ES2857813T3 - Anticuerpos anti pd-1 y anti-lag3 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo anti-PD1 que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); o, (b) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); o, (c) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti pd-1 y anti-lag3 para el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas novedosas de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales moléculas de anticuerpos; a procedimientos para preparar tales moléculas de anticuerpos; a células hospederas que expresan o son capaces de expresar tales moléculas de anticuerpos; a composiciones que comprenden tales moléculas de anticuerpos; y a los usos de tales moléculas de anticuerpos o tales composiciones, en particular con fines terapéuticos en el campo de las enfermedades cancerígenas. La divulgación técnica detallada que se expone más abajo puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no están destinados a definir la invención como tal (que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien a colocarla en un contexto técnico más amplio. En consecuencia, se apreciará que los términos "realizaciones", "aspectos", "tema" reflejan detalles específicos de la divulgación, pero en la medida en que se refieren a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no se pretende definir como parte del tema de la invención que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes
El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por un crecimiento celular anormal localizado con el potencial de extenderse por todo el cuerpo. En el mundo desarrollado es la segunda causa de muerte más común. Los tipos de cáncer más comunes en los hombres son el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata, el cáncer colorrectal y el cáncer de estómago, y en las mujeres, los tipos más comunes son el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón y el cáncer de cuello uterino. Si bien las posibilidades de supervivencia dependen principalmente del tipo de cáncer y la etapa a la hora de la identificación, para el cáncer de pulmón la tasa de supervivencia general de 10 años es de alrededor del 5 %.
En el pasado, los medios más frecuentes para tratar los cánceres tumorales (denominados "oncología") eran la cirugía, la radioterapia o el uso de fármacos quimioterápicos. Sin embargo, en los últimos años, la inmunoterapia contra el cáncer ha mostrado ser muy prometedora como modalidad de tratamiento para la oncología.
La inmunoterapia contra el cáncer es una rama de la oncología en la que se usa el sistema inmunológico para tratar el cáncer, lo que contrasta con los procedimientos de tratamiento comunes existentes en los que el tumor se extirpa o trata directamente. Este concepto terapéutico es en base a la identificación de una serie de proteínas en la superficie de las células T, que actúan para inhibir la función inmunológica de estas células. Entre estas proteínas se encuentra la PD1.
La PD1 (muerte celular programada 1) es una proteína receptora de la superficie celular expresada en células T. La proteína funciona como un inhibidor de un "punto de control inmunológico", es decir, esta actúa para modular la actividad de las células en el sistema inmunológico tanto para regular y limitar las enfermedades autoinmunes. Recientemente se ha entendido que muchos cánceres pueden protegerse del sistema inmunológico mediante la modificación de los inhibidores del "punto de control inmunológico" y de este modo evitar la detección.
Con respecto a la PD1, esta proteína tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2, que interactúan con el receptor de superficie celular. Al unirse, la PD-1 indujo una señal intracelular que regula negativamente la respuesta de las células T.
Como se detalló anteriormente, la PD1 es un regulador clave de la actividad de las células T. Recientemente, se ha mostrado en una variedad de escenarios de cáncer diferentes que las moléculas de anticuerpos antagonistas contra la PD-1 nivolumab y pembrolizumab pueden usarse para estimular el sistema inmunológico y, de esta manera, tratar el cáncer.
El gen 3 de activación de linfocitos (LAG3; CD223) es una proteína transmembrana de tipo I que se expresa principalmente en la superficie celular de las células T activadas, pero también se encontró que el LAG3 en subconjuntos de células NK y dendríticas está estrechamente relacionado con CD4, que es un correceptor para Activación de células T colaboradoras. Ambas moléculas tienen cuatro dominios extracelulares similares a Ig y requieren unirse a sus ligandos, el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II, para su actividad funcional. Al unirse al MHC-II, el LAG3 indujo una señal intracelular que regula negativamente la respuesta de las células T. Estudios recientes han revelado que el LAG3 y la PD1 se coexpresan en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), lo que sugiere que pueden contribuir a la supresión inmunológica mediada por tumores. Se cree que la exposición crónica a los antígenos conduce a una inactivación progresiva de las células T a través de un procedimiento denominado "agotamiento".
Las células T agotadas a menudo coexpresan receptores de regulación negativa como la PD1 y el LAG3.
A pesar de los resultados clínicos alentadores de los anticuerpos monoclonales antagonistas de la PD1 nivolumab y pembrolizumab, hasta el 70 % de los pacientes tratados no responden al tratamiento. Los datos preclínicos con células T derivadas de pacientes, así como también de modelos de ratón con tumores singénicos, han demostrado que las células T derivadas de tumores expresan con frecuencia otros receptores inhibidores además de la PD1. La neutralización combinada de la PD1 y el LAG3 mediante el uso de moléculas de anticuerpos monoclonales antagonistas aumentó la reactivación de las células T y mejoró el rechazo del tumor en comparación con la neutralización de la PD1 sola, en modelos in vitro e in vivo. En base a estos resultados, se espera que la neutralización del LAG3 mejore la eficacia de los mAb antagonistas de la PD1.
(U.S. Food § Drug Admininstratiom, Highlights of prescribing information - OPDIVO-. ID de Referencia: 3677021, https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2014/125554lbl.pdf) describe OPDIVO (nivolumab) que se indica para el tratamiento de pacientes con melanoma irresectable o metastásico y progresión de la enfermedad después de ipilimumab y, si la mutación BRAF V600 es positiva, un inhibidor de BRAf . Sin embargo, las moléculas de anticuerpo anti-PD1 existentes sufren de problemas asociados con el fracaso de una gran proporción de pacientes para responder al tratamiento. Por lo tanto, existe una necesidad de identificar anticuerpos monoclonales antagonistas de la PD1 más eficaces con perfiles de efectos secundarios manejables en comparación con los medicamentos de anticuerpos existentes en la técnica anterior cuando se usan solos o en combinación con otras moléculas terapéuticas, particularmente moléculas antagonistas adicionales para inhibidores adicionales de puntos de control de células T.
A partir de estos antecedentes, los inventores buscaron generar anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 adicionales que tuvieran un perfil terapéutico mejorado sobre las moléculas conocidas.
Breve sumario de la invención
La invención es según se define en las reivindicaciones adjuntas. En resumen, se trata de nuevas moléculas de anticuerpos anti-PD1. Como se describe adicionalmente en la presente memoria, las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención tienen propiedades sorprendentes y ventajosas sobre otros anticuerpos anti-PD1. En particular, demuestran una activación mejorada de las células T y una vida media terminal más prolongada que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de referencia. Como se apreciará, tales propiedades son deseables para moléculas de anticuerpo anti-PD1 para su uso en el tratamiento de cánceres.
También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo anti-PD1, vectores de expresión, células hospederas y procedimientos de producción de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención. Las moléculas de anticuerpo anti-PD-1 divulgadas en la presente memoria pueden usarse para tratar trastornos cancerígenos, que incluye tumores de tejidos sólidos y blandos.
Más específicamente, una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención comprende: (a) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (hcCDRI), SeQ ID NO: 2 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); o, b) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 7 (hcCDR1), SEQ iD NO: 8 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); o (c) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).
Además, la activación de las células T mejora cuando los anticuerpos anti-LAG3 divulgados en la presente memoria se usan en combinación con las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención en lugar de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 y las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de referencia. Como se apreciará, tales propiedades son deseables para moléculas de anticuerpo anti-LAG3 para su uso en el tratamiento
En consecuencia, la invención contempla composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos PD-1 de la invención y anticuerpos anti-LAG3, así como también la combinación de los mismos para su uso en el tratamiento del cáncer, particularmente NSCLC.
De acuerdo con un aspecto preferente, una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación se une a un epítopo del LAG3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos LlRRAGVT (SEQ ID NO: 111) y/o YRAAVHLRd Ra (SEQ ID NO: 112). En la presente memoria se proporcionan procedimientos para determinar el epítopo al que se une un anticuerpo.
De acuerdo con un aspecto preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación comprende (a) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); o (b) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), SEQ ID No : 46 (hcCDR2) y SeQ ID NO: 47 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, también se proporcionan procedimientos para el tratamiento de cánceres en los que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención pueden usarse en combinación con las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación, que pueden administrarse simultáneamente, concurrentemente, secuencialmente, sucesivamente o por separado, con las moléculas de anticuerpo anti-PD1. Leyendas de las figuras
Figura 1: Secuencias de aminoácidos del dominio variable de moléculas de anticuerpo anti-PD1. 77E11 es el nombre del anticuerpo progenitor murino. PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5 son anticuerpos anti-PD1 como se define en la presente memoria. Las secuencias CDR están subrayadas. VK 77E11 (SEQ ID NO: 113); VK PD1-1 (SEQ ID NO: 20); VK PD1-2; (SEQ ID NO: 22); VK PD1-3 (SEQ ID NO: 24); VK PD1-4, (SEQ ID NO: 26); VK PD1-5 (SEQ ID NO: 28); VH 77E11 (SEQ ID NO: 114); VH PD1-1 (SEQ ID NO: 19); VH PD1-2; (SEQ ID NO: 21); VH PD1-3 (SEQ ID NO: 23); VH PD1-4, (SEQ ID NO: 25); VH PD1-5 (SEQ ID NO: 27).
Figura 2: Inhibición de la unión del PD1-L1/L2 humano a la PD1 por moléculas de anticuerpo anti-PD1. (A) Muestra que los anticuerpos anti-PD1 de la invención inducen el bloqueo de la unión del PD-L1 a la PD-1 humana expresada en la superficie de las células CHO. (B) Muestra que los anticuerpos anti-PD1 de la invención inducen el bloqueo de la unión del PD-L2 a la PD-1 humana expresada en la superficie de las células CHO. Figura 3: Estimulación de la respuesta de células T antígeno específica por moléculas de anticuerpo anti-PD1. Muestra la capacidad de los anticuerpos anti-PD1 de la invención para estimular la producción de interferón-gamma (IFN-gamma) de células T de memoria CD4 específicas del tétanos de cuatro donantes individuales. Para este ensayo, las células T de PBMC derivadas de donantes sanos se expandieron en presencia de toxoide tetánico y se co-cultivaron con células dendríticas (DC) maduras autólogas cargadas con toxoide tetánico durante 2 días. La etapa de co-cultivo se repitió una segunda vez de manera similar en presencia de la PD1-1 y la PD1-3. Al final de la segunda etapa de co-cultivo, se evaluaron los sobrenadantes para determinar los niveles de IFN-gamma mediante ELISA.
Figura 4: Eficacia in vivo de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 en un modelo de ratón con inserción de gen de hpd-1. Muestra curvas individuales de crecimiento de ratones portadores de tumores de la línea celular carcinoma de colon (MC38). Los ratones se trataron con (A) PBS q3or4d, (B) Isotipo q3or4d, (C) PD1-3 q3or4d o (D) PD1-3 como dosis única. Se dosificaron la PD1-3 y el isotipo a 10 mg/kg.
Figura 5: Farmacocinética preclínica de moléculas de anticuerpos anti-PD1. Los parámetros farmacocinéticos de los anticuerpos contra la PD1 tras la dosificación intravenosa se trazan en relación a las dosis administradas a monos Cynomolgus. (A) Área bajo la curva (AUC), (B) concentración plasmática máxima (Cmáx), (C) aclaramiento plasmático (CL), (D) vida media de eliminación en fase terminal (t-i/2,z ).
Figura 6: Secuencias de aminoácidos del dominio variable de moléculas de anticuerpo anti-LAG3. 496G6 es el nombre del anticuerpo progenitor murino. LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5 son anticuerpos anti-LAG3 como se definen en la presente memoria. VK 496G6 (SEQ ID NO: 117); VK LAG3-1 (SEQ ID NO: 52); VK LAG3-2; (SEQ ID NO: 54); VK LAG3-3 (SEQ ID NO: 56); VK LAG3-4, (SEQ ID NO: 58); VK LAG3-5 (SEQ ID NO: 60); VH 496G6 (SEQ ID NO: 118); VH LAG3-1 (SEQ ID NO: 51); VH LAG3-2; (SEQ ID NO: 53); VH LAG3-3 (SEQ ID NO: 55); VH LAG3-4, (SEQ ID NO: 57); VH LAG3-5 (SEQ ID NO: 59).
Figura 7: Inhibición de la unión del LAG3 humano a MHCII por moléculas de anticuerpo anti-LAG3. Muestra la potencia de los mAb de LAG3 indicados y los mAb de control para bloquear la unión del LAG3 recombinante a MHCII expresado en la superficie de las células Raji.
Figura 8: Estimulación de la respuesta de células T antígeno específicas por moléculas de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3. (A) Muestra un aumento en % de las combinaciones de mAb PD1/LAG3 en relación con las cantidades saturadas de pembrolizumab (Keytruda(R)). Se combinaron concentraciones fijas de 100 nm de la PD1-3 y nivolumab (Opdivo(R)) con una cantidad creciente de mAb LAG3 (LAG3-1 se muestra como línea negra o una molécula de anticuerpo de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos de BMS-986016 que se muestra como línea de puntos, un anticuerpo LAG3 antagonista). (B) Muestra un aumento en % de moléculas de mAb PD1/LAG3 de las combinaciones de la invención con respecto a la actividad de pembrolizumab (Keytruda(R)). El nivel de actividad de mAb de combinación se evaluó a 100 nm para los mAb PD1 y 200 nm para los mAb LAG3. Las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de Graph Pad Prism mediante un ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey.
Figura 9: Eficacia in vivo de la terapia de combinación de anticuerpos PD1 y LAG3 en modelos de tumores singénicos. Se muestran curvas de crecimiento individuales de ratones portadores de tumores que se trataron con anticuerpos de herramienta dos veces por semana a una dosis de 10 mg/kg. (A) Los ratones portadores de un carcinoma de colon (MC38) se trataron con PBS, anti-LAG3, anti-PD1 o la combinación de anti-PD1 y anti-LAG3. Se trataron ratones portadores de melanoma (B16-F10) (B), carcinoma de pulmón (LL/2) (C), carcinoma de colon (Colon-26) (D) o un tumor de cáncer de mama (4T1) (E) con el isotipo PD1, anti-PD1 o la combinación de anti-PD1 y anti-LAG3.
Descripción detallada
Definiciones
Los aspectos y realizaciones anteriores y otros de la invención resultarán claros a partir de la descripción adicional en la presente memoria.
A menos que se indique o defina de cualquier otra manera, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que será claro para una persona experta. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándar, como Sambrook y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2da Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990), y Roitt y otros, "Immunology" (2da Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, Nueva York (1989), así como también a los antecedentes generales de la técnica citados en la presente memoria. Además, a menos que se indique de cualquier otra manera, todos los procedimientos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida per se, como quedará claro para la persona experta. Se hace referencia de nuevo, por ejemplo, a los manuales estándar, a los antecedentes generales de la técnica mencionada anteriormente y a las referencias adicionales citadas en los mismos.
Como se usa en la presente memoria, los artículos “un” y “una” se refieren a uno o más de uno (por ejemplo, al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
El término "o" se usa en la presente memoria para denotar los términos "y/o", y se usa indistintamente con este, a menos que se indique de cualquier otra manera.
"Acerca de" y "aproximadamente" generalmente significarán un grado aceptable de error para la cantidad medida según la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados ilustrativos de error están dentro del 20 por ciento (%), típicamente, dentro del 10 %, y más típicamente, dentro del 5 % de un valor dado o rango de valores.
"Moléculas de anticuerpos" o "anticuerpos" (usados como sinónimos en la presente memoria) son proteínas de gammaglobulina que pueden encontrarse en la sangre u otros fluidos corporales de vertebrados, y son usadas por el sistema inmunológico para identificar y neutralizar objetos extraños, tales como bacterias y virus. Típicamente, están hechos de unidades estructurales básicas, cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas, para formar, por ejemplo, monómeros con una unidad, dímeros con dos unidades o pentámeros con cinco unidades. Las moléculas de anticuerpos pueden unirse, mediante interacción no covalente, a otras moléculas o estructuras conocidas como antígenos. Esta unión es específica en el sentido de que una molécula de anticuerpo solo se unirá a una estructura específica con alta afinidad. La parte única del antígeno reconocida por una molécula de anticuerpo se denomina epítopo o determinante antigénico. La parte de la molécula de anticuerpo que se une al epítopo a veces se denomina parátopo y reside en el llamado dominio variable, o región variable (Fv) del anticuerpo. El dominio variable comprende tres regiones llamadas determinantes de complementariedad (CDR) separadas por regiones marco (FR).
Dentro del contexto de la presente invención, la referencia a las CDR se basa en la definición de Chothia (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), junto con Kabat (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller y H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).
En algunos aspectos, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; particularmente, elegida de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada (por ejemplo, humana) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera (por ejemplo, humana) de kappa o lambda. La región constante puede alterarse, por ejemplo, mutarse, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o más de: la unión al receptor Fc, la glicosilación de anticuerpos, la cantidad de residuos de cisteína, la función de la célula efectora y/o la función del complemento). En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene función efectora y puede fijar el complemento. En otras realizaciones, el anticuerpo no recluta células efectoras ni fija el complemento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo tiene una capacidad reducida o nula para unirse a un receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no soporta la unión a un receptor Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor Fc mutagenizada o eliminada.
La región constante del anticuerpo se altera en algunas realizaciones. Los procedimientos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo, con afinidad alterada por un ligando efector, tal como FcR en una célula, o el componente C1 del complemento pueden producirse mediante el reemplazo de al menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver por ejemplo, EP 388, 151 A1, patente de los Estados Unidos núm. 5,624,821 y patente de los Estados Unidos núm. 5,648,260, el contenido de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia). También se contemplan mutaciones de aminoácidos que estabilizan la estructura del anticuerpo, tales como S228P (nomenclatura EU, S241P en nomenclatura Kabat) en IgG4 humana. Se podría describir un tipo similar de alteraciones que si se aplicaran a la inmunoglobulina murina o de otra especie reducirían o eliminarían estas funciones.
El término "dominio variable" como se usa en la presente memoria significa una región de la molécula de anticuerpo que consiste esencialmente en cuatro "regiones marco" que se denominan en la técnica y en lo sucesivo "región marco 1" o "FR1"; como "región marco 2" o "FR2"; como "región marco 3" o "FR3"; y como "región estructural 4" o "FR4", respectivamente; cuyas regiones marco están interrumpidas por tres "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR", que se denominan en la técnica y en lo sucesivo como "región determinante de complementariedad 1" o "CDR1"; como "región 2 determinante de complementariedad" o "CDR2"; y como "región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Por tanto, la estructura o secuencia general de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse como sigue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 -FR4. El(los) dominio(s) variable(s) de inmunoglobulina es(son) el(los) que confiere(n) especificidad a un anticuerpo por el antígeno al llevar el sitio de unión al antígeno.
Los términos "variable pesado (o VH)" y "variable ligero (o VL)" se refieren a los dominios variables de las cadenas pesada o ligera, respectivamente, de una molécula de anticuerpo.
La técnica ha desarrollado aún más las moléculas de anticuerpos y las ha convertido en herramientas versátiles en la medicina y la tecnología. Por tanto, en el contexto de la presente invención, los términos "molécula de anticuerpo" o "anticuerpo" no solo incluyen anticuerpos tal como pueden encontrarse en la naturaleza, que comprenden, por ejemplo, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, sino que además abarcan todas las moléculas que comprenden al menos un parátopo con especificidad de unión a un antígeno y similitud estructural a un dominio variable de una molécula de anticuerpo.
Por tanto, una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un fragmento de un anticuerpo, en particular un fragmento Fv, Fab, Fab' o F(ab')2, un anticuerpo monocatenario, en particular un fragmento variable monocatenario (scFv), un inmunofarmacéutico modular pequeño (SMIP), un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo, un diacuerpo.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) son anticuerpos monoespecíficos que son idénticos en la secuencia de aminoácidos. Pueden producirse mediante tecnología de hibridoma a partir de una línea celular híbrida (llamada hibridoma) que representa un clon de una fusión de una célula B productora de anticuerpos específicos con una célula de mieloma (cáncer de células B) (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-7.). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante expresión recombinante en células hospederas (Norderhaug L., Olafsen T., Michaelsen T.E., Sandlie I. (mayo de 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77-87.
Para su aplicación en el hombre, a menudo es deseable reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos derivados originalmente de otras especies, como el ratón. Esto puede realizarse mediante la construcción de anticuerpos quiméricos, o mediante un procedimiento llamado "humanización". En este contexto, se entiende que un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que comprende una parte de secuencia (por ejemplo, Un dominio variable) derivada de una especie (por ejemplo, Ratón) fusionada a una parte de secuencia (por ejemplo, Los dominios constantes) derivada de una especie diferente (por ejemplo, Humano). Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende un dominio variable derivado originalmente de una especie no humana, en el que se han mutado determinados aminoácidos para hacer que la secuencia general de ese dominio variable se parezca más a una secuencia de un dominio variable humano. Los procedimientos de quimerización y humanización de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (Billetta R., Lobuglio A.F. "Chimeric Antibodies". Int Rev Immunol. 1993; 10(2-3): 165­ 76; Riechmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G. (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323.).
Además, se han desarrollado tecnologías para crear anticuerpos en base a secuencias derivadas del genoma humano, por ejemplo, mediante presentación de fagos o uso de animales transgénicos (documento WO 90/05144;D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. Mccafferty, A.D. Griffiths y G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage". J. Mol. Biol., 222, 581-597; Knappik y otros, J. Mol.
Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen y L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2): 189-203; Lonberg N., Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995; 13(1): 65-93.; Bruggemann M., Taussig M.J. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. Agosto de 1997; 8(4): 455-8.). Tales anticuerpos son "anticuerpos humanos" en el contexto de la presente invención.
Las moléculas de anticuerpos de acuerdo con la presente invención también incluyen fragmentos de las moléculas que retienen las propiedades de unión a antígeno, como fragmentos Fab, Fab' o F(ab')2. Tales fragmentos pueden obtenerse mediante fragmentación de moléculas de anticuerpos, por ejemplo, mediante digestión proteolítica o mediante expresión recombinante de tales fragmentos. Por ejemplo, la digestión de la molécula de anticuerpo puede lograrse mediante técnicas de rutina, por ejemplo, mediante el uso de papaína o pepsina (documento WO 94/29348). La digestión de anticuerpos con papaína típicamente produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un F(ab')2. En las moléculas Fab, cada uno de los dominios variables se fusiona con un dominio constante de inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Por tanto, el dominio variable de la cadena pesada puede fusionarse con un dominio CH1 (un fragmento denominado Fd), y el dominio variable de cadena ligera puede fusionarse con un dominio CL. Las moléculas Fab pueden producirse mediante la expresión recombinante de los ácidos nucleicos respectivos en las células hospederas, ver más abajo.
Se han desarrollado varias tecnologías para colocar dominios variables de moléculas de anticuerpos, o moléculas derivadas de tales dominios variables, en un contexto molecular diferente. Aquellos también deberían considerarse como "anticuerpos" de acuerdo con la presente invención. En general, estas moléculas de anticuerpos son de menor tamaño en comparación con las moléculas de anticuerpos naturales y pueden comprender una sola cadena de aminoácidos o varias cadenas de aminoácidos. Por ejemplo, un fragmento variable monocatenario (scFv) es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de moléculas de anticuerpo, unidas con un conector corto, generalmente serina (S) o glicina (G) (documento WO 88/01649; documento WO 91/17271; Huston y otros; International Reviews of Inmunology, volumen 10, 1993, 195-217). Los "anticuerpos de dominio único" o "nanocuerpos" albergan un sitio de unión a antígeno en un dominio similar a Ig (documento WO 94/04678; documento WO 03/050531, Ward y otros, Nature. 12 de octubre de 1989; 341 (6242): 544-6; Revets y otros, Expert Opin Biol Ther. 5(1): 111-24, 2005). Uno o más anticuerpos de dominio único con especificidad de unión para el mismo o un antígeno diferente pueden unirse entre sí. Los diacuerpos son moléculas de anticuerpos bivalentes que consisten en dos cadenas de aminoácidos que comprenden dos dominios variables (documento WO 94/13804, Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 15 de julio de 1993; 90(14): 6444-8). Otros ejemplos de moléculas similares a anticuerpos son los anticuerpos de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF; Srinivasan y Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96). Un concepto diferente conduce al llamado Inmunofarmacéutico Modular Pequeño (SMIP) que comprende un dominio Fv unido a dominios de bisagra y efector de cadena simple desprovistos del dominio constante CH1 (documento WO 02/056910).
La molécula de anticuerpo puede fusionarse (como una proteína de fusión) o unirse (mediante enlaces covalentes o no covalentes) a otras entidades moleculares que tengan un impacto deseado sobre las propiedades de la molécula de anticuerpo. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar las propiedades farmacocinéticas de las moléculas de anticuerpos, la estabilidad, por ejemplo, en fluidos corporales como la sangre, en particular en el caso de anticuerpos monocatenarios o anticuerpos de dominio. Se han desarrollado varias tecnologías a este aspecto, en particular para prolongar la vida media de tales moléculas de anticuerpos en la circulación, tal como la pegilación (documento w O 98/25971; documento WO 98/48837; documento w O 2004081026), mediante la fusión o unión covalente de la molécula de anticuerpo a otra molécula de anticuerpo que tiene afinidad por una proteína sérica como la albúmina (documento WO 2004041865; documento WO 2004003019), o expresión de la molécula de anticuerpo como proteína de fusión con todo o parte de una proteína sérica como albúmina o transferrina (documento WO 01/79258).
Los términos "epítopo" y "determinante antigénico", que pueden usarse indistintamente, se refiere a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que es reconocida por moléculas de unión a antígeno, tal como moléculas de anticuerpo de la invención, y más particularmente por el sitio de unión a antígeno de dichas moléculas. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para una molécula de anticuerpo y, por tanto, representan la diana de especificidad de una molécula de anticuerpo.
Una molécula de anticuerpo que puede "unir", "unirse a", "unir específicamente", o "unirse específicamente a", que "tiene afinidad por" y/o que "tiene especificidad para" un determinado epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) se dice que está "en contra" o "dirigida contra" dicho epítopo, antígeno o proteína o es una molécula de "unión" con respecto a tal epítopo, antígeno o proteína.
Generalmente, el término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o epítopos a los que puede unirse una molécula de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno particular (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse en base a su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (Kd), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: a menor valor de Kd, es más fuerte la fuerza de unión entre un epítopo y la molécula de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad puede expresarse también como la constante de afinidad (Ka), que es 1/Kd). Como quedará claro para la persona experta (por ejemplo, en base a la divulgación adicional en la presente memoria), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se, en función del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como una molécula de la invención) y el antígeno pertinente. La avidez se relaciona tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno.
Típicamente, las proteínas de unión a antígenos (tales como las moléculas de anticuerpos de la invención) se unirán con una constante de disociación (Kd) de 10E-5 a 10E-14 moles/litro (M) o menos, y preferentemente de 10E-7 a 10E-14 moles/litro (M) o menos, más con mayor preferencia de 10E-8 a 10E-14 moles/litro, e incluso más con mayor preferencia 10E-11 a 10E-13 (medido, por ejemplo, en un ensayo de Kinexa; conocido en la técnica), y/o con una constante de asociación (Ka) de al menos 10E7 ME-1, preferentemente al menos 10E8 ME-1, con mayor preferencia al menos 10E9 ME-1, tal como al menos 10E11 ME-1. Cualquier valor de Kd superior a 10E-4 M generalmente se considera que indica una unión no específica. Preferentemente, un anticuerpo de la invención se unirá al antígeno deseado con una Kd inferior a 500 nm, preferentemente inferior a 200 nm, con mayor preferencia inferior a 10 nm, tal como inferior a 500 pm. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o epítopo puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, que incluye, por ejemplo, los ensayos descritos en la presente memoria, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición en sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica.
La afinidad de unión de una molécula de anticuerpo puede mejorarse mediante un procedimiento conocido como maduración por afinidad (Marks y otros, 1992, Biotechnology 10: 779-783; Barbas y otros, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier y otros, 1995, Gene 169: 147-155). Por lo tanto, los anticuerpos madurados por afinidad también se incluyen en la presente invención.
Los términos "competir" o "competir de forma cruzada" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a la capacidad de una molécula de anticuerpo para interferir en la unión de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-PD1 o LAG3 de la invención, a una diana, por ejemplo, la PD1 o el LAG3 humana. La interferencia en la unión puede ser directa o indirecta (por ejemplo, a través de una modulación alostérica de la molécula de anticuerpo o la diana). El grado en el que una molécula de anticuerpo es capaz de interferir con la unión de otra molécula de anticuerpo a la diana y, por lo tanto, se puede decir que compite, puede determinarse mediante un ensayo de unión competitiva, por ejemplo, un ensayo FACS, un ensayo ELISA o BIACORE. En algunas realizaciones, un ensayo de unión competitiva es un ensayo competitivo cuantitativo. En algunas realizaciones, se dice que una primera molécula de anticuerpo anti-PD1 o LAG3 compite por la unión a la diana con una segunda molécula de anticuerpo anti-PD1 o LAG3 cuando la unión de la primera molécula de anticuerpo a la diana se reduce en un 10 % o más, por ejemplo, 20 % o más, 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 55 % o más, 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, 99 % o más en un ensayo de unión competitiva (por ejemplo, un ensayo competitivo descrito en la presente memoria).
Las composiciones y procedimientos divulgados en la presente memoria abarcan polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen las secuencias especificadas, o secuencias sustancialmente idénticas o similares a estas, por ejemplo, secuencias al menos 85 %, 90 %, 95 % idénticas o superiores a la secuencia especificada. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, el término "sustancialmente idéntico" se usa en la presente memoria para referirse a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de modo que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene al menos aproximadamente 85 %, 90 %. 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada en la presente memoria. En el contexto de una secuencia de nucleótidos, el término "sustancialmente idéntico" se usa en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la primera y la segunda secuencias de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio polipeptídico estructural común o una actividad polipeptídica funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia de referencia.
Los términos "idéntico" o "por ciento de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima. Para determinar el por ciento de identidad, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse interrupciones en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). Los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) *100). En algunas realizaciones, las dos secuencias que se comparan tienen la misma longitud después de que se introducen interrupciones dentro de las secuencias, según sea apropiado (por ejemplo, al excluir la secuencia adicional que se extiende más allá de las secuencias que se comparan). Por ejemplo, cuando se comparan secuencias de regiones variables, no se consideran las secuencias líder y/o de dominio constante. Para las comparaciones de secuencias entre dos secuencias, una CDR "correspondiente" se refiere a una CDR en la misma ubicación en ambas secuencias (por ejemplo, la CDR-H1 de cada secuencia).
La determinación del por ciento de identidad o el por ciento de similitud entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente, no limitante, de un algoritmo matemático que se utiliza para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico que codifica una proteína de interés. Las búsquedas de proteína en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína de interés. Para obtener las alineaciones con interrupción con el fin de comparar, puede utilizarse el Gapped BLAST como se describió en Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo preferente, no limitante, de un algoritmo matemático que se utiliza para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programa de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, pueden usarse una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización de longitud de interrupción de 12, y una penalización por interrupción de 4. Se conocen en la técnica algoritmos adicionales para el análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM como se describió en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; y FASTA descritos en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda. Si ktup = 2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se comparan al observar pares de residuos alineados; si ktup = 1, se examinan los aminoácidos alineados individuales. Ktup puede establecerse en 2 o 1 para secuencias de proteínas, o de 1 a 6 para secuencias de ADN. El valor predeterminado, si no se especifica ktup, es 2 para proteínas y 6 para ADN. Alternativamente, la alineación de la secuencia de proteínas puede llevarse a cabo mediante el uso del algoritmo CLUSTAL W, como se describió por Higgins y otros, 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402.
Los residuos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código estándar de aminoácidos de tres letras o de una letra, como se conoce generalmente y se acepta en la técnica. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácidos" se refiere a inserciones, deleciones o sustituciones del número indicado de residuos de aminoácidos en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En caso de sustitución(es), tal(s) sustitución(es) será(n) preferentemente sustitución(es) conservadora(s) de aminoácidos, lo que significa que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que tiene poca o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo del documento WO1998/49185, en el que las sustituciones conservadoras de aminoácidos son preferentemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) - (v) se sustituye por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (i) residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares pequeños: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (sin carga): Asp, Asn, Glu y Gln; (iii) residuos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) residuos alifáticos, no polares grandes: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y (v) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos particularmente preferentes son las siguientes: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; Ile en Leu o en Val; Leu en Ile o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en Ile; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp o en Phe; Val en Ile o en Leu.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” (si es monocatenaria) se usan indistintamente en la presente memoria.
Los términos "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente.
El término "aislado", como se usa en la presente memoria, se refiere al material que se elimina de su entorno original o nativo (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún estar aislados porque tal vector o composición no es parte del entorno en el que se encuentra en la naturaleza.
Preferentemente, el ácido nucleico será parte de un vector de expresión, en el que dicha molécula de ácido nucleico está operativamente unida a al menos una secuencia reguladora, en el que tal secuencia reguladora puede ser una secuencia promotora, potenciadora o de terminación, y con la máxima preferencia una secuencia promotora heteróloga, potenciadora o de terminación.
Anticuerpos anti-pd1
Como se detalló anteriormente, la PD1 juega un papel importante en la regulación de la actividad de las células T y, por lo tanto, la actividad del sistema inmunológico. Se ha mostrado en una variedad de escenarios de cáncer diferentes que las moléculas de anticuerpos anti-PD1 antagonistas pueden aumentar la actividad de las células T mediante la activación del sistema inmunológico para atacar los tumores y así tratar el cáncer.
Sin embargo, las moléculas de anticuerpo anti-PD1 existentes sufren de problemas asociados con los efectos secundarios, y también con el fracaso de una gran proporción de pacientes para responder al tratamiento. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar moléculas de anticuerpo anti-PD1 alternativas que tengan un índice terapéutico mejorado en comparación con la técnica anterior. Tales moléculas pueden usarse en monoterapia, y también en combinación con agentes terapéuticos adicionales, en particular otros moduladores de la actividad de las células T.
En este contexto, los inventores buscaron generar anticuerpos anti-PD1 adicionales. A partir de un anticuerpo murino progenitor de PD1 (denominado 77E11), prepararon 5 derivados humanizados, que son las moléculas de anticuerpo anti-PD1 objeto de la presente invención. Las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención se denominan PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5.
Mediante el uso de un ensayo de activación de células T in vitro (descrito adicionalmente en el Ejemplo 4) examinaron las características funcionales de anticuerpos anti-PD1 representativos de la presente invención. Como puede verse en el Ejemplo 12 y la Figura 8, los anticuerpos probados fueron capaces de inducir la activación de las células T a un nivel más alto cuando se combinaron con anticuerpos anti-LAG3 en comparación con la combinación de anticuerpos anti-PD1/LAG3 de referencia, lo que sugiere que tienen una actividad terapéutica más deseable que los anticuerpos anti-PD1 de referencia.
Como puede apreciarse, esta sorprendente capacidad de los anticuerpos anti-PD1 de la presente invención para inducir la activación de células T de manera más efectiva que el anticuerpo anti-PD1 de referencia de la técnica anterior sugiere que podrían usarse para tratar el cáncer a un nivel más bajo de dosificación que el anticuerpo anti-PD1 de referencia de la técnica anterior, lo que puede permitir una aplicación terapéutica con menos efectos secundarios no deseados.
Alentados por los datos, los inventores investigaron además otras diversas características funcionales de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención. Incluida en esta evaluación estaba la determinación de las propiedades farmacocinéticas in vivo. Como se describe en el Ejemplo 7 y se muestra en la Figura 5, según se midió en monos Cynomolgus, la vida media de eliminación terminal observada para un ejemplo de los anticuerpos anti-PD1 de la presente invención a una dosis intravenosa de 1 mg/kg fue de 1,5 a 2 veces más alto que los anticuerpos anti-PD1 de la técnica anterior de referencia.
En contraste con los anticuerpos anti-PD1 conocidos en la técnica, esto sugiere que los anticuerpos anti-PD1 de la invención tienen una vida media en suero de 11 días. Esto contrasta con las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de referencia conocidas que típicamente tienen una vida media de 4 a 6 días en el rango de dosis de 0,3-3 mg/kg, como puede verse en los ejemplos adjuntos. Esta característica sorprendente de las moléculas de anticuerpo reivindicadas puede permitir que un paciente sea tratado con los anticuerpos de la invención con menos frecuencia que los de la técnica, lo que puede traducirse en una reducción en la cantidad de anticuerpo que debe suministrarse, ya sea en la forma de frecuencia reducida de administración o en cantidad reducida de anticuerpo a usar. Dado que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 pueden inducir efectos secundarios no deseados en pacientes, como se discutió anteriormente, entonces los anticuerpos anti-PD1 de la invención pueden tener una ventaja clínica significativa y sorprendente sobre la técnica.
En consecuencia, un primer aspecto de la invención proporciona moléculas de anticuerpo anti-PD1, que comprenden:
(a) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (hcCDRI), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) y SEQ iD NO: 3 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); o,
(b) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) y SEQ iD NO: 9 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); o,
(c) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).
Como se indicó anteriormente, las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención se denominan PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5. En la presente memoria se proporciona una tabla de secuencias que permite fácilmente la identificación de secuencias de aminoácidos individuales con moléculas de anticuerpo anti-PD1 específicas de la presente invención. Se proporciona un sumario en la Tabla 1 en el Ejemplo 2.
Además de las secuencias CDR como se establece en la presente memoria, las moléculas de anticuerpo de la invención incluyen secuencias de la región marco (FR) de inmunoglobulina. Estas secuencias preferentemente no son inmunogénicas en humanos y, por lo tanto, preferentemente son secuencias FR humanas o humanizadas. Las secuencias FR humanas o humanizadas adecuadas se conocen en la técnica. Pueden tomarse secuencias de FR específicamente preferentes de las realizaciones mostradas en la presente memoria, que divulgan las moléculas de anticuerpo completas y, de esta manera, las secuencias de CDR, así como las secuencias FR.
Los procedimientos de preparación de moléculas de anticuerpo del primer aspecto de la invención son bien conocidos en la técnica, y la persona experta podrá preparar fácilmente una molécula de anticuerpo que tenga las características del primer aspecto de la invención. Ejemplos de tales procedimientos se proporcionan a continuación. Para la producción de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, como las del tipo IgG1 o IgG4, ver Norderhaug y otros, J Immunol Methods 1997, 204(1): 77-87; Kipriyanow y Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004; Shukla y otros, 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39.
También se conocen los procedimientos para fabricar anticuerpos scFv mediante la expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican construcciones scFv en células hospederas (como E. Coli, Pichia pastoris o líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, CHO o NSO), que producen moléculas scFV funcionales (Rippmann y otros, Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki y otros, J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda y otros, Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253).
Para evitar dudas, cada una de las realizaciones específicas enumeradas a continuación para el primer aspecto de la invención también pueden considerarse aspectos independientes de la invención.
Una realización preferente del primer aspecto de la invención es en la que dicha molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo humanizada.
Una realización preferente adicional del primer aspecto de la invención es en la que dicha molécula de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, Fab, F(ab')2, Fv o scFv.
Los términos "humanizado", "Fab", "F(ab')2", "Fv" y "scFv" son bien conocidos en la técnica y se discuten adicionalmente en la presente memoria en la sección Definiciones de la memoria descriptiva.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. Preferentemente, la región constante de cadena pesada es IgG4 con una mutación S241P.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una región constante de cadena ligera que es kappa o lambda.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 y 27. Preferentemente, dicha molécula de anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 y 27.
En una realización preferente las moléculas de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 y 28.
Preferentemente, dicha molécula de anticuerpo tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 y 28.
Los procedimientos para calcular las identidades de la secuencia de aminoácidos son bien conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la presente memoria en la sección Definiciones de la memoria descriptiva.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.
Para todas las realizaciones anteriores se entenderá que, mediante el uso del término "que comprende", se pretende incluir también una realización en la que el dominio o molécula respectiva "consiste" en la secuencia de aminoácidos indicada.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 es capaz de unirse a la PD1 humana con una constante de disociación (KD) de menos de 10 nm.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-PD1 es capaz de unirse a la PD1 humana y a la PD1 de mono Cynomolgus con alta afinidad. En algunas realizaciones, alta afinidad se refiere a una Kd de menos de 10 nm, por ejemplo, 9, 8, 7, 6 o menos, medido por SPR. Un protocolo para determinar la Kd mediante el uso de SPR se proporciona en los ejemplos adjuntos.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 no se une a la PD1 de ratón.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 es capaz de reducir la unión del PD-L1/L2 humana con la PD1 humana. En los ejemplos adjuntos se proporciona un ensayo para determinar la unión del PD-L1/L2 humana con la PD1 humana.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-PD1 es capaz de inhibir la unión de los ligandos PD-L1 y PD-L2 a la PD1 con un ICgüde menos de 10 nm, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 nm o menos. Un protocolo para determinar la IC90 se proporciona en los ejemplos adjuntos.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-PD1 es capaz de potenciar una respuesta de células T antígeno específica. En el Ejemplo 4 se proporciona un ensayo para determinar una respuesta de células T antígeno específica.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de los primeros aspectos de la invención.
Preferentemente la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77 o 79 que codifican respectivamente el dominio variable de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 o 27. Preferentemente la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 72, 74, 76, 78 u 80 que codifican respectivamente el dominio variable de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 o 28.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención. Preferentemente, el vector de expresión contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 71 y/o la SEQ ID NO: 72, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 73 y/o la SEQ ID NO: 74, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 75 y/o la SEQ ID NO: 76, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 77 y/o la SEQ ID NO: 78, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 79 y/o la SEQ ID NO: 80.
Preferentemente, el vector de expresión comprende, además, una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN, que codifica los dominios constantes de una cadena pesada y/o el dominio constante de una cadena ligera, respectivamente, unida a la molécula de ácido nucleico, preferentemente la molécula de ADN, que codifica el dominio variable de la cadena pesada y/o el dominio variable de la cadena ligera, respectivamente.
En una realización específicamente preferente, pueden usarse dos vectores de expresión, uno de ellos para la expresión de la cadena pesada, el otro para la expresión de la cadena ligera, cuyos dos vectores de expresión pueden transfectarse luego en una célula hospedera para la expresión de proteínas recombinantes.
Preferentemente, el vector de expresión será un vector que comprende dicha molécula o moléculas de ácidos nucleicos, operativamente unida a al menos una secuencia reguladora, en la que tal secuencia reguladora puede ser una secuencia promotora, potenciadora o de terminación, y con la máxima preferencia una secuencia promotora heteróloga, potenciadora o de terminación.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se (por ejemplo, mediante síntesis automatizada de ADN y/o tecnología de ADN recombinante), en base a la información sobre las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de la invención que se proporcionan en la presente memoria.
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedera que tiene un vector de expresión que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención y un vector de expresión que codifica una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención.
De acuerdo con una realización particularmente preferente, dichas células hospederas son células eucariotas tales como células de mamíferos. En otra realización, tales células hospederas son células bacterianas. Otras células útiles son las células de levadura u otras células fúngicas.
Las células de mamíferos adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibios, células de insectos, células vegetales y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas como tal.
Anticuerpos anti-LAG3
Como se detalló anteriormente, la PD1 juega un papel importante en la regulación de la actividad de las células T y, por lo tanto, la actividad del sistema inmunológico. Se ha mostrado en una variedad de escenarios de cáncer diferentes que las moléculas de anticuerpos anti-PD1 antagonistas pueden aumentar la actividad de las células T mediante la activación del sistema inmunológico para atacar los tumores y así tratar el cáncer.
También se ha demostrado que las combinaciones de anticuerpos anti-PD1 antagonistas con moléculas de anticuerpos que se dirigen a inhibidores de puntos de control de células inmunitarias adicionales pueden potenciar las propiedades anticancerígenas de los anticuerpos anti-PD1 antagonistas. Uno de tales inhibidores de puntos de control se llama LAG3.
Al igual que con la PD1, LAG3 parece desempeñar un papel en la mediación de la actividad de las células T. Además, se conoce en la técnica que el bloqueo en duelo de la vía PD1 y LAG3 es más efectivo para la inmunidad antitumoral que el bloqueo de cualquiera de las moléculas solas.
En este contexto, los inventores buscaron generar moléculas de anticuerpo anti-LAG3 adicionales que pudieran usarse solas o en combinación con las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención. A partir de un anticuerpo murino progenitor de LAG3 (denominado 496G6), prepararon cinco derivados humanizados, que se denominan LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5.
Mediante el uso de un ensayo de activación de células T in vitro (descrito adicionalmente en el Ejemplo 12) examinaron las características funcionales de moléculas de anticuerpo anti-LAG3 representativas de la presente divulgación. Como puede verse en el Ejemplo 12 y la Figura 8, la combinación de la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación con la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención es sorprendentemente superior a las combinaciones de anticuerpos anti-PD1/LAG3 de referencia conocidas en la técnica.
Como puede apreciarse, esta superioridad de la combinación de las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación con moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención sugiere que podrían usarse para tratar el cáncer a un nivel de dosis más bajo que las terapias de anticuerpos de la técnica anterior, que pueden permitir una aplicación terapéutica con menos efectos secundarios no deseados.
Dado que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 y anti-LAG3 pueden inducir efectos secundarios no deseados en pacientes, como se discutió anteriormente, entonces los anticuerpos anti-PD1 y los anticuerpos anti-LAG3 de la divulgación pueden tener una ventaja clínica significativa y sorprendente sobre la técnica mediante el uso de una dosis menor y/o regímenes de administración menos frecuentes.
Alentados por los datos, los inventores investigaron además otras diversas características funcionales de las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. En esta evaluación se incluyó la determinación del epítopo unido por ejemplos de moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación. Como puede verse en el Ejemplo 11, los inventores determinaron que las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación pueden unirse a dos regiones distintas del LAG-3 humano, LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) y/o YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Según el conocimiento de los inventores, ningún anticuerpo anti-LAG3 conocido de la técnica anterior tiene el mismo perfil de unión al epítopo que las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. Si bien no desean vincularse a ninguna teoría en particular, los inventores especulan que la sorprendente eficacia mejorada de la combinación de estas moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación con anticuerpos anti-PD1 de la presente invención en comparación con las moléculas de la técnica anterior puede ser atribuible al perfil de unión al epítopo de las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la divulgación proporciona una molécula de anticuerpo anti-LAG3, en el que dicha molécula de anticuerpo anti-LAG3 se une a un epítopo del LAG3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) y/o YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Tales moléculas se denominan en la presente memoria como moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación.
Los procedimientos para preparar moléculas de anticuerpo anti-LAG3 que tienen tales características de unión al epítopo son bien conocidos en la técnica.
Los procedimientos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse mediante cualquiera de varios procedimientos que emplean la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpos, el cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas (Orlandi y otros, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; Winter y otros, 1991, Nature 349: 293-299) o generación de moléculas de anticuerpos monoclonales por líneas celulares en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma del virus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler y otros, 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor y otros 1985. J. Immunol. procedimientos 81: 31-42; Cote y otros, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Cole y otros, 1984. Mol. Cell. Biol. 62: 109-120). Mediante el uso de estos procedimientos, sería rutinario para la persona experta en la técnica preparar anticuerpos que tengan un sitio de unión con la especificidad necesaria para el LAG3. Las moléculas de anticuerpo candidatas pueden cribarse mediante el uso de mapeo de epítopos para determinar si se unen a las mismas secuencias de epítopos que requieren los anticuerpos anti-LAG3 de la presente divulgación. Tales procedimientos de mapeo de epítopos son bien conocidos y rutinarios en la técnica y pueden ser adoptados fácilmente por la persona experta. Además, se proporciona un ejemplo de tal metodología en el Ejemplo 11 en la presente memoria descriptiva.
Dicha molécula de anticuerpo anti-LAG3 comprende:
(a) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); o,
(b) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 (hcCDRI), SEQ ID NO: 46 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).
Como se indicó anteriormente, las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación se denominan LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5. En la presente memoria se proporciona una tabla de secuencias que permite fácilmente la identificación de secuencias de aminoácidos individuales con moléculas de anticuerpo anti-LAG3 específicas de la presente divulgación. Se proporciona un sumario en la Tabla 6 en el Ejemplo 9.
Los procedimientos para preparar moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente divulgación son bien conocidos en la técnica, y la persona experta podrá preparar fácilmente una molécula de anticuerpo. Los ejemplos de tales procedimientos se proporcionaron anteriormente en relación con los anticuerpos anti-PD1.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a las SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 y 59. Preferentemente, dicha molécula de anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 y 59.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a las SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 y 60. Preferentemente, dicha molécula de anticuerpo tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 y 60.
Los procedimientos para calcular las identidades de la secuencia de aminoácidos son bien conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la presente memoria en la sección Definiciones de la memoria descriptiva.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62.
En una realización preferente, el anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70.
Para todas las realizaciones anteriores se entenderá que, mediante el uso del término "que comprende", se pretende incluir también una realización en la que la molécula o dominio respectivo "consiste" en la secuencia de aminoácidos indicada.
En una realización preferente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es capaz de unirse al LAG3 humano con una constante de disociación (KD) de menos de 1 nm.
En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es capaz de unirse al LAG3 humano y al LAG3 de mono Cynomolgus con alta afinidad. En algunas realizaciones, alta afinidad se refiere a una Kd de menos de 0,5 nm, por ejemplo, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07 o menos, medido por SPR. Un protocolo para determinar la Kd mediante el uso de SPR se proporciona en los ejemplos adjuntos.
En una realización adicional, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 no se une al LAG3 de ratón.
En una realización adicional, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es capaz de una o más de las propiedades siguientes: (i) unirse al LAG3 de mono Cynomolgus; (ii) falta de unión al LAG3 murino; (iii) inhibe la unión de LAG3 al MHC II; y (iv) estimula una respuesta inmune.
Un aspecto adicional proporciona una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación para su uso en medicina. Un aspecto adicional proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. Preferentemente la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 91, 93, 95, 97 o 99, respectivamente, que codifican el dominio variable de cadena pesada de las SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 o 59. Preferentemente la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 92, 94, 96, 98 o 100, respectivamente, que codifican el dominio variable de cadena ligera de las SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 o 60.
Un aspecto adicional proporciona un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y/o la cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. Preferentemente, el vector de expresión contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 101 y/o la SEQ ID NO: 102, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 103 y/o la SEQ ID NO: 104, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 105 y/o la SEQ ID NO: 106, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 107 y/o la SEQ ID NO: 108, o que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 109 y/o la SEQ ID NO: 110.
En una realización específicamente preferente, pueden usarse dos vectores de expresión, uno de ellos para la expresión de la cadena pesada, el otro para la expresión de la cadena ligera, cuyos dos vectores de expresión pueden transfectarse luego en una célula hospedera para la expresión de proteínas recombinantes.
Preferentemente, el vector de expresión será un vector que comprende dicha molécula o moléculas de ácidos nucleicos, operativamente unida a al menos una secuencia reguladora, en la que tal secuencia reguladora puede ser una secuencia promotora, potenciadora o de terminación, y con la máxima preferencia una secuencia promotora heteróloga, potenciadora o de terminación.
Los ácidos nucleicos pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se (por ejemplo, mediante síntesis automatizada de ADN y/o tecnología de ADN recombinante), en base a la información sobre las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria, como se describió anteriormente con relación a los anticuerpos anti-PD1 de la presente invención.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula hospedera que tiene un vector de expresión que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación y un vector de expresión que codifica una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación.
De acuerdo con una realización particularmente preferente, dichas células hospederas son células eucariotas tales como células de mamíferos, por ejemplo, las ya expuestas anteriormente en relación con la realización de anticuerpos anti-PD1. En otra realización, tales células hospederas son células bacterianas. Otras células útiles son las células de levadura u otras células fúngicas.
Combinación de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG
Un aspecto adicional de la invención proporciona un kit de partes que comprende una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención y una molécula de anticuerpo anti-LAG3.
Preferentemente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un kit de partes que comprende una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la invención y una molécula de anticuerpo anti-PD1. Preferentemente la molécula de anticuerpo anti-PD1 es una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención. Alternativamente, puede usarse otro anticuerpo anti-PD1, como pembrolizumab o nivolumab, en tal kit de partes.
Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención. Una realización de la invención es en la que la composición farmacéutica comprende además una molécula de anticuerpo anti-LAG3. Preferentemente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 descrita en la presente memoria.
Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la invención. En un aspecto, la composición farmacéutica comprende además una molécula de anticuerpo anti-PD1. Preferentemente la molécula de anticuerpo anti-PD1 es una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención. Alternativamente, puede usarse otro anticuerpo anti-PD1, como pembrolizumab o nivolumab, en tal composición farmacéutica.
Será evidente para la persona experta que, en base a lo anterior, también se divulgan en la presente, composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad (como se especifica con más detalle a continuación) mediante el uso de las moléculas de anticuerpo expuestas anteriormente, así como también procedimientos para tratar una enfermedad (como se especifica con más detalle a continuación) al hacer uso de tales composiciones farmacéuticas o moléculas de anticuerpos de la invención.
Cuando la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención y la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación deben administrarse simultáneamente a través de la misma vía de administración, estas pueden administrarse como formulaciones o composiciones farmacéuticas diferentes o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada. También, cuando la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención y la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación van a usarse como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada uno de los anticuerpos puede administrarse en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen como se usa cuando uno de los anticuerpos se usa solo, y tal uso combinado puede conducir o no a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de los anticuerpos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno o ambos anticuerpos, mientras se logra aún la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil, por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que esté asociado con el uso de uno o ambos anticuerpos cuando se usan en sus cantidades habituales, mientras se obtiene aún el efecto farmacológico o terapéutico deseado.
Composiciones farmacéuticas y su administración
La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de anticuerpo de la invención.
Las moléculas de anticuerpo de la invención y/o las composiciones que las comprenden pueden administrarse a un paciente que las necesite de cualquier manera adecuada, en función de la formulación o composición farmacéutica específica que se utilice. Por tanto, las moléculas de anticuerpo de la invención y/o las composiciones que las comprenden pueden, por ejemplo, administrarse por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), transdérmica, oral, sublingual (por ejemplo, en forma de tableta sublingual, aspersión o gota colocada debajo de la lengua y adsorbida a través de las membranas mucosas hacia la red capilar debajo de la lengua), (intra-)nasal (por ejemplo, en forma de aspersión nasal y/o como aerosol), tópica, por medio de un supositorio, por inhalación, o de cualquier otra forma adecuada en una cantidad o dosis efectiva.
Las moléculas de anticuerpo de la invención y/o las composiciones que las comprenden se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuado para tratar y/o aliviar la enfermedad, trastorno o afección que va a tratarse o aliviarse. El médico generalmente será capaz de determinar un régimen de tratamiento adecuado, en función de factores como la enfermedad, trastorno o afección que va a tratarse o aliviarse, la gravedad de la enfermedad, la gravedad de los síntomas de la misma, las moléculas de anticuerpos específicas de la invención que va a utilizarse, la vía de administración y la formulación o composición farmacéutica específica que va a usarse, la edad, sexo, peso, dieta, estado general del paciente y factores similares bien conocidos por el médico. Generalmente, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más moléculas de anticuerpo de la invención, o de una o más composiciones que las comprenden, en cantidades o dosis terapéuticamente efectivas.
Generalmente, para el tratamiento y/o alivio de las enfermedades, trastornos y afecciones mencionadas en la presente memoria y en función de la enfermedad, trastorno o afección específicos que va a tratarse, la potencia de la molécula de anticuerpo específico de la invención que va a usarse, la ruta específica de administración y la formulación o composición farmacéutica específica usada, las moléculas de anticuerpo de la invención generalmente se administrarán en una cantidad entre 0,005 y 20,0 mg por kilogramo de peso corporal y dosis, preferentemente entre 0,05 y 10,0 mg/kg/dosis, y con mayor preferencia entre 0,5 y 10 mg/kg/dosis, ya sea de forma continua (por ejemplo, por infusión) o con mayor preferencia como dosis únicas (tales como, por ejemplo, dos veces a la semana, dosis semanales o mensuales; ver a continuación), pero puede variar significativamente, especialmente, en función de los parámetros antes mencionados. Por tanto, en algunos casos puede ser suficiente usar menos de la dosis mínima dada anteriormente, mientras que en otros casos puede ser necesario exceder el límite superior. Cuando se administran grandes cantidades, puede ser aconsejable dividirlas en varias dosis más pequeñas repartidas a lo largo del día.
En función de la molécula de anticuerpo específica de la invención y sus propiedades farmacocinéticas específicas y otras, puede administrarse diariamente, cada dos, tres, cuatro, cinco o seis días, semanalmente, mensualmente y similares. Un régimen de administración podría incluir un tratamiento semanal a largo plazo. Por "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferentemente meses o años de duración.
La eficacia de las moléculas de anticuerpo de la invención, y de las composiciones que las comprenden, puede probarse mediante el uso de cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo en vivo y/o modelo animal conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, en función de la enfermedad específica involucrada. Los ensayos y modelos animales adecuados serán claros para la persona experta y, por ejemplo, incluyen los ensayos y modelos animales usados en los Ejemplos a continuación.
Para uso farmacéutico, las moléculas de anticuerpo de la invención pueden formularse como una preparación farmacéutica que comprende (i) al menos un anticuerpo de la invención (es decir, un anticuerpo anti-PD1 de la invención o un anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación o ambos tipos de anticuerpos de la invención juntos) y (ii) al menos un portador, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y (iii) opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacológicamente activos adicionales. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el material respectivo no muestra ningún efecto biológico o indeseable cuando se administra a un individuo y no interactúa de manera perjudicial con ninguno de los otros componentes de la composición farmacéutica (tal como, por ejemplo, el ingrediente farmacéuticamente activo) en el que está contenido. Pueden encontrarse ejemplos específicos en manuales estándar, tal como, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, Estados Unidos (1990). Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocida per se para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos convencionales y otras proteínas farmacéuticamente activas. Por tanto, de acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere a una composición o preparación farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo de la invención y al menos un vehículo, diluyente, excipiente, adyuvante y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más sustancias farmacológicamente activas. Las preparaciones farmacéuticas para administración parenteral, tales como inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o infusión intravenosa pueden ser, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo y que son adecuados, opcionalmente después de una etapa de disolución o dilución adicional, para la infusión o inyección. Los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones incluyen, por ejemplo, sin limitación, agua estéril y soluciones y tampones acuosos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank; aceites de agua; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol, así como también aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja, así como también mezclas adecuadas de los mismos.
Las soluciones de las moléculas de anticuerpo de la invención también pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos, tales como agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, phidroxibenzoatos, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal (sales de metales alcalinos de) ácido etilendiaminotetraacético y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. Opcionalmente, pueden usarse emulsionantes y/o dispersantes. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. También pueden añadirse otros agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones pueden cargarse en viales de inyección, ampollas, botellas de infusión y similares.
En todos los casos, la forma de dosificación final debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguido de la esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones filtradas, previamente esterilizadas.
Normalmente, se preferirán las soluciones o suspensiones acuosas. Generalmente, las formulaciones adecuadas para proteínas terapéuticas tales como los anticuerpos de la invención son soluciones proteicas tamponadas, tales como soluciones que incluyen la proteína en una concentración adecuada (tal como de 0,001 a 400 mg/ml, preferentemente de 0,005 a 200 mg/ml, con mayor preferencia de 0,01 a 200 mg/ml, con mayor preferencia de 1,0 a 100 mg/ml, tal como 1,0 mg/ml (administración i.v.) o 100 mg/ml (administración s.c.) y un tampón acuoso tal como:
- Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4,
- Otros tampones de fosfato, pH de 6,2 a 8,2,
- Tampones de acetato, pH de 3,2 a 7,5, preferentemente pH de 4,8 a 5,5
- Tampones de histidina, pH de 5,5 a 7,0,
- Tampones de succinato, pH de 3,2 a 6,6, y
- Tampones de citrato, pH de 2,1 a 6,2,
y, opcionalmente, sales (por ejemplo, NaCl) y/o azúcares (tales como, por ejemplo, sacarosa y trehalosa) y/u otros polialcoholes (tales como, por ejemplo, manitol y glicerol) para proporcionar isotonicidad de la solución.
Las soluciones de proteína tamponadas preferentes son soluciones que incluyen aproximadamente 0,05 mg/ml del anticuerpo de la invención disuelto en tampón fosfato de 25 mM, pH 6,5, ajustado a isotonicidad al añadir 220 mM de trehalosa. Además, en tales soluciones pueden incluirse otros agentes tales como un detergente, por ejemplo, Tween-20 o Tween-80 al 0,02 %. Las formulaciones para la aplicación subcutánea pueden incluir concentraciones significativamente más altas del anticuerpo de la invención, tal como hasta 100 mg/ml o incluso por encima de 100 mg/ml. Sin embargo, estará claro para la persona experta en la técnica que los ingredientes y las cantidades de los mismos que se proporcionaron anteriormente sólo representan una opción preferente. Las alternativas y variaciones de las mismas resultarán inmediatamente evidentes para la persona experta, o pueden concebirse fácilmente a partir de la divulgación anterior.
La administración del anticuerpo puede implicar el uso de un dispositivo, como una jeringa, un inyector, una microbomba u otro dispositivo.
Usos terapéuticos
Un aspecto adicional proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención. En una realización preferente, el procedimiento comprende además administrar a tal paciente una molécula de anticuerpo anti-LAG3. Preferentemente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación.
Un aspecto adicional de la invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, preferentemente en combinación con una molécula de anticuerpo anti-LAG3.
Preferentemente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación. Un aspecto adicional es el uso de la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención para preparar una composición farmacéutica para tratar el cáncer. En una realización preferente, el aspecto comprende además el uso adicional de una molécula de anticuerpo anti-LAG3. Preferentemente, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación.
En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD1 debe administrarse de forma simultánea, concurrente, secuencial, sucesiva, alternativa o separada, con la molécula de anticuerpo anti-LAG3.
También se divulga un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la invención. En una realización preferente, el procedimiento comprende además administrar a tal paciente una molécula de anticuerpo anti-PD1, y preferentemente una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención.
Un aspecto adicional proporciona una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer. En una realización preferente, el aspecto comprende además el uso adicional de una molécula de anticuerpo anti-PD1. Preferentemente la molécula de anticuerpo anti-PD1 es una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención.
Un aspecto adicional es el uso de la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación para preparar una composición farmacéutica para tratar el cáncer. En una realización preferente, el aspecto comprende además el uso adicional de una molécula de anticuerpo anti-PD1. Preferentemente la molécula de anticuerpo anti-PD1 es una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención.
En una realización, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 debe administrarse de forma simultánea, concurrente, secuencial, sucesiva, alternativa o separada, con la molécula de anticuerpo anti-PD1.
Para evitar dudas, los aspectos de uso médico pueden comprender cualquiera de la molécula de anticuerpo anti-PD1 específica de la invención y/o la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación como se describió anteriormente.
Debido a sus propiedades biológicas, estos anticuerpos son adecuados para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una proliferación celular excesiva o anormal, tal como el cáncer.
Como se usa en la presente memoria, el término "cáncer' pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados de manera maligna, independientemente del tipo histopatológico o etapa de invasividad. Los ejemplos de trastornos cancerígenos incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, cánceres hematológicos, tumores de tejidos blandos y lesiones metastásicas. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen tumores malignos, por ejemplo, sarcomas y carcinomas (que incluyen adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas) de los diversos sistemas de órganos, tales como los que afectan el hígado, pulmón, mama, linfoide, gastrointestinal (por ejemplo, colon), tracto genitourinario (por ejemplo, células renales y uroteliales), próstata y faringe. Los adenocarcinomas incluyen cánceres malignos tales como la mayoría de los cánceres del colon, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de hígado, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer del intestino delgado y cáncer de esófago. Los carcinomas de células escamosas incluyen tumores malignos, por ejemplo, en el pulmón, esófago, piel, región de la cabeza y el cuello, cavidad oral, ano y cuello uterino. En una realización, el cáncer es un melanoma, por ejemplo, un melanoma en etapa avanzada. Las lesiones metastásicas de los cánceres antes mencionados también pueden tratarse o prevenirse mediante el uso de los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria.
Los cánceres ilustrativos cuyo crecimiento puede inhibirse mediante el uso de las moléculas de anticuerpos divulgadas en la presente memoria incluyen cánceres que típicamente responden a la inmunoterapia.
Por ejemplo, los siguientes cánceres, tumores y otras enfermedades proliferativas pueden tratarse con anticuerpos de acuerdo con la invención, sin restringirse a ellos:
Cánceres de cabeza y cuello; cánceres de pulmón, tales como, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC); neoplasias del mediastino, tales como, por ejemplo, tumores neurogénicos y tumores mesenquimales; cánceres del tracto gastrointestinal (GI), tales como, por ejemplo, cánceres de esófago, estómago (cáncer gástrico), páncreas, hígado y vías biliares (que incluyen, por ejemplo, carcinoma hepatocelular (HCC)) y del intestino delgado y grueso (que incluye, por ejemplo, cáncer colorrectal); cánceres de próstata; cánceres de testículo; cánceres ginecológicos, tales como, por ejemplo, cánceres de ovario; cánceres de mama, tales como, por ejemplo, carcinoma de mama, cáncer de mama con receptor hormonal positivo, cáncer de mama positivo para Her2 y cáncer de mama triple negativo; cánceres del sistema endocrino; sarcomas de tejidos blandos, tales como, por ejemplo, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi; sarcomas del hueso, tales como, por ejemplo, mieloma, osteosarcoma, tumor de Ewing, fibrosarcoma, osteocondroma, osteoblastoma y condroblastoma; mesoteliomas; cánceres de piel, tales como, por ejemplo, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de Merkel y melanoma; neoplasias del sistema nervioso central y del cerebro, tales como, por ejemplo, astrocitoma, glioblastoma, gliomas, neuroblastomas y retinoblastomas; linfomas y leucemias tales como, por ejemplo, linfomas no Hodgkin (NHL) de células B, linfomas no Hodgkin de células T, leucemia linfocítica de células B (B-CLL) crónica, leucemia linfocítica de células T (T-CLL) crónica, enfermedad de Hodgkin enfermedad (HD), leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielógena/mieloide aguda (AML), leucemia linfática/linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiple (MM), plasmacitoma y síndromes mielodisplásicos (MDS); y cánceres de sitio primario desconocido.
En una realización preferente el cáncer es un cáncer de pulmón, preferentemente un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Se pretende que todos los cánceres, tumores, neoplasias, etc., mencionados anteriormente, que se caracterizan por su ubicación/origen específico en el cuerpo, incluyan tanto los tumores primarios como los tumores metastásicos derivados de los mismos.
Es posible que un paciente tenga más probabilidades de responder al tratamiento con una molécula de anticuerpo de la invención (como se describe en la presente memoria) si ese paciente tiene un cáncer que se caracteriza por tener una alta expresión del PD-L1, y/o donde el cáncer está infiltrado por células inmunes antitumorales, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores.
En particular, el paciente que va a tratarse puede tener un cáncer que se caracteriza por tener una alta expresión del PD-L1 y/o donde el cáncer está infiltrado por células inmunes antitumorales.
Además, es posible que un paciente tenga más probabilidades de responder al tratamiento con una molécula de anticuerpo de la invención (como se describe en la presente memoria) si ese paciente tiene un cáncer que se caracteriza por tener una alta carga mutacional. Los ejemplos de cómo puede evaluarse la alta carga mutacional incluyen determinar si el cáncer se caracteriza por tener inestabilidades de microsatélites o pobres eficiencias en la reparación de errores de emparejamiento del a Dn . Se cree que tales cánceres son más inmunogénicos y, por tanto, es más probable que respondan al tratamiento con regímenes terapéuticos inmunomoduladores, tal como una molécula de anticuerpo de la invención. En particular, el paciente que va a tratarse puede tener un cáncer que se caracteriza por tener una alta carga mutacional.
Las moléculas de anticuerpo de la invención pueden usarse en regímenes terapéuticos en el contexto de tratamientos de primera línea, segunda línea o cualquier otra línea.
Las moléculas de anticuerpo descritas en la presente memoria pueden usarse para la prevención, el tratamiento a corto o largo plazo de las enfermedades mencionadas anteriormente, opcionalmente también en combinación con radioterapia y/o cirugía.
Por supuesto, lo anterior también incluye el uso de las moléculas de anticuerpo descritas en la presente memoria en varios procedimientos de tratamiento de las enfermedades anteriores mediante la administración de una dosis terapéuticamente efectiva a un paciente que lo necesita, así como también el uso de estas moléculas de anticuerpo para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de tales enfermedades, así como también las composiciones farmacéuticas que incluyen las moléculas de anticuerpos descritas en la presente memoria, así como también la preparación y/o fabricación de medicamentos que incluyen tales anticuerpos.
Una molécula de anticuerpo de la invención, o la combinación de un anticuerpo anti-PD1 de la invención y un anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación puede usarse por sí solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en particular seleccionados de agentes quimioterapéuticos como agentes que dañan el ADN o compuestos terapéuticamente activos que inhiben la angiogénesis, las vías de transducción de señales o los puntos de control mitóticos en las células cancerígenas.
El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente, opcionalmente como un componente de la misma preparación farmacéutica, o antes o después de la administración de la molécula de anticuerpo.
En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser, sin limitación, uno o más inhibidores seleccionados del grupo de inhibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, auroraa, aurorab, PLK y quinasa PI3, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R o IR.
Otros ejemplos de agentes terapéuticos adicionales son inhibidores de CDK, Akt, src/bcr abl, ckit, cmet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas de hedgehog, inhibidores de JAK/STAT, Mek, mtor, nfkappab, el proteasoma, Rho, un inhibidor de la señalización de wnt o un inhibidor de la vía de ubiquitinación u otro inhibidor de la vía de señalización de Notch.
Ejemplos de inhibidores de Aurora son, sin limitación, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.
Un ejemplo de inhibidor de PLK es GSK-461364.
Ejemplos de inhibidores de raf son BAY-73-4506 (también un inhibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (también un inhibidor de VEGFR), sorafenib (también un inhibidor de VEGFR) y XL 281.
Ejemplos de inhibidores de KSP son ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 y SB-743921.
Ejemplos de inhibidores de src y/o bcr-abl son dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (también un inhibidor de IGF-1R), nilotinib (también un inhibidor de PDGFR y ckit), imatinib (también un inhibidor de ckit) y NS-187.
Un ejemplo de inhibidor de PDK1 es BX-517.
Un ejemplo de inhibidor de Rho es BA-210.
Ejemplos de inhibidores de la quinasa PI3 son PX-866, BEZ-235 (también un inhibidor de mtor), XL 418 (también un inhibidor de Akt), XL-147 y XL 765 (también un inhibidor de mtor).
Ejemplos de inhibidores de cmet o HGF son XL-184 (también un inhibidor de VEGFR, ckit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (también un inhibidor de VEGFR), MGCD-265 (también un inhibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 y AV-299.
Un ejemplo de inhibidor de c-Myc es CX-3543.
Ejemplos de inhibidores de Flt3 son AC-220 (también un inhibidor de ckit y PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (también un inhibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (también un inhibidor de JAK2), XL-999 (también un inhibidor de ckit, FGFR, PDGFR y VEGFR), sunitinib (también inhibidor de PDGFR, VEGFR y ckit) y tandutinib (también inhibidor de PDGFR y ckit).
Ejemplos de inhibidores de HSP90 son tanespimicina, alvespimicina, IPI-504 y CNF 2024.
Ejemplos de inhibidores de JAK/STAT son CYT-997 (que también interactúa con tubulina), TG 101348 (también inhibidor de Flt3) y XL-019.
Ejemplos de inhibidores de Mek son ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 y XL 518.
Ejemplos de inhibidores de mtor son temsirolimus, AP-23573 (que también actúa como inhibidor de VEGF), everolimus (además un inhibidor de VEGF). XL-765 (también un inhibidor de la quinasa PI3) y BEZ-235 (también un inhibidor de la quinasa PI3).
Ejemplos de inhibidores de Akt son perifosina, GSK-690693, RX-0201 y triciribina.
Ejemplos de inhibidores de ckit son AB-1010, OSI-930 (también actúa como un inhibidor de VEGFR), AC-220 (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), axitinib (también un inhibidor de VEGFR y PDGFR), XL-999 (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR) y XL-820 (también actúa como un inhibidor de VEGFR y PDGFR ), imatinib (también un inhibidor de bcr-abl), nilotinib (también un inhibidor de bcr-abl y PDGFR).
Ejemplos de antagonistas de hedgehog son IPI-609 y CUR-61414.
Ejemplos de inhibidores de CDK son seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (que también inhibe a VEGFR2 y PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 y AG 024322.
Ejemplos de inhibidores del proteasoma son bortezomib, carfilzomib y NPI-0052 (también un inhibidor de nfkappab). Un ejemplo de un inhibidor de la vía de nfkappab es NPI-0052.
Un ejemplo de un inhibidor de la vía de ubiquitinación es HBX-41108.
En realizaciones preferentes, el agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico.
Ejemplos de agentes anti-angiogénicos son inhibidores de FGFR, PDGFR y VEGFR o los ligandos respectivos (por ejemplo, inhibidores de VEGF como pegaptanib o el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab) y talidomidas, tales agentes se seleccionan, sin limitación, de nintedanib, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (también un inhibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (fármacos inmunomoduladores), CC-4047 derivado de talidomida, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (también un inhibidor de ckit y Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (también un inhibidor de Flt3), sunitinib (también un inhibidor de ckit y Flt3), axitinib (también un inhibidor de cKit), lestaurtinib (también un inhibidor de Flt3 y PKC), vatalanib, tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, tosilato de sorafenib (también un inhibidor de Raf), RAF-265 (también un inhibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (también inhibidor de EGFR y Her2), Ba Y-57-9352 (también inhibidor de Raf), BAY-73-4506 (también inhibidor de Raf), XL 880 (también inhibidor de cMet), XL-647 (también inhibidor de EGFR y EphB4), XL 820 (también inhibidor de cKit) y nilotinib (también inhibidor de cKit y brc-abl).
El agente terapéutico adicional también puede seleccionarse de inhibidores de EGFR, puede ser un inhibidor de EGFR de molécula pequeña o un anticuerpo anti-EGFR. Ejemplos de anticuerpos anti-EGFR, sin limitación, son cetuximab, panitumumab, matuzumab; ejemplos de un inhibidor de EGFR de molécula pequeña, sin limitación, son gefitinib, afatinib, osimertinib y olmutinib. Otro ejemplo de un modulador de EGFR es la toxina de fusión de EGF. Entre los inhibidores de EGFR y Her2 útiles para la combinación con la molécula de anticuerpo de la invención se encuentran lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (también un inhibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mab-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (también un inhibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.
Otros agentes que pueden combinarse ventajosamente en una terapia con las moléculas de anticuerpos de la invención son tositumumab e ibritumomab tiuxetan (dos anticuerpos anti-CD20 radiomarcados), alemtuzumab (un anticuerpo anti-CD52), denosumab (un inhibidor del ligando del factor de diferenciación de osteoclastos), galiximab (un antagonista de CD80), ofatumumab (un inhibidor de CD20), zanolimumab (un antagonista de CD4), SGN40 (un modulador del receptor del ligando CD40), rituximab (un inhibidor de CD20) o mapatumumab (un agonista del receptor TRAIL-1).
Otros fármacos quimioterapéuticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de anticuerpos de la presente invención son seleccionados de, pero no se limitan a, hormonas, análogos hormonales y antihormonales (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas y antagonistas de LNRH (por ejemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos como metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5 fluorouracilo, capecitabina, decitabina, nelarabina y gemcitabina, análogos de purina y adenosina, tales como tioguanina de mercaptopurina, claribidina y pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarubicina, mitomicina-C, bleomicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platino (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, lobaplatino, satraplatino); agentes alquilantes (por ejemplo, estramustina, mecloretamina, melfalán, clorambucilo, busulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiurea, temozolomida, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina y vincristina; y taxanos como paclitaxel, docetaxel y sus formulaciones, larotaxel; simotaxel y epotilonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y etopofos, tenipósido, amsacrina, topotecán, irinotecán) y quimioterapéuticos diversos como amifostina, anagrelida, interferón alfa, procarbazina, mitotano y porfímero, bexaroteno, celecoxib.
En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser un agente inmunoterapéutico adicional, tales como moduladores de los inhibidores de puntos de control siguientes: TIM3, PD-L1 (por ejemplo, Atezolizumab, avelumab o durvalumab), PD-L2, CTLA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM.
En otras realizaciones, el agente inmunoterapéutico puede ser una vacuna contra el cáncer.
Cuando van a usarse dos o más sustancias o principios como parte de un régimen de tratamiento combinado, estos pueden administrarse mediante la misma ruta de administración o mediante diferentes rutas de administración, esencialmente al mismo tiempo (es decir, simultáneamente, concurrentemente) o en diferentes tiempos (por ejemplo, secuencialmente, sucesivamente, alternativamente, consecutivamente o de acuerdo con cualquier otro tipo de régimen alterno).
Cuando las sustancias o principios deben administrarse simultáneamente a través de la misma vía de administración, estas pueden administrarse como formulaciones o composiciones farmacéuticas diferentes o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada. Además, cuando van a usarse dos o más sustancias o principios activos como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios puede administrarse en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen que se usa cuando se usa el compuesto o principio por sí solo, y tal uso combinado puede conducir o no a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de una, más o todas las sustancias o principios que van a administrarse, mientras se logra aún la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil, por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que esté asociado con el uso de uno o más de las sustancias o principios cuando se usan en sus cantidades habituales, mientras se obtiene aún el efecto farmacológico o terapéutico deseado.
Por supuesto, lo anterior incluye la preparación y los procedimientos de preparación de los anticuerpos de la invención para el uso combinado con las parejas de combinación anteriores. También se incluyen la preparación y los procedimientos de preparación de las parejas de combinación mencionadas anteriormente para el uso combinado con los anticuerpos de la invención.
Las moléculas de anticuerpo de la invención pueden usarse solas o en combinación con otros regímenes de tratamiento, por ejemplo, cirugía y/o radioterapia.
Kits
La invención también incluye kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invención y uno o más de otros componentes seleccionados del grupo que consiste en otros fármacos usados para el tratamiento de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente.
En una realización, el kit incluye una composición que contiene una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la divulgación en forma de dosificación unitaria. En otra realización, el kit incluye una composición que contiene una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación en forma de dosificación unitaria. En una realización adicional, el kit incluye tanto una composición que contiene una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención en forma de dosificación unitaria como una composición que contiene una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de la divulgación en forma de dosificación unitaria.
En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente estéril que contiene tal composición; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, bolsitas, blísteres u otras formas de recipiente adecuadas conocidas en la técnica. Tales recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, láminas metálicas u otros materiales adecuados para contener medicamentos.
Si se desea, se proporciona una molécula de anticuerpo de la invención, o una combinación de ambos tipos de anticuerpos de la invención y de la divulgación, junto con instrucciones para administrar el anticuerpo/anticuerpos a un sujeto que tiene cáncer. Las instrucciones generalmente incluirán información acerca del uso de la composición para el tratamiento o la prevención de un cáncer. En otras realizaciones, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del agente terapéutico; programa de dosificación y administración para el tratamiento o prevención del cáncer o síntomas del mismo; precauciones; advertencias; indicaciones; contraindicaciones; información sobre sobredosis; reacciones adversas; farmacología animal; estudios clínicos; y/o referencias. Las instrucciones pueden imprimirse directamente en el recipiente (cuando esté presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta separada que se suministra en o con el recipiente.
Fabricación y purificación.
También se proporcionan los procedimientos para fabricar una molécula de anticuerpo de la invención o de la divulgación, dichos procedimientos generalmente comprenden las etapas de:
- Cultivar células hospederas que comprenden un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo en condiciones que permiten la formación del anticuerpo y,
- Recuperar la molécula de anticuerpo expresada por las células hospederas del cultivo; y
- Opcionalmente purificar y/o modificar y/o formular adicionalmente la molécula de anticuerpo.
Un ácido nucleico adecuado para este fin puede, por ejemplo, ser una molécula de ADN que comprende secuencias codificantes, así como también secuencias reguladoras y opcionalmente intrones naturales o artificiales, o puede ser una molécula de ADNc. Puede tener sus codones originales o puede tener un uso de codón optimizado que ha sido adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedera u organismo hospedero deseado. Preferentemente, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se definió anteriormente.
El ácido nucleico se incorporará típicamente a un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión del polipéptido cuando se transfecta en una célula hospedera adecuada u otro sistema de expresión. Para fabricar los anticuerpos, el experto en la técnica puede elegir entre una gran variedad de sistemas de expresión bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los revisados por Kipriyanow y Le Gall, 2004.
Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, episomas derivados de EBV y similares. El vector de expresión y las secuencias control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula hospedera. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En determinadas realizaciones, ambas secuencias de ADN se insertan en el mismo vector de expresión.
Los vectores convenientes son aquellos que codifican una secuencia de inmunoglobulina humana funcionalmente completa de CH (pesada constante) o CL (ligera constante), con sitios de restricción apropiados diseñados de modo que cualquier secuencia VH (pesada variable) o VL (ligera variable) pueda fácilmente insertarse y expresarse, como se describió anteriormente. Para la cadena pesada del anticuerpo, puede ser, sin limitación, cualquier isotipo de IgG (lgG1, IgG2, IgG3, IgG4) u otras inmunoglobulinas, que incluye las variantes alélicas.
El vector de expresión recombinante puede también codificar un péptido señal que facilita la secreción de una cadena de anticuerpo de una célula hospedera. El ADN que codifica la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal se enlaza en marco del terminal amino del ADN de la cadena del anticuerpo maduro. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido heterólogo de una proteína que no es inmunoglobulina. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la cadena de anticuerpos puede contener ya una secuencia de péptido señal.
Además de las secuencias de ADN de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes típicamente portan secuencias reguladoras, opcionalmente secuencias reguladoras heterólogas, que incluyen señales promotoras, potenciadoras, de terminación y de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión que controlan la expresión de las cadenas de anticuerpos en una célula hospedera. Ejemplos de secuencias promotoras (ejemplificadas para la expresión en células de mamíferos) son promotores y/o potenciadores derivados de CMV (tal como el promotor/potenciador del CMV Simian Virus 40 (SV40)), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores potentes de mamíferos tales como promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Ejemplos de señales de poliadenilación son poliA BGH, poliA de SV40 tardía o temprana; alternativamente, 3'UTR de genes de inmunoglobulina, etc. Pueden usarse.
Los vectores de expresión recombinantes también pueden portar secuencias que regulan la replicación de un vector en las células hospederas (por ejemplo, orígenes de la replicación) y genes marcadores de selección. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma y/o la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, y los vectores que comprenden estas moléculas de ADN pueden introducirse en células hospedadoras, por ejemplo, células bacterianas o células eucariotas superiores, por ejemplo, células de mamíferos, de acuerdo con procedimientos de transfección bien conocidos en la técnica, que incluyen transfección mediada por liposomas, transfección mediada por policationes, fusión de protoplastos, microinyecciones, precipitación con fosfato cálcico, electroporación o transferencia mediante vectores virales.
Preferentemente, las moléculas de ADN que codifican la cadena pesada y la cadena ligera están presentes en dos vectores de expresión que se cotransfectan en la célula hospederas, preferentemente una célula de mamífero. Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospederas para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, SP2/0, células hela, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma humano (por ejemplo, células Hep G2 y A-549), células 3T3 o los derivados/progenies de tal línea celular. Pueden usarse otras células de mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a líneas celulares de humanos, ratones, ratas, monos y roedores, u otras células eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a células de levadura, insectos y plantas, o células procariotas tales como bacterias.
Las moléculas de anticuerpo se producen mediante el cultivo de las células hospederas por un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de la molécula de anticuerpo en las células hospederas. Las moléculas de anticuerpo se recuperan preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado o pueden recuperarse de los lisados de células hospederas si, por ejemplo, se expresan sin una señal secretora. Es necesario purificar las moléculas de anticuerpo mediante el uso de procedimientos estándar de purificación de proteínas usados para proteínas recombinantes y proteínas de células hospederas de manera que se obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas del anticuerpo. A modo de ejemplo, los procedimientos de purificación del estado de la técnica útiles para obtener moléculas de anticuerpo de la invención incluyen, como primera etapa, la eliminación de células y/o restos celulares en partículas del medio de cultivo o lisado. A continuación, el anticuerpo se purifica a partir de proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, por ejemplo, mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía Sephadex, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico. Como una etapa final en el procedimiento para obtener una preparación de molécula de anticuerpo, la molécula de anticuerpo purificada puede secarse, por ejemplo, liofilizarse, como se describe a continuación para aplicaciones terapéuticas. Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos de ratón que se unen a la PD1 y bloquean la unión del PDL-1 a la PD1. El dominio extracelular (ECD) de la proteína PD1 humana (aminoácidos 21-170 del número de acceso de genbank AAO63583.1) se sintetizó y preparó como inmunógeno. A continuación, los ratones se inmunizaron y luego se reforzaron con proteína PD1 ECD humana mediante técnicas de inmunización de laboratorio estándar.
A continuación, se recogió el plasma de los ratones inmunizados y se cribaron para identificar individuos con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-PD1. Mediante procedimientos de laboratorio estándar, se recolectaron linfocitos de los ratones seleccionados y se fusionaron con células de mieloma de ratón para generar hibridomas. Estos hibridomas se cribaron posteriormente para identificar líneas de hibridomas que producían moléculas de anticuerpo que presentaban unión en un rango de afinidad de bajo nM a la PD1 humana (ECD), y también bloqueaban la unión del PD-L1 humano a la PD1, mediante el uso de los ensayos descritos en la presente memoria a continuación. Se seleccionaron varios hibridomas que produjeron anticuerpos que se unieron a la PD1 humana y bloquearon la unión al PD-L1 humano, los dominios variables de anticuerpos se aislaron y clonaron mediante el uso de conjuntos de cebadores de la PCR estándar.
A partir de este estudio, se identificó una línea hibridómica murina, denominada 77E11, que producía anticuerpos monoclonales que presentaban afinidades de unión de bajo nM a la PD1 humana (ECD) y también bloqueaba la unión del PD-L1 a la PD1.
La secuencia de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo monoclonal producido por 77E11 se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos anti-PD1 humanizados
Se identificaron genes V de la línea celular hibridómica 77E11 murina mediante protocolos de secuenciación y la PCR bien conocidos en la técnica. Luego, los genes V se fusionaron con los genes de la línea germinal humana más cercanos, mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. En el caso de 77E11, esto dio como resultado moléculas de anticuerpo quimérico murino/humano que tenían residuos de aminoácidos Vk y Vh de ratón fusionados con residuos de aminoácidos Ck y Ch1 humanos.
Una vez preparado, el anticuerpo quimérico murino/humano se sometió a protocolos de "humanización". Aquí, se prepararon bibliotecas de aminoácidos mutados de los clones quiméricos de Fab 77E11. También se prepararon posiciones de biblioteca adicionales para eliminar los riesgos de secuencia (es decir, residuos de aminoácidos que se sabe son inmunogénicos o que crean problemas potenciales de fabricación). Estas bibliotecas mutadas suelen tener de 5 a 10 posiciones binarias (ratón frente a humano) por región V. Pueden construir varias bibliotecas más pequeñas para abordar los riesgos específicos en regiones V más complejas. Tales bibliotecas se preparan mediante el uso de procedimientos estándar en la técnica y pueden ser usados fácilmente por la persona experta. Una vez completada esta etapa, se prepararon varios Fab "humanizados" diferentes derivados de la secuencia del Fab 77E11 murino original. Estos Fab humanizados se probaron para determinar su capacidad para unirse a la PD1 humana y bloquear la interacción del PD-L1 con la PD1. Posteriormente se seleccionaron Fab modificados genéticamente que se comportan igual o mejor que el Fab quimérico correspondiente. Su secuencia de aminoácidos se analizó para determinar el porcentaje de secuencia humana, la inmunogenicidad probable y los riesgos de secuencia eliminados.
Tras la selección de los Fab humanizados más favorables, estos se colocaron en el formato de inmunoglobulina IgG4 (Pro) o IgG1KO humana. La IgG4 (Pro) se diferencia de la secuencia de la IgG4 humana canónica por tener la serina 241 alterada a prolina; se ha demostrado que esta alteración minimiza el intercambio dinámico de brazos Fab entre moléculas de IgG4. La IgG1KO se diferencia de la secuencia canónica de la IgG1 humana por dos sustituciones de aminoácidos (L234A, L235A) que se sabe minimizan la función efectora de las moléculas de anticuerpos.
Al finalizar este estudio, se habían preparado 5 versiones humanizadas diferentes del Fab 77E11 murino/humano quimérico original. Estos se denominan: PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5.
La secuencia de aminoácidos de las CDR para las PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5, las secuencias VH y VL y las secuencias completas de HC y LC se presentan en la tabla al final de la presente solicitud. Para evitar dudas, en la tabla a continuación también se presenta una correlación entre los anticuerpos y su número de SEQ ID:
TABLA 1: SEQ ID NO para los anticuerpos anti-PD1 de la invención
Anticuerpo anti-PD1 Secuencias CDR Secuencias VH Secuencias VL Secuencias HC Secuencias LC PD1-1 1-6 19 20 29 30
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PD1-5 13-18 27 28 37 38
Ejemplo 3: Unión de anticuerpos a la PD1 humana y bloqueo de la interacción del ligando de la PD1
Se determinó la unión de los anticuerpos anti-PD1 humanizados representativos derivados del hibridoma 77E11 murino (como se describió en el Ejemplo 2) a la PD1 humana.
Las afinidades de unión a la PD1 humana monomérica recombinante se midieron por SPR mediante el uso de un instrumento proteon XPR36. Los anticuerpos PD1-1, PD1-2 y PD1-3 se capturaron en superficies de Proteína A/G que estaban acopladas con amina a la superficie. Se inyectó ECD de la PD1 humana sobre los anticuerpos capturados durante 600 segundos a una tasa de flujo de 30 ul/min y una disociación durante 1.200 segundos. Las concentraciones de ECD de la PD1 humana fueron 0 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM. El fondo se sustrajo de los datos brutos y los sensogramas se ajustaron globalmente a la unión de Langmuir 1:1 para proporcionar valores de afinidad (KD).
Mediante el uso de ese protocolo, se determinó que los anticuerpos PD1-1, PD1-2 y PD1-3 se unen a la PD1 humana como se presenta en la tabla a continuación.
TABLA 2: Unión a la PD1 humana recombinante (Kd, nM)
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A continuación, se determinó la capacidad de los anticuerpos PD1 de la invención para bloquear la unión del PD-L1/2 humana a la PD1 humana expresada en las células CHO de superficie. Se incubaron células CHO que expresaban la PD1 con una concentración fija del PD-L1 o PD-L2 marcada con biotina recombinante en presencia de anticuerpos anti-PD1 de la invención (PD1 a PD1-5). La mezcla se incubó durante 1 hora a 37 grados centígrados. Se detectó el PD-L1/L2 unido a células con estreptavidina marcada con europio y se midió la fluorescencia mediante el uso de un lector de placas Perkin Elmer Victor X4. Los datos se muestran como porcentaje de inhibición. El 0 % de inhibición se define como el valor de fluorescencia de las células incubadas con el ligando sin anticuerpos, y el 100 % de inhibición se define como la señal obtenida solo con células sin ligandos y anticuerpos marcados. Los valores de porcentaje de inhibición se calcularon en Excel y el ajuste de la curva se realizó con Graphpad Prism. Los puntos de datos de la curva son valores medios de mediciones por triplicado.
Las curvas de inhibición y concentraciones de mAb necesarias para lograr una inhibición del 90 % (IC90) del bloqueo del ligando se muestran en la Figura 2 y la Tabla 3.
TABLA 3: Actividades de bloqueo de ligandos de mAb PD1
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A partir de este análisis, está claro que los anticuerpos PD1 humanizados de la invención exhiben potentes propiedades de unión a la PD1 y también inhiben efectivamente la interacción de la PD-1 con el PD-L1 y el PD-L2. Ejemplo 4: Estimulación de la respuesta de células T específicas de antígeno por anticuerpo anti-PD1 Los anticuerpos anti-PD1 humanizados preparados de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente se probaron posteriormente para determinar su capacidad para estimular la producción de citocinas de células T de memoria CD4 específicas del tétanos.
Para este ensayo, las células T de PBMC derivadas de donantes sanos se expandieron en presencia de toxoide tetánico y se co-cultivaron con células dendríticas (DC) maduras autólogas cargadas con toxoide tetánico durante 2 días. La etapa de cocultivo se repitió una segunda vez de manera similar en presencia de anticuerpos anti-PD1 representativos de la invención. Al final de la segunda etapa de cocultivo, los sobrenadantes se analizaron para IFN-gamma mediante ELISA y los resultados se muestran en la Figura 3.
Todos los anticuerpos PD1 de la invención probados muestran una clara activación muy potente dependiente de la dosis de las células T medida por la liberación de IFN-gamma. Cuando los anticuerpos PD1 de la invención se combinan con anticuerpos anti-LAG3, puede observarse una actividad superior en comparación con las combinaciones de anticuerpos anti-PD1 de la técnica anterior de referencia (ver el Ejemplo 12 y la Figura 8).
Ejemplo 5: Mapeo de epítopos de los anticuerpos monoclonales anti-PD1 humanizados.
El epítopo de un anticuerpo anti-PD1 representativo de la invención y una molécula de anticuerpo de referencia de la técnica anterior que tiene la misma secuencia de aminoácidos que nivolumab se analizaron mediante experimentos de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), que revela diferencias de epítopo a nivel de aminoácido individual en los epítopos de anticuerpos.
El análisis de HDX mostró que el anticuerpo anti-PD1 de la invención y la molécula de anticuerpo de referencia de la técnica anterior se unen a regiones similares y superpuestas de la PD1 humana. Sin embargo, los epítopos no son idénticos, y el anticuerpo PD1 representativo de la invención se une a un elemento de secuencia adicional como se detalla en la Tabla 4.
Tabla 4: Mapeo de epítopos de moléculas de anticuerpo anti-PD1 mediante espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio
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Ejemplo 6: Eficacia in vivo de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención en un modelo de ratón con inserción del gen de hpd-1
El fin del estudio fue medir la eficacia de las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención mediante el uso de un ratón completamente inmunocompetente que alberga una modificación genética que reemplaza el dominio extracelular de la PD1 de ratón con la región correspondiente de la PD1 humana. El ratón C57BL/6ntac-PDCD1tm(PDCD1)Arte usado para este experimento fue proporcionado por ISIS INNOVATION LIMITED, Oxford, Inglaterra y se denomina de ahora en adelante "ratón con inserción del gen de hpd1".
Se inyectaron por vía subcutánea células MC-38 en el flanco de ratones con inserción génica de hpd1 y el tratamiento se inició el día 6 después de la inyección celular. Los ratones recibieron PBS, control de isotipo o molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención a una dosis de 10 mg/kg dos veces por semana (cada 3 o 4 días) o se administró PD1-3 solo una vez.
La Figura 4 muestra el volumen tumoral a lo largo del tiempo para ratones con inserción génica de hpd1 individuales implantados con MC38 y la Tabla 5 resume la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) en el día 23 después de la inyección celular y las respuestas completas observadas al final del estudio.
La respuesta completa (CR) se define cuando (i) el tamaño del tumor es el mismo o menor en comparación con la primera medición y (ii) la inspección visual del material portador residual (matrigel) no muestra tejido tumoral. Se pudo demostrar que el régimen de dosificación única de la PD1-3 mostró efectos fuertes y antitumorales (TGI = 90 %; con 2 ratones que mostraron una CR) equivalentes en comparación con el régimen de dosificación dos veces por semana. Este estudio muestra que incluso una dosis única de la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención es suficiente para lograr la eficacia, lo que podría ser una consecuencia de una vida media más larga.
Tabla 5: TGI para la PD1
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Ejemplo 7: Farmacocinética preclínica de moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la invención.
Las propiedades farmacocinéticas (PK) de la molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención se determinaron en una dosis única i.v. Estudio de las PK en monos Cynomolgus.
La molécula de anticuerpo anti-PD1 de la invención administrada con una dosis de 1 mg/kg i.v. muestra un aclaramiento plasmático (CL) medio de 0,28 ml/h/kg. El volumen medio de distribución (Vss) para la PD1-3 fue de 58 ml/kg. La vida media terminal promedio para la PD1-3 fue de 11 días.
AUC y cmáx de la PD1-3 a 1 mg/kg en monos Cynomolgus son casi idénticos a los parámetros correspondientes de los anticuerpos PD-1 IgG4Pro nivolumab (BMS-936558, publicado en Wang, C. y otros, Cancer Immunol. Res. 2: 846-856, 2014) y pembrolizumab (MK-3475, publicado en Documento FDA BLA 1255140rig1s000 Pharmacology Review, 2014) en un rango de dosis comparable.
Sorprendente e inesperadamente, la vida media terminal observada para la PD1-3 fue 1,5-2 veces mayor que para nivolumab como se muestra en la Figura 5. Esto sugiere que los anticuerpos anti-PD1 de la invención tienen una vida media en suero de 11 días. Esto contrasta con las moléculas de anticuerpo anti-PD1 de referencia conocidas que típicamente tienen una vida media de 4 a 6 días en el rango de dosis de 0,3-3 mg/kg. Esta característica sorprendente de las moléculas de anticuerpo de la invención puede permitir que un paciente sea tratado con las moléculas de anticuerpos de la invención con menos frecuencia que los de la técnica, lo que puede traducirse en una reducción en la cantidad de anticuerpo que debe suministrarse, ya sea en la forma de frecuencia reducida de administración o en cantidad reducida de anticuerpo a usar. Dado que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 pueden inducir efectos secundarios no deseados en pacientes, como se discutió anteriormente, entonces los anticuerpos anti-PD1 de la invención pueden tener una ventaja clínica significativa y sorprendente sobre la técnica.
Ejemplo 8: Identificación de anticuerpos de ratón que se unen al LAG3
El dominio extracelular (ECD) de la proteína LAG3 humana (aminoácidos 23-450 del número de acceso de genbank NP_002277) se sintetizó y preparó como inmunógeno. A continuación, los ratones se inmunizaron y luego se reforzaron con proteína LAG3 eCd humana mediante técnicas de inmunización de laboratorio estándar.
A continuación, se recogió el plasma de los ratones inmunizados y se cribaron para identificar individuos con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-LAG3. Mediante procedimientos de laboratorio estándar, se recolectaron linfocitos de los ratones seleccionados y se fusionaron con células de mieloma de ratón para generar hibridomas. Se seleccionaron varios hibridomas que produjeron anticuerpos que se unieron específicamente al LAG3 humano, los dominios variables de anticuerpos se aislaron y clonaron mediante el uso de conjuntos de cebadores de la PCR estándar.
A partir de este estudio, se identificó una línea hibridómica murina, denominada 496G6, que producía anticuerpos monoclonales que presentaban afinidades de unión de bajo nM LAG3 humano (ECD) y se seleccionó para estudios adicionales.
La secuencia de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo monoclonal producido por 496G6 se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 9: Generación de anticuerpos anti-LAG3 humanizados
En este ejemplo, se proporcionan los procedimientos y resultados para el desarrollo de derivados humanizados del anticuerpo monoclonal producido por la línea de hibridoma murino 496G6, descritos en el Ejemplo 8.
Se identificaron genes V del hibridoma 496G6 murino mediante protocolos de secuenciación y la PCR bien conocidos en la técnica. Luego, los genes V se fusionan con los genes de la línea germinal humana más cercanos, mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. En el caso de 496G6, esto dio como resultado un anticuerpo quimérico murino/humano que tenían residuos de aminoácidos Vk y Vh de ratón fusionados con residuos de aminoácidos Ck y Ch1 humanos.
Una vez preparado, el anticuerpo quimérico murino/humano se sometió a protocolos de "humanización" estándar bien conocidos en la técnica. En este procedimiento, se prepararon bibliotecas de aminoácidos mutados de los clones quiméricos de Fab 496G6. También se prepararon posiciones de biblioteca adicionales para eliminar los riesgos de secuencia (es decir, residuos de aminoácidos que se sabe son inmunogénicos o que crean problemas potenciales de fabricación). Estas bibliotecas mutadas suelen tener de 5 a 10 posiciones binarias (ratón frente a humano) por región V. Pueden construir varias bibliotecas más pequeñas para abordar los riesgos específicos en regiones V más complejas. Tales bibliotecas se preparan mediante el uso de procedimientos estándar en la técnica y pueden ser usados fácilmente por la persona experta.
Una vez completada esta etapa, se prepararon varios Fab "humanizados" diferentes derivados de la secuencia del Fab 496G6 murino original. Estos Fab humanizados se probaron para determinar su capacidad para unirse al LAG3 humano y bloquear la interacción del MHCII con LAG3. Posteriormente se seleccionaron Fab modificados genéticamente que se comportan igual o mejor que el Fab quimérico correspondiente. Su secuencia de aminoácidos se analizó para determinar el porcentaje de secuencia humana, la inmunogenicidad probable y los riesgos de secuencia eliminados.
Tras la selección de los Fab humanizados más favorables, estos se colocaron en el formato de inmunoglobulina IgG4 (Pro) Humana. La IgG4 (Pro) se diferencia de la secuencia de la IgG4 Humana canónica por tener la serina 241 alterada a prolina; se ha demostrado que esta alteración minimiza el intercambio dinámico de brazos Fab entre moléculas de IgG4.
Al finalizar este estudio, se habían preparado 5 versiones de anticuerpos humanizados diferentes del Fab 496G6 murino/humano quimérico original. Estos se denominaron: LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5.
La secuencia de aminoácidos de las CDR para los LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5, las secuencias VH y VL y las secuencias completas de HC y LC se presentan en la tabla al final de la presente solicitud. Para evitar dudas, en la tabla a continuación también se presenta una correlación entre los anticuerpos y su número de SEQ ID:
TABLA 6: SEQ ID NO para los anticuerpos anti-LAG3 de la invención
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Ejemplo 10: Unión del anticuerpo al LAG3 humano y bloqueo de la interacción del ligando LAG3
Las afinidades de unión al LAG3 humano monomérico recombinante se midieron mediante el uso de SPR.
Los anticuerpos LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5 se capturaron en superficies de Proteína A/G. Se inyectó ECD-Fc del LAG3 humano sobre los anticuerpos capturados durante 300 segundos a una tasa de flujo de 30 ul/min y una disociación durante 1.800 segundos. Las concentraciones de ECD del LAG3 humano fueron 0 nM, 0,625 nM, 1,25 nM, 2,5 nM y 5 nM. El fondo se sustrajo de los datos brutos y los sensogramas se ajustaron globalmente a la unión de Langmuir 1:1 para proporcionar valores de afinidad (KD).
Mediante el uso de este protocolo, se determinó que los anticuerpos LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG-3-5 se unían al LAG-3 humano con alta afinidad, como se presenta en la tabla a continuación.
TABLA 7: Unión al LAG3 humano recombinante (Kd, nM)
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Los anticuerpos LAG3 de la invención se probaron para bloquear la unión de la proteína LAG3 humana recombinante a células Raji que expresan su ligando MHC II mediante el uso de FACS. Se incubó el dominio extracelular LAG3 humano recombinante fusionado con Fc humano (hLAG3-hlgFc) con los anticuerpos LAG3 LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5 durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) antes de agregar a células Raji seguido de incubación adicional durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron 3 veces. La unión de HLAG3-mlgFc a células Raji se detectó mediante el uso de una IgG antihumana marcada con PE. El análisis de la unión de HLAG3-mlgFc se llevó a cabo con un FACS Canto I (BD Bioscience). Los resultados se resumen en la Figura 7 y demuestran que todos los anticuerpos LAG3 de la invención probados inhiben selectiva y efectivamente la unión del LAG3 al MHC II.
Ejemplo 11: Mapeo de epítopos de los anticuerpos monoclonales anti-LAG3 humanizados.
El epítopo de un anticuerpo anti-LAG3 representativo de la invención y una molécula de anticuerpo de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos que BMS-986016 (una molécula de anticuerpo anti-LAG3 de referencia de la técnica anterior) se analizaron mediante el uso de un ensayo de "unión competitiva". Los resultados no mostraron competencia por la unión al LAG3, lo que muestra que el anticuerpo anti-LAG3 de la invención se une a un epítopo diferente al de la molécula de anticuerpo anti-LAG3 de referencia de la técnica anterior.
El epítopo de un anticuerpo anti-LAG3 representativo de la invención se refinó adicionalmente mediante experimentos de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), que revela diferencias de epítopo a nivel de aminoácido individual en los epítopos de anticuerpos.
El análisis de HDX mostró que el anticuerpo anti-LAG3 representativo de la invención se une a dos regiones distintas del LAG3 humano como se detalla en la Tabla 8.
Tabla 8: Mapeo de epítopos de los mAb anti-LAG3 mediante espectrometría de masas de intercambio de hidrógenodeuterio
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Ejemplo 12: Estimulación de la respuesta de células T antígeno específica con anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3.
Los anticuerpos individuales anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención, y combinaciones de estos anticuerpos, se probaron para determinar su capacidad para estimular la producción de citocinas de células T de memoria CD4 tétanos específica mediante ELISA y se compararon con anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la técnica anterior. Para este ensayo, las células T de PBMC de donantes sanos se expandieron en presencia de toxoide tetánico y se co-cultivaron con células dendríticas (DC) maduras autólogas cargadas con toxoide tetánico durante 2 días. El paso de co-cultivo se repitió una segunda vez de manera similar en presencia de anti-PD1, anti-LAG3 y una combinación de moléculas de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 mediante el uso de una cantidad fija de mAb anti-PD1 (200 nM) con cantidades crecientes de anticuerpos anti-LAG3. Al final de la segunda etapa de cocultivo, los sobrenadantes se analizaron para secreción IFN-gamma.
Mediante el uso de este ensayo, la combinación de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención se comparó con nivolumab (Opdivo (R)) (mAb PD1) más un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que BMS-986016 (mAb LAG3) en 4 donantes diferentes. Se usaron cantidades crecientes de anticuerpos anti-LAG3 en combinación con una dosis fija de mAb anti-PD1. Los datos mostrados se normalizaron a un anticuerpo anti-PD1 usado a una concentración de saturación indicada como 100 % y los resultados se muestran en la Figura 8.
Estos datos demuestran que una combinación de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención conduce a un aumento de 1,5 - 2 veces de la producción de IFN-gamma en comparación con el mAb anti-PD1 solo. Sorprendentemente, la combinación de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención es superior a la de los anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la técnica anterior.
Además, los datos muestran que en 3 de cada 4 donantes el anti-PD1-3 (un representante del anticuerpo PD1 de la invención) es superior al nivolumab (Opdivo (R)) como se observa en los niveles más altos de secreción de IFN-gamma en niveles muy bajos de mAb anti-LAG3 (Figura 8).
Como puede apreciarse, esta superioridad de la combinación de las moléculas de anticuerpo anti-LAG3 de la presente invención con moléculas de anticuerpo anti-PD1 de la presente invención sugiere que podrían usarse para tratar el cáncer a un nivel de dosis más bajo que las terapias de anticuerpos de la técnica anterior, que pueden permitir una aplicación terapéutica con menos efectos secundarios no deseados.
Dado que las moléculas de anticuerpo anti-PD1 y anti-LAG3 pueden inducir efectos secundarios no deseados en pacientes, como se discutió anteriormente, entonces los anticuerpos anti-PD1 y los anticuerpos anti-LAG3 de la invención pueden tener una ventaja clínica significativa y sorprendente sobre la técnica mediante el uso de una dosis menor y/o regímenes de administración menos frecuentes.
Ejemplo 13: Eficacia in vivo de la terapia de combinación de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 en modelos de tumores singénicos
Para probar si el tratamiento combinado de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención da como resultado una eficacia in vivo superior, se trataron varios modelos de ratón con tumores preclínicos con los mAb anti-PD1 y anti-LAG3. Todas las líneas celulares tumorales de ratón (MC38, Colon-26 colon-, melanoma B16F10, LL/2 (LLC1) Lewis Lung- y cáncer de mama 4T1) se inyectaron por vía subcutánea en C57BL/6 o BALB/c, en función del origen de la línea celular tumoral de ratón. El día 3 después de la inyección de células, los ratones se trataron por vía intraperitoneal (ip) seguido de dosificación dos veces por semana. Todos los anticuerpos se dosificaron a 10 mg/kg y la combinación de anticuerpos anti-LAG3 y anti-PD1 de la invención se dosificó a 10 mg/kg cada uno. Los anticuerpos usados en este estudio se obtuvieron todos de bioxcell, West Lebanon, NH, Estados Unidos. El grupo de control se trató con un anticuerpo IgG2a de rata (clon 2A3), el anticuerpo anti-PD1 usado tiene una parte Fc de IgG2a de rata (clon RMP1-14) y el anti-LAG3 usado en el estudio estaba en una parte Fc de IgG1 de rata (clon C9B7W). Se midió el tamaño del tumor al menos tres veces por semana en dos dimensiones (largo x ancho) y se calcularon los volúmenes tumorales. Los animales fueron sacrificados si el volumen del tumor alcanzaba los 1.500 mm3 o si los tumores estaban ulcerados.
Los resultados para TGI y CR resumidos en la Tabla 9 y la Figura 9 muestran el volumen tumoral a lo largo del tiempo para ratones individuales. En conclusión, el estudio muestra que un tratamiento anti-PD1 solo muestra eficacia en el MC 38 pero no en los otros modelos probados. Sin embargo, con la excepción del modelo LL/2, el tratamiento combinado de anticuerpos anti-PD1 y anti-LAG3 de la invención mejoró sustancialmente la eficacia de la monoterapia anti-PD1 y varios ratones estaban libres de tumores al final del estudio en el Modelo MC-38, Colon-26 y 4T1. De particular interés es que en el modelo 4T1 resistente a la PD1 la combinación muestra un efecto superior sobre el crecimiento del tumor y 3 de cada 5 ratones estaban completamente libres de tumores.
Tabla 9: Sumario de la inhibición del crecimiento tumoral de todos los modelos singénicos probados
Figure imgf000034_0001
Ejemplo 14: Formulación farmacéutica para s.c. administración
Cualquiera de las moléculas de anticuerpo anteriores de la invención puede seleccionarse para la fabricación de una formulación farmacéutica para la aplicación subcutánea que tenga una composición como sigue:
Substancia de fármaco: 100 mg/ml (1 a 3 nmol/ml)
Tampón de acetato: 25 mm
Trehalosa: 220 mm
Tween-20: 0,02 %
El fármaco se formula en una solución que tiene la composición anterior, se esteriliza y se almacena entre 2 y 8 °C. Ejemplo 15: Formulación farmacéutica para la administración i.v.
Cualquiera de las moléculas de anticuerpo anteriores de la invención puede seleccionarse para la fabricación de una formulación farmacéutica para la aplicación i.v. Un ejemplo de una formulación farmacéutica adecuada para el anticuerpo de la invención es el siguiente.
Un vial de 20 ml contiene 20 mg/ml del anticuerpo anti-PD1 de la invención, en un tampón que consiste en 21,5 mm de acetato de sodio, 3,5 mm de ácido acético, 240 mm de trehalosa, 0,67 mm de L-metionina, 0,04 % p/v de polisorbato 20 y agua para inyección (WFI).
Un vial de 20 ml contiene 20 mg/ml del anticuerpo anti-LAG3 de la invención, en un tampón que consiste en 25 mm de acetato, 240 mm de trehalosa, 0,67 mm de metionina, 0,04 % p/v de polisorbato 20, pH 5,5 y agua para inyección (WFI).
Ejemplo 16: Uso farmacéutico en humanos
Las soluciones descritas en el Ejemplo 15 anterior se aplican a un paciente que las necesita, tal como un ser humano que padece un cáncer, mediante infusión intravenosa (dosis de 100 a 200 mg) cada dos a cuatro semanas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de anticuerpo anti-PD1 que comprende:
(a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); o,
(b) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); o,
(c) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) y una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).
2. La molécula de anticuerpo anti-PD1 de la reivindicación 1 en la que dicha molécula de anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.
3. La molécula de anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que dicha molécula de anticuerpo tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, o una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32, o una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, o una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y una cadena ligera de una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y una cadena ligera de una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Una célula hospedera que tiene un vector de expresión que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un vector de expresión que codifica una cadena ligera de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. La molécula de anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en medicina, preferentemente para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer.
8. La molécula de anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que el uso comprende además la administración de una molécula de anticuerpo anti-LAG3.
9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 que comprende además una molécula de anticuerpo anti-LAG3.
11. Un kit de partes que comprende un anticuerpo anti-PD1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una molécula de anticuerpo anti-LAG3.
12. La molécula de anticuerpo anti-PD1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, la composición de la reivindicación 10 o el kit de la reivindicación 11 en el que dicha molécula de anticuerpo anti-LAG3 se une a un epítopo de LAG3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) y/o YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112).
13. La molécula de anticuerpo anti-PD1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, o la composición o kit de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha molécula de anticuerpo anti-LAG3 comprende:
(a) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), s Eq ID NO: 40 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); o,
(b) CDR de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), s Eq ID NO: 46 (hcCDR2) y SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) y tiene CDR de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) y SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).
14. La molécula de anticuerpo anti-PD1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8, 12 o 13 en el que la molécula de anticuerpo anti-PD1 debe administrarse de forma simultánea, concurrente, secuencial, sucesiva, alternativa o separada, con la molécula de anticuerpo anti-LAG3.
15. La combinación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12 o 13, en la que la molécula de anticuerpo anti-PD1 se selecciona del grupo que consiste en moléculas de anticuerpo anti-PD1 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 y PD1-5, y la molécula de anticuerpo anti-LAG3 se selecciona del grupo que consiste en moléculas de anticuerpo anti-LAG3 LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 y LAG3-5.
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