KR20170094223A - 방사성-제약 복합체 - Google Patents

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KR20170094223A
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앨런 커스버트슨
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바이엘 에이에스
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Abstract

본 발명은 a) N-위치에서 C1-C3 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 (HOPO) 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 것; b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를 적어도 1종의 아미드-커플링 시약에 의해 적어도 1개의 아민 모이어티를 포함하는 적어도 1종의 조직-표적화 펩티드 또는 단백질에 커플링시켜 조직-표적화 킬레이트화제를 생성하는 것; 및 c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 적어도 1종의 알파-방출 토륨 동위원소의 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법을 제공한다. 조직-표적화 토륨 복합체, 뿐만 아니라 상기 복합체 및 상응하는 제약 제제의 투여를 포함하는 신생물성 또는 과형성 질환의 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

방사성-제약 복합체 {RADIO-PHARMACEUTICAL COMPLEXES}
본 발명은 토륨 동위원소의 복합체 및 특히 조직 표적화 모이어티에 접합된 특정 옥타덴테이트 리간드와의 토륨-227의 복합체의 형성을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 복합체, 및 이러한 복합체의 투여를 수반하는, 질환, 특히 신생물성 질환의 치료에 관한 것이다.
특이적 세포 사멸은 포유동물 대상체에서 다양한 질환을 성공적으로 치료하는데 필수적일 수 있다. 이의 전형적인 예는 악성 질환 예컨대 육종 및 암종의 치료에 있다. 그러나 특정 세포 유형의 선택적 제거는 또한 다른 질환, 특히 과형성 및 신생물성 질환의 치료에서 주요 역할을 할 수 있다.
선택적 치료의 가장 통상적인 방법은 현재 수술, 화학요법 및 외부 빔 조사이다. 그러나, 표적화된 방사성핵종 요법은 고도로 세포독성인 방사선을 질환과 연관된 세포 유형에 특이적으로 전달할 가능성이 있는 유망하고 발전하고 있는 영역이다. 현재 인간에 사용되도록 인가된 방사성제약의 가장 흔한 형태는 베타-방출 및/또는 감마-방출 방사성핵종을 사용한다. 그러나, 알파-방출 방사성핵종을 요법에 사용하는 것이 그의 보다 특이적인 세포 사멸을 위한 가능성 때문에 일부 관심을 받은 바 있다.
생리학적 환경에서 전형적인 알파 방출체의 방사선 범위는 일반적으로 100 마이크로미터 미만으로, 이는 단지 수개의 세포의 직경에 해당한다. 이는 이들 공급원을 미세전이를 포함한 종양의 치료에 잘 적합하게 되도록 하는데, 그 이유는 이들이 종양 내부의 인접 세포에 도달할 수 있는 범위를 가지나, 잘 표적화되면 방사된 에너지가 표적 세포 이외에는 거의 통과하지 않을 것이기 때문이다. 따라서, 모든 세포가 표적화될 필요는 없지만, 주위 건강한 조직에 대한 손상은 최소화될 수 있다 (문헌 [Feinendegen et al., Radiat Res 148: 195-201 (1997)] 참조). 대조적으로, 베타 입자는 물에서 1 mm 이상의 범위를 갖는다 (문헌 [Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)] 참조).
알파-입자 방사의 에너지는 베타 입자, 감마선 및 X선에 의해 운반되는 것과 비교 시 높으며, 전형적으로 5-8 MeV, 또는 베타 입자의 것의 5 내지 10배 또는 감마선 에너지의 20배 이상이다. 따라서, 매우 짧은 거리에 걸친 다량의 에너지의 이러한 축적은 α-방사선은 감마 및 베타 방사선과 비교 시 예외적으로 높은 선형 에너지 전달 (LET), 높은 상대 생물학적 효능 (RBE) 및 낮은 산소 증진 비율 (OER)을 제공한다 (문헌 [Hall, "Radiobiology for the radiologist", Fifth edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000] 참조). 이는 알파 방출 방사성핵종의 예외적인 세포독성을 설명하며, 또한 이러한 동위원소의 생물학적 표적화에 대한 및 허용되지 않는 부작용을 피하기 위해 필요한 알파 방출 방사성핵종 분포의 제어 수준 및 연구에 대한 엄격한 요구사항을 부과한다.
하기 표 1은 치료적 효능을 가질 가능성이 있는 것으로 문헌에 지금까지 광범하게 제안된 알파 방출체의 물리적 붕괴 특성을 나타낸다.
표 1
Figure pct00001
* 반감기
지금까지, 방사선면역요법에서의 적용과 관련하여, 주요 관심은 211At, 213Bi 및 225Ac에 집중된 바 있고 이들 3종의 핵종은 임상적 면역요법 시험에서 탐구된 바 있다.
제안된 바 있는 여러 방사성핵종은 수명이 짧고, 즉 12시간 미만의 반감기를 갖는다. 이러한 짧은 반감기는 상업적인 방식으로 이들 방사성핵종을 기재로 하는 방사성제약을 생산 및 분배하는 것을 어렵게 만든다. 짧은 수명의 핵종의 투여는 또한 표적 부위에 도달하기 전에 신체 내에서 방출될 방사선 용량의 비율을 증가시킨다.
알파-방출로부터의 반도 에너지는 다수의 경우에 모핵종의 붕괴 위치로부터 딸 핵종의 방출을 초래할 것이다. 이러한 반도 에너지는, 모핵종을 보유할 수도 있을, 예를 들어 모핵종이 리간드 예컨대 킬레이트화제에 의해 복합체를 형성한 화학적 환경으로부터 많은 딸 핵을 파괴하기에 충분하다. 이는 딸이 동일 리간드와 상용성인, 즉 동일 리간드에 의해 복합체 형성이 가능한 경우에조차 발생할 것이다. 동등하게, 딸 핵종이 기체, 특히 영족 기체 예컨대 라돈이거나, 또는 리간드와 화학적으로 비상용성인 경우에, 상기 방출 효과는 더욱 커질 것이다. 딸 핵종이 수초를 넘는 반감기를 갖는 경우에, 이들은 혈액계 내로 확산될 수 있고, 모핵종을 보유한 복합체화제에 의해 억제되지 않는다. 이어서 이들 유리 방사성 딸은 바람직하지 않은 전신 독성을 일으킬 수 있다.
223Ra 딸 동위원소의 제어가 유지되는 조건 하에서의 토륨-227 (T1/2 = 18.7일)의 사용은 수년 전에 제안되었다 (WO 01/60417 및 WO 02/05859 참조). 이는 딸 핵종이 폐쇄된 환경에 의해 보유되도록 하는 담체 시스템이 사용되는 상황에서였다. 한 경우에, 방사성핵종은 리포솜 내에 배치되고, 실질적인 크기의 리포솜 (반도 거리와 비교 시)은 딸 핵종을 리포솜 내에 보유하는 것을 돕는다. 두 번째 경우에, 골 매트릭스 내에 혼입시키고 따라서 딸 핵종의 방출을 제한하는 방사성핵종의 향골성 복합체가 사용된다. 이들은 잠재적으로 고도로 유리한 방법이지만, 리포솜의 투여는 일부 상황에 바람직하지 않고, 방사성핵종이 딸 동위원소를 보유하도록 무기질화된 매트릭스에 의해 둘러싸일 수 없는 연부 조직의 많은 질환이 있다.
보다 최근에, 227Th의 붕괴 시 방출되는 223Ra 딸 핵의 독성이 포유동물 신체에서, 필적할만한 핵에 대한 선행 시험으로부터 예측되는 것보다 훨씬 더 많은 정도로 허용될 수 있는 것으로 확립되었다. 상기 논의된 토륨-227의 라듐 딸을 보유하는 특이적 수단의 부재 하에, 라듐 독성에 관한 공중 이용가능한 정보는, 토륨-227 붕괴로부터 치료 효과를 달성하는데 요구되는 투여량은 고도의 독성을 초래할 것이며 라듐 딸의 붕괴로부터 방사선의 고도로 독성이고 치명적인 투여량을 초래할 수 있으며, 즉 치료 범위가 없기 때문에 토륨-227을 치료제로서 사용하는 것은 불가능하다는 것을 명확하게 하였다.
WO 04/091668은 치료 유효량의 표적화된 토륨-227 방사성핵종이 허용되지 않는 골수독성을 일으키기에 충분한 양의 라듐-223을 생성하지 않으면서 대상체 (전형적으로 포유동물)에게 투여될 수 있는 치료적 치료 범위가 존재한다는 예상외의 발견을 기재하고 있다. 따라서 이는 골 및 연부-조직 부위 둘 다에서의 모든 유형의 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
상기 개발의 관점에서, 이제, 알파-방출 토륨-227 핵을 생성된 223Ra로부터 기인하는 치명적인 골수독성 없이 내부방사성핵종 요법에서 이용하는 것이 가능하다. 그럼에도 불구하고, 치료 범위는 상대적으로 좁은 상태로 남아 있고 모든 경우에 대상체에게 알파-방출 방사성동위원소를 절대적으로 필요한 양 이하로 투여하는 것이 바람직하다. 따라서 이러한 새로운 치료 범위의 유용한 탐구는 알파-방출 토륨-227 핵이 복합체화되어 고도의 신뢰성으로 표적화될 수 있다면 크게 증진될 것이다.
방사성핵종은 끊임없이 붕괴하기 때문에 단리와 대상체에게 투여하는 사이의 물질을 취급하는데 소요되는 시간은 매우 중요하다. 또한, 알파-방출 토륨 핵이 바람직하게는 표적화 실체의 특성에 비가역적 영향을 미치지 않는 소수의 단계, 짧은 인큐베이션 기간 및/또는 온도를 필요로 하는, 제조하기에 신속하고 편리한 형태로 복합체화되고, 표적화되고/되거나 투여될 수 있다면 상당한 가치가 있을 것이다. 게다가, 투여 이전에 제거를 필요로 하지 않는 용매 중에서 (본질적으로 수용액 중에서) 수행될 수 있는 공정은 용매 증발 또는 투석 단계를 피한다는 상당한 이점을 갖고 있다.
또한 상당히 증진된 안정성을 입증한 토륨 표지된 약물 제품 제제가 개발될 수 있다면, 그것은 유의한 가치로 간주될 것이다. 이것은 강건한 제품 품질 표준이 부착되고, 동시에 환자 용량을 전달하는 로지스틱 경로를 가능하게 하는 것을 확실하게 하는데 중요하다. 따라서 1-4일의 기간에 걸친 최소 방사선분해를 갖는 제제가 바람직하다.
히드록시피리디논 기를 함유하는 옥타덴테이트 킬레이트화제는 표적화 모이어티에 후속적으로 부착하기 위해, 알파 방출체 토륨-277을 조정하는데 적합한 것으로 이전에 제시된 바 있다 (WO2011098611). 표적화 분자에 접합하는데 사용된 개별 반응성 기를 갖는, 아민-기반 스캐폴드에 대해 링커 기로 연결되는 4개의 3,2- 히드록시피리디논 기를 함유하는 옥타덴테이트 킬레이트화제가 기재되었다. 이전의 발명의 바람직한 구조는 화합물 ALG-DD-NCS에 제시된 바와 같이, 3,2-히드록시피리디논 기를 함유하고 항체 성분에 바람직한 커플링 화학으로서 이소티오시아네이트 모이어티를 이용하였다. 이소티오시아네이트는 아민 기를 통해 단백질에 표지를 부착하는데 널리 사용된다. 이소티오시아네이트 기는 단백질에서 아미노 말단 및 1급 아민과 반응하고, 항체를 포함한 많은 단백질의 표지에 사용된 바 있다. 이들 접합체에서 형성된 티오우레아 결합은 상당히 안정하지만, 형광 이소티오시아네이트로부터 제조된 항체 접합체가 시간이 지나면서 저하되는 것으로 보고된 바 있다. [Banks PR, Paquette DM., Bioconjug Chem (1995) 6:447-458]. 플루오레세인 이소티오시아네이트과 아민과의 반응에 의해 형성된 티오우레아는 또한 염기성 조건 하에 구아니딘으로 전환되기 쉽다 [Dubey I, Pratviel G, Meunier BJournal: Bioconjug Chem (1998) 9:627-632]. 긴 생물학적 반감기의 모노클로날 항체에 커플링된 토륨-227의 긴 붕괴 반감기 (18.7일)로 인해 생체내 및 저장 둘 다에 보다 화학적으로 안정한 접합체를 생성하도록 보다 안정한 연결 모이어티를 사용하는 것이 바람직하다.
히드록시피리디논 리간드의 접합에 대해 가장 관련있는 이전의 연구는 WO2013/167754에 공개되었고, 히드록시알킬 관능기를 포함하는 모이어티를 가용화하는 물을 보유하는 리간드를 개시하고 있다. 이러한 킬레이트 부류의 히드록실 기의 반응성으로 인해, 활성화된 에스테르로서의 활성화는 다중 경쟁 반응이 에스테르화 반응을 통해 생성물의 복합체 혼합물로 이어지는 것처럼 가능하지 않다. 따라서 WO2013/167754의 리간드는 상기 기재된 바와 같이 덜 안정한 티오우레아 접합체를 제공하는 이소티오시아네이트와 같은 대안적 화학을 통해 조직-표적화 단백질에 커플링되어야만 한다. 또한 WO2013167755 및 WO2013167756은 각각 CD33 및 CD22 표적화 항체에 적용된 히드록시알킬/ 이소티오시아네이트 접합체를 개시하고 있다.
본 발명자들은 본 발명에 이르러 특정한 킬레이트화제를 적절한 표적화 모이어티에 커플링시키는 것에 이어서, 알파-방출 토륨 이온을 첨가하는 것에 의해 조직 표적화 복합체를 형성함으로써, 복합체는 온화한 조건 하에, 및 복합체의 저장 및 투여에 보다 안정한 연결 모이어티에 의해 신속하게 생성될 수 있는 것으로 확립하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 따라서
a) N-위치에서 C1-C3 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 (HOPO) 모이어티 및 카르복실산 기 (또는 그의 보호된 등가물)에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 것;
b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를 적어도 1종의 아미드-커플링 시약에 의해 적어도 1개의 아민 모이어티를 포함하는 적어도 1종의 조직-표적화 펩티드 또는 단백질에 커플링시켜 조직-표적화 킬레이트화제를 생성하는 것; 및
c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 적어도 1종의 알파-방출 토륨 동위원소의 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 것
을 포함하는, 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법을 제공한다.
이러한 복합체에서 (및 바람직하게는 본 발명의 모든 측면에서) 토륨 이온은 일반적으로 옥타덴테이트 히드록시피리디논-함유 리간드에 의해 복합체화될 것이고, 이는 차례로 아미드 결합을 통해 조직 표적화 모이어티에 부착될 것이다.
전형적으로, 이러한 방법은 계내 활성화를 통해 또는 활성 에스테르 그 자체의 합성 및 단리에 의해, 또한 활성 에스테르 (예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS 에스테르))의 형태로 활성화될 수 있는 반응성 카르복실레이트 관능기를 포함하는 3,2-히드록시피리디논-기재 옥타덴테이트 킬레이트의 합성을 위한 방법일 것이다.
생성된 NHS 에스테르는 광범위한 킬레이트 변형된 단백질 포맷을 생성하기 위한 단순한 접합 단계에 사용될 수 있다. 또한, 고도로 안정한 항체 접합체는 토륨-227로 용이하게 표지된다. 이는 전형적으로 높은 방사화학적 수율 및 순도로, 주위 온도에 이르거나 가까울 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 수용액 중에서 수행되고, 한 실시양태에서는 임의의 유기 용매의 부재 또는 실질적인 부재 (1 부피% 미만) 하에 수행될 수 있다.
바람직한 표적화 모이어티는 폴리클로날 및 특히 모노클로날 항체 및 그의 단편을 포함한다. 특이적 결합 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 단일-쇄 특이적 결합 항체는 전형적인 단편이다.
본 발명의 조직 표적화 복합체는 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게의 투여에 적합한 의약으로 제제화될 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 따라서 본원에 기재된 바와 같은 조직-표적화 복합체의 형성에 이어서, 적어도 1종의 제약 담체 및/또는 부형제의 첨가를 포함하는, 제약 제제의 생성 방법을 제공한다. 적합한 담체 및 부형제에는 완충제, 킬레이트화제, 안정화제 및 관련 기술분야에 공지되거나 본원의 임의의 측면에서 기재된 바와 같은 다른 적합한 성분을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 조직-표적화 토륨 복합체를 추가로 제공한다. 이러한 복합체는 본원 전체에 걸쳐 기재되는 특색, 특히 본원에 기재된 바람직한 특색을 가질 것이다. 복합체는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능하다. 따라서 이러한 방법은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체를 산출할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 복합체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 제제는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능하고, 적어도 1종의 완충제, 안정화제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다. 완충제 및 안정화제는 이들이 조직-표적화 복합체를 방사선분해로부터 보호하는 것을 함께 돕는 것으로 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 제제에서의 복합체의 방사선분해는 제제의 제조 후 심지어 수일이 지나도 최소이다. 이는 이러한 기술의 구현 및 실질적인 적용에 주요한 제품 품질 및 약물 공급의 로지스틱과 연관된 잠재적인 이슈를 해결하기 때문에 중요한 이점이다.
본 발명은 생물학적 관심 부위, 예컨대 종양 연관 수용체의 표적화를 위한 수많은 토륨-표지된 항체 접합체의 제조에서 유용성을 나타낸 바 있다.
본 발명의 맥락에서, "조직 표적화"는 본원에 사용되어 해당 물질 (특히 본원에 기재된 바와 같은 조직-표적화 복합체의 형태인 경우)은 그 자체를 그의 존재 (예를 들어 방사성 붕괴를 전달하기 위해)를 목적으로 하는 적어도 하나의 조직 부위에 우선적으로 국부화시키는 (특히 임의의 접합된 토륨 복합체를 국부화시키는) 역할을 한다는 것을 제시한다. 따라서 조직 표적화 기 또는 모이어티는 표적화 모이어티를 갖고 있지 않는 동등한 복합체의 농도와 비교하여 대상체에게 투여 후에 상기 대상체의 신체에서 적어도 하나의 바람직한 부위에 대한 보다 큰 국부화를 제공하는 역할을 한다. 본 경우의 표적화 모이어티는 암 세포와 연관된 세포-표면 수용체 또는 종양 미세환경과 연관된 다른 수용체에 특정하게 결합하기 위해 바람직하게 선택될 것이다.
과형성 및 신생물성 질환과 연관된 것으로 공지된 다수의 표적이 있다. 이들은 이환 세포의 부근에 세포외 매트릭스에서 발견된 특정 수용체, 세포 표면 단백질, 막횡단 단백질 및 단백질/펩티드를 포함한다. 신생물성 질환과 연관될 수 있는 세포-표면 수용체 및 항원의 예는 CD22, CD33, FGFR2 (CD332), PSMA, HER2, 메소텔린 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 조직-표적화 모이어티 (예를 들어 펩티드 또는 단백질)는 CD22, CD33, FGFR2 (CD332), PSMA, HER2와 메소텔린로부터 선택된 적어도 1종의 항원 또는 수용체에 대해 특이성을 갖는다.
CD22, 또는 분화 클러스터-22는 렉틴의 SIGLEC 패밀리에 속하는 분자이다 (SIGLEC=시알산-결합 이뮤노글로불린-유형 렉틴).
CD33 또는 Siglec-3은 골수계의 세포에 발현된 막횡단 수용체이다.
FGFR2는 섬유모세포 성장 인자를 위한 수용체이다. 이것은 인간에서 염색체 10 상에 있는 FGFR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
HER2는 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER/EGFR/ERBB) 패밀리의 구성원이다.
전립선-특이적 막 항원 (PSMA)은 인간에서 FOLH1 (폴레이트 히드롤라제 1) 유전자에 의해 코딩되는 효소이다.
또한 MSLN으로 공지된 메소텔린은 인간에서 MSLN 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
본 경우의 특히 바람직한 조직-표적화 결합제는 CD22 수용체에 특이적으로 결합하기 위해 선택될 것이다. 이는, 예를 들어, 비-CD22 발현 세포보다 CD22 발현되는 세포에 대해 50배 이상 더 높은 결합 친화도 (예를 들어 적어도 100배 더 큼, 바람직하게는 적어도 300배 더 큼)를 가짐으로써 반영될 수 있다. CD22는 (본원에 제시된 바와 같이) 특정 질환 상태를 갖는 세포에서 발현 및/또는 과다-발현되고, 따라서 CD22 특이적 결합제는 이러한 질환의 영향을 받는 세포에 복합체를 표적화하는 역할을 할 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게 조직 표적화 모이어티는 질환의 영향을 받는 세포에 근접한 세포 상에 존재하는 세포-표면 마커 (예를 들어 CD22 수용체)에 결합할 수 있다. CD22 세포-표면 마커는 건강한 세포 표면 상에서보다 이환 세포 표면 상에서 더 심하게 발현되거나 휴면기 동안보다 성장 또는 복제의 기간 동안 세포 표면 상에서 더 심하게 발현된다. 한 실시양태에서, CD22 특정한 조직-표적화 결합제는 질환-특이적 세포-표면 마커에 대해 또 다른 결합제와 조합하여 사용되어 이중-결합 복합체를 제공할 수 있다. CD-22에 대한 조직-표적화 결합제는 본원에 논의된 바와 같이 전형적으로 펩티드 또는 단백질일 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 다양한 측면은, 특히 이환 조직의 선택적 표적화를 위한 질환의 치료에 관한 것 뿐만 아니라 이러한 방법에 유용한 복합체, 접합체, 의약, 제제, 키트 등에 관한 것이다. 모든 측면에서, 이환 조직은 (예를 들어 국부화된 고형 종양의 경우에) 신체 내의 단일 부위에 존재할 수 있거나 또는 (예를 들어 관절염이 수개의 관절에 영향을 미치는 경우 또는 분포되거나 전이된 암성 질환의 경우에) 복수의 부위에 존재할 수 있다.
표적화될 이환 조직은 연부 조직 부위, 석회화 조직 부위 또는 모두 연부 조직에, 모두 석회화 조직에 있을 수 있는 복수의 부위에 있을 수 있거나 또는 적어도 하나의 연부 조직 부위 및/또는 적어도 하나의 석회화 조직 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 연부 조직 부위가 표적화된다. 표적화의 부위 및 질환 기원의 부위는 동일할 수 있지만, 대안적으로 (예컨대 전이 부위가 특히 표적화되는 경우에) 상이할 수 있다. 하나 초과의 부위가 수반되는 경우에 이는 기원의 부위를 포함할 수 있거나 복수의 2차 부위일 수 있다.
용어 "연부 조직"은 "경질" 무기질화 매트릭스를 갖지 않는 조직을 제시하기 위해 본원에 사용된다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 연부 조직은 골격 조직이 아닌 임의의 조직일 수 있다. 상응하게, 본원에 사용된 바와 같은 "연부 조직 질환"은 본원에 사용된 바와 같은 "연부 조직"에서 발생하는 질환을 제시한다. 본 발명은 암 및 "연부 조직 질환"의 치료에 특히 적합하고 따라서 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종, 및 임의의 "연부" (즉 비-무기질화) 조직에 발생하는 혼합형 암 뿐만 아니라, 이러한 조직의 다른 비암성 질환을 포괄한다. 암성 "연부 조직 질환"은 연부 조직에 나타나는 고형 종양 뿐만 아니라 전이 및 미세-전이 종양을 포함한다. 실제로, 연부 조직 질환은 동일한 환자에서 연부 조직의 원발성 고형 종양 및 연부 조직의 적어도 1종의 전이 종양을 포함할 수 있다. 대안적으로, "연부 조직 질환"은 단지 1종의 고형 종양 또는 단지 1종의 원발성 종양이 골격 질환인 전이만으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 모든 적절한 측면에서 치료 및/또는 표적화에 특히 적합한 것은 혈액 신생물 및 특히 림프성 세포의 신생물성 질환, 예컨대 비-호지킨 림프종, B-세포 림프종의 B-세포 신생물을 포함한 림프종 및 림프성 백혈병이다. 유사하게, 골수, 척추 (특히 척수) 림프절 및/또는 혈액 세포의 임의의 신생물성 질환은 본 발명의 모든 적절한 측면에서 치료 및/또는 표적화에 적합하다.
본 발명의 모든 적절한 측면에서 치료 및/또는 표적화에 적합한 B-세포 신생물의 일부 예는 하기를 포함한다:
만성 림프구성 백혈병/소림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종 (예컨대 발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 비장 변연부 림프종, 형질 세포 신생물 (예를 들어 형질 세포 골수종, 형질세포종, 모노클로날 이뮤노글로불린 침착 질환, 중쇄 질환), 림프절외 변연부 B 세포 림프종 (MALT 림프종), 결절성 변연부 B 세포 림프종 (NMZL), 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 종격 (흉선) 대 B 세포 림프종, 혈관내 대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종 및 버킷 림프종/백혈병.
본 발명의 FGFR2 표적화제를 사용하는 치료에 적합한 신생물의 일부 예는 돌연변이 이벤트가 유방암, 자궁내막암 및 위암을 포함한 종양 형성 및 진행과 연관된 경우를 포함한다.
본 발명의 CD33 표적화 작용제를 사용하는 치료에 적합한 골수성 유래 신생물의 일부 예는 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함한다.
본 발명의 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 표적화 작용제를 사용하는 치료에 적합한 신생물의 일부 추가의 예는 전립선암 및 뇌암을 포함한다.
본 발명의 인간 표피 성장 인자 수용체-2 (HER-2) 표적화 작용제를 사용하는 치료에 적합한 신생물의 일부 추가의 예는 유방암을 포함한다.
본 발명의 메소텔린 표적화 작용제를 사용하는 치료에 적합한 신생물의 일부 추가의 예는 악성종양 예컨대 중피종, 난소암, 폐암 및 췌장암을 포함한다.
항체 접합체가 저장 시 허용되는 기간 동안 안정한 것이 본 발명의 달성의 주요 기여이다. 따라서 비-방출성 항체 접합체 및 토륨-표지된 약물 제품 둘 다의 안정성은 방사성제약 생성물의 제조 및 분포를 위해 요구되는 엄격한 기준을 만족해야한다. 조직-표적화를 포함하는 본원에 기재된 제제가 저장 시 탁월한 안정성을 나타내는 것이 놀랍다. 이것은 심지어 전형적으로 가속 안정성 연구에 사용되는 승온에 적용된다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 한 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 특히, 시트레이트 완충제의 사용이 놀랍게도 안정적 제제를 제공한다는 것이 발견된 바 있다. 이것은 바람직하게는 1-100 mM (pH 4-7) 범위, 특히 10 내지 50 mM에서 범위에서의 시트레이트 완충제이지만, 가장 바람직하게는 20-40 mM 시트레이트 완충제이다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 p-아미노부티르산 (PABA)을 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 조합은 PABA와 조합된 (바람직하게는 본원에 기재된 농도에서) 시트레이트 완충제이다. 다른 작용제와의 조합을 포함한 본 발명의 임의의 측면에서 사용하기 위해 바람직한 PABA의 농도는 대략 0.005 내지 5 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/ml 및 보다 바람직하게는 0.01 내지 1mg/ml이다. 0.1 내지 0.5 mg/ml의 농도가 가장 바람직하다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)를 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 조합은 시트레이트 완충제와 EDTA의 사용이다. 특히 바람직한 조합은 PABA의 존재 하의 시트레이트 완충제와 EDTA의 사용이다. 이러한 조합에서 시트레이트, PABA 및 적절한 경우에 EDTA는 본원에 제시된 농도의 범위 및 바람직한 농도의 범위에 존재하는 것이 바람직하다. 다른 작용제와 조합한 것을 포함한, 본 발명의 임의의 측면에 사용하기 위한 EDTA의 바람직한 농도는 약 0.02 내지 200 mM, 바람직하게는 0.2 내지 20 mM 및 가장 바람직하게는 0.05 내지 8 mM이다.
본 발명의 모든 상용성 측면에 적용가능한 추가 실시양태에서, 조직-표적화 복합체는 적어도 1종의 폴리소르베이트 (PEG 그라프팅된 소르비탄 지방산 에스테르)를 함유하는 적합한 완충제 중에 용해될 수 있다. 바람직한 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), 폴리소르베이트 60 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 및 그의 혼합물을 포함한다. 폴리소르베이트 80 (P80)이 가장 바람직한 폴리소르베이트이다. 다른 작용제와 조합한 것을 포함한, 본 발명의 임의의 측면에 사용하기 위한 폴리소르베이트 (본원에 제시된 바와 같은 특히 바람직한 폴리소르베이트)의 바람직한 농도는 약 0.001 내지 10% w/v, 바람직하게는 0.01 내지 1% w/v 및 가장 바람직하게는 0.02 내지 0.5 w/v이다.
PABA가 이전에 방사성안정화제로 기재된 바 있지만 (US4880615 A 참조) 본 발명에서의 PABA의 긍정적 효과는 저장 시 비-방출성 접합체 상에서 관찰되었다. 방사선분해의 부재 하의 이러한 안정화 효과는 조직-표적화 킬레이트화제의 합성이 전형적으로 토륨 이온과 접촉하기 상당히 이전에 발생하기 때문에 특히 놀라운 이점을 구성한다. 따라서, 조직-표적화 킬레이트화제는 토륨 이온과 접촉하기 1시간 내지 3년 전에 생성될 수 있고, 바람직하게는 그 주기의 적어도 일부 동안 PABA와 접촉하여 저장될 것이다. 즉, 본 발명의 단계 a) 및 b)는 단계 c) 1시간 내지 3년 전에 및 단계 b) 및 c) 사이에 발생할 수 있고, 조직-표적화 킬레이트화제는 특히 완충제, 예컨대 시트레이트 완충제 중 PABA, 임의로 EDTA 및/또는 폴리소르베이트와 접촉하여 저장된다. 모든 물질은 바람직하게는 본원에 제시된 유형 및 농도이다. PABA는 따라서 본 발명의 제제의 고도로 바람직한 성분이고, 조직-표적화 킬레이트화제 및/또는 조직-표적화 토륨 복합체를 위한 장기간 안정성을 야기할 수 있다. 도 1은 본 시스템에서의 PABA의 효과를 예시한다.
본원에 기재된 바와 같은 시트레이트 완충제의 사용은 본 발명의 제제의 조직-표적화 토륨 복합체의 안정성과 관련하여 놀라운 이점을 추가로 제공한다. 과산화수소 생성에의 완충제-용액의 효과에 대한 조사 연구는 본 발명자들에 의해 예상외의 결과로 수행되었다. 과산화수소는 물 방사선분해의 결과로서 형성된다는 것으로 공지되어 있고, 용액 중 단백질 접합체의 화학적 변형에 기여한다. 과산화수소 생성은 따라서 생성물의 순도 및 안정성에 대한 바람직하지 않은 효과를 갖는다. 도 2는 과산화수소의 보다 낮은 수준이 시험된 다른 모든 완충제와 비교 시 시트레이트 완충제 중 Co-60 (10 kGy)으로 조사된 본 발명의 항체 HOPO 접합체 용액에서 측정되었다는 놀라운 발견을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 제제는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 시트레이트 완충제를 포함할 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 제제의 특정 성분의 결합 효과와 관련되는 추가의 놀라운 발견을 추가로 확립한 바 있다. 이는 다시 방사성표지된 접합체의 안정성과 관련된 것이다. 연구의 목적은 저장 동안 227Th-AGC1118 접합체의 안정성을 평가하는 것이었다 (하기 참조). 결합된 IRF 검정은 약 8000 Bq/μg의 비활성에서 227Th-AGC1118을 사용하여 수행되었다. 0.02, 0.2 또는 2 mg/ml의 pABA, pH 5.5 첨가된 30 또는 100 mM 시트레이트 완충제, 또는 30 mM 시트레이트 완충제를 사용하여, 227Th-AGC1118에 대한 5종의 상이한 저장 용액을 제조하였다. 도 3은 특히 본원에 제시된 범위에서의 시트레이트 및/또는 PABA에 결합되는 경우에 본 발명의 제제의 방사성 안정성에 대한 상당한 긍정적 효과를 제시한다. 상기 기재된 연구에서 가장 유효한 완충제로 발견된 바 있는 시트레이트의 이러한 효과가 PABA의 첨가로 추가로 개선되었다는 것은 놀라운 발견이다.
본 발명의 방법, 복합체 및 제제의 주요 성분은 옥타덴테이트 킬레이트화제 모이어티이다. 히드록시피리디논 리간드와 토륨 이온의 복합체화에 대한 가장 관련있는 이전의 연구는 WO2011/098611로 공개되었고, 이는 옥타덴테이트 HOPO-함유 리간드와 복합체화된 토륨 이온의 생성의 상대적 용이성을 개시하고 있다.
이전에 공지된 토륨에 대한 킬레이트화제는 또한 백본 질소에 부착된 산성 (예를 들어, 카르복시알킬) 기를 갖는 선형, 고리형 또는 분지형 폴리아자알칸 백본을 포함하는 폴리아미노폴리산 킬레이트화제를 포함한다. 이러한 킬레이트화제의 예는 DOTA 유도체 예컨대 p-이소티오시아네이토벤질-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (p-SCN-Bz-DOTA) 및 DTPA 유도체 예컨대 p-이소티오시아네이토벤질-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (p-SCN-Bz-DTPA)을 포함하고, 전자는 고리형 킬레이트화제이고, 후자는 선형 킬레이트화제이다.
1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산의 유도체는 이전에 예시되었지만, 표준 방법은 토륨을 DOTA 유도체로 킬레이트화하는데 용이하게 사용될 수 없다. DOTA 유도체를 금속과 함께 가열하면 킬레이트를 효과적으로 제공하지만, 종종 저수율이다. 리간드의 적어도 일부가 진행 중에 비가역적으로 변성되는 경향이 있다. 게다가, 비가역적 변성에 대한 그의 비교적 높은 감수성 때문에, 일반적으로 모든 가열 단계가 완료될 때까지 표적화 모이어티의 부착을 피하는 것이 필요하다. 이로써 알파-방출 토륨 동위원소의 붕괴 수명 동안에 수행되어야 하는 별도의 화학 단계 (모든 필요한 후처리 및 분리와 함께)가 추가된다. 명백하게, 알파-방출 물질을 이러한 방법으로 취급하지 않거나 또는 상응하는 폐기물을 필요 이상으로 많은 정도로 발생시키는 것은 바람직하지 않다. 게다가, 모든 시간이 이러한 제조 기간 동안 붕괴할 토륨의 일부인 접합체 폐기물을 제조하는데 소비된다.
모든 관점에서 본 발명의 주요 측면은 옥타덴테이트 리간드, 특히 4개의 HOPO 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 히드록시피리디논-함유 리간드의 사용이다. 이러한 리간드는 전형적으로 각각 독립적으로 하기 화학식 I의 치환된 피리딘 구조를 갖는 적어도 4개의 킬레이트화 기를 포함할 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00002
여기서 R1은 알킬 기 예컨대 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필 및 n-, sec- 이소- 또는 tert-부틸을 포함한 C1 내지 C5 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기이다. 바람직한 R1은 C1 내지 C3, 특히 메틸이다. 하나의 바람직한 실시양태에서 메틸 치환기는 화학식 I의 모든 4개의 모이어티의 질소 상에 존재한다.
본원에 지칭된 알킬 기는 전형적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C8 알킬 기 예컨대 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, n-, 이소-tert- 또는 sec-부틸 등이다.
특정의 이전의 개시내용, 예컨대 WO2013/167756, WO2013/167755 및 WO2013/167754에서 R1에 상응하는 기는 주로 가용화 기 예컨대 히드록시 또는 히드록시알킬 (예를 들어 -CH2OH, -CH2-CH2OH, -CH2-CH2-CH2OH 등)이었다. 이것은 보다 높은 용해도의 면에서 특정 이점을 갖지만, 이러한 킬레이트화제는 R1 위치에서의 반응성 때문에 아미드 결합을 사용하는 표적화 모이어티에 연결하기가 어렵다. 본 발명에서, 따라서, R1은 일반적으로 히드록실 또는 히드록시알킬이 아니다.
화학식 I에서, R2 내지 R6 기는 각각 독립적으로 H, OH, =O, 커플링 모이어티 및 링커 모이어티로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, R2 내지 R6 기 중 정확히 1개는 =O일 것이고 R2 내지 R6 기 중 정확히 1개는 OH 일 것이다. R2 내지 R6 기의 나머지 3개는 H일 수 있으나 적어도 R2 내지 R6 기 중 적어도 1개는 링커 모이어티 및/또는 커플링 모이어티일 것이다. 커플링 모이어티는 하기 본원에 기재되지만, 표적화 모이어티에 대한 아미드 결합에 의한 부착을 위한 카르복실산에서 종결한다. 이러한 커플링 모이어티는 R2 내지 R6 기 중 1개에서 고리에 직접적으로 부착할 수 있지만, 보다 바람직하게는 연결 모이어티에 부착할 것이고, 이는 그 자체로 R2 내지 R6 기 중 1개를 구성할 것이다.
N-치환된 3,2-HOPO 모이어티는 본 발명의 HOPO 기로서 고도로 바람직하고, 한 실시양태에서 옥타덴테이트 리간드의 모든 4개의 복합체화 모이어티는 3,2-HOPO 모이어티일 수 있다.
적합한 킬레이트화 모이어티는 US 5,624,901 (예를 들어 실시예 1 및 2) 및 WO2008/063721 (둘 다 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 형성될 수 있다.
바람직한 킬레이트화 기는 하기 화학식 II의 것들을 포함한다:
<화학식 II>
Figure pct00003
상기 화학식 II에서, =O 모이어티는 피리딘 고리의 임의의 탄소에 부착된 옥소-기를 나타내고, -OH는 피리딘 고리의 임의의 원자에 부착된 히드록시 모이어티를 나타내고, -RL은 히드록시피리디논 모이어티를 다른 복합체화 모이어티에 부착시켜 전반적인 옥타덴테이트 리간드를 형성하도록 하는 링커 모이어티를 나타낸다. 본원에 기재된 임의의 링커 모이어티는, 짧은 히드로카르빌 기, 예컨대, 모든 토폴로지의 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및/또는 헥실 기를 포함한 C1 내지 C8 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함한 C1 내지 C8 히드로카르빌 기를 포함한 RL로서 적합하다. RL은 피리딘 고리의 임의의 탄소에서 화학식 II의 고리를 연결할 수 있다. 이어서 RL 기는 차례로 또 다른 킬레이트화 모이어티에, 또 다른 링커 기 및/또는 중심 원자 또는 기, 예컨대 고리 또는 다른 템플레이트 (본원에 기재된 바와 같음)에 직접 결합할 수 있다. 링커, 킬레이트화 기 및 임의적인 템플레이트 모이어티는 적절한 옥타덴테이트 리간드를 형성하도록 선택된다.
RC는 하기 논의된 바와 같이, 커플링 모이어티를 나타낸다. 적합한 모이어티는 카르복실산 기에서 종결하는 히드로카르빌 기 예컨대 알킬 또는 알케닐 기를 포함한다. 본 발명자들에 의해, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 아미드를 형성하기 위한 카르복실산 연결 모이어티의 사용은 킬레이트화제와 조직-표적화 모이어티 사이에 보다 안정한 접합을 제공한다는 것을 확립된 바 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서 화학식 II의 -OH 및 =O 모이어티는 피리딘 고리에 인접한 원자 상에 위치하여, 예컨대 2,3-; 3,2-; 4,3-; 및 3,4-히드록시피리디논 유도체가 모두 고도로 적합하도록 한다. 기 RN은 메틸 치환기이다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 4개의 3,2- 히드록시피리디논 모이어티는 옥타덴테이트 리간드 구조에 존재한다.
보다 바람직한 킬레이트화 기는 화학식 IIa의 것들이다.
<화학식 IIa>
Figure pct00004
본원에 사용된 용어 "링커 모이어티" (화학식 II 및 화학식 IIa에서 RL)는 본 발명의 다양한 측면의 주요 성분을 형성하는 옥타덴테이트 리간드에서 적어도 2개의 킬레이트화 기를 연결하는 역할을 하는 화학 물질을 제시하는데 사용된다. 링커 모이어티는 또한 조직 표적화 모이어티에 옥타덴테이트 리간드 부분을 커플링시키는 역할을 하는 커플링 모이어티에 연결될 수 있다. 전형적으로, 각각의 킬레이트화 기 (예를 들어 상기 화학식 I 및/또는 II 및/또는 IIa의 것)는 두자리일 것이고 따라서 4개의 HOPO 킬레이트화 기가 전형적으로 리간드에 존재할 것이다. 이러한 킬레이트화 기는 그의 링커 모이어티에 의해 서로에 연결되고, 커플링 모이어티에 의해 (본 발명의 방법에서) 조직-표적화 모이어티에 커플링된다. 따라서, 링커 모이어티 (예를 들어 화학식 II의 기 RL)는 화학식 I 및/또는 II의 1개 초과의 킬레이트화 기 사이에서 공유될 수 있다. 링커 모이어티는 또한 옥타덴테이트 리간드 및 표적화 모이어티의 복합체화 부분 사이에 부착 지점으로서 역할을 할 수 있다. 이러한 경우, 적어도 1개의 링커 모이어티는 커플링 모이어티 (화학식 II의 RC)에 연결될 것이다. 적합한 링커 모이어티는 짧은 히드로카르빌 기, 예컨대 모든 토폴로지의 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및/또는 헥실 기를 포함한 C1 내지 C12 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함한 C1 내지 C12 히드로카르빌 기를 포함한다. 링커 모이어티 (RL)에 포함될 수 있는 다른 기는 임의의 적합한 강건한 관능기 예컨대 아릴 기 (예를 들어 페닐 기), 아미드, 아민 (특히 2급 또는 3급) 및/또는 에테르를 포함한다. RC 모이어티는 또한 알킬 및/또는 아릴 섹션 및 임의의 기 예컨대 아민, 아미드 및 에테르 연결을 포함한다. 일반적으로 커플링 모이어티의 모든 성분은 복합체가 적용될 것인 저장 상태에 강건할 필요가 있을 것이다. 이는 알파-방사선분해를 포함하고 따라서 불안정성 관능기는 바람직하지 않다.
한 실시양태에서, 커플링 모이어티는 말단 카르복실산, 적어도 1종의 알킬 부분 (예를 들어 메틸 또는 에틸 부분), 적어도 1종의 아미드 및 적어도 1종의 아릴 부분 (예를 들어 페닐 기)을 포함한다. 커플링 모이어티는 탄소-탄소 결합, 아미드, 아민 및/또는 에테르 연결에 의해 옥타덴테이트 리간드의 1개 이상의 링커 모이어티에 연결될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서 표적화 모이어티에 옥타덴테이트 리간드를 연결하는 커플링 모이어티 (RC)는 하기로 선택된다:
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
[-[CH2]1-3-Ar-N(H)-C(=O)-[CH2]1-5-C(=O)OH], 여기서 Ar은 방향족 기 예컨대 치환 또는 비치환된 페닐렌 기이고 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기이다.
링커 모이어티는 에스테르, 에테르, 아민 및/또는 아미드 기를 포함한 임의의 다른 적합하게 강건한 화학 결합일 수 있거나 그를 포함할 수 있다. 2개의 킬레이트화 모이어티를 연결하는 원자의 총수 (1개 초과의 경로가 존재할 경우 가장 짧은 경로에 의해 계수됨)는 일반적으로 한정되어 복합체 형성을 위한 적합한 배치에서 킬레이트화 모이어티를 강제하도록 할 것이다. 따라서, 링커 모이어티는 전형적으로 킬레이트화 모이어티 사이에 15개 이하의 원자, 바람직하게는, 1 내지 12개의 원자, 보다 바람직하게는 킬레이트화 모이어티 사이에 1 내지 10개의 원자를 제공하도록 선택될 것이다. 링커 모이어티가 2개의 킬레이트화 모이어티를 직접 연결하는 경우, 링커는 전형적으로 1 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 10개의 원자 길이 (예컨대 에틸, 프로필, n-부틸 등)가 될 것이다. 링커 모이어티가 중심 템플레이트에 연결되는 경우 (하기 참조)에 각각의 링커는 보다 짧아질 것이고 2개의 별개의 링커는 킬레이트화 모이어티를 연결한다. 1 내지 8개의 원자, 바람직하게는 1 내지 6개의 원자의 링커 길이는 이러한 경우에 바람직할 수 있다 (이들이 한쪽 말단 또는 둘 다에서 에스테르, 에테르 또는 아미드 결합을 갖는 기인 것과 같이 메틸, 에틸 및 프로필이 적합함).
주로 옥타덴테이트 리간드의 다양한 킬레이트화 기를 서로에 및/또는 중심 템플레이트에 연결하는 역할을 하는 링커 모이어티 이외에도, 옥타덴테이트 리간드는 말단 카르복실 기를 갖는 커플링 모이어티 (RC)를 추가로 포함한다. 커플링 모이어티의 기능은 안정한 공유 결합, 특히 아미드를 통해 옥타덴테이트 리간드를 표적화 모이어티에 연결하는 것이다. 바람직하게는 커플링 모이어티는 킬레이트화 기 중 1개에 대한 직접 공유 결합에 의해 또는 보다 전형적으로 링커 모이어티 또는 템플레이트에 대한 부착에 의해 킬레이트화 기에 공유 결합할 것이다. 2개 이상의 커플링 모이어티가 사용된다면, 각각은 예컨대 임의의 템플레이트, 링커 또는 킬레이트화 기 상의 임의의 이용가능한 부위에 부착될 수 있다.
한 실시양태에서, 커플링 모이어티는 하기 구조를 가질 수 있다.
Figure pct00005
여기서, R7은 가교 모이어티이고, 이는 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된 구성원이고; X는 아미드 또는 카르복실산 또는 동등한 관능기에 의해 연결된 표적화 모이어티이다. 바람직한 가교 모이어티는 적합한 링커 모이어티와 같이 본원에 제시된 그러한 기 모두를 포함한다.
바람직한 표적화 모이어티는 본원에 기재된 모든 것들을 포함하고 바람직한 반응성 X 기는 예를 들어, -COOH, -SH, -NHR 및 NHR에서의 R이 H이거나 본원에 기재된 임의의 짧은 히드로카르빌 기인 기를 포함한, 표적화 모이어티와 아미드 공유 연결 형성에 "카르복실산"의 역할을 할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 표적화 모이어티 상에의 부착에 고도로 바람직한 기는 리신 잔기의 엡실론-아민을 포함한다. 적합한 반응성 X 기의 비제한적 예는 N-히드록시숙시미딜에스테르, 이미도에스테르, 아실할리드, N-말레이미드, 및 알파-할로 아세틸을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서 가교 모이어티 R7은 치환된 아릴로 선택되고 표적화 모이어티에 옥타덴테이트 리간드를 연결하는 커플링 모이어티 (RC)는 [-C(=O)-CH2CH2-X-]로 선택되고, 여기서 HOPO 리간드 상의 유리 카르복실레이트 기는 표적화 모이어티의 접합 직전에 계내에서 수용액 중 N-히드록시숙신이미드 에스테르 형태로 활성화된다.
커플링 모이어티는 바람직하게는, 생성된 커플링된 옥타덴테이트 리간드가 안정한 금속 이온 복합체를 형성할 수 있도록 부착될 것이다. 따라서 커플링 모이어티는 바람직하게는 링커, 템플레이트 또는 킬레이트화 모이어티에 복합체화에 큰 지장을 주지 않는 부위에 연결될 것이다. 이러한 부위는 바람직하게는 링커 또는 템플레이트 상에, 보다 바람직하게는 표적에 결합하는 표면으로부터 먼 위치에 있게 될 것이다.
옥타덴테이트 리간드에서 화학식 I 또는 II 또는 IIa의 각각의 모이어티는 본원에 논의된 바와 같은 임의의 적절한 링커 기에 의해 및 임의의 적절한 토폴로지로 리간드의 잔여분에 연결될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I 및/또는 II 및/또는 IIa의 4개의 기는 그의 링커 기에 의해 백본에 연결되어 선형 리간드를 형성하도록 할 수 있거나, 또는 링커 기에 의해 브릿지되어 "올리고머" 유형 구조를 형성할 수 있고, 이는 선형 또는 고리형일 수 있다. 대안적으로, 화학식 I 및/또는 II 및/또는 IIa의 리간드 모이어티는 각각의 링커 (예를 들어 "RL" 모이어티)에 의해, "십자가" 또는 "별" 토포그래피로 중심 원자 또는 기에 연결될 수 있다. 링커 (RL) 모이어티는 단독으로 탄소-탄소 결합을 통해 연결되거나, 아민, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오-에테르 또는 디술피드 결합을 포함한 임의의 적절하게 강건한 관능기에 의해 서로에, 다른 킬레이트화 기에, 백본에, 템플레이트에, 커플링 모이어티에 또는 다른 링커에 부착될 수 있다.
"별모양" 배열은 하기 화학식 III으로 제시된다.
<화학식 III>
Figure pct00006
여기서, 모든 기 및 위치는 상기 제시된 바와 같고 "T"는 추가적으로 중심 원자 또는 템플레이트 기, 예컨대 탄소 원자, 히드로카빌 쇄 (예컨대 상기 본원에 기재된 것 중 임의의 것), 지방족 또는 방향족 고리 (헤테로시클릭 환 포함) 또는 융합된 고리계이다. 가장 기본적인 템플레이트는 단일 탄소일 것이고, 그 다음 이는 그의 연결기에 의해 킬레이트화 모이어티의 각각에 부착될 것이다. 보다 긴 쇄, 예컨대 에틸 또는 프로필은 템플레이트의 각 말단에 부착하는 2개의 킬레이트화 모이어티와 동일하게 실행가능하다. 분명하게, 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드, 티오-에테르 또는 디술피드 결합을 포함한 임의의 적합하게 강건한 결합을 사용하여 템플레이트와 링커 모이어티를 연결할 수 있다.
분명하게, 화학식 II, III, IV 및 IVb의 구조에서, (예를 들어 링커 또는 커플링 모이어티에 의해) 달리 치환되지 않은 피리딘 고리(들)의 그러한 위치는, 적절한 경우에, 화학식 I에서의 R1 내지 R5에 대해 기재된 치환기를 함유할 수 있다. 특히, 작은 알킬 치환기, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필 기는 임의의 위치에서 존재할 수 있다.
옥타덴테이트 리간드는 상기 기재된 바와 같은 적어도 1개의 커플링 모이어티를 추가로 포함할 것이다. 이는 본원에 제시된 임의의 것들을 포함한 임의의 적합한 구조일 수 있고, 본 발명의 방법의 최종 복합체에서 또는 카르복실산에서, 표적화 모이어티로 종결할 것이다.
커플링 모이어티는 링커, 템플레이트 또는 킬레이트화 모이어티의 임의의 적합한 지점에, 예컨대 화학식 III에 제시된 바와 같은 지점 a, b 및/또는 c에 부착될 수 있다. 커플링 모이어티의 부착은 임의의 적합하게 강건한 결합, 예컨대 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드, 티오-에테르 또는 디술피드 결합에 의해서일 수 있다. 유사하게, 표적화 모이어티에 임의의 이러한 연결을 형성할 수 있는 기는 커플링 모이어티의 관능성 말단에 적합하고 그러한 모이어티는 표적화 부분에 부착될 경우에 이러한 기로 종결할 것이다.
대안적으로, "백본" 유형 구조는 하기 화학식 IV로 제시된다.
<화학식 IV>
Figure pct00007
여기서 모든 기 및 위치는 상기 제시된 바와 같고, "RB"는 추가적으로 백본 모이어티이고, 이는 전형적으로 본원에 제시된 링커 모이어티 중 임의의 것과 유사한 구조 및 기능일 것이고, 따라서 링커 모이어티의 임의의 정의는 맥락이 허용하는 경우에 취해져 백본 모이어티에 적용될 수 있다. 적합한 백본 모이어티는 킬레이트화 모이어티가 그의 링커 기에 의해 부착된 스캐폴드를 형성할 것이다. 통상적으로 3 또는 4개의 백본 모이어티가 필요하다. 전형적으로 이는 선형 백본의 경우에 3개 또는 백본이 고리화된 경우에 4개일 것이다. 특히 바람직한 백본 모이어티는 한쪽 또는 양쪽 말단에 헤테로원자 또는 관능성 모이어티를 임의로 갖는 짧은 탄화수소 쇄 (예컨대 본원에 기재된 것들)를 포함한다. 아민 및 아미드 기가 이와 관련하여 특히 적합하다.
커플링 모이어티는 링커, 백본 또는 킬레이트화 모이어티의 임의의 적합한 지점에, 예컨대 화학식 IV에 제시된 바와 같은 지점 a, b 및/또는 c'에서 부착될 수 있다. 커플링 모이어티의 부착은 임의의 적합한 강건한 결합, 예컨대 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드, 티오-에테르 또는 디술피드 결합에 의해서일 수 있다. 유사하게, 표적화 모이어티에 대한 임의의 이러한 결합을 형성할 수 있는 기는 커플링 모이어티의 관능성 말단에 적합하고 그러한 모이어티는 표적화 부분에 부착될 경우 이러한 기로 종결할 것이다.
아미드 링커 기에 의해 백본에 부착된 4개의 3,2-HOPO 킬레이트화 모이어티를 갖는 "백본" 유형 옥타덴테이트 리간드의 예는 하기 화학식 V일 것이다.
<화학식 V>
Figure pct00008
명백하게, 커플링 모이어티 RC는 이러한 분자 상의 임의의 적합한 지점에, 예컨대 2급 아민 기 중 1개에 또는 임의의 백본 알킬 기 상의 분지 지점에 첨가될 수 있다. 기 RC에 대한 바람직한 부위는 화학식 V에 제시되어 있다. RC는 카르복실산에서 종결하거나, 본 발명의 적절한 측면에서 조직-표적화 모이어티에 아미드 연결에 의해 연결될 것이다. 모든 작은 알킬 기 예컨대 백본 프로필렌 또는 n-치환된 에틸렌 기는 다른 작은 알킬렌 예컨대 본원에 기재된 것 중 임의의 것들 (그들 중 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 및 부틸렌이 고도로 적합함)로 치환될 수 있다.
각각 에틸 아미드 기에 의해 에틸 및 프로필 디아민에 각각 연결된 4개의 3,2-HOPO 킬레이트화 모이어티를 갖는, 예시적인 "템플레이트된" 옥타덴테이트 리간드는 하기 화학식 VI일 것이다.
<화학식 VI>
Figure pct00009
명백하게, 에틸렌 모이어티로서 화학식 VI에 제시된 임의의 알킬렌 기는 다른 작은 알킬렌 기 예컨대 메틸렌, 프로필렌 또는 n-부틸렌으로 독립적으로 치환될 수 있다. 대칭이 유지되어 중심 프로필렌 C3 쇄가 다른 에틸렌 기가 남는 동안 바람직하거나, 또는 HOPO 모이어티를 하나 또는 양쪽의 중심 3급 아민에 연결하는 2개의 에틸렌은 메틸렌 또는 프로필렌으로 대체될 수 있는 것이 유익하다.
화학식 VIb는, 화학식 VI에서 임의의 적합한 위치, 예컨대 -CH- 기에 존재할 것인 커플링 모이어티 RC에 대한 가능한 위치를 제시한다.
상기 제시된 바와 같이, 옥타덴테이트 리간드는 전형적으로 임의의 지점에서 리간드의 나머지에 연결될 수 있는 커플링 모이어티를 포함할 것이다. 커플링 모이어티 부착을 위한 적합한 지점은 하기 화학식 VIb에서 제시되어 있다:
<화학식 VIb>
Figure pct00010
여기서 RC는 특히 아미드 기를 통해 조직 표적화 기에의 부착을 위한, 임의의 적합한 커플링 모이어티이다. 조직 표적화 모이어티에 아미드를 형성하기 위한 산 또는 동등한 활성 기에서 종결하는 짧은 히드로카르빌 기 예컨대 C1 내지 C8 시클릭, 분지형 또는 직쇄 방향족 또는 지방족 기는 화학식 VIb 및 본원 전체에 걸쳐 기 RC로서 고도로 적합하다.
예시적인 템플레이트는 또한 다른 것을 포함하고 따라서 커플링 기 RC는 화학식 VII에 제시된 바와 같은 아미노 백본의 질소 원자에 공유 연결된다.
<화학식 VII>
Figure pct00011
리간드 부착을 위한 적합한 부위를 제시하는 고도로 바람직한 옥타덴테이트 리간드는 하기 화학식 VIII 및 IX의 것들을 포함한다:
<화학식 VIII>
Figure pct00012
<화학식 IX>
Figure pct00013
화합물 (VIII)의 합성은 하기 기재되어 있고, 하기 본원에 기재된 합성 경로를 따른다.
AGC0019, 및 화학식 VI, VIb, VII, VIII 및 IX의 화합물은 카르복실산 기에서 종결하는 링커 모이어티를 갖는 바람직한 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성한다. 또한 그러한 구조에 제시된 옥타덴테이트 리간드 및 제시된 링커 모이어티는 그의 유형의 바람직한 예를 형성하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 이러한 조합은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법의 단계 a)는 임의의 적합한 합성 경로에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로 이는 임의로 템플레이트에 의해, 커플링 모이어티에 연결기에 의해 4개의 HOPO 모이어티 (예컨대 화학식 I 및/또는 II 및 또는 IIa의 것들)를 연결하는 것을 수반할 것이다. 이들 기 모두는 본원에 기재되고 바람직한 실시양태는 이러한 맥락에서 동등하게 바람직하다. HOPO 모이어티, 링커, 커플링 모이어티, 및 임의로 템플레이트 사이의 커플링은 전형적으로 강건한 기 예컨대 아미드, 아민, 에테르 또는 탄소-탄소 결합에 의해서일 것이다. 이러한 결합의 합성 방법 및 임의의 필요한 보호 전략은 합성 화학 분야에 널리 공지되어 있다. 합성 방법의 일부 구체적 예는 하기에 하기 실시예에서 주어진다. 이러한 방법은 구체적 예를 제공하나, 그에 예시된 합성 방법은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적 맥락에서 사용가능할 것이다. 실시예에 예시된 방법은 따라서 맥락이 허용하는 경우에 본 발명의 모든 측면 및 실시양태에 적용가능한 일반적인 개시내용으로도 의도된다.
본 발명의 모든 측면에서 알파-방출 토륨과 옥타덴테이트 리간드의 복합체는, 60℃ 초과로 가열하지 않으면서 (예를 들어 50℃ 초과로 가열하지 않으면서), 바람직하게는 38℃ 초과로 가열하지 않으면서, 가장 바람직하게는 25℃ 초과로 가열하지 않으면서 (예컨대 20 내지 38℃ 범위에서) 형성되거나 또는 형성가능한 것이 바람직하다. 전형적인 범위는 예를 들어 15 내지 50℃ 또는 20 내지 40℃일 수 있다. 복합체화 반응 (본 발명의 방법에서 파트 c))은 임의의 합리적인 기간에 수행될 수 있으나, 이는 바람직하게는 1 내지 120분, 바람직하게는 1 내지 60분, 및 보다 바람직하게는 5 내지 30분일 것이다.
표적화 모이어티 및 옥타덴테이트 리간드의 접합체는 알파-방출 토륨 동위원소 (예를 들어 227Th4 + 이온)의 첨가 이전에 제조하는 것이 추가로 바람직하다. 따라서 본 발명의 생성물은, 바람직하게는 옥타덴테이트 리간드와 조직-표적화 모이어티 (조직-표적화 킬레이트화제)의 접합체에 의한 알파-방출 토륨 동위원소 (예를 들어 227Th4+ 이온)의 복합체화에 의해 형성되거나 또는 형성가능하다.
옥타덴테이트 킬레이트화제 (본원에 기재된 바와 같은 커플링 모이어티를 포함)를 통해 토륨 (예를 들어 토륨-227)에 연결될 수 있는 표적화 화합물의 다양한 유형. 표적화 모이어티는 공지된 표적화 기로부터 선택될 수 있고, 이는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 성장 인자, 펩티드, 호르몬 및 호르몬 유사체, 폴레이트 유도체, 비오틴, 아비딘 및 스트렙타비딘 또는 그의 유사체를 포함한다. 다른 가능한 표적화 기는 적합한 관능화 RNA, DNA, 또는 그의 단편 (예컨대 압타머), 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 지질 또는 단백질 등과 함께 또는 없이 이러한 기의 조합에 의해 제조된 화합물. PEG 모이어티는 예컨대 생물학적 체류 시간을 증가시키고/거나 면역 자극을 감소시키기 위해 상기에 제시된 바와 같이 포함될 수 있다.
일반적으로, 본원에 사용된, 조직 표적화 모이어티는 "펩티드" 또는 "단백질"일 것이고, 이는 2급 및 3급 구조적 특색과 함께 또는 없이 아미노산 성분 사이의 아미드 백본으로 주로 형성된 구조이다.
조직 표적화 모이어티는, 한 실시양태에서, 향골성 물질, 리포솜 및 폴레이트 접합된 항체 또는 항체 단편을 배제한다.
본 발명에 따르면 227Th는 본원에 기재된 바와 같이 조직-표적화 모이어티에 아미드 연결에 의해 연결되거나 또는 연결가능한 착물화제를 표적화함으로써 복합체화될 수 있다. 전형적으로 표적화 모이어티는 100 g/mol 내지 수백만 g/mol (특히 100 g/mol 내지 1백만 g/mol)의 분자량을 가질 것이고, 바람직하게는 질환-관련 수용체에 대한 친화성을 직접 가질 것이고/거나, 227Th를 투여하기에 앞서 질환에 대해 표적화된 바 있는 분자에 결합된 적합한 예비-투여된 결합제 (예를 들어 비오틴 또는 아비딘)를 포함할 것이다. 적합한 표적화 모이어티는 폴리- 및 올리고-펩티드, 단백질, DNA 및 RNA 단편, 압타머 등, 바람직하게는 단백질, 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 (IgG 및 IgM 유형 항체 포함), 또는 단백질 또는 단백질의 단편 또는 구축물의 혼합물을 포함한다. 항체, 항체 구축물, 항체의 단편 (예를 들어 Fab 단편 또는 적어도 1종의 항원 결합 영역(들)을 포함하는 임의의 단편), 단편의 구축물 (예를 들어 단일 쇄 항체) 또는 그의 혼합물이 특히 바람직하다. 적합한 단편은 특히 Fab, F(ab')2, Fab' 및/또는 scFv를 포함한다. 항체 구축물은 본원에 나타낸 임의의 항체 또는 단편의 것일 수 있다.
본 발명의 모든 측면에 적용가능한 제1 표적화 실시양태에서, 특이적 결합제 (조직 표적화 모이어티)는 CD22 수용체를 표적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조직 표적화 모이어티는 하기 제시된 적어도 1종의 서열과 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드일 수 있다:
경쇄:
Figure pct00014
중쇄:
Figure pct00015
상기 서열에서, 인간화 (H'ised) 서열에서 "-"는 잔기가 뮤린 서열로부터 미변화된 것을 나타낸다.
상기 서열 (SeqID1-5)에서, 볼드체 영역은 주요 특이적-결합 영역 (CDRs)인 것으로 여겨지고, 밑줄친 영역은 결합에서 2차적 중요한 것으로 여겨지고, 비강조 영역은 특이적 결합 영역보다는 구조를 나타내는 것으로 여겨진다.
본 발명의 모든 측면에서, 조직 표적화 모이어티는 SeqID1-5에 제시된 적어도 1종 또는 임의의 서열과 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 유사성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 실질적인 서열 동일성/유사성은 완전한 서열에 대해 적어도 80% 및/또는 특이적 결합 영역 (상기 서열에서 볼드체로 제시된 영역 및 임의로 밑줄친 섹션)에 대해 적어도 90%의 서열 유사성/동일성을 갖는 것으로서 여겨질 수 있다. 바람직한 서열 유사성 또는 보다 바람직하게는 동일성은 볼드체 영역에 대해 적어도 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%일 것이고, 바람직하게는 전체 서열에 대해서도 마찬가지이다. 서열 유사성 및/또는 동일성은 위스컨신 대학교로부터의 지네틱스 컴퓨터 그룹 버전 10(Genetics Computer Group Version 10) 소프트웨어 패키지의 "베스트피트(BestFit)" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 이 프로그램은 하기 디폴트 값으로 스미스 및 워터만의 로칼 핸드 알고리즘을 사용한다: 갭 생성 페널티=8, 갭 연장 패널티=2, 평균 매치=2.912, 평균 미스매치 2.003.
조직 표적화 모이어티는 1종 초과의 펩티드 서열을 포함할 수 있고, 이러한 경우에 적어도 1종, 및 바람직하게는 모든 서열은 (독립적으로) 임의의 SeqID1-5에 대한 상기 기재된 서열 유사성 및 바람직하게는 서열 동일성에 부합 수 있다.
조직 표적화 모이어티는 CD22에 대한 결합 친화도를 가질 수 있고, 한 실시양태에서 또한 전체 도메인에 대해 약 40개 이하의 변형을 갖는 서열을 가질 수 있다 (바람직하게는 0 내지 30개 변형). 변이체는 삽입, 결실 및/또는 치환에 의한 것일 수 있고, SeqID1-5에 대해 인접하거나 비-인접할 수 있다. 치환 또는 삽입은 전형적으로 유전자 코드의 20개의 아미노산 중 적어도 1개에 의한 것이고 치환은 가장 일반적으로 보존적 치환일 것이다.
본 발명의 모든 측면에 적용가능한 제2 표적화 실시양태에서, 특이적 결합제 (조직 표적화 모이어티)는 CD33 수용체를 표적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조직 표적화 모이어티는 모노클로날 항체일 수 있고, C-말단에 린투주맙 또는 여분의 리신 잔기를 갖는 린투주맙으로 선택될 수 있다.
본 발명의 모든 측면에 적용가능한 제3 표적화 실시양태에서, 특이적 결합제 (조직 표적화 모이어티)는 HER-2 항원을 표적화하도록 선택될 수 있다. 조직 표적화 모이어티는 모노클로날 항체일 수 있고, 바람직하게는 트라스투주맙이다.
FGFR2, 메소텔린 및 PSMA를 표적화하는 다른 적합한 항체 서열은 실시예 섹션에 예시된다. 그러나 서열에 리신 잔기를 함유하는 질환 특이적 표적을 표적화하는 것으로 공지된 임의의 단백질 포맷은 본 발명의 방법의 후보이고 상응하게는 다른 모든 측면에 적용가능한 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
알파-방출 토륨 성분과 관련하여, 특정 알파-방출성 토륨 동위원소 (예를 들어 227Th)를 치료상 유효하면서도 또한 허용되지 않는 골수독성을 발생시키지 않는 양으로 투여될 수 있다는 것이 주요 최근 발견이다. 토륨-227 (227Th)은 본 발명의 모든 측면에서 바람직한 토륨 동위원소이다. 본원에 사용된 용어 "허용가능하게 비-골수독성"은, 가장 중요하게는, 투여된 토륨-227 방사성동위원소의 붕괴에 의해 생성된 라듐-223의 양이 일반적으로 대상체에 직접적으로 치명적이기에는 불충분하다는 것을 나타내는데 사용된다. 그러나, 그러한 치료의 허용되는 부작용이 될 골수 손상의 양 (및 치사적 반응의 확률)는 치료되는 질환의 유형, 치료 요법의 목적, 및 대상체에 대한 예후에 따라 상당히 변할 것으로 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 바람직한 대상체는 인간이지만, 다른 포유동물, 특히 반려 동물 예컨대 개는 본 발명의 사용으로 이익을 가질 것이고 허용되는 골수 손상의 수준은 또한 대상체의 종을 반영할 수 있다. 허용되는 골수 손상의 수준은 일반적으로 비-악성 질환의 경우보다 악성 질환의 치료에서 더 클 것이다. 골수독성 수준의 하나의 널리 공지된 척도는 호중구 세포 계수이고, 본 발명에서, 허용가능하게 비-골수독성 양의 223Ra는 전형적으로 그의 가장 낮은 지점 (최저점)에서의 호중구 분율이 처리 전 계수의 10% 이상이 되도록 제어된 양일 것이다. 바람직하게는, 허용가능하게 비-골수독성 양의 223Ra는 호중구 세포 분율이 최저점에서 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%가 되도록 하는 양일 것이다. 적어도 40%의 최저점 호중구 세포 분율이 가장 바람직하다.
또한, 방사성 토륨 (예를 들어 227Th) 함유 화합물은, 줄기 세포 지지체 또는 필적할만한 회수 방법이 포함되는 경우에 생성된 라듐 (예를 들어 223Ra)의 골수독성이 통상적으로 허용될 수 없을 것인 고용량 요법에서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 호중구 세포 계수는 최저점에서 10% 미만으로 감소될 수 있고, 예외적으로 적합한 주의를 기울이고 후속적인 줄기 세포 지지체가 주어진다면, 5%까지, 또는 필요하다면 5% 미만까지 감소될 것이다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에서 특히 관심 대상인 토륨 동위원소는 토륨-227이고, 토륨-227은 맥락이 허용하는 경우에 본원에서 토륨에 대한 모든 지칭에 대해 바람직한 동위원소이다. 토륨-227은 비교적 제조하기가 쉽고 중성자 조사된 226Ra로부터 간접적으로 제조될 수 있고, 이는 227Th의 모핵종, 즉 227Ac (T1/2 = 22년)을 함유할 것이다. 악티늄-227은 상당히 용이하게 226Ra 표적에서 분리되고 227Th에 대한 발생기로서 사용될 수 있다. 이러한 과정은 필요하다면 공업적 규모로 규모화될 수 있고, 따라서 분자 표적화된 방사선 치료를 위한 후보로 고려되는 대부분의 다른 알파-방출체에서 나타나는 공급의 문제를 피할 수 있다.
토륨-227은 라듐-223을 통해 붕괴한다. 이러한 경우에, 1차 딸은 11.4일의 반감기를 갖는다. 순수한 227Th 공급원으로부터, 처음 수일 동안은 단지 약간 양의 라듐이 생성된다. 그러나, 223Ra로부터 알파 입자의 방출은 수명이 짧은 딸로부터 추가의 3개의 알파 입자가 수분 이내에 뒤따르므로, 223Ra의 잠재적 독성은 227Th의 것보다 높다 (토륨-227에 대한 붕괴 시리즈를 제시하는 하기 표 2 참조).
표 2
Figure pct00016
잠재적으로 유해한 붕괴 생성물을 생성시킨다는 부분적인 이유 때문에, 토륨-227 (T1/2 = 18.7일)은 알파 입자 요법을 위해 널리 고려된 바 없다.
가장 풍부하게 자연 발생하는 토륨 동위원소, 즉 토륨-232 (반감기 1010년 및 효과적으로 비방사성)의 토륨 복합체와 구별하기 위해, 본원에 청구된 토륨 복합체 및 조성물은 알파-방출 토륨 방사성동위원소 (즉 반감기가 103년 미만인 토륨의 동위원소 적어도 1종, 예를 들어 토륨-227)를 자연 상대 존재량보다 더 많이, 예를 들어 적어도 20% 더 많이 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 필요는 치료 유효량의 방사성 토륨, 예컨대 토륨-227을 명백하게 필요로 하는 본 발명의 방법의 정의에 영향을 미치지 않지만, 바람직하게는 모든 측면에 해당될 것이다.
본 발명의 모든 측면에서, 알파-방출 토륨 이온이 토륨-227의 이온인 것이 바람직하다. 토륨의 4+ 이온은 본 발명의 복합체에 사용하기 위한 바람직한 이온이다. 이에 따라, 토륨-227의 4+ 이온은 고도로 바람직하다.
토륨-227은 허용되지 않는 골수 억제를 일으킬 만큼 많은 라듐-223을 생성시키지 않고 바람직한 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 표적화된 영역에서 딸 동위원소를 유지하여 추가의 치료 효과를 그의 붕괴로부터 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 허용되지 않는 골수독성을 유도하지 않고 유용한 치료 효과를 갖도록 하기 위해 토륨 붕괴 생성물의 제어를 유지할 필요는 없다.
종양 세포 사멸 효과가 주로 토륨-227로부터이고 그의 딸로부터가 아닐 것이라고 가정한다면, 이러한 동위원소의 가능한 치료 용량은 다른 알파 방사체와의 비교에 의해 확립될 수 있다. 예를 들어, 아스타틴-211의 경우, 동물에서의 치료 용량은 전형적으로 kg당 2-10 MBq인 바 있다. 반감기 및 에너지에 대해 보정함으로써, 토륨-227에 대한 상응하는 투여량은 체중 1 kg당 적어도 36-200 kBq가 될 것이다. 이는 치료 효과를 기대하여 유용하게 투여될 수 있는 227Th 양의 하한치를 설정할 것이다. 이러한 계산은 아스타틴과 토륨의 필적할 만한 보유를 가정한다. 그러나, 명백하게, 토륨의 18.7일의 반감기로 인해 필시 이 동위원소는 그 붕괴 이전에 더 많은 제거를 생성할 가능성이 가장 클 것이다. 따라서 이러한 계산된 투여량은 통상적으로 최소 유효량으로 간주되어야 한다. 완전히 보유된 227Th (즉, 신체로부터 제거되지 않는 227Th)로 환산된 치료 용량은 전형적으로 적어도 18 또는 25 kBq/kg, 바람직하게는 적어도 36 kBq/kg, 및 보다 바람직하게는 적어도 75 kBq/kg, 예를 들어 100 kBq/kg 이상일 것이다. 토륨의 양이 많을수록 더 큰 치료 효과를 가질 것으로 기대될 것이지만, 허용되지 않는 부작용을 초래하는 경우에는 투여될 수가 없다. 마찬가지로, 토륨이 짧은 생물학적 반감기 (즉 여전히 토륨을 보유하는 신체로부터 제거되기 전 반감기)를 갖는 형태로 투여될 경우에는, 많은 토륨이 붕괴되기 전에 제거될 것이므로 방사성동위원소의 더 많은 양이 치료 효과를 위해 필요할 것이다. 그러나, 생성되는 라듐-223의 양의 상응하는 감소가 있을 것이다. 동위원소가 완전히 보유될 경우에 투여되는 토륨-227의 상기 양은 보다 짧은 생물학적 반감기를 갖는 동등한 용량과 용이하게 관련될 수 있다. 이러한 계산은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 WO 04/091668 (예를 들어, 실시예 1 및 2의 본문에)에 제공되어 있다.
방사성 표지된 화합물이 딸 핵종을 방출하는 경우에는, 적용가능하다면 임의의 방사성 딸 핵종(들)의 운명을 아는 것이 중요하다. 227Th를 사용하면, 주요 딸 생성물은 223Ra이고, 이는 그의 향골 특성 때문에 임상 평가 단계에 있다. 라듐-223은 혈액을 매우 신속하게 정제하며 골격에서 농축되거나 소장 및 신장 경로를 통해 분비된다 (문헌 [Larsen, J Nucl Med 43 (5, Supplement): 160P (2002) 참조]). 따라서 227Th로부터 생체내에 방출된 라듐-223은 건강한 연부 조직에 크게 영향을 주지 않을 수 있다. 용해된 시트레이트 염으로서 227Th의 분포에 대한 뮐러에 의한 연구 (Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971))에서, 연부 조직에서의 227Th로부터 생성된 223Ra는 골에 용이하게 재분포되거나 또는 분비되었음이 밝혀졌다. 따라서 특히 골수에 대한, 알파 방출 라듐의 공지된 독성은, 토륨 투여량과 함께 이슈가 될 것이다.
WO 04/091668에서 처음으로 사실상, 인간 대상체에서 적어도 200 kBq/kg의 223Ra의 용량이 투여되고 용인될 수 있는 것으로 입증되었다. 이들 데이터는 그 공보에 기재되어 있다. 따라서, 정말 예기치않게, 그러한 대상체가 심각하거나 심지어는 치명적인 골수독성의 허용될 수 없는 위험으로 고통받을 것이 예상되지 않고 포유동물 대상체에게 치료상 유효량의 227Th (예컨대 36 kBq/kg을 초과하는)가 투여될 수 있는 치료 범위가 존재함을 이제 알 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 치료 범위의 최선의 사용이 극히 중요하고 따라서 방사성 토륨을 신속하고 효율적으로 복합체화하고, 매우 고친화도를 보유하여 용량의 가능한 가장 큰 비율을 표적 부위에 전달하도록 하는 것이 필수적이다.
227Th 의약품으로부터 생성된 223Ra의 양은 방사성 표지된 화합물의 생물학적 반감기에 의존할 것이다. 이상적인 상황은 종양 세포 내로의 내재화, 강력한 종양 보유 및 정상의 조직에서의 짧은 생물학적 반감기를 포함한 신속한 종양 흡수를 갖는 복합체를 사용하는 것일 것이다. 그러나 223Ra의 용량이 용인될 수 있는 수준 내에서 유지되는 한, 이상적인 생물학적 반감기보다 작은 반감기를 갖는 복합체가 유용할 수 있다. 생체내에서 생성되는 라듐-223의 양은 투여되는 토륨의 양 및 토륨 복합체의 생물학적 체류 시간의 요인이 될 수 있다. 임의의 특별한 경우에 생성되는 라듐-223의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 227Th의 최대 투여가능한 양은 생체내에서 생성되는 라듐의 양에 의해 결정될 것이고, 허용되지 않는 수준의 부작용, 특히 골수독성을 일으킬 양보다 적어야 한다. 이 양은 일반적으로 300kBq/kg 미만, 특히 200 kBq/kg 미만, 보다 바람직하게는 170 kBq/kg 미만 (예를 들어 130 kBq/kg 미만)일 것이다. 최소 유효 용량은 토륨의 세포독성, 생성된 알파 조사에 대한 이환 조직의 감수성 및 토륨이 표적화 복합체 (이 경우 리간드와 표적화 모이어티의 조합물임)에 의해 효율적으로 조합되고, 보유되고 전달되는 정도에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 방법에서, 토륨 복합체는 18 내지 400 kBq/kg 체중, 바람직하게는 36 내지 200 kBq/kg (예컨대 50 내지 200 kBq/kg), 보다 바람직하게는 75 내지 170 kBq/kg, 특히 100 내지 130 kBq/kg의 토륨-227 투여량으로 바람직하게 투여된다. 상응하게, 단일 투여량은 대략 임의의 이들 범위에 적합한 체중, 예컨대 30 내지 150 Kg, 바람직하게는 40 내지 100 Kg (예를 들어 용량당 540 kBq 내지 4000 KBq의 범위 등)을 곱한 것을 포함할 수 있다. 토륨 투여량, 착물화제 및 투여 경로는, 생체내에서 생성되는 라듐-223 투여량이 300 kBq/kg 미만, 보다 바람직하게는 200 kBq/kg 미만, 보다 더 바람직하게는 150 kBq/kg 미만, 특히 100 kBq/kg 미만이 되도록 하는 것이 보다 바람직할 것이다. 다시, 이는 이들 범위에 제시된 임의의 체중을 곱하여 제시된 223Ra에 대한 노출을 제공할 것이다. 상기 용량 수준은 바람직하게는 227Th의 완전히 보유된 용량이지만 일부 227Th는 그것이 붕괴되기 전에 신체로부터 정제될 것을 고려한 투여 용량일 수 있다.
227Th 복합체의 생물학적 반감기가 물리적 반감기에 비해 짧은 경우 (예를 들어 7일 미만, 특히 3일 미만)에는, 동등한 보유된 용량을 제공하기 위해 상당히 더 많은 용량이 필요할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 150 kBq/kg의 완전히 보유된 용량은 711 kBq/kg의 용량으로 투여된 5일의 반감기를 갖는 복합체에 해당한다. 임의의 적절한 보유된 용량에 대해 동등한 투여된 용량이 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 복합체의 생물학적 정제 속도로부터 계산될 수 있다.
1개의 227Th 핵의 붕괴가 1개의 223Ra 원자를 제공하므로, 227Th의 보유 및 치료적 활성은 환자가 겪는 223Ra 용량에 직접 관련될 것이다. 임의의 특별한 상황에서 생성된 223Ra의 양은 널리 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 따라서 (본원에 기재된 바와 같이)포유동물 대상체에 질환의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상체에게 본원에 기재된 바와 같이 적어도 1종의 조직-표적화 토륨 복합체의 치료상 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.
대상체의 223Ra 딸 동위원소에 대한 노출을 최소화하는 것이, 이러한 특성이 유용하게 사용되지 않는 한, 분명히 바람직하다. 특히, 생체내에서 생성된 라듐-223의 양은 전형적으로 40 kBq/kg보다 많고, 예를 들어 60 kBq/Kg보다 많을 것이다. 일부 경우에, 생체내에서 생성된 223Ra가 80 kBq/kg보다 많고, 예를 들어 100 또는 115 kBq/kg보다 많을 필요가 있을 것이다.
적절한 담체 용액 중 토륨-227 표지된 접합체는 정맥내로, 강내 (예를 들어 복강내로), 피하로, 경구로 또는 국소로, 단일 적용으로서 또는 분할된 적용 요법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 표적화 모이어티에 접합된 복합체는 비경구 (예를 들어 경피) 경로, 특히 정맥내로 또는 강내 경로에 의해 용액으로서 투여될 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 멸균 용액으로 제제화될 것이다.
본 발명의 방법 및 생성물에서 토륨-227은 단독으로 사용되거나, 수술, 외부 빔 방사선 요법, 화학요법, 다른 방사성핵종, 또는 조직 온도 조정 등을 포함하는 다른 치료 양식과 병용될 수 있다. 이는 본 발명의 방법의 추가의 바람직한 실시양태를 형성하고 제제/의약은 상응하게 1종 이상의 추가의 치료 활성제, 예컨대 또 다른 방사성 작용제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다.
하나의 특히 바람직한 실시양태에서 대상체는 또한 라듐-223 유도된 골수독성의 효과를 감소시키기 위한 줄기 세포 치료 및/또는 다른 지지 요법을 받는다.
본 발명의 토륨 (예를 들어 토륨-227) 표지된 분자는 질환-관련된 수용체를 표적화함으로써 암성 또는 비-암성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 전형적으로, 227Th의 이러한 의학적 용도는 암성 또는 비-암성 질환의 치료를 위해 227Th를 킬레이트화제에 의해 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편의 구축물에 연결하는 것을 기초로 하는 방사선면역요법에 의한 것일 것이다. 본 발명에 따르는 방법 및 의약품에서의 227Th의 사용은 암종, 육종, 림프종 및 백혈병, 특히 폐암, 유방암, 전립선암, 방광암, 신장암, 위암, 췌장암, 식도암, 뇌암, 난소암, 자궁암, 구강암, 대장암, 흑색종, 다발성 골수종 및 비-호지킨 림프종을 포함한 임의의 형태의 암의 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 연부 조직 및 골격 질환을 둘 다 갖는 환자는 227Th에 의해도 및 투여된 토륨에 의해 생체내에서 생성되는 223Ra에 의해서도 치료될 수 있다. 이러한 특히 유리한 측면에서, 치료에 대한 별도의 치료적 성분은 골격 질환의 표적화에 의해 223Ra의 허용가능하게 비-골수독성인 양으로부터 유래된다. 이러한 치료 방법에서, 227Th는 전형적으로, 원발성 및/또는 전이 연부 조직 암을 그에 대한 적합한 표적화에 의해 치료하는데 사용되고 227Th의 붕괴로부터 생성되는 223Ra는 동일 대상체에서 관련된 골격 질환을 치료하는데 사용된다. 상기 골격 질환은 원발성 연부 조직 암으로부터 초래되는 골격으로의 전이일 수 있거나, 연부 조직 치료가 전이 암을 대항하는 원발성 질환일 수 있다. 때때로 연부 조직 및 골격 질환은 관련이 없을 수도 있다 (예를 들어 환자에 있어서 류마티스성 연부 조직 질환과 함께 골격 질환의 추가의 치료).
본 발명의 방법, 용도 및 다른 측면에서의 치료에 특히 적합한 상태는, 신생물성 및 과형성 질환 예컨대 비-호지킨 림프종 또는 B-세포 신생물, 유방암, 자궁내막암, 위암, 급성 골수성 백혈병, 전립선암 또는 뇌암, 중피종암, 난소암, 폐암 또는 췌장암을 포함한, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 또는 혼합형 암을 포함한다
하기에 일부 합성 실시예가 제공된다. 이들 합성에 제시된 단계는 본 발명의 많은 실시양태에 적용가능할 것이다. 예를 들어, 단계 a)는 본원에 기재된 많은 또는 모든 실시양태에서, 하기 제시된 중간체 AGC0021를 통해 진행될 수 있다.
주요 중간체 AGC0020의 합성
N,N,N',N'-테트라키스(2-아미노에틸)-2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디아민
Figure pct00017
a) 디메틸말로네이트, 수소화나트륨, THF, b) DIBAL-H, THF, c) MsCl, NEt3, CH2Cl2, d) 이미다졸, Boc2O, CH2Cl2, 톨루엔, e) DIPEA, 아세토니트릴, f) MeOH, 물, AcCl
주요 중간체 AGC0021의 합성
3-(벤질옥시)-1-메틸-4-[(2-티옥소-1,3-티아졸리딘-3-일)카르보닐]피리딘-2(1H)-온
Figure pct00018
a) 디메틸말로네이트, 칼륨 에톡시드, 톨루엔, EtOH, b) Pd/C, p-크실렌, c) MeI, K2CO3, DMSO, 아세톤, d) i)BBr3, DCM, ii)BnBr, K2CO3, KI, 아세톤, e) NaOH, 물, MeOH, f)
Figure pct00019
, DCC, DMAP, DCM
화학식 VIII의 화합물의 킬레이트의 합성
4-{[4-(3-[비스(2-{[(3-히드록시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-일)카르보닐]아미노}에틸)아미노]-2-{[비스(2-{[(3-히드록시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-일)카르보닐]아미노}에틸)아미노]메틸}프로필)페닐]아미노}-4-옥소부탄산
Figure pct00020
본 발명의 복합체의 형성 방법에서, 옥타덴테이트 킬레이트화제와 조직 표적화 모이어티 사이의 커플링 반응은 수용액 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 이것은 여러 이점을 갖는다. 첫째로, 그것은 허용되는 수준 아래의 모든 용매를 제거하고 그 제거를 인증해야하는 제조업체의 부담을 제거한다. 둘째로 그것은 폐기물을 감소시키고 가장 중요하게는 분리 또는 제거 단계를 피함으로써 생산 속도를 가속한다. 본 발명의 방사성제약의 맥락에서, 방사성동위원소는 내내 붕괴할 것이고 제조에서 소비한 시간은 가치있는 물질을 낭비하고 오염 딸 동위원소를 도입하기 때문에 합성을 가능한 한 신속하게 수행하는 것이 중요하다.
적합한 수용액은 정제수 및 완충제 예컨대 임의의 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 완충제를 포함한다. 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 (예를 들어 PBS) 및 술포네이트 완충제 (예컨대 MES)는 널리 공지된 수성 완충제의 전형적인 예이다.
한 실시양태에서, 방법은 (본원 전체에 걸쳐 기재되는 바와 같은) 옥타덴테이트 히드록시피리디논-함유 리간드의 제1 수용액 및 (본원 전체에 걸쳐 기재되는) 조직 표적화 모이어티의 제2 수용액을 형성하고 상기 제1 및 상기 제2 수용액을 접촉시키는 것을 포함한다.
적합한 커플링 모이어티는 상기에 상세히 논의되고 커플링 및/또는 연결기로 본원에서 논의되는 모든 기 및 모이어티는 리간드에 표적화 모이어티를 커플링시키는 것에 적절하게 사용될 수 있다. 일부 바람직한 커플링 기는 아미드, 에스테르, 에테르 및 아민 커플링 기를 포함한다. 에스테르 및 아미드는 카르복실산으로부터의 활성화된 에스테르 기의 생성으로 편리하게 형성될 수 있다. 이러한 카르복실산은 표적화 모이어티에, 커플링 모이어티 및/또는 리간드 모이어티에 존재할 수 있고, 전형적으로 에스테르 또는 아미드를 형성하기 위해 알콜 또는 아민과 반응한다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, N-히드록시 말레이미드, 카르보디이미드 및/또는 아조디카르복실레이트 활성화 시약 예컨대 DCC, DIC, EDC, DEAD, DIAD 등을 포함한 널리 공지된 활성화 시약을 이용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, N-위치에서 C1-C3 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제는 적어도 1종의 커플링 시약 및 활성화제 예컨대 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 활성화시켜 (본원에 기재된 임의의 것과 같음) 옥타덴테이트 킬레이트화제의 NHS 에스테르를 형성할 수 있다. 이러한 활성화된 (예를 들어 NHS) 에스테르는 유리 아민 기 (예컨대 리신 측쇄 상에)를 갖는 임의의 조직 표적화 모이어티에 커플링을 위해 분리되거나 또는 분리 없이 사용된다. 다른 활성화된 에스테르는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 효과적 이탈기, 예컨대 플루오린화 기, 토실레이트, 메실레이트, 아이오다이드 등의 임의의 에스테르일 수 있으나, NHS 에스테르가 바람직하다.
커플링 반응은 바람직하게는 비교적 단기간 및 주위 온도에서 수행된다. 1-단계 또는 2-단계 커플링 반응을 위한 전형적 기간은 약 1 내지 240분, 바람직하게는 5 내지 120분, 보다 바람직하게는 10 내지 60분일 것이다. 커플링 반응을 위한 전형적 온도는 0 내지 90℃, 바람직하게는 15 내지 50℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃일 것이다. 대략 25℃ 또는 약 38℃가 적절하다.
표적화 모이어티로의 옥타덴테이트 킬레이트화제의 커플링은 전형적으로 표적화 모이어티의 결합 능력에 불리하게 (또는 적어도 비가역적으로) 영향 미치지 않는 조건 하에 수행될 것이다. 결합제는 일반적으로 펩티드 또는 단백질 기반 모이어티이므로, 이것은 2차/3차 구조의 변성 또는 손실을 피하기 위해 비교적 온화한 조건이 필요하다. 수성 상태 (본원의 모든 맥락에서 논의된 바와 같은)가 바람직하고, pH 및/또는 산화환원의 극단을 피하는 것이 바람직할 것이다. 단계 b)는 따라서 pH 3 내지 10, 바람직하게는 4 내지 9, 보다 바람직하게는 4.5 내지 8에서 수행될 것이다. 산화환원의 관점에서 중성인, 또는 공기 중에서의 산화를 피하기 위해 매우 온화하게 환원되는 조건이 바람직할 수 있다.
본 발명의 모든 측면에 적용가능한 바람직한 조직-표적화 킬레이트화제는 본원에 기재된 바와 같이 AGC0018이다. 227Th 이온을 갖는 AGC0018의 복합체는 본 발명의 복합체의 바람직한 실시양태 및 상응하는 제제, 용도, 방법 등을 형성한다. 본 발명의 이러한 모든 측면에서 사용가능한 다른 바람직한 실시양태는 CD22 수용체, FGFR2, 메소텔린, HER-2, PSMA 또는 CD33 중 임의의 것에 결합 친화도를 갖는 모노클로날 항체를 포함한, 조직 표적화 모이어티에 접합된 AGC0019의 227Th 복합체 (본원에 기재된 바와 같은)을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 용액 중 항체 접합체 AGC1118에 대한 EDTA/PABA의 안정화 효과를 입증하는 데이터.
도 2: 10 kGy의 방사선량으로 조사된 항체 HOPO 접합체를 함유하는 상이한 완충제의 과산화수소 수준에 대한 영향.
도 3: 대략 8000 Bq/μg까지의 비활성을 갖는 227Th-AGC1118의 방사성안정화 효과 (IRF 검정).
도 4: 상이한 총 활성 (4시간의 인큐베이션 시간)의 라모스에 대한 227Th-AGC1118의 세포독성 (실시예 3 참조).
도 5: 227Th-AGC0718은 시험관내 CD33-양성 세포의 표적 특이적 세포 사멸을 유도한다 (실시예 4 참조).
도 6: 높은 (20 kBq/μg) 및 낮은 (7.4 kBq/μg) 비활성에서의 227Th-AGC0118의 세포 세포독성. 음성 대조군은 동일한 용량 범위, 동일한 인큐베이션 시간 및 판독 이전의 일수를 갖는 저-결합 펩티드-알부민 복합체이다 (실시예 5 참조).
도 7: 227Th-AGC2518은 시험관내 FGFR2-양성 세포의 표적 특이적 세포 사멸을 유도한다 (실시예 6 참조).
도 8: 227Th-AGC2418은 시험관내 메소텔린-양성 세포의 표적 특이적 세포 사멸을 유도한다 (실시예 7 참조).
도 9: 227Th-AGC1018은 시험관내 PSMA-양성 LNCaP 세포의 표적 특이적 및 용량 의존성 세포 사멸을 유도한다 (실시예 9 참조).
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예에 의해 예시될 것이다. 실시예에 예시된 모든 화합물은 본 발명의 바람직한 실시양태 (바람직한 중간체 및 전구체 포함)를 형성하고 맥락이 허용하는 경우에 임의의 측면에서 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 실시예 2의 화합물 2 내지 4, 실시예 3의 화합물 10 및 실시예 4의 화합물 7 각각 및 모두가 그의 다양한 유형의 바람직한 실시양태를 형성한다.
실시예 1
화학식 VIII의 화합물의 합성
Figure pct00021
실시예 1 a)
디메틸 2-(4-니트로벤질) 말로네이트의 합성
Figure pct00022
수소화나트륨 (60% 분산액, 11.55 g, 289 mmol)을 450 mL 테트라히드로푸란 (THF) 중에 0℃에서 현탁시켰다. 디메틸 말로네이트 (40.0 mL, 350 mmol)를 대략 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 150 mL THF 중에 용해시킨 4-니트로벤질 브로마이드 (50.0 g, 231 mmol)를 0℃에서 대략 30분 동안 적가하고 이어서 주위 온도에서 2시간에 걸쳐 적가하였다.
500 mL 에틸 아세테이트 (EtOAc) 및 250 mL NH4Cl (aq, 포화)을 첨가한 다음, 용액을 여과하였다. 상을 분리하였다. 수성 상을 2*250 mL EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 250 mL 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다.
300 mL 헵탄 및 300 mL 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)을 잔류물에 첨가하고, 60℃로 가열하였다. 용액을 여과하였다. 여과물을 동결기에 밤새 두고, 여과하였다. 필터 케이크를 200 mL 헵탄으로 세척하고, 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다.
수율: 42.03 g, 157.3 mmol, 68%.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 3.30(d, 2H, 7.8 Hz), 3.68(t, 1H, 7.8 Hz), 3.70(s, 6H), 7.36(d, 2H, 8.7 Hz), 8.13(d, 2H, 8.7 Hz).
실시예 1 b)
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디올의 합성
Figure pct00023
디메틸 2-(4-니트로벤질) 말로네이트 (28.0 g, 104.8mmol)를 0℃에서 560 mL THF 중에 용해시켰다. 디이소부틸알루미늄 히드라이드 (DIBAL-H) (헥산 중 1M, 420 mL, 420 mmol)를 0℃에서 대략 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다.
20 mL 물을 반응 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 20 mL NaOH (aq, 15%)를 반응 혼합물에 0℃에서 적가하고 이어서 20 mL 물을 반응 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, 대략 150 g MgSO4를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 이것을 부흐너 깔때기 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 500 mL EtOAc로 세척하였다. 필터 케이크를 제거하고 800 mL EtOAc 및 200 mL MeOH로 대략 30분 동안 교반한 후 용액을 여과하였다. 여과물을 합하고, 감압 하에 건조시켰다.
헵탄 중의 EtOAc의 구배에 이어서, EtOAc 중의 MeOH의 구배를 사용한 실리카 상에서 DFC에 의해 표제 화합물을 연황색 고체로 수득하였다.
수율: 15.38 g, 72.8 mmol, 69%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.97-2.13(m, 3H), 2.79(d, 2H, 7.6 Hz), 3.60-3.73(m, 2H), 3.76-3.83 (m, 2H), 7.36(d, 2H, 8.4 Hz), 8.14(d, 2H, 8.4 Hz).
실시예 1 c)
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트의 합성
Figure pct00024
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디올 (15.3 g, 72.4 mmol)을 0℃에서 150 mL CH2Cl2 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 (23 mL, 165 mmol)을 첨가하고, 이어서 메탄술포닐 클로라이드 (12 mL, 155 mmol)를 대략 15분에 걸쳐 적가하고, 이어서 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다.
500 mL CH2Cl2를 첨가하고, 혼합물을 2*250 mL NaHCO3 (aq, 포화), 125 mL HCl (aq, 0.1 M) 및 250 mL 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
수율: 25.80 g, 70.2 mmol, 97%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 2.44-2.58(m, 1H), 2.87(d, 2H, 7.7 Hz), 3.03(s, 6H), 4.17(dd, 2H, 10.3, 6.0 Hz), 4.26(dd, 2H, 10.3, 4.4 Hz), 7.38(d, 2H, 8.6 Hz), 8.19(d, 2H, 8.6 Hz).
실시예 1 d)
디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트의 합성
Figure pct00025
이미다졸 (78.3g, 1.15 mol)을 500 mL CH2Cl2 중에 실온에서 현탁시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (Boc2O) (262.0 g, 1.2 mol)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 3*750 mL 물로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
잔류물을 250 mL 톨루엔 중에 용해시키고, 디에틸렌트리아민 (59.5 mL, 550 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다.
1 L CH2Cl2을 첨가하고, 유기 상을 2*250 mL 물로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다.
트리에틸아민 함유 CH2Cl2 중의 메탄올 (MeOH)의 구배를 사용한 실리카 상에서 DFC에 의해 표제 화합물을 무색 고체로 수득하였다.
수율: 102 g, 336 mmol, 61%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.41(s, 18H), 1.58(bs, 1H), 2.66-2.77(m, 4H), 3.13-3.26(m, 4H), 4.96(bs, 2H).
실시예 1 e)
테트라-tert-부틸 (((2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일))테트라카르바메이트의 합성
Figure pct00026
2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트 (26.0 g, 71 mmol) 및 디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트 (76.0 g, 250 mmol)를 700 mL 아세토니트릴 중에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (43 mL, 250 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 4일 동안 교반하였다.
휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
헵탄 중의 EtOAc의 구배를 사용한 실리카 상에서 DFC에 의해 표제 화합물을 연황색 고체 발포체로 수득하였다.
수율: 27.2 g, 34.8 mmol, 49%.
1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.40(s, 36H), 1.91-2.17(m, 3H), 2.27-2.54(m, 10H), 2.61-2.89(m, 2H), 2.98-3.26(m, 8H), 5.26(bs, 4H), 7.34(d, 2H, 8.5 Hz), 8.11(d, 2H, 8.5 Hz).
실시예 1 f)
N1,N1'-(2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(N1-(2-아미노에틸)에탄-1,2-디아민), AGC0020의 합성
Figure pct00027
테트라-tert-부틸 (((2-(4-니트로벤질)프로판-1,3-디일)비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일))테트라카르바메이트 (29.0 g, 37.1 mmol)를 950mL MeOH 및 50 mL 물 중에 용해시켰다. 아세틸 클로라이드 (50 mL, 0.7 mol)를 30℃에서 대략 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다.
휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 잔류물을 250 mL 물 중에 용해시켰다. 500 mL CH2Cl2을 첨가하고, 이어서 175 mL NaOH (aq, 5M, 포화, NaCl 포함)을 첨가하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 4*250mL CH2Cl2로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜, 표제 화합물을 점성 적갈색 오일로서 수득하였다.
수율: 11.20 g, 29.3 mmol, 79%. 순도 (HPLC 도 9): 99.3%.
1H NMR (300MHz, CDCl3): 1.55(bs, 8H), 2.03(dt, 1H, 6.6, 13.3 Hz), 2.15(dd, 2H, 12.7, 6.6), 2.34-2.47(m, 10H), 2.64-2.77(m, 10H), 7.32(d, 2H, 8.7 Hz), 8.10(d, 2H, 8.7 Hz).
13C-NMR (75MHz, CDCl3): 37.9, 38.5, 39.9, 58.0, 58.7, 123.7, 130.0, 146.5, 149.5
실시예 1 g)
에틸 5-히드록시-6-옥소-1,2,3,6-테트라히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00028
2-피롤리디논 (76 mL,1 mol) 및 디에틸 옥살레이트 (140 mL, 1.03 mol)를 실온에서 1 L 톨루엔 중에 용해시켰다. 칼륨 에톡시드 (EtOK) (EtOH 중 24%, 415 mL,1.06 mol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 90℃로 가열하였다.
200 mL EtOH을, 반응 혼합물의 증점 때문에 반응의 처음 1시간 동안 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. 210 mL HCl (5M, 수성)을 교반하면서 천천히 첨가하였다.
200 mL 염수 및 200 mL 톨루엔을 첨가하고, 상을 분리하였다.
수성 상을 2x400 mL CHCl3로 추출하였다. 합한 유기 상을 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 EtOAc로부터 재결정화하고, 연황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 132.7g, 0.72 mol, 72%.
실시예 1 h)
에틸 3-히드록시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00029
{에틸 5-히드록시-6-옥소-1,2,3,6-테트라히드로피리딘-4-카르복실레이트} (23.00 g, 124.2 mmol)을 150 mL p-크실렌 중에 용해시키고, 탄소 상 팔라듐 (10%, 5.75 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 300 mL MeOH로 희석하고, 셀라이트®의 짧은 패드를 통해 여과하였다. 패드를 300 mL MeOH로 세척하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 표제 화합물을 연적색-갈색빛 고체로서 수득하였다.
수율: 19.63 g, 107.1 mmol, 86%. MS (ESI, pos): 206.1[M+Na]+, 389.1[2M+Na]+
실시예 1 i)
에틸 3-메톡시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00030
{에틸 3-히드록시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (119.2 g, 0.65 mol)를 실온에서 600 mL 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 1.8 L 아세톤 중에 용해시켰다. K2CO3 (179.7 g, 1.3 mol)을 첨가하였다. 600 mL 아세톤 중에 용해시킨 메틸 아이오다이드 (MeI) (162 mL, 321 mmol)를 실온에서 대략 1시간에 걸쳐 적가하였다.
반응 혼합물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반한 후, MeI (162 mL, 2.6 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 감소시키고, 2.5 L EtOAc을 첨가하였다.
혼합물을 여과하고 감압 하에 농축하였다. 헵탄 중의 EtOAc을 사용한 SiO2 상에서 건조 플래쉬 크로마토그래피 (DFC)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 56.1 g, 210.1 mmol, 32%. MS (ESI, pos):234.1[M+Na]+, 445.1[2M+Na]+
실시예 1 j)
에틸 3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure pct00031
{에틸 3-메톡시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (5.93 g, 28.1 mmol)를 -78℃에서 80 mL 디클로르메탄 (DCM) 중에 용해시키고, 20 mL DCM 중에 용해시킨 BBr3 (5.3 mL, 56.2 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 0℃로 가열하였다. 반응물을 25 mL tert-부틸 메틸 에테르 (tert-BuOMe) 및 25 mL MeOH의 적가에 의해 켄칭하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 90 mL DCM 및 10 mL MeOH 중에 용해시키고, SiO2의 짧은 패드를 통해 여과하였다. 패드를 DCM 중 200 mL 10% MeOH로 세척하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 400 mL 아세톤 중에 용해시켰다. K2CO3 (11.65 g, 84.3 mmol), KI (1.39 g, 8.4 mmol) 및 벤질 브로마이드 (BnBr) (9.2 mL, 84.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 200 mL EtOAc로 희석하고, 3x50 mL 물 및 50 mL 염수로 세척하였다. 합한 수성 상을 2x50 mL EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 상을 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 용리액으로서 헵탄 중 EtOAc (40 - 70%)을 사용하여 SiO2 상에서 건조 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 5.21 g, 18.1 mmol, 65%. MS (ESI, pos): 310.2[M+Na]+, 597.4[2M+Na]+
실시예 1 k)
3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실산의 합성
Figure pct00032
{에틸 3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실레이트} (27.90 g, 97.1 mmol)를 250 mL MeOH 중에 용해시키고, 60 mL NaOH (5M, 수성)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 대략 1/3 이하로 농축하였다. 잔류물을 150 mL 물로 희석하고, 염화수소 (HCl) (5M, 수성)를 사용하여 pH 2로 산성화시켰다. 침전물을 여과하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다. 수율: 22.52g, 86.9 mmol, 89%.
실시예 1 l)
3-(벤질옥시)-1-메틸-4-(2-티옥소티아졸리딘-3-카르보닐)피리딘-2(1H)-온 (AGC0021)의 합성
Figure pct00033
{3-(벤질옥시)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-4-카르복실산} (3.84 g, 14.8 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) (196 mg, 1.6 mmol) 및 2-티아졸린-2-티올 (1.94 g, 16.3 mmol)을 50 mL DCM 중에 용해시켰다. N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (3.36g, 16.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응물을 여과하고, 고체를 DCM으로 세척하고, 여과물을 진공 하에 농축하였다. 생성된 황색 고체를 이소프로판올/DCM으로부터 재결정화하여 AGC0021을 수득하였다. 수율: 4.65 g, 12.9 mmol, 87%. MS(ESI, pos): 383[M+Na]+, 743[2M+Na]+
실시예 1 m)
AGC0023의 합성
Figure pct00034
AGC0020 (8.98 g; 23.5 mmol)을 CH2Cl2 (600 mL) 중에 용해시켰다. AGC0021 (37.43 g; 103.8 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하였다.
EtOAc 및 CH2Cl2의 1:1 혼합물 중의 메탄올의 구배를 사용한 SiO2 상에서 DFC에 의해 AGC0023을 고체 발포제로서 수득하였다.
평균 수율: 26.95 g, 20.0 mmol, 85%.
실시예 1 n)
AGC0024의 합성
Figure pct00035
AGC0023 (26.95 g; 20.0 mmol)을 에탄올 (EtOH) (675 mL) 중에 용해시켰다. 철 (20.76 g; 0.37 mol) 및 NH4Cl (26.99 g; 0.50 mol)을 첨가하고, 이어서 물 (67 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 보다 많은 철 (6.75 g; 121 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 74℃에서 1시간 동안 교반하였다. 보다 많은 철 (6.76 g; 121 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 74℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 감압 하에 감소시켰다.
CH2Cl2 중의 메탄올의 구배를 사용한 SiO2 상에서 DFC에 의해 AGC0024로서 고체 발포체를 수득하였다.
수율 18.64 g, 14.2 mmol, 71%.
실시예 1 o)
AGC0025의 합성
Figure pct00036
AGC0024 (18.64 g; 14.2 mmol)을 CH2Cl2 (750 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. BBr3 (50 g; 0.20 mol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 75분 동안 교반하였다. 반응물을 0℃에서 교반하는 동안 메탄올 (MeOH) (130 mL)을 조심스럽게 첨가하여 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. HCl (EtOH 중 1.25M, 320 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 이어서 플라스크를 회전 증발기를 사용하여 대기압 및 주위 온도에서 15분 동안 회전시키고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다.
물 중의 아세토니트릴 (ACN)의 구배를 사용한 비-말단캡핑된 C18 실리카 상에서 DFC에 의해 AGC0025로서 약간 오렌지색 유리질 고체를 수득하였다.
수율 13.27 g, 13.9 mmol, 98%.
실시예 1 p)
AGC0019의 합성
Figure pct00037
AGC0025 (10.63 g; 11.1 mmol)을 실온에서 ACN (204 mL) 및 물 (61 mL) 중에 용해시켰다. 숙신산 무수물 (2.17 g; 21.7 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 감소시켰다. 물 중의 ACN의 구배를 사용한 비-말단캡필된 C18 실리카 상에서 DFC에 의해 녹색빛 유리질 고체를 수득하였다.
고체를 40℃에서 MeOH (62 mL) 및 물 (10.6 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 EtOAc (750 mL)에 초음파처리 하에 적가하였다. 침전물을 여과하고, EtOAc로 세척하고, 감압 하에 건조시켜 AGC0019로서 녹색빛을 띄는 회백색 고체를 수득하였다.
수율: 9.20 g, 8.7 mmol, 78%. H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6).
실시예 2
순수한 토륨-227의 단리
토륨-227을 악티늄-227 발생기로부터 단리하였다. 악티늄-227을 라듐-226의 열 중성자 조사에 이어서 라듐-227 (t1/2=42.2 m)의 악티늄-227로의 붕괴를 통해 생성시켰다. 토륨-227를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 8M HNO3 용액 중 악티늄-227 붕괴 혼합물로부터 임의로 보유하였다. 70 mg의 AG®1-X8 수지 (200-400 메쉬, 니트레이트 형태)를 함유하는, 2mm 내부 직경, 길이 30mm의 칼럼을 사용하였다. 악티늄-227, 라듐-223 및 딸이 칼럼으로부터 용리된 후, 토륨-227을 12M HCl로 칼럼으로부터 추출하였다. 토륨-227을 함유하는 용리액을 증발 건조시키고, 표지 단계 이전에 잔류물을 0.01 M HCl에서 재현탁시켰다.
실시예 3
라모스에 대한 227Th-AGC1118의 세포독성
실시예 3 a)
항-CD22 모노클로날 항체 (AGC1100)의 생성
모노클로날 항체 (mAb) hLL2의 서열을 또한 에프라투주맙으로 불리고 본원에서 AGC1100로 나타내고, 문헌 [Leung, Goldenberg, Dion, Pellegrini, Shevitz, Shih, 및 Hansen: Molecular Immunology 32: 1413-27, 1995]에 기재된 바와 같이 구성하였다.
현재 실시예에 사용되는 mAb는 미국 뉴저지주 소재의 이뮤노메딕스 인크(Immunomedics Inc)에 의해 생산되었다. 이러한 mAb의 제조는 예를 들어 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 현탁액 (CHO-S) 세포에서 수행될 수 있다. 첫째로, 표준 절차를 사용하여 안정한 클론이 선택될 것이다. 단일-사용 생물반응기의 대략 14일 후에, 모노클로날 항체는 상청액의 여과 후에 회수될 수 있다. AGC1100은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe), 아톨(Atoll), 독일 바인가르텐)에 의해 추가로 정제되고, 이어서 이온 교환 단계가 있을 것이다. 정전기 및 소수성 기반의 제3 정제 단계는 응집체 및 잠재적 잔류 불순물을 제거하는데 사용될 수 있다. AGC1100의 동일성은 등전 포커싱, SDS-PAGE 분석, N-말단 서열분석 및 LC/MS 분석에 의해 확인될 수 있다. 샘플 순도는 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 분석될 것이다.
실시예 3 b) mAb AGC1100 (에프라투주맙)과 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)의 커플링에 의한 접합체 AGC1118의 제공
Figure pct00038
접합 이전에, 포스페이트 완충제 pH 7.5를 항체 용액 (AGC1100)에 첨가하여 용액의 완충 용량을 증가시켰다. 용기 중 AGC1100 (mAb)의 양을 결정하였다.
킬레이트화제 AGC0019를 1:1, DMA: 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다. NHS 및 EDC을 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다.
킬레이트화제 / N-히드록시숙신이미드 (NHS) / 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 1 / 1 / 3 몰 당량 용액 (EDC)을 제조하여 킬레이트화제를 활성화시켰다. 항체에 대한 접합을 위해 7.5/7.5/22.5/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb) 몰비의 활성화된 킬레이트화제를 mAb에 충전하였다. 20-40분 후, 접합 반응을 12% v/v 0.3M 시트르산으로 켄칭하여 pH는 5.5로 조정하였다.
용액은 이어서, 일정한 부피에서 접선 흐름 여과에 의해 30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5 mg/ml pABA, pH 5.5 (TFF 완충제)로 완충제 교환하였다. 투석여과의 끝에 용액을 제제 용기로 분출하였다. 생성물을 TFF 완충제 (30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5 mg/ml pABA, pH 5.5) 및 7% w/v 폴리소르베이트 80으로 제제화하여 30 mM 시트레이트, 70mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5mg/ml pABA 0.1% w/v PS80, pH 5.5 중 2.6 mg/ml AGC1118을 수득하였다. 최종적으로, 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 저장하기 이전에 멸균 병에 넣었다.
실시예 3 c)
227Th-AGC1118 주사의 용량의 제조
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하고, 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl로 토륨-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. 토륨-227의 용리된 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량의 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 산을, 이어서 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치하여 증발시켰다. 실온에 도달한 후, 6 ml AGC1118 접합체 2.5 mg/ml를 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 사용하기 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 3 d)
상이한 총 활성 및 비활성을 갖는 라모스에 대한 227Th-AGC1118의 세포독성
이 연구에서 227Th-AGC1118의 용량을 4시간 인큐베이션 시간 동안 변화하는 총 활성 및 비활성으로 시험하였다. 이 연구는 10/50 kBq/μg에서의 비활성 및 5, 10, 20 및 40 kBq/ml에서의 총 활성에 96 웰 플레이트 포맷에서 수행하였다.
라모스 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 RPMI1640-배지에서 배양하였다 (계대 22). 세포를 원심분리 튜브로 옮기고, 300G에서 5분 동안 원심분리하고, 5mL 배지에서 현탁시키고 Z2 쿨터 계수기(Coulter Counter)로 계수하였다. 세포 현탁액을 400,000개 세포/ml의 세포 농도의 배지로 희석하고 96 웰 플레이트 중 48 웰 (200 μl/웰)에 옮겨졌다 (80,000개 세포/웰). 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)은 세포 생존율을 측정하기 위해 사용하였다. 도 4 참조.
실시예 4
HL-60에 대한 227Th-AGC0718의 세포독성
실시예 4 a)
항-CD33 모노클로날 항체 (AGC0700)의 생성.
여기서 AGC0700으로 나타낸 모노클로날 항체 (mAb) HuM195/린투주맙의 서열은, (1) 및 (2)에서 기재된 바와 같이 문헌에서 검색되었다. AGC0700의 제조는 코브라바이오로직스(CobraBiologics) (스웨덴 쇠데르텔리에)의 시설에서 수행되었다. 간략하게, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 벡터(Vector) NTI® 소프트웨어 (인비트로젠/라이프 테크놀로지스 리미티드(Life-Technologies Ltd.), 영국 페이즐리)를 사용하여 DNA 서열로 역번역되었다. C-말단 리신의 코돈 (Lys)은 IgG1 중쇄 유전자로부터 생략되어, 실시예 2에서 약술된 바와 같이 접합체 대 항체 비 (CAR)의 정확한 결정이 용이하게 되도록 한다. 생성된 DNA 서열은 포유동물 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화되고 진아트(GeneArt) (진아트/ 라이프-테크놀로지스 리미티드, 영국 페이즐리)에 의해 합성되고 추가로 코브라바이오로직스 (스웨덴 쇠데르텔리에)에 의해 발현 벡터로 복제된 코돈이다. 차이니즈 햄스터 난소 현탁액 (CHO-S) 세포는 안정하게 AGC0700의 VH- 및 VL-도메인을 코딩하는 플라스미드로 형질감염되고 퓨로마이신 (12.5 mg/l; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))에 의해 보충되는 표준 CD-CHO 배지 (인비트로젠/라이프-테크놀로지스 리미티드, 영국 페이즐리)의 존재 하에 성장된다. AGC0700이 발현되는 안정한 클론은, 25 세대에 걸쳐 한계 희석을 통해 선택되었다. 클론 안정성은 상청액으로부터 단백질 역가를 측정함으로써 평가되었다. 가장 안정한 클론의 세포 은행을 수립하고 동결-보존되었다.
mAb의 발현을 250L 규모 단일-사용 생물반응기에서 37℃에서 대략 14일 동안 수행하였다. 모노클로날 항체는 상청액의 여과 후에 회수하였다. AC0700은 추가로 단백질 A 친화도 칼럼 (맙셀렉트 슈어, 아톨, 독일 바인가르텐)을 통해 정제하고, 이어서 1종의 음이온 (QFF-세파로스(QFF-Sepharose); 지이 헬스케어) - 및 양이온 (포로스XS(PorosXS); 인비트로젠/라이프-테크놀로지스 리미티드) - 크로마토그래피에 의해 순도 및 최종 수득률이 증가하였다. AGC0700의 동일성을 등전 포커싱 및 SDS-PAGE 분석에서 확인하였다. 정제된 AGC0700의 활성을 고정된 CD33-Fc 표적 (노보프로테인(Novoprotein))으로의 결합 ELISA로 분석하였다. 샘플 순도는 크기-제외 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였다.
참고문헌:
(1) Scheinberg DA. "Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody M195 and constructs thereof. US Patent Application 6007814 (1999 Dec 28).
(2) Co MS et al.; J Immunol. 1992 Feb 15;148(4):1149-54. Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen.
실시예 4 b)
접합체 AGC0718을 수득하기 위한 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)와 mAb AGC0700 (린투주맙)의 커플링
접합을 사소한 예외와 함께 실시예 3에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
접합 이전에, 포스페이트 완충제 pH 7.5를 항체 용액 (AGC0700)에 첨가하여 용액의 완충 용량을 증가시켰다. 용기 중 AGC0700 (mAb)의 양을 결정하였다.
킬레이트화제 AGC0019를 1:1, DMA: 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다. NHS 및 EDC을 0.1 M MES 완충제 pH 5.4 중에 용해시켰다.
킬레이트화제/NHS/EDC의 1/1/3 몰 당량 용액을 제조하여 킬레이트화제를 활성화시켰다. 항체에 대한 접합을 위해 20/20/60/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb) 몰비의 활성화된 킬레이트화제를 mAb에 충전하였다. 40-60분 후, 접합 반응을 12% v/v 0.3M 시트르산으로 켄칭하여 pH는 5.5로 조정하였다.
용액은 이어서, 일정한 부피에서 접선 흐름 여과에 의해 30 mM 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mg/ml pABA, pH 5.5 (TFF 완충제)로 완충제 교환하였다. 투석여과의 끝에 용액을 제제 용기로 분출하였다. 생성물은 TFF 완충제 (30 mM 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mg/ml pABA, pH 5.5)로 제제화하여 30 mM 시트레이트, 154mM NaCl, 2mM EDTA, 2mg/ml pABA, pH 5.5 중 2.5 mg/ml AGC0718을 수득하였다. 최종적으로, 용액을 저장 이전에 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 멸균 병에 넣었다
실시예 4 c)
227Th-AGC0718 주사의 용량의 제조
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하여 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl로 토륨-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. 토륨-227의 용리된 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량을 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 산을, 이어서 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치하여 증발시켰다. 실온에 도달한 후에, 6 ml AGC0718 접합체 2.5 mg/ml를 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 사용하기 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 4 d)
상이한 총 활성을 갖는 HL-60에 대한 227Th-AGC0718의 세포독성
227Th-AGC0718의 세포 독성을 입증하기 위해, CD33+-세포에 결합한 후 시험관내 세포 독성 검정을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 인간 골수원성 백혈병성 HL-60 세포주, 뿐만 아니라 CD33-음성 B-세포주 (라모스)를, 227Th-AGC0718에 노출하였다. 2 및 20 kBq/ml의 총 활성을 44 kBq/μg의 비활성에서 시험하였다. 모든 실험 절차는 RD2013.093에 기재하였다. 간략하게, IMDM-배지 중 50000개 인간 HL-60 세포/ ml를 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신과 함께 제조하고 24 웰 플레이트에 100,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 227Th-AGC0718의 0 내지 20 kBq/ml의 활성으로 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 각각 227Th-이소형 대조군 접합체 샘플 뿐만 아니라 ab 비표지된 AGC0718 샘플을 각각의 대조군과 평행하게 제조하였다. 그 후, 세포를 신선한 배지로 세척하고 새로운 24-웰 배양 플레이트 내에 시딩하였다.
상이한 시점에서, 세포를 회수하고, 생존율을 셀타이터글로(CellTiterGlo) 키트 (프로메가(Promega))를 사용하여 측정하였다. 생존율은 양성 대조군 (처리되지 않은 세포)을 100%로 설정하여 %로 나타내었다. 도 5 참조.
실시예 5
SKOV-3에 대한 227Th-AGC0118의 세포독성
실시예 5 a)
AGC0100 (트라스투주맙)의 생성
트라스투주맙 모노클로날 항체 (본원에 AGC0100으로 나타냄)는 로슈로부터 구입하고 PBS (둘베코 바이오크롬(Dulbecco BIOCHROM)) 중 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다.
실시예 5 b)
접합체 AGC0118을 수득하기 위한 mAb AGC0100 (트라스투주맙)과 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)의 커플링
접합은 실시예 3에 기재된 바와 같이에서 살짝 변형되어 수행되었다. 최종 접합된 mAb의 TFF 정제는 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의해 대체되었다.
PBS 중 트라스투주맙에 11% 1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4를 첨가하였다. 킬레이트화제 (AGC0019) NHS 및 EDC를 실시예 3 b)에 기재된 바와 같은 동일한 용액에 용해시켰다. 활성화 동안의 킬레이트화제/NHS/EDC의 몰비는 1/1/3이였다. 킬레이트화제/NHS/EDC/mAb에 상응하는 8/8/25/1의 몰비 및 30-40분 접합 시간은, 접합된 AGC0118에 대한 0.7-0.9의 CAR (킬레이트화제 대 항체 비)의 결과가 발생하였다. 반응물은 12% v/v 0.3M 시트르산을 첨가하여 최종 pH 5.5로 켄칭하였다.
AGC0118 접합체를 30 mM 시트레이트 pH 5.5, 154 mM NaCl으로의 정제 및 완충제 교환을 AKTA 시스템(지이 헬스케어)에 연결된 슈퍼덱스(Superdex) 200 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 칼럼 상의 겔 여과로 수행하였다. Abs 280 nm에서의 단백질 농도는 생성물을 완충제로 제제화하기 (30 mM 시트레이트, 154mM NaCl, 2mM EDTA, 2mg/ml pABA, pH 5.5 중 2.5 mg/ml AGC0118을 수득하기 위함) 전에 측정하였다. 최종적으로, 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 저장하기 이전에 멸균 병 내로 넣었다.
실시예 5 c)
227Th-AGC0118 주사의 용량의 제조
표지는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다:
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하여 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl로 토륨-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. 토륨-227의 용리된 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량의 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 산을, 이어서 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치하여 증발시켰다. 실온에 도달한 후, 6 ml AGC0118 접합체 2.5 mg/ml를 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 사용하기 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 5 d)
상이한 총 활성을 갖는 SKOV-3에 대한 227Th-AGC0118의 세포독성
세포 세포독성은 4시간 인큐베이션 시간 동안 웰에 첨가된 총 활성을 변경함으로써 227Th-AGC0118의 다양한 용량을 시험하였다. SKOV-3 세포를 실험 전날에 96 웰 플레이트의 웰당 10000개를 시딩하였다. 비활성 20 kBq/μg에서, 킬레이트된 227Th-AGC0118의 일련의 총 활성 5, 10, 20 및 40 kBq/ml를 제1일에 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 기간 후, 잔류 비-결합 227Th-AGC0118을 다중 어레이 피펫에 의해 제거하고, 이어서 배지 및 실질적으로 신선한 배양 배지로 추가로 1회 세척하였다. SKOV-3 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 맥코이(Mc-Coy) 배지 내에 배양하였다. 배양 배지를 227Th-AGC0118의 인큐베이션 동안 혈청-무함유 배지로 대체하였다. 제4일에 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)는 세포 생존율을 측정하기 위해 사용하였다. 도 6 참조.
실시예 6
NCI-H716에 대한 227Th-AGC2518의 세포독성
실시예 6 a)
FGFR2 모노클로날 항체 (BAY1179470; AGC2500)의 생성.
본원에 추가로 AGC2500으로 지칭된 모노클로날 항체 BAY 1179470의 생성은, WO2013076186A1에서 상세히 기재된다. 간략하게, 항체는 FGFR2 항원을 바이오패닝하여 회수하였다. 생성된 인간 IgG1 항체는 CHO 세포에서 발현하고, 단백질 A 친화도 칼럼 (맙셀렉트 슈어)를 사용하여 정제하고, 이어서 크기-제외 크로마토그래피로 단량체 분획을 단리하였다. 항체는 PBS, pH 7.4로 제제화하였다. 분석용 SEC는 동질성 > 99%를 나타내었다.
실시예 6 b)
접합체 AGC2518을 수득하기 위해 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)와 mAb AGC2500의 커플링
항체-함유 용액을 pH 7.5로 조정하였다. 킬레이트화제 AGC0019를 1:1, DMA: 0.1 M MES 완충제 pH 5.4에 용해시켰다. NHS 및 EDC를 0.1 M MES 완충제 pH 5.4에 용해시켰다. 킬레이트화제/NHS/EDC의 1/1/3 몰 당량 용액을 킬레이트화제를 활성화시키기 위해 제조하였다. 항체에 대한 접합을 위해 10/10/30/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb)의 몰비의 활성화된 킬레이트화제를 mAb에 충전하였다. 30분 후에, 접합 반응물을 12% v/v 0.3M 시트르산으로 켄칭하여 pH를 5.5로 조정하였다. 반응 샘플을 추가로 이동상으로서 30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, pH 5.5로 단량체 분획을 단리하기 위해 하이로드(HiLoad) 16/600 슈퍼덱스 200 (정제용-등급) 칼럼에 대해 로딩하였다. 크로마토그래피가 끝난 후에, 항체 접합체 AGC2518은 30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 0.5 mg/ml pABA 중 2.5 mg/ml에 농축하였다. 모든 절차는 문헌[RD.2014.092, Journal No. 211/149, 140619 AEF]에 기재된다.
실시예 6 c)
227Th-AGC2518 주사의 용량의 제조
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하여 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl로 토륨-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. 토륨-227의 용리된 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량의 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 산을, 이어서 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치하여 증발시켰다. 실온에 도달한 후, 6 ml AGC2518 접합체 2.5 mg/ml를 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 사용하기 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 6 d)
상이한 총 활성을 갖는 NCI-H716 세포에 대한 227Th-AGC2518의 세포독성
227Th-AGC2518의 세포 독성을 입증하기 위해, FGFR2+-세포에 결합한 후 시험관내 세포 독성 검정을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 인간 결장직장암 세포주 NCI-H716은 227Th-AGC2518에 노출하였다. 2, 10, 20 및 40 kBq/ml의 총 활성은 2 kBq/μg의 비활성에서 시험하였다. 비관련 이소형 대조군은 평행하게 비슷하게 제조되었다. 모든 실험 절차는 RD2014.138에 기재된다. 간략하게, RPMI 1640-배지 중 400000개 인간 NCI-H716 세포/ml를 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신과 함께 제조하고 96 웰 플레이트에 80,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 227Th-AGC2518의 0 내지 40 kBq/ml의 활성 및 각각의 227Th-이소형 대조군 접합체 샘플로 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포는 후에 신선한 배지로 세척하였고, 새로운 96-웰 배양 플레이트 내에 시딩하였다. 5 및 7일 후에, 세포를 회수하고 생존율을 셀타이터글로 키트 (프로메가)를 사용하여 측정하였다. 생존율은 양성 대조군 (처리되지 않은 세포)를 100%로 설정하여 %로 나타내었다. 도 7 참조.
실시예 7
HT29 세포에 대한 227Th-AGC2418의 세포독성
실시예 7 a)
메소텔린 모노클로날 항체 (BAY 86-1903; AGC2400)의 생성.
본원에 추가로 AGC2400으로 지칭된 모노클로날 항체 BAY 86-1903의 생성은, WO2009068204에서 상세히 기재된다. 간략하게, 항체는 메소텔린 항원을 바이오패닝하여 회수하였다. 생성된 인간 IgG1 항체는 CHO 세포에서 발현하고, 단백질 A 친화도 칼럼 (맙셀렉트 슈어)를 사용하여 정제하고, 이어서 HIC 칼럼 (토요펄(Toyopearl) 부틸 600M)을 사용하여 응집체를 제거한다. 항체를 PBS, pH 7.5로 제제화하였다.
실시예 7 b)
접합체 AGC2418을 수득하기 위한 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)와 mAb AGC2400의 커플링
항체-함유 용액을 pH 7.5로 조정하였다. 킬레이트화제 AGC0019를 1:1, DMA: 0.1 M MES 완충제 pH 5.4에 용해시켰다. NHS 및 EDC를 0.1 M MES 완충제 pH 5.4에 용해시켰다. 킬레이트화제/NHS/EDC의 1/1/3 몰 당량 용액을 킬레이트화제를 활성화시키기 위해 제조하였다. 항체에 대한 접합을 위해 16.5/16.5/49.5/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb)의 몰비의 활성화된 킬레이트화제를 mAb에 충전하였다. 30분 후에, 접합 반응물을 12% v/v 0.3M 시트르산으로 켄칭하여 pH를 5.5로 조정하였다. 반응 샘플을 추가로 이동상으로서 30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, pH 5.5로 단량체 분획을 단리하기 위해 하이로드 16/600 슈퍼덱스 200 (정제용-등급) 칼럼에 대해 로딩하였다. 크로마토그래피가 끝난 후에, 항체 접합체 AGC2418을 30 mM 시트레이트, 70 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 0.5 mg/ml pABA 중 2.5 mg/ml에 농축하였다. 모든 절차는 문헌 [RD.2014.111, Journal No. 211/160, 140814 AEF]에 기재된다.
실시예 7 c)
227Th-AGC2418의 용량의 제조
20 MBq 토륨-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하여 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl로 토륨-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. 토륨-227의 용리된 활성을 측정하고, 10 MBq의 용량의 비어있는 10 ml 유리 바이알로 옮겼다. 산을, 이어서 진공 펌프를 사용하고 가열 블록 (120℃로 설정됨)에서 30-60분 동안 바이알을 정치하여 증발시켰다. 실온에 도달한 후, 6 ml AGC2418 접합체 2.5 mg/ml를 방사성표지를 위해 첨가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서 용액을 멸균 바이알 내로 멸균 여과하고 샘플을 사용하기 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 7 d)
상이한 총 활성을 갖는, 메소텔린 항원을 과다발현하는 HT29 세포에 대한 227Th-AGC2418의 세포독성
227Th-AGC2418의 세포 독성을 입증하기 위해, 메소텔린+-세포에 결합한 후 시험관내 세포 독성 검정을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 메소텔린 항원으로 감염된 인간 결장직장암 세포주 HT29를 227Th-AGC2418에 노출시켰다. 총 활성은 10 kBq/μg의 비활성에서의 5 kBq/ml에서 시작하여, 3배 희석에서 12 지점에 걸쳐 적정하였다. 비관련 이소형 대조군을 평행하게 비슷하게 제조하였다. 모든 실험 절차는 RD2014.154에 기재하였다. 간략하게, RPMI 1640-배지 중 메소텔린 항원으로 형질감염된 200,000개 인간 HT29 세포는 10 % FBS, 1 % 페니실린/스트렙토마이신, 1 % NaHCO3, 600μg/ml 히그로마이신 B와 함께 제조하고 96 웰 플레이트에 40,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 227Th-AGC2418의 0 내지 40 kBq/ml의 활성 및 각각의 227Th-이소형 대조군 접합체 샘플로 37℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 제6일에, 세포를 회수하고 생존율을 셀타이터글로 키트(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 생존율은 양성 대조군 (처리되지 않은 세포)을 100%로 설정하여 %로 나타내었다.
실시예 8
아미드 및 이소티오시아네이트-연결된 접합체의 안정성의 비교
AGC1118 및 이소티오시아네이트 커플링 모이어티 (AGC1115)를 갖는 상응하는 접합체를 수용액에 40℃에서 11일 동안 저장하였다. 샘플은 정기적으로 꺼내었다.
Figure pct00039
상기 표에서 아미드-커플링된 접합체에 대한 접합체 농도에서 측정가능한 감소가 없었음을 알 수 있다. 대조적으로, 이소티오시아네이트 접합체는 5일 후 8% 및 11일 후 12% 감소하였다.
실시예 9
실시예 9 a)
PSMA 모노클로날 항체 (AGC1000)의 생성
하기에 AGC1000으로 지칭된 PSMA 모노클로날 항체는 미국 소재의 프로제닉스(Progenics)로부터 구입되었다.
실시예 9 b)
접합체 AGC1018을 수득하기 위해 킬레이트화제 AGC0019 (화학식 VIII의 화합물)와 mAb AGC1000의 커플링
항체-함유 용액을 pH 7.5로 조정하였다. 킬레이트화제 AGC0019를 1:1, DMA: 0.1M MES 완충제 pH 5.5에 용해시켰다. NHS 및 EDC를 0.1M MES 완충제 pH 5.5에 용해시켰다. 킬레이트화제/NHS/EDC의 1/1/2 몰 당량 용액을 킬레이트화제를 활성화시키기 위해 제조하였다. 항체에 대한 접합을 위해 20/20/40/1 (킬레이트화제/NHS/EDC/mAb)의 몰비의 활성화된 킬레이트화제는, 10분 간격의 4개의 부분으로, mAb에 충전하였다. 50분 후에, 접합 반응물을 12% v/v 1M TRIS pH 7.3으로 켄칭하였다. 접합체를 정제하고 접선 흐름 여과 (TFF)에 의해 완충제 교환하였다. 제제 완충제는 30mM 시트레이트, 70mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5 mg/ml pABA, pH 5.5이였다. 투석여과의 끝에 용액을 벌크 용기로 분출하고 농도를 2.7 mg/ml로 조정하였다. 최종적으로, 벌크 용액을 0.2 μm 멸균 필터를 통해 여과하고 저장을 위해 -20℃에서 멸균 바이알에 넣었다.
실시예 9 c)
227Th-AGC1018 주사의 용량의 제조
대략 50 MBq Th-227 클로라이드 필름의 바이알을 2 ml 8M HNO3 용액에 용해시키고 15분 동안 정치하여 시간이 경과됨에 따라 성장한 라듐-223의 제거를 위한 음이온 교환 칼럼에 적용하기 위해 용액을 인출하였다. 칼럼을, 3 ml 3M HCl을 갖는 Th-227이 용리하기 이전에 3 ml 8M HNO3 및 1 ml 물로 세척하였다. HCl 용리액을, 진공 펌프를 사용하고 100℃로 설정된 가열 블록에서 60-90분 동안 증발시켰다. 건조 Th-227의 활성을 용량 보정기로 측정하였다. 건조 Th-227을 0.5 MBq/μl의 농도를 주기 위해 0.05M HCl에 용해시켰다. AGC1018 접합체를, 방사성표지를 위해, 200 μl에서 25 μg mAb를 달성하기 위해 제제 완충제에 희석하였다. AGC1018 용액에, 1 MBq Th-227을 혼합하고 정확한 Th-227 활성을 게르마늄 검출기로 측정하였다. 킬레이트화를 멸균 바이알 내로 멸균 여과되기 이전에 실온에서 30-60분 동안 허용하였다. 샘플을 사용 이전에 RCP를 결정하기 위한 iTLC 분석을 위해 인출하였다.
실시예 9 d)
PSMA 발현 LNCaP 세포에 대한 227Th-AGC1018의 세포독성
227Th-AGC1018의 세포 독성을 입증하기 위해, PSMA 양성 세포에 결합한 후 시험관내 세포 독성 검정을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 인간 전립선암 세포주 LNCaP를 227Th-AGC1018에 노출시켰다. 총 활성은 40 kBq/μg의 비활성에서의 20 kBq/ml에서 시작하여, 3배 희석에서 12 지점에 걸쳐 적정하였다. 비관련 이소형 대조군은 평행하게 제조되었다. 모든 실험 절차는 아카이브 RD.2015.101에 기재하였다. 간략하게, 인간 LNCaP 세포는 10 % FBS와 1 % 페니실린/스트렙토마이신에 의해 보충된 RPMI 1640-배지 내에 배양하였다. 세포는 96 웰 플레이트에 2500개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 시딩 24시간 후 (제1일), 세포는 37℃에서 5일 동안 0 내지 20 kBq/ml 범위의 총 활성에서 227Th-AGC1018 및 227Th-이소형 대조군에 노출하였다. 제6일에, 세포를 회수하고 생존율을 셀타이터글로 키트(프로메가)를 이용하여 측정하였다. 생존율은 양성 대조군 (처리되지 않은 세포)을 100%로 설정하여 %로 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer AS <120> Conjugation methods <130> 95.121941 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine light chain sequence <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ala Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Gln Val Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised light chain sequence <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Val Asn Asp Arg Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ala Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Lys Ala Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Ser Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Phe Ile Ser Arg Ser Leu Val Pro Asp Leu Ile Ile Thr Tyr Cys His 85 90 95 Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine heavy chain sequence <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ser Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First humanised heavy chain sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second humanised heavy chain sequence <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115

Claims (27)

  1. a) N-위치에서 C1-C3 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 (HOPO) 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제를 형성하는 것;
    b) 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제를 적어도 1종의 아미드-커플링 시약에 의해 적어도 1개의 아민 모이어티를 포함하는 적어도 1종의 조직-표적화 펩티드 또는 단백질에 커플링시켜 조직-표적화 킬레이트화제를 생성하는 것; 및
    c) 상기 조직-표적화 킬레이트화제를 적어도 1종의 알파-방출 토륨 동위원소의 이온을 포함하는 수용액과 접촉시키는 것
    을 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체의 형성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b)가 수용액 중에서 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미드-커플링 시약이 수용액 중에서 기능적인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미드-커플링 시약이 카르보디이미드 커플링 시약 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 N,N'-다이사이클로헥실카르보디이미드 (DCC)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 pH 4 내지 9의 수용액 중에서 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 15 내지 50℃에서 5 내지 120분 동안 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 15 내지 50℃에서 1 내지 60분 동안 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제가 4개의 3,2-HOPO 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 옥타덴테이트 킬레이트화제가 화학식 VIb 및 VII로부터 선택되는 것인 방법.
    <화학식 VIb>
    Figure pct00040

    <화학식 VII>
    Figure pct00041

    여기서 Rc는 카르복실산 모이어티에서 종결하는 링커 모이어티, 예컨대
    [-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH],
    [-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH] 또는
    [-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]이고,
    여기서 Ph는 페닐렌 기, 바람직하게는 파라-페닐렌 기이다.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직-표적화 모이어티가 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, F(ab')2, Fab' 또는 scFv), 또는 이러한 항체 및/또는 단편의 구축물인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직-표적화 모이어티가 CD22 수용체, FGFR2, 메소텔린, HER-2, PSMA 또는 CD33에 대한 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 형성되거나 또는 형성가능한 조직-표적화 토륨 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 4개의 3,2-HOPO 모이어티를 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, CD22 수용체, FGFR2, 메소텔린, HER-2, PSMA 또는 CD33에 대한 결합 친화도를 갖는 조직-표적화 토륨 복합체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 알파-방출 토륨 방사성핵종 예컨대 227Th의 4+ 이온을 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 VIb 또는 VII의 옥타덴테이트 킬레이트화제, 바람직하게는 AGC0019를 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체.
    <화학식 VIb>
    Figure pct00042

    <화학식 VII>
    Figure pct00043

    여기서 RC는 아미드 기에 의해 조직 표적화 모이어티에 연결된 커플링 모이어티이다.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, F(ab')2, Fab' 또는 scFv), 또는 이러한 항체 및/또는 단편의 구축물로부터 선택된 조직 표적화 모이어티를 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열 중 적어도 1종과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 적어도 1종의 펩티드 쇄를 포함하는 조직 표적화 모이어티를 포함하는 조직-표적화 토륨 복합체.
    경쇄:
    Figure pct00044

    중쇄:
    Figure pct00045
  19. 적어도 1종의 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조직-표적화 토륨 복합체를 포함하는 제약 제제.
  20. 제19항에 있어서, 추가로 시트레이트 완충제를 포함하는 제약 제제.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 추가로 p-아미노부티르산 (PABA), 및 임의로 EDTA 및/또는 적어도 1종의 폴리소르베이트를 포함하는 제약 제제.
  22. 과형성 또는 신생물성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조직-표적화 토륨 복합체 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 제약 제제의 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 질환이 비-호지킨 림프종 또는 B-세포 신생물, 유방암, 자궁내막암, 위암, 급성 골수성 백혈병, 전립선암 또는 뇌암, 중피종암, 난소암, 폐암 또는 췌장암을 포함한, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 또는 혼합형 암인 용도.
  24. 적어도 1종의 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 조직-표적화 토륨 복합체 또는 적어도 1종의 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 제약 제제의 투여를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 (특히 치료를 필요로 하는 것)의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 과형성 또는 신생물성 질환, 예컨대 비-호지킨 림프종 또는 B-세포 신생물, 유방암, 자궁내막암, 위암, 급성 골수성 백혈병, 전립선암 또는 뇌암, 중피종암, 난소암, 폐암 또는 췌장암을 포함한, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 또는 혼합형 암의 치료 방법.
  26. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 과형성 및/또는 신생물성 질환 예컨대 비-호지킨 림프종 또는 B-세포 신생물, 유방암, 자궁내막암, 위암, 급성 골수성 백혈병, 전립선암 또는 뇌암, 중피종암, 난소암, 폐암 또는 췌장암을 포함한, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 또는 혼합형 암의 치료에 사용하기 위한 조직-표적화 토륨 복합체 또는 제약 제제.
  27. i) N-위치에서 C1-C3 알킬 기로 치환되는 4개의 히드록시피리디논 (HOPO) 모이어티 및 카르복실산 기에서 종결하는 커플링 모이어티를 포함하는 옥타덴테이트 킬레이트화제;
    ii) 적어도 1개의 아민 모이어티를 포함하는 적어도 1종의 조직-표적화 펩티드 또는 단백질;
    iii) 적어도 1종의 아미드-커플링 시약; 및
    iv) 임의로 및 바람직하게는 알파-방출 토륨 방사성핵종, 예컨대 227Th
    을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트.
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