JP2019517547A - 放射性医薬品錯体 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織標的化トリウム錯体を形成する方法であって、a）N−位がメチル基で置換された4個のヒドロキシピリジノン（HOPO）部分とカルボン酸基で終結するカップリング部分とを含む八座キレート剤を形成するステップと；b）前記八座キレート剤を、プロリルエンドペプチダーゼFAPを標的化する少なくとも1つの組織標化的部分に結合させるステップと；c）前記組織標的化キレート剤を、少なくとも1つのα放射性トリウム同位体のイオンを含む水溶液と接触させるステップとを含む方法を提供する。このような組織標的化トリウム錯体、ならびに錯体および対応する医薬製剤の投与を含む、腫瘍性疾患または過形成性疾患を治療する方法も提供される。

Description

本発明は、プロリルエンドペプチダーゼFAP抗原を標的化する組織標的化部分にコンジュゲートした一定の八座配位子を有するトリウム−227の錯体を形成する方法に関する。本発明はまた、錯体、およびこのような錯体の投与を含む、疾患、特に腫瘍性疾患の治療に関する。

特異的細胞殺傷は、哺乳動物対象における種々の疾患の治療の成功に不可欠であり得る。この典型的な例は、肉腫および癌などの悪性疾患の治療である。しかしながら、一定の細胞型の選択的除去は、他の疾患、特に過形成性疾患および腫瘍性疾患の治療においても重要な役割を果たすことができる。

選択的治療の最も一般的な方法は、現在、外科手術、化学療法および体外照射である。しかしながら、標的放射性核種療法は、疾患に関連する細胞型に特異的に高い細胞傷害性の放射線を送達する可能性がある有望で発展途上の分野である。ヒトでの使用が現在認可されている放射性医薬品の最も一般的な形態は、βおよび／またはγ放射性核種を使用する。しかしながら、より特異的な細胞殺傷の可能性のために、療法におけるα放射性核種の使用にいくらかの関心が寄せられてきた。

生理学的環境中の典型的なα線放射体の放射範囲は、一般的に100μm未満であり、わずかに数個の細胞の直径と同等である。これらの放射線源は腫瘍内の隣接細胞に到達する範囲を有するが、十分に標的化されていれば、放射されたエネルギーのほとんどが標的細胞を通過しないので、このことにより、これらの源は微小転移を含む腫瘍の治療に非常に適したものになる。したがって、全ての細胞が標的とされる必要がなく、周囲の健康な組織への損傷を最小化することができる（Feinendegenら、Radiat Res 148：195〜201（1997）参照）。対照的に、β粒子は水中で1mm以上の範囲を有する（Wilbur、Antibody Immunocon Radiopharm 4：85〜96（1991）参照）。

α粒子放射線のエネルギーは、典型的に5〜8MeVであるβ粒子、γ線およびX線によって運ばれるエネルギーと比較して高い、すなわちβ粒子の5〜10倍およびγ線のエネルギーの20倍以上である。したがって、非常に短い距離にわたる大量のエネルギーのこの堆積は、γ線およびβ線と比較して、α線に非常に高い線エネルギー付与（LET）、高い相対的生物学的有効性（RBE）および低い酸素増感比（OER）を与える（Hall、「Radiobiology for the radiologist」、第5版、Lippincott Williams＆Wilkins、Philadelphia PA、米国、2000参照）。このことが、α放射性核種の例外的な細胞傷害性の理由であり、またこのような同位体の生物学的標的化ならびに許容できない副作用を回避するために必要なα放射性核種分布の制御および研究のレベルに対して厳しい要求を課している。

これまでのところ、放射性免疫療法における適用に関して、²¹¹At、²¹³Biおよび²²⁵Acに主な注目が集まっており、これら3つの核種は臨床免疫療法試験で研究されてきた。

提案されている放射性核種のいくつかは短寿命である、すなわち12時間未満の半減期を有する。このような短い半減期は、商業的方法でこれらの放射性核種に基づく放射性医薬品を製造および分配することを困難にする。短寿命核種の投与はまた、標的部位に到達する前に体内で放射される放射線量の割合を増加させる。

α放射からの反跳エネルギーは、多くの場合、親の崩壊位置からの娘核種の放出を引き起こす。この反跳エネルギーは、例えば、親がキレート剤などの配位子によって錯化されていた、親を保持していた可能性がある化学的環境から多くの娘核を破壊するのに十分である。これは、娘が同じ配位子と化学的に適合性である、すなわち同じ配位子によって錯化可能である場合でさえも起こる。同様に、娘核種がガス、特にラドンなどの希ガスである、または配位子と化学的に不適合性である場合、この放出効果はさらに大きくなる。娘核種が数秒超の半減期を有する場合、これらは親を保持している錯化剤によって抑制されずに、血液系の中に拡散することができる。そのため、これらの遊離放射性娘は望ましくない全身毒性を引き起こすおそれがある。

²²³Ra娘同位体の制御が維持される条件下でのトリウム−227（T_1／2＝18．7日）の使用が数年前に提案された（国際公開第01／60417号パンフレットおよび国際公開第02／05859号パンフレット参照）。これは、娘核種を閉鎖環境に保持することを可能にする運搬システムが使用される状況にあった。ある場合には、放射性核種がリポソーム内に配置され、（反跳距離と比較した）リポソームの実質的なサイズがリポソーム内に娘核種を保持するのを助ける。第二の場合には、骨基質に組み込まれ、そのため娘核種の放出を制限する放射性核種の骨親和性錯体が使用される。これらは潜在的に非常に有利な方法であるが、リポソームの投与は状況によっては望ましくなく、娘同位体を保持するために放射性核種を鉱化マトリックスで取り囲むことができない軟部組織の多くの疾患がある。

最近になって、²²⁷Thの崩壊時に放出される²²³Ra娘核の毒性が、匹敵する核についての以前の試験から予測されるよりはるかに大きな範囲で哺乳動物体内で許容され得ることが確立された。上述したトリウム−227のラジウム娘を保持する具体的な手段の非存在下では、ラジウム毒性に関する公的に入手可能な情報が、トリウム−227の崩壊による治療効果を達成するのに必要な投与量が、ラジウム娘の崩壊による極めて毒性で、おそらくは致死的な線量の放射線をもたらす、すなわち治療濃度域が存在しないために、トリウム−227を治療薬として使用することが不可能であることを明らかにした。

国際公開第04／091668号パンフレットは、治療上有効量の標的化トリウム−227放射性核種を、許容できない骨髄毒性を引き起こすのに十分な量のラジウム−223を生成することなく、対象（典型的には、哺乳動物）に投与することができる治療濃度域が存在するという予期しない発見を記載している。そのため、これを骨と軟部組織の両方の部位におけるあらゆる種類の疾患の治療および予防に使用することができる。

上記の開発に照らして、生成された²²³Raに起因する致死的な骨髄毒性なしに内部放射性核種療法にα放射性トリウム−227核を使用することが今や可能である。それにもかかわらず、治療濃度域は比較的狭いままであり、全ての場合で、絶対的に必要であるに過ぎないα放射性同位体を対象に投与することが望ましい。そのため、α放射性トリウム−227核を錯化し、高い信頼度で標的化することができれば、この新しい治療濃度域の有用な活用は大いに強化されるだろう。

放射性核種は絶えず崩壊しているので、隔離〜対象への投与の間に物質を取り扱うのに費やす時間が非常に重要である。α放射性トリウム核を、好ましくは少ないステップ、短いインキュベーション期間および／または標的化実体の特性に不可逆的な影響を及ぼさない温度を要する、調製するのが迅速で簡便である形態で錯化、標的化および／または投与することができれば、かなりの価値があるだろう。さらに、投与前に除去を必要としない溶媒中（本質的には水溶液中）で行うことができる方法が、溶媒蒸発または透析ステップを回避するというかなりの利点を有する。

有意に増強された安定性を示すトリウム標識薬物製剤を開発することができれば、同様に重要な価値があると考えられるだろう。これは、確実に堅牢な製品品質基準を遵守すると同時に患者に線量を送達するための物流経路を可能にするために重要である。よって、1〜4日の期間にわたって最小限の放射線分解を有する製剤が好ましい。

ヒドロキシピリジノン基を含有する八座キレート剤は、その後の標的化部分への結合のために、α線放射体トリウム−277を配位させるのに適していることが以前に示されている（国際公開第2011098611号パンフレット）。標的化分子へのコンジュゲーションに使用される別個の反応性基を有する、リンカー基によってアミンベースの足場に連結した4個の3，2−ヒドロキシピリジノン基を含有する八座キレート剤が記載された。以前の発明の好ましい構造は、3，2−ヒドロキシピリジノン基を含有しており、化合物ALG−DD−NCSに示されるように抗体成分への好ましいカップリング化学としてイソチオシアネート部分を使用していた。イソチオシアネートは、アミン基を介してタンパク質に標識を付けるために広く使用されている。イソチオシアネート基はタンパク質中のアミノ末端および一級アミンと反応し、抗体を含む多くのタンパク質の標識に使用されている。これらのコンジュゲート中に形成されたチオ尿素結合はかなり安定であるが、蛍光イソチオシアネートから調製された抗体コンジュゲートは経時的に劣化することが報告されている［Banks PR、Paquette DM．、Bioconjug Chem（1995）6：447〜458］。フルオレセインイソチオシアネートとアミンの反応によって形成されるチオ尿素もまた、塩基性条件下でグアニジンに変換されやすい［Dubey I、Pratviel G、Meunier BJournal：Bioconjug Chem（1998）9：627〜632］。モノクローナル抗体の長い生物学的半減期と相まって、トリウム−227の長い崩壊半減期（18．7日）のために、インビボと貯蔵の両方でより化学的に安定なコンジュゲートを生成するためにより安定な連結部分を使用することが望ましい。

ヒドロキシピリジノン配位子のコンジュゲーションに関する最も関連性のある以前の研究は、国際公開第2013／167754号パンフレットに公開されており、ヒドロキシアルキル官能基を含む水溶性化部分を有する配位子を開示している。このキレートクラスのヒドロキシル基の反応性のために、複数の競合反応が続いて起こり、エステル化反応を介して生成物の複雑な混合物をもたらすので、活性化エステルとしての活性化は不可能である。そのため、国際公開第2013／167754号パンフレットの配位子は、イソチオシアネートなどの代わりの化学物質を介して組織標的化タンパク質に結合しなければならず、上記のように安定性が低いチオ尿素コンジュゲートを与える。さらに、国際公開第2013167755号パンフレットおよび国際公開第2013167756号パンフレットは、それぞれCD33およびCD22標的化抗体に適用されるヒドロキシアルキル／イソチオシアネートコンジュゲートを開示している。

プロリルエンドペプチダーゼFAP（線維芽細胞活性化タンパク質、またはFAPαとしても知られている）は、がん生理学において複数の役割を果たしている（Jiangら、Oncotarget．2016年3月15日）。FAPはがん関連線維芽細胞上で高度に発現され、がん細胞上にも存在し得る。上皮癌（例えば、乳房、肺、結腸、膵臓、頭頸部）ならびに骨および軟部組織肉腫の悪性細胞の90％超の間質における豊富な発現が、肝硬変などのいくつかの炎症状態下と同様に報告されている。

FAPは、もともと細胞外マトリックスリモデリングに関与するII型膜貫通セリンプロテアーゼである。これはがんの発生、進行および転移に直接的および間接的に寄与する。近年、FAPが適応性腫瘍関連抗原であり、そのため魅力的な治療標的であることを示唆する、FAP陽性がん関連線維芽細胞の免疫抑制的役割が記載されている。

FAPはESC11抗体の標的であり、国際公開第2011040972号パンフレットに記載されている。ESC11は、ヒトとマウス両方のFAP抗原を認識する高親和性抗体である。ESC11 IgG1は表面FAPの下方調節および内在化を誘導する。

本発明者らは、標的化部分としてのプロリルエンドペプチダーゼFAPに対するモノクローナル抗体に特異的キレート剤を結合させ、引き続いてα放射性トリウムイオンを添加することによって組織標的化錯体を形成することによって、温和な条件下で、錯体の貯蔵および投与にとってより安定なままである連結部分によって、錯体を迅速に生成することができることをここで確立した。

国際公開第01／60417号パンフレット 国際公開第02／05859号パンフレット 国際公開第04／091668号パンフレット 国際公開第2011098611号パンフレット 国際公開第2013／167754号パンフレット 国際公開第2013167755号パンフレット 国際公開第2013167756号パンフレット 国際公開第2011040972号パンフレット

Feinendegenら、Radiat Res 148：195〜201（1997） Wilbur、Antibody Immunocon Radiopharm 4：85〜96（1991） Hall、「Radiobiology for the radiologist」、第5版、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia PA、米国、2000 Banks PR、Paquette DM.、Bioconjug Chem（1995）6：447〜458 Dubey I、Pratviel G、Meunier BJournal：Bioconjug Chem（1998）9：627〜632 Jiangら、Oncotarget．2016年3月15日

そのため、第1の態様では、本発明は、組織標的化トリウム錯体を形成する方法であって、前記方法は、
a）式（I）または（II）の八座キレート剤を形成するステップと：
（式中、Rcはカルボン酸部分で終結するリンカー部分、例えば
［−CH₂−Ph−N（H）−C（＝O）−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］、
［−CH₂−CH₂−N（H）−C（＝O）−（CH₂−CH₂−O）_1〜3−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］または
［−（CH₂）_1〜3−Ph−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］（式中、Phはフェニレン基、好ましくはパラ−フェニレン基である）
である）；
b）前記八座キレート剤を
配列1、11または21の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖；
および配列5、15または25の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖を含む
組織標的化部分に結合させ、
それによって、組織標的化キレート剤を生成するステップと；
c）前記組織標的化キレート剤を、α放射性トリウム同位体²²⁷Thの4^＋イオンを含む水溶液と接触させるステップと
を含む方法を提供する。

このような錯体において（そして好ましくは本発明の全ての態様において）、トリウムイオンは一般に、八座ヒドロキシピリジノン含有配位子によって錯化され、今度はこれがアミド結合を介して組織標的化部分に結合される。

典型的には、この方法は、インサイツ活性化を介したまたは活性エステル自体の合成および単離による、活性エステル（N−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHSエステル）など）の形態で活性化することができる反応性カルボキシレート官能基を含む3，2−ヒドロキシピリジノン系八座キレートを合成する方法である。

得られたNHSエステルを、広範囲のキレート修飾タンパク質フォーマットを製造するための単純なコンジュゲーションステップにおいて使用することができる。さらに、非常に安定な抗体コンジュゲートはトリウム−227で容易に標識される。これは、典型的には高い放射化学収率および純度で、周囲温度またはそれに近い温度であり得る。

本発明の方法は、好ましくは水溶液中で行われ、一実施形態では、任意の有機溶媒の非存在下または実質的非存在下（1体積％未満）で行われ得る。

本発明の組織標的化錯体は、ヒトまたはヒト以外の動物対象への投与に適した医薬品に製剤化することができる。

そのため、第2の態様では、本発明は、本明細書に記載される組織標的化錯体を形成し、引き続いて少なくとも1種の医薬担体および／または賦形剤を添加するステップを含む医薬製剤を製造する方法を提供する。適切な担体および賦形剤には、緩衝剤、キレート剤、安定化剤、および当技術分野において公知であり、本明細書のいずれかの態様において記載される他の適切な成分が含まれる。

さらなる態様では、本発明はさらに、組織標的化トリウム錯体を提供する。このような錯体は、本明細書全体を通して記載される特徴、特に本明細書に記載される好ましい特徴を有するだろう。錯体は、本明細書に記載される方法のいずれかによって形成され得るまたは形成可能であり得る。よって、このような方法は、本明細書の任意の態様または実施形態に記載されるように、少なくとも1つの組織標的化トリウム錯体をもたらし得る。

なおさらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される錯体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。製剤は、本明細書に記載される方法のいずれかによって形成され得るまたは形成可能であり得、少なくとも1種の緩衝剤、安定化剤および／または賦形剤を含有し得る。緩衝剤および安定剤の選択は、これらが一緒になって組織標的化錯体を放射線分解から保護するのを助けるようなものであり得る。一実施形態では、製剤中の錯体の放射線分解が、製剤の製造の数日後でさえも最小限である。これは、この技術の実施可能性および実用化に重要な製品品質および医薬品供給の物流に関連する潜在的な課題を解決するので、重要な利点である。

本発明の好ましい抗FAP抗体のアノテーションが付与された配列を示す図である。 表1に記載される単一配列を示す図である。

本発明の文脈において、「組織標的化」は、当の物質が（特に本明細書に記載される組織標的化錯体の形態である場合）、（例えば、放射性崩壊をもたらすために）その存在が望まれる少なくとも1つの組織部位に対して優先的に、それ自体を局在化する（特に任意のコンジュゲートトリウム錯体を局在化する）ように働くことを示すために本明細書で使用される。よって、組織標的化基または部分は、標的化部分を有さない等価の錯体の濃度と比較して、その対象への投与後に対象の体内の少なくとも1つの所望の部位への大きな局在化を提供するように働く。

この場合の標的化部分は、プロリルエンドペプチダーゼFAPに対する特異性を有する。

本明細書に記載される本発明の種々の態様は、特に疾患組織の選択的標的化のための疾患の治療、ならびにこのような方法において有用な錯体、コンジュゲート、医薬品、製剤、キット等に関する。全ての態様において、疾患組織は体内の単一部位に存在してもよく（例えば、限局性固形腫瘍の場合）、または複数部位に存在してもよい（例えば、いくつかの関節が関節炎に罹患している場合、または分散型もしくは転移性の癌性疾患の場合）。

標的化される疾患組織は、軟部組織部位、石灰化組織部位、あるいは全て軟部組織内、全て石灰化組織内にあり得る、または少なくとも1つの軟部組織部位および／または少なくとも1つの石灰化組織部位を含み得る複数の部位にあり得る。一実施形態では、少なくとも1つの軟部組織部位が標的化される。標的化部位および疾患の起源部位は同じであってもよいが、異なっていてもよい（転移部位を特異的に標的化する場合など）。2つ以上の部位が関与する場合、これは起源部位を含んでもよいし、または複数の二次部位であってもよい。

「軟部組織」という用語は、「硬質」鉱化マトリックスを有さない組織を示すために本明細書で使用される。特に、本明細書で使用される軟部組織は、骨格組織ではない任意の組織であり得る。対応して、本明細書で使用される「軟部組織疾患」は、本明細書で使用される「軟部組織」に発生する疾患を示す。本発明はがんの治療に特に適しており、よって、「軟部組織疾患」は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および任意の「軟質」（すなわち、非石灰化）組織に発生する混合型がん、ならびにこのような組織の他の非癌性疾患を包含する。癌性「軟部組織疾患」には、軟部組織に発生する固形腫瘍、ならびに転移性および微小転移性腫瘍が含まれる。実際、軟部組織疾患は、同じ患者における軟部組織の原発固形腫瘍および軟部組織の少なくとも1つの転移性腫瘍を含み得る。あるいは、「軟部組織疾患」は、原発腫瘍のみまたは原発腫瘍が骨格疾患である転移のみからなる。

本発明のプロリルエンドペプチダーゼFAP標的化剤を用いた治療に適した新生物の例としては、結腸、直腸、肺、乳房、膵臓、皮膚、腹膜、女性生殖器、膀胱、胃および頭頸部の上皮癌ならびに肉腫が挙げられる。

抗体コンジュゲートが貯蔵時に許容される期間安定であることが、本発明の成功への重要な貢献である。したがって、非放射性抗体コンジュゲートと最終的なトリウム標識医薬品の両方の安定性が、放射性医薬品の製造および流通に要求される厳格な基準を満たさなければならない。組織標的化錯体を含む本明細書に記載される製剤が貯蔵時に優れた安定性を示すことは驚くべき発見であった。これは、加速安定性試験に典型的に使用される高温でさえも当てはまる。

本発明の全ての適合性の態様に適用可能な一実施形態では、組織標的化錯体を適切な緩衝液に溶解することができる。特に、クエン酸緩衝液の使用が驚くほど安定な製剤を提供することが分かった。これは、好ましくは1〜100mM（pH4〜7）の範囲、特に10〜50mMの範囲のクエン酸緩衝液であるが、最も好ましくは20〜40mMのクエン酸緩衝液である。

本発明の全ての適合性の態様に適用可能なさらなる実施形態では、組織標的化錯体を、p−アミノ酪酸（PABA）を含有する適切な緩衝液に溶解することができる。好ましい組み合わせは、PABAと組み合わせたクエン酸緩衝液（好ましくは本明細書に記載される濃度の）である。他の薬剤との組み合わせを含む本発明のいずれかの態様において使用するためのPABAの好ましい濃度は、約0．005〜5mg／ml、好ましくは0．01〜1mg／ml、より好ましくは0．01〜1mg／mlである。0．1〜0．5mg／mlの濃度が最も好ましい。

本発明の全ての適合性の態様に適用可能なさらなる実施形態では、組織標的化錯体を、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する適切な緩衝液に溶解することができる。好ましい組み合わせは、EDTAとクエン酸緩衝液の使用である。特に好ましい組み合わせは、PABAの存在下でのEDTAとクエン酸緩衝液の使用である。このような組み合わせにおいては、クエン酸塩、PABAおよびEDTAが、適宜、本明細書に示される濃度範囲および好ましい濃度範囲で存在することが好ましい。他の薬剤との組み合わせを含む本発明のいずれかの態様において使用するためのEDTAの好ましい濃度は、約0．02〜200mM、好ましくは0．2〜20mM、最も好ましくは0．05〜8mMである。

本発明の全ての適合性の態様に適用可能なさらなる実施形態では、組織標的化錯体を、少なくとも1種のポリソルベート（PEGグラフトソルビタン脂肪酸エステル）を含有する適切な緩衝液に溶解することができる。好ましいポリソルベートには、ポリソルベート80（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート）、ポリソルベート60（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノステアレート）、ポリソルベート40（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート80（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート）およびこれらの混合物が含まれる。ポリソルベート80（P80）が最も好ましいポリソルベートである。他の薬剤との組み合わせを含む本発明のいずれかの態様において使用するためのポリソルベート（本明細書に示される特に好ましいポリソルベート）の好ましい濃度は、約0．001〜10％w／v、好ましくは0．01〜1％w／v、最も好ましくは0．02〜0．5w／vである。

PABAは放射線安定剤（radiostabilizer）として以前に記載されているが（米国特許第4880615号明細書参照）、本発明におけるPABAのプラスの効果は貯蔵時の非放射性コンジュゲートに対して観察された。組織標的化キレート剤の合成が典型的にはトリウムイオンと接触させるかなり前に行われるので、放射線分解の非存在下でのこの安定化効果は、特に驚くべき利点を構成する。したがって、組織標的化キレート剤を、トリウムイオンとの接触の1時間〜3年前に生成することができ、好ましくはその期間の少なくとも一部の間、PABAと接触して貯蔵する。すなわち、本発明のステップa）およびb）を、ステップc）の1時間〜3年前およびステップb）とc）の間に行うことができ、組織標的化キレート剤を、特にクエン酸緩衝液などの緩衝液中、PABAと、場合によりEDTAおよび／またはポリソルベートと接触して貯蔵することができる。全ての材料は好ましくは本明細書に示される種類および濃度である。したがって、PABAは本発明の製剤の非常に好ましい成分であり、組織標的化キレート剤および／または組織標的化トリウム錯体に対して長期安定性をもたらし得る。

本明細書に記載されるクエン酸緩衝液の使用は、本発明の製剤中の組織標的化トリウム錯体の安定性に関してさらに驚くべき利点を提供する。過酸化水素発生に対する緩衝液の効果についての照射研究が本発明者らによって行われ、予想外の結果をもたらした。過酸化水素は水の放射線分解の結果として形成することが知られており、溶液中のタンパク質コンジュゲートの化学修飾に寄与する。そのため、過酸化水素の発生は生成物の純度および安定性に対して望ましくない効果をもたらす。図2は、試験した他の全ての緩衝液と比較して、クエン酸緩衝液中Co−60（10kGy）で照射した本発明の抗体HOPOコンジュゲート溶液において低レベルの過酸化水素が測定されたという驚くべき観察結果を示している。よって、本発明の製剤は、好ましくは本明細書に記載されるクエン酸緩衝液を含む。

本発明者らはさらに、本発明の製剤中の一定の成分の組み合わせ効果に関するさらなる驚くべき発見を確立した。これもまた放射性標識コンジュゲートの安定性に関連する。クエン酸塩が最も有効な緩衝液であることが分かり、この効果がPABAの添加によってなおさらに改善されることを発見したことは驚くべきことであった。

本発明の方法、錯体および製剤の重要な成分は、八座キレート剤部分である。トリウムイオンとヒドロキシピリジノン配位子の錯化に関する最も関連する以前の研究は、国際公開第2011／098611号パンフレットとして公開されており、八座HOPO含有配位子と錯化したトリウムイオンの比較的容易な生成を開示している。

トリウムのためのこれまでに知られているキレート剤にはまた、骨格窒素に結合した酸性（例えばカルボキシアルキル）基を有する直鎖、環状または分岐ポリアザアルカン骨格を含むポリアミノポリ酸キレート剤が含まれる。このようなキレート剤の例としては、p−イソチオシアナトベンジル−1，4，7，10−テトラアザシクロドデカン−1，4，7，10−四酢酸（p−SCN−Bz−DOTA）などのDOTA誘導体およびp−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸（p−SCN−Bz−DTPA）などのDTPA誘導体が挙げられ、前者は環状キレート剤であり、後者は直鎖キレート剤である。

1，4，7，10−テトラアザシクロドデカン−1，4，7，10−四酢酸の誘導体は以前に例示されているが、標準的な方法を使用して、DOTA誘導体によりトリウムをとキレート化することは容易にはできない。DOTA誘導体と金属の加熱はキレートを有効に提供するが、しばしば低収率である。手順中に配位子の少なくとも一部が不可逆的に変性する傾向がある。さらに、不可逆的変性に対するその比較的高い感受性のために、全ての加熱ステップが完了するまで標的化部分の取り付けを回避することが一般に必要である。これは、α放射性トリウム同位体の崩壊寿命の間に行わなければならない余分の化学的ステップ（全ての必要な後処理および分離を含む）を追加する。明らかに、このようにα放射性材料を取り扱うことも対応する廃棄物を必要以上に生成することも好ましくない。さらに、コンジュゲートの調製に費やされた全ての時間が、この準備期間中に崩壊する一定割合のトリウムを無駄にする。

本発明の重要な態様は、全ての点で、式（I）または（II）の八座キレート剤の使用である：
（式中、Rcはカルボン酸部分で終結するリンカー部分、例えば
［−CH₂−Ph−N（H）−C（＝O）−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］、
［−CH₂−CH₂−N（H）−C（＝O）−（CH₂−CH₂−O）_1〜3−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］または
［−（CH₂）_1〜3−Ph−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］（式中、Phはフェニレン基、好ましくはパラ−フェニレン基である）
である）。

国際公開第2013／167756号パンフレット、国際公開第2013／167755号パンフレットおよび国際公開第2013／167754号パンフレットなどの一定の以前の開示では、3，2−HOPO部分のN原子に結合しているメチル基が、主にヒドロキシまたはヒドロキシアルキル（例えば、−CH₂OH、−CH₂−CH₂OH、−CH₂−CH₂−CH₂OH等）などの可溶化基であった。これは高い溶解度の点で一定の利点を有するが、このようなキレート剤はアミド結合を用いて標的化部分に連結するのが困難である。

キレート化部分は、米国特許第5624901号明細書（例えば、実施例1および2）および国際公開第2008／063721号パンフレット（共に参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を含む、当技術分野で公知の方法によって形成され得る。

R_cはカップリング部分を表す。適切な部分には、カルボン酸基で終結するアルキルまたはアルケニル基などのヒドロカルビル基が含まれる。本発明の方法などによる、アミドを形成するためのカルボン酸連結部分の使用は、キレート剤と組織標的化部分との間のより安定なコンジュゲーションを提供することが本発明者らによって確立されている。

本発明の最も好ましい実施形態では、八座配位子を標的化部分に連結するカップリング部分（R_C）が、
［−CH₂−Ph−N（H）−C（＝O）−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］、
［−CH₂−CH₂−N（H）−C（＝O）−（CH₂−CH₂−O）_1〜3−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］または
［−（CH₂）_1〜3−Ph−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］
（式中、Phはフェニレン基、好ましくはパラ−フェニレン基である）
となるように選択される。

好ましい実施形態では、R_Cが［−（CH₂）_1〜3−Ph−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］である。より好ましい実施形態では、R_Cが［−（CH₂）−パラ−フェニレン−N（H）−C（＝O）−（CH₂）₂−C（＝O）OH］である。

非常に好ましい八座キレート剤には、以下の式（III）および（IV）のものが含まれる：

化合物（III）の合成は本明細書において以下に記載されており、本明細書において以下に記載されている合成経路に従う。

本発明の方法のステップa）は、任意の適切な合成経路によって行うことができる。合成方法のいくつかの具体例を以下の実施例において以下に示す。このような方法は具体例を提供するが、そこに例示されている合成方法は、当業者によって一般的状況においても使用可能であるだろう。そのため、実施例に例示されている方法は、状況が許せば、本発明の全ての態様および実施形態に適用可能な一般的な開示としても意図されている。

本発明の全ての態様におけるα放射性トリウムと八座配位子の錯体が、60℃より上の加熱なしで（例えば、50℃より上の加熱なしで）、好ましくは38℃より上の加熱なしで、最も好ましくは25℃より上の加熱なしで（20〜38℃の範囲など）形成されるまたは形成可能であることが好ましい。典型的な範囲は、例えば15〜50℃または20〜40℃であり得る。本発明の方法における錯化反応（パートc））は任意の合理的な期間行うことができるが、これは好ましくは1〜120分、好ましくは1〜60分、より好ましくは5〜30分である。

標的化部分と八座配位子のコンジュゲートが、α放射性トリウム同位体²²⁷Th^4＋イオンの添加前に調製されることがさらに好ましい。よって、本発明の生成物は、好ましくは、八座配位子と組織標的化部分（組織標的化キレート剤）とのコンジュゲートによるα放射性トリウム同位体（²²⁷Th^4＋イオン）の錯化によって形成されるまたは形成可能である。

（本明細書に記載されるカップリング部分を含む）八座キレート剤を介して、様々な種類の標的化化合物をトリウム（例えばトリウム−227）に連結することができる。

一般に、本明細書で使用される場合、組織標的化部分は、二次および三次構造的特徴を有するまたは有さないアミノ酸成分間のアミド骨格で主に形成される構造である「ペプチド」または「タンパク質」である。

本発明によると、²²⁷Thは、本明細書に記載されるように、組織標的化部分へのアミド結合によって結合または結合可能な標的化錯化剤によって錯化され得る。

典型的には、標的化部分は、100g／mol〜数百万g／mol（特に、100g／mol〜100万g／mol）の分子量を有し、好ましくは直接的に疾患関連受容体に対する親和性を有する、および／または²²⁷Th投与より前に疾患に標的化されている分子に結合した適切な前投与結合剤（例えば、ビオチンまたはアビジン）を含む。

本発明の特異的結合剤（組織標的化部分）は、プロリルエンドペプチダーゼFAP抗原を標的化するように選択される。

本発明の組織標的化部分は、配列1、11または21の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖、および配列5、15または25の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖を含む。

配列類似性は、言及される配列に対して少なくとも80％の配列類似性を有すると見なすことができる。好ましい配列類似性は、少なくとも90％、92％、95％、97％、98％または99％であり得る。ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupバージョン10ソフトウェアパッケージの「BestFit」プログラムを使用して、配列類似性および／または同一性を決定することができる。プログラムは、デフォルト値でSmithとWatermanのlocal hadアルゴリズムを使用する：ギャップ作成ペナルティ＝8、ギャップ伸張ペナルティ＝2、平均一致＝2．912、平均不一致2．003。

本発明の組織標的化部分はESC11およびその変異体を表す。ヒト生殖細胞系配列により近く、製造にとって潜在的に重要なアミノ酸を回避するよう最適化されているESC11のいくつかの変異体が作製されている（図1および表1参照）。

図1は本発明の好ましい抗FAP抗体のアノテーションが付与された配列を示す。IgG1の重鎖および軽鎖、ならびに選択された抗体のVH領域およびVL領域についてのタンパク質配列が提供される。配列の下に重要な領域がアノテーションされている（全長IgG中のVHおよびVL領域、ならびにCDR領域（H−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、L−CDR3））。

図2は、表1に記載される単一配列を示す。

好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1、11または21のいずれか1つと98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖、および配列5、15または25のいずれか1つと98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1、11または21のいずれか1つと99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖、および配列5、15または25のいずれか1つと99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列1と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列11と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列5と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列15と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

別の好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と98％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

より好ましい実施形態では、組織標的化部分が、配列21と配列同一性を有するペプチド鎖および配列25と99％以上の配列類似性または同一性を有するペプチド鎖を含む。

本発明のプロリルエンドペプチダーゼFAPに対する抗体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、抗原結合部分またはその変異体を組換え的に発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞で発現されるように、軽鎖および／または重鎖またはその一部をコードするDNA断片を有する1つまたは複数の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることができる。標準的な組換えDNA法を使用して、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および／または取得し、これらの核酸を組み換え発現ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞、例えばSambrook、FritschおよびManiatis（編）、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、N．Y．、（1989）、Ausubel，F．M．ら（編）Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、（1989）およびBossらの米国特許第4816397号明細書に記載されるものに導入する。

さらに、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を、例えば全長抗体鎖、Fab断片またはscFvをコードする核酸配列に変換することができる。VL−またはVH−コードDNA断片を、例えば、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーをコードする別のDNA断片に（2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームとなるように）作動可能に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat，E．A．ら（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U．S．Department of Health and Human Services、NIH公開番号91−3242参照）、これらの領域を包含するDNA断片は標準的なPCR増幅によって得ることができる。

scFvをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、VHおよびVLをコードする核酸を、VLおよびVH領域がフレキシブルリンカーによって結合されて、VHおよびVL配列が連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、フレキシブルリンカーをコードする別の断片に作動可能に連結することができる（例えば、Birdら（1988）Science 242：423〜426；Hustonら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：5879〜5883；McCaffertyら、Nature（1990）348：552〜554参照）。

抗体を発現させるために、その抗原結合断片またはその変異体の標準的な組換えDNA発現法を使用することができる（例えば、Goeddel；Gene Expression Technology．Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif．（1990）参照）。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、次いでこれを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は、原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするDNAを別々のベクターに挿入する。他の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするDNAを同じベクターに挿入する。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルおよび発現が構成的であるか誘導的であるかどうかなどの因子によって影響されることが理解される。

細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするDNA配列を、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み取り段階で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするために、および望ましい場合には宿主内での増幅を提供するために、1つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適した原核宿主には、それだけに限らないが、大腸菌（E．coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）ならびにシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌属（Staphylococcus）の種々の種が含まれる。

細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはファージミドに基づくものであり得る。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）のエレメントを含有する市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含有することができる。適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖の後、選択されたプロモーターを、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって脱抑制／誘導し、細胞はさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を、さらなる精製のために保持する。

細菌系では、発現されるタンパク質に意図された用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の産生またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、大量のこのようなタンパク質を産生する場合、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい場合がある。

本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば大腸菌（E．coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌属（Staphylococcus）の種々の種を含む原核宿主、好ましくは大腸菌（E．coli）細胞から組換え技術によって産生される産物が含まれる。

哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス40（SV40）（SV40プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞中での高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメントが含まれる。抗体の発現は、構成的であっても調節されていてもよい（例えば、Tet系と組み合わせてテトラサイクリンなどの小分子誘導物質の添加または除去により誘導可能）。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Stinskiによる米国特許第5168062号明細書、Bellらによる米国特許第4510245号明細書およびSchaffnerらによる米国特許第4968615号明細書を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含むこともできる（例えば、米国特許第4399216号明細書、同第4634665号明細書および米国特許第5179017号明細書参照）。適切な選択マーカーには、ベクターが導入された宿主細胞上で、G418、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン／ブレオマイシンもしくはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する遺伝子またはグルタミン合成酵素などの栄養要求性を利用する選択マーカーが含まれる（Bebbingtonら、Biotechnology（N Y）．1992年2月；10（2）：169〜75）。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与し、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のbsd遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンN−アセチルトランスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Sh ble遺伝子はゼオシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は、大腸菌（E．coli）ハイグロマイシン耐性遺伝子（hygまたはhph）によって付与される。DHFRまたはグルタミン合成酵素などの選択マーカーも、MTXおよびMSXと組み合わせた増幅技術に有用である。

発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、電気穿孔、ヌクレオフェクション（nucleofection）、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリカチオンベースのトランスフェクション（ポリエチレンイミン（PEI）ベースのトランスフェクションなど）およびDEAE−デキストラントランスフェクションなどの標準的な技術を用いて行うことができる。

本明細書で提供される抗体、その抗原結合断片またはその変異体を発現するための適切な哺乳動物宿主細胞には、それだけに限らないが、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（CHO−K1、CHO−S、CHO−K1SVなど）［例えば、R．J．KaufmanおよびP．A．Sharp（1982）Mol．Biol．159：601〜621に記載される、DHFR選択マーカーで使用される、UrlaubおよびChasin、（1980）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77：4216〜4220ならびにUrlaubら、Cell．1983年6月；33（2）：405〜12に記載されるdhfr−CHO細胞；およびFanら、Biotechnol Bioeng．2012年4月；109（4）：1007〜15に例示される他のノックアウト細胞を含む］、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、HEK293細胞、HKB11細胞、BHK21細胞、CAP細胞、EB66細胞およびSP2細胞が含まれる。

発現はまた、HEK293、HEK293T、HEK293−EBNA、HEK293E、HEK293−6E、HEK293−Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO−S、CHO−K1、CHO−K1SV、CHOEBNALT85、CHOS−XE、CHO−3E7またはCAP−T細胞などの発現系において一過性または半安定性であり得るだろう（例えば、Durocherら、Nucleic Acids Res．2002年1月15日；30（2）：E9）。

いくつかの実施形態では、発現されたタンパク質が宿主細胞が増殖する培養培地に分泌されるように、発現ベクターを設計する。抗体、その抗原結合断片またはその変異体を、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。

本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、それだけに限らないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホ−セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を精製に使用することもできる。例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、Colligan、Current Protocols in Immunology、またはCurrent Protocols in Protein Science、John Wiley＆Sons、NY、N．Y．、（1997〜2001）、例えば、第1、4、6、8、9、10章を参照されたい。

本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主から組換え技術によって産生される産物が含まれる。組換え産生手順に使用される宿主に応じて、本発明の抗体をグリコシル化することができる、または非グリコシル化することができる。このような方法は、Sambrook、上記、第17．37〜17．42節；Ausubel、上記、第10、12、13、16、18および20章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

好ましい実施形態では、抗体が、（1）例えば、Lowry法、UV−Vis分光法もしくはSDS−キャピラリーゲル電気泳動（例えば、Caliper LabChip GXII、GX90もしくはBiorad Bioanalyzer装置で）によって決定される95重量％超の抗体まで、さらに好ましい実施形態では、99重量％超まで、（2）N末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度まで、または（3）クーマシーブルーもしくは好ましくは、銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下で、SDS−PAGEによる均質性まで、精製される。単離された天然抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製される。

α放射性トリウム成分に関して、²²⁷Thを治療的に有効であると同時に耐えられない骨髄毒性を生じない量で投与することができることが近年の重要な発見である。本明細書で使用される場合、「許容される非骨髄毒性」という用語は、最も重要なことには、投与されたトリウム−227放射性同位体の崩壊によって生じるラジウム−223の量が一般に対象に直接致死的であるのに十分ではないことを示すために使用される。しかしながら、このような治療の許容可能な副作用となる骨髄損傷の量（および致死反応の可能性）は、治療される疾患の種類、治療レジメンの目的および対象の予後によって有意に変化することが当業者に明らかであるだろう。本発明の好ましい対象はヒトであるが、他の哺乳動物、特にイヌなどのコンパニオンアニマルも本発明の使用から利益を得、許容される骨髄損傷のレベルは対象の種も反映し得る。許容される骨髄損傷のレベルは、一般に非悪性疾患に対するよりも悪性疾患の治療において大きいだろう。骨髄毒性のレベルの1つの周知の尺度は好中球細胞数であり、本発明において、²²³Raの許容される非骨髄毒性量は、典型的にはその最低点（最下点）での好中球画分が治療前の数の10％以上となるように制御される量である。好ましくは、²²³Raの許容される非骨髄毒性量は、好中球細胞画分が最下点で少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％となるような量である。少なくとも40％の最下点好中球細胞画分が最も好ましい。

さらに、放射性²²⁷Th含有化合物を、幹細胞サポートまたは同等の回収方法を含める場合に、生成される²²³Raの骨髄毒性が通常耐えられない高線量レジメンにおいて使用することができる。このような場合、好中球細胞数は最下点で10％未満に減少することがあり、例外的に5％または必要に応じて5％未満に減少し、適切な警戒をし、その後の幹細胞サポートを与える。このような技術は当技術分野で周知である。

トリウム−227は製造が比較的容易であり、²²⁷Thの母核種、すなわち²²⁷Ac（T_1／2＝22年）を含有する中性子照射²²⁶Raから間接的に調製することができる。アクチニウム−227は²²⁶Ra標的から極めて容易に分離することができ、²²⁷Thの発生体として使用することができる。この方法は必要ならば工業規模に拡大することができ、したがって分子標的化放射線療法の候補と考えられる他のほとんどのα線放出体で見られる供給の課題を回避することができる。

トリウム−227は、耐えられない骨髄抑制を引き起こすほど多くのラジウム−223を生成することなく、望ましい治療効果を提供するのに十分な量で投与することができる。さらなる治療効果をそれらの崩壊から導出することができるように、娘同位体を標的化領域に維持することが望ましい。しかしながら、許容できない骨髄毒性を誘発することなく有用な治療効果を得るためにトリウム崩壊生成物の制御を維持する必要はない。

腫瘍細胞の殺傷効果がその娘からではなく主にトリウム−227からのものであると仮定すると、この同位体の可能性のある治療線量を他のα線放射体との比較によって確立することができる。例えば、アスタチン−211については、動物における治療線量は典型的には1kg当たり2〜10MBqであった。半減期およびエネルギーを補正することによって、トリウム−227の対応する投与線量は体重1kg当たり少なくとも36〜200kBqとなるだろう。これは、治療効果を期待して有用に投与することができる²²⁷Thの量に下限を設定するだろう。この計算はアスタチンとトリウムの同等の保持を仮定している。しかしながら、明らかに、トリウムの18．7日の半減期は、崩壊前にこの同位体のより大きな排除をもたらす可能性が極めて高い。そのため、この計算投与線量を通常、最小有効量であると見なすべきである。完全に保持された²²⁷Th（すなわち、体から排除されない²²⁷Th）に関して表される治療線量は、典型的には少なくとも18または25kBq／kg、好ましくは少なくとも36kBq／kg、より好ましくは少なくとも75kBq／kg、例えば100kBq／kg以上となるだろう。より多量のトリウムはより大きな治療効果を有すると予想されるだろうが、耐えられない副作用が生じる場合投与することができない。同様に、トリウムを短い生物学的半減期（すなわち、依然としてトリウムを有している体から排除される前の半減期）を有する形態で投与する場合、トリウムが崩壊する前にその多くが排除されるので、治療効果にはより多量の放射性同位体が必要となる。しかしながら、生成されるラジウム−223の量の対応する減少があるだろう。同位体が完全に保持される場合に投与すべきトリウム−227の上記量を、より短い生物学的半減期を有する等価線量に容易に関連づけることができる。このような計算は当技術分野で周知であり、国際公開第04／091668号パンフレット（例えば、実施例1および2の本文中）に示されている。

放射性標識化合物が娘核種を放出する場合、該当する場合、1個または複数の任意の放射性娘核種の運命を知ることが重要である。²²⁷Thでは、主な娘生成物は²²³Raであり、これはその骨親和特性のために臨床評価段階にある。ラジウム−223は血液を非常に急速に通過し、骨格に濃縮されるまたは腸および腎臓経路を介して排泄される（Larsen、J Nucl Med 43（5、補遺）：160P（2002）参照）。そのため、²²⁷Thからインビボで放出されたラジウム−223は、健康な軟部組織に大きな影響を与えないだろう。溶解クエン酸塩としての²²⁷Thの分布に関するMullerのInt．J．Radiat．Biol．20：233〜243（1971）の研究において、軟部組織中で²²⁷Thから生成された²²³Raは骨に容易に再分配される、または排泄されることが分かった。よって、特に骨髄に対するα放射性ラジウムの公知の毒性は、トリウム投与線量の問題である。

実際には、少なくとも200kBq／kgの線量の²²³Raをヒト対象に投与することができ、これが許容され得ることが、国際公開第04／091668号パンフレットで初めて確立された。これらのデータはその刊行物に提示されている。そのため、全く思いがけず、対象が深刻なまたは致死的でさえある骨髄毒性の許容できないリスクを被るという予想なしに、治療上有効量の²²⁷Th（36kBq／kg超など）を哺乳動物の対象に投与することができる治療濃度域が存在することがここで分かる。それにもかかわらず、この治療濃度域を最大限に利用することが非常に重要であるので、線量の最大可能割合が標的部位に送達されるように、放射性トリウムを迅速かつ効率的に錯化し、非常に高い親和性で保持することが必須である。

²²⁷Th医薬品から生成される²²³Raの量は、放射性標識化合物の生物学的半減期に依存する。理想的な状況は、腫瘍細胞への内在化、強い腫瘍保持および正常組織における短い生物学的半減期を含む、急速な腫瘍取り込みを伴う錯体を使用することであろう。しかしながら、²²³Raの線量が許容レベル内に維持される限り、理想的な生物学的半減期より短い錯体が有用となり得る。インビボで生成されるラジウム−223の量は、投与されるトリウムの量およびトリウム錯体の生物学的保持時間の因子となるだろう。任意の特定の場合において生成されるラジウム−223の量は、当業者によって容易に計算され得る。²²⁷Thの最大投与可能量は、インビボで生成されるラジウムの量によって決定され、許容できないレベルの副作用、特に骨髄毒性を生じる量よりも少なくなければならない。この量は一般に300kBq／kg未満、特に200kBq／kg未満、より好ましくは170kBq／kg未満（例えば、130kBq／kg未満）であるだろう。最小有効線量は、トリウムの細胞傷害性、生成されたα照射に対する患部組織の感受性、ならびに標的化錯体（この場合、配位子と標的化部分の組み合わせである）によってトリウムが効率的に結合、保持および送達される程度によって決定される。

本発明の方法では、トリウム錯体が、望ましくは18〜400kBq／kg体重、好ましくは36〜200kBq／kg（50〜200kBq／kgなど）、より好ましくは75〜170kBq／kg、特に100〜130kBq／kgのトリウム−227投与線量で投与される。対応して、単回投与線量は、おおよそこれらの範囲のいずれか×適切な体重、例えば30〜150kg、好ましくは40〜100kg（例えば、1回の投与線量当たり540kBq〜4000kBqの範囲）を含み得る。トリウム投与線量、錯化剤および投与経路は、さらに望ましくは、インビボで生成されるラジウム−223投与線量が300kBq／kg未満、より好ましくは200kBq／kg未満、なおさらに好ましくは150kBq／kg未満、特に100kBq／kg未満となるようなものであるだろう。さらに、これは、これらの範囲に、示される体重のいずれかをかけることによって、示される²²³Raへの被曝を提供する。上記の線量レベルは、好ましくは²²⁷Thの完全に保持された線量であるが、いくらかの²²⁷Thは崩壊する前に体から除去されることを考慮に入れた投与線量であり得る。

²²⁷Th錯体の生物学的半減期が物理的半減期と比較して短い場合（例えば、7日未満、特に3日未満）、同等の保持線量を提供するために、かなり多い投与線量が必要とされ得る。よって、例えば、150kBq／kgの完全に保持された線量は、711kBq／kgの線量で投与された5日の半減期を有する錯体と等価である。当技術分野で周知の方法を使用して、任意の適切な保持線量についての等価投与線量を錯体の生物学的クリアランス速度から計算することができる。

1個の²²⁷Th核の崩壊は1個の²²³Ra原子を提供するので、²²⁷Thの保持および治療活性は患者が被った²²³Ra線量に直接関連するだろう。任意の特定の状況において生成される²²³Raの量は、周知の方法を使用して計算することができる。

そのため、好ましい実施形態では、本発明は、（本明細書に記載される）哺乳動物対象の疾患を治療する方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される少なくとも1種の組織標的化トリウム錯体を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。

²²³Ra娘同位体の特性が有用に使用されない限り、²²³Ra娘同位体への対象の被爆を最小限にすることが明らかに望ましい。特に、インビボで生成されるラジウム−223の量は、典型的には40kBq／kg超、例えば60kBq／Kg超となるだろう。場合によっては、インビボで生成される²²³Raが80kBq／kg超、例えば100または115kBq／kg超であることが必要となるだろう。

適切な担体溶液中のトリウム−227標識コンジュゲートを、静脈内、腔内（例えば、腹腔内）、皮下、経口または局所的に、単回施用としてまたは分割施用レジメンで投与することができる。好ましくは、標的化部分にコンジュゲートしている錯体を、非経口（例えば、経皮）経路、特に静脈内または腔内経路によって溶液として投与する。好ましくは、本発明の組成物を、非経口投与用の滅菌溶液に製剤化する。

本発明の方法および生成物におけるトリウム−227は、単独で、または手術、体外照射療法、化学療法、他の放射性核種もしくは組織温度調整等を含む他の治療法と組み合わせて使用することができる。これは本発明の方法のさらなる好ましい実施形態を形成し、製剤／医薬品は対応して少なくとも1種のさらなる治療活性剤、例えば他の放射性剤または化学療法剤を含み得る。

1つの特に好ましい実施形態では、対象を、幹細胞治療および／または他の支持療法にも供して、ラジウム−223誘発骨髄毒性の効果を軽減する。

本発明のトリウム（例えば、トリウム−227）標識分子は、疾患関連受容体を標的化することによって、癌性または非癌性疾患の治療に使用することができる。典型的には、²²⁷Thのこのような医学的使用は、癌性または非癌性疾患を治療するための、キレート剤による抗体、抗体断片、または抗体もしくは抗体断片の構築物への²²⁷Thの連結に基づく放射免疫療法によるだろう。本発明による方法および医薬品における²²⁷Thの使用は、乳がん、胃がん、卵巣がん、非小細胞肺癌（NSCLC）および子宮がんの治療に特に適している。

本発明のさらなる実施形態では、軟部組織と骨格疾患の両方を有する患者を、投与されたトリウムによってインビボで生成される²²⁷Thと²²³Raの両方によって治療することができる。この特に有利な態様では、治療に対する余分の治療成分が、骨格疾患を標的化することによって許容される非骨髄毒性量の²²³Raから誘導される。この治療方法では、²²⁷Thが典型的には軟部組織の原発がんおよび／または転移性がんを適切に標的化することによって治療するために利用され、²²⁷Th崩壊から生成される²²³Raが同じ対象の関連骨格疾患を治療するために利用される。この骨格疾患は、原発軟部組織がんから生じる骨格への転移であり得る、または軟部組織治療が転移性がんに対抗することである原発性疾患であり得る。時折、軟部組織および骨格疾患は無関係であり得る（例えば、リウマチ性軟部組織疾患を有する患者における骨格疾患のさらなる治療）。

以下にいくつかの合成例を示す。これらの合成に示されるステップは、本発明の多くの実施形態に適用可能であるだろう。ステップa）は、例えば、本明細書に記載される実施形態の多くまたは全てにおいて、以下に示さる中間体AGC0021を介して進行し得る。
AGC0020重要中間体の合成
N，N，N’，N’−テトラキス（2−アミノエチル）−2−（4−ニトロベンジル）プロパン−1，3−ジアミン
a）ジメチルマロネート、水素化ナトリウム、THF、b）DIBAL−H、THF、c）MsCl、NEt₃、CH₂Cl₂、d）イミダゾール、Boc₂O、CH₂Cl₂、トルエン、e）DIPEA、アセトニトリル、f）MeOH、水、AcCl
AGC0021重要中間体の合成
3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−4−［（2−チオキソ−1，3−チアゾリジン−3−イル）カルボニル］ピリジン−2（1H）−オン
a）ジエチルオキサレート、カリウムエトキシド、トルエン、EtOH、b）Pd／C、p−キシレン、c）MeI、K₂CO₃、DMOS、アセトン、d）i）BBr₃、DCM、ii）BnBr、K₂CO₃、KI、アセトン、e）NaOH、水、MeOH、f）
DCC、DMAP、DCM
式（VIII）の化合物のキレートの合成
4−｛［4−（3−［ビス（2−｛［（3−ヒドロキシ−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−イル）カルボニル］アミノ｝エチル）アミノ］−2−｛［ビス（2−｛［（3−ヒドロキシ−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−イル）カルボニル］アミノ｝エチル）アミノ］メチル｝プロピル）フェニル］アミノ｝−4−オキソブタン酸

本発明の錯体の形成方法においては、八座キレート剤と組織標的化部分との間のカップリング反応を水溶液中で行うことが好ましい。これにはいくつかの利点がある。第一に、これは全ての溶媒を許容レベル未満まで除去し、その除去を証明する製造者の負担を取り除く。第二に、これは廃棄物を減らし、最も重要なことに、これは分離または除去ステップを回避することによって製造を加速する。本放射性医薬品の文脈では、放射性同位体が常に崩壊し、調製に費やされる時間が貴重な材料を無駄にし、汚染娘同位体を導入するので、合成を可能な限り迅速に行うことが重要である。

適切な水溶液には、精製水、および当技術分野で周知の多くの緩衝剤のいずれかなどの緩衝液が含まれる。酢酸、クエン酸、リン酸（例えば、PBS）およびスルホン酸緩衝液（MESなど）は周知の水性緩衝液の典型例である。

一実施形態では、本方法が、（本明細書全体を通して記載される）八座ヒドロキシピリジノン含有配位子の第1の水溶液および（本明細書全体を通して記載される）組織標的化部分の第2の水溶液を形成するステップと、前記第1の水溶液と前記第2の水溶液を接触させるステップとを含む。

適切なカップリング部分は上で詳細に論じられており、カップリングおよび／または連結基として本明細書で論じられている全ての基および部分が、標的化部分を配位子にカップリングするために適切に使用され得る。いくつかの好ましいカップリング基には、アミド、エステル、エーテルおよびアミンカップリング基が含まれる。エステルおよびアミドは、カルボン酸からの活性化エステル基の生成によって好都合に形成され得る。このようなカルボン酸は、標的化部分上、カップリング部分上および／または配位子部分上に存在することができ、典型的にはアルコールまたはアミンと反応してエステルまたはアミドを形成するだろう。このような方法は当技術分野において極めて周知であり、DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等などのN−ヒドロキシマレイミド、カルボジイミドおよび／またはアゾジカルボキシレート活性化試薬を含む周知の活性化試薬を利用することができる。

好ましい実施形態では、N−位がメチルアルキル基で置換された4個のヒドロキシピリジノン部分とカルボン酸基で終結するカップリング部分とを含む八座キレート剤が、少なくとも1種のカップリング試薬（本明細書に記載されるもののいずれかなど）およびN−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）などの活性化剤を使用して八座キレート剤のNHSエステルを形成して活性化され得る。この活性化（例えば、NHS）エステルは、遊離アミン基を有する任意の組織標的化部分（例えば、リジン側鎖上）とのカップリングのために分離され得るまたは分離しないで使用され得る。他の活性化エステルは当技術分野で周知であり、フッ素化基、トシレート、メシレート、ヨウ化物等などの有効な脱離基の任意のエステルであり得る。しかしながら、NHSエステルが好ましい。

カップリング反応は、好ましくは比較的短期間にわたって周囲温度付近で行われる。1段階または2段階カップリング反応の典型的な期間は、約1〜240分、好ましくは5〜120分、より好ましくは10〜60分であるだろう。カップリング反応の典型的な温度は0〜90℃、好ましくは15〜50℃、より好ましくは20〜40℃であるだろう。約25℃または約38℃が適切である。

八座キレート剤の標的化部分へのカップリングは、典型的には、標的化部分の結合能力に悪影響を及ぼさない（または少なくとも不可逆的には影響を及ぼさない）条件下で行われるだろう。結合剤は一般的にペプチドまたはタンパク質ベースの部分であるので、これは変性または二次／三次構造の喪失を回避するために比較的温和な条件を必要とする。（全ての文脈において本明細書で論じられる）水性条件が好ましく、極端なpHおよび／または酸化還元を回避することが望ましいだろう。よって、ステップb）は、pH3〜10、好ましくは4〜9、より好ましくは4．5〜8で行われ得る。酸化還元に関して中性である、または空気中での酸化を回避するために非常に温和に還元する条件が望ましいかもしれない。

本発明の全ての態様に適用可能な好ましい組織標的化キレート剤は、本明細書に記載されるAGC0018である。AGC0018と²²⁷Thのイオンの錯体が、本発明の錯体および対応する製剤、使用、方法等の好ましい実施形態を形成する。本発明の全てのこのような態様において使用可能な他の好ましい実施形態には、プロリルエンドペプチダーゼFAPに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体を含む（本明細書に記載される）組織標的化部分にコンジュゲートしたAGC0019の²²⁷Th錯体が含まれる。

本発明をここで以下の非限定的実施例によって説明する。実施例に例示される全ての化合物は、（好ましい中間体および前駆体を含む）本発明の好ましい実施態様を形成し、文脈が許す限り任意の態様で個別にまたは任意の組み合わせで使用することができる。

実施例1
式（III）の化合物の合成

実施例1．1
ジメチル2−（4−ニトロベンジル）マロネートの合成
水素化ナトリウム（60％分散液、11．55g、289mmol）を0℃でテトラヒドロフラン（THF）450mLに懸濁した。ジメチルマロネート（40．0mL、350mmol）を約30分間にわたって滴加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌した。THF150mLに溶解した4−ニトロベンジルブロミド（50．0g、231mmol）を0℃で約30分間、引き続いて周囲温度で2時間にわたって滴加した。

酢酸エチル（EtOAc）500mLおよびNH₄Cl（水溶液、飽和）250mLを添加した後、溶液を濾過した。相を分離した。水相をEtOAc 2×250mLで抽出した。有機相を合わせ、食塩水250mLで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。

ヘプタン300mLおよびメチルtert−ブチルエーテル（MTBE）300mLを残渣に添加し、60℃に加熱した。溶液を濾過した。濾液を一晩冷凍庫に入れ、濾過した。濾過ケークをヘプタン200mLで洗浄し、減圧下で乾燥させると、標記化合物が灰白色固体として得られた。
収量：42．03g、157．3mmol、68％。
1H−NMR（400 MHz，CDCl3）：3．30（d，2H，7．8 Hz），3．68（t，1H，7．8 Hz），3．70（s，6H），7．36（d，2H，8．7 Hz），8．13（d，2H，8．7 Hz）．

実施例1．2
2−（4−ニトロベンジル）プロパン−1，3−ジオールの合成
ジメチル2−（4−ニトロベンジル）マロネート（28．0g、104．8mmol）を0℃でTHF 560mLに溶解した。水素化ジイソブチルアルミニウム（DIBAL−H）（ヘキサン中1M、420mL、420mmol）を0℃で約30分間にわたって滴加した。反応混合物を0℃で2時間撹拌した。

水20mLを0℃で反応混合物に滴加した。NaOH 20mL（水溶液、15％）を0℃で反応混合物に滴加し、引き続いて水20mLを反応混合物に滴加した。混合物を0℃で20分間撹拌した後、MgSO4約150gを添加した。混合物を室温で30分間撹拌した後、これをブフナー漏斗で濾過した。濾過ケークをEtOAc 500mLで洗浄した。濾過ケークを取り出し、EtOAc 800mLおよびMeOH 200mLで約30分間撹拌した後、溶液を濾過した。濾液を合わせ、減圧下で乾燥させた。

ヘプタン中EtOAcの勾配、引き続いてEtOAc中MeOHの勾配を使用するシリカ上DFCによって、標記化合物が淡黄色固体として得られた。
収量：15．38g、72．8mmol、69％。
1H−NMR（400MHz，CDCl3）：1．97−2．13（m，3H），2．79（d，2H，7．6 Hz），3．60−3．73（m，2H），3．76−3．83（m，2H），7．36（d，2H，8．4 Hz），8．14（d，2H，8．4 Hz）．

実施例1．3
2‐（4‐ニトロベンジル）プロパン‐1，3‐ジイルジメタンスルホネートの合成
2−（4−ニトロベンジル）プロパン−1，3−ジオール（15．3g、72．4mmol）を0℃でCH₂Cl₂ 150mLに溶解した。トリエチルアミン（23mL、165mmol）を添加し、引き続いてメタンスルホニルクロリド（12mL、155mmol）を約15分間にわたって滴加し、引き続いて周囲温度で1時間撹拌した。

CH₂Cl₂ 500mLを添加し、混合物をNaHCO₃（水溶液、飽和）2×250mL、HCl（水溶液、0．1M）125mLおよび食塩水250mLで洗浄した。有機相をNa₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥させると、標記化合物が橙色固体として得られた。
収量：25．80g、70．2mmol、97％。
1H−NMR（400MHz，CDCl3）：2．44−2．58（m，1H），2．87（d，2H，7．7 Hz），3．03（s，6H），4．17（dd，2H，10．3，6．0 Hz），4．26（dd，2H，10．3，4．4 Hz），7．38（d，2H，8．6 Hz），8．19（d，2H，8．6 Hz）．

実施例1．4
ジ‐tert‐ブチル（アザンジイルビス（エタン‐2，1‐ジイル））ジカルバメートの合成
イミダゾール（78．3g、1．15mol）を室温でCH₂Cl₂ 500mLに懸濁した。ジ−tert−ブチルジカーボネート（Boc₂O）（262．0g、1．2mol）を少しずつ添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を水3×750mLで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で除去した。

残渣をトルエン250mLに溶解し、ジエチレントリアミン（59．5mL、550mmol）を添加した。反応混合物を60℃で2時間撹拌した。

CH₂Cl₂ 1Lを添加し、有機相を水2×250mLで洗浄した。有機相をNa₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量した。

トリエチルアミンを含むCH₂Cl₂中メタノール（MeOH）の勾配を使用するシリカ上DFCによって、標記化合物が無色固体として得られた。
収量：102g、336mmol、61％。
¹H−NMR（400MHz，CDCl3）：1．41（s，18H），1．58（bs，1H），2．66−2．77（m，4H），3．13−3．26（m，4H），4．96（bs，2H）．

実施例1．5
テトラ‐tert‐ブチル（（（2‐（4‐ニトロベンジル）プロパン‐1，3‐ジイル）ビス（アザネトリイル））テトラキス（エタン‐2，1‐ジイル））テトラカルバメートの合成
2−（4−ニトロベンジル）プロパン−1，3−ジイルジメタンスルホネート（26．0g、71mmol）およびジ−tert−ブチル（アザンジイルビス（エタン−2，1−ジイル）ジカルバメート（76．0g、250mmol）をアセトニトリル700mLに溶解した。N，N−ジイソプロピルエチルアミン（43mL、250mmol）を添加した。反応混合物を還流で4日間撹拌した。

揮発性物質を減圧下で除去した。

ヘプタン中EtOAcの勾配を使用するシリカ上DFCによって、標記化合物が淡黄色固体泡として得られた。
収量：27．2g、34．8mmol、49％。
¹H−NMR（400MHz，CDCl3）：1．40（s，36H），1．91−2．17（m，3H），2．27−2．54（m，10H），2．61−2．89（m，2H），2．98−3．26（m，8H），5．26（bs，4H），7．34（d，2H，8．5 Hz），8．11（d，2H，8．5 Hz）．

実施例1．6
N¹，N¹’−（2−（4−ニトロベンジル）プロパン−1，3−ジイル）ビス（N¹−（2−アミノエチル）エタン−1，2−ジアミン）、AGC0020の合成
テトラ‐tert‐ブチル（（（2‐（4‐ニトロベンジル）プロパン‐1，3‐ジイル）ビス（アザネトリイル））テトラキス（エタン‐2，1‐ジイル））テトラカルバメート（29．0g、37．1mmol）をMeOH 950mLおよび水50mLに溶解した。塩化アセチル（50mL、0．7mol）を30℃で約20分間にわたって滴加した。反応混合物を一晩撹拌した。

揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を水250mLに溶解した。CH₂Cl₂ 500mL、引き続いてNaOH（水溶液、5M、NaClで飽和）175mLを添加した。相を分離し、水相をCH₂Cl₂．4×250mLで抽出した。有機相を合わせ、Na₂SO₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥させると、標記化合物が粘性赤褐色油として得られた。
収量：11．20g、29．3mmol、79％。純度（HPLC図9）：99．3％。
¹H−NMR（300MHz，CDCl₃）：1．55（bs，8H），2．03（dt，1H，6．6，13．3 Hz），2．15（dd，2H，12．7，6．6），2．34−2．47（m，10H），2．64−2．77（m，10H），7．32（d，2H，8．7 Hz），8．10（d，2H，8．7 Hz）．
¹³C−NMR（75MHz，CDCl₃）：37．9，38．5，39．9，58．0，58．7，123．7，130．0，146．5，149．5

実施例1．7
エチル5−ヒドロキシ−6−オキソ−1，2，3，6−テトラヒドロピリジン−4−カルボキシレートの合成
2−ピロリジノン（76mL、1mol）およびジエチルオキサレート（140mL、1．03mol））を室温でトルエン1Lに溶解した。カリウムエトキシド（EtOK）（EtOH中24％、415mL、1．06mol）を添加し、反応混合物を90℃に加熱した。

反応混合物の増粘のために、反応の最初の1時間の間にEtOH 200mLを少しずつ添加した。反応混合物を一晩撹拌し、室温に冷却した。撹拌しながら、HCl（5M、水溶液）210mLをゆっくり添加した。

食塩水200mLおよびトルエン200mLを添加し、相を分離した。

水相をCHCl₃ 2×400mLで抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Na₂SO₄）、濾過し、真空中で減量した。残渣をEtOAcから再結晶すると、標記化合物が淡黄色固体として得られた。
収量：132．7g、0．72mol、72％。

実施例1．8
エチル3−ヒドロキシ−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレートの合成
｛エチル5−ヒドロキシ−6−オキソ−1，2，3，6−テトラヒドロピリジン−4−カルボキシレート｝（23．00g、124．2mmol）をp−キシレン150mLに溶解し、パラジウム炭素（10％、5．75g）を添加した。反応混合物を還流で一晩撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物をMeOH 300mLで希釈し、Celite（登録商標）の短いパッドを通して濾過した。パッドをMeOH 300mLで洗浄した。溶媒を真空中で除去すると、標記化合物が薄赤褐色がかった固体として得られた。
収量：19．63g、107．1mmol、86％。MS（ESI、pos）：206．1［M＋Na］^＋、389．1［2M＋Na］^＋

実施例1．9
エチル3−メトキシ−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレートの合成
｛エチル3−ヒドロキシ−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレート｝（119．2g、0．65mol）を室温でジメチルスルホキシド（DMSO）600mLおよびアセトン1．8Lに溶解した。K₂CO₃（179．7g、1．3mol）を添加した。アセトン600mLに溶解したヨウ化メチル（MeI）（162mL、321mmol）を室温で約1時間にわたって滴加した。

反応混合物を室温でさらに2時間撹拌した後、MeI（162mL、2．6mol）を添加した。反応混合物を還流で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で減量し、EtOAc 2．5Lを添加した。

混合物を濾過し、減圧下で減量した。ヘプタン中EtOAcの勾配を使用するSiO₂でのドライフラッシュクロマトグラフィー（DFC）による精製によって、標記化合物が得られた。
収量：56．1g、210．1mmol、32％。MS（ESI、pos）：234．1［M＋Na］^＋、445．1［2M＋Na］^＋

実施例1．10
エチル3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレートの合成
｛エチル3−メトキシ−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレート｝（5．93g、28．1mmol）を−78℃でジクロロメタン（DCM）80mLに溶解し、DCM 20mLに溶解したBBr₃（5．3mL、56．2mmol）を滴加した。反応混合物を−78℃で1時間撹拌した後、反応物を0℃に加熱した。tert−ブチルメチルエーテル（tert−BuOMe）25mLおよびMeOH 25mLを滴加して反応物をクエンチした。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をDCM 90mLおよびMeOH 10mLに溶解し、SiO₂の短いパッドを通して濾過した。パッドをDCM中10％MeOH 200mLで洗浄した。揮発性物質を真空中で除去した。残渣をアセトン400mLに溶解した。K₂CO₃（11．65g、84．3mmol）、KI（1．39g、8．4mmol）および臭化ベンジル（BnBr）（9．2mL、84．3mmol）を添加した。反応混合物を還流で一晩撹拌した。反応混合物をEtOAc 200mLで希釈し、水3x50mLおよび食塩水50mLで洗浄した。合わせた水相をEtOAc 2×50mLで抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Na₂SO₄）、濾過し、揮発性物質を真空中で除去し、溶離液としてヘプタン中EtOAc（40〜70％）を使用するSiO₂でのドライフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、標記化合物が得られた。
収量：5．21g、18．1mmol、65％。MS（ESI、pos）：310．2［M＋Na］^＋、597．4［2M＋Na］^＋

実施例1．11
3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボン酸の合成
｛エチル3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボキシレート｝（27．90g、97．1mmol）をMeOH 250mLに溶解し、NaOH（5M、水溶液）60mLを添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した後、反応混合物を真空中で約1／3に濃縮した。残渣を水150mLで希釈し、塩化水素（HCl）（5M、水溶液）を用いてpH2に酸性化した。沈殿を濾過し、真空中で乾燥させると、標記化合物が無色固体として得られた。収量：22．52g、86．9mmol、89％。

実施例1．12
3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−4−（2−チオオキソチアゾリジン−3−カルボニル）ピリジン−2（1H）−オン（AGC0021）の合成
｛3−（ベンジルオキシ）−1−メチル−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリジン−4−カルボン酸｝（3．84g、14．8mmol）、4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）（196mg、1．6mmol）および2−チアゾリン−2−チオール（1．94g、16．3mmol）をDCM 50mLに溶解した。N，N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（3．36g、16．3mmol）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。反応物を濾過し、固体をDCMで洗浄し、濾液を真空中で減量した。得られた黄色固体をイソプロパノール／DCMから再結晶すると、AGC0021が得られた。収量：4．65g、12．9mmol、87％。MS（ESI、pos）：383［M＋Na］^＋、743［2M＋Na］^＋

実施例1．13
AGC0023の合成
AGC0020（8．98g；23．5mmol）をCH₂Cl₂（600mL）に溶解した。AGC0021（37．43g；103．8mmol）を添加した。反応物を室温で20時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。

EtOAcとCH₂Cl₂の1：1混合物中メタノールの勾配を用いたSiO₂でのDFCによって、AGC0023が固体泡として得られた。
平均収量：26．95g、20．0mmol、85％。

実施例1．14
AGC0024の合成
AGC0023（26．95g；20．0mmol）をエタノール（EtOH）（675mL）に溶解した。鉄（20．76g；0．37mol）およびNH₄Cl（26．99g；0．50mol）、引き続いて水（67mL）を添加した。反応混合物を70℃で2時間撹拌した。さらなる鉄（6．75g；121mmol）を添加し、反応混合物を74℃で1時間撹拌した。さらなる鉄（6．76g；121mmol）を添加し、反応混合物を74℃で1時間撹拌した。反応混合物を冷却した後、反応混合物を減圧下で減量した。

CH₂Cl₂中メタノールの勾配を用いたSiO₂でのDFCによって、AGC0024が固体泡として得られた。
収量18．64g、14．2mmol、71％。

実施例1．15
AGC0025の合成
AGC0024（18．64g；14．2mmol）をCH₂Cl₂（750mL）に溶解し、0℃に冷却した。BBr₃（50g；0．20mol）を添加し、反応混合物を75分間撹拌した。0℃で撹拌しながらメタノール（MeOH）（130mL）を慎重に添加することによって反応物をクエンチした。揮発性物質を減圧下で除去した。HCl（EtOH中1．25M、320mL）を残渣に添加した。次いで、フラスコをロータリーエバポレーターを使用して大気圧および周囲温度で15分間回転させた後、揮発性物質を減圧下で除去した。

水中アセトニトリル（ACN）の勾配を使用する、末端キャップされていないC₁₈シリカでのDFCによって、AGC0025がわずかに橙色のガラス状固体として得られた。
収量13．27g、13．9mmol、98％。

実施例1．16
AGC0019の合成
AGC0025（10．63g；11．1mmol）を室温でACN（204mL）および水（61mL）に溶解した。無水コハク酸（2．17g；21．7mmol）を添加し、反応混合物を2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で減量した。水中ACNの勾配を用いた末端キャップされていないC₁₈シリカでのDFCによって、緑色がかったガラス状固体が得られた。

固体を40℃でMeOH（62mL）および水（10．6mL）に溶解した。溶液を超音波処理下でEtOAc（750mL）に滴加した。沈殿を濾過し、EtOAcで洗浄し、減圧下で乾燥させると、AGC0019が緑色がかった色調を有する灰白色固体として得られた。
収量：9．20g、8．7mmol、78％。H−NMR（400 MHz，DMSO−d₆），¹³C−NMR（100 MHz，DMSO−d₆）。

実施例2
純粋なトリウム−227の単離
トリウム−227をアクチニウム−227発生体から単離する。ラジウム−226の熱中性子照射、引き続いてラジウム−227のアクチニウム−227への崩壊（t1／2＝42．2分）によって、アクチニウム−227を製造した。トリウム−227を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、8M HNO₃溶液中でアクチニウム−227崩壊混合物から選択的に保持した。AG（登録商標）1−X8樹脂（200〜400メッシュ、硝酸塩型）70mgを含有する内径2mm、長さ30mmのカラムを使用した。アクチニウム−227、ラジウム−223および娘がカラムから溶出した後、トリウム−227を12M HClでカラムから抽出した。トリウム−227を含有する溶出液を蒸発乾固し、標識化ステップの前に残渣を0．01M HClに再懸濁した。

実施例3
実施例3．1
プロリルエンドペプチダーゼFAPに対するモノクローナル抗体（AGC3200）の作製
本発明のIgGのアミノ酸配列を含有するDNA配列を、Geneart／Life Technologies（Regensburg、ドイツ）で合成し、適切な発現ベクターにクローニングした。全ての遺伝子をCHO発現についてコドン最適化した。IgGを、NRC Canadaによる発現系（Durocherら、Nucleic Acids Res．2002年1月15日；30（2）：E9）を用いて、またはCHO−K1細胞の安定なトランスフェクション後にHEK293 6E細胞で一過的に発現させた。抗体を、以前に記載されたように（Hristodorovら、Mol Biotechnol（2013）53：326〜335）、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

実施例3．2コンジュゲートAGC3218を得るためのmAb AGC3200とキレート剤AGC0019（式（VIII）の化合物）のカップリング
コンジュゲーションの前に、リン酸緩衝液pH7．5を抗体溶液（AGC3200）に添加して溶液の緩衝能力を増加させる。容器内のAGC3200（mAb）の量を測定する。

PBS中AGC3200に、11％1Mリン酸緩衝液（pH7．4）を添加する。

キレート剤AGC0019を1：1、DMA：0．1M MES緩衝液pH5．4に溶解する。NHSおよびEDCを0．1M MES緩衝液pH5．4に溶解する。

キレート剤／N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）／1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の1／1／3モル当量溶液を調製して、キレート剤を活性化する。

抗体へのコンジュゲーションのために、モル比8／8／25／1（キレート剤／NHS／EDC／mAb）の活性化キレート剤をmAbに装入する。20〜40分後、コンジュゲーション反応物を12％v／vの0．3Mクエン酸でクエンチしてpHを5．5に調整する。

AKTAシステム（GE Healthcare）に接続されたSuperdex 200（GE Healthcare）カラムでのゲル濾過により、AGC3218コンジュゲートの精製および30mM クエン酸塩pH5．5、154mM NaClへの緩衝液交換を行う。Abs 280nmでのタンパク質濃度を測定した後、生成物を緩衝液で製剤化した（30mMクエン酸塩、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg／mL pABA、pH5．5中2．5mg／mL AGC0118を得るため）。最後に、溶液を貯蔵前に0．2μmフィルタを通して滅菌ボトルに濾過する。

実施例3．3
²²⁷Th−AGC3218注射の調製
標識を前記のように行う：
20MBqのトリウム−227クロリドフィルムのバイアルを8M HNO3溶液2mlに溶解し、15分間放置した後、時間とともに成長したラジウム−223を除去するために陰イオン交換カラムに適用するために溶液を取り除く。カラムを8M HNO3 3mlおよび水1mlで洗浄した後、トリウム−227を3M HCl 3mlで溶出する。トリウム−227の溶出活性を測定し、10MBqの線量を空の10mlガラスバイアルに移す。次いで、真空ポンプを使用し、バイアルを加熱ブロック（120℃に設定）に30〜60分間入れて酸を蒸発させる。室温に達した後、放射性標識のために、2．5mg／mlのAGC3218コンジュゲート6mlを添加する。バイアルを穏やかに混合し、室温で15分間放置する。次いで、溶液を滅菌バイアルに滅菌濾過し、iTLC分析のために試料を取り出して使用前にRCPを決定する。

実施例3．4
FAP陽性細胞株Hs68およびU87−MGに対する²²⁷Th−AGC3218の細胞傷害性およびIC₅₀決定
5日間のインキュベーション時間にわたって細胞に添加された全活性の滴定曲線の作成によって、²²⁷Th−AGC3218の細胞傷害性を決定する。実験の前日に、Hs68またはU87−MG細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり2000個播種する。比活性40 kBq／μgでキレート化した²²⁷Th−AGC3218の場合、3倍段階希釈した1．1×10⁻⁴〜20kBq／mlに及ぶ全活性の滴定を細胞に添加する。Hs68またはU87−MG細胞を、それぞれ10％FBSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM培地およびEMEM培地中で培養する。5日目に、CellTiter−Glo発光細胞生存率アッセイ（Promega）を細胞生存率の測定に使用する。滴定曲線をGraphPad Prism 6ソフトウェアに当てはめ、IC₅₀値を決定する。

実施例4
アミドおよびイソチオシアネート結合コンジュゲートの安定性の比較
AGC3218およびイソチオシアネートカップリング部分を有する対応するコンジュゲート（AGC3215）を40℃で11日間水溶液中に貯蔵する。試料を定期的に採取する。

アミド結合コンジュゲートについては、コンジュゲート濃度の測定可能な減少は見られないことが分かる。対照的に、イソチオシアネートコンジュゲートは減少する。

Claims (17)

1. 組織標的化トリウム錯体を形成する方法であって、前記方法は、
   a）式（I）または（II）の八座キレート剤を形成するステップと：
   （式中、R_Cはカルボン酸部分で終結するリンカー部分、例えば
   ［−CH₂−Ph−N（H）−C（＝O）−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］、
   ［−CH₂−CH₂−N（H）−C（＝O）−（CH₂−CH₂−O）_1〜3−CH₂−CH₂−C（＝O）OH］または
   ［−（CH₂）_1〜3−Ph−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］（式中、Phはフェニレン基、好ましくはパラ−フェニレン基である）
   である）；
   b）前記八座キレート剤を
   配列1、11または21の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖；
   および配列5、15または25の1つと配列同一性または類似性を有するペプチド鎖を含む、
   組織標的化部分に結合させ、
   それによって、組織標的化キレート剤を生成するステップと；
   c）前記組織標的化キレート剤を、α放射性トリウム同位体²²⁷Thの4^＋イオンを含む水溶液と接触させるステップと
   を含む方法。
2. ステップb）が水溶液中で行われる、請求項1に記載の方法。
3. 前記アミドカップリング試薬が1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）、N，N’−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）またはN，N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）などのカルボジイミドカップリング試薬である、請求項1または2に記載の方法。
4. ステップb）がpH4〜9の水溶液中で行われる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップb）が15〜50℃で5〜120分間行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップc）が15〜50℃で1〜60分間行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
7. R_Cが
   ［−（CH₂）_1〜3−パラ−フェニレン−N（H）−C（＝O）−（CH₂）_1〜5−C（＝O）OH］、
   好ましくは［−（CH₂）−パラ−フェニレン−N（H）−C（＝O）−（CH₂）₂−C（＝O）OH］
   である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって形成されるまたは形成可能である組織標的化トリウム錯体。
9. 請求項1から8のいずれか一項に定義される少なくとも1種の組織標的化トリウム錯体を含む医薬製剤。
10. クエン酸緩衝液をさらに含む、請求項9に記載の医薬製剤。
11. p−アミノ酪酸（PABA）、および場合によりEDTAおよび／または少なくとも1種のポリソルベートをさらに含む、請求項9または請求項10に記載の医薬製剤。
12. 過形成性疾患または腫瘍性疾患を治療するための医薬品の製造における請求項1から8のいずれか一項に定義される組織標的化トリウム錯体または請求項9から11のいずれか一項に記載の医薬製剤の使用。
13. 前記疾患が結腸がん、直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、皮膚がん、腹膜がん、女性生殖器がん、膀胱がん、胃がん、頭頸部がんおよび肉腫から選択される、請求項12に記載の使用。
14. 請求項1から8のいずれか一項に定義される少なくとも1種の組織標的化トリウム錯体または請求項9から11のいずれか一項に記載の少なくとも1種の医薬製剤の投与を含む、ヒトまたはヒト以外の動物（特にそれを必要とするもの）を治療する方法。
15. 結腸がん、直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、皮膚がん、腹膜がん、女性生殖器がん、膀胱がん、胃がん、頭頸部がんおよび肉腫を治療するための請求項14に記載の方法。
16. 結腸がん、直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、皮膚がん、腹膜がん、女性生殖器がん、膀胱がん、胃がん、頭頸部がんおよび肉腫の治療に使用するための請求項1から8のいずれか一項に定義される組織標的化トリウム錯体または請求項9もしくは10に記載の医薬製剤。
17. i）請求項1または7に定義される八座キレート剤；
    ii）請求項1に定義される少なくとも1つの組織標的化部分；
    iii）少なくとも1種のアミドカップリング試薬；および
    iv）場合により、好ましくは²²⁷Thなどのα放射性トリウム放射性核種
    を含むキット。