TW201627286A - 放射性醫藥複合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種形成靶向組織之釷複合物之方法，該方法包含；a)形成八齒螯合劑，其包含4個在N-位經C1-C3烷基取代之羥基吡啶酮(hydroxypyridinone；HOPO)部分及末端為羧酸基團之偶合部分；b)藉助至少一種醯胺偶合劑將該八齒螯合劑偶合至至少一種包含至少一個胺部分之靶向組織之肽或蛋白質，由此生成靶向組織之螯合劑；及c)使該靶向組織之螯合劑與包含至少一種α-發射釷同位素之離子之水溶液接觸。 本發明亦提供一種治療腫瘤性或增生性疾病之方法，其包含投與此一靶向組織之釷複合物；以及該複合物及相應醫藥調配物。

Description

放射性醫藥複合物
本發明係關於形成具有某些偶聯至組織靶向部分之八齒配體之釷同位素複合物且尤其釷-227複合物之方法。本發明亦係關於該等複合物，且係關於涉及投與該等複合物之疾病、尤其腫瘤性疾病之治療。
特異性細胞殺傷可對於成功治療哺乳動物個體之多種疾病係必需的。此殺傷之典型實例係在惡性疾病(例如肉瘤及癌)之治療中。然而，選擇性消除某些細胞類型亦可在其他疾病、尤其增生性及腫瘤性疾病之治療中發揮關鍵作用。
選擇性治療之最常用方法目前係手術、化學療法及體外射束照射。然而，靶向放射性核種療法係有前景且在發展中之領域，有可能將高細胞毒性放射特異性地遞送至與疾病相關之細胞類型。目前授權用於人類之放射性醫藥之最常見形式採用β-發射及/或γ-發射放射性核種。然而，由於α-發射放射性核種之更具特異性細胞殺傷之潛力，業內已有些關注在治療中使用α-發射放射性核種。
典型α發射體在生理環境中之放射範圍通常小於100微米，相當於僅幾個細胞直徑。此使得該等來源非常適合於治療腫瘤(包括微小轉移)，此乃因其在腫瘤內之範圍可到達鄰近細胞，但若其良好靶向，則放射能量幾乎不會超出靶細胞。因此，無需靶向每一細胞，但 對周圍健康組織之損傷可降至最低(見Feinendegen等人，Radiat Res 148：195-201(1997))。與之相比，β粒子在水中之範圍為1mm或更大(見Wilbur,Antibody Immunocon Radiopharm 4：85-96(1991))。
α-粒子放射之能量與β粒子、γ射線及X射線所載能量相比較高，通常為5-8MeV，或係β粒子之5至10倍，且係γ射線之能量的20倍或更多倍。因此，與γ及β放射相比，此大量能量在極短距離內的沈積給予α-放射極高線性能量轉移(LET)、高相對生物效能(RBE)及低氧增強比(OER)(見Hall,「Radiobiology for the radiologist」，第5版，Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia PA,USA,2000)。此解釋了α發射放射性核種之異常細胞毒性且亦對該等同位素之生物靶向及α發射放射性核種分佈之控制及研究程度提出嚴格需求，此為避免不可接受之副作用所必需。
下表1顯示迄今為止在文獻中儘可能廣泛提出之具有治療效能之α發射體之物理衰變性質。
* 半衰期
迄今為止，關於在放射性免疫療法中之應用，主要注意力集中於211At、213Bi及225Ac，且該三種核種已在臨床免疫療法試驗中加以探索。
已提出之若干種放射性核種具有短壽命，即半衰期短於12小 時。此一短半衰期使得難以以商業方式產生並分配基於該等放射性核種之放射性醫藥。投與短壽命核種亦增加將在到達靶位點之前在體內發射之放射劑量之比例。
在許多情形中，來自α發射之反沖能將引起自母核種衰變位置釋放子核種。此反沖能足以自可已保持母核種之化學環境(例如，其中母核種藉由諸如螯合劑等配體複合)爆發多個子核。此即使在子核種與相同配體化學相容(即可複合)時亦會發生。同樣，倘若子核種係氣體(尤其稀有氣體，例如氡)或與配體化學不相容，則此釋放效應將甚至更強。在子核種之半衰期長於數秒時，其可擴散出至血液系統中，不受保持母核種之複合劑約束。則該等游離放射性子核種可引起不期望之全身毒性。
幾年前提出在維持對223Ra子同位素之控制之條件下使用釷-227(T1/2=18.7天)(見WO 01/60417及WO 02/05859)。在此情況中使用容許藉由封閉環境來保留子核種之載劑系統。在一種情形中，將放射性核種安置在脂質體內且脂質體之大尺寸(與反沖距離相比)幫助將子核種保留在脂質體內。在第二種情形中，使用放射性核種之趨骨性複合物，其併入骨基質中且由此限制子核種之釋放。該等可能係非常有利的方法，但在一些情況中不期望投與脂質體，且在多種軟組織疾病中放射性核種無法由礦物化基質包圍以保留子同位素。
最近已確立，在227Th衰變時釋放之223Ra子核之毒性在哺乳動物體內可耐受至顯著大於自先前對可比較核種測試預測之程度。在不存在保留上文所論述之釷-227之鐳子核種之特定手段時，可公開獲得之關於鐳毒性之資訊使得顯而易見的是，不可能使用釷-227作為治療劑，此乃因自釷-227衰變達成治療效應所需之劑量將自鐳子核種之衰變產生高毒性且可能致死之劑量之放射，即不存在治療窗。
WO 04/091668闡述意外地發現，治療性治療窗確實存在，其中 可將治療有效量之靶向釷-227放射性核種投與個體(通常哺乳動物)而不生成足以引起不可接受之骨髓毒性之量的鐳-223。因此，此可用於在骨位點及軟組織位點二者治療及預防所有類型之疾病。
鑒於上述發展，現在可能在內源放射性核種療法中採用α-發射釷-227核而無所生成223Ra產生之致死骨髓毒性。然而，治療窗仍相對狹窄且在所有情形中皆期望僅將絕對需要之α-發射放射性同位素投與個體。因此，若α-發射釷-227核可以高可靠性程度複合並靶向，則將顯著增強此新治療窗之有用開發。
由於放射性核種不斷衰變，在分離與投與個體之間處置材料所耗時間具有顯著重要性。若α-發射釷核可以快速且便於製備(較佳需要少數步驟、短培育時間及/或溫度且不會不可逆地影響靶向實體之性質)之形式複合、靶向及/或投與，則亦具有顯著價值。此外，可在無需在投與前去除之溶劑中(基本上在水溶液中)實施之製程具有避免溶劑蒸發或透析步驟之顯著優點。
若可研發出顯示顯著增強之穩定性之釷標記藥品調配物，亦可視為具有重要價值。關鍵在於確保在容許遞送患者劑量之後勤路徑的同時符合穩健產物品質標準。因此，在1-4天時段期間具有極小放射分解之調配物較佳。
先前已顯示含有羥基吡啶酮基團之八齒螯合劑適於配位α發射體釷-277，用於隨後附接至靶向部分(WO2011098611)。八齒螯合劑經闡述含有4個藉由連接體基團接合至基於胺之支架之3,2-羥基吡啶酮基團，該基於胺之支架具有用於偶聯至靶向分子之單獨反應基團。先前發明之較佳結構含有3,2-羥基吡啶酮基團且採用異硫氰酸酯部分作為與抗體組份之較佳偶合化學物，如化合物ALG-DD-NCS中所示。異硫氰酸酯廣泛用於將標記經由胺基團附接至蛋白質。異硫氰酸酯基團與蛋白質中之胺基末端及一級胺反應且已用於標記包括抗體在內之多 種蛋白質。儘管在該等偶聯物中形成之硫脲鍵相當穩定，但已報導自螢光異硫氰酸酯製備之抗體偶聯物隨時間而劣化。[Banks PR、Paquette DM.,Bioconjug Chem(1995)6：447-458]。藉由螢光黃異硫氰酸酯與胺之反應形成之硫脲亦易於在鹼性條件下轉化為胍[Dubey I、Pratviel G,Meunier BJournal：Bioconjug Chem(1998)9：627-632]。由於偶合至長生物半衰期之單株抗體之釷-227之長衰變半衰期(18.7天)，可期望使用更穩定的連接部分以生成在活體內及對於儲存在化學上更穩定的偶聯物。
先前關於羥基吡啶酮配體之偶聯最相關之工作公開於WO2013/167754中且揭示具有水增溶部分之配體，該水增溶部分包含羥基烷基官能基。由於此螯合物類別中羥基之反應性，作為活化酯活化係不可能的，此乃因接著發生多個競爭反應，從而經由酯化反應產生產物之複合混合物。因此，WO2013/167754之配體必須經由替代性化學物(例如異硫氰酸酯)偶合至靶向組織之蛋白質，產生如上所述之較不穩定之硫脲偶聯物。另外，WO2013167755及WO2013167756揭示分別應用於CD33及CD22靶向抗體之羥基烷基/異硫氰酸酯偶聯物。
本發明者現已確立，藉由將特定螯合劑偶合至適當靶向部分，之後添加α-發射釷離子來形成靶向組織之複合物，可在溫和條件下且藉助對於複合物之儲存及投與保持更穩定之連接部分快速生成複合物。
因此，在第一態樣中，本發明提供形成靶向組織之釷複合物之方法，該方法包含：a)形成八齒螯合劑，其包含4個在N-位經C1-C3烷基取代之羥基吡啶酮(HOPO)部分及末端為羧酸基團(或其經保護等效物)之偶合部分；b)藉助至少一種醯胺偶合劑將該八齒螯合劑偶合至至少一種包含 至少一個胺部分之靶向組織之肽或蛋白質，由此生成靶向組織之螯合劑；及c)使該靶向組織之螯合劑與包含至少一種α-發射釷同位素之離子之水溶液接觸。
在該等複合物中(且較佳在本發明之所有態樣中)，釷離子通常將由八齒含羥基吡啶酮配體複合，其繼而將經由醯胺鍵附接至組織靶向部分。
通常，該方法將為用於合成包含反應性羧酸酯官能基之基於3,2-羥基吡啶酮之八齒螯合物之方法，其可以活性酯(例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS酯))形式經由原位活化或藉由活性酯自身之合成及分離來活化。
所得NHS酯可用於簡單偶聯步驟以產生眾多種螯合物修飾之蛋白質形式。另外，高穩定性抗體偶聯物易於經釷-227標記。此可在環境溫度下或接近環境溫度，通常具有高放射性化學產率及純度。
本發明方法較佳將在水溶液中實施且在一個實施例中可在任一有機溶劑不存在或實質上不存在(小於1體積%)下實施。
較佳靶向部分包括多株且尤其單株抗體及其片段。特定結合片段例如Fab、Fab'、F(ab')2及單鏈特異性結合抗體通常係片段。
本發明之靶向組織之複合物可調配為適於投與人類或非人類動物個體之藥劑。
在第二態樣中，本發明由此提供生成醫藥調配物之方法，其包含形成如本文所述之靶向組織之複合物，之後添加至少一種醫藥載劑及/或賦形劑。適宜載劑及賦形劑包括緩衝劑、螯合劑、穩定劑及業內已知且闡述於本文任一態樣中之其他適宜組份。
在另一態樣中，本發明另外提供靶向組織之釷複合物。此一複合物將具有本文通篇闡述之特徵，尤其本文所述之較佳特徵。該複合 物可係藉由或可藉由本文所述任一方法來形成。該等方法可由此產生至少一種如本文中任一態樣或實施例所述之靶向組織之釷複合物。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所述任一複合物之醫藥調配物。該調配物可係藉由或可藉由本文所述任一方法來形成且可含有至少一種緩衝劑、穩定劑及/或賦形劑。緩衝劑及穩定劑之選擇可使得其一起幫助防止靶向組織之複合物發生放射分解。在一個實施例中，即使在調配物製造後數天時，調配物中複合物之放射分解亦極低。此係重要優點，此乃因其解決與產物品質及藥物供應後勤相關之潛在問題，該等問題對於此技術之實現及實際應用很關鍵。
本發明已顯示可用於製備多種用於靶向具有生物學意義之位點(例如腫瘤相關受體)之釷標記抗體偶聯物。
圖1：顯示EDTA/PABA對溶液中之非放射性抗體偶聯物AGC1118之穩定效應之資料。
圖2：經10kGy放射照射之含有抗體HOPO偶聯物之不同緩衝劑對過氧化氫含量之效應；a)-NaCl，b)-乙酸鹽，c)-檸檬酸鹽。
圖3：比活性高達約8000Bq/μg之227Th-AGC1118之放射穩定效應(IRF分析)。
圖4：具有不同總活性之227Th-AGC1118針對Ramos之細胞毒性(4小時培育時間)(見實例3)。
圖5：227Th-AGC0718在活體外誘導CD33陽性細胞之靶特異性細胞殺傷(見實例4)。
圖6：227Th-AGC0118在高(20kBq/μg)及低(7.4kBq/μg)比活性下之細胞毒性。陰性對照係具有相同劑量範圍、相同培育時間及讀出前天數之低結合肽-白蛋白複合物(見實例5)。
圖7：227Th-AGC2518在活體外誘導FGFR2陽性細胞之靶特異性細 胞殺傷(見實例6)。
圖8：227Th-AGC2418在活體外誘導間皮素陽性細胞之靶特異性細胞殺傷(見實例7)。
圖9：227Th-AGC1018在活體外誘導PSMA陽性LNCaP細胞之靶特異性且劑量依賴性細胞殺傷(見實例9)。
在本發明上下文中，「靶向組織之」在本文中用於指示，所述物質(尤其呈如本文所述之靶向組織之複合物之形式時)用於將其自身(且尤其用於定位任一偶聯釷複合物)優先定位至至少一個期望其存在(例如以遞送放射性衰變)之組織位點。因此，組織靶向基團或部分用於在投與該個體後提供與不具有該靶向部分之等效複合物之集中相比，至個體體內至少一個期望位點之更強定位。本發明情形中之靶向部分將較佳經選擇以特異性結合至與癌細胞相關之細胞表面受體或與腫瘤微環境相關之其他受體。
已知多個與增生性及腫瘤性疾病相關之靶。該等靶包括某些受體、細胞表面蛋白、跨膜蛋白及在患病細胞附近之細胞外基質中發現之蛋白質/肽。可與腫瘤性疾病相關之細胞表面受體及抗原之實例包括CD22、CD33、FGFR2(CD332)、PSMA、HER2、間皮素(mesothelin)等。在一個實施例中，組織靶向部分(例如肽或蛋白質)對至少一種選自以下之抗原或受體具有特異性：CD22、CD33、FGFR2(CD332)、PSMA、HER2及間皮素。
CD22或分化-22簇係屬凝集素之SIGLEC家族之分子(SIGLEC=唾液酸結合免疫球蛋白型凝集素)。
CD33或Siglec-3係在骨髓系細胞上表現之跨膜受體。
FGFR2係纖維母細胞生長因子之受體。其係人類中由駐留在染色體10上之FGFR2基因編碼之蛋白質。
HER2係人類表皮生長因子受體(HER/EGFR/ERBB)家族之成員。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)係人類中由FOLH1(葉酸水解酶1)基因編碼之酶。
間皮素亦稱為MSLN，其係人類中由MSLN基因編碼之蛋白質。
本發明情形中之尤佳的靶向組織之結合劑將經選擇以特異性結合至CD22受體。此可反映為例如對表現CD22之細胞之結合親和性較對不表現CD22之細胞之結合親和性大50倍或更多倍(例如大至少100倍，較佳大至少300倍)。人們相信，CD22在具有某些疾病狀態(如本文所指示)之細胞中表現及/或過表現，且因此CD22特異性結合劑可用於將複合物靶向該等患病細胞。類似地，組織靶向部分可結合至存於患病細胞附近之細胞上的細胞表面標記物(例如CD22受體)。CD22細胞表面標記物在患病細胞表面上之表現可多於在健康細胞表面上，或在生長或複製時段期間於細胞表面上之表現可多於在休眠期期間。在一個實施例中，CD22特異性靶向組織之結合劑可與疾病特異性細胞表面標記物之另一結合劑組合使用，由此得到雙重結合複合物。用於CD-22之靶向組織之結合劑通常將係如本文所論述之肽或蛋白質。
如本文所述之本發明之各態樣係關於疾病之治療，尤其用於患病組織之選擇性靶向，以及係關於可用於該等方法之複合物、偶聯物、藥劑、調配物、套組等。在所有態樣中，患病組織可駐留於體內單一位點處(例如在局部性實體瘤之情形中)或可駐留於複數個位點處(例如在關節炎中影響若干個關節時或在分散性或轉移性癌性疾病之情形中)。
欲靶向之患病組織可在軟組織位點處，在鈣化組織位點處或複數個位點處，該複數個位點可皆在軟組織中，皆在鈣化組織中或可包括至少一個軟組織位點及/或至少一個鈣化組織位點。在一個實施例中，靶向至少一個軟組織位點。靶向位點及疾病起源位點可相同，但 或者可不同(例如在特異性靶向轉移位點時)。倘若涉及一個以上位點，則此可包括起源位點或可為複數個二次位點。
術語「軟組織」在本文中用於指示不具有「硬質」礦物化基質之組織。具體而言，如本文所用之軟組織可為並非骨骼組織之任何組織。相應地，如本文所用之「軟組織疾病」指示發生在如本文所用之「軟組織」中之疾病。本發明尤其適於治療癌症及「軟組織疾病」，由此涵蓋癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及在任何「軟」(即非礦物化)組織中發生之混合型癌症，以及該組織之其他非癌性疾病。癌性「軟組織疾病」包括在軟組織中發生之實體瘤以及轉移性及微轉移性腫瘤。實際上，軟組織疾病可包含軟組織之原發性實體瘤及同一患者中軟組織之至少一種轉移性腫瘤。或者，「軟組織疾病」可僅由原發性腫瘤組成，或僅由原發性腫瘤係骨骼疾病之轉移組成。在本發明之所有適當態樣中，尤其適於治療及/或靶向者係血液腫瘤及尤其淋巴樣細胞之腫瘤性疾病，例如淋巴瘤及淋巴性白血病，包括非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤之B細胞腫瘤。類似地，骨髓、脊柱(尤其脊髓)淋巴結及/或血細胞之任何腫瘤性疾病在本發明之所有適當態樣中適於治療及/或靶向。
在本發明之適當態樣中適於治療及/或靶向之B細胞腫瘤之一些實例包括：慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、B細胞前淋巴球性白血病、淋巴將細胞淋巴瘤(例如華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia))、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞腫瘤(例如漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、單株免疫球蛋白沈積病、重鏈疾病)、結外邊緣區B細胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL)、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤及柏基特 淋巴瘤(Burkitt lymphoma)/白血病。
適於使用本發明FGFR2靶向劑治療之腫瘤之一些實例包括彼等其中突變事件與腫瘤形成及進展相關者，包括乳癌、子宮內膜癌及胃癌。
適於使用本發明CD33靶向劑治療之骨髓源腫瘤之一些實例包括急性類骨髓性白血病(AML)。
適於使用本發明前列腺特異性膜抗原(PSMA)靶向劑治療之腫瘤之另外一些實例包括前列腺癌及腦癌。
適於使用本發明人類表皮生長因子受體-2(HER-2)靶向劑治療之腫瘤之另外一些實例包括乳癌。
適於使用本發明間皮素靶向劑治療之腫瘤之另外一些實例包括惡性病，例如間皮瘤、卵巢癌、肺癌及胰臟癌。
對本發明成功有關鍵貢獻者係，抗體偶聯物在可接受之儲存時間段中穩定。因此，非放射性抗體偶聯物及最終釷標記藥品二者之穩定性必須符合放射性醫藥產品之製造及分配要求之嚴格準則。令人驚訝地發現，本文所述包含組織靶向性之調配物顯示傑出的儲存穩定性。此即使在通常用於加速穩定性研究之升高溫度下亦適用。
在適用於本發明之所有相容態樣之一個實施例中，可將靶向組織之複合物溶解於適宜緩衝劑中。具體而言，已發現，檸檬酸鹽緩衝劑之使用提供極為穩定之調配物。此較佳係在1-100mM範圍內(pH 4-7)、尤其在10-50mM範圍內之檸檬酸鹽緩衝劑，但最佳為20-40mM檸檬酸鹽緩衝劑。
在適用於本發明所有相容態樣之另一實施例中，可將靶向組織之複合物溶解於含有p-胺基丁酸(PABA)之適宜緩衝劑中。較佳組合係檸檬酸鹽緩衝劑(較佳在本文所述濃度下)與PABA之組合。用於本發明任一態樣中(包括與其他試劑組合)之PABA之較佳濃度為約0.005 至5mg/ml，較佳0.01至1mg/ml且更佳0.01至1mg/ml。0.1至0.5mg/ml之濃度最佳。
在適用於本發明所有相容態樣之另一實施例中，可將靶向組織之複合物溶解於含有乙二胺四乙酸(EDTA)之適宜緩衝劑中。較佳組合係使用EDTA與檸檬酸鹽緩衝劑。尤佳組合係在PABA存在下使用EDTA與檸檬酸鹽緩衝劑。在該等組合中，若適宜，檸檬酸鹽、PABA及EDTA較佳將以本文所指示之濃度範圍及較佳濃度範圍存在。用於本發明任一態樣中(包括與其他試劑組合)之EDTA之較佳濃度為約0.02至200mM，較佳0.2至20mM，且最佳0.05至8mM。
在適用於本發明所有相容態樣之另一實施例中，可將靶向組織之複合物溶解於含有至少一種聚山梨醇酯(PEG接枝之去水山梨醇脂肪酸酯)之適宜緩衝劑中。較佳聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)去水山梨醇單油酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)去水山梨醇單硬脂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)去水山梨醇單棕櫚酸酯)、聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)去水山梨醇單月桂酸酯)及其混合物。聚山梨醇酯80(P80)最佳係聚山梨醇酯。用於本發明任一態樣中(包括與其他試劑組合)之聚山梨醇酯(如本文所指示之尤佳聚山梨醇酯)之較佳濃度為約0.001至10% w/v，較佳0.01至1% w/v且最佳0.02至0.5 w/v。
儘管先前已將PABA闡述為放射穩定劑(見US4880615 A)，但觀察到本發明中PABA對非放射性偶聯物儲存之正面效應。此在放射分解不存在下之穩定效應構成尤其驚人之優點，此乃因靶向組織之螯合劑之合成通常將在與釷離子接觸之前顯著發生。因此，靶向組織之螯合劑可在與釷離子接觸之前1小時至3年生成且較佳將在儲存時段之至少一部分期間與PABA接觸儲存。亦即，本發明之步驟a)及b)可在步驟c)之前1小時至3年發生，且在步驟b)與c)之間，靶向組織之螯合劑 可與PABA接觸、尤其在緩衝劑(例如檸檬酸鹽緩衝劑，且視情況含有EDTA及/或聚山梨醇酯)中儲存。所有材料皆較佳係本文所指示之類型及濃度。因此，PABA係本發明調配物之極佳組份且可產生靶向組織之螯合劑及/或靶向組織之釷複合物之長期穩定性。圖1圖解說明PABA在本發明系統中之效應。
如本文所述之檸檬酸鹽緩衝劑之使用提供關於本發明調配物中靶向組織之釷複合物之穩定性之另一驚人優點。本發明者實施關於緩衝劑-溶液對過氧化氫生成之效應的照射研究，得到意外結果。已知過氧化氫可因水放射分解而形成且有助於溶液中蛋白質偶聯物之化學修飾。因此，過氧化氫生成對產物之純度及穩定性具有不期望之效應。圖2顯示驚人的觀察結果，與所測試之所有其她緩衝劑相比，在經Co-60(10kGy)照射之本發明之抗體HOPO偶聯物之檸檬酸鹽緩衝劑溶液中量測到過氧化氫含量較低。因此，本發明調配物較佳將包含如本文所述之檸檬酸鹽緩衝劑。
本發明者另外已確立關於本發明調配物中之某些組份之組合效應之另一驚人發現。此亦係關於放射標記之偶聯物之穩定性。研究目的係評價227Th-AGC1118偶聯物(見下文)在儲存期間之穩定性。使用227Th-AGC1118在約8000Bq/μg之比活性下實施結合IRF分析。使用30或100mM檸檬酸鹽緩衝劑或添加0.02、0.2或2mg/mL pABA之30mM檸檬酸鹽緩衝劑製備227Th-AGC1118之5種不同儲存溶液，pH 5.5。圖3顯示尤其在以本文所指示範圍與檸檬酸鹽及/或PABA組合時，對本發明調配物之放射穩定性之顯著正面效應。在上述研究中已發現檸檬酸鹽係最有效緩衝劑，令人驚訝地發現，藉由添加PABA可進一步改良此效應。
本發明之方法、複合物及調配物之關鍵組份係八齒螯合劑部分。關於釷離子與羥基吡啶酮配體之複合的最相關先前工作公開為 WO2011/098611且揭示相對易於生成與八齒含HOPO配體複合之釷離子。
先前已知釷螯合劑亦包括聚胺基多酸螯合劑，其包含直鏈、環狀或具支鏈聚氮雜烷主鏈，且具有附接在主鏈氮處之酸性(例如羧基烷基)基團。該等螯合劑之實例包括DOTA衍生物(例如對異硫氰基苄基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA))及DTPA衍生物(例如對異硫氰基苄基-二乙烯三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA))，前者係環狀螯合劑，後者係直鏈螯合劑。
先前已例示1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸之衍生物，但無法容易地使用標準方法來螯合釷與DOTA衍生物。將DOTA衍生物與該金屬一起加熱有效提供螯合物，但通常產率較低。在該程序期間，往往有至少一部分配體不可逆地變性。此外，由於其對不可逆變性之相對高敏感性，通常需要避免靶向部分之附接，直至所有加熱步驟完成為止。此增加額外化學步驟(及所有所需的後處理及分離)，其必須在α-發射釷同位素之衰變壽命期間實施。顯然，較佳不以此方式處置α-發射材料或不生成大於所需程度之相應廢物。此外，製備偶聯物耗費的所有時間浪費一部分將在此製備時段期間衰變之釷。
本發明在所有方面中之關鍵態樣係使用八齒配體，尤其包含4個HOPO部分之八齒含羥基吡啶酮配體。該等配體通常將包含至少4個各自獨立地具有以下經取代吡啶結構(I)之螯合基團：
其中R1係烷基，例如C1至C5直鏈或具支鏈烷基，包括甲基、乙 基、正丙基或異丙基及正丁基、第二丁基、異丁基或第三丁基。較佳R1係C1至C3，尤其甲基。在一個較佳實施例中，甲基取代基存於式(I)中所有4個部分之氮上。
本文中所提及之烷基通常將係直鏈或具支鏈C1至C8烷基，例如甲基、乙基、正丙基或異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基或第二丁基等等。
在某些先前揭示(例如WO2013/167756、WO2013/167755及WO2013/167754)中，對應於R1之基團主要係增溶基團，例如羥基或羥基烷基(例如-CH2OH、-CH2-CH2OH、-CH2-CH2-CH2OH等)。此在較高溶解度方面具有某些優點，但該等螯合劑由於在R1位之反應性而難以使用醯胺鍵接合至靶向部分。因此，在本發明中，R1通常不為羥基或羥基烷基。
在式(I)中，基團R2至R6可各自獨立地選自H、OH、=O、偶合部分及連接體部分。較佳地，基團R2至R6中之恰好一者將係=O且基團R2至R6中之恰好一者將係OH。基團R2至R6中之其餘三者可為H，但R2至R6中之至少一者將係連接體部分及/或偶合部分。偶合部分闡述於下文中，但末端為羧酸以供藉由醯胺鍵附接至靶向部分。該偶合部分可在基團R2至R6中之一者處直接附接至環，但更佳將附接至連接部分，該連接部分自身將構成基團R2至R6中之一者。
N-取代之3,2-HOPO部分極佳作為本發明之HOPO基團，且在一個實施例中，八齒配體之所有4個複合部分可為3,2-HOPO部分。
適宜螯合部分可藉由業內已知方法來形成，包括闡述於US 5,624,901(例如實例1及2)及WO2008/063721(二者皆以引用方式併入本文中)中之方法。
較佳螯合基團包括彼等具有下式(II)者：
在上式(II)中，=O部分代表附接至吡啶環中任一碳之側氧基，-OH代表附接至吡啶環中任一碳之羥基部分，且-RL代表將羥基吡啶酮部分附接至其他複合部分以形成整體八齒配體之連接體部分。本文所述任一連接體部分適合作為RL，包括短烴基，例如C1至C8烴基，包括C1至C8烷基、烯基或炔基，包括所有拓撲之甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及/或己基。RL可在吡啶環之任一碳處接合式(II)之環。然後RL基團可繼而直接鍵結至另一螯合部分、鍵結至另一連接體基團及/或鍵結至中心原子或基團，例如環或其他模板(如本文所述)。連接體、螯合基團及可選模板部分經選擇以形成適當八齒配體。
RC代表偶合部分，如下文所論述。適宜部分包括烴基，例如末端為羧酸基團之烷基或烯基。本發明者已確立，藉由例如本發明方法使用羧酸連接部分形成醯胺在螯合劑與組織靶向部分之間提供更穩定的偶聯。
在一個較佳實施例中，式II之-OH及=O部分駐留於吡啶環之鄰近原子上，使得2,3-、3,2-；4,3-；及3,4-羥基吡啶酮衍生物非常適宜。基團RN係甲基取代基。
在一個較佳實施例中，4個3,2-羥基吡啶酮部分存在於八齒配體結構中。
更佳螯合基團係彼等具有式(IIa)者：
如本文所用術語「連接體部分」(式(II)及式(IIa)中之RL)用於指示用於接合八齒配體中之至少兩個螯合基團之化學實體，該等八齒配體在本發明之各態樣中形成關鍵組份。連接體部分亦可接合至用於將八齒配體部分偶合至組織靶向部分之偶合部分。通常，每一螯合基團(例如彼等具有上文式(I)及/或(II)及/或(IIa)者)將為二齒且因此4個HOPO螯合基團通常將存於配體中。該等螯合基團藉助其連接體部分彼此接合且藉助偶合部分偶合至組織靶向部分(在本發明方法中)。因此，式(I)及/或(II)之一個以上螯合基團之間可共享連接體部分(例如式(II)中之基團RL)。連接體部分亦可用作八齒配體之複合部分與靶向部分之間之附接點。在此一情形中，至少一個連接體部分將接合至偶合部分(式(II)中之RC)。適宜連接體部分包括短烴基，例如C1至C12烴基，包括C1至C12烷基、烯基或炔基，包括所有拓撲之甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及/或己基。連接體部分(RL)中可包含之其他基團包括任何適度穩健之官能基，例如芳基(例如苯基)、醯胺、胺(尤其二級胺或三級胺)及/或醚。RC部分亦可包含烷基及/或芳基區段及視情況諸如胺、醯胺及醚鍵聯等基團。通常，偶合部分之所有組份將需要對複合物將經受之儲存條件穩健。此包括α-放射分解且因此不穩定官能基並非較佳。
在一個實施例中，偶合部分包含末端羧酸、至少一個烷基部分(例如甲基或乙基部分)、至少一個醯胺及至少一個芳基部分(例如苯基)。偶合部分可藉助碳-碳鍵、醯胺、胺及/或醚鍵聯接合至八齒配體 之一或多個連接體部分。
在本發明之最佳實施例中，將八齒配體連接至靶向部分之偶合部分(RC)經選擇為[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]，[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或[-[CH2]1-3-Ar-N(H)-C(=O)-[CH2]1-5-C(=O)OH]，其中Ar係芳香族基團，例如經取代或未經取代之伸苯基，且Ph係伸苯基，較佳對伸苯基。
連接體部分可為或包含任何其他適宜穩健化學鍵聯，包括酯、醚、胺及/或醯胺基團。接合兩個螯合部分之總原子數(若存在一個以上路徑，則按最短路徑計數)通常將受限，以迫使螯合部分呈適合於複合物形成之排列。因此，連接體部分通常將經選擇以在螯合部分之間提供不多於15個原子，較佳地在螯合部分之間1至12個原子，且更佳1至10個原子。倘若連接體部分直接接合兩個螯合部分，則該連接體之長度通常將為1至12個原子，較佳2至10個原子(例如乙基、丙基、正丁基等)。倘若連接體部分接合至中心模板(見下文)，則每一連接體可較短，且兩個單獨連接體接合螯合部分。在此情形中，1至8個原子、較佳1至6個原子之連接體長度可較佳(甲基、乙基及丙基係適宜的，諸如該等在一端或兩端具有酯、醚或醯胺鍵聯者之基團亦適宜)。
除了主要用於將八齒配體之各個螯合基團彼此連接及/或連接至中心模板之連接體部分外，八齒配體進一步包含具有末端羧酸之偶合部分(RC)。偶合部分之功能係將八齒配體經由穩定共價鍵、尤其醯胺連接至靶向部分。較佳地，偶合部分將藉由直接共價附接至螯合基團中之一者或更通常地藉由附接至連接體部分或模板共價連接至螯合基團。應使用兩個或更多個偶合部分，其各自可附接至例如在任一模 板、連接體或螯合基團上之任一可用位點。
在一個實施例中，偶合部分可具有以下結構：
其中R7係橋接部分，其係選自以下之成員：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之雜環烷基、經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之雜芳基；且X係藉由醯胺或羧酸或等效官能基接合之靶向部分。較佳橋接部分包括所有彼等於本文中指示為適宜連接體部分之基團。
較佳靶向部分包括所有彼等本文所闡述者且較佳反應性X基團包括能在形成與靶向部分之醯胺共價鍵聯中起「羧酸」作用之任一基團，包括例如-COOH、-SH、-NHR及基團，其中NHR中之R可為H或本文所述短烴基中之任一者。附接至靶向部分上之極佳基團包括離胺酸殘基之ε-胺。適宜反應性X基團之非限制性實例包括N-羥基琥珀醯亞胺基酯、亞胺酸酯、醯鹵、N-馬來醯亞胺及α-鹵基乙醯基。
在本發明之一個較佳實施例中，橋接部分R7經選擇為經取代芳基且將八齒配體連接至靶向部分之偶合部分(RC)經選擇為[-C(=O)-CH2CH2-X-]，藉此在即將偶聯至靶向部分之前以N-羥基琥珀醯亞胺酯之水溶液形式原位活化HOPO配體上之游離羧酸酯基團。
偶合部分較佳經附接，使得所得偶合八齒配體將能夠經歷穩定金屬離子複合物之形成。因此，偶合部分較佳將在不會顯著干擾複合之位點處連接至連接體、模板或螯合部分。此一位點較佳將在連接體或模板上，更佳在遠離結合之靶之表面之位置處。
八齒配體中式(I)或(II)或(IIa)之每一部分可藉由如本文所論述之任一適當連接體基團且以任一適當拓撲接合至配體之其餘部分。舉例而言，4個式(I)及/或(II)及/或(IIa)基團可藉由其連接體基團接合至主 鏈，以形成直鏈配體，或可藉由連接體基團橋接以形成「寡聚物」型結構，其可為直鏈或環狀。或者，式(I)及/或(II)及/或(IIa)之配體部分可各自藉由連接體(例如「RL」部分)以「十字」或「星狀」形貌接合至中心原子或基團。連接體(RL)部分可僅經由碳-碳鍵接合，或可藉由任何適宜穩健官能基(包括胺、醯胺、醚或硫-醚鍵)附接至彼此，附接至其他螯合基團，附接至主鏈、模板、偶合部分或其他連接體。
「星形」排列指示於下式(III)中：
其中所有基團及位置皆係如上文所指示且「T」另外係中心原子或模板基團，例如碳原子、烴基鏈(例如彼等上文所述者中之任一者)、脂肪族或芳香族環(包括雜環)或稠合環系統。最基礎模板將係單一碳，隨後其將藉由其連接基團附接至螯合部分中之每一者。較長鏈(例如乙基或丙基)對於附接至模板每一端之兩個螯合部分具有同等活力。顯然，任何適宜穩健鍵聯可用於接合模板及連接體部分中，包括 碳-碳鍵、酯、醚、胺、醯胺、硫-醚或二硫鍵。
顯然，在式(II)、(III)、(IV)及(IVb)之結構中，若適宜，吡啶環中原本未經取代(例如藉由連接體或偶合部分)之位置可載有針對式(I)中R1至R5所述之取代基。具體而言，小烷基取代基(例如甲基、乙基或丙基)可存於任一位置處。
八齒配體另外將包含至少一個如上所述之偶合部分。在本發明方法中，在最終複合物中或在羧酸中，此可係任一適宜結構，包括彼等本文所指示者中之任一者，且末端將為靶向部分。
偶合部分可附接至連接體、模板或螯合部分之任一適宜點，例如如式(III)中所指示之點a、b及/或c。偶合部分可藉由任何適宜穩健鍵聯來附接，例如碳-碳鍵、酯、醚、胺、醯胺、硫-醚或二硫鍵。類似地，能與靶向部分形成任何該等鍵聯之基團適用於偶合部分之功能末端且該部分在附接至靶向部分時將以該等基團為末端。
替代性「主鏈」型結構指示於下式(IV)中
其中所有基團及位置皆係如上文所指示且「RB」另外係主鏈部 分，其通常將具有與本文所指示之任一連接體部分類似之結構及功能，且因此若情況容許，連接體部分之任一定義可適用於該主鏈部分。適宜主鏈部分將形成螯合部分藉助其連接體基團附接於其上之支架。通常需要3個或4個主鏈部分。通常對於直鏈主鏈此將為3個，或若主鏈環化則將為4個。尤佳主鏈部分包括短烴鏈(例如彼等本文所述者)，視情況在一端或兩端具有雜原子或功能部分。在此方面中，胺及醯胺基團尤其適宜。
偶合部分可附接至連接體、主鏈或螯合部分之任一適宜點，例如如式(IV)中所指示之點a、b及/或c'。偶合部分可藉由任何適宜穩健鍵聯來附接，例如碳-碳鍵、酯、醚、胺、醯胺、硫-醚或二硫鍵。類似地，能與靶向部分形成任何該等鍵聯之基團適用於偶合部分之功能末端，且該部分在附接至靶向部分時將以該等基團為末端。
具有4個藉由醯胺連接體基團附接至主鏈之3,2-HOPO螯合部分之「主鏈」型八齒配體將為如下式(V)：
顯然，偶合部分RC可在此分子上之任一適宜點添加，例如在一個二級胺基團處或在任一主鏈烷基上之分支點處。基團RC之較佳位點顯示於式(V)中。RC將以羧酸為末端，或在本發明之適當態樣中將藉助醯胺鍵聯接合至組織靶向部分。所有小烷基(例如主鏈伸丙基或n-取代伸乙基)可經其他小伸烷基(例如彼等本文所述者中之任一者(亞甲基、伸乙基、伸丙基及伸丁基尤其適宜))取代。
各自具有4個藉由乙基醯胺基團連接至乙二胺及丙二胺之3,2-HOPO螯合部分之實例性「模板化」八齒配體將分別係如下式(VI)：
顯然，式(VI)中顯示之任一伸烷基(如伸乙基部分)可獨立地經其他小伸烷基取代，例如亞甲基、伸丙基或伸正丁基。有益地，保留對稱性，故中心伸丙基C3鏈較佳，同時其他伸乙基保留，或將HOPO部分連接至一個或兩個中心三級胺之兩個伸乙基可由亞甲基或伸丙基替代。
式(VIb)顯示用於偶合部分RC之可能位置，其將存於式(VI)中之任一適當位置，例如-CH-基團。
如上文所指示，八齒配體通常將包括可在任一點接合至配體之其餘部分之偶合部分。用於偶合部分附接之適宜點顯示於下式(VIb)中：
其中RC係任一適宜偶合部分，尤其適用於經由醯胺基團附接至組織靶向基團。用於形成至組織靶向部分之醯胺之末端為酸或等效活性基團之短烴基(例如C1至C8環狀、具支鏈或直鏈芳香族或脂肪族基團)非常適宜作為式(VIb)及本文通篇中之基團RC。
實例性模板亦包括其他模板，其中偶合基團RC共價連接至如式(VII)中所示胺基主鏈中之氮原子。
顯示用於配體附接之適宜位點之包括極佳八齒配體彼等具有下式(VIII)及(IX)者：
化合物(VIII)之合成闡述於下文中且遵循下文所述之合成途徑。
AGC0019及式(VI)、(VIb)、(VII)、(VIII)及(IX)形成具有末端為羧酸基團之連接體部分之較佳八齒螯合劑。彼等結構中顯示之八齒配體及所示連接體部分亦形成其類型之較佳實例且可以任一組合來組合。該等組合將對於熟練技術人員顯而易見。
本發明方法之步驟a)可藉由任一適宜合成途徑來實施。通常，此將涉及藉助連接基團，視情況藉助模板將4個HOPO部分(例如彼等具有式(I)及/或(II)及/或(IIa)者)連接至偶合部分。所有該等基團皆闡述於本文中且較佳實施例在此情況中同樣較佳。HOPO部分、連接體、偶合部分與視情況模板之間之偶合通常將藉助穩健基團(例如醯胺、胺、醚或碳-碳鍵)來進行。該等鍵之合成方法及任何所需保護策略為合成化學業內所熟知。合成方法之一些特定實例給出於下文之以下實例中。該等方法提供特定實例，但本文所闡釋之合成方法亦將可由彼等熟習此項技術者用於一般情況中。因此，若情況容許，實例中闡釋之方法亦意欲作為適用於本發明所有態樣及實施例之一般揭示內容。
較佳地，本發明所有態樣中α-發射釷及八齒配體之複合物係或可在不在60℃以上加熱之情況下(例如不在50℃以上加熱之情況下)、較 佳在不在38℃以上加熱之情況下且最佳在不在25℃以上(例如在20至38℃範圍內)加熱之情況下形成。典型範圍可為例如15至50℃或20至40℃。本發明方法中之複合反應(部分c))可實施任一合理時段，但此時段較佳將介於1與120分鐘之間，較佳介於1與60分鐘之間，且更佳介於5與30分鐘之間。
另外較佳地，靶向部分與八齒配體之偶聯物係在添加α-發射釷同位素(例如227Th4+離子)之前製備。因此，本發明產物較佳係藉由或可藉由八齒配體與組織靶向部分(靶向組織之螯合劑)之偶聯物與α-發射釷同位素(例如227Th4+離子)之複合來形成。
各種類型之靶向化合物可經由八齒螯合劑(包含如本文所述之偶合部分)連接至釷(例如釷-227)。靶向部分可選自已知靶向基團，其包括單株或多株抗體、生長因子、肽、激素及激素類似物、葉酸衍生物、生物素、抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白或其類似物。其他可能的靶向基團包括適宜官能化RNA、DNA或其片段(例如適配體)、寡核苷酸、碳水化合物、脂質或藉由組合該等基團在有蛋白質或無蛋白質情況下製得之化合物等。可如上文所指示包括PEG部分，例如以延長生物保留時間及/或減小免疫刺激。
通常，如本文所用組織靶向部分將係「肽」或「蛋白質」，其係主要由胺基酸組份之間之醯胺主鏈來形成，具有或不具有二級或三級結構特徵。
在一個實施例中，組織靶向部分可不包括趨骨物、脂質體及葉酸偶聯之抗體或抗體片段。
根據本發明，227Th可由靶向複合劑複合，該靶向複合劑藉由醯胺鍵聯接合至或可接合至如本文所述之組織靶向部分。通常，靶向部分將具有100g/mol至數百萬g/mol(尤其100g/mol至1百萬g/mol)之分子量，且較佳將具有直接對疾病相關受體之親和性，及/或將包含適 宜預投與結合劑(例如生物素或抗生物素蛋白)，該結合劑結合至在投與227Th之前已靶向疾病之分子。適宜靶向部分包括多肽及寡肽、蛋白質、DNA及RNA片段、適配體等，較佳蛋白質，例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、多株或單株抗體(包括IgG及IgM型抗體)或蛋白質或蛋白質之片段或構築體之混合物。抗體、抗體構築體、抗體片段(例如Fab片段或任何包含至少一個抗原結合區之片段)、片段構築體(例如單鏈抗體)或其混合物尤佳。適宜片段尤其包括Fab、F(ab')2、Fab'及/或scFv。抗體構築體可為本文所指示之任一抗體或片段。
在適用於本發明所有態樣之第一靶向實施例中，特異性結合劑(組織靶向部分)可經選擇以靶向CD22受體。此一組織靶向部分可為與至少一個如下文所述之序列具有序列相似性或一致性之肽：
在上文序列中，人類化(H'ised)序列中之「-」指示該殘基自鼠類序列無變化。
在上文序列(SeqID1-5)中，相信粗體區係關鍵特異性結合區 (CDR)，相信加下劃線區域在結合中具有次要重要性，且相信未加重區域代表結構區而非特異性結合區。
在本發明之所有態樣中，組織靶向部分可具有與彼等闡述於SeqID1-5中之序列中之至少一者或任一者具有顯著序列一致性或顯著序列相似性之序列。顯著序列一致性/相似性可視為與完整序列具有至少80%序列相似性/一致性及/或與特異性結合區(彼等在上文序列中以粗體顯示之區域及視情況彼等加下劃線區段)具有至少90%序列相似性/一致性。對於粗體區域且較佳亦對於完整序列，較佳序列相似性或更佳一致性可為至少92%、95%、97%、98%或99%。序列相似性及/或一致性可使用來自威斯康辛大學(University of Wisconsin)之Genetics Computer Group 10版軟體包之「BestFit」程式來測定。該程式使用局部方式，採Smith及Waterman算法(algorithm of Smith and Waterman)，預設值：空位產生罰分=8，空位擴展罰分=2，平均匹配=2.912，平均失配=2.003。
組織靶向部分可包含一個以上肽序列，在此情形中至少一個且較佳所有序列可(獨立地)符合上述與SeqID1-5中任一者之序列相似性且較佳序列一致性。
組織靶向部分對CD22具有結合親和性，且在一個實施例中亦可具有在完整域中具有至多約40個變異(較佳0至30個變異)之序列。變體可藉由插入、缺失及/或取代所致，且對於SeqID1-5是鄰接或不鄰接的。取代或插入通常係藉助遺傳代碼之20個胺基酸中之至少一者，且取代最通常地係為保守取代。
在適用於本發明所有態樣之第二靶向實施例中，特異性結合劑(組織靶向部分)可經選擇以靶向CD33受體。此一組織靶向部分可為單株抗體且可經選擇為林妥珠單抗(lintuzumab)或在C-末端具有額外離胺酸殘基之林妥珠單抗。
在適用於本發明所有態樣之第三靶向實施例中，特異性結合劑(組織靶向部分)可經選擇以靶向HER-2抗原。組織靶向部分可為單株抗體且較佳為曲妥珠單抗(trastuzumab)。
用於FGFR2、間皮素及PSMA之靶向之其他適宜抗體序列例示於實例區段中。然而，對於熟習此項技術者應顯而易見，在序列中含有離胺酸殘基之已知靶向疾病特異性靶之任何蛋白質形式將係本發明方法之候選者且相應地適用於所有其他態樣。
關於α-發射釷組份，最近的重要發現為，某些α-放射性釷同位素(例如227Th)可以治療有效且不會生成不可耐受之骨髓毒性之量來投與。在本發明所有態樣中，釷-227(227Th)係較佳釷同位素。如本文所用術語「可接受之非骨髓毒性」意指，最重要的是，所投與釷-227放射性同位素之衰變生成之鐳-223之量對於個體通常不足以直接致死。然而，對於熟練技術人員清楚知道，該治療之可接受副作用之骨髓損傷之量(及致死反應之機率)將隨著所治療疾病之類型、治療方案之目標及個體之預後而顯著變化。儘管本發明之較佳個體係人類，但其他哺乳動物、尤其伴侶動物(例如狗)將受益於本發明之使用且可接受骨髓損傷之程度亦可反映個體之物種。與非惡性疾病相比，在惡性疾病治療中可接受骨髓損傷之程度通常將較大。骨髓毒性程度之一個熟知量度係嗜中性球計數，且在本發明中，223Ra之可接受之非骨髓毒性量通常將係受控量，使得在其最低點(底點)之嗜中性球分數不小於治療前計數之10%。較佳地，223Ra之可接受之非骨髓毒性量將係使得嗜中性球分數係底點之至少20%且更佳至少30%之量。至少40%之底點嗜中性球分數最佳。
另外，含有放射性釷(例如227Th)之化合物可以高劑量方案使用，其中所生成鐳(例如223Ra)之骨髓毒性通常將不可耐受，此時包括幹細胞支持或相當之恢復方法。在該等情形中，嗜中性球計數可降低至低 於底點之10%且尤其將降低至5%或(若需要)低於5%，前提係採取適宜預防措施且給予後續幹細胞支持。該等技術為業內所熟知。
本發明中尤其關注之釷同位素係釷-227，且若情況容許，對於本文中所有提及釷之情況，釷-227係較佳同位素。釷-227相對易於產生且可自中子照射之226Ra間接製備，其將含有227Th之母核，即227Ac(T1/2=22年)。錒-227可極其容易地自226Ra靶分離且用作227Th之產生者。若需要，此過程可按比例放大至工業規模，且因此可避免使用視為分子靶向放射療法候選者之大多數其他α-發射體時見到之供應問題。
釷-227經由鐳-223衰變。在此情形中，主要子核種之半衰期為11.4天。在最初幾天期間，自純227Th來源僅產生中等量之鐳。然而，223Ra潛在毒性高於227Th，此乃因在自223Ra發射α粒子後幾分鐘內自短壽命子核種發射另外三種α粒子(見下表2，其展示釷-227之衰變系)。
部分由於其生成可能有害之衰變產物，釷-227(T1/2=18.7天)已被廣泛認為不用於α粒子療法。
為與最高豐度天然釷同位素(即釷-232，半衰期1010年及有效非放射性)之釷複合物相區分，應理解本文主張之釷複合物及其組合物 包括大於天然之相對豐度(例如大至少20%)之α-發射釷放射性同位素(即至少一種半衰期小於103年之釷同位素，例如釷-227)。此不必影響本發明方法之定義，其中明確需要治療有效量之放射性釷(例如釷-227)，但較佳在所有態樣中將係如此。
在本發明之所有態樣中，α-發射釷離子較佳係釷-227離子。釷之4+離子係用於本發明複合物之較佳離子。相應地，釷-227之4+離子極佳。
釷-227可以足以提供可期望治療效應而不生成如此多鐳-223而引起不可耐受之骨髓阻抑之量投與。可期望將子同位素維持在靶向區中，以使得可自其衰變衍生其他治療效應。然而，無需維持對釷衰變產物之控制以在不誘導不可接受之骨髓毒性之情況下具有有用治療效應。
假定腫瘤細胞殺傷效應將主要來自釷-227且不來自其子核種，則此同位素之可能的治療劑量可藉由與其他α發射體比較來確認。舉例而言，對於砈-211，動物中之治療劑量通常係2-10MBq/kg。藉由針對半衰期及能量進行校正，釷-227之相應劑量可為至少36-200kBq/kg體重。此將設定可有用地在治療效應之預期中投與之227Th之量之下限。此計算假定砈與釷之保留相當。然而，顯然釷之18.7天半衰期將最有可能導致此同位素之消除在其衰變之前較多。因此，此計算劑量通常應視為最小有效劑量。根據完全保留之227Th(即未自體內消除之227Th)表示之治療劑量通常將為至少18或25kBq/kg，較佳至少36kBq/kg且更佳至少75kBq/kg，例如100kBq/kg或更多。預期更大量之釷將具有更大治療效應，但若將導致不可耐受之副作用則不可投與。同樣，若釷係以具有短生物半衰期(即自仍攜載釷之身體消除之前之半衰期)之形式來投與，則治療效應將需要更大量之放射性同位素，此乃因大部分釷將在其衰變之前被消除。然而，所生成鐳-223之量將 相應地降低。上文在同位素完全保留時欲投與之釷-227之量可容易地與較短生物半衰期之等效劑量相關聯。該等計算為業內所熟知且闡述於WO 04/091668中(例如在實例1及2之文本中)。
若放射標記化合物釋放子核種，則瞭解任何放射性子核種之命運係重要的(若適用)。對於227Th，主要子核種產物係223Ra，其由於其趨骨性質而處於臨床評估下。鐳-223極快地清除血液且在骨骼中集中或經由腸及腎途徑排泄(見Larsen,J Nucl Med 43(5，增刊)：160P(2002))。因此，在活體內自227Th釋放之鐳-223不顯著影響健康軟組織。在Müller於Int.J.Radiat.Biol.20：233-243(1971)中關於作為溶解檸檬酸鹽之227Th之分佈之研究中發現，軟組織中自227Th生成之223Ra易於重分佈至骨或被排泄。因此，α發射鐳尤其對骨髓之已知毒性係使用釷劑量之問題。
在WO 04/091668中首次確立，事實上，至少200kBq/kg之223Ra之劑量可在人類個體中投與並耐受。該等資料呈現於該公開案中。因此，現在可看出，極其意外地，治療窗確實存在，其中可將治療有效量之227Th(例如大於36kBq/kg)投與哺乳動物個體且預期此一個體將不會經受嚴重或甚至致死骨髓毒性之不可接受之風險。然而，極為重要的是，充分利用此治療窗且因此必需快速有效地複合放射性釷，且保持有極高親和性，以使得儘可能最大比例的劑量遞送至靶位點。
自227Th醫藥生成之223Ra之量將取決於放射標記化合物之生物半衰期。理想情況將係使用具有快速腫瘤攝取(包括內化至腫瘤細胞中，強腫瘤保留及在正常組織中之短生物半衰期)之複合物。然而，可使用生物半衰期不太理想之複合物，只要將223Ra之劑量維持在可耐受之程度內即可。在活體內生成之鐳-223之量將係所投與釷之量及釷複合物之生物保留時間之一因素。在任一具體情形中所生成之鐳-223之量可由熟習此項技術者容易地計算。227Th之最大可投與量將取 決於在活體內生成之鐳之量且必須小於將產生不可耐受程度之副作用、尤其骨髓毒性之量。此量通常將小於300kBq/kg，尤其小於200kBq/kg且更佳小於170kBq/kg(例如小於130kBq/kg)。最小有效劑量將取決於釷之細胞毒性、患病組織對所生成α照射之敏感性及靶向複合物(在此情形中係配體與靶向部分之組合)有效組合、保持及遞送釷之程度。
在本發明方法中，釷複合物可期望地以18至400kBq/kg體重、較佳36至200kBq/kg(例如50至200kBq/kg)、更佳75至170kBq/kg、尤其100至130kBq/kg之釷-227劑量來投與。相應地，單一劑量可包含乘以適宜體重(例如30至150Kg，較佳40至100Kg)之大約該等範圍中之任一者(例如每劑量540kBq至4000KBq之範圍等)。此外，釷劑量、複合劑及投與途徑將可期望地使得在活體內生成之鐳-223劑量小於300kBq/kg，更佳小於200kBq/kg，更佳小於150kBq/kg，尤其小於100kBq/kg。同樣，此將提供藉由將該等範圍乘以所指示之任一體重來指示之於223Ra中之暴露。上述劑量值較佳係227Th之完全保留劑量，但慮及一些227Th將在其衰變之前自體內清除，亦可係所投與劑量。
倘若227Th複合物之生物半衰期短於物理半衰期(例如短於7天，尤其短於3天)，則可能需要顯著較大之投與劑量以提供等效保留劑量。因此，例如，150kBq/kg之完全保留劑量等效於以711kBq/kg劑量投與之具有5天半衰期之複合物。任一適當保留劑量之等效投與劑量可使用業內熟知方法自複合物之生物清除速率來計算。
由於一個227Th核之衰變提供一個223Ra原子，故227Th之保留及治療活性將與患者所經受之223Ra劑量直接相關。在任一具體情況下生成之223Ra之量可使用熟知方法來計算。
因此，在較佳實施例中，本發明提供治療哺乳動物個體之疾病 之方法(如本文所述)，該方法包含向該個體投與治療有效量之至少一種如本文所述之靶向組織之釷複合物。
除非有用地採用此同位素之性質，否則顯然可期望將個體於223Ra子同位素中之暴露降至最低。具體而言，在活體內生成之鐳-223之量通常將大於40kBq/kg，例如大於60kBq/Kg。在一些情形中，在活體內生成之223Ra將需要大於80kBq/kg，例如大於100或115kBq/kg。
在適當載劑溶液中之釷-227標記之偶聯物可作為單一施用或以分次施用方案靜脈內、腔內(例如腹膜內)、皮下、經口或局部投與。較佳地，偶聯至靶向部分之複合物將作為溶液藉由非經腸(例如透皮)途徑、尤其靜脈內或腔內途徑來投與。較佳地，本發明組合物將調配於無菌溶液中以供非經腸投與。
本發明方法及產物中之釷-227可單獨使用或與其他治療方式(包括手術、外線束放射療法、化學療法、其他放射性核種或組織溫度調節等)組合使用。此形成本發明方法之另一較佳實施例且調配物/藥劑可相應地包含另外至少一種治療活性劑，例如另一放射性劑或化學治療劑。
在一個尤佳實施例中，個體亦經受幹細胞治療及/或其他支持療法以降低鐳-223誘導之骨髓毒性之效應。
本發明之釷(例如釷-227)標記之分子可用於藉由靶向疾病相關受體來治療癌性或非癌性疾病。通常，227Th之此一醫學用途將係藉由放射性免疫療法來實施，該療法係基於藉由螯合劑將227Th連接至抗體、抗體片段或抗體或抗體片段之構築體以供治療癌性或非癌性疾病。227Th在本發明方法及醫藥中之用途尤其適於治療任一形式之癌症，包括癌症、肉瘤、淋巴瘤及白血病，尤其肺癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、胰臟癌、食道癌、腦癌、卵巢癌、子宮 癌、口腔癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。
在本發明之另一實施例中，患有軟組織及骨骼疾病二者之患者可藉由227Th及在活體內由所投與之釷生成之223Ra二者來治療。在此尤其有利的態樣中，治療之額外治療組份係藉由靶向骨骼疾病衍生自可接受之非骨髓毒性量之223Ra。在此治療方法中，227Th通常用於藉由適宜靶向軟組織來治療該軟組織之原發性及/或轉移癌症，且自227Th衰變生成之223Ra用於治療同一個體之相關骨骼疾病。此骨骼疾病可係因原發性軟組織癌症所致之至骨骼之轉移，或可係原發性疾病，其中軟組織治療係欲抵抗轉移癌症。偶而，軟組織及骨骼疾病可不相關(例如在患有風濕性軟組織疾病之患者中另外治療骨骼疾病)。
尤其適於在本發明方法、用途及其他態樣中治療之病況包括腫瘤性及增生性疾病，例如癌症、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金氏淋巴瘤或B細胞腫瘤、乳癌、子宮內膜癌、胃癌、急性類骨髓性白血病、前列腺癌或腦癌、間皮瘤、卵巢癌、肺癌或胰臟癌。
下文提供一些實例性合成。該等合成中所示之步驟將適用於本發明之多個實施例。例如，步驟a)可經由下文在本文所述之多個或所有實施例中顯示之中間體AGC0021繼續進行。
AGC0020關鍵中間體之合成 N,N,N',N'-四(2-胺基乙基)-2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二胺
a)丙二酸二甲酯、氫化鈉、THF，b)DIBAL-H、THF，c)MsCl、NEt3、CH2Cl2，
d)咪唑、Boc2O、CH2Cl2、甲苯，e)DIPEA、乙腈，f)MeOH、水、AcCl。
AGC0021關鍵中間體之合成 3-(苄基氧基)-1-甲基-4-[(2-硫酮-1,3-噻唑啶-3-基)羰基]吡啶-2(1H)-酮
a)草酸二乙酯、乙醇鉀、甲苯、EtOH，b)Pd/C、對二甲苯，c) Mel、K2CO3、DMSO、丙酮，d)i)BBr3、DCM，ii)BnBr、K2CO3、KI、丙酮，e)NaOH、水、MeOH，f)、DCC、DMAP、DCM。
式(VIII)化合物之螯合物之合成 4-{[4-(3-[雙(2-{[(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-基)羰基]胺基}乙基)胺基]-2-{[雙(2-{[(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-基)羰基]胺基}乙基)胺基]甲基}丙基)苯基]胺基}-4-側氧丁酸
在本發明複合物之形成方法中，八齒螯合劑與組織靶向部分之間之偶合反應較佳係在水溶液中實施。此具有若干優點。首先，其去 除了製造商去除所有溶劑至可接受含量以下並證實該去除之負擔。其次，其減少浪費且最重要地其藉由避免分離或去除步驟而加快生產。在本發明放射性醫藥之情況中，重要的是儘可能快速地實施合成，此乃因放射性同位素將始終衰變且製備中耗費的時間浪費了有價值的材料並引入污染性子同位素。
適宜水溶液包括純化水及緩衝劑，例如多種業內熟知緩衝劑中之任一者。乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽(例如PBS)及磺酸鹽緩衝劑(例如MES)係熟知水性緩衝劑之典型實例。
在一個實施例中，該方法包含形成八齒含羥基吡啶酮配體(如本文中通篇所述)之第一水溶液及組織靶向部分(如本文中通篇所述)之第二水溶液以及使該第一水溶液與該第二水溶液接觸。
適宜偶合部分詳細論述於上文中且本文中論述為偶合及/或連接基團之所有基團及部分皆可適當地用於將靶向部分偶合至配體。一些較佳偶合基團包括醯胺、酯、醚及胺偶合基團。酯及醯胺可藉助自羧酸生成活化酯基團便捷地形成。此一羧酸可存於靶向部分上、偶合部分上及/或配體部分上，且通常將與醇或胺反應形成酯或醯胺。該等方法為業內所熟知且可利用熟知活化試劑，包括N-羥基馬來醯亞胺、碳二亞胺及/或偶氮二羧酸酯活化試劑(例如DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等)。
在較佳實施例中，包含4個在N-位經C1-C3烷基取代之羥基吡啶酮部分及末端為羧酸基團之偶合部分之八齒螯合劑可使用至少一種偶合劑(例如彼等本文所述者中之任一者)及活化劑(例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))來活化，藉此形成八齒螯合劑之NHS酯。此活化(例如NHS)酯可經分離或不經分離用於偶合至任一具有游離胺基團(例如在離胺酸側鏈上)之組織靶向部分。其他活化酯為業內所熟知且可為有效脫離基之任一酯，例如氟化基團、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、碘化物等。然 而，NHS酯較佳。
偶合反應較佳在相當短時段期間及在大約環境溫度下實施。1步式或2步式偶合反應之典型時段將為約1至240分鐘，較佳5至120分鐘，更佳10至60分鐘。偶合反應之典型溫度將介於0與90℃之間，較佳介於15與50℃之間，更佳介於20與40℃之間。約25℃或約38℃係適當的。
八齒螯合劑偶合至靶向部分通常將在對靶向部分之結合能力無不良(或至少並非不可逆地)影響之條件下實施。由於結合劑通常係基於肽或蛋白質之部分，此需要相當溫和之條件以避免變性或損失二級/三級結構。水性條件(如本文在所有情況中所論述)將較佳，且將可期望避免極端pH及/或氧化還原。因此，步驟b)可在介於3與10之間、較佳介於4與9之間且更佳介於4.5與8之間之pH下實施。在氧化還原方面為中性或極溫和地還原以避免在空氣中氧化之條件可為合意的。
適用於本發明所有態樣之較佳靶向組織之螯合劑係如本文所述之AGC0018。AGC0018與227Th離子之複合物形成本發明複合物及相應調配物、用途、方法等之較佳實施例。可用於本發明之所有該等態樣中之其他較佳實施例包括偶聯至組織靶向部分(如本文所述)之AGC0019之227Th複合物，該等組織靶向部分包括對以下中之任一者具有結合親和性之單株抗體：CD22受體、FGFR2、間皮素、HER-2、PSMA或CD33。
現將藉由以下非限制性實例闡釋本發明。實例中例示之所有化合物形成本發明之較佳實施例(包括較佳中間體及前體)，且若情況容許，可個別地或以任一組合用於任一態樣中。因此，例如，實例2化合物2至4、實例3之化合物10及實例4之化合物7中之每一者及全部形成其各種類型之較佳實施例。
實例1 式(VIII)化合物之合成
實例1 a) 2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯之合成
在0℃下將氫化鈉(60%分散液，11.55g,289mmol)懸浮於450mL四氫呋喃(THF)中。經約30分鐘逐滴添加丙二酸二甲酯(40.0mL,350mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。在0℃下經約30分鐘逐滴添加溶解於150mL THF中之4-硝基溴化苄基(50.0g,231mmol)，之後在環境溫度下2小時。
添加500mL乙酸乙酯(EtOAc)及250mL NH4Cl(aq,sat)，之後過濾溶液。分離各相。用2*250mL EtOAc萃取水相。合併有機相，用250mL鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾並在減壓下去除溶劑。
將300mL庚烷及300mL甲基第三丁基醚(MTBE)添加至殘留物中並加熱至60℃。過濾溶液。將濾液置於冷凍器中過夜並過濾。用200mL庚烷洗滌濾餅並在減壓下乾燥，得到呈灰白色固體之標題化合物。
產率：42.03g,157.3mmol,68%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：3.30(d,2H,7.8Hz),3.68(t,1H,7.8Hz),3.70(s,6H),7.36(d,2H,8.7Hz),8.13(d,2H,8.7Hz)。
實例1 b) 2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇之合成
在0℃下將2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯(28.0g,104.8mmo1)溶解於560mL THF中。在0℃下經約30分鐘逐滴添加二異丁基氫化鋁(DIBAL-H)(1M，於己烷中，420mL,420mmol)。在0℃下將反應混合物攪拌2小時。
在0℃下將20mL水逐滴添加至反應混合物。在0℃下將20mL NaOH(aq,15%)逐滴添加至反應混合物，之後將20mL水逐滴添加至反應混合物。將混合物在0℃下攪拌20分鐘，之後添加約150g MgSO4。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，之後將其在Büchner漏斗上過濾。使用500mL EtOAc洗滌濾餅。去除濾餅並與800mL EtOAc及200mL MeOH一起攪拌約30分鐘，之後過濾溶液。合併濾液並在減壓下乾燥。
在二氧化矽上使用EtOAc於庚烷中之梯度，之後使用MeOH於EtOAc中之梯度進行DFC，得到呈淺黃色固體之標題化合物。
產率：15.38g,72.8mmol,69%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：1.97-2.13(m,3H),2.79(d,2H,7.6Hz),3.60-3.73(m,2H),3.76-3.83(m,2H),7.36(d,2H,8.4Hz),8.14(d,2H,8.4Hz)。
實例1 c) 二甲烷磺酸2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基酯之合成
在0℃下將2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇(15.3g,72.4mmol)溶解於150mL CH2Cl2中。添加三乙胺(23mL,165mmol)，之後經約15分鐘逐滴添加甲烷磺醯氯(12mL,155mmol)，之後在環境溫度下攪拌1小時。
添加500mL CH2Cl2，且用2*250mL NaHCO3(aq,sat)、125mL HCl(aq,0.1M)及250mL鹽水洗滌混合物。有機相經Na2SO4乾燥，過濾並在減壓下乾燥，得到呈橙色固體之標題化合物。
產率：25.80g,70.2mmol,97%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：2.44-2.58(m,1H),2.87(d,2H,7.7Hz),3.03(s,6H),4.17(dd,2H,10.3,6.0Hz),4.26(dd,2H,10.3,4.4Hz),7.38(d,2H,8.6Hz),8.19(d,2H,8.6Hz)。
實例1 d) (氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基))二胺基甲酸二第三丁基酯之合成
在室溫下將咪唑(78.3g,1.15mol)懸浮於500mL CH2Cl2中。逐份添加二碳酸二第三丁基酯(Boc2O)(262.0g,1.2mol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。用3*750mL水洗滌反應混合物，經Na2SO4乾燥，過濾並在減壓下去除揮發性物質。
將殘留物溶解於250mL甲苯中並添加二乙烯三胺(59.5mL,550mmol)。將反應混合物在60℃下攪拌2小時。
添加1L CH2Cl2，且用2*250mL水洗滌有機相。經Na2SO4乾燥有機相，過濾並在減壓下減少。
在二氧化矽上使用甲醇(MeOH)於含有三乙胺之CH2Cl2中之梯度進行DFC，得到呈無色固體之標題化合物。
產率：102g,336mmol,61%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：1.41(s,18H),1.58(bs,1H),2.66-2.77(m,4H),3.13-3.26(m,4H),4.96(bs,2H)。
實例1 e) (((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)雙(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四胺基甲酸四第三丁基酯之合成
將二甲烷磺酸2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基酯(26.0g,71mmol)及(氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基))二胺基甲酸二第三丁基酯(76.0g,250mmol)溶解於700mL乙腈中。添加N,N-二異丙基乙胺(43mL,250mmol)。將反應混合物在回流下攪拌4天。
在減壓下去除揮發性物質。
在二氧化矽上使用EtOAc於庚烷中之梯度進行DFC，得到呈淺黃色固體發泡體之標題化合物。
產率：27.2g,34.8mmol,49%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：1.40(s,36H),1.91-2.17(m,3H),2.27-2.54(m,10H),2.61-2.89(m,2H),2.98-3.26(m,8H),5.26(bs,4H),7.34(d,2H,8.5Hz),8.11(d,2H,8.5Hz)。
實例1 f) N 1 ,N 1' -(2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)雙(N 1 -(2-胺基乙基)乙烷-1,2-二 胺),AGC0020之合成
將(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)雙(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四胺基甲酸四第三丁基酯(29.0g,37.1mmol)溶解於950mL MeOH及50mL水中。在30℃下經約20分鐘逐滴添加乙醯氯(50mL,0.7mol)。將反應混合物攪拌過夜。
在減壓下去除揮發性物質並將殘留物溶解於250mL水中。添加500mL CH2Cl2，之後添加175mL NaOH(aq,5M，經NaCl飽和)。分離各相，且用4*250mL CH2Cl2萃取水相。合併有機相，經Na2SO4乾燥，過濾並在減壓下乾燥，得到呈黏稠紅褐色油之標題化合物。
產率：11.20g,29.3mmol,79%。純度(HPLC圖9)：99.3%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)：1.55(bs,8H),2.03(dt,1H,6.6,13.3Hz),2.15(dd,2H,12.7,6.6),2.34-2.47(m,10H),2.64-2.77(m,10H),7.32(d,2H,8.7Hz),8.10(d,2H,8.7Hz)。
13C-NMR(75MHz,CDCl3)：37.9,38.5,39.9,58.0,58.7,123.7,130.0,146.5,149.5
實例1 g) 5-羥基-6-側氧基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-甲酸乙酯之合成
在室溫下將2-吡咯啶酮(76mL,1mol)及油酸二乙酯(140mL,1.03mol)溶解於1L甲苯中。添加乙醇鉀(EtOK)(24%，於EtOH中，415 mL,1.06mol)，並將反應混合物加熱至90℃。
由於反應混合物變稠，在反應最初1小時期間逐份添加200mL EtOH。將反應混合物攪拌過夜並冷卻至室溫。在攪拌的同時緩慢添加210mL HCl(5M,aq)。
添加200mL鹽水及200mL甲苯，並分離各相。
用2×400 mL CHCl3萃取水相。乾燥(Na2SO4)合併有機相，過濾並在真空中減少。將殘留物自EtOAc重結晶，得到呈淺黃色固體之標題化合物。
產率：132.7g,0.72mol,72%。
實例1 h) 3-羥基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯之合成
將{5-羥基-6-側氧基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-甲酸乙酯}(23.00g,124.2mmol)溶解於150mL對二甲苯中並添加碳載鈀(10%,5.75g)。將反應混合物於回流下攪拌過夜。在冷卻至室溫後，用300mL MeOH稀釋反應混合物並經由短矽藻土墊®過濾。用300mL MeOH洗滌該墊。在真空中去除溶劑，得到呈淡紅褐色固體之標題化合物。
產率：19.63g,107.1mmol,86%。MS(ESI,pos)：206.1[M+Na]+,389.1[2M+Na]+
實例1 i) 3-甲氧基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯之合成
在室溫下將{3-羥基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯}(119.2g,0.65mol)溶解於600mL二甲亞碸(DMSO)及1.8L丙酮中。添加K2CO3(179.7g,1.3mol)。在室溫下經約1小時逐滴添加溶解於600mL丙酮中之碘甲烷(MeI)(162mL,321mmol)。
將反應混合物在室溫下再攪拌2小時，之後添加MeI(162mL,2.6mol)。將反應混合物在回流下攪拌過夜。在減壓下減少反應混合物並添加2.5L EtOAc。
過濾混合物並在減壓下減少。藉由在SiO2上使用EtOAc於庚烷中之梯度之乾柱快速層析(DFC)純化，得到標題化合物。
產率：56.1g,210.1mmol,32%。MS(ESI,pos)：234.1[M+Na]+,445.1[2M+Na]+
實例1 j) 3-(苄基氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯之合成
在-78℃下將{3-甲氧基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯}(5.93g,28.1mmol)溶解於80mL二氯甲烷(DCM)中並逐滴添加溶解於20mL DCM中之BBr3(5.3mL,56.2mmol)。將反應混合物在-78℃下攪拌1小時，之後將反應物加熱至0℃。藉由逐滴添加25mL第三丁基甲醚(第三BuOMe)及25mL MeOH來淬滅反應。在真空中去除揮 發性物質。將殘留物溶解於90mL DCM及10mL MeOH中並經由短SiO2墊過濾。用200mL DCM中之10% MeOH洗滌該墊。在真空中去除揮發性物質。將殘留物溶解於400mL丙酮中。添加K2CO3(11.65g,84.3mmol)、KI(1.39g,8.4mmol)及溴化苄基(BnBr)(9.2mL,84.3mmol)。將反應混合物在回流下攪拌過夜。用200mL EtOAc稀釋反應混合物並用3×50mL水及50mL鹽水洗滌。用2×50mL EtOAc萃取合併水相。乾燥(Na2SO4)合併有機相，過濾，並在真空中去除揮發性物質且藉由在SiO2上使用庚烷中之EtOAc(40-70%)作為溶析劑之乾柱快速層析純化，以得到標題化合物。
產率：5.21g,18.1mmol,65%。MS(ESI,pos)：310.2[M+Na]+,597.4[2M+Na]+
實例1 k) 3-(苄基氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸之合成
將{3-(苄基氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯}(27.90g,97.1mmol)溶解於250mL MeOH中並添加60mL NaOH(5M,aq)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，之後將反應混合物在真空中濃縮至約1/3。用150mL水西使殘留物並使用氯化氫(HCl)(5M,aq)酸化至pH 2。過濾沈澱物並在真空中乾燥，得到呈無色固體之標題化合物。產率：22.52g,86.9mmol,89%。
實例1 l) 3-(苄基氧基)-1-甲基-4-(2-硫酮噻唑啶-3-羰基)吡啶-2(1H)-酮 (AGC0021)之合成
將{3-(苄基氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸}(3.84g,14.8mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)(196mg,1.6mmol)及2-噻唑啉-2-硫醇(1.94g,16.3mmol)溶解於50mL DCM中。添加N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)(3.36g,16.3mmol)。將反應混合物攪拌過夜。過濾反應物，用DCM洗滌固體並在真空中減少濾液。使所得黃色固體自異丙醇/DCM重結晶，得到AGC0021。產率：4.65g,12.9mmol,87%。MS(ESI,pos)：383[M+Na]+,743[2M+Na]+
實例1 m) AGC0023之合成
將AGC0020(8.98g；23.5mmol)溶解於CH2Cl2(600mL)中。添加AGC0021(37.43g；103.8mmol)。將反應物在室溫下攪拌20小時。在減壓下濃縮反應混合物。
在SiO2上使用甲醇於EtOAc與CH2Cl2之1：1混合物中之梯度進行DFC，產生呈固體發泡體之AGC0023。
平均產率：26.95g,20.0mmol,85%。
實例1 n) AGC0024之合成
將AGC0023(26.95g；20.0mmol)溶解於乙醇(EtOH)(675mL)中。添加鐵(20.76g；0.37mol)及NH4Cl(26.99g；0.50mol)，之後添加水(67mL)、將反應混合物在70℃下攪拌2小時。添加更多鐵(6.75g；121mmol)，且將反應混合物在74℃下攪拌1小時。添加更多鐵(6.76g；121mmol)，並將反應混合物在74℃下攪拌1小時。冷卻反應混合物，之後在減壓下減少反應混合物。
在SiO2上使用甲醇於CH2Cl2中之梯度進行DFC，產生呈固體發泡體之AGC0024。
產率18.64g,14.2mmol,71%。
實例1 o) AGC0025之合成
將AGC0024(18.64g；14.2mmol)溶解於CH2Cl2(750mL)中並冷卻至0℃。添加BBr3(50g；0.20mol)並將反應混合物攪拌75分鐘。藉由在0℃下在攪拌的同時謹慎添加甲醇(MeOH)(130mL)淬滅反應。在減壓下去除揮發性物質。將HCl(1.25M，於EtOH中，320mL)添加至殘留物。然後在大氣壓及環境溫度下使用旋轉蒸發器將燒瓶旋轉15分鐘，之後在減壓下去除揮發性物質。
在未封端C18二氧化矽上使用乙腈(ACN)與水中之梯度進行DFC，產生呈淡橙色玻璃質固體之AGC0025。
產率13.27g,13.9mmol,98%。
實例1 p) AGC0019之合成
在室溫下將AGC0025(10.63g；11.1mmol)溶解於ACN(204mL)
及水(61mL)中。添加琥珀酸酐(2.17g；21.7mmol)並將反應混合物攪拌2小時。在減壓下減少反應混合物。在未封端C18二氧化矽上使用ACN與水中之梯度進行DFC，產生綠色玻璃質固體。
在40℃下將固體溶解於MeOH(62mL)及水(10.6mL)中。將該溶液在超音處理下逐滴添加至EtOAc(750mL)中。過濾沈澱物，用EtOAc洗滌並在減壓下乾燥，得到呈帶綠色灰白色固體之AGC0019。
產率：9.20g,8.7mmol,78%。H-NMR(400MHz,DMSO-d6),13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)。
實例2 純釷-227之分離
釷-227係自錒-227產生者分離。錒-227係經由鐳-226之熱中子照射及之後鐳-227(t1/2=42.2m)衰變至錒-227來產生。釷-227係藉由陰離子交換層析自8M HNO3溶液中之錒-227衰變混合物選擇性保留。使用2mm內徑、長度30mm、含有70mg AG®1-X8樹脂(200-400目，硝酸鹽形式)之管柱。在錒-227、鐳-223及子核種已自該管柱溶析後，用12M HCl自該管柱萃取釷-227。在標記步驟之前，將含有釷-227之溶析物蒸發至乾燥並將殘留物再懸浮於0.01M HCl中。
實例3 227 Th-AGC1118針對Ramos之細胞毒性 實例3 a) 抗CD22單株抗體(AGC1100)之生成
單株抗體(mAb)hLL2(亦稱為依帕珠單抗(epratuzumab)，本文表示AGC1100)之序列係如Leung、Goldenberg、Dion、Pellegrini、Shevitz、Shih及Hansen：Molecular Immunology 32：1413-27,1995中所述來構築。
當前實例中使用之mAb係由Immunomedics Inc,New Jersey,USA 生產。此mAb可例如在中國倉鼠卵巢懸浮液(CHO-S)細胞中產生，經編碼編碼輕鏈及重鏈之基因之質體轉染。將選擇第一穩定純系用於使用標準程序。在單一用途生物反應器中約14天後，可在過濾上清液後收穫單株抗體。AGC1100將藉由蛋白質A親和層析(MabSelect SuRe,Atoll,Weingarten/Germany)及之後的離子交換步驟進一步純化。基於靜電及疏水性之第三純化步驟可用於去除聚集體及可能保留的雜質。AGC1100之身份將藉由等電聚焦、SDS-PAGE分析、N-末端測序及LC/MS分析來確認。樣品純度將藉由尺寸排除層析(SEC)進一步分析。
實例3 b)mAb AGC1100(依帕珠單抗)與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶合以得到偶聯物AGC1118
在偶聯之前，將磷酸鹽緩衝劑(pH 7.5)添加至抗體溶液(AGC1100)以增強溶液之緩衝能力。測定容器中AGC1100(mAb)之量。
將螯合劑AGC0019溶解於1：1之DMA：0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。將NHS及EDC溶解於0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。
製備螯合劑/N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)之1/1/3莫耳當量溶液以活化螯合劑。對於偶聯至抗體，將莫耳比為7.5/7.5/22.5/1(螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑裝載至mAb。在20-40分鐘後，用12% v/v 0.3M檸檬酸將pH調節至5.5，淬滅偶聯反應。
然後藉由以恆定體積切向流過濾將溶液緩衝劑交換至30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/ml pABA,pH 5.5(TFF緩衝劑)中。在滲濾結束時，將溶液排放至調配容器。用TFF緩衝劑(30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/ml pABA,pH 5.5)及7% w/v聚山梨醇酯80調配產物以獲得於30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/mL pABA、0.1% w/v PS80,pH 5.5中之2.6mg/mL AGC1118。最後，在儲存之前經由0.2μm過濾器將溶液過濾至無菌瓶中。
實例3 c) 用於 227 Th-AGC1118注射之劑量之製備之劑量之製備
將一小瓶20MBq氯化釷-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析釷-227。量測釷-227之溶析活性並將10MBq劑量轉移至空10ml玻璃小瓶中。然後使用真空幫浦並將該小瓶置於加熱區塊(設定為120℃)中30-60分鐘來蒸發酸。在達到室溫後，添加6ml 2.5 mg/ml AGC1118偶聯物用於放射標記。將該小瓶在室溫下溫和混合並靜置15分鐘。然後將溶液無菌過濾至無菌小瓶中並在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例3 d) 具有不同總活性及比活性之 227 Th-AGC1118針對Ramos之細胞毒性
在此研究中，藉由改變總活性及比活性以4小時培育時間測試多個227Th-AGC1118劑量。此研究係以96孔板形式在10/50kBq/μg之比活性及5、10、20及40kBq/ml之總活性下運行。
在含有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基中培養Ramos細胞(傳代22)。將細胞轉移至離心管中並在300G下離心5分鐘且懸浮於5mL培養基中，之後在Z2庫爾特計數器(Coulter Counter)上計數。用培養基將細胞懸浮液稀釋至400.000細胞/ml之細胞濃度並轉移至96孔板之48個孔(200μl/孔)中(80.000細胞/孔)。使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(Promega)來量測細胞活力。參見圖4。
實例4 227 Th-AGC0718針對HL-60之細胞毒性 實例4 a) 抗CD33單株抗體(AGC0700)之生成.
自如(1)及(2)中所述之文獻檢索單株抗體(mAb)HuM195/林妥珠單抗(本文表示為AGC0700)之序列。AGC0700之製造係在CobraBiologics(Södertälje,Sweden)之設施中實施。簡言之，使用Vector NTI®軟體(Invitrogen/Life-Technologies Ltd.,Paisley,United Kingdom)將重鏈及輕鏈之胺基酸序列回譯為DNA序列。自IgG1重鏈基因省略C-末端離胺酸(Lys)之密碼子以幫助精確測定如實例2中所概述之偶聯物對抗體之比率(CAR)。所得DNA序列由GeneArt(GeneArt/Life-Technologies Ltd.,Paisley,United Kingdom)密碼子優化以供在哺 乳動物細胞中表現並合成，且由CobraBiologics(Södertälje,Sweden)進一步選殖至表現載體中。用編碼AGC0700之VH-域及VL-域之質體穩定轉染中國倉鼠卵巢懸浮液(CHO-S)細胞並在補充有嘌呤黴素(puromycin)(12.5mg/l；Sigma Aldrich)之標準CD-CHO培養基(Invitrogen/Life-Technologies Ltd.,Paisley,United Kingdom)存在下生長。經由經25代限制性稀釋來選擇表現AGC0700之穩定純系。藉由自上清液量測蛋白質效價來評價純系穩定性。建立最穩定純系之細胞庫並低溫保藏。
mAb之表現係在37℃下在單一用途生物反應器中以250L規模實施約14天。在過濾上清液後收穫單株抗體。經由蛋白質A親和管柱(MabSelect SuRe,Atoll,Weingarten/Germany)及之後的一種陰離子交換層析(QFF-Sepharose；GE Healthcare)及一種陽離子交換層析(PorosXS；Invitrogen/Life-Technologies Ltd.)將AC0700進一步純化，以提高純度及最終產率。藉由等電聚焦及SDS-PAGE分析來確認AGC0700之身份。在針對固定CD33-Fc靶(Novoprotein)之結合ELISA中分析純化AGC0700之活性。藉由尺寸排除層析(SEC)分析樣品純度。
參考文獻：
(1) Scheinberg DA. 「Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody M195 and constructs thereof」. 美國專利申請案6007814(1999年12月28日)。
(2) Co MS等人；J Immunol. 1992年2月15日；148(4):1149-54.Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen。
實例4 b) mAb AGC0700(林妥珠單抗)與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶 合以得到偶聯物AGC0718
偶聯係如實例3中所述來實施，僅作微小修改。
在偶聯之前，將磷酸鹽緩衝劑(pH 7.5)添加至抗體溶液(AGC0700)以增強溶液之緩衝能力。測定容器中AGC0700(mAb)之量。
將螯合劑AGC0019溶解於1：1之DMA：0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。將NHS及EDC溶解於0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。
製備螯合劑/NHS/EDC之1/1/3莫耳當量溶液以活化螯合劑。對於偶聯至抗體，將莫耳比為20/20/60/1(螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑裝載至mAb。在40-60分鐘後，用12% v/v 0.3M檸檬酸將pH調節至5.5，淬滅偶聯反應。
然後藉由以恆定體積切向流過濾將溶液緩衝劑交換至30mM檸檬酸鹽、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/ml pABA,pH 5.5(TFF緩衝劑)中。在滲濾結束時，將溶液排放至調配容器。用TFF緩衝劑(30mM檸檬酸鹽、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/ml pABA,pH 5.5)調配產物以獲得於30mM檸檬酸鹽、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/mL pABA,pH 5.5中之2.5mg/mL AGC0718。最後，在儲存之前經由0.2μm過濾器將溶液過濾至無菌瓶中。
實例4 c) 用於 227 Th-AGC0718注射之劑量之製備
將一小瓶20MBq氯化釷-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析釷-227。量測釷-227之溶析活性並將10MBq劑量轉移至空10ml玻璃小瓶中。然後使用真空幫浦並將該小瓶置於加熱區塊(設定為120℃)中30-60分鐘來蒸發酸。在達到室溫後，添加6ml 2.5 mg/ml AGC0718偶聯物用於放射標記。將該小瓶在室溫下溫和混合並靜置15分鐘。然後將溶液無菌過濾至無菌小瓶中並在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例4 d) 具有不同總活性之 227 Th-AGC0718針對HL-60之細胞毒性
為顯示227Th-AGC0718在結合至CD33+細胞後之細胞毒性，實施活體外細胞毒性分析。出於此目的，使人類骨髓性白血病HL-60細胞系以及CD33陰性B細胞系(Ramos)暴露至227Th-AGC0718。在44kBq/μg之比活性下測試2kBq/ml及20kBq/ml之總活性。所有實驗程序皆闡述於RD2013.093中。簡言之，用10% FBS及1%青黴素/鏈黴素製備於IMDM培養基中之50000個人類HL-60細胞/ml並以100.000細胞/孔之密度接種於24孔板中。將細胞在37℃下培育4h且227Th-AGC0718活性為0至20kBq/ml。平行製備各別227Th-同型對照偶聯物樣品以及未標記AGC0718樣品作為各別對照。之後用新鮮培養基洗滌細胞並接種至新24孔培養板中。
在不同時間點，收穫細胞並使用CellTiterGlo套組(Promega)量測活力。活力係藉由將陽性對照(未處理細胞)設定為100%以%表示。參見圖5。
實例5 227 Th-AGC0118針對SKOV-3之細胞毒性 實例5 a) AGC0100(曲妥珠單抗)之生成
曲妥珠單抗單株抗體(本文表示為AGC0100)購自Roche並在PBS(Dulbecco BIOCHROM)中溶解至10mg/ml之濃度。
實例5 b) mAb AGC0100(曲妥珠單抗)與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶 合以得到偶聯物AGC0118
偶聯係如實例3中所述來實施，僅作微小修改。最終偶聯之mAb之TFF純化藉由凝膠過濾管柱層析替代。
向PBS中之曲妥珠單抗添加11% 1M磷酸鹽緩衝劑(pH 7.4)。將螯合劑(AGC0019)NHS及EDC溶解於與實例3 b)中所述相同之溶液中。活化期間螯合劑/NHS/EDC之莫耳比為1/1/3。對於偶聯AGC0118，對應於螯合劑/NHS/EDC/mAb之8/8/25/1之莫耳比及30-40min偶聯時間產生0.7-0.9之CAR(螯合劑對抗體比率)。藉由添加12% v/v 0.3M檸檬酸至最終pH為5.5來淬滅反應。
AGC0118偶聯物之純化及緩衝劑交換至30mM檸檬酸鹽(pH 5.5)、154mM NaCl中係藉由在連接至ÄKTA系統(GE Healthcare)之Superdex 200(GE Healthcare)管柱上凝膠過濾來實施。量測在Abs 280nm下之蛋白質濃度，之後用緩衝劑調配產物(以獲得於30mM檸檬酸鹽、154mM NaCl、2mM EDTA、2mg/mL pABA,pH 5.5中之2.5mg/mL AGC0118)。最後，在儲存之前經由0.2μm過濾器將溶液過濾至無菌瓶中。
實例5 c) 用於 227 Th-AGC0118注射之劑量之製備
標記係如先前所述來實施：
將一小瓶20MBq氯化釷-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析釷-227。量測釷-227之溶析活性並將10MBq劑量轉移至空10ml玻璃小瓶中。然後使用真空幫浦並將該小瓶置於加熱區塊(設定為120℃)中30-60分鐘來蒸發酸。在達到室溫後，添加6ml 2.5mg/ml AGC0118偶聯物用於放射標記。將該小瓶在室溫下溫和混合並 靜置15分鐘。然後將溶液無菌過濾至無菌小瓶中並在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例5 d) 具有不同總活性之 227 Th-AGC0118針對SKOV-3之細胞毒性
藉由在4小時培育時間改變添加至孔中之總活性來測試不同劑量之227Th-AGC0118之細胞毒性。在實驗前一天將SKOV-3細胞以10000/孔接種於96孔板中。在第1天將經螯合227Th-AGC0118在20kBq/μg比活性下之一系列5、10、20及40kBq/ml之總活性添加至細胞。藉由多陣列吸量管去除剩餘的未結合227Th-AGC0118，之後用培養基另外洗滌一次，並隨後在培育時段結束後用新鮮培養基洗滌。在含有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素之Mc-Coy培養基中培養SKOV-3細胞。用無血清培養基更換用227Th-AGC0118培育期間之培養基。在第4天，使用CellTiter-Glo發光細胞活力分析(Promega)來量測細胞活力。參見圖6。
實例6 227 Th-AGC2518針對NCI-H716之細胞毒性 實例6 a) FGFR2單株抗體(BAY1179470；AGC2500)之生成.
單株抗體BAY 1179470(本文另外稱為AGC2500)之生成詳細闡述於WO2013076186A1中。簡言之，在針對FGFR2抗原生物淘選後檢索抗體。所得人類IgG1抗體在CHO細胞中表現並使用蛋白質A親和管柱(MAb Select Sure)及隨後之尺寸排除層析純化以分離單體部分。將抗體調配至PBS(pH 7.4)中。分析型SEC顯示均質性>99%。
實例6 b) mAb AGC2500與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶合以得到偶聯物AGC2518
將含抗體溶液調節至pH 7.5。將螯合劑AGC0019溶解於1：1之DMA：0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。將NHS及EDC溶解於0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。製備螯合劑/NHS/EDC之1/1/3莫耳當量溶液以活化螯合劑。對於偶聯至抗體，將莫耳比為10/10/30/1(螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑裝載至mAb。在30分鐘後，用12% v/v 0.3M檸檬酸將pH調節至5.5，淬滅偶聯反應。將反應樣品進一步加載至HiLoad 16/600 Superdex 200(製備級)管柱上以使用30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl(pH 5.5)作為移動相分離單體部分。在層析結束時，將抗體偶聯物AGC2518在30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA及0.5mg/ml pABA中濃縮至2.5mg/ml。所有程序皆闡述於RD.2014.092，期刊號211/149,140619 AEF中。
實例6 c) 用於 227 Th-AGC2518注射之劑量之製備
將一小瓶20MBq氯化釷-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析釷-227。量測釷-227之溶析活性並將10MBq劑量轉移至空10ml玻璃小瓶中。然後使用真空幫浦並將該小瓶置於加熱區塊(設定為120℃)中30-60分鐘來蒸發酸。在達到室溫後，添加6ml 2.5mg/ml AGC2518偶聯物用於放射標記。將該小瓶在室溫下溫和混合並靜置15分鐘。然後將溶液無菌過濾至無菌小瓶中並在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例6 d) 具有不同總活性之 227 Th-AGC2518針對NCI-H716細胞之細胞毒性
為顯示227Th-AGC2518在結合至FGFR2+細胞後之細胞毒性，實施活體外細胞毒性分析。出於此目的，使人類結腸直腸癌細胞系NCI- H716暴露至227Th-AGC2518。在2kBq/μg比活性下測試2、10、20及40kBq/ml之總活性。以類似方式平行製備無關同型對照。所有實驗程序皆闡述於RD2014.138中。簡言之，用10% FBS及1%青黴素/鏈黴素製備RPMI 1640培養基中之400000個人類NCI-H716細胞/ml並以80.000細胞/孔之密度接種於96孔板中。以227Th-AGC2518之0至40kBq/ml之活性及各別227Th-同型對照偶聯物樣品將細胞在37℃下培育30min。之後用新鮮培養基洗滌細胞並接種至新96孔培養板中。在5及7天後，收穫細胞並使用CellTiterGlo套組(Promega)量測活力。活力藉由將陽性對照(未處理細胞)設定為100%以%表示。參見圖7。
實例7 227 Th-AGC2418針對HT29細胞之細胞毒性 實例7 a) 間皮素單株抗體(BAY 86-1903；AGC2400)之生成.
單株抗體BAY 86-1903(本文另外稱為AGC2400)之生成詳細闡述於WO2009068204中。簡言之，在針對間皮素抗原之生物淘選後檢索抗體。所得人類IgG1抗體在CHO細胞中表現並使用蛋白質A親和管柱(MAb Select Sure)純化，之後使用HIC管柱(Toyopearl Butyl 600M)去除聚集體。將抗體調配至PBS(pH 7.5)。
實例7 b) mAb AGC2400與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶合以得到偶聯物AGC2418
將含抗體溶液調節至pH 7.5。將螯合劑AGC0019溶解於1：1之DMA：0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。將NHS及EDC溶解於0.1M MES緩衝劑(pH 5.4)中。製備螯合劑/NHS/EDC之1/1/3莫耳當量溶液以活化螯合劑。對於偶聯至抗體，將莫耳比為16.5/16.5/49.5/1(螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑加載至mAb。在30分鐘後，用12% v/v 0.3M檸檬酸將pH調節至5.5，淬滅偶聯反應。將反應樣品進一步加載至HiLoad 16/600 Superdex 200(製備級)管柱上以使用30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl(pH 5.5)作為移動相分離單體部分。在層析結束時，將抗體偶聯物AGC2418在30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA及0.5mg/ml pABA中濃縮至2.5mg/ml。所有程序皆闡述於RD.2014.111，期刊號211/160,140814 AEF中。
實例7 c) 用於 227 Th-AGC2418之劑量之製備
將一小瓶20MBq氯化釷-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析釷-227。量測釷-227之溶析活性並將10MBq劑量轉移至空10ml玻璃小瓶中。然後使用真空幫浦並將該小瓶置於加熱區塊(設定為120℃)中30-60分鐘來蒸發酸。在達到室溫後，添加6ml 2.5mg/ml AGC2418偶聯物用於放射標記。將該小瓶在室溫下溫和混合並靜置15分鐘。然後將溶液無菌過濾至無菌小瓶中並在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例7 d) 具有不同總活性之 227 Th-AGC2418針對過表現間皮素抗原之HT29細胞之細胞毒性
為顯示227Th-AGC2418在結合至間皮素+細胞後之細胞毒性，實施活體外細胞毒性分析。出於此目的，使經間皮素抗原轉染之人類結腸直腸癌細胞系HT29暴露至227Th-AGC2418。總活性在以三倍稀釋之12個點中逐步增加，在10kBq/μg之比活性下始於5kBq/ml。以類似方式平行製備無關同型對照。所有實驗程序皆闡述於RD2014.154中。簡言之，用10% FBS、1%青黴素/鏈黴素、1% NaHCO3、600μg/ml 潮黴素B製備於RPMI 1640培養基中之200000個經間皮素抗原轉染之人類HT29細胞/ml並以40.000細胞/孔之密度接種於96孔板中。以227Th-AGC2418及各別227Th-同型對照偶聯物樣品之0至40kBq/ml之活性將細胞在37℃下培育6天。在第6天，收穫細胞並使用CellTiterGlo套組(Promega)量測活力。活力藉由將陽性對照(未處理細胞)設定為100%以%表示。
實例8 醯胺與異硫氰酸酯連接之偶聯物之穩定性的比較
將AGC1118及具有異硫氰酸酯偶合部分之相應偶聯物(AGC1115)在40℃下於水溶液中儲存11天。定期取樣。
正規化至每一4℃取樣點之40℃樣品
自上表可見，對於醯胺偶合之偶聯物，偶聯物濃度未見可量測降低。與之相比，異硫氰酸酯偶聯物在5天後降低8%且在11天後降低12%。
實例9 實例9 a) PSMA單株抗體(AGC1000)之生成
PSMA單株抗體(下文稱為AGC1000)購自Progenics,USA。
實例9 b) mAb AGC1000與螯合劑AGC0019(式(VIII)化合物)偶合以得到偶聯物AGC1018
將含抗體溶液調節至pH 7.5。將螯合劑AGC0019溶解於1：1,DMA：0.1M MES緩衝劑(pH 5.5)中將NHS及EDC溶解於0.1M MES緩衝劑(pH 5.5)中。製備螯合劑/NHS/EDC之1/1/2莫耳當量溶液以活化螯合劑。對於偶聯至抗體，將莫耳比為20/20/40/1(螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑以4份裝載至mAb，每份間隔10分鐘。在50分鐘後，用12% v/v 1M TRIS(pH 7.3)淬滅偶聯反應。藉由切向流過濾(TFF)將偶聯物純化並緩衝劑交換。調配緩衝劑為30mM檸檬酸鹽、70mM NaCl、2mM EDTA、0.5mg/ml pABA,pH 5.5。在滲濾結束時，將溶液排放至散裝容器中並將濃度調節至2.7mg/ml。最後，經由0.2μm無菌過濾器過濾本體溶液並轉移至無菌小瓶中以供在-20℃下儲存。
實例9 c) 227 Th-AGC1018注射之劑量之製備
將一小瓶約50MBq氯化Th-227薄膜溶解於2ml 8M HNO3溶液中並靜置15分鐘，之後取出該溶液以供施用至陰離子交換管柱來去除隨時間生長之鐳-223。用3ml 8M HNO3及1mL水洗滌該管柱，之後用3ml 3M HCl溶析Th-227。使用真空幫浦及設定為100℃之加熱區塊經60-90分鐘蒸發HCl溶析物。在劑量校準器中量測經乾燥Th-227之活性。將乾燥Th-227溶解於0.05M HCl中以得到0.5MBq/μl之濃度。對於放射標記，將偶聯物AGC1018稀釋於調配緩衝劑中以獲得200μl中之25μg mAb。向AGC1018溶液中混合1MBq Th-227並在鍺檢測器上量測確切Th-227活性。容許在室溫下螯合30-60分鐘，之後無菌過濾至無菌小瓶中。在使用前取出樣品用於iTLC分析以測定RCP。
實例9 d) 227 Th-AGC1018針對表現PSMA之LNCaP細胞之細胞毒性
為顯示227Th-AGC1018在結合至PSMA陽性細胞後之細胞毒性， 實施活體外細胞毒性分析。出於此目的，使人類前列腺癌細胞系LNCaP暴露至227Th-AGC1018。總活性經以三倍稀釋之12個點逐步增加，在40kBq/μg之比活性下始於20kBq/ml。平行製備無關同型對照。所有實驗程序皆闡述於檔案RD.2015.101中。簡言之，在補充有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素之RPMI 1640培養基中培養人類LNCaP細胞。將細胞以2500細胞/孔之密度接種於96孔板中。在接種後24小時(第1天)，使細胞在37℃下在介於0至20kBq/ml範圍內之總活性下暴露至227Th-AGC1018及227Th同型對照5天。在第6天，收穫細胞並使用CellTiterGlo套組(Promega)量測活力。活力藉由將陽性對照(未處理細胞)設定為100%以%表示。
<110> 挪威商拜耳公司
<120> 偶聯方法
<130> 95.121941
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類輕鏈序列
<400> 1
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化輕鏈序列
<400> 2
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類重鏈序列
<400> 3
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一人類化重鏈序列
<400> 4
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二人類化重鏈序列
<400> 5

Claims (25)

  1. 一種形成靶向組織之釷複合物之方法，該方法包含：a)形成八齒螯合劑，其包含4個在N-位經C1-C3烷基取代之羥基吡啶酮(hydroxypyridinone；HOPO)部分及末端為羧酸基團之偶合部分；b)藉助至少一種醯胺偶合劑將該八齒螯合劑偶合至至少一種包含至少一個胺部分之靶向組織之肽或蛋白質，由此生成靶向組織之螯合劑；及c)使該靶向組織之螯合劑與包含至少一種α-發射釷同位素之離子之水溶液接觸。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟b)係在水溶液中實施。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該醯胺偶合劑係在水溶液中起作用。
  4. 如任一前述請求項之方法，其中該醯胺偶合劑係碳二亞胺偶合劑，諸如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)。
  5. 如任一前述請求項之方法，其中步驟b)係在水溶液中於介於4與9之間之pH下實施。
  6. 如任一前述請求項之方法，其中步驟b)係在介於15℃與50℃之間實施5至120分鐘。
  7. 如任一前述請求項之方法，其中步驟c)係在介於15℃與50℃之間實施1至60分鐘。
  8. 如任一前述請求項之方法，其中該八齒螯合劑包含4個3,2-HOPO部分。
  9. 如任一前述請求項之方法，其中該八齒螯合劑選自下式(VIb)及 (VII)： 其中Rc係末端為羧酸部分之連接體部分，該羧酸部分諸如[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]，[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，其中Ph係伸苯基，較佳對伸苯基。
  10. 如任一前述請求項之方法，其中該組織靶向部分係單株或多株抗體、抗體片段(例如Fab、F(ab')2、Fab'或scFv)或該等抗體及/或片段之構築體。
  11. 如任一前述請求項之方法，其中該組織靶向部分對CD22受體、FGFR2、間皮素、HER-2、PSMA或CD33具有結合親和性。
  12. 一種靶向組織之釷複合物，其係藉由或可藉由如請求項1至11中任一項之方法來形成。
  13. 如請求項12之靶向組織之釷複合物，其包含4個3,2-HOPO部分。
  14. 如請求項12或13之靶向組織之釷複合物，其對CD22受體、FGFR2、間皮素、HER-2、PSMA或CD33具有結合親和性。
  15. 如請求項12至14中任一項之靶向組織之釷複合物，其包含α-發射釷放射性核種、諸如227Th之4+離子。
  16. 如請求項12至15中任一項之靶向組織之釷複合物，其包含下式(VIb)或(VII)之八齒螯合劑： 其中RC係藉由醯胺基團接合至組織靶向部分之偶合部分，較佳AGC0019。
  17. 如請求項12至16中任一項之靶向組織之釷複合物，其包含選自以下之組織靶向部分：單株或多株抗體、抗體片段(諸如Fab、F(ab')2、Fab'或scFv)或該等抗體及/或片段之構築體。
  18. 如請求項12至17中任一項之靶向組織之釷複合物，其包含包括至少一個肽鏈之組織靶向部分，該肽鏈與以下序列中之至少一者具有至少90%序列相似性：輕鏈： 重鏈：
  19. 一種醫藥調配物，其包含至少一種如請求項12至18中任一項之靶向組織之釷複合物。
  20. 如請求項19之醫藥調配物，其進一步包含檸檬酸鹽緩衝劑。
  21. 如請求項19或20之醫藥調配物，其進一步包含p-胺基丁酸(p-aminobutyric acid；PABA)及視情況EDTA及/或至少一種聚山梨醇酯。
  22. 一種如請求項12至18中任一項之靶向組織之釷複合物或如請求項19至21中任一項之醫藥調配物之用途，其用於製造用以治療增生性或腫瘤性疾病之藥劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該疾病係癌症、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)或B細胞腫瘤、乳癌、子宮內膜癌、胃癌、急性類骨髓性白血病、前列腺癌或腦癌、間皮瘤、卵巢癌、肺癌或胰臟癌。
  24. 如請求項12至18中任一項之靶向組織之釷複合物或如請求項19至21中任一項之醫藥調配物，其用於治療增生性及/或腫瘤性疾病，諸如癌症、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金氏淋巴瘤或B細胞腫瘤、乳癌、子宮內膜癌、胃癌、急性類骨髓性白血病、前列腺癌或腦癌、間皮瘤、卵巢癌、肺癌或胰臟癌。
  25. 一種用於如請求項1至11中任一項之方法中之套組，該套組包含：i)八齒螯合劑，其包含4個在N-位經C1-C3烷基取代之羥基吡啶酮(HOPO)部分及末端為羧酸基團之偶合部分；ii)至少一種靶向組織之肽或蛋白質，其包含至少一個胺部分；iii)至少一種醯胺偶合劑；及iv)視情況且較佳地α-發射釷放射性核種，諸如227Th。
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