KR20210013135A

KR20210013135A - 길항성 cd73 항체

Info

Publication number: KR20210013135A
Application number: KR1020207036693A
Authority: KR
Inventors: 일름가르트 마리아 리타 호프만; 제니퍼 알버그; 라지쿠마르 가네산; 프리얀카 구프타; 스펜 모스트뵈크; 시몬 플리트; 오트마르 샤프; 치아-훙 차이; 멜라니 부엄; 마르쿠스 제틀; 안드라데 페레이라 브루나 데; 야크 뵈트허
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2018-05-19
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2021-02-03
Also published as: WO2019224025A2; AR115389A1; JP2021522780A; TW202005982A; WO2019224025A3; BR112020017676A2; MX2020012327A; AU2019274626A1; CA3093882A1; CN112166124A; PH12020551907A1; EP3569618A1; EP3797119A2; US11312785B2; US20190352420A1; JP7263388B2; EA202092735A1

Abstract

본 발명은 CD73에 대한 신규한 길항성 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체 분자를 인코딩하는 핵산; 이러한 항체 분자의 제조 방법; 이러한 항체 분자를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 항체 분자를 포함하는 조성물; 및 이러한 항체 분자 또는 이러한 조성물의 용도, 특히, 암 질환 분야에서 치료 목적을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

길항성 CD73 항체

본 출원은 신규한 CD73 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법; 이러한 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 및 이러한 폴리펩타이드 또는 이러한 조성물의 용도, 특히 암 질환 분야에서 치료 목적을 위한 용도에 관한 것이다.

암은 몸 전체에 걸쳐 퍼질 가능성이 있는 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질병이다. 선진국에서, 이것은 두 번째로 가장 흔한 사망 원인이다. 남성에서 가장 흔한 유형의 암은 폐암, 전립선암, 대장암 및 위암이며, 여성에서 가장 흔한 유형은 유방암, 대장암, 폐암 및 자궁 경부암이다. 생존 가능성은 주로 암의 유형과 확인 단계에 좌우되지만, 폐암의 경우에는 전체 10년 생존율이 약 5%이다.

과거에 암을 치료하는 가장 빈번한 수단은 수술, 방사선 치료 또는 화학 요법 약물 사용이었다. 그러나, 최근에는 암 면역 요법이 종양학에 대한 치료 양식으로서 많은 가능성을 제공하는 것으로 나타났다.

암 면역요법은, 종양이 직접 절제되거나 치료되는 기존의 흔한 치료 방법과는 극명히 대조되는, 암을 공격하기 위해 면역계를 활성화하는 종양학의 한 분야이다. 이러한 요법 개념은 T-세포의 면역 기능을 억제하는 역할을 하는 T-세포의 표면 상의 다수의 단백질의 식별에 기초한다. 면역 요법은 이러한 억제 분자를 차단하여 면역계의 활성을 증가 시키거나, 면역 이펙터 세포의 활성화에 관여하는 경로를 자극한다. 이러한 단백질 중에는 CD73 및 PD-1이 열거된다.

엑토-5'-뉴클레오티다아제 (엑토-5'NT, EC 3.1.3.5)로도 또한 공지된 분화 클러스터 73 (Cluster of Differentiation 73: CD73)은 대부분의 조직에서 발견되는 글리코실-포스파티딜이노시톨 (GPI) 연결된 세포 표면 효소이지만, 특히, 내피 세포 및 조혈 세포의 서브 세트에서 발현된다 (문헌 [Resta et al., Immunol Rev 1998; 161:95-109] 및 [Colgan et al., Purinergic Signal 2006; 2:351-60]).

CD73은 AMP를 아데노신 및 무기 페스페이트로 전환하는 암 세포, 간질 세포 및 종양 상주 면역 세포 상에서 발현되는 세포 표면 효소이다. 아데노신은 면역 억제성이며 여러 면역 세포 유형의 기능에 영향을 미치는 능력을 갖는다. 아데노신은 조절 T 세포, MDSC 및 M2 대식 세포와 같은 면역 억제 세포에 대해 활성 효과를 가지며, 수지상 세포, 이펙터 T 세포 및 NK 세포와 같은 이펙터 세포에 대해 억제 효과를 갖는다. 중화 CD73 항체는 효소 활성을 차단하고/하거나 CD73 세포 표면 수준을 감소시킴으로써 CD73의 기능을 억제할 수 있다. 이것은 면역 억제 아데노신의 감소를 초래하므로 T 세포 활성의 증가를 초래한다.

CD73 및 면역 체크 포인트 - PD1 및 잠재적으로는 다른 것들 포함 - 의 이중 차단은 T 세포 기능성을 추가로 복원시켜 PD1 단일 요법과 비교하여 암 환자에서 개선된 목적 반응 및 전체 생존의 연장을 초래할 수 있다.

CD73은 결장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 방광암, 백혈병, 신경교종, 교모세포종, 흑색종, 갑상선암, 식도암, 전립선암 및 유방암을 비롯하여 다수의 다양한 암에서 발현되는 것으로 보고되었다 (문헌 [Jin et al., Cancer Res 2010; 70:2245-55] 및 [Stagg et al., PNAS 2010; 107:1547-52]). 또한, 암에서의 CD73 발현은 다수의 종양 징후, 특히, 위장, 유방 및 NSCLC 종양에서 보다 짧은 전체 생존과 상관 관계가 있었다 (문헌 [Wang et al., Prognostic value of CD73-adenosinergic pathway in solid tumor: A meta-analysis and systematic review, Oncotarget 2017]; [Inoue et al., Prognostic impact of CD73 and A2A adenosine receptor expression in non-small-cell lung cancer, Oncotarget 2017]). CD73 활성은 또한 유두 갑상선 암종에서 예후 마커로서 제안되었다. 면역 억제 아데노신을 생성함으로써, CD73은 면역 세포에 대해 광범위한 기능을 가지며 종양 내에 면역 억제 미세 환경을 생성한다. 아데노신은 증식, 세포독성 및 사이토카인 생성과 같은 T 세포 반응을 강력하게 억제한다. 또한, 아데노신은 수지상 세포의 분화를 변화시키므로 T 세포 반응을 손상시킨다. 아데노신은 또한 NK 세포에 작용하여 세포독성 기능의 억제를 초래한다. 또한, 아데노신은 면역 억제 세포 유형에 대한 자극 역할을 한다. 아데노신은 면역 억제 MDSC의 확장 및 대식 세포의 억제 M2 표현형으로의 분화를 유도한다. (문헌 [Antonioli et al., Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews Cancer 2013]; [Beavis et al., CD73: A potent suppressor of antitumor immune responses, Trends in Immunology, 2012]). 면역 세포에 대한 이의 영향에 추가하여, CD73은 혈관 형성 뿐만 아니라 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용의 조절에도 역할을 할 수 있다. 아데노신은 또한 암 세포에 직접 작용하며 세포 성장 뿐만 아니라 아폽토시스를 조절할 수 있고, 내약성과 연루되어 있다 (문헌 [Hunsucker et al., Pharmacol Ther 2005; 1:1-30]). 따라서, CD73은 암 진행을 직접 및 간접적으로 조절할 수 있으며, 이는 신규한 치료학적 표적으로서 이의 가능성을 강조한다. 알라드 등 (Allard et al)은 CD73의 표적화가 항-PD-1 및 항-CTLA-4 mAb의 항종양 활성을 증진시킨다고 보고하였다 (문헌 [Clin Cancer Res 2013; 19:5626]).

동일한 경로를 표적화하는 다른 제제로는 A2AR 길항제가 포함된다. 그러나, 아데노신 수용체 중복성으로 인해, A2AR 길항제는 CD73 억제제에 비해 아데노신 매개성 활성을 완전히 예방하지 못할 수 있는 것으로 예상될 수 있다.

비-가수 분해성 ADP-유사체 아데노신 5'-(알파,베타-메틸렌) 디포스페이트 (APCP)는 CD73 효소 활성의 억제제이며 상업적으로 이용 가능하다. AB421은 Arcus Biosciences에서 개발한 소분자 CD73 억제제이다.

국제공개공보 WO 2016/075099는 MEDI9447 항체를 비롯하여 항-CD73 결합 분자, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 개시하고 있다. MEDI9447은 CD73의 효소 활성을 억제하여 아데노신 모노포스페이트 (adenosine monophosphate: AMP)를 가수 분해하고 CD73의 내재화를 유도함으로써 CD73 기능을 감소시킨다.

국제공개공보 WO 2016/081748은 BMS 986179 항체를 비롯하여 사람 CD73의 효소 활성을 억제하는 항체 및 CD73을 세포 내로 내재화하는 항체를 개시하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 여러 암 질환의 치료에 사용될 수 있는 개선된 약리학적 활성제를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 당해 분야에서 현재 사용되고/사용되거나 공지되어 있는 약리학적 활성제, 조성물 및/또는 치료 방법과 비교하여 특정 이점을 제공하는 약리학적 활성제, 조성물 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점들은 특히 당해 분야에 이미 공지되어 있는 후보 약물과 비교하여 생체내 효능, 개선된 치료학적 및 약리학적 특성, 부작용 감소 및 다른 유리한 특성, 예를 들어, 개선된 제조 용이성 또는 제품 비용의 절감을 포함한다.

발명의 간단한 개요

제1 양태에 따르면, 항-CD73 항체 분자가 제공된다. 본 출원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-CD73 항체 분자는 다른 항-CD73 항체에 비해 놀랍고 유리한 특성을 갖는다. 예를 들어, 이들은 AMP 매개성 T 세포 억제를 초래하는 개선된 능력을 나타낸다 (예를 들어, 보다 높은 T 세포 증식 수준과 보다 강력한 IFNγ 분비 유도에 의해 입증된 바와 같음). IFNγ는 T 세포에 의해 매개되는 항종양 반응에 대해 중요한 인자인 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Tannenbaum, C., and Hamilton, T. Immune-inflammatory mechanisms in IFNγ-mediated anti-tumor activity, Seminars in Cancer Biology, 2000]). 또한, 본 출원에서 기재된 항-CD73 항체는 종래 기술의 항-CD73 항체와 비교하여 CD73의 개선된 억제를 나타낸다. 본 발명의 항체는 세포 결합 CD73 뿐만 아니라 세포 비결합 CD73도 동일하게 잘 억제한다. 본 발명의 항-CD73 항체는 기준 항-CD73 항체와 비교하여 아데노신 생성의 개선된 억제를 나타낸다. 또한, 이들은 사람 CD73에 대한 높은 친화성을 갖고 있다.

상기 항-CD73 항체 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 제조 방법도 또한 제공된다. 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물도 또한 제공된다. 본 출원에서 개시된 항-CD73 항체 분자는 고형 및 연조직 종양을 비롯하여 암성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 본 발명의 항-CD73 항체 분자는 하기를 포함한다:

(a) 서열 번호 25 (hcCDR1), 서열 번호 26 (hcCDR2) 및 서열 번호 27 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 28 (lcCDR1), 서열 번호 29 (lcCDR2) 및 서열 번호 30 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(b) 서열 번호 31 (hcCDR1), 서열 번호 32 (hcCDR2) 및 서열 번호 33 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 34 (lcCDR1), 서열 번호 35 (lcCDR2) 및 서열 번호 36 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(c) 서열 번호 37 (hcCDR1), 서열 번호 38 (hcCDR2) 및 서열 번호 39 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 40 (lcCDR1), 서열 번호 41 (lcCDR2) 및 서열 번호 42 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(d) 서열 번호 43 (hcCDR1), 서열 번호 44 (hcCDR2) 및 서열 번호 45 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 46 (lcCDR1), 서열 번호 47 (lcCDR2) 및 서열 번호 48 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(e) 서열 번호 49 (hcCDR1), 서열 번호 50 (hcCDR2) 및 서열 번호 51 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 52 (lcCDR1), 서열 번호 53 (lcCDR2) 및 서열 번호 54 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(f) 서열 번호 55 (hcCDR1), 서열 번호 56 (hcCDR2) 및 서열 번호 57 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 58 (lcCDR1), 서열 번호 59 (lcCDR2) 및 서열 번호 60 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(g) 서열 번호 61 (hcCDR1), 서열 번호 62 (hcCDR2) 및 서열 번호 63 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 64 (lcCDR1), 서열 번호 65 (lcCDR2) 및 서열 번호 66 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(h) 서열 번호 67 (hcCDR1), 서열 번호 68 (hcCDR2) 및 서열 번호 69 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 70 (lcCDR1), 서열 번호 71 (lcCDR2) 및 서열 번호 72 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR.

본 발명의 추가의 실시 형태에 따르면, 암 치료 방법도 또한 제공된다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명의 항-CD73 항체 분자는 제2 치료제, 예를 들어, PD-1 길항제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 치료제, 예를 들어, PD-1 길항제는 상기 항-CD73 항체 분자와 동시에 (simultaneously), 동시에 (concurrently), 순차적으로, 연속적으로, 교대로 또는 개별적으로 투여되어야 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PDR-001, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PDL-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체이다.

본 발명의 이러한 양태의 추가의 실시 형태는 본 발명의 항체 분자의 상기 사용이 제3 치료제와 조합될 수 있는 경우를 포함한다.

본 발명의 항체 분자를 포함하는 추가의 양태, 실시 형태, 용도 및 방법은 하기의 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암, NSCLC), 다양한 위장암 (예를 들어, 결장 암종, 위암, 간 세포 암종) 및 신장암 (예를 들어, 투명 세포 암종과 같은 신 세포 암)을 비롯하여 여러 암 유형의 보다 효율적인 치료를 가능하게 하는 신규한 항체 분자를 제공한다.

도 1: 수지상 세포/T 세포 공동 배양. 데이터 (실시예 7에서 추가로 기재된 바와 같음)는 AMP가 수지상 세포/T 세포 공동 배양 분석에서 항-PD1 반응을 억제하고, 항-CD73 항체 처리가 이러한 AMP 매개성 억제의 역전을 초래하는 것을 예시한다.
도 2: 항-CD73 항체 및 CD73의 복합체 형성. CD73 및 2개의 항-CD73 항체의 복합체의 올리고머 상태의 평가가 묘사되어 있다 (실시예 9에서 기재된 바와 같음). 본 발명에 따른 항-CD73 항체 분자는 정의된 크기를 갖는 가용성 CD73과 항원-항체 복합체, 예를 들어, 2:2 올리고머를 형성한다. 이러한 복합체는 "MEDI9447"과 같은 당해 분야에 공지된 다른 CD73 항체에 의해 형성된 복합체와 비교하여 보다 작다.
도 3: 항-CD73 항체의 결정 구조 - CD73 결정
(a) 본 발명의 항-CD73 항체의 Fab 단편의 CD73 상의 이의 입체 형태 에피토프에 대한 결합이 묘사되어 있다. 본 발명의 항-CD73 항체의 Fab 단편에 의해 접촉되고/되거나 특이적으로 결합되는 잔기는 흑색으로 묘사되고, Fab 단편의 V_H는 짙은 회색으로, V_L은 옅은 회색으로 채색되며, (b) 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합된 (A)에서 흑색으로 나타낸 입체 형태 에피토프의 확대; 입체 형태 에피토프에 포함되는 CD73의 아미노산 잔기는 3 문자 아미노산 코드를 사용하여 라벨링되며; (c) (A)에서 묘사된 입체 형태에 접촉되고/되거나 특이적으로 결합하는 (A)에서 나타낸 본 발명의 항체의 Fab 단편의 파라토프에 기여하는 본 발명의 항체의 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)의 아미노산 잔기; CD73 상의 입체 형태 에피토프에 접촉되고/되거나 특이적으로 결합하는 아미노산 잔기는 중쇄 및 경쇄 아미노산 잔기를 나타내는 (H) 및 (L)과 함께 3 문자 아미노산 코드를 사용하여 라벨링된다.
도 4: 사람 T 세포 분석에서 IFNγ 방출
자극된 1차 사람 T 세포를 다양한 aCD73 항체 농도로 처리한 다음 AMP를 첨가하였다. 증식 유도 및 IFNγ의 방출을 측정하였다. 분석을 실시예 6에서 개략적으로 서술된 바와 같이 수행하였다.

정의

본 발명의 상기 및 다른 양태 및 실시 형태는 본 출원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.

달리 명시되거나 정의되지 않는다면, 사용되는 모든 용어는 통상의 기술자에게 명백한 당해 분야의 일반적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)] 및 [Roitt et al., "Immunology" (2^nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)] 뿐만 아니라, 본 출원에서 인용된 일반적인 배경 기술을 참조한다. 또한, 달리 명시되지 않는다면, 상세하게 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있으며 수행되었다. 예를 들어, 표준 핸드북, 상기에서 언급된 일반적인 배경 기술 및 거기서 인용된 추가의 참고 문헌을 다시 참조한다.

본 출원에서 사용되는 단수형 관사 ("a" 및 "an")는 해당 관사의 하나 또는 하나 이상 (예를 들어, 적어도 하나)의 문법적 목적어를 지칭한다. 본 출원에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어 및 "포함한다" 및 "포함한다"와 같은 이의 변형은 각각 "함유하는" 또는 "포함하는" 또는 "갖는" 또는 "갖는다"라는 용어로 대체 될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다.

"항체 분자" 또는 "항체" (본 출원에서 동의어로 사용됨)는 척추 동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견될 수 있는 감마 글로불린 단백질이며, 세균 및 바이러스와 같은 외래 물체를 식별하고 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용된다. 이들은 전형적으로, 예를 들어, 하나의 단위를 갖는 단량체, 2개의 단위를 갖는 이량체, 또는 5개의 단위를 갖는 오량체를 형성하기 위해 기본 구조 단위 - 각각은 2개의 큰 중쇄 및 2개의 작은 경쇄를 가짐 - 로 만들어진다. 항체 분자는, 비공유 상호 작용에 의해, 항원으로서 공지된 다른 분자 또는 구조체에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 항체 분자가 높은 친화성으로 특정 구조에만 결합한다는 의미에서 특이적이다. 항체 분자에 의해 인식되는 항원의 독특한 부분은 에피토프 또는 항원 결정 인자라고 호칭된다. 에피토프에 결합하는 항체 분자의 부분은 가끔 항원과 특이적인 상호 작용을 하도록 하는 항체 구조 내의 분자 결정 인자인 파라토프; 및 CDR로 구성된 소위 가변 도메인 또는 항체의 가변 영역 (Fv)이라고 호칭된다. 파라토프는 주어진 항체의 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄와 경쇄 둘 다의 CDR을 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있다. 가변 도메인은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 이격된 3개의 소위 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

"상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어는, 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는, 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속 서열을 지칭하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 세 (3) 개의 CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 세 (3) 개의 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다.

주어진 CDR의 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ("Kabat" numbering scheme)], [Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948] ("초티아" 번호 지정 체계), [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745] ("접촉" 번호 지정 체계), [Lefranc M P et al., "IMGT　unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55-77] ("IMGT" 또는 "CCG" 번호 지정 체계 및 [Honegger A and Pltickthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70] (AHo　번호 지정 체계)에 기재된 것들을 비롯하여 공지된 다수의 방식 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.

주어진 CDR의 경계는 명명 규칙에 따라 달라질 수 있다. CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는, 예를 들어, Kabat의 번호 지정 체계에 따라 정의될 수 있으며, 여기서, VH 프레임워크 영역 (framework region: FR) 및 CDR은 다음과 같이 위치한다: 잔기 1~30 (FR1), 31~35 (CDR1), 36~49 (FR2), 50~65 (CDR2), 66~94 (FR3), 95~102 (CDR3) 및 103~113 (FR4). 또한, Kabat의 번호 지정 체계에 따르면, VL FR 및 CDR은 다음과 같이 위치한다: 잔기 1~23 (FR1), 24~34 (CDR1), 35~49 (FR2), 50~56 (CDR2), 57~88 (FR3), 89~97 (CDR3) 및 98~107 (FR4).

대안으로, IMGT 또는 CCG 고유 번호 지정은 항원 수용체, 쇄 유형 또는 종에 관계 없이 가변 도메인을 비교하기 위해 정의되었다 (문헌 [Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]). IMGT 고유 번호 지정에서, 보존된 아미노산은 항상 동일한 위치, 예를 들어, 시스테인 23 (1st-CYS), 트립토판 41 (CONSERVED-TRP), 소수성 아미노산 89, 시스테인 104 (2nd-CYS), 페닐알라닌 또는 트립토판 118 (J-PHE 또는 J-TRP)을 갖는다. IMGT 고유 번호 지정은 프레임워크 영역 (FR1-IMGT: 위치 1 내지 26, FR2-IMGT: 39 내지 55, FR3-IMGT: 66 내지 104, 및 FR4-IMGT: 118 내지 128) 및 상보성 결정 영역: CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2-IMGT: 56 내지 65, 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117의 표준화 경계를 제공한다.

본 발명의 맥락 내에서, CDR에 대한 언급은 CCG/IMGT 규약의 정의를 기반으로 하지만, 본 개시 내용은 임의의 하나의 번호 지정 체계에 의해 정의되는 FR 및 CDR에 제한되지 않고, 상기에서 논의된 것들을 비롯하여 모든 번호 지정 체계를 포함한다.

따라서, 달리 명시되지 않는다면, 주어진 항체 또는 이의 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역", 예를 들어, 상기 항체 또는 이의 영역의 가변 영역 및 개별 CDR (예를 들어, "CDR-H1, CDR-H2) 및 프레임워크 영역이라는 용어는 본 출원에 상기에서 기재된 임의의 공지된 방식에 의해 정의된 바와 같은 각각의 영역 (예를 들어, 상보성 결정 영역)을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에서, Kabat, Chothia, IMGT, AHO, 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 정의되는 CDR과 같은 특별한 CDR 또는 CDR들의 확인 방식이 명시되어 있다. 다른 경우에서, CDR의 특별한 아미노산 서열이 제공된다.

일부 실시 형태에서, 항체 분자는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고; 특히, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 (예를 들어, 사람) 중쇄 불변 영역으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 항체 분자는, 예를 들어, 카파 또는 람다의 (예를 들어, 사람) 경쇄 불변 영역으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 갖는다. 불변 영역은 항체의 특성을 변경하기 위해 (예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 및/또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키기 위해) 변경, 예를 들어, 돌연변이될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이펙터 기능을 가지며 보체를 고정할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 항체는 이펙터 세포를 동원하거나 보체를 고정하지 않는다. 특정 실시 형태에서, 항체는 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소되거나 없다. 예를 들어, 항체는 Fc 수용체에 대한 결합을 지원하지 않는 이소 타입 또는 서브 타입, 단편 또는 다른 돌연변이체일 수 있으며, 예를 들어, Fc 수용체 결합 영역이 돌연변이되거나 결실되어 있다.

항체 불변 영역은 일부 실시 형태에서 변경된다. 항체 불변 영역의 변경 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 기능이 변경된, 예를 들어, 이펙터 리간드, 예를 들어, 세포 상의 FcR, 또는 보체의 C1 성분에 대한 친화성이 변경된 항체는 항체의 불변 부분 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 교체함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 유럽 특허 EP 388,151 A1, 미국 특허 US 5,624,821 및 US 5,648,260 참조). 쥐과 동물 또는 다른 종의 면역글로불린에 적용되는 경우에는 이러한 기능들을 감소시키거나 제거하는 유사한 유형의 변경이 기술될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 항체는 본 출원에 기재된 예시적인 항체의 실제 번호 지정에서 위치 L232A 및 L233A에 상응하는 L234A 및/또는 L235A 돌연변이 (Kabat 명명법)를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 IgG1이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 특정 발현 시스템 (예를 들어, 특정 벡터 또는 숙주 세포)을 사용하여 발현되거나, 봉입체로서 또는 가용성 형태로 발현되거나, 매질 또는 원형질막 주위 공간으로 분비되거나, 세포 내에 함유되거나, 보다 균질한 생성물을 생산하도록 분자를 최적화하기 위해서 변형된 N-말단 서열, 예를 들어, 하나 이상의 N-말단 아미노산의 결실, 또는, 예를 들어, 제1 N-말단 아미노산 (예를 들어, 글루타메이트를 알라닌으로)의 교환을 가질 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드의 면역원성을 추가로 감소시키거나 안정성을 추가로 증가시키기 위해, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2012/175741, WO 2011/075861 또는 WO 2013/024059에서 설명된 바와 같이, 임의의 프레임워크 영역 내의 다른 정의된 위치에서 또는 C-말단 부분 내에 추가의 알라닌 및/또는 추가의 아미노산 교환 또는 결실과 같은 변형된 C-말단 서열을 가질 수 있다.

본 출원에서 상호 교환적으로 사용되는 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는, 당해 분야 및 이하에서 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"로서; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"로서; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"으로서; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 지칭되는 4개의 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 이루어지는 항체 분자의 영역을 의미하며; 상기 프레임워크 영역은 당해 분야 및 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로서; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로서; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로서 각각 지칭되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단되어 있다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 나타낼 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 이것은 항원 결합 부위를 가짐으로써 항원에 대한 특이성을 항체에 부여하는 면역글로불린 가변 도메인(들)이다.

"가변 중쇄 (또는 VH)" 및 "가변 경쇄 (또는 VL)"이라는 용어는 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄로부터의 가변 도메인을 각각 지칭한다.

따라서, 중쇄 (HC)의 CDR은 "HCDR"로 명명되고, 경쇄 (LC)의 CDR은 "LCDR"로 각각 명명된다.

당해 분야는 항체 분자를 추가로 개발하여 의학 및 기술에서 이를 다목적 도구로 만들었다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "항체 분자" 또는 "항체"라는 용어는, 예를 들어, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는, 자연에서 발견될 수 있는 바와 같은 항체를 포함할 뿐만 아니라, 항원에 대한 결합 특이성 및 항체 분자의 가변 도메인에 대한 구조적 유사성을 갖는 적어도 하나의 파라토프를 포함하는 모든 분자를 포괄한다.

따라서, 본 발명에 따른 항체 분자로는 단클론 항체, 사람 항체 또는 사람화 항체가 포함된다.

키메라 항체, 항체의 단편, 특히, Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂ 단편, 단일 쇄 항체, 특히, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 소형 모듈식 면역 약물 (small modular immunopharmaceutical: SMIP), 도메인 항체, 나노바디, 디아바디도 또한 고려된다.

단클론 항체 (mAb)는 아미노산 서열이 동일한 단일 특이적 항체이다. 이들은 특이적 항체 생산 B 세포와 골수종 (B 세포 암) 세포의 융합 클론을 나타내는 하이브리드 세포주 (하이브리도마라고 호칭됨)로부터 하이브리도마 기술에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7]). 대안으로, 단클론 항체는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells", J Immunol Methods 204 (1): 77-87]). "재조합 항체"는 재조합으로 조작된 숙주 세포에 의해 생산된 항체이다. 이것은 임의로 단리되거나 정제된다.

사람에게 적용하는 경우, 마우스와 같은 다른 종으로부터 최초로 유래된 항체의 면역원성을 감소시키는 것이 종종 바람직하다. 이것은 키메라 항체의 작제에 의해 또는 "사람화"라고 호칭되는 과정에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 맥락에서, "키메라 항체"는 한 종 (예를 들어, 사람)으로부터 유래된 서열 부분 (예를 들어, 불변 도메인)에 융합된 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터 유래된 서열 부분 (예를 들어, 가변 도메인)을 포함하는 항체인 것으로 이해된다. "사람화 항체"는 비-사람 종으로부터 최초로 유래된 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 특정 아미노산들은 가변 도메인의 전체 서열이 사람 가변 도메인의 서열과 보다 가깝게 유사하도록 돌연변이되어 있다. 항체의 키메라화 및 사람화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 (문헌 [Billetta R, Lobuglio AF. “Chimeric antibodies”. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76]; [Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323]).

"사람화" 항체는 비-사람 초가변 영역 (hypervariable region: HVR) 유래의 아미노산 잔기 및 사람 FR 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 사람화 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, 상보성 결정 영역 (CDR))은 비-사람 항체의 것들에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역 (FR)은 사람 항체 서열의 것들에 상응한다. 사람화 항체는 임의로 사람 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "사람화 형태", 예를 들어, 비-사람 항체는 사람화를 거친 항체를 지칭한다.

또한, 사람 게놈으로부터 유래된 서열을 기반으로, 예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 또는 형질 전환 동물의 사용에 의해, 항체를 생성하기 위한 기술이 개발되었다 (국제공개공보 WO 90/05144; 문헌 [D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597]; [Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000]; [S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203]; [Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93]; [Bruggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8]). 이러한 항체는 본 발명의 맥락에서 "사람 항체"이다.

항원 결합 특성을 보유하는 분자의 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂ 단편도 또한 고려된다. 이와 같은 단편은 항체 분자의 단편화에 의해, 예를 들어, 단백질 가수분해성 분해에 의해, 또는 이러한 단편의 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자 분해는 일상적인 기술의 수단에 의해, 예를 들어, 파파인 또는 펩신을 사용하여 달성될 수 있다 (국제공개공보 WO　94/29348). 항체의 파파인 분해는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 소위 Fab 단편과 나머지 Fc 단편을 생성한다. 펩신 처리는 F(ab')₂를 생성한다. Fab 분자에서, 가변 도메인은 각각 바람직하게는 사람 기원의 면역글로불린 불변 도메인에 융합된다. 따라서, 중쇄 가변 도메인은 CH₁ 도메인 (소위 Fd 단편)에 융합될 수 있으며, 경쇄 가변 도메인은 CL 도메인에 융합될 수 있다. Fab 분자는 숙주 세포에서 각각의 핵산의 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다 (하기 참조).

항체 분자의 가변 도메인 또는 이러한 가변 도메인으로부터 유래된 분자를 상이한 분자 환경에 도입하기 위한 다수의 기술이 개발되었다. 일반적으로, 이러한 항체 분자들은 자연 항체 분자와 비교하여 크기가 작으며, 단일 아미노산 쇄 또는 여러 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편 (scFv)은 짧은 링커, 보통 세린 (S) 또는 글리신 (G)과 함께 연결된, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 융합체이다 (국제공개공보 WO 88/01649; WO 91/17271; 문헌 [Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195-217]). "단일 도메인 항체" 또는 "나노바디"는 단일 Ig 유사 도메인 내에 항원 결합 부위를 갖는다 (국제공개공보 WO 94/04678; WO 03/050531, 문헌 [Ward et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6]; [Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005]). 동일하거나 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 단일 도메인 항체는 함께 연결될 수 있다. 디아바디는 2개의 가변 도메인을 포함하는 2개의 아미노산 쇄로 이루어진 2가 항체 분자이다 (국제공개공보 WO 94/13804, 문헌 [Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8]). 항체 유사 분자의 다른 예로는 면역글로불린 수퍼 패밀리 (superfamily) 항체가 있다 (IgSF; 문헌 [Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96]). 상이한 개념은 불변 도메인 CH1이 결여된 이펙터 도메인 및 단일 쇄 힌지에 연결된 Fv 도메인을 포함하는 소위 소형 모듈식 면역 약물 (SMIP)로 이어진다 (국제공개공보 WO　02/056910).

항체 분자는 항체 분자의 특성에 목적하는 영향을 미치는 다른 분자 엔터티 (entity)에 (융합 단백질로서) 융합되거나 (공유 또는 비공유 결합에 의해) 연결될 수 있다. 예를 들어, 특히 단일 쇄 항체 또는 도메인 항체의 경우에, 예를 들어, 혈액과 같은 체액에서 항체 분자의 약동학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 특히, 순환에서 이러한 항체 분자들의 반감기를 연장하기 위한 다수의 기술, 예를 들어, 페길화 (국제공개공보 WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004/081026), 항체 분자를 알부민과 같은 혈청 단백질에 대한 친화성을 갖는 또 다른 항체 분자에 융합시키거나 공유적으로 부착시키는 것 (국제공개공보 WO 2004/041865; WO 2004/003019), 또는 항체 분자를 알부민 또는 트랜스페린과 같은 혈청 단백질의 전부 또는 일부와의 융합 단백질로서 발현시키는 것 (WO 01/79258)이 개발되었다.

상호 교환적으로 사용될 수 있는 "에피토프" 및 "항원 결정 인자"라는 용어는 본 발명의 항체 분자와 같은 항원 결합 분자에 의해, 보다 특히, 상기 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되는 거대 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부를 지칭한다. 에피토프는 항체 분자에 대한 최소 결합 부위를 정의하므로, 항체 분자의 특이성의 표적을 나타낸다. 에피토프는 구조적 에피토프 또는 기능적 에피토프로 추가로 정의될 수 있다. "구조적 에피토프"는 일반적으로 구조에 의해 드러나는 항체와 밀접하게 접촉하는 영역 내의 아미노산 또는 기타 분자로 이루어진다. "기능적 에피토프"는 이들이 변경될 때 결합 친화성이 감소되도록 결합에 에너지적으로 기여하는 분자의 부분으로서 정의된다. 따라서, 파라토프와 접촉하는 잔기 및 친화성에 기여하는 임의의 잔기는 이들이 근접한지 여부와 관계 없이 에피토프를 정의할 때 중요한 고려 사항이 아니다. X선 결정학은 항체와 이의 항원 사이의 정확한 상호 작용 부위를 결정하는 하나의 방법이다. 결정 구조는 에피토프와 파라토프 둘 다에서 두 측쇄 유래의 개별 아미노산과 주쇄 원자 사이의 주요 상호 작용의 정확한 결정을 가능하게 한다. 서로 4.5 옹스트롬 이내에 있는 아미노산은 일반적으로 접촉 잔기인 것으로 간주된다.

특정 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프에) "결합할 수 있는", "에 결합할 수 있는", "특이적으로 결합할 수 있는" 또는 "에 특이적으로 결합할 수 있는", "에 대한 친화성을 갖는" 및/또는 "에 대한 특이성을 갖는" 항체 분자는 상기 에피토프, 항원 또는 단백질"에 대한" 또는 "에 관한" 것으로 말해지거나, 이러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합" 분자이다.

일반적으로, "특이성"이라는 용어는, 특별한 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인)이 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 에피토프의 수를 지칭한다. 항원 결합 단백질의 특이성은 이의 친화성 및/또는 결합 활성 (avidity)에 기초하여 결정될 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질의 해리에 대한 평형 상수 (K_D)로 나타낸 친화성은, 항원 결합 단백질 상의 에피토프와 항원 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다: K_D 값이 작을수록, 에피토프와 항원 결합 분자 사이의 결합 강도는 강해진다 (대안으로, 친화성은 또한 1/K_D인 친화 상수 (K_A)로서 표현될 수 있다). 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이 (예를 들어, 본 출원의 추가의 개시 내용에 기초함), 친화성은 관심 대상의 특정 항원에 따라 공지된 방식 자체로 결정될 수 있다. 결합 활성은 항원 결합 분자 (예를 들어, 본 발명의 항체)와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합 활성은 항원 결합 분자 상의 에피토프와 이의 항원 결합 부위 사이의 친화성과, 항원 결합 분자 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 둘 다와 관련이 있다.

전형적으로, 항원 결합 단백질 (예를 들어, 본 발명의 항체 분자)은 10E-5 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게는 10E-7 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 보다 바람직하게는 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 보다 더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 해리 상수 (K_D) (예를 들어, 키넥사 (Kinexa) 분석으로 측정될 때; 당해 분야에 공지되어 있음)로 및/또는 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게는 적어도 10E8 ME-1, 보다 바람직하게는 적어도 10E9 ME-1, 예를 들어, 적어도 10E11 ME-1의 결합 상수 (K_A)로 결합될 것이다. 10E-4 M 초과의 모든 K_D 값은 일반적으로 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들어, 500 pM 미만의 K_D로 목적하는 항원에 결합할 것이다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 분석, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR), 스캐차드 분석 (Scatchard analysis) 및/또는 경쟁 결합 분석, 예를 들어, 방사선 면역 분석 (radioimmunoassay: RIA), 효소 면역 분석 (enzyme immunoassay: EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석을 비롯하여 임의의 공지된 적합한 방식 자체 및 당해 분야에서 공지된 이의 상이한 변형법 자체로 측정될 수 있다.

항체 분자의 결합 친화성은 친화성 성숙으로서 공지된 방법 (문헌 [Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783]; [Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; [Shier et al., 1995, Gene 169:147-155])에 의해 증진될 수 있다. 따라서, 친화성 성숙 항체도 또한 본 발명에 포함된다.

예를 들어, 본 발명의 항체의 친화성 성숙은 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 도입된 하나 이상의 아미노산의 변경을 초래할 수 있으며, 이는 에피토프에 대한 항체의 특이성을 변화시키지 않고 항원에 대한 결합 친화성의 개선을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태는, 예를 들어, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77; 서열 번호 79; 서열 번호 81; 서열 번호 83; 서열 번호 85; 서열 번호 87; 서열 번호 89; 서열 번호 91; 서열 번호 93; 서열 번호 95와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 친화성 성숙 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 상기에서 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함 할 수 있으며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환, 또는 비보존적 아미노산 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 아미노산 치환을 포함하는 상기에서 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역일 수 있고, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 또한 치환, 내부 결실을 비롯한 결실, 융합 단백질을 생성하는 부가를 비롯한 부가, 또는 아미노산 서열 내 및/또는 이에 인접한 아미노산 잔기의 보존적 치환을 포함할 수 있지만 (변화가 기능적으로 동등한 항-CD73 항체를 생성한다는 점에서) 어떠한 기능적 변화도 초래하지 않는 ("침묵") 본 발명에 따른 항체 서열 내의 돌연변이를 고려한다. 이러한 변화는, 예를 들어, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함되고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 또한, 글리신 및 프롤린은 쇄 방향에 영향을 줄 수 있는 잔기이다. 비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반한다.

하나의 예에서, 본 발명은 증진된 이펙터 기능을 갖는 항-CD73 항체 뿐만 아니라, 변경된 결합 특성; 예를 들어, 변경된 결합 상수 k_ON, 해리 상수 k_OFF 및/또는 평형 상수 또는 결합 친화성 K_D을 나타내는 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 이의 변경된/돌연변이체 유도체에 관한 것이다.

본 출원에서 개시된 조성물 및 방법은 명시된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어, 명시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열의 맥락에서, "실질적으로 동일한"이라는 용어는, i) 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능적 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열 내의 정렬된 아미노산 잔기와 동일하거나 ii) 이러한 정렬된 아미노산 잔기의 보존적 치환인 충분하거나 최소 수의 아미노산 잔기를 포함하는 제1 아미노산을 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다. 예를 들어, 기준 서열, 예를 들어, 본 출원에서 제공된 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 공통 구조적 도메인을 포함하는 아미노산 서열. 뉴클레오타이드 서열의 맥락에서, "실질적으로 동일한"이하는 용어는, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열이 공통 기능적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하거나 공통 구조적 폴리펩타이드 도메인 및/또는 공통 기능적 폴리펩타이드 활성을 인코딩하도록 제2 핵산 서열 내의 정렬된 뉴클레오타이드와 동일한 충분하거나 최소 수의 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산 서열을 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다. 예를 들어, 기준 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, "동일한" 또는 "% 동일성"이라는 용어는, 최대 대응을 위해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. % 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭을 도입할 수 있다). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열들 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # (예를 들어, 중첩 위치)×100). 일부 실시 형태에서, 비교되는 2개의 서열들은, 적절한 경우, 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다 (예를 들어, 비교되는 서열을 초과하여 연장되는 추가의 서열 제외). 예를 들어, 가변 영역 서열을 비교할 때, 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열 사이의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 두 서열 (예를 들어, 각 서열의 CDR-H1)에서 동일한 위치의 CDR을 지칭한다.

2개의 서열들 사이의 % 동일성 또는 % 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이 있으며, 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 관심 대상 단백질을 인코딩하는 핵산에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 관심 대상 단백질과 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST는 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자들 사이의 원연 관계 (Id.)를 탐지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]; 및 [FASTA described in Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM을 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 민감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup = 2인 경우, 정렬된 잔기 쌍을 살펴봄으로써 비교되는 2개의 서열 내의 유사한 영역을 발견하며; ktup = 1인 경우, 단일 정렬된 아미노산을 검사한다. ktup은 단백질 서열에 대해 2 또는 1, DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup이 명시되지 않는 경우, 디폴트는 단백질에 대해 2, DNA에 대해 6이다. 대안으로, 문헌 [Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에서 기재된 바와 같은 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 단백질 서열 정렬을 수행할 수 있다.

아미노산 잔기는 당해 분야에 일반적으로 공지되고 동의된 바와 같은 표준 3 문자 또는 1 문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다. 2개의 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"라는 용어는 제2 서열과 비교하여 기준 서열의 위치에서 표시된 수의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 치환(들)의 경우, 이러한 치환(들)은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(들)일 것이며, 이러한 보존적 아미노산 치환(들)은 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 또는 본질적으로 어떠한 영향도 미치지 않는 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 이러한 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 1998/49185로부터 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 여기서, 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 다음 그룹 (i) 내지 (v) 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다: (i) 소형 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ii) 극성의 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (iii) 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (iv) 대형 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (v) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 다음과 같다: Ala을 Gly으로 또는 Ser으로; Arg을 Lys으로; Asn를 Gln으로 또는 His으로; Asp를 Glu으로; Cys을 Ser으로; Gln을 Asn으로; Glu을 Asp으로; Gly을 Ala으로 또는 Pro으로; His을 Asn으로 또는 Gln으로; lle을 Leu으로 또는 Val으로; Leu을 lle으로 또는 Val으로; Lys을 Arg으로, Gln으로 또는 Glu으로; Met을 Leu으로, Tyr으로 또는 lle으로; Phe을 Met으로, Leu으로 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp을 Tyr으로; Tyr을 Trp으로 또는 Phe으로; Val을 Ile으로 또는 Leu으로.

"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질" (단일 쇄인 경우)이라는 용어는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.

"핵산", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다.

본 출원에서 사용되는 "분리된"이라는 용어는 원래 또는 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 경우, 자연 환경)으로부터 제거되는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 사람 개입에 의해 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 분리될 수 있다.

바람직하게는, 핵산은 발현 벡터의 일부일 것이며, 여기서, 상기 핵산 분자는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있고, 이러한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 또는 종결 서열, 가장 바람직하게는 이종 프로모터, 인핸서 또는 종결 서열일 수 있다.

"PD1" 및 "PD-1"이라는 용어는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다. "PDL1" 및 "PDL-1"이라는 용어도 마찬가지로 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 출원에서 하기에 개시되는 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5는 각각 특정 항-PD-1 항체를 지칭한다.

인용 부호 (" ")로 표기될 때, 본 출원에서 사용되는 "MEDI9447" 및 "BMS986179"는 각각 국제공개공보 WO　2016/075099 ("MEDI9447") 및 WO　2016/081748 ("BMS986179", 여기서는 mAb-CD73.4-Vh-hHC-IgG2-IgG1.1f로도 또한 명명됨)에서 개시된 바와 같은 정보에 따라 생성된 기준 항체를 지칭한다. 국제공개공보 WO 2016/075099 및 WO 2016/081748은 각각 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.

의심의 여지를 없애기 위해, "분화 클러스터 73" 또는 "CD73"이란, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002517.1에서 접근 가능한 NCBI 기준 서열: NP_002517.1 (UniProt 수탁 번호 P21589에 상응하는 긴 이소 타입) 뿐만 아니라, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001191742.1 (짧은 이소 타입)에서 접근 가능한 NCBI 기준 서열: NP_001191742.1에서 제공되는 "NT5E 5'-뉴클레오티다아제 엑토 [호모 사피엔스 (사람)]" 유전자에 의해 인코딩되는 사람 단백질, 및 이러한 단백질들을 인코딩하는 각각의 핵산 서열을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 "CD73"은 이러한 단백질의 단량체 및/또는 이량체 형태를 지칭할 수 있다. 일부 실시 형태에서, "CD73"은 상기에서 기재된 바와 같은 사람 CD73의 긴 이소 타입을 지칭한다. 본 출원에서 제공되는 결정학적 데이터의 경우, 아미노산 번호 지정은 신호 펩타이드를 포함하는 Uniprot 수탁 번호 P21589에 상응하며, 여기서, 성숙 단백질은 P21589의 아미노산 잔기 1~26에 상응하는 신호 펩타이드가 없지만, 본 출원 전체에 걸친 번호 지정 체계는 P21589의 전장 아미노산 서열을 참조할 것이다. 본 출원에서 사용되는 쥐과 동물 CD73은 Uniprot 수탁 번호 Q61503을 지칭한다.

살아있는 세포 및 유기체에서, CD73은 일반적으로 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 막 연결 (본 출원에서 "GPI 앵커"로도 또한 명명됨)을 통해 세포막에 고정된 이량체 단백질로서 존재하며, 엑토-5'-뉴클레오티다아제 활성을 갖고 있다.

본 출원에서 상호 교환적으로 사용되는 "가용성 CD73" 및 "sCD73"이라는 용어는, 예를 들어, GPI 앵커를 통해, 막에 부착되지 않는 CD73 분자를 의미한다.

"세포 결합 CD73"이라는 용어는, 예를 들어, GPI 앵커를 통해, 세포 표면에 부착되는 CD73 분자를 의미한다.

"세포 비결합 CD73"이라는 용어는 세포외 공간에 존재하는 CD73을 지칭한다. 이것은 가용성 CD73과 소포체 결합 CD73 둘 다, 즉, 세포외 공간에서 소포체의 표면에 부착되는 CD73 분자들을 포함한다. "세포 비결합 CD73"이라는 용어는 모든 "세포 결합 CD73"을 제외한다. "세포 비결합 CD73"의 활성은 실시예 8에 기재된 바와 같이 세포 배양 상청액에서 CD73 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다.

"IFNγ", "IFNg", "인터페론 감마", "인터페론-감마", "IFN-감마", "IFNG", "IFN 감마", "IFN-y"라는 용어 또는 유사한 용어는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용되며, T 세포와 같은 선천 면역계와 적응 면역계 둘 다의 세포에 의해 분비되는, 당해 분야에 공지된 바와 같은 인터페론 계열의 사이토카인 (NCBI Gene ID: 3458)을 나타낸다.

본 발명의 항-CD73 항체

상기에서 상세히 기재된 바와 같이, CD73은 T 세포 활성을 조절하여 면역계 활성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 길항성 항-CD73 항체 분자가 아데노신 매개성 T 세포 활성 억제를 역전시킴으로써 면역계를 활성화시켜 종양을 공격하고 이에 의해 암을 치료할 수 있다는 것은 다양한 암 환경에서 밝혀졌다.

본 발명은 개선된 항-CD73 항체를 제공한다. A1, A2, A3 및 A4 (표 9 참조)로 명명된, CD73에 대한 선조 쥐과 동물 항체로부터 시작하여, 사람화 변이체가 생성되었다. 본 발명의 바람직한 항-CD73 항체 분자는 사람화 단클론 항체인 B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 (표 9 참조)으로 명명된다. 본 발명의 항-CD73 항체는, 예를 들어, 또한 "길항성 CD73 항체" 또는 "길항성 CD73 항체들"로 지칭될 수 있으며, "길항성"이라는 용어 또는 이의 임의의 문법적 등가물은 본 발명의 CD73 항체에 의한 CD73 기능 (예를 들어, 가용성 및 세포 표면 결합)의 억제를 지칭한다.

본 발명자들은 시험관내 T-세포 활성화 분석 (실시예 6에 추가로 기재됨)을 사용하여 본 발명의 대표적인 항-CD73 항체의 기능적 특성을 검사하였다. 실시예 6 및 표 5 및 6에서 알 수 있는 바와 같이, 테스트 항체는 특정 공여체의 기준 항-CD73 항체와 비교하여 T-세포 증식을 보다 높은 수준으로 유도할 수 있었다. 또한, 테스트 항체는 특정 공여체의 기준 항-CD73 항체와 비교하여 T 세포에서 보다 높은 IFNγ 수준을 유도할 수 있었다. 이해할 수 있는 바와 같이, 선행 기술의 기준 항-CD73 항체 보다 T-세포 활성화를 더 효과적으로 유도하는 본 발명의 항-CD73 항체의 이러한 놀라운 능력은 이들이 암의 보다 효과적인 치료 및/또는 개선된 임상 결과를 제공할 수 있다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 다양한 다른 기능적 특성을 추가로 조사하였다. 이러한 평가에는 항-CD73 항체에 의해 아데노신 형성을 억제하는 능력의 결정이 포함되었다. 이것은 세포 배양 상청액에서 세포 결합 CD73의 억제 뿐만 아니라 세포 비결합 CD73의 억제를 측정함으로써 수행되었다. 본 발명의 항-CD73 항체는 기준 항-CD73 항체와 비교하여 세포 비결합 CD73을 억제하는데 보다 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 이러한 항체는 기준 CD73 항체와 비교하여 CD73의 보다 완전한 억제를 초래하는 능력을 갖는다.

당해 분야에 공지된 항-CD73 항체와는 대조적으로, 본 발명의 항-CD73 항체는 특히 아데노신 생성 및 T 세포 활성화의 억제 측면에서 개선된 특성을 갖는다. 이것은 첨부된 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이 공지된 기준 항-CD73 항체 분자 "MEDI9447" 및 "BMS986179"와 대조적이다. 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 이러한 우수성은 이들이 다른 항-CD73 항체 보다 더 높은 효능 및/또는 더 나은 임상 결과를 가질 수 있으므로 보다 효과적인 암 요법을 가능하게 할 수 있다는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 하기를 포함하는 항-CD73 항체 분자를 제공한다:

(1) 서열 번호 1 (hcCDR1), 서열 번호 2 (hcCDR2) 및 서열 번호 3 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 4 (lcCDR1), 서열 번호 5 (lcCDR2) 및 서열 번호 6 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(2) 서열 번호 7 (hcCDR1), 서열 번호 8 (hcCDR2) 및 서열 번호 9 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 10 (lcCDR1), 서열 번호 11 (lcCDR2) 및 서열 번호 12 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(3) 서열 번호 13 (hcCDR1), 서열 번호 14 (hcCDR2) 및 서열 번호 15 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 16 (lcCDR1), 서열 번호 17 (lcCDR2) 및 서열 번호 18 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(4) 서열 번호 19 (hcCDR1), 서열 번호 20 (hcCDR2) 및 서열 번호 21 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 22 (lcCDR1), 서열 번호 23 (lcCDR2) 및 서열 번호 24 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(5) 서열 번호 25 (hcCDR1), 서열 번호 26 (hcCDR2) 및 서열 번호 27 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 28 (lcCDR1), 서열 번호 29 (lcCDR2) 및 서열 번호 30 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(6) 서열 번호 31 (hcCDR1), 서열 번호 32 (hcCDR2) 및 서열 번호 33 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 34 (lcCDR1), 서열 번호 35 (lcCDR2) 및 서열 번호 36 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(7) 서열 번호 37 (hcCDR1), 서열 번호 38 (hcCDR2) 및 서열 번호 39 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 40 (lcCDR1), 서열 번호 41 (lcCDR2) 및 서열 번호 42 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(8) 서열 번호 43 (hcCDR1), 서열 번호 44 (hcCDR2) 및 서열 번호 45 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 46 (lcCDR1), 서열 번호 47 (lcCDR2) 및 서열 번호 48 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(9) 서열 번호 49 (hcCDR1), 서열 번호 50 (hcCDR2) 및 서열 번호 51 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 52 (lcCDR1), 서열 번호 53 (lcCDR2) 및 서열 번호 54 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(10) 서열 번호 55 (hcCDR1), 서열 번호 56 (hcCDR2) 및 서열 번호 57 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 58 (lcCDR1), 서열 번호 59 (lcCDR2) 및 서열 번호 60 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(11) 서열 번호 61 (hcCDR1), 서열 번호 62 (hcCDR2) 및 서열 번호 63 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 64 (lcCDR1), 서열 번호 65 (lcCDR2) 및 서열 번호 66 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는

(12) 서열 번호 67 (hcCDR1), 서열 번호 68 (hcCDR2) 및 서열 번호 69 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 70 (lcCDR1), 서열 번호 71 (lcCDR2) 및 서열 번호 72 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR.

상기에서 개략적으로 서술된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항-CD73 항체 분자는 B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6으로 명명된다. 본 출원에서는 본 발명의 특정 항-CD73 항체 분자에 대한 개별 아미노산 서열의 확인을 용이하게 가능하게 하는 서열 표 (표 9)가 제공된다.

상기에서 설명된 바와 같은 CDR 서열에 추가하여, 본 발명의 항체 분자는 면역글로불린 프레임워크 영역 (FR) 서열을 포함한다. 이들 서열은 바람직하게는 사람에서 면역원성이 아니며, 따라서 바람직하게는 사람 또는 사람화 FR 서열이다. 적합한 사람 또는 사람화 FR 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 구체적으로, 바람직한 FR 서열은 완전한 항체 분자, 이에 의해 FR 서열 뿐만 아니라 CDR 서열을 개시하는 본 출원에서 나타낸 실시 형태로부터 취해질 수 있다.

본 발명의 제1 양태의 항체 분자를 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 본 발명의 제1 양태의 특징을 갖는 항체 분자를 용이하게 제조할 수 있을 것이다. 이러한 방법의 예는 하기에 제공된다.

IgG1 또는 IgG4 유형의 것들과 같이 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 항체의 생산을 위해, 문헌 [Norderhaug et al., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87]; [Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004]; [Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39]을 참조한다.

숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)/코마가텔라 파티이 (Komagataella phaffii) 또는 포유 동물 세포주, 예를 들어, CHO 또는 NS0)에서 scFv 작제물을 인코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 scFv 항체를 제조하여 기능성 scFv 분자를 생성하는 방법도 또한 공지되어 있다 (문헌 [Rippmann et al., Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869]; [Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407]; [Sonoda et al., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253]).

의심의 여지를 없애기 위해, 본 발명의 제1 양태에 대해 본 출원에서 열거된 구체적인 실시 형태 각각은 또한 본 발명의 독립적인 양태에 대해 고려될 수 있다.

본 발명의 제1 양태의 바람직한 실시 형태는 상기 항체 분자가 사람화 항체 분자인 경우이다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항체는 재조합 항체이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항체는 단리된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항체는 정제된다.

본 발명의 제1 양태의 추가의 바람직한 실시 형태는 상기 항체 분자가 단클론 항체, Fab, F(ab')₂, Fv 또는 scFv인 경우이다.

"사람화", "Fab", "F(ab')₂", "Fv" 및 "scFv"라는 용어는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서의 정의 부분에서 본 출원에서 추가로 논의된다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 갖는다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 IgG1, 보다 바람직하게는 L234A 및/또는 L235A 돌연변이 (Kabat 번호 지정; 실제 번호 지정에서는 L232A 및 L233A 위치에 상응함)를 갖는 IgG1이다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 카파 또는 람다인 경쇄 불변 영역을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 상기에서 개시된 바와 같은 서열 번호 73, 75, 77 또는 79 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항체 분자는 서열 번호 73, 75, 77 또는 79 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 또는 95 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 바람직하게는, 상기 항체 분자는 서열 번호 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 또는 95 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 사람화된다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 74, 76, 78 또는 80 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항체 분자는 서열 번호 74, 76, 78 또는 80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 또는 96 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 바람직하게는, 상기 항체 분자는 서열 번호 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 사람화된다.

아미노산 서열 동일성을 계산하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서의 정의 부분에서 본 출원에서 추가로 논의된다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

상기 모든 실시 형태의 경우, "포함하는"이라는 용어를 사용함으로써, 각각의 도메인 또는 분자가 표시된 바와 같은 아미노산 서열로 "이루어지는" 실시 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 10 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 pM 미만의 해리 상수 (K_D)로 사람 CD73에 결합할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 높은 친화성으로 사람 CD73 (긴 이소 타입) 및 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) CD73에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 높은 친화성은 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 측정될 때 10 nM 미만, 예를 들어, 9, 8, 7, 6 nM 또는 그 이하의 K_D를 지칭한다. 바람직한 실시 형태에서, 높은 친화성은 SPR로 측정될 때 1 nM 미만의 K_D를 지칭한다. 보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 500 pM 미만의 K_D로 사람 CD73에 결합할 수 있다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 상기 항체는 100 pM 미만의 K_D로 사람 CD73에 결합한다. SPR을 사용하여 K_D를 결정하는 프로토콜은 첨부된 실시예에서 제공된다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 사람 CD73과 비교하여 보다 낮은 친화성, 예를 들어, 사람 CD73과 비교하여 10x, 50x, 100x 또는 110x 더 낮은 친화성으로 마우스 CD73에 결합한다. 마우스 CD73의 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_035981.1 (1개의 형태만 확인됨)으로 접근 가능하다. 시노몰구스 CD73의 서열은 RefSeq 수탁 번호 XP_005552488.1로 접근 가능하다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 사람 CD73의 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 사람 CD73의 활성은 AMP를 아데노신으로 가수 분해하는 효소 기능을 지칭한다. 따라서, 사람 CD73의 활성을 감소시키는 것은 이러한 효소 기능을 억제하는 것을 지칭한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 실시예에서 기재된 바와 같이 시험관내에서 사람 CD73의 효소 기능을 억제한다. 일부 실시 형태에서, 사람 CD73의 활성 감소는 CD73의 세포 표면 수준의 감소를 지칭한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 억제 (CD73 효소 기능을 차단하거나 CD73 세포 표면 수준을 감소시킴으로써)는, 예를 들어, Colo201과 같은 암 세포주를 사용하여, 세포 기반 분석으로 결정된다.

일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 실시예 5에서 기재된 바와 같은 세포 기반 분석으로 결정될 때 아데노신의 형성을 적어도 70%, 바람직하게는 80% 이상 억제한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 세포 배양 상청액에서 아데노신의 형성을 적어도 60%, 적어도 70%, 바람직하게는 75% 이상 억제하며, 즉, 실시예 8에서 기재된 바와 같이 세포 비결합 CD73의 활성을 억제한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 세포 비결합 CD73에 의한 아데노신의 형성을 적어도 70% 억제한다.

더 추가의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 생체내에서 사람 CD73의 효소 기능을 억제한다.

시험관내 또는 생체내에서 사람 CD73의 효소 활성의 억제를 결정하기 위한 분석은 당해 분야에 공지되어 있으며, 또한 첨부된 실시예에서 보다 상세하게 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 사람 CD73의 효소 활성을 5 nM 미만, 즉, 4, 3, 2, 1.5, 1, 0.5 nM 또는 그 이하의 IC₉₀으로 억제할 수 있다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 사람 CD73의 효소 활성을 0.4 nM 미만의 IC₉₀으로 억제한다. IC₉₀를 결정하는 프로토콜은 첨부된 실시예에서 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 사람 CD73을 1 nM 미만의 IC₉₀으로 억제하지만, CD73의 세포 표면 수준을 중간 정도로만 (즉, 30% 미만, 25% 미만 또는 20% 미만까지) 감소시킨다.

하나의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 T 세포 기능의 AMP 의존적 억제를 역전시킬 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, T 세포 기능은 아데노신 모노포스페이트 (AMP)로부터 CD73에 의해 생성되는 아데노신에 의해 억제될 수 있는 것으로 공지되어 있는 T 세포 증식을 지칭한다. 본 발명의 항체는 CD73에 의한 아데노신 생성을 바람직하게는 대조군 수준 (AMP 첨가 없는 이소 타입 대조군으로 처리된 자극된 T 세포)과 실질적으로 동일한 수준으로 억제함으로써 이러한 억제를 역전시킬 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 T 세포의 증식을 대조군 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 심지어 100% 초과, 예를 들어, 110%, 115%, 120% 또는 125%로 복원시킬 수 있다. T 세포 기능의 AMP 의존적 억제를 결정하는 분석은 실시예 6에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 CD4+이다. 다른 실시 형태에서, 상기 T 세포는 CD8+이다.

일부 실시 형태에서, T 세포 기능은 T 세포에 의한 인터페론 감마 방출을 지칭한다. 임의의 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, CD73에 의해 생성된 아데노신은 T 세포에 의한 이러한 인터페론 감마 방출을 억제하는 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명의 항체는 T 세포에 의한 인터페론 감마 방출을 바람직하게는 대조군 수준 (AMP 첨가 없는 이소 타입 대조군으로 처리된 자극된 T 세포)과 실질적으로 동일한 수준으로 복원시킬 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 AMP에 의해 억제된 T 세포의 인터페론 감마 방출을 대조군 수준 (AMP 첨가를 갖는 이소 타입 대조군으로 처리된 자극된 T 세포)의 2x (즉, 2배), 3x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 50x 초과의 값까지 유도할 수 있다. T 세포의 인터페론 감마 방출을 결정하는 분석은 실시예 6에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 CD4+이다. 다른 실시 형태에서, 상기 T 세포는 CD8+이다.

특히 바람직한 실시 형태에서, T 세포 기능은 상기에서 기재된 바와 같이 T 세포 증식과 인터페론 감마 방출 둘 다를 지칭하며, 즉, 상기 항-CD73 항체는 T 세포의 T 세포 증식과 인터페론 감마 방출 둘 다를 자극할 수 있다.

추가의 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 정의된 크기를 갖는 가용성 CD73과 항원-항체 복합체, 예를 들어, 2:2 올리고머를 형성한다. 이러한 복합체는 당해 분야에 공지된 다른 CD73 항체에 의해 형성된 복합체와 비교하여 보다 작다 (예를 들어, 도 2 참조). 항원-항체 복합체의 크기는 이전에 Fcγ 수용체 활성화와 관련이 있었으므로, 바람직하지 않은 면역원성에 역할을 할 수 있다 (문헌 [Krayukhina et al., Analytical ultracentrifugation with fluorescence detection system reveals differences in complex formation between recombinant human TNF and different biological TNF antagonists in various environments (2017). mAbs]).

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 출원에서 기재된 항체 A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6과 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD73 항체를 제공한다 (표 9 참조). 일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6과 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁한다 (표 9 참조). 일부 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체는 A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6의 에피토프와 중첩되거나 실질적으로 중첩되는 에피토프에 결합한다 (표 9 참조). 바람직하게는, 상기 항-CD73 항체는 단클론 항체이다.

하나의 실시 형태에서, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, CD73 (Uniprot 수탁 번호 P21589) 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, S155, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, E203 및 K206 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73 상의 상기 아미노산 잔기에 대한 경쇄 가변 영역의 결합이 본 발명의 항-CD73 항체에 의한 CD73 기능의 억제에 기여하는 경쇄 가변 영역 파라토프를 포함한다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, 예를 들어, 본 발명의 항-CD73 항체에 의해 특이적으로 결합되는 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (아미노산 번호 지정은 신호 펩타이드를 포함하는 Uniprot 수탁 번호 P21589에 상응하므로, 성숙 단백질은 아미노산 잔기 1~26을 포함하는 신호 펩타이드가 없지만, 본 출원 전체에 걸친 번호 지정 체계는 P21589의 전장 아미노산 서열을 참조할 것이다)을 포함하는 CD73 상의 입체 형태 에피토프의 일부인 상기에서 개시된 바와 같은 아미노산 잔기, 예를 들어, F137, P138, I139, A151, S152, S155, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, E203 및 K206 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73 상의 상기 아미노산 잔기에 대한 중쇄 가변 영역의 결합이 본 발명의 항-CD73 항체에 의한 CD73 기능의 억제에 기여하는 경쇄 가변 영역 파라토프를 포함한다. 본 출원에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체에 의해 결합되는 본 발명에 따른 "입체 형태 에피토프"라는 용어는, 본 발명의 항체에 의해 인식 및 결합된 에피토프가 폴리펩타이드 또는 단백질의 2차 및/또는 3차 구조에 의해 형성되고 폴리펩타이드 또는 단백질의 접힌 3 차원 입체 형태에 독특한 비선형 에피토프를 지칭한다. 일반적으로, 입체 형태 에피토프는 단백질의 접힌 구조에서 함께 모이는 선형 서열에서 불연속적인 아미노산으로 이루어진다. 그러나, 입체 형태 에피토프는 또한 폴리펩타이드의 접힌 3 차원 입체 형태에 독특하고 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 변성 상태로 존재하지 않는 입체 형태를 채택하는 아미노산의 선형 서열로 이루어질 수 있다.

하나의 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (아미노산 번호 지정은 Uniprot 수탁 번호 P21589에 상응한다)을 포함하는 CD73 상의 입체 형태 에피토프의 일부인 아미노산 잔기 L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 및 N211 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73 상의 상기 아미노산 잔기에 대한 중쇄 가변 영역의 결합이 본 발명의 항-CD73 항체에 의한 CD73 기능의 억제에 기여하는 중쇄 가변 영역 파라토프를 포함한다.

하나의 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95에 따른 아미노산 서열 중 하나를 포함하고, 본 발명의 항-CD73 항체에 의해 특이적으로 결합되는 사람 CD73 (Uniprot 수탁 번호 P21589)의 아미노산 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211에 의해 형성된 입체 형태 에피토프의 일부인 CD73 상의 아미노산 잔기 L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 및 N211 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하는 중쇄 가변 영역 파라토프를 포함한다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, 서열 번호 102, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120 중 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 예를 들어, 아미노산 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211 (아미노산 번호 지정은 Uniprot 수탁 번호 P21589에 상응한다)에 의해 형성된 CD73 상의 입체 형태 에피토프에 기여하고 이의 일부인 상기에서 개시된 바와 같은 아미노산 잔기, 예를 들어, F137, P138, I139, A151, S152, S155, G156, L157, T158, L159, P160, Y161, K162, E203 및 K206 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하는 경쇄를 포함한다. 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211을 포함하는 CD73 상의 입체 형태 에피토프에 대한 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 경쇄의 결합은 CD73에 대한 본 발명의 항-CD73 항체의 특이적 결합에 기여하여 이의 기능을 억제한다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는, 서열 번호 101, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119 중 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 사람 CD73 (Uniprot 수탁 번호 P21589)의 아미노산 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211에 의해 형성된 입체 형태 에피토프에 기여하고 이의 일부인 CD73 상의 아미노산 L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, T209, L210 및 N211 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하는 중쇄를 포함한다. 아미노산 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211에 의해 형성된 CD73 상의 입체 형태 에피토프에 대한 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 중쇄의 결합은 CD73에 대한 본 발명의 항-CD73 항체의 특이적 결합에 기여하여 CD73의 기능을 억제한다.

하나의 실시 형태에 따르면, 사람 CD73 (Uniprot 수탁 번호 P21589)의 아미노산 F137, P138, 1139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211에 의해 형성된 입체 구조 에피토프에 대한 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73의 결합은 T 세포에서 IFNγ 방출을 유도한다 (예를 들어, 도 4 참조). 예를 들어, 서열 번호 55 (HCDR1), 서열 번호 56 (HCDR2) 및 서열 번호 57 (HCDR3)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 1~3 및 서열 번호 58 (LCDR1), 서열 번호 59 (LCDR2) 및 서열 번호 60 (LCDR3)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 1~3, 또는 서열 번호 91에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 92에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하거나, 예를 들어, 서열 번호 115에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 116에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체의 결합은 T 세포에서 IFNγ 방출을 유도하며 (예를 들어, 도 4 참조), 예를 들어, 본 발명의 항체에 의해 유도된 IFNγ 방출은 시험관내에서 이소 타입 대조군 + AMP와 비교하여 적어도 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배이고, 예를 들어. IFNγ 수준은 실시예 6에 개시된 바와 같이 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 T 세포에 의한 IFNγ 방출을 대조군 수준 (AMP가 첨가되지 않은 이소 타입 대조군으로 처리된 자극된 T 세포)의 실질적으로 동일한 수준, 예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%로 복원시킬 수 있다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 101에 따른 중쇄 및 서열 번호 102에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 109에 따른 중쇄 및 서열 번호 110에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 111에 따른 중쇄 및 서열 번호 112에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 113에 따른 중쇄 및 서열 번호 114에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 115에 따른 중쇄 및 서열 번호 116에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 117에 따른 중쇄 및 서열 번호 118에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 119에 따른 중쇄 및 서열 번호 120에 따른 경쇄를 포함하며, 본 발명의 CD73 상의 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211로 구성된 입체 형태 에피토프의 아미노산 잔기 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 모두에 결합하여 CD73의 기능을 억제한다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 본 발명은 사람 CD73의 아미노산 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211에 의해 형성된 입체 형태 에피토프에 결합하고 상기에서 개시된 본 발명의 항-CD73 항체의 입체 형태 에피토프에 대한 결합과, 예를 들어, 서열 번호 115에 따른 중쇄 및 서열 번호 116에 따른 경쇄를 포함하는 항-CD73 항체의 결합과 교차 경쟁하는 항-CD73 항체를 제공한다. 항체 결합의 교차 경쟁은, 예를 들어, 문헌 [Anal Biochem. 2009 Mar 15;386(2):172-80]에 기재된 것들과 같은 당해 분야에 공지된 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 본 발명의 항-CD73 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 28, T31, Y32, W33, Y52, L55, D57, L99, L100, D101, Y102 및 본 발명의 항-CD73 항체의 경쇄 가변 영역의 R30, S31, Y32, W49, Y50, T51, S52, R53, S65, G66, S67, E92는, 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211을 포함하는 CD73 상의 입체 형태 에피토프에 접촉하고/하거나 특이적으로 결합하며, 여기서, 상기 본 발명의 항-CD73 항체는 서열 번호 115 및 서열 번호 116에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본 발명의 항-CD73 항체는 CD73 효소 활성을 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.5 nM 미만 또는 그 이하의 IC₉₀으로, 바람직하게는 0.5 nM 미만의 IC₉₀으로 억제한다. 예를 들어, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항체는 아데노신의 형성을 적어도 60%, 적어도 70%, 바람직하게는 75% 이상 억제할 수 있다. 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항체에 의한 시험관내 아데노신 형성의 억제는, 예를 들어, 실시예 8에 기재된 바와 같이 세포 배양 상청액으로 평가될 수 있다. 본 발명의 항체에 의한 생체내 아데노신 형성의 억제는, 예를 들어, 문헌 [Lofgren L, Pehrsson S, Hagglund G, Tjellstrom H, Nylander S (2018) Accurate measurement of endogenous adenosine in human blood PLoS ONE 13(10): e0205707. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205707]에 기재된 바와 같은 방법에 의해 혈액 샘플으로 또는 종양 미세 환경으로부터 채취된 샘플으로 평가될 수 있다.

예를 들어, 바람직한 실시 형태에서, 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211을 포함하는 입체 형태 에피토프에 결합함으로써, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 AMP를 가수 분해하는 CD73의 효소 활성에 필요한 CD73의 "개방" 및 "폐쇄" 입체 형태의 채택을 억제함으로써 CD73의 효소 활성을 억제한다.

바람직한 실시 형태에 따르면, 상기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체는 아미노산 잔기 F137, P138, I139, A151, S152, G156, L157, Y158, L159, P160, Y161, K162, V163, P165, G167, D168, E169, V170, E203, K206, T209, L210, N211을 포함하는 CD73 상의 입체 형태 에피토프에 결합하여 CD73의 세포 표면 수준을 감소시킴으로써 CD73 효소 활성을 억제한다 (실시예 4 참조).

바람직하게는, 상기 항-CD73 항체는 사람화된다. 이러한 항체는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 면역화를 위한 에피토프 서열, 또는 재조합으로 발현되고 정제된 CD73 단백질을 사용하여 생성될 수 있다.

항체의 에피토프는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 수소-중수소 교환 질량 분광법 (hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry: HDX-MS), NMR, 부위 특이적 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝) 또는 항체-항원 복합체의 X선 결정학에 의해 결정될 수 있다.

수소-중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)은 단백질 백본 아미드 수소 원자의 중수소 교환의 속도와 정도를 모니터링하여 용액에서 단백질 입체 형태 및 입체 형태 역학을 결정한다. HDX의 교환 수준은 단백질 용매 접근성 및 수소 결합에 좌우되며, HDX에 대한 단백질의 질량 증가는 MS로 정확하게 측정될 수 있다. 이러한 기술이 효소 분해와 짝을 이룰 때, 펩타이드 수준의 구조 특징을 해결할 수 있는데, 이는 표면 노출된 펩타이드와 내부로 접힌 펩타이드의 구별을 가능하게 한다. 에피토프 맵핑 실험에서, 중수소 라벨링 및 후속 ??칭 (quenching) 실험을 항원 및 항원/mAb 복합체에 대해 병행하여 수행한 다음, 온라인 펩신 분해, 펩타이드 분리 및 MS 분석을 수행한다.

에피토프에 대한 결합 경쟁은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석 또는 경쟁적 ELISA 분석을 사용할 수 있는데, 여기서, 재조합 사람 CD73 단백질을 플레이트 상에 고정하고, 다양한 농도의 라벨링되지 않은 제1 항체를 첨가하고, 상기 플레이트를 세척하고, 라벨링된 제2 항체를 첨가하고, 세척하고, 결합된 라벨의 양을 측정한다. 라벨링되지 않은 (제1) 항체 ("차단 항체"로도 또한 지칭됨)의 농도 증가가 라벨링된 (제2) 항체의 결합을 억제하는 경우, 제1 항체는 플레이트 상의 표적에 대한 제2 항체의 결합을 억제한다고 하거나, 제2 항체의 결합과 경쟁한다고 한다. 추가로 또는 대안으로, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여 항체의 경쟁 능력을 평가할 수 있다. 본 출원에서 기재된 항-CD73 항체 (예를 들어, 항체 A1, A2, A3, A4, B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6, 표 9)의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은, 테스트 항체가 CD73에 결합하기 위해 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증한다.

상기에서 기재된, 즉, 본 발명의 제1 양태에 따른 항-CD73 항체는 또한 본 출원에서 "본 발명의 항체", "본 발명의 CD73 항체", "본 발명의 항-CD73 항체", "본 출원에서 기재된 항체"로서 또는 유사하게 총괄적으로 지칭된다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 제1 양태 중 어느 하나의 항-CD73 항체 분자의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 본 출원에서 제공된 항-CD73 항체 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 또한 국제공개공보 WO 2007/042309에서 정의된 바와 같이 높은 엄격한 결합 및 세척 조건하에 서열 목록에서 나타낸 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 DNA 분자와 하이브리드화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 분자 (mRNA 관점에서)는 본 출원에서 기재된 DNA 분자 중 하나와 적어도 75% 또는 80% (바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%)의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것들이다. 예로서, 상기 항체를 진핵 세포에서 발현하는 관점에서, 서열 목록에서 나타낸 DNA 서열은 진핵 세포에서 코돈 용법과 일치하도록 설계되었다. 상기 항체를 이. 콜라이에서 발현하는 것이 바람직한 경우, 이러한 서열은 이. 콜라이 코돈 용법과 일치하도록 변경될 수 있다. 본 발명의 DNA 분자의 변이체는, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2007/042309에서 기재된 바와 같이 여러 다른 방식으로 작제될 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 중 어느 하나의 항-CD73 항체 분자의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

바람직하게는, 핵산 분자는 서열 번호 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 및 95 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열 번호 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 또는 96 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 발현 벡터는 각각 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자에 연결된, 각각 중쇄의 불변 도메인 및/또는 경쇄의 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 또한 포함한다.

특별히 바람직한 실시 형태에서, 2개의 발현 벡터를 사용할 수 있는데, 이 중 하나는 중쇄의 발현을 위한 것이고, 다른 하나는 경쇄의 발현을 위한 것이며, 이어서, 2개의 발현 벡터 모두를 재조합 단백질 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다.

바람직하게는, 발현 벡터는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터일 것이며, 여기서, 이러한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 또는 종결 서열, 가장 바람직하게는 이종 프로모터, 인핸서 또는 종결 서열일 수 있다.

본 발명의 핵산은, 본 출원에서 주어진 본 발명의 항체에 대한 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여, 공지된 방식 자체로 (예를 들어, 자동화된 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해) 제조되거나 수득될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에서 기재된 바와 같은 발현 벡터, 예를 들어, 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터 및 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터를 갖는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는, 특히 상기 항체가 scFv와 같은 단일 쇄 항체인 경우, 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 경쇄와 중쇄 둘 다를 인코딩하는 벡터를 포함한다.

특히 바람직한 실시 형태에 따르면, 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유 동물 세포, 특히, 사람 세포 (시험관내)이다. 또 다른 실시 형태에서, 이러한 숙주 세포는 세균 세포이다. 기타 유용한 세포는 효모 세포 또는 기타 진균 세포이다.

발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유 동물 세포주는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 특히, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO; CHO-DG44) 세포, NSO, SP2/0 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 사람 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손을 포함한다. 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유 동물 세포, 또는 효모, 곤충 및 식물 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다른 진핵 세포, 또는 세균과 같은 원핵 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현을 위해 당해 분야에 사용되는 임의의 다른 세포도 또한 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다:

- 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 형성을 가능하게 하는 조건하에 상기에서 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

- 상기 항체 분자를 회수하는 단계.

하나의 실시 형태에서, 상기 제조 방법은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 상기 항체를 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 실시 형태에서, 상기 제조 방법은 본 출원에서 추가로 기재된 바와 같이 상기 항체를 추가로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 실시 형태에서, 상기 제조 방법은 본 출원에서 추가로 기재된 바와 같이 상기 항체 분자를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.

항체를 생산하기 위해 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법이, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 의학에서 사용하기 위해 상기에서 기재된 바와 같은 항-CD73 항체를 제공한다. 본 발명의 항체의 구체적인 의학 용도는 본 출원에서 하기에 보다 상세하게 기재된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 항-CD73 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 적합한 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 출원에서 하기에 추가로 기재된다. 이러한 조성물은 또한 PD-1 길항제와 같은 (이에 한정되는 것은 아님) 본 출원에서 보다 상세히 기재된 바와 같은 추가의 치료제를 포함할 수 있다.

항-CD73 항체 및 다른 치료제, 예를 들어, PD-1 길항제를 포함하는 약제학적 조성물; 부품 키트, 방법 및 용도

PD-1은 T 세포 활성을 조절하여 면역계 활성을 조절하는데 중요한 역할을 한다.

길항성 항-PD-1 항체 분자가 T 세포 활성을 증가시킴으로써 면역계를 활성화시켜 종양을 공격하고 이에 의해 암을 치료할 수 있다는 것은 다양한 여러 암 환경에서 밝혀졌다.

PD-1 수용체를 차단하는 단클론 항체는 다양한 암 유형에 대한 지속적인 임상 반응과 관련이 있으며 신규한 암 치료제로서 큰 잠재력을 가지고 있는 것으로 공지되어 있다. 또한 CD73의 표적화는 항-PD-1 항체의 항종양 활성을 증진시키는 것으로 나타났다.

이러한 배경에 대해, 본 발명자들은 본 발명의 항-CD73 항체와 PD-1 항체의 조합을 조사하고자 하였다.

본 발명자들은 수지상 세포/T 세포 공동 배양 분석 (실시예 7에서 추가로 개략적으로 서술됨)을 사용하여 항-PD-1 분자와 조합하여 본 발명의 대표적인 항-CD73 항체 분자의 기능적 특성을 검사하였다. 실시예 7 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 항-PD1 항체의 효과는 AMP에 의해 억제되며, 이는 PD1 반응이 AMP에 의존한다는 것을 분명하게 나타낸다. 본 발명의 항-CD73 항체 분자와 PD-1 길항제, 예를 들어, 항-PD-1 항체의 조합은 AMP 의존적 억제를 역전시키고 IFNγ 수준을 복원시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항-CD73 항체, PD-1 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 적합한 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 출원에서 하기에 추가로 기재된다.

적합한 PD-1 길항제는 본 출원에서 하기에 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 항-PDL-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 항-PD-1 항체는 PDR-001, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 항-PD-1 항체 분자는 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 상기 항-PDL-1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 더발루맙으로부터 선택된다.

본 발명의 항-CD73 항체 대신에, 또 다른 항-CD73 항체, 예를 들어, MEDI9447, BMS986179, CPX-006, CPX-0016, 또는 국제공개공보 WO 08/007648, WO 2016/075099, WO 2016/081748, WO 2016/055609, WO 2016/131950, WO 17/064043, WO 2017/100670, WO 17/152085 또는 WO 2018/013611에 기재된 바와 같은 항체도 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항-CD73 항체 분자 및 PD-1 길항제를 포함하는 부품 키트를 제공한다. 상기 키트는 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 PD-1 길항제는 본 출원에서 하기에 기재되어 있다.

상기에 기초하여, 상기에서 설명된 본 발명의 항체 분자, 예를 들어, 본 발명의 항-CD73 항체 및 PD-1 길항제를 사용하여 질병 (하기에 보다 상세히 명시된 바와 같음)을 치료하기 위한 약제학적 조성물 뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 약제학적 조성물 또는 항체 분자를 사용하여 질병 (하기에 보다 상세히 명시된 바와 같음)을 치료하는 방법도 또한 함께 개시된다는 것은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

의심의 여지를 없애기 위해, 본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물, 키트, 치료 방법, 의학 용도, 투여 방법 및 투약량에 관한 모든 실시 형태는 단독으로 또는 PD-1 길항제와 같은 추가의 치료제와 조합하여 본 출원에서 기재된 임의의 항-CD73 항체에 대해 고려된다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 임의의 PD-1 길항제 (PD-1 및 PDL-1의 억제제 포함), 예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 또는 PD1-5이 사용될 수 있다.

본 발명의 항-CD73 항체 분자 및 본 발명의 항-PD-1 항체 분자가 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되어야 할 때, 이들은 상이한 약제학적 제형 또는 조성물로서 또는 조합된 약제학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD73 항체 분자 및 본 발명의 항-PD-1 항체 분자가 조합된 치료 요법의 일부로서 사용되어야 할 때, 상기 항체들의 각각은 상기 항체들 중 하나가 단독으로 사용될 때 사용되는 동일한 요법에 따라 동일한 양으로 투여될 수 있으며, 이러한 조합 사용은 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 항체들의 조합 사용이 상승 효과를 유도할 때, 항체들 중 하나 또는 둘 다의 양을 감소시키면서 목적하는 치료학적 작용을 여전히 달성하는 것도 또한 가능할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 이들이 통상의 양으로 사용될 때에 상기 항체들 중 하나 또는 둘 다의 사용과 관련되는 임의의 원치않는 부작용을 회피, 제한 또는 감소시키면서 여전히 목적하는 약리학적 또는 치료학적 효과를 달성하는데 유용할 수 있다.

항-CD73 항체 및 PD-1 길항제에 추가하여, 상기에서 기재된 조성물 및 키트는 또한 본 출원에서 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 추가의 치료제를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물, 투여 방법, 투약량 (dosage)

본 발명은 또한 질병 (하기에서 보다 상세히 명시된 바와 같음)을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기서, 이러한 조성물은 본 출원에서 제공된 바와 같은 적어도 하나의 항-CD73 항체를 포함한다. 본 발명은 이전에 설명된 바와 같은 하나 이상의 항-CD73 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 방법 (하기에 보다 상세히 명시된 바와 같음)을 추가로 포함하며, 본 발명의 이러한 항-CD73 항체 분자(들) 또는 약제학적 조성물에 의해 이러한 질병을 치료하기 위한 약제의 제조를 추가로 포함한다.

이러한 조성물은 단독으로 또는 추가의 치료제, 예를 들어, PD-1 길항제, 예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 또는 PD1-5와 조합하여 본 출원에서 기재된 임의의 항-CD73 항체에 대해 고려된다.

항-CD73 항체 및/또는 이를 포함하는 조성물은 사용되는 구체적인 약제학적 제형 또는 조성물에 따라 임의의 적합한 방식으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 항-CD73 항체 및/또는 이를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 정맥내 (i.v.), 피하내 (s.c.), 근육내 (i.m.), 복강내 (i.p.), 경피로, 경구로, 설하로 (예를 들어, 혀 아래에 놓고 점막을 통해 혀 아래 모세혈관망으로 흡수되는 설하 정제, 스프레이 또는 점적의 형태로), 비강(내)으로 (예를 들어, 비강 스프레이의 형태로 및/또는 에어로졸로서), 국소적으로, 좌약에 의해, 흡입에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방식에 의해 유효량 또는 유효 용량으로 투여될 수 있다.

항-CD73 항체 및/또는 이를 포함하는 조성물은 치료 또는 완화되는 질환, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 완화시키기 위해 적합한 치료 요법에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로 치료 또는 완화되는 질환, 장애 또는 병태, 질환의 중증도, 이의 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 구체적인 항체 분자, 구체적인 투여 경로 및 사용되는 약제학적 제형 또는 조성물, 연령, 성별, 체중, 식이, 환자의 전반적인 상태와 같은 요인 및 임상의에게 널리 공지된 유사한 요인에 따라 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 치료 요법은 치료학적 유효량 또는 유효 용량으로 하나 이상의 본 발명의 항체 분자 또는 이를 포함하는 하나 이상의 조성물의 투여를 포함할 것이다.

일반적으로, 본 출원에서 언급된 질환, 장애 및 병태의 치료 및/또는 완화를 위해, 그리고 치료되는 구체적인 질환, 장애 또는 병태, 사용되는 본 발명의 구체적인 항체 분자의 효능, 구체적인 투여 경로 및 사용되는 구체적인 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 본 발명의 항체 분자는 일반적으로 체중 kg 및 용량 당 0.05 내지 50.0 mg, 바람직하게는 5.0 내지 20.0 mg/kg/용량, 보다 바람직하게는 10 내지 15 mg/kg/용량의 양으로 연속적으로 (예를 들어, 주입에 의해) 또는 단일 용량 (예를 들어, 주 2회, 매주 마다 또는 매달 마다의 용량: 하기 참조)으로 투여될 것이지만, 특히 이전에 언급된 파라미터에 따라 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 일부 경우에는 상기에서 주어진 최소 용량 미만으로 사용하는 것이 충분할 수 있는 반면, 다른 경우에는 상한을 초과해야 할 수 있다. 다량으로 투여될 때, 하루에 걸쳐 다수의 적은 용량으로 분할하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 구체적인 항체 분자 및 이의 구체적인 약동학적 및 다른 특성에 따라, 매일 마다, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 5일 마다 또는 6일 마다, 매주 마다, 매달 마다 등으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 장기의 주간 치료를 포함할 수 있다. "장기"란, 적어도 2주, 바람직하게는 수개월 또는 수년간의 지속을 의미한다.

본 발명의 항체 분자 및 이를 포함하는 조성물의 효능은, 관련된 구체적인 질환에 따라 그 자체로 공지된 임의의 적합한 시험관내 분석, 세포 기반 분석, 생체내 분석 및/또는 동물 모델 또는 이의 조합을 사용하여 테스트될 수 있다. 적합한 분석 및 동물 모델은 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 하기 실시예에서 사용되는 분석 및 동물 모델을 포함한다.

제형

약제학적 용도의 경우, 본 발명의 항체 분자는 (i) 적어도 하나의 본 발명의 항-CD73 항체 및 (ii) 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 아쥬반트 및/또는 안정화제, 및 (iii) 임의로, 하나 이상의 추가의 약리학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물, 예를 들어, PD-1 길항제를 포함하는 약제학적 제제로서 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란, 각각의 물질이 개체에게 투여될 때 어떠한 생물학적 또는 달리 바람직하지 않은 효과도 나타내지 않고, 각각의 물질이 함유된 약제학적 조성물 중 임의의 다른 구성요소 (예를 들어, 약제학적 활성 성분)와 유해한 방식으로 상호 작용하지 않는다는 것을 의미한다. 구체적인 예는 표준 핸드북, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)]에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 통상적인 항체 및 항체 단편 및 기타 약제학적 활성 단백질에 대해 임의의 공지된 방식 그 자체로 제형화되고 투여될 수 있다. 따라서, 추가의 실시 형태에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 CD73 항체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 아쥬반트 및/또는 안정화제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약리학적 활성 물질을 함유하는 약제학적 조성물 또는 제제에 관한 것이다.

정맥내, 근육내, 피하 주사 또는 정맥내 주입과 같은 비경구 투여용 약제학적 제제는, 예를 들어, 활성 성분을 포함하고 임의로 추가의 용해 또는 희석 단계 후에 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼 또는 분말일 수 있다. 이러한 제제에 적합한 담체 또는 희석제로는, 예를 들어, 멸균수 및 약제학적으로 허용되는 수성 완충액 및 용액, 예를 들어, 생리학적 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액 및 행크 용액; 워터 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩 기름, 대두 오일, 및 이들의 적합한 혼합물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 분자의 용액은 또한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, p-하이드록시벤조에이트, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티오메르살, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (의 알칼리 금속 염) 등과 같은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유할 수 있다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당류, 완충액 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 임의로, 유화제 및/또는 분산제를 사용할 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어, 리포솜의 형성에 의해, 분산액의 경우에서 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 또는 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 기타 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴도 또한 첨가할 수 있다. 용액은 주사용 바이알, 앰풀, 주입용 병 등에 충전될 수 있다.

모든 경우, 최종 투여 형태 (dosage form)는 제조 및 보관 조건하에 멸균 유체이며 안정해야 한다. 멸균 주사액은 활성 화합물을 필요에 따라 상기에서 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적당한 용매 중에 요구되는 양으로 혼입한 후 여과 멸균하여 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이러한 기술은 이전에 멸균 여과된 용액 중에 존재하는 임의의 추가의 목적하는 성분과 활성 성분의 분말을 생성시킨다.

일반적으로, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 항체와 같은 치료학적 단백질에 적합한 제형은 적합한 농도 (예를 들어, 0.001 내지 400 mg/ml, 바람직하게는 0.005 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게는 1.0~100 mg/ml, 예를 들어, 1.0 mg/ml, 50 mg/ml 또는 100 mg/ml의 단백질 및 용액의 등장성을 제공하기 위한 수성 완충액, 예를 들어,

- 포스페이트 완충 식염수, pH 7.4,

- 기타 포스페이트 완충액, pH 6.2 내지 8.2,

- 아세테이트 완충액, pH 3.2 내지 7.5, 바람직하게는 pH 4.8 내지 5.5,

- 히스티딘 완충액, pH 5.0 내지 7.0,

- 석시네이트 완충액, pH 3.2 내지 6.6, 및

- 시트레이트 완충액, pH 2.1 내지 6.2,

및, 임의로, 용액의 등장성을 제공하기 위한 염 (예를 들어, NaCI) 및/또는 당류 (예를 들어, 수크로오스 및 트레할로오스) 및/또는 기타 다가 알코올 (예를 들어, 만니톨 및 글리세롤), 및/또는 계면 활성제

를 포함하는 용액과 같은 단백질 완충 용액이다.

바람직한 단백질 완충 용액은 240 mM 트레할로오스를 첨가하여 등장성으로 조정된, 0.67 mM 메티오닌을 임의로 포함하는 25 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5) 중에 용해된, 약 0.05 mg/mL의 본 발명의 항체를 단독으로 또는 PD-1 길항제와 조합하여 포함하는 용액이다. 다른 계면 활성제, 예를 들어, 0.04% Tween-20, Tween-80 또는 Polysorbate 80도 또한 이러한 용액에 포함될 수 있다. 피하 적용을 위한 제형은 본 발명의 항체를 100 mg/ml 이하 또는 심지어 100 mg/ml 초과와 같은 상당히 높은 농도로 함유할 수 있다. 그러나, 상기에서 제공된 바와 같은 성분 및 이의 양이 단지 하나의 바람직한 옵션을 나타낸다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이의 대체 및 변형은 즉시 통상의 기술자에게 자명하거나 상기 개시 내용으로부터 출발하여 용이하게 상상할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본 발명의 항체 분자는 주사기, 주사기 펜, 마이크로 펌프 또는 다른 디바이스와 같은 항체의 투여에 유용한 디바이스와 조합하여 사용될 수 있다.

치료학적 용도/치료 방법

본 발명의 추가의 양태는 치료학적 유효량의 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 이러한 환자에게 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체와 같은 PD-1 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 항-PD-1 항체는 본 출원에서 기재된 바와 같은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 항-PDL-1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 상기 암은 신장암, 위장암 또는 폐암이다. 일부 실시 형태에서, 상기 위장암은 결장 암종, 위암 또는 간세포 암종이다. 일부 실시 형태에서, 상기 신장암은 신암, 바람직하게는 투명 세포 암종이다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 상기 암은 폐암, 바람직하게는 비-소세포 폐암 (NSCLC)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 결장 암종은 CRC이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-CD73 항체 분자는, 임의로 상기에서 기재된 바와 같은 PD-1 길항제와 함께, 하나 이상의 추가의 치료제 및/또는 시술과 조합하여 투여되며, 이러한 치료제 및 시술은 본 출원에서 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 비제한적인 예로는 화학 요법, 표적화 항암 요법, 종양 용해성 약물, 세포독성제, 면역 기반 요법, 사이토카인, 외과 수술, 방사선 시술, 백신 또는 세포 면역 요법으로부터 선택된 치료제 또는 시술이 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 치료제는 A2AR 길항제, CD39 길항제, LAG-3 길항제, CTLA-4 길항제, EGFR 길항제 또는 HER2 길항제이다.

본 발명의 추가의 양태는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 양태는 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체와 같은 PD-1 길항제의 추가의 용도를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 항-PD-1 항체는 본 출원에서 기재된 바와 같은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 항-PDL-1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

당해 분야에 공지된 "표적화 항암 요법"은, 활성화 또는 비활성화될 때, 악성 과정의 퇴행 또는 파괴를 유발하는 한편 건강한 조직에 대한 부작용을 최소화할 수 있는 잘 정의된 표적 또는 생물학적 경로에 특이적으로 작용하는 구체적인 메커니즘을 갖는 약물의 전신 투여를 지칭한다 (문헌 [Li et al, Target Oncol. 2012;7(1):69-85]). "면역 기반 요법" 또는 "면역 요법"은 면역 반응을 유도, 증진 또는 억제하는 질병의 치료이다. 암의 맥락에서, 면역 기반 요법은 보통, 예를 들어, 본 출원에서 하기에 기재된 바와 같은 면역 치료제를 사용하여, 면역 반응을 유도 및/또는 증진하는 요법을 지칭한다.

본 발명의 의미 내의 PD-1 길항제 및 이의 모든 실시 형태는 PD-1과 이의 수용체(들)의 상호 작용을 억제하는 화합물이다. PD-1 길항제는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151] (본 출원에 참조로 포함됨)에서 검토된다. 상기 PD-1 길항제는 PD-1의 억제제 또는 PDL-1의 억제제, 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 항-PDL-1 항체이다. 리 등 (Li et al.)의 문헌에서 개시된 것들 뿐만 아니라 본 출원에서 하기에 개시되는 추가의 항체들과 같은 임의의 PD-1 길항제, 특히, 항체를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 PD-1 길항제 및 이의 모든 실시 형태는 하기 항체들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

- 펨브롤리주맙 (항-PD-1 항체);

- 니볼루맙 (항-PD-1 항체);

- 피딜리주맙 (항-PD-1 항체);

- PDR-001 (항-PD-1 항체);

- 아테졸리주맙 (항-PDL-1 항체);

- 아벨루맙 (항-PDL-1 항체);

- 더발루맙 (항-PDL-1 항체);

- 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5 (항-PD1 항체).

예를 들어, 문헌 [Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44]에 개시된 펨브롤리주맙 (예전에 람브롤리주맙으로도 또한 공지됨; 상표명 Keytruda; MK-3475로도 또한 공지됨)은, PD-1에 결합하는 사람화 IgG4 단클론 항체이며; 이것은 Fc-매개된 세포독성을 예방하도록 설계된 C228P에서의 돌연변이를 포함한다. 펨브롤리주맙은, 예를 들어, 미국 특허 US 8,354,509 및 국제공개공보 WO 2009/114335에 개시되어 있다. 이것은 절제 불가능 흑색종 또는 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자 및 전이성 NSCLC 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.

니볼루맙 (CAS 등록 번호: 946414-94-4; BMS-936558 또는 MDX1106b)은 검출 가능한 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular toxicity: ADCC)이 결여된, PD-1을 특이적으로 차단하는 완전한 사람 IgG4 단클론 항체이다. 니볼루맙은, 예를 들어, 미국 특허 US 8,008,449 및 국제공개공보 WO 2006/121168에 개시되어 있다. 이것은 절제 불가능 흑색종, 전이성 흑색종, 전이성 NSCLC 및 진행성 신세포 암종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.

피딜리주맙 (CT-011; Cure Tech)은 PD-1에 결합하는 사람화 IgG1k 단클론 항체이다. 피딜리주맙은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2009/101611에 개시되어 있다.

PDR-001 또는 PDR001은 PD-1에 대한 PDL-1 및 PD-L2의 결합을 차단하는 높은 친화성의 리간드 차단성 사람화 항-PD-1 IgG4 항체이다. PDR-001은 국제공개공보 WO 2015/112900 및 WO 2017/019896에 개시되어 있다.

본 발명의 이러한 양태 및 임의의 다른 양태에 따르면, 항체 PD1-1 내지 PD1-5는 EP 16170174.3에 개시된 바와 같은 항체 분자이며, 추가로 하기 표 9에 나타낸 서열에 의해 정의된다.

따라서, PD1-1은 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지며;

PD1-2는 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지며;

PD1-3은 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지며;

PD1-4는 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가지며;

PD1-5는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.

본 발명의 추가의 양태는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항-CD73 항체 분자의 용도이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 양태는 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체와 같은 PD-1 길항제의 추가의 용도를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 항-PD-1 항체는 본 출원에서 기재된 바와 같은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 항-PDL-1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 실시 형태에서, 상기 항-CD73 항체 분자는 상기 PD-1 길항제와 동시에 (simultaneously), 동시에 (concurrently), 순차적으로, 연속적으로, 교대로 또는 개별적으로 투여되어야 한다.

본 발명의 의학 용도 양태는 본 발명의 구체적인 항-CD73 항체 분자 및/또는 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD-1 길항제 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

이들의 생물학적 특성으로 인해, 본 발명의 항체는 암과 같은 과도하거나 또는 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 적합하다.

본 출원에서 사용되는 "암"이라는 용어는 조직 병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계 없이 모든 유형의 암성 성장 또는 종양원성 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질 전환 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 암성 장애의 예로는 고형 종양, 혈액학적 암, 연조직 종양 및 전이성 병변이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서 개시된 항체 분자를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 예시적인 암으로는 전형적으로 면역 요법에 반응을 보이는 암이 포함된다.

예를 들어, 하기의 암, 종양 및 기타 증식성 질환이 본 발명에 따른 항체로 치료될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

고형 종양의 예로는 간, 림프구, 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로 상피 세포), 인두에 영향을 미치는 것들과 같은 다양한 장기 시스템의 악성 종양 종양, 예를 들어, 육종 및 암종 (선암종 및 편평 세포 암종 포함)이 포함된다. 선암종으로는 대부분의 결장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장과 같은 악성 종양이 포함된다. 편평 세포 암종은, 예를 들어, 폐, 식도, 피부, HNSCC, 구강, 항문 및 자궁 경부에서의 악성 종양을 포함한다.

치료될 수 있는 추가의 징후로는 신장암 (예를 들어, 투명 세포 암종과 같은 신암), 위장암, 위암, CRC, 결장 암종, 항문 부위 암, 췌장암, 난소암, 흑색종 (예를 들어, 피부 또는 안내 악성 흑색종과 같은 전이성 악성 흑색종), 유방암, HNSCC, HCC, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 비-소세포 폐암 (NSCLC), 비-NSCLC, 신경교종, 자궁 내막암, 전립선암 (예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종 또는 거세 저항성 전립선암 (castrate resistant prostate cancer: CRPC)), 갑상선암, 신경모세포종, 교모세포종 (다형성 교모세포종), 자궁 경부암, 위암, 방광암, 간암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 비부비동 자연 살해 림프종, 골암, 자궁암, 고환암, 난관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 아동기 고형 종양, 요관암, 신우암, 중추 신경계 신생물 (central nervous system: CNS), 원발성 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것들을 포함한 환경 유발암, 바이러스 관련 암 (예를 들어, 사람 유두종 바이러스 (human papilloma virus: HPV) 관련 종양) 및 2 가지 주요 혈액 세포 계통, 즉, 골수 세포주 (과립구, 적혈구, 혈소판, 대식 세포 및 비만 세포 생산) 또는 림프구 세포주 (B, T, NK 및 형질 세포 생산) 중 하나로부터 유래된 혈액학적 악성 종양, 예를 들어, 모든 유형의 백혈병, 림프종 및 골수종, 예를 들어, 급성, 만성, 림프구성 및/또는 골수성 백혈병, 예를 들어, 급성 백혈병 (acute leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병 (acute myelogenous leukemia: AML), 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia: CLL), 만성 림프성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia: CML), 미분화형 AML (MO), 골수아구성 백혈병 (myeloblastic leukemia: Ml), 골수아구성 백혈병 (M2; 세포 성숙), 전골수세포성 백혈병 (M3 또는 M3 변이체 [M3V]), 골수단구성 백혈병 (M4 또는 호산구 증가증 동반 M4 변이체 [M4E]), 단핵구 백혈병 (M5), 적백혈병 (M6), 거핵아구성 백혈병 (M7), 분리된 과립구 육종 및 녹색종; 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma: HL), 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL), B 세포 림프종, 전구체 림프종, 림프 형질 세포성 림프종, 림프구성 림프종, 급성 골수성 림프종, 단핵구성 B 세포 림프종, 점막 관련 림프성 조직 (mucosa-associated lymphoid tissue: MALT) 림프종, 역형성 (예를 들어, Kil+) 대세포 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병, 외투 세포 림프종, 혈관 면역 모세포성 T-세포 림프종, 혈관 중심 림프종, 장 T-세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종, T-림프아구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 전구체 T-림프아구성 림프종, 이식후 림프구 증식성 장애, 진성 조직구성 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프아구성 림프종 (lymphoblastic lymphoma: LBL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 미만성 조직구성 림프종 (diffuse histiocytic lymphoma: DHL), 면역 모세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 피부 T-세포 림프종 (cutaneous T-cell lymphoma: CTLC) (균상 식육종 또는 세자리 증후군으로도 또한 호칭됨), 역형성 대세포 림프종, 및 발덴스트룀 거대 글로불린 혈증을 동반한 림프 형질 세포성 림프종 (lymphoplasmacytoid lymphoma: LPL); 골수종, 예를 들어, IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비분비성 골수종, 무증상 골수종 (무통성 골수종으로도 또한 호칭됨), 고립성 형질 세포종 및 다발성 골수종, 모발상 세포 림프종; 골수계 조혈 종양, 중간엽 기원 종양, 예를 들어, 섬유 육종 및 횡문근 육종; 정상피종, 기형 암종, 중추 및 말초 신경계 종양, 예를 들어, 성상 세포종, 신경초종; 중간엽 기원 종양, 예를 들어, 섬유 육종, 횡문근 육종 및 골 육종; 및 기타 종양, 예를 들어, 건피증, 색소성 건피증, 각질 극세포종, 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형 암종, 림프계 조혈 종양, 예를 들어, 소세포 및 대뇌양 세포 유형을 포함한 T-전림프구성 백혈병 (T-prolymphocytic leukemia: TPLL)과 같은 T-세포 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않는 T-세포 및 B-세포 종양; 바람직하게는 T-세포 유형의 거대 과립 림프구 백혈병 (large granular lymphocyte leukemia: LGL); a/d T-NHL 간 비장 림프종; 말초/후흉선 T 세포 림프종 (다형성 및 면역 모세포성 서브 타입); 혈관 중심 (비강) T-세포 림프종; 직장암; 및 상기 암의 임의의 조합이 포함된다. 본 출원에서 기재된 방법은 또한 전이성 암, 이전 치료제에 대해 내성 또는 불응성인 암 (예를 들어, 차단성 CTLA-4 또는 PD-1 또는 PDL-1 항체에 의한 이전 면역 요법에 대해 불응성인 암), 및 재발성 암의 치료에 사용될 수 있다.

체내의 특정 위치/기원을 특징으로 하는 상기에 언급된 모든 암, 종양, 신생물 등은 원발성 종양과 이로부터 유도되는 전이성 종양 둘 다를 포함하는 것을 의미한다.

환자가 (암 세포 자체 상에서 또는 종양 내의 간질 또는 면역 세포 상에서) CD73의 높은 발현을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우; 및/또는 상기 암이 면역 세포, 예를 들어, 종양 침윤성 림프구에 의해 침윤되는 경우, 상기 환자가 (본 출원에서 기재된 바와 같은) 본 발명의 항체 분자에 의한 치료에 반응할 가능성이 보다 높다는 것은 가능하다. CD73의 일부 발현이 필요할 것으로 예상되지만, 본 발명의 항체 분자에 의한 치료는 CD73의 높은 발현을 갖는 암에 반드시 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 한 실시 형태는 치료되는 환자가 CD73의 높은 발현을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 앓고 있고/있거나 상기 암이 면역 세포에 의해 침윤되는 경우이다. 일부 실시 형태에서, 상기 환자는 종양 내의 암, 간질 또는 면역 세포 상에서 PDL-1 및/또는 CD73의 높은 발현을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 앓고 있으며, 본 출원에서 기재된 바와 같은 항-CD73 항체와 PD-1 길항제 둘 다로 치료된다.

이러한 발현은, 예를 들어, 암 세포, 종양 침윤성 림프구, 예를 들어, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포, 종양 혈관 구조, 종양 간질 상에서, 유세포 계측법 또는 면역 조직 화학과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 치료되는 환자는 CD73의 증가된 발현에 기초하여 선택된다.

또한, 환자가 높은 돌연변이 부담을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우, 상기 환자가 (본 출원에서 기재된 바와 같은) 본 발명의 항체 분자에 의한 치료에 반응할 가능성이 더 높다는 것은 가능하다. 높은 돌연변이 부담을 평가할 수있는 방법의 예로는, 암이 미세부수체 불안정성 또는 불량한 DNA 불일치 복구 효율을 갖는 것을 특징으로 하는지 여부를 결정하는 것이 포함된다. 이러한 암은 보다 면역원성이므로 본 발명의 항체 분자와 같은 면역 조절 치료 요법에 의한 치료에 반응할 가능성이 보다 높다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 한 실시 형태는 치료되는 환자가 높은 돌연변이 부담을 갖는 것을 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우이다.

본 발명의 항체 분자는 제1 라인, 제2 라인 또는 임의의 추가 라인 치료의 맥락에서 치료 요법에 사용될 수 있다.

하나의 실시 형태에서, 치료되는 환자는 이전에 또 다른 치료제에 의한 치료를 받은 적이 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 치료제는 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD-1 길항제, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 바와 같은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 또는 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5일 수 있다.

하나의 실시 형태에서, 치료되는 환자는 상기 치료제에 의한 치료에 대한 불량한 반응자이다. 예를 들어, 상기 환자는 상기 치료제에 의한 치료에 무반응성이거나, 최소 반응성이거나, 충분히 반응을 보이지 않는 것으로 공지되어 있는 암을 앓을 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 치료제에 의한 치료에 대한 불량한 반응자는 암 조직 또는 암 인접 조직이 (예를 들어, 기준과 비교하여) 불충분하거나 낮은 수준의 염증을 특징으로 하는 개체이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 치료제에 의한 치료에 대한 불량한 반응자는 상기 치료제로 치료를 받았으며 암이 진행된 개체이다. 하나의 실시 형태에서, 불량한 반응자이거나 불량한 반응성인 암을 앓고 있는 개체는 상기 치료제에 의한 치료에 대해 불량한 질병 예후를 갖는 개체이다. 상기 치료제에 의한 치료에 대해 불량한 반응을 보이는 개체는, 예를 들어, 하나 이상의 예측 인자에 기초하여 (예를 들어, 양호한 질병 예후를 보이는 개체와 비교하여) 암 진행의 위험이 높은 것으로 확인될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 예측 인자는 종양 미세 환경에서 (종양 또는 종양 인접 조직에서) CD73 발현 T 세포의 증가된 수 및/또는 CD73 발현 세포 또는 아데노신 수준의 증가된 수준의 존재를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 예측 인자는 하나 이상의 유전자에서 돌연변이의 존재 또는 부재를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 돌연변이는 T 세포에 의해 인식되는 네오-에피토프를 정의한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 예측 인자는 종양 세포에서 하나 이상의 유전자 또는 단백질, 예를 들어, PDL-1의 발현 수준, 종양 세포 상에서 PDL-1의 감소되거나 상승된 수준을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 예측 인자는 순환 또는 종양 환경하에 이펙터 T 세포에서 하나 이상의 유전자 또는 단백질, 예를 들어, PDL-1의 발현 수준을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 예측 인자는 상기에서 기재된 바와 같은 높은 돌연변이 부담을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 치료제는 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD-1 길항제, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 바와 같은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 또는 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5이다.

본 발명의 항체 분자는 상기에서 언급된 질환의 예방, 단기간 또는 장기간 치료에, 임의로 또한 방사선 요법, 화학 요법 및/또는 수술과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 실시 형태에서, 치료되는 환자는 이전에 방사선 요법 또는 화학 요법 (하기에서 추가로 기재된 바와 같음)으로 치료를 받은 적이 있다. 하나의 실시 형태에서, 치료되는 환자는 상기에서 기재된 바와 같은 방사선 요법 또는 화학 요법에 의한 치료에 대한 불량한 반응자이다.

물론, 상기 내용은 상기 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효 용량을 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 각종 방법에서 본 발명의 항체 분자의 용도, 및 이러한 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 이러한 항체 분자의 용도, 및 본 발명의 이러한 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 및 본 발명의 이러한 항체를 포함하는 약제의 조제 및/또는 제조 등을 포함한다.

다른 활성 물질 또는 치료제와의 조합

본 발명의 항-CD73 항체 분자, 또는 본 발명의 항-CD73 항체와 PD-1 길항제의 조합은 단독으로, 또는, 특히 암세포에서 혈관 형성, 신호 전달 경로 또는 유사 분열 체크 포인트를 억제하는 치료학적 활성 화합물 또는 화학 요법제, 예를 들어, DNA 손상제로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제(들) 또는 시술(들)과 조합하여 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 이러한 조합에서 사용되는 항-CD73 항체는 본 발명의 제1 양태에서 상기에 기재된 임의의 항체일 수 있다. 바람직한 항-CD73 항체는 B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6이다 (표 9).

일부 실시 형태에서, 당해 분야에 공지된 다른 항-CD73 항체가 제1 양태의 항체 대신에 또는 이에 추가하여 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 본 발명의 제1 양태의 항-CD73 항체 대신에, 또 다른 항-CD73 항체, 예를 들어, MEDI9447, BMS986179, CPX-006, CPX-0016, 또는 국제공개공보 WO 2008/007648, WO 2016/075099, WO 2016/081748, WO 2016/055609, WO 2016/131950, WO 17/064043, WO 2017/100670, WO 17/152085 또는 WO 2018/013611에 기재된 바와 같은 항체도 또한 사용될 수 있다.

추가의 치료제는 동일한 약제학적 제제와 함께, 임의로 이의 구성 성분으로서 동시에, 또는 항체 분자의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 추가의 치료제로는 EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK 및 PI3 키나아제, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, IAP (SMAC 모방체), Bcl-2, Mcl-1, HDAC (히스톤 데아세틸라아제), GSK3β, PDK1, PTK2, IGF-R 또는 IR의 억제제들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 억제제가 있을 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

추가의 치료제의 추가 예로는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, 해지호그 (hedgehog) 길항제, JAK/STAT의 억제제, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀, Rho 또는 유비퀴틴화 경로의 억제제 또는 Notch 신호 전달 경로의 또 다른 억제제, 또는 c-FLIP (세포성 FLICE 억제 단백질)의 조절제가 있다.

Aurora 억제제에 대한 예로는 PHA-739358, AZD-1152, AT　9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735가 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

PLK 억제제에 대한 예로는 GSK-461364가 있다.

raf 억제제에 대한 예로는 BAY-73-4506 (또한 VEGFR 억제제), PLX 4032, RAF-265 (또한 추가로 VEGFR 억제제), 소라페닙 (또한 추가로 VEGFR 억제제) 및 XL 281이 있다.

KSP 억제제에 대한 예로는 이스피네십, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK　246053A, GSK-923295, MK-0731 및 SB-743921이 있다.

SMAC 모방체 (IAP 길항제)에 대한 예로는 LCL-161, Debio 1143 및 ASTX-660이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

src 및/또는 bcr-abl 억제제에 대한 예로는 다사티닙, AZD-0530, 보수티닙, XL 228 (또한 IGF-1R 억제제), 닐로티닙 (또한 PDGFR 및 cKit 억제제), 이마티닙 (또한 cKit 억제제) 및 NS-187이 있다.

PDK1 억제제에 대한 예로는 BX-517이 있다.

Rho 억제제에 대한 예로는 BA-210이 있다.

PI3 키나아제 억제제에 대한 예로는 PX-866, BEZ-235 (또한 mTor 억제제), XL 418 (또한 Akt 억제제), XL-147 및 XL 765 (또한 mTor 억제제)가 있다.

cMet 또는 HGF의 억제제에 대한 예로는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 억제제), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR의 억제제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 억제제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 및 AV-299가 있다.

c-Myc 억제제에 대한 예로는 CX-3543이 있다.

Flt3 억제제에 대한 예로는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 억제제), KW 2449, 레스타우르티닙 (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 억제제), TG-101348 (또한 JAK2의 억제제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 억제제), 수니티닙 (또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 억제제) 및 탄두티닙 (또한 PDGFR 및 cKit의 억제제)가 있다.

HSP90 억제제에 대한 예로는 타네스피마이신, 알베스피마이신, IPI-504 및 CNF 2024가 있다.

JAK/STAT 억제제에 대한 예로는 CYT-997 (튜불린과 또한 상호 작용함), TG 101348 (또한 Flt3의 억제제) 및 XL-019가 있다.

Mek 억제제에 대한 예로는 ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 및 XL　518이 있다.

mTor 억제제에 대한 예로는 템시롤리무스, AP-23573 (VEGF 억제제로서 또한 작용함), 에베롤리무스 (추가로 VEGF 억제제), XL-765 (또한 PI3 키나아제 억제제) 및 BEZ-235 (또한 PI3 키나아제 억제제)가 있다.

Akt 억제제에 대한 예로는 페리포신, GSK-690693, RX-0201 및 트리시리빈이 있다.

cKit 억제제에 대한 예로는 AB-1010, OSI-930 (VEGFR 억제제로서 또한 작용함), AC-220 (또한 Flt3 및 PDGFR의 억제제), 탄두티닙 (또한 Flt3 및 PDGFR의 억제제), 액시티닙 (또한 VEGFR 및 PDGFR의 억제제), XL-999 (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 억제제), 수니티닙 (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR의 억제제) 및 XL-820 (VEGFR 및 PDGFR 억제제로서 또한 작용함), 이마티닙 (또한 bcr-abl 억제제), 닐로티닙 (또한 bcr-abl 및 PDGFR의 억제제)이 있다.

해지호그 길항제의 예로는 IPI-609 및 CUR-61414가 있다.

CDK 억제제의 예로는 셀리시클립, AT-7519, P-276, ZK-CDK (VEGFR2 및 PDGFR도 또한 억제함), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 및 AG 024322가 있다.

프로테아좀 억제제에 대한 예로는 보르테조밉, 카필조밉 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 억제제)가 있다.

NFkappaB 경로 억제제에 대한 예로는 NPI-0052가 있다.

유비퀴틴화 경로 억제제에 대한 예로는 HBX-41108이 있다.

바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 항혈관 형성제이다.

항혈관 형성제에 대한 예로는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 억제제 또는 각각의 리간드 (예를 들어, 페갑타닙과 같은 VEGF 억제제 또는 항-VEGF 항체 베바시주맙), 및 탈리도마이드가 있으며, 이러한 제제는 닌테다닙, 베바시주맙, 모테사닙, CDP-791, SU-14813, 텔라티닙, KRN-951, ZK-CDK (또한 CDK의 억제제), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (면역 조절 약물), 탈리도마이드 유도체 CC-4047, 레날리도마이드, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙, 세디라닙, XL-999 (또한 cKit 및 Flt3의 억제제), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (또한 Flt3의 억제제), 수니티닙 (또한 cKit 및 Flt3의 억제제), 액시티닙 (또한 cKit의 억제제), 레스타우르티닙 (또한 Flt3 및 PKC의 억제제), 바탈라닙, 탄두티닙 (또한 Flt3 및 cKit의 억제제), 파조파닙, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트 (또한 Raf의 억제제), RAF-265 (또한 Raf의 억제제), 반데타닙, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (또한 EGFR 및 Her2의 억제제), BAY-57-9352 (또한 Raf의 억제제), BAY-73-4506 (또한 Raf의 억제제), XL 880 (또한 cMet의 억제제), XL-647 (또한 EGFR 및 EphB4의 억제제), XL 820 (또한 cKit의 억제제) 및 닐로티닙 (또한 cKit 및 brc-abl의 억제제)으로부터 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

추가의 치료제는 또한 EGFR 억제제로부터 선택될 수 있으며, 이것은 소분자 EGFR 억제제 또는 항-EGFR 항체일 수 있다. 항-EGFR 항체에 대한 예로는 세툭시맙, 파니투무맙, 마투주맙이 있지만 이들에 한정되는 것은 아니며; 소분자 EGFR 억제제에 대한 제피티닙, 아파티닙, 오시메르티닙 및 올무티닙이 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. Another example for an EGFR 조절제에 대한 또 다른 예로는 EGF 융합 독소가 있다.

본 발명의 항체 분자와 조합하는데 유용한 EGFR 및 Her2 억제제 중에는 라파티닙, 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 세툭시맙, 트라스투주맙, 니모투주맙, 잘루투무맙, 반데타닙 (또한 VEGFR의 억제제), 퍼투주맙, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 억제제), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab이 있다.

본 발명의 항체 분자에 의한 요법에서 유리하게 조합될 수 있는 기타 제제로는 토시투무맙 및 이브리투모맙 티욱세탄 (2개의 방사선 라벨링된 항-CD20 항체), 알렘투주맙 (항-CD52 항체), 데노수맙 (파골 세포 분화 인자 리간드 억제제), 갈릭시맙 (CD80 길항제), 오파투무맙 (CD20 억제제), 자놀리무맙 (CD4 길항제), SGN40 (CD40 리간드 수용체 조절제), 리툭시맙 (CD20 억제제), 에프라투주맙 (CD22 항체) 또는 마파투무맙 (TRAIL-1 수용체 작용제)가 있다.

본 발명의 항체 분자와 조합하여 사용될 수 있는 기타 화학 요법 약물은 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬 (예를 들어, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 풀베스트란트, 메게스트롤 아세테이트, 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 부세렐린 아세테이트, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 메드록시프로게스테론, 옥트레오타이드, 아족시펜, 파시레오타이드, 바프레오타이드), 아로마타아제 억제제 (예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 리아로졸, 엑세메스탄, 아타메스탄, 포르메스탄), LHRH 작용제 및 길항제 (예를 들어, 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드, 아바렐릭스, 세트로렐릭스, 데슬로렐린, 히스트렐린, 트립토렐린), 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 페메트렉시드와 같은 항폴레이트, 5 플루오로우라실, 카페시타빈, 데시타빈, 넬라라빈 및 젬시타빈과 같은 피리미딘 유사체, 머캅토퓨린 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 사이타라빈, 플루다라빈과 같은 퓨린 및 아데노신 유사체); 항종양 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 아이다루비신과 같은 안트라사이클린, 미토마이신-C, 블레오마이신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미톡산트론, 픽산트론, 스트렙토조신); 백금 유도체 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 로바플라틴, 사트라플라틴); 알킬화제 (예를 들어, 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 다카바진, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 하이드록시우레아, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 예를 들어, 카무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사분열제 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 빈플루닌 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드; 및 파클리탁셀, 도세탁셀 및 이들의 제형, 라로탁셀과 같은 탁산; 익사베필론, 파투필론, ZK-EPO와 같은 에포틸론); 토포아이소머라아제 억제제 (예를 들어, 에토포사이드 및 에토포포스, 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸과 같은 에피포도필로톡신) 및 여러 가지 종류의 화학 요법제, 예를 들어, 아미포스틴, 아나그렐라이드, 인터페론 알파, 프로카바진, 미토탄, 및 포르피머, 벡사로텐, 셀레콕시브로부터 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

ATP 생성 화학 요법제, 예를 들어, 독소루비신과 CD73 차단을 조합하는 양성 효과가 입증된 독소루비신이 특히 바람직하다 (문헌 [Loi, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(27):11091-6]).

특정 실시 형태에서, 상기 추가의 치료제는 다음 조절제와 같은 추가의 면역 치료제일 수 있다: TIM-1, TIM3, TIM-4, PDL-1 (예를 들어, 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 더발루맙), PD-L2, LAG3, CTLA-4, Galectin 9, Galectin-1, CD69, CD113, GPR56, CD48, GARP, CAECAM-1, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM, CD39, TGFβ, IL-10, Fas 리간드, ICOS, IDO, Toll 유사 수용체, B7 계열 (B7-1, B7-2, B7-H1 (PDL-1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) 및 B7-H6).

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 면역 치료제는 CD40 및 CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-lBBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLlA, TRAMP/DR3, EDAR, EDAl, XEDAR, EDA2, TNFRl, 림포톡신 α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림포톡신 α1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR을 비롯한 동족 TNF 수용체 계열 구성원에 결합하는 분자의 TNF 계열의 구성원이다.

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 면역 치료제는 (i) T 세포 활성화를 억제하는 사이토카인의 길항제 (예를 들어, IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "면역 억제 사이토카인") 및/또는 (ii) T 세포 활성화를 자극하는 사이토카인 및/또는 면역 반응을 자극하기 위한, 예를 들어, 암과 같은 증식성 질환을 치료하기 위한 사이토카인, 예를 들어, IL2의 작용제로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 면역 치료제는 CD28, GITRL, OX40L, CD27 및 CD28H와 같은 T 세포 활성화를 자극하는 단백질의 작용제이다.

본 출원에서 기재된 항-CD73 항체는 또한 Fcα 또는 Fcγ 수용체 발현 이펙터 세포를 종양 세포에 표적화하는 이중 특이적 항체를 설계하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 5,922,845 및 US 5,837,243 참조). 이중 특이적 항체는 2개의 개별 항원을 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 수용체/항종양 항원 (예를 들어, Her-2/neu) 이중 특이적 항체를 사용하여 대식 세포를 종양 부위에 표적화하였다. 이러한 표적화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화할 수 있다. 대안으로, 항원은 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중 특이적 항체의 사용에 의해 DC에 직접 전달될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 상기 면역 치료제는 암 백신일 수 있다.

CD73 항체와 조합될 수 있는 기타 분자로는 NK 세포 상의 억제 수용체 길항제 또는 NK 세포 상의 활성화 수용체의 작용제, 예를 들어, KIR의 길항제 (예를 들어, 이릴루맙)가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 치료제는 CSF-1R 길항제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 대식 세포 또는 단핵구를 억제하거나 고갈시키는 제제일 수 있다.

다른 실시 양태에서, 상기 추가의 치료제는, 예를 들어, Treg 세포를 고갈시키거나 차단하는 제제, 예를 들어, CD25에 특이적으로 결합하는 제제일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 추가의 치료제는 A2A 또는 A2B 수용체의 억제제일 수 있다. 그 예로는 ATL-444, 이스트라데필린 (KW-6002), MSX-3, 프렐라데난트 (SCH-420,814), SCH-58261, SCH-412348, SCH-442416, ST-1535, 카페인, VER-6623, VER-6947, VER-7835, 비파데난트 (BIIB-014), PD116,948, ZM 241385, KW 6002, CGS 15943, ST1535, SYN-115, PSB1115, PSB 603, MRS 1754, CPI-444, PBF-509, AZD-4635 또는 ZM-241385가 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 추가의 치료제는 A2AR 길항제, CD39 길항제, LAG-3 길항제, CTLA-4 길항제, EGFR 길항제 또는 HER2 길항제이다.

2개 이상의 물질 또는 기본 제제가 조합된 치료 계획의 일부로서 사용되어야 할때, 이들은 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해, 본질적으로 동시에 (즉, 동시에 (simultaneously), 함께 (concurrently)) 또는 상이한 시점에 (예를 들어, 순차적으로, 연속적으로 (successively), 교대로, 연속적으로 (consecutively) 또는 임의의 다른 종류의 대체 계획에 따라) 투여 될 수있다.

상기 물질 또는 기본 제제가 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되어야 할 때, 이들은 상이한 약제학적 제형 또는 조성물로서 또는 조합된 약제학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 제제가 조합된 치료 계획의 일부로서 사용되어야 할 때, 상기 물질 또는 기본 제제의 각각은 상기 화합물 또는 기본 제제가 단독으로 사용될 때 사용되는 동일한 계획에 따라 동일한 양으로 투여될 수 있으며, 이러한 조합된 사용은 상승작용 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 제제의 조합된 사용이 상승작용 효과를 유도할 때, 투여될 물질 또는 기본 제제 중 하나, 그 이상 또는 전부의 양을 감소시키면서 목적하는 치료학적 작용을 여전히 달성하는 것도 또한 가능할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 이들이 통상의 양으로 사용될 때에 상기 물질 또는 기본 제제의 하나 이상의 사용과 관련되는 임의의 원치않는 부작용을 회피, 제한 또는 감소시키면서 여전히 목적하는 약리 또는 치료 효과를 달성하는데 유용할 수 있다.

물론, 상기 내용은 상기 조합 파트너와 조합 사용을 위한 본 발명의 항체의 제조 및 제조 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체와 조합 사용을 위한 상기에서 언급된 조합 파트너의 제조 및 제조 방법도 또한 포함된다.

본 발명의 항체 분자는 단독으로 또는 다른 치료 요법, 예를 들어, 수술 및/또는 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다.

키트, 및 제조 및 정제 방법

본 발명은 본 출원에서 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-CD73 항체 및 상기에서 기재된 바와 같은 질환 및 장애의 치료에 사용되는 다른 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 키트를 또한 포함한다.

하나의 실시 형태에서, 키트는 유효량의 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 단위 투여 형태로 함유하는 조성물을 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 키트는 유효량의 본 발명의 항-CD73 항체 분자를 단위 투여 형태로 함유하는 조성물 및 유효량의 PD-1 길항제, 예를 들어, 항 PD-1 항체, 가장 바람직하게는 본 출원에서 기재된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5를 단위 투여 형태로 함유하는 조성물을 모두 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 이러한 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하고; 이러한 용기는 상자, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터 팩, 또는 당해 분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층지, 금속 호일, 또는 약품 보관에 적합한 기타 재료로 만들어질 수 있다.

원하는 경우, 항-CD73 항체 분자는, 단독으로 또는 PD-1 길항제와 같은 또 다른 치료제와 조합하여, 항체/항체들을 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 설명서는 일반적으로 암의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 대한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시 형태에서, 설명서은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; 암 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 일정 및 투여; 주의 사항; 경고 사항; 적응증; 반대 적응증; 과다 복용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참조 사항. 설명서는 용기 (존재하는 경우) 상에 직접 인쇄되거나 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기 내에 또는 이와 함께 제공된 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 키트는 PD-1 길항제 (본 출원에서 추가로 기재된 바와 같음) 및 임의로 본 출원에서 상기에 기재된 바와 같은 추가의 치료제와 함께 본 출원에서 기재된 바와 같은 항-CD73 항체 분자를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항체 분자를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다:

- 본 발명의 항체의 형성을 허용하는 조건하에 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

- 상기 숙주 세포에 의해 발현된 항체 분자를 배양물로부터 회수하는 단계; 및

- 임의로, 본 발명의 항체 분자를 추가로 정제 및/또는 개질 및/또는 제형화하는 단계.

본 발명의 핵산은, 예를 들어, 코딩 서열 뿐만 아니라 조절 서열 및 임의로 천연 또는 인공 인트론을 포함하는 DNA 분자일 수 있거나, cDNA 분자일 수 있다. 이것은 자신의 원래 코돈을 가질 수 있거나, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현을 위해 특별히 채택된 최적화 코돈 용법을 가질 수 있다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 따르면, 본 발명의 핵산은 상기에서 정의된 바와 같은 본질적으로 분리된 형태이다.

본 발명의 핵산은 전형적으로 발현 벡터, 즉, 적합한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에 형질 감염될 때 폴리펩타이드의 발현을 제공할 수 있는 벡터에 통합될 것이다.

본 발명의 항체를 제조하기 위해, 통상의 기술자는 당해 분야에 널리 공지된 매우 다양한 발현 시스템, 예를 들어, 문헌 [Kipriyanow and Le Gall, 2004]에 의해 검토된 것들을 선택할 수 있다.

발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 숙주 세포와 상용 가능도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 두 DNA 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입된다.

편리한 벡터는, 임의의 VH (가변 중쇄) 또는 VL (가변 경쇄) 서열이 상기에서 기재된 바와 같이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 기능적으로 완전한 사람 CH (불변 중쇄) 또는 CL (불변 경쇄) 면역글로불린 서열을 인코딩하는 것들이다. 항체 중쇄의 경우, 이것은 대립 유전자 변이체를 비롯하여 임의의 IgG 이소 타입 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 또는 기타 면역글로불린일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 항체 쇄를 인코딩하는 DNA는, 신호 펩타이드가 성숙 항체 쇄 DNA의 아미노 말단에 프레임 내에서 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 비-면역글로불린 단백질 유래의 이종 펩타이드일 수 있다. 대안으로, 항체 쇄를 인코딩하는 DNA 서열은 이미 신호 펩타이드 서열을 포함할 수 있다.

항체 쇄 DNA 서열에 추가하여, 재조합 발현 벡터는 전형적으로 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호 및 숙주 세포에서 항체 쇄의 발현을 조절하는 다른 발현 조절 요소를 포함하는 조절 서열, 임의로 이종 조절 서열을 보유한다. 프로모터 서열 (포유 동물 세포에서 발현을 위해 예시됨)에 대한 예로는 CMV (예를 들어, CMV 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 폴리오마 및 강력한 포유 동물 프로모터, 예를 들어, 본래 면역글로불린 및 액틴 프로모터로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 있다. 폴리아데닐화 신호에 대한 예로는 BGH 폴리A, SV40 후기 또는 조기 폴리A가 있으며; 대안으로, 면역글로불린 유전자의 3' UTR 등을 사용할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 원점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 본 발명의 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 DNA 분자를 포함하는 벡터는, 리포좀 매개성 형질 감염, 다가 양이온 매개성 형질 감염, 원형질체 융합, 미세 주입, 인산 칼슘 침전, 전기 천공 또는 바이러스 벡터에 의한 전달을 비롯하여 당해 분야에 널리 공지된 형질 감염 방법에 따라, 숙주 세포, 예를 들어, 세균 세포 또는 고등 진핵 세포, 예를 들어, 포유 동물 세포에 도입될 수 있다.

바람직하게는, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA 분자는 숙주 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포에 공동 형질 감염되는 2개의 발현 벡터에 존재한다.

발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유 동물 세포주는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 특히, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0, SP2/0 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 사람 암종 세포 (예를 들어, Hep G2 및 A-549 세포), 3T3 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손을 포함한다. 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유 동물 세포, 또는 효모, 곤충 및 식물 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다른 진핵 세포, 또는 세균과 같은 원핵 세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 숙주 세포에서 항체 분자의 발현을 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체 분자는 바람직하게는 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수되거나, 예를 들어, 분비 신호 없이 발현되는 경우, 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 항체의 실질적인 동종 제제가 수득되는 방식으로, 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질에 사용되는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체 분자를 정제하는 것이 필요하다. 예로서, 본 발명의 항체 분자를 수득하는데 유용한 최신 정제 방법은, 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물로부터 세포 및/또는 입자성 세포 잔해물의 제거를 포함한다. 그 다음, 항체는, 예를 들어, 면역 친화성 또는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, Sephadex 크로마토그래피, 및 실리카 상에서 또는 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산의 오염물로부터 정제된다. 항체 분자 제제를 수득하기 위한 과정의 최종 단계로서, 정제된 항체 분자는, 예를 들어, 치료학적 적용을 위해 하기에서 기재된 바와 같이 건조, 예를 들어, 감압 동결 건조 (lyophilized)될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 이러한 실시 형태에 반드시 한정되지 않고 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 화합물, 용량 및 투여 경로 뿐만 아니라 치료 조합을 비롯한 예 또는 이의 일부는 각각 그 자체로서 또는 상기 상세한 설명과 조합하여 본 발명의 일부를 형성한다.

실시예

실시예 1: CD73에 대한 항체의 생성 및 최적화

CD73 녹 아웃 마우스를, C-말단 6xHis 태그를 갖는 사람 CD73 (Uniprot 수탁 번호 P21589)의 완전한 세포외 도메인 및 C-말단 사람 Fc 태그 (서열 번호 131)를 갖는 마우스 CD73 (UniProt 수탁 번호 Q61503)의 완전한 세포외 도메인으로 면역화하였다. 단일 B 세포 항체 생성 플랫폼을 사용하여 Hit를 식별하고 회수하였다. 이들을 사람, 시노몰구스, 마우스 및 래트 CD73에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 실시예 2 내지 6에서 기재된 바와 같이 기능적 분석에서 CD73의 억제에 대해 테스트하였다. 이러한 분석에 따른 최상의 특성 세트를 갖는 항체 분자를 더욱 최적화된 변이체의 기초로 사용하였다.

파지 스크리닝 방법을 사용하여 이러한 항-CD73 마우스 항체 유래의 CDR을 중쇄 및 경쇄에 대해 밀접하게 일치하는 생식 세포로부터 사람 프레임워크에 대해 서열 최적화하였다 (문헌 [Singh et al., MAbs. 2015 Jul-Aug; 7(4): 778-791]). 변이체의 결합 활성을 ELISA로 평가하였다. 높은 비율의 사람 잔기 및 낮은 예측 면역원성 (낮은 Epivax 점수)을 갖는 사람 CD73에 대한 높은 친화성을 갖는 변이체를 선택하였다.

실시예 2: 표적 결합 및 세포 선택성

결합 활성 형식의 경우, 실험을 Bio-Rad ProteOn XPR36 기기 상에서 수행하였다. Protein A/G를 통해 항체를 포획하고, 비공유 이량체 항원을 포획된 표면 위에 흐르게 하였다. 본 실험을 위한 실행 완충액 및 모든 희석액을 PBS-T-EDTA 중에서 제조하였다. GLM 센서칩을 제조업자의 권고 사항에 따라 정규화하고 예비 조건화하였다. 센서 칩을 30 μL/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 EDC/s-NHS의 동일 혼합물에 의해 활성화시키고, 30 μL/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 재조합 Protein A/G (10 mM 아세테이트 (pH 4.5) 중의 50 μg/ml)에 의해 고정시켜 표면 상에서 약 5000 RU의 Protein A/G를 생성하였다. 센서 칩을 30 μL/분의 유속에서 300초 동안 수평 방향으로 1M 에탄올아민-HCl에 의해 탈활성화시켰다. 센서 칩을 100 μL/분의 유속에서 수평으로 2회, 수직으로 2회 18초의 0.85% 인산에 의해 재생시켰다.

약 300 RU의 항체를 30 μL/분의 유속에서 60초 동안 수직으로 Protein A/G 표면 상에 포획하였다. PBS-T-EDTA를100 μL/분의 유속에서 60초 동안 수평으로 주입하여 포획 표면을 안정화시켰다. 분석물 (사람 CD73-His)을 포획된 항체 위에 30 μL/분의 유속에서 600초 동안 수평으로 1200초의 해리로 주입하였다. 사람 CD73-His의 농도는 0 nM, 3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM 및 50 nM이었다. 0.85% 인산을 100 μL/분의 유속에서 18초 동안 수평으로 1회, 수직으로 1회 주입하여 표면을 재생시켰다.

미가공 데이터로부터 인터스팟 (interspot) (센서 표면과의 상호 작용) 및 블랭크 (PBS-T-EDTA 또는 0 nM 분석물)를 공제한다. Bio-Rad ProteOn Manager 소프트웨어를 사용하여, 센서그램 (sensorgram)을 1:1 Langmuir 결합에 전체적으로 피팅 (fitting)하여 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd) 및 평형 해리 상수 (KD) 값을 제공하였다.

CD73을 내인성으로 발현하는 세포주 뿐만 아니라 CD73 음성 세포주를 사용하여 FACS 기반 분석에서 세포 선택성을 결정하였다. CD73 양성 세포에서는 결합이 용이하게 검출되는 반면, CD73에 대해 음성인 세포에서는 어떠한 검출 가능한 결합도 1000 nM 농도까지 관찰되지 않았다.

항-CD73의 결합을 또한 SPR에 의해 마우스 CD73에 대해 결정하고, 사람 CD73 (P21589, "긴 이소 타입")에 대한 결합과 비교하였다.

테스트 항체는 마우스 CD73 보다 더 높은 친화성으로 사람 CD73에 결합되었다 (마우스 CD73 보다 사람 CD73에 C1: 96배, C2: 138배, C3: 117배, C4: 120배, C5: 163배, C6: 58배 더 높은 결합).

실시예 3: CD73 효소 기능의 억제

루시퍼라아제 기반 분석을 사용하여 CD73 효소 기능을 측정하였다. CD73 기질 AMP는 루시퍼라아제 반응의 생성물이며, 루시퍼라아제에 대한 억제 활성을 나타낸다. 플레이트를 차단한 다음, 재조합 사람 CD73 단백질을 첨가하였다. 그 다음, CD73 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 기질 AMP를 첨가하고, 플레이트를 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. CellTiterGlo 시약 (CellTiterGlo 발광 세포 생존능 분석 키트, Promega, 카탈로그 번호 #G7571)을 시약 완충액 중에 용해시키고, 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고, 암실에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. EnVision 2104 Multilabel Reader를 사용하여 발광 신호를 측정하였다.

표 2에서 나타낸 바와 같이, 본 출원에서 기재된 CD73 항체는 CD73의 효소 기능의 억제에 대해 낮은 나노 몰 IC₉₀ 값을 나타낸다. 나타낸 데이터는 2개의 독립적인 실험으로부터 수득된 것이다.

실시예 4: CD73 단백질 표면 수준의 감소

CD73 단백질 표면 수준의 감소를 유세포 계측법에 의해 결정하였다. Colo201 세포주를 1 시간 동안 및 24 시간 동안 CD73 항체와 함께 인큐베이션하고, 2차 항체를 사용하여 세포 표면 상의 CD73 결합 항체 수준을 측정하였다.

TripLE 용액 (Gibco, 번호 12604-013)을 첨가하여 Colo201 세포를 떠어내고, 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 24 시간 후, CD73 항체를 첨가하였다. 라벨링된 2차 항체를 사용하여 1 시간 및 24 시간 후에 샘플을 유세포 계측법에 의해 분석하였다. FlowJo X 소프트웨어 버전 10.0.7r2를 사용하여 샘플 분석을 수행하였다. 게이트된 집단의 평균 형광 강도 (fluorescence intensity: FI)를 시점 0에서 상응하는 평균 FI에 대해 정규화하였다 (CD73 항체와 함께 1 시간 인큐베이션). 그 다음, 데이터를 정규화하여 CD73 표면 수준 감소를 유도하지 않는 CD73 항체 (미국 출원공개 US 2009/0203538에서 "067-213 항체"로서 개시된 바와 같음)와 함께 인큐베이션된 세포의 형광 값을 100% (최대 CD73 수준)로 설정하였다.

본 출원에서 기재된 CD73 항체는 CD73 표면 수준의 감소를 유도하는데 중간 정도의 활성을 나타낸다. 나타낸 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 수득된 것이다.

실시예 5: 세포주에서 아데노신 형성의 억제

세포 기반 분석을 사용하여 CD73 억제에 의한 아데노신 수준의 감소를 결정하였다. Colo-201 세포에 대한 AMP의 추가는 세포 상에서 발현된 CD73에 의한 AMP의 아데노신의 전환을 초래한다. AMP의 전환을 본 출원에서 제공되는 바와 같은 본 발명의 항-CD73 항체에 의해 억제한다. Colo-201 세포를 37℃에서 24 시간 동안 CD73 항체의 존재하에 배양하였다. 그 다음, 아데노신 데아미나아제를 차단하기 위해 에리트로-9-(2-하이드록시-3-노닐)아데닌을, 아데노신 키나아제를 차단하기 위해 5-요오도투베르시딘을, 알칼리성 포스파타아제를 차단하기 위해 β-글리세로포스페이트를, ENT1-4를 차단하기 위해 디피리다몰을 각각 함유하는 차단 용액을 첨가한다 (문헌 [Ramakers 2008]). 20분의 인큐베이션 후, 300 μM AMP를 30분 동안 첨가하고, 15 mM HCl 용액의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. 각각의 mAb 농도에 대한 인큐베이션으로부터 취한 세포 상청액의 분취량 50 μl를, 내부 표준 물질로서 0.5 mM 동위 원소 라벨링된 ¹³C₅-아데노신 + 차단 용액 50 μl를 96-웰 플레이트 형식에 함유하는 아세토니트릴 500 μl에 첨가하였다. 보정 표준 물질을 12 단계의 연속 희석으로 제조하였다. 블랭크 매트릭스로서의 세포 인큐베이션 배지 50 μl + 각각의 표준 물질 또는 QC 용액 50 μl를, 내부 표준 물질로서 0.5 mM 동위 원소 라벨링된 ¹³C₅-아데노신을 함유하는 아세토니트릴 500 μl에 첨가하여 보정 및 품질 조절 샘플을 제조하였다. 원심 분리 후, 50 μl의 상청액을 또 다른 96-웰 플레이트로 옮기고, N₂하에 증발 건조시키고, 25% 메탄올 + 0.01% 포름산 중에 재용해시켰다. ESI + 이온화에 의한 단위 질량 분해능으로 HPLC-MS/MS에 의해 아데노신 농도를 결정하였다. 샘플을 CTC PAL HTS-xt 자동 샘플러 (주입 부피 5 μL)로 HPLC/MS 시스템에 주입하였다. 실온에서 Phenomenex Synergy Hydro-RP C18 역상 HPLC 컬럼 (입자 크기 2.5 μm, 컬럼 치수 2 x 50 mm)이 장착된 Agilent HP1200 HPLC 시스템으로 정량 분석을 수행하였으며, 용매 A로서 5 mmol/L 암모늄 아세테이트 (pH 4.0)와 용매 B로서 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴을 갖는 HPLC 구배를 700 μl/분의 유속과 샘플 당 5분의 사이클 타임으로 적용하였다. 용매 B는 0에서 3.0분까지 2%에서 15%로 증가하고, 3.0분에서 3.1분까지 95% B로 증가하고, 3.1분에서 4.0분까지 95% B로 일정하게 유지한 후, 4.0분에서 4.1분까지 2% B 및 4.1분에서 5.0분까지 컬럼 재평형으로 돌아갔다. HPLC 시스템을 MRM 모드에서 작동되는 ABSCIEX API5000 삼중 4극 질량 분광계에 연결하였다. ABSCIEX DiscoveryQuantTM 2.1 소프트웨어를 사용하여 디클러스터링 전위 (declustering potential: DP) 및 충돌 에너지 (collision energy: CE) 설정을 자동으로 최적화하였다. 아데노신에 대해 268.2에서 136.1 (DP: 62, CE: 27)로와 ¹³C₅-아데노신에 대해 273.3에서 136.2 (DP: 64, CE: 27)로의 MRM 전이를 정량화에 사용하였다 (드웰 시간: 70 ms). Turbo Ion Spray 공급원의 공급원 온도는 650℃로 설정하였다. 크로마토그램을 통합하고, 피크 면적을 Analyst® 1.5.1 (ABSCIEX)에 의해 결정하였다. 형성된 아데노신의 절대량을 아데노신 농도의 측정 및 인큐베이션 부피로부터 계산하였다. 가변적 언던 경사 (variable hill slope)를 갖는 대칭적 S자형 곡선 분석 프로그램 (Graph Pad PRISM)을 사용하여 데이터를 반복 계산에 의해 피팅하였다. AMP가 첨가되지 않은 이소 타입 처리된 세포에 대해 수득된 아데노신 수준을 100% 억제로 설정하고; AMP가 첨가된 이소 타입 처리된 세포에 대해 수득된 아데노신 수준을 0% 억제로 설정한다.

본 출원에서 기재된 CD73 항체는 Colo201 세포에서의 아데노신 수준을 이소 타입 처리된 세포 +/- AMP 첨가와 비교하여 >75% 감소시켰다.

본 출원에서 기재된 항-CD73 항체는 표 4에서 입증된 바와 같이 기준 항-CD73 항체 "MEDI9447" 및 "BMS986179" (상기에서 정의된 바와 같음)와 비교하여 Colo201 세포에서 아데노신 수준을 감소시키는데 있어 우수한 활성을 나타냈다.

실시예 6: T 세포 증식 및 IFNγ 방출의 억제

1차 사람 T 세포 분석을 사용하여 T 세포에 대한 CD73 억제의 효과를 조사하였다. STEMCELL Technologies의 사람 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 해동하고, T 세포를 음성 선별에 의해 농축시켰다 (T-세포 농축 키트, Easy Sep 음성 선별; Stem Technologies #19051). 공여체를 내부적으로 공여체 A~F로 라벨링하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 T 세포를 Cell Trace Violet (CellTraceTM Violet Proliferation Kit, Molecular Probes, #C34557)으로 라벨링하였다. 분석을 항-CD3 (Ultra-LEAFTM 정제된 항-CD3 항체, 클론 HIT3a, Biolegend, #300332)으로 예비 코팅된 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 4℃에서 밤새 수행하였다. CTV-라벨링된 T 세포를 플레이팅하고, 항-CD28 (Ultra-LEAFTM 정제된 항-CD28 항체, 클론 CD28.2 ;Biolegend, #302934) 및 항-huCD73 또는 항-TNP HuIgG1KO 대조군과 함께 상이한 농도로 인큐베이션하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 22 시간 인큐베이션 후, AMP (아데노신 5'-모노포스페이트 이나트륨 염; Sigma Aldrich, Cat# 01930)를 200 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 또 다른 5일 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 취하고, 제조업자의 설명서에 따라 Meso Scale Diagnostics V-PLEX Human IFN-γ Kit에 의해 IFN 감마 분비에 대해 분석하였다. AMP가 첨가된 자극된 이소 타입 처리된 세포에 대해 값을 정규화하였다. BD FACS Canto II Flow Cytometer 및 BD FACSDiva 소프트웨어 (버전 8.0.1)를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ 세포 상의 CTV 라벨의 분석에 의해 세포의 증식을 결정하였다. AMP가 첨가되지 않은 자극된 이소 타입 처리된 세포의 증식을 100% 억제로 설정하고; AMP가 첨가된 자극된 이소 타입 처리된 세포의 증식을 0% 억제로 설정하였다.

본 출원에서 기재된 CD73 항체는 T 세포 증식 및 사이토카인 방출을 복원한다.

본 출원에서 기재된 항체는 "MEDI9447" 및 "BMS986179"와 비교하여 특정 공여체의 1차 사람 T 세포에서 T 세포 증식 및 IFNγ 방출을 유도하는데 있어 우수한 활성을 나타낸다 (표 5 및 6). 따라서, 생성된 CD73 항체는 특정 공여체의 두 경쟁자와 비교하여 AMP에 의해 억제된 T 세포의 기능을 보다 높은 수준으로 복원하는 능력을 갖고 있다.

상기 표 5 및 6은 테스트 항-CD73 항체가 "MEDI9447" 및 "BMS986179"와 비교하여 특정 공여체에서 T 세포 증식 및 IFNγ 방출을 유도하는데 있어 우수한 활성을 나타낸다는 것을 입증한다. 데이터는 1 nM의 CD73 항체 농도에서; 공여체 당 4개의 생물학적 복제물의 직접 대면 비교로부터 수득된다.

실시예 7: 수지상 세포/T 세포 공동 배양

또한, 수지상 세포/T 세포 공동 배양 시스템을 확립하였다. 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심 분리에 의해 건강한 공여체의 헤파린화 혈액으로부터 단리하고, -150℃에서 냉동 보관하였다. PBMC를 해동하고, 단핵구를 음성 선별 (자성 비드)에 의해 농축시켰다. 단핵구를 3 ng/ml 사람 IL-4 및 50 ng/ml 사람 GM-CSF를 함유하는 배지에서 37℃ 및 5% CO₂하에 배양하고, 수지상 세포 (dendritic cell: DC)로 분화시켰다. 5일째에, 10 ng/ml TNF 알파를 성숙을 위해 첨가하고, 세포를 밤새 배양하였다. 상이한 공여체 유래의 PBMC를 해동하고, T 세포를 면역 자성 음성 선별에 의해 단리하고, 5 ng/ml 사람 IL-2를 함유하는 배지에서 밤새 배양하였다. T 세포의 웰 당 200000개의 세포를 항 PD-1 항체 펨브롤리주맙 (본 출원 및, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2009/114335 및 WO 2015/088847에서 추가로 기재된 바와 같음) 및 상이한 농도의 본 발명의 다양한 항-CD73 항체의 존재하에 96 웰 플레이트에서 동종 이계 성숙 DC의 웰 당 50000개 세포와 함께 공동 배양 하였다. 사람 IgG4Pro 및 사람 IgG1KO 이소 타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 22 시간 후, 아데노신 5'-모노포스페이트 이나트륨 염 (AMP)를 첨가하였다. 공동 배양물을 37℃에서 5일 동안 배양한 다음, 상청액을 취하고, 제조업자의 설명서에 따라 Meso Scale Diagnostics V-PLEX Human IFN-γ Kit에 의해 IFN 감마 분비를 분석하였다.

PD1, CD73 또는 둘 다를 억제하는 효과를 이러한 시스템에서 조사할 수 있다. AMP의 첨가는 항-PD1 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 본 출원에서 제공된 항체를 사용하는 항-CD73 처리는 이러한 AMP 매개성 억제의 역전을 초래하였다 (도 1 참조). 나타낸 데이터는 1 μg/ml의 CD73 항체 농도에서; 공여체 당 5개의 생물학적 복제물 및 항체의 직접 대면 비교로부터 수득된다.

실시예 8: 세포 결합 대 세포 비결합 CD73의 억제

Colo-201 세포를 37℃에서 24 시간 동안 CD73 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 차단 용액 ("세포주에서 아데노신 형성의 억제" 참조)을 20분 동안 첨가하였다. 세포를 원심 분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 새로운 낮은 결합 플레이트로 옮겼다. 세포를 세척하고, 300 μM AMP를 세포 뿐만 아니라 상청액에 첨가하였다. 30분의 인큐베이션 시간 후, 15 mM HCl 용액의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. 상청액을 취하고, 아세토니트릴/차단 용액 혼합물과 혼합하여 가능한 효소 반응을 정지시켰다. 샘플을 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의해 아데노신 수준에 대해 분석하였다. 이것은 세포 결합 CD73의 억제 대 세포 배양 상청액의 CD73 (세포 비결합 CD73)의 억제를 조사할 수 있게 한다. AMP가 첨가되지 않은 이소 타입 처리에 대해 수득된 아데노신 수준을 100% 억제로 설정하고; AMP가 첨가된 이소 타입 처리에 대해 수득된 아데노신 수준을 0% 억제로 설정하였다. 표 7 및 8에서 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 CD73 항체, 특히, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6은 세포 배양 상청액 (세포 비결합 CD73)에 존재하는 CD73 뿐만 아니라 세포 결합 CD73을 70~80% 억제하였다. "MEDI9447"은 세포 결합 CD73에 대해 약 20% 더 낮은 억제 활성을 나타냈다. "MEDI9447" 및 "BMS 986179" 둘 다는 세포 배양 상청액에 존재하는 CD73을 억제하는데 있어 더 낮은 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명에 따른 CD73 항체는 두 경쟁 분자와 비교하여 CD73의 보다 완전한 억제를 초래하였다.

표 7은 본 발명의 항체가 세포 결합 CD73을 억제하는데 있어 비교 종래 기술 항체 "MEDI 9447" 보다 우수하다는 것을 입증한다. 나타낸 데이터는 항체 C2 (n=1)를 제외하고 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 수득된 것이다.

표 8은 본 발명의 항체가 세포 배양 상청액의 CD73을 억제하는데 있어 비교 종래 기술 항체 "MEDI 9447" 및/또는 "BMS 986179" 보다 우수하다는 것을 입증한다.. 나타낸 데이터는 항체 C2 (n=1)를 제외하고 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 수득된 것이다.

실시예 9: 항-CD73 항체와 CD73의 복합체 형성

CD73 및 2개의 상이한 항체의 샘플을 단일 구성 성분으로서 및 1:1 몰 CD73:항체 비율의 혼합물로서 사용하여 CD73과 2개의 항-CD73 항체 복합체의 올리고머 상태를 침전 속도 분석용 초고속 원심 분리 (sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: "SV-AUC") 실험에 의해 조사하였다. 280 nm에서 최적의 신호 대 잡음 비의 경우, 상기 혼합물을 2.4 μM의 농도에서 조사하였다. g(s) 비교를 용이하게 하기 위해 CD-73 단백질 및 본 발명의 항체의 개별 분취량을 2.4 μ몰의 농도에서 조사하였다. 혼합 및 원심 분리 전에 CD73 단백질 및 본 발명의 항체를 PBS 완충액에 투석하였다.

미가공 데이터의 변환에 의해 g(s) 분포 곡선을 제조하여 SV-AUC 실험을 정성적으로 분석하고, 다양한 곡선 피팅 알고리즘에 의해 보다 정량적으로 분석하였다. 소분산적 비가역 시스템, 또는 모든 상호 작용 K_D 값 보다 2 자릿수 이상 높은 농도를 갖는 가역 시스템의 경우, c(s) 분포 함수는 각각의 종의 백분율 및 분자량에 대한 정확한 추정치를 가져오는 강력한 곡선 피팅 방법이다. 개별 성분 (CD73 및 관련 항-CD73 항체 (본 발명의 항-CD73 항체 C4; "MEDI9447"))은 c(s) 알고리즘에 의해 곡선 피팅하기에 충분한 순도이었으며, 예상 분자량을 가져왔다. CD73 단백질과 항-CD-73 항체의 혼합물은 c(s) 알고리즘에 의해 디콘볼루션을 수행할 수 없는 광범위한 분포를 제공하므로, CD73 및 항-CD73 항체에 의해 형성된 종의 분포를 정성적으로 비교하기 위해 g(s), 명백한 침전 분포 플롯을 수행하였다.

물질

CD73 HuCD73_His_태그된 이량체의 분자량 (달톤): 118,032, 부분 비체적 0.73744, A280/mg/ml/cm 0.954, 저장 완충액 1x PBS, 0.2 M 수크로오스, 0.01% CHAPS, 5% 글리세롤, 1 mM TCEP, pH 7.2.

항-CD73 항체 C04 계산 분자량은 글리코실화에 대한 3000 Da을 포함하여 148,232 Da이다. 글리코실화에 대한 추정 3000 Da을 포함하여 항-CD73 항체 "MEDI9447" 계산 분자량은 150,669 Da이다.

방법

Beckman XL-I 분석용 초고속 원심 분리 (Beckman Coulter, Brea, California)를 사용하여 SV-AUC 실험을 위한 데이터 수집을 수행하였다. 각각의 실험 당일, 적절한 보관 온도에서 보관된 샘플을 필요에 따라 해동하고, 실온에서 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 검출기의 선형 범위 내의 흡광도 신호를 생성하는 농도로 희석하였다. 사파이어 또는 석영 창을 갖는 목탄 충전 에폰 셀의 샘플 섹터에 샘플을 부하하였다. 샘플 섹터를 400 μL의 희석 샘플로 부하하였다. 406 μL의 매칭 완충액을 셀의 기준 섹터에 사용하였다. 분석용 4홀 티타늄 An-60 Ti 로터 (Beckman Coulter)를 사용하여 실험을 수행하였다. 교정 균형추를 홀 4에 배치하였다. 3000 RPM으로 초기 스캔을 수행하여 세포 완전성을 확인하고 기기에 대한 방사형 보정을 수행하였다. 또한, 3000 RPM으로 각각의 세포에 대해 파장 스캔을 수행하여 흡광도를 확인하였다. 고속 40,000 RPM으로 원심 분리를 시작하기 전에 샘플을 20℃에서 적어도 2 시간 동안 온도 평형에 도달하도록 하였다. 방사형 위치의 함수로서 농도를 보고하는 각각의 세포의 데이터 스캔은 0.003 cm의 방사형 스텝 크기를 갖는 280 nm 흡광도 스캐닝, 연속 스캐닝, 채널 당 1회 플래시로 수집되었다.

c(s) 알고리즘을 사용하는 SV-AUC의 데이터 분석

샘플을 펠릿화한 후 스캔을 제1 스캔에서 약 제10 스캔까지 선택하였다. 샘플을 펠릿화한 후의 초과 스캔은 어떠한 정보도 포함하고 있지 않으며 기준선 기여도에 지나치게 가중치를 둔다. 완충액 특성 및 단백질 서열에 의해 계산된 부분 비체적의 추정치를 곡선 피팅에 대한 파라미터로서 입력하였다. 소프트웨어 패키지 SEDFIT 버전 15.01b (문헌 [Schuck Biophys J. 2000 Mar;78(3):1606-19])를 사용하여 연속 c(s) 분포를 생성하는 데이터를 분석하였다.

겉보기 침강 계수 분포 함수, g(s) 곡선 및 전체 경계 곡선 피팅을 SEDANAL 프로그램 (www.sedanal.org; 문헌 [Biophysical Chemistry 108 (2004) 231-243])으로 수행하였다. 모든 c(r) 데이터 파일을 검사하고, 필요에 따라 메니스커스 (meniscus) 위치, 피팅 범위, 셀 기반 및 광학 보정과 같은 메타 데이터를 채널 데이터 파일 (SEDANAL에 대해서는 *.abr 파일)에 기록하였다. g(s) 플롯은 겉보기 침강 분포 함수 플롯이며, 미가공 데이터를 겉보기 침강 계수의 x 축 (또는 속도 축) 및 g(s) 함수의 y 축 (c(r) 데이터의 도함수 형태)로 변환하는 것을 나타낸다. 이것은 모델 자유 변환 (model free transformation)이며, 피크의 위치는 경계의 속도를 나타내는 반면, 경계의 폭은 단일 종의 확산 또는 복수 종의 확산 및 분리 증가 (복수 종이 있는 경우)를 나타낸다. 소수의 c(r) 쌍을 사용하여 각각의 g(s) 플롯을 생성한다. g(s) 플롯의 정확한 형상은 플롯을 생성하는데 사용된 데이터의 회전 시작부터 경과 시간 및 기간에 좌우된다. x 축 상에서, 심지어 이상적인 단일 종의 g(s)도 침전 시작부터 스캔의 경과 시간에 비례하여 보다 좁고 보다 커질 것이다. 기간 일치된 g(s) 플롯 세트의 오버레이를 사용하여 동일한 샘플의 희석 시리즈의 가역적 자가 결합을 입증하거나 무효화할 수 있다.

SEDANAL은 또한 dc/dt (시간 변화로 나눈 농도 변화) 조작에 의해 변환된 미가공 데이터에 대한 직접 곡선 피팅을 수행할 것이다. 사용자가 명시한 모델을 사용하여, SEDANAL은 데이터 채널의 서브 세트의 dc/dt 곡선의 비선형 최소 제곱 곡선 피팅을 수행하여 데이터에 대한 모델의 최적 피팅 파라미터를 수득한다. SV-AUC는 다수의 모델의 적합도를 평가할 수 있는 소수의 생물리학적 방법 중 하나이며, 분석가가 데이터를 피팅하기 위해 최상의 모델을 선택하도록 도움을 준다.

결과

CD73의 샘플을 SEDANAL 및 SEDFIT에 의해 실행하고 곡선 피팅하였다.

C04의 샘플을 SEDANAL 및 SEDFIT에 의해 실행하고 곡선 피팅하였다.

"MEDI9447" 샘플을 SEDANAL 및 SEDFIT에 의해 실행하고 곡선 피팅하였다.

c(s) 및 SEDANAL에 의한 혼합물의 곡선 피팅은 신뢰할 수 있는 결과를 가져오지 않았으며, 결론은 디콘볼루션하는데 너무 많은 종이 있다는 것이었다. 정성적 비교의 경우, g(s) 오버레이 그래프를 제조하였다 (도 2 참조).

스베드베리와 분자량 사이의 상관 관계:

실시예 10: 결정학

CD73 단백질:

CD73 단백질 작제물은 문헌 [Knapp,K. Et al. (2012) Structure 20: 2161-2173] (10.1016/j.str.2012.10.001)에 기초하며, 단백질 생산 및 결정화 거동을 뒷받침하는 돌연변이를 포함한다. 각각의 돌연변이는 ASN53ASP, LYS145SER, LYS147SER, ASN311ASP, ASN333ASP, ASN403ASP, LYS478SER이며, 또한, 엔테로키나아제에 의한 절단 후 N-말단에 SER, PRO, ASP, PRO를 함유한다. 이것은 문헌 [Knapp,K. Et al. (2012) Structure　20: 2161-2173]에서 기재된 바와 같이 발현, 재폴딩 및 정제되었다.

FAB:

본 발명에 따른 항-CD73 항체의 Fab 단편을 엔테로키나아제 절단에 의해 수득하였다.

결정 구조 결정

단백질 (Fab 단편 및 CD73)을 복합체화하고, 겔 여과로 정제하고, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH = 8 중에서 21 mg/ml로 농축하였다. 12% PEG8000, 0.1 M MOPS pH 7.6 및 0.1 M 마그네슘 아세테이트를 함유하는 용액 0.2 μl를 단백질 용액 0.2 μL과 혼합함으로써 20℃에서 결정을 수득하였다. 플레이트 형상의 결정이 3일 후에 자랐다. 결정을 25% PEG400으로 보충된 저장소 용액으로 옮기고, 액체 질소에서 순간 동결시켰다. 회절 데이터를 Swiss Light Source에서 수집하였으며, 구조를 분자 대체로 해결하였다. 모델 구축 및 개량은 도 3에서 묘사된 CD73:항-CD73 Fab 복합체의 결정 구조를 생성하였다.

실시예 11: i.v. 투여를 위한 약제학적 제형

임의의 본 발명의 상기 항체는 하기와 같은 조성을 갖는 정맥내 적용을 위한 약제학적 제형의 제조를 위해 선택될 수 있다:

약물 성분: 50 mg/ml

히스티딘 완충액: 10 mM, pH 6.0

공급물: 220 mM

폴리소르베이트 20: 0.02 %

상기 조성물을 상기 조성을 갖는 주사용수 (water for injection: WFI) 중의 용액으로 제형화하고, 멸균하고, 10 ml 바이알에 2 내지 8℃에서 보관하였다.

상기 조성물을, 사용 전에 WFI 중에 재구성해야 하는 감압 동결 건조 제형으로 임의로 제공할 수 있다.

실시예 12: 사람에서의 약제학적 용도

상기 실시예 9에서 개략적으로 서술된 용액을 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 암을 앓고 있는 사람에게 2주 내지 4주 마다 정맥내 주입 (체중 킬로그램 및 용량 당 0.05 내지 50.0 mg의 투약량)으로 적용한다.

실시예에 따르면, 본 발명의 다수의 상이한 항-CD73 항체를 제조하였다. 하기 표에서, 이러한 항체들의 서열이 제공된다. A1, A2, A3 및 A4는 각각 쥐과 동물 항체이다. B1, B2, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6은 각각 사람화 항체이다. CDR 서열은 본 출원에서 기재된 바와 같은 IMGT 정의에 따라 제공된다.

또한, 각각 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 명명되는 본 발명의 항-PD1 항체의 서열이 제공된다.

<110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Antagonizing CD73 Antibody <130> 12-0426-WO1 <160> 131 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - HCDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - HCDR2 <400> 2 Thr Ile Asn Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - HCDR3 <400> 3 Gly Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser Ser Tyr Thr Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - LCDR2 <400> 5 Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 - LCDR3 <400> 6 Gln His Ser Trp Glu Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A2 - 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HCDR3 <400> 15 Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 - LCDR1 <400> 16 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 - LCDR2 <400> 17 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 - LCDR3 <400> 18 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 - HCDR1 <400> 19 Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 - HCDR2 <400> 20 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 - HCDR3 <400> 21 Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 - LCDR1 <400> 22 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 - 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HC <400> 127 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 128 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1-4 - LC <400> 128 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 129 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1-5 - HC <400> 129 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 130 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1-5 - LC <400> 130 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 131 <211> 785 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature murine CD73-HuFc-His6 <400> 131 Trp Glu Leu Thr Ile Leu His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu 1 5 10 15 Gln Thr Ser Asp Asp Ser Thr Lys Cys Leu Asn Ala Ser Leu Cys Val 20 25 30 Gly Gly Val Ala Arg Leu Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Lys Glu 35 40 45 Glu Pro Asn Val Leu Phe Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr 50 55 60 Ile Trp Phe Thr Val Tyr Lys Gly Leu Glu Val Ala His Phe Met Asn 65 70 75 80 Ile Leu Gly Tyr Asp Ala Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn 85 90 95 Gly Val Glu Gly Leu Ile Asp Pro Leu Leu Arg Asn Val Lys Phe Pro 100 105 110 Ile Leu Ser Ala Asn Ile Lys Ala Arg Gly Pro Leu Ala His Gln Ile 115 120 125 Ser Gly Leu Phe Leu Pro Ser Lys Val Leu Ser Val Gly Gly Glu Val 130 135 140 Val Gly Ile Val Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn 145 150 155 160 Pro Gly Thr Asn Leu Val Phe Glu Asp Glu Ile Ser Ala Leu Gln Pro 165 170 175 Glu Val Asp Lys Leu Lys Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu 180 185 190 Gly His Ser Gly Phe Glu Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg 195 200 205 Gly Val Asp Ile Val Val Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr 210 215 220 Gly Asn Pro Pro Ser Lys Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile 225 230 235 240 Val Thr Ala Asp Asp Gly Arg Gln Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala 245 250 255 Phe Gly Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Val Glu Phe Asp Asp Lys Gly 260 265 270 Asn Val Ile Thr Ser Tyr Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile 275 280 285 Pro Glu Asp Ala Thr Ile Lys Ala Asp Ile Asn Gln Trp Arg Ile Lys 290 295 300 Leu Asp Asn Tyr Ser Thr Gln Glu Leu Gly Arg Thr Ile Val Tyr Leu 305 310 315 320 Asp Gly Ser Thr Gln Thr Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn 325 330 335 Leu Ile Cys Asp Ala Met Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Pro Asp Glu 340 345 350 Met Phe Trp Asn His Val Ser Met Cys Ile Val Asn Gly Gly Gly Ile 355 360 365 Arg Ser Pro Ile Asp Glu Lys Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn 370 375 380 Leu Ala Ala Val Leu Pro Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu 385 390 395 400 Lys Gly Ser Thr Leu Lys Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr 405 410 415 Gly Gln Ser Thr Gly Glu Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val 420 425 430 Tyr Asp Ile Asn Arg Lys Pro Trp Asn Arg Val Val Gln Leu Glu Val 435 440 445 Leu Cys Thr Lys Cys Arg Val Pro Ile Tyr Glu Pro Leu Glu Met Asp 450 455 460 Lys Val Tyr Lys Val Thr Leu Pro Ser Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Asp 465 470 475 480 Gly Phe Gln Met Ile Lys Asp Glu Leu Leu Lys His Asp Ser Gly Asp 485 490 495 Gln Asp Ile Ser Val Val Ser Glu Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Val 500 505 510 Tyr Pro Ala Val Glu Gly Arg Ile Lys Phe Ser Gly Gly Ser Gly Gly 515 520 525 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu 530 535 540 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 545 550 555 560 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 565 570 575 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 580 585 590 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 595 600 605 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 610 615 620 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 625 630 635 640 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 645 650 655 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 660 665 670 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 675 680 685 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 690 695 700 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 705 710 715 720 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 725 730 735 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 740 745 750 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 755 760 765 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser Ala His His His His His 770 775 780 His 785

Claims

하기를 포함하는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체:
(a) 서열 번호 25 (hcCDR1), 서열 번호 26 (hcCDR2) 및 서열 번호 27 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 28 (lcCDR1), 서열 번호 29 (lcCDR2) 및 서열 번호 30 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(b) 서열 번호 31 (hcCDR1), 서열 번호 32 (hcCDR2) 및 서열 번호 33 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 34 (lcCDR1), 서열 번호 35 (lcCDR2) 및 서열 번호 36 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(c) 서열 번호 37 (hcCDR1), 서열 번호 38 (hcCDR2) 및 서열 번호 39 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 40 (lcCDR1), 서열 번호 41 (lcCDR2) 및 서열 번호 42 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(d) 서열 번호 43 (hcCDR1), 서열 번호 44 (hcCDR2) 및 서열 번호 45 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 46 (lcCDR1), 서열 번호 47 (lcCDR2) 및 서열 번호 48 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(e) 서열 번호 49 (hcCDR1), 서열 번호 50 (hcCDR2) 및 서열 번호 51 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 52 (lcCDR1), 서열 번호 53 (lcCDR2) 및 서열 번호 54 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(f) 서열 번호 55 (hcCDR1), 서열 번호 56 (hcCDR2) 및 서열 번호 57 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 58 (lcCDR1), 서열 번호 59 (lcCDR2) 및 서열 번호 60 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(g) 서열 번호 61 (hcCDR1), 서열 번호 62 (hcCDR2) 및 서열 번호 63 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 64 (lcCDR1), 서열 번호 65 (lcCDR2) 및 서열 번호 66 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR; 또는
(h) 서열 번호 67 (hcCDR1), 서열 번호 68 (hcCDR2) 및 서열 번호 69 (hcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR 및 서열 번호 70 (lcCDR1), 서열 번호 71 (lcCDR2) 및 서열 번호 72 (lcCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR.
제1항에 있어서, 상기 항체 분자가 사람화 항체 분자인, 항체 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 분자가 단클론 항체 분자, Fab, F(ab')₂, Fv 또는 scFv인, 항체 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항체 분자.
제4항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역이 IgG1, 바람직하게는 L234A 및/또는 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1인, 항체 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 카파 또는 람다인, 항체 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 및 95 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체 분자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 및 95 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 또는 96 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 항체 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 또는 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 서열 번호 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 또는 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가
서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가
서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 분자의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
제15항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제16항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제17항에 있어서, 상기 세포가 포유 동물 세포인, 숙주 세포.
하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 분자의 제조 방법:
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 형성을 허용하는 조건하에 제17항 또는 제18항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
- 상기 항체 분자를 회수하는 단계.
제19항에 있어서, 상기 항체 분자를 추가로 정제 및/또는 개질 및/또는 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 항체 분자를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한, 항체 분자.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CD73 항체 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, PD-1 길항제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 및 PD-1 길항제를 포함하는 부품 키트 (kit of parts).
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체인, 약제학적 조성물 또는 키트.
제26항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 PDR-001, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체인, 약제학적 조성물 또는 키트.
제26항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PDL-1 항체인, 약제학적 조성물 또는 키트.
제26항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 하기를 포함하는 항-PD-1 항체인, 약제학적 조성물 또는 키트:
(i) 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(ii) 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iii) 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iv) 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(v) 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물 또는 키트.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 분자를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항체 분자.
암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 분자의 용도.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 길항제를 추가로 포함하는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제34항에 있어서, 상기 항체 분자가 상기 PD-1 길항제와 동시에 (simultaneously), 동시에 (concurrently), 순차적으로, 연속적으로, 교대로 또는 개별적으로 투여되는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제36항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 PDR-001, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제36항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PDL-1 항체인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제36항에 있어서, 상기 PD-1 길항제가 하기를 포함하는 항-PD-1 항체 분자인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자:
(i) 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(ii) 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iii) 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iv) 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(v) 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 신장암, 위장암 및 폐암, 바람직하게는 비-소세포 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자(들)가 하나 이상의 추가의 치료제 또는 시술과 조합하여 투여되는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 치료제 또는 시술이 화학 요법, 표적화 항암 요법, 종양 용해성 약물, 세포독성제, 면역 기반 요법, 사이토카인, 외과 수술, 방사선 시술 또는 세포 면역 요법으로부터 선택되는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제41항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 A2AR 길항제, CD39 길항제, LAG-3 길항제, CTLA-4 길항제, EGFR 길항제 또는 HER2 길항제인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 환자가 CD73의 증가된 발현에 기초하여 선택되는, 방법 또는 용도 또는 항체 분자.
제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 환자가 이전에 또 다른 치료제로 치료를 받았고, 여기서, 상기 치료제가 바람직하게는 PD-1 길항제, 특별히, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 및 하기를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PD-1 길항제인, 방법 또는 용도 또는 항체 분자:
(i) 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(ii) 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iii) 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(iv) 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(v) 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.