KR20190016544A - 방사성-제약 복합체 - Google Patents

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알란 쿠쓰버슨
마르크 트라우트바인
에른스트 베버
제니 칼쏜
스테파니 해머
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바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
바이엘 에이에스
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Abstract

본 발명은 a) N-위치에서 메틸 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 (HOPO) 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 단계; b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를 프롤릴 엔도펩티다제 FAP를 표적화하는 적어도 1종의 조직-표적화 모이어티에 커플링시키는 단계; 및 c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 적어도 1종의 알파-방출 토륨 동위원소의 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법을 제공한다. 이러한 조직-표적화 토륨 복합체, 뿐만 아니라 상기 복합체 및 상응하는 제약 제제의 투여를 포함하는 신생물성 또는 과형성 질환의 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

방사성-제약 복합체
본 발명은 토륨-227과 프롤릴 엔도펩티다제 FAP 항원을 표적화하는 조직 표적화 모이어티에 접합된 특정 옥타덴테이트 리간드와의 복합체의 형성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 복합체, 및 이러한 복합체의 투여를 수반하는, 질환, 특히 신생물성 질환의 치료에 관한 것이다.
특이적 세포 사멸은 포유동물 대상체에서 다양한 질환을 성공적으로 치료하는데 필수적일 수 있다. 이의 전형적인 예는 악성 질환 예컨대 육종 및 암종의 치료이다. 그러나 특정 세포 유형의 선택적 제거는 또한 다른 질환, 특히 과형성 및 신생물성 질환의 치료에서 주요 역할을 할 수 있다.
선택적 치료의 가장 통상적인 방법은 현재 수술, 화학요법 및 외부 빔 조사이다. 그러나, 표적화된 방사성핵종 요법은 고도로 세포독성인 방사선을 질환과 연관된 세포 유형에 특이적으로 전달할 잠재력이 있는 유망하고 발전중인 영역이다. 현재 인간에 사용되도록 인가된 방사성제약의 가장 흔한 형태는 베타-방출 및/또는 감마-방출 방사성핵종을 사용한다. 그러나, 알파-방출 방사성핵종을 요법에 사용하는 것이 그의 보다 특이적인 세포 사멸을 위한 잠재력 때문에 일부 관심을 받은 바 있다.
생리학적 환경에서 전형적인 알파 방출체의 방사선 범위는 일반적으로 100 마이크로미터 미만으로, 이는 단지 수개의 세포의 직경에 해당한다. 이것은 이들 공급원이 미세전이를 포함한 종양의 치료에 잘 적합되도록 하며, 이들이 종양 내 인접 세포에 도달하는 범위를 갖지만 잘 표적화되면 방사된 에너지가 표적 세포 너머로는 거의 지나가지 않을 것이기 때문이다. 따라서, 모든 세포가 표적화될 필요가 없으며, 주위 건강한 조직에 대한 손상이 최소화될 수 있다 (문헌 [Feinendegen et al., Radiat Res 148: 195-201 (1997)] 참조). 대조적으로, 베타 입자는 물에서 1 mm 이상의 범위를 갖는다 (문헌 [Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)] 참조).
알파-입자 방사선의 에너지는 베타 입자, 감마선 및 X선에 의해 운반되는 것과 비교하여 높으며, 전형적으로 5-8 MeV, 또는 베타 입자의 것의 5 내지 10배 및 감마선 에너지의 20배 이상이다. 따라서, 매우 짧은 거리에 걸친 다량의 에너지의 이러한 축적은 α-방사선에 감마 및 베타 방사선과 비교하여 예외적으로 높은 선형 에너지 전달 (LET), 높은 상대 생물학적 효능 (RBE) 및 낮은 산소 증진 비 (OER)를 제공한다 (문헌 [Hall, "Radiobiology for the radiologist", Fifth edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000] 참조). 이것은 알파 방출 방사성핵종의 예외적인 세포독성을 설명하며, 또한 이러한 동위원소의 생물학적 표적화에 대한, 및 허용되지 않는 부작용을 피하기 위해 필요한 알파 방출 방사성핵종 분포의 제어 수준 및 연구에 대한 엄격한 요구를 부과한다.
지금까지, 방사선면역요법에서의 적용과 관련하여, 주요 관심은 211At, 213Bi 및 225Ac에 집중된 바 있고 이들 3종의 핵종은 임상 면역요법 시험에서 탐구된 바 있다.
제안된 바 있는 여러 방사성핵종은 수명이 짧으며, 즉 12시간 미만의 반감기를 갖는다. 이러한 짧은 반감기는 상업적인 방식으로 이들 방사성핵종 기재의 방사성제약을 생산 및 분배하는 것을 어렵게 만든다. 짧은 수명의 핵종의 투여는 또한 표적 부위에 도달하기 전에 신체 내에서 방출될 방사선량의 비율을 증가시킨다.
알파-방출로부터의 반도 에너지는 다수의 경우에 모핵종의 붕괴 위치로부터 딸 핵종의 방출을 초래할 것이다. 이러한 반도 에너지는, 모핵종을 보유할 수도 있는 화학적 환경, 예를 들어 모핵종이 리간드 예컨대 킬레이트화제에 의해 복합체화된 화학적 환경으로부터 많은 딸 핵을 파괴하기에 충분하다. 이것은 심지어 딸 핵종이 동일한 리간드와 화학적으로 상용성인, 즉 동일한 리간드에 의해 복합체화가능한 경우에도 발생할 것이다. 동등하게, 딸 핵종이 기체, 특히 영족 기체 예컨대 라돈이거나, 또는 리간드와 화학적으로 비상용성인 경우에, 상기 방출 효과는 더욱 커질 것이다. 딸 핵종이 수초를 넘는 반감기를 갖는 경우에, 이들은 모핵종을 보유한 복합체화제에 의해 억제되지 않으면서 혈액계 내로 확산될 수 있다. 이어서 이들 유리 방사성 딸 핵종은 바람직하지 않은 전신 독성을 일으킬 수 있다.
223Ra 딸 동위원소의 제어가 유지되는 조건 하에서의 토륨-227 (T1/2 = 18.7일)의 사용은 수년 전에 제안되었다 (WO 01/60417 및 WO 02/05859 참조). 이것은 딸 핵종이 폐쇄된 환경에 의해 보유되도록 하는 담체 시스템이 사용되는 상황에서였다. 한 경우에, 방사성핵종은 리포솜 내에 배치되고, (반도 거리와 비교하여) 상당한 크기의 리포솜은 딸 핵종을 리포솜 내에 보유하는 것을 돕는다. 두 번째 경우에, 골 매트릭스 내에 혼입시키고 따라서 딸 핵종의 방출을 제한하는 방사성핵종의 향골성 복합체가 사용된다. 이들은 잠재적으로 고도로 유리한 방법이지만, 리포솜의 투여는 일부 상황에서 바람직하지 않고, 방사성핵종이 딸 동위원소를 보유하도록 무기질화된 매트릭스에 의해 둘러싸일 수 없는 많은 연부 조직 질환이 존재한다.
보다 최근에, 227Th의 붕괴 시 방출되는 223Ra 딸 핵의 독성은 대등한 핵에 대한 선행 시험으로부터 예측되는 것보다 훨씬 더 많은 정도로 포유동물 신체에서 허용될 수 있는 것으로 확립되었다. 상기 논의된 토륨-227의 라듐 딸을 보유하는 특이적 수단의 부재 하에서, 라듐 독성에 관한 공중 이용가능한 정보는, 토륨-227 붕괴로부터 치료 효과를 달성하는데 요구되는 투여량은 라듐 딸의 붕괴로부터 방사선의 고도로 독성인 및 가능하게는 치사 투여량을 유발할 것이기 때문에 토륨-227을 치료제로서 사용하는 것은 불가능하다는 것, 즉 치료 범위가 존재하지 않는다는 것을 명확하게 하였다.
WO 04/091668은 치료 유효량의 표적화된 토륨-227 방사성핵종이 허용되지 않는 골수독성을 일으키기에 충분한 양의 라듐-223을 생성하지 않으면서 대상체 (전형적으로 포유동물)에게 투여될 수 있는 치료적 치료 범위가 존재한다는 예상외의 발견을 기재하고 있다. 따라서 이것은 골 및 연부-조직 부위 둘 다에서의 모든 유형의 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
상기 개발의 관점에서, 본 발명에 이르러 알파-방출 토륨-227 핵을 생성된 223Ra로부터 기인하는 치사 골수독성 없이 내부방사성핵종 요법에서 사용하는 것이 가능하다. 그럼에도 불구하고, 치료 범위는 비교적 좁은 상태로 남아 있고 모든 경우에 대상체에게 알파-방출 방사성동위원소를 절대적으로 필요한 양 이하로 투여하는 것이 바람직하다. 따라서 이러한 새로운 치료 범위의 유용한 탐구는 알파-방출 토륨-227 핵이 복합체화되어 고도의 신뢰성으로 표적화될 수 있다면 크게 증진될 것이다.
방사성핵종은 끊임없이 붕괴하기 때문에 단리와 대상체 투여 사이에 물질을 취급하는데 소요되는 시간은 매우 중요하다. 또한, 알파-방출 토륨 핵이 제조하기에 신속하고 편리한 형태로, 바람직하게는 표적화 물질의 특성에 비가역적이 아니게 영향을 미치는 소수의 단계, 짧은 인큐베이션 기간 및/또는 온도가 요구되는 형태로 복합체화되고/거나 표적화되고/되거나 투여될 수 있다면 상당한 가치가 있을 것이다. 게다가, 투여 전에 제거를 필요로 하지 않는 용매 중에서 (본질적으로 수용액 중에서) 수행될 수 있는 공정은 용매 증발 또는 투석 단계를 피한다는 상당한 이점을 갖고 있다.
또한 유의하게 증진된 안정성을 입증한 토륨 표지된 약물 제품 제제가 개발될 수 있다면, 그것은 유의한 가치가 있는 것으로 간주될 것이다. 이것은 강건한 제품 품질 표준을 고수하고 동시에 환자 용량을 전달하는 물류 경로를 가능하게 하는 것을 보장하는데 중요하다. 따라서 1-4일의 기간에 걸친 최소 방사선분해를 갖는 제제가 바람직하다.
히드록시피리디논 기를 함유하는 옥타덴테이트 킬레이트화제는 알파 방출체 토륨-277을 배위하는데, 후속적으로 표적화 모이어티에 부착하는데 적합한 것으로 이전에 제시된 바 있다 (WO2011098611). 표적화 분자에 접합하는데 사용되는 개별 반응성 기를 갖는, 아민-기반 스캐폴드에 대해 링커 기에 의해 연결되는 4개의 3,2-히드록시피리디논 기를 함유하는 옥타덴테이트 킬레이트화제가 기재되었다. 이전의 발명의 바람직한 구조는 화합물 ALG-DD-NCS에 제시된 바와 같이, 3,2-히드록시피리디논 기를 함유하고 항체 성분에 바람직한 커플링 화학으로서 이소티오시아네이트 모이어티를 사용하였다. 이소티오시아네이트는 아민 기를 통해 단백질에 표지를 부착하는데 널리 사용된다. 이소티오시아네이트 기는 단백질에서 아미노 말단 및 1급 아민과 반응하고, 항체를 포함한 많은 단백질의 표지에 사용된 바 있다. 이들 접합체에서 형성된 티오우레아 결합은 상당히 안정하지만, 형광 이소티오시아네이트로부터 제조된 항체 접합체가 시간 경과에 따라 저하되는 것으로 보고된 바 있다. [Banks PR, Paquette DM., Bioconjug Chem (1995) 6:447-458]. 플루오레세인 이소티오시아네이트와 아민과의 반응에 의해 형성된 티오우레아는 또한 염기성 조건 하에 구아니딘으로 전환되기 쉽다 [Dubey I, Pratviel G, Meunier BJournal: Bioconjug Chem (1998) 9:627-632]. 긴 생물학적 반감기의 모노클로날 항체에 커플링된 긴 붕괴 반감기 (18.7일)의 토륨-227로 인해, 생체내 및 저장 둘 다에 보다 화학적으로 안정한 접합체를 생성하도록 보다 안정한 연결 모이어티를 사용하는 것이 바람직하다.
히드록시피리디논 리간드의 접합에 대해 가장 관련있는 이전의 연구는 WO2013/167754에 공개되었고, 히드록시알킬 관능기를 포함하는 모이어티를 가용화하는 물을 보유하는 리간드를 개시하고 있다. 이러한 킬레이트 부류의 히드록실 기의 반응성으로 인해, 활성화된 에스테르로서의 활성화는 에스테르화 반응을 통해 생성물의 복합체 혼합물을 유도하는 다중 경쟁 반응이 뒤따름에 따라 불가능하다. 따라서 WO2013/167754의 리간드는 상기 기재된 바와 같이 덜 안정한 티오우레아 접합체를 제공하는 이소티오시아네이트와 같은 대안적 화학을 통해 조직-표적화 단백질에 커플링되어야만 한다. 추가로 WO2013167755 및 WO2013167756은 각각 CD33 및 CD22 표적화 항체에 적용된 히드록시알킬/ 이소티오시아네이트 접합체를 개시하고 있다.
프롤릴 엔도펩티다제 FAP (또한 섬유모세포 활성화 단백질 또는 FAP 알파로 공지됨)는 암 생리학에서 다중 역할을 갖는다 (Jiang et al., Oncotarget. 2016 Mar 15). FAP는 암-연관 섬유모세포 상에서 고도로 발현되고, 또한 암 세포 상에 존재할 수 있다. 상피 암종 (예를 들어 유방, 폐, 결장, 췌장, 두경부)의 90% 초과의 기질 및 골 및 연부 조직 육종의 악성 세포에서 뿐만 아니라 일부 염증성 상태 예컨대 간 경변증 하에서 풍부한 발현이 보고되었다.
FAP는 원래 세포외 매트릭스 리모델링에 연루된 유형 II 막횡단 세린 프로테아제이다. 그것은 직접적으로 및 간접적으로 암 개시, 진행 및 전이에 기여한다. 최근에, FAP-양성 암 연관 섬유모세포에 대한 면역억제 역할이 기재된 바 있으며, 이는 FAP가 적응 종양-연관 항원 및 따라서 매력적인 치료 표적이라는 것을 시사한다.
FAP는 WO2011040972에 기재된 ESC11 항체의 표적이다. ESC11은 인간 및 뮤린 FAP 항원 둘 다를 인식하는 고친화도 항체이다. ESC11 IgG1은 표면 FAP의 하향조정 및 내재화를 유도한다.
본 발명자들은 본 발명에 이르러, 특이적 킬레이트화제를 표적화 모이어티로서 프롤릴 엔도펩티다제 FAP에 대한 모노클로날 항체에 커플링시키고 이어서 알파-방출 토륨 이온을 첨가하여 조직 표적화 복합체를 형성함으로써, 복합체가 온화한 조건 하에서 및 복합체의 저장 및 투여에 보다 안정한 연결 모이어티에 의해 신속하게 생성될 수 있다는 것을 확립하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 따라서
a) 화학식 (I) 또는 (II)의 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 단계:
Figure pct00001
여기서 Rc는 카르복실산 모이어티에서 종결하는 링커 모이어티, 예컨대
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH] (여기서 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기)임;
b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를
서열 1, 11 또는 21 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄 및
서열 5, 15 또는 25 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄
를 포함하는 조직-표적화 모이어티에 커플링시켜
조직-표적화 킬레이트화제를 생성하는 단계; 및
c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 알파-방출 토륨 동위원소 227Th의 4+ 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법을 제공한다.
이러한 복합체에서 (및 바람직하게는 본 발명의 모든 측면에서) 토륨 이온은 일반적으로 옥타덴테이트 히드록시피리디논-함유 리간드에 의해 복합체화될 것이고, 이는 차례로 아미드 결합을 통해 조직 표적화 모이어티에 부착될 것이다.
전형적으로, 상기 방법은 활성 에스테르 (예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS 에스테르))의 형태로 활성화될 수 있는 반응성 카르복실레이트 관능기를 포함하는 3,2-히드록시피리디논-기재 옥타덴테이트 킬레이트의, 계내 활성화를 통한 또는 활성 에스테르 그 자체의 합성 및 단리에 의한 합성 방법일 것이다.
생성된 NHS 에스테르는 광범위한 킬레이트 변형된 단백질 포맷을 생성하기 위해 단순 접합 단계에 사용될 수 있다. 추가로, 고도로 안정한 항체 접합체는 토륨-227로 용이하게 표지된다. 이것은 전형적으로 높은 방사화학적 수율 및 순도로, 주위 온도 또는 그 근처에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 수용액 중에서 수행되고, 한 실시양태에서는 임의의 유기 용매의 부재 또는 실질적인 부재 (1 부피% 미만) 하에 수행될 수 있다.
본 발명의 조직 표적화 복합체는 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게의 투여에 적합한 의약으로 제제화될 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 따라서 본원에 기재된 바와 같은 조직-표적화 복합체의 형성에 이어서 적어도 1종의 제약 담체 및/또는 부형제의 첨가를 포함하는, 제약 제제의 생성 방법을 제공한다. 적합한 담체 및 부형제에는 완충제, 킬레이트화제, 안정화제 및 관련 기술분야에 공지되거나 본원의 임의의 측면에 기재된 다른 적합한 성분을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 조직-표적화 토륨 복합체를 추가로 제공한다. 이러한 복합체는 본원 전체에 걸쳐 기재되는 특색, 특히 본원에 기재된 바람직한 특색을 가질 것이다. 복합체는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능할 수 있다. 따라서 이러한 방법은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체를 생성할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 복합체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 제제는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능할 수 있고, 적어도 1종의 완충제, 안정화제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다. 완충제 및 안정화제의 선택은 이들이 조직-표적화 복합체를 방사선분해로부터 보호하는 것을 함께 돕도록 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 제제에서의 복합체의 방사선분해는 제제의 제조 후 심지어 수일이 지나도 최소이다. 이것은 이러한 기술의 구현 및 실제 적용에 주요한 제품 품질 및 약물 공급의 물류와 연관된 잠재적 이슈를 해결하기 때문에 중요한 이점이다.
본 발명의 맥락에서, "조직 표적화"는 해당 물질 (특히 본원에 기재된 바와 같은 조직-표적화 복합체의 형태인 경우)이 그 자체를 그의 존재 (예를 들어 방사성 붕괴를 전달하기 위해)가 요구되는 적어도 1개의 조직 부위에 우선적으로 국부화시키는 (특히 임의의 접합된 토륨 복합체를 국부화시키는) 역할을 한다는 것을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 따라서 조직 표적화 기 또는 모이어티는 표적화 모이어티를 갖지 않는 동등한 복합체의 농도와 비교하여, 대상체에게 투여 후 상기 대상체의 신체 내 적어도 1개의 목적하는 부위에 대한 보다 큰 국부화를 제공하는 역할을 한다.
본 경우에서의 표적화 모이어티는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP에 대한 특이성을 갖는다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 다양한 측면은, 특히 이환 조직의 선택적 표적화를 위한 질환의 치료에 관한 것 뿐만 아니라 이러한 방법에 유용한 복합체, 접합체, 의약, 제제, 키트 등에 관한 것이다. 모든 측면에서, 이환 조직은 (예를 들어 국부화된 고형 종양의 경우에) 신체 내의 단일 부위에 존재할 수 있거나 또는 (예를 들어 관절염이 수개의 관절에 영향을 미치는 경우 또는 분포되거나 전이된 암성 질환의 경우에) 복수의 부위에 존재할 수 있다.
표적화될 이환 조직은 연부 조직 부위, 석회화 조직 부위 또는 모두 연부 조직에, 모두 석회화 조직에 있을 수 있는 복수의 부위에 있을 수 있거나 또는 적어도 1개의 연부 조직 부위 및/또는 적어도 1개의 석회화 조직 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1개의 연부 조직 부위가 표적화된다. 표적화의 부위 및 질환 기원의 부위는 동일할 수 있지만, 대안적으로 (예컨대 전이 부위가 특이적으로 표적화되는 경우에) 상이할 수 있다. 1개 초과의 부위가 수반되는 경우에 이는 기원의 부위를 포함할 수 있거나 복수의 2차 부위일 수 있다.
용어 "연부 조직"은 "경질" 무기질화 매트릭스를 갖지 않는 조직을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 연부 조직은 골격 조직이 아닌 임의의 조직일 수 있다. 상응하게, 본원에 사용된 바와 같은 "연부 조직 질환"은 본원에 사용된 바와 같은 "연부 조직"에서 발생하는 질환을 제시한다. 본 발명은 암 및 "연부 조직 질환"의 치료에 특히 적합하고 따라서 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종, 및 임의의 "연부" (즉 비-무기질화) 조직에서 발생하는 혼합형 암 뿐만 아니라 이러한 조직의 다른 비암성 질환을 포괄한다. 암성 "연부 조직 질환"은 연부 조직에서 발생하는 고형 종양 뿐만 아니라 전이 및 미세-전이성 종양을 포함한다. 실제로, 연부 조직 질환은 동일한 환자에서 연부 조직의 원발성 고형 종양 및 연부 조직의 적어도 1종의 전이성 종양을 포함할 수 있다. 대안적으로, "연부 조직 질환"은 단지 원발성 고형 종양 또는 단지 원발성 종양이 골격 질환인 전이만으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 프롤릴 엔도펩티다제 FAP 표적화 작용제를 사용하는 치료에 적합한 신생물의 예는 결장, 직장, 폐, 유방, 췌장, 피부, 복막, 여성 생식 기관, 방광, 위 및 두경부의 상피 암종 뿐만 아니라 육종을 포함한다.
항체 접합체가 저장 시 허용되는 기간 동안 안정한 것이 본 발명의 성공의 주요 기여이다. 따라서 비-방사성 항체 접합체 및 최종 토륨-표지된 약물 제품 둘 다의 안정성은 방사성제약 제품의 제조 및 분배를 위해 요구되는 엄격한 기준을 충족해야 한다. 조직-표적화 복합체를 포함하는 본원에 기재된 제제가 저장 시 탁월한 안정성을 나타내는 것은 놀라운 발견이었다. 이것은 심지어 전형적으로 가속 안정성 연구에 사용되는 승온에도 적용된다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 한 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 특히, 시트레이트 완충제의 사용이 놀랍게도 안정한 제제를 제공하는 것으로 발견된 바 있다. 이것은 바람직하게는 1-100 mM (pH 4-7) 범위, 특히 10 내지 50 mM 범위에서의 시트레이트 완충제이지만, 가장 바람직하게는 20-40 mM 시트레이트 완충제이다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 p-아미노부티르산 (PABA)을 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 조합은 PABA와 조합된 (바람직하게는 본원에 기재된 농도의) 시트레이트 완충제이다. 다른 작용제와 조합한 것을 포함한, 본 발명의 임의의 측면에 사용하기 위한 PABA의 바람직한 농도는 약 0.005 내지 5 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/ml 및 보다 바람직하게는 0.01 내지 1mg/ml이다. 0.1 내지 0.5 mg/ml의 농도가 가장 바람직하다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 조합은 시트레이트 완충제와 EDTA의 사용이다. 특히 바람직한 조합은 PABA의 존재 하의 시트레이트 완충제와 EDTA의 사용이다. 이러한 조합에서 시트레이트, PABA 및 EDTA는 적절한 경우에 본원에 제시된 농도의 범위 및 바람직한 농도의 범위로 존재하는 것이 바람직하다. 다른 작용제와 조합한 것을 포함한, 본 발명의 임의의 측면에 사용하기 위한 EDTA의 바람직한 농도는 약 0.02 내지 200 mM, 바람직하게는 0.2 내지 20 mM 및 가장 바람직하게는 0.05 내지 8 mM이다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 적어도 1종의 폴리소르베이트 (PEG 그라프팅된 소르비탄 지방산 에스테르)를 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), 폴리소르베이트 60 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 및 그의 혼합물을 포함한다. 폴리소르베이트 80 (P80)이 가장 바람직한 폴리소르베이트이다. 다른 작용제와 조합한 것을 포함한, 본 발명의 임의의 측면에 사용하기 위한 폴리소르베이트 (본원에 제시된 바와 같은 특히 바람직한 폴리소르베이트)의 바람직한 농도는 약 0.001 내지 10% w/v, 바람직하게는 0.01 내지 1% w/v 및 가장 바람직하게는 0.02 내지 0.5 w/v이다.
PABA가 이전에 방사성안정화제로 기재된 바 있지만 (US4880615 A 참조) 본 발명에서의 PABA의 긍정적 효과는 저장 시 비-방사성 접합체 상에서 관찰되었다. 방사선분해의 부재 하의 이러한 안정화 효과는 조직-표적화 킬레이트화제의 합성이 전형적으로 토륨 이온과 접촉하기 상당히 이전에 일어날 것이기 때문에 특히 놀라운 이점을 구성한다. 따라서, 조직-표적화 킬레이트화제는 토륨 이온과 접촉하기 1시간 내지 3년 전에 생성될 수 있고, 바람직하게는 그 기간의 적어도 일부 동안 PABA와 접촉하여 저장될 것이다. 즉, 본 발명의 단계 a) 및 b)는 단계 c) 1시간 내지 3년 전에 및 단계 b)와 c) 사이에 일어날 수 있고, 조직-표적화 킬레이트화제는 특히 완충제, 예컨대 시트레이트 완충제 중 PABA 및 임의로 EDTA 및/또는 폴리소르베이트와 접촉하여 저장된다. 모든 물질은 바람직하게는 본원에 나타난 유형 및 농도이다. PABA는 따라서 본 발명의 제제의 고도로 바람직한 성분이고, 조직-표적화 킬레이트화제 및/또는 조직-표적화 토륨 복합체에 대한 장기간 안정성을 가져올 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 시트레이트 완충제의 사용은 본 발명의 제제에서의 조직-표적화 토륨 복합체의 안정성과 관련하여 놀라운 이점을 추가로 제공한다. 과산화수소 생성에 대한 완충제-용액의 효과에 관한 조사 연구가 본 발명자들에 의해 예상외의 결과로 수행되었다. 과산화수소는 물 방사선분해의 결과로서 형성되는 것으로 공지되어 있고, 이는 용액 중 단백질 접합체의 화학적 변형에 기여한다. 과산화수소 생성은 따라서 생성물의 순도 및 안정성에 대한 바람직하지 않은 효과를 갖는다. 도 2는 시험된 모든 다른 완충제와 비교하여 시트레이트 완충제 중 Co-60 (10 kGy)으로 조사된 본 발명의 항체 HOPO 접합체 용액에서 보다 낮은 수준의 과산화수소가 측정되었다는 놀라운 발견을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 제제는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 시트레이트 완충제를 포함할 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 제제에서의 특정 성분의 조합 효과와 관련된 추가의 놀라운 발견을 추가적으로 확립한 바 있다. 이것은 다시 방사성표지된 접합체의 안정성과 관련된다. 시트레이트는 가장 유효한 완충제인 것으로 발견된 바 있으며, 이러한 효과가 PABA의 첨가로 추가로 개선되었다는 것은 놀라운 발견이었다.
본 발명의 방법, 복합체 및 제제의 주요 성분은 옥타덴테이트 킬레이트화제 모이어티이다. 히드록시피리디논 리간드와 토륨 이온의 복합체화에 대한 가장 관련있는 이전의 연구는 WO2011/098611로 공개되었고, 이는 옥타덴테이트 HOPO-함유 리간드와 복합체화된 토륨 이온의 생성의 상대적 용이성을 개시하고 있다.
이전에 공지된 토륨에 대한 킬레이트화제는 또한 백본 질소에 부착된 산성 (예를 들어, 카르복시알킬) 기를 갖는 선형, 고리형 또는 분지형 폴리아자알칸 백본을 포함하는 폴리아미노폴리산 킬레이트화제를 포함한다. 이러한 킬레이트화제의 예는 DOTA 유도체 예컨대 p-이소티오시아네이토벤질-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (p-SCN-Bz-DOTA) 및 DTPA 유도체 예컨대 p-이소티오시아네이토벤질-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (p-SCN-Bz-DTPA)을 포함하며, 전자는 고리형 킬레이트화제이고, 후자는 선형 킬레이트화제이다.
1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산의 유도체는 이전에 예시되었지만, 표준 방법은 토륨을 DOTA 유도체로 킬레이트화하는데 용이하게 사용될 수 없었다. DOTA 유도체를 금속과 함께 가열하면 킬레이트를 효과적으로 제공하지만, 종종 저수율이다. 리간드의 적어도 한 부분은 절차 동안 비가역적으로 변성되는 경향이 있다. 게다가, 비가역적 변성에 대한 그의 비교적 높은 감수성 때문에, 일반적으로 모든 가열 단계가 완료될 때까지 표적화 모이어티의 부착을 피하는 것이 필요하다. 이로써 알파-방출 토륨 동위원소의 붕괴 수명 동안에 수행되어야 하는 별도의 화학 단계 (모든 필요한 후처리 및 분리와 함께)가 추가된다. 명백하게, 알파-방출 물질을 이러한 방식으로 취급하지 않거나 또는 상응하는 폐기물을 필요 이상으로 많은 정도로 생성시키는 것은 바람직하지 않다. 게다가, 접합체를 제조하는데 소요되는 모든 시간은 이러한 제조 기간 동안 붕괴할 소정 비율의 토륨을 낭비한다.
모든 관점에서 본 발명의 주요 측면은 화학식 (I) 또는 (II)의 옥타덴테이트 킬레이트화제의 사용이다:
Figure pct00002
여기서 Rc는 카르복실산 모이어티에서 종결하는 링커 모이어티, 예컨대
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH] (여기서 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기)이다.
특정의 이전의 개시내용, 예컨대 WO2013/167756, WO2013/167755 및 WO2013/167754에서 3,2-HOPO 모이어티의 N-원자에 부착된 메틸 기는 주로 가용화 기 예컨대 히드록시 또는 히드록시알킬 (예를 들어 -CH2OH, -CH2-CH2OH, -CH2-CH2-CH2OH 등)이었다. 이것은 보다 높은 용해도의 면에서 특정 이점을 갖지만, 이러한 킬레이트화제는 아미드 결합을 사용하는 표적화 모이어티에 연결하기가 어렵다.
킬레이트화 모이어티는 US 5,624,901 (예를 들어 실시예 1 및 2) 및 WO2008/063721 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 형성될 수 있다.
RC는 커플링 모이어티를 나타낸다. 적합한 모이어티는 카르복실산 기에서 종결하는 히드로카르빌 기 예컨대 알킬 또는 알케닐 기를 포함한다. 본 발명자들에 의해, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 아미드를 형성하기 위한 카르복실산 연결 모이어티의 사용은 킬레이트화제와 조직-표적화 모이어티 사이에 보다 안정한 접합을 제공한다는 것이 확립된 바 있다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서 표적화 모이어티에 옥타덴테이트 리간드를 연결하는 커플링 모이어티 (RC)는 하기이도록 선택된다:
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]
(여기서 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기).
바람직한 실시양태에서, RC는 [-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]이다. 보다 바람직한 실시양태에서, RC는 [-(CH2)-파라-페닐렌-N(H)-C(=O)-(CH2)2-C(=O)OH]이다.
매우 바람직한 옥타덴테이트 킬레이트화제는 하기 화학식 (III) 및 (IV)의 것을 포함한다:
Figure pct00003
화합물 (III)의 합성은 본원 하기에 기재되어 있고, 본원 하기에 기재된 합성 경로를 따른다.
본 발명의 방법의 단계 a)는 임의의 적합한 합성 경로에 의해 수행될 수 있다. 합성 방법의 일부 구체적 예는 하기에 하기 실시예에서 주어진다. 이러한 방법은 구체적 예를 제공하나, 그에 예시된 합성 방법은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적 맥락에서 사용가능할 것이다. 실시예에 예시된 방법은 따라서 맥락이 허용하는 경우에 본 발명의 모든 측면 및 실시양태에 적용가능한 일반적인 개시내용으로도 의도된다.
본 발명의 모든 측면에서 알파-방출 토륨과 옥타덴테이트 리간드의 복합체는, 60℃ 초과로 가열하지 않으면서 (예를 들어 50℃ 초과로 가열하지 않으면서), 바람직하게는 38℃ 초과로 가열하지 않으면서, 가장 바람직하게는 25℃ 초과로 가열하지 않으면서 (예컨대 20 내지 38℃ 범위에서) 형성되거나 또는 형성가능한 것이 바람직하다. 전형적인 범위는, 예를 들어 15 내지 50℃ 또는 20 내지 40℃일 수 있다. 복합체화 반응 (본 발명의 방법에서 파트 c))은 임의의 합리적인 기간 동안 수행될 수 있으나, 이것은 바람직하게는 1 내지 120분, 바람직하게는 1 내지 60분, 및 보다 바람직하게는 5 내지 30분일 것이다.
추가적으로 표적화 모이어티 및 옥타덴테이트 리간드의 접합체는 알파-방출 토륨 동위원소 227Th4+ 이온의 첨가 전에 제조하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 생성물은, 바람직하게는 옥타덴테이트 리간드와 조직-표적화 모이어티 (조직-표적화 킬레이트화제)의 접합체에 의한 알파-방출 토륨 동위원소 (227Th4+ 이온)의 복합체화에 의해 형성되거나 또는 형성가능하다.
표적화 화합물의 다양한 유형이 옥타덴테이트 킬레이트화제 (본원에 기재된 바와 같은 커플링 모이어티를 포함함)를 통해 토륨 (예를 들어 토륨-227)에 연결될 수 있다.
일반적으로, 본원에 사용된, 조직 표적화 모이어티는 "펩티드" 또는 "단백질"일 것이고, 이는 2급 및 3급 구조적 특색과 함께 또는 그 없이 아미노산 성분 사이의 아미드 백본으로 주로 형성된 구조이다.
본 발명에 따르면 227Th는 본원에 기재된 바와 같이 조직-표적화 모이어티에 아미드 연결에 의해 연결되거나 또는 연결가능한 착물화제를 표적화함으로써 복합체화될 수 있다.
전형적으로 표적화 모이어티는 100 g/mol 내지 수백만 g/mol (특히 100 g/mol 내지 1백만 g/mol)의 분자량을 가질 것이고, 바람직하게는 질환-관련 수용체에 대한 친화성을 직접 가질 것이고/거나, 227Th를 투여하기에 앞서 질환에 대해 표적화된 바 있는 분자에 결합된 적합한 예비-투여된 결합제 (예를 들어 비오틴 또는 아비딘)를 포함할 것이다.
본 발명의 특이적 결합제 (조직 표적화 모이어티)는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP 항원을 표적화하도록 선택된다.
본 발명의 조직 표적화 모이어티는 서열 1, 11 또는 21 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄 및 서열 5, 15, 또는 25 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
서열 유사성은 언급된 서열에 대해 적어도 80%의 서열 유사성을 갖는 것으로 여겨질 수 있다. 바람직한 서열 유사성은 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 서열 유사성 및/또는 동일성은 위스콘신 대학교로부터의 제네틱스 컴퓨터 그룹 버전 10 소프트웨어 패키지의 "베스트피트" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 이 프로그램은 하기 디폴트 값으로 스미스 및 워터만의 로컬 핸드 알고리즘을 사용한다: 갭 생성 페널티=8, 갭 연장 패널티=2, 평균 매치=2.912, 평균 미스매치 2.003.
본 발명의 조직 표적화 모이어티는 ESC11 및 그의 변이체를 나타낸다. 인간 배선 서열에 보다 가깝고 제조에 잠재적으로 중요한 아미노산을 피하도록 최적화된 ESC11의 여러 변이체가 생성되었다 (도 1 및 표 1 참조).
Figure pct00004
Figure pct00005
표 1: 단백질 (PRT)에 대한, TPP-ID에 대한 서열식별번호(SEQ ID NO) 및 연관 서열 특색 (항체의 중쇄 및 경쇄, 가변 영역, 상보성 결정 영역 (CDR))의 상관관계
도 1은 본 발명의 바람직한 항-FAP 항체의 주석달린 서열을 보여준다. IgG1의 중쇄 및 경쇄 뿐만 아니라 선택된 항체의 VH 및 VL 영역에 대한 단백질 서열이 제공된다. 하기에서 중요한 영역의 서열은 주석달려있다 (전장 IgG 내 VH 및 VL 영역, 및 CDR 영역 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
도 2는 표 1에 기재된 바와 같은 단일 서열을 보여준다.
바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1, 11 또는 21 중 어느 하나와 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5, 15 또는 25 중 어느 하나와 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1, 11 또는 21 중 어느 하나와 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5, 15 또는 25 중 어느 하나와 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 1과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 11과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 5와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 15와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 98% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티는 서열 21과의 서열 동일성을 갖는 펩티드 쇄, 및 서열 25와의 99% 이상의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명의 프롤릴 엔도펩티다제 FAP에 대한 항체는 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산 서열의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되도록 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 1종 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.)에 기재된 바와 같이, 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이들 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다.
추가로, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어 전장 항체 쇄, Fab 단편 또는 scFv를 코딩하는 핵산 서열로 전환시킬 수 있다. VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 (2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임이도록) 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다.
scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성시키기 위해, VH- 및 VL-코딩 핵산을, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 하나의 인접 단일-쇄 단백질로 발현될 수 있도록, 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554] 참조).
항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 참조). 예를 들어, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있으며, 이어서 이를 적합한 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 적합한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 예를 들어 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 및 곤충 세포, 식물 및 식물 세포, 트랜스제닉 동물, 또는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 동일한 벡터 내로 삽입된다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준, 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지의 여부와 같은 인자에 의해 영향을 받는 것으로 이해된다.
목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 기능적 프로모터가 있는 작동가능한 판독 상 내에 삽입함으로써 박테리아 사용에 유용한 발현 벡터가 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 바람직한 경우에, 숙주 내에서의 증폭을 제공하기 위해 1종 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 속 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 내의 다양한 종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이들 벡터는 널리-공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 전형적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터를 적절한 수단 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 탈-억제/유도하고, 세포를 추가의 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴시키고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 유지시킨다.
박테리아 시스템에서, 발현시킬 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 수많은 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하거나 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에는, 예를 들어 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움, 및 속 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 내의 다양한 종을 포함한 원핵 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다.
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 항체의 발현은 구성적이거나 또는 조절될 수 있다 (예를 들어 Tet 시스템과 함께 소분자 유도제 예컨대 테트라시클린의 첨가 또는 제거에 의해 유도가능함). 바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 대한 추가 설명에 대해서는, 예를 들어 U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘, 제오신/블레오마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 영양요구성을 이용하는 선택 마커 예컨대 글루타민 신테타제 (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):169-75)를 포함한다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여하고, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 bsd 유전자는 블라스티시딘에 대한 저항성을 부여하고, 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제는 퓨로마이신에 대한 저항성을 부여하고, Sh ble 유전자 생성물은 제오신에 대한 저항성을 부여하고, 히그로마이신에 대한 저항성은 이. 콜라이 히그로마이신 저항성 유전자 (hyg 또는 hph)에 의해 부여된다. DHFR 또는 글루타민 신테타제와 같은 선택 마커는 또한 MTX 및 MSX와 함께 증폭 기술에 유용하다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 표준 기술, 예컨대 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 다가양이온-기반 형질감염 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)-기반 형질감염 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에 제공된 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체를 발현시키기에 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) 예컨대 CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 및 Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12]에 기재된 dhfr- CHO 세포; 및 문헌 [Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15]에 예시된 다른 녹아웃 세포를 포함함], NS0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포, HKB11 세포, BHK21 세포, CAP 세포, EB66 세포, 및 SP2 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
발현은 또한 발현 시스템 예컨대 HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-프리스타일, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO 프리스타일, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 또는 CAP-T 세포에서 일시적이거나 반-안정할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9]).
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 분비되도록 설계된다. 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리-공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20]에 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리 방법, UV-Vis 분광분석법 또는 SDS-모세관 겔 전기영동 (예를 들어 캘리퍼 랩칩 GXII, GX 90 또는 바이오라드 생물분석기 장치 상에서)에 의해 결정시, 95 중량%의 항체를 초과하는 정도, 및 추가의 바람직한 실시양태에서는 99 중량%를 초과하는 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 동질성의 정도로 정제된다. 단리된 자연 발생 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1개의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
알파-방출 토륨 성분과 관련하여, 227Th를 치료상 유효하면서도 또한 허용되지 않는 골수독성을 생성시키지 않는 양으로 투여할 수 있다는 것이 주요 최근 발견이다. 본원에 사용된 용어 "허용가능하게 비-골수독성인"은, 가장 중요하게는, 투여된 토륨-227 방사성동위원소의 붕괴에 의해 생성된 라듐-223의 양이 일반적으로 대상체에 직접적으로 치사성이기에는 불충분하다는 것을 나타내는데 사용된다. 그러나, 이러한 치료의 허용되는 부작용이 될 골수 손상의 양 (및 치사 반응의 확률)은 치료되는 질환의 유형, 치료 요법의 목적, 및 대상체에 대한 예후에 따라 상당히 달라질 것임이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 바람직한 대상체는 인간이지만, 다른 포유동물, 특히 반려 동물 예컨대 개는 본 발명의 사용으로 이익을 가질 것이고 허용되는 골수 손상의 수준은 또한 대상체의 종을 반영할 수 있다. 허용되는 골수 손상의 수준은 일반적으로 비-악성 질환의 경우보다 악성 질환의 치료에서 더 클 것이다. 골수독성 수준의 하나의 널리 공지된 척도는 호중구 세포 수이고, 본 발명에서, 허용가능하게 비-골수독성인 양의 223Ra는 전형적으로 그의 가장 낮은 지점 (최저점)에서의 호중구 분율이 치료 전 수의 10% 이상이 되도록 제어된 양일 것이다. 바람직하게는, 허용가능하게 비-골수독성인 양의 223Ra는 호중구 세포 분율이 최저점에서 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%가 되도록 하는 양일 것이다. 적어도 40%의 최저점 호중구 세포 분율이 가장 바람직하다.
추가로, 방사성 227Th 함유 화합물은, 줄기 세포 지지체 또는 대등한 회수 방법이 포함되는 경우에 생성된 223Ra의 골수독성이 통상적으로 허용될 수 없을 것인 고용량 요법에서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 호중구 세포 수는 최저점에서 10% 미만으로 감소될 수 있고, 예외적으로 적합한 주의를 기울이고 후속적인 줄기 세포 지지체가 주어진다면, 5%까지, 또는 필요하다면 5% 미만까지 감소될 것이다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
토륨-227은 비교적 제조하기가 쉽고 중성자 조사된 226Ra로부터 간접적으로 제조될 수 있으며, 이는 227Th의 모핵종, 즉 227Ac (T1/2 = 22년)를 함유할 것이다. 악티늄-227은 상당히 용이하게 226Ra 표적에서 분리되고 227Th에 대한 발생기로서 사용될 수 있다. 이러한 과정은 필요하다면 산업적 규모로 규모화될 수 있고, 따라서 분자 표적화된 방사선요법에 대한 후보로 고려되는 대부분의 다른 알파-방출체에서 나타나는 공급의 문제를 피할 수 있다.
토륨-227은 허용되지 않는 골수 억제를 일으킬 만큼 많은 라듐-223을 생성시키지 않으면서 바람직한 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 표적화된 영역에서 딸 동위원소를 유지하여 추가의 치료 효과를 그의 붕괴로부터 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 허용되지 않는 골수독성을 유도하지 않으면서 유용한 치료 효과를 갖도록 하기 위해 토륨 붕괴 생성물의 제어를 유지할 필요는 없다.
종양 세포 사멸 효과가 주로 토륨-227로부터이고 그의 딸로부터가 아닐 것이라고 가정한다면, 이러한 동위원소의 가능한 치료 용량은 다른 알파 방출체와의 비교에 의해 확립될 수 있다. 예를 들어, 아스타틴-211의 경우, 동물에서의 치료 용량은 전형적으로 kg당 2-10 MBq인 바 있다. 반감기 및 에너지에 대해 보정함으로써, 토륨-227에 대한 상응하는 투여량은 체중 1 kg당 적어도 36-200 kBq가 될 것이다. 이것은 치료 효과를 기대하여 유용하게 투여될 수 있는 227Th 양의 하한치를 설정할 것이다. 이러한 계산은 아스타틴과 토륨의 대등한 보유를 가정한다. 그러나, 명백하게, 토륨의 18.7일의 반감기로 인해 이 동위원소는 그의 붕괴 전에 더 많이 제거될 가능성이 클 것이다. 따라서 이러한 계산된 투여량은 통상적으로 최소 유효량으로 간주되어야 한다. 완전히 보유된 227Th (즉, 신체로부터 제거되지 않는 227Th)로 환산된 치료 용량은 전형적으로 적어도 18 또는 25 kBq/kg, 바람직하게는 적어도 36 kBq/kg, 및 보다 바람직하게는 적어도 75 kBq/kg, 예를 들어 100 kBq/kg 이상일 것이다. 토륨의 양이 많을수록 더 큰 치료 효과를 가질 것으로 기대될 것이지만, 허용되지 않는 부작용을 초래하는 경우에는 투여될 수가 없다. 마찬가지로, 토륨이 짧은 생물학적 반감기 (즉 여전히 토륨을 보유하는 신체로부터 제거되기 전 반감기)를 갖는 형태로 투여될 경우에는, 많은 토륨이 붕괴되기 전에 제거될 것이므로 방사성동위원소의 더 많은 양이 치료 효과를 위해 요구될 것이다. 그러나, 생성되는 라듐-223의 양의 상응하는 감소가 있을 것이다. 동위원소가 완전히 보유될 경우에 투여되는 토륨-227의 상기 양은 보다 짧은 생물학적 반감기를 갖는 동등한 용량과 용이하게 관련될 수 있다. 이러한 계산은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 WO 04/091668 (예를 들어, 실시예 1 및 2의 본문에)에 제공되어 있다.
방사성 표지된 화합물이 딸 핵종을 방출하는 경우에는, 적용가능하다면 임의의 방사성 딸 핵종(들)의 운명을 아는 것이 중요하다. 227Th를 사용하면, 주요 딸 생성물은 223Ra이고, 이는 그의 향골 특성 때문에 임상 평가 하에 있다. 라듐-223은 혈액을 매우 신속하게 청소하며 골격에서 농축되거나 장 및 신장 경로를 통해 분비된다 (문헌 [Larsen, J Nucl Med 43 (5, Supplement): 160P (2002) 참조]). 따라서 227Th로부터 생체내에 방출된 라듐-223은 건강한 연부 조직에 크게 영향을 주지 않을 수 있다. 용해된 시트레이트 염으로서 227Th의 분포에 대한 뮐러에 의한 연구 (Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971))에서, 연부 조직에서의 227Th로부터 생성된 223Ra는 골에 용이하게 재분포되거나 또는 분비되었음이 밝혀졌다. 따라서 특히 골수에 대한, 알파 방출 라듐의 공지된 독성은, 토륨 투여량과 함께 이슈이다.
WO 04/091668에서 처음으로 사실상, 인간 대상체에서 적어도 200 kBq/kg의 223Ra의 용량이 투여되고 허용될 수 있는 것으로 확립되었다. 이들 데이터는 그 공보에 제시되어 있다. 따라서, 정말 예기치않게, 이러한 대상체가 심각하거나 심지어는 치사 골수독성의 허용될 수 없는 위험으로 고통받을 것이 예상되지 않으면서 포유동물 대상체에게 치료상 유효량의 227Th (예컨대 36 kBq/kg 초과)가 투여될 수 있는 치료 범위가 존재함을 이제 알 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 치료 범위를 최상으로 사용하는 것이 매우 중요하며, 따라서 방사성 토륨을 신속하고 효율적으로 복합체화하고 매우 고친화도를 보유케 하여 가능한 가장 큰 비율의 용량을 표적 부위에 전달하도록 하는 것이 필수적이다.
227Th 약품으로부터 생성된 223Ra의 양은 방사성 표지된 화합물의 생물학적 반감기에 좌우될 것이다. 이상적인 상황은 종양 세포 내로의 내재화, 강력한 종양 보유 및 정상 조직에서의 짧은 생물학적 반감기를 포함한 신속한 종양 흡수를 갖는 복합체를 사용하는 것일 것이다. 그러나 223Ra의 용량이 허용될 수 있는 수준 내에서 유지되는 한, 이상적인 생물학적 반감기보다 작은 반감기를 갖는 복합체가 유용할 수 있다. 생체내에서 생성되는 라듐-223의 양은 투여되는 토륨의 양 및 토륨 복합체의 생물학적 체류 시간의 요인이 될 것이다. 임의의 특정한 경우에 생성되는 라듐-223의 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 227Th의 최대 투여가능한 양은 생체내에서 생성되는 라듐의 양에 의해 결정될 것이고, 허용되지 않는 수준의 부작용, 특히 골수독성을 일으킬 양보다 더 적어야 한다. 이 양은 일반적으로 300kBq/kg 미만, 특히 200 kBq/kg 미만, 및 보다 바람직하게는 170 kBq/kg 미만 (예를 들어 130 kBq/kg 미만)일 것이다. 최소 유효 용량은 토륨의 세포독성, 생성된 알파 조사에 대한 이환 조직의 감수성, 및 토륨이 표적화 복합체 (이 경우 리간드와 표적화 모이어티의 조합임)에 의해 효율적으로 조합되고, 보유되고, 전달되는 정도에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 방법에서, 토륨 복합체는 18 내지 400 kBq/kg 체중, 바람직하게는 36 내지 200 kBq/kg (예컨대 50 내지 200 kBq/kg), 보다 바람직하게는 75 내지 170 kBq/kg, 특히 100 내지 130 kBq/kg의 토륨-227 투여량으로 바람직하게 투여된다. 상응하게, 단일 투여량은 대략 임의의 이들 범위에 적합한 체중, 예컨대 30 내지 150 Kg, 바람직하게는 40 내지 100 Kg (예를 들어 용량당 540 kBq 내지 4000 KBq의 범위 등)을 곱한 것을 포함할 수 있다. 토륨 투여량, 착물화제 및 투여 경로는, 생체내에서 생성되는 라듐-223 투여량이 300 kBq/kg 미만, 보다 바람직하게는 200 kBq/kg 미만, 보다 더 바람직하게는 150 kBq/kg 미만, 특히 100 kBq/kg 미만이 되도록 하는 것이 보다 바람직할 것이다. 다시, 이것은 이들 범위에 나타낸 임의의 체중을 곱하여 제시된 223Ra에 대한 노출을 제공할 것이다. 상기 용량 수준은 바람직하게는 227Th의 완전히 보유된 용량이지만 일부 227Th는 그것이 붕괴되기 전에 신체로부터 청소될 것을 고려한 투여 용량일 수 있다.
227Th 복합체의 생물학적 반감기가 물리적 반감기와 비교하여 짧은 경우 (예를 들어 7일 미만, 특히 3일 미만)에는, 동등한 보유된 용량을 제공하기 위해 상당히 더 많은 투여 용량이 필요할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 150 kBq/kg의 완전히 보유된 용량은 711 kBq/kg의 용량으로 투여된 5일의 반감기를 갖는 복합체에 해당한다. 임의의 적절한 보유된 용량에 대해 동등한 투여 용량이 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 복합체의 생물학적 청소율로부터 계산될 수 있다.
1개의 227Th 핵의 붕괴가 1개의 223Ra 원자를 제공하므로, 227Th의 보유 및 치료적 활성은 환자가 겪는 223Ra 용량에 직접 관련될 것이다. 임의의 특정한 상황에서 생성된 223Ra의 양은 널리 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 따라서 (본원에 기재된 바와 같은) 포유동물 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체의 치료상 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 질환의 치료 방법을 제공한다.
대상체의 223Ra 딸 동위원소에 대한 노출을 최소화하는 것이, 이러한 특성이 유용하게 사용되지 않는 한, 분명히 바람직하다. 특히, 생체내에서 생성된 라듐-223의 양은 전형적으로 40 kBq/kg보다 많고, 예를 들어 60 kBq/Kg보다 많을 것이다. 일부 경우에, 생체내에서 생성된 223Ra가 80 kBq/kg보다 많고, 예를 들어 100 또는 115 kBq/kg보다 많을 필요가 있을 것이다.
적절한 담체 용액 중 토륨-227 표지된 접합체는 정맥내로, 강내 (예를 들어 복강내로), 피하로, 경구로 또는 국소로, 단일 적용으로서 또는 분할된 적용 요법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 표적화 모이어티에 접합된 복합체는 비경구 (예를 들어 경피) 경로, 특히 정맥내로 또는 강내 경로에 의해 용액으로서 투여될 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 멸균 용액 중에 제제화될 것이다.
본 발명의 방법 및 생성물에서 토륨-227은 단독으로 사용되거나, 수술, 외부 빔 방사선 요법, 화학요법, 다른 방사성핵종, 또는 조직 온도 조정 등을 포함한 다른 치료 양식과 조합되어 사용될 수 있다. 이것은 본 발명의 방법의 추가의 바람직한 실시양태를 형성하고 제제/의약은 상응하게 적어도 1종의 추가의 치료 활성제, 예컨대 또 다른 방사성 작용제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다.
하나의 특히 바람직한 실시양태에서 대상체는 또한 라듐-223 유도된 골수독성의 효과를 감소시키기 위한 줄기 세포 치료 및/또는 다른 지지 요법을 받는다.
본 발명의 토륨 (예를 들어 토륨-227) 표지된 분자는 질환-관련된 수용체를 표적화함으로써 암성 또는 비-암성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 전형적으로, 227Th의 이러한 의학적 용도는 암성 또는 비-암성 질환의 치료를 위해 227Th를 킬레이트화제에 의해 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편의 구축물에 연결하는 것을 기초로 하는 방사선면역요법에 의한 것일 것이다. 본 발명에 따른 방법 및 약품에서의 227Th의 사용은 유방암, 위암, 난소암, 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 및 자궁암의 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 연부 조직 및 골격 질환을 둘 다 갖는 환자는 227Th, 및 투여된 토륨에 의해 생체내에서 생성되는 223Ra 둘 다에 의해 치료될 수 있다. 이러한 특히 유리한 측면에서, 치료에 대한 별도의 치료적 성분은 골격 질환의 표적화에 의해 223Ra의 허용가능하게 비-골수독성인 양으로부터 유래된다. 이러한 치료 방법에서, 227Th는 전형적으로, 원발성 및/또는 전이성 연부 조직 암을 그에 대한 적합한 표적화에 의해 치료하는데 이용되고 227Th 붕괴로부터 생성되는 223Ra는 동일 대상체에서 관련된 골격 질환을 치료하는데 이용된다. 상기 골격 질환은 원발성 연부 조직 암으로부터 초래되는 골격으로의 전이일 수 있거나, 또는 연부 조직 치료가 전이성 암을 대항하는 원발성 질환일 수 있다. 때때로 연부 조직 및 골격 질환은 관련이 없을 수도 있다 (예를 들어 류마티스성 연부 조직 질환을 갖는 환자에서 골격 질환의 추가의 치료).
하기에 일부 합성 실시예가 제공된다. 이들 합성에 제시된 단계는 본 발명의 많은 실시양태에 적용가능할 것이다. 예를 들어, 단계 a)는 본원에 기재된 많은 또는 모든 실시양태에서, 하기 제시된 중간체 AGC0021을 통해 진행될 수 있다.
주요 중간체 AGC0020의 합성
N,N,N',N'-테트라키스(2-아미노에틸)-2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디아민
Figure pct00006
주요 중간체 AGC0021의 합성
3-(벤질옥시)-1-메틸-4-[(2-티옥소-1,3-티아졸리딘-3-일)카르보닐]피리딘-2(1H)-온
Figure pct00007
화학식 (VIII)의 화합물의 킬레이트의 합성
4-{[4-(3-[비스(2-{[(3-히드록시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-일)카르보닐]아미노}에틸)아미노]-2-{[비스(2-{[(3-히드록시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-일)카르보닐]아미노}에틸)아미노]메틸}프로필)페닐]아미노}-4-옥소부탄산
Figure pct00008
본 발명의 복합체의 형성 방법에서, 옥타덴테이트 킬레이트화제와 조직 표적화 모이어티 사이의 커플링 반응은 수용액 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 이것은 여러 이점을 갖는다. 첫째로, 그것은 모든 용매를 허용되는 수준 아래로 제거하고 그 제거를 인증해야하는 제조업체의 부담을 제거한다. 둘째로, 그것은 폐기물을 감소시키고 가장 중요하게는 분리 또는 제거 단계를 피함으로써 생산 속도를 가속한다. 본 발명의 방사성제약의 맥락에서, 방사성동위원소는 내내 붕괴할 것이며 제조에 소요된 시간은 가치있는 물질을 낭비하고 오염 딸 동위원소를 도입하기 때문에 합성을 가능한 한 신속하게 수행하는 것이 중요하다.
적합한 수용액은 정제수 및 완충제 예컨대 임의의 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 많은 완충제를 포함한다. 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 (예를 들어 PBS) 및 술포네이트 완충제 (예컨대 MES)는 널리 공지된 수성 완충제의 전형적인 예이다.
한 실시양태에서, 방법은 (본원 전체에 걸쳐 기재된 바와 같은) 옥타덴테이트 히드록시피리디논-함유 리간드의 제1 수용액 및 (본원 전체에 걸쳐 기재된 바와 같은) 조직 표적화 모이어티의 제2 수용액을 형성하고 상기 제1 및 상기 제2 수용액을 접촉시키는 것을 포함한다.
적합한 커플링 모이어티는 상기에 상세히 논의되고 커플링 및/또는 연결기로 본원에서 논의되는 모든 기 및 모이어티는 리간드에 표적화 모이어티를 커플링시키는 것에 적절하게 사용될 수 있다. 일부 바람직한 커플링 기는 아미드, 에스테르, 에테르 및 아민 커플링 기를 포함한다. 에스테르 및 아미드는 카르복실산으로부터의 활성화된 에스테르 기의 생성으로 편리하게 형성될 수 있다. 이러한 카르복실산은 표적화 모이어티, 커플링 모이어티 및/또는 리간드 모이어티에 존재할 수 있고, 전형적으로 알콜 또는 아민과 반응하여 에스테르 또는 아미드를 형성할 것이다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, N-히드록시 말레이미드, 카르보디이미드 및/또는 아조디카르복실레이트 활성화 시약 예컨대 DCC, DIC, EDC, DEAD, DIAD 등을 포함한 널리 공지된 활성화 시약을 이용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, N-위치에서 메틸 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제는 적어도 1종의 커플링 시약 (예컨대 본원에 기재된 임의의 것) 및 활성화제 예컨대 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 활성화시켜 옥타덴테이트 킬레이트화제의 NHS 에스테르를 형성할 수 있다. 이러한 활성화된 (예를 들어 NHS) 에스테르는 유리 아민 기 (예컨대 리신 측쇄 상의 것)를 갖는 임의의 조직 표적화 모이어티에의 커플링을 위해 분리되거나 분리 없이 사용될 수 있다. 다른 활성화된 에스테르는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 효과적인 이탈기, 예컨대 플루오린화 기, 토실레이트, 메실레이트, 아이오다이드 등의 임의의 에스테르일 수 있다. 그러나, NHS 에스테르가 바람직하다.
커플링 반응은 바람직하게는 비교적 단기간에 걸쳐 및 약 주위 온도에서 수행된다. 1-단계 또는 2-단계 커플링 반응을 위한 전형적 기간은 약 1 내지 240분, 바람직하게는 5 내지 120분, 보다 바람직하게는 10 내지 60분일 것이다. 커플링 반응을 위한 전형적 온도는 0 내지 90℃, 바람직하게는 15 내지 50℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃일 것이다. 약 25℃ 또는 약 38℃가 적절하다.
표적화 모이어티에의 옥타덴테이트 킬레이트화제의 커플링은 전형적으로 표적화 모이어티의 결합 능력에 불리하지 않게 (또는 적어도 비가역적이 아니게) 영향을 미치는 조건 하에 수행될 것이다. 결합제는 일반적으로 펩티드 또는 단백질 기반 모이어티이므로, 이것은 2차/3차 구조의 변성 또는 손실을 피하기 위해 비교적 온화한 조건이 요구된다. 수성 조건 (본원의 모든 맥락에서 논의된 바와 같은)이 바람직할 것이고, pH 및/또는 산화환원의 극단을 피하는 것이 바람직할 것이다. 단계 b)는 따라서 pH 3 내지 10, 바람직하게는 4 내지 9, 및 보다 바람직하게는 4.5 내지 8에서 수행될 수 있다. 산화환원의 관점에서 중성인, 또는 공기 중에서의 산화를 피하기 위해 매우 온화하게 환원되는 조건이 바람직할 수 있다.
본 발명의 모든 측면에 적용가능한 바람직한 조직-표적화 킬레이트화제는 본원에 기재된 바와 같은 AGC0018이다. AGC0018과 227Th 이온과의 복합체는 본 발명의 복합체의 바람직한 실시양태 및 상응하는 제제, 용도, 방법 등을 형성한다. 본 발명의 이러한 모든 측면에서 사용가능한 다른 바람직한 실시양태는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP에 대한 결합 친화도를 갖는 모노클로날 항체를 포함한, 조직 표적화 모이어티 (본원에 기재된 바와 같은)에 접합된 AGC0019의 227Th 복합체를 포함한다.
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예에 의해 예시될 것이다. 실시예에 예시된 모든 화합물은 본 발명의 바람직한 실시양태 (바람직한 중간체 및 전구체 포함)를 형성하고 맥락이 허용하는 경우에 임의의 측면에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
실시예 1
화학식 (III)의 화합물의 합성
Figure pct00009
실시예 1.1
디메틸 2-(4-니트로벤질) 말로네이트의 합성
Figure pct00010
수소화나트륨 (60% 분산액, 11.55 g, 289 mmol)을 450 mL 테트라히드로푸란 (THF) 중에 0℃에서 현탁시켰다. 디메틸 말로네이트 (40.0 mL, 350 mmol)를 대략 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 150 mL THF 중에 용해시킨 4-니트로벤질 브로마이드 (50.0 g, 231 mmol)를 0℃에서 대략 30분에 걸쳐 적가하고 이어서 주위 온도에서 2시간에 걸쳐 적가하였다.
500 mL 에틸 아세테이트 (EtOAc) 및 250 mL NH4Cl (수성, 포화)을 첨가한 다음, 용액을 여과하였다. 상을 분리하였다. 수성 상을 2*250 mL EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 250 mL 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다.
300 mL 헵탄 및 300 mL 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)을 잔류물에 첨가하고, 60℃로 가열하였다. 용액을 여과하였다. 여과물을 동결기에 밤새 두고, 여과하였다. 필터 케이크를 200 mL 헵탄으로 세척하고, 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다.
수율: 42.03 g, 157.3 mmol, 68%.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.30(d, 2H, 7.8 Hz), 3.68(t, 1H, 7.8 Hz), 3.70(s, 6H), 7.36(d, 2H, 8.7 Hz), 8.13(d, 2H, 8.7 Hz).
실시예 1.2
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디올의 합성
Figure pct00011
디메틸 2-(4-니트로벤질) 말로네이트 (28.0 g, 104.8mmol)를 0℃에서 560 mL THF 중에 용해시켰다. 디이소부틸알루미늄 히드라이드 (DIBAL-H) (헥산 중 1M, 420 mL, 420 mmol)를 0℃에서 대략 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다.
20 mL 물을 0℃에서 반응 혼합물에 적가하였다. 20 mL NaOH (수성, 15%)를 0℃에서 반응 혼합물에 적가하고 이어서 20 mL 물을 반응 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, 대략 150 g MgSO4를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 이것을 부흐너 깔때기 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 500 mL EtOAc로 세척하였다. 필터 케이크를 제거하고 800 mL EtOAc 및 200 mL MeOH로 대략 30분 동안 교반한 후 용액을 여과하였다. 여과물을 합하고, 감압 하에 건조시켰다.
헵탄 중의 EtOAc의 구배에 이어서 EtOAc 중의 MeOH의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 DFC에 의해 표제 화합물을 연황색 고체로 수득하였다.
수율: 15.38 g, 72.8 mmol, 69%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.97-2.13(m, 3H), 2.79(d, 2H, 7.6 Hz), 3.60-3.73(m, 2H), 3.76-3.83 (m, 2H), 7.36(d, 2H, 8.4 Hz), 8.14(d, 2H, 8.4 Hz).
실시예 1.3
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트의 합성
Figure pct00012
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디올 (15.3 g, 72.4 mmol)을 0℃에서 150 mL CH2Cl2 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 (23 mL, 165 mmol)을 첨가하고, 이어서 메탄술포닐 클로라이드 (12 mL, 155 mmol)를 대략 15분에 걸쳐 적가하고, 이어서 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다.
500 mL CH2Cl2를 첨가하고, 혼합물을 2*250 mL NaHCO3 (수성, 포화), 125 mL HCl (수성, 0.1 M) 및 250 mL 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
수율: 25.80 g, 70.2 mmol, 97%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 2.44-2.58(m, 1H), 2.87(d, 2H, 7.7 Hz), 3.03(s, 6H), 4.17(dd, 2H, 10.3, 6.0 Hz), 4.26(dd, 2H, 10.3, 4.4 Hz), 7.38(d, 2H, 8.6 Hz), 8.19(d, 2H, 8.6 Hz).
실시예 1.4
디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트의 합성
Figure pct00013
이미다졸 (78.3g, 1.15 mol)을 실온에서 500 mL CH2Cl2 중에 현탁시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (Boc2O) (262.0 g, 1.2 mol)를 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 3*750 mL 물로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
잔류물을 250 mL 톨루엔 중에 용해시키고, 디에틸렌트리아민 (59.5 mL, 550 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다.
1 L CH2Cl2를 첨가하고, 유기 상을 2*250 mL 물로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다.
트리에틸아민 함유 CH2Cl2 중의 메탄올 (MeOH)의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 DFC에 의해 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다.
수율: 102 g, 336 mmol, 61%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.41(s, 18H), 1.58(bs, 1H), 2.66-2.77(m, 4H), 3.13-3.26(m, 4H), 4.96(bs, 2H).
실시예 1.5
테트라-tert-부틸 (((2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일))테트라카르바메이트의 합성
Figure pct00014
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트 (26.0 g, 71 mmol) 및 디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트 (76.0 g, 250 mmol)를 700 mL 아세토니트릴 중에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (43 mL, 250 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 4일 동안 교반하였다.
휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
헵탄 중의 EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 DFC에 의해 표제 화합물을 연황색 고체 발포체로 수득하였다.
수율: 27.2 g, 34.8 mmol, 49%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.40(s, 36H), 1.91-2.17(m, 3H), 2.27-2.54(m, 10H), 2.61-2.89(m, 2H), 2.98-3.26(m, 8H), 5.26(bs, 4H), 7.34(d, 2H, 8.5 Hz), 8.11(d, 2H, 8.5 Hz).
실시예 1.6
N1,N1'-(2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(N1-(2-아미노에틸)에탄-1,2-디아민), AGC0020의 합성
Figure pct00015
테트라-tert-부틸 (((2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일))테트라카르바메이트 (29.0 g, 37.1 mmol)를 950mL MeOH 및 50 mL 물 중에 용해시켰다. 아세틸 클로라이드 (50 mL, 0.7 mol)를 30℃에서 대략 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다.
휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 잔류물을 250 mL 물 중에 용해시켰다. 500 mL CH2Cl2를 첨가하고, 이어서 175 mL NaOH (수성, 5M, NaCl로 포화됨)를 첨가하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 4*250mL CH2Cl2로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜, 표제 화합물을 점성 적갈색 오일로서 수득하였다.
수율: 11.20 g, 29.3 mmol, 79%. 순도 (HPLC 도 9): 99.3%.
1H NMR (300MHz, CDCl3): 1.55(bs, 8H), 2.03(dt, 1H, 6.6, 13.3 Hz), 2.15(dd, 2H, 12.7, 6.6), 2.34-2.47(m, 10H), 2.64-2.77(m, 10H), 7.32(d, 2H, 8.7 Hz), 8.10(d, 2H, 8.7 Hz).
13C-NMR (75MHz, CDCl3): 37.9, 38.5, 39.9, 58.0, 58.7, 123.7, 130.0, 146.5, 149.5
실시예 1.7
에틸 5-히드록시-6-옥소-1,2,3,6-테트라히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00016
2-피롤리디논 (76 mL,1 mol) 및 디에틸 옥살레이트 (140 mL, 1.03 mol)를 실온에서 1 L 톨루엔 중에 용해시켰다. 포타슘 에톡시드 (EtOK) (EtOH 중 24%, 415 mL,1.06 mol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 90℃로 가열하였다.
200 mL EtOH를, 반응 혼합물의 증점 때문에 반응의 처음 1시간 동안 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. 210 mL HCl (5M, 수성)을 교반하면서 천천히 첨가하였다.
200 mL 염수 및 200 mL 톨루엔을 첨가하고, 상을 분리하였다.
수성 상을 2x400 mL CHCl3으로 추출하였다. 합한 유기 상을 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc로부터 재결정화하여, 표제 화합물을 연황색 고체로서 수득하였다.
수율: 132.7g, 0.72 mol, 72%.
실시예 1.8
에틸 3-히드록시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00017
{에틸 5-히드록시-6-옥소-1,2,3,6-테트라히드로피리딘-4-카르복실레이트} (23.00 g, 124.2 mmol)를 150 mL p-크실렌 중에 용해시키고, 탄소 상 팔라듐 (10%, 5.75 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 300 mL MeOH로 희석하고, 셀라이트(Celite)®의 짧은 패드를 통해 여과하였다. 패드를 300 mL MeOH로 세척하였다. 용매를 진공 하에 제거하여, 표제 화합물을 연적색-갈색빛 고체로서 수득하였다.
수율: 19.63 g, 107.1 mmol, 86%. MS (ESI, pos): 206.1[M+Na]+, 389.1[2M+Na]+
실시예 1.9
에틸 3-메톡시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00018
{에틸 3-히드록시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (119.2 g, 0.65 mol)를 실온에서 600 mL 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 1.8 L 아세톤 중에 용해시켰다. K2CO3 (179.7 g, 1.3 mol)을 첨가하였다. 600 mL 아세톤 중에 용해시킨 메틸 아이오다이드 (MeI) (162 mL, 321 mmol)를 실온에서 대략 1시간에 걸쳐 적가하였다.
반응 혼합물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반한 후, MeI (162 mL, 2.6 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 환원시키고, 2.5 L EtOAc를 첨가하였다.
혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 헵탄 중의 EtOAc 구배를 사용하는 SiO2 상에서의 건조 플래쉬 크로마토그래피 (DFC)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 56.1 g, 210.1 mmol, 32%. MS (ESI, pos):234.1[M+Na]+, 445.1[2M+Na]+
실시예 1.10
에틸 3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00019
{에틸 3-메톡시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (5.93 g, 28.1 mmol)를 -78℃에서 80 mL 디클로르메탄 (DCM) 중에 용해시키고, 20 mL DCM 중에 용해시킨 BBr3 (5.3 mL, 56.2 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 0℃로 가열하였다. 반응물을 25 mL tert-부틸 메틸 에테르 (tert-BuOMe) 및 25 mL MeOH의 적가에 의해 켄칭하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 90 mL DCM 및 10 mL MeOH 중에 용해시키고, SiO2의 짧은 패드를 통해 여과하였다. 패드를 DCM 중 200 mL 10% MeOH로 세척하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 400 mL 아세톤 중에 용해시켰다. K2CO3 (11.65 g, 84.3 mmol), KI (1.39 g, 8.4 mmol) 및 벤질 브로마이드 (BnBr) (9.2 mL, 84.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 200 mL EtOAc로 희석하고, 3x50 mL 물 및 50 mL 염수로 세척하였다. 합한 수성 상을 2x50 mL EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 상을 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 용리액으로서 헵탄 중 EtOAc (40 - 70%)를 사용하는 SiO2 상에서의 건조 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 5.21 g, 18.1 mmol, 65%. MS (ESI, pos): 310.2[M+Na]+, 597.4[2M+Na]+
실시예 1.11
3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실산의 합성
Figure pct00020
{에틸 3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (27.90 g, 97.1 mmol)를 250 mL MeOH 중에 용해시키고, 60 mL NaOH (5M, 수성)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 대략 1/3로 농축시켰다. 잔류물을 150 mL 물로 희석하고, 염화수소 (HCl) (5M, 수성)를 사용하여 pH 2로 산성화시켰다. 침전물을 여과하고, 진공 하에 건조시켜, 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 22.52g, 86.9 mmol, 89%.
실시예 1.12
3-(벤질옥시)-1-메틸-4-(2-티옥소티아졸리딘-3-카르보닐)피리딘-2(1H)-온 (AGC0021)의 합성
Figure pct00021
{3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실산} (3.84 g, 14.8 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) (196 mg, 1.6 mmol) 및 2-티아졸린-2-티올 (1.94 g, 16.3 mmol)을 50 mL DCM 중에 용해시켰다. N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (3.36g, 16.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 고체를 DCM으로 세척하고, 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 생성된 황색 고체를 이소프로판올/DCM으로부터 재결정화하여 AGC0021을 수득하였다. 수율: 4.65 g, 12.9 mmol, 87%. MS(ESI, pos): 383[M+Na]+, 743[2M+Na]+
실시예 1.13
AGC0023의 합성
Figure pct00022
AGC0020 (8.98 g; 23.5 mmol)을 CH2Cl2 (600 mL) 중에 용해시켰다. AGC0021 (37.43 g; 103.8 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다.
EtOAc 및 CH2Cl2의 1:1 혼합물 중의 메탄올의 구배를 사용하는 SiO2 상에서의 DFC에 의해 AGC0023을 고체 발포제로서 수득하였다.
평균 수율: 26.95 g, 20.0 mmol, 85%.
실시예 1.14
AGC0024의 합성
Figure pct00023
AGC0023 (26.95 g; 20.0 mmol)을 에탄올 (EtOH) (675 mL) 중에 용해시켰다. 철 (20.76 g; 0.37 mol) 및 NH4Cl (26.99 g; 0.50 mol)을 첨가하고, 이어서 물 (67 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 보다 많은 철 (6.75 g; 121 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 74℃에서 1시간 동안 교반하였다. 보다 많은 철 (6.76 g; 121 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 74℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 감압 하에 환원시켰다.
CH2Cl2 중의 메탄올의 구배를 사용하는 SiO2 상에서의 DFC에 의해 AGC0024로서 고체 발포체를 수득하였다.
수율 18.64 g, 14.2 mmol, 71%.
실시예 1.15
AGC0025의 합성
Figure pct00024
AGC0024 (18.64 g; 14.2 mmol)를 CH2Cl2 (750 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. BBr3 (50 g; 0.20 mol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 75분 동안 교반하였다. 반응물을 0℃에서 교반하는 동안 메탄올 (MeOH) (130 mL)을 조심스럽게 첨가하여 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. HCl (EtOH 중 1.25M, 320 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 이어서 플라스크를 회전 증발기를 사용하여 대기압 및 주위 온도에서 15분 동안 회전시킨 후에 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
물 중의 아세토니트릴 (ACN)의 구배를 사용하는 비-말단캡핑된 C18 실리카 상에서의 DFC에 의해 AGC0025를 연한 오렌지색 유리질 고체로서 수득하였다.
수율 13.27 g, 13.9 mmol, 98%.
실시예 1.16
AGC0019의 합성
Figure pct00025
AGC0025 (10.63 g; 11.1 mmol)를 실온에서 ACN (204 mL) 및 물 (61 mL) 중에 용해시켰다. 숙신산 무수물 (2.17 g; 21.7 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 환원시켰다. 물 중의 ACN의 구배를 사용하는 비-말단캡핑된 C18 실리카 상에서의 DFC에 의해 녹색빛 유리질 고체를 수득하였다.
고체를 40℃에서 MeOH (62 mL) 및 물 (10.6 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 EtOAc (750 mL)에 초음파처리 하에 적가하였다. 침전물을 여과하고, EtOAc로 세척하고, 감압 하에 건조시켜 AGC0019를 녹색빛을 띄는 회백색 고체로서 수득하였다.
수율: 9.20 g, 8.7 mmol, 78%. H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6).
실시예 2
순수한 토륨-227의 단리
토륨-227을 악티늄-227 발생기로부터 단리하였다. 악티늄-227을 라듐-226의 열 중성자 조사에 이어서 라듐-227 (t1/2=42.2 m)의 악티늄-227로의 붕괴를 통해 생성시켰다. 토륨-227를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 8 M HNO3 용액 중 악티늄-227 붕괴 혼합물로부터 선택적으로 보유시켰다. 70 mg의 AG®1-X8 수지 (200-400 메쉬, 니트레이트 형태)를 함유하는, 2 mm 내부 직경, 길이 30 mm의 칼럼을 사용하였다. 악티늄-227, 라듐-223 및 딸이 칼럼으로부터 용리된 후, 토륨-227을 12 M HCl로 칼럼으로부터 추출하였다. 토륨-227을 함유하는 용리액을 증발 건조시키고, 표지 단계 전에 잔류물을 0.01 M HCl 중에 재현탁시켰다.
실시예 3
실시예 3.1
프롤릴 엔도펩티다제 FAP에 대한 모노클로날 항체 (AGC3200)의 생성
본 발명의 IgG에 대한 아미노산 서열을 함유하는 DNA 서열을 진아트/라이프 테크놀로지스 (독일 레겐스부르크)에서 합성하고, 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 모든 유전자를 CHO 발현에 대해 코돈 최적화하였다. IgG를 NRC 캐나다에 의한 발현 시스템을 사용하여 HEK293 6E 세포에서 일시적으로 발현시키거나 (Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9) 또는 CHO-K1 세포의 안정한 형질감염 후에 발현시켰다. 항체를 이전에 기재된 바와 같이 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 후속 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다 (Hristodorov et al., Mol Biotechnol (2013) 53:326-335).
실시예 3.2 접합체 AGC3218을 수득하기 위한 mAb AGC3200과 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 (VIII)의 화합물)와의 커플링
Figure pct00026
접합 전에, 포스페이트 완충제 pH 7.5를 항체 용액 (AGC3200)에 첨가하여 용액의 완충 용량을 증가시켰다. 용기 중 AGC3200 (mAb)의 양을 결정하였다.
PBS 중 AGC3200에 11% 1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4를 첨가하였다.
킬레이트화제 AGC0019를 1:1의 DMA : 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다. NHS 및 EDC를 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다.
킬레이트화제 / N-히드록시숙신이미드 (NHS) / 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)의 1 / 1 / 3 몰 당량 용액을 제조하여 킬레이트화제를 활성화시켰다.
항체에 접합시키기 위해 8/8/25/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb) 몰비의 활성화된 킬레이트화제를 mAb에 충전하였다. 20-40분 후에, 접합 반응물을 12% v/v 0.3M 시트르산으로 켄칭하여 pH를 5.5로 조정하였다.
AGC3218 접합체의 정제 및 30 mM 시트레이트 pH 5.5, 154 mM NaCl로의 완충제 교환을 AKTA 시스템 (지이 헬스케어)에 연결된 슈퍼덱스 200 (지이 헬스케어) 칼럼 상에서의 겔 여과에 의해 수행하였다. Abs 280 nm에서의 단백질 농도를 측정한 후에 생성물을 완충제로 제제화하였다 (30 mM 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2mg/mL pABA, pH 5.5 중 2.5 mg/mL AGC0118을 수득함). 최종적으로, 용액을 보관 전에 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 멸균 병 내로 넣었다.
실시예 3.3
227Th-AGC3218 주사에 대한 용량의 제조
표지는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다:
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액 중에 용해시키고 15분 동안 정치시킨 후에, 시간 경과에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 배출시켰다. 칼럼을 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척한 후에, 3 ml 3M HCl로 토륨-227을 용리시켰다. 용리된 토륨-227의 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량을 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 이어서 산을 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치시켜 증발시켰다. 실온에 도달한 후, 6 ml AGC3218 접합체 2.5 mg/ml을 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 서서히 혼합하고 실온에서 15분 동안 정치시켰다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 iTLC 분석을 위해 회수하여 사용 전에 RCP를 결정하였다.
실시예 3.4
FAP 양성 세포주, Hs68 및 U87-MG에 대한 227Th-AGC3218의 세포독성 및 IC50 결정
5일 인큐베이션 시간 동안 세포에 첨가된 총 활성의 적정 곡선의 제조에 의해 227Th-AGC3218의 세포독성을 결정하였다. Hs68 또는 U87-MG 세포를 실험 전 날 96 웰 플레이트 내 웰당 2000개로 시딩하였다. 비활성 40 kBq/μg의 킬레이트화된 227Th-AGC3218 중 3배 단계로 희석된 1.1 x 10-4 내지 20 kBq/ml 범위의 총 활성의 적정물을 세포에 첨가하였다. Hs68 또는 U87-MG 세포를 각각 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 DMEM 및 EMEM 배지에서 배양하였다. 제5일에 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)을 세포 생존율 측정에 사용하였다. 적정 곡선을 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어에 피팅하고, IC50 값을 결정하였다.
실시예 4
아미드 및 이소티오시아네이트-연결된 접합체의 안정성의 비교
AGC3218 및 이소티오시아네이트 커플링 모이어티를 갖는 상응하는 접합체 (AGC3215)를 수용액에 40℃에서 11일 동안 저장하였다. 샘플을 정기적으로 취하였다.
아미드-커플링된 접합체에 대해 접합체 농도의 측정가능한 감소가 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 대조적으로, 이소티오시아네이트 접합체는 감소한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayern Pharma AG and Bayer AG <120> Radio-Pharmaceutical Complexes <130> BHC 16 3 049 <160> 30 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, VH-Region <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, HCDR1-Region <400> 2 Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, HCDR2-Region <400> 3 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, HCDR3-Region <400> 4 Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly Val Ala 1 5 10 15 Phe Asp Ile <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, VL-Region <400> 5 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, LCDR1-Region <400> 6 Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, LCDR2-Region <400> 7 Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, LCDR3-Region <400> 8 Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, Heavy Chain-Region <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11-hlgG1Kappa, Light Chain-Region <400> 10 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, VH-Region <400> 11 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, HCDR1-Region <400> 12 Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, HCDR2-Region <400> 13 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, HCDR3-Region <400> 14 Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly Val Ala 1 5 10 15 Phe Asp Val <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, VL-Region <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, LCDR1-Region <400> 16 Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, LCDR2-Region <400> 17 Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, LCDR3-Region <400> 18 Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 19 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, Heavy Chain-Region <400> 19 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v2-hlgG1Kappa, Light Chain-Region <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, VH-Region <400> 21 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, HCDR1-Region <400> 22 Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, HCDR2-Region <400> 23 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, HCDR3-Region <400> 24 Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly Val Ala 1 5 10 15 Phe Asp Val <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, VL-Region <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, LCDR1-Region <400> 26 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, LCDR2-Region <400> 27 Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, LCDR3-Region <400> 28 Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, Heavy Chain-Region <400> 29 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp 100 105 110 Gly Val Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 <210> 30 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESC11v3-hlgG1Kappa, Light Chain-Region <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (17)

  1. a) 화학식 (I) 또는 (II)의 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 단계:
    Figure pct00027

    여기서 RC는 카르복실산 모이어티에서 종결하는 링커 모이어티, 예컨대
    [-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
    [-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
    [-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH] (여기서 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기)임;
    b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를
    서열 1, 11 또는 21 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄 및
    서열 5, 15 또는 25 중 하나와의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드 쇄
    를 포함하는 조직-표적화 모이어티에 커플링시켜
    조직-표적화 킬레이트화제를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 알파-방출 토륨 동위원소 227Th의 4+ 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b)가 수용액 중에서 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미드-커플링 시약이 카르보디이미드 커플링 시약 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 pH 4 내지 9의 수용액 중에서 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 15 내지 50℃에서 5 내지 120분 동안 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 15 내지 50℃에서 1 내지 60분 동안 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    RC가
    [-(CH2)1-3-파라-페닐렌-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH],
    바람직하게는 [-(CH2)-파라-페닐렌-N(H)-C(=O)-(CH2)2-C(=O)OH]
    인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능한 조직-표적화 토륨 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체를 포함하는 제약 제제.
  10. 제9항에 있어서, 시트레이트 완충제를 추가로 포함하는 제약 제제.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, p-아미노부티르산 (PABA) 및 임의로 EDTA 및/또는 적어도 1종의 폴리소르베이트를 추가로 포함하는 제약 제제.
  12. 과형성 또는 신생물성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조직-표적화 토륨 복합체 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 제약 제제의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질환이 결장암, 직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 복막암, 여성 생식 기관의 암, 방광암, 위암, 두경부암 및 육종으로부터 선택된 것인 용도.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 적어도 1종의 제약 제제의 투여를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 (특히 치료를 필요로 하는 것)의 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 결장암, 직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 복막암, 여성 생식 기관의 암, 방광암, 위암, 두경부암 및 육종의 치료를 위한 방법.
  16. 결장암, 직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 복막암, 여성 생식 기관의 암, 방광암, 위암, 두경부암 및 육종의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조직-표적화 토륨 복합체 또는 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 제약 제제.
  17. i) 제1항 또는 제7항에 정의된 바와 같은 옥타덴테이트 킬레이트화제;
    ii) 제1항에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 모이어티;
    iii) 적어도 1종의 아미드-커플링 시약; 및
    iv) 임의로 및 바람직하게는 알파-방출 토륨 방사성핵종, 예컨대 227Th
    를 포함하는 키트.
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