BR112020017676A2 - Anticorpo antagonizante cd73 - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a novos anticorpos antagonizadores para cd73. a invenção da mesma forma se refere a ácidos nucleicos que codificam tais moléculas de anticorpo; a métodos para preparar tais moléculas de anticorpo; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais moléculas de anticorpo; as composições compreendendo tais moléculas de anticorpo; e as utilizações de tais moléculas de anticorpo ou de tais composições, em particular para fins terapêuticos no campo das doenças cancerígenas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPO ANTAGONIZANTE CD73".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a novos polipeptídeos de ligação a CD73. A invenção da mesma forma se refere a ácidos nu- cleicos que codificam tais polipeptídeos; a métodos para preparar tais polipeptídeos; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais polipeptídeos; a composições compreendendo tais polipeptídeos; e a utilizações de tais polipeptídeos ou de tais composi- ções, em particular para fins terapêuticos no campo das doenças can- cerígenas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento anormal de células com potencial para se espalhar por todo o corpo. No mundo desenvolvido, é a segunda causa de morte mais comum. Os tipos mais comuns de câncer em homens são câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de estômago e, nas mu- lheres, os tipos mais comuns são câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão e câncer cervical. Enquanto as chances de sobrevi- vência dependem principalmente do tipo de câncer e do estágio de identificação, para o câncer de pulmão a taxa de sobrevivência geral de 10 anos é de cerca de 5%.

[003] No passado, os meios mais frequentes de tratamento do câncer eram por meio de cirurgia, radioterapia ou uso de quimioterápi- cos. No entanto, nos últimos anos, a imunoterapia contra o câncer tem se mostrado muito promissora como uma modalidade de tratamento para oncologia.

[004] A imunoterapia do câncer é um ramo da oncologia em que o sistema imunológico é ativado para atacar o câncer, o que está em total contraste com os métodos comuns de tratamento existentes, em que o tumor é extirpado ou tratado diretamente. Este conceito terapêu- tico é baseado na identificação de uma série de proteínas na superfí- cie das células T que atuam inibindo a função imunológica dessas cé- lulas. As imunoterapias bloqueiam essas moléculas inibidoras para aumentar a atividade do sistema imunológico ou estimulam as vias envolvidas na ativação das células efetoras do sistema imunológico. Listadas entre essas proteínas estão CD73 e PD-1.

[005] Grupo de diferenciação 73 (CD73), da mesma forma co- nhecido como ecto-5'-nucleotidase (ecto-5'NT, EC 3.1.3.5), é uma en- zima de superfície celular ligada a glicosil-fosfatidilinositol (GPI) encon- trada na maioria dos tecidos, porém particularmente expressa em célu- las endoteliais e subconjuntos de células hematopoiéticas (Resta e outro, Immunol Rev 1998; 161: 95-109 e Colgan e outro, Purinergic Signal 2006; 2: 351-60).

[006] CD73 é uma enzima de superfície celular expressa em cé- lulas de câncer, células estromais e células imunes residentes de tu- mor que converte AMP em adenosina e fosfato inorgânico. A adenosi- na é imunossupressora e tem a capacidade de influenciar a função de vários tipos de células imunológicas. A adenosina tem um efeito ativa- dor em células imunossupressoras, tal como células T reguladoras, MDSCs e macrófagos M2, e um efeito inibitório em células efetoras, tais como células dendríticas, células T efetoras e células NK. Um an- ticorpo neutralizante de CD73 pode inibir a função de CD73, bloque- ando a atividade enzimática e/ou reduzindo os níveis de superfície ce- lular de CD73. Isso levará a uma redução na adenosina imunossu- pressora e, portanto, a um aumento nas atividades das células T.

[007] O bloqueio duplo de CD73 e pontos de verificação imunoló- gicos - incluindo PD1 e potencialmente outros - pode também restau- rar a funcionalidade de células T, resultando em melhores respostas objetivas e prolongamento da sobrevida geral em pacientes com cân-

cer em comparação com a monoterapia PD1.

[008] CD73 foi relatado ser expresso em muitos cânceres diferen- tes, incluindo câncer de cólon, pulmão, pâncreas, ovário, bexiga, leu- cemia, glioma, glioblastoma, melanoma, tireoide, esôfago, próstata e mama (Jin e outro, Cancer Res 2010; 70 : 2245-55 e Stagg e outro, PNAS 2010; 107: 1547-52). Além disso, a expressão de CD73 no cân- cer foi correlatada a uma sobrevida global mais curta em uma série de indicações de tumor, entre outros tumores gastrointestinais, de mama e de NSCLC (Wang e outro, Prognostic value of CD73-adenosinergic pathway in solid tumor: A meta-analysis and systematic review, Onco- target 2017; Inoue e outro, Prognostic impact of CD73 and A2A ade- nosine receptor expression in non-small-cell lung cancer, Oncotarget 2017). A atividade de CD73 foi da mesma forma proposta como um marcador prognóstico em carcinomas papilíferos da tireoide. Ao gerar adenosina imunossupressora, CD73 tem funções generalizadas nas células imunológicas e cria um microambiente imunossupressor dentro do tumor. A adenosina suprime potentemente as respostas das células T, tais como proliferação, citotoxicidade e produção de citocinas. Além disso, a adenosina altera a diferenciação das células dendríticas, pre- judicando as respostas das células T. A adenosina da mesma forma atua sobre as células NK, resultando na inibição de sua função citotó- xica. Além disso, a adenosina tem um papel estimulador em tipos de células imunossupressoras. A adenosina leva à expansão de MDSCs imunossupressores e à diferenciação de macrófagos no fenótipo M2 supressor. (Antonioli e outro, Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews Cancer 2013; Beavis e ou- tro, CD73: A potent supressor of antitumor imune responses, Trends in Immunology, 2012). Além de seus efeitos nas células imunes, CD73 pode ter papéis na regulação das interações célula-célula e célula- matriz, bem como na angiogênese. A adenosina pode da mesma for-

ma atuar diretamente nas células de câncer e regular o crescimento celular, bem como a apoptose, e está implicada na resistência aos medicamentos (Hunsucker e outro, Pharmacol Ther 2005; 1:1-30). Desse modo, CD73 pode regular a progressão do câncer tanto direta quanto indiretamente, o que destaca seu potencial como um novo alvo terapêutico. Allard e outro relataram que a segmentação de CD73 au- menta a atividade antitumoral de mAbs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 (Clin Cancer Res 2013; 19: 5626).

[009] Outros agentes que têm como alvo as mesmas trilhas in- cluem antagonistas A2AR. No entanto, devido à redundância do recep- tor de adenosina, pode ser esperado que os antagonistas A2AR não evitem totalmente as atividades mediadas pela adenosina em relação a um inibidor de CD73.

[0010] Adenosina análoga a ADP não hidrolisável difosfato 5'- (alfa,beta-metileno) (APCP) é um inibidor da atividade enzimática de CD73 e está comercialmente disponível. AB421 é um inibidor de CD73 de molécula pequena desenvolvido pela Arcus Biosciences.

[0011] WO 2016/075099 descreve moléculas de ligação anti- CD73, por exemplo, anticorpos e seus fragmentos de ligação a antíge- no, incluindo o anticorpo MEDI9447. MEDI9447 reduz a função de CD73 ao inibir a atividade enzimática de CD73 para hidrolisar o mono- fosfato de adenosina (AMP) e ao induzir a internalização de CD73. O documento WO 2016/081748 descreve anticorpos que inibem a ativi- dade enzimática de CD73 humano e anticorpos que internalizam CD73 em células, incluindo o anticorpo BMS 986179.

[0012] É um objetivo da invenção fornecer agentes farmacologi- camente ativos melhorados que podem ser usados no tratamento de várias doenças cancerosas.

[0013] Em particular, é um objetivo da invenção fornecer tais agen- tes farmacologicamente ativos, composições e/ou métodos de trata-

mento que fornecem certas vantagens em comparação com os agen- tes, composições e/ou métodos atualmente usados e/ou conhecidos na técnica. Estas vantagens incluem eficácia in vivo, propriedades te- rapêuticas e farmacológicas melhoradas, menos efeitos colaterais e outras propriedades vantajosas, tais como facilidade de preparação melhorada ou custos reduzidos de produtos, especialmente em com- paração com fármacos candidatos já conhecidos na técnica.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] De acordo com um primeiro aspecto, são fornecidas molé- culas de anticorpo anti-CD73. Como descrito também aqui, as molécu- las de anticorpo anti-CD73 da presente invenção têm propriedades surpreendentes e vantajosas sobre outros anticorpos anti-CD73. Por exemplo, elas mostram capacidade melhorada para reverter a supres- são de células T mediada por AMP (por exemplo, como demonstrado por níveis mais elevados de proliferação de células T e indução mais forte de secreção de IFNy). IFNy é conhecido por ser um fator crucial para a resposta antitumoral mediada por células T (Tannenbaum, C., and Hamilton, T. Immune-inflammatory mechanisms in IFNy-mediated antitumor activity, Seminars in Cancer Biology, 2000). Além disso, os anticorpos anti-CD73 aqui descritos mostram inibição melhorada de CD73 em comparação com os anticorpos anti-CD73 da técnica anteri- or. Os anticorpos da presente invenção inibem CD73 ligado à célula, bem como CD73 não ligado à célula, igualmente. Os anticorpos anti- CD73 da invenção mostram inibição melhorada da geração de adeno- sina em comparação com os anticorpos anti-CD73 de referência. Além disso, eles têm alta afinidade para CD73 humano.

[0015] As moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de anticorpo anti-CD73, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos de produção das moléculas de anticorpo anti-CD73 da inven- ção são da mesma forma fornecidos. As composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de anticorpo anti-CD73 da invenção são da mesma forma fornecidas. As moléculas de anticorpo anti-CD73 aqui descritas podem ser usadas para tratar distúrbios cancerígenos, incluindo tumores de tecidos moles e sólidos.

[0016] Mais especificamente, uma molécula de anticorpo anti- CD73 da invenção compreende: (a) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (hcCDRI), SEQ ID NO: 26 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 27 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (IcCDRI), SEQ ID NO: 29 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 30 (lcCDR3); ou, (b) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (hcCDRI), SEQ ID NO: 32 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 33 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (IcCDRI), SEQ ID NO: 35 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 36 (lcCDR3); ou, (c) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 (hcCDRI), SEQ ID NO: 38 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 39 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 (IcCDRI), SEQ ID NO: 41 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 42 (lcCDR3); ou (d) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 (hcCDRI), SEQ ID NO: 44 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 45 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46 (IcCDRI), SEQ ID NO: 47 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 48 (lcCDR3); ou (e) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido nce de SEQ ID NO: 49 (hcCDRI), SEQ ID NO: 50 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 51 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve com- preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (IcCDRI),

SEQ ID NO: 53 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 54 (lcCDR3); ou (f) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 (hcCDRI), SEQ ID NO: 56 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 57 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 58 (IcCDRI), SEQ ID NO: 59 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 60 (lcCDR3); ou (g) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61 (hcCDRI), SEQ ID NO: 62 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 63 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64 (IcCDRI), SEQ ID NO: 65 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 66 (lcCDR3); ou (h) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67 (hcCDRI), SEQ ID NO: 68 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 69 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70 (IcCDRI), SEQ ID NO: 71 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 72 (lcCDR3).

[0017] De acordo com outro aspecto da invenção, da mesma for- ma são fornecidos métodos para o tratamento de cânceres. Em uma modalidade, as moléculas de anticorpo anti-CD73 da invenção podem ser usadas em combinação com um segundo agente terapêutico, co- mo um antagonista de PD-1. Em algumas modalidades, o referido se- gundo agente terapêutico, tal como um antagonista de PD-1, deve ser administrado simultaneamente, concorrentemente, sequencialmente, sucessivamente, alternativamente ou separadamente, com as molécu- las de anticorpo anti-CD73. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1. Em al- gumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 selecionado a partir do grupo consistindo em PDR-001, pembrolizu- mabe, nivolumabe e pidilizumabe. Em algumas modalidades, o anta- gonista de PD-1 é um anticorpo anti-PDL-1 selecionado a partir do grupo consistindo em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD- 1 selecionado a partir do grupo consistindo em PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5. Outras modalidades destes aspectos da invenção in- cluem onde os referidos usos das moléculas de anticorpo da invenção podem ser combinados com um terceiro agente terapêutico.

[0018] Outros aspectos, modalidades, usos e métodos envolvendo as moléculas de anticorpo da invenção se tornarão claros a partir da seguinte descrição da invenção e das reivindicações anexas.

[0019] A invenção fornece novas moléculas de anticorpo que per- mitem um tratamento mais eficiente de vários tipos de câncer, incluin- do câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena, NSCLC), vários cânceres gastrointestinais (por exemplo, carcinoma do cólon, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular) e cân- cer renal, (por exemplo, câncer de células renais, tais como carcinoma de células claras). Breve descrição das figuras

[0020] Figura 1: Co-cultura de células dendríticas/células T. Os dados (conforme também descrito no Exemplo 7) ilustram que AMP inibe a resposta anti-PD1 em um ensaio de co-cultura de células den- dríticas/T, e o tratamento com anticorpo anti-CD73 leva à reversão desta inibição mediada por AMP.

[0021] Figura 2: Formação de complexos de anticorpos anti- CD73 e CD73. É descrita a avaliação do estado oligomérico de com- plexos de CD73 e dois anticorpos anti-CD73 (como descrito no Exem- plo 9). A molécula de anticorpo anti-CD73 de acordo com a invenção forma complexos antígeno-anticorpo com CD73 solúvel com um tama- nho definido, tal como um oligômero 2:2. Esses complexos são meno- res em comparação com os complexos formados por outros anticorpos CD73 conhecidos na técnica, como “MEDI9447”.

[0022] Figura 3: Estrutura cristalina de um anticorpo anti- CD73-cristal CD73 (A) Descrita é a ligação de um fragmento Fab do anticorpo anti-CD73 da invenção ao seu epítopo conformacional em CD73. Os resíduos que são contatados e/ou especificamente ligados pelo fragmento de Fab do anticorpo anti-CD73 da invenção estão re- presentados a preto; VH do fragmento Fab é colorido em cinza escuro, VL em cinza claro (B) aumento do epítopo conformacional mostrado em preto em (A) que é especificamente ligado pelo anticorpo da inven- ção; os resíduos de aminoácidos de CD73 que estão incluídos no epí- topo conformacional são marcados usando o código de aminoácidos de 3 letras; (C) resíduos de aminoácidos da cadeia pesada (H) e leve (L) do anticorpo inventivo que contribuem para o paratopo do fragmen- to de Fab do anticorpo inventivo mostrado em (A) que contata e/ou se liga especificamente ao epítopo conformacional representado em (A); resíduos de aminoácidos que contatam e/ou se ligam especificamente ao epítopo conformacional em CD73 são rotulados usando o código de aminoácidos de 3 letras com (H) e (L) indicando resíduos de aminoá- cidos de cadeia pesada e leve.

[0023] Figura 4: Liberação de IFNγ em ensaio de células T hu- manas. Células T humanas primárias estimuladas foram tratadas com uma faixa de concentrações de anticorpos αCD73 seguida pela adição de AMP. A indução da proliferação e liberação de IFNγ foi medida. O ensaio foi feito conforme descrito no Exemplo 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0024] Os aspectos acima e outros e modalidades da invenção se tornarão claros a partir da descrição adicional aqui.

[0025] A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os termos usados têm seu significado usual na técnica, que será claro para o especialista. Referência é feita, por exemplo, aos manuais pa-

drões, tais como Sambrook e outro, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), e Roitt e outro, "Immunology" (2 <nd> Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), bem como a técnica geral aqui citada. Além disso, a menos que indicado de outra forma, todos os métodos, eta- pas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhes podem ser realizados e foram realizados de uma maneira conhecida per se, como será claro para o especialista.

[0026] É feita referência, por exemplo, novamente aos manuais padrões, à técnica geral anterior referida acima e às referências adici- onais citadas aqui.

[0027] Quando aqui utilizado, os artigos "um" e "uma" se referem a um ou mais de um (por exemplo, a pelo menos um) do objetivo grama- tical do artigo. Quando aqui utilizado, o termo "compreendendo" e suas variações, tais como "compreende" e "compreender", podem ser subs- tituídos pelo termo "contendo" ou "incluindo" ou "tendo" ou "tem", res- pectivamente e vice-versa.

[0028] "Moléculas de anticorpos" ou "anticorpos" (usados como sinônimos aqui) são proteínas gama globulina que podem ser encon- tradas no sangue ou em outros fluidos corporais de vertebrados e são usadas pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar objetos estranhos, tais como bactérias e vírus. Eles são normalmente feitos de unidades estruturais básicas - cada uma com duas grandes cadeias pesadas e duas pequenas cadeias leves - para formar, por exemplo, monômeros com uma unidade, dímeros com duas unidades ou pen- tâmeros com cinco unidades. As moléculas de anticorpos podem se ligar, por interação não covalente, a outras moléculas ou estruturas conhecidas como antígenos. Esta ligação é específica no sentido de que uma molécula de anticorpo se ligará apenas a uma estrutura es-

pecífica com alta afinidade. A parte única do antígeno reconhecida por uma molécula de anticorpo é chamada de epítopo ou determinante antigênico. A parte da molécula de anticorpo que se liga ao epítopo é às vezes chamada de paratopo, que é o determinante molecular den- tro da estrutura do anticorpo que faz interação específica com o antí- geno; e o denominado domínio variável composto por CDRs, ou região variável (Fv) do anticorpo. Um paratopo pode compreender CDRs total ou parcial da cadeia pesada, cadeia leve ou ambas as cadeias pesa- das e leves de um determinado anticorpo. O domínio variável compre- ende as três chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR's) espaçadas por regiões estruturais (FR's).

[0029] Os termos "região determinante de complementaridade" e "CDR" são conhecidos na técnica como se referindo a sequências não contíguas de aminoácidos dentro de regiões variáveis de anticorpo, que conferem especificidade de antígeno e afinidade de ligação. Em geral, existem três (3) CDRs em cada região variável da cadeia pesa- da (CDR-FI1, CDR-FI2, CDR-FI3) e três (3) CDRs em cada região va- riável da cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2, CDR- L3).

[0030] Os limites da sequência de aminoácido de um dado CDR podem ser determinados usando qualquer um de uma série de es- quemas conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat e outro (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª Ed. Pu- blic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (“Ka- bat” numbering scheme), Al-Lazikani e outro, (1997) JMB 273, 927-948 ("Chothia" numbering scheme), MacCallum e outro, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745. (“Contact" numbe- ring scheme), Lefranc M P e outro, "IMGT unique numbering for immu- noglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V- like domains," Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1 ):55-77

("IMGT" or "CCG" numbering scheme), and Honegger A and Pltickthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable doma- ins: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70, (AHo numbering scheme).

[0031] Os limites de um determinado CDR podem variar depen- dendo da convenção de nomenclatura. As posições de aminoácidos atribuídas a CDRs e FRs podem ser definidas, por exemplo, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, em que as regiões de estrutu- ra VH (FRs) e CDRs estão posicionadas da seguinte forma: resíduos 1-30 (FR1), 31-35 (CDR1), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) e 103-113 (FR4). Além disso, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, VL FRs e CDRs estão posicionados da se- guinte forma: resíduos 1-23 (FR1), 24-34 (CDR1), 35-49 (FR2), 50-56 (CDR2), 57- 88 (FR3), 89-97 (CDR3) e 98-107 (FR4).

[0032] Alternativamente, a numeração única de IMGT ou CCG foi definida para comparar os domínios variáveis qualquer que seja o re- ceptor de antígeno, o tipo de cadeia ou a espécie (Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V ., Foulquier, E., Truong , L., Thou- venin-Contet, V. e Lefranc, G., "IMGT unique numbering for immuno- globulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Na numeração úni- ca de IMGT, os aminoácidos conservados têm sempre a mesma posi- ção, por exemplo cisteína 23 (1º-CYS), triptofano 41 (CONSERVED- TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2º-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). A numeração única de IMGT for- nece uma delimitação padronizada das regiões estruturais (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4- IMGT: 118 a 128) e da complementaridade regiões determinantes: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117.

[0033] No contexto desta invenção, a referência a CDRs é basea- da na definição da convenção CCG/IMGT, no entanto, a presente des- crição não está limitada a FRs e CDRs como definido por qualquer sis- tema de numeração, porém inclui todos os sistemas de numeração, incluindo aqueles discutido acima.

[0034] Desse modo, a menos que especificado de outra forma, os termos "CDR" e "região de determinação complementar" de um de- terminado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável, bem como CDRs individuais (por exemplo, "CDR-FI1, CDR-FI2) e es- trutura regiões (FRs) do anticorpo ou sua região, devem ser entendi- das como abrangendo a região respectiva (por exemplo, a região de determinação de complementaridade) como definido por qualquer um dos esquemas conhecidos descritos acima. Em alguns casos, o es- quema para identificação de um CDR particular ou CDRs é especifica- do, tal como o CDR conforme definido pelo Kabat, Chothia, IMGT, AFIO ou outros métodos conhecidos na técnica. Em outros casos, a sequência de aminoácido particular de um CDR é determinada.

[0035] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo tem uma região constante da cadeia pesada escolhida a partir de, por exemplo, as regiões constantes da cadeia pesada de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgD e IgE; particularmente, escolhido a partir de, por exemplo, as regiões constantes da cadeia pesada (por exemplo, humana) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em outra modalidade, a molécula de anticorpo tem uma região constante de cadeia leve es- colhida a partir de, por exemplo, as regiões constantes de cadeia leve (por exemplo, humana) de kappa ou lambda. A região constante pode ser alterada, por exemplo, mutada, para modificar as propriedades do anticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir um ou mais dentre: ligação ao receptor Fc, glicosilação do anticorpo, o número de resí- duos de cisteína, função da célula efetora e/ou função complemento).

Em algumas modalidades, o anticorpo tem função efetora e pode fixar complemento. Em outras modalidades, o anticorpo não recruta células efetoras ou fixa o complemento. Em certas modalidades, o anticorpo tem capacidade reduzida ou nenhuma capacidade de se ligar a um receptor Fc. Por exemplo, pode ser um isotipo ou subtipo, fragmento ou outro mutante, que não suporta a ligação a um receptor Fc, por exemplo, tem uma região de ligação ao receptor Fc mutagenizada ou deletada.

[0036] A região constante do anticorpo é alterada em algumas modalidades. Os métodos para alterar uma região constante do anti- corpo são conhecidos na técnica. Anticorpos com função alterada, por exemplo afinidade alterada para um ligante efetivo, tal como FcR em uma célula, ou o componente C1 do complemento pode ser produzido substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido na porção cons- tante do anticorpo por um resíduo diferente (veja, por exemplo, EP388,151A1, Patente US 5.624.821 e Patente US 5.648.260, cujos teores estão incorporados aqui por referência). Tipo similar de altera- ções que, se aplicadas à imunoglobulina de murinho ou outra espécie, reduziriam ou eliminariam essas funções. Em uma modalidade, o anti- corpo compreende uma mutação L234A e/ou L235A (nomenclatura Kabat), correspondendo às posições L232A e L233A na numeração real dos anticorpos exemplares aqui descritos. Em uma modalidade, o anticorpo é um IgG1 humano.

[0037] Os polipeptídeos da invenção podem ter uma sequência N- terminal modificada, por exemplo uma deleção de um ou mais dos aminoácidos N-terminais, ou uma troca de por exemplo o primeiro, aminoácido N-terminal (por exemplo, glutamato para alanina), para otimizar a molécula a ser expressa usando certos sistemas de expres- são (como vetores específicos ou células hospedeiras), ou para ser expressa como corpos de inclusão ou na forma solúvel, ou para ser secretado no meio ou no espaço periplasmático ou por estar contido na célula, ou por produzir um produto mais homogêneo. Os polipeptí- deos da invenção podem ter uma sequência C-terminal modificada, tal como uma alanina adicional e/ou outras trocas ou deleções de amino- ácidos na parte C-terminal ou em outras posições definidas em qual- quer uma das regiões estruturais, como explicado, por exemplo em WO2012 / 175741, WO2011 / 075861, ou WO2013 / 024059, a fim de, por exemplo melhorar ainda mais a estabilidade ou reduzir imunogeni- cidade de tais polipeptídeos.

[0038] O termo "região variável" ou "domínio variável", quando aqui alternadamente utilizado, significa uma região da molécula de an- ticorpo que consiste essencialmente em quatro "regiões estruturais" que são referidas na técnica e a seguir como "região estrutural 1" ou "FR1"; como "região estrutural 2" ou "FR2"; como "região estrutural 3" ou "FR3"; e como "região estrutural 4" ou "FR4", respectivamente; cu- jas regiões estruturais são interrompidas por três "regiões de determi- nação de complementaridade" ou "CDRs", que são referidas na técni- ca e a seguir como "região de determinação de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região de determinação de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região de determinação de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. Desse modo, a estrutura geral ou se- quência de um domínio variável da imunoglobulina pode ser indicada como segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. É(são) o(s) domínio(s) variável(is) de imunoglobulina que confere especifici- dade a um anticorpo para o antígeno por transportar o sítio de ligação de antígeno.

[0039] Os termos "variável pesada (ou VH)" e "variável leve (ou VL)" referem-se aos domínios variáveis das cadeias pesadas ou leves, respectivamente, de uma molécula de anticorpo. Desta maneira, CDRs da cadeia pesada (HC) são denominados “HCDRs” e os CDRs da ca-

deia leve (LC) são denominados “LCDRs”, respectivamente.

[0040] A arte desenvolveu ainda mais moléculas de anticorpos e as tornou ferramentas versáteis em medicina e tecnologia. Desse mo- do, no contexto da presente invenção, os termos “molécula de anticor- po” ou “anticorpo” não incluem apenas anticorpos, uma vez que po- dem ser encontrados na natureza, compreendendo, por exemplo, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, porém, além disso, engloba todas as moléculas compreendendo pelo menos um paratopo com es- pecificidade de ligação a um antígeno e semelhança estrutural com um domínio variável de uma molécula de anticorpo.

[0041] Desse modo, uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção inclui um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.

[0042] Da mesma forma contemplados são um anticorpo quiméri- co, um fragmento de um anticorpo, em particular um fragmento de Fv, Fab, Fab' ou F(ab')2, um anticorpo de cadeia única, em particular um fragmento variável de cadeia única (scFv), um imunofarmacêutico Mo- dular Pequeno (SMIP), um anticorpo de domínio, um nanocorpo, um diacorpo.

[0043] Os anticorpos monoclonais (mAb) são anticorpos monoes- pecíficos que são idênticos na sequência de aminoácido. Eles podem ser produzidos por tecnologia de hibridoma a partir de uma linhagem celular híbrida (chamada de hibridoma) representando um clone de uma fusão de uma célula B de produção de anticorpos específicos com uma célula de mieloma (câncer de células B) (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.). Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por expressão recombinante em células hospedeiras (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells", J Immunol Me- thods 204 (1 ): 77-87. Um "anticorpo recombinante" é um anticorpo que foi produzido por uma célula hospedeira de engenharia recombi- nante. É opcionalmente isolado ou purificado.

[0044] Para aplicação no homem, muitas vezes é desejável reduzir a imunogenicidade dos anticorpos originalmente derivado de outras espécies, tal como camundongo. Isso pode ser feito pela construção de anticorpos quiméricos ou por um processo denominado "humaniza- ção". Neste contexto, um "anticorpo quimérico" é entendido como um anticorpo que compreende uma parte da sequência (por exemplo, um domínio variável) derivado de uma espécie (por exemplo, camundon- go) fundido a uma parte da sequência (por exemplo, os domínios constantes) derivado de uma espécie diferente (por exemplo, huma- no). Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo que compreende um domínio variável originalmente derivado de uma espécie não humana, em que certos aminoácidos foram mutados para tornar a sequência geral desse domínio variável mais semelhante a uma sequência de um domínio variável humano. Os métodos de quimerização e humaniza- ção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (Billetta R, Lobuglio AF.“Chimeric antibodies”. Int Rev Immunol. 1993;10(2- 3):165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature : 332:323.).

[0045] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo que compreende resíduos de aminoácidos de regiões hipervariáveis não humanas (HVRs) e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá subs- tancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) correspondem àqueles de um anticorpo não humano, e todas ou subs-

tancialmente todas as regiões estruturais (FRs) correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de an- ticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido a humanização.

[0046] Além disso, foram desenvolvidas tecnologias para a criação de anticorpos baseados em sequências derivadas do genoma huma- no, por exemplo, por exibição de fago ou uso de animais transgênicos (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCaf- ferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J. Mol. Biol., 222, 581 -597; Knappik et al„ J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Brie- fings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1 (2): 189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1 ):65-93.; Bmggemann M, Taussig MJ. "Pro- duction of human antibody repertoires in transgenic mice”. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.). Tais anticorpos são "anticorpos humanos" no contexto da presente invenção.

[0047] Da mesma forma contemplados são fragmentos das molé- culas que retêm propriedades de ligação de antígeno, como fragmen- tos de Fab, Fab' ou F(ab')2. Esses fragmentos podem ser obtidos por fragmentação de moléculas de anticorpo, por exemplo por digestão proteolítica ou por expressão recombinante de tais fragmentos. Por exemplo, a digestão da molécula de anticorpo pode ser realizada por meio de técnicas de rotina, por exemplo usando papaína ou pepsina (WO 94/29348). A digestão de anticorpos com papaína normalmente produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, os chamados fragmentos de Fab, cada um com um único sítio de ligação de antíge-

no e um fragmento de Fc residual. O tratamento com pepsina produz um F(ab’)2. Em moléculas de Fab, os domínios variáveis são, cada um, fundidos a um domínio constante de imunoglobulina, de preferên- cia de origem humana. Desse modo, o domínio variável da cadeia pe- sada pode ser fundido a um domínio de CH1 (um denominado frag- mento de Fd) e o domínio variável da cadeia leve pode ser fundido a um domínio CL. As moléculas de Fab podem ser produzidas por ex- pressão recombinante dos respectivos ácidos nucleicos em células hospedeiras, veja abaixo.

[0048] Uma série de tecnologias foi desenvolvida para colocar domínios variáveis de moléculas de anticorpo, ou moléculas derivadas de tais domínios variáveis, em um contexto molecular diferente. Em geral, essas moléculas de anticorpo são menores em tamanho em comparação com as moléculas de anticorpo naturais e podem com- preender uma única cadeia de aminoácidos ou várias cadeias de ami- noácidos. Por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv) é uma fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de moléculas de anticorpo, ligadas em conjunto com um ligante curto, ge- ralmente serina (S) ou glicina (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Hus- ton e outro; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195-217). "Anticorpos de domínio único" ou "nanocorpos" abrigam um sítio de ligação de antígeno em um único domínio semelhante a Ig (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward e outro, Nature. 12 de outubro de 1989; 341 (6242): 544-6; Revets e outro, Expert Opin Biol Ther. 5 (1): 111-24, 2005). Um ou mais anticorpos de domínio único com es- pecificidade de ligação para o mesmo ou um antígeno diferente podem ser ligados entre si. Diacorpos são moléculas de anticorpos bivalentes que consistem em duas cadeias de aminoácidos compreendendo dois domínios variáveis (WO 94/13804, Holliger e outro, Proc Natl Acad Sci U S A. 1993, 15 de julho; 90 (14): 6444-8). Outros exemplos de molé-

culas semelhantes a anticorpos são os anticorpos da superfamília de imunoglobulina (IgSF; Srinivasan e Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6 (2): 185-96). Um conceito diferente leva ao denominado Small Modular Immunopharmaceutical (SMIP), que compreende um domínio de Fv ligado a uma articulação de cadeia única e domínios efetores desprovidos do domínio constante CH1 (WO 02/056910).

[0049] A molécula de anticorpo pode ser fundida (como uma prote- ína de fusão) ou de outra forma ligada (por ligações covalentes ou não covalentes) a outras entidades moleculares tendo um impacto deseja- do nas propriedades da molécula de anticorpo. Por exemplo, pode ser desejável melhorar as propriedades farmacocinéticas das moléculas de anticorpo, estabilidade, por exemplo em fluidos corporais como o sangue, em particular no caso de anticorpos de cadeia simples ou an- ticorpos de domínio. Uma série de tecnologias foram desenvolvidas a este respeito, em particular para prolongar a meia-vida de tais molécu- las de anticorpo na circulação, tal como a peguilação (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), fusão ou de outra maneira covalen- temente ligar a molécula de anticorpo a outra molécula de anticorpo tendo afinidade para uma proteína sérica como albumina (WO 2004041865; WO 2004003019), ou expressão da molécula de anticor- po como proteína de fusão com a totalidade ou parte de uma proteína sérica como albumina ou transferrina (WO 01/79258).

[0050] Os termos "epítopo" e "determinante antigênico", que po- dem ser usados alternadamente, referem-se à parte de uma macromo- lécula, como um polipeptídeo, que é reconhecido por moléculas de ligação de antígeno, como as moléculas de anticorpo da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação de antígeno das referidas moléculas. Os epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma molécula de anticorpo e, portanto, representam o alvo de especificida- de de uma molécula de anticorpo. Os epítopos podem ser ainda defi-

nidos como epítopos estruturais ou epítopos funcionais. Um “epítopo estrutural” consiste em aminoácidos ou outras moléculas em uma re- gião que está em contato próximo com o anticorpo geralmente revela- do por uma estrutura. Um "epítopo funcional" é definido como as par- tes de uma molécula que fazem uma contribuição energética para a ligação de tal forma que quando eles são alterados, há uma diminui- ção na afinidade de ligação. Portanto, os resíduos que entram em con- tato com o parátopo, e quais resíduos estão contribuindo para a afini- dade, sejam proximais ou não são considerações importantes na defi- nição do epítopo. A cristalografia de raios X é um método para deter- minar os sítios precisos de interação entre um anticorpo e seu antíge- no. As estruturas de cristal permitem a determinação precisa das prin- cipais interações entre os aminoácidos individuais de ambas as cadei- as laterais e os átomos da cadeia principal no epítopo e no parátopo. Os aminoácidos que estão a 4,5 Angstrom um do outro são geralmen- te considerados resíduos de contato.

[0051] Uma molécula de anticorpo que pode "ligar", "ligar-se a", "ligar-se especificamente" ou "ligar-se especificamente a", que "tem afinidade para” e/ou que "tem especificidade para” um determinado epítopo, antígeno ou proteína (ou para pelo menos uma parte, frag- mento ou epítopo do mesmo) é referido ser "contra" ou "dirigido con- tra" o referido epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molécula de "li- gação" em relação a tal epítopo, antígeno ou proteína.

[0052] Geralmente, o termo "especificidade" refere-se ao número de diferentes tipos de antígenos ou epítopos aos quais uma determi- nada molécula de ligação de antígeno ou proteína de ligação de antí- geno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variá- vel único de imunoglobulina) pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação de antígeno pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de li- gação de antígeno (KD), é uma medida para a resistência de ligação entre um epítopo e um sítio de ligação de antígeno na proteína de li- gação de antígeno: quanto menor o valor do KD, mais forte é a resis- tência de ligação entre um epítopo e a molécula de ligação de antíge- no (alternativamente, a afinidade pode da mesma forma ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD). Como será claro para o especialista (por exemplo com base na descrição adicional aqui), a afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida per se, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da resistência de ligação entre uma molécula de ligação de antígeno (como um anticorpo da invenção) e o antígeno pertinente. A avidez está relacionada à afinidade entre um epítopo e seu sítio de ligação de antígeno na molécula de ligação de antígeno e o número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula de ligação de antígeno.

[0053] Normalmente, as proteínas de ligação de antígeno (tais como as moléculas de anticorpo da invenção) irão se ligar a uma cons- tante de dissociação (KD) de 10E-5 a 10E-14 mols/litro (M) ou menos, e de preferência 10E-7 a 10E-14 mols/litro (M) ou menos, mais prefe- rencialmente 10E-8 a 10E-14 mols/litro, e ainda mais preferencialmen- te 10E-11 a 10E-13 (como medido, por exemplo, em um ensaio de Ki- nexa; conhecido na técnica), e/ou com uma constante de associação (KA) de pelo menos 10E7 ME-1, de preferência pelo menos 10E8 ME- 1, mais preferencialmente pelo menos 10E9 ME-1, tal como pelo me- nos 10E11 ME-1. Qualquer valor de KD superior a 10E-4 M é geral- mente considerado indicar ligação não específica. De preferência, um anticorpo da invenção se ligará ao antígeno desejado com um KD infe- rior a 500 nM, preferencialmente inferior a 200 nM, mais preferencial- mente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM. A ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno a um antígeno ou epítopo po-

de ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, os ensaios aqui descritos, tal como ressonân- cia de plásmon superficial (SPR), análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoen- saios enzimáticos (EIA) e ensaios de competição em sanduíche, e as diferentes variantes conhecidas per se na técnica.

[0054] A afinidade de ligação de uma molécula de anticorpo pode ser aumentada por um processo conhecido como maturação de afini- dade (Marks e outro, 1992, Biotechnology 10: 779-783; Barbas, e ou- tro, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier e outro, 1995, Ge- ne 169: 147-155). Os anticorpos maturados por afinidade são, portan- to, da mesma forma incluídos na presente invenção.

[0055] Por exemplo, a maturação de afinidade do anticorpo inven- tivo pode resultar em alterações de um ou mais aminoácidos introduzi- dos na estrutura e/ou regiões de CDR que podem resultar em uma melhoria na afinidade de ligação ao antígeno, sem alterar a especifici- dade do anticorpo para seu epítopo. Desse modo, as modalidades da invenção incluem, por exemplo anticorpos que se ligam especifica- mente a CD73 compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77; SEQ ID Nº: 79; SEQ ID Nº: 81; SEQ ID Nº: 83; SEQ ID Nº: 85; SEQ ID Nº: 87; SEQ ID Nº: 89; SEQ ID Nº: 91; SEQ ID Nº: 93; SEQ ID NO: 95 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96. Por exemplo, os an- ticorpos maturados por afinidade da invenção podem compreender uma região variável da cadeia leve, como descrito acima, compreen- dendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos, em que as substituições de aminoácidos podem ser substituições de ami- noácidos conservadoras ou substituições de aminoácidos não conser- vadoras e/ou uma região variável de cadeia pesada como descrito acima compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 substituições de aminoácidos, em que as substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservadoras ou substituições de ami- noácidos não conservadoras.

[0056] Por exemplo, a presente invenção da mesma forma con- templa mutações nas sequências de anticorpos de acordo com a in- venção, que podem incluir substituições, deleções, incluindo deleções internas, adições, incluindo adições que originam proteínas de fusão ou substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos dentro e/ou adjacentes à sequência de aminoácido, porém que resulta em nenhuma mudança funcional ("silenciosa"), em que a mudança produz um anticorpo anti-CD73 funcionalmente equivalente. Tal mudança po- de, por exemplo compreender substituições conservadoras de amino- ácidos que podem ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza an- fipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não pola- res (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros inclu- em glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina, aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisi- na e histidina; e os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Além disso, glicina e prolina são resíduos que podem influenciar a orientação da cadeia. As substi- tuições não conservadoras implicarão na troca de um membro de uma dessas classes para um membro de outra classe.

[0057] Em um exemplo, a presente invenção refere-se a anticor- pos anti-CD73 com função efetora aumentada, bem como derivados alterados/mutantes do mesmo incluindo, porém não limitado aqueles que exibem características de ligação alteradas; por exemplo constan- tes de associação alteradas koN, constantes de dissociação kOFF e/ou constante de equilíbrio ou afinidade de ligação, KD.

[0058] As composições e métodos descritos aqui abrangem poli- peptídeos e ácidos nucleicos com as sequências especificadas, ou sequências substancialmente idênticas ou similar a isso, por exemplo, sequências pelo menos 85%, 90%, 95% idênticas ou superiores à se- quência especificada. No contexto de uma sequência de aminoácido, o termo "substancialmente idêntico" é usado aqui para se referir a um primeiro aminoácido que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos que são i) idênticos a, ou ii) substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos alinhadas em uma segun- da sequência de aminoácido, de modo que a primeiro e a segunda se- quência de aminoácido podem ter um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, as sequências de aminoáci- dos que contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de referência, por exemplo, uma se- quência aqui fornecida. No contexto da sequência de nucleotídeos, o termo "substancialmente idêntico" é usado aqui para se referir a uma primeira sequência de ácido nucleico que contém um número suficien- te ou mínimo de nucleotídeos que são idênticos aos nucleotídeos ali- nhados em uma segunda sequência de ácido nucleico de modo que a primeira e segunda sequências de nucleotídeo codificam um polipeptí- deo com atividade funcional comum ou codificam um domínio de poli- peptídeo estrutural comum ou uma atividade de polipeptídeo funcional comum. Por exemplo, sequências de nucleotídeo com pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de referência.

[0059] Os termos "idêntico" ou "identidade percentual", no contex- to de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparados e ali- nhados para correspondência máxima. Para determinar a identidade percentual, as sequências são alinhadas para propósitos de compara- ção ideais (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para ali- nhamento ideal com um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são em seguida comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a po- sição correspondente na segunda sequência, em seguida as molécu- las são idênticas nessa posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas comparti- lhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = # de posições idên- ticas / # total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x100). Em algumas modalidades, as duas sequências que são comparadas têm o mesmo comprimento após as lacunas serem introduzidas nas sequências, quando apropriado (por exemplo, excluindo sequência adicional que se estende além das sequências sendo comparadas). Por exemplo, quando sequências de região variável são comparadas, as sequências de domínio líder e/ou constante não são consideradas. Para comparações de sequências entre duas sequências, um CDR "correspondente" refere-se a um CDR no mesmo local em ambas as sequências (por exemplo, CDR-FI1 de cada sequência).

[0060] A determinação da identidade percentual ou similaridade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático.

Um exemplo não limitante preferido de um algo- ritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 87: 2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 5873-5877. Um tal algoritmo é incorporado aos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e outro, 1990, J.

Mol.

Biol. 215: 403-410. As pesquisas de nucleotídeos de BLAST podem ser realizadas com o programa de NBLAST, pontuação = 100, comprimen- to de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse.

As pesqui- sas de proteína de BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter se- quências de aminoácidos homólogas a uma proteína de interesse.

Pa- ra obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e outro, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta rela- ções distantes entre as moléculas (Id.). Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrões dos res- pectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

Outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo mate- mático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). Esse algoritmo é incorporado ao pro- grama ALIGN (versão 2.0), que faz parte do pacote de software de ali- nhamento de sequência GCG.

Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de pe- so PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas.

Algoritmos adicionais para análise de sequência são conhecidos na técnica e incluem AD- VANCE e ADAM como descrito em Torellis e Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-8. No FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e a velocidade da pesquisa. Se ktup = 2, regiões similares nas duas sequências a serem comparadas são encontradas olhando para pares de resíduos alinhados; se ktup = 1, os aminoácidos alinhados simples são examinados ktup pode ser definido como 2 ou 1 para sequências de proteínas, ou de 1 a 6 para sequências de DNA. O padrão se ktup não for especificado é 2 para proteínas e 6 para DNA. Alternativamente, o alinhamento de sequên- cia de proteína pode ser realizado usando o algoritmo CLUSTAL W, como descrito por Higgins e outro, 1996, Methods Enzymol. 266: 383-

402.

[0061] Os resíduos de aminoácidos serão indicados de acordo com o código de aminoácidos de três ou uma letra padrão, como ge- ralmente conhecido e acordado na técnica. Ao comparar duas se- quências de aminoácidos, o termo "diferença de aminoácidos" refere- se a inserções, deleções ou substituições do número indicado de resí- duos de aminoácidos em uma posição da sequência de referência, em comparação com uma segunda sequência. No caso de substitui- ção(ões), tais substituições serão de preferência substituições conser- vadoras de aminoácidos, o que significa que um resíduo de aminoáci- do é substituído por outro resíduo de aminoácido de estrutura química semelhante que tem pouca ou essencialmente nenhuma influência so- bre a função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptí- deo. Tais substituições conservadoras de aminoácidos são bem co- nhecidas na técnica, por exemplo, de W01998/49185, em que as subs- tituições conservadoras de aminoácidos preferencialmente são substi- tuições em que um aminoácido dentro dos seguintes grupos (i) - (v) é substituído por outro resíduo de aminoácido dentro do mesmo grupo: (i) pequenos resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (ii) resíduos polares negativamente carrega- dos e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, Glu e Gin; (iii) resíduos polares carregados positivamente: His, Arg e Lys; (iv) grandes resí- duos alifáticos, não polares: Met, Leu, lie, Val e Cys; e (v) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. As substituições conservadoras de amino- ácidos particularmente preferidas são as seguintes: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gin ou His; Asp em Glu; Cys em Ser; Gin em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou Pro; Seu em Asn ou em Gin; IIe em Leu ou em Val; Leu em IIe ou em Val; Lys em Arg, em Gin ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em IIe; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp ou em Phe; Val em IIe ou em Leu.

[0062] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" (se de ca- deia simples) são usados alternadamente aqui.

[0063] Os termos "ácido nucleico", "sequência de ácido nucleico", "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de polinucleotídeo" e "poli- nucleotídeo" são usados alternadamente.

[0064] O termo "isolado", quando aqui utilizado, refere-se ao mate- rial que é removido de seu ambiente original ou nativo (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um poli- nucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipep- tídeo, separado por intervenção humana de alguns ou todos os mate- riais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptí- deos podem ser parte de uma composição, e ainda ser isolado no sen- tido de que tal vetor ou composição não faz parte do ambiente em que é encontrado na natureza.

[0065] De preferência, o ácido nucleico será parte de um vetor de expressão, em que a referida molécula de ácido nucleico está operaci- onalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora, em que tal sequência reguladora pode ser uma sequência promotora, intensifica- dora ou terminadora e, mais preferencialmente, um promotor heterólo- go, realçador ou sequência terminadora.

[0066] Os termos "PD1" e "PD-1" são usados alternadamente aqui. Os termos "PDL1" e "PDL-1" são igualmente usados alternadamente aqui. PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui abaixo referem-se a anticorpos anti-PD-1 específicos, respectivamente.

[0067] “MEDI9447” e “BMS986179”, quando aqui utilizado, quando escrito entre aspas (“”), referem-se a anticorpos de referência que fo- ram gerados de acordo com as informações descritas em WO 2016/075099 (“MEDI9447”) e WO 2016/081748 ("BMS986179", da mesma forma denominado mAb-CD73.4-Vh-hHC-lgG2-lgG1 1f aqui), respectivamente. WO 2016/075099 e WO 2016/081748, respectiva- mente, estão aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[0068] Para evitar dúvidas, por "Grupo de Diferenciação 73" ou "CD73" queremos dizer a proteína humana codificada pelo gene "NT5E 5'-nucleotidase ecto [Homo sapiens (humano)]", que é forneci- do em NCBI Reference Sequence: NP_002517.1, acessível em http://www.ncbi.nlm.nih.goV/protein/NP_002517.1 (Isoforma longa, que corresponde ao número de acesso UniProt P21589), bem como Se- quência de Referência NCBI: NP_001191742.1, acessível em https://www.ncbi.nlm.nih.goV/protein/NP_001191742.1 (isoforma cur- ta), e as respectivas sequências de ácido nucleico que codificam es- sas proteínas. Quando aqui utilizado, "CD73" pode se referir à forma monomérica e/ou dimérica dessas proteínas. Em algumas modalida- des, "CD73" se refere à isoforma longa de CD73 humano, como des-

crito acima. Para dados cristalográficos aqui fornecidos, a numeração de aminoácidos corresponde ao número de acesso Uniprot P21589, incluindo o peptídeo sinal, em que a proteína madura é desprovida do peptídeo de sinal correspondente aos resíduos de aminoácidos 1-26 de P21589, no entanto, o esquema de numeração ao longo deste pe- dido se refere à sequência de aminoácido de comprimento total de P21589. CD73 de murino, quando aqui utilizado, refere-se ao no. de acesso Uniprot. Q61503.

[0069] Em células e organismos vivos, CD73 está geralmente pre- sente como uma proteína dimérica ancorada à membrana celular atra- vés de uma ligação de membrana de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (da mesma forma denominada "âncora de GPI" aqui) e tem atividade de ecto-5'-nucleotidase.

[0070] Os termos "CD73 solúvel" e "sCD73", que são usados alternadamente aqui, significam moléculas de CD73 que não estão ligadas a uma membrana, por exemplo, por meio de uma âncora de GPI.

[0071] O termo "CD73 ligado à célula" significa moléculas de CD73 que estão ligadas a uma superfície celular, por exemplo por meio de uma âncora de GPI.

[0072] O termo "CD73 não ligado à célula" refere-se ao CD73 que está presente no espaço extracelular. Inclui CD73 solúvel e CD73 liga- do à vesícula, isto é moléculas de CD73 que estão ligadas à superfície das vesículas no espaço extracelular. O termo “CD73 não ligado à cé- lula” exclui todos os “CD73 ligado à célula”. A atividade de "CD73 não ligado à célula" pode ser determinada medindo a atividade de CD73 em sobrenadantes de cultura de células, como descrito no Exemplo 8.

[0073] Os termos "IFNγ", "IFNg", "interferon-gama", "interferon gama", "IFN-gama”, “IFNG”, “IFN gama”, “IFN-y”, ou similar, são usa- dos alternadamente aqui e denotam a citocina da família do interferon como conhecido na técnica (NCBI Gene ID: 3458), que é secretado por células do sistema imune inato e adaptativo, tal como as células T. Anticorpos anti-CD73 da invenção

[0074] Como detalhado acima, CD73 desempenha um papel im- portante na regulação da atividade das células T e, portanto, da ativi- dade do sistema imunológico. Foi demonstrado em uma faixa de dife- rentes cenários de câncer que as moléculas de anticorpos anti-CD73 antagonistas podem reverter supressão mediada por adenosina de atividade das células T, desse modo ativando o sistema imunológico para atacar tumores e desse modo tratar câncer.

[0075] A presente invenção fornece anticorpos anti-CD73 melho- rados. A partir de anticorpos de murino progenitores para CD73, de- nominados A1, A2, A3 e A4 (veja Tabela 9), variantes humanizadas foram geradas. Moléculas de anticorpo anti-CD73 preferidas da pre- sente invenção são denominadas B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 e C6 (veja Tabela 9), que são anticorpos monoclonais humanizados. Os an- ticorpos anti-CD73 da invenção podem, por exemplo ser da mesma forma referidos como "anticorpo CD73 antagonista" ou "anticorpos CD73 antagonistas", em que o termo "antagonista" ou qualquer equi- valente gramatical do mesmo refere-se à inibição da função de CD73 (por exemplo, solúvel e ligada à superfície celular) pelo anticorpo CD73 da invenção.

[0076] Usando um ensaio de ativação de células T in vitro (tam- bém descrito no Exemplo 6), os presentes inventores examinaram as características funcionais de anticorpos anti-CD73 representativos da presente invenção. Como pode ser visto no Exemplo 6 e na Tabela 5 e 6, os anticorpos testados foram capazes de induzir a proliferação de células T em um nível mais alto em comparação com os anticorpos anti-CD73 de referência em certos doadores. Além disso, os anticor- pos testados foram capazes de induzir níveis mais elevados de IFNγ em células T em comparação com anticorpos anti-CD73 de referência em certos doadores. Como pode ser apreciado, esta capacidade sur- preendente dos anticorpos anti-CD73 da presente invenção induzir mais eficazmente a ativação de células T do que o anticorpo anti- CD73 de referência da técnica anterior sugere que eles podem forne- cer um tratamento mais eficaz de câncer e/ou resultado clínico melho- rado.

[0077] Os inventores também investigaram várias outras caracte- rísticas funcionais das moléculas de anticorpo anti-CD73 da presente invenção. Incluída nesta avaliação estava a determinação da capaci- dade de inibir a formação de adenosina por anticorpos anti-CD73. Isto foi feito medindo-se a inibição de CD73 ligado a células, bem como a inibição de CD73 não ligado a células em sobrenadantes de cultura de células. Os anticorpos anti-CD73 da presente invenção mostraram maior atividade na inibição de CD73 não ligado à célula em compara- ção com os anticorpos anti-CD73 de referência. Desse modo, esses anticorpos têm a capacidade de levar a uma inibição mais completa do CD73 em comparação com os anticorpos CD73 de referência.

[0078] Em contraste com os anticorpos anti-CD73 conhecidos na técnica, os anticorpos anti-CD73 da invenção têm propriedades melho- radas, em particular em termos da inibição da geração de adenosina e ativação de células T. Isto está em contraste com as moléculas de an- ticorpo anti-CD73 de referência conhecidas "MEDI9447" e "BMS986179", como pode ser visto nos exemplos em anexo. Como pode ser apreciado, esta superioridade das moléculas de anticorpo anti-CD73 da presente invenção, sugere que elas podem ter uma mai- or eficácia e/ou melhor resultado clínico do que outros anticorpos anti- CD73 e, portanto, podem permitir uma terapia de câncer mais eficaz.

[0079] Desta maneira, portanto, um primeiro aspecto da invenção fornece moléculas de anticorpo anti-CD73, compreendendo:

(1) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (hcCDRI), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (IcCDRI), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); ou (2) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (hcCDRI), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (IcCDRI), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); ou (3) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (hcCDRI), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (IcCDRI), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 18 (lcCDR3); ou (4) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 (hcCDRI), SEQ ID NO: 20 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 21 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 (IcCDRI), SEQ ID NO: 23 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 24 (lcCDR3); ou (5) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (hcCDRI), SEQ ID NO: 26 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 27 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (IcCDRI), SEQ ID NO: 29 (lcCDR2) e SEQ ID NQ: 30 (lcCDR3); ou, (6) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (hcCDRI), SEQ ID NO: 32 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 33 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (IcCDRI), SEQ ID NO: 35 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 36 (lcCDR3); ou,

(7) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 (hcCDRI), SEQ ID NO: 38 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 39 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 (IcCDRI), SEQ ID NO: 41 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 42 (lcCDR3); ou (8) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 (hcCDRI), SEQ ID NO: 44 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 45 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46 (IcCDRI), SEQ ID NO: 47 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 48 (lcCDR3); ou (9) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49 (hcCDRI), SEQ ID NO: 50 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 51 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (IcCDRI), SEQ ID NO: 53 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 54 (lcCDR3); ou (10) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 (hcCDRI), SEQ ID NO: 56 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 57 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 58 (IcCDRI), SEQ ID NO: 59 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 60 (lcCDR3); ou (11) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61 (hcCDRI), SEQ ID NO: 62 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 63 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64 (IcCDRI), SEQ ID NO: 65 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 66 (lcCDR3); ou (12) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67 (hcCDRI), SEQ ID NO: 68 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 69 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70 (IcCDRI), SEQ ID NO: 71 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 72 (lcCDR3).

[0080] Como descrito acima, as moléculas de anticorpo anti-CD73 preferidas da presente invenção são denominadas B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 e C6. Fornecida aqui uma tabela de sequência (Tabela 9) que facilmente permite a identificação de sequências de aminoácidos indi- viduais para moléculas de anticorpo anti-CD73 específicas da presente invenção.

[0081] Além das sequências de CDR como mencionadas aqui, as moléculas de anticorpo da invenção incluem sequências da região de estrutura de imunoglobulina (FR). Estas sequências são preferencial- mente não imunogênicas em humanos e são, portanto, preferencial- mente sequências de FR humanas ou humanizadas. Sequências de FR humanas ou humanizadas adequadas são conhecidas na técnica. As sequências de FR especificamente preferidas podem ser retiradas das modalidades mostradas aqui, descrevendo as moléculas de anti- corpo completas e, desse modo, as sequências de CDR, bem como as sequências de FR.

[0082] Os métodos de preparação de moléculas de anticorpo do primeiro aspecto da invenção são bem conhecidos na técnica e o es- pecialista seria facilmente capazes de preparar uma molécula de anti- corpo com as características do primeiro aspecto da invenção. Exem- plos de tais métodos são fornecidos abaixo.

[0083] Para a produção de anticorpos compreendendo duas ca- deias pesadas completas e duas cadeias leves completas, como aque- las do tipo IgG1 ou IgG4, veja Norderhaug e outro, J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow e Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004; Shukla e outro, 2007, J. Chromatography B, 848 (1): 28-39.

[0084] Processos para a fabricação de anticorpos scFv para ex- pressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam construtores de scFv em células hospedeiras (como E. coli, Pichia pastoris / Koma-

gataella phaffii, or mammalian cell lines, por exemplo, CHO ou NS0), produzindo moléculas de scFv funcionais, são da mesma forma co- nhecidos (Rippmann e outro Applied and Environmental Microbiology 1998, 64 (12): 4862-4869; Yamawaki e outro, J. Biosci. Bioeng. 2007, 104 (5): 403-407; Sonoda e outro, Protein Expr. Purif. 2010, 70 (2): 248-253).

[0085] Para evitar dúvidas, cada uma das modalidades específicas listadas aqui para o primeiro aspecto da invenção pode da mesma forma ser considerada para aspectos independentes da invenção.

[0086] Uma modalidade preferida do primeiro aspecto da invenção é aquela em que a referida molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo humanizado.

[0087] Em uma modalidade, o referido anticorpo é um anticorpo recombinante. Em uma modalidade, o referido anticorpo é isolado. Em uma modalidade, o referido anticorpo é purificado.

[0088] Uma outra modalidade preferida do primeiro aspecto da invenção é aquela em que a referida molécula de anticorpo é um anti- corpo monoclonal, Fab, F(ab’)2, Fv ou scFv.

[0089] Os termos "humanizado", "Fab", "F(ab’)2", "Fv" e "scFv" são bem conhecidos na técnica e discutidos aqui na seção de Definições da especificação.

[0090] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região constante da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE. De preferência, a região constante da cadeia pe- sada é lgG1, mais preferencialmente lgG1 com uma mutação L234A e/ou L235A (numeração de Kabat; correspondendo às posições L232A e L233A na numeração real).

[0091] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região constante de cadeia leve que é kappa ou lambda.

[0092] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácido pelo menos 85%, 90%, 95% idêntica a qual- quer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 77 ou 79 como descrito acima.

[0093] Em uma modalidade, a referida molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequên- cia de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 77 ou 79.

[0094] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 85%, 90%, 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 ou 95. De preferência, a referida molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 ou 95. Mais preferencialmente, o referido anticorpo é humanizado.

[0095] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequên- cia de aminoácido de pelo menos 85% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 74, 76, 78 ou 80.

[0096] Em uma modalidade, a referida molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 74, 76, 78 ou 80.

[0097] Em uma modalidade preferida, as moléculas de anticorpo anti-CD73 têm um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 85% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 96. De preferência a referida molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 96. Mais preferencialmente, o referido anti-

corpo é humanizado.

[0098] Os métodos de cálculo de identidades de sequência de aminoácido são bem conhecidos na técnica e discutidos aqui na seção de Definições da especificação.

[0099] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 81.

[00100] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo o aminoácido sequência da SEQ ID NO: 83.

[00101] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85.

[00102] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87.

[00103] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89.

[00104] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91.

[00105] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 93.

[00106] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 95.

[00107] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se-

quência de aminoácido de SEQ ID NO: 82.

[00108] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 84.

[00109] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 86.

[00110] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 88.

[00111] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 90.

[00112] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 92.

[00113] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 94.

[00114] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 96.

[00115] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 105.

[00116] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 107.

[00117] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami-

noácido de SEQ ID NO: 109.

[00118] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 111.

[00119] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 113.

[00120] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 115.

[00121] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 117.

[00122] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 119.

[00123] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 106.

[00124] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 108.

[00125] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 110.

[00126] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 112.

[00127] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá-

cido de SEQ ID NO: 114.

[00128] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 116.

[00129] Em uma modalidade preferida, o anti-CD73 um a molécula de anticorpo tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 118.

[00130] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 120.

[00131] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 73 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 74.

[00132] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 75 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 76.

[00133] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 77 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 78.

[00134] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 79 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 80.

[00135] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID

NO: 82.

[00136] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84.

[00137] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 86.

[00138] Em uma modalidade preferida , a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 88.

[00139] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 90.

[00140] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 92.

[00141] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 93 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID

NO: 94.

[00142] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 96.

[00143] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 97 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 98.

[00144] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 99 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 100.

[00145] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 101 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 102.

[00146] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 molécula tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 103 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 104.

[00147] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido SEQ ID NO: 105 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 106.

[00148] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 107 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 108.

[00149] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 109 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 110.

[00150] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 111 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 112.

[00151] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 113 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 114.

[00152] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 115 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 116.

[00153] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 117 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 118.

[00154] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 120.

[00155] Para todas as modalidades anteriores, deve ser entendido que, ao usar o termo "compreendendo", é pretendido da mesma forma incluir uma modalidade em que o respectivo domínio ou molécula "consiste" na sequência de aminoácido como indicado.

[00156] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 é capaz de se ligar ao CD73 humano com uma constante de dissociação (KD) de menos do que 10 nM, preferencialmente menos do que 1 nM, mais preferencialmente menos do que 100 pM.

[00157] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CD73 é capaz de se ligar ao CD73 humano (isoforma longa) e CD73 de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis) com alta afinidade. Em algumas modalidades, alta afinidade se refere a um KD de menos do que 10 nM, por exemplo, 9, 8, 7, 6 ou inferior, como medido pela res- sonância de plásmon superficial (SPR). Em modalidades preferidas, alta afinidade se refere a um KD de menos do que 1 nM, como medido por SPR. Em modalidades mais preferidas, a molécula de anticorpo anti-CD73 é capaz de se ligar a CD73 humano com um KD inferior a 500 pM. Na modalidade mais preferida, o anticorpo liga-se ao CD73 humano com um KD inferior a 100 pM. Um protocolo para determinar KD usando SPR é fornecido nos exemplos anexos.

[00158] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo an- ti-CD73 liga-se ao CD73 de camundongo com afinidade mais baixa em comparação com CD73 humano, tal como afinidade 10x, 50x, 100x ou 110x menor em comparação com CD73 humano. A sequência de CD73 de camundongo é acessível pelo número de acesso do Gen- Bank NP_035981.1 (apenas 1 forma identificada). A sequência de CD73 cinomolgo é acessível por acesso de RefSeq No XP_005552488.1.

[00159] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é capaz de reduzir a atividade de CD73 humano. Em algumas modali- dades, a atividade de CD73 humano se refere à função enzimática de hidrolisar AMP em adenosina. Desta maneira, reduzir a atividade do CD73 humano refere-se à inibição dessa função enzimática. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 inibe a função enzimática do CD73 humano in vitro como descrito nos Exemplos. Em algumas modalida- des, a redução da atividade de CD73 humano se refere a uma redução dos níveis de superfície celular de CD73. Em outra modalidade, a ini- bição (bloqueando-se a função enzimática de CD73 ou reduzindo os níveis de superfície celular de CD73) é determinada em um ensaio com base em células, por exemplo, usando uma linhagem de célula de câncer, tal como Colo201.

[00160] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CD73 inibe a formação de adenosina em pelo menos 70%, de prefe- rência em mais do que 80%, como determinado em um ensaio com base em células como descrito no Exemplo 5. Em modalidades parti- cularmente preferidas, a molécula de anticorpo anti-CD73 inibe a for- mação de adenosina em pelo menos 60%, pelo menos 70%, de prefe- rência em mais do que 75% em sobrenadantes de cultura de células, isto é, inibe a atividade de CD73 não ligado à célula, como descrito no Exemplo 8. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 inibe a formação de adenosina por CD73 não ligado à célula em pelo menos 70%.

[00161] Em ainda uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD73 ini- be a função enzimática do CD73 humano in vivo.

[00162] Os ensaios para determinar a inibição da atividade enzimá- tica de CD73 humano in vitro ou in vivo são conhecidos na técnica e são da mesma forma descritos em mais detalhes nos exemplos ane- xos.

[00163] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CD73 é capaz de inibir a atividade enzimática do CD73 humano com um IC90 inferior a 5 nM, ou 4, 3, 2, 1,5, 1, 0,5 nM ou inferior. Em moda- lidades particularmente preferidas, a molécula de anticorpo anti-CD73 inibe a atividade enzimática de CD73 humano com um IC90 inferior a 0,4 nM. Um protocolo para determinar IC90 é fornecido nos exemplos anexos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD73 inibe CD73 humano com um IC90 de menos do que 1 nM, porém reduz apenas moderadamente os níveis de superfície celular de CD73 (ou seja, em menos de 30%, menos de 25% ou menos de 20%).

[00164] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 é capaz de re- verter a supressão dependente de AMP da função de célula T. Em uma modalidade preferida, a função de célula T refere-se à prolifera- ção das células T, que é conhecida por ser suprimível pela adenosina que é gerada por CD73 a partir do monofosfato de adenosina (AMP). O anticorpo da invenção é capaz de reverter esta supressão inibindo a produção de adenosina por CD73, de preferência em um nível subs- tancialmente igual ao nível de controle (células T estimuladas tratadas com controle de isotipo sem adição de AMP). Em modalidades preferi- das, o anticorpo da invenção é capaz de restaurar a proliferação de células T em 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou 100%, ou mesmo mais do que 100%, tal como 110%, 115%, 120% ou 125% do nível de controle. Um ensaio para determinar a supressão dependente de AMP da função de célula T é descrito no Exemplo 6. Em algumas modalidades, as células T são CD4+. Em ou- tras modalidades, as células T são CD8+.

[00165] Em algumas modalidades, a função de célula T refere-se à liberação de interferon gama pelas células T. Sem desejar ligado a qualquer teoria, acredita-se que a adenosina produzida por CD73 su- prime essa liberação de interferon gama pelas células T. Desta manei- ra, o anticorpo da invenção é capaz de restaurar a liberação de interfe- ron gama pelas células T, de preferência em um nível substancialmen- te igual ao nível de controle (células T estimuladas tratadas com con- trole de isotipo sem adição de AMP). Em modalidades preferidas, o anticorpo da invenção é capaz de induzir a liberação de interferon ga- ma de células T suprimidas por AMP até um valor de 2x (ou seja, duas vezes), 3x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x 50x ou mais de 50x do nível de con- trole (células T estimuladas tratadas com controle de isotipo com adi-

ção de AMP). Um ensaio para determinar a liberação de interferon gama de células T é descrito no Exemplo 6. Em algumas modalidades, as células T são CD4+. Em outras modalidades, as células T são CD8+.

[00166] Em uma modalidade particularmente preferida, a função de células T refere-se à proliferação de células T e liberação de interferon gama como descrito acima, isto é, os anticorpos anti-CD73 são capa- zes de estimular a proliferação de células T e liberação de interferon gama de células T.

[00167] Em uma outra modalidade, a molécula de anticorpo anti- CD73 forma complexos de antígeno-anticorpo com CD73 solúvel com um tamanho definido, tal como um oligômero 2:2. Estes complexos são menores em comparação com os complexos formados por outros anticorpos CD73 conhecidos na técnica (veja por exemplo a Fig. 2). O tamanho dos complexos de antígeno-anticorpo foi previamente ligado à ativação do receptor Fcy e pode, portanto, desempenhar um papel na imunogenicidade indesejada (Krayukhina e outro, Analytical ultra- centrifugation with fluorescence detection system reveals differences in complex formation between recombinant human TNF and different bio- logical TNF antagonists in various environments (2017). mAbs).

[00168] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece an- ticorpos anti-CD73 que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 ou C6 descritos aqui (co- mo referenciado na Tabela 9). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD73 compete pela ligação ao mesmo epítopo que A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 ou C6 (como referido na Tabela 9). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD73 se liga a um epítopo que se sobrepõe ou substancialmente se sobrepõe ao epítopo de A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 ou C6 (como referenciado na Ta- bela 9). De preferência, o referido anticorpo anti-CD73 é um anticorpo monoclonal.

[00169] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 inventivo, como descrito acima, compreende um paratopo de região variável de cadeia leve que se liga a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os seguintes aminoácidos em CD73 (Uniprot No. P21589): F137, P138, 1139, A151, S152, S155, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, E203 e K206, em que a ligação da região variável da cadeia leve aos referidos resíduos de aminoácidos em CD73 contribui para a inibição da função de CD73 pelo anticorpo anti- CD73 inventivo.

[00170] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende um paratopo da re- gião variável da cadeia leve que, por exemplo liga-se a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos como descrito acima, por exemplo F137, P138, 1139, A151, S152, S155, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, E203 e K206, que fazem parte do epítopo conformacional em CD73 que compreende os resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (a numera- ção de aminoácidos corresponde ao número de acesso Uniprot P21589, incluindo o peptídeo sinal, em que a proteína madura é des- provida do peptídeo sinal que compreende os resíduos de aminoáci- dos 1-26, no entanto, o esquema de numeração ao longo deste pedido irá referir-se à sequência de aminoácido de comprimento total de P21589) que é especificamente ligada pelo anticorpo anti-CD73 da invenção, em que a cadeia leve variável do anticorpo anti-CD73 da invenção compreende uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96. O termo “epítopo conformacional" de acordo com a invenção que é ligado pelo anticorpo anti-CD73 inventivo, como descrito aqui, refere-se a um epítopo não linear em que o epítopo reconhecido e ligado pelo anticorpo inventivo é formado pela estrutura secundária e/ou terciária de um polipeptídeo ou proteína e que é único a uma conformação tridimensional dobrada do polipeptídeo ou proteína. Geralmente, um epítopo conformacional consiste em aminoácidos descontínuos na sequência linear que se juntam na estrutura dobrada da proteína. No entanto, um epítopo con- formacional pode da mesma forma consistir em uma sequência linear de aminoácidos que adota uma conformação que é única para uma conformação tridimensional dobrada do polipeptídeo e que não está presente em um estado desnaturado do referido polipeptídeo ou prote- ína.

[00171] De acordo com uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 in- ventivo como descrito acima compreende um paratopo da região vari- ável da cadeia pesada que se liga a pelo menos dois, três, quatro, cin- co, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os seguintes resíduos de ami- noácidos L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 e N211 que fazem parte do epítopo conformacional em CD73 que compreende os resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (nu- meração de aminoácidos corresponde ao número de acesso Uniprot P21589), em que a ligação da região variável da cadeia pesado para os referidos resíduos de aminoácidos em CD73 contribui para a inibi- ção da função de CD73 pelo anticorpo anti-CD73 da invenção.

[00172] De acordo com uma modalidade, o anticorpo anti-CD73 in- ventivo como descrito acima compreende um paratopo da região vari- ável da cadeia pesada compreendendo uma das sequências de ami- noácidos de acordo com SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:

89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95 e se liga a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resíduos de aminoácidos L159, P160 , Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 e N211 em CD73 que fazem parte do epítopo conformacional formado pelos aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158 , L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 de CD73 humano (número de acesso Uniprot P21589) que está espe- cificamente ligado pelo anticorpo anti-CD73 inventivo.

[00173] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido de acordo com uma de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 e se liga, por exemplo a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resíduos de aminoácidos como descrito acima, por exemplo F137, P138, 1139, A151, S152, S155, G156, L157, T158, L159, P160, Y161, K162, E203 e K206, que contribuem para e são parte do epítopo conformacional em CD73 formado pelos aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (a numeração de aminoácidos corresponde ao número de aces- so Uniprot P21589). Ligação da cadeia leve inventiva, como descrito acima, ao epítopo conformacional em CD73 que compreende os resí- duos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 contribui para a ligação específica do anticorpo anti-CD73 da invenção ao CD73, desse modo inibindo a sua função.

[00174] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti-

CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de acordo com uma SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 e se liga a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os aminoácidos L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 e N211 em CD73 que contribuem para e são parte do epítopo conformacional formado pelos aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159 , P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 de CD73 humano (número de acesso Uniprot P21589). Ligação da cadeia pe- sada inventiva, como descrito acima, ao epítopo conformacional em CD73 formado pelos aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 contribui para a ligação específica do anticorpo anti-CD73 da invenção a CD73, desse modo inibindo a função de CD73.

[00175] De acordo com uma modalidade, a ligação do anti-CD73 inventivo como descrito acima ao epítopo conformacional formado pe- los aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165 , G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 de CD73 humano (número de acesso Uniprot P21589) induz a liberação de IFNγ em células T (veja, por exemplo, Fig. 4). Por exemplo, a ligação do anticorpo anti-CD73 inven- tivo, como descrito acima, que compreende CDRs 1-3 de cadeia pe- sada compreendendo sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 55 (HCDR1), 56 (HCDR2) e SEQ ID NO: 57 (HCDR3) e CDRs 1-3 de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 58 (LCDR1), SEQ ID NO.:59 (LCDR2) e SEQ ID NO: 60 (LCDR3), ou um VH compreendendo a sequência de amino-

ácido de acordo com SEQ ID NO 91 e um VL compreendendo a se- quência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO 92, ou por exemplo que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 115 e uma cadeia leve com- preendendo a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 116 induz a liberação de IFNγ em células T (por exemplo, veja: Fig. 4), por exemplo, liberação de IFNγ induzida pelo anticorpo da invenção é pelo menos 5-, 6-, 7-, 8- 9, - 10-, 11-vezes em comparação com con- trole de isotipo + AMP in vitro, em que, por exemplo níveis de IFNγ podem ser determinados como descrito no Exemplo 6. Consequente- mente, o anticorpo da invenção é capaz de restaurar a liberação de IFNγ pelas células T em um nível substancialmente o mesmo, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, do nível de controle (células T estimuladas tratadas com controle de isotipo sem adição de AMP).

[00176] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 101 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 102 e inibe a função de CD73 ligando-se a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 em CD73.

[00177] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 109 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 110 e inibe a função de CD73 pela ligação a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157,

Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00178] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 111 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 112 e inibe a função de CD73 pela ligação a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00179] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 113 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 114 e inibe a função de CD73 por ligação a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00180] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 115 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 116 e inibe a função de CD73 pela ligação a pelo menos dois, três , quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00181] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti-

CD73 inventivo, como descrito acima, compreende uma cadeia pesa- da de acordo com SEQ ID NO: 117 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 118 e inibe a função de CD73 por ligação a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00182] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima compreende uma cadeia pesada de acordo com SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 120 e inibe a função de CD73 por ligação a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou todos os resí- duos de aminoácidos de um epítopo conformacional constituído pelos resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 no CD73.

[00183] De acordo com uma modalidade preferida, a presente in- venção fornece anticorpos anti-CD73 que se ligam ao epítopo confor- macional formado pelos aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 de CD73 humano e que competem de forma cruzada com a ligação ao epítopo conformacional do anticorpo anti-CD73 inventivo descrito acima, por exemplo com a ligação de um anticorpo anti-CD73 que compreende uma cadeia pe- sada de acordo com SEQ ID NO: 115 e uma cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 116. A competição cruzada de ligação de anticorpo pode, por exemplo ser avaliada por métodos adequados conhecidos na técnica, tais como os descritos em Anal Biochem. 15 de março de 2009; 386 (2): 172-80.

[00184] De acordo com uma modalidade preferida, resíduos de aminoácidos T28, T31, Y32, W33, Y52, L55, D57, L99, L100, D101, Y102 da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD73 in- ventivo e resíduos de aminoácidos R30, S31, Y32, W49, Y50, T51, S52, R53, S65, G66, S67, E92 da região variável da cadeia leve do contato do anticorpo anti-CD73 inventivo e/ou ligar-se especificamente ao epítopo conformacional em CD73 compreendendo os resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211, em que o anticorpo anti-CD73 inventivo compreende sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 116, e em que o anticorpo anti-CD73 inventivo inibe a atividade enzimática de CD73 com um IC90 inferior a 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 15nM, 1 nM, 0,5nM ou inferior, de preferência com um IC90 inferior a 0,5nM. Por exemplo, o anticorpo inventivo, como descrito acima, pode inibir a formação de adenosina em pelo menos 60%, pelo menos 70%, de preferência em mais do que 75%. A inibição da forma- ção de adenosina in vitro pelo anticorpo inventivo como descrito acima pode, por exemplo ser avaliada em sobrenadantes de cultura de célu- las, como descrito no Exemplo 8.

[00185] A inibição da formação de adenosina pelo anticorpo da in- venção in vivo pode, por exemplo ser avaliada em amostras de san- gue, ou em amostras retiradas do microambiente de tumor por méto- dos como descrito em Lofgren L, Pehrsson S, Flagglund G, Tjellstrom FI, Nylander S (2018) Accurate measurement of endogenous adenosi- ne in human blood. PLoS ONE 13(10): e0205707. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205707.

[00186] Por exemplo, em uma modalidade preferida, por ligação ao epítopo conformacional que compreende os resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161,

K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 o anticorpo anti-CD73 inventivo, como descrito acima, inibe a atividade enzimática de CD73 por inibição a adoção de conformações “abertas” e “fechadas” de CD73, que são necessárias para a atividade enzimática de CD73 para hidrolisar AMP.

[00187] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo anti- CD73 inventivo como descrito acima inibe a atividade enzimática de CD73 por ligação a um epítopo conformacional em CD73 que compre- ende os resíduos de aminoácidos F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 desse modo reduzindo os níveis de superfície celular de CD73 (veja: Exemplo 4).

[00188] De preferência, o referido anticorpo anti-CD73 é humaniza- do. Tais anticorpos podem ser gerados usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo usando a sequência de epítopo para imuniza- ção ou proteína CD73 expressa e purificada de forma recombinante. O epítopo de um anticorpo pode ser determinado usando métodos co- nhecidos na técnica, por exemplo por espectrometria de massa de tro- ca de hidrogênio-deutério (HDX-MS), NMR, mutagênese sítio dirigida (por exemplo, varredura de alanina) ou cristalografia de raios-X do complexo anticorpo-antígeno.

[00189] A espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) determina a conformação da proteína e a dinâmica confor- macional em solução monitorando-se a taxa e a extensão da troca de deutério dos átomos de hidrogênio da amida da cadeia principal da proteína. O nível de troca de HDX depende da acessibilidade ao sol- vente da proteína e das ligações de hidrogênio, e o aumento de massa da proteína no HDX pode ser medido com precisão por MS. Quando esta técnica é combinada com a digestão enzimática, as característi- cas da estrutura no nível do peptídeo podem ser resolvidas, permitindo a diferenciação dos peptídeos expostos à superfície daqueles dobra- dos dentro. Em experiências de mapeamento de epítopos, a rotulagem de deutério e subsequentes experiências de extinção são realizados em paralelo para antígeno e complexo de antígeno/mAb, seguido por digestão de pepsina ligada, separação de peptídeo e análise de MS. A competição de ligação para um epítopo pode ser determinada usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ensai- os de ELISA padrões ou ensaios de ELISA competitivos podem ser usados em que uma proteína CD73 humana recombinante é imobili- zada na placa, várias concentrações do primeiro anticorpo não rotula- do são adicionadas, a placa é lavada, o segundo anticorpo rotulado é adicionado, lavado e o quantidade de rótulo ligado é medida. Se a concentração crescente do anticorpo não rotulado (primeiro) (da mes- ma forma referido como o "anticorpo de bloqueio") inibe a ligação do (segundo) anticorpo rotulado, o primeiro anticorpo é referido inibir a ligação do segundo anticorpo ao alvo na placa, ou é referido competir com a ligação do segundo anticorpo. Adicionalmente ou alternativa- mente, a análise de ressonância de plásmon superficial (SPR) pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos competirem. A ca- pacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação de um anticorpo an- ti-CD73 aqui descrito (por exemplo, anticorpos A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 ou C6, Tabela 9) para CD73 demonstra que o an- ticorpo de teste pode competir com o anticorpo para ligação a CD73.

[00190] Os anticorpos anti-CD73 descritos acima, ou seja, de acor- do com o primeiro aspecto da invenção, são da mesma forma coleti- vamente referidos aqui como "anticorpos da invenção", "anticorpos CD73 da invenção", "anticorpos anti-CD73 da invenção", "anticorpos descritos aqui" ou similar.

[00191] Um outro aspecto da presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam a região variável da cadeia pesada e/ou a região variável da cadeia leve de uma molécula de anti- corpo anti-CD73 de qualquer um do primeiro aspecto da invenção. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem, porém não são limi- tadas a moléculas de DNA que codificam as sequências de aminoáci- dos do anticorpo anti-CD73 aqui fornecidas. Além disso, a presente invenção da mesma forma se refere a moléculas de ácido nucleico que hibridizam com as moléculas de DNA que codificam as sequências de polipeptídeo mostradas na listagem de sequências em condições de ligação e lavagem de alto rigor, como definido em WO 2007/042309. Moléculas preferidas (do ponto de vista de mRNA) são aquelas que têm pelo menos 75% ou 80% (de preferência pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%) homologia ou identidade de sequência com uma das mo- léculas de DNA aqui descrita. A título de exemplo, tendo em vista a expressão dos anticorpos em células eucarióticas, as sequências de DNA apresentadas na lista de sequências foram concebidas para cor- responder à utilização de códons em células eucarióticas. Se for dese- jado expressar os anticorpos em E. coli, essas sequências podem ser alteradas para corresponder ao uso do códon de E. coli. As variantes de moléculas de DNA da invenção podem ser construídas de várias maneiras diferentes, como descrito por exemplo em WO 2007/042309.

[00192] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um ve- tor de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico que com- preende a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada e/ou a região variável da cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti-CD73 de qualquer um do primeiro aspecto da inven- ção. De preferência, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 e

95. De preferência, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o região variável da cadeia leve de qualquer uma de SEQ ID NOs SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 96.

[00193] De preferência, o vetor de expressão compreende, além disso, uma molécula de ácido nucleico, de preferência uma molécula de DNA, que codifica os domínios constantes de uma cadeia pesada e/ou o domínio constante de uma cadeia leve, respectivamente, liga- dos à molécula de ácido nucleico, de preferência a molécula de DNA, que codifica o domínio variável da cadeia pesada e/ou o domínio vari- ável da cadeia leve, respectivamente.

[00194] Em uma modalidade especificamente preferida, dois veto- res de expressão podem ser usados, um deles para a expressão da cadeia pesada, o outro para a expressão da cadeia leve, em que dois vetores de expressão podem então ser transfectados em uma célula hospedeira para a expressão da proteína recombinante.

[00195] De preferência, o vetor de expressão será um vetor com- preendendo a referida molécula ou moléculas de ácido nucleico, ope- racionalmente ligada a pelo menos uma sequência reguladora, em que tal sequência reguladora pode ser um promotor, realçador ou sequên- cia terminadora, e mais preferencialmente um promotor heterólogo, realçador, ou sequência terminadora.

[00196] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se (por exemplo, por síntese automática de DNA e/ou tecnologia de DNA recombinante), com base na informação sobre as sequências de aminoácidos para os anticorpos da invenção determinados aqui.

[00197] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hos- pedeira tendo um vetor de expressão como descrito acima, tal como um vetor de expressão que codifica uma cadeia pesada de uma molé- cula de anticorpo anti-CD73 da invenção e um vetor de expressão que codifica uma cadeia leve de um anti- Molécula de anticorpo CD73 da invenção. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um vetor que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada de uma molécu- la de anticorpo anti-CD73 da invenção, em particular se o anticorpo for um anticorpo de cadeia única, como um scFv.

[00198] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, as referidas células hospedeiras são células eucarióticas, tais como células de mamíferos, em particular células humanas (in vitro). Em ou- tra modalidade, tais células hospedeiras são células bacterianas. Ou- tras células úteis são células de levedura ou outras células fúngicas.

[00199] As linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e inclu- em, entre outros, células de ovário de hamster chinês (CHO, CHO- DG44), células de NSO, células de SP2/0, células de HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 ou os derivados/progênies de qualquer linhagem de células. Ou- tras células de mamíferos, incluindo, porém, não limitadas a linhagem de células humanas, de camundongo, ratos, macacos e roedores s, ou outras células eucarióticas, incluindo porém não limitadas a células de levedura, inseto e planta, ou células procarióticas, tais como bactérias, podem ser usadas. Os anticorpos da invenção são produzidos culti- vando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras. No entanto, células anfíbias, células de insetos, células de planta e quaisquer ou- tras células usadas na técnica para a expressão de proteínas heteró- logas podem da mesma forma ser usadas.

[00200] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de fabri- cação de uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção, compre- endendo as etapas de:

- cultivar uma célula hospedeira como descrito acima sob condições que permitem a formação de uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção; e, - recuperar a referida molécula de anticorpo.

[00201] Em uma modalidade, o método de fabricação adicionalmen- te compreende a etapa de também purificar o referido anticorpo, como descrito também abaixo.

[00202] Em uma modalidade, o método de fabricação adicionalmen- te compreende a etapa de modificação adicional do referido anticorpo, como também descrito aqui.

[00203] Em uma modalidade, o método de fabricação adicionalmen- te compreende a etapa de formular a referida molécula de anticorpo em uma composição farmacêutica como também descrito aqui.

[00204] Qualquer método que é conhecido na técnica para a produ- ção de um anticorpo pode ser usado, por exemplo como descrito aqui.

[00205] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- CD73 como descrito acima para uso em medicina. Usos médicos es- pecíficos dos anticorpos da invenção são descritos em mais detalhes aqui abaixo.

[00206] Em outro aspecto, uma composição farmacêutica é forneci- da, compreendendo um anticorpo anti-CD73 da invenção e um trans- portador farmaceuticamente aceitável. Os transportadores adequados são conhecidos na técnica e também descritos aqui a seguir. Esta composição pode da mesma forma compreender um agente terapêuti- co adicional como descrito aqui em mais detalhes, tal como, porém não limitado a, um antagonista de PD-1. Composições farmacêuticas incluindo anticorpos anti-CD73 e ou- tros agentes terapêuticos, tal como um antagonista de PD-1; kit de partes, métodos e usos

[00207] PD-1 desempenha um papel importante na regulação da atividade das células T e, portanto, a atividade do sistema imunológi- co. Foi demonstrado em uma variedade de configurações de câncer diferentes que moléculas de anticorpos anti-PD-1 antagonistas podem aumentar a atividade das células T, desse modo ativando o sistema imunológico para atacar tumores e, desse modo, tratar o câncer.

[00208] É conhecido que os anticorpos monoclonais que bloqueiam os receptores de PD-1 têm sido associados a respostas clínicas durá- veis contra uma variedade de tipos de câncer e têm grande potencial como novos terapêuticos para o câncer. Foi da mesma forma demons- trado que o direcionamento a CD73 aumenta a atividade antitumor de anticorpos anti-PD-1.

[00209] Contra este antecedente, os inventores procuraram investi- gar a combinação dos anticorpos anti-CD73 da invenção com anticor- pos PD-1.

[00210] Usando um ensaio de co-cultura de célula dendrítica/célula T (descrito mais detalhadamente no Exemplo 7), os inventores exami- naram as características funcionais das moléculas de anticorpo anti- CD73 representativas da presente invenção em combinação com mo- léculas anti-PD-1. Como pode ser visto no Exemplo 7 e na Figura 1, o efeito de um anticorpo anti-PD1 é suprimido por AMP, o que mostra claramente que a resposta de PD1 é dependente de AMP. A combina- ção da molécula de anticorpo anti-CD73 da presente invenção com um antagonista de PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-1, é capaz de re- verter a supressão dependente de AMP e restaurar os níveis de IFNγ.

[00211] Desse modo, um outro aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD73 da invenção, um antagonista de PD-1 e um transportador farmaceutica- mente aceitável. Os transportadores adequados são conhecidos na técnica e descritos aqui a seguir.

[00212] Antagonistas de PD-1 adequados são descritos aqui abai-

xo.

[00213] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um an- ticorpo anti-PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PDL-1. Em algumas modalidades, este anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em PDR-001, pembrolizumabe, nivolumabe e pidilizumabe. De preferência, a molé- cula de anticorpo anti-PD-1 é selecionada a partir de PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui.

[00214] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL-1 é seleci- onado a partir de atezolizumabe, avelumabe ou durvalumabe.

[00215] Em vez de um anticorpo anti-CD73 da invenção, outro anti- corpo anti-CD73, tal como MEDI9447, BMS986179, CPX-006, CPX- 0016, ou um anticorpo como descrito em W008007648, WO2016075099, WO2016081748, WO2016055609, W02016131950, W01706406, W017152085 ou WO2018013611 pode da mesma forma ser usado.

[00216] Um outro aspecto da invenção fornece um kit de partes compreendendo uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção e um antagonista de PD-1. O kit pode também compreender instruções de uso.

[00217] Antagonistas de PD-1 adequados são descritos aqui abai- xo.

[00218] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um an- ticorpo anti-PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PDL-1. Em algumas modalidades, este anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PDR-001, pembrolizumabe, nivolumabe e pidilizumabe. De preferência, a molé- cula de anticorpo anti-PD-1 é selecionada a partir de PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui.

[00219] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL-1 é seleci-

onado a partir de atezolizumabe, avelumabe ou durvalumabe.

[00220] Em vez de um anticorpo anti-CD73 da invenção, outro anti- corpo anti-CD73, tal como MEDI9447, BMS986179, CPX-006, CPX- 0016, ou um anticorpo como descrito em W008007648, WO2016075099, WO2016081748, WO2016055609, W02016131950, W01706406, W017152085 ou WO2018013611 pode da mesma forma ser usado.

[00221] Será claro para o especialista que com base no exposto acima, são da mesma forma descritas aqui composições farmacêuti- cas para o tratamento de uma doença (como especificado em mais detalhes abaixo) usando as moléculas de anticorpo da invenção esta- belecidas acima, por exemplo um anticorpo anti-CD73 da invenção e um antagonista de PD-1, bem como métodos de tratamento de uma doença (como especificado em mais detalhes abaixo) fazendo uso de tais composições farmacêuticas ou moléculas de anticorpo da inven- ção.

[00222] Para evitar dúvidas, todas as modalidades relacionadas a composições farmacêuticas, kits, métodos de tratamento, usos médi- cos, métodos de administração e dosagens como descrito aqui são contempladas para qualquer um dos anticorpos anti-CD73 descritos aqui, isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuti- cos, tal como um antagonista de PD-1. Qualquer um dos antagonistas de PD-1, como descrito aqui, pode ser usado (incluindo inibidores de PD-1 e PDL-1), tais como pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1- 4 ou PD1-5 como descrito aqui.

[00223] Quando a molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção e a molécula de anticorpo anti-PD-1 da invenção devem ser administradas simultaneamente por meio da mesma rotina de administração, elas podem ser administradas como formulações ou composições farma-

cêuticas diferentes ou como parte de uma formulação ou composição farmacêutica. Da mesma forma, quando a molécula de anticorpo anti- CD73 da invenção e a molécula de anticorpo anti-PD-1 da invenção devem ser usadas como parte de um regime de tratamento combina- do, cada um dos anticorpos pode ser administrado na mesma quanti- dade e de acordo com o mesmo regime usado quando um dos anti- corpos é usado sozinho, e esse uso combinado pode ou não levar a um efeito sinérgico. No entanto, quando o uso combinado dos anticor- pos leva a um efeito sinérgico, pode da mesma forma ser possível re- duzir a quantidade de um ou de ambos os anticorpos, enquanto ainda se atinge a ação terapêutica desejada. Isto pode, por exemplo, ser útil para evitar, limitar ou reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados que estão associados ao uso de um ou ambos os anticorpos quando eles são usados em suas quantidades usuais, enquanto ainda se ob- têm o efeito farmacológico ou terapêutico desejado.

[00224] Além do anticorpo anti-CD73 e do antagonista de PD-1, a composição e o kit descritos acima podem da mesma forma compre- ender um agente terapêutico adicional como descrito aqui abaixo em mais detalhes. Composições farmacêuticas, métodos de administração, dosa- gens

[00225] A invenção se refere ainda a composições farmacêuticas para o tratamento de uma doença (como especificado em mais deta- lhes abaixo), em que tais composições compreendem pelo menos um anticorpo anti-CD73 como fornecido aqui. A invenção também abrange métodos de tratamento de uma doença (como especificado em mais detalhes abaixo) usando pelo menos um anticorpo anti-CD73 ou com- posição farmacêutica como mencionado acima, e também abrange a preparação de um medicamento para o tratamento de tal doença usando tal(is) molécula(s) de anticorpo anti-CD73 da invenção ou composição farmacêutica.

[00226] Essas composições são contempladas para qualquer um dos anticorpos anti-CD73 descritos aqui, sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos, tal como um antagonista de PD-1, por exemplo, pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizu- mabe, avelumabe, durvalumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 ou PD1-5.

[00227] O anticorpo anti-CD73 e/ou a composição que compreende o mesmo pode ser administrado a um paciente em necessidade do mesmo de qualquer maneira adequada, dependendo da formulação ou composição farmacêutica específica a ser usada. Desse modo, o anti- corpo anti-CD73 e/ou a composição que compreende o mesmo pode, por exemplo, ser administrado por via intravenosa (iv), subcutânea (sc), intramuscular (im), intraperitoneal (ip), transdérmica, oral, sublin- gual (por exemplo, na forma de um comprimido sublingual, spray ou gota colocado sob a língua e adsorvido através das membranas mu- cosas na rede capilar sob a língua), (intra-)nasalmente (por exemplo, na forma de um spray nasal e/ou como um aerossol), topicamente, por meio de um supositório, por inalação ou qualquer outra maneira ade- quada em uma quantidade ou dose eficaz.

[00228] O anticorpo anti-CD73 e/ou a composição que compreende o mesmo são administrados de acordo com um regime de tratamento que é adequado para tratar e/ou aliviar a doença, distúrbio ou condi- ção a ser tratada ou aliviada. O clínico geralmente será capaz de de- terminar um regime de tratamento adequado, dependendo de fatores como a doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou aliviada, a gra- vidade da doença, a gravidade dos sintomas da mesma, as moléculas de anticorpo específicas da invenção a ser usada, a rotina específica de administração e a formulação ou composição farmacêutica a ser usada, a idade, sexo, peso, dieta, condição geral do paciente e fatores similares bem conhecidos do médico. Geralmente, o regime de trata- mento compreenderá a administração de uma ou mais moléculas de anticorpo da invenção, ou de uma ou mais composições compreen- dendo as mesmas, em quantidades ou doses terapeuticamente efica- zes.

[00229] Geralmente, para o tratamento e/ou alívio das doenças, dis- túrbios e condições mencionadas aqui e dependendo da doença, dis- túrbio ou condição específica a ser tratada, a potência da molécula de anticorpo específica da invenção a ser usada, a rotina específica de administração e a formulação ou composição farmacêutica específica utilizada, as moléculas de anticorpo da invenção serão geralmente administradas em uma quantidade entre 0,05 e 50,0 mg por quilogra- ma de peso corporal e dose, de preferência entre 5,0 e 20,0 mg/kg/dose, e mais preferencialmente entre 10 e 15 mg/kg/dose, con- tinuamente (por exemplo, por infusão) ou mais preferencialmente co- mo doses únicas (tal como, por exemplo, duas vezes por semana, do- ses semanais ou mensais; cf. abaixo), porém pode variar significati- vamente, especialmente, dependendo dos parâmetros mencionados anteriormente. Desse modo, em alguns casos pode ser suficiente usar menos do que a dose mínima fornecida acima, enquanto em outros casos o limite superior pode ter que ser excedido. Ao administrar grandes quantidades, pode ser aconselhável dividi-las em várias do- ses menores, distribuídas ao longo do dia.

[00230] Dependendo da molécula de anticorpo específica da inven- ção e suas propriedades farmacocinéticas e outras propriedades es- pecíficas, pode ser administrado diariamente, a cada segundo, tercei- ro, quarto, quinto ou sexto dia, semanalmente, mensalmente e similar. Um regime de administração pode incluir tratamento semanal a longo prazo. Por "longo prazo" entende-se pelo menos duas semanas e de preferência meses ou anos de duração.

[00231] A eficácia das moléculas de anticorpo da invenção e das composições que as compreendem pode ser testada usando qualquer ensaio in vitro adequado, ensaio com base em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo sobre a doença específica envolvida. Os ensai- os e modelos animais adequados serão claros ao especialista e, por exemplo, incluem os ensaios e modelos animais usados nos Exemplos abaixo. Formulações

[00232] Para uso farmacêutico, as moléculas de anticorpo da in- venção podem ser formuladas como uma preparação farmacêutica compreendendo (i) pelo menos um anticorpo anti-CD73 da invenção e (ii) pelo menos um transportador, diluente, excipiente, adjuvante e/ou estabilizador, e (iii) opcionalmente, um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmacologicamente ativos adicionais, tal como um anta- gonista de PD-1. Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se que o respectivo material não mostra quaisquer efeitos biológicos ou indese- jáveis quando administrado a um indivíduo e não interage de forma deletéria com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica (tal como, por exemplo, o ingrediente farmaceuticamente ativo) no qual está contido. Exemplos específicos podem ser encon- trados em manuais padrões, tal como, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990). Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser formulados e administrados de qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpos e outras proteínas farma- ceuticamente ativas. Desse modo, de acordo com uma outra modali- dade, a invenção se refere a uma composição ou preparação farma- cêutica que contém pelo menos um anticorpo CD73 da invenção e pe- lo menos um transportador, diluente, excipiente, adjuvante e/ou estabi-

lizador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um ou mais ou- tras substâncias farmacologicamente ativas, tal como um antagonista de PD-1, como também descrito aqui.

[00233] As preparações farmacêuticas para administração parente- ral, tais como injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou infu- são intravenosa podem ser, por exemplo, soluções estéreis, suspen- sões, dispersões, emulsões ou pós que compreendem o ingrediente ativo e que são adequados, opcionalmente após uma outra dissolução ou etapa de diluição, para infusão ou injeção. Os veículos ou diluentes adequados para tais preparações incluem, por exemplo, sem limita- ção, água estéril e tampões e soluções aquosas farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato fisiológico, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank; óleos de água; glicerol; etanol; glicóis tais como propileno glicol, bem como óleos minerais, óleos animais e óleos vegetais, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja, bem como misturas adequadas dos mesmos.

[00234] As soluções das moléculas de anticorpo da invenção po- dem da mesma forma conter um conservante para prevenir o cresci- mento de microrganismos, tais como agentes antibacterianos e anti- fúngicos, por exemplo, p-hidroxibenzoatos, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal, (sais de metal alcalino de) ácido etile- nodiamina tetraacético e similar. Em muitos casos, será preferível in- cluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. Opcionalmente, emulsificantes e/ou dispersantes podem ser usados. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela for- mação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula ne- cessário no caso de dispersões ou pelo uso de tensoativos. Outros agentes que atrasam absorção, por exemplo, monoestearato de alu- mínio e gelatina, podem da mesma forma ser adicionados. As solu- ções podem ser colocadas em frasconetes de injeção, ampolas, garra-

fas de infusão e similar.

[00235] Em todos os casos, a forma de dosagem final deve ser es- téril, fluida e estável nas condições de fabricação e armazenamento. As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando o com- posto ativo na quantidade necessária no solvente apropriado com vá- rios dos outros ingredientes enumerados acima, quando necessário, seguido por esterilização por filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem a vácuo e as técnicas de liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adici- onal desejado presente nas soluções previamente esterilizadas por filtração.

[00236] Normalmente, soluções ou suspensões aquosas serão pre- feridas. Geralmente, formulações adequadas para proteínas terapêuti- cas, tal como os anticorpos da invenção, são soluções de proteínas tamponadas, tal como soluções incluindo a proteína em uma concen- tração adequada (tal como de 0,001 a 400 mg/ml, de preferência de 0,005 a 200 mg/ml, mais preferencialmente 0,01 a 200 mg/ml, mais preferencialmente 1,0 - 100 mg/ml, tal como 1,0 mg/ml, 50 mg/ml ou 100 mg/ml e um tampão aquoso tal como: - solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, - outros tampões de fosfato, pH 6,2 a 8,2, - tampões de acetato, pH 3,2 a 7,5, de preferência pH 4,8 a 5,5 - tampões de histidina, pH 5,0 a 7,0, - tampões de sucinato, pH 3,2 a 6,6, e - tampões de citrato, pH 2,1 a 6,2, e, opcionalmente, sais (por exemplo, NaCl) e/ou açúcares (tal como por exemplo sacarose e trealose) e/ou outros poliálcoois (tal como por exemplo manitol e glicerol) para fornecer isotonicidade da solução e/ou tensoativos.

[00237] Soluções de proteína tamponada preferidas são soluções incluindo cerca de 50 mg/ml do anticorpo da invenção, sozinho ou em combinação com um antagonista de PD-1, dissolvido em tampão de acetato 25 mM, pH 5,5, opcionalmente compreendendo metionina 0,67 mM, ajustada para isotonicidade por adição de trealose 240 mM. Ou- tros tensoativos, por exemplo 0,04% Tween-20, Tween-80 ou Polis- sorbato 80, podem da mesma forma ser incluídos em tais soluções. As formulações para aplicação subcutânea podem incluir concentrações significativamente mais elevadas do anticorpo da invenção, tal como até 100 mg/ml ou mesmo acima de 100 mg/ml. No entanto, será claro para o especialista na técnica que os ingredientes e as suas quantida- des, como fornecidos acima, representam apenas uma opção preferi- da. As alternativas e variações das mesmas serão imediatamente evi- dentes para o especialista ou podem ser facilmente concebidas a partir da descrição acima.

[00238] De acordo com um outro aspecto da invenção, uma molé- cula de anticorpo da invenção pode ser usada em combinação com um dispositivo útil para a administração do anticorpo, tal como uma seringa, caneta injetora, microbomba ou outro dispositivo. Usos terapêuticos / métodos de tratamento

[00239] Um outro aspecto da invenção fornece um método de tra- tamento de câncer compreendendo a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção. Em uma modalidade preferida, o método compreende ainda a administração a tal paciente de um anta- gonista de PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo an- ti-PDL-1. De preferência, o referido anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidili- zumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui. De preferência, o referido anticorpo anti-PDL-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.

[00240] Em algumas modalidades, o câncer é câncer renal, câncer gastrointestinal ou câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o re- ferido câncer gastrointestinal é carcinoma de cólon, câncer gástrico ou carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o referido câncer renal é câncer renal, de preferência carcinoma de células claras. Em uma modalidade preferida da invenção, o câncer é câncer de pulmão, de preferência câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em algumas modalidades, o referido carcinoma do cólon é CRC.

[00241] Em algumas modalidades, a molécula do anticorpo anti- CD73 cule da invenção, opcionalmente em conjunto com um antago- nista de PD-1 como descrito acima, é administrado em combinação com um ou mais outros agentes e/ou procedimentos terapêuticos, cu- jos agentes e procedimentos são descritos aqui abaixo em mais deta- lhes. Exemplos não limitantes são agentes terapêuticos ou procedi- mentos selecionados a partir de quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada, um fármaco oncolítica, um agente citotóxico, uma terapia de base imunológica, uma citocina, procedimento cirúrgico, procedi- mento de radiação, vacina ou Imunoterapia.

[00242] Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é um antagonista de A2AR, antagonista de CD39, antagonista de LAG-3, antagonista de CTLA-4, antagonista de EGFR ou antagonista de HER2.

[00243] Um outro aspecto da invenção fornece uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção para uso em um método de trata- mento de câncer. Em uma modalidade preferida, o aspecto compreen- de ainda o uso adicional de um antagonista de PD-1, como um anti- corpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1. De preferência, o referido anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui. De preferência, o referido anticor- po anti-PDL-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em atezoli- zumabe, avelumabe e durvalumabe.

[00244] Em algumas modalidades, o câncer é câncer renal, câncer gastrointestinal ou câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o re- ferido câncer gastrointestinal é carcinoma de cólon, câncer gástrico ou carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o referido câncer renal é câncer renal, de preferência carcinoma de células claras. Em uma modalidade preferida da invenção, o câncer é câncer de pulmão, de preferência câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em algumas modalidades, o referido carcinoma do cólon é CRC.

[00245] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CD73 da invenção, opcionalmente em conjunto com um antagonista de PD-1 como descrito acima, é administrada em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos, cujos agen- tes e procedimentos são descritos aqui abaixo em mais detalhes. Exemplos não limitantes são agentes terapêuticos ou procedimentos selecionados a partir de quimioterapia, uma terapia anticâncer direcio- nada, um fármaco oncolítico, um agente citotóxico, uma terapia de ba- se imunológica, uma citocina, procedimento cirúrgico, procedimento de radiação, vacina ou Imunoterapia.

[00246] Como conhecido na técnica, "terapia anticâncer direciona- da" refere-se à administração sistêmica de fármacos com mecanismos particulares que atuam especificamente em alvos bem definidos ou trilhas biológicas que, quando ativadas ou inativadas, podem causar regressão ou destruição do processo maligno, entretanto, com efeitos adversos minimizados em tecidos saudáveis (Li e outro, Target Oncol. 2012; 7 (1): 69-85). Uma “terapia de base imunológica” ou “imunotera- pia” é o tratamento da doença induzindo, aumentando ou suprimindo uma resposta imunológica. No contexto do câncer, uma terapia de ba- se imunológica geralmente se refere a uma terapia que induz e/ou aumenta uma resposta imunológica, por exemplo usando agentes imunoterapêuticos como descrito abaixo.

[00247] Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é um antagonista de A2AR, antagonista de CD39, antagonista de LAG-3, antagonista de CTLA-4, antagonista de EGFR ou antagonista de HER2.

[00248] Um antagonista de PD-1 dentro do significado desta inven- ção e todas as suas modalidades é um composto que inibe a interação de PD-1 com seu(s) receptor(es). Os antagonistas de PD-1 são bem conhecidos na técnica, por exemplo revisado por Li e outro, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151 (aqui incorporado por referência). O antagonista de PD-1 pode ser um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PDL-1, como um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1. Em algumas mo- dalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Em algu- mas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PDL-1. Qualquer antagonista de PD-1, especialmente anticorpos, como aque- les descritos por Li e outro bem como os outros anticorpos descritos aqui abaixo, podem ser usados de acordo com a invenção. De prefe- rência, o antagonista de PD-1 desta invenção e todas as suas modali- dades são selecionados a partir do grupo que consiste nos seguintes anticorpos: - pembrolizumabe (anticorpo anti-PD-1); - nivolumabe (anticorpo anti-PD-1); - pidilizumabe (anticorpo anti-PD-1); - PDR-001 (anticorpo anti-PD-1); - atezolizumab (anticorpo anti-PDL-1); - avelumabe (anticorpo anti-PDL-1); - durvalumabe (anticorpo anti-PDL-1)

- PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui (anticorpos anti-PD1-).

[00249] Pembrolizumabe (anteriormente da mesma forma conheci- do como lambrolizumabe; nome comercial Keytruda; da mesma forma conhecido como MK-3475) descrito, por exemplo em Hamid, O. e ou- tro (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, é um an- ticorpo monoclonal IgG4 humanizado que se liga a PD-1; ele contém uma mutação em C228P projetada para prevenir a citotoxicidade me- diada por Fc. Pembrolizumabe é, por exemplo descrito em US

8.354.509 e W02009/114335. É aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de melanoma irressecável ou metastático e pacientes com NSCLC metastático. Nivolumabe (Número de registro CAS: 946414-94-4; BMS-93 6558 ou MDX1106b) é um anticorpo mo- noclonal IgG4 totalmente humano que bloqueia especificamente PD-1, sem toxicidade celular dependente de anticorpo detectável (ADCC). Nivolumabe é, por exemplo descrito em US 8.008.449 e W02006/121168. Foi aprovado pelo FDA para o tratamento de pacien- tes que sofrem de melanoma irressecável ou metastático, NSCLC me- tastático e carcinoma de células renais avançado.

[00250] Pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclo- nal lgG1 k humanizado que se liga ao PD-1. Pidilizumabe é, por exemplo descrito em WO 2009/101611.

[00251] PDR-001 ou PDR001 é um anticorpo anti-PD-1 lgG4 huma- nizado de alta afinidade, bloqueador de ligante, que bloqueia a ligação de PDL-1 e PD-L2 a PD-1. PDR-001 é descrito em WO2015/112900 e WO2017/019896.

[00252] De acordo com este e qualquer outro dos aspectos da pre- sente invenção, os anticorpos PD1-1 a PD1-5 são moléculas de anti- corpo como descrito em EP16170174.3 e são definidos pelas sequên- cias como mostrado na Tabela 9 mais abaixo.

[00253] Desta maneira, PD1-1 tem uma cadeia pesada compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122;

[00254] PD1-2 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 123 e uma cadeia leve compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 124;

[00255] PD1-3 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 125 e uma cadeia leve compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126;

[00256] PD1-4 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 127 e uma cadeia leve compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128; e

[00257] PD1-5 tem uma cadeia pesada compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 129 e uma cadeia leve compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130.

[00258] Um outro aspecto da invenção é o uso da molécula de anti- corpo anti-CD73 da invenção para preparar uma composição farma- cêutica para o tratamento do câncer. Em uma modalidade preferida, o aspecto compreende ainda o uso adicional de um antagonista de PD- 1, como um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1. De prefe- rência, o referido anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui. De preferência, o referido anticorpo anti-PDL-1 é selecionado a partir do grupo consis- tindo em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.

[00259] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 deve ser administrada simultaneamente, concorrentemente, sequenci- almente, sucessivamente, alternativamente ou separadamente, com o antagonista de PD-1.

[00260] Os aspectos de uso médico da invenção podem compreen-

der qualquer uma das moléculas de anticorpo anti-CD73 específicas da invenção e/ou antagonista de PD-1 como descrito aqui.

[00261] Devido às suas propriedades biológicas, os anticorpos da invenção são adequados para o tratamento de doenças caracterizadas por proliferação celular excessiva ou anormal, tal como o câncer.

[00262] Quando aqui utilizado, o termo "câncer" pretende incluir to- dos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos malignamente transformados, independentemente do tipo histopatológico ou estágio de invasividade. Exemplos de distúrbios cancerosos incluem, porém não são limitados a tumores sólidos, cânceres hematológicos, tumores de tecidos moles e lesões metastáticas.

[00263] Cânceres exemplares cujo crescimento pode ser inibido usando as moléculas de anticorpo descritas aqui incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia.

[00264] Por exemplo, os seguintes cânceres, tumores e outras do- enças proliferativas podem ser tratados com anticorpos de acordo com a invenção, sem ser restrito a eles: Exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, por exemplo, sar- comas e carcinomas (incluindo adenocarcinomas e carcinomas de cé- lulas escamosas) de vários sistemas de órgãos, tais como aqueles que afetam o fígado, linfoide, trato geniturinário (por exemplo, células re- nais, uroteliais), faringe. Os adenocarcinomas incluem doenças malig- nas, tais como a maioria dos cânceres de cólon, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de célula não pequena do pulmão, intestino delgado. Os carcinomas de células escamosas incluem do- enças malignas, por exemplo, no pulmão, esôfago, pele, HNSCC, ca- vidade oral, ânus e cérvice.

[00265] Outras indicações que podem ser tratadas incluem câncer de rim, por exemplo câncer renal, tal como carcinoma de células cla-

ras), câncer gastrointestinal, câncer gástrico, CRC, carcinoma do có- lon, câncer da região anal, câncer pancreático, câncer de ovário, me- lanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático, como melano- ma maligno cutâneo ou intraocular), câncer de mama, HNSCC, HCC, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer de pulmão de célula não pequena escamosas (NSCLC), não NSCLC, glioma, câncer en- dometrial, câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de prós- tata refratário de hormônio ou câncer de próstata resistente à castra- ção (CRPC)), câncer da tireoide, neuroblastoma, glioblastoma (glioblastoma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, cân- cer de bexiga, hepatoma, tumor de células germinativas, sarcoma pe- diátrico, linfoma assassino sinonasal, câncer ósseo, câncer uterino, câncer testicular, carcinoma da trompa de Falópio, carcinoma do en- dométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glându- la adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve re- nal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pi- tuitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, linfoma de células T, cânceres ambientalmente induzidos, incluindo aqueles induzidos por asbesto, cânceres relacionados a vírus (por exemplo, tumor relaciona- do ao vírus do papiloma humano (HPV)), e malignidades hematológi- cas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de célu- las sanguíneas, ou seja, a linhagem celular mieloide (que produz gra- nulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos e mastócitos) ou linha- gem celular linfóide (que produz células B, T, NK e plasmáticas), tal como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo,

leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielógenas, tal como leucemia aguda (LLA), leucemia mielóide aguda (AML), leucemia lin- foblástica aguda, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoide crônica e leucemia mielóide crônica (CML), AML indiferenciada (MO), leucemia mieloblástica (Ml), leucemia mieloblástica (M2; com matura- ção celular), leucemia promielocítica (variante M3 ou M3 [M3V]), leu- cemia mielomonocítica (M4 ou variante de M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megaca- rioblástica (M7) sarcoma granularocitário isolado e cloroma; linfomas, tais como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), linfo- mas de células B, linfomas precursores, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma linfocítico, linfoma mieloide agudo, linfoma de células B mono- citóide, linfoma de tecido linfoide associado a mucosa (MALT), linfoma de células grandes anaplásico (por exemplo, Kil+), linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de células do manto, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intesti- nal, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma T-linfoblástico, linfoma de células T periférico, linfoma T-linfoblástico precursor, distúr- bio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma de efusão primá- rio, linfoma linfoblástico (LBL), linfoma de células B difusos, linfoma de Burkitt , linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imu- noblástico de células grandes, linfoma B-linfoblástico precursor, linfo- ma de células T cutâneo (CTLC) (da mesma forma chamado de mico- se fungóide ou síndrome de Sezary), linfoma anaplásico de células grandes e linfoma linfoplasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tal como mieloma de IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (da mesma forma deno- minado mieloma indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múlti- plos, linfoma de células pilosas; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiosscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tu- mores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomios- sarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, por exemplo tumores de células T e B, incluindo, porém não limitado a dis- túrbios de células T, tal como leucemia T-prolinfocítica (TPLL), incluin- do do tipo de células pequenas e células cerebiformes; leucemia de linfócitos granulares grandes (LGL) de preferência do tipo de células T; linfoma hepatoesplênico a/d T-NHL; linfoma de células T periféri- co/pós-tímico (subtipos pleomórficos e imunoblásticos); linfoma de cé- lulas T angiocêntrico (nasal); câncer retal; bem como quaisquer com- binações dos referidos cânceres. Os métodos descritos aqui podem da mesma forma ser usados para o tratamento de cânceres metastáticos, cânceres resistentes ou refratários a tratamentos anteriores (por exemplo, cânceres refratários à imunoterapia anterior, por exemplo, com um anticorpo bloqueador CTLA-4 ou PD-1 ou PDL-1), e cânceres recorrentes.

[00266] Em algumas modalidades, o câncer é câncer renal, câncer gastrointestinal ou câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o re- ferido câncer gastrointestinal é carcinoma do cólon, câncer gástrico ou carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o referido câncer renal é câncer renal, de preferência carcinoma de células claras. Em uma modalidade preferida da invenção, o câncer é câncer de pulmão, de preferência câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em algumas modalidades, o referido carcinoma do cólon é CRC.

[00267] Todos os cânceres, tumores, neoplasias, etc., mencionados acima, que são caracterizados por sua localização/origem específica no corpo, pretendem incluir tanto os tumores primários quanto os tu- mores metastáticos derivados deles.

[00268] É possível que um paciente tenha maior probabilidade de responder ao tratamento com uma molécula de anticorpo da invenção (como descrito aqui) se esse paciente tem um câncer que é caracteri- zado por ter uma expressão elevada de CD73 (nas próprias células de câncer, ou nas células estromais ou imunes dentro do tumor); e/ou on- de o câncer é infiltrado por células imunes, por exemplo linfócitos de infiltração de tumor. Embora seja esperado que alguma expressão de CD73 possa ser necessária, o tratamento com uma molécula de anti- corpo da invenção não está necessariamente limitado a cânceres com uma alta expressão de CD73. Portanto, uma modalidade da invenção é aquela em que o paciente a ser tratado tem um câncer que é carac- terizado por ter uma alta expressão de CD73 e/ou onde o câncer é in- filtrado por células imunes. Em algumas modalidades, o paciente tem um câncer que é caracterizado por ter uma alta expressão de PDL-1 e/ou CD73 no câncer, células estromais ou imunes dentro do tumor e é tratado com um anticorpo anti-CD73 e um antagonista de PD-1 como descrito aqui.

[00269] Tal expressão pode ser determinada, por exemplo, em cé- lulas de câncer, linfócitos de infiltração de tumor, tal como células T CD8+ ou células T CD4+, vasculatura de tumor, estroma de tumor, por métodos conhecidos na técnica, tal como citometria de fluxo ou imu- noistoquímica.

[00270] Em uma modalidade preferida, o paciente a ser tratado é selecionado com base no aumento da expressão de CD73.

[00271] Além disso, é possível que um paciente tenha mais proba- bilidade de responder ao tratamento com uma molécula de anticorpo da invenção (como descrito aqui) se esse paciente tiver um câncer ca- racterizado por ter uma carga mutacional elevada. Exemplos de como a alta carga mutacional pode ser avaliada incluem determinar se o câncer é caracterizado por ter instabilidades de microssatélites ou bai- xas eficiências de reparo de incompatibilidade de DNA. Acredita-se que tais cânceres são mais imunogênicos e, portanto, são mais pro- pensos a responder ao tratamento com regimes terapêuticos imuno- moduladores, tais como uma molécula de anticorpo da invenção. Por- tanto, uma modalidade da invenção é aquela em que o paciente a ser tratado tem um câncer que é caracterizado por ter uma carga mutacio- nal elevada.

[00272] As moléculas de anticorpo da invenção podem ser usadas em regimes terapêuticos no contexto de primeira linha, segunda linha ou quaisquer outras linhas de tratamentos.

[00273] Em uma modalidade, o paciente a ser tratado foi previa- mente submetido a tratamento com outro agente de tratamento. Em algumas modalidades, tal agente de tratamento pode ser um antago- nista de PD-1 como descrito aqui, tal como pembrolizumabe, nivolu- mabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe ou PD1- 1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui.

[00274] Em uma modalidade, o paciente a ser tratado não responde ao tratamento com o referido agente de tratamento. Por exemplo, o paciente pode sofrer de um câncer que é conhecido por não ser res- ponsivo, ter uma resposta mínima ou não ser suficientemente respon- sivo ao tratamento com o referido agente de tratamento. Em uma mo- dalidade, um respondedor fraco ao tratamento com o referido agente de tratamento é um indivíduo cujo tecido canceroso ou tecido adjacen- te ao câncer é caracterizado por níveis insuficientes ou baixos de in- flamação (por exemplo, em comparação com uma referência). Em uma modalidade, um respondedor fraco ao tratamento com o referido agente de tratamento é um indivíduo que recebeu tratamento com o referido agente de tratamento e cujo câncer progrediu. Em uma moda-

lidade, um indivíduo que é uma resposta fraca ou que tem um câncer que é pouco responsivo é um indivíduo com um prognóstico de doen- ça ruim para o tratamento com o referido agente de tratamento. Um indivíduo com uma resposta fraca ao tratamento com o referido agente de tratamento pode, por exemplo, ser identificado por um risco alto ou maior de progressão do câncer (por exemplo, em comparação com indivíduos com um bom prognóstico de doença), com base em um ou mais fatores preditivos. Em uma modalidade, um fator preditivo com- preende a presença de números elevados de células T que expressam CD73 e/ou níveis elevados de células que expressam CD73 ou níveis de adenosina no microambiente de tumor (no tumor ou tecidos de tu- mor adjacentes). Em uma modalidade, um fator preditivo compreende a presença ou ausência de uma mutação em um ou mais genes. Em uma modalidade, a mutação define um neo-epítopo reconhecido por uma célula T. Em uma modalidade, o fator preditivo compreende o ní- vel de expressão de um ou mais genes ou proteínas em células de tumor, por exemplo PDL-1, níveis diminuídos ou elevados de PDL-1 em células de tumor. Em uma modalidade, o fator preditivo compreen- de o nível de expressão de um ou mais genes ou proteínas em células T efetoras em circulação ou no ambiente do tumor, por exemplo, PD-1. Em uma modalidade, o fator preditivo compreende uma alta carga mu- tacional como descrito acima.

[00275] Em algumas modalidades, o referido agente de tratamento é um antagonista de PD-1 como descrito aqui, tal como pembrolizu- mabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalu- mabe ou PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui.

[00276] As moléculas de anticorpo da invenção podem ser utiliza- das para a prevenção, tratamento de curto ou longo prazo das doen- ças mencionadas acima, opcionalmente da mesma forma em combi- nação com radioterapia, quimioterapia e/ou cirurgia. Portanto, em ou-

tra modalidade, o paciente a ser tratado foi previamente submetido a tratamento com radioterapia ou quimioterapia (como descrito abaixo). Em uma modalidade, o paciente a ser tratado é uma resposta insatis- fatória ao tratamento com radioterapia ou quimioterapia, como descrito acima.

[00277] Obviamente, o acima da mesma forma inclui o uso das mo- léculas de anticorpo da invenção em vários métodos de tratamento das doenças acima por meio da administração de uma dose terapeuti- camente eficaz a um paciente em necessidade, bem como o uso des- sas moléculas de anticorpo para a fabricação de medicamentos para o tratamento de tais doenças, bem como composições farmacêuticas, incluindo tais moléculas de anticorpo das invenções, bem como a pre- paração e/ou fabricação de medicamentos incluindo tais anticorpos da invenção e similar. Combinações com outras substâncias ativas ou tratamentos

[00278] Uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção, ou a combinação de um anticorpo anti-CD73 da invenção e um antagonista de PD-1, pode ser usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos ou procedimento (s), em particular seleci- onados a partir de agentes quimioterapêuticos como agentes de dano ao DNA ou compostos terapeuticamente ativos que inibem a angiogê- nese, trilhas de transdução de sinal ou pontos de verificação mitóticos em células de câncer.

[00279] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD73 usado em tal combinação pode ser qualquer um dos anticorpos descritos acima no primeiro aspecto da invenção. Os anticorpos anti-CD73 preferidos são B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 e C6 (Tabela 9).

[00280] Em algumas modalidades, é da mesma forma contemplado que outros anticorpos anti-CD73 conhecidos na técnica podem ser usados em vez de, ou em adição aos anticorpos do primeiro aspecto.

Em vez de um anticorpo anti-CD73 do primeiro aspecto da invenção, outro anticorpo anti-CD73, tal como MEDI9447, BMS986179, CPX- 006, CPX-0016, ou um anticorpo como descrito em W02008007648, WO2016075099, WO2016081748, WO2016055609, W02016131950, W017064043, WO2017100670, W017152085 ou WO2018013611 po- dem da mesma forma ser usados.

[00281] O agente terapêutico adicional pode ser administrado simul- taneamente, opcionalmente como um componente da mesma prepa- ração farmacêutica, ou antes ou após a administração da molécula de anticorpo.

[00282] Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional po- de ser, sem limitação, um ou mais inibidores selecionados a partir do grupo de inibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, Au- roraB, PLK e PI3 cinase, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, IAP (miméti- cos de SMAC), Bcl-2, Mcl-1, HDAC (histona desacetilase), GSK3, PDK1, PTK2, IGF-R ou IR.

[00283] Outros exemplos de agentes terapêuticos adicionais são inibidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/FIGF, c-Myc, Flt3, FISP90, antagonistas de hedgehog, inibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, proteassoma, Rho ou um inibidor da trilha de ubiqui- tinação ou outro inibidor da trilha de sinalização Notch, ou modulado- res de c-FLIP (proteína inibitória de celular FLICE).

[00284] Exemplos de inibidores Aurora são, sem limitação, PFIA- 739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN- 8045, PF-3814735.

[00285] Um exemplo de um inibidor de PLK é GSK-461364.

[00286] Exemplos de inibidores de raf são BAY-73-4506 (da mesma forma um inibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (da mesma forma em adição a um inibidor de VEGFR), sorafenibe (da mesma forma em adição de um inibidor de VEGFR) e XL 281.

[00287] Exemplos para inibidores de KSP são ispinesibe, ARRY- 520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 e SB-743921.

[00288] Exemplos de miméticos de SMAC (antagonistas de IAP) são, sem limitação, LCL-161, Debio 1143 e ASTX-660.

[00289] Exemplos de inibidores de src e/ou bcr-abl são dasatinibe, AZD-0530, bosutinibe, XL 228 (da mesma forma um inibidor de IGF-1 R), nilotinibe (da mesma forma um inibidor de PDGFR e cKit), imatini- be (da mesma forma um inibidor de cKit) e NS-187. Um exemplo de um inibidor PDK1 é BX-517.

[00290] Um exemplo de um inibidor de Rho é BA-210.

[00291] Exemplos de inibidores de PI3 cinase são PX-866, BEZ-235 (da mesma forma um inibidor de mTor), XL 418 (da mesma forma um inibidor de Akt), XL-147 e XL 765 (da mesma forma um inibidor de mTor).

[00292] Exemplos de inibidores de cMet ou HGF são XL-184 (da mesma forma um inibidor de VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK- 2461, XL-880 (da mesma forma um inibidor de VEGFR), MGCD-265 (da mesma forma um inibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA- 665752, AMG-102 e AV-299.

[00293] Um exemplo de um inibidor de c-Myc é CX-3543.

[00294] Exemplos de inibidores de Flt3 são AC-220 (da mesma forma um inibidor de cKit e PDGFR), KW 2449, lestaurtinibe (da mes- ma forma um inibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (da mesma forma um inibidor de JAK2), XL-999 (da mesma forma um ini- bidor de cKit, FGFR, PDGFR e VEGFR), sunitinibe (da mesma forma um inibidor de PDGFR, VEGFR e cKit) e tandutinibe (da mesma forma um inibidor de PDGFR e cKit).

[00295] Exemplos de inibidores de HSP90 são tanespimicina, al- vespimicina, IPI-504 e CNF 2024.

[00296] Exemplos de inibidores de JAK/STAT são CYT-997 (da mesma forma interagindo com tubulina), TG 101348 (da mesma forma um inibidor de Flt3), e XL- 019.

[00297] Exemplos de inibidores de Mek são ARRY-142886, PD- 325901, AZD-8330 e XL 518.

[00298] Exemplos de inibidores de mTor são temsirolimo, AP-23573 (que da mesma forma atua como um inibidor de VEGF), everolimo (um inibidor de VEGF adicional). XL-765 (da mesma forma um inibidor da PI3 cinase) e BEZ-235 (da mesma forma um inibidor de PI3 cinase).

[00299] Exemplos de inibidores de Akt são perifosina, GSK-690693, RX-0201 e triciribina.

[00300] Exemplos de inibidores de cKit são AB-1010, OSI-930 (da mesma forma atua como um inibidor de VEGFR), AC-220 (da mesma forma um inibidor de Flt3 e PDGFR), tandutinibe (da mesma forma um inibidor de Flt3 e PDGFR), axitinibe (da mesma forma um inibidor de VEGFR e PDGFR), XL-999 (da mesma forma um inibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinibe (da mesma forma um inibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR) e XL-820 (da mesma forma atua como um ini- bidor de VEGFR- e PDGFR ), imatinibe (da mesma forma um inibidor de bcr-abl), nilotinibe (da mesma forma um inibidor de bcr-abl e PDGFR).

[00301] Exemplos de antagonistas de hedgehog são IPI-609 e CUR-61414.

[00302] Exemplos de inibidores de CDK são seliciclibe, AT-7519, P- 276, ZK-CDK (da mesma forma inibindo VEGFR2 e PDGFR), PD- 332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 e AG 024322.

[00303] Exemplos de inibidores de proteassoma são bortezomibe, carfilzomibe e NPI-0052 (da mesma forma um inibidor de NFkappaB).

[00304] Um exemplo de um inibidor da trilha de NFkappaB é NPI-

0052.

[00305] Um exemplo de um inibidor da trilha de ubiquitinação é FIBX-41108.

[00306] Em modalidades preferidas, o agente terapêutico adicional é um agente anti-angiogênico.

[00307] Exemplos de agentes anti-angiogênicos são inibidores de FGFR, PDGFR e VEGFR ou os respectivos ligantes (por exemplo, ini- bidores de VEGF tal como pegaptanibe ou o anticorpo anti-VEGF be- vacizumabe) e talidomidas, tais agentes sendo selecionados a partir de, sem limitação, nintedanibe, bevacizumabe, motesanibe, CDP-791, SU-14813, telatinibe, KRN-951, ZK-CDK (da mesma forma um inibidor de CDK), ABT-869, BMS- 690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (fármacos imunomoduladores), derivado de talidomida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanibe, cediranibe, XL-999 (da mesma forma um inibidor de cKit e Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (da mesma forma um inibidor de Flt3), sunitinibe (da mesma forma um inibidor de cKit e Flt3), axitinibe (da mesma forma um inibidor de cKit), lestaurtinibe (da mesma forma um inibidor de Flt3 e PKC), vatalanibe, tandutinibe (da mesma forma um inibidor de Flt3 e cKit ), pazopanibe, GW 786034, PF-337210, IMC-1121 B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, tosilato de sorafenibe (da mesma forma um inibidor de Raf), RAF-265 (da mesma forma um inibidor de Raf), vandetanibe, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (da mesma forma um inibidor de EGFR e Her2), BAY-57-9352 (da mesma forma um inibidor de Raf), BAY-73-4506 (da mesma forma um inibidor de Raf), XL 880 (da mesma forma um inibidor de cMet), XL-647 (da mesma forma um inibidor de EGFR e EphB4), XL 820 (da mesma forma um inibidor de cKit) e nilotinibe (da mesma forma um inibidor de cKit e brc-abl).

[00308] O agente terapêutico adicional pode da mesma forma ser selecionado a partir de inibidores de EGFR, pode ser um inibidor de EGFR de molécula pequena ou um anticorpo anti-EGFR. Exemplos de anticorpos anti-EGFR, sem limitação, são cetuximabe, panitumumabe, matuzumabe; exemplos para um inibidor de EGFR de molécula pe- quena, sem limitação, são gefitinibe, afatinibe, osimertinibe e olmutini- be. Outro exemplo de um modulador de EGFR é a toxina de fusão de EGF.

[00309] Entre os inibidores de EGFR e Her2 úteis para combinação com a molécula de anticorpo da invenção estão lapatinibe, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, cetuximabe, trastuzumabe, nimotuzumabe, zalu- tumumabe, vandetanibe (da mesma forma um inibidor de VEGFRKI- 647), pertuzumabe, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (da mesma forma um inibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11 F8, Zemab.

[00310] Outros agentes que podem ser vantajosamente combina- dos em uma terapia com as moléculas de anticorpo da invenção são tositumumabe e ibritumomabe tiuxetano (dois anticorpos anti-CD20 marcados radioativamente), alentuzumabe (um anticorpo anti-CD52), denosumabe (um inibidor do ligante do fator de diferenciação de oste- oclastos) , galiximabe (um antagonista de CD80), ofatumumabe (um inibidor de CD20), zanolimumabe (um antagonista de CD4), SGN40 (um modulador de receptor de ligante de CD40), rituximabe (um inibi- dor de CD20), epratuzumabe (um anticorpo CD22) ou mapatumumabe (um agonista de receptor de TRAIL-1).

[00311] Outros fármacos quimioterapêuticos que podem ser usados em combinação com as moléculas de anticorpo da presente invenção são selecionados a partir de, porém não limitados a, hormônios, aná- logos hormonais e anti-hormonais (por exemplo, tamoxifeno, toremife- no, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de busereli- na, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), inibidores da aromatase (por exemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, for- mestano), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo, acetato de goserlina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptore- lina), antimetabólitos (por exemplo antifolatos como metotrexato, pe- metrexed, análogos de pirimidina como 5 fluorouracila, capecitabina, decitabina, nelarabina e gencitabina, purina e análogos de adenosina, tais como mercaptopurina tioguanina, cladribina e pentostatina, citara- bina, fludarabina); antibióticos antitumor (por exemplo, antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, mito- micina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixan- trona, estreptozocina); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes de alqui- lação (por exemplo, estramustina, mecloretamina, melfalano, cloram- bucila, bussulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiu- reia, temozolomida, nitrosoureias, como carmustina e lomustina, tiote- pa); agentes antimitóticos (por exemplo, alcaloides de vinca como vin- blastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como paclitaxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel e epoti- lonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inibidores de topoiso- merase (por exemplo, epipodofilotoxinas como etoposídeo e etofos, teniposídeo, ansacrina, topotecano, irinotecano) e diversos quimiote- rápicos, tal como amifostina, anagrelida, interferona alfa, procarbazina, mitotano e porfímero, bexaroteno, celecoxibe.

[00312] Particularmente preferidos são quimioterápicos geradores de ATP, por exemplo doxorrubicina onde um efeito positivo da combi- nação de doxorrubicina com bloqueio de CD73 foi demonstrado (Loi, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110 (27): 11091-6).

[00313] Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional po- de ser um outro agente imunoterapêutico, tal como moduladores de: TIM-1, TIM3, TIM-4, PDL-1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe ou durvalumabe), PD-L2, LAG3, CTLA-4, Galectina 9, Galectina-1, CD69, CD113, GPR56, CD48, GARP, CAECAM-1, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM, CD39, TGFp, IL-10, ligante de Fas, ICOS, IDO, Receptor Toll-like, família B7 (B7-1, B7-2, B7-H1 (PDL-1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4 , B7-H5 (VISTA) e B7- H6).

[00314] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adi- cional é um membro da família de TNF de moléculas que se ligam a membros da família de receptores de TNF cognatos, que incluem CD40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4- IBBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLIA, TRAMP/DR3, EDAR, EDAI, XEDAR, EDA2, TNFRI, Linfo- toxina α/TNF, TNFR2, TNFα, LTR, Linfotoxina α12, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR.

[00315] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adi- cional é selecionado a partir de (i) antagonistas de citocinas que ini- bem a ativação de células T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "citocinas imunossupressoras") e/ou (ii) agonistas de citocinas que es- timulam a ativação de células T e/ou citocinas, tal como IL2, para es- timular uma resposta imune, por exemplo, para tratar doenças prolife- rativas, tal como o câncer.

[00316] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adi- cional é um agonista de uma proteína que estimula a ativação de célu- las T, tal como CD28, GITRL, OX40L, CD27 e CD28H.

[00317] Os anticorpos anti-CD73 descritos aqui podem da mesma forma ser usados para projetar anticorpos biespecíficos que têm como alvo células efetoras que expressam o receptor de Fcα ou Fcy a célu- las de tumor (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.922.845 e

5.837.243, que estão aqui incorporadas por referência). Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para direcionar dois antígenos sepa- rados. Por exemplo, anticorpos biespecíficos de antígeno de receptor anti-Fc/anti-tumor (por exemplo, Her-2/neu), anticorpos biespecíficos têm sido usados para direcionar macrófagos a sítios de tumor. Este direcionamento pode ativar mais eficazmente as respostas específicas do tumor. Alternativamente, o antígeno pode ser liberado diretamente a DCs pelo uso de anticorpos biespecíficos que se ligam ao antígeno de tumor e um marcador de superfície celular específico de células dendríticas.

[00318] Em outras modalidades, o agente imunoterapêutico pode ser uma vacina contra o câncer.

[00319] Outras moléculas que podem ser combinadas com anticor- pos CD73 incluem antagonistas de receptores inibitórios em células de NK ou agonistas de receptores ativadores em células de NK, por exemplo, antagonistas de KIR (por exemplo, lirilumab.

[00320] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser um agente que inibe ou esgota macrófagos ou monócitos, incluindo, porém não limitado a antagonistas de CSF-1R.

[00321] Em outras modalidades, o agente terapêutico adicional po- de ser um agente que esgota ou bloqueia células de Treg, por exem- plo um agente que se liga especificamente ao CD25.

[00322] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser um inibidor dos receptores A2A ou A2B. Os exemplos são, porém não limitados a ATL-444, Istradefilina (KW-6002), MSX-3, Pre- ladenant (SCH-420.814), SCH-58261, SCH-412348, SCH-442416, ST- 1535, Cafeína, VER-6623, VER-6947, VER-7835, Vipadenant (BIIB- 014), PD116,948, ZM 241385, KW 6002, CGS 15943, ST1535, SYN- 115, PSB1115, PSB 603, MRS 1754, CPI-444, PBF-509 , AZD-4635 ou ZM-241385.

[00323] Em modalidades preferidas, o outro agente terapêutico é um antagonista de A2AR, antagonista de CD39, antagonista de LAG- 3, antagonista de CTLA-4, antagonista de EGFR ou antagonista de HER2.

[00324] Quando duas ou mais substâncias ou princípios devem ser usados como parte de uma combinação regime de tratamento neces- sário, eles podem ser administrados por meio da mesma rotina de ad- ministração ou por meio de diferentes rotinas de administração, es- sencialmente ao mesmo tempo (ou seja, simultaneamente, concorren- temente) ou em momentos diferentes (por exemplo, sequencialmente, sucessivamente, alternadamente, consecutivamente ou de acordo com qualquer outro tipo de regime alternativo).

[00325] Quando as substâncias ou princípios devem ser adminis- trados simultaneamente pela mesma rotina de administração, eles po- dem ser administrados como diferentes formulações ou composições farmacêuticas ou como parte de uma formulação ou composição far- macêutica. Além disso, quando duas ou mais substâncias ou princí- pios ativos devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, cada uma das substâncias ou princípios podem ser admi- nistrados na mesma quantidade e de acordo com o mesmo regime usado quando o composto ou princípio é usado por si só, e esse uso combinado pode ou não levar a um efeito sinérgico. No entanto, quan- do o uso combinado de duas ou mais substâncias ou princípios ativos leva a um efeito sinérgico, pode da mesma forma ser possível reduzir a quantidade de uma, mais ou todas as substâncias ou princípios a serem administrados, enquanto ainda se atinge a ação terapêutica de- sejada. Isto pode, por exemplo, ser útil para evitar, limitar ou reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados que estão associados ao uso de uma ou mais das substâncias ou princípios quando eles são usa- dos em suas quantidades usuais, enquanto ainda se obtém o efeito farmacológico ou terapêutico desejado.

[00326] Obviamente, o acima inclui a preparação e métodos de preparação dos anticorpos da invenção para o uso combinado com os parceiros de combinação acima. Também estão incluídos a prepara- ção e métodos de preparação dos parceiros de combinação mencio- nados acima para o uso combinado com os anticorpos da invenção.

[00327] As moléculas de anticorpo da invenção podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outros regimes de tratamento, por exemplo cirurgia e/ou radioterapia. Kits e métodos de fabricação e purificação

[00328] A invenção da mesma forma abrange kits compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD73 como descrito aqui, e um ou mais outros componentes selecionados a partir do grupo que consiste em outros fármacos usados para o tratamento das doenças e distúrbios descritos acima.

[00329] Em uma modalidade, o kit inclui uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção na forma de dosagem unitária. Em uma outra modalidade, o kit inclui uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo anti-CD73 da invenção na forma de dosagem unitária e uma composição contendo uma quantidade eficaz de um antagonista de PD-1 na forma de dosagem unitária, tal como um anti- corpo anti-PD-1, mais preferencialmente PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 como descrito aqui. Em algumas modalidades, o kit compre- ende um recipiente estéril que contém tal composição; tais recipientes podem ser caixas, ampolas, garrafas, frasconetes, tubos, bolsas, bol- sas, plásticos bolha ou outras formas de recipientes adequadas co- nhecidas na técnica. Esses recipientes podem ser feitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal ou outros materiais adequados para conter fármacos.

[00330] Se desejado, uma molécula de anticorpo anti-CD73, sozi- nha ou em combinação com outro agente terapêutico, tal como um antagonista de PD-1, é/são fornecidos juntamente com instruções para administrar o anticorpo/anticorpos a um indivíduo com câncer. As ins- truções geralmente incluirão informações sobre o uso da composição para o tratamento ou prevenção de um câncer. Em outras modalida- des, as instruções incluem pelo menos um dos seguintes: descrição do agente terapêutico; esquema de dosagem e administração para trata- mento ou prevenção de câncer ou seus sintomas; precauções; avisos; indicações; contra-indicações; informações de overdose; reações ad- versas; farmacologia animal; estudos clínicos; e/ou referências. As ins- truções podem ser impressas diretamente no recipiente (quando pre- sente), ou como um rótulo aplicado ao recipiente, ou como uma folha separada, panfleto, cartão ou pasta fornecida no ou com o recipiente. Em algumas modalidades, o kit compreende uma molécula de anticor- po anti-CD73, como descrito aqui, em conjunto com um antagonista de PD-1 (como descrito aqui) e, opcionalmente, um outro agente terapêu- tico, como descrito acima.

[00331] A invenção fornece ainda métodos de fabricação de uma molécula de anticorpo da invenção, tais métodos geralmente compre- endendo as etapas de: - cultivar células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica uma molé- cula de anticorpo da invenção sob condições que permitem a forma- ção do anticorpo da invenção; e, - recuperar a molécula de anticorpo expressa pelas células hospedeiras da cultura; e - opcionalmente purificar e/ou modificar e/ou formular a mo- lécula de anticorpo da invenção.

[00332] Um ácido nucleico da invenção pode, por exemplo ser uma molécula de DNA compreendendo sequências de codificação bem como como sequências regulatórias e, opcionalmente, íntrons naturais ou artificiais, ou podem ser uma molécula de cDNA. Pode ter seus có- dons originais ou pode ter um uso de códon otimizado que foi especifi- camente adaptado para expressão na célula hospedeira pretendida ou organismo hospedeiro. De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucleico da invenção está na forma essencialmente isolada, como definido acima.

[00333] O ácido nucleico da invenção será tipicamente incorporado em um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode fornecer a ex- pressão do polipeptídeo quando transfectado em uma célula hospedei- ra adequada ou outro sistema de expressão.

[00334] Para fabricar os anticorpos da invenção, o especialista na técnica pode escolher entre uma grande variedade de sistemas de ex- pressão bem conhecidos na técnica, por exemplo aqueles revisados por Kipriyanow e Le Gall, 2004.

[00335] Os vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, epissomas derivados de EBV e similar. O vetor de expres- são e as sequências de controle de expressão são selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em certas modalidades, ambas as sequências de DNA são inseridas no mesmo vetor de expressão.

[00336] Os vetores convenientes são aqueles que codificam uma sequência de imunoglobulina CH (constante pesada) ou CL (constante leve) humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apro- priados projetados de modo que qualquer sequência VH (variável pe- sada) ou VL (variável leve) possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. Para a cadeia pesada do anticorpo, pode ser, sem limitação, qualquer isotipo IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4) ou outras imunoglobulinas, incluindo variantes alélicas.

[00337] O vetor de expressão recombinante pode da mesma forma codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia do anti- corpo de uma célula hospedeira. O DNA que codifica a cadeia do anti- corpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ao terminal amino do DNA da cadeia do anticorpo maduro. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imuno- globulina ou um peptídeo heterólogo de uma proteína não imunoglobu- lina. Alternativamente, a sequência de DNA que codifica a cadeia do anticorpo pode já conter uma sequência de peptídeo sinal.

[00338] Além das sequências de DNA da cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes carregam tipicamente sequên- cias regulatórias, opcionalmente sequências regulatórias heterólogas, incluindo promotores, intensificadores, sinais de terminação e poliade- nilação e outros elementos de controle de expressão que controlam a expressão das cadeias de anticorpos em uma célula hospedeira. Exemplos de sequências promotoras (exemplificadas para expressão em células de mamíferos) são promotores e/ou potencializadores deri- vados de CMV (como o promotor / intensificador do vírus Simian 40 (SV40) do CMV), adenovírus (por exemplo, o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores fortes de mamíferos, tais como imunoglobulina nativa e promotores de actina.

[00339] Exemplos de sinais de poliadenilação são BGH poliA, SV40 tardio ou poliA inicial; alternativamente, 3' UTRs de genes de imuno- globulina etc. podem ser usados.

[00340] Os vetores de expressão recombinantes podem da mesma forma transportar sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. As moléculas de ácido nucleico que codifi- cam a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta e/ou a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo da invenção, e vetores compreendendo essas moléculas de DNA podem ser introduzidos em células hospedeiras, por exemplo cé- lulas bacterianas ou células eucarióticas superiores, por exemplo célu- las de mamíferos, de acordo com métodos de transfecção bem conhe- cidos na técnica, incluindo transfecção mediada por lipossoma, trans- fecção mediada por policátion, fusão de protoplastos, microinjeções, precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação ou transferência por vetores virais.

[00341] De preferência, as moléculas de DNA que codificam a ca- deia pesada e a cadeia leve estão presentes em dois vetores de ex- pressão que são cotransfectados na célula hospedeira, de preferência uma célula de mamífero.

[00342] As linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e inclu- em, entre outros, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de NSO, células de SP2/0, células de HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma humano (por exemplo, células de Hep G2 e A-549), células 3T3 ou os derivados/progênies de qualquer linhagem de células. Outras células de mamífero, incluindo, porém, não limitadas a linhagens de células humanas, camundongos, ratos, macacos e roedores, ou outras células eucarióticas, incluindo, porém, não limitadas a células de levedura, inseto e planta, ou células procarióticas, tais como bactérias, podem ser usadas.

[00343] As moléculas de anticorpo da invenção são produzidas cul- tivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão da molécula de anticorpo nas células hos- pedeiras. As moléculas de anticorpo são preferencialmente recupera- das do meio de cultura como um polipeptídeo segregado ou podem ser recuperadas de lisados de células hospedeiras se, por exemplo, expresso sem um sinal secretor. É necessário purificar as moléculas de anticorpo usando métodos de purificação de proteína padrões usa- dos para proteínas recombinantes e proteínas de células hospedeiras de uma forma que sejam obtidas preparações substancialmente ho- mogêneas do anticorpo. A título de exemplo, os métodos de purifica- ção do estado da técnica úteis para a obtenção de moléculas de anti- corpo da invenção incluem, como uma primeira etapa, a remoção de células e/ou fragmentos de células em partículas do meio de cultura ou lisado. O anticorpo é em seguida purificado a partir de proteínas solú- veis contaminantes, polipeptídeos e ácidos nucleicos, por exemplo, por fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipi- tação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em Sephadex, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica. Como uma etapa final no processo de obtenção de uma preparação de mo- lécula de anticorpo, a molécula de anticorpo purificada pode ser seca, por exemplo liofilizada, como descrito abaixo para aplicações terapêu- ticas.

[00344] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, sem estar necessariamente limitada a essas modalidades da invenção. Um exemplo ou parte do mesmo, incluindo compostos, doses e rotinas de administração, bem como combinações de trata- mento, cada um como tal ou em combinação com a descrição deta- lhada acima faz parte da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração e otimização de anticorpos contra CD73.

[00345] Os camundongos nocaute para CD73 foram imunizados com o domínio extracelular completo de CD73 humano (número de acesso UniProt P21589) tendo um rótulo 6xHis C-terminal e o domínio extracelular completo de CD73 de camundongo (número de acesso

UniProt Q61503; tendo um rótulo de Fc humano C-terminal (SEQ ID NO: 131). Os acertos foram identificados e recuperados usando uma única plataforma de geração de anticorpos de células B. Eles foram selecionados para ligação a CD73 humano, cinomolgos, camundongo e rato, e testados quanto à inibição de CD73 em ensaios funcionais, como descrito nos Exemplos 2 a 6. As moléculas de anticorpo com o melhor conjunto de propriedades de acordo com esses ensaios foram utilizadas como uma base para outras variantes otimizadas.

[00346] Os CDRs desses anticorpos anti-CD73 de camundongo foram otimizados para sequências em estruturas humanas de linhas germinativas semelhantes para cadeias pesadas e leves usando um método de avaliação de fago (como descrito por Singh e outro MAbs. 2015 Jul-Ago; 7(4): 778-791). A atividade de ligação das variantes foi avaliada por ELISA. Variantes tendo alta afinidade a CD73 humano com uma alta relação de resíduos humanos e baixa imunogenicidade prevista (baixa pontuação no Epivax) foram selecionadas. Exemplo 2: Ligação alvo e seletividade celular.

[00347] Para o formato de avidez, a experiência foi realizada em um instrumento Bio-Rad ProteOn XPR36. Os anticorpos foram capturados através da Proteína A/G e os antígenos diméricos não covalentes fluí- ram sobre a superfície capturada. O tampão fluente para esta experi- ência e todas as diluições foram preparadas em PBS-T-EDTA. O chip do sensor de GLM foi normalizado e pré-condicionado de acordo com as recomendações do fabricante. O chip sensor foi ativado com uma mistura igual de EDC/s-NHS na direção horizontal por 300 s em uma taxa de fluxo de 30 μL/min e imobilizado com Proteína A/G recombi- nante (50 pg/ml em acetato 10 mM pH 4,5) na direção horizontal por 300 s em uma taxa de fluxo de 30 pL/min, resultando em cerca de 5000 RU de Proteína A/G na superfície. O chip sensor foi desativado com 1M de etanolamina-HCl na direção horizontal por 300 s em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. O chip sensor foi regenerado com 18 s de ácido fosfórico a 0,85% em uma taxa de fluxo de 100 μL/min 2 vezes horizontalmente e 2 vezes verticalmente.

[00348] Cerca de 300 RU de anticorpo foram capturados na super- fície da Proteína A/G verticalmente por 60 s em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. A superfície de captura foi estabilizada pela injeção de PBS-T-EDTA por 60 s em uma taxa de fluxo de 100 μL/min horizon- talmente. O analisado (CD73-His humano) foi injetado horizontalmente sobre o anticorpo capturado por 600 s em uma taxa de fluxo de 30 μL/min com uma dissociação de 1200 s. As concentrações de CD73- His humano foram de 0 nM, 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM e 50 nM. A superfície foi regenerada pela injeção de ácido fosfórico a 0,85% por 18 s em uma taxa de fluxo de 100 μL/min uma vez horizon- talmente e uma vez verticalmente.

[00349] O interspot (interações com a superfície do sensor) e o branco (PBS-T-EDTA ou analisado 0 nM) foram subtraídos dos dados brutos. Usando o software Bio-Rad ProteOn Manager, sensorgramas foram ajustados globalmente para ligação Langmuir 1:1 para fornecer valores de constante de taxa de associação (ka), constante de taxa de dissociação (kd) e constante de dissociação de equilíbrio (KD). Tabela 1: Avidez de ligação de anticorpos anti-CD73 a CD73 por

SPR Anticorpo KD [pM] B2 420 C1 72 C2 63 C3 72 C4 74 C5 49 C6 96

[00350] A seletividade celular foi determinada usando linhagens ce-

lulares que expressam CD73 endogenamente, bem como uma linha- gem celular negativa para CD73 em um ensaio com base em FACS. Em células CD73 positivas, a ligação foi facilmente detectada, enquan- to em células negativas para CD73 nenhuma ligação detectável foi ob- servada até concentrações de 1000 nM.

[00351] A ligação do anti-CD73 foi da mesma forma determinada para o CD73 de camundongo por SPR e comparada à ligação ao CD73 humano (P21 589, “isoforma longa”).

[00352] Os anticorpos testados ligados ao CD73 humano com mai- or afinidade do que ao CD73 de camundongo (C1: 96 vezes; C2: 138 vezes; C3: 117 vezes; C4: 120 vezes; C5: 163 vezes, C6: 58 vezes maior ligação ao CD73 humano do que ao CD73 de camundongo). Exemplo 3: Inibição da função enzimática de CD73

[00353] A função enzimática de CD73 foi medida usando um ensaio com base em luciferase. O substrato de CD73 AMP é um produto da reação de luciferase e mostra atividade inibitória para a luciferase. As placas foram bloqueadas seguido pela adição da proteína de CD73 humana recombinante. Em seguida, os anticorpos CD73 foram adicio- nados em diferentes concentrações. As placas foram misturadas e in- cubadas durante 10 min a 37 °C. O substrato AMP foi adicionado, as placas foram misturadas e incubadas a 37 °C durante 30 min. O rea- gente CellTiterGlo (CellTiterGlo Luminescent Cell Viability Assay Kit, Promega, número de catálogo # G7571) foi dissolvido em tampão de reagente e adicionado a cada cavidade. A placa foi misturada e incu- bada por 10 min em temperatura ambiente no escuro. O sinal de lumi- nescência foi medido usando uma Leitora EnVision 2104 Multilabel.

[00354] Como mostrado na Tabela 2, os anticorpos CD73 descritos aqui mostram valores de IC90 nanomolar baixos para a inibição da fun- ção enzimática de CD73. Os dados mostrados são de duas experiên- cias independentes.

Tabela 2: Inibição da função enzimática de CD73 por anticorpos anti-CD73. Anticorpo IC90 [Nm] médio +/- SD B2 1,04 +/- 0,12 C1 0,49 +/- 0,09 C2 0,49 +/- 0,08 C3 0,32 +/- 0,01 C4 0,24 +/- 0,08 C5 0,29 +/- 0,05 C6 0,24 +/- 0,03 Exemplo 4: Redução dos níveis de superfície da proteína CD73.

[00355] A redução dos níveis de superfície da proteína CD73 foi determinada por citometria de fluxo. A linhagem de células Colo201 foi incubada com anticorpos CD73 por 1 h e por 24 h, e um anticorpo se- cundário foi usado para medir os níveis de anticorpos ligados a CD73 na superfície celular.

[00356] As células Colo201 foram separadas pela adição de solu- ção TripLE (Gibco, No.12604-013) e semeadas em placas de 96 cavi- dades. Após 24 horas, os anticorpos CD73 foram adicionados. As amostras foram analisadas após 1 hora e 24 horas por citometria de fluxo usando um anticorpo secundário rotulado. A análise da amostra foi realizada usando o software FlowJo X versão 10.0.7r2. A intensida- de média de fluorescência (FI) da população bloqueada foi normaliza- da para seu FI médio correspondente no ponto de tempo 0 (1h de in- cubação com anticorpo CD73). Os foram em seguida normalizados pelo qual o valor de fluorescência das células incubadas com um anti- corpo CD73 não induzindo uma redução do nível de superfície de CD73 (como descrito em US20090203538 como "anticorpo 067-213") foi definido para 100% (níveis máximos de CD73).

[00357] Os anticorpos CD73 descritos aqui mostram atividade mo- derada na indução de uma redução dos níveis de superfície de CD73.

Os dados mostrados são de pelo menos duas experiências indepen- dentes. Tabela 3: Redução dos níveis de superfície de CD73 por anticor- pos anti-CD73. Anticorpo CD73 redução de superfície [%] médio +/- SD B2 31 +/- 0,1 C1 20 +/- 3,1 C2 15 +/- 1,4 C3 16 +/- 1,5 C4 15 +/- 1,4 C5 19 +/- 1,5 C6 19 +/- 5,9 "MEDI 9447" 17 +/- 3,9 "BMS 986179" 58 +/- 1,7 Exemplo 5: Inibição de formação de adenosina em linhagens celu- lares

[00358] Um ensaio com base em células foi usado para determinar a redução dos níveis de adenosina pela inibição de CD73. A adição de AMP às células Colo-201 resulta na conversão de AMP em adenosina por CD73 expresso nas células. A conversão de AMP é inibida pelos anticorpos anti-CD73 da invenção, como fornecido aqui. As células Colo- 201 foram cultivadas na presença de anticorpos CD73 a 37 °C durante 24 horas. Em seguida, uma solução de bloqueio foi adicionada contendo eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil)adenina para bloquear a adenosina desami- nase, 5-Iodotubercidina para bloquear a adenosina cinase, b- glicerofosfato para bloquear a fosfatase alcalina e dipiridamol para blo- quear ENT1-4 (Ramakers 2008). Após uma incubação de 20 minutos, 300 μM de AMP foi adicionado durante 30 minutos e a reação foi inter- rompida pela adição de uma solução de 15 mM de HCl. Alíquotas de 50 μl de sobrenadantes celulares retirados das incubações para cada con- centração de mAb foram adicionadas a 500 μI de acetonitrila contendo

0,5 mM de C5-adenosina rotulado por isótopo como padrão interno + 50 μI de solução de bloqueio em um formato de placa de 96 cavidades. Os padrões de calibração foram preparados por diluições em série em doze etapas. Amostras de calibração e controle de qualidade foram pre- paradas adicionando 50 mI de meio de incubação de células como ma- triz em branco mais 50 μI do respectivo padrão ou solução de QC a 500 μI de acetonitrila contendo 0,5 mM de 13C5-adenosina rotulado por isóto- po como padrão interno. Após centrifugação, 50 μL do sobrenadante foram transferidos para outra placa de 96 cavidades, evaporados até a secura sob N2 e redissolvidos em metanol 25% + ácido fórmico 0,01%. As concentrações de adenosina foram determinadas por HPLC-MS/MS em resolução de massa unitária com ionização ESI+. As amostras foram injetadas no sistema HPLC/MS com um amostrador automático CTC PAL HTS-xt (volume de injeção 5 μL). As análises quantitativas foram realizadas com sistemas de HPLC Agilent HP1200 equipados com uma coluna de HPLC de fase reversa Phenomenex Synergy Hydro-RP C18 em temperatura ambiente (tamanho de partícula 2,5 μm, dimensão da coluna 2 x 50 mm), aplicando um gradiente de HPLC com 5 mmol/L de acetato de amônio (pH 4,0) como solvente A e acetonitrila com ácido fórmico 0,1% como solvente B com uma taxa de fluxo de 700 μl/min e um tempo de ciclo de 5 min por amostra. O solvente B foi aumentado de 2 a 15% de 0 a 3,0 min, aumentado para 95% B de 3,0 a 3,1 min, manti- do constante em 9 5% B de 3,1 a 4,0 min antes de retornar a 2% B de 4,0 a 4,1 min e reequilíbrio da coluna de 4,1 a 5,0 min. Os sistemas de HPLC foram acoplados aos espectrômetros de massa triplo quadrupolo ABSCIEX API5000 operados no modo de MRM. As avaliações de po- tencial de decomposição (DP) e energia de colisão (CE) foram otimiza- das automaticamente usando o software ABSCIEX DiscoveryQuantTM

2.1. As transições de MRM de 268,2 para 136,1 (DP: 62, CE:27) para 13 adenosina e 273,3 para 136,2 (DP: 64, CE:27) para C5-adenosina fo-

ram usadas para a quantificação (tempos de espera: 70 ms). A tempera- tura da fonte da fonte Turbo Ion Spray foi ajustada para 650 °C. Os cro- matogramas foram integrados e as áreas de pico foram determinadas com Analyst® 1.5.1 (ABSCIEX). As quantidades absolutas de adenosina formadas foram calculadas a partir das concentrações de adenosina medidas e dos volumes de incubação. Os dados foram ajustados por cálculo iterativo usando um programa de análise de curva sigmoidal si- métrica (Graph Pad PRISM) com declive variável. Os níveis de adenosi- na obtidos para células tratadas com isotipo sem adição de AMP são ajustados para 100% de inibição; os níveis de adenosina obtidos para células tratadas com isotipo com adição de AMP são ajustados para 0% de inibição.

[00359] Os anticorpos CD73 descritos aqui reduziram os níveis de adenosina em células Colo201 em >75% em comparação com células tratadas com isotipo +/- adição de AMP.

[00360] Os anticorpos anti-CD73 descritos aqui mostraram ativida- de superior na redução dos níveis de adenosina em células Colo201 em comparação com os anticorpos anti-CD73 de referência "ME- DI9447" e "BMS986179" (como definido aqui acima), como demons- trado na Tabela 4. Tabela 4: Inibição da formação de adenosina em células Colo201. Anticorpo % de inibição de adenosina máxima B2 77 C1 86 C2 88 C3 88 C4 88 C5 87 C6 88 "MEDI 9447" 63 "BMS 986179" 68

Exemplo 6: Indução de proliferação de células T e liberação de IFNγ.

[00361] O efeito da inibição de CD73 nas células T foi investigado usando um ensaio de células T humanas primárias. Células mononu- cleares de sangue periférico humano (PBMCs) de STEMCELL Technologies foram descongeladas e células T foram enriquecidas por seleção negativa (Kit de enriquecimento de células T, Easy Sep Nega- tive Selection; Stem Technologies #19051). Os doadores foram inter- namente rotulado A - F. Células T foram rotuladas com Cell Trace Vio- let (CellTraceTM Violet Proliferation Kit, Molecular Probes, # C34557) de acordo com o protocolo do fabricante. O ensaio foi realizado em uma placa de base redonda de 96 cavidades pré-revestida com anti- CD3 (anticorpo anti-CD3 purificado por Ultra-LEAFTM, clone HIT3a, Biolegend, # 300332) durante a noite a 4 °C. As células T rotuladas com CTV foram semeadas e incubadas com anti-CD28 (anticorpo anti- CD28 purificado por Ultra-LEAFTM, clone CD28.2; Biolegend, # 302934) e controle anti-huCD73 ou anti-TNP HulgdG1KO em concen- trações diferentes. Após incubação de 22 horas a 37 °C e 5% de CO2, AMP (sal dissódico de 5'-monofosfato de adenosina; Sigma Aldrich, Cat #01930) foi adicionado em uma concentração final de 200 mM. As células foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2 por mais 5 dias. Os so- brenadantes foram retirados e analisados quanto à secreção de IFN gama pelo kit Meso Scale Diagnostics V-PLEX Human IFN-y de acor- do com as instruções do fabricante. Os valores foram normalizados para células tratadas com isotipo estimulado com adição de AMP. A proliferação de células foi determinada por análise do rótulo de CTV em células CD4+ e CD8+ usando um citômetro de fluxo BD FACS Canto II e o software BD FACSDiva (versão 8.0.1). A proliferação de células tratadas com isotipo estimulado sem adição de AMP foi defini- da para 100%, a proliferação de células tratadas com isotipo estimula-

do com adição de AMP foi definida para 0%.

[00362] Os anticorpos CD73 descritos aqui restauram a proliferação de células T e a liberação de citocinas.

[00363] Os anticorpos descritos aqui mostram atividade superior na indução da proliferação de células T e liberação de IFNγ em células T humanas primárias em certos doadores em comparação com "ME- DI9447" e "BMS986179" (Tabela 5 e 6). Desse modo, os anticorpos CD73 gerados têm a capacidade de restaurar as funções das células T suprimidas pelo AMP em níveis mais elevados em comparação com ambas as moléculas concorrentes em certos doadores. Tabela 5: Proliferação de células T CD8, fornecida em [%] do con- trole (células tratadas com isotipo +/- AMP, em que células trata- das com isotipo estimulado sem adição de AMP são definidas a 100% e células tratadas com isotipo estimulado com adição de AMP são definidas a 0%); n.d.: não determinado CD73 Doador A Doador B Doador C Doador D Doador E Doador F mAB B2 55,6 62,2 95,8 98,5 99,1 -8,9 C1 103,5 86,7 106,9 99,5 100,9 84,2 C2 103,0 68,5 n.d. n.d. n.d. n.d. C3 103,2 80,2 116,5 99,3 101,0 91,3 C4 103,5 70,3 110,9 98,5 100,2 92,6 C5 103,2 80,3 100,6 99,3 100,4 86,0 C6 102,4 65,4 88,3 99,6 100,4 91,1 "MEDI 43,9 46,7 115,1 98,0 85,5 -34,1 9447" "BMS 40,7 61,7 99,6 98,7 95,4 22,5 986179"

Tabela 6: Liberação de IFNγ [mudança de dobra sobre controle]. O controle são células tratadas com isotipos estimulados com adição de AMP. CD73 Doador A Doador B Doador C Doador D Doador E Doador F mAB B2 12,6 8,1 34,1 17,7 11,1 3,1 C1 20,9 12,0 51,3 20,9 12,8 6,7 C2 20,3 7,8 n.d. n.d. n.d. n.d. C3 19,9 7,7 31,9 19,0 14,2 6,7 C4 20,2 8,7 35,2 13,7 14,1 7,1 C5 24,5 11,3 59,3 22,9 12,4 5,8 C6 24,3 12,9 55,5 25,8 14,0 10,3 "MEDI 7,7 5,3 16,2 20,7 5,0 1,1 9447" "BMS 10,9 5,2 36,4 13,3 7,2 2,9 986179"

[00364] As Tabelas 5 e 6 acima demonstram que os anticorpos anti- CD73 testados mostram atividade superior na indução da proliferação de células T e liberação de IFNγ em certos doadores em comparação com “MEDI9447” e “BMS986179”. Os dados são de comparações ca- beça a cabeça em concentração de anticorpo CD73 de 1 nM; 4 répli- cas biológicas por doador. Exemplo 7: Co-cultura de células dendríticas/células T

[00365] Além disso, um sistema de co-cultura de células dendríti- cas/células T foi estabelecido. Células mononucleares de sangue peri- férico Fluman (PBMCs) foram isoladas de sangue heparinizado de do- adores saudáveis por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll- Flypaque e armazenadas congeladas a -150°C. PBMCs foram des- congelados e monócitos foram enriquecidos por seleção negativa (contas magnéticas). Os monócitos foram cultivados em meio com 3 ng/ml de IL-4 humana e 50 ng/ml de GM-CSF humano a 37 °C e 5% de CO2 para se diferenciar em células dendríticas (DCs). No dia 5,

TNF alfa 10 ng/ml foi adicionado para maturação e as células foram cultivadas durante a noite. PBMCs de um doador diferente foram des- congelados, células T foram isoladas por seleção imunomagnética ne- gativa e cultivadas durante a noite em meio com 5 ng/ml de IL-2 hu- mana. 200000 células por cavidade de células T foram co-cultivadas com 50000 células por cavidade de DCs maduras alogênicas em pla- cas de 96 cavidades na presença do anticorpo antiPD-1 pembrolizu- mabe (como também descrito aqui, e por exemplo, em W02009/114335 e WO2015/088847) e vários anticorpos anti-CD73 da invenção em diferentes concentrações. Os controles de isotipo IgG4Pro humano e IgGIKO humano foram usados como controle ne- gativo. Após 22 horas a 37 °C e 5% de CO2 sal dissódico de 5'- monofosfato adenosina (AMP) foi adicionado. A co-cultura foi incubada por 5 dias a 37 °C, em seguida, os sobrenadantes foram retirados e a secreção de IFN gama foi analisada pelo Kit Meso Scale Diagnostics V-PLEX Human IFN-y de acordo com as instruções do fabricante.

[00366] Os efeitos da inibição de PD1, CD73 ou ambos podem ser investigados neste sistema. Adição de AMP foi constatado inibir a res- posta anti-PD1 e o tratamento com anti-CD73 usando os anticorpos fornecidos aqui levou a uma reversão desta inibição mediada por AMP (veja Figura 1). Os dados mostrados são de comparações diretas na concentração de anticorpo CD73 de 1 μg/ml; 5 réplicas biológicas por doador e anticorpo. Exemplo 8: Inibição de CD73 ligado à célula vs não ligado à célula

[00367] As células Colo-201 foram incubadas com anticorpos CD73 a 37 °C por 24 horas, em seguida a solução de bloqueio (veja “Inibição da formação de adenosina em linhagens celulares”) foi adicionada por 20 minutos. As células foram semeadas por centrifugação e o sobre- nadante foi transferido para uma nova placa de ligação baixa. As célu- las foram lavadas e 300 mM AMP foi adicionado às células, bem como ao sobrenadante.

Após um tempo de incubação de 30 minutos, a rea- ção foi interrompida pela adição de uma solução de HCl 15 mM.

Os sobrenadantes foram retirados e misturados com uma mistura de ace- tonitrila/solução de bloqueio para interromper possíveis reações enzi- máticas.

As amostras foram analisadas quanto aos níveis de adenosi- na por cromatografia líquida-espectrometria de massa.

Isso permite investigar a inibição de CD73 ligado à célula versus inibição de CD73 em sobrenadantes de cultura de células (CD73 não ligado à célula). Os níveis de adenosina obtidos para o tratamento com isotipo sem adição de AMP foram ajustados para 100% de inibição; os níveis de adenosina obtidos para o tratamento de isotipo com adição de AMP foram fixados em 0% de inibição.

Como demonstrado nas Tabelas 7 e 8, os anticorpos CD73 de acordo com a presente invenção, em parti- cular C1, C2, C3, C4, C5 e C6, inibiram CD73 ligado à célula, bem como CD73 presente em sobrenadantes de cultura de células (CD73 não ligado a célula) por 70-80%. “MEDI9447” exibiu uma atividade ini- bitória aproximadamente 20% menor no CD73 ligado à célula.

Tanto “MEDI9447” e “BMS 986179” mostraram atividades mais baixas na inibição de CD73 presente em sobrenadantes de cultura de células.

Desse modo, os anticorpos CD73 de acordo com a presente invenção levaram a uma inibição mais completa de CD73 em comparação com ambas as moléculas competidoras.

Tabela 7: Inibição de CD73 ligado à célula Anticorpo % de inibição de adenosina máxima B2 70 +/- 3 C1 79 +/- 3 C2 78 C3 81 +/- 4 C4 82 +/- 3 C5 82 +/- 6 C6 81 +/- 3

Anticorpo % de inibição de adenosina máxima "MEDI 9447" 62 +/- 4 "BMS 986179" 84 +/- 5

[00368] A Tabela 7 demonstra que os anticorpos da invenção são superiores ao anticorpo comparativo da técnica anterior "MEDI 9447" na inibição de CD73 ligado à célula. Os dados mostrados são de pelo menos duas experiências independentes além do anticorpo C2 (n=1). Tabela 8: Inibição de CD73 não ligado à célula Anticorpo % de inibição de adenosina máxima B2 62 +/- 2 C1 76 +/- 3 C2 77 C3 82 +/- 3 C4 81 +/- 1 C5 80 +/- 5 C6 78 +/- 2 "MEDI 9447" 56 +/- 7 "BMS 986179" 63 +/- 1

[00369] A Tabela 8 demonstra que os anticorpos da invenção são superiores aos anticorpos comparativos da técnica anterior "MEDI 9447" e/ou "BMS 986179" na inibição de CD73 em sobrenadantes de cultura de células. Os dados mostrados são de pelo menos duas expe- riências independentes além do anticorpo C2 (n = 1). Exemplo 9: Formação de complexos de anticorpos anti-CD73 e CD73

[00370] O estado oligomérico dos complexos de CD73 e dois anti- corpos anti-CD73 foi investigado usando amostras de CD73 e dois an- ticorpos diferentes por experiências de ultracentrifugação analítica de velocidade de sedimentação ("SV-AUC") como componentes únicos e como misturas com uma relação de CD73:anticorpo molar de 1:1. Para relação sinal/ruído ideal em 280 nm, as misturas foram examinadas em uma concentração de 2,4 mM. Alíquotas individuais da proteína

CD-73 e do anticorpo da invenção foram da mesma forma examinadas em uma concentração de 2,4 mMoIqG para facilitar a comparação de g(s). A proteína CD73 e o anticorpo da invenção foram dialisados em tampão de PBS antes da mistura e centrifugação.

[00371] As experiências de SV-AUC foram analisadas qualitativa- mente pela preparação de curvas de distribuição g(s) por uma trans- formação dos dados brutos, e mais quantitativamente por vários algo- ritmos de ajuste de curva. Para sistemas paucidispersos não reversí- veis, ou sistemas reversíveis com concentrações maiores ou iguais a 2 ordens de magnitude acima de todos os valores de KD interação, a função de distribuição c(s) é um método de ajuste de curva robusto que retornará estimativas precisas da porcentagem de cada espécie e peso molecular. Os componentes individuais (CD73 e os anticorpos anti-CD73 associados (anticorpo anti-CD73 inventivo C4; "MEDI9447") foram de pureza suficiente para serem ajustados à curva pelo algorit- mo c(s) e retornaram aos pesos moleculares esperados. As misturas de proteína CD73 com anticorpos anti-CD-73 produziu distribuições amplas que não eram passíveis de deconvolução pelo algoritmo c(s), desse modo ag(s), gráfico de distribuição de sedimentação aparente, foi feito para qualitativamente comparar a distribuição de espécies formadas por CD73 e anticorpos anti-CD73. Materiais

[00372] CD73 HuCD73_His_tagged, peso molecular do dímero (Daltons): 118.032, volume específico parcial 0,73744, A280/mg/ml/cm 0,954, tampão de armazenamento 1x PBS, 0,2 M Sacarose, 0,01% CHAPS, 5% Glicerol, 1 mM TCEP, pH- 7.2.

[00373] Anticorpo C04 anti-CD73, o peso molecular calculado é

148.232 Da, incluindo 3000 Da para glicosilação. Anticorpo anti-CD73 “MEDI9447”, peso molecular calculado incluindo 3000 Da estimado para glicosilação é 150.669 Da.

Métodos

[00374] A coleta de dados para as experiências de SV-AUC foi rea- lizada com uma ultracentrífuga analítica Beckman XL-I (Beckman Coulter, Brea, Califórnia). No dia de cada experiência, as amostras armazenadas na temperatura de armazenamento apropriada foram descongeladas, se necessário, e em temperatura ambiente são mistu- radas suavemente por pipeta, e diluídas em uma concentração resul- tando em um sinal de absorvância dentro da faixa linear do detector. As amostras foram carregadas nos setores de amostra de células epon preenchidas com carvão com janelas de safira ou quartzo. O se- tor de amostra foi carregado com 400 μl de amostra diluída. 406 μI de tampão combinado foram usados no setor de referência da célula. As experiências foram realizadas usando um rotor de titânio An-60 Ti ana- lítico de quatro furos (Beckman Coulter). O contrapeso de calibração foi colocado no orifício 4. Uma varredura inicial em 3000 RPM foi reali- zada para verificar a integridade da célula e realizar uma calibração radial do instrumento. Além disso, uma varredura de comprimento de onda foi realizada em cada célula em 3000 RPM para verificar a ab- sorbância. As amostras foram deixadas atingir o equilíbrio de tempera- tura a 20 °C por pelo menos 2 h antes do início da centrifugação em alta velocidade, 40000 RPM. As varreduras de dados de cada célula relatando concentração como uma função da posição radial foram co- letadas por varredura de absorvância a 280 nm com um tamanho de etapa radial de 0,003 cm, varredura contínua, 1 flash por canal. Análise de dados de SV-AUC usando o algoritmo c(s).

[00375] As varreduras foram escolhidas desde a primeira varredura até cerca da 10ª varredura após a amostra ser peletizada. Excesso de varreduras após a amostra ter sido peletizada não contêm informações e pesam excessivamente a contribuição da linha de referência. As propriedades do tampão e uma estimativa do volume específico parcial calculado pela sequência da proteína foram inseridos como parâme- tros para o ajuste da curva. Os dados foram analisados, produzindo distribuições c(s) contínuas usando o pacote de software SEDFIT ver- são 15.01b (Schuck Biophys J. 2000 Mar; 78 (3): 1606-19).

[00376] As funções de distribuição do coeficiente de sedimentação aparente, curvas g(s) e ajuste da curva de limite total foram realizadas com o programa SEDANAL (www.sedanal.org; Biophysical Chemistry 108 (2004) 231-243). Todos os arquivos de dados c(r) foram examina- dos e metadados, tal como a posição do menisco, intervalo para ajus- te, base de célula e correções ópticas, se necessário, foram gravados em um arquivo de dados de canal (arquivo *.abr para SEDANAL). O gráfico g(s) é o gráfico da função de distribuição de sedimentação apa- rente e representa uma transformação dos dados brutos em um eixo x do coeficiente de sedimentação aparente (ou eixo de velocidade) e no eixo y da função g(s) (a forma de derivado dos dados c(r)). Esta é uma transformação livre de modelo e a posição dos picos representa a ve- locidade do limite, enquanto a largura do limite representa a difusão de uma única espécie ou a difusão e a separação crescente de várias es- pécies (se várias espécies estiverem presentes). Um pequeno número de pares c(r) é usado para gerar cada gráfico g(s). As formas exatas dos gráficos g(s) dependem do intervalo de tempo e do tempo decorri- do desde o início da rotação dos dados usados para gerar o gráfico. No eixo x, o g(s) de até mesmo uma única espécie ideal se tornará mais estreito e mais alto proporcional ao tempo decorrido das varredu- ras desde o início da sedimentação. Sobreposições de conjuntos cor- respondentes de intervalo de tempo de gráficos de g(s) podem ser usados para demonstrar ou invalidar a autoassociação reversível de uma série de diluição da mesma amostra.

[00377] SEDANAL da mesma forma realizará ajustes diretos de curva para dados brutos transformados pela operação dc/dt (mudança na concentração dividida pela mudança no tempo). Usando um mode- lo especificado pelo usuário, SEDANAL faz um ajuste de curva de mí- nimos quadrados não linear das curvas de dc/dt de um subconjunto de um canal de dados para obter os melhores parâmetros de ajuste do modelo aos dados. SV-AUC é um dos poucos métodos biofísicos que podem classificar a qualidade de ajuste de uma série de modelos, aju- dando o analista a escolher o melhor modelo para ajustar os dados. Resultados

[00378] Uma amostra de CD73 foi testada e ajustada por SEDANAL e SEDFIT. Curva ajustada por SEDANAL para HuCD73his Valor de S 6,341 Peso 121000 Curva ajustada por Sedfit para HuCD73his Valor de S 6,389 Peso 126000

[00379] A amostra de CO4 foi conduzida e curva ajustada por SE- DANAL e SEDFIT Curva ajustada por SEDANAL para C04 Valor de S 6,304 Peso 141000 Curva ajustada por Sedfit para C04 Valor de S 6,300 Peso 144000

[00380] A amostra “MEDI9447” foi conduzida e ajustada por SE- DANAL e SEDFIT Curva ajustada por SEDANAL para "MEDI9447" Valor de S 6,347 Peso 141000 Curva ajustada por Sedfit para "MEDI9447" Valor de S 6,321 Peso 147000

[00381] O ajuste de curva das misturas por c(s) e SEDANAL não retornou resultados confiáveis e a conclusão foi que houve muitas es- pécies para deconvoluir. Para comparação qualitativa, gráficos de so- breposição g(s) foram preparados (veja: Fig.2).

[00382] Correlação entre Svedbergs e peso molecular: (Svedbergs) Mw Daltons 2 30,000 4 85,000 6 156,000 8 241,000 10 337,000 12 442,000 14 558,000 16 681,000 18 813,000 20 952,000 24 1,250,000 28 1,580,000 32 1,930,000 Exemplo 10: Cristalografia Proteína CD73:

[00383] A construção da proteína CD73 é baseada em Knapp, K. e outro (2012) Structure 20: 2161-2173 (10.1016/i.str.2012.10.001) e compreende mutações para suportar a produção de proteínas e o comportamento de cristalização. As respectivas mutações são ASN53 ASP, LYS145SER, LYS147SER, ASN311ASP, ASN333ASP, ASN403ASP, LYS478SER, além de conter SER, PRO, ASP, PRO no terminal N após a clivagem com enterocinase. Foi expresso, redobra- do e purificado como descrito em Knapp, K. e outro (2012) Structure 20: 2161 -2173. FAB:

[00384] O fragmento de Fab de um anticorpo anti-CD73 de acordo com a invenção foi obtido por clivagem com enterocinase. Determinação da estrutura cristalina

[00385] As proteínas (fragmento de Fab e CD73) foram complexa- das, purificadas por filtração em gel e concentradas a 21 mg/ml em Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pFH = 8. Os cristais foram obtidos a 20 °C misturando 0,2 µl de uma solução contendo PEG8000 a 12%, MOPS pFH 7,6 0,1 M e acetato de magnésio 0,1 M com solução de proteína 0,2 μI. Cristais em forma de placa cresceram após 3 dias. Os cristais foram transferidos em solução de reservatório suplementada com PEG400 a 25% e congelados em nitrogênio líquido. Os dados de di- fração foram coletados em Swiss Light Source e a estrutura foi resolvi- da por substituição molecular. A construção e o refinamento do modelo resultaram na estrutura de cristal do complexo de Fab CD73:anti-CD73 representado na Fig. 3. Exemplo 11: Formulação farmacêutica para administração i.v.

[00386] Qualquer uma das moléculas de anticorpo acima da inven- ção pode ser selecionada para a fabricação de uma formulação farma- cêutica para aplicação intravenosa tendo uma composição como se- gue: Substância de fármaco: 50 mg/ml Tampão de Histidina: 10 mM, phi 6,0 Sacarose: 220 mM Polissorbato 20: 0,02%

[00387] A composição acima é formulada em uma solução em água para injeção (WFI) tendo a composição acima, esterilizada e armaze- nada de 2 a 8 °C em um frasconete de 10 ml. A composição acima pode ser fornecida opcionalmente como uma formulação liofilizada que deve ser reconstituída em WFI antes do uso. Exemplo 12: Uso farmacêutico em humanos

[00388] As soluções descritas no Exemplo 9 acima são aplicadas em um paciente em necessidade, como um ser humano sofrendo de câncer, por infusão intravenosa (dosagem de 0,05 a 50,0 mg por qui- lograma de peso corporal e dose) a cada duas a quatro semanas.

[00389] De acordo com os Exemplos, vários anticorpos anti-CD73 diferentes da invenção foram preparados. Na tabela a seguir, as se- quências desses anticorpos são fornecidas. A1, A2, A3 e A4 são anti- corpos de murino, respectivamente. B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 e C6 são anticorpos humanizados, respectivamente. As sequências de CDR são fornecidas de acordo com a definição de IMGT como descrito aqui.

[00390] Além disso, as sequências dos anticorpos anti-PD1 da in- venção são fornecidas, as quais são denominadas PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5, respectivamente.

Tabela 9: Sequências de aminoácidos e SEQ ID NOs de CDRs, VH, VL, cadeias leve e pesada dos anticorpos anti-CD73 e anti-PD1 da invenção.

Claims (45)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga especificamente a CD73, caracteri- zado pelo fato de que compreende: (a) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (hcCDRI), SEQ ID NO: 26 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 27 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (IcCDRI), SEQ ID NO: 29 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 30 (lcCDR3); ou, (b) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (hcCDRI), SEQ ID NO: 32 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 33 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (IcCDRI), SEQ ID NO: 35 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 36 (lcCDR3); ou, (c) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 (hcCDRI), SEQ ID NO: 38 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 39 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 (IcCDRI), SEQ ID NO: 41 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 42 (lcCDR3); ou (d) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 (hcCDRI), SEQ ID NO: 44 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 45 (hcCDR3) tem CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46 (IcCDRI), SEQ ID NO: 47 (lcCDR2 ) e SEQ ID NO: 48 (lcCDR3); ou (e) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49 (hcCDRI), SEQ ID NO: 50 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 51 (hcCDR3) e cadeia leve C DRs compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (IcCDRI), SEQ ID NO: 53 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 54 (lcCDR3); ou (f) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 (hcCDRI), SEQ ID NO: 56 (hcCDR2) e

SEQ ID NO: 57 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 58 (IcCDRI), SEQ ID NO: 59 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 60 (lcCDR3); ou (g) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61 (hcCDRI), SEQ ID NO: 62 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 63 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64 (IcCDRI), SEQ ID NO: 65 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 66 (lcCDR3); ou (h) CDRs de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67 (hcCDRI), SEQ ID NO: 68 (hcCDR2) e SEQ ID NO: 69 (hcCDR3) e CDRs de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70 (IcCDRI), SEQ ID NO: 71 (lcCDR2) e SEQ ID NO: 72 (lcCDR3).

2. Molécula de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo humanizado.

3. Molécula de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo monoclonal, Fab, F(ab’)2, Fv ou scFv.

4. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que uma região constante da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consis- te nas regiões constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE.

5. Molécula de anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a região constante da cadeia pesada é lgG1, de preferência lgG1 com uma mutação L234A e/ou L235A.

6. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a região constan- te da cadeia leve é kappa ou lambda.

7. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a referida molé- cula de anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada compre- endendo uma sequência de aminoácido pelo menos 85% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 e 95.

8. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a referida molé- cula de anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada compre- endendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, e 95.

9. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a referida molé- cula de anticorpo tem uma região variável de cadeia leve compreen- dendo uma sequência de aminoácido pelo menos 85% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 96.

10. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ou 96.

11. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada compreenden- do a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 ou 119.

12. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 ou 120.

13. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 82, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 86, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 88, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 90, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 92, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 93 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 94, ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 95 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 96.

14. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 105 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 106, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 107 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 108, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 109 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 110, ou uma cadeia pesada compreendendo o aminoácido sequên- cia da SEQ ID NO: 111 e uma cadeia leve compreendendo a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 112, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 113 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 114, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 115 e uma cadeia leve compreendendo o se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 116, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 117 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 118, ou uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 119 e uma cadeia leve compreendendo a se-

quência de aminoácido de SEQ ID NO: 120.

15. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifi- ca a região variável da cadeia pesada e/ou a região variável da cadeia leve de uma molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende a se- quência de nucleotídeos como definida na reivindicação 15.

17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão, como definido na reivindicação

16.

18. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero.

19. Método de fabricação de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracteri- zado pelo fato de que compreende as etapas de: - cultura de uma célula hospedeira como definida na reivin- dicação 17 ou 18 sob condições que permitem a formação de uma mo- lécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14; e, - recuperar a referida molécula de anticorpo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de purifica- ção adicional e/ou modificação e/ou formulação da referida molécula de anticorpo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, carac- terizado pelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de formular a referida molécula de anticorpo em uma composição farma- cêutica.

22. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que é para uso em medicina.

23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo anti-CD73, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um transportador far- maceuticamente aceitável.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um anta- gonista de PD-1.

25. Kit de peças, caracterizado pelo fato de que compre- ende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um antagonista de PD-1.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 24 ou kit, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti- PDL-1.

27. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 selecionado a partir do grupo consistindo em PDR-001, pembrolizumabe, nivolumabe e pidilizumabe.

28. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PDL-1 selecionado a partir do grupo consistindo em atezolizuma- be, avelumabe ou durvalumabe.

29. Composição ou kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 compreendendo (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 123 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 124; ou (iii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 125 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126; ou (iv) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 127 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128; ou (v) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 129 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130.

30. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais outros agentes terapêuticos.

31. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessi- dade de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anti- corpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

32. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento de câncer.

33. Uso da molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer.

34. Método ou uso de uma molécula de anticorpo, de acor- do com a reivindicação 31 ou 33, ou a molécula de anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antagonista de PD-1.

35. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a molécula de anti- corpo deve ser administrada simultaneamente, concorrentemente, se- quencialmente, sucessivamente, alternativamente ou separadamente, com o antagonista de PD-1.

36. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1.

37. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 selecionado a partir do grupo consistindo em PDR-001, pembrolizumabe, nivolumabe e pidilizumabe.

38. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD- 1 é um anticorpo anti-PDL-1 selecionado a partir do grupo consistindo em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.

39. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD- 1 é uma molécula de anticorpo anti-PD-1 que compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 123 e uma cadeia leve compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 124; ou (iii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 125 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126; ou (iv) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 127 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128; ou (v) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 129 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130.

40. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 39, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer renal, câncer gastrointestinal e câncer de pulmão, de preferên- cia câncer de pulmão de célula não pequena.

41. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, caracterizado pelo fato de que a(s) molécula(s) de anticorpo são administradas em combinação com um ou mais agentes ou procedimentos terapêuticos adicionais.

42. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes ou procedimentos terapêuticos adicionais são selecionados a partir de quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada, um fármaco oncolí- tico, um agente citotóxico, uma terapia imune, uma citocina, um proce- dimento cirúrgico, um procedimento de radiação ou uma imunoterapia celular.

43. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o outro agente tera- pêutico é um antagonista de A2AR, antagonista de CD39, antagonista de LAG-3, antagonista de CTLA-4, antagonista de EGFR ou antago- nista de HER2.

44. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 43, caracterizado pelo fato de que o paciente a ser tratado é selecionado com base na expressão aumentada de CD73.

45. Método, uso ou anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que o paciente a ser tratado foi previamente submetido a tratamento com outro agente de tratamento, em que o referido agente de trata- mento é preferencialmente um antagonista de PD-1, especialmente um PD-1 antagonista selecionado a partir do grupo consistindo em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, aveluma- be, durvalumabe e um anticorpo compreendendo (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122; ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 123 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 124; ou (iii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 125 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126; ou (iv) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 127 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128; ou (v) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 129 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130.