TW202005982A - 拮抗cd73之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於CD73之新穎拮抗抗體。本發明亦關於編碼該等抗體分子之核酸；製備該等抗體分子之方法；表現或能夠表現該等抗體分子之宿主細胞；包括該等抗體分子之組合物；及該等抗體分子或該等組合物之用途，尤其用於癌症疾病領域中之治療目的。

Description

拮抗CD73之抗體
本發明係關於新穎CD73結合多肽。本發明亦係關於編碼該等多肽之核酸；製備該等多肽之方法；表現或能夠表現該等多肽之宿主細胞；包括該等多肽之組合物；及該等多肽或該等組合物之用途，尤其用於癌症疾病領域中之治療目的。
癌症係以異常細胞生長為特徵之疾病，其可能擴散至全身。在已開發國家，其係死亡之第二最常見病因。最常見類型之男性癌症係肺癌、前列腺癌、結腸直腸癌及胃癌，且女性中之最常見類型係乳癌、結腸直腸癌、肺癌及子宮頸癌。儘管存活機會主要取決於癌症類型及鑑別階段，但肺癌之整體10年存活率為約5%。
在過去，治療癌症之最常見方式係經由手術、輻射治療或使用化學治療藥物。然而，近年來，癌症免疫療法已展示可提供作為用於腫瘤學之治療方式之遠大前景。
癌症免疫療法係活化免疫系統以攻擊癌症之腫瘤學分支，其與直接切除或治療腫瘤之現有常用治療方法完全不同。此治療概念係基於鑑別出T細胞表面上之諸多抑制該等細胞之免疫功能之蛋白質。免疫療法阻斷該等抑制分子以增加免疫系統之活性或刺激涉及免疫效應細胞活化之路徑。在該等蛋白質中，尤其列示CD73及PD-1。
分化簇73 (CD73)亦稱為細胞外-5'-核苷酸酶(細胞外-5'NT，EC 3.1.3.5)，其係發現於大部分組織中、但尤其表現於內皮細胞及造血細胞子組中之醣基-磷脂醯肌(GPI)連接之細胞表面酶(Resta等人，Immunol Rev 1998; 161:95-109及Colgan等人，Purinergic Signal 2006；2:351-60)。
CD73係表現於癌細胞、基質細胞及腫瘤駐留免疫細胞上之細胞表面酶，其將AMP轉化成腺苷及無機磷酸鹽。腺苷具有免疫抑制性且能夠影響若干免疫細胞類型之功能。腺苷對免疫抑制細胞(例如調控性T細胞、MDSC及M2巨噬球)具有活化效應且對效應細胞(例如樹突狀細胞、效應T細胞及NK細胞)具有抑制效應。中和性CD73抗體可藉由阻斷酶活性及/或藉由減小CD73細胞表面含量來抑制CD73功能。此將減少免疫抑制性腺苷且由此增加T細胞活性。
雙重阻斷CD73及免疫檢查點(包含PD1及可能其他免疫檢查點)可進一步恢復T細胞功能性，從而與PD1單一療法相比改良癌症患者中之客觀反應並延長整體存活。
CD73已經報導在許多不同癌症上表現，包含結腸癌、肺癌、胰臟癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、甲狀腺癌、食道癌、前列腺癌及乳癌(Jin等人，Cancer Res 2010; 70:2245-55及Stagg等人，PNAS 2010; 107:1547-52)。此外，癌症中之CD73表現與諸多腫瘤適應症(尤其胃腸道腫瘤、乳房腫瘤及NSCLC腫瘤)中之較短整體存活相關(Wang等人，Prognostic value of CD73-adenosinergic pathway in solid tumor: A meta-analysis and systematic review, Oncotarget 2017；Inoue等人，Prognostic impact of CD73 and A2A adenosine receptor expression in non-small-cell lung cancer, Oncotarget 2017)。亦已提出將CD73活性作為乳頭狀甲狀腺癌中之預後標記。藉由生成免疫抑制性腺苷，CD73在免疫細胞上具有廣泛功能且在腫瘤內產生免疫抑制性微環境。腺苷強力抑制T細胞反應，例如增殖、細胞毒性及細胞介素產生。另外，腺苷改變了樹突狀細胞之分化，由此損害T細胞反應。腺苷亦作用於NK細胞，從而抑制其細胞毒性功能。另外，腺苷對免疫抑制細胞類型具有刺激作用。腺苷會引起免疫抑制性MDSC之擴增及巨噬球至抑制性M2表型之分化。(Antonioli等人，Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews Cancer 2013；Beavis等人，CD73: A potent suppressor of antitumor immune responses, Trends in Immunology, 2012)。除對免疫細胞之效應外，CD73亦可用於調控細胞-細胞及細胞-基質相互作用以及血管生成。腺苷亦可直接作用於癌細胞並調控細胞生長以及細胞凋亡且與藥物抗性有關(Hunsucker等人，Pharmacol Ther 2005；1:1-30)。因此，CD73可直接及間接調控癌症進展，此突出顯示了其作為新穎治療靶之潛力。Allard等人已報導，靶向CD73可增強抗PD-1及抗CTLA-4 mAb之抗腫瘤活性(Clin Cancer Res 2013；19:5626)。
靶向相同路徑之其他藥劑包含A2AR拮抗劑。然而，因腺苷受體冗餘，可預計A2AR拮抗劑相對於CD73抑制劑不能完全防止腺苷調介之活性。
不可水解性ADP類似物腺苷5′-(α,β-亞甲基)二磷酸鹽(APCP)係CD73酶活性之抑制劑且市面有售。AB421係由Arcus Biosciences研發之小分子CD73抑制劑。
WO 2016/075099揭示抗CD73結合分子，例如抗體及其抗原結合片段(包含MEDI9447抗體)。MEDI9447藉由抑制CD73之酶活性以水解單磷酸腺苷(AMP)且藉由誘導CD73內化來減小CD73功能。
WO 2016/081748揭示抑制人類CD73之酶活性之抗體及使CD73內化至細胞中之抗體(包含BMS 986179抗體)。
本發明之目標係提供可用於治療若干癌症疾病之經改良藥理學活性劑。
特定而言，本發明之目標係提供與當前使用及/或業內已知之藥劑、組合物及/或方法相比提供某些優點之該等藥理學活性劑、組合物及/或治療方法。該等優點包含活體內效能、改良之治療及藥理學性質、較少副效應及其他有利性質(例如改良之製備便利性或減小之貨物成本)，尤其係與業內已知之候選藥物相比。
根據第一態樣，提供抗CD73抗體分子。如本文進一步所闡述，本發明之抗CD73抗體分子較其他抗CD73抗體具有令人吃驚之有利性質。舉例而言，其展示改良逆轉AMP介導之T細胞抑制之能力(例如如藉由較高T細胞增殖程度及較強IFNγ分泌誘導所證實)。IFNγ已知係由T細胞調介之抗腫瘤反應之關鍵因子(Tannenbaum, C.及Hamilton, T. Immune-inflammatory mechanisms in IFNγ-mediated anti-tumor activity, Seminars in Cancer Biology, 2000)。另外，與先前技術之抗CD73抗體相比，本文所闡述之抗CD73抗體展示改良之CD73抑制。本發明抗體同等程度地抑制細胞結合性CD73以及非細胞結合性CD73。與參考抗CD73抗體相比，本發明之抗CD73抗體展示改良之腺苷生成抑制。另外，其對人類CD73具有高親和力。
亦提供編碼抗CD73抗體分子之核酸分子、表現載體、宿主細胞及製備本發明之抗CD73抗體分子之方法。亦提供包括本發明之抗CD73抗體分子之醫藥組合物。本文所揭示之抗CD73抗體分子可用於治療癌性病症，包含實體腫瘤及軟組織腫瘤。
更具體而言，本發明之抗CD73抗體分子包括： (a)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:25 (hcCDR1)、SEQ ID NO:26 (hcCDR2)及SEQ ID NO:27 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:28 (lcCDR1)、SEQ ID NO:29 (lcCDR2)及SEQ ID NO:30 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (b)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:31 (hcCDR1)、SEQ ID NO:32 (hcCDR2)及SEQ ID NO:33 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:34 (lcCDR1)、SEQ ID NO:35 (lcCDR2)及SEQ ID NO:36 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (c)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:37 (hcCDR1)、SEQ ID NO:38 (hcCDR2)及SEQ ID NO:39 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:40 (lcCDR1)、SEQ ID NO:41 (lcCDR2)及SEQ ID NO:42 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (d)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:43 (hcCDR1)、SEQ ID NO:44 (hcCDR2)及SEQ ID NO:45 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:46 (lcCDR1)、SEQ ID NO:47 (lcCDR2)及SEQ ID NO:48 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (e)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:49 (hcCDR1)、SEQ ID NO:50 (hcCDR2)及SEQ ID NO:51 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:52 (lcCDR1)、SEQ ID NO:53 (lcCDR2)及SEQ ID NO:54 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (f)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:55 (hcCDR1)、SEQ ID NO:56 (hcCDR2)及SEQ ID NO:57 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:58 (lcCDR1)、SEQ ID NO:59 (lcCDR2)及SEQ ID NO:60 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (g)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:61 (hcCDR1)、SEQ ID NO:62 (hcCDR2)及SEQ ID NO:63 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:64 (lcCDR1)、SEQ ID NO:65 (lcCDR2)及SEQ ID NO:66 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (h)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:67 (hcCDR1)、SEQ ID NO:68 (hcCDR2)及SEQ ID NO:69 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:70 (lcCDR1)、SEQ ID NO:71 (lcCDR2)及SEQ ID NO:72 (lcCDR3)之胺基酸序列。
根據本發明之另一態樣，亦提供治療癌症之方法。在一實施例中，本發明之抗CD73抗體分子可與第二治療劑(例如PD-1拮抗劑)組合使用。在一些實施例中，該第二治療劑(例如PD-1拮抗劑)擬與抗CD73抗體分子同時、並行、依序、連續、交替或分開投與。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：PDR-001、派姆單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)及匹利珠單抗(pidilizumab)。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PDL-1抗體：阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)及德瓦魯單抗(durvalumab)。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
本發明之該等態樣之其他實施例包含其中可組合使用本發明之該等抗體分子與第三治療劑者。
涉及本發明之抗體分子之其他態樣、實施例、用途及方法自本發明之下列實施方式及隨附申請專利範圍可顯而易見。
本發明提供容許更有效地治療若干癌症類型(包含肺癌(例如非小細胞肺癌NSCLC)、各種胃腸道癌(例如結腸癌、胃癌、肝細胞癌)及腎癌(例如腎細胞癌，例如透明細胞癌))之新穎抗體分子。
定義 自本文之進一步闡述將明瞭本發明之上述及其他態樣以及實施例。
除非另外指示或定義，否則所使用所有術語皆具有其為熟習此項技術者所明瞭之業內常用含義。舉例而言，可提及標準手冊(例如Sambrook等人，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 (第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin, 「Genes IV」, Oxford University Press, New York, (1990)；及Roitt等人，「Immunology」 (第2版), Gower Medical Publishing, London, New York (1989))以及本文所引用之一般背景技術。另外，除非另外指示，否則可實施且以本身已知之方式實施未明確詳細闡述之所有方法、步驟、技術及操縱，如熟習此項技術者所明瞭。再次參照例如標準手冊、上文所提及之一般背景技術及其中所引用之其他參考文獻。
如本文中所使用，冠詞「一(a及an)」係指一個或一個以上(例如至少一個)之該冠詞之文法詞。在用於本文中時，術語「包括(comprising)」及其變化形式(例如「包括(comprises及comprise)」)可分別經術語「含有(containing)」或「包含(including)」或「具有(having或has)」代替，且反之亦然。
「抗體分子」或「抗體」 (同義使用於本文中)係可發現於脊椎動物之血液或其他體液中之γ球蛋白，且藉由免疫系統用於鑑別及中和外來物體(例如細菌及病毒)。其通常由基本結構單元(各自具有兩條大重鏈及兩條小輕鏈)構成以形成(例如)具有一個單元之單體、具有兩個單元之二聚體或具有五個單元之五聚體。抗體分子可藉由非共價相互作用結合至稱為抗原之其他分子或結構。在抗體分子僅以高親和力結合至特定結構之意義上，此結合係特異性的。由抗體分子識別之獨特抗原部分稱為表位或抗原決定子。結合至表位之抗體分子部分有時稱為互補位，其係抗體結構內與抗原發生特異性相互作用之分子決定子；及抗體之由CDR構成之所謂的可變結構域或可變區(Fv)。互補位可完全或部分包括給定抗體之重鏈、輕鏈或重鏈及輕鏈二者之CDR。可變結構域包括三個由框架區(FR)間隔之所謂的互補決定區(CDR)。
術語「互補決定區」及「CDR」在業內已知係指抗體可變區內之胺基酸之非鄰接序列，其賦予抗原特異性及結合親和力。一般而言，在每一重鏈可變區中存在三個(3) CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且在每一輕鏈可變區中存在三個(3) CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
可使用諸多已知方案中之任一者來測定給定CDR之胺基酸序列邊界，包含由由以下文獻所闡述者：Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, Md. (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人(1997) JMB 273, 927-948 (「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography」，J. Mol. Biol. 262, 732-745。(「接觸」編號方案)；Lefranc M P等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」，Dev Comp Immunol，2003年1月；27(1):55-77 (「IMGT」或「CCG」編號方案)；及Honegger A及Pltickthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」，J Mol Biol, 2001 Jun. 8；309(3):657-70, (AHo編號方案)。
給定CDR之邊界可端視命名慣例有所變化。可(例如)根據Kabat編號系統來定義指派至CDR及FR之胺基酸位置，其中VH框架區(FR)及CDR之定位如下：殘基1-30 (FR1)、31-35 (CDR1)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66-94 (FR3)、95-102 (CDR3)及103-113 (FR4)。同樣，根據Kabat編號系統，VL FR及CDR之定位如下：殘基1-23 (FR1)、24-34 (CDR1)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)及98-107 (FR4)。
或者，已定義IMGT或CCG獨特編號以比較可變結構域，不論抗原受體、鏈類型或物種如何(Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.及Lefranc, G., 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」 Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))。在IMGT獨特編號中，保守胺基酸總是具有相同位置，例如半胱胺酸23 (1st-CYS)、色胺酸41 (保守-TRP)、疏水性胺基酸89、半胱胺酸104 (2nd-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118 (J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特編號提供框架區(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104及FR4-IMGT：118至128)及互補決定區(CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65及CDR3-IMGT：105至117)之標準化定界。
在本發明之上下文中，CDR之提及係基於CCG/IMGT慣例之定義，然而，本發明並不限於如由任一編號系統所定義之FR及CDR，但包含所有編號系統(包含上文所論述者)。
因此，除非另外指定，否則術語給定抗體或其區域(例如可變區)之「CDR」及「互補決定區」以及抗體或其區域之個別CDR (例如CDR-H1、CDR-H2)及框架區(FR)應為理解涵蓋如由上述任一已知反應圖所定義之各別區域(例如互補決定區)。在一些情況下，指定鑑別特定一或多個CDR之方案，例如如由Kabat、Chothia、IMGT、AHO或業內已知之其他方法所定義之CDR。在其他情形下，給出CDR之特定胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體分子具有選自(例如) IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區的重鏈恆定區；特定而言，重鏈恆定區係選自(例如) IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之(例如人類)重鏈恆定區。在另一實施例中，抗體分子具有選自(例如)κ或λ之(例如人類)輕鏈恆定區之輕鏈恆定區。可改變(例如突變)恆定區以改變抗體之性質(例如增加或減少以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基數、效應細胞功能及/或補體功能)。在一些實施例中，抗體具有效應功能且可固定補體。在其他實施例中，抗體並不招募效應細胞或固定補體。在某些實施例中，抗體具有降低之或不具結合Fc受體之能力。舉例而言，其可為同型或亞型、片段或其他突變體，此並不支持與Fc受體之結合，例如其具有誘變或缺失之Fc受體結合區。
抗體恆定區在一些實施例中發生改變。用於改變抗體恆定區之方法為業內已知。功能改變、例如對效應配體(例如細胞上之FcR或補體之C1組分)之親和力改變之抗體可藉由使用不同殘基代替抗體恆定部分中之至少一個胺基酸殘基來產生(例如參見EP 388,151A1、美國專利第5,624,821號及美國專利第5,648,260號，該等所有專利之內容皆以引用方式併入本文中)。若應用於鼠類或其他物種免疫球蛋白，則可闡述將降低或消除該等功能之類似變化類型。在一實施例中，抗體包括L234A及/或L235A突變(Kabat命名)，該等突變對應於本文所闡述實例性抗體之實際編號中之位置L232A及L233A。在一實施例中，抗體係人類IgG1。
本發明多肽可具有經修飾N-末端序列(例如缺失一或多個N-末端胺基酸或交換(例如)第一N-末端胺基酸(例如麩胺酸鹽至丙胺酸))以最佳化用於以下之分子：藉由使用某些表現系統(例如特定載體或宿主細胞)表現，或以納入體或可溶性形式表現，或分泌至培養基或周質空間中，或含於細胞內，或產生更均質產物。本發明多肽可具有經修飾C-末端序列(例如額外丙胺酸及/或C-末端部分中或任一框架區內之其他定義位置之其他胺基酸交換或缺失，如例如在WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所闡釋)以(例如)進一步增強該等多肽之穩定性或減小其免疫原性。
本文互換所用之術語「可變區 」或「可變結構域 」可意指抗體分子中基本上由4個「框架區」 (其在業內及下文中分別稱為「框架區1」或「FR1」、「框架區2」或「FR2」、「框架區3」或「FR3」及「框架區4」或「FR4」)組成之區域，該等框架區間雜有三個「互補決定區」或「CDR」 (其在業內及下本文中分別稱為「互補決定區1」或「CDR1」、「互補決定區2」或「CDR2」及「互補決定區3」或「CDR3」)。因此，免疫球蛋白可變結構域之一般結構或序列可指示如下：FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜載抗原結合位點來賦予抗體對抗原之特異性。
術語「可變重鏈( 或VH) 」及「可變輕鏈( 或VL) 」係指分別來自抗體分子之重鏈或輕鏈之可變結構域。
因此，分別地，重鏈(HC)之CDR稱為「HCDR」，且輕鏈(LC)之CDR稱為「LCDR」。
業內已進一步研發抗體分子且使其成為醫學及技術中之萬能工具。因此，在本發明之上下文中，術語「抗體分子」或「抗體」不僅包含可發現於自然界中之包括(例如)兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，且另外涵蓋所有包括至少一個對抗原具有結合特異性之互補位且與抗體分子之可變結構域具有結構類似性之分子。
因此，本發明之抗體分子包含單株抗體、人類抗體或人類化抗體。
亦涵蓋嵌合抗體、抗體片段(尤其Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2 片段)、單鏈抗體(尤其單鏈可變片段(scFv))、小模組免疫醫藥(SMIP)、結構域抗體、奈米抗體、二價抗體。
單株抗體(mAb)係胺基酸序列一致之單特異性抗體。其可藉由雜交瘤技術自雜交細胞系(稱為雜交瘤)產生，該雜交細胞系代表特定抗體產生性B細胞與骨髓瘤(B細胞癌)細胞之融合體之純系(Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.)。或者，可藉由重組表現在宿主細胞中產生單株抗體(Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (1997年5月).「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells」, J Immunol Methods 204 (1): 77-87。「重組抗體」係藉由重組改造之宿主細胞產生之抗體。其視情況經分離或純化。
為應用於人類中，通常期望減小最初衍生自其他物種(如小鼠)之抗體之免疫原性。此可藉由構築嵌合抗體或藉由稱為「人類化」之製程來達成。在此背景中，「嵌合抗體」應理解為包括融合之衍生自一種物種(例如小鼠)之序列部分(例如可變結構域)及衍生自不同物種(例如人類)之序列部分(例如恆定結構域)的抗體。「人類化抗體」係包括最初衍生自非人類物種之可變結構域之抗體，其中某些胺基酸已發生突變以使得該可變結構域之整體序列更接近類似於人類可變結構域之序列。抗體之嵌合化及人類化之方法在業內已眾所周知(Billetta R, Lobuglio AF. 「Chimeric antibodies」. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76；Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). 「Reshaping human antibodies for therapy」.Nature : 332:323.)。
「人類化」抗體係指包括來自非人類超變區(HVR)之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括實質上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之HVR (例如互補決定區(CDR))對應於非人類之彼等HVR，且所有或實質上全部之框架區(FR)對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包括源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體之「人類化形式」 (例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
另外，已研發用於基於衍生自人類基因體之序列來產生抗體之技術，例如藉由噬菌體顯示或使用轉基因動物(WO 90/05144；D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths及G. Winter (1991) 「By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage」. J.Mol.Biol., 222, 581-597；Knappik等人，J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000；S. Carmen及L. Jermutus, 「Concepts in antibody phage display」. Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203；Lonberg N, Huszar D. 「Human antibodies from transgenic mice」. Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93；Brüggemann M, Taussig MJ. 「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.)。在本發明之上下文中，該等抗體係「人類抗體」。
亦涵蓋保留抗原結合性質之分子片段，如Fab、Fab’或F(ab’)2 片段。可藉由片段化抗體分子(例如藉由蛋白水解消解)或藉由重組表現該等片段來獲得該等片段。舉例而言，可藉助常規技術(例如)使用木瓜酶或胃蛋白酶來達成抗體分子消解(WO 94/29348)。抗體之木瓜酶消解通常產生兩個相同抗原結合片段(所謂的Fab片段，每一片段具有單一抗原結合位點)及殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理會產生F(ab')2 。在Fab分子中，可變結構域各自融合至較佳地人類來源之免疫球蛋白恆定結構域。因此，重鏈可變結構域可融合至CH1 結構域(所謂的Fd片段)，且輕鏈可變結構域可融合至CL結構域。可藉由在宿主細胞中重組表現各別核酸來產生Fab分子，參見下文。
已研發諸多技術來將抗體分子之可變結構域或衍生自該等可變結構域之分子置於不同分子背景中。一般而言，該等抗體分子之大小小於天然抗體分子，且可包括單一胺基酸鏈或若干胺基酸鏈。舉例而言，單鏈可變片段(scFv)係抗體分子之重鏈及輕鏈之可變區經短連接體(通常絲胺酸(S)或甘胺酸(G))連接至一起之融合體(WO 88/01649；WO 91/17271；Huston等人，International Reviews of Immunology，第10卷，1993, 195 - 217)。「單一結構域抗體」或「奈米抗體」在單一Ig樣結構域中具有抗原結合位點(WO 94/04678；WO 03/050531；Ward等人，Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6；Revets等人，Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005)。對相同或不同抗原具有結合特異性之一或多個單一結構域抗體可連接至一起。二價抗體係由兩條包括兩個可變結構域之胺基酸鏈組成之二價抗體分子(WO 94/13804；Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8)。抗體樣分子之其他實例係免疫球蛋白超家族抗體(IgSF；Srinivasan及Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96)。不同概念產生所謂的小模組免疫醫藥(SMIP)，該物質包括連接至單鏈鉸鏈之Fv結構域及不含恆定結構域CH1之效應結構域(WO 02/056910)。
抗體分子可融合(呈融合蛋白形式)或以其他方式連接(藉由共價或非共價鍵)至對抗體分子之性質具有期望影響之其他分子實體。舉例而言，可期望改良抗體分子之藥物動力學性質、在(例如)體液(例如血液)中之穩定性，尤其在單鏈抗體或單一結構域抗體之情形下。已由此研發尤其用以延長該等抗體分子在循環中之半衰期之諸多技術，例如聚乙二醇化(WO 98/25971；WO 98/48837；WO 2004081026)，使抗體分子融合或以其他方式共價附接至對血清蛋白(如白蛋白)具有親和力之另一抗體分子(WO 2004041865；WO 2004003019)，或使抗體分子表現為具有所有或一部分血清蛋白(如白蛋白或轉鐵蛋白)之融合蛋白(WO 01/79258)。
可互換使用之術語「表位 」及「抗原決定子 」係指大分子(例如多肽)中由抗原結合分子(例如本發明之抗體分子)及更特定而言由該等分子之抗原結合位點識別之部分。表位定義抗體分子之最小結合位點，且由此代表抗體分子之特異性靶。表位可進一步定義為結構表位或功能表位。「結構表位」由與通常由結構揭示之抗體緊密接觸之區域中之胺基酸或其他分子組成。「功能表位」定義為對結合作出能量貢獻之彼等分子部分，其中在其改變時結合親和力將有所降低。因此，與互補位接觸之殘基及有助於親和力之殘基(不論其是否鄰近)係定義表位時之重要考慮因素。X射線結晶學係一種以測定抗體與其抗原之間之相互作用之精確位點的方法。晶體結構使得能夠準確測定來自表位及互補位中之側鏈及主鏈原子之個別胺基酸之間的關鍵相互作用。彼此在4.5埃內之胺基酸通常視為接觸殘基。
可「結合 」、「結合至 」、「特異性結合 」或「特異性結合至 」某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或表位)、「對其具有親和力 」及/或「對其具有特異性 」之抗體分子稱為「抵抗 」或「針對 」該表位、抗原或蛋白質，或係關於該表位、抗原或蛋白質之「結合 」分子。
通常，術語「特異性 」係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域)可結合諸多不同類型之抗原或表位。可基於親和力及/或親合力來測定抗原結合蛋白之特異性。親和力(由抗原與抗原結合蛋白之解離之平衡常數(KD )表示)係表位與抗原結合蛋白上之抗原結合位點之間之結合強度的量度：KD 值愈小，則表位與抗原結合分子之間之結合強度愈強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(KA )，其係1/KD )。如熟習此項技術者所明瞭(例如基於本文之其他揭示內容)，可端視所關注特定抗原以本身已知之方式來測定親和力。親合力係抗原結合分子(例如本發明抗體)與相關抗原之間之結合強度之量度。親合力與表位及抗原結合分子上之其抗原結合位點之間之親和力及存在於抗原結合分子上之相關結合位點數相關。
通常，抗原結合蛋白(例如本發明之抗體分子)以10E-5至10E-14莫耳/升(M)或更小及較佳地10E-7至10E-14莫耳/升(M)或更小、更佳地10E-8至10E-14莫耳/升及甚至更佳地10E-11至10E-13之解離常數(KD ) (如例如在業內已知之Kinexa分析中所量測)及/或以至少10E7 ME-1、較佳地至少10E8 ME-1、更佳地至少10E9 ME-1、例如至少10E11 ME-1之締合常數(KA )進行結合。任一大於10E-4 M之KD 值通常視為指示非特異性結合。較佳地，本發明抗體以小於500 nM、較佳地小於200 nM、更佳地小於10 nM、例如小於500 pM之KD 結合至期望抗原。可本身已知之任一適宜方式來測定抗原結合蛋白與抗原或表位之特異性結合，包含(例如)本文所闡述之分析，例如表面電漿共振(SPR)、斯卡查德分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析(例如放射性免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心式競爭分析)及業內本身已知之其不同變化形式。
可藉由稱為親和力成熟之過程來增強抗體分子之結合親和力(Marks等人，1992, Biotechnology 10:779-783；Barbas,等人，1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813；Shier等人，1995, Gene 169:147-155)。親和力成熟抗體由此亦涵蓋於本發明中。
舉例而言，發明性抗體之親和力成熟可改變引入框架及/或CDR區中之一或多種胺基酸，此可改良對抗原之結合親和力且並不改變抗體對其表位之特異性。因此，本發明實施例包含(例如)包括以下之特異性結合至CD73之抗體：與SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%胺基酸序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%胺基酸序列一致性之輕鏈可變區。舉例而言，本發明之親和力成熟抗體可包括如上文所揭示包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代(其中胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)輕鏈可變區及/或如上文所揭示包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸取代(其中胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)之重鏈可變區。
舉例而言，本發明亦涵蓋本發明之抗體序列中之突變，該等突變可包含取代、缺失(包含內部缺失)、添加(包含產生融合蛋白之添加)或胺基酸序列內及/或附近之胺基酸殘基之保守取代其不產生功能(「沉默」)變化，該變化會產生在功能上等效之抗CD73抗體)。該變化可(例如)包括保守胺基酸取代，該等取代可基於所涉及殘基在以下方面中之相似性來進行：極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性特性。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包含丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包含甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸及麩醯胺酸；帶正電荷(鹼性)胺基酸包含精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷(酸性)胺基酸包含天門冬胺酸及麩胺酸。另外，甘胺酸及脯胺酸係可影響鏈定向之殘基。非保守取代使得需要交換該等種類之一種之成員與另一種類之成員。
在一實例中，本發明係關於具有增強之效應功能之抗CD73抗體以及其經改變/突變衍生物，該等衍生物包含(但不限於)展現改變之結合特性(例如改變之締合常數k締合 、解離常數k解離及/或平衡常數或結合親和力KD )者。
本文所揭示之組合物及方法涵蓋具有所指定序列或與其實質上一致或類似之序列、例如與所指定序列至少85%、90%、95%一致或更高之序列的多肽及核酸。在胺基酸序列之背景下，術語「實質上一致」在本文中用於係指第一胺基酸含有足夠或最少數量之i)與第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基一致之胺基酸殘基，或ii)第二胺基酸序列中之所比對胺基酸殘基之保守取代，從而第一及第二胺基酸序列可具有共有結構結構域及/或共有功能活性。舉例而言，與參考序列(例如本文所提供之序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之含有共有結構結構域之胺基酸序列。在核苷酸序列之背景下，術語「實質上一致」在本文中用於係指第一核酸序列含有足夠或最少數量之與第二核酸序列中之所比對核苷酸一致之核苷酸，從而第一及第二核苷酸序列編碼具有共有功能活性之多肽或編碼共有結構多肽結構域或共有功能多肽活性。舉例而言，與參考序列具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
在兩個或更多個核酸或多肽序列之背景中，術語「一致」或「一致性百分比」係指，兩個或更多個序列或子序列在比較及比對最大相似性時相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。為測定一致性百分比，出於最佳對比目的來比對序列(舉例而言，可將空位引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基酸或核酸序列進行最佳對比)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。在第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%係該等序列所共有之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(例如重疊位置)數×100)。在一些實施例中，所比較兩個序列在視需要(例如不包含延伸出所比較序列外之額外序列)於序列內引入空位後長度相同。舉例而言，在比較可變區序列時，不考慮前導序列及/或恆定結構域序列。在兩個序列之間之序列對比中，「相應」 CDR係指兩個序列中相同位置之CDR (例如每一序列之CDR-H1)。
可使用數學算法來測定兩個序列之間之一致性百分比或類似性百分比。用於對比兩個序列之數學算法之較佳非限制性實例係Karlin及Altschul之算法(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)，其根據Karlin及Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877加以修改。此一算法已納入Altschul等人之NBLAST及XBLAST程式中(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)。可使用NBLAST程式(評分=100，字長=12)來實施BLAST核苷酸搜索以獲得與編碼所關注蛋白質之核酸同源之核苷酸序列。可使用XBLAST程式(評分=50，字長=3)來實施BLAST蛋白質搜索以獲得與所關注蛋白質同源之胺基酸序列。為獲得空位比對以用於對比目的，可如Altschul等人，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所闡述來利用空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast來實施迭代搜索以檢測分子之間之遠距離聯繫(同一文獻)。在利用BLAST、Gapped BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。用於對比序列之數學算法之另一較佳非限制性實例係Myers及Miller之算法(CABIOS，1989)。此一算法已納入ALIGN程式(2.0版)中，其係GCG序列比對軟體包之一部分。在利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘差表、等於12之空位長度罰分及等於4之空位罰分。用於序列分析之其他算法為業內已知且包含ADVANCE及ADAM，如Torellis及Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中所闡述；及FASTA，如Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8中所闡述。在FASTA內，ktup係設定靈敏度及搜索速度之控制選項。若ktup=2，則藉由檢查比對殘基對來發現所比較兩個序列中之類似區域；若ktup=1，則檢查單一比對胺基酸。對於蛋白質序列而言，可將ktup設定為2或1，或對於DNA序列設定為1至6。若未指定ktup，則對於蛋白質而言預設值為2且對於DNA而言預設值為6。或者，可使用CLUSTAL W算法來實施蛋白質序列比對，如由Higgins等人，1996, Methods Enzymol. 266:383-402所闡述。
根據標準三字母或單字母胺基酸代碼來指示胺基酸殘基，如業內通常所知並認可。在比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指與第二序列相比在參考序列之某一位置之所指示數量之胺基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代之情形下，該(等)取代較佳為保守胺基酸取代，此意指胺基酸殘基由具有類似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小或基本上無影響之另一胺基酸殘基代替。該等保守胺基酸取代已為業內(例如)自WO1998/49185所熟知，其中保守胺基酸取代較佳係以下群組(i) - (v)中之一個胺基酸由同一群組中之另一胺基酸殘基取代之取代：(i)較小脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gin；(iii)極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(iv)較大脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤佳之保守胺基酸取代如下：Ala取代為Gly或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或取代為His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為Gln；lle取代為Leu或取代為Val；Leu取代為lle或取代為Val；Lys取代為Arg、取代為Gln或取代為Glu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為lle；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp或取代為Phe；Val取代為Ile或取代為Leu。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」 (若為單鏈)可在本文中互換使用。
術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「多核苷酸序列」及「多核苷酸」可互換使用。
本文所用之術語「經分離」係指自其原始或天然環境(舉例而言，若其為天然的，則為天然環境)取出之材料。舉例而言，存在於活動物中之天然多核苷酸或多肽未經分離，但藉由人類干預與天然系統中之一些或所有共存材料分離之相同多核苷酸或多肽係經分離的。該等多核苷酸可為載體之一部分及/或該等多核苷酸或多肽可為組合物之一部分，且仍經分離以使該載體或組合物不為在自然界中發現其之環境的一部分。
較佳地，核酸係表現載體之一部分，其中該核酸分子可操作地連接至至少一個調控序列，其中該調控序列可為啟動子、增強子或終止子序列，且最佳為異源性啟動子、增強子或終止子序列。
術語「PD1」及「PD-1」可在本文中互換使用。術語「PDL1」及「PDL-1」同樣可在本文中互換使用。如下文所揭示之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5分別係指特定抗PD-1抗體。
在以引號(「 」)書寫時，本文所用之「MEDI9447」及「BMS986179」分別係指根據如WO 2016/075099 (「MEDI9447」)及WO 2016/081748 (「BMS986179」，在其中亦稱為mAb-CD73.4-Vh-hHC-IgG2-IgG1.1f)中所揭示之資訊生成之參考抗體。WO 2016/075099及WO 2016/081748之全部內容分別以引用方式併入本文中。
為避免疑問，「分化簇73」或「CD73」意指由基因「NT5E-細胞外5'-核苷酸酶[智人(人類) ]」編碼之人類蛋白質，其係以以下序列來提供：NCBI參考序列：NP_002517.1，可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002517.1獲得(長同功型，其對應於UniProt登錄號P21589)；以及NCBI參考序列：NP_001191742.1，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001191742.1獲得(短同功型)；及編碼該等蛋白質之各別核酸序列。如本文中所使用，「CD73」可係指該等蛋白質之單體及/或二聚體形式。在一些實施例中，「CD73」係指如上文所闡述之人類CD73之長同功型。對於如本文所提供之晶體學資料而言，胺基酸編號對應於Uniprot登錄號P21589 (包含信號肽)，其中成熟蛋白質不含對應於P21589之胺基酸殘基1-26之信號肽，然而，本申請案通篇之編號方案係指P21589之全長胺基酸序列。本文所用之鼠類CD73係指Uniprot登錄號Q61503。
在活細胞及活生物體中，CD73通常以經由醣基磷脂醯肌(GPI)膜鍵聯錨定至細胞膜(在本文中亦稱為「GPI錨」)之二聚體蛋白形式存在，且具有細胞外-5’-核苷酸酶活性。
術語「可溶性CD73」及「sCD73」可在本文中互換使用，其意指不(例如)經由GPI錨附接至膜之CD73分子。
術語「結合細胞之CD73」意指(例如)經由GPI錨附接至細胞表面之CD73分子。
術語「非結合細胞之CD73」係指存在於細胞外空間中之CD73。其包含可溶性CD73及結合囊泡之CD73 (亦即附接至細胞外空間中之囊泡之表面之CD73分子)。術語「非結合細胞之CD73」不包含所有「結合細胞之CD73」。可藉由量測細胞培養上清液中之CD73活性來測定「非結合細胞之CD73」之活性，如實例8中所闡述。
術語「IFNγ」、「IFNg」、「干擾素γ」、「干擾素-γ」、「IFN-γ」、「IFNG」、「IFNγ (IFN gamma)」、「IFN-y」或類似者可在本文中互換使用，且表示如業內已知之干擾素家族之細胞介素(NCBI基因編號：3458)，其係由先天性免疫系統及適應性免疫系統之細胞(例如T細胞)所分泌。
本發明之抗CD73抗體 如上文所詳述，CD73在調控T細胞活性及由此之免疫系統活性中發揮重要作用。在多種不同癌症環境中已展示，拮抗性抗CD73抗體分子可逆轉腺苷介導之T細胞活性抑制，由此活化免疫系統以攻擊腫瘤並由此治療癌症。
本發明提供改良之抗CD73抗體。自CD73之祖細胞鼠類抗體(稱為A1、A2、A3及A4，參見表9)，生成人類化變體。本發明之較佳抗CD73抗體分子稱為B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5及C6 (參見表9)，其係人類化單株抗體。本發明之抗CD73抗體亦可(例如)稱為「拮抗性CD73抗體(antagonistic CD73 antibody或antagonistic CD73 antibodies)」，其中術語「拮抗性」或其任一語法等效形式係指藉由發明性CD73抗體抑制CD73功能(例如可溶性及細胞表面結合)。
使用活體外T細胞活化分析(進一步闡述於實例6中)，本發明者檢驗本發明之代表性抗CD73抗體之功能特性。如可在實例6以及表5及6中看到，所測試抗體能夠誘導T細胞增殖至高於某些供體中之參考抗CD73抗體之程度。另外，與某些供體中之參考抗CD73抗體相比，所測試抗體能夠在T細胞中誘導較高IFNγ含量。如可瞭解，本發明之抗CD73抗體較先前技術之參考抗CD73抗體更有效地誘導T細胞活化之此驚人能力表明，其可更有效地治療癌症及/或改良臨床結果。
發明者進一步探究了本發明之抗CD73抗體分子之各種其他功能特性。此評價包含測定藉由抗CD73抗體抑制腺苷形成之能力。此係藉由在細胞培養上清液中量測結合細胞之CD73之抑制以及非結合細胞之CD73之抑制來進行。與參考抗CD73抗體相比，本發明之抗CD73抗體展示較高之抑制非結合細胞之CD73的活性。因此，與參考CD73抗體相比，該等抗體能夠更完全地抑制CD73。
與業內已知之抗CD73抗體相比，本發明之抗CD73抗體尤其在抑制腺苷生成及T細胞活化方面具有改良之性質。此與已知參考抗CD73抗體分子「MEDI9447」及「BMS986179」不同，如可自隨附實例看到。如可瞭解，本發明之抗CD73抗體分子之此優良性表明，其與其他抗CD73抗體相比可具有較高效能及/或較佳臨床結果且由此可容許更有效之癌症療法。
因此，本發明之第一態樣由此提供抗CD73抗體分子，其包括： (1)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:1 (hcCDR1)、SEQ ID NO:2 (hcCDR2)及SEQ ID NO:3 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:4 (lcCDR1)、SEQ ID NO:5 (lcCDR2)及SEQ ID NO:6 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (2)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:7 (hcCDR1)、SEQ ID NO:8 (hcCDR2)及SEQ ID NO:9 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:10 (lcCDR1)、SEQ ID NO:11 (lcCDR2)及SEQ ID NO:12 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (3)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:13 (hcCDR1)、SEQ ID NO:14 (hcCDR2)及SEQ ID NO:15 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:16 (lcCDR1)、SEQ ID NO:17 (lcCDR2)及SEQ ID NO:18 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (4)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:19 (hcCDR1)、SEQ ID NO:20 (hcCDR2)及SEQ ID NO:21 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:22 (lcCDR1)、SEQ ID NO:23 (lcCDR2)及SEQ ID NO:24 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (5)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:25 (hcCDR1)、SEQ ID NO:26 (hcCDR2)及SEQ ID NO:27 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:28 (lcCDR1)、SEQ ID NO:29 (lcCDR2)及SEQ ID NO:30 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (6)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:31 (hcCDR1)、SEQ ID NO:32 (hcCDR2)及SEQ ID NO:33 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:34 (lcCDR1)、SEQ ID NO:35 (lcCDR2)及SEQ ID NO:36 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (7)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:37 (hcCDR1)、SEQ ID NO:38 (hcCDR2)及SEQ ID NO:39 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:40 (lcCDR1)、SEQ ID NO:41 (lcCDR2)及SEQ ID NO:42 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (8)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:43 (hcCDR1)、SEQ ID NO:44 (hcCDR2)及SEQ ID NO:45 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:46 (lcCDR1)、SEQ ID NO:47 (lcCDR2)及SEQ ID NO:48 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (9)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:49 (hcCDR1)、SEQ ID NO:50 (hcCDR2)及SEQ ID NO:51 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:52 (lcCDR1)、SEQ ID NO:53 (lcCDR2)及SEQ ID NO:54 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (10)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:55 (hcCDR1)、SEQ ID NO:56 (hcCDR2)及SEQ ID NO:57 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:58 (lcCDR1)、SEQ ID NO:59 (lcCDR2)及SEQ ID NO:60 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (11)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:61 (hcCDR1)、SEQ ID NO:62 (hcCDR2)及SEQ ID NO:63 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:64 (lcCDR1)、SEQ ID NO:65 (lcCDR2)及SEQ ID NO:66 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (12)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:67 (hcCDR1)、SEQ ID NO:68 (hcCDR2)及SEQ ID NO:69 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:70 (lcCDR1)、SEQ ID NO:71 (lcCDR2)及SEQ ID NO:72 (lcCDR3)之胺基酸序列。
如上文所概述，本發明之較佳抗CD73抗體分子稱為B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5及C6。本文提供序列表(表9)，其易於容許鑑別本發明之特定抗CD73抗體分子之個別胺基酸序列。
除如本文所陳述之CDR序列外，本發明之抗體分子亦包含免疫球蛋白框架區(FR)序列。該等序列較佳地在人類中並非免疫原性，且由此較佳係人類或人類化FR序列。業內已知適宜之人類或人類化FR序列。特定較佳之FR序列可自本文所展示之實施例獲得，該等實施例揭示完整抗體分子及由此CDR序列以及FR序列。
製備本發明之第一態樣之抗體分子在業內已眾所周知，且熟習此項技術者將能夠易於製備具有本發明之第一態樣之特性之抗體分子。該等方法之實例提供於下文中。
關於包括兩條完整重鏈及兩條完整輕鏈之抗體(如具有IgG1或IgG4類型者)之產生，參見Norderhaug等人，J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87；Kipriyanow及Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004；Shukla等人，2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39。
亦已知藉由在宿主細胞(如大腸桿菌(E. coli)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)/法夫克馬格特勒酵母(Komagataella phaffii)或哺乳動物細胞系(例如CHO或NS0))中重組表現編碼scFv構築體之核酸以產生功能scFv分子來製造scFv抗體之製程(Rippmann等人，Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869；Yamawaki等人，J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407；Sonoda等人，Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253)。
為避免疑問，本文針對本發明之第一態樣所列示之每一具體實施例亦可考慮用於本發明之獨立態樣。
本發明之第一態樣之較佳實施例其中該抗體分子係人類化抗體分子者。
在一實施例中，該抗體係重組抗體。在一實施例中，該抗體係經分離的。在一實施例中，該抗體係經純化的。
本發明之第一態樣之另一較佳實施例係其中該抗體分子係單株抗體、Fab、F(ab’)2 、Fv或scFv者。
術語「人類化」、「Fab」、「F(ab’)2 」、「Fv」及「scFv」在業內已眾所周知且在本文中進一步論述於說明書之定義部分中。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有選自由以下組成之群之重鏈恆定區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區。較佳地，重鏈恆定區係IgG1，更佳地係具有L234A及/或L235A突變之IgG1 (Kabat編號；對應於實際編號中之位置L232A及L233A)。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有κ或λ輕鏈恆定區。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括如上文所揭示與SEQ ID NO: 73、75、77或79中之任一者至少85%、90%、95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域。
在一實施例中，該抗體分子具有包括SEQ ID NO: 73、75、77或79中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變結構域。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括與SEQ ID NO: 81、83、85、87、89、91、93或95中之任一者至少85%、90%、95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域。較佳地，該抗體分子具有包括SEQ ID NO: 81、83、85、87、89、91、93或95中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變結構域。更佳地，該抗體係人類化的。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括與SEQ ID NO: 74、76、78或80中之任一者至少85%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
在一實施例中，該抗體分子具有包括SEQ ID NO: 74、76、78或80中之任一者之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括與SEQ ID NO: 82、84、86、88、90、92、94或96中之任一者至少85%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。較佳地，該抗體分子具有包括SEQ ID NO: 82、84、86、88、90、92、94或96之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。更佳地，該抗體係人類化的。
計算胺基酸序列一致性之方法在業內已眾所周知且在本文中進一步論述於說明書之定義部分中。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 89之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之重鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之輕鏈。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 89之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之輕鏈。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之輕鏈。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 102之胺基酸序列之輕鏈。
在一實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之輕鏈。
在一較佳實施例中，抗CD73抗體分子具有包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之輕鏈。
對於所有上述實施例而言，應理解，藉由使用術語「包括」，其意欲亦包含各別結構域或分子「由所指示胺基酸序列組成」之實施例。
在一個較佳實施例中，抗CD73抗體分子能夠以小於10 nM、較佳地小於1 nM、更佳地小於100 pM之解離常數(KD )結合至人類CD73。
在一些實施例中，抗CD73抗體分子能夠以高親和力結合至人類CD73 (長同功型)及食蟹獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis )) CD73。在一些實施例中，高親和力係指KD 小於10 nM (例如9、8、7、6 nM或更低)，如藉由表面電漿共振(SPR)所量測。在較佳實施例中，高親和力係指KD 小於1 nM，如藉由SPR所量測。在更佳實施例中，抗CD73抗體分子能夠以小於500 pM之KD 結合至人類CD73。在最佳實施例中，抗體以小於100 pM之KD 結合至人類CD73。用於使用SPR測定KD 之方案提供於隨附實例中。
在一個較佳實施例中，抗CD73抗體分子以低於人類CD73之親和力(例如低於人類CD73 10倍、50倍、100倍或110倍之親和力)結合至小鼠CD73。小鼠CD73之序列可藉由基因庫登錄號NP_035981.1 (僅鑑別1種形式)獲得。食蟹獼猴CD73之序列可藉由RefSeq登錄號XP_ 005552488.1獲得。
在一個實施例中，抗CD73抗體分子能夠減小人類CD73之活性。在一些實施例中，人類CD73之活性係指將AMP水解成腺苷之酶功能。因此，減小人類CD73之活性係指抑制該酶功能。在一個實施例中，抗CD73抗體在活體外抑制人類CD73之酶功能，如實例中所述。在一些實施例中，減小人類CD73之活性係指減小CD73之細胞表面含量。在另一實施例中，在基於細胞之分析中例如使用癌細胞系(例如Colo201)來測定抑制(藉由阻斷CD73酶功能或藉由減小CD73細胞表面含量)。
在一些實施例中，抗CD73抗體分子將腺苷形成抑制至少70%、較佳地大於80%，如在實例5中所闡述之基於細胞之分析中所測定。在尤佳實施例中，抗CD73抗體分子將細胞培養上清液中之腺苷形成抑制至少60%、至少70%、較佳地大於75%，亦即其抑制非結合細胞之CD73之活性，如實例8中所闡述。在一實施例中，抗CD73抗體分子將非結合細胞之CD73之腺苷形成抑制至少70%。
在又一實施例中，抗CD73抗體在活體內抑制人類CD73之酶功能。
用以在活體外或在活體內測定人類CD73之酶活性抑制之方式在業內已習知，且亦進一步詳細闡述於隨附實例中。
在一些實施例中，抗CD73抗體分子能夠以小於5 nM或4、3、2、1.5、1、0.5 nM或更低之IC90 抑制人類CD73之酶活性。在尤佳實施例中，抗CD73抗體分子以小於0.4 nM之IC90 抑制人類CD73之酶活性。測定IC90 之方案提供於隨附實例中。在一些實施例中，抗CD73抗體以小於1 nM之IC90 抑制人類CD73，但僅中等程度地減小CD73之細胞表面含量(亦即小於30%、小於25%或小於20%)。
在一實施例中，抗CD73抗體能夠逆轉T細胞功能之AMP依賴性抑制。在一較佳實施例中，T細胞功能係指T細胞增殖，其已知可由藉由CD73自單磷酸腺苷(AMP)所生成之腺苷抑制。本發明抗體能夠藉由抑制藉由CD73之腺苷產生來逆轉此抑制，較佳地逆轉至與對照值(使用不添加AMP之同型對照處理之經刺激T細胞)實質上相同之值。在較佳實施例中，本發明抗體能夠將T細胞增殖恢復至對照值之40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或甚至大於100% (例如110%、115%、120%或125%)。用以測定T細胞功能之AMP依賴性抑制之分析闡述於實例6中。在一些實施例中，T細胞係CD4+。在其他實施例中，T細胞係CD8+。
在一些實施例中，T細胞功能係指藉由T細胞之干擾素γ釋放。不期望受限於任何理論，據信，由CD73產生之腺苷會抑制該藉由T細胞之干擾素γ釋放。因此，本發明抗體能夠恢復藉由T細胞之干擾素γ釋放，較佳地恢復至與對照值(使用不添加AMP之同型對照處理之經刺激T細胞)實質上相同之值。在較佳實施例中，本發明抗體能夠將由AMP抑制之T細胞之干擾素γ釋放誘導至最高2× (亦即兩倍)、3×、5×、10×、20×、30×、40×、50×或大於50×於對照值(使用添加AMP之同型對照處理之經刺激T細胞)之值。用以測定T細胞之干擾素γ釋放之分析闡述於實例6中。在一些實施例中，T細胞係CD4+。在其他實施例中，T細胞係CD8+。
在一尤佳實施例中，T細胞功能係指如上文所闡述之T細胞增殖及干擾素γ釋放，亦即，抗CD73抗體能夠刺激T細胞增殖及T細胞之干擾素γ釋放。
在另一實施例中，抗CD73抗體分子與可溶性CD73形成具有界定大小之抗原-抗體複合物(例如2:2寡聚物)。該等複合物小於藉由業內已知之其他CD73抗體形成之複合物(例如參見圖2)。抗原-抗體複合物之大小先前與Fcγ受體活化相關，且可由此在不期望免疫原性中發揮作用(Krayukhina等人，Analytical ultracentrifugation with fluorescence detection system reveals differences in complex formation between recombinant human TNF and different biological TNF antagonists in various environments (2017). mAbs)。
在一些實施例中，本發明提供與本文所闡述之抗體A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6 (如表9中所提及)結合至相同表位之抗CD73抗體。在一些實施例中，抗CD73抗體與A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6 (如表9中所提及)競爭結合至相同表位。在一些實施例中，抗CD73抗體結合至與A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6 (如表9中所提及)之表位重疊或實質上重疊之表位。較佳地，該抗CD73抗體係單株抗體。
在一實施例中，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括結合至CD73 (Uniprot編號P21589)上之下列胺基酸中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部之輕鏈可變區互補位：F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、E203及K206，其中輕鏈可變區與CD73上之該等胺基酸殘基之結合有助於藉由發明性抗CD73抗體來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括(例如)結合至如上文所揭示之胺基酸殘基(例如F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、E203及K206)中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部之輕鏈可變區互補位，該等胺基酸殘基係CD73上之包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211 (胺基酸編號對應於Uniprot登錄號P21589 (包含信號肽)，其中成熟蛋白質不含包括胺基酸殘基1-26之信號肽，然而，本申請案通篇之編號方案係指P21589之全長胺基酸序列)且由發明性抗CD73抗體特異性結合之構形表位之一部分，其中發明性抗CD73抗體之可變輕鏈包括SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96之一個胺基酸序列。本發明術語由如本文所揭示之發明性抗CD73抗體結合之「構形表位」係指非線性表位，其中由發明性抗體識別及結合之表位係藉由多肽或蛋白質之二級及/或三級結構形成且係多肽或蛋白質之摺疊三維構形之獨特之處。通常，構形表位由在線性序列中不連續但在蛋白質摺疊結構中聚集在一起之胺基酸組成。然而，構形表位亦可由採用關於多肽之摺疊三維構形之獨特構形之胺基酸線性序列組成，且該構形不存在於該多肽或蛋白質之變性狀態中。
根據一實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括結合至下列胺基酸殘基L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210及N211中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部之重鏈可變區互補位，該等胺基酸殘基係CD73上之包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211 (胺基酸編號對應於Uniprot登錄號P21589)之構形表位之一部分，其中重鏈可變區與CD73上之胺基酸殘基之結合有助於藉由發明性抗CD73抗體來抑制CD73功能。
根據一實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括含有SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95之胺基酸序列中之一者且結合至CD73上胺基酸殘基L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210及N211中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部的重鏈可變區互補位，該等胺基酸殘基係藉由人類CD73 (Uniprot登錄號P21589)之胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成且由發明性抗CD73抗體特異性結合之構形表位之一部分。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括含有SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120中之一者之胺基酸序列且結合(例如)至如上文所揭示胺基酸殘基(例如F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、T158、L159、P160、Y161、K162、E203及K206)中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部的輕鏈，該等胺基酸殘基構成CD73上之藉由胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211 (胺基酸編號對應於Uniprot登錄號P21589)形成之構形表位且係其一部分。如上文所揭示之發明性輕鏈與CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之結合有助於發明性抗CD73抗體與CD73的特異性結合，由此抑制其功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括含有SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119中之一者之胺基酸序列且結合至CD73上胺基酸L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210及N211中之至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部的重鏈，該等胺基酸構成藉由人類CD73之胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211 (Uniprot登錄號P21589)形成之構形表位且係其一部分。如上文所揭示之發明性重鏈與CD73上藉由胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成之構形表位之結合有助於發明性抗CD73抗體與CD73的特異性結合，由此抑制CD73功能。
根據一實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73與藉由人類CD73 (Uniprot登錄號P21589)之胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成之構形表位之結合誘導T細胞中的IFNγ釋放(例如參見圖4)。舉例而言，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體(其包括含有SEQ ID NO: 55 (HCDR1)、56 (HCDR2)及SEQ ID NO: 57(HCDR3)之胺基酸序列之重鏈CDR 1-3及含有SEQ ID NO: 58 (LCDR1)、SEQ ID NO.:59 (LCDR2)及SEQ ID NO: 60 (LCDR3)之胺基酸序列之輕鏈CDR 1-3，或包括含有SEQ ID NO 91之胺基酸序列之VH 及含有SEQ ID NO 92之胺基酸序列之VL ，或(例如)包括含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之重鏈及含有SEQ ID No: 116之胺基酸序列之輕鏈)之結合會誘導T細胞中之IFNγ釋放(例如參見圖4)，舉例而言，由發明性抗體誘導之活體外IFNγ釋放為同型對照+ AMP之至少5-、6-、7-、8-、9-、10-、11倍，其中IFNγ含量可(例如)如實例6中所揭示來測定。因此，本發明抗體能夠將藉由T細胞之IFNγ釋放恢復與對照值(使用不添加AMP之同型對照處理之經刺激T細胞)實質上相同之值(例如75%、80%、85%、90%、95%)。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 101之重鏈及SEQ ID NO: 102之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 109之重鏈及SEQ ID NO: 110之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 111之重鏈及SEQ ID NO: 112之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 113之重鏈及SEQ ID NO: 114之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 115之重鏈及SEQ ID NO: 116之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 117之重鏈及SEQ ID NO: 118之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 119之重鏈及SEQ ID NO: 120之輕鏈，且藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或所有胺基酸殘基來抑制CD73功能。
根據一較佳實施例，本發明提供抗CD73抗體，其結合至藉由人類CD73之胺基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成之構形表位且與 交叉競爭結合至上文所揭示發明性抗CD73抗體之構形表位(例如與包括SEQ ID NO: 115之重鏈及SEQ ID NO: 116之輕鏈之抗CD73抗體競爭結合)。可(例如)藉由業內已知之適宜方法(例如闡述於Anal Biochem. 2009 Mar 15;386(2):172-80中者)來評價抗體結合之交叉競爭。
根據一較佳實施例，發明性抗CD73抗體之重鏈可變區之胺基酸殘基T28、T31、Y32、W33、Y52、L55、D57、L99、L100、D101、Y102及發明性抗CD73抗體之輕鏈可變區之胺基酸殘基R30、S31、Y32、W49、Y50、T51、S52、R53、S65、G66、S67、E92接觸及/或特異性結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位，其中發明性抗CD73抗體包括SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，且其中發明性抗CD73抗體以小於5nM、4nM、3nM、2nM、1.5nM、1nM、0.5nM或更低之IC90 、較佳地以小於0.5nM之IC90 抑制CD73酶活性。舉例而言，如上文所揭示之發明性抗體可將腺苷形成抑制至少60%、至少70%、較佳地大於75%。可(例如)在細胞培養上清液中如實例8中所闡述來評價如上文所揭示之發明性抗體對活體外腺苷形成之抑制。可(例如)在血樣中或在自腫瘤微環境獲取之試樣中藉由如Löfgren L, Pehrsson S, Hägglund G, Tjellström H, Nylander S (2018) Accurate measurement of endogenous adenosine in human blood. PLoS ONE 13(10): e0205707. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205707中所闡述之方法來評價發明性抗體對活體內腺苷形成之抑制。
舉例而言，在一較佳實施例中，藉由結合至包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體藉由抑制CD73採用「開放」及「閉合」構形(其係CD73水解AMP之酶活性所需)來抑制CD73之酶活性。
根據一較佳實施例，如上文所揭示之發明性抗CD73抗體藉由結合至CD73上包括胺基酸殘基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211之構形表位來抑制CD73酶活性，由此減小CD73之細胞表面含量(參見實例4)。
較佳地，該抗CD73抗體係人類化的。可使用業內已知方法來生成該等抗體，例如藉由使用用於免疫化之表位序列或重組表現並純化之CD73蛋白。
可使用業內已知方法來測定抗體表位，例如藉由抗體-抗原複合物之氫-氘交換質譜(HDX-MS)、NMR、定點誘變(例如丙胺酸掃描)或X射線結晶術。
氫/氘交換質譜(HDX-MS)藉由監測蛋白質骨架醯胺氫原子之氘交換之速率及程度來測定溶液中之蛋白質構形及構形動力學。HDX之交換程度取決於蛋白質溶劑可及性及氫鍵，且可藉由MS精確量測HDX上蛋白質之質量增加。當此技術與酶消解配對時，可以肽層面解析結構特徵，此使得能夠將表面暴露之肽與內部摺疊之肽區分開。在表位定位實驗中，對抗原及抗原/mAb複合物平行實施氘標記及後續驟冷實驗，然後進行在線胃蛋白酶消解、肽分離及MS分析。
可使用業內已知之任一方法來測定表位之結合競爭。舉例而言，可使用標準ELISA分析或競爭性ELISA分析，其中將重組人類CD73蛋白固定在板上，添加不同濃度之未經標記之第一抗體，洗滌板，添加經標記之第二抗體，洗滌，並量測結合標記之量。若增加濃度之未經標記(第一)抗體(亦稱為「封阻抗體」)抑制經標記(第二)抗體之結合，則第一抗體視為抑制第二抗體與板上之靶之結合，或視為競爭第二抗體之結合。另外或或者，可使用表面電漿共振(SPR)分析來評價該等抗體競爭之能力。測試抗體抑制本文所闡述之抗CD73抗體(例如抗體A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6，表9)與CD73之結合之能力證實，測試抗體可與該抗體競爭結合至CD73。
上述(亦即根據本發明之第一態樣)抗CD73抗體亦在本文中通稱為「本發明抗體」、「本發明之CD73抗體」、「本發明之抗CD73抗體」、「本文所闡述之抗體」或類似者。
本發明之另一態樣提供編碼本發明之第一態樣中任一者之抗CD73抗體之分子重鏈可變區及/或輕鏈可變區的經分離核酸分子。
本發明之核酸分子包含(但不限於)編碼本文所提供之抗CD73抗體胺基酸序列之DNA分子。同樣，本發明亦係關於在高嚴格度結合及洗滌條件下(如WO 2007/042309中所定義)雜交至編碼序列表中所展示多肽序列之DNA分子之核酸分子。較佳分子(自mRNA角度)係與本文所闡述之一種DNA分子具有至少75%或80% (較佳地至少85%、更佳地至少90%及最佳地至少95%)之同源性或序列一致性者。舉例而言，鑒於在真核細胞中表現抗體，序列表中所展示之DNA序列已經設計以匹配真核細胞中之密碼子使用。若期望在大腸桿菌中表現抗體，則可改變該等序列以匹配大腸桿菌密碼子使用。可以若干不同方式來構築本發明之DNA分子之變體，如(例如)在WO 2007/042309中所闡述。
在另一態樣中，本發明提供含有核酸分子之表現載體，該核酸分子包括編碼本發明之第一態樣中之任一者之抗CD73抗體分子之重鏈可變區及/或輕鏈可變區的核苷酸序列。
較佳地，核酸分子包括編碼SEQ ID NO: 81、83、85、87、89、91、93及95中任一者之重鏈可變區之核苷酸序列。較佳地，核酸分子包括編碼SEQ ID NO: 82、84、86、88、90、92、94或96中任一者之輕鏈可變區之核苷酸序列。
較佳地，表現載體另外包括編碼重鏈之恆定結構域及/或輕鏈之恆定結構域之核酸分子、較佳地DNA分子，該等恆定結構域分別連接至分別編碼重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域之核酸分子、較佳地DNA分子。
在一特定較佳實施例中，可使用兩個表現載體，一個表現載體用於表現重鏈，另一表現載體用於表現輕鏈，該兩個表現載體可然後皆轉染至宿主細胞中以用於重組蛋白表現。
較佳地，表現載體係包括該(等)可操作地連接至至少一個調控序列之核酸分子之載體，其中該調控序列可為啟動子、增強子或終止子序列且最佳係異源性啟動子、增強子或終止子序列。
可以本身已知方式(例如藉由自動化DNA合成及/或重組DNA技術)基於關於本文所給出本發明抗體之胺基酸序列之資訊來製備或獲得本發明核酸。
在另一態樣中，本發明係關於具有如上文所闡述之表現載體之宿主細胞，表現載體係(例如)編碼本發明之抗CD73抗體分子之重鏈之表現載體及編碼本發明之抗CD73抗體分子之輕鏈之表現載體。在一些實施例中，宿主細胞包括編碼本發明之抗CD73抗體分子之輕鏈及重鏈二者之載體，尤其在抗體係單鏈抗體、例如scFv時。
根據一尤佳實施例，該等宿主細胞係真核細胞，例如哺乳動物細胞、尤其人類細胞(活體外)。在另一實施例中，該等宿主細胞係細菌細胞。其他有用細胞係酵母細胞或其他真菌細胞。
可用作表現宿主之哺乳動物細胞系在業內已眾所周知且尤其包含中國倉鼠卵巢(CHO, CHO-DG44)細胞、NSO、SP2/0細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞或任一該細胞系之衍生物/後代。可使用其他哺乳動物細胞(包含(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴及齧齒類動物細胞系)或其他真核細胞(包含(但不限於)酵母、昆蟲及植物細胞)或原核細胞(例如細菌)。藉由將宿主細胞培養足以容許在宿主細胞中表現抗體之時間段來產生本發明抗體。然而，亦可使用兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及業內用於表現異源性蛋白質之任何其他細胞。
在另一態樣中，本發明提供製造本發明之抗CD73抗體分子之方法，其包括以下步驟： -在容許形成本發明之抗CD73抗體分子之條件下培養如上文所闡述之宿主細胞；及 -回收該抗體分子。
在一實施例中，製造方法另外包括進一步純化該抗體之步驟，如下文進一步所闡述。
在一實施例中，製造方法另外包括進一步修飾該抗體之步驟，如本文進一步所闡述。
在一實施例中，製造方法另外包括將該抗體分子調配成醫藥組合物之步驟，如本文進一步所闡述。
可使用業內已知產生抗體之任一方法，例如如本文所闡述者。
在另一態樣中，本發明提供用於醫學中之如上文所闡述之抗CD73抗體。本發明抗體之具體醫學用途進一步詳細闡述於下文中。
在另一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包括本發明之抗CD73抗體及醫藥上可接受之載劑。適宜載劑在業內已習知且進一步闡述於下文中。此組合物亦可包括如下文更詳細地所闡述之另一治療劑，例如(但不限於) PD-1拮抗劑。
包含抗CD73抗體及其他治療劑(例如PD-1拮抗劑)之醫藥組合物；部分套組、方法及用途 PD-1在調控T細胞活性及由此免疫系統活性中發揮重要作用。
已在多種不同癌症環境中展示，拮抗性抗PD-1抗體分子可增加T細胞活性，由此活化免疫系統以攻擊腫瘤且由此治療癌症。
眾所周知，阻斷PD-1受體之單株抗體與針對各種癌症類型之持久臨床反應有關且具有作為新穎癌症治療劑之巨大潛力。亦已展示，靶向CD73可增強抗PD-1抗體之抗腫瘤活性。
基於此背景，發明者試圖探究本發明之抗CD73抗體與PD-1抗體之組合。
使用樹突狀細胞/T細胞共培養分析(進一步概述於實例7中)，發明者檢驗了本發明之代表性抗CD73抗體分子與抗PD-1分子之組合之功能特性。如可在實例7及圖1中看到，抗PD1抗體之效應受AMP抑制，此明確展示，PD1反應依賴於AMP。本發明之抗CD73抗體分子與PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體)之組合能夠恢復AMP依賴性抑制且恢復IFNγ含量。
因此，本發明之另一態樣提供一種醫藥組合物，其包括本發明之抗CD73抗體、PD-1拮抗劑及醫藥上可接受之載劑。適宜載劑在業內已習知且進一步闡述於下文中。
適宜PD-1拮抗劑闡述於下文中。
在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PDL-1抗體。在一些實施例中，此抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：PDR-001、派姆單抗、尼沃魯單抗及匹利珠單抗。較佳地，抗PD-1抗體分子係選自如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
在一些實施例中，抗PDL-1抗體係選自阿替珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗。
除本發明之抗CD73抗體外，亦可使用另一抗CD73抗體，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO08007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所闡述之抗體。
本發明之另一態樣提供包括本發明之抗CD73抗體分子及PD-1拮抗劑之部分之套組。該套組可進一步包括使用說明書。
適宜PD-1拮抗劑闡述於下文中。
在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PDL-1抗體。在一些實施例中，此抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：PDR-001、派姆單抗、尼沃魯單抗及匹利珠單抗。較佳地，抗PD-1抗體分子係選自如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
在一些實施例中，抗PDL-1抗體係選自阿替珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗。
除本發明之抗CD73抗體外，亦可使用另一抗CD73抗體，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO08007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所闡述之抗體。
熟習此項技術者基於上文將明瞭，亦一起揭示用於使用本發明之上述抗體分子(例如本發明之抗CD73抗體及PD-1拮抗劑)治療疾病(如下文更詳細地指定)之醫藥組合物以及使用本發明之該等醫藥組合物或抗體分子治療疾病(如下文更詳細地指定)之方法。
為避免疑問，與如本文所闡述之醫藥組合物、套組、治療方法、醫學用途、投與方法及劑量相關之所有實施例皆涵蓋本文所闡述之任一抗CD73抗體(單獨或與其他治療劑、例如PD-1拮抗劑組合)。可使用如本文所闡述之任一PD-1拮抗劑(包含PD-1及PDL-1之抑制劑)，例如派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4或PD1-5。
在本發明之抗CD73抗體分子及本發明之抗PD-1抗體分子擬經由相同投與途徑同時投與時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或作為組合醫藥調配物或組合物之一部分來投與。同樣，在本發明之抗CD73抗體分子及本發明之抗PD-1抗體分子擬作為組合治療方案之一部分來使用時，可與在使用一種抗體自身時以相同量且根據相同方案來投與每一抗體，且該組合使用可或可不產生協同效應。然而，在抗體組合使用產生協同效應時，亦可減小一或兩種抗體之量而仍達成期望治療作用。此可(例如)用於避免、限制或減少在以常用量使用時與使用一或兩種抗體有關之任何不期望副效應而仍獲得期望藥理學或治療效應。
除抗CD73抗體及PD-1拮抗劑外，上述組合物及套組亦可包括如下文更詳細地所闡述之另一治療劑。
醫藥組合物、投與方法、劑量 本發明進一步係關於用於治療疾病(如下文更詳細地指定)之醫藥組合物，其中該等組合物包括至少一種如本文所提供之抗CD73抗體。本發明進一步涵蓋使用至少一種如之前所陳述之抗CD73抗體或醫藥組合物治療疾病(如下文更詳細地指定)之方法，且進一步涵蓋藉由使用本發明之該(等)抗CD73抗體分子或醫藥組合物來治療該疾病之藥劑之製備。
該等組合物涵蓋本文所闡述之任一抗CD73抗體(單獨或與組合)，其他治療劑係(例如) PD-1拮抗劑，例如派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4或PD1-5。
端視擬使用之具體醫藥調配物或組合物，可以任一適宜方式將抗CD73抗體及/或包括其之組合物投與有需要之患者。因此，抗CD73抗體及/或包括其之組合物可(例如)以有效量或劑量使用以下方式投與：經靜脈內(i.v.)、經皮下(s.c.)、經肌內(i.m.)、經腹膜腔內(i.p.)、經皮、經口、經舌下(例如以置於舌下方且經由黏膜吸附至舌下方之毛細管網絡中之舌下錠劑、噴霧或滴劑形式)、經鼻(內) (例如以鼻噴霧及/或氣溶膠之形式)、經局部、藉助栓劑、藉由吸入或任一其他適宜方式。
根據適於治療及/或緩解擬治療或緩解之疾病、病症或病狀之治療方案來投與抗CD73抗體及/或包括其之組合物。臨床醫師通常能夠端視諸如以下等因素來確定適宜治療方案：擬治療或緩解之疾病、病症或病狀、疾病嚴重程度、其症狀嚴重程度、擬使用之特定本發明抗體分子、擬使用之特定投與途徑及醫藥調配物或組合物、患者之年齡、性別、體重、飲食、總體狀況及臨床醫師熟知之類似因素。通常，治療方案包括以治療有效量或劑量投與本發明之一或多種抗體分子或一或多種包括其之組合物。
通常，為治療及/或緩解本文所提及之疾病、病症及病狀且端視擬治療之特定疾病、病症或病狀、擬使用特定本發明抗體分子之功效、特定投與途徑及所用特定醫藥調配物或組合物，通常以介於0.05 mg/公斤體重及劑量與50.0 mg/公斤體重及劑量之間、較佳地介於5.0 mg/kg/劑量與20.0 mg/kg/劑量之間及更佳地介於10 mg/kg/劑量與15 mg/kg/劑量之間之量連續(例如藉由輸注)或更佳地作為單一劑量(例如每週兩次、每週一次或每月一次之劑量；參見下文)來投與本發明之抗體分子，但可尤其端視之前所提及之參數而顯著改變。因此，在一些情形下，使用低於上文給出之最低劑量可能已足矣，而在其他情形下可能不得不超出上限。在大量投與時，可適當地將其分成許多較小劑量在一天中不同時間投與。
端視本發明之特定抗體分子及其特定藥物動力學及其他性質，其可每天、每一第二、第三、第四、第五或第六天、每週、每月及以類似方式來投與。投與方案可包含長期每週治療。「長期」意指至少兩週及較佳地持續數月或數年。
端視所涉及特定疾病，可使用任一適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型或其任一組合來測試本發明之抗體分子及包括其之組合物之效能。適宜分析及動物模型為熟習此項技術者所明瞭，且(例如)包含下文實例中所使用之分析及動物模型。
調配物 對於醫藥應用而言，本發明之抗體分子可調配為包括以下之醫藥製劑：(i)至少一種本發明之抗CD73抗體，及(ii)至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑，及(iii)視情況一或多種其他藥理學活性多肽及/或化合物(例如PD-1拮抗劑)。「醫藥上可接受」意指，各別材料在投與個體時不展示任何生物或另外不期望效應且不以有害方式與含有其之醫藥組合物之任一其他組分(例如醫藥活性成分)相互作用。具體實例可參見標準手冊，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company, USA (1990)。舉例而言，可以本身已知用於習用抗體及抗體片段以及其他醫藥活性蛋白之任一方式來調配及投與本發明抗體。因此，根據另一實施例，本發明係關於一種醫藥組合物或製劑，其含有至少一種本發明之CD73抗體及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑及視情況一或多種如本文進一步所闡述之其他藥理學活性物質(例如PD-1拮抗劑)。
用於非經腸投與(例如靜脈內、肌內、皮下注射或靜脈內輸注)之醫藥製劑可(例如)為無菌溶液、懸浮液、分散液、乳液或粉劑，該等形式包括活性成分且適於(視情況在另一溶解或稀釋步驟之後)輸注或注射。用於該等製劑之適宜載劑或稀釋劑(例如)包含(但不限於)無菌水及醫藥上可接受之水性緩衝液及溶液，例如生理學磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及漢克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及其適宜混合物。
本發明之抗體分子之溶液亦可含有防腐劑以防止微生物生長，該防腐劑係(例如)抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoates、paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、乙二胺四乙酸之(鹼金屬鹽)及諸如此類。在許多情形下，較佳應包含等滲劑，例如糖、緩衝液或氯化鈉。視情況，可使用乳化劑及/或分散劑。可(例如)藉由形成脂質體、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形下)或藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。亦可添加延遲吸收之其他試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。可將溶液填充至注射小瓶、安瓿、輸注瓶及諸如此類中。
在所有情形下，最終劑型必須無菌、可流動且在製造及儲存條件下穩定。無菌可注射溶液係藉由以下方式進行製備：將所需量之活性化合物納入視需要具有上文所列舉其他成分之適當溶劑中，隨後過濾滅菌。在使用無菌粉劑製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，此產生存於先前經無菌過濾之溶液中之活性成分加上任一額外期望成分之粉劑。
通常，水溶液或懸浮液係較佳的。通常，用於治療蛋白(例如本發明抗體)之適宜調配物係緩衝蛋白質溶液，例如包含以下之溶液：適宜濃度(例如0.001 mg/ml至400 mg/ml、較佳地0.005 mg/ml至200 mg/ml、更佳地0.01 mg/ml至200 mg/ml、更佳地1.0 - 100 mg/ml，例如1.0 mg/ml、50 mg/ml或100 mg/ml)之蛋白質及諸如以下等水性緩衝液： -磷酸鹽緩衝鹽水，pH為7.4， -其他磷酸鹽緩衝液，pH為6.2至8.2， -乙酸鹽緩衝液，pH為3.2至7.5，較佳地pH為4.8至5.5 -組胺酸緩衝液，pH為5.0至7.0， -琥珀酸鹽緩衝液，pH為3.2至6.6，及 -檸檬酸鹽緩衝液，pH為2.1至6.2， 及視情況用於提供溶液等滲性之鹽(例如NaCl)及/或糖(例如蔗糖及海藻糖)及/或其他多元醇(例如甘露醇及甘油)及/或表面活性劑。
較佳緩衝蛋白質溶液係包含約50 mg/ml本發明抗體(單獨或與PD-1拮抗劑組合，溶於25 mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)中)之溶液，該溶液視情況包括0.67 mM甲硫胺酸且藉由添加240 mM海藻糖來調節等滲性。其他表面活性劑(例如0.04% Tween-20、Tween-80或聚山梨醇酯80)亦可包含於該等溶液中。用於皮下施加之調配物可包含顯著較高濃度之本發明抗體，例如最高100 mg/ml或甚至高於100 mg/ml。然而，熟習此項技術者將明瞭，上文所給出之成分及其量僅代表一種較佳選擇。熟習此項技術者將立即明瞭其替代形式及變化，或可容易地自上述揭示內容開始來設想。
根據本發明之另一態樣，本發明之抗體分子可與可用於投與抗體之裝置(例如注射器、注射筆、微幫浦或其他裝置)組合使用。
治療用途/治療方法 本發明之另一態樣提供治療癌症之方法，其包括向有需要之患者投與治療有效量之本發明之抗CD73抗體分子。在一較佳實施例中，該方法進一步包括向該患者投與PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體)。較佳地，該抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。較佳地，該抗PDL-1抗體係選自由以下組成之群：阿替珠單抗、阿維魯單抗及德瓦魯單抗。
在一些實施例中，癌症係腎癌、胃腸道癌或肺癌。在一些實施例中，該胃腸道癌係結腸癌、胃癌或肝細胞癌。在一些實施例中，該腎癌係腎臟癌、較佳地透明細胞癌。在本發明之一較佳實施例中，癌症係肺癌、較佳地非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，該結腸癌係CRC。
在一些實施例中，將本發明之抗CD73抗體分子視情況以及如上文所闡述之PD-1拮抗劑與一或多種其他治療劑及/或程序組合投與，該等藥劑及程序進一步詳細闡述於下文中。非限制性實例係選自以下之治療劑或程序：化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、疫苗或細胞免疫療法。
在一些實施例中，另一治療劑係A2AR拮抗劑、CD39拮抗劑、LAG-3拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、EGFR拮抗劑或HER2拮抗劑。
本發明之另一態樣提供用於治療癌症之方法中之本發明之抗CD73抗體分子。在一較佳實施例中，該態樣進一步包括PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體)之額外用途。較佳地，該抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。較佳地，該抗PDL-1抗體係選自由以下組成之群：阿替珠單抗、阿維魯單抗及德瓦魯單抗。
在一些實施例中，癌症係腎癌、胃腸道癌或肺癌。在一些實施例中，該胃腸道癌係結腸癌、胃癌或肝細胞癌。在一些實施例中，該腎癌係腎臟癌、較佳地透明細胞癌。在本發明之一較佳實施例中，癌症係肺癌、較佳地非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，該結腸癌係CRC。
在一些實施例中，將本發明之抗CD73抗體分子視情況以及如上文所闡述之PD-1拮抗劑與一或多種其他治療劑及/或程序組合投與，該等藥劑及程序進一步詳細闡述於下文中。非限制性實例係選自以下之治療劑或程序：化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、疫苗或細胞免疫療法。
如業內已知，「靶向抗癌療法」係指使用特異性作用於充分界定之靶或生物路徑之特定機制全身性投與藥物，該等充分界定之靶或生物路徑在活化或不活化時可消退或破壞惡性過程且同時最小化對健康組織之不良效應(Li等人，Target Oncol. 2012;7(1):69-85)。「基於免疫之療法」或「免疫療法」係藉由誘導、增強或抑制免疫反應來治療疾病。在癌症背景中，基於免疫之療法通常係指(例如)使用如下文所闡述之免疫治療劑誘導及/或增強免疫反應之療法。
在一些實施例中，另一治療劑係A2AR拮抗劑、CD39拮抗劑、LAG-3拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、EGFR拮抗劑或HER2拮抗劑。
本發明及所有其實施例之含義內之PD-1拮抗劑係抑制PD-1與其受體之相互作用之化合物。PD-1拮抗劑在業內已眾所周知，例如由Li等人，Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151 (以引用方式併入本文中)所綜述。PD-1拮抗劑可為PD-1抑制劑或PDL-1抑制劑，例如抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，PD-1拮抗劑係抗PDL-1抗體。可在本發明中使用任何PD-1拮抗劑、尤其抗體(例如由Li等人揭示者)以及下文所揭示之其他抗體。較佳地，本發明及所有其實施例之PD-1拮抗劑係選自由下列抗體組成之群： - 派姆單抗(抗PD-1抗體)； - 尼沃魯單抗(抗PD-1抗體)； - 匹利珠單抗(抗PD-1抗體)； - PDR-001 (抗PD-1抗體)； - 阿替珠單抗(抗PDL-1抗體)； - 阿維魯單抗(抗PDL-1抗體)； - 德瓦魯單抗(抗PDL-1抗體) - 如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5 (抗PD1抗體)。
派姆單抗(先前亦稱為蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)；商品名為Keytruda；亦稱為MK-3475；揭示於(例如) Hamid, O.等人(2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44中)係結合至PD-1之人類化IgG4單株抗體；其在C228P處含有經設計以防止Fc介導之細胞毒性之突變。派姆單抗(例如)揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。其由FDA批准用於治療患有不可切除性或轉移性黑色素瘤之患者及患有轉移性NSCLC之患者。
尼沃魯單抗(CAS登記號：946414-94-4；BMS-936558或MDX1106b)係完全人類IgG4單株抗體，其特異性阻斷PD-1且無可檢測抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。尼沃魯單抗(例如)揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。其已由FDA批准用於治療患有不可切除性或轉移性黑色素瘤、轉移性NSCLC及晚期腎細胞癌之患者。
匹利珠單抗(CT-011；Cure Tech)係結合至PD-1之人類化IgG1k單株抗體。匹利珠單抗(例如)揭示於WO 2009/101611中。
PDR-001或PDR001係高親和力、阻斷配體之人類化抗PD-1 IgG4抗體，其阻斷PDL-1及PD-L2與PD-1之結合。PDR-001揭示於WO2015/112900及WO2017/019896中。
根據本發明之此態樣及任何其他態樣，抗體PD1-1至PD1-5係如EP16170174.3中所揭示之抗體分子，且藉由如下表9中所展示之序列來進一步定義。
因此，PD1-1具有包括SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈； PD1-2具有包括SEQ ID NO:123之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO:124之胺基酸序列之輕鏈； PD1-3具有包括SEQ ID NO:125之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO:126之胺基酸序列之輕鏈； PD1-4具有包括SEQ ID NO:127之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO:128之胺基酸序列之輕鏈；且 PD1-5具有包括SEQ ID NO:129之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO:130之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之另一態樣係本發明之抗CD73抗體分子之用途，其用以製備用於治療癌症之醫藥組合物。在一較佳實施例中，該態樣進一步包括PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體)之額外用途。較佳地，該抗PD-1抗體係選自由以下組成之群：派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。較佳地，該抗PDL-1抗體係選自由以下組成之群：阿替珠單抗、阿維魯單抗及德瓦魯單抗。
在一實施例中，抗CD73抗體分子擬與PD-1拮抗劑同時、並行、依序、連續、交替或分開投與。
本發明之醫學用途態樣可包括本發明之任一特定抗CD73抗體分子及/或如本文所闡述之PD-1拮抗劑。
因生物性質，本發明抗體適於治療特徵在於過度或異常細胞增殖之疾病(例如癌症)。
不論侵襲之組織病理學類型或階段如何，本文所用之術語「癌症」意欲包含所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官。癌性病症之實例包含(但不限於)實體腫瘤、血液癌症、軟組織腫瘤及轉移性病灶。
可使用本文所揭示之抗體分子抑制生長之實例性癌症包含通常對免疫療法具有反應之癌症。
舉例而言，可使用本發明抗體來治療下列癌症、腫瘤及其他增殖性疾病且並不限於此：
實體腫瘤之實例包含惡性腫瘤，例如各種器官系統之肉瘤及癌(包含腺癌及鱗狀細胞癌)，例如侵襲肝、淋巴、生殖泌尿道(例如腎、尿道上皮細胞)、咽之彼等。腺癌包含惡性腫瘤，例如大部分結腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌。鱗狀細胞癌包含(例如)肺、食管、皮膚、HNSCC、口服、肛門及子宮頸中之惡性腫瘤。
可治療之其他適應症包含腎癌(例如腎臟癌，例如透明細胞癌)、胃腸道癌、 胃癌、CRC、結腸癌、肛門區癌、胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤，例如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、乳癌、HNSCC、HCC、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神經膠質瘤、子宮內膜癌、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌或去勢抗性前列腺癌(CRPC))、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、神經膠母細胞瘤(多形性神經膠母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤、鼻竇天然殺手淋巴瘤、骨癌、子宮癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌症、T細胞淋巴瘤、環境誘導性癌症(包含藉由石棉誘導者)、病毒相關癌症(例如人類乳頭瘤病毒(HPV)相關腫瘤)；及源自兩種主要血液細胞譜系、亦即骨髓樣細胞系(其產生顆粒球、紅血球、血小板、巨噬球及肥大細胞)或淋巴樣細胞系(其產生B細胞、T細胞、NK細胞及血漿細胞)之血液學惡性腫瘤，例如所有類型之白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性及/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性淋巴樣白血病及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML (MO)、骨髓母細胞系白血病(Ml)、骨髓母細胞系白血病(M2；伴有細胞成熟)、前髓細胞性白血病(M3或M3變體[M3V])、骨髓單核球性白血病(伴有嗜酸性球增多症之M4或M4變體[M4E])、單核球白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母球性白血病(M7)、分離之顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，例如何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma) (HL)、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞淋巴瘤、前體淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、淋巴球性淋巴瘤、急性骨髓樣淋巴瘤、單核球樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤、間變性(例如Kil+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、外套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱膈B細胞淋巴瘤、T-淋巴母細胞性淋巴瘤、末梢T細胞淋巴瘤、前體T-淋巴母細胞性淋巴瘤、移植後淋巴組織增殖性病症、真實組織細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤(LBL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性組織細胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B-淋巴母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC) (亦稱為蕈樣真菌病或塞紮裡症候群(Sezary syndrome))、間變性大細胞淋巴瘤及伴有瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)之淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、燜燃型骨髓瘤(亦稱為無痛骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、多毛細胞淋巴瘤；類骨髓譜系之造血性腫瘤、間質來源之腫瘤(包含纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤)；精細胞瘤、畸形癌、中樞及周圍神經腫瘤，包含星細胞瘤、神經鞘瘤；間質來源之腫瘤，包含纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包含著色性乾皮病、角質棘皮瘤、精細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌及畸形癌；淋巴譜系之造血性腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包含(但不限於) T細胞病症，例如T前淋巴球性白血病(TPLL)，包含小細胞及腦回狀細胞類型；較佳地T細胞類型之大的顆粒性淋巴球白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；末梢/胸腺後T細胞淋巴瘤(多型及免疫母細胞亞型)；血管中心(鼻) T細胞淋巴瘤；直腸癌；以及該等癌症之任何組合。本文所闡述方法亦可用於治療轉移性癌症、關於先前治療之抗性或難治性癌症(例如利用(例如)阻斷CTLA-4或PD-1或PDL-1抗體之先前免疫療法之難治性癌症)及復發性癌症。
在一些實施例中，癌症係腎癌、胃腸道癌或肺癌。在一些實施例中，該胃腸道癌係結腸癌、胃癌或肝細胞癌。在一些實施例中，該腎癌係腎臟癌、較佳地透明細胞癌。在本發明之一較佳實施例中，癌症係肺癌、較佳地非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，該結腸癌係CRC。
上文所提及特徵在於身體中之特定位置/來源之所有癌症、腫瘤、贅瘤等意欲包含原發性腫瘤及自其衍生之轉移性腫瘤二者。
可能的是，若患者患有特徵在於具有高CD73表現(在癌細胞自身上或在腫瘤內之基質細胞或免疫細胞上)之癌症；及/或若癌症由免疫細胞(例如腫瘤浸潤性淋巴球)浸潤，則該患者更可能對使用本發明之抗體分子(如本文所闡述)之治療具有反應。儘管預計可需要一定CD73表現，但使用本發明之抗體分子之治療未必限於具有高CD73表現之癌症。因此，在本發明一之實施例中，擬治療患者患有特徵在於具有高CD73表現之癌症，及/或癌症由免疫細胞浸潤。在一些實施例中，患者患有特徵在於在腫瘤內之癌細胞、基質細胞或免疫細胞上具有高PDL-1及/或CD73表現之癌症，且使用如本文所闡述之抗CD73抗體及PD-1拮抗劑進行治療。
可(例如)在癌細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(例如CD8+ T細胞或CD4+ T細胞)、腫瘤血管系統、腫瘤基質上藉由業內已知方法(例如流式細胞術或免疫組織化學)來測定該表現。
在一較佳實施例中，基於增加之CD73表現來選擇擬治療患者。
另外，可能的是，若患者患有特徵在於具有高突變負荷之癌症，則該患者更可能對使用本發明之抗體分子(如本文所闡述)之治療具有反應。可如何評價高突變負荷之實例含測定癌症是否特徵在於具有微衛星不穩定性或較差DNA失配修復效率。據信，該等癌症更具免疫原性且由此更可能對使用免疫調節治療方案(例如本發明之抗體分子)之治療具有反應。因此，本發明之一實施例係其中擬治療患者患有特徵在於具有高突變負荷之癌症者。
本發明之抗體分子可用於一線、二線或任何其他線治療之背景中之治療方案中。
在一實施例中，擬治療患者先前已使用另一治療劑進行治療。在一些實施例中，該治療劑可為如本文所闡述之PD-1拮抗劑，例如派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗或如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
在一實施例中，擬治療患者關於使用該治療劑之治療係較差反應者。舉例而言，患者可患有已知關於使用該治療劑之治療係無反應性、最小反應性或非充分反應性之癌症。在一實施例中，使用該治療劑之治療之較差反應者係癌症組織或癌症毗鄰組織之特徵在於發炎程度不充分或較低(例如與參考相比)之個體。在一實施例中，使用該治療劑之治療之較差反應者係已接受使用該治療劑之治療且其癌症已進展之個體。在一實施例中，係較差反應者或癌症具有較差反應性之個體係針對使用該治療劑之治療具有較差疾病預後之個體。可(例如)藉由癌症進展之高或較高風險(例如與具有良好疾病預後之個體相比)基於一或多種預測因子來鑑別對使用該治療劑之治療具有較差反應之個體。在一實施例中，預測因子包括在腫瘤微環境中(在腫瘤或腫瘤毗鄰組織中)存在升高數量之表現CD73之T細胞及/或升高含量之CD73表現細胞或腺苷含量。在一實施例中，預測因子包括一或多種基因中之突變之存在或不存在。在一實施例中，突變定義由T細胞識別之新表位。在一實施例中，預測因子包括一或多種基因或蛋白質在腫瘤細胞中之表現含量(例如PDL-1、在腫瘤細胞上降低或升高之PDL-1含量)。在一實施例中，預測因子包括一或多種基因或蛋白質(例如PD-1)循環或腫瘤環境中之效應T細胞中之表現程度。在一實施例中，預測因子包括如上文所闡述之高突變負荷。
在一些實施例中，該治療劑係如本文所闡述之PD-1拮抗劑，例如派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗或如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
本發明之抗體分子可用於預防、短期或長期治療上文所提及之疾病，視情況亦與放射療法、化學療法及/或手術組合。因此，在另一實施例中，擬治療患者先前已使用放射療法或化學療法(如下文進一步所闡述)進行治療。在一實施例中，擬治療患者關於使用放射療法或化學療法之治療係較差反應者，如上文所闡述。
當然，上文亦包含本發明之抗體分子在藉由向有需要之患者投與治療有效劑量來治療上述疾病之各種方法中之用途；以及該等抗體分子用以製造用於治療該等疾病之藥劑之用途；以及包含本發明之該等抗體分子之醫藥組合物；以及包含本發明之該等抗體之藥劑之製備及/或製造；及諸如此類。
與其他活性物質或治療之組合 本發明之抗CD73抗體分子或本發明之抗CD73抗體及PD-1拮抗劑之組合可單獨使用，或與一或多種尤其選自化學治療劑(如DNA損害劑)或抑制癌細胞中之血管生成、信號轉導路徑或有絲分裂檢查點之治療活性化合物之其他治療劑或程序組合。
在一些實施例中，該組合中所使用之抗CD73抗體可為上文在本發明之第一態樣中所闡述之任一抗體。較佳抗CD73抗體係B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5及C6 (表9)。
在一些實施例中，亦預計，可使用業內已知之其他抗CD73抗體來代替第一態樣之抗體或與其一起使用。除本發明之第一態樣之抗CD73抗體外，亦可使用另一抗CD73抗體，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO2008007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所闡述之抗體。
其他治療劑可與抗體分子同時投與(視情況作為同一醫藥製劑之組分)，或在其之前或之後投與。
在某些實施例中，其他治療劑可為(但不限於)一或多種選自以下物質之抑制劑之群之抑制劑：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、IAP (SMAC模擬物)、Bcl-2、Mcl-1、HDAC (組織蛋白去乙醯酶)、GSK3β、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。
其他治療劑之其他實例係CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制劑、hedgehog拮抗劑、JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶體、Rho之抑制劑或泛素化路徑抑制劑或Notch信號傳導路徑之另一抑制劑或c-FLIP (細胞FLICE-抑制蛋白)調節劑。
Aurora抑制劑之實例係(但不限於) PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。
PLK抑制劑之一實例係GSK-461364。
raf抑制劑之實例係BAY-73-4506 (亦係VEGFR抑制劑)、PLX 4032、RAF-265 (另外亦係VEGFR抑制劑)、索拉菲尼(sorafenib) (另外亦係VEGFR抑制劑)及XL 281。
KSP抑制劑之實例係伊帕尼西(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。
SMAC模擬物(IAP拮抗劑)之實例係(但不限於) LCL-161、Debio 1143及ASTX-660。
src及/或bcr-abl抑制劑之實例係達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼(bosutinib)、XL 228 (亦係IGF-1R抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib) (亦係PDGFR及cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib) (亦係cKit抑制劑)及NS-187。
PDK1抑制劑之一實例係BX-517。
Rho抑制劑之一實例係BA-210。
PI3激酶抑制劑之實例係PX-866、BEZ-235 (亦係mTor抑制劑)、XL 418 (亦係Akt抑制劑)、XL-147及XL 765 (亦係mTor抑制劑)。
cMet或HGF抑制劑之實例係XL-184 (亦係VEGFR、cKit、Flt3之抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880 (亦係VEGFR抑制劑)、MGCD-265 (亦係VEGFR、Ron、Tie2之抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。
c-Myc抑制劑之一實例係CX-3543。
Flt3抑制劑之實例係AC-220 (亦係cKit及PDGFR之抑制劑)、KW 2449、來他替尼(lestaurtinib) (亦係VEGFR、PDGFR、PKC之抑制劑)、TG-101348 (亦係JAK2抑制劑)、XL-999 (亦係cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR之抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib) (亦係PDGFR、VEGFR及cKit之抑制劑)及坦度替尼(tandutinib) (亦係PDGFR及cKit之抑制劑)。
HSP90抑制劑之實例係坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。
JAK/STAT抑制劑之實例係CYT-997 (亦與微管蛋白相互作用)、TG 101348 (亦係Flt3抑制劑)及XL-019。
Mek抑制劑之實例係ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。
mTor抑制劑之實例係替西羅莫司(temsirolimus)、AP-23573 (其亦用作VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus) (另外係VEGF抑制劑)、XL-765 (亦係PI3激酶抑制劑)及BEZ-235 (亦係PI3激酶抑制劑)。
Akt抑制劑之實例係哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西瑞賓(triciribine)。
cKit抑制劑之實例係AB-1010、OSI-930 (亦用作VEGFR抑制劑)、AC-220 (亦係Flt3及PDGFR之抑制劑)、坦度替尼(亦係Flt3及PDGFR之抑制劑)、阿西替尼(axitinib) (亦係VEGFR及PDGFR之抑制劑)、XL-999 (亦係Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR之抑制劑)、舒尼替尼(亦係Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制劑)及XL-820 (亦用作VEGFR-及PDGFR抑制劑)、伊馬替尼(亦係bcr-abl抑制劑)、尼羅替尼(亦係bcr-abl及PDGFR之抑制劑)。
hedgehog拮抗劑之實例係IPI-609及CUR-61414。
CDK抑制劑之實例係斯利西克(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK (亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。
蛋白酶體抑制劑之實例係硼替佐米(bortezomib)、卡夫佐米(carfilzomib)及NPI-0052 (亦係NFκB抑制劑)。
NFκB路徑抑制劑之一實例係NPI-0052。
泛素化路徑抑制劑之一實例係HBX-41108。
在較佳實施例中，其他治療劑係抗血管生成劑。
抗血管生成劑之實例係FGFR、PDGFR及VEGFR或各別配體之抑制劑(例如VEGF抑制劑，如培加尼布(pegaptanib)，或抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab))，及沙立度胺(thalidomides)，該等藥劑係選自(但不限於)尼達尼布(nintedanib)、貝伐珠單抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK (亦係CDK抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiDs (免疫調節藥物)、沙立度胺衍生物CC-4047、來那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布立尼布(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999 (亦係cKit及Flt3之抑制劑)、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530 (亦係Flt3抑制劑)、舒尼替尼(亦係cKit及Flt3之抑制劑)、阿西替尼(亦係cKit抑制劑)、來他替尼(亦係Flt3及PKC之抑制劑)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦係Flt3及cKit之抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉菲尼(亦係Raf抑制劑)、RAF-265 (亦係Raf抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788 (亦係EGFR及Her2之抑制劑)、BAY-57-9352 (亦係Raf抑制劑)、BAY-73-4506 (亦係Raf抑制劑)、XL 880 (亦係cMet抑制劑)、XL-647 (亦係EGFR及EphB4之抑制劑)、XL 820 (亦係cKit抑制劑)及尼羅替尼(亦係cKit及brc-abl之抑制劑)。
其他治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例係(但不限於)西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)；小分子 EGFR抑制劑之實例係(但不限於)吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、奧希替尼(osimertinib)及奧姆替尼(olmutinib)。EGFR調節劑之另一實例係EGF融合毒素。
可與本發明之抗體分子組合使用之EGFR及Her2抑制劑係拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼、西妥昔單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、凡德他尼(亦係VEGFR抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788 (亦係VEGFR抑制劑)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。
可有利地與本發明之抗體分子組合於療法中之其他藥劑係托西莫單抗(tositumumab)及替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (兩種經放射性標記之抗CD20抗體)、阿倫單抗(alemtuzumab) (抗CD52抗體)、地諾單抗(denosumab)、(破骨細胞分化因子配體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab) (CD80拮抗劑)、奧法木單抗(ofatumumab) (CD20抑制劑)、紮木單抗(zanolimumab) (CD4拮抗劑)、SGN40 (CD40配體受體調節劑)、利妥昔單抗(rituximab) (CD20抑制劑)、依帕珠單抗(epratuzumab) (CD22抗體)或馬帕木單抗(mapatumumab) (TRAIL-1受體激動劑)。
可與本發明之抗體分子組合使用之其他化學治療藥物係選自(但不限於)激素、激素類似物及抗激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))、LHRH激動劑及拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、柳培林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例如抗葉酸劑，如胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、嘧啶類似物(如5氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)及吉西他濱(gemcitabine))、嘌呤及腺苷類似物(例如巰嘌呤、硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)))；抗腫瘤抗生素(例如蒽環，如多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊達比星(idarubicin)、絲裂黴素(mitomycin)-C、博來黴素(bleomycin)、更生黴素(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉瓊(pixantrone)、鏈脲菌素(streptozocin))；鉑衍生物(例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、洛鉑(lobaplatin)、沙鉑(satraplatin))；烷基化劑(例如雌氮芥(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、馬利蘭(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、羥基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、噻替派(thiotepa))；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼，如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷(taxane)，如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(larotaxel)；西莫他賽(simotaxel)；及埃博黴素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹龍(patupilone)、ZK-EPO)；拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))；及各種化學治療劑，例如阿米福汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)及卟菲爾鈉(porfimer)、貝沙羅汀(bexarotene)、塞來昔布(celecoxib)。
尤佳者係生成ATP之化學治療劑(例如多柔比星)，其中已證實組合多柔比星與CD73阻斷之正面效應(Loi, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(27):11091-6)。
在某些實施例中，其他治療劑可為另一免疫治療劑，例如以下各項之調節劑：TIM-1、TIM3、TIM-4、PDL-1 (例如阿替珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗)、PD-L2、LAG3、CTLA-4、半乳糖凝集素9、半乳糖凝集素-1、CD69、CD113、GPR56、CD48、GARP、CAECAM-1、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、2B4、CEACAM、CD39、TGFβ、IL-10、Fas配體、ICOS、IDO、類鐸受體、B7家族(B7-1、B7-2、B7-H1 (PDL-1)、B7-DC (PD-L2)、B7-H2 (ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5 (VISTA)及B7-H6)。
在一些實施例中，其他免疫治療劑係結合至包含以下之同族TNF受體家族成員之分子之TNF家族成員：CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-lBBL、CD137、GITR、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLlA、TRAMP/DR3、EDAR、EDAl、XEDAR、EDA2、TNFRl、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。
在一些實施例中，其他免疫治療劑係選自(i)抑制T細胞活化之細胞介素(例如IL-6、IL-10、TGF-B、VEGF；「免疫抑制性細胞介素」)之拮抗劑及/或(ii)刺激T細胞活化之細胞介素及/或用於刺激免疫反應(例如用於治療增殖性疾病，例如癌症)之細胞介素(例如IL2)之激動劑。
在一些實施例中，其他免疫治療劑係刺激T細胞活化之蛋白質(例如CD28、GITRL、OX40L、CD27及CD28H)之激動劑。
本文所闡述之抗CD73抗體亦可用於設計使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體(例如參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號，其以引用方式併入本文中)。雙特異性抗體可用於靶向兩種單獨抗原。舉例而言，已使用抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性抗體使巨噬球靶向腫瘤位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記物之雙特異性抗體將抗原直接遞送至DC。
在其他實施例中，免疫治療劑可為癌症疫苗。
可與CD73抗體組合之其他分子包含NK細胞上抑制性受體之拮抗劑或NK細胞上活化受體之激動劑(例如KIR拮抗劑，例如利麗魯單抗(lirilumab))。
在一些實施例中，其他治療劑可為抑制或消耗巨噬球或單核球之藥劑，包含(但不限於) CSF-1R拮抗劑。
在其他實施例中，其他治療劑可為消耗或阻斷Treg細胞之藥劑，例如特異性結合至CD25之藥劑。
在一些實施例中，其他治療劑可為A2A或A2B受體之抑制劑。實例係(但不限於) ATL-444、伊曲茶鹼(Istradefylline) (KW-6002)、MSX-3、瑞德南特(Preladenant) (SCH-420,814)、SCH-58261、SCH-412348、SCH-442416、ST-1535、咖啡因(Caffeine)、VER-6623、VER-6947、VER-7835、韋帕南特(Vipadenant) (BIIB-014)、PD116,948、ZM 241385、KW 6002、CGS 15943、ST1535、SYN-115、PSB1115、PSB 603、MRS 1754、CPI-444、PBF-509、AZD-4635或ZM-241385。
在較佳實施例中，另一治療劑係A2AR拮抗劑、CD39拮抗劑、LAG-3拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、EGFR拮抗劑或HER2拮抗劑。
在兩種或更多種物質或成分擬用作組合治療方案之一部分時，其可經由相同投與途徑或經由不同投與途徑在基本上相同時間(亦即同時、並行)或在不同時間(例如依序、連續、交替、順序或根據交替方案之任一另一方式)投與。
在物質或成分擬經由相同投與途徑同時投與時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或作為組合醫藥調配物或組合物之一部分來投與。同樣，在兩種或更多種活性物質或成分擬用作組合治療方案之一部分時，可與在使用化合物或成分自身時以相同量及根據相同方案來投與每一物質或成分，且該組合使用可或可不產生協同效應。然而，在兩種或更多種活性物質或成分之組合使用產生協同效應時，亦可減小一種、多種或所有擬投與物質或成分之量，而仍達成期望治療作用。此可(例如)用於避免、限制或減少在以常用量使用時與使用一或多種物質或成分有關之任何不期望副效應而仍獲得期望藥理學或治療效應。
當然，上文包含用於與上述組合配偶體組合使用之本發明抗體之製劑及製備方法。亦包含用於與本發明抗體組合使用之上文所提及組合配偶體之製劑及製備方法。
本發明之抗體分子可單獨使用或與其他治療方案(例如手術及/或輻射療法)組合使用。
套組以及製造方法及純化 本發明亦涵蓋套組，其至少包括如本文所闡述之抗CD73抗體及一或多種選自由用於治療如上文所闡述疾病及病症之其他藥物組成之群的其他組分。
在一實施例中，該套組包含含有有效量之呈單位劑型之本發明之抗CD73抗體分子的組合物。在另一實施例中，該套組包含含有有效量之呈單位劑型之本發明之抗CD73抗體分子的組合物；及含有有效量之呈單位劑型之PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體，最佳係如本文所闡述之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5)之組合物。
在一些實施例中，該套組包括含有此一組合物之無菌容器；該等容器可為盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或業內已知之其他適宜容器形式。該等容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或適於容納藥劑之其他材料製得。
若期望，則抗CD73抗體分子(單獨或與另一治療劑、例如PD-1拮抗劑組合)係與關於向患有癌症之個體投與一或多種抗體之說明書一起提供。說明書通常包含關於使用組合物治療或預防癌症之資訊。在其他實施例中，說明書包含以下各項中之至少一者：治療劑之說明；用於治療或預防癌症或其症狀之劑量方案及投與；注意事項；警告；適應症；禁忌；超劑量資訊；不良反應；動物藥理學；臨床研究；及/或參考文獻。說明書可直接印刷在容器(存在時)上或以標記施加至容器，或呈於容器中或與其一起供應之單獨片、小冊子、卡片或文件夾形式。
在一些實施例中，該套組包括如本文所闡述之抗CD73抗體分子以及PD-1拮抗劑(如本文進一步所闡述)及視情況如上文所闡述之另一治療劑。
本發明進一步提供製造本發明之抗體分子之方法，該等方法通常包括以下步驟： -在容許形成本發明抗體之條件下培養包括含有編碼本發明抗體分子之核酸之表現載體的宿主細胞；及 -自培養物回收由宿主細胞表現之抗體分子；及 - 視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明之抗體分子。
本發明核酸可為(例如)包括編碼序列以及調控序列及視情況天然或人工內含子之DNA分子，或可為cDNA分子。其可具有其原始密碼子或可具有特別適於表現於預期宿主細胞或宿主生物體中之最佳化使用密碼子。根據本發明之一實施例，本發明核酸呈如上文所定義之基本上分離之形式。
本發明核酸通常納入表現載體(亦即可在多肽轉染至適宜宿主細胞或其他表現系統中時表現多肽之載體)中。
為製造本發明抗體，熟習此項技術者可自業內熟知之諸多表現系統(例如由Kipriyanow及Le Gall, 2004綜述者)進行選擇。
表現載體包含質體、逆轉錄病毒、黏粒、EBV源游離基因體及諸如此類。表現載體及表現控制序列經選擇與宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入單獨載體中。在某些實施例中，將兩個DNA序列插入同一表現載體中。
便利載體係編碼功能完整之人類CH (重鏈恆定區)或CL (輕鏈恆定區)免疫球蛋白序列者，其中改造適當限制位點以便可容易地插入及表現任一VH (重鏈可變區)或VL (輕鏈可變區)序列，如上文所闡述。對於抗體重鏈而言，其可為(但不限於)任一IgG同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白(包含等位基因變體)。
重組表現載體亦可編碼有利於自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將編碼抗體鏈之DNA選殖至載體中，從而信號肽框內連接至成熟抗體鏈DNA之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或來自非免疫球蛋白蛋白質之異源性肽。或者，編碼抗體鏈之DNA序列可已含有信號肽序列。
除抗體鏈DNA序列外，重組表現載體通常攜載調控序列、視情況異源性調控序列，包含啟動子、增強子、終止及多聚腺苷酸化信號及其他控制抗體鏈在宿主細胞中之表現之表現控制元件。啟動子序列之實例(針對哺乳動物細胞中之表現進行例示)係衍生自CMV (例如CMV猿病毒40 (SV40)啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒之啟動子及/或增強子及強哺乳動物啟動子(例如天然免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子)。多聚腺苷酸化信號之實例係BGH聚A、SV40晚期或早期聚A；或者，可使用免疫球蛋白基因之3´UTR等。
重組表現載體亦可攜載調控宿主細胞中之載體複製之序列(例如複製起點)及可選標記物基因。可根據業內熟知之轉染方法(包含脂質體調介之轉染、多聚陽離子調介之轉染、原生質體融合、微注射、磷酸鈣沈澱、電穿孔或藉由病毒載體轉移)將編碼本發明抗體之重鏈或其抗原結合部分及/或輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子及包括該等DNA分子的載體引入宿主細胞(例如細菌細胞或高等真核細胞(例如哺乳動物細胞))中。
較佳地，編碼重鏈及輕鏈之DNA分子存在於共轉染至宿主細胞(較佳地哺乳動物細胞)中之兩個表現載體上。
可用作表現宿主之哺乳動物細胞系在業內已眾所周知且尤其包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2/0細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類癌細胞(例如Hep G2及A549細胞)、3T3細胞或任一該細胞系之衍生物/後代。可使用其他哺乳動物細胞(包含(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴及齧齒類動物細胞系)或其他真核細胞(包含(但不限於)酵母、昆蟲及植物細胞)或原核細胞(例如細菌)。
藉由將宿主細胞培養足以容許在宿主細胞中表現抗體分子之時間段來產生本發明之抗體分子。抗體分子較佳地係自培養基以經分泌多肽形式回收或其可自宿主細胞溶解物回收(若例如在無分泌信號下表現)。需要使用用於重組蛋白及宿主細胞蛋白之標準蛋白質純化方法以獲得抗體之實質上均質製劑之方式來純化抗體分子。舉例而言，可用於獲得本發明之抗體分子之最新技術之純化方法包含(作為第一步驟)自培養基或溶解物去除細胞及/或微粒細胞碎屑。然後(例如)藉由免疫親和力或離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、Sephadex層析、二氧化矽或陽離子交換樹脂上之層析自污染物可溶性蛋白、多肽及核酸純化抗體。作為獲得抗體分子製劑之製程中之最終步驟，可乾燥(例如凍乾)經純化抗體分子，如下文針對治療應用所闡述。
藉由下列實例進一步闡釋本發明，且無需限於本發明之該等實施例。實例或其部分(包含化合物、劑量及投與途徑以及治療組合)各自本身或與上述詳述闡述組合形成本發明之一部分。
實例 實例1： 針對CD73之抗體之生成及最佳化 使用具有C-末端6xHis標籤之人類CD73 (UniProt登錄號P21589)之完整細胞外結構域及小鼠CD73 (UniProt登錄號Q61503；具有C-末端人類Fc標籤(SEQ ID NO: 131)之完整細胞外結構域對CD73敲除小鼠實施免疫。鑑別採樣且藉由使用單一B細胞抗體生成平臺進行回收。針對與人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠CD73之結合對其進行篩選，且在功能分析中測試CD73抑制，如實例2至6中所闡述。使用根據該等分析具有最佳組性質之抗體分子作為其他最佳化變體之基礎。
使用噬菌體篩選方法將來自該等抗CD73小鼠抗體之CDR序列最佳化至來自重鏈及輕鏈密切匹配種系之人類框架(如由Singh等人，MAbs. 2015 Jul-Aug；7(4): 778-791所闡述)。藉由ELISA評估變體之結合活性。選擇對人類CD73具有高親和力且具有高人類殘基比率及低預測免疫原性(低Epivax評分)之變體。
實例2： 靶結合及細胞選擇性. 對於親合力形式而言，在Bio-Rad ProteOn XPR36儀器上實施實驗。經由蛋白質A/G捕獲抗體且使非共價二聚體抗原流經捕獲表面上方。在PBS-T-EDTA中製備此實驗之運行緩衝液及所有稀釋液。將GLM感測器晶片正規化並根據製造商之推薦進行預條件化。使用EDC/s-NHS之等量混合物以30 µL/min之流速在水平方向上活化感測器晶片300 s並使用重組蛋白A/G (50 µg/ml，於10 mM乙酸鹽(pH 4.5)中)以30 µL/min之流速在水平方向上固定300 s，從而在表面上產生約5000 RU蛋白質A/G。使用1M乙醇胺-HCl以30 µL/min之流速在水平方向上將感測器晶片鈍化300 s。使用0.85%磷酸(18 s)以100 µL/min之流速將感測器晶片水平再生2次並垂直再生2次。
將約300 RU抗體以30 µL/min之流速垂直捕獲於蛋白質A/G表面上60 s。藉由以100 µL/min之流速水平注射PBS-T-EDTA 60 s來穩定捕獲表面。將分析物(人類CD73-His)以30 µL/min之流速水平注射於所捕獲抗體上600 s且解離1200 s。人類CD73-His之濃度為0 nM、3.125 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM及50 nM。藉由以100 µL/min之流速水平注射0.85%磷酸18 s一次且垂直注射一次來再生表面。
自原始資料扣除中間點(與感測器表面之相互作用)及空白(PBS-T-EDTA或0 nM分析物)。使用Bio-Rad ProteOn Manager軟體，將感測圖整體擬合至1:1蘭格繆爾(Langmuir)結合以提供締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及平衡解離常數(KD)值。 表1: 抗CD73抗體與CD73之結合親合力(藉由SPR)
Figure 108116376-A0304-0001
使用內源性表現CD73之細胞系以及CD73陰性細胞系在基於FACS之分析中測定細胞選擇性。在CD73陽性細胞中，易於檢測結合，而在CD73陰性細胞中，在高達1000 nM濃度時觀察到不可檢測結合。
亦藉由SPR測定抗CD73與小鼠CD73之結合且與至人類CD73 (P21589，「長同功型」)之結合進行比較。
所測試抗體以高於小鼠CD73之親和力結合至人類CD73 (與人類CD73之結合高於小鼠CD73：C1：96倍；C2：138倍；C3：117倍；C4：120倍；C5：163倍，C6：58倍)。
實例3： CD73酶功能之抑制 使用基於螢光素酶之分析來量測CD73酶功能。CD73受質AMP係螢光素酶反應之產物且針對螢光素酶展示抑制活性。阻斷板，隨後添加重組人類CD73蛋白。然後添加不同濃度之CD73抗體。混合板並在37℃下培育10 min。添加受質AMP，混合板並在37℃下培育30 min。將CellTiterGlo試劑(CellTiterGlo發光細胞活力分析套組，Promega，目錄號G7571)溶於試劑緩衝液中並添加至每一孔中。混合板並在室溫下於暗處培育10 min。使用EnVision 2104 Multilabel讀數儀量測發光信號。
如表2中所展示，本文所闡述之CD73抗體展示抑制CD73酶功能之低毫微莫耳IC90 值。展示來自兩個獨立實驗之資料。 表2：藉由抗CD73抗體抑制CD73酶功能。
Figure 108116376-A0304-0002
實例4： CD73蛋白表面含量之減小。 藉由流式細胞術測定CD73蛋白表面含量之減小。將Colo201細胞系與CD73抗體一起培育1h及24 h，且使用二級抗體量測細胞表面上之CD73結合抗體之含量。
藉由添加TripLE溶液(Gibco，編號12604-013)來剝離Colo201細胞並接種於96孔板中。在24小時之後，添加CD73抗體。在1小時及24小時之後藉由流式細胞術使用經標記二級抗體來分析試樣。使用FlowJo X軟體10.0.7r2版實施試樣分析。將經選通群體之平均螢光強度(FI)正規化至其在時間點0下之相應平均FI (與CD73抗體一起培育1h)。然後正規化資料，其中將與不誘導CD73表面含量減小之CD73抗體(如在US20090203538中揭示為「067-213抗體」)一起培育之細胞之螢光值設定於100% (最大CD73含量)。
本文所闡述之CD73抗體展示誘導減小CD73表面含量之中等活性。所展示資料係來自至少兩個獨立實驗。 表3：藉由抗CD73抗體來減小CD73表面含量。
Figure 108116376-A0304-0003
實例5： 細胞系中之腺苷形成之抑制 使用基於細胞之分析來測定藉由CD73抑制所達成之腺苷含量減小。向Colo-201細胞中添加AMP使得藉由表現於細胞上之CD73將AMP轉化成腺苷。AMP轉化受如本文所提供之本發明之抗CD73抗體抑制。將Colo-201細胞在CD73抗體存在下於37℃下培養24小時。然後添加含有赤型9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤之阻斷溶液以阻斷腺苷去胺酶，添加含有5-碘殺結核菌素之阻斷溶液以阻斷腺苷激酶，添加含有ß-甘油磷酸鹽之阻斷溶液以阻斷鹼性磷酸酶，且添加含有雙嘧達莫(dipyridamole)之阻斷溶液以阻斷ENT1-4 (Ramakers 2008)。在培育20分鐘之後，添加300 µM AMP 30分鐘且藉由添加15 mM HCl溶液來停止反應。在96孔板形式中，將自每一mAb濃度培育獲取之細胞上清液之50 µl等分試樣添加至含有0.5 mM經同位素標記之13 C5 -腺苷作為內部標準的500 µl乙腈+ 50 µl阻斷溶液中。藉由在12個步驟中連續稀釋來製備校準標準物。藉由將50 µl細胞培養基(作為空白基質)加上50 µl各別標準或QC溶液添加至含有0.5 mM經同位素標記之13 C5 -腺苷作為內部標準之500 µl乙腈中來製備校準及品質控制試樣。在離心之後，將50 µl上清液轉移至另一96孔板中，在N2 下蒸發至乾燥並再溶於25%甲醇+ 0.01%甲酸中。藉由HPLC-MS/MS在單位質量解析度下使用ESI+離子化來測定腺苷濃度。將試樣注入至具有CTC PAL HTS-xt自動採樣儀之HPLC/MS系統中(注入體積為5 µL)。使用配備有Phenomenex Synergy Hydro-RP C18反相HPLC管柱(粒徑為2.5 µm，管柱尺寸為2 × 50 mm)之Agilent HP1200 HPLC系統在室溫下實施定量分析，其中施加使用5 mmol/L乙酸銨(pH 4.0)作為溶劑A且使用含有0.1%甲酸之乙腈為溶劑B之HPLC梯度，流速為700 µl/min且循環時間為5 min/試樣。將溶劑B自0 min至3.0 min自2%增加至15%，自3.0 min至3.1 min增加至95% B，在3.1 min至4.0 min保持恆定於95% B，然後自4.0 min至4.1 min返回至2% B且自4.1 min至5.0 min再平衡管柱。使HPLC系統耦合至以MRM模式操作之ABSCIEX API5000三相四極質譜儀。使用ABSCIEX DiscoveryQuantTM 2.1軟體自動最佳化去簇電位(DP)及碰撞能量(CE)設置。使用腺苷之268.2至136.1 (DP: 62, CE: 27)及13 C5 -腺苷之273.3至136.2 (DP: 64, CE: 27)之MRM轉變來進行量化(留置時間：70 ms)。Turbo離子噴霧源之源溫度設定於650℃。對層析圖進行積分且使用Analyst® 1.5.1 (ABSCIEX)測定峰面積。自所量測腺苷濃度及培育體積來計算所形成腺苷之絕對量。藉由迭代計算使用對稱S形曲線分析程式(Graph Pad PRISM)利用可變希爾斜率(hill slope)來擬合資料。將針對不添加AMP之同型處理細胞所獲得之腺苷含量設定為100%抑制；將針對添加AMP之同型處理細胞所獲得之腺苷含量設定為0%抑制。
與+/- AMP添加之同型處理細胞相比，本文所闡述之CD73抗體將Colo201細胞中之腺苷含量減小＞75%。
與參考抗CD73抗體「MEDI9447」及「BMS986179」 (如上文所定義)相比，本文所闡述之抗CD73抗體在減小Colo201細胞中之腺苷含量方面展示優良活性，如表4中所顯示。表 4 ： Colo201 細胞中之腺苷形成之抑制。
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實例6： T細胞增殖及IFNγ釋放之誘導。 使用原代人類T細胞分析來探究CD73抑制對T細胞之效應。將來自STEMCELL Technologies之人類末梢血單核細胞(PBMC)解凍且藉由負向選擇(T細胞富集套組，Easy Sep負向選擇；Stem Technologies 19051號)富集T細胞。供體係內部標記之供體A - F。使用Cell Trace Violet (CellTraceTM Violet Proliferation套組，Molecular Probes，C34557號)根據製造商方案來標記T細胞。在4℃下於經抗CD3 (Ultra-LEAFTM純化抗CD3抗體，純系HIT3a, Biolegend, 300332號)預塗覆之96孔圓底板中過夜實施分析。平鋪經CTV標記之T細胞並與抗CD28 (Ultra-LEAFTM純化抗CD28抗體，純系CD28.2 ;Biolegend, 302934號)及抗huCD73或抗TNP HuIgG1KO對照在不同濃度下一起培育。在37℃及5% CO2 下培育22小時之後，以200 µM之最終濃度添加AMP (腺苷5‘-單磷酸二鈉鹽；Sigma Aldrich，編號01930)。將細胞在37℃及5% CO2 下再培育5天。獲取上清液且藉由Meso Scale Diagnostics V-PLEX人類IFN-y套組根據製造商說明書來分析IFNγ分泌。將值正規化至添加AMP之經刺激同型處理細胞。藉由使用BD FACS Canto II流式細胞儀及BD FACSDiva軟體(8.0.1版)分析CD4+及CD8+細胞上之CTV標記來測定細胞增殖。將不添加AMP之經刺激同型處理細胞之增殖設定為100%，將添加AMP之經刺激同型處理細胞之增殖設定為0%。 本文所闡述之CD73抗體恢復T細胞增殖及細胞介素釋放。 與「MEDI9447」及「BMS986179」相比，本文所闡述之抗體在誘導某些供體中之原代人類T細胞中之T細胞增殖及IFNγ釋放方面展示優良活性(表5及6)。因此，與兩種競爭劑分子相比，所生成CD73抗體能夠將某些供體中之由AMP抑制之T細胞功能恢復至較高程度。 表5：CD8 T細胞增殖，以對照(+/- AMP之同型處理細胞，其中將不添加AMP之經刺激同型處理細胞設定於100%且將添加AMP之經刺激同型處理細胞設定於0%)之[%]形式提供；n.d.：未測定
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 表6：IFNγ釋放[較對照之倍數變化]。對照係添加AMP之經刺激同型處理細胞。
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上表5及6證實，與「MEDI9447」及「BMS986179」相比，所測試抗CD73抗體在誘導某些供體中之T細胞增殖及IFNγ釋放方面展示優良活性。資料係來自在1nM之CD73抗體濃度下之直接對比；每一供體使用4個生物複製品。
實例7： 樹突狀細胞/T細胞共培養 另外，確立樹突狀細胞/T細胞共培養系統。藉由Ficoll-Hypaque密度梯度離心自健康供體之肝素化血液分離人類末梢血單核細胞(PBMC)並冷凍儲存於-150℃下。將PBMC解凍且藉由負向選擇(磁珠)富集單核球。將單核球與3 ng/ml人類IL-4及50 ng/ml人類GM-CSF在37℃及5% CO2 下於培養基中一起培養以分化至樹突狀細胞(DC)。在第5天，添加10 ng/ml TNFα以達成成熟且將細胞培養過夜。將來自不同供體之PBMC解凍，藉由免疫磁性負向選擇來分離T細胞並在培養基中與5 ng/ml人類IL-2一起培養過夜。將200000個細胞/孔之T細胞與50000個細胞/孔之同種異體成熟DC於96孔板中在不同濃度之抗PD-1抗體派姆單抗(如本文及例如在WO2009/114335及WO2015/088847中進一步所闡述)及本發明之各種抗CD73抗體存在下一起共培養。使用人類IgG4Pro及人類IgG1KO同型對照作為陰性對照。在37℃及5% CO2 下22小時之後，添加腺苷5‘-單磷酸二鈉鹽(AMP)。將共培養物在37℃下培育5天，然後獲取上清液且藉由Meso Scale Diagnostics V-PLEX人類IFN-y套組根據製造商說明書來分析IFNγ分泌。
可在此系統中探究抑制PD1、CD73或二者之效應。發現添加AMP會抑制抗PD1反應，且使用本文所提供抗體之抗CD73處理可逆轉此AMP介導之抑制(參見圖1)。所展示資料係來自在1 μg/ml之CD73抗體濃度下之直接對比；每一供體及抗體使用5個生物複製品。
實例8：結合細胞與非結合細胞之CD73之抑制 將Colo-201細胞與CD73抗體在37℃下一起培育24小時，然後添加阻斷溶液(參見「細胞系中之腺苷形成之抑制」) 20分鐘。藉由離心來粒化細胞且將上清液轉移至新低結合板中。洗滌細胞且將300 μM AMP添加至細胞以及上清液中。在30分鐘之培育時間之後，藉由添加15 mM HCl溶液來停止反應。獲取上清液並與乙腈/阻斷溶液混合物混合以停止可能之酶反應。藉由液相層析-質譜分析試樣之腺苷含量。此使得可探究結合細胞之CD73之抑制與細胞培養上清液中之CD73 (非結合細胞之CD73)之抑制。將針對不添加AMP之同型處理所獲得之腺苷含量設定為100%抑制；將針對添加AMP之同型處理所獲得之腺苷含量設定為0%抑制。如表7及8中所顯示，本發明之CD73抗體(尤其C1、C2、C3、C4、C5及C6)將結合細胞之CD73以及存在於細胞培養上清液中之CD73 (非結合細胞之CD73)抑制70 - 80%。「MEDI9447」對結合細胞之CD73顯示大約20%之較低抑制活性。「MEDI9447」及「BMS 986179」在抑制存在於細胞培養上清液中之CD73方面皆展示較低活性。因此，與兩種競爭劑分子相比，本發明之CD73抗體更完全地抑制CD73。 表7：結合細胞之CD73之抑制
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表7顯示，本發明抗體在抑制結合細胞之CD73方面優於先前技術之對比抗體「MEDI 9447」。所展示資料係來自除抗體C2 (n=1)外之至少兩個獨立實驗。 表8：非結合細胞之CD73之抑制
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表8顯示，本發明抗體在抑制細胞培養上清液中之CD73方面優於先前技術之對比抗體「MEDI 9447」及/或「BMS 986179」。所展示資料係來自除抗體C2 (n=1)外之至少兩個獨立實驗。
實例9： 抗CD73抗體及CD73之複合物形成 使用CD73及兩種不同抗體之試樣藉由沉降速度分析型超速離心(「SV-AUC」)實驗以單一組分形式及以具有1:1 CD73:抗體莫耳比率之混合物形式來探究CD73及兩種抗CD73抗體之複合物之寡聚狀態。對於280 nm下之最佳信號雜訊比而言，在2.4 μM之濃度下檢驗混合物。亦在2.4 μM之濃度下檢驗CD-73蛋白及發明性抗體之個別等分試樣以促進g(s)對比。在混合及離心之前，將CD73蛋白及發明性抗體透析至PBS緩衝液中。
藉由製作g(s)分佈曲線(藉由轉變原始資料)來定性分析SV-AUC實驗，且藉由各種曲線擬合算法來更定量地分析。對於少分散不可逆系統或濃度大於或等於2個數量級之上文所有相互作用KD 值之可逆系統而言，c(s)分佈函數係返回每一物質之百分比及分子量之準確估計值之穩健曲線擬合方法。個別組分(CD73及相關抗CD73抗體(發明性抗CD73抗體C4；「MEDI9447」)具有足夠純度以藉由c(s)算法擬合曲線且返回預期分子量。CD73蛋白與抗CD-73抗體之混合物產生不適於藉由c(s)算法解捲積之寬分佈，因此，製作g(s) (表觀沉降分佈繪圖)以定性比較由CD73及抗CD73抗體形成之物質之分佈。
材料 CD73 HuCD73_加His標籤，二聚體分子量(道爾頓)：118,032，部分比容：0.73744，A280/mg/ml/cm 0.954，儲存緩衝液：1× PBS，0.2 M蔗糖，0.01% CHAPS，5%甘油，1 mM TCEP，pH-7.2。
抗CD73抗體C04，計算分子量為148,232 Da，醣基化包含3000 Da。抗CD73抗體「MEDI9447」，包含所估計3000 Da醣基化之計算分子量為150,669 Da。
方法 使用Beckman XL-I分析型超離心器(Beckman Coulter, Brea, California)收集SV-AUC實驗之資料。在每一實驗當天，視需要將儲存於適當儲存溫度下之試樣解凍，且在室溫下藉由移液管輕微混合，並稀釋至產生信號檢測器之線性範圍內之吸光度之濃度。將試樣加載至具有藍寶石或石英窗口之經木炭填充之epon單元之試樣區段中。向試樣區段中加載400 µL經稀釋試樣。在單元之參考區段中使用406 µL匹配緩衝液。使用分析型4孔鈦An-60 Ti轉子(Beckman Coulter)實施實驗。將校準砝碼置於孔4中。在3000 RPM下實施初始掃描以驗證細胞完整性並實施徑向儀器校準。同樣，在每一單元上以3000 RPM實施波長掃描以驗證吸光度。使試樣在20℃下達到溫度平衡並保持至少2 h，然後開始在高速度(40,000 RPM)下離心。藉由280 nm下之吸光度掃描來收集每一單元之資料掃描(報告隨徑向位置而變化之濃度)，徑向步長為0.003 cm，連續掃描，每一通道1次閃光。
使用 c(s) 算法之 SV-AUC 之資料分析 . 掃描係選自第一次掃描至試樣粒化後之約第10次掃描。在試樣已經粒化後之過度掃描不含有任何資訊且使基線貢獻過重。輸入緩衝液性質及藉由蛋白質序列計算之部分比容估計值作為用於曲線擬合之參數。使用軟體包SEDFIT 15.01b版(Schuck Biophys J. 2000 Mar;78(3):1606-19)分析產生連續c(s)分佈之資料。
使用程式SEDANAL (www.sedanal.org ；Biophysical Chemistry 108 (2004) 231-243)實施表觀沉降係數分佈函數、g(s)曲線及全邊界曲線擬合。檢驗所有c(r)資料檔案且視需要將後設資料(例如彎液面位置、擬合範圍、單元基礎及光學校正)書寫成通道資料檔案(SEDANAL之*.abr檔案)。g(s)繪圖係表觀沉降分佈函數繪圖且代表表觀沉降係數之x軸(或速度軸)及g(s)函數之y軸上之原始資料的轉變(c(r)資料之導數形式)。此係無模型轉變且峰位置代表邊界速度，而邊界寬度代表單一物質之擴散或多種物質之擴散及生長中分離(若存在多種物質)。使用少量c(r)對來生成每一g(s)繪圖。g(s)繪圖之確切形狀取決於時間跨度及自開始循環用於生成繪圖之資料所經過之時間。在x軸上，甚至單一理想物種之g(s)亦將變得較窄且較高並與自沉降開始掃描之經過時間成正比。可使用g(s)繪圖之時間跨度匹配組之組合來證實或推翻經稀釋系列之相同試樣之可逆自締合。
SEDANAL亦對藉由dc/dt (濃度變化除以時間變化)操作轉變之原始資料實施直接曲線擬合。使用由使用者指定之模型，SEDANAL對資料通道子組之dc/dt曲線進行非線性最小平方曲線擬合以獲得資料之最佳模型擬合參數。SV-AUC係可將諸多模型之擬合優度分級以幫助分析員選擇最佳資料擬合模型之少數生物物理學方法之一。
結果 運行CD73之試樣且藉由SEDANAL及SEDFIT擬合曲線。
Figure 108116376-A0304-0009
 運行C04之試樣且藉由SEDANAL及SEDFIT擬合曲線
Figure 108116376-A0304-0010
 運行試樣「MEDI9447」且藉由SEDANAL及SEDFIT擬合曲線
Figure 108116376-A0304-0011
 藉由c(s)及SEDANAL曲線擬合混合物並不返回可靠結果且結論為存在過多物質以致不能解捲積。為進行定性對比，製作g(s)疊加圖(參見圖2)。 斯韋德貝裡(Svedberg)及分子量之間之關聯：
Figure 108116376-A0304-0012
實例10： 晶體學CD73 蛋白 ： CD73蛋白構築體係基於Knapp,K.等人(2012) Structure 20: 2161-2173 (10.1016/j.str.2012.10.001 )且包括突變以支持蛋白質產生及結晶行為。各別突變為ASN53ASP、LYS145SER、LYS147SER、ASN311ASP、ASN333ASP、ASN403ASP、LYS478SER，其另外在經腸激酶裂解之後於N-末端含有SER、PRO、ASP、PRO。如Knapp,K.等人(2012) Structure 20: 2161-2173中所闡述使其表現，再摺疊並純化。 FAB： 藉由腸激酶裂解來獲得本發明之抗CD73抗體之Fab片段。
晶體結構測定 使蛋白質複合化(Fab片段及CD73)，藉由凝膠過濾純化並在10mM Tris、150mM NaCl (pH=8)中濃縮至21mg/ml。在20℃下藉由混合0.2 µl含 12% PEG8000、0.1 M MOPS (pH 7.6)及0.1 M乙酸鎂之溶液與0.2 μL蛋白質溶液來獲得晶體。在3天之後，生長出片型晶體。將晶體轉移至補充有25% PEG400之儲槽溶液中並急凍於液氮中。在瑞士光源(Swiss Light Source)下收集繞射資料且藉由分子置換來解析結構。模型構建及細化可產生圖3中所繪示之CD73:抗CD73 Fab複合物之晶體結構。
實例11： 用於靜脈內投與之醫藥調配物 可選擇本發明之上述抗體分子中之任一者來製造用於靜脈內施加且具有如下組成之醫藥調配物： 藥物物質： 50 mg/ml 組胺酸緩衝液： 10 mM, pH 6.0 蔗糖： 220 mM 聚山梨醇酯20： 0.02% 將上述組合物在注射用水(WFI)中調配成具有上述組成之溶液，滅菌並在2℃至8℃下儲存於10 ml小瓶中。
上述組合物可視情況提供為在使用之前於WFI中重構之凍乾調配物形式。
實例12： 人類中之醫藥應用 藉由靜脈內輸注(0.05 mg至50.0 mg/公斤體重及劑量之劑量)每兩週至四週將上文實例9中所概述之溶液施加至有需要之患者(例如患有癌症之人類)。
根據實例，製備本發明之諸多不同抗CD73抗體。在下表中，提供該等抗體之序列。A1、A2、A3及A4分別係鼠類抗體。B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5及C6分別係人類化抗體。根據如本文所闡述之IMGT定義來提供CDR序列。
另外，提供本發明之抗PD1抗體(分別稱為PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5)之序列。 表9：本發明之抗CD73及抗PD1抗體之CDR、VH、VL、輕鏈及重鏈之胺基酸序列及SEQ ID NO。
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圖 1 ： 樹突狀細胞 /T 細胞共培養。 資料(如實例7中進一步所闡述)闡釋，AMP在樹突狀細胞/T細胞共培養分析中抑制抗PD1反應，且抗CD73抗體處理使得逆轉此AMP介導之抑制。圖 2 ： 抗 CD73 抗體及 CD73 之複合物形成。 繪示CD73及兩種抗CD73抗體之複合物之寡聚狀態之評價(如實例9中所闡述)。本發明之抗CD73抗體分子與可溶性CD73形成具有界定大小之抗原-抗體複合物(例如2:2寡聚物)。該等複合物小於藉由業內已知之其他CD73抗體(例如「MEDI9447」)形成之複合物。圖 3 ： 抗 CD73 抗體 - CD73 晶體之晶體結構 (A )繪示本發明之抗CD73抗體之Fab片段與CD73上之其構形表位之結合。以黑色繪示與發明性抗CD73抗體之Fab片段接觸及/或特異性結合之殘基；將Fab片段之VH 著色為深灰色，將VL 著色為淺灰色；(B ) (A)中以黑色所展示由發明性抗體特異性結合之構形表位之放大；使用3字母胺基酸代碼來標記構形表位中所包括之CD73胺基酸殘基；(C )發明性抗體之重(H)及輕(L)鏈中產生(A)中所展示發明性抗體之Fab片段之互補位的胺基酸殘基，其接觸及/或特異性結合至(A)中所繪示之構形表位；使用3字母胺基酸代碼來標記接觸及/或特異性結合至CD73上之構形表位之胺基酸殘基，其中(H)及(L)指示重鏈及輕鏈胺基酸殘基。圖 4 ： 人類 T 細胞分析中之 IFN γ 釋放 在多個CD73抗體濃度下處理經刺激原代人類T細胞，隨後添加AMP。量測IFNγ之增殖及釋放之誘導。如實例6中所概述進行分析。
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Claims (47)

  1. 一種特異性結合至CD73之抗體，其包括： (a)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:25 (hcCDR1)、SEQ ID NO:26 (hcCDR2)及SEQ ID NO:27 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:28 (lcCDR1)、SEQ ID NO:29 (lcCDR2)及SEQ ID NO:30 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (b)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:31 (hcCDR1)、SEQ ID NO:32 (hcCDR2)及SEQ ID NO:33 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:34 (lcCDR1)、SEQ ID NO:35 (lcCDR2)及SEQ ID NO:36 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (c)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:37 (hcCDR1)、SEQ ID NO:38 (hcCDR2)及SEQ ID NO:39 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:40 (lcCDR1)、SEQ ID NO:41 (lcCDR2)及SEQ ID NO:42 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (d)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:43 (hcCDR1)、SEQ ID NO:44 (hcCDR2)及SEQ ID NO:45 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:46 (lcCDR1)、SEQ ID NO:47 (lcCDR2)及SEQ ID NO:48 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (e)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:49 (hcCDR1)、SEQ ID NO:50 (hcCDR2)及SEQ ID NO:51 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:52 (lcCDR1)、SEQ ID NO:53 (lcCDR2)及SEQ ID NO:54 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (f)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:55 (hcCDR1)、SEQ ID NO:56 (hcCDR2)及SEQ ID NO:57 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:58 (lcCDR1)、SEQ ID NO:59 (lcCDR2)及SEQ ID NO:60 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (g)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:61 (hcCDR1)、SEQ ID NO:62 (hcCDR2)及SEQ ID NO:63 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:64 (lcCDR1)、SEQ ID NO:65 (lcCDR2)及SEQ ID NO:66 (lcCDR3)之胺基酸序列；或 (h)重鏈CDR，其包括SEQ ID NO:67 (hcCDR1)、SEQ ID NO:68 (hcCDR2)及SEQ ID NO:69 (hcCDR3)之胺基酸序列；及輕鏈CDR，其包括SEQ ID NO:70 (lcCDR1)、SEQ ID NO:71 (lcCDR2)及SEQ ID NO:72 (lcCDR3)之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體分子，其中該抗體分子係人類化抗體分子。
  3. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子係單株抗體分子、Fab、F(ab’)2 、Fv或scFv。
  4. 如請求項1或2之抗體分子，其包括選自由以下組成之群之重鏈恆定區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區。
  5. 如請求項4之抗體分子，其中該重鏈恆定區係IgG1，較佳係具有L234A及/或L235A突變之IgG1。
  6. 如請求項1或2之抗體分子，其中輕鏈恆定區係κ或λ。
  7. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子具有包括與SEQ ID NO: 81、83、85、87、89、91、93及95中任一者至少85%一致之胺基酸序列之重鏈可變區。
  8. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子具有包括SEQ ID NO: 81、83、85、87、89、91、93及95中任一者之胺基酸序列之重鏈可變區。
  9. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子具有包括與SEQ ID NO: 82、84、86、88、90、92、94或96中任一者至少85%一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  10. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包括含有SEQ ID NO: 82、84、86、88、90、92、94或96之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  11. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包括含有SEQ ID NO: 105、107、109、111、113、115、117或119之胺基酸序列之重鏈。
  12. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包括含有SEQ ID NO: 106、108、110、112、114、116、118或120之胺基酸序列之輕鏈。
  13. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包括 包括SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 89之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之輕鏈可變區，或 包括SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之重鏈可變區及包括SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  14. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包括 包括SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之輕鏈，或 包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之輕鏈。
  15. 一種經分離之核酸分子，其包括編碼如請求項1至14中任一項之抗體分子之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之核酸序列。
  16. 一種表現載體，其包括如請求項15之包括核苷酸序列之核酸分子。
  17. 一種宿主細胞，其包括如請求項16之表現載體。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
  19. 一種製造如請求項1至14中任一項之抗體分子之方法，其包括以下步驟： 如請求項17或18之宿主細胞在容許形成如請求項1至14中任一項之抗體分子之條件下培養；及 回收該抗體分子。
  20. 如請求項19之方法，其另外包括進一步純化及/或修飾及/或調配該抗體分子之步驟。
  21. 如請求項19或20之方法，其另外包括將該抗體分子調配成醫藥組合物之步驟。
  22. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至14中任一項之抗CD73抗體分子及醫藥上可接受之載劑。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其進一步包括PD-1拮抗劑。
  24. 如請求項23之醫藥組合物，其中該PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：PDR-001、派姆單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)及匹利珠單抗(pidilizumab)。
  26. 如請求項24之醫藥組合物，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PDL-1抗體：阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab)。
  27. 如請求項24之醫藥組合物，其中該PD-1拮抗劑係包括以下之抗PD-1抗體： (i) 包括SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之輕鏈；或 (ii) 包括SEQ ID NO: 123之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之輕鏈；或 (iii) 包括SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之輕鏈；或 (iv) 包括SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之輕鏈；或 (v) 包括SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之輕鏈。
  28. 如請求項22至27中任一項之醫藥組合物，其進一步包括一或多種其他治療劑。
  29. 一種部分套組(kit of parts)，其包括如請求項1至14中任一項之抗體及PD-1拮抗劑。
  30. 如請求項29之套組，其中該PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體。
  31. 如請求項30之套組，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：PDR-001、派姆單抗、尼沃魯單抗及匹利珠單抗。
  32. 如請求項30之套組，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PDL-1抗體：阿替珠單抗、阿維魯單抗或德瓦魯單抗。
  33. 如請求項30之套組，其中該PD-1拮抗劑係包括以下之抗PD-1抗體： (i) 包括SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之輕鏈；或 (ii) 包括SEQ ID NO: 123之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之輕鏈；或 (iii) 包括SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之輕鏈；或 (iv) 包括SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之輕鏈；或 (v) 包括SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之輕鏈。
  34. 如請求項29至33中任一項之套組，其進一步包括一或多種其他治療劑。
  35. 一種如請求項1至14中任一項之抗體分子之用途，其用以製造用於治療患者之癌症之藥劑。
  36. 如請求項35之用途，其中該藥劑進一步包括PD-1拮抗劑或與PD-1拮抗劑組合使用。
  37. 如請求項36之用途，其中該藥劑與該PD-1拮抗劑同時、並行、依序、連續、交替或分開投與。
  38. 如請求項36之用途，其中該PD-1拮抗劑係抗PD-1抗體或抗PDL-1抗體。
  39. 如請求項38之用途，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：PDR-001、派姆單抗、尼沃魯單抗及匹利珠單抗。
  40. 如請求項38之用途，其中該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群之抗PDL-1抗體：阿替珠單抗、阿維魯單抗及德瓦魯單抗。
  41. 如請求項38之用途，其中該PD-1拮抗劑係包括以下之抗PD-1抗體分子： (i) 包括SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之輕鏈；或 (ii) 包括SEQ ID NO: 123之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之輕鏈；或 (iii) 包括SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之輕鏈；或 (iv) 包括SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之輕鏈；或 (v) 包括SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之輕鏈。
  42. 如請求項35至41中任一項之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：腎癌、胃腸道癌及肺癌、較佳是非小細胞肺癌。
  43. 如請求項35至41中任一項之用途，其中該藥劑用於與一或多種其他治療劑或程序組合投與。
  44. 如請求項43之用途，其中該一或多種其他治療劑或程序係選自化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序或細胞免疫療法。
  45. 如請求項43之用途，其中該其他治療劑係A2AR拮抗劑、CD39拮抗劑、LAG-3拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、EGFR拮抗劑或HER2拮抗劑。
  46. 如請求項35至41中任一項之用途，其中基於增加之CD73表現來選擇擬治療患者。
  47. 如請求項35至41中任一項之用途，其中該擬治療患者先前已使用另一治療劑進行治療，其中該治療劑較佳係PD-1拮抗劑、尤其選自由以下組成之群之PD-1拮抗劑：派姆單抗、尼沃魯單抗、匹利珠單抗、阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗及包括以下之抗體： (i) 包括SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之輕鏈；或 (ii) 包括SEQ ID NO: 123之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之輕鏈；或 (iii) 包括SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之輕鏈；或 (iv) 包括SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之輕鏈；或 (v) 包括SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之輕鏈。
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