反应接连发生，导致通过酯化反应产生复杂的产物混合物。因此， WO2013/167754的配体必须通过替代化学物质(例如异硫氰酸酯)与组织靶向的蛋白偶联，得到如上所述的更不稳定的硫脲缀合物。另外， WO2013167755和WO2013167756公开了羟烷基/异硫氰酸酯缀合物，其分别应用于CD33和CD22靶向的抗体。

本发明人现在已确定，在温和的条件下利用使络合物的储存和给药保持更稳定的连接部分，通过将特异性螯合剂偶联到合适的靶向部分形成组织靶向的络合物，随后加入发射α的钍离子，可快速产生络合物。

发明内容

因此，在第一方面，本发明提供一种形成组织靶向的钍络合物的方法，所述方法包括：

a)形成包含四个在N位被C₁-C₃烷基取代的羟基吡啶酮(HOPO) 部分和末端为羧酸基团(或其被保护的等价物)的偶联部分的八齿螯合剂；

b)通过至少一种酰胺偶联剂将所述八齿螯合剂偶联至至少一种包含至少一个胺部分的组织靶向的肽或蛋白质上，从而产生组织靶向螯合剂；以及

c)将所述组织靶向的螯合剂与包含至少一种发射α的钍同位素的离子的水溶液接触。

在这类络合物(以及优选地在本发明的所有方面)中，钍离子通常通过包含羟基吡啶酮的八齿配体络合，所述配体进而经由酰胺键连接至组织靶向的部分。

通常，该方法将是一种合成包含反应性羧酸官能的基于3,2-羟基吡啶酮的八齿螯合剂的方法，所述八齿螯合剂可以以活化酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯))的形式经由原位活化或通过合成和分离活化酯本身而被活化。

所得的NHS酯可用于简单缀合步骤中以制备宽范围的螯合剂修饰的蛋白质形式。另外，非常稳定的抗体缀合物容易用钍-227标记。这可在环境温度下或接近环境温度下进行，通常具有高放射化学产率和纯度。

本发明的方法优选在水溶液中进行，并且在一个实施方案中，其可在没有或基本上没有(小于1体积％)任何有机溶剂的存在下进行。

优选的靶向部分包括多克隆抗体以及特别是单克隆抗体及其片段。特异性结合片段如Fab、Fab'、F(ab')₂和单链特异性结合抗体是常用的片段。

本发明的组织靶向的络合物可配制成适用于给予人类或非人类动物受试者的药物。

因此，在第二方面，本发明提供生产药物制剂的方法，其包括形成本文中所述的组织靶向的络合物，然后添加至少一种药物载体和/或赋形剂。合适的载体和赋形剂包括本领域已知的并记载于本文中任意方面的缓冲剂、螯合剂、稳定剂和其他合适的组分。

在另一方面，本发明额外地提供组织靶向的钍络合物。这类络合物将具有本文通篇所述的特征，特别是本文所述的优选特征。所述络合物可通过本文所述的任意方法形成或可形成。因此，这类方法可产生至少一种如本文任意方面或实施方案中所述的组织靶向的钍络合物。

在仍更进一步的方面，本发明提供包含本文所述的任意络合物的药物制剂。该制剂可通过本文中所述的任意方法形成或可形成，并可包含至少一种缓冲剂、稳定剂和/或赋形剂。缓冲剂和稳定剂的选择可使它们一起有助于保护组织靶向的络合物免受辐射分解。在一个实施方案中，即使在制剂制备后数天之后，制剂中络合物的辐射分解是最小的。这是一个重要的优势，因为其解决了与产品质量和药物供应物流相关的潜在问题，所述问题是该技术的实施和实际应用的关键。

本发明已示出在制备用于生物目标的位点(例如肿瘤相关的受体) 的靶向的大量的钍标记的抗体缀合物中的实用性。

具体实施方式

在本发明的上下文中，“组织靶向的”在本文中用于表示所述物质 (特别是当以本文中所述的组织靶向的络合物的形式时)优先将自身定位(并且特别是将任何缀合的钍络合物定位)于至少一个需要其存在(例如，以递送放射性衰变)的组织位点。因此，与不具有靶向部分的等价络合物的集中相比，组织靶向的基团或部分用于在给予至该受试者后向受试者体内至少一个所需位点提供更大的定位。在本案中，将优选地选择靶向部分以特异性结合至与癌细胞相关的细胞表面受体或与肿瘤微环境相关的其他受体。

存在许多已知与增生性和肿瘤性疾病有关的靶标。这些靶标包括在病变细胞附近的细胞外基质中发现的某些受体、细胞表面蛋白、跨膜蛋白和蛋白质/肽。与肿瘤性疾病相关的细胞表面受体和抗原的实例包括 CD22、CD33、FGFR2(CD332)、PSMA、HER2、间皮素等。在一个实施方案中，组织靶向的部分(如肽或蛋白质)对至少一种选自CD22、 CD33、FGFR2(CD332)、PSMA、HER2和间皮素的抗原或受体具有特异性。

CD22，或分化簇-22，为属于SIGLEC凝集素家族(SIGLEC＝唾液酸结合的免疫球蛋白型凝集素)的分子。

CD33或Siglec-3为在骨髓系的细胞上表达的跨膜受体。

FGFR2为成纤维细胞生长因子的受体。它是在人体中的由存在于 10号染色体上的FGFR2基因编码的蛋白质。

HER2为人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)为在人体中的由FOLH1(叶酸水解酶 1)基因编码的酶。

间皮素，还称作MSLN，为在人体中的由MSLN基因编码的蛋白质。

在本案中，将选择特别优选的组织靶向结合剂以特异性结合至 CD22受体。这可例如通过对表达CD22的细胞的结合亲和力比对非表达CD22的细胞的结合亲和力高50倍以上(例如高至少100倍，优选高至少300倍)来反映。人们相信，CD22在具有某些疾病状况的细胞(如本文中所示)中表达和/或过表达，因此该CD22特异性结合剂可用于使络合物靶向至这类受疾病影响的细胞。类似地，在受疾病影响的细胞附近，组织靶向部分可结合至细胞上存在的细胞表面标志物(例如 CD22受体)。CD22细胞表面标志物可在病变细胞表面上比在健康细胞表面上更大量地表达，或者在生长或复制期间比休眠期期间在细胞表面更大量地表达。在一个实施方案中，可将CD22特异性组织靶向的结合剂与疾病特异性细胞表面标志物的另一种结合剂组合使用，从而得到双重结合络合物。CD-22的组织靶向的结合剂通常是肽或蛋白质，如本文所述。

本文中所述的本发明的多个方面涉及疾病的治疗，特别是用于选择性靶向病变组织，并且涉及适用于这类方法的络合物、缀合物、药物、制剂、试剂盒等。在所有的方面，病变组织可存在于体内的单个位点(例如局部实体肿瘤的情况下)或者可存在于多个位点(例如其中几个关节受关节炎影响的情况或者在分散式或转移性癌性疾病的情况下)。

待靶向的病变组织可位于软组织位点、位于钙化组织位点或可全部位于软组织、全部位于钙化组织或可包括至少一个软组织位点和/或至少一个钙化组织位点的多个位点。在一个实施方案中，靶向至少一个软组织位点。靶向位点和疾病的起源位点可以是相同的，但或者可不同(例如其中转移性位点被特异性靶向的情况)。当涉及多于一个位点时，其可包括起源位点或可为多个继发性位点。

本文中所用的术语“软组织”表示不具有“硬”矿化基质的组织。具体地，本文中所用的软组织可为不为骨骼组织的任何组织。相应地，本文中所用的“软组织疾病”表示发生在本文中所用的“软组织”中的疾病。本发明特别适用于治疗癌症，因此“软组织疾病”包括在任何“软” (即非矿化)组织中发生的癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌症以及这类组织的其他非癌性疾病。癌性“软组织疾病”包括软组织中出现的实体肿瘤以及转移性和微转移性肿瘤。实际上，软组织疾病可包括同一个患者中的软组织的原发性实体肿瘤和至少一种软组织的转移性肿瘤。或者，“软组织疾病”可仅由原发性肿瘤组成或仅由原发性肿瘤为骨骼疾病的转移瘤组成。在本发明的所有适当方面中，特别适于治疗和/或靶向的为血液肿瘤和特别是淋巴样细胞的肿瘤性疾病如淋巴瘤和淋巴样白血病，包括非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤的B细胞肿瘤。类似地，骨髓、脊柱(特别是脊髓)淋巴结和/或血细胞的任何肿瘤性疾病都适于本发明的所有适当方面中的治疗和/或靶向。

适于本发明的适当方面中的治疗和/或靶向的B细胞肿瘤的一些实例包括：

慢性淋巴细胞性白血病/小型淋巴细胞性淋巴癌、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤(如

巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤(例如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病)、结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤/白血病。

适于使用本发明的FGFR2靶向剂治疗的肿瘤的一些实例包括其中突变事件与肿瘤形成和发展相关的那些，包括乳腺癌、子宫内膜癌和胃癌。

适于使用本发明的CD33靶向剂治疗的骨髓衍生的肿瘤的一些实例包括急性骨髓性白血病(AML)。

适于使用本发明的前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向剂治疗的肿瘤的一些其他实例包括前列腺癌和脑癌。

适于使用本发明的人表皮生长因子受体-2(HER-2)靶向剂治疗的肿瘤的一些其他实例包括乳腺癌。

适于使用本发明的间皮素靶向剂治疗的肿瘤的一些其他实例包括恶性肿瘤如间皮瘤、卵巢癌、肺癌和胰腺癌。

抗体缀合物在储存的可接受的时间期间是稳定的，这对本发明的成功是关键的贡献。因此，非放射性抗体缀合物和最终的钍标记的药物产品的稳定性必须满足放射性药物产品制造和分配所需的严格标准。出人意料的发现是，包含组织靶向的本文所述的制剂证明了在储存时的优异的稳定性。即使在通常用于加速的稳定性研究的高温下也适用。

在一个适用于本发明的所有相容的方面的实施方案中，组织靶向的络合物可溶于合适的缓冲液中。特别地，已发现使用柠檬酸盐缓冲剂提供出人意料的稳定制剂。优选柠檬酸盐缓冲剂在1-100mM范围内(pH 4-7)，特别是在10-50mM范围内，但是最优选20-40mM的柠檬酸盐缓冲剂。

在另一个适用于本发明的所有相容的方面的实施方案中，组织靶向的络合物可溶于合适的包含对氨基丁酸(PABA)的缓冲剂中。优选的组合为柠檬酸盐缓冲剂(优选在本文中所述的浓度下)与PABA组合。用于本发明的任意方面(包括与其他试剂的组合)的PABA的优选浓度为约0.005至5mg/ml，优选0.01至1mg/ml，更优选0.01至1mg/ml。最优选0.1至0.5mg/ml的浓度。

在另一个适用于本发明的所有相容的方面的实施方案中，组织靶向的络合物可溶于合适的包含乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲剂中。优选的组合为使用EDTA与柠檬酸盐缓冲剂。特别优选的组合为在PABA存在下使用EDTA与柠檬酸盐缓冲剂。在这样的组合中，优选柠檬酸盐、 PABA和EDTA适当地以本文所示的浓度范围和优选浓度范围存在。用于本发明的任意方面(包括与其他试剂的组合)的EDTA的优选浓度为约0.02至200mM，优选0.2至20mM以及最优选0.05至8mM。

在另一个适用于本发明的所有相容的方面的实施方案中，组织靶向的络合物可溶于合适的包含至少一种聚山梨醇酯(PEG接枝的脱水山梨糖醇脂肪酸酯)的缓冲剂。优选的聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)及其混合物。聚山梨醇酯80(P80)为最优选的聚山梨醇酯。用于本发明的任意方面(包括与其他试剂的组合)的聚山梨醇酯(尤其是上文所示的优选的聚山梨醇酯)的优选浓度为约0.001至10％w/v，优选0.01至1％w/v以及最优选0.02至0.5w/v。

尽管PABA之前已被记载为放射性稳定剂(参见US4880615A)，但在本发明中，观察到PABA对储存的非放射性缀合物的积极作用。在不存在辐射分解的情况下，该稳定作用构成特别出人意料的优点，因为组织靶向的螯合剂的合成通常主要发生在与钍离子接触之前。因此，组织靶向的螯合剂可在与钍离子接触前1小时至3年内产生，并且优选在该期间的至少一部分时间内与PABA接触储存。也就是说，本发明的步骤a)和b)可在步骤c)之前1小时至3年内并且在步骤b)与步骤c)之间进行，可将组织靶向的螯合剂与PABA接触储存，特别是在缓冲剂(如柠檬酸盐缓冲剂)中，并且任选地与EDTA和/或聚山梨醇酯接触储存。所有材料优选为本文所示的类型和浓度。因此，PABA为非常优选的本发明制剂的组分，并且可引起组织靶向的螯合剂和/或组织靶向的钍络合物的长期稳定性。图1说明PABA在本发明的体系中的作用。

使用本文中所述的柠檬酸盐缓冲剂提供了另一个关于在本发明的制剂中组织靶向的钍络合物的稳定性的出人意料的优点。本发明人针对缓冲剂溶液对过氧化氢产生的影响进行了辐射研究，取得了预料不到的结果。已知过氧化氢由于水辐射分解而形成，并有助于溶液中蛋白质缀合物的化学修饰。因此，过氧化氢产生对产品的纯度和稳定性具有不理想的效果。图2示出了出人意料的观察结果：与所测试的所有其他缓冲剂相比，在柠檬酸盐缓冲剂中，用Co-60(10kGy)照射的本发明的抗体HOPO缀合物溶液中测量出更低水平的过氧化氢。因此，本发明的制剂将优选包含如本文所述的柠檬酸盐缓冲剂。

另外，本发明人证实了另一个出人意料的关于本发明制剂中某些组分的组合效果的发现。这再次涉及放射性标记的缀合物的稳定性。研究的目的为评估储存期间²²⁷Th-AGC1118缀合物的稳定性(参见下文)。在约8000Bq/μg的比活度下，使用²²⁷Th-AGC1118进行结合IRF试验。使用30或100mM柠檬酸盐缓冲剂或添加0.02、0.2或2mg/mL pABA 的30mM柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.5)制备²²⁷Th-AGC1118的五种不同的储存溶液。图3示出对本发明制剂的放射性稳定性的显著的积极作用，特别是当与本文中所示的范围的柠檬酸盐和/或PABA组合时。在上述研究中已发现柠檬酸盐是最有效的缓冲剂，出人意料地发现该作用通过添加PABA仍进一步改善。

本发明的方法、络合物和制剂的关键组分为八齿螯合剂部分。对于钍离子与羟基吡啶酮配体络合的最相关的先前工作已公布在 WO2011/098611中，并且公开了相对容易地产生与含八齿HOPO的配体络合的钍离子。

先前已知的钍的螯合剂还包括聚氨基聚酸螯合剂，其包含直链、环状或支链的聚氮杂烷基(polyazaalkane)骨架，酸基团(例如羧基烷基) 连接于骨架的氮处。这类螯合剂的实例包括DOTA衍生物如对异硫氰酸基苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA) 和DTPA衍生物如对异硫氰酸基苄基-二亚乙基三胺五乙酸 (p-SCN-Bz-DTPA)，前者为环状螯合剂，后者为线性螯合剂。

1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的衍生物先前已被例证，但是标准方法不容易用于使钍与DOTA衍生物螯合。DOTA衍生物与金属的加热有效地提供螯合物，但通常收率低。在该过程中存在至少一部分配体不可逆变性的倾向。此外，由于其对不可逆变性的相对高的易感性，通常需要避免靶向部分的附着，直至完成所有的加热步骤。这增加了在发射α的钍同位素的衰变寿命期间必须进行的额外的化学步骤 (具有所有必要的后处理和分离)。显然，优选不以这种方式处理发射α的材料，或者不以比必要更大的程度产生相应的废物。此外，制备缀合物所花费的所有时间浪费一部分钍，其在该制备期间将会衰变。

在所有方面中，本发明的关键方面是使用八齿配体，特别是包含四个HOPO部分的八齿含羟基吡啶酮的配体。这类配体通常包含至少四个螯合基团，其各自独立地具有以下取代的吡啶结构(I)：

其中R¹为烷基如C₁至C₅直链或支链的烷基基团，包括甲基、乙基、正丙基或异丙基和正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。优选的R¹为C₁至C₃，尤其是甲基。在一个优选的实施方案中，甲基取代基存在于式(I)的所有四个部分的氮上。

本文中所述的烷基通常为直链或支链的C₁至C₈烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或仲丁基等。

在某些先前的公开内容，例如WO2013/167756、WO2013/167755 和WO2013/167754中，对应于R¹的基团主要是增溶性基团如羟基或羟烷基(例如-CH₂OH、-CH₂-CH₂OH、-CH₂-CH₂-CH₂OH等)。这在更高的溶解性方面具有一定的优势，但是由于R¹位上的反应性，这类螯合剂难以使用酰胺键连接至靶向部分。因此，在本发明中，R¹通常不为羟基或羟烷基。

在式(I)中，基团R²至R⁶可各自独立地选自H、OH、＝O、偶联部分和接头部分。优选地，基团R²至R⁶中正好有一个为＝O，并且基团 R²至R⁶中正好有一个为OH。基团R²至R⁶中剩余的三个可为H，但 R²至R⁶中至少一个为接头部分和/或偶联部分。偶联部分在下文中描述，但其末端为羧酸用于通过酰胺键与靶向部分连接。这类偶联部分可直接连接至在基团R²至R⁶之一处的环上，但更优选连接至接头部分，其自身将构成基团R²至R⁶之一。

N-取代的3,2-HOPO部分非常优选作为本发明的HOPO基团，并且在一个实施方案中，八齿配体的所有四个络合部分可为3,2-HOPO部分。

合适的螯合部分可通过本领域已知的方法形成，包括记载于US 5,624,901(例如实施例1和2)和WO2008/063721(二者均以引用的方式纳入本申请中)中的方法。

优选的螯合基团包括以下式(II)的那些：

在上述式(II)中，＝O部分代表连接至吡啶环的任意碳上的氧代基团， -OH代表连接至吡啶环的任意碳上的羟基部分以及-R_L代表将羟基吡啶酮部分连接至其他络合部分以形成整个八齿配体的接头部分。本文中所述的任意接头部分适合作为R_L，包括短烃基如C₁至C₈烃基，包括C₁至C₈烷基、烯基或炔基，包括所有拓扑结构的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和/或己基。R_L可在吡啶环的任意碳处连接至式(II)的环。然后 R_L基团可直接键合至另一个螯合部分、另一个接头基团和/或中心原子或基团如环或其他模板(如本文中所述)。选择接头、螯合部分和任选的模板部分以形成合适的八齿配体。

R_c代表偶联部分，如下文所述。合适的部分包括末端为羧酸基团的烃基如烷基或烯基。本发明人已确定，例如通过本发明的方法，使用羧酸连接部分来形成酰胺可在螯合剂和组织靶向的部分之间提供更稳定的缀合。

在一个优选的实施方案中，式II的-OH和＝O部分位于吡啶环的相邻原子上，因此2,3-、3,2-、4,3-和3,4-羟基吡啶酮衍生物全部为非常合适的。基团R_N为甲基取代基。

在一个优选的实施方案中，四个3,2-羟基吡啶酮部分存在于八齿配体结构中。

更优选的螯合基团为式(IIa)的那些：

如本文所用的，术语“接头部分”(式(II)和式(IIa)中的R_L)用于表示用于连接八齿配体中的至少两个螯合基团的化学实体，所述八齿配体在本发明的各个方面形成关键组分。接头部分还可连接至用于将八齿配体部分偶联至组织靶向的部分的偶联部分。通常，每个螯合基团(例如上述式(I)和/或(II)和/或(IIa)的那些)将为双齿的，因此四个HOPO 螯合基团通常将存在于配体中。这类螯合基团通过它们的接头部分彼此连接，并通过偶联部分偶联至组织靶向的部分(在本发明的方法中)。因此，接头部分(例如式(II)的基团R_L)可在大于一个的式(I)和/或(II) 螯合基团之间共享。接头部分还可用作八齿配体的络合部分和靶向部分之间的连接点。在这种情况下，至少一个接头部分将连接至偶联部分(式(II)中的R_C)。合适的接头部分包括短烃基如C₁至C₁₂烃基，包括C₁至C₁₂烷基、烯基或炔基，包括所有拓扑结构的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和/或己基。可包含在接头部分(R_L)中的其他基团包括任何合适的稳定的官能团如芳基(例如苯基)、酰胺、胺(尤其是仲胺或叔胺)和/或醚。R_C部分还可包含烷基和/或芳基片段和任选的基团如胺、酰胺和醚键。通常，偶联部分的所有组分将需要在络合物将要经受的储存条件下稳定。这包括α-辐射分解，因此不优选不稳定的官能团。

在一个实施方案中，偶联部分包含末端的羧酸、至少一个烷基部分 (例如甲基或乙基部分)、至少一个酰胺和至少一个芳基部分(例如苯基)。偶联部分可通过碳-碳键、酰胺、胺和/或醚键连接至八齿配体的一个或多个接头部分。

在本发明的最优选的实施方案中，将八齿配体连接至靶向部分的偶联部分(R_C)选自

[-CH₂-Ph-N(H)-C(＝O)-CH₂-CH₂-C(＝O)OH],

[-CH₂-CH₂-N(H)-C(＝O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(＝O)OH]或

[-[CH₂]_1-3-Ar-N(H)-C(＝O)-[CH₂]_1-5-C(＝O)OH]，其中Ar为芳族基团如取代或未取代的亚苯基，并且Ph为亚苯基，优选对亚苯基。

接头部分可为或包含任何其他合适的稳定化学键，包括酯、醚、胺和/或酰胺基。通常限制连接两个螯合部分的原子总数(如果存在多于一条路径，则通过最短路径计数)，以便将螯合部分限制在对于络合物形成合适的排列中。因此，通常选择接头部分以在螯合部分之间提供不超过15个原子，优选在螯合部分之间提供1至12个原子，更优选1至 10个原子。当接头部分直接连接两个螯合部分时，接头的长度通常为1 至12个原子，优选2至10个(如乙基、丙基、正丁基等)。当接头部分连接至中心模板(参见下文)时，则每个接头可更短，两个单独的接头连接螯合部分。在本案中，优选接头长度为1至8个原子，优选1至 6个原子(甲基、乙基和丙基是合适的，以及基团如在一端或两端具有酯、醚或酰胺键的那些)。

除了主要用于将八齿配体的各种螯合基团彼此连接和/或与中心模板连接的接头部分之外，八齿配体还包含具有末端羧酸的偶联部分(R_C)。偶联部分的功能为通过稳定的共价键——尤其是酰胺——将八齿配体连接至靶向部分。优选地，偶联部分将通过直接共价连接至螯合基团中的一个或者更经常地通过连接至接头部分或模板而共价连接至螯合基团。如果使用两个以上的偶联部分，则每个偶联部分可连接至任意可用位点，如任意模板、接头或螯合基团上的任意可用位点。

在一个实施方案中，偶联部分可具有以下结构：

其中R⁷为桥接部分，其为选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基的成员；X为通过酰胺或羧酸或等价官能团连接的靶向部分。优选的桥接部分包括所有的本文所示的作为合适的接头部分的那些基团。

优选的靶向部分包括所有的本文中所述的那些。并且优选的反应性 X基团包括能够在与靶向部分形成酰胺共价键中作为“羧酸”作用的任何基团，包括例如-COOH、-SH、-NHR和基团，其中NHR的R可为 H或本文所述的任何短烃基。连接至靶向部分上的非常优选的基团包括赖氨酸残基的ε-胺。合适的反应性X基团的非限制性实例包括N-羟基琥珀酰亚胺基酯、酰亚氨基酯、酰卤、N-马来酰亚胺和α-卤代乙酰基。

在本发明的一个优选的实施方案中，选择桥接部分R⁷为取代的芳基，并且选择将八齿配体连接至靶向部分的偶联部分(R_C)为 [–C(＝O)-CH₂CH₂-X-]，由此HOPO配体上的游离羧酸酯基团在与靶向部分缀合之前立即在水溶液中以N-羟基琥珀酰亚胺酯的形式原位活化。

偶联部分优选连接，使得所得的偶联八齿配体将能够形成稳定的金属离子络合物。因此，偶联部分将优选在不显著干扰络合的位点处连接至接头、模板或螯合部分。这类位点将优选在接头或模板上，更优选在远离与靶标结合的表面的位置处。

在八齿配体中式(I)或(II)或(IIa)的每个部分可通过本文中所述的任何合适的接头基团和以合适的拓扑结构连接至配体的其余部分。例如，四个式(I)或(II)或(IIa)的基团通过其接头基团连接至骨架上以形成线性配体，或者可通过接头基团桥接以形成“低聚物”型结构(其为线性或环状)。或者，式(I)和/或(II)和/或(IIa)的配体部分可以各自通过接头(例如“R_L”部分)以“交叉”或“星形”形态连接至中心原子或基团。接头(R_L)部分可单独通过碳-碳键连接；或可通过任何适当稳定的官能(包括胺、酰胺、醚或硫醚键)彼此连接，连接至其他螯合基团，连接至骨架、模板、偶联部分或其他接头上。

“星形”排列以下文式(III)表示：

其中所有基团和位置如上所示，另外，“T”为中心原子或模板基团，如碳原子、烃基链(例如本文中上述任何那些)、脂族环或芳族环 (包括杂环)或稠环体系。最基本的模板为单个碳，其会随后通过其连接基团连接于每个螯合部分。较长的链如乙基或丙基是同样可行的，其中两个螯合部分连接至模板的各端。显然，任何适合的稳定键可用于连接模板和接头部分，所述稳定键包括碳-碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。

显然，在式(II)、(III)、(IV)和(IVb)的结构中，原本未(例如通过接头或偶联部分)取代的吡啶环的那些位置可——如果合适——带有式 (I)中R¹至R⁵所述的取代基。特别地，小的烷基取代基(例如甲基、乙基或丙基)可存在于任何位置。

八齿配体将额外地包含至少一个如上所述的偶联部分。这可为包括本文所示的任意那些的任何合适的结构，并在本发明的方法中的最终络合物或羧酸中以靶向部分封端。

偶联部分可连接于接头、模板或螯合部分的任何合适的位点，例如式(III)中所示的a、b和/或c位点。偶联部分的连接可通过任何合适的稳定的键，例如碳-碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。类似地，能够与靶向部分形成任何这种键的基团适用于偶联部分的官能末端，并且该部分当连接至靶向部分时将以这类基团封端。

一种替代的“骨架”型结构示于以下式(VI)中

其中所有基团和位置如上述所示，并且另外“R_B”为骨架部分，其通常与本文中所示的任何接头部分具有相似的结构和功能，因此可将接头部分的任何定义应用于上下文允许的骨架部分。合适的骨架部分将形成支架，其中螯合部分通过其接头基团连接至该支架上。通常需要三个或四个骨架部分。通常，对于线性骨架，其为三个，如果骨架被环化，则为四个。特别优选的骨架部分包括在一端或两端任选地具有杂原子或官能部分的短烃链(例如本文中所述的那些)。在此方面，胺和酰胺基特别适合。

偶联部分可连接于接头、骨架或螯合部分的任何合适的位点，例如式(IV)中所示的a、b和/或c'位点。偶联部分的连接可通过任何合适的稳定的键，例如碳-碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。类似地，能够与靶向部分形成任何这种键的基团适用于偶联部分的官能末端，并且该部分当连接至靶向部分时将以这类基团封端。

具有通过酰胺接头基团连接至骨架上的四个3,2-HOPO螯合部分的“骨架”型八齿配体的实例为以下式(V)：

显然，偶联部分R_C可在该分子上的任何合适的位点加入，例如在一个仲胺基团处或在任何骨架烷基上的支化点处加入。基团R_C的优选的位点示于式(V)中。在本发明的合适的方面，R_C以羧酸为末端，或通过酰胺键连接至组织靶向的部分。所有小的烷基基团如骨架亚丙基或 n-取代的亚乙基可被其他小的亚烷基如任何本文中所述的任意的那些 (其中，亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基是非常适合的)取代。

各自具有通过乙酰胺基团分别连接至乙二胺和丙二胺的四个 3,2-HOPO螯合部分的示例性“模板化”八齿配体为以下式(VI)：

显然，作为亚乙基部分示于式(VI)的任何亚烷基基团可独立地被其他小的亚烷基基团如亚甲基、亚丙基和正亚丁基取代。有利的是，保留了对称性，因此优选中心亚丙基C₃链而其余的亚乙基保留，或者将 HOPO部分连接至一个或两个中心叔胺上的两个亚乙基可被亚甲基或亚丙基代替。

式(VIb)示出偶联部分R_C的可能位点，所述R_C将在任何合适的位置存在于式(VI)中，例如-CH-基团。

如上所示，八齿配体将通常包括可在任何位点连接至配体的其余部分的偶联部分。偶联部分连接的合适的位点示于以下式(VIb)中：

其中R_C为任何合适的偶联部分，特别是用于经由胺基连接至组织靶向的基团的偶联部分。用于与组织靶向的部分形成酰胺的末端为酸或等价的活性基团的短烃基如C₁至C₈环状、支链或直链的芳族或脂族基团非常适合作为式(VIb)和全文中的基团R_C。

示例性的模板还包括其中偶联基团R_C共价连接至氨基骨架中的氮原子上的其他模板，如式(VII)所示。

示出配体连接的合适的位点的非常优选的八齿配体包括以下式 (VIII)和(IX)的那些：

化合物(VIII)的合成在下文中描述并遵循下文所述的合成路线。

AGC0019和式(VI)、(VIb)、(VII)、(VIII)和(IX)的化合物形成具有末端为羧酸基团的接头部分的优选的八齿螯合剂。在那些结构中所示的八齿配体和所示的接头部分还形成他们的类型的优选实例并可以任何组合来组合。这类组合对技术人员是显而易见的。

本发明的方法的步骤a)可通过任何合适的合成路线进行。其通常包括通过连接基团将四个HOPO部分(如式(I)和/或(II)和/或(IIa)的那些) 连接至偶联部分，任选地通过模板进行。所有的这些基团在本文中描述，并且优选的实施方案在该上下文中同样是优选的。HOPO部分、接头、偶联部分和任选的模板之间的偶联通常利用稳定基团如酰胺、胺、醚或碳-碳键。合成这类键的方法和任何必需的保护策略在合成化学领域中是熟知的。合成方法的一些具体的实例在下文的以下的实施例中给出。这类方法提供具体的实例，但是其中所示的合成方法也可被本领域技术人员在一般背景下使用。因此，实施例中所示的方法还旨在作为一般性公开内容，适用于上下文允许的本发明的所有方面和实施方案。

优选地，在本发明的所有方面中，发射α的钍和八齿配体的络合物无需加热至60℃以上(例如无需加热至50℃以上)，优选无需加热至 38℃以上并最优选无需加热至25℃以上(例如在20至38℃的范围内) 而形成或可形成。常用的范围可为，例如15至50℃或20至40℃。本发明的方法中的络合反应(部分c))可进行持续任何合理的时间段，但其优选为1-120分钟，优选为1-60分钟，更优选为5-30分钟。

另外优选的是，制备靶向部分和八齿配体的缀合物之后添加发射α的钍同位素(例如²²⁷Th⁴⁺离子)。因此，优选通过利用八齿配体与组织靶向的部分的缀合物(组织靶向的螯合剂)络合发射α的钍同位素(例如²²⁷Th⁴⁺离子)而形成或可形成本发明的产物。

不同类型的靶向化合物可经由八齿螯合剂(包括本文中所述的偶联部分)连接至钍(例如钍-227)。靶向部分可选自已知的靶向基团，其包括单克隆抗体或多克隆抗体、生长因子、肽、激素和激素类似物、叶酸衍生物、生物素、抗生物素蛋白和链霉亲和素或其类似物。其他可能的靶向基团包括合适的官能化的RNA、DNA或其片段(例如适体)、低聚核苷酸、碳水化合物、脂质或通过将这些基团与或不与蛋白质组合而制备的化合物等。如上所述，可包括PEG部分，由此以增加生物保留时间和/或减少免疫刺激。

通常，如本文中所用的，组织靶向的部分为“肽”或“蛋白质”，其为主要由氨基酸组分之间的酰胺骨架形成的结构，具有或不具有二级和三级结构特征。

在一个实施方案中，组织靶向部分可排除趋骨物质、脂质体和叶酸缀合的抗体或抗体片段。

根据本发明，²²⁷Th可通过将由酰胺键连接或可连接的络合剂靶向至本文所述的组织靶向的部分来进行络合。通常，靶向部分的分子量为 100g/mol至数百万g/mol(特别是100g/mol至100万g/mol)，并且优选对疾病相关的受体直接具有亲和性，和/或包含适合的预给予的结合剂(例如生物素或抗生物素蛋白)，该结合剂在给予²²⁷Th之前结合至已靶向至疾病的分子。合适的靶向部分包括多肽或低聚肽、蛋白质、 DNA和RNA片段、适体等，优选蛋白质，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、多克隆抗体或单克隆抗体(包括IgG和IgM型抗体)，或蛋白质或蛋白质的片段或构建体的混合物。特别优选抗体、抗体构建体、抗体片段(例如Fab片段或包含至少一个抗原结合区域的任何片段)、片段构建体(例如单链抗体)或其混合物。合适的片段特别包括Fab、 F(ab')₂、Fab'和/或scFv。抗体构建体可为本文中所示的任何抗体或片段。

在适用于本发明的所有方面的第一靶向实施方案中，可选择特异性结合剂(组织靶向的部分)来靶向CD22受体。这类组织靶向的部分可为与以下所列的至少一个序列具有序列相似性或同一性的肽：

轻链：

重链：

在上述序列中，人源化(H'ised)序列中“-”表示从鼠序列中未改变的残基。

在上述序列(SeqID1-5)中，粗体区域被认为是关键的特异性结合区域(CDR)，下划线区域被认为在结合中是次级重要的，并且未强调的区域被认为代表结构性区域而不是特异性结合区域。

在本发明的所有方面中，组织靶向的部分可具有与SeqID1-5中所列的那些序列中的至少一个或任何一个具有基本的序列同一性或基本的序列相似性的序列。基本的序列同一性/相似性被认为是具有与完整序列至少80％和/或与特异性结合区(上述序列中粗体显示的那些区域以及任选地加下划线的那些部分)至少90％的序列相似性/同一性。对于粗体区域以及还更优选地对于全序列，优选的序列相似性或更优选的同一性可为至少92％、95％、97％、98％或99％。序列相似性和/或同一性可使用来自威斯康星大学的GeneticsComputer Group Version 10 软件包的“BestFit”程序来确定。该程序使用具有以下默认值的Smith 和Waterman的本地算法：空位产生罚分＝8，空位延伸罚分＝2，平均匹配＝2.912，平均错配2.003。

组织靶向的部分可包含多于一个肽序列，其中至少一个序列并且优选所有的序列可(独立地)符合与SeqID1-5中任一个的上述序列相似性和优选的序列同一性。

组织靶向的部分可对于CD22具有结合亲和性，并且在一个实施方案中，其还可相对于完整结构域具有最多达约40个变异(优选0至30 个变异)的序列。变体可通过插入、缺失和/或置换形成，并且可相对于SeqID1-5而言为连续或不连续的。置换或插入通常通过遗传密码的 20个氨基酸中的至少一个进行，并且置换最通常为保守置换。

在适用于本发明的所有方面的第二靶向实施方案中，可选择特异性结合剂(组织靶向的部分)来靶向CD33受体。这类组织靶向的部分可为单克隆抗体，并且可选择其为林妥珠单抗(lintuzumab)或在C末端具有额外赖氨酸残基的林妥珠单抗。

在适用于本发明的所有方面的第三靶向实施方案中，可选择特异性结合剂(组织靶向的部分)来靶向HER-2抗原。该组织靶向的部分可为单克隆抗体以及优选为曲妥珠单抗(trastuzumab)。

用于靶向FGFR2、间皮素和PSMA的其他合适的抗体序列示例于实施例部分。然而，对于本领域技术人员来说应该显而易见的是，在序列中包含赖氨酸残基的已知靶向疾病特异性靶标的任何蛋白质形式将为本发明方法的备选物，并且相应地适用于所有其他方面。

对于发射α的钍组分而言，最近的关键发现是，某些α放射性钍同位素(例如²²⁷Th)可以以治疗有效并且不会产生无法耐受的骨髓毒性的量给药。在本发明的所有方面中，钍-227(²²⁷Th)为优选的钍同位素。如本文中所用的，术语“可接受的非骨髓毒性”用于表示，最重要的是，通过给予的钍-227放射性同位素的衰变产生的镭-223的量通常不足以使受试者直接致死。然而，对于技术人员显而易见的是，骨髓损伤量(和致死反应的可能性)——其为这种治疗的可接受的副作用——将随待治疗疾病的类型、治疗方案的目标和受试者的预后而显著变化。尽管本发明的优选的受试者为人类，但其他哺乳动物，特别是伴侣动物如狗，将受益于本发明的使用，并且可接受的骨髓损伤的水平也可反映受试者的物种。可接受的骨髓损伤的水平通常在治疗恶性疾病中比在治疗非恶性疾病中更大。一个众所周知的骨髓毒性水平的量度为嗜中性粒细胞计数，并且在本发明中，²²³Ra的可接受的非骨髓毒性的量通常是受控的量，使得在其最低点处(最低点)的嗜中性粒细胞分数不低于治疗前计数的10％。优选地，²²³Ra的可接受的非骨髓毒性的量为使得嗜中性粒细胞分数在最低点为至少20％以及更优选至少30％的量。最优选至少40％的最低点嗜中性粒细胞分数。

另外，包含放射性钍(例如²²⁷Th)的化合物可用于高剂量方案，其中当包括干细胞支持或相当的恢复方法时，所产生的镭(例如²²³Ra) 的骨髓毒性通常是不可耐受的。在这类情况下，嗜中性粒细胞计数在最低点时降低至低于10％，并且特别地将降低至5％或如果需要低于5％，条件是采取适当的预防措施并随后给予干细胞支持。这些技术在本领域内是熟知的。

本发明中特别感兴趣的钍同位素为钍-227，并且钍-227为在上下文允许的情况下本文所有提及的钍的优选的同位素。钍-227相对容易生产，并且可间接由受中子照射的²²⁶Ra来制备，其将包含²²⁷Th的母核，即²²⁷Ac(T_1/2＝22年)。锕-227可非常容易地与²²⁶Ra靶标分离，并被用作²²⁷Th的发生器(generator)。如果需要，该方法可放大至工业规模，因此可避免被考虑作为分子靶向的放射治疗的备选物的大多数其他α发射体中出现的供应问题。

钍-227经由镭-223衰变。在这种情况下，初级子体的半衰期为11.4 天。由纯的²²⁷Th源，在最初几天仅产生中等量的镭。然而，²²³Ra的潜在毒性高于²²⁷Th的潜在毒性，因为在来自α粒子的²²³Ra的发射后几分钟之内就是来自短寿命子体的三种其他α粒子(参见以下表2，其中列出了钍-227的衰变系列)。

表2

部分由于它产生潜在有害的衰变产物，钍-227(T_1/2＝18.7天)尚未被广泛考虑用于α粒子治疗。

为了区分最丰富的天然存在的钍同位素(即钍-232(半衰期为1010 年，并为有效非放射性))的钍络合物，应理解，本文所要求保护的钍络合物及其组合物包括大于天然相对丰度(例如至少大20％)的发射α的钍放射性同位素(即半衰期小于103年的钍的至少一种同位素，例如钍-227)。该需求不影响本发明方法的定义，其中明确要求治疗有效量的放射性钍如钍-227，但优选在所有方面都是这种情况。

在本方面的所有方面中，优选发射α的钍离子为钍-227的离子。钍的4+离子为用于本发明的络合物的优选离子。相应地，非常优选钍-227 的4+离子。

钍-227以足以提供所需的治疗效果而不产生如此多的镭-223以引起不可耐受的骨髓抑制的量给予。期望在靶向区域中维持子体同位素以便由其衰变获得进一步的治疗效果。然而，不需要维持钍衰变产物的控制以便具有有用的治疗效果而不引起不可接受的骨髓毒性。

假设肿瘤细胞杀死效果主要来自钍-227而不是来自其子体，则该同位素的可能的治疗剂量可通过与其他α发射体比较来确定。例如，对于砹-211，在动物中的治疗剂量通常为2-10MBq/kg。通过校正半衰期和能量，钍-227的相应剂量为至少36-200kBq/kg体重。这将对²²⁷Th的量设定下限，该下限可被有效地给予，期望取得治疗效果。该计算假定砹和钍的保留量相当。然而显然地，钍的18.7天半衰期在其衰变前最有可能导致该同位素更大的消除。因此，该计算的剂量通常应当认为是最小的有效量。以完全保留的²²⁷Th(即未从体内消除的²²⁷Th)表示的治疗剂量通常为至少18或25kBq/kg，优选至少36kBq/kg以及更优选至少75kBq/kg，例如100kBq/kg或更大。预计更大量的钍将具有更大的治疗效果，但如果产生不可耐受的副作用，则不能给予。同样地，如果以具有短的生物半衰期(即从仍然携带钍的身体消除之前的半衰期) 的形式来给予钍，则需要更大量的放射性同位素以实现治疗效果，因为大量钍在其衰变前将被消除。然而，所产生的镭-223的量将相应减少。当同位素完全保留时，待给予的钍-227的上述量可容易地与具有更短生物半衰期的相等的剂量相关。这类计算是本领域熟知的，并且在WO 04/091668中(例如在实施例1和2中)给出。

如果放射性标记的化合物释放子体核素，则知晓任何放射性子体核素的最终结果(如果适用)是重要的。对于²²⁷Th，主要的子体产物为²²³Ra，由于其趋骨特性，其在临床评价中。镭-223非常快速地清除血液，并且富集于骨骼中或通过肠和肾的途径排出(参见Larsen,J Nucl Med 43(5,Supplement):160P(2002))。因此，由²²⁷Th在体内释放的镭-223不会在很大程度上影响健康的软组织。在Müller的Int.J.Radiat. Biol.20:233-243(1971)中关于作为溶解的柠檬酸盐的²²⁷Th的分布的研究中，发现在软组织中由²²⁷Th产生的²²³Ra容易地重新分布于骨骼或排泄出。因此，发射α的镭的已知毒性，特别是对骨髓的已知毒性，为钍剂量的问题。

在WO 04/091668中首次确认，事实上，在人类受试者中可给予并耐受至少200kBq/kg的²²³Ra的剂量。这些数据在该出版物中提供。因此，目前可看出，非常出乎意料的是，确实存在治疗窗口期，其中可将治疗有效量的²²⁷Th(例如大于36kBq/kg)给予哺乳动物受试者，而不期望这类受试者遭受严重或甚至致死的骨髓毒性的不可接受的风险。尽管如此，最好地使用该治疗窗口期是极其重要，因此必要的是放射性钍快速且有效地络合并以非常高的亲和力保持，以使剂量的最大可能比例被递送至靶向位点。

由²²⁷Th药物产生的²²³Ra的量将取决于放射性标记的化合物的生物半衰期。理想的情况为使用具有快速肿瘤吸收的络合物，包括内化至肿瘤细胞内、强的肿瘤保留和在正常组织中的短的生物半衰期。然而，只要²²³Ra的剂量维持在可耐受水平内，则具有低于理想的生物半衰期的络合物可为有用的。体内产生的镭-223的量将为给予的钍的量和钍络合物的生物保留时间的因素。在任何特定情况下，产生的镭-223的量可由普通技术人员容易地计算。²²⁷Th的最大的给药量将由体内产生的镭的量确定，且必须低于将产生不可耐受水平的副作用尤其是骨髓毒性的量。该量通常将低于300kBq/kg，特别是低于200kBq/kg且更优选低于170kBq/kg(例如低于130kBq/kg)。最小有效剂量将通过钍的细胞毒性、病变组织对产生的α照射的易感性和钍通过靶向络合物(在本案中为配体与靶向部分的组合)有效组合、保留和递送的程度来确定。

在本发明的方法中，钍络合物以18至400kBq/kg体重的钍-227剂量来理想地给予，优选36至200kBq/kg(比如50至200kBq/kg)，更优选75至170kBq/kg，尤其是100至130kBq/kg。相应地，单个剂量直到可包括在约乘以合适的体重(如30至150Kg，优选40至100Kg) 的这些范围中的任何范围(例如每剂量的范围为540kBq至4000KBq 等)。另外，钍的剂量、络合剂以及给药途径将理想地使得在体内生成的镭-223的剂量低于300kBq/kg，更优选低于200kBq/kg，仍更优选低于150kBq/kg，尤其是低于100kBq/kg。再次，这将提供通过用所示的任何体重乘以这些范围来表示的对²²³Ra的暴露量。上述剂量水平优选为²²⁷Th的完全保留剂量，但考虑到一些²²⁷Th将在衰变前从体内清除，其也可为给药剂量。

与物理半衰期相比，²²⁷Th络合物的生物半衰期短(例如低于7天，尤其是低于3天)，需要显著更大的给药剂量以提供等效保留剂量。因此，例如，150kBq/kg的完全保留剂量相当于以711kBq/kg的剂量给予的半衰期为5天的络合物。使用本技术领域熟知的方法，可由络合物的生物清除率计算任何适合的保留剂量的等效给药剂量。

由于一个²²⁷Th核衰变提供一个²²³Ra原子，²²⁷Th的保留和治疗活性将与患者所经受的²²³Ra剂量直接相关。在任何特殊的情况下产生的²²³Ra的量可使用熟知的方法计算。

在一个优选的实施方案中，本发明因此提供了治疗哺乳动物受试者 (如本文中所述)中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的如本文中所述的至少一种组织靶向的钍络合物。

显然需要使受试者对²²³Ra子体同位素的暴露最小化，除非²²³Ra 子体同位素的性质被有效利用。具体地，在体内产生的镭-223的量通常将高于40kBq/kg，例如高于60kBq/Kg。在某些情况下，体内产生的²²³Ra必需高于80kBq/kg，例如高于100或115kBq/kg。

在适当载体溶液中的钍-227标记的络合物可通过静脉内、腔内(例如腹膜内)、皮下、经口或局部给药，作为单次应用或以分次应用方案给予。优选地，缀合至靶向部分的络合物将作为溶液通过胃肠外(例如经皮)途径给药，尤其是通过静脉内或腔内途径给药。优选地，本发明的组合物将配制成用于胃肠外给药的无菌溶液。

本发明的方法和产物中的钍-227可单独使用或与其他治疗形式组合使用，所述其他治疗形式包括外科手术、外束放射治疗、化疗、其他放射性核素或者组织温度调节等。这形成了本发明方法的进一步优选的实施方案，并且制剂/药物可相应地包含至少一种额外的治疗活性剂如另一种放射性试剂或化疗剂。

在一个特别优选的实施方案中，受试者还进行了干细胞治疗和/或其他支持疗法以降低镭-223诱导的骨髓毒性效应。

本发明的钍(例如钍-227)标记的分子可用于通过靶向疾病相关受体来治疗癌性或非癌性疾病。通常，²²⁷Th的这样的医疗用途将通过基于通过螯合剂将²²⁷Th连接于抗体、抗体片段或者抗体构建体或抗体片段构建体的放射免疫疗法用于治疗癌性或非癌性疾病。在根据本发明的方法和药物中²²⁷Th的用途特别适于治疗任何形式的癌症，包括癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病，尤其是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、口腔癌、结直肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。

在本发明的另一个实施方案中，同时患有软组织和骨骼疾病的患者可通过给予钍而利用²²⁷Th和在体内生成的²²³Ra进行治疗。在该特别有利的方面，治疗的额外的治疗性组分来源于通过靶向骨骼疾病的可接受的非骨髓毒性量的²²³Ra。在该治疗方法中，²²⁷Th通常通过其适当的靶向用于治疗软组织的原发性和/或转移性癌症，并且由²²⁷Th衰变所产生的²²³Ra用于治疗同一患者的相关的骨骼疾病。该骨骼疾病可为由原发性软组织癌症导致其向骨骼的转移瘤，或可为原发性疾病，其中软组织治疗为对抗转移性癌症。有时，软组织和骨骼疾病可不相关(例如，额外治疗具有风湿性软组织疾病的患者的骨骼疾病)。

在本发明的方法、用途和其他方面中特别适于治疗的病况包括肿瘤性和增生性疾病，例如癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，其包括非霍奇金淋巴瘤或B细胞肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、急性骨髓性白血病、前列腺癌或脑癌、间皮瘤、卵巢癌、肺癌或胰腺癌。

下文提供一些示例合成。这些合成中所示的步骤将适用于本发明的许多实施方案。例如，在本文所述的许多或所有实施方案中步骤a)可通过下文所示的中间体AGC0021进行。

合成AGC0020关键中间体

N,N,N',N'-四(2-氨基乙基)-2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二胺

a)丙二酸二甲酯，氢化钠，THF；b)DIBAL-H，THF；c)MsCl,NEt₃,CH₂Cl₂；

d)咪唑，Boc2O,CH₂Cl₂,甲苯；e)DIPEA,乙腈；f)MeOH,水,AcCl

合成AGC0021关键中间体

3-(苄氧基)-1-甲基-4-[(2-硫代-1,3-噻唑烷-3-基)羰基]吡啶-2(1H)-酮

a)草酸二乙酯，乙醇钾，甲苯，EtOH；b)Pd/C，对二甲苯；c)Mel，K₂CO₃，DMSO，丙酮；

d)i)BBr₃，DCM，ii)BnBr，K₂CO₃，KI，丙酮；e)NaOH，水，MeOH；f)

DCC，DMAP，DCM

合成式(VIII)的化合物的螯合物4-{[4-(3-[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2- 氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]-2-{[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]甲基}丙基)苯基]氨基}-4-氧代丁酸

在形成本发明的络合物的方法中，优选八齿螯合剂与组织靶向的部分之间的偶联反应在水溶液中进行。这具有几个优点。第一，它消除了制造商清除所有溶剂至低于可接受水平并证明该清除的负担。第二，它减少了废物并且最重要的是它通过避免分离或清除步骤加快了生产。在本发明的放射性药物的上下文中，尽可能快速进行合成是重要的，因为放射性同位素将在所有时间正在衰变，并且在制备中花费的时间浪费有价值的材料并引入污染物子体同位素。

合适的水溶液包括纯化水和缓冲剂如本领域中熟知的许多缓冲剂中的任一种。乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐(例如PBS)和磺酸盐缓冲剂 (例如MES)为熟知的水性缓冲剂的常用实例。

在一个实施方案中，该方法包括形成八齿包含羟基吡啶酮的配体 (如本文通篇所述)的第一水溶液和组织靶向的部分(如本文通篇所述) 的第二水溶液，并将所述第一水溶液和所述第二水溶液接触。

合适的偶联部分在上文中详细讨论，以及作为偶联和/或连接基团的本文中所讨论的所有基团和部分可合适地用于将靶向部分偶联至配体上。一些优选的偶联基团包括酰胺、酯、醚和胺偶联基团。酯和酰胺可通过由羧酸产生活化酯基来方便地形成。这类羧酸可存在于靶向部分、偶联部分和/或配体部分，并且通常与醇或胺反应以形成酯或酰胺。这类方法是本领域内非常熟知的，并可利用熟知的活化试剂，所述活化试剂包括N-羟基马来酰亚胺、碳二亚胺和/或偶氮二羧酸酯活化试剂如 DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等。

在一个优选的实施方案中，包含四个在N位被C₁-C₃烷基取代的羟基吡啶酮部分和末端为羧酸基团的偶联部分的八齿螯合剂可使用至少一种偶联剂(例如本文中所述的那些中的任一种)和活化试剂如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化，由此以形成八齿螯合剂的NHS酯。该活化(例如NHS)酯可分离或无需分离而用于偶联至任何具有游离胺基 (例如在赖氨酸侧链上)的组织靶向的部分。其他活化酯是本领域熟知的，并且可为有效的离去基团(例如氟化基团、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基、碘化物等)的任何酯。然而优选NHS酯。

偶联反应优选在比较短的时间内并在约环境下进行。第1步或第2 步偶联反应的常用的时间为约1至240分钟，优选5至120分钟，更优选10至60分钟。偶联反应的常用的温度为0至90℃，优选15至50 ℃，更优选20至40℃。约25℃或约38℃是合适的。

将八齿螯合剂偶联至靶向部分通常在不会不利地(或至少不会不可逆地)影响靶向部分的结合能力的条件下进行。由于结合剂通常为基于肽或蛋白质的部分，这需要比较温和的条件以避免变性或二级/三级结构丧失。优选水性条件(如在所有上下文中所讨论的)，并且希望避免极端的pH和/或氧化还原作用。因此，步骤b)可在pH为3至10，优选4至9，更优选4.5至8下进行。可需要就氧化还原而言的中性条件，或者非常温和地还原以避免在空气中氧化。

可用于本发明的所有方面的优选的组织靶向的螯合剂为本文中所述的AGC0018。AGC0018与²²⁷Th离子的络合物形成本发明的络合物及其相应地制剂、用途、方法等的优选的实施方案。在本发明的所有这类方面中所用的其他优选的实施方案包括缀合至组织靶向的部分(如本文中所述)的AGC0019的²²⁷Th络合物，所述组织靶向的部分包括对 CD22受体、FGFR2、间皮素、HER-2、PSMA或CD33中的任一种具有结合亲和性的单克隆抗体。

附图简要说明：

图1：证明溶液中EDTA/PABA对非放射性抗体缀合物AGC1118 的稳定作用的数据。

图2：包含用10kGy辐射照射的抗体HOPO缀合物的不同缓冲剂对过氧化氢水平的影响。

图3：具有最高达约8000Bq/μg的比活度的²²⁷Th-AGC1118(IRF 测定)的放射性稳定化作用。

图4：具有不同总活度的²²⁷Th-AGC1118对Ramos(4小时的孵育时间)的细胞毒性(参见实施例3)

图5：²²⁷Th-AGC0718在体外诱导CD33阳性细胞的靶向特异性细胞杀伤(参见实施例4)

图6：²²⁷Th-AGC0118在高(20kBq/μg)和低(7.4kBq/μg)比活度下的细胞毒性。阴性对照为具有相同剂量范围、相同孵育时间和读出前天数的低结合肽-白蛋白络合物(参见实施例5)。

图7：²²⁷Th-AGC2518在体外诱导FGFR2阳性细胞的靶向特异性细胞杀伤(参见实施例6)。

图8：²²⁷Th-AGC2418在体外诱导间皮素阳性细胞的靶向特异性细胞杀伤(参见实施例7)。

图9：²²⁷Th-AGC1018在体外诱导PSMA阳性LNCaP细胞的靶向特异性和剂量依赖性细胞杀伤(参见实施例9)。

现在，本发明通过以下非限制性实施例来说明。实施例中示例的所有化合物形成本发明的优选的实施方案(包括优选的中间体和前体)并且可在上下文允许的任何方面中单独使用或以任何组合使用。因此，例如，实施例2的化合物2至4、实施例3的化合物10和实施例4的化合物7中的每个或全部形成其不同类型的优选的实施方案。

实施例1

合成式(VIII)的化合物

实施例1a)

合成2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯

在0℃下，将氢化钠(60％的分散剂,11.55g,289mmol)悬浮于450 ml四氢呋喃(THF)中。在约30分钟内逐滴加入丙二酸二甲酯(40.0mL, 350mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。将溶于150mL THF 中的4-硝基苄基溴(50.0g,231mmol)在0℃下约30分钟内逐滴加入，然后在环境温度下两小时内逐滴加入。

加入500mL乙酸乙酯(EtOAc)和250mL NH₄Cl(aq,sat)，然后过滤该溶液。分离各相。用2*250mL EtOAc萃取水相。将有机相合并，用250mL盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下除去溶剂。

将300mL庚烷和300mL甲基叔丁基醚(MTBE)加入至残留物中并加入至60℃。过滤该溶液。将滤液置于冷冻室中过夜并过滤。将滤饼用200mL庚烷洗涤并减压干燥，得到灰白色固体状标题化合物。

收率：42.03g，157.3mmol，68％。

1H-NMR(400MHz,CDCl3):3.30(d,2H,7.8Hz),3.68(t,1H,7.8 Hz),3.70(s,6H),7.36(d,2H,8.7Hz),8.13(d,2H,8.7Hz)。

实施例1b)

合成2-(4-硝基苄基)丙-1,3-二醇

在0℃下将2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯(28.0g,104.8mmol)溶于 560mL THF中。在0℃下约30分钟内逐滴加入二异丁基氢化铝 (DIBAL-H)(1M于己烷中，420mL，420mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌两小时。

在0℃下向反应混合物中滴加20mL水。在0℃下向反应混合物中滴加20mL NaOH(aq,15％)，然后向反应混合物中滴加20mL水。将混合物在0℃下搅拌20分钟，然后加入约150g MgSO₄。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后在布氏漏斗中过滤。将滤饼用500mLEtOAc 洗涤。将滤饼除去并与800mL EtOAc和200mL MeOH一同搅拌约30 分钟，然后过滤溶液。合并滤液并减压干燥。

在二氧化硅上使用EtOAc于庚烷中的梯度，然后使用MeOH于 EtOAc中的梯度的DFC获得浅黄色固体状标题化合物。

收率：15.38g，72.8mmol，69％。

1H-NMR(400MHz,CDCl3):1.97-2.13(m,3H),2.79(d,2H,7.6Hz), 3.60-3.73(m,2H),3.76-3.83(m,2H),7.36(d,2H,8.4Hz),8.14(d,2H,8.4 Hz)。

实施例1c)

合成2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯

在0℃下将2-(4-硝基苄基)丙-1,3-二醇(15.3g,72.4mmol)溶于150 mL CH₂Cl₂中。加入三乙胺(23mL,165mmol)，然后在约15分钟内逐滴加入甲磺酰氯(12mL,155mmol)，然后在环境温度下搅拌一小时。

加入500mL CH₂Cl₂，并用2*250mL NaHCO₃(aq,sat)、125mL HCl(aq,0.1M)和250mL盐水洗涤混合物。将有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并减压干燥，得到橙色固体状标题化合物。

收率：25.80g，70.2mmol，97％。

1H-NMR(400MHz,CDCl3):2.44-2.58(m,1H),2.87(d,2H,7.7Hz), 3.03(s,6H),4.17(dd,2H,10.3,6.0Hz),4.26(dd,2H,10.3,4.4Hz),7.38(d, 2H,8.6Hz),8.19(d,2H,8.6Hz)。

实施例1d)

合成(氮烷二基二(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯

在室温下将咪唑(78.3g,1.15mol)悬浮于500mL CH₂Cl₂中。逐份加入二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)(262.0g,1.2mol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用3*750mL水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压除去挥发物。

将残留物溶于250ml甲苯中，并加入二亚乙基三胺(59.5mL,550 mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌两小时。

加入1L CH₂Cl₂，并用2*250mL水洗涤有机相。将有机相用 Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下减缩。在二氧化硅上使用甲醇(MeOH) 于CH₂Cl₂与三乙胺中的梯度的DFC得到无色固体状标题化合物。

收率：102g，336mmol，61％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl3):1.41(s,18H),1.58(bs,1H),2.66-2.77(m, 4H),3.13-3.26(m,4H),4.96(bs,2H)。

实施例1e)

合成(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)二(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四氨基甲酸四叔丁酯

将2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯(26.0g,71mmol)和(氮烷二基二(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯(76.0g,250mmol)溶于700mL乙腈中。加入N,N-二异丙基乙胺(43mL,250mmol)。将反应混合物在回流下搅拌4天。

减压除去挥发物。

在二氧化硅上使用EtOAc于庚烷中的梯度的DFC得到浅黄色固体泡沫状标题化合物。

收率：27.2g，34.8mmol，49％。

¹H-NMR(400MHz,CDCl3):1.40(s,36H),1.91-2.17(m,3H), 2.27-2.54(m,10H),2.61-2.89(m,2H),2.98-3.26(m,8H),5.26(bs,4H), 7.34(d,2H,8.5Hz),8.11(d,2H,8.5Hz)。

实施例1f)

合成N¹,N¹'-(2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)二(N¹-(2-氨基乙基)乙 -1,2-二胺)，AGC0020

将(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)二(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基)) 四氨基甲酸四叔丁酯(29.0g,37.1mmol)溶于950mL MeOH和50mL水中。在30℃下约20分钟内逐滴加入乙酰氯(50mL,0.7mol)。将反应混合物搅拌过夜。

减压除去挥发物并将残留物溶于250mL水中。加入500mL CH₂Cl₂，然后加入175mLNaOH(aq,5M,用NaCl饱和的)。分离各相，并用4*250mL CH₂Cl₂萃取水相。将有机相合并，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压干燥，得到粘稠的红棕色油状标题化合物。

收率：11.20g，29.3mmol，79％。纯度(HPLC图)：99.3％。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):1.55(bs,8H),2.03(dt,1H,6.6,13.3Hz), 2.15(dd,2H,12.7,6.6),2.34-2.47(m,10H),2.64-2.77(m,10H),7.32(d,2H, 8.7Hz),8.10(d,2H,8.7Hz).

¹³C-NMR(75MHz,CDCl₃):37.9,38.5,39.9,58.0,58.7,123.7,130.0, 146.5,149.5

实施例1g)

合成5-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-羧酸乙酯

在室温下将2-吡咯烷酮(76mL,1mol)和草酸二乙酯(140mL,1.03 mol)溶于1L甲苯中。加入乙醇钾(EtOK)(24％于EtOH中，415mL， 1.06mol)，并将反应混合物加热至90℃。

由于反应混合物变稠，在反应的第一个小时期间逐份加入200mL EtOH。将反应混合物搅拌过夜并冷却至室温。在搅拌的同时，缓慢地加入210mL HCl(5M,aq)。

加入200mL盐水和200mL甲苯，并将各相分离。用2×400mL CHCl₃萃取水相。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中减缩。将残留物从EtOAc中重结晶，得到浅黄色固体状标题化合物。

收率：132.7g，0.72mol，72％。

实施例1h)

合成3-羟基-2-氧代-1,2-二羟基吡啶-4-羧酸乙酯

将{5-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-羧酸乙酯}(23.00g,124.2 mmol)溶于150mL对二甲苯中，并加入碳负载的钯(10％,5.75g)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。冷却至室温后，将反应混合物用300mL MeOH稀释并通过

短垫过滤。用300mL MeOH洗涤该垫。真空除去溶剂，得到浅红褐色固体状标题化合物。

收率：19.63g，107.1mmol，86％。MS(ESI,pos):206.1[M+Na]⁺, 389.1[2M+Na]⁺

实施例1i)

合成3-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸乙酯

在室温下将{3-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸乙酯}(119.2g, 0.65mol)溶于600mL二甲亚砜(DMSO)和1.8L丙酮中。加入K₂CO₃ (179.7g,1.3mol)。在室温下约1小时内逐滴加入溶于600mL丙酮中的碘甲烷(MeI)(162mL,321mmol)。

将反应混合物在室温下再搅拌两小时，然后加入MeI(162mL,2.6 mol)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。将反应混合物在减压下减缩并加入2.5L EtOAc。

将混合物过滤并在减压下减缩。通过在SiO₂上使用EtOAc在庚烷中的梯度的干柱快速色谱法(DFC)纯化，得到标题化合物。

收率：56.1g，210.1mmol，32％。MS(ESI,pos):234.1[M+Na]⁺, 445.1[2M+Na]⁺

实施例1j)

合成3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸乙酯

在-78℃下，将{3-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸乙酯}(5.93g,28.1mmol)溶于80mL二氯甲烷(DCM)中，并逐滴加入溶于 20mL DCM中的BBr₃(5.3mL,56.2mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，然后将该反应加热至0℃。通过滴加25mL叔丁基甲基醚(tert-BuOMe)和25mL MeOH终止反应。真空除去挥发物。将残留物溶于90mL DCM和10mLMeOH中并通过SiO₂短垫过滤。将该垫用200 mL 10％MeOH于DCM中的溶液洗涤。在真空下除去挥发物。将残留物溶于400mL丙酮中。加入K₂CO₃(11.65g,84.3mmol)、KI(1.39g,8.4mmol)和苄基溴(BnBr)(9.2mL,84.3mmol)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。将反应混合物用200mL EtOAc稀释并用3x50mL水和50mL 盐水洗涤。将合并的水相用2x50mL EtOAc萃取。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空下除去挥发物，并在SiO₂上使用庚烷中的EtOAc(40–70％)作为洗脱液，通过干柱快速色谱法纯化，得到标题化合物。

收率：5.21g，18.1mmol，65％。MS(ESI,pos):310.2[M+Na]⁺, 597.4[2M+Na]⁺

实施例1k)

合成3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸

将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸乙酯}(27.90g，97.1mmol)溶于250mL MeOH中，并加入60mL NaOH(5M,aq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后将反应混合物在真空下浓缩至约 1/3。将残留物用150mL水稀释，并用氯化氢(HCl)(5M,aq)酸化至pH 为2。将沉淀物过滤出并真空干燥，得到无色固体状标题化合物。收率：22.52g，86.9mmol，89％。

实施例1l)

合成3-(苄氧基)-1-甲基-4-(2-硫代噻唑烷-3-羰基)吡啶-2(1H)-酮 (AGC0021)

将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-羧酸}(3.84g,14.8 mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(196mg,1.6mmol)和2-噻唑啉-2- 硫醇(1.94g,16.3mmol)溶于50mLDCM中。加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(3.36g,16.3mmol)。将反应混合物搅拌过夜。将反应过滤，用DCM洗涤固体，并将滤液在真空下减缩。将所得的黄色固体从异丙醇/DCM中重结晶，得到AGC0021。收率：4.65g，12.9mmol，87％。 MS(ESI,pos):383[M+Na]⁺,743[2M+Na]⁺

实施例1m)

合成AGC0023

将AGC0020(8.98g；23.5mmol)溶于CH₂Cl₂(600mL)中。加入 AGC0021(37.43g；103.8mmol)。将反应在室温下搅拌20小时。将反应混合物减压浓缩。

在SiO₂上使用甲醇于EtOAc和CH₂Cl₂的1:1混合物中的梯度的 DFC获得固体泡沫状AGC0023.

平均收率：26.95g，20.0mmol，85％。

实施例1n)

合成AGC0024

将AGC0023(26.95g；20.0mmol)溶于乙醇(EtOH)(675mL)中。加入铁(20.76g；0.37mol)和NH₄Cl(26.99g；0.50mol)，然后加入水(67 mL)。将反应混合物在70℃下搅拌两小时。再加入铁(6.75g；121mmol)，并将反应混合物在74℃下搅拌一小时。再加入铁(6.76g；121mmol)，并将反应混合物在74℃下搅拌一小时。将反应混合物冷却，然后将反应混合物在减压下减缩。

在SiO₂上使用甲醇于CH₂Cl₂中的梯度的DFC获得固体泡沫状 AGC0024。

收率：18.64g，14.2mmol，71％。

实施例1o)

合成AGC0025

将AGC0024(18.64g；14.2mmol)溶于CH₂Cl₂(750mL)中并冷却至 0℃。加入BBr₃(50g；0.20mol)，并将反应混合物搅拌75分钟。在0 ℃搅拌的同时，通过小心添加甲醇(MeOH)(130mL)终止反应。减压除去挥发物。向残留物中加入HCl(1.25M于EtOH中,320mL)。然后，在大气压和环境温度下使用旋转蒸发仪将烧瓶旋转15分钟，然后减压除去挥发物。

在非末端封闭的C₁₈二氧化硅上使用乙腈(ACN)于水中的梯度的 DFC获得为略带橙色的玻璃状固体的AGC0025。

收率13.27g，13.9mmol，98％。

实施例1p)

合成AGC0019

在室温下将AGC0025(10.63g；11.1mmol)溶于ACN(204mL)和水 (61mL)中。加入琥珀酸酐(2.17g；21.7mmol)，并将反应混合物搅拌两小时。将反应混合物减压减缩。在非末端封闭的C₁₈二氧化硅上使用 ACN于水中的梯度的DFC获得浅绿色的玻璃状固体。

在40℃下将该固体溶于MeOH(62mL)和水(10.6mL)中。在超声处理下将该溶液滴加至EtOAc(750mL)中。将沉淀物过滤，用EtOAc 洗涤并减压干燥，得到具有浅绿色色调的灰白色固体状AGC0019。

收率：9.20g，8.7mmol，78％。H-NMR(400MHz,DMSO-d₆), ¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)。

实施例2

分离纯的钍-227

钍-227从锕-227发生器中分离出来。锕-227通过热中子照射镭-226，随后镭-227(t1/2＝42.2m)衰变至锕-227而产生。在8M HNO₃溶液中通过阴离子交换色谱法由锕-227衰变混合物选择性保留钍-227。使用内径为2mm、长度为30mm的柱，其含有70mg

1-X8树脂(200-400 目，硝酸盐形式)。从柱中洗脱出锕-227、镭-223和子体后，用12M HCl 从柱中提取出钍-227。将含钍-227的洗脱液蒸发至干燥，并在标记步骤前将残留物重新悬浮于0.01MHCl中。

实施例3

²²⁷Th-AGC1118对Ramos的细胞毒性

实施例3a)

产生抗CD22的单克隆抗体(AGC1100)

单克隆抗体(mAb)hLL2——也被称为依帕珠单抗(本文中表示为 AGC1100)——的序列，可如Leung,Goldenberg,Dion,Pellegrini, Shevitz,Shih,and Hansen:MolecularImmunology 32:1413-27,1995中记载的构建。

本发明的实施例中所用的mAb由Immunomedics Inc,New Jersey, USA来制备。该mAb可例如在用包含编码轻链和重链的基因的质粒转染的中国仓鼠卵巢悬液(CHO-S)细胞中制备。选择第一稳定克隆用于使用标准程序。在一次性使用的生物反应器中约14天后，可在过滤上清液后收集单克隆抗体。AGC1100可通过蛋白质A亲和色谱法(MabSelect SuRe,Atoll,Weingarten/Germany)，然后进行离子交换步骤来进一步纯化。使用基于静电和疏水性的第三纯化步骤来除去聚集体和可能剩余的杂质。通过等电点聚焦、SDS-PAGE分析、N-末端测序和LC/MS分析来确定AGC1100的同一性。样品纯度进一步通过尺寸排阻色谱法(SEC)来分析。

实施例3b)

将mAb AGC1100(依帕珠单抗)与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联以得到缀合物AGC1118

缀合之前，将pH 7.5的磷酸盐缓冲剂加入至抗体溶液(AGC1100) 以提高溶液的缓冲能力。确定容器中AGC1100(mAb)的量。

将螯合剂AGC0019溶于1:1的DMA:0.1M MES缓冲液(pH为 5.4)中。将NHS和EDC溶于pH为5.4的0.1M MES缓冲液中。

制备螯合剂/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)的1/1/3摩尔当量溶液以活化该螯合剂。为了与抗体缀合，将摩尔比为7.5/7.5/22.5/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂加入到mAb中。20-40分钟后，用12％v/v 0.3M柠檬酸终止缀合反应，以便将pH调至5.5。

然后将溶液通过切向流过滤(Tangential Flow Filtration)以恒定体积缓冲交换至30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5 mg/ml pABA、pH为5.5(TFF缓冲剂)中。在渗滤结束时，将溶液倒入制剂容器中。用TFF缓冲剂(30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/ml pABA,pH 5.5)和7％w/v聚山梨醇酯80配制产品以得到2.6mg/mL于30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA、 0.5mg/mL pABA、0.1％w/v PS80，pH 5.5中的AGC1118。最后，将溶液通过0.2μm过滤器过滤至无菌瓶中，然后储存。

实施例3c)

制备²²⁷Th-AGC1118注射的剂量

将一小瓶20MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO₃溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。测得钍-227的洗脱活度，将10MBq剂量转移至空的10ml玻璃小瓶中。然后使用真空泵蒸发酸，并将小瓶置于加热区(设定为120℃)30-60分钟。达到室温后，加入6ml 2.5mg/ml的 AGC1118缀合物用于放射性标记。将小瓶缓慢地混合，室温下放置15 分钟。然后将溶液无菌过滤至无菌小瓶中，使用前取样，进行iTLC分析以测定RCP。

实施例3d)

具有不同总活度和比活度的²²⁷Th-AGC1118对Ramos的细胞毒性

在本研究中，通过在4小时孵育时间下改变总活度和比活度来测试²²⁷Th-AGC1118的剂量。本研究在96孔板结构中以10/50kBq/μg的比活度以及5、10、20和40kBq/ml的总活度进行。

将Ramos细胞在具有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640- 培养基中培养(第22段)。将细胞转移至离心管中并在300G下离心 5分钟，并悬浮在5mL培养基中，然后在Z2库尔特计数器(Z2Coulter Counter)上计数。将细胞悬浮液用培养基稀释至细胞浓度为400.000 个细胞/ml，并转移至96孔板中的48个孔(200μl/孔)中(80.000个细胞/ 孔)。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)测量细胞活力。参见图4。

实施例4

²²⁷Th-AGC0718对HL-60的细胞毒性

实施例4a)

产生抗CD33单克隆抗体(AGC0700)

单克隆抗体(mAb)HuM195/林妥珠单抗(本文中表示为AGC0700) 的序列，可从如(1)和(2)中所述的文献中检索获得。在CobraBiologics (

Sweden)的设备中制备AGC0700。简言之，使用Vector

软件(Invitrogen/Life-Technologies Ltd.,Paisley,英国)将重链和轻链的氨基酸序列反向翻译成DNA序列。从IgG1重链基因去掉C-末端赖氨酸(Lys)的密码子，以便有助于实施例2所列出的缀合物与抗体比率(CAR)的精确测定。通过CobraBiologics(

Sweden)，将所得的DNA序列进行密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达，并通过 GeneArt(GeneArt/Life-Technologies Ltd.,Paisley,United Kingdom)合成，并进一步克隆至表达载体中。将中国仓鼠卵巢悬液(CHO-S)细胞使用编码AGC0700的V_H-和V_L-结构域的质粒稳定转染，并在补充了嘌呤霉素(12.5mg/l；SigmaAldrich)的标准的CD-CHO培养基 (Invitrogen/Life-Technologies Ltd.,Paisley,United Kingdom)存在下生长。通过25代内有限稀释法筛选表达AGC0700的稳定克隆。克隆稳定性通过测量上清液的蛋白质滴度来评估。建立最稳定克隆的细胞库并进行低温保存。

37℃下，在250L的一次性生物反应器中进行mAb表达约14天。过滤上清液后，收集单克隆抗体。AC0700经蛋白质A亲和柱(MabSelect SuRe，Atoll，Weingarten/Germany)进一步纯化，然后使用一个阴离子交换色谱(QFF-Sepharose；GE Healthcare)和一个阳离子交换色谱 (PorosXS；Invitrogen/Life-Technologies Ltd.)来提高纯度和最终收率。AGC0700的同一性通过等电点聚焦和SDS-PAGE分析来确定。在固定的CD33-Fc靶标(Novoprotein)的结合ELISA中分析纯化的AGC0700 的活度。通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析样品纯度。

参考文献

(1)Scheinberg DA.“Therapeutic uses of the hypervariable region ofmonoclonal antibody M195and constructs thereof.US Patent Application 6007814(1999Dec 28).

(2)Co MS et al；J Immunol.1992Feb 15；148(4):1149-54.Chimeric andhumanized antibodies with specificity for the CD33 antigen.

实施例4b)

将mAb AGC0700(林妥珠单抗)与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联以得到缀合物AGC0718

如实施例3所述，进行缀合，但有少许例外。

缀合之前，将pH 7.5的磷酸盐缓冲剂加入至抗体溶液(AGC0700) 以提高溶液的缓冲能力。确定容器中AGC0700(mAb)的量。

制备螯合剂/NHS/EDC的1/1/3摩尔当量溶液以活化该螯合剂。为了与抗体缀合，将摩尔比为20/20/60/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂加入到mAb中。40-60分钟后，用12％v/v 0.3M柠檬酸终止缀合反应，以便将pH调至5.5。

然后将溶液通过切向流过滤以恒定体积缓冲交换至30mM柠檬酸盐、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/ml pABA、pH为5.5(TFF缓冲剂)中。在渗滤结束时，将溶液倒入制剂容器中。用TFF缓冲剂(30mM 柠檬酸盐、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/ml pABA,pH 5.5)配制产品以得到2.5mg/mL于30mM柠檬酸盐、154mM NaCl、2mM EDTA、 2mg/mL pABA，pH 5.5中的AGC0718。最后，将溶液通过0.2μm过滤器过滤至无菌瓶中，然后储存。

实施例4c)

制备²²⁷Th-AGC0718注射的剂量

将一小瓶20MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO₃溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。测得钍-227的洗脱活度，将10MBq剂量转移至空的10ml玻璃小瓶中。然后使用真空泵蒸发酸，并将小瓶置于加热区(设定为120℃)30-60分钟。达到室温后，加入6ml 2.5mg/ml的 AGC0718缀合物用于放射性标记。将小瓶缓慢地混合，室温下放置15 分钟。然后将溶液无菌过滤至无菌小瓶中，使用前取样，进行iTLC分析以测定RCP。

实施例4d)

具有不同总活度的²²⁷Th-AGC0718对HL-60的细胞毒性

为了证明在结合CD33+细胞后²²⁷Th-AGC0718的细胞毒性，进行体外细胞毒性测定。为了这一目的，将人类骨髓瘤白血病HL-60细胞系以及CD33阴性B细胞系(Ramos)暴露于²²⁷Th-AGC0718中。在44 kBq/μg比活度下测定2和20kBq/ml的总活度。所有实验方法记载于RD2013.093中。简言之，用10％FBS和1％青霉素/链霉素制备在 IMDM培养基中的50 000个人HL-60细胞/ml，并以100.000个细胞/ 孔的密度接种在24孔板中。在37℃下，用0-20kBq/ml活度的²²⁷Th-AGC0718孵育细胞4小时。平行制备各自²²⁷Th-同型对照缀合物样品和ab未标记的AGC0718样品，作为各自的对照。然后将细胞用新鲜培养基洗涤，并接种至新的24孔培养板中。

在不同的时间点上，收集细胞，使用CellTiterGlo试剂盒(Promega) 测定活力。活力通过将阳性对照(未处理的细胞)设定为100％而以％表示。参见图5。

实施例5

²²⁷Th-AGC0118对SKOV-3的细胞毒性

实施例5a)

合成AGC0100(曲妥珠单抗)

曲妥单抗单克隆抗体(本文中表示为AGC0100)购买自Roche，并溶于PBS(DulbeccoBIOCHROM)中，浓度为10mg/ml。

实施例5b)

将mAb AGC0100(曲妥珠单抗)与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联以得到缀合物AGC0118

如实施例3所述，进行缀合，有少量修改。最终缀合的mAb的TFF 纯化用凝胶过滤柱色谱代替。

向PBS中的曲妥珠单抗中加入pH为7.4的11％1M的磷酸盐缓冲液。将螯合剂(AGC0019)NHS和EDC溶于与实施例3b)中所述的相同溶液中。活化期间，螯合剂/NHS/EDC的摩尔比为1/1/3。对应的螯合剂/NHS/EDC/mAb的8/8/25/1的摩尔比以及30-40分钟的缀合时间产生缀合的AGC0118的0.7-0.9的CAR(螯合剂与抗体比例)。通过加入 12％v/v 0.3M的柠檬酸终止反应，使得最终的pH为5.5。

通过在与

系统(GE Healthcare)连接的Superdex 200(GE Healthcare)柱上凝胶过滤，进行AGC0118缀合物的纯化和并将其缓冲交换至30mM柠檬酸盐(pH 5.5)、154mM NaCl。在Abs 280nm下测量蛋白质浓度，然后用缓冲剂配制产品(以得到2.5mg/mL的于30mM 柠檬酸盐、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/mL pABA中的AGC0118， pH 5.5)。最后，将溶液通过0.2μm过滤器过滤到无菌瓶中，然后储存。

实施例5c)

制备²²⁷Th-AGC0118注射的剂量

如前所述进行标记：

将一小瓶20MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO3溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。测得钍-227的洗脱活度，将10MBq剂量转移至空的10ml玻璃小瓶中。然后使用真空泵蒸发酸，并将小瓶置于加热区(设定为120℃)30-60分钟。达到室温后，加入6ml 2.5mg/ml的 AGC0118缀合物用于放射性标记。将小瓶缓慢地混合，室温下放置15 分钟。然后将溶液无菌过滤至无菌小瓶中，使用前取样，进行iTLC分析以测定RCP。

实施例5d)

具有不同总活度的²²⁷Th-AGC0118对SKOV-3的细胞毒性

通过在4小时孵育时间期间改变添加到孔中的总活度来测试各种剂量的²²⁷Th-AGC0118的细胞毒性。在实验前一天，将SKOV-3细胞以10000个/孔接种于96孔板中。在第1天，在比活度为20kBq/μg下，将一系列总活度为5、10、20和40kBq/ml的螯合的²²⁷Th-AGC0118加入到细胞中。孵育期结束后，通过多阵列移液管除去残余的未结合²²⁷Th-AGC0118，然后用培养基进行一次额外地洗涤，再用新鲜培养基进行洗涤。在具有10％FBS和1％青霉素/链霉素的Mc-Coy培养基中培养SKOV-3细胞。在用²²⁷Th-AGC0118孵育期间，用无血清培养基替代所述培养基。在第四天，用CellTiter-Glo发光细胞活力测定 (Promega)来测量细胞活力。参见图6。

实施例6

²²⁷Th-AGC0118对NCI-H716的细胞毒性

实施例6a)

产生FGFR2单克隆抗体(BAY1179470；AGC2500)

单克隆抗体BAY 1179470(本文中还表示为AGC2500)的产生详细记载于WO2013076186A1中。简言之，在FGFR2抗原上通过生物淘选 (biopanning)获得抗体。所得的人类IgG1抗体在CHO细胞中表达，并使用蛋白质A亲和柱(MAb Select Sure)纯化，然后通过尺寸排阻色谱法来分离单体级分。将抗体配制于pH为7.4的PBS中。分析型SEC证明均一度>99％。

实施例6b)

将mAb AGC2500与螯合剂AGC0019(式(VIII)化合物)偶联以得到缀合物AGC2518

将含抗体的溶液调节至pH为7.5。将螯合剂AGC0019溶于1:1的 DMA:pH为5.4的0.1M MES缓冲液中。将NHS和EDC溶于pH为 5.4的0.1M MES缓冲液中。制备螯合剂/NHS/EDC的1/1/3摩尔当量溶液以活化该螯合剂。为了与抗体缀合，将摩尔比为10/10/30/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂加入到mAb中。30分钟后，用12％v/v 0.3M柠檬酸终止缀合反应，以便将pH调至5.5。用30mM柠檬酸盐、 70mM NaCl，pH为5.5作为流动相，将反应样品再加到HiLoad 16/600 Superdex 200(prep-grade)柱上，以分离单体级分。在色谱分离结束时，将抗体缀合物AGC2518浓缩为于30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA和0.5mg/ml pABA中的2.5mg/ml。所有操作记载于RD.2014.092, Journal No.211/149,140619AEF中。

实施例6c)

制备²²⁷Th-AGC2518注射的剂量

将一小瓶20MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO3溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。测得钍-227的洗脱活度，将10MBq剂量转移至空的10ml玻璃小瓶中。然后使用真空泵蒸发酸，并将小瓶置于加热区(设定为120℃)30-60分钟。达到室温后，加入6ml 2.5mg/ml的 AGC2518缀合物用于放射性标记。将小瓶缓慢地混合，室温下放置15 分钟。然后将溶液无菌过滤至无菌小瓶中，使用前取样，进行iTLC分析以测定RCP。

实施例6d)

具有不同总活度的²²⁷Th-AGC2518对NCI-H716细胞的细胞毒性

为了证明在结合FGFR2+细胞后²²⁷Th-AGC2518的细胞毒性，进行体外细胞毒性测定。为了这一目的，将人类结肠直肠癌细胞系 NCI-H716暴露于²²⁷Th-AGC2518中。在2kBq/μg比活度下测试2、10、 20和40kBq/ml的总活度。平行地类似制备不相关的同型对照。所有实验方法记载于RD2014.138中。简言之，在RPMI 1640培养基中的400000 个人NCI-H716细胞/ml用10％FBS和1％青霉素/链霉素制备，并以 80.000个细胞/孔的密度在96孔板中接种。在37℃下，用0-40kBq/ml 活度的²²⁷Th-AGC2518和各自的²²⁷Th-同型对照缀合物样品孵育细胞30分钟。然后将细胞用新鲜培养基洗涤，并接种至新的96孔培养板中。 5天后和7天后，收集细胞，并使用CellTiterGlo试剂盒(Promega)测量活力。活力通过将阳性对照(未处理的细胞)活力设定为100％而以％表示。参见图7。

实施例7

²²⁷Th-AGC2418对HT29细胞的细胞毒性

实施例7a)

产生间皮素单克隆抗体(BAY 86-1903；AGC2400)

单克隆抗体BAY 86-1903(本文中还称为AGC2400)的产生详细记载于WO2009068204中。简言之，在间皮素抗原上通过生物淘选获得抗体。所得的人类IgG1抗体在CHO细胞中表达，使用蛋白质A亲和柱(MAb Select Sure)纯化，然后使用HIC柱(ToyopearlButyl 600M) 除去聚集体。将抗体配制于pH为7.5的PBS中。

实施例7b)

将mAb AGC2400与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联以得到缀合物AGC2418

将含抗体的溶液调节至pH为7.5。将螯合剂AGC0019溶于1:1的 DMA:pH为5.4的0.1M MES缓冲液中。将NHS和EDC溶于pH为 5.4的0.1M MES缓冲液中。制备螯合剂/NHS/EDC的1/1/3摩尔当量溶液以活化该螯合剂。为了与抗体缀合，将摩尔比为16.5/16.5/49.5/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂加入到mAb中。30分钟后，用 12％v/v 0.3M柠檬酸终止缀合反应，以便将pH调至5.5。用30mM柠檬酸盐、70mM NaCl，pH为5.5作为流动相，将反应样品再加到HiLoad 16/600Superdex 200(prep-grade)柱上，以分离单体级分。在色谱分离结束时，将抗体缀合物AGC2418浓缩为于30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA和0.5mg/mlpABA中的2.5mg/ml。所有操作记载于RD.2014.111,Journal No.211/160,140814AEF中。

实施例7c)

制备²²⁷Th-AGC2418注射的剂量

将一小瓶20MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO3溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。测得钍-227的洗脱活度，将10MBq剂量转移至空的10ml玻璃小瓶中。然后使用真空泵蒸发酸，并将小瓶置于加热区(设定为120℃)30-60分钟。达到室温后，加入6ml 2.5mg/ml的 AGC2418缀合物用于放射性标记。将小瓶缓慢地混合，室温下放置15 分钟。然后将溶液无菌过滤至无菌小瓶中，使用前取样，进行iTLC分析以测定RCP。

实施例7d)

具有不同总活度的²²⁷Th-AGC2418对过表达间皮素抗原的HT29 细胞的细胞毒性

为了证明在结合间皮素+细胞后²²⁷Th-AGC2418的细胞毒性，进行体外细胞毒性测定。为了这一目的，将用间皮素抗原转染的人类结直肠癌细胞系HT29暴露于²²⁷Th-AGC2418。在比活度为10kBq/μg下，在稀释三倍的情况下，从5kBq/ml开始在12个点滴定测量总活度。平行地类似制备不相关的同型对照。所有实验操作记载于RD2014.154中。简言之，在RPMI1640培养基中的用间皮素抗原转染的200000个人类 HT29细胞/ml用10％FBS、1％青霉素/链霉素、1％NaHCO₃、600μg/ml 潮霉素B制备，并以40.000个细胞/孔的密度接种于96孔板中。在37 ℃下，用0至40kBq/ml活度的²²⁷Th-AGC2418和各自的²²⁷Th-同型对照缀合物样品孵育细胞6天。在第6天，收集细胞，并使用CellTiterGlo 试剂盒(Promega)测量活力。活力通过将阳性对照(未处理的细胞)活力设定为100％而以％表示。

实施例8

比较酰胺和异硫氰酸酯-连接的缀合物的稳定性

在40℃，将AGC1118和相应的具有异硫氰酸酯偶联部分的缀合物 (AGC1115)保存在水溶液中11天。定期取样。

归一化为每个4℃取样点的40℃样品

从上表可看出，对于酰胺偶联的缀合物，未观察到缀合物浓度的可测量的降低。相反，异硫氰酸酯缀合物在5天后降低8％，11天后降低 12％。

实施例9

实施例9a)

产生PSMA单克隆抗体(AGC1000)

PSMA单克隆抗体(下文中称为AGC1000)购自Progenics,USA。

实施例9b)

将mAb AGC1000与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联以得到缀合物AGC1018

将含抗体的溶液调节至pH为7.5。将螯合剂AGC0019溶于1:1的 DMA:pH为5.5的0.1M MES缓冲液中。将NHS和EDC溶于pH为 5.5的0.1M MES缓冲液中。制备螯合剂/NHS/EDC的1/1/2摩尔当量溶液以活化该螯合剂。为了与抗体缀合，将摩尔比为20/20/40/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂分4部分，每部分之间10分钟，加入到mAb中。50分钟后，用pH为7.3的12％v/v 1M柠檬酸终止缀合反应。将缀合物纯化并通过切向流过滤(TFF)进行缓冲交换。制剂的缓冲液为30mM柠檬酸盐、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/ml pABA， pH为5.5。在渗滤结束时，将溶液倒入散装(bulk)容器中，将浓度调至2.7mg/ml。最后，将散装溶液通过0.2μm无菌过滤器过滤，并转移到无菌小瓶中用于在-20℃下储存。

实施例9c)

制备²²⁷Th-AGC1018注射的剂量

将一小瓶约50MBq的钍-227氯化物膜溶于2ml 8M HNO₃溶液中，放置15分钟，然后取出溶液，应用于阴离子交换柱上，以除去随时间而增加的镭-223。用3ml 8M HNO₃和1ml水洗涤该柱，然后用3ml 的3M HCl洗脱钍-227。使用真空泵和设置为100℃的加热区将HCl洗脱液蒸发60-90分钟。在剂量校准器中测量经干燥的Th-227的活度。将干燥的Th-227溶于0.05M HCl中，得到0.5MBq/μl的浓度。为进行放射性标记，在制剂缓冲液中稀释缀合物AGC1018以便得到在200μl 中的25μg mAb。向AGC1018溶液中混合1MBq Th-227，并在锗检测器上测量精确的Th-227活度。在室温下允许螯合30-60分钟，然后无菌过滤至无菌小瓶中。使用前取样，进行iTLC分析以确定RCP。

实施例9d)

²²⁷Th-AGC1018对表达PSMA的LNCaP细胞的细胞毒性

为了证明在结合PSMA阳性细胞后²²⁷Th-AGC1018的细胞毒性，进行体外细胞毒性测定。为了这一目的，将人前列腺癌细胞系LNCaP 暴露于²²⁷Th-AGC1018。在比活度为40kBq/μg下，在稀释三倍的情况下，从20kBq/ml开始在12个点滴定测量总活度。平行地制备不相关的同型对照。所有实验操作记载于存档RD2015.101中。简言之，在补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养人 LNCaP细胞。将细胞以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中。接种后24小时(第1天)，在37℃下，将细胞暴露于总活度为0至20kBq/ml 的²²⁷Th-AGC1018和²²⁷Th同型对照持续5天。在第6天，收集细胞，并使用CellTiterGlo试剂盒(Promega)测量活力。活力通过将阳性对照 (未处理的细胞)活力设定为100％而以％表示。

序列表

<110> 拜耳有限公司

<120> 缀合方法

<130> 95.121941

<160> 5

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠轻链序列

<400> 1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Asn Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ala Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Gln Val Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化轻链序列

<400> 2

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Val Asn Asp Arg Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ala Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Lys Ala Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly

50 55 60

Val Pro Asp Ser Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

65 70 75 80

Phe Ile Ser Arg Ser Leu Val Pro Asp Leu Ile Ile Thr Tyr Cys His

85 90 95

Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠重链序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ser Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Leu His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一人源化重链序列

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二人源化重链序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.组织靶向的钍络合物，包含化合物：

和发射α的钍放射性核素²²⁷Th的4+离子，

其中

代表组织靶向部分，其包含对间皮素或PSMA具有结合亲和性的至少一个肽或蛋白质。

2.药物制剂，其包含至少一种权利要求1所述的组织靶向的钍络合物。

3.权利要求2的药物制剂，其还包含柠檬酸盐缓冲剂。

4.权利要求2或权利要求3的药物制剂，其还包含对氨基丁酸(PABA)和任选的EDTA和/或至少一种聚山梨醇酯。

5.权利要求1所述的组织靶向的钍络合物或权利要求2至4中任一项所述的药物制剂在制备用于治疗增生性或肿瘤性疾病的药物中的用途，其中所述增生性或肿瘤性疾病为肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌或脑癌、间皮瘤、卵巢癌、肺癌或胰腺癌。

6.权利要求5的用途，其中所述的淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤或B细胞肿瘤。

7.权利要求1的组织靶向的钍络合物，其中组织靶向部分是抗间皮素单克隆抗体BAY86-1903。